( PDF ) Comparação entre medida da área de microvasos em espécies de biópsia e de cirurgia em casos de carcinoma brônquico através de sistema de análise de imagem

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Luciane Cristina Dreher Irion

COMPARAÇÃO ENTRE MEDIDA DE ÁREA DE

MICROVASOS EM ESPÉCIMES DE BIÓPSIA E DE

CIRURGIA EM CASOS DE CARCINOMA BRÔNQUICO

ATRAVÉS DE SISTEMA DE ANÁLISE DE IMAGEM

Fundação Faculdade Federal de

Ciências Médicas de Porto Alegre

Pós-graduação em Patologia

Tese de Doutorado

Orientadores:

Dr João Carlos Prolla

Dr Antônio Atalíbio Hartmann

Porto Alegre

2006

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iii

AGRADECIMENTOS

Um número grande de pessoas – mestres, colegas, amigos, familiares e

colaboradores – foram muito importantes durante a realização deste trabalho,

pelo apoio direto, indireto ou simplesmente pelo incentivo à distância, na

expectativa de ver esta etapa concluída. É difícil lembrar de todos os que

tenho a agradecer, mas gostaria de tornar pública a minha gratidão a todos

aqueles que de alguma forma colaboraram para a realização deste trabalho.

Agradecimentos especiais:

Aos meus orientadores, Dr João Carlos Prolla e Dr Antônio Hartmann, por

dividirem comigo suas experiências e por estarem sempre à disposição e

transmitindo tranqüilidade, principalmente durante a etapa final quando

surgem dúvidas a cada momento.

Às técnicas Rosalva e Terezinha, pela presteza, eficiência e amizade, sem as

quais o sucesso deste trabalho não poderia ser alcançado.

À Nice, sempre pronta para ajudar enquanto estive em Porto Alegre e,

principalmente, na fase final quando precisei trabalhar à distância.

Aos demais professores da Pós-graduação, dividindo seus conhecimentos com

as turmas de ansiosos novos pesquisadores.

Aos demais funcionários da Pós-graduação.

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Ao meu marido e amado companheiro, Klaus, que realizou grande parte das

biópsias avaliadas neste trabalho. Com seu nato e invejável espírito cientista,

apoiou-me incondicionalmente em todas as etapas do estudo tanto de forma

direta, revisando, discutindo e opinando, como de forma indireta

proporcionando as condições ideais, necessárias nos momentos de reflexão.

Ao meu filho, Kurt, pela compreensão, amor e respeito nos momentos de

ausência.

À minha sogra, Aidée, pelo carinho e grande incentivo ao estudo e por sua

inestimável ajuda, com tantas idas e vindas à Pós-graduação, para certificar-se

de que tudo estaria correto quando não podíamos estar em Porto Alegre.

À Ulla, braço direito nessa nova etapa de vida, e que sempre esteve na torcida

com um apoio irrestrito.

Ao Erik e ao Bruno, pelas noites de férias gastas ao computador.

Ao Alan pelas consultas estatísticas de última hora.

Ao Rodrigo e à Carolina pela disponibilidade em ajudar quando preciso.

E finalmente aos meus pais por terem me incentivado e ensinado a ter gosto

pelo estudo.

SUMÁRIO

LISTA DE ILUSTRAÇÕES ............................................................................................................................ vi

QUADROS................................................................................................................................................... vi

TABELAS...................................................................................................................................................vii

FIGURAS...................................................................................................................................................viii

ABREVIATURAS............................................................................................................................................ x

RESUMO........................................................................................................................................................ xii

1. INTRODUÇÃO............................................................................................................................................. 1

1.1 Carcinoma brônquico .............................................................................................................................. 1

1.1.1 Aspectos epidemiológicos................................................................................................................ 1

1.1.2 Métodos diagnósticos....................................................................................................................... 4

1.1.3 Classificação histológica .................................................................................................................. 6

1.1.4 Estadiamento e sobrevida................................................................................................................. 9

1.2 Angiogênese.......................................................................................................................................... 14

1.2.1 Conceito e mecanismos moleculares.............................................................................................. 14

1.2.2 Importância da angiogênese em tumores........................................................................................ 25

1.2.3 Avaliação da angiogênese .............................................................................................................. 29

2. OBJETIVO.................................................................................................................................................. 37

3. MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................................................... 38

3.1 Critérios de seleção................................................................................................................................ 39

3.1.1 Critérios de inclusão....................................................................................................................... 39

3.2 População do estudo.............................................................................................................................. 41

3.3 Preparação do material para análise ...................................................................................................... 41

3.4 Avaliação dos microvasos..................................................................................................................... 43

3.5 Avaliação dos dados.............................................................................................................................. 49

3.6 Delineamento......................................................................................................................................... 50

4. RESULTADOS........................................................................................................................................... 51

4.1 Classificação histológica....................................................................................................................... 51

4.2 Estadiamento......................................................................................................................................... 52

4.3 Avaliação dos microvasos..................................................................................................................... 54

4.3.1 Área dos microvasos....................................................................................................................... 57

4.3.2 Área vascular e outras variáveis..................................................................................................... 58

4.4 Resumo dos resultados.......................................................................................................................... 60

5. DISCUSSÃO............................................................................................................................................... 63

6. CONCLUSÕES........................................................................................................................................... 84

7. ABSTRACT................................................................................................................................................ 85

8. ANEXOS..................................................................................................................................................... 87

ANEXO 1 – Técnica de hematoxilina e eosina (HE):................................................................................. 87

ANEXO 2 – Preparação das lâminas com organosilano:............................................................................ 89

ANEXO 3 – Técnica de imuno-histoquímica:............................................................................................. 90

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................................................ 93

ARTIGO EM PORTUGUÊS ........................................................................................................................ 110

ANEXOS DO ARTIGO EM PORTUGUÊS................................................................................................. 126

ARTIGO EM INGLÊS...............................................................................................................

................... 131

ANEXOS DO ARTIGO EM INGLÊS.......................................................................................................... 143

___________________________________________________________

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

___________________________________________________________

QUADROS

Quadro 1 – Procedimentos para obtenção de espécimes para análise cito ou

histopatológica ............................................................................................... 6

Quadro 2 – Classificação histológica dos tumores epiteliais malignos de

pulmão, excluindo-se o carcinoma de pequenas células ............................... 8

Quadro 3 – TNM para estadiamento do carcinoma brônquico ..................... 10

Quadro 4 – Estadiamento de acordo com as subclasses do TNM ................ 11

Quadro 5 – Seqüência de eventos relacionados à angiogênese .................... 16

Quadro 6 – Alguns fatores moleculares provavelmente envolvidos nos

diferentes estágios da formação dos vasos sangüíneos ................................ 17

Quadro 7 – Alguns inibidores endógenos da angiogênese .......................... 24

Quadro 8 – Angiogênese na cascata metastática ......................................... 26

Quadro 9– Critérios de inclusão utilizados para a seleção dos casos ......... 40

vii

TABELAS

Tabela 1 – Exemplo de uma planilha do programa Microsoft Excel com o

valor de área total em cada uma das imagens analisadas pelo programa Image-

Pro Plus 4.5 ................................................................................................... 49

Tabela 2 – Distribuição dos pacientes em relação ao TNM .......................... 53

Tabela 3 – Distribuição dos pacientes em relação ao estadiamento .............. 54

Tabela 4 – Avaliação das áreas dos microvasos nas biópsias e peças

cirúrgicas em relação ao comprometimento linfonodal e ao estadiamento

clínico ............................................................................................................ 59

Tabela 5 – Principais achados nos 28 casos.................................................. 60

Tabela 6 – Correlações entre áreas de microvasos......................................... 62

viii

FIGURAS

Figura 1 – Classificação dos linfonodos regionais para o estadiamento do

carcinoma brônquico ..................................................................................... 11

Figura 2 – Amostra de tecido obtida através de biópsia por agulha .............. 35

Figura 3 – Visão panorâmica (25x) de uma lâmina de imuno-histoquímica

com o anticorpo anti-CD34 ........................................................................... 46

Figura 4 – Escolha dos pontos de concentração microvascular (“hot spots”)

em aumento de 100x ...................................................................................... 46

Figura 5 – Aumento de 200x para a avaliação dos microvasos .................... 47

Figura 6a – Imagem digitalizada de campo microscópico com aumento de

200x antes de acionar o comando do programa analisador de

imagem .......................................................................................................... 48

Figura 6b – Imagem da figura anterior após acionado o comando, mostrando

exatamente o que foi reconhecido pelo programa para ser

medido............................................................................................................ 48

Figura 7 – Distribuição da graduação histológica nos casos de

adenocarcinoma e carcinoma epidermóide provenientes dos espécimes

cirúrgicos........................................................................................................ 52

Figura 8a – Microvasos identificados com anticorpo anti-CD 34 em lâmina de

biópsia ........................................................................................................... 55

Figura 8b – Microvasos identificados com anticorpo anti-CD 34 em lâmina

proveniente de um espécime cirúrgico .......................................................... 55

Figura 9a – Imagem de campo microscópico incluindo área de antracose no

canto inferior esquerdo antes de acionar o comando do programa analisador

de imagem .................................................................................................... 56

Figura 9b– Imagem da figura anterior após o comando do programa

analisador de imagens, mostrando o que foi considerado ............................. 56

__________________________________________________________

ABREVIATURAS

___________________________________________________________

ABC - Avidin-biotin complex (complexo avidina-biotina)

aFGF - Acidic fibroblastic growth factor (fator de crescimento fibroblástico ácido)

Ang-1 - Angiopoietina-1

Ang-2 - Angiopoietina-2

bFGF - Basic fibroblastic growth factor (fator de crescimento fibroblástico básico)

CCD - Charge coupled devices (dispositivo por acoplamento de cargas)

CD - Cluster of differentiation (grupo de diferenciação)

DAB - Diaminobenzidina

HE - Hematoxilina e eosina

EGF - Epidermal growth factor (fator de crescimento epidérmico)

FGF - Fibroblastic growth factor (fator de crescimento fibroblástico)

HB-EGF - Heparin binding epidermal growth factor (fator de crescimento

epidérmico ligante à heparina)

IL-8 - Interleucina 8

INCA - Instituto Nacional de Câncer

MMP (3, 7, 9) - Matriz metaloproteinases (3, 7, 9)

OMS - Organização Mundial da Saúde

PBS - Phosphate buffered saline (tampão fosfato)

PDGF - Platelet-derived growth factor (fator de crescimento derivado de plaquetas)

PECAM-1 - Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (molécula de adesão

plaquetária de célula endotelial)

RTK - Receptor tyrosina cinase

TGF-α - Transforming growth factor

(fator de crescimento transformante alfa)

TGF-β - Transforming growth factor

(fator de crescimento transformante beta)

VEGF - Vascular endothelial growth factor (fator de crescimento vascular

endotelial)

VEGFR-1 - Vascular endothelial growth factor receptor-1 (receptor 1 do fator de

crescimento vascular endotelial)

VEGFR-2 - Vascular endothelial growth factor receptor-2 (receptor 2 do fator de

crescimento vascular endotelial)

VPF - Vascular permeability factor (fator de permeabilidade vascular)

xii

___________________________________________________________

RESUMO

___________________________________________________________

Apesar das modernas modalidades de diagnóstico e tratamento

disponíveis na atualidade, o câncer de pulmão continua sendo a neoplasia com

uma das maiores taxas de mortalidade no mundo inteiro. A cirurgia

permanece a opção de escolha para o tratamento com fins curativos, porém

mesmo pacientes tratados em estágios iniciais da doença possuem índices de

recorrência preocupantes. A diferença de sobrevida de pacientes de mesmos

TNM e tratamento é também uma indicação que a classificação pelo sistema

TNM, apesar de muito importante, ainda não é ideal. Muitas buscas têm sido

feitas no mundo científico no sentido de determinar novos e confiáveis fatores

prognósticos, capazes de identificar subgrupos de pacientes com maior risco

de recorrência, para que estes sejam beneficiados com modalidades de

tratamento adicionais. Vários estudos apontam que a angiogênese está

intimamente relacionada com o crescimento tumoral e tem inegável

importância como fator prognóstico. Em estudo prévio, observou-se que a

sobrevida média dos pacientes com carcinoma brônquico não de pequenas

células que apresentavam área vascular tumoral acima da média foi

significativamente menor do que a sobrevida nos pacientes cujos tumores

apresentaram área vascular abaixo da média. Nosso trabalho avaliou a

angiogênese em carcinomas brônquicos não de pequenas células,

comparando-se os achados da biópsia por agulha fragmentante com os do

espécime cirúrgico. Para isto, utilizou-se o método imuno-histoquímico com o

anticorpo anti-CD 34, para ressaltar os microvasos tumorais. Com o auxílio

xiii

do programa de computador Image-Pro Plus 4.5, foi avaliada a área vascular

nas amostras pré e pós-operatórias. Verificou-se uma forte correlação entre a

medida da área de microvasos em fragmentos provenientes de biópsias e nos

respectivos espécimes cirúrgicos. A existência de correlação indica que é

possível utilizar a amostra tecidual obtida por biópsia por agulha para

fornecer informações sobre a angiogênese do tumor ainda na fase do

diagnóstico e antes de alguma decisão terapêutica. Pesquisas futuras são

necessárias para identificar as melhores abordagens terapêuticas para grupos

de pacientes com alta ou com baixa área vascular calculada no espécime

obtido por biópsia lancetante em pacientes com câncer de pulmão.

___________________________________________________________

1. INTRODUÇÃO

___________________________________________________________

Duas áreas fascinantes no mundo da medicina são trazidas à

atenção neste trabalho: o carcinoma brônquico, que é uma neoplasia

desafiadora à intenção do médico de trazer a cura, e a patologia,

especificamente a imuno-histoquímica, que incessantemente abre um leque de

opções não somente como arma diagnóstica, mas também no

acompanhamento de resposta terapêutica.

1.1 Carcinoma brônquico

1.1.1 Aspectos epidemiológicos

O câncer de pulmão tem acompanhado a história da humanidade,

contudo tornou-se cada vez mais presente ao longo dos últimos séculos. Esta

neoplasia tem sido a principal causa de morte por câncer no mundo. Há

relatos que mais pessoas morrem de câncer de pulmão do que câncer de

cólon, mama e próstata combinados (AMERICAN CANCER SOCIETY,

2005; AMERICAN LUNG ASSOCIATION, 2005). Estimativas apontam que

aproximadamente um milhão de pessoas no mundo morrem anualmente

decorrentes de câncer de pulmão. Seis a cada dez pessoas com câncer de

pulmão morrem no primeiro ano após o diagnóstico e de sete a oito morrem

em dois anos (AMERICAN LUNG ASSOCIATION, 2005). Como a

incidência do câncer de pulmão está definitivamente relacionada à taxa de

fumo, recentemente têm havido alguns indícios de declínio da incidência

desta doença entre os homens, pois desde a década de 70 vem existindo uma

tendência de diminuição do número de fumantes em determinados países

(BROWN & SPIRO, 1999). A incidência desta neoplasia pulmonar no sexo

feminino, porém, ainda não está em declínio, pois historicamente o fumo

tornou-se mais presente na vida das mulheres décadas mais tarde que na dos

homens (AMERICAN CANCER SOCIETY, 2001; BROWN & SPIRO,

1999). Espera-se que num futuro próximo a curva de incidência nas mulheres

siga a tendência de queda já esboçada entre os homens. Deve-se lembrar,

contudo, que a simples cessação do ato de fumar não evita completamente o

risco de desenvolver câncer de pulmão. Aproximadamente metade dos novos

casos desta neoplasia são hoje diagnosticados em ex-fumantes (KEITH et al.,

2000).

No momento, mais de 3 milhões de pessoas apresentam-se com

câncer de pulmão, a maior parte destas proveniente de países em

desenvolvimento (AMERICAN LUNG ASSOCIATION, 2005). Nos diversos

países, as estatísticas disponíveis sobre câncer de pulmão são variáveis. Em

2005, segundo dados da American Cancer Society, eram esperados ao redor

de 172.570 casos novos de câncer de pulmão nos Estados Unidos, 93.010

entre os homens e 79.560 entre as mulheres. No mesmo ano, presume-se que

aproximadamente 163.510 pessoas tenham morrido desta doença (90.490

homens e 73.020 mulheres) (AMERICAN CANCER SOCIETY, 2005). Até a

presente data, estes dados ainda eram apenas estimativas. Ainda nos Estados

Unidos, entre os anos de 1992 e 1998, as taxas de morte decorrente do câncer

de pulmão entre os homens diminuiu 1,9% ao ano, contrastando com o

aumento anual de 0,8% entre as mulheres (AMERICAN CANCER

SOCIETY, 2001). No Reino Unido, segundo as estatísticas disponíveis,

37.699 casos novos (22.504 homens e 15.195 mulheres) foram diagnosticados

em 2002 (CANCER RESEARCH UK, 2006).

No Brasil, através das estimativas do Instituto Nacional de

Câncer (INCA), são esperados 27.170 casos novos de câncer da traquéia,

brônquios e pulmões no ano de 2006 (17.850 homens e 9.320 mulheres),

ocupando a terceira colocação nacional se não forem consideradas as

neoplasias de pele que não melanoma. As taxas brutas de incidência por

100.000 habitantes são lideradas pelo Rio Grande do Sul em ambos sexos

(53,15 entre os homens e 21,48 entre as mulheres). O segundo estado entre os

homens é Santa Catarina (31,25/100.000) e entre as mulheres é Rio de Janeiro

(14,7/100.000). A menor incidência nacional em ambos sexos cabe ao

Maranhão (4,57 e 2,49 por 100.000 homens e mulheres respectivamente)

(INCA, 2005). Da mesma forma, o Rio Grande do Sul tem liderado as taxas

nacionais de mortalidade. Entre os anos de 1995 e 1999, as taxas de

mortalidade por 100.000 homens e mulheres no estado foram 32,62 e 10,86

respectivamente (INCA, 2004).

1.1.2 Métodos diagnósticos

Os exames por imagens podem indicar a presença de uma

neoplasia pulmonar. Entretanto, a comprovação da presença de células ou

tecido neoplásico permanece essencial para a realização do diagnóstico

definitivo. Diversos procedimentos podem ser realizados na prática clínica na

tentativa de obtenção de amostra celular ou tecidual para análise. Estes

procedimentos estão listados no Quadro 1. A tentativa de coleta voluntária de

escarro pode ser sempre realizada, por ser o método mais inócuo, mas nem

sempre é bem sucedida. A escolha do procedimento para obtenção de amostra

tecidual ou citológica depende da localização da lesão em relação à árvore

brônquica ou à parede torácica, bem como da experiência do médico

responsável pela coleta da amostra. Dependendo da localização e do tamanho

da lesão, conforme demonstrado à tomografia computadorizada de tórax,

pode-se escolher a via de acesso com maior probabilidade de obtenção de

uma boa amostra com menor possibilidade de complicações. Para lesões

comprometendo brônquios de médio e grosso calibre, fibrobroncoscopia é a

técnica preferencial para obtenção de amostra diagnóstica. Os métodos mais

adequados para obtenção de material diagnóstico em lesões que não se

encontram em contato com vias aéreas de grosso e médio calibre são a punção

aspirativa para exame citopatológico ou a biópsia tecidual por agulha

fragmentante para exame anátomo-patológico. Apesar de adicionar algum

risco, a biópsia tecidual por agulha traz vantagens importantes. A maior delas

está em fornecer um fragmento de tecido tumoral com a arquitetura da lesão e

sua relação com tecidos adjacentes. Finalmente, quando trata-se de um nódulo

periférico muito pequeno, a opção seria a biópsia cirúrgica transtorácica

vídeo-assistida (FRANKLIN, 2000).

Quadro 1 – Procedimentos para obtenção de espécimes para análise cito ou

histopatológica

PROCEDIMENTOS

- Coleta voluntária de escarro para exame citopatológico

- Procedimentos fibrobroncoscópicos:

Escovado brônquico

Lavado bronco-alveolar

Biópsia endobrônquica

Biópsia transbrônquica

- Punção transcutânea aspirativa

- Biópsia tecidual com agulha

- Biópsia cirúrgica transtorácica vídeo-assistida

(FRANKLIN, 2000; adaptado)

1.1.3 Classificação histológica

A classificação histológica dos tumores pulmonares e pleurais da

Organização Mundial da Saúde (OMS) em vigência é bastante ampla,

incluindo lesões epiteliais benignas, pré-invasivas e malignas, lesões

mesoteliais e mesenquimais, doenças linfoproliferativas, tumores secundários,

tumores não classificados, alterações tumor-símile e também um grupo

chamado “miscelânea”. A classificação atual sugerida para o carcinoma

brônquico não de pequenas células, objeto de nosso estudo, divide-se nos

grandes grupos a seguir: carcinoma epidermóide, adenocarcinoma, carcinoma

de grandes células, carcinoma adenoescamoso e carcinoma com elementos

pleomórficos, sarcomatóides ou sarcomatosos (TRAVIS et al., 1999). Devido

ao alto grau de variabilidade morfológica, a maioria desses tipos histológicos

são subseqüentemente divididos em variantes, como apresentado no Quadro

2. Em alguns casos, as amostras contêm tumores insuficientemente

diferenciados ou são pequenas demais para adequada classificação baseada

apenas na morfologia. Nestes casos, o uso do método imuno-histoquímico

pode permitir classificação mais acurada (FRANKLIN, 2000).

Quadro 2 – Classificação histológica dos tumores epiteliais malignos de

pulmão, excluindo-se o carcinoma de pequenas células, segundo a OMS

• Carcinoma epidermóide

Variantes: Papilar

Células claras

Pequenas células

Basalóide

• Adenocarcinoma

Acinar

Papilar

Bronquíolo-alveolar

Sólido com mucina

Com subtipos mistos

Variantes: Adenocarcinoma fetal bem diferenciado

Adenocarcinoma colóide (mucinoso)

Cistadenocarcinoma mucinoso

Adenocarcinoma com células em anel de sinete

Adenocarcinoma de células claras

• Carcinoma de grandes células

Variantes: Neuroendócrino

Basalóide

Linfoepitelioma-símile

Células claras

Com fenótipo rabdóide

• Carcinoma adenoescamoso

• Carcinomas com elementos pleomórficos, sarcomatóides ou sarcomatosos

Carcinomas com células fusiformes e/ou gigantes

Carcinossarcoma

Blastoma pulmonar

Outros

(TRAVIS et al., 1999; adaptado)

Na rotina da prática clínica, é de conhecimento comum que os

tipos histológicos mais freqüentes sejam o carcinoma epidermóide e o

adenocarcinoma. O carcinoma epidermóide vinha sendo o tipo histológico

predominante de carcinoma brônquico, mas sua incidência diminuiu

dramaticamente nas últimas décadas. Observa-se, atualmente, que o

adenocarcinoma tornou-se o tipo mais comum de câncer de pulmão em

muitos países (ANDRE et al., 1999; CARBONE, 1997).

1.1.4 Estadiamento e sobrevida

Assim como em tumores de outras localizações, a classificação

usada para descrever a extensão anatômica do carcinoma brônquico não de

pequenas células segue o sistema TNM, também conhecido como sistema do

American Joint Committee on Cancer (AJCC) (Quadro 3) (MOUNTAIN,

1997). De acordo com a extensão conferida pelo TNM, o tumor é, então,

classificado em um dos quatro subgrupos do estadiamento (Quadro 4). A

Figura 1 demonstra o mapa de linfonodos mediastinais preconizado pelo

AJCC como padrão para o estadiamento.

Quadro 3 – TNM para estadiamento do carcinoma brônquico

TNM

Tumor primário (T)

Tumor primário não pode ser avaliado ou tumor comprovado por presença de células

malignas no escarro ou lavado brônquico, mas não visualizado por radiologia ou

broncoscopia

Sem evidência de tumor primário

Tumor ≤ 3 cm na maior dimensão, cercado por pulmão ou pleura visceral e sem

evidência de invasão mais proximal que brônquio lobar

Tumor com qualquer dos seguintes achados em tamanho ou extensão:

- >3 cm na maior dimensão

- envolvimento do brônquio principal ≥2 cm distal à carina

- invasão da pleura visceral

- associação com pneumonite obstrutiva estendendo à região hilar, mas sem

envolvimento de todo o pulmão

Tumor de qualquer dimensão com invasão direta de qualquer um dos seguintes:

parede torácica (incluindo tumores do sulco superior), diafragma, pleura mediastinal,

parietal ou pericárdio; ou tumor no brônquio principal <2 cm distal à carina, mas sem

envolvimento da mesma; ou tumor associado com atelectasia ou pneumonite

obstrutiva de todo o pulmão

Tumor de qualquer dimensão com invasão do mediastino envolvendo coração,

grandes vasos, carina, traquéia, esôfago ou vértebra; ou derrame pleural neoplásico;

ou lesão satélite no mesmo lobo

Linfonodos regionais (N)

Linfonodos regionais não avaliados

Ausência de metástases em linfonodos mediastinais

Metástase em linfonodo peribrônquico ipsilateral e/ou hilar ipsilateral ou

comprometimento de linfonodos intrapulmonares por invasão direta pelo tumor

primário

Metástase em linfonodo mediastinal ipsilateral e/ou subcarinal

Metástase em linfonodo hilar ou mediastinal contralateral ou escaleno ipsi ou

contralateral ou supraclavicular

Metástases à distância (M)

Metástases à distância não avaliadas

Ausência de comprometimento neoplásico à distância

Nódulo neoplásico em outro lobo pulmonar ou à distância

Quadro 4 – Estadiamento de acordo com as subclasses do TNM

Tumor

Linfonodos

T1 T2 T3 T4

N0 IA IB IIB IIIB

N1 IIA IIB IIIA IIIB

N2 IIIA IIIA IIIA IIIB

N3 IIIB IIIB IIIB IIIB

IV=M1

Figura 1 – Classificação dos linfonodos regionais para o estadiamento do

carcinoma brônquico

1)mediastinal mais alto; 2R)paratraqueal direito alto; 3)prevascular e retrotraqueal;

4R,L)paratraqueal baixo direito, esquerdo; 5)subaórtico; 6)para-aórtico;

7)subcarinal; 8)para-esofágico; 9)ligamento pulmonar; 10) hilar; 11R, L) interlobar

direito, esquerdo; 12R, L) lobar direito, esquerdo; 13R, L) segmentar direito e

esquerdo; 14R, L) subsegmentar direito, esquerdo; Ao) aorta; PA) artéria pulmonar.

Na prática clínica, o parâmetro prognóstico padrão permanece

sendo o estadiamento clínico-cirúrgico baseado no sistema TNM. Apesar dos

inegáveis avanços no setor diagnóstico na tentativa de identificar o tumor em

estágios precoces e mesmo utilizando-se as melhores combinações

terapêuticas disponíveis, o prognóstico do carcinoma brônquico ainda

permanece reservado (BROWN & SPIRO, 1999; FRANKLIN, 2000). Nos

Estados Unidos e outros países, a sobrevida média, em cinco anos, ainda não

tem alcançado a taxa de 15 % (AMERICAN LUNG ASSOCIATION, 2005;

FRANKLIN, 2000; MATSUYAMA et al., 1998) e no Reino Unido,

corresponde a 5,5 % (BROWN & SPIRO, 1999; GAVIN et al., 2003). A taxa

de sobrevida em cinco anos pode ser de até 49 % para os casos de doença

ainda localizada, porém apenas aproximadamente 16 % de todos os casos são

diagnosticados em estágios iniciais (AMERICAN LUNG ASSOCIATION,

2005). Sabe-se que esta é uma neoplasia com altos índices de morte nos

primeiros anos após o diagnóstico. Por outro lado, foi relatado que aqueles

pacientes que completaram cinco anos de sobrevida livre de doença podem ter

até 91% de chance de alcançar os dez anos (OKADA et al., 2003).

Muito tem sido debatido na comunidade científica no intuito de

melhorar a possibilidade de identificar os casos com possíveis

comportamentos biológicos mais agressivos. Até mesmo novas revisões do

atual sistema TNM foram sugeridas (TAKEDA et al., 2005; WISNIVESKY

et al., 2005). Isto deve-se, em parte, ao fato de que podem existir intrigantes

diferenças entre a evolução e o desfecho de pacientes classificados em

determinado estágio clínico-patológico ou com tumores de tipo histológico

semelhante (MATTERN et al., 1999). Por exemplo, parte dos pacientes em

estágio I irá desenvolver metástases à distância, mas atualmente pouco pode

ser feito para identificar estes casos (CAGINI et al., 2000; DUARTE et al.,

1998).

O estadiamento atual do carcinoma brônquico não de pequenas

células, baseado nas técnicas correntes, parece estar falhando em identificar

prováveis casos que necessitariam conduta terapêutica adicional. A

necessidade de novos e mais precisos indicadores prognósticos tem

fomentado a pesquisa de inúmeros parâmetros biológicos nos últimos anos,

tais como oncogenes, expressão de genes supressores de tumor, índices de

proliferação celular entre outros (CHIBA et al., 1999; D’AMICO et al., 1999;

D’AMICO et al., 2000; GIATROMANOLAKI et al., 1998; HARPOLE et al.,

1995; LESLIE & COLBY, 1997; STEFANOU et al., 2003).

Da mesma forma, estudos apontam que a angiogênese está

relacionada com o crescimento tumoral, com a ocorrência de metástases

(TANIGAWA et al., 1996; WEIDNER et al., 1993) e tem relevante

importância como fator prognóstico em vários tipos de tumores (FOLKMAN,

1990; MEERT et al., 2002; WEIDNER, 1993), como melanoma

(DEPASQUALE & THOMPSON, 2005) e carcinomas de várias localizações

(BETTENCOURT et al., 1998; BOSTWICK & ICZKOWSKI, 1998;

MARTIN et al., 2005; WEIDNER et al., 1991;), até mesmo de pulmão

(FONTANINI et al., 1997(b); FONTANINI et al., 1999; NAKASHIMA et

al., 2004). Inúmeras variações no campo da angiogênse estão sendo

exploradas, desde dosagens séricas de determinadas citocinas (LAACK et al.,

2002; MALL et al., 2002), aferições através do método tradicional de imuno-

histoquímica (CRISTI et al., 2005; ISHIKAWA et al., 2004; OGAWA et al.,

2004), cadeia de reação de polimerase (PCR) (TAKANAMI, 2004) até

análises com técnicas de cDNAmicroarray para distinção entre tumores

angiogênicos e não angiogênicos através da avaliação de sua expressão gênica

(HU et al., 2005). O processo angiogênico também tem sido alvo de pesquisas

de novos medicamentos. Estes agentes poderiam ser usados isoladamente ou

em combinação com quimioterapia tradicional, radioterapia ou cirurgia, com

o intuito de otimizar os efeitos anticâncer destas modalidades terapêuticas

(COX et al., 2000; HERBST et al., 2005).

1.2 Angiogênese

1.2.1 Conceito e mecanismos moleculares

De uma maneira simplificada, a angiogênese pode ser resumida

como o desenvolvimento e crescimento de novos microvasos. Os complexos

mecanismos contribuintes para o surgimento e desenvolvimento do capilar

sangüíneo estão sendo melhor entendidos como resultado do grande número

de estudos que vêm sendo realizados sobre angiogênese tumoral (FOLKMAN

et al., 1971; KERBEL, 2000). Angiogênese é um fenômeno também

observado no período embrionário e em processos reprodutivos (LEBOVIC et

al., 1999; MAAS et al., 2001; ZADEH & GUHA, 2003), nas reações

inflamatórias e de cicatrização (BROWN et al., 2002; FERRARA & DAVIS-

SMYTH, 1997) e em doenças não neoplásicas como endometriose

(FUJISHITA et al., 1999), retinopatias diabética e da prematuridade,

degeneração macular relacionada à idade, glaucoma neovascular (ADAMIS et

al., 1999), artrite reumatóide e psoríase (FERRARA & DAVIS-SMITH,

1997; FOLKMAN & KLAGSBRUN, 1987). No tecido normal, a formação

dos vasos sangüíneos é mantida em um nível estável pelo equilíbrio entre

ativadores e inibidores angiogênicos (KEITH et al., 2000; MAISONPIERRE

et al., 1997).

É sabido que a neoformação vascular desenvolve-se através da

degradação local da membrana basal de vênulas, seguida de migração,

alinhamento e proliferação de células endoteliais a partir de estímulos

angiogênicos (VORAVUD & CHARURUK, 1999). Da mesma forma,

tumores induzem a angiogênese através de uma seqüência de eventos ativados

pela expressão ordenada de fatores estimulantes e bloqueadores, que induzem

a tríade funcional de motilidade, proteólise e crescimento: motilidade de

células endoteliais (migração), lise da matriz extracelular e crescimento no

novo sítio (EISSA & SHOMAN, 1998; FOLKMAN et al., 1989; LE

QUERREC et al., 1993). O Quadro 5 sumariza a seqüência de eventos da

indução angiogênica e o Quadro 6 lista alguns fatores moleculares

provavelmente relacionados com diferentes estágios da formação dos vasos

sangüíneos.

Quadro 5 – Seqüência de eventos relacionados à angiogênese

SEQÜÊNCIA ANGIOGÊNICA

Células endoteliais estimuladas

↓

Degradação da membrana basal

↓

Migração para o estroma perivascular

↓

Iniciação do brotamento capilar

↓

Estrutura tubular microvascular

↓

Estabelecimento da rede capilar funcionante

(EISSA & SHOMAN, 1998; adaptado)

Quadro 6 – Alguns fatores moleculares provavelmente envolvidos nos

diferentes estágios da formação dos vasos sangüíneos

Moléculas Localização

Formação mesodérmica

VEGFR-2 Células mesodérmicas

Ets-1 Células mesodérmicas

Fibronectina Matriz extracelular

Agregação de angioblastos

VEGFR-2 / VEGFR-1 Angioblastos

VE-caderina Angioblastos

Tie-2/tek Angioblastos

Ets-1 Angioblastos

PECAM-1 Angioblastos

Fibronectina Matriz extracelular

VEGF Endoderma

Diferenciação endotelial e formação do plexo capilar primário

VEGFR-1 / VEGFR-2 Células endoteliais

VE-caderina Células endoteliais

Tie-1 / Tie-2/tek Células endoteliais

E-selectin Células endoteliais

Ets-1 Células endoteliais

PECAM-1 (CD31) Células endoteliais

Integrinas Células endoteliais

Fibronectina Matriz extracelular

Laminina Matriz extracelular

Colágeno IV Matriz extracelular

VEGF Endoderma

Recrutamento e diferenciação da célula muscular lisa

Tie-2 Células endoteliais

PDGF-AA / PDGF-BB Células endoteliais

HB-EGF Células endoteliais

BFGF Células endoteliais

Tromboxane-A2 Células endoteliais

Angiotensina II Células endoteliais

Endotelina Células endoteliais

Leucotrienos Células endoteliais

Serotonina Células endoteliais

Angiopoietina Mesênquima

TGF-β

Mesênquima

Laminina Membrana basal

Colágeno IV Membrana basal

Perlecan Membrana basal

Heparan sulfato Membrana basal

(MORRELL et al., 1999; adaptado)

Existem duas áreas que requerem atenção especial neste

processo: 1) a matriz extracelular juntamente com as interações célula-célula;

2) os fatores de crescimento.

Interações da matriz extracelular:

A matriz extracelular possui papel fundamental na morfogênese e

é composta por colágenos, glicoproteínas e proteoglicanos. No processo da

angiogênese, a matriz extracelular pode regular o crescimento vascular e sua

orientação, pois os componentes da matriz extracelular induzem e mantêm a

diferenciação das células endoteliais, além de modular a resposta a fatores

ativadores e inibidores da angiogênese (EIJÁN et al., 1993;

GOSPODAROWICZ & ILL, 1980). A membrana basal endotelial é

morfologicamente semelhante à de outras células e, dessa forma, possui

elementos em comum como laminina, colágeno IV e proteoglicanos

(VORAVUD & CHARURUK, 1999). Acredita-se que a membrana basal seja

produzida por células endoteliais e mantenha a polaridade e a diferenciação

dessas células (BISHOP et al., 1999). A expressão de componentes da matriz

extracelular ocorre durante estágios diferentes da formação e diferenciação

dos vasos. A fibronectina surge transitoriamente na membrana basal dos

capilares em estágios muito precoces da formação do novo vaso, estando

possivelmente relacionada com a agregação de células mesenquimais para a

formação dos tubos capilares. Em seqüência, a laminina tem sido relacionada

como promotora de adesão, migração, diferenciação e crescimento celular

(MORRELL et al., 1999; VORAVUD & CHARURUK, 1999). O colágeno

tipo IV é o principal componente estrutural da membrana basal madura.

Durante a angiogênese, ele surge em estágios posteriores à fibronectina e à

laminina, coincidindo com uma fase de redução na divisão da célula

endotelial e estando também relacionado com a manutenção da diferenciação

endotelial (MORRELL et al., 1999). Foi comprovada a existência de

membrana basal em vasos de tumores, assim como a presença de laminina,

fibronectina e colágeno IV. Apesar de presente, a membrana basal nestes

vasos apresentam anormalidades estruturais, incluindo fraca associação das

células endoteliais e pericitos, grandes extensões desconectadas da parede do

vaso e múltiplas camadas visíveis por microscopia eletrônica (BALUK et al.,

2003). Além do crucial papel das interações matriz-célula durante a

angiogênese, algumas integrinas também estão intimamente relacionadas ao

desenvolvimento vascular (αvβ3 e αvβ5). Elas atuam em muitos processos

fisiológicos e patológicos como sinalizadoras para eventos que medeiam

migração, proliferação, apoptose e sobrevivência celular (MORRELL et al.,

1999; VAN BEIJNUM et al., 2003).

Interações célula-célula:

Após as células endoteliais terem livrado-se das adesões celulares

normais e migrado através da matriz extracelular, é necessário que elas

refaçam as adesões célula-célula a fim de formar os novos capilares. Nesta

nova fase, as interações de adesão entre células endoteliais parecem ser

importantes na organização e estabilização dos tubos vasculares.

Pequenas moléculas de adesão também têm sido relacionadas

com a morfogênese capilar, como E-selectin e integrina alfa 4. Anticorpos

anti-E-selectin parecem prevenir a formação de tubos capilares em cultura

(MORRELL et al., 1999). Molécula de adesão plaquetária de célula

endotelial-1 (PECAM-1 / CD31) pertence à superfamília de imunoglobulinas

concentradas nas junções intercelulares das células endoteliais, mas também é

encontrada em plaquetas e leucócitos. Uma importante característica de

PECAM-1 é sua habilidade em mediar adesão celular através de múltiplas

interações de ligação. Ele pode interagir também com outros tipos de

moléculas, incluindo integrina αVβ3 e CD 38. A ligação com PECAM-1

pode promover sinais intracelulares que ativam a função das integrinas

(MORRELL et al., 1999). Foi demonstrado que anticorpos anti-PECAM-1

atuam como bloqueadores da neovascularização citocina-induzida em ratos, o

que poderia sugerir um papel importante de PECAM-1 no processo de

angiogênese (DELISSER et al., 1997; MORRELL et al., 1999).

Fatores de crescimento:

O idéia de que fatores solúveis poderiam promover angiogênese

surgiu em estudos relacionados com angiogênese induzida por tumor. Desde

então, uma variedade de polipeptídeos solúveis tem sido descritos como

promotores de angiogênese. Muitos mitógenos para o endotélio parecem

pertencer a uma grande família de moléculas como fator de crescimento

fibroblástico (FGF), que foi a primeira molécula pró-angiogênica descrita

(KERBEL, 2000). Fatores envolvidos no crescimento e diferenciação

endotelial inicial são agora melhor conhecidos. Por exemplo, a diferenciação

da célula endotelial e a formação de estruturas vasculares em embriões de

aves podem ser induzidos in vitro por incubação de células embriônicas

pluripotenciais com FGF ácido ou básico (aFGF e bFGF), mas não com

outros fatores de crescimento como TGF-β, TGF-α e EGF. Na verdade, TGF-

β1 pode estar envolvido na regressão de tubos endoteliais (MORRELL et al.,

1999). Da mesma forma, FGF também parece exercer papel na angiogênese

tumoral (KERBEL, 2000; SLODKOWSKA et al., 2000; VORAVUD &

CHARURUK, 1999).

O fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) foi

primeiramente descrito como uma molécula capaz de promover a

permeabilidade capilar, tendo sido previamente chamado como fator de

permeabilidade vascular (VPF) (KERBEL, 2000). Subseqüentemente, foi

reconhecido como sendo angiogênico tanto em situações fisiológicas, como

em tumores e sua estrutura molecular foi descrita em detalhes por Ferrara

(FERRARA & DAVIS-SMYTH, 1997). Este fator de crescimento é expresso

precocemente no endoderma embriônico. O mesoderma adjacente expressa o

receptor VEGF-2 (VEGFR-2), também conhecido como flk-1 no

camundongo ou KDR em humanos, que pertence à família de receptores

tirosina-cinase, sendo a primeira molécula a ser expressa pela população de

células mesodérmicas que dará origem aos angioblastos (MORRELL et al.,

1999). O VEGF atua sob diversas formas também nos tumores. Em resposta à

hipóxia, por exemplo, as células tumorais começam a secretar VEGF, o que

serve para iniciar a angiogênese e, conseqüentemente re-oxigenar o tumor

(VAN BEIJNUM et al., 2003).

Outra família de receptores tirosina-cinase (RTK) que exercem

alguma função no desenvolvimento vascular são tek e tie. Existem

experimentos demonstrando a importância destes RTKs na proliferação e

diferenciação endotelial (KERBEL, 2000). Angiopoietina-1 (Ang-1) foi o

primeiro ligante para tie descrito e seu anel receptor-ligante foi relacionado

com o acúmulo de células de músculo liso ao redor do vaso em

desenvolvimento. É possível que a investigação do sinal de transdução via

este RTK leve a um melhor entendimento dos mecanismos moleculares da

formação do vaso sangüíneo (MORRELL et al., 1999).

A interleucina 8 (IL-8) modula múltiplas funções biológicas

envolvendo quimotaxia, inflamação e angiogênese. Relatos demonstraram

que IL-8 modula diretamente a proliferação e migração da célula endotelial e

regula a angiogênse in vitro e in vivo (LI et al., 2005(a); YATSUNAMI et al.,

1997).

Fatores anti-angiogênicos:

Evidências sugerem que a angiogênese seja regulada pelo

equilíbrio entre fatores angiogênicos e anti-angiogênicos. Muitos fatores

angiogênicos têm sido descritos, entre eles a angiopoietina-2 (Ang-2), que é

uma proteína semelhante à Ang-1 mas que também possui alta afinidade por

Tie 2. Concentrações elevadas de Ang-2 bloqueiam a atividade de Ang-1,

sugerindo que Ang-2 pode ser um inibidor endógeno de Ang-1. Corroborando

com essa idéia, foi demonstrado que camundongos transgênicos com super-

expressão de Ang-2 tiveram fenótipo semelhante aos camundongos com

deficiência em Ang-1 (MAISONPIERRE et al., 1997).

Alguns dos mais potentes inibidores da angiogênese são

fragmentos de proteínas de matriz extracelular, por sua vez derivados de

proteínas maiores. A angiostatina é um produto de degradação do

plasminogênio. Várias metaloproteinases têm sido descritas como liberadoras

de angiostatina a partir de plasminogênio, incluindo estromelisina-1 (MMP-

3), matrilisina humana (MMP-7) e gelatinase neutrofil humana B (MMP-9)

(MORRELL et al., 1999). Endostatina é um fragmento do colágeno XVIII,

um colágeno não usual que está na membrana basal perivascular. Ambos têm

sido demonstrados como inibidores da proliferação celular endotelial in vitro

e inibidor do crescimento tumoral e de angiogênese (KERBEL, 2000;

MORRELL et al., 1999). Além destes, uma família grande de inibidores

endógenos da angioênese já são conhecidos, estando alguns listados no

Quadro 7.

Quadro 7 – Alguns inibidores endógenos da angiogênese

Nome Descrição

Trombospondina 1 Grande proteína de matriz extracelular

Angiostatina Fragmento do plasminogênio

Endostatina Pequeno fragmento do colágeno tipo XVIII

Vasostatina Fragmento N-terminal da calreticulina

Inibidor de fator de crescimento vascular

endotelial (VEGFI)

Proteína semelhante à superfamília das

fatores de necrose tumoral

Fragmento do fator plaquetário 4 (PP4) Fragmento N-terminal de PP4

Derivado da prolactina Fragmento do hormônio com 16kDa

Restina Domínio NC10 do colágeno XV humano

Proteína relacionada à proliferina (PRP) Relacionada a molécula pró-angiogênica da

proliferina

Produto de clivagem SPARC Frag. da proteína secretada, ricos em cisteína

Produto de clivagem da osteopontina Fragmento gerador de trombina

Interferon αβ

Proteína anti-viral conhecida

Meth 1

Proteínas contendo domínios metaloprotease

e trombospondina

Angiopoietina 2

Antagonista de angiopoietina 1 que liga-se a

receptores tie-2

Fragmento de antitrombina III Membro da família das serpinas

(KERBEL, 2000)

Os fatores anti-angiogênicos estão sendo atualmente explorados

como via de acesso terapêutico, havendo um grande número de pesquisas

envolvendo modelo animal e em ensaios clínicos, em busca de possíveis

drogas anti-angiogênicas eficazes (FALARDEAU et al., 2001; MASFERRER

et al., 2000; VOLM et al., 2000; WEIS et al., 2002; YAMADA et al., 2003)

1.2.2 Importância da angiogênese em tumores

A formação de novos vasos sangüíneos é essencial para o

crescimento tumoral, tendo sido comprovado que, em ambiente

avascularizado, o tumor pára de crescer ao atingir 2-4 mm de diâmetro

(FOLKMAN et al., 1971; KERBEL, 2000). Até este tamanho, as células

tumorais podem obter o suprimento necessário de oxigênio e nutrientes

através de difusão passiva (KERBEL, 2000). No organismo vivo, havendo

uma distância maior do que 4 mm da célula tumoral a um vaso nutridor, a

tendência é que ocorra necrose tecidual, a menos que seja possível a

ampliação da rede de suporte vascular à medida que o tumor cresce

(FOLKMAN et al., 1989; TJALMA et al., 1998). Dessa forma, a

neoformação vascular além de ser uma força propulsora do crescimento da

neoplasia, poderia também consistir em uma via de saída para a disseminação

neoplásica, participando da seqüência de eventos da progressão metastática

(Quadro 8).

Quadro 8 – Angiogênese na cascata metastática

EVENTOS DA CASCATA METASTÁTICA

Iniciação tumoral

⇓

Promoção e progressão

⇓

Proliferação descontrolada

⇓

Invasão tecidual local e de vasos

⇓

Células tumorais circulantes e extravasamento

⇓

Formação de colônia no sítio secundário

⇓

Perda das defesas do hospedeiro e resistência à terapia

(EISSA & SHOMAN, 1998; adaptado)

Recentemente, tem sido especulada a existência de formas

alternativas do estabelecimento do suprimento sangüíneo tumoral. A

angiogênese, formação de neovasos, seria a principal e atualmente a mais bem

conhecida, mas outras formas incluiriam também a vasculogênese, ou

crescimento de vasos sangüíneos a partir de estímulos provenientes de células

da medula óssea, o remodelamento capilar local, e a intussoscepção vascular

(FOX & HARRIS, 2004; VERMEULEN et al., 2002).

Torna-se incontestável, portanto, a importância da pesquisa

científica sobre o tema angiogênese, tendo em vista a idéia da agressividade

da neoplasia e a potencialidade de produzir metástases (FOLKMAN, 1990).

Este é um vasto campo de pesquisa clínica, que vem sendo explorado tanto no

setor de diagnóstico como terapêutico. Inúmeras abordagens terapêuticas

inovadoras vêm sendo sugeridas (BERGERS et al., 1999; DAVIS et al., 2004;

HAHNFELDT et al., 1999; KUDELKA et al., 1998; LI et al., 2005(b);

SAUER & DEISSLER, 2003; VORAVUD & CHARURUK, 1999), na

tentativa de melhorar o prognóstico dos pacientes com câncer, sobretudo os

portadores de carcinoma brônquico (KIM et al., 2003; MACCHIARINI et al.,

1994; SHEPHERD, 2001; YAMAZAKI et al., 1994; ZINNER et al., 2002).

No campo de diagnóstico, há mais de 30 anos, Dr. Judah

Folkman articulou sua clássica série de hipóteses a respeito da importância da

angiogênese no desenvolvimento tumoral e de metástases (FOLKMAN,

1971). A avaliação quantitativa e qualitativa da angiogênse em tumores com

verificação de seu significado prognóstico teve outro grande impulso a partir

do final da década de oitenta, com Srivastava pesquisando angiogênese em

melanomas (SRIVASTAVA et al., 1988). Desde então, diversos estudos

sobre este tema foram realizados em tumores de diferentes sítios como

carcinomas de mama (TOI et al., 1995; WEIDNER et al., 1991), de língua

(AMAR et al., 1992; HANNEN et al., 2001), de cabeça e pescoço

(GASPARINI et al., 1993), de próstata (WEIDNER et al., 1993), de ovário

(HOLLINGSWORTH et al., 1995), de estômago (TANIGAWA et al., 1996),

de intestino grosso (HEQUERA et al., 1999; TARTA et al., 2002), de colo

uterino (TJALMA et al., 1998), de fígado (KER et al., 1999), de rim (SABO

et al., 2001), de endométrio (OLZAP et al., 2003), de tireóide (STABENOW

et al., 2005) e tumores do sistema nervoso central (WESSELING et al., 1994).

Macchiarini apresentou o primeiro estudo de angiogênese em

tumores de pulmão (MACCHIARINI et al., 1992), sendo seguido por outros

autores, que analisaram a angiogênese nestes tumores em diferentes estágios

(ANGELETTI et al., 1996; COX et al., 2000; D'AMICO et al., 1999; IRION

et al., 2003). De uma forma geral, estes autores observaram que a angiogênese

tumoral correlaciona-se negativamente com a sobrevida. Por exemplo,

Srivastava e colegas comparando dois grupos de pacientes com melanoma

maligno, com e sem doença sistêmica disseminada, verificaram que os

resultados da avaliação dos microvasos tumorais foram duas vezes maior no

grupo com doença disseminada do que no grupo livre de recorrência

(SRIVASTAVA et al., 1988). Mais recentemente, Chiba e colaboradores

observaram que a contagem de microvasos em adenocarcinomas de pulmão

foi significativamente menor nos pacientes que sobreviveram pelo menos 3

anos (CHIBA et al., 1999).

1.2.3 Avaliação da angiogênese

Uma maneira bastante simples e acessível de identificar os vasos

a serem avaliados quanto ao nível de angiogênese é através do método imuno-

histoquímico. Para isto, um bom número de anticorpos diferentes que

permitem identificar elementos de vasos sangüíneos são disponíveis. Os

anticorpos mais conhecidos são anti-Fator VIII (fator de von Willebrand),

anti-CD 34, anti-CD 31 e anti-CD 105, todos utilizados em grande escala,

havendo algumas vantagens e desvantagens entre o emprego de cada um

(FONTANINI et al., 1995; GIATROMANOLAKI et al., 1996;

GIATROMANOLAKI et al., 1997; SHARMA et al., 2005). Há autores que

defendem o emprego do anticorpo anti-CD 34, pela tendência de não

apresentar reação cruzada com epitélio linfático ou células estromais (FINA et

al., 1990; MATSUYAMA et al., 1998). Além disso, acredita-se que o

anticorpo anti-CD 34 identifique microvasos de calibres menores mais

eficientemente que o anti-Fator VIII (MATSUYAMA et al., 1998;

TANIGAWA et al., 1996). A comparação dos resultados entre os anticorpos

para CD 34 e CD 31 parece ser a mais controversa. Na primeira tentativa de

realizar-se um consenso para quantificação da angiogênese em tumores

sólidos, foi realizada tal comparação, sem, contudo, chegar-se a uma

conclusão definitiva. O anticorpo anti-CD 31 pareceu ser bastante específico,

mas a utilização do anti-CD 34 provou ser mais reproduzível, sobretudo em

pesquisas envolvendo neoplasias de mama (VERMEULEN et al., 1996). Na

experiência de Alves e colegas, o anticorpo anti-CD 34 mostrou-se mais

sensível que o anti-CD 31 (ALVES et al., 1999). Em uma segunda tentativa

de padronização da quantificação da angiogênese em tumores sólidos, foi

mais uma vez sugerida a utilização do anticorpo anti-CD 34 para avaliação do

endotélio (VERMEULEN et al., 2002). O anticorpo anti-CD 105, também

conhecido como endoglina, foi introduzido mais recentemente. Alega-se que

ele apresentaria uma vantagem sobre os demais: identificação do endotélio

proliferante envolvido na angiogênese tumoral, ressaltando os vasos

neoformados e imaturos (SAAD et al., 2004). Mais uma vez, comparações

entre a acurácia dos marcadores vasculares apresentam resultados

divergentes. Há relato de que o anticorpo anti-CD 105 seria superior ao anti-

CD 34 (TANAKA et al., 2001), porém outro estudo posteriormente concluiu

que o anti-CD 34 apresenta melhores resultados que o anti-CD 105 e demais

marcadores endoteliais (MINEO et al., 2004).

Na grande maioria dos trabalhos, avaliou-se a densidade de

microvasos com imuno-histoquímica através de método semiquantitativo

(GUNDERSEN, 1977; HAMILTON, 1995), ou seja, contagem do número de

microvasos em determinada região da amostra tumoral (FONTANINI et al.,

1995; GIATROMANOLAKI, 2001; SHARMA et al., 2005; WEIDNER et al.,

1991). A densidade microvascular é o valor médio da contagem de

microvasos, obtido com o uso de uma objetiva de magnificação determinada

em um microscópio selecionado. A contagem dos microvasos é, em geral,

realizada em um número limitado, mas variável, de campos microscópicos,

selecionados subjetivamente nas áreas de maior vascularização, conhecidas na

literatura específica como pontos de concentração ou “hot spots”. (SHARMA

et al., 2005; WEIDNER et al., 1991). O critério geralmente aceito para

inclusão na contagem visual é a presença de microvasos individuais ou

unidades (células endoteliais) coradas por imuno-histoquímica através da

utilização de um dos marcadores endoteliais citados anteriormente, estando

estas separadas dos microvasos adjacentes e fora de zonas de necrose

(FONTANINI et al., 1996; MINEO et al., 2004; WEIDNER et al., 1991). Não

se faz necessária a presença de hemácias nem a identificação de uma luz

vascular (HANSEN et al., 2004; SHARMA et al., 2005). Na tentativa de

atingir um consenso sobre o que constituiria um microvaso, investigadores

avaliam as lâminas simultaneamente em microscópio de dupla ou múltipla

observação (FOX et al., 1995; MATSUYAMA et al., 1998). Segundo

Weidner, o método de densidade microvascular pode ser satisfatoriamente

reproduzível se os protocolos publicados forem seguidos criteriosamente e os

pontos de concentração de microvasos (“hot spots”) propriamente

selecionados por patologistas experientes (WEIDNER, 1995). Marson,

estudando a angiogênese em carcinomas de mama, encontrou correlação

significativa entre análises realizadas pelos mesmos observadores em ocasiões

diferentes com pelo menos duas semanas de intervalo entre elas. Também

houve correlação significativa entre análises realizadas por observadores

diferentes em momentos distintos (MARSON et al., 1999).

Em outras pesquisas, os microvasos foram quantificados pelo

método sugerido por Chalkley (FOX et al., 1995; HANSEN et al., 2000), que

também parte de uma região com maior concentração de microvasos

tumorais, determinada subjetivamente com lente de baixa magnificação.

Quando essa área de “hot spots” for determinada, passa-se para uma objetiva

de maior alcance e, diferindo do método de densidade microvascular, aplica-

se uma gratícula com 25 pontos aleatórios sobre o campo microscópico a ser

avaliado. A seguir, esta gratícula deve ser rotada até que o maior número de

microvasos corados seja “tocado” ou “encoberto” pelo maior número possível

dos pontos quaisquer da gratícula. Este número será, então, o valor

correspondente ao campo microscópico examinado a ser considerado para

fins dos cálculos estatísticos. Como no método da densidade microvascular, a

quantidade de campos microscópicos a serem analisados deve ser

previamente determinada, devendo constar nos relatórios gerados pelo

investigador (FOX & HARRIS, 2004; HANSEN et al., 2004; SHARMA et

al., 2005; VERMEULEN et al., 1996).

Outra alternativa de avaliação dos microvasos tumorais é através

do método semi-automatizado com o auxílio de programas de computador.

Até hoje, um número menor de pesquisas explorou essa possibilidade, em

geral empregando diferentes programas de computador (IRION et al., 2003;

KEITH et al., 2000; PAVLOPOULOS et al., 1998; SPECK et al., 2003;

TJALMA et al., 1998). Uma das possíveis vantagens da utilização programas

de computador para avaliar a angiogênese é que, ao serem arquivadas as

imagens digitalizadas de “hot spots” presentes nas lâminas histológicas, é

possível, além de efetuar a tradicional contagem numérica de microvasos,

explorá-las mais a fim de quantificar a área que os vasos tumorais ocupam, o

perímetro dos vasos, o diâmetro da luz dos mesmos, a diferença de

intensidade de impregnação do corante e outros aspectos ainda em

investigação (OLEWNICZAK et al., 2003; TJALMA et al., 1998;

VERMEULEN et al., 1996; WESSELING et al., 1994).

Independentemente do método escolhido para avaliar os

microvasos tumorais, cada um chegou à conclusão que definitivamente a

angiogênese tem importância prognóstica. Tentativas de uniformizar a

utilização dos métodos de avaliação da angiogênese já existem, porém ainda

há muita controvérsia (VERMEULEN et al., 1996). Os trabalhos são

unânimes apenas na escolha dos “hot spots” como alvo de estudo, já que estas

zonas de concentração vascular são facilmente identificados ao microscópio

óptico e teoricamente indicam a região de mais intensa angiogênese.

Em estudo prévio, avaliando-se a quantificação da angiogênese

nos carcinomas brônquicos não de pequenas células, através da utilização do

anticorpo anti-CD 34 e com o auxílio da análise computadorizada de imagem,

foi encontrada uma correlação negativa significativa entre a área vascular

nesses tumores e a sobrevida dos pacientes (IRION et al., 2003). Por técnica

de quantificação semi-automática da área vascular em tumores ressecados

cirurgicamente, Irion e colaboradores demonstraram que os pacientes com

área vascular tumoral acima da média apresentavam sobrevida

significativamente menor que a sobrevida dos pacientes cujos tumores

apresentavam baixa área vascular. Aqueles resultados obtidos abriram

horizontes para a busca de técnica similar que permitisse a avaliação da

angiogênese tumoral ainda na fase de diagnóstico, ou seja, antes da cirurgia.

A dúvida sobre a existência ou não de correlação entre a área vascular

tumoral de espécimes de biópsia diagnóstica por agulha a área vascular de

espécimes ressecados cirurgicamente foi, então, o motivo do presente estudo.

Como a biópsia por agulha (Figura 2) pode produzir, com sucesso, material

suficiente para o estabelecimento do diagnóstico, existiria a possibilidade de

adicionalmente avaliar-se a angiogênese tumoral neste tipo de amostra.

Figura 2 – Amostra de tecido obtida através de biópsia por agulha

fragmentante

Este procedimento beneficiaria o paciente, pois em casos

selecionados abriria-se a possibilidade de início imediato de outra modalidade

terapêutica antes da cirurgia, na tentativa de reduzir o suporte nutricional de

tumores altamente vascularizados, poupando recursos econômicos e

potenciais efeitos adversos naqueles pacientes que provavelmente pouco se

beneficiariam com este tipo de tratamento. Para isto, é necessário saber se o

material presente em uma biópsia com agulha reflete as características

vasculares do tumor de uma maneira confiável. Os autores desconhecem

relatos de tal avaliação em pacientes com neoplasias de pulmão. Há descrição

de estudo semelhante envolvendo carcinomas de próstata (YORUKOGLU et

al., 1999). Como a biópsia com agulha é uma peça chave no diagnóstico e

planejamento terapêutico do carcinoma de próstata, muitas pesquisas têm sido

realizadas a fim de obter a maior quantidade possível de informação a partir

de um material de tamanho limitado. Fruto disto, relatos demonstram que a

angiogênese em amostras de biópsia tem importância prognóstica naquela

neoplasia (BOSTWICK et al., 1996; KHATAMI et al., 2005; ROGATSCH et

al., 1997). Estas questões serviram como incentivo para que buscássemos

estudar mais detalhadamente o assunto.

___________________________________________________________

2. OBJETIVO

___________________________________________________________

Realizar a medida do conjunto das áreas de microvasos,

demonstrados por imuno-histoquímica através do anticorpo anti-CD 34, em

imagens digitalizadas de campos microscópicos de biópsias por agulha em

pacientes com carcinoma brônquico não de pequenas células, correlacionando

essas medidas com semelhante avaliação dos microvasos tumorais nas

respectivas peças cirúrgicas.

___________________________________________________________

3. MATERIAL E MÉTODOS

___________________________________________________________

Foram avaliados, inicialmente, os registros do arquivo de

punções e biópsias do Departamento de Radiologia do Pavilhão Pereira

Filho, Complexo Hospitalar Santa Casa, Porto Alegre, sendo revisados os

laudos de biópsias teciduais por agulha realizadas no período compreendido

entre agosto 1998 e abril 2002. Foram subseqüentemente revisados os

prontuários de internação dos pacientes nos quais a biópsia diagnosticou um

carcinoma brônquico não de pequenas células, a fim de selecionar para estudo

aqueles subseqüentemente tratados por cirurgia. Dessa triagem inicial, foram

selecionados casos de 32 pacientes, cujos blocos de parafina provenientes de

exames anátomo-patológicos de biópsias por agulha e de subseqüente peças

cirúrgicas foram utilizados. Quatro casos foram excluídos no decorrer do

estudo, por apresentarem lâminas de biópsia com material insuficiente para

gerar um número mínimo de imagens a serem digitalizadas. Ao final do

estudo, 28 casos preencheram os critérios de seleção abaixo referidos, sendo

este o número total de pacientes avaliados. Em todos os casos houve

comprovação diagnóstica por exame anátomo-patológico pré e pós-

operatório.

3.1 Critérios de seleção

3.1.1 Critérios de inclusão

Foram incluídos os casos de pacientes de ambos sexos

submetidos a biópsia diagnóstica por agulha (18 ou 20 gauge) com

subseqüente tratamento cirúrgico para carcinoma brônquico, com

comprovação por exame anátomo-patológico pré e pós-operatório. O

procedimento cirúrgico foi do tipo segmentectomia, lobectomia ou

pneumonectomia, realizado em até duas semanas após o diagnóstico. Para

fazer parte do grupo a ser pesquisado, os pacientes não deveriam ter recebido

qualquer tipo tratamento específico para a doença, como radio ou

quimioterapia, no intervalo de tempo entre a biópsia diagnóstica e a cirurgia.

O material para exame anátomo-patológico foi fixado em formol a 10 % e

submetido a processamento histológico convencional, sendo incluído em

blocos de parafina para confecção dos cortes histológicos e interpretação das

lâminas. Para cada caso, deveria haver disponível pelo menos um bloco de

parafina com material de biópsia e um da peça cirúrgica contendo amostra

suficiente de tumor para realização dos cortes histológicos e da captura de

imagens necessários para o estudo. Os critérios de inclusão seguem listados

no Quadro 9:

Quadro 9 – Critérios de inclusão utilizados para a seleção dos casos

CRITÉRIO

INCLUSÃO

DIAGNÓSTICO - carcinoma brônquico do tipo

epidermóide, adenocarcinoma ou outro

do tipo não de pequenas células

CIRURGIA - segmentectomia ou

- lobectomia ou

- pneumonectomia

TRATAMENTO ADJUVANTE - ausência de tratamento do tipo radio ou

quimioterápico até o momento do ato

cirúrgico

BLOCO DE PARAFINA - bloco disponível contendo material

suficiente para os cortes histológicos

necessários e para realização de um

número mínimo de fotos a serem

estudadas

3.2 População do estudo

O estudo incluiu 28 casos de pacientes de ambos sexos (19

homens e 9 mulheres), entre 43 e 86 anos de idade e com diagnóstico de

carcinoma epidermóide, adenocarcinoma ou outra variante do carcinoma

brônquico não de pequenas células, obtido por exame anátomo patológico em

biópsia por agulha e confirmado pelo exame do material de ressecção

cirúrgica. Todos os procedimentos de biópsia foram realizados no

Departamento de Radiologia e os procedimentos cirúrgicos foram realizados

no Serviço de Cirurgia Torácica, ambos no Pavilhão Pereira Filho do

Complexo Hospitalar Santa Casa em Porto Alegre, RS. A população estudada

teve a cirurgia realizada entre agosto de 1998 e abril de 2002.

3.3 Preparação do material para análise

Os espécimes de biópsia e de ressecção cirúrgica foram fixados

em formol a 10 %, entre 12 e 24 horas e submetidos a processamento

histológico convencional, sendo incluídos em blocos de parafina para

confecção dos cortes histológicos, interpretação das lâminas e diagnóstico em

um dos dois laboratórios que atendiam o hospital na época da cirurgia

(Laboratório de Patologia da Santa Casa de Porto Alegre e Laboratório

Geyer). Todos os blocos de parafina dos casos incluídos no trabalho foram

utilizados confeccionando-se lâminas coradas pela técnica de hematoxilina e

eosina (HE) para confirmação diagnóstica e adequada classificação, de acordo

com a Classificação Histológica para Tumores de Pulmão e Pleura da OMS

(TRAVIS et al., 1999). Através da avaliação das lâminas coradas por HE, foi

escolhida aquela correspondente ao melhor bloco de parafina para a avaliação

da angiogênese nas amostras provenientes de ressecção cirúrgica, ou seja,

apresentando maior representatividade do tumor, com transição para o

parênquima pulmonar normal e com a menor quantidade de necrose possível

(WEIDNER et al., 1991). Como de uma maneira geral as biópsias

diagnósticas por agulha são processadas em um único bloco de parafina, não

foi necessário fazer a escolha de tal bloco, mas todos os casos foram revisados

para confirmar a presença de material disponível suficiente para o estudo.

A identificação dos microvasos, para avaliação da expressão da

angiogênese, foi realizada por meio de técnica de imuno-histoquímica,

utilizando o método do complexo avidina-biotina-peroxidase (ABC) (ALVES

et al., 1999). Para isso, foi utilizado o anticorpo monoclonal anti-CD 34

(clone QB-End10; DAKO Corporation, Santa Barbara, CA, EUA) na diluição

1:1000. Nesta pesquisa, tanto o procedimento histológico tradicional,

envolvendo HE para confirmação dignóstica, como o de imuno-histoquímica

foram realizados no Laboratório de Patologia do Programa de Pós-graduação

da Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre

(FFFCMPA). Os cortes histológicos para o estudo imuno-histoquímico foram

seqüenciais e o processamento imuno-histoquímico da totalidade dos casos

ocorreu simultaneamente, com o intuito de manter as mesmas condições

ambientais, como temperatura, umidade e tempo de reação.

3.4 Avaliação dos microvasos

A avaliação das lâminas de imuno-histoquímica foi realizada no

Laboratório de Citopatologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. O

procedimento foi efetuado sem o conhecimento das informações clínicas de

cada caso. Adicionalmente, as lâminas de biópsia e as provenientes da

ressecção cirúrgica receberam nova identificação, randomizada, a fim de

evitar o conhecimento dos respectivos pares de amostra de cada paciente.

A avaliação dos microvasos através de análise computadorizada

foi realizada com digitalização de imagens, utilizando-se uma câmera de

vídeo Sony 3CCD, modelo DXC-97OMD e com sistema de cores padrão

RGB (red, green and blue). A câmera é ligada ao microscópio e ao

computador. O sistema utiliza também uma placa de conversão do sinal de

vídeo analógico para o formato digital, modelo Targa (Truevision, USA), com

tamanho de imagem de 640 x 480 pixeis e palavra de resolução de cores igual

a 24 bits. Para efetuar a análise nas imagens dos campos microscópicos

arquivados, foi utilizado o programa de processamento de imagem Image-Pro

Plus – 4.5 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD). Um teste piloto com

quinze casos não pertencentes à amostra atual foi realizado para treinamento

dos passos a serem seguidos com a utilização do computador. A análise das

lâminas de imuno-histoquímica seguiu modelo previamente sugerido (IRION

et al., 2003), conforme descrito a seguir.

• Seleção das imagens a serem digitalizadas:

Para os propósitos deste estudo, foram considerados os

microvasos tumorais e peritumorais, fora de zonas de necrose, sendo definido

como microvaso qualquer célula endotelial imunocorada e separada dos

microvasos adjacentes, das células tumorais e de outros elementos do tecido

conjuntivo (FONTANINI et al., 1996; FONTANINI et al., 1997(b)).

Primeiramente, através de aumento de baixa magnificação (25x –

objetiva de 2,5 e ocular de 10x) era realizada uma “varredura” da lâmina, para

localização da área contendo tumor. A seguir, com um aumento de 100x

(objetiva de 10x e ocular de 10x), eram determinadas três áreas com maior

concentração de microvasos, conhecidas na literatura como “hot spots”

(WEIDNER, 1993). Finalmente, com 200x de aumento (objetiva de 20x e

ocular de 10x), procedia-se à captura das imagens nos “hot spots” pré

determinados. A imagem capturada pela câmera de vídeo era imediatamente

transformada em uma imagem digital pela placa de digitalização e o

correspondente programa de computação.

Em cada lâmina proveniente dos espécimes cirúrgicos foram

capturadas imagens de seis diferentes campos microscópicos em cada “hot

spot”, totalizando dezoito campos fotografados para cada caso. O mesmo

procedimento foi seguido no momento da captura das imagens nas lâminas

provenientes das biópsias. Todavia, como o material disponível neste tipo de

amostra é muito menor que o obtido no espécime cirúrgico, nem todos os

casos apresentavam zonas de concentração de microvasos suficiente para a

obtenção das 18 imagens. A captura, então, foi feita objetivando o número

máximo de imagens possível conforme a extensão do fragmento. Casos nos

quais a quantidade do material de biópsia não permitia a obtenção de pelo

menos 14 imagens foram excluídos do estudo.

Todas as imagens digitalizadas dos campos microscópicos foram

arquivadas no computador em formato de arquivo de imagem codificada

(tagged image file format ou TIFF). Nas Figuras 3, 4 e 5 estão demonstrados

exemplos dos passos seguidos ao microscópio.

Figura 3 – Visão panorâmica (25x) de uma lâmina de imuno-histoquímica

com o anticorpo anti-CD34

Figura 4 – Escolha dos pontos de concentração microvascular (“hot spots”)

em aumento de 100x

Figura 5 – Aumento de 200x para a avaliação dos microvasos

• Análise das imagens digitais:

As imagens TIFF de cada caso foram analisadas com o auxílio do

programa Image-Pro Plus 4.5. Primeiramente, definiu-se o limiar de

positividade da reação imuno-histoquímica, ou seja, registrou-se no programa

a tonalidade mais tênue e a mais forte de marrom-acastanhado presente na

lâmina, revelada pelo cromógeno diaminobenzidina (DAB). A partir daí, o

programa analisa apenas os “objetos” corados dentro da faixa de tonalidades

estabelecidas e destaca em uma cor viva as áreas consideradas (Figuras 6a e

6b).

Figura 6a – Imagem digitalizada de campo microscópico com aumento de

200x antes de acionar o comando do programa analisador de imagem

Figura 6b – Imagem da figura anterior após acionado o comando, mostrando

exatamente o que foi reconhecido pelo programa para ser medido

O programa de computador foi calibrado para expressar a área

dos objetos (microvasos) identificados na imagem em micrômetros quadrados

– µm

. Esta calibragem permite que o programa compute a área total que os

objetos destacados ocupam em cada imagem TIFF. A medida de área e outros

dados calculados pelo programa são imediatamente transferidos para uma

planilha eletrônica do programa Microsoft Excel (Tabela 1). Este processo é

repetido para cada uma das imagens armazenadas de cada caso.

Tabela 1 – Exemplo de uma planilha do programa Microsoft Excel com o

valor de área total em cada uma das imagens analisadas pelo programa Image-

Pro Plus 4.5

images

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Stats Area Area Area Area Area Area Area Area Area Area Area Area Area Area Area Area Area Area

Min 2,5 3,25 2,5 3 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,75 2,5 2,75 2,5 3,75 2,5 2,75 2,75 2,5

Max 54,3 129 131 80,5 108 124 88,8 51,8 104 103 96,5 126 116 432,5 75,8 60,3 99,8 88,8

Range 51,8 126 129 77,5 105 121 86,3 49,3 101 101 94 123 113 428,8 73,3 57,5 97 86,3

Mean 18,5 40,2 34,2 30,1 18,3 21,6 16,1 13,9 24,7 32 34,7 36,5 25,5 73,96 15,1 17 16,1 16,1

Std.Dev 17,2 35,4 35 29,2 23,3 31,7 19,7 12,8 25,3 31,8 30,6 34 26,2 127,4 14,9 15,7 17,8 19,7

Sum 481 764 1267 512 788 280 708 404 791 480 417 365 408 888 633 458 692 708

A área total em cada imagem expressa em colunas corresponde ao valor identificado como somatório (Sum),

que traduz a soma das áreas de todos os objetos corados que foram analisados pelo programa.

3.5 Avaliação dos dados

Para fins de cálculos estatísticos, o valor da área vascular tumoral

considerada para cada lâmina avaliada correspondeu à media dos valores

(Sum) obtidos. No exemplo da lâmina acima (Tabela 1), a área vascular seria

614 µm

. O mesmo princípio foi seguido para determinar o valor individual

da área para cada caso de amostra de biópsia e de ressecção cirúrgica.

Com o auxílio do programa Microsoft Excel de manipulação de

planilhas, cada um desses valores individuais obtidos foram transferidos para

uma nova planilha de dados e organizados em duas colunas, uma com os

resultados da amostras das biópsias e a outra com os resultados das amostras

dos espécimes cirúrgicos.

A análise estatística foi realizada com o auxílio dos programas de

computador SPSS 8.0. Foram realizados o teste de correlação de Pearson e o

teste de Wilcoxon para amostras pareadas das medidas das áreas. O teste de

Mann-Whitney foi usado para comparar os resultados da área microvascular e

outras variáveis. Em todas as análises, um valor de P menor que 0,05 foi

considerado estatisticamente significativo.

3.6 Delineamento

Trata-se de estudo observacional, compreendendo a avaliação

dos microvasos identificados imuno-histoquimicamente em carcinomas

brônquicos não de pequenas células, através da medida computadorizada de

área vascular total por campo microscópico, em imagem digitalizada

proveniente das biópsias diagnósticas e respectivas peças cirúrgicas.

________________________________________________________________________

4. RESULTADOS

______________________________________________________________

4.1 Classificação histológica

A classificação por tipo histológico em espécimes cirúrgicos foi,

em geral, concordante com as respectivas amostras de biópsia. Apenas três

casos tiveram o laudo de biópsia referido genericamente como carcinoma não

de pequenas células, sendo posteriormente confirmados como

adenocarcinomas nas lâminas provenientes da ressecção cirúrgica. A

classificação histológica final, após confirmação pelas amostras provenientes

dos espécimes cirúrgicos, foi a seguinte: 18 (65%) adenocarcinomas, 6 (21%)

carcinomas epidermóides e 4 (14%) casos incluídos como outras variantes,

como o carcinoma adenoescamoso e o carcinoma de grandes células, ou casos

sem diferenciação morfológica específica pela lâmina corada por HE, que

foram classificados como carcinoma não de pequenas células.

Quanto à determinação da diferenciação da neoplasia, levou-se

em consideração o material proveniente de ressecção cirúrgica. A imensa

maioria dos adenocarcinomas foi classificada como moderadamente

diferenciado (doze casos, 67%), sendo cinco casos (28%) classificados como

pouco diferenciados e apenas um (5%) como adenocarcinoma bem

diferenciado. Entre os seis casos de carcinoma epidermóide, quatro foram

classificados como pouco diferenciados e dois como moderadamente

diferenciados (Figura 7).

Distribuição da graduação histológica nos casos de adenocarcinoma e carcinoma epidermóide

provenientes dos espécimes cirúrgicos

Adenocarcinoma Carcinoma Epidermóide

Neoplasia

Número de casos

Bem diferenciado

Moderadamente diferenciado

Pouco diferenciado

Figura 7 – Distribuição da graduação histológica nos casos de

adenocarcinoma e carcinoma epidermóide provenientes dos espécimes

cirúrgicos

4.2 Estadiamento

Em relação ao estadiamento pelo sistema TNM, 3 casos foram

classificados como T1, 21 como T2, 4 como T3 e nenhum caso T4. Foi

constatada presença de metástase em linfonodos em 11 (39,28 %) pacientes,

dos quais 7 foram N1 e 4 foram N2 (Tabela 2). A maior parte dos pacientes

concentrou-se nos estágios IB, IIB e IIIA, com 12, 8 e 5 pacientes,

respectivamente (Tabela 3).

Tabela 2 – Distribuição dos pacientes em relação ao TNM

Pacientes ( % )

N0 N1 N2

T1 2 (7,14 %) 1 (3,57 %) 0

T2 12 (42,86%) 5 (17,85 %) 4 (14,29 %)

T3 3 (10,71 %) 1 (3,57 %) 0

T4 0 0 0

Tabela 3 – Distribuição dos pacientes em relação ao estadiamento

GRUPOS

PACIENTES

IA 2 (7,14 %)

IB 12 ( 42,86 %)

IIA 1 (3,57 %)

IIB 8 (28,58 %)

IIIA 5 (17,85 %)

IIIB 0

4.3 Avaliação dos microvasos

A coloração das lâminas submetidas ao processo de exame

imuno-histoquímico com anticorpo anti-CD 34 apresentou boas condições de

interpretação, com boa qualidade nos resultados da reação, que mostrou-se

altamente específica e com mínima ou inexistente coloração de fundo

(“background”) (Figuras 8a e 8b).

Figura 8a – Microvasos identificados com anticorpo anti-CD 34 em lâmina de

biópsia

Figura 8b – Microvasos identificados com anticorpo anti-CD 34 em lâmina

proveniente de um espécime cirúrgico

A eventual presença de pigmento carbônico, antracose, nos

cortes histológicos do tumor não trouxe maiores dificuldades na análise das

imagens pelo programa de computador, não sendo, portanto, uma causa de

erro de mensuração em nossa amostra, conforme ilustrado nas Figuras 9a e

9b.

Figura 9a – Imagem de campo microscópico incluindo área de antracose no

canto inferior esquerdo antes de acionar o comando do programa

analisador de imagem

Figura 9b – Imagem da figura anterior após o comando do programa

analisador de imagem, mostrando o que foi considerado

4.3.1 Área dos microvasos

A medida da área de microvasos nas amostras de biópsia por

agulha apresentou uma média de 5093,6 µm

, variando entre 233,47 µm

17916,89 µm

, enquanto o resultado da média da área de microvasos nas

lâminas provenientes dos espécimes de ressecção cirúrgica foi 3599,38 µm

variando entre 376,91 µm

e 9514 µm

Encontrou-se forte correlação entre os valores de área vascular

nos fragmentos de biópsias e nos espécimes cirúrgicos, com coeficiente de

correlação de Pearson de 0,7 e valor P<0,0001.

A média das áreas de microvasos foi considerada ponto de corte

a fim de dividir os pacientes em dois subgrupos (alta e baixa área vascular

tumoral).

Primeiramente, utilizando-se como ponto de corte a média das

amostras das biópsias para dividi-las em alta e baixa densidade vascular,

encontrou-se uma correlação significativa entre os grupos de biópsias

assumidos como de baixa área vascular e respectivas peças cirúrgicas (r 0,84

e P = 0,0005). Por outro lado, não houve correlação significativa entre os

grupos de alta densidade vascular (r 0,06 e P = 0,84).

Por sua vez, utilizou-se também a média das áreas vasculares nas

amostras dos espécimes cirúrgicos como ponto de corte para subdividi-las em

grupos com alta e baixa área vascular. Foi verificada novamente uma

correlação significativa entre os grupos de baixa área vascular nos espécimes

cirúrgicos e respectivas biópsias (r 0,76 e P = 0,01). Não houve correlação

significativa entre os grupos considerados como de alta área vascular (r –0,22

e P = 0,45), à semelhança do que foi encontrado quando utilizada a média das

áreas das biópsias como ponto de corte.

Houve uma diferença significativa das medidas entre as amostras

das biópsias e dos espécimes cirúrgicos, com valores tendendo a ser menores

nas peças cirúrgicas (P = 0,02). Isto foi traduzido pelo fato de que em 20 dos

28 casos (71,5 %) a área vascular foi maior na biópsia que na peça cirúrgica,

enquanto em 8 casos (28,5 %) a maior área vascular ocorreu no espécime

cirúrgico.

4.3.2 Área vascular e outras variáveis

Na população estudada, não foi encontrada diferença

significativa ao avaliar-se a área dos microvasos nas biópsias e nas peças

cirúrgicas em relação ao comprometimento linfonodal e ao estadiamento

clínico (Tabela 4).

Tabela 4 – Avaliação das áreas dos microvasos nas biópsias e peças cirúrgicas

em relação ao comprometimento linfonodal e ao estadiamento clínico

Número de

pacientes

Biópsias

(Média/mediana)

Espécimes cirúrgicos

(Média/mediana)

Sem metástase

linfonodal

5171,4

1777,8

2925,5

1573,5

Com metástase

linfonodal

4973,3

3573,0

4640,8

6554,1

P = 0,75 P = 0,24

Até estágio IB

5399,2

2279,4

3180,0

1612,2

A partir de IIA

4788,0

3376,5

4018,8

4236,2

P = 0,78 P = 0,78

4.4 Resumo dos resultados

• Achados gerais:

O resumo dos achados clínicos, histológicos e as medidas

vasculares de cada caso encontram-se na Tabela 5.

Tabela 5 – Principais achados nos 28 casos

MÉDIAS DAS ÁREAS

CASOS IDADE SEXO DIAGNÓSTICO TNM

Estadiamento

Biópsia Cirurgia

1 62 M Adenocarcinoma T3N0 IIB 539,80 666,68

2 68 M Epidermóide T2N0 IB 1040,26 376,91

3 75 M Epidermóide T2N2 IIIA 764,27 613,47

4 70 F Epidermóide T2N0 IB 1547,11 681,80

5 74 F Adenocarcinoma T2N1 IIB 12453,07 5705,16

6 58 M Adenocarcinoma T2N0 IB 8952,27 5315,66

7 78 M ca grandes cel T2N1 IIB 3573,00 5664,11

8 72 F Adenocarcinoma T2N0 IB 386,52 799,62

9 43 F Adenoescamoso T2N0 IB 1163,20 806,44

10 59 M não peq cel T1N0 IA 755,63 423,65

11 64 M não peq cel T3N0 IIB 337,62 444,12

12 77 M Adenocarcinoma T2N2 IIIA 1378,38 965,83

13 72 M Epidermóide T3N1 IIIA 233,47 513,13

14 78 M Adenocarcinoma T2N1 IIB 1506,26 613,54

15 63 M Adenocarcinoma T1N0 IA 3486,87 1573,51

16 66 M Adenocarcinoma T2N0 IB 1764,30 1051,38

17 72 F Adenocarcinoma T2N0 IB 1777,78 1650,93

18 79 M Adenocarcinoma T2N0 IB 2781,00 6609,22

19 69 F Adenocarcinoma T2N0 IB 11192,57 8439,72

20 64 M Epidermóide T3N0 IIB 11448,40 4102,88

21 86 M Adenocarcinoma T2N2 IIIA 9553,20 9514,00

22 71 M Adenocarcinoma T2N2 IIIA 3180,00 7358,27

23 68 M Epidermóide T2N1 IIB 9036,27 4369,55

24 69 F Adenocarcinoma T2N0 IB 14068,00 6439,22

25 73 M Adenocarcinoma T1N1 IIA 8456,33 6540,94

26 83 F Adenocarcinoma T2N0 IB 17916,89 5878,72

27 66 M Adenocarcinoma T2N0 IB 8756,00 4473,66

28 77 F Adenocarcinoma T2N1 IIB 4572,58 9190,72

• Área de microvasos:

O valor da média da área de microvasos corados nas amostras de

biópsia foi 5093,6 µm

, enquanto o valor da média da área de microvasos

corados nas amostras de ressecção cirúrgica foi 3599,38 µm

Houve uma tendência dos valores de área nas amostras de

biópsia serem maiores que os valores encontrados nas peças cirúrgicas

subseqüentes (P = 0,02).

• Correlações:

As correlações efetuadas estão resumidas na Tabela 6 a seguir.

Tabela 6 – Correlações entre áreas de microvasos

Coef. de

Correlações

Correlação P

Área media nas biópsias

Área media nas peças

cirúrgicas

0,7

<0,0001

Divisão dos grupos pela media da área vascular nas biópsias

Biópsias com baixa área

vascular

x Área vascular nas peças

cirúrgicas correspondentes

0,84 0,0005

Biópsias com alta área

vascular

x Área vascular nas peças

cirúrgicas correspondentes

0,06 0,84

Divisão dos grupos pela media da área vascular nas peças cirúrgicas

Tumores com baixa área

vascular

x Área vascular nas biópsias

correspondentes

0,76 0,01

Tumores com alta área

vascular

x Área vascular nas biópsias

correspondentes

-0,22 0,45

___________________________________________________________

5. DISCUSSÃO

___________________________________________________________

A angiogênese tumoral é hoje uma realidade importante tanto nas

pesquisas como também na prática clínica, abrindo novas frentes de

investigação, que envolvem equipes das mais diversas áreas como clínica,

diagnóstica, biologia molecular e genética, medicina experimental e indústria

farmacêutica. Muito das novas descobertas a respeito do papel e dos meios de

controle da angiogênese no ser humano deve-se às pesquisas em tumores

(MORRELL et al., 1999). No presente estudo, investigou-se a angiogênese no

carcinoma brônquico não de pequenas células através da avaliação da área de

microvasos tumorais, verificando-se a correlação entre amostras de biópsia

por agulha e subseqüentes espécimes cirúrgicos.

Como em trabalho anteriormente realizado nesta linha de

pesquisa e com população de origem demográfica semelhante, houve um

número maior de pacientes do sexo masculino (IRION et al., 2003). Isto

provavelmente deve-se ao fato desta neoplasia pulmonar estabelecer-se após

anos de exposição contínua a agentes presentes no cigarro, por exemplo.

Como, há algumas décadas o número de mulheres fumantes era muito menor

que o de homens, as estimativas nacionais mostram que a incidência de

mulheres com câncer de pulmão ainda permanece menor que a incidência de

homens com esta neoplasia (17.850 casos novos estimados em homens e

9.320 em mulheres para o ano de 2006) (INCA, 2005). Por outro lado,

sabendo-se que no sexo masculino já há uma tendência de declínio na taxa de

fumo, espera-se que o número de casos novos de carcinoma brônquico

também reduza nas próximas décadas.

Quanto à freqüência dos tipos histológicos, parece ter havido

uma desproporção entre o número de carcinomas epidermóides e de

adenocarcinomas na nossa amostra, estes ocorrendo em muito maior número.

Historicamente, o carcinoma epidermóide vinha sendo o tipo histológico

predominante entre os carcinomas brônquicos (CARBONE, 1997). Nos

últimos anos, porém, tem sido observada uma tendência de casos crescentes

de adenocarcinomas. Hoje em dia, nos Estados Unidos e no Japão, a

incidência de adenocarcinomas já é maior que a de carcinomas epidermóides

(ANDRE et al., 1999; CARBONE, 1997; TAKEDA et al., 2005). Nossos

dados parecem ser concordantes com a tendência mundial, mas a marcante

desproporção entre número de adenocarcinomas e carcinomas epidermóides

poderia, de outra forma, ser explicada pelo tamanho mais restrito da presente

amostra. Este dado pode, ainda, ser reflexo da seleção amostral, que incluiu

pacientes submetidos a biópsia tecidual por agulha e, por sua vez, com

tumores mais periféricos.

Assim como em outras neoplasias, o estadiamento de acordo com

o TNM tem sido o parâmetro de escolha para a tradução da extensão da

neoplasia e a escolha do tratamento mais adequado (MOUNTAIN, 1997). A

distribuição dos pacientes em relação ao estadiamento seguiu a tendência

encontrada por Irion anteriormente (IRION et al., 2003). Tanto na amostra

atual como na amostra estudada previamente houve predominância do grupo

IB em relação ao estadiamento clínico final. A maioria das lesões

corresponderam ao estágio T2 no momento da cirurgia (42,86 % no presente

estudo e 30 % no estudo prévio). Em relação ao comprometimento

mediastinal, houve uma pequena diferença entre os estudos. Cerca de 60 %

dos casos atuais não apresentou metástase linfonodal, e pouco mais da metade

dos casos anteriores tiveram confirmação histológica de metástase em

linfonodos mediastinais (IRION et al., 2003).

A avaliação da angiogênese em tumores vem ganhando crescente

destaque nos últimos anos, havendo fortes evidências de seu papel no

crescimento e disseminação tumoral (LE QUERREC et al., 1993; SHARMA

et al., 2005; WEIDNER, 1993). Inúmeras variações do tema estão sendo

exploradas em relação ao câncer de pulmão e outros tipos, incluindo a

verificação da expressão de VEGF (fator de crescimento vascular endotelial)

(FERRARA & DAVIS-SMYTH, 1997; HUANG et al., 2005; INAI et al.,

2004, NÖR et al., 1999) e também de vários outros agentes angiogênicos e

anti-angiogênicos endógenos ou não, como timosina-β4 (CHA et al., 2003),

fator inibidor da migração do macrófago (WHITE et al., 2003),

trombospondina (Mascaux et al., 2002), colágeno XVIII (CHANG et al.,

2004) e outros (SHIMAMURA et al., 2003; YUAN et al., 2000). Realizando

uma elegante revisão do assunto, Kong e Crystal mostraram os principais

mediadores angiogênicos pesquisados produzidos por células tumorais e seus

respectivos efeitos nas células endoteliais (KONG & CRYSTAL, 1998).

Adicionalmente, novos testes para avaliação indireta da angiogênese estão

sendo empregados, explorando a combinação de métodos diagnósticos

diversos como imunocintilografia, tomografia computadorizada convencional

com avaliações de densidade antes a após injeção de meio de contraste

endovenoso e também tomografia por emissão de pósitrons (PET-scan) (LEE

et al, 2003; MORGAN et al., 2004; SANTIMARIA et al., 2003; VERONESI

et al., 2002; XIE et al., 2005).

Apesar das variadas formas disponíveis de avaliação dos

mecanismos relacionados com a angiogênese tumoral, a quantificação do

produto final da interação destes mecanismos, ou seja, dos microvasos

neoformados permanece sendo uma opção bastante confiável (SHARMA et

al., 2005; VERMEULEN et al., 1996).

Pode-se dizer que uma forma prática de avaliar a densidade de

microvasos tumorais e peritumorais é através do exame imuno-histoquímico

com um anticorpo que identifique a célula endotelial. Há muitos marcadores

que podem ser utilizados para identificar o endotélio vascular, sendo CD 34,

CD 31, CD 105 e fator VIII os mais comumente utilizados (FINA et al., 1990;

FONTANINI et al., 1995; MEERT et al., 2002; MEHTA et al., 2001;

MATSUYAMA et al., 1998; SAAD et al., 2004). Alguns poucos trabalhos

ainda utilizaram o anticorpo anti-Ulex europaeus aglutinina como marcador

endotelial (HOLLINGSWORTH et al., 1995; SRIVASTAVA et al., 1988).

Como anteriormente referido, o anticorpo anti-CD 34 permite identificar

microvasos de calibres menores com maior precisão que o anti-Fator VIII.

Segundo Tanigawa, o anticorpo anti-CD 34 é mais sensível e mais específico

que o anticorpo anti-fator VIII na impregnação das células endoteliais em

cortes histológicos contíguos (TANIGAWA et al., 1996). Em um trabalho

envolvendo carcinomas ovarianos, Hollingsworth e colaboradores tinham o

objetivo de realizar uma comparação da eficácia da reação imuno-

histoquímica entre os anticorpos anti-CD 34, anti-Fator VIII e anti-Ulex

europaeus aglutinina. Como houve uma subcoloração do epitélio vascular em

aproximadamente 50 % dos cortes histológicos submetidos aos anticorpos

anti-Fator VIII e anti-Ulex europaeus aglutinina, os autores realizaram as

correlações clínicas apenas com os resultados do processamento com o

anticorpo anti-CD 34 (HOLLINGSWORTH et al., 1995). Na experiência de

Alves e colaboradores, o anticorpo anti-CD 34 tem mostrado ser mais sensível

que o CD 31 (ALVES et al., 1999). Ao utilizar-se o anticorpo anti-CD 31,

regiões com um infiltrado inflamatório proeminente podem ser erroneamente

interpretadas como uma área de alta densidade vascular, especialmente se a

averiguação for realizada utilizando uma lente de baixa magnificação

(VERMEULEN et al., 1996). Khatami e colegas fizeram um teste piloto com

os anticorpos anti-CD31, anti-CD34 e anti-fator VIII para fazer a escolha do

anticorpo em seu estudo sobre carcinomas de próstata. Baseados nesta

comparação, eles optaram pelo anti-CD 34 por ressaltar os vasos com mais

clareza (KHATAMI et al., 2005). Em uma comparação entre os anticorpos

anti-CD 31 e anti-CD 105 em carcinomas de cólon, Saad e colegas

concluíram que a endoglina (CD 105) é um marcador de células endoteliais

mais sensível e específico que o anti-CD 31, por identificar um número maior

de vasos proliferantes nesta neoplasia, além de apresentar importância

prognóstica significativa (SAAD et al., 2004). Em trabalho realizado em

carcinomas de pulmão, Tanaka e equipe compararam os resultados da

utilização dos anticorpos contra CD 34 e CD 105. Por ser mais específico, a

média da contagem de microvasos com anti-CD 105 foi menor que a média

com anti-CD 34. Ambos apresentaram correlação significativa com o VEGF,

mas apenas anti-CD 105 mostrou correlação significativa com pior

prognóstico no carcinoma brônquico não de pequenas células (TANAKA et

al., 2001). Por outro lado, em um estudo mais abrangente comparando a

importância da utilização dos anticorpos anti-CD 34, anti-CD 31 e anti-CD

105 em células endoteliais e também anti-VEGF em células tumorais,

novamente em carcinomas de pulmão, foi mostrado que tanto anti-CD 105

como anti-CD 34 são marcadores significativos de neoangiogênese.

Interessante, porém, foi o fato de que anti-CD 105 foi excluído em análise

multivariada de sobrevida. VEGF, invasão vascular e apenas anti-CD 34 entre

os marcadores endoteliais tiveram significância prognóstica em casos de

carcinoma brônquico estágios IB-IIA (MINEO et al., 2004). A utilização do

anticorpo anti-CD 34 foi também sugerida no segundo consenso internacional

para avaliação da angiogênese (VERMEULEN et al., 2002). Novos

marcadores pan-endoteliais e marcadores endoteliais tumorais foram

recentemente descobertos, mas testes clínicos ainda estão em andamento para

revelar sua eficácia como marcadores prognósticos ou alvos terapêuticos

(VERMEULEN et al., 2002).

Apesar de aparentemente não haver um marcador endotelial

perfeito, a eleição do anticorpo anti-CD 34 para facilitar a discriminação dos

microvasos, em nosso estudo, mostrou-se adequada, pois ofereceu lâminas de

fácil interpretação, praticamente sem artefatos, como coloração de fundo

(“background”) e sem reações cruzadas com epitélio vascular linfático ou

células estromais, bem como possibilitou que o programa de computador

distinguisse focos de antracose e verdadeiros microvasos. Estas características

são fundamentais para o desenvolvimento de pesquisas que envolvem a

utilização de programas de computador para análise de imagem, facilitando a

automação e aumentando a credibilidade dos resultados.

Da mesma forma que a escolha do anticorpo para célula

endotelial, o método da quantificação dos microvasos é de fundamental

importância no estudo da angiogênese. O primeira evidência de análise

quantitativa da angiogênese em tumores foi baseada em melanomas cutâneos

(SRIVASTAVA et al., 1988). A grande maioria das pesquisas, entretanto,

baseou-se na publicação de Weidner e colegas para seleção da área tumoral a

ser estudada, independentemente do tipo de neoplasia em questão

(WEIDNER et al., 1991). Este método propõe a contagem de microvasos em

um campo microscópico a partir de áreas previamente escolhidas com o uso

de uma lente magnificação menor, nas quais existe a impressão visual de

numerosos microvasos, conferida pela maior concentração de células

endoteliais coradas através de imuno-histoquímica (VERMEULEN et al.,

2002). A avaliação dos microvasos nestas áreas de maior vascularização, mais

conhecidas como “hot spots”, usando microscopia óptica e sem o

conhecimento das informações clínicas dos pacientes é ponto comum em

quase todos os estudos sobre o assunto (SHARMA et al., 2005). Assim sendo,

a exemplo das demais pesquisas, realizamos a quantificação dos microvasos a

partir dos pontos de concentração vascular ou “hot spots”.

Enquanto a escolha dos “hot spots” como a área de interesse é

quase unânime, há muita variação nos critérios de seleção dos pacientes, do

número de “hot spots” e dos métodos de avaliação dos microvasos, além da

escolha do marcador endotelial, como previamente mencionado (SHARMA et

al., 2005). Isto verifica-se no fato de que, alguns trabalhos utilizaram apenas

um “hot spot” para a avaliação de neovasos, enquanto outros avaliaram

número maior de “hot spots” até um máximo de 10 (FONTANINI et al.,

1997(a); GASPARINI et al., 1993; GIATROMANOLAKI et al., 1997;

GIATROMANOLAKI et al., 1998; HARPOLE et al., 1996; VERMEULEN

et al., 1996). Da mesma forma, não parece haver consenso em termos de

classificação e graduação dos resultados. Quando há a averiguação de mais de

um campo microscópico, alguns autores consideram apenas a contagem

máxima obtida para avaliação estatística, enquanto outros baseiam os cálculos

no valor médio ou até mesmo na mediana da contagem de microvasos

(ANGELETTI et al., 1996; GIATROMANOLAKI et al., 1998; MINEO et al.,

2004; YUAN et al., 1995). Alguns estudos utilizaram valor da média da

contagem visual dos microvasos de todos os casos como ponto de corte para

dividir os casos em dois grandes grupos: de alta ou baixa densidade vascular

(BENOY et al., 2005; FONTANINI et al., 1995; IRION et al., 2003). Outra

forma descrita para estratificar os pacientes é a divisão dos casos entre três e

cinco faixas diferentes de densidade vascular (GIATROMANOLAKI et al.,

1996; JUCZEWSKA et al., 2001; ÖZUYSAL et al., 2003; WEIDNER, 1993).

A contagem visual de microvasos em determinado(s) campo(s)

microscópico(s) é uma das técnicas de quantificação de angiogênese bastante

utilizada. Outras técnicas descritas são o método de Chalkley e a opção semi-

automatizada com análise de imagem. O método de contagem de objetos

proposto por Chalkley em 1943 começou a ser utilizado para a avaliação da

angiogênse em carcinomas de mama por Fox e colegas (FOX et al., 1995).

Este método, baseado na adaptação de uma gratícula com vinte e cinco pontos

aleatórios no microscópio, que deve ser girada em torno de seu eixo central

até que o maior número pontos encubra o maior número de objetos

(microvasos corados pela imuno-histoquímica). Esta técnica foi empregada

em outros estudos (BENOY et al., 2005; HANSEN et al., 2000; HANSEN et

al., 2004; SHARMA et al., 2005). Uma vantagem atribuída a este método, é a

ausência de um passo altamente dependente do observador ao medir a

densidade vascular pelo método da contagem numérica visual de microvasos:

decidir se duas estruturas adjacentes imunocoradas são realmente dois vasos

sangüíneos isolados ou apenas a dobra de um vaso único. Como o método de

Chalkley conta o número de pontos da gratícula que coincidentemente

estariam sobrepostos aos microvasos corados, esta é a uma medida relativa ao

invés de uma verdadeira contagem de objetos (VERMEULEN, et al., 2002).

O terceiro, mas não menos interessante, método de avaliação dos

microvasos é o que utiliza sistemas multiparamétricos computadorizados de

análise de imagem, sendo este método por nós eleito para realização do

presente trabalho. Como as duas alternativas anteriores, este sistema permite

quantificar a angiogênese em um campo selecionado a partir da identificação

dos “hot spots”. Possui também a vantagem de que, com o auxílio da análise

semi-automática efetuada pelo computador, o processo torna-se menos

dependente da intervenção do investigador (VERMEULEN et al., 1996).

Diversos estudos realizaram a aferição da angiogênese com análise

computadorizada de imagem, mas em geral utilizaram sistemas

computadorizados distintos e em diferentes tipos de tumores, como por

exemplo o carcinoma de colo uterino, avaliado pelo programa de computador

denominado Vidas 25 (TJALMA et al., 1998), o carcinoma de endométrio

com o programa KS300 (SPECK et al., 2003), o adenocarcinoma colo-retal

com o programa SigmaScan 2.0 (PAVLOPOULOS et al., 1998) e o

carcinoma de mama com o programa Quantimet 600S (OLEWNICZAK et al.,

2003). Fujishita et al estudaram fatores angiogênicos em endométrio e

endometriose com o auxílio do programa de computador Mac SCOPE

(FUJISHITA et al., 1999). Goddard e colegas testaram um modelo de medida

de densidade vascular com sistema computadorizado de imagem em tumores

sólidos (GODDARD et al., 2002), com a intenção de diminuir o tempo de

avaliação e aumentar a confiabilidade e reproducibilidade do processo. Eles

realizaram a comparação do sistema convencional de contagem de

microvasos com o sistema computadorizado em carcinomas de bexiga, cólon

e pulmão e em metástases hepáticas. Para isto, foi utilizada uma câmera de

vídeo JVC KYF50 conectada a um microscópio Nikon, sendo o sinal de vídeo

enviado para um computador Apple Macintosh G-3. As imagens eram, então,

transferidas para o programa NIH Image. Uma rotina de seqüência semi-

automática de passos na execução do programa (rotina “macro”) foi criada no

computador, com comandos para identificar as imagens coloridas e convertê-

las em uma escala de cinza e desconsiderar os elementos claros. A macro,

então, instruía o computador a contar os microvasos corados, que na tela

apareciam em cinza escuro. O processo de contagem foi repetido

manualmente na imagem da tela do computador. Para auxílio do observador,

cada vaso contado era marcado com um ponto preto conferido por um “click”

do “mouse” do computador sobre a imagem. No final da avaliação, o

programa do computador fazia a contagem do total de objetos marcados em

preto. Eles encontraram uma boa correlação entre os dois métodos nos

diferentes tumores estudados, exceto nos tumores de pulmão, nos quais não

foi possível realizar a avaliação computadorizada pela presença de pigmento

antracótico no tecido pulmonar. Como a deposição de carbono (antracose) nos

tecidos confere uma coloração enegrecida, o programa não tinha a capacidade

de diferenciação entre a cor escura deste pigmento e os tons de cinza escuro

artificialmente conferidos aos microvasos neste sistema de avaliação em tons

de cinza. A vantagem do sistema por nós empregado, é a utilização da análise

em sistemas de cores reais, baseado na combinação das cores vermelho, verde

e azul (sistema de cores “RGB”), que permitiu ao programa distinguir entre o

tom muito próximo do preto nas áreas de antracose e as tonalidades

acastanhadas dos microvasos marcados pela diaminobenzidina (DAB), que é

um cromógeno tradicional para a técnica de imuno-histoquímica. Desta

forma, a eventual presença de pigmento carbônico nos tecidos não foi uma

causa de erro de mensuração em nossa amostra.

Acredita-se, sobretudo, que a principal vantagem de um sistema

computadorizado sobre os demais seria a possibilidade de explorar outros

tipos de variáveis durante a avaliação dos vasos. Uma das maiores vantagens

é que, uma vez selecionados os campos da lâmina a serem processados, a

imagem deste campo será armazenada em formato digital, a qual poderá ser

reutilizada e mesmo reprocessada inúmeras vezes, sem perder a qualidade e a

sua forma original. Isto já não pode ser feito se as imagens não são salvas ou

quando as imagens são documentadas em formatos não digitais como em

papel ou filme de transparências. O armazenamento digital das imagens

permite então que as imagens arquivadas em um disco ou outra mídia de

computador possam ser resgatadas em sua forma original, a qualquer

momento e testadas sob diferentes formas. Além da tradicional contagem de

microvasos, que neste momento pode ser realizada tanto visualmente (como

no microscópio óptico), como de maneira semi-automática utilizando-se um

programa de computador adequado, ainda há a alternativa de medir a área

vascular total no campo, o tamanho dos vasos, o perímetro vascular, entre

outras características (PAVLOPOULOS et al., 1998). Em nosso estudo, o

analisador de imagem foi utilizado para determinar a área de microvasos

corados em cada uma das imagens digitalizadas. O programa de computador

Image-Pro Plus 4.5 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) foi considerado

adequado para realização das medidas, calculando a área de objetos

(microvasos) corados e salvando os resultados diretamente no programa

Microsoft Excel. O mesmo programa para análise de imagem foi também

utilizado em outros estudos, como por exemplo: para avaliação do epitélio

escamoso displásico e angiogênico nos brônquios de indivíduos com alto

risco de desenvolver câncer de pulmão (KEITH et al., 2000); para análise do

crescimento microvascular a partir de anéis da aorta de ratos (BLATT et al.,

2004); para análise da pele de ratos após a injeção de estimuladores da

angiogênese (LUBIATOWSKI et al., 2002; PADUBIDRI & BORWNE,

1996) e para outras pesquisas na área da saúde (CARAI et al., 2002; XAVIER

et al., 2005).

O primeiro trabalho sugerindo a importância prognóstica da

angiogênese em tumores foi baseado na medida da área de capilares, sendo

elegantemente demonstrado que nos casos de melanoma cutâneo com

metástases a área de capilares na base do tumor primário duas vezes maior

que nos casos sem comprovação de metástases (SRIVASTAVA et al., 1988).

Hoje em dia, a medida de área microvascular total é um parâmetro aceito de

avaliação da angiogênese e possui um conceito definido: corresponde a área

ocupada por microvasos por unidade de área do tumor, obtida usando uma

objetiva de magnificação específica em um determinado microscópio e em

um limitado número de campos, subjetivamente selecionados a partir das

zonas mais vascularizadas do tumor (“hot spots”). O processo de seleção dos

“hot spots” é o mesmo utilizado na densidade microvascular (contagem visual

de microvasos) (SHARMA et al., 2005). Em estudo prévio, foi feita uma

comparação entre o método da densidade microvascular (contagem visual de

microvasos) e a medida da área microvascular total em imagens digitalizadas

de casos de carcinoma brônquico não de pequenas células (IRION et al.,

2003). As duas análises foram realizadas nas mesmas imagens em cada caso,

sem o conhecimento prévio dos resultados parciais de cada uma. Os

resultados foram correlacionados com o tempo de sobrevida dos pacientes em

até cinco anos. Naquela pesquisa mostrou-se que a medida da área

microvascular total teve melhor correlação, negativa, com a sobrevida

naquele grupo de pacientes do que fora encontrado correlacionando-se a

sobrevida com o número de vasos. Adicionalmente, um estudo sobre tumores

cerebrais astrocíticos também mostrou que, apesar da densidade

microvascular, a área microvascular total e a contagem de ramificações dos

vasos correlacionarem-se negativamente com a sobrevida livre de doença,

apenas a medida da área microvascular total permaneceu estatisticamente

significativa em análise multivariada. (KORKOLOPOULOU et al., 2002).

Vale a pena mencionar que o trabalho sobre astrocitomas e o estudo

envolvendo carcinomas de pulmão mencionados utilizaram o mesmo

anticorpo (anti-CD 34) para realçar os microvasos tumorais. Em carcinoma

transicional de bexiga foi, mais uma vez, demonstrado que a área

microvascular total é um bom preditor de sobrevida livre de doença nos

tumores superficialmente invasivos (KORKOLOPOULOU et al., 2001). Em

outro exemplo, desta vez em análise de melanomas uveais, foi relatado que a

porcentagem de área ocupada pelas malhas vasculares do tumor confere

informação prognóstica significativa comparada com parâmetros prognósticos

mais tradicionais para esta neoplasia (MEHAFFEY et al., 1997). Pavlopoulos

e colegas, estudando a angiogênese no adenocarcinoma colo-retal,

compararam a significância prognóstica em relação à sobrevida da contagem

de microvasos com outros parâmetros morfométricos, como área vascular

total, perímetro, eixo maior, eixo menor e outros. A análise foi realizada com

auxílio de programa de computador em “hot spots”, chegando-se à conclusão

de que a área vascular total foi o parâmetro morfométrico com significância

prognóstica. Em adenocarcinomas estágios B e C de Dukes, os casos com

menor área vascular total tiveram melhores taxas de sobrevida

(PAVLOPOULOS et al., 1998).

Alternativas para emprego de métodos computadorizados têm

sido recentemente testadas, utilizando sistemas automatizados em todas as

etapas de avaliação. Estes sistemas deveriam ser inclusive capazes de

identificar “hot spots” de uma maneira eficaz e confiável, através de uma

varredura motorizada em toda a extensão de uma lâmina histológica

(VERMEULEN et al., 2002). Desta forma, o método seria mais objetivo,

sendo evitada qualquer intervenção humana. Os resultados com esses novos

sistemas ainda são preliminares, fazendo-se necessária uma redução tanto dos

custos de implementação como do tempo gasto pelo sistema e da

complexidade de execução, para que sejam atrativos para utilização rotineira

em um laboratório convencional (FOX & HARRIS, 2004; VERMEULEN et

al., 2002).

Fundamentados nos resultados demonstrados até então, achamos

que a medida da área microvascular total pode ser um método útil de escolha

e também confiável na avaliação da angiogênese tumoral. Como esse é um

método de fácil realização e disponível em nosso meio, tivemos o interesse de

testá-lo em amostras teciduais com dimensões mais restritas, como as biópsias

diagnósticas por agulha, onde encontramos presença de forte correlação entre

os valores médios nas biópsia e nos subseqüentes espécimes cirúrgicos em

casos de carcinoma brônquico não de pequenas células.

A vasta maioria dos estudos sobre angiogênese tumoral foram

realizados em amostras provenientes de cirurgia radical. Poucos trabalhos

envolvendo tumores de próstata e mama foram baseados em espécimes de

biópsia apenas (BOSTWICK et al., 1996; KHATAMI et al., 2005; MARSON

et al., 1999). Não é de nosso conhecimento a existência de publicação

envolvendo avaliação microvascular em biópsias diagnósticas e em peças

cirúrgicas em casos de carcinomas de pulmão, o que limita a comparação de

resultados. Em um estudo envolvendo carcinomas de próstata, foi realizada a

comparação da densidade microvascular tumoral, ou seja, a contagem visual

de microvasos, em biópsias pré-operatórias e em espécimes de

prostatectomias (ROGATSCH et al., 1997). Os resultados daquele estudo

apontaram uma correlação significativa entre as duas medidas (r 0,89; P <

0,0001). Posteriormente, Yorukoglu e colegas encontraram resultados

semelhantes também analisando carcinomas de próstata (YORUKOGLU et

al., 1999). Foi concluído que a avaliação microvascular usando o número de

microvasos em biópsias diagnósticas transretais de próstata correlaciona-se

bem com os espécimes de cirurgia radical. Foi sugerido, ainda, que biópsias

pré-operatórias poderiam predizer as características gerais da

neovascularização tumoral, com possível impacto no estadiamento da doença

e no entendimento do comportamento biológico da neoplasia. Em outros dois

estudos envolvendo carcinomas de próstata, a realização avaliação da

angiogênese em biópsias por agulha é incentivada para comparação com os

dados após a cirurgia radical e como fator sinalizador de recorrência

(BOSTWICK & ICZKOWSKI, 1998; KHATAMI et al., 2005). Esses

resultados encorajadores não foram, porém, encontrados ao serem estudados

carcinomas de mama (MARSON et al., 1999). Marson e colaboradores não

encontraram correlação significativa entre a densidade de microvasos pelo

método de Chalkley em biópsias de carcinomas de mama e subseqüentes

espécimes cirúrgicos (r - 0,1). Ao comparar os resultados de outros espécimes

cirúrgicos com os de biópsias nas próprias peças cirúrgicas, realizadas

imediatamente após a ressecção, foi encontrada uma correlação positiva, mas

tal correlação falhou em atingir significância estatística (r 0,44; P = 0,09). Há

ainda um trabalho sobre tumores de mama verificando a correlação entre a

expressão de VEGF mRNA em amostras para citologia por punção aspirativa

(RT-PCR) e a densidade vascular tumoral em ressecções cirúrgicas (immuno-

histoquímica, anti-CD 31) (ANAN et al., 1997). Neste estudo, Anan e colegas

encontraram significativa correlação entre as duas variáveis (r 0,87 e P =

0,05).

Em relação à análise microvascular tumoral nas amostras pré e

pós cirúrgicas e os achados em outras variáveis como o comprometimento

linfonodal e o estadiamento clínico, não encontramos resultados

significativos. Nossos achados concordam com estudos prévios em

carcinomas de pulmão (IRION et al., 2003; MATSUYAMA et al., 1998;

YAMAZAKI et al., 1994), contrastando com outras pesquisas que haviam

demonstrado tal associação (FONTANINI et al., 1995; Yuan et al., 1995).

Em resumo, os resultados por nós obtidos na comparação da

angiogênese nas amostras de biópsia diagnóstica com agulha e nas respectivas

peças de ressecção cirúrgica em casos de carcinoma brônquico não de

pequenas células mostraram que pode haver boa correlação entre as duas

aferições. Isto torna-se especialmente importante levando-se em consideração

a subestratificação dos casos em baixa ou alta área vascular tumoral, pois,

como demonstrado em estudo prévio, a sobrevida dos pacientes com

carcinoma brônquico e baixa área vascular tumoral é significativamente maior

do que aqueles com tumores altamente vascularizados. Nossos dados atuais

estão de acordo com resultados publicados em algumas neoplasias já

avaliadas sob esse aspecto, como carcinomas de próstata. Em carcinomas de

mama, por exemplo, ainda há certa discordância, não tendo sido encontrada

tal correlação. Esta ainda é uma área em desenvolvimento no campo da

avaliação dos produtos da angiogênse, sendo necessários novos estudos em

outros tumores também e com uma amostra robusta para confirmação

definitiva do método.

A possibilidade de conhecimento do padrão vascular de uma neoplasia

no momento do diagnóstico e do estadiamento clínico pode ser uma

informação muito útil, tendo em vista consistentes comprovações da

importância prognóstica da angiogênese em tumores. A discussão sobre a

acurácia das biópsias em fornecer informação prognóstica é relevante, já que

esses espécimes são cada vez mais utilizados para diagnóstico e podem

consistir na única amostra tecidual disponível pré-tratamento. Poucas drogas

anti-angiogênicas encontram-se disponíveis para a prática clínica, mas em um

futuro próximo uma onda de novas drogas deve chegar ao mercado, fruto da

importante atuação dos pesquisadores e da indústria farmacêutica em busca de

drogas anti-angiogênicas eficazes que possam contribuir no combate ao

câncer.

___________________________________________________________

6. CONCLUSÕES

___________________________________________________________

Em casos selecionados de carcinoma brônquico não de pequenas

células, existe correlação entre a medida da área vascular por método

computadorizado nas biópsias diagnósticas por agulha e nos subseqüentes

espécimes cirúrgicos.

Esta correlação foi ligeiramente maior para casos de baixa área

vascular, utilizando-se a média da área vascular medida nas amostras de

biópsia como ponto de corte entre os grupos.

___________________________________________________________

7. ABSTRACT

___________________________________________________________

Despite modern diagnostic and therapeutic methods currently

available, lung cancer is a tumour responsible for one of the largest mortality

rates worldwide. The surgical resection still is the first therapeutic choice,

however, high recurrence rates are seen in some patients who have undergone

adequate treatment in early stages. The differences among survival rates of

same TNM stage patients who have been submitted to similar modalities of

treatment indicate that, despite of the great importance of this classification,

TNM is not the ideal therapeutic decision parameter for some subset of

patients. Extensive research has been made in order to find new reliable

prognostic markers, which could be helpful in identifying subsets of patients

with high recurrence risk who would benefit for having more aggressive

treatment in early phases. Studies have demonstrated that angiogenesis is

closely related to tumour growth and plays a major role as a prognostic

marker. In a previous study, it has been observed that the overall survival of

patients with non small cell lung cancer (NSCLC) and tumoral vascular area

above the mean value was significantly lower than in patients whose tumours

showed vascular area below the mean. The present study assessed the

angiogenesis in NSCLC, comparing their core biopsy and surgical specimen

findings. In order to highlight the vessels, we have performed

immunohistochemistry using anti-CD 34 antibody. The vascular area of each

sample (diagnostic biopsy and surgical specimen) has been calculated with

the software Image-Pro Plus 4.5. It has been observed a strong correlation

between the microvascular area from biopsy specimens and the corresponding

surgical specimens. This result represents an important step in the cancer

research since it raises the possibility of using angiogenic markers prior to

therapeutic decision. Further research can now be made to identify the best

therapeutic approach for lung cancer patients with high or low vascular area

measured in core biopsies.

__________________________________________________________________________________

8. ANEXOS

___________________________________________________________

ANEXO 1 – Técnica de hematoxilina e eosina (HE):

Após o material ter sido processado, desidratado em passagens

sucessivas por álcool, clarificado em duas passagens por xilol e embebido em

parafina duas vezes, foi incluído em blocos de parafina para confecção dos

cortes histológicos com espessura de 4 micrômetros. A seguir, está listada a

seqüência de soluções, nas quais foram embebidas as lâminas com os cortes

histológicos, para a coloração com HE:

1) xilol

2) xilol

3) álcool 100 %

4) álcool 100 %

5) álcool 95 %

6) álcool 95 %

7) álcool 80 %

8) hematoxilina (corante)

9) água corrente

10) eosina (corante)

11) álcool 100 %

12) álcool 100 %

13) álcool 100 %

14) álcool 100 %

15) xilol

16) xilol

17) montagem das lâminas com bálsamo e lamínula

ANEXO 2 – Preparação das lâminas com organosilano:

Seguem abaixo os passos para silanização das lâminas, segundo

recomendações do Manual de Imuno-histoquímica da Sociedade Brasileira de

Patologia (ALVES et al., 1999):

1) Lavar a lâmina em solução de detergente neutro Extran (Merck 7553) a 0,5

% em água, por 30 minutos

2) Lavar em água corrente para tirar o detergente (no mínimo por duas horas)

3) Lavar as lâminas em água quente

4) Secar em estufa

5) Guardar as lâminas limpas em caixas, evitando deposição de poeira

6) As lâminas limpas devem ser manipuladas com luvas para evitar

contaminação das mesmas pela oleosidade da pele

7) Imersão das lâminas em acetona por 2 minutos, retirando o excesso após

8) Imersão na solução de silano a 4 % em acetona, deixando por 2 minutos e

retirando o excesso após

9) Imersão quatro vezes em acetona, retirando o excesso

10) Secar em estufa, deixar esfriar e guardar em caixas limpas

ANEXO 3 – Técnica de imuno-histoquímica:

A técnica para análise imuno-histoquímica do anticorpo anti-

CD34 (clone QB-End10; DAKO Corporation, Santa Barbara, CA) foi feita

utilizando o método do complexo avidina-biotina-peroxidase (ABC), com o

princípio proposto por HSU et al (HSU et al., 1981), adaptado às nossas

condições laboratoriais:

Preparação dos cortes histológicos:

1) Utilizar as lâminas preparadas em organosilano (descrição em anexo 2)

2) Espessura de 4 micrômetros para os cortes do material incluído em parafina

3) Deixar 24 horas na estufa a 60

C, para melhor adesão do tecido nas

lâminas

4) Escorrer a parafina durante 20 minutos em estufa a 70

5) Desparafinização dos cortes em:

• Xilol a 60

C por 10 minutos

• Xilol em temperatura ambiente por mais 10 minutos

• Etanol 100 % por três vezes de 30 segundos

• Etanol 95 % por 30 segundos

• Etanol 80 % por 30 segundos

• Etanol 70 % por 30 segundos

• Lavar as lâminas em água destilada e água corrente

• Fazer o bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de

hidrogênio 3 % em metanol, com duas trocas de 5 minutos cada

• Lavar em água destilada e corrente por 3 minutos

• Lavar em solução salina tamponada com fosfatos (PBS) 0,01M, em

Ph 7,4, por 5 minutos

Recuperação antigênica:

Amostras fixadas em formalina, especialmente quando não foi possível

o controle de Ph, requerem recuperação antigênica. O método utilizado para

pesquisa do epitopo foi digestão enzimática (BATTIFORA & KOPINSKI,

1986):

1) Incubar as lâminas em uma solução de tripsina 30 mg% e cloreto de cálcio

134 mg% em PBS, Ph 7,8, a 37

C, no tempo de 20 minutos

2) Lavar em água corrente, água destilada e PBS

Reação utilizando o complexo ABC (HSU et al., 1981):

1) Incubar as lâminas com o anticorpo primário (anti-CD 34) na diluição

1:1000 em tampão PBS e deixar em câmara úmida coberta, a 4

C, durante a

noite

2) Escorrer e lavar em PBS três vezes de 5 minutos cada

3) Incubar com anticorpo secundário anti-mouse na diluição 1:300 em PBS e

deixar durante 30 minutos a 37

4) Lavar em PBS três vezes, com 5 minutos cada

5) Aplicar o complexo ABC, diluído em PBS na proporção 1:400 e deixar

durante 30 minutos em 37

6) Lavar em PBS com duas trocas de 5 minutos cada

Revelação e montagem:

1) Aplicar o cromógeno DAB e deixar atuar por 5 minutos a 37

C, ao abrigo

da luz

2) Lavar em água destilada e água corrente durante 5 minutos

3) Mergulhar em hematoxilina de Harris, para contracoloração, durante 30

segundos

4) Lavar em água corrente

5) Desidratar as lâminas em:

• Etanol 50 %, 1 minuto

• Etanol 80 %, 1 minuto

• Etanol 95 %, 1 minuto

• Etanol 100 % 3 vezes, 1 minuto cada

• Xilol 3 vezes, 1 minuto cada

6) Montagem das lâminas com bálsamo e lamínula

___________________________________________________________

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110

ARTIGO EM PORTUGUÊS

Angiogênese no carcinoma brônquico não de pequenas células:

área de microvasos em biópsias por agulha fornece uma idéia

confiável sobre a densidade vascular do tumor?

Angiogenesis in non small cell lung cancer: can microvessel area

in needle biopsies provide reliable information on the vascular

density of the tumour?

Trabalho realizado no laboratório de patologia

da Pós-graduação da FFFCMPA, baseado

na tese de doutorado da aluna

Luciane Cristina Dreher Irion.

Orientadores: João Carlos Prolla

Antônio Atalíbio Hartmann

111

RESUMO

Introdução: Estudos mostram que a angiogênese está intimamente relacionada com

crescimento tumoral e tem inegável importância como marcador prognóstico em vários

tumores. A medida da área vascular em carcinoma brônquico não de pequenas células

(CBNPC) parece ter impacto na sobrevida. Não está claro, porém, se a medida da área

vascular em biópsias por agulha também teria relevante importância. Objetivo: Avaliar a

angiogênese em CBNPC através de imuno-histoquímica comparando áreas vasculares em

biópsias por agulha e espécimes cirúrgicos. Material e método: 28 biópsias por agulha e

subsequentes espécimes cirúrgicos de CBNPC foram revisados. Os microvasos foram

salientados por imuno-histoquímica com anti-CD34, para captura de imagens digitalizadas

de “hot spots” nos espécimes cirúrgicos e nas biópsias. A área vascular de todos as

imagens foi avaliada com o programa Image-ProPlus 4.5. Resultados: O valor médio da

área de microvasos entre as biópsias foi 5093,6 µm

(233,4-17916,8 µm

) e entre os

espécimes cirúrgicos foi 3599,3 µm

(376,9-9514 µm

). Houve forte correlação entre a

área vascular das biópsias e dos espécimes cirúrgicos (r 0,7; P=0.0001). A media nas

biópsias foi usada para dividir os casos com baixa e alta área vascular. Uma melhor

correlação foi observada entre biópsias e espécimes cirúrgicos de tumores com baixa área

vascular (r 0,84; P=0.0001). Conclusão: Existe correlação entre a área microvascular de

biópsias por agulha e espécimes cirúrgicos em CBNPC, através de analise de imagem.

Estes resultados podem incentivar a pesquisa de novas formas de manejo de pacientes com

CBNPC.

Unitermos: angiogênese, carcinoma brônquico, CD 34, análise de imagem, área de

microvasos

Angiogenesis in non small cell lung cancer: can microvessel area in needle biopsies

provide reliable information on the vascular density of the tumour?

ABSTRACT

Background: Studies show that angiogenesis is closely related to tumour growth and has

undeniable importance as a prognostic marker in various types of tumours. The

microvessel area in non small cell lung cancer (NSCLC) may have impact on survival.

However, it is not known whether the microvessel area in core biopsies shows similar

importance. Objective: To assess the angiogenesis in NSCLC through

immunohistochemistry and compare vascular areas in needle biopsies and surgical

specimens. Methods: 28 core biopsies and further NSCLC surgical specimens have been

reviewed. The microvessels were highlighted by immunohistochemistry with anti-CD34 in

order to acquire digital images from hot spots of both surgical specimens and core

biopsies. The vascular area of all samples has been evaluated with the Image-ProPlus 4.5

software. Results: The mean value of the microvessel area among the cores was 5093.6

µm

(233.4-17916.8 µm

) and among the surgical specimens was 3599.3 µm

(376.9-9514

µm

). There was a strong correlation between the overall microvascular area in biopsies

and in surgical specimens (r 0.7; P=0.0001). The mean of the biopsies was used to divide

the cases with low and high vascular áreas. A stronger correlation was observed between

biopsies and surgical specimens of tumours with low vascular áreas (r 0.84; P=0.0001).

Conclusion: There is correlation of microvessel area between core biopsies and respective

surgical specimens in NSCLC cases, assessed by image analysis. This data could help in

finding new ways of managing lung cancer patients.

Keywords: angiogenesis, non small cell lung cancer CD 34, microvessel area

112

INTRODUÇÃO

O câncer de pulmão tem sido a principal causa de morte por câncer no mundo,

chegando a aproximadamente um milhão de mortes anuais, cifra maior do que a

mortalidade por câncer de cólon, mama e próstata combinados

(4,5)

. No Brasil, são

esperados 27.170 casos novos de carcinoma brônquico em 2006, correspondendo à terceira

neoplasia em incidência

(47)

Apesar dos avanços no setor diagnóstico na tentativa de identificar o tumor em

estágios precoces, o prognóstico do carcinoma brônquico permanece reservado

(12,5)

Intrigantes diferenças entre a evolução e o desfecho de pacientes com determinado TNM

ou com tumores de tipo histológico semelhante podem existir, sendo, porém, muito difícil

prever os casos de pior comportamento biológico

(14,21,63,92)

. Inúmeros marcadores

prognósticos estão disponíveis

(16,18,19,39,44,56,80)

, entre eles a angiogênese que está

relacionada com o crescimento tumoral e com metástases

(8,11,20,27,31,32,61,64,68,88,89,90)

. A

angiogênese também tem estimulado pesquisas de novos medicamentos em busca de

otimizar os efeitos anticâncer das modalidades terapêuticas tradicionais

(17,45)

Angiogênese é o processo de divisão das células endoteliais e migração para os

tecidos para formar novos capilares

(76)

. A formação dos vasos sangüíneos é mantida estável

pelo equilíbrio entre ativadores e inibidores angiogênicos

(49,59)

. Tais mecanismos estão

sendo melhor compreendidos devido, principalmente, a estudos sobre angiogênese

tumoral

(25,51)

. Este processo, entretanto, é também observado em diferentes situações

fisiológicas

(13,22,55,57,96)

e em algumas doenças não neoplásicas

(1,22,26,35)

Folkman foi o pioneiro no interesse pela angiogênese tumoral

(24)

. A avaliação

quantitativa da angiogênse em tumores e seu significado prognóstico teve impulso a partir

do estudo de Srivastava em melanomas

(78)

. Desde então, diversos estudos sobre este tema

foram realizados em tumores de diferentes sítios como mama

(88)

, língua

(3,41)

, cabeça e

pescoço

(36)

, próstata

(90)

, ovário

(46)

, estômago

(82)

, intestino grosso

(83)

, colo uterino

(84)

fígado

(50)

, rim

(74)

, endométrio

(69)

, tireóide

(79)

e sistema nervoso central

(91)

Macchiarini apresentou o primeiro estudo envolvendo tumores de pulmão

(58)

seguido por outros autores, que analisaram a angiogênese nos diferentes estágios destes

tumores

(6,17,18,48)

, sendo observado que a angiogênese tumoral correlaciona-se

negativamente com a sobrevida

(6,17,18,30,48)

113

Uma maneira simples e acessível de identificar os vasos a serem avaliados é através

de imuno-histoquímica. Ainda há muita discussão a respeito do anticorpo mais adequado,

mas anti-Fator VIII, anti-CD34, anti-CD31 e anti-CD105 são os mais

utilizados

(28,37,38,67,75,81,87)

Existem diferentes meios de quantificação histológica da angiogênese, incluindo a

densidade microvascular, a contagem de Chalkley e métodos semi-automatizados de

análise de imagem

(34,71,75,88)

. Por técnica de quantificação semi-automática da área

vascular, foi descrito que a sobrevida de pacientes com carcinoma brônquico não de

pequenas células (CBNPC) pode ser significativamente mais curta em casos de alta área

vascular quando comparada com tumores de baixa área vascular

(48)

. Não há conhecimento

definido sobre técnica similar que permita a avaliação da angiogênese em CBNPC ainda na

fase de diagnóstico. Como a biópsia por agulha pode produzir material suficiente para

estabelecer o diagnóstico, essa amostra poderia ser aproveitada também para avaliação da

angiogênese, contudo é necessário saber se esse mesmo material reflete as características

vasculares do tumor de uma maneira confiável. Os autores desconhecem relatos de tal

avaliação em neoplasias de pulmão. Há relatos sugerindo que a angiogênese em biópsias

de carcinomas próstata apresenta valor prognóstico

(10,52,72,94)

Ao adicionalmente avaliar-se a angiogênese em biópsias por agulha de CBNPC,

abriria-se a possibilidade de início imediato de outra modalidade terapêutica antes da

cirurgia, em casos selecionados, na tentativa de reduzir o suporte nutricional de tumores

altamente vascularizados.

OBJETIVO

O objetivo desse estudo foi avaliar a angiogênese em CBNPC através de imuno-

histoquímica e comparar áreas vasculares em espécimes de biópsia com as de espécimes

cirúrgicos.

114

MATERIAL E MÉTODO

Foram estudados casos de 28 pacientes entre 43 e 86 anos, com diagnóstico de

CBNPC obtido por biópsia transcutânea (agulha grossa) e confirmado pelo exame do

material de ressecção cirúrgica. As biópsias e os procedimentos cirúrgicos foram

realizados respectivamente no Departamento de Radiologia e no Serviço de Cirurgia

Torácica do Pavilhão Pereira Filho - Complexo Hospitalar Santa Casa, Porto Alegre. As

cirurgias foram realizadas em até duas semanas após o diagnóstico, entre agosto de 1998 a

abril de 2002. Os pacientes envolvidos não receberam qualquer tipo tratamento específico

para a doença, como radio ou quimioterapia, no intervalo entre a biópsia e a cirurgia.

Preparação do material

Blocos de parafina de todas as amostras foram reavaliados, confeccionando-se

lâminas coradas por hematoxilina e eosina (HE) para confirmação diagnóstica de acordo

com a classificação da Organização Mundial da Saúde

(85)

. As lâminas coradas por HE

serviram também para identificar o bloco de parafina mais representativo de cada amostra

cirúrgica, para posterior avaliação da angiogênese segundo os critérios de Weidner

(88)

. As

biópsias transcutâneas são, em geral, processadas em um único bloco de parafina, tendo

este sido revisado para confirmar a presença de material suficiente para o estudo.

Avaliação dos microvasos

Os microvasos foram identificados por meio de imuno-histoquímica com o

anticorpo anti-CD34 (clone QB-End10; DAKO). O processamento da totalidade dos casos

ocorreu simultaneamente, com o intuito de manter as mesmas condições gerais. As lâminas

receberam nova identificação, randomizada, a fim de evitar o conhecimento dos

respectivos pares de amostras.

Para a avaliação dos microvasos através da análise de imagens, utilizou-se uma

câmera de vídeo Sony 3CCD (DXC-97OMD) com sistema de cores padrão RGB (red,

green and blue), conectada ao microscópio e ao computador via placa de captura (Targa-

Truevision, USA, 640 x 480 x 24). A análise das imagens foi realizada com o programa de

computador Image-ProPlus 4.5 (Media Cybernetics). Um teste piloto com quinze casos

não pertencentes ao estudo foi realizado, para familiarização dos passos a serem seguidos.

115

A análise das lâminas de imuno-histoquímica seguiu modelo previamente

sugerido

(48)

e brevemente descrito a seguir.

Seleção das imagens a serem digitalizadas:

Um microvaso foi definido como qualquer célula endotelial imunocorada e

separada dos microvasos adjacentes, das células tumorais e de outros elementos do tecido

conjuntivo

(29,31)

, não sendo necessária a presença de hemácias nem a identificação de luz

vascular

(43,75)

Primeiramente, através de aumento de baixa magnificação (25x) realizava-se uma

“varredura” da lâmina, para localização do tumor. A seguir, com um aumento de 100x,

eram determinadas três áreas com maior concentração de microvasos, conhecidas na

literatura como “hot spots”

(89)

. Finalmente, com magnificação de 200x, procedia-se à

captura das imagens nos “hot spots” pré determinados. A imagem capturada era

imediatamente transformada em uma imagem digital e arquivada no computador em

formato TIFF (tagged image file format).

Em cada lâmina proveniente dos espécimes cirúrgicos foram capturadas imagens de

seis diferentes campos microscópicos em cada “hot spot”, totalizando dezoito imagens para

cada caso. Como o material disponível a partir de biópsias por agulha é mais restrito, nem

todos os casos apresentavam zonas de concentração de microvasos suficiente para a

obtenção das 18 imagens. Foram, então capturadas entre 14 e 18 imagens das lâminas de

biópsia. Casos nos quais a quantidade de material de biópsia não permitia a obtenção de

pelo menos 14 imagens foram excluídos do estudo.

Análise das imagens digitais:

Primeiramente, definiu-se o limiar de positividade da reação imuno-histoquímica,

registrando-se a tonalidade mais tênue e a mais forte de marrom-acastanhado presentes na

lâmina, reveladas pelo cromógeno diaminobenzidina (DAB). A partir daí, o programa

analisa apenas os “objetos” corados dentro da faixa de tonalidades estabelecida, destacando

as áreas consideradas em uma cor viva (figura 1) com a estimativa da área correspondente.

As medidas eram automaticamente salvas em arquivo .xls.

Análise estatística

Os resultados de todas as medidas foram transferidos para uma base de dados para

análise com o programa SPSS 8.0. Foram realizados os testes de Pearson, Wilcoxon e

116

Mann-Whitney. Em todas as análises, um valor P menor que 0,05 foi considerado

estatisticamente significativo.

RESULTADOS

Sexo e idade dos pacientes, assim como tipo histológico do tumor, estadiamento e área de

microvasos encontram-se listados na tabela 1.

As lâminas com o anticorpo anti-CD34 apresentaram boa qualidade nos resultados

da reação, que mostrou-se altamente específica e com mínima ou inexistente coloração de

fundo (“background”). A eventual presença de pigmento carbônico, antracose, não trouxe

maiores dificuldades na análise das imagens, não sendo, portanto, uma causa de erro de

mensuração

(figura 2).

Avaliação dos microvasos

A área de microvasos nas amostras de biópsia apresentou uma média de 5093,6

µm

(233,47 - 17916,89 µm

), enquanto a média da área de microvasos nas lâminas

provenientes dos espécimes cirúrgicos foi 3599,38 µm

(376,91 - 9514 µm

). Encontrou-se

forte correlação entre os valores de área vascular nas biópsias e nos espécimes cirúrgicos (r

0,7; P<0,0001).

Ao utilizar-se a média das áreas nas biópsias como ponto de corte, a fim de dividi-

las em grupos de baixa e alta área vascular, observou-se forte correlação (r 0,84; P=

0,0005) entre o grupo de biópsias com baixa área vascular e as respectivas peças

cirúrgicas. Por outro lado, não houve correlação significativa entre os grupos de alta

densidade vascular (r 0,06; P=0,84).

Ao utilizar-se a média das áreas nos espécimes cirúrgicos como ponto de corte, para

dividi-los em grupos de baixa e alta área vascular, observou-se um coeficiente de

correlação 0,76 (P=0,01) entre o grupo de baixa área vascular e as respectivas biópsias.

Novamente não houve correlação significativa entre os casos considerados como de alta

área vascular (r –0,22; P=0,45).

Houve uma diferença significativa das medidas entre as amostras das biópsias e dos

espécimes cirúrgicos, com valores tendendo a ser menores nas peças cirúrgicas (P = 0,02).

Isto traduziu-se no fato de que em 20 dos 28 casos (71,5 %) a área vascular média foi

maior na biópsia que na peça cirúrgica, enquanto em 8 casos (28,5 %) a maior área

117

vascular ocorreu no espécime cirúrgico. As correlações entre as áreas vasculares

encontram-se na tabela 2.

Área vascular e estadiamento

Não foi encontrada significância estatística ao avaliar-se a área dos microvasos nas

biópsias e nas peças cirúrgicas em relação ao comprometimento linfonodal e ao

estadiamento clínico (Tabela 3).

DISCUSSÃO

A angiogênese exerce papel importante no crescimento e disseminação tumoral.

Inúmeros estudos têm demonstrado que a avaliação da angiogênese em tumores apresenta

relevância prognóstica

(28,75,89)

Identificação e quantificação dos microvasos

Apesar das variadas formas disponíveis de avaliação dos mecanismos relacionados

com a angiogênese tumoral, a quantificação histológica dos microvasos neoformados

permanece sendo uma opção bastante confiável

(75,86)

Uma forma prática de avaliar a densidade de microvasos tumorais e peritumorais é

através de imuno-histoquímica com um anticorpo que identifique a célula endotelial. A

escolha do anticorpo mais adequado ainda é motivo de debate, pois há muitos marcadores

disponíveis, sendo CD34, CD31, CD105 (endoglina) e fator VIII os mais comumente

utilizados

(23,28,62,64,66,73)

. Poucos trabalhos utilizaram o anticorpo anti-Ulex europaeus

agglutinin como marcador endotelial

(46,78)

. Segundo os dois primeiros consensos sobre

quantificação da angiogênese em tumores sólidos, a utilização do anti-CD 34 parece ser

mais reproduzível

(86,87)

. Alega-se que a endoglina apresentaria a vantagem de identificar o

endotélio proliferante envolvido na angiogênese tumoral, ressaltando vasos neoformados e

imaturos

(73)

. Muitas comparações entre a acurácia dos marcadores vasculares apresentaram

resultados divergentes, havendo relatos favorecendo tanto o anti-CD34 como a

endoglina

(2,52,67,81,82)

. Apesar de aparentemente não haver um marcador endotelial perfeito,

a eleição do anticorpo anti-CD 34 no nosso estudo mostrou-se adequada, pois ofereceu

lâminas de fácil interpretação, praticamente sem artefatos e sem reações cruzadas com

118

epitélio vascular linfático ou células estromais, bem como possibilitou que o programa de

computador distinguisse entre focos de antracose (negro) e verdadeiros microvasos

(castanho - DAB). Estas características são fundamentais para o desenvolvimento de

pesquisas que envolvem a utilização de programas de computador para análise de imagem,

facilitando a automação e aumentando a credibilidade dos resultados.

Desde o primeiro estudo sobre quantificação da angiogênese em melanomas

(78)

diferentes métodos de aferição dos microvasos foram propostos. Muitas pesquisas

seguiram os passos sugeridos por Weidner

(88)

A densidade microvascular de Weidner propõe a contagem de microvasos em um

campo microscópico a partir de áreas previamente escolhidas com o uso de uma lente

magnificação baixa, nas quais existe a impressão visual de numerosos microvasos,

conferida pela maior concentração de células endoteliais coradas através de imuno-

histoquímica. A avaliação dos microvasos nestas áreas (“hot spots”), usando microscopia

óptica e sem o conhecimento das informações clínicas dos pacientes é ponto comum em

quase todos os estudos sobre o assunto

(75)

. A exemplo das demais pesquisas, também

realizamos a quantificação dos microvasos a partir dos pontos de concentração vascular ou

“hot spots”.

O método de contagem de objetos proposto por Chalkley em 1943 foi utilizado em

alguns estudos

(7,33,42,43)

. Este método também baseia-se em “hot spots”, mas

adicionalmente adapta uma gratícula com vinte e cinco pontos aleatórios no microscópio,

que deve ser girada em torno de seu eixo até que o maior número pontos encubra o maior

número de objetos (microvasos corados). Como o método de Chalkley conta o número de

pontos da gratícula que coincidentemente estariam sobrepostos aos microvasos corados,

esta é a uma medida relativa ao invés de uma verdadeira contagem de objetos

(87)

Há ainda sistemas multiparamétricos computadorizados de análise de imagem,

sendo este o método de avaliação dos microvasos por nós utilizado. A principal vantagem

atribuída a este método é a possibilidade de salvar e arquivar as imagens digitais, nas quais

a tradicional contagem de microvasos em “hot spots” pode ser facilmente realizada, além

da possibilidade de explorar adicionais parâmetros morfométricos, como área de

microvasos, perímetro, diâmetro das luzes, etc

(34,84,86,91)

. Outra vantagem seria que através

da análise semi-automática efetuada pelo computador o processo torna-se menos

dependente da intervenção do investigador

(86)

. Diversos estudos realizaram a aferição da

angiogênese com análise computadorizada de imagem, mas em geral utilizaram sistemas

119

computadorizados distintos e em diferentes tipos de tumores

(71,77,84,91)

ou alterações não

neoplásicas

(35)

. O programa utilizado neste estudo foi também eleito em outros trabalhos

presentes na literatura médica

(9,15,49,70)

Em um trabalho envolvendo metástases hepáticas e carcinomas de cólon,

bexiga e pulmão, o método da contagem visual de microvasos foi comparado com um

sistema assistido por computador

(40)

. Foi encontrada uma boa correlação entre os dois

métodos, exceto nos tumores de pulmão, nos quais não foi possível realizar a avaliação

computadorizada pela presença de pigmento antracótico no tecido pulmonar. Como as

imagens precisaram ser convertidas para uma escala de cinza para avaliação pelo programa

e a deposição de carbono nos tecidos confere uma coloração enegrecida, o programa não

tinha a capacidade de diferenciação entre a cor escura deste pigmento e os tons de cinza

escuro artificialmente conferidos aos microvasos neste sistema. A vantagem do sistema por

nós empregado é a utilização da análise em sistemas de cores reais, (sistema de cores

“RGB”), que permitiu ao programa distinguir o tom muito próximo do preto nas áreas de

antracose das tonalidades acastanhadas dos microvasos marcados pela DAB, que é um

cromógeno tradicional para imuno-histoquímica.

Área vascular tumoral

O primeiro relato sugerindo a importância prognóstica da angiogênese em tumores

foi baseado na medida da área de capilares

(78)

. Hoje em dia, a medida de área

microvascular total é um parâmetro de avaliação da angiogênese aceito e corresponde `a

área ocupada por microvasos por unidade de área do tumor, obtida usando uma objetiva de

magnificação específica em um determinado microscópio e em um limitado número de

campos, subjetivamente selecionados a partir das zonas mais vascularizadas do tumor (“hot

spots”). O processo de seleção dos “hot spots” é o mesmo utilizado na densidade

microvascular (contagem visual de microvasos)

(75)

. Um estudo demonstrou correlação

entre a densidade de microvasos e a área de microvasos em CBNPC

(48)

. Mostrou-se que a

sobrevida teve melhor correlação, negativa, com a medida da área microvascular total do

que com o número de microvasos. Adicionalmente, foi relatado que a área de microvasos

pode ser considerada como fator prognostico e correlaciona-se com a sobrevida em estudos

em tumores cerebrais

(54)

, uveais

(65)

e carcinomas de bexiga

(53)

e colo-retal

(71)

Baseados nestas demonstrações, achamos que a medida da área microvascular total

poderia ser um método útil e confiável na avaliação da angiogênese tumoral. Por esta

120

razão, tivemos o interesse de testá-lo em amostras teciduais com dimensões mais restritas,

como as biópsias diagnósticas por agulha, onde encontramos forte correlação entre as

medidas nas biópsias e nos cortes do tumor em casos de CBNPC.

Em geral, os estudos sobre angiogênese tumoral foram realizados em cortes

tumorais provenientes de ressecção cirúrgica. Poucos trabalhos envolvendo tumores de

próstata e mama analisaram espécimes de biópsia

(10,52,60)

. Não é de nosso conhecimento

relatos envolvendo avaliação microvascular em biópsias diagnósticas e em peças cirúrgicas

em casos de carcinomas de pulmão, o que limita a comparação de resultados. Tanto

Rogatsch et al., como Yorukoglu et al. observaram boa correlação entre biópsias por

agulha e prostatectomias ao compararem densidade microvascular em carcinomas de

próstata

(72,94)

. Ambos também sugeriram que biópsias pré-operatórias poderiam sugerir

características da vascularização do tumor, com possível impacto no estadiamento e

melhor entendimento do comportamento biológico desta neoplasia. Em dois outros estudos

explorando carcinomas de próstata, a avaliação de microvasos tumorais é incentivada para

fins de comparação com dados provenientes de cirurgia radical e como fator preditor de

recorrência

(11,52)

. Esses resultados encorajadores não foram, porém, encontrados em

carcinomas de mama através da contagem de Chalkley

(60)

Não encontramos resultados significativos em relação à análise microvascular

tumoral e o comprometimento linfonodal e o estadiamento clínico. Estes achados

concordam com estudos prévios em carcinomas de pulmão

(48,62,93)

, contrastando com

outras pesquisas que haviam demonstrado tal associação

(28,95)

Em resumo, resultados preliminares por nós obtidos em CBNPC mostram que pode

haver boa correlação entre a quantificação histológica da angiogênese em biópsias

diagnósticas por agulha e em tumores ressecados, assim como sugerido em carcinomas de

próstata. Este fato poderia ser particularmente importante ao ser considerada a

subestratificação de tumores de mesmo estágio clínico, mas com alta ou baixa área

vascular, tendo em vista que a sobrevida em casos de alta área vascular tumoral pode ser

mais curta que tumores com menor área vascular

(48)

. Este ainda é um campo em

desenvolvimento e novos estudos na fase diagnóstica do CBNPC e outros tumores são

estimulados. A discussão sobre a acurácia das biópsias em fornecer informação

prognóstica é relevante, já que esses espécimes são cada vez mais utilizados para

diagnóstico e podem consistir na única amostra tecidual disponível pré-tratamento.

121

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126

ANEXOS DO ARTIGO EM PORTUGUÊS

Tabela 1 – Principais achados em CBNPC em 28 pacientes

ÁREA MÉDIA (µm)

CASOS IDADE SEXO

TIPO

HISTOLÓGICO

TNM

Estadiamento

Biópsia Cirurgia

1 62 M Adenocarcinoma T3N0 IIB 539,80 666,68

2 68 M Epidermóide T2N0 IB 1040,26 376,91

3 75 M Epidermóide T2N2 IIIA 764,27 613,47

4 70 F Epidermóide T2N0 IB 1547,11 681,80

5 74 F Adenocarcinoma T2N1 IIB 12453,07 5705,16

6 58 M Adenocarcinoma T2N0 IB 8952,27 5315,66

7 78 M ca grandes cel T2N1 IIB 3573,00 5664,11

8 72 F Adenocarcinoma T2N0 IB 386,52 799,62

9 43 F Adenoescamoso T2N0 IB 1163,20 806,44

10 59 M não peq cel T1N0 IA 755,63 423,65

11 64 M não peq cel T3N0 IIB 337,62 444,12

12 77 M Adenocarcinoma T2N2 IIIA 1378,38 965,83

13 72 M Epidermóide T3N1 IIIA 233,47 513,13

14 78 M Adenocarcinoma T2N1 IIB 1506,26 613,54

15 63 M Adenocarcinoma T1N0 IA 3486,87 1573,51

16 66 M Adenocarcinoma T2N0 IB 1764,30 1051,38

17 72 F Adenocarcinoma T2N0 IB 1777,78 1650,93

18 79 M Adenocarcinoma T2N0 IB 2781,00 6609,22

19 69 F Adenocarcinoma T2N0 IB 11192,57 8439,72

20 64 M Epidermóide T3N0 IIB 11448,40 4102,88

21 86 M Adenocarcinoma T2N2 IIIA 9553,20 9514,00

22 71 M Adenocarcinoma T2N2 IIIA 3180,00 7358,27

23 68 M Epidermóide T2N1 IIB 9036,27 4369,55

24 69 F Adenocarcinoma T2N0 IB 14068,00 6439,22

25 73 M Adenocarcinoma T1N1 IIA 8456,33 6540,94

26 83 F Adenocarcinoma T2N0 IB 17916,89 5878,72

27 66 M Adenocarcinoma T2N0 IB 8756,00 4473,66

28 77 F Adenocarcinoma T2N1 IIB 4572,58 9190,72

127

Tabela 2 – Correlações entre áreas de microvasos

Coef. de

Correlações

Correlação P

Área media nas biópsias

Área media nas peças cirúrgicas

0,7

<0,0001

Divisão dos grupos pela media da área vascular nas biópsias

Biópsias com baixa área vascular x Área vascular nas peças cirúrgicas

correspondentes

0,84 0,0005

Biópsias com alta área vascular x Área vascular nas peças cirúrgicas

correspondentes

0,06 0,84

Divisão dos grupos pela media da área vascular nas peças cirúrgicas

Tumores com baixa área vascular x Área vascular nas biópsias

correspondentes

0,76 0,01

Tumores com alta área vascular x Área vascular nas biópsias

correspondentes

-0,22 0,45

128

Tabela 3 – Área de microvasos versus comprometimento linfonodal e estadiamento

Área de microvasos

Número de

pacientes

Biópsias

(Média/mediana)

Espécimes cirúrgicos

(Média/mediana)

Sem metástase

linfonodal

5171,4

1777,8

2925,5

1573,5

Com metástase

linfonodal

4973,3

3573,0

4640,8

6554,1

P = 0,75 P = 0,24

Até estágio IB 14

5399,2

2279,4

3180,0

1612,2

A partir de IIA 14

4788,0

3376,5

4018,8

4236,2

P = 0,78 P = 0,78

129

Figura 1. A, Exemplo de uma imagem antes da análise dos microvasos. B, Mesma imagem gerada pelo

programa de computador para mostrar os objetos considerados para a estimativa da área.

130

Figura 2. A, Exemplo de uma imagem contendo pigmento antracótico antes de analisar os microvasos.

B, Mesma imgaem gerada pelo programa de computador para mostrar os objetos considerados para a

estimativa de área. Notar que o pigmento antracótico não foi salientado pelo programa.

131

ARTIGO EM INGLÊS

Angiogenesis in non small cell lung cancer: can microvessel area

in needle biopsies provide reliable information on the

vascular density of the tumour?

Trabalho realizado no laboratório de patologia

da Pós-graduação da FFFCMPA, baseado

na tese de doutorado da aluna

Luciane Cristina Dreher Irion.

Orientadores: João Carlos Prolla

Antônio Atalíbio Hartmann

132

Summary

Aims: Angiogenesis has prognostic importance in various tumours. A high vascular area in

resected non small cell lung cancer (NSCLC) appears to correlate negatively with survival.

This study compared the microvessel area in NSCLC in needle biopsies with the area in

surgical specimens.

Methods and results: Core biopsies and surgical specimens from 28 patients with NSCLC

were reviewed. The microvessels were highlighted by immunohistochemistry with anti-

CD34. Digital photographs were taken from hot spots of surgical specimen slides and

respective biopsy sections. The microvessel area of all samples was assessed with the

Image-ProPlus 4.5 software. The mean value of the microvessel area among the cores was

5093.6 µm

(233.4-17916.8 µm

) and among the surgical specimens was 3599.3 µm

(376.9-9514 µm

). There was a strong correlation between the overall microvascular area

in biopsies and in surgical specimens (r 0.68; P=0.0001). The mean of the biopsies was

used to divide the cases of low and high vascular areas. A slightly stronger correlation was

observed between biopsies and surgical specimens with low vascular areas (r 0.84; P

=0.0001).

Conclusion: There is correlation of microvessel area in core biopsies and surgical

specimens in NSCLC. This data could help finding new ways of managing lung cancer

patients.

Keywords: angiogenesis, NSCLC, microvessel area, image analysis, CD34.

Introduction

Lung cancer is the leading cause of cancer death. An estimated 1 million people worldwide

die from lung cancer annually, which is more than the death rates of colon, breast and

prostate cancers combined.

1,2

Despite improvements in diagnosis and management, the

prognosis of lung cancer remains worrying.

2-4

Heterogeneity in outcomes among same

TNM stage patients or with tumours of similar histological type are observed but it is very

difficult to predict the cases of worse clinical behaviour.

5-8

Multiple prognostic markers for solid tumours are available,

9-15

including the

angiogenesis which also correlates with tumour growth and metastasis.

16-26

The research of

anti-angiogenic drugs has been encouraged as na attempt to improve the results of

traditional treatments.

27,28

Angiogenesis is the process of endothelial cell division and migration into tissues to

form new capillaries.

Blood vessel formation depends on the balance of angiogenesis

activators and inhibitors.

30,31

The pathways of angiogenesis are now better understood due

to studies in tumours

32,33

but this process also occurs in several physiological conditions

34-

as well as in some non neoplastic diseases.

38-41

133

The importance of angiogenesis in tumours was first described by Folkman.

Studies on quantitative analysis of angiogenesis and its prognostic significance were

encouraged after Srivastava’s study on melanomas.

Since then there have been several

studies about angiogenesis in tumours from various sites such as breast,

tongue,

44,45

head

and neck,

prostate,

ovary,

stomach,

colon,

cervix,

liver,

kidney,

endometrium,

thyroid

and central nervous system.

Macchiarini presented the first study involving angiogenesis and lung tumours.

This has been followed by other authors who analysed angiogenesis in different stages of

the neoplasm, and almost unanimously, it has been observed that angiogenesis correlates

negatively with survival.

11,27,57-59

Immunohistochemistry with a specific marker is a simple form of identifying

microvessels. There is still discussion about the most suitable antibody but anti-Fator VIII,

anti-CD34, anti-CD31 or anti-CD105 are used more.

60-66

Different ways of histological quantitation of tumour angiogenesis are available,

including the estimation of microvessel density, the Chalkley count and the use of semi-

automated image analysis systems.

21,64,67,68

By computerised image analysis, it has been

described that the survival of NSCLC patients can be significantly shorter in cases of large

microvessel area when compared to small microvessel area tumours.

However, it is not

of our knowledge the description of similar technique to allow the analysis of the

angiogenesis in NSCLC at in the diagnostic phase. As the core biopsy may produce

enough material for the diagnosis, the same sample could be additionaly used for

microvascular analysis. However, it is necessary to confirm whether this sample is a

reliable mirror of the tumour microvascular characteristics. This question has not been

addressed in lung cancer yet but it has been suggested that the angiogenesis in prostatic

cancer biopsies show prognostic importance.

69-72

In the present study, we evaluated the angiogenesis in NSCLC with

immunohistochemistry and computerised image analysis comparing the microvessel area

in needle biopsies and their respective surgical specimens. If angiogenesis can successfully

be studied in diagnostic samples of NSCLC, in selected patients there would be the

possibility of alternative therapy prior to the operation in order for reducing the nutritional

imput of highly vascularised tumours.

Materials and Methods

134

We studied 28 NSCLC cases in patients aged between 43 and 86 years whose diagnosis

was made by transcutaneous needle biopsy and confirmed by histology of the resected

tumour. The biopsies and the surgical procedures were performed respectively at the

Radiology Department and the Thoracic Surgery Unit of the Pavilhão Pereira Filho -

Complexo Hospitalar Santa Casa, Porto Alegre, Brazil. The surgical resections were

performed in up to two weeks after the diagnosis between August 1998 and April 2002.

The patients have not received any specific cancer treatment, i.e. radiotherapy or

chemotherapy, during the period between the diagnosis and the operation.

Preparation of the samples

Archived paraffin blocks from all the samples were reviewed with new haematoxilin and

eosin (H&E) stained sections for diagnostic confirmation according to the WHO

classification.

H&E stained slides were also used to identify the block containing the

most representative tumour in each resection sample for further microvessel evaluation

according to Weidner’s criteria.

Needle biopsies were embedded in a single block, from

which H&E slides were scanned in order to confirm the presence of enough material for

analysis.

Microvessel analysis

The microvessel were highlighted by immunohistochemistry with the anti-CD34 antibody

(clone QB-End10; DAKO, EUA). The slides have been relabelled randomly to avoid

recognition of the correspondent pair of samples.

The microvessel were evaluated by computerised image analysis using a Sony

3CCD videocamera (DXC-97OMD) and RGB colour system which was connected to the

microscope and to the computer via a capture board (Targa - Truevision, USA, 640 x 480 x

24). The digital images were analysed using the Image-ProPlus 4.5 software (Media

Cybernetics). A pilot test in 15 cases, which were not included in this study, was run for

training of the observer with the image analysis process.

The slides were then assessed following a model previously described

and

summarised below:

Acquiring the images:

A microvessel was defined as any brown immunostained endothelial cells separated from

adjacent microvessels, tumour cells, other connective-tissue elements or necrosis.

24,74

Red

cells or vascular lumen were not used to define a microvessel.

64,75

135

Firstly, the slides were scanned at low magnification (25x) to localise the tumour.

Secondly, at medium magnification (100x), three areas of visual impression of microvessel

concentration (hotspots) were determined.

Finally, at 200x magnification, the images in

those hotspots were digitised and saved in tagged image file format (TIFF).

Images from six microscopic fields were acquired in each of the hotspots from the

surgical specimen slides, totalling 18 images from each slide. As the sample available in

biopsy samples is more limited, sometimes it was not possible to save 18 images. The

number of images taken from slides from needle biopsies has then ranged between 14 and

18. Cases in which it was not possible to reach a minimum of 14 images were excluded of

the study.

Computerised image analysis:

The RGB threshold band correspondent to the positive immunostain reaction was selected.

The software then considered only the ‘objects’ (microvessels) in this band highlighting

them in a different coulour for appreciation of the observer (Figure 1), and estimated the

correspondent area. The measurements were automatically saved in a .xls file.

Statistical analysis

All calculated data were collected in a database for further statistical analysis with the

SPSS 8.0 software. The tests of Pearson, Wilcoxon and Mann-Whitney were used. A value

of P less than 0.05 was considered statistically significant.

Results

Sex and age of the patients as well as histological type of the tumour, stage and

microvessel area are listed in the Table 1. Staining for CD34 was easy to interpret, highly

specific, with almost inexistent background staining and, therefore, occasional antracotic

pigment did not represent a problem during the computerised assessment (Figure 2).

Microvessel assessment

The mean value of the microvessel area among core samples was 5093.6 µm

(233.47

µm

-17916.89 µm

) and among tumour sections was 3599.38 µm

(376.91 µm

-9514

µm

). There was a strong correlation between the microvessel area from both groups (r

0.7; P<0.0001).

By using the mean value of the microvessel area among cores to divide them in low

and large microvessel area groups, a correlation coefficient of 0.84 was observed between

136

the biopsies of low vascular area and the correspondent tumour sections (P 0.0005).

However, there was no significant correlation between large vascular area pairs (r 0.06; P

0.84).

By using the mean value of the microvessel area among tumour sections to divide

them in low and large microvessel area groups, there was also a good correlation between

the pairs of low vascular area (r 0.76; P 0.01). No significant correlation between large

vascular area pairs was found (r –0.22; P 0.45).

There was a significant difference in estimates in the two sample types with values

tending to be lower in tumour sections than in cores (P 0.02). This was reflected in 20 of

28 cases (71,5 %) in which the measurements were higher in cores than in tumour sections.

The correlations of the microvessel areas are shown in Table 2.

Microvessel area and staging

There was no statistical significance when microvessel area in both groups was compared

with lymph node status or stage (Table 3).

Discussion

Angiogenesis play a relevant role in tumour growth and spread, and assessing angiogenesis

in tumours has proven to be of prognostic importance in several studies.

60,64,76

Despite the

existance of many methods for evaluating the mechanisms related to angiogenesis in

tumours, the histological quantitation of neoformed microvessels remains a good

option.

64,77

Since the first study about quantitation of angiogenesis in melanomas,

different methods for estimating the microvessels were proposed, but many studies have

followed the steps suggested by Weidner.

The microvessel density corresponds to the mean value of microvessel count at a

determined magnification on a selected microscope.

21,60,64,78

The microvessel count is

performed in one or more fields previously determined and subjectively selected from the

areas of visual impression of larger concentration of microvessels (hot spots).

21,64

The Chalkley count has been used in some studies.

75,79-81

This method is similarly

based on hot spots but additionally uses a 25-point eyepiece graticule, which is rotated so

that the maximum number of points are on or within the vessels. Only the overlaying dots

are counted.

64,67,77

137

There is also the alternative of computerised image analysis systems which was

selected in this study. An advantage of computerised systems is the possibility of saving

and filing digital images, in which the traditional microvesel count in hotspots can be

easily performed and additional morphometric parameters can also be detected, i.e.

microvessel area, perimeters, range of vessel sizes or luminal diameter.

50,55,67,77

Another

advantage is the fact that the process less observer dependent through semi-automatic

computer analysis.

The image analysis has been emphasized in some studies in various

types of tumour

55,58,68

or in non neoplastic diseases

but sometimes with different

softwares.

30,50,82

The software used in this estudy was also used in others present in the

medical literature.

30,83-85

In study involving liver metastasis and carcinomas from colon, bladder and lung the

convencional visual method of microvessel count was compared with a computer assisted

system.

A good correlation between both methods was found, apart from in lung cancer

cases, in which the analysis was impaired due to the presence of antracotic pigment and

because the colour digital images had to be converted into a grey scale to be assessed by

the software. As a result, the software could not differentiate the black colour of the

antracotic pigment from the dark grey related to the microvessels. An advantage of the

present study is the use of a true colour system (RGB) so that an occasional presence of

antracosis in the sections have not caused difficulties during the computer analysis.

The first description of the prognostic importance of angiogenesis in tumours was

based on measurements of capillary areas.

Presently, the microvessel area is an accepted

parameter of angiogenesis assessment and corresponds to the area occupied by

microvessels per unit area of the tumour, by the use of determined magnification, in a

limited number of microscopic fields, subjectively selected from hotspots.

A study has

demonstrated correlation between microvessel density and microvessel area in NSCLC.

It has been also found that the microvessel area had a more significant correlation

(negative) with survival than the microvessel density. In studies involving brain,

bladder,

uveal,

and colorectal

tumours, it has also been shown that the microvessel

area is a prognostic factor and correlates with survival.

Based on these demonstrations, we assumed that the estimated microvessel area can

represent a good quantitation method of tumour angiogenesis, and for this reason we had

interest in test it in smaller samples like core biopsies. We have successfully found strong

correlation between the microvessel area in core biopsies and in tumour sections.

138

In general, histological analysis of tumour angiogenesis have been made in tumour

sections. Just a few studies on prostate and breast tumours analysed biopsy

specimens.

70,71,90

It is out of our knowledge a previous description of microvascular

assessment in core biopsies and tumour sections from NSCLC, which limits the

comparison of results in this neoplasm. Rogatsch et al and Yorukoglu et al have found a

good correlation between cores and prostatectomy specimens when comparing microvessel

density in prostate cancer.

69,72

They have also suggested that preoperative biopsies could

predict characteristics of tumour vascularisation, with possible impact on staging and better

understanding of the biologic behaviour of this neoplasia. In two more studies on prostate

carcinomas, the microvessel assessment in core biopsies is encouraged in order to compare

with data in radical specimens and as a recurrence signaling.

23,71

On the other hand, those

encouraging results in core samples were not found in breast carcinomas by Chalkley

count.

The lack of statistical significance of the microvessel estimates versus lymph node

status and stage in the present study is supported by previous studies on NSCLC,

58,91,92

contrasting with other reports which have demonstrated such association.

60,93

In summary, our preliminary results showed that, in NSCLC, there could be good

correlation between the histological quantitation of angiogenesis in diagnostic biopsies and

in resected tumours, as it has been demonstrated in prostate carcinomas. These findings

could be particularly important if considering a substratification of tumours of same stage

but with small or large microvascular area, as the survival in cases of small microvascular

area can be longer than in those largely vascularised.

This is still a developing branch

regarding tumour angiogenesis, and further studies in NSCLC and other tumours at the

diagnostic phase are encouraged. The discussion on the accuracy of core biopsies in

providing prognostic information is relevant as these specimens are increasingly used in

diagnosis and may represent the only pretreatment tissue available.

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143

ANEXOS DO ARTIGO EM INGLÊS

Table 1. Main findings in NSCLC from 28 patients

Mean microvascular area (µm)

Cases Age Sex Histologic type TNM Stage

Cores

Tumour

sections

1 62 M Adenocarcinoma T3N0 IIB 539.80 666.68

2 68 M Squamous cell carcinoma T2N0 IB 1040.26 376.91

3 75 M Squamous cell carcinoma T2N2 IIIA 764.27 613.47

4 70 F Squamous cell carcinoma T2N0 IB 1547.11 681.80

5 74 F Adenocarcinoma T2N1 IIB 12453.07 5705.16

6 58 M Adenocarcinoma T2N0 IB 8952.27 5315.66

7 78 M Large cell carcinoma T2N1 IIB 3573.00 5664.11

8 72 F Adenocarcinoma T2N0 IB 386.52 799.62

9 43 F Adenosquamous carcinoma T2N0 IB 1163.20 806.44

10 59 M Non small cell carcinoma T1N0 IA 755.63 423.65

11 64 M Non small cell carcinoma T3N0 IIB 337.62 444.12

12 77 M Adenocarcinoma T2N2 IIIA 1378.38 965.83

13 72 M Squamous cell carcinoma T3N1 IIIA 233.47 513.13

14 78 M Adenocarcinoma T2N1 IIB 1506.26 613.54

15 63 M Adenocarcinoma T1N0 IA 3486.87 1573.51

16 66 M Adenocarcinoma T2N0 IB 1764.30 1051.38

17 72 F Adenocarcinoma T2N0 IB 1777.78 1650.93

18 79 M Adenocarcinoma T2N0 IB 2781.00 6609.22

19 69 F Adenocarcinoma T2N0 IB 11192.57 8439.72

20 64 M Squamous cell carcinoma T3N0 IIB 11448.40 4102.88

21 86 M Adenocarcinoma T2N2 IIIA 9553.20 9514.00

22 71 M Adenocarcinoma T2N2 IIIA 3180.00 7358.27

23 68 M Squamous cell carcinoma T2N1 IIB 9036.27 4369.55

24 69 F Adenocarcinoma T2N0 IB 14068.00 6439.22

25 73 M Adenocarcinoma T1N1 IIA 8456.33 6540.94

26 83 F Adenocarcinoma T2N0 IB 17916.89 5878.72

27 66 M Adenocarcinoma T2N0 IB 8756.00 4473.66

28 77 F Adenocarcinoma T2N1 IIB 4572.58 9190.72

144

Table 2. Correlations among microvascular areas

Correlation

Correlations coefficient

Overall microvessel area

among cores

Overall microvessel area among

tumour sections

0.7 <0.0001

Mean microvessel area among cores to divide them in small and large microvascular area

Cores of small microvessel

area

Microvessel area in correspondent

tumour sections

0.84 0.0005

Cores of large microvessel

area

Microvessel area in correspondent

tumour sections

0.06 0.84

Mean microvessel area among tumour sections to divide them in small and large

microvascular area

Tumour sections of small

microvessel area

Microvessel area in correspondent

cores

0.76 0.01

Tumour sections of large

microvessel area

Microvessel area in correspondent

cores

-0.22 0.45

145

Table 3. Microvessel area versus lymph node status and stage

Microvessel area

Number of

patients

Cores

(mean/median)

Tumour sections

(mean/median)

No lymph node

metastasis

5171.4

1777.8

2925.5

1573.5

Lymph node

metastasis

4973.3

3573.0

4640.8

6554.1

P = 0.75 P = 0.24

Stage IA and IB

5399.2

2279.4

3180.0

1612.2

Stage IIA or higher

4788.0

3376.5

4018.8

4236.2

P = 0.78 P = 0.78

146

Figure 1. A, Example of an image prior to analysing the microvessels. B, Same image generated by the

software to show the objects considered for estimating the area.

147

Figure 2. A, Example of an image containing antracotic pigment prior to analysing the microvessels. B,

Same image generated by the software to show the objects considered for estimating the area. Note that the

antracotic pigment was not highlighted by the software.

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