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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS
PAPEL DO ZINCO NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL:
DEFESAS ANTIOXIDANTES
E SINALIZAÇÃO CELULAR VIA PI3K/AKT
CRISTINA FLORES BOROWSKI
FLORIANÓPOLIS, OUTUBRO DE 2006.
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PAPEL DO ZINCO NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL:
DEFESAS ANTIOXIDANTES
E SINALIZAÇÃO CELULAR VIA PI3K/AKT
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Santa Catarina como
requisito parcial para obtenção de grau
de Mestre em Neurociências.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Bainy Leal
Co-orientador: Prof. Dr. Alcir Luiz Dafre
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS
FLORIANÓPOLIS, OUTUBRO DE 2006.
ii
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“Nossas limitações estão dentro
das nossas mentes. Se conseguirmos ter
essa percepção, não existirá limites, e
seremos do tamanho dos nossos sonhos.”
iii
AGRADECIMENTOS
Concluir o mestrado foi um grande desafio. Muitas pessoas dedicaram seu tempo e
esforço, dando sua contribuição para me ajudar nesse processo. Esse período foi de grande
aprendizado e crescimento, não só intelectual, mas pessoal. Essas pessoas a quem gostaria
de agradecer contribuíram de várias formas pra esse crescimento. Portanto, agradeço...
A minha mãe, por todo o amor, conselhos e pela força nos momentos difíceis.
Também por ter possibilitado a minha vinda pra Florianópolis sem bolsa de estudos. E aos
meus irmãos pela amizade e pelo amor. Enfim, muito obrigada por tudo, de todo o meu
coração. Amo vocês.
Ao Professor Alcir, meu co-orientador, gostaria de agradecer pela oportunidade,
pela força, amizade, e pela grande ajuda que tornou possível a realização desta dissertação.
Obrigada também pela orientação e por todos os ensinamentos no período em que
trabalhamos juntos.
Ao Jeferson, que idealizou boa parte deste trabalho, e me ajudou muito com os
experimentos. Obrigada, também, pela amizade e pela força.
Ao Professor Rodrigo Leal, meu orientador, pela oportunidade de realizar este
trabalho, pelos ensinamentos e por toda a ajuda. Às meninas do lab, Thaís, Camila, Ana e
Fernanda, obrigada pelo companheirismo e pela ajuda neste trabalho. Sem todos vocês, ele
não seria possível. Ao Francesco, obrigada epla amizade e pela força. À Sara, obrigada pela
força.
Aos Professores Carlos Alberto Gonçalves e Carmem Gottfried, pela amizade e pelo
carinho. Ao pessoal do lab 33, agradeço pela amizade, pelo apoio, pelo carinho, enfim, foi
um grande prazer ter conhecido e convivido com todos vocês.
Aos Professores Nélson, Carla, Ana Lúcia e Marcelo, com quem tive a oportunidade
de conviver e aprender muito, seja nas disciplinas ou pelo convívio neste príodo.
iv
Ao Professor Adair, por todos os conselhos e incentivo, pela amizade e pelo apoio.
Ao Secretário da Pós-Graduação Nivaldo, por todo o apoio e ajuda neste período.
À Maria Carmelita, pela preciosa ajuda nesse processo.
v
SUMÁRIO
RESUMO.................................................................................................................ix
ABSTRACT……………………………………………………………...........................x
LISTA DE FIGURAS.............................................................................................. xi
LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................. xii
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1
1.1. Zinco nos Processos Biológicos........................................................................1
1.2. Zinco no Sistema Nervoso Central ...................................................................2
1.3. Radicais livres e espécies reativas de oxigênio (ERO) ................................. 7
1.3.1. Defesas Celulares ..........................................................................................10
1.3.1.1. Defesas Não Enzimáticas..........................................................................11
1.3.1.2. Defesas Enzimáticas ..................................................................................12
1.4. Zinco e estresse oxidativo ................................................................................17
1.5. Sinalização Celular ............................................................................................19
1.5.1. Proteínas Quinases........................................................................................20
1.5.1.1. Akt como Elemento Regulatório Essencial .............................................21
1.5.1.2. Papel de Radicais Livres e ERO na Sinalização Celular......................24
2. OBJETIVOS...................................................................................................... 27
3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 28
3.1. Animais ................................................................................................................28
3.2. Tratamentos in vivo ...........................................................................................28
3.2.1. Tratamento Agudo ou com Doses Repetidas de ZnCl
2
...........................28
3.3. Tratamentos in vitro...........................................................................................29
vi
3.3.1. Tratamento das Fatias de Hipocampo. ....................................................... 29
3.4. Avaliação da Viabilidade Celular..................................................................... 30
3.5. Parâmetros Antioxidantes.................................................................................31
3.5.1. Avaliação da Atividade Glutationa Peroxidase (GPx) ..............................31
3.5.2. Avaliação da Atividade Glutationa Redutase (GR) ...................................32
3.5.3. Avaliação da Atividade Glutationa S-Transferase (GST).........................32
3.5.4. Avaliação da Atividade Catalase (CAT)......................................................33
3.5.5. Avaliação da Atividade γ-Glutamil Transpeptidase (GGT) ......................33
3.5.6. Mensuração dos Níveis de GSH Total (GSH-t)......................................... 34
3.6. Dosagem de Proteínas .....................................................................................34
3.7. Separação de Proteínas ...................................................................................35
3.8. Eletrotransferência e Imunodetecção............................................................. 36
3.9. Análise Estatística..............................................................................................37
4. RESULTADOS.................................................................................................. 38
4.1. Estudos in vivo ...................................................................................................38
4.1.1. Glutationa no hipocampo e no córtex de ratos jovens tratados com
ZnCl
2
de forma aguda. ..............................................................................................38
4.1.2. Enzimas antioxidantes em hipocampo e córtex de ratos jovens tratados
com ZnCl
2
de forma aguda. ..................................................................................... 39
4.1.3. Glutationa no hipocampo e no córtex de ratos jovens tratados com
doses repetidas de ZnCl
2
. ........................................................................................ 41
4.1.4. Enzimas antioxidantes em hipocampo e em córtex de ratos jovens
tratados com doses repetidas de ZnCl
2
................................................................. 42
4.2. Estudos in vitro com fatias hipocampais de ratos jovens............................45
vii
4.2.1. Enzimas antioxidantes em fatias de hipocampo tratadas com diferentes
concentrações de ZnCl
2
. ..........................................................................................45
4.2.2. Avaliação da viabilidade celular em fatias hipocampais expostas ao
ZnCl
2
. ...........................................................................................................................47
4.2.3. Efeito do pré-tratamento com ZnCl
2
sobre a inibição de viabilidade
celular causada pelo peróxido de hidrogênio em fatias hipocampais............... 48
4.2.4. Fosforilação da Akt em fatias hipocampais de ratos jovens tratadas com
ZnCl
2
. ...........................................................................................................................49
4.2.5. Ação do inibidor da PI3K (LY294002) sobre a fosforilação da Akt
induzida pelo ZnCl
2
. ..................................................................................................51
4.2.6. Ação do inibidor da PI3K (LY294002) sobre a viabilidade celular em
fatias hipocampais expostas ao ZnCl
2
. .................................................................. 51
5. DISCUSSÃO ..................................................................................................... 54
6. CONCLUSÕES ................................................................................................. 64
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................. 66
viii
RESUMO
O zinco é um metal de transição presente nas sinapses, especialmente do córtex cerebral
e hipocampo, onde desempenha um papel modulatório sobre diversas proteínas,
incluindo enzimas e receptores. Neste trabalho foi realizado um estudo das ações do
zinco in vitro (10-100 µM; 2h) sobre a atividade de enzimas antioxidantes, sobre a
viabilidade celular e sobre a modulação da via PI3K/AKT em fatias de hipocampo de
ratos imaturos (14 dias de idade). Além disso, foram também avaliados os efeitos da
administração in vivo do zinco sobre a atividade de enzimas antioxidantes em hipocampo
e córtex cerebral de ratos jovens. Neste caso, foram utilizados tratamentos via
intraperitoneal com ZnCl
2
seguindo dois protocolos: a) tratamento agudo de ratos com 13
dias de idade, através da administração de dose única de ZnCl
2
(1, 4 e 16 mg/Kg); b)
tratamento com doses repetidas diárias de ZnCl
2
(1, 2 e 4 mg/Kg) por 5 dias no período
pós-natal (PN) entre o 8º e 12º dia de idade. Os animais foram avaliados no 14º dia PN.
Os resultados do estudo in vivo mostraram que não houve alteração nos níveis de
glutationa total (GSH-t) em nenhum dos tratamentos ou estruturas analisadas. Entretanto,
nos dois modelos de tratamento, foi observado um aumento na atividade das enzimas
glutationa S-transferase (GST) e glutationa peroxidase (GPx) no hipocampo, mas não no
córtex cerebral. A atividade das enzimas glutationa redutase (GR) e catalase não foram
alteradas pelos diversos tratamentos com zinco e em nenhuma das estruturas analisadas.
Nos estudos in vitro utilizando fatias hipocampais de ratos jovens todas as doses testadas
de ZnCl
2
(10 a 100 µM) produziram uma significativa e progressiva inibição da enzima
GR, o que não aconteceu com as enzimas GST, GPx e γ-glutamil-transpeptidase (GGT),
sugerindo um efeito seletivo do metal sobre a enzima GR. A viabilidade celular foi
analisada pela medida da redução do MTT. Os resultados mostraram que o ZnCl
2
, nas
concentrações mais elevadas (100-300 µM), reduziu significativamente a viabilidade
celular em fatias de hipocampo. Em função da inibição in vitro da enzima GR pelo zinco,
responsável pela regeneração intracelular de glutationa reduzida (GSH), foi analisado um
possível efeito de sinergismo entre o ZnCl
2
e o agente pró-oxidante H
2
O
2
. Os resultados
mostraram que o pré-tratamento com zinco (10-100 µM; 2h) não alterou a citotoxicidade
(avaliada pelo MTT) produzida pelo H
2
O
2
(1 mM). Este resultado sugere que a inibição
da GR pelo zinco não está diretamente relacionada à toxicidade do H
2
O
2
. O zinco 100
µM, mas não 30 µM, promoveu ativação significativa da AKT, observada através de um
significativo aumento de fosforilação na Serina 473. O uso de LY294002, um inibidor de
PI3K, enzima responsável pela ativação da AKT, inibiu a fosforilação no sitio 473,
indicando que o efeito do zinco sobre AKT é dependente desta via.
ix
ABSTRACT
Zinc is a transition metal found on synapses, specially in cerebral cortex and
hippocampus, where it has a modulatory role upon several proteins, including enzymes
and receptors. The present work was undertaken in order to investigate the effects of zinc
in vitro (10-100 µM; 2h) on antioxidant defense systems, on cell viability, and on
modulation of PI3K/AKT pathway in hippocampal slices of young rats (14 days old).
Additionally, we assess the actions of zinc in vivo on the activity of antioxidant defense
systems in cerebral cortex and hippocampus of young rats. In this case, ZnCl
2
was
administered intraperitoneally (i.p.) with the following two protocols: a) acute treatment
was performed in 13 days old rats through the administration of a single dose of ZnCl
2
(1, 4 e 16 mg/Kg); b) repeated dosing was performed by the treatment with daily
injections of ZnCl
2
(1, 2 e 4 mg/Kg) for 5 consecutive days in the postnatal period
between 8
th
and 12
th
days old (PN8-12). The animals were analyzed on 14
th
post-natal
day (PN14). The results showed that in vivo administration of zinc was unable of
inducing changes total glutathione (GSH-t) levels in either treatments or structures
analyzed. However, the results showed an increase of glutathione S-transferase (GST)
and glutathione peroxidase (GPx) activity on hippocampus, but not in cerebral cortex, in
both treatments used. The glutathione reductase (GR) and catalase activity did not
change in either in vivo treatments or structures analyzed. The study using hippocampal
slices of young rats (PN14) exposed in vitro to ZnCl
2
(10-100 µM) for 2 h, showed a
significant and progressive inhibition of GR, with no changes in GST, GPx and gamma-
glutamyl-transpeptidase (GGT) activity, suggesting a specific in vitro effect of zinc upon
GR. Cell viability was analyzed by measurement of cellular capacity to reduce MTT.
The results showed that ZnCl
2
in the highest concentrations tested (100-300 µM),
decreased cell viability of hippocampal slices. Once zinc can inhibit GR in vitro, and this
enzyme is responsible for intracellular regeneration of reduced glutathione (GSH), a
possible sinergistic effect between ZnCl
2
and H
2
O
2
was analyzed. The results showed
that pretreatment with ZnCl
2
(10-100 µM; 2h) did not change the citotoxicity (measured
by MTT) produced by H
2
O
2
(1 mM), suggesting that the inhibition of GR by zinc is not
directly related to H
2
O
2
toxicity. ZnCl
2
100 µM, but not 30 µM, promoted activation of
AKT, observed through a significant increase of the phosphorylation on Ser 473. The use
of LY294002, a PI3K inhibitor, prevented this activation, indicating that the effect of
ZnCl
2
on AKT is dependent of PI3K pathway.
x
LISTA DE FIGURAS
Fig. 1. Localização do zinco no cérebro de ratos. ................................................... 2
Fig. 2. Transporte do zinco para o interior do cérebro............................................. 3
Fig. 3. Distribuição do zinco nas células nervosas. ................................................. 4
Fig. 4. Transporte de zinco sináptico....................................................................... 5
Fig. 5. Alguns exemplos de espécies reativas de oxigênio. .................................... 7
Fig. 6. Redução univalente do oxigênio e formação de intermediários reativos...... 8
Fig. 7. Estresse oxidativo. ....................................................................................... 9
Fig. 8. Ciclo redox esquemático mostrando a relação entre enzimas antioxidantes
e a glutationa......................................................................................................... 11
Fig. 9. Alvos bioenergéticos potenciais para inibição pelo zinco........................... 18
Fig. 10. Diagrama esquemático do sistema de fosforilação de proteínas. ............ 19
Fig. 11. Alvos da regulação da sobrevivência celular pela Akt.............................. 23
Fig. 12. Vias que podem ser mediadas por estresse oxidativo. ............................ 25
Fig. 13. Efeito do ZnCl2 sobre os níveis de glutationa total (GSH-t) em ratos jovens
tratados com o metal de forma aguda................................................................... 38
Fig. 14. Efeito do tratamento agudo com ZnCl
2
sobre a atividade das enzimas
antioxidantes em hipocampo de ratos jovens........................................................ 40
Fig. 15. Efeito do tratamento agudo com ZnCl
2
sobre a atividade de enzimas
antioxidantes em córtex cerebral de ratos jovens. ................................................ 41
xi
Fig. 16. Efeito do ZnCl2 sobre os níveis de glutationa total (GSH-t) em ratos jovens
tratados com doses repetidas do metal................................................................. 42
Fig. 17. Efeito do tratamento com doses repetidas com ZnCl
2
sobre a atividade
das enzimas antioxidantes em hipocampo de ratos jovens. ................................. 43
Fig. 18. Efeito do tratamento com doses repetidas com ZnCl
2
sobre a atividade
das enzimas antioxidantes em córtex cerebral de ratos jovens. ........................... 44
Fig. 19. Atividade de enzimas antioxidantes de fatias hipocampais em resposta ao
tratamento in vitro com ZnCl
2
. ............................................................................... 46
Fig. 20. Efeitos do ZnCl
2
sobre a viabilidade de fatias de hipocampos. ................ 47
Fig. 21. Efeito do tratamento de zinco e H
2
O
2
na redução do MTT em hipocampo
de ratos jovens. ..................................................................................................... 49
Fig. 22. Efeito do ZnCl
2
sobre a fosforilação da proteína Akt em fatias hipocampais
de ratos jovens. ..................................................................................................... 50
Fig. 23. Ação do inibidor de PI3K, LY294002, sobre a fosforilação de Akt em
resposta ao tratamento in vitro com zinco............................................................. 52
Fig. 24. Ação do inibidor da PI3K/Akt, LY294002, sobre os efeitos do ZnCl
2
na
redução do MTT. ................................................................................................... 53
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
AMPA: α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid
AMPc: monofosfsto de adenosina cílcico
ARE: elemento de resposta a antioxidantes
ATP: trifosfato de adenosina
BSA: albumina sérica bovina
CAT: catalase
CDNB: clorodinitrobenzeno
CFS: fluido cérebro espinhal
Cu/ZnSOD: cobre-zinco-superóxido dismutase
DMSO: dimetil sulfóxido
DNA: ácido desoxirribonucléico
ECL: quimioluminescência
EDTA: ácido etileno-dinitrilo-tetra-acético
EGFR: receptor do fator de crescimento epidérmico
ERK: quinase regulada por sinal extracelular
ERO: espécies reativas de oxigênio
FAD: flavina adenina dinucleotídeo
Fe-SOD: ferro-superóxido dismutase
G6PDH: glicose-6-fosfato desidrogenase
GABA: ácido γ-aminobutírico
GCL: γ-glutamil-cisteína sintetase ou glutamato-cisteína ligase
GMPc: monofosfato de guanosina cíclico
GPx: glutationa peroxidase
GR: glutationa redutase
GSH: γ-glutamil-cisteinil-glicina ou glutationa
GSH-t: glutationa total
GSSG: dissulfeto de glutationa
xiii
GST: glutationa S-transferase
HEPES: ácido N-2-Hidroxietilpiperazina-N’-2-etanosulfônico
JNK: quinase c-Jun NH
2
-terminal
MAPK: proteína quinase ativada por mitógenos
MDA: malonildialdeído
Mn-SOD: manganês- superóxido dismutase
MTT: brometo de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2,5-difenil-tetrazolium)
NADPH: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NFκB: fator de transcrição nuclear kappa B
NMDA: N-Methil-D-Aspartato
NrF2: fator nuclear relacionado ao fator E2
p38
MAPK
: proteína quinase ativada por mitógeno de 38 kDa
PCA: ácido perclórico
PH: domínio de homologia à plecstrina N-terminal
PI3K: fosfoinositol 3-quinase
PIP
2
: fosfatidilinositol 3,4-bifosfato
PIP
3
: fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato
PI(4,5)P
2
: fosfatidilinositol 4,5-bifosfato
PKB: proteína quinase B
PKC: proteína quinase C
RNA: ácido ribonucléico
RNAm: ácido ribonucléico mensageiro
RTK: receptor tirosina quinase
SDS: dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS
SNC: sistema nervoso central
SOD: superóxido dismutase
TBARS: substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
t-BOOH: hidroperóxido de tert-butila
TBS: tampão tris-salina
TBS-T: tampão tris-salina com Tween-20
xiv
TCA: ácido tricarboxílico
TEMED: N, N, N’, N’-Tetrametiletilenodiamina
TGFβ: fator de crescimento tumoral β
xv
1. INTRODUÇÃO
1.1. Zinco nos Processos Biológicos
O zinco (Zn
2+
) é um metal de transição que modula a função de diversas proteínas
regulatórias associadas a uma variedade de atividades celulares (Eom et al., 2001). Nas
células de mamíferos, o zinco é o micronutriente essencial mais abundante depois do ferro.
Aproximadamente 300 enzimas diferentes requerem zinco, incluíndo DNA e RNA
polimerases, metaloproteinases e enzimas do metabolismo intermediário, como piruvato
carboxilase e lactato desidrogenase (Tapiero & Tew, 2003; Vallee & Auld, 1996; Vallee &
Falchuk, 1986). Fisiologicamente, em baixas concentrações, o zinco contribui para
importantes processos biológicos, incluindo expressão gênica, síntese de DNA, catálise
enzimática, sinalização celular e neurotransmissão (Frederickson et al., 2000). Por outro
lado, o excesso de zinco livre nos tecidos do corpo pode ser tóxico (Choi & Koh, 1998).
O crescimento e a diferenciação de células eucarióticas geralmente são induzidos
por hormônios e fatores de crescimento que acionam elementos que estão envolvidos em
cascatas intracelulares de sinalização, envolvendo receptores, mensageiros intracelulares,
proteínas cinases, proteínas fosfatases e fatores de transcrição (Lau & Huganir, 2006). O
zinco está envolvido em diversos pontos nas vias de transdução de sinal, podendo ser um
componente estrutural ou modulador da atividade de enzimas, proteínas regulatórias e
fatores de transcrição (Vallee & Falchuk, 1993; Beyersmann & Haase, 2001). Entretanto,
perturbação na homeostase do Zn
2+
intracelular pode, em determinadas situações, ser letal
1
para as células (Koh & Choi, 1994; Manev et al., 1997; Lobner et al., 2000; Marin et al.,
2000).
1.2. Zinco no Sistema Nervoso Central
Similar a outros compostos endógenos, o zinco pode ser tanto um neuromodulador
essencial quanto uma potente neurotoxina, dependendo da sua concentração intracelular
(Baranano et al., 2001). Baixos níveis de zinco possuem uma ação anticonvulsivante e
neuroprotetora, enquanto altas concentrações de zinco podem matar neurônios e induzir
atividade epilética (Frederickson & Moncrieff, 1994).
Fig. 1. Localização do zinco no cérebro de ratos. Quadrante caudal esquerdo do cérebro
de rato (secção horizontal) mostra o zinco vesicular na coloração marrom-escura a preta, a
partir da coloração para zinco vesicular pelo método de Danscher. A quarta camada do
isocórtex e o hipocampo se mostram bem coradas para o zinco vesicular. A maioria das
regiões corticais cerebrais é fortemente inervada por terminais que contêm zinco, enquanto
o córtex cerebelar (Ctx Cer) e o tálamo não estão corados para o zinco vesicular. A quarta
camada do isocórtex (IV), as regiões CA1, hilo do giro denteado (H), estrato oriens (O),
estrato radiato (R) e córtex subicular (Sub), todas pertencendo ao hipocampo, se mostram
bem coradas para o zinco vesicular (Frederickson et al., 2004).
2
O zinco é um nutriente essencial para as funções neurológicas normais. Dentre os
tecidos, o cérebro possui o maior conteúdo de zinco, apresentando concentrações cerca de
dez vezes maiores que o plasma (cerca de 100 – 150 µM) (Mocchegiani et al., 2005).
Apesar de neurônios que contêm zinco serem encontrados em várias regiões do cérebro,
incluindo neocórtex, amídala e bulbo olfatório, os neurônios do hipocampo (Fig.1) têm a
maior concentração de zinco e são particularmente vulneráveis ao dano celular mediado
pelo íon (Haug, 1967; Perez-Clausell & Danscher, 1985; Frederickson, 1989; Frederickson
et al., 2000; Li et al., 2001a). No sistema límbico, o zinco regula tanto a transmissão
sináptica inibitória quanto excitatória no hipocampo. Além disso, o zinco pode ter um
importante papel na formação da memória (Takeda, 2000).
Fig. 2. Transporte do zinco para o interior do cérebro. A albumina e os aminoácidos
histidina e cisteína ligados ao zinco são fontes deste metal no plasma. O zinco pode
atravessar a barreira hematoencefálica e a barreira hemato-fluidocérebroespinhal. No
interior do cérebro, pode se ligar a metaloproteínas ou ser incorporado a vesículas
sinápticas em neurônios glutamatérgicos (modificado a partir de Takeda, 2004).
O transporte de metais-traço para dentro do cérebro é rigorosamente regulado pelas
barreiras hemato-fluidocérebroespinhal e hematoencefálica (Fig. 2). O zinco atravessa a
3
barreira hematoencefálica ligado à albumina, ou a aminoácidos como histidina e cisteína
(Takeda, 2000). No cérebro, em condições normais, 90% do zinco se encontra ligado a
proteínas, como metalotioneínas (Cole et al., 1999). O restante, cerca de 10%, será
seqüestrado nas vesículas sinápticas de neurônios que contêm zinco, e posteriormente
liberado dos terminais neuronais (Crawford & Connor, 1973; Frederickson et al., 2004;
Takeda, 2004) (Fig.3).
Fig. 3. Distribuição do zinco nas células nervosas. O zinco pode ser encontrado ligado à
metaloproteínas ou no interior de vesículas sinápticas. O transporte do zinco é feito pelas
proteínas transportadoras ZnT e ZIP. Uma vez liberado na fenda sináptica, o zinco pode se
ligar a receptores de membrana ou entrar no neurônio pós-sináptico, através de canais
protéicos ou pela ação de transportadores, acionando cascatas de proteínas quinases que,
através da sinalização celular, podem induzir a expressão gênica. Em altas concentrações, o
zinco pode levar o neurônio à apoptose. (Adaptado de Colvin et al., 2003).
A captação de zinco nas células neuronais ocorre ao nível de corpo celular, bem
como pelo terminal neuronal. Como os terminais pré-sinápticos liberam zinco, e o corpo
4
celular e os dendritos do neurônio pós-sináptico possuem canais permeáveis ao zinco, sob
condições favoráveis, o zinco poderá translocar do interior do neurônio pré-sináptico para o
interior do neurônio pós-sináptico. Durante atividade neuronal intensa pode se esperar uma
intensificação desta translocação (Atar et al., 1995; Yin et al., 1998; Sensi et al., 2000;
Kerchner et al., 2000).
Fig. 4. Transporte de zinco sináptico. Vesículas com a proteína transportadora de zinco
vesicular, ZnT3 (1), reunidas no Aparelho de Golgi de neurônios glutamatérgicos que
contêm zinco, são transportadas pelo axônio (2). Uma vez no terminal pré-sináptico, essas
vesículas podem ser vistas contendo tanto zinco livre quanto glutamato (3). O zinco e o
glutamato são liberados por exocitose dependente de cálcio e impulso nervoso (4). Na
fenda sináptica o zinco modula uma variedade de canais transportadores e receptores (5-10)
em neurônios e células gliais. Os canais de cálcio possuem certa permeabilidade ao zinco (5
e 9), permitindo sua entrada na célula pós-sináptica, onde ele é ligado às metalotioneínas
(MT) (11). Oxidação e nitrosilação de tióis das metalotioneínas pelo óxido nítrico (NO)
promovem a liberação somática do zinco (12) (Frederickson et al., 2005).
A liberação de zinco na sinapse juntamente com o neurotransmissor glutamato tem
sido bem documentada (Fig. 4), e o termo “gluzinérgico” tem sido proposto para descrever
esse tipo de neurônios (Frederickson, 1989; Frederickson & Bush, 2001). Durante
atividades fisiológicas, incluindo memória e aprendizado, as fibras musgosas do hipocampo
5
podem transmitir informação aos neurônios desta estrutura em freqüências
excepcionalmente altas. Durante esses períodos, o zinco liberado sinapticamente pode agir
de forma a proteger os neurônios contra os potenciais de ação excitotóxicos conseqüentes
da transmissão glutamatérgica aumentada através da inibição dos receptores N-Metil-D-
Aspartato (NMDA) via um sítio de ligação de alta afinidade (Paoletti et al., 1997). A
concentração de zinco nas vesículas glutamatérgicas é de aproximadamente 300-350 µM
(Perez-Clausell & Dansher, 1985; Takeda, 2000). Durante a atividade neuronal, é estimado
que o zinco atinja um pico de concentração sináptica de 10-100 µM (Vogt et al., 2000),
podendo chegar a níveis ainda maiores após uma atividade sináptica aumentada (Assaf &
Chung, 1984; Howell et al., 1984; Molnar & Nadler, 2001).
Durante estímulo normal, o zinco liberado dos terminais pré-sinápticos
glutamatérgicos pode ser translocado para a célula pós-sináptica através dos canais de Ca
2+
dependentes de voltagem ou dos receptores AMPA/cainato, podendo acionar cascatas de
sinalização neste neurônio (Sensi et al., 1999a). Há evidências de que tal translocação
contribui para a injúria celular induzida pelo zinco na excitotoxicidade (Li et al., 2001b).
Assim, apesar dos importantes papéis neuromodulatórios do zinco livre, a liberação
excessiva deste metal nos botões sinápticos pode resultar em morte neuronal pós-sináptica
(Frederickson, 1989; Frederickson et al., 1989; Koh et al., 1996; Ahn et al., 1998).
Portanto, os estudos que investigam os mecanismos de neurotoxicidade do zinco têm
focado, principalmente, sua interação com o sistema glutamatérgico.
Considerando os aspectos relacionados à neurotoxicidade do zinco, tem sido
indicado que a excessiva liberação pré-sináptica do metal pode contribuir ou participar de
eventos bioquímicos relacionados à neurodegeneração após isquemia global transitória e
trauma cerebral (Aniksztejn et al., 1987; Suh et al., 2000; Weiss e Sensi, 2000; Koh, 2001).
6
Além disso, tem sido proposto que o aumento nos níveis intracelulares de zinco após um
evento de estresse, pode também se originar de compartimentos dos próprios neurônios
pós-sinápticos, como estoques mitocondriais e zinco ligado a metalotioneínas (Frederickson
et al., 2004).
1.3. Radicais livres e espécies reativas de oxigênio (ERO)
Radicais livres são moléculas que possuem elétrons desemparelhados no seu orbital
mais externo (Marks et al., 1996) e podem ser tanto moléculas orgânicas, tais como
quinonas, ou inorgânicas como o ânion superóxido (O
2
·
-
). São altamente reativos e,
portanto, com tempo de vida muito curto. São formados durante o metabolismo celular
normal e, também, quando o organismo é exposto a uma série de estímulos como radiação
ionizante e biotransformação de xenobióticos (Comporti, 1989).
Fig. 5. Alguns exemplos de espécies reativas de oxigênio.
Fonte: http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/R/ROS.html Acessado em
Julho de 2006.
Espécies reativas de oxigênio (ERO) são compostos contendo oxigênio (Fig. 5).
ERO incluem os radicais livres como o ânion superóxido, (O
2
·
-
), o radical hidroxila (OH·),
radicais hidroperoxil (HO
2
·), e as espécies não radicalares como o peróxido de hidrogênio
(H
2
O
2
) e o oxigênio singlet (O
2
↑
) (Halliwell & Gutteridge, 1999). Estas espécies são
altamente reativas e podem agir como sinalizadores celulares, ou ainda como causadores de
7
dano ao DNA, ativadores pró-carcinógenos, e podem alterar o sistema de defesa
antioxidante celular (Comporti, 1989; Cerutti, 1994; Liochev e Fridovich, 1999).
O oxigênio molecular, em seu estado fundamental, é um bi-radical contendo dois
elétrons desemparelhados no seu orbital mais externo. Entretanto, estes dois elétrons
desemparelhados apresentam “spins” de mesma orientação, tornando o O
2
uma molécula
pouco reativa, podendo reagir com apenas um elétron por vez. O O
2
é capaz de aceitar
quatro elétrons, o que o reduz à água. Entretanto, reduções parciais do O
2
conduzem ao
aparecimento de diversas espécies reativas (Fig 6).
Fig. 6. Redução univalente do oxigênio e formação de intermediários reativos. Os
quatro passos para a redução de O
2
geram, progressivamente, superóxido, peróxido de
hidrogênio, radical hidroxila e água (modificado a partir de Marks et al., 1996).
Quando o O
2
aceita um elétron, é formado o ânion superóxido, considerado um
radical por possuir um elétron desemparelhado. Essa reação não é termodinamicamente
favorável e requer um agente fortemente redutor como, por exemplo, a CoQ na cadeia
transportadora de elétrons. Quando o superóxido recebe um elétron, é reduzido a peróxido
de hidrogênio, que não é um radical, mas pode gerar o radical hidroxila em conseqüência
de uma nova redução. Finalmente, em um último passo, a entrada de mais um elétron reduz
o radical hidroxila à água (Marks et al., 1996).
Durante o metabolismo basal das células aeróbicas, existe uma produção constante
de radicais livres e ERO acompanhada pela sua contínua inativação através da ação de
8
antioxidantes, de modo a manter a integridade celular estrutural e funcional. A condição de
estresse oxidativo foi definida como um distúrbio no balanço pró-oxidante e antioxidante
(Fig.7), em favor do primeiro, podendo causar danos celulares (Sies, 1997; Ho et al., 1998).
Desta forma, o estresse oxidativo pode resultar: (1) da maior geração de ERO, (2) da defesa
insuficiente das enzimas antioxidantes, (3) da liberação de metais de transição, potenciais
geradores do radical hidroxila, (4) da combinação destes fatores (Halliwell, 2001).
Fig. 7. Estresse oxidativo. Estresse oxidativo ocorre quando a taxa de produção de
espécies reativas de oxigênio e radicais livres excede a taxa de sua remoção pelos
mecanismos de defesa antioxidantes. Fonte:
http://www.asiaandro.com/1008-
682x/6/59htm
. Acessado em Julho de 2006.
Os danos causados pelo estresse oxidativo incluem, principalmente, clivagem do
DNA pela hidroxilação da guanina e metilação da citosina (Lee et al., 2002), lise
mitocondrial, influxo de cálcio, oxidação de proteínas, gerando derivativos carbonil e
nitrotirosina (Adams et al., 2001), e peroxidação de lipídios da membrana celular (Marks et
al., 1996). Os organismos aeróbicos desenvolveram, portanto, diferentes mecanismos de
9
defesa antioxidante, enzimáticos e não-enzimáticos, que podem prevenir a formação das
ERO, reagir com estes intermediários reativos, bem como reparar os danos causados pelos
mesmos (Sies, 1993).
O cérebro é particularmente sensível aos danos causados por radicais livres e
espécies reativas de oxigênio (ERO) devido a sua alta taxa metabólica e sua capacidade
relativamente reduzida de regeneração celular comparada com outros órgãos (Andersen,
2004). Além disso, os tecidos cerebrais contêm grandes quantidades de ácidos graxos
poliinsaturados, que podem ser oxidados por radicais livres. Finalmente, o cérebro contém
altos níveis de ferro, o qual tem sido referido como importante elemento associado à
produção de radicais livres e injúria neural (Herbert et al., 1994).
1.3.1. Defesas Celulares
O organismo possui defesas antioxidantes que o protegem dos danos oxidativos.
Estas defesas podem ser definidas como “qualquer substância que, presente em baixas
concentrações quando comparadas a de um substrato oxidável, retarda ou inibe
significativamente a oxidação deste” (Halliwell e Gutteridge, 1999). Estas defesas podem
ser fornecidas por compostos não enzimáticos assim como por enzimas específicas
(Halliwell, 2001). Os antioxidantes protegem as células do dano oxidativo (Halliwell, 1992;
Sies, 1996). Portanto, frente a um estresse oxidativo, estas defesas são acionadas para
restabelecer o equilíbrio, evitando o dano oxidativo.
10
1.3.1.1. Defesas Não Enzimáticas
Existem várias moléculas que podem agir como antioxidantes não enzimáticos,
entre elas podemos citar: os tocoferóis, o ácido ascórbico, assim como os carotenóides e a
glutationa (GSH) (Sies et al., 1992).
A GSH é um tripeptídeo (γ-glutamil-cisteinil-glicina), sendo considerada o
antioxidante endógeno universal devido a sua importância na proteção celular contra a
formação de ERO, na homeostase tiólica, na manutenção da homeostase redox da célula, e
na defesa contra agentes eletrofílicos (Cooper, 1997; Dringen, 2000; Bharath et al., 2002).
Fig. 8. Ciclo redox esquemático mostrando a relação entre enzimas antioxidantes e a
glutationa. A glutationa é sintetizada em duas reações enzimáticas seqüenciais
dependentes de ATP. O primeiro passo da síntese da glutationa (GSH) é sintetizado pela γ-
glutamil-cisteína sintetase ou glutamato-cisteína ligase (GLC), a qual liga os aminoácidos
L-glutamato e L-cisteína. A enzima glutationa sintetase (GS) liga L-γ-glutamato-L-cisteína
com o aminoácido glicina para formar L-γ-glutamil-L-cisteinil-glicina (GSH). Modificado
a partir de Haddad & Harb, 2005.
A GSH é utilizada por uma série de enzimas, como a glutationa peroxidase (GPx) e
a glutationa S-transferase (GST). A GSH é sintetizada em dois passos, por duas enzimas
distintas: γ-glutamil-cisteína sintetase ou glutamato-cisteína ligase (GCL), que é
11
considerada o ponto regulatório da produção da GSH, e pela glutationa sintetase, que é
responsável pela adição de glicina (Sies, 1999) (Fig. 8). O termo glutationa total (GSH-t) é
usado para a soma do dissulfeto da glutationa (GSSG) com sua forma tiólica (GSH).
Os grupos tióis contidos na glutationa podem ser oxidados enzimaticamente,
levando à formação de pontes dissulfeto (-S-S-). Por outro lado, as pontes dissulfeto são
facilmente reduzidas, formando novamente os grupos tióis. Desta forma, a taxa de redução
e oxidação dos grupos tióis pode ser o principal fator determinante do potencial de redução
celular (Galaris & Evangelou, 2002). A razão entre a GSH reduzida e a oxidada
(GSH/GSSG) varia entre os vários compartimentos celulares, variando de 2:1 no retículo
endoplasmático a mais de 100:1 em outros compartimentos (Hwang et al., 1992). O
balanço entre a GSH reduzida e a oxidada representa um fator chave no estado redox
celular (Meister, 1994).
Foi demonstrado que neurônios em cultura são mais vulneráveis à compostos como
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), hidroperóxido de tert-butila (t-BOOH), ou peroxinitrito
(ONOO
-
)(Ben-Yoseph et al., 1994; Bolaños et al., 1995; Abe & Saito, 1998). Isso
provavelmente ocorre porque neurônios em cultura contêm glutationa em uma
concentração mais baixa do que células astrogliais em cultura (Raps et al., 1989; Bolaños et
al., 1995).
1.3.1.2. Defesas Enzimáticas
As principais enzimas antioxidantes são: superóxido dismutase (SOD), catalase
(CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR), glicose-6-fosfato
desidrogenase (G6PDH), glutationa S-transferase (GST) e γ-glutamil transpeptidase (γ-GT).
12
a) Superóxido Dismutase (SOD)
A enzima SOD catalisa a dismutação do radical O
2
·
-
em H
2
O
2
e O
2
(McCord e
Fridovich, 1969), conforme representado na equação [1] e [2]. Esta enzima é encontrada em
diferentes isoformas. A cobre-zinco-SOD (Cu/Zn-SOD) é uma metaloproteína dimérica que
possui em cada subunidade um sítio ativo com um átomo de cobre e um átomo de zinco. É
encontrada no citoplasma e núcleo das células de mamíferos (Halliwell e Gutteridge, 1999).
Eq. [1]
Enz-Cu
2+
+ O
2
•
-
→ Enz-Cu
+
+ O
2
Eq. [2] Enz-Cu
+
+ O
2
•
-
+ 2H+ → Enz-Cu
2+
+ H
2
O
2
Outras isoenzimas SOD foram identificadas. A enzima manganês-SOD (Mn-SOD)
possui manganês no sítio catalítico. Nas células humanas, a Mn-SOD é encontrada
principalmente na matriz mitocondrial (Halliwell & Gutteridge, 1999). A enzima
extracelular-SOD (EC-SOD) é encontrada na superfície celular, em quantidades muito
pequenas na maioria dos tecidos se comparada às isoformas Cu/Zn-SOD e Mn-SOD
(Marklund, 1984; Oury et al., 1996). Embora os níveis de EC-SOD no cérebro sejam
baixos, existem regiões específicas, como o hipocampo, nas quais a presença da enzima
EC-SOD é necessária para as funções normais de aprendizado e memória (Levin et al.,
1998). A isoforma ferro-SOD (Fe-SOD), que possui ferro no sítio catalítico, não é
encontrada nas células de mamíferos (Wandres & Denis, 1992).
b) Catalase (CAT)
A maioria das células aeróbicas possui atividade catalásica. A localização
intracelular da catalase é basicamente peroxissomal. Nos animais, a CAT está presente em
13
todos os principais órgãos do corpo, especialmente no fígado e nos eritrócitos (Halliwell &
Gutteridge, 1999). No sistema nervoso central, a catalase é encontrada nos quatro principais
tipos celulares, sendo eles astrócitos, neurônios, oligodendrócitos e microglia (Dringen et
al., 2005).
A CAT decompõe o H
2
O
2
em H
2
O e O
2
(Farber et al., 1990), conforme as equações
abaixo:
Eq. [3]
Cat-Fe
3+
+ H
2
O
2
→ Composto 1 + H
2
O
Eq. [4] Composto 1 + H
2
O
2
→ Cat-Fe
3+
+ H
2
O + O
2
c) Glutationa Peroxidase (GPx)
No cérebro, a enzima GPx é encontrada em astrócitos, neurônios, microglia e
oligodendrócitos (Dringen et al., 2005). Esta enzima está presente principalmente na matriz
mitocondrial, no citoplasma e no núcleo das células (Halliwell & Gutteridge, 1999). A
isoforma citosólica de GPx, GPx1, parece ser muito importante para o sistema de defesa
antioxidativo do cérebro (Zhang et al., 2000; Crack et al., 2001; Flentjar et al., 2002).
A GPx possui atividade peroxidase, utilizando doadores de elétrons para reduzir o
peróxido de hidrogênio à água (Little & O’Brien, 1968) conforme as equações abaixo:
Eq. [5]
H
2
O
2
+ 2GSH → 2H
2
O + GSSG
Eq. [6]
LOOH + 2GSH → LOH + H
2
O + GSSG
A GPx possui selênio no sítio catalítico e utiliza o tripeptídeo tiólico GSH como
doador de elétrons para a redução do H
2
O
2
(Eq. [5]) e de outros peróxidos orgânicos
14
(LOOH, Eq. [6]), tais como os lipoperóxidos provenientes da lipoperoxidação lipídica,
impedindo assim a fase de propagação deste processo (Keeling & Smith, 1982). Durante o
processo catalisado pela GPx ocorre a oxidação da GSH, e conseqüente formação de uma
ponte dissulfeto entre duas moléculas de glutationa (GSSG), com concomitante formação
do álcool (LOH) derivado do peróxido orgânico.
d) Glutationa Redutase (GR)
A importância da enzima GR consiste em manter o equilíbrio GSH/GSSG na célula,
pois a GSH é uma molécula que tem como função essencial manter as células no seu estado
reduzido. Portanto, ela atua como um agente antioxidante, reduzindo peróxidos através da
ação da glutationa peroxidase (Meister, 1983; Stamler, 1994; Fujii et al., 2000). No sistema
nervoso central, assim como a GPx, a GR é encontrada em astrócitos, neurônios, microglia
e oligodendrócitos (Dringen et al., 2005).
A GR contém um grupo prostético flavina adenina dinucleotídeo (FAD) transferidor
de elétrons que catalisa a redução da glutationa oxidada (GSSG) em glutationa reduzida
(GSH) de forma dependente de NADPH (Voet et al., 2000), conforme equação abaixo:
Eq. [7]
GSSG + NADPH → 2GSH + NADP
+
e) Glicose-6-Fosfato Desidrogenase (G6PDH)
A enzima G6PDH está presente no citoplasma de todas as células. Ela faz parte do
ciclo das pentoses e participa da produção de NADPH, uma molécula necessária em vários
processos de biossíntese e, também, na manutenção da atividade da glutationa redutase. A
15
G6PDH catalisa a oxidação da glicose-6-fosfato a 6-fosfogliconolactona, hidrolisada em 6-
fosfogliconato. No processo catalítico, esta enzima utiliza NADP
+
como aceptor de
elétrons, gerando equivalentes reduzidos de NADPH que mantém parte do poder redutor
intracelular (Voet et al., 2000).
Eq. [8] Glicose-6-P + NADP
+
→ NADPH + H
+
+ 6-P-Glucono-1,5-lactona
f) Glutationa S-Transferase (GST)
GST constitui uma família de enzimas multifuncionais envolvidas na detoxificação
metabólica de agentes eletrofílicos incluindo agentes alquilantes, herbicidas, pesticidas e
outros xenobióticos (Ketterer et al., 1988; Mannervik & Danielson, 1988; Vos & Van
Bladeren, 1990). GST possui diferentes isoformas, presentes na maioria dos órgãos de
mamíferos. São proteínas diméricas consistindo de duas subunidades pertencentes à mesma
classe, que pode ser α, µ, π, e θ (Mannervik & Danielson, 1988; Meyer et al., 1991). No
cérebro de ratos, GST está presente em neurônios, astrócitos, células endoteliais e
oligodendrócitos. Além disso, há diferenças regionais no padrão de expressão das classes α,
µ, π de GST (Johnson et al., 1993).
A catálise de GST propicia a conjugação destes agentes eletrofílicos com o grupo -
SH da GSH [Eq. 9], tornando os compostos mais hidrofílicos, facilitando sua
metabolização e excreção (Ketterer et al., 1983). GST apresenta também atividade
glutationa peroxidase [Eq. 6] independentemente de selênio, podendo reduzir peróxidos
orgânicos (Mosialou et al., 1993).
16
Eq. [9] GSH + X → GS-X
g) γ-Glutamil Transpeptidase (γ-GT)
γ-glutamil transpeptidase (γ-GT ou GGT) é uma enzima glicoprotéica ligada à
superfície da membrana celular, onde catalisa a transferência do grupo γ-glutamil da GSH
nas suas formas reduzida e oxidada por hidrólise de uma ligação γ-glutamil para outros
aminoácidos aceptores, peptídeos ou água, (Meister et al., 1981). No final da reação
catalisada por GGT são formados aminoácidos γ-glutamil (ou peptídeos γ-glutamil) e o
dipeptídeo CysGly.
No sistema nervoso central de ratos adultos, a GGT está principalmente localizada
nos pés astrocíticos perivasculares que circundam os vasos sangüíneos, e em alguns
pericitos (Zhang et al., 1997; Cambier et al., 2000).
1.4. Zinco e estresse oxidativo
Tanto o excesso quanto a deficiência de zinco podem levar ao estresse oxidativo e,
conseqüentemente, ativar ou inibir fatores de transcrição sensíveis à oxidação, podendo
afetar a função, a proliferação e a sobrevivência celular (Oteiza et al., 2004). Embora o
zinco não seja ele próprio um oxidante, este metal pode inibir a produção da energia celular
através de mecanismos que aumentam o estresse oxidativo (Fig. 9) (Dineley et al., 2003).
Alguns estudos evidenciam que o estresse oxidativo pode ser o principal causador de morte
neuronal pelo zinco (Kim et al., 1999b; Noh et al., 1999; Noh & Koh, 2000).
17
Fig. 9. Alvos bioenergéticos potenciais para inibição pelo zinco. O zinco pode
comprometer a produção de energia celular através da inibição da glicólise pela inibição da
enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), da inibição do ciclo do ácido
tricarboxílico (TCA) pela inibição docomplexo α-cetoglutarato desidrogenase (KGDHC), e
da inibição da cadeia transportadora de elétrons. Possíveis conseqüências do aumento da
concentração de zinco intracelular incluem consumo reduzido de O
2
, níveis de ATP
reduzidos, aumento na geração de ERO, permeabilidade mitocondrial transitória (PTM), e
morte neuronal. O impacto do zinco na permeabilidade mitocondrial, bem como os
mecanismos responsáveis pela captação de zinco pela mitocôndria permanecem obscuros
(modificado a partir de Dineley et al., 2003).
Um aumento no zinco intracelular pode causar disfunção mitocondrial, o que pode
levar à geração de espécies reativas de oxigênio (Sensi et al., 1999b). A inibição do ciclo
do ácido tricarboxílico (TCA) pelo zinco poderia estimular a produção de ERO através da
inibição do complexo da α-cetoglutarato desidrogenase (Gazaryan et al. 2002). Além disso,
um aumento nos níveis de zinco intracelular causa a inibição da atividade da GR in vitro
(Mize & Langdon, 1962), e aumenta a geração de ânion superóxido pela enzima NADPH
oxidase (Noh & Koh, 2000), resultando em elevada produção de ERO. Por fim, tem sido
sugerido que o zinco também pode contribuir na patobioquímica de desordens
18
neurodegenerativas, tais como Mal de Parkinson, algumas formas de Esclerose Lateral
Amiotrófica, e Mal de Alzheimer (Cuajungco & Lees, 1997; Puttaparthi et al., 2002;
Friedlich et al., 2004).
1.5. Sinalização Celular
Nos organismos multicelulares, as células necessitam utilizar vias de sinalização
para comunicar-se entre si e para comandar diversas funções relacionadas, entre outras, à
migração, proliferação, diferenciação e morte (Davis, 2000). Neste processo, a fosforilação
de proteínas representa uma via comum e de fundamental importância.
Fig. 10. Diagrama esquemático do sistema de fosforilação de proteínas. As proteínas
cinases catalisam a transferência de γ-fosfato (P) do ATP a resíduos de serina (Ser),
treonina (Thr), ou tirosina (Tyr) presentes nas proteínas substratos. As proteínas fosfatases
catalisam a hidrólise da ligação fosfoéster, causando a liberação do fosfato inorgânico (Pi).
Fonte: modificado a partir de http://www.emdbiosciences.com. Acessado em Julho de
2006.
Sinais extracelulares, dentro ou fora do SNC, são conhecidos por produzir muitos de
seus efeitos fisiológicos através da regulação do estado de fosforilação de proteínas
19
específicas em suas células-alvo (Robinson & Cobb, 1997; Hunter, 2000; Greengard,
2001). Um sistema de fosforilação de proteínas consiste de: uma proteína cinase, uma
proteína fosfatase, um substrato protéico e ATP (Fig. 10).
1.5.1. Proteínas Cinases
Proteínas cinases são classificadas como proteínas serina/treonina ou tirosina
cinases porque são capazes de fosforilar substratos protéicos em resíduos de serina/treonina
ou tirosina. As proteínas cinases catalisam a transferência de um grupo fosfato γ do ATP
para o grupo hidroxila no respectivo resíduo de aminoácido em seu substrato protéico (Fig.
10) (Nestler & Greengard, 1999).
A fosforilação de proteínas realiza um papel fundamental na regulação de diversas
funções celulares, sendo o principal mecanismo acionado no processo de transdução de
sinal em resposta a diversos sinais extracelulares (Hunter, 1995; Pawson & Scott, 1997;
Lau & Huganir, 1999; Nestler & Greengard, 1999; Schillace & Scott, 1999; Hunter, 2000;
Lau & Huganir, 2006). A fosforilação de uma proteína altera sua carga e, por conseqüência,
sua conformação de forma reversível. Esse mecanismo regula a atividade funcional de
diversas proteínas, desencadeando respostas biológicas específicas. Dessa forma, a
fosforilação/defosforilação de proteínas pode regular importantes processos biológicos,
como a atividade catalítica de enzimas, abertura/fechamento de canais iônicos, atividade de
receptores, atividade de fatores de transcrição, localização intracelular de proteínas e
dinâmica do citoesqueleto (Greengard, 2001).
No SNC, tem sido bem documentada a cascata de sinalização da via PI3K-Akt e seu
envolvimento na regulação da sobrevivência celular através de diversos mecanismos,
20
incluindo fosforilação e inibição de mediadores pró-apoptóticos (Datta et al., 1999), e
“upregulation” da expressão de genes com potencial antiapoptótico (Andjelkovic et al.,
1997; Meier et al., 1997). Além disso, há evidências do envolvimento da via PI3K-Akt no
metabolismo, através da sua atuação na captação de glicose (Kohn et al., 1995; Kohn et al.,
1996).
1.5.1.1. Akt como Elemento Regulatório Essencial
A proteína quinase B (PKB) ou Akt é amplamente expressa em mamíferos, sendo
que três membros desta família de serina/treonina cinases são conhecidos, sendo eles PKBα
ou Akt1, PKBβ ou Akt2, e PKBγ ou Akt3. A expressão celular da Akt pode variar entre os
diferentes tipos de tecidos e células (Chong et al., 2005). A Akt1 é a isoforma mais
expressa. Embora a Akt2 seja expressa em níveis menores do que a Akt1, ela ocorre em
tecidos responsivos à insulina, como músculo esquelético, fígado, coração, rins e tecido
adiposo (Altomare et al., 1995). Akt é parte da superfamília de proteínas cinases AGC
(proteína cinase dependente de cAMP/proteína cinase G/proteína cinase C), e consiste de
três domínios funcionais. O domínio N-terminal com homologia à plextrina (PH) fornece
sítios de ligação para os fosfolipídios de membrana, os quais estão envolvidos no
recrutamento da Akt para a membrana plasmática (Brazil et al., 2004). O domínio catalítico
da Akt tem especificidade por resíduos de serina ou treonina de proteínas substrato para
Akt (Frech et al., 1997). O domínio carboxil terminal possui um motivo hidrofóbico
característico da família AGC (Peterson & Schreiber, 1999). A fosforilação dos resíduos de
serina e treonina desse motivo hidrofóbico é necessária para a completa ativação da cinase
(Andjelkovic et al., 1997; Yang et al., 2002; Brazil et al., 2004; Hanada et al., 2004).
21
Em diversos tipos celulares, fatores tróficos ou citocinas, via modulação de
receptores tirosina cinases ou mesmo de receptores acoplados à proteína G, causam
ativação da enzima fosfatidil inositol 3 quinase (PI3K), junto à membrana celular (Fig. 11).
Após a ativação, PI3K fosforila, na posição 3, os glicerofosfolipídeos de membrana
fosfatidilinositol 4,5-bifosfato [PI(4,5)P
2
] ou fosfatidilinositol 4-monofosfato [PI(4)P],
resultando na produção de fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PIP
3
) e fosfatidilinositol 3,4-
bifosfato (PIP
2
). Este evento conduz ao recrutamento de Akt junto à membrana plasmática,
que, através da região com homologia à plextrina, liga-se aos PIP
2
ou PIP
3
de membrana,
sendo sua transição do citosol para a membrana plasmática um evento essencial para sua
ativação (Thomas et al., 2002; Brazil et al., 2004; Hanada et al. 2004). Assim, a Akt se
torna disponível para a fosforilação pela PKD1 na Treonina (Thr)
308
e por uma outra
proteína cinase ainda não estabelecida na posição Serina (Ser)
473
(Stephens et al., 1998;
Datta et al., 1999; Brazil et al., 2004; Hanada et al. 2004). A fosforilação dos resíduos de
Thr-308 e Ser-473 é considerada crítica para a ativação da Akt (Bellacosa et al., 1998;
Yang et al., 2002). Muitos dos efeitos antiapoptóticos desses fatores de crescimento podem
ser atribuídos, em parte, à ativação desta via, o que foi primeiramente demonstrado em
células PC12 por Yao e Cooper (1995).
22
Fig. 11. Alvos da regulação da sobrevivência celular pela Akt. Modificado a partir de
Song et al., 2005.
Muitos estudos têm demonstrado que a ativação da Akt é necessária para a
sobrevivência celular, sendo que a apoptose induzida pela retirada de fatores de
crescimento, radiação UV, dano ao DNA, e tratamento com TGFβ, em muitos tipos
celulares, é reduzida através da transfecção da Akt constitutivamente ativa. Em contraste, a
introdução da Akt dominante negativa (ou inativa) bloqueia a sobrevivência de células
mesmo na presença de fatores de crescimento, reforçando a significância desta via na
prevenção de morte celular (Dudek et al., 1997).
Akt é um fator de sobrevivência crítico que pode modular vias celulares no sistema
nervoso central e periférico. Numerosos estudos identificaram a Akt como um fator chave
na proteção contra a morte celular (Lawlor & Alessi, 2001). Estudos anteriores
demonstraram que a superexpressão da Akt nos neurônios do SNC previne apoptose
23
induzida pela privação celular de fatores de crescimento (Datta et al., 1997). Akt previne
apoptose promovendo a sobrevivência celular. Isso ocorre, primariamente, via fosforilação
da proteína pró-apoptótica BAD, desfazendo sua interação com as proteínas anti-
apoptóticas Bcl-2/Bcl-X
L
e evitando a liberação mitocondrial do citocromo c (Datta et al.,
1997; Prasad et al., 2000).
Portanto, tem sido bem documentado que Akt é necessária para a sobrevivência de
neurônios (Crowder & Freeman, 1998). O aumento da forma ativa da Akt (fosfo-Akt) pode
promover a sobrevivência celular durante exposição a radicais livres ou estresse oxidativo
(Matsuzaki et al., 1999; Chong et al., 2003; Kang et al., 2003a,b), dano ao DNA (Henry et
al., 2001; Kang et al., 2003a), pré-condicionamento hipóxico (Wick et al., 2002), exposição
ao peptídeo β-amilóde (Wick et al., 2002), e administração de TGF- β (Conery et al.,
2004).
A ativação da Akt, porém, nem sempre é desejada. Sob certas condições, a
sobrevivência celular aumentada durante a ativação da Akt poderia fomentar o crescimento
de células neoplásicas. Um estudo recente identificou a Akt como um alvo potencial a ser
bloqueado durante o tratamento de células cancerosas que contêm mutações no fator de
crescimento epidérmico (EGF) (Sordella et al., 2004).
1.5.1.2. Papel de radicais livres e ERO na sinalização celular
Recentemente, tem sido proposto que as espécies reativas de oxigênio possuem um
papel no mecanismo coordenado da sinalização celular. Foi demonstrado que elas
estimulam um grande número de vias de transdução de sinal que são importantes na
manutenção da homeostase celular neuronal (Borg & London, 2002).
24
As complexas redes de sinalização envolvem numerosas vias bioquímicas, e têm
sido extensivamente estudadas quanto ao seu papel na sobrevivência ou morte celular em
consequência de processos neurodegenerativos ou de injúria ao SNC. Como mostrado na
Fig. 12, muitas dessas vias podem ser reguladas pelo estado redox celular como
consequência, por exemplo, da modificação oxidativa de proteínas ou de sítios específicos
(Finkel, 1998).
Fig. 12. Vias que podem ser mediadas por estresse oxidativo. ERO ativam muitas vias
de sinalização celular. Algumas podem estar envolvidas na promoção de morte celular,
como as vias de p38, JNK, p53 e JAK/STAT, enquanto outras cascatas, como aquelas
envolvendo ERK1/2, Akt e HSF-1 têm sido propostas como citoprotetoras (modificado a
partir de Martindale & Holbrook, 2002).
As cascatas de sinalização envolvidas na sobrevivência celular são complexas e os
mecanismos de modulação destas vias pelos diversos fatores, incluindo ERO, não são bem
compreendidos. Estudos têm demonstrado que a ativação de JNK e p38
MAPK
por ERO
implica na promoção de morte celular, e que a ativação de vias como ERK1/2 e AKT têm
25
se mostrado neuroprotetoras (Martindale & Holbrook, 2002; Hanada et al., 2004; Murphy
& Blenis, 2006). Entretanto, na dependência do tempo de ativação e do compartimento
celular, podem ser observadas variações na ação de cada uma das MAPK quanto à
capacidade de causar dano ou proteção celular nas resposta de estresse (Chen et al., 2004;
Waetzig & Herdegen, 2005; Murphy & Blenis, 2006).
No que tange especificamente a modulação de Akt por ERO pode ser citado que o
peróxido de hidrogênio pode levar à ativação endógena da Akt em diversas linhagens
celulares, tais como células Hela, A549 e glioblastoma humano (Sonoda et al., 1999; Wang
et al., 2000). Além disso, a ativação da Akt tem sido demonstrada durante estresse
oxidativo em linhagens de células neuronais (Kang et al., 2003a,b; Salinas et al., 2003),
células primárias de hipocampo (Matsuzaki et al., 1999) e neurônios corticais
(Crossthwaite et al., 2002; Chong et al., 2003).
Diante da importância do zinco na promoção de estresse oxidativo e na regulação de
diversos alvos protéicos, incluindo a possível modulação de Akt, considerando o papel
fundamental desta proteína na regulação neural, se faz importante aprofundar o
entendimento das ações moleculares do zinco sobre estes parâmetros. Desta forma, através
da compreensão destas ações pretende-se contribuir para a melhor compreensão do papel
neuroprotetor e neurotóxico do zinco no SNC.
26
2. OBJETIVOS
¾ Objetivo Geral
O objetivo geral deste trabalho é investigar as ações do zinco sobre as defesas
celulares antioxidantes in vivo e in vitro. Além disso, o estudo pretende investigar possíveis
ações do zinco na modulação de alguns alvos moleculares relacionados à sinalização
celular e que poderiam intermediar ações fisiológicas ou patológicas do metal.
¾ Objetivos Específicos
1. Determinar o conteúdo de glutationa total e enzimas antioxidantes (GPx, GST, catalase
e GR), em hipocampo e córtex cerebral de ratos jovens tratados in vivo com zinco.
2. Determinar a atividade das enzimas antioxidantes (GPx, GST, GR e GGT) em fatias de
hipocampo de ratos jovens frente ao tratamento in vitro com zinco.
3. Investigar uma possível interação entre a ação do zinco e do peróxido de hidrogênio,
relativo à modulação da viabilidade celular em fatias hipocampais de ratos jovens.
4. Caracterizar a modulação pelo zinco da fosforilação da proteína quinase Akt em fatias
hipocampais de ratos jovens expostos in vitro ao metal, identificando o possível papel
desta regulação na modulação da viabilidade celular.
27
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Animais
Nos modelos experimentais foram utilizados ratos da linhagem Wistar provenientes
do Biotério Central da Universidade Federal de Santa Catarina. Foram usados ratos jovens
entre 8 e 13 dias de idade. Os animais tiveram acesso irrestrito a água e comida, e foram
mantidos em ambiente com temperatura entre 22 e 24°C, e ciclo claro-escuro de 12 horas
(luzes ligadas das 7:00 às 19:00 h). Os animais foram manipulados e mortos de acordo com
o código de ética de utilização de animais para pesquisa, conforme protocolo aprovado pela
CEUA-UFSC (Protocolo No. 297/CEUA; Processo No. 23080.012517/2004-36).
3.2. Tratamentos in vivo
3.2.1. Tratamento Agudo ou com Doses Repetidas de ZnCl
2
Para o estudo da ação do ZnCl
2
in vivo sobre os níveis de GSH-t ,e sobre a atividade
das enzimas antioxidantes GPx, catalase, GR e GST, os animais com 13 dias de idade
foram tratados com uma dose aguda de ZnCl
2
com uma injeção intraperitonial de solução
salina (NaCl 0,9%; controle) ou ZnCl
2
(1, 4 ou 16 mg/kg, diluído em solução salina). Os
animais foram sacrificados 24 horas após a injeção.
No tratamento com doses repetidas, os animais foram tratados por cinco dias
consecutivos (do 8º ao 12º dia pós-natal) com uma injeção diária intraperitonial (i.p.) de
solução salina (NaCl 0,9%; controle) ou ZnCl
2
(1, 2 ou 4 mg/kg, diluído em solução
28
salina). Os animais foram sacrificados no 14º dia pós-natal, ou seja, 48 horas após a última
injeção.
Os animais foram mortos por decapitação e as estruturas rapidamente dissecadas
sobre gelo. Para a determinação de GSH-t foi utilizado tecido fresco, enquanto que, para a
determinação da atividade das enzimas antioxidantes, as estruturas foram preservadas em
ambiente contendo gelo seco até seu armazenamento em freezer -80ºC para posterior
análise.
3.3. Tratamentos in vitro
Os animais foram mortos por decapitação e o cérebro rapidamente retirado e a
seguir dissecado (4ºC) sob papel filtro umidecido com tampão HEPES/salina (124 mM de
NaCl, 4 mM de KCl, 1,2 mM de MgSO
4
, 25 mM de HEPES, 12 mM de glicose e 1 mM de
CaCl
2
, pH 7.4), previamente oxigenado por 30 minutos. Os hipocampos foram isolados e
rapidamente fatiados na espessura de 400 μm, utilizando um “fatiador” de tecidos de
McIlwain. Após este procedimento, mantendo as fatias imersas em tampão HEPES/salina
(4ºC), foi realizada a seleção das fatias hipocampais com aproximadamente o mesmo
tamanho para os procedimentos subseqüentes.
3.3.1. Tratamento das Fatias de Hipocampo.
As fatias hipocampais foram usadas para o estudo da ação do ZnCl
2
sobre a
viabilidade celular, sobre a atividade das enzimas antioxidantes GPx, catalase, GR e GST.
Neste sentido, fatias de hipocampo (10 fatias/tratamento) foram pré-incubadas, por 30 min,
29
com tampão HEPES/salina (300µl), em temperatura ambiente, para recuperação metabólica
do tecido. Após esse período, o meio foi retirado e as fatias submetidas a incubações por
um período de 2 horas (37°C), em tampão HEPES/salina (controle), ou este mesmo meio
contendo 10, 30, 100 ou 300 μM de ZnCl
2
. Nos estudos de modulação de viabilidade e de
fosforilação de AKT, foi seguido o mesmo protocolo, exceto pela utilização de apenas uma
fatia/tratamento, realizado em triplicata.
Para determinar se a ação do zinco sobre a viabilidade celular poderia ter sinergismo
com a ação de agentes pró-oxidantes, as fatias foram incubadas com o zinco e, a seguir,
com peróxido de hidrogênio. Neste protocolo, após pré-incubação (30 min) com tampão
HEPES/salina, as fatias foram incubadas com diferentes concentrações de zinco (10–100
µM) por 2 horas (37ºC). A seguir as fatias foram lavadas com tampão HEPES/salina e,
então, foi adicionado H
2
O
2
1 mM por 1 hora adicional. Fatias incubadas com ZnCl
2
(10-
100 µM; 2h) seguidas da incubação apenas com tampão HEPES/salina serviram como
controle relativo à ação do zinco isoladamente.
3.4. Avaliação da Viabilidade Celular.
A viabilidade celular das fatias foi medida pelo método do MTT. Após os
respectivos tratamentos, as fatias hipocampais foram incubadas com MTT (0,5 mg/ml em
tampão HEPES/salina) por 30 minutos a 37°C. O MTT (brometo de 3-[4,5-Dimetiltiazol-2-
il]-2,5-difenil-tetrazolium = “Thiazolyl blue”) é um sal de tetrazólio solúvel em água, o
qual é convertido em um formazam púrpura após clivagem do anel de tetrazólio por
desidrogenases mitocondriais (Liu et al., 1997). O formazam é solubilizado com a adição
de dimetil sulfóxido (DMSO), formando um composto colorido cuja densidade óptica é
30
medida em 550 nm em uma leitora de placas de 96 poços. A atividade mitocondrial
(viabilidade celular) é diretamente proporcional à capacidade redutora sobre o MTT e,
portanto, à produção de cromógeno.
3.5. Parâmetros Antioxidantes
O hipocampo ou córtex cerebral foram homogeneizados em 300 μl de tampão
HEPES 20 mM, pH 7,0 e centrifugados a 20.000 g por 30 min. O sobrenadante foi coletado
para as dosagens das enzimas antioxidantes.
3.5.1. Avaliação da Atividade Glutationa Peroxidase (GPx)
A GPx catalisa a redução do H
2
O
2
, bem como de peróxidos orgânicos, utilizando a
glutationa reduzida (GSH) como co-substrato para esta reação para produzir glutationa
oxidada (GSSG). A GSSG é reduzida pela glutationa redutase com o consumo de NADPH
(ε = 6.220 M
-1
cm
-1
), que pode ser acompanhado espectrofotometricamente em 340 nm
(Wendel, 1981; Flohé & Günzler, 1984). Para este ensaio, o meio de reação continha
tampão fosfato 0,1 M, pH 7,0, 1 mM EDTA, GSH 1 mM e NADPH 0,1 mM. Adicionou-se
amostra neste meio para mensurar o consumo inespecífico de NADPH através de uma
leitura por 2 min a 340 nm. Ao adicionar o substrato t-BOOH (hidroperóxido de tert-butila)
1 mM, a leitura foi realizada por mais 2 min. Ao decréscimo de absorbância por minuto
obtido descontou-se o consumo inespecífico de NADPH. O valor obtido foi dividido pelo
coeficiente de extinção molar do NADPH (ε = 6.220 M
-1
cm
-1
) e multiplicado pelas
31
diluições. O valor foi expresso como mUnidades/mg de proteína. Uma Unidade
corresponde a 1 μmol/ml/min.
3.5.2. Avaliação da Atividade Glutationa Redutase (GR)
A GR catalisa a redução da glutationa oxidada (GSSG) através da oxidação do
NADPH. Ao utilizar o substrato GSSG, a enzima leva ao consumo de NADPH, que é
acompanhado em 340 nm. A velocidade de consumo do NADPH, em condições de
saturação, expressa a atividade enzimática (Carlberg e Mannervik, 1985). O meio de reação
continha tampão fosfato 0,1 M (pH 7,0), 1 mM de EDTA e NADPH 0,2 mM. Após
adicionar a amostra, o consumo inespecífico de NADPH foi medido por 2 min a 340 nm.
Ao adicionar o substrato GSSG 1 mM, a leitura foi realizada por 2 min adicionais. Do
decaimento por minuto obtido descontou-se o consumo inespecífico de NADPH. O valor
obtido foi dividido pelo coeficiente de extinção molar do NADPH (ε = 6.220 M
-1
cm
-1
) e
multiplicado pelas diluições. O valor foi expresso como mUnidades/mg de proteína. Uma
Unidade corresponde a 1 μmol/ml/min.
3.5.3. Avaliação da Atividade Glutationa S-Transferase (GST)
A GST catalisa a conjugação da GSH com o substrato sintético 1-cloro-2,4-
dinitrobenzeno (CDNB) que produz um conjugado que é detectado em 340 nm. A atividade
enzimática é proporcional à velocidade de produção do composto conjugado (Habig &
Jakoby, 1981). Para este ensaio, o meio de reação continha tampão fosfato 0,1 M, pH 7,0, 1
mM de EDTA e GSH 1 mM. Foram feitas leituras independentes realizadas por 2 min para
32
mensurar a velocidade da reação espontânea do CDNB com GSH, neste caso, sem a
presença da amostra. Depois de acrescentar a amostra e o segundo substrato (CDNB 1 mM)
ao meio de reação, realizou-se a leitura por 2 min a 340 nm. Ao decaimento por minuto
obtido com a amostra, descontou-se a velocidade da reação espontânea. O valor obtido pelo
coeficiente de extinção molar do conjugado GSH/CDNB (ε = 9.600 M
-1
cm
-1
) foi
multiplicado pelas diluições. O valor foi expresso como mUnidades/mg de proteína. Uma
Unidade corresponde a 1 μmol/ml/min.
3.5.4. Avaliação da Atividade Catalase (CAT)
A alta velocidade de reação desta enzima, associada a uma baixa “afinidade”,
permite a determinação de sua atividade na presença de concentrações elevadas de H
2
O
2
(10 mM). A atividade é determinada pela velocidade de consumo da H
2
O
2
no primeiro
minuto da reação. A leitura foi realizada em 240 nm (Aebi, 1984).
3.5.5. Avaliação da Atividade γ-Glutamil Transpeptidase (GGT)
A atividade da GGT foi analisada nos “pellets” das fatias submetidas à
centrifugação, os quais foram ressuspensos em tampão HEPES 20 mM pH 7,0. Os tecidos
foram incubados com γ-glutamyl p-nitroanilide e o dipeptídeo glicil-glicina. A GGT
transfere a porção γ-glutamyl da γ-glutamyl p-nitroanilide. No processo de transferência do
grupo gama-glutamil do substrato sintético gama-glutamil-p-nitroanilida para glicil-glicina,
um cromóforo é formado e lido em 410 nm. A formação da cor é diretamente proporcional
à atividade da enzima (Meister et al., 1981; Griffith, 1981).
33
3.5.6. Mensuração dos Níveis de GSH Total (GSH-t)
O hipocampo e o córtex cerebral foram homogeneizados em ácido perclórico (PCA)
0,5 M. As amostras foram centrifugadas por 2 min a 15.000 g, e o sobrenadante foi retirado
e diluído 10 vezes em tampão fosfato de potássio, 0,1 M, pH 7,0, para assim neutralizar a
amostra.
O método utilizado é enzimático e foi originalmente descrito por Tietze (1969), e
posteriormente modificado por Akerboom e Sies (1981). Este método é cíclico e detecta
tanto GSSG como GSH, definido como glutationa total (GSH-t). As leituras foram feitas
em espectrofotômetro a 412 nm por 2 min, contendo fosfato de potássio 0,1 M pH 7,0, 0,2
U/ml de GR, 0,1 mM DTNB, 1 mM EDTA e 0,2 mM NADPH. A concentração de
glutationa foi obtida através da realização de uma curva padrão com concentrações
conhecidas de GSSG. Os valores são expressos em μmol/g tecido fresco.
3.6. Dosagem de Proteínas
Para a análise através de Western Blotting, as proteínas foram dosadas através do
método de Peterson (1977). Sobre alíquotas de 3μl das amostras foram adicionados 397μl
de água e 400μl do reagente de Lowry (0,2 N de NaOH, 2,5% de SDS, 5% de Na
2
CO
3
,
0,2% de CuSO
4
e 0,1% de tartarato duplo de sódio e potássio). As amostras foram agitadas
imediatamente e deixadas em repouso por dez minutos. Em seguida foram adicionados 200
μl do reagente de FOLIN 0,4 N, seguido de agitação imediata, e incubadas por 30 minutos.
34
A leitura foi realizada em 750 nm e as concentrações foram obtidas através de uma curva-
padrão utilizando albumina de soro bovino (BSA).
Para a análise da atividade da glutationa e das enzimas antioxidantes, o conteúdo de
proteínas foi quantificado pelo método de Bradford (1976). A absorbância foi lida em
espectrofotômetro a 595 nm, usando albumina de soro bovino como padrão.
3.7. Separação de Proteínas
As fatias hipocampais foram colocadas individualmente em tampão de amostra (4 %
de SDS, 50 mM de Tris e 100 mM de EDTA , pH 6.8) e aquecidas por cinco minutos para
permitir a solubilização do tecido. Foram usados 100µl de tampão de amostra por fatia.
Cada fatia hipocampal de animais de 14 dias tinha, em média, 150µg de proteína. Em
seguida foi adicionada a solução de diluição de amostra (40% de glicerol, 25mM de Tris e
Bromofenol Blue; pH 6.8), numa proporção solução de diluição/solução de amostra de
25:100 (v/v), e 8% de β-mercaptoetanol. As proteínas (50μg/poço) foram separadas por
eletroforese em minigel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE), usando gel de
separação a 10% e gel de entrada a 4% de acrilamida. A eletroforese foi realizada com
corrente fixa de 20 mA por placa e voltagem máxima de 140 V, por aproximadamente 2,5
h, em temperatura ambiente, utilizando-se o tampão superior (190mM de glicina, 25mM de
Tris e 0,1% de SDS) e o inferior (50 mM de Tris; pH 8.3). Após a corrida, os géis foram
submetidos à eletrotransferência.
35
3.8. Eletrotransferência e Imunodetecção
Após a eletroforese o gel foi fixado durante 1 hora em solução fixadora (50% de
metanol e 8% de ácido acético) e a seguir foi lavado com tampão superior de eletroforese
(25 mM de Tris, 190 mM de glicina e 0,1% de SDS) por 30 minutos. Após esse período, o
gel foi equilibrado em tampão de transferência (50 mM de Ácido Bórico e 4 mM de EDTA;
pH 8.9) durante 30 minutos. As proteínas foram transferidas do gel para a membrana de
nitrocelulose no sentido do pólo negativo para o positivo, utilizando um “sanduíche”
compreendido de espuma de suporte, papel filtro, gel, nitrocelulose, novamente papel filtro
e espuma de suporte. A transferência foi realizada a 4°C usando corrente de 400 mA por 3
horas em uma cuba contendo tampão de transferência. Após a eletrotransferência, as
membranas foram coradas com solução de Ponceau [0,5% de Ponceau (w/v) em 1% de
ácido acético (v/v)] para controle da transferência.
Para a imunodetecção as membranas foram lavadas primeiro com água miliQ,
depois com TBS (10 mM de Tris, 150 mM de NaCl, pH 7.5). A seguir foram bloqueadas
por 1 hora com 5% de leite desnatado em TBS em temperatura ambiente. Após esse
primeiro bloqueio, as membranas foram lavadas por 3 vezes de 5 minutos com TBS-T
(Tween-20 0,05%, 10 mM de Tris e 150 mM de NaCl, pH 7.5) e submetidas a um segundo
bloqueio de 1 hora usando uma solução de 1,5% de gelatina em TBS. As membranas foram
novamente lavadas 3 vezes (5 minutos cada) com TBS-T, para finalmente serem incubadas
com o anticorpo primário anti-fosfo Akt (p-serina-473) durante 12-14h e anti-Akt total por
um período de 2 horas à temperatura ambiente.
Após as incubações, as membranas foram novamente lavadas com TBS-T (4 vezes
de 5 minutos) e incubadas por 1 hora em temperatura ambiente com anticorpos secundários
36
específicos (conjugados à peroxidase). Para a imunodetecção, as membranas foram lavadas
4 vezes (5 minutos) com TBS-T e 2 vezes com TBS, sendo que as bandas correspondentes
às respectivas proteínas foram reveladas utilizando kit ECL (quimiluminescência)
conforme as recomendações do fabricante. As medidas de fosforilação e/ou imunoconteúdo
das proteínas foram realizadas através de densitometria. Para análise de uma mesma
membrana com sucessivos anticorpos foi realizado o “strip de membrana”, que consistia na
sucessiva lavagem das membranas com: 1) água milli-Q, 2) NAOH 0,2 M, 3) água milli-Q
e 4) TBS-T (5 min em cada).
3.9. Análise Estatística
Os resultados foram analisados pelo teste ANOVA, seguido, quando apropriado, do
teste de Duncan. Os resultados foram considerados significativos quando P < 0,05.
37
4. RESULTADOS
4.1. Estudos in vivo
4.1.1. Glutationa total no hipocampo e no córtex cerebral de ratos
jovens tratados com ZnCl
2
de forma aguda.
Os níveis de glutationa total (GSH-t) em resposta ao tratamento agudo com ZnCl
2
(1, 4 ou 16 mg/kg) foram avaliados em hipocampo e córtex cerebral de ratos imaturos com
14 dias de idade (PN14). Os resultados mostraram que o tratamento com metal não causou
alteração significativa dos níveis de GSH-t em nenhuma das estruturas analisadas (Fig. 13).
Fig. 13. Efeito do ZnCl
2
sobre os níveis de glutationa total (GSH-t) em ratos jovens
tratados com o metal de forma aguda. Os painéis mostram os níveis de GSH-t em
hipocampo (A) e córtex cerebral (B) de ratos tratados no 13º dia pós-natal (PN13) com
ZnCl
2
(1, 4 e 16 mg/kg; i.p.). Os animais controle recebiam injeção de salina. Todos os
grupos foram avaliados no PN14. O conteúdo de glutationa é expresso em µmol/g tecido.
Os valores representam as médias + E.P.M. (n = 5 - 6). O tratamento não causou alteração
significativa nos níveis de GSH-t nas regiões estudadas.
38
4.1.2. Enzimas antioxidantes em hipocampo e córtex cerebral de ratos
jovens tratados com ZnCl
2
de forma aguda.
O tratamento agudo de ratos imaturos (PN13) com ZnCl
2
aumentou
significativamente a atividade das enzimas antioxidantes GPx [F
(3,18)
= 4,57; p ≤ 0,05] e
GST [F
(3,18)
= 3,68; p ≤ 0,05] em hipocampo, quando comparados ao controle (Fig. 14 A e
B). O aumento foi de 55% e 36% para a atividade de GPx e GST, respectivamente, e foi
observado apenas na dose de ZnCl
2
16 mg/kg. A atividade das enzimas catalase e
glutationa redutase (GR) não sofreu alteração significativa em resposta ao tratamento com o
metal (Figura 14 C e D). Avaliando o córtex cerebral os resultados mostraram que o
tratamento com ZnCl
2
(1, 4 e 16 mg/kg) não alterou, de forma estatisticamente
significativa, a atividade das enzimas antioxidantes GPx, GST, catalase e GR (Fig. 15).
39
Fig. 14. Efeito do tratamento agudo com ZnCl
2
sobre a atividade das enzimas
antioxidantes em hipocampo de ratos jovens. Os painéis mostram a atividade, no
hipocampo, das enzimas glutationa peroxidase (GPx) (A), glutationa S-transferase (GST)
(B), catalase (C), glutationa redutase (GR) (D) de ratos tratados no 13º dia pós-natal
(PN13) com ZnCl
2
(1, 4 e 16 mg/kg; i.p.). Os animais controle recebiam injeção de salina.
Todos os grupos eram avaliados no PN14. A atividade da enzima antioxidante GPx (A)
demonstrou um aumento de 55% em relação ao controle na dose de 16 mg/kg de ZnCl
2
. A
atividade da enzima GST (B) demonstrou um aumento de 36% em relação ao controle, na
dose de 16 mg/kg de ZnCl
2
. O perfil da atividade das enzimas catalase (C), bem como GR
(D) não sofreu nenhuma alteração significativa. Os valores da atividade das enzimas
antioxidantes foram expressos como mU/mg de proteína. As barras representam as médias
dos valores + E.P.M. (n = 5 - 6). * P < 0,05 quando comparado ao grupo controle (solução
salina).
40
Fig. 15. Efeito do tratamento agudo com ZnCl
2
sobre a atividade de enzimas
antioxidantes em córtex cerebral de ratos jovens. Os painéis mostram a atividade, no
córtex cerebral, das enzimas glutationa peroxidase (GPx) (A), glutationa S-transferase
(GST) (B), catalase (C), glutationa redutase (GR) (D) de ratos tratados no 13º dia pós-natal
(PN13) com ZnCl
2
(1, 4 e 16 mg/kg; i.p.). Os animais controle recebiam injeção de salina.
Todos os grupos eram avaliados no PN14. Os valores de atividade das enzimas
antioxidantes foram expressos como mU/mg de proteína. As barras representam a média
+
E.P.M. (n = 6).
4.1.3. Glutationa total no hipocampo e no córtex cerebral de ratos
jovens tratados com doses repetidas de ZnCl
2
.
Os níveis de glutationa total (GSH-t) em resposta ao tratamento com doses repetidas
de ZnCl
2
(1, 2 e 4 mg/kg), administradas em ratos imaturos do 8º ao 12º dia do período pós-
natal (PN8-12), foram avaliados no hipocampo e no córtex cerebral de animais no 14º dia
41
pós-natal (PN14). Os resultados mostraram que o tratamento com ZnCl
2
não causou
alteração significativa dos níveis de GSH-t no hipocampo ou córtex cerebral (Fig. 16).
Fig. 16. Efeito do ZnCl
2
sobre os níveis de glutationa total (GSH-t) em ratos jovens
tratados com doses repetidas do metal. Os painéis mostram os níveis de GSH-t em
hipocampo (A) e córtex cerebral (B) de ratos tratados com doses repetidas de ZnCl
2
. O
tratamento compreendia a administração i.p. de ZnCl
2
(1, 2, e 4 mg/kg) no período do 8º ao
12º dia PN. Os animais controle recebiam injeção de salina. Todos os grupos eram
avaliados no 14º dia PN. O conteúdo de glutationa é expresso em µmol/g tecido. Os valores
representam as médias + E.P.M. (n = 5 - 6). Os tratamentos não causaram alteração
significativa nos níveis de GSH-t nas regiões estudadas.
4.1.4. Enzimas antioxidantes em hipocampo e em córtex cerebral de
ratos jovens tratados com doses repetidas de ZnCl
2
.
O tratamento de animais jovens com administração diária de ZnCl
2
, entre o 8º e 12º
dias de vida pós-natal, aumentou significativamente em cerca de 52% a atividade de GPx
na dose de 4 mg/kg [F
(3,20)
= 3,37; p ≤ 0,05] e a atividade de GST em 31% e 28% nas doses
de 2 e 4 mg/kg [F
(3,20)
= 15,64; p ≤ 0,01], respectivamente (Figura 17 A e B) em relação ao
grupo controle.
42
Os resultados também mostram que o tratamento com ZnCl
2
(1, 2 e 4 mg/kg) não
alterou significativamente a atividade das enzimas antioxidantes GR e catalase no
hipocampo de ratos jovens tratados com zinco (Fig. 17 C e D).
Fig. 17. Efeito do tratamento com doses repetidas com ZnCl
2
sobre a atividade das
enzimas antioxidantes em hipocampo de ratos jovens. Os painéis mostram a atividade,
no hipocampo, das enzimas glutationa peroxidase (GPx) (A), glutationa S-transferase
(GST) (B), catalase (C) e glutationa redutase (GR) (D) de ratos tratados com doses
repetidas de ZnCl
2
. O tratamento compreendia a administração i.p. de ZnCl
2
(1, 2, e 4
mg/kg) no período do 8º ao 12º dia PN. Os animais controle recebiam injeção de salina.
Todos os grupos eram avaliados no 14º dia PN. O tratamento com ZnCl
2
na dose de 4
mg/kg causou um aumento de cerca de 52% na atividade de GPx (A) e nas doses de 2 e 4
mg/kg causou aumento da atividade de GST em cerca de 30% (B). Nenhuma das doses de
ZnCl
2
testadas alterou a atividade das enzimas catalase (C) e GR (D). Os valores da
atividade das enzimas antioxidantes foram expressos como mU/mg de proteína. As barras
representam as médias dos valores + E.P.M. de seis experimentos (n = 6). * P < 0,05 e ** P
< 0,01 quando comparado ao grupo controle (solução salina).
43
A atividade enzimática de GPx, GST, catalase e GR não sofreu alteração no córtex
de ratos jovens por nenhum dos tratamentos com doses repetidas aplicados (ZnCl
2
1, 2 e
4mg/kg) (Fig. 18 A - D).
Fig. 18. Efeito do tratamento com doses repetidas com ZnCl
2
sobre a atividade das
enzimas antioxidantes em córtex cerebral de ratos jovens. Os painéis mostram a
atividade, no córtex cerebral, das enzimas glutationa peroxidase (GPx) (A), glutationa S-
transferase (GST) (B), catalase (C) e glutationa redutase (GR) (D) de ratos tratados com
doses repetidas de ZnCl
2
. O tratamento compreendia a administração i.p. de ZnCl
2
(1, 2, e 4
mg/kg) no período do 8º ao 12º dia PN. Os animais controle recebiam injeção de salina.
Todos os grupos eram avaliados no 14º dia PN. Os tratamentos não modificaram a
atividade no córtex cerebral de nenhuma das enzimas estudadas. Os valores da atividade
das enzimas antioxidantes foram expressos como mU/mg de proteína. As barras
representam as médias + E.P.M. (n = 6).
44
4.2. Estudos in vitro com fatias hipocampais de ratos jovens
4.2.1. Enzimas antioxidantes em fatias de hipocampo tratadas com
diferentes concentrações de ZnCl
2
.
O tratamento in vitro de fatias hipocampais com ZnCl
2
(10, 30, 100 µM) diminuiu
significativamente a atividade de GR [F
(4,37)
=44,46; p ≤ 0,001] em todas as concentrações
testadas. O tratamento com ZnCl
2
10 µM causou uma redução, em relação ao controle, de
27 % na atividade de GR. Na concentração de ZnCl
2
30 µM, a atividade da enzima foi
reduzida em 49%, enquanto na concentração de 100 µM, a atividade enzimática da GR foi
reduzida em 75%. Estes resultados indicam um forte efeito inibitório do zinco sobre a
atividade de GR e dependente de concentração (Fig. 19 D).
A atividade das enzimas antioxidantes GGT, GST e GPx também foi medida em
fatias hipocampais de ratos jovens tratados in vitro com zinco. Os resultados mostraram que
o tratamento com ZnCl
2
(10 - 100 µM) não alterou, de forma estatisticamente significativa
a atividade de nenhuma das enzimas estudadas (Fig. 19 A - C).
45
Fig. 19. Atividade de enzimas antioxidantes de fatias hipocampais em resposta ao
tratamento in vitro com ZnCl
2
. Fatias de hipocampo de ratos jovens foram expostas
durante 2 h às concentrações indicadas de ZnCl
2
. Após homogeneização as fatias foram
ensaiadas para medida da atividade das enzimas: γ-glutamiltranspeptidase (GGT) (A),
glutationa S-transferase (GST) (B), glutationa peroxidase (GPx) (C) e glutationa redutase
(GR) (D). A atividade de GR foi fortemente reduzida pelo ZnCl
2
de forma dose
dependente. Os dados estão expressos como percentagem do controle (100 %). Os valores
da atividade das enzimas antioxidantes foram expressos como mU/mg de proteína. As
barras representam as médias + E.P.M. (n = 5-8). A média + E. P. M. da atividade das
enzimas antioxidantes no grupo controle foram: GGT 3,39 ± 0,15; GST 34,62 ± 3,99; GPx
7,18 ± 1,74; e GR 17,2 ± 0,71 mU/g . *** P < 0,001 quando comparado ao grupo controle.
46
4.2.2. Avaliação da viabilidade celular em fatias hipocampais expostas
ao ZnCl
2
.
Os resultados mostraram que o tratamento com ZnCl
2
diminuiu a viabilidade celular
em fatias hipocampais de forma dependente de concentração quando comparado aos
grupos-controle. O ZnCl
2
, após 2 horas de incubação na concentração de 100 μM, diminuiu
significativamente, em 20%, a viabilidade celular [F
(4,26)
= 7,13; p ≤ 0,001] (Fig. 20). ZnCl
2
10 e 30 µM não causaram modificação significativa da viabilidade celular. ZnCl
2
300 µM
causou um efeito similar ao ZnCl
2
100 µM. Com base nestes dados e considerando os
possíveis níveis sinápticos do metal (Frederickson et al., 2005), optamos por utilizar ZnCl
2
100 µM como concentração máxima de metal, nos estudos de modulação de viabilidade e
de sinalização celular.
Fig. 20. Efeitos do ZnCl
2
sobre a viabilidade de fatias de hipocampos. Fatias de
hipocampo foram incubadas por 2 h com tampão HEPES/salina (Controle; C) ou com este
mesmo tampão contendo ZnCl
2
(10–100 µM). Após os tratamentos as fatias foram
ensaiadas para avaliação de viabilidade através do teste do MTT. Os valores estão
expressos como percentagem do controle. As barras representam as médias expressas em
porcentagem +
E.P.M. em relação ao controle (100%) (n = 7). *** P < 0,001 quando
comparado ao grupo controle.
47
4.2.3. Efeito do pré-tratamento com ZnCl
2
sobre a redução da
viabilidade celular causada pelo peróxido de hidrogênio em fatias
hipocampais.
Previamente determinamos que o tratamento de fatias hipocampais com H
2
O
2
1 mM
(1 h) causava diminuição da viabilidade celular, medida pelo MTT. Considerando que o
ZnCl
2
foi capaz de inibir in vitro a atividade de glutationa redutase (GR), uma enzima
envolvida na defesa antioxidante, buscou-se estudar uma possível interação entre o
tratamento com zinco e a suscetibilidade das fatias frente a compostos pró-oxidantes como
o H
2
O
2
. Desta forma, fatias hipocampais foram pré-incubadas com ZnCl
2
(10 - 100 μM)
por 2 h. Após este período, as fatias foram lavadas com tampão HEPES/salina e foi
adicionado H
2
O
2
1 mM. As fatias foram incubadas por mais 1 h. Os resultados mostram
que o zinco ou H
2
O
2
individualmente diminuem a viabilidade das fatias hipocampais em
cerca de 20%. Entretanto, o pré-tratamento (2h) com ZnCl
2
seguido da incubação com
H
2
O
2
1 mM (1h) não causou modificação da viabilidade celular, quando comparado aos
tratamentos com zinco ou peróxido de hidrogênio aplicados isoladamente. Portanto,
aparentemente não há interação entre os dois insultos, sendo que a pré-incubação com zinco
não torna as fatias hipocampais mais suscetíveis a citotoxicidade induzida pelo H
2
O
2
1 mM
(1h) (Fig. 21).
48
Fig. 21. Efeito do tratamento de zinco e H
2
O
2
na redução do MTT em hipocampo de
ratos jovens. Fatias de hipocampos foram incubadas com tampão HEPES/salina (C) ou
ZnCl
2
(Zn10–100 µM) por 2 h. A seguir, as fatias foram lavadas com tampão
HEPES/salina e incubadas na ausência ou presença de H
2
O
2
1 mM (H
2
O
2
). Fatias contendo
somente ZnCl
2
10 a 100 µM foram incubadas pelo mesmo período e serviram como
controle para o efeito do zinco. Os valores estão expressos como percentagens relativas ao
controle (100%) e representam as médias + E.P.M. (n = 7). * P < 0,05, ** P < 0,01 e *** P
< 0,001 quando comparado ao grupo controle. Não foram encontradas outras diferenças
significativas.
4.2.4. Fosforilação da Akt em fatias hipocampais de ratos jovens
tratadas com ZnCl
2
.
A modulação da fosforilação de Akt foi analisada em fatias de hipocampo expostas
ao ZnCl
2
(10-100 µM). A Figura 22 A mostra a fosforilação do sítio de Ser-473 de Akt e o
conteúdo total de Akt, respectivamente. A Figura 22 B mostra a quantificação da
fosforilação desta proteína quinase. O tratamento com zinco 100 μM por 2 horas aumentou
significativamente o nível de fosforilação da Akt (P-Ser-473) em aproximadamente 230%
em relação ao controle [F
(4,34)
= 4,45; p ≤ 0,01]. O ZnCl
2
não alterou significativamente o
imunoconteúdo de Akt (Fig. 22 A).
49
Fig. 22. Efeito do ZnCl
2
sobre a fosforilação da proteína Akt em fatias hipocampais de
ratos jovens.
Fatias hipocampais foram incubadas por 2 horas na ausência (controle) ou em presença de
ZnCl
2
(10-100 μM). As proteínas foram separadas em SDS-PAGE e transferidas para
membrana de nitrocelulose. A fosforilação e o conteúdo total de AKT foram detectados por
ECL. A) Mostra um “imunoblotting” representativo das formas fosforilada (P-AKT) e total
(T-AKT) de AKT. B) Mostra a análise quantitativa da fosforilação da proteína Akt em
resposta a exposição ao ZnCl
2.
As bandas foram quantificadas por densitometria. A
fosforilação de Akt foi medida como a razão da densidade óptica (D.O.) da forma
fosforilada relativo à D.O. da forma total. Os resultados estão expressos como percentagem
do controle (C; HEPES/salina) considerado 100% e representam a média
+ E.P.M (n = 9).
** P < 0.01 quando comparado ao grupo controle.
50
4.2.5. Ação do inibidor da PI3K (LY294002) sobre a fosforilação da Akt
induzida pelo ZnCl
2
.
O efeito do inibidor da PI3K (LY294002; 20 µM) foi avaliado em fatias de
hipocampo de ratos jovens tratados com ZnCl
2
. A exposição das fatias hipocampais ao
inibidor de PI3K, LY294002, reverteu significativamente, o efeito produzido pelo ZnCl
2
sobre a fosforilação da proteína Akt [F
(4,34)
= 4,45; p ≤ 0,001] (Fig. 23).
4.2.6. Ação do inibidor da PI3K (LY294002) sobre a viabilidade celular
em fatias hipocampais expostas ao ZnCl
2
.
Sabendo-se que a via PI3K/AKT está envolvida nos mecanismos de crescimento,
diferenciação, desenvolvimento e inibição de apoptose (Lee et al., 2006), foi utilizado o
inibidor de PI3K, LY294002, para confirmar se a ativação de AKT estaria amenizando a
citotoxidade do zinco. A Figura 24 mostra o efeito da pré-incubação (1h) com LY294002
seguido da co-incubação por 2h de LY294002 com ZnCl
2
. Os resultados mostram que a
pré-incubação com o inibidor de PI3K, tornou as fatias mais suscetíveis ao efeito citotóxico
do zinco, considerando a dose de 30µM de ZnCl
2
. Por outro lado, o tratamento com
LY294002 não foi capaz de modificar a citotoxicidade causada pela exposição das fatias ao
ZnCl
2
100 µM (Figura 24). Embora, nestas condições, o LY294002 tenha sido efetivo na
inibição da fosforilação (portanto ativação) de Akt em resposta ao ZnCl
2
100 µM,
conforme apresentado na Figura 23.
51
Fig. 23. Ação do inibidor de PI3K, LY294002, sobre a fosforilação de Akt em resposta
ao tratamento in vitro com zinco.
Fatias hipocampais foram previamente incubadas com tampão HEPES/salina ou com
LY294002 (20 μM) por 1 hora. Em seguida foram incubadas por 2 horas em presença ou
não de ZnCl
2
100 μM (Zn100), ou LY294002 20 μM (LY), ou ZnCl
2
/LY294002
(LY/Zn100). As fatias controle (C) foram pré-incubadas e incubadas com meio
HEPES/salina contendo DMSO (0,1%). As proteínas foram separadas em SDS-PAGE e
transferidas para membrana de nitrocelulose. A fosforilação e o conteúdo total de AKT
foram detectados por ECL. A) Mostra um “imunoblotting” representativo das formas
fosforilada e total de Akt após a exposição ao ZnCl
2
na presença e na ausência de LY. B)
Mostra a análise quantitativa da fosforilação da proteína Akt após a incubação com ZnCl
2
na presença ou ausência de LY. As bandas foram quantificadas por densitometria. A
fosforilação de Akt foi medida como a razão da densidade óptica (D. O.) da forma
fosforilada relativo à D.O. da forma total. Os resultados estão expressos como percentagem
do controle (C; HEPES/salina contendo 0,1% DMSO) considerado 100% e representam a
média
+ E.P.M (n = 3). A análise estatística foi realizada por ANOVA seguida pelo teste de
Duncan. ** P < 0,01 quando comparado ao grupo controle.
52
Fig. 24. Ação do inibidor da PI3K/Akt, LY294002, sobre os efeitos do ZnCl
2
na
redução do MTT.
Fatias hipocampais foram incubadas com tampão HEPES/salina ou com LY294002 (20
μM) por 1 hora. A seguir o meio foi trocado e as fatias incubadas por 2 horas em presença
ou não de ZnCl
2
(100 μM), ou LY294002 (20 μM), ou ZnCl
2
/LY294002. As fatias controle
foram pré-incubadas e incubadas com o veículo (HEPES/salina contendo DMSO (0,1%)).
Os valores estão expressos como percentagens relativas ao controle (100%) e representam
as médias + E.P.M. (n = 5). * P < 0,05 e ** P < 0,01 quando comparado ao grupo controle
(DMSO).
53
5. DISCUSSÃO
Os níveis de GSH-t no córtex cerebral e no hipocampo de ratos jovens, tratados
tanto de forma aguda quanto com doses repetidas de ZnCl
2
, não mostraram diferença
significativa em relação aos animais controle. Da mesma forma, em outros estudos, os
níveis de GSH-t não foram alterados no córtex cerebral e hipocampo de ratos adultos
tratados de forma aguda com ZnCl
2
(5 mg/Kg) (Brocardo et al., 2005). Entretanto, tem sido
demonstrado aumento nos níveis de GSH-t pela exposição in vitro ao ZnCl
2
. Em cultura de
células epiteliais da retina, 150 µM de zinco induziu aumento nos níveis de GSH (Ha et al.,
2006). Em concentrações similares, via ativação das seqüências ARE (elemento de resposta
a antioxidantes) no DNA, o zinco aumentou os níveis de RNA mensageiro da enzima de
síntese de glutationa, glutamato-cisteína ligase (GCL) (Jaiswal, 2004; Kwak et al., 2004).
Por outro lado Chen & Liao (2003) demonstraram que o zinco in vitro pode reduzir os
níveis de GSH em culturas corticais mistas de ratos, bem como reduzir a ativação de ARE e
a síntese de GSH. Estes estudos aparentemente contraditórios mostram a dualidade das
ações do zinco, dependendo do modelo e da concentração, provocando tanto respostas
antioxidantes como pró-oxidantes.
Considerando nossos resultados em que os níveis de GSH-t foram determinados em
córtex e hipocampo dos animais tratados in vivo, é possível que uma quantidade limitada de
zinco possa atravessar a barreira hematoencefálica para atingir a concentração necessária
para causar alteração de expressão de GSH. De acordo com Griffith (1999), a concentração
intracelular de GSH reflete o balanço dinâmico entre a síntese de GSH, o consumo e a
54
perda através de seu transporte para o exterior da célula. O zinco, em várias linhagens de
células de pulmão, pode aumentar o efluxo celular de GSH (Wilhelm et al., 2001), um
evento que poderia compensar um eventual (e paralelo) estímulo da síntese de GSH em
resposta ao metal. Nesse sentido, um aumento na atividade de GPx observado no
hipocampo frente aos tratamentos com zinco também poderia ter implicações relacionadas
aos níveis de GSH-t, na medida em que poderia gerar uma maior quantidade de glutationa
oxidada (GSSG) que, nesta forma, tem maior facilidade de sair da célula (Wilhelm et al.,
2001). Adicionalmente, o aumento na atividade de GST, também observado no hipocampo
em resposta ao tratamento com ZnCl
2
, poderia levar a uma maior conjugação de GSH com
metabólitos, impedindo sua detecção. Em conjunto, estes efeitos poderiam mascarar a
detecção de possíveis aumentos de GSH-t. Por fim, cabe salientar que, para proteger o
organismo do dano oxidativo, não apenas os níveis de GSH-t são importantes, mas também
a razão GSH/GSSG (Meister, 1994). Assim, estudos posteriores devem ser realizados para
avaliar alterações na razão entre a GSH reduzida e oxidada em resposta aos tratamentos in
vivo com ZnCl
2
. Além disso, uma medida de GSH-t em fatias expostas in vitro com o
metal também será importante para determinar possíveis diferenças de respostas frente à
exposição ao metal in vivo e in vitro.
Nosso estudo demonstrou um aumento significativo na atividade da GPx e da GST
no hipocampo, mas não no córtex cerebral, frente ao tratamento agudo ou com doses
repetidas com ZnCl
2
e nas concentrações mais elevadas do metal. GPx possui um papel
crucial na detoxificação de peróxidos, e sua atividade pode ser aumentada sob condições de
estresse oxidativo associado à exposição a metais pesados (Flohé et al., 1973; Rotruck et
al., 1973). Adicionalmente, a GST está normalmente envolvida na detoxificação de
substâncias eletrofílicas pela sua conjugação com glutationa. Estes conjugados são,
55
posteriormente, metabolizados ou transportados para o meio extracelular. Além disto, a
GST também tem atividade GPx, independente de selênio (Deneke & Fanburg, 1989).
Em um estudo realizado com ratos adultos tratados com ZnCl
2
5 mg/kg de forma
aguda, a atividade das enzimas GST e GPx foram reduzidas significativamente no córtex
cerebral, mas não foram afetadas no hipocampo (Brocardo et al., 2005). Este dados com
animais adultos contrastam com o aumento na GPx e GST no hipocampo de ratos jovens
tratados com ZnCl
2
, sem nenhuma alteração no córtex cerebral. O efeito do zinco em
animais adultos foi associado a um aumento na lipoperoxidação, determinada através da
medida de TBARS (Brocardo et al., 2005). Porém, em nosso estudo não foram detectadas
alterações nos níveis de TBARS em nenhuma das doses de ZnCl
2
(dados preliminares não
mostrados), sugerindo que, se houve lipoperoxidação, esta não pode ser detectada pelo
método empregado.
Com base nesses dados, é interessante ressaltar que a barreira hematoencefálica do
cérebro de animais em desenvolvimento possui uma maior permeabilidade a aminoácidos e
proteínas quando comparada com a de animais adultos (Baños et al., 1978; Braun et al.,
1980; Cornford et al., 1982; Brenton & Gardiner, 1988). Isso, provavelmente, é reflexo do
crescimento rápido do cérebro em desenvolvimento, resultando da necessidade de um
influxo maior de aminoácidos para síntese de proteínas (Saunders et al., 1999). Como o
zinco atravessa a barreira hematoencefálica ligado a proteínas e aminoácidos, é possível
que uma maior quantidade de zinco chegue ao cérebro em animais imaturos (8-14 dias)
quando comparado com animais adultos. Com base nesta informação, poderíamos supor
que animais jovens poderiam ter uma maior sensibilidade à exposição a metais, como o
zinco, o que eventualmente levaria a uma alteração na atividade das enzimas antioxidantes
ainda maior que em animais adultos. Uma das possibilidades seria a inibição da GR, como
56
demonstrado in vitro (Fig. 18; Mize & Langdon, 1962) ou em cultura de células (Wilhelm
et al., 2001). Entretanto, não foi observada a redução na atividade GR. Além disto, a
atividade GST e GPx foram maiores no hipocampo de animais tratados com ZnCl
2
. Frente
a estes dados, pode-se supor que a capacidade de resposta frente ao insulto causado por
zinco parece levar a um aumento compensatório na atividade destas duas enzimas
antioxidantes.
Nossos resultados também demonstram a ausência de alteração nas defesas
antoxidantes no córtex cerebral de ratos jovens tratados com zinco. Esses resultados
contrastam com àqueles encontrados por Brocardo et al. (2005), onde houve uma redução
na atividade de GST e GR nessa estrutura. No mesmo estudo, a atividade da GPx no córtex
não foi alterada pelo tratamento com zinco. Esses resultados contrastantes indicam
respostas diferenciadas das defesas antioxidantes entre ratos jovens e adultos.
Foi previamente demonstrado que o metabolismo aeróbico aumenta à medida que
ocorre a maturação do cérebro de ratos (Booth et al., 1980). Além disso, há um aumento na
geração de espécies reativas de oxigênio durante o processo de desenvolvimento,
especialmente durante o período de mielinização e sinaptogênese, que ocorre em torno do
10º ao 14º dia após o nascimento (Khan & Black, 2003). A intensa proliferação de células
gliais pode ser um dos principais responsáveis pelo aumento nas defesas antioxidantes neste
período, uma vez que estas células possuem maiores níveis de glutationa e de enzimas
antioxidantes do que neurônios (Rice & Russo-Menna, 1998). Sabe-se que há aumento das
enzimas antioxidantes, tais como a GPx (Lindenau et al., 1998; Rohrdanz et al., 2001) e
GST (Sharma et al., 2005), em condições de estresse oxidativo. Além disto, vários
trabalhos sugerem que o tratamento com ZnCl
2
causa aumento na formação de espécies
reativas de oxigênio e de radicais livres (Kim et al., 1999b; Noh et al., 1999; Noh & Koh,
57
2000). Baseado nestes dados supõe-se que o ZnCl
2
esteja causando estresse oxidativo.
Entretanto, a confirmação desta possibilidade seria obtida através da análise dos danos
oxidativos sobre proteínas, lipídeos e DNA, que poderia indicar de forma mais direta o
possível papel pró-oxidante do ZnCl
2
.
A atividade da GR é essencial na manutenção da GSH na sua forma reduzida, e a
inibição dessa enzima cria um desbalanço na taxa GSH/GSSG (Meister & Anderson, 1983;
Stamler, 1994). Um dos resultados mais significativos apresentados no presente estudo foi
a forte inibição dose-dependente in vitro da GR por ZnCl
2
em todas as concentrações
utilizadas (10-100 µM), indicando que a atividade desta enzima é bastante sensível à
inibição pelo zinco. A presença de ZnCl
2
30 µM causa uma inibição da GR de cerca de
50%. A inibição da GR pelo zinco in vitro tem sido documentada sobre a enzima purificada
a partir de fígado de ratos (Mize & Langdon, 1962). Adicionalmente, uma forte inibição da
GR também foi observada em células epiteliais pulmonares tratadas com o metal (Walther
et al., 2003).
O nosso estudo demonstrou a inibição da GR pelo ZnCl
2
em fatias de hipocampo.
Neste modelo utilizando fatias hipocampais, é importante notar que se mantém a matriz
extracelular natural, a conectividade neuronal e as interações neuro-gliais (Rodnight et al.,
1991; Gong et al., 2001; Cordova et al., 2004). Além disso, como não conhecemos a
disponibilidade intracelular de zinco, pois as células dispõem de muitos mecanismos para
imobilizar o metal, é possível que a concentração intracelular de zinco seja bem menor que
as concentrações empregadas. Neste sentido, no tecido nervoso central homogeneizado foi
observada a inibição de 50% da atividade da GR na presença de ZnCl
2
10 µM (dados não
publicados). Baseado nestas observações é possível hipotetizar que a concentração
58
intracelular de ZnCl
2
ultrapassou 10 µM quando fatias de hipocampo foram tratadas com
ZnCl
2
100 µM, tendo em vista a observação de que a atividade GR foi reduzida em ~75%.
As outras enzimas analisadas (GGT, GST e GPx) não tiveram suas atividades
alteradas pela exposição in vitro das fatias a este metal. Portanto, o zinco mostrou, de forma
inequívoca, uma inibição específica e dose-dependente da GR, mas não de outras enzimas
antioxidantes. Como essa enzima possui resíduos tióis participando nos eventos catalíticos,
uma possibilidade é de que o zinco possa ser quelado no sítio ativo da enzima (Mize &
Langdon, 1962), impedindo sua interação com seus substratos.
Na avaliação da ação do zinco sobre a viabilidade celular em fatias hipocampais,
nossos resultados demonstraram que o ZnCl
2
(100 μM), concentração atingida nas sinapses
em condições patológicas (Haug et al., 1971; Sloviter 1985; Frederickson et al., 1988),
diminui a viabilidade das células do hipocampo.
Uma de nossas hipóteses é a de que a inibição da GR seja um mecanismo envolvido
nesta redução de viabilidade. A capacidade de degradar peróxidos via GPx requer GSH
para fornecer os equivalentes redutores na degradação de peróxidos. Ao degradá-los, a GPx
leva à formação de GSSG (Flohé et al., 1973). Como a atividade da GR é necessária para a
regeneração de GSH a partir de GSSG, e como ZnCl
2
100 μM causa redução da atividade
de GR em ~75%, esperávamos que o tratamento das fatias com ZnCl
2
e o posterior
tratamento com peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
1 mM) causaria um efeito sinérgico em
termos de prejuízo de viabilidade. Entretanto, o H
2
O
2
1 mM não potencializou a redução de
viabilidade causada por ZnCl
2
100 μM. De certa forma, nossos resultados sobre a
viabilidade celular de fatias hipocampais na presença de ZnCl
2
e H
2
O
2
estão de acordo com
a idéia de que os níveis de GR estão acima do mínimo necessário para reduzir GSSG
59
(Jopperi-Davis et al., 2004), ou que sistemas alternativos para redução de GSSG possam
existir (Kanzok et al., 2000). No trabalho de Jopperi-Davis et al. (2004), uma forte inibição
da GR hepática por uma nitrosouréia levou a um modesto aumento nos níveis de GSSG.
Por outro lado, os níveis de GSSG no fígado (~50 μM; Shaik & Mehvar, 2006) são cerca de
25 vezes maiores do que no SNC (~2 μM; Cooper & Kristal, 1997; Dafre et al., 2003),
indicando que o SNC possui alta eficiência na redução da GSSG.
Alem da GR, a catalase contribui para a detoxificação de H
2
O
2
. Sob condições
fisiológicas, a catalase aceita somente o H
2
O
2
como substrato (e não peróxidos orgânicos),
tendo uma ação efetiva na presença de altas concentrações desse composto (Aebi, 1984), o
que minimizaria a necessidade do sistema dependente de GSH e GR. Embora a atividade
específica da catalase seja muito menor no cérebro do que em tecidos como rim e fígado,
esta enzima, mesmo assim, poderia ser importante no metabolismo de H
2
O
2
no tecido
nervoso. Dringen et al. (1999) demonstraram que os neurônios dependem da catalase para
detoxificar H
2
O
2
, uma vez que o sistema da glutationa possui uma eficácia reduzida nessas
células, contrastando com astrócitos, onde a inibição da catalase demonstrou ser
funcionalmente compensada pelo sistema da glutationa (Dringen & Hamprecht, 1997). Para
testar esta possibilidade, seria importante avaliar a viabilidade celular na presença de
peróxidos orgânicos, que não servem de substrato para a catalase, e a detoxificação de tais
peróxidos dependeria, basicamente, do sistema da glutationa.
No presente estudo, foi observado que zinco (100 µM) estimulou a fosforilação de
Akt (proteína cinase B) em fatias hipocampais expostas durante 2 h ao metal. Akt é uma
proteína cinase conhecida por promover a sobrevivência celular através da fosforilação de
diversos alvos, conduzindo à inibição de vias apoptóticas (Lizcano et al., 2000, Masters et
60
al., 2001). Outros trabalhos também demonstraram o aumento de fosforilação e ativação da
Akt pelo zinco, porém em cultura de fibroblastos e adipócitos (Tang & Shay, 2001), em
cultura de células Swiss 3T3 (Kim et al., 2000) e em linhagens de neuroblastoma (An et al.,
2005).
A PI3K estimula a produção de fosfoinositóis fosforilados na posição 3 (PI-3,4,5P),
o que leva a ativação de proteínas quinases como PDK1, o qual fosforila Akt no resíduo de
treonina 308. Além disso, outras cinases (de identidade ainda não bem estabelecida)
também são ativadas neste processo e fosforilam um segundo resíduo, a Serina 473. A
fosforilação dos dois resíduos é necessária para a plena ativação da Akt (Alessi et al.,
1996). Considerando estes aspectos na ativação de Akt, também analisamos se a ativação
da Akt pelo zinco é dependente da via PI3K, utilizando o inibidor desta enzima, LY294002.
Os resultados mostraram que a ação do zinco foi revertida aos níveis do controle na
presença do inibidor.
A presença do LY294002 não diminuiu a viabilidade celular na presença do zinco
na concentração de 100μM. Provavelmente essa concentração é muito tóxica, sobrepondo
aos efeitos citoprotetores da Akt. Entretanto, deve ser considerado que o modelo utilizado
em nosso trabalho é agudo, não sendo adequado para avaliação de eventos tardios como
morte apoptótica ou sua proteção. Neste sentido, deve ser lembrado que a morte neuronal
induzida pelo zinco exibe características de apoptose quando células em cultura são
expostas a baixos níveis de toxicidade, passando a necrose quando há exposição a altos
níveis de toxicidade (Kim et al., 1999a; Lobner et al., 2000; Weiss et al., 2000; Sensi et al.,
2000; Koh, 2001; Jiang et al., 2001). Portanto, é possível que na presença de ZnCl
2
100 μM
as células estejam morrendo por necrose, processo independente da via de PI3K/Akt. Além
disso, devemos considerar que, em modelos in vitro de cultura de células e modelos in vivo,
61
tem sido documentada a ação neuroprotetora de AKT relativa à morte celular que aparece
mais tardiamente frente a excitotoxicidade ou isquemia (Dhandapani et al., 2005; Zhao et
al., 2005). Desta forma, a ativação de AKT pelo zinco poderia ser um evento importante
para neuroproteção frente à morte que pode aparecer mais tardiamente (12 ou 24h). Além
do aspecto relacionado à neuroproteção, deve também ser considerado que a via PI3K/AKT
também está envolvida na modulação de fenômenos de neuroplasticidade como LTD e LTP
(Hou & Klann, 2004; van der Heide et al., 2005). Em conjunto, nossos dados e outras
observações da literatura, reforçam a possível dualidade de efeitos do zinco. Apesar da
necessidade de mais estudos para determinar as ações do zinco na modulação de vias de
sinalização, e as implicações deste processo na sobrevivência ou morte celular no modelo
de fatais, salienta-se que nossos resultados trazem dados inéditos no que se refere aos
possíveis alvos moleculares do zinco nas sinapses hipocampais, onde este metal é
fisiologicamente abundante.
A fosforilação de resíduos de tirosina em receptores para fatores neurotróficos é
fundamental na ativação de uma cascata de eventos, que culmina com a ativação de Akt e
MAPKs (Guyton et al., 1996; Wang et al., 2001). Os níveis de fosforilação sobre resíduos
de tirosina são regulados por atividades enzimáticas opostas que fosforilam (tirosina
cinases) e defosforilam (tirosina fosfatases) esses resíduos (Sun & Tonks, 1994; Hunter,
1995). Desta forma, tanto a ativação da cinase como a inibição da fosfatase podem conduzir
a um aumento de fosforilação sobre as proteínas alvo (Hunter, 1995; Lee et al., 1998;
Cortizo & Etcheverry, 1995; Bae et al., 1997; Leal et al., 2002). Inclusive a inibição
transitória de tirosinas fosfatases tem um papel crítico na sinalização celular (Lee et al.,
1998; Bae et al., 1997). Considerando os possíveis mecanismos envolvidos na ativação de
62
AKT pelo zinco, deve ser salientado que este metal é um reconhecido inibidor de proteínas
tirosinas fosfatases. Neste sentido, um mecanismo de inibição direta, onde o zinco bloqueia
a atividade dessas proteínas pela ligação à cisteína catalítica e a resíduos de histidina ou
aspartato vizinhos presentes no sítio ativo destas enzimas, foi recentemente proposto
(Haase & Maret, 2003). Samet et al. (1999) observaram esse efeito inibitório das proteínas
tirosinas fosfatases em cultura de células BEAS S6 expostas por 60 minutos ao zinco.
Devido ao potente efeito inibitório do zinco sobre a atividade das tirosinas fosfatases, é
possível que esse metal facilite a ativação dos receptores e conduza ao aumento da ativação
da via PI3K/AKT, como obervado neste estudo, bem como das vias de MAPKs, observada
em estudos prévios em nosso grupo.
Em conjunto, nosso estudo demonstra que o zinco in vivo pode promover aumento
das defesas antioxidantes em hipocampo de ratos jovens. Por outro lado, o zinco in vitro, na
concentração de 100 µM, pode inibir a enzima glutationa redutase, ativar AKT via PI3K, e
produzir neurotoxicidade em fatias hipocampais de animais imaturos. Estes dados mostram
evidências de neurotoxicidade causada pelo metal juntamente com a ativação de eventos
bioquímicos reconhecidos como neuroprotetores.
63
6. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos neste estudo permitem as seguintes conclusões:
Experimentos in vivo:
1- O tratamento dos animais jovens in vivo com zinco (administrando doses repetidas ou
agudas) não alterou os níveis de glutationa total tanto no córtex cerebral quanto no
hipocampo.
2 - O tratamento dos animais jovens in vivo com zinco (administrando doses repetidas ou
agudas) e nas doses mais elevadas do metal (4 ou 16 mg/Kg), estimulou a atividade das
enzimas antioxidantes GPx e GST no hipocampo. Esse efeito não foi observado na
atividade das outras enzimas testadas, como a GR e catalase. A atividade das mesmas
enzimas analisadas no córtex cerebral desses animais não demonstrou alteração em resposta
a nenhum dos tratamentos com zinco.
Experimentos in vitro:
3 - Em fatias de hipocampo de ratos jovens, a enzima GR foi inibida na presença de zinco
em todas as concentrações testadas (10 a 300 µM). Além disso, o efeito inibitório do zinco
é específico sobre esta enzima, uma vez que os perfis de atividade de outras enzimas
analisadas (GGT, GST e GPx) não foram alterados.
64
4 - A exposição de fatias de hipocampo ao ZnCl
2
(100 e 300 µM) por 2 horas causou uma
diminuição significativa na viabilidade celular, medida pela redução do MTT.
5 – Apesar da inibição de GR pelo zinco, não houve sinergismo significativo entre o pré-
tratamento com ZnCl
2
e o tratamento com H
2
O
2
. Isso sugere que, nas fatias hipocampais, as
células possivelmente podem utilizar outros meios para detoxificar o H
2
O
2
.
6 - A exposição das fatias hipocampais ao zinco causou um aumento na fosforilação da Akt
observado somente na concentração de 100µM.
7 - O tratamento das fatias com o inibidor da PI3K, LY294002, reverteu a fosforilação
zinco-dependente de Akt, indicando que a ação do zinco na fosforilação da Akt ocorre
através da via PI3K.
65
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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