( PDF ) Esteato-Hepatite não alcoólica

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IDILIO ZAMIN JÚNIOR

ESTEATO-HEPATITE NÃO ALCOÓLICA −

−−

−

MODELO EXPERIMENTAL

Porto Alegre, 2006

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IDILIO ZAMIN JÚNIOR

ESTEATO-HEPATITE NÃO ALCOÓLICA −

−−

−

MODELO EXPERIMENTAL

Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação

em Medicina: Hepatologia da Fundação

Faculdade Federal de Ciências Médicas de

Porto Alegre para obtenção do título de

Doutor em Medicina.

Orientador: Prof. Dr. Ângelo Alves de Mattos

Porto Alegre, 2006

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iii

Ficha Catalográfica

Ruth B. F. Oliveira

Bibliotecária CRB10/501

Z23e

min Júnior, Idílio

Esteato – hepatite não alcoólica – modelo experimental / Idílio

Zamin Júnior; orient. Ângelo Alves de Mattos. Porto Alegre :

FFFCMPA, 2006.

100f.; il.; tab.

Tese (Doutorado) - Fundação Faculdade Federal de Ciências

Médicas de Porto Alegre. Faculdade de Medicina. Programa de

Pós-Graduação em Medicina. Área de concentração: Hepatologia.

1. Esteato -

hepatite não alcoólica. 2. Modelo experimental.

3. Vitamina E. 4. Metformina. I. Mattos, Ângelo Alves de. II.

Titulo.

CDD 6l6.36 23

CDU 6l6.36

–

002

Para minha esposa, Laura, que durante a

realização deste trabalho, com seu companheirismo,

soube abdicar de muitos momentos de lazer. Seu

carinho, sua sensibilidade e seu apoio foram

fundamentais para esta conquista.

Para minha filha, Mariana, sua presença e alegria

são estímulo constante para o meu crescimento

profissional.

Agradecimentos

•

Ao meu orientador, amigo e exemplo profissional, Prof. Dr. Ângelo Alves de Mattos,

para quem agradecer simplesmente é pouco diante de tudo o que representou na execução

deste trabalho. Durante estes 13 anos de convívio científico, que se transformaram em

grande amizade, o Dr. Ângelo muito acrescentou à minha formação, tanto pessoal como

profissional e intelectual. Médico e pesquisador brilhante, com prestígio internacional,

ocupa sem dúvida o lugar de destaque que merece. A quem sempre soube incentivar o meu

desenvolvimento científico, a minha admiração e gratidão.

•

Aos acadêmicos da Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre

(FFFCMPA), hoje residentes, Ângelo Z. Mattos, Diogo Santos, Ernesto Soares e Eduardo

Migon que me auxiliaram em todo o período do estudo experimental, incansáveis e sempre

dispostos a despender seu precioso tempo de trabalho.

•

Ao Prof. Dr. Marcos Luiz Santos Perry, do Departamento de Bioquímica da Universidade

Federal do Rio Grande do Sul, sempre muito atencioso e disponível para qualquer

explicação. A sua experiência e o seu conhecimento em modelos experimentais foram

extremamente importantes para o desenvolvimento da dieta.

•

À Gabriela Coral, Gastroenterologista e Hepatologista da FFFCMPA e da Irmandade

Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre (ISCMPA), pelo auxílio prestado na área da

Patologia

•

À Dra. Cláudia Ramos Rhoden, do departamento de farmacologia da FFFCMPA, a sua

colaboração foi fundamental para a realização do estudo do estresse oxidativo.

•

A todos os professores da Enfermaria de Gastroenterologia e Hepatologia da FFFCMPA e

ISCMPA, que muito contribuíram para minha formação, tanto pessoal como intelectual.

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

.................................................................................................... viii

LISTA DE TABELAS

.............................................................................................................................................................. x

LISTA DE FIGURAS

............................................................................................................................................................... xi

RESUMO

............................................................................................................................................................................................ xii

ABSTRACT

...................................................................................................................................................................................... xiv

1 INTRODUÇÃO

........................................................................................................................................................................ 2

1. 1 Epidemiologia

..................................................................................................................................................................... 3

1. 2 História Natural

............................................................................................................................................................... 4

1. 3 Patogênese da EHNA

................................................................................................................................................... 6

1.3.1 Primeira Etapa: Esteatose

......................................................................................................................................... 7

1.3.2 Segunda Etapa: Esteato-Hepatite Não Alcoólica

..................................................................................... 12

1.4 Tratamento

........................................................................................................................................................................... 18

2 OBJETIVOS

............................................................................................................................................................................. 25

3 MATERIAL E MÉTODOS

.......................................................................................................................................... 27

3. 1 Animais

.................................................................................................................................................................................... 27

3. 2 Dieta

............................................................................................................................................................................................ 27

3. 3 Drogas

....................................................................................................................................................................................... 28

3. 4 Procedimento Experimental

.................................................................................................................................. 28

3. 5 Coleta dos Materiais e Morte dos Animais

............................................................................................... 29

3. 6 Análise Bioquímica

........................................................................................................................................................ 29

3. 7 Análise da Lipoperoxidação

................................................................................................................................... 30

3. 8 Análise Histológica

......................................................................................................................................................... 31

3. 9 Comitê de Ética

................................................................................................................................................................. 33

3.10 Análise Estatística

........................................................................................................................................................... 33

vii

4 RESULTADOS

......................................................................................................................................................................... 35

4. 1 Peso dos Animais

............................................................................................................................................................. 35

4. 2 Aminotransferases

.......................................................................................................................................................... 37

4. 3 Perfil Lipídico

..................................................................................................................................................................... 38

4. 4 Análise da Lipoperoxidação

................................................................................................................................... 39

4. 5 Aspecto Macroscópico dos Fígados

.................................................................................................................. 40

4. 6 Histologia

................................................................................................................................................................................ 42

5 DISCUSSÃO

............................................................................................................................................................................... 49

5. 1 O Modelo Experimental Desenvolvido

......................................................................................................... 49

5. 2 Drogas

....................................................................................................................................................................................... 54

5.2.1 Metformina

............................................................................................................................................................................ 54

5.2.2 Vitamina E

............................................................................................................................................................................. 58

5.2.3 Sinvastatina

........................................................................................................................................................................... 63

6 CONCLUSÕES

........................................................................................................................................................................ 67

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

................................................................................................................. 69

viii

Lista de Abreviaturas e Símbolos

alfa

% percentual

ALT alanina-aminotransferase

AST aspartato-aminotransferase

ATP trifosfato de adenosina

C282Y substituição da cisteína por tirosina

CHC carcinoma hepatocelular

cm Centímetros

CYP2E1 citocromo P450 2E1

DHGNA doença hepática gordurosa não alcoólica

DM diabetes melito

DMC dieta deficiente em metionina e colina

EHNA esteato-hepatite não alcoólica

FA fosfatase alcalina

FFFCMPA Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre

FNT fator de necrose tumoral

g grama

GGT gama-glutamiltransferase

h hora

H63D substituição da histidina por ácido aspártico

HDL colesterol de alta densidade

HFE gene da hemocromatose

HMG-CoA 3-hidroxi-3metilglutaril-coenzima A redutase

HOMA Homeostasis Model Assessment Method

IMC índice de massa corporal

IU unidade internacional

IU/d unidade internacional por dia

IU/kg unidade internacional por quilograma

kg quilograma

LDL colesterol de baixa densidade

LPO lipoperoxidação

MF metformina

mg/d miligrama por dia

mg/dL miligrama por decilitro

mg/kg miligrama por quilograma

ml mililitro

mmHg milímetro de Mercúrio

mmol/L milimol por litro

n número

NASH Nonalcoholic Steatohepatitis

nm nanômetros

nmol nanomol

º C grau centígrado

R ração

RI resistência à insulina

rpm rotações por minuto

SF soro fisiológico

Sinv sinvastina

SM síndrome metabólica

TBARS teste de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

TGF β1 transforming growth factor β1

U/mL unidade por mililitro

Vit E vitamina E

VLDL lipoproteínas de densidade muito baixa

beta

µg/min

micrograma por minuto

Lista de Tabelas

Tabela 1 Peso dos ratos (gramas) antes e após o tratamento

...................................................................... 35

Tabela 2 Comparação dos níveis séricos de colesterol total, LDL, HDL e

triacilgliceróis

......................................................................................................................................................... 39

Tabela 3 Distribuição de freqüência dos escores de atividade inflamatória

entre os grupos

....................................................................................................................................................... 45

Tabela 4 Distribuição de freqüência dos escores de fibrose entre os

grupos

........................................................................................................................................................................... 46

Lista de Figuras

Figura 1 Animal que recebeu a dieta DMC e metformina após 90 dias de

tratamento

................................................................................................................................................................. 36

Figura 2 Animal que recebeu ração normal para ratos durante 90 dias

............................................. 36

Figura 3 Comparação dos níveis de AST (U/L) entre os grupos

............................................................ 37

Figura 4 Comparação dos níveis de ALT (U/L) entre os grupos

........................................................... 38

Figura 5 Comparação dos escores de lipoperoxidação (nmol de malondialdeído/mg

de proteína) entre os grupos

......................................................................................................................... 39

Figura 6 Aspecto macroscópico de um fígado do grupo que recebeu ração

.................................. 40

Figura 7 Aspecto macroscópico de um fígado, após ser removido, do grupo que

recebeu ração

.......................................................................................................................................................... 40

Figura 8 Aspecto macroscópico de um fígado do grupo que recebeu a dieta DMC

................ 41

Figura 9 Aspecto macroscópico de um fígado, após ser removido, do grupo que

recebeu a dieta DMC

........................................................................................................................................ 41

Figura 10 Fotomicrografia demonstrando esteatose macrovesicular acentuada e

atividade necroinflamatória (H&E, 200X)

........................................................................................ 42

Figura 11 Fotomicrografia demonstrando esteatose macrovesicular acentuada e

infiltrado inflamatório celular (H&E, 400X)

................................................................................... 43

Figura 12 Comparação dos escores de esteatose macrovesicular entre os grupos

........................ 44

Figura 13 Comparação dos escores de atividade inflamatória entre os grupos

............................... 45

Figura 14 Fotomicrografia demonstrando a presença de cirrose (picro-sirius, 400X)

............... 46

Figura 15 Comparação dos escores de fibrose entre os grupos

.................................................................. 47

xii

RESUMO

Este estudo tem como objetivo desenvolver um modelo experimental de esteato-

hepatite não alcoólica (EHNA) induzida por dieta deficiente em metionina e colina (DMC),

bem como avaliar o papel do hipoglicemiante metformina, do antioxidante vitamina E e do

hipolipemiante sinvastatina na doença hepática gordurosa não alcoólica.

Foram estudados prospectivamente 50 ratos da linhagem Wistar, por um período de 90

dias, sendo os mesmos divididos em 5 grupos de 10 ratos. Um grupo recebeu ração e os

demais a dieta DMC. Dentre os 4 grupos que receberam a dieta, para um foi administrado

soro fisiológico (SF) e para os demais o metformina, a vitamina E e a sinvastatina. Após o

período de estudo os animais foram mortos, sendo colhido sangue para análise bioquímica e

removido o fígado para análise da lipoperoxidação e histológica. Na análise estatística foi

utilizado um nível de significância de α = 0,05.

A utilização da dieta DMC foi capaz de induzir o desenvolvimento de esteatose em

100% dos animais enquanto que a EHNA foi diagnosticada em 26 (66,6%) dos 39 ratos

submetidos à dieta.

Entre os grupos que receberam a dieta DMC, os animais que utilizaram a vitamina E

apresentaram os menores níveis de aminotransferases, mas não houve diferença estatisticamente

significante em relação ao grupo do SF e do metformina. Os níveis da alanina-aminotransferase

(ALT) foram significativamente maiores no grupo da sinvastatina. Os níveis de aspartato-

aminotransferase (AST) também foram maiores no grupo da sinvastatina, mas apenas foram

estatisticamente significantes em relação ao grupo da ração. Não ocorreu diferença no perfil

lipídico entre os grupos. Quando se compararam os valores de lipoperoxidação, os grupos da

ração e da vitamina E apresentaram índices significativamente menores que os demais. A

presença de EHNA foi significativamente maior naqueles que receberam sinvastatina e foi

semelhante entre os demais grupos que receberam a dieta DMC. Todos os ratos que

receberam a dieta DMC apresentaram esteatose macrovesicular. A atividade inflamatória e o

escore de fibrose foram significativamente maiores naqueles que receberam sinvastatina.

xiii

Quando a comparação foi feita apenas em relação a presença ou ausência de fibrose, a mesma

foi significativamente menor no grupo que recebeu a vitamina E.

Com os resultados obtidos, foi possível estabelecer as seguintes conclusões:

•

A dieta DMC desenvolvida foi eficaz em induzir esteatose e EHNA, podendo ser

utilizada para estudos experimentais em modelo animal.

•

O grupo que utilizou a vitamina E apresentou os menores níveis de aminotransferases

ao final do tratamento entre os grupos submetidos à dieta DMC, porém estes achados não

foram estatisticamente significativos. No entanto, a utilização da sinvastatina foi associada

com níveis de ALT significativamente maiores que os demais.

•

Quando utilizado o teste de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico no tecido

hepático, a vitamina E demonstrou reduzir o estresse oxidativo hepático.

•

A vitamina E foi eficaz em reduzir o desenvolvimento de fibrose na EHNA, e a

sinvastatina agravou tanto a atividade inflamatória como o estadiamento da EHNA.

xiv

ABSTRACT

The present study aims at developing an experimental model of nonalcoholic steatohepatitis

(NASH) induced by a methionine and choline deficient diet (DMC), as well as analysing the

role of the insulin sensitizing agent metformina, the antioxidant vitamin E and the

antihyperlipidemic agent sinvastatin in the nonalcoholic fatty liver disease.

Fifty Wistar rats were prospectively studied, along a 90 days period, divided in 5 groups, 10

rats in each group. One of the groups was fed with standard diet to rats while the others were

given the DMC diet. Physiologic solution was given to one of the four groups on the diet

DMC, and metformina, vitamin E and sinvastatina to the other groups. The animals were

death after the experiment, blood samples were biochemically analysed and their livers were

checked for stress oxidative and histological analysis. For statistical analysis a α = 0,05 was

considered significant.

The DMC diet was able to induce the development of steatosis in 100% of the animals while

NASH was diagnosed in 26 (66.6%) out of the 39 rats on the DMC diet.

The lowest rates of aminotransferases found among the groups on the DMC diet were shown

by the animals given the vitamin E, however, there was no relevant statistical difference when

compared with the physiologic solution and the metformina groups. Considerably higher

levels of alanine aminotransferase (ALT) were found in the sinvastatin group. The rates of

aspartate aminotransferase (AST) were also higher in the sinvastatin group, while just

statistically relevant concerning the group of standard diet. There was no difference among

the lipid concentrations feature of the groups. Concerning stress oxidative the groups given

standard diet and vitamin E showed considerably lower rates than the others. The NASH rates

were quite higher in those under sinvastatin and were similar to the ones given the DMC diet.

All the rats fed with the DMC diet showed macrovesicular steatosis. Inflammatory activity

and score of fibrosis were quite higher among the ones in the sinvastatin group. When

checked for presence or absence of fibrosis, lower rates were shown by the vitamin E group.

The results obtained led to the following conclusions:

•

The DMC diet was effective to induce steatosis and NASH, and may be used in

experiments on animals.

•

In the end of the treatment, lower rates of aminotransferases were shown by the vitamin E

group compared with the other groups on the DMC diet, although such results were not

statistically significant. However, the use of sinvastatin was related to rates of ALT

considerably higher than others.

•

Vitamin E proved to reduce stress oxidative hepatic when the test for thiobarbituric acid

reactive substances was used on hepatic tissue.

•

Vitamin E was effective to reduce the development of fibrosis in NASH, while sinvastatin

increased both the inflammatory activity and the staging the NASH.

1 INTRODUÇÃO

1 Introdução

1 INTRODUÇÃO

O objetivo deste trabalho é contribuir para o avanço do conhecimento das doenças

associadas com o acúmulo de gordura no fígado. Para tal fim, foi realizada pesquisa

experimental com ratos, desenhada de forma a desenvolver esteatose e EHNA. O experimento

testou alternativas terapêuticas, com a finalidade de comparar os resultados por elas

proporcionados.

A associação de esteatose, infiltrado inflamatório hepático e cirrose com obesidade e

diabetes melito (DM) aparece descrita desde longa data

1apud

, tendo sido bem caracterizada por

Schaffner e Adler

, em 1979. Esses autores, ao estudarem indivíduos obesos sem história de

consumo abusivo de álcool, observaram achados histológicos hepáticos semelhantes àqueles

encontrados nos pacientes etilistas ou que realizaram cirurgia de derivação intestinal. A

continuidade desses estudos por Ludwig e colaboradores

, em 1980, levou à utilização do

termo esteato-hepatite não alcóolica. Tais autores chamaram a atenção para a associação da

doença com obesidade, sexo feminino e DM, bem como para seu potencial evolutivo.

Posteriormente, outros estudiosos

demonstraram que a EHNA também pode ocorrer em

indivíduos do sexo masculino e não obesos.

Atualmente, no ocidente, a EHNA tem sido considerada a segunda

ou a terceira

doença hepática mais comum em pacientes ambulatoriais, sendo que muitos casos de cirrose

criptogênica podem ser devidos à evolução da EHNA

6, 7

O reconhecimento do seu potencial evolutivo

2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15

e a sua alta

prevalência são os principais motivos que despertam o interesse da comunidade científica em

relação ao seu estudo.

Mais recentemente

5, 11

, vem sendo proposto o termo doença hepática gordurosa não

alcoólica (DHGNA) com a finalidade de englobar o espectro de doenças associadas com acúmulo

de gordura no fígado, desde a esteatose, a EHNA até a cirrose e carcinoma hepatocelular

(CHC).

1 Introdução

1.1 Epidemiologia

A prevalência exata da EHNA permanece desconhecida, principalmente devido ao seu

curso silencioso e assintomático na maior parte dos pacientes. A maioria dos estudos realizados

sobre a EHNA

2, 3, 4, 9, 16

é retrospectiva e avalia pacientes referendados por apresentarem alterações

de provas de função hepática ou pacientes que haviam recebido diagnóstico prévio de hepatite

alcoólica através dos achados histológicos, sendo, posteriormente, excluído o uso de álcool.

Wanless e Lentz realizaram estudo a partir de necropsias e encontraram esteatose em

70% dos obesos e 35% dos indivíduos sem obesidade, tendo diagnosticado EHNA em 18,5%

dos obesos e em 2,7% nos demais indivíduos

A DHGNA tem distribuição mundial, embora exista importante variação geográfica,

pois ocorre maior prevalência justamente em países onde a obesidade é mais comum. A

EHNA é encontrada em 7-11% dos pacientes que realizam biópsia hepática nos Estados

Unidos e Canadá

3, 17

, porém, no Japão, ocorre em apenas 1,2% das biópsias

Nos Estados Unidos, estima-se que a DHGNA seja a principal causa de elevação

persistente de aminotransferases. Recentes dados do National Health and Nutritional

Examination Survey mostram que sua prevalência atinge 23% em americanos adultos, o que

significa que a doença ocorre em torno de 30 milhões de pessoas neste país

. Além disso,

como a prevalência de obesidade nos Estados Unidos continua aumentando, estima-se que a

prevalência da DHGNA e, conseqüentemente, a da EHNA também aumentem.

Dixon e colaboradores

realizaram biópsia hepática em pacientes com obesidade

mórbida que foram submetidos à cirurgia bariátrica e observaram uma prevalência de

DHGNA de 95% e de EHNA de 25%.

Um estudo prospectivo que avaliou 81 pacientes referendados com aminotransferases

elevadas e marcadores virais e auto-imunes negativos observou EHNA em 26 casos (32%),

sendo que 2 pacientes já apresentavam cirrose na avaliação inicial

Em nosso meio, ao serem avaliados, prospectivamente, 912 indivíduos obesos, sem

DM associado, em um ambulatório de nutrição, foi possível determinar, pela primeira vez em

estudo populacional e não de uma série de casos, uma prevalência de esteato-hepatite não

alcoólica da ordem de 3,18%

. Essa prevalência, no entanto, é subestimada, uma vez que só

foram avaliados os pacientes com alterações de aminotransferases.

1 Introdução

1.2 História Natural

A despeito de apresentar alta prevalência na população, a história natural de EHNA

ainda é pouco estudada. Atualmente, acredita-se que a EHNA pode evoluir para cirrose e

CHC, enquanto que a esteatose isolada não costuma apresentar esta evolução; porém existem

poucos estudos prospectivos na literatura com biópsias seqüenciais em pacientes com EHNA.

Os resultados de três estudos que se propuseram a realizar nova biópsia hepática em

26 pacientes com EHNA, após um período médio de seguimento de 9 anos, mostraram que,

em 50% destes pacientes, a doença permaneceu estável, mas, em 46%, ocorreu progressão em

relação ao escore de inflamação e/ou fibrose, sendo que, em 19%, houve evolução para

cirrose

4, 14, 21

Por outro lado, Teli e colaboradores

repetiram a biópsia em 12 pacientes, após um

seguimento de 7,6 a 16 anos, e observaram que apenas um paciente apresentou evolução do

quadro com desenvolvimento de fibrose leve, após 9 anos da primeira biópsia. Nos demais

pacientes, os achados permaneceram inalterados ou ocorreu melhora.

Harrison e colaboradores

avaliaram 22 pacientes com diagnóstico prévio de EHNA e

realizaram nova biópsia hepática em um período médio de 5,7 anos. Em relação à atividade

inflamatória, foi observada redução em 50% dos pacientes, enquanto que, em 18%, ocorreu

evolução. O escore de fibrose permaneceu inalterado em 50% dos pacientes e reduziu em

outros 18%. Em 32% dos pacientes, entretanto, ocorreu evolução da fibrose. Tanto nos

pacientes em que a doença melhorou, como naqueles em que ocorreu progressão, os autores

não encontraram relação com o índice de massa corporal (IMC), idade, presença de diabetes e

com o índice AST/ALT, que são fatores descritos como de maior risco para a evolução.

Recentemente, Adams e colaboradores

, em estudo retrospectivo, avaliaram 103

pacientes que realizaram uma nova biópsia hepática, após um diagnóstico inicial de DHGNA

e não foram submetidos a um tratamento específico. Após um intervalo médio de 3,2 anos, os

autores observaram que o estágio de fibrose progrediu em 37%, permaneceu estável em 34%

e regrediu em 29% dos pacientes. Através de análise multivariada, os autores associaram

presença de DM, estágio baixo de fibrose na biópsia inicial e alto IMC com uma maior

progressão da fibrose.

Matteoni e colaboradores

, em um estudo retrospectivo, observaram que a mortalidade

associada à doença hepática dos pacientes com EHNA foi significativamente maior do que a

população geral nos Estados Unidos. Este estudo, em um seguimento médio de 8,3 anos,

1 Introdução

observou que a ocorrência de cirrose, a taxa de mortalidade geral e a mortalidade associada à

doença hepática foram de 15%, 36% e 7% respectivamente. Os autores também destacaram

que o risco de mortalidade associa-se com o grau de inflamação e fibrose observados na

biópsia inicial. Por outro lado, pacientes nos quais foi diagnosticada apenas esteatose tendem

a não apresentar progressão da doença.

Um dos maiores estudos populacionais a respeito da história natural da DHGNA foi

realizado por Adams e colaboradores

, em que os autores identificaram 420 pacientes que

receberam este diagnóstico entre os anos de 1980 a 2000, em uma cidade dos Estados Unidos.

Após um seguimento médio de 23,5 anos, observaram que a ocorrência de cirrose, a taxa de

mortalidade geral e a mortalidade associada à doença hepática foram de 5%, 12,6% e 1,7%

respectivamente. Esta sobrevida foi estatisticamente inferior a da população geral da mesma

cidade pareados para sexo e idade.

Em relação à evolução para cirrose é interessante salientar o trabalho de Caldwell e

colaboradores

que revisou 102 casos de pacientes com diagnóstico de cirrose criptogênica.

Os autores observaram franco predomínio de mulheres obesas, com diabetes melito e idade

mais avançada, semelhante ao perfil observado em pacientes com EHNA, concluindo que

muitos casos de cirrose dita “criptogênica” podem ser, na realidade, secundários à EHNA.

Bugianesi e colaboradores

, em um estudo de caso-controle, avaliando 23 pacientes

com cirrose criptogênica e CHC, observaram uma maior prevalência de obesidade, de DM, de

dislipidemia, de resistência à insulina e de níveis baixos de aminotransferases. Quando

realizada uma análise multivariada, foram identificados como fatores de risco para a neoplasia

a presença de DM, dislipidemia e um menor nível de aminotransferases. Avaliando-se este

estudo, conclui-se que os fatores implicados na EHNA são mais freqüentes nos pacientes com

neoplasia e cirrose idiopática, podendo a neoplasia ser uma complicação tardia da cirrose

relacionada à EHNA.

A identificação dos pacientes que apresentarão curso desfavorável com evolução da

doença hepática constitui outro desafio em relação à EHNA e também vem sendo estudada.

Alguns autores observaram que a idade avançada, DM, obesidade, níveis elevados de ácidos

graxos livres e grau de atividade inflamatória na biópsia hepática são fatores associados com a

presença e evolução da fibrose

10, 11, 26, 27

. A presença de um índice AST/ALT superior a 1 também

foi associada com um maior grau de fibrose em pacientes com EHNA

10, 28

1 Introdução

Outros autores

sugerem que a presença de mutação no gene para hemocromatose

(HFE) resulta em maiores níveis séricos de transferrina, maior concentração de ferro hepático

e lesão hepática mais importante, principalmente com maior expansão fibrosa. Acreditam que

uma leve sobrecarga de ferro, como ocorre no paciente heterozigoto para hemocromatose,

pode atuar sinergicamente na promoção de fibrose na EHNA. Esses trabalhos, no entanto,

receberam contestações

30, 31

A porcentagem de pacientes que desenvolveu cirrose clinicamente descompensada e

necessitou transplante hepático não é conhecida, tendo em vista o desaparecimento da

esteatose com a evolução da doença, pois, no momento do transplante, não está mais presente

o quadro histológico característico da EHNA

. Isto pode ocorrer devido a alterações no fluxo

sanguíneo e permeabilidade capilar que ocorrem com a evolução da fibrose e dificultam a

deposição de gordura no fígado

. Entretanto, muitos pacientes com cirrose criptogênica que

realizam transplante apresentam os fatores epidemiológicos associados à EHNA, incluindo,

principalmente, a obesidade e o DM

A ocorrência de esteatose e EHNA tem sido observada nos enxertos pós-transplante

hepático de pacientes que apresentavam cirrose criptogênica

. Charlton e colaboradores

acompanharam 16 pacientes com cirrose por provável evolução da EHNA que realizaram

transplante hepático. Os autores observaram recorrência da EHNA em 33% dos pacientes,

sendo que, em 12,5%, a doença progrediu para cirrose em 1 ano após o transplante. Os autores

sugerem que a EHNA, além de evoluir para cirrose, também pode apresentar recidiva após o

transplante.

Tendo em vista a prevalência desta entidade, bem como a sua história natural, é

fundamental que haja uma melhor compreensão dos seus mecanismos patogênicos, para que

possamos propor alternativas terapêuticas com mais segurança.

1.3 Patogênese da EHNA

A patogênese da EHNA ainda não está bem esclarecida e também não são conhecidos

os fatores envolvidos com a sua progressão para cirrose. Vários estudos recentes sugerem que

a patogênese é multifatorial e citam, entre os fatores potencialmente envolvidos, a resistência

periférica à insulina, os distúrbios do metabolismo dos lipídios, a produção hepática de

1 Introdução

radicais livres de oxigênio, a produção anormal de citoquinas, todos levando à injúria celular

e fibrose.

A teoria mais aceita em relação à patogênese foi proposta por Day e James em

editorial publicado em 1998

. Segundo esta hipótese, a doença ocorre em duas etapas:

a)a) a primeira etapa consiste no acumulo de ácidos graxos e triacilgliceróis no fígado,

levando à esteatose;

b)b) uma vez a esteatose presente, em alguns pacientes, ocorre a segunda etapa, que

consiste na formação de inflamação crônica, injúria e necrose celular.

1.3.1 Primeira Etapa: Esteatose

A esteatose, condição necessária para a ocorrência posterior de EHNA, acontece

quando há um distúrbio no metabolismo hepático dos lipídios e está associada com múltiplas

condições clínicas, como obesidade, diabetes melito, alcoolismo, desnutrição protéico calórica,

uso crônico de corticoesteróides

37, 38, 39, 40

O fígado exerce um papel central no metabolismo dos lipídios. São consideradas como

suas principais funções:

a) facilitar a digestão e absorção através da produção de bile;

b) realizar a síntese e oxidação de ácidos graxos e a síntese de triacilgliceróis e

fosfolipídeos;

c) converter os ácidos graxos em corpos cetônicos;

d) realizar a síntese e o metabolismo de lipoproteínas

40, 41, 42

Quando há um desequilíbrio entre a velocidade de formação e de liberação hepática

dos triacilgliceróis em favor da lipogênese, ocorre a esteatose

. Isto pode acontecer quando,

pelo menos, um dos quatro processos básicos no ciclo de lipídios entre tecido adiposo e o

fígado está alterado

4, 15, 40

, ou seja, quando ocorrer:

a) aumento na quantidade de ácidos graxos liberados para o fígado;

b) aumento na síntese de ácidos graxos no fígado;

c) redução na betaoxidação de ácidos graxos no fígado;

d) redução na síntese ou secreção de lipoproteínas de densidade muito baixa (VLDL).

1 Introdução

Atualmente, acredita-se que a resistência à insulina (RI) é um dos principais fatores

que promovem a esteatose

44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51

, e sua presença também tem sido identificada

na maioria dos pacientes com EHNA

44, 45, 48

. A RI é um achado comum em pacientes obesos e

diabéticos, e os indivíduos com esteatose e EHNA têm, significativamente, maior RI quando

comparados aos controles

O termo resistência à insulina indica a presença de uma menor resposta biológica à

secreção de insulina endógena ou à sua administração de forma exógena. A RI é manifestada

por uma redução do transporte e metabolismo da glicose no tecido adiposo e no músculo

esquelético, mediada pela insulina. A sensibilidade à insulina decorre de uma série de fatores,

incluindo raça, idade, altura, obesidade (principalmente abdominal), atividade física,

medicamentos, entre outros

48, 52

. Também há uma forte influência genética para a ocorrência

de RI e, desta forma, para o DM

O mecanismo patogênico da RI consiste numa alteração da capacidade da célula do

tecido adiposo em responder a variações dos níveis séricos de glicose, o que acaba ocasionando

um aumento da insulina circulante. A insulina, em níveis elevados, produz alterações tanto no

tecido adiposo, como no fígado. No adipócito, a insulina produz lipólise com liberação de

ácidos graxos para o fígado. Já no hepatócito, mais particularmente na mitocôndria, a insulina

estimula a síntese e inibe a oxidação de ácidos graxos, o que acaba gerando acúmulo hepático

dos mesmos

53, 54

. Outro estudo

também demonstrou que a hiperinsulinemia pode aumentar a

degradação da apolipoproteína B100, que é um dos principais componentes da VLDL,

dificultando, desta forma, a mobilização de lipídios do fígado para a periferia.

A importância da insulina agindo diretamente no fígado foi comprovada por Wanless e

colaboradores

, ao observarem a ocorrência de esteatose e EHNA subcapsular, em pacientes

diabéticos e com insuficiência renal crônica, que realizavam diálise peritoneal e recebiam

infusão de insulina junto com a solução de diálise. A insulina, entrando em contato com o

fígado durante a diálise, promoveu a ocorrência de esteatose e EHNA. A este respeito, Sohn e

colaboradores

observaram a ocorrência de esteatose adjacente a metástases hepáticas de

insulinoma, identificando, desta forma, o papel direto da insulina na patogênese da esteatose.

Alguns autores consideram também que a hiperinsulinemia pode exercer um efeito

indutor do citocromo P450 2E1 (CYP2E1), contribuindo, desse modo, para a formação de

substâncias pró-oxidantes que favorecem a evolução da esteatose para a EHNA, como será

discutido adiante

1 Introdução

Existem vários métodos de avaliar a sensibilidade à insulina. O padrão áureo foi descrito

por DeFronzo e colaboradores

em 1979 e consiste no clamp euglicêmico-hiperinsulinêmico.

O teste é realizado colocando-se um cateter venoso em um braço para a infusão de solução de

glicose/insulina. Um segundo cateter é inserido em uma veia do braço oposto, permanecendo

com infusão de solução salina, para a coleta de amostras de sangue a intervalos estabelecidos

para a determinação de glicose e insulina plasmática, que são inseridos e analisadas em uma

curva, segundo o protocolo do teste. Um outro teste mais simples de sensibilidade à insulina e

que apresenta ótima correlação com o clamp euglicêmico-hiperinsulinêmico é o HOMA

(Homeostasis Model Assessment Method). Neste teste, é realizada apenas uma determinação

de insulina e de glicemia de jejum. O cálculo é realizado com a seguinte fórmula: insulina

(U/ml) x glicose (mmol/L)/22,5. O resultado do teste HOMA maior do que 3,5 indica resistência

à insulina. Vários estudos em relação à sensibilidade à insulina na EHNA utilizaram o

HOMA

44, 48, 49

Alguns trabalhos têm sido realizados para identificar o papel que a RI e a hiperinsulinemia

exercem na patogenia da EHNA

44, 50, 57

. Em 1999, Marchesini e colaboradores

estudaram 46

pacientes que apresentavam esteatose à ecografia e aminotransferases elevadas, sem diabetes

melito e compararam com grupo controle. Os autores observaram que a RI e a hiperinsulinemia

foram associadas com a presença de esteatose, independentemente do IMC.

Sanyal e colaboradores

compararam pacientes com EHNA com outros que

apresentavam apenas esteatose e com um grupo de controle, normal em relação à resistência à

insulina. Os autores concluíram que a resistência periférica à insulina, via de regra, está

sempre presente nos pacientes com esteatose e nos pacientes com EHNA, enquanto que os

últimos também apresentam anormalidades estruturais mitocondriais e maior estresse oxidativo.

Os autores formularam a hipótese de que as alterações observadas nas mitocôndrias são

responsáveis pela progressão da esteatose para a EHNA, porém ressalvaram que tais achados

podem ser conseqüências e, não, causa da EHNA.

Muitos pacientes apresentam, simultaneamente, obesidade, dislipidemia, diabetes melito e

hipertensão, condição denominada síndrome metabólica (SM)

. Atualmente, vários estudos

têm demonstrado forte associação entre os componentes da SM e a EHNA. Porém, desde a

descrição original, as condições que compreendem a SM bem como os valores limites das

mesmas vêm sendo tema de diversos debates.

1 Introdução

A Organização Mundial de Saúde

definiu a SM como a presença de resistência à

insulina (diabetes melito tipo 2, intolerância a glicose ou glicemia de jejum elevada), mais 2

dos seguintes itens:

a)a) hipertensão arterial sistêmica (pressão sistólica ≥ 140 mmHg e diastólica ≥ 90 mmHg)

ou uso de tratamento anti-hipertensivo;

b)b) níveis séricos de triacilgliceróis acima de 150 mg/dl e/ou níveis baixos de colesterol

HDL (< 36 em homens e < 40 em mulheres);

c)c) índice da massa corporal > 30 kg/m² e/ou obesidade abdominal (índice cintura-

quadril > 0,9 em homens e > 0,85 em mulheres);

d)d) presença de microalbuminúria (albumina urinária ≥ 20 ug/min).

Porém há divergências em relação aos critérios diagnósticos da SM. Uma outra definição

também muito utilizada não leva em consideração a microalbuminúria, e a resistência à

insulina não necessita estar sempre presente

Com o objetivo de determinar a presença da SM em pacientes com EHNA assim como

o papel da SM na sua progressão, Marchesini e colaboradores

estudaram 304 pacientes

consecutivos, com alteração persistente de aminotransferases e esteatose à ecografia, sem

diagnóstico de diabetes melito ou história de alcoolismo e com marcadores virais e auto-

imunes negativos. Dos 163 pacientes que realizaram biópsia hepática, foi diagnosticada

EHNA em 120 (73,6%), sendo que 88% dos mesmos preencheram os critérios para diagnóstico

da SM, o que foi estatisticamente significativo em relação aos pacientes com esteatose à

biópsia, em que foi diagnosticada SM em apenas 53%. Os autores observaram também que a

SM foi associada com a presença e graduação da fibrose e concluíram que os pacientes com

EHNA e SM são aqueles que apresentam maior probabilidade de evoluir para cirrose.

Chitturi e colaboradores

estudaram 66 pacientes com EHNA em relação à resistência

à insulina e compararam com grupo controle de pacientes com hepatite crônica C, pareados

para sexo, idade e grau de fibrose hepática. Os autores observaram que a resistência à insulina

é condição essencial para a ocorrência da EHNA, independente do grau de obesidade, sendo

que a maioria destes pacientes preencheu os critérios mínimos para o diagnóstico da SM. A

presença de RI e de SM foram significativamente superiores nos pacientes com EHNA, quando

comparados aos pacientes com hepatite C. Os autores chamaram atenção também para a

presença de obesidade central na maioria desses pacientes com EHNA e consideraram que a

deposição de gordura esplâncnica favorece a formação de esteatose. Outros estudos também

reconhecem a obesidade central como fator de risco para EHNA

45, 61

1 Introdução

A RI e a SM parecem ser os principais fatores associados com a EHNA, mesmo em

pacientes não obesos e sem diabetes melito. A este respeito, Pagano e colaboradores

estudaram 19 pacientes com diagnóstico de EHNA, sem cirrose, não obesos e sem diabetes

melito e compararam com grupo controle normal, pareados para sexo e idade. Os autores

observaram haver RI e hiperinsulinemia na maioria dos pacientes com EHNA. Em relação à

SM, 9 pacientes preencheram os critérios para o diagnóstico e outros 7 apresentavam 1

componente da síndrome. O fato de apenas terem sido estudados pacientes sem doença

avançada sugere que o desequilíbrio do metabolismo da insulina é causa e não conseqüência

da doença hepática. Nesses pacientes ocorre um aumento da secreção pancreática de insulina.

Já tardiamente, com a progressão da doença hepática, pode ocorrer redução da degradação

hepática de insulina, agravando a hiperinsulinemia e conseqüente resistência periférica. Nesse

estudo, os autores observaram correlação entre a circunferência abdominal e o índice de

resistência à insulina e os níveis de aminotransferases em pacientes com EHNA

Apesar da resistência à insulina, atualmente, ser considerada condição essencial para a

ocorrência da EHNA, o seu papel na patogênese da inflamação e da fibrose ainda não está

claro e necessita ser melhor investigado.

Outro hormônio que, atualmente, está associado com a patogênese da esteatose e

também da EHNA é a leptina. Esse hormônio é responsável pela homeostasia de energia no

organismo. Sendo produzido, principalmente, pelos adipócitos, exerce um efeito regulador

importante do metabolismo dos ácidos graxos, orientando a direção da rota metabólica dos

mesmos para a oxidação mitocondrial ou para a síntese de triacilgliceróis

. Em nível central,

a leptina promove um sinal de saciedade, e a sua ausência está associada com hiperfagia e

obesidade

A deficiência de leptina, como acontece em ratos geneticamente obesos (ob/ob), está

associada ao fenótipo obeso e também à redução da oxidação de ácidos graxos no fígado e

conseqüente acúmulo de gordura (esteatose). Por outro lado, a administração exógena de

leptina reverte tanto a obesidade como a esteatose nestes animais

Em humanos, porém, paradoxalmente, a obesidade está associada a níveis elevados de

leptina

, provavelmente devido a uma resposta inadequada dos seus receptores periféricos,

caracterizando a presença de resistência. Acredita-se que este hormônio, em níveis elevados,

promove resistência periférica à insulina, agindo principalmente no adipócito. Já no fígado, a

leptina induz aumento da produção de ácidos graxos

. A este respeito, Uygun e colaboradores

observaram níveis elevados de leptina na maioria dos pacientes com EHNA.

1 Introdução

Uma observação interessante em ratos com deficiência de leptina é a de que, apesar da

ocorrência de obesidade e esteatose, não há formação de fibrose, sugerindo que a mesma participe

do processo de fibrogênese

. Em seres humanos, estudos epidemiológicos demonstraram que

a obesidade é um fator de risco independente para o desenvolvimento de fibrose em pacientes

com doença hepática crônica, como a hepatite C ou a doença hepática alcoólica

. A leptina

pode ser o elo de ligação entre a obesidade e o diabetes melito com a fibrose hepática, tendo

em vista que a mesma demonstrou ser um importante indutor das células estrelares e das células

endoteliais dos sinusóides, quando se apresenta em níveis elevados e há um estímulo

inflamatório crônico hepático

Em modelos animais de cirrose, também foi demonstrado um importante papel da

leptina na formação de fibrose. A este respeito, Ikejima e colaboradores

realizaram estudo

com ratos Zucker (fa/fa), os quais são resistentes à ação biológica da leptina, devido à mutação

em seu receptor. Quando expostos à intoxicação por thioacetamide, ocorreu uma redução

significativa da resposta fibrogênica em relação aos ratos normais. Também foi observada a

ocorrência de maior resposta inflamatória e maior fibrose em ratos expostos ao tetracloreto de

carbono, quando receberam injeção de leptina

Desta forma, a leptina pode estar envolvida tanto na patogênese da esteatose, promovendo

a deposição de gordura hepática, quanto na patogênese da EHNA, ao induzir a inflamação e

fibrose.

Por outro lado, recentemente, Serin

e colaboradores, estudando 2 grupos de pacientes

com esteatose à ecografia, um com aminotransferases normais e outro elevadas, observaram

que aqueles pacientes com enzimas normais apresentavam significativamente maiores níveis

séricos de leptina, sugerindo um efeito “protetor”da mesma na DHGNA.

Certamente, maiores estudos necessitam serem realizados para um melhor entendimento

do papel da leptina na DHGNA.

1.3.2 Segunda Etapa: Esteato-Hepatite Não Alcoólica

Uma vez que a esteatose esteja presente, em alguns pacientes, ocorre o desenvolvimento

de inflamação hepatocitária, necrose e fibrose. Os fatores que desencadeiam estas alterações

ainda estão sendo investigados.

1 Introdução

Estudos em relação à patogênese da EHNA

12, 23, 36, 48, 51, 52

acreditam que a mesma seja

multifatorial e sugerem que uma série de eventos deva ocorrer no hepatócito de um paciente

com esteatose para que aconteça a progressão para EHNA. Como várias condições clínicas

estão associadas com a EHNA (obesidade, diabetes melito, dislipidemia, desnutrição protéico-

calórica, etc.), provavelmente a mesma seja o evento final de uma série de diferentes estímulos, os

quais podem agir de forma isolada ou combinada.

Lipoperoxidação

O estresse oxidativo, resultando em lipoperoxidação, está sendo considerado como um

dos principais fatores associados com a progressão da esteatose para EHNA

70, 71

. Há

evidências sugerindo que os triacilgliceróis hepáticos fornecem um aumento de substrato para

oxidação, via mitocôndria e microssomos, com conseqüente geração de intermediários

potencialmente reativos e citotóxicos, que podem induzir uma resposta inflamatória hepática

39, 42

A partir de estudo, em modelo animal, Pessayre e colaboradores

sugerem que a peroxidação

dos lipídios exerce um papel central na fisiopatologia da esteato-hepatite, de forma independente

da etiologia da esteatose. Isso pode explicar por que estímulos diferentes podem causar um

dano hepático semelhante. Desse modo, a peroxidação crônica de lipídios pode explicar

diversas lesões encontradas na EHNA, pois pode causar necrose celular. Por outro lado, os

produtos da peroxidação estimulam a produção de colágeno pelas células estrelares

. Achados

semelhantes já haviam sido observados por Lombardi

, ao demonstrarem que a presença de

ácidos graxos livres acarreta resposta inflamatória hepática e produção de tecido fibroso. Um

aumento de fibroblastos hepáticos foi demonstrado em animais com esteato-hepatite induzida

por drogas

. Além disso, os produtos da lipoperoxidação podem ligar-se a proteínas do

hepatócito formando antígenos capazes de desencadear uma resposta imunológica, desta

forma aumentando o processo inflamatório e a indução de fibrose

A esteato-hepatite é menos freqüente em obesos e em pacientes com diabetes melito

do que em etilistas. Isto pode ser explicado porque, em casos de alcoolismo, além do substrato

para a peroxidação de lipídios (esteatose), também há formação de substâncias oxidantes em

níveis elevados

, fato também observado com o uso de certas drogas

O CYP2E1 é a maior fonte microssomal de radicais livres de oxigênio e tem aparecido

como um dos principais fatores associados com a patogênese da EHNA. Weltman e

colaboradores

demonstraram que pacientes com EHNA, à semelhança de pacientes com doença

hepática alcoólica, apresentam CYP2E1 induzido. Os autores concluem que o mecanismo

1 Introdução

patogênico da EHNA é similar ao descrito nos etilistas, em que a indução do citocromo

CYP2E1 exerce um importante papel na patogênese da doença hepática. Dessa forma, os

pacientes com esteatose que apresentem uma expressão maior do CYP2E1 podem evoluir

para EHNA. Afirmam também que os ácidos graxos e os corpos cetônicos exercem indução

do citocromo nos obesos à semelhança do que ocorre com o uso de álcool. A este respeito,

Nanji e colaboradores

, em modelo animal, observaram que os ácidos graxos e corpos

cetônicos são indutores endógenos do CYP2E1. Uma situação extrema dessa indução seria a

que ocorre durante uma rápida perda de peso, como a produzida após uma cirurgia de

derivação intestinal. Nesse caso, há níveis muito elevados de ácidos graxos e de corpos

cetônicos no fígado

. Yoo e colaboradores

, em modelo animal, verificaram que o CYP2E1

é ativado por corpos cetônicos e dietas com alta concentração de lipídios e pobres em

carboidratos, explicando por que a EHNA ocorre com maior freqüência em pacientes com

obesidade e DM ou nos casos de desnutrição protéico-calórica.

Weltman e colaboradores

realizaram um estudo com modelo animal de EHNA, induzida

por dieta deficiente em metionina e colina. Os autores observaram haver importante indução

mitocondrial do CYP2E1, a qual, semelhante à EHNA em humanos, foi mais proeminente na

zona 3.

Emery e colaboradores

estudaram a atividade do CYP2E1 em 16 pacientes com

obesidade mórbida e esteatose ou EHNA, que realizaram cirurgia redutora gástrica. Os autores

utilizaram, como grupo controle, indivíduos sem obesidade. Foi verificada uma associação

positiva entre a atividade do CYP2E1 pré-operatória e o grau de obesidade, bem como com a

presença de esteatose, sendo que os pacientes com EHNA apresentaram maior atividade do

CYP2E1. Em 1 ano após a realização da gastroplastia, todos os pacientes obtiveram redução

significativa do peso, a qual foi acompanhada por redução da atividade do CYP2E1. Não foi

realizada, entretanto, nova biópsia hepática. Neste estudo os autores sugerem que a obesidade

promova indução do CYP2E1, levando à lesão hepática, enquanto que a redução de peso

exerce efeito contrário

Leclercq e colaboradores

, em modelo animal de EHNA, observaram que outra região

do citocromo P450, a 3A4, também está associada com a lipoperoxidação e EHNA. Os

autores demonstraram que esse citocromo está ativado na EHNA, gerando níveis elevados de

produtos da lipoperoxidação, e o uso de anticorpos anti-CYP2E1 inibe a formação destes

produtos.

1 Introdução

Conforme relatado, o papel do CYP2E1 na EHNA tem sido bastante investigado em

modelo animal, porém, há poucos estudos em seres humanos com EHNA. A este respeito,

Chalasani e colaboradores

avaliaram a atividade do CYP2E1 em 20 pacientes com EHNA

sem diabetes melito e compararam com grupo controle, pareados para sexo, idade e IMC. Os

autores observaram que a atividade hepática do CYP2E1 foi significativamente superior nos

pacientes com EHNA. Através de análise univariada, observaram correlação significativa

entre a atividade do CYP2E1 e o IMC e também com os níveis séricos de triacilgliceróis, de

insulina e a resistência periférica a insulina.

Provavelmente, a indução do citocromo não seja o único fator associado com a

lipoperoxidação e a formação de radicais livres de oxigênio na EHNA. A este respeito,

Berson e colaboradores

, em modelo animal de EHNA induzida por drogas, observaram a

ocorrência de disfunção mitocondrial e lipoperoxidação sem a indução do citocromo. Nesse

estudo ocorreu inibição da ß-oxidação mitocondrial de ácidos graxos e conseqüente redução

da síntese de trifosfato de adenosina (ATP), além de aumento da formação mitocondrial de

radicais livres de oxigênio. Os autores sugerem que tanto a depleção de ATP como a formação

de radicais livres de oxigênio causam necrose celular

A lipoperoxidação crônica também gera depleção hepática da glutationa, a qual é

considerada um antioxidante endógeno. Por isso, ocorre acúmulo de substâncias oxidantes e

radicais livres de oxigênio, que além de serem lesivos ao hepatócito, costumam perpetuar o

processo

Citoquinas

As citoquinas são um grupo de moléculas com atividade endócrina, parácrina e

autócrina que podem ser produzidas por quase todas as células nucleadas do organismo, sendo

subdivididas em interleucinas, fator de necrose tumoral (FNT), interferons, entre outras

. No

fígado, em condições normais, a produção de citoquinas é mínima ou ausente, porém, com

uma injúria, sua produção aumenta consideravelmente, participando na resposta inflamatória

hepática, necrose hepatocitária e formação de fibrose

Atualmente, postula-se a interação das citoquinas com a liperoxidação como um dos

principais fatores associados à progressão da esteatose para EHNA

. Dentre as citoquinas, na

EHNA, o FNT-alfa tem sido responsabilizado como um importante mediador associado com a

resposta inflamatória hepática, ativando a produção de outras citoquinas que associadas, além

de perpetuarem o processo inflamatório, favorecem a necrose hepatocitária e também estimulam a

1 Introdução

cicatrização, induzindo a formação de fibrose. Os pacientes com EHNA, por sua vez, costumam

apresentar o FNT-alfa em níveis elevados

Em modelo animal de EHNA, utilizando ratos geneticamente obesos, os quais também

apresentam resistência à insulina e dislipidemia, foi observada uma produção elevada de FNT.

Estes animais apresentam também disfunção mitocondrial, tornando a célula mais sensível à

injúria produzida pelo FNT. Nesses casos, os depósitos de gordura parecem ser a principal

fonte de citoquinas

Os modelos animais com indução de EHNA, através de dieta deficiente em metionina

e colina, apresentaram resultados semelhantes, com elevada produção do FNT e hiperativação

do CYP2E1, com conseqüente estresse oxidativo. Nestes estudos, o uso de anticorpos anti-

FNT reduziu significativamente a resposta inflamatória

80, 87

Também as endotoxinas de origem bacteriana podem contribuir para a patogênese da

EHNA ao estimular síntese e liberação de citoquinas

Outros Fatores

Um outro fator que está sendo considerado na etiopatogenia da EHNA, principalmente

na formação da fibrose, é a presença de depósitos aumentados de ferro no fígado. George e

colaboradores

, estudando 51 pacientes com EHNA, demonstraram que 31% apresentaram

mutação no gene para hemocromatose, causando uma substituição da cisteína por tirosina

(C282Y) ou a substituição da histidina por ácido aspártico (H63D), sendo considerados

heterozigotos. Os autores observaram que esses pacientes apresentaram maiores níveis séricos

de transferrina, maior concentração de ferro hepático e lesão hepática mais importante,

principalmente com maior expansão fibrosa. Acreditam que uma leve sobrecarga de ferro,

como ocorre no paciente heterozigoto para hemocromatose, pode atuar sinergicamente na

promoção de fibrose na EHNA e consideram que a flebotomia pode ser uma forma de

tratamento nos pacientes com sobrecarga hepática de ferro, na tentativa de prevenir o

surgimento de fibrose. A este respeito, Desai e Chiorean

realizaram flebotomias seqüenciais

em 8 pacientes com EHNA com aminotransferases elevadas e, ao final de um ano, observaram

queda significativa das mesmas em todos os casos. Neste estudo, não foi realizada biópsia de

controle.

Por outro lado, Younossi e colaboradores

, ao avaliarem pacientes com EHNA,

realizaram determinação das concentrações hepáticas de ferro e do índice de ferro hepático.

Os autores não encontraram associação do ferro com a ocorrência de fibrose ou com os

1 Introdução

demais achados histológicos observados na EHNA, sugerindo não haver um papel importante

do ferro na EHNA.

Outros dois estudos que se propuseram a avaliar a prevalência da mutação do HFE na

EHNA apontaram resultados divergentes. Bonkovsky e colaboradores

estudaram 57

pacientes com EHNA e 348 doadores de sangue como controle. Os autores observaram a

presença de mutação do HFE (C282Y ou H63D) em 69,4% dos pacientes com EHNA o que

foi significativamente superior aos pacientes do grupo controle, em que a mutação foi

observada em 40,5% dos casos. Também a presença de fibrose hepática foi significativamente

maior naqueles pacientes com EHNA e mutação do C282Y. Por outro lado, Chitturi e

colaboradores

, ao avaliarem 59 pacientes com EHNA, observaram uma prevalência na

mutação do HFE menor. Neste estudo, foi observada a presença de mutação do C282Y em

22% dos pacientes com EHNA, significativamente superior aos 9,9% dos controles. Já a

mutação do H63D foi menor dos pacientes com EHNA (19%), quando comparada ao grupo

controle (33%). Além disso, a presença da mutação não foi associada com maior expansão

fibrosa hepática.

Em nosso meio, quando avaliamos um grupo de pacientes com EHNA em relação à

mutação do HFE (C282Y e H63D), não observamos diferença na sua prevalência em relação

ao grupo controle, bem como não foi observada associação entre a presença da mutação e a

atividade inflamatória hepática e o escore de fibrose

Desta forma, até o presente momento, o papel do ferro e da mutação do HFE na

EHNA permanecem incertos, e a pesquisa rotineira das mutações do HFE em pacientes com

EHNA bem como a realização de flebotomias naqueles pacientes com sobrecarga de ferro

ainda carecem de respaldo científico.

O supercrescimento de bactérias no intestino também está sendo considerado como

um fator associado à EHNA

92,

sendo detectado através de testes respiratórios com lactulose e

d-xilose

. Também, a proliferação bacteriana intestinal tem sido associada na patogênese de

uma forma secundária de EHNA que ocorre após cirurgia de derivação intestinal para o

tratamento da obesidade

As bactérias intestinais e suas endotoxinas podem liberar radicais livres de oxigênio e

aumentar o estresse oxidativo hepático, através do estímulo da produção de etanol endógeno e

da liberação de lipopolissacarídeos bacterianos, sendo que ambas estimulam a produção de

citoquinas inflamatórias, principalmente o FNT-alfa

. Neste sentido, alguns autores propõem a

utilização de antibióticos para o tratamento da EHNA, os quais agiriam reduzindo a flora

1 Introdução

bacteriana

1,39

. Com finalidade similar, outros estudos recomendam o uso de probióticos, que

poderiam agir reduzindo a formação de citoquinas, substituindo as bactérias patogênicas e

auxiliando a barreira epitelial a bloquear a entrada dos produtos bacterianos na circulação

Atualmente, a divisão em duas etapas proposta em 1998

, em relação à patogênese da

EHNA, apesar de ainda amplamente aceita, está sendo revisada. As principais modificações

propostas sugerem que a resistência à insulina, os ácidos graxos livres e o tecido adiposo

sejam as principais origens tanto do estresse oxidativo como das citoquinas, os quais ainda

são considerados os fatores centrais na patogênese da EHNA

O reticulo endosplasmático também tem sido apontado como um fator muito importante

na patogênese desta doença, levando a injúria hepatocitária e morte celular por apoptose

Neste novo modelo proposto, a esteatose e a EHNA ocorreriam simultaneamente e o

tecido adiposo tem papel ativo na patogênese, principalmente em produzir citoquinas

inflamatórias

Certamente outros estudos ainda se fazem necessário para um melhor entendimento da

complexa patogênese da EHNA.

1.4 Tratamento

Em relação ao tratamento da EHNA, até o presente momento, nenhuma terapia

específica mostrou resultados conclusivos. Enquanto a maioria dos autores acredita que os

pacientes que apresentam esteatose devem ser apenas observados e avaliados periodicamente,

muito tem se estudado em relação à terapêutica da EHNA. Embora alguns trabalhos sugiram

que a redução gradual de peso em pacientes obesos pode ter um efeito benéfico

14, 96, 97

, mais

estudos com seguimento histológico são necessários para demonstrar se essa conduta ocasiona

regressão das lesões hepáticas a longo prazo. Também é importante salientar que a rápida

perda de peso, como costuma ocorrer imediatamente após a realização de cirurgia bariátrica,

tende a ocasionar piora do processo necro-inflamatório e uma maior proliferação de tecido

fibroso

. Isto ocorre porque há uma grande mobilização de gordura do tecido adiposo para o

fígado e, como o organismo está desprovido de proteínas e outros nutrientes essenciais, não

consegue mobilizar esta gordura hepática

. No entanto, outros autores observaram ocorrer

regressão da esteatose, do infiltrado inflamatório e da fibrose em pacientes com EHNA que

1 Introdução

foram submetidos a cirurgia bariátrica, mesmo quando a perda de peso foi considerada

rápida

100

Luyckx e colaboradores

101

realizaram biópsia hepática em pacientes que foram

submetidos à cirurgia bariátrica e a repetiram após marcada redução de peso. Os autores

observaram regressão significativa da esteatose, porém tanto a atividade inflamatória como a

fibrose permaneceram inalteradas.

Anderson e colaboradores recomendam que a perda de peso não deve exceder a 1,6 kg

por semana

102

, pois observaram que a rápida perda de peso foi associada com aumento do

grau de esteatose, maior infiltrado inflamatório portal e um maior grau de fibrose. Outros

autores sugerem que ocorra uma perda de aproximadamente 10% do peso basal em 6 meses

Existem pacientes obesos que apresentam freqüente ganho e perda de peso. À

semelhança do que ocorre com uma rápida perda de peso, esta “flutuação” do índice de massa

corporal pode agravar as lesões hepáticas

103

Wang e colaboradores

104

, em 2003, realizaram estudo de revisão a respeito do papel da

perda de peso na EHNA. Dentre os 517 estudos identificados, apenas 15 preencheram os critérios

de inclusão. Nesta revisão, não foi possível identificar se a redução de peso é realmente eficaz

no tratamento da EHNA, porém os autores chamam a atenção para a carência de estudos

randomizados e controlados a este respeito, principalmente com seguimento histológico.

Alguns autores acreditam que a realização regular de atividade física aeróbica, associada à

dieta, pode ser benéfica, tanto como auxiliar para a redução gradual de peso, como também

pelo aumento da sensibilidade do tecido muscular à insulina

5, 11, 12, 63, 105

. A este respeito, Franzese

e colaboradores

106

estudaram 33 crianças obesas, com esteatose à ecografia e alteração de

aminotransferases, que foram submetidas a um programa de redução gradual de peso através

da realização de uma dieta hipocalórica, associada a atividade física regular. Após um período

de 6 meses, os autores observaram que todos os pacientes que perderam, no mínimo, 10% do

peso basal apresentaram normalização das aminotransferases e regressão da esteatose à

ecografia. Neste estudo não foi realizada biópsia hepática.

Os agentes anorexígenos, como a sibutramina, e uma droga que atua inibindo a

absorção de lipídeos, o orlistat, foram liberados pelo Food and Drug Administration para o

tratamento da obesidade nos Estados Unidos. O National Institutes of Health recomenda

considerar a terapia farmacológica, se não houver uma perda ponderal equivalente a 10% do

peso basal, após 6 meses de dieta e exercícios

107

. Como adjuvante no tratamento da EHNA,

no entanto, há poucos estudos com estas drogas. Harrison e colaboradores

108

relatam três

1 Introdução

casos de pacientes obesos com EHNA que utilizaram orlistat e, após um período de 6-12

meses, apresentaram perda de peso, normalização das aminotransferases e melhora histológica

com regressão da esteatose, inflamação e fibrose.

Em relação ao tratamento medicamentoso da EHNA, inúmeras drogas já foram

propostas como será discutido a seguir.

Agentes antidiabéticos

Quando os pacientes apresentam diabetes melito associado, recomenda-se adequado

controle glicêmico, porém ainda não há estudos demonstrando se esta medida realmente

previne a evolução da EHNA.

Como a resistência à insulina e a hiperinsulinemia exercem importante papel na

patogênese da doença, o uso de drogas que atuem nesta condição parece bastante atrativo.

Com este propósito, Caldwell e colaboradores

109

realizaram estudo no qual administraram a

troglitazona, que é um hipoglicemiante oral da classe das thiazolinediones, cujo principal

mecanismo de ação envolve a redução da resistência à insulina e atua tanto no fígado como no

tecido adiposo e muscular. Neste estudo, foram incluídos 10 pacientes com diagnóstico

histológico de EHNA, sendo que apenas dois pacientes apresentavam DM. Todos receberam a

droga por 6 meses. Ocorreu normalização das aminotransferases em 7 pacientes, porém nova

biópsia mostrou que todos ainda apresentavam EHNA e, em apenas quatro pacientes, havia

ocorrido pequena redução da atividade necroinflamatória. Os autores chamam a atenção para o

fato de que a normalização bioquímica não se correlacionou com a resposta histológica.

Posteriormente, a troglitazona foi retirada do mercado devido à ocorrência de casos de

hepatite fulminante

110

Uma outra droga da classe das thiazolinediones, a rosiglitazona foi testada em pacientes

com EHNA por Neuschwander-Tetri e colaboradores

111

. Os autores administraram a droga a

30 pacientes obesos com EHNA por 48 semanas. Em todos os pacientes ocorreu redução da

resistência à insulina de forma significativa. Dos 25 pacientes que completaram o tratamento,

24 realizaram nova biópsia. Os autores observaram redução significativa na atividade

necroinflamatória e também na balonização hepatocitária, porém a redução do escore de

fibrose não apresentou significância estatística.

1 Introdução

Outro estudo promissor foi realizado por Promrat e colaboradores

112

, utilizando a

pioglitazona. Os autores avaliaram prospectivamente 18 pacientes com EHNA, sem DM

associado, os quais foram tratados com esta droga por 48 semanas. Após este período, foi

observada melhora bioquímica e histológica na maioria dos pacientes.

Tanto a rosiglitazona quanto a pioglitazona foram associadas com aumento do índice

de massa corporal, o que traz um questionamento quanto ao seu uso a longo prazo. Estes

últimos estudos sugerem, no entanto, que este grupo de drogas pode ser uma opção terapêutica

para a EHNA.

Um outro agente hipoglicemiante oral que tem sido estudado para tratamento da EHNA é

o metformina, cujo efeito principal é reduzir a resistência à insulina e a hiperinsulinemia. A

utilização do metformina em um pequeno grupo de pacientes com EHNA por quatro meses

foi associada com normalização das aminotransferases e da esteatose à ecografia, porém não

houve controle histológico desses casos

113

Ácido ursodesoxicólico

Laurin e colaboradores

114

realizaram estudo comparando os efeitos do ácido

ursodesoxicólico com o clofibrato no tratamento de pacientes com EHNA. Os pacientes que

receberam o ácido ursodesoxicólico, após 12 meses, apresentaram redução estatisticamente

significativa na AST, ALT, fosfatase alcalina (FA) e gama-glutamiltransferase (GGT) e

também na esteatose, em relação aos pacientes que receberam clofibrato. Porém, em ambos os

grupos, não ocorreram alterações no grau da inflamação ou da fibrose hepática. Posteriormente,

Ludwig e colaboradores

115

observaram melhora das provas de função hepática e redução da

esteatose com o uso do ácido ursodesoxicólico, mas também não ocorreu redução do grau de

inflamação hepática e da fibrose. Recentemente, Lindor e colaboradores

116

, em um grande

estudo, randomizaram 166 pacientes com EHNA para receberem ácido ursodesoxicólico ou

placebo por um período de 2 anos. Deste grupo, 107 pacientes realizaram nova biópsia hepática

ao final do tratamento. Os autores

116

observaram que esta droga não foi superior ao placebo,

tanto em relação à melhora bioquímica como à histológica. Desta forma, pode-se concluir que

esta droga, aparentemente, não mostrou benefícios para os pacientes com EHNA.

Agentes hipolipemiantes

Como a EHNA está associada com uma disfunção da homeostasia hepática dos

lipídeos, sendo que a hipertriacilgliceridemia e os níveis baixos de colesterol HDL são as

1 Introdução

principais alterações observadas na EHNA

, a consideração de que os agentes hipolipemiantes

exercem um efeito benéfico parece atrativa, porém existem poucos estudos utilizando estas

drogas e apresentam resultados insatisfatórios.

Um agente que promove redução dos níveis de triacilgliceróis, o clofibrato, foi testado

em um grupo de pacientes com EHNA e hipertrigliceridemia

114

, mas, após 12 meses de

tratamento, não ocorreu melhora histológica. Porém, outro agente, o genfibrosil, reduziu os

níveis de aminotransferases após 4 semanas de tratamento, mas não foi realizado controle

histológico

117

Há alguns poucos estudos testando a eficácia dos inibidores da enzima 3-hidroxi-3-

metilglutaril-coenzima A redutase (HMG-CoA) na EHNA

118, 119, 120

, provavelmente devido ao

receio que estas drogas, com potencial hepatotóxico, possam agravar as lesões hepáticas.

Agentes antioxidantes

Tendo em vista o importante papel que a lipoperoxidação crônica e seus produtos bem

como as citoquinas exercem na fisiopatogenia da EHNA a utilização de agentes antioxidantes

na tentativa de bloquear este processo parece bastante atrativa. Neste sentido, várias drogas

com potencial antioxidante tem sido estudadas, como a betaina, a N-acetilcisteína e as vitaminas

E e C.

Abdelmalek e colaboradores

121

avaliaram, por 12 meses, a eficácia da betaina em 10

pacientes com EHNA. Os autores observaram redução significativa das aminotransferases e

melhora histológica, tanto na esteatose como na atividade inflamatória e no escore de fibrose.

Esses dados sugerem que esta droga pode ser promissora no tratamento da EHNA.

A N-acetilcisteina atua aumentando os níveis de glutationa no fígado, protegendo-o do

estresse oxidativo. Em um estudo piloto, Gulbahar e colaboradores

122

administraram esta

medicação a 11 pacientes com EHNA, por um período de 3 meses, e observaram redução

significativa dos níveis de aminotransferases e GGT, ao final do período. Neste estudo não foi

realizado controle histológico.

Lavine

123

administrou vitamina E para um grupo de 11 crianças obesas com esteatose

à ecografia e aminotransferases elevadas. Após um período médio de 5 meses, os autores

observaram normalização das aminotransferases em todos os pacientes, as quais tornaram a

elevar-se com a suspensão da medicação. No entanto, Kugelmas e colaboradores

, em estudo

piloto com um grupo de 16 pacientes com EHNA, os quais foram submetidos e dieta para

redução de peso e atividade física e foram randomizados para receber vitamina E ou nenhuma

1 Introdução

terapia associada, obtiveram resultado diverso. Houve redução dos níveis sérios das

aminotransferases e da interleucina 6 (um marcador de estresse oxidativo) após 12 semanas,

porém não ocorreu diferença entre o grupo que realizou apenas dieta e atividade física e aquele

que também recebeu vitamina E.

Harrison e colaboradores

124

, em um dos poucos estudos que realizaram controle

histológico, avaliaram a eficácia do uso combinado das vitaminas E e C em pacientes com

EHNA. Neste estudo prospectivo, 45 pacientes foram randomizados para receber as vitaminas

E e C ou placebo por 6 meses. Após este período, os pacientes realizaram uma nova biópsia

hepática. Os pacientes que receberam as vitaminas apresentaram melhora significativa no

escore de fibrose, embora não tenha sido observada diferença no infiltrado inflamatório entre

os grupos.

Como pode ser observado, ainda existe uma carência de estudos que permitam a utilização

segura de tratamento medicamentoso em pacientes com EHNA. A maior parte dos existentes

carece de um número significativo de pacientes e peca em seu desenho metodológico, pelo

fato de não considerarem, em regra, um segundo estudo histológico. Este fato é compreensível,

visto ser a biópsia de fígado um procedimento intervencionista, não raras vezes com efeitos

colaterais de monta

125

. Desta forma, tendo em vista a história natural de doença é mister que

se demonstre o papel terapêutico medicamentoso para alterar o seu curso evolutivo. Nesta etapa

do conhecimento, entende-se que os modelos experimentais são os mais adequados para

individualizar seu papel.

Tendo em vista o custo de linhagens de ratos geneticamente modificadas, é importante

que se consiga desenvolver um modelo experimental de EHNA, adaptada à necessidade do

nosso meio, para, então, avaliar o efeito terapêutico das drogas elencadas, objetivo maior do

presente estudo.

2 OBJETIVOS

2 Objetivos

2 OBJETIVOS

•

Desenvolver um modelo experimental de indução de EHNA, através da utilização

de dieta deficiente em metionina e colina.

•

Analisar, quando presente, o efeito do hipoglicemiante metformina, do antioxidante

vitamina E e do hipolipemiante sinvastatina na DHGNA, através da análise:

a)a) das enzimas hepáticas (AST e ALT);

b)b) do estresse oxidativo, pelas alterações decorrentes da utilização das drogas, no

processo de lipoperoxidação (LPO);

c)c) das alterações histológicas observadas.

3 MATERIAL E MÉTODOS

3 Material e Métodos

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Animais

Nesse experimento, foram utilizados 50 ratos machos, com 45 dias de idade, pesando

entre 200 e 250 g, da espécie Rattus norvegicus da linhagem Wistar, heterozigotos. Os animais

foram provenientes do Biotério da Fundação Faculdade Federal de Ciência Médicas de Porto

Alegre (FFFCMPA). Esses ratos foram mantidos em gaiolas de polipropileno de dimensões

47 x 34 x 18 cm, em conjuntos de 5 animais por gaiola, sob um ciclo claro/escuro de 12 h

(ciclo claro das 7 às 19 h) e sob condições controladas de temperatura (22º C ± 2,0º C).

3.2 Dieta

A dieta DMC foi processada no Laboratório da Faculdade de Bioquímica da

Universidade Federal do Rio Grande do Sul, segundo o modelo de Rogers e Newberne

126

para a indução de EHNA, sendo composta por:

•

caseína livre de vitaminas 6%;

•

óleo de soja 45%;

•

amido 41% ;

•

fibras 1%;

•

mistura vitamínica 2% (acetato de vitamina A 0,03; vitamina D 0,003; menadiona

0,001; acetato de vitamina E 0,045; tiamina 0,001; riboflavina 0,002; piridoxina 0,001; ácido

p-aminobenzóico 0.01; biotina 0,00005; nicotinamida 0,005; pantotenato de cálcio 0,005;

inositol 0,02; ácido ascórbico 0,02);

•

sais 5%.

3 Material e Métodos

3.3 Drogas

Foram utilizadas as formas comerciais das seguintes drogas com suas respectivas

doses:

c)a) Sinvastatina (0,5 mg/kg de peso por dia);

b)b) Vitamina E (10 IU/kg de peso por dia);

a)c) Metformina (35 mg/kg de peso por dia).

As drogas foram diluídas, em soro fisiológico, imediatamente antes da sua administração.

Para a vitamina E, como é lipossolúvel, foi adicionado uma gota de solvente durante a

diluição.

3.4 Procedimento Experimental

O modelo de indução de EHNA foi realizado mediante alimentação dos animais com

dieta pobre em metionina e colina

126

ad libitum durante três meses. A água foi oferecida ad

libitum através de mamadeiras de vidro com bico de inox em rolha de borracha.

O animais foram divididos, aleatoriamente, em cinco grupos:

•

Grupo 01 (grupo R): 10 ratos receberam ração padronizada (Nuvilab CR-1-

Nuvital Nutrientes Ltda

) sem administração de qualquer substância durante três meses.

•

Grupo 02 (grupo SF): 10 ratos receberam dieta deficiente em metionina e colina

concomitante ao uso de soro fisiológico 1 ml/kg de peso, diariamente, administrada por

gavagem durante três meses.

•

Grupo 03 (grupo VitE): 10 ratos receberam dieta deficiente em metionina e colina

concomitante ao uso de vitamina E 10 IU/kg de peso, diariamente, administrada por gavagem

durante três meses.

•

Grupo 04 (grupo MF): 10 ratos receberam dieta deficiente em metionina e colina

concomitante ao uso de metformina 35 mg/kg de peso, diariamente, administrada por gavagem

durante três meses.

•

Grupo 05 (grupo Sinv): 10 ratos receberam dieta deficiente em metionina e colina

concomitante ao uso de sinvastatina 0,5 mg/kg de peso administrada por gavagem durante três

meses.

3 Material e Métodos

Durante o período de estudo, os animais foram pesados semanalmente, e a dose das

drogas foi reajustada quando necessário.

3.5 Coleta dos Materiais e Morte dos Animais

No primeiro dia do estudo, além da determinação do peso dos animais, foi coletado

sangue por punção de plexo retro-ocular, sob anestesia com éter etílico, para a análise

bioquímica proposta. Um dia após o término do período de indução e administração das drogas

(90 dias), os animais foram mortos por decapitação. Novamente, coletou-se sangue de cada

animal para análise bioquímica. Então, foi realizada laparotomia com hepatectomia total e

preparo do material para análise macroscópica, histológica e da lipoperoxidação.

Os fígados foram seccionados e o lobo direito colocado em fixador de Bouin (solução

composta por ácido pícrico, formol e ácido acético), permanecendo nessa solução por

aproximadamente 4 horas, para então ser lavado em água corrente. Após, o material foi

transferido para frascos com álcool 50%, onde permaneceu por 30 minutos. Por último, os

fígados foram armazenados em frascos com álcool 70%, aguardando o processo para inclusão

em parafina. Já o lobo esquerdo foi preparado em solução tampão e com soro fisiológico e,

posteriormente, foi congelado a uma temperatura de menos 80º C para, em uma etapa

posterior, ser avaliada a LPO.

3.6 Análise Bioquímica

A determinação da atividade sérica das enzimas AST e ALT foi realizada no tempo

zero e no momento da morte dos animais através de teste colorimétrico, utilizando o kit

Labtest − Diagnóstico S, sendo o intervalo de referência para a AST foi 39-111U/L e para a

ALT foi 20-61 U/L. Também foi analisado o perfil lipídico, ao final do período de tratamento,

com a determinação dos níveis séricos de colesterol total e triacilgliceróis através do método

enzimático automatizado, do HDL colesterol com o método enzimático colorimétrico direto e o

LDL colesterol foi determinado através da fórmula de Friedewald, utilizando o kit − 2

ADVIA 1650, Bayer, no Laboratório Weimann.

3 Material e Métodos

3.7 Análise da Lipoperoxidação

Além da amostra de fígado destinada à análise histológica, uma amostra de tecido

hepático foi destinada para a realização da LPO.

Foi realizado o homogeneizado do tecido na proporção de 9 ml de KCl 1,15% para

cada grama em um homogeneizador (Ultra Turrax), durante 1 minuto, à temperatura de 0º a

2º

C. A seguir, o homogeneizado foi colocado em centrífuga refrigerada (Sorvall RC 5B −

Rotor SM 24) por 10 minutos a 1.000 rpm. O precipitado foi desprezado e o sobrenadante

utilizado para as medidas de LPO, através do teste de substâncias reativas ao ácido

tiobarbitúrico (TBARS).

O método TBARS consiste em incubar o material biológico com ácido tiobarbitúrico

em meio ácido, e medir, espectrofometricamente (535 nm), a formação de malondialdeído

derivado da LPO, que se constitui em um pigmento rosa.

Para determinar a LPO no fígado, foram utilizados 1,5 ml de ácido tricloroacético a

10%, 0,5 ml de homogeneizado do tecido, 1,0 ml de ácido tiobarbitúrico a 0,67% e 0,5 ml de

água destilada, para completar o volume adequado à cubeta do espectrofotômetro.

Esta mistura foi agitada por 10 segundos e aquecida durante 15 minutos a 100º C.

Depois de resfriada, foi adicionado 3,0 ml de álcool n-butílico para extrair o produto corado

(apolar) da solução aquosa, que foi agitado, a seguir, durante 40 segundos. Após, foi

centrifugado por 10 minutos a 2.500 rpm. O sobrenadante foi agitado para a leitura no

espectrofotômentro (535 nm). Ao final, a proteína do mesmo homogeneizado foi quantificada

segundo o método descrito por Lowry e colaboradores

127

, e os resultados foram expressos em

nmol de malondialdeído/mg de proteína.

O cálculo para determinação da concentração de malondialdeído seguiu o método de

TBARS:

AX diluição/E

Conc. prot.

C = concentração de TBA-RS em nmol/mg de proteína

A = absorbância da amostra

E = 1,5X10

-1

Diluição = volume final (1,5 ml)/ volume da amostra (250 ul) = 6

diluição/E = 38,46

Conc. prot. = concentração de proteínas

C =

3 Material e Métodos

3.8 Análise Histológica

Inicialmente, foi realizado estudo macroscópico dos fígados retirados. Para a avaliação

microscópica, os fígados foram processados em histotécnico (OMA, Brasil) e, após, incluídos

em parafina. Foi obtido 1 bloco de parafina de cada animal, para posterior microtomia (Leica

RM 2025, Alemanha), com espessura de 3 µm e fixação em lâminas de vidro. As lâminas dos

fragmentos hepáticos foram coradas com hematoxilina-eosina, picro-sirius, para avaliação do

grau de fibrose, e Perls, para avaliação da presença de depósitos de ferro, tendo sido examinadas

por um único patologista, “as cegas” em relação aos dados dos animais.

O critério histológico mínimo para o diagnóstico de EHNA foi a presença de esteatose

associada à balonização hepatocelular, envolvendo a zona 3 e infiltrado inflamatório lobular

128, 129

Os corpúsculos de Mallory e a fibrose sinusoidal, envolvendo a zona 3, podem ou não estar

presentes

128, 129

Na análise histológica, foram determinados e quantificados os seguintes aspectos:

•

esteatose macrovesicular;

•

esteatose microvesicular;

•

balonização hepatocelular;

•

inflamação porta;

•

inflamação lobular;

•

corpúsculos de Mallory;

•

depósitos de ferro;

•

fibrose/cirrose.

Esses dados histológicos foram classificados em ausente, leve, moderado ou acentuado, de

acordo com sua intensidade.

A esteatose foi considerada leve quando atingiu até 1/3 do lóbulo hepático; moderada,

quando foi encontrada em 1/3 a 2/3 do lóbulo hepático e acentuada, quando presente em mais

de 2/3 do lóbulo hepático.

Para determinar o grau da inflamação do espaço porta (leve, moderado ou acentuado),

foi considerado o número de espaços porta comprometidos e a presença de atividade em cada

espaço porta.

A determinação do grau de inflamação lobular (leve, moderado ou acentuado) foi

realizada de acordo com o tipo de infiltrado e a intensidade do mesmo.

3 Material e Métodos

A balonização hepatocelular também foi quantificada em leve, moderada ou acentuada

de acordo com sua intensidade e localização e baseada no número de hepatócitos que

apresentou esta alteração.

Então, de acordo com a presença e a intensidade destes achados, foi realizado o

diagnóstico de esteato-hepatite não alcoólica bem como determinado o escore da atividade

necroinflamatória e o escore da fibrose:

•

Atividade necroinflamatória:

a) grau 1: esteatose envolvendo no máximo 66% da amostra; leve balonização

hepatocelular na zona 3; presença de polimorfonucleares no parênquima hepático com ou sem

linfócitos; com inflamação portal ausente ou leve;

b) grau 2: esteatose de qualquer grau; balonização hepatocelular moderada

(predominante na zona 3); presença de polimorfonucleares no parênquima hepático os quais

podem estar associados a fibrose pericelular na zona 3; infiltrado inflamatório portal e lobular

considerado leve a moderado;

c) grau 3: esteatose panacinar; balonização hepatocelular acentuada (predominante

na zona 3); infiltrado inflamatório lobular as custas de polimorfonucleares; infiltrado inflamatório

portal leve ou moderado.

•

Escore de fibrose:

a) estágio 1: fibrose perisinusoidal e/ou pericelular na zona 3;

b) estágio 2: fibrose perisinusoidal e/ou pericelular na zona 3 com septos ou pontes

fibrosas porta incompletas;

c) estágio 3: presença de septos completos, porta-porta ou porta-centrolobular;

b) estágio 4: cirrose.

A graduação, tanto da atividade necroinflamatória como da fibrose, foi realizada

segundo a classificação proposta por Brunt e colaboradores

129

em 1999.

3 Material e Métodos

3.9 Comitê de Ética

Este projeto de pesquisa foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em estudo

animal da FFFCMPA. Todos os ratos foram manipulados observando-se, rigorosamente, as

normas institucionais para trabalhos experimentais com animais preconizadas por este comitê.

3.10 Análise Estatística

Foram calculadas a médias e o desvio padrão de todas as variáveis quantitativas e

ordinais. No caso dos escores, optou-se por realizar transformação em postos antes da

comparação dos grupos. A comparação foi feita por análise de variância com um critério de

classificação, que quando aplicada sobre os postos é equivalente ao procedimento de Kruskal-

Wallis. A localização de eventuais diferenças entre os grupos baseou-se no procedimento de

Tukey, executado sobre os postos (quando necessário). As variáveis dicotômicas foram

comparadas pelo teste exato de Fisher. O nível de significância do estudo foi estabelecido em

α = 0,05. Os dados foram analisados no programa SPSS v12.0

130, 131

4 RESULTADOS

4 Resultados

4 RESULTADOS

Dos 50 ratos que foram submetidos ao estudo, 49 completaram os 90 dias da dieta e

tratamento. Apenas um rato foi ao óbito durante o período de estudo devido à hemorragia

ocorrida por lesão durante a gavagem para administração da medicação. Este animal pertencia

ao grupo do metformina.

4.1 Peso dos Animais

O peso inicial dos animais foi semelhante entre os grupos, porém os ratos que receberam a

dieta DMC, independentemente da medicação utilizada, apresentaram perda significativa de

peso ao final dos três meses com achados de desnutrição. Ao contrário, o grupo que recebeu

ração apresentou ganho de peso (tabela 1 e figuras 1 e 2).

Tabela 1 - Peso dos ratos (gramas) antes e após o tratamento

Grupo Peso inicial (g) Peso final (g) P

Ração 260,7 ± 24,9

368,1 ± 32,9

< 0,001

Soro fisiológico 237,1 ± 11,4

213,2 ± 25,3

0,002

Vitamina E 270,7 ± 18,6

b,c

226,1 ± 18,3

< 0,001

Metformina 279,3 ± 18,2

212,6 ± 29,1

< 0,001

Sinvastatina 253,6 ± 21,4

a,b

229,8 ± 31,4

0,001

P* < 0,001 < 0,001

Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.

* Letras-índice não coincidentes dentro das variáveis peso inicial ou peso final

representam diferenças estatisticamente significativas.

4 Resultados

Fig. 1 - Animal que recebeu a dieta DMC e metformina após

90 dias de tratamento.

Fig. 2 - Animal que recebeu ração normal para ratos durante 90 dias.

4 Resultados

4.2 Aminotransferases

Em relação às aminotransferases, todos os animais apresentavam AST e ALT normais

na primeira determinação, que foi realizada um dia antes do início do tratamento. No entanto,

ao final do estudo, as aminotransferases apresentaram-se alteradas na maioria dos animais

submetidos à dieta deficiente em metionina e colina, enquanto aqueles que receberam apenas

ração permaneceram com aminotransferases normais. Quando foram analisados os níveis de

AST entre os grupos, foi observada diferença estatisticamente significativa entre o grupo 1

(ração) com os demais grupos (figura 3).

Média 73,1 159,6 143,4 174,2 189,6

Desvio padrão 24,5 45,6 21,8 52,5 88,0

n 10 10 10 9 10

R: ração; SF: soro fisiológico; Vit E: vitamina E; MF: Metformina; Sinv: sinvastina.

Fig. 3 - Comparação dos níveis de AST (U/L) entre os grupos.

No entanto, os níveis de ALT foram significativamente maiores no grupo 5 (sinvastatina)

e menores no grupo 1 (ração) (figura 4). Já nos demais grupos, não ocorreu diferença

significativa.

300

250

200

150

100

AST (U/L)

R SF Vit E MF Sinv

4 Resultados

Média 40,8 59,4 53,2 60,0 83,1

Desvio padrão

7,5 8,8 7,1 9,6 7,5

n 10 10 10 9 10

R: ração; SF: soro fisiológico; Vit E: vitamina E; MF: Metformina; Sinv: sinvastina.

Fig. 4 - Comparação dos níveis de ALT (U/L) entre os grupos.

4.3 Perfil Lipídico

Os níveis de colesterol total, de suas frações e dos triacilgliceróis, colhidos ao final do

período de estudo, podem ser observados na tabela 2. A comparação entre os níveis de

colesterol total e suas frações bem como dos níveis de triacilgliceróis mostrou não haver

diferença significativa entre os grupos.

100

ALT (U/L)

R SF Vit E MF Sinv

4 Resultados

Tabela 2 - Comparação dos níveis séricos de colesterol total, LDL, HDL e triacilgliceróis

Grupo Ração Soro

fisiológico

Vitamina E Metformina Sinvastatina P

Colesterol LDL

(mg/dL)

11,1 ± 3,5 17,9 ± 7,6 10,0 ± 10,1 19,3 ± 19,7 14,3 ± 6,7 0,25

Colesterol HDL

(mg/dL)

53,6 ± 7,6 46,0 ± 13,5 55,6 ± 12,1 61,0 ± 12,3 58,1 ± 17,2 0,13

Triacilgliceróis

(mg/dL)

71,3 ± 38,7 76,8 ± 27,5 68,3 ± 13,6 64,9 ± 15,5 69,4 ± 14,4 0,86

Colesterol total

(mg/dL)

79,3 ± 9,1 79,0 ± 15,3 77,7 ± 14,0 90,8 ± 20,0 85,9 ± 15,8 0,29

Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.

4.4 Análise da Lipoperoxidação

Quando se compararam os valores de lipoperoxidação, obtidos através do teste de

substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, realizado no tecido hepático dos animais estudados,

os grupos 1 (ração) e 3 (vitamina E) apresentaram índices significativamente menores que os

demais (figura 5).

Média 0,23 0,50 0,30 0,58 0,51

Desvio padrão 0,08 0,11 0,06 0,17 0,10

n 10 10 10 9 10

R: ração; SF: soro fisiológico; Vit E: vitamina E; MF: Metformina; Sinv: sinvastina.

Fig. 5 - Comparação dos escores de lipoperoxidação (nmol de malondialdeído/mg

de proteína) entre os grupos.

R SF Vit E MF Sinv

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

Escore de lipoperoxidação

4 Resultados

4.5 Aspecto Macroscópico dos Fígados

Em relação ao exame macroscópico dos fígados, todos os animais que receberam ração

apresentaram fígado com aspecto e coloração normal, enquanto os animais que receberam a dieta

DMC apresentaram fígado aumentado de tamanho, com coloração esbranquiçada e, em alguns

espécimes, puderam ser observadas áreas amareladas de depósitos de gordura (figuras 6 a 9).

Fig. 6 - Aspecto macroscópico de um fígado do grupo que recebeu

ração.

Fig. 7 - Aspecto macroscópico de um fígado, após ser removido,

do grupo que recebeu ração.

4 Resultados

Fig. 8 - Aspecto macroscópico de um fígado do grupo que recebeu

a dieta DMC.

Fig. 9 - Aspecto macroscópico de um fígado, após ser removido, do

grupo que recebeu a dieta DMC.

4 Resultados

4.6 Histologia

Em relação aos achados histológicos, nenhum dos 10 ratos que recebeu ração

apresentou alterações histológicas, sendo considerados como tendo fígado normal.

O diagnóstico de esteato-hepatite não alcoólica foi realizado nos 10 ratos que receberam

sinvastatina, porém, no grupo que recebeu vitamina E, apenas quatro ratos preencheram os

critérios diagnósticos de EHNA, e a mesma foi diagnosticada em seis e sete ratos que

receberam metformina e soro fisiológico, respectivamente. Quando se comparou a presença

de EHNA entre os grupos, a mesma foi significativamente maior naqueles que receberam

sinvastatina e foi semelhante entre os demais grupos que receberam a dieta DMC.

Dentre os 39 ratos que receberam a dieta DMC, todos apresentaram, pelo menos,

algum grau de esteatose macrovesicular, que sempre foi predominante em relação à

microvesicular. As figuras 10 e 11 ilustram dois casos com esteatose macrovesicular.

Fig. 10 - Fotomicrografia demonstrando esteatose macrovesicular acentuada

e atividade necroinflamatória (H&E, 200X).

4 Resultados

Fig. 11 - Fotomicrografia demonstrando esteatose macrovesicular acentuada e

infiltrado inflamatório celular (H&E, 400X).

Na análise por grupo, dentre os animais que receberam sinvastatina, quatro apresentaram

esteatose macrovesicular considerada moderada e seis, acentuada. No grupo que recebeu a

vitamina E, um rato apresentou esteatose macrovesicular leve; três, moderada e outros seis

apresentaram esteatose macrovesicular acentuada. No grupo que recebeu metformina, a

esteatose macrovesicular foi considerada leve em um rato, moderada em quatro e acentuada

em outros quatro. Já no grupo que recebeu soro fisiológico, a esteatose macrovesicular foi

considerada moderada em oito e acentuada em dois. Quando se comparou o grau de esteatose

macrovesicular entre os grupos que utilizaram a dieta DMC, não se observou diferença

significativa (figura 12).

4 Resultados

Média 0,1 2,3 2,7 2,2 2,9

Desvio padrão 0,3 0,7 0,9 0,8 0,9

n 10 10 10 9 10

R: ração; SF: soro fisiológico; Vit E: vitamina E; MF: Metformina; Sinv: sinvastina.

Fig. 12 - Comparação dos escores de esteatose macrovesicular entre os grupos.

Em relação ao grau de atividade inflamatória, no grupo da sinvastatina todos os animais

apresentaram algum grau de atividade, sendo que três ratos apresentaram grau 1, outros três

grau 2 e quatro, Grau 3. No grupo da vitamina E, entretanto, a atividade inflamatória esteve

ausente em seis ratos; foi considerada grau 1 em dois, grau 2 em um, e apenas um rato

apresentou grau 3. No grupo que recebeu metformina, a atividade inflamatória esteve ausente

em três ratos, foi considerada grau 1 em cinco e grau 2 em um animal. Já no grupo que

recebeu SF, três ratos não apresentaram atividade inflamatória, três foram considerados grau

1; outros três, grau 2 e apenas um rato foi considerado grau 3. A tabela 3 resume o grau de

atividade inflamatória observado nos grupos.

R SF Vit E MF Sinv

Escore de esteatose

macrovesicular

4 Resultados

Tabela 3 - Distribuição de freqüência dos escores de atividade inflamatória entre os

grupos

Atividade inflamatória Soro fisiológico Vitamina E Metformina Sinvastatina

Ausente 3 6 3 0

Grau 1 3 2 5 3

Grau 2 3 1 1 3

Grau 3 1 1 0 4

Quando se comparou o grau de atividade inflamatória entre os grupos, a mesma foi

significativamente maior naqueles que receberam sinvastatina, quando comparados ao grupo

que recebeu vitamina E (p = 0,003) e ao grupo que recebeu metformina (p = 0,009). No

entanto, entre os demais grupos, não foi observada diferença significativa na atividade

inflamatória, apesar de ter ocorrido uma tendência de a mesma ser menor nos grupos que

receberam vitamina E e metformina, quando comparados àqueles que receberam SF (figura 13).

Média 0,0 1,2 0,6 0,7 2,1

Desvio padrão 0,0 1,0 0,8 0,7 0,9

n 10 10 10 9 10

R: ração; SF: soro fisiológico; Vit E: vitamina E; MF: Metformina; Sinv: sinvastina.

Fig. 13 - Comparação dos escores de atividade inflamatória entre os grupos.

R SF Vit E MF Sinv

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,4

0,0

Escore de esatividade

inflamatória

4 Resultados

Embora ausente em dois casos, a fibrose foi mais freqüente no grupo que recebeu

sinvastatina. Em cinco ratos deste grupo, foi considerada estágio 1, dois apresentaram estágio

3 e um rato apresentou cirrose (Estágio 4). No entanto, no grupo que recebeu vitamina E,

apenas dois ratos apresentaram fibrose, sendo um deles diagnosticado como estágio 2 e outro

estágio 3. A fibrose esteve presente em quatro ratos que receberam metformina, sendo três no

estágio 1 e outro foi diagnosticado como estágio 3. Já no grupo que recebeu SF, seis ratos

apresentaram fibrose, sendo cinco diagnosticados no estágio 1 e outro no estágio 3. A tabela 4

resume a presença e o estadiamento da fibrose observada nos grupos, e a figura 14 ilustra o

caso que apresentou cirrose.

Tabela 4 - Distribuição de freqüência dos escores de fibrose entre os grupos

Escore de fibrose Soro fisiológico Vitamina E Metformina Sinvastatina

Ausente 4 8 5 2

Estágio 1 5 0 3 5

Estágio 2 0 1 0 0

Estágio 3 1 1 1 2

Estágio 4 0 0 0 1

Fig. 14 - Fotomicrografia demonstrando a presença de cirrose (picro-sirius, 400X).

4 Resultados

Quando se comparou o estágio de fibrose nos diferentes grupos, o mesmo foi

significativamente maior no grupo que recebeu sinvastatina (p = 0,003). No entanto, entre os

demais grupos, não ocorreu diferença significativa (figura 15). Quando a comparação foi feita

apenas em relação a presença ou ausência de fibrose, a mesma foi significativamente menor

no grupo que recebeu a vitamina E (p < 0,05).

Média 0,0 0,8 0,5 0,6 1,4

Desvio padrão 0,0 0,9 1,0 1,0 1,2

n 10 10 10 9 10

R: ração; SF: soro fisiológico; Vit E: vitamina E; MF: Metformina; Sinv: sinvastina.

Fig. 15 - Comparação dos escores de fibrose entre os grupos.

Dentre os demais aspectos histológicos, não foram observados depósitos de ferro e a

presença de Corpúsculos de Mallory ocorreu em apenas 5 casos, sendo 4 deles pertencentes

ao grupo da sinvastatina.

Escore de Fibrose

R SF Vit E MF Sinv

5 DISCUSSÃO

5 Discussão

5 DISCUSSÃO

5.1 O Modelo Experimental Desenvolvido

A utilização de modelos animais com EHNA é muito importante no estudo desta

doença, pois pode permitir um melhor entendimento de sua fisiopatologia, ajudar a esclarecer

os mecanismos envolvidos na transição da esteatose para a EHNA, bem como testar o

resultado das várias drogas disponíveis para o seu tratamento. A indução de EHNA tem sido

realizada de diferentes maneiras: por indução medicamentosa (tetraciclina, amiodarona,

corticosteróides, entre outros); com a utilização de ratos geneticamente obesos ou com

manipulação genética e com a utilização de dietas que promovem a sua ocorrência, seja por

ser rica em gordura ou por restrição de aminoácidos

75, 80, 126, 132, 133

As drogas podem induzir esteatose e EHNA ao inibir a β-oxidação mitocondrial de

ácidos graxos, como ocorre com a amiodarona, as tetraciclinas e os corticosteróides entre

outras, ou também ao bloquear a liberação de triacilgliceróis do fígado, proporcionando,

conseqüentemente o seu acúmulo como ocorre, por exemplo, com o ácido valpróico

133

Lettéron e colaboradores

133

, conseguiram a indução de esteatose em ratos com a administração de

diversas drogas (amiodarona, doxiciclina, etanol, tetraciclina, ácido valpróico e dexametasona)

em diferentes raças de animais. A maiorias dos animais apresentou esteatose predominantemente

microvesicular, à exceção do grupo que recebeu etanol, no qual a forma de esteatose

predominante foi macrovesicular. Este modelo de indução de esteatose e esteato-hepatite,

apesar de eficaz, certamente, na maioria das vezes, não traduz uma patogênese semelhante à

da EHNA e também pode refletir a hepatotoxicidade específica da droga, confundindo os

resultados dos estudos quando avaliado o papel de determinado medicamento em sua

prevenção. Desta forma, não parece ser a melhor opção para modelos experimentais que se

propõem a estudar a EHNA.

5 Discussão

Os modelos genéticos de EHNA utilizam animais que possuem alguma mutação

espontânea que promove a doença ou linhagens de animais geneticamente modificadas em

laboratório, que desenvolverão EHNA

134

Os ratos ob/ob são o principal exemplo de animais que apresentam uma mutação

espontânea que bloqueia a produção de leptina

134, 135

. Este hormônio, sintetizado principalmente

pelo tecido adiposo, é responsável pela sensação de saciedade, exercendo um efeito anorexígeno

quando a ingestão calórica já foi suficiente para suprir as demandas do organismo. A sua

ausência está associada com hiperfagia e obesidade

135

. Também, à semelhança dos humanos,

estes animais apresentam hiperinsulinemia (resistência à insulina), hiperglicemia e dislipidemia e

desenvolvem esteatose

135

. A administração exógena de leptina reverte tanto a obesidade como

a esteatose

134, 135

Na deficiência de leptina, conforme descrito, ocorre importante esteatose, porém a

esteato-hepatite somente ocorre se houver um outro estímulo hepatotóxico como, por exemplo,

o uso de alguma droga ou a indução de isquemia

. Em ratos com deficiência de leptina, portanto,

apesar da ocorrência de obesidade e esteatose, não há formação de inflamação e fibrose, o que

sugere que a leptina participa do processo de fibrogênese

Uma outra linhagem de ratos geneticamente obesos são os fa/fa, que desenvolvem uma

mutação espontânea no gene do receptor da leptina

136

. Desta forma, apesar de produzirem o

hormônio, apresentam resistência periférica ao mesmo, com efeito final semelhante ao que

ocorre com os ratos ob/ob, porém sem responderem à administração exógena de leptina

134

Em laboratório de genética, consegue-se realizar modificações gênicas e a produção de

linhagens de animais que desenvolvem esteatose. Existem várias intervenções que podem ser

realizadas em genes diferentes com objetivo semelhante, ou seja, gerar um desequilíbrio na

homeostasia dos lipídeos, de forma que ocorra a formação de esteatose. Uma das principais

modificações genética utilizada nestes modelos é a ativação de genes envolvidos na síntese de

ácidos graxos e colesterol, promovendo a lipogênese e deposição de gordura no fígado

134

Tanto os ratos com mutação natural que induz a esteatose e a EHNA, como aqueles

geneticamente modificados são excelentes modelos experimentais para estudo desta doença e

são utilizados, rotineiramente, com tal propósito em pesquisas

68, 137, 138

. Trata-se, porém, de

modelos onerosos, pela dificuldade de aquisição de linhagens com mutação espontânea ou

pela necessidade de técnicas sofisticadas em laboratório de biologia molecular, as quais são

pouco disponíveis em nosso meio. Desta forma, torna-se difícil a utilização destes modelos na

maioria das pesquisas.

5 Discussão

A indução de EHNA também é possível em modelos animais, através de manipulação

da dieta, de forma a promover a deposição de lipídeos no fígado. Neste sentido, podem-se

utilizar dietas que promovam a obesidade e a esteatose ou dietas que induzam somente a

deposição de gordura hepática, sem a ocorrência de obesidade.

Como a DHGNA está fortemente associada com a obesidade, alguns estudos em

modelos experimentais a induzem e, desta forma, esperam a ocorrência posterior de esteatose

e EHNA. Entretanto, à semelhança dos seres humanos, os ratos apresentam respostas e

suscetibilidade diferentes à dieta, sendo que tanto a ocorrência de obesidade como posteriormente

a DHGNA dependem de outros fatores, como idade, sexo e predisposição genética. Dentre as

diversas dietas com este propósito, aquelas com elevadas quantidades lipídeos ou glicídios são

as mais utilizadas.

Lieber e colaboradores

139

propuseram um modelo de dieta hiperlipídica (71% da

energia sendo proveniente de lipídeos) para a indução de EHNA e, com este propósito, a

testaram em um grupo de 22 ratos por 3 semanas. Esse grupo foi comparado a outro semelhante,

que recebeu dieta com igual quantidade de calorias e mesmo período, só que com apenas 35%

da energia proveniente de lipídeos. Apesar de os autores não informarem a porcentagem de

ratos que desenvolveu EHNA em cada grupo, os animais submetidos à dieta hiperlipídica

desenvolveram esteatose, infiltrado inflamatório e fibrose. Também, à semelhança dos pacientes

com EHNA, estes animais desenvolveram obesidade, resistência à insulina, elevados níveis de

fator de necrose tumoral e ativação do citocromo P450 2E1, com aumento da lipoperoxidação

hepática. Os autores

139

concluem que a dieta hiperlipídica reproduz a forma humana da doença,

sendo um excelente modelo experimental para o seu estudo.

Dietas com alta quantidade de glicídios também induzem DHGNA. A este respeito,

Poulsom

140

demonstrou que ratos alimentados com dietas enriquecidas com frutose desenvolvem

anormalidades semelhantes àquelas que ocorrem em indivíduos com diabetes melito, incluindo

doença hepática e vasculopatia periférica. Por outro lado, dietas com quantidades semelhantes

de glicose não produzem tais efeitos. Ressalta-se que há uma variação na resposta à dieta,

dependente, principalmente de raça e sexo, sendo os ratos machos da raça Wistar os mais

vulneráveis

141

Ao contrário do que acontece com as dietas anteriormente descritas, os animais que

são alimentados com dieta deficiente em metionina e colina apresentam perda de peso e

importante desnutrição

80, 132

. Estes aminoácidos essenciais possuem papel fundamental na

síntese das apoproteínas, que são proteínas especializadas no transporte dos lipídios no

5 Discussão

plasma, favorecendo na sua ausência o acúmulo dos mesmos no fígado

80, 132

. Além disso, com

a dieta DMC, a ß-oxidação mitocondrial de lipídeos fica reduzida, contribuindo para a

ocorrência de esteatose. O mecanismo da produção deste modelo também se vale do fato de

que a metionina e a colina são precursores essenciais para a síntese hepática de fosfatidilcolina, a

qual, junto com o colesterol, perfaz a maioria absoluta dos lipídeos secretados na bile

134

Historicamente, esta dieta foi descrita por Rogers e Newberne

126

em 1973, ao observarem

que poderia ocorrer o desenvolvimento de cirrose em um modelo animal apenas com

manipulação da dieta e sem o uso de álcool. Os autores demonstraram que a utilização de uma

dieta deficiente dos aminoácidos colina e metionina e também sem o ácido fólico e a vitamina

B12, mas rica em lipídios, induz importante esteatose e doença hepática semelhante à

observada com o uso de álcool. Quanto mais deficiente em aminoácidos, ficou comprovada

maior velocidade de instalação e gravidade da doença hepática. Neste estudo, os autores

descreveram e testaram três composições com graus progressivos de deficiência nutricional,

mas não relataram a porcentagem de esteatose e EHNA obtida com cada dieta. Este modelo

de dieta DMC vem sendo utilizado até hoje com o propósito de indução de EHNA em

modelos animais.

Okan e colaboradores

142

, com a finalidade de testar o papel do ácido ursodesoxicólico

na EHNA, realizaram a sua indução em ratos Wistar, utilizando uma dieta DMC. Os autores

empregaram uma forma industrializada da dieta disponível comercialmente nos Estados

Unidos. Ao final de 30 dias, foi observada esteatose em 19 (52,7%) dos 36 ratos submetidos à

dieta. A EHNA, porém, ocorreu em apenas 5 (13,8%) ratos. Por outro lado, Weltman e

colaboradores

, também utilizando uma forma comercial da dieta DMC, conseguiram a

indução de esteatose em todos os 6 animais submetidos ao estudo, após quatro semanas de

tratamento. Como o objetivo do estudo era avaliar a atividade do citocromo CYP2E1 e a

lipoperoxidação, os autores não citaram quantos ratos desenvolveram EHNA. Chamaram a

atenção, entretanto, para a importante perda de peso que esta dieta induz nos animais.

A maioria dos estudos em modelos animais

80, 81, 142

que utiliza a dieta DMC para a

indução de EHNA usou uma forma industrializada dessa dieta e somente citou o laboratório

que a produziu. Apenas Grattagliano e colaboradores

143

, apesar de também utilizarem forma

industrial da dieta, descreveram detalhadamente a sua fórmula. Neste estudo, após 10 dias de

dieta, os autores observaram esteatose macrovesicular significativa em todos os 14 animais

avaliados, porém, provavelmente pelo curto período, não foi observada a ocorrência de

EHNA.

5 Discussão

No presente estudo, foi utilizada a dieta DMC para a indução de EHNA, desenvolvida

de maneira “artesanal”, seguindo o modelo proposto por Rogers e Newberne

126

. Todos os

animais estudados, com exceção de um, concluíram o protocolo proposto. O único óbito

ocorreu devido a uma hemorragia ocasionada durante a gavagem para a administração da

medicação. Desta forma, o óbito não foi associado com a dieta ou com a medicação.

À semelhança dos outros estudos

80, 81, 142, 143

, os animais que utilizaram a dieta DMC

apresentaram perda significativa de peso ao final dos 90 dias de tratamento, com sinais

inequívocos de desnutrição protéico-calórica.

Com a administração desta dieta por 90 dias, obteve-se a indução de esteatose em

100% dos animais. A esteatose pôde ver avaliada já macroscopicamente, pois os animais

submetidos ao tratamento apresentaram fígado aumentado de tamanho, com coloração

esbranquiçada, podendo ser observadas áreas amareladas de depósitos de gordura em alguns

espécimes. Ao analisar-se a histologia, todos os ratos apresentaram, pelo menos, algum grau

de esteatose macrovesicular, que sempre foi predominante em relação à microvesicular, indo

ao encontro dos demais estudos que utilizam dieta DMC para a indução de EHNA

80, 81, 142, 143

O diagnóstico de esteato-hepatite não alcoólica foi realizado em 27 (69,2%) dos 39

animais submetidos à dieta DMC. Dentre os 10 ratos em que foi utilizado soro fisiológico junto

com a dieta DMC, desta forma sem a interferência de drogas, 7 (70%) foram diagnosticados

com EHNA. Estes achados confirmam que a dieta utilizada é altamente eficaz para a indução

da doença. Os estudos que utilizam a dieta DMC não especificam exatamente quantos animais

desenvolveram a EHNA para comparação.

O estudo comprovou, pois, que a utilização de dieta com restrição de metionina e

colina é eficaz e se destaca, entre as várias maneiras de induzir EHNA em modelos animais,

pelo baixo custo e pelo fato de poder ser facilmente manipulada em laboratório, sem a

necessidade de técnicas sofisticadas. É também importante destacar o fato deste modelo não

necessitar o uso de uma droga para a indução da doença e, principalmente, por apresentar

elevados índices de indução de esteatose e EHNA.

5 Discussão

5.2 Drogas

Há poucos estudos testando drogas para avaliar a eficácia terapêutica em modelos

animais com EHNA tanto quanto em seres humanos, nos quais uma das grandes dificuldades

é a necessidade da realização de uma segunda biópsia hepática, uma vez ser esta a única

maneira fidedigna de avaliar o efeito da droga na evolução da EHNA.

Tendo em vista a escassez de estudos na literatura com modelos animais, ao discutir o

papel dos fármacos utilizados, algumas vezes compararam-se resultados com os obtidos em

humanos. Essa ressalva mostra a atenção dada às dificuldades e limitações destas comparações.

5.2.1 Metformina

Há uma indiscutível relação da resistência à insulina e da hiperinsulinemia com a

esteatose, assim como com a EHNA

44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51

. O metformina é um agente

hipoglicemiante oral, cujo efeito principal é reduzir a hiperinsulinemia e melhorar a resistência

hepática à insulina

144

. Além disso, esta droga tem a capacidade de aumentar a utilização de

glicose pelos tecidos periféricos e reduzir a lipólise, levando a menor concentração hepática

de ácidos graxos livres

144, 145

, os quais são o substrato para posterior lipoperoxidação. Em

função disso, especula-se muito o valor terapêutico do metformina na EHNA.

Lin e colaboradores

137

estudaram o efeito do metformina em ratos geneticamente

obesos, os quais caracteristicamente apresentam resistência à insulina e hiperinsulinemia.

Neste estudo, os autores dividiram os animais em 3 grupos. O primeiro deles recebeu ração

normal para ratos concomitantemente com uma dose de metformina de 35 mg/kg de peso por

dia por 4 semanas. O segundo e o terceiro grupos receberam a mesma dieta, um deles

libitum

e o outro com uma quantidade controlada de dieta, igual à do grupo que estava usando

a medicação. Foram observados níveis significativamente menores de aminotransferases e FA

no grupo tratado em relação aos controles. Em relação aos achados histológicos, também

ocorreu redução significativa da esteatose e atividade necroinflamatória naqueles animais que

receberam o metformina. Neste estudo, os autores não analisaram a fibrose, bem como não foi

avaliada a lipoperoxidação.

5 Discussão

Os autores

137

observaram que o efeito benéfico do metformina na EHNA não foi em

conter a hiperfagia ou em reduzir a ingestão calórica, já que ambas foram virtualmente idênticas

nos três grupos. Também não ocorreu diferença nos níveis glicêmicos e de trigliacilgliceróis

entre os grupos. A resposta terapêutica do metformina foi atribuída à redução da resistência à

insulina e a menor expressão hepática do fator de necrose tumoral-alfa observadas no grupo

tratado. O FNT-alfa tem sido responsabilizado como um importante mediador associado com

a resposta inflamatória hepática, favorecendo a necrose hepatocitária e também induzindo a

formação de fibrose. Além disso, o FNT-alfa induz a uma maior resistência à insulina

perpetuando o processo, sendo que tal indução é bloqueada pelo uso do metformina

146, 147, 148

Estas observações de Lin e colaboradores

137

foram posteriormente confirmadas em um

estudo piloto em seres humanos, realizado por Marchesini e colaboradores

113

, no qual 14

pacientes com EHNA usaram metformina 500 mg três vezes por dia por um período de 4

meses. Foi utilizado um grupo controle de 6 pacientes. Neste estudo, os pacientes que

utilizaram o metformina apresentaram queda significativa nos níveis das aminotransferases,

menor resistência à insulina e redução da hepatomegalia e da esteatose à ecografia. Não foi

realizada biópsia de controle.

No presente estudo, o metformina foi administrado para um grupo de 10 animais em

dose diária igual aquela utilizada no estudo realizado por Lin e colaboradores

137

, já que foi o

único estudo com o metformina em modelo animal de EHNA identificado. Um dos animais

deste grupo morreu devido à hemorragia ocorrida por lesão, durante a gavagem para

administração da medicação. No início do tratamento, os animais apresentaram aminotransferases

normais. Já ao final do tratamento, após os 90 dias do estudo, as aminotransferases estavam

elevadas. Este grupo apresentou níveis de AST com diferença estatisticamente significativa

do grupo da ração, porém os níveis não diferiram dos demais grupos que usaram a dieta

DMC. Em relação a ALT, os níveis foram inferiores ao grupo da sinvastatina e superiores ao

da ração. Foram semelhantes aos grupos que utilizaram SF e vitamina E. Ao contrário de Lin

e colaboradores

137

, no presente estudo, o uso do metformina não mostrou eficácia em reduzir

os níveis de aminotransferases em relação ao SF.

A respeito dos níveis séricos de colesterol e triacilgliceróis, entretanto, os resultados

foram semelhantes aos obtidos por Lin e colaboradores

137

, pois não ocorreu diferença significativa

entre o grupo que utilizou metformina com os demais ao final do tratamento.

5 Discussão

Em relação à lipoperoxidação hepática, o metformina não demonstrou benefício,

sendo os níveis observados, através do teste de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

realizado no tecido hepático, semelhantes aos animais que utilizaram o SF. Desconhece-se

estudo que tenha avaliado o papel do metformina na lipoperoxidação hepática para comparação

com o resultado agora obtido.

A EHNA foi diagnosticada em 6 (66,6%) dos 9 ratos que completaram o tratamento

com o metformina, o que não foi diferente daqueles do grupo do SF (70%). Também não

houve diferenças estatisticamente significantes com o grupo que recebeu vitamina E (40%). A

presença de EHNA, porém, foi significativamente maior naqueles animais que receberam

sinvastatina (100%). A esteatose foi semelhante entre os 4 grupos que utilizaram a dieta

DMC.

A atividade inflamatória, no grupo que recebeu metformina, esteve ausente em 3 ratos;

foi considerada Grau 1 em 5 e Grau 2 em 1 animal, sendo de menor intensidade quando

comparada aos animais que utilizaram a sinvastatina, e semelhante ao grupo da vitamina E.

Apesar de haver uma tendência a ser menor, não foi observada diferença significativa em

relação ao soro fisiológico, provavelmente devido ao tamanho da amostra. Estes dados

contrastam com aqueles observados por Lin e colaboradores

137

, que observaram redução da

atividade inflamatória com a utilização do metformina em modelo animal.

Ocorreu fibrose em 4 (44,4%) ratos que receberam metformina, sendo 3 no estágio 1 e

um no estágio 3. Neste estudo, o metformina não mostrou benefício, quando comparado ao SF

em reduzir a fibrose. No estudo de Lin e colaboradores

137

, os autores não analisaram a fibrose.

Em seres humanos, há alguns estudos utilizando o metformina em pacientes com

DHGNA ou com EHNA, além do já citado

113

. Em uma população pediátrica, Schwimmer e

colaboradores

148

utilizaram o metformina, na dose de 500 mg, duas vezes por dia, por 24

semanas em pacientes com EHNA e sem DM associada. Nos 10 pacientes que completaram o

tratamento, os autores observaram queda significativa dos níveis de aminotransferases e redução

da esteatose mensurada por ressonância magnética. Os autores observaram também melhora

dos índices de resistência à insulina. Não foi realizada nova biópsia hepática para controle.

Uygun e colaboradores

146

randomizaram 36 pacientes com EHNA para receber dieta

hipocalórica isolada ou a mesma dieta associada ao uso de metformina 850 mg, duas vezes

por dia, por um período de 6 meses. Ao final do tratamento, foi observada redução significativa

dos níveis de aminotransferases e dos índices de resistência à insulina no grupo que recebeu o

metformina. O índice de massa corporal reduziu em ambos grupos, mas a perda de peso foi

5 Discussão

significativamente maior no grupo que recebeu a medicação. A biópsia hepática foi repetida

em 10 pacientes do grupo controle e em 13 pacientes do grupo que recebeu metformina. Os

pacientes que receberam o metformina apresentaram melhora da atividade necroinflamatória e

da esteatose, mas esse resultado não foi estatisticamente significativo. Também não ocorreu

diferença em relação ao escore de fibrose em ambos os grupos. Neste estudo piloto

146

, os

autores observaram um efeito benéfico do metformina na EHNA e sugeriram que devem ser

realizados estudos com maior número de pacientes e, principalmente, com controle histológico

realizado com um período de tempo maior, para que os benefícios observados, laboratorialmente,

reflitam-se na histologia.

Contrastando com o estudo anterior, Nair e colaboradores

149

utilizaram o metformina

em 15 pacientes com EHNA por um período de 1 ano e observaram redução transitória das

aminotransferases e da resistência à insulina nos primeiros meses de tratamento, com retorno

aos níveis anteriores ainda durante o uso da droga. Neste estudo, dos 10 pacientes que realizaram

nova biópsia hepática, apenas dois evidenciaram melhora da atividade necroinflamatória, e o

escore de fibrose regrediu em apenas um paciente.

Finalmente, Bugianesi e colaboradores

150

realizaram estudo em um grupo de pacientes

com EHNA, no qual compararam os efeitos do metformina com a vitamina E. Os autores

randomizaram 55 pacientes para usar metformina 2 g/dia, por 12 meses. Para o grupo controle, os

autores administraram a vitamina E 800 UI/dia para 28 pacientes e para outros 27 pacientes

foi prescrita apenas dieta hipocalórica. Foi observado que os níveis de aminotransferases

reduziram-se nos três grupos, mas o grupo do metformina foi associado com as mais altas

taxas de normalização, depois de análise multivariada. Apenas 17 pacientes realizaram uma

nova biópsia hepática após o tratamento, todos do grupo que recebeu o metformina e ainda

permaneciam com aminotransferases elevadas. Os autores observaram que a atividade

inflamatória e a fibrose regrediram em, pelo menos, um grau em 10 pacientes, permaneceram

inalteradas em 6 casos, e apenas um paciente apresentou evolução desfavorável. A partir

desses dados, concluíram que o metformina é superior à vitamina E para o tratamento da

EHNA. Este estudo apresenta, contudo, vários problemas metodológicos, principalmente pelo

fato de apenas um grupo de pacientes, aqueles que receberam o metformina, terem realizado

controle histológico. Dessa forma, não permite que se assuma a conclusão de que metformina

é melhor que a vitamina E.

5 Discussão

Cabe salientar que, nestes estudos em seres humanos

146, 148, 149, 150

, não foram observados

efeitos colaterais importantes associados à droga. Mesmo naquele que administrou doses

elevadas do metformina

150

e também nos voltados para a população pediátrica

148

, a tolerância

foi boa. A acidose láctica, uma complicação potencialmente grave decorrente do metformina,

não foi observada.

5.2.2 Vitamina E

A vitamina E possui propriedades antioxidantes, tendo a capacidade potencial de

proteger as estruturas celulares de lesões promovidas por radicais livres de oxigênio e também

pelos produtos da lipoperoxidação

151

. Além disso, existem estudos indicando que a vitamina

E pode melhorar o transporte de glicose na célula e reduzir a resistência periférica à

insulina

152, 153

, embora permaneçam desconhecidos os mecanismos exatos pelos quais exerce

esta atividade. Além disso, a vitamina E auxilia na reposição das reservas de glutationa no seu

estado reduzido, o qual constitui um dos principais agentes antioxidantes hepáticos

154

também está associado ao favorecimento da ação da insulina, reduzindo sua resistência

periférica

153

. Desta forma, o uso da vitamina E vem sendo considerado para várias condições

clínicas em que o estresse oxidativo está envolvido, embora as evidências de seu efeito

benéfico sejam muito variáveis

151

Conforme discutido anteriormente, o estresse oxidativo parece ser o principal responsável

pela “segunda etapa” da patogênese da EHNA, por favorecer a ocorrência de inflamação e

fibrose

. Deste modo, justifica-se a utilização da vitamina E em pacientes com EHNA, como

proposto em alguns estudos clínicos e experimentais.

Parola e colaboradores

155

, em estudo experimental com ratos expostos ao tetracloreto

de carbono, observaram que a administração concomitante de vitamina E reduziu a necrose

hepática aguda induzida pela droga. Durante a exposição crônica ao tetracloreto de carbono,

os autores observaram também que a vitamina E, embora não tenha protegido os animais da

ocorrência de esteatose, foi eficaz em reduzir o estresse oxidativo e a produção de colágeno.

O grupo de animais que utilizou a vitamina E apresentou menor atividade inflamatória e

menor evolução para cirrose. Desta forma, esses autores concluíram que esta vitamina protege

o fígado da lesão crônica induzida pelo tetracloreto de carbono.

5 Discussão

Posteriormente, Parola e colaboradores

156

, em outro estudo com modelo animal,

utilizaram ratos Wistar, os quais foram divididos em dois grupos. Um deles recebeu a ração

padrão para ratos e o outro recebeu a mesma ração, porém enriquecida com vitamina E,

250 mg/kg de ração, ambos por três semanas. Após este período, 50% dos animais de cada

grupo foram submetidos à indução de cirrose com a administração intraperitoneal de tetracloreto

de carbono por cinco semanas e, então foram sacrificados. Os autores observaram que a

administração de vitamina E inibiu a síntese de colágeno, bloqueando a atividade do pró-

colágeno tipo I e da expressão do gene responsável pela produção do peptídeo

transforming

growth factor β1

(TGF β1), o qual é reconhecido como um dos principais reguladores dos

fibroblastos e responsável pela indução de fibrose hepática em condições experimentais

157

Em humanos, níveis aumentados do TGF β1 foram detectados em pacientes com hepatite

crônica C e houve correlação dos mesmos com a fibrose hepática

158

A respeito do TGF β1, fibrose e o papel da vitamina E na EHNA, Hasegawa e

colaboradores

159

realizaram estudo com 22 pacientes, sendo 10 com esteatose e 12 com EHNA,

todos com diagnóstico realizado por biópsia hepática, os quais foram submetidos à dieta

hipocalórica e receberam a vitamina E 300 IU/d por 12 meses. Os autores observaram,

inicialmente, que os pacientes com esteatose apresentavam níveis séricos de TGF β1 semelhantes

a voluntários normais, enquanto que, naqueles com EHNA, os níveis do TGF β1 estavam

elevados e poderiam, inclusive, constituir um método não-invasivo para o diagnóstico diferencial

entre esteatose e EHNA. Após os 12 meses de tratamento, os pacientes com EHNA apresentaram

redução significativa dos níveis séricos das aminotransferases, bem como ocorreu redução

significativa do TGF β1 sérico. Foi repetida a biópsia hepática em 9 pacientes com EHNA,

que mostrou regressão da esteatose em 6 pacientes e da inflamação e da fibrose em 5

pacientes. Os autores concluíram que a vitamina E pode exercer um efeito terapêutico na

EHNA.

Harrison e colaboradores

124

realizaram estudo duplo-cego, randomizado, com seguimento

histológico, no qual avaliaram o papel das vitaminas E e C, na EHNA. Dos 45 pacientes que

completaram o estudo, 23 receberam a combinação das vitaminas (1.000 IU/d de vitamina E e

1.000 mg/d de vitamina C) e 22 o placebo por 6 meses. Apesar de não ter ocorrido queda

importante das aminotransferases no grupo tratado, ocorreu significativa redução no escore de

fibrose.

5 Discussão

Não foi possível encontrar, mesmo após extensa revisão bibliográfica, estudo que

tenha testado o papel da vitamina E em modelo animal de EHNA para comparação. Sendo

publicado na forma de resumo, Phung e colaboradores

160

, em modelo animal de EHNA

induzida por dieta DMC, administraram a vitamina E na dieta (250 IU/kg de dieta) por 10

semanas. Os autores observaram a ocorrência de menor escore de fibrose, estatisticamente

significativo, nos animais que receberam a vitamina E quando comparado ao grupo controle,

concluindo que a vitamina E inibe a fibrogênese em modelo animal de EHNA. Como está

publicado na forma de resumo, não há maiores informações sobre o estudo para discussão.

Os estudos em modelo animal da EHNA que utilizaram a vitamina E, acrescentaram a

mesma na dieta

156, 160

. No presente estudo optou-se por administração das drogas por gavagem

a qual, embora trabalhosa, garante que cada animal, diariamente, receba a dose da medicação

determinada para o seu peso. Foi utilizada a vitamina E em uma dose de 10 IU/kg por dia.

Essa dose foi baseada em pesquisas em seres humanos, que utilizaram doses de 300 a

1.200 IU por dia

123, 124, 150, 161

, tomando-se uma dose média de 800 IU por dia e estimando-se o

peso médio de um adulto de 80 kg.

O grupo que utilizou a vitamina E apresentou os menores níveis médios de AST entre

os animais que usaram a dieta DMC, porém sem significância estatística. Em relação à ALT,

nos animais tratados com a vitamina E, os níveis médios também foram os menores entre os

que receberam a dieta DMC, estatisticamente significantes apenas em relação ao grupo da

sinvastatina.

Em seres humanos, Harrison e colaboradores

124

não observaram redução das

aminotransferases com a vitamina E, porém no estudo de Hasegawa e colaboradores

159

autores observaram redução significativa dos níveis das aminotransferases após 12 meses de

tratamento com a vitamina E. Já Lavine

123

, estudando uma população pediátrica, observou

queda significativa dos níveis das aminotransferases com a utilização de vitamina E, com

retorno aos níveis anteriores após a interrupção da droga. Mesmo com a normalização das

aminotransferases, os autores não observaram redução da esteatose à ecografia. Vajro e

colaboradores

161

randomizaram 28 crianças obesas, com aminotransferases elevadas e

esteatose à ecografia para realizar dieta hipocalórica associada com placebo em um grupo e

com vitamina E no outro grupo. Os autores observaram redução das aminotransferases com a

utilização da vitamina E, independentemente da ocorrência de perda de peso, e sugerem a

mesma como opção terapêutica para aqueles pacientes que não aderem à dieta hipocalórica.

5 Discussão

No presente estudo, a vitamina E, aparentemente, não exerceu efeito sobre os níveis

séricos de colesterol e suas frações, bem como em relação aos triacilgliceróis. Não foi

encontrado estudo que tenha avaliado o papel desta vitamina sobre o perfil lipídico para

comparação.

A vitamina E foi efetiva em reduzir os valores de lipoperoxidação observados através

do TBARS realizado no tecido hepático. Dentre os animais estudados, aqueles que utilizaram

a vitamina E apresentaram estresse oxidativo significativamente inferior aos demais grupos

submetidos à dieta DMC, sendo que os níveis de lipoperoxidação observados foram semelhantes

ao grupo controle geral que recebeu a ração. Desta forma, confirmou-se a ação antioxidante

que a vitamina E exerce na EHNA. Em estudo experimental realizado em ratos e publicado na

forma de resumo Phung e colaboradores

160

também observaram que a vitamina E reduz

significativamente o estresse oxidativo, mensurado através do TBARS realizado no tecido

hepático. No grupo controle, os autores

160

também observaram depleção das reservas da

glutationa hepática, fato que não ocorreu naqueles que receberam a vitamina E. Phung e

colaboradores

160

concluíram que esta vitamina exerce importante papel terapêutico em

modelo animal de EHNA ao inibir o estresse oxidativo. Não foi encontrado nenhum outro

estudo que tenha analisado o papel da vitamina E na lipoperoxidação hepática em modelo

animal de EHNA.

Em seres humanos, Kugelmas e colaboradores

estudaram um grupo de 16 pacientes

com EHNA, os quais foram submetidos à dieta para redução de peso e atividade física e

foram randomizados para receber vitamina E ou nenhuma terapia associada. O objetivo do

estudo foi avaliar o efeito da redução de peso e da vitamina sobre as aminotransferases e as

citoquinas, as quais, conforme discutido anteriormente, junto com a lipoperoxidação, exercem

importante papel na patogênese da EHNA, principalmente para induzir resposta inflamatória.

Os autores

observaram, após 12 semanas de tratamento, redução dos níveis sérios das

aminotransferases e da interleucina 6, a qual é considerada um marcador do estresse oxidativo

e da resposta inflamatória

162

. Não ocorreu, entretanto, diferença entre o grupo que realizou

apenas dieta e atividade física e aquele que também recebeu vitamina E. A interleucina 8 e o

fator de necrose tumoral, que estavam em concentrações elevadas nos pacientes com EHNA,

não se modificaram com a dieta e com o uso da vitamina E. Ressalta-se que, neste estudo,

foram incluídos apenas 16 pacientes, por um curto período, e não foi realizada análise

histológica.

5 Discussão

No presente estudo, os animais que receberam a vitamina E apresentaram a menor

prevalência de EHNA. O seu diagnóstico foi realizado em apenas 4 (40%) dos 10 ratos, a

despeito de ter sido diagnosticada EHNA em 100% dos animais que receberam sinvastatina,

em 70% do grupo do soro fisiológico e 66% daqueles tratados com metformina. Quando se

comparou a presença de EHNA entre os grupos, a mesma foi significativamente maior

naqueles que receberam sinvastatina e foi semelhante entre os demais grupos que receberam a

dieta DMC, embora tenha ocorrido uma tendência a ser menor no grupo da vitamina E. Pode-

se inferir que, com uma amostra maior, provavelmente seria verificado, de forma significativa, o

efeito protetor da vitamina E na ocorrência de EHNA. Não foi encontrado estudo

experimental semelhante para comparar o efeito da vitamina E na prevenção da ocorrência de

EHNA.

Neste estudo, todos os animais que receberam a vitamina E apresentaram esteatose,

não ocorrendo diferença em relação à presença e intensidade da esteatose com os demais

grupos que receberam a dieta DMC. Os estudos que avaliaram seu papel em pacientes com

esteatose

123, 124, 159

também não observaram um efeito da vitamina E sobre a mesma.

Em relação à atividade da doença, os ratos que receberam a vitamina E foram os que

menos apresentaram atividade inflamatória, estando presente em apenas 4 (40%) ratos, sendo

que, em 2 deles, foi considerada de Grau 1. No entanto, na comparação com os achados dos

demais grupos, o grupo da vitamina E foi estatisticamente menor somente em relação ao

grupo da sinvastatina.

Em relação ao estádio da doença, os animais que receberam vitamina E foram os que

menos apresentaram fibrose, que esteve presente em apenas 2 (20%) ratos. Comparando-se o

estágio de fibrose nos 4 grupos que receberam a dieta DMC, porém, esta diferença é

estatisticamente significativa apenas com relação ao grupo da sinvastatina. Já, quando se

analisou apenas a presença ou a ausência de fibrose, foi observada diferença estatisticamente

significativa entre os achados dos animais que receberam a vitamina E com os demais. Estes

resultados vão ao encontro daqueles estudos que acreditam que a vitamina E exerce um efeito

terapêutico na EHNA, principalmente na prevenção da ocorrência de fibrose

124, 156, 159, 160

5 Discussão

5.2.3 Sinvastatina

A sinvastatina é uma droga da classe das vastatinas, as quais têm a propriedade

comum de inibir a síntese de colesterol endocelular, por competição com a enzima 3-hidroxi-

3metilglutaril-coenzima A redutase (HMG-CoA), a qual é a fundamental para a síntese do

colesterol

163

. Tanto a sinvastatina como as demais vastatinas são absorvidas no intestino e

extraídas do sangue na primeira passagem pelo fígado. Nas células hepáticas, são metabolizadas

pelo citocromo P450 (3A4) e transformadas em metabólitos ativos e inativos

163

As vastatinas podem causar injúria hepática, sendo descrita a ocorrência de alteração

dos níveis séricos das aminotransferases em 1% a 3% dos pacientes em uso destas drogas, os

quais costumam voltar ao normal com a interrupção da medicação

164

. Nos casos testados, parece

ser bastante rara hepatite aguda com comprometimento maior da função hepática

164, 165

Apenas três estudos, sendo dois publicados na forma de resumo, foram encontrados a

respeito da utilização das vastatinas para tratamento da EHNA. Horlander e colaboradores

118

avaliaram o papel da atorvastatina em um pequeno grupo, de apenas 7 pacientes com EHNA e

dislipidemia, e observaram a ocorrência de melhora da esteatose e também da atividade

inflamatória, após um seguimento médio de 21 meses. Neste estudo

118

, não foi observado

ocorrer regressão do escore de fibrose.

Kiyici e colaboradores

119

realizaram estudo prospectivo com 44 pacientes com EHNA.

Para os 17 indivíduos sem dislipidemia associada, foi administrado o ácido ursodesoxicólico,

enquanto que os 27 pacientes que apresentavam dislipidemia receberam atorvastatina, todos

por 6 meses. Ao final do estudo, os autores observaram redução significativa dos níveis da

AST e da ALT e também redução da esteatose à tomografia nos pacientes que utilizaram a

atorvastatina, enquanto que, no grupo que recebeu o ácido ursodesoxicólico, apenas a ALT e a

GGT reduziram significativamente. Neste estudo, não foi realizado controle histológico.

Nair e Wiseman

120

, com o propósito de avaliar a hepatotoxicidade das vastatinas em

pacientes com DHGNA, realizaram estudo de caso e controle no qual avaliaram pacientes

com DHGNA que estavam em uso de uma das vastatinas há mais de 6 meses devido a

dislipidemia. Como grupo controle foram utilizados pacientes com DHGNA pareados para idade

e sexo. Os autores não observaram diferenças histológicas entre os controles e os pacientes

em uso dos inibidores da HMG-CoA, concluindo que a utilização dos mesmos não altera a

evolução da DHGNA.

5 Discussão

No presente estudo, utilizou-se a sinvastatina numa dose de 0,5 mg/kg/dia. Como não

foram encontrados estudos experimentais ou em seres humanos com esta droga na EHNA, a

dose foi calculada a partir de estudos experimentais em ratos realizados com outras

finalidades, principalmente na área da cardiologia, que utilizaram doses variando de 0,1 a

10 mg/kg/dia

166, 167, 168, 169

Em relação aos níveis da AST, não foi observada diferença entre os quatro grupos que

receberam a dieta DMC. No entanto, ao contrário do observado com a atorvastatina por Horlander

e colaboradores

118

e Kiyici e colaboradores

119

, os níveis de ALT foram significativamente

maiores no grupo da sinvastatina.

O grupo que utilizou a sinvastatina apresentou, ao final do tratamento, perfil lipídico

semelhante aos demais, não ocorrendo diferença significativa dos níveis de colesterol e dos

triacilgliceróis. Kiyici e colaboradores

119

também não observaram diferença nos níveis de

triacilgliceróis, porém os pacientes apresentaram redução significativa dos níveis de colesterol

com o uso da atorvastatina.

No presente estudo, em relação à lipoperoxidação, o grupo que utilizou a sinvastatina

não apresentou diferença no estresse oxidativo em relação aos grupos do SF e do metformina.

Não foi encontrado estudo que tenha avaliado o papel da sinvastatina no estresse oxidativo

hepático, em modelo experimental de EHNA ou em humanos, para comparação.

Todos os 10 (100%) ratos que receberam a sinvastatina desenvolveram EHNA, sendo

esta incidência estatisticamente superior em relação aos achados nos demais grupos,

demonstrando que, provavelmente, a utilização desta droga pode aumentar o dano hepático.

Ressalta-se não ter havido diferença em relação à presença de esteatose.

A atividade inflamatória e a fibrose foram significativamente maiores no grupo que

utilizou a sinvastatina, inclusive quando comparado com o grupo do SF, sugerindo sua

atuação no agravamento das lesões hepáticas observadas na EHNA. Estes achados contrariam

aqueles observados nos 2 estudos que utilizaram vastatinas para pacientes com EHNA e

realizaram controle histológico, pois Horlander e colaboradores

118

observaram melhora da

esteatose e da atividade inflamatória enquanto que Nair e Wiseman

120

não observaram diferenças

histológicas com o grupo controle. Como estes 2 estudos estão publicados na forma de

resumo, não há maiores informações para comparação.

Atualmente, tanto a sinvastatina como as demais vastatinas não estão sendo consideradas

como uma opção terapêutica para os pacientes com EHNA. Como estas drogas são a base do

tratamento da dislipidemia, que é uma condição comumente associada com a EHNA, e a

5 Discussão

letalidade das alterações cardiovasculares associadas à dislipidemia é maior do que aquelas

causadas pela DHGNA, é usual serem utilizadas nestes pacientes. Caso sejam confirmadas as

observações do presente estudo, em que a sinvastatina agravou as lesões da EHNA, o uso das

vastatinas para tratamento da dislipidemia em pacientes com EHNA deverá ser reconsiderado.

Os resultados do presente estudo permitem fazer uma avaliação das drogas usadas para

o tratamento da EHNA. Por um lado, a sinvastatina agravou as lesões hepáticas, o que sugere

que, quando necessária, deva ser usada com cautela. Por outro lado, a vitamina E e, em menor

grau, o metformina, parecem contribuir para melhores resultados. Como a esteatose e a EHNA

estão associadas com a resistência à insulina, e a progressão da doença, com inflamação e

fibrose, está intimamente ligada ao estresse oxidativo, provavelmente a associação do

metformina com a vitamina E possa trazer maiores benefícios. Para verificar essa hipótese,

sugere-se a realização de novos estudos com esta combinação.

6 CONCLUSÕES

6 Conclusões

6 CONCLUSÕES

•

A dieta deficiente em metionina e colina desenvolvida foi eficaz em induzir

esteatose e EHNA, podendo ser utilizada para estudos experimentais em modelo animal.

•

O grupo que utilizou a vitamina E apresentou os menores níveis de AST e ALT ao

final do tratamento entre os grupos submetidos à dieta DMC, porém estes achados não foram

estatisticamente significativos. Por outro lado, a sinvastatina concorreu para níveis mais

elevados de ALT.

•

Quando utilizado o teste de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico no tecido

hepático, a vitamina E demonstrou reduzir o estresse oxidativo hepático.

•

Não se observou papel protetor das drogas avaliadas no que tange a esteatose.

•

O grupo que utilizou a vitamina E apresentou o menor desenvolvimento de EHNA,

sem ter sido detectada significância estatística. A vitamina E foi eficaz em reduzir o

desenvolvimento de fibrose na EHNA, e a sinvastatina agravou tanto a atividade inflamatória

quanto o estadiamento da EHNA.

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