( PDF ) Estudo da atividade anti-HSV-1 de Terpenos isolados de algas pardas marinhas

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

CENTRO DE ESTUDOS GERAIS

INSTITUTO DE BIOLOGIA

PROGRAMA DE NEUROIMUNOLOGIA

JULIANA LOURENÇO ABRANTES

ESTUDO DA ATIVIDADE ANTI-HSV-1 DE TERPENOS ISOLADOS DE ALGAS

PARDAS MARINHAS

NITERÓI

2006

Programa de Neuroimunologia

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

CENTRO DE ESTUDOS GERAIS

INSTITUTO DE BIOLOGIA

PROGRAMA DE NEUROIMUNOLOGIA

JULIANA LOURENÇO ABRANTES

ESTUDO DA ATIVIDADE ANTI-HSV-1 DE TERPENOS

ISOLADOS DE ALGAS PARDAS MARINHAS

Niterói

2006

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JULIANA LOURENÇO ABRANTES

ESTUDO DA ATIVIDADE ANTI-HSV-1 DE TERPENOS ISOLADOS DE ALGAS

PARDAS MARINHAS

Trabalho desenvolvido no laboratório de Virologia Molecular do Departamento de

Biologia Celular e Molecular, Programa de Neuroimunologia, Instituto de Biologia –

UFF.

Orientadora: Izabel Christina de Palmer Paixão Frugulhetti

Co-orientadora: Valéria Laneuville Teixeira

NITERÓI

2006

Dissertação de mestrado

submetida à Univers

idade Federal

Fluminense como requisito parcial

para obtenção de grau de Mestre

em Neuroimunologia.

Abrantes, Juliana Lourenço

Estudo da atividade anti-HSV-1 de terpenos isolados de algas pardas

marinhas./ Juliana Lourenço Abrantes – Niterói, 2006

XIII, 81f

Dissertação (Mestrado em Neuroimunologia) – Universidade Federal

Fluminense, Instituto de Biologia, 2006

1. HSV-1 2. Produtos Naturais

3. Agentes antivirais 4. Algas Pardas

– Teses. I. Título

CDD

JULIANA LOURENÇO ABRANTES

ESTUDO DA ATIVIDADE ANTI-HSV-1 DE TERPENOS ISOLADOS DE ALGAS

PARDAS MARINHAS

Dissertação de mestrado

submetida à Universidade Federal

Fluminense como requisito parcial

para obtenção de Mestre em

Neuroimunologia

Niterói, 11 de agosto de 2006

BANCA EXAMINADORA

Dra. Helena Carla Castro Rangel

UFF

"A melhor maneira de

ter uma boa idéia é ter

muitas idéias”.

Linus Pauling

AGRADECIMENTOS

Às professoras

Izabel Frugulhetti e Valéria Laneuville Teixeira pela orientação e

amizade.

Aos professores Renato Crespo e Valéria Teixeira e aos alunos do Departamento

de Biologia Marinha da UFF, pela colaboração que nos permite o desenvolvimento

da pesquisa na área de antivirais.

Aos professores do Curso de Pós-Graduação em Neuroimunologia pelos

ensinamentos indispensáveis para a minha formação acadêmica.

Aos Professores Carlos Frederico Leite Fontes e Júlio Alberto Mignaco do Instituto

de Bioquímica Médica da UFRJ e a todos os seus alunos, por estarem sempre

dispostos a colaborar com o nosso trabalho.

À banca desta dissertação.

À professora Elizabeth Giestal de Araújo pela revisão desta dissertação.

A todos os colegas do curso de Pós-Graduação em Neuroimunologia.

Às amigas Samara e Hania Rosado pela indispensável prestação de serviços

técnicos.

A todos os meus amigos, que são muito especiais.

Aos amigos do Laboratório de Virologia Molecular da UFF, Luciano Sant'Anna,

Priscila Born, Tamara Fogel, Silmara Souza, Diego Queiroz, Marcelo do

Nascimento Costa, Milene Dias Miranda e Thiago Moreno Lopes e Souza.

À minha família por ter me dado apoio e todo suporte necessário para o

desenvolvimento desta dissertação.

E ao meu namorado Thiago Moreno Lopes e Souza por toda a orientação

profissional, além de todo o carinho, dedicação, companheirismo e amor.

3.9. Efeito das substâncias DA-1 e Dol-2 em células infectadas sobre a

Síntese de Proteínas --------------------------------------------------------------32

3.10. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida e Auto-radiografia----------------33

3.11. Ensaio de Inibição da enzima DNA polimerase viral ----------------------33

3.12. Análise Estatística ------------------------------------------------------------------34

4. RESULTADOS -----------------------------------------------------------------------------35

4.1. Avaliação da atividade antiviral--------------------------------------------------35

4.2. Avaliação da citotoxicidade-------------------------------------------------------37

4.3. Os produtos naturais apresentaram valores de inibição comparáveis

ao do ACV----------------------------------------------------------------------------37

4.4. As substâncias podem estar atuando em fases iniciais da replicação

viral-------------------------------------------------------------------------------------39

4.5. As substâncias não atuam sobre a adsorção viral na célula hospedeira

-------------------------------------------------------------------------------------------42

4.6. As substâncias revertem a inibição da síntese de proteínas em células

Vero infectadas com HSV-1 -----------------------------------------------------44

4.7. A inibição da expressão de proteínas virais ---------------------------------46

4.8. As substâncias não inibem a atividade da DNA polimerase viral ------49

5. DISCUSSÃO -------------------------------------------------------------------------------51

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS -------------------------------------------------58

7. Anexo-----------------------------------------------------------------------------------------75

LISTA DE ABREVIATURAS

µg/mL – micrograma por mililitro

µCi/mL – microCurie por mililitro

µM – Micromolar

M - Molar

α-TIF – Fator indutor de transcrição de proteínas de fase α.

ACV – Aciclovir

– Citotoxicidade em 50%

– Dióxido de Carbono

DMEM – Dubelcco´s modified Eagle medium

DMSO - Dimetilsulfóxido

DNA – Ácido desoxirribonucléico

DTT - Dithiothreitol

– Concentração da droga capaz de inibir em 50% a replicação viral

EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético

FBS – Soro fetal bovino

g – Força da gravidade

HCF – Proteína estabilizadora de fator de transcrição

HCl – Ácido clorídrico

HIV - Vírus da imunodeficiência humana

HVEM – Mediador da entrada de herpesvirus

HSV-1 – Vírus herpes simples tipo – 1

HSV-2 – Vírus herpes simples tipo - 2

ICP – Proteína de célula infectada

MgCl

– Cloreto de Magnésio

MHC - Principal complexo de histocompatibilidade

MOI – Multiplicidade de infecção

MTT – 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliumbrometo

NGF – Fator de crescimento do nervo

h p.i. – Horas pós - infecção

PBS – Salina tamponada com fosfato

PFU – Unidades formadoras de placas virais

PMSF - Fenilmetilsulfonil fluoreto

RNA – Ácido ribonucléico

RNAm – Ácido desoxirribonucléico mensageiro

RPM – Rotações por minuto

SDS - Dodecilsulfato de sódio

SI – Índice de Seletividade

TAP – Transportador associado com o processamento do antígeno

TCA – Ácido tricloroacético

TNF – fator de necrose tumoral

TK – Timidina cinase

Vero - Células de rim de macaco verde africano

VHS – Virus host shut-off

OCT-1 e OCT-2 – proteínas reguladoras de transcrição

RESUMO

O vírus herpes simples tipo-1 pode causar doenças como encefalite,

ceratoconjutivite e escarificação mucocutânea. O aciclovir é o composto mais

utilizado no tratamento de pacientes acometidos por estas doenças. Neste

trabalho avaliamos o mecanismo de ação de terpenos isolados das algas pardas

Dictyota menstrualis, Dictyota pfaffii e Stypopodium zonale, coletadas na costa

Brasileira, na replicação “in vitro” do vírus Herpes Simples Tipo-1 em células Vero.

Podemos observar que estas moléculas inibiram a expressão de proteínas de fase

β. Isto sugere que os compostos podem estar atuando sobre a fase α da

replicação viral, já que cada etapa da replicação do vírus herpes simples tipo-1

ocorre como uma cascata, onde cada fase é dependente da fase anterior ou que

as substâncias poderiam estar atuando sobre proteínas de fase β expressas

anteriormente àquelas que foram inibidas.

Palavras-chave: HSV-1, produtos naturais, agentes antivirais e algas pardas.

ABSTRACT

The herpes simplex type-1 virus can cause illness such as encephalitis,

keratoconjutivits and mucocutaneous scarification. The acyclovir is the reference

compound used to treat these threats. In this work, we evaluated the mechanism of

action of terpenes isolated from the brown algaes Dictyota menstrualis, Dictyota

pfaffii and Stypopodium zonale collected in Brazilian shore on the “in vitro”

replication of herpes simplex type-1 virus in Vero cells. We could observe that

these molecules inhibited the expression of β proteins. It suggests that the

compounds could be acting at α phase of viral replication, since each step of

herpes simplex type-1 virus replication occurs in a pathway, in which each phase

depends on the previous one or the substances could be acting at β proteins

expressed upstream those that were inhibited.

Key-words: HSV-1, natural products, antiviral agents and brown algaes.

1 - INTRODUÇÃO

1.1 – O Vírus Herpes Simples tipo 1 (HSV-1)

1.1.1 – Histórico e transmissão

O vírus Herpes Simples tipo 1 (HSV-1), também denominado Herpesvirus

Humano tipo 1 (HHV-1) foi primeiramente documentado pelo médico grego

Hipócrates (460/377 a.C.), que o batizou de herpes (do latim herpin = rastejar,

reptil) devido ao aspecto das lesões causadas pelo vírus, como vesículas no trato

bucal, febre e ulcerações nos lábios. Todas estas manifestações caracterizavam a

doença Herpes febrilis, descrita mais tarde por Heródoto (484/425 a.C.). No

entanto, somente no século XX, entre 1920 a 1960, foi demonstrado que os

isolados virais infectavam uma grande gama de hospedeiros, como ratos,

camundongos, coelhos, cobaias e macacos. Além disso, também foi demonstrado

que este vírus poderia se multiplicar rapidamente em cultura de células

fibroblásticas, epiteliais, nervosas e ovos embrionados, levando à lise celular. Em

1968, os pesquisadores Nahmias e Dowdle classificaram o vírus herpes no gênero

Simplex e, com base em diferenças imunológicas, epidemiológicas e clínicas,

separaram este vírus em duas espécies diferentes, classificando-os de HSV-1 e

HSV-2 (Miranda et al., 2002). Contudo, desde a última reunião do International

Comitee for Viruses taxonomy (ICVT) o vírus herpes simples tipo 1 foi classificado

como pertencente à família Herpesviridae e à subfamília alphaherpesviridae,

devido as suas características genômicas, sorológicas, ciclo replicativo e latência

(Miranda et al., 2002).

Hoje sabemos que a transmissão do HSV-1 ocorre por contato direto da

mucosa ou pele com algum tipo de abrasão com as secreções que contenham o

vírus em questão. Após sua entrada, as partículas virais são transportadas

retrogradamente, ao longo dos neurônios sensoriais até o gânglio trigêmeo, onde

podem estabelecer infecções latentes por toda vida do hospedeiro (Brady et al.,

2004).

A lesão orolabial recorrente causada pelo HSV-1 tem como sintomas uma

vermelhidão em torno dos lábios e pode ser precedida por formigamento ou

queimação local (Whitley et al., 2002). O HSV-1 pode causar lesões

mucocutâneas, encefalite em pacientes imunocomprometidos e neonatos, e

ceratoconjutivite, sendo uma das principais causas de cegueira em países em

desenvolvimento (Corey & Spear, 1986) (Esquema 1). Apesar do HSV-1 ser

classicamente conhecido como causador do herpes labial, outros herpesvírus

como o HSV-2, classicamente descrito como causador do herpes genital, pode ser

encontrado no sítio labial; neste caso, a transmissão se dá, sobretudo, através do

sexo oral. Da mesma forma pode acontecer a infecção pelo HSV-1 no trato

genital, com conseqüente estabelecimento de latência nos gânglios lombo-sacros

(Bhattarakosol et al., 2005).

Esquema 1 - Lesões causadas pelo HSV-1 (http://www.google.com.br)

1.1.2 – Morfologia

A partícula viral completa do HSV-1 mede cerca de 150nm. Além disso, este

vírus apresenta um envelope lipídico, no qual estão inseridas as glicoproteínas

virais e algumas proteínas de envelope, como gE, gI e C-1, relacionadas com a

inibição do complemento pelas vias clássica e alternativa. Outras glicoproteínas

virais, como gM, gK e gI, estão relacionadas com o espalhamento do HSV-1 pelas

junções intercelulares e pela formação de sincício (Flakow, 1996) (Tabela 1).

Abaixo do envelope lipídico a partícula viral apresenta um material protéico e

amorfo, denominado tegumento, que é composto pela proteína majoritária ICP5 e

também pelas proteínas VHS, responsável pela degradação do RNAm celular e

desagregação de polissomas, e α-TIF, responsável pela formação do complexo de

pré-iniciação, dando início ao processo de transcrição viral. Além do tegumento, o

HSV-1 apresenta um capsídeo, também de natureza protéica, que mede cerca de

100nm e que serve de cerne para o genoma viral (Esquema 2).

O genoma viral é representado por uma molécula de DNA dupla fita linear

que contém cerca de 150kb, sendo constituído por 2 segmentos: um longo (L) e

um curto (S). Estes segmentos estão ligados covalentemente e são flanqueados

por seqüências invertidas e repetidas (Esquema 3). No genoma viral existem

seqüências para codificação de cerca de 70 proteínas. Durante a infecção ocorre

a circularização do DNA viral no núcleo da célula hospede

GLICOPROTEÍNAS

FUNÇÕES

gB Interação com GAGs; Adsorção e Fusão; Formação de sincício

gC Interação com GAGs

gD Adsorção em receptores diferentes dos GAGs; Espalhamento célula-célula; Não forma sincício

gE Receptor para Fc de Imnunoglobulinas

gI Forma complexo com gE; Envolvido com o espalhamento pelas junções intercelulares

gH Forma complexo com gL; Envolvido na fusão do envelope viral com a membrana plasmática

gL Forma complexo com gH

gK Envolvido com o transporte do vírion pelo citoplasma

gM Interação com receptores nas junções intercelulares, mediando o espalhamento viral

Tabela 1 – Função de algumas glicoproteínas do HSV-1. (Adaptado de Miranda et al., 2002)

Esquema 2 – Eletromicrografia do HSV-1 (http://darwin.bio.uci.edu)

Esquema 3 – Mapa genético do HSV-1 (http://darwin.bio.uci.edu)

1.1.3 – Mecanismos da multiplicação viral

1.1.3.1 - A entrada do HSV-1 na célula hospedeira (Adsorção e

Penetração)

A primeira etapa da infecção viral inicia-se no momento em que ocorre a

adsorção do HSV-1 na célula hospedeira. Nesta etapa, ocorre a interação das

glicoproteínas virais gC e gB com proteoglicanos celulares, principalmente com

moléculas de heparan sulfato. Após este processo, a glicoproteína gD pode

interagir com três tipos distintos de receptores secundários, responsáveis pela

entrada do vírus na célula hospedeira (Esquema 4): o mediador da entrada de

herpesvírus (HVEM - herpesvirus entry mediator), um membro da superfamília dos

receptores do TNF/NGF; os receptores da família da Nectina -1 e Nectina -2,

membros da superfamília das imunoglobulinas; e moléculas de heparan sulfato

modificadas em sítios específicos pela ação da enzima 3 – O – sulfotransferase

(Spear et al., 2000; Spear & Longnecker, 2003; Spear, 2004; Spear et al., 2006).

Esquema 4 – Entrada do HSV-1 na célula hospedeira (http://darwin.bio.uci.edu)

O receptor HVEM é um receptor da família do TNF que pode ser encontrado

em uma grande variedade de tecidos e tipos celulares, incluindo células T e B,

células epiteliais e fibroblastos. Porém, ainda não foi constatada sua presença em

neurônios (Montgomery et al., 1996). Além da glicoproteína viral gD, outras

moléculas também podem interagir com o HVEM através de sítios específicos de

ligação, como por exemplo os ligantes endógenos como o LIGHT e a Linfotoxina-α

(LT-α), não sendo possível a ligação de todas estas moléculas ao mesmo tempo

(Whitbek et al., 1997; Mauri et al., 1998; Sarrias et al., 2000; Benedict et al., 2001;

Benedict et al., 2003; Ware, 2003).

Os receptores Nectina -1 e Nectina -2 são as únicas isoformas dos

receptores da Nectina capazes de permitir a entrada do HSV-1, apresentando uma

grande importância sobretudo no que diz respeito à dispersão célula–célula deste

vírus (Yoon & Spear, 2002; Marozin et al., 2004). Estes receptores podem ser

encontrados em células epiteliais, fibroblastos e neurônios, co-localizando com

caderinas em junções aderentes, participando dos processos de adesão celular

(Spear, 2004).

Já as moléculas de heparan sulfato são glicosaminoglicanas, sintetizadas

pela adição de unidades repetidas de N-acetil-glicosamina e acido glicurônico

seguido pela sulfatação por ação enzimática (Lindahl et al., 1998).

Após o processo de adsorção ocorre a exposição de resíduos hidrofóbicos

de diversas glicoproteínas virais, como gD e gH/gL, resultando na fusão do

envelope viral com a membrana plasmática da célula hospdeira. Em seguida, as

proteínas do tegumento, juntamente com o nucleocapsídeo, são liberadas no

citoplasma da célula hospedeira. O nucleocapsídeo será, então, transportado via

citoesqueleto para a área perinuclear, onde o capsídeo é desmontado, ocorrendo

a liberação do genoma viral no núcleo da célula hospedeira (Esquema 4)

(Roizman & Sears, 1996).

1.1.3.2 – Latência e ciclo lítico (produtivo)

Após a sua entrada na célula hospedeira, o HSV-1 pode estabelecer a

latência ou o ciclo lítico. Apesar dos fatores que possam estar influenciando a

latência ou o ciclo produtivo ainda não serem bem estabelecidos, pesquisas

indicam que a presença de Fator de Crescimento do Nervo (NGF) pode induzir a

latência em gânglios da raiz dorsal pela indução da transcrição do gene viral LAT

(Latency-Associated-Transcript) (Preston, 2000; Mitchell et al., 2003).

Durante o período de latência o HSV-1 associa-se a histonas, formando um

DNA episomal. Além disso, a latência ocorre principalmente no sistema nervoso

onde há uma maior expressão do fator nuclear OCT-2 em relação a isoforma

OCT-1, que é expressa principalmente em outros tecidos. Na maioria dos tecidos

a proteína do tegumento viral α-TIF interage preferecialmente com a proteína

OCT-1. Esta ligação é estabilizada pelo fator HCF proporcionando a formação do

complexo de pré-iniciação junto ao TATA Box do genoma do HSV-1, iniciando a

transcrição de genes de fase alfa e conseqüente infecção produtiva (Preston,

2000).

Algumas situações como estresse, hipertermia, aumento das concentrações

citosólicas de AMPc, transplante de orgãos e imunossupressão, o HSV-1 pode ser

reativado (Kuo et al., 1987) (Esquema 5). Durante a reativação, as partículas virais

são transportadas via transporte anterógrado ao longo dos neurônios sensoriais

periféricos, causando a infecção produtiva, podendo provocar lesões no tecido

mucocutâneo. Em alguns casos, como em pacientes imunocomprometidos e

neonatos, as partículas virais podem migrar em direção ao sistema nervoso

central, podendo provocar quadros de encefalite e ceratoconjutivite (Corey &

Spear, 1986; Roizman & Sears, 1996; Brady et al., 2004). Além disso, o HSV-1

parece ser um fator importante para disseminação do HIV-1, podendo causar uma

série de enfermidades associadas à AIDS (Mann et al., 1984; Chen et al., 1998).

O ciclo produtivo do HSV-1 pode ser cineticamente dividido em três fases

(Esquemas 6, 7 e 8). A primeira delas é denominada fase alfa (Immediately-early),

que tem início no momento em que a proteína do tegumento viral α-TIF, associada

aos fatores nucleares OCT-1 e HCF, se liga ao TATA Box no genoma viral,

formando o complexo de pré-iniciação viral. Inicia-se, então, a síntese de

proteínas de fase alfa, como ICP4, ICP27 e ICP47, responsáveis pela regulação

positiva das fases beta e gama, além de inibir a ação das proteínas TAP inibindo a

apresentação de antígenos virais pelo MHC de classe I. Após a fase alfa inicia-se

a fase beta (Early), na qual são sintetizadas enzimas análogas às celulares e que

possibilitam a replicação do DNA, como a timidina cinase (TK) e UL30/UL42 (DNA

polimerase viral). A última fase é denominada fase gama (Late), na qual são

produzidas as proteínas estruturais do vírion, ocorrendo a montagem da partícula

viral (Roizman & Sears, 1996; Whitley, 1996; Boehmer & Lehman, 1997).

Após a montagem das partículas virais no núcleo da célula hospedeira, o

nucleocapsídeo viral é envelopado, através da fusão com a membrana nuclear

interna, havendo o aumento de vírus envelopados no espaço perinuclear. Para

que as partículas virais possam ser liberadas do núcleo da célula hospedeira

ocorre a fusão do envelope viral com a membrana nuclear externa, havendo uma

acumulação de capsídeos sem envelope no citoplasma. Os capsídeos são então

re-envelopados por vesículas derivadas do complexo de Golgi. Esta última etapa

pode estar sendo mediada por interações entre proteínas do tegumento viral e

porções citoplasmáticas de glicoproteínas virais, que já estariam inseridas nas

vesículas derivadas do Golgi (Melancon et al., 2004) (Esquema 9).

Esquema 5 - Latência e Reativação do HSV-1 (http://darwin.bio.uci.edu)

Esquema 6 – Início da replicação viral, fase α (Baseado em Roizman & Sears, 1996)

Esquema 7 – Segunda fase da replicação do HSV-1, fase β. (UL-29 – proteína ligadora de fita simples;

UL-9 – Helicase; UL-30/UL-42 – DNA polimerase viral) (Baseado em Roizman & Sears, 1996)

Esquema 8 – Terceira fase da replicação do HSV-1, fase γ (http://darwin.bio.uci.edu)

Esquema 9 – Liberação das partículas virais da célula hospedeira (http://darwin.bio.uci.edu)

1.2 – Drogas utilizadas no tratamento de pacientes infectados com HSV-1

Dentre as drogas mais utilizadas no tratamento de pacientes infectados com

o HSV-1 destacam-se o Aciclovir (ACV), Ganciclovir, Cidofovir e Foscarnet. O

ACV é uma guanina com grupamento ribosil incompleto, isto é, não apresenta os

carbonos 2’ e 3’ e suas respectivas hidroxilas. Tal composto é primeiramente

fosforilado pela timidina cinase viral e di e trifosforilado por enzimas celulares.

Finalmente, a molécula é captada pela DNA polimerase viral (complexo

UL30/UL42), resultando na terminação de cadeia da fita de DNA, pela ausência do

3’-OH (De Clercq, 2004) (Esquema 10). O ACV é considerado uma droga segura

para o tratamento de pacientes com lesões herpéticas devido à sua baixa

citotoxicidade. No entanto, vem sendo observado o aumento do número de cepas

de HSV-1 resistentes a esta droga, principalmente isoladas de pacientes

imunocomprometidos, além desta droga poder causar neurotoxicidade (Coen,

1996; Ernst & Franey, 1998; Stranska et al., 2005). Além disso, a administração

sistêmica de ACV vem sendo correlacionada com a formação de cristais e

conseqüente falha no funcionamento renal (Lyon et al., 2002).

Uma outra molécula utilizada no tratamento de pacientes infectados pelo

HSV-1 é o Ganciclovir, que também atua como inibidor da DNA polimerase viral

(De Clercq, 2004). Porém, além de poder causar neurotoxicidade, assim como a

ACV, está associado com a supressão da atividade de medula óssea (Liu et al.,

2004) e, em alguns casos, com carcinogênese (Wutzler & Thust, 2001). Drogas

como o foscarnet, têm sido empregadas no tratamento de pacientes infectados

com cepas resistentes ao ACV (Esquema 11). Porém, a sua utilização pode

ocasionar em falhas no funcionamento renal devido a sua cristalização após

administração intravenosa (Zanetta et al., 1999), além de poder ocorrer a seleção

de enzimas DNA polimerase mutantes (Hwang et al., 1992).

Pelo fato das drogas que são utilizadas no tratamento de pacientes

infectados pelo HSV-1 causarem vários efeitos colaterais, o número de trabalhos

voltados em demonstrar a atividade anti-HSV-1 de análogos não nucleosídicos

vem crescendo muito em vários países. Várias moléculas derivadas de produtos

naturais vêm sendo extraídas e modificadas com o objetivo de obtermos mais

moléculas bioativas e menos tóxicas. Além disso, moléculas isoladas de

organismos marinhos, como algas e esponjas, vêm ganhando um grande espaço

na pesquisa em antivirais.

Esquema 10 – Mecanismo de ação do Aciclovir (ACV) (Hardman, et al.,2001)

Esquema 11 – Outras moléculas utilizadas como anti-HSV-1 (http://www.google.com.br)

Foscarnet

Vidarabina

Cidofovir

1.3 – Produtos Naturais

Os produtos naturais, tanto compostos purificados quanto extratos, podem

ser considerados uma grande fonte de novas moléculas com efeitos

farmacológicos devido a sua grande diversidade química (Cos et al., 2006). Estes

produtos já foram explorados pelo homem com diversos propósitos, incluindo seu

uso em alimentos, fragrâncias, pigmentos, inseticidas e fármacos, que muitas

vezes são descobertos através da medicina popular.

Existem diversos trabalhos na literatura demonstrando a atividade anti-

herpética de plantas e ervas medicinais (Khan et al., 2005). Como por exemplo,

pode-se citar os óleos essenciais isolados da planta Santolina insularis, capazes

de inibir a dispersão do HSV célula-célula (De logu et al., 2000), os compostos

isolados de ervas como a Psychotria serpens e Limonium sinense (Kuo et al.,

2001; Kuo et al., 2002), capazes de inibir o HSV em várias etapas de sua

replicação, extratos isolados de plantas da Tailândia, que apresentaram efeito

seletivo sobre o HSV-1 (Lipipun et al., 2003) e substâncias isoladas da erva

chinesa Polygonatum cyrtonema, as quais apresentaram atividade anti-HSV-2 em

cultura de células (Liu et al., 2004).

Os oceanos também apresentam uma grande diversidade de produtos

naturais, que podem ser derivados de diversos organismos como esponjas,

moluscos, bactérias marinhas, cianobactérias e algas multicelulares, os quais

podem apresentar substâncias com efeitos farmacológicos contra doenças

causadas por fungos, parasitas, bactérias e vírus, além de alguns deles também

apresentarem efeito anticâncer (Donia et al., 2003). Os primeiros registros da

utilização de produtos isolados de organismos marinhos datam de 1600 a.C.,

quando os Fenícios utilizavam a secreção de moluscos para produzir um corante

de roupas denominado "Púrpura de Tyrian" (Faulkner, 1992).

Dentre os organismos marinhos, as esponjas e as algas, além de fornecerem

o maior número de produtos naturais marinhos conhecidos, deram origem a cerca

de 65% das patentes existentes em antitumorais e antivirais (Bongiorni & Pietra,

1996). Além disso, dados da literatura descrevem compostos isolados de oalgas

que possuem atividade antiviral para herpesvírus (HSV-1, HSV-2 e HCMV),

togavírus (Sindbis e Semliki), paramixovírus (RSV), rabdovírus (VSV) e retrovírus

(SIV e HIV) (De Clercq, 2000).

Nosso grupo já demonstrou a atividade anti-HSV-1 de alcalóides isolados da

esponja Aaptos aaptos (Coutinho et al., 2002), como também de diterpenos

isolados da alga parda Dictyota pfaffii (Barbosa et al., 2004) e, além disso, a

inibição da enzima transcriptase reversa (TR) do vírus HIV pelo diterpeno DA-1,

isolado da alga parda Dictyota menstrualis (Pereira et al., 2004).

Desde 1.500 A.C. as algas marinhas já eram utilizadas como fonte de

fármacos para o tratamento de gota, fístulas e de algumas formas de câncer.

Entretanto, somente a partir de 1970 é que vários grupos de pesquisadores

iniciaram a triagem sistemática de extratos de algas com intuito de encontrar

produtos com atividade biológica. Como resultado, foram encontradas substâncias

com atividade antiviral, antifúngica, antibacteriana e anticâncer, mostrando que as

algas são uma fonte muito rica de produtos potencialmente utilizáveis como

fármacos (Bongiorni & Pietra 1996).

As algas podem ser unicelulares e procariontes, como as algas azuis ou

cianobactérias, unicelulares e eucariontes como as euglenófitas, dinoflagelados e

diatomáceas ou pluricelulares e eucariontes como as algas verdes (Chlorophytas),

pardas (Phaeophytas) e vermelhas (Rhodophytas) (Vidotti & Rollemberg, 2004).

As algas pardas e vermelhas caracterizam-se pela produção de

hidrocarbonetos voláteis, polifenóis e terpenos. Os hidrocarbonetos podem atuar

como feromônios sexuais e os polifenóis como mecanismo de defesa contra

herbivoría. Os terpenos também podem atuar contra herbivoría. Além disso, essas

substâncias parecem reforçar a proteção das algas contra bactérias, fungos ou

organismos incrustantes como esporos de algas e larvas de invertebrados,

podendo assim, aumentar as vantagens das algas na competição interespecífica

por espaço (Teixeira et al., 2001).

Algumas espécies de algas pardas e vermelhas participam de maneira

bastante abrangente na vida cotidiana do homem, através dos colóides extraídos

dos seus talos. Existem alguns produtos de importância econômica, como os

ácidos algínicos (alginatos), as agaranas e as carragenanas, os quais são usados

como matéria prima em vários segmentos da indústria alimentícia, farmacêutica,

cosméticos, têxtil, bebidas, etc., como também na biotecnologia (Vidotti &

Rollemberg, 2004).

A primeira evidência de que as algas marinhas possuem propriedades

antivirais foi demonstrada por Gerber e colaboradores em 1958, que observaram

que polissacarídeos extraídos de Gelidium cartilagenium protegiam embriões de

galinha contra a infecção por vírus influenza B e vírus da caxumba.

Posteriormente, o efeito inibidor de vários produtos isolados de várias espécies de

algas para diferentes vírus foi demonstrado (Carlucci et al., 1997; Duarte et al.,

2001).

Desde estas descobertas, a pesquisa da atividade antiviral de

polissacarídeos sulfatados obtidos de algas marinhas tem sido explorada,

observando-se sua ação inibitória na replicação de herpes vírus (Carlucci et al.,

1999; Duarte et al., 2001; Carlucci et al., 2004; Duarte et al., 2004; Talarico et al.,

2004; Faria-Tischer et al., 2006), vírus da imunodeficiência humana (Lee et al.,

1999), vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (Romanos et al., 2002), vírus

respiratórios (Hasui et al., 1995) e vírus da dengue (Talarico et al., 2005).

Organismos marinhos são grandes produtores de metabólitos secundários

derivados de unidades isoprênicas, incluindo os monoterpenos (C10), os

sesquiterpenos (C15), os diterpenos (C20), os triterpenos (C30) e os tetraterpenos

(C40). Dentre esses organismos, as algas marinhas estão entre os principais

produtores destas substâncias (Blunt et al., 2006). Dos 15.000 metabólitos

secundários de origem marinha, descobertos até o ano passado,

aproximadamente 55% são derivados terpenoídicos. Esta proporção pode ser

muito superior em alguns filos, representando até 90% dos metabólitos isolados

(Harper et al.,2001).

Esqueletos terpenoídicos são produzidos por representantes de todas as

divisões de macroalgas marinhas, dentre eles, derivados halogenados e terpenos

de origem biossintética mista (meroterpenóides), como os metabólitos isolados de

algas vermelhas do gênero Laurencia (Ceramiales, Rhodomelaceae) e de algas

pardas do gênero Stypopodium (Dictyotaceae) (Soares, 2003; Kladi et al., 2006).

A extensa área costeira do Brasil e diversidade de espécies encontradas

nesta região, principalmente de algas multicelulares, constituem fontes de grande

potencialidade para a descoberta de novos fármacos, com potencial aplicação em

diversos tipos de patologia. Neste trabalho foram utilizados diterpenos, isolados

das algas marinhas Dictyota menstrualis e Dictyota pfaffii e meroditerpenos,

isolados da alga Stypopodium zonale. Todas essas algas são encontradas no

litoral brasileiro e pertencem à classe Phaeophyceae.

2 – OBJETIVOS

Sendo o HSV-1 um patógeno de grande interesse clínico, existem

diversas drogas utilizadas no tratamento de paciente658(a)-4(ci00191v(a)-4(m)-79.844 0 Td[(e)-(c(t)-2(a)-4(d)-4(o)-4(a)-6)2(co)-4(m)-7.00195( -6)7.0-2(e658(st)-2.00195(e)-4( )277.998]TJ-79.844 -27.6 Td[(v)10(í)8(r)3(u)-4s.t)-2( )-32(PV)-3od)-4(r)3éam (o)-4( )-32(f,)-23(a)-4(t)-2(o)-4( )-32((d)-4(e)-4s(t)-2(a)-4s( )-32((d)-4(r)3(o)-4(g)6(a)-4(s )-32(pd)-4(o)-4(d)-4(e)-4(r)3(e)-4(m)-7( )-32(c(a)-4(u)-4sap)-3.99658(r)3( )-32(e1v(a)-)-23ed)-4(i)2(t)-2(o)-4s( )]TJ471.64 0 Td[(co)-4(l)2(a)-4(t)-2(e)-4.00391ri)2.99052(a)-4(i)2.00195(( )-2)7.0-2(e658( )277.998]TJ-471.64 -27.6 Td[(t)-2(a)-4(m)-7ba)-4éem deido o parecimento de pa de HSV-1 recite658n e

compdoto -872(d)-4(e)-4( )872(r)3(e)-4rnci, comoe o V, tora u de noa ac(m)-(oe)-4llas

com( )-22(a)-4(t)-2(i)2(v)10(i)4(d)-4(a)-4(d)-4se anti-HSV-1 de um impdortnci m( )1-2(i)2ssco, no eivs

3 – MATERIAL E MÉTODOS

3.1- Linhagens Celulares e Drogas

Células de rim de macaco verde africano (Vero) foram cultivadas em meio

DMEM (Dulbecco's modified Eagle’s medium) contendo 5% de soro fetal bovino

(SFB), 100U/mL de penicilina, 100µg/mL de estreptomicina e 2,5µg/mL de

anfotericina B. As culturas foram mantidas a 37ºC em atmosfera com 5% de CO

Durante a passagem, as células foram tratadas com PBS1/EDTA (Reagen) e

tripsina 0,25% (GIBCO).

Todas as substâncias testadas neste trabalho foram isoladas no

Departamento de Biologia Marinha da Universidade Federal Fluminense, diluídas

em Dimetilsulfóxido (DMSO) 100% e estocadas nas concentrações de 50mM ou a

2mg/mL a -20ºC. Durante os testes, as substâncias foram diluídas em DMEM com

soro.

3.2 - Preparação do Vírus

As partículas virais (cepa AR-29, cedida gentilmente pela professora Márcia

Wigg da Universidade Federal do Rio de Janeiro) foram diluídas em meio DMEM

sem soro e multiplicadas em células Vero, utilizando-se uma multiplicidade de

infecção (MOI) de 0,1 (Lagrota et al., 1994; Esquenazi et al., 2002). Após 24h p.i.,

as células foram lisadas por ciclos de congelamento e descongelamento. O

conteúdo foi centrifugado a 400x g por 20min a 4ºC e o título viral foi dosado pelo

método de ensaio de placa (Kuo et al., 2001).

3.3 - Ensaio de Placa

Para determinarmos o título viral, células Vero mantidas em placas de 6 poços

(3x10

células/poço) foram infectadas com diferentes diluições de HSV-1 por 1h a

37ºC em atmosfera com 5% de CO

. Após este período, o inóculo viral foi retirado

e as monocamadas cobertas com DMEM com 5% de soro fetal bovino e 1% de

Metilcelulose (Fluka) (meio para ensaio de placa). Após 72h as monocamadas de

células foram fixadas com 10% de formaldeído e coradas com 0,1% de cristal

violeta. Em seguida as placas virais foram contadas e o título viral foi determinado

de acordo com o número de placas virais (PFU/mL).

3.4 - Inibição do Efeito Citopático

A avaliação da inibição do efeito citopático viral pelas substâncias foi

realizada em células Vero, mantidas em placas de 96 poços (1 x 10

células/poço)

e infectadas com diferentes diluições de HSV-1 durante 1h a 37ºC em atmosfera

com 5% de CO

, para que iniciasse o processo de adsorção viral. Após este

período, o inóculo viral foi retirado e as células foram tratadas com as substâncias

nas concentrações de 50µM ou 2µg/mL. Após 72h, o título viral foi determinado na

presença e na ausência das drogas (Read & Muench, 1938).

3.5- Ensaios de Citotoxicidade

A citotoxicidade foi avaliada por duas metodologias: No primeiro método,

células Vero em placas de 24 poços (4 x 10

células/poço) permaneceram em

contato ou não com diferentes concentrações das substâncias por 72h a 37ºC em

atmosfera com 5% de CO

. Após este período, as células foram tratadas com

PBS/EDTA, tripsinizadas e coradas com azul de Trypan a 0,04% em PBS. A

viabilidade celular foi determinada de acordo com o seguinte cálculo:

100

× =

TOTAIS

VIÁVEIS

E VIABILIDAD

No segundo método, células Vero, mantidas em placas de 96 poços (1 x 10

células/poço), permaneceram em contato ou não com diferentes concentrações

das substâncias por 72h a 37ºC em atmosfera com 5% de CO

. Após esse

período, foi adicionado MTT a 5mg/mL. Após 4h de incubação a 37ºC foi

adicionado 100µL da solução de 10% de SDS, 0,01N de HCl e após 24h os poços

foram analisados em um leitor de Elisa a 540 e 620nm.

3.6- Inibição da produção de partículas virais

Células Vero, mantidas em placas de 24 poços (1 x 10

células/poço), foram

infectadas com HSV-1 (cepa AR29) utilizando-se um MOI de 1 ou 5 por 1h a 37ºC

em atmosfera com 5% de CO

. Após esse período as células foram tratadas com

diferentes concentrações dos compostos em DMEM contendo 5% de SFB. As

células foram lisadas por 3 ciclos de congelamento e descongelamento 20hp.i.. O

sobrenadante foi titulado pelo ensaio de inibição do efeito citopático.

3.7- Infecção Curso -Temporal

Para determinarmos a etapa da replicação viral na qual as substâncias

poderiam estar agindo, células Vero, mantidas em placas de 6 poços (3x10

células/poço), foram separadas em 5 grupos (Gong et al., 2002):

Adsorção  Células Vero foram tratadas com os compostos a 10µM por 2h a

4ºC. Após a lavagem, as células foram infectadas com 100 PFU/mL por 1h a 37ºC

em atmosfera com 5% de CO

, para permitir a penetração viral. Após esse

período, o inóculo viral foi retirado e a monocamada coberta com DMEM com 5%

de SFB e 1% de Metilcelulose (meio para ensaio de placa). Após 72h o número de

placas virais foi contado.

Penetração  Células Vero foram infectadas com 100 PFU/mL a 4ºC por 1h

para permitir o processo de adsorção viral. Após esse período, as células foram

lavadas com solução de glicina em PBS pH 2.2, para remover as partículas virais

que não adsorveram nas células. Após esse processo, as células foram tratadas

com as substâncias a 10µM e a temperatura elevada para 37ºC por 1h para

permitir a penetração viral. Após esse período a monocamada foi coberta com

meio para ensaio de placa. Após 72h, o número de placas virais foi contado.

0-3hp.i.  Células Vero foram infectadas com 100 PFU/mL de HSV-1 por 1h

a 37ºC em atmosfera com 5% de CO

. Após esse período (tempo 0), o inóculo

viral foi retirado e as células tratadas com as substâncias a 10µM de 0 a 3hp.i.. Foi

adicionado o meio para ensaio de placa e após 72h, o número de placas virais foi

contado.

3-6hp.i.  Células Vero foram infectadas com 100 PFU/mL de HSV-1 por 1h

a 37ºC em atmosfera com 5% de CO

. Após esse período (tempo 0), o inóculo

viral foi retirado e as monocamadas cobertas com meio DMEM com soro. No

tempo 3hp.i. as células foram tratadas com as substâncias a 10µM, que

permaneceram em contato com as células até 6 h p.i.. Foi adicionado o meio para

ensaio de placa e após 72h, o número de placas virais foi contado.

6-20hp.i.  Células Vero foram infectadas com 100 PFU/mL de HSV-1 por

1h a 37ºC em atmosfera com 5% de CO

. Após esse período (tempo 0), o inóculo

viral foi retirado e as monocamadas cobertas com meio DMEM com soro. No

tempo 6hp.i. as células foram tratadas com as substâncias a 10µM, que

permaneceram em contato com as células até 20 h p.i.. Foi adicionado o meio

para ensaio de placa e após 72h, o número de placas virais foi contado.

3.8– Ensaio de Inibição da Adsorção Viral

Para analisarmos se os compostos DA-1 e Dol 2 poderiam influenciar a

adsorção viral, células Vero, mantidas em placas de 6 poços (3x10

células/poço),

foram infectadas com 100 PFU/poço e tratadas com valores de EC

dos

compostos por 1h a 4ºC. Após este período, as células foram lavadas com PBS,

cobertas com meio para ensaio de placa e a temperatura foi elevada para 37ºC,

permitindo a entrada das partículas virais. Após 72h as células foram coradas

conforme descrito no item 3.3 e as placas virais foram contadas.

3.9 – Efeito das substâncias DA-1 e Dol-2 em células infectadas sobre a

Síntese de Proteínas

Células foram mantidas em garrafas de cultura de 25 cm

(2 x 10

células) e

infectadas ou não com HSV-1 com MOI de 5 e 20 por 1h a 37ºC. Em seguida, o

vírus residual foi lavado e as células foram incubadas na presença ou ausência de

DA-1 ou Dol-2 na concentração de 10µM. Após 4h de infecção foi adicionado

[

S]-Metionina (50µCi/mL) e mantido por 2h quando as culturas foram lisadas com

T∅ (Tris-HCl (pH 6,8) 1M; azul de bromofenol 0,02%; β-mercaptoetanol 5%; SDS

10%; glicerol 10%).

Para que fosse realizada a medição da radiação por cintilação de fase

líquida, as amostras foram tratadas com TCA 10% e filtradas em filtros de fibra de

vidro (Whatman) GF/A.

3.10- Eletroforese em Gel de Poliacrilamida e Auto-radiografia

Para analisarmos o perfil protéico das células, as amostras obtidas, conforme

descrito no item anterior, foram dosadas pelo método de Bradford e separadas em

gel SDS-PAGE. As amostras de proteínas mantidas em tampão T∅ foram

aquecidas a 100ºC por 1min e submetidas a um gel contendo 10% de

poliacrilamida, 0,1% de SDS, posteriormente corado com azul de Coomassie

0,1%. Em seguida, o gel foi desidratado com glicerol 50% e etanol 25% e

submetido a uma auto-radiografia em filme X-OMAT (Kodak). Posteriormente, o

perfil protéico foi analisado.

3.11 – Ensaio de Inibição da enzima DNA polimerase viral

Para que pudéssemos observar se as substâncias poderiam estar atuando

sobre a atividade da enzima DNA polimerase viral foi realizado, primeiramente, o

isolamento da enzima de células Vero infectadas com HSV-1. Para tal finalidade,

células Vero foram infectadas com MOI de 5 por 12h em atmosfera com 5% de

. Após esse período foi adicionado um tampão específico (0,25 mM fosfato de

potássio (pH 7,2), 10mM de 2-mercaptoetanol, 1mM EDTA, 0,5% Triton-X-100,

20% de glicerol e 0,5 mM de PMSF), as células foram sonicadas 8X por 15

segundos e o conteúdo foi centrifugado a 12.000 rpm (Sorvall RCS. 5B) por 10

min a 4ºC.

A reação enzimática foi realizada por 30 min a 37ºC em um volume final de

100 µL, contendo 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 mM DTT, 8 mM MgCl

, 100 mM

sulfato de amônia, 0,1 mM dNTP, sendo [

H]-dTTP (0,5 µCi/nmol) e 25 µg de DNA

de esperma de salmão desnaturado. Os compostos foram testados na

concentração de 50µM. Após esse período a reação foi interrompida pela adição

de TCA 10%. As amostras foram filtradas em filtros de fibra de vidro GF/C

(Whatman) previamente lavados com TCA 10%, e a radioatividade incorporada foi

determinada por cintilação de fase líquida (Knopf, 1979).

3.12- Análise Estatística

A análise estatística foi feita utilizando-se os programas Excel para

Windows. A significância dos dados foi determinada através do teste t de Student.

Utilizamos um intervalo de confiança de 95%; logo, valores de P < 0,05 foram

considerados significativos. Todos os dados foram analisados a partir da média,

do desvio padrão (ℵ± D.P.) e de, no mínimo, três experimentos independentes

totalizando um n=6 para todos os experimentos.

4– RESULTADOS

4.1- Avaliação da atividade antiviral

Para avaliarmos se os produtos naturais estudados apresentariam potencial

antiviral, utilizamos o teste de inibição do efeito citopático viral (Read & Muench,

1938). As substâncias em questão foram isoladas das algas pardas Dictyota

menstrualis, Dictyota pfaffii e Stypopodium zonale. Nossos resultados mostram

que todas as substâncias apresentaram inibições maiores que 80%, comparáveis

a do Aciclovir (ACV) na concentração de 10µM, que é capaz de inibir 92% do

efeito citopático viral (Figuras 1, 2 e 3).

Figura 1

– Estrutura da substância DA-1, isolada da alga parda Dictyota menstrualis

e a sua

porcentagem de inibição do efeito citopático viral, quando testada na concentração de 50µM.

93%

89%

Figura 2

– Estrutura da substância Dolabellano 2 (Dol-2), isolada da alga parda Dictyota pfaffii

a sua porcentagem de inibição do efeito citopático viral, quando testada na concentração de

50µM.

Angel 1 – Extrato Bruto

Figura 3

–

Estrutura das substâncias Angel 2, Angel 3 e Peroxilactona, isoladas da alga parda

Stypopodium zonale

e as suas respectivas porcentagens de inibição do efeito citopático viral,

quando testadas na concentração de 2µg/mL (~4,5µM).

Angel

Angel 3

Peroxilactona

99%

98%

96%

83%

4.2 – Avaliação da citotoxicidade

Visto que os produtos naturais testados apresentaram porcentagens de

inibição do efeito citopático viral acima de 80%, tornou-se necessário a avaliação

da citotoxicidade dos mesmos. Para isso, buscamos a concentração das

substâncias necessária para inibir em 50% a viabilidade de células Vero (CC

através das metodologias de azul de tripan e MTT. Os resultados mostram que o

composto DA-1 foi menos citotóxico do que as outras substâncias testadas.

Apesar de apresentarem valores de citotoxicidade menores do que o do ACV, as

substâncias isoladas das Stypopodium zonale e Dictyota pfaffii também

apresentaram valores satisfatórios, 10 ou 4X maiores do que as concentrações

necessárias para inibir o efeito citopático viral, respectivamente (Tabela 2).

4.3 – Os produtos naturais apresentaram valores de inibição comparáveis ao

do ACV

Para que pudéssemos determinar as concentrações mais efetivas das

substâncias, capazes de inibir a produção de partículas virais, utilizamos a medida

de EC

, ou seja, a concentração dos compostos capaz de inibir em 50% a

produção de partículas virais. Fizemos esta avaliação tanto em células Vero

infectadas com MOI de 1 quanto com MOI de 5 e os valores de EC

foram

calculados a partir de uma curva dose-resposta. Podemos observar que os

compostos apresentaram valores de EC

comparáveis ao do ACV, com exceção

da substância peroxilactona, com EC

um pouco mais elevado, aproximadamente

2X maior do que os demais compostos isolados da alga S. zonale, que

apresentaram valores muito aproximados. É importante resssaltar que o valor de

para o composto Angel 1 não foi determinado por se tratar de um extrato

bruto. Podemos observar também que quando utilizamos 5X mais vírus, na

infecção com MOI de 5, foi necessário aproximadamente 5X mais droga para inibir

50% da replicação, mostrando que o EC

foi dependente do MOI utilizado. Além

disso, n02(t)-1.77-61.7219(f)-1.77101(M)3.67984(O)-1.36119(I)-1..7219(f)-1.77101(d)-3.5408(e)-3.5408( )-1.77408(o)-3.5408(,)-131.501(t)-1.77101(i)2.18083(s)0.406219(i)2.18083()-6.31074(o)-3.5408(b)-3.5408()-3.54202(tâ)3.27002(a)-3.5483(éi)2.18083(l)2.18083(z)10.4016(ai)2.18083(s)0.40982( D)2.5904( A-61.7219(E--3.54202()-141.656(1)-3. Td[(t)-1.77101(e)-3.54202( D)2.5904( )-3.54202(o)-2.44902(--3.54202(2-1.77101(e)-3.54202( )-61.7219(f)-11.7628(or-3.54273.5)]TJ323.)-3.54202(a)-3.54202(m)-3. Td[(t)-1.77101(e)-61.7219(f)-3.54202(e)-3.54202(tl)2.18083()-81.7055(v)10.4016(ai)2.18083(s)0.40982( e-3.54202(a)-3.54202(m)-3. Td[(t)-1.77101(c)0.40902(e)-3.54202(nc)-3.5408(s)0.40902(e)-3.54202(n)-3.54202(t)-3.54202(r)3.2688(aa)-3.5408(õ-3.54202(d)-3.54202(ei)2.18083(s)6.31318( 73.5)]J-229.68 -r)3.27063(ua)-3.5408(m)-6.311967 )-141.656(ps)0.40982(o)-6.31074()-1.77101(c)0.40982(s)0.40982( )-91.6908(me)3.27002(a)-3.5422(n02(t)-1.7o)-3.5408(r)3.27002(e)-3.5408(s)0.40982( n)-3.5408(d)-3.5196(os)0.40982( q)-3.5408()-6.31074(e)0.40982(s)0.40982( c)0.40982(s)0.40982( )-141.656(C)2.5904( V-91.6973(É)-2.4516( (-3.54202(T)-87041572(r)3.2688(ab-3.54202(d)-3.54202(el)2.18083(z)10.4016(aÉ)-2.4516( 2-1.77101(e)-3.54368(o)-3.5408(,)-12.4516( i)2.18083()-6.31024(o)-3.54202()-1.77101(e)-3.54202(( )8.2208(i)2.18083(n)-3.54202(d)-0.40989.24)]TJ301.2 .40982( q)-3.7219(q)6.44979(u)-3.54202(eo)-3.5408(,)-12.4516( )-1.77101(c)0.40902(e)-3.54202(m)-33.2688( )-61.7219(M)3.68106(O)-1.36119(I)-13.2688( )-1.77101(m)-6.31074(a)-3.54202(l)2.18083(o)-3.54202)-3.54202(ei)2.18083(o)-3.5408(,)-3.54202( 89.24)J-229.68 -s)0.40982(oe)-3.5408(s)02.77557a)-3.54141(p)-3.54141(s)0.40982(on)-3.5408()-6.31074(s)0.40982(t)-1.77101(e)-3.5408(s)02.77552(a)-3.5422(a-6.31074(s)0.40982(tu02(t)-1.7o)-3.5408(a-6.31074()-3.54202(i)2.18083(s)02.77552()-141.656(p)-3.53916(o)-3.5408(d)-3.5408(e)-3.5408(ms)02.77552(b)-3.5408(s)0.40901(a)-3.54202(r)32.77552()-1.77101(m)-6.31074(a)-3.54202(i)2.18083(s)0258 Tf6t)-1.77101(e)-61.7219(fl)2.18083(i)2.18083(c)0.40656(pi)2.18083()-3.54202(ei)2.18083(s)0258 Tf6t)-61.7219(d)-3.54202(o)-3-6.310743ç5408(r)3.27002( )-331.19(I)-1..7219(f)-1.7409f)-1.7409f)-3.54202( 5.54202-3-6.310743ç54E886G)2.18083()T2ç54E886 Td[(b)-3o(l)2.180-141.656(p)-3.53916(o.2688( )-1.77101(3 0 0 cm BT/R9 12 Tf1 0 0 1 85.0795 38.4 Tm( )Tj214.92 0 Td[(52)500]TJ/R11 12.0098 Tf-213.5408(o)-3.5408()3.67984(O)-1.36150 0 )02.77557a)-3.54141(p).36150 0 )0J/R11 12.0098 Tf-21b6.31074(s)0.40982(tG205-3.54141(p).36150 0 )02.54141(p).361m)-6.31074(i)2.180840982(on)-3.5)-33v0982(s)0.40982(á)-3.54202( )-141.656(p)-7101(e)-61.7219656(s)0.40982(e)]TJ301.2 0 Td[( )-141.40982( c)0.323.aarr ii da

Tabela 2 – Citotoxicidade e atividade antiviral dos produtos naturais e ACV.

* – Índice de seletividade calculado a partir da razão entre CC

e EC

ND – Não dosado.

– Por se tratar de um extrato bruto, foi testado em µg/mL.

4.4 – As substâncias podem estar atuando em fases iniciais da replicação

viral

Além da substância DA-1 ter sido a molécula mais promissora, devido a sua

baixa citotoxicidade e boa atividade anti-HSV-1, já havia sido demonstrado pelo

nosso grupo o seu efeito anti-HIV-1, assim como o efeito da substância Dol-2

sobre o mesmo vírus (Cirne-Santos et al., 2006). Por estas razões, resolvemos

prosseguir com o trabalho estudando o efeito anti-HSV-1 somente destas duas

substâncias.

Com base nestas justificativas, fomos avaliar em qual momento do ciclo

replicativo do HSV-1 as substâncias DA-1 e Dol-2 poderiam apresentar seu melhor

efeito. Para isso, células Vero foram infectadas com HSV-1 e tratadas por

diferentes períodos pós-infecção: adsorção, penetração e quando ocorre o pico

Substâncias

(µM) EC

(µM)

SI*

MOI=1 MOI=5 MOI=1 MOI=5

DA-1 1000 1,6 5,9 625 169,4

Dol-2 189 1,2 5,1 157,5 37

Angel 1

>200

ND ND ND ND

Angel 2 >452 1,28 ND >353,1 ND

Angel 3 >485 1,34 ND >361,9 ND

Peroxilactona

>413 2,38 ND >173,5 ND

ACV 860 1,2 6,5 716,6 132,3

das proteínas de fase α (0-3 hp.i.), β (3-6 hp.i.) e γ (6-20 hp.i.) (Roizman & Sears,

1996; Boehmer & Lehman, 1997). Neste estudo foram utilizadas as substâncias

DA-1 e Dol-2 na concentração de 10µM, já que nesta concentração, estas drogas

inibem em 100% a produção de partículas virais.

Podemos observar na Figura 4 que o melhor efeito da substância DA-1

sobre a replicação do HSV-1 ocorreu no período de 0-3h p.i., no qual ocorre o pico

de proteínas de fase α, as quais são reponsáveis pela regulação das demais fases

do ciclo replicativo do HSV-1 (Roizman & Sears, 1996; Boehmer & Lehman, 1997).

Não foi observado nenhum efeito significativo da substância DA-1 sobre as demais

etapas da replicação do HSV-1. Por outro lado, no tratamento com a substância

Dol-2, podemos notar que houve uma inibição em dois momentos distintos: em 0-

3h p.i. e em 3-6h p.i., nos quais ocorrem os picos de proteínas de fase α e β,

respectivamente. Isto sugere que esta droga tem como alvo alguma

macromolécula sintetizada nestas fases, ou que este composto atue exatamente

em 3 hp.i..

100

150

200

250

Adsorção Penetração 0-3h 3-6h 6-20h

PFU/mL

HSV-1

DA-1

Dol-2

Figura 4

– Período de ação dos diterpenos sobre a replicação do HSV-

1. Células Vero

foram infectadas e tratadas com as dr

ogas por diferentes períodos, conforme já foi

descrito no item 3.7 da seção Material e Métodos. Observamos que os compostos DA-

e Dol-2 apresentaram melhor efeito de 0-3h, sugerindo uma participação na fase α

. Vale

lembrar que essa última substância também apresentou uma inibição significativa de 3

6h, sugerindo uma participação na fase β. O asterisco indica um P < 0,05.

4.5 – As substâncias não atuam sobre a adsorção viral na célula

hospedeira

A partir dos resultados obtidos durante o ensaio curso-temporal

observamos que a adsorção não seria uma etapa inibida por nenhuma das

drogas. Porém, por esta etapa ser um dos alvos destes compostos sobre a

replicação do vírus HIV-1 (Pereira et al., 2004; Cirne-Santos, dados não

publicados), fomos avaliar se as substâncias DA-1 e Dol-2 realmente não teriam

efeito relevante sobre esta etapa da replicação viral. Para isso, as células foram

infectadas e tratadas com valores de EC

dos compostos. Utilizamos como

controle positivo a heparina na concentração de 1µg/mL; esta concentração é

necessária para inibir cerca de 80% da adsorção do HSV-1 (Bender et al., 2005).

Observamos que esta etapa não é, de fato, o alvo de ação de nenhuma das duas

drogas (Figura 5).

100

120

140

160

180

Infectado Heparina Dol-2 DA-1

PFU/mL

100

120

140

160

180

Infectado Heparina Dol-2 DA-1

PFU/mL

Figura 5

– Os diterpenos testados não inibiram a etapa

de adsorção do ciclo

replicativo do HSV-1. Células Vero foram infectadas por 1h a 4

C na presença

dos compostos Dol-2 ou DA-1 na concentração de 1µ

M, ou do controle positivo

Heparina a 1µ

g/mL. Em seguida as células foram lavadas (item 3.3) e após 72h,

placas virais foram coradas e contadas. Podemos observar nos resultados

que não houve uma mudança dos títulos virais na presença dos compostos

testados. O asterisco indica um P <0,05.

4.6- As substâncias revertem a inibição da síntese de proteínas em células

Vero infectadas com HSV-1

Desde a década de 70 já se sabe que o vírus Herpes é capaz de provocar

uma diminuição da síntese de macromoléculas da célula hospedeira (Fenwick &

Walker, 1978). Com base nesta informação e pelo fato de que durante o ensaio

curso-temporal obtivemos melhores inibições das drogas em períodos que

coincidem com etapas de produção de síntese de proteínas, fomos avaliar se

estas substâncias seriam capazes de reverter a inibição da síntese de proteínas

de células Vero, infectadas com HSV-1 com MOI de 5 e 20 e tratadas com 10µM

dos compostos, através de pulso de [

S]-Metionina (50µCi/mL) de 4 a 6hp.i..

As células Vero foram divididas em quatro grupos: controle (C), infectado

(I), controle tratado (CT) e infectadas e tratadas (IT). Como já esperado, houve

uma inibição da síntese de macromoléculas de células infectadas com HSV-1 (I).

Além disso, o tratamento com os compostos (IT) foi capaz de reverter à inibição

induzida pelo HSV-1, tanto no MOI de 5 quanto no MOI de 20. Além disso, no

tratamento com o composto DA-1 obtivemos um efeito dependente do MOI

utilizado, ou seja, a droga só conseguiu reverter a inibição viral em células

infectadas com MOI de 5, enquanto que no MOI de 20, o perfil observado foi

semelhante ao do controle. Já o efeito do composto Dol 2 se mostrou ser

independente do MOI, visto que nos dois MOI utilizados observamos a reversão

da inibição causada pelo HSV-1 (Figura 6).

5000

10000

15000

20000

25000

30000

C CT I (5) I (20) IT (5) IT(20)

CPM

DA-1

Dol-2

Figura 6

– Os produtos naturais previnem a inibição da síntese de prot

eínas induzida

pelo HSV-1. Células Vero foram infectadas com MOI de 5 ou de 20 e tratadas com 10µ

de DA-1 ou Dol-

2. Posteriormente, a síntese de proteínas foi traçada conforme descrito

no item 3.9, utilizando [

S]-Metionina. C – células controle não infectadas, CT –

células

controle não infectadas e tratadas com os compostos, I (5) –

células infectadas com MOI

de 5, I(20) – células infectadas com MOI de 20, IT (5) -

células infectadas e tratadas com

MOI de 5, IT(20) – células Infectadas e tratadas com MOI

de 20. Observamos que a

substância DA-1 preveniu a inibição da síntese protéica induzida pelo HSV-

1 de forma

dependente do MOI e a Dol-

2 preveniu tal evento independentemente do MOI. O

asterisco representa um P < 0,05.

* *

4.7 – A inibição da expressão de proteínas virais

Com o intuito de entendermos se o efeito das drogas foi realmente nas

fases sugeridas no ensaio curso-temporal, analisamos o perfil protéico através de

gel SDS-PAGE e autoradiografia das amostras obtidas no ensaio com [

S]-

Metionina, conforme descrito no item anterior. Observamos que não havia

diferença entre o controle (C) e o contole tratado (CT) com relação às proteínas

expressas, tanto para a DA-1 quanto para o Dol-2, independente do MOI utilizado.

Utilizando-se o MOI de 5, ambas as drogas conseguiram prevenir completamente

a infecção, quando comparamos o infectado tratado (IT) com o controle (dados

não mostrados). Já no MOI de 20 observamos que ambas as drogas inibiram a

expressão de proteínas de fase β. De acordo com os pesos moleculares destas

proteínas, as duas drogas dificultaram a expressão das proteínas UL-8, RL-1 e

UL-12 (Figura 7 A e B). No entanto, Dol-2 também dificultou a expressão das

proteínas DNA polimerase e UL-9 (Figura 7 A). Estes resultados sugerem que

estas drogas atuam sobre alguma das primeiras proteínas produzidas na fase β ou

sobre alguma proteína de fase α, o que poderia dificultar a expressão de proteínas

de fase β, já que as proteínas de fase α são regulatórias.

1 2 3 4

kDa

200

116

97,4

66,2

21,5

14,4

1 2 3 4

kDa

200

116

97,4

66,2

21,5

14,4

Figura 7

–

Efeito dos produtos naturais sobre a síntese protéica. Células Vero foram

infectadas com MOI de 20 e tratadas com DA-1 ou Dol-2 na concentração de 10µ

M. A

síntese protéica foi marcada com [

S]-Metionina, as proteínas separadas por gel SDS

PAGE e identificadas por autoradiografia. 1 – Célula controle, 2 –

células controle

tratadas com os compostos, 3 – células infectadas e 4 –

células infectadas e tratadas

com os compostos. Em (A) observamos os efeitos do Dol-2 e em (B) os efeitos da DA

1. Observamos uma inibição da expressão de proteínas virais de fase β

. Os asteriscos

representam as proteínas virais inibidas por ação dos produtos naturais.

1 2 3 4

kDa

200

116

97,4

66,2

21,5

14,4

1 2 3 4

kDa

200

116

97,4

66,2

21,5

14,4

4.8 - As substâncias não inibem a atividade da DNA polimerase viral

As enzimas DNA polimerase do HSV-1 e a transcriptase reversa do HIV-1

pertencem à família das polimerases do tipo B, por apresentarem um domínio

polimerase e um domínio endonuclease. Uma vez determinado que estas drogas

inibem a enzima transcriptase reversa (Barbosa et al., 2004; de Souza et al.,

2005;) resolvemos verificar se elas poderiam estar inibindo a atividade da DNA

polimerase do HSV-1. Para isso, verificamos o efeito dos produtos sobre esta

enzima não purificada, a partir do extratro crú de células Vero infectadas. Estes

ensaios foram realizados sob condições cinéticas de primeira ordem para

captação de dTTP; além disso, foi adicionado ao meio de reação 100mM de

sulfato de amônio para inibir a atividade de prováveis DNA polimerases celulares

contaminantes. Podemos observar na Figura 8 que não houve inbição da atividade

enzimática,6-3.5408(,6-3.54084(d)3.27124(s)0.40982(a)-2( )8.D)-6.311516(a)-3.54202(r1311516(a)-3.5-3.5408(b)-3.5408(i)2.18083(f)-11.762b)-3.54202(i)1.402(s)0.40982(o)-3.54202(b)-3..54202(s)0.40982(e)-3.54202(r)3.27124(e)-3.Fiinbiuho te d . E nfecti27124(a)-3.54202( )-451.402(of)-11.7628(i)2.54202( )-81.7055(t)-17055(e)-3.54202( )-81.7055(a)-3.54202( )-8140982(i)2.18083(o)-3.54254202(r)3.27124(a)-3.54202( )8.2208(8)-3.83(d)-3.545..5d.7622(a)7.6 Td[(e)-3306.72 -27.

5-DISCUSSÃO

A incidência global de doenças causadas por vírus, como o HIV e HSV, é

bastante significativa na população humana mundial. Estima-se que milhões de

indivíduos em todo o mundo sejam acometidos por alguma das doenças causadas

por estes vírus. Sendo assim, estudos que visem o controle de propagação e

manifestação de tais doenças, além da inativação destes patógenos, seriam de

grande interesse da população mundial, sobretudo com o desenvolvimento de

novos fármacos, inclusive através da obtenção de novas patentes das substâncias

mais promissoras.

Produtos naturais podem representar uma nova classe de antivirais sendo

organismos marinhos uma fonte muito rica destas substâncias. Além disso, já

foram isoladas moléculas de algas com grande potencial antiviral para alguns

herpesvírus (De Clercq, 2000).

Muitas destas substâncias naturais com potencial antiviral são terpenos. Os

terpenos utilizados neste trabalho foram isolados das algas pardas marinhas

Dictyota menstrualis, Dictyota pfaffii e Stypopodium zonale, coletadas no litoral

brasileiro. Estas substâncias foram isoladas no Departamento de Biologia Marinha

da UFF, como parte do projeto que visa a pesquisa por compostos naturais com

potencial antiviral e baixa citotoxicidade.

Durante a triagem inicial das substâncias, obtivemos porcentagens de

inibição do efeito citopático causado pelo HSV-1 maiores do que 80%. Dentre as

substâncias isoladas da alga Stypopodium zonale, a substância Peroxilactona foi o

que apresentou a menor porcentagem de inibição, cerca de 10% menor do que as

demais substâncias.

Em seguida, avaliamos a citotoxicidade destes compostos e observamos

que a molécula DA-1 foi a menos citotóxica, com CC

igual a 1000µM, sendo

cerca 16% menos citotóxica do que o composto de referência utilizado, o ACV.

Por outro lado, embora os produtos isolados das algas Dictyota pfaffii e

Stypopodium zonale tenham apresentado valores de CC

4X e 10X maiores do

que a concentração necessária para inibirem o efeito citopático viral, eles foram

mais citotóxicos do que o ACV. Apesar disto, estes compostos são menos

citotóxicos do que outros diterpenos descritos na literatura, cujo foco da pesquisa

acaba sendo a atividade antitumoral (De Inês et al., 2006).

Semelhantemente com o que ocorreu durante a triagem das drogas,

obtivemos resultados um pouco diferentes com a substância peroxilactona em

relação às moléculas Angel 2 e 3. A peroxilactona apresentou seu EC

cerca de

2X maior do que estas outras moléculas. Talvez a diferença mais marcante desta

molécula em relação às demais seja pela presença do grupamento funcional -O-

O-, que é característico dos peróxidos. Este result

explicado pela diferença entre os valores de EC

, já que no MOI de 1 a

substância DA-1 tem o EC

em 1,6µM, um pouco maior do que o do ACV, que é

1,2µM. No entanto, no MOI de 5, obtivemos com a DA-1 um valor de EC

5,9µM, menor do que o do ACV, que é 6,5µM.

Com relação a substância Dol-2 podemos perceber que apresentou valores

de SI bem menores em relação a DA-1 e o composto de referência ACV, o que

pode ser explicado pela sua maior citotoxicidade. Por outro lado, o EC

, tanto do

Dol-2 quanto da DA-1, no MOI de 5, foi menor do que o do ACV, sugerindo que

quando as células são infectadas com uma quantidade maior de vírus os terpenos

utilizados podem ser mais eficazes do que o ACV. Isto também indica que

possíveis modificações estruturais no anel dolabelano do Dol-2 ou no anel

dicotoma da DA-1 podem levar a uma redução dos seus valores de EC

. Outros

produtos naturais, sobretudo diterpenos, já foram descritos como agentes anti-

herpéticos; contudo, grande parte destes produtos apresenta baixos índices de

seletividade, justificando a necessidade de modificações estruturais pós-

isolamento (Khan et al., 2005).

Uma das razões que incentivaram a continuidade do estudo apenas com os

compostos DA-1 e Dol-2 foi devido aos resultados obtidos no nosso laboratório,

que demonstraram que estas substâncias são potentes inibidores do vírus da

imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) (Barbosa et al., 2004; Pereira et al., 2004;

de Souza et al., 2005; Cirne-Santos et al., 2006). Sendo assim, realizamos o

ensaio curso-temporal com o objetivo de determinarmos o momento de ação dos

compostos e com isso tentarmos entender o mecanismo de ação destas drogas.

Este ensaio curso-temporal foi realizado seguindo as instruções de Gong e

colaboradores de 2002, levando em consideração a capacidade do HSV-1 de se

replicar com uma cinética bastante constante, isto é, um ciclo replicativo que gira

em torno de 18 a 20h e com pico de proteínas de cada uma de suas fases nos

tempos de 0-3h (α), 3-6 (β) e 6-20h (γ) (Roizman & Sears, 1996; Boehmer &

Lehman, 1997). Neste experimento observamos que a DA-1 poderia estar atuando

no período de 0-3h do ciclo replicativo viral, período este que coincide com a

produção de proteínas de fase α, na qual são produzidas proteínas responsáveis

por regular as demais fases da replicação viral, como a ICP4, ICP27 e ICP47. Já o

composto Dol-2 poderia estar atuando em dois períodos distintos da replicação;

um deles seria o mesmo alvo da DA-1 e o outro seria o período de 3-6h, que

coincide com a produção de proteínas de fase β, na qual são produzidas proteínas

necessárias para que ocorra a duplicação do DNA viral, como a timidina cinase

(TK) e o complexo UL30/UL42 (DNA polimerase viral).

As outras etapas da replicação do HSV-1, ou seja, adsorção, penetração e

fase γ, na qual ocorre a produção de proteínas estruturais do vírion, parecem não

ser o alvo de ação dos compostos utilizados neste trabalho. Podemos observar

também com este ensaio que o mecanismo de ação destes compostos frente a

replicação do HSV-1 é diferente daquele observado para a replicação do HIV-1, já

que estas substâncias atuam durante a adsorção do HIV-1 na célula hopedeira

(Pereira et al., 2004 & Cirne-Santos, dados não publicados).

Alguns trabalhos clássicos que abordam a replicação do HSV-1 mostram

que este vírus é capaz de inibir a maquinaria de síntese de macromoléculas da

célula hospedeira (Fenwick & Walker, 1978). Isto representa uma importante

vantagem para a replicação viral, já que a maquinaria de síntese de

macromoléculas do hospedeiro fica disponível para que ocorra a replicação viral

(Roizman & Sears, 1996). Sendo assim, avaliamos a capacidade dos diterpenos

das algas D. menstrualis e D. pfaffii em prevenir este efeito do HSV-1. Para isto,

infectamos células Vero com HSV-1 com MOI de 5 e traçamos a síntese protéica

com [

S]-Metionina e observamos que houve uma redução da síntese de

proteínas quando as células Vero foram infectadas; contudo, quando estas células

foram tratadas com as substâncias foi possível previnir esta inibição, retornando a

níveis iguais ao do controle não infectado e não tratado. Já no MOI de 20 o

composto DA-1 não conseguiu prevenir esta inibição viral, mostrando ser

dependente do MOI utilizado, conforme já esperado, pois a concentração testada

foi duas vezes maior que o EC

para o MOI de 5. Curiosamente, o mesmo não

aconteceu com o Dol-2, já que este atuou de maneira independente do MOI. Uma

provável explicação para este efeito pode residir na correlação estrutural entre do

Dol-2 e o éster de fosbol PMA (Liu & Heckman, 1998). Se assumirmos que o Dol-2

poderia também ativar a PKC, teríamos um efeito independente do MOI, pois seria

um efeito sobre a célula; como o número de células durante todo o experimento é

constante, teríamos, novamente, um efeito independente do MOI. No entanto, esta

hipótese deve ser confirmada experimentalmente.

Neste mesmo ensaio podemos observar que houve uma diminuição da

contagem no controle tratado com as substâncias em relação ao controle não

infectado e não tratado. Isso pode ser explicado por alguma diferença na

sinalização celular de maneira que as drogas reduzissem transitoriamente a

síntese protéica celular, já que estes compostos apresentaram valores de

citotoxicidade em 50% (CC

) bem maiores do que a concentração de 10µM

utilizada neste ensaio.

Com relação a expressão de proteínas decidimos estudar o perfil protéico

no MOI de 20, pois conseguimos obter um bom perfil de proteínas virais, isto é,

podemos observar proteínas de todas as fases da replicação do HSV-1 e, assim,

podemos reduzir significativamente a interferência de proteínas celulares devido à

alta inibição da síntese de macromoléculas induzida pelo vírus. Portanto,

observamos em células Vero infectadas e tratadas no MOI de 20 que ambas as

drogas inibiram a expressão de proteínas de fase β, dificultando a expressão das

proteínas virais helicase (UL-8), modulador da expressão gênica e ciclo celular

(RL-1) e desoxiribonuclease (UL-12), sendo que o Dol-2 também dificultou a

expressão das proteínas DNA polimerase (UL30) e Ori biding protein (UL-9). Estas

proteínas foram identificadas pelos seus pesos moleculares no sitio da web

contendo o proteoma do HSV-1 cepa 17+ (http://www.virusys.com/HSV-1/HSV-

1_ORFS/hsv-1_orfs.html).

Sendo assim, estas substâncias podem estar atuando sobre alguma das

primeiras proteínas produzidas na fase β que seja sintetizada antes destas que

tem sua expressão inibida ou sobre alguma proteína de fase α, cuja atividade

poderia dificultar a expressão de proteínas de fase β, já que as proteínas de fase α

são regulatórias (Boehmer & Lehman, 1997). Levando em consideração os dados

da infecção curso-temporal e a análise do perfil protéico, podemos concluir que

proteínas virais de fase α são o alvo dos diterpenos estudados.

Por fim, como estas drogas também foram utilizadas como inibidores da

transcriptase reversa do HIV-1 (Barbosa et al., 2004; de Souza et al., 2005),

analisamos se eles seriam eficazes em inibir a atividade da enzima DNA

polimerase do HSV-1. Observamos que este não é o alvo de ação destas drogas

na replicação do HSV-1, mostrando novamente que o alvo destas drogas é

diferente nos dois tipos de vírus. Este efeito característico parece ser

compartilhado com outros produtos naturais que inibem os dois vírus

simultaneamente por mecanismos diferentes (Smit, 2004). Porém, esta

caracerística difere de alguns produtos sintéticos como os cloroxoquinolínicos, que

apresentam o mesmo alvo na replicação do herpes e do HIV (Souza et al., dados

não publicados; Souza, 2005). Podemos, ainda, comparar um outro parâmetro dos

compostos testados entre a replicação do herpes e do HIV que é seu EC

; os

valores desta medida para replicação do herpes foram cerca de 8x menores do

que aqueles obtidos para replicação do HIV, sugerindo que o principal alvo das

moléculas testadas é a replicação do HSV-1.

Sendo assim, o estudo de novas moléculas derivadas de algas marinhas

com potencial antiviral pode ser uma boa oportunidade para o desenvolvimento de

fármacos com boa atividade antiviral sobre a fase α da replicação do HSV-1 e com

baixa citotoxicidade. É particularmente interessante o desenvolvimento de novos

compostos contra esta fase da replicação do HSV-1, pois não exitem drogas

disponíveis na clínica que tenham como alvo esta etapa, além de ser uma etapa

diferente daquela inibida pelo ACV, sugerindo que a combinação destes

compostos pode apresentar um efeito terapêutico aditivo ou sinergístico.

6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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