( PDF ) Estudo do marcador nuclear Ciclina D1 e da oncoproteína c-erbB-2 em pacientes, portadores de carcinoma de pulmão de células não-pequenas, avaliados no tumor primário e na metástase

UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES

DALVA MIDORI SUZUKI SAITO

Estudo do marcador nuclear Ciclina D1 e da oncoproteína

c-erbB-2 em pacientes, portadores de Carcinomas de pulmão

de células não – pequenas, avaliados no tumor primário e na

metástase

Mogi das Cruzes-SP

2005

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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES

DALVA MIDORI SUZUKI SAITO

Estudo do marcador nuclear Ciclina D1 e da oncoproteína

c-erbB-2 em pacientes, portadores de Carcinomas de pulmão

de células não – pequenas, avaliados no tumor primário e na

metástase

Dissertação apresentada à comissão do curso de

Engenharia Biomédica da Universidade de Mogi

das Cruzes, como parte dos requisitos para

obtenção do Título de Mestre.

Professor Orientador: Dr. Olavo Ribeiro Rodrigues

Profª. Co-Orientadora: Drª. Vera Luiza Capelozzi

Mogi das Cruzes - SP

2005

LISTA DE TABELAS

TABELA I- Dados clínicos, estadiamento TNM e sobrevida dos doentes do grupo I...........28

TABELA II-Dados clínicos, estadiamento TNM e sobrevida dos doentes do grupo II.........29

TABELA III –Valores imunohistoquímicos de Ciclina D1 e c-erbB-2 dos doentes do

grupo I, expressos em porcentagens ( %)................................................................................32

TABELA IV – Valores imunohistoquímicos de Ciclina D1 e c-erbB-2 dos doentes do grupo

II, expressos em porcentagens ( % )........................................................................................33

TABELA V- Valores individuais da Ciclina DI e do c-erbB-2 no tumor primário e nas

metástases em 36 doentes do grupo I e no tumor primário em 26 doentes do grupo II de

CCNP.......................................................................................................................................39

TABELA VI- Dados individuais dos pacientes do grupo I (Anexo I )..................................65

TABELA VII-Dados individuais dos pacientes do grupo II (Anexo II )............................... 66

LISTA DE ILUSTRAÇÕES -FIGURAS

FIGURA 1 – Fotomicrografia –400X. A coloração castanho dos núcleos evidencia a

expressão de Cyclina DI..........................................................................................................34

FIGURA 2 – Fotomicrografia –400X. A coloração castanho no citoplasma demonstra a

positividade do c-erbB-2.........................................................................................................35

FIGURA 3 – Fotomicrografia de lâmina de tumor em aumento de 400x , demonstrando a

aplicação do retículo na quantificação da expressão imunohistoquímica- Técnica do point-

couting.....................................................................................................................................36

FIGURA 4 - Expressão de Ciclina D1 no tumor primário e em sua respectiva metástase

hematogênica em 36 doentes do grupo I................................................................................42

FIGURA 5 – Gráfico demonstrando a expressão de c-erbB-2 no tumor primário e em suas

respectivas metástases nos doentes do grupo I........................................................................44

FIGURA 6 – Expressão de Ciclina D1 nos tumores que apresentaram metástases (grupo 1) e

nos do grupo II. A expressão desse marcador é maior nos tumores do grupo I que

apresentaram metástases hematogênicas.................................................................................47

FIGURA 7- Expressão de c-erbB-2 no tumor com metástase comparado com tumores sem

metástases................................................................................................................................49

FIGURA 8 A – Sobrevida global dos pacientes em relação á expressão de CiclinaD1........51

FIGURA 8 B- Sobrevida global dos pacientes em relação á expressão de c-erbB-2............52

DEDICATÓRIA

À minha família,

Sempre calorosos e compreensivos, mesmo na distância, e na ausência que,

muitas vezes, foram necessárias para o empenho aos estudos e às pesquisas.

À memória dos doentes que já partiram e que fazem parte deste trabalho.

AGRADECIMENTOS AO ORIENTADOR

Pela confiança e oportunidade .

Sempre com muita paciência, incentivou-me fazer a pós-graduação e certamente, se não

fossem suas severas exigências, eu não teria conseguido completar essa conquista.

AGRADECIMENTOS

`A Profª. Dra Vera Luiza Capelozzi, professora do Departamento de Patologia da Faculdade

de Medicina da Universidade de São Paulo, pela dedicação, pelas idéias inovadoras, pela

orientação e auxilio na análise histológica.

`A Profª. Dra Fabíola Del Carlo Bernardi, minha gratidão, pela dedicação, experiência e

empenho na redação deste trabalho.

Ao Dr Marco Antonio Soufen, Diretor Médico do Laboratório Cytolab, pela oportunidade

de ingressar na carreira universitária como professora, pela confiança, sabedoria e nobreza de

caráter, permitindo-me a realização deste trabalho.

`A Prof.ª. Dra. Annie France Frère Slaets pela dedicação, pela seriedade na coordenação do

NPT e pelo auxílio financeiro na aquisição dos marcadores.

Ao Prof. Dr. Helio Minamoto, do Instituto do Coração do HC-FMUSP pelo auxílio e

contribuição na seleção das Lâminas .

Ao Prof. Dr. Roberto Storte Matheus, do Departamento de Cirurgia da UMC, pela

contribuição e auxílio, no fornecimento dos prontuários e nos registros operatórios dos doentes.

Ao Prof. Dr. Aurelino Fernandes Schmidt Jr, Cirurgião do Instituto do Tórax, minha

gratidão, pelo estímulo e pelo auxílio na computação gráfica.

Ao Dr Marco Aurélio Tevano de Andrade, Diretor do Laboratório Cytolab, pela

oportunidade, na execução deste trabalho.

Ao Prof. Dr Edwin Roger Parra, médico patologista da Universidade de São Paulo, pela

atenção e dedicação nas contagens microscópicas.

Ao Prof. Dr. Mohamed Hada, Professor da Disciplina de Patologia da Universidade de Mogi

das Cruzes , pela utilização do Microscópio para contagem das lâminas.

Ao Prof. Dr. Melquíades Portela, do Centro de Ciências Biomédicas da Universidade de

Mogi Das Cruzes, por ter permitido a utilização do Microscópio e do retículo para a contagem

dos anticorpos.

Ao Prof. Dr Alexandre Muxfeldt A`b Saber, Médico Patologista da Universidade de São

Paulo , pela dedicação nas contagens microscópicas e nas fotomicrografías.

`A Profª. Cecília Farhatt , estaticista da Universidade de São Paulo, minha gratidão pelos

ensinamentos e auxílio na análise estatística realizado neste trabalho.

Aos amigos Anselmo Froes e Ziva Maria dos Santos, histotécnicos, pelos estímulos

constantes, paciência e dedicação para a realização dos cortes histológicos.

`A histotécnica Esmeralda Miristeni Eher, da Universidade de São Paulo, pelo carinho e

empenho na execução dos testes Imunohistoquímicos.

`A bióloga Angela Batista Gomes dos Santos, da Universidade de São Paulo, pela

dedicação e carinho na execução dos testes Imunohistoquímicos.

`A bióloga Sandra de Moraes Fenezelian, da Universidade de São Paulo, pelo empenho,

carinho e sugestões das técnicas imunohistoquímicas.

`A bióloga Profª. Ana Lúcia Garippo , pelo apoio e empenho na busca da literatura.

`A Drª. Renata de Oliveira Arantes, Biomédica do Laboratório Cytolab, pelo estímulo e

contribuição da literatura.

`As Drªs. Maureen M. Tevano de Andrade e Dra. Luciana Palhari, Biomédicas do

laboratório Cytolab, pelos constantes votos de incentivo, durante as etapas deste trabalho.

`As técnicas Flavia Regina de Lima, Adriana Aparecida Coutinho e Roberta do Carmo,

pela paciência, dedicação e auxílio na execução das lâminas histológicas.

Ao amigo Sergio Fernandes de Freitas, pelo apoio, dedicação e solidariedade que

contribuiu de maneira excepcional para a realização deste trabalho.

`A Maira Rovigatti Franco, minha gratidão, pela dedicação e carinho no auxilio da

contagem imunohistoquímica e levantamento dos dados dos doentes.

`A amiga Paula Montagna, pelo apoio nas difíceis batalhas, carinho e auxílio na computação.

Ao Clube Náutico Mogiano, na pessoa do Prof. Carlos Pinheiro Ferreira Alves, coordenador

geral, minha gratidão pela oportunidade de ingresso na carreira universitária como professora.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

n frequência

EGFR “epidermal growth factor receptor”

DNA Acido Desoxirribonucléico

RNA Acido Ribonucléico

Tu Tumor

M Metástase

CCNP Carcinoma de Células Não-Pequenas

CCE- Carcinoma de células escamosas

CCP Carcinoma de Células Pequenas

OMS Organização Mundial da Saúde

TNM Tumor , Nódulo, Metástase

UK Reino Unido

HE Hematoxilina-eosina

LSABPLUS “Labelled Streptavidin-Biotin Plus”

EUA Estados Unidos da América

CE coeficiente de erro

IH Índice imunohistoquímico

SE Erro Padrão

Mean media

Pih positividade imunohistoquímico

Pt pontos positivos

µ micra

Bcl-2 antígeno marcador de células de linfoma B

p53 Proteina nuclear 53

k- ras Kirsten Murine Sarcoma Virus

c- myc Avian myelocytomatosis vírus

G1 Período pós mitótico

G2. Período pré mitótico

S Período de síntese

Status condição de óbito ou vivo

AgNOR Região Organizadora de Nucléolo corada pela Prata

Ki-67 Proteína nuclear Ki 67

MMP9 Matriz de Metalloproteínase

CD-34 Catepsina D34

Star Volume Volume nuclear

SPSS Statistical Package for Social Science

RESUMO

O Objetivo desta pesquisa foi investigar a expressão dos marcadores tumorais, o

oncogene citoplasmático c-erbB-2 e a oncoproteína nuclear Ciclina D1, suas relações com

o perfil de agressividade do tumor ,seu potencial metastático e o impacto na sobrevida dos

doentes, portadores de CCNP de pulmão. Com este propósito foram estudados,

retrospectivamente, 62 doentes, 34 homens e 28 mulheres, operados no período entre 1988

a 2003. A idade variou de 38 a 87 anos, média de 62 anos. Segundo os critérios de

estadiamento TNM, havia 07 doentes em estádio IA , 11 em IB, 04 em IIB, 04 em IIIB e 36

em estádio IV. Os doentes foram distribuídos em 2 grupos : Grupo I – composto por 36

doentes em que se estudou os marcadores no tumor primário e nas respectivas metástases

hematogênicas. Os tecidos para o estudo histopatológico foram obtidos de pulmão,

cérebro, ossos, fígado, partes moles e adrenal; e Grupo II – representado por 26 doentes,

com espécimes do tumor primário. Secções histológicas foram coradas para demonstração e

quantificação de Ciclina D1 e c-erbB-2, pelo método imunohistoquímico . Para determinação

dos índices imunohistoquímicos, utilizou-se a técnica do point-counting ao aumento de 400x.

Foram examinados 10 campos microscópicos não-coincidentes para cada doente. Os valores

médios da expressão de ciclina D1 foi, significantemente, maior no tumor primário do que

em suas respectivas metástases ( p=0,000 ). Para o c-erbB-2 foi obtida uma diferença

relevante , porém não-significante ( significância marginal ) entre as médias de expressão de

C-erbB-2 nos tumores primários e suas respectivas metástases. p= 0,093 ) . Quando

comparou-se a expressão da Ciclina D1 nos tumores que apresentaram metástases ( Grupo I )

com aqueles que não apresentaram ( Grupo II ) ,verificou-se que existe diferença

estatisticamente significante em relação `a expressão de Ciclina D1 em tumores que

apresentaram metástases hematogênicas ( p = 0,002 ). Não foi observada diferença

estatisticamente significante entre a expressão de c-erbB-2 no tumor com metástase quando

comparado com o tumor sem metástase ( p= 0,234 ). A sobrevida global diferiu,

significantemente, nos dois grupos , com baixa e elevada expressão dos marcadores (p<0,05

). A superexpressão de Ciclina D1 e c-erbB-2 tiveram valor prognóstico e foram

associados com menor sobrevida dos doentes. Os resultados obtidos encorajam a inclusão

da quantificação da Ciclina D1 e do c-erbB-2 no painel imunohistoquímico de marcadores de

prognóstico em CCNP de pulmão.

Palavras –chave: marcadores tumorais, c-erbB-2, Cyclina D-1, carcinomas de pulmão.

ABSTRACT

This research had the objective of investigating the expression of tumours markers,

the cytoplasmic oncogen c-erbB-2 and the nuclear onco-protein Cyclin D1; their relation

with the profile of tumors aggressivity; their metastatic potential; and the impact in the

survival of patients, with NSCC lung.With this purpose, 62 patients, 34 men and 28 women,

operated between 1.988 and 2.003, were retrospectively studied. There was an average of 62

years-old, varying from 38 to 87 years-old. Regarding to the criterious of TNM stages, there

were 07 patients in stage IA, 11 in IB, 04 in IIB, 04 in IIIB and 36 in stage IV. The patients

were divided into 2 groups: group I – constituted by 36 patients. In this group, it was studied

the markers in primary tumour and in respective hematogenic metastasis. The tissues for

histopathologic study were obtained from lung, brain, bones, liver, soft tissues and adrenal;

and group II – represented by 26 patients. Obtained specimens of primary tumor .

Histologic sections, were coloured for demonstration and quantification of Cyclin D1 and

c-erbB-2 immunohistochemical method. It was used the point-counting technic of 400x

increase for immunohistochemical rates. It was examined 10 non-coincident microscopic

fields for each patient. The middle values of the expression of Cyclin D1 were significantly

higher in primary tumor, if compared with its respective metastasis (p=0,000). It was

obtained a relevant difference in c-erbB-2, but non-significant (marginal meaning), between

the average of the expression of c-erbB-2 in primary tumors and their respective metastasis

(p=0,093). When the expression of Cyclin D1 was compared in tumours which hematogenic

metastasis (group I) with those which did not show it (group II), it was checked that there is

a significant difference according to statistics in respect to the expression of Cyclin in

tumours which showed hematogenic metastasis (p=0,002). It was not observed a significant

difference according to statistics between the expression of c-erbB-2 in the tumor with

metastasis, compared to the tumor without metastasis (p=0,234). The global survival of

patients since the diagnosis of the disease differed significantly in the groups, with low and

high expressions of the markers (p<

<<

<0,05). The overexpression of Cyclin D1 and c-erbB-2

had a prognostic value and was associated with a low survival of the patients.

The obtained results encourages the inclusion of quantification of Cyclin D1 and

c-erbB-2 in the immunohistochemical panel of markers of prognosis in non-small cell lung

carcinomas patients.

Keywords : tumours markes , c-erbB-2, Cyclin D1, lung carcinomas.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO...................................................................................................... ...18

2. OBJETIVO ............................................................................................................ 23

3. LITERATURA ...................................................................................................... 24

4. MÉTODO ............................................................................................................ ..27

Amostra ........................................................................................................................27

Dados individuais e Estadiamento TNM dos doentes .................................................29

Procedimentos ..............................................................................................................31

Análise Histológica ...................................................................................................... 31

Análise Imunohistoquímica .........................................................................................31

Quantificação de Ciclina D1 e c-erbB-2....................................................................... 32

Determinação dos Índices Imunohistoquímicos de Ciclina D1, c-erbB-2.................. .35

Análise Estatística ........................................................................................................ 39

5. RESULTADOS ...................................................................................................... 40

Expressão de Ciclina D1 e c-erbB-2 no Tu. Primário e Metástase..............................40

Expressão de Ciclina D1 e c-erbB-2 – Comparação entre os grupos.............................42

Análise da Interação Ciclina D1 , c-erbB-2 e sobrevivência .......................................51

6. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 54

7. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 58

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 59

9. NORMAS ADOTADAS ....................................................................................... 64

10. APÊNDICE E ANEXOS .......................................................................................65

18

I- INTRODUÇÃO

Câncer é resultante de mutações acumuladas no genoma, associadas ao descontrole

proliferativo e diferenciação celular.

O câncer de pulmão é a neoplasia de maior mortalidade, visto que seu diagnóstico

geralmente é tardio, e em estádios avançados da doença, impedindo um tratamento curativo .

De acordo com a Organização Mundial de Saúde (CLINICAL REFERENCE

SYSTEMS -2002 ), os carcinomas pulmonares podem ser classificados em dois grandes

grupos: - Carcinomas de células pequenas (CCP) e Carcinomas de células não-pequenas

(CCNP), este subdivido em três subtipos histológicos – O carcinoma de células escamosas,

adenocarcinoma e carcinoma de células grandes.

Enquanto os carcinomas de células pequenas respondem melhor ao tratamento

quimioterápico, os de células não-pequenas respondem melhor à cirurgia e radioterapia.

O câncer de pulmão continua sendo a neoplasia de maior mortalidade, tendo um

diagnóstico tardio e muitas vezes de estadiamento avançado, prejudicando um tratamento

curativo. Dentre os diversos fatores de risco, o fumo foi considerado o maior causador dos

males. Neste mesmo trabalho, são descritos os diversos genes envolvidos com o câncer de

pulmão.

A incidência de câncer de pulmão continua em ascensão desde a década de 60,

especialmente no sexo masculino. Atualmente, lidera as causas de morte por câncer na

Europa, Estados Unidos e Brasil (OLIVEIRA e cols.,2002).

Apesar de todos os avanços no diagnóstico e na terapêutica , com a cirurgia radical,

quimioterapia e radioterapia, o carcinoma broncogênico ainda representa um desafio para os

oncologistas, pois a taxa de cura permanece inalterada em 14% ao longo das últimas

décadas.

A maioria destes casos de progressão da doença ocorre às custas de metástases em

órgãos distantes, constituindo-se num fenômeno complexo, que exige o cumprimento de

múltiplas etapas para o desenvolvimento (WEISS e cols. ,1996).

No momento do diagnóstico, estima-se que 55% dos pacientes já se apresentam com

metástases a distância e isto pode ser um dos motivos para essa alta taxa de mortalidade,

outros 25% têm extensão da neoplasia para linfonodos mediastinais e restam apenas 20%

com doença localizada (SEREGNI, e cols.,1995).

19

Mesmo estes pacientes com doença localizada, em que a ressecção cirúrgica

representa a chance real de cura, após o tratamento cirúrgico radical, cerca de 30 a 40 % dos

pacientes morrem em consequência da progressão tardia da neoplasia

A metástase é um processo complexo, resultante de interações celulares com o

ambiente tecidual onde estas células se encontram (MELLO e cols.,2002).

Durante a disseminação do tumor, as células tumorais têm capacidade de se soltar do

tumor primário, escapando do tecido de origem, invadindo a matriz extracelular, migrando

ativamente pelo estroma intersticial, induzindo à formação de novos vasos sanguíneos e/ou

linfáticos (angiogênese), essenciais para a expansão da massa tumoral.

As moléculas de células metastáticas apresentam expressões diferentes

qualitativamente e quantitativamente, sendo assim identificados por marcadores de

progressão tumoral (VOLM e cols.,1992; MATHEUS,2004 & HIRASHIMA e cols.,2001).

Diversos trabalhos envolvendo linhagens tumorais identificaram variedades de

marcadores moleculares e mutações específicas que podem estar envolvidos na patogênese

do câncer de pulmão.

Os estudos moleculares têm demonstrado que a carcinogênese do pulmão, ocorre

após um processo complexo e com múltiplos passos sucessivos

Existem diversos genes envolvidos na carcinogênese do Câncer de pulmão, entre eles

os oncogenes da família Ras, Myc, Erb-B2.

A ativação de oncogenes, freqüentemente, ocorre no câncer de pulmão e contribui

para a malignidade do fenótipo. Mutações no K-ras resultam numa sinalização prolongada

inadequada para a divisão celular, piorando o prognóstico da doença e estão relacionadas ao

fumo (VOLM e cols.,1999 & RATSCHILLER e cols.,2003).

Alterações nos oncogenes da família myc (c-myc, L-myc e N-myc) aparecem numa

proporção variável nos carcinomas de pulmão, sendo mais frequentes nos de células

pequenas. Os oncogenes myc ocorrem com maior frequência em pacientes tratados com

quimioterapia e são correlacionados com pior prognóstico(BATTLEHNER e cols , 1993 &

ANTONANGELO e cols, 1997 & MODVAY e cols., 2000 )

A oncoproteína c-erbB-2 está presente em uma variedade de tecidos tumorais, sendo

sua expressão demonstrada no citoplasma das células cancerígenas na reação de

imunohistoquímica.

Considera-se que c-erbB-2 ( HER-2/neu ) é um proto - oncogene localizado no braço

longo do cromossoma 17. Embora c-erbB-2 tenha sido estudado mais extensivamente em

20

câncer de mama, existe relativamente pouca informação disponível referente a seu valor

prognóstico em câncer de pulmão ( HAN e cols., 2002).

As alterações na c-erbB-2 ocorrem em, aproximadamente, 30% dos carcinomas de

células não - pequenas, notadamente em adenocarcinomas, sendo associadas a um fenótipo

múlti-resistente às drogas e a um potencial metastático.

Anticorpos de receptor de c-erbB-2 foram estudados em combinação com

quimioterápicos, demonstrando não haver associação entre alta expressão deste anticorpo

com a resposta quimioterápica em doentes operados de CCNP de pulmão ( MOLDVAY e

cols.,2000 ) .

Outros marcadores tumorais têm sido investigados em nosso meio, através de

métodos imunohistoquímicos, histoquímicos, citometria e por estudos de morfometria. .

No Brasil, vários autores têm investigado o papel de marcadores de atividade

proliferativa em câncer de pulmão, como AgNOR ( RODRIGUES e cols.,1997 ); AgNOR,

bcl-2, Ki-67, p53, e DNA-ploidia ( CARVALHO e cols.,2000) ; AgNOR, índice mitótico,

star volume e Ki-67 ( MATHEUS e cols.,2004 ) ; AgNOR, CD-34, p53, bcl-2, Ki-67,

MMP9 ( MINAMOTO e cols.,2003 ) .

A proteína Ciclina D1 é um anticorpo monoclonal, específico, em que a reação

positiva é demonstrada no núcleo das células tumorais.

A expressão de gens e de atividade proliferativa p16 – Ciclina D1 -cd k4-Rb

é a central de controle da transição G1-S do ciclo celular e seus componentes estão

funcionalmente alterados ou mutados em diferentes cânceres, inclusive o do pulmão.

A superexpressão da Ciclina D1 é encontrada em 25 a 47% dos carcinomas de células

não-pequenas de pulmão (VOLM e cols.,1999 & CASTRO e cols.,2001). A proteína

Ciclina D1 inibe a atividade do gene Rb e estimula a fosforilação de seu produto protéico

pela cdk4.

A referida proteína tem um importante papel no controle do ciclo celular, mais

especificamente, na transição da fase G1 para a fase S . Sua função está relacionada com a

proteína Rb (produzida pelo gene retinoblastoma); que em sua forma desfosforilada se liga a

fatores transcripcionais (E2F), impedindo a transcrição de muitas proteínas requeridas para a

síntese de DNA, como a DNA polimerase.

Quando sinais extracelulares, como o fator de crescimento epidermal (EGFR),

ativam receptores da membrana, a concentração da molécula Ciclina D1 é aumentada

durante a fase G1. Esta ativa a molécula quinase, dependente de Ciclina D1 (Cdk4), que é

21

responsável pela fosforilação da proteína Rb e a consequente liberação dos fatores E2F e

início da síntese de DNA.

Um importante regulador da expressão da Ciclina D1 é a proteína p16, que exerce sua

função inibindo as quinases dependentes de Ciclina (SAIKAWA . e cols.,2001 & YANG e

cols.,2002).

As Ciclinas D1 são expressadas precocemente na fase G1 e são degradadas antes da

entrada na fase S do ciclo celular (JIMENEZ e cols.,2001).

Estudos realizados com secções de tecido de pacientes demonstraram que a Ciclina

D1 tem sua expressão aumentada em 61,82% dos carcinomas pulmonares de células não-

pequenas, o que indica a possibilidade dela funcionar como uma oncoproteína ( LIANG e

cols.,2003 )

Observou-se que havia diferenças significativas, com relação à sobrevida, entre os

grupos que apresentaram expressão positiva (menor tempo de sobrevivência) e aqueles que

apresentaram expressão negativa da molécula de Ciclina D1, o que caracterizou a proteína

como indicadora de um mal prognóstico em doentes operados de câncer de pulmão de

células não-pequenas (GUGGER e cols., 2001 & POLAN e cols.,2003 ).

As freqüentes mudanças genéticas moleculares que ocorrem durante a carcinogênese

pulmonar têm sido identificadas. Destas , a expressão aberrante de Ciclina é freqüente com

alteradas expressões de Ciclina D1 ocorrendo, precocemente, na carcinogênese pulmonar.

Quando há superexpressão de Ciclina, as células diminuem a transição através do ciclo

celular ( G1 – S – G2 – M ) e talvez limita o potencial para reparação do DNA danificado ,

causando exposição carcinogênica, assim hipoexpressão de Ciclina D1 tem papel protetor na

carcinogênese pulmonar ( DRAGNEV e cols. , 2003 ).

Estudos recentes consideram a expressão de Ciclina D1 nos tumores de pulmão um

importante elemento para a aplicação de quimioprevenção ( PETTY e cols., 2003 ).

Apesar da grande importância dessa molécula na regulação do ciclo celular e no

desenvolvimento de carcinomas pulmonares primários e suas metástases, até o presente

momento seu detalhado papel na metástase permanece obscuro.

Este fato motivou esta investigação sobre a expressão de dois marcadores, o

oncogene c-erbB-2 e a oncoproteína Ciclina D1 em doentes operados de carcinoma de

pulmão do tipo de células não-pequenas .

22

23

II – OBJETIVO

1. Estudar a expressão dos marcadores tumorais, o oncogene c-erbB-2 e a oncoproteína

Ciclina D1 em tumores e metástases de doentes operados de carcinoma de células

não-pequenas de pulmão;

2. Investigar a relação entre a expressão dos marcadores tumorais e o perfil de

agressividade do tumor, seu potencial metastático e o impacto na sobrevida dos

doentes tratados .

24

III- LITERATURA

Castro e cols. (2001) estudaram 238 casos de adenocarcinomas de pulmão nas suas

formas bronquíolo-alveolar, mista e sólido-acinar. Esses autores determinaram a expressão

de Ciclina D1, Ciclina E e da proteína p53 por imuno-histoquímica. Concluíram não haver

correlação entre os parâmetros clínicos e patológicos estudados e a expressão dos

marcadores tumorais.

Cox G e cols. (2001) estudaram 334 casos de CCNP de pulmão, em dois diferentes

centros . Observaram esses autores não haver correlação entre a imuno-expressão do

marcador c-erbB-2 e o tipo histológico do tumor. Não encontraram valor prognóstico em

câncer de pulmão.

Giatromanolaki A e cols. (1996) investigaram a expressão do c-erbB-2 e a

angiogênese tumoral na sobrevida e no comportamento metastático de 107 amostras de

pacientes submetidos a cirurgia de CCNP. Esses autores observaram que existe uma

associação entre alta expressão de c-erbB-2 e baixa angiogênese tanto no tumor primário

quanto na metástase tumoral.

Greatens Todd M. e cols.(1998) estudaram 101 pacientes que foram operados de

CCNP de pulmão e seguidos pelo período de 2 anos. Esses autores avaliaram o gene

supressor de tumor p53 e o oncogene k-ras, por reação de polimerase em cadeia (PCR ).

Avaliaram também por técnica imunohistoquímica a proteína bcl-2, c-erbB-1 e c-erbB-2.

Concluíram que houve uma associação entre o estadiamento cirúrgico avançado do tumor e

menor sobrevida dos doentes, enquanto que os múltiplos marcadores celulares não tiveram

um papel relevante em predizer a sobrevida dos pacientes operados.

Gugger M e cols. (2001) estudaram 92 doentes portadores de CCNP de pulmão nos

estádios não-avançados ( I-IIIA ) e nos estádios avançados ( IIIB-IV ). Esses autores

determinaram por imunohistoquímica a expressão de Ciclina D1 em tumores primários

ressecados e em metástases linfonodais, metástases ósseas e metástases gastrointestinais .

Concluíram esses autores que a Cyclina D1 foi o único fator independente de valor

25

prognóstico em tumores ressecáveis. Observaram ainda um risco alto de recorrência do

tumor nos casos de alta expressão de Ciclina D1.

Hirashima N e cols. ( 2001) realizaram estudo imunohistoquímico para

c-erbB-2, envolvendo 182 casos de carcinomas primários de pulmão e 13 metastáticos.

Concluíram, esses autores, que a alta expressão dessa oncoproteína na membrana celular

poderá ser útil no tratamento neo- adjuvante de pacientes com carcinoma pulmonar.

Matheus R S e cols. (2004) investigaram os índices de proliferação celular (star

volume, mitotic index, AgNOR, Ki-67 ) em CCNP de pulmão e suas correspondentes

metástases hematogênicas. O resultado da investigação demonstrou que a fase de metástase

no cérebro apresenta uma variação acentuada na expressão desses marcadores proliferativos

em relação aos demais pesquisados.

Mello F H M e cols. (2002) realizaram um estudo sobre mecanismo de invasão e

metástase. Descreveram, nesse trabalho, fatores que controlam transcrição de genes, fatores

que controlam o ciclo celular e mecanismos de invasão tecidual das metástases.

Minamoto H e cols. (2003) realizaram estudos com os marcadores proliferativos

AgNOR, p53, MMP-9, de angiogênese (CD34) e a interação da matriz extracelular em

pacientes com CCNP de pulmão. Foram analisados 80 casos de carcinomas pulmonares

primários e suas correspondentes metástases hematogênicas . Os resultados demonstraram

que a metástase representa uma população de células com características de agressividade

maior em relação ao tumor primário.

Moldvay J e cols. (2000) analisaram 227 pacientes, submetidos a ressecção cirúrgica

de CCNP do pulmão, sendo 132 casos de CCE e 95 casos de adenocarcinomas em vários

estádios da doença. Observaram, esses autores, que a expressão de c-erbB-2 foi mais

freqüente em CCE do que nos adenocarcinomas. Não se observou relação entre a expressão

de c-erbB-2 com a sobrevida dos pacientes.

Polan M e cols. (2003) estudaram a expressão de c-erbB-2 em 40 pacientes

portadores de CCNP de pulmão e relacionaram essa expressão com o estadiamento, o tipo

histológico e a sobrevida dos pacientes. Encontraram uma expressão aumentada de c-erbB-2

26

em 35% dos doentes . Observaram, também, que adenocarcinomas em estádios avançados (

IIIB e IV ) possuem maior expressão desse marcador . Esse estudo demonstrou que não

houve associação entre alta expressão de c-erbB-2 e a sobrevida dos pacientes .

Ratschiller D e cols. (2003) estudaram a expressão de Ciclina D1, por

imunohistoquímica, em lesões pré-malignas de epitélio brônquico e em mucosa brônquica

normal em 48 doentes portadores de CCNP de Pulmão. Verificaram, esses autores, que a

expressão de Ciclina D1 em múltiplos locais da mucosa brônquica em pacientes fumantes

relacionou-se com um pior prognóstico

Volm M e cols. (1992) foram os pioneiros no estudo do proto-oncogen c-erbB-2

em câncer de pulmão operado. Esses autores estudaram a expressão desse marcador por

método imunohistoquímico, em 81 casos de CCE de pulmão. Compararam a expressão do

c-erbB-2 com os parâmetros clínicos : sobrevida, presença de metástases e estadiamento do

tumor. Esses autores não encontraram correlação entre a expressão desse proto-oncogen e os

parâmetros clínicos estudados.

Volm M & Koomagi R (1999) investigaram a expressão de Ciclina D1, em 181

amostras de CCNP de pulmão, de pacientes fumantes e não fumantes. Observaram, esses

autores, que os carcinomas dos pacientes fumantes expressaram Ciclina D1 em 77 %,

enquanto que os carcinomas de pacientes não fumantes expressaram apenas 57 %.

Verificaram que, dentre os pacientes fumantes, existe uma correlação alta entre a expressão

de Ciclina D1 e o CCE de doentes fumantes, enquanto que não foi observado essa relação

com os doentes fumantes portadores de adenocarcinomas de pulmão.

27

IV- MÉTODO

Amostra

Realizou-se um estudo retrospectivo, em que foram selecionados 62 doentes

operados de carcinoma de células não-pequenas ( CCNP ) de pulmão em estádios

avançado e não-avançado.

Os doentes foram operados no Hospital da Santa Casa de Mogi das Cruzes e no

Hospital das Clínicas da USP, no período de 1988 a 2003. Os doentes foram

selecionados com base no diagnóstico histopatológico e na avaliação dos blocos de

parafina, contendo fragmentos dos tumores.

Foram obtidas informações relativas à idade do paciente, sexo e dados operatórios .

As informações referentes à evolução pós-operatória foram feitas nos registros médicos,

hospitalares e em consultas à família dos pacientes.

A amostra era composta de 34 homens e 28 mulheres. A média de idade foi de 62

anos ( 38-87 anos )

O estadiamento da doença foi baseado no sistema internacional de estadiamento para

tumores pulmonares ( TNM-97 ).

Quanto ao estadiamento clínico e patológico final, a amostra na data da conclusão do

estudo era constituída de :

Estádio IA = 07 ( 11,3 % )

Estádio IB = 11 (17,7 %)

Estádio IIA = 0 ( 0,0% )

Estádio IIB = 04 (6,4 %)

Estádio IIIA = 01 (1,6 %)

Estádio IIIB = 03 ( 4,8 % )

Estádio IV = 36 (58,2 % )

TOTAL = 62 doentes

No período estudado, os doentes que desenvolveram metástases hematogênicas e

passaram para o estádio IV foram submetidos a novos procedimentos cirúrgicos para

obtenção de tecido tumoral e confirmação histológica.

Os doentes foram divididos em 2 grupos:

28

Grupo I = n= 36 ( ANEXO I )

Nesse grupo foram incluídos os doentes em que foram estudados os blocos de

parafina do tumor primário obtidos por ressecção, durante o tratamento cirúrgico inicial (1

a

operação) e os blocos das metástases hematogênicas, obtidas por ressecção ou por

procedimentos diagnósticos e ou biópsias, no decurso da doença (2

a

operação).

Nesse grupo obteve-se tecido metastático para estudo histopatológico dos seguintes

órgãos :

Pulmão = 06

Cérebro = 12

Ossos = 07

Fígado = 02

Supra Renal = 01

Partes Moles = 07

Diafragma = 01

TOTAL = 36 Doentes

No período estudado, 38 doentes ( 61%) dos 62 incluídos no estudo morreram de

causas relacionadas ao câncer, sendo que eles encontravam-se em estado M1 na avaliação

final.

No grupo I, apenas 03 doentes estavam vivos na conclusão do estudo.

Grupo II = n= 26 ( ANEXO II )

Compreendeu os doentes em que dispúnhamos, apenas, dos blocos de parafina do

tumor primário ressecado por ocasião da operação.

Para análise da sobrevida, a média da duração do seguimento dos doentes foi de 33

meses (1 a 97 meses ).

O tempo de sobrevida, expresso em meses, foi definido como o período entre o

tempo da operação até a data do óbito.

Esta pesquisa encontrou-se enquadrada nas Normas de Pesquisa em Seres Humanos (

Pesquisa em Saúde ), expressas na Resolução nº196/96 do CONSELHO NACIONAL DE

SAÙDE e na Lei 8.501, de 30/11/92, que trata sobre utilização de cadáver e ou peças

anatômicas humanas ( ANEXO lll ).

29

Os dados clínicos, individuais, estadiamento e tempo de sobrevivência dos doentes

do grupo I e do grupo II estão distribuídos nas TABELAS I e II

TABELA I

- Dados clínicos, estadiamento TNM e sobrevida dos doentes do grupo I

Caso

Nº

Paciente

BlocoTu.Prim

ário

Bloco

META

1 PF

354/01 782-3b

72 M T4NxM1 IV Pulmão homol. 9 9

2 AVSF

7653/00 1447/01

75 M T2 NO MI IV pared.toracic. 6 6

3 AMS

1443/00 1443-A6

73 F T3N0M1 IV diafragma 11 11

4 LMS

AP-2316/99 2847/99

68 M T3N3M1 IV clavícula 8 3

5 IJB

04728/99 1739/99

67 F T3 Nx M1 IV costela 10 9

6 AM

1231/97 1089/97

60 M Tx Nx M1 IV cérebro 12 10

7 LFK

HC-99/475 99/084

54 M Tx Nx M1 IV costela 14 14

8 RCPF

00775/98 2231/99

62 F T3N0M1 IV cérebro 23 12

9 AWG

399145-A 1734/99

51 M T2N2M1 IV figado 33 25

10 NVS

94/714 CB97/2336

59 M T2N3M1 IV P.contra lateral 97 53

11 JOJ

17673 3936/98

52 M T4N2M1 IV cérebro 39 39

12 JBS

5450 5125/98

54 M Tx Nx M1 IV fígado 8 8

13 MM

B97-4049 C 98/8790

54 M T xNx M1 IV cérebro 3 3

14 JP

1197/99 0443/99

56 F Tx Nx M1 IV cérebro 10 17

15 IABD

97/0781-C 98-03094-8

49 F T2N2M1 IV cérebro 35 12

16 JFS

27473 3640-A

61 M T1N1M1 IV osso 46 17

17 MFA

PC99/0323 38409/99

42 F T4N3M1 IV cérebro 12 7

18 JP

314214 322802

59 M Tx Nx M1 IV osso 11 3

19 APD

318829 319319

62 M TxNx M1 IV osso 3 2

20 JRM

3022453 0340741-A

58 M T3N3M1 IV P.contra lateral 62 8

21 WL

0295380-A 294930

52 M Tx Nx M1 IV cérebro 22 21

22 HMJ

293789 302731

55 F Tx Nx M1 IV partes moles 55 12

23 NP

U98-02045 098-1416

67 M Tx Nx M1 IV cérebro 5 5

24 LPI

99031/98 B99-1968

56 F Tx Nx M1 IV supra renal 24 23

25 EF

336627 P96/1949

59 F Tx Nx M1 IV cérebro 5 3

26 MLBR

328982 329841-A

57 F Tx Nx M1 IV osso 10 10

27 ATY

330850 330850-L

38 M T xN3 M1 IV P. contra lateral

15 15

28 JMN

43204-A 029976-8

69 M Tx Nx M1 IV Partes moles 3 1

29 ACR

B93-327031 4569/94

72 M T2N2M1 IV P. contra lateral.

62 46

30 JPS

AP 2539/03 3316/03

52 M T2N2M1 IV pared. toracic. 28 2

31 BASM

AP 5632/02 33478

63 M T2N0M1 IV cérebro 18 9

32 BFB

VB 754 U03-012030

73 M T2N1M1 IV P. contra lateral

42 13

33 AJR

AP 2451/03 PC-516/03

64 M TxNx M1 IV partes moles 1 1

34 KS

AP-3688/02 AP-7232/02

87 f T1N1M1 lV partes moles 6 3

35 ARS

AP-4620/03 B04-7880

64 F T2N2M1 lV axila 10 5

36 AAS

AP-451302

AP-5359-01

64 F T2N2M1 lV cérebro 24 36

*P. contra lateral = pulmão contra lateral

** axila = partes moles

*** pared. toracic. = partes moles

TABELA II-

Dados clínicos, estadiamento TNM e sobrevida dos

30

doentes do grupo II

Nº

caso

Nºbloco idade

sexo TNM E C sobrevida

Status vitae

1 54807-A

79 F T3N2M0

IIIA 41

óbito

2 55148 63 M T1N0M0

IA 42

Vivo

3 52149 65 F T2N1M0

IIB 50

óbito

4 97-4904 79 M T2N0M0

IB 48

Vivo

5 53222 57 F T3N0M0

IIB 52

Vivo

6 B/93-708

63 M T1N3M0

IIIB 43

óbito

7 39087 56 F T2N1M0

IIB 39

Vivo

8 624322 56 M T1N0M0

IA 43

Vivo

9 39050 56 F T2N1MO

IIB 39

Vivo

10 43394 50 F T2N0M0

IB 48

Vivo

11 B94-1582

72 F T1N0M0

IA 50

Vivo

12 B94-342

65 M T2N0M0

IB 62

Vivo

13 2237 55 M T2N0M0

IB 47

Vivo

14 96-3520-A

62 F T2N0M0

IB 50

Vivo

15 B86-963

64 F T1N0M0

IA 65

Vivo

16 B94-1638

56 M T2N0M0

IB 60

Vivo

17 B94-1135

58 F T1N0M0

IA 63

Vivo

18 B96-3462

70 F T2N0M0

IB 58

Vivo

19 39050-G

64 M T1N0M0

IA 59

Vivo

20 95-726 61 F T1N0M0

IA 48

Vivo

21 B92-1874

58 F T2N0M0

IB 47

Vivo

22 B88-2359

75 M T4N0M0

IIIB 49

óbito

23 3688 64 M T4N0M0

IIIB 53

óbito

24 51-8820 69 M T2N0M0

IB 50

Vivo

25 54-5512 62 F T2N0M0

IB 49

Vivo

26 60-2105 63 F T2N0M0

IB 53

Vivo

* Status vitae : Referente ao mês de Set/04

31

Procedimentos

Análise Histológica

Os fragmentos obtidos do tumor primário e das metástases foram fixados em solução

de formalina 10% . Para cada caso, uma ou duas áreas do tumor foram submetidas ao exame

histopatológico e emblocados em parafina .

Dos blocos de parafina com o material a ser analisado, foram feitos cortes de 3

micrometros de espessura.

Os fragmentos microscópicos foram aderidos à lâmina de vidro.

Esses fragmentos foram corados pela hematoxilina-eosina (HE), para revisão

histopatológica , e também foram montados em lâminas silanizadas para o estudo

imunohistoquímico da Ciclina D1 e C-erbB-2 .

A classificação e diferenciação histológica foram realizadas nas áreas mais

representativas, identificadas após análise microscópica do patologista *.

A classificação histológica obedeceu aos critérios preconizados pela OMS, baseada

no subtipo histológico predominante identificado na maioria das áreas.

Análise Imunohistoquímica

Coloração para demonstração e quantificação do antígeno de proliferação núclear

Ciclina D1 e da oncoproteina c-erbB-2.

A reação de imunohistoquímica utilizada para a pesquisa dos anticorpos foi o

método de Biotina-streptavidina peroxidase.

Foram feitos cortes histológicos de 3 micrometros aderidos às lâminas de vidro

silanizadas ( 3-Aminopropil-trietoxi-silano ).

*

Laboratório Cytolab –Departamento de Anatomia Patológica -Mogi Das Cruzes-SP

32

Essas lâminas foram desparafinizadas e hidratadas.

A recuperação de antígeno foi obtida por meio de tratamento por calor (50 minutos).

Foram realizados sete bloqueios da peroxidase endógena com água oxigenada de 10 V a 3%.

As lâminas foram incubadas durante uma noite na geladeira com anticorpos

primários monoclonais de camundongo – clone DCS -6 Cyclina D1 e c-erbB-2 e

(Laboratório Novocastra Ltd. UK-NCL ). Incubações subseqüentes foram realizadas com o

Kit LSABPLUS ( Dako A/S, Dinamarca ). As lâminas foram, a seguir, impregnadas com o

cromógeno 3,3’-diaminobenzidina ( Sigma Diagnostics, St., Louis, E.U.A ) e contra-coradas

com uma solução de Hematoxylina ( Sigma Diagnostics, St., Louis, E.U.A. ). Para controles

positivos, cortes em parafina, de carcinoma pulmonares ,fixados em formol, sabidamente

positivos para a Ciclina D1 e c-erbB-2, foram corados simultaneamente. Para controle de

negativos, os cortes foram incubados com soro fetal bovino * .

Os valores imunohistoquímicos dos doentes dos Grupos I e II estão distribuídos e

expressos em porcentagem nas Tabelas III e IV

*Laboratório de Imunohistoquímica da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

33

TABELA III

–Valores Imunohistoquímicos de Ciclina D1 e c-erbB-2 dos doentes do

grupo I expressos em porcentagens (%)

Caso

Nº

Pacientes

N º Bloco tu.

Primário

Nº Bloco

META

c-erbB–2

TU.

c-erbB-

2

META

1 PF 354/01 782-3b 0 3 25 59

2 AVSF 7653/00 1447/01 0 3 34 86

3 AMS 1443/00 1443/A6 0 1 76 85

4 LMS AP-2316/99 2847/99 0 0 65 6

5 IJB 04728/99 1739/99 11 18 6 17

6 AM 1231/97 1089/97 23 3 33 71

7 LFK HC-99/475 99/084 18 0 62 0

8 RCPF 00775/98 2231/99 1 63 73 72

9 AWG 399145-A 1734/99 3 0 33 32

10 NVS 94/714 CB97/2336

21 0 60 63

11 JOJ 17673 3936/98 0 3 86 28

12 JBS 5450 5125/98 6 5 18 12

13 MM B97-4049 C 98/8790 0 3 6 31

14 JP 1197/99 0443/99 0 13 7 50

15 IABD 97/0781-C 98-03094-8

14 5 39 52

16 JFS 27473 3640-A 5 8 14 76

17 MFA PC99/0323 38409/99 0 9 53 18

18 JP 314214 322802 10 3 32 29

19 APD 318829 319319 12 0 41 5

20 JRM 3022453 0340741-A 4 0 68 0

21 WL 0295380-A 294930 1 3 55 47

22 HMJ 293789 302731 0 0 63 46

23 NP U98-02045 098-1416 0 3 46 49

24 LPI 99031/98 B99-1968 10 52 20 37

25 EF 336627 P96/1949 0 1 29 37

26 MLBR 328982 329841-A 0 0 25 2

27 ATY 330850 330850-L 4 10 14 29

28 JMN 43204-A 029976-8 2 5 24 36

29 ACR B93-327031-F

4569/94 0 0 122 52

30 JPS AP 2539/03 3316/03 18 7 30 0

31 BASM AP 5632/02 33478 11 9 35 6

32 BFB VB 754 U03-012030

35 53 8 15

33 AJR AP 2451/03 PC-516/03 19 18 87 4

34 KS AP-3688/02 AP-7232/02

1 6 53 23

35 ARS AP-4620/03 B04-7880 4 5 0 0

36 AAS AP-451302 AP-5359-01

4 10 72 50

34

TABELA IV

–Valores Imunohistoquímicos de Ciclina D1 e c-erbB-2 dos doentes do

grupo II expressos em porcentagens (%)

Caso Nº

Paciente

Nº Bloco

Tu.

Primário

Nº

Bloco

META

c-erbB–2

Tu.

c-erbB-

2

META

1 - 54807-A - 0 - 33 -

2 - 55148 - 0 - 0 -

3 - 52149 - 8 - 6 -

4 - 97-4904 - 0 - 0 -

5 - 53222 - 0 - 0 -

6 - B/93-708 - 0 - 0 -

7 - 39087 - 0 - 0 -

8 - 624322 - 0 - 0 -

9 - 39050 - 8 - 0 -

10 - 43394 - 21 - 15 -

11 - B94-1582 - 0 - 0 -

12 - B94-342 - 0 - 0 -

13 - 2237 - 13 - 9 -

14 - 96-3520-A

- 14 - 18 -

15 - B86-963 - 0 - 0 -

16 - B94-1638 - 0 - 2 -

17 - B94-1135 - 0 - 19 -

18 - B96-3462 - 1 - 3 -

19 - 39050-G - 0 - 0 -

20 - 95-726 - 0 - 0 -

21 - B92-1874 - 0 - 0 -

22 - B88-2359 - 10 - 50 -

23 - 3688 - 1 - 53 -

24 - 51-8820 - 2 - 9 -

25 - 54-5512 - 5 - 15 -

26 - 60-2105 - 3 - 64 -

35

Determinação de índices imunohistoquímicos de Ciclina D1 e c-

erbB-2

Para Ciclina D1 a coloração castanho dos núcleos é considerada como uma evidência

da expressão dos antígenos através das células tumorais. ( FIGURA 1 ).

Figura 1- Fotomicrografia- 400x. A coloração castanho dos

núcleos evidencia a expressão de ciclina D1.

36

A coloração castanho no citoplasma das células, mostram a positividade do antígeno

C-erbB-2. ( FIGURA 2 )

Figura 2- Fotomicrografia- 400x. A coloração castanho no

citoplasma demonstra a positividade do c-erbB-2

37

Para determinação dos índices de expressão imunohistoquímica, foi utilizada a

técnica do point-couting ( FIGURA 3 ) . Ao aumento de 400X, foram examinados 10

campos microscópicos não-coincidentes, em cada caso, para quantificar todos os pontos que

recaem sobre as porções coradas, totalizando 1000 pontos que cobrem uma área de 62,500

micrometros quadrados por campo de estudo. Estes pontos representam a proporção de

células coradas, positivamente, em área de tecido tumoral. Os índices de proliferação

imunohistoquímicos (IPI) são obtidos pela seguinte relação:

IPI= Pih = (% da seção)

Pt

Onde Pih e Pt são os números de pontos que se localizam sobre tecido corado de

células tumorais, respectivamente, expressos em porcentagem.

Para todos os procedimentos morfométricos, uma estimativa de erro ( CE ) é

calculada pela relação:

CE = SE

Mean

Onde SE representa o erro padrão da média.

Considerando o número de pontos contados, CE é mantido abaixo de 10% em todas

as medidas morfométricas.

* SE = Standard error

** Mean = média

38

Figura 3- Fotomicrografia de lâmina de tumor em aumento de 400x, demonstrando a aplicação do retículo na

quantificação da expressão imunohistoquímica - Técnica do point-counting.

Quantificam-se os pontos que recaem sobre as porções coradas do tumor.

39

Análise Estatística

Os valores individuais dos marcadores Ciclina D1 e c-erbB-2, a média, valores

máximos,mínimos e o desvio padrão para cada parâmetro avaliado foram colocados em

tabelas. Antes de proceder à analise dos dados, foi feita a estatística descritiva e ilustrada

graficamente.

Para verificar as diferenças nos índices entre o tumor primário e as metástases,

procedeu-se à análises formais dos dados.

Análise estatística dos doentes do Grupo I ( n= 36 ) – refere-se ao grupo de doentes em que

se dispunha dos índices de Ciclina D1 e c-erbB-2 no tumor primário e nas metástases

hematogênicas.

A primeira análise avaliou as diferenças e associações entre a expressão dos

marcadores Ciclina D1 e c-erbB2 no tumor primário e suas respectivas metástases.

Trabalhou-se com as médias e como as medidas são variáveis do mesmo paciente utilizou-se

o teste T para amostras pareadas.

A segunda análise comparou a expressão dos marcadores Ciclina D1 e c-erbB-2

no tumor primário, avaliando se existe diferença na expressão dos marcadores entre tumores

que apresentaram metástases (Grupo I , n=36 ) e aqueles que não apresentaram (Grupo II ,

n=26 ). Utilizou-se o teste T não-pareado (Teste de Levene ).

Todos os procedimentos usados na análise estatística foram feitos usando o programa

e o software SPSS ( SPSS Inc;Chicago,IL ).

Para cálculo de sobrevivência, utilizou-se as curvas de Kaplan Meyer.

O nível de significância adotado foi de 5% ( p<0,05 ).

40

V - RESULTADOS

Os resultados foram expressos em gráficos e tabelas.

Expressão de Ciclina D1 e c-erbB-2

A Tabela V mostra os valores individuais da Ciclina D1 e do c-erbB-2 separados no

tumor primário e nas metástases .

TABELA V - Valores individuais da Ciclina D1 e do c-erbB-2 no tumor primário e

nas metástases em 36 doentes do Grupo I e no tumor primário em 26 doentes do

grupo II de CCNP.

Pacientes

Ciclina D1

T

(%)

Ciclina D1

M

(%)

c-erbB2

T

(%)

c-erbB2

M

(%)

1

0 3 25 59

2

20 3 34 86

3

0 1 76 85

4

20 0 65 6

5

18 1 6 17

6

23 3 33 71

7

18 0 62 0

8

63 1 73 72

9

3 0 33 32

10

21 0 6 63

11

0 3 86 28

12

16 5 18 12

13

13 0 6 31

14

13 0 7 50

15

14 5 39 52

16

15 8 14 76

17

19 0 53 18

18

50 3 32 29

19

62 0 41 5

20

14 0 68 0

21

3 1 55 47

22

22 0 63 46

23

31 0 46 49

24

1 52 2 37

25

20 1 29 37

26

13 0 25 2

27

14 1 14 29

28

52 5 24 36

29

0 0 122 52

30

58 7 30 0

41

31

11 9 35 6

32

135 53 8 15

33

59 18 87 4

34

1 6 53 23

35

4 5 0 0

36

4 10 72 50

37

0 . 33 .

38

0 . 0 .

39

8 . 6 .

40

0 . 0 .

41

0 . 0 .

42

0 . 0 .

43

0 . 0 .

44

0 . 0 .

45

8 . 0 .

46

21 . 15 .

47

0 . 0 .

48

0 . 0 .

49

13 . 9 .

50

14 . 18 .

51

0 . 0 .

52

0 . 2 .

53

0 . 19 .

54

1 . 3 .

55

0 . 0 .

56

0 . 0 .

57

0 . 0 .

58

10 . 50 .

59

1 . 53 .

60

2 . 98 .

61

5 . 15 .

62

3 . 64 .

Abreviações: T= tumor primário ; M = metástases.

42

1.Análise das diferenças e associações entre os marcadores no

Tu. Primário e nas metástases ( dentro do Grupo I ).

EXPRESSÃO DE CICLINA D1

TESTE T PAREADO

Este teste analisou se há diferença entre a expressão dos marcadores no tumor

primário e suas respectivas metástases. As tabelas abaixo demonstram os cálculos estatísticos

(Teste para variáveis dependentes ). Foram utilizadas as médias para a Ciclina D1.

Estatística das amostras pareadas

Média

N Desvio

padrão

Erro

padrão da

média

Grupo 1 Ciclina no

tumor

14,2806

36 18,8533 3,1422

Ciclina na

nMetastase

2,3117 36 3,8184 ,6364

Correlação de amostras pareadas

N Correlação

Sig.

grupo 1 Ciclina no

Tumor e

Metastase

36 ,415 ,012

Teste para amostras pareadas

Diferenças

pareadas

Média

Desvio

padrão

Erro

padrão da

média

95% Intervalo

de confiança

da diferença

inferior superior

Grupo 1 Ciclina

Tumor e

Metastase

11,9689 17,6142

2,9357 6,0091 17,9287

t df Sig. (2-tailed)

4,077 35 ,000

43

Observou-se que existe diferença, estatisticamente, significante entre as variáveis

analisadas

. p=0,000

A expressão de Ciclina D1 é, significantemente, maior no tumor primário do que em

sua respectiva metástase ( Fig. 4 ).

3636N =

metástasetumor primário

95%INTERVALO DE CONFIANÇA (CICLINA D1)

30

20

10

0

Figura 4 - O gráfico demonstra a expressão de Ciclina D1 no Tumor primário e em sua respectiva

metástase hematogênica em 36 doentes do Grupo I ( p=0,000 ) .

44

EXPRESSÃO DE c-erbB-2

As tabelas abaixo demonstram os cálculos estatísticos (Teste para variáveis

dependentes ). Utilizou-se as médias para o c-erbB2 .

Estatística para amostras pareadas

Média

N Desvio

Padrão

Erro

padrão da

média

Grupo 1 c-erbB-_TU

22,3756

36 24,0423 4,0070

c-erbB_ME 34,0278

36 25,9862 4,3310

Correlação das amostras pareadas

N Correlação

Sig.

Grupo 1 c-erbB_TU &

cerbB_ME

36 -,312 ,064

Teste para amostras pareadas

Diferenças

pareadas

t df Sig. (2-

tailed)

Média Desvio

padrão

Erro

padrão da

média

95%

Intervalo, de

confiança

da diferença

inferior

superior

Grupo 1

c-erbB_TU –

c-erbB_ME

-11,6522

40,5352

6,7559 -25,3673 2,0629

-1,725 35 ,093

45

Para o c-erbB-2, foi obtido uma diferença relevante, porém não-significante

(significância marginal ) entre as médias de expressão de c-erbB-2 nos tumores primários e

suas respectivas metástases. p= 0,093 ( p>0,05 ).

3636N =

metástasetumor primário

95% INTERVALO DE CONFIANÇA (c_erbB-2)

50

40

30

20

10

Figura 5 – O gráfico demonstra a expressão de c-erbB-2 no tumor primário e em suas respectivas metástases

nos doentes do grupo I. Observar que houve diferença relevante entre as médias da expressão do marcador ,

porém não-significante (p=0,093 ) .

46

2. Análise da Expressão dos marcadores entre os doentes do

Grupo I ( com metástase ) e do Grupo II ( sem metástases ).

Utilizou-se o Teste T não-pareado ( Teste de Levene ) para grupos independentes

para comparar a expressão dos marcadores na amostra total de tumores primários ( N= 62 ) .

Avaliou-se se existem diferenças entre a expressão dos marcadores nos tumores primários

que apresentaram metástases ( Grupo I, n =36 ) comparados àqueles que não apresentaram

metástases (Grupo II, n=26 ).

47

CICLINA D1

As tabelas abaixo demonstram os cálculos estatísticos da ciclina D1 nos tumores

com e sem metástases.

Estatística Descritiva

CICLINA

N Média Desvio

Padrão

Erro padrão

95% intervalo

de confiança

para média

Mínimo

Máximo

Limite inferior

Limite

superior

,00 26 3,3077 5,6197 1,1021 1,0378 5,5776 ,00 21,00

1,00 36 14,2806 18,8533 3,1422 7,9015 20,6596 ,00 62,00

Total 62 9,6790 15,7063 1,9947 5,6904 13,6677 ,00 62,00

Teste de homogeneidade de variâncias

CICLINA

Teste de

Levene

df1 df2 Sig.

15,511 1 60 ,000

As variâncias dos dois grupos são diferentes.

Teste para amostras independentes

Teste de

Levene para

igualdades de

variânçias

teste -

t para

igualdade de

médias

F Sig. t df Sig. (2-

tailed)

Diferença

da média

Diferença

do err

o

padrão

Ciclina

Variânçias iguais

assumidas

15,51

1

,000 -2,871 60 ,006 -10,9729 3,8218

Variânçias iguais

não-assumidas

-3,295 43,225 ,002 -10,9729 3,3299

95%

intervalo

de confiança da

diferença

48

inferior superior

-18,6176 -3,3282

-17,6872 -4,2585

Quando comparou-se a expressão da oncoproteína Ciclina D1 nos tumores que

apresentaram metástases (Grupo I ) com aqueles que não apresentaram ( GrupII ),

verificou-se que existe diferença, estatisticamente significante, em relação `a expressão de

Ciclina, ou seja, a expressão desse marcador tumoral é mais evidente em tumores que

apresentaram metástases hematogênicas . ( p = 0,002 ) (Fig. 6 ).

3626N =

com metástasesem metástase

95% INTERVALO DE CONFIANÇA (CICLINA)

30

20

10

0

-10

Figura 6 - Observar a expressão de Ciclina D1 nos tumores que apresentaram metástases ( Grupo I ) e nos do

Grupo II . A expressão desse marcador tumoral é mais evidente nos tumores do Grupo I que apresentaram

metástases hematogênicas ( p = 0,002 ).

49

c-erbB-2

As tabelas abaixo demonstram os cálculos estatísticos da expressão de c-erbB-2 no

tumores com e sem metástases.

Grupo estatístico

Metástase N Média Desvio Padrão

Erro padrão da

média

c-erbB-2_TU ,00 26 14,8077 25,0296 4,9087

1,00 36 22,3756 24,0423 4,0070

Teste para amostras independentes

Teste de

Levene

para

igualdade

de

variançias

t-teste

para

igualdade

de médias

F Sig. t df Sig. (2-

tailed)

Diferença

média

Diferença

erro

padrão

95%

Intervalo

de

confiança

da

diferença

inferior Superior

c-EbB

-TU

Variânçias

iguais

assumidas

,294 ,589 -1,202 60 ,234 -7,5679 6,2949 -20,1595 5,0238

Variânçias

iguais

não-

assumidas

-1,194 52,703 ,238 -7,5679 6,3365 -20,2790 5,1433

50

Observou-se, pelo teste de Levene, que as variâncias são iguais. Não foi observada

diferença, estatisticamente significante, entre a expressão de c-erbB2 no tumor com

metástase quando comparado com o tumor sem metástase ( p= 0,234)

(Fig.7 ) .

3626N =

com metástasesem metástase

95% INTERVALO DE CONFIANÇA (c_erbB-2)

40

30

20

10

0

Figura 7 – Este gráfico demonstra que não foi observada diferença, estatisticamente significante, entre a

expressão de c-erbB-2 nos tumores com metátase ( Grupo I ) quando comparados com os tumores sem

metástases ( Grupo II ) ( p > 5%) .

51

3. Análise da Interação de Ciclina D1 e c-erbB-2 e sobrevida

Houve o interesse de se analisar se as alterações nos reguladores do ciclo celular (

Ciclina D1) e nos receptores de fatores de crescimento (c-erbB-2 ) têm valor preditivo de

sobrevida.

Para a análise da sobrevida, os doentes foram agrupados em 2 sub-grupos : os que

apresentavam Ciclina D1 abaixo e acima do ponto de corte ( 2% de expressão de células

tumorais ) e os que apresentavam valores de c-erbB-2, maior ou menor que 6% ( ponto de

corte ). Observou-se que a sobrevida global diferiu, significantemente, nos dois grupos ,com

baixa e elevada expressão dos marcadores ( p< 0,05 ).

A superexpressão de ciclina D1 ( ponto de corte = 2% ) e de c-erbB-2 ( ponto de

corte = 6% ) tiveram valor prognóstico e foram associados com menor sobrevida. ( Figura

8 A e B ). Em análise multivariada, o risco de recorrência nos pacientes, nos quais os

tumores superexpressaram a Ciclina D1 ( > 2% ) e c-erbB-2 ( > 6% ) foi mantido após

o ajustamento por idade e estádio de doença (p= 0,001). O risco estimado para

recorrência foi 1,30 no grupo, com superexpressão de ciclina D1 e c-erbB-2, comparado ao

grupo com subexpressão em aproximadamente 95% CI ( 1,01 –1,41 ).

Entretanto, observou-se maior valor de significância e maior diferença de sobrevida

entre os sub-grupos para o marcador Ciclina D1 ( p= 0,007; p=0,7% ) – Figura 8A,

enquanto que para o marcador cerbB-2, as diferenças de sobrevida tiveram um valor de

significância menor ( p= 0,03; p= 3% ) - Figura 8 B.

52

Figura 8 A - Sobrevida global dos pacientes cujos tumores tinham alterações de superexpressão de ciclina D1

( >2% ) comparados àqueles com subexpressão (<2%) [ Log Rank = 7,27 ; p=0.007 ].

MESES

100

80

60

40

20

0

SOBREVIDA GLOBAL

1.2

1.0

.8

.6

.4

.2

0.0

-.2

Expressão Ciclina D1

> 2%

< 2%

> 2%

53

Figura 8 B-Sobrevida global dos pacientes cujos tumores tinham superexpressão ( >6% )

de C-erbB2 comparados àqueles com subexpressão (< 6%) [ Log Rank = 4,367; P=0,03 ].

Figura 8 B - Sobrevida global dos pacientes cujos tumores tinham superexpressão ( >6% ) de c-erbB-

2 comparados àqueles com subexpressão (< 6%) [ Log Rank = 4,367; p=0,03 ].

B

MESES

100

80

60

40

20

0

SOBREVIDA GLOBAL

1.2

1.0

.8

.6

.4

.2

0.0

Expressão c-erbB2

> 6%

censurado

< 6%

54

VI – DISCUSSÃO

Para o estudo dos marcadores Ciclina D1 e c-erbB-2, procurou-se homogenizar a

amostra. Foram escolhidos, apenas, os tipos histológicos de carcinomas de células não-

pequenas. Estes tumores apresentam maior uniformidade nos critérios de estadiamento e,

sobretudo, semelhanças nas formas de tratamento e na evolução clínica.

O carcinoma de células não pequenas de pulmão, freqüentemente, apresentam

metástases hematogênicas para órgãos distantes. Os locais usuais de metástases a distância

incluem o cérebro, os pulmões, os ossos, as supra-renais e o fígado. As metástases podem

estar presentes, ao mesmo tempo, no tumor primário ou ocorrerem mais tarde podendo ser

simples ou múltiplas. Aproximadamente, 60% dos pacientes com CCNP de pulmão

apresenta doença disseminada por ocasião do diagnóstico e apenas 15 a 20 % do total

sobrevivem 5 anos.

Os motivos para a divisão da amostra em dois grupos, grupo I ( Grupo tumor +

metástase ) e grupo II ( grupo tumor ) foram as semelhanças no comportamento clínico,

no tratamento e no prognóstico observadas nesses grupos. Os doentes do grupo I

compreendiam aqueles portadores de doença em estádios avançados, geralmente IIIB e IV, e

que se dispunha de amostras do tumor primário e das correspondentes metástases

hematogênicas . É sabido que os doentes, que por ocasião do diagnóstico apresentam

metástases hematogênicas, ou que as desenvolvem no período pós-operatório, têm um tempo

de sobrevivência menor do que os do grupo sem metástases ( grupo II ); ( MOUNTAIN,

1997 ).

O estadiamento anatomopatológico foi o que ratificou e definiu a amostra nesses 2

grupos.

O papel da quimioterapia no tratamento do CCNP não está totalmente compreendido

e existem controvérsias a cerca dos seus benefícios quando a doença é avançada.

Existem recentes estudos focalizando a identificação de marcadores teciduais que

possam predizer uma resposta ao tratamento, a taxa de crescimento tumoral, o potencial de

metástase e à taxa de sobrevivência dos pacientes.( RODRIGUES e cols.,1997 &

ANTONANGELO e cols-1997 &BATTLEHNER e cols- 1993).

A oncoproteína c-erbB-2 está presente em uma variedade de tecidos tumorais sendo

sua expressão demonstrada no citoplasma das células cancerígenas. Embora o c-erbB-2

55

tenha sido estudado extensivamente em câncer de mama existe pouca informação referente

ao seu valor prognóstico em câncer de pulmão ( HAN e cols.,2002 ).

A proteína Ciclina D1 é um anticorpo monoclonal específico e demonstrada no

núcleo das células tumorais. A superexpressão da Ciclina D1 é encontrada em 25 a 47 % dos

CCNP de pulmão ( VOLM e cols. & CASTRO e cols.,2001).

Quando se analisou a expressão dos marcadores isoladamente,nos tumores primários

e nas metástases, sem dividi-los em grupos, os resultados de nossa investigação

demonstraram que a expressão do oncogen c-erbB-2 e da oncoproteína Ciclina D1 tiveram

um comportamento distinto e diferente nos tumores primários e em suas metástases

hematogênicas.

A expressão de Ciclina D1 mostrou-se, significantemente, maior no tumor primário

do que em sua respectiva metástase. Observou-se que existe diferença, estatisticamente

significante, entre as variáveis analisadas ( Ciclina no tumor primário versus Ciclina nas

metástases ), p=0,000.

Embora os clones das células que se destacam do tumor primário, para formar suas

metástases hematogênicas, possam representar caráter mais agressivo; estas células

apresentaram hipo- expressão de Ciclina D1.

Em relação ao marcador c-erbB-2, foi observado o inverso, ou seja a expressão de c-

erbB-2 é maior nas células tumorais das metástases hematogênicas. Obteve-se uma

diferença relevante, porém não-significante (significância marginal ), entre as médias de

expressão de c-erbB-2 nos tumores primários e suas respectivas metástases, p= 0,093 (

p>0,05 ). Não existem registros na literatura comparando a expressão desses marcadores em

tumores pulmonares e suas correspondentes metástases hematogênicas para que pudéssemos

cotejar esses dados.

Quando se analisou a expressão dos marcadores nos doentes estratificados em grupo

I ( com metástases ) e grupo II ( sem metástases ), demonstrou-se também que a expressão

de Ciclina D1 nos tumores que apresentaram metástases ( Grupo I ) foi maior que nos

doentes do Grupo II. A expressão desse marcador tumoral é mais evidente nos tumores do

Grupo I que apresentaram metástases hematogênicas. Este achado é relevante ao oncologista,

ao clínico e ao cirurgião, posto que direciona a hiperexpressão de Ciclina D1, com um

provável potencial de metástase do tumor ressecado. Este fato coloca a Ciclina D1 como um

marcador de metástase e, conseqüentemente, com valor preditivo de recorrência e de

sobrevivência dos pacientes tratados. A Ciclina D1 demonstrou ter valor prognóstico no

56

potencial de aparecimento de metástases em doentes operados, mesmo nos estádios não-

avançados.

Os resultados foram coincidentes com os observados por GUGGER e cols. (

2001) & POLAN e cols. (2003), o de que havia diferenças significativas entre os grupos de

tumores que apresentaram expressão positiva de Ciclina D1 ( menor tempo de sobrevivência

) em relação àqueles que apresentaram subexpressão da molécula de Ciclina D1, o que

caracterizou esse marcador como um indicador de mal prognóstico em doentes operados de

CCNP de pulmão.

DRAGNEV e cols.,( 2003), também observaram que a hipoexpressão de Ciclina D1

tem um papel protetor na carcinogênese pulmonar, enquanto que sua hiperexpressão foi

acompanhada de alto risco de recorrência de metástases nos doentes operados.

Estudos recentes consideram a expressão de Ciclina D1, nos tumores de pulmão, um

importante elemento para a aplicação de químio prevenção (PETTY e cols.,2003).

Referente ao c-erbB-2 não foi observada diferença estatisticamente significante entre

a expressão de c-erbB-2 nos tumores com metástase, quando comparados com o grupo de

doentes com tumores sem metástases( p= 0,234), achado este, que faz supor que a

expressão de c-erbB-2 não tem valor preditivo para o desenvolvimento de metástases.

Com referência ao tempo de sobrevivência dos doentes ,estratificados em 2 sub-

grupos, observou-se que a sobrevida global diferiu significantemente nos dois grupos, com

baixa e elevada expressão dos marcadores ( p< 0,05 ). A superexpressão de Ciclina D1 e c-

erbB-2 tiveram valor prognóstico e foram associados menor sobrevida e com menor tempo

livre de doença .

Em análise multivariada, o risco de recorrência nos pacientes nos quais os tumores

superexpressaram a Ciclina D1 e c-erbB-2 foi mantido após o ajustamento por idade e

estádio ( p= 0,001 ). O risco estimado para recorrência foi 1,30 no grupo com

superexpressão de Ciclina D1 e c-erbB-2 comparado ao grupo com subexpressão em,

aproximadamente, 95% CI ( 1,01 –1,41 ).

A sobrevida global dos pacientes cujos tumores tinham alterações de superexpressão

de Ciclina D1 ( >2% ) foi menor quando comparados àqueles com subexpressão (<2%) [

Log Rank = 7,27 ; p=0.007 ].

Em análise multivariada, a sobrevida global dos pacientes cujos tumores tinham

superexpressão ( >6% ) de c-erbB-2, também foi menor quando comparados àqueles com

subexpressão (< 6%) [ Log Rank = 4,367; p=0,03 ].

57

Existem divergências na literatura quanto ao valor preditivo de sobrevida e a

expressão de c-erbB-2 e Ciclina D1.

CASTRO e cols., (2001 ) não encontraram correlação entre a expressão de Ciclina

D1 e parâmetros clínicos em doentes operados de adenocarcinomas bronquíolo alveolar de

pulmão. Entretanto a amostra deste estudo não continha este tipo histológico em que

trabalhou esse autor.

Outros resultados discrepantes também foram observados por COX e cols (2001) ;

MOLDVAY e cols., (2000) que, também,não encontraram correlação entre a imuno-

expressão do marcador c-erbB-2 e valor prognóstico de sobrevida em câncer de pulmão.

Entretanto esses autores não trabalharam com a imuno-expressão dos marcadores em

metástases hematogênicas e tampouco em grupos de doentes tratados em estádios avançados

de doença.

Contrapondo-se a esses achados, RASTSCHILLER e cols., ( 2003) observaram que a

hiperexpressão de Ciclina D1 relaciona-se com pior prognóstico em doentes operados de

CNPC de pulmão, observações coincidentes em relação aos resultados deste estudo.

58

VII – CONCLUSÕES

1 - A hiperexpressão do marcador Ciclina D1 relacionou-se com maior potencial de

aparecimento de metástases hematogênicas e com menor tempo de sobrevivência em

doentes operados de CCNP de pulmão.

2 - A expressão de c-erbB-2 não tem valor preditivo para o desenvolvimento de metástases.

3 - Em análise multivariada a hiperexpressão do marcador c-erbB-2 relacionou-se com

menor tempo de sobrevivência em doentes operados de CCNP de pulmão.

59

VIII- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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3-Bernardi FC; Antonângelo L; Beyru TR; Takagaki T; Saldiva PHN; Capelozzi VL.- A

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Histopathology 1997; 31: 420-429.

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64

IX- NORMAS ADOTADAS

- Conselho Nacional de Saúde – Resolução nº 196 de outubro de 1996.

Normas de pesquisa em saúde- ( D.O.U. 18/10/1996 ).

- Associação Brasileira de Normas Técnicas . Apresentação de originais :

NB-1139. Rio de Janeiro,1990.

- International Anatomical Nomenclature Committee

Nomina anatômica .5.ed. Rio de Janeiro , Medsi, 1987. 110p.

- Fagundes DJ. Normas para citações e referências [ Disponível em

http//www.epm.br/dcir/toce/pg]. São Paulo : UNIFESP-EPM-TOCE,2001.

- DeCS- Descritores em Ciências da Saúde.3ª ed. São Paulo, Bireme, 1992. 1111p.

- GOLDENBERG, S.- Orientação normativa para elaboração de tese, instruções e normas

para referências bibliográficas. São Paulo, Ed. Particular,1996.

65

X- APÊNDICE E ANEXOS

66

TABELA VI- Dados individuais dos pacientes do grupo I ANEXO I

Caso Nº Nome Idade

Sexo

Grupo TNM

E C

Local da

metastase

Causa

mortis

STATUS

sobrev.

após

cir.

TU.

sobrev.

após

diagn.

META

Ciclin

a D1

TU

Ciclina

D1

META

c-

erbB-2

TU

c-

erbB-

2

META

1 PF 72 M T4NxM1 IV pulmâo

intra lobar

insuf.resp 9 9 0 3 25 59

2 AVSF 75 M T2 NO MI IV pared.toraci

..

met.mult. 6 6 0 3 34 86

3 AMS 73 F T3N0M1 IV Diafragma

fratura

nultipla

11 11 0 1 76 85

4 LMS 68 M T3N3M1 IV Clavícula met.mult. 8 3 0 0 65 6

5 IJB 67 F T3 Nx M1 IV Costela met.multi. 10 9 11 18 6 17

6 AM 60 M Tx Nx M1 IV Cérebro Meta .cere.

12 10 23 3 33 71

7 LFK 54 M Tx Nx M1 IV Costela Frat.pat. 14 14 18 0 62 0

8 RCPF 62 F T3N0M1 IV Cérebro Meta .cereb.

23 12 1 63 73 72

9 AWG 51 M T2N2M1 IV Fígado Insuf Resp.

33 25 3 0 33 32

10 NVS 59 M T2N3M1 IV P.contra

lateral

Insuf Resp.

97 53 21 0 60 63

11 JOJ 52 M T4N2M1 IV Cérebro AVC 39 39 0 3 86 28

12 JBS 54 M Tx Nx M1 IV Fígado meta.cereb.

8 8 6 5 18 12

13 MM 54 M T xNx M1 IV Cérebro meta.cereb.

3 3 0 3 6 31

14 JP 56 F Tx Nx M1 IV Cérebro meta.cereb.

10 17 0 13 7 50

15 IABD 49 F T2N2M1 IV Cérebro meta.cereb.

35 12 14 5 39 52

16 JFS 61 M T1N1M1 IV Osso Meta.

multi..

46 17 5 8 14 76

17 MFA 42 F T4N3M1 IV Cérebro meta.cereb.

12 7 0 9 53 18

18 JP 59 M Tx Nx M1 IV Osso Insu.respi. 11 3 10 3 32 29

19 APD 62 M TxNx M1 IV Osso sind.consup.

3 2 12 0 41 5

20 JRM 58 M T3N3M1 IV P.contra

lateral

IAM+meta

ósseas

62 8 4 0 68 0

21 WL 52 M Tx Nx M1 IV Cérebro múltip.meta

.

22 21 1 3 55 47

22 HMJ 55 F Tx Nx M1 IV partes

moles

sind.consup

55 12 0 0 63 46

23 NP 67 M Tx Nx M1 IV cérebro sind.consup.

5 5 0 3 46 49

24 LPI 56 F Tx Nx M1 IV supra renal

insuf.resp. 24 23 10 52 20 37

25 EF 59 F Tx Nx M1 IV cérebro meta.cereb.

5 3 0 1 29 37

26 MLBR 57 F Tx Nx M1 IV osso insuf resp. 10 10 0 0 25 2

27 ATY 38 M T xN3 M1 IV P.contra

lateral

insuf.resp. 15 15 4 10 14 29

28 JMN 69 M Tx Nx M1 IV part.moles insuf.resp. 3 1 2 5 24 36

29 ACR 72 M T2N2M1 IV P.contra

lateral.

caquexia 62 46 0 0 122 52

30 JPS 52 M T2N2M1 IV Parede

torácica

insuf.resp. 28 2 18 7 30 0

31 BASM 63 M T2N0M1 IV cérebro meta.cereb.

18 9 11 9 35 6

32 BFB 73 M T2N1M1 IV P. contra

lateral

Vivo 42 13 35 53 8 15

33 AJR 64 M TxNx M1 IV partes

moles

insuf.resp. 1 1 19 18 87 4

34 KS 87 f T1N1M1 Lv partes

moles

insuf.resp. 6 3 1 6 53 23

35 ARS 64 F T2N2M1 LV axila Vivo 10 5 4 5 0 0

36 AAS 64 F T2N2M1 LV cérebro Vivo 24 36 4 10 72 50

67

TABELA VII -Dados individuais dos pacientes do grupo II ANEXO II

caso

Nº Bloco

idade

sexo

TN M E C

sobrevida

Ciclina D1

c-erbB-2

STATUS

1 54807-A 79 F T3N2M0 IIIA

41 0 33

Óbito

2 55148 63 M T1N0M0 IA 42 0 0

Vivo

3 52149 65 F T2N1M0 IIB 50 8 6

Óbito

4 97-4904 79 M T2N0M0 IB 48 0 0

Vivo

5 53222 57 F T3N0M0 IIB 52 0 0

Vivo

6 B/93-708 63 M T1N3M0 IIIB 43 0 0

Óbito

7 39087 56 F T2N1M0 IIB 39 0 0

Vivo

8 624322 56 M T1N0M0 IA 43 0 0

Vivo

9 39050 56 F T2N1MO

IIB 39 8 0

Vivo

10 43394 50 F T2N0M0 IB 48 21 15

Vivo

11 B94-1582 72 F T1N0M0 IA 50 0 0

Vivo

12 B94-342 65 M T2N0M0 IB 62 0 0

Vivo

13 2237 55 M T2N0M0 IB 47 13 9

Vivo

14 96-3520-A

62 F T2N0M0 IB 50 14 18

Vivo

15 B86-963 64 F T1N0M0 IA 65 0 0

Vivo

16 B94-1638 56 M T2N0M0 IB 60 0 2

Vivo

17 B94-1135 58 F T1N0M0 IA 63 0 19

Vivo

18 B96-3462 70 F T2N0M0 IB 58 1 3

Vivo

19 39050-G 64 M T1N0M0 IA 59 0 0

Vivo

20 95-726 61 F T1N0M0 IA 48 0 0

Vivo

21 B92-1874 58 F T2N0M0 IB 47 0 0

Vivo

22 B88-2359 75 M T4N0M0 IIIB 49 10 50

Óbito

23 3688 64 M T4N0M0 IIIB 53 1 53

Óbito

24 51-8820 69 M T2N0M0 IB 50 2 9

Vivo

25 54-5512 62 F T2N0M0 IB 49 5 15

Vivo

26 60-2105 63 F T2N0M0 IB 53 3 64

Vivo

68

ANEXO III

Paciente Nº_____

TERMO DE CONSENTIMENTO

(Resolução nº 196 de 10 de outubro de 1996 do Conselho Nacional de Saúde e atribuições

conferidas pelas leis nº 8080 de 19 de setembro de 1990 e lei nº 8142 de dezembro de 1990)

Eu ....................................................................................................................... RG nº

............................................................., em pleno estado das minhas faculdades mentais, após

ouvir e ter entendido a explicação completa e pormenorizada sobre a natureza da pesquisa, e

seus objetivos nesse estudo científico, expresso neste termo de consentimento minha

participação voluntária no estudo sobre: “ESTUDO DO MARCADOR NUCLEAR

CICLINA D1 E DA ONCOPROTEÍNA c-erbB-2 EM PACIENTES COM CARCINOMA

DE PULMÃO DE CÉLULAS NÃO-PEQUENAS AVALIADOS NO TUMOR PRIMÁRIO

E NA METÁSTASE “

Fica assegurada a garantia do sigilo quanto a privacidade dos dados confidenciais envolvidos

nessa pesquisa.

________________________ __________________________

Coordenador da pesquisa Pesquisador / Responsável

Data: _____ / _____ / _____

69

PROTOCOLO DE PESQUISA ANEXO IV

DADOS DO PACIENTE

Identificação:

Paciente nº: ___________ Data da coleta : ____/____/____

Nome: ______________________________________________________________

Sexo: _____________ Idade: ________ Raça: _________________

Institutição: ____________________________________________________________

Nº Registro hospital (SAME):

TUMOR PRIMÁRIO:

Data do diagnostico: _____/_____/_____

Nº do Exame Anatomopatológico :_______________________________________

Diagnostico: _________________________________________________________

Laboratório de Patologia: _______________________________________________

Data da operação: _____/_____/_____

Tipo de operação (resecção) ou procedimento no TUMOR PRIMÁRIO:

- Biopsia Broncoscópica

- Biopsia Transtorácica

- Ressecção Cirúrgica : pneumonectomia / lobectomia /

outro____________________________

Dados Pré-operatórios:

Estádio TNM (ao diagnóstico): __________________Grupo TNM: _____________

Índice de Karnofsky ( PS ): _____________________________________________

METÁSTASE :

Local da metástase (orgão): __________________________________ ___________

cérebro / osso / pele / adrenal / pulmão / fígado / outro __________________

Data do diagnóstico da metástase: _____/_____/_____

Nº do Exame Anatomopatológico:________________________________________

Diagnóstico:

____________________________________________________________________

Laboratório de Patologia: _______________________________________________

Data da re-operação: _____/_____/_____

Tipo de re-operação ou procedimento na METÁSTASE: ______________________

- Ressecção Cirúrgica

- Biópsia Incisional

- Biópsia c/ agulha

Data do óbito: _____/_____/_____

Causa mortis: ___________________________________________________________

Vivo ( data ) : _____/_____/_____

Se vivo : sim _____ não _____ Com Doença: ______ Sem Doença_______

Follow up (meses): ___________________

Tempo de Sobrevivência após a primeira cirurgia (meses): ______________

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