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Universidade de Mogi das Cruzes
Maristela Boaceff Ciraulo
Análise genômica funcional da bactéria fitopatogênica
Xylella fastidiosa cultivada em 3G10-R - um meio baseado
na composição química do xilema
Mogi das Cruzes, SP
2006
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Universidade de Mogi das Cruzes
Maristela Boaceff Ciraulo
Análise genômica funcional da bactéria fitopatogênica
Xylella fastidiosa cultivada em 3G10-R - um meio baseado
na composição química do xilema
Dissertação apresentada ao curso de
Mestrado em Biotecnologia da
Universidade de Mogi das Cruzes como
parte dos requisitos para a conclusão
do curso.
Orientador: Prof. Dr. Luiz R. Nunes
Mogi das Cruzes, SP
2006
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FICHA CATALOGRÁFICA
Universidade de Mogi das Cruzes - Biblioteca Central
Ciraulo, Maristela Boaceff
Análise genômica funcional da bactéria fitopatogênica
Xylella fastidiosa cultivada em meio 3G10-R - um meio
baseado na composição química do xilema / Maristela
Boaceff Ciraulo. – 2006.
87 f.
Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) -
Universidade de Mogi das Cruzes, 2006.
Área de concentração: Ciências Biológicas
Orientador : Prof. Dr. Luiz R. Nunes
1. Xylella fastidiosa 2. Microarranjos 3. Meios de
cultura I. Título II. Nunes, Luiz R.
CDD 579.3
A Deus,
pela vida, por escolher-me e capacitar-me.
Aos meus pais, pelo carinho, atenção, cuidados
e apoio em todos os momentos...
Obrigada !
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Luiz R. Nunes por me introduzir no caminho da pesquisa
científica, pelos ensinamentos e compreensão. A você todo meu carinho,
admiração e gratidão.
Aos meus professores, Luiz R Nunes e Regina Lucia Batista Costa de Oliveira,
que muito contribuíram para o meu conhecimento e aperfeiçoamento profissional.
Aos meus irmãos Antonio Boaceff Ciraulo e Solange De Matteo Ciraulo,
Margarete Boaceff Ciraulo Duarte e Carlos Humberto Martins Duarte, pelas
conversas, conselhos e pela suas presenças, sempre me apoiando e aos meus
sobrinhos Marco, Caio, Letícia, Andressa e Augusto pelo amor e por me trazer
tantas alegrias.
As grandes amigas Marlene e Lúcia pelos conselhos, amizade e encorajamento
que tanto contribuíram para o meu desenvolvimento pessoal.
A amiga Maria Cristina Pires de Brum pelas horas de estudo, amizade e
momentos de descontração.
Aos membros da banca de qualificação e defesa, Dra Renata Guimarães
Moreira, Dr Welington Luiz de Araújo e Dr Walter Maccheroni pelas sugestões
e colaborações.
Aos amigos do laboratório de Genômica pelo companheirismo e pela troca de
experiências.
A toda equipe da pós-graduação, em especial Priscila, Denise, Neilce e
Renata, pela colaboração e amizade.
A Secretária de Estado da Educação pela bolsa mestrado
RESUMO
Xylella fastidiosa é um bacilo gram-negativo que coloniza os vasos do xilema de
uma ampla variedade de espécies de plantas. Diferentes isolados deste
microorganismo têm sido associados ao desenvolvimento de patogênese em
espécies de plantas com significativa importância econômica em toda a América.
Um dos mais intrigantes aspectos deste microorganismo é sua capacidade de
crescer em um ambiente extremamente inóspito como o xilema, constituído
basicamente de água, sais minerais e alguns poucos nutrientes. Espera-se que a
análise das variações de expressão gênica em resposta as condições nutricionais
do xilema possa nos ajudar a entender os mecanismos usados por esta bactéria
para se adaptar à vida dentro da planta, bem como a identificação de fatores de
virulência deste fitopatógeno. Dessa forma, células de
X. fastidiosa
(linhagem
9a5c) foram crescidas em 3G10-R, um meio definido que mimetiza diversos
aspectos nutricionais e químicos do xilema da planta. Amostras de RNA total
destas células foram extraídas e usadas para hibridação competitiva em
microarranjos contra RNA obtido de células crescidas em meio PW (“Periwinkle
Wilt”), o meio complexo tradicionalmente usado para cultivar X. fastidiosa em
laboratório. Este experimento permitiu a identificação de 288 genes que
apresentam modulação de transcrição estatisticamente significativa em resposta
ao crescimento em um dos meios. Os resultados obtidos mostram que alguns
destes genes têm função conhecida e estão envolvidos em processos biológicos
importantes tais como: formação de biofilme, absorção de nutrientes, transporte de
ferro, patogenicidade, virulência, adaptação e competição com outros organismos.
Finalmente, durante o estabelecimento de cultura de X. fastidiosa em 3G10-R,
desenvolveu-se, paralelamente, um novo meio de cultura, chamado CCON, o qual
apresenta taxa de crescimento bacteriano bem maior do que aquelas observadas
em outros meios, o que pode ajudar a manutenção da cultura em laboratório deste
fitopatógeno de crescimento fastidioso. A contribuição destas descobertas, para
nosso conhecimento sobre o patógeno X. fastidiosa está sendo examinada neste
trabalho.
Palavra – chave: Xylella fastidiosa/ microarranjos/ meios de cultura.
ABSTRACT
Xylella fastidiosa is a Gram-negative bacillus that colonizes the xylem vessels of a
wide variety of plant species and different isolates of this microorganism have been
shown to be associated with the development of pathogenicities in many
economicaly important crops throughout the Americas. One of the most intriguing
aspects of this microorganism is its capacity to grow in an extremely harsh
environment, such as the xylem, mainly composed of water, minerals acid very
limited nutrient availability. It is expected that the analysis of gene expression
variations in response to xylem nutritional conditions may help us to understand
the mechanisms used by this bacterium to adapt to life inside the plant, as well as
in the identification of virulence factors from this phytopathogen. Thus, X. fastidiosa
cells (strain 9a5c) have been grown in 3G10-R, a chemically defined medium that
mimics several chemical and nutritional aspects of plant xylem. Total RNA from
these cells was extracted and used in competitive microarray hybridizations
against RNA obtained from cells grown in PW (“Periwinkle Wilt”) medium, the
complex medium traditionally used to cultivate X. fastidiosa in laboratory. These
experiments allowed the identification of 288 genes that displayed statistically
significant transcription modulation in response to growth in each of the two media.
Our results show that some of these genes are known to be involved in important
biological processes, such as biofilm formation, nutrient uptake, iron transport,
pathogenicity, virulence, adaptation and competition with other microorganisms.
Finally, during the establishment of X. fastidiosa cultures in 3G10-R, we
serendipitously developed a new medium, named CCON, which supports bacterial
growth at much higher rates than those observed with any other media, which may
help the maintenance of laboratory cultures of this fastidiously growing
phytopathogen. The contribution of these findings to our knowledge about X.
fastidiosa pathobiology is discussed in this work.
Keywords: Xylella fastidiosa/ microarray/ medium
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 ORFs de Xf 9a5c utilizadas para caracterização celular por PCR ........ 30
Tabela 02 Composição dos meios de cultura utilizados neste trabalho .................. 34
Tabela 03 Identificação e grupo funcional das 114 ORFs que
apresentaram modulação positiva significativa em resposta ao
crescimento de células cultivadas em 3G10-R, um meio
quimicamente definido, em relação ao crescimento em PW. ................75
Tabela 04 Identificação e grupo funcional das 174 ORFs que
apresentaram modulação negativa significativa em
resposta ao crescimento de células cultivadas
em 3G10-R, em relação ao crescimento em PW.....................................80
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 01 Características de folhas de citros acometidas pela CVC.......................15
Figura 02 Sintomas da CVC nos frutos.........................................................................16
Figura 03 Principais vetores da CVC no Brasil............................................................18
Figura 04 Micrografia eletrônica de varredura de vasos xilemáticos de
folhas de citros infectadas por X. fastidiosa .............................................. 20
Figura 05 Representação esquemática de hibridação competitiva
em microarranjos de DNA.............................................................................26
Figura 06 Imagem do “biochip” de Xf 9a5c obtida pelo “scanner” óptico................40
Figura 07 Esquema das hibridações competitivas entre células Xf 9a5c
crescidas em meios PW e 3G10-R.............................................................. 41
Figura 08 Curvas de crescimento de Xf 9a5c cultivada em PW e 3G10-R............44
Figura 09 Genes com mudança de expressão estatisticamente
significativa em um dos dois meios (PW e 3G10-R).................................46
Figura 10 Padrões de expressão das 288 ORFs com modulação
estatisticamente significativa em células crescidas em
3G10-R contra células crescidas em meio PW ........................................47
Figura 11 Distribuição funcional das ORFs com modulação
estatisticamente significativa em Xf 9a5c cultivadas
em meio 3G10-R em relação às crescidas em meio PW ........................48
Figura 12 Curvas de crescimento de células de Xf 9a5c em
meios de cultura 3G10-R, PW e CCON...................................................... 51
Figura 13 Aspecto da cultura de
Xf
9a5c crescida em meio líquido
3G10-R, PW e CCON ...................................................................................52
Figura 14 Crescimento de Xf 9a5c cultivada em CCON, na
presença de diferentes fontes de ferro.......................................................54
Figura 15 Crescimento de Xf 9a5c cultivada em CCON, na
presença e na ausência de glicose ............................................................55
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATP Adenosina trifosfato
BSA Bovine Serum Albumin (Soro albumina bovina).
CCON Controle de Crescimento Ordenado por Nutrientes (Meio de
cultura)
cDNA DNA complementar
Cy3-dCTP 2’ - desoxicitosina 5’ - trifosfato acoplado ao fluoróforo Cy - 3
Cy5-dCTP 2’ - desoxicitosina 5’ - trifosfato acoplado ao fluoróforo Cy - 5
CVC Clorose Variegada dos Citros
dATP 2’ - desoxiadenosina 5’ - trifosfato
dCTP 2’ - desoxicitidina 5’- trifosfato
DEPC Dietil pirocarbonato
dGTP 2’ - desoxiguanidina 5’ - trifosfato
DNA Ácido desoxirribonucléico
dNTPS Desoxirribonucleotídeos
DO
600
Densidade óptica em 600nm
DTT Ditiotreitol
dTTP 2’ - desoxitimidina 5’ - trifosfato
EDTA Ácido etilenediaminotetracético.
EPS Exopolissacarídeo
LB Meio de cultura complexo para Escherichia coli (Luria Bertani)
Mev Arquivo “Multi-Experiment Viewer”
MOPS Ácido 3 [N-morfolino] propano sulfônico
NADH Nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma reduzida)
ORF Open Reading Frame (Fase aberta de leitura)
PCR Reação em Cadeia de Polimerase
PD Pierce’s Disease (Doença de Pierce)
PVF Fluoreto de polivilideno
RNA Ácido ribonucléico
rpm Rotações por minuto
SAM Significance Analysis of Microarrays (Análise de Significância de
Microarranjos)
SDS Dodecil sulfato de sódio
SSC Solução de citrato de sódio (0,15 M) e cloreto de sódio (0,15 M)
pH=7,2
TE Solução de Tris (10mM) e EDTA (1mM)
Tris Tris (hidroximetil) aminometano
UDP Uridina difosfato
Xf 9a5c Linhagem de Xylella fastidiosa
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................................14
1.1 Transmissão da Clorose Variegada de Citros....................................................17
1.2 Hospedeiros vegetais de Xylella fastidiosa......................................................... 18
1.3 Xylella fastidiosa...................................................................................................... 20
1.3.1 Histórico de Xylella fastidiosa...................................................................22
1.3.2 Análise genômica do isolado 9a5c de Xylella fastidiosa...................... 23
1.4 Hibridação em microarranjos de DNA .................................................................24
2 OBJETIVOS.......................................................................................................................28
3 MÉTODOS.........................................................................................................................29
3.1 Cultivo de X. fastidiosa...........................................................................................29
3.2 Caracterização celular por PCR ...........................................................................29
3.3 Meios de Cultura. ...................................................................................................31
3.3.1 Meio complexo PW (Periwinkle Wilt).......................................................31
3.3.2 Meio Definido 3G10-R................................................................................31
3.3.3 Meio de cultura CCON (Controle de Crescimento
Ordenado por Nutrientes)....................................................................32
3.4 Preparação de material e extração de RNA ....................................................... 35
3.4.1 Extração de RNA ........................................................................................35
3.4.2 Gel de eletroforese de RNA ......................................................................37
3.5 Marcação de RNA com fluoróforos Cy3-dCTP e Cy5-dCTP...........................37
3.6 Hibridação dos “biochips” de X. fastidiosa.......................................................... 39
3.7 Aquisição de imagens e análise dos resultados.............................................41
4 RESULTADOS..................................................................................................................43
4.1 Crescimento de X. fastidiosa em diferentes meios de cultura...................... 43
4.2 Identificação de genes diferencialmente expressos
em células crescidas em meios de cultura PW e 3G10-R..............................44
4.3 Desenvolvimento e cultivo de Xf 9a5c em meio CCON.................................49
5 DISCUSSÃO .....................................................................................................................56
REFERÊNCIAS....................................................................................................................66
APÊNDICES......................................................................................................................... 74
14
1 INTRODUÇÃO
A citricultura nacional é um dos alvos mais presentes em pesquisas
tecnológicas e científicas. O setor investe na geração de tecnologia, medidas de
controle e pesquisas de excelente nível, destinadas ao efetivo controle das doenças.
O Brasil, e em especial o Estado de São Paulo, está entre os grandes produtores
mundiais de citros, exportando, somente no ano de 2005, 82% do suco de laranja
concentrado que produz para os exigentes mercados da Europa, Estados Unidos e
Japão, entre outros. A condição do solo e do clima, em diversas áreas do Brasil,
permite uma crescente cultura de citros, embora a produtividade possa ainda ser
considerada muito baixa, levando-se em consideração o potencial agrícola da
região. Pragas agrícolas, déficit da água e de fatores nutricionais são alguns dos
agentes relacionados a esta baixa produtividade. Estima-se que de 20 a 30% dos
US$ 1,2 bilhões exportados em sucos são investidos na tentativa de se eliminar as
doenças, que são os principais fatores limitantes ao cultivo de citros do Brasil
(FUNDECITRUS, 2005).
Plantas cítricas têm sido alvo de várias doenças, que as atingem em diversas
fases de crescimento, desde a sementeira até a fase adulta. A tristeza do citros, na
década de quarenta, foi responsável pela destruição de 80% das plantas. O cancro
cítrico, na década de sessenta, trouxe grandes prejuízos à economia brasileira ao
atingir a região nobre da citricultura paulista (HASSE, 1987). Outras doenças como
verrugose, leprose, antracnose, são sinônimos de prejuízo e inquietação por parte
de citricultores.
Atualmente uma das grandes preocupações em plantações de citros é a
doença conhecida como Clorose Variegada dos Citros (CVC), causada pela bactéria
patogênica Xylella fastidiosa, que foi identificada no Brasil pela primeira vez em
1987, em pomares dos estados de São Paulo e Minas Gerais (ROSSETI et al., 1990;
CHANG et al., 1993). Embora essas regiões continuem a ser as mais afetadas pela
CVC até os dias de hoje, a doença está presente em quase todas as áreas citrícolas
do país. Levantamentos recentes estimam que, aproximadamente, 35% o dos
pomares localizados em regiões nobres da citricultura brasileira estão infectados
com esta bactéria, como o norte e noroeste do Estado de São Paulo e o Triângulo
Mineiro (FUNDECITRUS, 2005).
15
A doença afeta todas as variedades de laranja doce cultivadas no Estado de
São Paulo, embora não sejam verificados sintomas em outras plantas cítricas, como
tangerineiras, limeiras e limoeiros, mesmo quando estas plantas estão localizadas
em áreas altamente infectadas. Considerada de grande importância econômica, a
Clorose Variegada de Citros afeta principalmente a qualidade dos frutos, tornando-
os de tamanho reduzido para a comercialização "in natura" e mesmo para produção
de suco concentrado. A perda de peso do fruto pode chegar a 75% e os gastos
brasileiros chegam a US$ 150 milhões anuais em reposição de mudas, poda de
plantas infectadas e controle do vetor, afetando também milhares de empregos
diretos e indiretos (FUNDECITRUS, 2005).
A CVC é também conhecida pelo nome de "amarelinho", devido a um de seus
principais sintomas: uma clorose foliar generalizada, responsável por um aspecto
amarelado nas folhas das plantas, sobretudo nos casos de ataques mais severos.
Conforme ilustra a figura 01, os primeiros sintomas são vistos nas folhas. A clorose,
que se apresenta inicialmente nas regiões mediana e superior da copa, pode evoluir
de modo disperso, atingindo todas as folhas da planta. Ocorre então redução de
crescimento, morte de ramos ponteiros e número excessivo de folhas diminutas,
diferindo do padrão das brotações normais (FUNDECITRUS, 2005).
Os sintomas evoluem posteriormente para os frutos e acabam afetando toda a
planta. Com o avanço da CVC, observa-se a desfolha dos ramos mais altos da
planta, locais mais atacados pelas cigarrinhas, seus principais vetores.
Figura 01: Características de folhas de citros acometidas pela CVC. No painel A observam-se
pequenas manchas amareladas espalhadas na face superior da folha, representando os sintomas
iniciais da CVC. O painel B ilustra um estágio mais avançado da CVC, apresentando folha com lesões
de cor palha, nos dois lados da folha e áreas necrosadas na parte lisa da folha. O painel C revela a
desfolha dos ramos mais altos da planta. Foto obtida de FUNDECITRUS, 2005.
A
B
C
16
Com o agravamento da doença, a produção do pomar afetado cai
rapidamente. O desenvolvimento anormal dos frutos favorece a incidência de
rachaduras da casca, queimaduras de sol, ataque de insetos e fungos assim como
outros fatores que podem provocar sua queda. Parte dos frutos é de tamanho
reduzido, endurecida, com maturação precoce, imprestável para o comércio. Pode
ocorrer formação de pencas com quatro a dez frutos pequenos, características
atípicas das variedades de laranja doce (figura 02, painel A).
Figura 02: Sintomas da CVC nos frutos. Em A, observam-se frutos sadios ao lado de frutos de
tamanho reduzido devido à doença CVC, agrupados em cachos. Em B, destacam-se os sintomas de
murcha em folhas e queimaduras de sol em frutos. No painel C podemos observar os detalhes de
murcha em folhas e queimaduras do sol em frutos. Obtida de FUNDECITRUS, 2005.
O potencial máximo de produção de uma árvore de citros é expresso entre
seis a oito anos após o plantio e o tempo de vida útil pode ser de até 30 anos,
dependendo do manejo da cultura. Através das observações em campo, verificou-se
que a doença é mais severa quando atinge pomares com mais de seis anos, com
incidência de 57,65%. Por outro lado, em plantas novas, até dois anos, a incidência
foi de 5,66%. A severidade diminui quando a doença incide em árvores de oito a dez
anos após o plantio. Na árvore que tem CVC com sintomas iniciais e não é eliminada
ou podada adequadamente, a doença evolui, servindo de fonte de contaminação
para outras plantas (FUNDECITRUS, 2005).
A
B
C
17
1.1 Transmissão da Clorose Variegada de Citros
O mecanismo mais comum pelo qual uma bactéria fitopatogênica invade seu
hospedeiro é através de aberturas naturais presentes ao longo da estrutura do
vegetal ou através de feridas, de onde podem colonizar os espaços intercelulares.
Algumas bactérias podem ser transmitidas diretamente para o interior de vasos
condutores por insetos que se alimentam de seiva.
A disseminação de Xylella fastidiosa, bactéria responsável pela CVC, para
infecção da planta depende de insetos vetores, conhecidos popularmente como
“cigarrinhas” sugadoras de seiva. Ao se alimentarem do xilema de árvores
contaminadas, as “cigarrinhas” adquirem a bactéria, que no interior destes insetos se
multiplica, formando agregados densos de células, anexos ao canal dos alimentos
no pré-cibário e na válvula cibariana, além de se acumularem na parte anterior do
tubo digestivo, o estomodéu. Durante a alimentação, ocorre o desprendimento dos
agregados celulares para os estiletes e a bactéria é então transmitida para outras
plantas sadias (HILL & PURCELL, 1995). Em videira, “cigarrinhas” adultas podem
transmitir a bactéria logo após sua infecção e continuam a transmitir pelo resto do
ciclo de vida, o que pode durar meses, devido à capacidade da bactéria de
multiplicar-se dentro de seu vetor (PURCELL et al., 1979; PURCELL & FINLAY,
1979).
Onze espécies de “cigarrinhas” pertencentes à família Cicadellidae, subfamilia
Cicadellinae são comprovadamente capazes de transmitir a bactéria X. fastidiosa e,
portanto, são responsáveis pela disseminação da CVC em todas as regiões
citrícolas do país. Um dado importante é a existência de uma matriz extracelular no
interior do aparelho bucal destes insetos com características físico-químicas
similares à matriz que envolve células bacterianas nos vasos do xilema. Foram
encontradas células bacterianas presentes no canal do pré-cibário de Oncometopia
nigricans envolvidas por uma matriz extracelular com eletrodensidade e aparência
similar à matriz extracelular que envolve X. fastidiosa em vasos do xilema da planta
(BRLANSKY et al., 1983; HOPKINS, 1989).
No Brasil, as espécies mais freqüentes são: Oncometopia facialis,
Dilobopterus costalimai e Acrogonia citrina (figura 03).
18
Figura 03: Principais vetores da CVC no Brasil. Fotos das espécies: Oncometopia facialis,
Dilobopterus costalimai e Acrogonia citrina, respectivamente. Obtida de FUNDECITRUS, 2005.
Em anos chuvosos, as cigarrinhas aparecem na primavera e em anos secos,
surgem mais tarde, no verão. No meio do ano, quando se inicia a seca, sua
incidência diminui. O controle químico das cigarrinhas é uma forma de prevenção e
pode ser auxiliada por monitoramentos periódicos, principalmente na primavera e
verão. As pulverizações realizadas no sentido de eliminar este transmissor devem
ser criteriosas, levando-se em conta que seu uso indiscriminado poderia eliminar os
inimigos naturais destes vetores, que sozinhos são responsáveis pelo controle de
40% da população de cigarrinhas (FUNDECITRUS, 2005).
Também foi descrita a transmissão de X. fastidiosa por enxertia natural de
raízes de laranjeira (HE et al., 2000). Assim, o controle do inseto transmissor e uso
de mudas, livres de contaminação, se constituem nos meios mais usuais para evitar
o alastramento para plantas não infectadas. Além das técnicas já em uso, diversos
trabalhos científicos convergem para a busca de mecanismos que bloqueiem a ação
patogênica de X. fastidiosa.
1.2 Hospedeiros vegetais de Xylella fastidiosa
Para que uma planta possa ser considerada hospedeira de X. fastidiosa, ela
deve ser alvo dos vetores citados acima e manter uma alta densidade populacional
desta bactéria, o que significa apresentar entre 10
7
a 10
9
bactérias vivas por grama
de tecido (HOPKINS, 1985). Nem todos os fatores que determinam o crescimento e
a reprodução de X. fastidiosa em tecidos vegetais são conhecidos, porém a fisiologia
da planta, nutrientes presentes no xilema e as condições climáticas são fatores
19
importantes para o estabelecimento da bactéria na planta hospedeira (HILL &
PURCELL, 1995). As condições ambientais influenciam extremamente as interações
plantas – microorganismos e podem determinar o grau de predisposição do
hospedeiro à infecção, agindo indireta ou diretamente sobre o patógeno e
interferindo em sua sobrevivência de forma positiva ou negativa. Apesar dos
mecanismos exatos que levam ao aparecimento dos sintomas da doença ainda não
serem conhecidos e algumas plantas portadoras serem assintomáticas (RAJU et al.,
1983), as doenças causadas por X. fastidiosa são caracterizadas, em geral, por um
fenômeno de estresse hídrico sistêmico. Embora haja um fluxo ascendente de seiva
nos vasos, a formação de biofilme, que liga as bactérias umas às outras e aos vasos
do xilema, gomas e tiloses do hospedeiro, podem frear o deslocamento das células
de X. fastidiosa, principalmente porque os diâmetros dos vasos do xilema não
permitem que os agregados da bactéria circulem livremente (HOPKINS, 1989). No
entanto, somente estes fatores não poderiam responder por todos os sintomas da
CVC, sugerindo que mecanismos adicionais seriam necessários para a
manifestação da doença, que acabariam comprometendo o pleno desenvolvimento
da planta (MC ELRONE et al., 2003).
A bactéria se desenvolve no interior dos vasos xilemáticos de várias espécies
vegetais, podendo ser transmitida para até 100 espécies (FREITAG, 1951) incluindo
28 famílias de monocotiledôneas e dicotiledôneas, estando associada ao
desenvolvimento de patogenias em espécies de significativa importância econômica
em diferentes regiões, sobretudo nas Américas (HOPKINS & PURCELL, 2002).
Como exemplo de plantas hospedeiras de X. fastidiosa, pode ser citado: citros,
videira, cafeeiro, ameixeira, amoreira, pereira, amendoeira, olmo, figueira, carvalho,
alfafa, tabaco e recentemente, plantas ornamentais (COLETTA-FILHO et al., 2001).
Também foram descritos diversos hospedeiros alternativos de X. fastidiosa como o
capim carrapicho (Cenchrus echinatus), capim favorito (Rhynchelitrum repens),
capim pé de galinha (Eleusine indica), vinca (Cantharanthus roseus), grama seda
(Cynodon dactylon), poaia branca (Rhichardia brasiliensis), entre outras (DONADIO
& MOREIRA, 1997). Desta forma, diferentes isolados de X. fastidiosa já foram
implicados no desenvolvimento de CVC em citros, Doença de Pierce (PD) em
videiras, escaldadura foliar em ameixeiras e outras fitopatogenias (HOPKINS, 1989;
PURCELL et al., 1979; PURCELL & HOPKINS, 1996).
20
1.3 Xylella fastidiosa
X. fastidiosa é uma bactéria limitada ao xilema que, depois de instalada na
planta, se multiplica e obstrui os vasos responsáveis por levar água e nutrientes da
raiz para a parte aérea da planta. Esta bactéria é um bacilo gram-negativo,
aflagelado, apigmentado, não formador de esporos e estritamente aeróbico,
podendo atingir o tamanho de 0,25 a 3,5 µm X 0,9 a 3,5 µm. O crescimento ótimo da
bactéria ocorre em pH 6,5 – 6,9 e a temperaturas de 26-28ºC (HOPKINS &
MOLLENHAUER, 1973; WELLS et al., 1987). Temperaturas na faixa de 28ºC a 30ºC
também foram relatadas como ótimas para isolados de videiras (FEIL & PURCEL,
2001). O tempo de duplicação desta bactéria, em laboratório, é dependente do meio,
sendo a média entre 10 e 48 horas (WELLS et al., 1987). A figura 4 mostra o bacilo
de X. fastidiosa se desenvolvendo nos vasos xilemáticos de citros.
Figura 04: Micrografia eletrônica de varredura de vasos xilemáticos de folhas de citros
infectadas por X. fastidiosa. Foto de E.W.Kitajima Esalq/USP/Brasil. Obtida de Xylella fastidiosa
home page, 2005. A seta indica X. fastidiosa bloqueando os vasos xilemáticos.
O termo “bactéria limitada ao xilema” refere-se a procariotos patogênicos de
plantas difíceis de se isolar que requerem meios complexos para o crescimento e
1 µm
21
habitam o xilema de plantas infectadas (LEITE et al, 2001). Diferentes meios de
cultura vêm sendo desenvolvidos para a manutenção desta bactéria in vitro, sendo
os seguintes meios os mais utilizados para isolamento e cultivo de diferentes
linhagens de X. fastidiosa: PD
2
(DAVIS et al., 1981), PW (DAVIS et al., 1981), BCYE
(WELLS et al., 1981), CS20 (CHANG et al., 1988). Todos estes meios são
complexos, com inclusão de peptona de soja, triptona, extrato de levedura,
aminoácidos, sais inorgânicos, citrato, succinato, amido, soro albumina bovina ou
carvão ativado, além de hemina clorada ou pirosfosfato férrico. Tais formulações
foram empiricamente desenvolvidas, baseadas no raciocínio que todas as bactérias
necessitam de fonte de carbono, nitrogênio, sais inorgânicos, ferro e fosfato (LEMOS
et al., 2003).
O mais utilizado destes meios é o meio PW (“Periwinkle Wilt”), capaz de
garantir crescimento vigoroso de diferentes linhagens de X. fastidiosa, mas que
apresenta a desvantagem de ser um meio complexo, o que limita sua utilização para
o estudo dos requerimentos nutricionais e do controle da fisiologia bacteriana
(DAVIS et al., 1981).
Na tentativa de obter meios de cultivo de composição controlada, mais
adequados a análises de mecanismos bioquímicos e fisiológicos da bactéria, Chang
& Donaldson (1993) descreveram um meio conhecido como XF-26, constituído por
alguns sais inorgânicos, dois ácidos carboxílicos, amido e 17 aminoácidos. Este
primeiro meio definido serviu de base para o desenvolvimento de uma série de
outros meios de cultura, conhecidos como a série XDM (Xylella Defined Medium),
que se baseiam ainda em informações advindas do sequenciamento genômico da X.
fastidiosa (LEMOS et al., 2003).
A hipótese de que X. fastidiosa poderia crescer em uma dieta mínima com um
número muito menor de componentes, devido à diversidade limitada dos
componentes do xilema, e que alterações em meios simples, definidos
quimicamente, poderiam mudar as características de X. fastidiosa, levou ao
desenvolvimento de dois novos meios definidos, designados 3G10-R e CHARD2
(LEITE et al., 2004).
Os meios CHARD2 e 3G10-R, cujas composições são baseadas na análise
dos constituintes do xilema, são capazes de sustentar o crescimento de diferentes
linhagens de X. fastidiosa, que chegam inclusive a apresentar formação de biofilme
e de agregados bacterianos (LEITE et al., 2004). Ambos possuem em comum uma
22
alta concentração de L-glutamina, uma vez que este aminoácido parece ser
necessário ao crescimento de X. fastidiosa. Os aminoácidos arginina, alanina, ácido
aspártico, cisteína e glutamina foram utilizados como fontes de carbono na
formulação do meio CHARD2, enquanto a glicose é a principal fonte de carbono
presente no meio 3G10-R. Tanto glicose como aminoácidos estão presentes, em
baixa concentração, no xilema de diversas espécies vegetais (LEITE et al., 2004),
assim como alguns ácidos orgânicos e glutationa, um tripeptídeo composto por
glutamato, L-cisteína e L-glicina, que age como um eficiente agente antioxidante
(adicionado também à formulação de 3G10 -R).
Análises comparativas entre bactérias crescidas em PW e um representante
da série XDM (XDM
1
) revelaram que, de fato, variações na composição nutricional
do meio parecem exercer grande influência na ativação de diferentes lotes gênicos
(NUNES et al., 2003).
Desta forma, a utilização destes meios de cultura, assemelhados a um xilema
artificial, pode permitir a obtenção de células crescidas em condições que mimetizam
algumas das características encontradas no interior do sistema vascular vegetal.
1.3.1 Histórico de Xylella fastidiosa
Os primeiros relatos da literatura sobre a X. fastidiosa datam de 1973, quando
uma bactéria semelhante às bactérias da família Rickttsiaceae foi associada ao mal
de Pierce (PIERCE, 1982). Bactérias da espécie X. fastidiosa foram inicialmente
associadas a membros da família Rickttsiaceae devido a similaridades na
morfologia, na ultra-estrutura da célula bacteriana e nos requerimentos nutricionais
(HOPKINS & MOLLENHAUER, 1973). Esta bactéria só foi cultivada axenicamente
pela primeira vez em 1978, quando estudos com seu DNA revelaram uma
composição diferente do grupo das Rickttsiaceae, caracterizando-a como uma
bactéria pertencente a um grupo taxonômico diferente, passando então a ser
chamada de bactéria limitada ao xilema (CHEN et al, 1992). Foi verificado que o
DNA de X. fastidiosa apresenta o conteúdo de G+C entre 49,5 e 53,1 % (WELLS et
al., 1987), enquanto que para a rickettsia Rochalimaea quintana esses valores estão
em torno de 38,5 % (DAVIS et al., 1981). Além disto, estudos de homologia de DNA
23
revelaram que a relação entre X. fastidiosa e espécies da família Rickttsiaceae foi de
somente 2%. Em decorrência destes fatores, em 1987, Wells sugeriu a criação de
um novo gênero: Xylella que possuía apenas uma espécie, a Xylella fastidiosa.
Neste mesmo ano, laranjeiras apresentando sintomas desconhecidos foram
detectados no sudoeste de Minas Gerais e norte de São Paulo. Esta doença
recebeu o nome de Clorose Variegada de Citros (CVC). Em 1994 estudos
constataram, por testes sorológicos, que a bactéria causadora da CVC tinha
semelhanças com a X. fastidiosa (HARTUNG et al., 1994).
Um isolado de X. fastidiosa, obtido na cidade de Macaubal, interior de São
Paulo, permitiu o desenvolvimento de uma série de experimentos que, ao fechar os
Postulados de Koch, estabeleceram, de maneira clara a correlação entre a infecção
por X. fastidiosa e o desenvolvimento da CVC (LI et al., 1999). Este isolado,
denominado 9a5c (Xf 9a5c), teve seu genoma completamente seqüenciado através
de iniciativa pioneira da FAPESP, o que possibilitou a proposição de um abrangente
metaboloma virtual, descrevendo as principais vias metabólicas e características
fisiológicas desta bactéria (SIMPSON et al., 2000).
1.3.2 Análise genômica do isolado 9a5c de Xylella fastidiosa
Estudos genômicos na bactéria causadora da CVC revelaram que,
estruturalmente, ela apresenta um cromossomo principal, circular com 2.679.305
pares de bases e dois plasmídeos de 51.158 e 1.285 pares de base, denominados
pXF51 e pXF1.3, respectivamente. Dentro do cromossomo principal foram descritas
2.782 ORFs (“open reading frame” – genes em potencial) onde 1.283 (46,1%)
correspondem as ORFs com designação funcional, 310 (11,1%) são ORFs
conservadas hipotéticas, e 1.083 (38,9%) ORFs hipotéticas. O plasmídeo maior
apresenta 64 ORFs, onde 30 (46,8%) possuem designação funcional e 8 (12,5%)
são proteínas conservadas hipotéticas, enquanto que o plasmídeo menor tem
apenas 2 ORFs, uma delas com designação funcional (SIMPSON et al., 2000).
De acordo com uma revisão feita na anotação genômica da Xf 9a5c, foi
avaliado que a maioria destas pequenas ORFs eram, na verdade falsas previsões,
24
re-definindo o número de ORFs presentes neste organismo em 2249 (VAN SLUYS
et al., 2003).
Este estudo, o primeiro a ser realizado com uma fitobactéria, forneceu
interessantes informações acerca de mecanismos potencialmente utilizados por
fitopatógenos para o desenvolvimento de doenças em plantas e em particular no
caso da CVC. Muitos destes mecanismos são similares àqueles observados em
bactérias que infectam animais e incluem, por exemplo, a síntese de toxinas e
enzimas degradadoras de tecido, transportadores envolvidos com a homeostase de
metais (principalmente ferro), presença de sistemas de secreção, enzimas
responsáveis por resistência a diferentes drogas, fatores de adesão, etc.
Estas observações colaboram, ainda que parcialmente, para reforçar uma das
principais teorias relacionadas ao desenvolvimento da CVC, que pode estar
associada justamente à obstrução dos vasos do xilema por aglomerados
bacterianos, que poderiam ser sustentados através de um eficiente mecanismo de
adesão que envolveria a síntese de uma matriz exopolissacarídica e de diferentes
fatores de adesão célula-célula e célula-substrato, como fímbrias, aglutininas e
adesinas. No entanto, os exatos mecanismos de patogenicidade da Xf 9a5c e os
aspectos moleculares relacionados ao aparecimento da CVC ainda não foram
totalmente esclarecidos, uma vez que há inúmeros casos descrevendo plantas
infectadas por Xf 9a5c que permanecem assintomáticas durante anos. Além disso, a
análise genômica sugere a existência de variados mecanismos de patogenicidade
que não são mutuamente exclusivos. Estudos vêm sendo desenvolvidos,
atualmente, no intuito de compreender os mecanismos de controle de expressão
gênica desta bactéria quando submetida a diferentes condições experimentais e
identificar genes diretamente envolvidos em variados processos metabólicos (DE
SOUZA et al., 2004; PASHALIDIS et al., 2005).
1.4 Hibridação em microarranjos de DNA
Desde as primeiras análises genômicas realizadas com a Xf 9a5c, avanços
significativos foram obtidos através da disponibilização de uma importante
ferramenta, que permite a análise global de expressão gênica da bactéria em
25
diferentes situações fisiológicas, os microarranjos de DNA (“biochips”). Estes
“biochips” são capazes de auxiliar na identificação e caracterização de genes
diretamente envolvidos no processo de virulência da Xf 9a5c e de outros
microorganismos, analisando, por exemplo, condições de crescimento que induzam
variados níveis de infectividade (COSTA DE OLIVEIRA et al., 2002). A despeito
destes avanços, no entanto, uma grande quantidade de ORFs mapeadas no
genoma desta bactéria (mais de 50% do total) parece codificar proteínas cujas
funções são ainda desconhecidas (SIMPSON et al, 2000), razão pela qual estudos
funcionais ainda são necessários para desvendar os detalhes associados à fisiologia
bacteriana e os processos de virulência em Xf 9a5c.
Microarranjos de DNA (figura 05) têm sido cada vez mais utilizados,
particularmente para organismos cujos genomas estão completamente
caracterizados, pois seu emprego em análises de expressão gênica e genômica
comparativa pode fornecer informações importantes, através de uma análise
abrangente baseada em uma imensa quantidade de dados, aliada às vantagens de
facilidade de manuseio, custo razoável e rapidez na obtenção de resultados.
Os métodos tradicionais utilizados em biologia molecular são limitados porque
enfocam apenas a análise de um gene por experimento, impossibilitando uma visão
mais geral das interações simultâneas entre os milhares de genes presentes em um
genoma. Os microarranjos de DNA ou “biochips” permitem diferentes aplicações,
como monitorar a expressão gênica em larga escala
caracterizando o nível de
transcritos e a identificação de conjunto de genes que são expressos em resposta a
diversas condições fisiológicas (DUGGAN et al., 1999)
Os microarranjos são constituídos de uma matriz de superfície sólida que
permite uma imobilização efetiva da sonda em sua superfície e na qual estão
aderidas as seqüências dos genes de um determinado organismo, de forma que
suas posições sejam conhecidas. O suporte sólido pode ser uma membrana de
nylon ou vidro.
A produção de um microarranjo se inicia com a seleção das sondas que
estarão em sua composição e posterior distribuição ordenada das sondas
selecionadas em cima de uma lâmina, através de um robô (“arrayer”) de alta
precisão. Este robô recolhe alíquotas de microplacas de 96 ou 384 poços através de
agulhas que trabalham simultaneamente. Cada agulha coleta e deposita 0,25-1,0 nl
em cada lâmina de vidro, criando “spots” de aproximadamente 100-150 µm de
26
diâmetro (até 200 µm), separados pela distância de aproximadamente 200-250 µm
(medidos do centro de cada “spot”). Em geral, podem carregar até 10.000 pontos
distribuídos em uma área de 2cm X 7 cm.
Para análise de expressão gênica, amostras de cDNA marcados com
fluoróforos distintos, excitadas em diferentes comprimentos de ondas (BROWN et
al., 1999; DUGGAN et al., 1999), provenientes de duas condições experimentais
testadas, são misturadas em quantidades equimolares e submetidas à hibridação
com os “biochips”. Após lavagem, estas lâminas são submetidas à leitura em um
“scanner” óptico, onde imagens de hibridação são geradas para cada fluoróforo
independentemente, conforme ilustra a figura 5.
Figura 05: Representação esquemática de hibridação competitiva em microarranjos de DNA. 1-
Esquema de células submetidas às duas condições distintas. 2- Extração de RNA de células em duas
condições previamente estipuladas para estudo. 3- Marcação das populações alvo de DNA
complementar (teste e referência) com dois fluoróforos diferentes. 4 e 5- Hibridação no “biochip” . 6-
Obtenção de imagem pelo “scanner”. Obtida de “Food and Agriculture Organization of the United
Nations”.
27
A quantificação dos valores de intensidade de cada “spot” é feita por
programas de computador, gerando um perfil da expressão gênica da célula,
permitindo acessar bancos de dados para se obter informações a respeito de cada
gene.
A metodologia de “array” vem sendo utilizada para estudo da expressão
gênica em larga escala com diversos microorganismos, inclusive com Xf 9a5c.
Dessa forma, trabalhos envolvendo análise genômica comparativa de diversas
linhagens de X. fastidiosa (COSTA DE OLIVEIRA et al., 2002), controle de
transcrição coordenado por elementos transferidos lateralmente (NUNES et al.,
2003), análise de expressão gênica em diferentes estágios de crescimento de X.
fastidiosa e relação com patogenicidade (DE SOUZA et al., 2003; KOIDE et al.,
2004), entre outros, foram desenvolvidos através da metodologia de hibridação em
microarranjos de DNA, contribuindo para estudos da bactéria X. fastidiosa.
28
2 OBJETIVOS
Identificar genes cuja expressão seja modulada em células de Xf 9a5c
crescidas no meio 3G10-R, um meio quimicamente definido, cuja composição
mimetiza algumas condições encontradas no interior dos vasos xilemáticos de
videiras. Esta análise será feita por hibridação competitiva em microarranjos de DNA
(“biochips”) de X. fastidiosa em comparação com um RNA de referência obtido de
células crescidas em meio PW, que apresenta composição nutricional complexa e
rica para sustentar o crescimento da X. fastidiosa in vitro.
29
3 MÉTODOS
3.1 Cultivo de X. fastidiosa
Células de Xf 9a5c foram crescidas em 20 ml de cada um dos meios de
cultura destinados a este estudo: PW (DAVIS et al., 1981) e 3G10-R (LEITE et al.,
2004). Em todos os casos, as bactérias foram mantidas em agitação constante de
100 rpm, a 28ºC, em um agitador orbital (Environ Shaker, Lab-Line).
O crescimento celular foi monitorado diariamente e repetidas vezes, com base
na turbidez do meio com o auxílio de um espectrofotômetro (Ultrospec 2000,
Pharmacia Biotech) pela absorbância a 600nm (DO
600
).
Para a determinação da curva de crescimento de Xf 9a5c cultivada em meio
3G10-R, foi utilizado frasco “schott” com capacidade de 250 ml contendo 47ml do
meio 3G10-R, aos quais foram adicionados 3 ml de inóculo da bactéria crescida em
meio PW em fase exponencial de crescimento. Durante o período de crescimento,
as células bacterianas foram incubadas a 28º C em agitador orbital a 100 rpm, por
15 dias. Para a curva de crescimento de Xf 9a5c cultivada em meio PW, foi utilizado
frasco “schott” com capacidade de 100 ml contendo 30ml do meio PW aos quais
foram adicionados 2 ml de inóculo da bactéria crescida em meio PW, em fase
exponencial de crescimento. Durante o período de crescimento, as células
bacterianas foram incubadas a 28º C em agitador orbital a 100 rpm, durante 5 dias.
3.2 Caracterização celular por PCR
A fim de controlar a ocorrência de eventuais contaminações na cultura de Xf
9a5c, observações ao microscópio foram realizadas quinzenalmente, após a
coloração pela técnica de Gram. Foi visualizada sistematicamente uma cultura de
morfologia homogênea, com bactérias Gram-negativas. Além disto, alíquotas das
culturas foram semeadas em placas de Petri contendo meio PW sólido a cada 15
dias e 5 a 10 colônias isoladas, obtidas destas placas, foram então submetidas à
30
técnica de amplificações por Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) diretamente
de colônia, de modo que os fragmentos amplificados, gerados a partir do DNA obtido
de uma colônia isolada em meio sólido pudessem confirmar a identidade da bactéria.
Para cada reação, células de uma colônia isolada em meio sólido foram
lisadas por adição de água e aquecidas a 96ºC durante cinco minutos quando então
foram adicionados 1,5µl de cada primer específico (100 pmol) para as seguintes
ORFs de Xf 9a5c:
Tabela 01: ORFs de Xf 9a5c utilizadas para caracterização celular por PCR
ORFs Seqüência de primers
Xf 0667 F-5’TCCAGGATGTGGTATCACTCGG3’
R-5’GTCCCAGGTCCAGACCGAC3’
Xf 0975 F-5’GCCGGTGCAATCCATTG3’
R-5’AACTTGGGCGCGTAGTTC3’
Xf 2151 F-5’TTTGACAAGCGTTCTTTCCCC3’
R-5’ACCGCAATGGCACAACTCTCC3’
Juntamente com os primers foram adicionados:
- AmpliTaq (Applied Biosystems) (2U -1µ l),
- GeneAMp Buffer 10X (Applied Biosystems) (5µ l),
- desoxirribonucleotídeos (dNTPs) (1µ l).
O programa empregado no termociclador (MJ. Research, Inc) consistiu em:
- Aquecimento a: 94ºC - 5 minutos,
94ºC - 3 segundos
55ºC - 30 segundos 25 vezes
74ºC - 1 minuto
4ºC -
A reação controle positiva foi realizada utilizando-se o DNA de Xf 9a5c como
substrato para amplificação. O tamanho dos fragmentos amplificados foi analisado
em gel de agarose (Invitrogen) 0,8%, com marcador de peso molecular
λ/
HindIII
(Invitrogen) e visualizados por coloração com brometo de etídio, sob luz ultravioleta.
31
3.3 Meios de Cultura.
3.3.1 Meio Complexo PW (Periwinkle Wilt).
A composição final do meio PW utilizado neste trabalho foi K
2
HPO
4
(6,9 mM),
KH
2
PO
4
(7,3 mM), MgSO
4.
7H
2
O (1,6 mM), peptona de soja (4,0 g.L
-1
), triptona (1,0
g.L
-1
), hemina clorada (0,01 g.L
-1
), vermelho de fenol (53,1 µM), H
2
O deionizada, L-
glutamina (27,4 mM) e BSA (6 g.L
-1
).
Os componentes: K
2
HPO
4
, KH
2
PO
4
, MgSO
4.
7H
2
O, peptona de soja, triptona,
hemina clorada, vermelho de fenol, diluídos em 820ml de H
2
O deionizada, foram
misturados em frascos de um litro e autoclavados por vinte minutos à temperatura de
120ºC. Separadamente, a BSA foi dissolvida em água deionizada e mantida em
agitação constante de 100 rpm, a 28ºC em um agitador orbital até se obter uma
mistura homogênea, enquanto a L-glutamina foi dissolvida em água deionizada, em
banho–maria à 65ºC, por quinze minutos. Tanto a solução de BSA quanto a de L-
glutamina foram posteriormente esterilizadas por filtração, em filtro de PVF com 0,22
µm diâmetro de poro (Millipore).
Os componentes do meio esterilizados por autoclavagem ou por filtração
foram submetidos a teste de esterilidade, mantidos a 28º C por 24 horas, para então
serem adicionados um ao outro.
3.3.2 Meio Definido 3G10-R.
A composição do meio é K
2
HPO
4
(8,6 mM), KH
2
PO
4
(7,3 mM), MgSO
4.
7H
2
O
(0,8 mM), D-biotina (10
-4
g.L
-1
), pirosfosfato férrico (0,3 mM), vermelho de fenol
(5,3µM), L-glutamina (27,4 mM), glutationa reduzida (20µM), glicose (11,1 mM) e
H
2
O deionizada. Os componentes K
2
HPO
4
, KH
2
PO
4
, MgSO
4.
7H
2
O, D-biotina,
vermelho de fenol foram adicionados a 838 ml de H
2
O deionizada em frascos de um
litro e, após ajustar seu pH entre 6,6 e 6,7 usando 1N HCL, foram autoclavados por
vinte minutos a 120ºC. Pirosfosfato férrico, L-glutamina, glutationa e glicose foram
dissolvidos separadamente em água deionizada para filtração em filtro de “PVF” com
32
poro de 0,22 µm (Millipore). Solução de glutationa esterilizada foi misturada com a
solução de glutamina. Tanto os componentes do meio obtidos por autoclavagem
como por filtração foram submetidos a teste de esterilidade, mantidos a 28º C por 24
horas, para então serem adicionados um ao outro.
3.3.3 Meio de cultura CCON (Controle de Crescimento Ordenado
por Nutrientes).
Na tentativa de se estabelecer o cultivo de Xf 9a5c nos meios PW e 3G10-R,
foi desenvolvido durante este trabalho um novo meio de cultura, designado como
meio CCON (controle de crescimento ordenado por nutrientes).
O novo meio de cultura, (CCON) tem em sua composição K
2
HPO
4
(7,5 mM),
KH
2
PO
4
(7,3 mM), MgSO
4.
7H
2
O (1,2mM), peptona de soja (2,0 g.L
-1
) , triptona (0,5
g.L
-1
), hemina clorada (5 x 10
-3
g.L
-1
), vermelho de fenol (29,2 µM), D-biotina (5 x 10
-5
g.L
-1
) , H
2
O deionizada, L-glutamina (27,4 mM), pirosfosfato férrico (0,2 mM),
glutationa reduzida (10 µM) e glicose (5,5mM). Os componentes: K
2
HPO
4
, KH
2
PO
4
,
MgSO
4.
7H
2
O, D-biotina, vermelho de fenol, peptona de soja, triptona, hemina
clorada dissolvidos em 779 ml.de H
2
O deionizada foram preparados em frascos de
um litro e, após ajustar seu pH entre 6,6 e 6,7 usando 1N HCL, foram autoclavados
por vinte minutos a 120ºC. Pirosfosfato férrico, L-glutamina, glutationa e glicose
foram dissolvidos separadamente em água deionizada para filtração em filtro de PVF
com poro de 0,22 µm (Millipore). Solução de glutationa esterilizada foi misturada
com a solução de glutamina. Tanto os componentes do meio obtidos por
autoclavagem como por filtração foram submetidos a teste de esterilidade, mantidos
a 28º C por 24 horas, para então serem adicionados um ao outro.
Meios sólidos PW, 3G10-R e CCON foram preparados pela adição de Agar
(12 g.L
-1
) nos componentes do meio obtidos por autoclavagem.
Para estabelecimento de cultivo e determinação da curva de crescimento de
Xf 9a5c no meio CCON, foi utilizado frasco “schott” com capacidade de 100 ml
contendo 30ml de meio CCON aos quais foram adicionados 2 ml de inóculo da
bactéria crescida em meio PW em fase exponencial de crescimento. As células
33
bacterianas cultivadas em CCON foram incubadas em agitador orbital a 100 rpm e
28ºC. O crescimento de Xf 9a5c em meio CCON foi monitorado diariamente através
de absorbância a 600 nm (DO
600
) com o auxílio de um espectrofotômetro.
Foram elaborados, ainda, meios derivados do CCON, contendo como fonte
de ferro hemina clorada (0,01 g.L
-1
) ou pirosfosfato férrico (0,3 mM), além de um
meio utilizado como controle negativo do qual excluiu-se tanto a hemina clorada,
como o pirosfosfato férrico. Para estudo da influência da glicose no crescimento de
Xf 9a5c cultivada em meio CCON, células de Xf 9a5c foram crescidas também em
meio CCON sem glicose.
A tabela 02 mostra a composição dos meios utilizados neste trabalho (PW e
3G10-R) e suas contribuições para o desenvolvimento do meio CCON.
34
Tabela 02: Composição dos meios de cultura utilizados neste trabalho.
Meios de cultura
PW CCON 3G10-R
Tampão
K
2
HPO
4
(6,9 mM)
KH
2
PO
4
(7,3 mM)
K
2
HPO
4
(7,5 mM)
KH
2
PO
4
(7,3 mM)
K
2
HPO
4
(8,6 mM)
KH
2
PO
4
(7,3 mM)
Sais inorgânicos
MgSO
4.
7 H
2
O
(1,6 mM)
MgSO
4.
7 H
2
O
(1,2 mM)
MgSO
4.
7 H
2
O
(0,8 mM)
Fontes de ferro
hemina clorada
(0,01 g.L
-1
)
hemina clorada
(5 x 10
-3
g.L
-1
)
___
___
pirosfosfato férrico
(0,2 mM)
pirosfosfato férrico
(0,3 mM)
Fonte de carbono
___
glicose (5,5 mM)
glicose (11,1 mM)
Vitamina ___ D-biotina
(5 x 10
-5
g.L
-1
)
D-biotina
(10
-4
g.L
-1
)
Aminoácidos
L-glutamina
(27,4 mM)
L-glutamina
(27,4 mM)
L-glutamina
(27,4 mM)
Fontes de
polipeptídios
e aminoácidos
peptona de soja
(4,0 g.L
-1
)
triptona (1,0g.L
-1
)
peptona de soja
(2,0 g.L
-1
)
triptona (0,5g.L
-1
)
___
Antioxidante soro albumina
bovina (BSA)
(6 g.L
-1
).
___
___
___ glutationa reduzida
(10 µM).
glutationa reduzida
(20 µM).
Indicador de pH
vermelho de fenol
(53,1µM)
vermelho de fenol
(29,2µM)
vermelho de fenol
(5,3µM)
35
3.4 Preparação de material e extração de RNA
Todos os materiais utilizados para extração de RNA foram tratados de modo a
remover quaisquer traços de ribonucleases. Para tanto, foi utilizada água
previamente tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) a 0,1% para preparo das
soluções e tratamento de vidrarias. As vidrarias foram imersas em água DEPC ativa
por um período de 24h, seguido de autoclavação por trinta minutos. Além disso,
foram utilizados materiais plásticos novos e o uso de luvas durante todo o processo.
Todas as etapas de extração de RNA foram realizadas no gelo a fim de evitar a
degradação de RNA.
3.4.1 Extração de RNA
Células de Xf 9a5c foram crescidas num total de 400ml de 3G10-R, divididos
em dois frascos “schott” com capacidade de 1 litro, contendo cada um deles 200ml
de meio. Para a preparação da cultura, em cada frasco foi inoculado 12ml de cultura
de Xf 9a5c crescida em meio líquido PW, com uma DO
600
~0,2. Diariamente o
crescimento celular foi monitorado através de absorbância a 600nm, com o auxílio
de um espectrofotômetro, até se atingir uma DO
600
~
0,15, em treze dias de cultivo.
Bactérias também foram crescidas em 400ml de meio PW como descrito
acima. Em cada frasco foram inoculados 10ml de células de Xf 9a5c, crescidas em
meio líquido PW, com DO
600
~ 0,2. Após o inóculo, o crescimento celular foi
monitorado diariamente, através de absorbância a 600nm, com o auxílio de um
espectrofotômetro, até atingir uma Densidade Óptica na ordem de DO
600
~ 0,2.
As células de Xf 9a5c cultivadas nos meios de cultura PW e 3G10-R foram
centrifugadas e submetidas à extração de RNA total como descrito por Sambrook et
al. (1989). Inicialmente, as duas culturas de Xf 9a5c foram centrifugadas (16.900g
por 10 minutos a 4ºC) e o sobrenadante foi descartado. O precipitado de células foi
ressuspenso em 6ml de água deionizada e novamente centrifugado (6.770g por 5
minutos a 4ºC). A ressuspensão foi repetida, utilizando-se 4ml de água deionizada.
Após o descarte do sobrenadante foi adicionado, para cada meio, 0,002g de
36
lisozima diluída em 2 ml de TE (TRIS 10mM, EDTA 1mM, pH 8,0) e 400µl de SDS
10%. Após a homogeneização, foram adicionados 1/10 do volume de acetato de
sódio (1M) pH 5,2 e um volume de fenol pré-aquecido por dez minutos a 64ºC; cada
tubo foi homogeneizado e incubado por 6 minutos a 64º e centrifugado (20.800g por
10 minutos a 4ºC). Um total de 3ml do sobrenadante de cada uma das amostras foi
recolhido. Foram adicionados, então, 3ml de clorofórmio e a solução foi
homogeneizada e centrifugada (20.800g por 10 minutos a 4ºC). O sobrenadante foi
recolhido e alíquotas de 400µl foram distribuídas em tubos “Eppendorf “ de 1,5 ml. A
cada tubo foram adicionados 40 µl de acetato de sódio (3M), 1µl EDTA (1mM), 880
µl de etanol 100% gelado para precipitação durante a noite, a -20ºC. No dia
seguinte, o material foi centrifugado (20.800g por 25 minutos a 4ºC) e o precipitado
foi lavado com 1 ml de etanol 80%, seguido de outra centrifugação (20.800g por 5
minutos a 4ºC). O sobrenadante foi descartado e o precipitado de RNA foi seco a
37ºC, ressuspenso em 100 µl de água e tratado com 1µl de DNAse RQ1 (5U / µl) por
1 hora a 37ºC.
Finalmente, o RNA foi submetido a uma nova extração com um volume de
fenol saturado, um volume de fenol:clorofórmio (1:1 v:v) e um volume de clorofórmio.
A suspensão (300 µl) foi colocada a -70ºC por 40 minutos após a adição de 30 µl de
acetato de sódio (3M) e 660µl de etanol 100% em cada tubo. Após centrifugação
(20.800g por 25 minutos a 4ºC), o precipitado foi lavado com 1ml de etanol 70% e
centrifugado novamente. Finalmente, o RNA obtido foi seco a 37ºC e ressuspenso
em 50µl de água.
O RNA foi quantificado através de absorbância a 260nm e 280nm, com o
auxílio de um NanoDrop (Spectrophotometer ND-1000). Só foram utilizados os RNAs
cuja densidade óptica apresentou uma razão A
260
/A
280
entre 1,9 e 2,0.
Para a verificação da integridade do RNA, amostras das diferentes
preparações foram submetidas a eletroforese e seu padrão de migração visualizadas
sob luz ultravioleta, conforme descrito por Sambrook et al. (1989). A presença de
bandas intactas de RNA ribossomal foi usada como critério para verificar a
degradação do material. A seguir, o RNA foi submetido à purificação através do
sistema RNeasy, da Qiagen, segundo especificações do fabricante. Um sistema
tampão permite que RNA maiores que 200 bases se liguem em uma membrana de
sílica-gel RNeasy, o que permite purificar e selecionar os RNAs
37
O RNA purificado através desta metodologia possui pureza suficiente para
permitir eficiente marcação com Cy3-dCTP ou Cy5-dCTP (Amersham Biosciences)
através de protocolos tradicionais.
3.4.2 Gel de eletroforese de RNA
Para a verificação da integridade do RNA, foram fracionadas amostras das
diferentes preparações em gel de agarose a 1,2%, em 2.2 M de formaldeído, 200
mM de Tampão MOPS, corado com brometo de etídeo e visualizado sob luz
ultravioleta (SAMBROOK et al., 1989). Para que amostras das extrações de RNA
fossem analisadas, foram adicionados 6 µl do tampão de amostra a 3 µg do RNA
extraído, dissolvido em 2µl de água DEPC ativa. O tampão de amostra era composto
de: 10 µl de tampão MOPS (200mM), 21 µl de formaldeido, 60 µl de formamida, 6 µl
de brometo de etídeo e 29 µl de tampão “loading” (ficoll a 20%, EDTA a 20mM, azul
de bromofenol e xilenocianol 15%, pH 8,0). A reação foi submetida a 60ºC por 10
minutos, para desnaturação e finalmente aplicada no gel, para ser submetida a
eletroforese em tampão de corrida (20 mM de tampão MOPS dissolvido em água
DEPC ativa), por 40-50 minutos a 76 V. A visualização dos fragmentos de RNA foi
feita sob luz UV e foi utilizado, como referência, um marcador 0,16-1,77 Kb RNA
“Ladder” (Invitrogen).
3.5 Marcação de RNA com fluoróforos Cy3-dCTP e Cy5-dCTP.
Populações de cDNA marcados foram obtidas a partir de 30 µg de RNA total
de Xf 9a5c cultivadas nos meios de cultura PW ou 3G10-R pela incorporação de
dCTP acoplado a um fluoróforo (Cy3 ou Cy5) na síntese da 2ª fita de cDNA, como
descrito por Bowtell et al.(2002). A este RNA foi acrescentado um controle positivo, o
RNA de λQ (ver item 3.6 de Métodos).
A síntese da primeira fita de cDNA foi realizada através da reação:
38
- 4 µl de primer mix Xf (100 µM)
- 1 µl de RNA de λQ 20ng/ µl
- 0,5 µl de primer antisense Q plus10 mM (5
’
TTTTTTTTTTTTTTTTTGGGTTGGGTAAG 3
’
).
- 14 µl RNA (30 µg)
- 4,5 µl de H
2
O deionizada autoclavada
______
24 µl total
O primer mix Xf (100 µM), utilizado na reação acima, contém 1µl de cada par
de primers específico para o genoma de Xf 9a5c, desenhados com auxílio do
programa Primer 3 (http://www.genome.wi.mit.edu/cgi/bin/primer/primer3.cgi), como
descrito por Costa de Oliveira et al (2002).
Assim, para anelamento do primer, a reação acima foi submetida a 70ºC por 5
minutos, 40ºC por 2 minutos e finalmente 37ºC por 2 minutos. Em seguida, foram
adicionados:
- 6 µl de 5X First Strand Buffer (Invitrogen)
- 3 µl de 0,1 M DTT
- 0,6 µl de dNTPs (25mM de cada dNTP)
- 1 µl de Superscript II RT (200 U/µl) (Invitrogen).
A reação foi então mantida a 42ºC por 2,5 horas, seguida de incubação a
70ºC por 10 minutos e tratamento com 1 µl de RNAse (10mg/ml) a 37ºC para
degradar o RNA molde. A purificação da primeira fita de cDNA foi realizada em
Microcon YM-30 (Millipore), e o volume da amostra ajustado para 22 µl.
A marcação da 2ª fita foi iniciada por uma incubação a 95ºC por 5 minutos,
sendo então acrescidos:
- 20 µl de 2,5 X solução de primers randômicos – BIOPRIME DNA Labelling
System (Invitrogen)
- 5 µl de mistura dNTPs (24mM dATP, 24mM dTTP, 24mM dGTP, 12mM dCTP)
- 2 µl de 25nmol Fluorolink
TM
Cy3-dCTP ou Cy5-dCTP (Amersham)
- 1 µl de Klenow (40U/µl) - BIOPRIME Labelling System (Invitrogen).
39
As reações foram incubadas a 37ºC durante 2 horas, seguido de purificação
em filtro Microcon YM-30 (Millipore) com 3 lavagens utilizando 400 µl de H
2
O
deionizada autoclavada em cada. O volume final de cada amostra foi ajustado para
15 µl.
3.6 Hibridação dos “biochips” de X. fastidiosa
“Biochips” de Xf 9a5c, carregando seqüências representativas de 2200 ORFs
da bactéria, foram construídos pelo Laboratório de Genômica Estrutural e Funcional
do NIB-UMC. Este microarranjo é composto de sondas amplificadas por PCR, a
partir de cosmídeos e DNA genômico deste isolado (COSTA DE OLIVEIRA et al.,
2002, NUNES et al., 2003). O “chip” foi preparado com réplicas de cada setor,
portanto cada “biochip” possui duas cópias do genoma de Xf 9a5c, conforme ilustra
a figura 06. Além disto, o gene Q do fago
λ
foi amplificado e distribuído em pontos
específicos da lâmina para funcionar como controle externo positivo e genes de
outros microorganismos distintos aos de Xf 9a5c, cDNAs de células eucarióticas e
amostras constituídas de tampão sem DNA foram utilizadas como controles
negativos.
Amostras de cDNA marcados com Cy3 e Cy5-dCTP, provenientes de duas
condições experimentais testadas (por exemplo,.PW e 3G10-R), foram misturadas
em quantidades equimolares, acrescidas de 70 µl de solução de hibridação ( 6X
SSC, 5X Solução de Denhardt’s, 0.25 mg/ml de DNA de esperma de salmão e 0,5%
SDS) e submetidas a hibridação com o “biochip” de Xf 9a5c, a 42°C, por um período
de 14-16 horas em uma estação de hibridação GeneTac (Genomic Solutions, Inc.).
Após a incubação, as lâminas foram lavadas na própria estação de
hibridação. Foram realizadas duas etapas de lavagem a 25ºC em solução 0,05 X
SSC, 0,01% SDS, 2 lavagens em solução 0,06X SSC, 0,01% SDS e duas lavagens
finais com 0,06X SSC. Cada lavagem consistiu de 1 minuto de fluxo, seguida de 5
minutos de incubação sem agitação e submetidas à leitura em um “scanner” óptico
Affymetrix 418, nos comprimentos de onda 532nm e 635nm para Cy3 e Cy5-dCTP,
40
respectivamente (COSTA DE OLIVEIRA et al., 2002; NUNES et al., 2003; DE
SOUZA et al., 2004).
Imagens de hibridação foram geradas para cada fluoróforo (Cy3 e Cy5)
independentemente. Para cada leitura, a potência do laser e o ganho do
fotomultiplicador foram ajustados, para minimizar o background e evitar saturação de
sinal em diferentes “spots” do “chip”.
A figura 06 ilustra uma imagem obtida após leitura em “scanner” óptico
Affymetrix 418, no comprimento de onda 635nm, obtida neste trabalho, pela
hibridação com fluoróforo Cy5, referente ao DNA total de células de Xf 9a5c
cultivadas em meio 3G10-R.
Figura 06: Imagem do “biochip” de Xf 9a5c obtida pelo “scanner” óptico. Representação de uma
imagem obtida após leitura em “scanner” óptico após hibridação com cDNA de células de Xf 9a5c
cultivadas em meio 3G10-R e marcados com Cy5. Destaque para arquitetura do “biochip”, onde estão
assinalados os setores em duplicata. Réplicas de cada setor foram depositadas abaixo do setor
correspondente, formando duas cópias do genoma de Xf 9a5c em cada “biochip”.
41
3.7 Aquisição de imagens e análise dos resultados
Para os experimentos de comparação dos perfis de expressão gênica, RNA
foi extraído de duas culturas independentes, mantidas em PW, e de duas culturas
independentes mantidas em 3G10-R. Estes RNAs foram marcados e utilizados em
hibridações, obedecendo a um esquema de troca de fluoróforos (“dye swap”),
totalizando duas hibridações para cada extração de RNA. Uma vez que cada
“biochip” possui duas cópias do genoma de Xf 9a5c, estas quatro hibridações
geraram oito leituras para cada “spot”, a partir das quais, os dados foram analisados
através de análise estatística.
1º Extração de RNA
Hibridação 1
Leitura 1- Xf 9a5c PW Cy3 X Xf 9a5c 3G10-R Cy5
Leitura 2- Xf 9a5c PW Cy3 X Xf 9a5c 3G10-R Cy5
Hibridação 2
Leitura 3- Xf 9a5c PW Cy5 X Xf 9a5c 3G10-R Cy3
Leitura 4- Xf 9a5c PW Cy5 X Xf 9a5c 3G10-R Cy3
2º Extração de RNA
Hibridação 3
Leitura 5- Xf 9a5c PW Cy3 X Xf 9a5c 3G10-R Cy5
Leitura 6- Xf 9a5c PW Cy3 X Xf 9a5c 3G10-R Cy5
Hibridação 4
Leitura 7- Xf 9a5c PW Cy5 X Xf 9a5c 3G10-R Cy3
Leitura 8- Xf 9a5c PW Cy5 X Xf 9a5c 3G10-R Cy3
Figura 7- Esquema das hibridações competitivas entre células Xf 9a5c crescidas em meios PW
e 3G10-R. Para cada extração de RNA, duas hibridações foram realizadas. Cada par era constituído
por uma hibridação que combinava o RNA referência marcado com Cy3 ao RNA teste, marcado com
Cy5 e por uma segunda hibridação, que combinava o RNA de referência marcado com Cy5 ao RNA
teste marcado com Cy3. Uma vez que cada “biochip” possui duas réplicas do genoma, oito leituras
puderam ser obtidas para cada gene (“spot”) presente na lâmina.
42
A quantificação dos valores de intensidade de cada “spot” foi feita através
de um processo de segmentação de histograma com o programa TIGR spotfinder
v.2.2.4 (SAEED et al., 2003) que delimita a área dos “spots” a partir de uma imagem
bruta. Um “grid” de identificação foi definido e “spots” foram delimitados pela medida
do raio (mínimo 15 / máximo 20). Os “pixels” pertencentes a cada “spot” foram
identificados e quantificados, gerando para cada “spot” um valor integrado de
intensidade, já descontados os valores de “background” local, descartando todos os
“spots” que possuíssem valores medianos de intensidade inferiores ao “background”
local mais dois desvios-padrão.
Dados relativos a cada experimento foram salvos em uma planilha gerada
especificamente pelo TIGR spotfinder (denominada arquivo .mev). Nesta planilha,
foram compiladas todas as informações sobre as intensidades das leituras,
“background” local e controle de qualidade de cada “spot”.
Os valores de intensidade, obtidos em cada canal, foram normalizados
utilizando o método de Lowess (WORKMAN et al., 2002), com o auxílio do programa
TIGR Midas v.3.1 (SAEED et al., 2003). Os arquivos .mev, produzidos por cada
experimento, foram compilados em um banco de dados e analisados pelo programa
Multi-Experiment Viewer - TIGR MEV v3.1 (SAEED et al., 2003) que permite
trabalhar simultaneamente com os resultados de várias hibridações, sejam elas
réplicas de um mesmo experimento ou de múltiplos experimentos diferentes. Todos
os softwares empregados nestes estudos, bem como detalhes a respeito de sua
utilização podem ser obtidos em htpp://www.tigr.org/software.
Genes regulados positiva ou negativamente em cada meio de cultura foram
identificados através de critérios estatísticos, utilizando o método conhecido como
SAM (Significance Analysis of Microarrays), descrito por Tusher et al. (2001).
43
4 RESULTADOS
4.1 Crescimento de X. fastidiosa em diferentes meios de cultura.
A avaliação dos efeitos de diferentes condições nutricionais no crescimento e
na sobrevivência de fitopatógenos in vitro pode fornecer conhecimentos básicos que
auxiliem a compreensão dos mecanismos utilizados pela bactéria para se adaptar à
vida no interior da planta. Tomando por base esta afirmação, foi estabelecido o
cultivo de Xf 9a5c nos diferentes meios de cultura em estudo, monitorando-se a taxa
de crescimento celular a fim de se elaborar curvas, conforme descrito nos Métodos.
O gráfico da figura 08 compara o crescimento de Xf 9a5c em meios PW e
3G10-R, permitindo verificar que bactérias cultivadas em meio PW apresentam um
crescimento mais intenso, alcançando o início da fase exponencial em apenas três
dias pós-inóculo e a fase estacionária a partir do quinto dia. Células crescidas em
meio 3G10-R, por outro lado, apresentam uma multiplicação celular menor e a uma
taxa mais lenta quando comparadas às bactérias crescidas em meio PW. Foi
observada uma taxa de crescimento linear em meio 3G10-R, iniciado a partir de seis
dias e estendendo-se até aproximadamente o dia 14 após o inóculo inicial. Em
ambos os meios, o inóculo inicial foi feito a partir de uma alíquota de células
cultivadas em meio PW, na fase exponencial (DO
600
∼ 0,2) na proporção de 1:15.
Após 14 dias de incubação, a cultura entrou em fase estacionária de crescimento e,
posteriormente, em fase de declínio (dados não mostrados).
44
Figura 08: Curvas de crescimento de Xf 9a5c cultivada em PW e 3G10-R. As culturas foram
iniciadas a partir de inóculos de células crescidas em meio PW, em fase exponencial de crescimento,
na proporção de 1:15. Eixo das ordenadas indica a densidade óptica (DO), medida por absorbância a
600 nm, com o auxílio de um espectrofotômetro. Eixo das abscissas indica as periodicidades das
leituras realizadas, indicada em dias. Os dados são médias de três repetições.
Foi observado que o meio 3G10-R, embora menos eficiente em sua
capacidade de promover o crescimento de Xf 9a5c, permite a verificação de outras
características desta bactéria como a formação de biofilme, facilmente identificado
pela discreta formação de agregados celulares aderidos à parede do frasco
contendo a cultura em meio líquido, por volta de treze dias após o inóculo (veja item
4.3).
4.2 Identificação de genes diferencialmente expressos em células
crescidas em meios de cultura PW e 3G10-R.
Uma vez padronizado o cultivo de Xf 9a5c em PW e 3G10-R e confirmadas as
diferenças no padrão de crescimento, foi iniciada a análise comparativa da
expressão gênica entre as bactérias crescidas nestes dois meios. Dessa forma, a
bactéria foi cultivada independentemente em 400 ml de PW e 3G10-R, até que as
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tempo (dias)
OD
600nm
PW
3G10-R
45
culturas atingissem DO
600
de
0,2 e 0,15, respectivamente e amostras de RNA total
foram extraídas e marcadas, conforme descrito nos Métodos.
Para cada condição experimental utilizada, os dados foram obtidos após a
avaliação de quatro réplicas experimentais, realizadas com as fluorescências
invertidas (“dye swap”). Cada par experimental foi realizado com amostras de RNA
extraídas de culturas independentes. Além disso, uma vez que cada “biochip”
carregava duas réplicas do genoma de Xf 9a5c, um total de oito leituras de razão
Cy5/Cy3 foi obtido para cada gene presente no “biochip”. A resposta transcricional
de células de Xf 9a5c crescidas em meio PW e 3G10-R foi analisada pela
metodologia estatística conhecida como Análise de Significância de Microarranjos
(SAM), e permitiu a identificação de um total de 288 genes apresentando modulação
de expressão estatisticamente significativa. Destes, 114 genes foram identificados
com expressão aumentada em células crescidas em 3G10-R, quando comparadas
às células crescidas em PW, enquanto que, 174 genes apresentaram expressão
aumentada em células crescidas em PW, quando as células crescidas em 3G10-R
são usadas como referência. O conjunto de genes, que apresentou modulação de
expressão, pode ser visto representado na figura 09 onde, através de um processo
de reamostragem (“Bootstrap”), a diferença relativa de expressão observada para
cada gene é plotada contra a diferença relativa de expressão esperada para este
mesmo gene. A disparidade entre estes dois valores é diretamente proporcional à
confiabilidade estatística associada à variação de expressão do gene nestes dois
meios.
Uma lista completa dos genes diferencialmente expressos identificados neste
experimento pode ser vista nas Tabelas 3 e 4 (em Anexos), assim como na figura 11
e sua distribuição em diferentes categorias e grupos funcionais, de acordo com a
base de dados de Xylella fastidiosa está disponível em (http://
www.aeg.lbi.ic.unicamp.br/xf). O padrão de variação de expressão gênica de cada
um dos 288 genes identificados como modulados entre os dois meios é mostrado na
figura 10, onde os resultados obtidos das oito réplicas experimentais podem ser
observados simultaneamente.
De maneira a padronizar as observações, optou-se por usar a expressão em
PW como referência, designando os genes do 1º grupo como os que apresentam
modulação positiva em 3G10-R, enquanto os genes do segundo grupo foram
designados como genes que apresentam modulação negativa em 3G10-R.
46
Figura 09: Genes com mudança de expressão estatisticamente significativa em um dos dois
meios (PW e 3G10-R). O gráfico mostra a diferença relativa observada (eixo das ordenadas) contra a
diferença relativa esperada (eixo das abscissas) na expressão dos genes. A linha sólida indica onde a
diferença relativa observada é idêntica à diferença relativa esper ada. As linhas tracejadas
estabelecem o “cutoff” estatístico para genes modulados com um “false discovery rate” (FDR) < 1. Os
pontos verdes representam genes com expressão diminuída em células crescidas em 3G10-R (genes
com modulação negativa) e, portanto, superexpressos em células crescidas em PW, enquanto os
pontos vermelhos representam expressão aumentada em células crescidas em 3G10-R (genes com
modulação positiva) e, portanto, subexpressos em células crescidas em PW.
47
Figura 10: Padrões de expressão das 288 ORFs com modulação estatisticamente significativa
em células crescidas em 3G10-R contra células crescidas em meio PW. Compararam-se células
crescidas em 3G10-R contra o RNA de referência, obtido de células crescidas em meio PW. Genes
com expressão aumentada em 3G10-R aparecem em vermelho, enquanto que os de expressão
aumentada em PW aparecem em verde.
48
A figura abaixo (figura 11) permite a comparação entre as classes funcionais
das ORFs que apresentaram modulação positiva (superexpressas em 3G10-R) ou
negativa (superexpressas em PW) (ORFs consideradas como proteínas hipotéticas
e hipotéticas conservadas não estão contabilizadas nesta figura).
0
5
10
15
20
25
30
35
Número
de ORFs
1 2 3 4 5 6 7 8
Categoria Funcional das ORFs
Superexpressas em meio 3G10-R Superexpressas em meio PW
Figura 11: Distribuição funcional das ORFs com modulação estatisticamente significativa em
Xf 9a5c cultivadas em meio 3G10-R em relação às crescidas em meio PW. As colunas nos eixo
das abscissas representam: 1- Metabolismo intermediário. 2- Biossíntese de pequenas moléculas. 3-
Metabolismo de macromoléculas. 4- Estruturas celulares. 5- Processos celulares. 6- Elementos
genéticos móveis. 7- Patogenicidade, virulência e adaptação. 8- ORFs com categoria indefinida. A
categorização obedece ao padrão proposto por Simpson et al.(2000).
Xf 9a5c apresentou uma maior quantidade de genes superexpressos em PW
do que em 3G10-R, com destaque para as diferenças no padrão de expressão de
genes envolvidos com metabolismo intermediário e de macromoléculas, estruturas e
processos celulares. Uma análise deste grupo também mostra que as bactérias
crescidas em meio 3G10-R apresentaram superexpressão de um número maior de
genes associados a elementos genéticos móveis, quando comparadas às células
crescidas em PW.
A grande diferença observada no grupo de genes relacionados ao
metabolismo de macromoléculas deve-se à modulação de expressão de um grande
número de genes envolvidos com metabolismo de DNA (dnaA, dnaN, gyrB, recD,
49
llallA, hrpA, hpallM, ruvB, ung) e RNA (rpsU, greA, pcnB, rluC, proS, queA, thrS,
Tm0492, valS, rluD, orn, rpsE, rplE, rph e rnhB) cuja expressão é mais intensa em
células crescidas em meio PW, o que estaria de acordo com a taxa de crescimento
mais elevada observada nestas condições.
Genes que codificaram enzimas relacionadas ao metabolismo protéico
também se encontraram superexpressas em células cultivadas em meio PW. Estas
incluem tanto proteínas envolvidas em processos de tradução e modificação (fusA,
mip, TP0862, frr, lepB), como genes relacionados à degradação de proteínas (pepQ,
mucD, SC9B10.04, ptrB), sugerindo intensa atividade proteolítica, provavelmente
associada ao uso de peptona e triptona de soja como principais fontes de carbono
presentes neste meio. Células cultivadas em meio 3G10-R também apresentaram
superexpressão de algumas ORFs associadas ao metabolismo protéico, como a
ORF Xf0453, que codifica uma proteinase, semelhante à proteinase Hfl C de E.coli.
A análise do perfil de expressão gênica em células de Xf 9a5c crescidas no
meio 3G10-R, quando comparado ao obtido para células crescidas em meio PW,
mostrou ainda uma proporção relativamente grande de ORFs identificadas como
codificadoras de proteínas hipotéticas, para as quais não foi encontrada homologia
com nenhuma seqüência descrita (42% do total de genes expressos positivamente e
30,5 % do total de genes expressos negativamente). Uma outra grande parcela
corresponde a proteínas hipotéticas conservadas, que apresentaram similaridade a
proteínas de função desconhecida, mas já descritas em outras bactérias (14% do
total de genes expressos positivamente e 12% do total de genes expressos
negativamente).
4.3 Desenvolvimento e cultivo de Xf 9a5c em meio CCON.
Durante a padronização da proporção dos inóculos iniciais de culturas em PW
ou 3G10-R foram observadas flutuações na taxa de crescimento em função do
aporte de meio PW nas alíquotas. Experimentos realizados com inóculos de
diferentes proporções entre os meios PW e 3G10-R sugeriram que uma mistura dos
dois meios poderia favorecer o crescimento de Xf 9a5c. Desta maneira, testes de
50
crescimento, envolvendo diferentes proporções dos dois meios, foram realizados
permitindo a formulação de um meio híbrido, composto pelas adições e modificações
de concentrações de alguns componentes dos meios PW e 3G10-R. Este novo meio
de cultura foi denominado CCON (Tabela 02 no item Métodos deste trabalho). O
meio CCON se notabiliza por fornecer à bactéria duas fontes alternativas de carbono
(glicose - uma fonte sacarídica e peptona/triptona - uma fonte protéica), assim como
duas fontes alternativas de ferro (hemina - uma fonte orgânica e pirofosfato férrico -
uma fonte inorgânica). A presença de GSH garante a manutenção de uma atmosfera
redutora, o que pôde contribuir para a formação de biofilme, como proposto por Leite
et al. (2004). Além disso, o meio também contem biotina, cuja presença auxilia o
crescimento de X. fastidiosa e glutamina, identificada como um nutriente
imprescindível para o crescimento de diversas linhagens de X. fastidiosa (DAVIS et
al., 1981a; CHANG & DONALDSON, 1993; LEITE et al., 2004).
O gráfico da figura 12 mostra que o meio CCON foi capaz de promover um
grande aumento na taxa de crescimento celular, quando comparado aos outros dois
meios de cultura (3G10-R e PW), atingindo o início da fase exponencial em
aproximadamente 2 dias e a fase estacionária em 6 dias, a partir de um inóculo de
1:15, realizado a partir de células crescidas em meio PW, em fase exponencial de
crescimento.
Comparações entre as curvas de crescimento mostradas na figura 12
permitiram observar similaridades no padrão de crescimento de Xf 9a5c cultivada em
meio PW (linha verde) e CCON (linha rosa) quanto ao tempo (em dias) necessários
para atingir tanto a fase exponencial como a estacionária. Este padrão difere em
células crescidas em meio 3G10-R, que apresentam uma curva de crescimento
distinta (linha amarela), com as fases de crescimento bacteriano pouco definidas e
onde podemos notar um padrão que, embora ascendente, é bem mais lento quando
comparado aos dois outros meios. As curvas de crescimento apresentadas na figura
12 mostram claramente que bactérias crescidas no meio CCON apresentam um
aumento cerca de três vezes na taxa de crescimento, comparadas com Xf 9a5c
cultivadas em meio PW e, de pelo menos cinco vezes quando comparado com
bactérias crescidas em meio 3G10-R.
51
Figura 12: Curvas de crescimento de células de Xf 9a5c em meios de cultura 3G10-R, PW e
CCON. As culturas foram iniciadas a partir de inóculos de células crescidas em meio PW, em fase
exponencial de crescimento, na proporção de 1:15. Eixo das ordenadas indica a densidade óptica
(DO), monitorado através de absorbância a 600 nm, com o auxílio de um espectrofotômetro. Eixo das
abscissas indica as leituras realizadas, medidas em dias. Os dados são médias de três repetições.
Desta forma, foi observado que a cultura de Xf 9a5c em CCON apresentou
características mistas: um tempo de incubação semelhante à bactéria crescida em
meio PW, com a vantagem de proporcionar um aumento de até três vezes no
crescimento da bactéria. Aproximadamente dez dias após o inóculo inicial, foi
verificada ainda a presença de agregados celulares, bem como formação de um
biofilme mais visível do que aquele observado nas paredes dos frascos da cultura
contendo meio 3G10-R, conforme ilustra a figura 13.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tempo (dias)
OD
600nm
PW
CCON
3G10-R
52
A
A
Figura 13: Aspecto de culturas de Xf 9a5c crescida em meios líquidos 3G10-R, PW e CCON. O
painel A mostra cultura de Xf 9a5c cultivada em 3G10-R, após treze dias de crescimento. O painel B
ilustra células crescidas treze dias em PW. Os painéis C e D referem-se a Xf 9a5c crescidas em meio
CCON durante treze dias. As setas nos painéis A e D ilustram a formação de biofilme na parede dos
frascos e a seta no painel C mostra agregados celulares no fundo do frasco.
Avaliando-se a composição do meio CCON e comparando-a com as
composições individuais dos meios PW e 3G10-R, optou-se por verificar se haveria
um ou mais componentes responsáveis por este aumento na taxa de crescimento.
Sabe-se que em Xf 9a5c foram encontrados diversos genes que codificam
para receptores transmembrânicos envolvidos na absorção de ferro. Além disso, já
foi aventada a possibilidade de que a redução na disponibilidade de ferro e
manganês para a planta possa contribuir significativamente para o aparecimento das
lesões nas folhas dos hospedeiros (SIMPSON et al, 2000; MEIDANIS et al., 2002).
Dessa forma, decidiu-se verificar se a mistura de fontes de ferro orgânico e
C
D
B
A
53
inorgânico existente no meio CCON poderia ser um dos fatores responsáveis pelo
aumento na taxa de crescimento de Xf 9a5c observado neste meio de cultura.
Foram testadas três variantes de meio de cultura derivados do meio CCON,
com alterações apenas nas fontes de ferro (veja item 3.3.3 dos Métodos deste
trabalho). Analisando as curvas de crescimento de Xf 9a5c mostrada na figura 14, foi
notado um crescimento sem diferenças significativas quando a bactéria é cultivada
em meio CCON contendo tanto hemina clorada como pirofosfato férrico como fonte
de ferro ou somente hemina clorada. Uma taxa de crescimento celular menor foi
observada para células de Xf 9a5c crescendo somente na presença de pirofosfato
férrico. Na figura 14 nota-se que, neste três meios, a fase exponencial de
crescimento de Xf 9a5c estendeu-se até aproximadamente 5 dias e a fase
estacionária iniciou-se no sexto dia após o inóculo. Células de Xf 9a5c cultivadas em
meio CCON sem fontes de ferro apresentaram um índice de crescimento celular
56% menor em relação ao meio CCON padrão e uma reduzida fase exponencial de
crescimento bacteriano, alcançando o início da fase exponencial em
aproximadamente 2 dias e a fase estacionária 3 dias após o inóculo. É possível que,
em condições de privação de fontes de ferro, Xf 9a5c seja induzida a se multiplicar
por um curto período de tempo e atingir rapidamente a fase estacionária de
crescimento. A entrada na fase estacionária de crescimento altera drasticamente os
padrões de expressão gênica, permitindo prolongar a sobrevivência bacteriana na
ausência de nutrientes. Em E.coli, a entrada em fase estacionária resulta no
aumento de resistência a diversas situações provocadas por estresses ambientais
(DONG et al., 2001).
Sabe-se que Xf 9a5c necessita de fontes de ferro orgânico ou inorgânico,
uma vez que o íon ferro, juntamente com outros íons, é essencial para a
sobrevivência de todos os organismos, participando como co-fatores para enzimas.
Na ausência de ferro, o crescimento da cultura de Xf 9a5c é prejudicado, levando a
uma diminuição na taxa de divisão celular e a uma adiantada fase estacionária.
Porém, ao se traçar um paralelo entre as curvas de crescimento mostradas nas
figuras 08 e 14, nota-se que a bactéria crescida em meio CCON modificado, sem
nenhuma fonte de ferro na sua composição, ainda assim apresenta um crescimento
maior que culturas em meios PW e 3G10-R, levando à conclusão de que haveria
outro fator no meio CCON responsável pelo aumento na taxa de crescimento
bacteriano. Além disto, foi observada uma taxa de crescimento semelhante em
54
meios contendo pirofosfato férrico ou hemina clorada ou a mistura de ambos. Estes
fatos levaram à conclusão de que a mistura de ferro orgânico e inorgânico, de
diferentes fontes, não foi o componente que promoveu o aumento na taxa de
crescimento de Xf 9a5c cultivada em meio CCON.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1 2 3 4 5 6
Tempo (dias)
DO
600nm
Meio CCON contendo hemina clorada (0,005 g/l) e pirosfosfato férrico (0,2mM)
Meio CCON contendo hemina clorada (0,01g/l)
Meio CCON contendo pirofosfato férrico (0,3 mM)
Meio CCON sem fontes de ferro
Figura 14: Crescimento de Xf 9a5c cultivada em CCON, na presença de diferentes fontes de
ferro. As culturas foram iniciadas a partir de inóculos de células crescidas em meio PW, em fase
exponencial de crescimento, na proporção de 1:15. Os dados são médias de três repetições.
A presença de glicose no meio CCON, utilizada como fonte de carbono,
também poderia ser responsável por promover um maior crescimento de células de
Xf 9a5c, uma vez que o meio PW utiliza peptídeos e aminoácidos derivados de
triptona e peptona como principal fonte de carbono. As células foram então crescidas
55
em 30 ml de CCON, ou em igual volume de CCON modificado, de onde a glicose foi
subtraída (figura 15). Observando o gráfico verifica-se que células cultivadas em
CCON sem glicose apresentam uma taxa de crescimento cerca de 5 vezes menor,
quando comparadas à Xf 9a5c crescida na presença de glicose. Além disso, na
ausência de glicose, nota-se que as fases de crescimento bacteriano apresentam-se
pouco definidas. A comparação das duas curvas de crescimento da figura 15 leva à
conclusão que a presença de glicose no meio é, provavelmente, o principal fator
responsável pelo maior índice de crescimento da bactéria no meio CCON.
Figura 15: Crescimento de Xf 9a5c cultivada em CCON, na presença e na ausência de glicose.
As culturas foram iniciadas a partir de inóculos de células crescidas em meio PW, em fase
exponencial de crescimento, na proporção de 1:15. Os dados são médias de três repetições.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1 2 3 4 5 6 7
Tempo (dias)
OD600nm
Meio CCON sem glicose Meio CCON com glicose
56
5 DISCUSSÃO
Os resultados obtidos com o cultivo de X. fastidiosa (9a5c) nos meios 3G10-R
e PW mostraram claramente que, apesar das diferenças observadas nas taxas de
multiplicação bacteriana, ambos são capazes de sustentar o crescimento deste
microorganismo in vitro. Curiosamente, os dois meios possuem poucas
características comuns, que poderiam ser resumidas à presença de um sistema
tamponante (K
2
HPO
4 :
KH
2
PO
4
), de concentrações milimolares de um único sal
inorgânico (MgSO
4
), do indicador de pH vermelho de fenol (presente em uma
concentração dez vezes maior no meio PW) e do aminoácido L - glutamina, que
parece ser um aminoácido indispensável para o cultivo de X. fastidiosa (DAVIS et al.,
1981a; CHANG & DONALDSON, 1993). Coincidentemente, este é também o mais
abundante aminoácido encontrado no xilema de videira, uma planta sabidamente
infectada por esta fitobactéria (ANDERSEN et al., 1991; ISHIDA et al., 2004). Em
contrapartida, os dois meios apresentam uma série de diferenças em suas
respectivas composições, como no uso de antioxidantes – BSA em PW ou
Glutationa reduzida em 3G10-R (FUKUZAWA et al., 2005); na definição de uma
fonte de ferro - orgânica em PW (Hemina Clorada), ou inorgânica em 3G10-R
(Pirofosfato Férrico); e na fonte de carbono disponibilizada - protéica em PW ou à
base de carboidrato (glicose), em 3G10-R. O meio 3G10-R apresenta ainda, biotina
em sua composição, enquanto nenhuma vitamina é adicionada ao meio PW.
Estas diferenças na composição dos meios resultam em significativas
alterações nas condições de crescimento das células cultivadas em PW ou em
3G10-R. As concentrações relativamente elevadas de Peptona e Triptona de soja
fazem do PW um meio significativamente rico do ponto de vista nutricional (DAVIS et
al., 1981), o que propicia um intenso ritmo de crescimento nas bactérias nestas
condições, não observado em células cultivadas em 3G10-R. Este elevado ritmo de
crescimento estabelece, por exemplo, uma maior demanda energética por parte
destas células, que em conseqüência, apresentam superexpressão de uma série de
genes relacionados ao complexo NADH Desidrogenase I, o primeiro componente da
cadeia transportadora de elétrons (Complexo I), responsável pela recepção de
elétrons provenientes de carreadores NADH (genes nuoBGFM, presentes em um
operon que se estende da ORF Xf0305 até a ORF Xf0318). Resultados semelhantes
57
foram obtidos em experimentos de hibridação em microarranjos de DNA com células
de E. coli submetidas a cultivo em meios de cultura que apresentavam variadas
limitações nutricionais. Hua et al. (2004) descreveram a superexpressão de 8 dos 13
genes do operon nuo em resposta ao aumento na taxa de crescimento destas
bactérias em meios com limitação de glicose, enquanto Tao et al. (1999)
evidenciaram um aumento na taxa de expressão de nuo M e nuo N quando
compararam células de E. coli crescidas em meio complexo LB (Luria Bertani) com
células crescidas em meio mínimo M63. Estes últimos estudos mostraram ainda a
superexpressão de um outro componente da cadeia transportadora de elétrons, o
cyoA (que codifica uma subunidade da citocromo oxidase c). A elevação na
produção destas proteínas, diretamente envolvidas com o transporte de elétrons e
com o processo de fosforilação oxidativa tende a favorecer a produção de ATP,
viabilizando a síntese de diversos tipos de biomoléculas necessárias à manutenção
da taxa de crescimento celular verificada em tais condições.
A divergência na fonte de carbono disponibilizada por cada meio parece ser
de extrema importância para determinar as tendências do metabolismo celular. No
meio 3G10-R, a glicose atua como principal fonte de carbono e energia, o que
deveria levar bactérias crescidas neste meio a apresentar uma elevação na
expressão de genes envolvidos na degradação de glicose e na biossíntese de
aminoácidos que, à exceção da glutamina, não são disponi bilizados para as células
crescidas nestas condições. De fato, células crescidas em 3G10-R apresentaram
superativação de 6 genes envolvidos em variadas etapas da síntese de diversos
aminoácidos (codificados pelas ORFs Xf1121, Xf1334, Xf2223, Xf2272, Xf2325 e
Xf2396). Paradoxalmente, não foi possível verificar a superexpressão de genes
associados à degradação de glicose em células crescidas em 3G10-R, que, no
entanto, apresentaram superativação em células crescidas em PW. Dois deles
codificam enzimas da via glicolítica, o gene da triose-fosfato isomerase (ORF
Xf0303) – enzima envolvida na quinta etapa da degradação da glicose (a
isomerização da dihidroxiacetona-fosfato em gliceraldeído 3-fosfato) e o gene da
enolase (ORF Xf1291), responsável pela nona (e penúltima) etapa da glicólise (a
conversão de 2-fosfoglicerato em fosfoenolpiruvato). Dois outros genes, associados
ao Ciclo de Krebs, também se apresentam superativados em células crescidas em
PW, codificando a subunidade alfa da succinil-coA sintetase (4
a
etapa do ciclo) e a
fumarato hidratase C (7
a
etapa do ciclo). Além disso, quando crescida em meio
58
3G10-R, a Xf 9a5c apresenta superexpressão do gene dld1, que codifica a D-lactato
desidrogenase, enzima envolvida na conversão do piruvato em lactato.
Verifica-se, portanto, que em 3G10-R a bactéria apresenta reduzida taxa de
crescimento e aumento na expressão de lactato desidrogenase, enquanto que em
PW, há elevação na taxa de crescimento, associada a um aumento na expressão de
genes que codificam enzimas da via glicolítica, do ciclo de Krebs e de componentes
da cadeia transportadora de elétrons. Tomados em conjunto, estes dados parecem
sugerir que o metabolismo energético de Xf 9a5c, em PW, estaria majoritariamente
associado ao processo de respiração aeróbica, enquanto as condições de
crescimento estabelecidas pelo 3G10-R favoreceriam a fermentação, ainda que
ambas as culturas sejam mantidas sob as mesmas condições de aeração constante.
Apesar de verificarmos modulação em genes da via glicolítica, é importante
ressaltar que estudos bioquímicos funcionais mostraram que as atividades de
algumas enzimas desta via metabólica, como aldolase, gliceraldeído 3-fosfato
desidrogenase e enolase não puderam ser detectadas em extratos brutos de X.
fastidiosa crescendo em meio XDM
2
(contendo glicose, mas na ausência de
aminoácidos) (FACINCANI et al., 2003). Em contrapartida, foi detectada atividade da
enzima glicose-6-fosfato desidrogenase, levando os autores a sugerir que a via
glicolítica não seria utilizada por células de X. fastidiosa, que oxidariam glicose,
preferencialmente, através da via de Entner-Doudoroff, de maneira a viabilizar não
apenas a produção de piruvato para o ciclo de Krebs, como também para a
produção de intermediários necessários à síntese de aminoácidos e nucleotídeos.
Nesse sentido, o funcionamento adequado desta via seria de fundamental
importância para células de X. fastidiosa, uma vez que a via das pentose-fosfato
encontra-se incompleta devido à ausência de genes que codifiquem fosfogluconato
desidrogenase ou transaldolase. No cromossomo de Xf 9a5c, todas as enzimas da
via de Entner-Doudoroff são codificadas por um mesmo operon, compreendido entre
as ORFs Xf1061 e Xf1065, mas nenhum destes genes teve sua expressão
modulada de maneira significativa neste experimento.
Além de funcionar como metabólito primário para a obtenção de energia, as
moléculas de glicose presentes no 3G10-R poderiam estar sendo utilizadas para a
produção de componentes da parede celular ou de exopolissacarídeos (EPS), cuja
intensa produção foi verificada em bactérias cultivadas neste meio (LEITE et al.,
2004). Este uso alternativo da glicose também já foi aventado como uma possível
59
explicação para o comportamento fastidioso da X. fastidiosa (FACINCANI et al.,
2003), agravado no meio 3G10-R, onde esta molécula estaria atuando também
como principal fonte de energia. Coincidentemente, quando as células de Xf 9a5c
são crescidas em 3G10-R, observa-se um aumento na expressão do gene xanA,
que codifica uma fosfoglucomutase que atua na conversão de glicose-6P para
glicose-1P. Esta molécula atua como precursora de UDP-glicose e UDP-galactose,
utilizados na síntese de diversos tipos de EPS (BOELS et al., 2003). Em
Lactococcus lactis, verificou-se que um aumento de 100 vezes na produção de
Fosfoglucomutase levou a um aumento de 5 vezes no acúmulo de UDP-glicose e
UDP-galactose, embora isto não resultasse diretamente em um aumento na taxa de
produção de EPS nesta bactéria (DE VOS et al.,1996).
O meio 3G10-R foi desenvolvido de maneira a mimetizar algumas das
condições encontradas na composição do xilema de videiras e a presença de
glicose no meio é, provavelmente, um dos aspectos mais importantes a serem
considerados. Uma vez que a função do xilema é transportar água e nutrientes
inorgânicos da raiz para todas as partes aéreas da planta, a composição do fluido
xilemático foi sempre considerada de baixa complexidade para sustentar o
crescimento de microorganismos em seu interior. No entanto, estudos mais recentes
vêm demonstrando que, além de sais minerais, o xilema contém nutrientes
orgânicos, tais como aminoácidos, algumas proteínas e até carboidratos como
frutose, sacarose e glicose (KEHR et al., 2005; GOODGER et al., 2005; ONDA &
ITO, 2005). Além disso, a concentração de glicose encontrada no 3G10-R (~10 mM)
assemelha-se à concentração de glicose verificada no xilema de algumas plantas,
como Symplocarpus foetidus (~3,5 mM) e os experimentos de complementação do
meio CCON com glicose (a uma concentração de aproximadamente 5,5 mM) deixam
claro que este carboidrato parece exercer um fator de fundamental importância para
garantir o crescimento eficiente desta bactéria.
A resposta transcricional de Xf 9a5c a diferentes concentrações de glicose já
foi estudada por experimentos de hibridação em microarranjos de DNA
(PASHALIDIS et al., 2005), mostrando alguns resultados condizentes com aqueles
verificados neste estudo. Desta forma, a presença de glicose no meio 3G10-R
parece ser o fator responsável pela superexpressão do gene pilY1, observada tanto
em bactérias cultivadas neste meio, como naquelas submetidas a cultivo em
concentrações crescentes de glicose (PASHALIDIS et al., 2005). Embora pilY1
60
esteja relacionado à estrutura de superfície de Xf 9a5c, este gene pode atuar como
fator de virulência baseado em motilidade ou formação de biofilme (NUDLEMAN &
KAISER, 2004). Fimbrias e pili medeiam uma ligação de X. fastidiosa com o xilema o
que tem sido indicada como essencial para o sucesso da colonização (PURCELL &
HOPKINS, 1996; SIMPSON et al., 2000).
Genes associados à produção de bacteriocinas também foram
coincidentemente identificados como superexpressos em resposta ao aumento na
concentração de glicose e ao crescimento em meio 3G10-R. Pashalidis et al. (2005)
verificaram aumento na expressão das bacteriocinas codificadas pelas ORFs Xf0262
e Xf0264, situação semelhante à verificada nas células crescidas em 3G10 -R, que
apresentaram ainda, superexpressão da bacteriocina codificada pela ORF Xf0263,
além das duas mencionadas acima. A possibilidade de que a Xf 9a5c aumente a
expressão de bacteriocinas quando coloniza o xilema é muito interessante, pois
estas proteínas possuem uma atividade bactericida capaz de conferir uma
significativa vantagem adaptativa em um ambiente competitivo como o xilema,
eliminando a competição por outras bactérias endofíticas encontradas neste
ambiente, como por exemplo, Pantoea agglomerans, Enterobacter cloacae, Bacillus
pumilus, Curtobacterium flaccumfaciens, entre outras (ARAÚJO et al., 2001).
É importante ressaltar que um modelo para regulação, síntese e imunidade
contra bacteriocinas em Xf 9a5c foi proposto por Pashalidis et al. (2005). Segundo
este modelo, a glicose presente no meio ativaria a expressão de cvpA (Xf1948), que
codifica uma proteína precursora que induziria a produção de bacteriocinas pelos
genes cvaC (Xf0262 e Xf0263). Após serem produzidas, estas proteínas seriam
transportadas do citosol para o periplasma da célula por expressão de um gene
presente na membrana interna, o gene cvaB (Xf1220). A proteína expressa pelo
gene cvaA (Xf1216) estaria inserida na membrana externa e transportaria as
bacteriocinas do periplasma para o meio externo, utilizando como assistente a
proteína expressa pelo gene tolC, que também se localizaria na membrana externa.
O gene cvi (Xf0261) que codifica uma proteína de imunidade se localizaria na
membrana interna de Xf 9a5c, inibindo a toxidade de bacteriocinas contra a própria
célula. No entanto, de todos estes genes mencionados acima, os estudos de
Pashalidis et al. (2005) só foram capazes de detectar a superexpressão dos genes
representados pelas ORFs Xf0261 e Xf1948. Nas células crescidas em 3G10-R, não
foi possível verificar aumento na expressão de nenhum destes genes, nem mesmo
61
da Xf0261, uma vez que esta ORF não estava presente no microarranjo utilizado
neste trabalho. Estudos envolvendo outras bactérias mostraram comportamentos
distintos no que diz respeito à cvaC. A bactéria X. axonopodis pv citri, um membro
da mesma família de X. fastidiosa, que também infecta laranjais, parece incapaz de
produzir cvaC na ausência de cvaA e cvaB. Em X.campestris pv campestris, cvaA,
cvaB e cvaC não foram encontrados (DA SILVA et al., 2002), o que pode estar
relacionado ao habitat desta bactéria, caracterizado por um ambiente rico em
nutrientes e fontes de carbono (mesófilo) e pela sua capacidade de degradar tecidos
de plantas infectadas.
Um outro aspecto a destacar da análise comparativa do transcriptoma de Xf
9a5c, mantida nos dois meios de cultura, diz respeito ao comportamento de genes
relacionados à resposta contra condições de estresse oxidativo. O aumento da
atividade respiratória durante o crescimento em PW tende a produzir um aumento na
concentração intracelular de espécies ativas de oxigênio (ROS), geradas como
subproduto do metabolismo do oxigênio durante a respiração (FRIDOVICH, 1978).
Diversos microorganismos desenvolveram mecanismos específicos para lidar com
os efeitos deletérios destas substâncias através da ação de um grupo de genes
conhecidos como Genes de Resposta a estresse Oxidativo (OSR). Nesse sentido, é
possível verificar que, como esperado, células crescidas em PW apresentam
superexpressão de alguns genes tradicionalmente associados à resposta a estresse
oxidativo. Um melhor conhecimento acerca dos mecanismos usados pela Xf 9a5c
para lidar com espécies ativas de oxigênio pode ser importante para um melhor
entendimento do processo de infecção in planta, uma vez que um dos mecanismos
mais comumente utilizados por vegetais para combater infecções microbianas é o
“burst” oxidativo, caracterizado por uma intensa produção de espécies ativas de
oxigênio pelas células do tecido vegetal infectado (SCHEEL, 1998). Estas
substâncias atuam como eficientes agentes antimicrobianos, o que faz com que
fitopatógenos, como a Xf 9a5c, tenham desenvolvido mecanismos eficientes para
contrabalançar os efeitos deletérios do “burst” oxidativo, garantindo sua
sobrevivência durante o desenrolar do processo infeccioso (FARR & KOGOMA,
1991). Uma análise do genoma da Xf 9a5c demonstrou que esta bactéria é
convenientemente provida de genes capazes de produzir proteínas que detoxificam
espécies ativas de oxigênio (kat, Mn, Sod, Ahp, etc.), assim como genes envolvidos
62
na reparação de danos causados por estes agentes – principalmente no DNA (mut
T, fpg, xth, etc.) (GREEN & PAGET, 2004). Além disso, pelo menos um regulador de
transcrição, ativado em resposta a estresse oxidativo foi identificado (oxyR). Apesar
disso, os detalhes referentes ao envolvimento destes genes em diferentes etapas do
processo de resistência a estresse oxidativo em Xf 9a5c ainda não são
completamente conhecidos.
Nesse sentido, os experimentos de hibridação em microarranjos, descritos
neste trabalho, apresentam alguns resultados que podem ajudar a compreender o
envolvimento e a ativação de alguns destes genes na presença de agentes
oxidantes, como no caso de células crescidas em PW, que apresentaram
superativação de genes como ohr (ORF Xf1827), correlacionado à resistência a
hidroperóxidos orgânicos (OLIVEIRA et al., 2006), fumC (ORF Xf1554), uma
isoenzima da fumarato hidratase, que apresenta maior capacidade catalítica na
presença de agentes oxidantes e que é expressa preferencialmente em condições
de estresse oxidativo (LU, et al., 2003) e a bacterioferritina frpC (ORF Xf1011), uma
proteína diretamente envolvida com a homeostase de íons Fe (MA et al., 1999). Em
diversos sistemas, verificou-se que o aumento na concentração interna de Fe é um
importante fator associado à geração de espécies ativas de oxigênio, devido à sua
participação na reação de Fenton, que converte peróxidos em radicais hidroxila
altamente reativos (CABISCOL et al., 2000). Nesse sentido, o controle na
concentração de Fe intracelular é de extrema importância para controlar situações
de estresse oxidativo em qualquer sistema biológico. Por exemplo, verificou-se que
células de E. coli respondem à presença de agentes oxidantes através da
superexpressão do gene fur, envolvido com a importação deste elemento por
receptores de membrana. Em Xf 9a5c, verifica-se que não há a modulação de
expressão do gene fur nas células crescidas em meio PW e a concentração de íons
Fe no interior da célula pode ser controlada através da superexpressão de
bacterioferritina, uma vez que esta proteína tem a capacidade de se ligar a íons Fe,
retirando-os de solução (MA et al., 1999).
Curiosamente, células de Xf 9a5c crescidas em meio 3G10-R apresentaram
superexpressão de oxyR, um dos principais ativadores transcricionais de resposta a
estresse oxidativo (STORZ & ALTUVIA, 1994). OxyR é um regulador transcricional
da família LysR que regula negativamente sua própria expressão e regula
63
positivamente a expressão de proteínas importantes para a defesa contra peróxido
de hidrogênio em Escherichia coli e Salmonella typhimurium (FARR & KOGOMA,
1991). A ativação de OxyR em células cultivadas em 3G10-R é paradoxal, uma vez
que são as células cultivadas em PW que parecem estar submetidas a uma maior
concentração de agentes oxidantes, a julgar pelo aumento de expressão de tantos
genes de resposta a estresse oxidativo e dos componentes do Complexo I
mitocondrial. No entanto, o aumento na expressão de OxyR parece ser um evento
isolado, uma vez que não parece levar a um aumento na expressão de nenhum dos
genes tradicionalmente regulados por este ativador transcricional. Por exemplo,
sabe-se que em Escherichia coli e Salmonella typhimurium, alguns dos genes
ativados por OxyR incluem: ahpCF e katG, que codificam, respectivamente, as
enzimas alquil-hidroperóxido redutase e catalase, responsáveis pela detoxificação
direta de peróxido de hidrogênio (FARR & KOGOMA, 1991); flu, que codifica uma
proteína de membrana externa denominada Ag43, responsável pelo fenômeno de
autoagregação celular (ZHENG et al., 2001); dsbG, que codifica uma chaperona
isomerase disulfeto, envolvida na redução de pontes dissulfeto criadas entre radicais
SH de proteínas oxidadas por diversos tipos de espécies ativas de oxigênio (ZHENG
et al., 2001).; gorA, que codifica a glutationa redutase, envolvida na reciclagem da
glutationa (ZHENG et al., 2001), um dos mais importantes antioxidantes
intracelulares; e os genes grxA e trxC, que codificam, respectivamente, a
glutaredoxina e a tioreoxina, que compõem um conjunto de proteínas capazes de
reduzir agentes oxidantes através de ciclos redox (ZHENG et al., 2001).
Muitos destes genes estão presentes no genoma de Xf 9a5c e dados
independentes obtidos em nosso laboratório mostram que alguns deles são ativados
em resposta à presença de Paraquat (um agente gerador de radicais superóxido)
(L.R. NUNES, comunicação pessoal). Talvez o caso mais interessante seja o caso
dos genes ahpCF, que se apresentam intensamente superexpressos em resposta às
concentrações crescentes de Paraquat. A enzima AhpCF é uma das principais
responsáveis pela detoxificação de peróxidos em diversos microorganismos
(ZHENG et al., 2001). A ativação transcricional do operon ahp por OxyR tem sido
demonstrada em sistemas bacterianos, tais como Escherichia coli e Salmonella
typhimurium (FARR & KOGOMA, 1991). Análises de “footprinting” identificaram que
a proteína OxyR se liga a uma seqüência específica, próxima ao sítio -35 dos
64
promotores bacterianos e interage com a RNA polimerase para ativar a transcrição
dos genes ahpCF (TARTAGLIA et al., 1989). Em Xf 9a5c, o gene oxyR encontra-se
contíguo ao operon ahpCF, mas o aumento na expressão de AhpCF, verificado com
os experimentos de tratamento com Paraquat não parece estar relacionado a um
aumento na expressão de oxyR. Da mesma forma, os experimentos descritos neste
trabalho, mostram que a ativação de expressão de oxyR, ocorrida nas células
cultivadas em 3G10-R, não leva a aumento na expressão de ahp ou de nenhum
outro gene tradicionalmente pertencente ao regulon oxyR (STORZ & ALTUVIA,
1994). Todos em conjunto, estes dados sugerem que o gene oxyR pode não estar
diretamente envolvido na resposta a estresse oxidativo em Xf 9a5c.
Finalmente, durante este trabalho, houve o desenvolvimento de um novo meio
de cultura para Xf 9a5c, denominado CCON. Este meio possui características
comuns a outros meios utilizados para cultivo de X. fastidiosa, como a presença de
um sistema tamponante K
2
HPO
4 :
KH
2
PO
4
, e de um único sal inorgânico (MgSO
4
), do
indicador de pH vermelho de fenol e do aminoácido L - glutamina. A definição de
fonte de ferro no meio CCON diferencia de outros meios de cultura por apresentar
duas fontes distintas: orgânica (Hemina Clorada) e inorgânica (Pirofosfato Férrico).
Peptona de soja e triptona (fontes de polipeptídeos), presentes em CCON, também
são encontradas na composição de outros meios de cultura para X. fastidiosa, tais
como: PW ( DAVIS et al., 1981) , SPW (HARTUNG et al., 1994), PD2 (DAVIS et al.,
1981), PD3 (DAVIS et al., 1981), CS20 (CHANG & WALTER, 1988), CVC1 (CHANG
et al., 1993), CVC2. (CHANG et al., 1993). O antioxidante BSA (FUKUZAWA et al.,
2005), presente nos mais utilizados meios de cultura complexos, não participa da
composição do meio CCON e assim como no meio 3G10-R a presença de glutationa
reduzida funciona como antioxidante (LEITE et al., 2004) neste meio. A presença da
vitamina biotina em CCON pode também ser observada em outros meios tais como:
CHARD2, 3G10-R (LEITE et al., 2004) e meios da série XDM.(LEMOS et al., 2003).
Glicose, sacarose ou amido são componentes de alguns dos meios de cultura de X.
fastidiosa (PD3, CS20, SPW, 3G10-R e série XDM). A glicose foi incluída em todos
os meios da série XDM e não foi observado crescimento da bactéria sem glicose
nestes meios (LEMOS et al., 2003). O mesmo aconteceu em culturas de Xf 9a5c em
CCON, onde a presença de glicose assumiu destaque por ser responsável pela
elevada taxa de crescimento desta bactéria.
65
O meio CCON possui a vantagem de ser mais econômico comparado ao meio
PW (dados não mostrados), apresentar a formação de biofilme e de agregados
celulares mais visíveis que em cultivo de X. fastidiosa em outros meios de cultura.
Uma outra grande vantagem está associada aos resultados obtidos com o cultivo de
Xf 9a5c no meio CCON, que mostraram claramente uma taxa de multiplicação
bacteriana muito mais alta do que aquelas observadas em outros meios de cultura,
podendo ser comumente usado para a manutenção desta bactéria in vitro.
66
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74
APÊNDICE A - Identificação e grupo funcional das 114 ORFs que apresentaram
modulação positiva significativa em resposta ao crescimento de células cultivadas
em 3G10-R, um meio quimicamente definido, em relação ao crescimento em PW.
75
Tabela 3: Identificação e grupo funcional das 114 ORFs que apresentaram modulação positiva
significativa em resposta ao crescimento de células cultivadas em 3G10-R, um meio quimicamente
definido, em relação ao crescimento em PW.
Functional Group
ORF
number
Gene Name
Gene product
Log
2
(ratio)
I. Intermediary Metabolism
1.A.. Degradation of small
molecules
XF2210
None- dioxygenase 1,14
1.B. amino sugars
XF2355 exoII N-acetyl-beta-glucosaminidase
1,57
1.C. Sugar-nucleotide
biosynthesis XF0260 xanA
Phosphoglucomutase/
Phosphomanomutase
1,21
1.D. Energy
metabolism,carbon
XF0347
dId1
D-lactate dehydrogenase
1,35
1.E. Regulatory Functions
XF1182 act
lipase modulator
1,22
XF1354 yybA
transcriptional regulator (MarR
family)
1,95
XF2336 colR
two-component system, regulatory
protein
1,50
XF1752 None
transcriptional regulator (LysR
family)
1,91
XF1132 act
transcriptional regulator (LysR
family
1,02
XF1733 af0343
tryptophan repressor binding
protein
1,10
II. Biosynthesis of Small Molecules
II.A. Aspartate
family,pyruvate family
XF2396
aspC OR
rv0337C OR
mtcY279.04C
aminotransferase
1,38
XF2272 metE
5-
methyltetrahydropteroyltriglutamate-
-homocysteine methyltransferase
1,54
XF1121
metF OR
AQ_1429
5,10-methylenetetrahydrofolate
reductase
1,20
XF2223
thrC
threonine synthase
1,32
II.B. Aromatic amino acid
family XF1334
aroB OR
HI0208
3-dehydroquinate synthase
0,75
XF2325 aroQ/pheA
P-protein
0,85
II.C. Nucleotides
Biosynthesis
XF1503
gmk or spoR
guanylate kinase
1,08
XF2150 apaH diadenosine tetraphosphatase
1,35
XF 1196
nrdA or
tp1008
ribonucleoside-diphosphate
reductase
1,25
II.D. Cofactors,Prosthetic
groups Carriers
Biosynthesis. XF2477 bioD
dethiobiotin synthetase
0,94
XF1916
af1671
coenzyme F390 synthetase
1,36
(continua na próxima página)
76
Tabela 3 (continuação)
Functional Group
ORF
number
Gene Name
Gene product
Log
2
(ratio)
II.E. Fatty acid and
phosphatidic acid
Biosynthesis XF0572 fabA
beta-hydroxydecanoyl-ACP
dehydratase
0,87
XF0771
acpC
acyl carrier protein
0,94
IIII. Macromolecule Metabolism
III.A. DNA Metabolism
XF0423 recB or rorA exodeoxyribonuclease V beta chain
1,30
XF1644 ssb
single-stranded DNA binding
protein
1,01
III.B. RNA Metabolism
XF2615 rnaSA3
ribonuclease
1,06
III.C. Protein Metabolism
XF0453
hflC or
hI0150 integral membrane proteinase
1,21
XF1018 ate1 arginine-tRNA-protein transferase
1,01
IV. Cell Structure
IV.A.. Surface
polysaccharides,
lipopolysaccharides, and
antigens XF1419
lpxD or firA or
omsA
acetyltransferase
1,02
XF0105
kdtA or
waaA
-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid
transferase
1,25
IV.B. Surface structures.
XF1224
pilY1
PilY1 gene product
0,74
V. Cellular Processes
V.A.Transport
XF 1903 Kup or trkD potassium uptake protein
1,21
XF0599 ybiL
TonB-dependent receptor for iron
transport
1,47
XF1409
hl1140
ABC transporter ATP-binding
protein
0,92
VI. Mobile Genetic Elements
VI.A.. Phage-related
functions and prophages
XF1706 gp37
phage-related tail fiber protein
1,41
XF1786 none
phage-related protein
1,35
XF2523 none phage-related protein
1,11
XF2492 gpv phage-related protein
1,44
XF2522 none phage-related protein
1,43
VI.B. Transposon- and
intron-related functions
XF1775
IS629
reverse transcriptase
0,93
VII. Pathogenicity,Virulence , and Adaptation
VII.A.Toxin production and
detoxification
XF0263 cvaC
colicin V precursor
2,02
XF0262 cvaC
colicin V precursor
5,88
(continua na próxima página)
77
Tabela 3 (continuação)
Functional Group
ORF
number
Gene Name
Gene product
Log
2
(ratio)
XF2135 frnE
polyketide synthase (PKS)
1,93
XF2094 acrF or envD
multidrug-efflux transporter
0,77
XF1890 gpo
glutathione peroxidase-like protein
0,87
XF1532 oxyR
oxidative stress transcriptional
regulator
1,06
VII.B. Host cell wall
degradation
XF2466
pglA polygalacturonase precursor
0,75
VII.C. Outros
XF2121
vapE
virulence-associated protein E
1,38
VIIII. ORFs with undefined
category XF0088 None -HFLX
GTP-binding protein
1,65
XF1723 yrpG
sugar-phosphate dehydrogenase
1,37
IX. Hypothetical
IX.A. Conserved
Hypothetical Protein XF1611 yimS conserved hypothetical protein
1,11
XF0407 yccW conserved hypothetical protein 0,96
XF0842 scm1L.14c conserved hypothetical protein 0,90
XF2179 ybeN conserved hypothetical protein 1,27
XF2270 yeaD conserved hypothetical protein 1,01
XF1754 Orf1 conserved hypothetical protein 1,52
XF0903 HL0004 conserved hypothetical protein 1,12
XF2273 MI0002 conserved hypothetical protein 0,69
XF0066 ylbK conserved hypothetical protein 1,06
XF2170 ybhB conserved hypothetical protein 0,83
XF0139 yjgP conserved hypothetical protein 1,33
XF0497 rv2514c conserved hypothetical protein 0,93
XF2647 conserved hypothetical protein 1,29
XF2493 conserved hypothetical protein 1,25
XF0241 ytfG conserved hypothetical protein 1,00
XF2088 conserved hypothetical protein 1,36
IX.B. Hypothetical Protein
XF1100
hypothetical protein
1,28
XF2271 hypothetical protein 1,43
XF2270 hypothetical protein 1,01
XF0898 hypothetical protein 0,95
XF0019 hypothetical protein 0,86
XF1513 hypothetical protein 1,11
XF0397 hypothetical protein 0,83
XF0985 hypothetical protein 1,00
XF0492 hypothetical protein 1,12
XF0279 hypothetical protein 1,83
XF0480 hypothetical protein 0,88
(continua na próxima página)
78
Tabela 3 (continuação)
Functional Group
ORF
number
Gene Name
Gene product
Log
2
(ratio)
XF1868 hypothetical protein 1,22
XF2115 hypothetical protein 1,21
XF0529 hypothetical protein 0,90
XF2021 hypothetical protein 1,10
XF1028 hypothetical protein 1,15
XF2769 hypothetical protein 1,23
XF2391 hypothetical protein 1,30
XF0475 hypothetical protein 0,66
XF0493 hypothetical protein 1,05
XF0098 hypothetical protein 0,93
XF2738 hypothetical protein 1,68
XF0327 hypothetical protein 1,00
XF0877 hypothetical protein 1,49
XF1700 hypothetical protein 1,28
XF0242 hypothetical protein 1,47
XF1239 hypothetical protein 0,97
XF1719 hypothetical protein 1,12
XF1647 hypothetical protein 0,76
XF1559 hypothetical protein 0,83
XF1753 hypothetical protein 1,49
XF1788 hypothetical protein 1,14
XF0035 hypothetical protein 1,18
XF2413 hypothetical protein 1,13
XF2711 hypothetical protein 1,24
XF1279 hypothetical protein 1,29
XF1704 hypothetical protein 1,13
XF0689 hypothetical protein 1,11
XF1655 hypothetical protein 0,95
XF0687 hypothetical protein 1,15
XF1917 hypothetical protein 2,11
XF2514 hypothetical protein 1,79
XF0491 hypothetical protein 1,44
XF0265 hypothetical protein 4,10
XF1060 hypothetical protein 1,97
XF0871 hypothetical protein 1,88
XF2122 hypothetical protein 1,38
XF0264 hypothetical protein 4,06
Dados baseados em Xylella database (http://aeg.lbi.ic.unicamp.br/xf.).
79
APÊNDICE B - Identificação e grupo funcional das 174 ORFs que apresentaram
modulação negativa significativa em resposta ao crescimento de células cultivadas
em 3G10-R, em relação ao crescimento em PW.
80
Tabela 4: Identificação e grupo funcional das 174 ORFs que apresentaram modulação negativa
significativa em resposta ao crescimento de células cultivadas em 3G10-R, em relação ao
crescimento em PW.
Functional Group
ORF number
Gene
name
Gene product
Log
2
(ratio)
I. Intermediary Metabolism
1.A.. Degradation
of small molecules XF2432 gtaB UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase
-1,26
XF0610 galE UDP-glucose 4-epimerase
-1,53
XF1250 rocF arginine deaminase
-2,07
XF0781 estA lipase/esterase
-0,61
XF2259 none polyvinylalcohol dehydrogenase
-0,74
1.B.
Pool,multipurpose
conversions
XF0880 yadF carbonic anhydrase
-1,43
XF2255 acs acetyl coenzyme A synthetase
-1,64
1.C. sugar-
nucleotide
biosynthesis,
conversions XF1468 mrsA phosphomannomutase
-0,58
1.D. Energy
metabolism,
carbon - Aerobic
respiration
XF0306
nuoB
NADH-ubiquinone oxidoreductase, NQO6
subunit
-0,97
XF0311 nuoG
NADH-ubiquinone oxidoreductase, NQO3
subunit
-1,25
XF0310 nuoF
NADH-ubiquinone oxidoreductase, NQO1
subunit
-1,07
XF0317 nuoM
NADH-ubiquinone oxidoreductase, NQO13
subunit
-1,16
1.E. Energy
metabolism,
carbon - Electron
transport
XF1990
yneN
thioredoxin
-1,22
XF0620 dsbD
c-type cytochrome biogenesis protein (copper
tolerance)
-0,91
1.F. Energy
metabolism,
carbon - Glycolysis XF0303
tpiA OR
tpi Triosephosphate isomerase -0,93
XF1291
eno
enolase
-1,10
1.G. Energy
metabolism,
carbon - TCA
cycle
XF2548
sucD
succinyl-CoA synthetase, alpha subun
-1,89
XF1554 fumC fumarate hydratase
-1,37
1.H. Regulatory
functions XF1254 araL transcriptional regulator (AraC family)
-1,16
XF2534 colR two-component system, regulatory protein
-1,10
(continua na próxima página)
81
Tabela 4 (continuação)
Functional Group
ORF
number
Gene
name
Gene product
Log
2
(ratio)
II. Biosynthesis of Small Molecules
II.A. Amino acids
biosynthesis -
Glutamate
family|nitrogen
assimilation XF1427
argM OR
astC OR
cstC succinylornithine aminotransferase -0,82
II.B. Nucleotides
biosynthesis -
Pyrimidine
ribonucleotides
XF1106
carA
carbamoyl-phosphate synthase small chain -1,18
XF2439
cmkA OR
HI1219
cytidylate kinase -0,71
XF1107
carB OR
pyrA carbamoyl-phosphate synthase large chain -1,12
II.C. Nucleotides
biosyn
thesis-2'-
Deoxyibonucleo
tides
XF0580
ph1695
thymidylate kinase
-1,01
XF1441 orfU1 phosphohydratase -1,62
II.D. Cofactors,
prosthetic groups,
carriers
biosynthesis
XF0229
panB
3-methyl-2-oxobutanoate
hydroxymethyltransferase
-1,70
XF0783 thiG thiamine biosynthesis protein -0,97
XF1487
ubiE
ubiquinone/menaquinone transferase
-1,76
II.E. Fatty acid and
phosphatidic acid
biosynthesis
XF2269
drb0080
3-alpha-hydroxysteroid dehydrogenase
-1,10
IIII. Macromolecule Metabolism
III.A. DNA
metabolism -
Replication
XF0005 gyrB DNA gyrase subunit B -1,03
XF0001 dnaA chromosomal replication initiator
-0,91
XF0002 dnaN DNA polymerase III, beta chain -0,90
XF1383
hrpA
helicase, ATP dependent
-0,82
III.B. DNA
metabolism -
Recombination
XF0425
recD
Exodeoxyribonuclease V alpha chain
-1,24
III.C. DNA
metabolism -
Repair
XF1902
ruvB OR
hl0312
holliday junction binding protein, DNA
helicase
-1,29
XF2692
ung
uracil-DNA glycosylase
-1,25
(continua na próxima página)
82
Tabela 4 (continuação)
Functional Group
ORF
number
Gene
name
Gene product
Log
2
(ratio)
III.D. DNA
metabolism -
Restriction,
modification
XF1774
hpaIIM
DNA methyltrarase
-0,84
XF0935 llaIIA methyltransferase -0,84
III.E. RNA
metabolism -
Ribosomal
proteins
XF0434
rpsU
30S ribosomal protein S21
-1,05
XF1169
rpsE OR
spc 30S ribosomal protein S5 -1,20
XF1164
rplE OR
rpl5 OR
HI0790
50S ribosomal protein -0,98
III.F. RNA
metabolism -
Ribosomes -
maturation and
modification
XF0939
rluD OR
sfhB
ribosomal large subunit pseudouridine sy
-1,17
III.G. RNA
metabolism -
Aminoacyl tRNA
synthetases, tRNA
modification
XF0428
tm0492
tryptophanyl-tRNA synthetase
-2,11
XF0445
proS OR
drpA
prolyl-tRNA synthetase -1,17
XF1314 queA
S-adenosylmethionine: tRNA
ribosyltransferase
-isomerase -1,10
XF0736
thrS
threonyl-tRNA synthetase
-1,15
XF0134
valS OR
hl1391
valyl-tRNA synthetase
-0,88
III.H. RNA
metabolism - RNA
synthesis,
modification, DNA
transcription
XF1108
greA
transcriptional elongation factor
-1,80
XF0227 pcnB polynucleotide adenyltransferase
-1,41
XF2606 rluc pseudouridylate synthase
-1,12
III.I RNA
metabolism - RNA
degradation
XF1257
orn
oligoribonuclease
-0,92
XF1041 rnhB ribonuclease HII
-1,14
XF1505
rph
ribonuclease PH
-0,68
(continua na próxima página)
83
Tabela 4 (continuação)
Functional Group
ORF
number
Gene
name
Gene product
Log
2
(ratio)
III.J. Protein
metabolism -
Translation and
modification.
XF0644
mip
peptidyl-prolyl cis-trans isomerase
-1,16
XF1051
frr OR
h0808 ribosome recycling factor -0,77
XF2629
fusA
elongation factor G
-1,00
XF2244
lepB
signal peptidase
-0,74
XF1605
TP0862
peptidyl-prolyl cis-trans isomerase
-0,88
III.L. Protein
metabolism -
Protein
degradation
XF0220
pepQ
proline dipeptidase
-1,22
XF2241
mucD
periplasmic protease
-0,90
XF0816
SC9B10.
04
zinc protease
-0,75
XF1479
ptrB OR
tlp
peptidase
-0,92
IV. Cell Structure
IV.A. Surface
structures
XF2544
pilB
pilus biogenesis protein
-0,83
XF2539
none
fimbrial protein
-1,12
IV.B. Membrane
components -
Outer membrane
constituents
XF1024
none
outer membrane protein
H.8 precursor
-1,30
IV.C. Murein
sacculus,
peptidoglycan.
XF0276
mpl
UDP-N-acetylmuramate
-L-alanine ligase
-0,85
XF0416
vacJ
lipoprotein precursor
-0,90
XF0799
ddlB OR
ddl
D-alanine--D-alanine ligase B
-1,84
IV.D. Surface
polysaccharides,
lipopolysaccharide
s, and antigens
XF0803
lpxC
UDP-3-O-[3-hydroxymyristoyl] N-
acetylglucosamine deacetylase
-0,77
XF2154 opsX saccharide biosynthesis regulatory protein -1,30
XF1638
none
dolichyl-phosphate mannose synthase
related protein
-1,25
(continua na próxima página)
84
Tabela 4 (continuação)
Functional Group
ORF
number
Gene
name
Gene product
Log
2
(ratio)
XF1415
murA OR
murZ
UDP-N-acetylglucosamine- 1-
carboxyvinyltransferase -0,70
XF0879
rfbU
lipopolysaccharide biosynthesis protein
-0,87
XF1646
lpxD/firA
UDP-3-0-(R-3-hydroxymyristoyl)-glucosamine
N-acyltransferase.
-0,90
V. Cellular Processes
V.A. Transport -
Amino acids,
amines
XF1937
gltP
proton glutamate symport protein
-1,04
XF2730
rhtC
amino acid transporter
-1,09
V.B. Transport -
Anions
XF1344
sbp
ABC transporter sulfate binding protein
-0,70
V.C. Transport -
Carbohydrates,
organic acids,
alcohols
XF0976
dctA
C4-dicarboxylate transport protein
-1,36
V.D. Transport -
Cations
XF0395
bfr
bacterioferritin
-1,40
V.E. Transport -
Protein, peptide
secretion
XF2261
hi0561/5
60
oligopeptide transporter
-1,42
XF2685
sppA
protease IV
-0,98
V.F Transport -
Other
XF1604
btuE
ABC transporter vitamin B12 uptake
permease
-1,76
XF2301
mrp OR
hl1277
Polysaccharide export protein
-0,81
XF2251
ppa
solute:Na+ symporter
-0,76
V.G. Cell division
XF2281
dr0012
Chromosome partitioning protein
-1,14
VI. Mobile Genetic Elements
VI.A. Phage-
related functions
and prophages
XF0513
lycV
phage-related endolysin
-1,15
VI.B. Transposon-
and intron-related
functions.
XF0535
none
transposase OrfA
-0,80
Plasmid-related
functions
XFa 0008
traC/vir
B5
conjugal transfer protein
-1,87
XFa 0040
trbl
conjugal transfer protein
-1,20
VII. Pathogenicity,Virulence, and Adaptation
VII.A. Toxin
production and
detoxification
XF2384
mtrC
membrane fusion protein precursor
-0,83
(continua na próxima página)
85
Tabela 4 (continuação)
Functional Group
ORF
number
Gene
name
Gene product
Log
2
(ratio)
XF1827 ohr organic hydroperoxide resistance protein- -1,55
XF1011
frpC
hemolysin-type calcium binding protein
-1,54
XF1897
tolB
TolB protein precursor
-1,47
VII.B. Host cell
wall degradation
XF0818
engXCA
endo-1,4-beta-glucanase
-0,87
VII.C. Adaptation,
atypical conditions
XF2682
mdoG
periplasmic glucan biosynthesis protein
-0,81
XF2622 tapB
temperature
acclimation protein B -1,36
VII.D.
Exopolysaccaride
XF2360
gumM
GumM protein
-1,30
VII. Other
XF1114
rpfC
regulator of pathogenicity factors -0,92
XF1987
vacB
VacB protein
-1,53
VIII. Hypothetical
VIII.A. Conserved
Hypothetical
Protein
XF0339
btuB OR
bfe OR
cer
conserved hypothetical protein -1,30
XF0196 none conserved hypothetical protein -2,15
XF0363 yiaD conserved hypothetical protein -1,94
XF2450
XF-
02A11-
GL34
conserved hypothetical protein -1,31
XF0553 Hl1655 conserved hypothetical protein -1,34
XF2153 Hl0260.1 conserved hypothetical protein -1,33
XF1829 rp471 conserved hypothetical protein -1,01
XF1405 yhbJ conserved hypothetical protein -0,92
XF2010 none conserved hypothetical protein -1,10
XF1054 TM1087 conserved hypothetical protein -0,95
XF2088 none conserved hypothetical protein -0,99
XF1272
RV1827
or
mtcY1A1
1.16C conserved hypothetical protein -1,18
XF2651
ycbY
conserved hypothetical protein
-1,30
XF0552 yraL conserved hypothetical protein -1,15
XF0554 yraN conserved hypothetical protein -0,94
XF2575 DR0386 conserved hypothetical protein -0,96
XF0758 yjeE conserved hypothetical protein -1,05
XF1808 ybaB conserved hypothetical protein -1,16
XF 2474 yjeK conserved hypothetical protein -0,79
XF0941 yuxK conserved hypothetical protein -0,83
XFa0045
conserved hypothetical protein
-2,45
(continua na próxima página)
86
Tabela 4 (continuação)
Functional Group
ORF
number
Gene
name
Gene product
Log
2
(ratio)
VIII.B.
Hypothetical
Protein
XF2193
hypothetical protein
-2,38
XF0726 hypothetical protein -0,89
XF2076 hypothetical protein -0,80
XF2701 hypothetical protein -1,75
XF2702 hypothetical protein -1,73
XF2194 hypothetical protein -2,38
XF2264 hypothetical protein -1,86
XF2265 hypothetical protein -1,86
XF2254 hypothetical protein -3,22
XF0914 hypothetical protein -1,49
XF2240 hypothetical protein -0,83
XF0074 hypothetical protein -1,21
XF1034 hypothetical protein -1,47
XF1035 hypothetical protein -1,47
XF2543 hypothetical protein -1,13
XF2454 hypothetical protein -1,08
XF2449 hypothetical protein -1,17
XF1803 hypothetical protein -1,84
XF1989 hypothetical protein -1,01
XF2103 hypothetical protein -1,13
XF0444 hypothetical protein -1,31
XF0512 hypothetical protein -0,96
XF1036 hypothetical protein -1,12
XF1128 hypothetical protein -1,28
XF1129 hypothetical protein -1,28
XF2410 hypothetical protein -1,35
XF0388 hypothetical protein -0,92
XF0870 hypothetical protein
-0,83
XF2017 hypothetical protein -1,36
XF1770 hypothetical protein -0,86
XF2192 hypothetical protein -0,76
XF1986 hypothetical protein -1,26
XF1287 hypothetical protein -1,39
XF2305 hypothetical protein -0,80
XF0921
hypothetical protein -0,88
XF0735 hypothetical protein -0,85
XF0364 hypothetical protein -0,91
XF0531 hypothetical protein -1,32
XF0540 hypothetical protein -1,42
XF2111 hypothetical protein -0,67
XF1364 hypothetical protein -0,90
XF0025 hypothetical protein -1,12
XF0293 hypothetical protein -1,38
XF1204 hypothetical protein -0,80
XF2079 hypothetical protein -0,95
(continua na próxima página)
87
Tabela 4 (continuação)
Functional Group
ORF
number
Gene
name
Gene product
Log
2
(ratio)
XF1434 hypothetical protein -1,37
XF1835
hypothetical protein
-0,80
XF2730
hypothetical protein
-1,09
XF1769
hypothetical protein
-0,74
XFa0004
hypothetical protein
-2,02
XFa0026
hypothetical protein
-1,14
XFa0017
hypothetical protein
-1,99
Xfa0031
hypothetical protein
-1,47
Dados baseados em Xylella database (http://aeg.lbi.ic.unicamp.br/xf.).
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