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Universidade
Estadual de Londrina
Centro de Ciências Agrárias
Depto. De Ciência e Tecnologia de Alimentos
Programa de Mestrado e Doutorado em Ciência de Alimentos
CONTAMINAÇÃO DE CARCAÇAS DE FRANGO POR
Campylobacter jejuni ANTES E APÓS
ARMAZENAMENTO SOB RESFRIAMENTO OU
CONGELAMENTO
MAIKE TAÍS MAZIERO
Londrina
2007
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MAIKE TAÍS MAZIERO
CONTAMINAÇÃO DE CARCAÇAS DE FRANGO POR
Campylobacter jejuni ANTES E APÓS
ARMAZENAMENTO SOB RESFRIAMENTO OU
CONGELAMENTO
Dissertação de Mestrado apresentado ao
Programa de Pós Graduação em Ciência de
Alimentos do Departamento de Ciência e
Tecnologia de Alimentos da Universidade
Estadual de Londrina, como requisito à
obtenção do título de Mestre em Ciência de
Alimentos.
Orientadora: Profa. Dra. Tereza Cristina R.
Moreira Oliveira
Londrina
2007
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MAIKE TAÍS MAZIERO
CONTAMINAÇÃO DE CARCAÇAS DE FRANGO POR
Campylobacter jejuni ANTES E APÓS ARMAZENAMENTO
SOB RESFRIAMENTO OU CONGELAMENTO
Dissertação apresentada ao Curso de
Pós Graduação em Ciência de Alimentos
da Universidade Estadual de Londrina,
como requisito parcial para a obtenção
do título de Mestre.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Tereza Cristina R. Moreira Oliveira
Universidade Estadual de Londrina
Prof. Dr. Luciano dos Santos Bersot
Universidade Federal do Paraná
Prof. Dr. Ernst Muller
Universidade Estadual de Londrina
FICHA CATALOGRÁFICA
Título em inglês: Campylobacter jejuni contamination of broiler carcass before and
after refrigerated or frozen storage
Palavras-chave em ingles: Campylobacter, microaerophilic, termotolerant, broiler
meat
Titulação: Mestre em Ciência de Alimentos
Banca examinadora: Tereza Cristina R. Moreira Oliveira, Luciano dos Santos Bersot,
Ernst Muller
Data da defesa: 26/03/2007
Maziero, Maike Taís. Contaminação de carcaças de frango po
r
Campylobacter jejuni antes e após armazenamento sob
resfriamento ou congelamento. Londrina, Paraná. 2007
Orientadora: Tereza Cristina Rocha Moreira Oliveira
Dissertação de Mestrado. Universidade Estadual de Londrina,
Centro de Ciências Agrárias
Palavras-chave: Campylobacter, microaerófila, termotolerante,
carne de frango
AGRADECIMENTOS
À Profa. Doutora Tereza Cristina Moreira Oliveira por sua orientação, paciência e
atenção.
A todos os professores do Departamento de Ciência e Tecnologia em Alimentos pelo
conhecimento compartilhado durante esses 2 anos de convívio.
À empresa Perdigão Agroindustrial Ltda. pela oportunidade de acompanhar as
análises de Campylobacter em seu Centro de Tecnologia, principalmente ao senhor
Paulo Rogério Franchin por sua disposição em ajudar.
A todas minhas colegas de mestrado, por sua amizade e companheirismo.
À Universidade Estadual de Londrina, por promover conhecimento e oportunidades
aos seus alunos.
Ao CNPQ por prover apoio financeiro.
A todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste trabalho.
Meu agradecimento especial a Roberto Montanhini Neto, pelo carinho, apoio e
compreensão durante essa jornada.
Enfim, meu eterno agradecimento a Deus, sempre presente em minha vida.
Muito Obrigada!
MAZIERO, M.T. Contaminação de carcaças de frango por Campylobacter jejuni
antes e após armazenamento sob resfriamento ou congelamento. 2007.
Dissertação de Mestrado. Universidade Estadual de Londrina
RESUMO
Campylobacter é a causa mais freqüente de gastroenterite bacteriana em vários
países, sendo o frango e seus derivados o principal veículo transmissor ao homem.
O Brasil, apesar de ser o maior exportador mundial de carne de frango, possui
poucas informações sobre a incidência deste microrganismo em sua cadeia de
produção. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do armazenamento no
isolamento de Campylobacter em 30 amostras de carne de frango conservadas por
7 dias a 4 °C e por 28 dias a -20 °C, bem como do enriquecimento seletivo no
resultado da análise. As amostras frescas apresentaram 93,3% de positividade para
Campylobacter spp. termotolerante, com contagem média de 3,08 Log
10
UFC/g no
plaqueamento direto. Após a refrigeração, a percentagem de positividade passou
para 53,3%, com contagem média de 1,19 Log
10
UFC/g. Amostras congeladas
apresentaram 36,6% de positividade, com contagem média de 0,71 Log
10
UFC/g.
Após o enriquecimento a taxa de positividade para C. jejuni nas amostras frescas,
refrigeradas e congeladas foi de 50%, 36,7% e 33,3%, respectivamente. Após o
enriquecimento seletivo, não houve diferença significativa na incidência de C. jejuni
nas amostras frescas e nas conservadas a baixas temperaturas, indicando que este
microrganismo é capaz de sobreviver nas condições de armazenamento testadas.
Palavras-chave: Campylobacter, microaerófila, termotolerante, carne de frango.
MAZIERO, M.T. Campylobacter jejuni contamination of broiler carcass before
and after refrigerated or frozen storage. 2007.
ABSTRACT
Campylobacter jejuni is the most common cause of bacterial gastroenteritis in many
countries and broiler and its by-products are the main source of human disease.
Although Brazil is the world's 1
st
largest chicken exporter, a little information is
available about the prevalence of Campylobacter in chicken production chain. The
aim of this study was to evaluate the effect of the storage temperature on
Campylobacter detection of chicken meat stored for seven days at 4°C and for
twenty-eight days at -20°C. The effect of the selective enrichment on the detection of
Campylobacter was also evaluated. Thirty fresh chicken meat samples were
analyzed and 93.3% was contaminated with termotolerant Campylobacter spp. with
average counting of 3.08 Log
10
CFU/g on the direct plating. After refrigeration, 53.3%
of the analyzed samples tested positive for Campylobacter and the average counting
was 1.19 Log
10
CFU/g. Of samples stored at -20°C, 36.6% tested positive with
average counting of 0.71 Log
10
CFU/g. After enrichment, C. jejuni was detected in
50%, 36.7% and 33.3% of the fresh, refrigerated and frozen meat samples analyzed,
respectively. After selective enrichment, there was no difference between the fresh or
low temperature storage, showing that microorganism can survive at the tested
storage conditions.
Key-words: Campylobacter, microaerophilic, termotolerant, broiler meat.
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 Resultados das análises de Contagem de Campylobacter spp.
termotolerantes por plaqueamento direto e Pesquisa de C.
jejuni após o enriquecimento seletivo em carne de frango
fresca (analisada 1 h após a embalagem), refrigerada a 4 °C
por 7 dias e congelada a – 20 °C por 28 dias.............................
44
Tabela 02 Valores médios da contagem de Campylobacter sp
p
termotolerante por grama de carne de frango apó
plaqueamento direto ...................................................................
45
Tabela 03 Número de amostras de carne de frango positivas para C. jejuni
após o enriquecimento seletivo ...................................................
48
ÍNDICE
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................ 06
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................ 09
2.1 Características do microrganismo .......................................................... 09
2.2 Epidemiologia da Campilobacteriose Humana........................................ 13
2.3 Contaminação de Frango por Campylobacter ....................................... 19
2.4 Transmissão de Campylobacter na Cadeia de Produção de Frango...... 21
2.5 Efeito do Resfriamento e Congelamento na Sobrevivência de
Campylobacter ................................................................................................ 27
2.6 Detecção de Campylobacter ................................................................... 30
3 OBJETIVOS ................................................................................................. 36
3.1 Objetivo Geral ......................................................................................... 36
3.2 Objetivos Específicos .............................................................................. 36
4 MATERIAIS E MÉTODO .............................................................................. 37
4.1 Coleta e Preparo das Amostras .............................................................. 37
4.2 Contagem de Campylobacter spp. Termotolerante Antes do
Pré-enriquecimento e Enriquecimento Seletivo (Plaqueamento direto)..........
.
38
4.3 Pesquisa de C. jejuni Após o Enriquecimento Seletivo ............................ 39
4.4 Identificação Bioquímica .......................................................................... 40
4.4.1 Hidrólise do Hipurato .......................................................................... 40
4.4.2 Teste da Catalase ............................................................................... 41
4.5 Análise Estatística .................................................................................... 41
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 43
6 CONCLUSÃO ............................................................................................. 51
7 REFERÊNCIAS …………………………………….………………………….. 52
ANEXOS ......................................................................................................... 60
6
1 INTRODUÇÃO
A produção brasileira de frangos de corte tem protagonizado um dos maiores
sucessos no competitivo setor do agronegócio nestas últimas décadas, colocando o
país no topo do comércio internacional de carne de frango. O Brasil iniciou sua
produção intensiva de aves na década de sessenta e atualmente, é o segundo
produtor e o primeiro exportador mundial de carne de frango, segundo dados da
União Brasileira de Avicultura (UBA, 2006). O Paraná é o maior estado produtor e
exportador de carne de frango do Brasil. Estas posições são decorrentes de
investimentos visando à alta qualidade dos produtos, atualmente consumidos em
mais de 100 países em todo o mundo. Na última década, a produção de frangos
cresceu 142% e as exportações de carne de frango aumentaram 300% (SILVA,
2004).
Em 2005, a produção foi de aproximadamente 9.297 milhões de toneladas,
com cerca de 30% deste total exportado. O consumo per capita passou de 2,3 kg,
em 1971, para 35,5 kg, em 2005, tornando o Brasil o quarto maior consumidor de
carne de frango do mundo (UBA, 2006).
A carne de frango e seus derivados são considerados o principal veículo
transmissor de Campylobacter para o homem (BUTZLER, 2004). Esta bactéria é
considerada a mais freqüente causa de gastroenterite bacteriana em alguns países
desenvolvidos. Nos Estados Unidos, mais de dez mil casos de campilobacteriose
são reportados anualmente ao Center for Disease Control and Prevention (CDC),
que estima uma ocorrência de mais de dois milhões de casos anuais, o que
corresponde a 1% da população americana. Segundo o CDC, a estimativa é de 500
óbitos por ano, embora, na maioria dos casos, a doença não necessite de
7
tratamento médico. Além disso, artrite ou Síndrome de Guillain-Barré podem ocorrer
como conseqüência da campilobacteriose. Esta Síndrome é uma doença auto-imune
que aparece semanas após o término dos sintomas da gastroenterite e afeta os
nervos periféricos, levando à paralisia, e, freqüentemente, à necessidade de terapia
intensiva por várias semanas. Nos Estados Unidos, mais de 40% dos casos de
Guillain-Barré ocorrem após a infecção intestinal por Campylobacter e estima-se que
0,1% dos pacientes com campilobacteriose desenvolvam a síndrome (CDC, 2006).
No Brasil, a ocorrência de campilobacteriose é desconhecida.
O controle de Campylobacter na cadeia de produção de alimentos é
atualmente o objetivo primário da indústria de alimentos. No entanto, as estratégias
de desenvolvimento e implementação requerem um maior conhecimento a respeito
da extensão do problema (NEWEL, 2004), uma vez que o monitoramento desta
bactéria é muito importante para o controle da doença humana.
O efeito do resfriamento e do congelamento na sobrevivência de C. jejuni
ainda não foi bem elucidado. Alguns estudos confirmam uma redução significativa na
porcentagem de carcaças positivas para C. jejuni após o congelamento (ALTER et
al., 2005, STERN et al., 1984). O congelamento pode reduzir significativamente a
sobrevivência de Campylobacter, uma vez que, diversos fatores, incluindo a
nucleação do gelo e a desidratação, levam à injúria do microrganismo, além do
estresse oxidativo que pode induzir a morte da célula (PARK, 2002).
No entanto, um número significativo de C. jejuni pode sobreviver ao
resfriamento e congelamento, alertando que estes tratamentos sozinhos não
garantem a segurança do alimento, com respeito a este microrganismo (BHADURI &
COTTRELL, 2004; ROSENQUIST et al., 2006; GEORGSSON et al., 2006).
8
Este trabalho teve como objetivo avaliar a contaminação de carcaças de
frango por Campylobacter antes e após o armazenamento por resfriamento e
congelamento, bem como a influência do enriquecimento seletivo no resultado da
análise.
9
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Características do Microrganismo
O gênero Campylobacter (do grego capilo=curvo e bacter=bastão) é
constituído por 18 espécies de bacilos Gram-negativos, curvos ou espiralados. As
espécies deste gênero são microaerófilas, termofílicas e não-formadoras de esporos,
podendo adquirir morfologia cocóide, correspondente às formas não cultiváveis.
Apresentam um único flagelo polar, duas a três vezes maior que o tamanho da
célula, responsável por seu movimento em saca-rolha ou vai-vêm (FRANCO &
LANDGRAF, 1996). Apresentam arranjo típico em forma de “S” ou asa de gaivota,
quando as células formam pequenas cadeias (SILVA et al.,1997).
Figura 01: Morfologia de Campylobacter por microscopia eletrônica e por coloração
de Gram (aumento 1000 x).
Disponível em: http://www.pref.aichi.jp/eiseiken/67f/microbiol.html e http://www.microbisome.com
/imagenes/iconos_nuevos/microbisome_Campylobacter_jejuni.jpg
As células são pequenas, variam de 0,5 a 0,8 µm de comprimento e 0,2 a 0,5
µm de largura. O metabolismo é estritamente respiratório, não fermentam nem
oxidam carboidratos, usam aminoácidos e componentes intermediários do ciclo do
ácido tricarboxílico como principais fontes de energia. São oxidase-positivas e
10
podem ser separadas em dois grupos: (1) Campylobacter catalase-positiva, no qual
estão incluídos C. jejuni, C. fetus, C. faecalis e C. coli, espécies mais importantes do
ponto de vista patogênico; (2) Campylobacter catalase-negativa, onde estão
incluídos C. sputorum e C. concisus. Campylobacter catalase-negativa são mais
sensíveis ao oxigênio e requerem baixos níveis para uma ótima multiplicação.
Somente o grupo catalase negativo reduz nitrato a nitrito (BUTZLER, 1984).
Outra divisão importante dentro do gênero Campylobacter se refere à
capacidade de multiplicação acima da temperatura de 37 °C. Algumas espécies se
multiplicam bem entre 25 e 37 °C, mas não a 42 °C, e há espécies que não
apresentam multiplicação a 25 °C, se multiplicam a 37 °C, porém apresentam
multiplicação preferencial a 42 °C. Este último grupo é denominado termofílico ou
termotolerante e inclui as principais espécies responsáveis por infecções
gastrointestinais (ALLOS & TAYLOR, 1998, apud THOMÉ, 2006).
As condições de multiplicação requeridas por Campylobacter são incomuns,
quando comparada a outras bactérias patogênicas (PARK, 2002). A multiplicação é
inibida quando a concentração de oxigênio no ambiente é inferior a 3% e superior a
15%, sendo 5% a atmosfera ideal. Além disso, são capnofílicas, ou seja, requerem
cerca de 10% de CO
2
para sua multiplicação. São rapidamente destruídas pelo calor,
não sobrevivendo aos processos térmicos utilizados no preparo de alimentos. Não
sobrevivem ao processo de pasteurização (D
55ºC
= 0,7 a 1 min), nem ao aquecimento
a 60 ºC por 10 minutos (FRANCO & LANDGRAF, 1996; FORSYTHE, 2002).
C. jejuni cresce em temperaturas que variam de 30 a 47 ºC, sendo a sua
temperatura ótima de multiplicação é em torno de 42 ºC. Apesar de ser incapaz de
se multiplicar em temperaturas normais de refrigeração dos alimentos, é
metabolicamente ativo a temperaturas inferiores ao seu ótimo de multiplicação
11
(PARK, 2002). Diversos fatores influenciam a taxa de inativação de C. jejuni durante
a desidratação e armazenamento em condições de baixa umidade, entre eles, o
serovar e a temperatura (BUTZLER, 1984). C. jejuni é relativamente sensível à
radiação gama e raios ultravioleta, além de ter seu multiplicação inibido em
concentrações superiores a 2% de cloreto de sódio (MEAD, 2004).
A subtipagem é essencial tanto para traçar as fontes de contaminação por
Campylobacter em frangos quanto para entender a transmissão deste
microrganismo para o homem (HÖÖKS et al., 2005). Segundo a classificação de Lior
(1984), C. jejuni apresenta 4 biotipos que podem ser identificados através dos
seguintes testes bioquímicos: hidrólise do indol-acetato, resistência ao ácido
nalidíxico e cefalotina, hidrólise do hipurato e teste de DNAse (PEZZOTTI et al.,
2003).
Os antígenos somáticos, capsular e flagelar, contribuem para a existência de
inúmeros sorotipos (STROHL et al., 2004). Dois processos de sorotipagem são
utilizados: o de Penner e o de Hennessy, para antígenos termicamente estáveis
(lipopolissacarídeos), com mais de 60 sorotipos de C. jejuni e C. coli, e o de Lior
para antígenos termossensíveis (flagelos), com mais de 100 serotipos de C. jejuni,
C. coli e C. lari. A fagotipagem pode diferenciar linhagens de um sorotipo e é uma
técnica simples para ser aplicada em um grande número de linhagens
simultaneamente (FORSYTHE, 2002)
No Quadro 1 estão apresentadas características bioquímicas e de
crescimento das espécies do gênero Campylobacter.
12
Quadro 01: Características bioquímicas e de multiplicação das espécies de Campylobacter
Crescimento
Espécie Catalase Nitrato H
2
S Hipurato Urease
25 °C 37 °C 42 °C
C. coli
+ + - - - - + +
C. jejuni ssp. jejuni + + - + - - + +
C. jejuni ssp. doylei + - - + - - + +
C. fetus ssp. fetus + + - - - + + -
C. fetus ssp. venerealis + + - - - + + -
C. hyointestinalis
+ + + - - + + +
C. lari
+ + - - - - + +
C. upsaliensis
- + - - - - + +
C. sputorum ssp. faecalis + + + - - - + +
C. sputorum ssp. bubulus - + + - - - + +
C. mucosalis
- + + - - - + +
C. concisus
- + + - - - + +
Adaptado: Manual Oxoid, 2000
13
2.2 Epidemiologia da Campilobacteriose Humana
Campylobacter spp. tem sido foco de crescente interesse nos últimos 30
anos, devido ao aumento na freqüência de seu isolamento em humanos, animais,
alimentos e água (BUTZLER, 2004).
C. jejuni e C. coli são responsáveis por 95% dos casos de campilobacteriose
em humanos. São comensais do trato gastrointestinal de uma grande variedade de
animais domésticos e silvestres (bovinos, suínos, gatos, cães, roedores e,
principalmente, de aves). Os pombos, gaivotas, pardais, patos, perus e,
especialmente, o frango, são considerados reservatórios primários de C. jejuni
(PARK, 2002; FORSYTHE, 2002). Sabe-se que nas aves a colonização é
geralmente assintomática, podendo ser encontrados níveis de 10
9
UFC/g de fezes
sem sintomas clínicos de doença (KEENER, 2004). A alta incidência de C. jejuni em
frangos pode ser reflexo da sua temperatura ótima de multiplicação, uma vez que o
trato intestinal das aves tem uma temperatura superior à dos mamíferos, ou seja,
cerca de 42 °C (PARK, 2002).
A maioria dos casos de campilobacteriose são esporádicos, e os surtos são
incomuns. A infecção pode ocorrer pela ingestão de menos de 500 UFC (BLACK et
al., 1998, apud KEENER, 2004 e PARK, 2002). O maior número de casos
esporádicos ocorre, usualmente, por contaminação cruzada durante a manipulação
de carne de frango crua ou pelo consumo da carne mal cozida (KEENER, 2004).
Pezzotti et al. (2003) verificaram a ocorrência de C. jejuni biotipo 1 entre as
177 linhagens de Campylobacter isoladas de pacientes de hospitais de Pádua,
Verona e Pordenone, no nordeste da Itália. Esse mesmo biotipo havia sido isolado
em 50% das 155 amostras de carne de frango analisadas na mesma região, o que
14
reforça a hipótese de que a carne de frango é um importante veículo de transmissão
deste patógeno aos humanos.
C. jejuni pode ser encontrado em bovinos, sendo a taxa de positividade nas
fezes maior no verão. Embora, as carcaças possam ser contaminadas com conteúdo
intestinal, isto não é comum e, quando ocorre, o nível de contaminação é baixo
(BUTZLER, 1984). A maioria dos surtos já descritos foi associada ao consumo de
leite cru, visto que Campylobacter não resiste à pasteurização. A mastite por
Campylobacter spp. pode ser a causa da contaminação, porém, é mais comum a
contaminação do leite por fezes, durante a ordenha dos animais em condições
precárias de higiene (FRANCO & LANDGRAF, 1996).
A água contaminada, apesar de pouco comum, pode ser considerada como
fonte direta ou indireta de contaminação, e está associada a surtos (BUTZLER,
1984). A contaminação cruzada de alimentos, especialmente saladas, é usual.
Os manipuladores de alimentos também podem ser fontes de contaminação.
Um estudo realizado em Florianópolis, Brasil, constatou que 6,2% dos
manipuladores assintomáticos analisados apresentavam o intestino colonizado com
Campylobacter, sendo que as espécies isoladas foram C. jejuni e C. coli (TOSIN &
MACHADO, 1995).
Campylobacter pode também ser transmitido aos humanos pelo contato com
animais contaminados, sendo esse tipo de transmissão mais comum em crianças
após o contato com filhotes infectados (BUTZLER, 1984).
O mecanismo pelo qual C. jejuni causa a doença ainda não está
suficientemente esclarecido. Resultados obtidos até o presente momento indicam
que sua patogenicidade é multifatorial. A adesão à mucosa intestinal é indispensável
e já foi comprovado que algumas cepas são capazes de produzir toxinas. Entre as
15
toxinas produzidas por C. jejuni destaca-se uma toxina termolábil, semelhante à
toxina colérica, e citotoxinas. Muitos pacientes apresentam sangue e muco nas
fezes, o que sugere um mecanismo invasivo do cólon. Em alguns casos, C. jejuni
penetra na mucosa intestinal, multiplicando-se na lâmina própria, tal como ocorre
com a Salmonella spp. e Yersinia enterocolitica (FRANCO & LANDGRAF, 1996).
Campylobacter jejuni coloniza a porção distal do íleo e do cólon do trato
intestinal humano. Após a colonização da mucosa e a aderência à superfície das
células intestinais, o microrganismo altera a capacidade absortiva normal dos
enterócitos do intestino, prejudicando a função das células epiteliais. A sobrevivência
dentro da célula hospedeira pode ser auxiliada pela produção de catalase que
protege contra o estresse oxidativo causado pelos lisossomos (FORSYTHE, 2002).
Thomé (2006) constatou que C. jejuni é capaz de produzir três citotoxinas
diferentes, testadas em células Vero (rim de macaco africano): CDT (Toxina de
Distensão Citoletal), que provoca o alongamento da célula levando à morte celular
em até 120 horas de ensaio, CLRT (Toxina Citoletal de Arredondamento), que
provoca arredondamento, levando à morte celular em até 120 horas de ensaio, e
uma citotoxina de 70-kDa, que provoca arredondamento levando à morte celular em
no máximo 48 horas de ensaio.
Em comparação a Salmonella, Campylobacter coloniza de maneira mais
persistente o trato gastrointestinal com tendência a colonizar o ceco com altas
contagens. A morfologia espiralada da célula e os flagelos polares facilitam a
penetração no muco. Além disso, as células são quimicamente atraídas pela mucina,
o principal componente do muco, apresentando, ainda, quimiotaxismo para a L-
fucose. Estes componentes podem ser utilizados como fonte de energia para a
multiplicação celular da bactéria (MEAD, 2004).
16
A infecção por C. jejuni ou C. coli pode causar vários sintomas clínicos, e a
susceptibilidade à doença depende do hospedeiro e da virulência do serovar
(FRANCO & LANDGRAF, 1996). C. jejuni tem sido reconhecido como agente
causador da diarréia dos viajantes (BUTZLER, 1984). A incidência de infecção é
maior em crianças com menos de 2 anos, sendo causa significante de desnutrição,
morbidade e mortalidade (MEAD, 2004).
A infecção pode manifestar-se de várias formas, sendo a enterocolite a mais
comum. O período de incubação varia de 2 a 5 dias, podendo estender por até 10
dias. A sintomatologia é clinicamente semelhante à causada por diversos patógenos
entéricos, ocorrendo diarréia acompanhada de febre baixa e dores abdominais.
Muitos episódios de diarréia são de curta duração e não complicados, não
requerendo tratamento específico (BUTZLER, 2004). Em alguns casos, a febre pode
ser alta e as fezes podem conter sangue, leucócitos e muco. Vômitos são raros. A
fase aguda da diarréia dura dois a três dias, mas as dores abdominais podem
persistir por até três semanas (FRANCO & LANDGRAF, 1996).
Em países em desenvolvimento a infecção tende a resultar em diarréia
aquosa e em países desenvolvidos normalmente ocorre enterite inflamatória aguda
(PARK, 2002).
Nos Estados Unidos, foram estimados 2,4 milhões de casos de infecção por
Campylobacter spp. por ano, afetando aproximadamente 1% da população, que
resulta em aproximadamente 13.000 hospitalizações e 124 mortes (MEAD, 2004). O
custo anual devido à infecção é estimado em 1,3 a 6,2 bilhões de dólares
(FORSYTHE, 2002).
A campilobacteriose também é a doença de origem alimentar mais comum na
Dinamarca, onde, foram registrados, em 2003, 3.542 casos, com 90% das infecções
17
sendo causadas por C. jejuni (MPG, 2005).
Apesar de a sintomatologia predominante ser diarréia, a campilobacteriose
pode resultar em seqüelas graves, tais como, Síndrome de Guillain-Barré (GBS) e
artrite reativa ou septicemia em indivíduos imunossuprimidos (MEAD, 2004).
A GBS afeta cerca de 2 a cada 100.000 pessoas e é, atualmente, a causa
mais comum de paralisia neuromuscular aguda no mundo. Em um estudo realizado
no Japão, 22 dos 159 pacientes (14%) com GBS haviam tido infecção por C. jejuni
(HUGHES, 2004). De um número estimado de 2.628 a 9.575 casos anuais de GBS
nos Estados Unidos, 526 a 3.830 estão associados a infecções prévias por
Campylobacter (FORSYTHE, 2002). Em outro estudo feito na França, 58 de 264
pacientes (22%) com GBS tiveram a doença após infecção por C. jejuni (SIVADON
et al., 2005).
O sorotipo O:19 é considerado o principal responsável por esta enfermidade
auto-imune, devido a um mecanismo chamado mimicria molecular, no qual o sistema
imunológico destrói a cobertura de mielina que envolve os nervos longos. O sintoma
mais freqüente é fraqueza precedida ou acompanhada por sensação de
formigamento. Pode progredir para a completa paralisia das pernas, braços e
músculos da respiração (YUKI, 1997). Os casos de GBS devido à campilobacteriose
podem requerer tratamento hospitalar intensivo e o paciente pode ficar debilitado por
um longo período (MEAD, 2004).
Em geral, as penicilinas são moderadamente ativas contra Campylobacter. C.
jejuni é resistente à cloxaciclina e a flucloxaciclina apresenta pouca atividade, assim
como, as cefalosporinas. A ampicilina é a mais ativa das penicilinas e, juntamente
com a amoxicilina, apresenta boa atividade bactericida contra C. jejuni. Os
aminoglicosídeos são os antibióticos mais ativos, sendo a gentamicina o mais
18
potente. As tetraciclinas são geralmente eficientes e a maioria dos serovares são
inibidos por menos de 1 µg de tetraciclina por ml. Porém, a resistência à tetraciclina
é relativamente alta na América do Norte e na Europa. Em geral, a eritromicina é o
medicamento mais efetivo e usualmente recomendado no tratamento de enterites
humanas causadas por C. jejuni. No entanto, em alguns países a ocorrência de
serovares resistentes a este antibiótico pode variar. Por exemplo, no Canadá a
resistência de C. jejuni à eritromicina é de aproximadamente 1%; já na Suíça a
percentagem sobe para 10% (BUTZLER, 1984).
Órgãos de saúde pública associam o aumento da incidência de serovares
resistentes de Campylobacter aos antimicrobianos usados na medicina veterinária. A
emergência de resistência é particularmente marcante em relação ao grupo das
fluoroquinolonas. O uso de antibióticos na produção de animais pode promover a
seleção de serovares resistentes que podem infectar o homem através da cadeia
alimentar. Além da significância deste fato para a saúde pública, a rápida
emergência de linhagens resistentes é um indicador da capacidade de adaptação de
Campylobacter a condições adversas (MEAD, 2004).
Atualmente, tem-se discutido o uso de fluoroquinolonas em animais de
produção e o aumento da resistência bacteriana a esse grupo de antibióticos,
também utilizado no tratamento de doenças humanas. Neste sentido, o FDA
conduziu um processo de análise de risco, concluindo que o uso veterinário de
enrofloxacina e sarafloxacina deveria ser suspenso. O uso da eritromicina é indicado
como a primeira escolha para o tratamento de infecções causadas por C. jejuni em
animais de produção (SPINOSA et al., 2002).
Todos os alimentos oriundos de animais contaminados por Campylobacter
são considerados veículos potenciais de transmissão. Partindo-se dessa premissa,
19
os cuidados higiênicos e tecnológicos durante a evisceração destes animais são
sumamente importantes. É provável que o controle da campilobacteriose humana
melhore com o domínio da infecção dos animais que servem de alimento e com a
prevenção da contaminação de produtos alimentícios de origem animal (PARDI et
al., 1995). Além disso, o cozimento adequado dos alimentos potencialmente
contaminados (por exemplo, o frango) e a pasteurização do leite e de produtos
lácteos são essenciais para a prevenção da campilobacteriose (STROHL et al.,
2004).
2.3 Contaminação de Frango por Campylobacter
As percentagens de lotes de frango colonizados com Campylobacter variam
muito entre países e esta variação pode ser devido às diferentes técnicas de
amostragem e isolamento (JORGENSEN et al., 2000; MEAD, 2003; NEWELL,
2004).
Nos Estados Unidos, estudos têm mostrado que 60 a 80% das carcaças de
frango estão contaminadas com Campylobacter, com contagens variando de 10.000
a 100.000 microrganismos por carcaça (KENNER, 2004).
Nierop et al. (2005) na África do Sul avaliaram 99 amostras de frango frescas
e congeladas, e encontraram 32,3% contaminadas com Campylobacter.
Estudo feito no nordeste da Itália, durante os anos de 2000 e 2001, detectou
Campylobacter spp. em 81,3% das 155 amostras de carne de frango, 1,3% das 151
amostras de carne bovina e 10,3% das 175 amostras de carne suína analisadas
(PEZZOTTI et al., 2003).
20
Paulsen et al. (2005) analisaram 461 amostras de carne de aves, suína e
bovina e seus derivados adquiridas em supermercados e lojas de conveniências na
Áustria, e isolaram Campylobacter spp. em 18,44% do total das amostras
analisadas, porém não isolaram Campylobacter spp. em produtos de frango
processados termicamente.
A ocorrência de espécies termotolerante de Campylobacter em 200 amostras
de frango foi de 44,5% em um estudo realizado no Perú, sendo C. jejuni a espécie
mais isolada, correspondendo a 21,5% das amostras, seguida da C. coli (14%) e C.
lari (9%) (TRESIERRA-AYALA et al., 1995). Em um trabalho realizado no sul do
Chile 25,7% das 300 amostras analisadas estavam contaminadas com
Campylobacter, sendo que 76,6% corresponderam a C. jejuni e 23,4% a C. coli
(FERNANDEZ & TORRES, 2000).
Um estudo feito no Brasil avaliou a presença de C. jejuni em 48 amostras de
diversos produtos derivados de carne bovina, suína, frango, pato, ovos e leite
obtidos em estabelecimentos comerciais da região de São Gonçalo, Rio de Janeiro.
Foi isolado C. jejuni em 64,8% do total das amostras analisadas, sendo que 100%
das amostras de coxa e fígado resfriadas de frango estavam contaminadas. Não
houve isolamento nas amostras de carne suína congelada, fígado bovino resfriado,
leite de cabra e queijo frescal (GONÇALVES & FRANCO, 2002). Outro estudo feito
na região de São Paulo, Brasil, detectou 47% das amostras de frango resfriadas
contaminadas por Campylobacter (MODOLO et al., 2005). Franchin et al. (2005)
detectaram Campylobacter termofílico em 91,7% dos lotes de frango avaliados na
região sul do Brasil, sendo que as principais fontes de contaminação foram as penas
(79,2%) e a cloaca (75%).
21
2.4 Transmissão de Campylobacter na Cadeia de Produção de Frango
Muitos esforços têm sido feitos no sentido de diminuir a presença de
Campylobacter na carne de frango, porém, o resultado obtido tem sido limitado, pois
são poucas as informações conclusivas de como esse microrganismo contamina os
lotes comerciais de frango (COX et al., 2002). Além disso, ainda não existem
métodos efetivos de controle de Campylobacter nas granjas (KENNER, 2004).
Segundo NEWEL & FEARNLEY (2003), algumas das estratégias utilizadas
para o controle da contaminação por Salmonella não tiveram efeito sob C. jejuni. Isto
pode ser considerado como um reflexo das diferenças na fisiologia, epidemiologia e
ecologia desses microrganismos.
A transmissão vertical de Campylobacter nos lotes de frango através do ovo
contaminado gera muitas controvérsias. Algumas pesquisas demonstraram que
Campylobacter pode passar da matriz para o ovo fértil através da colonização do
oviduto ou pela contaminação da casca do ovo com fezes. Esta transferência pode
ser considerada uma fonte significativa de contaminação dos lotes de frango de
corte (COX et al., 2002).
A colonização por Campylobacter está associada a muitos fatores, entre eles,
a idade do frango. O frango comercial normalmente é colonizado entre 2 e 4
semanas de idade. Na Europa, Campylobacter não é detectado nos lotes até 10 dias
de idade. No entanto, uma vez colonizado, a transmissão de ave para ave dentro do
lote ocorre rapidamente, e a maioria das aves será colonizada em poucos dias
(EVANS & SAYERS, 2000). A localização geográfica e as condições climáticas têm
forte influência nos índices de colonização, sendo, geralmente, mais altos no verão
do que no inverno (NEWELL & FEARNLEY, 2003).
22
A transmissão horizontal (ambiental) é a rota mais comum de contaminação
(MEAD, 2004) e muitas estratégias de intervenção em granjas têm sido propostas.
Em geral, o objetivo é modificar as condições ambientais, prevenindo e/ou reduzindo
a extensão da colonização. Outras estratégias incluem vacinação, tratamento com
probióticos e resistência genética (NEWEL, 2004). O uso de prebióticos estimula a
multiplicação de bactérias benéficas presentes no trato intestinal, especialmente no
cólon. A associação de frutoligossacarídeos e mananoligossacarídeos com produtos
de exclusão competitiva oferece maior proteção contra a colonização por
Campylobacter spp. (SPINOSA et al., 2002).
Fontes potenciais de contaminação das aves são os roedores, aves silvestres
e insetos que tenham acesso à granja, além de visitantes. Campylobacter spp. é
eliminado pelos processos normais de tratamento de água, porém, quando se utiliza
água não tratada esta pode ser um potencial veículo de contaminação. C. jejuni
pode permanecer viável em água de mina mantida a 4 ºC por até 4 semanas e pode
ser isolada nos biofilmes que se formam no sistema de distribuição de água das
granjas (MEAD, 2004). A ração não tem sido considerada um veículo de
contaminação, pois a baixa umidade é uma condição desfavorável para a
sobrevivência de Campylobacter (BRYAN & DOYLE, 1995).
As práticas de manejo têm forte influência no índice de contaminação dos
lotes de frango. Muitos fatores de risco já foram identificados e os procedimentos de
biossegurança devem ser cumpridos para manter a negatividade do lote. Os
cuidados na granja incluem a manutenção dos galpões (para evitar a entrada de
roedores), limpeza, desinfecção e período de carência entre lotes. Além disso, é
importante evitar a construção de granjas muito próximas umas das outras e utilizar
23
barreiras sanitárias, como lavar as mãos, desinfetar os calçados e trocar as roupas
para entrar nas granjas (NEWELL & FAERNLEY, 2003).
As aves podem excretar Campylobacter spp. durante o apanhe e transporte,
devido ao estresse (KEENER, 2004). As gaiolas de transporte podem ser fontes de
contaminação cruzada entre os lotes. Franchin et al. (2005) encontraram 50% das
gaiolas de transporte e 25% das amostras de água de lavagem destas gaiolas
contaminadas por Campylobacter.
Quando lotes negativos são transportados em caixas previamente utilizadas
no transporte de lotes positivos para Campylobacter, a contaminação de aves não
colonizadas pode aumentar em mais de 50%, o que demonstra que as fezes
excretadas durante o transporte resultam em importante fonte de contaminação
cruzada entre as aves (BERRANG et al., 2003). Uma vez que as carcaças são
contaminadas, Campylobacter dificilmente será eliminado durante o processo de
abate (KENNER, 2004).
O controle de microrganismos que contaminam a carne fresca inicia-se com
medidas básicas de higiene, iniciando-se nos cuidados ante mortem dos animais.
Estes devem estar descansados, submetidos à dieta hídrica e em condições de
mínimo estresse (PARDI et al., 1995).
As operações de abate incluem a sangria, escaldagem a 60 °C por 90
segundos, depenagem, remoção dos pés, evisceração e resfriamento em água
tratada (MIWA et al., 2003).
A contaminação durante o abate ocorre diretamente, via conteúdo intestinal
ou, indiretamente, de ave para ave, via contato com equipamentos ou água. A
bactéria adere à superfície da pele, formando um biofilme, que dificulta sua remoção
(ALTER et al. 2005).
24
Um estudo feito em um matadouro de aves no Japão avaliou a contaminação
entre diferentes lotes de frango durante a depenagem e evisceração. Foi observado
o isolamento de Campylobacter em todas as aves abatidas após o processamento
de um lote contaminado, o que sugere a fácil disseminação de Campylobacter entre
lotes (MIWA et al., 2003).
O nível de contaminação por Campylobacter em carcaças normalmente
diminui na escaldagem, mas aumenta significativamente (cerca de 3,7 Log
10
) após a
depenagem (BERRANG & DICKENS, 2000). Se o intestino for rompido durante a
evisceração a contaminação da pele pode chegar a 10
6
UFC/g (KEENER, 2004).
Um estudo feito em uma linha de abate de perus na Alemanha mostrou que o
nível de amostras positivas para C. jejuni no início do abate era de 76,7%. Este nível
diminuiu significativamente para 37,2% após a escaldagem, porém, o nível de
amostras positivas durante a depenagem subiu para 58,1% e na evisceração para
72,1%, indicando uma recontaminação das carcaças (ALTER et al., 2005).
O aumento na contaminação superficial das carcaças após a evisceração se
deve à ruptura das vísceras e exposição do conteúdo fecal. A ruptura das vísceras
durante a evisceração não é incomum, uma vez que a maioria das plantas
processadoras utiliza a evisceração mecânica, que não é ajustada para os diferentes
tamanhos de carcaça (ROSENQUIST et al., 2006).
Durante a depenagem ocorre a exposição dos folículos penosos, e
Campylobacter pode penetrar nestas aberturas, que promovem um microambiente
protetor contra a dessecação, oxigênio e outras formas de estresse (DUFRENNE et
al., 2001, BHADURI & COTTRELL, 2004). A escaldagem, depenagem e evisceração
são as operações que levam à maior disseminação de microrganismos entre as
carcaças durante o processo de abate (BRYAN & DOYLE, 1995).
25
Uma vez que a pele do frango pode promover um microambiente protetor,
Campylobacter pode se multiplicar nesta quando as condições são favoráveis, como
a exposição da carcaça à temperatura ambiente, tornando-se um potencial problema
de saúde pública (LEE et al., 1998).
O método de resfriamento por imersão em água gelada (chiller) é muito
utilizado por permitir uma redução rápida da temperatura das carcaças. Porém, o
resfriamento da carcaça por imersão em água tratada pode ser uma etapa potencial
de contaminação cruzada, dependendo do pH da água, da renovação de água e do
teor de cloro livre. O resfriamento por ar possibilita uma menor disseminação de
Campylobacter entre as carcaças do que o resfriamento em água, no entanto, este
método é pouco utilizado devido à desidratação da superfície da carcaça (KEENER,
2004).
Rosenquist et al. (2006) detectaram uma redução significativa nas contagens
de Campylobacter após o resfriamento, tanto no resfriamento por imersão quanto no
resfriamento por ar (0,83 e 0,97 Log
10
UFC/g respectivamente).
Vários métodos têm sido avaliados para reduzir a carga microbiana e,
consequentemente, a contaminação cruzada entre as carcaças, entre eles, enxágüe
das carcaças antes da entrada no chiller, adição contínua de água limpa no chiller
em contra-corrente com as carcaças, adição e renovação de cloro ou outros agentes
antimicrobianos na água do chiller (SMITH et al., 2005).
A água do chiller deve conter até 5 ppm de cloro residual de acordo com a
Portaria nº 210 do Ministério da Agricultura e do Abastecimento do Brasil (1998) para
as aves comercializadas no mercado interno; a temperatura das carcaças na saída
deve ser de, no máximo, 7 °C. Segundo Arrit et al. (2002) o aumento do cloro na
água de enxagüe para redução de Salmonella e Escherichia coli levou a um
26
pequeno efeito na redução da contaminação por Campylobacter. A água clorada só
é efetiva na redução da contaminação em pH 6 a 8 e quando a matéria orgânica
presente é mínima (KENNER, 2004).
A eficácia de outros agentes antimicrobianos contra C. jejuni tem sido testada.
Estudos comprovaram que a solução de cloreto de cetilperidina a 0,5%, bem como a
solução de fosfato trissódico (10%) com cloreto de sódio acidificado (0,1%),
aspergidas sobre a carcaça do frango, foram efetivas para inativação de C. jejuni
(ARRIT et al., 2002). Porém, como na Europa a descontaminação química foi
proibida a partir de 2006, haverá a necessidade de implantação de um
monitoramento efetivo sem o uso de substâncias antimicrobianas em todas as
etapas da cadeia de produção (MEAD, 2004).
Algumas linhagens de C. jejuni variam quanto à habilidade de resistir ao
estresse ambiental que ocorre durante o abate, como as temperaturas utilizadas na
escaldagem e no resfriamento. Alter et al. (2005) isolaram em aves uma grande
variedade de genótipos de C. jejuni no início do abate. Porém, somente alguns
subtipos estáveis geneticamente foram isolados após a escaldagem e alguns grupos
identificados após 24 horas de refrigeração. Estes resultados sugerem que o
processo de escaldagem e resfriamento selecionam uma população de C. jejuni
resistente ao estresse que pode sobreviver e permanecer na cadeia do alimento.
Práticas inadequadas de higiene e processamento por pessoas inabilitadas
na linha de produção podem provocar contaminação cruzada. Considerando-se que
uma grande percentagem das pessoas envolvidas na manipulação de alimentos
carece de conhecimentos relativos aos cuidados higiênico-sanitários que devem ser
seguidos antes e depois da manipulação dos alimentos, a manipulação inadequada
27
pode ser considerada um risco em potencial à saúde pública (TOSIN & MACHADO,
1995).
A implantação do sistema de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle
(APPCC) em plantas processadoras de frango monitora os pontos críticos de
contaminação por agentes microbianos não detectáveis pelos procedimentos
convencionais de inspeção da carne (Mead, 2004).
2.5 Efeito do Resfriamento e Congelamento na Sobrevivência de Campylobacter
A redução da temperatura prolonga a vida útil dos alimentos, devido ao
aumento no tempo de geração, retardando a multiplicação microbiana. A
refrigeração evita a multiplicação dos microrganismos termófilos, e de muitos
mesófilos. A diminuição da temperatura de um alimento abaixo do seu ponto de
congelamento faz com que parte da água que o alimento contém mude de estado,
formando cristais de gelo. A imobilização da água na forma de gelo e o aumento na
concentração de solutos reduzem a atividade de água (FELLOWS, 1994).
Define-se como carne refrigerada, aquela armazenada em temperaturas de 0
a 4 ºC. O prazo de vida comercial das carnes resfriadas varia em função das
condições técnicas de sua obtenção e das temperaturas em que são mantidas. Já
as carnes congeladas são aquelas mantidas em temperaturas abaixo do seu ponto
de congelação (-1,5 ºC). O congelamento é a forma de conservação, a longo prazo,
que menos deprecia o valor nutritivo e a qualidade sensorial da carne “in natura”. A
carne magra, contendo em torno de 75% de água inicia seu congelamento a
temperaturas inferiores a -1,5°C. A -5 °C, aproximadamente 75% da água cristaliza-
se, a -10 °C, cerca de 82%, a -20 °C, em torno de 85%, e a -30 °C,
28
aproximadamente 87%. Cerca de 12% da água total encontra-se de tal forma ligada
às proteínas que não se congela, ainda que a temperaturas muito baixas (PARDI et
al., 1995).
O efeito do resfriamento e do congelamento na sobrevivência de C. jejuni
ainda não foi bem elucidado. C. jejuni apresenta uma temperatura ótima de
multiplicação entre 37 a 42 °C e não cresce a temperaturas inferiores a 30 °C, porém
apresenta atividade biológica a 4 °C, e pode sobreviver na água por diversas
semanas a esta temperatura (BHADURI & COTTRELL, 2004; BAM, 2001).
Alguns estudos confirmam uma redução significativa na porcentagem de
carcaças positivas para C. jejuni após o congelamento (ALTER et al., 2005, STERN
et al., 1984). Diversos fatores, incluindo a nucleação do gelo e a desidratação, levam
à injúria do microrganismo, além do estresse oxidativo, que pode levar a morte da
célula, reduzindo significativamente a sobrevivência de Campylobacter ao
congelamento (PARK, 2002).
Georgsson et al. (2006) avaliaram a influência do congelamento e do tempo
de estocagem na incidência de Campylobacter em carne de frango. Esses autores
analisaram 90 carcaças provenientes de lotes positivos para Campylobacter e
armazenadas a -20 °C por 31, 73, 122 e 220 dias. Após 31 dias houve uma redução
significativa (p≤ 0,05) na contagem em comparação com a amostra analisada logo
após o abate. Após 73 dias esta contagem estabilizou, não havendo redução
significativa até o período final (220 dias).
Bhaduri & Cottrell (2004) avaliaram a sobrevivência de C. jejuni durante o
resfriamento a 4 °C e congelamento a -20 °C em amostras de frango irradiadas e
artificialmente contaminadas. A refrigeração causou um pequeno decréscimo nas
contagens somente após 3 e 7 dias, indicando que esta bactéria pode sobreviver ao
29
período de estocagem utilizado durante a comercialização de carnes resfriadas. As
amostras congeladas apresentaram um declínio significativo na contagem de C.
jejuni, porém, células viáveis foram detectadas após 14 dias de estocagem.
Estudo feito no País de Gales, entre março e dezembro de 2003, mostrou que
o congelamento não prejudicou a recuperação de Campylobacter nas amostras de
carne de frango analisadas. Neste estudo 73,5% das 544 amostras de carne de
frango fresca e 71,9% das 192 amostras congeladas analisadas estavam
contaminadas com Campylobacter (MELDRUM, 2005).
Em 2000, a Islândia decidiu empregar o congelamento da carne de frango
como uma estratégia para reduzir a exposição humana a Campylobacter. Em 2001,
a Noruega adotou a mesma estratégia (GEORGSSON et al., 2006). No entanto,
recentes estudos mostraram que não existe diferença significativa na taxa de
positividade em amostras de carne de frango frescas e congeladas (MELDRUM et
al., 2005; NIEROP et al., 2005), indicando que uma porção significativa de C. jejuni
sobrevive ao resfriamento, congelamento e armazenagem combinada de
resfriamento e congelamento. Esses resultados alertam que estes tratamentos
sozinhos não garantem a segurança do alimento, com respeito a este microrganismo
(BHADURI & COTTRELL, 2004).
Muitos produtos alimentícios são acondicionados em embalagens com
atmosferas modificadas e armazenados em baixas temperaturas para reduzir ou
prevenir a multiplicação de microrganismos deteriorantes e estender a vida útil do
produto. A sobrevivência de C. jejuni em amostras de pele de frango artificialmente
contaminadas embaladas em atmosfera de dióxido de carbono foi maior em
amostras congeladas a -70 ºC do que a -20 ºC (LEE et al., 1998).
30
Dykes & Moorhead (2001) avaliaram a influência da embalagem a vácuo e em
atmosfera modificada (100% CO
2
) na sobrevivência de C. jejuni em amostras de
carne bovina artificialmente contaminadas, armazenadas por 41 dias a -1,5 °C.
Verificaram que não houve redução significativa na incidência de C. jejuni nas
amostras, indicando a habilidade deste microrganismo em sobreviver às diferentes
condições de ambiente.
2.6 Detecção de Campylobacter
A dificuldade de isolamento de Campylobacter diminuiu após a publicação do
método de cultivo padronizado por Butzler e colaboradores, em 1973. A maior
facilidade de isolamento mostrou a alta ocorrência de Campylobacter como causa de
diarréias humanas. O trabalho de Skirow, publicado em 1977, foi de grande
contribuição para tornar a infecção por Campylobacter mundialmente conhecida
(THOMÉ, 2006).
A detecção rápida de Campylobacter é comprometida pela baixa velocidade
de multiplicação e pela dificuldade de identificação das espécies. Os métodos
convencionais para isolamento de Campylobacter em alimentos requerem 4 dias
para fornecer um resultado negativo e de 6 a 7 dias para confirmar um resultado
positivo (OLIVEIRA et al., 2005).
Não existe um consenso quanto ao melhor método de isolamento. Diferentes
métodos são usados, sendo importante avaliar se a técnica a ser utilizada é
adequada ao tipo de alimento a ser examinado (MOORE, 2001). O sucesso da
detecção de Campylobacter em alimentos, geralmente depende do enriquecimento
31
seletivo em condições microaerófilas à temperatura de 42 ºC (BOLTON &
ROBERTSON, 1982).
Os resultados das análises microbiológicas feitas em frango variam
consideravelmente, devido ao número de aves avaliadas por lote (variação estatística);
diferentes procedimentos de amostragem (25g de carne com ou sem pele, enxágüe de
carcaça, etc.) e pelos diferentes métodos analíticos utilizados (pré-enriquecimento,
enriquecimento, variações no tempo e temperatura de incubação, etc.) (BRYAN &
DOYLE, 1995).
Todo o meio de cultura disponível para pesquisa de Campylobacter contém
peptonas e antibióticos, alguns contêm sangue, e outros incluem agentes quelantes
dos derivados tóxicos do oxigênio (peróxido de hidrogênio e superóxidos)
(DONNISON, 2003).
A detecção de Campylobacter em alimentos deve levar em consideração que
a população presente pode ser baixa, devido ao fato de Campylobacter ser sensível
a concentração de oxigênio do ar (21%) e não crescer a temperaturas abaixo de
30°C, utilizadas normalmente na conservação dos alimentos. O sucesso da
detecção, geralmente, depende da análise de um grande número de amostras,
concentração de células presentes e enriquecimento seletivo em condições
microaerófilas à temperatura de 42 ºC. A manutenção de condições seletivas, tanto
no enriquecimento quanto no plaqueamento subseqüente, é garantida pela utilização
de meios nutritivos suplementados com sangue de cavalo ou carneiro e diferentes
antibióticos, tais como, vancomicina, polimixina, cicloheximida, trimetroprim,
rifampicina, cefoperazona, anfotericina, cefalotina, colistina, cefazolina, novobiocina
e bacitracina. A utilização de meios adicionados de carvão ativado em substituição
ao sangue é comum, além da adição de agentes redutores, como o sulfato ferroso,
32
metabissulfito de sódio e piruvato de sódio, na concentração de 0,025% cada
(SILVA et al., 1997).
Os antibióticos mais utilizados no isolamento de Campylobacter são:
vancomicina (inibe cocos Gram-positivos); polimixina B (inibe Enterobacteriaceae e
Pseudomonas spp.); trimetoprim (inibe Proteus spp. e cocos Gram-positivos) e
cefalosporinas (inibem Enterobacter spp., Serratia spp., Pseudomonas aeruginosa,
alguns Proteus spp., Yersinia enterocolitica) (DONNISON, 2003).
Line (2001) avaliou diferentes formulações de antibióticos para a recuperação
de Campylobacter, os melhores resultados foram obtidos com a combinação de
cefoperazona, cicloheximida, vancomicina, trimetoprim e polimixina B. Esse mesmo
autor também comprovou que a adição de 200 mg/l de cloreto de trifeniltetrazólio
(TTC) facilita a visualização e contagem das colônias.
O pré-enriquecimento com incubação a 37°C por 4 horas permite a
recuperação das células de Campylobacter injuriadas pela desidratação,
aquecimento, falta de nutrientes, congelamento ou exposição a radicais de oxigênio.
Portanto, a incubação a 37 °C por 4 horas é recomendada antes da incubação a
42°C por mais 24 a 44 h. Ultrapassar 4 h de pré-enriquecimento pode favorecer a
multiplicação da microbiota contaminate (DONNISON, 2003).
Vários métodos têm sido reportados na literatura para a análise de
Campylobacter. Os meios de enriquecimento descritos com maior freqüência são:
caldo Preston, caldo Exeter, caldo Bolton, caldo CEB e caldo Park & Sanders. Os
ágares seletivos mais comumente utilizados são: Skirrow, Campy-Cefex, Butzler,
Preston e Exeter (todos com inclusão de sangue), mCCDA (modified charcoal
cefoperazone, deoxycholate agar) e Karmali (sem inclusão de sangue) (DONNISON,
2003). O caldo Preston, seletivo para isolamento de C. jejuni e C. coli, proposto por
33
Bolton e Robertson em 1982, têm sido muito utilizado por ser mais seletivo que o
meio de Skirrow no isolamento de Campylobacter de diferentes origens.
Um dos meios de enriquecimento mais utilizados é o caldo Bolton, que pode
ser usado com sucesso sem sangue, e contém sulfato ferroso, metabissulfito de
sódio e piruvato de sódio (PAULSEN et al., 2005). Estes compostos suplementares
aumentam a tolerância do Campylobacter ao oxigênio extinguindo ânions
superóxidos e peróxido de hidrogênio que ocorrem espontaneamente no meio de
cultura. O sulfato ferroso, piruvato de sódio e o metabissulfito de sódio agem
destruindo o radical superóxido (GONÇALVES & FRANCO, 2002)
O caldo Bolton é recomendado pelo FDA (Food and Drug Administration) dos
Estados Unidos no BAM (Bacteriological Analytical Manual, 2001) para recuperar
Campylobacter em diferentes tipos de alimentos, associado ao pré-enriquecimento
por 4 h a 37 °C e ao enriquecimento seletivo a 42 °C por 20 - 44 h em condições
microaerófilas, seguido de estriamento em ágar seletivo.
Paulsen et al. (2005) compararam o caldo Preston e o caldo Bolton e
verificaram que o enriquecimento em caldo Bolton foi mais sensível e apresentou
uma percentagem de isolamento de Campylobacter significativamente maior que a
obtida após o enriquecimento em caldo Preston.
As colônias de Campylobacter nos diversos meios de plaqueamento
(CampyBap, CCDA, Skirrow ou Butzler) são semelhantes, podendo apresentar-se
lisas, convexas e brilhantes, com bordas perfeitas, ou planas, translúcidas e
lustrosas, com bordas irregulares e espalhadas. Geralmente são incolores,
levemente cremes ou acinzentadas, com dimensão variando de pontual a 4 a 5 mm.
Nos meios com sangue (Ágar de Blaser, Skirrow ou Butzler), não apresentam
hemólise (SILVA et al., 1997). Campylobacter reduz o cloreto de trifeniltetrazólio
34
(TTC) formando um complexo insolúvel magenta quando cresce em meios de cultura
contendo este sal (LUECHTEFELD & WANG, 1982; LINE, 2001).
Em amostras com uma elevada carga de microbiota competitiva os agentes
seletivos do meio de enriquecimento podem ser insuficientes para inibir a
multiplicação desta e comprometer a detecção de Campylobacter (DUFRENNE et
al., 2001). As colônias de microrganismos contaminantes geralmente são maiores e
apresentam-se úmidas, com aparência cerosa. O técnico precisa ser experiente para
distinguir as colônias de Campylobacter das contaminantes (LINE, 2001).
Um estudo feito por Jorgensen et al. (2002) mostrou não haver diferença
significativa entre os métodos de preparo de amostra utilizando-se 25 g de pele, 25
ml da solução de lavagem de pele ou combinando 17 ml da solução de lavagem com
8 g de pele em 225 ml de água peptonada tamponada seguida de agitação por 60
segundos em Stomacher. Este mesmo estudo demonstrou que Campylobacter spp.
foi isolado de 38% das 145 amostras analisadas por plaqueamento direto (sem
enriquecimento), porém o limite mínimo de detecção deste método foi de 500 UFC/g.
O BAM (2001) sugere que as colônias características de Campylobacter sejam
identificadas empregando a coloração de Gram, motilidade em contraste de fase e
confirmação pelas prova da catalase e oxidase. Somente C. jejuni apresenta atividade
hipuricase e hidrolisa o hipurato de sódio em ácido benzóico e glicina. A ninidrina é
usada como indicador da presença de glicina (LUECHTEFELD & WANG, 1982).
É muito importante lembrar que embora várias técnicas de isolamento de
Campylobacter tenham sido testadas e aprovadas, a exposição de Campylobacter a
condições adversas pode causar injúria sub-letal e isto pode inibir a multiplicação
subseqüente nos meios de isolamento empregados nos laboratórios. Condições
desfavoráveis induzem as células a mudar sua característica de morfologia vibrióide
35
para a forma cocóide (VNC – viáveis, mas não cultiváveis), que não podem ser
cultivadas, mesmo em meios seletivos. As células cocóides retêm algumas das suas
propriedades associadas à manutenção da viabilidade e virulência, mesmo com a
inibição de transcrição de DNA, e permanecem capazes de reduzir certos sais de
tetrazólio (MEAD, 2004). As células VNC representam um perigo potencial à saúde
pública e são de interesse considerável em microbiologia de alimentos, já que um
lote pode ser liberado devido à não detecção do patógeno, apesar da sua presença
(FORSYTHE, 2002).
Num panorama mais moderno, no que diz respeito à identificação de
bactérias do gênero Campylobacter, a técnica PCR (Polymerase Chain Reaction)
tornou-se muito difundida e bastante utilizada para o diagnóstico laboratorial de
Campylobacter spp., principalmente pelas vantagens que oferece, aliadas à alta
sensibilidade e especificidade, além da facilidade de sua execução (BUTZLER,
2004).
36
3 OBJETIVOS
3.1 Geral
Avaliar a contaminação por Campylobacter spp. em carcaças de frango obtidas em
um matadouro no interior do Paraná e verificar a ocorrência de C. jejuni após o
armazenamento sob refrigeração e congelamento. Este procedimento teve a
finalidade de avaliar a carne nas condições de venda ao consumidor, como também,
se o processo de conservação afeta a viabilidade das células.
3.2 Específicos
• Avaliar a eficiência da técnica de contagem de unidades formadoras de
colônias de Campylobacter spp. por plaqueamento direto em amostras
frescas, refrigeradas e congeladas.
• Verificar se o enriquecimento seletivo é capaz de recuperar as células de C.
jejuni injuriadas durante o armazenamento.
37
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Coleta e Preparo das Amostras
As carcaças de frango analisadas neste trabalho foram obtidas em um
matadouro de aves da região de Londrina, no interior do Paraná – Brasil, com
capacidade média de abate de 50.000 aves/dia. As aves abatidas são das linhagens
Cobb e Ross de ambos os sexos com idade média de 46 dias.
As coletas foram feitas no período de setembro a novembro de 2006,
sempre no turno matutino (8 às 11 h). As carcaças foram coletadas imediatamente
após a embalagem e analisadas em seguida (o tempo máximo entre as coletas das
amostras e início da análise foi de, aproximadamente, 1 hora).
De cada carcaça foram retiradas, assepticamente, 3 amostras de 25 g
compostas por porções de pele de diferentes partes (cloaca, pescoço, peito e coxa).
As amostras foram acondicionadas em sacos estéreis para Stomacher, sendo uma
porção analisada imediatamente, a segunda, mantida por 7 dias a temperatura de
refrigeração (4 °C) e, a terceira, armazenada por 28 dias em temperatura de
congelamento (-20 °C). Foram avaliadas 30 carcaças, totalizando 90 amostras.
Foram adicionados às amostras 225 ml de água peptonada tamponada
(Himedia Laboratories Put. Ltd. Mumbai, India) e agitadas em Stomacher 400 (Lab
System Ltd., USA) por 60 segundos em velocidade média (esquema do método de
análise de Campylobacter no anexo 01).
Como medida de controle do procedimento, a cada coleta, uma amostra de
25 g foi artificialmente contaminada com C. jejuni ATCC 33291 (Lote 03/04 – Instituto
38
Adolfo Lutz, São Paulo, Brasil), com a finalidade de avaliar se a metodologia estava
adequada para a recuperação de Campylobacter.
Para o preparo da suspensão, a cepa padrão de C. jejuni congelada a -80 °C
em caldo BHI com 15% de glicerol foi ressuspendida em caldo Bolton (Merck,
Darmstadt, Germany) e incubada por 24 h a 42 °C em microaerofilia. A partir dessa
suspensão foram realizadas diluições decimais até 10
-6
. Alíquotas de 0,1 ml desta
diluição, que corresponde a aproximadamente 100 UFC/ml, foram inoculadas em 25
g de amostra.
4.2 Contagem de Campylobacter spp. Termotolerante antes do Enriquecimento
Seletivo (Plaqueamento direto)
As amostras analisadas por plaqueamento direto foram inoculadas em ágar
Bolton modificado segundo Franchin et al. (2005), preparado a partir de caldo Bolton
(Merck) adicionado de 1,5% de ágar-ágar (Himedia Laboratories Put. Ltd., Mumbai,
India), 0,5g/litro de sulfato ferroso (J. T. Baker, Germany), 200 ppm de solução de
2,3,5 cloreto trifeniltetrazolium (TTC) (Sigma, USA) e Suplemento SR183E (Oxoid Ltd.,
Hampshire, England) (cefoperazone, 10mg/500 ml; vancomicina, 10 mg/500 ml;
trimetropim, 10mg/500 ml e anfotericina B, 5mg/500 ml). Para tanto, inoculou-se 0,2
ml da amostra diluída em água peptonada tamponada na superfície do Ágar Bolton
Modificado.
O período de incubação foi de quatro horas a 37 °C em estufa bacteriológica
(Fanem Ltda., São Paulo, Brasil) seguido de 44 horas a 42 °C em estufa BOD (Biologic
Oxigen Demand) (Tecnal Equipamentos para Laboratórios Ltda., São Paulo, Brasil),
sob condições de microaerofilia (5% O
2
, 10% CO
2
e 85% N
2
) empregando sistema
39
Microaerobac (Probac do Brasil). Foram utilizadas jarras para anaerobiose de 3,5L
(Permution, Paraná, Brasil).
As colônias características (cor magenta, pequenas, lisas, convexas e
brilhantes, com bordas perfeitas) crescidas no plaqueamento direto em ágar Bolton
modificado e confirmadas pela identificação bioquímica foram contadas. O número de
unidades formadoras de colônias por grama foi calculado multiplicando o número de
colônias pelo inverso da diluição e pelo volume inoculado (0,2 ml). O resultado final
representa a contaminação por Campylobacter spp. termotolerante / g.
4.3 Pesquisa de C. jejuni Após o Enriquecimento Seletivo
Alíquotas de 5 ml da amostra homogeneizada em água peptonada tamponada
foram enriquecidas em 45 ml de caldo Bolton (Merck) e suplemento SR183E Oxoid
(cefoperazone, 10mg/500 ml; vancomicina, 10 mg/500 ml; trimetropim, 10mg/500 ml e
anfotericina B, 5mg/500 ml). O período de pré-enriquecimento foi de quatro horas a 37
°C seguido do enriquecimento de 44 horas a 42 °C, sob condições de microaerofilia
(5% O
2
, 10% CO
2
e 85% N
2
) empregando sistema Microaerobac (Probac do Brasil).
Após o enriquecimento seletivo as amostras foram estriadas com alça
bacteriológica em ágar Bolton modificado. As placas foram incubadas a 42 °C por 24
horas sob condições microaerófilas (5% O
2
, 10% CO
2
e 85% N
2
).
As colônias características obtidas após enriquecimento seletivo seguida do
plaqueamento diferencial em ágar Bolton modificado e confirmadas pela prova de
hidrólise do hipurato foram consideradas positivas para C. jejuni em 0,5 g
(enriquecimento de 5 ml da diluição 10
-1
).
40
4.4 Identificação Bioquímica
Colônias características de Campylobacter (cor magenta, lisas, convexas e
brilhantes, com bordas perfeitas, ou planas, translúcidas e lustrosas, com bordas
irregulares e espalhadas) foram confirmadas pela morfologia ao Gram (Microscópio
Olympus Optical CO. Ltd. CH2, Japan), movimento característico em microscópio
biológico binocular com contraste de fase (Bioval, Model L2000A) (aumento de 1000 x)
e pelo teste de catalase.
A identificação de C. jejuni nas colônias características isoladas após o
enriquecimento foi confirmada empregando-se a hidrólise do hipurato. Para tanto, as
colônias características foram repicadas em Columbia ágar base (Himedia
Laboratories Put. Ltd., Mumbai, India) com 7% de sangue de carneiro e incubadas por
24 h a 42 °C em microaerofilia, a fim de aumentar o inóculo da colônia.
4.4.1 Hidrólise do Hipurato
Solução de hipurato de sódio (1%) foi esterilizada em membrana com 0,2 µm de
porosidade (Millipore Products Division, Bedford, USA). Dois mililitros foram
transferidos para tubos de ensaio (12 x 100 mm) e estocados sob congelamento a -20
°C. No momento do uso, descongelou-se a solução de hipurato de sódio e transferiu-
se uma alçada com inóculo pesado das colônias suspeitas repicadas em ágar sangue,
homogeneizando bem. Após a inoculação os tubos foram incubados em estufa (Fanem
Ltda.) a 37 °C por 2 h. Em seguida, adicionou-se cuidadosamente 0,2 ml de solução
ninidrina (3,5% ninidrina em solução 1:1 butanol-acetona). Os tubos foram mantidos
sem agitação por 10 min a 37 °C. O desenvolvimento de uma coloração violeta escura
41
indica resultado positivo para C. jejuni; caso a suspensão permaneça incolor ou
ligeiramente púrpura indica teste negativo. As cepas de C. jejuni hidrolisam o hipurato,
enquanto C. coli e C. lari não hidrolisam (SILVA et al., 1997).
4.4.2 Teste da Catalase
Para a realização do teste, transferiu-se uma alçada de colônias do meio de
agar Bolton para uma gota de peróxido de hidrogênio 3%, em uma lâmina de
microscopia e observou-se a formação de um borbulhamento imediato (teste positivo).
4.5 Análise Estatística
Os resultados obtidos para contagem de unidades formadoras de colônias
(variável dependente) de Campylobacter spp. termotolerante para as diferentes
condições de armazenamento – amostra fresca, refrigerada e congelada – foram
transformados logaritmicamente na base 10, somando-se 1 (um) para que fosse
possível a avaliação de valores de contagem zero, obtendo-se a seguinte expressão:
Log
10
(n+1). Posteriormente foi aplicado o Teste de Shapiro-Wilk (Programa Statistica,
versão 6) sobre o grupo de valores transformados, objetivando a verificação de
adequação à normalidade (SHAPIRO, 1968).
Como as distribuições de freqüência não se adequaram à curva normal de
Gauss, utilizou-se para a comparação, os Testes Não-Paramétricos Kolmogorov-
Smirnov (KOLMOGOROV, 1941; SMIRNOV, 1939 e 1948) e de Mann-Whitney (MANN
e WHITNEY, 1947).
42
Os resultados de ocorrência de C. jejuni nos diferentes pontos foram
comparados entre si pelo teste epidemiológico de Caso-Controle por Qui-Quadrado
(FISCHER, 1934), com 95% de confiabilidade.
43
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados das análises de contagem de Campylobacter spp.
termotolerantes por plaqueamento direto e pesquisa de C. jejuni após o
enriquecimento seletivo nas amostras de carne de frango fresca (analisada 1 h após a
embalagem), refrigerada a 4 °C por 7 dias e congelada a – 20 °C por 28 dias estão
apresentados na tabela 01.
As amostras 5 e 6 apresentaram contagem de Campylobacter spp. por
plaqueamento direto somente nas amostras frescas, porém, após o enriquecimento foi
confirmada a presença de C. jejuni tanto nas amostras frescas quanto nas refrigeradas
e nas congeladas. Fato semelhante aconteceu nas amostras 9 e 12 refrigeradas e nas
amostras 15 e 28 congeladas, onde a presença de C. jejuni só foi detectada após o
enriquecimento.
A liberação de amostras falso-negativas (não detectadas na análise, porém
contaminadas) para comercialização representa um perigo potencial à saúde, uma vez
que um lote de alimento pode ser liberado devido à não detecção de patógenos.
As amostras contaminadas artificialmente (identificadas na tabela como C.A.)
foram utilizadas como medida de controle do procedimento. A cepa foi recuperada
após todas as etapas, indicando que as condições da análise foram adequadas para
recuperação de Campylobacter.
44
Tabela 01: Resultados das análises de contagem de Campylobacter spp.
termotolerantes por plaqueamento direto e pesquisa de C. jejuni após o
enriquecimento seletivo em amostras de carne de frango fresca (analisada 1 h após a
embalagem), refrigerada a 4 °C por 7 dias e congelada a – 20 °C por 28 dias.
Amostras Frescas Amostras Refrigeradas Amostras Congeladas
Amos
tra
Campylobacter
spp.
(Log
10
UFC/g)
Pesquisa
C. jejuni
Campylobacter
spp.
(Log
10
UFC/g)
Pesquisa
C. jejuni
Campylobacter
spp.
(Log
10
UFC/g)
Pesquisa
C. jejuni
1 0,00 Negativo 0,00 Negativo 0,00 Negativo
2 3,50 Positivo 0,00 Negativo 0,00 Positivo
3 0,00 Negativo 0,00 Negativo 0,00 Negativo
4 3,40 Negativo 0,00 Negativo 0,00 Negativo
5 3,30 Positivo 0,00 Positivo 0,00 Positivo
6 3,00 Positivo 0,00 Positivo 0,00 Positivo
7 2,30 Positivo 0,00 Negativo 1,71 Negativo
8 2,90 Negativo 0,00 Negativo 0,00 Negativo
9 2,80 Negativo 0,00 Positivo 1,71 Positivo
10 2,80 Positivo 0,00 Negativo 0,00 Negativo
11 3,10 Positivo 0,00 Negativo 0,00 Negativo
12 3,90 Positivo 0,00 Positivo 0,00 Negativo
13 3,60 Positivo 2,00 Positivo 2,18 Positivo
14 3,00 Positivo 1,71 Positivo 0,00 Negativo
15 3,10 Positivo 1,71 Positivo 0,00 Positivo
16 3,50 Positivo 2,55 Positivo 2,30 Positivo
17 3,00 Negativo 2,18 Negativo 0,00 Negativo
18 3,10 Negativo 2,40 Negativo 0,00 Negativo
19 3,20 Negativo 2,30 Negativo 2,00 Negativo
20 4,40 Negativo 0,00 Negativo 0,00 Negativo
21 4,00 Positivo 2,70 Positivo 1,71 Positivo
22 4,20 Negativo 1,71 Negativo 0,00 Negativo
23 3,70 Negativo 1,71 Negativo 0,00 Negativo
24 3,80 Negativo 0,00 Negativo 2,00 Negativo
25 3,20 Negativo 2,81 Negativo 1,71 Negativo
26 2,60 Positivo 1,71 Positivo 1,71 Positivo
27 3,50 Negativo 2,55 Negativo 2,18 Negativo
28 2,70 Positivo 2,30 Positivo 0,00 Positivo
29 3,30 Negativo 2,60 Negativo 0,00 Negativo
30 3,70 Positivo 2,65 Negativo 2,18 Negativo
C.A. 4,65 Positivo 2,54 Positivo 2,60 Positivo
C.A. 4,00 Positivo 3,38 Positivo 3,04 Positivo
C.A. 4,62 Positivo 3,50 Positivo 3,08 Positivo
C.A: Contaminação Artificial
45
A contagem média de Campylobacter spp. termotolerante em unidades
formadoras de colônias por grama (UFC/g), encontrada nas amostras de frango
analisadas após o plaqueamento direto, estão apresentadas na Tabela 02.
Tabela 02: Valores médios da contagem de Campylobacter spp. termotolerante por
grama de carne de frango após plaqueamento direto
Amostra
Número de amostras
positivas / número de
amostras avaliadas
Média Contage
m
Log
10
UFC/g
Contagem mínima
e máxima
Carne de Frango
Fresca
(1)
28/30
a
3,08
a
2,30 – 4,37
Carne de Frango
Refrigerada
(2)
16/30
b
1,19
b
1,71 – 2,81
Carne de Frango
Congelada
(3)
11/30
b
0,71
b
1,71 – 2,30
Fonte: Londrina, 2006
Letras diferentes na mesma coluna indicam que houve diferença significativa entre as amostras ao nível
de 95% de confiabilidade (P < 0,05)
(1)
Amostras analisadas 1 h após a embalagem da carcaça de frango
(2)
Amostras refrigeradas a 4 °C por 7 dias
(3)
Amostras congeladas a –20 °C por 28 dias
No presente trabalho, houve diferença significativa ao nível de 95% de
confiabilidade entre os resultados das contagens de UFC/g de Campylobacter spp.
termotolerante obtidas nas amostras frescas, quando comparadas com as refrigeradas
e congeladas. Esta redução pode ser explicada pela injúria que a mudança de
temperatura causa à célula, levando Campylobacter a assumir a forma VNC (viável,
mas não cultivável), a qual não pode ser recuperada pelos métodos usuais (PARK,
2002).
Campylobacter spp. termotolerante foi detectado em 28 (93,3%) das 30
amostras frescas, em 16 (53,3%) das 30 amostras refrigeradas e em 11 das 30
(36,67%) amostras congeladas analisadas no presente trabalho pela técnica de
plaqueamento direto.
46
A média da contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) de
Campylobacter spp. termotolerante por grama nas amostras refrigeradas foi de 3,08
Log
10
, sendo a contagem mínima de 2,30 Log
10
UFC/g e a máxima de 4,37 Log
10
UFC/g.
A média da contagem nas amostras refrigeradas foi de 1,19 Log
10
UFC/g, sendo
a contagem mínima de 1,71 Log
10
UFC/g e a máxima de 2,81 Log
10
UFC/g. Resultado
semelhante foi obtido por Rosenquist et al. (2006), que ao analisarem amostras de
diferentes lotes de frango refrigerado encontraram médias de contagens variando de
1,49 a 2,13 Log
10
UFC/g.
Contagens mais altas utilizando também o método de plaqueamento direto
foram encontradas por Jorgensen et al. (2002). Esses autores obtiveram contagens de
Campylobacter variando entre 3,77 a 5,63 Log
10
UFC / frango em 40% das 75
amostras de frango refrigeradas.
A redução na contagem por plaqueamento direto nas amostras refrigeradas foi
de aproximadamente 3,07 Log
10
UFC/g quando comparada com a contagem obtida
nas amostras frescas. Bhaduri & Cottrell (2004) encontraram, utilizando a mesma
técnica, uma redução de 0,63 Log
10
UFC/g em amostras de pele de frango
artificialmente contaminadas com Campylobacter e refrigeradas a 4 °C por 7 dias.
A contagem média das amostras congeladas foi de 0,71 Log
10
UFC/g, sendo a
contagem mínima obtida de 1,71 Log
10
UFC/g e a máxima de 2,30 Log
10
UFC/g. As
contagens foram significativamente menores que as obtidas nas amostras frescas.
Este resultado foi inferior ao obtido por Rosenquist et al. (2006) que encontraram 45
amostras positivas das 60 carcaças de frango analisadas (75%) após o congelamento
a -20 ºC, com contagens médias variando entre 1,10 e 1,96 Log
10
UFC/g.
47
A redução nas contagens das amostras congeladas quando comparadas com
as frescas foi de 3,08 Log
10
UFC/g. Este resultado foi superior ao de Bhaduri & Cottrell
(2002), que encontraram uma redução de 1,38 a 2,26 Log
10
UFC/g de Campylobacter
em amostras de pele de frango artificialmente congeladas e armazenadas por 14 dias
a -20 ºC. Stern et al., (1984) encontraram uma incidência de C. jejuni cinco vezes
menor em amostras congeladas (2,3%) do que nas amostras frescas (12,1%).
Jorgensen et al. (2002) isolaram, por plaqueamento direto, Campylobacter spp.
em 4 das 26 amostras da água de lavagem das carcaças congeladas, com contagens
variando de 2,80 a 4,40 Log
10
UFC / frango, sendo que o limite de detecção foi de 500
UFC.
No estudo feito por Georgsson et al. (2006) utilizando a técnica de
plaqueamento direto, a redução nas contagens de Campylobacter foi de 0,65 a 2,87
Log
10
UFC/g após 31 dias de estocagem a -20 ºC, indicando uma redução significativa
quando comparada aos resultados obtidos nas amostras frescas. No entanto, apesar
da redução significativa nas contagens, o índice de contaminação após este período
permaneceu na faixa de 3,13 a 4,01 Log
10
UFC/g.
Lee et al. (1998) comprovaram que C. jejuni é hábil em sobreviver por longo
período (56 dias) armazenado a -20 ºC, temperatura da maioria dos freezers
domésticos. Apesar da redução de aproximadamente 5 Log
10
nas contagens de UFC/g
por plaqueamento direto, no entanto, C. jejuni permaneceu viável, mesmo em baixas
contagens. Assim sendo, considerando que a dose mínima infecciosa é de 500
células, o congelamento dos alimentos não pode ser considerado como um
procedimento que garante a segurança do produto.
Bolton & Robertson (1982) afirmaram que a técnica de plaqueamento direto
pode ser utilizada em laboratórios de diagnóstico clínico, onde as contagens de
48
Campylobacter presentes nas fezes são altas, porém, em se tratando de estudos
envolvendo baixas contagens, o método com enriquecimento é o mais indicado.
Apesar de prática e rápida, a técnica de contagem de Campylobacter spp.
termotolerante por plaqueamento direto, subestima a contaminação real de amostras
submetidas a baixas temperaturas, uma vez que não recupera as células injuriadas.
Além disso, em 4 amostras refrigeradas e 4 amostras congeladas analisadas neste
trabalho (tabela 01), Campylobabcter foi isolado somente após o enriquecimento.
Portanto, o plaqueamento direto é mais recomendado para amostras frescas, durante
o monitoramento dos pontos críticos de controle no processo de abate antes do
resfriamento.
Os resultados do isolamento de C. jejuni de amostras de carne de frango fresca,
refrigerada e congelada obtidos após o enriquecimento seletivo estão apresentados na
tabela 03.
Tabela 03: Número de amostras de carne de frango positivas para C. jejuni após o
enriquecimento seletivo
Amostra Taxa de Positividade
Carne de frango Fresca
(1)
15/30
a
Carne de frango Refrigerada
(2)
11/30
a
Carne de frango Congelada
(3)
10/30
a
Fonte: Londrina, 2006
Letras iguais na mesma coluna indicam que não houve diferença significativa entre as amostras ao nível
de 95% de confiabilidade (P >0,05).
(1)
Amostras analisadas 1 h após a embalagem da carcaça de frango
(2)
Amostras refrigeradas a 4 °C por 7 dias
(3)
Amostras congeladas a –20 °C por 28 dias
O número de amostras positivas para C. jejuni das amostras frescas após o
enriquecimento seletivo foi de 15 em 30 amostras analisadas (50%). No método de
plaqueamento direto 28 das 30 amostras frescas (93,3%) estavam contaminadas com
Campylobacter spp. termotolerante. A identificação bioquímica de C. jejuni foi realizada
49
somente após o enriquecimento seletivo. Assim sendo, esta percentagem maior no
isolamento de Campylobacter spp. antes do enriquecimento seletivo sugere a
presença de outras espécies de Campylobacter spp. termotolerantes que não puderam
ser identificadas, tais como: C. coli, C. lari e C. upsaliensis.
Onze das 30 amostras refrigeradas analisadas (36,7%) foram positivas para C.
jejuni. Esta percentagem de positividade é semelhante a encontrada por Paulsen et al.
(2005) que avaliaram 190 amostras de carne de frango refrigerada obtidas em lojas de
conveniências, supermercados e açougues, e detectaram 39% das amostras
analisadas positivas para Campylobacter spp. após o enriquecimento.
As carcaças congeladas apresentaram 33,3% amostras positivas para C. jejuni.
Este resultado foi inferior ao encontrado por Meldrum et al. (2005) que encontraram
71,9% das amostras de frango congelado positivas para Campylobacter, porém os
autores não pesquisaram a presença de C. jejuni.
Não houve diferença significativa (P > 0,05) na taxa de positividade de C. jejuni
entre as amostras frescas e as submetidas a baixas temperaturas. Resultado
semelhante ao encontrado por Meldrum et al. (2005). Contudo, Alter et al. (2005)
avaliaram 43 amostras de peru e verificaram uma redução significativa na taxa de
positividade (de 67,4 para 25,6%) nas amostras avaliadas após o resfriamento entre 0
e 3 °C por 24 h. Estas diferenças podem ser explicadas pelas diferentes técnicas de
enriquecimento e preparo das amostras empregadas.
Fernández & Pisón (1996) avaliaram 126 amostras de fígado de frango usando
o método de enriquecimento e encontraram 117 (92,9%) amostras positivas para
Campylobacter spp., destas 92 amostras (73%) foram identificadas como C. coli, e 25
(19,8%) como C. jejuni. Os autores sugerem que C. coli é mais resistente a injúria que
50
ocorre durante a exposição a baixas temperaturas e às condições adversas do
ambiente.
Em 2000, a Islândia decidiu empregar o congelamento da carne de frango como
uma estratégia para reduzir a exposição humana a Campylobacter. Em 2001, a
Noruega adotou a mesma estratégia (GEORGSSON et al., 2006). No entanto, os
resultados obtidos no presente trabalho indicam que não existe diferença significativa
na taxa de positividade em amostras de carne de frango frescas, refrigeradas e
congeladas indicando que uma porção significativa de C. jejuni sobrevive a tais
condições. Esses resultados alertam que estes tratamentos sozinhos não garantem a
segurança do alimento, com respeito a este microrganismo.
51
6. CONCLUSÃO
Frangos frescos abatidos no estado do Paraná apresentaram alta contagem
de Campylobacter spp. termotolerante, mesmo depois de estocados a 4 °C por sete
dias e a -20 °C por 28 dias.
A dificuldade de recuperação de células injuriadas pelo plaqueamento direto
pode ser a explicação para o não isolamento de Campylobacter ou pela diminuição
significativa das contagens obtidas com amostras de frango refrigeradas ou
congeladas. Por outro lado, utilizando-se a técnica de enriquecimento seletivo, a
recuperação de C. jejuni foi estatisticamente igual entre as amostras frescas e
refrigeradas ou congeladas, indicando que este organismo pode sobreviver a tais
condições de armazenamento.
52
7. REFERÊNCIAS
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60
Anexo
61
Anexo: Esquema método de análise de Campylobacter spp. (plaqueamento direto) e
C. jejuni (enriquecimento seletivo)
25 g amostra + 225 ml
água peptonada
(homogeneização em
Stomacher por 1 minuto)
Plaqueamento
direto: 0,2 ml em
agar Bolton
4 h a 37 °C
44 h a 42 °C
Microaerofilia
Identificação e
contagem das
colônias
características
UFC/g
Campylobacter
spp.
termotolerante
Enriquecimento
seletivo: 5 ml em
45 ml caldo Bolton
4 h a 37 °C
44 h a 42 °C
Microaerofilia
Estrias em agar
Bolton
24 h a 42 °C
Microaerofilia
Identificação das
colônias
características
Presença /
Ausência em 0,5 g
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