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LIANA CARBALLO MENEZES
AMOSTRAS DE Pseudomonas aeruginosa
RESISTENTES A CARBAPENENS ISOLADAS EM
HOSPITAIS BRASILEIROS: PERFIL DE
SENSIBILIDADE, DETECÇÃO DE METALO-BETA-
LACTAMASE E ANÁLISE DA SIMILARIDADE
GENÉTICA
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo – Escola
Paulista de Medicina para obtenção
do Título de Mestre em Ciências.
São Paulo
2005
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LIANA CARBALLO MENEZES
AMOSTRAS DE Pseudomonas aeruginosa
RESISTENTES A CARBAPENENS ISOLADAS EM
HOSPITAIS BRASILEIROS: PERFIL DE
SENSIBILIDADE, DETECÇÃO DE METALO-BETA-
LACTAMASE E ANÁLISE DA SIMILARIDADE
GENÉTICA
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo – Escola Paulista
de Medicina para obtenção do Título de
Mestre em Ciências.
Este trabalho foi realizado com auxílio
financeiro fornecido pelo Conselho
Nacional para o Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq)
Orientadora:
Prof
a
Dr
a
Ana Cristina Gales
São Paulo
2005
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MENEZES, Liana Carballo
Amostras de Pseudomonas aeruginosa resistentes a
carbapenens isoladas em hospitais brasileiros: perfil de
sensibilidade, detecção de metalo-beta-lactamase e análise da
similaridade genética/ Liana Carballo Menezes - São Paulo, 2005.
ix, 100f.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola
Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Doenças
Infecciosas e Parasitárias
Título em inglês: Pseudomonas aeruginosa resistant to
carbapenens isolated from Brazilian Hospitals: susceptibility, . metallo-
beta-lactamase detection, and genetic similarity.
1. Pseudomonas aeruginosa 2. Metalo-β-lactamase 3. Resistência
4. spm 5. PFGE
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
DISCIPLINA DE DOENÇAS INFECCIOSAS E PARASITÁRIAS
Chefe do Departamento: Prof. Dr. Antonio Roberto Chacra
Coordenador do Curso de Pós-Graduação: Prof. Dr. Arnaldo Lopes Colombo
São Paulo
2005
iv
Dedico este trabalho a minha mãe Zulma e meu
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pai Luiz pela dedicação, confiança e amor em todos
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os momentos da minha vida.
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Que sempre estiveram ao meu lado e me
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ensinaram a superar todas as dificuldades, pois o
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caminho percorrido para chegar até aqu
caminho percorrido para chegar até aqucaminho percorrido para chegar até aqu
caminho percorrido para chegar até aqui não foi
i não foi i não foi
i não foi
nada fácil e sem o apoio de vocês eu jamais
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nada fácil e sem o apoio de vocês eu jamais
conseguiria!
conseguiria!conseguiria!
conseguiria!
v
AGRADECIMENTOS
A DEUS primeiramente pôr minha existência, paz, amor e pôr tudo em
que eu creio e para tudo que eu vivo, sem esta fé eu jamais conseguiria.
A Profª. Drª. Ana Cristina Gales pelos ensinamentos e também pôr me
conceder o privilégio da sua orientação; e acima de tudo pela lição de vida que
me foi transmitida. Ana, muito obrigada não apenas pelas correções deste
trabalho, mas no convívio diário, você é um exemplo a ser seguido como
pessoa e como profissional.
Profº Drº Hélio Silva Sader pela grande oportunidade, por me receber
no LEMC com grande profissionalismo e acima de tudo por ter me concedido o
privilégio de fazer parte da família LEMC.
Ao Profº Drº Antônio Carlos Campos Pignatari, pelo grandioso
convívio e pelas oportunidades nesse intenso convívio.
A Maria Cristina Bronharo Tognin pelo grande companheirismo e
convivência diária, por todos os conselhos e opiniões decisivas em minha vida
profissional.
A Adriana Oliver Reis pelos ensinamentos que propiciaram os meu
primeiros passos como pesquisadora em microbiologia.
A Andreia Penteado, Juliana Gugel, Luciana Cirilo, Thais A. Fernandes,
Kelly Santiago e Juliana Bertoli pelo companheirismo diário, por estarem
sempre prontas a me ajudarem e sem duvida vocês ocupam um imenso lugar
no meu coração.
vi
A Andrea Pereira pela amizade verdadeira, pelo incentivo, pelos
conselhos, por sempre ter uma palavra acolhedora nos momentos mais difíceis
e sem dúvida pelos momentos inesquecíveis que passamos juntas.
A Jussimara Monteiro pela companhia diária, não só no laboratório
como em casa também. Dizer muito obrigada seria muito pouco e injusto pois
afinal foram intensos meses de convívio o que sempre foi um grande prazer
estar ao seu lado diretamente, uma pessoa tão amiga, tão irmã.
Aos Pós Graduandos Rodrigo Elisandro Mendes e a Mariana
Castanheira. supervisores do Laboratório Especial em Microbiologia Clínica
LEMC-ALERTA, pela dedicação e colaboração para a realização deste
trabalho.
A amiga Suzane Silbert que me acompanha desde o primeiro dia em
que cheguei no LEMC até hoje, sem ela não estaria onde estou agora. Continue
sendo o que você é, uma pessoa única.
A Soraya Sgambatti de Andrade pela amizade verdadeira, pelo
incentivo, pelos conselhos, por sempre ter uma palavra acolhedora nos
momentos mais difíceis e sem dúvida pelos momentos inesquecíveis que
passamos juntas.
A Secretária Rosana Capecce pela amizade, carinho e convivência
diária.
A Jacira Donizetti pelo seu trabalho que é fundamental no LEMC e por
todas as tardes esquentar o meu coração com seus doces chás
vii
As Meninas do IDIPA Adryella, Agda, Ângela, Mirella e Renata. por me
auxiliarem na identificação das cepas deste trabalho quando precisei.
As todas as pessoas que participaram diretamente ou indiretamente do
meu trabalho, o meu muito obrigado.
viii
SUMÁRIO
Dedicatória......................................................................................................
iv
Agradecimentos.............................................................................................. v
Lista de Figuras.............................................................................................. ix
Lista de Tabelas..............................................................................................
x
Resumo...........................................................................................................
xi
1. INTRODUÇÃO............................................................................................
1
1.1. Agente Etiológico..................................................................................... 1
1.2. Infecções causadas por Pseudomonas aeruginosa.................................
2
1.3.Terapia antimicrobiana........................................................................
3
1.4. Mecanismo de Resistência Antimicrobina em P. aeruginosa.................. 5
1.4.1.Alteração de permeabilidade com alteração de proteínas de
membrana externa (porinas)...........................................................................
6
1.4.2. Alteração do sítio de ligação do antimicrobiano....................................
7
1.4.3. Mecanismo ativo de efluxo de antimicrobianos.....................................
8
1.4.4. Produção de enzimas inativadoras de antimicrobianos........................
9
1.4.4.1. Produção de enzimas inativadoras de aminoglicosídeos.................. 9
1.4.4.2. Produção de β-lactamases.................................................................
9
1.5. Tipagem Molecular...................................................................................
22
2. OBJETIVO...................................................................................................
25
3. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................
26
3.1. Amostras Bacterianas..............................................................................
26
3.2. Avaliação da Sensibilidade In Vitro aos Antimicrobianos.........................
27
3.2.1. Teste de disco-difusão..........................................................................
28
3.2.2. Microdiluição em caldo..........................................................................
29
3.3. Detecção das amostras de Pseudomonas aeruginosa produtoras de
metalo-β-bactamase........................................................................................
30
3.3.1.1. Testes fenotípicos..............................................................................
30
3.3.1.1.1. Disco-aproximação..........................................................................
30
3.3.1.1.2. Etest
®
...............................................................................................
31
3.3.1.1.3. Avaliação da Hidrólise de Carbapenens.........................................
32
3.3.1.2. Testes genotípicos.............................................................................
33
3.3.1.2.1. Pesquisa de genes relacionados à produção de MβL bla
IMP-1
,
bla
VIM-1
, bla
VIM-2
e bla
SPM-1
pela técnica da reação de polimerase em
cadeia..............................................................................................................
33
3.3.1.2.2. Clivagem dos produtos de PCR......................................................
35
3.3.1.2.3. Reação de seqüenciamento............................................................
36
3.4. Avaliação da similaridade genética das amostras de Pseudomonas
37
ix
aeruginosa resistentes a carbapenens..........................................................
3.4.1. Ribotipagem automatizada....................................................................
38
3.4.2. Eletroforese em campo elétrico pulsado (PFGE)..................................
39
4. RESULTADOS............................................................................................
40
4.1. Amostras Bacterianas 40
4.2. Avaliação da sensibilidade in vitro a antimicrobianos das 206 amostras
clínicas de P. aeruginosa pelo método de disco-difusão
42
4.3. Avaliação das amostras de P. aeruginosa com sensibilidade reduzida a
imipenem pela metodologia da microdiluição em caldo
43
4.4. Detecção do mecanismo de resistência aos carbapenens
46
4.4.1. Detecção fenotípica da produção de metalo-β-lactamase pelo teste
de disco-aproximação e Etest
®
46
4.4.2. Avaliação da Hidrólise de Carbapenens 49
4.4.3. Detecção dos genes que codificam as metalo-β-lactamases
50
4.5. Clivagem e seqüenciamento dos amplicons obtidos com primers
bla
SPM-1
53
4.6. Tipagem Molecular 53
5. DISCUSSÃO 59
6. CONCLUSÃO 71
8. REFERENCIAS 72
7. ABSTRACT 101
7. ANEXOS 102
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Amostra de P. aeruginosa apresentando teste fenotípico
positivo para a produção de metalo-β-lactamase. A seta indica o disco de papel
de filtro estéril contendo 3µl de uma solução pura de ácido 2-
mercaptopropiônico a 1,2 g/ml.
Figura 2 – Amostra de P. aeruginosa apresentando teste fenotípico
positivo para a produção de metalo-β-lactamase. A seta indica o disco de papel
de filtro estéril contendo 5 µl de uma solução de EDTA a 100mM.
Figura 3 – Etest MβL positivo para amostra de P. aeruginosa produtora
de metalo-β-lactamase. Notar o decréscimo > 3 diluições na MIC do imipenem
associado ao EDTA em comparação a MIC de imipenem sozinho.
Figura 4 – Localização dos centros médicos com amostras de P.
aeruginosa resistentes aos carbapenens, as cidades que estão marcadas com
asterisco preto apresentam amostras com o gene bla
SPM-1.
Figura 5 – Reação de PCR utilizando-se o primer bla
SPM-1.
Figura 6 – Perfil de ribotipagem dos diferentes clones de P. aeruginosa
isoladas dos distintos centros médicos brasileiros.
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Características funcionais e moleculares dos principais
grupos de β-lactamases. ESBL
b
conferem resistência a cefalosporinas de
amplo espectro e monobactâmicos.
Tabela 2 – Metalo-β-lactamases pertencentes às famílias IMP, VIM,
SPM e GIM.
Tabela 3 – Distribuição das 206 amostras de P. aeruginosa coletadas
dos 25 centros brasileiros entre janeiro de 2001 e junho de 2003 de acordo com
o sítio corporal.
Tabela 4 – Perfil de sensibilidade in vitro a antimicrobianos das 206
amostras de P. aeruginosa pela técnica de disco-difusão.
Tabela 5 – Potência antimicrobiana e porcentagem de sensibilidade
aos agentes antimicrobianos testados contra as 85 amostras clínicas de P.
aeruginosa resistentes a imipenem.
Tabela 6 – Variabilidade genética das 82 amostras de P. aeruginosa
produtoras de SPM-1 isoladas em 15 distintos centros médicos brasileiros,
correlacionados ao local e sítio corpóreo de isolamento.
xii
ABREVIATURAS
AAC – Acetiltransferases
AMI - Amicacina
ANT – Adeniltransferases
APH – Fosfotransferases
ATCC – American Type Culture Collection
ATM - Aztreonam
ATP – Trifosfato de adenosina
BHI – Brain-Heart Infusion
CAZ - Ceftazidima
CDC – Centers for Disease Control and Prevetion
CIPRO - Ciprofloxacina
CPM - Cefepima
DIPA – Disciplina de Doenças Infecciosas e Parasitárias
DNA – Ácido desoxirribonucléico
EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético
GEN - Gentamicina
IMP- Imipenem
IOP – Instituto de Oncologia Pediátrica
LEMC – Laboratório Especial de Microbiologia Clínica da Disciplina de Doenças
Infecciosas Parasitárias da UNIFESP/EPM
MER - Meropenem
MIC – Concentração inibitória mínima
MIC50 – Concentração inibitória mínima para 50% das amostras
xiii
MIC90 – Concentração inibitória mínima para 90% das amostras
MBL – Metalo-
β
-lactamase
2-MPA – Ácido 2-mercaptopropiônico
MYSTIC – Meropemen Yearly Susceptibility Test Information Collection
NCCLS – National Committee for Clinical Laboratory Standards
NNISS – National Nosocomial Infections Surveillance System
OMP- Outer Membrane Protein
PBPs – Proteínas ligadoras de penicilinas
PCR – Reação de polimerase em cadeia
PIP/TAZ – Piperacilina/Tazobactam
POLIB – Polimixina B
RNA – Ácido ribonucléico
RND – Resistance Nodulation Division
SDS-PAGE – Sodium Dodecyl Sulfate-Poliacrylamide Gel Electrophoresis
SPM-1 – São Paulo Metallo-
β
-lactamase
UFC – Unidades formadoras de colônias
UTI – Unidade de terapia intensiva
xiv
RESUMO
As infecções causadas por P. aeruginosa são freqüentemente de difícil
tratamento devido a sua virulência e a resistência a vários atimicrobianos. Os
carbapenens são geralmente ativos contra P. aeruginosa multirresistentes,
porém, a resistência a estes compostos tem aumentado rapidamente. As altas
taxas de resistência aos carbapenens são incomuns e geralmente é um
indicativo da presença de metalo-β-lactamase. O propósito deste estudo foi
avaliar o perfil de sensibilidade a antimicrobianos das amostras de P.
aeruginosa resistentes aos carbapenens isoladas de hospitais brasileiros,
detectar a presença dos genes bla
SPM-1,
bla
IMP-1,
bla
VIM-1
e
bla
VIM-2
e avaliar a
similaridade genética entre as amostras de P. aeruginosa resistentes aos
carbapenens. Foram avaliadas 206 amostras de P. aeruginosa resistentes aos
carbapenens isoladas de 2001 a 2003 de 25 centros médicos. As 206 amostras
foram testadas pelo método de disco-difusão. Os testes de sensibilidade foram
realizados de acordo com a padronização do “National Committee for Clinical
Laboratory Standards” (NCCLS). Os isolados resistentes aos carbapenens
foram triados para a produtoção de metalo-β-lactamases pelo teste de
aproximação de discos utilizando dois inibidores enzimáticos (EDTA e ácido 2-
mercaptopropiônico). A produção de MβL foi confirmada pela metodologia do
Etest
(fita Etest
MBL). Em seguida foi realizada a técnica de PCR para a
pesquisa dos genes bla
IMP-1
, bla
VIM-1
, bla
VIM-2
e bla
SPM-1
. A avaliação da
similaridade genética foi realizada nas amostras produtoras de MβL e em uma
amostra não produtora de MβL dos centros médicos pela técnica da
ribotipagem automatizada e PFGE. Foram observadas altas taxas de
resistência a maioria dos antimicrobianos. As polimixinas foram os únicos
agentes a inibir o crescimento de 100,0% das amostras. A produção de MβL foi
demonstrada em 98 (47,6%) das 206 amostras. O gene bla
SPM-1
foi detectado
em 82 amostras (83,7%) e o gene bla
IPM-1
em 3 amostras (16,3%). A análise da
similaridade genética mostrou uma grande diversidade clonal entre as 98
amostras resistentes aos carbapenens (46 ribogrupos). CONCLUSÃO: Este
xv
estudo indica uma alta prevalência de P. aeruginosa resistentes aos
carbapenens produtoras de MβL e uma disseminação clonal destes
microrganismos em regiões geográficas distintas no Brasil.
1
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 - Agente Etiológico
A família Pseudomonadaceae é constituída por um grupo grande de bactérias
Gram-negativas não fermentadoras de glicose. Dois esquemas foram propostos para
classificar organismos desta família. Um primeiro esquema, proposto por Gillardi (1991), é
baseado nas características fenotípicas e divide os microrganismos em sete grandes
grupos: fluorescens, stutzeri, alcaligenes, pseudomallei, acidovorans, facili-delafieldii e
diminuta. O segundo esquema, desenvolvido por Palleroni (1984), é baseado em estudos
de homologia genética do RNA ribossômico e do DNA, classificando estes microrganismos
em cinco grupos. Recentes estudos filogenéticos baseados na análise das seqüência de
nucleotídeos da porção 16S do RNA ribossômico levaram a uma nova descrição do
gênero Pseudomonas e limitaram as espécies de acordo com a homologia do RNA
ribossômico em cinco grupos. O gênero Pseudomonas pertence ao grupo I, que incluem
as espécies P. aeruginosa, P. fluorescens, P. putida (Kersters et al., 1996; Anzai et al.,
2000).
Pseudomonas spp. são bacilos gram-negativos com aproximadamente 1.5 a 5.0
µm de comprimento e 0.5 a 1.0 µm de largura, são estritamente aeróbios tendo o oxigênio
como aceptor final de elétron no metabolismo respiratório. Alguns microrganismos podem
crescer em condições de anaerobiose utilizando nitrato ou arginina como aceptor final de
elétron. São microrganismos não formadores de esporos e apresentam um ou mais
flagelos polares. Estes microrganismos apresentam a prova da oxidase positiva, exceto P.
luteola e P. oryzihabitans, e produzem catalase. A maioria degrada glicose oxidativamente
e convertem nitrato em nitrito. São capazes de crescer em ágar MacConkey,
apresentando-se como colônias não-fermentadores de lactose, e em temperaturas que
variam de 5°C a 42°C, sendo 37°C a temperatura considerada ideal. Estes
microrganismos são metabolicamente versáteis capazes utilizar uma variedade de
carboidratos simples ou complexos, álcoois e aminoácidos como substratos.
2
2
Amostras de Pseudomonas spp. podem apresentar morfologias distintas,
variando desde uma colônia plana, difusa, característica da maioria dos isolados clínicos,
até colônias bem pequenas. Colônias de aspecto mucóide são comuns em amostras
isoladas de infecções do trato respiratório, principalmente, de pacientes com fibrose
cística. A maioria das amostras de P. aeruginosa pode ser identificada devido à sua
morfologia e por possuírem pigmentação verde-azulada devido à produção de piocianina.
As colônias também possuem um odor característico de frutas (Gillardi et al., 1980).
1.2 - Infecções causadas por Pseudomonas aeruginosa
Amostras de Pseudomonas spp. encontram-se amplamente distribuídas pela
natureza, sendo preferencialmente encontradas no meio ambiente, como, na água, no
solo e nas plantas, incluindo frutas e vegetais (Holt et al.,1994). Devido à habilidade de
sobreviver em meio aquoso, estes microrganismos, principalmente P. aeruginosa, têm se
tornado importantes patógenos no ambiente hospitalar, pois são capazes de sobreviver
em soluções aquosas como desinfetantes, sabões, pomadas, fluidos de diálise e
equipamentos (Morrison et al.,1984). A utilização de dispositivos respiratórios, como
inaladores, circuitos utilizados para ventilação mecânica são descritos como importantes
reservatórios destes patógenos facilitando a disseminação intra-hospitalar destes
microrganismos. (Neu et al.,1983; Pollack et al., 2000).
As mãos dos profissionais de saúde representam outro modo importante na
disseminação intra-hospitalar de P. aeruginosa, pois atuam como um elo entre o paciente
e o ambiente (Widmer et al., 1993 e Moolenaar et al., 2000).
A colonização por esse microrganismo muitas vezes precede a infecção, como
ocorre nas pneumonias associadas à ventilação mecânica, nas infecções do trato
urinário, nas infecções de pele dos grandes queimados e em outros processos sépticos
(Gould et al., Wise et al., 1985; Rello et al., Jubert et al., 19sp1). rasto gastroitestial,
assim como mucos e pel e pcnts hosializados, receedo
3
3
antibioticoterapia de amplo espectro, podem estar colonizados com P. aeruginosa, em
mais de 50% das vezes (Pollack et al., 2000).
As infecções por bacilos Gram-negativos adquiridos no ambiente hospitalar
constituem um dos maiores problemas de saúde pública, devido à sua freqüência, à
gravidade e ao custo no tratamento (Pittet et al., 1993). Segundo dados do National
Nosocomial Infection Surveillance (NISS) System do Center for Diseases Control and
Prevetion (CDC) coletados entre 1986 e 1998, a P. aeruginosa é a segunda e a terceira
causa mais freqüente de pneumonias hospitalares e de infecções urinárias,
respectivamente. Ainda segundo esses dados, permanece como a quarta causa de
infecções de sítio cirúrgico e o sétimo patógeno mais freqüentemente isolado em
corrente sanguínea (NISS, 2003).
O Programa de Vigilância de Resistência a Antimicrobianos SENTRY avaliou
70.067 amostras clínicas obtidas de paciente internados em hospitais da Ásia, Europa,
Estados Unidos, Canadá e América Latina, no período de 1997 a 1999, e mostrou que
deste total de amostras clínicas, 6.631 amostras foram identificadas como de P.
aeruginosa. A ocorrência de infecções por P. aeruginosa foi maior na América Latina
(11,4%) e Ásia (11,4%) quando comparada à Europa (9,3%), aos Estados Unidos
(8,7%) e ao Canadá (8,6%). O trato respiratório foi o sítio que apresentou a maior
prevalência de infecção por P. aeruginosa (Gales et al., 2001).
1.3 - Terapia antimicrobiana
As opções terapêuticas para o tratamento de infecções causadas por P.
aeruginosa incluem penicilinas com atividade anti-Pseudomonas e cefalosporinas de
amplo espectro, aztreonam, carbapenens e fluorquinolonas (Carmeli et al., 1999). A
monoterapia com os aminoglicosídeos é raramente utilizada, pois, esses agentes são
freqüentemente utilizados em regimes combinados aos beta-lactâmicos na tentativa de
potencializar a atividade anti-bacteriana e evitar o desenvolvimento de resistência
4
4
bacteriana. Entre as opções terapêuticas, os carbapenens são potentes agentes
antimicrobianos devido à grande estabilidade frente à hidrólise causada pela maioria das
β-lactamases produzidas por P. aeruginosa, e também por apresentarem maior
capacidade de penetração pela membrana externa bacteriana (Senda et al., 1996; Yan et
al., 2001; Eron et al., 1983.).
O surgimento e a disseminação de bactérias multirresistentes têm dificultado
muito o tratamento das infecções hospitalares no Brasil. Devido ao alto grau de resistência
a antimicrobianos, a introdução empírica da terapia antimicrobiana adequada é muitas
vezes retardada, elevando assim a morbi-mortalidade dos pacientes. Além disso, a
escolha da terapia antimicrobiana empírica para os diferentes tipos de infecções
hospitalares se torna difícil à medida que a prevalência de bactérias multirresistentes
aumenta, obrigando a utilização de combinações de antimicrobianos e/ou de drogas mais
tóxicas.
Os carbapenens apresentavam excelente atividade contra P. aeruginosa e
representavam a terapêutica empírica de escolha para infecções graves, causadas por
este patógenos. Dessa maneira, até pouco tempo os carbapenens representavam a
terapia mais “segura” para tratamento de infecções por P. aeruginosa. Atualmente a
resistência a esta droga aumentou, entre os bacilos Gram-negativos, principalmente
entre as amostras de P. aeruginosa (Hirakata et al., 2003).
Um estudo do Programa SENTRY analisou o perfil de sensibilidade de 1894
amostras de P. aeruginosa, isoladas de seis países da América Latina, no período de
1997 a 2001. Comparando os resultados obtidos durante todos os anos do estudo,
observaram uma diminuição significativa (p<0,001) nas taxas de sensibilidade para todos
os agentes antimicrobianos testados. Os dados mais
5
5
drogas utilizadas até o início da década de 60 (Edgar et al. e Dickinson et al.), voltaram
a ser uma opção terapêutica para a o tratamento de infecções causadas por P.
aeruginosa multirresistentes em pacientes hospitalizados. Entretanto, a taxa de
sucesso terapêutico reportada para o tratamento de infecções causadas por P.
aeruginosa e Acinetobacter baumannii em pacientes graves, com alta pontuação de
APACHE II e internados na UTI foi de 60% com o uso de colistina (Levin et al., 1999).
Dados semelhantes foram relatados por Linden (2003), no tratamento de 14 casos de
infecções por P. aeruginosa multirresistentes isolados de vários sítios, de pacientes
transplantados e que estavam internados na UTI.
1.4 – Mecanismo de Resistência Antimicrobina em P. aeruginosa
A emergência e disseminação de organismos multirresistentes revela uma
variedade de fatores responsáveis pelo aumento da resistência bacteriana a
antimicrobianos. Alguns desses fatores incluem a mutação em genes de resistência
ampliando seu espectro de atividade, e a aquisição de novos genes de resistência através
da troca de informações genéticas entre os microrganismos. Além disso, o uso de
antimicrobianos no meio hospitalar e na comunidade levam à pressão seletiva facilitando o
desenvolvimento e a disseminação de clones bacterianos multirresistentes (Tenover et al.,
2001).
Bacilos Gram-negativos como Acinetobacter spp. e P. aeruginosa constituem
importantes patógenos em hospitais brasileiros (Arruda et al.,1999; Sader et al.,1999).
Vários estudos multicêntricos têm mostrado altas taxas de resistência aos carbapenens
entre amostras de P. aeruginosa e cerca de 10 a 20% destas amostras seriam resistentes
a todos os antimicrobianos disponíveis comercialmente (Gales et al., 1997; Gales et al.,
2000; Sader et al.,1998; Sader et al., 1999) .
Os mecanismos de resistência antimicrobianos desenvolvidos por P. aeruginosa
podem ser:
6
6
• Alteração de permeabilidade com alteração de proteínas de membrana
externa (porinas).
• Alteração do sítio de ligação do antimicrobiano.
• Mecanismo ativo de efluxo de antimicrobianos.
• Produção de enzimas inativadoras de antimicrobianos.
1.4.1 - Alteração de permeabilidade com alteração de proteínas de
membrana externa (porinas)
As proteínas de membrana externa, porinas, são estruturas protéicas
tridimensionais presentes na membrana externa formando canais preenchidos por água e
que permitem a entrada por difusão de moléculas hidrofílicas e de baixo peso molecular
como os aminoácidos, sacarídeos, antibióticos β-lactâmicos (Livermore et al., 2001), e a
extrusão de produtos não utilizados pela célula bacteriana (Nikaido et al., 1994).
Dentre as diferentes porinas, OprC, OprD, OprE e OprF que se encontram na
membrana externa da P. aeruginosa, a maior e mais abundante é a porina OprF, um
polipeptídeo de 36-kDa. Provavelmente, esta é a mais utilizada pela maioria dos β-
lactâmicos para penetrar no interior da bactéria (Vila & Marco et al., 2002). As porinas OprC
e OprE são canais inespecíficos, no entanto, são utilizadas para entrada na célula
bacteriana pelos antimicrobianos, β-lactâmicos, cloranfenicol, fluorquinolonas e
gentamicina (Vila & Marco , 2002; Yoneyama et al., 1995).
A proteína OprD, inicialmente chamada de D2, presente em P. aeruginosa, é
também permeável aos carbapenens, mas não a outros β-lactâmicos (Huang & Hancock et
al., 1996; Livermore et al., 2001). A alteração na porina OprD, seja diminuindo seu número
ou sua expressão, acarreta à resistência ao imipenem e à diminuição da sensibilidade ao
meropenem (Livermore et al., 2001; Vila & Marco et al., 2002).
7
7
1.4.2 - Alteração do sítio de ligação do antimicrobiano
As proteínas ligadoras de penicilina (PBP) situadas na face externa da membrana
citoplasmática, apresentam atividade enzimática de transglicosidase, transpeptidase,
carboxipeptidases e endopepetidases, participando na terceira etapa da biossíntese do
peptideoglicano (Spratt & Cromie et al., 1988). Os antimicrobianos beta-lactâmicos são
análogos estereoquímicos das subunidades formadoras do peptidioglicano, ou seja, do
substrato destas enzimas. A resistência a estas drogas pode ocorrer devido a alterações
nas PBPs. Apesar de infreqüentes, alterações nas PBPs já foram reportadas em isolados
clínicos de P. aeruginosa (Godfrey, Bryan & Rabin et al., 1981). A resistência à penicilina
em P. aeruginosa foi associada à diminuição da quantidade da PBP-3 (Gotoh, Nunomura
e Nishino, 1990). A resistência a carbapenens descrita em P. aeruginosa foi também
associada a alterações na PBP-4 (Bellido et al., 1999).
A alteração no sítio de ação constitui o principal mecanismo de resistência às
fluorquinolonas. As topoisomerases são enzimas capazes de alterar o estado topológico
do DNA. A DNA girase, topoisomerase II, é um tetrâmero que possui duas subunidades
GyrA e GyrB codificadas respectivamente pelos genes gyrA e gyrB. A topoisomerase IV
possui as subunidades ParC e ParE codificadas pelos genes parC e parE, os quais são
homólogos aos genes gyrA e gyrB. A resistência às quinolonas ocorre de maneira gradual
e cumulativa.. Altos graus de resistência às fluoroquinolonas estão associadas à mutação
nos genes gyrA e parC às quais levam a alteração nas subunidades GyrA e ParC (Hooper
et al., 2001). Em P. aeruginosa mutações nas topoisomerases do tipo II associadas a
expressão de bombas de efluxo pode levar ao alto grau de resistência a esses
antimicrobianos (Nakajima et al., 2002).
8
8
1.4.3 - Mecanismo ativo de efluxo de antimicrobianos
O sistema de efluxo confere resistência a vários antimicrobianos, tornando assim,
um significante determinante de multirresistência intrínseca e adquirida. Existem cinco
grandes famílias de sistemas de efluxo descritos: a) família de grandes facilitadores (major
facilitator family ou MFS), b) família da resistência nodulada (resistance-nodulation-division
family ou RND), c) família de pequena multirresistência (small multidrug resistance family
ou SMR), d) transportadores de adenosina trifosfato (ATP-cassete transporters ou ABC) e
família extrusão de compostos tóxicos e multidrogas (multidrug and toxic compound
extrusion family ou MATE) (Poole et al., 2004).
O sistema de efluxo é organizado por três componentes: um transportador (RND,
MFS, ABC, SMR ou MATE) presente na membrana citoplasmática; por uma proteína de
fusão com membrana periplasmática (MFP), presente no espaço periplasmático e por um
canal extrusor (OMF) presente na membrana externa (Poole et al.,2001).
Em Pseudomonas aeruginosa são descritos os sistemas de efluxo da família RND
como: MexAB-OprM, MexCD–OprJ, MexEF-OprN e, MexXY–OprM (Livermore et al.,
2002). O sistema MexXY-OprM desempenha um papel muito importante na resistência
intrínseca da P. aeruginosa a aminoglicosídeos, tetracilina e eritromicina (Masuda et al.,
2000; Aires et al. , 1999).
Entre os sistemas descritos, o MexAB-OprM é o maior sistema constitutivamente
expresso, que contribui para a extrusão de uma grande variedade de β-lactâmicos (Li,
Poole & Nikaido, 2003; Srikumar et al.,1999), fluorquinolonas (Le Thomas et al., 2001),
tetraciclina e cloranfenicol (Srikumar et al., 1999). A mutação tipo nalB ocorre no gene
cromossomal mexR, que regula este sistema, resultando em um aumento na MIC de
penicilinas, cefalosporinas, quinolonas, tetraciclina e cloranfenicol; contudo, não interfere
na MIC do imipenem (Srikumar et al., 2000). Porém o meropenem é reconhecido e
eliminado por este sistema, muito provavelmente por apresentar uma cadeia lateral
hidrofóbica na posição 2’ (Köhler et al., 1999; Livermore et al., 2001).
9
9
O sistema MexEF-OprN não contribui diretamente para o extrusão de β-lactâmicos
e é regulado pelo gene nfxC, que por sua vez co-regula a expressão da porina OprD, a sua
diminuição resulta na resistência à imipenem, fluorquinolona e menor diminuição na
sensibilidade ao meropenem (Livermore et al., 2002). Caso a mutação ocorra no gene
nfxB, que regulam o sistema MexCD-OprJ, os microrganismos tornam-se mais sensíveis
ao imipenem, ao biapenem (Shiba et al., 1995); porém, tornam-se resistentes às
cefalosporinas de quarta geração, cefepima e cefpiroma (Gotoh et al., 1998; Poole et al.,
1996).
1.4.4 - Produção de enzimas inativadoras de antimicrobianos
1.4.4.1 – Produção de enzimas inativadoras de aminoglicosídeos
Existem três classes de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos:
acetiltransferases (AAC), adeniltransferases (ANT) e fosfostransferases (APH). Estas
enzima modificadoras podem atuar em diferentes posições acetilando ou fosforilando
grupos amina ou hidroxil dos aminoglicosídeos ( Gilbert et al., 2000). As enzimas mais
freqüentemente encontradas em P. aeruginosa são ANT2’’-I, que confere resistência à
gentamicina, à tobramicina, à dibekacina e à kanamicina; e a enzima AAC6’-II, que
confere resistência à tobramicina, à gentamicina e à netilmicina (Giamarellou et al., 2001).
1.4.4.2 - Produção de β
ββ
β-lactamases
As β-lactamases são um grupo de enzimas capazes de inativar antimicrobianos
β-lactâmicos, por hidrolisarem a ligação amida do anel β-lactâmicos, causando, assim, a
destruição irreversível do antimicrobiano (Livermore et al.,1995). A atividade enzimática é
10
10
variável de acordo com o tipo, a quantidade de β-lactamase produzida e os diversos
substratos β-lactâmicos existentes (Medeiros et al.,1997).
As β-lactamases constituem um grupo heterogêneo de enzimas produzidas por
inúmeras espécies bacterianas, tanto Gram-positivas quanto Gram-negativas, porém com
diversidades estruturais e localizações diferentes. Nas bactérias Gram-positivas, as β-
lactamases são secretadas para o meio extracelular, dessa forma são menos ativas que
as β-lactamases produzidas pelas bactérias Gram-negativas. Nesses microrganismos, as
β-lactamases estão presentes no espaço periplásmico, podendo assim alcançar maiores
concentrações e agirem de uma maneira mais eficaz sobre os antimicrobianos β-
lactâmicos (Livermore et al., 1993).
A codificação para a produção das β-lactamases está situada no DNA
cromossômico, ou no DNA extracromossômico (plasmídeos e “transposons”) bacteriano
(Livermore et al., 1991; Livermore et al., 1993).
Um grande número de β-lactamases codificadas por genes plamidiais já foram
descritas em bactérias Gram-negativas (Medeiros et al.,1984; Bush et al., 1989a). Essas
β-lactamases podem ser transferidas horizontalmente entre as diferentes espécies
bacterianas, ao contrário que ocorre com as β-lactamases cromossômicas que são
transmitidas verticalmente.
A primeira classificação fenotípica destas enzimas foi proposta, em 1973, por
Richmond & Sykes, que dividiram as β-lactamases em cinco grandes grupos (I, II, III, IV e
V), baseando-se no perfil enzimático.
Em 1980, Ambler propôs a classificação molecular das β-lactamases, de acordo
com a seqüência de aminoácidos, descrevendo quatro principais classes moleculares. A
classificação de Bush (1989) foi a primeira a correlacionar o substrato preferencial e
propriedades inibitórias com a estrutura molecular da enzima.
Atualmente a classificação mais utilizada combina características estruturais e
funcionais das β-lactamases, sendo uma versão mais atualizada da classificação anterior
proposta por Bush em 1989 (Bush, Jacoby & Medeiros, 1995). A Tabela 1 apresenta de
11
11
modo simplificado a correlação entre a classificação molecular de Ambler (1980) e a de
Bush, Jacoby & Medeiros (1995).
12
12
Tabela 1. Características funcionais e molecular grupos de β-lactamases.
a. BGN, bacilos Gram-negativos;
b. ESBL, β-lactamases de espectro ampliado;
c. N.D., não determinada (Adaptado do artigo de Bush, Jacoby & Medeiros, 1995).
Grupo
Funcional
Sub-
grupos
Classe
molecular
Características funcionais
1
C
Enzimas freqüentemente cromossomais em
BGN
a
, mas podem ser codificados por
plasmídios. Conferem resistência a todos os β-
lactâmicos, exceto carbapenens (exceto quando
combinado com alteração porinas). Não são
inibidas pelo ácido clavulânico
2
A e D
Grande maioria das enzimas é inibida pelo
ácido clavulânico
2a
A
Penicilinases produzidas por Staphylococcus
spp.. e Enterococcus spp.. Conferem altos
níveis de resistência às penicilinas
2b A
β-lactamases de espectro reduzido de bactérias
Gram negativas. Inclui TEM-1 e SHV-1
2be A
ESBL
b
conferem resistência a cefalosporinas de
amplo espectro e monobactâmicos
2br A
β-lactamases derivadas de TEM resistentes aos
inibidores de β-lactamases (IRT)
2c A Enzimas que hidrolisam a carbenicilina
2d D
Enzimas que hidrolisam a cloxacilina (oxacilina);
fracamente inibidas pelo ácido clavulânico
2e A Cefalosporinase inibidas por acido clavulânico
2f A
Enzimas que hidrolisam carbapenens com sítio
ativo serina, inibidas pelo ácido clavulânico
3 3a,
3b,
3c
B
Metalo-β-lactamases que conferem resistência
aos carbapenens e todos os outros β-lactâmicos
com exceção dos monobactâmicos. Não são
inibidas por ácido clavulânico
4 ND
c
Enzimas não seqüenciadas que não se
encaixam em outros grupos
13
13
As β-lactamases do grupo 1 de Bush, Jacoby e Medeiros (1995) ou da classe
molecular C de Ambler (1980), são conhecidas como β-lactamases AmpC. Este grupo de
enzimas é produzido por várias bactérias como P. aeruginosa, Proteus vulgaris,
Morganella morganii, Serratia marcescens, Providencia spp. e Enterobacter cloacae
(Livermore et al.,1991).
Estas são enzimas codificadas, geralmente, por genes cromossomais, induzíveis,
e hidrolizam todos os β-lactâmicos exceto os carbapenens. Normalmente, são produzidas
em pequenas quantidades, porém, na presença de β-lactâmicos, principalmente cefoxitina
e imipenem, a produção desta enzima pode aumentar de 100 a 1000 vezes (Lodge et al.,
1991). Estas enzimas são inibidas competitivamente pela cloxacilina; entretanto, não são
inibidas pelo ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam. Existem vários compostos
capazes de inibirem as β-lactamase AmpC como os penems monobactâmicos e o
Syn2190 (Babini, 2000). Este composto apresenta o núcleo 1,5 dihidroxi-4piridon no
carbono 3 do anel monobactâmico sendo capaz de inibir exclusivamente β-lactamases
AmpC ( Babini et al., 2000 ; Danes et al., 2002).
A expressão da β-lactamase AmpC em P. aeruginosa é similar aos mecanismos
regulatórios encontrados em enterobactérias (Langaee et al., 2000; Bagge et al., 2002).
Em amostras de P. aeruginosa a produção de β-lactamases AmpC é codificada por um
gene estrutural ampC. Estas são de origem cromossômica, podendo ser induzíveis ou
constitutivas. A indução desta enzima ocorre na presença de β-lactâmicos, tendo assim,
sua produção aumentada e quando o antimicrobiano é retirado, estas enzimas voltam a
ser sintetizadas em menor quantidade. Os β-lactâmicos, cefoxitina e imipenem, são
potentes indutores das β-lactamases AmpC, entretanto, o imipenem, apesar de ser
potente indutor, é um pobre substrato para estas enzimas, permanecendo estável à sua
hidrólise. O antimicrobiano ceftazidima é um fraco indutor e, apesar de ser hidrolisado por
estas enzimas podem permanecer ativo quando a produção das β-lactamases é pequena,
ou seja a bactéria é sensível a este agente porque a quantidade de enzima produzida não
é suficiente para hidrolisar a quantidade total de antimicrobiano que penetra na célula
bacteriana (Livermore et al., 1995; Medeiros et al., 1997). Em uma população de P.
14
14
aeruginosa a freqüência de mutações que leva à hiperprodução de β-lactamases AmpC,
ou seja à desrepressão do gene AmpC é de 10
-7
a 10
-9
/ UFC (Livermore et al., 1995).
O mecanismo para hiperprodução de β-lactamases AmpC envolve a mutação ou
deleções que ocorrem no gene ampD. A hiperexpressão resulta em alto nível de produção
de β-lactamases do tipo AmpC e ocorre independente da concentração do antimicrobiano,
sendo assim, considerada constitutiva (Medeiros et al., 1997; Helfand & Bonomo et al.,
2003) Existem poucos mutantes desreprimidos que apresentam mutações em ampR, a
maioria das mutações estão presentes no gene ampD (Langaee et al., 2000, Bagge et al.,
2002).
No grupo 2 da classificação de Bush, Jacoby e Medeiros (1995) estão as β-
lactamases mediadas por plasmídios e que, geralmente, são inibidas pelos inibidores de
β-lactamase como o ácido clavulânico, o tazobactam e o sulbactam. Elas estão divididas
segundo a classificação molecular de Ambler (1980) em duas classes A e D.
As β-lactamases da classe molecular A de Ambler (1980) e pertencentes ao
grupo 2 de Bush, Jacoby e Medeiros (1995) são conhecidas como β-lactamases de
espectro ampliado (“extended spectrum β-lactamases” - ESBL). Elas conferem resistência
à ampicilina, à carbenicilina, à ticarcilina e às cefalosporinas, no entanto, geralmente
mantêm a sensibilidade às cefamicinas, aos carbapenens e aos monobâctamicos. São,
geralmente, produzidas por Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae, mas podem ser
produzidas por qualquer bactéria Gram-negativa. As ESBLs encontram-se disseminadas
por todo o mundo e a maioria delas são estruturalmente relacionadas às β-lactamases do
tipo TEM-1, TEM-2, SHV-1 e PSE-1 (Shannon et al., 1990). Na América Latina, as β-
lactamases de espectro ampliado derivadas do gene ctx-m também são freqüentemente
encontradas (Winokur et al., 2001).
A β-lactamase PER-1 foi inicialmente descrita em amostras de P. aeruginosa
resistentes à ceftazidima isoladas na Turquia. O gene que codifica esta enzima pode
estar localizado no cromossomo ou em plasmídeos (Vahaboglu et al.,1997).
Recentemente, foi reportado a presença de amostras de P. aeruginosa produtoras de
PER-1 em um surto nosocomial em seis hospitais na Itália (Pagani et al., 2004). É
15
15
também relatada a presença desta enzima em amostras de Acinetobacter spp.
(Vahaboglu et al.,1997), Alcaligenes faecalis (Pereira et al.,2000) e Proteus mirabilis
(Pagani et al., 2002). O gene bla
PER-2
,que codifica a enzima PER-2, apresenta 86,4% de
homologia com o gene bla
PER-1,
que codifica a enzima PER-1, este gene encontra-se em
um plasmídio, sendo assim, de fácil transferência para membros da família
Enterobacteriaceae. A produção desta enzima tem sido reportada em amostras de
Salmonella typhimurium, E. coli, P. mirabilis isoladas de pacientes hospitalizados na
Argentina (Bauernfeind et al., 1996).
Ainda dentro da classe molecular A, a enzima pertencente ao grupo 2f, GES-1, foi
inicialmente descrita em 1998 em amostras de K. pneumoniae (Poirel et al., 2000). A
produção desta enzima foi reportada em amostras K. pneumoniae isolada de hospitais na
Guiana Francesa (Poirel et al., 2000) e em Portugal (Duarte et al., 2003). Esta enzima
também foi relatada em amostras de P. aeruginosa e, mais recentemente, isolada de uma
amostra de P. aeruginosa no Brasil (Castanheira et al., 2004). A enzima GES-2 foi isolada,
em 2000, na África do Sul em amostras de P. aeruginosa, e apresenta fraca atividade
hidrolítica contra os carbapenens. A análise cinética de enzima mostrou que esta
apresenta atividade catalítica contra imipenem 100 vezes maior que a GES-1. No entanto,
a atividade da GES-2 permanece 1000 vezes menor do que outras enzimas pertencentes
a classe A, capazes de hidrolisar os carbapenens como, da SME-1 e NMC-A, enzimas
identificadas em amostras de Serratia marcescens e Enterobacter cloacae,
respectivamente (Poirel et al., 2001).
Uma outra enzima da classe A, a VEB-1, primeiramente reportada em
amostras de E. coli isoladas no Vietnam (Poirel et al., 1999) foram reportadas em P.
aeruginosa isoladas na Tailândia (Naas et al., 1999) e Kuwait (Poirel et al., 2001). Foi
também identificada em amostras de Acinetobacter baumannii isoladas na França (Poirel
et al., 2003) e, mais recentemente, em amostras de P. aeruginosa isoladas na Índia
(Aubert et al., 2004). Os genes que codificam esta enzima apresentam-se localizados em
um integron de classe 1 (Aubert et al., 2004).
As oxacilinases da classe D de Ambler (1980), pertencentes ao grupo 2d de
Bush (1995), incluem a OXA-11, OXA -14, OXA -16, OXA -17, OXA -18, OXA -19, OXA
16
16
- 23, OXA - 24, OXA - 25, OXA - 26, OXA – 27, OXA –28 e OXA – 40. E como as
ESBLs produzidas pela K. pneumoniae das classes TEM e SHV, as enzimas do tipo
OXA, apresentam resistência às cefalosporinas, monobactâmicos e penicilinas, mas
apresentam a oxacilina como substrato preferencial. Estas enzimas também se
caracterizam por serem fracamente inibidas pelo ácido clavulânico (Danel et al.,1999).
Algumas enzimas da família OXA, OXA-23 a OXA-27, possuem a capacidade de hidrolisar
fracamente os carbapenens. Geralmente estas enzimas são produzidas por amostras de
Acinetobacter spp., mas não foram descritas em P. aeruginosa. As OXA - 24, OXA - 25,
OXA – 26 e OXA – 40 são homologas entre si, e a OXA-40 apresenta uma alta
atividade hidrolítica contra ao imipenem (Heritier et al., 2003). O gene bla
OXA–45
, foi
isolado em amostras de P. aeruginosa e apresenta 65,9% de homologia com o gene
bla
OXA–18
. A enzima OXA-45 apresenta atividade hidrolítica contra aztreonam e
oxacilina (Toleman et al., 2003). Recentemente, a OXA-50, isolada também em uma
amostra de P. aeruginosa mostrou-se ser expressa contitutivamente (Girlich et al., 2004) e
apresentar baixa afinidade ao imipenem, comparável à mesma afinidade apresentada
pelas enzimas OXA-27 (Shab et al., 2001) e OXA-24 (Bou et al., 2000). Mais
recentemente, OXA-58 foi isolada na França em A. baumannii (Poirel et al., 2005).
Na classe molecular B ou Grupo 3, estão presentes e as metalo-β-lactamases
que são um grupo de enzimas que possuem a capacidade de hidrolizar todos os β-
lactâmicos, exceto monobactâmicos, e não são inibidas pelo ácido clavulânico (Bush et
al., 1998). Inicialmente codificadas por genes cromossomais em várias bactérias, incluindo
Bacillus cereus (Sabath et al., 1966), Stenotrophomonas maltophilia (Saino et al., 1982),
Aeromonas spp. (Shannon et al., 1986), Chryseobacterium spp. (Bellais et al., 2000). Este
grupo apresenta-se dividido em três subgrupos funcionais que: 3a, 3b e 3c (Bush et al.,
1998).
O subgrupo 3a apresenta enzimas que hidrolisam penicilinas tão ou mais rápido
que o imipenem. As cefalosporinas também são hidrolisadas por estas enzimas, porém
mais lentamente que o imipenem. As prinicipais representantes deste subgrupo são as
enzimas produzidas por Bacillus cereus. No segundo subgrupo 3b estão incluidas as
enzimas de Aeromonas spp., as verdadeiras carbapenemases. Essas enzimas
apresentam alta especificidade pelos carbapenens e não são detectadas com o uso de
17
17
nitrocefin. Já o subgrupo 3c foi proposto apenas para incluir a metalo-β-lactamase
produzida por Legionella gormanii. Esta enzima apresenta grande capacidade de
hidrolisar cefalosporinas e apresenta propriedades bioquímicas distintas das outras
enzimas do grupo 3 (Bush et al.,1998).
Uma característica importante que distingue o subgrupo 3b do subgrupo 3a é o
efeito da adição do zinco (Zn
++
) no sítio ativo da enzima. Todas as metalo-β-lactamases
são enzimas que apresentam como cofator o íon Zn
++
, sendo
a atividade catalítica da
enzima aumentada na presença deste cátion. Ao contrário do observado para as enzimas
do subgrupo 3a, três enzimas do subgrupo 3b (ASA-1, AsbM1 e ACP) são inibidas por
baixas concentrações de Zn
++
(Bush et al., 1998).
As enzimas da classe B somente são inibidas pelo EDTA e pelos compostos
derivados do ácido tiolático, como por exemplo, o ácido 2-mercaptopropiônico. Elas
não são inibidas por inibidores de β-lactamases, disponíveis clinicamente como o ácido
clavulânico, o sulbactam e o tazobactam (Bush et al., 2001).
A primeira MβL, IMP-1, cuja produção era mediada por um gene situado em um
plasmídeo, foi reportado em uma amostra de Serratia marcescens, isolada em um hospital
de Osaka, em 1991 (Osano et al., 1994). No mesmo ano, Watanabe e colaboradores
reportaram uma cepa de P. aeruginosa isolada em 1988, no Japão, que produzia uma
MβL transferível e mediada por plasmídio. Segundo Livermore & Woodford (2000),
provavelmente, tratava-se da enzima IMP-1, a qual foi formalmente isolada e seqüenciada
também no Japão, em 1991. A Tabela 2 apresenta as metalo-β-lactamases descritas até o
momento pertencentes às famílias IMP, VIM, SPM e GIM.
Como outras metalo-β-lactamases (MβL), a IMP-1 apresenta um perfil de
substratos preferenciais bastante amplo, incluindo cefalosporinas de amplo espectro
(cefotaxima, ceftazidima, cefepima) e carbapenens (imipenem, meropenem, panipenem).
O aztreonam apresenta estabilidade à hidrólise pelas enzimas IMP-1; entretanto, os
microrganismos que produzem essa enzima são freqüentemente resistentes ao
aztreonam por apresentarem outros mecanismos de resistência (Osano et al., 1994;
Watanabe et al., 1991; Ito et al., 1995). Esta enzima é zinco-dependente, sensível ao
EDTA e não é inibida pelos inibidores de β-lactamases (Haruta et al., 2000). O gene
18
18
bla
IMP-1
freqüentemente ocorre em um cassete inserido em um integron da classe 1 (Laraki
et al., 1999). Além de incluir a resistência a todos os β-lactâmicos, os integrons que
carreiam o gene bla
IMP-1
também carreiam outros genes que codificam a resistência
cruzada aos aminoglicosídeos (Arakawa et al., 1995). Apesar da IMP-1 ser bastante
freqüente em amostras isoladas no Japão, tem sido recentemente identificada em
isolado16.3954(s)-9.84667(f)10.723(o)0.8683973(o)0.0.867144(d)-19.6933df97[(c)-14.05814(o)21.4276(-117( )-236.0,1)0.867144(97[(c)-e(s)-14.0117(o)0.862)-96.3942(f)1eis 4(ü)-19.6933(e)0.865889(n)0.86588913 0 Td[(e)0.8658828(e)0.86504(e)0.86584(s)-14.0123((e)0.865E(9)-19.59351(i)36.9546(m)10.5814( )-318.255(n)0.865884(s)-14.0123(( )1071443(i)36.9542(d)0.86581N(A)-11.49o(P)-11.4958(-)4.0332d9(ã)21.4264(o)-19.69a3(e)0.865889(n)077.135(r)4.03329(o)0.865889&(9)0.86583((e)0.865P(9)-19.59389(m)10.58189(e)0.8653(a)0.865889(m)10.7.1275 0 Td(9(l)221.999]T(e)0.86529(m)10.7.109(m)10.58109(m)10.5812,)-9.84604( )-256.572(1l)221.999]T(e)0.865E(9)0.5938(i)16.3942(d)0..59329(n)077.1309(n)077.1309)-14.014939(n)077.13,(a)0.868364(t)-9.84855(a71443(i4.0098(i)-4.1(t)10.71194(16.3954(s(e)-19.692 (t)10.7119(e-311.213 -323.459 -2-312.413 -19.92 Td.998]TJ/R223( )-400.496(i)16.395o(q)0.867144(üd)-96.3942(f)13 -323.459 -2s)-1459144( )-277144(üd)-96.3942(f)1r4( )-28413(L)0.8.5814(ü)-19.6933(e)0.833573(i)36.9559(n)-19.642(f)10.7144(im)10.78(v(M)-9.97906(P)-11.335z( )-236.0,1)0.867144()0.86714( )277.998]4(o)-19.69a3(e)0.8658(o)0.86588989(d)-19.6946(i)361414( )-318.253( )-236.07(a)-19.6946(m)10.5814(s)-14.0123(am)10.5816(n)0.865889(t)-9.84609(a)0.865889(k)-14.0123(a)468657i)36.954A)908 549123(i)16.3942(s)-14.01n( )-318.25e9(n)0.86588913 0 Td4( )-318.25b(n)0.865884(s)-14.0123( )-236.013(r)4.030749(e)-19.6946-256.5723(am)10.581b(n)0.865884(s)-14.0126(n)0.8658m )-277.1324(s)-14.012n3(e)0.865889(n)0.865889(e)0.8652(s)-14.01[(I)-2.3557(M)-8.06907(P1)-197(i)36.954p9(e)-19.6946-256.5723(q)0.865889(s)-14.0126(33(a)0.865889( )278o9(e)-19.6946-256.57242(f)10.7144(im)10.94604(i)16.39e2(f)10.7144(im)10.94M)833(o)21.4289(s)6.54813)107242.011(o)0.865889(s)-14.0123( )]7237(i)36.954L9(s)6.55064(t)-9.84855(464.-1974(q)0.868399.998]TJ/R273(i)36.95p6(i)16.395o()-19.6933(o)0-1988646()-19.693( )-277.692(d)0.865889(a)0.81.211()-19.6933(o)71)-28767(r)24.5925o()-19.6933(o)0-19892(Bd)0.86563559(n)-19.642s)-34.5728(o)0.867173(i)36.95-2-312.41,1)0.867144()0-19892((e)-19.6921(m)31.167144(t)-9.847-2s)-1459144( )-27714[(c)-14.0117(r)4.03203(u)0-19892((a)0.867144(d)-19.6933(o)0-198803(e)0.867144( )-9.8469(r)4.03329(o)0-1988014.05814(o)21s)-14.0123( )-236.046-256.57221sooro ose( )1076865(i)36.9547(d)-19.694.6794 Tf225.(e)0.865(o)71 eem71 33(a)0.8638(i)16.3942(71)-27525(n)0.865884(33(a)0.8623( )-236.089(e)0.8659(t)-9.84604(e)0.865889( )-400.49e(r)4.03329(o)0-198802(s)-14.01n( )-318.258913 0 Td[((e)-19.6946-256.572n(n)0.865884(33(a)0.86(a)0.833844(o)0.86714(o)0-19905889(n)077.13a(o)0.86714(o)0-199058U(A)-11.49T)-5.812752I(a)0.868364(t)-9.84855(a76865(i99(n)-19.69296(i)16.395o(q)0.867144()-19.693H(A)-130854(s)-14.0117(o)0.86714p6(i)16.395(e)-19.62d.998]TJ/R223( )-400.4le)-19.692 (97[(c)-Sd)0.865635ã6(i)16.395o(q)0.867144()-19.622(d)0.8656 11.6794 Tf0u3( )-400.4le)-19.692o()-19.6933(o)0.867142(d)0.86714G8(o.277.1223( )-400.4le)-19.692e(s)-14.0117(6794 Tf889(k)-14.0123(a65(.4144(n)0.864(97[(c)-e(r)24.5925(e)-19.623(o)0.8671423( )-400.4le485 0 Td[(e)-19.6946(t)10.7144( )-277.132(a)0.865889(l)221.999]TJ)221.9992(o)21.42609(m)10.58109(m)10.5813(33(a)0.86( )-215.693(1l)221.7223(( )1-1o)0145i995)-400.4986(9)0.86558(o))0.8.8644(m)10.5808( )-297.693z3( )-236.089s)-145914(o)-19.69a3(e)0.87144(üm)10.78(Io)0.86714( )-277.132(d)0.865889(a)0.867142)( )-277144(üd)-fo)0.867144(16.3954(s(e)-19.692 (tm)10.78((e)-19.6921(m)31.167144(t)-9.847-2s)-1459144( )-27714[(c)-11.4264(s)-14.0123(a)0.8.716(n)0.865889(t)-9.84609(a)0.8.713(e)0.867144( )-9.8469(r)4.03329(o))0.8.7189(d)-19.6946(i)361414(())4.03329(.)10.717(a)-19.6946(o)21.4276(s)-14.0123(am)10.5816(n)0.865889(t)-9.84609(a)0.865889(k)-14.0123(a)4-277.i)36.954A)908 549123( )-236.089(e)0.865n(n)0.865889(t)-9.84608(i)36.9547(a)-19.6946b(n)0.865884(s)-14.012c( )-236.07(a)-19.69449(e)-19.6946-256.5723(am)10.581b(n)0.865884(33(a)0.866(n)0.8658m )-277.1324(s)-14.012n3s)-14.012n3(e)0.86582(s)-14.01ie485 0 Td[(e)-19.6946(t)10.128.471enooaroLt
19
19
no site http:// www.lahey.org e acesso no “genebank” AB074437, foi encontrada em uma
amostra de P. aeruginosa no Japão; a IMP-12
foi isolada em uma amostra de P. putida
na Itália (Docquier et al., 2003); a IMP-13
isolada, em 2001, em uma amostra de
P.
aeruginosa isolada também na Itália (Toleman et al., 2003). Recentemente, uma nova
MβL, IMP-16
,
foi isolada, no Brasil, em uma amostra de P. aeruginosa proveniente do
Hospital de Base de Brasília (Mendes et al., 2004). Ainda não foram descritas as MβL
IMP-14 e 15. Mais recentemente, uma nova MβL, IMP-20, foi isolada no Japão em uma
amostra de P. aeruginosa (Shibata, 2005, no prelo).
Tanto os genes da família IMP como da família VIM foram encontrados em genes
cassetes móveis inseridos em integrons da classe 1. Os integrons da classe 1 são as vias
mais comuns, pela quais os genes cassetes de resistência mobilizam-se de uma bactéria
para a outra (Livermore et al.,2000).
Uma outra família de β-lactamase da classe B, foi identificada inicialmente em
uma amostra de P. aeruginosa na Itália em 1997, com menos de 30% de homologia
com as enzimas da família IMP, esta enzima foi designada como VIM-1 e deu origem à
família VIM (Lauretti et al., 1999). A MβL VIM-2, codificada pelo gene bla
VIM-2,
foi
identificada por Poirel et al. (2000), em uma amostra de P. aeruginosa sensível à
polimixina e aztreonam, isolada em hemocultura de uma paciente internada, em 1996,
no Instituto Paoli-Calmettes em Marselha, França. O gene bla
VIM-2
apresenta 90% de
homologia com o gene bla
VIM-1
.
A enzima VIM-3, presente em gene cromossomal, foi reportada em amostras de
P. aeruginosa isoladas em Taiwan. A seqüência de aminoácidos da enzima VIM-3 difere
da seqüência de VIM-2 pela mudança de somente dois aminoácidos (Yan et al., 2001).
Recentemente, a enzima VIM-4 foi isolada em uma amostra de P. aeruginosa na Grécia,
apresentando uma mutação que resultou na substituição da serina pela arginina na
posição 175 em comparação à seqüência de aminoácidos da enzima VIM-1 (Pournaras et
al., 2002).
Ainda não publicadas, mas já descritas no site http:// www.lahey.org foram
reportadas novas enzimas da família VIM: VIM-5 com acesso no “gene bank” AY144612,
isolada de K. pneumoniae, na Turquia e VIM-6 acesso no “gene bank” AY165025, isolada
20
20
de P. putida, em Singapura. A enzima VIM-7 foi isolada de uma amostra de P. aeruginosa
nos Estados Unidos da América como parte do programa de vigilância de resistência
CANCER (Toleman et al., 2004). O gene bla
VIM-7
encontrava-se em um plasmídio
podendo ser facilmente transferível para outras espécies de enterobactérias e
Pseudomonas (Toleman et al., 2004).
Mais recentemente, foi identificado o gene bla
VIM-8
em amostras de P.
aeruginosa isoladas na Colômbia, apresentando homologia de 90,2% com o gene
bla
VIM-1
(Crespo et al., 2004). As MβLs VIM-9 e VIM-10 foram isoladas em amostras de
P. aeruginosa no Reino Unido e quando comparada a VIM-1, apresentavam 90,2% e
90,6% de homologia, respectivamente (Woodford, 2004, no prelo). Uma outra nova MβL,
VIM-11, foi reportada na Argentina e na Itália, o gene bla
VIM-11
apresenta 90,2% de
homologia com o gene bla
VIM-1
(Pasteran et al, 2004; Mazzoriol, 2004, no prelo).
Em 2001, uma metalo β-lactamase foi identificada no Instituto de Oncologia
Pediátrica (IOP) do Complexo Hospitalar do Hospital São Paulo, São Paulo, que
mostrava uma homologia de 35,5% com a IMP-1 (Toleman et al., 2002). A nova MβL
denominada, SPM-1, São Paulo metalo-β-lactamase, identificada em uma cepa de P.
aeruginosa isolada inicialmente na urina e depois na hemocultura de uma criança de
quatro anos, portadora de leucemia. A SPM-1 hidrolisa todos os β-lactâmicos com
exceção do aztreonam, e é inibida pelo EDTA.
Mais recentemente foi identificada uma nova MβL, GIM-1, em amostras de P.
aeruginosa isoladas na Alemanha. O gene bla
GIM-1
apresenta 43,1% de homologia com
o gene bla
IMP-1
, 28,8% com gene bla
VIM-1
e apenas 28,0% com o gene bla
SPM-1
. Mostrou
uma atividade hidrolítica 10 vezes maior para o imipenem em comparação ao
meropenem. (Castanheira et al., 2004).
21
21
Tabela 2. Metalo-β-lactamases pertencentes às famílias IMP, VIM, SPM e GIM.
Enzima Espécie Bacteriana Origem
IMP-1
Serratia marcescens
P. aeruginosa
Japão
Japão
IMP-2 Acinetobacter baumannii Itália
IMP-3
Shigella flexneri
Japão
IMP-4
Acinetobacter baumannii
Citrobacter youngae
Hong Kong
China
IMP-5 Acinetobacter baumannii Portugal
IMP-6
Serratia marcescens
Japão
IMP-7
P. aeruginosa
Canadá
IMP-8
Klebsiella pneumoniae
Taiwan
IMP-9
P. aeruginosa
China
IMP-10
P. aeruginosa
Alcaligenes xylosoxidans
Japão
Japão
IMP-11
a
P. aeruginosa
Japão
IMP-12
P. aeruginosa
Turquia
IMP-13
P. aeruginosa
Itália
IMP-14
Não publicado
IMP-15
Não publicado
IMP-16
P. aeruginosa
Brasil
IMP-20 P. aeruginosa
Japão
VIM-1
P. aeruginosa
Acinetobacter baumannii
Achromobacter xylosoxydans
Itália
Itália
Itália
VIM-2
P. aeruginosa
França
Grécia
Itália
Coréia
Acinetobacter baumannii
Coréia
Enterobacter cloacae
Coréia
Serratia marcescens
Coréia
Pseudomonas putida
Coréia
22
22
Acinetobacter genomoesp. 3
Itália
Pseudomonas putida
Taiwan
Pseudomonas stutzeri
Taiwan
VIM-3
P. aeruginosa
Taiwan
VIM-4
P. aeruginosa
Grécia
VIM-5
Klebsiella pneumoniae
Turquia
VIM-6
P. putida
Cingapura
VIM-7
P. aeruginosa
Estados Unidos
VIM-8
P. aeruginosa
Colômbia
VIM-9
P. aeruginosa
Reino Unido
VIM-10
P. aeruginosa
Reino Unido
VIM-11
P. aeruginosa
Argentina
SPM-1
P. aeruginosa
Brasil
GIM-1
P. aeruginosa
Alemanha
Adaptado do artigo de Nordmann & Poirel (2002).
NP, não publicado
a. Espécie bacteriana na qual a enzima foi isolada pela primeira vez. A descrição desta
enzima encontra-se no site http://www.lahey.org
1.5 – Tipagem Molecular
A tipagem molecular utiliza técnicas de biologia molecular para evidenciar uma
possível relação genética entre os isolados clínicos de uma mesma espécie.
O acompanhamento e a avaliação do comportamento de determinadas cepas
dentro de uma população ao longo do tempo podem determinar a evolução de cepas
bacterianas de importância clínica e auxiliar na implementação de estratégias para
controlar o aparecimento de novas infecções (Pfaller et al., 2001; Gales et al., 2001b). A
23
23
caracterização de cepas bacterianas usando técnicas de tipagem molecular pode auxiliar
na avaliação de surtos hospitalares causados por microrganismos; como, também, na
detecção de disseminação local, regional e global de bactérias multirresistentes aos
antimicrobianos (Struelens et al., 1993a; Sader et al., 1995; Pfaller et al., 2001).
A técnica de eletroforese em campo elétrico variado (“Pulsed-Field Gel
Eletroforesis”- PFGE) se caracteriza por ser um sistema de eletroforese que utiliza
múltiplos eletrodos dispostos de forma hexagonal, por exemplo, gerando um campo
elétrico homogêneo e uma alternância na direção da corrente elétrica que gera um perfil
migratório em linha reta (Chu et al., 1986) e permite, assim, a separação de moléculas de
DNA de até duas megabases, que foram previamente digeridos por enzimas de restrições.
Embora existam no mínimo sete sistemas distintos empregando a técnica da eletroforese
pulsada para a separação do DNA, o sistema CHEF é o mais popular, sendo utilizado com
sucesso em estudos epidemiológicos e para traçar surtos hospitalares (Sader et al., 1993;
Livesley et al., 1998; D'Agata et al., 2000).
A técnica de ribotipagem foi descrita por Grimont & Grimont (1986) e tem como
princípio avaliar o polimorfismo do DNA bacteriano na região onde está localizado o
operon rrn, composto pelos genes 16S e 23S, que codificam o RNA ribossomal (rRNA)
das bactérias. Estes genes são altamente conservados nas espécies bacterianas e
permitem assim, que esta técnica seja aplicada com sucesso em vários estudos para
diferenciar cepas bacterianas. Inicialmente, a ribotipagem foi descrita para ser utilizada
com finalidades taxonômicas. Estudos posteriores demonstraram a utilidade desta técnica
para fins epidemiológicos e desde então, a ribotipagem se tornou uma das ferramentas
mais conhecidas nos estudos de epidemiologia molecular (Stull et al., 1988).
Vários estudos utilizando técnicas de tipagem molecular são realizados, sendo
que muitos destes trabalhos ajudam a esclarecer a dinâmica das infecções, principalmente
em bacilos Gram negativos não fermentadores de glicose, que representam um grande
problema nas infecções hospitalares (Pfaller et al., 2001). Surtos ocasionados por P.
aeruginosa mutirresistentes aos antimicrobianos são freqüentemente reportados em
unidades de queimados, unidade de neurocirurgia, unidades de terapia intensiva,
24
24
unidades oncológicas e entre pacientes com fibrose cística (Sader et al., 1993; Barth &
Pitt, 1998; Speijer et al., 1999; Arruda et al., 1999; Pellegrino et al., 2002).
25
25
2
. OBJETIVOS
2.1 Avaliar o perfil de sensibilidade a diversos agentes antimicrobianos das 206
amostras de Pseudomonas aeruginosa resistentes aos carbapenens isoladas em distintos
hospitais brasileiros, pela técnica disco-difusão;
2.2 Avaliar a freqüência da produção de MβL entre as amostras de P. aeruginosa
resistentes aos carbapenens isoladas em distintos hospitais brasileiros;
2.3 Avaliar o perfil de sensibilidade a antimicrobianos das amostras de P.
aeruginosa produtoras de MβL pela técnica de microdiluição em caldo;
2.4 Avaliar a presença dos genes bla
SPM-1,
bla
VIM-1
, bla
VIM-2
e bla
IPM-1
entre as
amostras de P. aeruginosa produtoras de MβL isoladas de distintos hospitais brasileiros;
2.5 Avaliar a presença de variantes alélicos do gene bla
SPM-1
entre as amostras
de P. aeruginosa
produtoras da MβL do tipo SPM-1;
2.6 Avaliar a similaridade genética entre as amostras de P. aeruginosa resistentes
aos carbapenes produtoras de SPM-1 isoladas de distintos hospitais brasileiros.
26
26
3 - MATERIAL E MÉTODOS
3 - MATERIAL E MÉTODOS
3.1 - Amostras Bacterianas
Foi solicitado para cada um dos 25 centros médicos participantes do projeto
multicêntrico de vigilância de resistência bacteriana a antimicrobiano intitulado:
"Caracterização molecular de bactérias multirresistentes e avaliação do modo de
disseminação da resistência bacteriana a antimicrobianos", número: 2001/033497
financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP, que
encaminhassem todas as amostras de P. aeruginosa resistentes a carbapenens isoladas
entre janeiro de 2001 a junho de 2003.
Os centros médicos participantes do estudo foram:
1. Santa Casa de Montes Claros, Montes Claros, MG;
2. Hospital do Servidor Público Estadual, São Paulo,SP;
3. Hospital Aliança, Salvador, BA;
4. Hospital Geral de Carapicuíba Sanatorinhos, Carapicuíba, SP;
5. Universidade Estadual de Londrina, Londrina, PR;
6. Hospital de Base de Brasília, Brasília, DF;
8. Hospital e Maternidade Brasil, Santo André, SP;
9. Laboratório Louis Pasteur, Fortaleza, CE;
10. Hospital Messejana, Fortaleza, CE;
11. Hospital Felício Rocho, Belo Horizonte, MG;
13. Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS;
14. Fundação Municipal de Ensino Superior de Marília, Marília, SP;
15. Universidade Estadual de Maringá, Maringá, PR;
18. Laboratório Cedro, São Luis, MA;
19. Laboratório Santa Luzia, Florianópolis, SC;
27
27
20. Universidade Federal do Paraná, Curitiba, PR;
21. Hospital das Clinicas , Goiânia, GO;
22. Hospital Sírio Libanês, São Paulo, SP;
23. Hospital Dante Pazzanese, São Paulo, SP;
24. Hospital Estadual de Diadema, Diadema, SP
25. Laboratório Protocor, Rio de Janeiro, RJ;
26. Centro Administrativo São Sebastião (CASS), Rio de Janeiro, RJ;
27. Hospital São Paulo, UNIFESP, São Paulo, SP;
77. Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG;
88. Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, PB;
Durante este período, foram encaminhadas ao Laboratório Especial de
Microbiologia Clínica (LEMC) 206 amostras clínicas de P. aeruginosa resistentes á
carbapenens. No LEMC, as amostras foram armazenadas em caldo TSB – “Tryptone Soya
Broth” (Oxoid
®
, Basingstoke, Inglaterra) com 15% de glicerol e estocadas em freezer a -
20ºC até a realização dos testes laboratoriais.
As amostras foram devidamente identificadas por cada centro médico participante
do estudo empregando-se métodos utilizados rotineiramente por cada instituição. A
confirmação da identificação bacteriana foi realizada no LEMC utilizando-se testes
bioquímicos convencionais e o sistema para identificação de bacilos Gram-negativos BBL
“Crystal Identification Systems Enteric/Nonfermenter ID” (Becton, Dickinson and Company,
Sparks, MD, USA).
3.2 - Avaliação da Sensibilidade In Vitro aos Antimicrobianos
Os testes de sensibilidade aos antimicrobianos foram realizados pelas técnicas de
disco difusão e microdiluição em caldo de acordo com a padronização do “National
Committee for Clinical Laboratory Standards” (NCCLS 2003a,b) e as interpretações
realizadas nas publicações do NCCLS (2004). Para o controle de qualidade dos testes de
sensibilidade foram utilizadas as amostras da “American Type Culture Collection” (ATCC),
Escherichia coli ATCC 25922 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
28
28
3.2.1 - Teste de disco-difusão
Esta técnica foi realizada com o objetivo de avaliar o perfil de sensibilidade a
antimicrobianos e confirmar o fenótipo de resistência, ou seja, a resistência a imipenem
e/ou meropenem. Com auxílio de uma alça bacteriológica, cinco colônias bacterianas
foram suspensas em 5 ml de caldo Müeller-Hinton (Oxoid
®
, Basingstoke, Inglaterra), para
obter uma turvação correspondente a 0,5 da escala de McFarland. Após a
homogeneização da amostra, foi introduzido um swab estéril dentro do tubo, e, em
seguida, este foi comprimido contra a parede do tubo para a remoção do excesso de
líquido. Com auxílio do swab, a inoculação da amostra foi realizada em forma de estrias
na superfície da placa de Müeller-Hinton ágar (Oxoid
®
, Basingstoke, Inglaterra) em três
direções, girando a placa em ângulo de 60° antes da mudança de sentido na inoculação.
Antes da aplicação dos discos, as placas semeadas foram deixadas em temperatura
ambiente por aproximadamente 5 minutos para absorver o excesso de umidade na
superfície do ágar.
Os discos foram retirados do freezer uma hora antes de sua aplicação e deixados
à temperatura ambiente. A aplicação foi realizada com auxílio de uma pinça estéril,
pressionando-se os discos suavemente contra a superfície do ágar. As distâncias de 30
mm (centro a centro) entre os discos e de 15 mm da margem da placa foram mantidas, a
fim de impedir a superposição dos halos de inibição. Os discos de antimicrobianos
(Oxoid
®
, Basingstoke, Inglaterra) utilizados foram: aztreonam (30µg), ceftazidima (30µg),
cefepima (30µg), imipenem (10µg), meropenem (10µg), piperacilina (30µg),
piperacilina/tazobactam (30µg/10µg), amicacina (5µg), gentamicina (10µg), ciprofloxacina
(5µg) e polimixina B (300U).
As placas foram incubadas a 35°C por 18 a 24 horas em ar ambiente. Após este
período, foi realizada a leitura dos halos de inibição com auxílio do paquímetro, os quais
foram interpretados de acordo com os critérios de sensibilidade estabelecidos pelo NCCLS
para bacilos Gram-negativos não-fermentadores de glicose (NCCLS, 2004). A
interpretação do halo da polimixina B foi baseado no trabalho publicado por Gales e
colaboradores (2001).
29
29
3.2.2 - Microdiluição em caldo
As amostras confirmadas como produtoras do gene bla
SPM-1
e bla
IMP-1
pela técnica
de reação da polimerase em cadeia (PCR) foram também avaliadas pela metodologia de
microdiluição em caldo de acordo com as recomendações do NCCLS (2003b), utilizando-
se placas de microdiluição liofilizadas (“Trek Diagnostic Systems”, West Sussex,
Inglaterra). As placas foram mantidas em ar ambiente até sua utilização. Definiu-se como
concentração inibitória mínima (MIC) a menor concentração de antimicrobiano capaz de
inibir o crescimento bacteriano. As MIC
50
e MIC
90
foram definidas como as menores
concentrações de antimicrobianos capazes de inibir o crescimento de 50% e 90% das
amostras, respectivamente. As amostras foram classificadas em sensíveis, intermediárias
ou resistentes, empregando-se os limites de sensibilidade preconizados pelo NCCLS
(2004), para avaliação da sensibilidade à colistina, foram utilizados os limites
estabelecidos por Gales e colaboradores (2001).
Os agentes antimicrobianos testados e as respectivas diluições (µg/ml) foram:
amicacina (8-64), ampicilina/sulbactam (4/2-64/32), aztreonam (1-32), ceftazidima (1-32),
cefepima (1-32), ciprofloxacina (0.06-4), gatifloxacina (0.06-8), gentamicina (2-16),
imipenem (0.25-32), meropenem (0.25-32), piperacilina/tazobactam (8/4-256/4) e colistina
(0,5-8). Para cada amostra de P. aeruginosa uma suspensão bacteriana foi preparada em
5 ml de caldo de Müeller-Hinton (Oxoid®, Basingstoke, Inglaterra) e a turbidez ajustada a
0,5 da escala de McFarland utilizando o turbidímetro digital (Baxter
®
, Sacramento, EUA).
Cinqüenta microlitros desta suspensão foi transferido para um tubo contendo 10 ml de
caldo de Müeller-Hinton (“Trek Diagnostic Systems”, West Sussex, Inglaterra), no qual
foram ajustadas a concentrações de cálcio e magnésio, utilizando-se uma solução estoque
de CaCl
2
e MgCl
2
. Após a homogeneização, 100 µl desta suspensão bacteriana foi
inoculado nas placas de microdiluição utilizando-se a pipeta multicanal, a fim de se obter
um inóculo final de 5 x 10
4
unidades formadoras de colônias (UFC) UFC/ml. A seguir, as
placas foram incubadas a 35°C, por 18 a 24 horas em ar ambiente. Após esse período,
determinou-se, através da inspeção visual das placas a MIC para cada um dos
antimicrobianos testados.
30
30
3.3 Detecção das amostras de Pseudomonas aeruginosa produtoras de metalo-β-
bactamase
3.3.1.1. Testes fenotípicos
3.3.1.1.1. Disco-aproximação
As amostras de P. aeruginosa confirmadas como resistentes aos carbapenens
foram submetidas ao teste de triagem para avaliação fenotípica da produção de MβL de
acordo com o teste de Arakawa modificado (2000). Foram testadas diferentes distâncias
(1 - 3 cm) entre os discos comerciais contendo antimicrobianos, ceftazidima (30µg) e
imipenem (30µg) (Oxoid
®
, Basingstoke, Inglaterra), e os discos estéreis de papel de
contendo inibidores de MβL, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e o ácido 2-
mercaptopropiônico (2-MPA). Foi adicionado sobre cada disco estéril, 5 µl de uma solução
de EDTA a 100mM ou 3 µl do produto puro de 2-MPA, com densidade de 1,2 g/ml. Foi,
então, determinada a melhor distância para detecção das amostras positivas utilizando-se
amostras controles produtoras de diferentes de MβL: Acinetobacter baumannii 17-4 e P.
aeruginosa 319 produtoras da MβL IMP-1 (gentilmente cedidas pelo Dr. Arakawa) e a P.
aeruginosa nº 1088, produtora de SPM-1. Como controle negativo, foi utilizada a cepa de
P. aeruginosa ATCC 27853.
A melhor distância padronizada para detecção da produção de MβL, entre os
discos comerciais de ceftazidima e imipenem e o disco adicionado de EDTA foi de 1 cm,
enquanto 2,5 cm foi a melhor distância para o disco contendo 2-MPA.
3.3.1.1.2. Etest
®
A confirmação fenotípica da produção de MβL pela amostra bacteriana foi
realizada utilizando-se a fita de Etest
®
MβL. Estas fitas, de um lado são impregnadas com
31
31
imipenem (4-256 µg/ml) e, do lado oposto, com imipenem (1-64 µg/ml) associado a EDTA
(320 µg/ml).
Uma suspensão bacteriana ajustada a 0,5 da escala de McFarland foi
uniformemente semeada na placa de ágar Müeller-Hinton (Oxoid
®
, Basingstoke,
Inglaterra) e após 15 minutos, as fitas de Etest
®
MβL foram dispensadas sobre a placa. As
placas foram incubadas a 35°C, em aerobiose, por um período de 18 a 24 horas.
Amostras cujas MICs da associação imipenem/EDTA foram pelo menos 3 diluições
logarítmicas inferiores às MICs de imipenem foram confirmadas fenotipicamente como
produtoras de MβL (Walsh et al., 2002). Como controles positivos foram utilizadas as
cepas, de A. baumannii 17-4 e P. aeruginosa 319 produtoras da MβL IMP-1. Como
controle negativo, foi utilizada a cepa de P. aeruginosa ATCC 27853.
3.3.1.1.3 Avaliação da Hidrólise de Carbapenens
As amostras de P. aeruginosa identificadas fenotipicamente como produtoras de
MβL pelo método de disco-aproximação e Etest, e cuja pesquisa para os genes que
codificam MβL, bla
IMP-1,
bla
VIM-1
, bla
VIM-2
e bla
SPM-1
pela técnica de reação da polimerase
em cadeia (PCR), foram negativas, foram, então, encaminhadas para a avaliação da taxa
de hidrólise ao meropenem pelo extrato bruto de β-lactamases de acordo com a
metodologia descrita por Da Silva et al.(1999).
Para extração do extrato bruto de β-lactamase, dez colônias bacterianas foram
inoculadas em 10 ml de caldo TSB – “Tryptone Soya Broth” (Oxoid
®
, Basingstoke,
Inglaterra) e incubadas a 37°C por 18 a 24 horas. A pós este período, as culturas
bacterianas foram centrifugadas a 5000g por 15 minutos à temperatura ambiente e o
sobrenadante desprezado.
Em seguida, o precipitado foi ressuspensso em 1ml da solução tampão (Tris-HCl
a 1mM e ZnSO
4
1 mM). Após esta etapa, as amostras foram lisadas por sonicação (4
pulsos de 30 segundos cada) em sonicador (XL2000 “Ultrasonic Cell Disruptor-Fisher
Scientific International” Inc. EUA). Durante o processo de sonicação as amostras foram
mantidas em gelo. Em seguida, as células lisadas foram transferidas para tubos tipo
32
32
eppendorf e centrifugadas a 5000g por 3 minutos a 4°C para a remoção dos debris
celulares. O sobrenadante foi descartado e o precipitado transferido para um novo tubo
eppendorf, e mantido a 4°C até o momento do teste.
Para avaliar a taxa de hidrólise foi utilizado um ensaio enzimático, o qual avalia a
absorbância da amostra versus o tempo, no espectrofotômetro “Termo Spectronic” (Fisher
Scientific Company, EUA). Além do extrato bruto, foi também utilizado uma solução de
meropemen 1 mM, cuja absorbância variava entre 1300 a 1400 dA/min. A absorbância das
amostras foi medida no comprimento de onda 299 nm por 2 minutos.
Uma cubeta de quartzo contendo 1000 µl da solução de antibiótico foi utilizada
para calibrar o aparelho. A seguir, foi adicionado em outra cubeta, a solução de antibiótico,
50 a 100 µl do extrato cru de β-lactamase e a leitura foi iniciada. A presença da atividade
enzimática foi observada medindo-se a absorbância inicial e final (RATE) a 299 nm.
3.3.1.2. Testes genotípicos
3.3.1.2.1. Pesquisa de genes relacionados à produção de MβL pela técnica da
reação de polimerase em cadeia
As amostras de P. aeruginosa detectadas fenotipicamente como produtoras de
MβL foram investigadas quanto à presença dos genes bla
IMP-1,
bla
VIM-1
, bla
VIM-2
e bla
SPM-1
que codificam as MβL utilizando-se a técnica de reação da polimerase em cadeia (PCR).
Para extração do DNA bacteriano as amostras foram subcultivadas em ágar
MacConkey e três a cinco colônias de cada amostra foram transferidas para um tubo
cônico de microcentrífuga contendo 200 µl de água destilada estéril. Em seguida, os tubos
foram incubados à temperatura de 100°C por 15 minut os. Após este tempo, os debris
celulares foram precipitados por centrifugação a 12.000 g por 10 minutos à temperatura
ambiente. Dez microlitros do sobrenadante foi utilizado para a reação de PCR.
33
33
Em fluxo laminar, foi preparada uma solução mãe (“master mix”) contendo: água
milliQ; MgCl
2
(concentração final na reação = 1,5mM); tampão 10X PCR (contendo tris-HCl
20mM e e KCl 500 mM) à concentração final de 1x; deoxinucleotídeos (dATP, dTTP,
dGTP e dCTP) cuja concentração final por reação foi de 200 µM cada um deles; enzima
Taq DNA polimerase (5 U/µl) que foi diluída para uma concentração final de 2,5 U e
34
34
bla
VIM-1
originaria um produto com aproximadamente 920 pares de base. Como controles
positivos e negativos foram utilizadas as cepas de P. aeruginosa, 75-3666 produtora de
MβL VIM-1, gentilmente cedida pela Dra. Lalitagauri Deshpande, e a P. aeruginosa ATCC
27853, respectivamente.
A seqüência dos nucleotídeos dos primers utilizados na amplificação do gene
bla
VIM-2
foi: 5' ATGTTCAAACTTTTGAGTAGTAAG 3' (“sense”) e 5'
CTACTCAACGACTGAGCG 3' (“anti-sense”) (Poirel et al.,2000; Poirel et al.,2001). As
condições de ciclagem foram as mesmas utilizadas para a amplificação do gene bla
VIM-1
. A
reação de amplificação do gene bla
VIM-2
originaria um produto com aproximadamente 865
pares de base. Como controles positivos e negativos foram utilizadas as cepas de P.
aeruginosa, 81-11963 produtora de MβL VIM-2, gentilmente cedida pela Dra. Lalitagauri
Deshpande e a amostra de P. aeruginosa ATCC 27853, respectivamente.
Na amplificação do gene bla
SPM-1
a seqüência de nucleotídeos do primer “sense”
foi 5' CCTACAATCTAACGGCGACC 3' e “anti-sense” 5' TCGCCGTGTCCAGGTATAAC 3'
(Toleman et al.,2002). As condições de termociclagem foram as seguintes: cinco minutos
a 95°C para o primeiro ciclo (fase inicial de desna turação do DNA), seguidos por 30 ciclos
de um minuto a 94°C (desnaturação), um minuto a 40° C (anelamento), um minuto a 68°C
(extensão) e cinco minutos de incubação final a 68°C. A reação de amplificação do gene
bla
SPM-1
originou um produto com aproximadamente 650 pares de base. Como controle
positivo foi utilizada a cepa de P. aeruginosa 1088 produtora de SPM-1, e, como controle
negativo, a amostra de P. aeruginosa ATCC 27853.
Dez microlitros dos produtos de cada reação de PCR foi submetido à eletroforese
em gel de agarose a 0,8% (Gibco BRL Life Technologies, Rockville, MD, EUA) a 100 V por
40 minutos em tampão TBE 0,5X (89 nM Tris-Borato e 2mM EDTA pH 8,0). Foi utilizado
como marcador do peso molecular 100 pb DNA "ladder" 1µg/µl (“Invitrogen Life
Technologies”, Rockville, EUA). O DNA amplificado foi revelado com acréscimo de
brometo de etídio (0,5 µg/ml) no gel. Foi assim, visualizado e fotografado contra luz
35
35
3.3.1.2.2. Clivagem dos produtos de PCR
Após a realização das reações de PCR, os amplicons da PCR para o gene bla
SPM-
1
foram submetidos à clivagem com as seguintes enzimas de restrição: TaqαI e Sau3AI.
Em tubo de microcentrífuga, foi adicionado 5 µl de DNA, 1 µl de cada enzima de restrição,
2 µl do tampão 10X concentrado e adequado para as enzimas utilizadas, e água
deionizada q.s.p. para um volume final de 20 µl. A mistura foi deixada a 37°C por pelo
menos 4 horas. O bloqueio da reação foi feito a 65°C. Os produtos clivados foram
visualizados após eletroforese em gel de agarose a 1% a 100V por 40 minutos. Só foram
submetidas à reação de seqüenciamento, para identificação do gene produtor de MβL, as
amostras que apresentaram diferentes padrões de clivagem.
3.3.1.2.3. Reação de seqüenciamento
Devido ao alto custo da reação de seqüenciamento foram seqüenciados apenas
dois dos amplicons de aproximadamente 650 pb de 2 amostras de P.aeruginosa
utilizando-se iniciadores bla
SPM-1
. Os amplicons de PCR foram purificados utilizando-se o
kit “Concert Rapid PCR Purification System” (LifeTechnologies, Valencia, USA), antes de
serem submetido às reações de seqüenciamento conforme as instruções do fabricante.
A reação de seqüenciamento foi preparada em dois tubos de microcentrífuga,
utilizando-se de 2 a 10 µl de DNA. Em cada tubo contendo a quantidade de DNA
adequada para a reação de seqüenciamento, foi adicionado 2 µl dos iniciadores (“sense”
em um tubo e “anti-sense” em outro), 2 µl do tampão de seqüenciamento e 8 µl do kit de
seqüenciamento “Big Dye terminator” versão II que contém os di-deoxinucleotídeos (d-
36
36
ciclos de 96° por 10 segundos, 50° por 30 segundos e 60° por 4 minutos. Após o término
da reação, o produto foi precipitado para eliminação dos d-dNTPs marcados não
incorporados à reação. Após a precipitação e lavagem com etanol, o produto foi
ressuspenso em polímero TSR e colocado no aparelho ABI PRISM 310 - Genetic Analyzer
(Perkin Elmer, Califórnia, EUA) para leitura. Após a leitura o resultado foi analisado,
editado e submetido ao programa Lasergene (DNASTAR, Madison, Wisconsin) para
comparação com os genes similares já descritos na literatura.
3.4 - Avaliação da similaridade genética das amostras de Pseudomonas
aeruginosa resistentes a carbapenens
Foram selecionadas para avaliação da similaridade genética através das técnicas
de ribotipagem automatizada as amostras de P. aeruginosa resistentes a carbapenens
confirmadas pela técnica de PCR como produtoras do gene bla
SPM-1
e bla
IMP-1.
Foram
incluídas no máximo 15 amostras por centro médico. Para comparação, uma amostra de
P. aeruginosa resistente a carbapenem, mas não produtora de MβL, isolada de cada um
dos centros médicos, que apresentaram amostras produtoras de SPM-1, foi submetida
aos testes de tipagem molecular. Foram encaminhadas para a técnica de “Pulsed-Field
Gel Eletroforesis” (PFGE) as amostras de P. aeruginosa que foram classificadas sob o
mesmo ribogrupo pela técnica de ribotipagem automatizada.
3.4.1. Ribotipagem automatizada
As amostras de P. aeruginosa foram semeadas em ágar sangue e incubadas a
37°C por 24 horas. Com o auxílio de um bastão plást ico fornecido pelo fabricante o
crescimento bacteriano foi transferido para um tubo contendo 200 µl de solução tampão
("Sample Buffer" - Qualicon, Wilmington, DE, USA). A suspensão composta pelas células
bacterianas e 200 µl de solução tampão foi homogeneizada com auxílio de um agitador e
30 µl desta suspensão foi transferida para um tubo cônico apropriado para introdução das
amostras no aparelho.
3
7
37
Na etapa seguinte, o tratamento térmico das amostras foi realizado, inativando as
nucleases presentes e preparando as células para a lise. Para a realização deste
tratamento, ciclos de aquecimento e resfriamento foram realizados segundo o programa
da unidade de tratamento térmico ("Heat Treatment Station"). Após o tratamento térmico, 5
µl dos reagentes de lise A e B (Qualicon, Wilmington, DE, USA) foram adicionados à cada
amostra para iniciar a ruptura da membrana das células bacterianas. Em seguida, as
amostras foram inseridas no aparelho RiboPrinter
®
(Qualicon, Wilmington, DE, USA) e
processadas.
No aparelho, as seguintes etapas foram realizadas: (1) preparo do DNA, onde foi
realizada a extração do DNA com sua posterior fragmentação com a enzima de restrição
PvuII (2) separação e transferência dos fragmentos de DNA, caracterizada por uma
corrida em gel de eletroforese, onde houve a separação dos fragmentos por gradiente de
peso molecular, e transferência destes fragmentos para uma membrana de nitrocelulose,
utilizando a técnica de "Southern blotting" modificado; (3) processamento da membrana,
onde os fragmentos do DNA foram expostos a um tratamento químico-enzimático com
uma sonda de DNA, derivada do RNA ribossomal de uma E. coli e um marcador
quimioluminescente, revelando assim, os fragmentos hibridizados; (4) detecção, as
imagens das membranas foram capturadas por uma máquina fotográfica, inseridas no
sistema e transferidas eletronicamente para o computador acoplado ao aparelho. No
computador, a imagem de cada gel foi tratada e comparada com o banco de dados para a
caracterização das cepas. Cinco marcadores de peso molecular foram distribuídos no gel,
permitindo que cada coluna, representando os dados da amostra, fosse padronizada de
acordo com um marcador padrão, baseado na posição e intensidade das bandas (Hollis et
al., 1999).
Coeficientes de similaridade foram calculados pelo programa de computação
acoplado ao aparelho, baseando-se na posição e no peso relativo das bandas. Todos os
isolados que apresentaram coeficientes de similaridade iguais ou maiores que 0,93 (93%)
foram classificados como pertencentes ao mesmo ribogrupo. Aqueles que apresentaram
coeficientes de similaridade menor que 0,92 foram considerados distintos (Bruce et al.,
1996).
38
38
3.4.2. Eletroforese em campo elétrico pulsado (PFGE)
As amostras de P. aeruginosa agrupadas em um mesmo ribogrupo pela técnica
de ribotipagem automatizada foram tipados também pela técnica da eletroforese pulsada
("Pulsed-Field Gel Electrophoresis" - PFGE) (Pfaller et al., 1992).,
Aproximadamente 10 côlonias de cada amostra bacteriana foram inoculadas em
10 ml de TSB (Oxoid
®
, Basingstoke, Inglaterra) e incubadas a 37ºC por 18 a 24 horas.
Após incubação, os tubos foram centrifugados a 12.000 g por 15 minutos. Em seguida, o
centrifugado (células) foi diluído em 1 ml de solução salina e transferido para um tubo de
microcentrifuga de peso conhecido. Os tubos foram centrifugados a 12.000 g por
aproximadamente 30 segundos e o sobrenadante foi cuidadosamente aspirado e
desprezado. Com a finalidade de se determinar o peso do centrifugado (células), os tubos
foram novamente pesados. O centrifugado foi diluído em salina na proporção de 1:1, isto
é, o volume da solução salina em µl foi equivalente ao peso do centrifugado em µg. Um
volume de 5 µl desta solução foi transferido para outro tubo, onde foi adicionadoi 300 µl da
solução tampão TEN (Tris 100 mM; pH 7,5; EDTA 100 mM; NaCl 150 mM; água
destilada). Essa nova solução foi homogeneizada e misturada a 340 µl de agarose ("low
melt" - FMC, Rockland, EUA) para a formação de pequenos blocos de géis contendo o
DNA cromossômico ("plugs"). Os blocos foram incubados por um período mínimo de cinco
horas em solução EC (Tris 6mM, pH 7,5; NaCl 1M; EDTA 0,01 M ; Brij 58 0,5%; Sarcosil
0,5%; Deoxicolato 0,2% e água destilada) a 37°C e a seguir incubados a 50°C, em 2ml de
solução ES (EDTA 0,4M, pH 9,3; Sarcosil 1,0%) contendo proteinase K (20mg/ml, Sigma -
P4914) numa proporção de 1:1 (2 mg de proteinase K para 2 ml de ES), por um período
de 12 horas. Após este período de incubação os blocos foram lavados quatro vezes com
solução CHEF-TE (Tris 0,1M, pH 7,5; EDTA 0,1M) e armazenados nessa solução até
serem submetidos à digestão enzimática e posterior eletroforese.
O DNA bacteriano das amostras de P. aeruginosa estudadas foram digeridos com
a enzima de restrição SpeI (New England Biolab, Inc., Beverly, Mass, USA - 10U por
amostra), por 12 a 18 horas à temperatura de 37°C. A eletroforese foi realizada em gel de
agarose a 1% no sistema CHEF-DR III (Bio-Rad, Richmond, CA, EUA) e o padrão de
variação da corrente elétrica ("switch time") foi de 5 a 90 segundos. A eletroforese foi
39
39
realizada por um período de 24 horas, em solução 0,5x TBE (Tris 0,089M; ácido bórico
0,089M; EDTA, 0,002M) à uma temperatura de 13°C e u tilizando uma corrente elétrica de
200 volts (6 V/cm). O gel foi revelado com brometo de etídio (0,08 µL/ml) por uma hora,
descorados em água destilada por mais uma hora e fotografados sob luz ultravioleta
(Quantity one 4.4.0, Bio-Rad - Califórnia, EUA).
Os perfis moleculares foram analisados visualmente, seguindo o critério de Pfaller
e colaboradores (1992). Foram consideradas idênticas, derivadas de uma mesma cepa ou
pertencentes a um mesmo clone, todas as amostras que apresentaram perfil migratório
das bandas idêntico. As amostras que apresentaram perfil migratório com diferença de até
três bandas foram consideradas semelhantes e subtipos pertencentes a um mesmo clone.
As amostras que apresentaram quatro ou mais bandas discordantes foram consideradas
distintas.
40
40
4 – RESULTADOS
4.1 – Amostras Bacterianas
Foram encaminhadas ao LEMC 206 amostras de Pseudomonas aeruginosa, entre
janeiro de 2001 a junho de 2003. Todas as amostras obedeceram ao critério de inclusão
de resistência aos carbapenens, ou seja, imipenem e/ou meropenem, ou a pelo menos a
um deles. A distribuição das 206 amostras clínicas de P. aeruginosa está apresenta na
Tabela 3 e pode ser simplificada da segunda forma: cateter venoso (15,55%), escarro
(3,00%), ferida cirúrgica (4,40%), hemocultura (10,
41
41
Tabela 3. Distribuição das 206 amostras de P. aeruginosa coletadas dos 25 centros
brasileiros entre janeiro de 2001 e junho de 2003 de acordo com o sítio corporal.
Centro
Cidade
Estado
Cateter venoso
Escarro
Ferida cirúrgica
Hemocultura
Líquidos
LCR
a
Pele
Sec
a
. traqueal
secreções
TGI
a
TRI
a
Urina
Não Especificado
Total por Centro
1
Montes Claros MG
1 1
2
São Paulo SP
2 4 1 1 1 1 10
3
Salvador BA
1 1 1 1 4
4
Carapicuíba SP
2 1 1 4
5
Londrina PR
3 3 3 1 5 15
6
Brasília DF
2 1 2 3 2 4 15
8
Santo André SP
1 2 8 4 15
9
Fortaleza CE
2 2 2 2 8
10
Fortaleza CE
1 1
11
Belo Horizonte MG
1 2 3 6
13
Porto Alegre RS
3 1 4 8
14
Marília SP
3 4 2 1 1 1 1 14
15
Maringá PR
1 1 1 3 6
18
São Luis MA
4 6 1 2 13
19
Florianópolis SC
3 1 1 1 3 9
20
Curitiba PR
1 2 3
21
Goiânia GO
1 1 1 3
22
São Paulo SP
4 1 1 2 1 1 2 1 13
23
São Paulo SP
4 2 1 7
24
Diadema SP
1 1 1 3
25
Rio de Janeiro RJ
1 2 1 4
26
Rio de Janeiro RJ
4 4
27
São Paulo SP
15 15
77
Belo Horizonte MG
5 1 1 1 2 3 1 1 15
88
João Pessoa PB
1 1 2 3 3 10
Total por Sítio Corporal 32 6 9 22 3 1 21 23 10 10 13 38 18 206
a. TGI, trato gastrointestinal; LCR, líquido cefalorraquidiano; Sec,
secreção; TRI, trato respiratório inferior.
42
42
4.2 – Avaliação da sensibilidade in vitro a antimicrobianos pelo método de
disco-difusão
A porcentagem de amostras de P. aeruginosa sensíveis, intermediárias e
resistentes aos diferentes antimicrobianos de acordo com a técnica de disco-difusão pode
ser observada na Tabela 4.
De maneira geral, altas taxas de resistência aos antimicrobianos foram
observadas, já que as amostras de P. aeruginosa enviadas pelos centros médicos ao
LEMC eram resistentes a ambos carbapenens, ou a pelo menos um deles. Das 206
amostras avaliadas pelo método de disco-difusão 95,8% e 81,4% foram resistentes a
imipenem e a meropenem, respectivamente. A polimixina B foi o único antimicrobiano
capaz de inibir o crescimento de todas as amostras estudadas apresentando uma taxa de
sensibilidade de 100%. O segundo antimicrobiano que apresentou a maior taxa de
sensibilidade foi o aztreonam (48,4%), seguido pelos antimicrobianos piperacilina e
piperacilina/tazobactam que apresentaram a mesma sensibilidade (38,5%). Entre as
cefalosporinas avaliadas, a cefepima apresentou maior porcentagem de sensibilidade que
a ceftazidima (26,2% versus 23,9%). As taxas de sensibilidade para os aminoglicosídeos
amicacina e gentamicina foram 18,7% e 11,3%, respectivamente. A ciprofloxacina
apresentou uma das menores taxas de sensibilidade (11,5%).
43
43
Tabela 4. Perfil de sensibilidade in vitro a antimicrobianos das 206 amostras de P.
aeruginosa pela técnica de disco-difusão.
Antimicrobianos % Sensibilidade
a
% Resistência
a
Aztreonam 48,4 24,7
Ceftazidima 23,9 66,0
Cefepima 26,2 61,9
Imipenem 2,9 95,8
Meropenem 9,8 81,4
Piperacilina 38,5 61,5
Piperacilina/Tazobactam
38,5 61,5
Amicacina 18,7 79,9
Gentamicina 11,3 85,8
Ciprofloxacina 11,5 87,4
Polimixina B
b
100,0 0,0
a. Porcentagens de sensibilidade e resistência calculadas de acordo com os limites
estabelecidos pelo NCCLS (2004) com exceção da polimixina B (Gales, Reis & Jones,
2001).
b. Os limites de resistência e sensibilidade utilizados para a polimixina B foram ≤10mm e
≥14mm, respectivamente (Gales, Reis & Jones, 2001).
4.3 – Avaliação das amostras de P. aeruginosa produtoras de MβL pela
metodologia da microdiluição em caldo
As amostras classificadas como resistentes a imipenem pelo teste de disco-
difusão e que apresentaram o produto de amplicação para os genes que codificam a
produção de metalo-β-lactamase (MβL) foram também avaliadas pela metodologia da
44
44
microdiluição em caldo, totalizando 85 amostras (41,3%) testadas pelas duas
metodologias. Ainda com relação ao imipenem, houve concordância de 100% entre a
técnica de disco-difusão e microdiluição em caldo na classificação das amostras quanto à
categoria de sensibilidade.
Na Tabela 5 estão apresentados os dados referentes à potência antimicrobiana e
porcentagem de sensibilidade dos agentes antimicrobianos testados contra as 85
amostras de P. aeruginosa. Entre os antimicrobianos avaliados pela técnica de
microdiluição em caldo, a polimixina E foi o antimicrobiano mais potente (MIC
50
, ≤ 0,5
µg/ml), capaz de inibir o crescimento de 100% das amostras de P. aeruginosa. O segundo
antimicrobiano mais potente foi o aztreonam (MIC
50
, 8 µg/ml) apresentando uma taxa de
sensibilidade de 57,8%. Apesar de apresentar fraca atividade o antimicrobiano
piperacilina/tazobactam (MIC
50
, 128 µg/ml) foi capaz de inibir 24,1% das amostras de P.
aeruginosa. Apesar da amicacina apresentar fraca atividade (MIC
50
, > 32 µg/ml), este
antimicrobiano apresentou a terceira maior taxa de sensibilidade, que mesmo assim
chegou somente a 7,2%. As cefalosporinas, ceftazidima e cefepima exibiram fraca
atividade (MIC
50
, > 32 µg/ml) e todas as amostras apresentaram 100% de resistência. As
quinolonas apresentaram fraca atividade (ciprofloxacina MIC
50
, > 4 µg/ml; gatifloxacina
MIC
50
, > 8 µg/ml), e ambas inibiram somente 1,2% das amostras de P. aeruginosa
produtoras de MβL. Todas as amostras exibiram 100% de resistência aos carbapenens,
imipenem e meropenem.
45
45
Tabela 5. Potência antimicrobiana e porcentagem de sensibilidade aos agentes
antimicrobianos testados contra as 85 amostras clínicas de P. aeruginosa produtoras de
MβL.
Antimicrobianos
MIC (µg/mL)
MIC
50
a
MIC
90
a
%Sensíbilidade
b
%Resistência
b
Piperacilina/tazobactam 128 >256 24,1 75,9
Ceftazidima >32 >32 0,0 100,0
Cefepima >32 >32 0,0 100,0
Aztreonam 8 32 57,8 42,2
Imipenem >32 >32 0,0 100,0
Meropenem >32 >32 0,0 100,0
Amicacina >64 >64 7,2 92,8
Gentamicina >16 >16 3,6 96,4
Ciprofloxacina >4 >4 1,2 98,8
Gatifloxacina >8 >8 1,2 98,8
Polimixina E
c
≤0,5
2 100,0 0,0
a. A MIC foi determinada pela técnica de microdiluição em caldo, a MIC
50
e MIC
90
foram
definidas como as menores concentrações de antimicrobianos capazes de inibir o
crescimento de 50% e 90% das amostras, respectivamente.
b. As porcentagens de sensibilidade e resistência foram calculadas de acordo com os
limites de sensibilidade estabelecidos pelo NCCLS, com exceção da polimixina E (NCCLS,
2004).
c. O limite de resistência utilizado para a polimixina E foi ≥ 4µg/ml (Gales, Reis & Jones,
2001).
46
46
47
47
Figura 1. Amostra de P. aeruginosa apresentando teste fenotípico positivo para a
produção de metalo-β-lactamase. A seta indica o disco de papel de filtro estéril contendo 3
µl de uma solução pura de ácido 2-mercaptopropiônico a 1,2 g/ml.
48
48
Figura 2. Amostra de P. aeruginosa apresentando teste fenotípico positivo para a
produção de metalo-β-lactamase. A seta indica o disco de papel de filtro estéril contendo 5
µl de uma solução de EDTA a 100mM.
Figura 3. Etest MβL positivo para amostra de P. aeruginosa produtora de metalo-β-
lactamase. Notar o decréscimo > 3 diluições na MIC do imipenem associado ao EDTA em
comparação a MIC de imipenem sozinho.
49
49
4.4.2 – Avaliação da Hidrólise de Carbapenens
As treze amostras fenotipicamente classificadas como produtoras de metalo-β-
lactamases somente pelo inibidor EDTA foram submetidas a confirmação da capacidade
de hidrolisar o meropenem, por ensaio espectrofotométrico, pois não houve a detecção
dos genes que codificam MβL pela técnica de PCR. As treze amostras não foram capazes
de hidrolisar o meropenem.
4.4.3 - Detecção dos genes que codificam as metalo-β
ββ
β-lactamases
Dentre as 98 (47,6%) amostras de P. aeruginosa inicialmente classificadas
fenotipicamente como produtoras de MβL, a presença do gene bla
SPM-1
foi confirmada em
82 (83,7%) isolados, na Figura 4 podemos observar o produto de amplificação de
aproximadamente 650 pb produzido por amostras de P. aeruginosa produtoras de bla
SPM-1
.
Três amostras (16,3%) apresentaram produto de amplificação de PCR para o gene
bla
IMP-1
. As treze amostras fenotipicamente classificadas como produtoras de MβL pelo
inibidor EDTA e com fenótipo negativo para o inibidor ácido 2- mercaptopropiônico não
apresentaram produto de amplificação de PCR para nenhum dos genes pesquisados.
As amostras de P. aeruginosa produtoras de MβL do tipo SPM-1 foram encontradas
em quinze centros médicos, localizados em noves estados brasileiros, estes estão
ilustrados na Figura 4 .
Os centros que apresentaram o isolamento das amostras de P. aeruginosa
produtoras de MβL do tipo SPM-1 foram os seguintes: centro 2 (Hospital do Servidor
Público Estadual – São Paulo, SP); centro 3 (Hospital Aliança – Salvador, BA), centro 5
(Universidade Estadual de Londrina – Londrina, PR); centro 6 (Hospital de Base de
Brasília – Brasília, DF); centro 8 (Hospital e Maternidade Brasil – Santo André, SP); centro
9 (Laboratório Louis Pauster – Fortaleza, CE); centro 11 (Hospital Felício Rocho, Belo
Horizonte, MG; centro18 (Laboratório Cedro – São Luis, MA); centro 20 (Universidade
50
50
Estadual do Paraná – Curitiba, PR); centro 22 (Hospital Sírio Libanês – São Paulo, SP);
centro 23 (Hospital Dante Pazzanese - São Paulo, SP); centro 26 (Centro Administrativo
São Sebastião, CASS, Rio de Janeiro, RJ); centro 27 (Hospital São Paulo – UNIFESP -
São Paulo, SP; centro 77 (Universidade Federal de Minas Gerais – Belo Horizonte, MG);
centro 88 (Universidade Federal da Paraíba – João Pessoa, PB). As três amostras com
produtos de amplificação de PCR para o gene bla
IMP-1
foram detectadas em dois centros,
uma amostra (P2814) estava presente no Centro 6 (Hospital de Base de Brasília, DF) e
duas amostras (P3486, P3489) foram encontradas no centro 88 (Universidade Federal da
Paraíba, PB).
Figura 4. Localização dos centros médicos que enviaram amostras de P. aeruginosa
produtoras de SPM-1.
51
51
λ
λ
λ
λ
600 pb
600 pb
λ
λ
λ
λ
600 pb
600 pb
Figura 5: DNA “λ ladder” clivado 100 pb; linha 1, amostra de Pseudomonas aeruginosa 1088
controle positivo bla
SPM-1;
linha 2, amostra de P. aeruginosa ATCC 27853 controle negativo; linha
3, amostra 2975; linha 4, amostra 2477; linha 5, amostra 2611; linha 6, amostra 2525; linha 7,
amostra 2807; linha 8, amostra 3095; linha 9, amostra 2431; linha 10, amostra 3102; linha 11,
amostra 2966; linha 12, amostra 2613; linha 13, amostra 3141; linha 14, amostra 2818; linha 15,
amostra 2951; linha 16, amostra 3747; linha 17, amostra 4618; linha 18, amostra 3298; linha 19,
amostra 3488; linha 20, amostra 926 e linha 21, amostra 1638. As amostras das linhas 5, 8, 10 e
11 foram fenotipicamente detectadas como produtoras de MβL, mas não foram confirmadas pela
taxa de hidrólise do meropenem.
4.5 - Clivagem e seqüenciamento dos amplicons obtidos com primers bla
SPM-1
52
52
Os amplicons, com aproximadamente 650 pb, obtidos pela reação de PCR com a
utilização do primer bla
SPM-1
foram clivados por duas enzima de restrição TaqαI e Sau3AI.
O amplicon do gene bla
SPM-1
foi clivado em dois fragmentos com aproximadamente 420 pb
e o outro com aproximadamente 230 pb. E todos os amplicons foram igualmente clivados.
A enzima Sau3AI clivou os produtos de amplificação em dois fragmentos, um de
aproximadamente 350 pb e outro de aproximadamente 300 pb, e também foram idênticos
em todos os amplicons clivados.
Após a clivagem com as enzimas de restrição foram selecionados dois dos
produtos amplificados pela reação de PCR com os primers bla
SPM-1,
das amostras
produtoras de MβL, 2431 e 2975. Estes dois produtos foram escolhidos aleatoriamente e
assim purificados para serem submetidos ao seqüenciamento. O produto seqüenciado foi
submetido ao progama BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) para determinação da
homologia entre o produto seqüenciado e outras seqüências de genes já descritas na
literatura. A similaridade genética foi de 100% com os genes produtores de MβL da família
SPM. Após uma análise de similaridade mais detalhada entre estes genes, utilizando-se o
programa MegAlingn do DNAStar - CLUSTAL V foi confirmado que a seqüência do gene
amplificado era 100% homóloga à sequência do gene que codifica a MβL SPM-1 - acesso
ao gene bank AJ492820.
4.6 - Tipagem Molecular
Os padrões de bandas gerados pela técnica de ribotipagem automatizada
(RiboPrinter Microbial Characterization System, Qualicon, Wilmington, EUA) possibilitou
a análise da similaridade genética entre as amostras de Pseudomonas aeruginosa. Os
diferentes perfis foram divididos em ribotipos ou ribogrupos designados pelo número da
corrida, seguido do número correspondente a linha em que a amostra foi identificada pela
primeira vez.
Foram ribotipadas as 98 amostras de P. aeruginosa com sensibilidade reduzida aos
carbapenens, 82 amostras confirmadas como produtoras do gene bla
SPM-1,
3 amostras
53
53
como produtoras do gene bla
IMP-1
e 13 não produtoras de MβL isoladas de cada centro
médico, que apresentavam amostras de P. aeruginosa produtoras de MβL. Os centros
médicos 3, 20 e 77 apresentaram somente amostras de P. aeruginosa produtoras do gene
bla
SPM-1
e por isso não tiveram amostras não produtoras de MβL
tipadas. A análise dos
padrões gerados pela ribotipagem das 98 amostras de P. aeruginosa tipadas permitiu a
identificação de 42 ribogrupos distintos.
Os dados do centro médico, cidade, estado, sítio corpóreo, teste fenotípico, presença
do gene bla
SPM-1,
ribogrupo e perfil de PFGE das amostras com sensibilidade reduzida ao
carbapenens avaliadas no estudo podem ser observados na Tabela 6.
Quatro ribogrupos, 69-5, 72-1, 72-3, 88-2 foram encontrados em mais de uma
amostra.
O ribogrupo 69-5 foi identificado em duas amostras de P. aeruginosa provenientes
dos centros médicos localizados em Belo Horizonte e São Luiz. Porém, após a tipagem
molecular destas amostras pela técnica de PFGE, foi observado que elas pertenciam a
genótipos distintos.
Já o ribogrupo 72-1 foi encontrado em duas amostras produtoras de MβL isoladas em
João Pessoa e um amostra não produtora de MβL isolada em Fortaleza. De acordo com
os resultados de PFGE, estas amostras foram consideradas pertencentes ao mesmo
genótipo.
Amostras isoladas em São Paulo e Rio de Janeiro produtoras de SPM-1 foram
classificadas sob ribogrupo 88-2. Pela técnica de PFGE, estas amostras foram
classificadas como pertencentes ao mesmo genótipo.
Cinqüenta e três amostas de P. aeruginosa, 52 delas produtoras de SPM-1 e uma
não produtora de MβL, possuíam o ribogrupo 72-3. Estas amostras foram provenientes de
13 centros médicos, localizados em 11 cidades de 9 estados brasileiros. De acordo com a
técnica de PFGE, estas amostras pertencem a um único padrão de PFGE denominado
padrão C. Quatro subtipos do padrão C foram encontrados. O padrão C em 39 amostras,
C
1
em 13 amostras, C
2
, C
3
e C
4
em 1 amostra, respectivamente.
54
54
A análise do DNA cromossômico bacteriano gerado pela ribotipagem automatizada
demonstrou uma grande diversidade genômica entre as amostras de P. aeruginosa
resistentes a carbapenens produtoras de MβL. A produção de SPM-1 foi detectada em 30
ribotipos distintos entre as 82 amostras de P. aeruginosa. Enquanto, as três amostras de
IMP-1 pertencem a dois ribogrupos distintos 72-1 e 88-5.
55
55
Tabela 6. Variabilidade genética das 85 amostras de P. aeruginosa produtoras de MβL
isoladas correlacionados ao local e sítio corpóreo de isolamento.
Amostra Centro
Médico
Cidade Estado Sítio
Corpóreo
Teste
fenotípico
Gene
bla
SPM-1
Ribotipo
Padrão
PFGE
3298 77
Belo Horizonte
MG
Urina positivo positivo 103-8
3301 77
Belo Horizonte
MG
Pele positivo positivo 105-3
3302 77
Belo Horizonte
MG
C. venoso positivo positivo 105-4
3309 77
Belo Horizonte
MG
Sangue positivo positivo 105-5
3310 77
Belo Horizonte
MG
S. traqueal positivo positivo 105-6
3311 77
Belo Horizonte
MG
C. venoso positivo positivo 105-7
3305 77
Belo Horizonte
MG
Pele positivo positivo 106-2
3307 77
Belo Horizonte
MG
C. venoso positivo positivo 106-4
3496 88
João Pessoa PB
TRI
a
negativo negativo 122-5
3223 2
São Paulo SP
TGI
a
negativo negativo 127-8
3141 18
São Luis MA
C. venoso positivo positivo 129-4
3748 23
São Paulo SP
Secreção positivo positivo 129-8
3337 22 São Paulo SP Urina negativo negativo 133-1
4619 26 Rio de Janeiro RJ NE
a
negativo negativo 159-7
2669 11
Belo Horizonte
MG
Urina negativo negativo 69-5 A
3135 18
São Luis MA
C. Venoso negativo negativo 69-5
B
2842 23
São Paulo SP
Secreção negativo negativo 70-4
2800 6
Brasília DF
Pele negativo negativo 71-2
2478 3
Salvador BA
Pele positivo positivo 71-5
2607 9
Fortaleza CE
TRI
a
negativo negativo 72-1
3486 88
56
56
2608 9
Fortaleza CE
Urina positivo positivo 72-3 C
2756 9
Fortaleza CE
Urina positivo positivo 72-3 C
2807 6
Brasília DF
S. traqueal positivo positivo 72-3 C
2818 20
Curitiba PR
TRI
a
positivo positivo 72-3 C
1
2819 20
Curitiba PR
Urina positivo positivo 72-3 C
2820 20
Curitiba PR
Urina positivo positivo 72-3 C
1110 27
São Paulo SP
Sangue positivo positivo 72-3
C
1088 27
São Paulo SP
Sangue positivo positivo 72-3
C
1111 27
São Paulo SP
Sangue positivo positivo 72-3
C
1228 27
São Paulo SP
Sangue positivo positivo 72-3 C
1129 27
São Paulo SP
Sangue positivo positivo 72-3
C
1212 27
São Paulo SP
Sangue positivo positivo 72-3
C
2951 22
São Paulo SP
Pele positivo positivo 72-3
C
1
2671 5
Londrina PR
TGI
a
positivo positivo 72-3
C
2675 5
Londrina PR
C. venoso positivo positivo 72-3
C
2746 5
Londrina PR
C. venoso positivo positivo 72-3
C
2
2747 5
Londrina PR
Urina positivo positivo 72-3
C
3966 11
Belo Horizonte
MG
F. cirúrgica positivo positivo 72-3
C
1
3967 11
Belo Horizonte
MG
Urina positivo positivo 72-3
C
4618 26
Rio de Janeiro
RJ
NE
a
positivo positivo 72-3
C
3
3142 18
São Luis MA
Urina positivo positivo 72-3
C
4
3964 11
Belo Horizonte
MG
Urina positivo positivo 72-3
C
3965 11
Belo Horizonte
MG
F. cirúrgica positivo positivo 72-3
C
2975 2
São Paulo SP
Sangue positivo positivo 72-3
C
2673 5
Londrina PR
Secreção positivo positivo 72-3
C
2745 5
Londrina PR
Secreção positivo positivo 72-3
C
2529 5
Londrina PR
Secreção negativo negativo 72-3
C
2605 8
Santo André SP
Sangue positivo positivo 72-3
C
1
2672 8
Santo André SP
Secreção positivo positivo 72-3
C
1
3488 88
João Pessoa PB
F. cirúrgica positivo positivo 72-3
C
3490 88
João Pessoa PB
Pele positivo positivo 72-3
C
3491 88
João Pessoa PB
NE
a
positivo positivo 72-3
C
3493 88
João Pessoa PB
S. traqueal positivo positivo 72-3
C
3494 88
João Pessoa PB
NE
a
positivo positivo 72-3
C
3495 88
João Pessoa PB
TRI
a
positivo positivo 72-3
C
3335 22
São Paulo SP
TGI
a
positivo positivo 72-3
C
1
2525 5
Londrina PR
Secreção positivo positivo 77-1
2527 5
Londrina PR
Urina positivo positivo 77-2
2433 8
Santo André SP
TGI
a
negativo negativo 77-4
2533 8
Santo André SP
TGI
a
positivo positivo 77-5
2535 8
Santo André SP
TGI
a
positivo positivo 77-7
2536 8
Santo André SP
TGI
a
positivo positivo 77-8
2526 5
Londrina PR
C. venoso positivo positivo 78-4
2640 3
Salvador BA
C. venoso positivo positivo 79-8
2613 9
Fortaleza CE
C.venoso positivo positivo 82-2
2610 9
Fortaleza CE
C. venoso positivo positivo 82-5
1104 27
São Paulo SP
Sangue positivo positivo 87-1
57
57
1280 27
São Paulo SP
Sangue positivo positivo 87-4
2839 2
São Paulo SP
Sangue positivo positivo 88-1
4620 26
Rio de Janeiro
RJ
NE
a
positivo positivo 88-2
D
3747 23
São Paulo SP
Secreção positivo positivo 88-2
c
2814 6
Brasília DF
TRI
b
positivo negativo 88-5
1621 27
São Paulo SP
Sangue positivo positivo 89-5
1638 27
São Paulo SP
Sangue positivo positivo 89-6
1221 27
São Paulo SP
Sangue negativo negativo 90-7
929 27
São Paulo SP
Sangue positivo positivo 92-1
956 27
São Paulo SP
Sangue positivo positivo 92-4
971 27
São Paulo SP
Sangue positivo positivo 92-5
3304 77
Belo Horizonte
MG
S. traqueal positivo positivo 97-7
a. TGI, trato gastrointestinal; LCR, líquido cefaloraquidiano; LBA, lavado brônquico
alveolar; TRI, trato respiratório inferior; S., secreção; C.,cateter; F., ferida; NE, não
especificado.
b. amostra produtora de metalo-β-lactamase do tip IMP-1.
c. amostra não viável para realização de PFGE.
58
58
5 – DISCUSSÃO
As infecções causadas por microrganismos Gram-negativos multirresistentes,
particularmente aquelas causadas por Pseudomonas aeruginosa tem aumentado em todo
o mundo. Segundo os dados fornecidos pelo National Nosocomial Infections Surveillance
(NNIS) System, entre 1992 a 2002, P. aeruginosa atualmente é considerada um dos
principais responsáveis pelas infecções hospitalares devido à sua freqüência e à sua
elevada resistência antimicrobiana. Um estudo de vigilância conduzido entre 1997 a 2000
nos Estados Unidos mostrou que 16% dos isolados clínicos de P. aeruginosa eram
resistentes a pelo menos 3 drogas anti-Pseudomonas (amicacina, ceftazidima,
ciprofloxacina, gentamicina, imipenem e piperacilina) e, que 1% destas amostras eram
resistentes a todos estes antimicrobianos (Livermore et al., 2002).
Dados do Programa SENTRY, de Vigilância de Resistência Bacteriana, coletados
no período entre 1997 e 2001, na América Latina, mostraram que a resistência aos
carbapenens dobrou durante o período de estudo e que a maior redução na taxa de
sensibilidade foi observada para o meropenem (83% versus 64,4%) (Andrade et al.,
2003).
Altas taxas de resistência aos agentes antimicrobianos avaliados, no presente
estudo, foram detectadas entre as 206 amostras de P. aeruginosa previamente
categorizadas como resistentes aos carbapenens isoladas dos 26 centros médicos
participantes do projeto multicêntrico de vigilância de resistência a antimicrobianos.
Provavelmente, as altas taxas de resistência a antimicrobianos encontrada entre as
amostras avaliadas possa ser atribuída em parte ao critério de seleção das amostras,
resistência a imipenem e/ou meropenem.
No presente estudo, todas as 206 amostras de P. aeruginosa foram sensíveis a
polimixina B, pela técnica de disco-difusão e o mesmo resultado de percentual de
sensibilidade, 100%, foi obtido pelo antimicrobiano polimixina E, pela técnica de MIC, nas
98 amostras de P. aeruginosa com fenótipo positivo para MβL. Levin e colaboradores
59
59
(1999), reportam o uso intravenoso da polimixina E no tratamento de infecções causadas
por amostras multirressistentes de P. aeruginosa e Acinetobacter spp.. Segundo este
trabalho, 35 (58,0%) de 60 pacientes foram tratados com sucesso, no entanto a falência
terapêutica chegou a 75,0% quando a colisitina foi utilizada para o tratamento de
pneumonias (Levin et al., 1999). No entanto, são descritos o aparecimento de amostras
clínicas de P. aeruginosa com diminuição da sensibilidade à polimixina (Groisman, Kayser
& Soncini 1997). Li e colaboradores relatam a diminuição na atividade como também na
potência antimicrobiana da polimixina E em amostras de P. aeruginosa (Li et al., 2005).
Os antimicrobianos avaliados no presente estudo demonstraram baixa atividade
in vitro, contra as amostras de P. aeruginosa estudadas. O aztreonam apresentou um
percentual de sensibilidade de 48,4% nas 206 amostras de P. aeruginosa, já nas 85
amostras de P. aeruginosa com fenótipo positivo para MβL o percentual de sensibilidade
foi de 57,8%. Inúmeros estudos relatam que as amostras produtoras de MβL geralmente
apresentam baixas MICs para o antimicrobiano aztreonam (Lauretti et al., 1999; Osano et
al., 1994; Poirel et al., 2000; Riccio et al., 2000; Toleman et al., 2002). A resistência aos
antimicrobianos β-lactâmicos em P. aeruginosa pode ser devido à hiperprodução da β-
lactamase cromossômica do tipo AmpC. A hiperprodução desta enzima pode levar à
resistência às penicilinas e às cefalosporinas de amplo espectro e monobactâmicos, no
entanto, os carbapenens são estáveis frente à hidrólise por parte dessa β-lactamase (Vila
& Marco, 2002). A resistência aos carbapenens não é apenas pela produção de β-
lactamases capazes de hidrolisar carbapenens, mas também por outros mecanismos
como: diminuição da permeabilidade de membrana externa, modificações nas PBPs e
efluxo ativo (Livermore et al., 1996; 2001; 2002; Rasmussen & Bush, 1997; Bush et al.,
1998; Nordmann & Poirel, 2002). Portanto, mecanismos adicionais de resistência como
alteração das proteínas da membrana externa e efluxo devem estar presentes nas
amostras de P. aeruginosa resistentes aos carbapenens não produtoras de MβL.
Um estudo conduzido nos Estados Unidos avaliando mais de 2000 isolados de P.
aeruginosa mostrou que as taxas de sensibilidade encontradas para a ceftazidima e a
cefepima foram superiores às observadas neste estudo (Ramphal et al., 2000).
60
60
A introdução das fluoroquinolonas na prática clínica foi associada ao surgimento
de resistência entre certas bactérias, as quais eram inerentemente menos sensíveis a esta
classe como, por exemplo, a P. aeruginosa. Mesmo com o advento das novas
fluorquinolonas, nenhuma nova molécula apresenta melhor atividade contra amostras de
P. aeruginosa que a ciprofloxacina. No presente estudo, somente 11,5%, das 206
amostras de P. aeruginosa foram sensíveis a esta droga e apenas 1,2% das 85 amostras
de P. aeruginosa produtoras de MβL, foram sensíveis. Entre os mecanismos de
resistência as fluorquinolonas estão a extrusão por bombas de efluxo e mutações nas
topoisomerases II e IV (Hooper et al., 2000).
A correlação entre o uso de imipenem e o desenvolvimento de resistência durante
o tratamento de infecções causadas por P. aeruginosa tem sido reportada em vários
estudos (Quinn et al., 1986; Troillet et al., 1997; Carmelli et al., 1999). Além do
desenvolvimento de resistência ao imipenem, estes estudos mostram também a
associação entre o consumo de imipenem e o desenvolvimento de resistência à
ceftazidima, à ciprofloxacina e à piperacilina/tazobactam durante o tratamento (Carmelli et
al., 1999).
Atualmente, relatos cada vez mais freqüentes da presença de amostras
produtoras de MβL em diferentes regiões do mundo foram reportados, incluindo o Brasil
(Gales et al., 2003; Mendes et al., 2004; Sader et al., 2005). Com isso houve a
necessidade do desenvolvimento de um teste que fosse simples e de baixo custo para a
triagem de amostras produtoras de MβL (Arakawa et al., 2000; Lee et al., 2003).
Arakawa e colaboradores (2000) propuseram um simples teste de disco
aproximação utilizando como inibidores o EDTA e o 2-MPA e como substratos os discos
comerciais de imipenem e ceftazidima com excelentes resultados (Arakawa et al., 2000). A
maioria destes testes utiliza os inibidores de MβL derivados de ésteres de thiol como ácido
mercaptoacético, ácido mercaptocarboxílico, ácido 2-mercaptopropiônico e ácido
mercaptoetanol, p-clorometilbenzoato, metais pesados como Hg (II), Fe (II), Fe (III) Cu (II),
ácido etilenodiaminotretaacético e ácido succicínico (Arakawa et al., 2000; Goto et al.,
1997; Greenlee et al., 1999; Hammond et al., 1999; Marumo et al., 1995; Mollard et al.,
2001; Senda et al., 1996b). Deste modo, testes baseados na inibição da atividade das
61
61
MβL por compostos derivados do ácido tiolático, apesar de bastante tóxicos, são
adequados para a triagem dessas amostras (Arakawa et al., 2000).
Relatos cada vez mais freqüentes de amostras produtoras de metalo-β-
lactamases, fora do Japão, local onde a primeira MβL foi reportada em 1991, citam a
utilização de inibidores dessas enzimas em testes laboratoriais (Arakawa et al., 2000; Lee
et al., 2001; Lee et al., 2003).
No presente estudo foram selecionados dois inibidores de MβL, o ácido 2-
mercaptopropiônico e EDTA, para serem utilizados no teste de disco aproximação com os
antimicrobianos (substratos) ceftazidima e imipenem (Arakawa et al., 2000; Walsh et al.,
2002).
Semelhante aos resultados apresentados por Arakawa e colaboradores (2000),
no presente estudo, o inibidor de MβL ácido 2-mercaptopropiônico apresentou melhor
atividade que o EDTA na detecção das MβL. Este estudo mostrou que 98 amostras
(47,6%) das 206 estudadas produziram MβL. Das 98 amostras fenotipicamente produtoras
de MβL, 85 apresentaram amplificação para os genes que codificam a produção de
metalo-β-lactamases pesquisados (bla
IMP-1
, bla
VIM-1
, bla
VIM-2
e bla
SPM-1
). Dentre as amostras
produtoras de MβL detectadas pelo 2-MPA, 96,5% foram do tipo SPM, 3,5% do tipo IMP.
No entanto, treze amostras fenotipicamente classificadas como produtoras de MβL pelo
inibidor EDTA e com fenótipo negativo para o inibidor àcido2-mercaptopropiônico não
apresentaram amplificação para nenhum dos genes pesquisados Os experimentos de
PCR foram repetidos e os resultados dessas amostras foram reprodutíveis, dessa
maneira, não se pode descartar a possibilidade dessas amostras produzirem um novo tipo
de enzima. Estas treze amostras de P. aeruginosa foram submetidas a avaliação da taxa
de hidrolise ao meropenem por ensaio espectrofotométrico e não foram capazes de
hidrolisar este β-lactâmico após incubação dos seus extratos brutos de β-lactamase.
Todas as amostras fenotipicamente classificadas como produtoras de MβL pelo teste de
aproximação de discos utilizando os inibidores EDTA e 2-MPA foram também
classificadas como produtoras pelo Etest MβL (Walsh et al., 2000). Sabe-se que altas
62
62
provavelmente estas treze amostras tiveram o seu crescimento inibido pelo EDTA, o que
levou à falsa identificação de fenótipo de MβL. A concentração final do EDTA utilizada na
fita de Etest MβL é de 320 µg/ml enquanto que a concentração final no disco de papel de
filtro estéril utilizado no teste de disco aproximação foi de 186µg. Provavelmente a
concentração de 320 µg/ml utilizada na fita de Etest MβL seja uma concentração limite
entre uma maior sensibilidade na detecção de MβL versus a inibição do crescimento
bacteriano ocasionada pelo EDTA.
Segundo Arakawa e colaboradores (2000), o antimicrobiano ceftazidima mostrou
ser o substrato ideal para a detecção de amostras produtoras de MβL IMP-1, uma vez
que, geralmente amostras produtoras dessas enzimas demonstram alto nível de
resistência à ceftazidima (MIC, >64µg/mL). No entanto, este mesmo estudo mostrou que
qualquer disco de β-lactâmico de amplo espectro pode ser utilizado neste teste (Arakawa
et al., 2000).
Apesar da existência do teste fenotípico para a detecção de amostras produtoras
de MβL ainda não existe nenhuma padronização de um teste de “screening” para MβL
pelo NCCLS.
A utilização de primers para a amplificação dos genes bla
IMP
, bla
VIM
e bla
SPM,
pela
técnica da reação em cadeia da polimerase, é bastante útil para a detecção dos genes
responsáveis pela codificação das MβL conhecidas até o momento. Contudo, por ser uma
técnica laboriosa e de alto custo, o seu emprego na rotina de um laboratório de
microbiologia é mais difícil (Gibb et al., 2002). Além disso, alguns alelos dos genes que
codificam a produção dessas enzimas são suficientemente divergentes para serem
detectados com a utilização de primers convencionais implicando na necessidade de
repetição do teste com outros primers (Arakawa et al., 2000).
As 85 amostras de P. aeruginosa produtoras de MβL foram resistentes aos
carbapenens como era esperado já que os carbapenens são substratos para as MβL
(Arakawa et al., 2000).
Três amostras (3,1%) apresentaram produto de amplificação de PCR para o gene
bla
IMP-1
. As MβL do tipo IMP, foram primeiramente reportadas no Japão, em isolados de P.
63
63
aeruginosa e S. marcescens e recentemente têm sido reportadas em isolados europeus
(Cornaglia et al., 1999; Riccio et al., 2000; Senda et al., 1996a). Variantes da enzima IMP-
1 (IMP-2 a IMP-12) têm sido caracterizadas e apresentam entre si homologia de 85,0% a
99,0%. O número de substituições de aminoácidos das enzimas IMP-2, IMP-4, IMP-3 e
IMP-6 comparadas a enzima IMP-1 são respectivamente, 36, 10, 2 e 1 (Iyobe et al., 2002).
No Brasil, isolados clínicos de P. aeruginosa produtores de metalo-β-lactamases do tipo
IMP-16 foram, recentemente, reportados em Brasília (Mendes et al., 2004). A enzima tipo
IMP-1 foi reportada em amostras de P. fluorescens e Acinetobacter baumannii em São
Paulo (Sader et al., 2005; Gales et al., 2003). Microrganismos produtores de metalo-β-
lactamase IMP-1, podem apresentar vários níveis de resistência a imipenem (MICs entre 4
e >128µg/mL) incluindo baixos níveis de resistência in vitro a carbapenens (Arakawa et al.,
2000; Toleman et al., 2002; Yum et al., 2002). Uma única substituição de aminoácidos
pode resultar na alteração do perfil de substratos enzimáticos preferenciais. A substituição
da serina na posição 196 (metalo-β-lactamase IMP-1) pela glicina (metalo-β-lactamases
IMP-3 e IMP-6) resulta em um baixo nível de atividade por parte das penicilinas e uma
hidrólise mais eficaz do meropenem que do imipenem (Iyobe et al., 2002; Yano et al,
2001).
As MβL do tipo VIM (VIM-1 a VIM-4) foram descritas primeiramente na Europa
(Itália, França e Grécia), e mais recentemente na Coréia e Estados Unidos (Nordmann &
Poirel, 2002; Toleman et al., 2004). No presente estudo, nenhuma amostra apresentou
produto de amplificação de PCR para os genes bla
VIM-1
e bla
VIM-2.
As MβL do tipo VIM
hidrolisam cefalosporinas e o cassete do gene bla
VIM-2
pode fazer parte de um integron da
classe 1, o qual também carreia resistência aos aminoglicosídeos (Poirel et al., 2001).
Oitenta e duas amostras (96,5%) apresentaram produto de amplificação de PCR
para o gene bla
SMP-1.
Este gene foi descrito recentemente em uma amostra de P.
aeruginosa isolada no complexo do Hospital São Paulo (Murphy et al., 2003; Toleman et
al., 2002).
O Programa SENTRY tem detectado e caracterizado várias novas MβL em
bacilos Gram negativos não fermentadores multirresistentes. Sader avaliou a freqüência
da produção de MβL em 1186 amostras de P. aeruginosa e 5 amost6 moa
64
64
isoladas de centros médicos da América Latina. O centro que apresentou maior
porcentagem (70%) de amostras com fenótipo positivo para produção de MβL foi o centro
médico de São Paulo (Sader et al., 2005). A freqüência e diversidade de MβL detectadas
em P. aeruginosa isoladas na América Latina incluem a primeira enzima descrita pelo
programa SENTRY, SPM -1 (Toleman et al., 2002) isoladas em amostras de P.
aeruginosa coletadas de São Paulo e Brasília, e a enzima IMP-16 isolada em Brasília.
Outra MβL detectada na América Latina incluí a enzima VIM-2, isolada em amostras de P.
aeruginosa presentes em Caracas, Venezuela, e, em amostras de P. fluorescens em
Santiago, Chile (Sader et al., 2005). Além das enzimas VIM-8 e VIM-11 isolada em P.
aeruginosa isoladas na Colômbia e na Argentina, respectivamente (Crespo et al., 2004;
Pasteran et al., 2005).
Em concordância ao relatado por Sader, duas das quatro enzimas MβL
reportadas foram encontradas no presente estudo. A freqüência e diversidade de MβL
detectadas em P. aeruginosa isoladas dos 26 centros médicos participantes inclui a
primeira enzima SPM-1, codificada pelo gene bla
SPM-1
(Murphy et al., 2003; Toleman et al.,
2002). A enzima SPM-1 foi encontrada em 15 centros médicos participantes, estes
centros estão localizados em nove estados e em onze cidades brasileiras: São Paulo
(SP), Salvador (BA), Londrina (PR), Santo André (SP), Fortaleza (CE), Belo Horizonte
(MG), São Luis (MA), Curitiba (PR), Rio de Janeiro (RJ), João Pessoa (PB), Brazilia (DF).
Outra enzima encontrada, no presente estudo em amostras de P. aeruginosa foi a enzima
IMP-1, codificada pelo gene bla
IPM-1.
A enzima IMP-1 foi encontrada em três amostras de
P. aeruginosa isoladas de dois centros médicos, um localizado em Brasília (DF) e o outro
em João Pessoa (PB). Este é o primeiro estudo brasileiro que reporta a disseminação de
P. aeruginosa com a presença do gene bla
SPM-1
presente em instituições distintas
geograficamente e que estes isolados correspondem a uma grande proporção (39,8%) de
P. aeruginosa resistentes a carbapenens. Outros estudos reportam a presença de alelos
que codificam MβL, também disseminados por regiões geográficas distintas (Toleman et
al., 2005; Kimura et al., 2005; Jones et al., 2004).
Além disso, foram reportados a disseminação de genes que codificam a produção
de MβL para enterobactérias. O gene bla
VIM-2
foi reportado em uma amostra de Citrobacter
65
65
freundii e o gene bla
IMP-8
em uma amostra de Enterobacter cloacae, ambos isolados em
uma hospital universitário em Taiwan (Yan et al., 2002). O gene bla
VIM-2
também foi
reportado em uma amostra de Serratia marcescens isolada na Coréia (Yum et al., 2002).
O gene bla
VIM-5
foi detectado em uma amostra de Klebsiella pneumoniae isolada na
Turquia (Midilli et al., 2003). O gene bla
VIM-1
foi identificado em uma amostra de
Escherichia coli isolada na Grécia (Miriagou et al., 2003). No Brasil, foram identificadas
amostras de Klebsiella pneumoniae resistentes a carbapenens com a presença do gene
bla
IMP-1
isoladas do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo e do Hospital
Servidos Público Estadual (Lincopan et al., 2005). Para os bacilos Gram-negativos não-
fermentadores de glicose, como Acinetobacter sp. e P. aeruginosa, e os bacilos K.
pneumoniae e E. coli, que apresentam resistência aos carbapenens ainda tem como
opção terapêutica o antimicrobiano polimixina, já para os bacilos S. marcescens e C.
freundii resistentes aos carbapenens e que apresentam resistência intrínseca à polimixina
existe então, uma possível falta de opção terapêutica para o tratamento. A disseminação
de genes que codificam a produção de MβL tornou-se um problema grave, pois ainda não
existem medidas de controles efetivas para mecanismos de resistência mediados por
plasmídios e transposons.
A primeira suspeita da produção de MβL presentes em amostras brasileiras foi
publicado por Pellegrino e colaboradores (2002) em amostras de P. aeruginosa coletadas
no Rio de Janeiro. Entretanto, este relato foi confirmado alguns meses após com a
descoberta da primeira MβL isolada e caracterizada em uma amostra brasileira de P.
aeruginosa, a MβL SPM, isolada em São Paulo e, por isso, a denominação SPM (São
Paulo metalo-β-lactamase) (Toleman et al., 2002). A amostra de P. aeruginosa produtora
de SPM foi isolada em uma amostra de sangue (hemocultura) de uma criança
hospitalizada no Instituto de Oncologia Pediátrica.
A detecção de amostras produtoras de MβL no Brasil, disseminadas por regiões
geográficas distintas, alerta para o aparecimento e disseminação deste mecanismo de
resistência em nosso âmbito hospitalar (Gales et al., 2003). A emergência de clones
resistentes depende da quantidade e do tipo de antimicrobiano utilizado em uma área
geográfica específica, do tipo de paciente que é assistido pelo serviço, do contexto social
66
66
em que os pacientes vivem e também da qualidade da infraestrutura hospitalar
(Deshpande et al., 2004). Desta forma, medidas para prevenir a disseminação das MβL
nos hospitais incluem não somente medidas de isolamento e precauções universais, como
também uma efetiva política de uso racional de antimicrobianos. As medidas de controle
de infecção hospitalar podem ser implementadas efetivamente evitando assim a
disseminação das cepas produtoras de MβL entre pacientes. Entretanto, a aquisição
destes plasmídios por cepas de Gram-negativos colonizando o próprio paciente infectado
ou colonizado por P. aeruginosa produtora de MβL estabelece um grande desafio ao
médico assistente, como também a equipe do serviço de controle de infecção hospitalar,
pois não se conhecem medidas efetivas no controle de bactérias resistentes a
antimicrobianos que apresentam mecanismos de resistências, os quais são mediados por
plasmídios. Foi sugerido para os mecanismos de resistência mediados por transposons,
as medidas de precauções de contato devem ser empregadas com rigorosa adesão
também aos germes produtores de MβL.
A determinação precisa da prevalência e diversidade das enzimas MβL entre
amostras clínicas de microrganismos Gram-negativos clinicamente e os fatores de risco
para a aquisição destes patógenos são importantes para o controle da disseminação
deste mecanismo de resistência aos carbapenens. Outro importante aspecto a ser
avaliado é o papel dos antimicrobianos β-lactâmicos na seleção de bactérias produtoras
de MβL. Além disso, a origem dos genes que codificam a produção de enzimas capazes
de hidrolisar carbapenens ainda é deconhecida. É muito provável que as enterobactérias
não representem o reservatório natural dessas enzimas (Nordmann & Poirel, 2002). A
determinação dos prováveis reservatórios, os quais podem ter origem ambiental,
provavelmente contribuirá para a prevenção do aparecimento e da disseminação destes
genes e de novos genes que codificam essas enzimas. A luta pelo controle da resistência
é um problema mundial, e mais estudos que objetivem o conhecimento dos mecanismos
de resistência e o entendimento de como as amostras resistentes disseminam-se, são
necessários para que medidas efetivas de controle possam der empregadas.
A clivagem com as enzimas de restrição, TaqαI e Sau3AI, como não clivou na
região que emite o sinal para codificação do peptídeo e, por isso, pode não ter detectado
67
67
alelos variantes do gene bla
SPM-1,
já que somente duas amostras foram seqüenciadas,
devido ao alto custo a reação de sequênciamento.
A análise de similaridade genética pela ribotipagem demonstrou uma grande
variedade genômica entre as amostras de P. aeruginosa resistentes a carbapenens
produtoras do gene bla
SPM-1
, sendo observados 35 ribotipos entre as 82 amostras de P.
aeruginosa produtoras do gene bla
SPM-1.
Apesar da grande diversidade genômica entre as
amostras estudadas, há a predominância de clones tanto em amostras produtoras do
gene bla
SPM-1
(72-3, 87-2, 88-2, 103-1, 104-6 e 105-1) quanto em amostras não produtoras
do gene bla
SPM-1
(69-5). Porém a diversidade genética entre as amostras de P. aeruginosa
não produtoras de MβL foi maior em relação às amostras de P. aeruginosa produtoras do
gene bla
SPM-1.
Entre as amostras com o mesmo genótipo, o ribotipo 72-3 foi encontrado em um
número maior amostras e centros, foram 18 amostras isoladas de 7 centros diferentes.
Este ribogrupo está disseminado entre cidades e estados diferentes, sendo assim,
presente nos estados de São Paulo nas cidades de São Paulo e Santo André; no do
Paraná nas cidades de Curitiba, Londrina; no estado da Bahia, Salvador; no Distrito
Federal; e no estado do Ceará, Fortaleza.
O segundo ribotipo mais prevalente, 88-2, foi isolado em 17 amostras de P.
aeruginosa encontrados em oito centros médicos, presentes em cinco estados brasileiros,
como: São Paulo, Paraná, Minas Gerais, Rio de Janeiro e Paraíba. O terceiro ribogrupo,
87-2, foi encontrado em 11 amostras de P. aeruginosa que estão presentes em seis
centros médicos, localizados em cinco estados brasileiros, São Paulo, Rio de Janeiro,
Belo Horizonte, Paraná e Maranhão. Estes resultados sugerem a disseminação clonal de
P. aeruginosa que produzem MβL entre diferentes regiões geográficas, Kimura e
colaboradores também observaram a disseminação de clones de P. aeruginosa
produtoras de MβL, entre diferentes hospitais japoneses, localizados a uma distancia de
400 a 800 Km (Kimura et al., 2005). A disseminação de clones de P. aeruginosa
resistentes aos carbapenens também foi observada pelo programa MYSTIC (Gales et al.,
2001; Jones et al., 2004).
68
68
As amostras com os mesmos ribotipos apresentando ou não os genes que
codificam a produção de metalo-β-lactamases reforça a idéia dos genes pesquisados
estarem presentes no DNA extracromossômico bacteriano, em plasmídios, transposons e
integrons, e que estes sejam os responsáveis pela disseminação desse mecanismo de
resistência entre as diversas amostras bacterianas (Nordmann & Poirel, 2002).
Um estudo realizado por Hollis e colaboradores comparou a ribotipagem
automatizada com o PFGE, do total de 411 isolados clínicos, 12 isolados foram amostras
de P. aeruginosa. Observaram que o número de ribogrupos identificados pela técnica de
ribotipagem automatizada foi igual ao número de padrões de PFGE encontrados nestas 12
amostras de P. aeruginosa (Hollis et al., 1999). No presente estudo observou-se que as 56
amostras de P. aeruginosa apresentando 7 ribogrupos distintos apresentaram apenas 4
padrões de PFGE. Estes resultados mostram que a ribotipagem automatizada apresentou
excelente desempenho para as amostras de P. aeruginosa em comparação ao PFGE.
Para que o controle da resistência bacteriana seja eficaz é necessário a atuação
de vários setores, sendo assim, as medidas que envolvem o controle da disseminação
horizontal (paciente-paciente) de bactérias resistentes seria o ponto principal e para
complementar seria adequado a implementação de uma política de uso racional de
antimicrobianos (Coignard et al., 2000). Porém, para que essas medidas sejam
implementadas de forma apropriada torna-se necessário o conhecimento dos mecanismos
de resistência envolvidos e como estes responderão a pressão seletiva exercida por
diferentes classes de antimicrobianos, ou mesmo por diferentes drogas de uma mesma
classe. Como existe um grande número de variáveis envolvidas é importante que as
medidas de controle sejam baseadas em estudos locais. Desta forma, os laboratórios
precisam estar preparados para detectar os diferentes tipos de resistência. Para isso, é
necessário que os testes diagnósticos sejam realizados de maneira adequada para
detecção dos mecanismos de resistência mais freqüentes no âmbito hospitalar. O
conhecimento de como os diferentes tipos de resistência se disseminam é necessário
para que as medidas de controle possam ser implementadas (Pfaller et al., 2001).
6
9
69
70
70
6. CONCLUSÕES
1. Entre as amostras de Pseudomonas aeruginosa resistentes a carbapenens
foram observadas altas taxas de resistência a diferentes classes de antimicrobianos
testados.
2. As polimixinas B e E foram os únicos antimicrobianos a inibir o crescimento
de 100,0% das amostras de P. aeruginosa.
3. A produção de MβL foi demonstrada em 98 (47,6%) das 206 amostras. O
gene bla
SPM-1
foi detectado em 82 amostras (83,7%) e o gene bla
IPM-1
em 3 amostras
(16,3%). A enzima VIM não foi detectada nas amostras avaliadas.
4. As amostras de P. aeruginosa produtoras de MβL do tipo SPM-1 foram
encontradas em quinze centros médicos, localizados em noves estados brasileiros.
5. Os resultados de tipagem molecular mostram uma grande diversidade clonal
entre as amostras de P. aeruginosa resistentes aos carbapenens. O ribogrupo mais
prevalente, 72-3, foi encontrado em 18 amostras isoladas de 7 centros diferentes,
localizados em cinco estados brasileiros.
6. A ribotipagem automatizada apresentou excelente desempenho para as
amostras de P. aeruginosa em comparação ao PFGE.
71
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7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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100
100
ABSTRACT
Infections caused by Pseudomonas aeruginosa are often difficult to treat because of its
virulence and antimicrobial resistance. Carbapenems are usually active against multi-
resistant P. aeruginosa, but resistant to these compounds has been increasing rapidly.
High-level resistance to carbapenems is still uncommon in P. aeruginosa and is usually
indicative of metallo-β-lactamases (MβL). The purpose of the study were to evaluate the
antimicrobial susceptibility profiles of carbapenems resistant P. aeruginosa isolated from
Brazilian Hospitals, were to detect the presence of gene bla
SPM-1,
bla
IMP-1,
bla
VIM-1
e
bla
VIM-2
and to evaluate the genetic similarity of P. aeruginosa resistant to carbapenems. Were
evaluated 206 P. aeruginosa resistant to carbapenems collected during 2001 – 2003 from
25 medical centers. Antimicrobial susceptibilities testing to selected agents were
determined by disk diffusion to 206 strains. The suscepptibility testing were to using the
reference “National Committee for Clinical Laboratory Standards” (NCCLS). Carbapenems
resistant isolates were screened for MβL production by disk approximation test using 2
enzyme inhibitors (EDTA and 2-mercaptopropionic acid). The procedure was confirmed by
Etest
(Etest
MBL strip) and also by PCR assays using the following primers bla
IMP-1
,
bla
VIM-1
, bla
VIM-2
e bla
SPM-1
. The genetic similarity was performed in MβL producers strains
and one negative-MβL strains for medical centers by automated ribotyping and PFGE.
High resistance rates to majority of the antimicrobial agents were demonstrated. The
polymyxins were the most active antimicrobial agents evaluated with 100,0% of
susceptibility rate to all strains. The MβL production was detected in 98 (47,6%) of 206
strains. The bla
SPM-1
gene was detected in 82 strains (83,7%) and bla
IPM-1
gene in 3
strains (16,3%). Thirteen isolates did not show PCR amplification for none of the primers
used. The analysis of genetic similarity showed a clonal diversity among the 98
carbapenems-resistant strains (46 ribogroups). CONCLUSION: This study indicates high
prevalence of MβL producing in carbapenems-resistant P. aeruginosa and clonal
dissemination these microrganism to a wide geographic area of Brazil.
101
101
ANEXOS
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