ads:
NORMA APARECIDA DOS SANTOS ALMEIDA
“ESTUDO DA EXPRESSÃO ATRIAL DAS
CONEXINAS 40 E 43 E ALTERAÇÕES DE
CONDUÇÃO ELÉTRICA EM CAMUNDONGOS COM
EXPRESSÃO EXCLUSIVA NO MIOCÁRDIO DE UM
RECEPTOR PARA HORMÔNIO TIREOIDEANO
DOMINANTE NEGATIVO”
TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE
JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE
DOUTOR EM CIÊNCIAS
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
2 0 0 6
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
ii
ALMEIDA, Norma Aparecida dos Santos
“Estudo da expressão atrial das conexinas 40 e 43 e alterações de condução elétrica
em camundongos com expressão exclusiva no miocárdio de um receptor para
hormônio tireoideano dominante negativo”/ Norma Aparecida dos Santos Almeida-
Rio de Janeiro: UFRJ-IBCCF, 2006.
xvii, 72f: il.; 27,94 cm
Orientador: Carmen Cabanelas Pazos-Moura
Tese (Doutor em Ciências)- UFRJ/ IBCCF/ Programa de Pós-graduação em
Ciências Biológicas (Fisiologia)
Referências Bibliográficas: f. 62-72.
1. Hormônio Tireoideano 2. Hipotireoisdismo 3. Coração
4. Junção Comunicante 5. Conexina40 6. Animal Transgênico
7.Receptor para hormônio tireoideano
I. Pazos-Moura, CC II. Universidade Federal do Rio de Janeiro - Centro de Ciências
da Saúde - Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho - Programa de Biofísica Celular
e Sistemas.
III. Título
ads:
iii
Este trabalho foi realizado em colaboração nos Laboratórios de Endocrinologia
Molecular e de Cardiologia Celular e Molecular do Instituto de Biofísica Carlos Chagas
Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob orientação da Dr
a
Carmen
Cabanelas Pazos-Moura e co-orientação do Dr Antonio Carlos Campos de Carvalho
com o apoio financeiro das seguintes instituições:
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Fundação de Amparo a Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ).
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
iv
“ Há duas maneiras para viver sua vida:
Uma é acreditar que não existe milagre .
A outra é acreditar que todas as coisas são um milagre.”
Albert Einstein
v
Esta tese é dedicada a
Aos meus pais por natureza, opção e amor, Moacyr e Vera Lúcia Almeida, por
compartilharem os meus sonhos
meu irmão Joppert Almeida, pelo cuidado, dedicação e o amor incondicional
minha avó, Madalena dos Santos, pelo exemplo de garra, perseverança e dignidade
meu tio Gastão dos Santos, pela orientação, iniciativa e preocupação com minha
educação desde a infância.
vi
“Saber e não fazer ... Ainda é não saber”
À MINHA FAMÍLIA. AMO VOCÊS.
vii
AGRADECIMENTOS
À minha família, por sempre apoiarem e incentivarem todas as minhas decisões,
pela estabilidade emocional, carinho e compreensão. Sem vocês jamais teria chegado
até aqui.
À minha orientadora, Carmen Cabanelas Pazos-Moura, pelos ensinamentos,
pela confiança e o incentivo.
Ao meu orientador, Antonio Carlos Campos de Carvalho, pela oportunidade e
pelo aprendizado.
À Aline Cordeiro, minha boneca Emília: querida, esperta, falante, inteligente e
companheira. Ora irmã mais nova, ora mais velha. Obrigado por ter embarcado nessa
aventura!!!
Ao Thiago Ladeira, meu designer favorito, pela companhia, amizade, ajuda
imprescindível e o senso de humor peculiar.
As minhas eternas companheiras de bancada: Luciene Pascoal, Patrícia Costa
e Vania Linhares, por compartilharmos a descoberta da alquimia, a reinvenção da roda
e o aperfeiçoamento nem sempre bem sucedido dos protocolos. Vocês são demais !!!!
Ao Ramon Peçanha, pela ajuda na montagem dos eletrodos, pela simpatia e a
tranqüilidade de sempre.
Ao Ricardo Henrique, pela companhia, ajuda na elaboração dos experimentos
eletrocardiográficos, pelos momentos de reflexão sobre a ciência e tantos temas
filosóficos e fisiológicos, pelos nossos artigos e livros publicados nos lanches no fim da
tarde.
À Maria Conceição, nossa “Mary”, pelo carinho e cooperação. Por sempre
atender com um sorriso os pedidos de última hora e arrumar um espaço na autoclave
para aquela garrafinha de água. Saiba que seu trabalho foi fundamental para a realização
do meu.
Aos amigos Luis Eduardo e Círia Carolina, pela amizade e por estarem
sempre dispostos a colaborar e discutir as idéias.
Ao Mauro Costa e Sylvia Suadicany, pelo carinho e mesmo tão longe sempre
tão solícitos.
viii
Ao amigo Paulo Redner, “Santo Paulo da bancada”, por me salvar naqueles
momentos difícieis como sexta à noite e sábado à tarde com ½ microlitro de enzima ou
com o restinho de resina que eu precisava para o experimento.
À tia Daizy Avanzi, pela simpatia e amizade.
À professora Doris Rosenthal, pelas críticas construtivas e revisão da tese.
À Sandra Brito e Diogo Cordeiro, pela paciência e ajuda nos assuntos
burocráticos.
Aos meus tios Jorge e Marisa, pelo carinho, o cuidado, as palavras de conforto
e o chocolate quente para relaxar e recomeçar.
Ao professor Jairo Pinheiro, pelo exemplo de ética, equilíbrio e seriedade.
Obrigado pela ajuda, compreensão e carinho. É muito bom conhecer pessoas como você
que nos faz acreditar que a humanidade tem conserto.
Ao professor Alcides Marinho, meu “Mestre Yoda”, por ter sempre palavras de
conforto e me fazer acreditar que no fim tudo acaba bem.
À professora Adriana Rayol, pela amizade e as conversas animadas durante a
carona.
Aos professores do Departamento de Ciências Fisiológicas da UFRRJ, pelo
carinho com que me receberam e pelo agradável ambiente de trabalho.
Aos professores José Hamilton, Masako Masuda e Regina Goldenberg, por
tanto tempo de convivência, pelos ensinamentos e a amizade.
A professora Tânia Ortiga e a todas as meninas do Laboratório de
Endocrinologia Molecular: Adriana Cabanelas, Cristina Aragão, Danielle Gomes,
Débora Moraes, Diana Aragão, Gabriela Monteiro, Karen Oliveira, Letícia
Aragão e Luana Lopes, pelos momentos de descontração.
Ao Marco Aurélio, pela amizade e o carinho.
Aos meus amigos ex-cardíacos: Anna Beatriz Garcez, Bruno Andrade, Elen
Aguiar, Fabio Feitosa, Paulo Cabral, Rodrigo Fortunato, Thaís Moraes e Ulisses
Alves e aos cardíacos: Bruno Parede (NoBru), Débora Melo (Beba), Fabio Fortes,
Juliana Dias (Jujuba) e Vanessa Ribeiro, pelo carinho e os maravilhosos momentos
que vivemos dentro e fora do laboratório. Vocês são muito queridos por mim.
Aos amigos Diego Cabral e João Pedro Werneck, obrigado por simplesmente
tudo!!!
ix
As eternas DENILA (Danielle, Eliane, Isabella, Liane e Aleksandra) e Paula
Fonseca, pela companhia desde o primeiro período da graduação. Nossa amizade é
muito importante em minha vida.
À todos do Laboratório de Cardiologia Celular e Molecular e do Laboratório de
Eletrofisiologia Cardíaca Antonio Paes de Carvalho.
À todos que torcem pela realização dos meus sonhos.
x
RESUMO
O hormônio tireoideano (HT) regula muitos genes cardíacos através de seus
receptores (TR). Camundongos transgênicos que superexpressam um TRβ mutante
(Δ337T) exclusivamente no coração (KS) exibem um fenótipo de hipotireoidismo
cardíaco em presença de concentrações séricas normais de HT e apresentam
prolongamento dos intervalos eletrocardiográficos. A propagação da atividade elétrica
no miocárdio depende a transferência de corrente através das junções comunicantes
sendo as conexinas (Cx) 40 e 43 as principais proteínas juncionais no coração. Nós
usamos os camundongos KS para avaliar a ação direta do HT mediada pelo TR sobre a
expressão cardíaca do mRNA das Cx40 e 43 e correcioná-las aos estudos
eletrocardiográficos. Camundongos KS foram comparados aos animais selvagens em
situações de hipo- e eutireoidismo por análise eletrocardiográfica em animais
conscientes e a expressão das Cx40 e 43 foi analisada por RT-PCR. Nossos resultados
demonstraram que os animais KS apresentam freqüência cardíaca menor que os animais
selvagens. Camundongos KS e selvagens hipotireoideos apresentaram prolongamento
dos intervalos eletrocardiográficos e a duração da onda P aumentou. Os ensaios de RT-
PCR mostraram que não houve alteração da expressão do mRNA da Cx43 no ventrículo
e átrio dos animais KS, no entanto a expressão atrial do mRNA da Cx40 diminuiu 80%
nos animais KS e 25% nos animais selvagens hipotireoideos. Não houve diferença nos
intervalos eletrocardiográficos e na expressão atrial do mRNA da Cx40 entre os animais
KS e KS-hipo. Portanto, a diminuição da velocidade de condução elétrica nas células
atriais nos camundongos KS e selvagens hipotireoideos pode ser atribuída, pelo menos
em parte, à redução da expressão atrial da Cx40. É a primeira vez que se evidencia que
o HT regula de forma positiva a expressão atrial do mRNA da Cx40.
xi
ABSTRACT
Thyroid hormones (TH) regulate many cardiac genes via the thyroid hormone
receptor (TR). Transgenic mice overexpressing the dominant negative mutant TRβ
(Δ337T) exclusively in the heart (KS) exhibited a cardiac hypothyroidism phenotype in
the presence of normal sera concentrations of TH and exhibited prolonged
electrocardiogram (ECG) intervals. The propagation of electrical activity in the
myocardium depends on the transfer of current through gap junctions. Connexins (Cx)
40 and 43 represent the main junctional proteins in the heart. KS mice were used to
evaluate the direct action of TH through TR on cardiac Cx40 and Cx43 mRNA levels
and to correlate this with the ECG studies. ECG recordings were obtained from
conscious KS mice and compared to wt littermates under hypo- and normal thyroid
status. Cx40 and 43 expressions were assessed by RT-PCR. We observed a lower heart
rate for the KS animals when compared to wt littermates. In this regard, KS and
hypothyroid wt littermates showed prolonged ECG intervals and a longer P wave. RT-
PCR assays showed no change in the Cx43 mRNA level in atrium or ventricle of KS
animals. However, the atrium Cx40 mRNA level decreased by 80% and 25% in the KS
and hypothyroid wt littermates respectively. No difference was observed in ECG
intervals or Cx40 mRNA levels between euthyroid and hypothyroid KS animals.
Therefore, the slow velocity of electrical conduction in atrium myocardial cells in KS
and wt-hypo mice can be attributed, at least in part, to the reduced expression of atrium
Cx40. This is the first reported evidence that TH up-regulates atrium Cx40 mRNA.
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
cDNA- ácido desoxirribonucléico complementar
Cx- conexina
DEPC- dietil pirocarbonato
DNA- ácido desoxiribonucleico
dNTP- desoxiribonucleotídeo trifosfato
EDTA- ácido etileno diamino tetraácido
ECG- eletrocardiograma
GAPDH- gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase
HT- hormônio tireoideano
i.p.- intra-peritonial
Kb- quilobase
kD- quilodalton
LDL- lipoproteína de baixa densidade
MHC- cadeia pesada da miosina
mRNA- ácido ribonucleico mensageiro
mV- milivolts
pb- pares de base
PBS- tampão salina-fosfato
PTU- 5-propil-3-tiouracil
RNA- ácido ribonucleico
RT-PCR- transcrição reversa seguida de reação em cadeia de polimerase
rT
3
- 3, 3´, 5´-triiodotironina
SDS- dodecil sulfato sódio
T
3
- 3,5,3´-triiodotironina
T
4
- 3,5,3´,5´-tetraiodotironina
TAE- tampão Tris-acetato/ EDTA
TR - receptor para hormônio tireoideano
TRH- hormônio liberador de tireotrofina
xiii
TSH- hormônio estimulador da tireóide
v/v- volume/volume
xiv
ÍNDICE
Página
I- Introdução ...................................................................................................................01
I.1- Regulação da função tireoideana .......................................................................01
I.2- Metabolismo desiodativo...................................................................................03
I.3- Mecanismo de ação dos hormônios tireoideanos ..............................................05
I.4- Efeitos desencadeados pelos hormônios tireoideanos .......................................09
I.5- O hormônio tireoideano e o sistema cardiovascular..........................................11
I.6- Junções Comunicantes.......................................................................................19
II- Objetivo....................................................................................................................28
III-Metodologia ..............................................................................................................29
III.1- Genotipagem.................................................................................................29
III.1a-Extração de DNA.............................................................................29
III.1b- Southern blot..............................................................................................30
III.2- Desenho experimental.....................................................................................32
III.3- Avaliação eletrocardiográfica .........................................................................32
III.4- Obtenção de animais hipotireoideos ..............................................................35
III.5- Extração do RNA total dos tecidos cardíacos .................................................35
III.5a- RT-PCR semi-quantitativo.........................................................................36
III.6- Dosagem hormonal por radioimunoensaio .....................................................38
III.7- Análise estatística............................................................................................39
IV- Resultados...............................................................................................................40
IV.1- Avaliação eletrocardiográfica de camundongos selvagens e KS
conscientes eutireoideos ...........................................................................................40
IV.2- Avaliação eletrocardiográfica de camundongos selvagens e KS
conscientes
hipotireoideos ...........................................................................................................43
IV.3- Dosagem da concentração sérica de TSH.......................................................47
IV.4- Avaliação do mRNA das Conexinas 40 e 43 no coração de
camundongos KS......................................................................................................47
xv
IV.5- Avaliação do RNAm das Conexinas40 e 43 no átrio de camundongos
selvagens e KS hipotireoideos..................................................................................48
V- Discussão..................................................................................................................55
VI- Conclusão................................................................................................................61
VII- Referências Bibliográficas...................................................................................62
xvi
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1: Modelo topológico das conexinas .................................................................21
Figura 2: Desenho esquemático dos possíveis arranjos dos conexons para formar
os canais juncionais ........................................................................................................22
Figura 3: Localização das conexinas em diferentes regiões do coração de
camundongo ...................................................................................................................27
Figura 4: Radiografia de um experimento de Southern blot.........................................31
Figura 5: Esquema representativo do eletrocardiograma de um camundongo
eutireoideo ......................................................................................................................34
Figura 6: Eletrocardiograma representativo de camundongos conscientes ..................42
Figura 7: Eletrocardiograma representativo de camundongos selvagens
conscientes tratados com PTU........................................................................................45
Figura 8: Eletrocardiograma representativo de camundongos KS conscientes
tratados com PTU ...........................................................................................................46
Figura 9: Ensaio de RT-PCR em átrio de camundongo utilizando iniciadores para
a Cx40 e GAPDH ...........................................................................................................49
Figura 10:
Ensaio de RT-PCR em átrio de camundongo utilizando iniciadores
para a Cx43 e GAPDH ...................................................................................................50
Figura 11: Ensaio de RT-PCR em ventrículo de camundongo utilizando
iniciadores para a Cx43 e GAPDH.................................................................................51
Figura 12: Expressão do mRNA da Conexina40 em átrio de camundongos
selvagens e KS tratados ou não com PTU 0,15%...........................................................52
Figura 13:
Expressão do mRNA da Conexina43 em átrio de camundongos
selvagens e KS tratados ou não com PTU 0,15%...........................................................53
Figura 14: Expressão do mRNA da Conexina43 no ventrículo de camundongos
selvagens e KS eutireoideos ...........................................................................................54
xvii
ÍNDICE DE TABELAS
Página
Tabela 1: Condições da reação de RT-PCR para os iniciadores específicos............36
Tabela 2: Iniciadores utilizados na reação de RT-PCR.............................................37
Tabela 3: Parâmentros eletrocardiográficos de camundongos machos
selvagens e transgênicos conscientes e eutireoideos ..................................................41
Tabela 4: Parâmentros eletrocardiográficos de camundongos machos
selvagens e transgênicos conscientes, eutireoideos e tratados com PTU 0,15%
durante 4 semanas........................................................................................................44
1
I- INTRODUÇÃO
A glândula tireóide é responsável por sintetizar, armazenar e secretar os
hormônios tireoideanos (HT): tetraiodotironina ou tiroxina (T
4
) e triiodotironina (T
3
),
além de secretar T
3
reverso (rT
3
), que não possui atividade hormonal. Esses hormônios
modulam vários processos celulares tais como: a diferenciação, o desenvolvimento e o
crescimento, o metabolismo celular e a termogênese, e ainda regulam a secreção e o
metabolismo de outros hormônios (Yen, 2001).
I.1- REGULAÇÃO DA FUNÇÃO TIREOIDEANA
A síntese e secreção dos hormônios tireoideanos é regulada por um sistema de
retroalimentação negativa que envolve o hipotálamo, a adenohipófise e a tireóide. A
hipófise, através da secreção do hormônio estimulador da tireóide (TSH) ou tireotrofina,
controla a função tireoideana. A secreção de TSH é modulada de forma positiva pelo
hormônio liberador de tireotrofina (TRH), que por sua vez é secretado pelo hipotálamo.
A secreção de TSH e TRH é regulada de forma negativa pelo T
3
(Yen, 2001).
O papel fisiológico do TSH sobre a tireóide inclui o estímulo à diferenciação e
ao crescimento da glândula, e ainda impede que os tireócitos entrem em apoptose. O
TSH estimula todos os processos de biosíntese e secreção dos hormônios tireoideanos.
Estimula a captação e incorporação do iodeto na tireoglobulina, proteína que funciona
como substrato para a síntese hormonal, e estimula a atividade das enzimas envolvidas
no processo, como a tireoperoxidase e a NADPH oxidase (Grossmann et al., 1997).
2
Ainda atua nos processos de hidrólise da tireoglobulina iodada e liberação dos
hormônios tireoideanos para a circulação, assim como influencia o metabolismo de
proteínas, carboidratos, ácidos nucléicos e fosfolipídeos (Grossmann et al., 1997).
O TSH é um heterodímero constituído pelas subunidades, α e β. A subunidade α
é comum ao TSH e a outros hormônios glicoproteicos hipofisários, como o hormônio
luteinizante (LH) e o hormônio folículo estimulante (FSH). A subunidade β é específica
e confere a estes hormônios especificidade biológica. Após serem sintetizadas, as
subunidades são glicosiladas, unidas por ligação não covalente e armazenadas em
grânulos (Grossmann et al., 1997).
Os efeitos do TSH sobre a tireóide são mediados por um receptor específico
(TSH-R), situado na membrana dos tireócitos. Este receptor está acoplado à proteína
Gs, que ativa a via adenilato ciclase-AMPc e à Gq que ativa a via da fosfolipase C;
sendo a primeira via a responsável pela maioria dos efeitos do TSH (Nagayama &
Nagataki, 1994). A ativação da adenilato ciclase ocasiona aumento da concentração
intracelular de AMPc e a ativação da proteína cinase A (PKA), esta por sua vez fosforila
proteínas citoplasmáticas envolvidas no metabolismo celular e fatores transcricionais,
como CREB (proteína ligadora do elemento responsivo ao AMPc), que alteram a
expressão de genes envolvidos na função tireoideana (Nagayama & Nagataki, 1994).
O TRH é secretado por neurônios hipotalâmicos dos núcleos paraventriculares e,
através da circulação porta-hipofisário, atinge os tireotrofos, células da adenohipófise
responsáveis pela síntese e liberação de TSH (Yen, 2001). Após a interação com
receptores de alta afinidade (TRH-R), que estão acoplados a proteína Gq, ocorre
aumento dos níveis citoplasmáticos de cálcio e ativação da proteína cinase C (PKC)
(Ashworth & Hinkle, 1996). Esta cascata de sinalização estimula a fosforilação de
3
proteínas envolvidas na exocitose e o aumento da taxa de transcrição das subunidades α
e β do TSH (Shupnik et al., 1989).
O mecanismo de retroalimentação negativa que acarreta a inibição de TSH é
exercido pelo T
3
. Este mecanismo pode ocorrer de forma direta, através do bloqueio da
expressão gênica das subunidades α e β do TSH, ou indiretamente pelo bloqueio da
atividade transcricional do gene que codifica o pró-TRH. Entre os mecanismos não
relacionados ao bloqueio da expressão gênica do TSH ou TRH pelo HT, tem sido
observado o bloqueio da síntese de TSH-R nos tireócitos (Saiardi et al., 1994), a
diminuição da glicosilação das subunidades α e β do TSH, que diminuiria a atividade
do TSH, e o aumento da atividade de enzimas de degradação do TRH (Scanlon & Toft,
1996).
I.2- METABOLISMO DESIODATIVO
O T
4
é o hormônio majoritário liberado na circulação, ele
é encontrado numa
concentração de até 40 vezes a de T
3
(Yen, 2001). Uma pequena concentração de
hormônios tireoideanos permanece livre na circulação, o restante encontra-se ligado a
proteínas carreadoras como a TBG (globulina ligadora de tiroxina), transtiretina e
albumina. Uma vez na circulação, os hormônios livres são capazes de entrar na célula-
alvo e gerar uma resposta biológica (Yen, 2001).
O T
3
é considerado a forma biologicamente ativa, por ser responsável pela
maioria dos efeitos observados, ao passo que T
4
é tido como pré-hormônio tendo os
4
tecidos a capacidade de converter T
4
em T
3
, por enzimas denominadas 5´-desiodases
(Yen, 2001).
A observação de que sítios extra-tireoideanos eram capazes de dar origem a T
3
, a
partir de T
4
, levou os pesquisadores a identificarem as desiodases. Elas contribuem para
a manutenção das concentrações plasmáticas e teciduais de T
3
e, através de alterações
em suas atividades, podem levar a modificações nos efeitos dos hormônios tireoideanos,
sobretudo em tecidos onde este efeito seja predominantemente causado pela geração
local de T
3
. Dessa forma, a ação das desiodases é outro ponto de regulação da ação do
hormônio tireoideano (Koehrle, 1994).
A monodesiodação de T
4
consiste na retirada do átomo de iodo do anel externo
(C5’ ou C3’) ou do anel interno (C5 ou C3) – fenólico ou tirosílico. A desiodação do
anel fenólico ou 5’-desiodação é conhecida como uma via bioativadora, uma vez que é
esta via que origina T
3
, sendo a via 5-desiodação do anel tirosílico a via que origina T
3
reverso e T
2
(a partir de T
4
e T
3
, respectivamente) e, por isso, denominada via
bioinativadora (Leonard & Koehrle, 1996).
Existem três isoformas de desiodases: tipo 1 (D1), tipo 2 (D2) e tipo 3 (D3), e
todas possuem uma selenocisteína no centro ativo. D1 e D2 realizam 5’-desiodação e 5-
desiodação é realizada por D1 e D3. Elas também possuem padrão de expressão tecidual
e localização subcelular distintos (Leonard & Koehrle, 1996).
A enzima D1 é encontrada em vários órgãos, no entanto é no fígado e no rim que
ela apresenta maior atividade, sendo estimulada por T
3
no fígado e por TSH nas células
da tireóide. A D2 possui alta afinidade por T
4
, no entanto sua atividade é inibida por
hormônio tireoideano, e é encontrada no cérebro, coração, músculo esquelético,
hipófise, placenta, tecido adiposo marrom e tireóide (Larsen et al., 1998).
5
A atividade de D3 é observada principalmente no sistema nervoso central,
placenta e pele, seu substrato preferencial é T
3
seguido por T
4
, e sua atividade é
estimulada pelo aumento de hormônio tireoideano. Especula-se que a D3 desempenhe
um papel de proteção nos órgãos que a expressam contra os efeitos desencadeados por
T
3
, sobretudo em algumas fases de desenvolvimento (Larsen et al., 1998).
I.3- MECANISMO DE AÇÃO DOS HORMÔNIOS TIREOIDEANOS
Os principais efeitos dos hormônios tireoideanos ocorrem através da regulação
da transcrição gênica. Uma vez no interior das células, o T
3
é capaz de migrar para o
núcleo, onde se liga com alta afinidade a seu receptor, o TR (receptor de hormônio
tireoideano). Estes receptores são fatores transcricionais associados à cromatina, que se
ligam ao DNA em sítios específicos, denominados elementos responsivos ao hormônio
tireoideano (TRE). Essa regulação gênica pode ser positiva ou negativa (Wu & Koenig,
2000).
Os TRs são capazes de interagir com os TREs como monômeros ou
homodímeros, ou, ainda, como heterodímeros. Os heterodímeros mais comuns são
aqueles com os receptores nucleares para ácido retinóico, mas também ocorrem
heterodímeros de TR com os receptores nucleares para vitamina D e para o estrogênio
(Bigler & Eisenman, 1995). A modulação da expressão gênica pelos TRs envolve uma
complexa rede de interações coordenadas com outras proteínas co-reguladoras,
incluindo co-ativadores e co-repressores. Em geral, na ausência de T
3
, a ligação do TR
ao TRE positivo resulta na repressão da transcrição gênica, sendo mediada pela
6
interação do TR com um complexo protéico repressor. A ligação do hormônio
tireoideano ao TR induz mudanças na sua conformação que resultam na liberação do
complexo repressor e recrutamento de co-ativadores, levando à ativação transcricional.
Menos caracterizados são os TREs negativos nos quais a transcrição é estimulada pelo
TR não ligado ao HT e reprimida pela ligação TR-HT (Wu & Koenig, 2000).
Os co-ativadores possuem atividade histona acetiltransferase ou são capazes de
recrutar essas enzimas. A hiperacetilação das histonas está relacionada à ativação
gênica, por facilitar o acesso da maquinaria basal de transcrição ao promotor do gene-
alvo; dentre esses co-ativadores já foram descritos as proteínas CBP, p300 e p120 (Yen,
2001). Os co-repressores, de modo inverso, promovem a desacetilação das histonas,
impedindo o acesso à região promotora, sendo os mais estudados os fatores NcoR e
SMTR (Yen, 2001).
O TR é capaz de regular a transcrição gênica não apenas pelo remodelamento da
cromatina, que permite ou não o acesso da maquinaria de transcrição à região
promotora, mas também por ativar os fatores de transcrição gerais, TFIIE e TFIIF, que
interagem diretamente com a RNA polimerase II (Gu & Roeder, 1997; Buratowski et
al., 1991).
Os receptores tireoideanos são fatores de transcrição do tipo dedo de zinco.
Apresentam domínios de ligação ao DNA, ligação ao T
3
, assim como domínios de
dimerização e transativação (Wu & Koenig, 2000). Em mamíferos, 2 genes distintos
codificam as isoformas de TRα e β. Estes TRs apresentam seqüências bastante
conservadas nos domínios de ligação ao DNA, ligação ao T
3
, e possuem praticamente a
mesma afinidade ao T
3
; no entanto diferem completamente em suas seqüências na
região N-terminal (Wu & Koenig, 2000).
7
O gene do TRα codifica o TRα
1
e α
2
, este último é conseqüência de um splicing
alternativo
,
possuindo os primeiros 350 aminoácidos idênticos ao TRα
1
, porém
não
apresenta o sítio de ligação ao HT, nem a região de ligação a co-repressores, sendo por
isso incapaz de responder ao HT. Especula-se que o TRα
2
poderia atuar como inibidor
da ação do TRα
1
por competir com esse na ligação com o TRE (Lazar et al., 1990).
Além destes 2 receptores foram identificados 2 variantes de TRα: TRΔα1 e TRΔα2 que
são moléculas pequenas (154 e 237 aminoácidos, respectivamente), geradas a partir de
um promotor interno, localizado no íntron 7 do lócus. O papel funcional destes variantes
ainda é pouco conhecido, no entanto, já se sabe que eles não têm domínio de ligação ao
DNA (Gauthier et al., 2001).
O gene TRβ codifica os TRβ
1
, β
2
, β
3
e Δβ
3
. Estas isoformas são geradas a partir
de promotores distintos e splicing alternativos. Com exceção do Δβ
3
, que não apresenta
os domínios de ligação ao DNA e N-terminal, todos os outros são capazes de interagir
com T
3
(Williams, 2000).
A expressão das isoformas de TRs tem padrões distintos nos diversos tecidos. A
isoforma TRα
1
é expressa de forma ubíqua em todos os tecidos, assim como a isoforma
TRβ
1
. A isoforma TRβ
2
é expressa predominantemente na hipófise, no córtex cerebral,
na retina, no cerebelo e em regiões do hipotálamo (Zhang & Lazar, 2000).
A existência de diversas isoformas de TR sugere redundância funcional; no
entanto, o padrão de expressão dos TRs em alguns tecidos sugere diferenças funcionais.
O papel biológico das diferentes isoformas tem sido analisado através do estudo dos
fenótipos de animais knockout.
A análise do fenótipo de camundongos knockout para a isoforma TRα
1
, indica que
este é o principal mediador dos efeitos do HT sobre a função cardíaca e sobre a
8
termogênese (Wikström et al., 1998). Animais knockout para as isoformas α
1
e α
2
apresentam retardo no crescimento, má formação da mucosa intestinal, são
hipotireoideos e morrem após o desmame (Plateroti et al., 1999). A deleção de todos as
variantes do TRα leva ao retardo na maturação óssea, má formação da mucosa
intestinal, mas os animais são eutireoideos (Gauthier et al., 1999 e 2001). Esses dados
indicam que os transcritos do TRα que não se ligam ao T
3
desempenham um importante
papel, ainda não esclarecido, no processo de maturação óssea e desenvolvimento da
parede intestinal (Gauthier et al., 2001).
Os estudos sobre o papel das isoformas do TRβ indicam que as proteínas
codificadas pelo gene TRβ são as responsáveis pelo efeito de retroalimentação do T
3
no
eixo hipotálamo-hipófise, sobretudo a isoforma β
2
(Abel et al., 1999). Todos os animais
knockout, tanto para β
1
e β
2
quanto somente para o β
2
apresentam concentrações séricas
elevadas de TSH, T
4
e T
3
(Forrest et al., 1996; Abel et al., 1999). No entanto, estes
animais não apresentam comprometimento no crescimento e apenas os animais
knockout para β
1
e β
2
são surdos.
Mutações no gene do TRβ estão associadas à Síndrome de Resistência ao
Hormônio Tireoideano que é caracterizada por uma responsividade diminuída dos
tecidos à ação dos hormônios tireoideanos, que estão em concentrações séricas
elevadas, com TSH aumentado ou normal (Refetoff et al., 1993). Este quadro hormonal
ocorre em função da diminuição da retro-alimentação negativa do eixo hipotálamo-
hipófise pelo T
3
, que não é capaz de suprimir a secreção de TSH e, com isto, há
hiperestimulação da tireóide. Os tecidos que continuam responsivos ao hormônio
tireoideano irão apresentar sinais de hipertireoidismo, devido à alta concentração de
hormônio tireoideano circulante, ao passo que os tecidos nos quais os principais efeitos
9
do HT forem mediados pelo TRβ, apresentarão sinais de hipotireoidismo. O fenótipo
mais comum apresentado pelos pacientes é: bócio, taquicardia, comportamento
hipercinético, retardo no crescimento, deficiência de aprendizado, entre outros sinais e
sintomas (Refetoff et al., 1993).
Efeitos do hormônio tireoideano que não envolvem a modulação da transcrição
gênica pelos TRs são chamados efeitos não genômicos. Evidências desses efeitos são
baseadas sobretudo no fato de que ocorrem num tempo muito inferior aquele necessário
para que a síntese protéica ocorra e não são inibidos por bloqueadores de síntese
protéica. Esses efeitos podem ser mediados não só por T
3
, mas também por T
4
, rT
3
e 3,5
T
2
(Yen, 2001).
I.4- EFEITOS DESENCADEADOS PELOS HORMÔNIOS TIREOIDEANOS
O hormônio tireoideano, por estimular a síntese protéica em virtualmente todas
as células do organismo, desencadeia aumento na taxa metabólica e, conseqüentemente,
termogênese (Yen, 2001).
A termogênese denominada por alguns como termogênese facultativa, ocorre em
resposta ao frio e é dependente do hormônio tireoideano, que estimula a síntese de
UCPs (proteínas desacopladoras). Estas são proteínas mitocondriais e aumentam a
termogênese por desacoplarem a fosforilação oxidativa, o que resulta na dissipação de
energia sob a forma de calor, sem a produção de ATP. Têm sido encontradas isoformas
de UCPs em tecido adiposo e músculo esquelético (Yen, 2001).
10
O hormônio tireoideano também possui papel importante no desenvolvimento e
funcionamento do tecido adiposo branco e marrom (Ailhaud et al., 1992). Regula o
consumo basal de oxigênio, os estoques de ácidos graxos, a lipogênese e a lipólise, por
modular diretamente a expressão de enzimas envolvidas nessas vias, e, dessa forma,
altera o metabolismo lipídico e energético inclusive no fígado (Oppenheimer et al.,
1991).
O hormônio tireoideano regula a expressão de genes envolvidos em vias
celulares que determinam diversas funções hepáticas, como a gliconeogênese e
lipogênese, a proliferação e a apoptose (Yen, 2001). Indiretamente, o HT estimula
algumas enzimas lipogênicas, que são reguladas por GH, e ainda promove aumento na
captação de glicose, por estimular a secreção de insulina (Yen, 2001). A regulação pelo
HT da síntese de proteínas envolvidas no metabolismo do colesterol e síntese de
receptores para LDL, também tem sido descrita (Yen, 2001).
Durante o desenvolvimento celular, o hormônio tireoideano, juntamente com
glicocorticóides, promovem a maturação pulmonar, por estimular a síntese e secreção
do surfactante alveolar pelos pneumócitos do tipo 2 (Yen, 2001). No desenvolvimento
do sistema nervoso central, tem sido demonstrado que ratos com hipotireoidismo
apresentam comprometimento do crescimento axonal e da arborização dendrítica no
córtex cerebral, hipocampo e cerebelo, comprometendo a formação de sinapses (Rabie
& Legrand, 1973). O hormônio tireoideano regula a síntese e secreção de alguns
hormônios na hipófise. O T
3
modula de forma positiva a expressão de GH e tem um
efeito inibitório sobre a expressão gênica da prolactina e das subunidades de TSH, tendo
ainda um efeito indireto na síntese de TSH, por inibir a síntese de TRH no hipotálamo
(Yen, 2001).
11
O desenvolvimento e crescimento ósseo são regulados por hormônio
tireoideano, de forma direta, alterando a expressão de genes-alvo, ou indireta, via GH e
IGF-1. O T
3
estimula a síntese de proteínas, expressas pelos osteoblastos, envolvidas na
formação da matriz, favorecendo a calcificação, e também apresenta efeitos
estimulatórios sobre os osteoclastos, promovendo a reabsorção óssea. Especula-se que a
atividade do HT sobre os osteoclastos seja mediada por uma via parácrina promovida
por fatores secretados pelos osteoblastos (Yen, 2001).
Nas linhagens musculares, o hormônio tireoideano modula o padrão de
contração, que é conseqüência do tipo e número de fibras (tipo 1 ou 2) e está associado
ao metabolismo aeróbico e anaeróbico, respectivamente (Yen, 2001).
I.5- O HORMÔNIO TIREOIDEANO E O SISTEMA CARDIOVASCULAR
O hormônio tireoideano tem vários efeitos sobre o sistema cardiovascular. Estes
efeitos são claramente observados durante disfunção tireoideana, quando o excesso ou a
escassez de hormônio tireoideano induzem importantes alterações no sistema
cardiovascular.
O aumento da concentração sérica de hormônio tireoideano na circulação
promove diminuição da resistência vascular periférica, como conseqüência da rápida
utilização do oxigênio pelos tecidos e aumento dos produtos finais do metabolismo
celular e da ação direta do HT sobre a musculatura lisa da parede dos vasos, induzindo o
relaxamento (Ojamaa et al., 1996).
12
No coração o excesso de hormônio tireoideano causa aumento da freqüência
cardíaca, da contratilidade, do débito cardíaco e induz hipertrofia cardíaca (Klein &
Ojamaa, 2001). Esses efeitos são causados por ação direta do HT sobre as células
cardíacas ou indiretamente, porque o hormônio tireoideano torna as células cardíacas
mais responsivas à ação de norepinefrina, por estimular a síntese de receptores β
1
-
adrenérgicos (Klein & Ojamaa, 2001).
O sistema renina angiotensina também contribui para o processo hipertrófico
induzido pelo hipertireoidismo. Foi demonstrado que o hormônio tireoideano estimula a
síntese do mRNA da renina (Gilbert et al., 1994) e a síntese de receptores para
angiotensina II nos miócitos cardíacos de cães (Sernia et al., 1993). Kobori e
colaboradores, em 1999, demonstraram que o hormônio tireoideano ativa o sistema
renina-angiotensina cardíaco, sugerindo que este pode ser o fator inicial para o
desenvolvimento da hipertrofia. Também foi demonstrado que ratos hipertireoideos,
tratados com antagonista do receptor de angiotensina II ou antagonista β-adrenérgico,
não apresentam processo hipertrófico, indicando a participação do sistema nervoso
simpático e do sistema renina angiotensina no processo hipertrófico induzido pelo
hormônio tireoideano (Hu et al., 2003).
Bachman e colaboradores, em 2004, utilizando um modelo de camundongo
knockout para os 3 subtipos de receptores β-adrenérgicos, observaram que estes animais
apresentam hipertrofia induzida por hipertireoidismo; no entanto, num grau inferior aos
animais selvagens hipertireoideos. Estes dados reforçam a participação do sistema
adrenérgico na hipertrofia causada pelo hormônio tireoideano, mas também demonstram
que parte da hipertrofia ocorre independentemente deste sistema.
13
Além dos efeitos indiretos sobre a atividade cardíaca, o hormônio tireoideano
modula diretamente a expressão de genes cardíacos que codificam proteínas estruturais
e regulatórias. O mecanismo de contração dos miócitos cardíacos possui vários
componentes que são influenciados pelos HT, que vão desde a regulação dos níveis
citoplasmáticos de Ca
+2
até alterações na isoforma predominante de miosina,
acarretando o aumento da velocidade de contração e relaxamento e, ainda, aumento da
força de contração (Klein & Ojamaa, 2001).
A expressão gênica dos canais de Ca
+2
do tipo-L e dos canais de rianodina é
modulada positivamente por T
3
. Estes canais são responsáveis pelo aumento da
concentração citoplasmática de Ca
+2
que é o principal mediador do processo contrátil. A
velocidade em que diminui o nível citoplasmático de Ca
+2
determina a velocidade do
relaxamento diastólico, e este é mais eficiente na presença do hormônio tireoideano. A
Ca
+2
-ATPase (SERCA 2), situada no retículo sarcoplasmático e que remove o Ca
+2
do
citoplasma, finalizando a contração, tem a expressão estimulada pelo HT, e a proteína
fosfolambam, que inibe a atividade da SERCA 2, tem sua expressão inibida pelo T
3
(Klein & Ojamaa, 2001).
As alterações no padrão de expressão das isoformas da cadeia pesada da miosina
cardíaca (MHC) pelo hormônio tireoideano já foram bem caracterizadas, tendo sido
identificado um TRE positivo na região regulatória do gene da isoforma α. Em roedores
adultos, a isoforma predominante é a α-MHC, que possui alta atividade ATPásica. No
hipertireoidismo observa-se aumento da expressão desta isoforma e inibição da
expressão da isoforma β. Este efeito, somado ao aumento dos níveis citoplasmáticos de
Ca
+2
, contribui para o aumento da força e da velocidade observados na contração
cardíaca sob influência do HT. O efeito inverso é observado no hipotireoidismo,
14
sobretudo o aumento da expressão da β-MHC cuja expressão gênica é fortemente
reprimida pelo hormônio tireoideano (Klein & Ojamaa, 2001). Além disso, tem sido
mostrado que o T
3
é capaz de aumentar o nível protéico da α-actina em cultura de
cardiomiócitos (Tribulova et al., 2004).
O HT também modula a atividade elétrica cardíaca. O aumento da
concentração sérica de hormônio tireoideano é capaz de induzir aumento da freqüência
cardíaca e encurtamento do potencial de ação, ocorrendo o inverso no hipotireoidismo
(Klein & Ojamaa, 2001). Tem sido demonstrado que o T
3
modula positivamente a
expressão de canais envolvidos com as correntes marcapasso, HCN2 e HCN4 (canais
ativados por hiperpolarização e nucleotídeos cíclicos), do trocador sódio-cálcio e das
subunidades de alguns canais de potássio, como o retificador retardado e o responsável
pela corrente transiente de efluxo (Pachucki et al., 1999). O aumento do número destes
canais induz aumento na velocidade da despolarização diastólica, associado ao
encurtamento do potencial de ação das células do nodo sinoatrial e à diminuição do
período refratário das células cardíacas contráteis (Klein, 2001). Experimentos in vitro
têm demonstrado que o tratamento de cultura de cardiomiócitos com T
3
é capaz de
aumentar a corrente de sódio e de potássio em menos de 30 minutos e cogita-se que
esses efeitos sejam mediados por ações não genômicas do hormônio tireoideano,
envolvendo o estado de fosforilação desses canais (Dudley et al., 1993).
No coração, os efeitos do hormônio tireoideano são mediados pelos receptores
TRα
1
e β
1
, sendo que a isoforma α
1
é expressa predominantemente. Swanson e
colaboradores, em 2003, demonstraram que as isoformas α e β são expressas no nodo
sinusal; no entanto, assim como ocorre nas células ventriculares, a principal isoforma é
15
a α
1
, embora a isoforma β também seja capaz de estimular as células do marcapasso
cardíaco, como foi observado nos experimentos de Wikström e colaboradores em 1998.
Alguns trabalhos têm sugerido uma possível relação entre o padrão de expressão
gênica das isoformas dos TRs no coração e doenças cardíacas (nas quais as
concentrações séricas de HT circulantes são normais).
Kinugawa e colaboradores, em 2001(a), mostraram existir uma correlação direta
entre os níveis de mRNA dos TRs e a transcrição de genes responsivos ao hormônio
tireoideano, em diferentes tipos de hipertrofia cardíaca. Nesse trabalho, ratos foram
submetidos a diferentes modelos de hipertrofia cardíaca e observou-se que a hipertrofia
provocada por exercício aumentou os níveis de TRβ
1
, α-MHC e SERCA e diminuiu os
níveis de β-MHC, ao passo que, na hipertrofia provocada por sobrecarga de pressão,
ocorreu diminuição da expressão das 3 isoformas de TR encontradas no coração (TRβ
1
,
α
1
e α
2
) e, ainda, diminuição nos níveis de expressão do mRNA do α-MHC e SERCA e
aumento nos níveis do mRNA do β-MHC.
Naquele mesmo ano (Kinugawa et al., 2001(b)) foi demonstrada diminuição dos
níveis de mRNA do TRα
1
e aumento dos níveis de TRα
2
em humanos com falência
cardíaca, provavelmente por alterações no splicing que ocorre no gene TRα. Além
disso, houve uma correlação negativa entre a expressão de TRα
2
e α-MHC, e uma
relação positiva entre a expressão de TRα
2
e do peptídeo natriurético atrial (um clássico
marcador de hipertrofia e falência cardíaca). Uma vez que o TRα
2
parece ser um
inibidor da ação dos outros TRs, postulou-se que o aumento de sua expressão
prejudicaria a sinalização do HT no coração, e este poderia ser um dos fatores
16
moleculares responsáveis pela indução da expressão de genes fetais no ventrículo em
falência.
Nos últimos anos, vários estudos in vivo e in vitro estão sendo realizados com o
intuito de caracterizar o papel dos TRs na fisiologia cardíaca, e muitas informações
estão sendo adquiridas, sobretudo em estudos com animais transgênicos.
Em camundongos knockout para a isoforma α
1
do TR foi observado bradicardia,
aumento dos intervalos PR e QT e do complexo QRS sendo todos estes efeitos
compatíveis com o fenótipo do hipotireoidismo em ratos e humanos. Quando estes
animais foram submetidos a tratamento com T
3
, foi observado aumento na freqüência
cardíaca, porém este aumento foi inferior ao observado nos camundongos selvagens
submetidos ao mesmo tratamento (Wikström et al., 1998).
O eletrocardiograma dos camundongos knockout para a isoforma α
1
e
β do TR,
apresenta padrão similar aos animais knockout para o TRα
1
, inclusive após tratamento
com T
3
. Estes dados indicam que o efeito do hormônio tireoideano sobre o marcapasso
cardíaco e o processo de repolarização ventricular são modulados principalmente pelo
TRα
1
(Johansson et al., 2000).
Em 2001, Gloss e colaboradores demonstraram que animais TRα
-
/
-
(estes
animais não expressam a isoforma α
1
nem α
2
) além de serem bradicárdicos
apresentavam diminuição da função contrátil. Estes animais apresentavam diminuição
do mRNA dos canais HCN2 e HCN4 (nas células atriais), dos canais de potássio
envolvidos na repolarização ventricular (nas células ventriculares) e de α-MHC e
SERCA (nas células do músculo papilar). Estes resultados foram similares aos obtidos
nos camundongos selvagens nos quais foi induzido hipotireoidismo. No entanto, a
função contrátil dos animais TRβ
-
/
-
foi semelhante à dos animais selvagens. Estes
17
resultados reforçam a idéia de que o fenótipo cardíaco modulado por T
3
seja
predominantemente exercido pela interação do hormônio tireoideano com o TRα
1.
A caracterização dos efeitos diretos do hiper ou hipotireoidismo sobre a função
cardíaca é dificultada em função das alterações que ocorrem paralelamente no sistema
vascular e se refletem na hemodinâmica cardíaca através de mudanças na pré- e pós-
carga.
Pazos-Moura et al., em 2000, desenvolveram camundongos transgênicos que
expressam, somente no tecido cardíaco, um TRβ
1
contendo uma mutação dominante
negativa. A expressão deste TR mutado está sob o controle de um promotor cardíaco-
específico, o da isoforma α da cadeia pesada da miosina (α-MHC), o que garante sua
expressão, em abundância, somente nos cardiomiócitos. Esta mutação no TRβ é
encontrada em pacientes com Síndrome de Resistência ao Hormônio Tireoideano e é
uma mutação pontual que resulta em deleção do aminoácido treonina na posição 337
(Δ337T), tornando este receptor incapaz de se ligar ao T
3
e se dissociar dos co-
repressores, interferindo na sinalização do T
3
mediada pelo TRβ e TRα nos
cardiomiócitos. O TRβ (Δ337T) age como um dominante negativo em relação aos
receptores endógenos. Independentemente das concentrações séricas normais de
hormônios tireoideanos, o fenótipo cardíaco observado foi semelhante aquele dos
animais com hipotireoidismo: prolongamento dos intervalos PR e QT, e do complexo
QRS (observado em análise eletrocardiográfica de animais anestesiados), e diminuição
da função contrátil, em ensaios funcionais ex vivo, evidenciando hipotireoidismo
cardíaco. Essa linhagem de camundongos, denominada KS, é portanto um modelo de
hipotireoidismo cardíaco seletivo, interessante para estudar os efeitos dos hormônios
18
tireoideanos exercidos diretamente no tecido cardíaco através de seus receptores
nucleares.
Análises funcionais realizadas in vivo, demonstraram que os animais KS
desenvolvem mecanismos compensatórios que, em situações basais, mantêm parâmetros
normais de “performance” cardíaca.
Em 2004, Ortiga-Carvalho e colaboradores realizaram estudos funcionais
cardíacos, comparando os animais KS com outros camundongos que expressam o
mesmo TRβ mutado (Δ337T) em todas as células, já que esta mutação estava presente
na linhagem germinativa, pois havia sido introduzida no genoma dos animais por
recombinação homóloga. Estes animais foram denominados KI. Os autores compararam
o efeito, sobre a função cardíaca, da mutação presente somente nos cardiomiócitos ou
em todas as células nas quais o TRβ é expresso.
Foram estudados animais KI heterozigotos, já que é a forma de apresentação
preponderante nos pacientes com a Síndrome de Resistência aos Hormônios
Tireoideanos. Neste trabalho, foi observado que os animais KS possuem a parede livre
do ventrículo esquerdo mais espessa do que os animais selvagens e que, após tratamento
com excesso de hormônio tireoideano, estes camundongos não têm aumento de
freqüência cardíaca, mas respondem ao processo hipertrófico provocado pelo T
3.
Já a
“performance” cardíaca dos animais KI (heterozigotos) é bastante semelhante à dos
animais selvagens, tanto em situações de hipo, quanto de hipertireoidismo. Entretanto, a
hipertrofia do ventrículo esquerdo que ocorreu nos animais KI foi menor que a
observada nos outros dois grupos de animais (selvagem e KS) quando tratados com
excesso de hormônio tireoideano. Ou seja, a presença da mutação apenas no tecido
cardíaco teve repercussões mais importantes na capacidade do T
3
de induzir o aumento
19
da freqüência cardíaca do que sobre seu efeito hipertrófico. Já a mutação de TRβ
expressa a partir da sua localização genômica, mostrou repercussões mais importantes
na capacidade do T
3
de induzir hipertrofia. Estes resultados podem nos sugerir a
participação de fatores extra-cardíacos, modulados pelo T
3
, via TRβ, na promoção da
hipertrofia cardíaca induzida pelo hormônio tireoideano.
Todos os estudos realizados com animais transgênicos convergem no sentido de
indicar que a interação T
3
-TRα exerce efeito predominante sobre a eletrofisiologia e a
mecânica cardíaca. No entanto, a isoforma β parece ser importante no processo de
hipertrofia cardíaca, que é uma das conseqüências do excesso da estimulação do
hormônio tireoideano sobre o coração. Nos modelos de knockout para as isoformas α e
β, submetidos ao tratamento com excesso de HT, somente os animais knockout para a
isoforma α apresentam sinais de hipertrofia, quando avaliados por ecocardiografia
(Weiss et al., 2002). Também os animais heterozigotos para a mutação germinativa
TRβ (Δ337T), KI, descritos anteriormente, responderam menos ao efeito hipertrófico do
excesso de T
3
(Ortiga-Carvalho et al., 2004).
I.6- JUNÇÕES COMUNICANTES
As junções comunicantes são estruturas especializadas de membrana, que
formam canais intercelulares permitindo a passagem direta de metabólitos, íons e
pequenas moléculas de até 1kDa entre as células adjacentes (Loewenstein, 1981).
O canal juncional é uma estrutura dodecamérica constituída por dois hemicanais
(conexons), sendo que cada um se encontra em uma das células adjacentes. Cada
20
hemicanal é constituído por seis subunidades de proteínas denominadas conexinas (Cx)
(Kumar & Gilula, 1992 e 1996; Bruzzone et al., 1996) (Figura 1). Até o momento já
foram identificadas 20 e 21 diferentes conexinas em camundongos e humanos,
respectivamente (Hervé, 2004).
As conexinas estão arranjadas radialmente delimitando um poro central (Yeager,
1998). No modelo representativo da disposição das conexinas na membrana plasmática,
o polipeptídeo atravessaria a membrana lipídica quatro vezes (M1-M4), formando duas
alças extracelulares (E1 e E2) e uma alça intracelular (AC), estando as regiões amino- e
carboxi- terminal no lado citoplasmático (Figura 1) (Yeager & Gilula, 1996).
Comparações entre as seqüências de aminoácidos das diferentes conexinas tem
mostrado que a porção carboxi-terminal assim como a alça citoplasmática são as regiões
de maior diversidade entre as conexinas e teriam papel essencial na regulação química
do canal. Pelas características anfipáticas do domínio M3 ele poderia contribuir para a
formação do canal; enquanto E1, M1 e M2 estariam envolvidos na sensibilidade à
voltagem e E2 estaria envolvido na especificidade da interação entre os hemicanais
(Rubin et al., 1992, Suchyna et al., 1993; White et al., 1995).
A interação entre dois conexons é mediada por ligações não covalentes entre as
duas alças extracelulares das conexinas. Durante a oligomerização, a formação de
conexons homoméricos (compostos por seis conexinas idênticas) ou heteroméricos
(compostos por mais de uma espécie de conexina) é possível. Tendo em vista que as
duas alças extracelulares são altamente conservadas, canais homotípicos (formados por
dois conexons idênticos), assim como canais heterotípicos (formados por dois conexons
diferentes) podem ocorrer (Jiang & Goodenough, 1996; Konig & Zampihi, 1995),
(Figura 2).
21
Figura 1: Modelo topológico das conexinas. A. Modelo topológico das conexinas. Os
cilindros representam os domínios transmembranares (M1-M4). As alças entre o primeiro e
segundo, bem como entre o terceiro e quarto domínios transmembranares são extracelulares
(E1 e E2, respectivamente), AC- alça intracelular, N- região N-terminal, C- região C-terminal.
B. Modelo dos domínios transmembranares de seis subunidades de conexinas arranjados para
formar o espaço hidrofílico (poro) do canal juncional. Figuras A e B retiradas de Kumar &
Gilula, 1996.
A
A
B
B
AC
22
Figura 2: Desenho esquemático dos possíveis arranjos dos conexons para
formar os canais juncionais.
Os conexons consistindo de seis subunidades de conexinas
(vermelho e azul) são ilustrados em várias configurações. Conexons podem ser homoméricos
(compostos de seis subunidades idênticas) ou heteroméricos (compostos de mais de duas
espécies de conexinas). Conexons cedidos por células adjacentes se associam para formar o
canal juncional. O canal pode ser homotípico (se os conexons são idênticos) ou heterotípicos
(se os dois conexons são diferentes). Figura retirada de Kumar & Gilula, 1996.
Homomérico
Heteromérico
Homomérico Heteromérico
Heterotípico HeterotípicoHomotípico Homotípico
Canal
Canal
Conexon
Conexon
Canal
Canal
Conexon
Conexon
23
As propriedades dos canais juncionais são determinadas pelas diferentes
conexinas que constituem o canal, pois estas proteínas possuem diferentes propriedades
biofísicas: regulação, permeabilidade e condutância (Elfgang et al., 1995; Veenstra et
al., 1995). Diferenças na permeabilidade e na regulação das junções comunicantes
podem ter implicações fisiológicas importantes, podendo ser responsáveis pela
formação de microambientes dentro de um mesmo órgão, uma vez que um tipo celular
pode expressar mais de um tipo de conexina.
A comunicação celular via junções comunicantes está relacionada com eventos
fisiológicos críticos, incluindo a regulação de eventos iniciais do desenvolvimento, a
proliferação e o crescimento celular, a nutrição de tecidos avasculares e a propagação de
impulsos elétricos no músculo cardíaco e no músculo liso.
A geração do potencial de ação no coração ocorre numa região especializada,
conhecida como nodo sinoatrial, propagando-se pelos átrios e, em seguida, pelos
ventrículos. Como o átrio e o ventrículo são eletricamente isolados, o impulso elétrico é
transmitido aos ventrículos através do sistema de condução atrioventricular. Este
sistema é composto pelo nodo atrioventricular, feixe de Hiss e suas ramificações, e
pelas células de Purkinje.
Até o momento foram encontrados, no coração, transcritos para as Cx37, Cx40,
Cx43 e Cx45 (Kanter et al., 1992; Haefliger et al., 1992). A Cx43 é a mais abundante e
amplamente distribuída sendo encontrada no átrio e no ventrículo (Gourdie et al., 1991).
A Cx40 apresenta um padrão mais restrito, sendo encontrada no átrio (de algumas
espécies), no sistema de condução e no endotélio (Gros et al., 1994). A presença da
Cx45 é detectada no miocárdio atrial e ventricular (Thomas et al., 1998), enquanto a
Cx37 é detectada no endotélio (Figura 3).
24
A presença da Cx40 no sistema de condução átrio-ventricular, com exceção do
nodo atrioventricular, confere ao sistema alta velocidade na propagação do potencial de
ação, devido a sua alta condutância (Beblo et al., 1995).
O padrão de distribuição de diferentes Cxs no miocárdio adulto, está relacionado
com propriedades específicas de condução das regiões cardíacas, sincronizando o
potencial de ação e, conseqüentemente, a capacidade contrátil.
Alterações no nível de expressão e na distribuição tecidual das Conexinas 40 e
43 estão relacionadas com arritmias, e tem sido demonstrado que o átrio de cabras e
humanos com fibrilação crônica apresenta mudanças na distribuição da Cx40 e 43,
respectivamente (Van der Velden et al., 2000; Polontchouk et al., 2001). Em doenças
cardíacas como hipertrofia e falência cardíaca também são detectadas alterações na
expressão dessas conexinas; no entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos
moleculares que acarretam estas alterações (Teunissen et al., 2004).
Os poucos estudos que foram realizados sobre regulação transcricional da Cx40,
até o momento, têm demonstrado que a região regulatória do gene da Cx40 é alvo do
controle de fatores transcricionais cardíaco-específicos como Nkx2.5, Tbx5 e GATA4
(Kasahara et al., 2001; Bruneau et al., 2001; Linhares et al., 2004) e fatores
constitutivos como Sp1 e Sp3 (Bierhuizen et al., 2000). Todos esses fatores são capazes
de interagir com a região do promotor mínimo da Cx40 e estimular a sua transcrição in
vitro (Bierhuizen et al., 2000; Linhares et al., 2004).
A transcrição do gene da Cx43 é estimulada pelos fatores transcricionais
constitutivos: AP1, Sp1, Sp3 (Echetebu et al., 1999). Alguns hormônios estimulam a
atividade transcricional do promotor da Cx43 de modo tecido específico, já foi descrito
25
que o paratormônio estimula a transcrição da Cx43 em osteoblastos e que o T
3
estimula
a sua transcrição em células do fígado (Mitchell et al., 2001; Stock & Sies, 1998).
A utilização de animais deficientes para as conexinas têm contribuído para o
entendimento do papel desempenhado por essas proteínas na função cardíaca.
As conexinas 40 e 43 são proteínas que formam os canais juncionais
responsáveis pelo acoplamento elétrico entre as células cardíacas. O fenótipo dos
animais deficientes na expressão dessas proteínas é de diminuição da velocidade de
despolarização atrial e ventricular.
Animais transgênicos, homozigotos para deleção da Cx43, morrem após o
nascimento, devido à formação de septos no ventrículo direito, o que causa baixa
oxigenação e morte pós natal, e demonstra a importância desta proteína no
desenvolvimento correto do coração (Reaurne et al., 1995). Animais heterozigotos são
viáveis e têm comprometimento da condução ventricular, mas têm duração maior da
condução do potencial de ação entre as células ventriculares (observado pela duração do
complexo QRS), sem apresentar qualquer alteração no potencial de membrana das
células ventriculares (Guerrero et al., 1997). A expressão das Cxs 40 e 45 não estava
alterada no coração desses animais (Thomas et al., 1998). A diminuição da expressão da
Cx43 no átrio desses animais não causou nenhuma alteração na condução atrial,
indicando que a Cx40, que é expressa apenas no átrio, seria a principal proteína
responsável pelo acoplamento elétrico no músculo atrial e a Cx43 seria responsável pelo
acoplamento no músculo ventricular (Thomas et al., 1998).
A importância da Cx40 na regulação e na coordenação da contração atrial
começou a ser revelada com a utilização de animais deficientes em Cx40. Estes estudos
26
reforçam a teoria de que as Conexinas 40 e 43 desempenham importante papel na
condução do impulso elétrico de modo câmara-específico.
As análises eletrocardiográficas de animais knockout para Cx40 demonstram que
estes têm aumento do tempo de condução atrial (Simon et al., 1998; Kirchhoff et al.,
1998). As análises eletrofisiológicas desses animais confirmam a importância desta Cx
na condução atrial e do tecido de condução (nodo átrio-ventricular e no sistema Hiss-
Purkinje) (VanderBrink et al., 2000; Bagwe et al., 2005). Medidas de potencial de
membrana revelaram que parâmetros como duração e amplitude do potencial de ação
não são alterados nos animais deficientes em Cx40, confirmando a importância desta
proteína na propagação do potencial entre os miócitos atriais (Bagwe et al., 2005).
As mudanças observadas no eletrocardiograma de animais mutantes para os
TRs como: aumento da duração da condução átrio-ventricular e ventricular, são
similares às de animais hipotireoideos. O aumento da duração da repolarização
ventricular pode estar relacionado a alterações na expressão de canais iônicos, como os
canais de cálcio e potássio (Bouter et al., 2003; Gloss et al., 2001). Até o momento,
nenhuma alteração na expressão gênica de canais de sódio, induzida por hormônio
tireoideano, foi demonstrada.
A semelhança de alguns parâmetros eletrocardiográficos dos animais deficientes
em conexina e dos animais hipotireoideos nos levou a pensar que a expressão dessas
conexinas no coração dos animais hipotireoideos poderia estar alterada, e que este fato
poderia estar contribuindo para as alterações de condução elétrica no coração
hipotireoideo.
27
Cx43 Cx40 = Cx45
Cx43 = Cx40 > Cx45
Cx43<<<Cx45
Nodo AV
Nodo AV
Feixe de
Feixe de
Hiss
Hiss
Fibra de
Fibra de
Purkinje
Purkinje
Cx40, Cx43
e Cx45
Cx43 e Cx45
B
B
Figura 3: Localização das conexinas em diferentes regiões do coração de
camundongo. A .
Corte frontal de um coração, as letras identificam as regiões do
cardíacas A- nodo sinusal; B- nodo AV; C- Feixe de Hiss; D- Ramo direito e esquerdo; E-
Fibras de Purkinje. A seta superior indica as Conexinas expressas no átrio e a inferior as
Conexinas expressas no ventrículo
B.
Esquema do tecido de condução átrio-ventricular e a
localização da expressão das conexinas. Adaptado de Lo et al., 1999.
A
A
28
II- OBJETIVO
Investigar a expressão gênica das conexinas 40 e 43 no coração de animais com
hipotireoidismo cardíaco seletivo e hipotireoidismo sistêmico, e correlacioná-las
às alterações de condução elétrica presentes nestes modelos.
.
29
III- METODOLOGIA
Para a realização deste estudo foram utilizados camundongos machos da
linhagem FVB albinos, selvagens e mutantes KS, com aproximadamente 3 meses de
idade. Os animais foram mantidos com água e ração ad libitum, em ciclo controlado
claro-escuro de 12 horas (luzes apagadas às 19 horas) e temperatura em torno de 24°C.
Os camundongos KS superexpressam a mutação TRβ
1
(Δ337T) apenas no
coração, o que foi obtido pela incorporação, ao genoma do zigoto, de uma construção de
DNA onde o TRβ
1
(Δ337T) foi clonado à jusante do promotor da isoforma α da cadeia
pesada da miosina (α-MHC) (Pazos-Moura et al., 2000).
Os procedimentos de manipulação dos animais foram em conformidade com o
comitê de uso de animais do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho-UFRJ.
III.1- Genotipagem
A linhagem foi mantida em heterozigose e a determinação de genótipo dos
camundongos KS foi realizada através da técnica de Southern blot .
III.1a-Extração de DNA
Para a análise genotípica foi utilizado DNA genômico extraído da cauda do
animal. Pequenos pedaços da cauda foram digeridos em uma solução contendo
proteinase K (PROMEGA) 200 μg/mL, SDS 10%, NaCl 150 mM, citrato de sódio
30
15 mM, Tris-HCl 500 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5, por um período de 18 horas, a 37ºC.
Após a digestão, o material foi centrifugado a 14000 g por 15 minutos. Ao sobrenadante
foi adicionado um volume igual de fenol:clorofórmio, seguido por centrifugação por 10
minutos. A fase aquosa foi removida e acrescida de isopropanol. Após nova
centrifugação de 15 minutos, o sobrenadante foi descartado e o DNA solubilizado em
água destilada autoclavada e sua concentração determinada através de espectofotometria
a 260 nm (Sambrook et al., 1989).
III.1b- Southern blot
Cerca de 10 µg de DNA genômico de cada animal foram digeridos com a
enzima de restrição Bgl II (GIBCO
®
BRL), a 37
ο
C, por 18 horas, para a liberação de um
fragmento de aproximadamente 2.4 Kb. Após este período, as amostras foram
fracionadas por eletroforese em um gel de agarose 1% em TAE (Tris-acetato 40 mM,
EDTA 1 mM pH 7,5). E, a seguir o material foi transferido, por capilaridade, para uma
membrana de nylon durante 16 horas, em uma solução contendo NaCl 0,4 M e NaOH
0,6 M. Após a transferência, a membrana foi embebida por 20 minutos em uma solução
de neutralização (TrisCl 1 M, NaCl 1 M, pH 7,0), e pré-hibridizada por 4 horas em
tampão de hibridização Rapid Hyb Buffer (Amersham).
A sonda foi marcada com
32
P-CTP utilizando o sistema Random Primers DNA
Labeling (Invitrogen), seguindo o protocolo do fabricante. A sonda foi desnaturada por
aquecimento a 95°C, durante 3 minutos, e adicionada ao tampão de hibridização que
previamente incubava a membrana. A hibridização foi realizada por 18 horas a 65
o
C.
31
Em seguida, a membrana foi submetida a duas lavagens na solução I (SSC 2x: NaCl 0,3
M, citrato de sódio 0,03 M, pH 7,0), por 15 minutos cada lavagem, e depois outras duas
lavagens na solução II (SSC 0,1x: NaCl 15 mM, citrato de sódio 1,5 mM, SDS 1%) por
20 minutos a 65ºC. Após este período os híbridos foram visualizados por auto-
radiografia (Figura 4).
Figura 4: Radiografia de um experimento de Southern blot.
A seta indica
a presença de híbridos com peso molecular de 2,4 Kb, demonstrando a presença do
transgene.
Fragmento de 2,4 Kb
32
III.2- Desenho experimental
Experimento 1- Animais selvagens e KS com aproximadamente 3 meses foram
submetidos à avaliação eletrocardiográfica e, logo em seguida, foram sacrificados por
inalação de CO
2
e então decapitados. O sangue foi coletado, para posterior dosagem de
TSH, e os corações foram excisados, átrios e ventrículos dissecados e armazenados a
-70°C para posterior quantificação do mRNA das Conexinas 40 e 43.
Experimento 2- Animais selvagens e KS com aproximadamente 2 meses foram
submetidos a dieta contendo PTU 0,15%, durante 4 semanas. No 27° dia de tratamento
foram realizadas avaliações eletrocardiográficas e no dia seguinte os animais foram
sacrificados. O sangue foi coletado, para posterior dosagem de TSH, e os corações
foram excisados, átrios e ventrículos dissecados e armazenados a -70°C para posterior
quantificação do mRNA das Conexinas 40 e 43.
III.3- Avaliação eletrocardiográfica
Os animais a serem submetidos ao eletrocardiograma foram anestesiados com
uma combinação de cloridrato de ketamina (Dopalen
®
) e cloridrato de xilasina
(Amasedan
®
) (50 e 5 mg por kg de peso, respectivamente, diluídos em solução salina
0,9% v/v) pela via intra-peritoneal (i.p.). Após o estabelecimento de um bom plano de
anestésico, verificados pela ausência de reflexos motores e protetores, os eletrodos
33
foram implatados no espaço subcutâneo da região dorsal e ventral à altura do tórax dos
camundongos.
Dois dias após o implante, os eletrodos foram conectados a um amplificador
diferencial e os registros foram adquiridos digitalmente (amostragem de 150 pontos por
segundo) usando uma interface analógica-digital da Axon Instruments Inc (Union City,
Califórnia, Estados Unidos) e o software Axoscope 9,0 da mesma firma (adaptado por
Pereira Jr et al., 2006).
Os registros eletrocardiográficos do presente trabalho foram realizados em
animais conscientes, com o objetivo de evitar o efeito de anestésicos sobre a
eletrofisiologia cardíaca. A aquisição dos registros foi feita sempre no mesmo horário e
os parâmetros analisados foram: freqüência cardíaca e duração das ondas P e T, do
complexo QRS e dos intervalos PR e QT.
Nesse tipo de registro, a primeira deflexão (onda P) representa a despolarização
do átrio. Esta é seguida por um longo intervalo denominado segmento PR, que
corresponde a lenta condução do impulso do átrio para os ventrículos, através do nodo
átrio-ventricular. O intervalo PR compreende a onda P e o segmento PR e indica o
tempo de propagação do impulso desde o início da despolarização dos átrios até o início
da despolarização dos ventrículos. A segunda série de deflexões positivas ou negativas
(complexo QRS) representa a despolarização ventricular e a última, a repolarização do
ventrículo (onda T) e o intervalo QT indica a duração média do potencial de ação
ventricular (Figura 5).
34
Figura 5: Esquema representativo do eletrocardiograma de
camundongo eutireoideo.
R
T
Intervalo P
R
Intervalo
Q
T
Q
P
S
35
III.4- Obtenção de animais hipotireoideos
Com aproximadamente 3 meses de idade camundongos machos selvagens e KS
foram submetidos a hipotireoidismo sistêmico. Este quadro foi obtido pela ingestão de
ração contendo PTU 0,15% (SIGMA), durante 4 semanas.
III.5- Extração do RNA total dos tecidos cardíacos
O RNA total foi obtido utilizando o reagente TRIZOL (GIBCO), uma solução
monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina. Foi adicionado 1 mL de TRIZOL a
100 mg das amostras, em seguida estas foram homogeneizadas e incubadas, por 10
minutos, à temperatura ambiente para permitir a completa dissociação dos complexos
nucleoprotéicos. Após a incubação foi adicionado 0,2 mL de clorofórmio a cada uma
das amostras que foram incubadas por 5 minutos, à temperatura ambiente, e
centrifugadas a 12000 g por 15 minutos. A fase aquosa foi transferida para tubos tipo
eppendorf, novos, e o RNA precipitado com 0,5 mL de isopropanol. As amostras foram
incubadas por 10 minutos à temperatura ambiente e centrifugadas por 10 minutos a
12000 g. O precipitado de RNA, resultante da centrifugação, foi lavado com 1 mL de
etanol 75%, seco à temperatura ambiente e solubilizado em água tratada com DEPC
(SIGMA). A concentração do RNA obtido foi determinada por espectrofotometria a 260
nm (Sambrook et al., 1989).
36
III.5a- RT-PCR Semi-quantitativo
Nos ensaios de RT-PCR foram utilizados 100 ng de RNA total. O RNA foi
submetido à reação de transcriptase reversa pela enzima M-MuLv utilizando random
primers (Frist Strand cDNA Synthesis kit, Pharmacia), segundo o protocolo do
fabricante. Dois microlitros do cDNA foram amplificados por PCR utilizando
iniciadores específicos para Conexina40, Conexina43 e GAPDH (um gene constitutivo
da via glicolítica), utilizado como controle interno. As amostras foram submetidas à
ciclagem térmica utilizando o Programmable Thermal Controller (MJ Research) com o
protocolo representado na Tabela 1. Ao fim da ciclagem as amostras foram fracionadas
por eletroforese em gel de agarose 1,5% em TAE e os produtos de amplificação foram
identificados de acordo com o peso molecular esperado (Tabela 2). A análise
densitométrica foi realizada utilizando o programa Kodak Digital Science 1D v2.0.3. Os
valores obtidos para o produto de amplificação da Cx40 ou Cx43 foram relacionados ao
produto de amplificação do controle interno, GAPDH. Os valores densitométricos
foram obtidos pela razão entre os produtos da amplificação para as conexinas e para o
GAPDH. Os valores obtidos nos animais selvagens foram normalizados como 1.
Tabela1. Condições da reação de RT-PCR para os iniciadores específicos.
Iniciadores Tecido Concentração Ciclos
de RNA(ng/μL)
Desnaturação Duração Anelamento Duração Polimerização duração
Condições para a amplificação
Cx40/GAPDH átrio 150 25 94°C 1 min 58°C 1 min 72°C 1,5 min
Cx43/GAPDH átrio 100 26 94°C 1 min 58°C 1 min 72°C 1,5 min
Cx43/GAPDH ventrículo 200 21 94°C 1 min 58°C 1 min 72°C 1,5 min
37
Tabela 2. Iniciadores utilizados na reação de RT-PCR.
Iniciador Senso Antisenso
Seqüência dos iniciadores utilizados na reação de RT-PCR e os tamanhos esperados
para o produto de amplificação.
Cx40 (camundongo) 5’GCACACTGTGCGCATGCAGG3’ 5’CTGCTGGCCTTACTAAGGCG3’
Produto da amplificação: 750 pb
Cx43 (camundongo) 5’ATCCAGTGGTACATCTATGG3’ 5’CTGCTGGCTCTGCTGGAAGG3’
Produto da amplificação: 593 pb
GAPDH (camundongo) 5’CCCCAATGTGTCCGTCGTGGAT3’ 5’TGGAGGCCATGTAGGCCATGAGG3’
Produto da amplificação: 300 pb
38
III.6- Dosagem hormonal por radioimunoensaio
Para o ensaio foram utilizados reagentes fornecidos pelo National Hormone
Pituitary Program (NHPP - Bethesda, Estados Unidos): TSH de camundongo para a
curva padrão e anticorpo produzido em cobaia contra TSH de camundongo (primeiro
anticorpo). O segundo anticorpo, específico para imunoglobulina de cobaia foi obtido
comercialmente (Antibodies Incorporated, EUA).
A marcação do TSH com
125
I foi feita pela técnica de cloramina T (Sigma)
(Chard, 1987). A purificação do TSH marcado foi feita em cromatografia de gel de
poliacrilamida (Biogel - P60 fino da Bio-rad), ressuspenso em tampão fosfato 0,05 M,
pH 7,5.
O ensaio foi realizado em 100 μL de tampão PBS - fosfato de sódio 10 mM e
cloreto de sódio 140 mM, pH 7,0, contendo albumina 0,25%, EDTA 125 mM e soro
normal de cobaia 0,25%. Após 2 horas de incubação de 100 μL da amostra ou padrão
com o primeiro anticorpo foi adicionado o TSH marcado radioativamente. Após 21
horas de incubação à temperatura ambiente, adicionou-se o segundo anticorpo
juntamente com polietilenoglicol 5%. Três horas após esta incubação à temperatura
ambiente os tubos foram centrifugados a 12000 g por 30 minutos a 4°C. O sobrenadante
foi desprezado e a radioatividade do precipitado medida em um cintilador de fase sólida.
Para este experimento utilizamos uma curva padrão na faixa de concentração de
25 a 500 ng/mL, a diluição final do primeiro anticorpo foi 1:300.000 e a diluição do
segundo foi de 1:80. Para a análise estatística de TSH sérico foi feita inicialmente a
transformada logarítimica.
39
III.7- Análise estatística
Os resultados estão apresentados em média ± desvio padrão. Para análise de dois
grupos experimentais foi utilizado o teste t-student e os experimentos com mais de dois
grupos de animais foi feito o teste ANOVA univariada seguido pelo teste de múltiplas
comparações student-Newman Keuls (GrafPAD, Prisma). A diferença foi aceita como
significativa quando p≤0,05.
40
IV- RESULTADOS
IV.1- Avaliação eletrocardiográfica de camundongos conscientes, selvagens e KS
eutireoideos
O efeito do transgene mutante (TRβ
1
Δ337T) sobre a atividade elétrica cardíaca
dos camundongos foi avaliado por eletrocardiograma. Para evitar a influência do
anestésico sobre os parâmetros cardíacos todos os registros eletrocardiográficos foram
realizados em animais não anestesiados.
Foram realizados ECGs em animais eutireoideos conscientes, 10 animais
selvagens (wt) e 8 KS, conforme mostrado na Tabela 3 e ilustrado na Figura 6. Nestes
experimentos foram observadas alterações temporais em todos os parâmetros avaliados:
(exceto a duração do complexo QRS).
Os animais KS apresentam freqüência cardíaca aproximadamente 32% menor
que os animais selvagens (p<0,001) e a duração das ondas P e T é significativamente
maior. A duração da onda P dos animais KS é 80% maior (p<0,001) e a da onda T é
aproximadamente 2,5 vezes maior que nos animais selvagens (p<0,001). Os intervalos
PR e QT também apresentam duração aumentada, de 23% (p<0,05) e 60% (p<0,001)
em relação aos animais selvagens, respectivamente.
41
Tabela 3. Parâmetros eletrocardiográficos de camundongos machos selvagens e transgênicos
conscientes e eutireoideos.
Os valores representam a média ± desvio-padrão. Os números entre parênteses indicam o número de
animais avaliados. Letras diferentes correspondem a médias estatísticamente diferentes. p<0,05
(teste-t não pareado).
wt KS
(N =10) (N =8)
Grupos Experimentais
Parâmetros
Freqüência Cardíaca 660
±
16,57
a
457,7 ± 15,52
b
(bpm)
Onda P (ms) 10, 45 ± 0,48
a
17,62 ± 0,26
b
Intervalo PR (ms) 26,72 ± 1,44
a
32,94 ± 1,31
b
Complexo QRS (ms) 10,10 ± 0,44 11,46 ± 0,47
Intervalo QT (ms) 17,60 ± 1,14
a
30,07 ± 3,63
b
Onda T (ms) 7,50 ± 0,80
a
18,61 ± 3,38
b
42
Figura 6: Eletrocardiograma representativo de camundongos conscientes.
A . Animal selvagem eutireoideo. B. Animal KS eutireoideo. C. Segmento ampliado dos
registros apresentados anteriormente, à esquerda segmento correspondente à figura A e à
direita correspondente à figura B.
100 ms
0,2 mV
50 ms 50 ms
0,2 mV
0,2 mV
C
C
B
B
A
A
100 ms
0,2 mV
43
IV.2- Avaliação eletrocardiográfica de camundongos selvagens e KS conscientes e
hipotireoideos
As alterações observadas no ECG dos animais KS são semelhantes às
encontradas em pacientes hipotireoideos. Em uma segunda fase comparamos o
eletrocardiograma dos animais KS eutireoideo, com animais selvagens hipotireoideos
sistêmicos e KS hipotireoideo.
Cinco camundongos selvagens tratados durante 4 semanas com PTU 0,15%
foram submetidos à análise eletrocardiográfica. Estes animais apresentaram diminuição
na freqüência cardíaca, no entanto essa diminuição não foi significativa quando
comparada aos animais selvagens eutireoideos. Assim como foi observado nos animais
transgênicos, não houve alteração na duração do complexo QRS. Foi observado
aumento na duração da onda P de 40% (p<0,05) e a duração da onda T foi
aproximadamente 2,5 vezes superior à dos animais selvagens eutireoideos (p<0,001).
Os intervalos PR e QT também apresentaram aumento de 15% (p<0,01) e 46% ,
respectivamente, nos selvagens hipotireoideos (p<0,001).
O modelo de hipotireodismo cardíaco seletivo (animais KS) apresentou
alterações temporais semelhantes ao modelo de hipotireoidismo sistêmico (animais
selvagens hipotireoideos), no entanto estas alterações são mais intensas nos animais
transgênicos (Tabela 4). A análise do eletrocardiograma dos animais KS tratados com
PTU foi semelhante aos animais KS eutireoideos: aumento na duração das ondas P e T e
dos intervalos PR e QT.
Os resultados dessas análises estão na Tabela 4 e ilustrados nas Figuras 7 e 8.
44
Os valores representam a média ± desvio-padrão. Os números entre parênteses indicam o número de
animais avaliados. Letras diferentes correspondem a médias estatísticamente diferentes (p<0,05).
Tabela 4. Parâmetros eletrocardiográficos de camundongos machos selvagens e transgênicos
conscientes, eutireoideos e tratados com PTU 0,15% durante 4 semanas.
Freqüência Cardíaca 660
±
16,57
a
450,7
±
15,52
b
609,4 ± 11,37
a
466
±
23,66
b
(bpm)
Onda P (ms) 10,45 ± 0,48
a
17,62 ± 0,26
b
14,50 ± 0,41
c
20,55 ± 3,92
b
Intervalo PR (ms) 26,72 ± 1,44
a
32,94 ± 1,31
b
30,30 ± 1,11
c
31,69 ± 2,22
b
Complexo QRS (ms) 10,10 ± 0,44
11,46 ± 0,47 10,93 ± 1,12 11,58 ± 0,67
Intervalo QT (ms) 17,60 ± 1,14
a
30,07 ± 3,63
b
27,96 ± 0,83
b
29,49 ± 2,45
b
Onda T (ms) 7,50 ± 0,80
a
18,61 ± 3,38
b
17,01 ± 0,77
b
17,86 ± 2,06
b
(N =10) (N=8) (N=5) (N =7)
wt KS wt+PTU KS+PTU
Parâmetros Grupos Experimentais
45
Figura 7: Eletrocardiograma representativo de camundongos selvagens
conscientes tratados com PTU.
A. Animal selvagem tratado com veículo. B. Animal
selvagem tratado com PTU 0,15 % durante 4 semanas. C. Segmento ampliado dos registros
apresentados anteriormente, à esquerda segmento correspondente à figura A e à direita
correspondente à figura B.
50 ms
0,2 mV
0,25 mV
100 ms
50 ms
0,2 mV
100 ms
0,25 mV
C
C
B
B
A
A
46
50 ms
0,2 mV
100 ms
0,25 mV
100 ms
0,25 mV
50 ms
0,2 mV
C
C
A
A
B
B
Figura 8: Eletrocardiograma representativo de camundongos KS
conscientes tratados com PTU.
A. Animal KS tratado com veículo. B. Animal KS
tratado com PTU 0,15 % durante 4 semanas. C. Segmento ampliado dos registros apresentados
anteriormente, à esquerda segmento correspondente à figura A e à direita correspondente à
figura B.
47
IV.3- Dosagem da concentração sérica do TSH
A concentração de TSH dos animais KS é similar à dos animais selvagens (Wt:
78 ± 4 ng/mL e KS: 81 ± 3 ng/mL). Após o tratamento com PTU 0,15% durante 4
semanas os animais selvagens e KS apresentaram aumento significativo na
concentração de TSH, superior a 5 vezes à dos animais normais (ultrapassando a
sensibilidade de detecção da técnica). Estes dados confirmam o estado hipotireoideo
dos animais tratado com PTU.
IV.4- Avaliação do mRNA das Conexinas 40 e 43 no coração de camundongos KS
A expressão do mRNA das conexinas foi avaliada por RT-PCR semi-
quantitativo, utilizando o GAPDH como controle interno. Nas figuras 9, 10 e 11
mostramos curvas obtidas com diferentes números de ciclos e com diferentes
concentrações de RNA demonstrando a adequação das condições empregadas para as
análises, uma vez que estas foram realizadas dentro da faixa de linearidade do ensaio
(para a Cx40 - 26 ciclos utilizando 150 ng de RNA total de átrio e para a Cx43 - 25
ciclos e 100 ng de RNA e 21 ciclos e 200 ng de RNA total de átrio e ventrículo,
respectivamente).
A análise da expressão para a Cx40 no átrio dos camundongos KS eutireoideos
demonstrou diminuição na expressão do mRNA. Esta representa apenas 20% da
expressão dos animais selvagens (p<0,001), Figura 12.
48
A expressão do mRNA da Cx43 no átrio e no ventrículo dos animais KS
eutireoideos foi avaliada e nenhuma alteração significativa foi observada quando
comparada aos animais selvagens (Figuras 13 e 14, respectivamente).
IV.5- Avaliação do mRNA das Conexinas 40 e 43 no átrio de camundongos
selvagens e KS hipotireoideos
Os animais selvagens submetidos ao quadro de hipotireoidismo sistêmico
apresentaram diminuição de aproximadamente 25% na expressão do mRNA da Cx40
em relação a expressão nos animais selvagens eutireoideos (p<0,05).
A expressão do mRNA da Cx40 nos animais KS tratados durante 4 semanas com
PTU 0,15% foi similar a expressão da Cx40 dos animais KS eutireoideos.
Nenhuma alteração foi observada ao compararmos a expressão atrial do mRNA
da Cx43 entre os animais selvagens eu- e hipotireoideos (Figura 13).
O tratamento dos animais KS com PTU 0,15% durante 4 semanas não alterou de
forma significativa a expressão atrial do mRNA da Cx43 (Figura 13).
49
Figura 9: Ensaio de RT-PCR em átrio de camundongo utilizando
iniciadores para a Cx40 e GAPDH. A.
Gel de agarose 1,5% com produtos da reação
com 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 e 36 ciclos utilizando 1μg de RNA (Curva de Ciclos). PM,
padrão de peso molecular.
B. Gráfico da análise densitométrica do gel observado em A. C.
Gel de agarose 1,5% com produtos da reação utilizando 62,5, 125, 250, 500, 1000 ng de
RNA na realização de RT (Curva de Massa) em um PCR com 26 ciclos.
D. Gráfico da
análise densitométrica do gel observado em C.
62,5
125
250 500 1000PM
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
20 22 24 26 28 30 32 34 36 38
GAPDH
Cx40
Ciclos
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
Concentração de RNA (ng)
GAPDH
Cx40
22 24 26
28
30 32 34PM
36
Cx40
GAPDH
A
A
B
B
C
C
D
D
Log dos valores densitométricos
Log dos valores densitométricos
GAPDH
Cx40
50
Figura 10: Ensaio de RT-PCR em átrio de camundongo utilizando
iniciadores para a Cx43 e GAPDH. A.
Gel de agarose 1,5% com produtos da reação
com 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 ciclos utilizando 1μg de RNA (Curva de Ciclos). PM, padrão
de peso molecular.
B.
Gráfico da análise densitométrica do gel observado em A.
C.
Gel de
agarose 1,5% com produtos da reação utilizando 62,5, 125, 250, 500, 1000 ng de RNA na
realização de RT (Curva de Massa) em um PCR com 25 ciclos.
D.
Gráfico da análise
densitométrica do gel observado em C.
62,5
125
250 500 1000PM
24 28 26
30
32 34 36PM
Cx43
GAPDH
A
A
GAPDH
Cx43
C
C
GAPDH
Cx43
B
B
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
20 22 24 26 28 30 32 34 36 38
C
G
Ciclos
Cx43
GAPDH
D
D
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
Concentração de RNA (ng)
Log dos valores densitométricos
Log dos valores densitométricos
51
Figura 11: Ensaio de RT-PCR em ventrículo de camundongo utilizando
iniciadores para a Cx43 e GAPDH. A.
Gel de agarose 1,5% com produtos da reação
com 18, 20, 22, 24, 26, 28 ciclos utilizando 1μg de RNA (Curva de Ciclos). PM, padrão de
peso molecular.
B.
Gráfico da análise densitométrica do gel observado em A.
C.
Gel de
agarose 1,5% com produtos da reação utilizando 62,5, 125, 250, 500, 1000 ng de RNA na
realização de RT (Curva de Massa) em um PCR com 21 ciclos.
D.
Gráfico da análise
densitométrica do gel observado em C.
Cx43
GAPDH
18
20 22 24
26 28
PM
A
A
GAPDH
Cx43
62,5 125 250 500 1000
PM
C
C
Ciclos
GAPDH
Cx43
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
16 18 20 22 24 26 28 30
B
B
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
0 200 400 600 800 1000
Concentração de RNA (ng)
D
D
Log dos valores densitométricos
Log dos valores densitométricos
Cx43
GAPDH
52
Figura 12: Expressão do mRNA da Conexina40 em átrio de camundongos
selvagens e KS tratados ou não com PTU 0,15%.
A. Gel de agarose 1,5%
representativo do PCR utilizando iniciadores para a Cx40 e GAPDH. PM, padrão de peso
molecular; Coluna 1: animal wt eutireoideo; Coluna 2: animal KS eutireoideo; Coluna 3: animal
wt tratado durante 4 semanas com PTU 0,15% e Coluna 4: animal KS tratado durante 4 semanas
com PTU 0,15%. B. Gráfico da média da razão dos valores densitométricos Cx40/GAPDH
relativo ao wt. wt n= 7; KS n=6; wt + PTU n=4; KS + PTU n=4. As barras indicam a média ±
desvio-padrão. Letras diferentes correspondem a médias estatísticamente diferentes.
PM1234
Cx40
Cx40
GAPDH
GAPDH
A
A
B
B
Média da Razão Cx40/GAPDH
relativa ao wt
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
wt
KS
wt+PTU KS+PTU
c
b
b
a
53
Figura 13: Expressão do mRNA da Conexina43 em átrio de
camundongos selvagens e KS tratados ou não com PTU 0,15%.
A. Gel de
agarose 1,5% representativo do PCR utilizando iniciadores para a Cx43 e GAPDH. PM,
padrão de peso molecular; Coluna 1: animal wt eutireoideo; Coluna 2: animal KS
eutireoideo; Coluna 3: animal wt tratado durante 4 semanas com PTU 0,15 % e Coluna 4:
animal KS tratado durante 4 semanas com PTU 0,15%. B. Gráfico da média da razão dos
valores densitométricos Cx43/GAPDH relativo ao wt. wt n= 7; KS n=6; wt + PTU n=4; KS
+ PTU n=4. As barras indicam a média ± desvio-padrão.
PM 1 2 3 4
Cx43
Cx43
GAPDH
GAPDH
A
A
B
B
Média da Razão Cx43/GAPDH
relativa ao wt
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
wt
KS
wt+PTU KS+PTU
54
Figura 14: Expressão do mRNA da Conexina43 no ventrículo de
camundongos selvagens e KS eutireoideos.
A. Gel de agarose 1,5% representativo do
PCR utilizando iniciadores para a Cx43. PM, padrão de peso molecular. B. Gráfico da média da
razão dos valores densitométricos Cx43/GAPDH relativo ao wt. wt n=3; KS n=3. As barras
indicam a média ± desvio-padrão.
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Média da Razão Cx43/GAPDH
relativa ao wt
Cx43
Cx43
GAPDH
GAPDH
A
A
B
B
PM wt
KS
wt
KS
55
V- DISCUSSÃO
Alterações nas concentrações plasmáticas de hormônio tireoideano produzem
vários efeitos sobre o sistema cardiovascular. Estes efeitos são observados através de
alterações na hemodinâmica, incluindo freqüência cardíaca, débito cardíaco e
resistência vascular periférica (Klein & Ojamaa, 2001).
A caracterização dos efeitos diretos do hiper- ou hipotireoidismo sobre a função
cardíaca é dificultada devido às alterações que ocorrem paralelamente no sistema
vascular e se refletem na hemodinâmica cardíaca por alterações na pré- e pós-carga.
Com objetivo de caracterizar a ação específica do hormônio tireoideano,
mediada pelo TR, sobre as células cardíacas foi desenvolvido um modelo de
camundongo transgênico que possui expressão cardíaca específica de um TR mutado.
Este animal possui um fenótipo de hipotireoidismo cardíaco na presença de
concentração sérica normal de HT (Pazos-Moura et al., 2000). Esta linhagem de
camundongos denominada KS, superexpressa um TR com deleção do aminoácido
treonina na posição 337 do TRβ
1
, sob a regulação do promotor cardíaco-específico, α-
MHC. Esta mutação torna o receptor incapaz de se ligar ao T
3
, agindo como um
dominante negativo (Pazos-Moura et al., 2000).
Os animais KS apresentam alteração no padrão de expressão das isoformas da
cadeia pesada da miosina, independente da concentração sérica de hormônio
tireoideano, que corresponde ao padrão associado ao hipotireoidismo. O tratamento com
T
3
para indução de hipertireoidismo, não foi capaz de induzir aumento na expressão da
isoforma α e reprimir a isoforma β como era esperado. Estes resultados confirmam a
resistência do tecido cardíaco ao HT (Pazos-Moura et al., 2000).
56
Nossos resultados demonstram que os animais KS são bradicárdicos: têm
freqüência cardíaca 30% menor que os animais selvagens (Tabela 3). Esta diminuição
deve ocorrer principalmente por alteração na expressão dos genes HCN2 e 4. Estes
genes codificam canais responsáveis pela corrente marcapasso, I
f
. Gloss e
colaboradores, em 2001, demonstraram que a expressão desses genes é alterada em
função da concentração sérica de hormônio tireoideano, portanto a diminuição da
expressão desses genes pode estar relacionada com a indução da bradicardia no
hipotireoidismo (Gloss et al., 2001).
Os registros eletrocardiográficos dos animais KS demonstraram alterações
semelhantes às descritas em pacientes e roedores hipotireoideos. Os animais KS
apresentaram aumento na duração das ondas P e T e dos intervalos PR e QT, semelhante
aos animais selvagens hipotireoideos (Tabela 3). Esses dados sugerem lentificação da
condução do impulso elétrico entre as células cardíacas.
O comportamento eletrofisiológico normal do coração é determinado por uma
propagação ordenada do estímulo excitatório que resulta em despolarização rápida e
repolarização lenta, ocasionando potenciais de ação nas células cardíacas. Alterações na
geração do impulso elétrico, em sua propagação ou na duração do potencial de ação das
células cardíacas constituem a base da desorganização do ritmo cardíaco. A atividade
integrada de correntes iônicas específicas gera o potencial de ação, e genes cuja
expressão resulta na expressão de componentes moleculares destes canais iônicos são
alvo da regulação pelo hormônio tireoideano.
O intervalo QT representa a duração do potencial de ação ventricular, este
intervalo se inicia com o complexo QRS e termina ao fim da onda T. Os animais KS
não apresentam alteração na duração do complexo QRS, mas apresentam aumento
57
significativo da duração da onda T, ou seja, aumento do tempo de repolarização
ventricular. Este prolongamento pode estar relacionado a alterações na expressão de
canais de potássio, voltagem-dependentes, como tem sido demonstrado em modelo de
ratos e camundongos hipotireoideos. Já foi demonstrado que o hipotireoidismo reduz
transcritos de subunidades de canais de potássio, como Kv4.2, 2.1 e 1.5 (Gloss et al.,
2001; Bouter et al., 2003), acarretando diminuição das correntes I
TO
(corrente transiente
de efluxo) e I
K
(retificador retardado). Alterações na corrente de cálcio também podem
acarretar mudanças na repolarização, e o hormônio tireoideano regula de forma positiva
a expressão do canal de cálcio do tipo L (Bouter et al., 2003).
Apesar de haver bastantes estudos acerca dos efeitos dos hormônios tireoideanos
sobre a função ventricular, se conhece bem menos a respeito do papel deste hormônio
nos cardiomiócitos atriais. Recentemente, Sunagawa et al., (2005) caracterizaram a
eletrofisiologia de miócitos atriais sob efeito do hormônio tireoideano. Utilizando a
técnica de patch-clamp, estes autores demostraram que ratos tratados com hormônio
tireoideano apresentam alterações nas propriedades elétricas dos miócitos atriais,
incluindo encurtamento da duração do potencial de ação. Neste estudo não foram
observadas mudanças nas correntes I
Na
e I
K1
(retificador de influxo), no entanto, houve
diminuição da densidade de I
Ca(L)
e aumento da densidade de I
K
. Desta forma, as
alterações nestas correntes podem ser responsáveis pelo encurtamento do potencial de
ação induzido pelo tratamento com T
4
.
A propagação da atividade elétrica no miocárdio depende da transferência
intercelular de correntes elétricas que ocorre via junções comunicantes. A conexina43,
mais expressa no miocárdio de trabalho (Gros & Jogsma, 1996), e a conexina40
58
principal conexina do sistema de condução (Gros & Jogsma, 1996; Simon et al., 1998;
Kirchhoff et al., 1998), são consideradas as principais conexinas do coração.
Animais heterozigotos para Cx43 apresentam lentificação do impulso no
ventrículo (Thomas et al., 1998). Experimentos de transfecção transiente e mutagênese
sítio-dirigida demonstraram a presença de regiões responsivas ao hormônio tireoideano
no promotor da Cx43. Neste mesmo trabalho foi observado que o tratamento com uma
única dose de T
4
é capaz de aumentar a expressão de mRNA para Cx43 no fígado de
ratos; no entanto, não foi observada alteração no mRNA para Cx43 no coração desses
animais (Stock & Sies, 2000).
Nós investigamos a expressão do mRNA para Cx43 no coração dos animais KS.
Ao invés de avaliarmos a expressão desta conexina no coração total, separamos átrio e
ventrículo e analisamos a expressão nos dois tecidos isoladamente. O resultado obtido
no átrio e no ventrículo dos animais transgênicos não indica alteração na expressão da
Cx43 (Figuras 13 e 14, respectivamente). A expressão atrial do mRNA da Cx43
também não foi alterada pelo hipotireoidismo sistêmico (Figura 13). Este resultado
concorda com outro estudo no qual se estudou ventrículos de ratos hipotireoideos
(Bouter et al., 2003). Este resultado reforça a idéia de que o prolongamento do intervalo
QT está relacionado com alterações na expressão de canais de potássio.
A propagação do impulso elétrico entre átrio e ventrículo é mais lenta que o
normal em camundongos knockout para Cx40 (Simon et al., 1998; Kirchhoff et al.,
1998). Além disso, foi verificado que esses mesmos animais apresentam velocidade de
condução atrial reduzida e maior vulnerabilidade a arritmias atriais (Verheule et al.,
1999; Hagendorff et al., 1999). Recentemente foi demonstrado que camundongos
knockout para Cx40 não apresentaram modificações no potencial de repouso da
59
membrana, na amplitude do potencial de ação, ou na duração deste potencial, que são
semelhantes aos das células atriais dos animais selvagens (Bagwe et al., 2005). Estes
dados reforçam a importância da Cx40 na propagação do estímulo elétrico entre as
células atriais.
Ratos ou camundongos hiper ou hipotireoideos não apresentam modificações na
densidade da I
Na
nem na expressão desses canais, seja no átrio ou no ventrículo (Bouter
et al., 2003; Sunagawa et al., 2005), o que descarta o envolvimento de alterações do
canal de sódio com as modificações induzidas na despolarização atrial pela falta ou
excesso de HT.
A semelhança entre os fenótipos eletrocardiográficos encontrados nos animais
knockout para Cx40, nos animais KS ou com hipotireoidismo sistêmico - prologamento
da onda P e do intervalo PR - nos levou a investigar a expressão desta conexina no átrio
dos camundongos KS e dos selvagens com hipotireoidismo sistêmico.
Nosso trabalho demonstra, pela primeira vez, que há diminuição muito
importante do mRNA para Cx40 no átrio de camundongos hipotireoideos (Figura 12).
No modelo de hipotireoidismo cardíaco seletivo há prolongamento da onda P e do
intervalo PR e a expressão atrial do mRNA da Cx40 é apenas 20% da expressão
encontrada nos animais selvagens (Figura 12).
As alterações na condução elétrica e na expressão atrial da Cx40 são observadas
nos dois modelos de hipotireoidismo (cardíaco seletivo e sistêmico), no entanto os
efeitos são mais intensos nos animais transgênicos. Este fato pode ser explicado pela
atuação como dominante negativo, associada à superexpressão cardíaca do TRβ
1
(Δ337T). Pazos-Moura e colaboradores, em 2000, demonstraram que a expressão
cardíaca do mutante TRβ
1
(Δ337T) é 4 vezes maior que a expressão do TRβ
1
endógeno.
60
A presença do TR mutante nos cardiomiócitos inibe a sinalização do T
3
mediada pelos
TRs endógenos, uma vez que ele não se liga ao T
3
e compete com os TRs pela ligação
ao DNA e interação com os co-estimuladores do processo de transcrição (Usala et al.,
1991; Baniahmad et al., 1992). Os efeitos desta situação são mais drásticos do que os
observados quando há apenas redução do ligante (T
3
), nos animais com
hipotireoidismo sistêmico.
O comprometimento da sinalização do T
3
mediada pelo TR nos cardiomiócitos
dos animais KS pode ser tão intenso que nenhuma alteração foi observada ao
submetermos estes animais a uma situação de hipotireoidismo sistêmico (Tabela 4 e
Figura 12).
Os dados apresentados na literatura, somados aos nossos, nos fazem crer que a
lentificação da propagação do impulso elétrico, caracterizada pelo aumento de duração
da onda P e do intervalo PR nos modelos de hipotireoidismo sistêmico e cardíaco
seletivo que estudamos, pode ser atribuído, pelo menos em parte, à diminuição atrial da
expressão da Cx40.
Os nossos dados também demonstram que a expressão atrial da Conexina40 é
estimulada por hormônios tireoideanos atuando via seus receptores nucleares, ou seja,
descrevemos um novo gene regulado positivamente pelo hormônio tireoideano.
O efeito do T
3
sobre a transcrição do gene da Cx40, pode ser um efeito direto,
por ligação dos TRs à região promotora deste gene, ou indireto, agindo sobre fatores
transcricionais específicos que interagem com a região promotora da Cx40 regulando
sua atividade transcricional.
61
VI- CONCLUSÃO
O mRNA do gene da Conexina40, mas não da 43, é alvo de estímulo dos
hormônios tireoideanos, atuando diretamente nos cardiomiócitos atriais vias seus
receptores nucleares.
A redução da condução atrial que ocorre no hipotireoidismo pode ser atribuída
em grande parte pela redução da expressão da Conexina40, que compromete o
acoplamento entre os cardiomiócitos atriais.
62
VII- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Abel, ED; Boers, ME; Pazos-Moura, CC; Moura, E; Kaulbach, H; Zakaria, M;
Lowell, B; Radovick, S; Liberman, MC & Wondisford, F, 1999. Divergent roles for
thyroid hormone receptor β isoforms in the endocrine axis and auditory system. J Clin
Invest, 104: 291-300.
Ailhaud, G; Grimald, P & Negrel, R, 1992. Cellular and molecular aspects of adipose
tissue development. Annu Rev Nutr, 12: 207-233.
Ashworth, P & Hinkle, PM, 1996. Tryrotropin-release hormone-induced intracellular
calcium responses in individual rat lactotrophs and thyrotrophs. Endocrinology, 137
(12): 5205-12.
Bachman, ES; Hampton, TG; Dhillon, H; Amende, I; Wang, J; Morgan, JP &
Hollenberg, AN, 2004. The metabolic and cardiovascular effects of hyperthyroidism
are largely independent of β-adrenergic stimulation. Endocrinology, 145 (6): 2767-74.
Bagwe, S; Berenfeld, O; Vaidya, D; Morley, GE & Jalife, J, 2005. Altered right
atrial excitation and propagation in connexin40 knockout mice. Circulation, 112: 2245-
53.
Baniahmad, AB; Tsai, SY; O Malley, BW & Tsai, M-j, 1992. Kindred S family
thyroid receptor is an active and constitutive silencer and a repressor for thyroid
hormone and retinoic acid responses. Proc Natl Acad Sci, 89: 10633-37.
Beblo, DA; Wang, HZ; Beyer, EC; Westphale, EM & Veenstra, RD, 1995. Unique
conductance, gating, and selective permeability properties of gap junction channels
formed by connexin 40. Circ Res 77, 813-822.
63
Bigler, J & Eisenman, RN, 1995. Novel location and function of a thyroid hormone
response element. EMBO J, 14: 5710-5723.
Bierhuizen, MFA; Van Amersfoorth, SCM; Groenewegen, WV; Saskia, V &
Jogsma, HJ, 2000. Characterization of the rat connexin40 promoter: two Sp1/Sp3
binding sites contribute to transcriptional activation. Cardiovascular Research 46, 511-
522.
Bouter, Sl; Demolombe, S; Chambellan, A; Bellocq, C; Aimond, F; Toumaniantz,
G; Lande, G; Siavoshian, S; Baró, I; Pond, AL; Nerbonne, JM; Léger, JJ;
Escande, D & Charpentier, F, 2003. Microarray analysis reveals complex remodeling
of cardiac ion channel expression with altered thyroid status. Circ Res, 92:234-242.
Bruneau, BG; Nemer, G; Schimitt, JP; Charron, F; Robitaille, L; Caron, S, 2001.
A murine Model of Holt-Oram syndrome defines roles of the T-box transcription factor
Tbx5 in cardiogenesis and disease. Cell, 106: 709-721.
Bruzzone, R; White, TW & Goodenough, DA, 1996. The cellular internet: on-line
with connexins. BioEssays 18 (9), 709-718.
Buratowisk, S; Sopta, M; Greenblat, J & Sharp, P, 1991. RNA polimeraseII
associated proteins are required for a DNA conformation change in the transcription
initiation complex. Proc Natl Acad Sci USA, 88: 7509-7513.
Chard, T, 1987. An introduction to radioimunoassay and related tecniques In Burdon,
RH & van Kinippenberg, PH (editors). Tecniques in biochemistry and molecular
biology, vol 6, cap 2, p 1-37.
Dudley, SC Jr & Baumgarten, CM, 1993. Bursting of cardiac sodium channels after
acute exposure to 3,5,3`-triiodo-L-thyronine. Circ Res 73: 301-313.
64
Echetebu, CO; Ali, M; Izban, MG; MacKay, L & Garfield, RE, 1999. Localization
of regulatory protein binding sites in the proximal region of human myometrial
connexin43 gene. Mol Hum Reprod, 5: 757-766.
Elfgang, G; Eckert, R; Lichtenberg-Fraté, H; Butterweck, A; Traub, O, Klein,
RA; Hulser, DF & Willecke, K, 1995. Specific permeability and selective formation of
gap junction channels in connexin-transfected Hella cells. J Cell Biol 129, 805-817.
Gauthier, K; Chassande, O; Plateroti, M; Roux, JP; Legrand, C; Pain, B; Rousset,
B; Weiss, R; Trouillas, J & Samarut, J, 1999. Different functions for the thyroid
hormone receptors Trα and TRβ in the control of thyroid hormone production and post-
natal development. EMBO J; 18(3):623-631.
Gauthier, K; Plateroti, M; Harvey, CB; Williams, GR; Weiss, RE; Refetoff, S;
Willott, JF; Sundin, V; Roux, JP; Malaval, L; Hara, M; Samaruti, J & Chassande,
O, 2001. Genetic analysis reveals different function for the products of the thyroid
hormone receptor α locus. Molecular and Cellular Biology, 21(14): 4748-4760.
Gilbert, MT; Sun, J; Yan, Y; Oddux, C; Lazarus, A; Tansey, WP; Lavin, TN &
Cantarazo, DF, 1994. Renin gene promoter activity in CC cells is regulated by cAMP
and thyroid hormone through Pit-1-dependent mechanisms. Journal of Biological
Chemistry, 269: 28049-28054.
Gloss, B; Trost, SU; Bluhm, WF; Swanson, EA; Clark, R; Winkfein, R; Janzen,
KM; Giles, W; Chassende, O; Samarut, J & Dillmann, WH, 2001. Cardiac ion
channel expression and contractile function in mice with deletion of thyroid hormone
receptor α or β. Endocrinology, 142: 544-550.
65
Gourdie, RG; Green, CR & Serves, NL, 1991. Gap junction distribuition in the adult
mammalian myocardium revealed by na laser scanning confocal microscop. J Cell Sci
99, 41-55.
Gros, D; Jarry-Guichard, T; Velde, IT; Maziere, A; Van Van Kempen, MJA;
Davoust, J; Briand, JP; Moormna, AFM & Jongsma, HJ, 1994. Restrict
distribuition of connexin 40, gap junction protein, in mammalian heart. Circ Res 74 (5),
839-845
Grossmann, M; Weintraub, BD & Szkudlinski, MW, 1997. Novel insights into the
molecular mechanisms of human thyrotropin action: structural, physiological, and
therapeutic implications for the glicoprotein hormone family. Endocrine Reviews, 18
(4): 476-501.
Guerrero, PA; Schuessler, RB & Davis, LM, 1997. Slow ventricular conduction in
mice heterozygous for a connexin43 null mutation. J Clin Invest, 99: 1991-1998.
Gu, W & Roeder, RG, 1997. Activation of p53 sequence-specific DNA binding by
acetylation of the p53 C-terminal domain. Cell, 90: 595-606.
Haefliger, JÁ; Bruzzone, R; Jenkins, NA; Gilbert, DJ; Copeland, NG & Paul, DL,
1992. Four novel members of the connexin family of gap junction proteins. J Biol Chem
267, 2057-2064.
Hervé J-C, 2004. The connexins. Biochimica et Biophysica Acta 1662: 1-2.
Hu, LW; Benvenuti, LA; Liberti, EA; Carneiro-Ramos, MS & Barreto-Chaves,
MLM, 2003. Thyroxine-induced cardiac hypertrophy: influence of adrenergic nervous
system versus renin-angiotensin system on myocyte remodeling. Am J Physiol Regul
Integr Comp Physiol, 285: R1473-R1480.
66
Jiang, JX & Goodenough, DA, 1996. Heteromeric connexons in lens gap junction
channels. Proct Natl Acad Sci USA 93, 1287-1291.
Johansson, C; Göthe, S; Frrest, D; Vennström, B & Thorén, P, 1999.
Cardiovascular phenotype and temperature control in mice lacking receptor-β or both
α
1
and
β. Am J Physiol, 276: H2006-2012.
Kanter, HL; Saffitz, JE & Beyer, SC, 1992. Cardiac myocytes express multiple gap
junction proteins. Circ Res, 70: 438-444.
Kasahara, H; Wakimoto, H; Liu, M; Maguire, CT; Converso, KL; Shioi, T;
Huang, W-Y; Manning, WJ; Paul, D; Lawitts, L; Berul, CI & Izumo, S, 2001.
Progressive atrioventricular conduction defects and heart failure in mice expressing a
mutant Csx/Nkx2.5 homeoprotein. JCI 108, 189-201.
Kinugawa, K; Minobe, WA; Wood, WM; Ridgway, EC; Baxter, JD; Ribeiro, RCJ;
Tawadrous, MF; Lowes, BA; Long, CS & Bristow, MR, 2001(b). Signaling
pathways responsible for fetal gene induction in failing human heart evidence for
altered thyroid hormone receptor gene expression. Circulation, 103 1089-1094.
Kinugawa, K; Yonekura, K; Ribeiro, RCJ; Eto, Y; Aoyagi, T; Baxter, JD;
Camacho, AS; Bristow, MR; Long, CS & Simpson, PC, 2001(a). Regulation of
thyroid hormone receptor isoforms in physiological and pathological cardiac
hypertrophy. Circ Res; 89 591-598.
Kirchhoff, S; Nelles, E; Hagendorff, A; Kruger, O; Traub, O & Willecke, K, 1998.
Reduced cardiac conduction velocity and predisposition ta arrhythmias in connexin 40-
deficient mice. Curr Biol 8, 299-302.
Klein, I & Ojamaa, K, 2001. Thyroid hormone and the cardiovascular system. N.
Engl. J. Med. 334 (97): 501-509.
67
Kobori, H; Ichihara, A; Miyashita, Y; Hayashi, M & Saruta, T, 1999. Local renin-
angiotensin system contributes to hyperthyroidism-induced cardiac hypertrophy. J
Endocrinol, 160: 43-47.
Koehrle, J, 1994. Thyroid hormone deionation in target tissue – a regulatory role for
the trace element selenium? Exp Clin endocrinol, 102: 63-89.
Konig, N & Zampighi, G, 1995. Purification of a bovine lens cell-to-cell channels
composed of connexin 44 and connexin 50. J Cell Sci 108, 3091-3098.
Kumar, NM & Gilula, NB, 1992. Molecular biology and genetics of gap junction
channels. Semin Cell Biol 3, 3-16.
Kumar, NM & Gilula, NB, 1996. The gap junction communication channel. Cell 84,
381-388.
Larsen , PR; Davies, TF & Hay, ID, 1998. The thyroid gland. In: Wilson, JD; Foster,
DW; Kronenberg, HM & Larsen, PR eds Williams Texbook of Endocrinology 9
th
ed
W.b. Saunders Company, Phyladelphia: 389-515.
Lazar, MA; Hodin, RA; Cardona, GR & Chin, WW, 1990. Gene expression fron the
c-erbAa/Rev-erbAa genomiclocus: potential regulation of alternative splicing by
complementary transcripts from opposite DNA strands. J Biol Chem, 265:12859-63.
Leonard, Jl & Korhe, J, 1996. Intracellular pathways of iodothyronine metabolism. In
Braverman, LE & Utiger, RD eds, The Thyroid – A Fundamental and Clinical Text 7
th
ed, Phyladelphia: 125-161.
Linhares, VLF; Almeida, NAS; Cabral, DM; Elliot, DA; Lai, D; Beyer, EC;
Campos de Carvalho, AC & Costa, MW, 2004. Transcription regulation of the
murine Connexin40 promoter by cardiac factors Nkx2-5, GATA4 and Tbx5.
cardiovascular Research, 64: 402-411.
68
Lo, CW; Waldo, KL & Kirby, ML, 1999. Gap junction comunication and modulation
of cardiac neural crest neural. Trends Cardiovasc Med, Apr-May 9 (3-4): 63-69.
Loewenstein, WR, 1981. Junctional intercellular communication: the cell-to-cell
membrane channel. Physiol Ver 61, 829-913.
Mitchell, JA; Ou, CV; Chen, ZQ, Nishimura & Lye, SJ, 2001. Parathyroid hormone-
induced up-regulation of connexin-43 messenger ribonucleic acid (mRNA) is mediated
by sequences within both the promoter and the 3V-untranslated region of the mRNA.
Endocrinology, 142: 907-915.
Nagayama, Y & Nagataki, S, 1994. The thyrotropin receptor: its gene expression and
structure-function relationships. Thyroid today, 17 (2): 1-9.
Ojamaa, K; Klemperer, JD & Klein I, 1996. Acute effects of thyroid hormone on
vascular smooth muscle. Thyroid 6: 505-512.
Oppenheimer, JH; Schwartz, HL; Lane, JT & Thonpson, MP, 1991. Functional
relationship of thyroid hormone-induced lipogenesis, lipolysis and thermogenesis in the
rat. J Clin Invest, 87:125-132.
Ortiga-Carvalho, TM; Hashimoto, K; Pazos-Moura, CC; Geenen, D; Cohen, R;
Lang, RM & Wondisford, FE, 2003. Thyroid hormone resistance in the heart: role of
the thyroid hormone receptor β isoform. Endocrinology, 145(4): 1625-1633.
Pachucki, J; Burmeister, LA & Larsen, PR, 1999. Thyroid hormone regulates
hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel (HCN2) mRNA in the rat
heart. Circ Res, 85: 498-503.
Pazos-Moura, CC; Abel, ED; Boers, ME; Moura, E; Hampton, TG; Wang, J;
Morgan, JP & Wondisford, FE, 2000. Cardiac Dysfunction Caused by Miocardium-
Specific Expression of a Mutant Thyroid Hormone Receptor. Circ Res, 86: 700-706.
69
Pereira Jr, PP; Chaves, EA; Costa e Sousa, RH; Masuda, MO; Campos de
Carvalho, AC & Nascimento, JHM, 2006. Cardiac autonomic dysfunction in rats
chronically treated with anabolic steroid. Eur J Appl Physiol, 96: 487-494.
Plateroti, M; Chassande, O; Fraichard, A; Gauthier, K; Freund, JN; Samarut, J &
Kedinger, M, 1999. Involvement of T3Rα- and β-receptor subtypes in mediation of T3
functions during post-natal murine intestinal development. Gastroenterology, 116:
1367-1378.
Polontchouk, L; Haefliger, JA; Ebelt, B; Schaefer, T; Stuhlmann, D; Mehlhorn, U
& Kuhn-Regnier, F, 2001. Effects of chronic atrial fibrillation on gap junction
distribution I human and rat atria. J Am Coll Cardiol, 38: 883-891.
Rabie, A & Legrand, J, 1973. Effects of thyroid hormone and undernour-ishiment on
the amount synaptosomal fraction in the cerebellum of the young rat. Brain Res, 61:
267-278.
Reaume, AG; de Sousa, PA; Kulkarni, S; Langille, BL; Zhu, D; Davies, TC;
Juneta, SC; Kidder, GM & Rossant, J, 1995. Cardiac malformation in neonatal mice
lacking connexin43. Science, 267: 1831-1834.
Refetoff, S; Weiss, RE & Usula, SJ, 1993. The syndromes of resistance to thyroid
hormone. Endocrine Reviews, 14(3): 348-399.
Rubin, JB; Verselis, VK; Bennet, MVL & Bargiello, TA, 1992. A domain
substituition procede and its use to analyze voltage dependence of homotypic gap
junctions formed by connexin 26 and 32. Proc Natl Acad Sci USA 89, 3820-3824.
Sambrook, J; Fritsch, EF & Maniatis, T, 1989. Molecular Cloning – A Laboratory
Manual- 2
th
ed, Cold Spring Harbor Laboratory (editors) vol 1, p E.5.
70
Scanlon, MF & Toft, AD, 1996. Regulation of thyrotropin secretion In Braverman, LE
& Utiger, RD (editors). The thyroid: A fundamental and clinical Text (7ª ed).
Lippincott-Raven, Nova York, cap 12, 220-240.
Sernia, C; Marchant, C; Brown, L & Hoey, A, 1993. Cardiac angiotensin receptors is
experimental hyperthyroidism in dogs. Circ Res, 27: 423-428.
Siardi, A; Falasca, P & Civitareale, D, 1994. The thyroid hormone inhibits the
thirotropin receptor promoter activity: evidence for a short loop regulation. Biochem
Biophys Res commun, Nov 30; 205 (1): 230-237.
Simon, AM; Goodenough, DA; Li, E & Paul, DL. Mice lacking connexin 40 have
cardiac conduction abnormalities characteristic of atrioventricular block and bundle
branch block. Curr Biol 8, 295-298
Shupnick, MA; Ridgway, EC & Chin, WW, 1989. Molecular biology of thyrotropin.
Endocrinology Reviews, 10 (4): 459-475.
Stock, A & Sies H, 2000. Thyroid hormone receptors bind to an element in the
connexin43 promoter. Biol Chem, 2000: 973-979.
Suchyna, TM; Xu, LX; Gao, F; Fourtner, CR & Nicholson, BJ, 1993. Identification
of a proline residue as a transduction element involved in voltage gating of gap
junctions. Nature 365, 847-849.
Sunagawa, M; Munesada, Y; Yamakawa, M; Shimabukuro, M; Higa, N; Takasu,
N & Kosugi, T, 2005. Eletrophysiologic characteristics of atrial myocytes in levo-
thyroxine-treated rats. Thyroid, 15(1): 3-11.
Swanson, EA; Gloss, B; Belke, DD; Kaneshige, M; Cheng, SY & Dillmann, WH,
2003. Cardiac expression and function of thyroid hormone receptor β and its PV
mutant. Endocrinology, 144:4820-4825.
71
Teunissen, BEJ & Bierhuizen, MFA, 2004. Transcription control of myocardial
connexins. Cardiovascular Research, 62: 246-255.
Tribulova, N; Shneyvaays, V; Mameodova, LK; moshel, S; Zinman, T; Shainberg,
A; Manoach, M; Weismann, P & Kostin, S, 2004. Enhanced connexin-43 and α-
sarcomeric actin expression in cultured heart myocytes exposed to triiodo-L-thyronine.
Journal of Molecular Histology, 35: 463-470.
Thomas, SA; Richard, B; Berul, CI, Beardslee, MA, Beyer, EC, Mendelsohn,
ME& Saffitz, JE, 1998. Disparate effects of deficient expression of Connexin43 on
atrial and ventricular conduction: evidence for chamber-specific molecular determinants
of conduction. Circulation, 97: 686-691.
Usala, SJ; Menke, JB; Watson, TL; Wondisford, FE; Weintraub, BD, Bérard, J;
Bradley, WEC; Ono, S; Mueller, OT & Bereu, BB, 1991. A homozygous deletion in
the c-erbAβ thyroid hormone receptor gene in a patient with generalized thyroid
hormone resistance: isolation and characterization of the mutant receptor. Mol
Endocrinol, 5: 327-335.
VanderBrink, BA; Sellitto, C; Saba, S; Link, MS; Zhu, W; Homoud, MK, Mark
Estes III, NA; Paul, DL & Wang, PJ, 2000. Connexin40 deficient mice exhibit
atrioventricular nodal and infra-hisian conduction abnormalities. J Cardiovasc
Electrophysiol, 11(11): 1270-1276.
Van der velden, HMW; Ausma, J; Rook, MB; &, 2000. Gap junctional remodeling
in relation to stabilization of atrial fibrillation in the goat. Cardiovasc Res, 46: 476-486.
Veenstra RD, 1996. Size and selectivity of gap junction channels formed from different
connexins. J Biomembr 28, 327-337.
72
Weiss, RE; Korcarz, C; Chassande, O; Cua, K; Sadow, PM;, Koo, EJ; Samarut, J
& Lang, R, 2002. Thyroid hormone and cardiac function in mice deficient in thyroid
hormone receptor-α or -β: an Echocardiograph Study. AM J Physiol Endocrinol Metab:
283 E428-35.
White, TW; Bruzzone, R; Wolfram, S; Paul, DI & Goodenough, DA, 1994.
Selective interactions among the multiple connexin proteins expressed in the vertebrate
lens: the second extracellular domain is a determinant of compatibility between
connexins. J Cell Biol 125, 879-892.
Wikström, L; Johansson, C; Saltó, C; Barlow, C; Barros, AC; Baas, F; Forrest, D;
Thorén, P & Vennström, B, 1998. Abnormal heart rate and body temperature in mice
lacking thyroid receptor α1. EMBO J, 17:455-461.
Williams, GR, 2000. Cloning and characterization of two novel thyroid hormone
receptor β isoforms. Mol Cell Biol 20: 8329-8342.
Wu, Y & Koenig, RJ, 2000. Gene regulation by thyroid hormone. TEM, 11 (6)207-11.
Yeager, M & Gilula, NB, 1992. Membrane topology and quaternary structure of
cardiac gap junction ion channels. J Mol Biol 223, 929-948.
Yeager, M, 1998. Structure of cardiac gap junction intercellular channels. J Struct Biol
121, 231-245.
Yen, PM, 2001. Physiological and molecular basis of thyroid hormone action.
Physiological Reviews, 81 (3), july: 1097-1142.
Zhang, J & Lazar, MA, 2000. The mechanism of action of thyroid hormones. Annu
Rev Physiol, 62: 439-466.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
