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DANIELLE PEREIRA CAVALCANTI
CARACTERIZAÇÃO ULTRAESTRUTURAL E MOLECULAR DE
PROTEÍNAS ASSOCIADAS AO CINETOPLASTO DE
TRIPANOSOMATÍDEOS
Rio de Janeiro
2006
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ii
Danielle Pereira Cavalcanti
“Caracterização ultraestrutural e molecular de proteínas associadas ao
cinetoplasto de tripanosomatídeos”
Tese de doutorado apresentada ao programa de pós-
graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), Instituto de
Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do
Rio de Janeiro, como requisito necessário à obtenção do
título de Doutor em Ciências Biológicas (Biofísica).
Orientadores:
Dra. Maria Cristina Machado Motta
Dr. Stênio Perdigão Fragoso
Rio de Janeiro
2006
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iii
Cavalcanti, Danielle Pereira
“Caracterização ultraestrutural e molecular de proteínas associadas ao cinetoplasto de
tripanosomatídeos”. Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ,
2006.
XX, 143f.
Orientadores: Dra. Maria Cristina Machado Motta
Dr. Stênio Perdigão Fragoso
Tese de doutorado em Ciências Biológicas (Biofísica)- UFRJ/ Instituto de Biofísica
Carlos Chagas Filho, 2006.
1. Tripanosomatídeos 2. kDNA 3. Histonas 4. Topoisomerases 5. Ultraestrutura
6. Biologia molecular
I. Universidade Federal do Rio de Janeiro
II. Título
iv
Danielle Pereira Cavalcanti
“Caracterização ultraestrutural e molecular de proteínas associadas ao
cinetoplasto de tripanosomatídeos”
Tese de doutorado apresentada ao programa de pós-graduação em Ciências Biológicas
(Biofísica), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de
Janeiro, como requisito necessário à obtenção do título de Doutor em Ciências
Biológicas (Biofísica).
Aprovada por:
_______________________________________________________
Dra. Thais Cristina Baeta Soares Souto-Padrón
________________________________________________________
Dr. Turan Peter Urmenyi
________________________________________________________
Dr. Sérgio Schenkman
________________________________________________________
Dra. Maria Cristina Machado Motta (orientadora)
________________________________________________________
Dra. Rosane Silva (revisora)
Rio de Janeiro
2006
v
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Ultraestrutura Celular Hertha
Meyer, do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho/ Universidade Federal do Rio de
Janeiro, sob orientação da Dra. Maria Cristina Machado Motta e no Instituto de
Biologia Molecular do Paraná/ FIOCRUZ, sob co-orientação do Dr. Stênio Perdigão
Fragoso. A presente tese contou com o auxílio financeiro do Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
vi
Aos meus pais, por serem os melhores pais que alguém pode ter.
Obrigada pelo amor, pelo apoio, pelas oportunidades que me
proporcionaram e por estarem por perto sempre que precisei. Agradeço
também por me ensinarem o valor do trabalho, do respeito e da
honestidade e por me ensinarem a lutar pelos meus objetivos e pelas
coisas em que acredito. Espero sempre seguir seus ensinamentos. Amo
muito vocês!
vii
Ao Pedro, pelo grande homem que é. Agradeço todo o amor, paciência
e dedicação ao longo desses anos. Obrigada por estar ao meu lado não
só nos momentos de alegria, mas também nos de angústia e de tristeza
e por me dar força no momento mais difícil, quando eu quase desisti.
Agradeço, sobretudo, pela confiança e por aceitar minhas constantes
ausências sem nenhuma cobrança. Amo você!
viii
A minha avó Maria, uma das minhas maiores torcedoras, por suas
“orações” para que tudo desse certo e pelos sábios ensinamentos.
ix
Agradecimentos especiais
“Ha pessoas que nos falam e nem as escutamos; há pessoas que nos ferem e nem
cicatrizes deixam. Mas há pessoas que, simplesmente, aparecem em nossa vida e que
marcam para sempre...” (Cecília Meireles)
Chegar até o fim desta tese teria sido muito mais difícil sem o apoio de vocês. Espero
sempre retribuir o carinho, amizade e respeito com que sempre me trataram. Agradeço
em especial:
Ana Cristina Dore, pelo carinho e amizade, por me escutar e dar força nas horas que
precisei, pelo apoio e pela torcida para que tudo desse certo e pelas conversas animadas
e descontraídas que sempre deixavam meus dias mais leves.
Isabella Palmié, pela bonita amizade que começamos a cultivar ainda no início da pós,
quando fazíamos mestrado juntas. Nesse período, plantamos uma semente que
germinou e foi além dos muros da UFRJ. Que bom que a nossa amizade ultrapassou o
convívio do laboratório e se fortalece cada vez mais. É muito bom ter uma amiga tão
competente, capaz e batalhadora como você. Admiro muito a sua garra e estarei sempre
torcendo por você! Muito obrigada por tudo que você me ensinou no laboratório, por
me ouvir sempre que precisei desabafar (e olha que não foram poucas vezes) e por todos
os conselhos.
Márcia Shimada, que conheço há pouco tempo, mas que se tornou uma grande amiga,
quase irmã. Obrigada por me receber tão bem em sua casa, pelo carinho e amizade e
pela GRANDE ajuda que na parte experimental da tese. Com certeza sempre lembrarei
com saudades das inúmeras noites e fins de semana que passamos no IBMP (comendo
lasanha de caixa...) e de todos os momentos divertidos e angustiantes que
compartilhamos.
Thiago Manchester, pela amizade e carinho, por me apoiar, por me ajudar sempre que
precisei e por ser capaz de me fazer rir mesmo nos momentos mais difíceis. Adoro
você!
Agradeço também, com muito carinho, a equipe técnica do laboratório Hertha Meyer,
pela convivência agradável ao longo desses oito anos, pela amizade e pelo excelente
trabalho que vocês realizam. Bosco, Nete e Cazuza, obrigada por alegrarem o
laboratório com suas brincadeiras, trabalhar com vocês por perto sempre foi muito
divertido. Deda, você é um grande talento na câmara escura e agora também na
microscopia. Obrigada por me ensinar a fazer fotos mais bonitas do que qualquer
Photoshop é capaz de fazer. Pena que essa nova geração da “era digital” não vá
aprender os seus “truques”... Noêmia, obrigada por sempre me ajudar nas inúmeras
vezes que precisei. Você é uma profissional extremamente competente! Obrigada por
tudo ao longo desses anos.
x
Agradecimentos
“A vida é a arte do encontro, embora haja tantos desencontros pela vida”
(Vinicius de Moraes)
Agradeço, em primeiro lugar, à minha família e à família do Pedro, pelo apoio, pela
torcida e por vibrarem comigo a cada conquista. Agradeço, sobretudo, a minha irmã e
meu cunhado por me darem presentes tão especiais: a minha afilhada Isabela e o meu
sobrinho Felipe (que está por vir...). É impressionante como esses seres tão
pequenininhos são capazes de fazer a gente parar para refletir e passar a ver o que
realmente é importante nessa vida. Obrigada por vocês existirem!
A Dra. Maria Cristina Machado Motta, pela convivência e orientação ao longo desses
anos, pelos ensinamentos científicos e pelas palavras de otimismo que sempre nos faz
acreditar que tudo dará certo. A sua dedicação, perseverança e amor pela ciência são
exemplares. Obrigada por acreditar em mim e no meu trabalho e pela preocupação em
querer me dar uma formação científica sólida e abrangente.
Ao Dr. Stênio Perdigão Fragoso, a quem tenho grande admiração, carinho e respeito e
que foi muito importante em minha formação científica. Não sei como você conseguiu
me convencer a gostar de biologia molecular, mas o fato é que você conseguiu. Acho
que na verdade o seu entusiasmo contagia qualquer um que esteja por perto. Obrigada
pela orientação, por me receber tão bem em seu laboratório, pela paciência em ensinar
quantas vezes fossem necessário e por ser uma pessoa de fácil convívio e presente no
dia-a-dia de seus alunos. Admiro bastante sua competência, dedicação e a maneira como
você conduz o seu grupo. Fazer parte desse grupo só me fez crescer... Você realmente é
nota 10, não só como orientador, mas principalmente como pessoa.
Ao Dr. Samuel Goldenberg e Dr. Wanderley de Souza, chefes dos laboratórios onde o
trabalho foi desenvolvido, por me acolherem em seus grupos de pesquisa e por
compartilharem o enorme conhecimento de vocês com jovens aprendizes da ciência.
A Dra. Rosane Silva, pela revisão da tese e pelas sugestões.
Aos professores e ex-professores do laboratório de Ultraestrutura Celular Hertha Meyer:
Narcisa, Márcia, Rossiane, Técia, Sônia, Thaïs e Fernando, por estarem sempre
xi
dispostas a ajudar, pelos ensinamentos e por compartilhar o conhecimento de vocês com
todos nós.
A toda equipe de pesquisadores do Instituto de Biologia Molecular do Paraná: Cláudia
Nunes, Marco Krieger, Andréa Ávila, Bruno Dallagiovana e demais pesquisadores, por
me receberem de braços abertos e pelos ensinamentos.
Aos queridos alunos que já passaram pelo grupo dos simbiontes: Miguel, Marcinha,
Carla, Ricardo e, em especial, Patty e Adriana, por me ajudarem sempre que precisei,
pelo carinho e pela amizade.
A Juliana Dutra, Emile, Daniela e Joana, pela amizade, pelos momentos de
descontração e por estarem sempre dispostas a ajudar, principalmente no final da tese.
A todos os alunos do Laboratório de Ultraestrutura Celular Hertha Meyer e agregados,
pela convivência agradável ao longo desses anos, pela ajuda e pelo companheirismo.
Agradeço em especial à Marina, Gustavo e Leandro (os caras mais implicantes que já
conheci, mas de quem gosto muito...), Ana Cláudia, Loraine, Juliany, Celso, Bel,
Letícia, Allan, Iamara, Paulo, André, Cláudia Maia, Alek e Melissa.
As queridas e doces amigas curitibanas Flavinha e Cíntia, pela paciência e boa vontade
em ajudar, pela força que me deram, pelo carinho com que me trataram e pelos
momentos divertidos que passamos. Vocês são especiais.
A todos os alunos e equipe técnica do Instituto de Biologia Molecular do Paraná, pela
acolhida, ajuda e carinho com que me receberam. Agradeço de maneira especial: Dani
Fiori, Didi, Lucía, Rosana, Léo, Sheila, Patrícia, Lauro, Édio, Gisele, Paulo, Nilson,
Cassiano e Marcos.
Ao pessoal do Espaço Ciência Viva, em especial Cecília Cavalcanti, Dra. Eleonora
Kurtenbach e Dr. Pedro Persechini, por me mostrarem o quanto é importante e nobre a
tarefa de divulgar ciência. Este aprendizado foi de grande valia na minha formação
científica!
A todos os amigos, que torceram por mim e me deram força. Agradeço em especial
Débora, Fábio, Vera, Glória, Magali e Gildinha.
xii
Uma tese é uma tese
Mário Prata
Sabe tese, de faculdade? Aquela que defendem? Com unhas e dentes? É dessa tese que
eu estou falando. Você deve conhecer pelo menos uma pessoa que já defendeu uma
tese. Ou esteja defendendo. Sim, uma tese é defendida (...)
As teses são todas maravilhosas. Em tese. Você acompanha uma pessoa meses, anos,
séculos, defendendo uma tese. Palpitantes assuntos. Tem tese que não acaba nunca, que
acompanha o elemento para a velhice. Tem até teses pós-morte.
O mais interessante na tese é que, quando nos contam, são maravilhosas, intrigantes. A
gente fica curiosa, acompanha o sofrimento do autor, anos a fio. Aí ele publica, te dá
uma cópia e é sempre - sempre - uma decepção. Em tese. Impossível ler uma tese de
cabo a rabo.
(...) Escrever uma tese é quase um voto de pobreza que a pessoa se autodecreta. O
mundo pára, o dinheiro entra apertado, os filhos são abandonados, o marido que se vire.
Estou acabando a tese. Essa frase significa que a pessoa vai sair do mundo. Não por
alguns dias, mas anos. Tem gente que nunca mais volta.
E, depois de terminada a tese, tem a revisão da tese, depois tem a defesa da tese. E,
depois da defesa, tem a publicação. E, é claro, intelectual que se preze, logo em seguida
embarca noutra tese. São os profissionais, em tese. O pior é quando convidam a gente
para assistir à defesa. Meu Deus, que sono. Não em tese, na prática mesmo.
(...) Tenho um casal de amigos que há uns dez anos prepara suas teses. Cada um, uma.
Dia desses a filha, de 10 anos, no café da manhã, ameaçou:
- Não vou mais estudar! Não vou mais na escola.
Os dois pararam - momentaneamente - de pensar nas teses.
- O quê? Pirou?
- Quero estudar mais, não. Olha vocês dois. Não fazem mais nada na vida. É só a tese, a
tese, a tese. Não pode comprar bicicleta por causa da tese. A gente não pode ir para a
praia por causa da tese. Tudo é pra quando acabar a tese. Até trocar o pano do sofá. Se
eu estudar vou acabar numa tese. Quero estudar mais, não. Não me deixam nem mexer
mais no computador. Vocês acham mesmo que eu vou deletar a tese de vocês?
Pensando bem, até que não é uma má idéia!
Quando é que alguém vai ter a prática idéia de escrever uma tese sobre
a tese? Ou uma outra sobre a vida nos rodapés da história? (...)
xiii
RESUMO
“Caracterização ultraestrutural e molecular de proteínas associadas ao cinetoplasto de
tripanosomatídeos”
Danielle Pereira Cavalcanti
Orientadores: Dra. Maria Cristina Machado Mota
Dr. Stênio Perdigão Fragoso
Resumo de tese de Doutorado apresentada ao programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas (Biofísica), do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para obtenção do título
de Doutor em Ciências Biológicas (Biofísica).
A família Trypanosomatidae compreende um grande número de protozoários,
sendo alguns deles agentes de doenças tropicais. Estes protozoários apresentam
estruturas biológicas incomuns, como o cinetoplasto, uma região especializada da
mitocôndria que contém o DNA mitocondrial (kDNA). O kDNA é constituído por
moléculas circulares que se encontram interligadas. Topoisomerases do tipo II (topo II)
são enzimas que desempenham um papel essencial na replicação do kDNA,
promovendo a catenação e decatenação das moléculas de DNA circulares. Uma vez que
as topoisomerases são enzimas essenciais para os tripanosomatídeos, é interessante
examinar se inibidores da topo II podem atuar sobre a enzima destes protozoários. No
presente trabalho, avaliamos o efeito de inibidores da topo II de procariotos e de
eucariotos na proliferação celular e na ultraestrutura de tripanosomatídeos que
apresentam arranjos distintos da rede de kDNA. Os inibidores procarióticos foram mais
efetivos contra os tripanosomatídeos, sendo capazes de reduzir a proliferação celular e
promover alterações ultraestruturais na organização do kDNA. Sendo Blastocrithidia
culicis a espécie mais afetada após o tratamento com as drogas e considerando que este
protozoário possui um arranjo mais frouxo da rede de kDNA, resolvemos investigar se
estas diferenças poderiam estar relacionadas a uma atividade distinta da topo II neste
organismo. Assim, clonamos e caracterizamos o gene que codifica a topoisomerase II
(BcTOP2) neste tripanosomatídeo. Nossos resultados mostraram que BcTOP2 é um
gene de cópia única no genoma do protozoário, que codifica um polipeptídeo de 138
kDa. A seqüência de aminoácidos deduzida a partir de BcTOP2 foi muito similar a da
topo II de outros tripanosomatídeos. O antisoro produzido contra a topo II de B. culicis
(BctopoII) foi capaz de reconhecer um antígeno nuclear no protozoário.
xiv
A rede de kDNA dos tripanosomatídeos é altamente condensada e organizada na
estrutura em forma de disco do cinetoplasto. Entretanto, o mecanismo pelo qual o
kDNA é compactado é pouco entendido. Algumas proteínas associadas ao cinetoplasto
(KAPs) têm sido descritas em Crithidia fasciculata, sendo estas proteínas semelhantes a
histonas e capazes de condensar a rede de kDNA in vitro. Uma vez que as moléculas
envolvidas no arranjo do kDNA de Trypanosoma cruzi ainda não estão bem
caracterizadas, neste trabalho nós clonamos três genes que codificam proteínas
semelhantes a histonas em T. cruzi (TcKAPs) e produzimos antisoros contra as proteínas
recombinantes. Duas destas proteínas foram imunolocalizadas no cinetoplasto de
formas epimastigota, amastigota e tripomastigota do parasita. Adicionalmente, a
superexpressão das KAPs em epimastigotas de T. cruzi não promoveu alterações
fenotípicas no parasita.
Estudos adicionais são necessários para melhor caracterizar a ação de
topoisomerases, KAPs e outras proteínas, com o objetivo de entender o papel destas
moléculas na organização e na replicação da complexa rede de kDNA.
Palavras chave: tripanosomatídeos, cinetoplasto, kDNA, histonas, topoisomerases II
xv
ABSTRACT
“Ultrastructural and molecular characterization of kinetoplast associated proteins
in trypanosomatids”
Danielle Pereira Cavalcanti
Orientadores: Dra. Maria Cristina Machado Mota
Dr. Stênio Perdigão Fragoso
Resumo de tese de Doutorado apresentada ao programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas (Biofísica), do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para obtenção do título
de Doutor em Ciências Biológicas (Biofísica).
The Trypanosomatidae family comprises a large number of protozoa, some of
which are agents of tropical diseases. These protozoa present unusual biological
structures such as the kinetoplast, a specialized region of the mitochondrion that
contains the mitochondrial DNA (kDNA). The kDNA is constituted by circular
molecules, which are interlocked. Type II topoisomerases (topo II) are enzymes which
performing essential role in the kDNA replication, promoting the catenation and
decatenation of circular DNA molecules. Since topoisomerases are essential enzymes
for the trypanosomatids, it is worth examining whether the topo II inhibitors can target
the protozoa enzyme. In this work, we evaluated the effect of the prokaryotic and
eukaryotic topo II inhibitors on the proliferation and ultrastructure of trypanosomatids
that present distinct kDNA arrangements. Prokaryotic inhibitors were more effective
against trypanosomatids, being able to reduce cell proliferation and to promote
ultrastructural alteration in the kDNA organization. Since Blastocrithidia culicis was the
most affected species after drug treatment and considering that this protozoan has a
looser kDNA arrangement, we investigated whether these differences could be related
to a distinct topo II activity. Thus, we cloned and characterized the gene that encodes
type II topoisomerase (BcTOP2) in this trypanosomatid. Our results showed that
BcTOP2 is a single copy gene in the genome of protozoan, which encodes a 138 kDa
polypeptide. The amino-acid sequence deduced from the BcTOP2 was highly similar to
topo II from other trypanosomatids. The antiserum raised against the B. culicis topo II
(BctopoII) was able to recognize a nuclear antigen in the protozoan.
The kDNA network in trypanosomatids is highly condensed and organized into a
disk-shaped structure of the kinetoplast. However, the mechanism by which kDNA is
xvi
compacted is poorly understood. Several kinetoplast associated proteins (KAPs) have
been described in Crithidia fasciculata as histone H1-like proteins, which are capable of
condensing kDNA networks in vitro. Since the molecules involved in Trypanosoma
cruzi kDNA arrangement are uncertain, in the present work, we cloned three genes that
encode histone-like proteins in T. cruzi and also produced antisera against such
recombinant proteins. Two of these proteins were immunolocalized in the kinetoplast of
epimastigote, amastigote and trypomastigote forms of the parasite. Additionally, the
over expression of KAPs in epimastigotes of T. cruzi did not promote phenotypic
alteration in the parasite.
Further studies are necessary to better characterize the action of topoisomerases,
KAPs and other proteins in order to understand the role of such molecules in the
organization and replication of the intricate kDNA network.
Key words: tripanosomatids, kinetoplast, kDNA, histones, topoisomerases II
xvii
LISTA DE ABREVIATURA
BSA: albumina de soro bovino
DAPI: 4',6-diamidino-2-fenilindol
DEPC: dietil pirocarbonato
DMSO: dimetil sulfóxido de sódio
EDTA: ácido etilenodiaminotetracético
FITC: isotiocianato de fluoresceína
GFP: proteína verde fluorescente
GST: glutationa S-transferase
IgG: imunoglobulina
IPTG: isopropil-1-tio-β-D-galactopiranosideo
KAPs: proteínas associadas ao cinetoplasto
Kb: quilobase (1000 pares de base de DNA)
kDa: quilodalton
kDNA: DNA do cinetoplasto
KFZ: zona cinetoflagelar
L: litro
LLCMK2: célula epitelial de rim de macaco Rhesus
M: molar
mL: mililitro (10
-3
litro)
mM: milimolar (10
-3
molar)
mRNA: RNA mensageiro
NCBI: National Center for Biotechnology Information
ng: nanograma (10
-9
grama)
nm: nanômetro (10
-9
metro)
pb: pares de base
PBS: solução salina tamponada
PCR: reação em cadeia da polimerase
pH: potencial de hidrogênio
RNAi – interferência de RNA
SDS: dodecil sulfato de sódio
TAC: complexo de ligação tripartite (liga o cinetoplasto ao corpo basal)
TIGR: The Institute for Genomic Research
Topo I: DNA topoisomerase do tipo I
Topo II: DNA topoisomerase do tipo II
UMS: seqüência universal de minicírulos
UMSBP: proteínas que se ligam a seqüência universal de minicírculos
V: Volts
WHO: Organização Mundial de Saúde
μg: micrograma (10
-6
grama)
μl: microlitro (10
-6
litro)
μm: micrômetro (10
-6
metro)
xviii
SUMÁRIO
I. INTRODUÇÃO ............................................................................................................1
I.1 FAMÍLIA TRYPANOSOMATIDAE ..........................................................................2
I.1.a Introdução ......................................................................................................2
I.1.b Características morfológicas ..........................................................................4
I.1.c Ciclo de vida dos tripanosomatídeos .............................................................7
I.2 CINETOPLASTO ......................................................................................................10
I.2.a Histórico .......................................................................................................10
I.2.b Variações na estrutura do kDNA .................................................................10
I.2.c Características gerais da rede de kDNA dos tripanosomatídeos .................12
I.2.d Composição da rede de kDNA ....................................................................16
I.2.e Replicação da rede de kDNA .......................................................................18
I.2.f Proteínas envolvidas na organização e replicação da rede de kDNA ..........22
I.3 DNA TOPOISOMERASES .......................................................................................24
I.3.a Considerações gerais ....................................................................................24
I.3.b Mecanismos de ação das topoisomerases ....................................................27
I.3.c Inibidores de DNA topoisomerases .............................................................29
I.3.d Topoisomerases tipo II em tripanosomatídeos ............................................31
I.3.e Ação de inibidores de DNA topoisomerases na rede de kDNA ..................32
I.4 PROTEÍNAS ASSOCIADAS AO kDNA (KAPs) ....................................................33
I.4.a Histonas e proteínas semelhantes a histonas ................................................33
I.4.b Outras proteínas associadas ao cinetoplasto .................................................38
xix
II. OBJETIVOS .............................................................................................................40
Racional ...........................................................................................................................41
II.1 Objetivos gerais .........................................................................................................41
II.1 a Objetivos específicos ...................................................................................42
III. MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................43
III.1 Cultivo de células .....................................................................................................44
III.2 Tratamento com inibidores de topoisomerase II ......................................................44
III.3 Microscopia eletrônica de transmissão
a) preparação de rotina.........................................................................................45
b) preparação para imunocitoquímica..................................................................45
III.4 Ensaios de imunolocalização
a) por microscopia óptica ...................................................................................46
b) por microscopia eletrônica .............................................................................46
III.5 Extração de ácidos nucléicos
a) extração de DNA ............................................................................................47
b) extração de RNA total ....................................................................................47
III.6 Southern blot ...........................................................................................................48
III.7 Northern blot ...........................................................................................................49
III.8 Western blot ............................................................................................................49
III.9 Clonagem e sequenciamento do gene que codifica a topoII em B. culicis (BcTOP2)
a) Clonagem de um fragmento do gene BcTOP2 ...............................................50
b) Sub-clonagem do fragmento BC7-14 .............................................................51
c) Construção da biblioteca genômica de B. culicis ...........................................52
d) Varredura da biblioteca genômica de B. culicis .............................................53
e) Clonagem de fragmentos do gene BcTOP2 a partir de um clone genômico ..54
f) Seqüenciamento do gene BcTOP2 e análise computacional ...........................55
III.10 Caracterização e análise da expressão do gene BcTOP2 ......................................55
III.11 Expressão da região carboxi-terminal de BcTOP2 fusionada a GFP ...................56
III.12 Obtenção do antisoro anti-BctopoII .....................................................................58
III.13 Estudo da expressão da BctopoII por Western blot ..............................................58
xx
III.14 Localização celular da topoisomerase II em B. culicis .........................................59
III.15 Clonagem de genes que codificam proteínas associadas ao cinetoplasto (KAPs)
de T. cruzi ............................................................................................................59
III.16 Expressão das KAPs de T. cruzi em E. coli ..........................................................61
III.17 Obtenção de antisoro contra KAPs recombinantes ..............................................61
III. 18 Análise da expressão das KAPs por ensaios do tipo Western blot ......................62
III.19 Localização celular das KAPs em T. cruzi ...........................................................62
III.20 Superexpressão das KAPs em T. cruzi, utilizando o plasmídeo pTEX ................62
IV. RESULTADOS .......................................................................................................64
IV.1 Efeito de inibidores da topo II na proliferação celular e ultraestrutura ..................65
IV.2 Clonagem e caracterização do gene que codifica a topo II de B. culicis e
localização celular desta enzima ............................................................................74
IV.3 Clonagem e expressão de genes que codificam proteínas associadas ao cinetoplasto
de T. cruzi e localização celular destas proteínas ..................................................83
a) Análise de Tcp14.............................................................................................83
b) Análise de Tcp21 e Tcp23...............................................................................87
c) Expressão das proteínas recombinantes Tcp14, Tcp21 e Tcp23 em E. coli....93
d) Produção de antisoros contra as proteínas Tcp14, Tcp21 e Tcp23.................95
e) Localização celular das KAPs em T. cruzi................................................... ..96
f) Superexpressão das KAPs em epimastigotas de T. cruzi...............................104
V. DISCUSSÃO ..........................................................................................................107
VI. CONCLUSÕES ....................................................................................................119
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................123
VIII. ANEXOS ............................................................................................................142
I. INTRODUÇÃO
2
I.1 FAMÍLIA TRYPANOSOMATIDAE
I.1.a) Introdução
O Reino Protista abriga uma grande variedade de protozoários, que estão entre
os eucariotos mais primitivos na escala evolutiva. Por esse motivo, não é surpreendente
que tais organismos apresentem propriedades biológicas não encontradas em qualquer
outro ser. As estruturas e processos celulares únicos, aliados à capacidade de adaptação
a diferentes ambientes, fazem com que os protistas sejam alvo de grande interesse de
estudo. Dentro deste Reino, a família Trypanosomatidae (tabela I) tem recebido especial
atenção por compreender protozoários causadores de doenças de interesse médico,
agrícola e veterinário.
Os tripanosomatídeos são classificados taxonomicamente dentro da ordem
Kinetoplastida, que engloba protozoários flagelados de vida livre assim como parasitas
de insetos, plantas e vertebrados. O nome desta ordem deriva da presença de uma
estrutura singular, o cinetoplasto, que ocorre como uma massa de DNA extranuclear
Tabela I: Classificação taxonômica da família Trypanosomatidae
REINO: Protista
SUB-REINO: Protozoa
FILO: Sarcomastigophora
SUB-FILO: Mastigophora
CLASSE: Zoomastigophorea
ORDEM: Kinetoplastida
FAMÍLIA: Trypanosomatidae
3
concentrado na mitocôndria única destes protistas (Moreira, López-Garcia &
Vickerman, 2004). Os tripanosomatídeos assumem relevância médica e econômica, uma
vez que vários membros da família são agentes etiológicos de doenças humanas de
grande impacto social, especialmente em países da América Central, América do Sul e
África. A doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi, a doença do sono,
causada pelo Trypanosoma brucei e as leishmanioses, causadas por diferentes espécies
de Leishmania são exemplos de morbidades que causam milhões de mortes em todo o
mundo (WHO, 2006).
Dentro da família Trypanosomatidae, um pequeno número de espécies apresenta
uma bactéria simbiótica em seu citoplasma, que se divide sincronicamente com a célula
hospedeira. Como exemplos, podemos citar Blastocrithidia culicis (Brueske, 1967),
Crithidia oncopelti (Gill & Vogel, 1963), Crithidia deanei (Mundim et al., 1974),
Herpetomonas roitmani (Fiorini et al., 1989; Faria e Silva et al., 1991) e Crithidia
desouzai (Fiorini et al., 1989), todas isoladas do tubo digestivo de invertebrados. As
espécies que possuem endosimbionte apresentam menor exigência nutricional que os
demais tripanosomatídeos, podendo ser cultivadas em meio de cultura sem fonte de
hemina e purina, por exemplo. Isto porque, a bactéria simbiótica é capaz de sintetizar e
fornecer fatores de crescimento essenciais ao protozoário, estabelecendo ciclos
metabólicos completos com o seu hospedeiro. Além da influência nutricional, a
presença do simbionte promove alterações ultraestruturais e físico-químicas
irreversíveis na célula hospedeira (revisto por De Souza & Motta, 1999).
4
I.1.b) Características morfológicas
Além das organelas típicas da maioria das células eucarióticas, como núcleo,
retículo endoplasmático, complexo de Golgi e mitocôndria, os tripanosomatídeos
apresentam algumas estruturas peculiares (figura 1), como os microtúbulos
subpeliculares, a estrutura paraflagelar, o cinetoplasto, os glicosomos e os
acidocalcisomos (revisto por De Souza, 2002).
Microtúbulos
subpeliculares
Nucléolo
Golgi
Acidocalcisomo
Glicosomo
Axonema
Estrutura paraflagelar
Bolsa flagelar
Cinetoplasto
Mitocôndria
Núcleo
Microtúbulos
subpeliculares
Nucléolo
Golgi
Acidocalcisomo
Glicosomo
Axonema
Estrutura paraflagelar
Bolsa flagelar
Cinetoplasto
Mitocôndria
Núcleo
Figura 1- Aspectos gerais da ultraestrutura de um tripanosomatídeo
(esquema concebido por Flávia Moreira Leite)
5
A superfície celular dos tripanosomatídeos é composta pela membrana
plasmática e imediatamente abaixo dela está presente uma camada de microtúbulos
subpeliculares. Estes se encontram distribuídos por todo o corpo do protozoário, exceto
na região de ligação do flagelo ao corpo celular e na região da bolsa flagelar (De Souza,
2002). Em tripanosomatídeos que possuem endosimbionte, também estão ausentes nas
regiões onde os ramos mitocondriais tocam a membrana plasmática (Freymuller &
Camargo, 1981). Os microtúbulos subpeliculares estão conectados uns aos outros e à
membrana plasmática por pontes de natureza protéica, criando uma trama que confere
estabilidade e é responsável pela resistência à ruptura por efeitos mecânicos (De Souza,
2002).
Todos os membros da família Trypanosomatidae apresentam um flagelo típico
(formado por 9 pares de microtúbulos periféricos e um par central), que emerge de uma
invaginação da membrana plasmática conhecida como bolsa flagelar. Um complexo
arranjo de filamentos protéicos, chamado estrutura paraflagelar, encontra-se associado
ao flagelo destes protozoários (revisto por Gull, 1999). Mutantes que não expressam as
proteínas majoritárias da estrutura paraflagelar apresentam mobilidade reduzida,
padrões de batimento flagelar alterado, ou ainda completa imobilidade (revisto por
Landfear & Ignatushchenko, 2001). Por muito tempo se acreditou que os
tripanosomatídeos com endosimbionte não apresentavam estrutura paraflagelar. Porém,
Gadelha e colaboradores (2005) demonstraram que C. deanei expressa uma proteína
majoritária da estrutura paraflagelar, que embora reduzida, também está presente neste
protozoário.
Em relação à mitocôndria dos tripanosomatídeos, esta é única e ramificada e se
estende por todo o corpo celular. Em uma determinada porção da mitocôndria existe
uma região alargada, que acumula o DNA mitocondrial, conhecida como cinetoplasto.
6
O DNA do cinetoplasto, também chamado de kDNA, é constituído por moléculas
circulares que estão interligadas formando um extensa rede (Shlomai, 1994). O
cinetoplasto se encontra localizado próximo ao corpo basal, perpendicularmente ao eixo
do flagelo e está fisicamente conectado ao corpo basal por meio de filamentos de
natureza desconhecida (Robinson & Gull, 1991). A posição do cinetoplasto em relação
ao núcleo é um dos critérios utilizados para classificar as diferentes formas evolutivas
que existem na família, são elas: amastigota, epimastigota, tripomastigota,
coanomastigota, esferomastigota, promastigota, paramastigota e opistomastigota (Hoare
& Wallace, 1966).
Um tipo especial de peroxisomo encontra-se presente nos tripanosomatídeos e
acumula enzimas da via glicolítica evolvidas na conversão da glicose a 3-fosfoglicerato.
Devido ao seu conteúdo, tal estrutura foi chamada de glicosomo. Os glicosomos são
envoltos por uma unidade de membrana e não possuem DNA, de modo que as proteínas
constituintes deste compartimento são codificadas por genes nucleares e importadas
pós-traducionalmente para a organela (Opperdoes & Borst, 1977, Opperdoes, 1987).
Estruturas envoltas por uma unidade de membrana e com conteúdo elétron-
denso no interior também estão presentes no citoplasma dos tripanosomatídeos.
Análises por microscopia eletrônica analítica indicam a presença de polifosfatos, cálcio,
magnésio, sódio e zinco no interior destes compartimentos. Devido ao alto teor de
cálcio, a organela foi chamada de acidocalcisomo. Tal organela varia em número de
espécie para espécie e ainda de acordo com os diferentes estágios de desenvolvimento
de uma mesma espécie. Os acidocalcisomos provavelmente estão envolvidos em
diversos processos biológicos, tais como o armazenamento de cálcio e polifosfatos,
adaptação dos tripanosomatídeos a condições de stress ambiental, manutenção do pH
intracelular e osmorregulação (revisto por Docampo et al., 2005).
7
I.1.c) Ciclo de vida dos tripanosomatídeos
A família Trypanosomatidae abriga protozoários heteroxênicos, isto é, que
alternam seu ciclo de vida entre dois hospedeiros e protozoários monoxênicos, que
apresentam durante seu ciclo de vida um único hospedeiro invertebrado (revisto por De
Souza, 1999).
Os tripanosomatídeos monoxênicos não são patogênicos ao homem. No entanto,
o interesse no estudo destes protozoários tem aumentado após relatos recentes
demonstrarem que tais microorganismos podem atuar como patógenos oportunistas,
causando infecções em pacientes imunocomprometidos (Dedet JP & Pratlong F., 2000).
Espécies dos gêneros Crithidia, Blastocrithidia, Herpetomonas e Leptomonas são
exemplos de protozoários monoxênicos.
Dentre os tripanosomatídeos heteroxênicos encontram-se o Trypanosoma cruzi
e espécies do gênero Leishmania. O T. cruzi apresenta um ciclo de vida complexo, que
envolve pelo menos três formas evolutivas e dois hospedeiros, um inseto vetor e o
hospedeiro vertebrado mamífero. Durante o ciclo de vida, o parasita sofre alterações
morfológicas, ultraestruturais e bioquímicas. Formas epimastigotas replicativas do T.
cruzi, que se encontram no intestino do inseto vetor, se multiplicam, aderem à superfície
do intestino e se transformam em tripomastigotas metacíclicos, formas não
proliferativas capazes de infectar o hospedeiro vertebrado. Durante o repasto alimentar
do inseto, os tripomastigotas metacíclicos são eliminados junto com as fezes e urina e
podem penetrar facilmente através das mucosas e das conjuntivas ou de qualquer
solução de continuidade da pele. Feridas causadas pelo ato de coçar e o próprio local da
picada são pontos favoráveis para a invasão do protozoário. Na região onde se deu a
penetração, os tripomastigotas são fagocitados pelos macrófagos, transformam-se em
8
amastigotas e rompem a membrana do vacúolo parasitóforo, invadindo o citoplasma da
célula hospedeira. Após sucessivas divisões no citoplasma, os amastigotas se
diferenciam em tripomastigotas e as células hospedeiras rompem, liberando os parasitas
na corrente sanguínea (tripomastigotas sanguíneos). Alguns parasitas invadem novas
células da vizinhança, enquanto outros são disseminados pela corrente sanguínea, indo
colonizar diversos órgãos e tecidos, repetindo o ciclo intracelular. Eventualmente, os
triatomíneos se alimentam do sangue de um animal infectado e ingerem tripomastigotas
metacíclicos, que se transformam novamente em epimastigotas replicativos no intestino
do inseto, fechando assim o ciclo de vida do protozoário - figura 2 (revisto por De
Souza, 2002). Na maior parte dos casos, o T. cruzi é transmitido ao homem como
descrito acima, por insetos hematófagos infectados da família Reduviidae, subfamília
Triatominae. Entretanto, a transmissão congênita, por via oral ou por transfusão de
sangue também pode ocorrer, porém com menor freqüência (Rey, 2002).
A transformação da forma epimastigota do T. cruzi em tripomastigota
metacíclico (metaciclogênese) é de grande interesse de estudo, já que envolve a
mudança de uma forma não patogênica em uma patogênica. Este processo, que ocorre
naturalmente no intestino do inseto vetor, pode ser mimetizado in vitro utilizando-se
meio quimicamente definido que simula as condições da urina do inseto vetor
(Contreras et al., 1985). O processo de amastigogênese, no qual tripomastigotas
metacíclicos se transformam em amastigotas, também pode ser mimetizado in vitro
(Contreras et al, 2002). Tais processos envolvem mudanças morfológicas, metabólicas e
genéticas do parasita, além de promoverem alterações em estruturas celulares, como no
arranjo de DNA do cinetoplasto (Soares et al., 1989). Nas formas amastigota e
epimastigota de T. cruzi, o DNA do cinetoplasto se apresenta mais condensado quando
comparado à forma tripomastigota (De Souza, 1999).
9
Figura 2- Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi
sanguíneas
10
I.2. CINETOPLASTO
I.2.a) Histórico
As primeiras indicações sobre a existência do cinetoplasto foram feitas há
aproximadamente 100 anos, com a descoberta de uma estrutura próxima a base do
flagelo dos tripanosomas, que era marcada fortemente com corantes básicos. Em 1917,
Alexeieff nomeou tal estrutura de cinetoplasto (cineto = movimento), já que se
acreditava que por sua localização, esta estaria envolvida com a motilidade dos
protozoários. Somente nos anos 60, com os primeiros estudos desta estrutura, se pôde
mostrar que o caráter basófilo do cinetoplasto era atribuído à alta concentração de DNA
em seu interior. A notável configuração molecular do material genético contido no
cinetoplasto só foi revelada no final dos anos 60, por estudos de microscopia eletrônica
(revisto por Shapiro & Englund, 1995; Maslov, Podlipaev & Lukes, 2001). Hoje se sabe
que o cinetoplasto é uma estrutura ímpar na natureza, encontrada na mitocôndria única
dos protozoários flagelados da ordem Kinetoplastida. Tal estrutura abriga o DNA
mitocondrial, ou kDNA, em uma organização diferente de qualquer outra descrita na
natureza.
I.2.b) Variações na estrutura do kDNA
A ordem Kinetoplastida engloba as famílias Trypanosomatidae, Bodonidae e
Cryptobiidae, sendo caracterizada pela presença do cinetoplasto. Quase todo o
conhecimento sobre a organização do DNA do cinetoplasto provém de estudos com os
tripanosomatídeos, o que nos leva a pensar que todos os cinetoplastos são iguais, com
11
variações muito pequenas (Lukes et al., 2002). Entretanto, o kDNA pode assumir
diferentes padrões de distribuição entre os cinetoplastídeos (figura 3), estando
concentrado como uma única massa próxima à base do flagelo (eucinetoplasto) ou
disperso através do lúmen mitocondrial, tanto como massas difusas (pancinetoplasto)
como em discretos focos distintos (policinetoplasto) (revisto por Moreira, López-Garcia
& Vickerman, 2004). Análises detalhadas do cinetoplasto dos membros da ordem
Kinetoplastida revelam um grau de complexidade ainda maior. Os tripanosomatídeos e
o protozoário ancestral de vida livre Bodo saltans, por exemplo, são espécies que
apresentam eucinetoplasto. No entanto, o kDNA é formado por moléculas circulares
topologicamente interligadas nos tripanosomatídeos, enquanto que em B. saltans as
moléculas circulares não se encontram catenadas. Já em Bodo caudatus, um organismo
pancinetoplástico, as moléculas circulares se encontram superenoveladas ao invés de
relaxadas, como nos tripanosomatídeos (Simpson, Lukes & Roger, 2002).
Figura 3: Variações na organização do kDNA (baseado em Lukes et al., 2002). O kDNA de
Bodo caudatus e de espécies do gênero Cryptobia se distribui difusamente pela matriz
mitocondrial (pancinetoplasto). Já o kDNA de espécies do gênero Dimastigella se distribui
como nódulos distintos pelo lúmem da mitocôndria (policinetoplasto). Os tripanosomatídeos
possuem o kDNA organizado como uma única massa próxima ao flagelo (eucinetoplasto). n:
núcleo, k: cinetoplasto, fl: flagelo e m: mitocôndria.
12
I.2.c) Características gerais da rede de kDNA dos tripanosomatídeos
O DNA mitocondrial dos tripanosomatídeos, ou kDNA, tem sido
extensivamente estudado, sendo único em estrutura, função e mecanismo de replicação.
O kDNA encontra-se encerrado em uma pequena porção da mitocôndria, o cinetoplasto,
sendo formado por milhares de moléculas circulares, topologicamente relaxadas e
interligadas umas as outras (figura 4). Este arranjo contém aproximadamente 30% do
DNA total dos tripanosomatídeos (Shapiro & Englund, 1995).
Figura 4: Representação esquemática da rede de kDNA isolada, formada por moléculas
circulares interligadas. Quando a rede não está em processo replicativo, cada círculo se liga a 3
círculos vizinhos, ou seja, apresenta valência igual a 3, exceto os círculos da periferia que se
ligam a duas outras moléculas (Shapiro & Englund, 1995).
Alguns autores tentam entender a razão pela qual o kDNA se encontra
organizado como um rede de círculos topologicamente interligados. Para Borst (1991),
esta organização do DNA seria importante para assegurar uma segregação igualitária
dos círculos durante a divisão celular, já que a informação genética está distribuída em
múltiplos círculos de DNA não idênticos. Entretanto, alguns cinetoplastídeos ancestrais,
como os bodonídeos, apresentam círculos não catenados, o que indica que a catenação
não é essencial para a segregação dos mesmos. Baseado nesta observação, Hajduk e
colaboradores (1986) sugeriram que a organização do k-DNA nos tripanosomatídeos
13
pode ter evoluído como um modo conveniente de armazenar uma grande quantidade de
DNA em um pequeno espaço. Shapiro & Englund (1995) propõem ainda que tal arranjo
facilitaria a interação entre os transcritos dos maxicírculos e minicírculos, contribuindo
para a ocorrência do processo de edição do mRNA dos maxicírculos, a ser discutido
adiante.
Outro fator surpreendente na organização do kDNA dos tripanosomatídeos
refere-se ao fato dos círculos se encontrarem topologicamente relaxados, ao contrário de
qualquer outro DNA circular conhecido na natureza, que apresenta superenovelamento
negativo. Como existe mais espaço no centro de um círculo relaxado do que no círculo
superenovelado, isto facilitaria a interpenetração e catenação das moléculas de DNA
para formar a rede. Uma vez que o superenovelamento fornece energia para o
desenrolamento da fita de DNA em processos biológicos importantes, como transcrição
e replicação, os tripanosomatídeos devem ter sacrificado as vantagens do
superenovelamento para que os círculos de DNA pudessem ser montados em uma rede
compacta que coubesse no pequeno espaço da matriz mitocondrial (Englund et al.,
1996).
Ainda que o cinetoplasto de todos os tripanosomatídeos seja formado por
moléculas circulares relaxadas e catenadas, diferentes arranjos da rede de kDNA podem
ser observados entre os membros desta família. Em formas amastigota e epimastigota
de T. cruzi e nos outros protozoários da família de um modo geral, as fibrilas de kDNA
se apresentam bastante compactadas e contidas em um cinetoplasto em forma de bastão
(figura 5B). Em tripomastigotas de T. cruzi, a rede de kDNA torna-se menos compacta e
a forma em bastão do cinetoplasto dá lugar a uma forma arredondada - figura 5C (De
Souza, 1984). Já os tripanosomatídeos que contêm endosimbionte possuem uma
organização característica do cinetoplasto, apresentando fibrilas de DNA organizadas
14
em um arranjo mais largo e frouxo, que preenche toda a matriz do cinetoplasto - figura
5A (Freymuller & Camargo, 1981). Os vários graus de compactação do kDNA em
tripanosomatídeos podem estar relacionados com a ação de proteínas que condensam o
DNA.
Figura 5- Diferentes arranjos da rede de kDNA nos tripanosomatídeos. (A) B. culicis, uma
espécie com endosimbionte (B) epimastigota de T.cruzi e (C) tripomastigota de T. cruzi. Fotos
A e B retiradas de Cavalcanti et al., 2004. Foto C- Cavalcanti, D.P.
O cinetoplasto de todos os tripanosomatídeos encontra-se localizado próximo ao
corpo basal, perpendicularmente ao eixo do flagelo. Em alguns tripanosomatídeos que
sofrem diferenciação ao longo de seu ciclo de vida, como o T. cruzi, o cinetoplasto
muda de posição dentro da célula, passando da região anterior (nos epimastigotas) para
a região posterior (nos tripomastigotas), porém permanecendo próximo e perpendicular
ao corpo basal. Apesar da observação de que estas duas estruturas encontravam-se
sempre próximas, evidências diretas de que o cinetoplasto é fisicamente conectado ao
corpo basal surgiram somente no início dos anos 90, a partir de estudos em T. brucei
(Robinson & Gull, 1991). Em 2003, Ogbadoyi, Robinson & Gull, demonstraram a
existência de um grupo de filamentos citoplasmáticos, que chamaram de complexo de
48.000x
57.000x
60.000x
CC
15
ligação tripartite (TAC), conectando o kDNA ao corpo basal. Segundo os autores, este
complexo seria responsável pelo posicionamento espacial do cinetoplasto e por sua
segregação (figura 6). Além disso, o TAC poderia representar um sistema remanescente
de um mecanismo evolutivo arcaico para segregação de genomas (Robinson & Gull,
1991; Ogbadoyi, Robinson & Gull, 2003).
Figura 6: Diagrama esquemático do complexo de ligação tripartite (TAC) em tripanosomas
(retirado de Liu et al., 2005). O TAC é formado por 3 estruturas: os filamentos da zona de
exclusão, as membranas mitocondriais diferenciadas e os filamentos unilaterais. Os filamentos
da zona de exclusão ocupam a área entre o corpo basal e a membrana mitocondrial externa,
sendo que sua presença exclui os ribossomos citoplasmáticos. Os filamentos unilaterais ligam o
kDNA à membrana mitocondrial interna. Entre os dois grupos de filamentos, existe uma região
de membrana mitocondrial diferenciada, mais paralela que as outras áreas da membrana, sem
cristas e resistente à extração por detergente (Ogbadoyi, Robinson & Gull, 2003).
Corpo basal
Flagelo
Filamentos da zona de exclusão
Filamentos unilaterais
Membranas mitocondriais diferenciadas
kDNA
Membrana mitocondrial
Corpo pró-basal
16
I.2.d) Composição da rede de kDNA
O DNA do cinetoplasto é formado por dois tipos de moléculas circulares: os
minicírculos, de tamanho entre 0,5 e 2,5 kb, e os maxicírculos, que apresentam entre 20
e 40 kb. Cerca de 10.000 minicírculos e 50 maxicírculos se encontram catenados
formando uma extensa rede (figura 7).
Figura 7: Rede de kDNA isolada de C. fasciculata. Os pequenos laços correspondem ao
minicírculos, enquanto fitas maiores (seta) são partes de maxicírculos (Liu et al., 2005).
Os maxicírculos, assim como o DNA mitocondrial de outros eucariotos,
codificam RNAs ribosomais e diversas proteínas da cadeia respiratória, incluindo
subunidades da citocromo oxidase e NADH desidrogenase (revisto por Shapiro &
Englund, 1995). Entretanto, a expressão gênica na mitocôndria destes protozoários
envolve um esforço cooperativo entre os transcritos dos minicírculos e maxicírculos.
Isto porque, os transcritos dos maxicírculos são processados pós-transcricionalmente
para formar mRNAs funcionais, através de um processo conhecido como edição ou
editoração do RNA. A editoração do RNA consiste na inserção ou retirada de resíduos
17
de uridina em sítios específicos dos RNAs transcritos pelos maxicírculos, a fim de criar
códons de iniciação ou terminação, mudanças na fase de leitura ou quadros abertos de
leitura a partir de seqüências sem sentido. O processo de edição é especificado por
pequenos RNAs guias, produzidos pelos minicírculos, e catalisado por um complexo
multiprotéico, o editosomo, em diverso ciclos coordenados de reações enzimáticas
(revisto por Estévez & Simpson, 1999 e por Stuart & Panigrahi, 2002).
Os minicírculos de cada espécie são altamente heterogêneos quanto à seqüência
de nucleotídeos, o que parece refletir a necessidade de um número de RNAs guia
suficiente para o extensivo processo de editoração do RNA que ocorre nestes
protozoários. Apesar da heterogeneidade, os minicírculos apresentam pelo menos duas
regiões conservadas: o dodecâmero GGGGTTGGTGTA, conhecido como seqüência
universal dos minicírculos (UMS) e o hexâmero ACGCCC, que correspondem à origem
de replicação da fita L (Light) e da fita H (Heavy), respectivamente. Já os maxicírculos
de uma dada espécie são mais homogêneos quanto às seqüências de DNA, apresentando
uma região codificante conservada e uma região variável não codificante com
seqüências repetitivas. A variação do tamanho dos maxicírculos entre as diferentes
espécies reflete principalmente diferenças nas regiões variáveis dessa molécula e no
número de suas repetições. A região variável contém a origem de replicação dos
maxicírculos (revisto por Shlomai, 1994).
18
I.2.e) Replicação da rede de kDNA
Na maioria dos eucariotos, a replicação do DNA mitocondrial ocorre
continuamente ao longo do ciclo celular. Entretanto, nos tripanosomatídeos, a
replicação do kDNA é periódica e coordenada com a fase S nuclear (Hines & Ray,
1997). A replicação dos minicírculos se inicia quando estes são individualmente
decatenados da rede de kDNA pela ação de DNA topoisomerases do tipo II. Os
minicírculos são liberados da rede em direção a zona cinetoflagelar (KFZ), uma região
especializada da matriz mitocondrial entre o kDNA e o corpo basal, que abriga
proteínas envolvidas com o início da replicação (figura 8). Em seguida, os círculos
migram (ou são transportados) para os pólos opostos da rede de kDNA, para completar
sua replicação.
Figura 8: A figura mostra a zona
cinetoflagelar (KFZ), onde se inicia a
replicação dos minicírculos. Nos pólos
opostos da rede de kDNA (As) a
replicação é finalizada. Em vermelho
um minicírculo livre. KD = rede de
kDNA (Liu et al., 2005).
O início da replicação dos minicírculos na região cinetoflagelar envolve a
montagem de um complexo protéico na origem de replicação dos círculos, com a
participação da primase, polimerase e proteínas que se ligam à seqüência universal de
minicírculos (UMSBP). Estas e outras proteínas geram uma forquilha de replicação, que
se propaga unidirecionalmente formando uma estrutura tipo-θ intermediária, com a
síntese de uma nova fita L contínua e uma fita H descontínua (figura 9).
AS
19
Minicírculos em replicação
(estrutura tipo tipo-θ )
Minicírculos livres
Cinetoplasto
Minicírculos pós-replicação
Minicírculos em replicação
(estrutura tipo tipo-θ )
Minicírculos livres
Cinetoplasto
Minicírculos pós-replicação
Figura 9: Mecanismo de replicação dos minicírculos. A replicação dos minicírculos tem início
na zona cinetoflagelar, quando a seqüência universal de minicírculos (UMS) é reconhecida por
proteínas que se ligam à essa região (UMSBP). Em seguida, um primer complementar a UMS é
sintetizado por uma primase, sendo posteriormente estendido por uma DNA polimerase.
Quando a nova fita L nascente atinge cerca de 100 nucleotídeos, a fita parental já se encontra
deslocada o suficiente para permitir que a origem de replicação da fita H seja exposta, iniciando
a replicação desta outra fita. As proteínas geram uma forquilha de replicação que se propaga
unidirecionalmente, formando uma estrutura tipo-θ, com a síntese de uma nova fita L contínua e
de uma fita H descontínua.
Os minicírculos recém-replicados migram da zona KFZ para dois complexos
protéicos situados nos pólos diametralmente opostos do cinetoplasto, onde os próximos
passos de replicação irão ocorrer (figura 10). Estes passos incluem: remoção dos
primers pela ação de endonucleases, preenchimento de alguns intervalos entre os
fragmentos de Okazaki pela DNA polimerase β e união dos cortes (nicks) por uma
DNA ligase. Após estas etapas, os novos círculos sintetizados, que ainda possuem pelo
menos uma interrupção em sua seqüência, são reunidos à periferia da rede pela ação de
20
topoisomerases II. Os intervalos presentes nos minicírculos (resultantes da remoção do
primer da fita L contínua ou da não ligação dos fragmentos de Okazaki da fita H
descontínua), permitem distinguir os minicírculos já replicados daqueles que ainda não
sofreram replicação, assegurando que cada círculo seja replicado somente uma vez por
ciclo celular. Após todos os minicírculos terem sido replicados, os intervalos são
reparados. Pouco se sabe sobre o processo de replicação dos maxicírculos. Assim como
os minicírculos, os maxicírculos também sofrem replicação unidirecional, que se inicia
em uma origem contida na região variável da molécula, formando estruturas tipo-θ.
Entretanto, ao contrário dos minicírculos, eles permanecem ligados à rede de kDNA
durante o processo replicativo (revisto por Klingbeil et al., 2001, Liu et al., 2005).
Localização de:
Zona cinetoflagelar
(KFZ)
Corpo basal
Complexo de replicação em um
dos sítios diametralmente opostos
da rede de kDNA
Localização de:
Zona cinetoflagelar
(KFZ)
Corpo basal
Complexo de replicação em um
dos sítios diametralmente opostos
da rede de kDNA
Figura 10: Mecanismo de replicação da rede de kDNA (Liu et al., 2005). Os minicírculos recém
replicados migram da zona cinetoflagelar (setas vermelhas) para os dois complexos protéicos
situados nos pólos opostos da rede.
21
Uma questão intrigante em relação aos minicírculos diz respeito a sua
distribuição por toda rede de kDNA após o processo replicativo, uma vez que os
círculos recém sintetizados são religados à rede nas regiões adjacentes aos complexos
de replicação. Como tais complexos encontram-se situados nos pólos diametralmente
opostos do cinetoplasto, seria de se esperar que os novos círculos se acumulassem
somente nesta região. Entretanto, ensaios utilizando
3
H timidina ou nucleotídeos
fluorescentes demonstraram que em C. fasciculata, T. cruzi, Leishmania tarentolae,
Leishmania donovani e Phytomonas serpens, os minicírculos recém-sintetizados são
religados uniformemente ao redor da periferia da rede de kDNA, formando um anel que
cresce em espessura a medida que a replicação procede - figura 11b (Pérez-Morga &
Englund, 1993, Guilbride & Englund, 1998). Para explicar este padrão anular de
replicação, os autores propõem uma rotação do cinetoplasto como maneira de distribuir
os novos círculos replicados pela rede de kDNA (figura 11d). Entretanto, estudos com
T. brucei sugerem uma diferença fundamental no mecanismo de replicação. Neste
protozoário se assume que o cinetoplasto não apresente movimento de rotação e que os
círculos recém sintetizados se aglomerem nos pólos opostos da rede de kDNA - figuras
11a e 11c (modelo polar de replicação). Entretanto, estudos recentes têm sugerido a
possibilidade de movimentação do cinetoplasto de T. brucei, que ao invés da rotação
poderia oscilar para frente e para trás, distribuindo os novos círculos ao redor dos pólos
(revisto por Liu et al., 2005).
22
Figura 11: Distribuição dos novos minicírculos sintetizados em uma rede de kDNA em
replicação. Redes foram isoladas de (a) T. brucei e (b) T. cruzi. Minicírculos com intervalos em
suas seqüências foram marcados com nucleotídeo fluorescente (verde) usando terminal
deoxynucleotidyl transferase (TdT). Em azul, a mesma rede corada com DAPI. Em (c)
representação esquemática do modelo polar de replicação do T. brucei e em (d) do modelo
anular de replicação de T. cruzi e C. fasciculata (retirado de Liu et al., 2005).
I.2.f) Proteínas envolvidas na organização e replicação da rede de kDNA
Algumas proteínas envolvidas na manutenção e na replicação da rede de kDNA
têm sido caracterizadas nos últimos anos (tabela II). Muitas delas foram
imunolocalizadas em diferentes sítios do cinetoplasto (figura 10). Enzimas envolvidas
na replicação, como as topoisomerases II (Melendy, Sheline & Ray, 1988), DNA
polimerase β (Ferguson et al., 1992) e a ribonuclease SSE1 (Engel & Ray, 1998) se
localizam nos pólos diametralmente opostos da rede de kDNA. Já a primase se localiza
nas faces anterior e posterior do disco (Johnson & Englund, 1999). A localização de
algumas dessas enzimas se altera quando as células se encontram em um estágio não
replicativo (Johnson & Englund, 1998).
23
Tabela II: Algumas proteínas envolvidas na estrutura e replicação do kDNA
Proteína Função Organismo
DNA polimerase β
Preencher pequenos intervalos na
seqüência de DNA
C. fasciculata
1
DNA primase
Sintetizar pequenos
oligoribonucleotídeos que servem como
primers para o início da síntese de DNA
C. fasciculata
2
Ribonuclease H
Remoção dos primers
C. fasciculata
3
Topoisomerase II
Atividade catalítica: catenação e
decatenação dos círculos de DNA; papel
estrutural: ancorar maxicírculos à
membrana mitocondrial
C. fasciculata
4-5
L. donovani
6
T. brucei
7-8
T. cruzi
9-10
B. culicis
11
UMSBP (Proteínas que se
ligam à seqüência universal
de minicírculos)
Reconhecer e se ligar à origem de
replicação
C. fasciculata
12
T. cruzi
13
Proteínas histona-like
Condensar a rede de kDNA
C. fasciculata
14-15
Proteínas heat-shock
Facilitar a importação de proteínas para
mitocôndria e podem estar envolvidas na
montagem e desmontagem de complexos
protéicos, como o complexo de
replicação e o de edição do RNA
C. fasciculata
16
L. major
17
T. cruzi
18
(1) Torri & Englund, 1992; (2) Li & Englund, 1997; (3) Engel & Ray, 1998; (4) Shlomai et al., 1984;
(5) Melendy & Ray, 1989; (6) Chakraborty & Majumder, 1987; (7) Strauss & Wang, 1990;
(8) Kulikowicz & Shapiro, 2006; (9) Douc-Rasy et al., 1986; (10) Fragoso & Goldenberg, 1992;
(11) Lourenço et al., 2006 (12) Tzfati et al., 1992; (13) Coelho et al., 2003, (14) Xu & Ray, 1993;
(15) Tittawella et al., 1993; (16) Effron et al., 1993; (17) Searle et al., 1993; (18) Engman et al., 1989.
24
I.3 DNA TOPOISOMERASES
I.3.a) Considerações gerais
A manipulação topológica da molécula de DNA é um fator determinante para
vários processos biológicos ligados ao seu metabolismo. A necessidade de acessar a
informação genética armazenada no DNA em eventos como a replicação, a transcrição e
a recombinação, requer que as duas fitas da dupla hélice sejam separadas. No entanto,
estas fitas não estão simplesmente dispostas lado a lado, mas sim enroladas uma sobre a
outra. Isto significa que para separá-las, uma deve girar ao redor da outra no espaço. Se
imaginarmos a estrutura do DNA em termos de uma extremidade livre, tal movimento
não encontraria qualquer dificuldade para ocorrer. Porém, a molécula de DNA in vivo
comporta-se com uma estrutura fechada que não dispõe de extremidades livres, assim
como as moléculas de DNA circulares. Desse modo, a separação das fitas
inevitavelmente gera uma tensão na dupla hélice, que tem como resposta o surgimento
de superenovelamentos na molécula (figura 12). O superenovelamento excessivo do
DNA pode se tornar um obstáculo insuperável ao avanço da forquilha de replicação ou
ao movimento da RNA polimerase durante a transcrição. Além disso, a associação do
DNA com histonas e outras proteínas também introduz enovelamentos no DNA, que
devem ser relaxados. Tais problemas topológicos inerentes ao metabolismo do DNA
podem ser superados pela introdução de um corte transitório em uma das fitas do DNA,
catalisado por enzimas conhecidas como DNA topoisomerases (Lewin, 2001,
Champoux, 2001).
25
DNA com extremidade livre
DNA com extremidades fixas
DNA com 10 pares de
bases desespiralizadas
(uma volta na hélice)
DNA com 10 pares de
bases desespiralizadas
(uma volta na hélice)
Superenovelamento negativo
abertura da hélice facilitada
A hélice de DNA forma
um superenovelamento
Superenovelamento positivo
abertura da hélice dificultada
molécula protéica
DNA
(A)
(C)
(B)
DNA com extremidade livre
DNA com extremidades fixas
DNA com 10 pares de
bases desespiralizadas
(uma volta na hélice)
DNA com 10 pares de
bases desespiralizadas
(uma volta na hélice)
Superenovelamento negativo
abertura da hélice facilitada
A hélice de DNA forma
um superenovelamento
Superenovelamento positivo
abertura da hélice dificultada
molécula protéica
DNA
(A)
(C)
(B)
Figura 12: A tensão no DNA causa superenovelamento. (A) Para uma molécula de DNA com
uma extremidade livre (ou com uma quebra em uma das fitas), a dupla hélice gira uma volta a
cada 10 pares de nucleotídeos abertos. (B) Se a rotação é impedida, ocorre introdução de tensão
no DNA quando a hélice é aberta, que tem como resposta o surgimento de superenovelamento
na molécula. (C) Superenovelamentos são introduzidos no DNA por uma proteína que trafega
sobre a dupla hélice. Sob estas condições, o movimento da proteína provoca um excesso de
giros que se acumulam no DNA à sua frente e um déficit de giros atrás (figura adaptada de
Alberts et al., 2004). No superenovelamento positivo, o enrolamento da dupla hélice no espaço
se dá na mesma direção do enrolamento das duas fitas do dúplex de DNA, ao contrário do
superenovelamento negativo que se dá em sentido oposto (Lewin, 2001).
26
As DNA topoisomerases são enzimas ubíquas, sendo encontradas nos três
domínios da natureza (Bacteria, Archaea e Eukarya), além de terem sido descritas em
vírus. Elas representam uma classe heterogênea de enzimas que possuem diferentes
mecanismos de ação e atividades biológicas. Algumas destas enzimas podem relaxar
somente superenovelamentos negativos do DNA, outras podem relaxar tanto
enovelamentos negativos como positivos. Existem também as que introduzem
superenovelamentos negativos no DNA, como a girase bacteriana ou
superenovelamentos positivos como a girase reversa. Adicionalmente, as
topoisomerases podem promover a catenação e decatenação de moléculas circulares e
criar ou remover estruturas em forma de laço no DNA - figura 13 - (Champoux, 2001).
Superenovelado
Catenado
Relaxado
Decatenado
Formação/ remoção
de estruturas em laço
Superenovelado
Catenado
Relaxado
Decatenado
Formação/ remoção
de estruturas em laço
Figura 13: Representação esquemática de algumas reações catalisadas por
topoisomerases (Cheesman, 2000).
27
I.3.b) Mecanismos de ação das topoisomerases
As topoisomerases são divididas em duas classes, de acordo com seu mecanismo
de ação. As enzimas do tipo I (topo I) agem introduzindo uma quebra transitória em
uma das fitas de DNA, enquanto as do tipo II (topo II) clivam as duas fitas. Estas
enzimas podem ser adicionalmente agrupadas na subfamília A, quando se ligam ao
terminal 5
’
fosfato do DNA ou subfamília B, quando se ligam ao terminal 3
’
fosfato do
DNA (Champoux, 2001). A clivagem do DNA pelas topoisomerases é acompanhada
pela formação de uma ligação transitória entre um resíduo de tirosina da enzima e uma
das extremidades da fita clivada (Lewin, 2001).
A topoisomerase tipo I melhor caracterizada é a de E. coli, a qual relaxa DNA
com elevado grau de superenovelamento negativo. A topo I bacteriana liga-se a uma
região parcialmente desenrolada do DNA, quebra uma das fitas, puxa a outra fita
através da lacuna gerada e, finalmente, sela a lacuna (Lewin, 2001). As topoisomerases
I de eucariotos não apresentam similaridades de seqüência ou estrutural com as enzimas
procarióticas. Elas formam um intermediário covalente com a extremidade 3’ da fita
clivada e podem relaxar tanto enovelamentos positivos como negativos. O modelo para
a ação da topoisomerase I eucariótica está ilustrado na figura 14.
As topoisomerases II clivam uma região da fita dupla de DNA, criando desse
modo uma abertura ou intervalo. Uma segunda região de fita dupla de DNA, que pode
ser da mesma molécula ou não, atravessa o intervalo criado e em seguida a fita clivada é
selada (figura 15). A reação catalisada pela topoisomerase II geralmente requer hidrólise
de ATP. A DNA girase, uma topo II bacteriana, é a única enzima conhecida capaz de
introduzir superenovelamento negativo no DNA. Em E. coli, a enzima é um tetrâmero
formado por dois tipos de subunidades, GyrA e GyrB. A subunidade GyrA forma o sítio
28
que se liga ao DNA para depois clivá-lo, já a subunidade GyrB contém o domínio
ATPásico. Ambas subunidades são alvos de antibióticos.
uma das extremidades da dupla hélice de DNA
não pode girar em relação a outra extremidade
DNA topoisomerase
tipo I com uma tirosina
no sítio ativo
a DNA topoisomerase se liga
covalentemente a um fosfato do
DNA, quebrando uma ligação
fosfodiéster em uma das fitas
as duas extremidades da dupla
hélice de DNA podem agora girar
uma em relação a outra, aliviando
a tensão acumulada
a energia da ponte fosfodiéster original
é armazenada na ligação fosfotirosina,
tornando a reação reversível
reformação espontânea
da ligação fosfodiéster
regenera a hélice de DNA
e a DNA topoisomerase
uma das extremidades da dupla hélice de DNA
não pode girar em relação a outra extremidade
DNA topoisomerase
tipo I com uma tirosina
no sítio ativo
a DNA topoisomerase se liga
covalentemente a um fosfato do
DNA, quebrando uma ligação
fosfodiéster em uma das fitas
as duas extremidades da dupla
hélice de DNA podem agora girar
uma em relação a outra, aliviando
a tensão acumulada
a energia da ponte fosfodiéster original
é armazenada na ligação fosfotirosina,
tornando a reação reversível
reformação espontânea
da ligação fosfodiéster
regenera a hélice de DNA
e a DNA topoisomerase
Figura 14: A reação reversível de quebra catalisada
pela enzima DNA topoisomerase I eucariótica.
Retirado de Alberts et al., 2004.
Figura 15: A reação de passagem da hélice
de DNA catalisada pela topoisomerase II
(Alberts et al., 2004).
duas duplas hélices
de DNA circular
uma topoisomerase
do tipo II liga-se
covalentemente e de
modo reversível às
duas fitas de DNA,
interrompendo a
dupla hélice (em
laranja) e formando
uma“fenda” protéica
a fenda da
topoisomerase
abre e fecha,
Permitindo a
passagem da
segunda hélice
de DNA
a reversão
da ligação
covalente da
topoisomerase
restaura uma
dupla hélice
intacta
duas duplas hélices
de DNA circular
separadas
duas duplas hélices
de DNA circular
entrelaçadas
uma topoisomerase
do tipo II liga-se
covalentemente e de
modo reversível às
duas fitas de DNA,
interrompendo a
dupla hélice (em
laranja) e formando
uma“fenda” protéica
a fenda da
topoisomerase
abre e fecha,
permitindo a
passagem da
segunda hélice
de DNA
a reversão
da ligação
covalente da
topoisomerase
restaura uma
dupla hélice
intacta
duas duplas hélices
de DNA circular
separadas
uma das extremidades da dupla hélice de DNA
não pode girar em relação a outra extremidade
DNA topoisomerase
tipo I com uma tirosina
no sítio ativo
a DNA topoisomerase se liga
covalentemente a um fosfato do
DNA, quebrando uma ligação
fosfodiéster em uma das fitas
as duas extremidades da dupla
hélice de DNA podem agora girar
uma em relação a outra, aliviando
a tensão acumulada
a energia da ponte fosfodiéster original
é armazenada na ligação fosfotirosina,
tornando a reação reversível
reformação espontânea
da ligação fosfodiéster
regenera a hélice de DNA
e a DNA topoisomerase
uma das extremidades da dupla hélice de DNA
não pode girar em relação a outra extremidade
DNA topoisomerase
tipo I com uma tirosina
no sítio ativo
a DNA topoisomerase se liga
covalentemente a um fosfato do
DNA, quebrando uma ligação
fosfodiéster em uma das fitas
as duas extremidades da dupla
hélice de DNA podem agora girar
uma em relação a outra, aliviando
a tensão acumulada
a energia da ponte fosfodiéster original
é armazenada na ligação fosfotirosina,
tornando a reação reversível
reformação espontânea
da ligação fosfodiéster
regenera a hélice de DNA
e a DNA topoisomerase
Figura 14: A reação reversível de quebra catalisada
pela enzima DNA topoisomerase I eucariótica.
Retirado de Alberts et al., 2004.
Figura 15: A reação de passagem da hélice
de DNA catalisada pela topoisomerase II
(Alberts et al., 2004).
uma das extremidades da dupla hélice de DNA
não pode girar em relação a outra extremidade
DNA topoisomerase
tipo I com uma tirosina
no sítio ativo
a DNA topoisomerase se liga
covalentemente a um fosfato do
DNA, quebrando uma ligação
fosfodiéster em uma das fitas
as duas extremidades da dupla
hélice de DNA podem agora girar
uma em relação a outra, aliviando
a tensão acumulada
a energia da ponte fosfodiéster original
é armazenada na ligação fosfotirosina,
tornando a reação reversível
reformação espontânea
da ligação fosfodiéster
regenera a hélice de DNA
e a DNA topoisomerase
uma das extremidades da dupla hélice de DNA
não pode girar em relação a outra extremidade
DNA topoisomerase
tipo I com uma tirosina
no sítio ativo
a DNA topoisomerase se liga
covalentemente a um fosfato do
DNA, quebrando uma ligação
fosfodiéster em uma das fitas
as duas extremidades da dupla
hélice de DNA podem agora girar
uma em relação a outra, aliviando
a tensão acumulada
a energia da ponte fosfodiéster original
é armazenada na ligação fosfotirosina,
tornando a reação reversível
reformação espontânea
da ligação fosfodiéster
regenera a hélice de DNA
e a DNA topoisomerase
Figura 14: A reação reversível de quebra catalisada
pela enzima DNA topoisomerase I eucariótica.
Retirado de Alberts et al., 2004.
Figura 15: A reação de passagem da hélice
de DNA catalisada pela topoisomerase II
(Alberts et al., 2004).
duas duplas hélices
de DNA circular
uma topoisomerase
do tipo II liga-se
covalentemente e de
modo reversível às
duas fitas de DNA,
interrompendo a
dupla hélice (em
laranja) e formando
uma“fenda” protéica
a fenda da
topoisomerase
abre e fecha,
Permitindo a
passagem da
segunda hélice
de DNA
a reversão
da ligação
covalente da
topoisomerase
restaura uma
dupla hélice
intacta
duas duplas hélices
de DNA circular
separadas
duas duplas hélices
de DNA circular
entrelaçadas
uma topoisomerase
do tipo II liga-se
covalentemente e de
modo reversível às
duas fitas de DNA,
interrompendo a
dupla hélice (em
laranja) e formando
uma“fenda” protéica
a fenda da
topoisomerase
abre e fecha,
permitindo a
passagem da
segunda hélice
de DNA
a reversão
da ligação
covalente da
topoisomerase
restaura uma
dupla hélice
intacta
duas duplas hélices
de DNA circular
separadas
duas duplas hélices
de DNA circular
uma topoisomerase
do tipo II liga-se
covalentemente e de
modo reversível às
duas fitas de DNA,
interrompendo a
dupla hélice (em
laranja) e formando
uma“fenda” protéica
a fenda da
topoisomerase
abre e fecha,
Permitindo a
passagem da
segunda hélice
de DNA
a reversão
da ligação
covalente da
topoisomerase
restaura uma
dupla hélice
intacta
duas duplas hélices
de DNA circular
separadas
duas duplas hélices
de DNA circular
entrelaçadas
uma topoisomerase
do tipo II liga-se
covalentemente e de
modo reversível às
duas fitas de DNA,
interrompendo a
dupla hélice (em
laranja) e formando
uma“fenda” protéica
a fenda da
topoisomerase
abre e fecha,
permitindo a
passagem da
segunda hélice
de DNA
a reversão
da ligação
covalente da
topoisomerase
restaura uma
dupla hélice
intacta
duas duplas hélices
de DNA circular
separadas
29
I.3.c) Inibidores de DNA topoisomerases
O grande interesse no estudo das topoisomerases deriva não somente do papel
crucial que estas enzimas desempenham na topologia do DNA, mas também dos
grandes avanços realizados na área de quimioterapia (Champoux, 2001). Uma série de
drogas que têm como alvo topoisomerases, tanto de procariotos quanto de eucariotos,
têm sido desenvolvidas, sendo algumas delas utilizadas clinicamente (Drlica & Franco,
1988). Na tabela III encontram-se listados alguns inibidores de topoisomerases e seus
respectivos alvos.
Tabela III: Inibidores de DNA topoisomerases (Drlica & Franco, 1988)
Classe de droga
Exemplos
Topoisomerases inibidas
Coumarinas Novobiocina Girase bacteriana (subunidade B)
Coumermicina A Topoisomerase II eucariótica
Clorobiocina Girase reversa
Topoisomerase tipo I de vaccinia
Quinolonas
Ácido nalidíxico
Girase bacteriana (subunidade A)
Ácido oxolinico Topoisomerase fago T4
Norfloxacin
Acridinas m-AMSA* Topoisomerase II eucariótica
Topoisomerase fago T4
Antraciclinas 5-iminodaunorubicin
Topoisomerase II eucariótica
Elipticinas 2-ME-9-OH-E+**
Topoisomerase II eucariótica
Epipodofilotoxinas VP-16***
VM-26***
Topoisomerase II eucariótica
Alcalóides Camptotecina Topoisomerase I eucariótica
* m-AMSA: N-[4-(acridinylamino)-3-methoxyphenyl] methanesulfonamide;
** 2-ME-9-OH-E+: 2-methyl-9-hydroxyl-ellipticinium acetato;
*** VP 16- etoposide; VM-26: teniposide.
30
Alguns inibidores de topoisomerases são potentes agentes bactericidas. A
novobiocina pertence à classe das coumarinas e bloqueia a atividade ATPásica da
subunidade B da girase bacteriana, competindo com o ATP pela ligação à enzima. Já o
ácido nalidíxico pertence à classe das quinolonas e bloqueia a subunidade A da girase,
responsável pela reação de clivagem e reunião do DNA. Este último antibiótico
estabiliza o complexo DNA / topoisomerase (complexo de clivagem), impedindo que a
reação catalisada pele topoisomerase se complete (Drlica & Franco, 1988).
Uma variedade de drogas que inibem topoisomerases II de eucariotos também
atuam estabilizando o complexo de clivagem. Tais drogas são utilizadas clinicamente
como agentes antitumorais, sendo que algumas são intercalantes de DNA, como as
acridinas e antraciclinas, e outras não-intercalantes, como o etoposídeo [VP-16] e o
teniposídeo [VM-26] (Liu, 1989).
A formação do complexo DNA-topoisomerase-droga rapidamente bloqueia a
replicação do DNA. Entretanto, a formação do complexo por si só não é citotóxico; o
mecanismo que leva a morte celular parece ser um processo ativo, que envolve a
ativação de alguns sistemas dentro da célula. Em bactéria, por exemplo, as quinolonas
induzem a expressão de uma série de genes que participam do sistema de reparo SOS
(Drlica & Franco, 1988).
31
I.3.d) Topoisomerases tipo II em tripanosomatídeos
As topoisomerases II são essenciais para os tripanosomatídeos, pois além de
resolverem os problemas topológicos inerentes ao metabolismo do DNA nuclear,
participam do processo de replicação do kDNA. Estas enzimas atuam na decatenação
dos minicírculos da rede de kDNA no início do processo replicativo, para que estes
possam ser replicados como círculos livres e religam os mesmos à rede após a
replicação. Além disso, atuam na separação dos círculos-irmão recém sintetizados para
que estes sejam posteriormente segregados. Existem ainda evidências de que as topo II
desempenhem um papel estrutural no cinetoplasto, ancorando os maxicírculos à
membrana mitocondrial (Shapiro, 1993; Shapiro, 1994).
Topoisomerases II têm sido descritas em diferentes cinetoplastídeos, incluindo
T. brucei (Straus & Wang 1990, Kulikowicz & Shapiro, 2006), T. cruzi (Fragoso &
Goldenberg 1992), C. fasciculata (Pasion et al,. 1992), L. donovani (Das et al., 2001),
L. infantum (Hanke et al., 2003), L. chagasi (De Sousa et al., 2003), Bodo saltans
(Gaziová & Lukes, 2003) e B. culicis (Lourenço et al., 2006). Os dados disponíveis na
literatura indicam que as topo II encontradas no núcleo e no cinetoplasto são as mesmas
proteínas, que são codificadas por um só gene nuclear e importadas posteriormente para
os diferentes compartimentos. Entretanto, recentes estudos indicam que genes distintos
codificam as topoisomerases II nuclear e mitocondrial em T. brucei (Kulikowicz &
Shapiro, 2006). A localização mitocondrial da topo II foi demonstrada apenas em C.
fasciculata, L. donovani e B. saltans, sendo que nos dois últimos protozoários a
localização nuclear também foi observada.
32
I.3.e) Ação de inibidores de DNA topoisomerases na rede de kDNA
A importância das topoisomerases II para a sobrevivência dos tripanosomatídeos
foi observada após o tratamento destes protozoários com inibidores da enzima.
Inibidores da topo II bacteriana, como as quinolonas e as coumarinas, promovem
alterações no DNA mitocondrial dos tripanosomatídeos, além de inibir a proliferação
celular de maneira dose-dependente (Gonzales-Perdomo et al., 1990; Cavalcanti et al.,
2004). Já inibidores da topoII de eucariotos, como o etoposídeo, promovem a
linearização dos minicírculos e liberação dos maxicírculos da rede de kDNA de T.
equiperdum (Shapiro, 1994; Shapiro & Showalter, 1994). Além disso, estudos sobre a
ação da topo II em T. brucei usando a técnica de interferência de RNA, demonstram que
a ausência desta enzima causa a retração e perda da rede de kDNA (Wang & Englund
2001; Wang et al., 2002).
Agentes intercalantes que se ligam diretamente ao DNA, como o brometo de
etídeo e a acriflavina, também promovem modificações na rede de kDNA dos
tripanosomatídeos. Estas drogas promovem o fenômeno de diskinetoplastia, que
consiste na desorganização e dispersão da rede de kDNA pela matriz mitocondrial. A
acriflavina perturba o metabolismo mitocondrial, reduzindo a atividade de algumas
enzimas, como a NADH oxidase, succinato oxidase e succinato desidrogenase (Hill &
Anderson, 1969; Hajduk & Cosgrove, 1979).
Com base nos estudos acima relatados, a rede de kDNA dos tripanosomatídeos
constitui um alvo promissor para o desenvolvimento de quimioterápicos.
33
I.4 PROTEÍNAS ASSOCIADAS AO KDNA (KAPs)
I.4.a) Histonas e proteínas semelhantes a histonas
As histonas são proteínas básicas, de baixo peso molecular e ricas em resíduos
de lisina e alanina. Elas desempenham um importante papel na organização do DNA
nuclear e na expressão gênica, estando entre as proteínas eucarióticas mais conservadas
ao longo do processo evolutivo. Estão presentes em grande quantidade nas células, de
modo que sua massa total na cromatina é quase igual à do DNA. As histonas são
responsáveis pelo nível mais básico de organização cromossômica: os nucleosomos. O
princípio de organização desta estrutura e seu modo de interação com o DNA foi
proposto em 1974 por Kornberg e Thomas. Os nucleosomos são formados por um
octâmero de histonas, contendo duas cópias de cada uma das histonas H2A, H2B, H3 e
H4 (figura 16). O octâmero forma um cerne protéico ao redor do qual uma dupla fita de
DNA de 146 nucleotídeos de comprimento se enrola. Pontes de hidrogênio e interações
hidrofóbicas mantêm o DNA e as proteínas ligados. Além disso, as histonas são ricas
em aminoácidos com cadeias laterais básicas e suas cargas positivas neutralizam a
estrutura carregada negativamente do DNA (Alberts et al., 2004).
Figura 16: Modelo para o nucleosomo, mostrando o núcleo formado pelo tetrâmero H3
2
-H4
2
e
um dos dímeros H2A-H2B. O outro dímero, que não pode ser visualizado nesta figura, está em
um plano abaixo. A molécula de DNA envolve o octâmero (Lewin, 2001).
34
A formação dos nucleosomos converte a molécula de DNA em uma fita de
cromatina de 10nm, que quando observada ao microscópio eletrônico é vista como uma
série de “contas em um colar”. Cada conta corresponde a uma partícula de nucleosomo
(figura 17 A e B). Entretanto, em uma célula viva a cromatina é adicionalmente
compactada, formando uma fibra mais espessa de 30nm (figura 17 C e D).
Provavelmente, vários mecanismos atuam em conjunto para formar a fibra de 30nm a
partir do cordão linear de nucleosomos. Uma histona adicional, denominada H1,
participa deste processo. Esta é pouco conservada quando comparada às demais histonas
e apresenta um papel diferente ao das histonas centrais: uma única molécula de histona
H1 liga-se a cada nucleosomo, no ponto onde o DNA entre e sai da partícula - figura 18
(Lewin, 2001; Alberts et al., 2004; Kornberg & Lorch, 1999). Um segundo mecanismo
para formar a fibra de 30nm provavelmente envolve as caudas das histonas centrais, que
se estendem para fora dos nucleosomos e poderiam auxiliar na ligação entre eles, como
mostra a figura 19 (Alberts et al., 2004).
Figura 17: (A) Fibra de cromatina de 10 nm e (C) fibra de 30 nm, observadas por microscopia
eletrônica. Em (B), representação esquemática da fibra de 10 nm. (D) Esquema mostrando a
compactação adicional do cordão de nucleosomos para formar a fibra de 30 nm. Em amarelo, o
cerne de histonas do nucleosomo; em vermelho, o DNA. Retirado de
Alberts et al., 2004.
cerne de histonas
do nucleosomo
DNA
A
C
B
D
cerne de histonas
do nucleosomo
DNA
cerne de histonas
do nucleosomo
DNA
A
C
B
D
35
octâmero
de histonas
octâmero
de histonas
Figura 18: Representação esquemática do octâmero de histonas, ao redor do qual a molécula de
DNA (em vermelho) dá duas voltas. Uma histona H1 (em amarelo) se liga a cada nucleosomo
(Cooper, 2000).
H4 cauda
H2B cauda
H3 cauda
H4 cauda
H3 cauda
H2B cauda
H2A cauda
H2A cauda
H4 cauda
H2B cauda
H3 cauda
H4 cauda
H3 cauda
H2B cauda
H2A cauda
H2A cauda
Figura 19: Modelo especulativo para a participação das caudas de histonas na formação da fibra
de 30 nm (Alberts et al., 2004). (A) Representação do nucleosomo e das caudas das histonas.
(B) Modelo de como as caudas das histonas podem auxiliar no empacotamento dos
nucleosomos na fibra de 30 nm.
36
Alterações na estrutura dos nucleosomos afetam a acessibilidade ao DNA, sendo
essenciais em processos biológicos como replicação, transcrição e reparo e podendo
gerar ainda domínios de cromatina especializados no genoma. Tais alterações podem ser
introduzidas por remodelamento da cromatina após as histonas sofrerem modificações
pós-traducionais ou pela incorporação de variantes das histonas nos nucleosomos. (Jin
et al., 2005). O remodelamento da cromatina é realizado por complexos protéicos, que
utilizam a energia de hidrólise do ATP para mudar temporariamente a estrutura dos
nucleosomos, permitindo assim o acesso ao DNA nucleosomal ou montando novamente
os nucleosomos quando o acesso ao DNA não é mais necessário. A modificação
reversível da estrutura da cromatina é dada por modificações nas caudas das histonas.
Cada uma das histonas do cerne possui uma cauda de aminoácidos N-terminal, que se
estende para fora do nucleosomo e está sujeita a diversos tipos de modificações
covalentes, incluindo acetilação, metilação e fosforilação. Tais modificações são
realizadas por enzimas localizadas no núcleo e podem ter diferentes significados, como
por exemplo, atrair proteínas específicas para um segmento de cromatina
apropriadamente modificado. Recentemente, um outro mecanismo de modificação da
cromatina passou a ser discutido: a deposição nos nucleosomos de variantes de histonas,
ou seja, isoformas de histonas, principalmente H2A e H3. Estas variantes são inseridas
em contextos específicos e em regiões definidas da cromatina para realizar uma
determinada função (Pólo & Almouzni, 2006, Alberts et al., 2004).
Os tripanosomatídeos possuem, além do genoma nuclear, um grande genoma
mitocondrial (kDNA), que parece ser compactado por proteínas semelhantes às histonas
H1. Tais proteínas foram identificadas no cinetoplasto de C. fasciculata, e os genes que
as codificam têm sido clonados e seqüenciados: KAP1, KAP2, KAP3 e KAP4 codificam
as proteínas KAP 1, 2, 3 e 4, respectivamente (Xu & Ray, 1993, Xu et al., 1996; Hines
37
& Ray, 1998). As KAPs de C. fasciculata apresentam semelhanças com as histonas,
pois são proteínas básicas, ricas em resíduos de lisina e alanina e de baixo peso
molecular. Possuem também uma pré-sequência clivável de nove aminoácidos,
provavelmente envolvida na importação da proteína para a mitocôndria. Ensaios de
imunolocalização confirmaram a presença destas proteínas exclusivamente no
cinetoplasto do protozoário, estando distribuídas por toda a rede de kDNA. Esta
localização difere da encontrada para a topoisomerase II e polimerase β, que se situam
nos dois sítios opostos que flanqueiam a rede de kDNA. A habilidade das KAPs
purificadas de condensar a rede de kDNA in vitro, sugere que tais proteínas
desempenhem um importante papel na organização e condensação do kDNA in vivo.
Para avaliar o papel desempenhado pelas KAPs na estrutura e função do kDNA,
linhagens mutantes de C. fasciculata que não expressam KAPs foram geradas pela
técnica de nocaute gênico. O nocaute de ambos os alelos do gene KAP1 produziu
mutantes que, apesar de viáveis, apresentavam intenso rearranjo na estrutura do
cinetoplasto. Nestes, a forma e dimensão do cinetoplasto não foram alterados, porém a
organização do kDNA sofreu severa modificação. A rede de kDNA passou a apresentar
espessas fibras de DNA e uma camada elétron-densa no centro do disco. A restauração
da KAP1 nestas linhagens mutantes, restaurou também o fenótipo normal do kDNA.
Este estudo evidenciou que a KAP1 está envolvida na organização do DNA do
cinetoplasto de C. fasciculata, mas esta proteína não é essencial para a viabilidade
celular (Lukes et al., 2001). O duplo nocaute dos genes KAP2 e KAP3 também produziu
células viáveis, porém estas apresentaram o crescimento bastante reduzido e o kDNA
inalterado. Ao serem examinados por microscopia eletrônica de transmissão, observou-
se uma grande variedade de morfologias entre os duplo-mutantes, o acúmulo de
numerosos e grandes vacúolos e freqüentes invaginações da superfície celular. Nestes
38
mutantes a função mitocondrial também foi alterada, com a redução da respiração e
aumento da expressão de mRNAs codificados pelos maxicírculos. Este estudo sugere
que as KAP2 e KAP3 desempenham um papel diferente ao da KAP1, estando
envolvidas com o metabolismo mitocondrial e com a proliferação celular (Avliyakulov,
Lukes & Ray, 2004).
I.4.b) Outras proteínas associadas ao cinetoplasto
Proteínas associadas ao kDNA foram descritas também em T. cruzi. González e
colaboradores (1990) clonaram e caracterizaram um gene que codifica uma proteína
associada ao cinetoplasto das formas epimastigota e amastigota de T. cruzi. Esta
proteína, de 175 kDa, é codificada por um gene de cópia única e parece não estar
presente em tripomastigotas. A presença desta KAP somente nos estágios replicativos
do parasita sugere que ela esteja envolvida com o processo de replicação do kDNA. Em
2000, Zavala-Castro e colaboradores identificaram sete proteínas de baixo peso
molecular (entre 20 e 39 kDa), que reconhecem tanto os minicírculos como os
maxicírculos de amastigotas e tripomastigotas de T. cruzi. Algumas destas proteínas são
expressas igualmente em ambos os estágios, enquanto outras mostram níveis diferentes
de expressão ou um padrão de expressão estágio específico. Segundo os autores, suas
funções podem estar relacionadas à organização da rede de kDNA. Dois anos mais
tarde, este mesmo grupo identificou proteínas que se ligam ao kDNA de epimastigotas
de T. cruzi, que variam entre 17 e 31 kDa, além de identificarem uma proteína de 66
kDa e confirmarem a presença da proteína de 175 kDa neste estágio evolutivo do
protozoário (Zavala- Castro et al., 2002).
39
O desenvolvimento de ferramentas para isolar e caracterizar genes estágio-
específicos de T. cruzi, levou à identificação de dois genes expressos somente em
formas tripomastigotas metacíclicas. Um deles, o gene TcMet2, codifica a proteína
metaciclina 2. Esta proteína, de caráter acídico, está localizada no cinetoplasto do
parasita, associada às fibrilas de kDNA (Yamada-Ogatta et al., 2004). O papel da
metaciclina ainda não foi esclarecido.
Sendo o cinetoplasto uma estrutura típica dos tripanosomatídeos, que apresenta
um arranjo de DNA e um mecanismo de replicação sem precedentes na natureza, este é
um potencial alvo para o desenvolvimento de quimioterápicos e para estudos evolutivos
e moleculares que possam elucidar os processos biológicos peculiares que ocorrem
nestes eucariotos primitivos.
40
II.OBJETIVOS
41
RACIONAL
O cinetoplasto é uma estrutura peculiar dos membros da ordem Kinetoplastida e
abriga o DNA mitocondrial destes protozoários. Diferentes graus de compactação das
fibrilas de kDNA podem ser observados entre os tripanosomatídeos, porém as
moléculas envolvidas na manutenção das distintas organizações que a rede de kDNA
assume nestes eucariotos primitivos são desconhecidas. Topoisomerases e proteínas
semelhantes a histonas são possíveis moléculas envolvidas com a dinâmica de
condensação e rearranjo da rede de kDNA durante o ciclo de vida dos
tripanosomatídeos, embora outras proteínas e enzimas também possam atuar. Neste
sentido, a caracterização e estudo de proteínas associadas ao cinetoplasto destes
protozoários pode vir a elucidar os intrincados processos biológicos que ocorrem nesta
estrutura e o entendimento da ação de drogas que atuam sobre o cinetoplasto.
II.1 OBJETIVOS GERAIS
• Avaliar o papel do cinetoplasto como potencial alvo quimioterápico
• Caracterizar proteínas envolvidas na organização e replicação da rede de kDNA
em diferentes tripanosomatídeos
42
II.1.a) Objetivos específicos
• Analisar o efeito de inibidores da topoisomerase II na proliferação celular e na
ultraestrutura de tripanosomatídeos com diferentes arranjos de kDNA, através de
curvas de crescimento e por técnicas de microscopia
• Clonar e caracterizar o gene que codifica a topoisomerase II em B. culicis
• Imunolocalizar a enzima topoisomerase II em B. culicis
• Clonar genes que codificam proteínas associadas ao cinetoplasto de T. cruzi
(TcKAPs)
• Definir a localização celular das KAPs nos diferentes estágios evolutivos do
T. cruzi
• Analisar a expressão das KAPs nas diferentes formas evolutivas do T. cruzi
• Avaliar se a superexpressão das KAPs interfere com a organização do
cinetoplasto de T. cruzi
43
III. MATERIAIS E MÉTODOS
44
III.1 Cultivo de células
B. culicis, C. fasciculata, formas promastigotas de L. amazonensis e formas
epimastigotas de T. cruzi (cepa Y) foram cultivadas em meio Warren (Warren, 1960),
suplementado com 10% de soro fetal bovino, a 28
o
C, para os ensaios com inibidores de
topoisomerase. Para os demais ensaios, epimastigotas de T. cruzi (Dm28c) foram
cultivadas em meio LIT (Camargo, 1964), com 10% de soro fetal bovino, a 28
o
C.
Tripomastigotas metacíclicos foram obtidos a partir do clone Dm28c em meio de
diferenciação TAU3AAG conforme descrito por Contreras e colaboradores (1985). A
linhagem celular de mamífero LLCMK2, usada como controle positivo para o teste do
etoposídeo, foi cultivada por 24h em meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal
bovino, a 37
o
C em 5% de CO
2
.
III.2 Tratamento com inibidores de topoisomerase II
Para avaliar o efeito de inibidores de topoisomerase II na ultraestrutura dos
tripanosomatídeos, três inibidores da enzima foram utilizados. O ácido nalidíxico e a
novobiocina (Sigma) inibem a topo II de procariotos, enquanto o etoposídeo (Sigma) é
um potente inibidor da topo II de eucariotos. As drogas foram adicionadas ao meio de
cultura na fase exponencial de crescimento dos protozoários, nas concentrações de
150μg.mL
-1
, 300μg.mL
-1
e 500μg.mL
-1
. O ácido nalidíxico e a novobiocina foram
adicionados diretamente ao meio de cultura, enquanto o etoposídeo foi diluído em
DMSO. A cada 24h, parte da cultura era removida para contagem das células em
câmara de Neubauer e parte fixada para processamento para microscopia eletrônica de
transmissão.
45
III.3 Microscopia eletrônica de transmissão:
a) preparação de rotina: as células foram fixadas em glutaraldeído 2,5% diluído em
tampão cacodilato 0,1M, pH 7,2, lavadas no mesmo tampão e pós-fixadas em solução
contendo tetróxido de ósmio (OsO4) 1% diluído em tampão cacodilato 0,1M, pH 7,2,
ferrocianeto de potássio (FeCNK) 0,8% e cloreto de cálcio 5mM por 1h, a temperatura
ambiente. Em seguida, as células foram lavadas em tampão cacodilato 0,1M, pH 7,2 e
desidratadas em graus crescentes de acetona (50%, 70%, 90% e 2x 100%). O material
foi mantido a temperatura ambiente, em solução de acetona 100% e resina Polybed (v/v)
por aproximadamente 16h. Posteriormente, o material foi colocado em resina Polybed
pura por 5h, e após este tempo incluído na mesma resina. A polimerização da resina
ocorreu a 60
o
C por 48h. Os cortes ultrafinos obtidos foram contrastados em solução de
acetato de uranila aquosa 5% por 45 min e citrato de chumbo por 5 min. As amostras
foram observadas ao microscópio eletrônico Zeiss 900 ou Jeol 1200.
b) preparação para imunocitoquímica: as células foram fixadas em solução contendo
glutaraldeído 0,3%, sacarose 0,25M, paraformaldeído 4% e ácido pícrico 1% diluídos
em tampão cacodilato 0,1M, pH 7,2, por 1h, a temperatura ambiente. Em seguida, as
células foram lavadas em tampão cacodilato 0,1M, pH 7,2, e desidratadas em graus
crescentes de etanol (30%, 50%, 70%, 90% e 2x 100%) a 4
o
C, por 1h em cada etapa.
Posteriormente, as amostras foram colocadas em solução contendo 2 volumes de etanol
100% e 1 volume de resina Unicryl, a -20
o
C, por aproximadamente 16h. Após este
período, as amostras foram transferidas para solução contendo iguais volumes de etanol
100% e resina Unicryl (v/v), por 8h, a -20
o
C, e em seguida para solução contendo 1
volume de etanol 100% e 2 volumes de resina, a -20
o
C, por 16h. O material foi mantido
46
em resina Unicryl por 12h, e em seguida incluído na mesma resina. A polimerização da
resina ocorreu sob luz ultravioleta por 72 h, a -20
o
C.
III.4 Ensaios de imunolocalização:
a) por microscopia óptica: os protozoários fixados em paraformaldeído 4% diluído em
PBS (tampão fosfato 0,01M pH 7,2; NaCl 150mM), foram depositados em lamínulas
previamente cobertas com poli-L-lisina (1 mg.mL
-1
) e permeabilizados com Triton X-
100 0,5%. Posteriormente, o material foi incubado em solução de bloqueio (PBS pH 8,0
contendo albumina de soro bovino -BSA- 1,5%, gelatina de peixe 0,5% e Tween 20
0,02%) por 30 min, seguido da incubação com diferentes concentrações dos antisoros
primários por 1h. As lamínulas foram posteriormente incubadas por 45 min com
anticorpo anti-IgG de coelho ou anti-IgG de camundongo (dependendo do antisoro
primário utilizado) conjugado a FITC (Sigma) na diluição de 1:400. Em seguida, os
protozoários foram incubados com DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) na concentração
de 10μM por 10 min e as lamínulas foram montadas sobre as lâminas com N-propil-
galato (Sigma). O material foi observado ao microscópio óptico Axioploan (Zeiss). Nas
lamínulas controle, a incubação com o antisoro primário foi omitida.
b) por microscopia eletrônica: as grades contendo cortes ultrafinos dos protozoários
foram incubadas em solução de bloqueio contendo BSA 1,5%, gelatina de peixe 0,5% e
Tween 20 0,02% diluídos em PBS pH 8,0. Em seguida o material foi incubado com o
antisoro primário diluído em solução de bloqueio por 1h e lavado nesta mesma solução.
As amostras foram posteriormente incubadas por 30 min com anticorpo anti-IgG de
coelho ou anti-IgG de camundongo (dependendo do antisoro primário utilizado)
47
acoplado a partículas de ouro coloidal de 10nm diluído 1:250 em solução de bloqueio.
Após incubação com os anticorpos, os cortes foram lavados em solução de bloqueio e
em água destilada. No controle, a incubação do material com o antisoro primário foi
omitida. As grades foram contrastadas com acetato de uranila e citrato de chumbo,
como descrito anteriormente, e observadas ao microscópio Zeiss 900.
III.5 Extração de ácidos nucléicos:
a) extração de DNA: este procedimento foi realizado de acordo com Medina-Acosta &
Cross, 1993. As células (1 x 10
7
até 1 x 10
8
) foram centrifugadas a 1.360 x g por 10
min, lavadas em PBS e ressuspensas em tampão de lise (tampão TELT) contendo Tris-
HCl 50mM, pH 8,0; EDTA 62,5mM, pH 9,0; LiCl 2,5M e triton X-100 4%. Após 5 min
de incubação, 1 volume de fenol/clorofórmio foi misturado à amostra e o material foi
centrifugado a 13.000 x g por 5 min. O DNA foi recolhido da fase superior da amostra e
precipitado com 2 volumes de etanol absoluto. O DNA foi coletado por centrifugação a
13.000 x g por 10 min e o pellet foi lavado com etanol 70%, seco e em seguida
ressuspenso em tampão TE (Tris 10mM pH 7,5, EDTA 1mM pH 8,0) contendo
20μg.mL
-1
de RNAse A.
b) extração de RNA total: o RNA total dos protozoários foi obtido segundo o método de
Karlinsey e colaboradores (1989). As células (1x10
9
a 1x10
10
) foram centrifugadas a
9.600 x g por 10 min, lavadas em PBS e lisadas em tampão contendo isotiocianato de
guanidina 5M, EDTA 10mM, β-mercaptoetanol 8% e Tris-HCl 50mM, pH 8,0. Em
seguida, foram adicionados 7 volumes de LiCl 4M ao material e este foi guardado a
4
o
C por 16h . Após este período, a amostra foi centrifugada a 12.000 x g por 15 min, a
48
4
o
C. O sobrenadante foi descartado e o RNA total lavado em LiCl 3M. O material foi
centrifugado duas vezes nas mesmas condições anteriores e o sedimento ressuspenso em
solução de Tris-HCl 10mM, pH 7,5, EDTA 1mM e SDS 0,1%. O RNA foi extraído uma
vez com fenol/clorofórmio e uma vez com clorofórmio/álcool isoamílico e precipitado
com 1 volume de isopropanol a -20
o
C. Em seguida o RNA foi ressuspenso em água
ultrapura tratada com dietil pirocarbonato (DEPC ) 0,1%.
III.6 Southern blot
O DNA genômico (5- 10μg) dos protozoários foi completamente digerido com
enzimas de restrição apropriadas e submetido à eletroforese em gel de agarose 1% em
tampão TBE. O DNA foi transferido para uma membrana de nylon (Hybond-N,
Amersham Biosciences), seguindo procedimentos padrões (Sambrook, Fritsch &
Maniatis, 1989). Após a transferência, a membrana foi incubada em solução de
hibridização contendo SSC 5 X (citrato de sódio 0,075M, NaCl 0,75M); solução de
Denhardt 5 X (ficoll 0,05%, polivinilpirrolidona 0,05%, albumina de soro bovino
0,02%); SDS 0,1% e DNA de esperma de salmão 100μg.mL
-1
por 1h a 65 ºC. Em
seguida, o material foi incubado por 16h com a sonda radioativa (1 x 10
6
cpm.mL
-1
).
Posteriormente, a membrana foi lavada 2 vezes por 15 min em soluções com
concentrações decrescentes de SSC (SSC 2 x / SDS 0,1%, SSC 1 x / SDS 0,1% e SSC
0,1 x / SDS 0,1%), a 65
o
C. A membrana foi exposta a filme de raio-X (Hyperfilm,
Amersham) na presença de tela intensificadora (Dupont Cronex Lighting plus) a -70 ºC.
49
III.7 Northern blot
O RNA total dos protozoários (10μg) foi submetido à eletroforese em gel de
agarose 1,2%- formaldeído em tampão MOPS (MOPS 20mM; acetato de sódio 5mM;
EDTA 2mM, pH 7,5) e, em seguida, transferido para membrana de nylon (Hybond-N,
Amersham Biosciences), utilizando o protocolo descrito por Sambrook, Fritsch &
Maniatis, 1989. Após a transferência, a membrana foi incubada em solução de
hibridização (SSC 5 X; solução de Denhardt 2 X ; SDS 0,1%; DNA de esperma de
salmão 100μg.mL
-1
;
formamida 40%) por 1 h a 42 ºC, hibridizada por 16 h com a sonda
marcada radioativamente (1 x 10
6
cpm.mL
-1
) e lavada duas vezes, por 15 min cada, em
soluções com concentrações decrescentes de SSC a 42 ºC (SSC 2 x / SDS 0,1%, SSC 1
x / SDS 0,1% e SSC 0,5 x / SDS 0,1%). A membrana foi exposta a filme de raio-X
(Hyperfilm, Amersham) na presença de tela intensificadora (Dupont Cronex Lighting
plus) a -70 ºC.
III.8 Western blot
Este procedimento foi executado segundo o método de Towbin e colaboradores
(1979). Amostras contendo extratos de protozoários equivalentes a 1 x 10
9
células.mL
-1
foram obtidas conforme descrito a seguir: o sedimento celular obtido após centrifugação
da cultura foi ressuspenso em 75μl de PBS e 25μl de tampão de amostra 4x (Tris-HCl
125mM, pH 6,8, SDS 2%, β-mercaptoetanol 5%, glicerol 12% e azul de bromofenol
0,012%), aquecido a 100
o
C por 5 min e uma alíquota (5 ou 10μl) deste material
submetida à eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE), junto ao
marcador de peso molecular Benchmark (Invitrogen). Após a separação eletroforética,
as proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose (Hybond C, Amersham
Biosciences), sendo a transferência realizada em tampão contendo glicina 190mM,
50
metanol 20%, Tris-base 20mM e SDS 0,005%, por 2h, a 60 V. Após a transferência, a
membrana foi corada com Ponceau S (Ponceau S 0,5% em ácido acético 1%), as bandas
correspondentes ao marcador de peso molecular marcadas a lápis e a membrana foi
descorada em água bidestilada. A membrana foi bloqueada em solução de bloqueio
contendo PBS pH 8,0, Tween 20 0,05% e leite desnatado 5% por 30 min e em seguida
incubada com o antisoro de interesse diluído em solução de bloqueio por 1h. A
membrana foi lavada em PBS pH 8,0, Tween 20 0,05% três vezes, com intervalos de 5
min para cada lavagem, sendo em seguida incubada em solução de bloqueio contendo
anticorpos anti-IgGs de camundongo ou de coelho (dependendo do antisoro primário
usado) conjugados a fosfatase alcalina. A membrana foi lavada três vezes com PBS-
Tween e a revelação foi realizada em 10mL de solução contendo Tris-HCl 100mM pH
9,5; NaCl 100mM; MgCl
2
5mM acrescidos de 66μl de NBT (nitroblue tetrazolium)
50μg.mL
-1
(PROMEGA) e 33μl de BCIP (5-Bromo- 4 Cloro -3 indolil fosfato)
50μg.mL
-1
(PROMEGA).
III.9 Clonagem e sequenciamento do gene que codifica a topoII em B. culicis (BcTOP2)
a) Clonagem de um fragmento do gene BcTOP2: o alinhamento entre as seqüências dos
genes que codificam topoisomerases II em diferente tripanosomatídeos (T. cruzi, T.
brucei, C. fasciculata e L. donovani), utilizando o programa megalign (Lasergene,
DNASTAR Inc.), nos permitiu construir oligonucleotídeos a partir das regiões
conservadas entre as enzimas dos diferentes protozoários. Os oligonucleotídeos BC7
(5’-AAGATCGTGGACGAAATTCTGCTCAA-3’) e BC14 (5’-CCGTTGCACAGCA
GCA-3’) foram utilizados para amplificar parte do gene BcTOP2 por PCR, usando as
seguintes condições: 100ng do DNA total B. culicis, 10pmol de cada oligonucleotídeo,
51
200μM de cada dNTP, MgCl
2
1,5mM, tampão Taq DNA polimerase 1x e 2,5 U de Taq
DNA polimerase (Invitrogen). A reação foi processada no termociclador modelo 9700
(Applied Biosystems, EUA) com a desnaturação do material por 3 min a 94 °C, seguida
de 35 ciclos com uma etapa de desnaturação a 94 °C por 30 s, uma etapa de
hibridização dos oligonucleotídeos a 54 °C por 30 s e uma etapa de extensão a 72 °C
por 2 min. O produto amplificado (chamado BC7-14) foi purificado usando o kit High
Pure PCR Purification (Roche) e clonado no vetor pDK-101 (Kovalic, Kwak &
Weisblum, 1991). Este vetor tem como característica a presença de um resíduo de
timina despareado em cada extremidade 5’. Isto favorece a clonagem de produtos de
PCR amplificados com Taq DNA polimerase, já que a Taq tem a capacidade de
adicionar resíduos extras de adenina nas extremidades 3’ do material amplificado. A
ligação do fragmento de DNA purificado ao vetor (relação molar 3:1) foi realizada com
a utilização de 1 U da enzima T4 DNA ligase (USB) e seu respectivo tampão em
volume final de 10μl, sendo incubada a 16 ºC por 16h. Este material foi utilizado na
transformação de linhagem de E. coli (Top10F’) CaCl
2
competente. Clones
recombinantes que continham o inserto BC7-14 foram selecionados pela técnica de
palitagem (toothpick). Um destes clones foi purificado com o kit de minipreparação de
plasmídeos (Qiagen), conforme instruções do fabricante. As extremidades do inserto
contido no plasmídeo recombinante foram então seqüenciadas.
b) Sub clonagem do fragmento BC7-14: para sequenciar todo o fragmento BC7-14, o
plasmídeo recombinante purificado foi digerido com diferentes enzimas de restrição que
possuem um único sítio de corte no vetor pDK-101. A enzima SalI (Biolabs) gerou um
perfil pouco complexo de restrição e foi utilizada para digerir o plasmídeo recombinante
em uma reação contendo 20 U da enzima em um volume final de 20μl, a 37
o
C por 2h.
52
O material digerido foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TBE
a 100 V. Fragmentos com peso molecular de 560 pb e 630 pb, resultantes da digestão do
inserto, foram removidos do gel com auxílio de uma lâmina de bisturi e purificados com
o kit High Pure PCR Purification (Roche) conforme instruções do fabricante. Os
fragmentos purificados foram ligados ao vetor pBluescript (KS+) previamente digerido
com 20 U de SalI e desfosforilado com 1 U da enzima CIP – fosfatase alcalina de
intetino de bezerro - (Promega). Este material foi utilizado na transformação de
linhagem de E. coli (Top10F’) CaCl
2
competente. Clones recombinantes foram
selecionados pela técnica de palitagem (toothpick) e os plasmídeos destes clones foram
purificados com o kit de minipreparação de plasmídeos (Qiagen). O inserto clonado foi
seqüenciado.
c) Construção da biblioteca genômica de B. culicis: para obtenção de toda a região
codificante do gene BcTOP2, a biblioteca genômica de B. culicis foi construída, para
posterior varredura do gene de interesse. As seguintes condições foram utilizadas:
200μg de DNA genômico do protozoário foram digeridos com Sau3A (Biolabs) e o
DNA digerido foi extraído com 1 volume de fenol/clorofórmio e precipitado com 1/10
do volume de acetato de sódio 3M, pH 6,0 e 2 volumes de etanol absoluto por 16h, a
-20
o
C. Após este período, o material foi centrifugado a 12.000 x g por 15 min e o
sedimento contendo o DNA foi lavado duas vezes com etanol 70%, seco e ressuspenso
em 200μl de TE (Tris 10mM, pH 7,5, EDTA 1mM, pH 8,0). O DNA foi depositado no
topo de um gradiente de NaCl de 5% a 25% e submetido a centrifugação a 65.000 x g
por 4,5h. As frações que continham o DNA entre 15 a 20 kb foram utilizadas, após
precipitação do DNA e dosagem por espectrofotometria a 260 nm. Os fragmentos foram
ligados ao DNA do vetor lambda EMBL3 digerido com BamHI. O DNA ligado foi
53
empacotado in vitro, usando-se extratos de empacotamento comercial (Gigapack gold
plus, Stratagene) e a biblioteca foi amplificada em E. coli LE392.
d) Varredura da biblioteca genômica de B. culicis: para selecionar os clones contendo
seqüências do gene Bctop2, foi feita uma varredura de 36.000 clones da biblioteca
genômica, distribuídos em 10 placas LB/Mg, utilizando como sonda o fragmento
BC7-14 marcado radioativamente. Réplicas em membranas de nitrocelulose (Amersham
Biosciences) dos fagos contidos nas placas foram realizadas segundo o procedimento
descrito por Benton & Davis, 1977. As membranas foram cuidadosamente retiradas das
placas e colocadas em solução de desnaturação por 1 min. Após desnaturação do DNA,
os filtros foram transferidos duas vezes para uma solução de neutralização, onde
permaneceram por 5 min. Os filtros foram então lavados em SSC 2 x por 5 min e secos
sobre papel de filtro 3MM. O DNA foi fixado à membrana através do aquecimento em
forno a 80 ºC, durante 2h. As membranas contendo os ácidos nucléicos foram incubadas
em solução de hibridização para southern blot por 1h, a 65 ºC, antes da adição do
fragmento BC7-14 marcado radioativamente por nick-translation na concentração de 1 x
10
6
cpm.mL
-1
(atividade específica de 1 x 10
8
cpm.μg
-1
). A incubação procedeu por
mais 16h e então as membranas foram lavadas por 30 min em soluções com
concentrações decrescentes de SSC a 65ºC (SSC 2 x / SDS 0,1%, SSC 1 x / SDS 0,1% e
SSC 0,1 x / SDS 0,1%). Em seguida, as membranas foram expostas a filmes de raio-X
(Hyperfilm, Amersham) na presença de tela intensificadora (Dupont Cronex Lighting
plus) a -70 ºC.
As auto-radiografias foram analisadas a fim de identificar a posição dos clones
nas placas de petri. Os clones foram então coletados e colocados em 200μl de SM (Tris-
HCl 50mM pH 7,5; NaCl 100mM; MgSO
4
8mM; Gelatina 0,01%). Duas varreduras
54
adicionais da biblioteca genômica foram executadas da mesma forma. Após a terceira
varredura, o DNA de um clone genômico (λBc1) foi purificado como descrito por
Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989.
e) Clonagem de fragmentos do gene BcTOP2 a partir do clone genômico λ Bc1:
Para a clonagem de fragmentos do gene BcTOP2 contidos no clone genômico,
este foi analisado por southern blot para a escolha dos fragmentos a serem clonados.
Para tanto, 2μg de DNA do clone λBc1, obtido na varredura da biblioteca genômica,
foram digeridos por 3h, a 37 º C, com as enzimas XcmI ou SacII, em reações contendo
20 U das respectivas enzimas e tampão apropriado, em volume final de 40μl. Em
seguida, efetuamos a clonagem de alguns dos fragmentos que tiveram sinal positivo
para a sonda, como descrito a seguir. Oito microgramas de DNA do clone λBc1 foram
digeridas com as enzimas XcmI ou Sac II em reações contendo 60 U das respectivas
enzimas em seus tampões, em um volume final de 40μl. As reações foram incubadas a
37 ºC por 3h e submetidas à eletroforese em gel de agarose 0,8% em tampão TBE a
100 V. Os fragmentos de DNA que mostraram sinais positivos por southern blot foram
removidos do gel com o auxílio de uma lâmina de bisturi e purificadas com o kit
QIAEXII. A digestão com a enzima SacII resultou em fragmentos de 1 kb e de 3 kb,
que foram ligados ao vetor pBluescript/SacII. A digestão com a enzima XcmI resultou
em fragmentos de 4,2 kb, 2,5 kb e 1,1 kb, que foram tratados com a enzima Klenow em
reações contendo 5 U da enzima em seu tampão, em volume final de 20μl. As reações
foram incubadas a 37 ºC por 15 min e purificadas com o Kit QIAEXII. O material
purificado foi ligado ao vetor pBluescript/XcmI. A linhagem de E.coli TOP10F’ CaCl
2
foi transformada com cada uma das ligações e a seleção dos clones recombinantes foi
55
feita com a técnica de palitagem (toothpick). Os clones recombinantes obtidos foram
purificados com o kit de minipreparação de plasmídeos (Qiagen).
f) Sequenciamento do gene BcTOP2 e análise computacional: o sequenciamento dos
clones contendo fragmentos do gene BcTOP2 foi feito utilizando o Kit BigDye
tm
Terminator ready Reaction Mix baseado na técnica descrita por Sanger, Nicklen &
Coulson, 1977. As reações foram aplicadas em um seqüenciador automático de DNA,
modelo 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), de acordo com as instruções do
fabricante. As seqüências foram analisadas utilizando-se os programas EditSeq,
MapDraw, Megalign e SeqMan (DNASTAR), bem como o algoritmo BLAST,
disponível na homepage do National Center for Biotechnology Information
(www.ncbi.nlm.nih.gov). Para busca de sinais de localização celular foram utilizados os
programas SignalP 3.0 (Bendtsen et al., 2004) e PSORT II (Nakai & Horton, 1999).
III.10 Caracterização e análise da expressão do gene BcTOP2
A caracterização do gene BcTOP2 pela técnica de Southern blot foi realizada
conforme descrito no item III.6, utilizando as enzimas de restrição Sal1, BglII, Pst1,
SacII e Xho1, em reações contendo 60 U de cada enzima e seus respectivos tampões, em
volume final de 40μl. O fragmento BC7-14 marcado radioativamente (1x 10
6
cpm.mL
-1
)
foi utilizado como sonda. A marcação da sonda com α-
32
P-dCTP foi realizada pelo
sistema de nick-translation (Invitrogen), conforme especificações do fabricante. Após
marcação, a sonda radiotiva foi purificada em microcolunas ProbeQuant G-50
(Amersham Biosciences). A mesma sonda foi utilizada para análise da expressão do
gene por Northern blot, técnica detalhada no item III.7.
56
III.11 Expressão da região carboxi-terminal de BcTOP2 fusionada a GFP
O gene da GFP foi amplificado por PCR a partir do plasmídeo pEGFP-C3
utilizando os iniciadores (5’GGGGGGATCCCACGATGAGCGTGCGGATGTT 3’) e
(5’ GGGGGGATCCAGCTTCGTGAAAATGTA 3’), ambos contendo sítio para a
enzima de restrição BamHI (seqüência em negrito nos iniciadores). A condições da
reação de PCR foram seguidas segundo ítem III.9 (a), exceto que a hibridização dos
oligonucleotídeos foi feita a 55
o
C por 30 s e a extensão a 72
o
C por 1 min. O produto
amplificado foi purificado com o sistema High Pure PCR Purification Kit (Roche) e
digerido com a enzima BamHI (20 U da enzima em um volume de reação de 20mL,
contendo 500ng do gene GFP amplificado por PCR). Em seguida o material foi
novamente purificado e ligado ao vetor pQE-30/BamHI/CIP (relação molar de 3:1). A
ligação foi utilizada para transformar E.coli TOP10F’ CaCl
2
competentes e a seleção
dos clones recombinantes foi feita pela técnica de palitagem (toothpick). A orientação
do inserto nos clones recombinantes foi verificada por PCR utilizando os iniciadores
RBS (5’ CGGATAACAATTTCACACAG 3’) e (5’ GGGGGGATCCAGCTTC
GTGAAAATGTA 3’). Um dos clones selecionados, denominado pQEGFP, foi
purificado pelo sistema de minipreparação de plasmídeos (Qiagen) e digerido com 20 U
das enzimas SacI e HindIII.
Com o propósito de produzir um antisoro policlonal contra a topoII de B. culicis,
a região 3’ do gene BcTOP2 (nucleotídeos 3394-3693), que codifica um fragmento de
11,3 kDa a partir do carboxi-terminal da BctopoII, foi clonada em fase com a
extremidade 3’ do gene da GFP no vetor pQE-30, para posterior expressão em E. coli.
O plasmídeo de expressão pQE-30 (Qiagen) foi escolhido, pois neste sistema a proteína
recombinante é expressa juntamente a um “tag” de 6 resíduos de histidina na sua porção
amino-terminal. Tal característica facilita a purificação da proteína recombinante
57
através de cromatografia de afinidade em coluna de níquel (Ausubel et al., 1987), uma
vez que as histidinas em pH maior do que 7,0 possuem carga negativa e desse modo
interagem facilmente com as cargas positivas do íon níquel. Com isso, a eluição da
proteína pode ser feita reduzindo-se o pH ou por competição com o imidazol.
A porção carboxi-terminal de BcTOP2 foi amplificada por PCR, a partir do
DNA genômico de B. culicis, utilizando os oligonucleotídeos Bc20/SacI (5’ -
GGGGGAGCTCGTGCGGTCGCTGCAGGCCCCCG A- 3’) e Bc/HindIII (5’
ATGGTAAGCTTAAACGCAGACAAGGTCTATCCCG 3’), que contêm sítios para
as enzimas SacI e HindIII respectivamente. As condições do PCR foram as mesmas
descritas acima para amplificação do gene de GFP. O produto amplificado foi
purificado com o sistema High Pure PCR Purification Kit (Roche) e digerido com 20 U
das enzimas SacI e HindIII. Em seguida o material foi ligado ao vetor pQEGFP digerido
com 20 U de SacI e HindIII e a reação de ligação foi utilizada para transformar E. coli
TOP10F’ CaCl
2
competente. A seleção dos clones recombinantes foi feita como
descrito anteriormente e um dos clones selecionados foi purificado pelo sistema de
minipreparação de plasmídeos (Qiagen), sendo posteriormente utilizado para
transformar a linhagem de E. coli M15.
Após a transformação em E. coli M15, uma colônia foi inoculada em meio LB
(Bacto-triptona 10g.l
-1
; extrato de levedura 5g.l
-1
; NaCl 5g.l
-1
) contendo 100μg.mL
-1
de
ampicilina e 25μg.mL
-1
de kanamicina e a cultura foi incubada a 37 ºC por 18h, sob
agitação. Após este período, 10% deste pré-inóculo foi transferido para outro tubo
contendo meio LB-ampicilina-kanamicina por 1h, a 37 ºC, sob agitação constante. Após
este tempo, 2mM de IPTG (isopropil-1-tio-β-D-galactopiranosideo) foi adicionado a
cultura e a incubação prosseguiu por mais 3h nas mesmas condições. Um controle
negativo foi feito como descrito acima, exceto que neste controle não foi adicionado
58
IPTG a cultura. Alíquotas da cultura induzida com IPTG e do controle não induzido
foram coletadas para análise em gel de poliacrilamida SDS-PAGE. Em seguida, as
bactérias foram coletadas por centrifugação a 6.000 x g, por 10 min, a 4 ºC, lavadas em
PBS e ressuspensas em Tris-HCl 20mM, pH 8,0 contendo NaCl 0,5M, sendo o material
sonicado (Ultrasonic homogenizer, Cole-Parmer) com 5 pulsos de 10 s cada, a 4
o
C,
potência 8. O material foi centrifugado a 10.000 x g por 15 min e amostras do pellet e
sobrenadante foram coletadas para análise em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). O
sobrenadante coletado após indução de 200mL de cultura, foi incubado com 400mL de
resina níquel-NTA (Qiagen) por 2h a 4 ºC, sob leve agitação e a proteína purificada
conforme instruções do fabricante.
III.12 Obtenção do antisoro anti-BctopoII
A proteína recombinante purificada foi utilizada para inocular coelhos New
Zeland, por via sub-cutânea, com 3 aplicações de aproximadamente 50-100μg de
antígeno em intervalos de 15 dias, seguida de obtenção do soro após 2 semanas da
última inoculação. O antígeno foi emulsificado em adjuvante completo de Freund
(Sigma), na primeira inoculação, e em adjuvante incompleto nas duas finais.
III.13 Estudo da expressão da BctopoII por Western blot
O estudo da expressão de BcTOPII pela técnica de Western blot foi realizado de
acordo com o descrito no ítem III.8. Extratos protéicos de B. culicis, C. fasciculata e
epimastigotas de T. cruzi foram utilizados nos experimentos. A diluição do antisoro
anti-BctopoII foi de 1:250. Quanto ao anticorpo secundário, usamos anticorpo anti-IgG
de coelho conjugado a fosfatase alcalina (Promega) na diluição de 1:10.000.
59
III.14 Localização celular da topoisomerase II em B. culicis
Ensaios de imunolocalização da topo II em B. culicis foram realizados de acordo
com o protocolo descrito na seção III.4. Para os ensaios de localização por microscopia
óptica, a diluição do antisoro anti-BctopoII foi de 1:30, enquanto para os ensaios de
imunocitoquímica ultraestrutural, a diluição foi de 1:50. Para os ensaios de microscopia
óptica, o anticorpo secundário utilizado foi anti-coelho conjugado a FITC (Sigma) na
diluição de 1:400; para microscopia eletrônica, o anticorpo secundário anti-IgG de
coelho acoplado a partículas de ouro coloidal de 10nm (Sigma) diluído 1: 250 foi
utilizado.
III.15 Clonagem de genes que codificam proteínas associadas ao cinetoplasto (KAPs)
de T. cruzi
As anotações do projeto genoma do T. cruzi permitiram a identificação, neste
protozoário, de proteínas associadas ao cinetoplasto (KAPs) semelhantes as KAPs já
descritas em C. fasciculata. A partir da análise do genoma do parasita disponibilizado
pelo consórcio TIGR - The Institute for Genomic Research (www.tigr.org),
oligonucleotídeos foram construídos para amplificar os genes que codificam três KAPs
em T. cruzi, as quais chamamos de Tcp14, Tcp21 e Tcp23, de acordo com o peso
molecular indicado por suas seqüências de aminoácidos. Os pares de primers
p14F/BamHI: 5' – GGGGGATCCATGCTCCGCTTTTGTCGGTCTCGCCTCGC - 3' e
p14R/SalI: 5' - GGGGTCGACTTAAGTCTTTTTCTTCTTTGGCTGCTGCT - 3',
p21F/BamHI: 5’ - GCGGGATCCATGCTTCGCGTCTCCCTGCTT - 3’ e
p21R/SalI: 5’ - GGGGTCGACTCACACCTTGCTACGTGTGATCTTCTTG - 3’,
p23F/BamHI: 5’ - GGGGGATCCATGCTTCGACGCACGATGACGG - 3’ e
p23R/SalI: 5’ - GGGGTCGACTCATTGTTTCTTGTATCCCTTCGCCCCTGT - 3’
60
foram utilizados em reações de PCR, usando as seguintes condições: 100ng DNA total
T. cruzi Dm28c, 10 pmol dos oligonucleotídeos 5’ (direto = F) e 3’ (reverso = R),
200μM de cada dNTP, MgCl
2
1,5mM, tampão Taq DNA polimerase 1x, 2,5 U de Taq
DNA polimerase (Invitrogen). A reação de PCR foi processada no termociclador
modelo 9700 (Applied Biosystems, EUA) com a desnaturação do material por 4 min a
94 °C, seguida de 30 ciclos de desnaturação a 94 °C por 30 s, hibridização dos
oligonucleotídeos a 58 °C por 30 s e extensão a 72 °C por 1 min. O material
amplificado em cada reação foi purificado usando o kit High Pure PCR Purification
(Roche) e digerido com as enzimas de restrição BamHI e SalI (já que todos os primers F
continham sítio para BamHI e os primers R para SalI), com uso de 20 U de cada enzima
e seus respectivos tampões em volume final de 20μl, por 4 h a 37
o
C. O material foi
novamente purificado e utilizado para ligação com o plasmídeo de expressão pQE-30
(Qiagen) previamente digerido com BamHI e SalI. A reação de ligação foi realizada
conforme descrito na seção III.9. Este material foi utilizado na transformação da
linhagem de E. coli TOP10F’ CaCl
2
competente. A seleção e purificação dos clones
recombinantes foi realizada como descrito na seção III.11 e um dos clones
recombinantes foi utilizado para transformar E. coli M15 CaCl
2
competente, para
posterior expressão da proteína.
Para Tcp23 foi construído adicionalmente um oligonucleotídeo reverso,
chamado p23R/ HindIII (5’ – CCCAAGCTTTCATTGTTTCTTGTATCCCTTCGC
CCCTGT – 3’), para clonagem no vetor pGEX-B (Pharmacia Biotech). Parte do gene
Tcp23 foi amplificado com os oligonucleotídeos p23F/ BamHI e p23R/ HindIII,
conforme descrito acima e clonado no vetor pGEXB digerido com BamHI e SalI. Este
vetor permite a expressão de genes ou fragmentos de genes fusionados a glutationa S-
transferase (GST), sendo a proteína de fusão purificada posteriormente por
61
cromatografia de afinidade. O produto da ligação foi usado para transformar E. coli
Xl1-Blue. As condições de indução da expressão do fragmento do gene Tcp23 em
pGEX foram as mesmas descritas no item III.11, exceto que a cultura foi colocada em
meio LB-ampicilina e o IPTG foi utilizado na concentração de 0,3mM.
III.16 Expressão das KAPs de T. cruzi em E. coli
Colônias de E. coli (M15) contendo os plasmídeos recombinantes foram
induzidas a expressar a proteína de interesse, após o cultivo em meio LB contendo 2mM
de IPTG, conforme descrito na seção III.11. Após sonicação, o lisado foi centrifugado e
o sobrenadante submetido à eletroforese em gel SDS-PAGE. Após este procedimento, o
gel foi tratado com KCl 0,1M gelado para visualização da banda correspondente à
proteína recombinante. A banda de interesse foi cortada do gel com ajuda de uma
lâmina de bisturi, colocada dentro de membranas de diálise (Spectaphor, MW cut-off
12.000) e eletroeluída a 100 V por 2h. O material eletroeluído foi dialisado por 16h em
PBS pH 8,0 e em seguida dosado por espectrofotometria.
III.17 Obtenção de antisoro contra KAPs recombinantes
KAPs recombinantes purificadas foram utilizadas para inocular camundongos
suíços, por via sub-cutânea, com aplicações de aproximadamente 50-100μg de antígeno
em intervalos de 15 dias, seguida de obtenção do soro após 1 semana da última
inoculação. O antígeno foi emulsificado em adjuvante completo de Freund, na primeira
inoculação, e em adjuvante incompleto nas demais.
62
III.18 Análise da expressão das KAPs por ensaios do tipo Western blot
O estudo da expressão das KAPs pela técnica de Western blot foi realizado de
acordo com o descrito no item III.8. Extratos protéicos de epimastigotas, amastigotas e
tripomastigotas metacíclicos de T. cruzi foram utilizados nos experimentos. A diluição
dos antisoros anti-Tcp14, anti-Tcp21 e anti-Tcp23 foi de 1:500. Quanto ao anticorpo
secundário, utilizamos anti-IgG de camundongo conjugado a fosfatase alcalina
(Promega) na diluição de 1:10.000.
III.19 Localização celular das KAPs em T. cruzi
Para os ensaios de imunolocalização das proteínas associadas ao cinetoplasto
(KAPs) de T. cruzi, os antisoros anti-Tcp14, anti-Tcp21 e anti-Tcp23 foram testados em
formas epimastigota, amastigota e tripomastigota metacíclico do protozoário. A diluição
testada para os três soros foi de 1:150 em epimastigotas e 1:50 em amastigotas e
tripomastigotas. O anticorpo secundário utilizado nestes ensaios foi anti-IgG de
camundongo acoplado a FITC (Sigma) diluído 1:400. A metodologia completa
encontra-se descrita na seção III.4 (a).
III.20 Superexpressão das KAPs em T. cruzi, utilizando o plasmídeo pTEX
Com o intuito de superexpressar as proteínas Tcp14 e Tcp23 em formas
epimastigotas de T. cruzi, os genes Tcp14 e Tcp23 foram amplificados por PCR a partir
do DNA genômico do parasita, digeridos com as enzimas de restrição BamHI e SalI (20
U da cada enzima em volume final de reação de 20μl) e o material digerido foi
purificado, conforme descrito na seção III.15. Este material foi usado na ligação com o
plasmídeo pTEX (Kelly et al., 1992), previamente digerido com BamHI e SalI. A
reação de ligação ocorreu conforme descrito na seção III.9. A ligação foi utilizada na
63
transformação de linhagens de E. coli TOP10F’ CaCl
2
competentes e a posterior seleção
e purificação de clones recombinantes realizada como descrito na seção III.11. Os
plasmídeos recombinantes pTEX-Tcp14 e pTEX-Tcp23 foram utilizados para
transformar epimastigotas de T. cruzi. Para transformação, os parasitas (5x10
8
células)
foram coletados por centrifugação a 4.000 x g, por 10 min, a 4
o
C e ressuspensos em
1mL de HEPES 25mM contendo NaCl 140mM e Na
2
HPO
4
0,74mM, pH 7,5. Vinte e
cinco microgramas de cada um dos plasmídeos recombinantes (pTEX-Tcp14 ou pTEX-
Tcp23) foram utilizados para transformar epimastigotas de T. cruzi , com 2 pulsos a
450V, 500μF (Gene Pulser II, Biorad). Após eletroporação, as células foram
transferidas para meio LIT contendo 10.000
U
de penicilina e 100μg.mL
-1
de
streptomicina. Após 24h, foi adicionado à cultura 250μg.mL
-1
de geneticina (G418-
Sigma) para selecionar as células que continham os plasmídeos recombinantes. As
células foram submetidas a passagens semanais em meio LIT contendo 250μg.mL
-1
de
G418, até o estabelecimento de uma população resistente.
64
IV.RESULTADOS
65
IV.1 Efeito de inibidores da topoII na proliferação celular e na ultraestrutura de diversos
tripanosomatídeos (dados publicados: Cavalcanti et al., 2004)
Topoisomerases do tipo II estão envolvidas em processos celulares essenciais
para os tripanosomatídeos, como o metabolismo do DNA nuclear e a replicação do
kDNA. Diversos inibidores desta enzima encontram-se disponíveis comercialmente,
sendo utilizados como agentes bactericidas e até mesmo em tratamento de tumores.
Considerando o importante papel que as topoII desempenham nos tripanosomatídeos,
resolvemos investigar se algumas destas drogas podem afetar a sobrevivência de tais
protozoários. Inibidores da topoII de procariotos, como o ácido nalidíxico e a
novobiocina, e inibidores da topoII de eucariotos, como o etoposídeo, foram testados
em espécies que apresentam arranjos distintos da rede de kDNA. Desse modo, B.
culicis, C. fasciculata, epimastigotas de T. cruzi e promastigotas de L. donovani foram
tratados com concentrações crescentes das drogas, variando de 150μg.mL
-1
a
500μg.mL
-1
.
O ácido nalidíxico inibiu a proliferação de todas as espécies analisadas de
maneira dose-dependente, sendo B. culicis e C. fasciculata as espécies mais afetadas
(figura 20). Já a novobiocina exerceu efeito inibitório menos pronunciado na
proliferação de B. culicis e C. fasciculata, causando uma queda acentuada na
proliferação de T. cruzi e L. amazonensis tratados com concentrações maiores que
300μg.mL
-1
(figura 21). O etoposídeo não promoveu inibição da proliferação celular da
maioria das espécies analisada; somente o crescimento de L. amazonensis mostrou-se
ligeiramente reduzido (figura 22).
Para obter informações sobre os efeitos ultraestruturais destes inibidores no
cinetoplasto dos diferentes protozoários estudados, células não tratadas e tratadas com
66
diferentes concentrações das drogas foram analisadas por microscopia eletrônica de
transmissão. O tratamento com ácido nalidíxico resultou em intensa compactação da
rede de kDNA de B. culicis e de C. fasciculata, com a formação de uma camada
elétron-densa no centro da rede (figura 23 A-F). A concentração de 300μg.mL
-1
da
droga promoveu a compactação parcial das fibrilas de DNA em C. fasciculata (figura
23-E, seta), enquanto em B. culicis a dose de 500μg.mL
-1
levou ao aparecimento de
formas torcidas do cinetoplasto (figura 23-C). Em epimastigotas de T. cruzi, a
compactação das fibrilas de kDNA foi mais tênue (figura 23-H), ainda que a dose de
500μg.mL
-1
tenha promovido o descolamento do kDNA da membrana mitocondrial
(figura 23-I). Em formas promastigotas de L. amazonensis, o tratamento com ácido
nalidíxico promoveu o inchaço mitocondrial e o alargamento das cristas, porém a rede
de kDNA não mostrou-se alterada (figura 24).
A novobiocina também promoveu intensa compactação do kDNA de B. culicis,
porém não afetou o kDNA de C. fasciculata. Esta droga provocou a lise celular quando
epimastigotas de T. cruzi e promastigotas de L. amazonensis foram tratadas com
concentrações a partir de 300μg.mL
-1
por 72- 96h (figura 25).
Surpreendentemente o etoposídeo, um inibidor de topoisomerase II de
eucariotos, não promoveu alterações ultraestruturais nos protozoários analisados (figura
26).
67
Figura 20 - Efeito do ácido nalidíxico na proliferação de B. culicis, C. fasciculata, epimastigotas
de T. cruzi e promastigotas de L. amazonensis. A droga é adicionada à cultura após 24h de
cultivo. Um efeito inibitório dose-dependente é observado na proliferação celular das quatro
espécies tratadas, sendo este mais acentuado em B. culicis. Estes resultados são a média de três
experimentos independentes e o desvio padrão é indicado por barras verticais.
B. culicis
1
10
100
1000
10000
024487296120
horas
10
6
células.ml
-1
control
150 ug/ml
300 ug/ml
500 ug/ml
C. fasciculata
1
10
100
1000
024487296120
horas
10
6
células.ml
-1
control
150 ug/ml
300 ug/ml
500 ug/ml
T. cruzi
1
10
100
0 24 48 72 96 120 144 168
horas
10
6
células.ml
-1
control
150 ug/ml
300 ug/ml
500 ug/ml
L. amazonensis
1
10
100
0 24 48 72 96 120 144
horas
10
6
cells.ml
-1
controle
150µg.ml-1
300µg.ml-1
500µg.ml-1
68
Figura 21 - Efeito da novobiocina na proliferação celular de B. culicis, C. fasciculata, formas
epimastigotas de T. cruzi e promastigotas de L. amazonensis. A droga é adicionada à cultura
após 24h de cultivo. Estes resultados são a média de três experimentos independentes e o desvio
padrão é indicado por barras verticais. Notar uma queda acentuada na proliferação de T. cruzi e
L. amazonensis tratados com concentrações maiores que 300μg.mL
-1
B. culicis
1
10
100
1000
0 24487296120
horas
10
6
células/ml
control
150 ug/ml
300 ug/ml
500 ug/ml
C. fasciculata
1
10
100
1000
0 24487296120
horas
10
6
células/ml
control
150 ug/ml
300 ug/ml
500 ug/ml
T. cruzi
1
10
100
0 24 48 72 96 120 144 168
horas
10
6
células/ml
control
150 ug/ml
300 ug/ml
500 ug/ml
L. amazonensis
1
10
100
0 24487296120144
horas
10
6
cells.ml
-1
controle
150µg.ml-1
300µg.ml-1
500µg.ml-1
69
Figura 22 - Efeito do etoposídeo na proliferação celular de B. culicis, C. fasciculata, formas
epimastigotas de T. cruzi e promastigotas de L. amazonensis. A droga é adicionada à cultura
após 24h de cultivo. Estes resultados são a média de três experimentos independentes e o desvio
padrão é indicado por barras verticais.
B. culicis
1
10
100
1000
024487296
horas
10
6
cells.ml
-1
control
DMSO
150µg.ml-1
300µg.ml-1
500µg.ml-1
C. fasciculata
1
10
100
1000
0 24487296120
horas
10
6
cells.ml
-1
control
DMSO
150µg.ml-1
300µg.ml-1
500µg.ml-1
T. cruzi
1
10
100
0 24 48 72 96 120 144 168
horas
10
6
cells.ml
-1
control
DMSO
150µg.ml-1
300µg.ml-1
500µg.ml-1
L. amazonensis
1
10
100
0 24 48 72 96 120 144
horas
10
6
cells.ml
-1
control
DMSO
150µg.ml-1
300µg.ml-1
500µg.ml-1
70
Figura 23- Efeitos do ácido nalidíxico na ultraestrutura de B. culicis (A-C), C. fasciculata (D-F)
e epimastigotas de T. cruzi (G-I). A, D e G: cinetoplasto de células controle. B, E e H:
cinetoplasto de células tratadas com 300μg.mL
-1
por 48h. C, F e I: cinetoplasto de células
tratadas com 500μg.mL
-1
por 48h. Barras = 0,25μm.
71
Figura 24: Efeito do ácido nalidíxico na ultraestrutura de L. amazonensis. A: célula controle,
mostrando o núcleo (n), cinetoplasto (k) e bolsa flagelar (fp). Em B célula tratada com
500μg.mL
-1
da droga por 48h. A rede de kDNA não foi afetada (seta), porém observamos o
inchaço da mitocôndria (m) e alargamento das cristas. Barras = 0,5 μm.
n
k
fp
m
AB
n
k
fp
m
AB
72
Figura 25: Efeito da novobiocina em epimastigotas de T. cruzi (A) e em promastigotas de
L. amazonensis (B) após tratamento por 48h. A droga promoveu a lise das células (setas) em
concentrações a partir de 300μg.mL
-1
. Barras = 0,5 μm.
B
A
BB
AA
73
Figura 26- Ultraestrutura de B. culicis (A), C. fasciculata (B), epimastigota de T. cruzi (C) e
promastigota de L. amazonensis (D) tratados com etoposídeo. A droga não afetou o cinetoplasto
de nenhuma das espécies analisadas. Barras = 0,2 μm (A-C) e 0,5 μm (D). n: núcleo,
k: cinetoplasto.
A
B
C
D
n
k
A
B
C
D
n
k
74
IV.2 Clonagem e caracterização do gene que codifica a topoII de B. culicis e
localização celular desta enzima (dados publicados: Lourenço, Cavalcanti e col., 2006)
B. culicis é uma espécie com endosimbionte que possui um arranjo de kDNA
típico e ainda não bem caracterizado. Nesta espécie, o arranjo das fibrilas de kDNA é
mais frouxo quando comparada com as demais. Além disso, o cinetoplasto deste
protozoário foi o mais afetado após tratamento com inibidores de topoisomerase II.
Assim, resolvemos averiguar se a topoisomerase II deste protozoário apresentava
características diferentes das demais enzimas descritas em outros membros da família.
Para clonar o gene que codifica a topoII de B. culicis, diversos oligonucleotídeos
foram construídos baseados em regiões conservadas entre as topo II descritas em outros
tripanosomatídeos. Um dos pares de oligonucleotídeos utilizados na reação de PCR (o
par Bc7 + Bc14), promoveu a amplificação de um fragmento de DNA específico de 2,3
kb. Este fragmento, que chamamos de BC7-14, foi clonado no vetor pDK-101 e um dos
clones recombinantes que obtivemos foi parcialmente seqüenciado. O sequenciamento
das extremidades deste segmento indicou uma alta similaridade de BC7-14 com genes
TOP2 de outros tripanosomatídeos, confirmando que o produto clonado era um
fragmento do gene BcTOP2. Para conseguir sequenciar todo o segmento de 2,3 kb,
fragmentos menores de BC7-14 foram sub-clonados no vetor pBluescript e
seqüenciados. A sobreposição de todas as seqüências que obtivemos permitiu o
conhecimento completo do fragmento BC7-14. Este foi posteriormente utilizado como
sonda, para obtenção de toda a região codificante de BcTOP2 a partir da biblioteca
genômica de B. culicis. A seqüência completa de BcTOP2 (número de acesso no
GenBank AY185495) mostrou que este possui uma fase aberta de leitura de 3.693 pb,
codificando uma proteína com 1.230 aminoácidos, com massa molecular esperada de
75
138 kDa.
A comparação da seqüência de aminoácidos deduzida a partir do gene BcTOP2
com a seqüências de outras topo II descritas demonstra que a enzima de B. culicis
(BctopoII) apresenta similaridade com outras topo II de tripanosomatídeos (em torno de
78%), sendo esta maior com C. fasciculata. A similaridade com outras topoisomerases
eucarióticas é de cerca de 50% (tabela IV). Além disso, podemos observar que a
similaridade está dispersa por toda a seqüência, sendo menor na região carboxi-terminal
(figura 27). Esta característica é comum a todas as topoisomerases II já descritas.
Tabela IV: Semelhança entre topoisomerases II eucarióticas
B.culicis
(identidade - similaridade)
C. fasciculata
71% - 81%
L .infantum
68% - 79%
T. brucei
61% - 74%
T. cruzi
64% - 76%
S. cerevisae
30% - 50%
D. melanogaster
35% - 51%
H. sapiens
31% - 48%
76
Figura 27: Alinhamento entre as seqüências de aminoácidos de algumas topoisomerases
II eucarióticas.
77
78
NOTA: As regiões em preto representam aminoácidos com 100% de identidade. As
regiões em cinza escuro ou cinza claro representam seqüências com menor homologia.
A coluna em vermelho representa o provável resíduo de tirosina envolvido na ligação
covalente entre a topo II e o DNA. Os números de acesso das topoisomerases II utilizadas no
alinhamento são: B. culicis (protein_id = AAO23340.1 / NCBI), C. fasciculata (protein_id =
CAA42182.1 / NCBI), L. donovani (protein_id = AAD34021.1 / NCBI), L. infantum
(protein_id = AAF86355.1 / NCBI), T. brucei (protein_id = AAA30256.1 / NCBI), T. cruzi
(protein_id = AAA85575.1 / NCBI), S. cerevisiae (protein_id = AAM00524.1 / NCBI), D.
melanogaster (protein_id = NP_476760.1 / NCBI) e H. sapiens (protein_id = NP_001058.2 /
NCBI).
79
A análise da seqüência de aminoácidos de BctopoII mostrou que esta possui
domínios funcionais conservados em relação a outras topo II, principalmente quando
comparadas com a DNA girase de E. coli - figura 28 (Swanberg & Wang, 1987). A
porção amino-terminal da BctopoII é homóloga à subunidade B da girase (responsável
pela atividade ATPásica da enzima), enquanto a porção central apresenta homologia
com a subunidade A. Dentro da porção central é possível alinharmos o resíduo de
tirosina responsável pela ligação covalente da girase ao DNA (Horowitz & Wang, 1987)
com o resíduo de tirosina (Tyr
775
) na topo II de B.culicis .
Figura 28: Esquema dos domínios: ATPase, de clivagem/religação e carboxi-terminal
de BctopoII em comparação à DNA girase de E. coli. Y representa o resíduo de tirosina
envolvido na ligação da topo II ao DNA.
A seqüência de BctopoII foi também analisada em busca de sinais de
endereçamento celular para o núcleo e/ou mitocôndria, com os programas SignalP 3.0
(Bendtsen et al., 2004) e PSORT II (Nakai & Horton, 1999). Encontramos na região
carboxi-terminal da topo II de B.culicis duas prováveis seqüências de endereçamento
nuclear: (1165-1174 PPPSKRKPQ) e (1188-1205 KRLRNVKGKLKGKKTRR).
80
A análise de BcTOP2 por Southern blot (figura 29) mostrou um padrão simples,
no qual observamos uma só banda após a digestão do DNA com enzimas que não
possuíam sítio de clivagem dentro da sonda (DraI e ClaI), duas bandas para enzimas
com um sítio de clivagem dentro da sonda (BclI e PvuI) e três bandas para enzimas que
contêm dois sítios de clivagem dentro da sonda (SacI, AatII e XcmI). Estes resultados
sugerem que BcTOP2 é um gene de cópia única. A análise por Northern blot
demonstrou que este gene origina um único transcrito de 4,4 kb, tamanho este
compatível com a maior fase de leitura do gene BcTOP2 (figura 30).
Figura 29 (A) - Análise do arranjo do gene BcTOP2 por Southern blot. O DNA genômico de
B. culicis foi digerido com as enzimas (1) BclI, (2) AatII, (3) DraI, (4) SacI, (5) XcmI, (6) PvuI,
(7) ClaI. Os números a esquerda da figura representam os tamanhos dos polipeptídeos do
marcador de peso molecular.
Figura 29 (B) Mapa de restrição do gene BcTOP2 (barra vermelha) deduzido e confirmado por
digestão com as enzimas de restrição BclI, AatI, SacII, XcmI, PvuI. A região utilizada como
sonda é representada pela barra azul. As enzimas ClaI e DraI não possuem sítios de restrição
dentro da região utilizada como sonda.
81
Figura 30- Análise da expressão do gene BcTOP2 por Northern blot. Dez microgramas do RNA
total de B. culicis foram separados em gel de agarose 1,2%, transferidos para membrana de
nylon e hibridizados com a sonda radiotiva descrita na página 55. (1) RNA total de B. culicis
tratado com Rnase, (2) RNA total não tratado com RNase.
Com o propósito de produzir um antisoro contra a BctopoII, expressamos a
região carboxi-terminal desta proteína em E. coli. Escolhemos esta região por ser a
menos conservada entre as topo II, evitando assim uma possível reação cruzada com
topoisomerases II distintas. A fusão do carboxi-terminal de BctopoII com GFP foi feita
com o intuito de aumentar a estabilidade e a solubilidade da proteína em E. coli, já que
existem evidências de que proteínas fusionadas ao carboxi-terminal de GFP se tornam
mais solúveis e estáveis em E. coli (Rucker et al., 2001). A análise por Western blot nos
mostrou que o antisoro produzido reconhece um polipeptídeo de 138 kDa em extrato de
E. coli que expressa a proteína recombinante e em extrato de B. culicis (figura 31). O
antisoro foi utilizado também em ensaios de imunolocalização, onde reconheceu
exclusivamente o núcleo de B. culicis. A marcação apresentava-se mais intensa na
periferia do núcleo, como confirmado por imunocitoquímica ultraestrutural (figura 32).
82
Figura 31- Western blot utilizando antisoro anti-BctopoII em extratos de E. coli contendo o
plasmídeo recombinante pQE-BctopoII (1) não induzido e (2) induzido com IPTG. (3) extrato
de B. culicis.
Figura 32- Imunolocalização da topoisomerase II em B. culicis com o antisoro anti-BctopoII,
mostrando marcação ao redor do núcleo. As setas indicam o núcleo e as cabeças de seta o
cinetoplasto. A: imagem de contraste interferencial diferencial, B: imagem de fluorescência, C:
microscopia eletrônica de transmissão. A e B: barras = 10μM; C: barra = 0,25μM.
A
A
B
C
A
B
C
83
IV.3 Clonagem e expressão de genes que codificam proteínas associadas ao cinetoplasto
de T. cruzi e localização celular destas proteínas (dados em fase de redação para
publicação)
Pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos na compactação da rede de
kDNA dos tripanosomatídeos. Algumas proteínas semelhantes à histona foram
identificadas no cinetoplasto de C. fasciculata, sendo estas capazes de compactar a rede
de kDNA in vitro. As quatro proteínas associadas ao cinetoplasto (KAPs) de C.
fasciculata descritas, chamadas KAP1, 2, 3 e 4, apresentam baixo peso molecular e são
ricas em resíduos de lisina e alanina. A partir das anotações do genoma do T. cruzi
disponibilizados pelo consórcio TIGR (The Institute for Genomic Research),
identificamos neste protozoário seqüências ortólogas àquelas que codificam as KAPs de
C. fasciculata. A partir daí, desenhamos oligonucleotídeos para amplificar os genes que
codificam estas proteínas em T. cruzi, utilizando como modelo o clone Dm28c.
Chamamos estes genes de Tcp14, Tcp21 e Tcp23, sendo esta nomenclatura adotada em
função do peso molecular indicado a partir da seqüência de aminoácidos deduzida dos
genes. Os contigs obtidos a partir dos dados fornecidos pelo projeto genoma do T. cruzi
foram analisados, mostrando que um dos genes, o Tcp14, apresenta mais de uma cópia
no genoma do parasita, enquanto os outros dois parecem ser genes de cópia única. Nas
seções abaixo, descrevemos com maior detalhes os três genes.
IV.3.a) Análise de Tcp14
De acordo com a análise dos dados obtidos a partir do projeto genoma do T.
cruzi, o gene Tcp14 apresenta cinco cópias no genoma do parasita. Porém, não sabemos
quais destas cópias são provenientes de cromossomos homólogos. Chamamos de Tcp14
84
A, B, C, D e E as diferentes formas do gene. Desenhamos oligonucleotídeos para as
cinco formas, com o intuito de amplificar o gene Tcp14, a partir do DNA genômico do
clone Dm28c de T. cruzi. Todos os oligonucleotídeos amplificaram fragmentos de
aproximadamente 0,4 kb. O produto amplificado a partir dos primers desenhados para a
forma B foi escolhido para clonagem em vetor de expressão. O produto clonado foi
seqüenciado e comparado com as seqüências de nucleotídeos de Tcp14 disponibilizadas
pelo projeto genoma. A comparação entre as seqüências de Tcp14 com o gene
Tcp14_Dm28 clonado neste trabalho, é mostrada na figura 33. O alinhamento das
seqüências de aminoácidos deduzidas a partir destes genes é mostrado na figura 34.
Figura 33: Alinhamento de Tcp14, através do método ClustalW, realizado a partir do programa
MegAlign (DNASTAR Inc., USA). Em preto, regiões com 100% de identidade e em cinza
regiões com diferentes graus de identidade entre si. Tcp14 A-E são as diferentes formas do gene
obtidas a partir das anotações do projeto genoma do T. cruzi.
85
Figura 34: Alinhamento das seqüências de aminoácidos deduzidas a partir da seqüência de
nucleotídeos do gene Tcp14. Tcp14 A-E são as seqüências deduzidas a partir das seqüências de
nucleotídeos das diferentes formas do gene disponibilizadas pelo projeto genoma do T. cruzi.
Cfp16_KAP4 (número de acesso PIR- Protein Information Resource: JC6092) é a seqüência da
proteína KAP4 de C. fasciculata, que possui massa molecular de 16 kDa. As regiões com total
similaridade (aminoácidos com mesmas propriedades físico-químicas) estão marcadas em preto,
enquanto as regiões em diferentes tons de cinza representam diferentes graus de similaridade
entre as seqüências.
86
O gene Tcp14 do clone Dm28c de T. cruzi, que foi clonado neste trabalho,
apresenta 387 nucleotídeos, codificando uma proteína de 128 aminoácidos (tabela V),
com massa molecular estimada de 14 kDa. Além disso, este gene apresenta cerca de
90% de identidade com as diferentes formas de Tcp14 anotadas no projeto genoma do
T. cruzi (tabela VI). Quando analisamos a seqüência de aminoácidos deduzida a partir
dos genes, observamos uma identidade que varia entre 55% e 61% em relação à
proteína KAP4 de C. fasciculata (tabela VII). A proteína Tcp14 de T. cruzi Dm28c,
alvo de nosso estudo, apresenta similaridade de 55% com a KAP4 de C. fasciculata
(tabela VII). A análise da seqüência de aminoácidos nos mostra ainda que Tcp14
apresenta em média 28% de resíduos de aminoácidos básicos e pI de aproximadamente
11. A presença de resíduos básicos e alto pI é uma característica geral das histonas.
Tabela V- Informações sobre Tcp14.
Gene Tcp14 Nomenclatura TIGR Número de
nucleotídeos
Número de
aminoácidos
Tcp14_A Tc00.1047053509793.10 384 127
Tcp14_B Tc00.1047053509793.30 372 123
Tcp14_C Tc00.1047053509793.40 387 128
Tcp14_D
Tc00.1047053508719.40 387 128
Tcp14_E
Tc00.1047053508719.60 384 127
Tcp14_Dm28
---------- 387 128
NOTA: Tcp14_A-E correspondem as diferentes formas do gene obtidas a partir do projeto genoma do T.
cruzi. Tcp14_Dm28 corresponde ao gene Tcp14 clonado neste trabalho, a partir do clone Dm28c de T.
cruzi.
87
Tabela VI. Identidade entre as diferentes formas de Tcp14 (A-E) e Tcp14_ Dm28c,
baseado em suas seqüências de nucleotídeos
% IDENTIDADE Gene Tcp14
Tcp14_A Tcp14_B Tcp14_C Tcp14_D Tcp14_E Tcp14_Dm28
Tcp14_A
100 87,2 92,7 90,9 95,6 91,7
Tcp14_B
100 91,7 91,7 87,4 89,0
Tcp14_C
100 95,6 89,7 95,9
Tcp14_D
100 89,7 93,0
Tcp14_E
100 89,6
Tcp14_Dm28
100
Tabela VII. Identidade entre as seqüências de aminoácidos codificadas pelas diferentes
formas do gene Tcp14 (A-E), Tcp14_Dm28 e KAP4 de C. fasciculata
% IDENTIDADE
PROTEÍNA
Tcp14_A Tcp14_B Tcp14_C Tcp14_D Tcp14_E Tcp14
_Dm28
Cfp16
_KAP4
Tcp14_A 100 77,3 84,4 83,6 96,1 85,2 57,8
Tcp14_B 100 84,7 90,3 80,6 83,9 61,3
Tcp14_C 100 91,5 82.9 94,6 55,0
Tcp14_D 100 83,7 89,1 58,1
Tcp14_E 100 83,6 59,4
Tcp14_Dm28 100 55,0
Cfp16_KAP4 100
IV.3.b) Análise de Tcp21 e Tcp23
De acordo com as informações obtidas a partir do projeto genoma de T. cruzi, o
gene Tcp21 apresenta apenas duas seqüências, sendo que estas são provavelmente
alélicas, já que as regiões que as flanqueiam são muito similares. O mesmo ocorre para
Tcp23. Neste trabalho, desenhamos oligonucleotídeos para amplificar Tcp21 e Tcp23 a
partir do DNA genômico de T. cruzi, clone Dm28c. Nas figuras 35 a 38, podemos
observar o alinhamento entre as seqüências de Tcp21. O mesmo pode ser observado
para Tcp23. O alinhamento foi realizado a partir do programa MegAlign (DNASTAR
Inc., USA).
88
Figura 35: Alinhamento de Tcp21. Tcp21_A e B são as seqüências obtidas a partir do projeto
genoma do T. cruzi. Tcp21_Dm28 corresponde ao gene Tcp21 clonado neste trabalho, a partir
do DNA genômico do clone Dm28c de T. cruzi. As regiões pretas representam regiões com
100% de identidade.
89
Figura 36: Alinhamento entre as seqüências de nucleotídeos do gene Tcp23. Tcp23_A e B são
as seqüências obtidas a partir do projeto genoma do T. cruzi. Tcp23_Dm28 corresponde ao gene
Tcp23 clonado neste trabalho, a partir do DNA genômico do clone Dm28c de T. cruzi. As
regiões pretas representam regiões com 100% de identidade.
90
Figura 37: Alinhamento das seqüências de aminoácidos deduzidas a partir do gene Tcp21. As
regiões com total similaridade (aminoácidos com mesmas propriedades físico-químicas) estão
marcadas em preto.
Figura 38: Alinhamento das seqüências de aminoácidos deduzidas a partir do gene Tcp23. As
regiões com total similaridade (aminoácidos com mesmas propriedades físico-químicas) estão
marcadas em preto.
91
Nas tabelas VIII e IX reunimos algumas informações sobre os genes Tcp21 e
Tcp23. Tcp21 possui 558 nucleotídeos e codifica uma proteína de 185 aminoácidos,
com massa molecular esperada de 21 kDa. Já Tcp23 apresenta 588 nucleotídeos,
codificando uma proteína de 195 aminoácidos e peso molecular estimado em 23 kDa.
Tcp21 apresenta cerca de 30% de aminoácidos básicos e pI estimado igual a 11. Tcp23
apresenta pI de aproximadamente 12 e 34% de aminoácidos básicos. Na tabela X
encontra-se a porcentagem de identidade entre Tcp21 e Tcp23 em relação as KAPs de
C. fasciculata. Oligonucleotídeos construídos para amplificar estes genes por PCR,
resultaram na amplificação de fragmentos de aproximadamente 0,6 kb, que foram
posteriormente clonados em vetor de expressão, como descrito no item IV.3 (c).
Tabela VIII- Informações sobre o gene Tcp21
Gene Tcp21 Nomenclatura TIGR Número de
nucleotídeos
Número de
aminoácidos
Tcp21_A Tc00.1047053509791.120 558 185
Tcp21_B Tc00.1047053511039.10 558 185
Tcp21_Dm28 ---------- 558 185
Tabela IX- Informações sobre o gene Tcp23
Gene Tcp23 Nomenclatura TIGR Número de
nucleotídeos
Número de
Aminoácidos
Tcp23_A Tc00.1047053511029.20 624 207
Tcp23_B Tc00.1047053511529.80 588 195
Tcp23_Dm28 ---------- 588 195
Tabela X: Identidade entre Tcp21 e Tcp23 e as KAPs de C. fasciculata
% IDENTIDADE
Proteína
P16 (KAP4) P17 (KAP3) P18 (KAP2) P21 (KAP1)
Tcp21 24,7 24,2 24,2 a 24,7 23,1
Tcp23 18,8 a 20,4 30,8 a 33,2 21,6 a 23,5 26 a 28,6
92
A análise da seqüência de aminoácidos das três KAPs de T. cruzi, em busca de
sinais de endereçamento, mostrou que Tcp14, Tcp21 e Tcp23 (figuras 34, 37 e 38)
apresentam em sua extremidade N-terminal uma região muito similar a pré-seqüência
clivável de nove aminoácidos encontrada em C. fasciculata, que está envolvida na
importação das KAPs para a mitocôndria deste protozoário (figura 39). Estas pré-
seqüências possuem oito ou nove resíduos de aminoácidos, sendo alguns deles
hidrofóbicos, não possuindo resíduos acídicos e começando com os resíduos metionina
(M), leucina (L) e arginina (R). Estes três resíduos foram encontrados também no início
das seqüências de aminoácidos de Tcp14, Tcp21 e Tcp23, reforçando a idéia de que as
três proteínas analisadas a partir do genoma de T. cruzi sejam de fato proteínas
associadas ao cinetoplasto deste parasita.
Figura 39: Comparação entre pré-sequências de proteínas importadas para a mitocôndria em
tripanosomatídeos. As proteínas comparadas são a polimerase beta e proteínas associadas ao
cinetoplasto (KAPs p18, p17, p16 e p21) de C. fasciculata; a aldeído desidrogenase de L.
tarentolae e a hsp60 (Hines & Ray, 1998). Em negrito a pré-sequência de nove aminoácidos
envolvida na importação mitocondrial destas proteínas. Dentro dos boxes, as regiões de maior
homologia.
93
IV.3 c) Expressão das proteínas recombinantes Tcp14, Tcp21 e Tcp23 em E. coli
Com o intuito de produzir antisoros contra as proteínas Tcp14, Tcp21 e Tcp23,
clonamos os genes que codificam estas proteínas no vetor de expressão pQE-30, para
que estes fossem posteriormente expressos em linhagens de E. coli M15. Na figura
40 A-B podemos observar a expressão de Tcp14 e de Tcp21 após indução da expressão
com IPTG. Entretanto, não conseguimos expressar a proteína Tcp23 na linhagem M15,
uma vez que as bactérias não se multiplicavam após a adição do IPTG. Como Tcp23
poderia estar sendo tóxica para as bactérias, resolvemos utilizar outra estratégia para
obtenção da Tcp23 recombinante, usando o plasmídeo pGEX-B para a expressão do
gene Tcp23. Neste sistema, a proteína recombinante é obtida como uma proteína de
fusão com GST (glutationa transferase). Um novo oligonucleotídeo reverso foi
desenhado, para ser usado na reação de amplificação apenas da metade inicial do gene
Tcp23. Depois de clonar este fragmento de Tcp23 no vetor pGEX, obtivemos a
expressão de parte da proteína Tcp23 (aproximadamente 10 kDa) fusionada a GST (29
kDa) (figura 40 C).
A) Tcp14 B) Tcp21 C) Tcp23
Figura 40: Extratos de E. coli que expressam a proteína recombinante (setas). (A) Tcp14, (B)
Tcp21 e (C) Tcp23 antes da indução com IPTG (1) e após a indução com IPTG (2).
kDa
50
40
30
25
20
1
2
kDa
50
40
30
25
20
1
2
kDa
50
40
30
25
20
12
kDa
50
40
30
25
20
12
kDa
12
50
40
30
25
20
kDa
12
50
40
30
25
20
94
Como as proteínas recombinantes obtidas usando o sistema de expressão em
pQE-30 são sintetizadas com um “tag” de histidina em sua porção amino-terminal e
aquelas em pGEX são fusionadas com GST, confirmamos a expressão das proteínas
recombinantes em E. coli por Western blot, utilizando extratos de bactéria não
induzidos e induzidos, reagidos com anticorpo monoclonal anti-polihistidina ou soro
anti-GST (Figura 41). A expressão de Tcp14 e Tcp21 foi confirmada com o uso do
anticorpo monoclonal anti-polihistidina, enquanto a expressão de Tcp23 foi confirmada
com o uso do antisoro anti-GST. O Western blot para Tcp23 apresentou uma banda do
tamanho esperado para a proteína recombinante (aproximadamente 40 kDa) e bandas
menores, provavelmente resultantes da degradação da proteína de fusão. Após
confirmar que as culturas bacterianas estavam expressando as proteínas de interesse,
purificamos Tcp14, Tcp21 e Tcp23 de gel preparativo de poliacrilamida 13%. As
proteínas purificadas foram utilizadas para imunizar camundongos suíços, com intuito
de produzir antisoros contra cada uma destas KAPs de T. cruzi.
A) Tcp14 B) Tcp21 C) Tcp23
Figura 41: Extratos de E. coli não induzido (1) e induzido com IPTG (2) foram reagidos com
anticorpo monoclonal anti-polihistidina (A e B) ou soro anti-GST (C), para demonstrar a
expressão das proteínas recombinantes na bactéria (setas). Em C, observamos degradação da
proteína recombinante (seta) em fragmentos menores, sendo um deles inclusive de mesma
massa molecular de GST (3*). Obs: na figura C, a canaleta 3 contem GST purificada em
coluna.
50
40
30
25
20
15
kDa 1
2
50
40
30
25
20
15
kDa 1
2
50
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25
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15
kDa 1
2
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12
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12
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20
kDa 1 2
3
*
50
40
30
25
20
kDa 1 2
3
*
95
IV.3 d) Produção de antisoros contra as proteínas Tcp14, Tcp21 e Tcp23
Os antisoros contra as KAPs de T. cruzi obtidos após a imunização dos
camundongos, foram utilizados em ensaios do tipo Western blot, para avaliar se estes
reconheciam o polipeptídeo de interesse no parasita. Pudemos mostrar que o soro anti-
Tcp14 reconhece um peptídeo de aproximadamente 16 kDa em extratos de epimastigota
de T. cruzi, o anti-Tcp21 reconhece um polipeptídeo com cerca de 23 kDa e o anti-
Tcp23 uma banda de aproximadamente 25 kDa (figura 42). Um fato interessante em
relação às três proteínas (Tcp14, Tcp21 e Tcp23), é que suas massas moleculares
preditas a partir de suas seqüências de aminoácidos são menores do que suas massas
moleculares determinadas no gel SDS-PAGE. Esta migração anômala no gel de
poliacrilamida, provavelmente resulta da natureza altamente básica destas proteínas,
assim como ocorre com C. fasciculata (Xu et al., 1996).
A) Tcp14 B) Tcp21 C) Tcp23
Figura 42: Extratos de epimastigotas de T. cruzi reagidos com os soros anti-Tcp14 (A), anti-
Tcp21 (B) e anti-Tcp23 (C). Os três soros reconheceram uma banda específica e de peso
molecular esperado.
kDa
40
50
30
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20
15
kDa
40
50
30
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20
25
kDa
50
40
30
20
25
96
Analisamos também se estas proteínas eram expressas nas formas amastigota e
tripomastigota do parasita. Como mostrado na figura 43 A, o soro anti-Tcp14 reconhece
um polipeptídeo nos três estágios evolutivos do protozoário. O mesmo ocorre quando o
soro anti-Tcp21 é utilizado. Já o soro anti-Tcp23 reconhece um polipeptídeo apenas nas
formas epimastigotas (figua 43 B).
A) Tcp14 B) Tcp23
Figura 43: Análise da expressão de Tcp14 e Tcp23 em formas tripomastigotas (1), amastigotas
(2) e epimastigotas (3) de T. cruzi reagidos com os soros anti-Tcp14 e anti-Tcp23,
respectivamente.
IV.3 e) Localização celular das KAPs em T. cruzi
Com o objetivo de determinar a localização das KAPs, realizamos ensaios de
imunofluorescência com os soros produzidos. Na forma epimastigota de T. cruzi, a
Tcp14 encontra-se localizada em dois sítios opostos que flanqueiam a rede de kDNA
em cerca de 40% dos protozoários da cultura. Nos demais protozoários, a enzima
encontra-se distribuída por todo o kDNA (figura 44). Esta diferença pode estar
relacionada ao fato de que estas células encontram-se em fases distintas do ciclo celular,
já que trabalhamos com culturas não sincronizadas. Em formas amastigota, a proteína
kDa
40
50
30
25
20
1
23
kDa
40
50
30
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20
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23
kDa
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20
kDa 1
23
40
50
30
25
20
kDa 1
23
97
encontra-se distribuída por todo o cinetoplasto do parasita (figura 45), enquanto em
tripomastigotas metacíclicos, Tcp14 se encontra distribuída na periferia da rede de
kDNA (figura 46).
A proteína Tcp21 encontra-se distribuída por todo o cinetoplasto das formas
epimastigota e amastigotas de T. cruzi (figuras 47 e 48), enquanto nas formas
tripomastigota está localizada na periferia da rede de kDNA (figura 49), assim como
Tcp14. Já o soro contra Tcp23 não foi capaz de marcar nenhum compartimento celular
nos epimastigotas, sendo observada uma marcação espalhada por todo o citoplasma do
parasita (figura 50).
98
Figura 44 (I e II): Imunolocalização de Tcp14 em epimastigotas de T. cruzi. A:
contraste interferencial diferencial (DIC); (B): fluorescência, mostrando a localização de
Tcp14 exclusivamente no cinetoplasto do protozoário; (C): marcação com DAPI,
indicando o cinetoplasto (k) e o núcleo (n) do parasita. Note nas figuras B que Tcp14
encontra-se distribuída nos pólos diametralmente opostos da rede de kDNA (*) em
alguns protozoários da cultura. Barras = 10µm.
A
B
C
*
*
k
k
n
ABC
*
*
k
n
II
I
A
B
C
*
*
k
k
n
A
B
C
*
*
k
k
n
ABC
*
*
k
n
II
I
ABC
*
*
k
n
ABC
*
*
k
n
II
I
99
Figura 45 (I e II): Distribuição celular de Tcp14 em amastigotas de T. cruzi. A:
contraste interferencial diferencial (DIC); (B): fluorescência, mostrando que o antisoro
anti-Tcp14 reconhece exclusivamente o cinetoplasto do parasita; (C): marcação com
DAPI, indicando o cinetoplasto (k) e o núcleo (n). Barras = 5µm.
I
k
n
A
B
C
k
n
k
n
A
B
C
k
n
ABC
k
n
k
n
ABC
II
100
Figura 46 (I e II): Imunolocalização de Tcp14 em tripomastigotas de T. cruzi. A:
contraste interferencial diferencial (DIC); (B): fluorescência, mostrando a localização de
Tcp14 exclusivamente o cinetoplasto do parasita. Note que Tcp14 encontra-se
distribuída na periferia da rede de kDNA (setas). K= cinetoplasto. Barras = 10µm.
k
AB
A
B
II
I
k
AB
k
AB
A
B
II
I
A
B
A
B
II
I
101
Figura 47 (I e II) : Imunolocalização de Tcp21 em epimastigotas de T. cruzi. A:
contraste interferencial diferencial (DIC); (B): fluorescência, mostrando a distribuição
de Tcp21 por todo o cinetoplasto do protozoário; (C): marcação com DAPI, indicando o
cinetoplasto (k) e o núcleo (n). Barras = 10µm.
A
BC
k
n
k
A
BC
k
n
k
I
II
A
BC
k
n
k
A
BC
k
n
k
A
BC
k
n
k
A
BC
k
n
k
I
II
102
Figura 48: Localização de Tcp21 em amastigotas de T. cruzi. A: contraste interferencial
diferencial (DIC); (B): fluorescência, mostrando que Tcp21 se distribui por todo o
cinetoplasto do parasita; (C): marcação com DAPI, indicando o cinetoplasto (k) e o
núcleo (n). Barra = 5µm.
Figura 49 (I e II): Distribuição de Tcp21 em tripomastigotas de T. cruzi. A: contraste
interferencial diferencial (DIC); (B): fluorescência, mostrando que Tcp21 se encontra
distribuída na periferia da rede de kDNA; (C): marcação com DAPI, indicando o
cinetoplasto (k) e o núcleo (n). Barras = 10µm.
AB
C
k
n
k
AB
C
k
k
I
II
AB
C
k
n
k
AB
C
k
n
k
AB
C
k
k
AB
C
k
k
I
II
AB
C
k
n
k
AB
C
k
n
k
103
Figura 50: Imunolocalização de Tcp23 em epimastigotas de T. cruzi. A: fluorescência,
mostrando que o soro anti-Tcp23 não é capaz de reconhecer nenhuma estrutura
específica no protozoário. B: DAPI, com marcação mais intensa no cinetoplasto (k) do
parasita. Barra = 10 μm.
k
k
AB
kk
k
AB
104
IV.3 f) Superexpressão das KAPs em epimastigotas de T. cruzi
Para avaliar o efeito da superexpressão das KAPs na organização da rede de
kDNA, os genes Tcp14 e Tcp23 foram clonados separadamente no plasmídeo pTEX,
que contem o gene que codifica resistência a neomicina. Epimastigotas de T. cruzi
foram transformados separadamente com cada plasmídeo recombinante (pTEX-Tcp14
ou pTEX-Tcp23) e as culturas transformadas foram selecionadas com o uso de um
análogo da neomicina, a geneticina ou G418. Após algumas semanas, culturas controle
(não tranformadas) e culturas transfectadas contendo parasitas resistentes ao antibiótico
foram analisadas por ensaios de Northern blot e Western blot. Através do Northern blot
pudemos identificar que o gene Tcp14 transcreve RNAs de aproximadamente 2kb e 3
kb, sendo que estes RNAs podem ser resultantes de diferentes cópias do gene presentes
no genoma do protozoário ou de um mecanismo de processamento diferencial da
molécula de RNA transcrita a partir de um gene de cópia única. Já o gene Tcp23
transcreve apenas uma espécie de RNA de aproximadamente 4 kb. A análise por
Northern blot dos parasitas transfectados com pTEX-Tcp14 ou pTEX-Tcp23
demonstrou espécies adicionais de RNA nos parasitas transfectados, indicando que os
protozoários resistentes a G418 transcreviam os genes para Tcp14 ou Tcp23 clonados
no plasmídeo pTEX (figura 51). Entretanto, a análise por Western blot demonstrou não
haver diferença significativa entre a quantidade das proteínas em extratos de células
controle (não transfectados) e células contendo os plasmídeos recombinantes pTEX-
KAP (figura 52). Análises por microscopia eletrônica de transmissão não demonstraram
alterações fenotípicas no cinetoplasto, ou em qualquer outro compartimento celular das
células transformadas com o plasmídeo recombinante pTEX-Tcp14 ou pTEX-Tcp23
(figura 53).
105
Figura 51: Northern blot mostrando uma espécie de RNA adicional de aproximadamente
2,3 kb para Tcp14 e Tcp23 (setas em A e B, respectivamente), nas frações de RNA total
obtidas dos parasitas transfectados (2) em comparação com os parasitas não
transfectados (1).
A B
Figura 52: Análise da expressão de Tcp14 (A) e Tcp23 (B) utilizando os soros anti-Tcp14 e
anti-Tcp23, respectivamente. Em (1) extrato obtido a partir de cultura de epimastigotas de T.
cruzi transformados com o plasmídeo ptex-Tcp14 (A) ou ptex-Tcp23 (B). Em (2) extratos
obtidos a partir de uma cultura controle (não transformada).
kDa
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50
30
25
20
15
1
2
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40
50
30
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15
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40
50
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15
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2
kDa
40
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30
25
20
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2
kDa
40
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30
25
20
15
1
2
kDa
40
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30
25
20
15
kDa
40
50
30
25
20
15
1
2
1
2
7,4
4,4
2,3
1,3
kb
12
7,4
4,4
2,3
1,3
kb
7,4
4,4
2,3
1,3
kb
7,4
4,4
2,3
1,3
kb
12
7,4
4,4
2,3
1,3
kb
1
2
7,4
4,4
2,3
1,3
kb
7,4
4,4
2,3
1,3
kb
7,4
4,4
2,3
1,3
7,4
4,4
2,3
1,3
kb
1
2
A B
106
Figura 53: Micrografias eletrônicas de epimastigotas de T. cruzi. (A) célula transformada
somente com pTEX , (B): célula transformada com ptex-Tcp14 e (C): célula transformada com
ptex-Tcp23. Barras = 0,5 μm.
N
k
k
N
B
C
k
N
A
N
k
k
N
B
C
k
N
A
N
k
k
N
B
C
k
N
A
107
V. DISCUSSÃO
108
Os tripanosomatídeos assumem grande relevância médica, econômica e social,
uma vez que vários membros desta família são agentes etiológicos de graves doenças
tropicais. A doença de Chagas e as leishmanioses são problemas de saúde pública
principalmente em países da América Latina, ocasionando milhares de óbitos a cada
ano, deixando outros milhares de indivíduos incapacitados de trabalhar e gerando ônus
para os governos com o tratamento dos doentes.
Além da relevância médica e econômica, esta família de protozoários desperta
grande interesse de estudo devido ao seu o caráter ancestral na escala evolutiva. Estes
eucariotos primitivos apresentam estruturas e propriedades biológicas não encontradas
em qualquer outro ser, o que torna o grupo extremamente atraente para pesquisas na
área de evolução, biologia celular e molecular. Uma das estruturas peculiares dos
tripanosomatídeos é o cinetoplasto, uma região alargada da mitocôndria que abriga o
DNA mitocondrial. O kDNA apresenta uma organização diferente de qualquer outro
DNA conhecido, sendo formado por moléculas circulares, topologicamente relaxadas e
interligadas umas as outras. Considerando o caráter ímpar do cinetoplasto na natureza,
este se torna um potencial alvo para o desenvolvimento de quimioterápicos. Desse
modo, o conhecimento das diversas moléculas envolvidas na organização e replicação
da rede de kDNA, assim como o entendimento dos processos fisiológicos que ocorrem
nesta estrutura, podem contribuir para o desenvolvimento de novas terapias anti-
tripanosomais mais eficazes do que as já existentes.
A maior parte do conhecimento sobre o cinetoplasto de tripanosomatídeos
provém de pesquisas com C. fasciculata e em menor quantidade com T. brucei. Porém,
estudos demonstram que dentro desta família existem variações entre o cinetoplasto das
diferentes espécies, principalmente no que se refere ao arranjo da rede de kDNA. A
maior parte dos tripanosomatídeos da família apresenta o cinetoplasto em forma de
109
bastão, com as fibrilas de kDNA bastante compactadas (revisto por De Souza, 1984).
Entretanto, nos tripanosomatídeos que apresentam endosimbionte, as fibrilas de DNA
encontram-se organizadas em um arranjo mais largo e frouxo, que preenche toda a
matriz do cinetoplasto (Freymuller & Camargo, 1981). Formas tripomastigotas de T.
cruzi também apresentam uma organização menos condensada da rede de kDNA,
contida em um cinetoplasto que apresenta uma estrutura arredondada (revisto por De
Souza, 1984).
Um dos objetivos do presente trabalho foi avaliar o papel do cinetoplasto como
potencial alvo quimioterápico. Para tal, tripanosomatídeos que apresentam distintos
arranjos da rede de kDNA foram submetidos a tratamento com drogas que atuam sobre
as topoisomerases II. Estas enzimas são essenciais para estes protozoários, pois
participam não somente do metabolismo do DNA nuclear como também da replicação
do DNA do cinetoplasto. As topoisomerases II liberam os minicírculos da rede de
kDNA para que eles sejam replicados como círculos livres, religam os mesmos à
periferia da rede após a replicação, participam da segregação dos círculos irmãos e
possuem papel estrutural, ancorando os maxicírculos à membrana mitocondrial
(Shapiro, 1993). Uma variedade de fármacos que têm como alvo topoisomerases tanto
de procariotos como de eucariotos, encontram-se disponíveis comercialmente, sendo
utilizados como potentes agentes bactericidas ou no tratamento de tumores (Drlica &
Franco, 1988). Relatos na literatura indicam que muitos destes fármacos são capazes de
afetar os tripanosomatídeos, inibindo a proliferação celular e promovendo efeitos
marcantes sobre a rede de kDNA (Shapiro, 1993, Gonzalez-Perdomo et al., 1990).
Drogas pertencentes à classe das quinolonas, como o ácido nalidíxico e o ácido
oxolínico, ou pertencentes à classe das coumarinas, como a novobiocina, atuam sobre a
DNA girase, a topoisomerase II bacteriana. As quinolonas atuam sobre a subunidade A
110
da girase, que é responsável pela atividade catalítica de quebra e reunião da dupla fita de
DNA, enquanto as coumarinas atuam sobre a subunidade B, que é responsável pela
ligação da enzima ao ATP. Quando utilizadas em altas concentrações, tais drogas
podem modificar também as funções catalíticas da topoisomerase II de eucariotos
(Robinson et al., 1991). Inibidores da topo II de eucariotos, como o etoposídeo e o
teniposídeo, também estão disponíveis para uso clínico no tratamento de tumores.
Considerando o importante papel que a topoisomerase II desempenha nos
tripanosomatídeos e a disponibilidade comercial de diversas drogas que atuam sobre
esta enzima, resolvemos avaliar os efeitos de inibidores da topo II na ultraestrutura e
proliferação celular dos tripanosomatídeos. Espécies que apresentam diferentes graus de
compactação da rede de kDNA, como B. culicis, C. fasciculata, epimastigotas de T.
cruzi e promastigotas de L. donovani, foram tratadas com inibidores da topo II de
procariotos e eucariotos. O ácido nalidíxico foi a primeira quinolona descoberta no
início dos anos 60, sendo introduzido em tratamentos clínicos de infecções urinárias em
1967. Em procariotos, esta droga estabiliza o complexo formado entre a girase e o
DNA, inibindo o processo de replicação (Maxwell, 1997). Nos tripanosomatídeos, o
ácido nalidíxico inibiu a proliferação celular de maneira dose-dependente e promoveu
alterações ultraestruturais em todas as espécies analisadas. O principal efeito
ultraestrutural promovido por este inibidor foi a compactação das fibrilas de kDNA, que
ocorreu com maior intensidade nas espécies com arranjo mais frouxo da rede de kDNA.
Assim, B. culicis e C. fasciculata foram afetadas mesmo quando a concentração mais
baixa da droga foi utilizada. Talvez estes protozoários tenham sido mais afetados, por
possuírem um arranjo menos compacto do kDNA do que as demais espécies, o que
facilitaria a interação da droga com seu alvo. Porém, outros fatores que não o grau de
compactação da rede de kDNA podem ter sido os responsáveis por tal efeito, como
111
discutido adiante. A novobiocina é um composto natural conhecido desde a década de
50 e atua competindo com o ATP pela ligação à girase. Esta droga promoveu intensa
extração citoplasmática e lise celular em epimastigotas de T. cruzi e promastigotas de L.
amazonensis, após uso de concentrações maiores que 300 μg.mL
-1
. Nossos resultados
estão de acordo com os dados obtidos por Gozales-Perdomo e colaboradores (1990),
que relatam que altas doses de novobiocina promovem a lise de epimastigotas de T.
cruzi. Um estudo recente demonstrou ainda que esta coumarina induz a morte celular
com características de apoptose em promastigotas de L. donovani (Singh, Jayanarayan
& Dey, 2005), indicando que nos tripanosomatídeos este pode ser o mecanismo
disparado pela novobiocina com a inibição da topo II. No entanto, não podemos
descartar a possibilidade da morte celular ser causada por outros fatores que não a
inibição direta da enzima. O etoposídeo, que inibe a topo II de eucariotos, não
promoveu alterações ultraestruturais nem inibiu a proliferação dos tripanosomatídeos
analisados, embora relatos anteriores tenham demonstrado que esta droga promove a
linearização dos minicírculos e liberação dos maxicírculos da rede de kDNA em T.
equiperdum (Shapiro, 1994, Shapiro & Showalter, 1994). As concentrações necessárias
para inibir a proliferação e promover alterações ultraestruturais nos tripanosomatídeos
variou de espécie para espécie e de acordo com a droga utilizada. Estas divergências
podem estar relacionadas a diversos fatores, tais como diferenças de (a) permeabilidade
celular, (b) graus de compactação da rede de kDNA, (c) sensibilidade das distintas
topoisomerases aos inibidores, (d) propriedades farmacológicas intrínsecas de cada um
dos inibidores e (e) capacidade destes protozoários de bombear a droga para fora da
célula.
A compactação da rede de kDNA de C. fasciculata após tratamento com alta
dose de ácido nalidíxico, promoveu neste protozoário um fenótipo similar ao de
112
linhagens mutantes que não expressam a proteína KAP1. Tal proteína está associada ao
cinetoplasto de C. fasciculata e tem um papel estrutural na organização da rede de
kDNA. O duplo nocaute do gene KAP1 neste tripanosomatídeo produz células viáveis,
porém estas apresentam um intenso rearranjo do kDNA. Nestes mutantes, o DNA do
cinetoplasto é altamente condensado, formando grossas fibras de DNA e uma camada
elétron-densa no centro da rede (Lukes et al., 2001). Este resultado é muito parecido ao
que obtivemos após o tratamento de C. fasciculata com um inibidor da girase, o que
sugere que a topo II possa desempenhar um papel não somente na replicação da rede de
kDNA, como também em sua organização (Cavalcanti et al., 2004).
O tratamento com os inibidores de topoisomerase revelou ainda que as drogas
que atuam sobre a DNA girase foram mais eficazes em inibir a proliferação dos
tripanosomatídeos do que o etoposídeo, um inibidor da topo II de eucariotos. Este
resultado é extremamente interessante do ponto de vista quimioterápico, uma vez que os
inibidores da topo II de procariotos já são utilizados clinicamente como agentes
bactericidas, causando danos reduzidos às células eucariotas. Além disso, desde os anos
80, uma série de novas quinolonas (fluoroquinolonas) têm sido produzidas, com intuito
de aumentar o espectro de atividade destes antibióticos, de reduzir as dosagens
utilizadas no tratamento e de diminuir os efeitos colaterais (Emmerson & Jones, 2003).
Assim, fármacos que têm sido utilizadas há anos estritamente como agentes
bactericidas, podem no futuro ter um importante papel na quiomioterapia de doenças
causadas por tripanosomatídeos.
Sendo B. culicis o tripanosomatídeo mais afetado pelo tratamento com inibidores
de topoisomerase II e a espécie que apresenta o arranjo mais frouxo das fibrilas de
kDNA, resolvemos averiguar se a topo II deste protozoário apresentava características
distintas das demais enzimas descritas. Em tripanosomatídeos, topoisomerases II foram
113
identificadas em T. brucei (Straus & Wang 1990, Kulikowicz & Shapiro, 2006), T. cruzi
(Fragoso & Goldenberg, 1992), C. fasciculata (Pasion et al., 1992), L. donovani (Das et
al., 2001), L. infantum (Hanke et al., 2003) e L. chagasi (De Sousa et al., 2003). Neste
trabalho, clonamos e sequenciamos o gene que codifica a topo II (BcTOP2) no
tripanosomatídeo monoxênico B. culicis. A análise de BcTOP2 indicou que este é um
gene de cópia única no genoma do protozoário, que transcreve um RNA de 4,4 kb e
codifica uma proteína de 138 kDa (Lourenço et al., 2006), tamanho compatível ao de
outras topo II descritas em tripanosomatídeos (Pasion et al., 1992, Fragoso &
Goldenberg 1992, Straus & Wang 1990). A comparação entre a seqüência de
aminoácidos deduzida a partir de BcTOP2 com a topo II de outros tripanosomatídeos,
revelou que a enzima de B. culicis (BctopoII) apresenta cerca de 78% de similaridade
com a topo II de outros membros da família e 48% de similaridade com a topo II
humana. Além disso, BctopoII apresenta domínios funcionais conservados, como
observado pela comparação com as subunidades da DNA girase de E. coli. A porção
amino-terminal de BctopoII apresenta homologia com a subunidade B da girase (GyrB),
que é responsável pela ligação ao ATP. A homologia entre GyrB e a topo II de
tripanosomatídeos se estende até aproximadamente 600 aminoácidos a partir da região
amino-terminal da topoII. Já a região central de BctopoII é homóloga a subunidade A da
girase (GyrA). A existência de homologia entre a topoII dos tripanosomatídeos e a
girase é consistente com nossos resultados de que drogas que atuam sobre a topo II
bacteriana são capazes de inibir a proliferação celular destes protozoários. As topo II
dos tripanosomatídeos apresentam maior homologia com as topo II eucarióticas, do que
procarióticas. Entretanto, não podemos descartar a possibilidade da existência de
enzimas semelhantes às bacterianas no cinetoplasto destes protozoários, já que
inibidores da girase foram capazes de promover uma intensa modificação ultraestrutural
114
na rede de kDNA. A análise da seqüência peptídica de BctopoII mostrou também que a
homologia entre esta enzima e outras topos II eucarióticas encontra-se distribuída por
toda a seqüência, sendo alta na região amino-terminal e menor na região carboxi-
terminal (Lourenço et al., 2006). Esta característica é comum a todas as topo II já
descritas. Tais diferenças na região carboxi-terminal podem ser reflexo dos tipos de
modificação e do grau de modulação que contribuem para a atividade da enzima ao
longo do ciclo celular nas diferentes espécies. Em leveduras, por exemplo, o domínio
carboxi-terminal da topo II é fosforilado por uma caseína quinase, aumentando a
estabilidade do complexo DNA-proteína e estimulando a atividade da topo II (Dang,
Alghisi & Gasser, 1994).
A identidade das topoisomerases II presentes no núcleo e no cinetoplasto dos
tripanosomatídeos é uma questão bastante controversa. A maioria dos autores acredita
que o mesmo gene codifica a topo II nuclear e mitocondrial, uma vez que todos os
genes TOP2 clonados em tripanosomatídeos, inclusive BcTOP2, são genes cópia única.
Corroborando esta idéia, em B. saltans e L. donovani, a enzima localiza-se tanto no
núcleo como no cinetoplasto, quando antisoros policlonais produzidos a partir da topo II
destes protozoários foram utilizados (Gaziová & Lukes, 2003, Das et al., 2001).
Entretanto, Kulikowicz & Shapiro (2006) demonstraram recentemente que T. brucei
possui pelo menos dois genes TOP2 independentes, que codificam a topo II nuclear e
mitocondrial neste parasita. Analisando a seqüência de aminoácidos de BctopoII em
busca de sinais de endereçamento celular, encontramos na região carboxi-terminal sinal
de endereçamento nuclear, porém sinais de endereçamento para mitocôndria não foram
observados. Não sabemos, entretanto, se outro gene distinto ao que clonamos codifica a
topoII mitocondrial em B. culicis.
A distribuição celular da topo II nos tripanosomatídeos tem sido muito discutida.
115
O antisoro produzido contra a topo II de C. fasciculata reconhece um antígeno no
cinetoplasto tanto de C. fasciculata como de T. cruzi (Melendy, Sheline & Ray, 1988,
Fragoso et al., 1998). Já o soro produzido contra a topo II de T. cruzi reconhece um
antígeno exclusivamente nuclear nestes dois protozoários (Fragoso et al., 1998). Em L.
donovani e B. saltans, a enzima localiza-se nos dois compartimentos celulares (Das et
al., 2001, Gaziová & Lukes, 2003). Com o intuito de definir a localização da topo II de
B. culicis, produzimos um antisoro contra a porção carboxi-terminal da proteína (anti-
BctopoII). Este soro não reagiu com nenhum polipeptídeo de T. cruzi ou C. fasciculata
quando testado em ensaios do tipo Western blot ou por imunofluorescência, o que já era
esperado uma vez que o soro foi feito a partir da região menos conservada entre as topo
II eucarióticas. Em B. culicis, o soro reconheceu um antígeno nuclear após análises por
imunofluorescência, sendo este resultado confirmado por imunocitoquímica
ultraestrutural. A topo II de B. culicis foi localizada na periferia do núcleo, próximo à
regiões de heterocromatina. Este resultado é diferente do obtido quando o antisoro
produzido contra a topo II de C. fasciculata (anti-CfatopoII) foi utilizado em B. culicis
(Melendy, Sheline & Ray, 1988). O soro anti-CfatopoII, que reconhece os sítios de
replicação diametralmente opostos no cinetoplasto de C. fasciculata, também reconhece
o cinetoplasto de B. culicis (Cavalcanti et al., 2004), reforçando a idéia de que
diferentes topo II possam estar presentes no núcleo e no cinetoplasto deste protozoário
monoxênico. Estas topoisomerases poderiam ser codificadas por dois genes distintos,
assim como em T. brucei (Kulikowicz & Shapiro, 2006) ou pelo mesmo gene, a partir
do qual seriam utilizados dois diferentes pontos de iniciação para a transcrição do
mRNA. Isto ocorre, por exemplo, com a histidina-tRNA sintetase e valina-tRNA
sintetase de levedura, presentes tanto no citosol como na mitocôndria e que são
codificadas por um mesmo gene (Natsoulis, Hilger & Fink, 1986, Chatton et al., 1988).
116
Apesar de nos últimos anos dezenas de proteínas relacionadas à replicação do
DNA do cinetoplasto terem sido identificadas, pouco se sabe sobre as moléculas que
participam da dinâmica de condensação da rede de kDNA dos tripanosomatídeos.
Algumas proteínas foram isoladas do cinetoplasto de C. fasciculata, sendo estas capazes
de compactar a rede de kDNA in vitro. Estas proteínas associadas ao cinetoplasto,
chamadas de KAPs (do inglês “kinetoplast associated proteins”), são semelhantes a
histonas H1, sendo extremamente básicas, ricas em resíduos de lisina e alanina e
apresentando baixo peso molecular. Elas possuem também uma pré-sequência clivável,
de nove aminoácidos, provavelmente envolvida na importação da proteína para a
mitocôndria (Xu & Ray, 1993). Ensaios de imunolocalização confirmam que as KAPs
encontram-se localizadas exclusivamente no cinetoplasto de C. fasciculata (Xu et al.,
1996, Hines & Ray, 1998). O nocaute de ambos alelos do gene KAP1 neste protozoário
promove um intenso rearranjo da rede de kDNA, demonstrando que esta KAP está
envolvida na organização estrutural do kDNA de C. fasciculata (Lukes et al., 2001).
Apesar de alguns esforços para identificar proteínas associadas ao cinetoplasto
de T. cruzi terem sido realizados (Zavala-Castro et al., 2002), pouco se sabe sobre as
moléculas envolvidas no arranjo da rede de kDNA deste parasita. As anotações do
genoma do T. cruzi nos permitiu identificar, neste protozoário, seqüências que
apresentam homologia com os genes que codificam as KAPs de C. fasciculata. A partir
desta análise, identificamos três KAPs em T. cruzi, as quais chamamos de Tcp14, Tcp21
e Tcp23. A proteína Tcp14 apresenta cinco seqüências similares no genoma do parasita,
enquanto Tcp21 e Tcp23 apresentam duas seqüências cada, sendo estas muito parecidas
e provavelmente alélicas. A análise da seqüência de aminoácidos obtida a partir dos
genes anotados no banco de dados do genoma do T. cruzi revelou que as três KAPs são
proteínas básicas, de baixo peso molecular e ricas em resíduos de lisina e alanina,
117
características estas comuns a histonas. Além disso, as três apresentam uma seqüência
de nove aminoácidos na região amino-terminal, muito similar à pré-sequência clivável
de importação mitocondrial encontrada em C. fasciculata, reforçando a idéia de que
estas sejam realmente proteínas associadas ao cinetoplasto.
No presente trabalho, clonamos e expressamos três KAPs de T. cruzi em E. coli,
com o intuito de produzir antisoro e imunolocalizar as proteínas nos diferentes estágios
evolutivos do parasita. Os soros anti-Tcp14 e anti-Tcp21 reconheceram o cinetoplasto
de T. cruzi, sendo que Tcp14 encontra-se localizada em dois sítios opostos que
flanqueiam a rede de kDNA. A presença de Tcp14 nestes sítios, que correspondem aos
complexos de replicação, indica que esta poderia estar envolvida com a compactação
dos círculos recém-replicados, contribuindo para a re-organização da rede de kDNA
após a replicação. Enzimas como a DNA topoisomerase, a ligase, a endonuclease e a
polimerase também estão localizadas nos dois complexos de replicação existentes no
cinetoplasto de C. fasciculata (revisto por Liu et al, 2005). Já Tcp21 encontra-se
distribuída por toda a rede de kDNA das formas epimastigota, estando provavelmente
envolvida na manutenção da organização da rede de kDNA de maneira constitutiva. Em
formas tripomastigota, tanto Tcp14 como Tcp21 apresentam uma localização
diferenciada, estando distribuídas pela periferia da rede de kDNA. Esta localização pode
estar relacionado ao próprio arranjo do kDNA nestas formas evolutivas, que ao
contrário dos epimastigotas, apresentam uma organização mais frouxa das fibrilas de
kDNA, que estão contidas em um cinetoplasto de forma arredondada.
Para avaliar o efeito da superexpressão das KAPs na organização da rede de
kDNA, os plasmídeos pTEX-Tcp14 e pTEX-Tcp23 foram construídos e usados para
transformar culturas de T. cruzi. Após seleção das células contendo os plasmídeos
recombinantes, demonstramos por Northern blot que estas culturas apresentavam um
118
aumento na quantidade de RNA para Tcp14 e Tcp23. Porém, nenhum efeito
ultraestrutural foi observado no cinetoplasto ou em qualquer outro compartimento
celular destes protozoários. O aumento dos níveis de RNA não se traduziu em maior
quantidade de proteínas dentro da célula, como demonstrado por Western blot,
indicando que algum tipo de controle pós-transcricional impede o aumento da síntese
das proteínas Tcp14 e Tcp23. De fato, o controle da expressão gênica em
tripanosomatídeos ocorre principalmente em nível pós-transcricional, através do
controle no processamento, estabilidade ou tradução dos mRNAs (Vanhamme & Pays,
1995). Futuros ensaios utilizando técnicas de nocaute gênico, de imunoprecipitação,
ensaios de alteração de mobilidade eletroforética (EMSA) e outras abordagens, poderão
esclarecer questões relacionadas à ligação das KAPs ao kDNA e a outras proteínas, bem
como o papel funcional desta proteína no cinetoplasto de T. cruzi.
O conhecimento das diversas moléculas envolvidas na organização e replicação
da rede de kDNA, assim como o entendimento dos mecanismos fisiológicos que
ocorrem no cinetoplasto dos tripanosomatídeos, podem nos ajudar a entender um pouco
mais sobre a biologia destes eucariotos primitivos e sobre a evolução do genoma
mitocondrial ao longo do processo evolutivo. Além disso, muitas das moléculas e
processos biológicos únicos destes protozoários podem servir para o desenvolvimento
de novas e eficazes terapias contra doenças causadas por tripanosomatídeos, que apesar
de conhecidas há mais de um século, continuam matando milhões de pessoas.
119
VI. CONCLUSÕES
120
• Inibidores da topoisomerase II de procariotos são capazes de reduzir a
proliferação celular e promover alterações ultraestruturais na rede de kDNA de
B. culicis e outras espécies de tripanosomatídeos;
• As concentrações necessárias para inibir a proliferação celular dos
tripanosomatídeos variam de espécie para espécie e de acordo com o inibidor
utilizado. Tais divergências podem estar relacionadas a fatores como: diferenças
na permeabilidade celular de cada protozoário e sensibilidade das distintas
topoisomerases aos inibidores;
• As topoisomerases II dos tripanosomatídeos podem desempenhar um papel
estrutural, além de sua função na replicação do kDNA. Este dado é sugerido pela
observação de que inibidores da topo II promovem alterações fenotípicas
similares às observadas em linhagens mutantes de C. fasciculata que não
expressam uma proteína semelhante à histona, que está associada à organização
da rede de kDNA;
• Os inibidores de topo II de procariotos constituem possíveis agentes
quimioterápicos contra os tripanosomatídeos, já que são capazes de inibir a
proliferação destes protozoários e causar danos reduzidos às células de
mamíferos;
121
• B. culicis foi a espécie mais afetada pelo tratamento com inibidores da topo II,
ainda que a topoisomerase II deste protozoário apresente alta homologia com a
topo II de outros tripanosomatídeos;
• O gene que codifica a topo II em B. culicis provavelmente é um gene de cópia
única no genoma do protozoário, que transcreve um mRNA de 4,4 kb,
produzindo uma proteína de 138 kDa, resultado similar ao descrito para outros
membros da família;
• T. cruzi apresenta proteínas associadas ao cinetoplasto (TcKAPs) similares as
KAPs de C. fasciculata, sendo estas proteínas ricas em resíduos de lisina e
alanina, de baixo peso molecular e alto pI, assim como as histonas;
• Uma das proteínas associadas ao cinetoplasto de T. cruzi (Tcp14), está
localizada em sítios diametralmente opostos da rede de kDNA da forma
epimastigota, sugerindo que tal proteína possa estar envolvida com a
compactação dos círculos de kDNA recém-replicados;
• A localização de Tcp14 em formas tripomastigotas de T. cruzi é distinta da
encontrada nos epimastigotas, sendo que no primeiro caso a proteína se encontra
localizada na periferia da rede de kDNA. Tal localização diferenciada pode estar
relacionada ao fato dos tripomastigotas apresentarem um arranjo mais frouxo
das fibrilas de kDNA, que se distribuem em um cinetoplasto de forma
arredondada;
122
• A proteína Tcp21 se encontra distribuída por toda a rede de kDNA dos
epimastigotas e amastigotas de T. cruzi, podendo desempenhar um papel
constitutivo na organização do DNA do cinetoplasto;
• O aumento nos níveis de RNA para as TcKAPs não se traduziu em aumento na
quantidade destas proteínas em epimastigotas de T. cruzi, nem promoveu
alterações fenotípicas nos parasitas, sugerindo que algum tipo de controle pós-
transcricional impeça a tradução destas proteínas.
123
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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142
VIII. ANEXOS
143
A presente tese resultou na elaboração dos seguintes trabalhos:
1- Cavalcanti, D.P., Fragoso, S.P., Goldenberg, S., De Souza, W. & Motta, M.C.M.
The effect of topoisomerase II inhibitors on the kinetoplast ultrastructure.
Parasitology Research, v. 94, p. 439-448, 2004.
2- Lourenço, E.E., Cavalcanti, D.P., Picchi, G.F.A., De Souza, W., Krieger, M.A.,
Motta, M.C.M., Goldenberg, S. & Fragoso, S.P. Molecular characterization of
type II topoisomerase in the endosymbiont-bearing trypanosomatid
Blastocrithidia culicis. FEMS Microbiology Letters, v. 257, p. 163-170, 2006.
3- Cavalcanti, D.P., Shimada, M.K., De Souza, W., Goldenberg, S., Fragoso, S.P.
& Motta, M.C.M. Identification of two kinetoplast associated proteins in
Trypanosoma cruzi. Artigo em fase final de redação.
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