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ANNA CAROLINA VALENTE MAIA
Avaliação do potencial terapêutico de
células mononucleares do cordão
umbilical humano no modelo de infarto
agudo do miocárdio experimental.
TESE DE MESTRADO APRESENTADA AO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (FISIOLOGIA) DO INSTITUTO DE BIOFÍSICA
CARLOS CHAGAS FILHO DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO,
VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS.
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
2006
UFRJ
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iiii
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL TERAPÊUTICO DE CÉLULAS
MONONUCLEARES DO CORDÃO UMBILICAL NUM MODELO
EXPERIMENTAL DE INFARTO AGUDO DO MIOCÁRDIO.
Anna Carolina Valente Maia
Tese de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em ciências
biológicas (Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da
Universidade Federal do Rio de Janeiro-UFRJ, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências.
ORIENTADOR: ANTÔNIO CARLOS CAMPOS DE CARVALHO
MARCELO MARCOS MORALES
Rio de Janeiro
2006
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iiiiii
FOLHA DE APROVAÇÃO
Anna Carolina Valente Maia
Avaliação do potencial terapêutico de células mononucleares de
cordão umbilical num modelo experimental de infarto agudo do
miocárdio.
Laboratório de Cardiologia Celular e Molecular do Instituto de Biofísica Carlos Chagas
Filho do Centro de Ciências e Saúde da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como
parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre.
APROVADA POR:
____________________________________________________________
Prof. Dr. Antônio Carlos Campos de Carvalho-Orientador
Laboratório de Cardiologia Celular e Molecular do Instituto de Biofísica Carlos Chagas
Filho do Centro de Ciências e Saúde da Universidade Federal do Rio de Janeiro
_____________________________________________________________
Profa. Dra. Regina Coeli dos Santos Goldenberg
Laboratório de Cardiologia Celular e Molecular do Instituto de Biofísica Carlos Chagas
Filho do Centro de Ciências e Saúde da Universidade Federal do Rio de Janeiro
________________________________________________________________________
Profa. Dra.Rosália Mendes Otero
Laboratório de Neurobiologia Celular e Molecular do Instituto de Biofísica Carlos Chagas
Filho do Centro de Ciências e Saúde da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
_________________________________________________________________________
Prof.Dr. Fernando Costa e Silva Filho
Laboratório de Biologia da Superfície Celular do Instituto de Biofísica Carlos Chagas
Filho do Centro de Ciências e Saúde da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
_________________________________________________________________________
Prof.Dr. Roberto Coury Pedrosa Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da
Universidade Federal do Rio de Janeiro
______________________________________
Profa. Dra. Jennifer Lowe
Laboratório de Físico-Química Biológica Ainda Hassón-voloch do Instituto de Biofísica
Carlos Chagas Filho do Centro de Ciências e Saúde da Universidade Federal do Rio de
Janeiro
iviv
A minha mãe, Maria Albertina, minha
melhor amiga e professora! Minha alma
gêmea! Sempre presente em tudo!
Ao meu pai, Maia Neto, meu maior exemplo
de determinação, amizade e dedicação! A Prova
de que para todo fim há sempre um recomeço!
Além de ser o melhor pai do mundo!
da vida
Ao meu irmão, Phelippe, por ser o melhor e
mais completo amigo que uma irmã pode ter!
Estando sempre ao meu lado em tudo!
As minhas queridas avós, Ana e Wilma, por
serem as melhores avós do mundo! Preenchendo a
minha vida com muita atenção e carinho!
vv
AGRADECIMENTOS:
Ao meu orientador professor Antonio Carlos C. Carvalho pela oportunidade de participar
deste projeto e por contribuir para o meu amadurecimento pessoal e profissional.
A professora Regina Coeli dos Santos Goldenberg, pelo interesse e pela grande
contribuição durante esses meus anos no laboratório!
Ao Igor e a Fabiane pela realização da citometria de fluxo!Muito obrigada!
Ao Professor e grande amigo, João Pedro S. Werneck de Castro, não só pela grande
participação neste projeto, mas também, pela sua amizade!
A minha grande amiga Vanessa Pinho Ribeiro (TCHU) por estar sempre presente
contribuindo e participando dos meus projetos profissionais e pessoais! Agradeço por
todos os bons e grandes momentos que passamos juntas! Te adoro muito!
A minha amiga, importada de Gurupi, Patrícia Fideles (Pat), pelo carinho, dedicação e pela
participação fundamental neste trabalho! É muito bom sempre poder contar com você!
As minhas super-patas amigas, Débora Mello e Juliana Dias, por todos os nossos
surpreendentes momentos! E, também, pelas festinhas e viagens inesquecíveis! É um
privilégio ter amigas assim! Vocês são demais!
vivi
Aos meus super-amigos hepáticos, Bruno Dias Paredes (Nobrux) e Luis Fernando
Quintanilha, pela amizade e pelos inesquecíveis momentos de risadas!
A minha querida amiga Dayse pela sua atenção, carinho e dedicação! Mostrando que bons
profissionais são essenciais no laboratório! Obrigada por tudo!
A minha amiga, Juliana Silva, pelo carinho, amizade e a ajuda prestada!
Ao pós-graduando, Ricardo Souza, pela participação nesse trabalho! E, também, pelas
opiniões sempre pertinentes!
A Dra Nazaréth pelo auxílio na realização do ecocardiograma! Muito obrigada!
A todos os amigos do laboratório: Ramon, Leandro, Fabrício, Cássia, Felipe, Luis
Fernando, Carol, Brenda, Fabio Fortes, Rafael, Débora, Amarildo e Bruno Esporcatte.
Valeu pelo apoio galera!
A Dra. Débora Ornellas pela super-paciência e atenção!
Aos meus afilhados Samir e Bia, por todo o carinho e pela grande assistência tecnológica
prestada a qualquer hora! Além do imenso carinho! Muito obrigada!
A minha super-amiga de todas as horas, Amanda Santos (big monster), pelas longas
conversas e caronas! Além das choppadas, festas e mangues inesquecíveis: é claro! Te
adoro, bebe!
viivii
minha querida tia, Fátima, e a minha super-dinha, Cristina, por toda a atenção, carinho e
amizade! Amo vocês!
Aos meus super-tios (Marcelo e Afonso) e ao meu padrinho exclusivo, Nelsinho, pelo
carinho de sempre!
A minha super-prima, Ana Luisa, pela grande amizade, carinho e pela sua atenção!
A minha cunhadinha Ana Maria, por todo apoio e carinho! E bom ter você na nossa
família!
A minha querida Daise França, pelas longas conversas, me fazendo ver a vida por todos os
ângulos!
Ao meu amigo, Renato (Fraconildo), pelas longas conversas e pelo carinho de sempre!
A Eliane e toda a sua equipe da 7
a
CRE, por ceder o computador nas horas de desespero!
Muito obrigada!
viiiviii
RESUMO
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL TERAPÊUTICO DE CÉLULAS
MONONUCLEARES DO CORDÃO UMBILICAL NUM MODELO
EXPERIMENTAL DE INFARTO AGUDO DO MIOCÁRDIO.
Anna Carolina Valente Maia
Orientador: Antônio Carlos Campos de Carvalho.
Tese de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em ciências biológicas
(Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da Universidade Federal do
Rio de Janeiro-UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de
Mestre em Ciências.
As células mononucleares de cordão umbilical humano (CMCUH) contêm
células progenitoras com capacidade de se diferenciar em capilares e cardiomiócitos.
Além disso, diferente das células da medula óssea, as células do cordão umbilical
podem ser obtidas de forma não invasiva. Assim, o objetivo desse estudo foi investigar
o impacto da administração das CMCUH no modelo de infarto do miocárdio (IM).
Três horas após o IM, (2x10
7
) CMCUH (congeladas ou não congeladas) ou
somente o veículo foram injetadas diretamente no miocárdio. Vinte e um dias após a
cirurgia, a função cardíaca foi avaliada por eletro e ecocardiograma, hemodinâmica e
teste de exercício em esteira.
Os grupos infartados exibiram função cardíaca comprometida quando
comparados a ratos falso-operados. Todos os parâmetros de função cardíaca
avaliados não foram estatisticamente diferentes entre os grupos tratados com células
ou veículo em condições de repouso, bem como depois do teste de estresse por
exercício em esteira.
Estes dados demonstram que o tratamento com CMCUH congeladas ou não
congeladas, foi incapaz de prevenir um remodelamento cardíaco ou de melhorar a
função cardiovascular em ratos em um modelo de IM.
Palavras chaves: Infarto do miocárdio – células tronco- sangue de cordão umbilical -
regeneração cardíaca.
Rio de janeiro,
Dezembro 2006
ixix
ABSTRACT
EVALUATION OF THERAPEUTIC OF UMBILICAL CORD BLOOD
MONONUCLEAR CELLS ON AN EXPERIMENTAL MODEL OF ACUTE
MYOCARDIAL INFARCTION.
Anna Carolina Valente Maia
Orientador: Antônio Carlos Campos de Carvalho.
Tese de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em ciências biológicas
(Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da Universidade Federal do
Rio de Janeiro-UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de
Mestre em Ciências.
Human umbilical cord blood mononuclear cells (HUCBMC) contain
progenitor cells that could potentially differentiate into capillares and cardiomyocytes
in vitro. In addition, cord blood can be obtained non-invasively in contrast to invasive
bone marrow aspiration. The aim of this study was to investigate the impact
HUCBMC of administration on cardiac function in a rat model of myocardial
infarction (MI).
Three hours after IM, we injected 2x10
7
HUCBMC (frozen (group 4) or not
frozen (group 5) or vehicle (group 3) directly into myocardium. Twenty one days
later, cardiac performance was evaluated by electro- and echocardiography,
hemodynamic (PDVE, dP/dT max and dP/dT min) and treadmill exercise test
(oxygen consumption: VO
2
).
All the infarcted groups exhibited impaired cardiac function compared to
sham-operated rats (DDVE group 3= 8,8 ± 0,42, group 4= 8,9 ± 0,60, group 5= 10,0 ±
0,20 vs grupo 2= 6,6 ± 0,05, p<0,05). All cardiac functional parameters evaluated were
not statistically different between infarct + HUCBMC group and vehicle group at
resting conditions as well as after treadmill exercise stress test (VO
2
group 1= 50,0 ±
12,4 vs group 2= 40,5 ± 6,4 ml O
2
/kg min, p>0,05).
These data show that HUCBMC (frozen or not frozen) treatment was unable
to prevent cardiac remodeling or to improve cardiovascular function in a rat model
of myocardial infarction.
Keywords: myocardial infarction – stem cells – umbilical cord blood - cardiac
regeneration.
Rio de janeiro,
Dezembro 2006
xx
SUMÁRIO
Folha de rosto.
Folha de aprovação
Agencias financiadoras
Dedicatória
Agradecimentos
Resumo
Abstract
Sumário
Índice de figuras
Índice de tabelas
Abreviaturas
i
ii
iii
iv
v
viii
ix
x
x
xii
xiii
xixi
1 – Introdução
1.1 - O Infarto do miocárdio.
1.2 - O modelo de infarto experimental
1.3 -Terapia Celular
1.4-Células-tronco: Conceito e Hierarquia
1.5 - Células-tronco embrionárias e seu uso terapêutico no infarto do miocárdio
1.6 - Células-tronco adultas e seu uso terapêutico no infarto do miocárdio.
1.6.1 - O cordão umbilical.
1.7-Tratamento utilizando células-tronco do cordão umbilical em modelos experimentais de IM
1
2
4
5
7
9
15
19
2 – Objetivos
24
3 – Materiais e Métodos
3.1 - Animais
3.2 - Isolamento das células mononucleares de cordão umbilical congelado
3.3 - Isolamento das células mononucleares de cordão umbilical não congelado.
3.4 - Contagem de célular
3.5 - Marcação das células com HOECST.
3.6 - Citometria de Fluxo.
3.7 - Técnica de indução do modelo do infarto do miocárdio.
3.8 - Transplante de células ou veículo nos animais infartados.
3.9- Registros eletro e ecocardiográficos.
3.10- Canulação da artéria carótida esquerda
3.11- Análises hemidinâmicas
3.12- Teste cardiopulmonar
3.13- Histopatologia
3.14- Análises estatísticas
25
25
26
27
27
28
30
31
32
37
38
40
41
42
4 - Resultados
4.1- Análises eletrocardiográficas.
4.2- Análises ecocardiográficas.
4.3- Parâmetros hemodinâmicos
4.4- Teste cardiopulmonar.
4.5- Identificação de células no tecido cardíaco.
4.6- Citometria de fluxo
5 - Discussão
6 - Conclusões
7 - Referências bibliográficas.
43
48
53
56
58
60
65
73
74
xiixii
ÍNDICE DE FIGURAS
3-MATERIAIS E MÉTODOS
Figura 1. O modelo do infarto. 31
Figura 2. Realização do exame eletrocardiográfico 34
Figura 3. Realização do exame ecocardiográfico 34
Figura 4. Medida da fração de encurtamento 35
Figura 5. Calculo da fração de encurtamento de área. 35
Figura 6. Calculo do percentual de acinesia do VE 36
Figura 7. Processo cirúrgico de canulação da artéria carótida direita 37
Figura 8. Sistema de registro da pressão intraventriculares 39
Figura 9. Secções realizadas nos ventrículos para análises histológicas 41
4-RESULTADOS
Figura 10. Ângulo QRS dos grupos antes do tratamento. 45
Figura 11. Índice de amplitude QRS antes e 21 depois do tratamento. 46
Figura 12. Ângulo QRS dos grupos 21 dias após o tratamento. 47
Figura 13. Acompanhamento ecocardiográfico ao longo do tempo. 51
Figura 14. Análise de Pressão Desenvolvida pelo VE realizada 21 dias depois do tratamento. 54
Figura 15. Tempo de permanência em exercício obtido no teste de esforço máximo. 57
Figura 16. Consumo máximo de oxigênio obtido no teste de esforço. 57
Figura 17. Análise do tecido cardíaco de um animal infartado e transplantado com células. 59
xiiixiii
LISTA DE TABELAS
3-MATERIAIS E MÉTODOS
Tabela 1. Lista dos anticorpos conjugados com o fluorocromo utilizados na marcação celular. 29
4-RESULTADOS
Tabela 2. Dados do ECO, comparação entre o grupo1e grupo2 48
Tabela 3. Dados do ECO 3 horas após o procedimento cirúrgico (antes do tratamento). 49
Tabela 4. Dados do ECO 21 dias após o IM. 52
Tabela 5. Dados hemodinâmicos 21 dias após o tratamento. 55
Tabela 6. Imunofenotipagem das células mononucleares de cordão umbilical não congelado. 61
Tabela 7. Imunofenotipagem das células mononucleares de cordão umbilical não congelado através de
outros marcadores. 62
xivxiv
LISTA DE ABREVIATURAS
âQRS Angulo do vetor de despolarização do VE
ADVE Área em diástole do VE
ASVE Área em sístole do VE
CCS Centro de Ciências da Saúde
DDVE Diâmetro diastólico do VE
DNA Ácido desoxiribonucleico
DSVE Diâmetro sistólico do VE
G-CSF Fator de estimulação de colônia de granulócitos
GFP+ Green fluorescent protein
HUCB-C Células mononucleares do cordão umbilical congelado
HUCB-F Células mononucleares do cordão umbilical não congelado
HSC Células progenitoras hematopoiética.
IBCCF Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
ICC Insuficiência cardíaca congestiva.
IM Infarto do miocárdio
IL-2 interleucina 2
iQRS Índice QRS
PDFVE Pressão diastólica final do VE
PDVE Pressão desenvolvida do VE
PSFVE Pressão sistólica final do VE
UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro
VE Ventrículo esquerdo
VEGF Fator de crescimento de endotélio
TNF gama Fator de necrose tumoral gama
SCF Fator de Células-Tronco
11
1- INTRODUÇÃO
1.1- O INFARTO DO MIOCÁRDIO
O infarto do miocárdio é uma doença que resulta de uma redução da perfusão local
ocasionada por uma obstrução ao fluxo sangüíneo na circulação coronariana. A partir desta
obstrução, diversas modificações agudas e crônicas ocorrem tanto na região infartada
quanto na área não infartada. Estas modificações são, em geral, referidas como sendo o
remodelamento cardíaco (Litwin et al., 1994; Jain et al., 2001). O processo de
remodelamento cardíaco se caracteriza não só pela remoção dos cardiomiócitos necróticos,
mas também, pela formação do tecido de granulação e a indução da neovascularização da
região peri infarto. Além destas alterações, o miocárdio remanescente é submetido a
modificações geradas por fatores estruturais (extensão da lesão) e hemodinâmicos
(sobrecarga de volume). Assim, o processo de remodelamento cardíaco acaba por
promover hipertrofía do miocárdio remanescente e o aumento da cavidade ventricular
(Ellis et al., 1962; Factor et al., 1990; Pfeffer & Braunwald., 1990)
Apesar dos avanços terapêuticos, atualmente, as doenças cardiovasculares muito
contribuem para as taxa mundiais de mortalidade e morbidade. .No Brasil, este panorama
não é diferente, as doenças do aparelho circulatório e o infarto do miocárdio são
responsáveis por respectivamente 22,93% e 6,39% da taxa de mortalidade
(www.datasus.gov.br
). Dentre as formas de tratamento mais utilizadas no infarto do
miocárdio, as intervenções cirúrgicas e hemodinâmicas convencionais (re-vascularização e
angioplastia) e as terapias farmacológicas (Goodman & Gilman) têm grande destaque no
aumento da sobrevida. Porém, na maioria dos casos, estas terapias não impedem a
evolução do processo congestivo que pode levar a um quadro clínico grave de insuficiência
cardíaca (IC). Muitas vezes, no estágio grave de IC o transplante cardíaco se torna a única
22
possibilidade de tratamento. Entretanto, a terapia é bastante limitada devido à falta de
doadores e as complicações da imunossupressão (Chui et al., 1995; Hughes et al., 2002).
Assim, tratamentos alternativos como o uso de células tronco tem despertado um grande
interesse da comunidade científica.
1.2- O MODELO DE INFARTO EXPERIMENTAL
O modelo experimental de oclusão permanente da artéria coronariana é o mais
utilizado para reproduzir o infarto que ocorre em humanos. Este modelo foi descrito por
Rober F Heimburg, no ano de 1946, que estudava a revascularização do miocárdio através
da injeção de substâncias no saco pericárdio.
A oclusão completa da artéria descendente anterior esquerda promove uma
isquemia transmural em ratos e, consequentemente, o infarto da parede livre do ventrículo
esquerdo (Jonhs & Olson., 1954). É importante ressaltar que a extensão do infarto varia de
acordo com a altura em que é realizada a ligadura da artéria coronária durante o
procedimento cirúrgico.
Do ponto de vista histopatológico, o modelo de ligadura permanente da artéria
coronária anterior foi classicamente descrita por Fishbein et al (1978). Este trabalho relata,
de forma detalhada, todas as etapas do processo fisiopatológico gerado pela obstrução do
fluxo coronariano. Já no primeiro dia após o infarto, os autores descrevem que o
aparecimento de neutrófilos no coração, as primeiras células do sistema imune a
proliferarem com a inflamação. A seguir, no segundo dia, observa-se a infiltração de
células linfocitárias que atingem o seu pico máximo no sétimo dia após o início da injúria.
O terceiro dia do infarto, por sua vez, se caracteriza pelo início de intensa proliferação
vascular que se estende até o décimo sétimo dia. Somente, a partir do quarto e do quinto
dia é evidenciada a presença de fibroblastos e a deposição de colágenos respectivamente.
33
Tanto a proliferação de fibroblastos quanto a deposição de colágeno perduram até três
semanas após o início da injúria. E, ao término da fase de cicatrização (21
o
dia após a
cirurgia), a análise histológica revela uma ausência quase total de necrose, sinais discretos
de edema, hemorragia e congestão, poucos linfócitos; presença moderada de fibroblastos,
proliferação vascular e níveis altos de colágeno intersticial.
A fase aguda do IM é caracterizada por um quadro isquêmico com lesão tecidual
que evolui para uma acentuada morte celular. Essas mudanças histopatológicas resultam
em alterações significativas na função e na geometria cardíacas.
Logo após a perda do miocárdio viável, ainda na fase aguda da injúria, é iniciado o
processo de remodelamento cardíaco. Neste momento, a função ventricular já diminui e o
miocárdio sobrevivente, muitas vezes, não é capaz de compensar a perda tecidual nos
aspectos funcional e metabólico. Esta impossibilidade do miocárdio não isquêmico
compensar a perda tecidual promove o aumento da pressão diastólica e a queda da pressão
sistólica no ventrículo esquerdo o que leva a uma diminuição do débito cardíaco (Zimmer
et al., 1989).
O infarto do miocárdio cicatrizado, por sua vez, se caracteriza, estruturalmente,
pela formação de uma cicatriz fibrosa, neovascularizada, transmural ou subendocárdica
constituída por uma camada densa de fibras colágenas e fibroblastos (Mallory et al., 1939;
Fishebein et al., 1978b; Factor et al., 1990). Nesta fase, destacam-se a hipertrofia e o
aumento da cavidade ventricular resultantes das alterações anatomo-patológicas iniciadas
na fase aguda da injúria (Ellis et al., 1962; Factor et al., 1990; Pfeffer & Braunwald.,
1990).
Nos ratos, a fase crônica de grandes infartos é caracterizada por uma modificação
macroscópica da geometria cardíaca (Olivetti et al.,1991). Tanto o diâmetro transverso
44
quanto o longitudinal encontram-se aumentados. Além disso, há um aumento do volume da
câmara esquerda (Turek et al., 1978; Anversa et al., 1984; Spadaro et al., 1989; Olivetti et
al., 1991).
As características da evolução histopatológica do modelo experimental de IM em
ratos são similar a do infarto humano. Contudo, nos ratos essa evolução é mais rápida e,
apresenta uma resposta polimorfonuclear menos intensa (Selye et al.,1978). Estudos
sugerem que essa rápida progressão do infarto é devido à presença de uma pobre
circulação colateral nos ratos (Schaper et al., 1984; Hearse et al., 1988).
Na população humana, indivíduos coronariopatas crônicos são caracterizados clinicamente
pela presença de arritmias ventriculares, angina pectoris e insuficiência cardíaca. Sendo
essas características, ainda mais evidentes, em pacientes que possuem um infarto de grande
extensão (Julian et al., 1989; Morris et al., 1990). Além disso, esses pacientes são muito
suscetíveis à morte súbita (Hagstrom et al., 1964; Panidis & Morganroth., 1983; Kempf &
Josephson., 1984).
Devido a todas essas características, um grande desafio médico-cientifico é tentar
impedir ou pelo menos atenuar a progressão do infarto para fase crônica. Assim, a falência
cardíaca congestiva poderia ser evitada.
1.3-TERAPIA CELULAR:
A cardiomioplastia celular, que constitui a possibilidade de reconstituição do
miocárdio danificado através do transplante celular, tem sido considerada uma grande
possibilidade de conduta terapêutica (Marelli et al., 1992; Chui et al., 1994). Neste caso,
um determinado tipo celular apropriado é transplantado para o miocárdio injuriado visando
uma melhoria da função contrátil do coração, e, impedindo a progressão da insuficiência
cardíaca.
55
Diferentes tipos celulares têm sido utilizados tanto em modelos animais como em
seres humanos nos últimos anos. Dentre eles, fibroblastos (Sakai et al., 1999a; Hutcheson
et al., 2000), células cardíacas adultas (Li et al., 2000; Li et al., 1999ª), cardiomiócitos
atriais autólogos (Sakai et al. 1999b), cardiomiócitos fetais (Koh et al., 1993; Soonpaa et
al., 1994; Li et al., 1996), mioblastos esqueléticos (Marelli et al., 1992; Chiu et al., 1995;
Taylor et al., 1998; Kessler et al., 1999; Scorsin et al., 2000; Menasche et al., 2001),
células-tronco embrionárias (Klug et al., 1996; Min et al. 2002), células-tronco
mesenquimais de medula óssea (Wang et al., 2000ª; Wang et al., 2001 Olivares et al ,
2004), células-tronco hematopoiéticas (Tomita et al., 1999; Liechty et al.,2000; Orlic et
al., 2001), células-tronco derivadas de fígado de rato adulto (Malouf et al., 2001),
precursores de células endoteliais derivados de medula óssea humana (Kocher et al.,
2001), células endoteliais diferenciadas (Kim et al., 2001), células musculares lisas (Li et
al., 1999b), células mononucleares de medula óssea humana (Perin et al., 2003), células
mononucleares de cordão umbilical (Henning et al., 2004) e células mesenquimais do
cordão umbilical (Kim BO et al., 2005) vêm sendo testados.
Contudo, apesar da diversidade de tipos celulares disponíveis, a escolha quanto ao
melhor tipo de célula doadora permanece controverso.
1.4- CÉLULAS - TRONCO: CONCEITO E HIERARQUIA
A célula-tronco é uma célula indiferenciada, com capacidade de proliferação, auto-
renovação e plasticidade (capacidade de se diferenciar em vários tipos celulares distintos)
(Loeffler& Potten., 1997). Embora a sua capacidade de proliferação seja baixa, essa célula
é altamente clonogênica (Alison et al., 2002). Dois diferentes modelos de divisão celular
podem ser seguidos pelas células–tronco: o denominado determinístico, no qual sua
divisão gera sempre uma célula-tronco idêntica e uma célula progenitora já comprometida
com alguma linhagem específica; ou o dito estocástico (aleatório), onde algumas células-
66
tronco geram somente novas células-tronco e outras geram apenas células progenitoras já
comprometidas (Loffler & Potten 1997). Essas células possuem diferentes graus de
comprometimento celular, ou seja, algumas são completamente indiferenciadas e outras já
apresentam um grau de comprometimento o que possibilita uma classificação hierárquica.
As únicas células-tronco totipotentes são os zigotos (oócitos fertilizados) e as descendentes
das duas primeiras divisões mitóticas que possuem a capacidade de gerar o embrião e o
trofoblasto da placenta. Já as células-tronco denominadas de pluripotentes são aquelas
capazes de se diferenciar em tecidos provenientes dos três folhetos embrionários
(ectoderma, endoderma e mesoderma). Como exemplo de pluripotencialidade, podemos
citar as células-tronco embrionárias derivadas da massa interna do blastocisto (Tomson et
al, 1998; Shamblott et al, 1998). Há autores que propõe que as células mesenquimais da
medula óssea (Orlic et al., 2001; Caplan et al., 1991; Pittinger et al., 1999) e mesenquimais
do cordão umbilical (Erices et al, 2000; Romavano et al., 2003; Kögler G et al., 2004)
também possam exibir pluripotencialidade embora não haja um consenso a esse respeito
(Balsam LB et al, 2004; Murry CE et al., 2004). Existe, também, um outro tipo de célula-
tronco classificado como multipotente. Essas células são encontradas na maioria dos
tecidos e são capazes de produzir uma limitada variedade de linhagens celulares
diferenciadas de acordo com a sua localização (Alison et al., 2002). As células-tronco
encontradas no sistema nervoso central são exemplos de células multipotentes, já que são
capazes de gerar as três linhagens distintas presentes no sitema nervoso central: neurônios,
oligodentrócitos e astrócitos (Clarke et al., 2000; Momma et al., 2000). Por último, na
hierarquia das células-tronco, estão as células chamadas de unipotentes (progenitoras
comprometidas) que apresentam a capacidade de gerar apenas um único tipo celular (ex:
células-tronco constituintes da camada basal da epiderme, que originam somente as células
escamosas queratinizadas da pele). Estas células progenitoras comprometidas originam
77
células com capacidade de auto-renovação limitada, baixa clonogenicidade e rápida taxa de
proliferação. A seguir, estas células se dividem originando células totalmente
diferenciadas, que perdem sua capacidade de proliferação e mais tarde evoluem para um
processo de morte celular programada (Alison et al., 2000).
1.5- CÉLULAS–TRONCO EMBRIONÁRIAS E SEU USO TERAPÊUTICO NO
INFARTO DO MIOCÁRDIO
Conhecidas como ES, do inglês Embrionic Stem Cell, as células-tronco
embrionárias são encontradas na massa celular interna (MCI) do blastocisto. Devido à
pluripotencialidade dessas células, ou seja, a capacidade de se diferenciar em tipos
celulares dos diversos folhetos embrionários, surgiu um grande interesse da comunidade
científica em produzir órgão e tecidos in vitro, tornando viável a bioengenharia tecidual.
Os trabalhos de Thompson et al. (1998) e Shamblott et al. (1998) descreveram o
isolamento, o cultivo e a manutenção das células ES in vitro. A partir desses resultados,
vários pesquisadores vêm investindo em identificar as condições ideais de cultivo para
induzir a diferenciação destas células em tipos celulares específicos. Os avanços
alcançados incluem a diferenciação em: cardiomiócioto (Kehat et al., 2001; Bin Z et al.,
2006; Wang X et al., 2006), hepatócito (Ishizaka S et al., 2006; Lavon N. et al., 2005) e
neurônio (Li XJ. et al., 2006; Ueno M et al., 2006), dentre outros. Contudo, o percentual de
diferenciação para um determinado tipo celular ainda é muito pequeno indicando que
muitos estudos precisam ser feitos para melhorar o rendimento dos métodos até aqui
propostos.
Como essas células só podem ser obtidas pela destruição de embriões no estágio de
blastocistos (4 à 7 dias de idade), entraves éticos e religiosos constituem grandes barreiras
para a utilização das células ES. Recentemente, o grupo do Lanza (2006) realizou um
88
trabalho demonstrando a obtenção de células ES a partir da remoção de um único
blastômero sem que houvesse nenhum dano ao embrião (Klimanskaya I et al, 2006).
Contudo, novos estudos precisam ser realizados comprovando a eficácia do método e,
assim, viabilizando a obtenção rotineira de células ES sem a destruição dos embriões.
Outra desvantagem relacionada ao uso terapêutico das células ES reside no fato
destas células não serem imuno-compatíveis. Assim, é necessário o uso de terapias de
imunossupressão ou a manipulação dessas células in vitro (células ES obtidas por
transferência nuclear, por exemplo) para que o seu uso terapêutico seja possível in vivo.
Além disso, as células embrionárias freqüentemente desenvolvem instabilidade genotípica,
pois espontaneamente acumulam anormalidades genéticas em cultura, e são propensas a
crescimentos incontroláveis e à formação tumoral quando transplantadas em animais
(formação de teratomas) (Przyborski AS et al., 2004; Asano T et al., 2006).
Apesar de todos esses problemas, a implantação de células ES no tecido cardíaco
infartado tem sido investigada por alguns autores. Em 2002, Min et al administraram, em
ratos por via intra miocárdica, células ES da linhagem ES-D3 murina, 30 minutos após a
oclusão da artéria coronária descendente anterior. Eles verificaram a implantação e
sobrevivência destas células, bem como a melhora da função cardíaca global.Um outro
estudo de destaque, realizado recentemente, testou a injeção intracardíaca de duas
linhagens de células ES que expressavam e-GFP e beta-galactosidase no modelo de
ligadura permanente da artéria coronária em camundongos. Duas semanas após o IM, as
células transplantadas foram encontradas no miocárdio do animal e nenhuma formação
tumoral era evidente. Através de técnicas da imuno-histoquímica foi constatada que essas
células se diferenciaram em: cardiomiócitos, endotélio e células do músculo liso presente
nos vasos sangüíneos. Esses achados corroboraram com a melhora funcional desses
99
animais encontrada nas análises ecocardiográficas (Singla DK et al., 2006). No mesmo
ano, foi publicado um trabalho em que 10
7
células ES murinas, transfectadas com um gene
biolumenescente através de um lenti vírus, foram injetadas no miocárdio de ratos
imunodeficeintes. Desta forma, os autores monitorizaram in vivo as células transplantadas
durante 4 semanas. Os resultados demonstraram que o sinal biolumenescente aumentava
neste período indicando não só a sobrevivência, mas também, proliferação das células ES
injetadas. Contudo, durante as análises histológicas observou-se a formação de teratomas
no coração e em outros órgãos desses animais (Cao F et al., 2006).
Estes resultados indicam que muitos estudos precisam ser realizados em modelos
animais antes que a utilização clínica das células ES possa ser considerada uma alternativa
segura.
1.6- CELULAS-TRONCO ADULTAS E SEU USO TERAPÊUTICO NO INFARTO
DO MIOCÁRDIO
As células-tronco adultas são indiferenciadas e encontradas entre células
diferenciadas de um tecido ou órgão (Berne R.M. & Levy M.N, 1993). Elas podem se
renovar e são capazes de se diferenciar para produzir diversos tipos celulares. O papel
primário dessas células em um organismo vivo é manter e reparar o tecido no qual elas são
encontradas. Esse tipo de célula tronco, muitas vezes, é denominado de célula-tronco
somática.
Células-tronco somáticas residentes nos diversos tecidos adultos estão sendo
empregadas em muitos trabalhos com o objetivo não apenas de diferenciar no órgão de
onde elas se originam, mas também, de diferenciar em outros órgãos (Orlic et al, 2001).
Dentre as diferentes células-tronco adultas que tem sido bastante utilizada, está o mioblásto
esquelético. O músculo esquelético é um tecido com grande capacidade de regeneração
após a injúria, devido à presença de células satélites (também chamadas de mioblastos).
1010
Tais células encontram-se normalmente quiescentes sob a membrana basal da fibra
muscular esquelética madura. Contudo, quando estimuladas por estímulos apropriados
(como por exemplo: uma lesão muscular), proliferam e diferenciam-se em novas fibras
musculares esqueléticas (Dorfman et al, 1998). Alguns autores acreditavam que o micro
ambiente poderia influenciar na diferenciação das células satélites em tecido cardíaco, após
a sua implantação no miocárdio lesado. Vários grupos demonstraram em modelos animais
que mioblastos esqueléticos transplantados em corações submetidos à crioinjúria foram
capazes de reduzir a cicatriz, e formar novas fibras musculares (Chiu et al., 1995; Dorfman
et al., 1998; Taylor et al., 1998). Em 2000, Scorsin et al avaliaram efeito do transplante
intramiocárdico de mioblastos esqueléticos autólogos sete dias depois do IM. Este
transplante resultou na melhora da função cardíaca e numa limitação do processo de
remodelamento. No entanto, a análise histológica revelou que as células transplantadas,
localizadas na borda do infarto, não expressavam conexina 43. A ausência desta proteína
não permitiria o acoplamento elétrico entre o tecido hospedeiro e o mioblasto esquelético.
Logo, não haveria uma propagação sincronizada de estímulos elétricos, podendo gerar
focos arrítmicos no coração. Este mesmo grupo submeteu um paciente de 72 anos, com
grave insuficiência cardíaca, e sem opções terapêuticas convêncionais, ao tratamento com
mioblastos autólogos. Eles verificaram a melhora da função cardíaca através do
ecocardiograma e da tomografia (Menasché et al., 2001). Entretanto, estudos posteriores
comprovaram o aparecimento de focos arrítmicos nos corações de pacientes que receberam
mioblastos esqueléticos, limitando o uso deste tipo celular na prática clínica.
Recentemente, alguns pesquisadores isolaram células com capacidade clonogênica
que expressavam marcadores de células-tronco e de células progenitoras endoteliais em
corações de camundongos e de humanos (Oh H et al., 2003; Beltrami et al., 2003). Essas
células foram denominadas células progenitoras cardíacas. O estudo de Beltrine et al
1111
detectou e isolou essas células no coração do rato através de um marcador característico de
célula tronco (c-Kit). Além disso, este trabalho não só demonstrou a capacidade
clonogênica e a multipotencialidade dessas células, mas, também, o seu potencial na
regeneração de cardiomiócitos e dos vasos sangüíneos após o IM (Beltrami et al., 2003).
Dois anos depois, assim como nos modelos animais, foram isoladas células-tronco no
miocárdio de pacientes. Um estudo, realizado por Urbanek e colaboradores, observou um
aumento no número das células progenitoras cardíacas logo após o IM. Contudo, na fase
crônica do IM, este trabalho demonstrou um menor número dessas células, além disso, as
células-tronco cardíacas ainda presentes, possuíam um menor potencial regenerativo
(Urbanek et al., 2005). Esse fato pode justificar a presença da disfunção ventricular
esquerda na cardiomiopatia isquêmica. No mesmo ano, outro estudo promoveu o
isolamento e a expansão dessas células in vitro a partir de biopsias do endomiocárdio
humano (Smith et al, 2005). Esse trabalho é de grande importância por que pode
representar o surgimento no futuro próximo de uma nova fonte celular para o transplante
autólogo em pacientes com cardiopatia.
Em meio aos muitos tipos de células-tronco somáticas existentes, como os descritos
acima, está a medula óssea. Na medula óssea, existem dois tipos de células-tronco: as
células-tronco hematopoiéticas (HSC, do inglês Hematopoietic Stem cell) e as células-
tronco mesenquimais (MSCs). Trabalhos realizados a partir da década de 70 já
demonstravam que o pequeno aspirado retirado da medula era capaz de gerar colônias a
partir de uma única célula (Friedenstein et al.,1974; Castro-Malaspina et al., 1980; Mets &
Verdonk., 1981; Piersma et al., 1985; Owen& Friedenstein., 1988; Colter et al., 2000;
Woodbury et al., 2000). Além disso, muitos estudos evidenciaram a capacidade das MSCs
em se diferenciar em osteoblasto, adipócitos e condrócitos (Caplan et al;1991, Prockop et
al.,1997, Pittinger et al.,1999), músculo cardíaco (Makino et al.,1999; Tomita et al., 1999;
1212
Wang et al., 2000; Orlic et al., 2001; Toma et al., 2002, Hakuno et al., 2002), hepatócitos
(Petersen et al.,1999; Alison et al., 2000; Theise et al., 2000), neurônios, oligodentrócitos e
astrócitos (Sanchez-Ramos et al., 2000; Woodbury et al., 2000; Jian et al., 2002).
Contudo, mais recentemente, alguns autores passaram a questionar a
pluripotencialidade das células-tronco da medula óssea (Hidemasa Oh et al, 2003; Balsam
LB et al., 2004). Em 2004, Charle E et al realizaram um estudo em que foram utilizados
camundongos transgênicos o que permitiu aos autores monitorizar os eventos de trans-
diferenciação através da associação da expressão da α-cadeia pesada de miosina cardíaca
com a expressão nuclear da β-galactosidade. Neste trabalho, as células-tronco da medula
óssea eram injetadas no miocárdio dos animais infartados e não foi observada nenhuma
evidência de trans-diferenciação. Corroborando com esses resultados, Balsam LB et al
publicou um artigo utilizando 3 tipos celulares da medula óssea ( células cKit
+
, células
Lin
-
/ cKit
+
e Lin
-
/cKit
+
/Thy1.1
lo
/ Sca 1
+
) oriundas de um camundongo transgênico GFP.
Essas células foram transplantadas diretamente no coração 3 horas após o IM. Dez dias
após a injeção, as células GFP
+
eram detectadas no miocárdio dos animais. Porém, 1mês
depois, poucas células foram observadas. Nenhuma célula transplantada expressava
marcadores específicos dos tecidos cardíacos. Contudo, algumas células GFP
+
expressavam marcadores hematopoiéticos e mieloides. Além disso, um experimento feito
neste estudo, utilizando o modelo de parabiose GFP
+
/GFP
-
, avaliou o potencial de trans-
diferenciação das células progenitoras presente na circulação na presença do IM. Mesmo
assim, nenhuma evidencia de trans-diferenciação foi encontrada e as células GFP
+
,
presentes no miocárdio infartado, expressavam somente marcadores hematopoieticos. Com
isso a autora, descartou a possibilidade de trans-diferenciação das células da medula óssea
em cardiomiócito.
1313
Ainda questionando a pluripotencialidade das células-tronco da medula óssea,
alguns autores sugerem uma aparente plasticidade destas células. Assim, eventos de fusão
celular ocorreriam ao invés de trans-diferenciação celular (Andrew E Wurmser & Fred H
Gage, 2002; Alvarez-Dollado et al, 2003.) Mesmo com todas essas questões descritas
acima, a medula tem sido a fonte mais utilizada para estudos clínicos.
O uso das células da medula óssea, por ser uma técnica invasiva, apresenta algumas
desvantagens. Uma delas é a submissão do doador aos riscos da anestesia (hipotensão,
hipóxia e parada cardíaca) para a coleta da medula (Buckner et al., 1983). A outra é a
possível injúria do tecido no procedimento de coleta, incluindo dano ósseo, dano nervoso e
os riscos de infecções nos sítios de coleta de medula (Bortin et al., 1983.; Buckner et al.,
1983 ). Diante deste quadro, a utilização de fatores de mobilização (G-CSF, SCF) que
promovem o aumento de células progenitoras na circulação ganhou destaque como uma
opção menos invasiva. Isso porque a coleta de células do sangue periférico pode ser
realizada sem a necessidade de hospitalização do doador e não requer anestesia ou cirurgia
Neste contexto, as células mobilizadas para o sangue periférico têm substituído a punção
em transplantes de medula óssea no tratamento de doenças malígnas. Porém, o aumento do
número de células progenitoras na circulação promovido por essas drogas ocasiona alguns
efeitos colaterais como: a trombocitopenia e esplenomegalia. (Goodman & Gilman).
A utilização das células da medula óssea como terapia alternativa no infarto do
miocárdio tem sido estudada por inúmeros grupos (Tomita et al., 1999; Wang et al., 2000;
Orlic et al., 2001 a; Orlic et al., 2001b). Dentre os diversos estudos realizados, estão os
trabalhos do nosso grupo de pesquisa. Em 2004, Olivares et al publicaram um artigo que
muito contribuiu para o uso das células do estroma da medula óssea no modelo de infarto
induzido pela ligadura permanente da descendente anterior (Olivares et al., 2004). Neste
1414
trabalho, as células de estroma da medula óssea injetadas diretamente no coração, um mês
depois da indução do IM, foram capazes de melhorar a função cardíaca global dos ratos. O
sucesso deste experimento incentivou a realização de um trabalho em humanos (Perin et
al., 2003). Pacientes infartados com ICC grave, sem alternativas terapêuticas, receberam,
através de cateterismo, transplante cardíaco de células mononucleares da medula óssea.
Esses pacientes apresentaram melhora no desempenho cardíaco e na qualidade de vida.
Recentemente, procurando formas terapêuticas menos invasivas, o grupo do nosso
laboratório avaliou o efeito terapêutico da mobilização celular induzida pelo G-CSF no
infarto do miocárdio em ratos Wistar (Werneck de Castro JPS et al., 2006). Os resultados
obtidos nas análises funcionais demonstram que o tratamento com o G-CSF foi incapaz de
prevenir o remodelamento ou melhorar a função cardíaca.
Baseado nas vantagens e desvantagens do uso dos diversos tipos celulares descritos
acima, o aparecimento de estudos que evidenciavam a presença de células progenitoras no
cordão umbilical proporcionou o surgimento de uma nova possibilidade de fonte de células
tronco adultas (Knudtzon K et al., 1974; Nakahata T et al., 1982). Embora o volume de
células obtido nessa coleta seja menor e as mesmas não possuam utilidade no caso de
doenças genéticas, sua utilização oferece grandes benefícios. Uma grande vantagem é que
coleta das células é realizada de forma não invasiva e não oferece risco para mãe e para a
criança. A outra vantagem está relacionada ao fato de que as células progenitoras presentes
no cordão são menos imunorreativas do que as da medula óssea, permitindo o uso em
transplantes não-aparentados idênticos ou parcialmente idênticos com menos
complicações.
1515
1.6.1- O CORDÃO UMBILICAL
O cordão umbilical é um anexo exclusivo dos mamíferos que possui duas artérias e
uma veia, ligando o umbigo do feto à placenta. O sangue com pouco oxigênio e muito gás
carbônico sai do feto e chega à placenta onde é purificado e retorna ao feto com nutrientes,
oxigênio e anticorpos. Em conjunto com a placenta e o líquido amniótico, o cordão
umbilical garante a nutrição, a respiração e a proteção da criança dentro do útero.
A presença de células progenitoras no cordão umbilical humano tem sido sugerida
por muitos autores desde a década de 70 (Knudtzon S et al., 1974; Nakahata T et al.,
1982). Porém, somente em 1989, surgiu um trabalho de grande destaque do grupo de
Boxmeyer que demonstrou de forma consistente evidências experimentais da existência
células progenitoras hematopoieticas no cordão umbilical humano (HUCB). Neste mesmo
ano, Glukman et al provaram que as HUCB eram capazes de reconstituir o sistema
hematopoietico de uma criança com anemia de Fanconi. A partir daí, aumentou, de forma
significativa, o interesse da comunidade científica pela caracterização do sangue de cordão
umbilical.
Características peculiares das células presentes no sangue do cordão umbilical
foram descritas em diversos trabalhos (Broxemeyer et al., 1989; Mayani H et al., 2003).
Uma das moléculas mais estudadas é o CD34
+
, uma glicoproteina de membrana, cuja
função parece estar relacionada à adesão das células hematopoiéticas ao microambiente da
medula e a manutenção fenotípica e da função das células progenitoras hematopoiéticas.
Em 1993, um estudo identificou células CD34
+
no sangue de cordão umbilical (Cardoso
AA et al., 1993) e o autor, também, analisou a presença de um importante regulador da
função linfocitária (CD38
+
) na superfície celular. O resultado demonstrou que o número de
células CD34
+
CD38
-
é quatro vezes maior no sangue de cordão umbilical do que na
1616
medula óssea indicando uma maior proporção de células progenitoras hematopoiéticas
imaturas.
Outro estudo identificou que nos estágios iniciais da gravidez o percentual de
células CD34
+
no sangue de cordão umbilical
é muito alto (11%) e vai decrescendo ao
longo da gravidez. Esses dados, então, sugeriram que a presença de células progenitoras
hematopoiéticas no cordão umbilical poderia variar de acordo com a idade gestacional
(Thilaganathan B et al., 1994).
Ainda ressaltando os trabalhos que identificaram células progenitoras
hematopoiéticas, alguns autores reportaram que a concentração de células do sangue do
cordão umbilical, marcadas com um anticorpo monoclonal anti-CD34
+
e analisadas através
da citômetria de fluxo, varia entre 0,33 a 1,98% (Sutherland et al., 1994; Scott M A et al.,
1995; Gluckman et al., 1997). A concentração desse mesmo tipo celular na medula óssea é
descrita na literatura como sendo sempre menor que 1% (Davis BH et al, 1997) e no
sangue periférico varia entre 0,01 e 0,05% (Bender J et al., 1992). Este resultado
demonstra que o percentual de células progenitoras hematopoiéticas no cordão umbilical
pode ser igual ou, até mesmo, maior do que o encontrado na medula óssea. Assim, de
acordo com esses dados, o sangue presente no cordão pode ser uma fonte rica em células-
tronco hematopoiéticas.
Além disso, as HSC presentes no cordão apresentam um grande potencial de
proliferação. Essa característica pode estar relacionada ao grande comprimento dos
telômeros existentes nessas células. Os telômeros são seqüências repetidas de DNA
encontradas nas extremidades dos cromossomos e responsáveis pela estabilidade dos
mesmos. Ao longo de repetidas divisões celulares, o comprimento dos telômeros diminui
e, ao atingir um determinado tamanho, a divisão celular cessa. Por esse motivo, telômeros
1717
com comprimentos maiores devem permitir um maior número de divisões celulares
(Mayani et al., 1994; Regeczy N et al., 2002.; Gammaitoni L et al., 2004). Este fato cria a
possibilidade de que a desvantagem relacionada à restrição de uma única coleta do sangue
de cordão, com um volume celular restrito, possa ser superada. Isso por que essas células
podem ser expandidas rapidamente in vitro.
A identificação de células-tronco mesenquimais no sangue de cordão umbilical está
sendo descrita em vários trabalhos (A. Erices et al., 2000; Romanov Y A et al., 2003; G.
Kogler et al., 2004; Xin Quin Kang et al., 2006). Esse tipo celular, muitas vezes, é
denominado na literatura de USSC do inglês: unrestricted somatic stem cell. Estudos
sugerem que as células USSC constituem uma rara população que cresce de forma
aderente na cultura. Porém, as USSC possuem uma grande capacidade de expansão
mantendo o seu cariótipo normal. In vitro, essas células parecem capazes de se diferenciar
em osteoblasto, condroblasto, adipócitos, células hematopoiéticas, cardiomiócitos e células
neurais (G.Kogler et al., 2004). Recentemente, um trabalho realizado por Yong Zhao
sugeriu a presença de um novo tipo de célula-tronco mesenquimal presente no cordão. Essa
população celular apresentou marcação para fatores de transcrição específicos para células
ES (OCT-4 e Nanog) e antígenos específicos para estágios embrionários (SSEA-3 SSEA-
4). Além do mais, essas células apresentaram também características hematopoéticas
(CD45
+
e CD117
+
) (Yong Zhao et al., 2006). Outra fonte de obtenção de células
mesenquimais, que está sendo demonstrada em alguns trabalhos, é a camada subendotelial
da veia umbilical humana (HUVEC, do inglês human umbilical vein endotelial cell). Yuri
A.Romavano (2003) foi capaz de isolar essas células e expandi-las em cultura. Além disso,
o trabalho demonstrou que as células cultivadas apresentavam a morfologia e o imuno-
fenótipo similar ao encontrado nas células MSC oriundas da medula óssea.
1818
As demais características peculiares do cordão umbilical estão relacionadas ao
sistema imunológico. O sistema imune do cordão umbilical de um neonato é
funcionalmente imaturo (Christesen RD., 1989). Linfocinas e citocinas hematopoieticas do
cordão umbilical encontram-se desreguladas quando comparadas as do indivíduo adulto.
Esta desregulação contribui muito para a grande suscetibilidade de infecção no período
neonatal (Wilson CB, 1986; Hill HR, 1987) e pode, também, explicar a menor taxa de
incidência e o menor grau de severidade das doenças enxerto-hospedeiro tanto aguda
quanto crônicamente após transplante de células-tronco de cordão umbilical. O grupo de
Cairo demonstrou que há uma menor expressão de RNA mensageiro de interleucinas
(IL12, IL15 e IL18) nas células mononucleares do cordão umbilical comparado as
mononucleares do sangue periférico adulto (Lee SM et al., 1996; Cairo MS et al., 2002).
Também, foi descrito que duas importantes linfocínas regulatórias da imunidade celular
(IL-2 e INF-gama) não são sintetizadas no sangue de cordão (Rubistein et al, 1994.; Cairo
MS et al, 1996; Lee SM et al., 1996). Por último, a diminuição da atividade das células
natural killer e das células dentríticas podem também justificar esta menor taxa de
incidência dessa patologia (Tanaka H et al., 2003; Langrish CL et al., 2002).
Ainda relacionado às características do sistema imune, as células encontradas no
sangue do cordão possuem uma menor expressão do complexo principal de histo-
compatibilidade (HLA-DR) (Kundtzon S et al., 1974; D’Arena G et al., 1998). Esse
antígeno é, por sua vez, o principal marcador de superfície celular relacionado a
imunofenotipagem.
Todas essas peculiaridades descritas refletem, na clínica, numa menor necessidade
de uma proporção de identidade HLA para que não haja risco de doenças enxerto-
hospedeiro após o transplante dessas células (Ringdén and Le Blanc, 2005).
1919
1.7- TRATAMENTO UTILIZANDO CÉLULAS-TRONCO DO CORDÃO
UMBILICAL HUMANO EM MODELOS EXPERIMENTAIS DE IM
Em 1988, uma criança apresentando anemia de Fanconi foi transplantada com as
células oriundas do sangue de cordão umbilical da sua irmã recém nascida, HLA
compatível e saudável. As células progenitoras do cordão foram capazes de reconstituir, de
forma eficaz, o sistema hematopoietico da criança com anemia (Gluckman et al., 1989). A
partir daí, o transplante hematopoietico alogênico está sendo muito realizado nos casos de
doenças da medula óssea maligna ou não.
Alguns estudos demonstrando que o cordão umbilical possui células progenitoras
com capacidade potencial de se diferenciar em capilares e cardiomiócitos foram realizados
(Broxmeyer, H.E et al., 1989 e 1995). Porém, o uso de células progenitoras de cordão
umbilical em modelo experimental de IM é recente.
Somente em 2004, surgiu a primeiro trabalho publicado que avaliou o uso da fração
mononuclear e o uso específico de células CD34
+
oriundas do cordão umbilical (Botta R et
al., 2004). Logo após a oclusão permanente da artéria coronária descendente anterior,
células CD34
+
(2x10
5
) eram transplantadas no miocárdio de camundongos
imunodeficientes. Três semanas depois do transplante, os animais tratados com as células
apresentavam uma melhora no desempenho cardíaco (parâmetros hemodinâmicos) e uma
redução do tamanho do infarto. Além disso, um grupo de animais transplantados com
apenas 2 x10
3
células da fração CD34
+
KDR
+
(comprometida com a linhagem
hematopoietica e endotelial) obteve também uma melhora desses parâmetros. Porém, um
outro grupo de animais, que recebeu a fração de células CD34
+
KDR
-
,
não obteve nenhuma
melhora funcional. Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que as células
2020
CD34
+
, mais especificamente as CD34
+
KDR
+
,
são capazes de melhorar a função cardíaca
após o IM.
No mesmo ano, o grupo de Sanberg publicou um estudo de grande destaque. Nesse
trabalho, o transplante intramiocárdio de 10
6
células mononucleares do cordão (HUCB) era
realizado 1 hora após a indução permanente do IM e, pela primeira vez, nenhuma droga
imunosupressora foi administrada nesses animais (ratos Sprague–Dawley). Análises
funcionais, análises hemodinâmicas realizadas com animais anestesiados com fenilefrina, e
medidas da extensão tamanho do infarto foram feitas 1, 2, 3 e 4 meses após a terapia. O
resultado sugeriu que as HUCB eram capazes de reduzir o tamanho do infarto mesmo sem
a terapia imunosupressora. Ademais, o autor, também observou a melhora da função
cardíaca (aumento da fração de ejeção do VE) e dos parâmetros hemodinâmicos.
No ano seguinte, fazendo uso do mesmo modelo de indução de infarto, foi
publicado um estudo realizado em ratos Wistar. Porém, esses animais recebiam tratamento
imunossupressor (FK506 - Fujisama, Japan) seis horas antes, logo após e um dia depois do
procedimento cirúrgico. Células CD34
+
(2x10
5
)
do cordão foram injetadas diretamente na
região de borda do infarto vinte minutos após a indução do mesmo. Quatro semanas após o
IM, os ratos tratados com as células obtiveram
tanto o aumento da densidade vascular quanto a melhora da função cardíaca quando
comparados ao grupo de animais controle (tratados somente com o veículo). A marcação
por imunufluorescência com anticorpos antihumanos (CD34
+
CD45
+
e PECAM) indicou
que as células estavam presentes no miocárdio (Hirata Y et al., 2005).
A via sitémica, também, foi utilizada para demonstrar o potencial de migração das
células mononucleares de cordão para a região infartada. Camundongos (NOD/scid)
infartados ou não receberam injeção de 10
6
células CD34
+
na veia da cauda. Os resultadaos
2121
demonstraram que células humanas foram encontradas somente no miocárdio de animais
do grupo submetido ao IM. O grupo infartado tratado também apresentou uma diminuição
do tamanho do infarto comparado ao grupo controle (injetado com veículo). Também,
nesse estudo, o tratamento promoveu um aumento na densidade vascular. Capilares
quiméricos foram encontrados ocasionalmente, porém a maior parte das células endoteliais
era do camundongo. Nenhuma evidência de diferenciação em cardiomiócito foi encontrada
através da co-localização do HNA-1 ou HLA-1 com o GATA- 4 e com a conexina 43 (Ma
N et al., 2005).
Recentemente, o isolamento de células do cordão umbilical (USSC) pluripotentes
com alta capacidade de proliferação possibilitou a utilização deste tipo celular nos estudos
das cardiomiopatias isquêmicas. Um estudo foi realizado utilizando como modelo a
oclusão temporária da artéria descendente anterior esquerda em porcos. Os animais eram
submetidos à administração diária de uma droga imunosupressora. Ao contrário dos outros
estudos já realizados com células de cordão, as USSC foram transplantadas diretamente no
coração somente 4 semanas após o infarto. A melhora da função cardíaca e a diminuição
do tamanho da extensão do infarto foi visualizado 1 mês após o tratamento. Além de
encontrar células humanas no miocárdio dos porcos tratados, essas células expressavam as
proteínas específicas para cardiomiócitos (cadeia pesada da miosina e troponina I) através
de imagens obtidas em microscopia confocal. Esses dados sugerem que o transplante desse
tipo celular pode ser eficaz no processo de cardiomioplastia celular (Byung-Ok Kim et al.,
2005).
Em meados de 2005, o estudo do grupo de Kuan P associou do uso de células
tronco com a terapia gênica (Kuan P et al., 2005). O cDNA do gene do VEGF ou da
angiopoentina 1 eram inseridos sozinhos ou em conjunto, através de um vetor viral, no
2222
material genético das células CD34
+
oriundas do cordão umbilical. Através do modelo de
ligadura permanente, camundongos imunodeficientes foram submetidos ao IM.
Imediatamente após a indução do IM, 1x10
6
células foram transplantadas diretamente no
miocárdio. A diminuição da extensão do infarto foi ainda maior no grupo que recebeu as
células geneticamente modificadas, com aumento da expressão dos dois fatores. Houve,
também, uma melhora maior da função cardíaca e um maior aumento da densidade capilar
nesse grupo. O resultado deste estudo sugere, não só a eficácia do transplante das células
progenitoras do cordão, mas uma otimização da resposta ao tratamento quando a terapia
gênica está associada.
No início de 2006, surgiu o primeiro trabalho utilizando as células CD133
+
num
modelo de IM ocasionado por crioinjúria que constitui um marcador de células
progenitoras endoteliais. O autor se propôs a comparar o tratamento com as células
CD133
+
provenientes da medula óssea e do cordão umbilical. O transplante foi realizado
imediatamente após o IM. O número de células injetadas no miocárdio foi o mesmo
(5X10
5
) em todos os animais tratados. Um mês depois, todos os animais transplantados
com célula possuíram uma densidade capilar aumentada quando comparados aos controles
(animais tratados com salina). Porém, somente os camundongos tratados com as células
CD133
+
da medula óssea não apresentaram piora da função cardíaca após a crioinjúria.
Assim, esse trabalho sugere que o tratamento as células CD133
+
da medula
é mais eficazes
para evitar o processo de remodelamento do que as células CD133
+
de cordão (Ma N et al.,
2006).
Por último, um estudo injetou células mononucleares do sangue do cordão
umbilical no miocárdio de ratos Wistar submetidos à ligadura permanente da artéria
coronária descendente anterior (HU-Cheng-heng et al, 2006). A análise funcional feita 4
2323
semanas depois do transplante, observou uma melhora dos parâmetros ecocardiográficos e
hemodinâmicos dos animais transplantados com células comparado aos ratos injetados
somente com o veículo de injeção (p<0,05). O autor observou que os ratos transplantados
possuíam uma menor extensão da área de infarto e um aumento da densidade capilar. Além
disso, os corações dos animais submetidos à terapia celular expressavam VEGF (fator de
crescimento vascular endotelial, do inglês “vascular endothelial growth factor”) entre o 7˚
e 28˚ dias após o transplante. Assim como no trabalho realizado por Henning et al, o autor
sugere que mesmo sem a terapia imunossupressora as células de cordão humano são
capazes de sobreviver no miocárdio do rato infartado. Ademais, o autor propõe que estas
células são capazes de melhorar o desempenho funcional desses animais.
A partir dos trabalhos publicados na literatura, pode ser observado que a utilização
de células progenitoras do cordão umbilical no infarto do miocárdio ainda é controversa. O
número de trabalhos realizados ainda é pequeno e, diversas questões ainda não foram
esclarecidas. Neste contexto, o Laboratório de Cardiologia Celular e Molecular resolveu
investigar o efeito do transplante intra-miocárdico de células mononucleares do cordão
umbilical humano em ratos Wistar. Neste estudo, utilizamos à fração mononuclear de
células de cordão umbilical proveniente de bolsas frescas ou congeladas no modelo de IM
agudo através da ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior.
2424
2-OBJETIVOS
Baseado no fato de que sangue do cordão umbilical possui células progenitoras
capazes de se diferenciar em capilares e cardiomiócitos in vitro (Broxmeyer et al, 1989;
Broxmeyer et al, 1995; G.Kogler et al, 2004) e visto a escassez de trabalhos na literatura
sobre a aplicação terapêutica de células mononucleares do sangue do cordão umbilical no
IM, os nossos objetivos foram os seguintes:
-Avaliar a eficácia terapêutica do transplante de células mononucleares do cordão
umbilical humano no modelo de infarto agudo do miocárdio em ratos Wistar.
-Averiguar se há diferença entre o potencial terapêutico das células mononucleares
obtidas de cordões umbilicais frescos ou congelados.
2525
3- MATERIAS E MÉTODOS:
3.1- ANIMAIS
Ratos machos singênicos pesando entre 200 e 300g foram obtidos do biotério do
Centro de Pesquisa Gonçalo Muniz da FIOCRUZ-Bahia/BA. Todos os animais eram
utilizados segundo o guia de utilização de animais do Instituto de Biofísca Carlos Chagas
Filho. Neste estudo, os ratos foram divididos nos seguintes grupos: animais normais ou não
operados (grupo 1), animais falso-operados (grupo 2), animais infartados e tratados com
veículo (grupo 3), animais infartados e tratados com células mononucleares de cordão
umbilical congelados (grupo 4) e animais infartados e tratados com células mononucleares
de cordão não congelados (grupo 5).
3.2-ISOLAMENTO DAS CÉLULAS MONONUCLEARES DE CORDÃO
UMBILICAL HUMANO CONGELADO.
Uma única bolsa, armazenada a -80°C, com volume aproximado de 250 ml
contendo as células do sangue umbilical, foi fornecida pela Cryopraxis Criobiologia que,
por sua vez, possuía um termo de consentimento informado aprovado pelo comitê de ética
da instituição aonde ocorria à coleta da bolsa. No dia da injeção, essa bolsa foi
descongelada sob temperatura controlada a 37°C. Em seguida, para retirarmos o DMSO
(Dimetil Sufóxido), usado no processo de congelamento, adicionamos meio de cultura
Dubelcco’s Modifified Eagle Medium (DMEM) (Life Tecnologies
®
,Grand Island, NY,
EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) (Life Tecnologies
®
) obedecendo
uma diluição de 1:5. Esta solução foi homogeneizada lentamente com o auxílio de uma
pipeta Pasteur e centrifugada a 480 g por 7 minutos. O sedimento resultante dessa
centrifugação foi novamente lavado com meio DMEM suplementado com 10% de SFB
2626
utilizando a mesma diluição e mesma a velocidade de rotação. O “pellet” de células foi
ressuspendido com meio de cultura DMEM e submetido a um gradiente de Ficoll-
Hystopaque (Histopaque 1077 – Sigma Chemical Co. St Louis, MO, EUA). Este gradiente
foi formado utilizando 30 ml de células suspensas em DMEM sem a suplementação do
SFB e 15 ml de Ficoll num tubo estéril de poliestireno cônico de 50 ml (Falcon
®
). O
material foi centrifugado a 600g por 30 minutos e, em seguida, o anel de células, formado
na interface Ficoll-DMEM, foi coletado e colocado num tubo Falcon
®
. As células obtidas
foram lavadas em salina tamponada com fosfato (PBS) (10 mM, pH 7,4) acrescida com 5%
de SFB (Life Tecnologies
®
) numa diluição de 1:5 através de três repetidas centrifugações
de 480g por 7 minutos . Após a ultima lavagem, 1,4 x10
8
células foram ressuspendidas em
DMEM (Life Tecnologies
®
) destinadas à injeção intramiocárdica.
3.3- ISOLAMENTO DAS CÉLULAS MONONUCLEARES DE CORDÃO
UMBILICAL HUMANO NÃO CONGELADAS.
Duas bolsas, também fornecidas Cryopraxis Criobiologia, foram coletadas no
máximo 24horas antes do experimento e armazenadas a 4
◦
C. O conteúdo desta bolsa foi
diretamente submetido ao mesmo gradiente de Ficoll descrito acima. Obedecendo a mesma
diluição do processo realizado para a obtenção das células congeladas, este gradiente foi
formado pela adição lenta e cuidadosa de 30 ml do conteúdo coletado da bolsa sobre 15 ml
de Ficoll. Para a formação das três fases, este conteúdo foi centrifugado a 800g por 15
minutos. O anel de células, formado pela interface Ficoll-células, foi coletado e colocado
num tubo estéril de poliestireno de 50 ml (Falcon
®
) e lavado como descrito acima (item
3.2). Por último, uma alíquota contendo 10
7
células foi ressupendida em salina (PBS (10
mM, pH 7,4)) e destinada à caracterização celular através do FACS, enquanto, o restante
das células (10
8
) foi ressuspendido em DMEM e destinado à injeção intramiocárdica.
2727
3.4-CONTAGEM CELULAR
Para a contagem celular, uma alíquota de 1µl de células foi diluída em uma solução
de PBS (10 mM, pH 7,4) acrescida com 5% de SFB (Life Tecnologies
®
) na proporção
1:10 . As células diluídas foram, por sua vez, homogeneizadas e uma nova alíquota de 1µl
desta solução foi separada. Esta nova alíquota de células foi homogeneizada em 10 µl de
uma solução de ácido acético 2% (Reagem®) (líquido de Turck) afim de lisar as hemácias
e evitar a contagem das mesmas. Após essa etapa, foi realizada uma última diluição de
alíquota de 1µl das células adicionadas ao líquido de Turck numa solução de10 µl de Azul
de Tripan para testar a viabilidade. Então, retirou-se desta última diluição de células um
volume 10µl e adicionou-se na câmara de Neubaeur (Hausser Scientific). O número de
células redondas e brilhantes foi contado nos quatro quadrantes. O percentual obtido de
células viáveis foi sempre maior do que 95%.
3.5-MARCAÇÃO DAS CÉLULAS COM HOECHST
As células, injetadas nos animais, foram marcadas com um traçador nuclear
(Hoechst 33342, Sigma Chemical, USA) para posterior identificação em cortes
histológicos. Uma alíquota de 1µl da solução estoque deste marcador nuclear foi diluída
em 5ml de DMEM (Life Tecnologies
®
) contendo 10% de SFB (Life Tecnologies
®
). O
Hoechst diluído foi adicionado ao sedimento de células e homogeneizado. As células,
privadas de luz, foram incubadas numa estufa com atmosfera úmida em presença de 5% de
CO2 (Thermo Forma) durante 30 minutos. Uma alíquota das células foi examinada num
microscópio de epifluorescência (AXIOVERT 100, Carl ZEISS), com excitação λ=490nm
e emissão de 350ηm a fim de verificar a marcação das células com o corante Hoechst
33342. Certificada a marcação, o excesso do marcador foi retirado através de três repetidas
2828
centrifugações a 480g por 7 minutos. Então, uma nova determinação da viabilidade celular
foi realizada da forma descrita no item 3.4. Por último, o volume de solução foi ajustado de
acordo com o número de células necessárias para o transplante.
3.6- CITOMETRIA DE FLUXO
A imunofenotipagem celular foi realizada somente com a fração de células
mononucleares de cordão umbilical não congelado. A marcação das células foi feita
através da utilização dos anticorpos relacionados na tabela 1. Antes de iniciar a marcação,
o número de células da amostra foi determinado em um contador hematológico e volume
específico do material celular foi colocado em cada tubo de forma que todos tivessem o
mesmo número de células. Então, 3µl de cada anticorpo foram acrescentados em diferentes
tubos de ensaio de plástico identificados de acordo com os anticorpos/fluorocromo. Todos
os tubos foram privados de luz e incubados em temperatura ambiente por 20 minutos. A
seguir, 2ml de PBS (10 mM, pH 7,4) (Life Tecnologies
®
) foram adicionados à cada tubo e
o excesso de marcação foi retirado através de duas lavagens com centrifugações de 400 g
por 3 minutos. Por último, as células foram ressuspendidas em 500µl PBS (10 mM, pH
7,4) (Life Tecnologies
®
) e a detecção dos antígenos de marcação foi realizada utilizando
um citometro de fluxo (BD Bioscience FACScanto).
2929
Nome do Produto Marca
Iso Gen BD
Bcrp1 - ABCG2 - PE RD
CD105 - FITC RD
CD117 - PerCP BD
CD133/1 - PE Miltenyi Biotec
CD14 – PE Immunotech
CD146 - PE Pharm
CD166 - PE Pharm
CD19 - FITC BD
CD235a-APC Pharm
CD3 – PE BD
CD31-FITC Pharm
CD33 – FITC Pharmigen
CD33 – PE-Cy7 BD
CD34 – FITC BD
CD34 – PE-Cy7 BD
CD34 - PE Pharm
CD4 - PerCP BD
CD44 - FITC BD
CD45 – PC5 Immunotech
CD45 - APC BD
CD45 - Cy7 Pharmigen
CD51/61- FITC Pharm
CD54 - PerCP Pharm
CD56 – PE BD
CD64 – FITC Immunotech
CD73 - PE Pharm
CD8 – FITC BD
CD90 - PECy5 Pharm
CXCR4 - PECy5 Pharm
HLA-DR - PerCP BD
Tabela 1: Lista dos anticorpos momo ou policlonais conjugados com fluorocromo
utilizados para a marcação celular.
3030
3.7-TÉCNICA DE INDUÇÃO DO MODELO DE INFARTO DO
MIOCÁRDIO
O infarto experimental em ratos foi relizado como descrito por Johns & Olson
(1954) e Selye et al (1960). Após a anestesia com éter dietílico PA (Merck), os animais
foram fixados numa pequena mesa cirúrgica em decúbito dorsal, tricotomizados em nível
torácico, e em seguida, submetidos ao procedimento cirúrgico que se segue: incisão da pele
em nível paraesternal esquerda de aproximadamente 1 cm de comprimento e localizada a
1cm da linha esternal média, na junção dos terços inferior e médio da distância entre a
clavícula e o rebordo costal. Em seguida, os músculos peitoral maior e menor foram
dissecados para melhor visualização do gradil costal esquerdo. Neste momento, foi feita
uma sutura em bolsa da pele e dos músculos da região, deixando o nó aberto até o termino
da cirurgia. Com o auxílio de uma pinça hemostática reta foi feita uma incisão entre o 4 ou
o 5 espaço intercostal esquerdo, através do qual o coração era exteriorizado por meio de
uma compressão manual torácica direita. Após a localização da artéria coronária esquerda,
a oclusão era feita com o fio de seda 6-0 através de um nó duplo o mais próximo possível
de sua origem na aorta (figura 1). Em seguida, o coração foi recolocado rapidamente em
sua posição anatômica original e o nó da sutura foi finalmente apertado. Caso fosse
necessário, os animais eram ventilados manualmente através de um ambú de fabricação
doméstica.
Os animais controle da cirurgia (falso operados-FO) foram submetidos à cirurgia
fictícia. Todos os passos descritos acima foram feitos, porém os fios não foram apertados
em volta da coronária, ou seja, o fio de sutura era somente passado pelo músculo cardíaco
sem promover o nó cirúrgico.
3131
Figura 1: O modelo de infarto experimental
3.8-TRANSPLANTE DE CÉLULAS OU VEÍCULO NOS ANIMAIS
INFARTADOS.
Após o isolamento, marcação com Hoechst 33342, análise da viabilidade e
contagem, aliquotas de 300µl de DMEM (Life Tecnologies
®
) contendo 2x10
7
células
mononucleares de cordão umbilical congelado (grupo 4) ou células não congeladas (grupo
5) foram preparadas para injeção. Em seguida, o transplante celular intramiocárdico foi
realizado três horas após a indução do infarto do micárdio. Para tanto, os animais foram
novamente anestesiados com éter dietílico PA (Merck). Após a esteriorização do coração e
a identificação da área infartada, as células HUCB (2x10
7
células) ou apenas meio de
cultura (grupo 3) foram injetadas com auxílio de uma seringa de insulina, em pelo menos
dois pontos distintos, no miocárdio viável adjacente a cicatriz. Uma vez terminado tal
processo, o coração era colocado novamente em sua posição anatômica original e o tórax
suturado.
3232
3.9-REGISTROS ELETRO E ECOCARDIOGRÁFICOS
Tanto os registros eletrocardiográficos quanto os registros ecocardiográficos foram
realizados três horas após o procedimento cirúrgico em todos os grupos, portanto, antes do
tratamento nos grupos 3, 4 e 5. Os registros foram novamente realizados 21 dias após a
terapia.
Os animais foram anestesiados com uma combinação de cloridato de ketamina
(Doplalen®) na dose de 50 mg/kg e cloritato de xilazina (Amasedan®) na dose de 5mg/kg
intraperitonealmente. Após a perda dos reflexos postural e locomotor, o registro do ECG
de superfície era realizado com os animais na posição de decúbito dorsal sobre uma mesa
de madeira. As patas dianteiras foram fixadas com fitas adesivas na mesa
perpendicularmente ao corpo. Os quatro eletrodos para as derivações do plano frontal do
eletrocardiógrafo convencional (cardiomax FX2111-Fukuda Denshi) foram conectados às
agulhas hipodérmicas inseridas sob a pele dos animais (figura 2). As derivações utilizadas
foram: as derivações clássicas do plano frontal D1, D2, D3, aVr, aVL e aVF. O aparelho
foi calibrado para a velocidade de 50 mm/s e a voltagem de 20 mm = 1mV. Para
diminuirmos a variabilidade dos registros, sobretudo para cálculos dos vetores médios de
despolarização ventricular, o posicionamento dos animais foi rigorosamente padronizado.
A presença da onda Q na derivação D1, o índice de amplitude do QRS (iQRS) e o desvio
do eixo de despolarização ventricular para direita (>90
◦
) foram usados como evidência de
infarto.
Para o registro ecocardiográfico foi realizada a tricotomia da região torácica e os
animais foram colocados em decúbito lateral esquerdo ou decúbito dorsal. Os exames
foram realizados em um equipamento comercialmente disponível (Megas–Esaote) que
permite a obtenção de imagens nos modos unidimensional e bidimensional. Foi utilizado
3333
um trandutor de 10 MHz e as imagens foram armezenadas no próprio aparelho para
posterior análise (figura 3).
A análise ecocardiográfica foi realizada por um único observador que desconhecia
os grupos aos quais os animais pertenciam.
As imagens do eixo transversal do ventrículo esquerdo foram realizadas ao nível
dos músculos papilares para obtenção das medidas do ventrículo esquerdo nos modos
bidimensionais e no modo M. Através do modo M, foram mensurados os diâmetros do
ventrículo esquerdo ao final da sístole (DSFVE) e da diástole (DDFVE). Já as áreas do
ventrículo esquerdo em diástole (AVED) e sístole (AVES), foram obtidas a partir das
imagens bidimensionais. Assim, a função sistólica dos animais foi avaliada pela fração de
encurtamento (FE (%) = ([(DDVE-DSVE) / DDVE] *100) e pela fração de encurtamento
de área (FEA (%) = [(ADVE-ASVE) /ADVE] *100 (figuras: 4 e 5).
A extensão do infarto foi analisada também através das imagens bidimensionais.
Tanto o perímetro da parede infartada (PAVE) quanto o perímetro total do VE (PTVE)
foram medidos ao final da diástole e utilizados para determinar o percentual de acinesia do
VE (AVE%) (figura 6). Essa medida assegurava que a extensão do infarto era semelhante
entre todos os animais e foi calculada a partir da seguinte formula:
(AVE%) = (PTVE – PAVE / PTVE) X 100
3434
Figura 2: Realização do exame eletrocardiográfico em ratos.
Figura 3: Realização do exame ecocardiográfico em ratos.
3535
Figura 4 - Medida de fração de encurtamento no ecocardiograma. (A) Modo bidimensional de
um corte transversal do VE na altura dos papilares. (B) Modo M guiado pelo bidimensional em A. (C)
A partir da relação do diâmetro do VE em sístole e em diástole é calculada a fração de encurtamento
(FE=(DDVE-DSVE)/DDVE 100)*
Figura 5 - Cálculo da fração de encurtamento de área (FEA). (A) Tracejado da área de um
animal infartado em diástole. (B) Tracejado da área do mesmo animal em sístole. FEA = (ADVE –
ASVE)/ ADVE * 100.
A
B
C
B
A
3636
Figura 6: Calculo do percentual de acinesia do VE obtido através da mensuração do PTVE (A)
e do PAVE (B) ao final da diástole.
PAVE
B
A
3737
3.10- CANULAÇÃO DA ARTÉRIA CARÓTIDA DIREITA
A artéria carótida foi canulada para que fosse possível registrar as pressões
ventriculares. Neste procedimento, os animais foram anestesiados com quetamina /xilazina
e, após, a perda dos reflexos postural e locomotor, a região lateral direita do pescoço foi
tricotomizada. Em seguida, os músculos do pescoço foram cuidadosamente dissecados e a
artéria carótida visualizados. Após a visualização, uma cânula P10 foi lentamente
introduzida pela artéria até que fosse atingido o VE. Por último, a ponta oposta da cânula
foi exteriorizada dorsalmente entre as escápulas com auxílio de um espaçador (figura 7).
Figura 7: Processo cirúrgico de canulação da artéria carótida direita. (A) Dissecação dos
músculos do pescoço. (B) Visualização da artéria carótida direita do rato. (C) Introdução de uma
cánula (P10), através da artéria carótoida direita, até a cavidade ventricular esquerda. (D)
Exteriorização da cânula na região dorsal superior do animal
A B
D C
3838
3.11- ANÁLISES HEMODINÂMICAS
Vinte e quatro horas após o procedimento cirúrgico de canulação, a ponta da cânula
foi conectada a um transdutor de pressão (MTL) /D, instrumentos /ADI) associada a um
sistema de aquisição Power-Lab 400 (intrumentos/ADI). Após o período de adaptação de
30 minutos, iniciou-se a aquisição da pressão ventricular esquerda com os animais
acordados (figura 8). Nenhum animal do grupo 4 morreu durante a manipulação no sistema
de aquisição porém, no grupo 5 somente 1 animal foi a óbito durante este procedimento.
Os parâmetros hemodinâmicos analisados foram os seguintes: freqüência cardíaca
(FC); pressão sistólica do ventrículo esquerdo (PSVE); pressão diastólica do ventrículo
esquerdo (PDVE); pressão desenvolvida pelo ventrículo esquerdo (PDVE), representada
pela diferença entre PSVE e PDVE; o índice contratilidade cardíaca, representado pela
dP/dTmax; e o índice de relaxamento cardíaco, representado pela dP/dTmin. A dP/dT
representa a derivada temporal da curva de pressão.
Para a análise do registro, foi escolhido o período mais estável de no mínimo 10
batimentos. A partir daí, a média de cada um dos valores foi obtida.
3939
PSFVE
PDFVE
IP
d
P
d
t
+
d
P
d
t
-
PSFVE
PDFVE
IP
d
P
d
t
+
d
P
d
t
-
Figura 8 - Sistema de registro das pressões intraventriculares (A) Cânula
inserida diretamente no VE ligada ao sistema de aquisição. (B) Registro das pressões
ventriculares. (C) Derivada da curva de pressão sobre o tempo.
Transdutor
de
p
ressão
Amplificado Placa A/D
A
B
4040
3.12-TESTE CARDIOPULMONAR
Após a pesagem, na terceira semana após o procedimento cirúrgico, os animais
eram exercitados numa esteira de ratos completamente vedada (AccuSacn
Instrument,Model LC2/USA) com uma única conexão direcionada a um analisador de
oxigênio (Sable Systems FC-1B O2 e analisadores CA-2 C O2,USA) com a finalidade de
mensurar o consumo máximo de oxigênio (VO
2
). Por todo o sistema, a velocidade do fluxo
de ar foi padronizada em 680 ml/min e a temperatura mantida em 22
◦
C. Além disso,
durante todo o teste, a inclinação da esteira foi fixada em 10
graus (esteira Accupacer,
Accuscan Instruments, Inc Columbs, Ohio, USA).
O protocolo de exercício máximo utilizado foi uma adaptação do trabalho realizado
por Henderson et al (2002) para os animais infartados. Em síntese, cada animal passou por
um processo de adaptação ao exercício que correspondia a um período de 3-4 dias no qual
o rato corria durante 5 minutos numa velocidade constante de 17 cm/s. No quinto dia, cada
rato foi testado para a capacidade máxima de exercício. Antes do início do teste, foi
mensurado o consumo de oxigênio basal num período de 10 minutos. O início do teste foi
realizado com uma velocidade inicial de 17 cm/s e uma inclinação constante de 10
◦
. A cada
2 minutos a velocidade da esteira foi aumentada em 2 cm/s e cada animal correu até a
exaustão. Também, a cada 2 minutos, era mensurado o consumo de oxigênio. Os ratos
permaneciam em exercício através de choques elétricos, no fundo da esteira, aplicados
quando o animal estacionava. O critério de exaustão foi determinado pela permanência na
área de choque por mais de 1 minuto. Foi considerado como consumo máximo do oxigênio
aquele obtido em exercício máximo. Já o consumo de oxigênio era obtido através da
seguinte fórmula:
VO2 = [(%O
2
ar– %O
2
durante o exerc) x 680 ml/min] / peso (Kg)
4141
O mesmo protocolo foi repetido com 7 dias de intervalo em oito animais normais
para assegurar a sua reprodutibilidade obtendo-se uma boa relação entre os resultados (r =
0,82).
3.13-HISTOPATOLOGIA
Após a analise da função cardíaca, os animais foram sacrificados e seus corações
destinados à análise histológica. Para isso, os corações foram fixados em tampão fosfato
acrescido de paraformol adeido 4% durante a noite. Os ventrículos foram seccionados em 3
partes do ápice até a base (A, B e C, respectivamente ) (figura 9). Em seguida, essas fatias
foram embebidas em Optimal Cutting Temperature (OCT) (Sakura), congeladas no
nitrogênio líquido, e, armazenadas a -80
◦
C. Cortes seriados de 5µm das três fatias foram
destinados à busca das células injetadas e coradas com Hoechst 33342.
FATIA C
FATIA B
FATIA A
Figura 9: Seções realizadas nos ventrículos para análises histológicas.
4242
3.14-ANÁLISE ESTATÍSTICA.
Os dados foram expressos como média ± desvio padrão. A diferença entre os
grupos foi testada por ANOVA (grupo, tempo) complementada com o pós-teste de
Bonferroni. O grau mínimo de significância foi 95% (p<0,05) e os cálculos foram
realizados, utilizando o programa Graphpad Prism (New York, EUA).
4343
4- RESULTADOS
4.1- ANÁLISES ELETROCARDIOGRÁFICAS
Os parâmetros avaliados na análise eletrocardiográfica foram presença de onda Q
na derivação frontal D1, índice de amplitude do complexo do QRS (iQRS) e o vetor de
despolarização ventricular (âQRS).
Dentre os parâmetros avaliados, o índice de amplitude QRS (iQRS) foi calculado
pela soma em módulo das ondas positivas e negativas de uma mesma derivação e o seu
valor nas três derivações bipolares. Já o cálculo vetorial do eixo médio de despolarização
ventricular no plano frontal (âQRS) foi obtido pela relação trigonométrica existente entre
D1 e aVF , ou seja , através do arc tang (D1/aVF) para ângulos entre 0 e 90º e o arc tang
(aVF/D1) para os ângulos entre 90 e 180º.
No grupo de animais normais (grupo 1), as análises realizadas demonstraram que
todos os registros não apresentavam onda Q na derivação bipolar D1. O mesmo ocorreu
nos animais submetidos à cirurgia fictícia (grupo 2) que possuíam um registro
eletrocardiográfico muito semelhante ao dos animais normais. Esta semelhança pode ser
confirmada pelos outros parâmetros avaliados. Assim como nos animais normais (grupo
1), os ratos do grupo 2 apresentavam o ângulo do vetor médio de despolarização na faixa
da normalidade (entre 0 e 90
◦
) ( âQRS: Normais = 53,75º ± 20,14 vs FO = 52,9º ± 13,0).
Os valores obtidos no cálculo do índice de amplitude QRS para os dois grupos, também,
não foram diferentes significativamente (iQRS: Normais= 1,27± 0,05 vs FO= 1,47± 0,01
mv).
Entretanto, todos os animais infartados (grupos 3, 4 e 5) incluídos no experimento
apresentavam onda Q na derivação D1 três horas após a indução do infarto. Além disso, o
vetor médio do eixo de despolarização desses ratos encontrava-se desviado para a direita,
4444
ou seja, no segundo quadrante (entre 90 e 180
◦
) o que confirmava a existência de lesão
miocárdica (âQRS: grupo 3= 131,4º±19,0, grupo 4 = 137,1˚±16,7, grupo 5= 112˚± 13,3, vs
grupo 2= 52,9˚ ± 13,0, p<0,001) (figura 10). Embora o índice de amplitude do QRS obtido
em todos os grupos infartados fosse menor quando comparado ao grupo 2, essa diferença
não foi significativa (iQRS: grupo 3= 0,61±0,06, grupo 4= 0,23±0,05, grupo 5= 0,25±0,02
vs grupo 2= 1,12±0,02, p>0,05 em relação ao FO ).
Vinte e um dias após a injeção de células (congeladas ou não), as alterações
eletrocardiográficas produzidas pela cirurgia do infarto não foram revertidas com o
tratamento. Os registros eletrocardiográficos dos animais tratados com as células
mononucleares do cordão umbilical (grupo 4 e 5) eram bastante similares aos dos animais
que receberam somente a injeção do veículo (grupo 3). O índice de amplitude QRS dos
grupos infartados era menor quando comparado aos animais do grupo 2 (iQRS: grupo 3=
0,39 ± 0,04, grupo 4 = 0,13 ± 0,04, grupo 5= 0,18 ± 0,05 vs grupo 2 = 1,47 ± 0,01 mv,
p<0,05 em relação ao FO) (figura 11). Tanto o grupo 4 (HUCB-C) quanto o grupo 5
(HUCB-F) continuavam apresentando um desvio deste ângulo para a direita e não havia
nenhuma diferença significativa entre os grupos infartados independente do tipo celular
injetado (p>0,05) (figura 12).
4545
Figura 10: âQRS dos grupos, antes do tratamento ( 3 horas após o procedimento cirúrgico): Falso
Operado (grupo2), grupo infartado tratado com veículo (grupo 3) e os grupos infartados tratados com
células (grupo 4 e 5). Nota-se que o eixo médio de despolarização ventricular está desviado para direita
nos grupos submetidos ao IM.
0
◦
180
◦
+ 90
◦
- 90
◦
112º ± 13,3
13
7
º ± 16,
7
GRUPO 3 (n=3)
GRUPO 4 (n=7)
52,9º± 13,3
GRUPO 2 (n=9)
GRUPO 5 (n=5)
131,4º ± 19,0
4646
3 HORAS 21 DIAS
0
1
2
FO(n=9)
DMEM-ic (n=3)
HUCB-C (n=7)
HUCB-F (n=5)
*
*
*
*p<0,05 em relação ao FO
TEMPO
iQRS
Figura 11: Índice de amplitude do QRS (iQRS), antes do tratamento ( 3 horas depois do
procedimento cirúrgico) e 21 dias após a terapia.
4747
Figura 12: âQRS dos grupos 21 dias após o procedimento cirúrgico: Falso Operado (grupo2), grupo
infartado tratado com veículo (grupo 3) e os grupos infartados tratados com células (grupo 4 e 5).
Nota-se que 21 dias após o tratamento o eixo médio de despolarização ventricular continua desviado
para direita.
0
◦
180
◦
+ 90
◦
- 90
◦
152º ± 24,7
7
135º ± 13,14
GRUPO 3 (n=3)
GRUPO 4 (n=7)
60,7º ± 12,05
GRUPO 2 (n=9)
121,4º ± 4,70
GRUPO 5 (n=5)
4848
4.2- ANÁLISES ECOCARDIOGRÁFICAS
Os dados obtidos pelas análises ecocardiográficas do grupo 2, assim como os
resultados eletrocardiográficos, não demonstraram alterações funcionais do VE. Três
horas após o procedimento cirúrgico, os parâmetros avaliados nos animais FO não eram
significativamente diferentes dos valores encontrados nos ratos normais (p>0,05) (tabela
2).
Tabela 2: Dados do ECO, comparação entre o grupo 1 (animais normais ) e o grupo
(animais Falso- Operados).
Contudo, nos grupos infartados, três horas depois da ligadura permanente da artéria
coronária descendente anterior, foi possível observar a eficiência da cirurgia (tabela 3).
Esses animais já possuíam alterações significativas dos parâmetros sistólicos e da
geometria ventricular. Neste mesmo momento, a FEA era menor em todos os ratos
submetidos ao infarto quando comparados aos animais Falso-Operados (p<0,05). Além
disso, os três grupos possuíam sinais de dilatação do VE apresentando um maior DDVE
em relação ao grupo FO (p<0,05). Nestas imagens, pode ser observada a presença acinesia
na parede anterior do VE e o cálculo do percentual desta acinesia ventricular obtido nos
grupos infartados (grupo 3, 4 e 5) foram semelhantes (%AVE) (%AVE: grupo 4= 43,7 ±
7,36 grupo5= 47,1 ± 9,2 vs grupo 3= 38,7 ± 8,7 ).
NORMAIS
(n=50)
FO
(n=9)
DDVE (mm)
5,51± 0,75 4,9 ± 1,03
DSVE (mm)
1,80 ± 0,54 2,35 ± 1,22
4949
Dados ecocardiográficos: 3 horas após o procedimento cirúrgico
Tabela 3: Dados do ECO 3 horas após o procedimento cirúrgico (antes do tratamento). Valores
estão em média e desvio - padrão. FO, Falso Operado. *p<0,05 vs FO
FO
(n=9)
Grupo 2
DEMEM-ic
(n=5)
Grupo 3
HUCB-C
(n=7)
Grupo 4
HUCB-F
(n=5)
Grupo 5
DDVE (mm)
5,0 ± 0,1 7,32 ± 0,38* 7,5 ± 6,28* 7,2 ± 1,04*
DSVE (mm)
2,8 ± 0,1 5,86 ± 0,39* 4,65 ± 0,86* 5,16 ± 1,0*
FE (%)
57,7±15,1 20± 3,1* 26,4 ± 6,4* 25,6 ± 1,5*
ADVE (cm
2
)
1,82±0,53 0,34 ± 0,05* 0,28 ± 0,06* 0,32 ± 0,29*
ASVE (cm
2
)
0,63±0,24 0,21± 0,02 * 0,14 ±0,04* 0,19 ± 0,05*
FEA (%)
64,8±9,3 37± 11,6* 50,4 ± 6,3* 41,2 ± 12,5*
5050
Ao longo do tempo, não houve melhora na função cardíaca dos animais infartados
independente da forma de tratamento (grupo 3, grupo 4 e grupo 5) (tabela 4 e figura 12).
Mesmo 21 dias depois da indução do infarto, a área do ventrículo em sístole (ASVE) e a
área do ventrículo em diástole (ADVE) aumentaram. Os valores obtidos da ASVE e da
ADVE nos grupos tratados com células (grupo 4 e 5) não foram significativamente
diferentes do grupo que recebeu somente o veículo (grupo 3) (p>0,05). Assim, da mesma
forma, a FEA permaneceu deteriorada e nenhuma diferença significativa desse parâmetro
foi detectada entre os grupos de animais infartados (p>0,05) (figura 13). A cavidade
ventricular aumentou ao final da sístole (DSVE) e da diástole (DDVE) quando comparada
ao grupo FO (p<0,001).
Assim, a análise conjunta dos dados ecocardiográficos avaliados acima
demonstram que o tratamento com células mononucleares congeladas (grupo 4) ou o
tratamento com essa mesma fração celular não congelada (grupo 5) não foram capazes de
conter o remodelamento cardíaco. Isto foi refletido não só na dilatação da câmara
ventricular durante a sístole e diástole, mas também, na queda da FEA.
5151
3
HORA
S
2
1 DIA
S
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
FO
DMEM-ic
HUCB-C
*
*
*
*
HUCB-F
* p<0,01 em relação ao FO
# p<0,05 em relação ao FO
#
(n=9)
(n=7)
(n=5)
(n=5)
*
TEMPO
FEA (%)
Figura 13: Acompanhamento ecocardiográfico. Fração de encurtamento de área
(FEA) ao longo do tempo.
5252
Dados ecocardiográficos: 21 dias após o procedimento cirúrgico.
Tabela 4: Dados do ECO 21 dias após o IM. Valores estão em média e desvio - padrão.
FO, Falso Operado. *p<0,05 vs FO
.
FO
(n=8)
Grupo 2
DEMEM-ic
(n=6)
Grupo 3
HUCB-C
(n=7)
Grupo 4
HUCB-F
(n=5)
Grupo 5
DDVE (mm)
6,6 ± 0,05 8,8 ± 0,42* 8,9 ± 0,60* 10,0 ± 0,20*
DSVE (mm)
2,80 ± 0,10 6,90 ± 0,42* 6,10±0,24* 8,90 ± 0,60*
FE (%)
57,7±15,1 21,2±2,27* 20,1±5,6* 20,4±10,4*
ADVE (cm
2
)
0,66±0,06 0,88±0,04* 0,89±0,06* 1,06±0,02*
ASVE (cm
2
)
0,32±0,05 0,63±0,07* 0,61±0,1* 0,77±0,06*
FEA (%)
73,9±10,6 33,5±5,5* 28,5±8,7* 33,3±10,4*
5353
4.3 - PARÂMETROS HEMODINÂMICOS
Três semanas após o tratamento, os parâmetros hemodinâmicos foram mensurados
através de uma cânula que foi introduzida pela artéria carótida direita até o VE.
Os dados hemodinâmicos encontrados (tabela 3) demonstram um aumento da
pressão diastólica final do VE (PDFVE) e, ao mesmo tempo, uma queda da pressão
sistólica (PSFVE) dos animais infartados. Essas duas alterações foram responsáveis pela
queda da pressão desenvolvida pelo VE (PDVE= PDSVE - PDDVE) nos grupos infartados
(3, 4 e 5) quando comparados aos ratos FO (p<0,05) (figura 14). Além disso, tanto o índice
de contratilidade (dP/dTmax) quanto o de relaxamento do VE (dP/dTmin) apresentados
foram muito menores nos animais infartados, independente do tratamento, em comparação
ao grupo FO (p<0,001). Quando comparamos as formas de tratamento utilizadas, não foi
constatada nenhuma diferença estatística dos parâmetros avaliados entre os grupos 3, 4 e 5
(p>0,05). Logo, esses dados sugerem um acometimento não só da capacidade de
relaxamento, mas também, da contratilidade do VE nos ratos infartados independente do
tipo de tratamento proposto.
5454
0
50
100
150
***
*
***
***p<0,001 em relação ao FO
*p<0,05 em relação ao FO
FO (n=6)
DMEM-ic (n=3)
HUCB-F (n=4)
HUCB-C (n=6)
Figura 14- Análise da pressão desenvolvida pelo VE , vinte e um dias após o tratamento.
PDVE(mmHg)
5555
Dados hemodinâmicos 21 dias pós o IM.
FO
(n=6)
Grupo 2
DMEM-ic
(n=5)
Grupo 3
HUCB-C
(n=6)
Grupo 4
HUCB-F
(n=4)
Grupo 5
PDFVE (mmHg)
3,8 ± 3,2 22,0±7,35* 16,7±9,0* 27,8±2,0*
PSFVE (mmHg)
133 ± 13,5 113±4,8* 108±10,6* 111±5,4*
PDVE (mmHg)
130 ± 16 90,8 ± 12* 91,6 ± 18,5* 83,1±6,9*
dP/dT
-
(mmHg/s)
- 6200±645 -38252±162* -4032±643* -2862±590*
dP/dT
+
(mmHg/s)
8119±864 5368±210* 5484±875* 4585±955*
Tabela 5: pressão diastólica final do VE; PSFVE, pressão sistólica final do VE; PDFVE,
pressão desenvolvida pelo VE; PDVE. Valores estão em média e Desvio-padrão. FO, Falso
Operado. *p<0,05 vs FO
.
5656
4.4-TESTE CARDIOPULMONAR
Em condições basais (ECO, ECG e parâmetros hemodinâmicos), os dados
funcionais não demonstraram que o tratamento com HUCB-C foi capaz de impedir a piora
da função cardíaca após o infarto, sendo ineficaz na prevenção do remodelamento.
Para investigar possíveis diferenças funcionais entre os grupos sob condições de
estresse ao aparelho cardiovascular, submetemos os animais ao teste cardiopulmonar 21
dias após o procedimento cirúrgico. Este teste foi realizado nos grupos 1, 2, 3 e 4, mas não
no grupo 5 (animais tratados com HUCB-F).
Como nas análises anteriores em condições basais, não detectamos diferenças entre
o grupo tratado e não tratado em nenhum dos dois parâmetros avaliados (p>0,05). O tempo
de permanência em exercício foi menor nos grupos infartados (grupo 3 e 4) comparado ao
grupo FO ( grupo 3= 840 ± 129, grupo 4= 868 ± 195 vs grupo 2= 1418 ± 193 s, p<0,001
em relação ao FO) (figura 15). Da mesma forma, o consumo máximo de oxigênio (VO
2
)
obtido foi menor nos dois grupos infartados (figura 15) (grupo 3 = 24,7 ± 5,0, grupo 4=
24,7 ± 5,0 vs grupo 2 = 40,5 ± 6,4 ml O
2
/ kg min, p<0,001 em relação ao FO).
Com relação ao grupo 2 (Falso-Operado), os parâmetros analisados, possuíam
valores similares aos encontrados no grupo 1 (animais normais). O tempo de permanência
em exercício (TEMPO: grupo 1= 1416 ± 2612 vs grupo2= 1418 ± 193 s, p>0,05) e o
consumo de oxigênio (VO
2
:
:
grupo 1= 50,0 ± 12,4 vs grupo 2= 40,5 ± 6,4 ml O
2
/kg min,
p>0,05) obtidos nesses dois grupos não foram significativamente diferentes (p>0,05)
(figura 16).
5757
Figura 15: Tempo de permanência em exercício obtido no teste de esforço máximo
0
1000
2000
***
***
*** p<0,001 comparado ao FO
###
###
### p<0,001 comparado ao Normal
DEMEM-ic (n=6)
HUCB-C( n=6)
NORMAL (n=37)
FO (n=7)
TEMPO(s)
0
50
100
***
***
*** p<0,001 comparado ao FO
# p<0,05 comparado ao Normal
#
FO (n=7)
NORMAL (n =37)
DMEM -ic (n=6)
HUCB-C(n=6)
Figura 16: Consumo máximo de oxigênio (VO
2
) obtido no teste de esforço.
ml O2/Kg.min
5858
4.5-IDENTIFICAÇÃO DE CÉLULAS NO TECIDO CARDÍACO
As análises histológicas foram realizadas três semanas após a terapia celular os
animais foram sacrificados. Os cortes seriados de 5µm do tecido cardíaco analisados
demonstraram a presença de células marcadas com HOECHST na região de borda do
infarto no VE nos dois grupos infartados e tratados com células (grupo 4 e 5). Essas células
foram, principalmente, encontradas na fatia B do coração. A figura 17 ilustra a presença de
células marcadas com corante nuclear Hoechst na fatia B do coração de um animal
infartado pertencente ao grupo 5.
5959
Figura 17: Análise de um mesmo corte do tecido cardíaco (fatia B) de um animal infartado,
sacrificado 21 dias após a injeção intramiocárdica. Nota-se a presença de células
mononucleares de cordão umbilical ilustrando o campo claro, a microscopia de fluorescência e
a imagem de sobreposição. Isso pode ser visto nas regiões indicadas pelas setas. As marcações
nucleares típicas (setas) foram encontradas na nas regiões próximas a zona de injeção (A1 e
A2). Porém, na área de transição somente em uma região foram observadas células marcadas
com corante Hoechst em meio ao tecido cardíaco (B1 e B2). Por último, na região distante do
local de injeção nenhuma célula corada com marcador nuclear Hoechst (C1 e C 2) foi
encontrada.
63x
20x
63x
A1 A2
B1 B2 B3
C1 C2
6060
4.6-CITOMETRIA DE FLUXO
Com o objetivo de caracterizar a população de células injetadas, utilizamos um
painel de anticorpos que permitiu estabelecer o perfil fenotípico da fração celular através
da citometria de fluxo. A imunofenotipagem para mapeamento celular foi realizada,
somente, com a fração de células injetadas no grupo 5, ou seja, células de cordão umbilical
não congeladas. Os dados encontrados na análise estão ilustrados na tabela 4. O percentual
de células precursoras CD34
+
obtido foi de 0,33%. Este valor se encontra dentro da faixa
de valores descritos na literatura, embora na faixa inferior (Scott M.A et al, 1995;
Sutherland D.R et al, 1994; Guckman et al, 1997).
Além disso, o percentual de linfócitos T encontrado (49,37%) é superior aos
linfócitos totais existentes no sangue periférico adulto (21-35%), mas é coerente com a
taxa de linfócitos totais existente nas crianças (45 a 75%). Isto demonstra que, durante a
coleta, a taxa de contaminação com o sangue materno foi baixa.
Por último, vale ressaltar que a análise encontrou um percentual de 0,08% de
células com imunofenótipo de células mesenquimais (CD45
-
/ CD34
-
/ CD105
+
) e de 0,98%
de precursores endoteliais (CD133
+
/CD34
+
) (Tabela 7).
6161
Imunofenotipagem para mapeamento celular
Precursores eritróides
38,9%
Neutrófilos 15,1%
Eosinófilos
0,0%
Basófilos 0,0%
Monócitos maduros 14,7%
Precursores de monócitos
(
CD133
+
/CD64
+
/CD14
-
)
0,98%
Precusores mieloides
(
CD133
+
/CD34
+
/CD11
7
+
)
0,0%
T auxiliar 42,17%
Linfócitos T maduros
T citotóxicos 7,20%
Natural Killer 4,29%
Linfócitos B maduros 4,29%
Linfócitos B imaturos
(
CD45
+
fraco/CD19
+
/CD10
+
/CD34
+
)
0,06%
Precursor B
(
CD45
+
fraco/CD19
+
/CD10
+
/CD34
-
)
0,00%
Precursor CD34 0,33%
Tabela 6: Imunofenotipagem da fração de células mononucleares de cordão umbilical
oriundas da bolsa fresca. Os valores percentuais relativo ao total de células presentes no
material.
6262
Imunofenotipagem para mapeamento celular para outros
marcadores:
CD133
+
1,01%
CD45
+
FRACO
CD34
+
CD133
+
0,16%
CD45
+
FORTE
CD34
+
CD133
+
CD105
+
0,82%
CD45
-
CD34
+
CD133
+
0,01%
CD45
-
CD34
-
CD133
+
0,02%
CD105+ 2,28%
CD45
+
FRACO
CD34
+
CD105
+
0,0%
CD45
+
FORTE
CD34
+
CD105
+
0,0%
CD45
+
FORTE
CD34
-
CD105
+
2,20%
CD45
-
CD34
-
CD105
+
0,08%
CD166
+
10,60%
CD45
+
FRACO
CD34
+
CD166
+
0,19%
CD45
+
FORTE
CD34
-
CD166
+
9,6%
CD45
-
CD34
-
CD166
+
0,14%
CD73
+
3,18%
CD45
+
FRACO
CD34
+
CD73
+
CD117
-
0,2%
CD45
+
FORTE
CD34
-
CD73
+
14,94%
6363
CD45
-
CD34
+
CD73
+
0,08%
CD90
+
2,28%
CD45
+
FRACO
CD34
+
CD90
+
0,04%
CD45
+
FORTE
CD34
+
CD90
+
1,83%
CD45
-
CD34
+
CD90
+
0,0%
CD45
-
CD34
-
CD90
+
0,09%
CD51
+
CD61
+
2,28%
CD45
+
FRACO
CD34
+
CD51
+
CD61
+
0,04%
CD45
+
FORTE
CD34
+
CD51+CD61+ 1,83%
CD54
+
15,05%
CD45
+
FRACO
CD34
+
CD54
+
0,04%
CD45
+
FORTE
CD34
+
CD54
+
0,02%
CD45
+
CD34
-
CD54
+
14,85%
CD45
-
CD34
-
C54
+
0,2%
CD44
+
52,05%
CD45
+
FRACO
CD34
+
CD44
+
52,08%
CD45
+
CD34
-
CD44
+
0,0%
CD45
-
CD34
-
CD44
+
0,0%
CD146
+
0,26%
CD45
+
FRACO
CD34
+
CD146
+
0,0%
6464
CD45
+
FORTE
CD34
+
CD146
+
0,25%
CD45
+
CD34
-
CD146
+
0,0%
CD45
-
CD34
+
CD146
+
0,01%
Tabela 7: Imunofenotipagem, através de outros marcadores, da fração de células
mononucleares de cordão umbilical oriundas da bolsa fresca. Os valores percentuais relativo
ao total de células presentes no material.
6565
5- DISCUSSÃO
A terapia celular vem sendo proposta como alternativa para a reconstituição do
tecido cardíaco lesado pelo processo isquêmico. Atualmente, o tipo celular mais utilizado
nos estudo da cardiomioplastia celular é a célula-tronco da medula óssea (Tomita et al.,
1999; Wang et al., 2000; Orlic et al., 2001 a; Orlic et al., 2001b, Olivares et al., 2004).
Embora muitos trabalhos demonstrem a eficácia terapêutica dessas células, a sua coleta
ocorre de forma invasiva. Isso implica não só num risco de dano tecidual durante a coleta,
mas também, numa possibilidade de infecção local. Além disso, ainda existem os riscos
inerentes ao uso da anestesia durante o procedimento de coleta (Buckner et al., 1984).
Diferente das células-tronco da medula óssea, a coleta das células do cordão
umbilical ocorre de forma não invasiva, não oferecendo nenhum risco para a mãe ou para a
criança. Além disso, as células presentes no cordão umbilical, por serem coletadas logo
após o nascimento, quase não são expostas aos fatores ambientais capazes de promover
alterações na genética e na fisiologia celular.
Outra característica interessante peculiar das células de cordão é o seu grande
potencial de proliferação relacionado, por muitos autores, ao maior comprimento do
telômero dessas células o que permite um maior número de divisões celulares (Mayani et
al., 1994; Regeczy N et al., 2002.; Gammaitoni L et al., 2004). Por último, os estudos,
também, vêm identificando a presença de células progenitoras, hematopoieticas (Cardoso
AA et al., 1993. Thilaganathan B et al., 1994; Mayani et al., 1994), mesenquimais (A.
Erices et al., 2000; Romanov Y A et al., 2003; G. Kogler et al., 2004; Xin Quin Kang et
al., 2006) e endoteliais (Schimidt D et al., 2004; Delorme B et al, 2005) no cordão
umbilical com capacidade de proliferação in vitro. Neste contexto, as células–tronco do
6666
cordão umbilical se tornaram candidatas potenciais para reconstituição do miocárdio
infartado.
O número de estudos que investigaram a eficácia terapêutica das células de cordão
umbilical no modelo de IM ainda é restrito. A maioria desses trabalhos ressalta o aumento
da densidade capilar e a diminuição da área de infarto. Além disso, alguns autores ainda
destacam a melhora função cardíaca após a terapia. Clinicamente, o uso das células de
cordão umbilical tem se restringido a reconstituição da medula óssea após doenças
neoplásicas ou não. Assim, nenhum estudo clínico investigou o transplante dessas células
no infarto.
Baseado nisto, o presente trabalho se propôs a avaliar o potencial terapêutico das
células mononucleares de cordão umbilical congelado ou não congelado no modelo de
infarto agudo em ratos Wistar.
Os resultados obtidos, três semanas após o transplante, demonstram que nenhuma
das formas de tratamento utilizadas promoveu melhora da função cardíaca em condições
basais. Os perfis eletrocardiográficos e ecocardiográficos dos animais tratados com células
(grupo 4 e 5) foram similares aos dos animais infartados tratados com meio (grupo3)
(figura 11 e tabela 4). Mais ainda, a análise hemodinâmica mostrou uma diminuição
semelhante da contratilidade (dP/dTmax) e do relaxamento (dP/dTmin) em todos os
animais infartos (tabela 4). Da mesma forma, quando submetido ao estresse físico, o grupo
que recebeu as células de cordões congeladas (grupo 4) não exibiu um melhor desempenho
funcional (figuras 14 e 15).
Em nenhum dos nossos experimentos, os resultados funcionais encontrados
mostraram diferença entre os dois grupos tratados com células (grupo 4 e 5) sugerindo que
6767
o insucesso do tratamento não se deveu ao processo de congelamento das células do
sangue do cordão umbilical (figuras 10, 12 e 13) (tabelas 2, 3 e 4) . Embora as células de
cordão utilizada em nosso estudo tenham permanecido congeladas por um curto período de
tempo (menos de 1 semana), o processo de congelamento poderia promover alterações
celulares que pudessem comprometer a eficácia do resultado. Essa preocupação com as
conseqüências do processo e com o período de congelamento da bolsa de cordão umbilical
tem sido alvo de alguns estudos (Broxmeyer H.E. et al., 1989; Boxmeyer H.E. & Copper
S.,1997; Kobylka et al , 1998; Mugishima et al, 1999). Os autores vêm tentando elucidar
se há uma modificação do número de células progenitoras viáveis e se a eficiência celular
(capacidade de formar colônias) é afetada com o aumento do período de congelamento. Os
dados encontrados nesses trabalhos propõem que as células progenitoras podem sobreviver
ao processo de congelamento e a um longo período de estocagem. Ademais, Broxmeyer
H.E. et al demonstraram não só a manutenção da capacidade de proliferação, auto-
renovação e expansão de células progenitoras oriundas de uma bolsa de cordão congelada
por 15 anos in vitro, mas também, a capacidade dessas células de reconstituir a medula
óssea de camundongos (2003).
A via de injeção das células mononucleares do cordão, escolhida no nosso estudo,
foi a intra-cardíaca. A razão desta escolha está associada ao principal objetivo do trabalho
que foi avaliar o potencial terapêutico das células mononucleares do cordão umbilical
congelado ou não. Em nenhum momento, o estudo se propõe a investigar a migração
dessas células para a região infartada. Assim, para melhor assegurar a presença das células
na região de injúria escolhemos o transplante intra-cardíaco. Uma vez que, por via de
injeção intra-venosa a chegada das células ao miocárdio danificado será dependente dos
6868
mecanismos de sinalização envolvidos (Tsvee Lapidot and Isabelle, 2002, 2002; Askari et
al., 2003).
O número de células transplantadas diretamente na região de borda do infarto, nos
nosso estudo, foi 2x10
7
. Apenas o trabalho publicado por Byung-Ok Kim et al., realizado
em suínos, transplantou um valor maior do que este (10
8
) (Byung-Ok Kim et al., 2005).
Em sua maioria, o número de células injetadas variou entre 10
5
e 10
6
(Henning et al, 2003;
Hirata Y et al., 2005; Kuan P et al., 2005; Ma N et al., 2006). Até mesmo o estudo que
investigou o potencial de migração das células mononucleares do cordão umbilical para a
região infartada, injetou um menor número de células na veia da cauda (10
6
) (Ma N et al.,
2005).
Uma grande preocupação nossa foi assegurar que todos os animais inseridos na
pesquisa possuíam infarto de mesma extensão visto que o tamanho do infarto pode variar
de acordo com a altura de oclusão da coronária esquerda. Para tanto, nas análises
ecocardiográficas realizadas antes do tratamento, foi calculado o percentual de acinesia da
parede do VE. Até hoje, nenhum estudo que avaliou os animais transplantados com células
de cordão assegurou que a extensão do infarto, antes do tratamento, era a mesma em todos
os grupos de estudo. Assim, as diferenças funcionais e no tamanho do IM encontradas
nesses estudos depois da terapia podem não estar relacionadas somente a forma de
tratamento ao qual o animal foi submetido.
Uma vez que transplantamos em ratos Wistar células oriundas do cordão umbilical
humano e os resultados encontrados foram negativos, outra grande questão a ser levantada
está relacionada à rejeição imunológica das células injetadas (doença enxerto-hospedeiro).
Grande parte dos trabalhos realizados que obtiveram sucesso com a terapia fizeram uso de
6969
camundongos imunodeficeintes ou utilizaram drogas imunosupressoras (Peschle C et al.,
2004; Takamoto S et al., 2005; Steinhoff G et al., 2005; Byung-Ok Kim et al., 2005; Kuan
P et al., 2005; Gustav Steinhoff et al., 2006).
Contudo, dois estudos realizados demonstraram não só uma melhora na função
cardíaca, mas também, uma redução da área de infarto após o transplante de células
mononucleares do cordão umbilical humano em animais não imunosuprimidos (Henning et
al., 2004; HU Cheng-heng et al, 2006). Os autores justificam a ausência dessa reação
imunológica nos ratos tratados com células progenitoras de cordão pelo fato do cordão
umbilical apresentar células imunológicamente imaturas (Christesen RD et al., 1989;
Ridson G et al., 1994). Além disso, os autores ressaltam que as células do cordão umbilical
possuem menor expressão de HLA classe II, em sua superfície. No nosso estudo, 21 dias
após a injeção, nós encontramos um grande número de células com núcleo marcado
(HOECHST) nos cortes histológicos nas áreas próximas a injeção sugerindo também que a
reação imunológica não foi capaz de impedir a sobrevivência das células transplantadas
(figura 9).
Uma outra questão relevante, é o imunofenótipo das células de cordão
transplantadas. Muitos trabalhos até hoje publicados não só analisaram o imunofenótipo,
mas também, isolaram uma fração celular específica para ser utilizada no transplante. A
escolha do tipo celular variou, alguns autores optaram por transplantar células
comprometidas com a linhagem hematopoiética (CD34
+
) (Takamoto S et al., 2005;
Steinhoff G et al., 2005). Outros autores injetaram células com comprometimento
endotelial (Peschle C et al., 2004; Gustav Steinhoff et al., 2006) e, mais recentemente,
alguns estudo vêm testando a utilização de células mesenquimais do cordão (Byung-Ok
Kim et al., 2005).
7070
Somente quatro estudos transplantaram a fração de células mononucleares
propriamente dita (Peschle C et al., 2004; Henning et al., 2004; Steinhoff G et al., 2005;
HU Cheng-heng et al, 2006). Em 2004, Peschle C et al realizaram um trabalho
comparando o potencial terapêutico das células mononucleares do cordão com o potencial
da linhagem hematopoiética CD34
+
do próprio cordão. Três semanas depois do tratamento,
os animais que receberam as células CD34
+
apresentaram melhora dos parâmetros
hemodinâmicos e uma menor área de infarto. Entretanto, as células mononucleares
injetadas não foram capazes de induzir a angiogênese e promover uma melhora funcional.
Além disso, ainda nesse trabalho, o autor transplantou um número muito menor de células
comprometidas com a linhagem endotelial (CD34
+
/KDR
+
) num grupo de animais. Esses
animais também apresentaram uma melhora da densidade capilar e da função cardíaca. A
partir desses dados, o autor sugeriu que as células CD34
+
/KDR
+
seriam a linhagem celular
responsável pela melhora funcional dos animais. Em concordância com o trabalho de
Peschle C et al, os nossos resultados não demonstram nenhuma melhora da função
cardíaca basal após o tratamento com um número maior de células mononucleares do
cordão umbilical (2x10
7
). Ademais, o nosso trabalho também submeteu os animais a
estresse fisiológico. Vinte e um dias após o IM, os ratos foram submetidos a um teste de
esforço progressivo máximo em esteira. O teste de esforço é comumente utilizado em
pacientes como ferramenta de análise de função cardiopulmonar. Este teste de esforço
máximo poderia detectar pequenas diferenças na capacidade contrátil do coração, já que o
débito cardíaco é um dos principais limitantes do exercício. Todavia, não houve diferenças
significativas entre os grupos infartados tanto no consumo máximo de oxigênio quanto no
tempo de permanência em exercício (figuras 7 e 8 ).
7171
Em outro estudo, publicado por Henning et al, as células mononucleares do cordão
foram capazes de promover a melhora funcional dos animais tratados 4 meses após o
transplante. Nesse trabalho, o autor fez uma análise temporal da função cardíaca: 1, 2, 3 e 4
meses depois da terapia. Com relação aos parâmetros ecocardiográficos, no primeiro mês
após o tratamento, houve uma queda da fração de ejeção de todos os animais infartados e
não houve diferença significativa entre o grupo tratado com células e o grupo controle
(injetado com veículo). Somente após o terceiro mês de tratamento, animais transplantados
com células apresentaram uma fração de ejeção significativamente maior que o grupo
controle. Os parâmetros hemodinâmicos mensurados foram adquiridos sob condição de
estresse farmacológico através da infusão de fenilefrina. Da mesma forma, no quarto mês
de análise o índice de relaxamento (dP/dTmin ) e o índice de contratilidade (dP/dTmax)
dos ratos transplantados com células foram significativamente maiores do que o grupo
controle. Contudo, a injeção das células do cordão proporcionou uma redução da área de
infarto desde o primeiro mês (p<0,01 em relação aos animais injetados com veículo).
Tendo em vista os resultados funcionais obtidos por Henning et al no primeiro mês de
análise e os resultados encontrados no corrente estudo 21 dias depois do transplante
(tabelas 2 e3), podemos supor que o período de observação foi insuficiente para promover
a melhora funcional (Henning et al., 2005).
Entretanto, o mais recente trabalho publicado por HU Cheng-heng et al verificou,
quatro semanas após a injeção de células mononucleares do cordão umbilical, uma
melhora da função cardíaca de ratos Wistar. Nesse estudo tanto os parâmetros
ecocardiográficos quanto os hemodinâmicos apresentados pelos animais transplantados
com células mononucleares foram diferentes dos valores encontrados no grupo injetado
com veículo (p<0,05). Estes resultados funcionais ainda foram associados a um aumento
7272
da densidade capilar, redução da extensão do infarto e uma maior expressão de VEGF
(fator de crescimento vascular endotelial, do inglês “vascular endothelial growth factor”)
no período entre 7 e 28 dias após a terapia celular. Dessa forma, o autor não só relata a
sobrevivência das células humanas injetadas nos animais imunosuprimidos, mas sugere
que a melhora funcional obtida pelo transplante estaria relacionada ao aumento da
densidade capilar no miocárdio injuriado (HU Cheng-heng et al ., 2006)
Porém, deve ser destacado que diferente do estudo realizado por Henning et al, HU
Cheng-heng et al analisou, através de uma citometria de fluxo, o percentual de células
CD34
+
existentes nas amostras transplantadas. Isto é importante por que o número de
células CD34
+
presentes no cordão umbilical é muito diversificado e o seu percentual pode
variar na faixa de 0,33% a 1,98% (Scott M.Aet al, 1995; Sutherland D.R et al, 1994;
Guckman et al, 1997). A porcentagem de células CD34
+
, descrita neste trabalho de HU
Cheng-heng et al, existente na fração mononuclear injetada foi de 1,5. Esse valor é muito
superior ao encontrado na fração mononuclear utilizada no nosso estudo. A nossa análise
de FACS, realizada somente na fração de células mononucleares oriundas da bolsa de
cordão umbilical humano fresca, demonstrou um percentual de células CD34
+
mínimo,
descrito na literatura, de 0,33% (tabela 4). Assim, as diferentes respostas funcionais ao
transplante de células mononucleares podem, também, estar associadas ao respectivo
imunofenótipo de cada fração mononuclear.
7373
6- CONCLUSÕES:
O estudo nos permitiu concluir que:
-as células mononucleares de cordão umbilical humano transplantadas no
miocárdio de ratos Wistar parecem sobreviver por pelo menos vinte e um dias após a
injeção.
-a injeção de células mononucleares do cordão umbilical (congeladas ou não
congeladas) não foi capaz de alterar os parâmetros funcionais cardíacos três semanas após
o transplante.
-não houve diferença entre a eficácia terapêutica das células mononucleares de
cordão umbilical congelado e não congelados.
7474
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