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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
BIOTECNOLOGIA
Thiago Bruce Rodrigues
EXPRESSÃO DO GENE DA AMINOLEVULINATO SINTASE
(ALAS) NA OSTRA Crassostrea gigas EXPOSTA À ESGOTO
DOMÉSTICO
Florianópolis
2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
BIOTECNOLOGIA
Thiago Bruce Rodrigues
EXPRESSÃO DO GENE DA AMINOLEVULINATO SINTASE
(ALAS) NA OSTRA Crassostrea gigas EXPOSTA À ESGOTO
DOMÉSTICO
Orientadora: Profa. Dra. Maria Risoleta Freire Marques
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
da Universidade Federal de Santa Catarina como requisito parcial para a
obtenção do título de Mestre em Biotecnologia
Florianópolis
2007
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Sumário
Resumo III
Abstract VI
1. Introdução 1
1.1. A contaminação ambiental 1
1.2. Esgoto doméstico 4
1.3. A importância dos recursos marinhos 9
1.4. Biomonitoramento 10
1.5. Genes diferencialmente expressos: a busca por
biomarcadores moleculares 13
1.6. A enzima 5- aminolevulinato sintase 15
2. Objetivos 22
3. Materiais e métodos 23
3.1- Coleta e manutenção dos animais 23
3.2 - Exposição ao esgoto doméstico 24
3.3- Obtenção dos tecidos 24
3.4- Clonagem dos fragmentos de cDNA diferencialmente expressos 24
3.5- Purificação do plasmídeo para seleção dos clones 26
3.6- Seqüenciamento e análise das seqüências 26
3.7- Iniciadores 26
3.8- Extração do RNA total 27
3.9- Síntese do cDNA 28
3.10- Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 28
3.11- Reações de PCR semi-quantitativo 30
3.12- Análise dos resultados 30
4. Resultados 31
II
4.1. Identificação do gene da 5-aminolevulinato sintase 31
4.2. Iniciadores 32
4.3. Padronização das condições de PCR 33
4.4. RT-PCR semiquantitativo 35
5. Discussão 38
6. Considerações finais 46
7. Referências 47
III
Resumo
Os organismos necessessitam de tetrapirróis, primariamente na forma de grupo heme
e/ou clorofila. O heme está presente como grupo prostético em um grande número de
proteínas, incluindo a hemoglobina, mioglobina e citocromos, enquanto a clorofila é
utilizada nos processos fotossintéticos. A formação de tetrapirróis nos organismos tem
início na síntese do ácido aminolevulínico (ALA). A enzima 5-aminolevulinato sintase
(ALAS), EC 2.3.1.37, catalisa a condensação de succinil-CoA e glicina para a formação
do ALA na mitocôndria. No presente trabalho, ostras Crassostrea gigas foram expostas
à esgoto doméstico bruto diluído a 33%, sob condições controladas de laboratório
durante 48 horas. Após a exposição, a expressão o gene da ALAS foi analisada nas
brânquias e glândula digestiva, através de RT-PCR (Reverse Transcriptase- Polymerase
Chain Reaction) semi-quantitativo, utilizando-se iniciadores específicos. A exposição
ao esgoto doméstico não promoveu um aumento significativo na expressão do gene
ALAS na glândula digestiva. Por outro lado, as brânquias apresentaram um aumento
significativo na expressão deste gene. Nossos resultados demonstram um aumento de
68% na expressão do gene ALAS nas brânquias dos indivíduos do grupo tratado em
relação ao grupo controle. Esses dados sugerem que o gene ALAS é um potencial
candidato a biomarcador molecular de exposição à esgoto doméstico na ostra C. gigas.
Palavras-chave: 5-aminolevulinato sintase, ALAS, heme, esgoto doméstico,
biomarcador molecular, C. gigas.
IV
Abstract
Living organisms require tetrapyroles, primarily in the form of heme and/or chlorophyll.
Heme serves as the prosthetic group in a number of important proteins, including
hemoglobin, myoglobin, and cytochromes, whereas chlorophyll is used in
photosynthesis. Formation of tetrapyroles in all organisms begins with the synthesis of
5-aminolevulinic acid (ALA). The enzyme 5-aminolevulinate synthase (ALAS), EC
2.3.1.37, catalyzes the condensation of succinyl-CoA and glycine to yield ALA in
mitochondria. In the present study, oyster C. gigas were exposed to crude domestic
sewage diluted at 33%, under controlled laboratory conditions for 48 hours. RNA
extract was obtained from gills and digestive gland samples. The expression of the
ALAS was analysed by semiquantitative RT-PCR (Reverse Transcriptase- Polymerase
Chain Reaction) experiments with specific primers. The exposure to domestic sewage
did not elicit a significant increased in the expression of the ALAS gene expression in
the digestive gland, although the exposed group showed increased ALAS RNAm
expression level in gills. Our results showed a increase in 68% in ALAS gene
expression in gills in the exposed group compared the control group. These data suggest
that ALAS gene is a potencial candidate as a molecular biomarker of domestic sewage
exposure in C. gigas.
Key-words: 5-aminolevulinate synthase, ALAS, heme, domestic sewage, molecular
biomarker, C. gigas.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. A contaminação ambiental
O impacto ambiental causado pela presença de contaminantes mostrou um
aumento significativo no último século, como decorrência do crescimento da população
mundial e da intensificação das atividades humanas ligadas à indústria e agricultura. O
termo contaminate difere do termo poluente, pois o primeiro refere-se à presença de
uma substância no ambiente e/ou nos organismos, enquanto o segundo causa,
necessariamente, um efeito adverso à biota (WALKER et al, 1996)
Compostos tóxicos para os organismos vivos, também conhecidos como
xenobióticos, presentes no ecossistema são, usualmente, de origem industrial e
apresentam uma estrutura química normalmente não encontrada na biosfera. Entre eles
estão as bifenilas policloradas (PCBs), as policlorodioxinas, o trinitrotolueno (TNT) e
diversos corantes.
As maiores fontes de contaminação ambiental são as indústrias química e
farmacêutica que produzem um amplo repertório de xenobióticos e polímeros sintéticos.
Os processos envolvendo a produção de papel e celulose representam a maior fonte de
organoclorados no ambiente. Por outro lado, as atividades mineradoras liberam metais
pesados. O uso generalizado de combustíveis fósseis, como carvão e petróleo, aumenta
significativamente as concentrações de CO
2
na atmosfera e, consequentemente a
incidência de chuvas ácidas, enquanto a agricultura intensiva utiliza grandes
quantidades de fertilizantes e pesticidas (DUA et al, 2002; BONNIE; CAREY;
PETSONK, 2002; LEAF; VEROLME; HUNT, 2003).
Entre os contaminantes químicos liberados no ambiente em larga escala, estão
compostos alifáticos, aromáticos, halogenados, nitroaromáticos e outros
(LINIVGSTONE, 1985; CAJARAVILLE et al., 2000). As condições do local e a
concentração do contaminante dependem da quantidade presente, da sua
biodisponibilidade, da estabilidade do composto sobre condições aeróbicas e
anaeróbicas, da sua mobilidade e taxa de degradação biológica e não-biológica. Os
xenobióticos orgânicos são mais frequentes e mais disponíveis em ambientes aquáticos
em comparação aos inorgânicos. Por terem características apolares, são absorvidos
2
facilmente pelos organismos, atravessam as membranas biológicas passivamente e são
distribuídos para os tecidos através de fluidos corpóreos, geralmente associados a
lipoproteínas (HODGSON & LEVI, 1994). O rápido avanço do desenvolvimento
industrial em todo o mundo tem contribuído para o grande aporte de contaminantes ao
ambiente, provocando sérias ameaças ao equilíbrio ambiental (NIYOGI et al., 2001).
Se por um lado a atividade industrial é caracterizada pela emissão de substâncias
altamente tóxicas, o esgoto doméstico apresenta quantidade cada vez maior de
contaminantes, como produtos farmacêuticos humanos e veterinários, produtos de
higiene pessoal, surfactantes e seus resíduos (PETROVIC; GONZALEZ; BARCELÓ,
2003). Além disso, patógenos, principalmente entéricos, como vírus e bactérias
encontram concentrações elevadas de nutrientes favorecendo seu desenvolvimento nos
locais de descarte. A contaminação de ambientes aquáticos por patógenos apresenta
importante papel epidemiológico por constituir um veículo potencial de dispersão de
microrganismos. A etiologia de muitas epidemias provocadas por patógenos
transmitidos pela água permanece desconhecida, embora o papel da água como fonte de
transmissão seja bem caracterizado para uma série de doenças, tanto de origem viral
quanto bacteriana. Os rotavirus, por exemplo, são conhecidos como uma das maiores
causas de morbidade em crianças de países desenvolvidos e de mortalidade em países
em desenvolvimento (PARASHAR et al., 2003). A epidemia de cólera ocorrida na
América do Sul em 1991 teve sua origem no Peru, chegando ao Brasil através do Rio
Solimões. Ao alcançar o Rio Amazonas, foi disseminada pela costa brasileira, chegando
até o Estado do Rio de Janeiro (TAUXE et al, 1994).
A intensa ocupação urbana, associada à atividade humana e industrial, resulta em
exploração inadequada dos recursos disponíveis e a conseqüente degradação do
ambiente (KENISH, 1991). O crescimento desordenado e o adensamento das
populações costeiras no Brasil tiveram sua origem na colonização do país. O papel de
colônia de exploração promoveu a ocupação do território brasileiro do litoral para o
interior, tendo em vista facilitar o escoamento do comércio e o trânsito de pessoas entre
colônia e metrópole. Estas áreas foram alvos de um processo de ocupação acelerado que
teve como vetores básicos a urbanização, o turismo e a industrialização
(Macrodiagnóstico da Zona Costeira do Brasil na Escala da União, 1996). Com o
surgimeto de grandes centros urbanos próximos a faixa litorânea, têm-se observado
mudanças significativas na qualidade das águas costeiras e estuários, principalmente em
3
função do despejo de esgoto doméstico e efluentes industriais não tratados, diretamente
nos corpos de água (MEDEIROS et al, 2005; NAKADA et al, 2006; BOUND;
VOULVOULIS, 2006). Dados do IBGE (2000) mostram uma grande concentração de
áreas com potencial poluidor ao longo do litoral brasileiro e próximo a corpos de água
(Figura 1).
Figura 1.: Áreas com potencial impacto poluidor, localizadas próximas a corpos d’água. Os pontos
vermelhos indicam as áreas com potencial impacto poluidor. A maior concentração dessas áreas encontra-
se ao longo da costa brasileira, onde observamos maior concentração de atividades humanas e industriais.
Fonte: IBGE, 2000
NOTA: A denominação “áreas com potencial
impacto poluidor sobre os mananciais” refere-
se, especifi camente, aos distritos com mais de
50 000 habitantes, que apresentaram ao menos
um dos “fatores potencialmente poluidores” e
dois ou mais fatores “complementares” e/ou
“potenciais”. Foi considerado “fator
potencialmente poluidor” o lançamento do
esgoto in natura e dos lodos de tratamento da
água e do esgoto em rios, lagos, lagoas, baías
e mar. Como “fator complementar”, porém não
menos impactante, considerou-se a presença
de unidades de destino do lixo (inclusive o
séptico e o industrial) em vazadouros a céu
aberto (lixões) e em áreas alagadas. Os demais
pontos presentes no mapa são os distritos que
apresentaram apenas uma ou duas ocorrências
relativas ao lançamento de esgoto e/ou lodos
de tratamento nos rios, lagos, lagoas, baías e
mar.
4
Assim, o aumento no grau de variedade e a complexidade dos problemas causados
em decorrência do despejo de efluentes municipais e industriais no meio ambiente nas
últimas décadas, têm gerado a necessidade de proteger principalmente, seus recursos
hídricos e avaliar as condições de seus sistemas físicos, químicos e biológicos
(KENNISH, 1991)
1.2. Esgoto doméstico
Entre os serviços de saneamento básico, o esgotamento sanitário é o que tem
menor cobertura nos municípios brasileiros. Em relação ao esgotamento sanitário,
47,8% dos municípios brasileiros não têm coleta de esgoto (IBGE, 2000). O Norte é a
região com a maior proporção de municípios sem coleta (92,9%), seguido do Centro-
Oeste (82,1%), Sul (61,1%), Nordeste (57,1%) e Sudeste (7,1%). Nesses casos, os
principais receptores do esgoto in natura não coletado são os rios e mares,
comprometendo a qualidade da água utilizada para abastecimento, irrigação e recreação.
No Brasil, dos 52,2% dos municípios que têm esgotamento sanitário, 32% têm serviço
de coleta e 20,2% coletam e tratam o esgoto (IBGE, 2000).
Tabela 1. Proporção dos municípios com serviço de esgotamento sanitário (%).
Fonte: Diretório de Pesquisas, Departamento de População e Indicadores Sociais, Pesquisa Nacional de
Saneamento Básico 1989/2000. I BGE, 2000.
Esfera administrativa
Total Municipal Estadual Federal Particular
Grandes
Regiões
1989 2000 1989 2000 1989 2000 1989 2000 1989 2000
Brasil 47,3 52,2 35,2 38,4 11,9 14,1 0,7 0,1 0,2 1,0
Norte 8,4 7,1 3,4 3,3 4,0 2,2 0,3 0,0 1,7 1,8
Nordeste 26,1 42,9 22,3 37,9 3,9 5,6 0,6 0,2 0,0 0,6
Sudeste 91,0 92,9 67,6 66,3 22,7 26,8 1,5 0,0 0,2 1,9
Sul 39,1 38,9 28,2 24,5 11,2 15,0 0,1 0,0 0,0 0,1
Centro-Oeste 12,9 17,9 3,7 7,4 9,2 10,1 0,3 0,0 0,0 0,4
5
Figura 2.: O problema do esgoto no Brasil. Mapa do Brasil contendo dados referentes aos sistemas de
tratamento (A) e coleta (B) do esgoto no Brasil. Os dados revelam a falta de eficiência dos sistemas de
esgototamento sanitário nas diferentes regiões do Brasil. Fonte: IBGE, 2000.
Esgoto coletado Esgoto tratado
B)
A)
6
A maioria das cidades da costa brasileira não é capaz de realizar a coleta e tratamento de
esgotos domésticos, sendo o esgoto in natura lançado nos rios ou no mar (Figura 2).
Quando existe rede coletora, não há estação de tratamento de esgotos, o que vem a
agravar ainda mais a situação, pois a carga acaba por se concentrar em um determinado
ponto ou setor do rio ou manancial .
O Brasil apresenta mais de 2/3 da sua população vivendo ao longo da costa
(LACERDA et al., 2002). O processo de urbanização do litoral brasileiro promoveu a
concentração da população e das atividades econômicas nessa região do país e vem
sendo um dos principais processos responsáveis pela modificação dos habitats e das
comunidades dos ecossistemas aquáticos (MASALA, 1999). Assim, a necessidade de
sistemas de saneamento básico e tratamento eficaz de esgoto se mostra intimamente
ligada à questão da qualidade da água. As principais conseqüências da má utilização
desses recursos hídricos são a contaminação de águas recreacionais e de consumo, além
da modificação de ecossistemas (MARQUES et al., 2004).
Na cidade de Florianópolis, a poluição orgânica é uma constante no mar das
baías Norte e Sul, estendendo-se para áreas estuarinas, nos manguezais de Ratones e
Itacorubi, caracterizando estes ambientes como deficitários de oxigênio, predominando,
nas áreas de baixa circulação, os processos de decomposição anaeróbica (MATER et
al., 2004). Essas alterações podem estar associadas à floração de cianobactérias, dentre
elas algumas do gênero Trichodesmium, as quais geram toxicidade no meio aquático,
afetando a cadeia alimentar do ecossistema e impossibilitando o uso de recursos
marinhos (FONSECA; BRAGA; EICHLER, 2002). Recentemente, a preocupação com
o crescente impacto ambiental que a Lagoa da Conceição vem experimentando, bem
como os problemas decorrentes desta situação foram objeto de matéria jornalística na
imprensa local ( Jornal Notícias do Dia, 2007). A inexistência de saneamento ao redor
de toda a Lagoa destacada na referida matéria foi confirmada pelo representante da
CASAN (Companhia Catarinense de Águas e Saneamento), o qual informou, inclusive,
que a ampliação da rede coletora da região faz parte das ações planejadas pela
companhia. Além do grande potencial turístico, a região também se destaca pela alta
produtividade na aquicultura, em especial no cultivo de ostras. Com núcleos de
produção em Sambaqui e Santo Antônio de Lisboa, ao norte, e no Ribeirão da Ilha e
áreas próximas, ao sul, a capital catarinense é a maior produtora de ostras do Brasil.
Santa Catarina aparece em primeiro lugar no país, detendo cerca de 85% da produção.
7
Devido às características climáticas e geográficas do litoral, tais como, inúmeras áreas
protegidas, compostas por baías, enseadas e estuários, com águas de ótima qualidade, a
costa litorânea catarinense tem se destacado como uma região excelente para o cultivo
de moluscos.
O esgoto doméstico representa uma fonte rica em fósforo, potássio e nitrogênio,
particulado ou dissolvido, além de outras substâncias químicas de uso diário. Em
ambientes costeiros que apresentam maiores concentrações imobiliárias, os efluentes
são despejados in natura na coluna d`água, aumentando a concentração de matéria
orgânica e promovendo eutrofização. Entretanto, o esgoto doméstico é heterogêneo em
relação à sua composição e por isso, apresenta grande variedade de classes de
contaminantes. Entre aqueles mais encontrados estão os fármacos, compostos
fenólicos, desinfetantes, hidrocarbonetos, patógenos, como vírus e bactérias, e matéria
orgânica (MONARCA et al, 1999; BRETON; TEED; MOORE, 2003;
STACKELBERG et al., 2004).
A natureza lipofílica de contaminantes, como hidrocarbonetos e pesticidas,
aumenta a probabilidade de associação com componentes de membranas lipídicas.
Metais pesados também são conhecidos por interagir com componentes da membrana,
catalisando o processo de peroxidação de lipídeos (CHELOMIN; BELCHEVA, 1991)
Recentemente, o monitoramento de fármacos residuais no meio ambiente vem
ganhando grande interesse devido ao fato de muitas destes compostos serem
freqüentemente encontradas em efluentes de Estações de Tratamento de Esgoto (ETEs)
e águas naturais, em concentrações na faixa de μg/L e ng/L. Os fármacos são
desenvolvidos para serem persistentes, mantendo suas propriedades químicas o bastante
para servir a um propósito terapêutico. Stumpf et al. (1999), relataram em seu estudo
que a presença de fármacos residuais em águas superficiais pode ser um indicativo de
contaminação por esgoto. Em todo mundo, fármacos, tais como, antibióticos,
hormônios, anestésicos, antiinflamatórios entre outros, foram detectados no esgoto
doméstico (ZUCCATO; CASTIGLIONI; FANELLI, 2005; NAKADA et al., 2006).
Alguns grupos de fármacos residuais merecem uma atenção especial, dentre eles estão
os antibióticos e os estrogênios. Os antibióticos são usados em grandes quantidades,
tanto na medicina humana, quanto na medicina veterinária, na produção bovina, avícola,
suína e, ainda, na aqüicultura e apresentam potencial para promover o desenvolvimento
de bactérias resistentes no meio ambiente (SCHMIDT et al., 2000; PETERSEN et al.,
8
2002). A importância dos estrogênios reside no seu potencial de afetar adversamente o
sistema reprodutivo de organismos aquáticos, por exemplo, causando, a feminização de
peixes machos presentes em rios contaminados (GAGNÉ et al., 2005).
Alguns patógenos também podem estar presentes no esgoto domético. Bactérias
vêm sendo isoladas de diferentes efluentes urbanos e, em alguns casos, sua resistência a
algum antibiótico já foi demonstrada (COSTA; VAZ-PIRES; BERNARDO, 2006;
SCHWARTZ et al., 2006). Na Suécia, pesquisadores observaram a sobrevivência de
uma cepa de Salmonella, envolvida em casos de infecção humana, após o tratamento do
esgoto (SAHLSTRÖM; DE JONG; ASPAN, 2006). Além das bactérias, a presença de
vírus também torna o esgoto um veículo de propagação de doenças, tanto para o ser
humano, como para os organismos aquáticos (DANOVARO et al., 2003). Entre os vírus
mais encontrados no esgoto, estão aqueles que utilizam a via fecal-oral como meio de
transmissão (GRIFFIN et al., 2003).
A utilização de cloro é um dos métodos mais utilizados para desinfecção da água
para consumo. Entretanto, seu uso pode provocar a formação de produtos de
propriedades tóxicas com características mutagênicas e carcinogênicas que são
potencialmente nocivos para seres humanos e organismos aquáticos. Por isso, efluentes
domésticos podem apresentar substâncias químicas desconhecidas com propriedades
mutagênicas em virtude de reações químicas sofridas pelos precursores presentes nos
desinfetantes (MONARCA et al., 2000).
Substâncias surfactantes estão presentes em produtos de uso doméstico como,
por exemplo, detergentes, emulsificantes, dispersantes, pesticidas, além de outros com
aplicações industriais. A classe de surfactante mais utilizada é a dos alquilfenóis
etoxilados, cujo a degradação primária no ambiente pode gerar alquilfenóis de cadeia
curta. Esses produtos de degradação são substâncias persistentes como nonilfenol,
octilfenol e alquilfenóis mono- , di- e tri-oxilados que são metabólitos de relativa
estabilidade e apresentam características estrogênicas para alguns organismos aquáticos
(YING; WILLIAMS; KOOKANA, 2002; CHENG et al., 2006).
Alguns trabalhos demonstram a utilização de lipídeos como marcadores de
contaminação por esgoto (AVERY; DUNSTAN; NELL, 1998; CHALER; SIMONEIT;
GRIMALT, 2001; CARREIRA; WAGENER; READMAN, 2004). A maior parte
desses lipídeos são descartados após o uso doméstico ou são excretados pelo homem.
Da mesma forma que os coliformes fecais são utilizados como indicadores de poluição
9
por serem liberados juntamente com as fezes, os esteróis presentes nas fezes também
podem ser considerados como tal, pois são produtos da redução do colesterol pela ação
microbiana no intestino, gerando o coprostanol (TAKADA; EGANHOUSE, 1998).
Com isso, a presença de esteróis ou o perfil desses lipídeos presentes na água,
sedimento e/ou em organismos aquáticos podem ser usados para indicar o impacto de
um ambiente aquático por esgoto doméstico.
Assim sendo, podemos considerar que o esgoto constitui um material no qual
existem contaminantes, os quais podem interagir e causar alterações prejudiciais ao
ecossistema aquático. Com isso, o monitoramento dos lançamentos deste tipo de
efluente e seu efeito potencial sobre os organismos aquáticos deve se tornar uma
ferramenta importante não somente na conservação de ambientes aquáticos, mas ainda,
na prevenção de acidentes ambientais, na fiscalização e na implementação de projetos
para a recuperação de ambientes impactados por esgoto doméstico.
1.3. A importância dos Recursos Marinhos.
O potencial turístico do Estado de Santa Catarina alcança expressão nacional,
sendo que, particularmente, a Ilha de Santa Catarina encontra no turismo uma das
principais fontes de renda da sua população. A população flutuante atraída pela beleza
natural da região, principalmente as praias, praticamente triplica durante a alta
temporada. Tal fato traz benefícios econômicos à população local, mas também
aumenta a quantidade de esgoto doméstico produzido e lançado direta ou indiretamente
nos ecossistemas aquáticos.
O Estado de Santa Catarina atualmente destaca-se como produtor de organismos
aquáticos cultivados do país. As características do Estado permitem uma aqüicultura
diversificada, gerando oportunidades de ocupação de mão-de-obra e renda para cerca de
24 mil pequenos produtores rurais e pescadores artesanais (EPAGRI, 2005). A zona
litorânea, cuja extensão é de 561 km, apresenta inúmeras áreas protegidas, compostas
por baías, enseadas e estuários, o que, associado à elevada produtividade do mar,
favorece o desenvolvimento do cultivo de moluscos (mexilhões, ostras e vieiras),
representando alternativa de renda para os pescadores artesanais e populações
tradicionais das comunidades pesqueiras. Na faixa litorânea, áreas planas próximas ao
10
mar, impróprias para a agricultura caracterizam-se com potencial para implantação de
cultivo de camarões e peixes marinhos. Os recursos marinhos apresentam grande
diversidade nesta região e por um longo período movimentaram a economia da cidade
de Florianópolis e levaram o Estado, na década de 70 e 80, a ocupar uma posição de
destaque na produção de pescado no Brasil.
Santa Catarina é o principal produtor nacional, com mais de 8 mil toneladas de
mexilhões e 1.600 toneladas de ostras, equivalente a 82% da produção nacional.
Atualmente a atividade gera cerca de 5000 empregos diretos, e movimenta em torno de
trinta e oito milhões de reais, o que representa cerca de 1,15% do PIB catarinense (PMF,
2004).
A criação do camarão marinho em cativeiro teve início em Santa Catarina em
1983, embora o pioneirismo da atividade no Estado tenha sido na década de 70.
Atualmente, os cultivos concentram-se no Complexo Lagunar Sul (Laguna, Imaruí,
Imbituba e Jaguaruna) estendendo-se também para outras regiões próximas a grande
Florianópolis, Bacia da Foz do Tijucas e Litoral Norte catarinense, utilizando áreas
subaproveitadas ou não competitivas para atividades agropecuárias.
Assim, a qualidade da água passa a ser item determinante para a certificação
sanitária dos produtos de origem aqüícola, o que, consequentemente, aponta a
relevância de se monitorar as áreas de cultivo. A implementação de programas de
monitoramento aquático tem a finalidade de evitar ou detectar a presença de
contaminação por substâncias tóxicas, como metais; óleos, pesticidas e corantes, entre
outros e, ainda, agentes patogênicos, os quais podem estar presentes na composição do
esgoto doméstico. Além disso, a matéria orgânica produzida pelas atividades humanas e
descartada no ambiente, provoca modificações no aporte de oxigênio e na concentração
de nutrientes, gerando alterações que acarretam prejuízos ao ecossistema aquático.
1.4. Biomonitoramento
A habilidade de avaliar os impactos em ecossistemas depende da capacidade de
distinguir os efeitos das ações humanas das variações naturais, buscando entendimento
dessas ações sobre os sistemas biológicos (CAIRNS; McORMICK;
NIEDERLEHENER, 1993). Desta forma, o desenvolvimento de metodologias
11
eficientes de diagnóstico é fundamental para uma gestão eficiente dos recursos hídricos.
Segundo documento das Nações Unidas, Agenda 21, “... a utilização da água deve ter
como prioridades a satisfação das necessidades e a preservação dos ecossistemas.”.
Para isso, é necessário o desenvolvimento de métodos específicos, sensíveis e rápidos
de detecção e que não estejam baseados unicamente na detecção de patógenos
bacterianos ou em análises físico-químicas. As metodologias atuais utilizadas na
determinação de qualidade sanitária da água, baseadas no monitoramento dos níveis de
coliformes fecais, têm se mostrado ineficientes para a detecção de enterovírus e
protozoários (MUNIAIN-MUJIKA et al., 2003). Do primeiro dispositivo legal voltado
exclusivamente para recursos hídricos, o Código das Águas (decreto n° 24.643 de 10 de
julho de 1934 –Brasil), passando pela resolução do Conselho Nacional de Meio
Ambiente (CONAMA) n° 20 de 1986, até a Lei das Águas (Lei 9.433/97, Brasil), não
há qualquer menção ao uso de biomonitoramento para avaliar a qualidade das águas.
Desta forma, as aplicações mais bem sucedidas na implementação desses programas no
Brasil são realizados de forma não sistemática pelas agências ambientais, em conjunto
com as universidades ou centros de pesquisa (BUSS; BAPTISTA; NEISSIMIAN,
2003).
Resta portanto, estabelecer metodologias que possam evidenciar situações de
risco ambiental. Tradicionalmente, os programas de avaliação e monitoramento de
contaminação aquática utilizam parâmetros químicos para avaliar a presença e
concentração de contaminantes na água, sedimento e organismos do ecossistema.
Entretanto, estes tipos de análise não evidenciam as consequências toxicológicas dos
contaminantes na biota (FENT, 2003). A utilização de respostas fisiológicas em
avaliações de laboratório é genericamente conhecida como testes toxicológicos. O
International Council for the Explotation of the Sea, ICES (2003) sugere a análise de
biomarcadores como metodologia complementar às tradicionais, para expressar o grau
de toxicidade dos contaminantes nos organismos (BURGEOT et al., 1996).
Biomarcadores são respostas em nível molecular, celular ou fisiológico de
organismos vivos, que podem ser utilizadas para avaliar as alterações ocorridas no
ambiente e que expressam o efeito tóxico causado por contaminantes (MATTHEWS;
BUIKEMA; CAIRNS, 1982, WALKER et al., 1996; BINELLI et al., 2006).
Os biomarcadores moleculares ou bioquímicos apresentam a vantagem de
servirem de aviso prévio da degradação ambiental causada pelos contaminantes
12
(RAND, 1995), antecipando os possíveis danos em maior escala, tais como efeitos
deletérios na população e na comunidade biológica (CAJARAVILLE et al., 2000).
Além disso, a análise desses biomarcadores apresenta, na maioria das vezes, menor
custo, maior facilidade de execução e rapidez do que as análises químicas
convencionais (GALLOWAY et al., 2004). Apesar dessas vantagens, a especificidade
das respostas dos biomarcadores para as diferentes classes de contaminantes na maioria
das vezes não é muito clara. Desta forma, os programas de monitoramento vêm
utilizando esta estratégia com cautela, avaliando um conjunto de biomarcadores de
maneira programada e esquemática, juntamente com as análises químicas
(GALLOWAY et al., 2004). Respostas bioquímicas como indução de metalotioneínas
em reposta a exposição de metais pesados, assim como a indução de citocromos P450
por PAH’s e PCB’s e inibição de enzimas envolvidas na síntese de quitina em
exposição a pesticidas são observadas em peneídeos (BAINY, 2000). Além disso, os
metabólitos gerados por um contaminante também podem ser usados como
biomarcadores. Os conjugados pela glutationa durante a biotransformação, podem ser
identificados pela formação de metabólito reativo presente na urina (TIMBRELL,
2003).
Os biomarcadores podem ser divididos em dois grupos, indicando o efeito ou a
exposição do organismo a um contaminate. Os biomarcadores de exposição indicam a
magnitude da perturbação causada em resposta a um poluente. Dentre eles estão as
enzimas de conjugação de xenobióticos, as metalotioneínas e as defesas antioxidantes.
Entre os biomarcadores de efeito, encontram-se as medidas de dano de DNA e de
peroxidação de lipídeos (RAND, 1995; CAJARAVILLE et al., 2000).
Programas de biomonitoramento vêm sendo utilizados em diversos países para
prevenir e avaliar danos ambientais. Estes estudos utilizam espécies-chaves com
diferentes propósitos, podendo ser definidas como indicadores, sentinelas ou monitores,
de acordo com o propósito a que se destinam. As espécies indicadoras acusam
mudanças populacionais da espécie em resposta ao impacto causado. Nas espécies
sentinelas, a análise da concentração de substâncias químicas em seus tecidos, reflete a
concentração do contaminante que está biodisponível no ambiente. Já as espécies
monitoras demonstram efeitos adversos no metabolismo em resposta a presença do
contaminante (BEEBY, 2001). Segundo Johnson, Weiderholm, Rosenberg (1993),
espécies-chave ideais devem apresentar as seguintes características: distribuição
13
geográfica ampla; variabilidade genética e ecológica; baixa mobilidade, longo ciclo de
vida; ser abundante e/ou de fácil coleta, dispor de características ecológicas bem
conhecidas, além de apresentar facilidade de uso e manipulação em estudos
laboratoriais.
Moluscos bivalves vêm sendo amplamente utilizados em programas de
biomonitoramento, uma vez que apresentam características como ampla distribuição
geográfica, além de serem sésseis, abundantes e filtradores (WALKER et al, 1996;
SHEENAN; POWER, 1999). Alterações no metabolismo energético desses animais
foram relatadas em resposta ao estresse ambiental, associado à temperatura, salinidade e
deficiência de oxigênio, além da exposição a contaminantes (WALKER et al, 1996;
PÖRTNER et al., 1998; SOKOLOVA; BOCK; PÖRTNER, 2000).
Nesse sentido, o programa “Mussel Watch”, nos Estado Unidos, foi um dos
pioneiros na utilização de bivalves como sentinelas, assim como o programa de
14
amostra biológica. A transcrição ou perfil de expressão são analisados através da
utilização de até 10.000 sondas em uma única matriz ou chip, onde estas são
imobilizadas, podendo ser oligonucleotídeos ou cDNAs. Esta técnica vem sendo
aplicada, principalmente, na elucidação de mecanismos de doenças humanas e
processos toxicológicos (NEUMANN; GALVEZ, 2002; VISSERS et al., 2005;
LETTIERI, 2006) A utilização desta ferramenta na área ambiental ainda é pequena,
principalmente, pelo baixo número de espécies que têm seu genoma completamente
seqüenciado e são utilizadas como organismos sentinelas.
Uma forma alternativa para o isolamento e a caracterização de sondas, seria a
utilização genes que apresentem a sua expressão alterada. Esta estratégia permite a
criação de bibliotecas de cDNA enriquecidas por genes transcritos em resposta a um
poluente. Isto pode ser obtido através da supressão subtrativa de genes, seguida de
hibridização. Através da Supression Subtractive Hibridization (SSH), técnica
desenvolvida por Diatchenko et al. (1996), os genes transcritos e diferencialmente
expressos são isolados como fragmentos de cDNA, através da subtração entre os
animais expostos a contaminantes e os animais controle (não-expostos). Com base
nestes resultados, aliados à bioinformática e análises estatísticas, podemos inferir quais
os genes que estão sendo expressos em diferentes tecidos, sugerindo sua relevância
dentro dos diferentes processos bioquímicos e fisiológicos do organismo. Isso nos
permite relacionar as alterações geradas no metabolismo em decorrência das alterações
dos níveis de expressão dos genes, em condições específicas (CARULLI et al., 1998;
KOZIAN; KIRSCHBAUM, 1999).
Podemos determinar os níveis de expressão de um determinado gene em
resposta a presença de contaminantes através da quantificação das moléculas de RNA
mensageiro (RNAm). Essas moléculas refletem os níveis de transcrição dos genes no
instante da exposição. Vários métodos como Northern blot, Ribonuclease assay
protection e RT-PCR (Reverse Trancriptase – Polymerase Chain Reaction) são
propostos para quantificar os níveis de RNA. Através da comparação desses métodos,
REUE (1998) demonstrou vantagens e desvantagens e preconiza que a escolha da
metodologia a ser utilizada irá depender da sua aplicação. Sendo assim, o RT-PCR
demonstrou ser o mais adequado para avaliar potenciais candidatos a biomarcadores
moleculares por apresentar maior sensibilidade na detecção da alteração dos níveis de
RNAm. Em teoria, o PCR é capaz de detectar o cDNA originado de uma única
15
molécula de RNAm, mas na prática, pelo menos 10 cópias da molécula são requeridas.
Tal fato se deve a ineficiência da transcriptase reversa ao converter RNAm em cDNA
para posterior amplificação (FOLEY; LEONARD; ENGEL, 1993).
O RT-PCR semi-quantitativo é uma método rápido para estimar as quantidades
relativas em populações de RNA, utilizando um gene constitutivo como controle interno
para normalizar os níveis de expressão do gene alvo de interesse. A expressão do gene
referência utilizado para normalização deve permanecer constante entre as células de
diferentes tecidos e sob condições diferentes. Caso contrário, a escolha de um gene
referência inadequado pode levar a resultados errôneos. Genes envolvidos em rotas
metabólicas básicas como os que codificam para a ubiquitina, actina, o RNA ribossomal
(rRNA) 28S e a enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) têm sido
usados amplamente como controle interno para a análise da expressão de genes.
Entretanto, alguns trabalhos demonstram que o nível de transcrição de alguns dos genes
tidos como constitutivos pode apresentar variações nos níveis de transcrição sob
diferentes condições experimentais (SELVEY et al., 2001; HALLER et al., 2004;
SHULZHENKO et al., 2005).
A relação dos produtos amplificados deve refletir a relação inicial da
concentração de RNAm. Com isso, a metodologia requer padronização prévia das
condições da reação, como concentração dos iniciadores, dos desoxi-ribonucleotídeos
trifosfatados (dNTPs ) e, principalmente, da concentração inicial de cDNA e número
de ciclos, para assegurar que os dados sejam capturados durante a fase exponencial da
reação de amplificação. Durante a fase exponencial a taxa de amplificação permanece
constante devido à plena atividade da enzima, concentrações suficientes de iniciadores e
dNTPs e não há formação de produtos inibitórios da reação. Após a fase exponencial, a
taxa de amplificação é reduzida drasticamente, alcançando a fase de saturação, onde a
maior parte dos reagentes já foi consumida, além de se observar perda da atividade
enzimática, reduzindo a eficiência da reação. A determinação do número de ciclos pode
ser feita através da retirada progressiva dos produtos da reação (REUE; COHEN;
SCHOTZ, 1997) e, assim, monitorar a intensidade do sinal gerado a cada intervalo
determinado de ciclos por densitometria. Com isso, podemos determinar em quantos
ciclos o sinal passa de indetectável (cerca de 20 ciclos) à saturado, ao se alcançar o fim
da fase exponencial.
16
Entre os biomarcadores de contaminação aquática mais utilizados e
recomendados estão as enzimas de defesa antioxidante e de conjugação de xenobióticos,
pois estas fornecem informações a respeito da capacidade de defesa do organismo, bem
como a capacidade de transformação de compostos tóxicos (BURGEOT et al., 1996;
MONSERRAT et al., 2006; VALAVANIDIS et al., 2006). Entre as fases do
metabolismo de xenobióticos, podemos citar as reações de fase I (biotransformação) e
fase II (conjugação). A primeira fase promove o aumento da hidrosolubilidade dos
contaminantes, facilitando a sua excreção (LIVINGSTONE, 1985). Por isso, a demanda
metabólica requerida durante o processo de detoxificação acarreta na alteração dos
níveis de expressão dos genes que codificam as enzimas envolvidas. Sendo assim, a
variação dos níveis de expressão de um gene ou conjunto de genes, pode indicar
alterações no metabolismo em resposta a presença de um contaminante específico
presente no ambiente. Estas respostas podem então ser utilizadas como biomarcadores
moleculares de contaminação aquática.
O Laboratório de Biomarcadores de Contaminação Aquática e Imunoquímica –
Labcai, CCB, UFSC, vem desenvolvendo um projeto (CNPq-Proc. 475995/2003-1) que
envolve a identificação e a caracterização de biomarcadores de exposição a esgoto
doméstico na ostra Crassostrea gigas. Através da técnica de hibridização subtrativa de
cDNA, foi possível encontrar similaridades com proteínas conhecidas, como, por
exemplo, a Proteína Ligante a Ácidos Graxos (FABP), o citocromo P450 (CYP450) e a
enzima 5- aminolevulinato sintase.
1.6. A enzima 5- aminolevulinato sintase
Os compostos tetrapirrólicos desempenham um importante papel metabólico
como pigmentos fotossínteticos (clorofilas e bilinas) e grupos prostéticos (grupos heme
e corrinas) de diversas proteínas, como os citocromos da cadeia respiratória e o
citocromo P450, por exemplo.
A a reação que catalisa o pimeiro passo da biossíntese dos tetrapirróis foi
descoberta por SHEMIN (1955) e sua atividade em eritrócitos foi comprovada por
Laver, Neuberg, Udenfriend (1958). A enzima 5-aminolevulinato sintase (ALA-sintase
17
ou ALA-S; EC 2. 3. 1. 37), também denominada ácido δ-aminolevulínico sintase, foi
purificada por Warnick, Burnham (1971) é um homodímero piridoxal fosfato-
Figura 3.: Modelo esquemático das principais etapas da biosíntese de heme a partir de intermediários do
ciclo dos ácidos tricarboxílicos (TCA). A enzima 5-aminolevulinato sintase (ALAS) promove a
condensação de succinil-CoA e glicina para a formação de heme. As setas indicam a direção do fluxo
metabólico dos intermediários.
TCA
Acetil-CoA
Glicose e aminoácidos
Aminoácidos
Ácidos graxos
Piruvato
+
Glicina
5-Aminolevulinato sintase
(
ALAS
)
Ferroquelatase
(FC)
HEME
Ferro
Aminoácidos
Ácidos graxos
18
dependente, composto por monômeros de 44-65 kDa (CHRISTEN; METHA 2001), que
catalisa a descarboxilação condensativa da glicina e do succinil-Coenzima A (CoA-SH).
Este último proveniente do Ciclo dos Ácidos Tricarboxílicos (TCA) (Figura 3). O
produto gerado na reação é o ácido 5-aminolevulínico (ALS ou ALA), precursor
universal dos anéis tetrapirróis. Esta reação acontece na mitocôndria de uma série de
organismos, como animais, fungos e alguns protistas, diferentemente de plantas,
bactérias e archea, onde o ALA é derivado do glutamato (via C5) por vias biossintéticas
distintas (FERREIRA; GONG, 1995; SCHULZE et al., 2006).
A análise de 30 sequências do gene que codifica a ALA-S demonstrou que ele é
altamente conservado entre protostomados, fungos, protozoários e bactérias. Na enzima,
2/3 da seqüência da região carboxi-terminal da proteína não processada, apresentam
entre 40-90% de homologia, sendo que as bactérias mostraram os maiores percentuais
(DUNCAN et al, 1999). A sequência de ALAS apresenta 49% de identidade entre a
proteína humana e aquela sintetizada pela bactéria Rhodobacter capsulatus (ASTNER
et al., 2005). Oh-Hama, 1997, propôs que a produção de ALA via C5 é ancestral em
relação à produção via ALAS, fazendo parte do metabolismo de α-proteobactérias que
estariam crescendo em aerobiose durante a oxigenação da amosfera terrestre.
Os vertebrados apresentam duas isoformas da enzima, as quais são codificadas
por diferentes genes, localizados em diferentes cromossomos. A isoforma ALS1 ou
ALS-H, tida como produto de um gene “housekeeping”, é provavelmente produzida por
todos os tecidos, ativando a biosíntese de heme para os citocromos e outras
hemoproteínas (MAY et al., 1995). A ALS2 ou ALS-E, é uma enzima específica de
células eritróides que tem sua síntese aumentada durante a eritropoiese, devido à
demanda por grupos heme para a produção de hemoglobina (MAY et al., 1995).
Além de seu papel como grupo prostético de proteínas envolvidas no transporte
de oxigênio na respiração mitocondrial, o heme (Figura 4) desempenha funções
biológicas importantes, como no metabolismo de drogas, biossíntese de estrógenos,
defesa celular antioxidante e, ainda, na transdução de sinal (PODVINEC et al., 2002;
OATES; WEST, 2006; TSIFTSOGLOU; TSAMADOU; PAPADOPOULOU, 2006;
ATAMNA, 2004). Por outro lado, o heme pode ter sua síntese aumentada em resposta a
estrógenos e aumento de disponibilidade de ferro (Figura 5).
O heme é capaz de promover a repressão da transcrição do gene, a diminuição
da meia vida da enzima e a inibição dos processos pós-traducionais da pré-proteína
19
(HAMILTON et al., 1991). Muitas condições são capazes de alterar a biosíntese de
heme, diminuindo ou aumentando sua concentração celular, como deficiência de
vitaminas específicas (B6 e riboflavinas), minerais, exposição a altas doses de toxinas e
anoxia, podem levar a diminuição da síntes de heme (DANIELL et al., 1997). O
produto final da reação catalisada pela ALA-S, o heme, atua não somente como inibidor
alostérico da enzima, mas, ainda, como co-repressor da sua biossíntese. Este segundo
mecanismo de regulação, envolvendo a síntese da enzima, parece ser o mais importante
(ELLIOT; ELLIOT, 2001).
Figura 4.: Estrutura molecular de heme com íon divalente ferro.
Apesar do controle da síntese do heme estar intimamente relacionado com a
regulação do uptake de Fe e o armazenamento deste elemento na célula, a atividade da
ALAS é o passo limitante da velocidade da síntese de heme pois é ela quem dá origem
às moléculas de ALA para montagem de heme. A última etapa da biosíntes de heme é
catalisada pela enzima ferroquelatase que promove a inserção de um átomo de ferro na
protoporfirina IX, formando heme (WOODARD; DAILEY, 2000; BERG;
TYMOCZKO; STRYER, 2002) (Figura 5). Além disso, existem mecanismos de
regulação pós-transcripcionais relacionados como a concentração de ferro através de
uma alça ou estrutura em grampo (hairpin loop), denominada de elemento reponsivo a
Fe (Iron- Responsive Element, IRE) na região não traduzida da extermidade 5´ (5´-
Untranslated Region, 5´- UTR) do RNAm da ALAS-E (COX et al., 1991). O controle é
20
mediado pela proteína Irr (Iron response regulator) que regula negativamente a síntese
de heme (figura 5). Irr é uma proteína condicionalmete estável que degrada quando as
células estão expostas a ferro permitindo a repressão da síntese de heme (HAMZA et
al., 1998). Quando a disponibilidade de ferro para a síntese de heme é suficiente, Irr se
liga a enzima ferroquelatase. Este turnover dependente de ferro é mediado por heme,
que se liga a Irr promovendo sua degradação (QI et al., 1999).
O chumbo quando presente no sangue e ossos em níveis elevados (0.8 µg mL
-1
)
pode interferir nos níveis de heme e induzir a síntese de porfirinas, reduzindo os níveis
de hemoglobina (TIMBRELL, 2003). Enzimas como ALA-S, ferroquelatase e δ-
aminolevulinato desidratase (δ-ALA-D) (E.C.: 4.2.1.24.) têm suas funções
comprometidas pelo chumbo. Metais como o chumbo podem comprometer importantes
etapas de biosíntese de heme pois competem com o ferro. Os altos níveis de chumbo e m
humanos resultam na inibição da enzima δ-ALA-D que promove as etapas de
condensação e ciclização de duas moléculas de ácido aminolevulínico para geração de
porfobilinogênio. Com isso, a presença de ALA na urina é um dos principais
marcadores de exposição a chumbo em humanos.
Muitos trabalhos indicam uma co-regulação na síntese de heme pela atividade do
citocromo P450 (CYP). O heme livre é encontrado em baixas concentrações no interior
das células, pois seu aumento causa efeitos cititóxicos (MAY et al., 1995). Assim, a
demanda por heme pode aumentar em resposta ao aumento da síntese e atividade do
citocromo P450 durante a metabolização de algumas drogas (LOUIS et al., 1998; IBA
et al., 1999). Nesta situação, os níveis de RNAm da ALAS1 são aumentados com o
objetivo de suprir a demanda de heme dos apocitocromos. Além disso, outros estudos
têm demonstrado que a regulação pode ocorrer pela ativação direta da transcrição do
gene ALAS1 por algumas drogas, devido à presença de sequências capazes de interagir
com xenobióticos, funcionando como xenosensores (JOVER, HOFFMANN; MEYER,
1996; FRASER et al., 2002; PODVINEC et al., 2004).
Assim sendo, poder-se-ia considerar que a regulação e, consequentemente, a
expressão do gene ALAS venham apresentar variações em resposta a exposição à
contaminantes, ao estresse oxidativo e a outras condições que alterem a homeostase
celular. Estas variações podem representar uma estratégia fundamental na tentativa de
manter o equilíbrio celular, podendo vir a ser um biomarcador molecular de
contaminação aquática em potencial.
21
Figura 5.: Modelo esquemático da regulação do gene ALAS por ferro. Inicialmente, o gene ALAS é
transcrito no núcleo e traduzido no citop lasma. Na presença de ferro (Fe +), uma proteína reguladora (PR)
se liga ao domínio IRE (Iron Response Element), permitindo a tradução do RNAm de ALAS, levando à
degradação de Irr (Iron Response Regulator). Irr promove a repressão do gene em baixas concentrações
de Fe se ligando ao IRE, impedindo a ligação da PR. A tradução do gene ALAS gera uma proteína pré-
ALAS que só se torna ativa após translocação para o interior da mitocôndria, após processamento de uma
sequência da porção N-terminal.
22
2. OBJETIVOS
Principal
Analisar os diferentes níveis de expressão do gene da aminolevulinato sintase
em brânquias e glândula digestiva da ostra Crassostrea gigas exposta à esgoto
doméstico através de RT-PCR (Reverse Transcriptase – Polimerase Chain Reaction)
semi-quantitativo.
Específicos
Padronizar reações de PCR para amplificação do fragmento do gene da
aminolevulinato sintase;
Padronizar as reações de PCR semiquantitativo para cada tecido;
Analisar os diferentes níveis de expressão do gene em laboratório.
23
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Coleta e manutenção dos animais
Os espécimes de Crassostrea gigas (C.gigas) foram obtidos junto a unidade de
mar do Laboratório de Moluscos Marinhos (LMM, Universidade Federal de Santa
Catarina), localizado na praia de Sambaquí (Florianópolis, SC, Brasil) (Figura 6. A).
Após a coleta, os animais foram levados para o laboratório e separados em dois grupos
distintos (n= 10 por grupo). Cada grupo foi mantido em um aquário com 45 L de água
do mar filtrada, em salinidade 24% e a temperatura ambiente, sob aeração constante
(figura 6.B). Os animais foram mantidos nestas condições por um período inicial de 10
dias (período de aclimatação), durante o qual foram realizadas, diariamente, a troca de
água e a alimentação dos animais com microalgas Chaetocerus calcitrans (10
4
cel/mL).
A) B)
Figura 6.: Experimeto de exposição à esgo to doméstico em laboratório. A) Ostras Crassostrea gigas. B)
As ostras em aclimatação em um aquário com 45 L de água do mar filtrada, salinidade 24%, a
temperatura ambiente, sob aeração constante por 10 dias.
24
3.2. Exposição ao esgoto doméstico
Após o período de aclimatação, um dos grupos foi exposto a esgoto doméstico
não-tratado, coletado na estação de tratamento da Companhia Catarinense de Águas e
Saneamento (CASAN) na data de 25 de junho de 2005 e diluído para uma concentração
final igual a 33%. O período de exposição deste grupo de ostras C. gigas foi de 48
horas. Durante este período, o grupo mantido no segundo aquário recebeu apenas água
do mar filtrada (Figura 7). Não houve mortalidade entre os indivíduos durante o
período de exposição.
Figura 7.: Aquários contendo água do mar (à esquerda) e esgoto doméstico diluído a 33% (à direita),
utilizados no exp erimento de exposição.
3.3. Obtenção dos tecidos
Ao término do período de exposição, 10 animais de cada grupo foram dissecados
para a retirada das brânquias e da glândula digestiva. Os tecidos foram armazenados em
solução RNAlater (Ambion) à -20°C até a extração do RNA total.
3.4. Clonagem dos fragmentos de cDNA diferencialmente expressos
Utilizamos pGEM®-T Easy Vector Systems (Promega) (Figura 8) para a
clonagem do fragmento contendo a seqüência do gene ALAS, obtido a partir da
biblioteca de cDNA resultante de experimentos de hibridização subtrativa. Neste
sistema, o vetor de clonagem apresenta um sítio múltiplo de clonagem, além de uma
sequência para clivagem com a enzima de restrição Eco RI. A seleção das células
transformantes é realizada através da alteração de cor, devido à inserção do fragmento
25
clonado, a qual promove a disrupção de um gene promotor (lacZ). Este gene está
envolvido no metabolismo de lactose. Sendo assim, a perda de função desse promotor
será indicada por alterações colorimétricas das células, indicando a inserção (colônias
brancas) ou não (colônias azuis) do fragmento de interesse.
Figura 8.: Plasmídeo pGEM-T Easy utilizado como vetor de clonagem. Apresenta um promotor lacZ
com sítio múltiplo de clonagem, flanquead o por sítio de restrição para EcoRI.
Para a reação de ligação foram utilizados 2 µL do cDNA em tampão de ligação
(5x), contendo o vetor (50 ng) e a enzima de ligação T4 DNA ligase (4 U); sendo a
mistura mantida por 14 horas a 4°C.
Para a reação de transformação foram utilizadas bactérias competentes
Escherichia coli , linhagem JM109. Foram adicionados 2 µL da reação de ligação a 50
µL de células competentes, as quais foram mantidas em gelo por 30 minutos. Em
seguida, as amostras foram colocadas a 42°C por 45 segundos e, imediatamente
transferidas para o gelo novamente por mais dois minutos. Para cada amostra foram
adicionados 950 µL de meio LB, seguido de incubação a 37°C por 90 minutos, sob
agitação constante a 120 rpm. Após a transformação, 200µl da solução contendo as
bactérias transformadas foram aplicados em placa contendo ágar 35g/L (LB Agar-
Sigma), ampicilina (100mM), IPTG (0,5mM) e X-Gal (50mM), as quais foram
mantidas a 37º C por 18 horas para o crescimento das colônias.
26
3.5. Purificação do plasmídeo para seleção dos clones
Todas as colônias brancas, obtidas na transformação, foram transferidas
separadamente para tubos de ensaio contendo meio de cultura líquido 20g/L (LB Broth -
Sigma), os quais foram, em seguida, mantidos sob agitação constante durante 18 horas a
37º C.
A purificação do plasmídeo foi feita a partir de 3 mL do meio líquido, pelo
método de lise alcalina, utilizando o kit Perfectprep
®
Plasmid Mini (Eppendorf), de
acordo com as instruções do fabricante.
A presença do fragmento foi confirmada através de digestão do plasmídeo no
sítio de restrição da enzima Eco RI (Biolabs). A reação, contendo 2 µL de tampão, 1µL
da enzima, 15 µL de água e 100 ng de DNA plasmidial, foi mantida a 37°C durante 2
horas. O produto da reação foi submetido a eletroforese em gel de agarose 1%.
3.6. Seqüenciamento e análise das seqüências
Os fragmentos de cDNA diferencialmente expressos clonados foram
encaminhados para seqüenciamento ao Laboratório de Hanseníase (FIOCRUZ, Rio de
Janeiro), sob a coordenação do Dr. Milton Ozório de Moraes. O seqüenciamento foi
realizado com o kit ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing kit (PE Applied
Biosystems).
As seqüências obtidas foram analisadas através do programa computacional
BioEdit e comparadas com o banco de dados disponíveis no banco de genes. A análise
comparativa dos dados foi feito com o programa BLASTX
(http://ncbi.nlm.nih.gov//BLAST/).
3.7. Iniciadores
Após sequenciamento dos fragmentos clonados, obtidos pela hibridização
subtrativa, utilizamos o programa BioEdit para a análise das seqüências obtidas e o
27
programa Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) para
desenhar os iniciadores, bem como para analisar suas características gerais, visando
obter uma maior eficiência nas reações de amplificação pela reação em cadeia da
polimerase (PCR).
Os pares de iniciadores obtidos foram denominados PL 48 (antisense) e PR 475
(sense), cujas seqüências são respectivamente: 5’- CTT CAC TAC CAG TCT CCT
CCC ACC AC – 3’ e 5’- AGA CCT CAC ACTCAT CCG GAC AGA CAG – 3’, sendo
o tamanho do fragmento esperado igual a 427 pb.
Paralelamente, foram também desenhados iniciadores para a amplificação da
seqüência correspondente a um gene constitutivo a ser utilizado como gene referência
ou gene normalizador, o gene da enzima Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
(GAPDH). Os pares de iniciadores obtidos foram denominados GAPDHF e GAPDHR,
cujas seqüências são respectivamente: 5’ - ACT CCA AAG ACC AGA ACA TCG T -
3’ e 5’ - CAA AGC TGT CGG AAA GGT TAT C - 3’ , sendo o tamanho do fragmento
esperado de 275 pb.
3.8. Extração do RNA total
A extração do RNA total foi realizada pelo método TRIzol (Invitrogen),
seguindo protocolo modificado em nosso laboratório. Do tecido excisado, 100 mg
foram transferidos para um microtubo livre de DNase e RNase, ao qual foi adicionado 1
mL de TRIzol. Após homogeneização, como o auxílio de um homogeneizador de
tecidos, as amostras foram incubadas por 1 hora a temperatura ambiente, sendo, em
seguida, adicionados 200 µL de clorofórmio. Após vigorosa agitação por 15 segundos,
as amostras foram incubadas por 30 minutos no gelo. Os tubos foram centrifugados a
14.000 x g por 30 minutos a 4°C e a fase aquosa foi coletada e transferida para tubos
limpos. À fase aquosa foram adicionados 500 µL de isopropanol, seguidos de incubação
por 10 minutos a temperatura ambiente. Após a incubação, o material foi centrifugado a
14.000 x g por 40 minutos à 4°C. O sobrenadante foi descartado e, após a adição de 1
mL de etanol, o material foi novamente centrifugado, a 7.500 x g à 4°C. O
sobrenadante foi descartado e, após secagem do precipitado a temperatura ambiente, o
material foi ressuspendido em 20 µL de água tratada com DEPC e armazenado a -80°C.
28
A concentração do RNA total foi determinada pela razão das absorbâncias
determinadas a 260 e 280 nm (A
260
/A
280
)
.
3.9. Síntese do cDNA
Para a síntese do cDNA foi realizada a transcrição reversa, utilizando o sistema
comercial Omniscript RT Kit (Qiagen). Este sistema apresenta uma trancriptase reversa
multifuncional com três atividades distintas, tornando o processo mais rápido em
relação aos protocolos tradicionais. Além de apresentar atividade como DNA
polimerase RNA-dependente e DNA polimerase DNA-dependente, comum às outras
transcriptases, esta enzima apresenta atividade de exoribonuclease. Desta forma, a
combinação destas três atividades permite a síntese do cDNA e a degradação do RNA
molde em uma única reação. A obtenção do cDNA, a partir do RNA, foi realizada
utilizando como iniciador oligo-dT
15
(Promega), o qual hibridiza especificamente com a
cauda poli-A das moléculas de RNA mensageiro.
As reações de transcrição reversa (RT) foram realizadas com 2µg de RNA
molde, tampão RT 1x, 2 mM de dNTPs (concentração final), 1 mM de oligo-dT
(concentração final), 10 U de inibidor de Rnase, 4 U de Omniscript Reverse
Trancriptase em um volume final de 20 µL, completado com água livre de DNase e
RNase. A reação foi incubada a 37°C durante 1 hora. O material resultante foi guardado
em alíquotas a -20°C. A concentração do cDNA sintetizado foi determinada pela razão
das absorbâncias determinadas a 260 e 280 nm (A
260
/A
280
)
.
3.10. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Para otimizar e padronizar as condições para a amplificação do cDNA pela
reação de PCR, cada par de iniciador foi utilizado em um ensaio preliminar para
confirmar sua especificidade e o número de ciclos em que a quantidade de cDNA
formado pudesse ser avaliada durante a fase exponencial.
Como a reação de PCR é baseada no aumento logarítimico da quantidade de
produto formado em um intervalo de tempo, não é possível comparar simultaneamente a
29
expressão de múltiplos genes. Assim, as reações para o gene alvo (ALAS) e o gene
controle (GAPDH) foram realizadas separadamente.
Para cada reação de PCR, a concentração de cada uma das amostras foi ajustada
de modo a apresentar 1,2 µg de cDNA em um volume final de 20 µL, contendo: 2 µL
de Tampão 10X; 0,4 µL de dNTP (2,5 mM); MgCl
2
(50 mM); 0,4 µL de Iniciador
forward (10 mM); 0,4 µL de Iniciador reverse
(10 mM) e 0,2 µL de Taq polimerase (5
U/µL).
Os programas utilizados para as reações de amplificação estão mostrados na
Tabela 2. O número de ciclos para cada reação variaram de acordo com a padronização
obtida para cada tecido utilizado (26 e 27, para as brânquias e para a glândula
digestiva, respectivamente). Para testar a eficiência dos iniciadores e confirmar a
presença do fragmento nos clones, foram utilizados 30 ciclos.
Tabela 2. Programas utilizados nos experimentos de PCR
Gene Programa
Tamanho do fragmento
esperado
ALAS
94°C por 30 s
58°C por 30 s
72°C por 30 s
427 pb
GAPDH
94°C por 15 s
49°C por 45 s
72°C por 1 min
275 pb
Os produtos de PCR (10µl da reação) foram submetidos a eletroforese em gel de
agarose 1,2% em tampão TAE 1x, sendo visualizados com brometo de etídeo
(0,7µg/mL), sob luz U.V. O gel foi fotografado e o tamanho do fragmento obtido foi
comparado com o marcador de peso molecular 1kb Plus (Amersham).
30
3.11. Reações de PCR semi-quantitativo
A variação dos níveis de mRNA nas amostras foi avaliada a partir das condições
determinadas na padronização da reação de PCR. Para cada condição foram utilizados o
cDNA de 5 ou 6 indivíduos, de acordo com a disponibilidade do tecido a ser analisado.
Os produtos de PCR foram visualizados e fotografados conforme descrito
anteriormente (item 2.10).
3.12. Análise dos resultados
Após a fotodocumentção dos géis, as imagens foram digitalizadas e a
densitometria das bandas foi realizada através do programa Scion Image for
®
Windows.
A análise da normalidade dos dados foi realizada através do teste Kolgomorov
Smirnov, utilizando-se um p<0,05, através do programa Statistica 6.0. Os dados de
densitometria dos fragmentos amplificados foram comparados estatisticamente pelo
teste t de Student após confirmação da normalidade dos dados.
31
4. RESULTADOS
4.1 Identificação do gene da 5-aminolevulinato sintase (ALAS)
O produto do experimento de subtração foi clonado em células E. coli JM109 no
plasmídeo vetor pGEM-T Easy (figura 8). Realizamos extração plasmidial como forma
de screening preliminar para confirmar a transformação, sendo obtidos cerca de 70
clones. O DNA plasmidial foi purificado e foi realizado o sequenciamento dos
fragmentos, a partir dos quais foram identificados 21 genes diferencialmente expressos.
Após a análise comparativa das sequências obtidas com os bancos de dados disponíveis,
o sequenciamento gerou uma lista de genes com diferentes funções biológicas, dentre
eles, o gene da ALAS, a partir do sequenciamento do fragmento de 540 pb dentre eles, o
fragmento de 540 pb presente no gene da ALAS (Figura 9).
PL48 >>>>>>>>
1 ACCTCGAGGACAGTGGACATGATCAGGAGTTACGGGTCGGGCTTCATCTTCACTACCAGT
>>>>>>>>>>>>>>>>
61 CTCCCTCCCACCACACTGGCGGGGGCCAGGGCATCCATACAGGTTTTGCGCGGTGAAGAA
121 GGCAAGCATCTGCGTGAAAAACATCAGAGCAACGTCCGTTACCTGCGACAGAACCTGATA
181 GAGGCGGGTATTCCTGCTATACACTCCCCGAGTCACATCATTCCCATTCATGTTGGTGAT
241 GCTGCCTTATGCACTCATCTATCTGCGGAGCTCATGAACAAACACGACATCTACGTCCAG
301 GCCATCAACTATCCGACCGTGGCTCGTGGTAGCGAGCGACTCCGCGTGGCTCCAACCCCT
361 CACCACACCAAGGCCATGATGGACTACTTCGTGTCCTCAGTCATCAGAGTCTGGAGTGAC
<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<< PR475
421 AATGGTCTGGAATTGAGCAGGGAGAGATCTGTCTGTCCGGATGAGTGTGAGGTCTGCAAC
481 AAGCCCCTGGGGATCCAGATACTCCAGGCGGAAGAGAAAGTCTGCGGCCGATCCAACTGT
32
Figura 9.: Seqüência de 540 pb do fragmento clonado, contendo uma região do gene da 5-
aminolevulinato sintase (ALAS) e os iniciadores (PL48 e PR475) utilizados neste trabalho p ara ampl
ificação posterior do fragmento de 427 pb.
4.2. Iniciadores
Foram realizados ensaios preliminares com os iniciadores desenhados
utilizando-se o programa computacional Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-
bin/primer3/primer3_www.cgi), a partir da sequência obtida na hibridização subtrativa e
comparação com seqüências de bancos de dados disponíveis em rede. Os iniciadores
desenhados através do referido programa, tanto para o gene da ALAS quanto para o da
GAPDH, foram alinhados com as seqências existentes, de modo a avaliar sua
especificidade em relação aos respectivos genes e o restante do genoma.
Os pares de iniciadores geraram fragmentos dentro do tamanho esperado e com
grande especificidade, gerando uma banda única de 427 pb para o gene ALAS e uma
banda única de 275 pb para o gene da GAPDH (Figura 10).
A) 1 2 B) 1 2
Figura 10. Perfil da eletroforese em gel de agarose 1,2% em TAE 1X, utilizada para avaliar a eficiência
dos iniciadores para ALAS e GAPDH , após a reação de amplificação (PCR). (A) 1. Marcador de peso
molecular 1 kb Plus Ladder (Amersham); 2. fragmento de 427 pb, correspondente à amplificação da
seqüência parcial do gene da ALAS; (B) 1. Marcador de peso molecular 1kb Plus Ladder (Amersham); 2.
Fragmento de 275 pb, a partir do conjunto de cDNA de indivíduos tratados e não tratados.
427
275
33
4.3. Padronização das condições de PCR
Durante a reação de PCR semi-quantitativo, o acúmulo de produtos gerados
deve ser medido durante a fase exponencial da reação através da sua interrupção após
determinado número de ciclos, com o objetivo de estabelecer o ponto de saturação da
reação.
Assim, com o objetivo de padronizar as condições para a realização da RT-PCR
semi-quantitativa foram testados diferentes números de ciclos da reação, de modo a se
determinar o ponto no qual a reação encontrava-se ainda na fase exponencial. Para cada
par de iniciadores para de cada gene foi realizado um ensaio preliminar, com o objetivo
de se estabelecer o número de ciclos em que não se observasse saturação do sinal
gerado pela expressão do gene de interesse durante a reação de PCR. Além disso, é
necessário que seja determinada a quantidade inicial de cDNA, uma vez que esta reflete
a população inicial de RNA total presente no tecido sob as condições analisadas. Desta
forma, a quantidade inicial tem que ser capaz de gerar um sinal dentro da faixa de maior
eficiência para a reação de PCR, além de nos permitir comparar a variação na síntese de
produtos entre os indivíduos tratados e não tratados em relação ao gene controle.
Sendo assim, os ciclos testados nas brânquias para o gene ALAS foram 20, 25, 30
e 35 enquanto que 20, 23, 25, 28 e 30 ciclos foram testados para GAPDH. Para a
glândula digestiva, testamos os ciclos 20, 25, 30 e 35 para ALAS e 25, 30 35, 40 e 45
para GAPDH (Figura 11.A).
Após análise densitométrica das bandas, determinamos o número de ciclos a
serem usados nos experimentos de RT-PCR semi-quantitativo. Para as brânquias foram
estabelecidos 26 e 27 ciclos para ALAS e GAPDH, respectivamente. Para a glândula
digestiva, 27 e 30 ciclos foram os determinados para ALAS e GAPDH, respectivamente
(Figura 11.B).
34
A)
B)
Figura 11. Perfil da eletroforese em gel de agarose 1,2%, TAE 1X. Produtos de PCR obtidos na curva de
expressão para determinação do número de ciclos para padronização das reações de PCR semi-
quantitativo para diferentes tecidos e gráficos da densitometria para determinação do ponto de saturação
25 30 35 40 45
0
100
200
ciclos
Absorbância (U.A)
20 25 30 35
0
100
200
300
400
CICLOS
Absorbância (U.A)
ALAS GAPDH
27 ciclos 30 ciclos
427
p
b
0
50
100
150
200
250
20 25 30 35
Ciclos
Unidades arbitrárias (u.a.)
35
das reações. A) Brânquias e B) Glândula digestiva. As setas indicam o número de ciclos identificados
como ideal.
4.4. RT-PCR semi-quantitativo
A reações foram realizadas separadamente de acordo com o tecido e genes alvo
e controle. Utilizamos o gene da GAPDH para normalizar os níveis de cDNA presentes
nas amostras. Apesar de todos os indivíduos apresentarem a banda correspondente à
amplificação do gene controle, a intensidade captada pela densitometria demonstra que
ocorrem variações internas, que podem ser consideradas normais entre os indivíduos de
uma população.
Assim, a quantidade relativa de cDNA, que reflete a quantidade inicial de RNA
total, foi determinada através da relação densitométrica ALAS/GAPDH. Comparamos
as relações obtidas na densitometria dos indivíduos tratados e não tratados nos
diferentes tecidos: brânquia e glândula digestiva. Nas brânquias observamos que entre
os indivíduos tratados, o gene ALAS foi induzido 0,59 vezes (Figura 12). Na glândula
digestiva observamos que houve uma pequena indução do gene ALAS no grupo tratado.
Entretanto, esta indução não foi significativa, gerando uma relação de 0.93 (Figura 13).
Este resultado próximo a 1 demonstra que a variação na expressão do gene ALAS foi
mínima e com isso não podemos afirmar que realmete ocorreu indução ou repressão do
gene neste tecido.
36
A)
B)
Não tratado Tratado
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
ALAS/GAPDH (Unidades Arbitrárias)
Figura 12. Avaliação semi quantitativa da variação da expressão do gene ALAS em brânquias de ostras C.
gigas após 48 horas de exposição a esgoto doméstico a 33%. A) Gel de agarose 1,2%, TAE 1X. Diferença
de expressão do gene ALAS e GAPDH (normalizador) entre grupo tratado e não tratado. B) Aumento de
4,1 vezes na expressão do gene após tratamento. O gráfico mostra a relação entre a intensidade
densitométrica das bandas geradas pela expressão do gene ALAS, normalizadas com GAPDH para cada
indivídu o (P > 0,05).
Tratados Não tratados
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
ALAS
GAPDH
427 pb
275 pb
37
A)
B)
Figura 13. Avaliação semi quantitativa da variação da expressão do gene ALAS em Glândula digestiva de
ostras C. gigas após 48 horas de exposição a esgoto doméstico a 33%. A) Gel de agarose 1,2%, TAE 1X.
Diferença de expressão do gene ALAS e GAPDH (normalizador) entre indivíduos do grupo tratado e não
Tratados Não tratados
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6
Não tratados Tratados
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
ALAS/GAPDH (U.A)
427 pb
275 pb
ALAS
GAPDH
38
tratado. B) Aumento não significativo na expressão do gene após tratamento. O gráfico mostra a relação
entre a intensidade densitométrica das bandas geradas pela expressão do gene ALAS, normalizadas com
GAPDH (P > 0,05).
5. Discussão
A implementação de programas de monitoramento do ambiente aquático pode
reduzir, ou mesmo evitar, o impacto ambiental sobre os recursos hídricos. Desta forma,
a identificação e a caracterização de genes expressos diferencialmente sob condições de
impacto antropogênico, decorrente da exposição à xenobióticos, bem como alterações
no padrão de expressão destes genes, representam uma ferramenta valiosa para o
delineamento de estratégias que visem garantir a qualidade da água para o consumo e
para as atividades de produção aquícola. O presente estudo está inserido dentro de um
projeto em curso, o qual tem como objetivo o estabelecimento de um “Programa de
Controle e Monitoramento de Águas Destinadas ao Consumo Humano e Cultivo de
Bivalves” (CNPq-Proc. 475995/2003-1). Por isso, realizamos experimentos de
exposição em laboratório de ostras C. gigas à esgoto doméstico. Submetemos o RNA
total extraído das brânquias e glândula digestiva das ostras à análises por RT-PCR
semi-quantitativo para avaliarmos as alterações dos níveis de expressão do gene ALAS.
O trabalho teve como foco o desenvolvimento de uma metodologia capaz de identificar
o impacto gerado pela contaminação desses recursos hídricos pelo esgoto produzido em
áreas com grande concentração de atividades humanas e industriais.
O desenvolvimento de métodos específicos, sensíveis e rápidos para avaliar o grau
de comprometimento ou a qualidade do ambiente aquático é desejável e não deveriam
ser baseados unicamente na detecção de patógenos bacterianos ou em análises físico-
químicas. As metodologias atuais utilizadas na determinação de qualidade sanitária da
água, baseadas no monitoramento dos níveis de coliformes fecais, por exemplo, têm se
mostrado ineficientes para a detecção de enterovírus e protozoários, além da grande
variedade de xenobióticos presentes no esgoto doméstico (HALLING-SØRENSEN et
al., 1998; MUNIAIN-MUJIKA et al., 2003).
Apesar de reconhecermos a necessidade de uma maior caracterização do esgoto
não-tratado utilizado no presente trabalho, devemos destacar que nosso objetivo foi
avaliar a resposta de um gene de um organismo indicador frente a uma mistura de
contaminantes para, posteriormente, poder relacioná-la à presença de um grupo de
39
contaminantes específicos, presentes no esgoto. Sendo assim, os diferentes padrões de
resposta podem identificar esgotos com maiores teores de uma classe ou contaminantes
específicos em sua composição. Dados sobre a composição química e microbiológica
do esgoto doméstico não-tratado utilizado nos experimentos de exposição nos
permitiriam possivelmente rastrear alterações mais específicas na expressão de genes
em resposta a determinado contaminante presente em diferentes concentrações.
Os dados referentes ao esgoto utilizado neste trabalho foram obtidos através da
CASAN, sendo as análises realizadas por técnicos da própria companhia (Tabela 3).
Cabe salientar que a exposição dos animais foi realizada com uma diluição de 33% do
esgoto doméstico, visando possibilitar a manutenção da salinidade na faixa de 25. De
acordo com estudos anteriores desenvolvidos em nosso laboratório, nesta faixa de
salinidade ocorre um aumento na atividade das defesas antioxidantes nas brânquias da
ostra C. rhizophorae, favorecendo, assim, a variação da expressão, seja induzindo ou
reprimindo, de genes envolvidos no processo de biotransformação e conjugação de
xenobióticos (SILVA et al., 2005). Segundo Castro et al. (1985), ostras da espécie C.
rhizophorae apresentam maior taxa de filtração nas salinidades 20 e 25, com valores de
1,33 e 1,4 L/h, respectivamente, a temperatura de 24°C. Esta taxa de filtração mais
elevada aumenta a disponibilidade de energia oriunda da alimentação, propiciando
condições mais adequadas para uma conjugação eficiente de xenobióticos.
Tabela 3.: Dados referente ao esgoto utilizado n o trabalho. Testes realizados por técnicos da CASAN
pH Alcalinidade
mg/L CaCO3
Cloretos
mg Cl
-
/L
DBO
mg/L
DQO
mg/L
Coli. Totais
NMP/100mL
Coli. Fecais
NMP/100mL
6,51 18,24 203 280 370 2,7x10
9
4,7x10
4
Legenda: DQO (Demanda Química de Oxigênio); DBO (Demanda Bioquímica de Oxigênio); Coli
(Coliformes); NMP (Número mais provável).
A expressão diferencial de genes vem se tornando uma ferramenta cada vez mais
utilizada na elucidação dos mecanismos moleculares associados à alterações ambientais.
Para organismos invertebrados, muitos pesquisadores têm obtido sucesso ao utilizar esta
abordagem para a identificação de genes envolvidos nas respostas imunes e respostas
celulares frente a presença de contaminantes químicos e alterações das condições
ambientais (LIAO et al., 2002). Algumas proteínas homólogas de vertebrados têm sido
40
encontradas em organismos invertebrados utilizados como modelo, em resposta a
diferentes mecanismos de resposta a estresse (STEVENSON et al., 2006; CELLURA et
al., 2007; GONZALEZ et al, 2007; PREVODNIK et al, 2007). Entre elas estão as
Metalotioneínas (MT), a Superóxido dismutase (SOD), a Ubiquitina, a Catalase (CAT),
as isoenzimas da família da Glutationa-S-transferase (GST) e as Proteínas de Choque
Térmico (Heat-shock proteins, HSP) ou de Estresse, tanto de alto, como de baixo peso
molecular (GIGLIO et al., 1994 ; BOUTET et al., 2002; BOUTET et al., 2004; HUVET
et al., 2004; TANGUY et al., 2005). Sendo assim, este trabalho tem origem em uma
biblioteca de cDNA, obtida a partir de um experimento de hibridização subtrativa
realizado em nosso laboratório. Dentre os diferentes fragmentos clonados, identificados
como genes diferencialmente expressos em brânquias de C. gigas após a exposição ao
esgoto doméstico, optamos por trabalhar com um fragmento de 540 pb, cuja seqüência,
após análise comparativa em bancos de dados, revelou identidade com parte da
seqüência do gene que codifica para a enzima 5-aminolevulinato sintase (ALA-S). A
comparação com seqüências disponíveis em bancos de dados encontrou mais de 500
sequências homólogas com alto score, ou seja, entre 80 e 200, de diferentes espécies
animais, para o gene que codifica a enzima 5-aminolevulinato sintase (ALA-S). Este
resultado aumenta a confiabilidade na identificação de um gene que apresenta alto grau
de conservação durante a evolução das espécies (DUNCAN et al., 1999). Com base
nestes resultados, foram desenhados iniciadores para as extremidades 5’ e 3’ do
fragmento e, através da amplificação por PCR, confirmamos a especificidade e
eficiência deste par de oligonucleotídeos, sendo gerado um fragmento único de 427 pb.
A partir destes resultados, foram realizados os ensaios de RT-PCR semi-quantitativo.
A maioria dos fragmentos de cDNA gerados através de expressão diferencial
contém a região 3’ não traduzida. Para a grande maioria dos invertebrados, não há
genomas e genes inteiramente sequenciados para podermos inferir o tamanho total do
gene com o qual estamos trabalhando. Por isso, utilizamos o kit Smart Race (Clontech)
na tentativa de amplificarmos as extremidades das regiões 5’ e 3’ para possibilitar o
sequenciamento total do gene. Entretanto, apesar de conseguirmos amplificar as regiões
com eficiência, não obtivemos resultados com o sequenciamento. Acreditamos que o
mal resultado deveu-se principalmente pela falta de uma metodologia mais eficiente de
purificação das bandas retiradas do gel de agarose, impossibilitando uma concentração
satisfatória para as reações de sequenciamento
41
A aplicação da metodologia de RT-PCR semi-quantitativo permite a análise da
expressão de RNAm de um gene induzível, na preseneça de determinado xenobiótico,
em relação a um gene constitutivo. Em muitos estudos, o foco não é a avaliação de
pequenas variações ou mesmo, do número exato de moléculas presentes, mas , sim, do
aumento ou decréscimo na faixa mínima de uma ou duas vezes nos níveis de mRNA
expresso. Apesar da significativa precisão das tecnologias desenvolvidas mais
recentemente, os métodos semi-quantitativos, são ainda largamente empregados e
considerados como apropriados para várias situações ou vários objetivos (MARONE et
al., 2001). De modo a assegurar uma análise quantitativa, a utilização desta estratégia
metodológica deve considerar ainda, como base comparativa, a expressão de um gene
constitutivo (controle interno) (MARONE et al., 2001). Desta forma, podemos
identificar genes ou grupos de genes que apresentem determinado padrão de expressão
na resposta à alterações ambientais e utilizá-los como biomarcadores moleculares
Evidencias demonstram que todos os genes são regulados por alguma condição que
pode, potencialmente se manifestar em campo (BUSTIN, 2000; HUGGETT et al.,
2005). Por isso, o estabelecimento de um gene controle adequado constitui uma escolha
determinante para o sucesso da aplicação do RT-PCR semi-quantitativo, uma vez que
não existe um gene controle ideal. Cada caso exige a análise de um gene candidato a
controle, adequado para uma condição específica. Assim, mesmo sendo a normalização
realizada contra um gene controle que deve apresentar uma expressão uniforme, ou seja,
um gene constitutivo do organismo, como mencionado anteriormente, mesmo aqueles
genes considerados como “housekeeping” sofrem pequenas variações na sua expressão,
em diferentes condições (CHRISTOPHER; DIPAK, 2005).
Neste trabalho, utilizamos como controle o gene que codifica para a enzima
gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) (EC 1.2.1.12), uma enzima glicolítica
envolvida na produção de energia. É uma das mais abundantes proteínas celulares,
expressa em diferentes tipos celulares e é tida como uma molécula “housekeeping”.
Entretanto, estudos vem demonstrando que esta proteína desempenha papel importante
em outra vias metabólicas, demonstrando que seu papel não está restrito apenas à
funções glicolíticas mas também à fusão de membrana, atividade fosfotransferase,
replicação e reparo do DNA (SIROVER, 1999; HARA; CASCIO; SAWA, 2006). Para
este trabalho, a eficácia da utilização deste gene foi confirmada através de experimentos
de RT-PCR semi-quantitativo para o gene da GAPDH, apresentando um padrão de
42
expressão homogêneo entre os indivíduos submetidos às mesmas condições. Entretanto,
o mesmo não aconteceu para o gene que codifica para a β-actina. A variação na
expresão do gene impossibilitou sua utilização como gene controle/normalizador neste
trabalho. Como resultado da padronização do número de ciclos a ser uitlizado, foi
definido 26 e 27 ciclos para o amplificação do fragmento do gene ALAS e 29 e 30 ciclos
para amplificação do fragmento do gene GAPDH, em brânquias e glândula digestiva
respectivamente. Estes ciclos correspondem ao número mínimo de ciclos necessários
para que a reação alcance seu ponto de saturação (WANG; DOYLE; MARK, 1989).
Neste trabalhao, avaliamos a expressão do gene ALAS em diferentes tecidos de C.
Gigas expostas a esgoto doméstico. Observamos que a exposição não foi capaz de
promover variação significativa do gene em glândula digestiva. O grupo que foi exposto
apresentou níveis de expressão do RNAm de ALAS muito próximos aqueles observados
no grupo controle após a normalização dos resultados. Entretanto, a expressão do gene
nas brânquias apresentou uma grande variação entre os grupos. Observamos um
aumento de 68% nos níveis de expressão do grupo exposto em relação ao grupo
controle. Acreditamos que as brânquias apresentaram uma maior variação na expressão
em relação a glândula digestiva em decorrência das suas distintas funções biológicas.
As brânquias de animais filtradores como a C. gigas funcionam como uma peneira,
retendo partículas que ficam suspensas na água, que depois são levadas à boca e
ingeridas, enquanto a glândula digestiva tem como função promover a digestão
enzimática desses alimentos (NIELSEN, 2002). Logo, as brânquias ficam em contato
com o meio ambiente, e por consequência com os contaminantes ali presentes, e este
contato pode ter gerado uma maior ativação do gene ALAS . Além disso, a análise dos
níveis de expressão do RNAm da ALAS em diferentes tecidos da ostra C.gigas,
demonstrou que os níveis basais de expressão são mais altos na glândula digestiva em
relação às bânquias, manto e músculo (dados não mostrados). Isso sugere que quando
exposta ao esgoto doméstico a 33%, a expressão do gene nas brânquias apresenta maior
variação níveis de expressão, pois este tecido parte de uma concentração menor de
RNAm do que a glândula digestiva, um órgão que promove a biotransformação de
contaminantes em moluscos bivalves e por este motivo apresenta concentrações basais
mais altas que as brânquias.
A enzima 5-aminolevulinato sintase catalisa o primeiro passo da biosíntese de
tetrapirróis, promovendo a condensação de succinil-CoA e glicina (SHEMIN, 1955).
43
Heme é um tetrapirrol que serve de gupamento prostético para diversas proteínas
conjugadas como mioglobinas, hemoglobinas, ubiquinonas e citocrom os.
Nos vertebrados, a isoforma ALAS2 é fortemente induzida em células eritróides
durante a hematopoiese, para a formação de hemoglobina. Por outro lado, a isoforma
ALAS1 é expressa em todos os tecidos para prover heme para os citocromos
respiratórios e outras hemoproteínas (SADLON et al., 1999). Sob certas condições, a
biosíntese de heme gera espécies reativas de oxigênio por dois mecanismos gerais:
oxidação aeróbica de precursores do ácido aminolevulínico por metais e reações
fotoquímicas da protoporfirina IX (RYTER; TYRREL, 2000). Desta forma, as
condições a que foram submetidas as ostras, expostas a esgoto doméstico, pode ter
alterado o metabolismo de heme em virtude da demanda energética empregada no
processo de detoxificação em resposta às diferentes classes de contaminantes presentes
no esgoto.
Muitos trabalhos indicam uma co-regulação na síntese de heme pela atividade do
citocromo P450 (CYP). O heme livre é encontrado em baixas concentrações no interior
das células, pois seu aumento causa efeitos cititóxicos (MAY et al., 1995). Assim, a
demanda por heme pode aumentar em resposta ao aumento da síntese e atividade do
citocromo P450 durante a metabolização ou biotransformação de algumas drogas
(LOUIS et al., 1998; IBA et al., 1999). Nesta situação, os níveis de RNAm de ALAS1
são aumentados com o objetivo de suprir a demanda de heme dos apocitocromos. Sob
condições fisiológicas normais, os níveis de heme livre é baixo e severamente regulado
devido ao potencial efeito tóxico que ocorre com o aumento da concentração de heme
não incorporado. Após a acumulação do RNAm e da proteína ALAS1, heme reprime a
expressão de ALAS1 por mecanismos de “feedback” negativo ainda não bem
esclarecidos, os quais inibem o transporte de ALAS1 para o interior da mitocôndria,
aumentando a degradação de heme pela indução da atividade heme oxigenase (CABLE;
MILLER; ISOM, 2000). Desta maneira, a célula é capaz de suprir sua demanda de
heme sem que os níveis de heme livre, bem como de seus precurssores, atinjam níveis
potencialmente tóxicos para o seu metabolismo.
Entretanto, outros estudos têm demonstrado que a regulação pode ocorrer pela
ativação direta da transcrição do gene ALAS1 por algumas drogas, devido à presença de
sequências capazes de interagir com xenobióticos, funcionando como xenosensores
(JOVER, HOFFMANN; MEYER, 1996; FRASER et al., 2003; PODVINEC et al.,
44
2004). Entre as diferentes sequências “enhancers” dos genes CYP, os receptores
nucleares tem se mostrado essenciais na ativação transcripcional desses genes em
resposta a drogas (STOLTZ; ANDERSON, 1999; PODVINEC, et al., 2002). Duas
sequências desses elementos presentes na região 5’-UTR do gene ALAS1 humano
também são encontradas nos receptores X pregnano, androstano e “chicken xenobiotic-
sensing”. No gene ALAS1 esses elementos são chamados “aminolevulinic acid synthase
drug-responsive enhancer sequence” (ADRES) (FRASER et al., 2002). Isso reforça a
idéia de que estas sequências promovem a ativação do genes através de motivos
específicos capazes de interagir com uma variedade de compostos exógenos e
endógenos.
Estudos têm demonstrado que nas células hepáticas, a síntese da ALAS pode ser
induzida por diferentes compostos, como o N-alil-N-isopropilacetamida, o qual é
bastante ativo e, ainda, por diversos medicamentos de uso comum, como anti-micóticos
(Griseo-fulvin, por exemplo), fenobarbital e outros barbitúricos (KARLSON, GEROK;
GROSS, 1989; DOGRA; MAY, 1996). A indução por estas classes de compostos
parece também ter relação com a indução do P450, durante o processo de
biotransformação de xenobióticos. Estudos anteriores mostraram que a administração de
fenobarbital em células de hepatócito de galinha induziu o aumento nos níveis de
mRNA de ALAS e CYP2H1 em 15 e 10 veze, respectivamente (DOGRA et al., 1993).
Aparentemente, não apenas substâncias exógenas podem agir como indutoras da síntese
da ALAS mas também alguns esteróides que podem ocorrer como produtos
intermediários ou finais do metabolismo de lipídeos, como o 17-hidroxi-5β-androstan-
3-ona, porém não os hormônios esteróides fisiológicos (KARLSON et al., 1989).
Moluscos bivalves vêm sendo amplamente utilizados em programas de
biomonitoramento, uma vez que apresentam características como ampla distribuição
geográfica, além de serem sésseis; abundantes e filtradores (WALKER et al, 1996). As
respostas bioquímicas apresentam potencial demonstrado como biomarcadores de
contaminação ambiental, sendo que a caracterização das diferentes classes e tipos
isoenzimáticos pode determinar a susceptibilidade de uma espécie animal a um inibidor
ambiental específico (MORA; FOURNIER; NARBONNE, 1999; BINELLI et al., 2006;
ZANETTE; MONSERRAT; BIANCHINI, 2006). O estudo realizado por Silva et al.,
2001 demonstrou diferença significativa entre a acumulação de nove metais-traço pela
ostra Crassostrea rhizophorae, conferindo ao organismo potencial para sua utilização
45
em programas de biomonitoramento. A espécie ainda apresentou índices de expressão
gênica que puderam ser correlacionados com as concentrações de metais detectados na
região da Baía de Sepetiba (RJ) (REBELLO, 2001).
O estudo da expressão diferencial de genes de Dreisseria polymorpha em contato
com arcolor 1254,3 - metilcolantreno, criseno e atrazine foi capaz de identificar 242
mRNA, alguns envolvidos com mecanismos de detoxificação, o quais podem ser
potencialmente usados para monitorar os efeitos da poluição aquática por estas classes
de compostos (BULTELLE et al., 2002). Estudos utilizando SSH demonstraram
diferença na expressão de genes em Crassostrea gigas, envolvidos nas bases funcionais
da resistência e susceptibilidade a mortalidade no verão, demonstrando de forma
satisfatória a utilização desta técnica em ostras (HUVET et al., 2004). A avaliação da
resposta dessa mesma espécie de bivalve à contaminação por hidrocarbonetos, levou à
clonagem de um total de 258 genes diferencialmente expressos (BOUTET; TANGUY;
MORAGA et al., 2004). Uma biblioteca de cDNA gerada por SSH permitiu a
identificação de 18 genes que tiveram sua expressão avaliada por RT-PCR em
Crassostrea gigas expostas a pesticida (TANGUY et al., 2005). A exposição da ostra C.
gigas à condição de hipoxia em laboratório e análise de brânquias, manto e glândula
digestiva gerou 616 sequências relacionadas a doze funções fisiológicas diferentes,
sendo alguns envolvidos com detoxificação de xenobióticos e matabolismo energético
(DAVID et al., 2005).
46
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Índices baseados nos níveis de expressão gênica podem ser desenvolvidos para
detectar o grau de impacto decorrente de derramamentos de óleo, poluição orgânica,
lançamento de pesticidas e outras fontes de contaminação, como o esgoto doméstico.
A implementação de programas de monitoramento de águas destinadas ao
consumo e atividades aquícolas, como o cultivo de moluscos, através da avaliação do
grau de contaminação por efluentes domésticos, pode servir de alerta precoce,
fornecendo subsídios para a tomada das medidas necessárias para a manutenção da
qualidade dos recursos aquáticos.
Neste trabalho, analisamos a expressão de um gene relacionada ao metabolismo
do grupo heme em diferentes tecidos (glândula digestiva e brânquias) da ostra C. gigas.
Nossos resultados demonstraram que, em condições controladas de laboratório, houve
uma indução significativa no aumento dos níveis (68%) de RNAm de ALAS. Estes
dados sugerem que o gene ALAS pode ser considerado como um potencial candidato a
biomarcador molecular por esgoto doméstico. Por isso, os resultados aqui apresentados
serão de fundamental importância para a continuidade da linha de pesquisa.
Futuramente, temos como objetivo realizar a clonagem e o sequenciamento deste
gene para que possamos complementar as análises comparativas com as sequências já
descritas, bem como, aprofundar nosso conhecimentos sobre os mecanismos
moleculares envolvidos nos processos regulatórios da biosíntese de heme. Além disso,
pretendemos realizar experimentos em campo, os quais já forma iniciados, visando
avaliar os níveis de RNAm de ALAS, após exposição a esgoto doméstico in situ, bem
como validar a metodologia aqui empregada em experimentos em laboratório.
47
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