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CENTRO DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
CURSO DE MESTRADO EM ODONTOLOGIA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PERIODONTIA
CARACTERIZAÇÃO MICROBIOLÓGICA DE INDIVÍDUOS
PORTADORES DE DOENÇA PERIODONTAL CRÔNICA
E AGRESSIVA GENERALIZADA
MICHELLE LUBA
1º Orientador: Prof.
a
Dr.
a
Luciene C. de Figueiredo
2º Orientador: Prof.
a
Dr.
a
Magda Feres
Guarulhos
2006
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ii
MICHELLE LUBA
CARACTERIZAÇÃO MICROBIOLÓGICA DE INDIVÍDUOS
PORTADORES DE DOENÇA PERIODONTAL CRÔNICA
E AGRESSIVA GENERALIZADA
Dissertação apresentada à Universidade
Guarulhos para obtenção do título de
Mestre em Odontologia, Área de
Concentração em Periodontia.
1º Orientador: Prof.
a
Dr.
a
Luciene C. de Figueiredo
2º Orientador: Prof.
a
Dr.
a
Magda Feres
Guarulhos
2006
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iii
AGRADECIMENTOS
À Universidade Guarulhos, instituição onde tive a oportunidade de dar
um importante passo rumo ao crescimento científico e profissional.
Aos meus pais, pelo constante apoio e incentivo à realização dos
nossos sonhos.
Ao Fernando, meu marido, que esteve ao meu lado durante todo o
curso.
À minha orientadora, Prof.
a
Dr.
a
Luciene Figueiredo pela competente
orientação, colaboração e compreensão em todos os momentos.
À minha co-orientadora, Prof.
a
Dr.
a
Magda Feres, um exemplo a ser
seguido.
Ao Prof. Dr. Paulo Sérgio Pedrosa Ferraz, pelo incentivo à continuidade
dos meus estudos.
À bióloga Izilvânia Q. Barreto, por sua essencial ajuda durante a
realização da fase laboratorial do trabalho.
Aos professores do Programa de Pós Graduação em Odontologia da
UnG, Profa Dra Magda Feres, Luciene Figueiredo, Jamil Awad Shibli,
Sheila C. Cortelli, Cristiane M. Amaral, Poliana M. Duarte, José A.
Rodrigues, Cláudia Ota-Tsuzuki pelos ensinamentos transmitidos, pelo
exemplo profissional e pela amizade constante.
Aos funcionários que de alguma forma contribuíram para os meus
trabalhos durante este período.
iv
Aos pacientes e aos voluntários que contribuíram de forma significante
para o meu aprendizado e para a execução deste trabalho.
Às amigas Juliana Lucchezi, Flávia Matarazzo e Paula Soldani, pela
companhia e carinho durante todo o curso.
À todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização
deste estudo.
v
RESUMO
O objetivo deste estudo transversal foi analisar o perfil microbiano
subgengival por meio da técnica do Checkerboard DNA-DNA Hybridization em
uma população brasileira portadora de doença periodontal crônica e agressiva
generalizada. Para tal finalidade, foram selecionados 72 indivíduos, sendo 30
indivíduos portadores de doença periodontal crônica ( grupo PC), 12 com
periodontite agressiva generalizada (grupo PA) e 30 periodontalmente
saudáveis (grupo S). Os parâmetros clínicos analisados foram Profundidade à
Sondagem (PS-mm), Nível Clínico de Inserção (NCI-mm), presença ou
ausência de placa visível, sangramento gengival, sangramento à sondagem e
supuração. Amostras de biofilme subgengival foram coletadas de 9 sítios
mésio-vestibulares nos indivíduos do grupo S e de 9 sítios (rasos < 3mm,
intermediários 4-6mm e profundos >7mm) nos indivíduos dos grupos PC e PA,
sendo posteriormente avaliadas em relação a 38 espécies bacterianas por
meio da técnica do Checkerboard DNA-DNA Hybridization. Em relação aos
parâmetros clínicos, os grupos PA e PC foram homogêneos e apresentaram as
maiores médias de PS, NCI, percentual de sítios com SS e SUP em
comparação aos indivíduos periodontalmente saudáveis. O grupo PC
demonstrou o maior percentual de sítios com placa bacteriana visível, enquanto
os grupos PA e S foram semelhantes. O grupo PC apresentou níveis médios
de contagem total das espécies analisadas significantemente maiores (37,1 x
10
6
) do que os grupos PA (21,7 x 10
6
) e S (2,7 x 10
6
). A.
actinomycetemcomitans foi encontrado em elevadas contagens, proporções e
percentual de sítios colonizados em indivíduos do grupo PA quando
comparados aos indivíduos periodontalmente saudáveis (p<0,001). Os
complexos laranja e vermelho representaram as maiores proporções no grupo
PC (30,6% e 24,9%, respectivamente) e no grupo PA (32,3% e 31,1%,
respectivamente), porém sem diferenças estatisticamente significantes entre os
grupos. Por outro lado, os indivíduos periodontalmente saudáveis
apresentaram apenas 4,3% de complexo vermelho. O grupo PA apresentou as
menores proporções (5,2%) das espécies de Actinomyces em comparação aos
grupos PC (17,7%) e S (32,9%), estatisticamente semelhantes (p>0,05). Em
conclusão, a composição microbiana subgengival de indivíduos com PC e PA
diferem marcadamente da observada em indivíduos periodontalmente
saudáveis. Além disso, discretas diferenças no perfil geral de colonização
foram observadas em relação às duas formas da doença.
Palavras-chaves: doença periodontal agressiva, doença periodontal crônica,
microbiota subgengival.
vi
ABSTRACT
The purpose of the present investigation was to analyze the
subgingival microbial profile through the Checkerboard DNA-DNA Hybridization
technique in a Brazilian population with chronic periodontitis and generalized
aggressive periodontitis. To this end, 72 subjects were selected, being 30 with
chronic periodontitis (ChP), 12 subjects with generalized aggressive
periodontitis (GAgP) and 30 healthy (H). The analyzed clinical parameters were:
probing pocket depth (PD-mm), clinical attachment level (AL-mm), presence or
absence of visible dental plaque, gingival bleeding, bleeding on probing and
suppuration. Samples of subgingival biofilm were collected from 9 mesial
surfaces in the subjects of the group S and of 9 sites (shallow < 3mm, medium
4-6mm and deep >7mm) in the individuals of the groups GAgP and ChP, being
appraised later in relation to 38 bacterial species through the Checkerboard
DNA-DNA Hybridization technique. In relation to the clinical parameters, the
groups GAgP and ChP were homogeneous and they presented the highest
average percentiles of PD and AL sites with SS and SUP in comparison to the
healthy subjects. The group ChP demonstrated the highest percent of colonies
with visible bacterial plaque, while the GAgP and H were similar. The group
ChP presented medium levels of total counts of the analyzed species
significantly higher (37.1 x 10
6
) than the groups GAgP (21.7 x 10
6
) and H (2.7 x
10
6
). A. actinomycetemcomitans was found in high counts, proportions and the
percentile of colonies colonized in subjects of the group GAgP when compared
to the healthy subjects (p < 0.001). The complexes orange and red represented
the largest proportions in the group ChP (30.6% and 24.9%, respectively) and in
the group GAgP (32.3% and 31.1%, respectively), however without significant
statistical differences among the groups. On the other hand, the healthy
subjects only presented 4.3% of red complex and the largest proportions
(32.9%) of the species of Actinomyces in comparison with the groups ChP
(17.7%) and AP (5.2%), is statistically similar (p>0.05). In conclusion, the
subgingival microbiota of ChP and GAgP markedly differed from H subjects.
Additionally, slight differences in the overall profile of colonization were
observed between these two forms of disease.
Key-words: Aggressive periodontitis, chronic periodontitis, subgingival
microbiota.
vii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Relação das cepas empregadas para a confecção das
sondas de DNA separadas por complexos bacterianos............................
14
Tabela 2. Índice utilizado para a determinação dos níveis dos
microrganismos nas amostras de biofilme subgengival............................
19
Tabela 3. Média (+ dp) dos parâmetros clínicos nos grupos Periodontite
Crônica (PC), Periodontite Agressiva (PA) e Saudável (S).......................
21
Tabela 4. Freqüências médias de sítios de acordo com diferentes
categorias de Profundidade à Sondagem e Nível Clínico de Inserção,
nos grupos Periodontite Crônica (PC) e Periodontite Agressiva (PA).......
22
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação gráfica do Minislot (Immunetics,
Cambridge, MA, EUA) e resumo da preparação e deposição das
amostras de biofilme subgengival (técnica Checkerboard DNA-DNA
Hybridization) .......................................................................................
15
Figura 2. Representação gráfica do Miniblotter (Immunetics,
Cambridge, MA, EUA) e resumo das etapas de hibridização e
detecção das espécies bacterianas presentes nas amostras de
biofilme subgengival (técnica Checkerboard DNA-DNA
Hybridization)........................................................................................
16
Figura 3. Representação gráfica do padrão de hibridização entre as
bactérias presentes nas amostras de biofilme e as sondas de DNA
(técnica Checkerboard DNA-DNA Hybridization) ................................
17
Figura 4. Representação esquemática do padrão de hibridização
entre as bactérias presentes nas amostras de biofilme e as sondas
de DNA (técnica Checkerboard DNA-DNA Hybridization). Nesta
figura estão apresentadas 40 bactérias, e as amostras de biofilme
são de todos os dentes de um mesmo indivíduo ................................
18
Figura 5. Perfil microbiano das médias de contagem (x10
5
), da
proporção das sondas de DNA e do percentual de sítios colonizados
das 38 espécies bacterianas presentes nas amostras de biofilme
subgengival de 30 indivíduos com periodontite crônica e 30
indivíduos periodontalmente saudáveis. Análise de covariância
ajustada para idade: *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. Os resultados
foram ajustados para comparações múltiplas......................................
27
ix
Figura 6. Perfil microbiano das médias de contagem (x10
5
), da
proporção das sondas de DNA e do percentual de sítios colonizados
das 38 espécies bacterianas presentes nas amostras de biofilme
subgengival de 12 indivíduos com periodontite agressiva
generalizada e 30 indivíduos periodontalmente saudáveis. Análise
de covariância ajustada para idade: *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.
Os resultados foram ajustados para comparações múltiplas...............
28
Figura 7. Perfil microbiano das médias de contagem (x10
5
), da
proporção das sondas de DNA e do percentual de sítios colonizados
das 38 espécies bacterianas presentes nas amostras de biofilme
subgengival de 30 indivíduos com periodontite crônica e 12
indivíduos com periodontite agressiva generalizada. Análise de
covariância ajustada para idade: *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. Os
resultados foram ajustados para comparações múltiplas……………..
29
Figura 8. Média das proporções dos complexos microbianos
descritos por Socransky et al. (1998), presentes nas amostras de
biofilme subgengival dos 3 grupos experimentais. As áreas dos
gráficos foram ajustadas para refletir a contagem total das espécies
bacterianas em cada grupo. Análise de covariância ajustada para
idade (*p<0,01). Letras distintas nos complexos significam
diferenças significativas entre os grupos..............................................
30
Figura 9. Perfil microbiano das médias de proporção de sondas de
DNA das 38 espécies bacterianas analisadas nas amostras de
biofilme subgengival de 30 indivíduos com periodontite crônica
(sítios separados por categoria de profundidade à sondagem-PS,
sendo rasos: < 3mm, intermediários: 4-6mm, profundos: >7mm) e 30
indivíduos periodontalmente saudáveis (PS <3mm). Análise de
covariância ajustada para idade: *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. Os
resultados foram ajustados para comparações múltiplas ....................
31
x
Figura 10. Perfil microbiano das médias de proporção de sondas de
DNA das 38 espécies bacterianas analisadas nas amostras de
biofilme subgengival de 12 indivíduos com periodontite agressiva
generalizada (sítios separados por categoria de profundidade à
sondagem-PS, sendo rasos: <3mm, intermediários: 4-6mm,
profundos: >7mm) e 30 indivíduos periodontalmente saudáveis
(sítios com PS <3mm). Análise de covariância ajustada para idade:
*p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. Os resultados foram ajustados para
comparações múltiplas ........................................................................
32
Figura 11. Perfil microbiano das médias de proporção de sondas de
DNA das 38 espécies bacterianas analisadas nas amostras de
biofilme subgengival de 30 indivíduos com periodontite crônica e 12
indivíduos com periodontite agressiva generalizada, sendo os sítios
separados por categoria de Profundidade à Sondagem-PS: rasos
(<3mm), intermediários (4-6mm), profundos (>7mm). Análise de
covariância ajustada para idade: *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. Os
resultados foram ajustados para comparações múltiplas ....................
33
xi
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA......................................................... 01
1.1. Etiologia da doença periodontal crônica ...................................... 02
1.2. Etiologia da doença periodontal agressiva .................................. 03
1.3. Métodos para avaliação da composição da placa bacteriana ... 05
2. PROPOSIÇÃO ....................................................................................... 07
3. MATERIAL E MÉTODO ......................................................................... 08
3.1. Seleção da amostra ........................................................................ 08
3.2. Critérios de inclusão e exclusão ................................................... 08
3.3. Avaliação clínica ............................................................................. 09
3.3.1. Calibração dos examinadores ............................................... 09
3.3.2. Parâmetros clínicos ............................................................... 10
3.4. Avaliação microbiológica ............................................................... 11
3.4.1. Seleção dos sítios-teste ......................................................... 11
3.4.2. Checkerboard DNA-DNA Hybridization ............................... 12
3.5. Análise estatística ........................................................................... 19
4. RESULTADOS ....................................................................................... 21
4.1. Resultados clínicos ........................................................................ 21
4.2. Resultados microbiológicos .......................................................... 23
5. DISCUSSÃO .......................................................................................... 34
6. CONCLUSÃO ........................................................................................ 39
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................... 40
ANEXOS .................................................................................................... 50
1
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
A doença periodontal acomete as estruturas de proteção e sustentação
dos dentes e tem como fator etiológico microrganismos específicos presentes na
placa bacteriana supra e subgengival (Löe et al., 1965; Socransky, 1970; Listgarten
et al., 1978; Loesche et al., 1985; Socransky & Haffajee, 1994; Haffajee &
Socransky, 1994; Socransky et al., 1998). A comprovação da natureza infecciosa da
doença periodontal foi demonstrada por Löe e colaboradores na década de 60 após
o estudo clássico sobre a “gengivite experimental” que demonstrou a relação
existente entre o acúmulo de placa dentária e a inflamação gengival (Löe et al.,
1965). O reconhecimento da especificidade da placa subgengival e da existência de
diferentes formas de infecções periodontais associadas a diferentes patógenos
(Loesche 1976; Socransky & Haffajjee, 1994), tem levado pesquisadores e clínicos a
um melhor entendimento desse processo patológico e, eventualmente, à elaboração
de terapias específicas, com maiores probabilidades de sucesso.
Neste contexto, a doença periodontal agressiva é uma infecção que
acomete indivíduos sistemicamente saudáveis, normalmente jovens, caracterizada
por uma severa perda de inserção clínica associada a uma rápida destruição óssea
alveolar (Miller et al., 1987; Tonetti & Mombeli, 1999; Armitage, 1999; Lang et al.,
1999). Esta forma de doença periodontal é classificada de maneira localizada ou
generalizada, dependendo de sua extensão (Armitage, 1999; Lang et al., 1999).
Existe um forte consenso na literatura quanto ao envolvimento da espécie
bacteriana Aggregactibater actinomycetemcomitans (Norskov-Lauritsen et al., 2006)
anteriormente denominado Actinobacillus actinomycetemcomitans, na etiopatogenia
da doença periodontal agressiva (Slots et al., 1980; Zambon et al., 1985; Schenkein
et al., 1993; Tinoco et al., 1997, Cortelli et al., 2005). Porém, poucos estudos
avaliaram de forma sistemática a composição da microbiota subgengival de
indivíduos brasileiros com periodontite agressiva.
O advento de novas técnicas microbiológicas e o avanço na identificação
de novas espécies de microrganismos vem demonstrando que alguns indivíduos
portadores de doença periodontal agressiva não apresentam ou apresentam baixas
proporções de A. actinomycetemcomitas (Han et al., 1991; Kamma et al., 2001;
Mullally et al., 2000; Lopez et al., 1996; Trevilatto et al., 2002; Kamma et al., 2004)
2
ou de outros patógenos relacionados com a doença periodontal agressiva, tais
como, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia,
Campylobacter rectus e Fusobacterium ssp. (Loesche et al., 1985; Moore & Moore
1994; Mullally et al., 2000; Kamma et al., 2001). Esses dados sugerem que outras
espécies bacterianas podem estar relacionadas com o início e a progressão desta
infecção.
1.1. Etiologia da doença periodontal crônica
Os microrganismos presentes na placa dentária ou biofilme dental
(Costerton et al., 1999) localizada no sulco gengival e/ou bolsa periodontal assim
como os subprodutos derivados do metabolismo microbiano são considerados o
agente etiológico primário da doença periodontal (Pennel & Keagle, 1977; Loesche
et al., 1985). À medida que se estabelecem alterações inflamatórias no tecido
gengival induzidas pela placa, ocorre um aumento tanto na quantidade de bactérias,
como também alterações nos tipos morfológicos presentes nesta placa (Löe et al.,
1965). Os microrganismos, considerados periodontopatogênicos e associados tanto
à gengivite quanto a uma ou mais formas de periodontitite, são na maioria das
vezes, Gram-negativos, anaeróbios, dotados de motilidade e, menos freqüentemente
microaerófilos (Socransky, 1970; Socransky, 1977; Theilade, 1986; Socransky &
Haffajee, 1994).
A busca dos fatores etiológicos associados às doenças periodontais
iniciou-se há várias décadas. Estudos epidemiológicos (Schei et al., 1959; Lovdal et
al., 1958; Russel, 1967; Löe et al., 1965; Löe et al., 1967; Theilade et al., 1966),
realizados na década de 60 mostraram uma relação positiva entre o acúmulo de
placa dentária e a patogenia da doença, comprovando sua importância na etiologia
das doenças periodontais. Seguindo esta filosofia, estabeleceu-se o conceito da
“Hipótese da placa não-específica”, teoria que relacionava qualquer acúmulo de
microrganismos na margem gengival à produção de fatores irritantes e,
conseqüentemente, à inflamação gengival e à destruição periodontal (Theilade,
1986). O estudo clássico da “gengivite experimental” em humanos demonstrou
conclusivamente, uma forte relação entre o acúmulo de placa, as alterações nas
proporções dos tipos morfológicos bacterianos, e a inflamação gengival. Por outro
3
lado, o controle da placa dentária mostrou ser capaz de reverter o processo de
inflamação gengival e levar as proporções microbianas e a um perfil associado à
saúde periodontal (Löe et al., 1965).
Uma grande contribuição para os novos conceitos do desenvolvimento da
doença periodontal surgiu com os estudos de Löe et al. (1986) realizados com os
plantadores de chá do Sri Lanka. Estes estudos observaram 480 plantadores de chá
durante 15 anos, e demonstraram que 11% destes indivíduos, independentemente
da presença massiva de depósitos de placa dentária, não apresentavam progressão
da doença periodontal, contradizendo assim os princípios da inespecificidade da
placa dentária (Löe et al., 1978, Löe et al., 1986). Nesta mesma época, outros
estudos microbiológicos reconheceram certas manifestações periodontais, tais como
a “periodontite juvenil localizada” e a “gengivite ulcerativa necrozante”, como sendo
entidades clínicas distintas, causadas por microrganismos específicos, A.
actinomycetemcomitans e Treponema vicentii, respectivamente (Listgarten, 1965;
Slots, 1976; Haffajee et al., 1984; Mandell et al., 1987). Surgia então a “Hipótese da
placa específica”, sustentada até os dias atuais, na qual a composição microbiana
da placa dentária difere entre indivíduos e entre as diversas entidades clínicas
periodontais, tais como periodonto saudável, gengivites e periodontites (Loesche,
1976).
A associação de microrganismos específicos com as diversas formas de
doença periodontal permitiu e incentivou o desenvolvimento de métodos de
diagnóstico baseados na detecção de uma ou mais espécies de bactérias, ou de
alterações em sua proporção na placa (Bretz & Loesche, 1987; Loesche et al.,
1990). As pesquisas em periodontia voltaram-se então, a vista disso, para
determinar quais os microrganismos, dentre as mais de 700 espécies bacterianas
presentes na cavidade bucal (Kazor et al., 2003), seriam os responsáveis pelo
desenvolvimento da doença periodontal.
1.2. Etiologia da doença periodontal agressiva
A microbiota da doença periodontal agressiva é complexa, consistindo
geralmente de bactérias anaeróbias Gram-negativas, tais como,
A.actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythia, C. rectus e
Fusobacterium ssp. (Loesche et al., 1985; Moore & Moore 1994; Mullally et al., 2000;
4
Kamma et al., 2001). O papel de bactérias específicas, especialmente A.
actinomycetemcomitans na forma localizada da doença periodontal agressiva tem
sido extensivamente estudado em adolescentes e adultos jovens (Zambon, 1985;
Schenkein et al., 1993; Tinoco et al., 1997; Cortelli et al., 2005). Slots et al. (1980)
analisando por meio de cultura microbiana amostras de biofilme subgengival de
bolsas profundas de pacientes portadores de doença periodontal agressiva
localizada encontraram em 9 dos 10 indivíduos analisados uma alta prevalência de
A. actinomycetemcomitans. Entretanto, os relatos da prevalência deste patógeno em
indivíduos jovens saudáveis e portadores de doença periodontal crônica são
menores, principalmente em estudos realizados no Brasil (Cortelli et al., 2005 Tinoco
et al., 1997). Outros estudos isolaram A. actinomycetemcomitans em cerca de 75 a
100% de amostras de bolsas periodontais ativas na doença periodontal agressiva
(Zambon et al., 1983; Christersson et al., 1985; Mandell & Socransky, 1981; Zambon
et al., 1985; Russo et al., 1998; Lee et al., 2003; Cortelli et al., 2003; Yang et al.,
2005), corroborando assim a relação existente entre este patógeno e a forma
agressiva da doença periodontal.
Embora A. actinomycetemcomitans seja indicado como principal patógeno
na doença periodontal agressiva, existem algumas controvérsias na literatura (Han
et al., 1991; Kamma et al., 2001; Mullally et al., 2000; Lopez et al., 1996; Ishikawa et
al., 2002; Trevilatto et al., 2002; Takeuchi et al., 2003; Gajardo et al., 2005) Kamma
et al. (2001) estudando uma população na Grécia e Mullally et al. (2000) na Irlanda
do Norte, observaram por meio da técnica do PCR (Reação em Cadeia da
Polimerase) uma baixa prevalência de A. actinomycetemcomitans (18,8 e 28%) em
bolsas periodontais de indivíduos com doença periodontal agressiva localizada. Em
outro estudo, Han et al. (1991) não isolaram A. actinomycetemcomitans em
nenhuma das 23 amostras subgengivais obtidas de indivíduos chineses portadores
da forma agressiva da doença periodontal. Trevilatto et al. (2002) estudaram uma
família brasileira com doença periodontal agressiva (n=14) e relataram uma baixa
prevalência de A. actinomycetemcomitans, questionando assim o valor do
isolamento e a presença deste microrganismo como forma de diagnóstico (etiologia)
para a doença periodontal agressiva. Recentemente, Gajardo et al. (2005) por meio
de cultura microbiana isolaram A. actinomycetemcomitans em apenas 19,4% de
bolsas periodontais de 30 indivíduos com doença periodontal agressiva em uma
população chilena. Esta baixa prevalência de A. actinomycetemcomitans na
5
população chilena já havia sido reportada por Lopez et al. (1996). Complementando,
Mombelli et al. (2002), em uma revisão sistemática da literatura, relataram que a
presença ou ausência de A. actinomycetemcomitans não pode ser um parâmetro
para diferenciar indivíduos com doença periodontal agressiva e com a forma crônica
da doença. Logo, estes estudos sugerem que outros microrganismos podem estar
associados à etiologia da doença periodontal agressiva.
1.3. Métodos para avaliação da composição da placa bacteriana
Inúmeros métodos foram e têm sido utilizados para identificação dos
microrganismos bucais. As técnicas de microscopia de contraste de fase e de campo
escuro podem demonstrar diferenças de tamanho, forma e mobilidade dos
microrganismos presentes na placa bacteriana. Porém, estes métodos
microscópicos não diferenciam as espécies bacterianas (Loesche et al., 1985;
Beltrami et al., 1987; Omar et al., 1990; Furuichi et al., 1997; Dahan et al., 2004). A
utilização do método de cultura, considerado um gold standard, é capaz de
identificar diversos microrganismos presentes na placa bacteriana, além de ser
extremamente importante para a busca de novas espécies e para a determinação da
susceptibilidade microbiana à diferentes antibióticos (Newman & Socransky,1977; Ali
et al.,1992; Lie et al., 1995), entretanto, estima-se atualmente que a cavidade bucal
apresente aproximadamente 700 espécies de bactérias, sendo que mais de 50%
destas espécies ainda não foram cultivadas. Assim, outros microrganismos poderiam
estar presentes na doença periodontal sem o devido conhecimento e caracterização
(Paster et al., 2001; Kazor et al., 2003). Desta maneira, vários métodos
independentes de cultura surgiram nos últimos anos com o objetivo de obter maiores
informações sobre a composição da microbiota, baseados em sondas de DNA como
o Checkerboard DNA-DNA Hybridization, ou na reação em cadeia da polimerase
qualitativa ou quantitativa usando PCR em tempo real. O método do Checkerboard
DNA-DNA Hybridization foi desenvolvido por Socransky et al. (1994) e utiliza sondas
genômicas de DNA para a identificação de até 40 espécies bacterianas em 28
amostras de placa bacteriana por teste. Esta técnica permite a elaboração de
estudos de grande porte para o conhecimento da microbiota das doenças
periodontais, propiciando a avaliação de um grande número de amostras e de
microrganismos orais. As maiores vantagens deste método de diagnóstico incluem a
6
rápida identificação e a avaliação semiquantitativa dos microrganismos presentes
nas amostras, a identificação de bactérias de difícil cultivo e o baixo custo. Sendo
assim, o Checkerboard DNA-DNA Hybridization tem sido utilizado com sucesso na
avaliação da composição da microbiota subgengival e de outros nichos da cavidade
oral (Haffajee et al., 1997a, b; Feres et al., 1999a,b; Cugini et al., 2000; Ximénez-
Fyvie et al., 2000; Feres et al., 2001; Faveri et al., 2006).
Neste contexto, Socransky et al. (1998) examinaram as relações
existentes entre as espécies bacterianas na placa subgengival com a doença
periodontal crônica. Utilizando o método Checkerboard DNA-DNA Hybridization
avaliaram 13.261 amostras de placa subgengival. Os autores demonstraram a
existência de associações entre as espécies bacterianas estudadas, as quais foram
agrupadas da seguinte forma: complexo vermelho, composto por P. gingivalis, T.
forsythia e Treponema denticola; complexo laranja, composto por subespécies de
Fusobacterium nucleatum (Fusobacterium nucleatum ssp. nucleatum, Fusobacterium
nucleatum ssp. polymorphum, Fusobacterium nucleatum ssp. vincentii),
Fusobacterium periodonticum, P. intermedia, Prevotella nigrescens,
Peptostreptococcus micros, Campylobacter showae, C. rectus, Campylobacter
gracilis, Eubacterium nodatum e Streptococcus constellatus; complexo verde,
formado por 3 espécies de Capnocytophaga (Capnocytophaga gingivalis,
Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena), Eikenella corrodens e A.
actinomycetemcomitans sorotipo a; complexo amarelo, formado por espécies de
Streptococcus (Streptococcus mitis, Streptococcus sanguinis, Streptococcus oralis,
Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius) e complexo roxo, composto de
Actinomyces odontolyticus e Veillonella parvula. Espécies como Selenomonas noxia,
A. actinomycetemcomitans sorotipo b e Actinomyces naeslundii genospécie 2 não
formaram complexos com outras espécies microbianas. Este mesmo estudo
demonstrou, ainda, a existência de relações entre os complexos, de forma que, por
exemplo, o complexo laranja precede a colonização do complexo vermelho.
Também foram observadas as relações existentes entre certos complexos e
aspectos clínicos da doença periodontal. Os parâmetros de profundidade à
sondagem, sangramento à sondagem e nível de inserção clínica, por exemplo,
mostraram relação direta com a presença das espécies do complexo vermelho e, em
certa extensão, do complexo laranja.
7
2. PROPOSIÇÃO
* Analisar o perfil microbiano subgengival em uma população brasileira
portadora de doença periodontal crônica e de doença periodontal agressiva
generalizada, por meio da técnica do Checkerboard DNA-DNA Hybridization,
comparando-os com indivíduos periodontalmente saudáveis.
8
3. MATERIAL E MÉTODO
3.1. Seleção da amostra
Foram selecionados 72 indivíduos que procuraram tratamento na Clínica
de Odontologia da Universidade Guarulhos (SP), constituindo-se três grupos:
Periodontite Crônica - PC (n=30, indivíduos portadores de periodontite crônica),
Periodontite Agressiva - PA (n=12, indivíduos portadores de periodontite agressiva
generalizada) e Saudáveis - S (n=30, indivíduos periodontalmente saudáveis). A
seleção foi realizada por três mestrandos em periodontia, sob a supervisão dos
professores da disciplina de Periodontia. Todos os participantes foram informados
dos objetivos do estudo, de seus riscos e benefícios, incluindo os tipos de medições
clínicas e coletas. Os indivíduos que concordaram em participar do estudo
assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, contendo as
informações a respeito da pesquisa, objetivos, riscos e conseqüências.
Posteriormente, responderam a um questionário de saúde e foram submetidos a
exame periodontal completo (anexo A) e receberam terapia periodontal gratuita,
estando de acordo com as diretrizes e normas do Conselho Nacional de Saúde
(Resolução nº196/96). O projeto foi submetido à apreciação e aprovação do Comitê
de Ética em Pesquisa em Seres Humanos da Universidade Guarulhos (anexo B).
3.2. Critérios de inclusão e exclusão
3.2.1. Critérios de inclusão
Para a inclusão no estudo, a seleção dos participantes respeitou os
seguintes critérios:
Grupo Periodontite Crônica – PC
• Ter idade igual ou superior a 30 anos;
• Possuir no mínimo 15 dentes, excluindo-se os terceiros molares;
• Apresentar pelo menos 6 dentes com 1 sítio interproximal com
profundidade à sondagem e nível clínico de inserção
> 5 mm, não
contíguos, distribuídos em quadrantes distintos.
Grupo Periodontite Agressiva Generalizada – PA
9
• Ter idade igual ou inferior a 30 anos;
• Possuir no mínimo 15 dentes, excluindo-se os terceiros molares;
• Possuir pelo menos 6 dentes com 1 sítio interproximal apresentando
profundidade à sondagem e nível clínico de inserção maior do que 5
mm, não contíguos, localizados na região de incisivos e molares;
• Além disso, no mínimo outros três dentes com as mesmas
características clínicas.
Grupo Saudável – S
• Ter idade igual ou superior a 30 anos;
• Possuir no mínimo 20 dentes, excluindo-se os terceiros molares;
• Não apresentar sítios com profundidade à sondagem e nível clínico de
inserção > 4 mm, sendo aceitável no máximo 2 sítios por indivíduo com
nível clínico de inserção igual a 5 mm, apenas em caso de retração.
• Não apresentar sinais clínicos de gengivite e não apresentar mais de
20% dos sítios com sangramento à sondagem.
3.2.2. Critérios de exclusão
• Fumantes;
• Gravidez ou lactação;
• História de tratamento periodontal anterior;
• Antibioticoterapia e/ou uso de medicamentos sistêmicos e anti-sépticos
bucais nos últimos seis meses;
• Doença sistêmica que comprometa a resposta do hospedeiro ou exija
medicação profilática ao tratamento.
3.3. Avaliação clínica
3.3.1. Calibração dos examinadores
Três examinadores foram treinados e calibrados com o objetivo de
conseguir a máxima reprodutibilidade nas medições realizadas por cada um deles e
entre eles. A metodologia utilizada para a calibração foi preconizada por Araujo et al.
10
(2003), que avaliaram o erro padrão da medida (e.p.m.) e o erro médio percentual
(e.m.p.) para os parâmetros clínicos periodontais contínuos (profundidade à
sondagem e nível clínico de inserção). O e.p.m. e o e.m.p. variaram entre 0,14mm-
0,31mm e 4,3%-7,86%, respectivamente. Para as variáveis categóricas (índice de
placa visível e índice de sangramento gengival), considerando a presença ou
ausência do parâmetro clínico, foi realizada a média do nível de concordância para
cada examinador e entre eles, obtendo-se concordância superior a 92% (teste
Kappa).
3.3.2. Parâmetros clínicos
As avaliações clínicas foram realizadas por três examinadores calibrados
utilizando sondas periodontais milimetradas tipo PCPUNC-BR 15 (HuFriedy do
Brasil, RJ, RJ, Brasil). Todos os dentes, exceto os terceiros molares, foram avaliados
em 6 sítios (mésio-vestibular, vestibular, disto-vestibular, mésio-lingual, lingual, disto-
lingual), para os seguintes parâmetros:
• Índice de Placa Visível – (Ainamo & Bay, 1975): ausência (escore 0) ou
presença (escore 1) de placa dentária supragengival visível, após lavagem e
secagem dos dentes.
• Índice de Sangramento Gengival – (Ainamo & Bay, 1975): ausência (escore 0)
ou presença (escore 1) de sangramento na gengiva marginal após percorrer
levemente a sonda periodontal ao longo do sulco gengival.
• Profundidade à Sondagem – Distância, em milímetros, entre a margem
gengival livre e a porção mais apical sondável do sulco/bolsa periodontal.
• Nível Clínico de Inserção – Distância, em milímetros, entre a junção cemento-
esmalte e a porção mais apical sondável do sulco/bolsa periodontal.
• Sangramento à Sondagem – Presença (escore 1) ou ausência (escore 0) de
sangramento até 20 segundos após a sondagem com sonda periodontal
milimetrada.
• Supuração – Presença (escore 1) ou ausência (escore 0) de supuração até 20
segundos após a sondagem com sonda periodontal milimetrada.
3.4. Avaliação microbiológica
11
3.4.1. Seleção dos sítios-teste
Grupo Periodontite Crônica - PC
Foram coletadas amostras de biofilme subgengival de 9 sítios por
indivíduo, localizados em dentes com faces interproximais não-contíguas, nas
seguintes categorias de profundidade à sondagem – PS: sítios rasos (PS<3mm),
intermediários (PS de 4 a 6 mm) e profundos (PS>7mm). Sempre que possível
foram incluídos sítios de todos os hemi-arcos. Quando o indivíduo não possuía 3
sítios com PS > 7 mm, foram coletados sítios intermediários (entre 4 e 6 mm) para
completar os 9 sítios.
Grupo Periodontite Agressiva Generalizada – PA
Foram coletadas amostras de biofilme subgengival de 9 sítios por
indivíduo, localizados em dentes com faces interproximais não-contíguas, nas
seguintes categorias de profundidade à sondagem – PS: sítios rasos (PS<3mm),
intermediários (PS de 4 a 6 mm) e profundos (PS>7mm). Sempre que possível
foram incluídos sítios de todos os hemi-arcos. Quando o indivíduo não possuía 3
sítios com PS > 7 mm, foram coletados sítios intermediários (entre 4 e 6 mm) para
completar os 9 sítios.
Grupo Saudável - S
Amostras de biofilme subgengival foram coletadas de 9 sítios mésio-
vestibulares selecionados ao acaso por meio de sorteio, contemplando pelo menos
um dente por cada sextante.
Nos três grupos não foram selecionados sítios próximos ou em dentes
com próteses mal-adaptadas, lesão de cárie extensa e/ou lesão endo-periodontal.
3.4.2. Checkerboard DNA-DNA Hybridization
12
Cepas bacterianas e condições de crescimento
A lista das 38 cepas bacterianas utilizadas neste estudo para o preparo
das sondas de DNA está apresentada na Tabela 1. Todas as cepas foram
adquiridas liofilizadas da ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD,
USA) ou do Forsyth Institute (Boston, MA, USA). O conteúdo liofilizado foi reidratado
em caldo para crescimento de Mycoplasma (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) e
cultivado em ágar triptose de soja contendo 5% de sangue de ovelha desfibrinado
(BBL, Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville, MD, USA) a 35
o
C sob
condição de anaerobiose (80% N
2
, 10% CO
2
, 10%H
2
). Algumas bactérias foram
cultivadas em meios de cultura enriquecidos de forma a suprir suas necessidades
nutricionais. T. forsythia, por exemplo, foi cultivada em ágar triptose de soja com 5%
de sangue de ovelha desfibrinado e 10 µg/ml de ácido N-acetil murâmico (NAM)
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA); enquanto P. gingivalis cresceu em um
meio similar, suplementado com 5% de sangue de ovelha desfibrinado, 0,3µg/ml de
menadiona (Sigma) e 5µg/ml de hemina (Sigma). T. denticola e T. socranskii foram
cultivados em caldo para crescimento de Mycoplasma (Difco) suplementado com
1mg/ml de glicose, 400µg/ml de niaciamida, 150µg/ml espermina tetraidroclorídrica,
20µg/ml de isobutirato de Na, 1mg/ml de L-cisteína, 5µg/ml de tiamina pirofosfato e
0,5% de soro bovino.
Isolamento do DNA e preparo das sondas
As cepas bacterianas foram anaerobicamente cultivadas na superfície de
ágar-sangue contido em placas de Petri, com exceção das 2 espécies de
espiroquetas, que foram cultivadas em caldo de cultura, por 3 a 7 dias. As colônias
foram raspadas e depositadas em tubos de microcentrífuga de 1,5ml contendo 1ml
de solução TE (10 mM Tris-HCl, 0,1mM EDTA, pH 7,6). As células foram lavadas 2
vezes por centrifugação na solução-tampão de TE a 3.500 gp por 10 minutos. Em
seguida, as células das cepas Gram-negativas foram novamente suspensas e
lisadas com SDS (dodecilsulfato de sódio, C
12
H
25
NaO
4
S) a 10% e proteinase K em
uma concentração de 20mg/ml (Sigma). As cepas Gram-positivas foram lisadas em
150µl de uma mistura enzimática contendo 15mg/ml de lisozima (Sigma) e 5mg/ml
de acromopeptidase (Sigma) em solução tampão de TE (pH 8,0). O DNA foi isolado
e purificado como descrito por Smith et al.,(1989). As sondas multi-genômicas
13
(whole-genomic) foram preparadas para cada uma das 38 espécies pela marcação
de 1µg do DNA bacteriano com digoxigenina, por meio do random primer
digoxigenin labeling kit (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA), de acordo
com o método descrito por Feinberg & Vogelstein (1983). As espécies bacterianas
avaliadas foram selecionadas segundo sua associação com diferentes tipos de
doenças ou saúde periodontal (Haffajee & Socransky, 1994).
Coleta de amostras de biofilme subgengival
A coleta de amostras de biofilme subgengival foi realizada com curetas
Gracey do tipo mini-five (HuFriedy), posicionadas na porção mais apical dos 9 sítios
previamente selecionados para o exame microbiológico. As amostras foram
imediatamente depositadas em tubos plásticos individuais contendo 150μl de
solução TE (pH 7,6), ao qual foram adicionados 100μl de NaOH a 0,5 M para que o
DNA bacteriano permanecesse viável por longos períodos de tempo. Estes tubos
foram então identificados e armazenados até serem analisados por meio da técnica
do Checkerboard DNA-DNA Hybridization para as 38 cepas bacterianas descritas na
Tabela 1, no laboratório de microbiologia da Universidade Guarulhos.
14
Tabela 1. Relação das cepas empregadas para a confecção das sondas de DNA
separadas por complexos bacterianos (Socransky et al., 1998; Socransky &
Haffajee, 2002).
Espécies Cepas Espécies Cepas
C
C
o
o
m
m
p
p
l
l
e
e
x
x
o
o
A
A
z
z
u
u
l
l
C
C
o
o
m
m
p
p
l
l
e
e
x
x
o
o
L
L
a
a
r
r
a
a
n
n
j
j
a
a
(
(
c
c
o
o
n
n
t
t
.
.
)
)
Actinomyces gerencseriae 23860
a
Fusobacterium nucleatum ssp.
Nucleatum
25586
a
Actinomyces israelii 12102
a
Fusobacterium nucleatum ssp.
Polymorphum
10953
a
Actinomyces naeslundii I 12104
a
Fusobacterium nucleatum ssp.
Vincentii
49256
a
C
C
o
o
m
m
p
p
l
l
e
e
x
x
o
o
R
R
o
o
x
x
o
o
Fusobacterium periodonticum 33693
a
Actinomyces odontolyticus 17929
a
Peptostreptococcus micros 33270
a
Veillonella parvula 10790
a
Prevotella intermédia 25611
a
C
C
o
o
m
m
p
p
l
l
e
e
x
x
o
o
A
A
m
m
a
a
r
r
e
e
l
l
o
o
Prevotella nigrescens 33563
a
Streptococcus gordonii 10558
a
Streptococcus constellatus 27823
a
Streptococcus intermedius 27335
a
C
C
o
o
m
m
p
p
l
l
e
e
x
x
o
o
V
V
e
e
r
r
m
m
e
e
l
l
h
h
o
o
Streptococcus mitis 49456
a
Tannerella forsythia 43037
a
Streptococcus oralis 35037
a
Porphyromonas gingivalis 33277
a
Streptococcus sanguinis 10556
a
Treponema denticola B1
b
C
C
o
o
m
m
p
p
l
l
e
e
x
x
o
o
V
V
e
e
r
r
d
d
e
e
O
O
u
u
t
t
r
r
a
a
s
s
E
E
s
s
p
p
é
é
c
c
i
i
e
e
s
s
Eubacterium saburreum 33271
a
Aggregactibacter
actinomycetemcomitans a e b
43718
a
29523
a
Gemella morbillorum 27824
a
Capnocytophaga gingivalis 33624
a
Leptotrichia buccalis 14201
a
Capnocytophaga ochracea 33596
a
Prevotella melaninogenica 25845
a
Capnocytophaga sputigena 33612
a
Propionibacterium acnes I e II 11827
a
11828
a
Eikenella corrodens
23834
a
Selenomonas noxia 43541
a
C
C
o
o
m
m
p
p
l
l
e
e
x
x
o
o
L
L
a
a
r
r
a
a
n
n
j
j
a
a
Streptococcus anginosus 33397
a
Campylobacter gracilis 33236
a
Treponema socranskii S1
b
Campylobacter rectus 33238
a
Campylobacter showae 51146
a
Eubacterium nodatum 33099
a
a
ATCC (American Type Culture Collection)
b
Forsyth Institute.
15
Hibridização DNA-DNA
As suspensões contidas nos tubos foram fervidas em banho-maria por 10
minutos e, em seguida, neutralizadas pela adição de 0,8 ml de acetato de amônia a
5 M. Cada suspensão de placa bacteriana contendo o DNA livre foi depositada em
uma das canaletas do Minislot (Immunetics, Cambridge, MA, USA- Figura 1) ficando,
assim, concentrada em uma membrana de nylon (15 x 15cm) com carga positiva
(Boehringer Mannheim). As duas últimas canaletas do Minislot (Immunetics) foram
ocupadas por controles contendo uma mistura do DNA das espécies de
microrganismos investigadas pelas sondas, nas concentrações correspondentes a
10
5
e 10
6
células, ou seja, 1ng e 10ng de DNA de cada espécie, respectivamente
(Socransky et al., 1994; Haffajee et al., 1997a, b). A membrana foi então removida
do Minislot (Immunetics) e o DNA nela concentrado foi fixado por meio de
aquecimento em forno a 120º C por 20 minutos.
Figura 1. Representação gráfica do Minislot (Immunetics, Cambridge, MA, USA) e
resumo da preparação e deposição das amostras de biofilme subgengival (técnica
Checkerboard DNA-DNA Hybridization).
A membrana foi pré-hibridizada a 42º C, por 1 hora, em uma solução
contendo 50% de formamida, 1% de caseína (Sigma), 5 x standard saline citrate -
SSC (1 x SSC = 150mM NaCl, 15mM de citrato de sódio, pH 7,0), 25 mM de fosfato
de sódio (pH 6,5) e 0,5 mg/ml de RNA de levedura (Boehringer Mannheim).
16
Em seguida, a membrana foi posicionada no Miniblotter (Immunetics,
Figura 2) com as linhas de DNA perpendiculares às canaletas do aparato. Em cada
canaleta do Miniblotter (Immunetics) foi adicionada uma sonda de DNA (diluída a
aproximadamente 20ng/ml) em 130 μl de uma solução de hibridização composta de
45% de formamida, 5 X SSC, 20 mM de fosfato de sódio (pH 6,5), 0,2 mg/ml de RNA
de levedura (Boehringer Mannheim), 10% de sulfato de dextrano e 1% de caseína
(Sigma). A hibridização ocorreu por um período mínimo de 20 horas, a 42º C.
Figura 2. Representação gráfica do Miniblotter (Immunetics, Cambridge, MA, USA) e
resumo das etapas de hibridização e detecção das espécies bacterianas presentes
nas amostras de biofilme subgengival (técnica Checkerboard DNA-DNA
Hybridization).
Detecção das espécies
Após o período de hibridização, a membrana foi removida do Miniblotter
(Immunetics) lavada por 40 minutos, a 65ºC numa solução adstringente composta de
1% de SDS, 1mM de EDTA e 20mM de Na
2
HPO
4
, a fim de remover as sondas que
não hibridizaram completamente. Em seguida, a membrana foi imersa por 1 hora em
uma solução contendo 1% de ácido maleico (C
4
H
4
O
4
), 3 M de NaCl, 0,2 M de NaOH,
0,3% de Tween 20, 0,5% de caseína, pH 8,0, e, logo após, por 30 minutos, na
17
mesma solução contendo o anticorpo anti-digoxigenina conjugado à fosfatase
alcalina em uma concentração de 1:10.000. A membrana foi depois lavada 2 vezes,
por 20 minutos, em uma solução de 0,1 M de ácido maleico, 3 M de NaCl, 0,2 M de
NaOH, 0,3% de Tween 20, pH 8,0, e 1 vez, por 5 minutos, em uma solução de 0,1 M
de Tris HCl, 0,1M de NaCl, 50 mM de MgCl
2
, pH 9,5.
Os próximos passos foram a incubação da membrana por 45 minutos a
37
o
C em uma solução detectora à base de fosfatase alcalina, CDP-Star
TM
Detection
Reagent (Amersham Biosciences UK Limited, Buckinghamshire, England, UK). A
seguir, a membrana foi colocada em um cassete, Chassi Radiográfic 30x40cm
(Konex, Ind. Bras., SP, Brasil), sob um filme radiográfico de marca Kodak X-Omat K,
18x24cm (Kodak Brasileira Com. e Ind. Ltda, São José dos Campos, SP, BR) por 40
minutos. O filme foi posteriormente revelado (Figuras 3 e 4) manualmente pelo
método convencional temperatura-tempo, de acordo com orientações do fabricante.
As soluções utilizadas foram da marca Kodak, sempre mantidas à temperatura de
20ºC.
Figura 3. Representação gráfica do padrão de hibridização entre as bactérias
presentes nas amostras de biofilme e as sondas de DNA (técnica Checkerboard
DNA-DNA Hybridization).
18
Figura 4. Representação esquemática do padrão de hibridização entre as bactérias
presentes nas amostras de biofilme e as sondas de DNA (técnica Checkerboard
DNA-DNA Hybridization). Nesta figura estão apresentadas 40 bactérias, e as
amostras de biofilme são de todos os dentes de um mesmo indivíduo.
A leitura dos filmes radiográficos foi realizada por um único examinador
treinado, da seguinte forma: cada sinal produzido por uma determinada sonda na
amostra de placa foi comparado em intensidade ao sinal produzido pela mesma
sonda nos dois controles contendo 10
5
e 10
6
bactérias. Desta forma, o número 0 foi
registrado quando não houve detecção do sinal; 1 equivaleu a um sinal menos
intenso que o controle de 10
5
células; 2 equivaleu a aproximadamente 10
5
células; 3,
entre 10
5
e 10
6
células; 4 aproximadamente 10
6
células e 5, mais de 10
6
células
(Tabela 2). Estes registros foram então utilizados para determinar os níveis das
diferentes espécies investigadas nos sítios e indivíduos do estudo.
19
Tabela 2. Índice utilizado para a determinação dos níveis dos microrganismos nas
amostras de biofilme subgengival.
ÍNDICE NÍVEL DO MICRORGANISMO CONTAGEM
0 Não detectado 0
1 Menos de 10
5
células 10.000
2 Aproximadamente 10
5
células 100.000
3 Entre 10
5
e 10
6
células 500.000
4 Aproximadamente 10
6
células 1.000.000
5 Mais de 10
6
células 10.000.000
3.5. Análise estatística
3.5.1. Análise clínica
A média das medidas clínicas de Profundidade à Sondagem e Nível
Clínico de Inserção, assim com a média da porcentagem de sítios apresentando
placa visível, sangramento gengival, sangramento à sondagem e supuração foram
computadas para cada indivíduo e, posteriormente, dentro de cada grupo. As
diferenças entre os grupos foram avaliadas utilizando o Teste Kruskal-Wallis e o
Teste U de Mann–Whitney. O teste Qui-quadrado foi utilizado para a variável gênero
e para analisar as diferentes categorias de profundidade à sondagem nos grupos. A
significância estatística foi estabelecida em 5% (p<0,05).
3.5.2. Análise microbiológica
Os dados microbiológicos foram expressos em nível médio de cada
espécie (contagem) em cada sítio. Estes níveis foram computados por indivíduo e
depois dentro de cada grupo experimental. Diferenças nos níveis médios, nas
proporções de microrganismos e na média de freqüência de sítios colonizados
dentro de cada grupo foram avaliadas por meio de Análise de Covariância. A
significância estatística foi estabelecida em 5%. Todas as análises foram realizadas
20
utilizando ajustes para comparações múltiplas, como proposto por Socransky et al.
(1991). Foi aplicada a fórmula 0,05 = 1 – (1-k)
38
, onde k é o valor equivalente ao
p<0,05 quando ajustado para a comparação de 38 bactérias. Desta forma, as
diferenças detectadas no presente estudo foram consideradas significativas quando
p<0,002.
21
4. RESULTADOS
4.1. Resultados clínicos
A Tabela 3 apresenta os dados epidemiológicos e os valores médios dos
parâmetros clínicos dos indivíduos dos três grupos experimentais. Os grupos PC e S
foram homogêneos em relação à idade, entretanto o grupo PA apresentou média
estatisticamente inferior aos demais grupos experimentais. Não foram observadas
diferenças estatísticas entre os grupos experimentais em relação à distribuição do
gênero (Teste Qui-quadrado). Foram observadas diferenças significativas entre os
grupos para todas as variáveis clínicas. Em relação aos parâmetros clínicos, os
grupos PA e PC foram homogêneos e apresentaram as maiores médias de PS, NCI,
percentual de sítios com SS e SUP em comparação aos indivíduos periodontalmente
saudáveis. O grupo PC demonstrou o maior percentual de sítios com placa
bacteriana visível, enquanto os grupos PA e S foram semelhantes. O percentual de
sítios com sangramento gengival foi menor nos indivíduos do grupo S, seguido dos
grupos PA e PC, respectivamente.
Tabela 3. Média (+ dp) dos parâmetros clínicos nos grupos Periodontite Crônica
(PC), Periodontite Agressiva (PA) e Saudável (S).
Grupos
Variáveis
PC PA S
n (indivíduos) 30 12 30
Idade (anos)* 42,03 + 6,2
A
26,00 + 3,0
B
41,10 + 8,5
A
Gênero (m:f)
†
8:22 3:9 6:24
Profundidade à Sondagem (mm)* 3,85
+ 0,7
A
4,72 + 0,7
A
2,16 + 0,2
B
Nível Clínico de Inserção (mm)* 4,33 + 1,0
A
4,65 + 1,1
A
2,20 + 0,2
B
% sítios com
Placa Visível* 84,73 + 10,7
A
53,30 + 14,8
B
43,74 + 17,8
A
Sangramento Gengival* 40,72 + 22,4
A
14,20 + 11,0
B
6,52 + 5,5
C
Sangramento à Sondagem* 63,63 + 20,2
A
69,90 + 16,2
A
27,73 + 20,5
B
Supuração* 3,09 + 3,7
A
4,21 + 3,19
A
0,0
B
m=masculino; f=feminino;
†
p>0,05 - Teste Qui-quadrado; * p<0,05 – Teste Kruskal-Wallis.
Diferentes letras nas colunas indicam diferenças estatisticamente significantes entre os grupos (Teste
U de Mann-Whitney).
22
Uma descrição mais detalhada dos parâmetros clínicos PS e NCI dos
indivíduos portadores de doença periodontal crônica ou doença periodontal
agressiva generalizada está apresentada na Tabela 4. Foram avaliados clinicamente
3984 e 1937 sítios nos grupos PC e PA, respectivamente. De acordo com a
Profundidade à Sondagem, os sítios foram categorizados em sítios rasos (PS <
3mm), sítios intermediários (PS 4-6mm) e sítios profundos (PS > 7mm). Em relação
ao Nível Clínico de Inserção, este parâmetro foi categorizado em perdas leves (NCI
< 3mm), perdas moderadas (NCI 4-6mm) e perdas avançadas (NCI > 7mm).
A distribuição das freqüências médias de sítios de acordo com as
diferentes categorias de Profundidade à Sondagem e Nível Clínico de Inserção, nos
grupos PC e PA, revelou que as diferenças mais marcantes entre os grupos estão
nos percentuais de sítios com PS e NCI > 7mm. Apenas 7,4% dos sítios dos
indivíduos do grupo PC apresentaram PS > 7mm e 13,7% dos sítios apresentaram
perdas avançadas de inserção. No grupo PA estes percentuais foram superiores,
sendo 19,8% e 20,5%, respectivamente.
Tabela 4. Freqüências médias de sítios de acordo com diferentes categorias de
Profundidade à Sondagem e Nível Clínico de Inserção, nos grupos Periodontite
Crônica (PC) e Periodontite Agressiva (PA).
Grupos
Variáveis
PC
(n = 30)
PA
(n = 12)
Número de sítios 3984 1937
% sítios (n) com
Profundidade à Sondagem (PS)
p*
PS
< 3mm 55,8 (2218) 40,7 (788) 0,03
PS 4-6mm 36,8 (1469) 39,5 (765) NS
PS > 7mm 7,4 (297) 19,8 (384) 0,01
Nível Clínico de Inserção (NCI)
NCI < 3mm 46,9 (1869) 40,0 (783) NS
NCI 4-6mm 39,4 (1567) 39,5 (765) NS
NCI > 7mm 13,7 (548) 20,5 (389) 0,01
*Teste Qui-quadrado; NS=Diferença não significante.
23
4.2. Resultados microbiológicos
4.2.1. Médias de contagem (x10
5
), das proporções de sondas de DNA
e do percentual de sítios com contagens iguais ou superiores a 10
6
espécies
bacterianas
A Figura 5 apresenta a média de contagem (x10
5
), a média da proporção
das sondas de DNA e a média do percentual de sítios com contagens iguais ou
superiores a 10
6
espécies bacterianas nas amostras de biofilme subgengival de 30
indivíduos periodontalmente saudáveis e 30 indivíduos com periodontite crônica. Os
indivíduos com periodontite crônica demonstraram contagens significativamente
superiores para todas as espécies analisadas em comparação aos indivíduos
saudáveis, após o ajuste para comparações múltiplas. As espécies encontradas em
maiores proporções nos indivíduos com periodontite crônica foram C. rectus, E.
nodatum, P. micros, P. nigrescens, T. forsythia, P. gingivalis, T. denticola,
Leptotrichia buccalis e S. noxia, enquanto A. naeslundii 1 e S. oralis estavam em
altas proporções nos indivíduos periodontalmente saudáveis. Vinte e nove espécies
apresentaram proporções mais elevadas de sítios colonizados com > 10
6
no grupo
PC em comparação ao grupo S, sendo que dentre tais espécies estão incluídas as
três do complexo vermelho (T. forsythia, P. gingivalis e T. denticola), 11 espécies do
complexo laranja, e outras espécies consideradas possíveis patógenos tais como S.
noxia e T. socranskii.
A média de contagem (x10
5
), a média da proporção das sondas de DNA
e a média do percentual de sítios com contagens iguais ou superiores a 10
6
frente às
38 espécies bacterianas analisadas em amostras de biofilme subgengival de 30
indivíduos periodontalmente saudáveis e 12 indivíduos com periodontite agressiva
generalizada estão apresentadas na Figura 6. Os níveis de contagem das 19
espécies foram significativamente diferentes entre os grupos PA e S. Destas, 18
espécies estavam em níveis superiores no grupo PA incluindo dez espécies do
complexo laranja e as três espécies do complexo vermelho, enquanto A. naeslundii
genospecies 1 estava em níveis superiores no grupo S (p<0,001). Considerando as
proporções destas espécies, Actinomyces gerencseriae, Actinomyces israelii, A.
naeslundii 1, S. sanguinis e C. ochracea demonstraram proporções
significativamente superiores nos indivíduos periodontalmente saudáveis (p<0,001).
Já as espécies A. actinomycetemcomitans, C. rectus, E. nodatum, P. nigrescens, T.
24
forsythia, P. gingivalis, T. denticola foram encontradas em proporções
significativamente superiores no grupo PA. As principais diferenças significativas no
percentual de sítios colonizados com níveis > 10
6
bactérias foram observadas nas
espécies dos complexos laranja e vermelho. Além disso, vale destacar que A.
actinomycetemcomitans foi encontrado em contagens, proporções e percentual de
sítios colonizados superiores no grupo PA quando comparado ao grupo de
indivíduos periodontalmente saudáveis (p<0,001).
A Figura 7 apresenta a média de contagem (x10
5
), a média da proporção
das sondas de DNA, e a média do percentual de sítios com contagens iguais ou
superiores a 10
6
para as 38 espécies analisadas em amostras de biofilme
subgengival de 30 indivíduos com periodontite crônica e 12 indivíduos com
periodontite agressiva generalizada. A. gerencseriae, A. israelii, A. naeslundii 1, S.
sanguinis, C. ochracea e P. intermedia foram encontradas em níveis
significativamente superiores nos indivíduos com periodontite crônica, enquanto P.
gingivalis e V. parvula em indivíduos com periodontite agressiva (p<0,001). O grupo
PA apresentou proporções significativamente superiores de Fusubacterium.
nucleatum ssp. polymorphum, enquanto A. naeslundii 1 foi encontrado em altas
proporções no grupo PC. Os indivíduos com periodontite crônica demonstraram um
percentual de sítios colonizados por A. gerencseriae, A. israelii, A. naeslundii 1 e C.
ochracea significativamente superior em comparação aos indivíduos com
periodontite agressiva.
4.2.2. Proporções dos complexos microbianos
As proporções dos complexos microbianos estão apresentadas na Figura
8. A área dos gráficos foi ajustada para refletir a diferença da contagem total de
bactérias nas amostras de biofilme subgengival entre os grupos experimentais. As
espécies bacterianas identificadas por meio das sondas de DNA foram agrupadas de
acordo com os complexos microbianos descritos por Socransky et al. (1998). As
proporções das espécies pertencentes a cada complexo foram somadas e a
proporção total de cada complexo foi determinada. A contagem total das 38
espécies bacterianas sugengivais foi de 37,1 x 10
6
para o grupo PC, 21,7 x 10
6
para
o grupo PA e 2,7 x 10
6
para o grupo S, sendo que estes resultados foram
estatisticamente diferentes entre os grupos (p<0,01). Os complexos laranja e
vermelho representaram as maiores proporções no grupo PC (30,6% e 24,9%,
25
respectivamente) e no grupo PA (32,3% e 31,1%, respectivamente), porém sem
diferenças estatisticamente significantes entre os grupos. Por outro lado, os
indivíduos periodontalmente saudáveis apresentaram apenas 4,3% de complexo
vermelho. O grupo PA apresentou uma média de proporção significativamente
inferior de Actinomyces ssp. (5,2%) em comparação aos grupos PC (17,7%) e S
(32,9%), que se apresentaram estatisticamente semelhantes (p>0,05).
4.2.3. Sítios categorizados de acordo com a profundidade à
sondagem inicial
Com a finalidade de fazer uma avaliação mais detalhada do perfil
microbiológico dos diferentes grupos experimentais, os sítios dos grupos PA e PC
foram subdivididos em 3 categorias de profundidade à sondagem: rasas (< 3mm),
intermediárias (4-6mm) e profundas (> 7mm). A análise estatística foi repetida, ou
seja, os dados foram computados para cada indivíduo e, posteriormente, dentro de
cada grupo. Como os indivíduos pertencentes ao grupo S possuem apenas sítios
rasos, os resultados foram repetidos em todas as categorias de profundidade à
sondagem a fim de tornar possível a comparação entre os três grupos.
A Figura 9 apresenta a média da proporção das sondas de DNA nas
26
sondagem, está apresentada na Figura 10. P. gingivalis, T. denticola e P. intermedia
foram encontrados em proporções elevadas em todas as categorias de profundidade
à sondagem do grupo PA, enquanto A. naeslundii 1 foi encontrado em proporções
superiores nos indivíduos periodontalmente saudáveis quando comparados com os
indivíduos com periodontite agressiva, nos sítios rasos, intermediários e profundos.
Outra importante diferença significante foi observada no grupo PA, incluindo altas
proporções de V. parvula e F. nucleatum ss polymorphum em sítios rasos; A.
actinomycetemcomitans, P. nigrescens e T. forsythia em sítios intermediários e A.
actinomycetemcomitans, E. nodatum, F. nucleatum ssp. polymorphum e T. forsythia
em sítios profundos.
A Figura 11 apresenta a média da proporção das sondas de DNA nas
amostras de biofilme subgengival de 30 indivíduos com periodontite crônica 12
indivíduos com periodontite agressiva, nas diferentes categorias de profundidade à
sondagem. O grupo PC mostrou altas proporções de A. gerencseriae, A. naeslundii
1 e C. sputigena em sítios intermediários, e A. gerencseriae e A. naeslundii 1 em
sítios profundos. Por outro lado, o grupo PA apresentou altas proporções de V.
parvula e F. nucleatum ss polymorphum em sítios rasos; A. actinomycetemcomitans,
F. nucleatum ss polymorphum e P. gingivalis em intermediários; e F. nucleatum ssp.
polymorphum e P. gingivalis em sítios profundos.
27
Figura 5. Perfil microbiano das médias de contagem (x10
5
), da proporção das sondas de DNA e do percentual de sítios colonizados das 38 espécies
bacterianas presentes nas amostras de biofilme subgengival de 30 indivíduos com periodontite crônica e 30 indivíduos periodontalmente saudáveis. Análise
de covariância ajustada para idade: *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. Os resultados foram ajustados para comparações múltiplas.
28
Figura 6. Perfil microbiano das médias de contagem (x10
5
), da proporção das sondas de DNA e do percentual de sítios colonizados das 38 espécies
bacterianas presentes nas amostras de biofilme subgengival de 12 indivíduos com periodontite agressiva generalizada e 30 indivíduos periodontalmente
saudáveis. Análise de covariância ajustada para idade: *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. Os resultados foram ajustados para comparações múltiplas.
29
Figura 7. Perfil microbiano das médias de contagem (x10
5
), da proporção das sondas de DNA e do percentual de sítios colonizados das 38 espécies
bacterianas presentes nas amostras de biofilme subgengival de 30 indivíduos com periodontite crônica e 12 indivíduos com periodontite agressiva
generalizada. Análise de covariância ajustada para idade: *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. Os resultados foram ajustados para comparações múltiplas.
30
Figura 8. Média das proporções dos complexos microbianos descritos por Socransky et al. (1998), presentes nas amostras de biofilme subgengival dos 3
grupos experimentais. As áreas dos gráficos foram ajustadas para refletir a contagem total das espécies bacterianas em cada grupo. Análise de Covariância
ajustada para idade (*p<0,01). Letras distintas nos complexos significam diferenças significativas entre os grupos.
31
Figura 9. Perfil microbiano das médias de proporção de sondas de DNA das 38 espécies bacterianas analisadas nas amostras de biofilme subgengival de 30
indivíduos com periodontite crônica (sítios separados por categoria de profundidade à sondagem-PS, sendo rasos:
<3mm, intermediários: 4-6mm, profundos:
>7mm) e 30 indivíduos periodontalmente saudáveis (PS <3mm). Análise de covariância ajustada para idade: *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. Os resultados
foram ajustados para comparações múltiplas.
32
Figura 10. Perfil microbiano das médias de proporção de sondas de DNA das 38 espécies bacterianas analisadas nas amostras de biofilme subgengival de
12 indivíduos com periodontite agressiva generalizada (sítios separados por categoria de profundidade à sondagem-PS, sendo rasos:
<3mm, intermediários:
4-6mm, profundos:
>7mm) e 30 indivíduos periodontalmente saudáveis (PS <3mm). Análise de covariância ajustada para idade: *p<0,05, **p<0,01 e
***p<0,001. Os resultados foram ajustados para comparações múltiplas.
33
Figura 11. Perfil microbiano das médias de proporção de sondas de DNA das 38 espécies analisadas presentes nas amostras de biofilme subgengival de 30
indivíduos com periodontite crônica e 12 indivíduos com periodontite agressiva generalizada, sendo os sítios separados por categoria de Profundidade à
Sondagem-PS: rasos (
<3mm), intermediários (4-6mm), profundos (>7mm). Análise de covariância ajustada para idade: *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. Os
resultados foram ajustados para comparações múltiplas.
34
5. DISCUSSÃO
O objetivo deste estudo foi avaliar a composição microbiana de indivíduos
com periodontite crônica (PC) e com periodontite agressiva generalizada (PA),
comparando-os com indivíduos periodontalmente saudáveis (S). A idade média
significativamente mais alta foi observada no grupo de indivíduos com PC em
comparação aos do grupo PA. Visto que esta variável pode estar relacionada à
progressão da doença (Salonen et al., 1991), foram realizados ajustes para este
fator de confundimento na coleta dos dados microbiológicos.
Nossos resultados indicam que há diferenças quantitativas e qualitativas
nos padrões de colonização das 38 espécies avaliadas entre os três grupos clínicos
(Figs. 5-8). Foram observadas proporções médias significativamente mais altas de
A. naeslundii 1 e de S. oralis no grupo S em comparação com os indivíduos do grupo
PC; enquanto A. gerencseriae, A. israelii, A. naeslundii1, S. sanguinis e C.
ochraceae foram encontradas em proporções mais elevadas em indivíduos
saudáveis (S) comparados aos do grupo PA (Figs. 5 e 6). Esses achados
corroboram estudos anteriores em que essas espécies estavam associadas à saúde
periodontal (Colombo et al., 2002; Haffajee & Socransky, 2005; Haffajee et al., 2006;
Lopez et al., 2004; Socransky & Haffajee, 2005; Ximenez-Fyvie et al., 2006a).
Os indivíduos do grupo PC apresentaram contagens bacterianas mais
altas, seguidos pelos do grupo PA e pelos indivíduos saudáveis (Fig. 8). Em
comparação com indivíduos saudáveis, as contagens médias para 38 e 18 espécies
apresentaram-se significativamente mais altas em amostras de placa subgengival de
indivíduos dos grupos PC e PA, respectivamente (Figs. 5 e 6). Esses resultados e o
número maior de sítios com acúmulo de placa supragengival observado em
indivíduos com periodontite crônica (84,73%) comparado a indivíduos com
periodontite agressiva generalizada (53,3%) sustentam a hipótese de que essa
quantidade de depósitos microbianos na periodontite agressiva é inconsistente com
a severidade da doença (AAP, 2000; Lang et al., 1999).
T. forsythia, P. gengivalis e T. denticola estavam em níveis, proporções e
prevalência mais elevados em indivíduos do grupo PC do que nos do grupo S.
Dados similares foram reJ-ram reJ.c opez
35
respectivamente. O fato interessante é que essas duas populações, de brasileiros
(Colombo et al., 2002 e o presente estudo) e de chilenos (Lopez et al., 2004),
apresentaram proporções e níveis mais elevados destes patógenos em comparação
com indivíduos norte-americanos (Haffajee et al., 2004), mexicanos (Ximenez-Fyvie
et al., 2006a,b) e suecos (Haffajee et al., 2004). Essas divergências podem ser
devidas a diferenças na microbiota específica de cada uma das populações destas
regiões geográficas, ou podem estar relacionadas ao nível de infecção dos
indivíduos incluídos nos vários estudos.
Outras espécies bacterianas também encontradas em grandes
quantidades, proporções e prevalências na PC em comparação com indivíduos
saudáveis são C. rectus, E. nodatum, P. micros, P. nigrescens, L. buccalis e S. noxia
(Fig. 5). A maioria dessas espécies pode ser considerada como possíveis patógenos
periodontais e têm sido previamente associadas com a etiologia da doença
periodontal (Choi et al., 2000, Darout et al., 2003; Gajardo et al., 2005; Haffajee et
al., 2004; Lopez et al., 2004; Sanz et al., 2000, van Winkelhoff et al., 2005). Muitos
autores (Dibart et al., 1998; Socransky & Haffajee, 2005; Socransky et al., 1998;
Tanner et al., 1998) têm feito referências sobre a participação da S. noxia na
etiologia da periodontite crônica. C. rectus e P. micros foram encontradas em altas
proporções em suecos (Haffajee et al., 2004) e a P. nigrescens, em chilenos (Lopez
et al., 2004), com periodontite crônica. Além disso, recentemente, a E. nodatum foi
associada com periodontite crônica em norte-americanos com baixos níveis e
proporções de P. gengivalis e T. forsythia (Hafajee et al., 2006) Também é
importante enfatizar que as proporções de todas as espécies consideradas
benéficas nos complexos roxo, amarelo e verde e as espécies de Actinomyces
encontraram-se reduzidas no grupo PC em comparação ao grupo S. Esse perfil de
colonização foi descrito também para outras populações (Colombo et al., 2002;
Haffajee et al., 2006; Lopez et al., 2004; Socransky et al., 1998; Ximenez-Fyvie et al.,
200a, b).
As espécies encontradas em altos níveis, proporções e prevalência em
indivíduos com periodontite agressiva generalizada comparados a indivíduos
saudáveis foram A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola,
E. nodatum e P. nigrescens. V. parvula e F. nucleatum ssp. polymorphum também
foram predominantes nas amostras de placa subgengival em indivíduos com doença
agressiva (PA) (Figs. 6 e 10 ). Outro achado interessante foi a baixa detecção de
36
três espécies de Actinomyces (A. gerencseriae, A israelii e A. naeslundii 1), em
indivíduos do grupo PA comparados com os indivíduos dos grupos S e PC (Figs. 6-
8, 10 e 11).
A. actinomycetemcomitans tem sido apontado como um importante
agente etiológico da periodontite agressiva localizada em brasileiros (Cortelli et al.,
2005; Tinoco et al., 1997) e em outras populações (Lee et al., 2003; Tan et al., 2001;
Zambon et al., 1983). No presente estudo, esse microrganismo apresentou-se em
taxas elevadas em indivíduos do grupo PA, quando comparados a indivíduos
saudáveis (S), no entanto, os valores dessa espécie foram bastante baixos para a
doença agressiva generalizada. A. actinomycetemcomitans foi uma das espécies
encontradas em níveis baixos (2,4x10
5
), tendo colonizado apenas 5,2% dos sítios e
representando somente 4,7% das espécies avaliadas em indivíduos com doença
agressiva. Bragd et al. (1987) e Rams et al. (1997) sugeriram que a A.
actinomycetemcomitans apresenta uma alta patogenicidade e, portanto, mesmo
níveis baixos dessa espécie poderiam ser danosos ao periodonto. Nossos resultados
são consistentes com os de outros estudos que reportaram baixas contagens,
prevalência e proporções dessa espécie em indivíduos com periodontite agressiva
(Gajardo et al., 2005; Kamma et al., 2004; Lopez et al., 2000; Rams et al, 1997;
Takeuchi et al., 2003; Timmerman et al., 2001; Trevilatto et al., 2002).
Uma limitação deste estudo é a impossibilidade de discriminar sorotipos
diferentes. O reconhecimento de que variedades de A. actinomycetemcomitans com
alta leucotoxicidade podem estar associadas a formas agressivas da doença
(Colombo et al., 2002; Haubek et al., 2002; Holt et al., 1991) sugerem que uma
sonda para distinguir tipos clonais virulentos de não-virulentos seria útil no
esclarecimento do papel dessas espécies nas diferentes manifestações da doença
periodontal.
A colonização intensa de espécies do complexo vermelho e algumas do
complexo laranja em indivíduos com PA foi, de certa maneira, inesperada. No
entanto, outros pesquisadores têm sugerido que estes patógenos podem ter
influência na etiologia da periodontite agressiva (Kamma et al., 1999; Kamma et al.,
2004; Kamma et al., 1995; Lee et al., 2003; Loesche et al., 1985; Mullally et al.,
2000; Muller & Flores-de-Jacoby, 1985, Takeuchi et al., 2003; Ximenez-Fyvie et al.,
2006a). P. gingivalis, por exemplo, foi encontrada em níveis significativamente altos
em indivíduos do grupo PA, mesmo na comparação com o grupo PC (Fig. 7),
37
especialmente nas categorias de Profundidade à Sondagem intermediárias e
profundas (Fig. 11). Hamlet et al. (2001) sugere que a A. actinomycetemcomitans é
capaz de dar início à doença, o aprofundamento das bolsas e a maior anaerobiose
favoreceriam o crescimento de outras espécies, como P. gingivalis.
Mombelli et al. (2002) revisaram sistematicamente 33 estudos
transversais e longitudinais que forneciam dados microbiológicos tanto de indivíduos
portadores de periodontite agressiva como de periodontite crônica. Os autores
concluíram que a presença ou ausência de A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis,
P. intermedia, T. forsythia e C. retus não poderiam distinguir indivíduos com
periodontite crônica ou agressiva. Nosso estudo também detectou as 38 espécies
avaliadas em todos os grupos clínicos.
Até onde sabemos, este estudo é o primeiro em que a composição da
microbiota gengival de brasileiros com periodontite agressiva generalizada foi mais
profundamente examinada. De fato, apenas recentemente, a técnica Checkerboard
DNA-DNA Hybridization foi usada para analisar o perfil da periodntite agressiva
numa população de mexicanos (Ximenez-Fyvie et al., 2006b). Os autores
compararam a microbiota de 19 pacientes com periodontite agressiva e 39
indivíduos com periodontite crônica e observaram que nem os níveis e proporções
nem a prevalência das 40 espécies bacterianas diferiram entre os grupos clínicos
estudados. No entanto, nosso estudo detectou algumas diferenças em espécies
bacterianas específicas entre os indivíduos dos grupos PA e PC. P. gingivalis e V.
parvula estavam presentes em níveis mais elevados, e F. nucleatum ssp.
polymorphum foi encontrada em proporções mais altas em todas as categorias de
Profundidade à Sondagem no grupo PA em comparação ao grupo PC.
Foram observados também baixos níveis, proporções e prevalência de
espécies de Actinomyces nos indivíduos com periodontite agressiva comparados
aos do grupo PC. Outro achado interessante refere-se ao padrão de colonização
observado na categoria de Profundidade à Sondagem profunda entre as duas
formas da doença (Figs. 9-11). Indivíduos do grupo PC mostraram uma alteração
evidente na microbiota nas profundidades rasas às profundas. Houve um aumento
na proporção das três espécies do complexo vermelho e de várias outras espécies
do complexo laranja, acompanhado por uma diminuição na proporção de algumas
espécies de Actinomyces e de outras espécies benéficas. Essa mudança foi bem
menos marcante nos indivíduos do grupo PA, em que as únicas alterações
38
observadas com o aprofundamento das bolsas foram a redução nas proporções de
V. parvula e um aumento de A. actinomycetemcomitans e das três espécies do
complexo vermelho. Esses dados sugerem que a infecção no grupo PA parece ser
distribuída mais homogeneamente entre os diferentes sítios subgengivais do que
nos indivíduos do grupo PC. Os resultados ligeiramente diversos deste estudo e os
do estudo de Ximenez-Fyvie et al. (2006a) podem ser explicados pelas diferenças na
composição da microbiota da população dos dois países, ou mesmo pelas diferentes
características clínicas dos indivíduos avaliados. A Profundidade à Sondagem e o
Nível Clínico de Inserção médios foram mais baixos na população mexicana (3,9 mm
e 3,9 mm, respectivamente) comparados aos brasileiros (4,72 mm e 4,65 mm,
respectivamente). Estudos incluindo mais indivíduos poderiam ajudar a esclarecer
essas questões.
39
6. CONCLUSÃO
* A microbiota subgengival de indivíduos brasileiros com periodontite
crônica é semelhante a dos indivíduos com periodontite agressiva generalizada,
porém difere marcadamente da observada em indivíduos periodontalmente
saudáveis.
* Discretas diferenças no perfil geral de colonização foram observadas em
relação às duas formas da doença.
.
40
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50
ANEXOS
- Anexo A: Exame periodontal
- Anexo B: Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos
51
ANEXO A
52
ANEXO B
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