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Universidade do Extremo Sul Catarinense
Curso de Pós-Graduação em Ciências Ambientais
ESTUDOS PRELIMINARARES DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO
EXTRATO HIDROETANÓLICO DE FOLHAS JOVENS E ADULTAS DE
TABEBUIA HEPTAPHYLLA (VELL.) TOLEDO (IPÊ-ROXO)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Ambientais da
Universidade do Extremo Sul Catarinense, para
obtenção do Grau de Mestre em Ciências
Ambientais.
Orientador:
Prof. Dr: Felipe Dal-Pizzol
Co-Orientadora:
Profª. Drª: Vanilde Citadini-Zanette
Criciúma, SC
2006
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ESTUDOS PRELIMINARARES DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO
EXTRATO HIDROETANÓLICO DE FOLHAS JOVENS E ADULTAS DE
TABEBUIA HEPTAPHYLLA (VELL.) TOLEDO (IPÊ-ROXO)
Patrícia Budni
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Ambientais da
Universidade do Extremo Sul Catarinense, para
obtenção do Grau de Mestre em Ciências
Ambientais.
Área de Concentração:
Ecologia e Gestão do Ambientes Alterados
Orientador:
Prof. Dr: Felipe Dal-Pizzol
Co-Orientadora:
Profª. Drª: Vanilde Citadini-Zanette
Criciúma, SC
2006
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ii
AGRADECIMENTOS
A Deus por estar sempre presente na minha vida, e tornar tudo possível;
Agradeço a minha família, em especial meu esposo, por todo apoio e
confiança em mim depositada, o que tornou possível a realização deste projeto;
Aos meus amigos de todas as horas, Adalberto , Beatriz e Dometila ;
Ao meu Orientador Professor Dr°: Felipe Dal-Pizzol, pela credibilidade e
orientação;
A minha co-orientadora professora Drª. Vanilde Citadini-Zanette pelo auxílio
e orientação;
Ao Professor Dr°. Flávio Henrique Reginatto, da Universidade de Passo
Fundo, pelo auxílio na obtenção dos extratos e conhecimento prestado;
A colega doutoranda da Universidade Federal do Rio Grande do Sul,
Fabrícia Petronilho, pela contribuição com seus conhecimentos;
Um especial agradecimento também, aos bolsistas da Universidade do
Extremo Sul Catarinense, Larissa Constantino, Roberta Albino e Leonardo
Figueiredo Dore, pela grandiosa ajuda nos experimentos, madrugadas de estudo e
pela amizade;
A todos os colegas dos Laboratórios de Fisiologia e Neurociências da
UNESC, pela compreensão e amizade;
Aos funcionários da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC,
pela contribuição para que este trabalho pudesse ser feito ;
iii
RESUMO
Considerando o emprego de plantas na medicina popular, a presença de
altos teores de compostos fenólicos na sua composição química e o baixo número
de investigações a respeito das propriedades biológicas das folhas de T.
heptaphylla (Vell.) Toledo (ipê-roxo), o presente trabalho teve por objetivo avaliar a
capacidade do extrato hidroetanólico de T.heptaphylla, num modelo in vitro, na
prevenção de formação de TBARS induzido por três geradores de radicais livres,
H
2
O
2
, FeSO
4
e AAPH, em um substrato rico em lipídeos. O extrato hidroetanólico,
em diferentes concentrações (2, 20, 200 µg/mL e 2, 20 mg/mL), foi adicionado em
um tubo teste juntamente com soluções indutoras de dano. Por existir uma
sensibilidade diferenciada de alguns vegetais a depender da idade e também do
teor e tipo estrutural de flavonóides presentes nas folhas, acreditamos que esta
possa ser uma das razões pelas quais as folhas adultas se mostraram mais efetivas
que as jovens. Após, conduzimos nossa pesquisa para um modelo in vivo, com
ratos machos wistar, porém somente com os extratos das folhas adultas, nas
concentrações de 1 e 10 mg/Kg. O CCl
4
foi utilizado para induzir a peroxidação
lipídica que foi mensurada em termos de detecção dos derivados lipoperóxidos,
através de substâncias que reagem com ácido tiobarbitúrico (TBARS) e oxidação
de proteínas. Os resultados sugerem que o tratamento com extratos de folhas de T.
heptaphylla foram protetores quando usados terapeuticamente com CCl
4
no
cérebro e fígado. Em contraste, no protocolo profilático, a administração de extratos
de folhas teve ação pró-oxidante no fígado e em algumas regiões do cérebro.
Nossos resultados podem contribuir para avaliação de efeitos do extrato da planta e
sugerir que um mesmo extrato poderia agir como um antioxidante ou como um pró-
oxidante dependendo do tempo da administração. Assim, o cuidado é necessário
ao projetar experimentações para determinar a eficácia de extratos da planta no
tratamento ou na profilaxia de doenças mediadas por radicais livres.
Palavras-chave: Tabebuia heptaphylla, antioxidante, compostos fenólicos, pró-
oxidante, tetracloreto de carbono.
iv
ABSTRACT
Considering the ample use of plants in the popular medicine, the phenolic
compounds text presence high in its chemical composition and the low number of
inquiries regarding the biological properties of leves of T. heptaphylla (Vell.) Toledo
(ipê-roxo), the present work had for objective to evaluate the capacity of the
hidroetanolic extract of T.heptaphylla, in a model in vitro, the prevention of induced
formation of TBARS for three generators of free radicals, H
2
O
2
, FeSO
4
and AAPH, in
a rich substratum in lipids. The hidroetanolic extract, in different concentrations (2,
20, 200 µg/mL and 2, 20 mg/mL), was added in a tube has tested together with
inductive solutions of damage. For existing a differentiated sensitivity of some
vegetables to also depend on the age and on the text and structural type of
flavonoids gifts in leves, we believe that this can be one of the reasons for which the
adult leves had shown more effective that the young. After, we lead our research for
the research in an alive model in vivo, with male rats to wistar, however only with
extracts of adult leves, in the concentrations of 1 and 10 mg/Kg. The CCl
4
was used
to induce the lipoperoxidation that was mensured in terms of detention of the
lipoperoxides derivatives, through substances that react with acid thiobarbituric
(TBARS) and protein oxidation. Our results suggest that the treatment with leaf
extracts of T. Heptaphylla in initial injury with CCl
4
had been protective when used
after, in both, brain and liver. In contrast, in the prophylactic protocol, the leaf extract
administration had action pro-oxidante in the liver and some regions of the brain.
Our results can contribute for evaluation of effect of the extract of the plant and
suggest that one exactly extract could act as an antioxidant substance or as an pro-
oxidante depending on the time of the administration. Thus, the care is necessary
when projecting experimentations to determine the extract effectiveness of the plant
in the treatment or the prophylaxis of illnesses mediated for free radicals.
Keywords: Tabebuia heptaphylla, antioxidant, phenolic compounds, prooxidant,
tetrachloride carbon.
v
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Detalhe da árvore de Tabebuia heptaphylla (Vell.) Toledo (ipê-roxô).
Fonte : www.eco.tur.br......................................................................3
Figura 2
Detalhe das folhas de Tabebuia heptaphylla (Vell.) Toledo (ipê-
roxô). Fotos: Giselda Durigan...........................................................4
Figura 3 Vias de geração de espécies reativas de oxigênio e mecanismos
antioxidantes biológicos. Fonte: www.sistemanervoso.com /
images...............................................................................................8
Figura 4 Mecanismo de toxicidade do CCl
4
. Fonte: Adaptado de Halliwell &
Gutteridge (1999)............................................................................15
Figura 5 Núcleo fundamental dos flavonóides. Fonte: Adaptado de Rice-
Evans & Miller (1996)......................................................................17
Figura 6 Determinantes estruturais da propriedade antioxidante dos
flavonóides. Fonte: Adaptado de Tiwari (2001)...............................17
Figura 7 Mecanismo de seqüestro de espécies reativas de oxigênio por
flavonóides e formação de estrutura estável. Fonte: Adaptado de
Heim (1996).....................................................................................18
Figura 8 Sítios de ligação nos flavonóides para metais de transição. Fonte:
Adaptado de Tiwari (2001).............................................................19
vii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
•
CCl
3
- Radical triclorometil
•
NO - Radical do óxido nítrico
•
OH - Radical hidroxila
1
O
2
- Oxigênio singlet
AAPH - 2,2’–azobis (2-metilpropionamidina) dihidrocloreto
ANOVA
- Analysis of Variance
Ca
2+
- Íons cálcio
Cu
2+
- Íons cobre
C2-C3 - Carbono na posição 2 ligado ao Carbono na posição 3
CAT - Catalase
CCD - Cromatografia de Camada Delgada
CCl
4
- Tetracloreto de carbono
Cl
3
COO
•
- Radical triclorometilperoxil
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico
CNS
- Central nervous system
DNA - Ácido desoxirribonucléico
DNPH - 2,4 dinitrofenilidrazina
DP - Desvio padrão
ERN - Espécies Reativas do Nitrogênio
ERO - Espécies Reativas do Oxigênio
EtOH - Etanol
FADH - Flavina-adenina-dinucleotídeo oxidado
FAPERGS - Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio Grande do Sul
FAPESC - Fundação de Apoio à Pesquisa Científica e Tecnológica do
Estado de Santa Catarina
FeSO
4
- Sulfato ferroso
GSH - Glutationa
GSH-Px - Glutationa peroxidase
GSH-Rd - Glutationa redutase
GSSG - Glutationa oxidada
GST - Glutationa transferase
viii
H
2
O
2
- Peróxido de hidrogênio
HCl - Ácido clorídrico
LH - Lipídeo
LO
•
2
- Radical peroxil
LO
•
- Radical alcoxil
LOOH - Lipoperóxido
LPO - Lipoperoxidação
MDA - Malondialdeído
NADH - Nicotinamida-adenina-dinucleotídeo-fosfato oxidado
NADPH - Nicotinamida-adenina-dinucleotídeo-fosfato reduzida
O
2
- Oxigênio molecular
O
2
•-
- Radical ânion superóxido
-
OH - Radical ânion hidroxila
ONOO
-
- Peroxinitrito
PROADE - Projetos em Administração e Desenvolvimento Empresarial
RL - Radical livre
-SH - Grupamento tiol
SOD - Superóxido dismutase
TBA - Ácido tiobarbitúrico
TBARS - Substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico
UNESC - Universidade do Extremo Sul Catarinense
WHO
- World Health Organization
ix
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 1
1.1 Plantas medicinais e suas atribuições 1
1.2
Tabebuia heptaphylla (Vell.) Toledo (ipê-roxo)
1
1.2.1 Ocorrência 2
1.2.2 Descrição botânica 2
1.2.3 Dados farmacológicos 3
1.2.4 Composição fitoquímica 4
1.3 Estresse oxidativo 5
1.3.1 Metabolismo do oxigênio 5
1.3.2 Radicais livres 6
1.3.3 Espécies reativas do oxigênio e nitrogênio 6
1.3.4 Mecanismos de defesa antioxidante 9
1.3.5 Estresse oxidativo 12
1.3.6 Mecanismos oxidativos em sistemas biológicos 14
1.3.7 Estresse oxidativo e tetracloreto de carbono 14
1.4 Flavonóides e atividade antioxidante 15
2 OBJETIVOS 21
2.1 Objetivo Geral
21
2.2 Objetivos Específicos
21
3 CAPÍTULO 1 23
3.1 Estudos preliminares da atividade antioxidante do extrato hidroetanólico
de folhas jovens e adultas de Tabebuia heptaphylla (Vell.) Toledo (ipê-
roxo)
24
4 CAPÍTULO 2 39
4.1
Protective effects of Tabebuia heptaphylla (Vell.) Toledo (ipê-roxo)
leaves extract on carbon tetrachloride induced oxidative damage in rats
40
5.0 CONSIDERAÇÕES FINAIS 61
5.1
Atividade antioxidante in vitro
61
5.2
Atividade antioxidante in vivo
65
6.0 CONSIDERAÇÕES E CONCLUSÕES 69
7.0 REFERÊNCIAS 71
1
1) 1 INTRODUÇÃO
1.1 Plantas medicinais e suas atribuições
O Homem primitivo, ao procurar plantas para seu sustento, habitação, defesa
e ataque, foi descobrindo espécies com ação tóxica ou medicinal.
A utilização de plantas é uma prática generalizada baseada na crendice
popular e nas formações culturais que as usam como recurso terapêutico. Com isso
tem sido tradicionalmente utilizadas por populações de todos os continentes no
controle de diversas enfermidades e pragas, sendo que muitas delas são usadas
mundialmente como fármacos ou fonte de fármacos. Apesar dos grandes avanços
da medicina moderna nos últimos cem anos, as plantas medicinais continuam tendo
sua contribuição para o arsenal terapêutico atual.
A disseminação do uso de determinadas partes das plantas consideradas
medicinais tem resultado em intenso extrativismo. Essa prática exploratória
descontrolada de recursos naturais coloca em risco a extinção de inúmeras
espécies nativas, causando sérios distúrbios ecológicos, atentando as pessoas
para o desenvolvimento de um sistema de conservação dos ecossistemas
tropicais, evitando assim extinção de espécies que poderia ser potencialmente
úteis à ciência. Uma das razões que justificaria seu uso descontrolado seria a
insatisfação com a eficácia, o custo elevado e os efeitos indesejáveis comparadas
aos medicamentos alopáticos.
Considerando que o Brasil possui a maior diversidade genética vegetal do
mundo em matéria prima para produção de fitofármacos e que apenas 8% das
espécies vegetais foram estudadas, é de suma importância que se busque nestas
plantas uma fonte alternativa de tratamento, visando no futuro à obtenção de
novos fármacos mais eficazes e específicos. No Brasil, estima-se que 25% dos U$
8 bilhões do faturamento, aplicados no ano de 1996, da indústria farmacêutica
nacional sejam derivados de plantas (GUERRA; NODARI, 2004).
No Brasil e em vários outros países, uma grande variedade de vegetais vem
sendo utilizado como fonte alternativa de medicamentos. Segundo análise feita
pela Annual Reports of Medical Chemistry, cerca de 60% dos fármacos lançados
no mercado norte-americano entre 1985 e 1995, são de origem natural e vegetal
(NIERO et al., 2003).
2
Apesar de substâncias naturais com importância terapêutica terem sido
isoladas de plantas da flora brasileira, as investigações científicas relacionadas aos
estudos químicos, bioquímicos e farmacológicos de substâncias provenientes de
plantas medicinais estão aquém do potencial de nossa flora. Em nosso país, dos
aproximados 6 mil produtos farmacêuticos disponíveis, entre fármacos e
fitofármacos, poucos foram desenvolvidos por indústrias nacionais. No entanto,
investem-se bilhões de dólares na importação da matéria-prima utilizada na
produção de fármacos (BLOCK et al., 1998)
1.2 Tabebuia heptaphylla (Vell.) Toledo (Ipê-Roxo)
1.2.1 Ocorrência
De grande importância econômica, ecológica e medicinal, Tabebuia
heptaphylla (Vell.) Toledo - ipê roxo, pertencente à família Bignoniaceae, é uma
espécie autóctone da América do Sul, ocorrendo em todo Brasil desde o
Amazonas até o Rio Grande do Sul. Ocorre em solos úmidos das depressões e
matas de encostas suaves. No Brasil, os nomes populares “pau d’arco” e “ipê” são
usados para diversas bignoniáceas , sobretudo do gênero Tabebuia e Tecoma. O
nome popular “ipê” geralmente é acompanhado pela especificação de
características especiais (ipê-roxo, ipê-amarelo, entre outras). Muitas dessas
espécies são conhecidas nos países latino-americanos de língua espanhola como
“lapacho”. Também podemos encontrá-la como cabroé, graraíba, ipê-piranga, ipê-
preto, ipê-rosa, piúva e ipê-roxo-de-sete-folhas (PIO CORREA, 1984; LORENZI,
1998; MIRANDA et al., 2001; LORENZI; MATOS, 2002; PARK et al., 2003; AWALE
et al., 2005; HIGA, 2006).
1.2.2 Descrição botânica
Árvore com 10 a 20 metros de altura e tronco com 30 a 60 cm de diâmetro.
Folhas compostas, digitadas com 5-7 folíolos serrilhados, elípticos, quase glabros,
com até 14 cm de comprimento por 06 cm de largura. Flores róseo-arroxeadas
cobrindo quase toda a planta que fica completamente sem folhas durante a
floração. Frutos do tipo síliqua com comprimento de 20 a 35 cm e 1,5 cm de
diâmetro, contendo sementes aladas com aproximadamente 20 mm de
3
comprimento e 7 mm de largura (Figuras 1 e 2) (CARVALHO, 1994; LORENZI;
MATOS, 2002; BACKES; IRGANG, 2004).
Quase todos os ipês possuem um lenho bastante resistente, o que confere à
sua madeira um grande valor comercial sendo utilizada com sucesso em
reflorestamento misto (CARVALHO, 1994). Muitas espécies apresentam potencial
de utilização como corantes (PIO CORREA, 1984, DUKE, 1985). Podem ainda ser
usadas na construção civil, como vigas e assoalhos. Possui grande potencial
ornamental, sendo largamente empregada em praças, jardins e arborização de
ruas (HIGA, 2006).
Figura 1: Tabebuia heptaphylla (Vell.) Toledo - ipê-roxo.
Fonte: www.eco.tur.br
4
1.2.3 Dados farmacológicos
A literatura etnobotânica cita o uso da casca e da folha da planta na
medicina popular sob a forma de chá, como antibacteriano, antifúngico, diurético,
adstringente e no tratamento caseiro para impetigo e contra alguns tipos de câncer,
lúpus, doença de Parkinson, psoríase e alergia (MIRANDA et al., 2001; PARK et al.,
2003). Sua casca interna também é utilizada no nordeste brasileiro como
antiinflamatório, analgésico, antineoplásico e diurético (MIRANDA et al., 2001). A
atividade anticancerígena da casca do ipê é atribuída principalmente as
naftoquinonas lapachol e hidro-α-lapachona, que apresentaram in vitro efeito
inibidor sobre o crescimento de tumores malignos, além de outras propriedades
farmacológicas, como atividade anticoagulante, antimalárica e antianêmica (HIGA,
2006). Em um trabalho realizado por Awale et al (2005) verificaram que extratos
aquosos de cascas de T. heptaphylla possuem forte atividade inibitória na produção
de óxido nítrico em lipopolissacarídeos ativados (AWALE et al., 2005).
As folhas são popularmente empregadas no caso de úlceras gástricas e
duodenais e o chá da entrecasca é muito utilizado para gripe. O ipê-roxo também é
indicado no tratamento de gastrite, estomatite, bronquite e asma (HIGA, 2004).
1.2.4 Composição Fitoquímica
Considerando o número de relatos de utilização pela medicina popular de
chá das cascas de ipê-roxo com fins terapêuticos, a maioria das investigações
Figura 2: Detalhes das folhas de Tabebuia heptaphylla (Vell.) Toledo - ipê-roxo.
Foto: Giselda Durigan
5
farmacológicas e estudos de caracterização fitoquímica ficaram voltados à pesquisa
de compostos provenientes das cascas desta planta, sendo limitado os estudos
realizados com suas folhas.
No ano de 1956, pesquisadores como Gonçalves de Lima e colaboradores
constataram no cerne do pau d’arco roxo, Tabebuia sp., a existência de um
composto de coloração amarela com atividade antimicrobiana, e que no decurso
dos estudos químicos chegaram a conclusão de que era lapachol. Além do
lapachol, posteriormente foram isolados nas espécies de Tabebuia avellanedae Lor.
ex Griseb (= T. heptaphylla), seis tipos de naftoquinonas e nove antraquinonas. A
presença de filoquinona (vitamina K) foi registrada apenas nas folhas (FONSECA et
al., 2003). As cascas das várias espécies de Tabebuia são fontes de
furanonaftoquinonas, quinonas, ácido benzóico, derivados de benzaldeídos,
dialdeído ciclopentano, iridóides, flavonóides e glicosídeos fenólicos (AWALE et al.,
2005). Investigação fitoquímica das cascas de T. impetiginosa levou ao isolamento
de 5-hidróxi-2-(1-hidroxietil) nafto [2,3-b]furan-4,9-diona (FUJIMOTO et al., 1991).
Iridóides glicosilados foram isolados das cascas de Tabebuia heptaphylla (= T.
avellanedae) (NAKANO et al., 1993). Da fração diclorometânica do extrato
metanólico das cascas de T. impetiginosa foram isolados os ciclopentenos
dialdeídos 1 e 2 que mostraram atividade antiinflamatória (KOYAMA et al., 2000).
1.3 Estresse Oxidativo
1.3.1 Metabolismo do oxigênio
Exceto para organismos anaeróbios e organismos unicelulares tolerantes ao
oxigênio, todos os animais, plantas e bactérias o requerem para produção eficiente
de energia (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999). Normalmente, em torno de 95 a
98% do oxigênio utilizado pelos organismos aeróbios é reduzido à água na cadeia
respiratória no processo conhecido como fosforilação oxidativa (BATELO, 2002).
As fontes que cedem cátions de hidrogênio e os elétrons para essa
reação são, o NADH, o FADH e a ubiquinona ou coenzima Q (HALLIWELL;
GUTTERIDGE, 1999). Todavia, restando de 2 a 5% do O
2
este será reduzido
univalentemente, produzindo intermediários altamente reativos, denominados
Espécies Reativas de Oxigênio - ERO, que algumas vezes constituem os radicais
livres. Os principais sistemas enzimáticos que catalisam a redução do oxigênio são
as ciclooxigenases, lipoxigenases, xantina oxidase, aldeído oxigenase, flavina
6
desidrogenase e peroxidases. Essa redução também ocorre em reações não
enzimáticas e em reações de autooxidação como as que ocorrem com
catecolaminas, flavinas e ferridoxinas, além de reações catalisadas por ferro, cobre
e radiações ionizantes (GUTIERREZ, 2002)
1.3.2 Radicais Livres
O termo radical livre (RL) é freqüentemente definido para designar qualquer
átomo ou molécula, com existência independente, apresentando em sua estrutura
atômica, um ou mais elétrons desemparelhados no seu orbital mais externo,
conferindo maior reatividade em relação às espécies não radicalares. Os RL são
produzidos em situações fisiológicas ou patológicas por mecanismos diferentes
como na respiração celular e reações de oxidação, sendo danosos às células
quando produzidos em excesso (GUTIERREZ, 2002). Apresentam, em geral, uma
grande instabilidade e possuem tempo de meia vida muito curto, reagindo
rapidamente com diversos compostos, podendo atacar alvos celulares como
membranas lipídicas, proteínas e molécula de DNA (JORDÃO JR. et al., 1998). Os
efeitos deletérios dos RL variam conforme o tipo de organismo testado, a idade,
estado fisiológico e a dieta ingerida. A toxicidade do oxigênio é alterada pela
presença, na dieta, de quantidades diferentes de vitaminas A, E, C, carotenóides,
ferro, selênio, enzimas e ácidos graxos poliinsaturados onde a quantidade relativa
de antioxidantes e pró-oxidantes pode influenciar na susceptibilidade de um
indivíduo desenvolver um estresse oxidativo mediado por RL (VANNUCCHI et al.,
1998).
Quatro fontes parecem ser responsáveis pela produção da grande maioria
dos radicais livres conhecidos, entre elas os elétrons oriundos da cadeia
respiratória mitocondrial, os elétrons provenientes do escape do sistema citocromo
P-450 e citocromo b
5
no retículo endoplasmático, das células fagocíticas e dos
peroxissomas (PÔRTO, 2001).
1.3.3 Espécies reativas do Oxigênio (ERO) e do Nitrogênio (ERN)
Espécies ativas, ou reativas, é um termo coletivo que incluem radicais do
oxigênio e do nitrogênio, e certas espécies não-radicalares que podem ser
convertidas facilmente à radical (Tabela 1).
7
“Reativo” não é sempre um termo apropriado uma vez que H
2
O
2
, O
2
•-
e
óxido nítrico (
•
NO) reagem diretamente com poucas moléculas no corpo humano,
enquanto
•
OH pode reagir com qualquer molécula. Sendo os radicais mais
importantes, do ponto de vista biológico, aqueles derivados do oxigênio
(PUNCHARD; KELLY, 1996; HALLIWELL, 2001; EHRENBRINK et al, 2006)
Tabela 1: Principais espécies reativas do oxigênio e espécies reativas do nitrogênio
nas formas de radicais e não radicais
Fonte: Rebello (2005).
O oxigênio pode gerar EROs seja por absorção de energia ou transferência
de elétrons. Quando o oxigênio absorve energia (luz ou radiação) no seu estado
fundamental, formam-se as espécies excitadas conhecidas como oxigênio singlet
(
1
O
2
) que apesar de não constituírem radicais livres apresenta um maior poder
oxidante e reagem rapidamente com biomoléculas (BARREIROS et al., 2006).
O outro mecanismo de geração de ERO é a redução do oxigênio à água
com a formação de radical ânion superóxido (O
2
•-
) , peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
),
e radical hidroxil (
•
OH) (Figura 3). Atribui-se a esses produtos, a toxicidade do
oxigênio, que podem reagir com biomoléculas, danificando ou inativando estruturas
celulares (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999).
8
Figura 3: Vias de geração de EROs e mecanismos antioxidantes biológicos. Fonte:
Prof. Dr. Durval Damiani (www.sistemanervoso.com / images)
Cada ERO tem suas próprias características, com diferentes reatividades e
tempos de meia-vida e são gerados no citoplasma, mitocôndria, retículo
endoplasmático, membrana celular e núcleo de todas as células aeróbias (YU,
1994; TEIXEIRA, 2003).
O ânion radical superóxido (O
2
•-
) é o primeiro intermediário da redução
univalente do oxigênio, e a partir desse serão formadas as demais ERO
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999). Em condições fisiológicas é gerado
principalmente nas mitocôndrias, microssomas e peroximas. Apresenta meia vida
mais longa comparada ao radical hidroxil podendo reagir com as moléculas por
mais tempo (ANDRADE JR et al., 2005). Durante o estresse oxidativo um aumento
na concentração intracelular de íons cálcio pode induzir uma conversão irreversível
de xantina desidrogenase para xantina oxidase, que pode levar a sua geração
(MUTHUSWAMY et al, 2006). Seus efeitos deletérios vêm da habilidade de gerar
radicais secundários como H
2
O
2
, por dismutação espontânea, e radicais
9
extremamente tóxico, como
•
OH através da redução de quelatos de Fe (III)
formando Fe
2+
. Além disso, o radical O
2
•-
tem habilidade de liberar Fe
2+
das
proteínas de armazenamento e de ferro-sulfoproteínas. Esse radical pode ainda
reagir com óxido nítrico para formar peroxinitrito (ONOO
-
) e com o radical
•
OH
produzindo
1
O
2
(ANDRADE JR et al., 2005; BARREIROS et al., 2006).
Embora H
2
O
2
não seja um verdadeiro radical livre, pode reagir com metais
redox-ativos como ferro e cobre, seja via reação de Fenton (Reação 1) ou de
Haber-Weiss (Reação 2) , gerando o importante radical
•
OH (YOSHIDA; CAMPOS,
2005). Possui um tempo de meia vida longo e grande capacidade de atravessar as
membranas celulares hidrofóbicas e se difundir para o interior da célula
(ANDRADE JR et al., 2005).
Reação 1
Reação de Fenton:
Fe
++
+ O
2
<————> Fe
+++
+ O
2
•
-
2 O
2
•
-
+ 2H
+
————> O
2
+ H
2
O
2
Fe
++
+ H
2
O
2
————> Fe
+++
+ OH
-
+ HO
•
O radical hidroxil (
•
OH) é um dos mais deletério ao organismo pois possui
tempo de meia vida muito curto sendo difícil de ser seqüestrado in vivo e não
possui enzimas que catalise sua remoção. Pode ser gerado principalmente por
radiação ionizante e em reação com metais de transição, a partir da Reação de
Fenton ou de Haber-Weiss, ou ainda pode reagir com o radical ânion superóxido e
peróxido de hidrogênio. Freqüentemente causa dano por retirar átomos de
hidrogênio do grupo metileno dos ácidos graxos polIinsaturados e por adição nas
insaturações (DAL-PIZZOL, 2001; YOSHIDA; CAMPOS, 2005).
Além do oxigênio, o nitrogênio também participa da geração de radicais
livres, em especial óxido nítrico, cujo precursor é a L-arginina (LEITE; SARNI,
2003). Como representante da classe de ERN tem-se o radical óxido nítrico (
•
NO)
que não é suficientemente reativo para atacar DNA diretamente, mas pode reagir
com o radical O
2
•-
gerando peroxinitritos que pode então sofrer reações
Reação 2
Reação de Haber-Weiss:
Fe
+++
+ O
2
<————> Fe
++
+ O
2
•
-
Fe
++
+ H
2
O
2
————> Fe
+++
+ OH
-
+ HO
•
2 O
2
•
-
+ H
2
O
2
————> O
2
+ OH
-
+ HO
•
10
secundárias formando agentes capazes de nitrar aminoácidos aromáticos e as
bases de DNA, em particular guanina (BARREIROS, 2006).
Contudo, a oxidação é parte fundamental da vida aeróbia e do metabolismo
animal, e assim, os RL são produzidos naturalmente ou por alguma disfunção
biológica, mantidas sob um equilíbrio de agentes antioxidantes naturais. Nos
organismo, as ERO e ERN encontram-se envolvidas na produção de energia,
fagocitose, regulação crescimento celular, sinalização intercelular e síntese de
substâncias biológicas importantes. No entanto, seu excesso apresenta efeitos
prejudiciais ao organismo como peroxidação dos lipídeos de membrana e
agressão às proteínas, enzimas, carboidratos e DNA (HUSAIN et al., 1987;
DAVIES, 1994; BARREIROS, 2006)
1.3.4 Mecanismos de Defesas Antioxidantes
Para prevenir o dano causado pelas ERO e ERN o sistema biológico
desenvolveu sistemas de defesa antioxidante, que incluem antioxidantes
enzimáticos e não-enzimáticos atuando conjuntamente na proteção celular
(CHAUDIÈRE; FERRARI-ILIOU, 1999; SZYMONIK-LESIUK et al., 2003).
É considerado um agente antioxidante, qualquer substância capaz de
prevenir os efeitos deletérios dos processos ou reações que levam a oxidação de
macromoléculas ou estruturas celular (FRAGA; OTEIZA, 2002). Pode se incluir
como defesas antioxidantes os agentes que cataliticamente removem radicais livres
e outras espécies reativas, as proteínas que diminuem a disponibilidades de
agentes prooxidantes, como os íons metálicos e ainda agentes seqüestrantes de
ERO e ERN (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999).
Podemos classificá-los em sistema antioxidantes enzimáticos e não
enzimáticos. Os antioxidantes enzimáticos são formados por várias enzimas das
quais pode-se destacar: superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa
peroxidase (GPx) (TIEPPO, 2006).
A GSH é um tripeptídeo, contendo cisteína e é o tiol não-protéico mais
abundante nas células dos mamíferos podendo ser considerado um dos agentes
mais importantes dos sistemas de defesas antioxidantes. Sua capacidade redutora
é determinada pelo grupamento tiol (-SH) presente na cisteína, atuando também
como transportadora e reservatório de cisteína e participa na detoxificação de
11
agentes químicos e eliminação de produtos de lipoperoxidação. Ainda é requerida
para síntese de DNA, de proteínas e algumas prostaglandinas. (FERREIRA et al.,
1997; JORDÃO JR. et al., 1998; YOSHIDA; CAMPOS, 2005).
É constituída em conjunto com duas outras enzimas, a glutationa
peroxidase (GSH-Px) e a glutationa redutase (GSH-Rd) formando um sistema. A
versatilidade de suas propriedades químicas faz com que sirva como um eficiente
agente redutor interagindo com componentes oxidantes como O
2
• -
, H
2
O
2
,
•
OH.
(ANDRADE JR et al., 2005). Após a exposição da GSH ao agente oxidante ocorre
sua oxidação à glutationa oxidada (GSSG), via enzima GSH-Px, que a utiliza como
substrato para eliminar peróxidos (Reação 3). A recuperação da GSH é então feita
pela enzima GSH-Rd, uma flavoproteína dependente de nicotinamida-adenina-
dinucleotídeo-fosfato reduzida (NADPH), sendo essa, uma etapa essencial para
manter íntegro o sistema de proteção celular (Reação 4). A GSH pode ainda
proteger contra lipoperoxidação, reduzindo a forma oxidada da vitamina E,
mantendo-a na sua forma reduzida e funcional (YU, 1994; FERREIRA et al., 1997).
2GSH + H
2
O
2
GSSG + H
2
O (Reação 3)
2GSSG
-
+ NADPH + H
+
2 GSH + NADP
+
(Reação 4)
Finalmente, a GSH pode, através da Glutationa-S-Transferases (GST),
detoxificar potentes agentes alquilantes, incluindo compostos farmacologicamente
ativos como herbicidas, pesticidas e xenobióticos e também aldeídos reativos
(como malondialdeído) que são gerados durante a peroxidação lipídica. As GSTs
catalisam a reação destes compostos alquilantes com o grupamento -SH da
glutationa, neutralizando assim seus sítios eletrofílicos e transformando-os em
produtos mais hidrossolúveis, que são de mais fácil excreção (JORDÃO JR. et al.,
1998; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999). Variações nos níveis de glutationa
afetam diretamente a síntese de proteínas e DNA, e ainda situações de estresse
oxidativo muito intenso, podem levar a sua perda irreversível, onde permanecerá na
sua forma oxidada (UHLIG; WENDEL, 1992).
GSH-Px
GSH-Rd
12
As Superóxido Dismutases são metaloenzimas que catalisam muito
eficientemente a dismutação de dois radicais superóxido para formar o H
2
O
2
que é
menos reativo e pode ser degradado por outras enzimas (DEL MAESTRO, 1980).
Estas enzimas estão amplamente distribuídas nos sistemas biológicos, com
diferentes formas, onde as que contém cobre e zinco em seu sítio de ativação, são
encontradas no citoplasma das células eucarióticas e são conhecidas como Cu/Zn-
SOD e as que contêm manganês que se encontram na mitocôndria, mais
precisamente na matriz mitocondrial, são conhecidas como Mn-SOD. Há ainda uma
terceira, a Fe-SOD, é uma ferro-enzima que foi identificada em bactérias (CHANCE
et al., 1979; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999). As diferentes formas de SOD
catalisam a mesma reação, sendo a dismutação do radical superóxido (Reação 5):
O
2
• -
+ O
2
• -
+ 2H
+
H
2
O
2
+ O
2
(Reação 5)
A CAT é a enzima que catalisa a transformação de duas moléculas de H
2
O
2
em água e oxigênio, sendo altamente específica por atuar em hidroperóxidos de
hidrogênio, de etila e de metila (Reação 6). Divide essa função com a GPx , onde
na presença de baixos níveis de H
2
O
2
, os peróxidos orgânicos são eliminados
preferencialmente pela GSH-Px, enquanto que em altas concentrações predomina
a ação da CAT (CHANCE et al., 1979; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999; CHUNG-
MAN et al., 2001).
2H
2
O
2
2H
2
O + O
2
(Reação 6)
Assim como os mecanismos de defesa antioxidantes enzimáticos, existem
substâncias que podem atuar, prevenindo ou inibindo a formação de RL ou
ERO/ERN, evitando uma cadeia de peroxidação na fase de propagação e
reparando e reconstituir membrana. São conhecidas como antioxidantes não-
enzimáticos sendo exemplos a glutationa, ácido ascórbico (vitamina C), α-tocoferol
(vitamina E), β-carotenos e flavonóides (ABDALLA, 1993; HALLIWELL;
GUTTERIDGE, 1999; GUTIERREZ, 2002; GUREL et al., 2005) quando presentes
SOD
CAT
13
em altas concentrações, podem contribuir para capacidade antioxidante total
(DROGE, 2002).
1.3.5 Estresse Oxidativo
Aos efeitos nocivos das reações de oxidação induzidas pelos radicais livres
e capazes de lesar as estruturas dos sistemas biológicos dá-se o nome de estresse
oxidativo. Pode resultar do excesso na produção oxidante ou da depleção das
defesas antioxidantes. Pode ser benéfico no caso de infecções ou prejudicial
quando a perda de controle da produção dos radicais livres (LEITE; SARNI, 2003).
1.3.6 Mecanismos Oxidativos em Sistemas Biológicos
Todos os componentes celulares são suscetíveis à ação das ERO, porém a
membrana é um dos mais atingidos em decorrência da lipoperoxidação (LPO), que
acarreta alterações na estrutura e na sua permeabilidade, liberando enzimas que
degradam os lisossomos e rapidamente destroem a célula (MELLO, 2001) e que
segundo Del Maestro (1980), este seria o efeito mais deletério dos radicais livres
nos sistemas biológicos. É considerada a maior fonte de produtos citotóxicos,
como aldeídos, produzidos da decomposição de hidroperóxidos. Os principais
ácidos graxos que sofrem peroxidação lipídica na célula são ácido linoléico, ácido
araquidônico e ácido docohexanóico (ESTERBAUER et al., 1987; YU, 1994) .
No passo inicial da LPO acontece o processo de ataque aos ácidos graxos
poliinsaturados (LH) presentes na membrana com retirada de um átomo de
hidrogênio e formando um radical (L
•
) (Reação 7) seguido pela reação com o
oxigênio molecular (O
2
) e levando a formação do radical peroxil (LO
•
2
) (Reação 8).
Com o radical peroxil inicia-se a fase de propagação da LPO, uma vez que este
pode remover um átomo de hidrogênio do LH adjacente ou de um outro doador de
hidrogênio, gerando assim um lipoperóxido (LOOH) e um radical carbono central
(L
•
) (Reação 9). Esse poderá reagir com o oxigênio e levar a uma propagação na
cadeia de reação de LPO. O lipoperóxido, portanto, produz malondialdeído e
outros aldeídos, por reações catalisadas por metais. A reação em cadeia acaba
quando dois radicais reagem entre si formando um produto que é instável e pode
ser decomposto (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999).
14
LH + HO
•
→ L
•
+ H
2
O (Reação 7)
L
•
+ O
2
→ LO
•
2
(Reação 8)
LH + LO
2
•
→ L
•
+ LOOH (Reação 9)
Os dano às proteínas por radicais livres também merecem destaque, pois eles
induzem mudanças físicas da molécula do tipo fragmentação, agregação e
susceptibilidade a digestão proteolítica. As proteínas são seletivamente
fragmentadas nos resíduos de prolina, pelo radical hidroxila, bem como os
aminoácidos histidina e arginina. A agregação pode estar ligada também ao radical
•
OH, em decorrência de sua capacidade de realizar ligações cruzadas entre elas.
Por último o processo de digestão proteolítica é resultado de alterações grosseiras
da conformação da proteína (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999). Reações de RL
com cadeias laterais de lisina, arginina, prolina e resíduos de ácido glutâmico de
proteínas levam a formação de derivados carbonil e o dano oxidativo à elas é
refletido pelo aumento dos níveis de proteína carbonil (MUTHUSWAMY et al,
2006).
Na peroxidação dos carboidratos , a glicose oxidada também pode servir
como fonte de EROs podendo reagir com proteínas, num processo conhecido
como glicosilação (BARREIROS et al, 2006). Estudos realizados por Wolff et al
(1984) demonstraram que monossacarídeos simples, em condições fisiológicas,
rapidamente sofrem auto-oxidação formando complexos dicarbonil e H
2
O
2
.
Outra alteração importante causada pelos radicais livres é dano a molécula
de DNA, tendo-se em média, cerca de 10.000 ataques ao DNA/célula/dia em
humanos (PÔRTO, 2001). Dos cinco componentes do DNA, a timina e citosina são
as bases mais susceptíveis aos danos causados pelo radical
•
OH (FRAGA et al.,
1990; SAUL et al., 1987).
1.3.7 Estresse oxidativo e CCl
4
O tetracloreto de carbono também chamado de tetraclorometano é utilizado
como solvente industrial e que possui um considerável efeito hepatotóxico (SUN et
al., 2001; TIRKEY et al., 2005). Estudos demonstram que administração de CCl
4
significantemente aumenta a liberação de enzimas hepáticas e geração de
15
produtos advindos da LPO, tais como malondialdeído e 4-hidroxinonenol
(SZYMONIK-LESIUK et al., 2003). Sua lipossolubilidade permite que atravesse as
membranas celulares e em parte se distribua por órgão e tecidos rapidamente,
com tropismo por tecidos ricos em gordura. É biotransformado via citocromo P-450
por clivagem da molécula de CCl
4
em uma forma radicular,
•
CCl
3
(radical livre
triclorometil) e esse por sua vez, pode se combinar com oxigênio molecular e
formar radical triclorometilperoxil, Cl
3
COO
•
(Figura 4) (HALLIWELL ;
GUTTERIDGE, 1999).
Figura 4: Fluxograma das vias de toxicidade do CCl
4
. Fonte: Adaptado de Halliwell;
Gutteridge, (1999).
Seu efeito tóxico advém da reação das suas espécies radiculares com lipídios
e proteína, causando peroxidação de lipídeos polienóicos do retículo
endoplasmático levando a geração de radicais secundários e com isso
desencadeando uma série de reações podendo levar a morte celular (KLAASSEN,
1996). Vários estudos demonstraram que o fígado não é o único órgão alvo para
ação do CCl
4
, causando geração de radical livre em outros tecidos como rins,
O
2
•
O
2
CCl
3
Ligação covalente
a macromoléculas
Início da peroxidação
lipídica por abstração
Aldeídos
citotóxico
Depleção
de GSH
•
CCl
3
CCl
4
Dano no mecanismo
de seqüestro de Ca
2+
Solvente: dano nas
membranas
Ligação covalente a
macromoléculas
16
coração, pulmões, testículos, cérebro e sangue. Também é descrito que exposição
a CCl
4
induz a dano renal agudo e crônico (SUN et al., 2000; TIRKEY et al., 2005).
Certas características do cérebro o fazem particularmente vulnerável ao
ataque de espécies radicalares, levando ao quadro de estresse oxidativo. Isso pode
ser devido ao alto consumo de oxigênio pelo cérebro, representado por cerca de
20% do total consumido em repouso por um indivíduo adulto, e também por possuir
membranas celulares ricas em cadeias laterais de ácido graxo poliinsaturado
facilmente oxidáveis. Outro fato que possibilita essa vulnerabilidade é o fato de ser
relativamente deficiente de mecanismo protetores frente a oxidação comparado
com outros órgão como o fígado, e a concentração destes, variar conforme a região
do cérebro e ainda o conteúdo de ferro presente nas diferentes regiões que pode
contribuir para geração de EROs (HALLIWELL ; GUTTERIDGE, 1999; PÔRTO,
2001; MANIKANDAM et al., 2005).
Existem poucas enzimas antioxidantes do tipo catalase na substância
cinzenta e branca e moderadas quantidades de glutationa peroxidase e glutationa
reduzida, contrastando com a enzima Cu-ZnSOD, que possue relativa expressão
nos neurônios (MUTHUSWAMY et al, 2006). Um grande número de enzimas
expressadas no cérebro produz H
2
O
2
e O
2
•-
como produto de sua atividade
metabólica, podendo ocorrer ainda autooxidação de substâncias endógenas o que
pode leva a um aumento nos níveis de H
2
O
2
.
•
NO também é formado nos
neurônios como resultado do fluxo de cálcio e este, se estiver aumentado, poderá
gerar radical ânion superóxido, via xantina oxidase (PÔRTO, 2001; GILGUN-
SHERKI et al., 2002;).
1.4 Flavonóides e Atividade Antioxidante
Os efeitos farmacológicos das plantas medicinais têm sido extensamente
estudados em relação as suas propriedades antioxidantes que incluem inibição da
peroxidação lipídica e proteção de neurônios contra dano oxidativo.
Uma substância fenólica ou polifenólica é aquela que possui um ou mais
núcleos aromáticos contendo substituintes hidroxilados e/ou seus derivados
funcionais, substituindo ao menos um hidrogênio (CARVALHO; GOSMANN;
SCHENKEL, 2003; ZUANAZZI; MONTANHA, 2004). Os compostos fenólicos
podem atuar nas plantas como antioxidantes, antimicrobianos, antifúngicos,
17
fotoreceptores, atraentes visuais e repelentes de predadores. Contudo, há
atualmente grande interesse sobre sua atividade antioxidante, devido a sua
habilidade de seqüestrar e de reduzir a formação de EROs (MIDDLETON;
KANDASWAMI; THEOHARIDES, 2000; PIETTA, 2000; CARVALHO; GOSMANN;
SCHENKEL, 2003).
Entre os polifenóis estudados, destacam-se os flavonóides, existentes
naturalmente em uma variedade de alimentos de origem vegetal como frutas,
sementes, folhas e flores, fazendo parte integrante da dieta humana. Flavonóides é
o nome genérico de um grupo de moléculas formadas pelo metabolismo
secundário dos vegetais, que se originam mediante uma via biossintética mista
(RICE-EVANS; MILLER, 1996).
A estrutura básica de um flavonóide contém um núcleo flavona (2-fenil-
benzo-γ-pirano) constituído de anel benzeno (A) e (B) unidos por anel que contêm
oxigênio (C). Os diferentes substitutos no anel (C) distinguem as diferentes classes
de flavonóides (Figura 5) (TIWARI, 2001).
Figura 5: Núcleo fundamental dos flavonóides. Fonte: Adaptado de Rice-Evans; Miller,
(1996).
Vários são os mecanismos propostos para ação antioxidante dos
flavonóides a considerar as diferentes formas estruturais que existem e que pode
ser determinada por alguns fatores como: reatividade como agente doador de
hidrogênio e elétrons, estabilidade do radical flavonoil formado, reatividade frente a
outros antioxidantes, capacidade de quelar metais de transição e a ainda sua
solubilidade e interação com as membranas (BARREIROS et al., 2006).
Bors et al (1990) sugeriram o seguinte determinante estrutural para a efetiva
atividade seqüestradora de radicais livres pelos flavonóides (Figura 6): Um grupo
catecol no anel B sendo provavelmente o alvo para o radical, juntamente com uma
dupla insaturação entre C2-C3 (1) sendo essa insaturação, conjugada com um
grupamento 4-oxo, responsável pela deslocação de elétrons (2). A adição de 3 e 5
18
grupamento hidroxila (OH) levaria a um efeito máximo da capacidade antioxidante
do flavonóide (3) (TIWARI, 2001).
(1) (2) (3)
Figura 6: Determinantes estruturais da propriedade antioxidante dos flavonóides Fonte:
Adaptado de Tiwari (2001).
Alguns autores sugerem que os flavonóides bloqueiam a lipoperoxidação
através da doação de átomos de hidrogênio aos radicais hidroxil e peroxil,
formando um radical semiquinona ou radical aroxil que pode reagir com um
segundo radical adquirindo uma estrutura quinona estável (Figura 7), terminando
assim a cadeia de propagação de LPO (TIWARI, 2001).
Figura 7: Mecanismo de seqüestro de EROs (R
•
) por flavonóides e formação de estrutura
estável. Fonte: Adaptado de Heim (2002).
Com raríssimas exceções, para proteger os lisossomos e outras membranas
contra o estresse oxidativo foi constatada a necessidade de no mínimo duas
hidroxilas fenólicas no flavonóide. Entre os flavonóides diidroxilados, destacam-se
aqueles que possuem o sistema catecol (3’, 4’-diidroxil) no anel B. Entre os
flavonóides com múltiplas hidroxilas destacam-se a miracetina, quercetina que
19
possuem forte atividade antioxidante quando comparadas com α-tocoferol, ácido
ascórbico, β-caroteno, glutationa (HEIM et al., 2002; BARREIROS et al., 2006).
Entretanto estudos feito por Hanasaki et al. (1994) com diversos flavonóides,
demonstraram que a presença de múltiplos grupos hidroxilas ligados à estrutura
dos flavonóides, possam ter aumentado significantemente a produção do radical
hidroxila (CAO et al., 1997; HEIM et al., 2002).
Em algumas plantas como Baccharis articulata (Lam.) Pers., Cymbopogon
citratus (DC.) Stapf., Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss., Rosmarinus officinalis L.,
Achyrocline satureioides (Lam.) DC., Ilex paraguariensis St. Hil., Ageratum
conyzoides L. já foram comprovadas cientificamente a sua atividade antioxidante
(GUGLIUCCI, 1996; DESMARCHELIER; COUSSIO; CICCIA, 1998; MELO et al.,
2001; GALATI et al., 2001; VANDERJAGT et al., 2002; DE OLIVEIRA et al., 2003).
Além das suas propriedades antioxidantes, alguns flavonóides atuam como
agentes quelantes de metais de transição, principalmente Fe
+2
e Cu
+2
, inibindo a
formação do radical hidroxil, via reação de Fenton. Autores sugerem que a
atividade quelante destes fitoquímicos seja devida a sua ligação ao metal (M) em
dois pontos da molécula: no grupamento orto-difenol do anel B e no anel C (Figura
8) (SUGIHARA et al., 1999; TRUEBA; SÁNCHES, 2001; YUNES; CALIXTO, 2001;
TIWARI, 2001; REPETTO; LLESUY, 2002; BLOKHINA; VIROLAINEN;
FAGERSTEDT, 2003). Outra possibilidade de inibirem a oxidação via reação de
Fenton seria a presença de polihidroxilas , e ainda flavonóides que possuam grupo
catecol na posição 3´-4´ do anel B, 4-oxo no anel C e 5-OH no anel A, prevenindo
desta maneira a formação de radical hidroxila (HEIM et al., 2002).
Figura 8: Sítios de ligação nos flavonóides para metais de transição. Fonte:
Adaptado de Tiwari (2001).
20
Entretanto, flavonóides com potencial de oxidação menor que o do Fe
3+
e
Cu
2+
e seus complexos podem reduzir esses metais, sendo potencialmente
prooxidantes, tendo em vista que esses íons metálicos participam da reação de
Fenton geradora de radicais livres (Rice-Evans et al., 2004). Alguns ainda podem
produzir uma autooxidação resultando na formação de O
2
•-
e H
2
O
2
levando a danos
em certas situações (HANASAKI; O GAWA; FUKUI, 1994; DECKER, 1997).
Compostos fenólicos e alguns flavonóides ainda podem interagir em
sinergismo com antioxidantes endógenos, como o ascorbato e α-tocoferol para
impedir a LPO. Estudos com suplementação de polifenóis demonstraram um
aumento nas concentrações de α-tocoferol, que é sabido ser regenerado sob
influência do ácido ascórbico. Esse fato é sugestível de que esses compostos
podem agir na interface da membrana entre o ascorbato, na porção hidrofílica, e o
α-tocoferol, na porção hidrofóbica, modulando a resposta antioxidante (BALU et al,
2005).
Dessa forma, a propriedade antioxidante das plantas tem atraído a atenção
para a nutrição preventiva por contribuírem para a redução do aparecimento de
patologias. Cientistas estão cada vez mais interessados nessas propriedades,
concentrando sua atenção na capacidade em retardar e/ou prevenir o processo de
oxidação que pode danificar os tecidos e comprometer o sistema biológico.
21
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Estudar a atividade antioxidante dos extratos de folhas de Tabebuia
heptaphylla (Vell.) Tolledo - ipê-roxo, através da indução da peroxidação de lipídios
in vitro por três diferentes geradores de radicais livres pelo método das substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e in vivo através da indução ao dano pela
toxicidade de tetracloreto de carbono (CCl
4
).
2.2 Objetivos específicos
a) Avaliar o potencial antioxidante dos extratos de folhas jovens e adultas de
Tabebuia heptaphylla (Vell.) Tolledo - ipê-roxo através da indução da
peroxidação de lipídios por peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) in vitro , por
TBARS.
b) Utilizar sulfato ferroso (FeSO
4
) na indução da peroxidação de lipídios para
avaliar o potencial antioxidante dos extratos de folhas jovens e adultas de
T. heptaphylla pelo método TBARS, in vitro.
c) Comprovar pelo mesmo método a atividade antioxidante dos extratos
folhas jovens e adultas com o gerador de radicais livres 2,2’ azo-bis (2-
amidinopropano) (AAPH).
d) Avaliar o potencial antioxidante dos extratos de folhas adultas de T.
heptaphylla através da indução da peroxidação lipídica por tetracloreto de
carbono (CCl
4
) em um modelo experimental in vivo, pelo método de
TBARS.
22
e) Determinar alterações histopatológicas do fígado em animais tratados ou
não com extratos das folhas adultas de T. heptaphylla em modelo animal
de hepatite severa.
f) Determinar parâmetros oxidativos nas proteínas, em animais tratados ou
não com extrato das folhas adultas de T. heptaphylla, através do método
de carbonilação protéica.
24
3.1 Estudos preliminares da atividade antioxidante do extrato
hidroetanólico de folhas jovens e adultas de Tabebuia heptaphylla
(Vell.) Toledo (ipê-roxo)
Preliminary studies of the antioxidant activity of adult and young leaves
extract hydroetanolic of Tabebuia heptaphylla (Vell.) Toledo (ipê-roxo)
Patrícia Budni
a,c
, Fabrícia Cardoso Petronilho
a
, Vanilde Citadini-Zanette
c, e
, Chaiana
Marcondes
d
, Alana Neto Zoch
d
, Flávio Henrique Reginatto
d
, Felipe Dal-Pizzol
a, b,
(
*
)
a
Laboratório de Fisiopatologia Experimental, Universidade do Extremo Sul Catarinense, SC,
Brasil.
b
Programa de Pós-graduação de Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul
Catarinense, SC, Brasil
c
Programa de Pós-graduação em Ciências Ambientais , Universidade do Extremo Sul
Catarinense, SC, Brasil
d
Laboratório de Farmacognosia, Universidade de Passo Fundo, 99010-080, Passo Fundo,
RS, Brasil
e
Herbário Pe. Dr. Raulino Reitz, Universidade do Extremo Sul Catarinense, 88806-000,
Criciúma, SC, Brasil.
Autor para correspondência:
*Felipe Dal-Pizzol
Fone: 55 48 3431 2759.
Fax: # 55 48 34312750.
Endereço E-mail : pizzol.ez@terra.com.br
25
RESUMO: A atividade antioxidante in vitro do extrato de folhas jovens e adultas de
T. heptaphylla (Vell.) Toledo (ipê-roxo) foi estimada pela prevenção de formação de
TBARS induzido por três geradores de radicais livres, H
2
O
2
, FeSO
4
e AAPH, em um
substrato rico em lipídeos. A presença de diferentes constituintes do extrato bruto
foi estabelecida por CCD, detectando-se a presença de flavonóides sendo
observado efeito inibidor na lipoperoxidação induzida por H
2
O
2
e FeSO
4
nas
concentrações de 2, 20 e 200 µg/mL e 2, 20mg/ml.
PALAVRAS CHAVES: Antioxidante, Compostos fenólicos, Lipoperoxidação, T.
heptaphylla (Vell). Toledo
SUMMARY: The antioxidant activity in vitro of adult and Young leaves extracts of
the T. heptaphylla (Vell.) Toledo (ipê-roxo) were estimated by the prevention of
formation of TBARS induced by three different free radicals generators, H
2
O
2
,
FeSO
4
and AAPH, in a lipid rich substrate.The presence different constituent of the
crude extract was established by TLC, and showing the presence of flavonoids in
the. Young and old leaves showed an inhibitor effect on lipid peroxidation induced
by H
2
O
2
and FeSO
4
in concentrations of 2, 20 e 200 µg/mL e 2, 20mg/ml.
KEY WORDS: Antioxidant, Lipoperoxidation, Phenolic compounds, T. heptaphylla
(Vell.) Toledo.
26
INTRODUÇÃO
Tabebuia spp. (Bignoniaceae) são espécies nativas de floresta tropical
úmida, gerando diversos produtos a partir de suas cascas os quais são conhecidos
popularmente como “taheebo”, “lapacho”, “pau d´darco” e no Brasil como “ipê roxo”
(1-3). Na medicina tradicional extratos de Tabebuia ssp são empregados para
tratamento de úlcera, sífilis, desordens gastrointestinais, câncer e alergias. (4-5).
Na literatura os principais constituintes químicos relatados nas cascas são as
quinonas (6) e os flavonóides (7). Os compostos fenólicos são protótipos de
substâncias antioxidantes que agem interrompendo a cadeia de autooxidação dos
lipídeos das membranas celulares, a qual pode ser iniciada por radicais livres e
causando dano celular. Os danos celulares causados por estresse oxidativo têm
sido considerados um importante fator no envelhecimento e no desenvolvimento
de uma ampla variedade de patologias , como câncer, diabetes e aterosclerose (8).
Dentre os compostos fenólicos, os flavonóides tem demonstrado exercer efeitos
benéficos frente a esta ampla variedade de doenças (9). Grandes partes de suas
ações têm sido atribuídas a suas propriedades antioxidantes, quer seja pela sua
capacidade redutora em si ou por sua capacidade em influenciar o estado redox
intracelular (10). Contudo, os mecanismos pelos quais os flavonóides exercem
seus efeitos benéficos ou tóxicos, permanecem incertos. Recentes estudos têm
especulado que a atividade antioxidante clássica, por sua capacidade de doação
de hidrogênio, pode não ser a única explicação para seus efeitos celulares (11).
Considerando o amplo emprego de plantas na medicina popular, a presença de
altos teores de compostos fenólicos na sua composição química e o baixo número
de investigações a respeito das propriedades biológicas das folhas de T.
heptaphylla (Vell.) Toledo (ipê-roxo), o presente trabalho teve por objetivo avaliar a
capacidade do extrato hidroetanólico de T.heptaphylla na prevenção de formação
de TBARS induzido por três geradores de radicais livres, H
2
O
2
, FeSO
4
e AAPH, em
um substrato rico em lipídeos.
MATERIAIS E MÉTODOS
Reagentes
Ácido tiobarbitúrico e sulfato ferroso (FeSO
4
) foram adquiridos da Sigma, St.
Louis, MO. 2,2’–azobis (2-metilpropionamidina) dihidrocloreto (AAPH) foi adquirido
27
Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI. Ácido tricloroacético e o peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
) foram adquiridos da Labsynth, São Paulo, Brasil.
Planta
As folhas jovens e adultas de T. heptaphylla (Vell.) Toledo (ipê-roxo) foram
coletadas em Criciúma, Estado de Santa Catarina, Brasil em Dezembro 2004. A
planta foi identificada pela Dr
a
. Vanilde Citadini-Zanette e uma amostra testemunho
(CRI 7373) está depositada no Herbário Pe. Dr. Raulino Reitz (Universidade do
Extremo Sul Catarinense).
Preparação dos extratos
Folhas secas, jovens e adultas de T. heptaphylla (Vell.) Toledo (ipê-roxo)
foram extraídas, separadamente, por refluxo (90°C - 30 min) com EtOH 40ºGL. Os
extratos brutos etanólicos foram filtrados e o solvente eliminado sob pressão
reduzida.
Caracterização fitoquímica
A análise fitoquímica preliminar foi realizada de acordo com os métodos de
WHO (12) e Andrighetti-Fröhner et al (13). A confirmação da presença dos
componentes verificados nos ensaios clássicos foi estabelecida por CCD em placas
de sílica gel (Merck 60 F
254
) usando como fase móvel triclorometano:etanol:ácido
acético (100:40:6 v/v/v) para triterpenóides e acetato de etila: ácido
acético:isopropanol:água (110:1:10:8 v/v/v/v) para compostos fenólicos. Como
agentes reveladores foram empregados anisaldeído sulfúrico/aquecimento e
reagente natural A/UV365nm.
Atividade antioxidante
A atividade antioxidante in vitro T. heptaphylla foi estimada pela inibição de
formação de espécies reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS) induzida por três
diferentes geradores de radicais livres em um substrato rico em lipídeos (gema de
ovo) (14). Inicialmente, 500µL de lipídio a 0,1% (v:v) foram homogeneizados em
28
tampão fosfato (pH 7.4) misturados com 500µl de ácido tricloroacético (10%) e
centrifugados a 1.200 rpm (10min). O extrato hidroetanólico, em diferentes
concentrações (2, 20, 200 µg/mL e 2, 20 mg/mL), foi adicionado em um tubo teste
juntamente com soluções de 2,2'-azobis (2-amidino-propano) dicloreto (AAPH -
0.5M), FeSO
4
(0.145mM) ou H
2
O
2
(0.4M) para induzir lipoperoxidação. Os tubos
foram incubados a temperatura ambiente por 15 minutos sendo a seguir adicionado
a estes, 500 µL de ácido tiobarbitúrico (TBA - 0.67%) e colocado sob aquecimento
(100ºC) por 30 minutos. Após arrefecimento foi medido, espectrofotometricamente,
(Micronal®), numa absorvância de 532nm. Os resultados foram expressos como o
equivalente de malondialdeído formado em nmol (MDA)/mL de substrato. Os
grupos controles foram realizados simultaneamente aos grupos testes.
Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± DP e valores de p foram
considerados significantes quando p<0.05. Diferenças entre os grupos foram
determinadas por ANOVA. Comparação entre as médias foi realizada usando teste
o Newman-Keulls .
RESULTADOS
Análise fitoquímica preliminar
A análise fitoquímica indicou a presença de antraquinonas livres nas folhas
jovens e a ausência destas substâncias nas folhas adultas. A presença de
compostos polifenólicos (especialmente flavonóides) foi confirmada através das
análises por CCD. Foi possível verificar que o perfil químico de compostos fenólicos
é diferenciado para folhas jovens e adultas.
Mudanças nos níveis de TBARS por T. heptaphylla
A diminuição da oxidação lipídica por radicais livres induzidos pelos três
geradores citados foi avaliada pelos níveis de redução na formação de TBARS. As
diferentes concentrações de extratos de folhas jovens aplicados reduziram os níveis
de formação de TBARS, quando aplicados H
2
O
2
e FeSO
4,
em todas as
29
concentrações em comparação com o indutor (Figuras 1 e 2). Contudo na indução
de lipoperoxidação por AAPH, este extrato revelou proteção apenas na
concentração 200µg/mL de extrato. Além disso, quando submetido a radicais
gerados por AAPH (figura 3), o extrato demonstrou atividade pró-oxidante na
concentração de 2µg/mL.
O extrato de folhas adultas apresentou perfil semelhante ao das folhas
jovens na redução da lipoperoxidação quando aplicados os indutores H
2
O
2
e FeSO
4
sendo efetivo em todas as concentrações aplicadas (figuras 4 e 5). Diferentemente
do observado nos extratos das folhas jovens, os extratos de folha adulta reduziram
significantemente a lipoperoxidação induzida por AAPH em três concentrações
aplicadas (2, 20 e 200µg/mL), não demonstrando atividade pró-oxidante em
nenhuma concentração quando comparados com o indutor (figura 6). Quando
comparada a capacidade de redução de formação de TBARS entre folhas jovens e
adultas frente aos indutores H
2
O
2
e AAPH, não observamos diferenças
estatisticamente significativas nas diferentes concentrações usadas (dados não
mostrados). Contudo, quando o indutor utilizado foi FeSO
4
, observamos uma
proteção mais efetiva nas folhas adultas quando comparadas com as folhas jovens,
naS concentrações aplicadas de 2, 200µg/mL e 2, 20mg/mL (figura 7).
DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
Segundo a literatura, diversos compostos fenólicos demonstraram a
possibilidade de inibição de oxidação de lipoproteínas de baixa densidade (LDL),
assim como também apresentaram capacidade de capturarem radicais como
hidroxila, peroxila, superóxido, óxido nítrico e DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil) (15-
16). Os efeitos protetores dos flavonóides em sistemas biológicos são descritos
pela sua capacidade de transferir elétrons dos radicais livres, quelar metais, ativar
enzimas antioxidantes e inibir oxidases (17). Os flavonóides também demonstraram
inibir enzimas como xantina oxidase e proteína C, in vitro, sendo estas
responsáveis pela geração de ERO (18). Quando sais de ferro são adicionados a
meio de cultura celular, podem reagir com oxigênio e formar radical ânion
superóxido que ainda poderá sofrer dismutação a peróxido de hidrogênio, podendo
iniciar a peroxidação lipídica, o mesmo ocorrendo com a adição de H
2
O
2
levando
indiretamente a oxidação de lipídeos, proteínas pela ação de seus subprodutos,
como o radical hidroxila (19). No presente trabalho esses efeitos, foram
30
observados através dos níveis de formação de TBARS visto que estes foram
aumentados quando comparados ao controle. A indução de lipoperoxidação por
azo-indicador, como o AAPH, apresenta como característica a geração de um
carbono central radicalar que reage prontamente com oxigênio para formar um
radical peroxil (20), efeito esse também encontrado em nosso experimento quando
comparados com o controle. Dados obtidos em modelos in vitro, de diversos
flavonóides, estruturalmente diferentes, consistentemente demonstram a eficácia
antioxidante em relação a muitas circunstâncias de estresse oxidativo. A avaliação
da atividade antioxidante dos extratos de folhas jovens e adultas, indicou redução
na formação de TBARS em todas as concentrações testadas quando os indutores
utilizados foram FeSO
4
e H
2
O
2
. Esses resultados vêm em concordância ao previsto
na literatura em outros trabalhos que relatam a forte atividade antioxidante de
flavonóides contra lipoperoxidação induzida por ferro (21). Contudo na indução de
lipoperoxidação com AAPH o extrato obtido a partir das folhas jovens apresentou
pequena redução de formação de TBARS na concentração de 200µg/mL indicando
ação pró-oxidante na menor concentração aplicada. Isso pode ser relacionado a
capacidade dos flavonóides em seqüestrar espécies radicalares, ou seja,
flavonóides por possuírem potencial menor que os íons Fe
3+
e Cu
2+
, podem reduzir
esses metais presentes no meio, sendo potencialmente pró-oxidante, tendo em
vista que esses metais participam da reação de Fenton, geradora de outras
espécies radicalares (22). Outra forma de explicar seria a relação direta dos
flavonóides e sua quantidade de grupos hidroxilas ligadas. Em um estudo feito por
Hanasaki et al (1994), uma série de mono e dihidroxifenóis não demonstraram
atividade pró-oxidante, embora a presença de múltiplos grupos hidroxilas ligados à
estrutura dos flavonóides, tenham aumentado significantemente a produção do
radical hidroxila (23-24). Contudo, nas folhas adultas também houve redução na
formação de TBARS, nas concentrações de 2µg/mL, 20µg/mL e 200µg/mL . Por
existir uma sensibilidade diferenciada de alguns vegetais a depender da idade e
também do teor e tipo de flavonóides presentes nas folhas, acreditamos que esta
possa ser uma das razões pelos quais as folhas adultas se mostraram mais efetivas
que as jovens. Além disso, estudos que correlacionam a estrutura química dos
flavonóides e sua atividade, têm demonstrado diferenças no seu potencial
antioxidante, pois esta propriedade in vitro depende do rearranjamento de grupos
funcionais em torno da estrutura nuclear (25).
31
Contudo, considerando as análises fitoquímicas realizadas, os produtos
radicalares gerados pelo AAPH, FeSO
4
e H
2
O
2
, ou seja, radicais peroxil, alcoxil e
hidroxil, e os resultados obtidos no presente trabalho, é possível supor que as
folhas adultas possuem composição flavonoídica diferente das folhas jovens e que
esta diferença influencia o desempenho antioxidante frente esses radicais.
AGRADECIMENTOS
Este trabalho recebeu apoio da Universidade do Extremo Sul Catarinense,
FAPESC, FAPERGS (PROADE-2). F. Dal-Pizzol agradece também ao CNPq.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Med. 20:331-42
33
LEGENDAS DAS FIGURAS
Figura 1: Efeito do extrato de folhas jovens de T. heptaphylla na formação de
TBARS induzido por H
2
O
2
. (Valores expressos como MDA (nmol/mg) comparados
com controle).
* Estatística significante p<0,005 comparada com controle.
**Estatística significante p<0,005 comparada com indutor H
2
O
2
Figura 2: Efeito do extrato de folhas jovens de T. heptaphylla na formação de
TBARS induzido por FeSO
4.
(Valores expressos como MDA (nmol/mg) comparados
com controle).
* Estatística significante p<0,005 comparada com controle.
** Estatística significante p<0,005 comparada com FeSO
4
Figura 3: Efeito do extrato de folhas jovens de T. heptaphylla na formação de
TBARS induzido por AAPH. (Valores expressos como MDA (nmol/mg) comparados
com controle).
* Estatística significante p<0,005 comparada com controle.
** Estatística significante p<0,005 comparada com AAPH
Figura 4: Efeito do extrato de folhas adultas de T. heptaphylla na formação de
TBARS induzido por H
2
O
2
. (Valores expressos como MDA (nmol/mg) comparados
com controle).
* Estatística significante p<0,005 comparada com controle.
** Estatística significante p<0,005 comparada com indutor H
2
O
2
Figura 5: Efeito do extrato de folhas adultas de T. heptaphylla na formação de
TBARS induzido por FeSO
4.
(Valores expressos como MDA (nmol/mg) comparados
com controle).
* Estatística significante p<0,005 comparada com controle.
34
** Estatística significante p<0,005 comparada com indutor FeSO
4
Figura 6: Efeito do extrato de folhas adultas de T. heptaphylla na formação de
TBARS induzido por AAPH. (Valores expressos como MDA (nmol/mg) comparados
com controle).
* Estatística significante p<0,005 comparada com controle.
** Estatística significante p<0,005 comparada com indutor AAPH
Figure 7: Efeito de extrato de folhas jovens e adultas de T. heptaphylla na
formação de TBARS induzido por FeSO
4
. (Valores expressos como TBARS
(nmol/mg) comparado controle).
* Estatística significante p<0,005 comparada controle.
Diferentes letras indicam diferença significante entre folhas jovens e adultas.
35
FIGURAS
Figura 1
H
2
O
2
Folhas Jovens
0,00E+00
4,00E-02
8,00E-02
1,20E-01
1,60E-01
2,00E-01
co
ntr
o
l
H2O2(0,4M)
2
µ
g/m
l+
H2
O
2
2
0µ
g/m
l
+H
2O
2
20
0µ
g/m
l+
H2
O
2
2m
g
/ml+
H
2O
2
2
0
mg
/m
l+H
2
O2
MDA equivalente (nmol/mg proteina)
Figura 2
F eS O
4
F o lh a s J o v en s
0,00E + 00
2,00E -02
4,00E -02
6,00E -02
8,00E -02
1,00E -01
1,20E -01
1,40E -01
1,60E -01
c
o
ntrol
F
eS
O
4(0,14
5mM)
2µg/ml+FeSO4
20
µ
g/ml+FeSO
4
20
0µ
g
/
ml
+
F
eSO4
2mg/ml+FeSO4
20
mg
/
ml
+
F
eS
O4
MDA equivalente (nmol/mg proteína)
*
*/**
*/**
*/** */** */**
*
*/**
*/**
*/**
*/**
*/**
36
Figura 3
AAPH Folhas Jovens
0,00E+00
5,00E-02
1,00E-01
1,50E-01
2,00E-01
2,50E-01
control
AAPH(0,5M
)
2µg/ml+AAPH
20
µ
g/ml
+
AAP
H
2
0
0µ
g
/m
l
+
AAP
H
2
m
g/m
l
+AAPH
2
0
m
g
/ml+
A
APH
MDA equivalentes (nmol/mg proteína)
Figura 4
H
2
O
2
Folhas Adultas
0,00E+00
4,00E-02
8,00E-02
1,20E-01
1,60E-01
2,00E-01
2,40E-01
con
t
rol
H
2O2(0,4M
)
2µg/m
l+H
2O2
20µg/ml+H2O2
20
0µg/ml+H2O2
2m
g/ml
+
H2O2
20
mg/m
l
+
H
2O2
MDA equivalentes (nmol/mg proteína)
*
*/**
*
**
*
*
*
*/**
*/***/**
*/** */**
37
Figura 5
FeSO
4
Folhas Adultas
0,00E+00
2,00E-02
4,00E-02
6,00E-02
8,00E-02
1,00E-01
1,20E-01
1,40E-01
c
o
ntrol
F
eSO4(
0
,145mM)
2µg/ml+FeSO4
20µg/ml+FeSO4
200µg/ml+FeSO
4
2
mg
/m
l+
F
eSO4
2
0
mg
/
ml+
F
eSO4
MDA equivalentes (nmol/mg proteína)
Figura 6
AAPH Folhas Adultas
0,00E+00
4,00E-02
8,00E-02
1,20E-01
1,60E-01
2,00E-01
control
A
A
PH(0,5
M
)
2µg/ml+AAP
H
20µg/
m
l+AAPH
200µg
/m
l+AAPH
2m
g/m
l
+
A
AP
H
20mg/ml+A
A
P
H
MDA equivalentes (nmol/mg proteína)
*
*/ ** */** */**
*/** */**
*
**
**
**
*
*
40
4.1 Protective effects of Tabebuia heptaphylla (Vell.) Toledo (ipê-
roxo) leaves extract on carbon tetrachloride induced oxidative damage
in rats
Patrícia Budni
a
, Larissa Constantino
a
, Roberta Machado
a
, Leonardo
Figueiredo Dore
a
, Filipe Giordani Schimidtz
a
, Flávio Henrique Reginatto
b
, Emílio L.
Streck
a
, José Cláudio F. Moreira
c
, Vanilde Citadini-Zanette
d
, Felipe Dal-Pizzol
a*
a
Laboratório de Fisiopatologia Experimental, Universidade do Extremo Sul
Catarinense, SC, Brazil.
b
Laboratório de Farmacognosia, Universidade de Passo Fundo, Passo
Fundo, RS, Brazil
c
Centro de Estudos em Estresse Oxidativo, Departamento de Bioquímica,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, RS, Brazil
d
Herbário Pe Dr. Raulino Reitz, Universidade do Extremo Sul Catarinense,
Criciúma, SC, Brazil.
*
Correspondence author: Felipe Dal-Pizzol, M.D., Ph.D, Laboratório de Fisiopatologia
Experimental, Universidade do Extremo Sul Catarinense, 88806-000, Criciúma, SC, Brasil. Phone: 55
48 3431 2759. Fax: # 55 48 34312750.
E-mail adress: pizzol.ez@terra.com.br
41
Abstract. Preparations made with Tabebuia heptaphylla were used as
antineoplasic, antifungal, antiviral, antimicrobial and antiparasitical. The purpose of
this study was to determine the antioxidant potential of Tabebuia heptaphylla leaf
extracts against carbon tetrachloride (CCl
4
)-induced injury. We demonstrated an
antioxidant effect of Tabebuia heptaphylla when administered after CCl
4
in the
central nervous systems and liver. When animals were pre-treated with Tabebuia
heptaphylla we demonstrated both antioxidant and pro-oxidant effects. In this
protocol Tabebuia heptaphylla increased CCl
4
-induced liver injury. Our results may
contribute to the evaluation of plant extract effects and suggested that the same
extract could act as an antioxidant or pro-oxidant depending on the administration
time.
Keywords: Tabebuia heptaphylla, Antioxidant, Pro-oxidant, Carbon tetrachloride.
42
INTRODUCTION
It has been propoused that oxidative damage to cellular and extracellular
macromolecules, such proteins, lipids, and nucleic acids (Halliwell and Gutteridge,
1999; Aniya et al., 2005) results from the tipping of balance toward prooxidant
status. In addition, the production of reactive oxygen species (ROS) has been
implicated in the pathogenesis of age-related diseases (Ames et al., 1993) such as
cancer, and coronary heart disease and neurodegenerative disorders such as
Alzheimer’s disease (Smith et al., 1996). The consumption of plant-derived
phytochemicals may contribute to shift the balance toward an adequate antioxidant
status (Lee et al., 2005). Preparations made with the south-american tree Tabebuia
heptaphylla (Vell.) Toledo (ipê-roxo), known in the popular medicine as Ipê-roxo,
Pau D’Arco, Lapacho (Awale et al., 2005; de Miranda et al., 2001), were used as
antineoplasic, antifungal, antiviral, antimicrobial, antiparasitical and anti-
inflammatory (de Miranda et al., 2001; Riffel et al., 2002). The antioxidant activity of
Tabebuia species has not been described, and unpublished results from our
laboratory detected the presence of flavonoids in the leaves of the Tabebuia
heptaphylla (Vell.) Toledo (ipê-roxo).
Carbon tetraclhoride (CCl
4
) is one of the most widely used toxins for
experimental induction of liver injury induced by oxidants in animals. The toxicity of
CCl
4
results from its reduction by citocrome P-450 to give the
•
CCl
3
radical. The
radical can either covalenty bind to membrane proteins or initiate lipid peroxidation
by abstracting a hydrogen atom from unsaturated fatty acids (Srivastava et al.,
1989). Thus, we here investigate the antioxidant effect of the Tabebuia heptaphylla
(Vell.) Toledo (ipê-roxo) in vivo using the CCl
4
model in Wistar rats.
MATERIALS AND METHODS
Animals
Adult male Wistar rats (age, 2-3 months; weight, 250-320 g) were used in all
experiments. Animals were kept five to a cage on a 12h light/dark cycle with food
and water available ad libitum, a temperature 22°C. All experiments procedures
were performed in accordance with the NIH Guide for the Care and Use of
laboratory Animals and were approved by the local ethics committee.
43
Treatment protocols
In all experiments animals were injected intraperitoneally with carbon
tetrachloride (diluted in mineral oil 1:1 - 5 ml/Kg) in two different protocols:
1) In the post-injury protocol animals were injected with CCl
4
and treated
intra-gastrically with saline (as a control to Tabebuia extracts), mineral oil (as a
control to vitamin E), vitamin E (800 mg/Kg dissolved in mineral oil) or ethanolic
extract (96°GL) from Tabebuia heptaphylla (Vell.) Toledo (ipê-roxo) leaves (1 and
10mg/Kg) two times a day for two consecutive days. 24 h after the last dose animals
were sacrificed and the liver and central nervous system (CNS) were isolated for
posterior analyses (n=8 each group).
2) In the pre-injury protocol animals were intra-gastrically treated once a day
during 7 consecutive days with saline, mineral oil, vitamin E (800mg/Kg) or ethanolic
extract (96°GL) from Tabebuia heptaphylla (Vell.) Toledo (ipê-roxo) (1 and
10mg/Kg). In the seventh day CCl
4
was injected and 24h after CCl
4
administration
animals were sacrificed and the liver and CNS were isolated for posterior analyses
(n=8 each group).
Oxidative stress parameters
We used the formation of thiobarbituric acid reactive species during an acid-
heating reaction as an index of oxidative stress as previously described (Esterbauer
and Cheeseman, 1990). Briefly, samples were mixed with 1 mL of trichloroacetic
acid 10% and 1 mL thiobarbituric acid 0,67% and then heated in a boiling water bath
for 30 minutes. TBARS were determined by the absorvance at 532 nm. In addition,
protein carbonyls were determinate as previously described (Levine et al., 1990).
Briefly, samples homogenates were centrifuged at 7,000 x g for 15 min and the
supernatant was mixed with 10mM 2,4 dinitrophenylhydrazine (DNPH) in 2N HCl.
The mixture was incubated at room temperature for 1h, followed by the addition of
100 µl 20% trichloroacetic acid and centrifugation 3,000 x g for 3 min. The
absorbance was read 370 nm to quantify protein carbonyls and data are expressed
as nmol/mg protein.
Protein determination
44
All results were normalized to protein concentration measured by the Lowry
method (Lowry and Rosebrough, 1951).
Histopatologyc analyses
For liver histopathologic analyses after fixation excised tissues were
embedded in parafin and then routinely stained with hematoxylin and eosin. An
experienced pathologist performed blinded histopathologic analyses.
Statistical analyses
All data were expressed as mean ± S.D. The statistical significance was
evaluated by one-way analysis of variance (ANOVA) and post-hoc analyses were
carried out by the LSD test using SPSS version 12.0 (SPSS, Cary, NC, U.S.A).
Differences were considered significant when p <0.05.
RESULTS
Oxidative variables
As expected, in both protocols CCl
4
administration induced liver damage and
oxidative stress in comparison to sham animals (data not shown). In addition, saline
(as a control to Tabebuia heptaphylla extracts) and mineral oil (as a control to
vitamin E) treatment did not protects against CCl
4
-induced injury (data not shown),
thus in the results we presented a polled data obtained from both saline and mineral
oil groups (saline group) to avoid excessive data in the presented figures.
In order to evaluate the effects of Tabebuia heptaphylla leaft extract in the
post-injury protocol, TBARS and protein carbonyls levels were determined in the
liver and CNS. Significant protection was observed with the administration Tabebuia
heptaphylla leaf extract in several CNS regions and liver (Figures 1 and 2). In the
cerebellum, cortex and striatum (Figure 1A, 1B and 1C) all used concentrations (1
and 10mg/kg) decreased TBARS levels, an effect similar to vitamin E treatment. In
the hippocampus (Figure 1D) and cortex pre-frontal (Figure 1E) we only observed
protection with the higher used dose. No significant effects on CCl
4
-induced protein
carbonyl formation were observed in CNS structures with the use of Tabebuia
45
heptaphylla leaf extract in the post-injury protocol (data not shown). In contrast, we
observed a diminution in both TBARS (Figure 2) and protein carbonyls (Figure 3)
levels in the liver of rats submitted to the post injury protocol in all used doses. This
diminution on oxidative markers in the liver was accompanied by a diminution in the
necrosis extend determined by histopathologic analyses (data not shown).
In the pre-injury protocol the results were different when compared to the
post-injury protocol. In the CNS the Tabebuia heptaphylla leaft extract could act as
an antioxidant (Figure 4A-B), pro-oxidant (Figure 4C) or had no effect (in the
hippocampus and cortex, data not shown) when determining TBARS levels. No
significant effects were observed in the CNS when determining protein carbonyls
levels in the pre-injury protocol (data not shown). In addition, the administration of
Tabebuia heptaphylla leaf extract before CCl
4
administration increased dose-
dependent TBARS levels, but not protein carbonyls levels (data not shown), in the
liver (Figure 5). The degree of necrosis was higher in the Tabebuia heptaphylla
treated animals when compared to CCl
4
group (data not shown).
DISCUSSION
Pharmacological effects of medicinal plants can be related to its free-radical
scavenging properties (Manikandan et al., 2005). These protective properties have
been attributed to flavonoids and several other products from plant intermediary
metabolism. These coompounds can act as antioxidant by direct free radical
scavenging, metal chelating properties and inhibition of enzymes like NADPH-
oxidase and phospholipase C (Devi et al., 2006; Dajas et al., 2003; Tiwari, A. K,
2001).
This experiment was carried out to evaluate the antioxidant effects of
Tabebuia heptaphylla (Vell.) Toledo (ipê-roxo) leaft extract against oxidative
damage induced by CCl
4
in the liver and brain. CCl
4
is biotransformed by the liver
microssomal cytochrome P450 enzyme system to radicals such as trichloromethyl
radical (
•
CCL
3
) and trichlorometrhyl peroxyl radical (
•
OOCCL
3
) (Aniya et al., 2005;
Tirkey et al., 2005). Its toxic effect is related to free radical-mediated lipid
peroxidation that cause damage mainly to the liver (Chen et al., 2005). In addition,
CCl
4
could also induce oxidative damage in the brain (Dal Pizzol et al., 2004). Our
results suggested that the treatment with Tabebuia heptaphylla leaft extract were
protective when used after the initial injury, both in the liver and brain. The protective
46
effects of the extracts could be related to its antioxidant activity direct by scavenging
the
•
CCl
3
radical or by the interruption in the lipid peroxidation progression. The
protective effect on brain oxidative stress is an interesting finding. Several studies
demonstrated a protective effect of plant extracts in different models of brain
oxidative stress (Defeudis et al., 2003; Banskota et al., 2000; Ostrowaska et al.,
2004, El-Beshbishy, 2005), but none of this in the CCl
4
model.
In contrast, in the pre-injury protocol the administration of leaf extracts could
act as a pro-oxidant in the liver and some brain regions. Free radical scavenging by
flavonoids could generate semiquinone free-radical or aroxyl radical with can
interact with oxygen, generating O
2
•-
wich may be responsible to the prooxidant
effects of flavonoids (Tiwari, A. S, 2001). Flavonoids, which possess pyrogallol
and/or catechol moieties in their structure, generate H
2
O
2
via O
2
•-
production (Miura
et al., 1998; Sakihama et al., 2002). We had previously demonstrated that extracts
obtained from Achyrocline satureioides could act as a pro-oxidant in cell cultures
(Polydoro et al., 2004). Quercetin caused mitochondrial respiration bursts and cells
underwent autoxidation resulting in hydrogen peroxide, superoxide and hydroxyl
radical formation (Hodnik 1986). In addition, Choi et al (2003) demonstrated that
chronic administration of quercetin in rats decrease gluathione concentration and
glutathione reductase activity, suggesting a prooxidant effect of quercetin. It was
demonstrated that the flavonoid epigallocatechin gallate, the phenolic propyl gallate
and Kava extracts could be hepatotoxic (Giuseppe et al., 2004, Mathews et al.,
2002).
Despite the increasing interest in flavonoid properties on human health, ‘‘in
vivo’’ data on the disposition, absorption, bioavailability and metabolism of
flavonoids after intravenous and oral administration in humans are sparse and
contradictory. Our results may contribute to the evaluation of plant extract effects
and suggested that the same extract could act as an antioxidant or pro-oxidant
depending on the inductor administration time. Thus, caution is necessary when
designing trials to determine the efficacy of plant extracts in the treatment or
prophylaxis of free radical-mediated diseases.
47
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53
Legends to Figures
Fig. 1. Effects of post injury administration of Tabebuia heptaphylla leaves
extract on CCl
4
-induced lipid peroxidation in different rat brain regions.
Animals were injected with CCl
4
, treated intra-gastrically with saline; Tabebuia
heptaphylla leaves extract (1 and 10 mg/Kg) or vitamin E (800mg/Kg) and sacrificed
as described under Material and Methods. (A) Cerebellum; (B) cortex; (C) striatum;
(D) Hippocampus; (E) cortex pre-frontal were isolated to the determination of
TBARS. Values were expressed as mean ± S.E.M. * statistically different from
control p<0.05. ** statistically different from ipê1 p<0.05. ipê1 = Tabebuia
heptaphylla leaves extract at 1mg/kg, ipê10 = Tabebuia heptaphylla leaves extract
at 10mg/kg, vitE = vitamin E at 800mg/kg.
Fig. 2. Effects of post injury administration of Tabebuia heptaphylla leaves
extract on CCl
4
-induced lipid peroxidation in the liver. Animals were injected
with CCl
4
, treated intra-gastrically with saline; Tabebuia heptaphylla leaves extract
(1 and 10 mg/Kg) or vitamin E (800mg/Kg) and sacrificed as described under
Material and Methods. The liver was isolated to the determination of TBARS. Values
were expressed as mean ± S.E.M. * statistically different from control p<0.05. ipê1 =
Tabebuia heptaphylla leaves extract at 1mg/kg, ipê10 = Tabebuia heptaphylla
leaves extract at 10mg/kg, vitE = vitamin E at 800mg/kg.
Fig. 3 Effects of post injury administration of Tabebuia heptaphylla leaves
extract on CCl
4
-induced protein carbonylation in the liver. Animals were injected
with CCl
4
, treated intra-gastrically with saline; Tabebuia heptaphylla leaves extract
(1 and 10 mg/Kg) or vitamin E (800mg/Kg) and sacrificed as described under
Material and Methods. The liver was isolated to the determination of protein
carbonyls. Values were expressed as mean ± S.E.M. * statistically different from
control p<0.05. ipê1 = Tabebuia heptaphylla leaves extract at 1mg/kg, ipê10 =
Tabebuia heptaphylla leaves extract at 10mg/kg, vitE = vitamin E at 800mg/kg.
Fig.4. Effects of pre-injury administration of Tabebuia heptaphylla leaves
extract on CCl
4
-induced lipid peroxidation in different rat brain regions.
Animals were treated intra-gastrically with saline; Tabebuia heptaphylla leaves
54
extract (1 and 10 mg/Kg) or vitamin E (800mg/Kg) for seven days, than injected with
CCl
4
, and sacrificed as described under Material and Methods. (A) Cerebellum; (B)
pre-frontal cortex; (C) striatum were isolated to the determination of TBARS. Values
were expressed as mean ± S.E.M. * statistically different from control p<0.05. ipê1 =
Tabebuia heptaphylla leaves extract at 1mg/kg, ipê10 = Tabebuia heptaphylla
leaves extract at 10mg/kg, vitE = vitamin E at 800mg/kg.
Fig. 5. Effects of pre-injury administration of Tabebuia heptaphylla leaves
extract on CCl
4
-induced lipid peroxidation in the liver. Animals were treated
intra-gastrically with saline; Tabebuia heptaphylla leaves extract (1 and 10 mg/Kg)
or vitamin E (800mg/Kg) for seven days, than injected with CCl
4
, and sacrificed as
described under Material and Methods. The liver was isolated to the determination
of TBARS. Values were expressed as mean ± S.E.M. * statistically different from
control p<0.05. ** statistically different from ipê1 p<0.05. ipê1 = Tabebuia
heptaphylla leaves extract at 1mg/kg, ipê10 = Tabebuia heptaphylla leaves extract
at 10mg/kg, vitE = vitamin E at 800mg/kg.
61
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
5.1 Atividade antioxidante in vitro
A capacidade “scavengers” de radicais livres dos flavonóides é demonstrada
em trabalhos sendo essa propriedade explorada com sucesso em diversos modelos
experimentais in vitro e in vivo (KOSTYUK et al., 2001).
Após análise dos dados obtidos com os extratos brutos etanólicos das folhas
de T.heptaphylla -ipê-roxo, tanto as folhas jovens como adultas, apresentaram
atividade antioxidante estatisticamente significativas em relação à indução de dano
provocado em pelo menos algumas das concentrações testadas em um modelo
experimental in vitro.
É conhecido que exposição a xenobióticos, radiações ionizantes e poluentes
ambientais pró-oxidantes, induzem a formação de radicais livres que podem iniciar
a oxidação de lipídeos e outras tantas estruturas celulares (TIRKEY et al., 2005).
O resultado da produção excessiva de espécies oxidantes e/ou depleção
das defesas antioxidantes celulares, leva a um desequilíbrio no status redox da
célula conhecido como estresse oxidativo, sendo esta condição associada a
desordens degenerativas como doença cardiovascular, câncer, comprometimento
do sistema imune de defesa e envelhecimento (FAROMBI et al., 2004; GONZALES
et al., 2005).
As propriedades medicinais de algumas plantas têm sido documentadas a
várias décadas, e preparações com seus extratos tem demonstrado efetividade no
tratamento de várias doenças, especialmente funcionando como antioxidante (PIAO
et al., 2006) . As plantas podem contribuir grandemente nesse aspecto antioxidante,
e conservador para as células, oferecido pelos seus constituintes e que atualmente
vem sido o desejo de descoberta de muitos pesquisadores. Dentre as substâncias
isoladas nas plantas com substancial atividade antioxidante temos o α-tocoferol
(vitamina E), caretonóides, ácido ascórbico (vitamina C), flavonóides e taninos
(RAJASEKARAN et al., 2005).
Os polifenóis, incluindo os flavonóides, tem sido reportados como fortes
“scavengers” de radicais livres, demonstrando exercer efeitos benéficos em uma
variedade de doenças (RICE-EVANS, 2004). Grande parte de suas ações tem sido
atribuída a suas propriedades antioxidantes, quer seja pela sua capacidade
redutora em si ou por sua capacidade em influenciar o estado redox intracelular
62
(RICE-EVANS, 2001). Os mecanismos precisos, pelos quais os flavonóides
exercem seus efeitos benéficos ou tóxicos, permanecem incertos. Estudos recentes
têm especulado que a atividade antioxidante clássica, que seria por sua capacidade
de doação de hidrogênio, pode não ser a única explicação para seus efeitos
celulares (WILLIAMS et al., 2004) podendo atribuir a estes ainda, a capacidade de
quelar metais, ativar enzimas antioxidantes e inibir oxidases geradoras de ERO
(FREI; HIGDON, 2003).
Com base na análise fitoquímica preliminar realizada com T. heptaphylla,
onde a presença de flavonóides se deu tanto nas folhas jovens como nas adultas,
partiu-se para o screening biológico, onde se observou o efeito “scavengers” de
radicais livres e potencial antioxidante do extrato, em um modelo in vitro, onde a
função dos polifenóis, seria a inibição do processo de lipoperoxidação induzido por
3 geradores de radicais livres conhecidos, o AAPH, FeSO
4
e H
2
O
2
, em um substrato
rico em lipídeo, neste caso, gema de ovo, que possui significativo conteúdo de
ácido graxo poliinsaturado tornando-o susceptível a lipoperoxidação (ISHIKAWA et
al., 2004).
Escolheu-se como método para medir o dano oxidativo de lipídios, o método
de TBARS, que é baseado na reação do ácido tiobarbitúrico com os produtos da
decomposição de hidroperóxidos advindos do processo de lipoperoxidação, sendo
um dos principais produtos formados, o malondialdeído (MDA). Uma molécula de
MDA reage com duas moléculas de TBA para formar um complexo de cor rosada,
em meio ácido e em alta temperatura (SILVA; BORGES; FERREIRA, 1999).
Quando sais de ferro são adicionados ao meio de cultura celular, podem
reagir com oxigênio e formar radical ânion superóxido que ainda poderá sofrer
dismutação a peróxido de hidrogênio, podendo iniciar a peroxidação lipídica. Íons
de ferro são tóxicos porque facilitam a geração de espécies altamente reativas,
como oxiradical. O mesmo ocorre com a adição de H
2
O
2
levando indiretamente a
oxidação de lipídeos, pela ação de seus subprodutos, como o radical hidroxila
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999; ZHAO et al., 2006).
O AAPH, um componente azo, gera radicais livres que reagem com o
oxigênio molecular e rapidamente geram radical peroxil que em seguida ataca
outros radicais lipídicos. Essa reação ocorre repetidamente resultando no ataque de
várias moléculas biológicas e induz dano celular (PIAO et al., 2006). Nesse estudo,
63
observaram-se estes efeitos através dos níveis de TBARS que estiveram
aumentados em relação ao controle.
Quando os extratos das folhas jovens foram testados, observamos uma
redução da peroxidação lipídica induzida por H
2
O
2
e FeSO
4
para todas as
concentrações testadas (**p<0,05) corroborando com dados relatados na literatura
que demonstram uma forte atividade antioxidante de flavonóides contra
lipoperoxidação induzida por ferro e hidroperóxidos (REBELLO, 2005). Observou-
se ainda maior efeito na concentração de 200µg/ml quando induzido pelo H
2
O
2
e
20µg/ml quando induzido por FeSO
4
.
É sabido que a configuração e o número de grupos hidroxilas nos
antioxidantes polifenólicos substancialmente influenciam nos mecanismos de
atividade antioxidante. A posição destas hidroxilações influenciará na habilidade de
deslocar um elétron desemparelhado para estabilizar o radical formado após reação
com o radical iniciador (HSU, 2005).
Em um estudo realizado por Heim e colaboradores (2002) sobre a relação-
estrutura-atividade de flavonóides em relação sua capacidade quelante de metal,
acredita-se que flavonóides polihidroxilados possuam uma maior capacidade de
inibir a oxidação mediada por metal comparada a indução por não-metal, podendo
ser essa uma forma de justificar a menor concentração protetora requerida para
indução pelo FeSO
4
comparada a dose efetiva contra H
2
O
2
(HEIM et al., 2002).
Estudos com os flavonóides como quercetina e rutina demonstraram eficiente ação
quelantes de metal de transição.
Outro estudo realizado in vitro com Garcinia, um bioflavonóide, os autores
demonstraram que este atenuou os danos gerados à molécula de DNA induzida por
H
2
O
2
numa dose dependente, corroborando com outro estudo onde a quercetina e
kaempferol demonstraram reduzir os efeitos deletérios in vitro do H
2
O
2
em linfócitos
humanos (HEIM et al., 2002; FAROMBI et al., 2004). Vários flavonóides com
estruturas relacionadas à quercetina e miracetina aumentaram a sobrevida de
células expostas a H
2
O
2
(DAJAS et al., 1999). Ainda nas folhas jovens, a inibição
do dano por AAPH não se mostrou efetiva, com exceção quando aplicado 200µg/ml
de extrato. Considerando se tratar de uma condição estrutural, os flavonóides com
vários grupamentos hidroxil em sua estrutura, frente a peroxidação induzida por
AAPH, um não-metal, possuem limitada ação antioxidante de “scavengers” do
radical peroxil, pois deste modo não haverá contribuição do mecanismo quelante
64
destes flavonóides (HEIM et al., 2002). O arranjamento estrutural 3´-4´-catecol
presente no anel B, aumenta fortemente a inibição da lipoperoxidação, e esta
presente na maioria dos potentes flavonóides “scavengers” de radicais peroxil,
superóxido e peroxinitrito (HAENEN et al., 1997; CAO et al., 1997; RATTY; DAS,
1998). Van Acker et al. (1996) demonstraram que a habilidade “scavengers” do
radical peroxil do flavonóide luteína excede substancialmente a do kaempferol,
devido a presença de grupo catecol no anel B (VAN ACKER et al., 1996).
Considerando este fato, pode-se sugerir que o flavonóide presente nas folhas
jovens de T. heptaphylla não apresente esta característica estrutural, o que foi
demonstrada pela baixa efetividade antioxidante dos extratos T. heptaphylla em
relação ao radical peroxil, gerado pelo AAPH. Outro resultado que se mostrou
interessante, foi o efeito pró-oxidante observado na menor dose aplicada do extrato
de folhas jovens, quando o indutor foi o AAPH. Segundo Sugihara (1999) os
polifenóis também podem atuar como pró-oxidantes. Em um estudo feito por
Hanasaki et al (1994), uma série de mono e dihidroxifenóis testados não
demonstraram atividade pró-oxidante, embora a presença de múltiplos grupos
hidroxilas ligados à estrutura dos flavonóides, tenham aumentado significantemente
a produção do radical hidroxila (CAO et al., 1997; HEIM et al., 2002) podendo desta
forma ser comparado com nossos resultados encontrados.
Nas folhas adultas observou-se um perfil semelhante as jovens em todas as
concentrações testadas frente ao H
2
O
2
e FeSO
4
. Já frente ao AAPH, os extratos
demonstraram uma diminuição mais efetiva da peroxidação em relação às folhas
jovens e não apresentaram efeitos pró-oxidantes. Por existir uma sensibilidade
diferenciada de alguns vegetais a depender da idade e também do teor e tipo de
flavonóides presentes nas folhas, acreditamos que esta possa ser uma das razões
pelas quais as folhas adultas se mostraram mais efetivas que as jovens. Além
disso, vários estudos, que correlacionam a estrutura química dos flavonóides e sua
atividade, têm demonstrado diferenças no seu potencial antioxidante, pois esta
propriedade in vitro depende do rearranjamento de grupos funcionais em torno da
estrutura nuclear (VAN ACKER et al., 1996).
Como se pode observar nos resultados, em ambas as folhas, a atividade
contra o AAPH se mostrou bem menos efetiva em relação aos outros indutores.
Esse efeito também foi observado num estudo realizado por Arora et al (1998) onde
examinaram plantas fenólicas, estruturalmente diferentes, em sua habilidade de
inibir a LPO induzido por íons metálicos Fe(II) e Fe(III) e por radical peroxil derivado
65
de composto azo, em um sistema de membrana lipossomal. Os resultados que
obtiveram, demonstrou que todos os flavonóides testados foram fortemente
eficazes contra peroxidação induzida por metal em relação à induzida por radical
peroxil, sugerindo que a ação quelante de metais pode ter um papel maior na
atividade antioxidante do que atualmente vem sendo proposto (ARORA et al.,
1998).
Contudo, considerando as análises fitoquímicas preliminares realizadas, os
produtos radicalares gerados pelo AAPH, FeSO
4
e H
2
O
2
, ou seja, radicais peroxil,
alcoxil e hidroxil, e os resultados obtidos no presente trabalho, é possível supor que
as folhas adultas possuem composição flavonoídica diferente das folhas jovens e
que esta diferença influencia o desempenho antioxidante frente esses radicais.
5.2 Atividade antioxidante in vivo
Após verificar a atuação dos extratos de folhas de T. heptaphylla como
antioxidante num modelo in vitro, conduzimos nossa pesquisa para a pesquisa em
um modelo in vivo, porém somente com os extratos das folhas adultas, pois estes
demonstraram melhor desempenho como protetores contra o dano oxidativo
aplicado. Elegemos como parâmetro de avaliação de dano e possível mecanismo
protetor dos extratos, diferentes estruturas cerebrais e o fígado. Empregamos dois
modelos para testar a efetividade da planta, sendo um profilático e um terapêutico.
No presente estudo, o CCl
4
foi utilizado para induzir a peroxidação lipídica
que foi mensurada em termos de detecção dos derivados lipoperóxidos, através de
substâncias que reagem com ácido tiobarbitúrico (TBARS) e oxidação de proteínas.
A toxicidade do CCl
4
é devida à reação de suas espécies radicalares, como
triclorometano e o radical peroxil do triclorometano, com lipídios e proteínas,
causando peroxidação destes e oxidação das proteínas, podendo levar a geração
de radicais secundários e desencadeando com isso, uma série de reações que
podem levar a morte celular (KLAASSEN, 1996). Além disso alguns autores
atribuem sua toxicidade pelo aumento da geração de radical
•
OH na ausência da
enzima catalase (WANG et al., 1998). Vários estudos demonstram que o fígado não
é o único órgão alvo para ação do CCl
4
, causando geração de radical livre em
outros tecidos como rins, coração, pulmões, testículos, cérebro e sangue. Também
é descrito que exposição a CCl
4
induz a dano renal agudo e crônico (SUN et al.,
2000; TIRKEY et al., 2005).
66
Certas características do cérebro o fazem particularmente vulnerável ao
ataque de espécies radicalares, levando ao quadro de estresse oxidativo. Isso pode
ser devido o alto consumo de oxigênio pelo cérebro, por possuir membranas
celulares ricas em cadeias laterais de ácido graxo poliinsaturado e ser
relativamente deficiente de mecanismo protetores frente à oxidação comparado
com outros órgãos como o fígado, além disso, a concentração destes mecanismos
protetores, varia conforme a região do cérebro. Além de possuir um conteúdo
significativo de metais pró-oxidantes (TEJADA et al., 2006; PÔRTO, 2001; KASHIF;
BANU, 2004; MANIKANDAM et al., 2005). As concentrações da enzima catalase
são muito pequenas, enquanto as concentrações de GPx e SOD, são moderadas.
A relação da concentração de SOD sobre a GPX, é muito maior no cérebro e
aliado a baixa concentração de CAT, esse órgão se torna um dos mais vulneráveis
a ação de H
2
O
2
(SIQUEIRA et al., 2005). Em um estudo realizado por Baek et al
(1999) demonstrou, uma relação direta entre o aumento de geração de ERO e
diminuição da atividade da enzima SOD em regiões do cérebro comprometendo
assim o efeito protetor desta enzima (BALU et al, 2005).
Um grande número de enzimas expressadas no cérebro produz como
produto de sua atividade metabólica, H
2
O
2
e O
2
• -
, podendo ocorrer ainda
autooxidação de substâncias endógenas o que pode levar a um aumento nos
níveis de H
2
O
2
. O
•
NO também é formado nos neurônios como resultado do influxo
de cálcio e este, se estiver aumentado, poderá gerar radical ânion superóxido, via
enzima xantina oxidase (PÔRTO, 2001; GILGUN-SHERKI et al., 2002).
Os resultados encontrados sugerem que o tratamento com extratos de
folhas de T. heptaphylla foram protetores quando usados terapeuticamente após
dano com CCl
4
, no cérebro e fígado. O efeito protetor dos extratos pode estar
relacionado com ação direta “scavengers” do radical
•
CCl
3
ou por interrupção da
progressão da lipoperoxidação. Um importante estudo revela que flavonóides,
devido sua lipossolubilidade, são hábeis em atravessar a barreira hemato-
encefálica, incluindo os administrados por via oral (MERCER et al., 2004).
Corroborando outros trabalhos, os resultados desse estudo confirmaram que
a vitamina E agiu como um excelente antioxidante por todo cérebro, funcionando
como um “quencher” na cadeia de LPO (HONG et al., 2004).
Em um estudo feito por Farombi et al (2004) ratos tratados com kolaviron,
um bioflavonóide, apresentaram redução da oxidação de proteínas hepáticas e
67
também efeito hepatoprotetor contra lipoperoxidação induzida por CCl
4
(FAROMBI
et al., 2004).
O efeito neuroprotetor contra o dano oxidativo foi um achado interessante.
Alguns estudos demonstraram um efeito protetor de extratos de plantas em
diferentes modelos de estresse oxidativo no cérebro (DEFEUDIS et al., 2003;
BANSKOTA et al., 2000; OSTROWASKA et al., 2004, EL-BESHBISHY, 2005),
porém não com um modelo de indução por CCl
4
. Há um crescente número de
estudos com polifenóis sugerindo habilidade destes em proteger a célula neural
contra morte. A Epicatequina, um componente da proantocianidina, tem sido
reportada como um potente agente neuroprotetor (DEVI et al., 2006).
Dentre os poucos trabalhos que investigaram a ação neuroprotetora dos
flavonóides in vivo, Shutenko et al (1999) caracterizaram mudanças nos níveis de
óxido nítrico em um modelo global de isquemia e reperfusão na presença de
quercetina, atribuindo as mudanças observadas a ação “scavengers” dos
flavonóides. Outro estudo tem reportado os efeitos benéficos da quercetina
atribuindo a estes efeitos a inibição da lipoperoxidação e aumento da atividade da
enzima glutationa peroxidase (DAJAS et al., 2002). Corroborando com os
resultados encontrados com outro estudo realizado por Kamada et al (2005) onde a
quercetina se mostrou efetiva em inibir lipoperoxidação na aorta, induzida por uma
dieta com alto conteúdo de colesterol (KAMANDA et al., 2005).
Em contraste, no protocolo profilático, a administração de extratos de folhas
teve ação pró-oxidante no fígado e algumas regiões do cérebro. Ação “scavengers”
de radicais livres por flavonóides pode gerar uma forma radicalar semiquinona ou
um radical aroxil que pode interagir com oxigênio, gerando O
2
•-
que pode ser
responsável pelo seu efeito pró-oxidante (TIWARI, 2001). Flavonóides que
possuem grupo pirogalol e/ou catecol em sua estrutura, geram H
2
O
2
via produção
de O
2
•-
(MIURA et al., 1998; SAKIHAMA et al., 2002). Tem-se previamente
demonstrado que extratos obtidos de Achyrocline satureioides podem agir como um
pró-oxidante em culturas celulares (POLYDORO et al., 2004). Em um outro
trabalho, quercetina causou “burst” na cadeia respiratória mitocondrial e
autoxidação de células, resultando em formação de H
2
O
2
, O
2
•-
e HO
•
(HODNIK
1986). Em adição , Choi et al (2003) demonstraram que administração crônica de
quercetina em ratos, diminuiu a concentração da glutationa e glutationa redutase,
sugerindo efeito pró-oxidante da quercetina. Também foi demonstrado que
68
flavonóides epigalocatequina e extratos de Kava podem ser hepatotóxicos
(GIUSEPPE et al., 2004, MATHEWS et al., 2002).
As diferenças encontradas no processo de lipoperoxidação nas diferentes
regiões do cérebro encontradas neste trabalho, podem ser devidas ao padrão de
consumo de oxigênio pela região e conteúdo de ferro, que influenciará na geração
de ERO, via reação de Fenton (BALU et al., 2005). Manolli et al (2000) e Baek et al
(1999) concluíram que a vulnerabilidade para o estresse oxidativo depende da
região específica do cérebro, do conteúdo de ferro endógeno e da habilidade de
produzir lipoperóxidos (MANOLLI et al., 2000). É conhecido que o córtex cerebral e
o estriado são mais susceptíveis ao dano oxidativo devido ao grande consumo de
oxigênio nessas regiões e por apresentarem grande conteúdo de ferro (BALU et al,
2005; MUTHUSWAMY et al, 2006).
Estudos feitos por Mandavilli e Rao (1996) demonstraram que regiões como
córtex, hipotálamo, hipocampo e estriado são mais susceptíveis a ação das EROS
quando comparados com o cerebelo (MANIKANDAN et al., 2005). Em um outro
estudo realizado por Shiela et al (2005), regiões como córtex, hipocampo e estriado
exibiram um maior aumento da LPO em relação ao cerebelo (SHILA et al., 2005).
Estudos demonstram que a atividade antioxidante dos flavonóides pode ser
devido sua estrutura química e sua localização nas membranas e sugerem que
diferentes regiões do cérebro exibem concentrações diferenciadas de antioxidantes
(SAIJA et al., 1995). Fenólicos e alguns flavonóides, a depender de sua estrutura
química e potencial redox intermediário, podem possivelmente atuar na interface da
membrana entre o ascorbato e o tocoferol, propiciando um sinergismo na defesa
antioxidante (BALU et al., 2005; GUREL et al., 2005).
Apesar do interesse crescente nas propriedades terapêuticas dos
flavonóides, os dados in vivo disponíveis sobre absorção, biodisponibilidade e
metabolismo, após a administração intravenosa e oral nos seres humanos, são
escassos e, algumas vezes, contraditórios. Os resultados apresentados neste
estudo podem contribuir para avaliação de efeitos do extrato da planta e sugerir que
um mesmo extrato poderia agir como um antioxidante ou como um pró-oxidante
dependendo do tempo da administração do indutor de dano oxidativo. Assim, o
cuidado é necessário ao projetar experimentações para determinar a eficácia de
extratos da planta no tratamento ou na profilaxia de doenças mediadas por radicais
livres.
69
6 CONSIDERAÇÕES E CONCLUSÕES
P Com base na análise fitoquímica preliminar realizada com T. heptaphylla
(Vell.) Tolledo - ipê-roxo, detectamos a presença de flavonóides tanto nas folhas
jovens como nas adultas;
P Em todas as concentrações testadas com extrato das folhas jovens in vitro,
observamos uma redução da peroxidação lipídica induzida por H
2
O
2
e FeSO
4
sendo maior efeito na concentração de 200µg/ml quando induzido pelo H
2
O
2
e
20µg/ml quando induzido por FeSO
4
;
P Ainda nas folhas jovens, a inibição do dano por AAPH, in vitro, não se
mostrou efetiva, com exceção quando aplicado 200µg/ml de extrato;
P Nas folhas adultas observou-se um perfil semelhante as jovens em todas as
concentrações testadas num modelo in vitro frente ao H
2
O
2
e FeSO
4
. Já frente
ao AAPH, os extratos demonstraram uma diminuição mais efetiva da
peroxidação em relação às folhas jovens;
P Os extratos de T.heptaphylla (Vell.) Toledo – ipê-roxo foram antioxidantes na
maioria das concentrações testadas in vitro;
P Os extratos de folhas adultas apresentaram melhor perfil antioxidante em
relação às folhas jovens, com todos os indutores testados;
P A ação antioxidante dos extratos foi melhor evidenciada na indução de LPO
por FeSO
4
em comparação com H
2
O
2
e AAPH;
70
P Os resultados encontrados in vivo no presente trabalho, sugerem que o
tratamento com extratos de folhas adultas de T. heptaphylla foram antioxidantes
quando usados terapeuticamente, após indução de dano com CCl
4
, em ambos,
cérebro e fígado, o que sugere ação direta sobre o radical triclorometil ou
inibição do progresso da LPO
P Em contraste, no protocolo profilático in vivo, a administração de extratos de
folhas adultas, apresentou ação pró-oxidante no fígado e algumas regiões do
cérebro, sugerindo incapacidade de acúmulo dos antioxidantes nos sistemas
biológicos para posterior proteção e/ou interferência com sistema glutationa;
P Observamos ainda efeito antioxidante mais pronunciado sob marcadores de
peroxidação lipídica quando comparados à oxidação protéica
P Nossos resultados sugerem que a atividade antioxidante do extrato se
relacione à presença de Flavonóides polihidroxilados, corroborando com os
resultados encontrados :
- No ensaio in vitro: observamos atividade antioxidante mais
pronunciada quando induzida por indutor metálico (FeSO
4
);
- No ensaio in vivo: observamos maior efeito antioxidante em áreas
cerebrais que conhecidamente apresentam um maior conteúdo de ferro
(córtex e estriado);
P Considerando as análises fitoquímicas realizadas, os produtos radicalares
gerados pelo AAPH, FeSO
4
e H
2
O
2
e os resultados obtidos no ensaio in vivo, é
possível supor que as folhas adultas possuem composição flavonoídica
diferente das folhas jovens e que esta diferença influencia o desempenho
antioxidante frente esses radicais.;
71
P Esses resultados podem contribuir para avaliação de efeitos do extrato da
planta e sugerir que um mesmo extrato poderia agir como um antioxidante ou
como um pró-oxidante dependendo do tempo da administração do indutor de
dano oxidativo;
P Assim, o cuidado é necessário ao projetar experimentações para determinar
a eficácia de extratos de planta no tratamento ou na profilaxia de doenças
mediadas por radicais livres.
72
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