Download PDF
ads:
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
CENTRO BIOMÉDICO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOPATOLOGIA CLÍNICA E
EXPERIMENTAL
ESTUDO DA AÇÃO DA RADIAÇÃO
ULTRAVIOLETA E CLORETO ESTANOSO EM
DIFERENTES SISTEMAS BIOLÓGICOS
ELLEN SERRI DA MOTTA
Rio de Janeiro
2006
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
CENTRO BIOMÉDICO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOPATOLOGIA CLÍNICA E EXPERIMENTAL
ESTUDO DA AÇÃO DA RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA E CLORETO ESTANOSO EM
DIFERENTES SISTEMAS BIOLÓGICOS
Ellen Serri da Motta
Dissertação apresentada à Pós-Graduação em Fisiopatologia Clínica
e Experimental, da Universidade do Estado do Rio de Janeiro,
visando a obtenção do grau de Mestre.
Rio de Janeiro
2006
ads:
FICHA CATALOGRÁFICA
Motta, Ellen Serri da
Estudo da ação da radiação ultravioleta e cloreto estanoso e
m
diferentes sistemas biológicos / Ellen Serri da Motta, 2006.
xx, 82 p.:il.
Orientador: José Carlos Pelielo de Mattos
Co-orientador: Adriano Caldeira de Araujo
Dissertação (mestrado) – Universidade do Estado do Rio de Janeiro,
Centro Biomédico, Faculdade de Ciências Médicas
1. Cloreto estanoso 2. Radiação ultravioleta 3. Espécies reativas de
oxigênio 4. Teses I. De Mattos, José Carlos Pelielo. II. Universidade do
Estado do Rio de Janeiro, Centro Biomédico, Faculdade de Ciências
Médicas. III. Título
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
CENTRO BIOMÉDICO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOPATOLOGIA CLÍNICA E EXPERIMENTAL
ESTUDO DA AÇÃ O DA RADIAÇ ÃO ULTRAVIOLE TA E CLORETO ESTANOSO
EM DIFERENTES SISTEMAS BIOLÓGICOS
Ellen Serri da Motta
Orientador: Prof. Dr. José Carlos Pelielo de Mattos
Co-orientador: Prof. Dr. Adriano Caldeira de Araujo
Aprovada em 20 de fevereiro de 2006, pela seguinte banca examinadora:
Prof. Dr.: Carlos Eduardo Bonacossa de Almeida
Prof. Dr.: José Augusto Adler Pereira
Prof. Dr.: Nasser Ribeiro Asad
Rio de Janeiro
2006
O presente trabalho foi desenvolvido sob a orientação do Prof. José Carlos Pelielo de
Mattos e Prof. Adriano Caldeira de Araujo, no Laboratório de Radio e Fotobiologia do
Departamento de Biofísica e Biometria, do Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes,
em colaboração com os Departamentos de Bioquímica e de Patologia e Laboratório, da
Universidade do Estado do Rio de Janeiro, na vigência dos auxílios concedidos pela
CAPES, CNPq, FAPERJ e UERJ.
“Uma jornada de mil milhas começa com um simples passo.”
Lao-tse
Aos meus pais Clarenson e Maria Helena,
ao meu irmão Flávio e ao meu noivo Júnior.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela minha vida.
Ao Professor José Carlos Pelielo de Mattos, pela amizade, carinho, disponibilidade em
todos os momentos e, principalmente, por ter acreditado em mim desde o início, me
ensinado tudo. Obrigada por ter contribuído na minha formação científica.
Ao Professor Adriano Caldeira de Araujo, pela simplicidade, humor, paciência, incentivo,
amizade, disponibilidade na correção deste trabalho e, muito obrigada pelo carinhoso
apelido de Ellenzinha, que acabou se disseminando no laboratório.
Ao Professor Flávio José da Silva Dantas, pelo otimismo sempre presente, dizendo: “Calma
Ellenzinha, tudo vai dar certo”, e por ter alegrado as tardes do laboratório com as famosas
tortas de limão.
Ao Professor Luis Fernando Marques Dorvillé, pela amizade, confiança em mim depositada
e por ter me indicado ao Professor José Carlos, dando início a este trabalho.
Aos professores do departamento Nasser, Lídia, Bob e Milton, pelo aprendizado ao longo
desses anos.
À minha família e ao meu noivo, que sempre incentivaram e apoiaram as minhas decisões,
me acompanhando em todos os momentos, compreendendo as minhas ausências e
proporcionando meios para que eu chegasse até aqui. Amo muito vocês!!
Aos amigos do laboratório Claudia, minha companheira de quarto, Márcia, Izabel, Michelle,
Vanessa e Anderson, pelo companheirismo, divisão de bancadas, idéias e pelos momentos
de descontração e desabafo.
Aos estagiários do laboratório Josiane, Renata, Eric e Cristiane pela amizade e ajuda nos
experimentos. Um agradecimento especial ao aluno Paulo Thiago, que perdeu feriados e
finais de semana me ajudando. Sem você este trabalho não seria possível. Obrigada pela sua
amizade e pelas suas “viagens”.
Aos amigos que já passaram pelo laboratório Alessandra, Ana Paula, Samara, Sílvia, Paula,
Carla e Diana, pela convivência.
A todos os professores, estagiários e funcionários do Departamento, pela convivência
tranqüila, em especial ao Sr. Antônio e a Simone pela responsabilidade e competência na
lavagem dos materiais, tornando este trabalho possível. Obrigada também pela sua amizade,
Simone.
Aos Departamentos de Bioquímica e de Patologia e Laboratório, que cederam materiais e
equipamentos para realização deste trabalho.
Ao Professor Egberto Gaspar de Moura, pela excelente coordenação do Programa de Pós-
graduação em Fisiopatologia Clínica e Experimental.
A Amélia Gomes, pela extrema competência na realização do seu trabalho.
A todos que, sem querer, eu possa ter esquecido e que contribuíram para realização deste
trabalho.
ix
SUMÁRIO
Página
LISTA DE ILUSTRAÇÕES...................................................................................................xi
LISTA DE QUADROS E TABELA.....................................................................................xiv
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS............................................................................xv
RESUMO..............................................................................................................................xix
ABSTRACT...........................................................................................................................xx
INTRODUÇÃO.......................................................................................................................1
1. Considerações iniciais..................................................................................................1
2. Estanho.........................................................................................................................1
3. Radiação Ultravioleta...................................................................................................6
4. Espécies Reativas de Oxigênio...................................................................................12
5. Mecanismos de Defesa contra as ERO e Reparação do DNA...................................14
5.1. Reparação por Excisão de Bases.........................................................................15
5.1.1. DNA Glicosilases relevantes neste trabalho..................................................16
5.1.2. AP Endonucleases relevantes neste trabalho..................................................18
OBJETIVOS...........................................................................................................................21
1. Objetivos Gerais..........................................................................................................21
2. Objetivos Específicos..................................................................................................21
MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................................22
1. Composição dos meios de cultura e das soluções empregadas neste estudo..............22
2. Técnica de inativação celular......................................................................................23
2.1. Cepas bacterianas................................................................................................23
2.2. Conservação das cepas bacterianas.....................................................................23
x
2.3. Obtenção das culturas bacterianas.......................................................................24
2.4. Tratamento com radiação ultravioleta e cloreto estanoso...................................24
3. Técnica de eletroforese em gel alcalino de agarose para experimentos com
bactérias.......................................................................................................................26
3.1. Tratamento com radiação ultravioleta e cloreto estanoso...................................27
3.2. Preparação dos blocos em agarose low melting point.........................................27
3.3. Lise das células e lavagem dos blocos................................................................28
3.4. Gel de agarose.....................................................................................................28
3.5. Eletroforese alcalina............................................................................................28
4. Técnica de eletroforese em gel de agarose para experimentos com plasmídios.........30
4.1. Extração de DNA plasmidial...............................................................................30
4.2. Preparação das amostras......................................................................................30
4.3. Gel de agarose.....................................................................................................32
4.4. Eletroforese neutra..............................................................................................33
RESULTADOS E DISCUSSÃO...........................................................................................35
1. Eletroforese em gel de agarose....................................................................................35
2. Inativação bacteriana...................................................................................................44
3. Eletroforese em gel alcalino de agarose......................................................................53
CONCLUSÕES......................................................................................................................62
ETAPAS FUTURAS..............................................................................................................64
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................................65
PRODUÇÃO CIENTÍFICA DURANTE A PÓS-GRADUAÇÃO.......................................78
xi
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Página
Figura 1. Representação esquemática do mecanismo de reparo por excisão de bases..........16
Figura 2. Representação esquemática da técnica de inativação bacteriana ...........................26
Figura 3. Representação esquemática da técnica de eletroforese em gel alcalino de
agarose...................................................................................................................29
Figura 4. Representação esquemática da técnica de extração plasmidial..............................30
Figura 5. Representação do DNA plasmidial nas três formas................................................33
Figura 6. Representação esquemática do tratamento e eletroforese em gel de agarose do
DNA plamidial.......................................................................................................34
Figura 7. a. Eletroforese em gel de agarose (0,8%) e análise densitométrica do plasmídio
pUC 9.1 tratado com SnCl
2
(200µg/mL) e UVA (90kJ/m
2
), isoladamente, e pré-
tratado com UVA seguido da incubação com SnCl
2
; b. Número médio de
quebras/genoma no DNA plasmidial tratado com SnCl
2
(200µg/mL) e UVA
(90kJ/m
2
), isoladamente, e pré-tratado com UVA seguido da incubação com
SnCl
2
......................................................................................................................36
Figura 8. a. Eletroforese em gel de agarose (0,8%) e análise densitométrica do plasmídio
pUC 9.1 tratado com SnCl
2
(200µg/mL) e UVB (10kJ/m
2
), isoladamente, e pré-
tratado com UVB seguido da incubação com SnCl
2
; b. Número médio de
quebras/genoma no DNA plasmidial tratado com SnCl
2
(200µg/mL) e UVB
(10kJ/m
2
), isoladamente, e pré-tratado com UVB seguido da incubação com
SnCl
2
......................................................................................................................38
Figura 9. a. Eletroforese em gel de agarose (0,8%) e análise densitométrica do plasmídio
pUC 9.1 tratado com diferentes doses de radiação ultravioleta C; b. Número
xii
médio de quebras/genoma no DNA plasmidial tratado com diferentes doses de
UVC.......................................................................................................................40
Figura 10. a. Eletroforese em gel de agarose (0,8%) e análise densitométrica do plasmídio
pUC 9.1 tratado com SnCl
2
(200µg/mL) e UVC (5 e 50 J/m
2
), isoladamente, e
pré-tratado com UVC seguido da incubação com SnCl
2
; b. Número médio de
quebras/genoma no DNA plasmidial tratado com SnCl
2
(200µg/mL) e UVC (5 e
50 J/m
2
), isoladamente, e pré-tratado com UVC seguido da incubação com
SnCl
2
......................................................................................................................41
Figura 11. a. Eletroforese em gel de agarose (0,8%) e análise densitométrica do plasmídio
pUC 9.1 tratado com SnCl
2
(200µg/mL) e UVC (100 e 500 J/m
2
), isoladamente,
e pré-tratado com UVC seguido da incubação com SnCl
2
; b. Número médio de
quebras/genoma no DNA plasmidial tratado com SnCl
2
(200µg/mL) e UVC (100
e 500 J/m
2
), isoladamente, e pré-tratado com UVC seguido da incubação com
SnCl
2
......................................................................................................................42
Figura 12. Sobrevivência de E. coli AB1157; BH20; BW375; BW9091; BW527 tratadas
com SnCl
2
(25µg/mL)...........................................................................................45
Figura 13. Sobrevivência de E. coli AB1157; BW527; BW434; BW544; BW534 tratadas
com SnCl
2
(25µg/mL)...........................................................................................47
Figura 14. Sobrevivência de E. coli AB1157; BH20; BW375; BW9091; BW527; BW434;
BW544; BW534; BW535 tratadas com SnCl
2
(25µg/mL)...................................48
Figura 15. Sobrevivência de E. coli AB1157; BH20; BW375; BW9091; BW527 pré-
iluminadas com UVA (90kJ/m
2
) seguido da incubação com SnCl
2
(25µg/mL)..............................................................................................................50
Figura 16. Sobrevivência de E. coli AB1157; BW527; BW434; BW544; BW534 pré-
iluminadas com UVA (90kJ/m
2
) seguido da incubação com SnCl
2
(25µg/mL)..............................................................................................................51
Figura 17. Sobrevivência de E. coli AB1157; BH20; BW375; BW9091; BW527; BW434;
BW544; BW534; BW535 pré-iluminadas com UVA (90kJ/m
2
) seguido da
incubação com SnCl
2
(25µg/mL)..........................................................................52
Figura 18. Eletroforese em gel alcalino de agarose e análise densitométrica do DNA de E.
coli BH20 tratada com SnCl
2
(25µg/mL) e UVA (90kJ/m
2
), isoladamente, e pré-
xiii
tratada com UVA seguido da incubação com
SnCl
2
......................................................................................................................55
Figura 19. Eletroforese em gel alcalino de agarose e análise densitométrica do DNA de E.
coli AB1157 tratada com SnCl
2
(25µg/mL) e UVA (90kJ/m
2
), isoladamente, e
pré-tratada com UVA, seguido da incubação com
SnCl
2
......................................................................................................................56
Figura 20. Eletroforese em gel alcalino de agarose e análise densitométrica do DNA de E.
coli BW375 tratada com SnCl
2
(25µg/mL) e UVA (90kJ/m
2
), isoladamente, e pré-
tratada com UVA seguido da incubação com SnCl
2
.............................................57
Figura 21. Eletroforese em gel alcalino de agarose e análise densitométrica do DNA de E.
coli BW9091 tratada com SnCl
2
(25µg/mL) e UVA (90kJ/m
2
), isoladamente, e
pré-tratada com UVA seguido da incubação com
SnCl
2
......................................................................................................................58
Figura 22. Eletroforese em gel alcalino de agarose e análise densitométrica do DNA de E.
coli BW527 tratada com SnCl
2
(25µg/mL) e UVA (90kJ/m
2
), isoladamente, e pré-
tratada com UVA seguido da incubação com SnCl
2
.............................................59
Figura 23. Eletroforese em gel alcalino de agarose e análise densitométrica do DNA de E.
coli BW434 tratada com SnCl
2
(25µg/mL) e UVA (90kJ/m
2
), isoladamente, e pré-
tratada com UVA seguido da incubação com SnCl
2
.............................................59
Figura 24. Eletroforese em gel alcalino de agarose e análise densitométrica do DNA de E.
coli BW534 tratada com SnCl
2
(25µg/mL) e UVA (90kJ/m
2
), isoladamente, e pré-
tratada com UVA seguido da incubação com SnCl
2
.............................................60
Figura 25. Eletroforese em gel alcalino de agarose e análise densitométrica do DNA de E.
coli BW544 tratada com SnCl
2
(25µg/mL) e UVA (90kJ/m
2
), isoladamente, e pré-
tratada com UVA seguido da incubação com SnCl
2
.............................................60
Figura 26. Eletroforese em gel alcalino de agarose e análise densitométrica do DNA de E.
coli BW535 tratada com SnCl
2
(25µg/mL) e UVA (90kJ/m
2
), isoladamente, e pré-
tratada com UVA seguido da incubação com SnCl
2
.............................................61
xiv
LISTA DE QUADROS E TABELA
Página
Quadro 1. Redução do oxigênio por via monoeletrônica e pela citocromo C oxidase..........13
Quadro 2. Reação de Fenton e de Haber-Weiss.....................................................................13
Quadro 3. Reação similar à de Fenton com a participação do estanho..................................13
Quadro 4. Meios de cultura e soluções utilizadas neste estudo............................................22
Quadro 5. Cepas de E. coli e características genéticas de interesse para este trabalho..........23
Tabela 1. Picos de absorção de DNA plasmidial (pUC 9.1) tratado com SnCl
2
, UVA, UVB e
pré-tratado com UVA ou UVB, seguido da incubação com SnCl
2
.........................39
xv
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
% - porcentagem
γ – gama
µg – micrograma
µL – microlitro
µM – micromolar
χ
2
- qui-quadrado
1
O
2
– oxigênio singleto
99m
Tc – Tecnécio-99m
Agarose LMP - agarose low melting point
ANOVA – análise de variância
AP endonucleases – endonucleases que reconhecem sítios apurínicos ou apirimidínicos
BER – base excision repair (reparo por excisão de bases)
CA – conformação em círculo aberto ou forma II do plasmídio pUC 9.1
can
+
- resistência ao antibiótico canamicina
cm – centímetro
CPD – dímeros ciclobutânicos de pirimidinas
Cu – cobre
DNA – ácido desoxirribonucléico
DNA glicosilases – glicosilases que reconhecem e retiram bases lesadas do DNA
DNA ligase – enzima que promove a união de bases à cadeia de fosfato e açúcar do DNA
DNA polimerase I – enzima que incorpora novas bases ao DNA
e
-
- elétron
E. coli – Escherichia coli
xvi
EDTA – ácido etilenodiaminotetracético
ERO – espécies reativas de oxigênio
Fapy glicosilase – formamidopirimidina-DNA glicosilase
Fe – ferro
Fe
2+
- íon ferroso
Fe
3+
- íon férrico
Fpg – formamidopirimidina-DNA glicosilase
fpg ou mut M – gene que codifica para síntese da proteína Fpg
FS – fração de sobrevivência (N/No)
h – hora
H
+
- íon hidrogênio
H
2
O – água
H
2
O
2
– peróxido de hidrogênio
J/m
2
/s – joule por metro quadrado por segundo
kJ/m
2
– quilojoule por metro quadrado
L – conformação linear ou forma III do plasmídio pUC 9.1
LB – meio Luria-Bertani
LiCl – cloreto de lítio
Mg
2+
- íons magnésio
min – minuto
mL- mililitro
MMS – metil metanosulfonato
NaCl – cloreto de sódio
NaOH – hidróxido de sódio
nfo – gene que codifica para a síntese da proteína endonuclease IV
xvii
Nfo – proteína endonuclease IV
ng – nanograma
nm – nanômetro
nth – gene que codifica para a síntese da enzima timina glicol-DNA glicosilase ou
endonuclease III
Nth – proteína timina glicol-DNA glicosilase ou endonuclease III
O
2
– oxigênio
O
2
-
- radical oxigênio
O
2
y
-
- radical superóxido
ºC – grau Celsius
OH
y
- radical hidroxil
oxyR – gene que controla a regulação de estresse oxidativo induzido por peróxido
pH – potencial hidrogeniônico
recA – gene, cujo produto participa do reparo por recombinação
RNAse – enzima que degrada RNA
RNA-t – ácido ribonucléico transportador
sfiA::lacZ – fusão de operons que codificam para síntese da proteína β-galactosidase
SH – conformação superhelicoidizada ou forma I do plasmídio pUC 9.1
sítios AP – sítios apurínicos ou apirimidínicos
Sn
2+
- íon estanoso
Sn
3+
- íon estânico
SnCl
2
– cloreto estanoso
SOD – superóxido dismutase
SOS – conjunto de funções celulares indutíveis
TAE –tampão tris-acetato EDTA
xviii
TE – solução tris-EDTA
UV – ultravioleta
UVA – ultravioleta A
UVB – ultravioleta B
UVC – ultravioleta C
V – Volts
W – Watts
xthA – gene que codifica para a síntese da proteína exonuclease III
XthA - proteína exonuclease III
xix
RESUMO
O cloreto estanoso (SnCl
2
), utilizado em diversos setores da atividade humana e a
radiação ultravioleta (UV), compreendendo o UVA (400 a 320 nm), UVB (320 a 290 nm) e
UVC (290 a 200 nm), são agentes que lesam o DNA, por diferentes vias. O objetivo deste
trabalho foi estudar o efeito da combinação da radiação UV com o SnCl
2
, uma vez que as
lesões induzidas por eles podem ser mediadas pela geração de espécies reativas de oxigênio.
Assim, avaliou-se a genotoxicidade e citotoxicidade do pré-tratamento com UV, seguido da
incubação com SnCl
2
(UV+SnCl
2
) em plasmidios e em células de E. coli, mutantes em
reparo por excisão de bases (BER), buscando identificar as enzimas envolvidas na
restauração das lesões produzidas pelos dois agentes. Para tal, empregaram-se as técnicas de
eletroforese em gel de agarose, para experimentos com plasmídios; sobrevivência e
eletroforese alcalina em gel de agarose, para experimentos em bactérias. Os resultados com
DNA plasmidial mostratam: i) o SnCl
2
, o UVA e UVB induzem quebras, ao contrário do
UVC; ii) UVA +SnCl2 ou UVB + SnCl
2
, protegeram o plasmídio dos efeitos do SnCl
2
e não
observou-se proteção para UVC+SnCl
2
; iii) o SnCl
2
alterou o espectro de absorção do DNA
plasmidial, sendo que UVA+SnCl2 ou UVB+SnCl
2
reduziram o efeito causado por este sal,
isoladamente. Os resultados de inativação mostraram que: i) o SnCl
2
inativa as cepas
estudadas, na seguinte ordem xthA-nth-nfo > nfo > fpg, em relação `a selvagem; ii)
UVA+SnCl
2
induziu efeito sinergístico letal em todas as cepas, novamente, na seguinte
ordem xthA-nth-nfo > nfo > fpg, em relação à selvagem. Na eletroforese alcalina, os
resultados indicaram que: i) o UVA induziu quebras no DNA de todas as cepas; ii) o SnCl
2
induziu um número de quebras superior ao do UVA, no DNA de todas as cepas, à exceção
de fpg; iii) UVA+ SnCl
2
induziu mais quebras, se comparado ao SnCl
2
isoladamente, sendo
xthA-nth-nfo > nfo. Este estudo sugere que o reparo das lesões produzidas pelos agentes
testados, nas condições deste trabalho, é preferencialmente realizado pelos produtos dos
genes fpg e nfo e que a enzima Nth participa de alguma fase do reparo.
xx
ABSTRACT
Stannous chloride (SnCl
2
), widely used in human day life and ultraviolet light
radiation (UV), including UVA (400-320 nm), UVB (320-290 nm) and UVC (290-200 nm),
are agents able to induce DNA lesions through different ways. Reactive oxygen species
(ROS) can be generated by UV in a range between 290-400 nm, and it is also produced by
stannous ion. Since ROS are involved in cellular damage induction, the aim of this work
was to study the association of UV and SnCl
2
. So, the genotoxicity and citotoxicity induced
by the UV pre-illumination, followed by SnCl
2
treatment, was evaluated in plasmid DNA
and E. coli base excision repair mutants in order to identify genes that play a role in the
DNA lesions repair induced by these agents. Experiments were done using neutral and
alkaline agarose gel electrophoresis and bacterial inactivation techniques. Experiments
carried out with plasmid DNA showed that: i) SnCl
2
, UVA and UVB radiation induced
DNA strand breaks, but it not happened with UVC; ii) UVA or UVB pre-illumination
protected plasmid DNA against the SnCl
2
-induced damage; iii) SnCl
2
was able to modify
the plasmid DNA absorption spectrum and the UVA or UVB pre-illumination decreased
this effect. The survival assays showed that: i) SnCl
2
decreased the survival fractions in all
strains tested, in the following sequence xthA-nth-nfo > nfo > fpg, compared to wild type; ii)
lethal synergistic effect was observed after UVA pre-illumination, plus SnCl
2
incubation, in
all strains assayed, in the same sequence above, compared to wild type. The alkaline agarose
gel electrophoresis assays pointed that: i) UVA light was able to induce DNA breaks in all
tested strains; ii) SnCl
2
-induced DNA strand breaks were higher than those from UVA, in
all strains, except in fpg; iii) UVA pre-illumination followed by SnCl
2
treatment, promoted
increasing in DNA breaks compared with SnCl
2
alone, being once more xthA-nth-nfo > nfo.
In summary, data suggest that DNA damage repair induced by UV and stannous chloride, in
the tested conditions, is preferentially done by fpg and nfo genes and Nth protein is involved
in some repair step.
Introdução
1
INTRODUÇ ÃO
1. Considerações iniciais
Os seres vivos estão diariamente expostos a uma variedade de agentes químicos e
físicos, que podem causar lesões em diversas estruturas celulares, incluindo o material
genético. O cloreto estanoso (SnCl
2
) e a radiação ultravioleta (UV) são exemplos desses
tipos de agentes, que possuem as suas ações mediadas pela geração de espécies reativas de
oxigênio (ERO) (Dantas et al., 1996; Pfeifer et al., 2005).
As ERO estão envolvidas em diversos processos celulares, sendo alguns benéficos,
com atuações nas respostas imunitárias e nas reações inflamatórias e outros lesivos, como a
mutagênese, o envelhecimento precoce e a cancerização, podendo levar, até mesmo, à morte
celular. Entretanto, durante o processo evolutivo, surgiram diversos mecanismos de defesa
contra as ERO, enzimáticos ou não, que procuram manter íntegras as propriedades celulares,
sendo o reparo por excisão de bases, um dos mais importantes na restauração de lesões
oxidativas (Leitão e Alcantara-Gomes, 1997).
2. Estanho
O estanho, classificado como metal pertencente ao grupo 14 da tabela periódica, é
um dos mais antigos elementos químicos conhecidos, sendo encontrado, na natureza, sob a
forma de cassiterita. Sua utilização pelo homem data da Pré-história, quando o estanho era
empregado junto com o cobre para produção de armas e de ferramentas (Lee, 1996).
Introdução
2
Sua utilização pode ser verificada até hoje, em diversos setores industriais, o que
coloca os seres humanos em contato direto com este agente. Na forma orgânica, o estanho é
utilizado em preparações biocidas, como fungicidas, inseticidas e herbicidas (Hallas &
Cooney, 1981). Na forma inorgânica, é freqüentemente empregado como anticorrosivo em
embalagens metálicas de alimentos (Budavery, 2001), como conservante em refrigerantes
(McLean et al., 1983) e como veiculador do flúor na composição de cremes dentais e
enxagüantes orais (Faller et al., 1995; White, 1995).
A aplicação do estanho em diferentes compostos utilizados pelo homem, já
justificaria a necessidade de se estudar os efeitos biológicos decorrentes de sua exposição.
Porém, segundo Rader (1991), a ingestão do estanho por via oral não é preocupante, uma
vez que sua absorção gastrointestinal é baixa.
Contudo, o estanho, sob a forma de SnCl
2
, compondo radiofármacos, é amplamente
empregado em exames da área de medicina nuclear, sendo um dos compostos mais
utilizados como agente redutor para a fixação do tecnécio-99m (
99m
Tc) a estruturas e
moléculas de interesse biológico (Hladik et al., 1987; Saha, 1992). Neste caso, sua
administração é feita por via endovenosa, não restando dúvidas quanto a sua absorção, o que
mais uma vez demonstra a importância de se estudar os efeitos biológicos induzidos por este
agente.
Diversos efeitos biológicos induzidos pelo estanho já se encontram descritos na
literatura. Gillespie et al. (1973) mostraram que o estanho, quando injetado em animais de
laboratório, pode produzir estimulação e subseqüente depressão do sistema nervoso central,
bem como diarréia e vômitos. Em 1990, Larsson observou que o estanho pode causar
irritação da mucosa oral de ratos.
Hattori e Maehashi (1994) verificaram que o SnCl
2
facilita a entrada de cálcio nos
terminais de nervos motores de sapos e ratos. Efeito semelhante foi observado por Hattori e
Introdução
3
colaboradores (2001) ao observar que, em osteoblastos, o SnCl
2
também facilita a entrada
de cálcio, através dos canais de cálcio L-type voltagem-dependente, sob condição de
despolarização da membrana plasmática.
Silva de Souza et al. (2003), estudando o efeito do SnCl
2
em Corynebacterium
diphtheriae, mostraram que o tratamento com este agente foi capaz de alterar a morfologia
celular e as propriedades adesivas destas células.
El-Demerdash e colaboradores (2005) observaram que o SnCl
2
induziu a geração de
espécies reativas de oxigênio em células do fígado, rim, pulmão, cérebro e coração de
coelhos, além de alterar a atividade das enzimas glutationa transferase e aspartato
aminotransferase. Neste mesmo estudo também foram observadas alterações
histopatológicas em hepatócitos e vasos sangüíneos desses animais. Yousef (2005),
estudando, também, o efeito do SnCl
2
em coelhos, verificou que este agente provocou uma
diminuição na performance reprodutiva desses animais em conseqüência da diminuição da
qualidade do sêmen.
Com relação às atividades genotóxica e mutagênica do estanho, existem resultados
contraditórios na literatura. Em 1980, Kanematsu e colaboradores, através da técnica do Rec
Ensaio em cepas de Bacillus subtilis, avaliaram a potencialidade genotóxica de 127
compostos metálicos, dentre eles o SnCl
2
, encontrando um resultado negativo para este
agente, sugerindo que o mesmo não era capaz de induzir lesões na molécula de DNA.
Utilizando a mesma técnica, Nishioka (1975) encontrou resultados semelhantes. Singh
(1983) não detectou mutagenicidade induzida pelo SnCl
2
em Saccharomyces cerevisae e
Tripathy et al. (1990) descreveram ausência de efeito genotóxico do SnCl
2
em células
primordiais de Drosophila melanogaster.
Por outro lado, McLean e colaboradores (1983) mostraram, através da técnica de
sedimentação em gradiente alcalino de sacarose, que o SnCl
2
era capaz de induzir lesões no
Introdução
4
DNA de células de ovário de hamster chinês. Da mesma forma, Olivier e Marzin (1987),
utilizando a técnica do SOS cromoteste, concluíram que o SnCl
2
era genotóxico para células
de Escherichia coli (E. coli).
Devido aos resultados conflitantes na literatura, bem como pela ampla utilização do
estanho em diversos setores humanos, grupos de pesquisa vêm, nos últimos anos,
intensificando os estudos acerca deste agente, principalmente sob a forma de SnCl
2
, a fim de
verificar o seu potencial citotóxico, genotóxico e mutagênico.
Resultados obtidos por Bernardo-Filho e colaboradores (1994) mostraram que o
SnCl
2
era capaz de causar inativação em cepas de E. coli, bem como induzir as funções SOS
(indução lisogênica e filamentação), sugerindo um potencial genotóxico para este agente.
Em 1996, Dantas e colaboradores verificaram que a ação lesiva do SnCl
2
em E. coli
era mediada pela produção de ERO, uma vez que a presença de catalase (enzima que
degrada peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)), tiouréia e benzoato de sódio (aceptores de radicais
livres) e dipiridil (quelante de íons metálicos) protegia as células da inativação produzida
pelo SnCl
2
. Neste estudo, foi sugerido, ainda, que o SnCl
2
poderia gerar ERO através de
uma reação do tipo Fenton. Resultados semelhantes foram encontrados por Caldeira-de-
Araujo e colaboradores (1996). Estes autores, estudando os efeitos do SnCl
2
sobre DNA
plasmidial pUC 9.1, verificaram, através da técnica de eletroforese em gel de agarose, que
concentrações crescentes de SnCl
2
eram capazes de induzir lesões do tipo quebra na
molécula de DNA, apresentando um efeito dose-resposta e, também, que esses efeitos
diminuíam na presença de EDTA (quelante de íons divalentes) e benzoato de sódio (aceptor
de radicais livres), reforçando, mais uma vez, a hipótese de que as lesões produzidas pelo
SnCl
2
sejam mediadas por ERO.
Utilizando cartilagem de tubarão, Felzenszwalb e colaboradores (1998), mostraram
um efeito protetor deste agente contra as ERO induzidas pelo SnCl
2
, uma vez que, quando
Introdução
5
os agentes foram aplicados em conjunto, a cartilagem de tubarão diminuiu o número de
quebras induzidas pelo SnCl
2
em DNA plasmidial, bem como protegeu contra a inativação
de E.coli tratada com este sal e aumentou a eficiência de transformação bacteriana de
plasmídios pUC 9.1 tratados com este mesmo agente. Resultados semelhantes foram
encontrados por Silva e colaboradores (1994), ao verificar um efeito protetor da radiação
UVA contra a inativação de E. coli induzida pelo SnCl
2
, quando os agentes foram
empregados simultaneamente.
Cabral e colaboradores (1998) avaliaram a potencialidade citotóxica do SnCl
2
em
cepas de E. coli deficientes no mecanismo de reparo por excisão de bases, identificando a
enzima Exonuclease III, produto do gene xthA, como a mais importante no reparo das
lesões induzidas pelo SnCl
2
. Devido ao fato desta enzima estar ligada ao reparo de danos
oxidativos, foi sugerido, novamente, que o SnCl
2
poderia estar ocasionado lesões mediadas
pela geração de ERO. Neste estudo, os autores também avaliaram a potencialidade
mutagênica do SnCl
2
em plasmídios pAC 189, que contêm o gene supF de Escherichia coli,
verificando que o agente em estudo foi capaz de induzir mutações, do tipo transversões G:C
Æ T:A, provavelmente devido à formação de lesões 8-oxoguanina, e G:C Æ C:G,
proveniente de uma lesão ainda não identificada.
Em 1999, Dantas e colaboradores estudaram o efeito de diferentes concentrações de
SnCl
2
sobre DNA plasmidial pUC 9.1, através de eletroforese em gel de agarose, em pH
neutro e ácido. Os resultados obtidos por estes autores mostraram que, em pH neutro, o
tratamento com SnCl
2
induziu quebras simples no plasmídio e que estes efeitos foram
diminuídos pela presença de benzoato de sódio e EDTA. Além do mais, tal tratamento
também diminuiu a capacidade de transformação de E. coli. Contudo, a eletroforese em pH
ácido mostrou um efeito protetor contra a depurinação induzida pelo ácido clorídrico no
Introdução
6
DNA. Desse modo, os autores sugeriram que a proteção conferida pelo SnCl
2
poderia ser
efeito de sua ligação à molécula de DNA, evitando a ação daquele ácido.
Tal sugestão foi posteriormente corroborada por De Mattos e colaboradores (2000),
que, usando DNA plasmidial pUC 9.1 linearizado, tratado com diferentes concentrações de
SnCl
2
, verificaram, através de eletroforese em gel de agarose, um retardo na migração
eletroforética do plasmídio. Os autores concluíram que este efeito era devido à alteração da
carga elétrica total do DNA, provocada pela ligação do SnCl
2
à molécula.
Recentemente, De Mattos e colaboradores (2005), usando DNA de timo de bezerro
tratado com SnCl
2
Introdução
7
com importâncias biológicas distintas: UVA (400 a 320 nm), UVB (320 a 290 nm) e UVC
(290 a 200 nm). Dentre estes, apenas o UVA e o UVB alcançam a superfície terrestre, uma
vez que o UVC é absorvido pela camada de ozônio.
O UV é cap az de ca usar d anos mole cular es, in vivo e in vitro, através de efeitos
diretos e indiretos. Os efeitos diretos são produzidos pela interação da radiação ultravioleta
com a molécula alvo e os indiretos são mediados pela formação de radicais livres e/ou
moléculas excitadas (Axelrod et al., 1990).
A radiação UVC é a principal responsável pelos efeitos diretos no DNA. Fótons de
UVC são diretamente absorvidos por esta molécula, causando alterações nas bases púricas e
pirimidínicas, tendo como fotoprodutos mais comuns, os dímeros de pirimidina,
especialmente os de timina; hidratos de bases pirimidínicas; ligações (cross-linkings) entre
bases pirimidínicas e aminoácidos; produtos de fotoadição (adutos) (Leitão e Alcantara-
Gomes, 1997).
A radiação UVB também é responsável por efeitos diretos no DNA, dando origem,
principalmente, a dímeros ciclobutânicos de pirimidinas (CPD) e ao fotoproduto 6-4
pirimidina pirimidona (Pfeifer et al., 2005). Recentemente, Gomes e colaboradores (2005)
verificaram que o UVB também é capaz de produzir ERO.
A radiação UVA, apesar de causar alguns danos diretos no DNA, tem a maioria dos
seus efeitos mediada pela excitação de fotosensibilizadores endógenos, o que acarreta a
geração de ERO, que, por sua vez, podem provocar lesões em diferentes estruturas
celulares, incluindo o material genético (Pfeifer et al., 2005).
Apesar de vários fotosensibilizadores endógenos já terem sido identificados, os seus
mecanismos de produção de lesões, através de ERO, ainda não foram totalmente
estabelecidos. Em virtude disto, diferentes autores vêm buscando identificar os efeitos do
Introdução
8
UVA, em diferentes sistemas biológicos, a fim de verificar a indução de lesões mediadas
pelas ERO.
Peak e colaboradores (1983) observaram, através de experimentos com radiações
monocromáticas de UVA (365 nm), que a inativação de células de E. coli ocorre apenas
acima de uma dose limiar, a qual, dependendo da espécie bacteriana, está na faixa entre 100
e 200 kJ/m
2
.
Favre e colaboradores (1985) mostraram que, em doses subletais, inferiores a 200
kJ/m
2
, um dos fenômenos induzidos, em E. coli, pelo UVA consiste num bloqueio
temporário do crescimento e da divisão celular (growth delay). Neste mecanismo, certas
espécies de RNA-t constituem as moléculas alvo e uma base rara, a 4-tiouridina, é o
cromóforo responsável por este efeito. O mecanismo de growth delay também foi observado
em Enterobacter cloacae submetida a doses subletais de UVA (Oppezzo e Pizarro, 2001).
Em 1986, Caldeira-de-Araujo e Favre construíram um mutante deficiente em 4-
tiouridina contendo uma fusão de operons sfiA::lacZ e demonstraram, através do SOS
cromoteste, que lesões causadas pelo UVA induzem a expressão das funções SOS em E.
coli, o que lhe confere uma potencialidade mutagênica. Este resultado esclareceu, na época,
um fato que ainda não era bem entendido. O UVA era tido como carcinogênico em
humanos, mas não era mutagênico em E. coli (Turner e Eisenstark, 1984), apesar da
existência de uma forte correlação entre esses dois fenômenos (White e Rasmussen, 1996).
Eisenstark (1987) observou a produção de H
2
O
2
em bactérias irradiadas com UVA,
Introdução
9
Shennan e colaboradores (1996) verificaram que cepas de E. coli deficientes em
Fapy glicosilase foram mais sensíveis quando irradiadas com UVA do que quando
irradiadas com UVC. Como a enzima Fapy glicosilase está associada ao reparo de danos
oxidativos, este resultado sugere, mais uma vez, a indução de ERO pelo UVA.
Corroborando, Palmer e colaboradores (1997) ao estudar cepas de E. coli deficientes
em Fapy glicosilase, irradiadas com UVA, observaram um aumento na taxa de mutação
dessas cepas, em contraste ao observado em cepas selvagem e deficientes em Fapy
glicosilase, irradiadas com UVC.
De forma semelhante, Serafini e Schellhorn (1999) verificaram a inativação celular
de cepas de E. coli, deficientes no mecanismo de reparo por excisão de bases (BER), ao
serem irradiadas com UVA, indicando, novamente, que enzimas que protejam as células de
lesões oxidativas sejam importantes na restauração de lesões induzidas pelo UVA.
Em 2002, Kim et al., estudando o BER nas lesões oxidativas, mediadas por UVA,
observaram que fibroblastos embrionários de camundongos e fibroblastos humanos, nos
quais BER estava inibido pela ação da metoxiamina, foram hipersensíveis à radiação UVA,
em especial às doses de 50 e 100kJ/m
2
.
Paretzoglou e colaboradores (1998) verificaram que a histidina atua como um
fotosensibilizador de UVA, uma vez que a exposição do fago T7 a uma combinação de
histidina e UVA, provocou uma inativação sinergística deste fago e que, a utilização de
seqüestradores dos radicais superóxido (O
2
y
-
), hidroxil (OH
y
) e H
2
O
2
reduziu este efeito,
indicando a participação destas ERO na inativação do fago.
Kawanishi e colaboradores (2001) propuseram dois tipos de mecanismos para a
indução de lesões mediadas pelo UVA. O tipo 1 consiste no mecanismo de transferência de
elétrons de bases de DNA, especialmente guaninas, para os fotosensibilizadores, como as
flavinas, as pterinas e o ácido nalidíxico, resultando na formação do cátion guanina, que, por
Introdução
10
sua vez, leva à formação de 8-oxoguanina, podendo gerar, também, outros produtos como o
2-aminoimidazolona e o 2,2-diaminooxazolona. O mecanismo tipo 2, consiste na
transferência de elétrons de um fotosensibilizador excitado para uma molécula de oxigênio,
produzindo oxigênio singleto (
1
O
2
), que causa danos às bases guaninas. Os autores sugerem,
ainda, uma outra forma de produção de lesões pelo mecanismo tipo 2. Neste caso, a
transferência de elétrons de um fotosensibilizador excitado para uma molécula de oxigênio,
dá origem ao radical oxigênio (O
2
-
), que por dismutação, gera H
2
O
2
. Este, por sua vez, na
presença de Cu(I), causa lesões em timinas da seqüência 5’-GTC-3’, porém, na presença de
Fe(II), gera OH
y
, através da reação de Fenton, causando lesões em diferentes nucleotídeos,
sem uma seqüência específica.
Recentemente, Hoerter e colaboradores (2005) verificaram que lesões induzidas por
UVA dependem da taxa de dose ao nível da preparação e da distribuição de dose, e não da
dose total utilizada. Neste estudo, os autores observaram que células de E. coli, em fase
estacionária, quando submetidas a uma taxa de dose de 7,4 J/m
2
/s, durante 10 horas (dose
total de 270kJ/m
2
), apresentam um aumento nos níveis das enzimas glutationa redutase,
SOD e hidroperoxidases. Eles também verificaram que essas enzimas não foram capazes de
atenuar a oxidação protéica induzida pelo UVA, qu ando as mesmas células foram irradiadas
com uma taxa de dose de 50J/m
2
/s por 45 minutos (dose total de 135kJ/m
2
).
Estudos em células eucarióticas também mostram a indução de lesões oxidativas
pelo UVA. Em 1997, Zhang e colaboradores verificaram a indução de 8-oxoguanina em
DNA de timo de bezerro e células HeLa irradiados com UVA.
Zhang e colaboradores (1997) verificaram, através do uso de enzimas antioxidantes e
de captadores de radicais livres, que a formação de 8-oxoguanina em DNA de timo de
bezerro é mediada pela geração de
1
O
2
, H
2
O
2
e OH
y
, quando esta molécula é irradiada com
UVA.
Introdução
11
Em 2000, Krutmann sugeriu que a geração de oxigênio singleto, mediada pelo UVA,
em células da pele humana seja um fator importante para o envelhecimento. Recentemente,
Halliday (2005) descreveu que efeitos inflamatórios, mutações gênicas e imunossupressão
em células da pele, em resposta à geração de ERO mediada pelo UVA, são processos que
contribuem para fotocarcinogênese.
Estudando culturas de fibroblastos e queratinócitos humanos, submetidos ao
tratamento com UVA, Courdavault e colaboradores (2004) verificaram, através de ensaios
cromatográficos, maior produção de CPD que de 8-oxoguanina nestas células. Resultados
semelhantes foram encontrados em células de ovário de hamster chinês (Douki et al., 2003)
e em células de roedores (Rochette et al., 2003). Em 1973, Tyrrell já havia descrito a
indução de CPD em DNA bacteriano.
Em 1995, Drobetsky e colaboradores identificaram mutações, do tipo transversões
A:T Æ C:G, em células de ovário de hamster chinês, expostas a 500 kJ/m
2
de UVA.
Kozmin e colaboradores (2005) também verificaram que o UVA é capaz de induzir
mutagenicidade em cepas de Saccharomyces cerevisiae, sendo a 8-oxoguanina, a lesão
predominante.
Gao e colaboradores (2005) observaram que metabólitos de benzo(a)pireno
combinados com UVA induzem um efeito sinergístico na produção de 8-oxoguanina, em
DNA de timo de bezerro. Este estudo revelou, também, através do uso de seqüestradores de
ERO, que o oxigênio singleto e o radical superóxido estão envolvidos na formação da lesão
mencionada.
Recentemente, Cadet e colaboradores (2005) verificaram que a 8-oxoguanina é a
principal lesão induzida pelo UVA, numa faixa de dose de 0-150 kJ/m
2
, e que esta lesão
predomina sobre as quebras induzidas, pelo UVA, no DNA. Os autores sugeriram, ainda,
uma alta participação (85%) do oxigênio singleto contra uma baixa contribuição (15%) do
Introdução
12
radical OH
y
, ambos produzidos durante a irradiação com UVA, na produção de 8-
oxoguanina. Desta forma, os autores evidenciam que as diferentes classes de lesões
oxidativas, produzidas no DNA pela radiação UVA, variam conforme a natureza das
células, uma vez que estas podem conter diferentes tipos e quantidades de
fotosensibilizadores.
4. Espécies Reativas de Oxigênio
Os processos evolutiv os favoreceram a seleção de espécies que utilizavam oxigênio
para oxidação de carboidratos, uma vez que o rendimento energético, neste processo, é
cerca de 12 vezes maior do que em processo de anaerobiose.
Durante o processo de respiração celular, 95% do oxigênio é reduzido pela ação da
enzima citocromo C oxidase, mediante a captura de 4 elétrons e 4 átomos de hidrogênio,
levando à formação de água. Contudo, em decorrência de sua configuração eletrônica, 5%
do oxigênio utilizado é reduzido por uma via monoeletrônica, recebendo um elétron de cada
vez, tendo como conseqüência a formação sucessiva de radical superóxio, peróxido de
hidrogênio e radical hidroxil (Meneghini, 1987; Leitão e Alcantara-Gomes,1997). As
reações de redução do oxigênio por via monoeletrônica (etapas I, II e III), bem como pela
enzima citocromo C oxidase (etapa V) estão representadas no quadro 1.
Introdução
13
Quadro 1. Re dução do oxigênio por via monoeletrônica e pela citocromo C oxidase
O
2
+ e
-
Æ
O
2
y
-
I
O
2
y
-
+ e
-
Æ H
2
O
2
II
H
2
O
2
+ e
-
Æ H
2
O + OH
y
III
OH
y
+ H
+
+ e
-
Æ H
2
O IV
O
2
+ 4e
-
+ 4H
+
Æ 2H
2
O V
Alguns autores (Meneghini, 1997; Asad e Leitão, 1991; Kehrer, 2000) sugeriram que
metais de transição, como Cu(I) e Ferro(II), participam como agentes redutores na formação
do radical hidroxil, através das reações de Fenton (quadro 2; etapa II) e de Haber-Weiss
(quadro 2; etapa III). Conforme descrito anteriormente, Dantas e colaboradores (1996)
sugeriram a participação do estanho em uma reação similar à reação de Fenton (quadro 3).
Quadro 2. Reação de Fenton e de Haber-Weiss
Fe
3+
+ O
2
y
-
Æ Fe
2+
+ O
2
I
Fe
2+
+ H
2
O
2
Æ Fe
3+
+ OH
-
+ OH
y
II
O
2
y
-
+ H
2
O
2
Æ O
2
+ OH
-
+ OH
y
III
Quadro 3. Reação similar à de Fenton com a participação do estanho
Sn
2+
+ O
2
Æ Sn
3+
+ O
2
-
Sn
3+
+ O
2
-
+ 2H
+
Æ Sn
4+
+ H
2
O
2
O
2
+ Sn
2+
+ 2H
+
Æ H
2
O
2
+ Sn
4+
Introdução
14
O radical hidroxil tem sido descrito como um poderoso oxidante, capaz de reagir
com qualquer molécula orgânica, de forma quase instantânea (Meneghini, 1987). Contudo,
diversos estudos, também, têm mostrado a ação oxidante de outras espécies reativas de
oxigênio, como, por exemplo, o oxigênio singleto, o radical superóxido, o peróxido de
hidrogênio e as espécies de nitrogênio (para referências, ver: Marnett, 2000; Dizdaroglu et
al., 2002; Martinez et al., 2003; Bjelland e Seeberg, 2003).
As espécies reativas de oxigênio, formadas no metabolismo celular, desempenham
importantes ações na resposta imunitária, nas reações inflamatórias, na peroxidação de
lipídeos e na produção de quebras ou alterações estruturais em cromossomos (Leitão e
Alcantara-Gomes, 1997).
Nos últimos anos, em virtude dos diversos efeitos mediados por ERO, especial
atenção tem sido dada ao papel biológico dessas espécies químicas, uma vez que elas estão
envolvidas em processos como o envelhecimento, a mutagênese, e, até mesmo, a
cancerização. Contudo, apesar dos inúmeros relatos na literatura acerca dessas ERO, ainda
se conhece pouco sobre os mecanismos de ação letal e os de reparação envolvidos nas
chamadas lesões oxidativas.
5. Mecanismos de Defesa contra as ERO e Reparação do DNA
A amplitude dos efeitos lesivos, mediados pelas espécies reativas de oxigênio, pode
ser reduzida pela presença de compostos conhecidos como aceptores de radicais livres, tais
como vitamina A, vitamina E, vitamina C, benzoato de sódio, tiouréia e quelantes de íons
metálicos, como o dipiridil.
Introdução
15
Além dos aceptores de radicais livres, existem ainda, em todos os organismos
aeróbicos estudados até hoje, enzimas específicas com função de defesa contra os efeitos
das ERO. Dentre elas pode-se citar a superóxido dismutase, a catalase e a glutationa
peroxidase. A primeira catalisa a dismutação do ânion superóxido, gerando H
2
O
2
que por
sua vez é convertido em água pela ação tanto da catalase quanto pela glutationa peroxidase
(Meneghini, 1987; Leitão e Alcantara-Gomes, 1997).
Contudo, nem sempre os aceptores de radicais livres e as enzimas antioxidantes são
capazes de impedir ou reduzir os efeitos lesivos induzidos no DNA, pela ação das ERO. Por
isso, ao longo da evolução, foram selecionados positivamente organismos que
desenvolveram sistemas de reparação que procuram manter a fidelidade do material
genético e a integridade celular, uma vez que a sua ausência pode ter conseqüências
diversas, podendo levar, até mesmo, à morte celular.
5.1. Reparação por Excisão de Bases
O reparo por excisão de bases é um dos mais bem estudados em E. coli e o mais
importante sistema de reparação de lesões oxidativas. Esse mecanismo é mediado pelas
enzimas DNA glicosilases, que reconhecem e retiram a base lesada, gerando sítios AP no
DNA. Estes, por sua vez, são reconhecidos pelas AP endonucleases ou AP liases, que
produzem incisões ou quebras na dupla fita do DNA, do lado 5’da lesão. Em seguida, a
incorporação de uma nova base, não lesada, é feita pela DNA polimerase I e, finalmente, a
DNA ligase promove a união dessa base à cadeia de fosfato e açúcar, reconstituindo a
integridade da fita de DNA (Friedberg et al., 1995; Norbury e Hickson, 2001; Slupphaug et
al., 2003) (Figura 1).
Introdução
16
Figura 1. Representação esquemática do mecanismo de reparo por excisão de bases (extraída de Leitão e
Alcantara-Gomes, 1997)
5.1.1. DNA glicosilases relevantes neste trabalho
- Formamidopirimidina-DNA glicosilase (Fpg)
A formamidopirimidina-DNA glicosilase é uma enzima codificada pelo gene fpg
(também conhecido como mut M), que reconhece purinas oxidadas como substrato. Neste
caso, estão incluídas as lesões 2,6-diamino-4-hidroxi-5-N-metilformamidopirimidina,
produzida pela exposição à radiação γ, e a lesão 8-oxoguanina, que é capaz de fazer
Introdução
17
pareamento com a adenina, ocasionando mutações do tipo G:C Æ T:A. Foi verificado que
mutantes fpg apresentam um aumento na freqüência dessas mutações, indicando, portanto, a
importância da enzima Fpg no reparo da lesão 8-oxoguanina (Friedberg et al., 1995;
Norbury e Hickson, 2001).
A enzima Fpg apresenta uma atividade AP liase associada, conseguindo, assim, além
de reconhecer a base lesada, catalisar a excisão da mesma por hidrólise da ligação N-
glicosil, que liga a base ao esqueleto açúcar fosfato, gerando um sítio AP, que será
posteriormente processado pelas enzimas AP endonucleases (Friedberg et al., 1995).
- Timina glicol-DNA glicosilase (Nth)
A enzima timina glicol-DNA glicosilase (endonuclease III), codificada pelo gene
nth, reconhece resíduos de pirimidinas como substrato. Neste caso, estão incluídos lesões,
como, glicol de timina, 5,6-dihidrotimina, uréia, ácido β-ureidoisobutírico, 5-hidroxi-6-
hidrotimina, glicol de uracil, 5,6-dihidrouracil e 5-hidroxi-6-hidrouracil. Também tem sido
sugerido que a endonuclease III ataca resíduos de guaninas, formados por agentes
oxidativos (Friedberg et al.,1995).
A endonuclease III, assim como a Fpg, possui uma atividade AP liase, removendo a
base lesada, através da incisão no DNA por uma reação de β-eliminação, deixando como
resíduos os aldeídos α,β-insaturados no terminal 3’. Entretanto, estes resíduos não
constituem substratos para a ação da DNA polimerase I, necessitando serem processados,
pelas AP endonucleases, para que ocorra a reparação (Friedberg et al., 1995).
Introdução
18
5.1.2. AP endonucleases relevantes neste trabalho
- Exonuclea se III (X thA)
Conforme mencionado acima, após o reconhecimento e excisão da base lesada, é
formado um sítio AP. É neste sítio que as AP endonucleases atuam, preparando o DNA para
a reparação. Uma dessas enzimas é a exonuclease III, codificada pelo gene xthA, que foi
caracterizada como uma exonuclease com atividade fosfatase associada, necessitando, para
sua atuação, de um terminal 3’OH em dupla hélice (Friedberg et al.,1995).
Além de suas duas atividades catalíticas, a exonuclease III também degrada
copolímeros de ribo e desoxirribonucleotídeos, o que corresponde a uma atividade de
Rnase. A exonuclease III possui ainda uma atividade 3’fosfodiesterase, que remove resíduos
de aldeídos 3’ α,β-insaturados gerados após a ação da endonuclease III ou Fpg. Por fim,
uma atividade 5’ foi descoberta para a exonuclease III (Friedberg et al.,1995).
A atividade da exonuclease III requer a presença de Mg
2+
, ao passo que é inibida
pela presença de EDTA. A enzima catalisa a hidrólise, em dupla hélice, em sítios AP, no
lado 5’ da perda da base, deixando terminais 3’OH e 5’P. Tem sido aceito que a
exonuclease III reconheça sítios AP, oriundos da perda de purinas ou pirimidinas do DNA,
com igual facilidade. Entretanto, comparações quantitativas deste parâmetro ainda não
foram relatadas (Friedberg et al., 1995).
O exato papel biológico da exonuclease III ainda não está claro. Porém, foi
verificado que mutantes xthA são sensíveis a lesões oxidativas produzidas por agentes como
as radiações UVA e UVB e o H
2
O
2
, sugerindo que esta enzima participe do reparo de lesões
oxidativas. Esta evidência foi corroborada pela demonstração que a exonuclease III também
Introdução
19
retira produtos da fragmentação de timinas, como, por exemplo, resíduos de uréia
(Friedberg et al.,1995).
- Endonuclease IV (Nfo)
A endonuclease IV é o segundo exemplo de AP endonuclease existente em E. coli.
Sua atividade corresponde a apenas 10% da atividade total das AP endonucleses. Esta
enzima catalisa a formação de quebras simples em sítios de perda de bases, em DNA dupla
hélice (Friedberg et al.,1995).
Assim como, a exonuclease III, a endonuclease IV ataca as ligações fosfodiéster no
lado 5’ do sítio AP, deixando grupos 3’OH. Outras semelhanças podem ser verificadas,
como a remoção de fosfoglicoaldeído, fosfato, deoxiribose-5-fosfato e 4-hidroxi-2-pentenal
do terminal 3’ do DNA em dupla hélice, além de retirar resíduos de uréia presentes no
DNA. Na realidade, a única diferença da atividade catalítica da endonuclease IV para a
exonuclease III é a presença da atividade 3’ nesta última (Friedberg et al.,1995).
Mutantes nfo apresentam uma alta sensibilidade a agentes alquilantes, como o met il
metanosulfonato (MMS) e a mitomicina, e também a agentes oxidantes, como o tert-butil
hidroperóxido e a bleomicina. Foi verificado que a sensibilidade à mitomicina se eleva
ainda mais em um duplo mutante xthA-nfo, sugerindo que endonuclease IV e exonuclease
III possuam substratos similares. Contudo, mutantes nfo são mais sensíveis aos ag entes tert-
butil hidroperóxido e bleomicina, sugerindo, desta vez, que a enzima endonuclease IV
reconheça lesões que não sejam reconhecidas pela exonuclease III (Friedberg et al.,1995).
O nível de endonuclease IV pode ser aumentado, de 10 a 20 vezes, quando é
realizado um tratamento com agentes químicos, como o paraquate e a menadiona. Estes são,
Introdução
20
enzimaticamente, reduzidos in vivo por transferência de elétrons e, em seguida, auto-
oxidados para geração de radical superóxido. De forma semelhante, a endonuclease IV
também é induzida quando células deficientes em SOD crescem em presença de oxigênio
puro, sendo esta indução independente de oxyR, um gene que controla a regulação de
estresse oxidativo induzido por peróxido (Friedberg et al., 1995). Estes achados sugerem
que, assim como a exonuclease III, a endonuclease IV também participa do reparo de lesões
induzidas por espécies reativas de oxigênio.
Objetivos
21
OBJETIVOS
1. Objetivo geral
Conforme exposto anteriormente, com exceção do UVC, tanto as radiações UVA e
UVB quanto o SnCl
2
são capazes de induzir lesões mediadas pela ação das ERO. Devido ao
fato dessas espécies químicas estarem envolvidas em diversos processos celulares, torna-se
interessante um estudo sobre a ação combinada desses agentes, a fim de identificar os seus
mecanismos de produção de lesões, e as vias de reparação envolvidas.
Portanto, este trabalho teve por objetivo avaliar os efeitos biológicos induzidos pela
associação da radiação ultravioleta e do cloreto estanoso, em DNA plasmidial e em células
de Escherichia coli selvagem e deficientes em reparo por excisão de bases.
2. Objetivos específicos
- Avaliar a citotoxicidade da associação da radiação ultravioleta e do cloreto estanoso em
células de E. coli;
- Avaliar a genotoxicidade da associação da radiação ultravioleta e do cloreto estanoso em
células de E. coli
e em DNA plasmidial;
- Identificar as enzimas de reparo por excisão de bases envolvidas na restauração das
lesões produzidas pela associação da radiação ultravioleta e do cloreto estanoso.
Material e Métodos
22
MATERIAL E MÉTODOS
1. Composição dos meios de cultura e das soluções empregadas neste estudo
Quadro 4. Meios de cultura e soluções utilizados neste estudo
Soluções/Meios Composição / Concentração Procedência
Extrato de levedura / 0,45% DIFCO
Bacto-triptona / 0,9% ACUMEDIA
NaCl / 0,9% LAFAN
Meio LB líquido
(Luria & Burrous, 1957)
pH 7,0
Meio LB líquido Meio LB gelificado
Ágar-ágar / 1,5% DIFCO
Salina NaCl / 0,9% LAFAN
Cloreto estanoso SnCl
2
.2H
2
O / 25 µg/mL ou
200 µg/mL
SIGMA
Tris•Cl / 50mM, pH 8.0 NUCLEAR TE
EDTA / 5mM, pH 8.0 LAFAN
Agarose low melting
point
Agarose LMP / 1,5 % INVITROGEN
Agarose Agarose / 0,76% ou 0,8% INVITROGEN
EDTA / 0,1mM, pH 8.0 LAFAN
NaOH / 0,5M NUCLEAR
Solução de lise
SDS / 0,05%
PH da solução: 13,0
SIGMA
NaOH / 0,03mM NUCLEAR Tampão alcali no
EDTA / 0,01mM, pH 8.0
PH da solução: 13,0
LAFAN
NaCl / 30mM LAFAN Solução de
neutralização
Tris•Cl / 50mM; pH 6.0 NUCLEAR
Brometo de etídio 0,5 µg/mL INVITROGEN
TAE Tris•Cl / 0,4M
Ácido acético glacial
EDTA / 0,001M
NUCLEAR
MERCK
LAFAN
azul de bromofenol / 0,25% SIGMA
xileno cianol / 0,25% SIGMA
Tampão de
Carregamento
glicerol / 30% REAGEN
Material e Métodos
23
2. Técnica de inativação celular
2.1. Cepas bacterianas
As cepas de E. coli utilizadas nesse estudo estão relacionadas no quadro abaixo.
Quadro 5. Cepas de E. coli e características genéticas de interesse para este trabalho
Cepa Característica relevante para este estudo Referência
AB1157
Selvagem (proficiente em todos os mecanismos de
reparo de DNA)
Howard-Flanders
et al., 1964
BW9091
xthA (deficiente em exonuclease III – reparo por excisão
de
bases)
Demple et al.,
1983
BW375
nth (deficiente em endonuclease III – reparo por excisão
de
bases)
Cunningham &
Weiss, 1985
BW527
nfo (deficiente em endonuclease IV – reparo por excisão
de bases)
Cunningham et
al., 1986
BW544
xthA, nfo (deficiente nas enzimas exonuclease III e
endonuclease IV – reparo por excisão de bases)
Cunningham et
al., 1986
BW434
xthA, nth (deficiente em exonuclease III e endonuclease
III – reparo por excisão de bases)
Weiss & Duker,
1986
BW534
nth, nfo (deficiente nas enzimas endonuclease III e
endonuclease IV – reparo por excisão de bases)
Serafini &
Schellhorn, 1999
BW535
xthA, nfo, nth (deficiente nas enzimas exonuclease III,
endonuclease IV e endonuclease III – reparo por excisão
de bases)
Serafini &
Schellhorn, 1999
BH20 fpg (deficiente na enzima formamidopirimidina-DNA
glicosilase – reparo por excisão de bases)
Bouiteux &
Huisman, 1989
DH5αF’IQ recA, can
+
(deficiente em reparo por recombinação e
resistente ao antibiótico canamicina)
Hannanah, 1983
2.2. Conservação das cepas bacterianas
Os estoques das cepas bacterianas eram preparados, utilizando-se volumes iguais
(5 mL) de cultura bacteriana, em fase estacionária de crescimento, e glicerol estéril. Tais
Material e Métodos
24
estoques eram acondicionados em tubos de vidro com rosca e armazenados a -20ºC, sendo
renovados a cada 4 meses.
2.3. Obtenção das culturas bacterianas
Uma alíquota (100µL) do estoque bacteriano em glicerol era colocada em um
erlenmeyer estéril (50mL), contendo 5mL de meio LB. Incubava-se a 37°C, sob agitação,
por 15 a 18 horas (tempo para a cultura atingir a fase estacionária de crescimento - 10
9
células/mL). Uma alíquota desta cultura era misturada com meio LB, na proporção de
1:100, e incubada a 37°C, sob agitação constante, até atingir a fase exponencial de
crescimento (1-2 x 10
8
células/mL). As culturas assim obtidas eram, então, centrifugadas
(10 minutos; 4.000 xg; 4ºC), sendo o sobrenadante descartado e o sedimento bacteriano
ressuspenso em solução salina. Repetia-se o processo para a total eliminação do meio de
crescime nto.
2.4. Tratamento com radiação ultravioleta e cloreto estanoso
Após a obtenção das culturas, uma alíquota era retirada para iluminação com
lâmpada de vapor de mercúrio 125 W (Phillips), emitindo mais de 95% dos fótons em 365
nm. A taxa de dose, ao nível da preparação (25 J/m
2
/s), era ajustada com dosímetro Vilbert
Lourmat 365, sendo que, ao final de 60 minutos de exposição, as amostras haviam recebido
uma dose subletal total de 90 kJ/m
2
de radiação ultravioleta 365 nm. Uma placa de vidro era
Material e Métodos
25
colocada entre a preparação bacteriana e a fonte de irradiação, a fim de impedir possíveis
contaminações por comprimentos de onda mais curtos.
Em seguida à irradiação, uma solução de SnCl
2
(25µg/mL) era preparada, usando-se
como solvente, salina 0,9% e a cultura bacteriana era separada nas seguintes frações:
controle; tratada com SnCl
2
(25 µg/mL); iluminada com radiação ultravioleta 365 nm
(90kJ/m
2
); e pré-iluminada com radiação ultravioleta 365 nm (90kJ/m
2
), seguida da
incubação com SnCl
2
(25 µg/mL). Todas as frações eram mantidas a 37ºC, sob agitação,
durante 1 hora, sendo que a cada 20 minutos, alíquotas eram retiradas, diluídas
convenientemente e semeadas em placas de Petri contendo meio LB gelificado (1,5% agar).
As placas eram incubadas a 37ºC, por cerca de 18h, para formação das colônias. Após este
período, era realizada a contagem das colônias crescidas e determinadas as frações de
sobrevivência (FS) para os diferentes tempos de incubação. As FS (N/N
o
) eram calculadas
dividindo-se o número de células viáveis, após cada tempo de tratamento (N), pelo número
de células viáveis no tempo zero de incubação (N
o
). Os dados obtidos nesses experimentos
eram analisados pelo teste ANOVA, seguido do teste de comparações múltiplas de Tukey,
através do programa estatístico GraphPad Prism, versão 4.0, sendo adotado um nível de
significância de 5%, com o intuito de verificar a existência de diferença significativa entre
os grupos tratados, ou não, e entre diferentes cepas utilizadas.
A técnica de inativação bacteriana utilizada neste estudo encontra-se esquematizada
na figura 2.
Material e Métodos
26
Figura 2. Representação esquemá tica da técnica de inativação bacteriana utilizada neste estudo
3. Técnica de eletroforese em gel alcalino de agarose para experimentos com bactérias
Esta técnica permite verificar a genotoxicidade dos agentes em estudo, através da
visualização de quebras no DNA bacteriano. Quando a molécula é desnaturada e submetida
à eletroforese em gel alcalino de agarose, os diversos fragmentos de DNA migram de forma
diferente, gerando uma distribuição que depende da extensão das quebras no DNA. O
protocolo utilizado foi proposto por Zirkle e Krieg (1996) e adaptado às condições
experimentais deste estudo, estando descrito em detalhes a seguir (itens 3.1 a 3.5).
As cepas bacterianas utilizadas neste teste e os procedimentos para sua conservação
e obtenção foram idênticos aos empregados nos experimentos de inativação bacteriana.
Material e Métodos
27
3.1. Tratamento com radiação ultravioleta e cloreto estanoso
Após a obtenção das culturas bacterianas, uma alíquota era retirada para iluminação
conforme as condições já descritas no item 2.4.
Ao final do período de irradiação, uma solução de SnCl
2
era preparada em solução
salina 0,9% e a cultura bacteriana, iluminada com UV 365 nm, era separada em duas
frações, sendo uma delas incubada com SnCl
2
(25 µg/mL), a 37ºC, sob agitação, durante 40
minutos. Uma fração da amostra controle (não iluminada) também era retirada e tratada com
SnCl
2
, nas mesmas condições.
Após esse intervalo de tempo obtinham-se as seguintes amostras: controle;
iluminada com radiação ultravioleta 365 nm (90kJ/m
2
); tratada com SnCl
2
(25µg/mL); pré-
iluminada com radiação ultravioleta 365 nm (90kJ/m
2
) seguida da adição de SnCl
2
.
3.2. Preparação dos blocos em agarose low melting point
Após o período de tratamento, 1,5 mL de cada fração eram retirados e centrifugados
(1 min; 12000 xg), em tubos de microcentrífuga, sendo o sobrenadante descartado e o
sedimento bacteriano ressuspenso em 10 µL de TE gelado. Em seguida, 50 µL de agarose
low melting point (0,15% em TE), a 37ºC, eram misturados aos 10 µL de cada fração. A
mistura (60 µL) era, então, colocada em um recipiente de acrílico contendo pequenos poços
e incubada a temperatura ambiente, por aproximadamente 30 minutos, para formação de
blocos de aproximadamente 0,5 cm de lado.
Material e Métodos
28
3.3. Lise das células e lavagem dos blocos
Após a gelificação, os blocos eram incubados em solução de lise por 2 horas a
temperatura ambiente, ao abrigo da luz. Em seguida, os blocos eram lavados três vezes, com
intervalos de 5 minutos, com 1 mL de TE gelado. Os blocos eram, então, arrumados nos
dentes do pente da cuba de eletroforese (Horizon 58 “GIBCO BRL - Life technologies” -
EUA) e o excesso de TE removido com papel filtro, a fim de facilitar a aderência dos blocos
ao pente.
3.4. Gel de agarose
A solução de agarose 0,76% era feita em tampão alcalino, e aquecida até sua
completa homogeneização. Após leve resfriamento, a solução era depositada em uma cuba
horizontal (Horizon 58 “GIBCO BRL - Life technologies” - EUA), onde o pente, contendo
os blocos, era encaixado. Após a gelificação, o pente era retirado, permanecendo no gel os
blocos que continham o lisado celular bacteriano.
3.5. Eletroforese alcalina
A cuba de eletroforese era preenchida com tampão alcalino e o gel submetido a uma
tensão de 7V, por 14 horas. Concluída a eletroforese, o gel era imerso em solução de
neutralização, durante 1 hora. Em seguida, o gel era corado com brometo de etídio (0,5
µg/mL), por aproximadamente 15 minutos e as bandas de DNA eram visualizadas em um
Material e Métodos
29
transiluminador UVP (Model TM-10E-EUA), sendo o gel, então, digitalizado em um
sistema de captura de imagens (Kodak Digital Science 1d, EDAS 120). As imagens eram
posteriormente analisadas, utilizando-se o software Image J, versão 1.33u, para a
quantificação das quebras no DNA. Os dados coletados eram submetidos ao teste qui-
quadrado (χ
2
), a fim de verificar a existência de diferença significativa entre os tratamentos,
sendo adotado um nível de significância de 5%.
A técnica de eletroforese em gel alcalino de agarose utilizada neste estudo está
representada na figura 3.
Figura 3. Representação esquemática da técnica de eletroforese em gel alcalino de agarose utilizada neste
estudo
Cultura em
glicerol
Meio LB
1:100
15-18h; 37ºC;
sob agitaç ão
Material e Métodos
30
4. Técnica de eletroforese em gel de agarose para experimentos com plasmídios
4.1. Extração de DNA plasmidial
O plasmídio utilizado foi o pUC 9.1, que confere resistência ao antibiótico
ampicilina. O DNA plasmidial, contido em células de Escherichia coli DH5αF’IQ, era
obtido através do método de extração por lise alcalina, conforme protocolo proposto por
Sambrook e colaboradores em 1989, com algumas modificações (figura 4).
Figura 4. Representação esquemática da técnica de extração plasmidial
4.2. Preparação das amostras
Nestes experimentos, o DNA plasmidial foi tratado com as radiações UVA, UVB ou
UVC, conforme as condições descritas abaixo:
Cultura em fase
estacionária
15 min., 4ºC,
4000xg
Suspensão do
sedimento em
solução I gelada
Acréscimo
de lisozima
Adição de
solução II
Adição de
solução III
5 min., 4ºC,
4000xg
Adição de eta n o l absoluto,
clorofórmio, LiCl e RNAse
5 min., 4ºC,
4000xg
Ressuspensão
em água milli-Q
Material e Métodos
31
- Irradiação com UVA (365 nm): uma alíquota (200ng) de DNA plasmidial era iluminada
com UVA pela mesma fonte e nas mesmas condições descritas para uma cultura
bacteriana, no item 2.4, recebendo, ao final de 60 minutos, uma dose total de 90 kJ/m
2
.
- Irradiação com UVB (312 nm): uma alíquota (200ng) de DNA plasmidial era iluminada
com lâmpada Vilber Lourmat (VL-6M), de potência 12W, com a maioria das emissões
em 312nm. A taxa de dose, ao nível da preparação (3,6 J/m
2
/s), era ajustada com
dosímetro Vilbert Lourmat 312, sendo que, ao final de 46 minutos de exposição, a
amostra havia recebido uma dose total de 10 kJ/m
2
de radiação ultravioleta 312 nm.
- Irradiação com UVC (254 nm): sete alíquotas (200ng) de DNA plasmidial eram
iluminadas com lâmpada de vapor de mercúrio 15W, com espectro principal em 254nm.
A taxa de dose ao nível da preparação (0,5; 1,0; 2,0; 2,5; 2,8 J/m
2
/s) era ajustada com
dosímetro Latarjet, sendo que, ao final de determinado tempo, as alíquotas haviam
recebido doses totais de 5, 10, 50, 100, 500, 1000 e 5000 J/m
2
.
Em seguida à irradiação, uma solução de SnCl
2
era preparada em água mili-Q e as
suspensões contendo plasmídios iluminados com UVA (90kJ/m
2
), UVB (10kJ/m
2
) ou UVC
(somente nas doses de 5, 50, 100 e 500 J/m
2
) eram separadas em duas frações, sendo uma
delas incubada com SnCl
2
(200 µg/mL). Uma outra fração (controle - não iluminada),
contendo 200 ng de DNA plasmidial, também era preparada e tratada com SnCl
2
. Todas as
amostras eram incubadas à temperatura ambiente, durante 40 minutos.
Após esse intervalo de tempo obtinham-se as seguintes amostras: controle;
iluminadas com UVA (90kJ/m
2
) ou com UVB (10kJ/m
2
) ou irradiadas com UVC (5, 50,
100 e 500 J/m
2
); tratada com SnCl
2
(200 µg/mL); pré-iluminadas com UVA (90kJ/m
2
) ou
com UVB (10kJ/m
2
) ou irradiadas com UVC (5, 50, 100 e 500 J/m
2
), seguidas da adição de
SnCl
2
.
Material e Métodos
32
Em seguida, 10µL de cada amostra eram misturados a 2µL de tampão de
carregamento 6x concentrado, sendo essa suspensão aplicada nos slots do gel de agarose.
Análises espectrofotométricas também eram realizadas para as amostras controle;
iluminadas com UVA (90kJ/m
2
) ou com UVB (10kJ/m
2
); tratada com SnCl
2
(200µg/mL); e
pré-iluminadas com UVA (90kJ/m
2
) ou com UVB (10kJ/m
2
), seguidas da adição de SnCl
2
.
As alíquotas (200µL) das amostras eram analisadas por espectro de absorção, na faixa do
ultravioleta (200-400nm), utilizando-se um espectrofotômetro, modelo U-3300 Hitachi.
Como referência para as amostras controle e iluminadas com UVA ou UVB, era usada água
mili-Q e, para as amostras tratadas com SnCl
2
e pré-iluminadas com UVA ou UVB,
seguidas da incubação com SnCl
2
, era utilizada como referência uma solução de SnCl
2
, na
mesma concentração das amostras tratadas com este sal.
4.3. Gel de agarose
Uma solução de agarose 0,8% era preparada em tampão TAE 1x concentrado, sendo
aquecida até sua completa homogeneização. Após leve resfriamento, a solução era
depositada em uma cuba horizontal (Horizon 58 “GIBCO BRL - Life technologies” - EUA),
onde se encaixava o pente para a formação dos slots (pequenos reservatórios com
capacidade de até 20µL de solução), nos quais eram aplicadas as amostras plasmidiais.
Material e Métodos
33
slot
Forma I
Forma III
Forma II
4.4. Eletroforese neutra
A cuba de eletroforese era pr eenchida com tampão TAE (1x) e aplicada uma tensão
de 60V, por cerca de 40 minutos. Concluída a eletroforese, o gel era corado, visualizado e a
imagem digitalizada nas mesmas condições descritas no item 3.8.
As imagens obtidas eram analisadas utilizando-se o software Image J, versão 1.33u,
para a quantificação das formas estruturais do DNA plasmidial – que podem ser de três tipos
(figura 5): i) forma superhelicoidizada (SH), também chamada de forma I, correspondente
ao plasmídio sem quebras; ii) forma círculo aberto (CA) ou forma II, resultante de quebras
simples; iii) forma linear (L) ou forma III, resultante de quebras duplas. Após a
quantificação das diferentes formas do plasmídio, o número médio de quebras era calculado
pela distribuição de Poisson.
Uma representação esquemática do tratamento do plasmídio pUC 9.1 e a eletroforese
podem ser vistas na figura 6.
Figura 5. Representação do DNA plasmidial nas três formas. Forma I (superhelicoidizada), correspondente ao
plasmídio sem quebras; Forma II (círculo aberto), resultante de quebras simples; Forma III (linear), resultante
de quebras duplas.
Material e Métodos
34
Figura 6. Representação esquemática do tratamento e eletroforese em ge l de agarose do DNA plamidial
SnCl
2
(200µg/ mL )
(40 min)
Eletroforese em gel
de agarose (0,8%) a
60V; 40 min
O ge l f o i c orad o em b rom et o de
etídio e as band as d o DN A
visua liza d as por transi lum inaç ã o
Digi taliza çã o
da imagem
controle UVA, UVB
ou UVC
UVA, UVB ou
UVC + SnCl
2
(40 min)
Pré-tratamento com UVA, UVB ou UVC
SnCl
2
(200µg/ mL )
(40 min)
Eletroforese em gel
de agarose (0,8%) a
60V; 40 min
O ge l f o i c orad o em b rom et o de
etídio e as band as d o DN A
visua liza d as por transi lum inaç ã o
Digi taliza çã o
da imagem
controle UVA, UVB
ou UVC
UVA, UVB ou
UVC + SnCl
2
(40 min)
Pré-tratamento com UVA, UVB ou UVC
Resultados e Discussão
35
RESULTADOS E DISCUSSÃO
1. Eletroforese em gel de agarose
A técnica de eletroforese em gel de agarose de DNA plasmidial tratado com SnCl
2
e
radiação ultravioleta (A, B ou C), foi empregada com a finalidade de avaliar a capacidade
desses agentes induzirem lesões do tipo quebra na molécula.
A figura 7 apresenta os resultados referentes ao tratamento do plasmídio pUC 9.1
com SnCl
2
(200µg/mL) ou com UVA (90kJ/m
2
), isoladamente, bem como a iluminação do
DNA plasmidial com UVA, seguida da incubação com SnCl
2
.
Como pode ser observado, o SnCl
2
e o UVA (raias 2 e 3, respectivamente) foram
capazes de induzir quebras na molécula de DNA plasmidial, quando comparados à raia 1
(controle - DNA não tratado). Contudo, quando os agentes foram empregados em seqüência,
observou-se que o pré-tratamento com a radiação UVA protegeu o plasmídio dos efeitos da
incubação com o SnCl
2
(raia 4), quando comparado a este último isoladamente.
Resultados e Discussão
36
Figura 7. a. Eletroforese em gel de agarose (0,8%) e análise densitométrica do plasmídio pUC 9.1 tratado com
SnCl
2
(200µg/mL) e UVA (90kJ/m
2
), isoladamente, e pré-tratado com UVA s eguido d a incub ação co m SnCl
2
;
b. Número médio de quebras/genoma no DNA plasmidial tratado com SnCl
2
(200µg/mL) e UVA (90kJ/m
2
),
isoladamente, e pré-tratado com UVA seguido da incubação com SnCl
2
. 1 (controle), 2 (SnCl
2
), 3 (UVA), 4
(UVA + SnCl
2
). O número médio de quebras/genoma foi determinado pela distribuição de Poisson, conforme
descrito em mater ial e métodos.
123 4
I
II
III
0
20
40
60
80
100
1234
Tr atame n to
% DNA
II (%)
I (%)
III (%)
a
0
1
2
3
4
1234
Tr atame n to
nº médi o de
quebras /g enoma
b
Resultados e Discussão
37
Resultados semelhantes foram encontrados para o tratamento com a radiação UVB
(figura 8). Da mesma forma, o SnCl
2
e o UVB (raias 2 e 3, respectivamente) foram capazes
de induzir quebras no DNA plasmidial, quando comparados ao controle (raia 1) e, quando
associados, também observou-se que o pré-tratamento com UVB protegeu o plasmídio dos
efeitos da incubação subseqüente com o SnCl
2
(raia 4), quando comparado a este último.
Pela análise das figuras 7b e 8b, verifica-se que o UVB produz um número maior de
quebras no DNA plasmidial, além de proteger menos dos efeitos do SnCl
2
, quando
comparado ao UVA.
Resultados e Discussão
38
Figura 8. a. Eletroforese em gel de agarose (0,8%) e análise densitométrica do plasmídio pUC 9.1 tratado com
SnCl
2
(200µg/mL) e UVB (10kJ/m
2
), isoladamente, e pré-tratado com UVB seguido da incubação com SnCl
2
;
b. Número médi o de que bras/gen oma no DNA plasmid ial tratado co m SnCl
2
(20 0µg/mL) e UVB (10kJ/m
2
),
isoladamente, e pré-tratado com UVB seguido da incubação com SnCl
2
. 1 (controle), 2 (SnCl
2
), 3 (UVB), 4
(UVB + SnCl
2
). O número médio de quebras/genoma foi determinado pela distribuição de Poisson, conforme
descrito em mater ial e métodos.
123 4
I
II
III
0
20
40
60
80
100
12 34
Tr atame n to
% DNA
II (%)
I (%)
III (%)
a
0
1
2
3
4
1234
Tr atam e n to
Nº médi o de
quebras /g enoma
b
Resultados e Discussão
39
Alíquotas das amostras referentes aos resultados acima foram separadas e analisadas
através de espectrofotometria, a fim de verificar a hipótese de que possíveis alterações
induzidas no DNA plasmidial pelo tratamento com as radiações UVA e UVB, poderiam ser
responsáveis pela proteção contra os efeitos da incubação posterior com SnCl
2
. Os
resultados apresentados na tabela 1, most5.9( (o)-1.)5.3i16. 3(qu, )5.ou, S5(l)]TJ7.5 0 0 7.378.6 609.6 8 Tm0 Tc0 Tw(2)Tj11.28 0 0 11.238 -28 60 1049002 Tm-0.0405 Tc0.0543 Tw é capaz(e d( ae( ( ode )-5.4icode )-5.defe)3.1( )]TJ7147340 -2.2979 TD-0.0013 Tc042995 Tw[b8(s)9.7(o0)1.3bação )-5.c2 r2oseio0256,4o ),(e slse)3.ocando-ção r716.a .u, r
Resultados e Discussão
40
plasmídio dos efeitos da incubação subseqüente com SnCl
2
, ao contrário do observado com
as radiações UVA e UVB.
Figura 9. a. Eletroforese em gel de agarose (0,8%) e análise densitométrica do plasmídio pUC 9.1 tratado com
diferentes doses de radiação ul travioleta C; b. Número médio de quebras/genoma no DNA plasmidial tratado
com diferentes doses de UVC. 1 (controle), 2 (5J/m
2
), 3 (10J/m
2
), 4 (50J/m
2
), 5 (100J/m
2
), 6 (500J/m
2
), 7
(1000J/m
2
), 8 (5000J/m
2
). O número médio de quebras/genoma foi determinado pela distribuição de Poisson,
conforme desc rito em material e métodos.
1234 5
6
78
I
II
0
20
40
60
80
100
12 34 56 78
Tr atame n to
% DNA
II (%)
I (%)
a
0
1
2
3
4
12345678
Tr ata.l40o6(r)-56.2(3 57(2(at)83(to)]TJ0 9430 956 0 1158 1.8 10.17 Tm- m023 T425.6565 Tw.2(8(7)5º6(r4e)6.6(am385.3(cn1)6.i(56)264.2(r)-16.2( 56)8 10.2( )]T 53900745 92 4307 TD052023 Tc0 [(q)cn1)6u)n)-6(eb)cn1)6ra r4e7(/4(,)10g2(n9-6(e)0w.2n)-6(o)r)-56m
Resultados e Discussão
41
Figura 10. a. Eletroforese em gel de agarose (0,8%) e análise densitométrica do plasmídio pUC 9.1 tratado
com SnCl
2
(200µg/mL) e UVC (5 e 50 J/m
2
), isoladamente, e pré-tratado com UVC seguido da incubação
com SnCl
2
; b. Número médio de quebras/genoma no DNA plasmidial tratado com SnCl
2
(200µg/mL) e UVC
(5 e 50 J/m
2
), isoladamente, e pré-tratado com UVC seguido da incubação com SnCl
2
. 1 (controle), 2 (SnCl
2
),
3 (UVC – 5 J/m
2
), 4 (UVC – 5 J/m
2
+ SnCl
2
), 5 (UVC – 50 J/m
2
), 6 (UVC – 50 J/m
2
+ SnCl
2
). O número
médio de quebras/genoma foi determinado pela distribuição de Poisson, conforme descrito em material e
métodos.
12345
6
I
II
0
20
40
60
80
100
123 456
Tr atame nto
% DNA
II (% )
I (% )
a
0
1
2
3
4
123456
Tr atam e n to
n º m é di o de
quebras /g enoma
b
Resultados e Discussão
42
Figura 11. a. Eletroforese em gel de agarose (0,8%) e análise densitométrica do plasmídio pUC 9.1 tratado
com SnCl
2
(200µg/mL) e UVC (100 e 500 J/m
2
), isoladamente, e pré-tratado com UVC seguido da incubação
com SnCl
2
; b. Número médio de quebras/genoma no DNA plasmidial tratado com SnCl
2
(200µg/mL) e UVC
(100 e 500 J/m
2
), isoladamente, e pré-tratado com UVC seguido da incubação com SnCl
2
. 1 (controle), 2
(SnCl
2
), 3 (UVC – 100 J/m
2
), 4 (UVC – 100 J/m
2
+ SnCl
2
), 5 (UVC – 500 J/m
2
), 6 (UVC – 500 J/m
2
+ SnCl
2
).
O número médio de quebras/genoma foi determinado pela distribuição de Poisson, conforme descrito em
material e métodos.
12345
6
I
II
0
20
40
60
80
100
123456
Tr a tame n to
% DNA
II (%)
I (%)
a
0
1
2
3
4
123456
Tr atam e n to
n º m é di o de
quebras /g enoma
b
Resultados e Discussão
43
A ausência de proteção conferida pelo UVC pode ser explicada pelo fato de que as
alterações produzidas por esta radiação são, majoritariamente, em bases pirimidínicas
(Leitão e Alcantara-Gomes, 1997; Pfeifer, et al., 2005). Esse fato, portanto, não interferiria
na ação subseqüente do SnCl
2
, uma vez que este atua preferencialmente em bases purínicas,
conforme demonstrado por Cabral e colaboradores (1998) ao detectarem lesões 8-
oxoguanina em DNA plasmidial tratado com SnCl
2
e, posteriormente, corroborado por De
Mattos e colaboradores (2005), ao observarem, com exceção da timina, que as bases
adenina, citosina e guanina sofreram alterações no espectro de absorção, quando tratadas
com SnCl
2
(200µM).
Com relação à proteção conferida pelo UVA, poderíamos sugerir que as lesões
produzidas, sendo principalmente em bases púricas, como por exemplo a 8-oxoguanina
(Pfeifer, et al., 2005), levariam a uma diminuição da quantidade dessas bases como
substrato para a ação do SnCl
2
. Por outro lado, com relação ao UVB, a explicação para este
fenômeno torna-se mais difícil, uma vez que a literatura cita que as lesões induzidas por esta
radiação são qualitativamente semelhantes àquelas produzidas pelo UVC (Pfeifer, et al.,
2005). No entanto, resultados recentes (Gomes et al., 2005) indicam que a radiação UVB
também seja capaz de induzir ERO, o que nos permite fazer, para os resultados relativos a
esta radiação, um raciocínio semelhante àquele correspondente ao da radiação UVA.
Conforme pode ser comprovado na literatura, a restauração das lesões induzidas por
agentes oxidantes, como o UVA e o SnCl
2
, é preferencialmente realizada pelo reparo por
excisão de bases (Serafini e Schellhorn, 1999; Cabral, et al., 1998). Juntando essas
informações aos resultados apresentados acima, resolveu-se estudar o efeito do pré-
tratamento com UVA, seguido da incubação com SnCl
2
em cepas de E. coli deficientes em
genes que codificam para diferentes proteínas envolvidas no mecanismo de reparo por
excisão de bases.
Resultados e Discussão
44
2. Inativação bacteriana
Resultados obtidos nos experimentos de sobrevivência mostraram, para todas as
cepas utilizadas, que a dose de UVA empregada neste trabalho (90kJ/m
2
) não foi capaz de
promover qualquer inativação bacteriana, sendo considerada, portanto, subletal (dados não
mostrados).
Com relação ao tratamento realizado com SnCl
2
(25µg/mL), os resultados indicam
que não existe diferença significativa (p>0,05) entre os níveis de inativação produzidos nas
cepas AB1157 (selvagem) e nos mutantes BW9091 e BW375. Porém, foi verificada
diferença significativa (p<0,001) entre a cepa selvagem e os mutantes BW527 e BH20
(figura 12).
Resultados e Discussão
45
Figura 12. Sobrevivência de E. coli AB1157; BH20; BW375; BW9091; BW527. Culturas em fase exponencial
de crescimento e ressuspensas em NaCl (0,9%) eram tratadas com SnCl
2
(25µg/mL) durante 60 minutos.
Alíquotas eram retiradas a cada 20 minutos, diluídas convenientemente, semeadas em meio LB gelosado e
incubadas a 37ºC, por aproximadamente 18 horas, para contagem das unidades formadoras de colônias e
determinação das frações de sobrevivência.
Estes resultados sugerem que as enzimas endonuclease IV e Fpg sejam importantes
no reparo das lesões promovidas pelo SnCl
2
. Nesta mesma figura (12), pode-se observar que
o mutante BH20 (fpg) mostrou-se mais sensível (p<0,001) que o mutante BW375 (nth), o
que confirma os relatos existentes na literatura (Friedberg et al., 1995), nos quais é citado
que a enzima Fpg reconheça lesões oxidativas como a 8-oxoguanina, sabidamente
produzidas pelo SnCl
2
(Cabral et al., 1998). Ainda pode-se verificar nos resultados obtidos,
que a enzima endonuclease IV, produto do gene nfo, seja mais importante que a exonuclease
III, produto do gene xthA, na r eparação de sítios AP gerados durante o reparo das lesões
induzidas pelo SnCl
2
. Essa afirmação se sustenta uma vez que a cepa BW9091 não se
mostrou sensível ao tratamento realizado, fato que pode ser explicado pela presença da
proteína endonuclease IV funcionante.
0,01
0,1
1
0204060
Temp o (min)
N/No
AB1157 (Selvagem)
BH 20 (fpg)
BW375 (nth)
BW9091 (xthA)
BW527 (nfo)
Resultados e Discussão
46
Os resultados obtidos com os mutantes duplos BW434, BW544 e BW534 (figura 13)
reforçam o importante papel do gene nfo no reparo das lesões induzidas pelo SnCl
2
, pois,
conforme pode ser observado, a cepa BW434 (xthA-nth) apresentou sobrevivência
semelhante (p>0,05) à cepa selvagem (AB1157). Este fato pode ser explicado pela atuação
das enzimas Fpg e endonuclease IV, capazes de restaurar as lesões induzidas pelo agente em
estudo, aumentando, portanto, a sobrevivência da cepa em questão. Os resultados mostram
também que as cepas BW544 (xthA-nfo) e BW527 (nfo) apresentaram os mesmos níveis de
inativação (p>0,05), enquanto a cepa BW534 (nth-nfo), mesmo sendo deficiente no produto
do gene nfo, não se mostrou tão sensível quanto a BW544 e a BW527. Estes dados sugerem
que a proteína exonuclease III, produto do gene xthA, tenha alguma participação na
reparação das lesões induzidas pelo agente em estudo, uma vez que a cepa BW534 foi
menos sensível que as outras duas, provavelmente por possuir a exonuclease III
funcionante. Além disso, pode-se verificar que, na ausência da exonuclease III, a enzima
Nth participe na reparação das lesões induzidas pelo SnCl
2
, uma vez que a cepa BW544 não
foi mais sensível que a BW527.
Resultados e Discussão
47
Figura 13. Sobrevivência de E. coli AB1157; BW527; BW434; BW544; BW534. Culturas em fase
exponencial de crescimento e ressuspensas em NaCl (0,9%) eram tratadas com SnCl
2
(25 µg/mL) durante 60
minutos. Alíquotas eram retiradas a cada 20 minutos, diluídas convenientemente, semeadas em meio LB
gelosado e incubadas a 37ºC, por aproximadamente 18 horas, para contagem das unidades formadoras de
colônias e determinaçã o das frações de sobrevivência.
Quando todas as cepas foram comparadas, observou-se que a triplo mutante BW535
(xthA-nth-nfo) foi a cepa mais sensível ao tratamento realizado com SnCl
2
(figura 14). Tal
resultado confirma que a proteína Nth possa estar atuando em alguma fase do reparo, uma
vez que na ausência também desta enzima, a cepa apresenta inativação ainda maior.
0,01
0,1
1
0 204060
Tempo (m in)
N/No
AB1157 (Selvagem)
BW527 (nfo)
BW434 (xthA-nth)
BW544 (xthA-nfo)
BW534 (nth-nfo)
Resultados e Discussão
48
Figura 14. Sobrevivência de E. coli AB1157; BH20; BW375; BW9091; BW527; BW434; BW544; BW534;
BW535. Culturas em fase exponencial de crescimento e ressuspensas em NaCl (0,9%) eram tratadas com
SnCl
2
(25µg/mL) durante 60 minutos. Alíquotas eram retiradas a cada 20 minutos, diluídas convenientemente,
semeadas em meio LB gelosado e incubadas a 37ºC, por aproximadamente 18 horas, para contagem das
unidades formadora s de colônias e determina ção das frações de sobrevivência.
Com relação ao tratamento realizado com UVA e SnCl
2
, ou seja, pré-tratamento com
UVA seguido da incubação com SnCl
2
, observou-se que a associação destes agentes
produziu um efeito sinergístico letal em todas as cepas testadas, quando comparado ao
efeito do SnCl
2
isoladamente (p<0,001). Conforme exposto, anteriormente, tanto o SnCl
2
quanto o UVA são capazes de produzir quebras em DNA plasmidial e induzir lesões do tipo
8-oxoguanina em células de E. coli. Uma vez que as lesões 8-oxoguanina acarretam em
inativação celular, os resultados obtidos nos experimentos de inativação bacteriana
permitem supor que, nesta condição experimental, a radiação UVA esteja gerando lesões
diferentes de 8-oxoguanina, devido ao fato desta radiação não ter induzido inativação em
nenhuma das cepas testadas. Portanto, esses dados permitem sugerir que o UVA esteja
produzindo quebras no DNA de E. coli, assim como ocorre em DNA plasmidial, e que estas
0,001
0,01
0,1
1
0204060
Tempo (m in)
N/No
AB1157 (Selvagem)
BH 20 (fpg)
BW375 (nth)
BW9091 (xthA)
BW527 (nfo)
BW434 (xthA-nth)
BW544 (xthA-nfo)
BW534 (nth-nfo)
BW535 (xthA-nth-nfo)
Resultados e Discussão
49
lesões, em conjunto com as induzidas pelo SnCl
2
– quebras e 8-oxoguanina – sejam capazes
de promover o efeito sinergístico letal observado nas células de E. coli.
Na figura 15 estão apresentados resultados de sobrevivência bacteriana obtidos com
a cepa selvagem (AB1157) e as cepas mutantes BH20, BW375, BW9091 e BW527, tratadas
com radiação UVA, seguida da incubação com SnCl
2
, indicando a existência de diferença
significativa (p<0,001) entre elas. Assim como ocorreu com o tratamento apenas com SnCl
2
,
a mutante BW527 (nfo) foi a mais sensível à associação do UVA, na condição de pré-
tratamento, com SnCl
2
, reforçando, mais uma vez, a idéia de que a enzima endonuclease IV
seja importante, não só na reparação das lesões induzidas pelo SnCl
2
, mas também naquelas
geradas pela sua associação com UVA. Nesta condição de tratamento, a cepa BH20 (fpg)
também se mostrou mais sensível que a BW375 (nth), sugerindo, novamente, que a enzima
Fpg seja mais eficiente que a Nth em reconhecer e remover lesões promovidas por esses
agentes.
Resultados e Discussão
50
Figura 15. Sobrevivência de E. coli AB1157; BH20; BW375; BW9091; BW527. Culturas em fase exponencial
de crescimento e ressuspensas em NaCl (0,9%) eram pré-iluminadas com UVA (90kJ/m
2
), seguidas da
incubação com SnCl
2
(25µg/mL) durante 60 minutos. Alíquotas eram retiradas a cada 20 minutos, diluídas
convenientemente, semeadas em meio LB gelosado e incubadas a 37ºC, por aproximadamente 18 horas, para
contagem das unidades form adoras de colônias e determ inaçã o das fra ções de sobr evivência .
Resultados obtidos quando os duplo mutantes BW434, BW544 e BW534 foram
submetidos ao pré-tratamento com UVA, seguido da incubação com SnCl
2
, mostraram que
a cepa BW434 (xthA-nth) foi menos sensível que os outros duplo mutantes (figura 16), da
mesma forma como ocorreu com o tratamento apenas com SnCl
2
, indicando que nesta
associação, o produto do gene nfo também seja muito importante na restauração das lesões.
Entretanto, ao contrário do ocorrido no tratamento apenas com SnCl
2
, a cepa BW544 (xthA-
nfo) foi mais sensível (p<0,001) em relação à cepa BW527 (nfo), enquanto esta não
apresentou diferença na sobrevivência, quando comparada à BW534 (nth-nfo). De qualquer
forma, o duplo mutante BW544 foi mais sensível que a BW534 (p<0,001; figura 16),
mostrando, mais uma vez, que a proteína exonuclease III também participe do reparo das
lesões induzidas no DNA, não só pelo SnCl
2
como também pela associação do UVA com
SnCl
2
.
Resultados e Discussão
51
Figura 16. Sobrevivência de E. coli AB1157; BW527; BW434; BW544; BW534. Culturas em fase
exponencial de crescimento e ressuspensas em NaCl (0,9%) eram pré-iluminadas com UVA (90kJ/m
2
),
seguidas da incubação com SnCl
2
(25µg/mL) durante 60 minutos. Alíquotas eram retiradas a cada 20 minutos,
diluídas convenientemente, semeadas em meio LB gelosado e incubadas a 37ºC, por aproximadamente 18
horas, para contagem das unidades formadoras de colônias e determ inação das fra çõe s de sobrevivência.
De forma semelhante ao ocorrido com o tratamento apenas com SnCl
2
, os resultados
obtidos na comparação da fração de sobrevivência de todas as cepas também indicaram a
BW535 (xthA-nth-nfo) como a mais sensível ao pré-tratamento com UVA seguido da
incubação com SnCl
2
(figura 17), sugerindo, novamente, que a enzima Nth também tenha
alguma participação no reparo das lesões induzidas pela associação do UVA, na condição
de pré-tratamento, com SnCl
2
.
0,001
0,01
0,1
1
0204060
Temp o (min)
N/No
AB1157 (Selvagem)
BW527 (nfo)
BW434 (xthA-nth)
BW544 (xthA-nfo)
BW534 (nth-nfo)
Resultados e Discussão
52
Figura 17. Sobrevivência de E. coli AB1157; BH20; BW375; BW9091; BW527; BW434; BW544; BW534;
BW535. Culturas em fase exponencial de crescimento e ressuspensas em NaCl (0,9%) eram pré-iluminadas
com UVA (90kJ/m
2
), seguidas da incubação com SnCl
2
(25µg/mL) durante 60 minutos. Alíquotas eram
retiradas a cada 20 minutos, diluídas convenientemente, semeadas em meio LB gelosado e incubadas a 37ºC,
por aproximadamente 18 horas, para contagem das unidades formadoras de colônias e determinação das
frações de sobrevivência.
Tomados em conjunto, os resultados apresentados até aqui, obtidos nos
experimentos de inativação bacteriana, indicam que a enzima endonuclease IV, produto do
gene nfo, seja a preferencial na restauração das lesões induzidas pelos agentes em estudo,
assim como ocorre com os agentes químicos tert-butil hidroperóxido e bleomicina,
responsáveis pela produção de lesões que não são reconhecidas pela exonuclease III, mas o
são pela endonuclease IV (Friedberg, et al., 1995). Dessa forma, pode-se explicar a
resistência do mutante xthA (BW9091) e do duplo mutante xthA-nth (BW434). No primeiro
caso, a presença da enzima endonuclease IV funcionante faria o reconhecimento das lesões
induzidas. No segundo caso, a resistência do duplo mutante BW434 poderia ser explicada
pela presença da enzima Fpg, que, assim como Nth, reconhece lesões oxidativas e da
0,0001
0,001
0,01
0,1
1
0204060
Temp o (min)
N/No
AB1157 (Selvagem)
BH 20 (fpg)
BW375 (nth)
BW9091 (xthA)
BW527 (nfo)
BW434 (xthA-nth)
BW544 (xthA-nfo)
BW534 (nth-nfo)
BW535 (xthA-nth-nfo)
Resultados e Discussão
53
enzima endonuclease IV, o que, mais uma vez, reforça o importante papel do gene nfo no
reparo dessas lesões.
Contudo, os resultados evidenciam que as enzimas exonuclease III e Nth também
participem na reparação das lesões produzidas pelo SnCl
2
, ou pela associação do UVA com
SnCl
2
. Este fato pode ser explicado pela maior sobrevivência do duplo mutante BW534
(nth-nfo), em relação a BW544 (xthA-nfo), o que se justifica pela funcionalidade da
exonuclease III, indicando que esta enzima tenha uma participação no reparo das lesões,
mesmo que pequena, uma vez que essa cepa foi mais sensível que a selvagem. Já para o
triplo mutante (xthA-nth-nfo), observou-se que a proteína Nth também estaria atuando em
alguma fase do reparo, uma vez que a BW535 foi mais sensível que a BW544.
Os dados obtidos também sugerem que a enzima Fpg, responsável pelo
reconhecimento e excisão de lesões oxidativas, desempenhe papel mais importante que a
enzima Nth, nas condições experimentais testadas. Entretanto, os resultados indicam que na
ausência de Fpg, a proteína Nth também atuaria no reparo das lesões induzidas pelos
agentes em estudo, uma vez que o mutante fpg, apesar de ter sido mais sensível que o
mut a nt e nth, não foi tão sensível quanto o mutante nfo.
3. Eletroforese em gel alcalino de agarose
De acordo com os resultados apresentados até aqui, foi verificado que, tanto o SnCl
2
quanto a radiação UVA, sejam responsáveis por quebras em DNA plasmidial. Além disso, o
SnCl
2
e a sua associação com UVA promovem inativação diferenciada em cepas bacterianas
mutantes em diferentes genes envolvidos no reparo por excisão de bases. Para uma melhor
Resultados e Discussão
54
compreensão dos mecanismos de produção de lesões pelos agentes em estudo foi utilizada,
então, uma técnica capaz de detectar quebras no genoma bacteriano.
Alíquotas das culturas bacterianas foram analisadas por meio de eletroforese em gel
alcalino (conforme descrito no item 3.8 de material e métodos) e os resultados obtidos
mostraram que o UVA, o SnCl
2
e a associação do UVA com SnCl
2
são capazes de induzir
quebras no DNA de todas as cepas utilizadas. Além disso, foi verificado que o pré-
tratamento com UVA, seguido da incubação com SnCl
2
provocou um efeito mais intenso na
indução de quebras (p<0,0001), quando comparado ao obtido com o SnCl
2
isoladamente.
A análise densitométrica dos géis obtidos nos diferentes experimentos mostrou que,
para o tratamento apenas com SnCl
2
, a cepa BH20 (fpg) foi a que apresentou menos quebras
no DNA (figura 18), quando comparada às outras cepas. Este resultado está de acordo com
aqueles obtidos nos experimentos de sobrevivência, mostrando a importância da enzima Fpg
na detecção das lesões induzidas pelo SnCl
2
. Como já conhecido na literatura (Cabral, et al.,
1998) esse agente é capaz de produzir a lesão 8-oxoguanina, sabidamente reconhecida por
Fpg (Friedberg, et al., 1995). Portanto, na ausência desta enzima, não haveria o
reconhecimento dessa lesão e a conseqüente formação de sítios AP (álcali-lábeis), por isso,
menos quebras seriam visualizadas no DNA da cepa BH20.
Resultados e Discussão
55
Figura 18. Eletrof orese em gel alcalino de ag arose e análise densit ométrica do DNA de E. coli BH20 tratada
com SnCl
2
(25µg/mL) e UVA (90kJ/m
2
), isoladamente, e pré-tratada com UVA, seguido da incubação com
SnCl
2
. 1 (controle), 2 (SnCl
2
), 3 (UVA), 4 (UVA + SnCl
2
).
Com relação à análise densitométrica das cepas pré-tratadas com UVA, seguidas da
incubação com SnCl
2
, observou-se que a cepa selvagem (AB1157) foi a que apresentou um
menor número de quebras no seu DNA (figura 19). Este dado indica que a cepa em questão
possua uma vantagem em relação às outras, ou seja, a funcionalidade de todas as proteínas
do mecanismo de reparo por excisão de bases, garantiria uma restauração mais rápida das
lesões induzidas por estes agentes, e por isso, seriam visualizadas menos quebras em seu
DNA.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
1234
Tratamento
% DNA
% DNA íntegro
% DNA quebrado
12 3 412 3 412 3 4
Resultados e Discussão
56
Figura 19. Eletroforese em gel alcalin o de agaro se e análise densito métri ca do DNA de E. coli AB1157 tratada
com SnCl
2
(25 µg/mL) e UVA (90kJ/m
2
), isoladamente, e pré-tratada com UVA, seguido da incubação com
SnCl
2
. 1 (controle), 2 (SnCl
2
), 3 (UVA), 4 (UVA + SnCl
2
).
A análise dos géis alcalinos dos mutantes em BER (figuras 20 a 26) sugere que a
proteína Fpg funcionante reconheça e retire as bases lesadas, uma vez que essas cepas
apresentaram um elevado número de quebras. No entanto, o processo de reparação, nessas
cepas, seria mais lento, quando comparado com a cepa selvagem que apresentou menos
quebras (figura 19). Pode-se ainda sugerir que a não funcionalidade de qualquer uma das
outras enzimas envolvidas no BER, retardaria este mecanismo. Essas suposições são
baseadas em dados da literatura onde é citado que as enzimas do BER são constitutivas
(Friedberg et al., 1995). Dentre as diferentes proteínas codificadas pelos genes desse
mecanismo de reparo, o produto do gene nfo, além de existir constitutivamente, pode ter sua
síntese aumentada em caso de ativação do sistema SoxRS (Pomposiello e Demple, 2001).
Baseado nesse fato pode-se explicar a razão dos mutantes no gene nfo terem sido os mais
sensíveis, pois, como pode ser observado nas figuras 22, 24, 25 e 26, as cepas deficientes
neste gene apresentaram um elevado número de quebras, o que sugere, novamente, que a
enzima endonuclease IV seja importante no reparo das lesões induzidas pelos agentes em
estudo.
12 34
0%
20%
40%
60%
80%
100%
1234
Tratamento
% DNA
% DNA íntegro
% DNA quebrado
Resultados e Discussão
57
Os resultados também mostraram que a cepa BW535 (xthA-nth-nfo) foi a que
apresentou mais quebras no DNA (figura 26), o que indica, novamente, que a proteína Nth
também tenha alguma participação na reparação das lesões induzidas pelos agentes
estudados.
Figura 20. Eletro forese em gel al calino de agaro se e análise densito métrica do DNA de E. coli BW3 75 trat ada
com SnCl
2
(25µg/mL) e UVA (90kJ/m
2
), isoladamente, e pré-tratada com UVA, seguido da incubação com
SnCl
2
. 1 (controle), 2 (SnCl
2
), 3 (UVA), 4 (UVA + SnCl
2
).
12 34
0%
20%
40%
60%
80%
100%
1234
Tratam ento
% DNA
% DNA íntegro
% DNA quebrado
Resultados e Discussão
58
Figura 21. Eletroforese em gel alcalino de agarose e análise densitométrica do DNA de E. coli BW9091
tratada com SnCl
2
(25µg/mL) e UVA (90kJ/m
2
), isoladamente, e pré-tratada com UVA, seguido da incubação
com SnCl
2
. 1 (controle), 2 (SnCl
2
), 3 (UVA), 4 (UVA + SnCl
2
).
12 34
0%
20%
40%
60%
80%
100%
1234
Tratamento
% DNA
% DNA íntegr o
% DNA queb rado
Resultados e Discussão
59
Figura 22. Eletro forese em gel al calino de agaro se e análise densito métrica do DNA de E. coli BW5 27 trat ada
com SnCl
2
(25µg/mL) e UVA (90kJ/m
2
), isoladamente, e pré-tratada com UVA, seguido da incubação com
SnCl
2
. 1 (controle), 2 (SnCl
2
), 3 (UVA), 4 (UVA + SnCl
2
).
Figura 23. Eletro forese em gel al calino de agaro se e análise densito métrica do DNA de E. coli BW4 34 trat ada
com SnCl
2
(25µg/mL) e UVA (90kJ/m
2
), isoladamente, e pré-tratada com UVA, seguido da incubação com
SnCl
2
. 1 (controle), 2 (SnCl
2
), 3 (UVA), 4 (UVA + SnCl
2
).
0%
20%
40%
60%
80%
100%
1234
Tratamento
% DNA
% DNA íntegro
% DNA quebrado
123412341234
12 34
0%
20%
40%
60%
80%
100%
1234
Tratamento
% DNA
% DNA íntegr o
% DNA queb rado
Resultados e Discussão
60
Figura 24. Eletro forese em gel al calino de agaro se e análise densito métrica do DNA de E. coli BW5 34 trat ada
com SnCl
2
(25µg/mL) e UVA (90kJ/m
2
), isoladamente, e pré-tratada com UVA, seguido da incubação com
SnCl
2
. 1 (controle), 2 (SnCl
2
), 3 (UVA), 4 (UVA + SnCl
2
).
Figura 25. Eletro forese em gel al calino de agaro se e análise densito métrica do DNA de E. coli B W54 4 trat ada
com SnCl
2
(25µg/mL) e UVA (90kJ/m
2
), isoladamente, e pré-tratada com UVA, seguido da incubação com
SnCl
2
. 1 (controle), 2 (SnCl
2
), 3 (UVA), 4 (UVA + SnCl
2
).
12 34
0%
20%
40%
60%
80%
100%
1234
Tratam ento
% DNA
% DNA íntegro
% DNA quebrado
12 34
0%
20%
40%
60%
80%
100%
1234
Tratamento
% DNA
% DNA íntegro
% DNA quebrado
Resultados e Discussão
61
Figura 26. Eletro forese em gel al calino de agaro se e análise densito métrica do DNA de E. coli BW5 35 trat ada
com SnCl
2
(25µg/mL) e UVA (90kJ/m
2
), isoladamente, e pré-tratada com UVA, seguido da incubação com
SnCl
2
. 1 (controle), 2 (SnCl
2
), 3 (UVA), 4 (UVA + SnCl
2
).
12 34
0%
20%
40%
60%
80%
100%
1234
Tratamen to
% DNA
% DNA íntegro
% DNA quebrado
Conclusões
62
CONCLUSÕES
Analisados em conjunto, os resultados obtidos através das técnicas e condições
empregadas neste estudo, permitem concluir que:
- O cloreto estanoso, e as radiações ultravioleta A e B induziram lesões, do tipo quebra,
em DNA plasmidial, ao contrário da radiação ultravioleta C;
- O pré-tratamento com UVA ou UVB, seguido da incubação com cloreto estanoso foi
capaz de proteger parcialmente a molécula de DNA plasmidial dos efeitos do tratamento
somente com SnCl
2
, enquanto nenhuma proteção foi observada ao serem realizados pré-
tratamentos com UVC;
- O cloreto estanoso foi capaz de alterar o espectro de absorção do DNA plasmidial,
enquanto que o pré-tratamento com UVA ou UVB, seguido da incubação com este sal,
inibiu parcialmente o efeito produzido pelo SnCl
2
isoladamente;
- O cloreto estanoso foi capaz de promover inativação diferenciada em cepas deficientes
no mecanismo de reparo por excisão de bases, sendo a triplo mutante (xthA-nth-nfo) a
mais sensível ao tratamento, seguida pelas mutantes no gene nfo e pela mutante fpg;
- O pré-tratamento com UVA, seguido da incubação com SnCl
2
, induziu um efeito
sinergístico letal em todas as cepas testadas, sendo, novamente, a triplo mutante, as
mutantes em nfo e a mutante em fpg mais sensíveis a esse tratamento;
- A radiação UVA foi capaz de induzir quebras no genoma bacteriano de todas as cepas
testadas;
- O cloreto estanoso foi capaz de induzir um alto número de quebras no DNA de todas as
cepas, com exceção da mutante fpg;
Conclusões
63
- O pré-tratamento com UVA, seguido da incubação com cloreto estanoso induziu um
número de quebras ainda maior, quando comparado ao SnCl
2
, isoladamente, sendo a
triplo mutante (xthA-nth-nfo) e as mutantes no gene nfo mais sensíveis ao tratamento;
- O reparo das lesões induzidas pelos agentes e condições experimentais utilizadas neste
estudo é preferencialmente realizado pelos produtos dos genes fpg e nfo, uma vez que
mutações nesses genes dificultam ou retardam o processo de reparação;
- A enzima Nth participa de alguma fase do reparo das lesões induzidas pelos agentes e
condições estudadas, uma vez que o triplo mutante (xthA-nth-nfo) foi o mais sensível
aos tratamentos realizados.
Etapas Futuras
64
ETAPAS FUTURAS
Os resultados deste estudo demonstram que as enzimas endonuclease IV e Fpg,
envolvidas no mecanismo de reparo por excisão de bases, sejam importantes para a
restauração de lesões oxidativas induzidas pela associação da radiação ultravioleta A, na
condição de pré-tratamento, com o cloreto estanoso. Uma vez que o acúmulo de lesões
oxidativas no DNA representa um grande risco para a funcionalidade celular, torna-se
relevante o estudo mais detalhado dos mecanismos de reparação das lesões induzidas pelo
UVA e pelo SnCl
2
.
Portanto, como etapas futuras serão realizados:
- experimentos de cinética de reparo do DNA de E. coli, tratadas como descrito neste
estudo, através da técnica de eletroforese alcalina em gel de agarose, com a finalidade de
esclarecer as sugestões propostas a partir deste estudo;
- construção de plasmídios contendo gene
Referências Bibliográficas
65
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ASAD, N.R.; LEITÃO , A.C. Effects of metal ion chelators on DNA strand breaks and
inactivation produced by hydrogen peroxide in Escherichia coli: detection of iron-
independent lesions. Journal of Bacteriology, 173(8), p. 2562-2568, 1991.
AXELROD, M.; SERAFIN, D. ; KLITZMAN, B. Ultraviolet light and free radicals: an
immunologic theory of epidermal carcinogenesis.
Plastic and Reconstructive Surgery
,
86(3), p. 582-593, 1990.
BERNARDO-FILHO, M.; CUNHA, M.C.; VALSA, J.O.; CALDEIRA-DE-ARAUJO, A.;
SILVA, F.C.P.; FONSECA, A.S. Evaluation of potencial genotoxicity of stannous chloride:
inactivation, filamentation and lysogenic induction of Escherichia coli. Food and Chemical
Toxicology, 32(5), p. 477-479, 1994.
BJELLAND, S.; SEEBERG, E. Mutagenicity, toxicity and repair of DNA base damage
induced by oxidation.
Mutation Research
, 531, p. 37-80, 2003.
BOITEUX, S.; HUISMAN, O. Isolation of a formamidopyrimidine-DNA glycosylase (fpg)
mutant of Escherichia coli K12. Molecular and General Genetics, 215, p. 300-305, 1989.
BUDAVERY, S. (Editor).
The Merck Index
. Merck and Co., Whitehouse Station, New
Jersey, p. 1500-1501, 1996.
Referências Bibliográficas
66
CABRAL, R.E.C.; LEITÃO, A.C.; LAGE, C.; CALDEIRA-DE-ARAUJO, A.;
BERNARDO-FILHO, M.; DANTAS, F.J.S.; CABRAL -NETO, J.B. Mutational potentiality
of stannous chloride: an important reducing agent in the Tc-99m-radiopharmaceuticals.
Mutation Research, 408, p.129-135, 1998.
CADET, J.; SAGE, E.; DOUKI, T. Ultraviolet radiation-mediated damage to cellular DNA.
Mutation Research, 571, p. 3-17, 2005.
CALDEIRA-DE-AR AUJO, A.; DANTAS, F.J.S.; MORA ES, M.O.; FELZENSZWALB, I.;
BERNARDO-FILHO, M. Stannous chloride partipates in the generation of reactive oxygen
species. Free Radical Research in Latin America, 48(1/2), p. 109-113, 1996.
CALDEIRA-DE-AR AUJO, A.; FAVRE, A. Near ultr aviolet DNA damage induces the SOS
response in Escherichia coli. The EMBO Journal, 5(1), p. 175-179, 1986.
COURDAVAULT, S.; BAUDOUIN, C.; CHARVERON, M.; FAVIER, A.; CADET, J.
DOUKI, T. Larger yield of cyclobutane dimers than 8-oxo-7, 8-dihydroguanine in the DNA
of UVA-irradiated human skin cells. Mutation Research, 556, p. 135-142, 2004.
CUNNINGHAM, R.P.; SAPORITO, S.M.; SPITZER, S.G.; WEISS, B. Endonuclease IV
(nfo) mutants of Escherichia coli.
Journal of Bacteriology
, 168 (3), p. 1120-1127, 1986.
CUNNINGHAM, R.P.; WEISS, B. Endonuclease III (nth) mutants of Escherichia coli.
Proceedings of National Academy of Sciences USA, 82, p. 474-478, 1985.
Referências Bibliográficas
67
DANTAS, F.J.S.; DE MATTOS, J.C.P.; MORAES, M.O.; VIANA, M.E.; LAGE, C.A.S.;
CABRAL-NETO, J.B.; LEITÃO, A.C.; BERNARDO-FILHO, M.; BEZERRA, R.J.A.C.;
CARVALHO, J.J.; CALDEIRA-DE-ARAUJO, A. Genotoxic effects of stannous chloride
(SnCl
2
) in K562 cell line. Food and Chemical Toxicology, 40, p. 1493-1498, 2002.
DANTAS, F.J.S.; MORAES, M.O.; CARVALHO, E.F.; VALSA, J.O.; BERNARDO-
FILHO, M.; CALDEIRA-DE-ARAUJO, A. Lethality induced by stannous chloride on
Escherichia coli AB1157: participation of reactive oxygen species.
Food and Chemical
Toxicology, 34, p.959-962, 1996.
DANTAS, F.J.S.; MORAES, M.O.; DE MATTOS, J.C.P.; BEZERRA, R.J.A.C.
CARVALHO, E.F.; BERNARDO-FILHO, M.; CALDEIRA-DE-ARAUJO, A. Stannous
chloride mediates single strand breaks in plasmid DNA through reactive oxygen species
formation. Toxicology Letters, 110, p.129-136, 1999.
DE MATTOS, J.C.P.; DANTAS, F.J.S.; BEZERRA, R.J.A.C.; BERNARDO-FILHO, M.;
CABRAL-NETO, J.B.; LAGE, C.; LEITÃO, A.C.; CALDEIRA-DE-ARAUJO, A. Damage
induced by stannous chloride in plasmid DNA. Toxicology Letters, 116, p. 159-163, 2000.
DE MATTOS, J.C.P.; LAGE, C.; DANTAS, F.J.S.; MORAES, M. O.; NUNES, A.P.M.;
BEZERRA, R.J.A.C.; FARIA, M.V.C. LE ITÃO, A.C. CALD EIRA-DE-ARAUJO , A.
Interaction of stannous chloride leads to alteration in DNA, triphosphate nucleotides and
isolated bases. Molecular and Cellular Biochemistry, 280, p. 173-179, 2005.
Referências Bibliográficas
68
DEMPLE, B.; HALBROOK, J.; LINN, S . Escherichia coli xthA mutants are hypersensitive
to hydrogen peroxide. Journal of Bacteriology, 153 (2), p. 1079-1082, 1983.
DIZDAROGLU, M.; JARUGA, P. BIRINCIOGLU, M. RODRIGUEZ, H. Free radical-
induced damage to DNA: mechanisms and measurement. Free Radical Biology &
Medicine, 32(11), p. 1102-1115, 2002.
DOUKI, T.; REYNAUD-ANGELI N, A.; CADET, J.; SAGE, E. Bipy rimidine
photoproducts rather than oxidative lesions are the main type of DNA damage involved in
the genotoxic effects of solar UVA radiation. Biochemistry, 42, p. 9221-9226, 2003.
DROBETSKY, E.A.; TORCOTTE, J.; CHÂTEAUNEUF, A. A role for ultraviolet A in
solar mutagenesis. Proceedings of National Academy of Sciences USA, 92, p. 2350-2354,
1995.
EISENSTARK, A. Mutagenic and lethal effects of near-ultraviolet radiation (290-400 nm)
on bacteria and phage.
Environmental Molecular Mutagenesis
, 10, p. 317-337, 1987.
EL-DEMERSDASH, F.M.; YOUSEF, M.I.; ZOHEIR, M.A. Stannous chloride induces
alterations in enzyme activities, lipid peroxidation and histopathology in male rabbit:
Antioxidant role of vitamin C.
Food and Chemical Toxicology
, 2005. In press.
FALLER, R.V.; BEST, J.M.; FEATHERSTONE, J.D.B.; BARRET-VESPONE, N.A.
Anticaries efficacy of an improved stannous fluoride toothpaste. Journal of Clinical
Dentistry VI (Special Issue), p. 89-96, 1995.
Referências Bibliográficas
69
FAVRE, A.; HAJNSDOR F, E.; THIAM, K.; CALDEI RA-DE-AR AUJO, A. Mutagenesis
and growth delay induced in Escherichia coli by near-ultraviolet radiations. Biochimie, 67,
p.335-342, 1985.
FELZENSZWALB, I.; DE MATTOS, J.C.P.; BERNARDO-FILHO, M.; CALDEIRA-DE-
ARAUJO, A. Shark cartilage-containing preparation: Protection against reactive oxygen
species. Food and Chemical Toxicology, 36, p.1079-1084, 1998.
FRIEDBERG, E.C.; WALKER, G.C.; SIED, W. DNA Repair and Mutagenesis.
Washington, DC. ASM Press, 1995.
GAO, D.; LUO, Y.; GUEVARA, D.; WANG, Y.; RUI, M.; GOLDWYN, B.; LU, Y.;
SMITH, E.C.A.; LEBWOHL, M.; WEI, H. Benzo[a]py rene and its metabolites combined
with ultraviolet A synergistically induce 8-hidroxy-2’-deoxyguanosine via reactive oxygen
species. Free Radical Biology & Medicine, 39, p. 1177-1183, 2005.
GILLESPIE, G.Y. ; BARTH, R.F.; GOBUTTY, A. Labeling of mammalian nucleated cells
with 99mTc. Journal of Nuclear Medicine, 14, p. 706-708, 1973.
GOMES, A.A.; S ILVA-JUNI OR, A.C.; OLI VEIRA, E.B.; ASAD, L.M.; REIS, N.C.;
FELZENSZWALB, I.; KOVARY, K.; ASAD, N.R. Reactive oxy gen species mediate
lethality induced by far-UV in Escherichia coli cells.
Redox report: communications in
free radical research, 10(2), p. 91-95, 2005.
Referências Bibliográficas
70
HALLAS, L.E.; COONEY, J.J. Tin and tin-resistant microorganisms in Chesapeake Bay.
Applied and Environmental Microbiology, 41, p. 466-471, 1981.
HALLIDAY, G.M. Inflammation, gene mutation and photoimmunosuppression in response
to UVR-induced oxidative damage contributes to photocarcinogenesis. Mutation Research,
571, p. 107-120, 2005.
HANNANAH, D. Study on transformation of E. coli with plasmids.
Journal of Molecular
Biology, 166, p. 557-567, 1983.
HATTORI, T.; MAEHASHI, H. Augmentation of calcium influx by stannous chloride at
mouse motor nerve terminals.
Research Communications in Molecular Pathology and
Pharmacology, 84(2), p. 253-256, 1994.
HATTOTI, T.; MAEHASHI, H.; MIYAZAWA, T.; NAITO, M. Potentiation by stannous
chloride of calcium entry into osteoblastic MC3T3-E1 cells through voltage-dependent L-
type calcium channels.
Cell Calcium
, 30(1), p.67-72, 2001.
HLADIK III, W.B.; SAHA, G.B.; STUDY, K.T. Essenti als of Nuclea r Medicin e Science.
Williams and Wilkins, Baltimore, 1987.
HOERTER, J.D.; ARNOLD, A.A.; KU CZYNSKA, D. A.; SHIBUYA, A.; WARD, C.S. ;
SAUER, M.G.; GIZACHEW, A.; HOTCHKISS, T.M.; FLEMING, T.J.; JOHNSON, S.
Effects of sublethal UVA irradiation on activity levels of oxidative defense enzymes and
Referências Bibliográficas
71
protein oxidation in Escherichia coli. Journal of Photochemistry and Photobiology B, 81,
p.171-180, 2005.
HOWARD-FLANDERS, P.; SIMSON, E.; THERIOT, L. A locus that controls filament
formation and sensitivity to radiation in Escherichia coli K12. Genetics, 49, p. 237-246,
1964.
KANEMATSU, N.; HARA, M.; KADA, T. Rec assay and mutagenicity studies on metal
compounds. Mutatation Research, 77, p. 109-116, 1980.
KAWANISHI , S.; HIRAKU, Y.; OI KAWA, S. Mechanism of guanine-specific DNA
damage by oxidative stress and its role in carcinogenesis and aging.
Mutation Research
,
488, p. 65-76, 2001.
KEHRER, J.P. The Haber-Weiss reaction and mechanisms of toxicity. Toxicology, 149, p.
43-50, 2000.
KIM, K.J.; CHAK RABARTY, I. ; LI, G.Z.; GRÖ SCH, S.; KAINA, B.; RÜNGER, T.M.
Modulation of base excision repair alters cellular sensitivity to UVA1 but not to UVB.
Photochemistry and Photobiology, 75(5), p.507-512, 2002.
KNOWLES, R.; EISENSTARK, A. Near-ultraviolet mutagenesis in superoxide dismutase-
deficient strains of Escherichia coli. Environmental Health Perspectives, 102, p.88-94,
1994.
Referências Bibliográficas
72
KOZMIN, S.; SLEZAK, G.; REYNAUD-ANGELIN, A.; ELIE, C.; RYCKE, Y.;
BOITEUX, S.; SAGE, E. UVA radiation is highly mutagenic in cells that are unable to
repair 7,8-dihydro-8-oxoguanine in Saccharomyces cerevisiae.
Proceedings of the
National Academy of Sciences USA, 102(38), p. 13538-13543, 2005.
KRUTMANN, J. Ultraviolet A radiation-induced biological effects in human skin:
relevance for photoaging and photodermatosis. Journal of Dermatological Science, 23(S1)
p. 22-26, 2000.
LARSSON, A.; KINNBY, B. ; KUNSBERG, R.; P ERZKOWSKI, M.J.; W ARFUINGE, G.;
Irritant and sensitizing potential of copper, mercury and tin salts in experimental contact
stomatitis of rat oral mucosa.
Contact Dermatitis
, 23, p. 146-153, 1990.
LEE, J.D. Química Inorgânica não tão Concisa. Tradução de Juergen Heinrich Maar. 4.
ed. São Paulo: Edgard Blücher LTDA, 1996.
LEITÃO, A.C.; ALCANTARA-GOMES, R. Respostas celulares às lesões induzidas por
agentes físicos e químicos. Apostila de Radiobiologia e Fotobiologia, p. 1-119, 1997.
LURIA, S.E.; BURROUS, J.W. Hybridization between E. coli and Shigella. Journal of
Bacteriology
, 74, p. 461-476, 1957.
MARNETT, L.J. Oxyradicals and DNA damage. Carcinogenesis, 21(3), p. 361-370, 2000.
Referências Bibliográficas
73
MARTINEZ, G.R.; LOUREIRO, A.P.M.; MARQUES, S.A.; MIYAMOTO, S.;
YAMAGUCHI, L.F .; ONUKI, J.; ALMEIDA, E.A.; GA RCIA, C.C.M.; BARBOSA, L.F.;
MEDEIROS, M.H.G.; DI MASCIO, P. Oxidative and alkylating damage in DNA.
Mutation Research, 544, p. 115-127, 2003.
MCLEAN, J.R.; BLAKEY, D.H.; DOUGLAS, G.R. KAPLAN, J.G. The effect of stannous
and stannic (tin) chloride on DNA in Chinese hamster ovary cells. Mutation Research,
119(2), p. 195-201, 1983.
MENEGHINI, R. A toxicidade do oxigênio. Ciência Hoje, 28, p. 57-62, 1987.
NISHIOKA, H. Mutagenic activities of metal compounds in bacteria.
Mutation Research
,
31, p. 185-189, 1975.
NORBURY, C.J.; HICKSON, I.D. Cellular response to DNA damage. Annual Review of
Pharmacology and Toxicology, 41, p. 367-401, 2001.
OLIVIER, P.; MARZIN, D. Study of genotoxic potential of 48 inorganic derivatives with
the SOS chromotest. Mutation Research, 189(3) p. 263-269, 1987.
OPPEZZO, O.; PIZARRO, R.A. Sublethal effects of ultraviolet A radiation on Enterobacter
cloacae.
Journal of Photochemistry and Photobiology B
, 62, p.158-165, 2001.
Referências Bibliográficas
74
PALMER, C.M.; SERAFINI, D.M.; SCHELLHORN, H.E. Near ultraviolet radiation (UVA
and UVB) causes a formamidopyrimidine glycosylase-dependent increase in G to T
transversions.
Photochemistry and Photobiology
, 65(3), p. 543-549, 1997.
PARETZOGLOU, A.; STOCKENHUBER, C.; KIRK, S.H.; AHAMD, S.I. Generation of
reactive oxygen species from the photolysis of histidine by near-ultraviolet light: effects on
T7 as a model biological system. Journal of Photochemistry and Photobiology B, 43, p.
101-105, 1998.
PEAK, J.G.; PEAK, M.J.; NERAD, L. The role of 4-thiouridine in lethal effects in DNA
backbone caused by 334 nm ultraviolet light in E. coli. Photochemistry and Photobiology,
37, p. 169-172, 1983.
PFEIFER, G.P.; YOU, Y.H.; BESARATINIA, A. Mutations induced by ultraviolet light.
Mutation Research, 571, p. 19-31, 2005.
POMPOSIELLO, P.J.; DEMPLE, B. Redox-operated genetic switches: the SoxR and OxyR
transcription factors. TRENDS in Biotechnology, 19(3), p. 109-114, 2001.
PUNGARTNIK, C.; VI AU, C.; PICADA, J.; CALDEIRA-DE-ARAUJO, A.;
HENRIQUES, J.A.P.; BRENDEL, M. Genotoxicity o f stannous chloride in yeast and
bacteria.
Mutation Research
, 583, p.146-157, 2005.
RADER J.I. Anti-nutritive effects of dietary tin. Advances in Experimental Medicine and
Biology, 289, p. 509-524, 1991.
Referências Bibliográficas
75
ROCHETTE, P.J.; THERRIEN, J.P.; DROUIN, R.; PERDIZ, D.; BASTIEN, N.;
DROBETSKY, E.A.; SAGE, E. UVA-induced cy clobutane pyrimidine dimers from
predominantly at thymine- thymine dipyrimidine and correlate with the mutation spectrum
in rodent cells. Nucleic Acid Research, 31, p. 2786-2794, 2003.
SAHA, G.B. Fundamentals of Nuclear Pharmacy, Springer Verlag, New York, 1992.
SAMBROOK, J.; FRITSCH, E.F.; MANIATIS, T. Extraction and purification of plasmid
DNA. In: Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory,
1989.
SERAFINI, D.M.; SCHELLHORN, H.E. Endonuclease III and endonuclease IV protect
Escherichia coli from the lethal and mutagenic effects of near-UV irradiation. Canadian
Journal of Microbiology, 45, p.632-637, 1999.
SHENNAN, M.G.; PALMER, C.M.; SCHELLHORN, H.E. Role of Fapy glycosylase and
UvrABC excinuclease in the repair of UVA (320-400 nm)-mediated DNA damage in
Escherichia coli. Photochemistry and Photobiology, 63(1), p. 68-73, 1996.
SILVA DE SOUZA, S.M.; HIRATA R.JR. MOREIRA, L.O.; GOMES, M.L.; BRAGA DE
ANDRADE, A.F.; BERNARDO-FILHO, M.; MATTOS-GUARALDI, A.L. Influence of
stannous chloride on the adhesive properties of Corynebacterium diphteriae strains.
International Journal of Molecular Medicine, 12(4), p. 657-661, 2003.
Referências Bibliográficas
76
SILVA, F.C.P.; FONSECA, A.S. ; CORRÊA, A.S.; LEE, C.C.; CALDEIRA-DE-ARAUJO,
A.; VALSA, J.O.; BERNARDO-FILHO, M.; FRAVE, A. Near-UV light protection effect
against lethality induced by stannous chloride in Escherichia coli.
Microbios
, 79, p. 241-
244, 1994.
SINGH, I. Induction of reverse mutation and mitotic gene conversion by some compounds
in Saccharomyces cerevisae. Mutation Research, 117, p. 149-152, 1989.
SLUPPHAUG, G.; KAVLI, B.; KRO KAN, H.E. The interaction pathways for prevention
and repair of oxidative DNA damage. Mutation Research, 531, p. 231-251, 2003.
TRIPHATY, N.K.; WURGLER, F. E.; FREI, H. Genetic toxicity of six carcinogens and six
non-carcinogens in the Drosophila wing spot test. Mutation Research, 242, p. 169-180,
1990.
TURNER, M.A.; EISENSTARK, A. Near-ultraviolet radiation blocks SOS responses to
DNA damage in Escherichia coli.
Molecular & general genetics
., 193, p. 33-37, 1984.
TYRRELL, R.M. Induction of pyrimidine dimers in bacterial DNA by 365 nm radiation.
Photochemistry and Photobiology, 17, p. 69-73, 1973.
WEISS, R.B.; DUKER, N.J. Photoalkylated DNA and ultraviolet-irradiated DNA are
incised at cytokines by endonuclease III. Nucleic Acids Research, 14 (16), p. 6621-6631,
1986.
Referências Bibliográficas
77
WHITE, D.J. “Return” to Stannous Fluoride Dentifricies. Journal of Clinical Dentistry VI
(Spec. Issue) , p. 29-36, 1995.
WHITE, P.A.; RASMUSSEN, J.B. SOS chromotest results in a broader context: empirical
relatioships between genotoxic potency, mutagenic potency, and carcinogenic potency.
Environmental and Molecular Mutagenesis, 27, p. 270-305, 1996.
YOUSEF, M.I. Protective role of ascorbic acid to enhance reprodutive performance of male
rabbits treated with stannous chloride. Toxicology, 207, p.81-89, 2005.
ZHANG, X.; ROSENSTEIN, B.S.; WANG, Y.; LEBWOHL, M.; MICHELL, D.M.; WEI,
H. Induction of 8-hidroxy -2’-deoxyguanosine by ultraviolet radiation in calf thymus DNA
and HeLa cells. Photochemistry and Photobiology, 65, p. 119-124, 1997.
Produção Científica
78
PRODUÇÃO CIE NTÍFICA DURANTE A PÓS-GRADUAÇÃO
1. Um artigo em revista internacional
Leme, A.A.P.; Motta, E.S.; De Mattos, J.C.P.; Dantas, F.J.S., Bezerra, R.J.A.C.; Caldeira
De Araujo, A. Assessment of Aloe vera (L.) genotoxic potencial on Escherichia coli and
plamid DNA.
Journal of Ethnopharmacology
, 2005. 102, 197-201.
2. Nove resumos no Congresso de Mutagênese, Carcinogênese e Teratogênese
Ambiental
Guedes, A.P.; Matos, V.C.;
Motta
, E.S.; Rodrigues, M.P.; Silva, C.R.; Claudio, I.L.P.;
Souza, D.V.; Bittencourt, P.C.; Neiva, R.S.; Oliveira, M.B.N.; Bezzera, R.J.A.C.; Mattos,
J.C.P.; Dantas, F.J.S.; Caldeira De Araujo, A. Avaliação da citotoxicidade induzida pelo kit
de medicina nuclear MDP e seus componentes isolados em Escherichia coli. In: VII
Congresso Brasileiro de Mutagênese, Carcinogênese e Teratogênese Ambiental, 2005,
Natal. Genetics and Molecular Biology. São Paulo.: SBG, 2005. v. 28, p. 53.
Silva, C.R.; Monteiro, M.R.;
Motta
, E.S.; Rodrigues, M.P.; Rocha, H.M.; Teixeira, V.C.;
Mattos, J.C.P.; Caldeira De Araujo, A.; Bezzera, R.J.A.C. Avaliação do potencial
mutagênico através do mutoxitest e da alteração conformacional e/ou quebra do plasmídeo
pUC 9.1 através de eletroforese em gel de agarose (0,8%) induzidos pela papaína (Carica
papaya), sene (Cássia angustifolia), pata de vaca (Bauhi. In: VII Congresso Brasileiro de
Mutagênese, Carcinogênese e Teratogênese Ambiental, 2005, Natal.
Genetics and
Molecular Biology. São Paulo.: SBG, 2005. v. 28, p. 54.
Motta, E.S.; Rodrigues, M.P.; Claudio, I.L.P.; Matos, V.C.; Guedes, A.P.; Bittencourt, P.C.;
Souza, D.V.; Neiva, R.S.; Oliveira, M.B.N.; Silva, C.R.; Bezzera, R.J.A.C.; Dantas, F.J.S.;
Mattos, J.C.P.; Caldeira De Araujo, A. Efeito do cloreto estanoso e da radiação ultravioleta
em DNA plasmidial. In: VII Congresso Brasileiro de Mutagênese, Carcinogênese e
Teratogênese Ambiental, 2005, Natal.
Genetics and Molecular Biology
.
São Paulo.: SBG,
2005. v. 28, p. 52.
Produção Científica
79
Matos, V.C.; Guedes, A.P.; Rodrigues, M.P.; Oliveira, M.B.N.; Claudio, I.L.P.; Motta, E.S;
Souza, D.V.; Bittencourt, P.C.; Neiva, R.S.; Dantas, F.J.S.; Mattos, J.C.P.; Caldeira De
Araujo, A. Efeito genotóxico dos kits MDP e DTPA através da avaliação da capacidade
transformante do plasmídeo pUC 9.1. In: VII Congresso Brasileiro de Mutagênese,
Carcinogênese e Teratogênese Ambiental, 2005, Natal. Genetics and Molecular Biology.
São Paulo.: SBG, 2005. v. 28, p. 217.
Caldeira De Araujo , A.; Rodr igues, M.P .; Matos, V.C. ; Motta, E.S.; Claudio, I.L.P.;
Guedes, A.P.; Bittencourt, P.C.; Souza, D.V.; Neiva, R.S.; Oliveira, M.B.N.; Silva, C.R.;
Bezzera, R.J.A.C.; Moraes, M.O.; Mattos, J.C.P.; Dantas, F.J.S. Efeito Genotóxico induzido
por kit de radiofarmácia em ratos Wistar machos. In: VII Congresso Brasileiro de
Mutagênese, Carcinogênese e Teratogênese Ambiental, 2005, Natal.
Genetics and
Molecular Biology. São Paulo.: SBG, 2005. v. 28, p. 56.
Rodrigues, M.P.; Matos, V.C.; Motta, E.S.; Claudio, I.L.P.; Guedes, A.P.; Bittencourt, P.C.;
Souza, D.V.; Neiva, R.S.; Oliveira, M.B.N.; Silva, C.R.; Bezzera, R.J.A.C.; Ornellas,
M.H.F.; Moraes, M.O.; Mattos, J.C.P.; Dantas, F.J.S.; Caldeira De Araujo, A. Estudo da
ação genotóxica e indução de apoptose em células de pacientes submetidos à cintilografia
óssea. In: VII Congresso Brasileiro de Mutagênese, Carcinogênese e Teratogênese
Ambiental, 2005, Natal. Genetics and Molecular Biology. São Paulo.: SBG, 2005. v. 28, p.
51.
Dantas, F.J.S.; Rodrigues, M.P.; Matos, V.C.; Motta, E.S.; Claudio, I.L.P.; Guedes, A.P.;
Bittencourt, P.C.; Souza, D.V.; Neiva, R.S.; Oliveira, M.B.N.; Silva, C.R.; Bezzera,
R.J.A.C.; Moraes, M.O.; Mattos, J.C.P.; Caldeira De Araujo, A. Indução de quebras em
DNA plasmidial tratado com componentes de kits utilizados na radiofarmácia. In: VII
Congresso Brasileiro de Mutagênese, Carcinogênese e Teratogênese Ambiental, 2005,
Natal. Genetics and Molecular Biology. São Paulo.: SBG, 2005. v. 28, p. 57.
Mattos, J.C.P.; Fischer, S.C. A.; Motta, E.S.; Oliveira, M.B.N.; Moraes, M.O.; Dantas,
F.J.S.; Bezzera, R.J.A.C.; Rodrigues, M.P.; Claudio, I.L.P.; Matos, V.C.; Guedes, A.P.;
Bittencourt, P.C.; Souza, D.V.; Caldeira De Araujo, A. Mecanismos de reparo envolvidos
na ação sinergística letal entre cloreto estanoso e radiação UVA em Escherichia coli. In: VII
Produção Científica
80
Congresso Brasileiro de Mutagênese, Carcinogênese e Teratogênese Ambiental, 2005,
Natal.
Genetics and Molecular Biology
.
São Paulo.: SBG, 2005. v. 28, p. 58.
Claudio, I.L.P.; Rodrigues, M.P.; Motta, E.S.; Matos, V.C.; Guedes, A.P.; Souza, D.V.;
Silva, C.R.; Mattos, J.C.P.; Caldeira De Araujo, A.; Moura, E.G. Metformina protege o
DNA de ratos diabéticos tipo 2 contra a indução de quebras. In: VII Congresso Brasileiro de
Mutagênese, Carcinogênese e Teratogênese Ambiental, 2005, Natal.
Genetics and
Molecular Biology. São Paulo: SBG, 2005. v. 28, p. 187.
3. Um resumo no Congresso Brasileiro de Genética
Silva, J.C.F.; Guedes, A.P.; Matos, V.C.;
Motta
, E.S.; Cláudio, I.L.P; Rodrigues, M.P.;
Bezerra, R.J.Á.C.; Mattos, J.C.P.; Dantas, F.J.S.; Caldeira De Araujo, A.. Análise da
potencialidade genotóxica de kits de medicina nuclear em DNA plasmidial através das
técnicas de transformação bacteriana e eletroforese em gel de agarose. In: 51º Congresso
Brasileiro de Genética, 2005, Águas de Lindóia. 51º Congresso Brasileiro de Genética.
2005. p. 1184-1184.
4. Três resumos na Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia
Experimental
Motta, E.S.; Rodrigues, M.P.; Claudio, I.L.P.; Matos, V.C.; Guedes, A.P.; Bittencourt, P.C.;
Neiva, R.S.; Oliveira, M.B.N.; Dantas, F.J.S.; Mattos, J.C.P.;Caldeira De Araujo, A. Efeito
genotóxico da associação do cloreto estanoso e radiação ultravioleta em plasmídeo pUC 9.1.
In: XX Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental, 2005, Águas
de Lindóia. FeSBE. 2005. v. 19.
Rodrigues, M.P.; Matos, V.C.; Motta, E.S.; Claudio, I.L.P.; Guedes, A.P.; Bittencourt,
P.C.; Neiva, R.S.; Oliveira, M.B.N.; Mattos, J.C.P.; Dantas, F.J.S.; Caldeira De Araujo, A.
Efeitos induzidos por kits de radiofarmácia em diferentes sistemas biológicos. In: XX
Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental, 2005, Águas de
Lindóia. FeSBE. 2005. v. 19.
Produção Científica
81
Moura, E.G.; Claudio, I.L.P.; Rodrigues, M.P.; Motta, E.S.; Matos, V.C.; Guedes, A.P.;
Souza, D.V.; Silva, C.R.; Hassan, B.K.; Lima, N.S. ; Mattos, J .C.P.; Caldeir a De Arauj o, A.
Metformina impede a indução de quebras do DNA de ratos diabéticos tipo 2. In: XX
Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental, 2005, Águas de
Lindóia. FeSBE. 2005. v. 19.
5. Um resumo no Congresso Brasileiro de Endocrinologia e Metabologia
Claudio, I.L.P.; Rodrigues, M.P.; Motta, E.S.; Matos, V.C.; Mattos, J.C.P.; Caldeira De
Araujo, A.; Moura, E.G. A metformina possui efeito antioxidante capaz de impedir a quebra
no DNA. In: 26º Congresso Brasileiro de Endocrinologia e Metabologia, 2004,
Florianópolis.
Endocrinologia & Metabologia
.
SBEM, 2004. v. 48, p. 637.
6. Um resumo no Congresso de Endocrinologia - ENDORECIFE
Claudio, I.L.P.; Rodrigues, M.P.; Motta, E.S.; Matos, V.C.; Mattos, J.C.P.; Caldeira De
Araujo, A.; Moura, E.G. Avaliação da genotoxidade e efeito antioxidante da metiformina.
In: ENDORECIFE, 2004, Porto de Galinhas. Endocrinologia & Metabologia. SB EM,
2004. v. 48, p. 421.
7. Uma comunicação oral
Motta, E.S.; Rodrigues, M.P.; Claudio, I.L.P.; Matos, V.C.; Guedes, A.P.; Bittencourt, P.C.;
Neiva, R.S.; Oliveira, M.B.N.; Dantas, F.J.S.; Mattos, J.C.P.; Caldeira De Araujo, A. Efeito
genotóxico da associação do cloreto estanoso e radiação ultravioleta em plasmídio pUC 9.1.
In: XX Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental, 2005, Águas
de Lindóia. FeSBE. 2005. v. 19.
8. Um prêmio de Menção Honrosa
Motta
, E.S.; Rodrigues, M.P.; Claudio, I. L.P.; Matos, V.C.; Guedes, A.P.; Bittencourt, P.C.;
Neiva, R.S.; Oliveira, M.B.N.; Dantas, F.J.S.; Mattos, J.C.P.; Caldeira De Araujo, A. Efeito
genotóxico da associação do cloreto estanoso e radiação ultravioleta em plasmídio pUC 9.1.
Produção Científica
82
In: XX Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental, 2005, Águas
de Lindóia.
FeSBE
.
2005. v. 19.
9. Duas participações em orientações de bolsistas de iniciação científica
- Participação na orientação do bolsista de Iniciação Científica Paulo Thiago de Souza
Santos. Esta orientação deu origem ao seguinte resumo em congresso internacional:
Santos, P.T.S.; Motta, E.S.; De Mattos, J.C.P.; Dantas, F.J.S.; Caldeira De Araújo, A. UV A
pré-illumination of E. coli enhances the cell’s survival to UV C. In: V Scientific Meeting of
the Brazilian Society of Nuclear Biosciences / I Encuentro cientifico hispanobrasileño.
2005. Belo Horizonte/MG.
- Participação na orientação da bolsista de Estágio Interno Complementar Paula da
Conceição Bittencourt. Esta orientação originou dois resumos na Semana de Graduação da
UERJ. São eles:
Bittencourt, P.C.; Motta, E.S.; Caldeira De Araujo, A.; De Mattos, J.C.P. Efeito do cloreto
estanoso e da radiação ultravioleta em DNA plasmidial. In: 5ª Semana de Graduação da
UERJ, 2005.
Bittencourt, P.C.; Motta, E.S.; Caldeira De Araujo, A.; De Mattos, J.C.P. Lesões induzidas
pelo cloreto estanoso e radiação ultravioleta em DNA plasmidial. In: 4ª Semana de
Graduação da UERJ, 2004.
10. Uma participação em curso
- Participação do Workshop em Estresse Oxidativo, realizado em 12 de maio de 2004, no
Hotel Everest, Rio de Janeiro, RJ.
11. Duas participações em banca examinadora
- Participação na banca de correção da prova de Biologia do Exame Discursivo do
Vestibular Estadual (UERJ - UENF) em 2005 e 2006.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo