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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS
ESTUDO DO MECANISMO
ESTUDO DO MECANISMO ESTUDO DO MECANISMO
ESTUDO DO MECANISMO NEUROPROTETOR DA
NEUROPROTETOR DA NEUROPROTETOR DA
NEUROPROTETOR DA
G
GG
GUANOSINA EM FATIAS DE HIPOCAMPO
UANOSINA EM FATIAS DE HIPOCAMPO UANOSINA EM FATIAS DE HIPOCAMPO
UANOSINA EM FATIAS DE HIPOCAMPO DE
DE DE
DE
RATOS
RATOS RATOS
RATOS SUBMETIDAS À PRIVAÇÃO DE GLICOSE E
SUBMETIDAS À PRIVAÇÃO DE GLICOSE E SUBMETIDAS À PRIVAÇÃO DE GLICOSE E
SUBMETIDAS À PRIVAÇÃO DE GLICOSE E
OXIGÊNIO
OXIGÊNIOOXIGÊNIO
OXIGÊNIO
SCHEYLA PAU
SCHEYLA PAUSCHEYLA PAU
SCHEYLA PAULA BOLLMANN OLESKOVI
LA BOLLMANN OLESKOVILA BOLLMANN OLESKOVI
LA BOLLMANN OLESKOVICZ NOGUEIRA
CZ NOGUEIRACZ NOGUEIRA
CZ NOGUEIRA
Orientadora: Dra. Carla Inês Tasca
Departamento de Bioquímica
Florianópolis, fevereiro de 2007.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS
ESTUDO
ESTUDOESTUDO
ESTUDO D
D D
DO MECANISMO
O MECANISMO O MECANISMO
O MECANISMO NEUROPROTETOR DA
NEUROPROTETOR DA NEUROPROTETOR DA
NEUROPROTETOR DA
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GG
GUANOSINA EM FATIAS DE HIPOCAMPO
UANOSINA EM FATIAS DE HIPOCAMPO UANOSINA EM FATIAS DE HIPOCAMPO
UANOSINA EM FATIAS DE HIPOCAMPO DE
DE DE
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RATOS
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SUBMETIDAS À PRIVAÇÃO DE GLICOSE E SUBMETIDAS À PRIVAÇÃO DE GLICOSE E
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SCHEYLA PAULA BOLLMA
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SCHEYLA PAULA BOLLMANN OLESKOVICZ NOGUEI
NN OLESKOVICZ NOGUEINN OLESKOVICZ NOGUEI
NN OLESKOVICZ NOGUEIRA
RARA
RA
Orientadora: Dra. Carla Inês Tasca
Departamento de Bioquímica
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-graduação em Neurociências da
Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito parcial à obtenção de
Grau de Mestre.
Florianópolis, fevereiro de 2007.
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Dedico este trabalho às minhas amigas Karina Brongholi e
Melissa de Medeiros Braz, pois sem seu apoio e incentivo,
nada disso teria acontecido
AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOSAGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS
A Deus, por estar sempre ao meu lado. Muito obrigada por tudo o que eu sou e por
tudo o que conquistei!
Aos meus pais, Salvador e Maristella, que sempre me apoiaram e me estimularam a
buscar meus sonhos. Amo vocês!
À minha irmã, Fernanda, por ser tão especial e por sempre estar ao meu lado nos
momentos mais especiais e mais difíceis. Eu te amo muito!
Ao meu amore Ricardo, por toda paciência, ajuda e incentivo nesses dois anos de
mestrado e de casamento. Agora vamos poder curtir mais tranqüilos!!! Te amo!
À minha orientadora, professora Carla Inês Tasca, pela confiança depositada em
mim nesses dois anos, além da paciência, ensinamentos e atenção, mesmo estando
vivendo um momento tão especial em sua vida. Que vocês sejam muito felizes!
Aos meus amigos de laboratório: Bruno (que com seus goles de soluções nos fez rir
muito), Carina (por me ensinar algumas coisinhas básicas como pipetar e pesar),
Cristiane (por me ensinar a abrir cérebros de ratos), Denis, Ellen, Helena (que tá lá
longe...), Marina (que muito me ajudou, principalmente na reta final), Ronan (por fazer
algumas leituras), Samuel (com sua risada engraçada), Simone (pela ajuda nos cálculos
e amizade), Tetsadê, Tharine (que me ajudou a dissecar hipocampos) e meu braço
direito Wagner (por toda ajuda durante os experimentos). Todos vocês, de uma maneira
ou de outra, me ensinaram um pouquinho a cada dia. MUITO OBRIGADA por tudo!
Aos meus colegas do Curso de Pós-graduação em Neurociências, em especial as
alunas do professor Rodrigo e da professora Ana Lúcia.
Aos professores do Curso de Pós-Graduação em Neurociências, todos professores
excelentes, fazendo com que as disciplinas se tornassem sempre interessantes e
estimulantes.
Ao secretário da Pós-graduação em Neurociências, Nivaldo, que sempre esteve
disposto a nos ajudar e nos atender.
Ao Biotério Central da UFSC e seus funcionários, especialmente à Jô e ao Gilmar,
pelo fornecimento de animais.
Ao Gabriel, por toda paciência em esperar o fevereiro chegar para poder usar o
computador novamente. Fevereiro chegou!
Aos meus amigos e familiares, por todo o apoio nesses 2 anos e o meu pedido de
desculpas pelos momentos em que não pude estar presente.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS...............................................................................................................i
LISTA DE ABREVIATURAS...............................................................................................iii
RESUMO.................................................................................................................................v
ABSTRACT............................................................................................................................vi
1. INTRODUÇÃO
........................................................................................................1
1.1. ISQUEMIA CEREBRAL E DESEQUILÍBRIO IÔNICO...............................................1
1.1.1 Importância da neurotransmissão glutamatérgica na isquemia......................................5
1.2. PURINAS.........................................................................................................................9
1.2.1. Derivados da Guanina..................................................................................................13
2. OBJETIVOS
..............................................................................................................16
2.1. OBJETIVO GERAL.......................................................................................................16
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS..........................................................................................16
3. MATERIAIS E MÉTODOS
..............................................................................18
3.1. MATERIAIS...................................................................................................................18
3.1.1. Reagentes.....................................................................................................................18
3.1.2. Equipamentos...............................................................................................................18
3.2. ANIMAIS.......................................................................................................................19
3.3. PREPARAÇÃO E PRÉ-INCUBAÇÃO DAS FATIAS HIPOCAMPAIS.....................19
3.4. MODELO DE ISQUEMIA: FATIAS DE HIPOCAMPO SUBMETIDAS À
PGO........................................................................................................................................19
3.4.1. Fatias de hipocampo submetidas à PGO na presença de Guo e GMP.........................20
3.4.2. Avaliação do mecanismo de ação da Guanosina.........................................................20
3.4.3. Avaliação das vias de sinalização................................................................................22
3.5. ENSAIO DE VIABILIDADE CELULAR.....................................................................22
3.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA.............................................................................................23
4. RESULTADOS
........................................................................................................24
4.1. AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR DE FATIAS DE HIPOCAMPO DE
RATOS SUBMETIDAS À PRIVAÇÃO DE GLICOSE E OXIGÊNIO SEGUIDA DE
REPERFUSÃO......................................................................................................................24
4.1.1. O papel da Guanosina..................................................................................................24
4.1.2. O papel do GMP..........................................................................................................26
4.2. MECANISMO DE AÇÃO DO EFEITO NEUROPROTETOR DA
GUANOSINA........................................................................................................................28
4.2.1. Avaliação da viabilidade celular na presença de Guo e antagonistas de receptores de
adenosina e inibidor do transporte de nucleosídeos...............................................................29
4.2.2. Avaliação da viabilidade celular na presença de Guo e antagonistas de receptores de
glutamato................................................................................................................................31
4.2.3. Avaliação da viabilidade celular na presença de Guo e inibidores de captação de
glutamato................................................................................................................................33
4.2.4. Avaliação da viabilidade celular na presença de Guo e inibidores de transporte
reverso de glutamato..............................................................................................................35
4.2.5. Avaliação da viabilidade celular na presença de Guo e o papel do Cálcio..................37
4.2.5.1. Avaliação da viabilidade celular na presença de Guo e o papel do EGTA, um
quelante de Cálcio extracelular..............................................................................................37
4.2.5.2. Avaliação da viabilidade celular na presença de Guo e Flunarizina.........................39
4.2.5.3. Avaliação da viabilidade celular na presença de Guo e Nifedipina..........................41
4.2.6. Avaliação da viabilidade celular na presença de Guo e bloqueador de canal de
Potássio.................................................................................................................................43
4.3. AVALIAÇÃO DAS VIAS DE SINALIZAÇÃO CELULAR ENVOLVIDAS NA
NEUROPROTEÇÃO INDUZIDA PELA GUO EM FATIAS DE HIPOCAMPO DE
RATOS SUBMETIDAS À PGO...........................................................................................45
5. DISCUSSÃO
.............................................................................................................48
6. CONCLUSÕES
.......................................................................................................57
7
.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
.........................................................59
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Morte excitotóxica induzida pelo glutamato............................................................2
Figura 2: Captação extracelular de glutamato..........................................................................8
Figura 3: Representação esquemática dos receptores de purinas expressos por astrócitos e
neurônios.................................................................................................................................11
Figura 4: Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos submetidas à
PGO na presença ou não de Guanosina..................................................................................25
Figura 5: Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos submetidas à
PGO na presença ou não de GMP..........................................................................................27
Figura 6: Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos submetidas à
PGO na presença de Guanosina, antagonistas de receptores de ADO e inibidor de transporte
de nucleosídeos.......................................................................................................................30
Figura 7: Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos submetidas à
PGO na presença de Guanosina e antagonistas de receptores de glutamato..........................32
Figura 8: Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos submetidas à
PGO na presença de Guanosina e inibidores da captação de glutamato................................34
Figura 9: Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos submetidas à
PGO na presença de Guanosina e inibidores de transporte reverso de glutamato..................36
Figura 10: Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos submetidas à
PGO na presença de Guanosina e EGTA...............................................................................38
Figura 11: Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos submetidas à
PGO na presença de Guanosina e Flunarizina........................................................................40
Figura 12: Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos submetidas à
PGO na presença de Guanosina e Nifedipina.........................................................................42
Figura 13: Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos submetidas à
PGO na presença de Guanosina e 4-AP.................................................................................44
Figura 14: Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos submetidas à
PGO na presença de Guanosina e inibidores específicos de vias de sinalização
intracelulares...........................................................................................................................46
Figura 15: Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos submetidas à
PGO na presença de Guanosina e inibidores específicos de vias de sinalização
intracelulares............................................................................................................................47
LISTA DE ABREVIATURAS
4-AP – 4- aminopiridina
ADA – adenosina deaminase
ADO - adenosina
ADP – adenosina 5`difosfato
AMPA – alfa-amino-3-hidroxi-metilisoxazolepropionato
ATP – adenosina 5` trifosfato
Ca
++
- cálcio
CA1 – área CA1 do hipocampo
CA3 – área CA3 do hipocampo
CaMKII – proteína quinase ativada por cálcio e calmodulina
Che - queleretrine
DG – derivados da guanina
DL-TBOA - DL-treo-beta-benziloxiaspartato
DMSO - dimetilsulfóxido
DPCPX – 8-ciclopentil-1,3-dipropilxantina
EGTA - etileno glicol-bis (beta-aminoetil eter)-N,N,N',N'-tetraacetico ácido
ERK – proteína quinase regulada por sinal extracelular
Flu - flunarizina
GAMS - gamma-D-glutamilamino-metilsulfonato
GDP - guanosina 5`-difosfato
Glu – glutamato
GMP – guanosina 5`-monofosfato
GTP – guanosina 5`-trifosfato
Guo - guanosina
K
+
- potássio
K
ATP
– Canais de potássio dependentes de ATP
KN – KN62
L-PDC - L-trans-2,4-pirrolidina dicarboxilato
MAPK – proteína quinase ativada por mitógeno
MCPG - alpha-methil-4-carboxi-fenilglicina
Mg
++
- magnésio
MK-801 – (+)-5-metil-10,11-dihidro-5H-dibenzo(a,b)ciclohepteno-5,10-imina
MP – membrana plasmática
MTT – (3-[4,5-Dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolium brometo = Azul de Tiazolil)
Na
+
- sódio
Nif - nifedipina
NMDA – N-metil-D-aspartato
PC12 – linhagem celular Feocromocitoma 12
PD – PD98059
PGO – Privação de Glicose e Oxigênio
PI3-K – quinase de fosfatidilinositol
PKA – proteína quinase dependente de AMPc
PKC – proteína quinase C
PLC – fosfolipase C
ROS – Espécies reativas de oxigênio
SNC – Sistema Nervoso Central
Wo - wortmanina
RESUMO
Os derivados da guanina (DG) desempenham um importante papel extracelular na
modulação da transmissão glutamatérgica, pois inibem a união do glutamato aos seus
receptores, protegendo contra a neurotoxicidade mediada por receptores glutamatérgicos.
Eles são liberados no meio extracelular espontaneamente em meio de cultura de astrócitos
sendo o mesmo observado em condições de privação de glicose e oxigênio (PGO). O
objetivo de nosso trabalho foi estudar os mecanismos envolvidos no papel neuroprotetor da
Guanosina (Guo) em fatias de hipocampo de ratos submetidas à PGO identificando os
possíveis sítios de ação extracelular e as vias de sinalização intracelular envolvidas na sua
ação. Observamos que a Guo (100 µM) e o GMP (100 µM) previnem a diminuição da
viabilidade celular em fatias de hipocampo submetidas a 15 minutos de PGO seguidos de 2
horas de reperfusão. A ação da Guo se manteve mesmo na presença de antagonistas de
receptores de adenosina (ZM241385, DPCPX); de antagonista de transporte de nucleosídeo
(dipiridamol); de antagonistas de receptor de glutamato (MK-801, GAMS, MCPG), de
inibidores de transporte de glutamato (DL-TBOA, L-PDC), inibindo tanto o transporte
reverso como a captação de glutamato; e da flunarizina (bloqueador de canal de Na
+
e Ca
++
).
Ao utilizarmos o EGTA, um quelante de Ca
++
extracelular, a Guo perdeu sua ação
neuroprotetora; na presença da nifedipina (bloqueador de canal de Ca
++
e Na
+
), a Guo teve
uma potencialização de seu efeito neuroprotetor; e o 4-AP, bloqueador de canal de K
+
,
reverteu o efeito protetor da Guo. Ao avaliarmos as vias de sinalização intracelular
envolvidas na neuroproteção mediada pela Guo, observamos o envolvimento das vias da
PKA, PKC, MEK e PI3-K. Estes resultados demonstram que a Guo atua via canal de K
+
, de
forma dependente dos níveis extracelulares de íons Ca
++
, e com ação dependente da ativação
das vias de PKA, PKC, MEK E PI3-K.
ABSTRACT
Guanine derivates (GD) have been implicated in many important extracellular
mechanisms, such as modulation of glutamate transmission, protecting the neurons against
excitotoxic damage induced by glutamate. GD are spontaneously released to the extracellular
space from cultured astrocytes and, during oxygen-glucose deprivation (OGD). The aim of
this study was evaluating the mechanisms involved on the neuroprotective role of Guanosine
(Guo) in rat hippocampal slices submitted to OGD and, identifying a putative extracellular
binding site and intracellular signaling pathways related to Guo neuroprotection. Cell death
was prevented by addition of Guo (100 µM) or GMP (100 µM) in hippocampal slices
submitted to 15 minutes of OGD followed by 2 hours of reperfusion. The neuroprotective
effect of Guo was not altered in the presence of adenosine receptor antagonists (ZM241385,
DPCPX); nucleoside transport inhibitor (dipyridamole); glutamate receptor antagonists (MK-
801, GAMS, MCPG); glutamate transport inhibitors (DL-TBOA, L-PDC) inhibiting reverse
glutamate transport and glutamate uptake; and flunarizine (Na
+
and Ca
++
channel blocker). In
the presence of EGTA, a Ca
++
ions chelator, Guo was ineffective. Nifedipine (a Ca
++
channel
blocker), increased the neuroprotective effect of Guo and, 4-aminopyridine (4-AP), a K
+
channel blocker, reverted Guo effect. The evaluation of intracellular signaling pathways
related to Guo neuroprotection showed the involvement of PKA, PKC, MEK and PI3K
pathways. Therefore, this study suggests Guo is acting via K
+
channels activation, depending
on extracellular Ca
++
levels, and via PKA, PKC, MEK and PI3K pathways activation.
1. INTRODUÇÃO
1.1. ISQUEMIA CEREBRAL E DESEQUILÍBRIO IÔNICO
A isquemia cerebral resulta da interrupção completa do fluxo sanguíneo cerebral, como
por exemplo, durante uma parada cardíaca. Quando o fluxo cerebral diminui, duas áreas de
dano neuronal são formadas. A área isquêmica central é caracterizada por infarto com um
centro necrótico, onde todas as células morrem rapidamente. Na área ou zona de penumbra,
adjacente à área isquêmica, as células morrem em dias ou semanas (MATTSON, 2000;
CAMACHO & MASSIEU, 2006).
Durante a isquemia, há um prejuízo metabólico decorrente da hiperativação de receptores
glutamatérgicos. O excesso de glutamato extracelular leva a um desequilíbrio iônico
relacionado à excessiva entrada de íons sódio (Na
+
) e cálcio (Ca
++
) através dos canais
sensíveis à voltagem e dependentes de ligantes. O aumento de Ca
++
intracelular seguido da
produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) levam à ativação de várias enzimas (como
proteases, fosfolipases, óxido nítrico sintase ou endonucleases) que podem danificar
proteínas, DNA e lipídeos, o que contribui para a morte neuronal necrótica e apoptótica
(WALLIN et al., 1999; MELDRUM, 2000; WHITE et al., 2000; CAMACHO & MASSIEU,
2006). Além destes fatores, foi observado que durante a fase de reperfusão, após um insulto,
ocorre uma aceleração no dano da estrutura celular conseqüente à geração excessiva de ROS
seguida por peroxidação lipídica que resulta em morte celular (WHITE et al., 2000) (Figura
1).
Figura 1: Morte excitotóxica induzida pelo glutamato. 1.chegada do potencial de ação;
2. despolariza a membrana plasmática (MP) e ativa canais de Ca
++
dependentes de voltagem;
3. ancoramento das vesículas sinápticas; 4. liberação de glutamato (Glu) e aumento da
concentração de Glu na fenda sináptica; 5. ativação de receptores AMPA com influxo de Na
+
e despolarização da MP; 6. o Mg
++
é liberado do receptor NMDA; 7. ativação de receptor
NMDA; 8. influxo de Ca
++
e Na
++
; 9. influxo de Ca
++
via canais de Ca
++
voltagem-
dependentes; 10. entrada de Ca
++
via receptor AMPA; 11. aumento na concentração de Ca
++
induz a ativação de fosfolipase, 12.proteases, 13. nucleases, 14. produção de ROS que geram
estresse oxidativo com prejuízo metabólico mitocondrial com 15. falência energética
resultando em 16. morte neuronal (modificada e adaptada a partir de CAMACHO &
MASSIEU, 2006).
Morte
Celular
16
O gradiente iônico transmembrana é mantido por bombas na membrana dependentes de
ATP (Na
+
/K
+
– ATPase, Ca
++
- ATPase), por sistema de troca iônica (como a troca Ca
++
-
Na
+
), e pelo fluxo passivo de íons através de canais iônicos dependentes de voltagem e de
ligantes (como canais de Na
+
, canais de glutamato) (LOPACHIN et al., 2001). Durante a
isquemia, flutuações na oferta de metabólicos modificam a função neuronal pela regulação
dos canais iônicos, responsáveis por controlar a homeostase iônica no cérebro de mamíferos
(VELASCO et al., 2006) e também leva a disfunção dos transportadores de glutamato
dependentes de Na
+
e do consumo de ATP (CAMACHO & MASSIEU, 2006). Com poucos
minutos de privação de glicose e oxigênio (PGO), a diminuição dos níveis de ATP, a
liberação de aminoácidos excitatórios e o colapso dos gradientes celulares iônicos resultam
na despolarização celular (SIESJO, 1992; MARTIN et al., 1994).
Em condições fisiológicas, o aumento no metabolismo da glicose estimula a produção de
ATP e posterior fechamento dos canais de K
+
dependentes de ATP (K
ATP
), levando a uma
rápida despolarização da membrana. Porém, a depleção energética causada pela hipóxia ou
isquemia resulta na hiperpolarização com abertura dos canais K
ATP
, o que pode prevenir o
influxo de cálcio e a excitotoxicidade (FUJIMURA et al., 1997; VELASCO et al., 2006).
Com isso, sugere-se que os canais K
ATP
possam estar envolvidos em mecanismos
citoprotetores em neurônios hipocampais (HEURTEAUX et al., 1995).
Os canais de K
+
podem ainda ser ativados pelo acúmulo intracelular de íons como Na
+
e
Ca
++
, sendo estes últimos mais bem caracterizados (BHATTACHARJEE & KACZMAREK,
2005), sendo ambos importantes na repolarização da membrana. Estes canais são conhecidos
como canais de K
+
de baixa condutância sensíveis ao Ca
++
(canais SK) e canais de K
+
de alta
condutância sensíveis ao Ca
++
(canais BK) (YUAN E CHEN, 2006; STOCKER, 2004).
Por este e outros fatores, a manutenção da homeostase intracelular de cálcio é crucial
para a sobrevida neuronal, e sua perda pode estar envolvida em muitas enfermidades do
sistema nervoso central (SNC), incluindo a isquemia. Se ocorrer um aumento da
concentração de Ca
++
no citoplasma, o conseqüente aumento na concentração do Ca
++
na
matriz mitocondrial pode induzir a um fenômeno chamado permeabilidade transitória
mitocondrial, caracterizada por uma permeabilização da membrana interna mitocondrial,
redução da síntese de ATP, edema da organela, rompimento da membrana externa e
liberação de diferentes fatores apoptogênicos no citoplasma. Estes fatores incluem citocromo
c, fator indutor de apoptose e pro-caspases (MATTSON, 2000; MACIEL et al., 2001).
Porém, um moderado aumento na concentração intracelular de Ca
++
diminui a morte neuronal
em neurônios hipocampais submetidos à PGO (BICKLER & FAHLMAN, 2004). Isto pode
ocorrer, pois um moderado aumento na concentração de Ca
++
ativa importantes vias de
sobrevida, incluindo a proteína quinase B (Akt; CHENG et al., 2003), a via das proteínas
quinases ativadas por mitógenos p42/44 (MAPK / ERK de 42 e 44 KDa; FAHLMAN et al.,
2002) e o fator de crescimento derivado do cérebro (CHEN et al., 2003).
A via da quinase de fosfatidilinositol (PI3-K) e da proteína quinase B (PKB ou Akt)
apresenta importante papel na sinalização de sobrevivência celular. Em cultura de neurônios
hipocampais submetida à hipóxia, a ativação de PI3-K/Akt preveniu a apoptose através da
inibição de genes e proteínas pró-apoptóticas (YAMAGUCHI et al., 2001).
Os membros da família das proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs), em
particular a JNK, a p38
MAPK
e a ERK apresentam um importante papel na transdução de
sinais relacionados ao estresse em células eucarióticas (KYRIAKIS & AVRUCH, 1996).
Estudos sugerem que JNK e p38
MAPK
estejam ativadas após isquemia e reperfusão, sugerindo
que a sinalização através destas quinases seja importante e responsável pela lesão tecidual
após isquemia-reperfusão (HU & WIELOCH, 1994; MIZUKAMI et al., 1997; YIN et al.,
1997; HERDEGEN et al., 1998; WALTON et al., 1998). A p38
MAPK
(MAPK de 38 KDa),
está envolvida na morte celular apoptótica, sendo que sua inibição pode levar à
neuroproteção contra PGO moderada mas não contra PGO severa, sugerindo que outras vias
possam estar envolvidas na morte celular mediada por excitotoxicidade severa (LEGOS et
al., 2002). Esta via pode ainda estar ativada em modelos de pré-condicionamento com PGO
via óxido nítrico produzido durante o estresse oxidativo, sendo esta uma importante via para
o desenvolvimento da tolerância isquêmica (GONZALEZ-ZULUETA et al., 2000).
A via da proteína quinase dependente de cálcio e calmodulina (CaMKII) está presente
nas sinapses glutamatérgicas, podendo atuar tanto pré como pós-sinapticamente, fosforilando
muitas proteínas sinápticas, além de estar envolvida na síntese e na liberação do glutamato
(FINK & MEYER, 2001). A baixa concentração de glutamato extracelular observada em
culturas submetidas à PGO, pode resultar da redução de liberação de glutamato do terminal
pré-sináptico mediada pela CaMKII, levando à neuroproteção (TAUSKELA et al., 2003).
Propõe-se que a via da proteína quinase C (PKC) seja uma das vias de sinalização
envolvidas na morte celular induzida pela PGO, pois está relacionada com o dano neuronal
durante e após o infarto. A utilização de inibidores desta via durante a reperfusão reduziu a
morte celular apoptótica e aumentou a sinalização de sobrevivência celular sugerindo que a
morte celular induzida pela reperfusão após isquemia seja mediada, pelo menos em parte,
pela via da PKC (BRIGHT et al., 2004).
1.1.1. IMPORTÂNCIA DA NEUROTRANSMISSÃO GLUTAMATÉRGICA NA
ISQUEMIA
O aminoácido L-glutamato é considerado o principal mediador de sinais excitatórios no
Sistema Nervoso Central (SNC) de mamíferos e está envolvido na maioria dos aspectos
funcionais normais do cérebro, incluindo cognição, memória e aprendizado (OZAWA et al.,
1998). Sua diversidade funcional é resultado da existência de uma grande variedade de
receptores, os quais podem ser caracterizados em dois grupos, denominados ionotrópicos e
metabotrópicos (GASIC & HOLLMAN, 1992).
Os receptores ionotrópicos são canais iônicos dependentes da ativação por ligantes
específicos. São responsáveis pela sinalização excitatória mais rápida do SNC, o que faz com
que contribuam para a plasticidade neuronal e que estejam implicados em nossa capacidade
de aprendizado e memória. Distintas famílias de receptores ionotrópicos têm sido
identificadas farmacologicamente por suas afinidades com agonistas sintéticos. São eles:
AMPA (alfa-amino-3-hidróxi-metilisoxazole-propionato), Kainato e NMDA (N-metil-D-
aspartato) (MADDEN, 2002). O receptor AMPA é distribuído igualmente pelo SNC sendo
ricamente expresso no hipocampo (área CA1 mais que área CA3). Ele é permeável aos íons
Na
+
, K
+
e Ca
++
. Já o receptor kainato é um potente agonista do AMPA, apresentando
substancial permeabilidade ao íon Ca
++
. Sua distribuição pelo SNC se concentra na área CA3
do hipocampo e na camada granular do cerebelo. O receptor NMDA é encontrado em todo o
cérebro, sendo localizado principalmente no cérebro anterior e na região CA1 do hipocampo.
O potencial de repouso deste receptor é mantido por um íon Mg
++
. Correntes iônicas através
do receptor ocorrem apenas quando a membrana neuronal é despolarizada. Significante
quantidade de Ca
++
extracelular entra para o interior da célula durante a ativação do receptor
(OZAWA et al., 1998).
Os receptores metabotrópicos, que ativam cascatas intracelulares de sinalização via
receptores acoplados à proteína G, foram identificados e classificados em 3 grupos (I, II e
III), baseados na homologia da seqüência de aminoácidos, vias de transdução de sinais e
seletividade farmacológica. O grupo I (mGluR1 e mGluR5) está predominantemente
localizado pós-sinapticamente onde se acopla à proteína G para ativar a fosfolipase C (PLC),
que catalisa a produção de inositol (1,4,5)-trifosfato e por meio disso dispara a liberação de
cálcio dos estoques intracelulares. O grupo II de receptores metabotrópicos de glutamato
(mGluR2 e mGluR3) é encontrado tanto pré como pós-sinapticamente e são acoplados à
proteína G
i/o
regulando a atividade da adenilil ciclase. Finalmente, o grupo III de receptores
mGlu (mGluR4, mGluR6, mGluR7 e mGluR8) está predominantemente localizado pré-
sinapticamente onde atua como autoreceptor, e também está acoplado às proteínas G
modulando a atividade da adenilil ciclase (KENNY & MARKOU, 2004).
A resposta pós-sináptica está relacionada à concentração de glutamato liberado na fenda
sináptica em função do tempo e é cuidadosamente regulada pelos transportadores de
glutamato. O glutamato liberado extracelularmente é inativado através da recaptação pelas
células gliais e pelos neurônios, por um processo mediado pela família de transportadores de
alta afinidade dependentes de Na
+
(GLAST/EAAT1, GLT1/EAAT2, EAAC1/EAAT3,
EAAT4 e EAAT5) (STRUZYNSKA et al., 2005). Dois dos cinco subtipos de transportadores
identificados, GLT1 e GLAST, estão predominantemente localizados nos astrócitos, sendo
responsáveis pelo maior volume de glutamato captado (VOUTSINOS-PORCHE et al.,
2003). A atividade destes transportadores é dependente do gradiente eletroquímico gerado
pela Na
+
/K
+
ATPase. Uma molécula de glutamato é transportada para o citoplasma junto
com 2 íons Na
+
, enquanto um K
+
é expulso para o meio extracelular. A recuperação do
gradiente eletroquímico de Na
+
após a captação dos aminoácidos ocorre à custa do consumo
de ATP pela Na
+
/K
+
ATPase. Portanto, a manutenção dos níveis energéticos é essencial para
o controle da transmissão glutamatérgica (CAMACHO & MASSIEU, 2006). Além disso, os
transportadores podem ser regulados pelo seu estado redox (BRONGHOLI et al., 2006) e
pelo nucleosídeo guanosina (FRIZZO et al., 2001). Alguns destes fatores promovem
mudanças no estado catalítico do transportador, que pode estar ligado ao gradiente
eletroquímico ou a mudanças no número destes transportadores na membrana celular
(BOECK et al., 2005) (Figura 2).
Figura 2: Captação extracelular de glutamato. O aumento da concentração extracelular
de glutamato é altamente regulado por proteínas transportadoras localizados na membrana
plasmática de neurônios e glia (adaptado de CAMACHO & MASSIEU, 2006).
A captação de glutamato é essencial para a finalização da transmissão sináptica durante
condições fisiológicas (DANBOLT, 2001; BONDE et al., 2003), pois o acúmulo de
glutamato no espaço extracelular pode ser excitotóxico para os neurônios. Assim, o ótimo
funcionamento dos transportadores é essencial para manter os níveis extracelulares de
glutamato suficientemente baixos a fim de restringir a superestimulação dos receptores
glutamatérgicos e prevenir o dano neuronal. A disfunção dos transportadores pode ser o
evento que inicia ou participa da cascata que leva à disfunção e à morte celular
(STRUZYNSKA et al., 2005).
1.2. PURINAS
As bases purinas, como adenina e guanina, e seus nucleosídeos correspondentes, como
adenosina (ADO) e guanosina (Guo) e seus produtos metabólicos apresentam importante
papel como neurotransmissores e neuromoduladores no SNC, sistema nervoso periférico e
sistema nervoso entérico (RATHBONE et al., 1999). Os astrócitos são a principal fonte de
purinas da adenina e da guanina e expressam receptores específicos para estas substâncias
(CICCARELLI et al, 1999a; 2001).
Os receptores mais bem caracterizados são os das purinas da adenina (RATHBONE et
al., 1999), sendo o receptor do tipo P1 para os receptores de ADO e os receptores P2 para
adenosina 5’ trifosfato (ATP) e adenosina 5’ difosfato (ADP). A família de receptores P1
compreende os receptores de adenosina A
1
, A
2A
, A
2B
e A
3
sendo todos acoplados à proteína
G. Os receptores P2 são de 2 tipos: P2X é da família de receptor ligado ao canal iônico e o
P2Y é o receptor ligado à proteína G. A ativação de receptor A
1
inibe a adenilato ciclase , o
que leva a diminuição dos níveis do segundo mensageiro AMPc. Isto resulta na inibição da
liberação de neurotransmissores. Já a ativação de receptor A
2A
ativa a adenilato ciclase,
facilitando a liberação de neurotransmissores. Os efeitos biológicos dos receptores A
2B
e A
3
não são completamente conhecidos. A ativação de receptor de ATP pode estimular ou inibir
a liberação de glutamato de neurônios hipocampais de ratos (FIELDS & BURNSTOCK,
2006).
Enquanto os receptores das purinas da adenina são bem caracterizados, não há evidência
de sítios específicos de ligação para os derivados da guanina (DG), como Guanosina (Guo) e
guanosina 5’ trifosfato (GTP) em astrócitos (CHEN et al, 1993) ou outras células
(VUORINEN et al, 1991, 1992). Nem GTP nem Guo se ligam aos receptores das purinas da
adenina com alta afinidade (MULLER & SCIOR, 1993), sugerindo que os DG apresentam
sítios específicos. Foi demonstrado que o GTP une-se a sítios específicos em células de
feocromocitoma (PC12) (GYSBERS et al., 2000) e em membranas cerebelares de pintos,
sítios estes que não apresentam atividade enzimática (GTPásica) (TASCA et al., 1999a), o
que sugere a presença de verdadeiros sítios receptores. Além disso, foram identificados e
caracterizados farmacologicamente sítios específicos de união para a Guo em preparações de
membrana de cérebro de ratos (TRAVERSA et al., 2002), em cultura de astrócitos (CHEN et
al., 1993) e em células PC12 (BAÚ et al., 2005), sendo este sítio acoplado à proteína G
(TRAVERSA et al., 2003) (figura 3).
Figura 3: Representação esquemática dos receptores de purinas expressos por
astrócitos e neurônios (adaptado de CICCARELLI et al., 2001). Adenosina deaminase
(ADA), inisitol-1,4,5-trifosfato (IP3), purina nucleosídeo fosforilase (PNP).
Em condições fisiológicas ocorre liberação espontânea de DG em meio de cultura de
astrócitos de ratos em concentrações três vezes maior que das purinas da adenina, que se
mantém constante. A concentração de DG, principalmente a Guo, aumenta quando a célula é
exposta a um breve período de hipóxia/hipoglicemia. Após este insulto, a concentração de
Guo se mantém elevada por 30 minutos. Uma pequena parte é captada por um sistema
seletivo para Guo e a maior parte tende a se acumular no meio extracelular (CICCARELLI et
al., 1999a).
A concentração extracelular dos nucleosídeos presentes na fenda é modulada, de maneira
bidirecional, por transportadores de nucleosídeos. Estes transportadores compreendem uma
família de proteínas com afinidade para substratos distintos, distribuição variável pelo tecido
cerebral, diferente especificidade entre as espécies e sensibilidade as bloqueio por agentes
farmacológicos. ADO apresenta um sistema específico de transporte que regula a quantidade
de ADO para interagir com seus receptores na membrana celular. Nos astrócitos, os
transportadores de nucleosídeos apresentam maior capacidade de transportar ADO em
relação aos neurônios, exercendo papel mais importante na regulação dos efeitos da ADO no
SNC (BENDER et al., 1994; GU et al., 1996).
Além de serem captadas por transportadores, purinas da adenina e guanina são
metabolizadas por ecto-enzimas específicas que regulam os efeitos dos nucleotídeos e
nucleosídeos após estes serem liberados por vesículas sinápticas, transportadores, canais
iônicos (BODIN & BURNSTOCK, 2001) e astrócitos (CICCARELLI et al., 1999a).
As purinas da adenina, assim como os DG, apresentam importantes efeitos tróficos como
mudanças plásticas envolvendo aprendizado e memória, brotamento colateral de terminações
nervosas, neuroproteção contra estímulos nocivos e regulação de células através de apoptose
(RATHBONE et al., 1999). Os DG regulam também o crescimento neurítico (GYSBERS &
RATHBONE, 1996a); a proliferação de células gliais (CICCARELLI et al., 1994), a adesão
de neurônios granulares do cerebelo em cultura (DECKER, 2006), regulam a síntese e
liberação de neurotrofinas e pleiotrofinas (MIDDLEMISS et al., 1995b; CICCARELLI et al.,
1997), entre outros.
1.2.1. Derivados da Guanina
Os derivados da guanina (DG) – GTP (guanosina 5’ trifosfato), GDP (guanosina 5’
difosfato) e GMP (guanosina 5’ monofosfato) e o nucleosídeo Guanosina (Guo). São
reconhecidos como importantes moléculas de sinalização extracelular (NEARY et al., 1996).
Os DG são liberados no meio extracelular espontaneamente em meio de cultura de astrócitos
juntamente com as purinas da adenina, e em uma concentração muito maior que a de purinas
da adenina, sendo o mesmo observado em condições de privação de glicose e oxigênio
(PGO). Isto permite que os DG, mais especificamente a Guo, ativem a produção de fatores
tróficos nos astrócitos, importante no restabelecimento da transmissão sináptica
(CICCARELLI et al., 1999b; 2001).
Intracelularmente, os DG modulam a atividade das proteínas-G, são fonte de energia para
a síntese protéica, ativam proteínas na exocitose e constituem os ácidos nucléicos (BOURNE
et al., 1990).
Além disso, os DG desempenham um importante papel extracelular, na modulação da
transmissão glutamatérgica, pois inibem a união do glutamato aos seus receptores, sem
envolvimento de proteínas-G (TASCA et al., 1995; 1998; 1999a), e protegendo contra a
neurotoxicidade mediada por receptores glutamatérgicos (OLIVEIRA et al., 2002; MOLZ et
al., 2005).
A Guo aumenta a captação de glutamato por astrócitos em cultura de células, sugerindo
estar envolvida com a neuroproteção contra a excitotoxicidade glutamatérgica (FRIZZO et
al., 2001). Em vesículas sinápticas de cérebro de ratos adultos, há uma diminuição da
captação de glutamato na presença dos DG, o que pode alterar a força sináptica pela
diminuição da quantidade de glutamato liberado na fenda (TASCA et al., 2004). Com isso, a
vulnerabilidade celular em processos neurodegenerativos assim como a plasticidade neuronal
pode ser influenciada pelos DG. Foi observado que após um insulto de hipóxia-isquemia, a
captação de glutamato em fatias de hipocampo de ratos neonatos foi significativamente
reduzida e que esta redução foi prevenida pelo tratamento in vivo com a Guo (MORETTO et
al., 2005).
O GTP, GDP e GMP antagonizam a toxicidade induzida por NMDA e Kainato em
cultura de neurônios neocorticais e hipocampais de ratos, sendo a eficiência dos DG maior
que a dos nucleotídeos da adenina (MORCIANO et al., 2004). A inibição da toxicidade
pelos DG deve ser mediada pela inibição de receptores glutamatérgicos endógenos ou ainda
pela união a sítios específicos para os DG.
Estudos in vivo investigaram o efeito protetor da Guo contra a hiperatividade
glutamatérgica mostrando que ela previne contra convulsões induzidas por ácido quinolínico,
substância que provoca superestimulação do sistema glutamatérgico (LARA et al., 2001;
SCHMIDT et al., 2000).
Estudo realizado por DECKER (2006) mostrou que o número de neurônios granulares de
cerebelo cultivados em meio condicionado de astrócitos tratados com GMP e Guo, ou
cultivados na presença de GMP ou Guo, aumentou de forma significativa quando comparado
à situação controle. GTP e Guo também atuam como fatores tróficos para neurônios e como
fator de proliferação para astrócitos (KIM et al., 1991; RATHBONE et al., 1992 a,b;
GYSBERS & RATHBONE, 1992; 1996a; CICCARELLI et al., 2001).
Além disso, a Guo estimulou a expressão funcional de canais iônicos de K
+
em cultura de
astrócitos, sugerindo que seu efeito neuroprotetor possa estar relacionado com a habilidade
de regular a homeostase do K
+
via astrócitos (BENFENATI et al., 2006).
A concentração extracelular de Guo é resultado da sua liberação pelos transportadores de
membrana bidirecionais equilibrativos, ou da hidrólise do GTP por ectonucleotidases na
fenda sináptica após a liberação vesicular do GTP (ZIMMERMANN, 1996). O GTP, que é
captado e estocado nas vesículas sinápticas (SANTOS et al., 2006), após ser liberado é
hidrolisado à GDP, GMP e posteriormente à Guo.
Em função do exposto, nosso trabalho justificou-se pela necessidade de verificar o efeito
neuroprotetor de Guo e GMP em um modelo de isquemia in vitro, e identificar um possível
sítio de ação para os DG, especificamente a Guo, que é o produto final da degradação dos
DG. Também buscamos avaliar as vias de sinalização intracelulares envolvidas na
neuroproteção induzida pela Guo.
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Estudar os mecanismos envolvidos no papel neuroprotetor da Guanosina (Guo) em fatias
de hipocampo de ratos submetidas a um modelo de isquemia in vitro, a privação de glicose e
oxigênio (PGO), identificando os possíveis sítios de ação extracelular e as vias de sinalização
intracelular envolvidas na ação da Guo.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Avaliar a neuroproteção dos DG, Guo e GMP, em um modelo de isquemia in vitro,
através da PGO em fatias de hipocampo de ratos;
2. Avaliar a participação dos receptores purinérgicos (adenosinérgicos) na ação
neuroprotetora da Guo em fatias de hipocampo de ratos submetidas à PGO;
3. Avaliar a participação dos receptores glutamatérgicos na ação neuroprotetora da Guo
em fatias de hipocampo de ratos submetidas à PGO;
4. Avaliar o envolvimento dos transportadores de nucleosídeos na ação neuroprotetora
da Guo em fatias de hipocampo de ratos submetidas à PGO;
5. Avaliar o envolvimento da modulação do transporte de glutamato (captação e
transporte reverso) na ação neuroprotetora da Guo em fatias de hipocampo de ratos
submetidas à PGO;
6. Avaliar a participação de canais iônicos (de Ca
++
e K
+
) na ação neuroprotetora da
Guo em fatias de hipocampo de ratos submetidas à PGO;
7. Avaliar as vias de sinalização intracelular envolvidas na neuroproteção induzida pela
Guo em fatias de hipocampo de ratos submetidas à PGO.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Materiais
3.1.1. Reagentes:
2-deoxiglicose, 4-AP (4–aminopiridina) (gentilmente cedida pelo professor Dr. Rodrigo
Bainy Leal), A23187, Brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólico (MTT),
Dimetilsulfóxido (DMSO), Dipiridamol, DL-TBOA (DL-treo-beta-benziloxiaspartato),
DPCPX (8-ciclopentil-1,3-dipropilxantina), EGTA (etileno glicol-bis (beta-aminoetil eter)-
N,N,N',N'-tetraacetico ácido), Flunarizina (gentilmente cedida pelo professor Dr. Nelson
Horácio Gabilan), GAMS (gamma-D-glutamilamino-metilsulfonato), GMP, Guanosina, H-
89 (gentilmente cedida pelo professor Dr. Nelson Horácio Gabilan), KN-62, L-PDC (L-trans-
2,4-pirrolidina dicarboxilato), MCPG (alpha-methil-4-carboxi-fenilglicina), MK-801 ((+)-5-
methil-10,11-dihidro-5H-dibenzo[a,d]ciclohepten-5,10-imine maleato), Nifedipina,
PD98059, Queleretrine, Wortmanina, ZM 241385.
3.1.2. Equipamentos:
Banho Maria Biomatic
Estufa de cultura modelo 002 CB FANEM LTDA
Leitora de Elisa – Labsystems Multiskan MS
Fatiador de tecidos McIlwain – Brinkmann Laboratory
®
3.2. Animais
Foram utilizados ratos Wistar machos adultos (60 a 90 dias), provenientes do Biotério
Central da UFSC e mantidos no biotério setorial de Neuroquímica do Departamento de
Bioquímica, em ciclo claro/escuro de 12 horas, em temperatura entre 22 e 25°C, com água e
ração ad libitum. Os procedimentos adotados com os animais seguiram os “Princípios Éticos
do COBEA”, conforme protocolo aprovado pela CEUA/UFSC.
3.3. Preparação e pré-incubação das fatias hipocampais
Os animais foram mortos por decapitação e os hipocampos foram rapidamente removidos
e mantidos em tampão Krebs-Ringer bicarbonato (KRB). Este tampão é composto por: NaCl
122 mM, KCl 3 mM, CaCl
2
1,3 mM, MgSO
4
1,2 mM, KH
2
PO
4
0,4 mM, NaHCO
3
25 mM, D-
glicose 10 mM, sendo gaseificado com carbogênio (95% O
2
- 5% CO
2
) por 15 minutos para
atingir o pH 7,4 e mantido gelado. As fatias com 0,4 mm de espessura foram obtidas
utilizando-se um fatiador de tecidos McIlwain, sendo separadas e colocadas em tubo
contendo KRB. Estas foram gaseificadas com carbogênio por aproximadamente 15 segundos
para pré-incubação por 30 min a 37
o
C. Após a pré-incubação, iniciava-se a incubação,
havendo troca de meio do KBR da pré-incubação pelo tratamento escolhido para cada grupo
de fatias em triplicata.
3.4. Modelo de isquemia: Fatias de hipocampo submetidas à PGO
Para obter-se o modelo de isquemia, as fatias de hipocampo foram submetidas à privação
de glicose e oxigênio (PGO) através da incubação com um tampão de PGO, composto por
NaCl 122 mM, KCl 3 mM, CaCl
2
1,3 mM, MgSO
4
1,2 mM, KH
2
PO
4
0,4 mM e, a glicose
utilizada no tampão KRB foi substituída por 10 mM de 2-deoxi-glicose (um análogo não
utilizável da glicose) (POCOCK & NICHOLS, 1998).
3.4.1. Fatias de hipocampo submetidas à PGO na presença de Guo e GMP
As fatias controles foram incubadas na presença do tampão KRB ou tampão KRB
associado à Guo ou GMP, gaseificadas com carbogênio por aproximadamente 15 segundos, e
mantidas por 1 hora nessas condições. No caso de grupo controle com reperfusão, após 1
hora de incubação com KRB, havia novamente troca do meio por KRB ou KRB associado à
Guo ou GMP, a fatia era gaseificada com carbogênio, sendo mantida em reperfusão por 2
horas.
As fatias submetidas à PGO foram incubadas no tampão da PGO ou no tampão de PGO
com Guo ou GMP, gaseificadas com nitrogênio por aproximadamente 15 segundos, sendo
mantidas nestas condições por 15 ou 60 minutos.
Nos grupos submetidos à PGO e reperfusão, a isquemia inicial era realizada apenas com
tampão da PGO, que era substituído por tampão KRB ou tampão KRB na presença ou de
Guo ou de GMP, gaseificado por aproximadamente 15 segundos com carbogênio e as fatias
foram mantidas por 2 horas nestas condições.
A incubação terminava colocando-se as fatias em banho de gelo (4
o
C).
3.4.2. Avaliação do mecanismo de ação da Guanosina
Para avaliarmos o mecanismo de ação da Guanosina foram utilizados antagonistas de
receptores de adenosina e glutamato, inibidores de transportadores de glutamato e
nucleosídeos e bloqueadores de canais iônicos.
Para avaliarmos a relação da Guo com a transmissão das purinas da adenina, utilizamos
antagonistas de receptores de adenosina: ZM 241385 (50 nM), antagonista de receptor A
2A
e
DPCPX (10 µM), antagonista de receptor A
1
de adenosina, e o dipiridamol (10 µM), um
bloqueador de transporte de nucleosídeos.
Para avaliarmos a relação da Guo com a neurotransmissão glutamatérgica, foram
utilizados o MK-801 (50 µM), antagonista do receptor glutamatérgico NMDA, o GAMS (50
µM), antagonista de receptor Kainato e o MCPG (500µM), antagonista de receptor
metabotrópico de glutamato.
Também utilizamos inibidores do transporte de glutamato para avaliar se há
envolvimento da Guo com estes transportadores. Para isto utilizamos o DL-TBOA (100 µM
para avaliar inibição de captação de glutamato e 10 µM para avaliar inibição de transporte
reverso de glutamato) e L-PDC (10 µM, inibindo o transporte reverso de glutamato).
O EGTA (1 mM), a flunarizina (50 µM) e a nifedipina (10 µM) foram utilizados para
avaliar o envolvimento da ação neuroprotetora da Guo com canais de Ca
++
. O 4-AP (50 µM),
um bloqueador de canal de K
+
, foi utilizado para avaliar a relação entre o bloqueio deste
canal com a ação neuroprotetota da Guo.
Estes fármacos foram utilizados nos grupos controle, 15 minutos de PGO e 15 minutos de
PGO seguidos de 2 horas de reperfusão, sendo preparados em tampão fisiológico (KBR) ou
em tampão isquêmico (PGO).
Os antagonistas e inibidores foram incubados da mesma forma descrita para Guo e GMP,
nos grupos controle, 15 minutos de PGO e 15 minutos de PGO seguidos de 2 horas de
reperfusão.
Para avaliarmos um possível bloqueio da ação neuroprotetora da Guo, as drogas foram
adicionadas à reperfusão 10 minutos antes da adição de Guo.
3.4.3. Avaliação das vias de sinalização
As fatias hipocampais submetidas à PGO foram incubadas na presença de inibidores
específicos de proteínas quinases: PD98059 – 25 µM (inibidor específico da MEK), H89 – 5
µM (inibidor específico da PKA), wortmanina – 1 µM (inibidor específico da quinase de
fosfatidilinositol, PI3-K), KN-62 – 10 µM (inibidor específico de quinase dependente de
cálcio-calmodulina – CaMKII), queleritrina – 1 µM (inibidor específico de PKC).
Os inibidores foram incubados da mesma forma descrita para Guo e GMP, em grupos
controle, 15 minutos de PGO e 15 minutos de PGO seguidos de 2 horas de reperfusão.
Os inibidores foram adicionados ao meio de incubação no início da reperfusão, sendo que
a Guo apenas após os 10 minutos iniciais para que o inibidor pudesse atuar, inibindo a via de
sinalização celular correspondente.
3.5. Ensaio de viabilidade celular
A viabilidade celular foi avaliada pela redução do MTT (3-[4,5-Dimetiltiazol-2-il]-2,5-
difenil-tetrazolium brometo = Thiazolyl blue). O MTT é um sal de tetrazolium solúvel em
água, que é convertido a um formazam púrpura insolúvel após clivagem do anel de tetrazólio
por desidrogenases mitocondriais (JACOBSSON & FOWLER, 1999). Após o período de
PGO e reperfusão, as fatias hipocampais foram incubadas com MTT (0,5mg/ml) à 37
o
C por
20 minutos e o formazam reduzido foi solubilizado pela adição de DMSO. A viabilidade
celular foi proporcional à leitura da absorbância medida em leitora de Elisa (550 nm).
3.6. Análise estatística: Os resultados obtidos foram avaliados através da análise de
variância de uma via (ANOVA), seguido do Teste de Duncan, quando necessário. Os
resultados foram considerados significativos quando p< 0,05.
4. RESULTADOS
O objetivo inicial deste trabalho foi avaliar o papel neuroprotetor do nucleosídeo e
nucleotídeo da guanina, Guanosina (Guo) e GMP, respectivamente, frente a um modelo de
isquemia cerebral que é obtido pela Privação de Glicose e Oxigênio (PGO) em fatias de
hipocampo de ratos.
4.1. Avaliação da viabilidade celular de fatias de hipocampo de ratos submetidas à
privação de glicose e oxigênio seguida de reperfusão
4.1.1. O papel da Guanosina
As fatias de hipocampo submetidas a 15 minutos de PGO apresentaram queda
significativa da viabilidade celular em relação ao grupo controle. A adição de Guo
(concentração de 100 µM) aos 15 minutos de PGO, ou a reperfusão por um período de 2
horas após os 15 minutos de PGO, reverteu parcialmente a perda de viabilidade celular
induzida pelos 15 minutos de PGO. Entretanto observou-se melhora estatisticamente
significativa da viabilidade celular pela presença da Guo (100 µM) adicionada ao período de
2 horas de reperfusão, após os 15 minutos de PGO (Figura 4).
Os grupos submetidos a 60 minutos de PGO apresentaram queda significativa de
viabilidade celular que não foi revertida pela presença ou não de Guo e/ou reperfusão (Figura
4).
Figura 4. Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos
submetidas à PGO na presença ou não de Guanosina (100µ
µµ
µM). Fatias incubadas na
situação controle (C), por 15 minutos (15 PGO) e por 60 minutos (60 PGO) de PGO, seguido
ou não por 2 horas de reperfusão (+ R). A avaliação da viabilidade celular foi realizada
conforme descrito nos Materiais e Métodos. Os valores representam a média + desvio padrão
de 5 experimentos realizados em triplicatas. * indica médias diferentes do controle; # indica
média diferente de 15 PGO; p<0,05 (ANOVA seguido do teste de Duncan).
C
C Guo
C R
C
+
R Guo
15
P
G
O
15 PGO Gu
o
1
5
P
G
O
+ R
15 PG
O
+
R Gu
o
60
P
G
O
60
PGO G
uo
60
P
G
O
+
R
60
PG
O
+
R
G
uo
0
25
50
75
100
125
#
*
*
*
*
*
Viabilidade celular (%)
4.1.2. O papel do GMP
Foi observado que o GMP (100uM), quando adicionado ao período de reperfusão após 15
minutos de PGO, reverteu significativamente à diminuição da viabilidade celular causada
pela PGO de 15 minutos. Os demais grupos submetidos à PGO apresentaram diminuição da
viabilidade celular que não foi revertida pela presença ou não de GMP e/ou reperfusão
(Figura 5).
Figura 5. Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos
submetidas à PGO na presença ou não de GMP (100µ
µµ
µM). Fatias incubadas na situação
controle (C), por 15 minutos (15 PGO) e por 60 minutos (60 PGO) de PGO, seguido ou não
por 2 horas de reperfusão (+ R). A avaliação da viabilidade celular foi realizada conforme
descrito nos Materiais e Métodos. Os valores representam a média + desvio padrão de 6
experimentos realizados em triplicatas. * indica médias diferentes do controle; # indica
média diferente de 15 PGO; p<0,05 (ANOVA seguido do teste de Duncan).
C
C GMP
C+ R
C + R GMP
1
5PGO
15
PGO GMP
15 PGO + R
1
5
PGO
+
R
GMP
6
0
P
GO
60 PGO GMP
6
0
P
GO+ R
60
PGO
+
R
GMP
0
25
50
75
100
125
*
*
*
*
*
*
*
#
Viabilidade celular (%)
Após este experimento, foi iniciado o estudo sobre o mecanismo de ação da Guo. Sabe-se
que a Guo apresenta importante papel na prevenção de crises convulsivas (LARA et al.,
2001; SCHMIDT et al., 2000), melhora a captação de glutamato diminuindo a toxicidade
glutamatérgica (FRIZZO et al., 2001), estimula a proliferação glial e diferenciação neuronal
(CICCARELLI et al., 2001; RATHBONE et al, 1992b; GYSBERS & RATHBONE, 1996a),
e é neuroprotetora, como observado nos resultados mostrados anteriormente (Figura 4). Além
disto, a concentração extracelular de Guo é resultado da hidrólise do GTP por
ectonucleotidases na fenda sináptica após liberação do GTP, onde este último pode ser
captado e estocado em vesículas (SANTOS et al., 2006). Entretanto, o mecanismo de ação da
Guo, assim como dos demais DG não está elucidado. Portanto, foi investigado o mecanismo
de ação da Guo como agente neuroprotetor em modelo de isquemia através da PGO. Para
isto foi escolhido o tempo de 15 minutos de PGO para os experimentos seguintes, em
decorrência de que no tempo de 60 minutos de PGO não foi observada nenhuma melhora da
viabilidade celular.
4.2. Mecanismo de Ação do Efeito Neuroprotetor da Guanosina
Para avaliar o mecanismo de ação do efeito neuroprotetor da Guo, foi adicionado
antagonistas de receptores ou inibidores de transportadores e canais iônicos durante a PGO
de 15 minutos e durante a PGO seguida de reperfusão de 2 horas. Na PGO, os antagonistas e
inibidores foram adicionados juntamente com o tampão isquêmico. Nos grupos submetidos à
reperfusão, nos primeiros 10 minutos da reperfusão os antagonistas e inibidores foram
adicionados ao meio junto ao tampão fisiológico e somente após estes 10 minutos a Guo foi
adicionada ao meio. Assim pode-se observar se o papel neuroprotetor da Guo era bloqueado
ou não pela inibição destes receptores, transportadores e canais iônicos, sendo possível assim
identificar seu mecanismo de ação.
4.2.1. Avaliação da viabilidade celular na presença de Guo e antagonistas de receptores
de adenosina e inibidor do transporte de nucleosídeos
Evidências mostram que as purinas da guanina se unem aos receptores das purinas da
adenina com baixa afinidade (MULLER & SCIOR, 1993). Com isso, ao iniciar a avaliação
do mecanismo de ação da Guo, foi escolhido os receptores de adenosina (ADO). Utilizou-se
o ZM241385 (50 nM), um antagonista específico de receptor A
2A
de adenosina, e o DPCPX
(10 µM), um antagonista específico de receptor A
1
de adenosina. Foi constatado que os
grupos submetidos a 15 minutos de PGO apresentaram diminuição significativa da
viabilidade celular, que não foi alterada pela presença das drogas referidas. Os grupos que
foram submetidos à reperfusão com Guo não tiveram seu efeito bloqueado pela presença dos
antagonistas, não evidenciando a ação da Guo via os receptores de adenosina A
2A
e A
1
(Figura 6).
Para caracterizar se o efeito neuroprotetor da Guo ocorria no meio extracelular ou
intracelular, foi utilizado o Dipiridamol (10 µM), um inibidor de transporte de nucleosídeos.
Estes transportadores de nucleosídeos funcionam de forma bidirecional, modulando a
concentração de nucleosídeos presentes na fenda sináptica (BENDER et al., 1994; GU et al.,
1996). Foi constatado que a Guo mantém seu efeito neuroprotetor mesmo na presença do
inibidor de transporte de nucleosídeos (dipiridamol), não sendo evidenciada uma ação
intracelular da Guo (Figura 6).
Figura 6. Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos
submetidas à PGO na presença de Guanosina (100µ
µµ
µM), antagonistas de receptores de
ADO e inibidor de transporte de nucleosídeos. Fatias incubadas na situação controle (C),
por 15 minutos (15 PGO) e 15 minutos seguido de reperfusão com Guo (15 PGO + RGuo).
Foram utilizados ZM (antagonista específico de receptor A
2A
de adenosina, 50 nM), DPCPX
(antagonista específico de receptor A
1
de adenosina, 10 nM) e Dipiridamol (inibidor de
transporte de nucleosídeos, 10 nM) nos três grandes grupos (Controle, 15 PGO, 15 PGO +
RGuo). A avaliação da viabilidade celular foi realizada conforme descrito nos Materiais e
Métodos. Os valores representam a média + desvio padrão de 4 experimentos realizados em
triplicatas. * indica médias diferentes do controle; # indica médias diferentes de 15 PGO;
p<0,05 (ANOVA seguido do teste de Duncan).
C
C ZM
C DP
C
PX
C Dip
15
P
GO
1
5 P
GO
ZM
15 PGO DP
C
PX
15 PGO Dip
1
5 P
GO
+
R
G
uo
15 PGO + R ZM
G
uo
15 PGO + R DP
C
PX
G
uo
15
P
GO + R Dip
G
uo
0
25
50
75
100
125
*
*
*
*
# #
#
#
Viabilidade celular (%)
4.2.2. Avaliação da viabilidade celular na presença de Guo e antagonistas de receptores
de Glutamato
Para avaliar se o papel neuroprotetor da Guo estava envolvido com receptores de
glutamato, foi utilizado um antagonista do receptor ionotrópico NMDA, o MK-801 (50 µM),
um antagonista do receptor ionotrópico kainato, GAMS (50 µM), e um antagonista não-
seletivo de receptores metabotrópicos, MCPG (500 µM).
Todos os grupos submetidos a 15 minutos de PGO apresentaram queda significativa da
viabilidade celular. Os grupos que foram submetidos à reperfusão na presença de Guo,
apresentaram reversão da perda da viabilidade celular e a adição dos antagonistas não alterou
a ação neuroprotetora da Guo, mostrando que seu efeito não ocorre via ativação de receptores
de glutamato (Figura 7).
Os receptores de glutamato, quando bloqueados individualmente por seus antagonistas
específicos, não alteraram a função neuroprotetora da Guo. Para avaliar se o bloqueio
simultâneo destes receptores alterava a ação neuroprotetora da Guo, foi utilizado um coquetel
com os 3 bloqueadores simultaneamente (MK-801, GAMS, MCPG), nas mesmas
concentrações que quando utilizados isoladamente. Porém não foi observada nenhuma
alteração na ação da Guo (Figura 7).
Figura 7. Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos
submetidas à PGO na presença de Guanosina (100 µ
µµ
µM) e antagonistas de receptores de
glutamato. Fatias incubadas na situação controle (C), por 15 minutos (15 PGO) e 15 minutos
seguido de reperfusão com Guo (15 PGO + RGuo). Foram utilizados antagonista de receptor
NMDA (MK-801, 50 µM), antagonista de receptor kainato (GAMS, 50 µM), antagonista de
receptor metabotrópico (MCPG, 500 µM) e um coquetel (Coq, com as mesmas
concentrações que as utilizadas individualmente) de antagonistas de receptores de glutamato
nos três grandes grupos (C, 15 PGO, 15 PGO + RGuo). A avaliação da viabilidade celular foi
realizada conforme descrito nos Materiais e Métodos. Os valores representam a média +
desvio padrão de 5 experimentos realizados em triplicatas. * indica médias diferentes do
controle; # indica médias diferentes de 15 PGO; p<0,05 (ANOVA seguido do teste de
Duncan).
C
C MK-801
C GA
M
S
C
M
C
P
G
C
Coq
15 P
GO
15
P
GO MK-80
1
15
P
GO GAMS
15 PGO MCPG
15 PGOCoq
15
P
GO + R
Gu
o
1
5 P
GO +
R MK-8
01Gu
o
15
P
GO +
R GA
M
S
Gu
o
15
P
GO +
R MCP
G Guo
15 PGO+
R
Co
q
Guo
0
25
50
75
100
125
*
*
*
*
*
#
#
#
#
#
Viabilidade celular (%)
4.2.3. Avaliação da viabilidade celular na presença de Guo e inibidores de captação de
glutamato
FRIZZO et al. (2002) observaram que a Guo, nas concentrações de 1 e 100 µM,
aumentam significativamente a captação de glutamato em fatias de córtex submetidas à PGO,
sendo que este efeito pode estar envolvido com a neuroproteção contra a excitotoxicidade
glutamatérgica.
Segundo BONDE et al. (2003), altas concentrações do DL-TBOA (acima de 50 µM)
induzem a uma marcante neurotoxicidade, por diminuir consideravelmente a captação de
glutamato, resultando na ativação de receptores NMDA.
Para avaliar se a ação da Guo se dava via transportadores de glutamato foi utilizado o
DL-threo-beta-benziloxiaspartato (DL-TBOA, 100 µM), um inibidor de transporte de
glutamato. A adição do DL-TBOA não aumentou o dano causado pela PGO, e não alterou
ação da Guo (Figura 8).
Figura 8. Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos
submetidas a PGO na presença de Guanosina (100 µ
µµ
µM) e inibidores da captação de
glutamato. Fatias incubadas na situação controle (C), por 15 minutos (15 PGO) e 15 minutos
seguido de reperfusão com Guo (15 PGO + RGuo). Foi utilizado inibidor de captação de
glutamato (DL-TBOA, 100 µM) nos três grandes grupos (C, 15 PGO, 15 PGO + RGuo). A
avaliação da viabilidade celular foi realizada conforme descrito nos Materiais e Métodos. Os
valores representam a média + desvio padrão de 5 experimentos realizados em triplicatas. *
indica médias diferentes do controle; # indica médias diferentes de 15 PGO; p<0,05
(ANOVA seguido do teste de Duncan).
C
C
DL-
TBOA
1
5
P
GO
1
5 PGO DL-TBOA
15
PG
O
+
R Gu
o
1
5
PG
O
+
R DL-TBOA Guo
0
25
50
75
100
125
*
*
#
#
Viabilidade celular (%)
4.2.4. Avaliação da viabilidade celular na presença de Guo e inibidores de transporte
reverso de glutamato
Após ser avaliado o papel dos transportadores de Glutamato inibindo a captação de
glutamato e observando-se que a Guo não atua via este mecanismo, foi avaliado se o
bloqueio do transporte reverso de glutamato interfere na ação da Guo. Segundo BONDE et
al. (2003) quando em concentrações subtóxicas (10 µM), o DL-TBOA e o L-PDC (L-trans-
2,4-pirrolidina dicarboxilato) reduzem significativamente o transporte reverso de glutamato,
protegendo neurônios piramidais da área CA1 do hipocampo submetidos à PGO.
A utilização de bloqueadores de transporte de glutamato (DL-TBOA e L-PDC) em uma
concentração de 10 µM, onde apenas o transporte reverso de glutamato é inibido, não alterou
a ação neuroprotetora da Guo, nem o dano causado pela PGO (Figura 9).
C
C
D
L
-T
B
O
A
C
L
-P
D
C
1
5 PGO
1
5
P
G
O
D
L
-
TBOA
1
5
P
G
O
L-
P
DC
1
5
P
G
O
+
R
G
u
o
15 PGO+ R DL-TBOA
G
u
o
15 PGO+
R
L-PDC
G
u
o
0
25
50
75
100
125
*
*
*
#
#
#
Viabilidade celular (%)
Figura 9. Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos
submetidas à PGO na presença de Guanosina (100 µ
µµ
µM) e inibidores de transporte
reverso de glutamato. Fatias incubadas na situação controle (C), por 15 minutos (15 PGO) e
15 minutos seguido de reperfusão com Guo (15 PGO + RGuo). Foram utilizados inibidores
de transporte reverso de glutamato (DL-TBOA e L-PDC, 10 µM) nos três grandes grupos (C,
15PGO, 15 PGO + RGuo). A avaliação da viabilidade celular foi realizada conforme descrito
nos Materiais e Métodos. Os valores representam a média + desvio padrão de 6 experimentos
realizados em triplicatas. * indica médias diferentes do controle; # indica médias diferentes
de 15 PGO; p<0,05 (ANOVA seguido do teste de Duncan).
4.2.5. Avaliação da viabilidade celular na presença de Guo e o papel do Cálcio
Após ser demonstrado que o papel neuroprotetor da Guo não ocorre via receptores e
transportadores de ADO e de glutamato, e depois de constatado que a ação neuroprotetora da
Guo é extracelular, pois a utilização do dipiridamol não alterou seu efeito, foi estudado o
papel do cálcio na função neuroprotetora da guanosina.
4.2.5.1 Avaliação da viabilidade celular na presença de Guo e o papel do EGTA, um
quelante de Cálcio extracelular
As fatias de hipocampo submetidas à PGO e reperfusão em um tampão sem cálcio e na
presença de um quelante de cálcio extracelular, EGTA (1 mM), apresentaram uma
diminuição significativa da viabilidade celular no grupo submetido à reperfusão na presença
de Guo, em relação ao mesmo grupo na presença de íons cálcio. Guo teve seu efeito
neuroprotetor abolido na presença do EGTA, ou seja, em um meio extracelular com redução
nos níveis de cálcio. Nos 15 minutos de PGO não houve alteração da viabilidade celular na
presença de EGTA (Figura 10).
Figura 10. Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos
submetidas a PGO na presença de Guanosina (100 µ
µµ
µM) e EGTA. Fatias incubadas na
situação controle (C), por 15 minutos (15 PGO) e 15 minutos seguido de reperfusão com Guo
(15 PGO + RGuo). Foi utilizado EGTA (quelante de Cálcio, 1 mM) nos três grandes grupos
(C, 15 PGO, 15 PGO + RGuo). A avaliação da viabilidade celular foi realizada conforme
descrito nos Materiais e Métodos. Os valores representam a média + desvio padrão de 5
experimentos realizados em triplicatas. * indica médias diferentes do controle; # indica
média diferente de 15 PGO, + indica média diferente de 15 PGO + RGuo; p<0,05 (ANOVA
seguido do teste de Duncan).
C
C EG
T
A
1
5
P
GO
15 PG
O
E
GT
A
15
PG
O
+
R
Guo
15
PG
O
+
R
E
GT
A Gu
o
0
25
50
75
100
125
*
*
#
+
Viabilidade celular (%)
4.2.5.2. Avaliação da viabilidade celular na presença de Guo e Flunarizina
Para dar continuidade à investigação sobre o papel do cálcio na neuroproteção induzida
pela Guo observada em fatias de hipocampo submetidas a 15 minutos de PGO e reperfusão
de 2 horas, foi utilizada a flunarizina, um bloqueador de canais tipo T de Na
+
e Ca
++
, numa
concentração de 50 µM em 0,5 % de DMSO. O DMSO 0,5 % não alterou a viabilidade dos
grupos controle, na PGO e na reperfusão.
Não foi observada nenhuma alteração na viabilidade celular com a adição da flunarizina
no período de reperfusão juntamente com a Guo, constatando que a Guo não atua via estes
canais iônicos (Figura 11).
Figura 11. Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos
submetidas a PGO na presença de Guanosina (100 µ
µµ
µM) e Flunarizina. Fatias incubadas
na situação controle (C), por 15 minutos (15 PGO) e 15 minutos seguido de reperfusão com
Guo (15 PGO + RGuo). Foi utilizado Flunarizina (flu, 50 µM) e um controle com 0,5% de
DMSO nos três grandes grupos (C, 15 PGO, 15 PGO + RGuo). A avaliação da viabilidade
celular foi realizada conforme descrito nos Materiais e Métodos. Os valores representam a
média + desvio padrão de 4 experimentos realizados em triplicatas. * indica médias
diferentes do controle; # indica médias diferentes de 15 PGO; p<0,05 (ANOVA seguido do
teste de Duncan).
C
C
F
lu
C D
M
S
O
0,5
%
15
P
G
O
15
P
G
O F
lu
15 PG
O
D
M
S
O
0,
5%
1
5 PGO + R Gu
o
15
P
G
O+ R Flu Gu
o
1
5'
isq + R
D
MSO
0
,5% Gu
o
0
25
50
75
100
125
*
*
*
#
#
#
Viabilidade celular (%)
4.2.5.3. Avaliação da viabilidade celular na presença de Guo e Nifedipina
Em decorrência da inespecificidade da flunarizina para canais de cálcio, foi utilizado
outro bloqueador de canal iônico, a nifedipina, um bloqueador de canal de Ca
++
dependente
de voltagem do tipo L.
A adição da nifedipina (10 µM em 0,3 % de DMSO) à reperfusão na presença de Guo,
aumentou a viabilidade celular quando comparado à reperfusão com Guo. No entanto, ambos
são estatisticamente iguais ao controle, mostrando um efeito parcial do bloqueio de canais de
cálcio do tipo L na potencialização do efeito da Guo. Desta forma, observa-se que a Guo não
atua diretamente via canais de cálcio do tipo L. Nos grupos submetidos a 15 minutos de
PGO, a nifedipina não alterou a redução da viabilidade celular (Figura 12).
Figura 12. Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos
submetidas à PGO na presença de Guanosina (100 µ
µµ
µM) e Nifedipina. Fatias incubadas na
situação controle (C), por 15 minutos (15 PGO) e 15 minutos seguido de reperfusão com Guo
(15 PGO + RGuo). Foi utilizado Nifedipina (Nif, 10 µM) e um controle com 0,3% de DMSO
nos três grandes grupos (C, 15 PGO, 15 PGO + RGuo). A avaliação da viabilidade celular foi
realizada conforme descrito nos Materiais e Métodos. Os valores representam a média +
desvio padrão de 6 experimentos realizados em triplicatas. * indica médias diferentes do
controle; # indica médias diferentes de 15 PGO; + indica média diferente de 15 PGO +
RGuo; p<0,05 (ANOVA seguido do teste de Duncan).
C
C N
if
C D
M
S
O
0,3
%
15
P
G
O
15 PGO N
if
15 PG
O
D
M
S
O
0,
3%
1
5 PGO + R Gu
o
15 PGO + R
N
if
+
Gu
o
15 PGO
+
R
DMSO 0,3%
+
Gu
o
0
25
50
75
100
125
#
*
*
*
#
+
Viabilidade celular (%)
4.2.6. Avaliação da viabilidade celular na presença de Guo e bloqueador de canal de
potássio
Considerando que os canais de Ca
++
avaliados não demonstraram o possível sítio de ação
extracelular da Guo, foi avaliado o papel dos canais de K
+
. Para isto foi utilizado o 4-
aminopiridina (4-AP, 50 µM), um bloqueador de canal de K
+
.
O 4-AP não alterou a viabilidade nos grupos controle e 15 minutos PGO, porém diminuiu
a viabilidade celular quando adicionado à reperfusão com Guo, sugerindo que ao bloquear o
canal de K
+
, a Guo não consegue exercer seu papel neuroprotetor, demonstrando a
participação de canais de K
+
na ação neuroprotetora da Guo (Figura 13).
Figura 13. Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos
submetidas à PGO na presença de Guanosina (100 µ
µµ
µM) e 4-AP. Fatias incubadas na
situação controle (c), por 15 minutos (15 PGO) e 15 minutos seguido de reperfusão com Guo
(15 PGO + RGuo). Foi utilizado o 4 aminopiridina (4-AP, 50 µM) nos três grandes grupos
(C, 15 PGO, 15 PGO + RGuo). A avaliação da viabilidade celular foi realizada conforme
descrito nos Materiais e Métodos. Os valores representam a média + desvio padrão de 6
experimentos realizados em triplicatas. * indica médias diferentes do controle; # indica
média diferente de 15 PGO; + indica média diferente de 15 PGO + RGuo; p<0,05 (ANOVA
seguido do teste de Duncan).
C
C
4
-
A
P
15
PGO
15
PGO
4
-
A
P
1
5
PGO
+
R
G
uo
15 PGO + R 4-AP Guo
0
25
50
75
100
125
*
*
#
+
Viabilidade celular (%)
4.3 Avaliação das vias de sinalização celular envolvidas na neuroproteção induzida
pela Guo em fatias de hipocampo de ratos submetidas à PGO
Para determinar as vias de sinalização envolvidas na neuroproteção mediada pela Guo em
fatias de hipocampo submetidas à PGO, foram utilizados inibidores específicos das vias da
CaMKII, PKC, PKA, MEK e PI3-K.
Como demonstram as Figuras 14 e 15, a adição da queleritrina (Che, 1 µM), inibidor
específico da PKC; do H89 (5 µM), inibidor especifico da PKA; do PD98059 (25 µM),
inibidor específico da MEK; e da wortmanina (1 µM), inibidor específico da PI3-K, diminuiu
significativamente o efeito neuroprotetor da Guo durante a reperfusão. A reperfusão com
Guo na presença de inibidor específico da via da proteína PI3-K apresentou diminuição
significativa da viabilidade celular quando comparado ao grupo submetido à reperfusão na
presença de PD98059. Não houve alteração da viabilidade celular na presença do KN-62 (10
µM), inibidor específico da proteína CaMKII. Os grupos controle e 15 minutos de PGO não
apresentaram alteração de viabilidade celular na presença ou ausência dos inibidores
utilizados.
C
C
KN
C Che
C
H89
15 P
G
O
15 PGO KN
15
PGO C
h
e
15
PGO
15
PG
O
+
R
G
u
o
1
5 P
G
O+
R
K
N
G
u
o
1
5
PG
O
+
R
C
h
e G
u
o
1
5 P
G
O
+
R
H
8
9 G
u
o
0
25
50
75
100
125
*
*
*
*
#
#
+
+
Viabilidade celular (%)
Figura 14. Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos
submetidas à PGO na presença de Guanosina (100 µ
µµ
µM) e inibidores específicos de vias
de sinalização intracelulares. Fatias incubadas na situação controle (C), por 15 minutos (15
PGO) e 15 minutos seguido de reperfusão com Guo (15 PGO + RGuo). Foi utilizado o KN-
62 (KN, 10 µM), a queleretrina (Che, 1 µM) e o H89 (5 µM) nos três grandes grupos (C, 15
PGO, 15 PGO + RGuo). A avaliação da viabilidade celular foi realizada conforme descrito
nos Materiais e Métodos. Os valores representam a média + desvio padrão de 3-5
experimentos realizados em triplicatas. * indica médias diferentes do controle; # indica
médias diferentes de 15 PGO; + indica médias diferentes de 15 PGO + RGuo; p<0,05
(ANOVA seguido do teste de Duncan).
C
C
PD
C Wo
15
PG
O
1
5 PGO PD
15 PG
O
Wo
15
PGO
+
R
Guo
15 PGO + R
PD Guo
1
5
PG
O
+
R
W
o
Guo
0
25
50
75
100
125
*
*
*
+
#
°
Viabilidade celular (%)
Figura 15. Avaliação da viabilidade celular em fatias de hipocampo de ratos
submetidas à PGO na presença de Guanosina (100 µ
µµ
µM) e inibidores específicos de vias
de sinalização intracelulares. Fatias incubadas na situação controle (C), por 15 minutos (15
PGO) e 15 minutos seguido de reperfusão com Guo (15 PGO + RGuo). Foi utilizado o
PD98059 (PD, 25 µM) e a wortmanina (Wo, 1 µM) nos três grandes grupos (C, 15 PGO, 15
PGO + RGuo). A avaliação da viabilidade celular foi realizada conforme descrito nos
Materiais e Métodos. Os valores representam a média + desvio padrão de 3-4 experimentos
realizados em triplicatas. * indica médias diferentes do controle; # indica média diferente de
15 PGO; + indica média diferente do grupo 15 PGO + R Guo e 15 PGO + R Wo Guo;
◦
indica média diferente do grupo 15 PGO + R Guo e 15 PGO + R PD Guo; p<0,05 (ANOVA
seguido do teste de Duncan).
5. DISCUSSÃO
Os derivados da guanina (DG) e o nucleosídeo guanosina (Guo) são caracterizados em
vários estudos como moduladores da transmissão glutamatérgica (SOUZA & RAMIREZ,
1991; TASCA et al., 1995; 1998; 1999b) apresentando importante papel neuroprotetor em
isquemias (OLIVEIRA et al., 2002), convulsões (SCHMIDT et al.,2000; LARA et al.,2001;
TAVARES et al., 2005) e toxicidade induzida por glutamato (MOLZ et al., 2005). Além
disso, apresentam importante papel neurotrófico e estimulam a produção de fatores
neuroprotetores em culturas de células neuronais e gliais (RATHBONE et al., 1999;
CICARELLI et al., 2001).
A Guo apresenta vários efeitos em células astrogliais que podem estar contribuindo para
sua ação neuroprotetora, incluindo a síntese e secreção de neurotrofinas e fatores
pleiotróficos (MIDDLEMISS et al, 1995b; RATHBONE et al, 1998; CICCARELLI et al,
1999b) e estimulação de captação de glutamato em cultura de astrócitos (FRIZZO et al,
2001). A importância da Guo como molécula protetora é suportada por experimentos in vivo
onde a administração crônica de Guo previne o aparecimento de crises convulsivas e morte
celular em modelos de excitotoxicidade glutamatérgica (LARA et al, 2001; VINADÉ et al,
2003). A Guo afeta ainda parâmetros comportamentais dos ratos, como memória, ansiedade e
locomoção (LARA et al., 2001; VINADÉ et al., 2003; 2005).
Com isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar o papel neuroprotetor da Guo em fatias de
hipocampo de ratos em um modelo de isquemia in vitro através da Privação de Glicose e
Oxigênio (PGO).
A isquemia cerebral resulta na severa degeneração das células e conseqüente perda das
funções cerebrais. Diferentes modelos de isquemia in vitro são estudados, entre eles a PGO
utilizando fatias de hipocampo. O hipocampo é utilizado por ser a área mais susceptível do
SNC à isquemia, onde neurônios da área CA1 são os mais vulneráveis. As fatias de
hipocampo são facilmente estudadas por manterem os circuitos neuronais locais e também
pela fácil aplicação de drogas às mesmas (SCHMIDT-KASTNER & FREUND, 1991; TORP
et al., 1992).
No modelo de isquemia através da PGO, observamos uma redução significativa na
viabilidade celular após 60 minutos de PGO que não foi revertida pela presença ou não de
reperfusão e DG (Figura 4 e 5). Este resultado é semelhante ao encontrado por STRASSER
& FISCHER (1995) e BRONGHOLI et al. (2006), onde foi observado dano neuronal de 50 a
60% em fatias de hipocampo submetidas a 60 minutos de PGO.
Já foi demonstrado que a reperfusão após insultos isquêmicos pode ser mais danosa às
células neurais (SHARKEY et al., 1997). Nesse período ocorre uma grande oferta de
oxigênio às células, causando um desequilíbrio energético intracelular e este pode não ser
totalmente reduzido ocorrendo produção de espécies reativas de oxigênio. No entanto, em
nosso estudo não observamos efeito adicional da reperfusão ao período de PGO, sugerindo a
participação de estresse oxidativo já no período inicial de privação de glicose e oxigênio,
como anteriormente demonstrado (BRONGHOLI et al., 2006).
Com 15 minutos de PGO seguidos de 2 horas de reperfusão na presença de GMP ou de
Guo, ambos com a concentração de 100 µM (Figuras 4 e 5), houve aumento da viabilidade
celular quando comparada a 15 minutos de PGO. Tanto a Guo como o GMP já haviam sido
demonstrados preservando a viabilidade celular de células gliais e fatias hipocampais em
experimentos em que as condições causariam morte celular (LITSKY et al, 1999;
OLIVEIRA et al., 2002; DI IORIO et al, 2004; MOLZ et al., 2005; YOO et al, 2005).
Observou-se em cultura de astrócitos sob condições basais, que tanto purinas da adenina
quanto DG são liberados concomitantemente. Entretanto, a concentração de DG encontra-se
mais elevada que a de purinas da adenina. A concentração de DG se mantém constante
durante 3 horas sendo que a concentração de Guo é 3 vezes maior que a de ADO (purina da
adenina correspondente). Em condições de hipóxia e hipoglicemia, a quantidade de DG e
seus metabólitos aumentam cerca de 2,5 a 3,5 vezes em relação aos valores basais, mantendo
estes níveis elevados por até 30 minutos após à hipóxia e hipoglicemia. A concentração final
de DG durante e após hipóxia-hipoglicemia permanece constante e substancialmente mais
alta que os valores basais, embora a concentração extracelular de Guo aumente
progressivamente, podendo ser resultado do metabolismo extracelular do GTP
(CICCARELLI et al., 1999a).
Após observarmos que a Guo também apresenta ação neuroprotetora em modelo de
isquemia in vitro durante a PGO, buscamos identificar seu mecanismo de ação, pois os DG,
diferentemente das purinas da adenina, não apresentam seus sítios de ação identificados e
caracterizados (RATHBONE et al., 1999).
As purinas da adenina apresentam seus receptores identificados, sendo receptores P1 para
ADO e receptores P2 para ATP e ADP (BURNSTOCK, 1978). Os receptores P1 são
subdivididos em A
1
, A
2A
, A
2B
e A
3
, e os receptores P2 em P2X e P2Y (FIELDS &
BURNSTOCK, 2006). Utilizamos o ZM 241385 (antagonista de receptor de A
2A
de
adenosina) e o DPCPX (antagonista de receptor A
1
de adenosina) que não influenciaram na
ação da Guo (Figura 6). Este resultado vai de acordo com o encontrado por MULLER &
SCIOR (1993) que relatam que nem GTP nem Guo se ligam a receptores de purinas da
adenina com alta afinidade e com os trabalhos de TRAVERSA et al. (2002; 2003) que
demonstrou sítios específicos para a ação da Guo.
Estudos realizados por FRIZZO et al. (2001) e DECKER (2006) já haviam demonstrado
que mesmo com a utilização de inibidores de transporte de nucleosídeos, como o
dipiridamol, a Guo continuava a exercer seu papel neuroprotetor e trófico, o que caracteriza a
ação extracelular da Guo. Em nosso trabalho, o mesmo foi observado (Figura 6), não
havendo diminuição da ação da Guo na presença de dipiridamol, o que vem de acordo com
os dados previamente relatados.
A excitotoxicidade induzida pela PGO pode ter sido mediada ou pelo mau funcionamento
dos transportadores de glutamato ou pela ativação de receptores glutamatérgicos.
A ausência de oxigênio e glicose leva a depleção de ATP e dissipação do gradiente de
Na
++
através da membrana celular, onde a saída de glutamato pode ocorrer por transporte
reverso dependente de sódio (ROSSI et al., 2000). Além do transporte reverso, os
transportadores podem ser inativados durante a isquemia, fazendo com que a retirada de
glutamato do meio extracelular seja ineficaz causando toxicidade. Estes transportadores
podem ter sua captação de glutamato regulada pela Guo (FRIZZO et al., 2001).
Sabendo disso, avaliamos o papel dos transportadores de glutamato na neuroproteção
mediada por Guo. Para isso utilizamos o DL-TBOA e o L-PDC a 10 µM (inibindo o
transporte reverso) e o DL- TBOA a 100 µM (inibindo a captação de glutamato) (BONDE et
al., 2003). Entretanto não observamos nenhuma alteração na ação da Guo (Figuras 8 e 9).
A via clássica de excitotoxicidade, mediada pela ativação de receptores ionotrópicos de
glutamato, dispara o influxo de Ca
++
por estes receptores, que levam a mudança letal na
homeostase de cálcio, aumentando as espécies reativas de oxigênio e eventualmente levando
à morte celular. Esta via pode ser inibida pela presença de antagonistas específicos de
receptores glutamatérgicos (TAN et al., 1998). Os receptores ionotrópicos de glutamato
AMPA e NMDA apresentam importante papel na isquemia neuronal, sendo que o receptor
AMPA é permeável a cátions monovalentes como Na
+
, K
+
, e o receptor NMDA é acoplado a
canais de alta condutância mediando o fluxo de Na
+
, K
+
e Ca
++
(LOPACHIN et al., 2001). Já
os receptores metabotrópicos ativam cascatas intracelulares de sinalização via receptores
acoplados às proteínas G (KENNY & MARKOU, 2004).
Na tentativa de avaliarmos se o efeito neuroprotetor da Guo se dá via estes receptores,
não conseguimos observar diminuição da ação da Guo na presença dos antagonistas MK-801
(receptor NMDA), GAMS (receptor Kainato) e M-CPG (receptor metabotrópico), quando
estes antagonistas foram utilizados individualmente ou em conjunto (Figura 7).
A função neuronal é criticamente dependente da manutenção na distribuição
transmembrana dos íons Na
+
, K
+
, Cl
-
e Ca
++
, e a perda desses gradientes iônicos é
considerada um gatilho para a fisiopatologia da isquemia cerebral e reperfusão, causando
dano neuronal (LOPACHIN et al., 2001).
O gradiente iônico transmembrana é mantido por bombas dependentes de ATP (Na
+
/K
+
-
ATPase; Ca
++
ATPase); por trocas iônicas através de sistema de antiporter (troca de Na
+
-
Ca
++
) e por fluxo passivo através de canais iônicos dependentes ou de voltagem ou de
ligantes (canais de Na
+
, K
+
e Ca
++
, canais de glutamato) (LOPACHIN et al., 2001).
Com poucos minutos de PGO, os níveis de ATP celular diminuem, os aminoácidos
excitatórios são liberados e o colapso no gradiente iônico resulta em despolarização da
membrana (SIESJO, 1992), o que resulta em morte neuronal.
Em estudo realizado por LIMBRICK et al. (2003), a remoção de Ca
++
do meio
extracelular resultou na recuperação dos níveis intracelulares de Ca
++
após a exposição à
excitotoxicidade glutamatérgica. Isto ocorreu, pois a retirada de Ca
++
extracelular, mas não
de Na
+
reduziu a elevação de Ca
++
intracelular induzida pelo glutamato e capacitou o
neurônio a restaurar os níveis de repouso de Ca
++
intracelular, sugerindo que o influxo de
Ca
++
é o maior contribuinte para elevação da concentração de Ca
++
intracelular.
Em nosso trabalho, ao utilizarmos o EGTA (um quelante de Ca
++
extracelular em um
meio sem adição de íons Ca
++
) nas fatias hipocampais submetidas à 15 minutos de PGO
seguida de reperfusão e na presença de Guo, observamos uma redução significativa no efeito
neuroprotetor da Guo, demonstrando a participação do influxo de Ca
++
no efeito da Guo
(Figura 10). Entretanto, ao utilizarmos a nifedipina (bloqueador de canal de Ca
++
dependentes de voltagem) durante a reperfusão, a Guo teve seu efeito potencializado,
demonstrando que o bloqueio dos canais do tipo L também auxilia na recuperação celular
promovida pela nova oferta de glicose e oxigênio (reperfusão) (Figura 12). A flunarizina
(bloqueador de canal de Ca
++
e Na
+
dependentes de voltagem) não exerceu nenhum efeito
contrário à ação da Guo (Figura 11).
No SNC, a liberação de neurotransmissores, a excitabilidade e a plasticidade neuronal, a
expressão gênica dependente de atividade, o crescimento de neuritos, a sinaptogênese, a
diferenciação e a sobrevida neuronal são processos dependentes de Ca
++
(PIETROBON,
2005). Entretanto, todas estas funções são realizadas dentro de uma estreita variação na
amplitude de concentração de Ca
++
, pois este cátion pode ser tóxico se o seu nível não estiver
controlado (BUDDE et al., 2002).
Um moderado aumento na concentração intracelular de Ca
++
diminui a morte neuronal
em neurônios hipocampais submetidos à PGO (BICKLER & FAHLMAN, 2004). Isto pode
ocorrer, pois um moderado aumento na concentração de Ca
++
ativa importantes vias de
sobrevida, incluindo a proteína quinase B (Akt; CHENG et al., 2003), a via das proteínas
quinases ativadas por mitógenos p42/44 (MAPK / ERK de 42 e 44 KDa; FAHLMAN et al.,
2002) e o fator de crescimento derivado do cérebro (CHEN et al., 2003).
Estudo recente relatou que tratamento por 48 horas com Guo em cultura de astrócitos
corticais promove a expressão funcional de canais de K
+
retificadores de correntes (Kir), até
então não observados neste tipo de células. Com isso, estes canais regulam a homeostase de
K
+
, sugerindo um papel neuroprotetor exercido pela Guo. Entretanto não se sabe por qual
mecanismo a Guo é capaz de promover este efeito (BENFENATI et al., 2006).
Além de canais de K
+
que retificam correntes (os canais Kir ou GIRK), temos os canais
de K
+
dependente de voltagem, como os tipo A, D, M e o retificado com atraso, que
contribuem para a repolarização, e os canais de K
+
dependentes de Ca
++
que abrem após a
despolarização para repolarizar, conhecidos como canais SK (de baixa condutância) e BK (de
grande condutância) (YUAN & CHEN, 2006).
Todos os canais com condutância ao K
+
são sensíveis à glicose e ao ATP. Sendo assim,
qualquer mudança no estado redox da célula faz com que a condutância através dos canais de
K
+
seja alterada (VELASCO et al., 2006).
A área CA1 do hipocampo é a região do cérebro mais vulnerável ao dano induzido por
isquemia e reperfusão (SMITH et al., 1984), junto com o fato de que a região CA1 é a região
com menor densidade de canais de K
+
sensíveis ao ATP (KARSCHIN et al, 1997; ZAWAR
et al., 1999). Isto suporta a hipótese que os canais de K
+
sensíveis à ATP têm um importante
papel na resposta celular ao dano isquêmico.
O estudo realizado por BENFENATI et al (2006) nos impulsionou a buscar um possível
mecanismo de ação para a Guo via canais de K
+
, com a utilização do 4-AP, um inibidor de
canal de K
+
. O 4-AP bloqueia preferencialmente canal de K
+
tipo A dependente de voltagem,
o que resulta num grande potencial de ação dendrítico que algumas vezes leva ao influxo
Ca
++
(YUAN & CHEN, 2006). Com a utilização do 4-AP, e conseqüente bloqueio de canais
de K
+
, observamos uma diminuição da ação neuroprotetora da Guo (Figura 13).
Ao bloquearmos o canal de Ca
++
do tipo L com a nifedipina, a Guo tem seu efeito
potencializado. Porém, quando utilizamos o 4-AP, que bloqueia o canal de K
+
, a Guo perde
seu efeito neuroprotetor. Efeito semelhante ocorre quando utilizamos um quelante de Ca
++
extracelular, pois a Guo perde parcialmente o seu efeito. Com isso podemos concluir que a
Guo atua via canal de K
+
e de forma dependente das concentrações de Ca
++
extracelular.
Isto pode ocorrer, pois o canal de K
+
do tipo SK (dependente de Ca
++
) está colocalizado
com o canal de Ca
++
do tipo L a uma distância estimada de 50 a 150 nm, na membrana
celular de corpos de neurônios piramidais da região CA1 do hipocampo (MARRION &
TAVALIN, 1998). A entrada de Ca
++
pelo canal do tipo L pode ativar o canal de K
+
,
favorecendo a Guo de exercer sua ação neuroprotetora. Estes canais de K
+
dependentes de
Ca
++
podem ser ativados através da liberação dos estoques intracelulares de Ca
++
. Isto resulta
num recrutamento diferente destes canais, que depende da freqüência de disparo do neurônio
e é um importante mecanismo para regulação da excitabilidade da membrana celular de
maneira plástica (AKITA & KUBA, 2000).
Como a isquemia e a reperfusão levam a um aumento marcante da concentração de Ca
++
intracelular, este se liga à calmodulina e estimula a ativação de uma variedade de enzimas,
entre elas a CAMKII (GHOSH & GREENBERG, 1995). A CAMKII é a proteína de
sinalização mais abundante na densidade pós-sináptica e uma das quinases mais importantes
ativadas durante a isquemia cerebral e início do período de reperfusão (MENG et al., 2003).
No entanto, em nosso trabalho, não encontramos correlação direta entre o efeito
neuroprotetor da Guo na PGO e a ativação da proteína CAMKII, através da utilização de um
inibidor seletivo (Figura 14).
Evidências mostram que a morte neuronal após a isquemia pode ser causada por um
desequilíbrio em eventos de sinalização, dentre elas a via da PI3-K-AKT que é uma
importante via de sinalização anti-apoptótica em neurônios (LOVE, 2003). Diferentes áreas
hipocampais apresentam sensibilidade diferente à PI3-K: a área do giro denteado tem a PI3-
K como principal via anti-apoptótica, enquanto a área CA1 apresenta outras vias anti-
apoptóticas (HORN et al., 2005). Em nosso trabalho, após 15 minutos de PGO seguidos de 2
horas de reperfusão na presença de wortmanina e Guo, a Guo perdeu seu efeito
neuroprotetor, demonstrando que a via da PI3-K é uma das vias envolvidas na neuroproteção
induzida pela Guo.
Células PC12 tratadas com os nucleosídeos, adenosina e Guo, apresentam aumento da
viabilidade celular e no crescimento neurítico após insulto hipóxico. Isto se dá, pois os
nucleosídeos da purina ativam a via da MAPK (TOMASELLI et al., 2005). Estes dados vão
de encontro ao resultado encontrado em nosso trabalho, onde a adição de PD98059 à
reperfusão com Guo inibiu a ação da Guo, demonstrando que esta via também está envolvida
na recuperação da viabilidade celular obtida pela adição de Guo à reperfusão.
Em PGO e outros danos excitotóxicos in vitro os níveis e a atividade de PKC encontram-
se aumentados precocemente (SELVATICI et al., 2003), estando a ativação da PKC
relacionada a insultos isquêmicos. Entretanto a ativação desta via pode estar relacionada à
tolerância do cérebro pós-precondicionamento (BRIGHT & MOCHLY-ROSEN, 2005). Em
nosso trabalho, a via da PKC está envolvida com a neuroproteção mediada pela Guo, pois
sua inibição leva à diminuição da viabilidade celular na presença de queleretrina e Guo.
Outra via avaliada foi a via da PKA, que também está envolvida com a neuroproteção
mediada pela Guo em modelo de isquemia in vitro através da PGO.
Portanto, a neuroproteção induzida pela Guo se dá via a ativação das vias de sinalização
intracelulares PKA, PKC, MEK/MAPK e PI3-K (Figura 14 e 15). A participação destas
proteínas quinases, individualmente ou em conjunto, no efeito neuroprotetor da Guo, bem
como os mecanismos de ativação destas proteínas decorrente da ação da Guo, permanecem
como questões a serem respondidas.
6. CONCLUSÕES
1. Os DG, Guo e GMP, são neuroprotetores no modelo de isquemia in vitro (PGO)
quando fatias de hipocampo são submetidas a 15 minutos de PGO seguidos de 2 horas de
reperfusão na presença destes DG;
2. A Guo não atua via receptores purinérgicos (adenosinérgicos), pois a utilização de
antagonistas para estes receptores não inibiu seu efeito protetor;
3. A presença de antagonistas de receptores glutamatérgicos ionotrópicos e
metabotrópicos isolados ou em conjunto não interferiram na ação neuroprotetora da Guo,
concluindo que a Guo não atua via estes receptores;
4. A Guo atua no meio extracelular, pois a utilização de inibidores de transporte de
nucleosídeos não alterou sua ação neuroprotetora em fatias de hipocampo submetidas a 15
minutos de PGO seguidos de 2 horas de reperfusão;
5. A ação neuroprotetora da Guo em fatias de hipocampo de ratos submetidas à PGO não
é alterada pelo bloqueio de transporte de glutamato (captação ou transporte reverso de
glutamato);
6. A Guo necessita de Ca
++
extracelular para atuar como agente neuroprotetor após a
PGO em fatias de hipocampo de ratos, pois ao quelarmos o Ca
++
extracelular, a Guo perde
seu efeito;
7. O bloqueio do canal de Ca
++
potencializa parcialmente o efeito da Guo, mostrando que
a Guo não atua diretamente via canais de Ca
++
do tipo L;
8. O bloqueio de canal de K
+
leva à perda do efeito neuroprotetor da Guo, sugerindo que
a ação neuroprotetora da Guo ocorre através da ativação de canais de K
+
dependentes de
Ca
++
;
9. A ação neuroprotetora da Guo durante a PGO em fatias de hipocampo ocorre via
ativação das vias da PKA, PKC, MEK e PI3K.
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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