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LUIZ ALBERTO PESSONI
ESTRATÉGIAS DE ANÁLISE DA DIVERSIDADE EM GERMOPLASMA DE
CAJUEIRO (Anacardium spp. L.)
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das
exigências do Programa em
Genética e Melhoramento, para
obtenção do título de Doctor
Scientiae.
VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL
2007
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Ficha catalográfica preparada pela Seção de Catalogação e
Classificação da Biblioteca Central da UFV
T
Pessoni, Luiz Alberto, 1965-
P475e Estratégias de análise da diversidade em germoplasma de
2007 cajueiro (Anacardium spp. L.) / Luiz Alberto Pessoni.
– Viçosa : UFV, 2007.
xiii, 159f. : il. ; 29cm.
Orientador: Cosme Damião Cruz.
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Viçosa.
Referências bibliográficas: f. 148-159.
1. Caju - Genética. 2. Caju - Populações. 3. Caju -
Melhoramento genético. 4. Análise multivariada .
5. Marcadores genéticos. 6. Anacardium ocidentale.
I. Universidade Federal de Viçosa. II.Título.
CDD 22.ed. 634.5732
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LUIZ ALBERTO PESSONI
ESTRATÉGIAS DE ANÁLISE DA DIVERSIDADE EM GERMOPLASMA DE
CAJUEIRO (Anacardium spp. L.)
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das
exigências do Programa em
Genética e Melhoramento, para
obtenção do título de Doctor
Scientiae.
APROVADA: 08 de março de 2007.
____________________________
Prof. Everaldo Gonçalves de Barros
(Co-orientador)
____________________________
Prof. Luiz Antônio dos Santos Dias
(Co-orientador)
_____________________________
Prof. Luiz Orlando de Oliveira
_____________________________
Dr. Levi de Moura Barros
________________________
Prof. Cosme Damião Cruz
(Orientador)
ii
Dedico este trabalho à minha família, em especial aos meus pais Romilda e Otílio (
in
memoriam
), como reconhecimento pelo esforço e incentivo dispensados para minha
qualificação profissional, mas, acima de tudo, para formação e aperfeiçoamento
pessoais.
iii
AGRADECIMENTO
À Universidade Federal de Viçosa e ao Programa de Pós-Graduação em
Genética e Melhoramento pela oportunidade de realização do curso.
À Universidade Federal de Roraima pela concessão de licença e apoio a
esta importante etapa da minha capacitação profissional.
Aos órgãos financiadores de pesquisa, pelo apoio à manutenção da
infraestrutura das instituições, em especial à Coordenação de Aperfeiçoamento
de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de estudo e
recursos financeiros para o trabalho de pesquisa, através do programa de
qualificação institucional (PQI).
À Embrapa Agroindústria Tropical pela disponibilização do material
genético de seu Banco Ativo de Germoplasma.
Ao Centro de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária da UFV (Bioagro),
nomeadamente aos Laboratórios de Bioinformática, Genética Molecular de
Plantas (BIOMOL) e de Sequenciamento de DNA, imprescindíveis na execução
deste trabalho.
Ao Professor Cosme Damião Cruz pelo incentivo, apoio, orientação e,
sobretudo, pela amizade, momentos de convívio e exemplo de conduta.
Aos professores Everaldo Gonçalves e Luiz Orlando pela motivação,
ensinamentos, disponibilização de espaço físico e recursos materiais para o
desenvolvimento da pesquisa.
Ao Dr. João Rodrigues de Paiva, pela acolhida e viabilização do trabalho
de campo na Embrapa Agroindústria Tropical.
Às servidoras da UFV, Maria Salvadora, Rita de Cássia e Rose Tomás,
pelo pronto atendimento às minhas solicitações.
Aos membros da banca examinadora, professores Everaldo, Luiz
Antonio, Luiz Orlando e doutor Levi de Barros, pelas críticas e contribuições
para a melhoria do trabalho.
A todos os colegas da UFV, em especial aos de laboratório: Adésio,
Ana, Andréia, Bia, Bruna, Carlos, Cassiana, Chico, Clever, Demerson, Gisele,
Geovane, Glauco, João Paulo, Jorge, Luciano, Maíra, Márcia Flores, Márcia
iv
Regina, Márcia Carvalho, Matheus, Nilton, Pedro, Polyana, Thiago, Valéria,
Willian, pelo convívio, amizade e paciência nos momentos difíceis.
Aos Amigos de todas as horas, Leonarda, Marcos, Fábio, Sônia e Kelly,
pelo companheirismo, momentos de alegria e descontração e, sobretudo, pelo
indispensável suporte emocional.
À Cláudia Pombo, Flávio e Lívia pela atenção e acolhida dispensada
durante o trabalho de coleta de dados em Campos RJ.
À Srª Cláudia Laranjeira pela simpática recepção e pronta autorização
para realização do trabalho de campo nos cajuais nativos de sua propriedade.
À Tereza Cristina e Mônica pela amizade e acolhida em Fortaleza.
Ao Professor Fabrizio D’Ayala Valva, da Universidade Federal de Goiás,
que foi sempre uma referência de dedicação e conduta profissional em minha
vida.
Aos professores, pesquisadores, funcionários e estagiários das diversas
instituições que, mesmo sem terem sido nomeados, contribuíram para minha
formação profissional e para a realização deste trabalho.
v
BIOGRAFIA
Luiz Alberto Pessoni, filho de Otílio Pessoni e Romilda Montagnini
Pessoni, nasceu em 18 de agosto de 1965, em Inhumas, Goiás.
Em dezembro de 1990, graduou-se em Agronomia pela Universidade
Federal de Goiás.
Em fevereiro de 1995, concluiu o curso de Mestrado em Genética e
Melhoramento de Plantas pela Universidade Federal de Goiás.
Foi Professor auxiliar, com contrato temporário, de bioestatística e
genética do Departamento de Biologia Geral da UFG, no período de março de
1994 a fevereiro de 1995.
A partir de março de 1995, tornou-se professor assistente do
Departamento de Biologia da Universidade Federal de Roraima, tendo sido
aprovado em concurso público para provimento de cargo efetivo em agosto de
1995. Atualmente é professor adjunto II do Departamento de Biologia desta
instituição.
Em março de 2003, Iniciou o curso de Doutorado no Programa de Pós-
Graduação em Genética e Melhoramento da UFV, submetendo-se à defesa de
tese em 08 de março de 2007.
vi
SUMÁRIO
Página
RESUMO ............................................................................................ x
ABSTRACT ........................................................................................ xii
1 INTRODUÇÃO GERAL ................................................................... 1
2 REVISÃO DE LITERATURA .......................................................... 6
2.1 O gênero Anacardium ............................................................... 7
2.1.2 Distribuição geográfica e hábito ................................................ 7
2.1.3 Morfologia floral ......................................................................... 8
2.1.4 Biologia reprodutiva ................................................................... 9
2.1.5 Cariótipo .................................................................................... 12
2.1.6 Análise cladística ....................................................................... 12
2.1.7 Descrição de algumas espécies e/ou ecótipos de Anacardium 14
2.2 Análises da Diversidade de Recursos Genéticos Aplicadas
a Caracteres Morfométricos .....................................................
16
2.2.1 Componentes principais ............................................................ 17
2.2.2 Análise discriminante ................................................................. 19
2.2.2.1 Análise discriminante canônica .............................................. 21
2.2.2.2 Análise discriminante baseada em distâncias de
Mahalanobis ...........................................................................
23
2.2.3 Análise de agrupamento ............................................................ 25
2.2.4 Aplicações de técnicas multivariadas na análise de
diversidade baseada em caracteres fenotípicos .......................
26
2.3 Marcadores Moleculares na Análise Genética Vegetal ........... 29
2.3.1 Marcadores ISSR ...................................................................... 31
2.3.2 Marcadores moleculares em cajueiro ....................................... 34
2.4 Análises da Diversidade de Recursos Genéticos Aplicadas
a Variáveis Binárias ....................................................................
36
2.4.1 Análise discriminante ................................................................. 36
2.4.2 Analise de variância molecular .................................................. 37
CAPÍTULO 1
ANÁLISE DA DIVERSIDADE EM Anacardium spp. BASEADA EM
DADOS MORFOMÉTRICOS
1 INTRODUÇÃO ................................................................................. 43
2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................ 45
2.1 Material vegetal ............................................................................. 45
2.2 Coleta de dados ............................................................................ 48
2.3 Análise da divergência entre ecótipos e/ou espécies de
Anacardium ...................................................................................
49
2.4 Análise de divergência segundo a origem geográfica de acessos
de Anacardium .............................................................................
49
vii
2.5 Análises dos dados ....................................................................... 50
2.5.1 Análise de variância ................................................................... 50
2.5.2 Análises discriminantes ............................................................. 51
2.5.3 Análise de agrupamento ............................................................ 52
3 RESULTADOS ................................................................................ 53
3.1 Análise da divergência entre ecótipos e/ou espécies de
Anacardium ...................................................................................
53
3.2 Análise de divergência segundo a origem geográfica de acessos
de Anacardium ..............................................................................
59
3.3 Análises de agrupamento ............................................................. 65
4 DISCUSSÃO .................................................................................... 69
4.1 Divergência entre ecótipos e/ou espécies de Anacardium ........... 69
4.2 Divergência segundo a origem geográfica de acessos de
Anacardium ...................................................................................
71
4.3 Análises de agrupamento ............................................................. 72
5 CONCLUSÕES ................................................................................ 74
CAPÍTULO 2
ANÁLISE DA DIVERSIDADE EM Anacardium spp. BASEADA EM
MARCADORES MOLECULARES ISSR
1 INTRODUÇÃO ................................................................................ 76
2 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................... 80
2.1 Material vegetal ............................................................................ 80
2.2 Extração do DNA ......................................................................... 80
2.3 Quantificação e qualidade do DNA .............................................. 84
2.4 Seleção de primers ...................................................................... 84
2.5 Otimização das condições de amplificação ................................. 84
2.6 Resolução e visualização dos fragmentos amplificados .............. 86
2.6.1 Sistema em gel desnaturante de poliacrilamida ....................... 86
2.6.2 Sistema em gel de agarose ...................................................... 88
2.7 Análise dos dados ........................................................................ 89
2.7.1 Análises preliminares e descritivas ........................................... 89
2.7.2 Estimação do número ótimo de marcadores ............................ 90
2.7.3 Análise discriminante ................................................................ 91
2.7.4 Projeção gráfica das distâncias ................................................ 92
viii
2.7.5 Análise de variância molecular ................................................. 93
2.7.6 Análise de agrupamento entre populações e acessos ............. 95
3 RESULTADOS ............................................................................... 95
3.1 Padrões da variabilidade acessada ............................................. 95
3.2 Estimação do número ótimo de marcadores ............................... 99
3.3 Análise discriminante ................................................................... 99
3.4 Projeção gráfica das distâncias ................................................... 102
3.5 Análise de variância molecular .................................................... 102
3.6 Análise de agrupamento .............................................................. 104
4 DISCUSSÃO ................................................................................... 108
4.1 Aspectos da variabilidade acessada ............................................ 108
4.2 Análises discriminantes ................................................................ 109
4.3 Análise de variância molecular e de agrupamento entre as
populações .................................................................................
111
5 CONCLUSÕES .............................................................................. 112
CAPÍTULO 3
ANÁLISE DA DIVERSIDADE EM Anacardium spp. BASEADA EM
CARACTERES FENOTÍPICOS DISCRETOS
1 INTRODUÇÃO .................................................................................
115
2 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................
116
2.1 Material vegetal .............................................................................
116
2.2 Coleta de dados .............................................................................
116
2.3 Análises estatísticas ......................................................................
117
3 RESULTADOS .................................................................................
120
3.1 Distribuição e índices de diversidade dos caracteres ....................
121
3.2 Análise discriminante e projeção das distâncias ...........................
121
3.3 Análise de agrupamento ................................................................
123
4 DISCUSSÃO ....................................................................................
124
5 CONCLUSÕES ...............................................................................
128
CAPÍTULO 4
ANÁLISE COMPARATIVA DA DIVERSIDADE EM Anacardium
spp. ACESSADA POR MEIO DE DADOS MORFOMÉTRICOS,
FENOTÍPICOS DISCRETOS E MOLECULARES
1 INTRODUÇÃO ................................................................................. 130
2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................. 133
ix
2.1 Material vegetal ............................................................................. 133
2.2 Coleta de dados ............................................................................. 133
2.3 Análises estatísticas dos dados ..................................................... 134
3 RESULTADOS ................................................................................. 135
3.1 Correlações entre medidas de dissimilaridades ............................ 135
3.1 Análises discriminantes ................................................................. 136
3.3 Análises de agrupamento dos acessos ......................................... 138
4 DISCUSSÃO .................................................................................... 142
5 CONCLUSÕES ................................................................................ 144
3 CONCLUSÕES GERAIS .................................................................. 145
4 BIBLIOGRAFIA ................................................................................ 148
x
RESUMO
PESSONI, Luiz Alberto, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, março de
2007. Estratégias de avaliação da diversidade em germoplasma de
cajueiro (Anacardium spp. L.). Orientador: Cosme Damião Cruz. Co-
orientadores: Everaldo Gonçalves de Barros, João Rodrigues de Paiva e
Luiz Antônio dos Santos Dias.
O cajueiro (Anacardium occidentale) é uma fruteira arbórea perene,
atualmente cultivada em diversos países da faixa intertropical terrestre. O
território brasileiro constitui o provável centro de origem e principal centro de
diversidade desta e da maioria das espécies do gênero Anacardium. Por outro
lado, estudos envolvendo a avaliação e caracterização do germoplasma
disponível ainda são incipientes e restritos a acessos de A. occidentale. Neste
trabalho foi avaliada a diversidade genética em Anacardium spp., a partir de
acessos mantidos pelo Banco Ativo de Germoplasma do Cajueiro (BAG –
Embrapa Agroindústria Tropical), localizado em Pacajus - CE e de indivíduos
amostrados em uma população subespontânea de Anacardium occidentale L.,
localizada no estado do Rio de Janeiro. A caracterização envolveu a análise de
dados de descritores fenotípicos discretos e morfométricos e de marcadores
moleculares ISSR. Foram analisados 45 indivíduos da população do Rio de
Janeiro e 91 acessos do BAG, de diferentes procedências, pertencentes às
espécies A. occidentale (tipos comum e anão precoce), A. othonianum, A.
humile e A. microcarpum. As informações morfométricas foram submetidas a
técnicas multivariadas consistindo de análises discriminantes de Anderson e de
componentes principais e análises de agrupamento por componentes
principais, UPGMA e otimização de Tocher. Os dados moleculares e
fenotípicos discretos foram investigados por meio de análises discriminantes
baseadas no método não paramétrico de k vizinhos mais próximos, projeção
gráfica das distâncias no espaço e agrupamento por UPGMA. Análise de
variância molecular (AMOVA) foi aplicada aos dados moleculares e análises
comparativas dos resultados, fornecidos pelas três classes de dados e pelas
suas combinações, através da soma de matrizes de distâncias, também foram
realizadas. Verificou-se que as técnicas de análise discriminante aplicadas às
variáveis morfométricas foram adequadas para a caracterização dos grupos de
xi
Anacardium avaliados. Entretanto, o método baseado em funções
discriminantes de Anderson, proporcionou melhor discriminação dos grupos,
além de possibilitar a classificação de acessos desconhecidos ou cujas
informações foram consideradas duvidosas. O padrão de agrupamento
UPGMA, baseado em dados morfométricos, exibido pelas populações
analisadas refletiu adequadamente o grau de relacionamento esperado entre
elas, considerando as evidências biológicas e históricas disponíveis. Em
relação à análise discriminante, baseada em dados moleculares, observou-se
que ela foi adequada apenas na classificação de acessos de diferentes
populações de A. occidentale. A AMOVA indicou que 27,5% da variação
acessada foi devido a diferenças entre as populações investigadas, enquanto o
restante foi decorrente de diferenças entre acessos dentro das populações. Por
outro lado, os valores estimados de
ST
φ
entre pares de populações
demonstraram que, à exceção do par ‘othonianum’ x ‘humile’, todas as
populações foram estatisticamente diferentes entre si. A maioria dos
descritores fenotípicos discretos analisados apresentou ampla variabilidade,
possibilitando discriminar, sem ambigüidades, todos os acessos de Anacardium
avaliados. Por outro lado, os padrões de distribuição desta variabilidade foram
“inadequados” para caracterizar grupos de acessos de origem comum. A
análise comparativa das diferentes classes de dados mostrou que apenas os
descritores morfométricos e os marcadores moleculares foram correlacionados,
enquanto os descritores multicategóricos apresentaram correlações nulas com
as classes de variáveis morfométricas e moleculares, respectivamente. Foi
confirmado que a região Nordeste é um importante centro de diversidade de A.
occidentale, mas o Norte Fluminense e o Estado de Roraima apresentam
populações naturais que diferem daquelas encontradas nos Estados do
Nordeste necessitando, por isso, serem mais investigadas através de
prospecções e coletas de materiais. Em relação a A. othonianum e A. humile,
concluiu-se que estudos adicionais envolvendo acessos e populações naturais
destas espécies necessitam ser realizados, tanto para elucidar melhor o status
taxonômico de cada uma delas, quanto para fins de utilização e conservação
destes recursos genéticos.
xii
ABSTRACT
PESSONI, Luiz Alberto, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, March of 2007.
Strategies for evaluating the diversity in germplasm of the cashew
(Anacardium spp. L.). Adviser: Cosme Damião Cruz. Co-advisers:
Everaldo Gonçalves de Barros, João Rodrigues de Paiva and Luiz Antônio
dos Santos Dias.
The cashew (Anacardium occidentale) is a perennial arboreal fruit tree
that is actually cropped in several tropical countries around the World. The
Brazilian territory is probably the original and main diversity center of this tree
fruit, as well as for most species of the genus Anacardium. On the other hand,
studies concerning to the evaluation and characterization of the available
germplasm are still incipient and restricted to accesses of A. occidentale. In this
study, the genetic diversity in Anacardium spp. was evaluated from either the
accesses kept by the Banco Ativo de Germoplasma do Cajueiro (BAG -
Embrapa Agroindústria Tropical) located in Pacajus - CE and individuals
sampled in a subspontaneous population of Anacardium occidentale L. located
in Rio de Janeiro State. The characterization involved the analysis of the data
for both morphometric and discrete phenotypic descriptors and the DNA
molecular markers of the ISSR type. Forty five individuals of the Rio de Janeiro
population and 91 accesses of BAG from different provenances, belonging to
the species A. occidentale (common and precocious dwarf types), A.
othonianum, A. humile and A. microcarpum were analyzed. The morphometric
data were subjected to multivariate techniques consisting of discriminant
analysis by Anderson´s and principal components methods, and cluster
analysis by hierarchical UPGMA method and optimizing Tocher´s approach.
Both molecular and discrete phenotypic data were investigated, by using
discriminant analyses based on nonparametric k-nearest neighbor method,
graphic projection of the distances in space and cluster analysis by UPGMA.
Molecular variance analysis (AMOVA) was applied to the molecular data, as
well as the comparative analyses of the results supplied by either three data
classes and their combinations were also accomplished. The discriminant
analysis techniques applied to the morphometric variables were appropriate for
characterization of the Anacardium groups under evaluation. However, the
xiii
method based on Anderson´s discriminant functions provided better
discrimination of the groups, besides making possible the classification of
unknown accesses or whose information were considered as doubtful. The
cluster pattern UPGMA, based on morphometric data, exhibited by the
populations under analysis rather appropriately reflected the level of the
expected relationship among them, as considering both biological and historical
evidences available. Relative to the discriminant analysis based on molecular
data, it was only adequate for classification of the accesses from different A.
occidentale populations. AMOVA showed that 27.5% of the accessed variation
were due to the differences among the populations under investigation,
whereas the remainder occurred because the differences among accesses
within populations. On the other hand, the estimated values of
ST
φ
between the
population pairs showed that all populations were statistically different from
each others, except for the pair 'othonianum' x 'humile'. Most discrete
phenotypic descriptors presented wide variability, making possible to
discriminate without ambiguities all Anacardium accesses under evaluation.
However, the distribution patterns of this variability were "inadequate" to
characterizing access groups from common origin. The comparative analysis of
the different data classes showed that only the morphometric descriptors and
molecular markers were correlated, whereas the discrete phenotypic
descriptors presented null correlations with the others data classes. The
Nordeste region was confirmed to be an important diversity center of A.
occidentale, but Norte Fluminense and the Roraima State show natural
populations differing from those found on the Northeast States. Therefore, there
is a need for a more accurate investigation and material collections of these
populations. Relative to A. othonianum and A. humile, it was concluded that
there is a need for additional studies involving accesses and natural populations
of these species either for getting a better elucidation of the taxonomic status of
each one and the use and conservation of these genetic resources.
1
1 INTRODUÇÃO GERAL
O estudo da diversidade visa elucidar relações genéticas, quantificar ou
predizer o nível de variabilidade total existente e a sua distribuição entre e/ou
dentro de unidades taxonômicas, quer elas sejam indivíduos, acessos de
bancos de germoplasma, linhagens, cultivares, populações (de sistemas
controlados de acasalamento ou naturais) e espécies. Este conhecimento tem
proporcionado importantes contribuições ao melhoramento genético, ao
gerenciamento de bancos de germoplasma, a conservação de recursos
genéticos e ao entendimento dos processos evolutivos das espécies.
A quantificação da diversidade genética auxilia no planejamento de
estratégias mais eficazes que venham a maximizar os ganhos genéticos no
melhoramento. Dentre as possibilidades de estudos da diversidade, destacam-
se, entre outras (Mohammadi e Prasanna, 2003; Reif et al., 2005):
a) determinação das inter-relações genéticas entre linhagens, cultivares e
populações;
b) identificação de combinações parentais adequadas à obtenção de híbridos
altamente heteróticos e que possibilitem maior segregação em
recombinações, com o aparecimento de transgressivos;
c) introgressão de genes favoráveis provenientes dos acessos de bancos de
germoplasma, componentes da base genética da espécie alvo;
d) identificação de variedades derivadas no processo de proteção de cultivares.
Nos bancos de germoplasma, a análise da diversidade pode ajudar a
classificar corretamente um acesso, identificar duplicatas e subgrupos de
coleções núcleo e auxiliar na quantificação do nível de variabilidade presente
em um pool gênico, bem como seu fluxo através do tempo (Reif et al., 2005).
Atualmente, existem muitos métodos disponíveis para o estudo da
diversidade genética, seja em avaliações de acessos de bancos de
germoplasma, cultivares melhoradas ou populações. Estes métodos podem ser
aplicados na análise de dados de pedigree, dados morfológicos, dados de
performance agronômica, dados bioquímicos e dados moleculares baseados
na análise de DNA. Entretanto, trabalhos envolvendo espécies perenes
2
tropicais, ainda são relativamente reduzidos e, normalmente, associados a
algumas poucas espécies de grande expressão econômica mundial.
O cajueiro, (Anacardium occidentale L.), é uma importante fruteira
arbórea tropical pertencente à família Anacardiaceae, cujos demais membros
são também de ocorrência predominantemente tropical e subtropical. Devido,
principalmente, à importância econômica que o comércio de sua amêndoa
(castanha) apresenta no mercado internacional, esta espécie é explorada em
diversos paises tropicais (Barros e Crisóstomo, 1995). A área mundial ocupada
com a cultura do cajueiro está estimada em 2,6 milhões de hectares (Pimentel
et al. 2002) e os maiores produtores de castanha in natura em 2005 foram (em
milhares de toneladas): Vietnã (960,8), Nigéria (594,0), Índia (460,0), Brasil
(251,3) e Indonésia (122,0) (FAO, 2007). Entretanto, os paises maiores
produtores de castanha beneficiada são, respectivamente, Índia, Vietnã e
Brasil, que respondem por 60%, 24% e 15,1% do volume de produção mundial
(FAO, 2007).
No Brasil, mais de 90% do caju é produzido na região Nordeste, com
áreas concentradas nos estados do Ceará, Piauí e Rio Grande do Norte
(Barros et al. 2002). Nestes Estados, a agroindústria do caju exerce importante
papel econômico e social, pelo número significativo de empregos gerados e
expressiva participação na geração de divisas externas, com valores entre 140
e 160 milhões de dólares anuais (Barros, 2002). Outros produtos derivados,
como o aproveitamento do pedúnculo na produção de suco concentrado,
fabricação de doces e comercialização na forma de fruta fresca, apresentam
enorme importância para mercado interno, ainda com grande potencial de
expansão (Barros, 2002).
A baixa produtividade das lavouras é o problema mais significativo da
cajucultura no Brasil, com média de 220 kg de castanhas in natura por hectare,
razão pela qual o programa de pesquisa de melhoramento genético da
Embrapa Agroindústria Tropical vem dando prioridade à obtenção de cultivares
mais produtivas (Barros e Crisóstomo, 1995).
Diversos fatores contribuem para a baixa produtividade dos atuais
plantios, dentre eles a propagação realizada por sementes é o principal, já que
3
o cajueiro é uma espécie predominantemente alógama, o que resulta na
heterogeneidade de diversos caracteres da planta (Crisóstomo et al., 1992;
Barros et al., 2002). Por outro lado, a propagação clonal, através de enxertia de
genótipos de cajueiro do tipo anão precoce trouxe novas perspectivas para o
desenvolvimento da cultura no Brasil, elevando o potencial produtivo, em
regime de sequeiro, para níveis superiores a 1300 kg/ha de castanha, com a
vantagem das plantas apresentarem redução de porte, em relação ao tipo
comum (Barros e Crisóstomo, 1995).
O porte baixo das plantas é um caráter da maior importância na
fruticultura moderna. A introdução de clones de cajueiro do tipo anão precoce
proporcionou a uniformização da copa, facilitando as práticas de manejo, como
poda e combate a pragas e doenças, assim como colheita do pseudofruto,
atividades inviáveis em pomares de cajueiro do tipo comum (Barros et al.,
2000). Entretanto, alguns caracteres como a qualidade e o peso da castanha e
amêndoa, resistência a pragas e doenças, menor teor de tanino e conservação
pós-colheita do pseudofruto, para consumo in natura, necessitam de avanços.
Estudos básicos de herança e de estimação de parâmetros genéticos
são também fundamentais na orientação de um programa de melhoramento de
qualquer espécie. No caso do cajueiro, os trabalhos desta natureza são
relativamente recentes, podendo ser citados, entre outros, os de Paiva et al.
(1998) e Holanda-Neto et al. (2001), que avaliaram os efeitos da endogamia
sobre a cultura; Azevedo et al. (1998) e Cavalcanti et al. (2000a), que
realizaram, respectivamente, estudos de correlações e de repetibilidade, para
caracteres de produção e porte da planta; Cavalcanti et al. (2000b), que
avaliaram a divergência genética e a heterose de híbridos interpopulacionais
entre cajueiro comum e anão precoce; Cardoso et al. (1999), que realizaram
estudos da genética da resistência do cajueiro anão à antracnose, mofo preto e
mancha angular, três das principais doenças fúngicas no Brasil e Crisóstomo et
al. (2002), que apresentaram resultados preliminares sobre incorporação de
caracteres de melhoria da qualidade do pseudofruto, através da hibridização de
A. occidentale e A. microcarpum.
Apesar de ser encontrada, na atualidade, em toda faixa intertropical da
Terra, a maior variabilidade de A. occidentale ocorre no Brasil, particularmente
nas zonas costeiras do Nordeste, onde populações espontâneas fazem parte
4
da vegetação de dunas e restingas (Lima, 1986; apud Barros et al. 2002). Por
outro lado, Barros et al. (2002) destacam que, diferentemente de outras
espécies do gênero, o cajueiro não suporta a concorrência com outras
espécies arbóreas. Segundo Barros (1995) as teorias atuais sobre a origem do
cajueiro fundamentam-se ainda em provas circunstanciais, as quais apontam o
Brasil, ou pelo menos o norte da América do Sul e parte da América Central,
como o mais provável centro de origem e domesticação da espécie. Dentre os
fatos e argumentos apresentados pelo autor destacam-se: a distribuição
geográfica e comportamento ecológico das espécies do gênero; os padrões de
variação de A. occidentale, as mais antigas referências históricas e ilustrações
sobre a planta; a origem etimológica da palavra caju e suas variações em
outros idiomas, assim como a estreita associação, no território brasileiro, entre
as atividades humanas (de populações indígenas e não indígenas) e a planta
de cajueiro. Weiduschat (1999), a partir de uma revisão de documentos
históricos, relatos de membros de comunidades indígenas que habitam as
regiões de savana e análise de caracteres morfométricos de populações
espontâneas de cajueiro, argumenta a favor do caráter “nativo” desta espécie
no Estado de Roraima. Mitchell e Mori (1987), também reconhecem a
existência de populações indígenas de A. occidentale nas savanas da
Colômbia, Venezuela e Guianas.
De acordo com Mitchell e Mori (1987), A. occidentale é uma espécie
polimórfica, constituída por dois ecótipos distintos: um ecótipo típico de zonas
de restinga, da qual se originaram as formas cultivadas e um ecótipo típico dos
cerrados do Brasil Central, não cultivado e associado à vegetação aberta de
fisionomia savanóide desta região.
Apesar dos principais centros de diversidade do gênero Anacardium se
localizarem na Amazônia e no Planalto Central do Brasil, trabalhos de
avaliação e caracterização do germoplasma disponível ainda são incipientes,
destacando-se apenas o estudo de Barros (1991), que fez a caracterização
morfológica e isoenzimática, por meio de técnicas multivariadas, de parte do
Banco Ativo Germoplasma do Cajueiro (BAG-Cajueiro), do Centro Nacional de
Pesquisa de Caju (atual Embrapa Agroindústria Tropical). Trabalhos deste tipo
fornecem subsídios fundamentais aos programas de melhoramento da espécie,
5
assim como ao processo de otimização nas atividades de coleta e de
conservação dos recursos genéticos, tanto in situ quanto ex situ.
O BAG do cajueiro localiza-se no Campo Experimental de Pacajus, no
litoral Leste do Ceará (4°10’S e 38°27’W) a 155 km de Fortaleza, pela BR 116.
A coleção de germoplasma é formada por 621 acessos, sendo 565 de A.
occidendale e 56 de outras espécies do gênero, originários da Região dos
Cerrados (Paiva et al. 2003). Uma descrição mais detalhada do BAG, com
informações relacionadas ao histórico de coletas, coleções disponíveis e
atividades de caracterização já executadas, é encontrada no trabalho de Paiva
et al. (2003).
Os objetivos deste trabalho foram avaliar estratégias de análise da
diversidade genética em Anacardium spp., a partir de acessos mantidos pelo
BAG do Cajueiro (Embrapa CNPAT – CE) e de indivíduos amostrados em uma
população subespontânea de Anacardium occidentale L., localizada no estado
do Rio de Janeiro, considerando a utilização de informações de descritores
morfométricos e fenotípicos discretos e de marcadores de moleculares de DNA
do tipo ISSR.
6
2 REVISÃO DE LITERATURA
A mais antiga ilustração conhecida de cajueiro, feita por Thevet (1558).
(extraído de Johnson (1974): O caju no Nordeste do Brasil – um estudo geográfico)
7
2.1 O gênero Anacardium
Anacardium (L.) é o gênero tipo da família Anacardiaceae. Segundo
Ferreira (1973), esta família é composta por árvores ou arbustos de folhas
alternas, coriáceas e sem estípulas, sempre providas de canais resiníferos em
seus ramos. Vários gêneros são produtores de frutos comestíveis, como
Mangifera (mangas), Spondias (cajás e umbu) e Anacardium (cajus), além de
outros possuidores de madeira de ótima qualidade como Astronium (Gonçalo
Alves, aroeiras) e Schinopsis (braúna e quebracho).
Mitchell e Mori (1987) realizaram a mais recente revisão taxonômica
sobre Anacardium. De acordo com os autores, Anacardium é um pequeno
gênero de árvores, arbustos e subarbustos nativos dos neotrópicos. Neste
trabalho são reunidas informações sobre anatomia, morfologia, ecologia,
fitogeografia, relações interespecíficas e botânica econômica sobre o gênero.
A primeira descrição e ilustração, baseadas em Anacardium occidentale,
foi publicada pelo naturalista francês Andre de Thevet em 1558, a partir de
observações de indivíduos ocorrentes na costa nordeste do Brasil. A este
trabalho se seguiram outros, com descrições e ilustrações da mesma espécie,
realizados por exploradores portugueses, cronistas e naturalistas europeus pré-
Lineanos. Em 1735, Lineu descreveu Anacardium como um gênero e em 1853
a espécie A. occidentale. A partir de 1830, Lindley designou Anacardium como
gênero tipo da família Anacardiaceae (Mitchell e Mori, 1987).
Aproximadamente, entre 21 e 22 espécies de Anacardium são
reconhecidas pela taxonomia formal clássica (Ferreira, 1973; Barros, 1995;
Ferrão, 1995). Por outro lado, na monografia de revisão do gênero, baseada
em dados de coleções de diversos herbários e trabalhos de campo realizados
no Panamá, Guiana Francesa, Amazônia, regiões Nordeste e Centro Oeste do
Brasil, Mitchell e Mori (1987) reconheceram a existência de dez espécies
apenas.
2.1.2 Distribuição geográfica e hábito
De acordo com Mitchell e Mori (1987), a distribuição natural do gênero
Anacardium estende-se desde Honduras, na América Central, até o sul do
8
Paraná e leste do Paraguai. À exceção de A. excelsum, nenhuma espécie
ocorre a oeste da cordilheira andina, na América do Sul. Segundo os autores,
este gênero possui dois centros de diversidade: um centro localizado na
Amazônia Central, ilustrado pela ocorrência de quatro espécies (A. giganteum,
A. spruceanum, A. parvifolium e A. microsepalum) nas cercanias de Manaus e
um centro localizado no Planalto Central do Brasil, onde três espécies
correlatas (A. humile, A. nanum e A. cobrybosum) ocupam o mesmo habitat.
O gênero Anacardium apresenta duas formas básicas, quanto ao hábito
de crescimento: as espécies de floresta (A. excelsum, A. giganteum, A.
microsepalum, A. parvifolium e A. spruceanum) são constituídas por árvores do
dossel ou emergentes. As espécies A occidentale e A. fruticosum são árvores
de porte médio a baixo com grande envergadura da copa, adaptadas a
ambientes de savana como os cerrados e as áreas de restinga do nordeste
brasileiro. Por outro lado, A. corymbosum, A. humile e A. nanum, são espécies
constituídas por subarbustos com tronco subterrâneo, confinadas ao cerrado
do Planalto Central do Brasil (Mitchell e Mori, 1987).
2.1.3 Morfologia floral
As flores das espécies de Anacardium são reunidas em inflorescências
terminais ou axilares, formando panículas esparsas ou densas, com flores
estaminadas e hermafroditas. As flores bissexuadas apresentam cálice
imbricado, com cinco sépalas lanceoladas ou ovais, corola pentâmera,
campanulada ou cilíndrica, imbricada na pré-floração e reflexa na antese,
geralmente apresentando cor avermelhada ou rósea na parte interna ou
superior. Os estames são concrescidos na base, com número variando de 6 a
12, possuem comprimentos desiguais, sendo que um, (quatro no caso de A.
excelsum) por ser muito maior que os demais, se projeta para além dos limites
da corola. O ovário é oblíquo obovado, unilocular com um óvulo. O estilete é
central ou lateral e geralmente é mais longo do que o maior dos estames. As
flores estaminadas possuem formatos e tamanhos similares aos das flores
bissexuadas. Contudo, o filete do estame mais longo geralmente é mais
comprido do que seu equivalente nas flores bissexuadas, além do ovário e do
estilete serem rudimentares (Ferreira, 1973; Mitchell e Mori, 1987).
9
Estudos histoquímicos, com gemas florais de A. occidentale de
diferentes idades, revelaram que o tecido pistilar primordial das gemas florais
presumivelmente hermafroditas acumulam maiores quantidades de proteína e
taxa de crescimento, em relação às zonas pistilares das flores
presumivelmente masculinas. Estas observações indicam que a acumulação
protéica teria um importante papel na indução do desenvolvimento do gineceu
e explicariam a maior preponderância de flores estaminadas na inflorescência,
cujo crescimento é indeterminado. Uma vez que os pistilos são os órgãos de
diferenciação mais tardia nas gemas primordiais é provável que a insuficiência
de metabólicos seja a causa da baixa produção de flores hermafroditas
(Pavithran et al., 1985).
Uma vez fertilizada, o pedicelo das flores bissexuadas de Anacardium
aumentam de tamanho, formando o pedúnculo (hipocarpo) suculento
denominado genericamente de caju. Esta combinação do desenvolvimento do
fruto verdadeiro constituído por uma drupa rígida e o pedúnculo suculento
constitui um processo complicado da chamada “frutificação dupla de
Anacardium”. Os dois componentes desta frutificação se desenvolvem com
diferentes taxas. A drupa alcança a maturação primeiro que o pedicelo. O
desenvolvimento do pedicelo é caracterizado pelo maior crescimento inicial no
comprimento, seguido pelo aumento no diâmetro, na medida em que se torna
mais suculento. No processo de maturação o pedúnculo gradualmente perde
seu sabor adstringente através da conversão de taninos livres em formas
insolúveis. A cor vermelha brilhante, freqüente nos pedúnculos de várias
espécies, é resultante da acumulação de antocianinas nas camadas
subepidérmicas (Mitchell e Mori, 1987).
2.1.4 Biologia reprodutiva
A maior parte das informações a respeito da biologia reprodutiva de
Anacardium é resultante de trabalhos realizados com A. occidentale. Freitas e
Paxton (1998) analisaram a biologia reprodutiva em uma população
espontânea de A. occidentale, localizada no litoral do Ceará. O estudo
envolveu ainda a comparação da ação de duas espécies de abelhas na
polinização: a indígena Centris tarsata e a exótica Apis mellifera. De acordo
10
com os autores, as panículas apresentaram uma proporção de 10% de flores
hermafroditas para 90% de flores masculinas. A antese nas flores masculinas
inicia-se por volta das 6h, encerrando-se por volta das 10h da manhã,
enquanto nas flores hermafroditas a antese, a exposição e receptividade do
estigma ocorrem no intervalo entre 10h e 12h. A deiscência das anteras ocorre
depois das 9h, nas flores masculinas e por volta das 10h, nas flores
hermafroditas. Por outro lado, as flores masculinas contribuem,
proporcionalmente, com a maior quantidade de pólen viável.
As duas espécies de abelhas tocam os estames das flores masculinas e
os estigmas das flores hermafroditas em suas visitas. Por outro lado, as
operárias de A. mellifera e os machos de C. tarsata coletam apenas néctar,
enquanto as fêmeas de C. tarsata coletam tanto pólen quanto néctar.
Aparentemente o pólen é coletado somente da antera do estame mais longo
das flores masculinas. Os horários de visitas ao longo do dia são similares para
as duas espécies de abelhas, coincidindo com a liberação dos grãos de pólen
pelas anteras e a maior receptividade dos estigmas, sugerindo que ambas as
espécies são polinizadoras potenciais de A. occidentale (Freitas e Paxton,
1998).
Paulino (1992) também realizou trabalho de avaliação da polinização
entomófila em cajueiro. O estudo foi conduzido em pomares do campo
experimental da Embrapa CNPAT, localizado no estado do Ceará. Embora
tenha observado a visita de insetos de diversas espécies, o autor não registrou
visitas de C. tarsata e concluiu que A. mellifera é a espécie mais importante na
polinização da cultura.
O ciclo de florescimento de A. occidentale, observado em populações
naturais e em cultivo de sequeiro, na Região Nordeste, é de cinco a sete
meses (Jul/Ago-Dez/Jan) para o cajueiro comum e de sete a nove meses
(Jun/Jul-Jan/Fev) para o tipo anão precoce (Barros et al., 2002). Na panícula, o
florescimento se inicia com a abertura de flores masculinas, passando por uma
fase de florescimento misto, isto é, com abertura de flores masculinas e
bissexuais, finalizando com uma fase de abertura de flores exclusivamente
masculinas (Barros, 1995; Bueno, 1997). Por outro lado, estudos realizados na
década de 1970 em Vittal (Índia), com 100 acessos de diversas procedências,
mostraram que pode existir grande variação neste padrão (Kumaran et al.,
11
1985). De acordo com os autores, cerca de 50% dos acessos apresentaram
florescimento bissexual inicialmente, isto é, apenas de flores hermafroditas,
enquanto alguns outros acessos iniciaram o florescimento diretamente na fase
mista.
De maneira geral, o florescimento das espécies de Anacardium coincide
com a chegada da estação seca, sendo restrito a este período para as
espécies de ambientes abertos ou de savana, onde esta estação é mais
pronunciada (Mitchell e Mori, 1987).
Aparentemente, não há nenhum sistema de incompatibilidade que
impeça a ocorrência de autogamia no cajueiro (Barros, 1995). Por outro lado, a
espécie sofre depressão por endogamia e apresenta autoimcopatibilidade
parcial, manifestada no maior percentual de abortamento de frutos imaturos
resultantes de autofecundações (Paulino, 1992; Holanda-Neto et al., 2002),
assim como redução do percentual de germinação das sementes (Paiva et al.,
1998) e do tamanho dos frutos (Paulino, 1992).
Estudos de polinização controlada, conduzidos por Holanda-Neto et al.
(2002), mostraram que a taxa de frutificação inicial em A. occidentale não difere
entre tratamentos de autopolinização e polinização cruzada. Confirmando
resultados de outros trabalhos, de que o cajueiro aceita os dois tipos de
polinização. Este comportamento talvez explique a pouca importância dada à
polinização cruzada na produtividade da espécie. Por outro lado, a partir do
sétimo dia após a polinização, houve uma taxa de abortamento diferenciada de
frutos imaturos entre os dois tipos de tratamentos, de tal ordem que na
maturação a taxa de frutos produzidos por polinização cruzada foi 240% maior
do que pela autopolinização manual. Os autores ressaltam, contudo, que este
significativo aumento no sucesso reprodutivo só ocorre se a transferência de
pólen envolver indivíduos de genótipos diferentes e, portanto, esta deve ser
uma preocupação adicional na implantação de novos pomares constituídos de
clones melhorados.
De acordo com Mitchell e Mori (1987), três espécies simpátricas do
planalto central brasileiro, A. occidentale (ou A. othonianum), A. humile e A.
nanum, florescem no mesmo período. Suas flores são virtualmente idênticas
em morfologia e são polinizadas pelos mesmos tipos de vetores, constituídos
por borboletas e abelhas. Ainda, de acordo com os autores, parece haver
12
poucas barreiras extrínsecas ao cruzamento entre elas. Tais fatores
explicariam a existência de indivíduos nas populações naturais que são
intermediários entre A. occidentale e A. humile, assim como entre A. humile e
A. nanum.
No que se refere à dispersão das sementes, sabe-se que castanha e
pedúnculo juntos flutuam na água o que possibilita a dispersão da espécie
pelos rios (Johnson, 1974). Entretanto, atribui-se a morcegos frugívoros o papel
de principal agente dispersor das espécies de Anacardium que apresentam
pedúnculo carnoso e suculento (Johnson, 1974; Mitchell e Mori, 1987). É
importante destacar que a dispersão e distribuição atual de A. occidentale é
resultante, em grande parte, de atividades antrópicas desde o período pré-
colombiano (Mitchell e Mori, 1987).
2.1.5 Cariótipo
Estudos relacionados com a determinação do número de cromossomos
foram realizados apenas para A. occidentale, e os resultados encontrados na
literatura são bastante divergentes, com números de cromossomos relatados
de 2n=24, 2n=40 e 2n=42 (Goldblatt, 1981; Goldblatt, 1984). Thankamma-Pillai
e Nambiar (1985) analisaram 223 células em metáfase I, de seis indivíduos
diferentes, e verificaram que 64 a 68% delas apresentaram 21 bivalentes, o
que corresponde a um cariótipo 2n=42. As demais células apresentaram
irregularidades cromossômicas que, segundo os autores, explicaria a elevada
taxa de grãos de pólen estéreis.
Leão et al. (2001) investigaram células mitóticas, de pontas de raízes de
plântulas, de A. othonianum e concluíram que o cariótipo da espécie é 2n=16
cromossomos. Sugeriram ainda que a espécie seria diplóide, enquanto outras
como A. occidentale seriam poliplóides. Entretanto, essas especulações
carecem de mais estudos para serem confirmadas.
2.1.6 Análise cladística
A filogenia das espécies de Anacardium, reconhecidas por Mitchell e
Mori (1987), foi estabelecida por Michell e Young (1987) através da aplicação
13
de um método de reconstrução filogenética baseada em parcimônia, utilizando
20 caracteres morfológicos qualitativos. O gênero Fegimanra foi utilizado como
grupo externo no estabelecimento da polaridade dos estados de caráter e
posicionamento da raiz do dendrograma (Figura 1). De acordo com os autores,
várias árvores igualmente parcimoniosas foram obtidas a partir dos dados
analisados, sendo possível a distinção de três clados:
a) clado 1 – constituído por A. excelsum;
b) clado 2 – abrangendo as espécies A. occidentale, A. spruceanum, A.
humile, A. nanum e A corymbosum;
c) clado 3 – formado por A. parvifolium, A. fruticosum, A giganteum e A.
microsepalum.
Os resultados obtidos desta análise, entretanto, devem ser considerados
apenas como uma aproximação das inter-relações filogenéticas das espécies
de Anacardium em decorrência da precária resolução dos cladogramas obtidos
(Michell e Young, 1987).
Figura 1 – Cladograma das espécies de Anacardium reconhecidas por Mitchell
e Mori (1987), obtido por Mitchell e Young (1987) através da
reconstrução filogenética, utilizando 20 caracteres morfológicos
qualitativos.
14
2.1.7 Descrição de algumas espécies e/ou ecótipos de Anacardium
a) Anacardium occidentale L.
De acordo com Mitchell e Mori (1987), A. occidentale é uma espécie
polimórfica, constituída por dois ecótipos distintos: um ecótipo típico de zonas
de restinga, de qual se originaram as formas cultivadas e um ecótipo típico dos
cerrados do Brasil Central, não cultivado e associado à vegetação aberta de
fisionomia savanóide desta região.
O ecótipo de restinga consiste de árvores de folhas perenes, com
ramificação baixa e cuja copa pode alcançar 10 a 15 metros de altura. Possui
raiz pivotante muito desenvolvida e extensa rede de raízes fasciculadas. As
folhas são simples alternas, arredondadas ou obovadas, muitas vezes
indentadas no ápice e alongadas na base, com pecíolos curtos de 1 a 3 cm.
Após a emergência, o limbo possui consistência delicada e apresenta
coloração acobreada, avermelhada ou verde clara, passando progressivamente
para o verde escuro e consistência cartácea ou coriácea, típicos das folhas
adultas (Johnson, 1974; Ferrão, 1995). As flores estão reunidas em panículas
esparsas a congestas (11-29 x 4,5-24,5 cm e são de dois tipos: bissexuais e
estaminadas). As flores bissexuais com corola cilíndrica (3-5 mm de diâmetro),
cm pétalas reflexas de cor branca ou verde claro, apresentando linhas róseas
ou vermelhas na antese, mudando para vermelho escuro após a fertilização.
Apresentam de 6 a 10 estames, raramente 12, sendo um (raramente dois)
muito maior que os demais, porém todos com anteras normais. Ovário com
estilete central e estigma puntiforme. As flores estaminadas possuem pistilódio
e estames de comprimentos desiguais como nas flores bissexuais (Mitchell e
Mori, 1987). O fruto é uma drupa sub-reniforme (3-5 x 2-3,5 cm), que pesa de 3
a 20 gramas e apresenta cor cinza ou marrom na maturação. O pedúnculo é
piriforme e sua cor, na maturação, varia do vermelho ao amarelo. Mede de 5 a
20 cm de comprimento e 2 a 8 cm de largura (Johnson, 1974).
Anacardium occidentale é nativo da América tropical, mas sua
distribuição natural não é clara, em razão da longa e íntima associação desta
espécie com atividades humanas no continente. Por outro lado, Mitchell e
Mori (1987) acreditam que a espécie tenha evoluído originalmente nos
15
cerrados do Brasil Central e, posteriormente, colonizou as zonas de restingas
da costa brasileira.
Alguns autores também diferenciam o ecótipo associado à restinga em
duas formas, também denominadas de variedades ou ecótipos: cajueiro
comum e cajueiro anão precoce (Almeida et al., 1993; Barros et al., 2002).
O Cajueiro comum possui porte elevado com altura variando de 8 a 15m
e envergadura da copa com até 20 m. Apresenta grande variação na
distribuição de ramos e formato da copa, que vai desde ereta e compacta até
espraiada e grande variabilidade no peso do fruto e pseudofruto, atingindo
valores de até 33 e 500 gramas, respectivamente. A idade mínima de
estabilização da produção das plantas é superior a oito anos (Barros et al.,
2002).
O cajueiro anão precoce caracteriza-se pelo porte baixo (inferior a 4 m),
com copa compacta e homogênea e de maior envergadura que o porte (5 a 6,5
m). Nas populações naturais apresenta peso do fruto variando entre 3 e 10 g e
pedúnculo com 20 a 160 g (Almeida et al., 1993; Barros et al., 2002). Especula-
se que sua origem geográfica seja as savanas de Roraima, mas indivíduos
isolados, cultivados ou espontâneos, são encontrados no Ceará e outro
estados do nordeste (Almeida et al, 1993).
b) Anacardium humile (St. Hilaire)
Denominado de caju do campo ou caju rasteiro, é um subarbusto com
tronco subterrâneo vigoroso e ramos ascendentes rígidos de 30 a 150 cm de
altura. As folhas coriáceas são elípticas a oblanceoladas, de ápice obtuso,
pecíolo muito curto ou séssil e nervura central proeminente. Apresenta
inflorescência esparsa a congesta (9-27 x 6-24 cm), localizada na extremidade
dos ramos. As flores bissexuadas apresentam corola cilíndrica com pétalas
reflexas, de cor branca ou creme, com listas róseas ou vermelhas na antese,
tornando-se vermelho escuro após a fertilização. Os estames, 5-9, apresentam
comprimentos desiguais, sendo um, ou raramente dois, com filete muito maior
que os demais, mas as anteras são normais nos dois tipos. O ovário apresenta
estilete central e estigma puntiforme. As flores masculinas também apresentam
um estame de maior comprimento e exserto. O pedicelo (pseudofruto) do fruto
é tuberisado, desenvolvido, carnoso, suculento de sabor ácido, cônico ou
16
piriforme (1-3 x1-2 cm) de cor avermelhada ou amarelada quando maduro. O
fruto é uma drupa reniforme (1,3 x 12,3 x 1-1,17 cm) de cor cinza ou marrom na
maturidade (Ferreira, 1973; Mitchell e Mori, 1987).
Distribuição geográfica: Santa Cruz, Bolívia, sul e leste do Paraguai e
Brasil, do sudeste de Rondônia e norte de Goiás até sul do Paraná.
c) Anacardium othonianum (Rizzini)
Conhecida popularmente por cajuzinho de cerrado, esta espécie é uma
árvore de porte mediano de 3 a 6 metros de altura e tronco de 20 a 40 cm de
diâmetro, de córtex fusco e fissurado. Possui ramos crassos, sulcados e
ferruginosos, com folhas elípticas, de ápice obtuso a emarginado, crassas,
coriáceas, glabras com 13 a 18 nervuras laterais proeminentes e pecíolo curto.
As flores são reunidas em panículas amplas, laxas mais ou menos corimbosas,
com 15 a 25 cm de comprimento por 15 a 20 cm de largura. As flores
bissexuadas têm pedicelos pilosos com 2 a 3 mm, pétalas estreitas alongadas
e externamente pubérulas com 6 a 7 mm de comprimento. O ovário é oblíquo e
o estigma é puntiforme. Os estames, em número de 8, são concrescidos na
base. O pseudofruto apresenta cor avermelhada ou amarelada, suculento e
ácido quando maduro. O fruto é reniforme, com 1,5-2,2 cm de comprimento e
1,2-1,5 cm de largura (Ferreira, 1973).
Esta espécie foi considerada por Mitchell e Mori (1987) como membro do
ecótipo de A. occidentale, circunscrito à região dos cerrados e caracterizado
por apresentar folhas mais coriáceas, onduladas e subsésseis, assim como
pseudofruto menor e mais ácido que o ecótipo típico das áreas de restingas.
Distribuição Geográfica: Cerrados do Brasil Central, principalmente
Goiás e Distrito Federal.
2.2 Análises da Diversidade de Recursos Genéticos Aplicadas a
Caracteres Morfométricos
Técnicas analíticas multivariadas permitem a manipulação simultânea de
múltiplas medidas, tomadas de cada indivíduo sob investigação e são
amplamente utilizadas em estudos de diversidade, independente do tipo de
dados analisados, sejam eles morfológicos, bioquímicos ou marcadores
17
moleculares (Mohammadi e Prasanna, 2003). Entre os algoritmos utilizados
destacam-se as análises de componentes principais ou coordenadas principais,
análise discriminante e análises de agrupamento.
2.2.1 Componentes principais
A análise dos componentes principais (CPs) é uma técnica multivariada
cujo objetivo é partir de um conjunto de p variáveis, designadas por X
1
, X
2
, ...,
X
p
, e encontrar combinações lineares que produzam índices Z
1
, Z
2
, ..., Z
p
ortogonais entre si. Esta ortogonalidade ou ausência de correlação entre os
índices é uma propriedade desejável porque indica que eles estão medindo
diferentes “dimensões" dos dados (Manly, 1998). De acordo Anderson (1984),
o método dos CPs é, do ponto de vista estatístico, utilizado para encontrar
combinações lineares com grande variância, considerando que em muitos
estudos exploratórios o número de variáveis disponíveis é muito elevado e o
principal interesse do pesquisador se concentra nos desvios das observações.
Uma maneira de reduzir o número de variáveis a serem manipuladas é,
segundo o autor, descartar combinações lineares que apresentem baixa
variância, mantendo somente aquelas com variância elevada. Também é
buscada uma ordenação decrescente da grandeza destes índices de tal forma
que Z
1
, retenha o máximo da variabilidade disponível, Z
2
o máximo da
variabilidade restante disponível e assim por diante (Manly, 1998; Cruz e
Carneiro, 2003). Dessa forma var(Z
1
) ≥ var(Z
2
) ≥ ... ≥ var(Z
p
), onde Z
i
e var(Z
i
)
indicam o componente principal em consideração e sua variância,
respectivamente.
A expectativa de uma análise de componentes principais é que a maior
parte da variação dos dados possa ser descrita adequadamente por poucos
índices Zs, enquanto as variâncias dos índices remanescentes sejam tão
baixas que possam ser negligenciadas (Manly, 1998). Neste sentido, a analise
busca algumas poucas combinações lineares que possam ser utilizadas para
descrever os dados, de modo que a perda de informação seja a menor
18
possível. Esta tentativa de redução da dimensionalidade pode ser qualificada
como “redução parcimoniosa” dos dados (Mardia et al., 1997).
Por outro lado, deve ser enfatizado que a técnica dos componentes
principais nem sempre atua no sentido de reduzir um grande número de
variáveis originais em pequeno número de variáveis transformadas. Os
melhores resultados são obtidos quando as variáveis originais são altamente
correlacionadas, seja positiva ou negativamente. Neste caso, a análise de CP
será importante em estabelecer medidas relacionadas com as “dimensões”
implícitas nos dados assim como apontar redundância de informações contidas
nas variáveis originais, com muitas delas medindo coisas semelhantes (Manly,
1998).
De acordo com Manly (1998) a análise de componentes principais, de
um conjunto de dados envolvendo p variáveis e n indivíduos, pode ser
resumida na execução dos seguintes passos:
a) Padronização das variáveis X
1
, X
2
, ..., X
p
, de modo que cada uma passe
a exibir média zero e variância igual a unidade. Embora possa ser
omitido em alguns casos, tal procedimento assegura que nenhuma das
variáveis tenha uma influência excessiva sobre os componentes,
decorrente de fatores como diferenças de escala ou de amplitude de
variação;
b) Cálculo da matriz de covariância C. No caso dos dados terem sido
padronizados, esta matriz corresponde uma matriz de correlação;
c) Determinação dos λ
1
, λ
2
, ..., λ
p
autovalores e dos a
1
, a
2
, ..., a
p
autovetores correspondentes. Os coeficientes do i-ésimo componente
principal são dados por a
i
, enquanto λ
i
é sua variância. Isto é,
pipiii
XaXaXaZ
+
++= ...
221
, sua variância é Var(Z
i
) = λ
i
e as constantes
a
i1
, a
i2
, ..., a
ip
são os elementos correspondentes ao autovetor, com a
restrição que a
i1
+ a
i2
+ ... + a
ip
= 1. Esta restrição é importante para que a
Var(Z
i
) não aumente pela simples elevação dos valores de qualquer a
ij
;
d) Descarte de todos os componentes que explicam apenas uma pequena
porção da variabilidade total. Por exemplo, se os dados originais são
representados por um conjunto de 20 variáveis e os dois primeiros
19
componentes principais explicam 80% ou mais da variabilidade total os
outros 18 CP podem ser descartados ou ignorados.
Uma propriedade importante dos autovetores destacada por Manly
(1998) é que eles são totalizados pela soma dos elementos diagonais (o traço)
da matriz C. Isto é
ppp
ccc
+
+
+
=
+
+
+ ......
221121
λ
λ
λ
. E, uma vez que c
ii
é a
variância de X
i
e λ
i
é a variância de Z
i
, a soma das variâncias dos componentes
principais é igual à soma das variâncias das variáveis originais padronizadas.
Outro importante aspecto da técnica de componentes principais é a
possibilidade de avaliar a contribuição relativa de cada uma das variáveis
originais na divergência das entidades sob avaliação. Conforme destacado por
Cruz e Carneiro (2003) e Cruz et al. (2004), uma vez que a importância relativa
dos CP decresce do primeiro para o último, a variável que apresenta maior
coeficiente de ponderação ou elemento do autovetor no componente de menor
autovalor é considerada de menor importância para explicar a variabilidade do
material sob investigação, sendo possível o seu descarte sem
comprometimento da qualidade das informações. De acordo estes autores a
literatura recomenda, em estudos com variáveis padronizadas, descartar os
caracteres de maiores coeficientes (em valores absolutos) nos autovalores
menos importantes, partindo-se do último até àquele componente cujo
autovetor não exceda a 0,70.
2.2.2 Análise discriminante
A análise discriminante procura determinar uma variável estatística, a
partir da combinação linear de variáveis independentes, que fará a melhor
distinção entre grupos definidos a priori. A discriminação é conseguida
estabelecendo-se pesos às variáveis independentes de modo a maximizar a
variância entre grupos em relação à variância dentro dos grupos (Hair et al.,
2005). A combinação linear para uma análise discriminante, também conhecida
como função discriminante, é determinada por uma equação que assume a
seguinte forma:
nknkkjk
XWXWXWaZ
+
+
++= ...
2211
20
Onde
jk
Z
= escore Z discriminante da função discriminante J para o objeto K
a = constante
i
W = peso discriminante para a variável independente i
ik
X = variável independente i para o objeto k.
Calculando-se a média dos escores discriminantes para todos os
indivíduos do grupo, obtém-se a média do grupo. Esta média de grupo é
chamada centróide e existe uma para cada grupo envolvido na análise. Os
centróides indicam o local mais típico de qualquer indivíduo de um grupo
particular, e suas posições relativas ao longo da dimensão testada indicam o
quão afastados ou divergentes são os grupos avaliados (Hair et al., 2005).
A alocação dos objetos ou unidades amostrais em uma das várias
populações é um problema multivariado, por isso, é necessário produzir um
índice ou um critério bem definido que possa ser utilizado como regra de
classificação. Evidentemente, nenhuma regra de decisão será perfeita e,
portanto, sempre haverá certa probabilidade de erro de classificação. Tal
probabilidade, entretanto, pode ser controlada ou minimizada (Khattree e Naik,
2000).
Ao contrário do recomendado em uma análise de componentes
principais ou análise de fatores, os dados que serão utilizados em uma análise
discriminante não necessitam ser padronizados antes de serem submetidos
aos cálculos. Isto porque o resultado de uma análise discriminante não é
afetado por problemas de escala de variáveis individuais (Manly, 1998).
A análise discriminante pode ser considerada uma análise de perfil ou
uma técnica preditiva analítica que permite ao pesquisador compreender
diferenças de grupos ou classificar corretamente objetos em grupos ou classes.
Em qualquer caso, esta técnica é mais apropriada onde só existe uma variável
categórica dependente e diversas variáveis métricas independentes (Hair et al.,
2005).
Por outro lado, segundo Khattree e Naik (2000), embora a distribuição
normal multivariada seja uma pressuposição comum para populações, algumas
análises discriminantes podem ser realizadas sob a pressuposição de outros
tipos de distribuição também. Outras técnicas discriminantes, segundo os
21
autores, podem ser não paramétricas quando nenhuma pressuposição é feita
sobre as distribuições das variáveis, ou ainda serem aplicadas quando algumas
ou todas as variáveis são categóricas.
De acordo com Hair et al. (2005), a aplicação da análise discriminante
pode ser vista como a construção de um modelo de seis estágios:
1) Estabelecimento dos objetivos, avaliando diferenças de grupos
em um perfil multivariado e identificando dimensões de
discriminação entre grupos;
2) Planejamento da pesquisa, selecionando as variáveis
independentes, determinando o tamanho da amostra total e
criando as amostras de análise e de teste;
3) Certificação das suposições inerentes ao modelo, como
normalidade e ausência de multicolinearidade das variáveis
independentes, linearidade das relações e igualdade das
matrizes de dispersão;
4) Estimação das funções discriminantes e de suas significâncias
estatísticas, avaliação da precisão preditiva através da
aplicação de uma matriz de classificação;
5) Interpretação das funções discriminantes, determinando
quantas funções serão interpretadas e quais variáveis
independentes mais contribuem para distinguir os grupos;
6) Validação dos resultados discriminantes através da utilização
de amostra de teste ou da validação cruzada.
Existem duas metodologias básicas de análise discriminante aplicadas a
dados métricos multivariados: análise discriminante canônica e análise
discriminante baseada em distâncias de Mahalanobis.
2.2.2.1 Análise discriminante canônica
A análise discriminante canônica ou de componentes principais é uma
técnica de redução de dimensionalidade semelhante à análise de componentes
principais e correlação canônica (Khattree e Naik, 2000). No contexto da
análise discriminante, esta técnica fornece uma representação das várias
populações sob investigação em um subespaço de dimensões reduzidas.
22
De maneira análoga aos componentes principais, o método visa obter
combinações lineares das variáveis métricas independentes X, tal que
pipiii
XaXaXaZ +++= K
2211
Estas funções “Z” são denominadas de funções discriminantes canônicas. O
número máximo de funções estimadas, para um particular conjunto de dados, é
valor mínimo entre (p-1, v), em que p é o número de populações e v o número
de variáveis (Manly, 1998; Cruz e Carneiro, 2003).
As funções são obtidas em ordem decrescente de importância, de tal
forma que a primeira função explica o máximo da variância entre os grupos e a
segunda, ortogonal à primeira, explica o máximo da variância remanescente e
assim por diante (Manly, 1998; Cruz e Carneiro, 2003). Este processo é
repetido até que toda a variância da matriz W
-1
B seja extraída, onde W é a
matriz de variâncias e covariâncias dentro de grupos e B a matriz de variâncias
e covariâncias entre grupos. Por outro lado, a expectativa do pesquisador é
que apenas as duas ou três primeiras funções sejam suficientes para explicar a
maior parte das diferenças entre os grupos (Manly, 1998).
Obtidas as funções que melhor discriminam os grupos sob análise, o
passo seguinte é estimar os escores a partir dos valores dos indivíduos
pertencentes a cada grupo, de foram que se possa visualizar as
dissimilaridades entre este indivíduos e seus respectivos grupos, por meio do
exame da dispersão gráfica dos dados (Cruz e Carneiro, 2003).
Esta análise também possibilita avaliar a importância relativa dos
caracteres avaliados na discriminação dos diferentes grupos. Utilizando o
critério de peso das variáveis nos autovetores das funções canônicas
estimadas, são consideradas de menor importância as variáveis de maiores
pesos desde o último autovetor até aquele associado a um autovalor igual ou
inferior a 0,70 (Cruz e Carneiro, 2003; Cruz et al. 2004).
23
2.2.2.2 Análise discriminante baseada em distâncias de Mahalanobis
Anderson (1958, 1984) descreve um método de análise discriminante
quando existem )2(≥k populações com distribuição normal multivariada,
denominadas por
1
,
2
, ...,
k
. O propósito, neste caso, é obter regras de
discriminação para classificar quaisquer observações futuras em uma destas K
populações (Khattree e Naik, 2000). Para isso, o espaço p-dimensional é
dividido em k regiões disjuntas e mutuamente exclusivas, denominadas R
1
, R
2
,
..., R
k
e se uma observação cai dentro da região R
i
assume-se que ela é
proveniente da população
i
. Adicionalmente, são assumidas probabilidades a
priori para cada uma das populações, de modo que
1
21
=++
+
k
K , além
de um custo de má classificação na construção das funções de discriminação
(Anderson,1958, 1984; Khattree e Naik, 2000).
Anderson (1958, 1984) mostrou que a regra de Bayes, para um dado
conjunto de probabilidades a priori e uma matriz específica de má classificação,
é baseada em razões de probabilidades para todos os pares de grupos, se
vetores de médias )(
k
μ
e a matriz de covariância comum
)(Σ
ou suas
estimativas são conhecidos.
Utilizando a notação de Cruz e Carneiro (2003), a forma genérica da
função discriminante de Anderson é dada pela expressão:
)
~
2(
2
1
)ln()
~
(
11
jjjjj
xpxD
μμμ
−−
Σ
′
+Σ
′
−=
onde
j
p : é a probabilidade a priori de indivíduo ou elemento pertencer a uma
determinada população;
x
~
: é o vetor de observações do individuo cuja população é desconhecida;
Σ : é a matriz de variâncias e covariâncias comum das populações;
j
μ
: é o vetor de médias das populações.
Ou
vjvjjjj
xxxxD
α
α
α
κ
+
+
+
+= K
2211
)
~
(
Onde
jjjj
p
μμκ
1
2
1
)ln(
−
Σ
′
−= : constante associada à função discriminante;
24
jk
α
: coeficiente de ponderação da k-ésima variável (k=1, 2, ..., v) na j-ésima
função discriminante;
k
x : valor representativo do escore da k-ésima variável do elemento que se
deseja classificar em uma das populações em estudo.
Depois de estimadas, é importante avaliar a eficácia das funções
discriminantes obtidas. Esta eficácia depende do grau de divergência das
populações, da quantidade e qualidade das variáveis utilizadas na
discriminação (Cruz e Carneiro, 2003). Existem diversos métodos de avaliar a
taxa de erro do esquema de discriminação adotado, entretanto, alguns utilizam
os próprios dados para obter as estimativas de erro de classificação (Khattree e
Naik, 2000).
Um destes métodos, denominado de taxa de erro aparente (TEA),
consiste na reclassificação de todos os dados que foram utilizados para gerar
as funções discriminantes. Baseado na suposição do conhecimento a priori da
população a que cada elemento pertence, a classificação de um elemento da
população
j
π
em outra população é indicativo da menor eficiência da função
discriminante estimada (Cruz e Carneiro, 2003). A soma de todos os casos de
reclassificação incorreta fornece a taxa de erro aparente (TEA), do conjunto de
funções estimadas. Esta taxa é viesada para baixo, uma vez que o mesmo
conjunto de dados utilizado para estimar as funções é empregado para avaliar
suas eficiências (Khattree e Naik, 2000; Cruz e Carneiro, 2003).
Uma possibilidade alternativa de validação das funções consiste em
dividir o conjunto de elementos de cada população em duas sub-amostras.
Neste caso, um conjunto de sub-amostras é utilizado para estimar as funções
discriminantes (amostras de análises) e o outro é utilizado para avaliar a
eficiência de classificação (amostras de teste) (Khattree e Naik, 2000; Hair et
al., 2005). Esta estratégia requer um grande número de observações por
população para produzir estimativas satisfatórias, já que apenas uma parte dos
dados é utilizada na construção das funções que serão utilizadas para
classificar outro conjunto de dados, cujos coeficientes de discriminação possam
ser comparáveis (Khattree e Naik, 2000).
O terceiro método é o da validação cruzada, em que a função é
construída utilizando todas as observações disponíveis para a população
25
exceto uma, cuja alocação é posteriormente verificada através da função
discriminante obtida. Este processo de construção de função e de classificação
da observação excluída é repetido para todas as observações da população e
para todas as populações. Posteriormente, é computado o número de más
classificações individuais, por população, ou global, expressos em valores
percentuais ou proporcionais. De acordo com Khattree e Naik (2000), este
método conduz a estimativas com considerável redução no viés e as diversas
estimativas de funções obtidas para uma única população, através da retirada
de uma única observação do conjunto de dados praticamente não variam, a
menos que haja algumas observações muito discrepantes.
2.2.3 Análise de agrupamento
“Análise de agrupamento” refere-se a um conjunto de técnicas
multivariadas cujo principal propósito é agrupar indivíduos ou objetos baseados
nas características que eles possuem. Assim, indivíduos com descrições
similares são matematicamente alocados no mesmo grupo. Os grupos
resultantes devem então exibir elevada homogeneidade interna e alta
heterogeneidade externa (entre grupos). Por isso, se a classificação for bem
sucedida, espera-se que os indivíduos dentro de um grupo formem
aglomerados quando plotados geometricamente e, simultaneamente, se
distanciem dos aglomerados formados pelos indivíduos de outros grupos.
De acordo com Mohammadi e Prasanna (2003), existem dois tipos
básicos de métodos de agrupamento:
a) métodos baseados em distâncias, nos quais uma matriz de distâncias
entre pares de indivíduos é utilizada como entrada de dados, na análise
realizada por meio de um algoritmo de agrupamento específico. Este
tipo de método conduz a uma representação gráfica (tais como uma
árvore ou dendrograma) que permite a identificação visual dos grupos;
b) métodos baseados em modelos, nos quais se assume que as
observações de cada grupo constituem amostras aleatórias de algum
modelo paramétrico particular. Inferências a respeito dos parâmetros
correspondentes de cada grupo, assim como dos membros dos grupos
26
são estimados conjuntamente, utilizando métodos estatísticos padrões
tais como máxima verossimilhança ou métodos Bayesianos.
Os métodos baseados em distâncias são os mais freqüentemente
utilizados e podem ser divididos em duas categorias: hierárquicos e não
hierárquicos. A aplicação dos métodos hierárquicos envolve uma série de
sucessivas “fusões” ou sucessivas divisões de um grupo de indivíduos. O
primeiro caso, conhecido como método hierárquico aglomerativo, inicia-se
com um único indivíduo. Assim há, inicialmente, tantos grupos quantos forem o
número de indivíduos. Então os indivíduos mais similares são agrupados e a
este grupo inicial são incorporados os demais indivíduos de acordos com suas
similaridades (Mohammadi e Prasanna, 2003). Entre os vários métodos
hierárquicos aglomerativos destacam-se, na análise de diversidade de
espécies cultivadas, o UPGMA (Unweighted Paired Group Method using
Arithmetic Averages) de Sneath e Sokal (1973) e o método da variância mínima
de Ward (Ward, 1963).
Os procedimentos de agrupamento não hierárquicos não envolvem a
construção de árvores ou dendrogramas. Tais procedimentos são também
referidos como “agrupamento de k-médias”. A alocação dos indivíduos nos
grupos é baseada em processos denominados de “limiar seqüencial”, “limiar
paralelo”, ou “otimização”, uma vez que o número de grupos a serem formados
é especificado. Este tipo de agrupamento raramente é utilizado em análises
de diversidade intra-específica, já que dificilmente se dispõe de informação a
priori sobre o número ótimo de grupos necessário para uma alocação acurada
dos indivíduos (Mohammadi e Prasanna, 2003).
2.2.4 Aplicações de técnicas multivariadas na análise de diversidade baseada
em caracteres fenotípicos
Métodos multivariados podem ser utilizados de diversas maneiras na
análise de diversidade, a partir de dados morfométricos, por exemplo:
a) Em sistemática e taxonomia, como técnica auxiliar na delimitação de
táxons, caracterização de zonas híbridas e elucidação de complexos de
espécies;
27
b) Na caracterização de divergência genética entre populações naturais
intra-especificas;
c) Na caracterização da divergência entre genótipos ou acessos de plantas
cultivadas, sejam eles resultantes de material melhorado ou de uso
tradicional, como meio de identificar grupos divergentes para fins de
conservação e/ou hibridação.
Nielsen et al. (2003) trabalharam com populações “típicas” e “atípicas”
de duas espécies de Asteraceae arbustivas, endêmicas das ilhas Galápagos,
Scalesia divisa e S. incisa. Os autores avaliaram dados morfométricos
vegetativos e reprodutivos das populações, assim como dados moleculares.
Análises multivariadas, baseadas em componentes principais e função
discriminante de Anderson, mostraram que as populações desviantes são
resultantes de uma zona de hibridação formada entre as populações “típicas”
das duas espécies. Estas espécies estiveram geograficamente isoladas no
passado, em decorrência de atividade vulcânica, mas agora se encontram em
processo de expansão sobre o solo vulcânico recém formado, se hibridizando
na zona de contato, uma vez que as barreiras do isolamento reprodutivo ainda
não haviam sido estabelecidas por completo.
Em um outro trabalho, também envolvendo uma espécie de Asteraceae,
Senecio aquaticus, Pelser e Houchin (2004) avaliaram, por componentes
principais e análise discriminante, um total inicial de 60 caracteres
morfométricos diagnósticos potenciais de dois subgrupos da espécie:
Aquaticus e Barbareifolius. A aplicação de análise discriminante, através de
processo stepwise, possibilitou a identificação de sete caracteres diagnósticos
mais confiáveis para os dois subgrupos. Os autores atribuíram o status de
variedades para ambos os subgrupos uma vez que, embora distintos, há
sobreposição dos agrupamentos de Aquaticus e Barbareifolius no espaço
morfométrico multivariado e não há uma distinção clara referente às suas
distribuições geográficas.
Em um estudo envolvendo o gênero Vicia (Fabaceae), van de Woun et
al. (2003) avaliaram 53 caracteres morfológicos da série Vicia (uma subdivisão
do gênero), empregando análises de coordenadas principais e agrupamento
por UPGMA. Baseados nos resultados obtidos, os autores justificaram a
delimitação de quatro espécies distintas dentro da série e de seis subespécies
28
dentro do agregado Vicia sativa, que constitui a espécie morfologicamente mais
diversa e de maior distribuição geográfica do gênero.
A análise de características morfométricas através de técnicas
multivariadas possibilitou a caracterização de seis espécies de crustáceos do
gênero Artemia. A utilização da análise discriminante, baseada em variáveis
canônicas, mostrou que 92,8% da variância, contida nas 12 variáveis
morfométricas originalmente computadas, poderiam ser condensadas nas três
primeiras funções canônicas. A primeira destas funções foi relacionada,
principalmente, com as variáveis morfométricas associadas a características da
furca, a segunda relacionou-se com variáveis associadas ao comprimento do
animal e a terceira com variáveis associadas à largura do animal (Baxevanis et
al., 2005).
Diversos trabalhos de avaliação de acessos de plantas cultivadas
através de técnicas multivariadas estão disponíveis na literatura. Por exemplo,
Ferreira et al. (1995) aplicaram análise discriminante em genótipos de arroz
para classificá-los quanto à tolerância à toxidez de alumínio. Vidigal et al.
(1997) avaliaram a divergência entre cultivares de mandioca, adaptadas ao
cultivo no norte do Paraná, através de variáveis canônicas e análise de
agrupamento UPGMA, identificando grupos heteróticos para possíveis
hibridações futuras. Cruz et al. (2004) também empregaram técnicas
multivariadas a dados morfométricos de trigo com o intuito de identificar
variabilidade e possíveis grupos heteróticos para resistência ao acamamento.
Fonseca et al. (2004) avaliaram a adequação da composição de genótipos de
três cultivares clonais de café robusta (Coffea canephora). Os autores
empregaram a análise discriminante para classificar os clones em uma das três
categorias: a) maturação precoce, b) maturação intermediária e c) maturação
tardia.
O principal trabalho de análise de dados morfométricos, através de
técnicas multivariadas, envolvendo acessos de cajueiro foi realizado por Barros
(1991). O autor estudou 67 acessos de Anacardium occidentale do BAG do
cajueiro da Embrapa Agroindústria Tropical, sendo 10 acessos do tipo anão
precoce, 27 do tipo comum, coletados em diferentes municípios do Ceará, 9
introduzidos da Índia, 11 da Venezuela e 10 do Estado de São Paulo. Foram
avaliados 30 caracteres morfológicos, entre características quantitativas e
29
qualitativas ou multicategóricas. As estimativas de divergência foram obtidas
por meio da técnica de componentes principais e agrupamento pelo método de
otimização de Tocher, baseado em distâncias Euclidianas médias
padronizadas. De acordo com o autor, os dois primeiros componentes
principais explicaram apenas 44,6% da variância contida nos dados originais,
enquanto a inclusão do terceiro componente ampliou este valor para 57,09%.
Dessa forma, a projeção gráfica dos acessos nos espaços bi ou tridimensionais
apresentam elevadas taxas de distorção, prejudicando a confiabilidade nos
resultados e nas interpretações subseqüentes. Por outro lado, a análise
agrupamento pelo método de Tocher alocou os 67 acessos em 12 grupos
diferentes. Sete dos 10 acessos de cajueiro do tipo anão foram alocados
juntos, constituindo um grupo distinto em relação os demais acessos. Enquanto
a maior parte dos acessos coletados no Ceará foi distribuída em 10 grupos
diferentes, todos os acessos introduzidos da Índia, Venezuela e Valinhos foram
alocados em um único grupo. Barros (1991) concluiu que estes resultados
reforçam a hipótese de que o Nordeste brasileiro seja em um importante centro
de diversidade de A. occidentale e que o cajueiro anão precoce constitui uma
forma ou ecótipo da espécie A. occidentale.
Samal et al. (2003) avaliaram 20 variedades de cajueiro através de oito
variáveis morfométricas relacionadas com o padrão de ramificação,
florescimento, razão sexual entre flores na panícula e componentes de
produção de castanha, por um período de três anos consecutivos. Análises de
divergência, baseada na distância de Gower, e de agrupamento, por UPGMA,
evidenciaram a formação de quatro grupos distintos com nível de similaridade
igual ou superior a 70%. Entretanto, o maior grupo foi formado por 12
genótipos, enquanto dois grupos foram formados, cada um, por um genótipo
apenas.
2.3 Marcadores Moleculares na Análise Genética Vegetal
A utilização de marcadores moleculares de diversos tipos tornou
possível a identificação e caracterização de germoplasma, a construção de
mapas genéticos e a estimativa da distância genética entre indivíduos e/ou
populações de várias espécies vegetais. Tais tecnologias podem contribuir
30
para uma aceleração de ganhos genéticos em plantas de interesse,
especialmente em culturas cujas informações ainda limitadas, como é o caso
da maioria das espécies tropicais arbóreas (Federezzi, 1998; Ferreira &
Grattapaglia, 1998; Picoli et al., 2001). De modo semelhante, as informações
de diversidade e distância genética têm sido avaliadas para a identificação das
melhores combinações híbridas e na organização de bancos de germoplasma;
indicando redundâncias e deficiências das coleções, além de gerar dados
sobre a eficiência do processo de coleta, manutenção e ampliação de um
banco de germoplasma (Barbosa-Neto & Bered, 1998; Ferreira & Grattapaglia,
1998).
O desenvolvimento de marcadores bioquímicos e moleculares
proporcionou um salto qualitativo e quantitativo em estudos da estrutura
populacional e do sistema reprodutivo de diversas espécies. Vários parâmetros
populacionais, como grau de endogamia e sistema reprodutivo predominante,
entre outros, podem ser obtidos e são de grande importância na determinação
de estratégias de conservação da variabilidade genética na natureza, bem
como para sua melhor utilização em programas de melhoramento genético das
espécies domesticadas (Carlini-Garcia et al., 2001; Reif et al., 2005).
Barbosa-Neto e Bered (1998) argumentam que não há sérias restrições
quanto aos marcadores moleculares preferenciais para utilização em estudos
de diversidade genética. De modo geral, os marcadores devem ser confiáveis
em termos de repetibilidade, ter baixo custo e serem fáceis e rápidos de
analisar. Neste sentido, os marcadores baseados em técnicas de PCR (reação
em cadeia da polimerase) são mais atrativos, principalmente aqueles que
apresentam grande polimorfismo como microssatélites e AFLP.
Em um trabalho de compilação de dados, de 307 estudos de avaliação
de diversidade inter e intrapopulacional de espécies de plantas selvagens,
baseados em marcadores de DNA nuclear, Nybom (2004) observou que as
estimativas derivadas de marcadores de herança dominante (RAPD, AFLP e
ISSR) são muito similares e podem ser comparáveis diretamente. Por outro
lado, marcadores de herança co-dominante (microssatélites) produziram
valores de diversidade intrapopulacional quase três vezes superiores, enquanto
que as estimativas de diversidade interpopulacionais foram similares àquelas
obtidas pelos marcadores de herança dominante. A distância geográfica
31
máxima entre populações amostradas, produziu acentuado efeito positivo na
diversidade interpopulacional e, para espécies perenes, alógamas e/ou de
sucessão tardia, a maior parte da variabilidade é de natureza intrapopulacional.
A autora também observou que o número de plantas amostradas por
população e o número de alelos de microssatélite detectados foram
correlacionados com alguns parâmetros genéticos populacionais.
2.3.1 Marcadores ISSR
Os marcadores ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) são produtos de
uma técnica baseada no método de amplificação de DNA pela reação em
cadeia da polimerase (PCR) (Reddy et al., 2002). Esta metodologia foi
originalmente descrita, com pequenas variações e diferentes denominações,
pelos trabalhos de Zietkiewicz et al. (1994), Gupta, et al. (1994) e Wu et al.
(1994). Basicamente, a técnica envolve a amplificação de regiões entre
seqüências de microssatélites adjacentes, inversamente orientadas. Os primers
são baseados nas próprias seqüências repetitivas (com motivos di, tri, tetra ou
penta nucleotídeos) proporcionando amplo arranjo de possíveis produtos
amplificáveis (Zietkiewicz et al., 1994). Nenhum conhecimento a priori do
genoma é necessário e primers baseados numa seqüência repetitiva, tal como
(CA)
n
, podem ser desenhados considerando apenas o motivo existente na
própria seqüência tais como (CA)
8
ou (CA)
9
(Gupta et al., 1994; Bornet e
Branchard, 2001) ou com uma ancoragem, formada por um pequeno segmento
de bases arbitrárias e/ou degeneradas, localizado em uma das extremidades
(3’ ou 5’) da seqüência repetitiva, tais como (CA)
8
RG e (CA)
8
YT ou BDB(CA)
7
(onde R=purinas, Y=pirimidinas, B=C, G ou T e D=A, G, ou T) (Zietkiewicz et
al., 1994; Godwin et al., 1997, Fang et al., 1997, Reddy et al., 2002).
Considerando a ubiqüidade das seqüências microssatélites nos
genomas dos eucariotos, o resultado da amplificação por primers ISSR é um
sistema de marcadores multilocos útil para fingerprinting, análises de filogenia
e diversidade, mapeamento e etiquetagem gênica e análises de biologia
evolutiva (Godwin, et al., 1997; Reddy et al., 2002). Para que a amplificação de
locos ISSR tenha sucesso, os pares de seqüências repetitivas devem ocorrer
dentro de uma distância suficientemente curta, que possa ser amplificada pela
32
reação de PCR e os seus produtos separados em géis padrões de agarose ou
poliacrilamida (Zietkiewicz et al., 1994, Gupta, et al., 1994; Godwin, et al., 1997;
Reddy et al., 2002).
De acordo com Reddy et al. (2002), as fontes de variabilidade e o nível
de polimorfismo detectado através dos marcadores ISSR, são decorrentes dos
seguintes fatores: a) elevada taxa de mutação das seqüências microssatélites,
alvos do anelamento do primer empregado; b) natureza do primer utilizado, isto
é, seqüência repetitiva ou motivo, existência ou não de região de ancoragem,
assim como localização (5’ ou 3’), extensão e composição da seqüência de
ancoragem; d) método de resolução utilizado, isto é, gel desnaturante de
poliacrilamida (PAGE) em combinação com marcação radiativa ou coloração
com nitrato de prata ou gel de agarose, corado com brometo de etídeo.
Segundo Blair et al. (1999), se a distribuição das diferentes seqüências
microssatélites é aleatória, o número de bandas produzidas por um primer
ISSR, de um dado motivo, deveria ser o reflexo deste motivo em um dado
genoma. Dessa forma, tal situação forneceria uma estimativa da abundância de
diferentes motivos, a partir de uma biblioteca de hibridização, e auxiliaria na
seleção de motivos-alvos para o desenvolvimento futuro de marcadores de
microssatélites.
O número de trabalhos utilizando marcadores ISSR tem sido crescente
desde as primeiras publicações sobre a técnica. Esta classe de marcadores
combina a maioria das vantagens dos marcadores AFLP, microssatélite, e
RAPD, como elevado grau de reprodutilibidade dos dois primeiros e baixo
custo, simplicidade e universalidade, do último (Godwin, et al., 1997; Fang et
al., 1997, Bornet e Branchard, 2001; Reddy et al., 2002). A alta
reprodutibilidade é resultante do comprimento dos primers empregados (16 a
25 pb) e de condições de anelamento mais estrigentes (com temperaturas
entre 45°C e 60°C), enquanto o baixo custo e a simplicidade são em
decorrência dos primers serem universais e livres de patenteamento, assim
como da possibilidade de utilização sistemas de resolução que dispensam o
uso de radiatividade, como o gel agarose corado com brometo de etídeo.
Reddy et al. (2002) discutem as aplicações, relacionando diversos exemplos,
desta classe de marcadores no melhoramento de plantas cultivadas. Por outro
lado, uma parcela significativa dos trabalhos encontrados na literatura atual
33
envolve a aplicação dos marcadores ISSR na análise genética de espécies
silvestres, sejam elas aparentadas ou não de espécies de plantas cultivadas.
Estes trabalhos envolvem estudos de diversidade genética intra e
interespecíficas de acessos ou genótipos, assim como análise da estrutura
genética entre e dentro de populações naturais.
Huang e Sun (2000) avaliaram a diversidade e as inter-relações de
acessos de batata doce (Ipomoea batatas) e de outras nove espécies silvestres
relacionadas, utilizando marcadores ISSR e DNA do cloroplasto. De acordo
com os autores, as análises filogenéticas, conduzidas com os dois tipos de
marcadores, produziram resultados semelhantes, entretanto o elevado nível de
polimorfismo exibido pelos marcadores ISSR resultou em melhor separação
dos acessos ao nível infra-específico. Análise de diversidade e relações
filogenéticas, utilizando marcadores ISSR, foi realizada no gênero Oryza por
Joshi et al. (2000). O trabalho envolveu 17 espécies de arroz selvagem e duas
cultivadas (O. sativa e O. glaberrima), além de espécies de outros três gêneros
relacionados, perfazendo um total de 42 genótipos avaliados. O emprego de 11
primers polimórficos e informativos possibilitou o agrupamento dos genótipos
de acordo com seus respectivos genomas, além de revelar a existência de 87
marcas espécies e/ou genoma específicos para oito dos nove genomas
existentes em Oryza e sugerir um padrão evolutivo polifilético para o gênero.
Estudos com marcadores ISSR envolvendo a caracterização de acessos
pertencentes a uma única espécie foram realizados por Fang et al. (1997), que
avaliaram 48 acessos de Poncirus trifoliata da coleção de Citrus da
Universidade da Califórnia; Blair et al. (1999), que analisaram 58 acessos
representativos da diversidade de arroz cultivado (Oriza sativa); Eiadthong et
al. (1999), que investigaram a divergência entre 22 cultivares de manga
(Mangifera indica), plantados na Tailândia; Assefa et al. (2003), que estudaram
a divergência genética de 92 genótipos do cereal Eragrostis tef, originários de
oito regiões diferentes da Etiópia. Em todos estes trabalhos, o nível de
polimorfismo acessado foi considerado satisfatório pelos autores, possibilitando
a distinção entre genótipos, individualmente e por grupo de afinidade, na quase
totalidade dos casos. Os dados observados também foram compatíveis com
os resultados obtidos de outros estudos, quando os mesmos materiais foram
34
investigados através de outros tipos de marcadores moleculares, como
isoenzimas, RAPD, RFLP e AFPL.
Os marcadores ISSR também têm sido utilizados com sucesso em
estudos de diversidade e estrutura genética de populações naturais de
espécies silvestres, tais como mangue (Aegiceras corniculatum) da costa da
China (Ge e Sun, 1999); amora (Morus serrata) na Índia (Vijayan et al., 2004);
café (Coffea arabica) na Etiópia, (Aga et al., 2005); leguminosas do gênero
Ammopiptanthus do deserto do Noroeste da China (Ge et al., 2005) e de três
espécies de montana (Symplocos lauriana, Gaultheria fragrantissima e Eurya
nitida), endêmicas da região de Western Ghats da Índia (Deshpande et al.,
2001).
2.3.2 Marcadores moleculares em cajueiro
O primeiro trabalho envolvendo a utilização de marcadores moleculares
de DNA em cajueiro foi descrito por Silva-Neto et al. (1995). Neste estudo os
autores avaliaram a viabilidade da utilização de marcadores RAPD na
identificação de clones de cajueiro anão precoce e concluíram que a técnica
era apropriada para ser empregada em análises de germoplasma de A.
occidentale. Por outro lado, ainda hoje a utilização de marcadores moleculares
na caracterização de recursos genéticos de cajueiro é bastante restrita, se
limitando a um pequeno número de trabalhos conduzidos com coleções de
bancos de germoplasma da Tanzânia e da Índia. O primeiro destes estudos foi
realizado por Mneney et al. (2001), que avaliaram a divergência genética,
baseada em marcadores RAPD, de acessos da Tanzânia, Sri Lanca,
Moçambique, Índia, Brasil e Cook Islands. Os autores verificaram que os
acessos brasileiros formaram um grupo separado e mais distinto em relação
aos das demais procedências. Posteriormente, Dhanaraj et al (2002)
estimaram a diversidade genética entre 90 acessos do Banco Nacional de
Genética do Cajueiro da Índia, também utilizando marcadores RAPD. De
acordo com os autores, este estudo permitiu confirmar que diversidade do
banco indiano de germoplasma de caju pode ser considerada de moderada a
alta. Os resultados também permitiram estabelecer uma coleção nuclear (core
35
colletion) menor, com representação da mesma diversidade da população
inteira.
Archak et al. (2003a) compararam a eficiência e utilidade de três tipos de
marcadores moleculares (RAPD, ISSR e AFLP) e de descritores morfológicos
na medida de variação e discriminação genotípica de germoplasma de caju. Os
autores verificaram que, a partir de cada um dos três tipos de marcadores
utilizados, foi possível discriminar os 19 acessos avaliados, com maior
eficiência para os marcadores AFLPs. Por outro lado, não foi observada a
ocorrência de correlação entre o conjunto de 27 descritores morfométricos
utilizados e os marcadores moleculares. Apenas os marcadores RAPD e ISSR
apresentaram correlação significativa (r=0,63 p<0,01). Archak et al. (2003b)
também utilizaram marcadores RAPD e ISSR na caracterização fingerprinting
de 35 variedades elites, sendo 24 seleções e 11 híbridos, desenvolvidas por
diferentes centros de pesquisa da Índia. A partir de 94 locos amplificados foi
possível diferenciar, com alto grau de certeza, todos os genótipos. Por lado, os
resultados evidenciaram que a base genética entre eles é muito estreita,
apesar da grande amplitude geográfica entre os locais de obtenção dos
cultivares, fato atribuído ao intenso intercâmbio de material genético entre os
centros de pesquisa e ao número reduzido de parentais empregados nos
programas de produção de híbridos.
Trabalhos utilizando marcadores moleculares específicos para o
cajueiro, como microssatélites, ainda não estão disponíveis na literatura até a
presente data. Entretanto, Croxford et al. (2006) relataram o desenvolvimento
de 21 pares de primers microssatélites, a partir de uma biblioteca genômica
não enriquecida de A. occidentale. A viabilidade destes primers foi testada em
uma população de 49 indivíduos de cajueiro e a maioria amplificou dois ou três
alelos distintos, com um deles produzindo um máximo de cinco alelos. Syed et
al. (2005) descreveram o desenvolvimento de marcadores baseados no
sistema de polimorfismo de amplificação de seqüência específica (SSAP) da
região LTR (Long Terminal Repeat) do retrotransposon Ty1-copia, a partir do
sequenciamento de duas LTRs isoladas do genoma de A. occidentale. De
acordo com os autores, esta classe de marcadores apresentou nível de
polimorfismo superior ao obtido por marcadores AFLP em cajueiro, sendo de
grande potencial na construção mapas saturados e seleção assistida.
36
2.4 Análises da Diversidade de Recursos Genéticos Aplicadas a Variáveis
Binárias
2.4.1 Análise Discriminante
Diversos procedimentos de análises discriminantes, aplicados a dados
binários, já foram sugeridos por diferentes autores (Moore, 1973; Hand, 1983;
Beharav e Nevo, 2003). Nos últimos anos, as estimativas de variação genética
têm sido, de forma crescente, baseadas na informação extraída ao nível de
seqüências de DNA, através de diferentes classes de marcadores moleculares.
Este tipo de informação, frequentemente, é convertida em um sistema binário e
utilizada em análises discriminantes, com o propósito de identificar os locos
que sejam os melhores fatores de diferenciação, isto é, aqueles locos que
apresentem elevado nível de diferenciação nas freqüências alélicas para
diferentes populações e, por isso, são úteis na classificação correta dos
indivíduos nas suas respectivas populações (Beharav e Nevo, 2003).
Os métodos de análises discriminantes normalmente empregados na
classificação de genótipos, a partir de dados moleculares binários, são ditos
não paramétricos, uma vez que não é assumida nenhuma forma paramétrica
de distribuição para a função de densidade das variáveis analisadas (Khattree
e Naik, 2000). Uma das técnicas frequentemente empregadas é o método dos
k vizinhos mais próximos. Este procedimento é baseado em certo critério
envolvendo distâncias entre indivíduos imediatos. Ou seja, dado um grupo de
observações a serem classificadas, um algoritmo procura, para uma particular
observação, aquelas que lhe sejam mais próximas. Assim, cada observação é
alocada na classe que contenha a maior proporção de k vizinhos mais
próximos (Khattree e Naik, 2000; Beharav e Nevo, 2003).
Supondo que se deseje alocar um indivíduo, cujo valor observado seja
igual a x, em uma de duas ou mais populações, e que k seja um número inteiro
positivo definido pré-especificado. A partir de todas as distâncias genéticas
entre pares de indivíduos, define-se os k indivíduos mais próximos daquele que
se deseja classificar. Supondo que dentre esses k indivíduos, k
t
são
provenientes da população t, cuja probabilidade a priori é
t
π . Então, a
37
probabilidade a posteriori de que este indivíduo pertença a t-ésima população é
estimada por:
∑
=
=
p
s
sss
ttt
nk
nk
P
1
)/(
)/(
π
Onde
s: é número de populações avaliadas (
ps ,,1 L
=
);
n: é o número de indivíduos de cada população.
A observação x será classificada na t-ésima população se a
probabilidade posterior para esta população for a maior entre todas. Ou seja, x
será classificado na t-ésima população se
ttt
nk
for maior que
sss
nk
para
todo s (Khattree e Naik, 2000). Geralmente, no caso de ocorrência de empate
entre probabilidades, x é alocado uma população designada de
“desconhecida”.
2.4.2 Analise de Variância Molecular
Técnicas multilocos de fingerprinting de DNA, baseadas na reação em
cadeia da polimerase (PCR), tais como RAPD (random amplified polymorphic
DNA), AFLP (amplified fragment length polymorphism) e ISSR (inter-simple
sequence repeats), apresentam enorme valor nos estudos de variação genética
de populações naturais, uma vez que elas proporcionam a geração de grande
quantidade de dados de maneira rápida e relativamente fácil (Krauss, 2000),
além de prescindir de qualquer conhecimento prévio do genoma da espécie ou
populações analisadas. Por outro lado, apesar das vantagens citadas a análise
desse tipo de marcador apresenta alguns problemas de ordem prática, sendo o
principal deles o fato de não ser possível distinguir, diretamente, os genótipos
heterozigotos dos homozigotos dominantes, ou seja, se um haplótipo ou “alelo”
de um sítio de RAPD é amplificado, não é possível distinguir entre o loco
homozigoto marcador/marcador (situação em que são amplificados os
fragmentos dos dois haplótipos do indivíduo) e o heterozigoto marcador/ loco
38
nulo (situação em que ocorre a amplificação de apenas um dos haplótipos do
indivíduo) (Lynch e Milligan, 1994).
Uma estratégia alternativa é a análise de progênies ou de tecido
haplóide (como o macrogametófito de coníferas), de cada indivíduo que
apresenta o alelo dominante. Entretanto tal estratégia amplia
significativamente o volume de trabalho laboratorial e, mais importante ainda,
em muitos casos não se dispõe de tais progênies e/ou tecidos haplóides
(Zhivotovsky, 1999). Por isso, segundo Krauss (2000), três soluções, de
natureza estatística, têm sido propostas para contornar este problema:
a) A freqüência do alelo nulo, para um dado loco, pode ser estimada
através da raiz quadrada da freqüência do genótipo homozigoto nulo
(banda ausente no gel), assumindo equilíbrio de Hardy-Weinberg na
população e/ou loco;
b) Aplicação da metodologia proposta por Lynch e Milligan (1994), cujo
propósito principal é reduzir o viés das estimativas obtidas, pelo método
da raiz quadrada. Para isto, a análise ignora os locos cujas freqüências
de indivíduos homozigotos nulos não excedam a três e utiliza
estimadores de parâmetros populacionais obtidos pela expansão, de
segunda ordem, da série de Taylor;
c) Utilização de uma abordagem Bayesiana, proposta por Zhivotovsky
(1999), na estimação da freqüência dos alelos nulos.
As três metodologias relacionadas assumem, de algum modo, que o
coeficiente de endogamia intrapopulacional é conhecido (Holsinger et al.,
2002). Uma outra metodologia, amplamente utilizada atualmente, é AMOVA
(analysis of molecular variance) desenvolvida por Excoffier et al. (1992). Neste
caso, os dados fenotípicos multilocos, de cada indivíduo, são tratados como
haplótipos e utilizados na construção de matrizes que descrevem a distância
entre haplótipos na análise de variância molecular (Holsinger et al., 2002).
A analise de variância molecular (AMOVA) foi concebida como uma
extensão dos trabalhos de Cockerham (1973) e de Long (1986), para a
correlação alélica entre demes, para dados de diversidade entre haplótipos.
Dessa forma, partindo do pressuposto que uma soma de quadrados
convencional pode ser escrita como uma soma de quadrados das diferenças
entre todos os pares de observações, Excoffier et al. (1992) elaboraram uma
39
análise hierárquica da variância molecular diretamente da matriz de quadrados
de distâncias entre todos os pares de haplótipos, produzindo estimativas de
componentes de variância análogas às estatísticas F de Wright, denominadas
de “estatísticas Φ ”. O método é flexível para acomodar diversos tipos de
matrizes, correspondentes a diferentes tipos de dados moleculares e/ou
pressuposições evolutivas, sem necessidade de mudança na estrutura básica
da análise.
O termo haplótipo, empregado neste contexto, refere-se à combinação
de marcadores moleculares presentes em alguma área definida do genoma.
Assim, o haplótipo de um indivíduo é representado por um vetor p, com valores
1, se a banda homóloga estiver presente e 0, caso contrário, enquanto um
marcador, pode ser um fragmento de restrição/amplificação, um nucleotídeo ou
um evento mutacional (Excoffier et al.,1992).
Considerando o caso em que os indivíduos amostrados são oriundos de
diferentes populações, arranjadas em grupos, definidos a priori por um critério
não genético, os haplótipos podem ser representados pelo modelo linear:
ijkjkkijk
cbaxx +++=
onde x
ijk
é a freqüência do vetor do i-ésimo haplótipo, da j-ésima população no
k-ésimo grupo, x é o valor esperado desconhecido de x
ijk
, a é efeito de grupos,
b é efeito de populações e c de indivíduos ou haplótipos. Tais efeitos são
assumidos como sendo aditivos, aleatórios, não correlacionados, associados
aos componentes de variância σ
2
a
, σ
2
b
e σ
2
c
, respectivamente, que são
utilizados na obtenção das estatísticas
Φ
2
22
σ
σσ
ba
ST
+
=Φ ,
2
2
σ
σ
a
CT
=Φ ,
22
2
cb
b
SC
σσ
σ
+
=Φ
onde
2222
bba
σσσσ
++= ;
ST
Φ
é correlação entre pares de haplótipos aleatórios
dentro de populações, em relação à correlação de pares de haplótipos tomados
ao acaso da espécie como um todo;
CT
Φ
é a correlação entre haplótipos
dentro de cada grupo de populações, em relação à de pares de haplótipos
tomados ao acaso da espécie como um todo e
SC
Φ
é correlação da
diversidade molecular entre haplótipos aleatórios dentro das populações,
40
relativa à correlação entre pares de haplótipos tomados ao acaso dentro de
uma região (Excoffier et al.,1992).
Originalmente, a metodologia da AMOVA foi desenvolvida para
aplicação em sistemas haplóides (mtDNA) constituídos de um único grupo de
ligação. Posteriormente, Michalakis e Excoffier (1996), descreveram
estimadores para dados multilocos de microssatélites em sistemas diplóides.
Os autores sugeriram manipular os genótipos dos indivíduos como dois
haplótipos distintos, por isso, seria necessário conhecer a fase gamética e/ou
que os marcadores fossem codominantes. Entretanto, Huff et al. (1993)
aplicaram a metodologia original de Excoffier et al. (1992), na análise de
diversidade de populações de uma espécie alógama obrigatória de gramínea
(Buchoë dactyloides), genotipadas com marcadores RAPD, decompondo a
variação total observada em componentes devido às diferenças entre
indivíduos dentro de populações, entre populações dentro de regiões
adaptativas e entre regiões. A partir daí este método tornou-se um dos mais
utilizados, para partição da variabilidade genética, em trabalhos envolvendo
populações naturais avaliadas com marcadores moleculares de herança
dominante (Nybom, 2004). Posteriormente, modelos com decomposição da
variação total, específicos para diversos tipos de dados, incluindo dados
genotípicos com alelos recessivos e fase gamética desconhecida, foram
incorporados ao aplicativo computacional empregado na execução da AMOVA
(Schneider et al., 2000).
Diferentes métodos para obtenção da matriz de distância têm sido
utilizados, destacando-se o quadrado da distância euclidiana, distância de Nei
e Li e distância de Jaccard, mas todos eles produzem resultados praticamente
idênticos na análise de variância molecular, quando aplicados ao mesmo
conjunto de dados (Nybom, 2004). A significância dos componentes de
variância e das estatísticas
Φ
são testadas através de análise de permutação
(Excoffier et al., 1992). Neste caso, uma distribuição nula é computada por
reamostragem dos dados, de modo que, a cada permutação, cada indivíduo é
alocado aleatoriamente dentro da população, mantendo-a de tamanho
constante. A repetição do processo diversas vezes possibilita a construção de
uma distribuição nula, que será utilizada na estimação do grau de significância
da estatística obtida.
41
O método da AMOVA apresenta uma relação direta com as estatísticas
F, estando sujeito às mesmas limitações das pressuposições assumidas pelo
modelo proposto por Cockerham (1973). É assumido que os acasalamentos
ocorram completamente ao acaso e que não há endogamia. Caso contrário, o
nível de heterozigose será inferior e a variabilidade poderá não ser
convenientemente estimada. Em razão da deriva genética, fica difícil assumir
que qualquer haplótipo seja representativo da variação completa do genoma.
Também é importante que os dados sejam derivados de um número adequado
de marcadores moleculares. Os efeitos de seleção também não são
completamente considerados nesta metodologia de análise. Se as
subpopulações estão sob diferentes pressões seletivas, a seleção poderá ter
efeitos muito diferentes sobre os alelos e sobre as combinações genotípicas.
Por outro lado, conforme destaca Excoffier et al.(1992), o propósito
principal da AMOVA é delinear a extensão da diferenciação genética entre e
dentro de populações, através de componentes de variância. Por isso, os
resultados obtidos deverão ser interpretados com a devida cautela.
42
CAPÍTULO 1
ANÁLISE DA DIVERSIDADE EM Anacardium spp.
BASEADA EM DADOS MORFOMÉTRICOS
Desenhos esquemáticos extraídos de Cashew Descriptors (IBPGR, 1986)
base
lado
dorsal
ápice
Comprimento
largura
cavidade
sulco apical
crista ou nervura
lado
ventral
ombro
inserção da haste
haste
comprimento
largura
flancos
espessura
43
1 INTRODUÇÃO
Anacardium é um pequeno gênero da família Anacardiaceae constituído
de árvores, arbustos e subarbustos nativos dos neotrópicos. Segundo Ferreira
(1973), esta família é composta por árvores ou arbustos de folhas alternas,
coriáceas e sem estípulas, sempre providas de canais resiníferos em seus
ramos. Vários gêneros são produtores de frutos comestíveis, como Mangifera
(mangas), Spondias (cajás e umbu) e Anacardium (cajus), além de outros
possuidores de madeira de ótima qualidade como Astronium (Gonçalo Alves,
aroeiras) e Schinopsis (braúna e quebracho).
A única espécie cultivada é A. occidentale, devido, principalmente, à
importância econômica que o comércio de sua amêndoa (castanha) apresenta
no mercado internacional. No Brasil, a baixa produtividade das lavouras é o
problema mais significativo desta cultura, com produtividade média de 220 kg
de castanhas in natura por hectare, razão pela qual o programa de pesquisa de
melhoramento genético vem dando prioridade à obtenção de cultivares mais
produtivas (Barros e Crisóstomo, 1995). Diversos fatores contribuem para a
baixa produtividade dos atuais plantios, dentre eles a propagação realizada por
sementes é o principal, já que o cajueiro é uma espécie predominantemente
alógama. Isto resulta na heterogeneidade de diversos caracteres da planta
como: altura, formato e expansão da copa, época de florescimento e de
produção, tamanho do fruto, peso total, peso da amêndoa, despeliculagem,
relação peso da amêndoa/peso do fruto e do pseudofruto, coloração, formato e
composição química do suco (Crisóstomo et al., 1992; Barros et al., 2002).
A propagação clonal, através de enxertia de genótipos de cajueiro anão
precoce, trouxe novas perspectivas para o desenvolvimento da cajucultura
brasileira, elevando o potencial produtivo, em regime de sequeiro, para níveis
superiores a 1300 kg/ha de castanha, com a vantagem das plantas
apresentarem redução de porte, em relação ao tipo comum (Barros e
Crisóstomo, 1995). Por outro lado, existem poucos clones do tipo anão
recomendados para plantio, todos resultantes de um programa de
melhoramento de base genética muito estreita, constituindo situação de
vulnerabilidade à cultura (Cavalcanti et al., 2000b; Barros et al., 2000). Esta
realidade pode ser modificada com uma maior disponibilização de diversidade
44
genética, caracterizada e quantificada, para uso imediato nos programas de
melhoramento para obtenção de cultivares mais produtivos e adaptados a
diferentes ecossistemas tropicais, como os cerrados e o semi-árido brasileiros
(Barros et al. 2000).
No que se refere à origem geográfica, o Brasil é considerado o local de
origem do cajueiro, uma vez que a espécie ocorre em praticamente todo o
território nacional e já era amplamente utilizada, pelas populações indígenas, à
época da chegada dos europeus (Lima, 1986; apud Barros et al. 2002). Além
de A. occidentale, outras vinte espécies de Anacardium foram descritas pela
taxonomia clássica, número este reduzido a dez espécies por Mitchell e Mori
(1987). Estas espécies são tipicamente tropicais, sendo encontradas na
Amazônia (florestas úmidas, matas de galeria e cerrado), planalto central e
Nordeste (cerrado) do Brasil, embora A. humile seja encontrada até o sul do
trópico de Capricórnio, na América do Sul (Mitchell e Mori, 1987).
De acordo com Mitchell e Mori (1987), A. occidentale é uma espécie
polimórfica, constituída por dois ecótipos distintos: um ecótipo típico de zonas
de restinga, de qual se originaram as formas cultivadas e um ecótipo típico dos
cerrados do Brasil Central, não cultivado e associado à vegetação aberta de
fisionomia savanóide desta região. Por outro lado, os autores acreditam que a
espécie tenha evoluído originalmente nos cerrados do Brasil Central e,
posteriormente, colonizou as zonas de restingas, mais recentes, da costa
brasileira.
Embora seja considerado o principal centro de diversidade do gênero
Anacardium, poucos trabalhos de avaliação e caracterização do germoplasma
foram realizados no Brasil, destacando-se apenas estudo de Barros (1991),
que fez a caracterização morfológica e isoenzimática, por meio de técnicas
multivariadas, de parte do Banco Ativo Germoplasma do Cajueiro, do Centro
Nacional de Pesquisa de Caju (atual Embrapa Agroindústria tropical).
Trabalhos desta natureza fornecem subsídios fundamentais aos programas de
melhoramento da espécie, assim como ao processo de otimização nas
atividades de coleta e de conservação dos recursos genéticos, tanto in situ
quanto ex situ.
Este trabalho teve por finalidade avaliar a diversidade genética de parte
dos acessos de Anacardium spp., mantidos pelo Banco Ativo de Germoplasma
45
do Cajueiro (BAG – Embrapa CNPAT – CE) e de indivíduos amostrados em
uma população subespontânea de cajueiro (Anacardium occidentale),
localizada no estado do Rio de Janeiro, através de descritores morfométricos.
Especificamente, os objetivos foram:
- Caracterizar e quantificar a variabilidade genética existente entre
acessos e dentro de populações de cajueiro, através de variáveis
morfométricas;
- Estimar as distâncias genéticas entre as populações e avaliar suas
relações com a origem geográfica;
- Comparar diferentes estratégias de análises baseadas em técnicas
multivariadas aplicadas a caracteres de variação contínua.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Material vegetal
As informações utilizadas para o estudo foram obtidas de 69 acessos do
Banco Ativo de Germoplasma do Cajueiro (Quadro 01) e de 23 indivíduos de
uma população subespontânea de uma área de restinga do litoral norte do
Estado do Rio de Janeiro. Cada acesso foi representado por um indivíduo
apenas, perfazendo um total de 92 genótipos analisados, os quais serão
referidos daqui em diante simplesmente como acessos, independentemente da
origem.
O BAG do Cajueiro pertence a Embrapa Agroindústria Tropical e
localiza-se na Microrregião Litoral de Pacajus, Município de Pacajus, Estado do
Ceará, no km 5 da Estrada Pacajus-Itaipaba, a partir da BR-116, a
aproximadamente 55 km da cidade de Fortaleza e cerca de 40 km, em linha
reta, do oceano. Esta localização corresponde às coordenadas 4
o
10' S e
38
o
27' W, com altitude de 60 m acima do nível do mar. O clima da Região
enquadra-se no tipo seco/sub úmido (c2) da classificarão de Thornthwaite. A
precipitação média anual é de 1100 mm com duas estações definidas: uma de
chuvas que vai, normalmente, de janeiro a junho com cerca de 90% do total da
precipitação anual, caracterizada por ser extremamente irregular, e outra seca,
de julho a dezembro, na qual ocorrem normalmente o florescimento e a
46
frutificação do cajueiro (Barros, 1991, Paiva et al., 2003). A área é composta de
três unidades pedogenéticas: a) podzólico vermelho-amarelo eutrófico; b)
podzólico vermelho-amarelo distrófico e, 3) areias quartzosas distróficas. O
relevo é plano e as características físicas de maior importância são associadas
à textura. A condição arenosa resulta em fraca agregação do solo, baixa
retenção de umidade, lixiviação de fertilizantes aplicados à superfície e
drenagem acentuada, forte ou excessiva. O pH está entre 5,0 e 6,0
(moderadamente ácido) e a fertilidade natural é baixa (Barros, 1991).
Quadro 1 – Informações das coleções e dos acessos do Banco Ativo de
Germoplasma do Cajueiro empregados na análise de diversidade
baseada em dados morfométricos.
Nome da coleção,
procedência e data
da introdução
Número
da planta
no BAG
Espécie
Local da Coleta
29
A. othonianum
Campos Belos (GO)
100
A. othonianum
São Domingos (GO)
138
A. othonianum
Arraias (GO)
197 Anacardium sp. Cristalina (PI)
205
A. occidentale
Itaituba (PA)
209 Anacardium sp. Eliseu Martins (PI)
226
A. othonianum
Barra do Garças (MT)
241
A. occidentale
Itaituba (PA)
245
A. occidentale
Itaituba (PA)
Coleção C-02,
“Cerrado”
Goiás, Mato Grosso,
Pará e Piauí.
Introdução por
sementes em 1975
281 A. othonianum (?) Água Boa (MT)
05
A. occidentale
Venezuela - El Tigre
09
A. occidentale
Venezuela – El Tigre
10
A. occidentale
Índia - Ullal
12
A. occidentale
Índia - Ullal
16
A. occidentale
Índia - Ullal
19
A. occidentale
Índia - Ullal
25
A. occidentale
Valinhos (SP)
Coleção C-03
Venezuela, Índia e
Valinhos
Introdução por
sementes em 1973
30
A. occidentale
Valinhos (SP)
01 Anacardium sp. Rio Tacutu / Faz. Caju
18 Anacardium sp. Est. Tabalascada - Cantá
19 Anacardium sp. Est. Normandia Km 25
24 Anacardium sp. Est. Normandia Km 25
30 Anacardium sp. Maloca do Sucuba
38 Anacardium sp. Est. Normandia Km 25
46 Anacardium sp. Est. Normandia Km 25
Coleção C-04
Roraima
Introdução por
sementes em 1983
54 Anacardium sp. Rio Tacutu / Faz. Caju
Coleção C-05 Paraíba
Introdução por
sementes em 1990
40
A. occidentale
-
11
A. occidentale
Pacajus
47
28
A. occidentale
Aracati
34
A. occidentale
Trairi
47
A. occidentale
Trairi
55
A. occidentale
Aracati
65
A. occidentale
Aracati
75
A. occidentale
Trairi
78
A. occidentale
Aracati
102
A. occidentale
Aracati
118
A. occidentale
Trairi
174
A. occidentale
Cascavel
184
A. occidentale
Russas
187
A. occidentale
Russas
195
A. occidentale
Aracoiaba
196
A. occidentale
Aracoiaba
223
A. occidentale
Russas
236
A. occidentale
-
261
A. occidentale
Russas
Coleção C-06 Ceará
Introdução por
enxertia em 1979
275
A. occidentale
Aracoiaba
C-07 Camocin -1979 01 Anacardium sp. Camocin (CE)
-
A. microcarpum
Ceará
A. microcarpum
sementes - 1964
-
A. microcarpum
Ceará
08 A. othonianum -
14
A. othonianum
-
Coleção C-09 Goiás
Introdução por
sementes em 1975
30
A. occidentale
-
CP12
A. occidentale
Pacajus
64
A. occidentale
Pacajus
63 (CP77)
A. occidentale
Pacajus
67 (CP137)
A. occidentale
Pacajus
09 (CP138)
A. occidentale
Pacajus
54 (CP96)
A. occidentale
Pacajus
Coleção Pacajus – CE
Introdução por
sementes entre 1956
e 1959
CP 136
A. occidentale
Pacajus
14
A. occidentale
Maranguape
15
A. occidentale
Maranguape
16 (CP76)
A. occidentale
Maranguape
22 (CP06)
A. occidentale
Maranguape
23 (CP09)
A. occidentale
Maranguape
25(CP1001)
A. occidentale
Maranguape
28
A. occidentale
Maranguape
29
A. occidentale
Maranguape
30
A. occidentale
Maranguape
Coleção Maranguape
– CE
Introdução por
sementes em 1956
35
A. occidentale
Maranguape
A população subespontânea amostrada de A. occidentale localiza-se na
Fazenda Pontinha (21°43’77’’S e 41º05’68’’O), distrito do Cajueiro, município
de São João da Barra – RJ. De acordo com Dias (1984, apud Assumpção e
Nascimento, 1998) as planícies quaternárias próximas à desembocadura do rio
Paraíba do Sul classificam-se como cristas de praia ou simplesmente restingas.
O clima da região é quente e úmido, com estação chuvosa no verão e
48
pluviosidade anual atingindo cerca de 1000 mm (Assumpção e Nascimento,
1998).
2.2 Coleta de dados
Os caracteres botânico-agronômicos foram avaliados durante a fase
reprodutiva, nos meses de novembro e dezembro de 2004, para os acessos do
Rio de Janeiro e outubro e novembro de 2005, para os acessos do BAG.
Treze características quantitativas relacionadas na lista de descritores
do cajueiro, estabelecida pelo IBPGR (1986), foram empregadas no estudo. As
variáveis utilizadas foram referentes à inflorescência, pedúnculo, castanha e
porte da planta, conforme relação a seguir:
a) Comprimento da inflorescência (CIN), em centímetros;
b) Largura máxima da inflorescência (LIN), em centímetros;
c) Número total de ramificações da inflorescência (NRIN), em relação ao
eixo principal;
d) Comprimento do pedúnculo (CPE), em centímetros;
e) Diâmetro da base do pedúnculo (DBPE), em centímetros;
f) Diâmetro do ápice do pedúnculo (DAPE), em centímetros;
g) Peso do pedúnculo (PPE), em gramas;
h) Comprimento da castanha (CCA), em centímetros;
i) Largura da castanha (LCA), em centímetros;
j) Espessura da castanha (ECA), em centímetros;
k) Peso da castanha (PCA), em gramas;
l) Altura máxima da planta (AMP), em metros;
m) Diâmetro médio da copa (DMC), considerando os eixos N-S e W-E, em
metros.
À exceção das variáveis relativas ao porte da planta, foram realizadas 10
medições, por indivíduo, para cada uma das características. Este número foi
considerado suficiente para obter médias com confiabilidade igual ou superior a
90 por cento, a partir de um estudo preliminar de repetibilidade realizado por
Pessoni e Cruz (2005).
49
Dados referentes ao porte das plantas não foram tomados dos acessos
do Rio de Janeiro, em decorrência da ausência de uniformidade quanto à idade
e espaçamento entre os indivíduos.
2.3 Análise da divergência entre ecótipos e/ou espécies de Anacardium
Este estudo envolveu apenas os 69 acessos do BAG do cajueiro, para
os quais se dispunha de informações relativas a 13 variáveis morfométricas e
dos registros individuais de identificação parcial ou total, quanto à espécie e/ou
ecótipo.
A caracterização da divergência genética foi realizada por meio do
emprego de análise discriminante, baseadas em componentes principais e em
funções de classificação de Anderson, considerando 13 variáveis relativas à
inflorescência, pedúnculo, castanha e porte da planta.
Os acessos foram classificados segundo a espécie e/ou ecótipo em um
dos três grupos: A. occidentale comum, A. occidentale anão precoce e A.
othonianum. Quatorze acessos não foram pré-alocados por estarem
identificados incorretamente ou de modo incompleto, ou ainda por não
pertencerem a nenhum dos três grupos. Nestes casos tais acessos foram
alocados a posteriori, através das funções de classificação de Anderson, para
averiguar suas similaridades com cada um dos grupos pré-estabelecidos.
2.4 Análise de divergência segundo a origem geográfica de acessos de
Anacardium
Para esta caracterização, foi considerada, além dos diferentes ecótipos
e/ou espécies, a origem geográfica dos acessos avaliados. O trabalho foi
conduzido com todos os acessos com dados morfológicos disponíveis, ou seja,
69 acessos do BAG e 23 indivíduos da população do Rio de Janeiro. Foram
estabelecidos seis grupos a priori, envolvendo 80 dos acessos sob
investigação. A definição dos grupos foi realizada utilizando como critérios a
origem geográfica dos acessos e tamanho mínimo do grupo igual ou superior a
quatro acessos.
50
As funções discriminantes foram construídas a partir de 11 variáveis
morfométricas comuns a todos os acessos avaliados, referentes à
inflorescência, pedúnculo e castanha.
Os grupos pré-estabelecidos apresentaram as seguintes denominações
e constituições:
a) Grupo Nordeste (NE): 28 acessos de A. occidentale, 27 do
estado do Ceará e 1 da Paraíba;
b) Grupo Anão Precoce (AP): 10 acessos de A. occidentale anão
precoce, coletados no Município de Maranguape, estado do
Ceará;
c) Grupo Rio de Janeiro (RJ): 23 acessos de A. occidentale do
norte fluminense;
d) Grupo Roraima (RR): 08 acessos de A. occidentale oriundos
do Estado de Roraima;
e) Grupo Índia (IN): 04 acessos de A. occidentale provenientes da
Índia;
f) Grupo othonianum (OT): 06 acessos de A. othonianum do
Cerrado do Brasil Central.
Os 12 acessos remanescentes não foram agrupados por não atenderem
aos critérios de agrupamento pré-estabelecidos. A alocação a posteriori destes
acessos, dentro dos grupos pré-estabelecidos, foi averiguada através da
análise discriminante de Anderson.
2.5 Análises dos dados
2.5.1 Análise de variância
As medidas individuais das variáveis relativas à inflorescência,
pedúnculo e castanha foram submetidas, inicialmente, a análises de variâncias
considerando um fator de classificação, à exceção das variáveis peso do
pedúnculo e peso da castanha, para os indivíduos do BAG, cujos valores foram
obtidos pela média aritmética do peso conjunto de 10 frutos ou 10 castanhas.
51
2.5.2 Análises discriminantes
A divergência ao nível de grupo foi avaliada através do emprego de
análises discriminantes baseada em componentes principais (CP) e função
discriminante de Anderson, utilizado as médias de variáveis dos indivíduos
amostrados.
Na análise discriminante baseada em CP as funções são obtidas em
ordem decrescente de importância, de tal forma que a primeira função explica o
máximo da variância entre os grupos e a segunda, ortogonal à primeira, explica
o máximo da variância remanescente e assim por diante (Manly, 1998; Cruz e
Carneiro, 2003). O modelo matemático destas funções possui a seguinte
composição:
viviii
XaXaXaZ
+
++= ...
2211
onde
i
Z : função discriminante de ordem i;
ivii
aaa K,,
21
: pesos discriminantes para variáveis independentes v
),2,1( vi K= , na função discriminante
i
Z ;
v
XXX ,,,
21
K : variáveis independentes.
O número máximo de funções estimadas, para um particular conjunto de
dados, é o valor mínimo entre (p-1, v), em que p é o número de populações e v
o número de variáveis (Manly, 1998; Cruz e Carneiro, 2003).
A partir das funções discriminantes de grupos foram estimados os
escores dos indivíduos pertencentes a cada grupo. Em seguida, as
dissimilaridades entre indivíduos e seus respectivos grupos foram visualizadas
por meio de dispersão gráfica, no espaço bi ou tridimensional (Cruz e Carneiro,
2003).
A importância relativa dos caracteres empregados na discriminação dos
grupos foi avaliada utilizando o critério de peso das variáveis nos autovetores.
Foram consideradas de menor importância, as variáveis com maiores pesos,
desde o último autovetor até aquele associado a um autovalor igual ou inferior
a 0,70 (Cruz e Carneiro, 2003; Cruz at al. 2004).
Na análise discriminante de Anderson (1958, 1984) parte-se de um
conjunto de observações pertencentes a )2(≥p populações conhecidas com
52
distribuição normal multivariada, denominadas por
1
,
2
, ...,
p
π
, para obter
regras de discriminação de futuras observações de origem desconhecida
(Khattree e Naik, 2000). Para isso, o espaço p-dimensional é dividido em p
regiões disjuntas e mutuamente exclusivas, denominadas R
1
, R
2
, ..., R
p
e se
uma observação cai dentro da região Ri assume-se que ela é proveniente da
população
i
. Adicionalmente, são assumidas probabilidades a priori para
cada uma das populações, de modo que 1
21
=
+
+
+
p
π
π
π
K , além de um custo
de má classificação na construção das funções de discriminação
(Anderson,1958, 1984; Khattree e Naik, 2000).
De acordo com a notação de Cruz e Carneiro (2003), a forma genérica
da função discriminante de Anderson é dada pela expressão:
viviiii
xxxxD
α
α
α
κ
+
+
++
=
K
2211
)
~
(
Onde
i
κ
: constante associada à função discriminante;
ij
α
: coeficiente de ponderação da j-ésima variável ),,2,1( vj K= na i-ésima
função discriminante;
x
j: valor representativo do escore da j-ésima variável do elemento que se
deseja classificar em uma das populações em estudo.
A eficácia das funções discriminantes estimadas foi testada através do
cálculo da taxa de erro aparente (TEA). Esta taxa é obtida através da soma de
todos os casos de alocação incorreta, decorrentes da reclassificação dos
dados utilizados na geração das funções, dividido pelo número total de
classificações realizadas.
2.5.3 Análise de agrupamento
As inter-relações dos grupos, descritos anteriormente, foi avaliada
através de uma árvore não enraizada, construída pelo método UPGMA, a partir
das distâncias de Mahalanobis.
A divergência entre todos os acessos foi avaliada através da dispersão
baseada em componentes principais. Os autovetores e autovalores foram
estimados a partir da matriz de correlação dos dados padronizados das médias
53
originais. Adicionalmente, foi comparado o padrão de agrupamento submetido
à análise discriminante de Anderson com o padrão de agrupamento obtido pela
técnica de otimização de Tocher.
3 RESULTADOS
3.1 Análise da divergência entre ecótipos e/ou espécies de Anacardium
As médias, amplitudes totais e intervalos de confiança (95%) das 13
características morfométricas avaliadas, segundo os grupos ou ecótipos, são
apresentadas graficamente na Figura 1. De modo geral, observa-se que o
grupo 1 (A. occidentale comum) apresentou as maiores amplitudes em todas
as variáveis, mas com a maior parte das observações concentradas em torno
das médias do grupo, conforme destacado pelos intervalos de confiança. O
grupo 3 (othonianum) apresentou as maiores médias para os caracteres
relativos à inflorescência, mas estas diferenças foram estatisticamente
significativas (teste t a 0,05 de probabilidade) apenas para variável ‘largura da
inflorescência’. Por outro lado, este grupo apresentou valores
significativamente inferiores aos dos demais para as variáveis relativas ao
pedúnculo, castanha e porte da planta.
Nenhuma das variáveis analisadas apresentou médias que diferissem
estatisticamente (α = 0,05) entre os grupos de A. occidentale comum (1) e anão
precoce (2).
Os resultados da análise discriminante baseada em componentes
principais estão resumidos na Figura 2. Observa-se que o centróide e a
dispersão dos acessos de A. othonianum são claramente divergentes das
dispersões apresentadas pelos outros dois grupos. Por outro lado, é possível
notar também uma tendência de diferenciação entre grupos na dispersão dos
acessos ‘comum’ e ‘anão precoce’, em torno de seus centróides.
54
Figura 1 – Médias (ponto), amplitudes (barra escura) e intervalos de confiança
95% (barra azul) de 13 variáveis morfométricas, de acessos de
Anacardium agrupados em ecótipos e/ou espécies (1 - A.
occidentale comum; 2 – A. occidentale anão precoce; 3 – A.
othonianum).
55
Continuação Figura 1
56
Continuação Figura 1
Figura 2 - Dispersão gráfica dos centróides (números) e acessos de três
ecótipos de Anacardium, em relação funções discriminante
estimadas por componentes principais, a partir da combinação
linear entre 13 características morfométricas. (1-azul: A.
occidendale comum, 2-vermelho: A. occidendale anão precoce, 3-
verde: A. othonianum).
3
2
1
CP
1
95,28%
CP
2
4,72%
57
O primeiro componente principal é um vetor que concentra quase toda a
variação disponível, respondendo por 95,3% da variação total dos dados.
Todas as variáveis analisadas apresentaram pesos semelhantes para este
componente. A única exceção foi variável altura da planta, que teve um efeito
um pouco menor no primeiro componente ao mesmo tempo em que foi a de
maior efeito no segundo componente principal, indicando com isso que é a
variável de menor importância na discriminação dos grupos (Tabela 1).
Na Tabela 1 são apresentadas as funções discriminantes de Anderson,
estimadas para os três grupos investigados. A classificação dos acessos obtida
a partir destas funções, apresentada na Tabela 2, confirma o maior grau de
diferenciação do grupo ‘othonianum’, com todos os seus representantes
alocados corretamente no grupo respectivo, ao mesmo tempo em que este
grupo não recebeu a alocação de nenhum acesso pertencente a outro grupo.
Por sua vez, os percentuais de classificações incorretas nos grupos ‘comum’ e
‘anão precoce’ também foram relativamente baixos, com maior freqüência de
acessos do grupo ‘comum’ sendo alocados incorretamente no grupo ‘anão
precoce’ do que o contrário. Dessa forma, dos 55 acessos pré-classificados
apenas oito foram alocados incorretamente, o que resultou em uma taxa de
erro aparente total de 14,5%.
Entre os 14 acessos alocados a posteriori, oito foram alocados no grupo
‘comum’, quatro no grupo ‘anão precoce’ e dois no grupo ‘othonianum’. Dos
oito acessos provenientes do estado de Roraima e identificados no BAG
apenas como Anacardium sp, quatro foram alocados no grupo ‘anão precoce’ e
quatro grupo ‘comum’. Entre os dois acessos alocados no grupo ‘othonianum’
um foi coletado no estado do Piauí e encontra-se identificado apenas como
Anacardium sp. O outro acesso está identificado como A. microcarpum e sua
origem é desconhecida. Os quatro acessos restantes foram alocados no grupo
‘comum’, sendo três identificados apenas como Anacardium sp. e um como A.
othonianum.
58
Tabela 1 - Constantes, coeficientes de ponderação e estimativas de
autovetores referentes às funções discriminantes por
componentes principais (1) e de Anderson (2), considerando
três ecótipos de Anacardium e 13 variáveis métricas.
Variáveis
1
Coeficientes de ponderação e
estimativas de autovetores (λ
j
)
2
Constantes e coeficientes de ponderação
das funções discriminantes de Anderson
Constante CP
1
CP
2
-205,1661 -203,4227 -190,7639
CIN -0,2827 -0,1292 -1,3352 -0,9138 -1,1182
LIN -0,2673 0,4331 1,4140 1,1066 1,3391
NRIN -0,2644 -0,4672 6,1883 6,3746 6,3922
CPE 0,2797 -0,2254 -1,7381 -2,1354 -2,8950
DBPE 0,2823 -0,1437 -17,3110 -17,8891 -20,0715
DAPE 0,2800 -0,2174 37,6960 37,9786 36,7747
CCA 0,2840 0,0369 42,3910 44,4063 41,0549
LCA 0,2841 -0,0170 65,4769 63,4634 66,7939
ECA 0,2826 -0,0816 55,2291 54,9172 52,5099
PPE 0,2776 -0,2729 -0,6168 -0,5623 -0,5419
PCA 0,2841 0,0180 -19,1260 -19,5991 -18,8419
AMP 0,2543 0,5692 2,2889 1,5162 2,1589
DMC 0,2796 0,2272 0,2218 0,4585 0,0460
λ
j
13,3861 0,6138 - - -
λ
j
(%)
95,28 4,72 - - -
Tabela 2 – Análise discriminante de ecótipos de Anacardium baseada em
funções discriminantes de Anderson, estimadas a partir da
combinação linear de 13 características morfométricas. Os
valores destacados em negrito referem-se aos percentuais de
alocação dos acessos nos seus respectivos grupos de origem.
Percentuais de alocação nos diferentes grupos Grupo de
origem
Número
de
Indivíduos
A. occidentale
comum
A. occidentale
anão precoce
A.
othonianum
A. occidentale
comum
39
82,05
17,95 0,00
A. occidentale
anão precoce
10 10,00
90,00
0,00
A. othonianum
06
0,00 0,00
100
Alocados a
posteriori
14 57,14 28,57 14,28
Total de indiv. 69 41 20 08
Taxa de erro aparente = 14,5%.
59
3.2 Análise de divergência segundo a origem geográfica de acessos de
Anacardium
As médias, amplitudes e intervalos de confiança (95%) das 11
características avaliadas, dos seis grupos de Anacardium estabelecidos a
priori, são apresentadas na Figura 3. Novamente o grupo ‘othonianum’ (6) se
destaca por apresentar os maiores valores médios para os caracteres relativos
à inflorescência e as menores médias para os demais caracteres. Entre os
grupos constituídos por acessos de A. occidentale, o do ‘Rio de Janeiro’ (3)
apresentou as menores médias para 10 das 11 características, a única
exceção foi a variável número de ramificações da inflorescência. Entretanto
estas diferenças foram estatisticamente significativas apenas para os
caracteres relativos ao pedúnculo e ao peso da castanha.
Embora os grupos 3 e 5 (Índia) não tenham diferido para caráter número
de ramificações da inflorescência, esta variável foi importante na discriminação
destes dois grupos em relação aos demais envolvidos no estudo.
A Tabela 3 e a Figura 4 apresentam os resultados da análise
discriminante baseada em componentes principais, considerando as seis
populações pré-estabelecidas, segundo os critérios de ecótipo e/ou espécie e
origem geográfica dos acessos.
Verifica-se que a maior parte da variabilidade foi retida nos primeiros
componentes principais, com o primeiro e o segundo componentes explicando,
respectivamente, 77,58% e 17,84% da variação total. Dentro destas
circunstâncias, os dois primeiros componentes retêm cerca de 95% da
variância dos dados.
Examinando a Tabela 3 também é possível identificar as variáveis de
maiores pesos nos últimos autovetores e, portanto, com menor contribuição na
discriminação dos grupos. Estas variáveis foram, em ordem crescente de
importância, comprimento da castanha, comprimento da inflorescência e
número de ramificações da inflorescência, conforme valores destacados em
negrito na Tabela.
60
Figura 3 – Médias (ponto), amplitudes (barra escura) e intervalos de confiança
95% (barra azul) de 11 variáveis morfométricas de acessos de
Anacardium, agrupados segundo a origem geográfica, ecótipos ou
espécie. Grupos: 1 – Nordeste ; 2 – Anão Precoce; 3 – Rio de
Janeiro; 4 – Roraima; 5 – Índia; 6 - A. othonianum.
61
Continuação Figura 3
62
Tabela 3 – Estimativas de autovalores e autovetores associados aos
componentes principais, obtidos da matriz de correlação entre
11 variáveis morfométricas de Anacardium spp. Valores
expressos em:
1
centímetros,
2
números e
3
gramas.
Autovetores (λ
j
) associados aos Componentes Principais
Variável
CP
1
CP
2
CP
3
CP
4
CP
5
CIN
1
-0,1999 0,5499 0,2804
-0,5679
-0,0866
LIN
1
-0,2566 0,4260 0,3423 0,5208 -0,3762
NRIN
2
-0,1462
0,6070 -0,5435
-0,0057 0,3833
CPE
1
0,3360 0,0797 -0,2957 -0,0269 0,0385
DBPE
1
0,3349 0,1129 -0,2264 0,1301 -0,1348
DAPE
1
0,3379 0,0491 -0,1537 -0,0963 -0,3704
CCA
1
0,3263 0,1302 0,2699 0,1877
0,5854
LCA
1
0,3251 0,2000 0,0560 0,3684 -0,0488
ECA
1
0,3305 -0,0004 0,4164 -0,3664 0,1727
PPE
3
0,3291 0,1528 -0,1318 -0,2455 -0,4149
PCA
3
0,3223 0,2144 0,2824 0,1183 0,0119
λ
j
8,5334 1,9628 0,2711 0,1344 0,0978
λ
j
(%) 77,58 17,84 2,46 1,22 0,89
* valores em negrito destacam a variável de maior peso no respectivo autovetor.
A dispersão gráfica dos centróides e acessos, apresentadas na Figura 4,
mostra ser possível delimitar os grupos ‘othonianum’ e ‘Rio de Janeiro’ com
relativa facilidade. Por outro lado, nos demais grupos há uma acentuada
proximidade dos centróides e sobreposição na dispersão de seus respectivos
acessos, impossibilitando a distinção destes grupos.
63
Figura 4 - Dispersão gráfica dos centróides (números) e acessos de seis
populações de Anacardium, em relação a funções discriminantes
estimadas por componentes principais, a partir da combinação
linear entre 11 características morfométricas. Grupos: 1-azul –
Nordeste; 2-vermelho – Anão Precoce; 3-verde escuro – Rio de
Janeiro; 4-preto – Roraima; 5-rosa – Índia; 6-verde claro – A.
othonianum.
A Tabela 5 apresenta a alocação dos acessos nos diferentes grupos,
obtida de acordo com as seis funções discriminantes de Anderson estimadas,
apresentadas na Tabela 4. Uma vez mais a singularidade do grupo
‘othonianum’ é destacada. Observa-se também que todos os acessos do grupo
da ‘Índia’ foram alocados corretamente, embora diversos acessos pertencentes
a outros grupos também tenham sido alocados neste grupo. O grupo ‘Rio de
Janeiro’ também apresentou elevado grau de discriminação, com a ocorrência
de uma permuta recíproca apenas entre um de seus acessos com outro do
grupo ‘Nordeste’.
Por outro lado, a discriminação dos demais grupos foi menos eficiente,
com muitos acessos sendo alocados em grupos diferentes dos estabelecidos a
priori. O grupo ‘Nordeste’ foi o que apresentou o maior percentual de erro de
6
1
2
5
3
4
CP
1
77,58%
CP
2
17,84%
64
alocação, com 37% de seus acessos sendo alocados em outros grupos.
Considerando as 78 classificações realizadas 16 foram incorretas, o que
resultou em uma taxa de erro aparente de 20,51%.
Tabela 4 – Funções discriminantes de Anderson, referentes a seis populações
de Anacardium spp., obtidas pela combinação linear de 11
características métricas.
Nome das Populações
Componente
Nordeste Anão
precoce
Rio de
Janeiro
Roraima Índia
othonianum
Constante -244,0509 -243,9762 -241,5911 -241,6326 -237,9737 -222,9650
CIN 1,2668 1,6745 1,1383 0,6773 1,2671 1,3475
LIN 0,7340 0,4159 0,7476 0,8384 0,7523 0,6938
NRIN 4,2782 4,3513 4,0415 5,1833 3,4931 4,6913
CPE -1,03557 -0,9620 -1,5422 0,5584 -1,0907 -2,5812
DBPE -19,0902 -19,5064 -20,8918 -17,2405 -20,3531 -22,6102
DAPE 43,8324 44,8787 45,1468 44,2412 47,0456 43,0151
CCA 66,2065 63,7227 67,3847 60,8981 61,3708 60,9453
LCA 70,7953 72,3593 70,9039 73,3362 74,1993 73,8511
ECA 60,5603 60,9390 63,4861 52,9955 59,2953 56,7851
PPE -0,6869 -0,6512 -0,6748 -0,7449 -0,6844 -0,5963
PCA -24,0431 -24,6695 -24,8457 -23,4100 -24,2122 -23,4764
Entre as classificações realizadas a posteriori, três acessos foram
alocados no grupo ‘Nordeste’, sendo um originário de Venezuela e os outros
dois da Região Nordeste. Estes últimos identificados apenas como Anacardium
sp. O grupo ‘Anão precoce’ recebeu a alocação de dois acessos, um originário
do Pará e outro de São Paulo, ambos identificados como A. occidentale. No
grupo ‘Roraima’ foram alocados cinco acessos, dois do Pará, um de Mato
Grosso, um da Venezuela e um do Ceará. Este último identificado apenas
como Anacardium sp. Apenas um acesso originário de São Paulo foi alocado
no grupo ‘Índia’, enquanto no grupo ‘othonianum’ foram alocados três acessos.
Dois destes acessos já haviam sido alocados neste grupo, na análise
discriminante de ecótipos (Tabela 1). O terceiro acesso incluído no grupo
‘othonianum’ é originário de Goiás e está identificado como A. occidentale.
65
Tabela 5 – Análise discriminante de seis populações de Anacardium baseada
em funções discriminantes de Anderson, estimadas a partir da
combinação linear de 11 características morfométricas. Os Valores
destacados em negrito referem-se aos percentuais de alocação dos
acessos nos seus respectivos grupos de origem.
Percentuais de alocação nas diferentes populações Grupo de
origem
Nº de
Indiv.
NE AP RJ RR ID OT
Nordeste
(NE -01)
27
62,96
7,41 3,70 11,11 14,81 0,00
Anão Precoce
(AP – 02)
10 10,00
70,00
0,00 10,00 10,00 0,00
Rio de Janeiro
(RJ – 03)
23 4,35 0,00
95,65
0,00 0,00 0,00
Roraima
(RR - 04)
08 0,00 12,50 0,00
75,00
12,50 0,00
Índia
(ID - 05)
04 0,00 0,00 0,00 0,00
100
0,00
othonianum
(OT - 06)
06 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
100
Alocados a
posteriori
14 21,43 14,28 0,00 37,71 7,14 21,43
Total de Indiv.
alocados
92 22 12 23 14 12 09
Taxa de erro aparente = 20,51%.
3.3 Análises de agrupamento
As similaridades entre as seis populações, delimitadas segundo a
origem geográfica, ecótipo e/ou espécie, são apresentadas no dendrograma da
Figura 05. As duas populações mais similares foram Nordeste (NE) e Anão
precoce (AP), consideradas ecótipos diferentes, embora de mesma origem
geográfica (região Nordeste). A este grupo inicial as populações mais
próximas, em ordem decrescente de similaridade, foram Índia (ID), Roraima
(RR) e Rio de Janeiro (RJ), todas pertencentes a A. occidentale. Novamente a
população ‘othonianum ‘(OT) mostrou-se mais divergente em relação a todas
as demais avaliadas.
66
Figura 5 - Dendrograma de seis populações de Anacardium, obtido por
agrupamento UPGMA a partir de distâncias generalizadas de
Mahalanobis. Populações: NE - nordeste, AP - anão precoce, ID -
Índia, RR – Roraima, RJ – Rio de Janeiro, OT – othonianum.
Os resultados da avaliação da diversidade entre os 92 acessos baseada
em análise multivariada por componentes principais são apresentados na
Figura 6 e Tabela 6.
A análise da Tabela 6 indica que o primeiro e segundo componentes
respondem, respectivamente, por 59,83 e 21,54 por cento da variabilidade total
dos dados. Portanto, a combinação destes dois componentes explica mais de
80% da variação disponível nos dados originais e, dessa forma, a dispersão
gráfica dos acessos no espaço bidimensional traduz bem suas similaridades
relativas.
A partir dos dados apresentados na Tabela 6 é possível também
identificar a importância relativa das variáveis sobre a diversidade genética dos
acessos. Variáveis de maior peso nos menores autovetores, são de menor
importância na discriminação dos acessos. Partindo-se do último até o terceiro
autovetor, as variáveis de maiores pesos foram, respectivamente: peso da
castanha (PCA), diâmetro do ápice do pedúnculo (DAPE), largura da castanha
(LCA), peso do pedúnculo (PPE), comprimento da inflorescência (CIN),
espessura da castanha (ECA), diâmetro da base do pedúnculo (DBPE),
número de ramificações da inflorescência (NRIN) e comprimento do pedúnculo
(CPE).
Na Figura 6 além das similaridades entre os acessos, evidenciada pela
dispersão gráfica dos pontos, procurou-se demonstrar os agrupamentos
obtidos segundo dois critérios diferentes.
O primeiro tipo de agrupamento destaca os grupos formados pela
análise discriminante de Anderson, considerando seis populações previamente
67
estabelecidas segundo a origem geográfica, ecótipo e/ou espécie dos acessos.
Estes agrupamentos são diferenciados pelas cores dos pontos e os acessos de
cada grupo incluem aqueles determinados a priori, assim como aqueles
alocados a posteriori, a partir das funções discriminantes obtidas (Tabela 4).
O segundo tipo de agrupamento foi obtido através do método de
otimização de Tocher. Neste caso, foram produzidos sete grupos de acessos,
delimitados pelas figuras geométricas (elipses).
Figura 6 - Dispersão gráfica de 92 acessos de Anacardium, em relação ao
primeiro e segundo componentes principais, estabelecidos pela
combinação linear de 11 variáveis morfométricas. As cores
diferenciam os acessos alocados nas seis populações pela análise
discriminante de Anderson, enquanto as figuras geométricas
delimitam os grupos obtidos pela análise de agrupamento de
Tocher. Grupos: 1 – Nordeste; 2 – Anão Precoce; 3 – Rio de
Janeiro; 4 – Roraima; 5 – Índia; 6 – A. othonianum.
CP
1
59, 83%
CP
2
21,54%
Tabela 6 – Estimativas de autovalores e autovetores associados aos componentes principais, obtidos da matriz de correlação entre
11 variáveis morfométricas de 92 acessos de Anacardium spp. CIN – comprimento da inflorescência; LIN – largura da
inflorescência; NRIN – número de ramificações da inflorescência; CPE – comprimento do pedúnculo; DBPE – diâmetro
da base do pedúnculo; DAPE – diâmetro do ápice do pedúnculo; CCA – comprimento da castanha; LCA – largura da
castanha; ECA – espessura da castanha; PPE – peso do pedúnculo; PCA – peso da castanha.
Elementos de autovetores associados
λ
j
λ
j
(%)
Acumulada
CIN LIN NRIN CPE DBPE DAPE CCA LCA ECA PPE PCA
6,5814 59,83 0,0846 0,0478 0,0909 0,3085 0,3465 0,3635 0,3566 0,3591 0,3284 0,3659 0,3703
2,3699 81,37 0,6043 0,5810 0,5119 -0,0569 -0,0631 -0,0938 -0,0229 0,0127 -0,1359 -0,0083 -0,0018
0,5873 86,71 0,0462 0,1835 -0,2548
0,6927
-0,0918 0,1679 -0,1293 -0,2755 -0,3534 0,3253 -0,2440
0,5128 91,38 -0,1306 -0,4157
0,6751
0,0234 0,3153 0,2323 -0,2967 -0,2045 -0,1076 0,1486 -0,1922
0,3366 94,44 0,0151 -0,3568 0,3534 0,4451
-0,5659
-0,3292 0,2880 0,0408 0,1364 -0,0944 0,0932
0,2485 96,69 0,3134 -0,0382 -0,1286 0,0510 -0,1032 0,0674 -0,3861 -0,3051
0,7794
0,0510 -0,1223
0,1179 97,77
-0,5455
0,4196 0,1908 0,1768 -0,1433 -0,0147 -0,3967 0,4593 0,2059 -0,0746 -0,1473
0,0937 98,62 0,1048 0,0040 -0,0314 0,3349 0,5217 -0,1879 0,2208 0,0683 0,1211
-0,5587
-0,4337
0,0848 99,40 -0,4438 0,3855 0,1751 -0,0384 0,0379 0,0188 0,3967
-0,6441
0,1932 -0,0397 0,0970
0,0406 99,76 -0,0569 0,0151 -0,0291 0,1351 0,3779
-0,7372
-0,2704 -0,0952 -0,0058 0,2625 0,3742
0,0265 100 -0,0360 0,0044 0,0078 -0,2396 -0,0161 -0,2909 0,3144 0,1376 0,1290 0,5817
-0,6193
* Valores em negrito destacam a variável de maior peso nos respectivos autovalores.
68
69
4 DISCUSSÃO
Estudos de diversidade baseados na análise de vários caracteres
morfológicos, tomados de cada indivíduo ou acesso, podem ser realizados por
meio do emprego de métodos multivariados. A confiabilidade dos resultados é
maior quando os dados são obtidos a partir de um delineamento experimental
com repetições. Entretanto, esta estratégia é muito difícil quando se trabalha
com plantas perenes arbóreas, como no caso do cajueiro, e impraticável
quando se avaliam indivíduos de populações naturais. Neste caso, a obtenção
de medidas repetidas para uma mesma variável em cada acesso e, quando
possível, a avaliação dos acessos em um mesmo ambiente, pode minimizar os
erros aleatórios que incidem sobre os resultados.
No presente trabalho, a avaliação dos acessos foi realizada através da
média de observações por variável, valor este considerado satisfatório a partir
de um estudo preliminar de repetibilidade conduzido com as variáveis sob
investigação. Além do mais, a maior parte dos acessos avaliados é cultivada
em um mesmo local, que é o BAG do Cajueiro, o que reduz as diferenças
decorrentes da variação ambiental. Adicionalmente, os dados são analisados
por diferentes métodos multivariados, considerando diferentes arranjos, com o
propósito de avaliar a consistência dos resultados obtidos.
4.1 Divergência entre ecótipos e/ou espécies de Anacardium
As análises discriminantes, baseadas em componentes principais e
funções discriminantes de Anderson, evidenciaram a singularidade do grupo
‘othonianum’ em relação aos grupos ‘comum’ e ‘anão precoce’. Os acessos
deste grupo foram coletados na região dos cerrados do Brasil Central. De
acordo com Ferreira (1973), A. othonianum foi descrita como uma espécie
distinta de Anacardium por Rizzini em 1969. Conhecida popularmente por
cajuzinho de cerrado, esta espécie é caracterizada como uma árvore de porte
mediano de 3 a 6 metros de altura, com tronco de 20 a 40 cm de diâmetro, de
córtex fusco e fissurado. Entretanto, Mitchell e Mori (1987), consideraram esta
e outras espécies ocorrentes na região do Brasil Central (i.e. A.curatellaefolium,
A. rondonianum, A. amilcarianum e A. kuhlmannianum) como membros do
ecótipo de A. occidentale circunscrito à região dos cerrados, sendo
70
caracterizado por apresentar folhas mais coriáceas, onduladas e subsésseis,
assim como pseudofruto menor e mais ácido que o ecótipo típico das áreas de
restingas. Por outro lado, a diferenciação entre os grupos ‘comum’ e ‘anão
precoce’ foi bem menos pronunciada, especialmente se considerarmos a
dispersão gráfica obtida pela análise discriminante baseada em componentes
principais. Observa-se grande proximidade entre os centróides dos dois
grupos, assim como elevada sobreposição na dispersão entre os acessos de
cada grupo.
Entretanto, a utilização das funções discriminantes de Anderson na
classificação dos acessos, segundo os grupos de alocação a priori, mostrou-se
bastante eficiente, com nenhum erro de classificação associado ao grupo
‘othonianum’ e com a alocação correta de nove dos dez acessos de ‘anão
precoce’ e 32 dos 39 acessos de ‘comum’. A utilização destas funções na
classificação dos acessos alocados a posteriori também produziu resultados
satisfatórios. Quase todos os acessos coletados no Estado de Roraima
apresentam porte reduzido, com as demais características típicas de A.
occidentale, apesar de serem identificados apenas como Anacardium sp.
Dessa forma, a alocação de metade destes acessos no grupo ‘comum’ e
metade no grupo ‘anão precoce’ é plenamente justificável. Estes resultados, de
certa forma, corroboram a hipótese de que o tipo ‘anão precoce’ teria sua
origem nas savanas de Roraima (Almeida et al., 1993). Entre os acessos
alocados no grupo ‘othonianum’, aquele identificado apenas como Anacardium
sp, coletado no Estado do Piauí, apresenta muitas características fenotípicas
próprias de A. othonianum, além das avaliadas neste trabalho, como tronco de
casca muito fissurada e folhas coriáceas e subsésseis. O outro acesso,
identificado como A. microcarpum, apresentou castanha e pseudofruto com
dimensões semelhantes às de A. othonianum, mas suas características
vegetativas como porte da planta e tipo foliar são mais associadas a A.
occidentale. De fato, A. microcarpum é considerada, por Mitchell e Mori (1987),
uma sinonímia de A. occidentale (ecótipo de restinga). Os demais acessos
alocados no grupo ‘comum’ apresentam características típicas de A.
occidentale. Embora um destes acessos esteja identificado como A.
othonianum, todos os seus indivíduos indiscutivelmente são de A. occidentale
71
do tipo comum e, portanto, trata-se de um erro de identificação do acesso no
BAG.
Portanto, as funções discriminantes de Anderson obtidas permitiram
uma boa discriminação dos grupos pré-estabelecidos, assim como uma
classificação adequada de novos acessos cujos grupos sejam desconhecidos,
mas assumindo que eles pertençam a um destes grupos definidos.
4.2 Divergência segundo a origem geográfica de acessos de Anacardium
A análise discriminante baseada em componentes principais,
considerando as seis populações, definidas a priori, evidenciou a maior
divergência do grupo ‘othonianum’ em relação aos demais tanto pela posição
mais distanciada de seu centróide como pela relativa facilidade de delimitação
da dispersão de seus acessos. Situação semelhante também foi verificada para
a população ‘Rio de Janeiro’. Por outro lado, não é possível distinguir as
demais populações entre si, considerando os padrões de dispersão que seus
centróides e acessos apresentaram no plano bi-dimensional. Deve-se ressaltar
que essa dispersão representa bem as interrelações entre os elementos
investigados, uma vez que os dois primeiros componentes explicam mais de
95% da variação total, contida nos dados originais. Por isso, parece que o grau
de diferenciação entre estas populações é baixo. Mesmo a população ‘anão
precoce’ que havia se mostrado razoavelmente distinta quando confrontada
com o grupo ‘comum’, na análise discriminante de ecótipos, agora apresenta
seus acessos com um padrão de dispersão que não mais possibilita sua
delimitação. Outro aspecto que deve ser destacado são as grandes distâncias
relativas, apresentadas pelos acessos da população ‘othonianum’ comparadas
com dispersão dos acessos da população ‘Rio de Janeiro’. Estas distâncias
refletem o grau de divergência intrapopulacional. No caso do grupo
‘othonianum’ esta divergência reflete, ainda que parcialmente, o grau de
diferenciação de várias populações naturais da espécie ou ecótipo, uma vez
que os acessos avaliados são de procedências diversas. Por outro lado, os
acessos da população ‘Rio de Janeiro’ são todos de uma mesma população
natural, cujos membros apresentam níveis variados de parentesco e, portanto,
maior similaridade relativa.
72
As funções discriminantes de Anderson possibilitaram melhor distinção
entre as populações em comparação com discriminação obtida por
componentes principais. A taxa global de erro aparente foi de pouco mais de
20%, mas as populações ‘othonianum’ e ‘Rio de Janeiro’ novamente foram as
que apresentaram os melhores níveis de discriminação de seus acessos.
Embora nenhum acesso da ‘Índia’ tenha sido alocado incorretamente, vários
acessos de outras populações foram classificados como pertencentes a este
grupo. Por outro lado, o grupo ‘Nordeste’ teve muitos de seus acessos
alocados em outros grupos, embora tenha recebido apenas dois acessos de
outras populações. Estes resultados e a amplitude de dispersão de seus
acessos, observada na Figura 04, apontam para a maior diversidade relativa do
grupo ‘Nordeste’, confirmando a tese de que as zonas costeiras do Nordeste
Brasileiro constituem um centro de diversidade de A. occidentale (Lima, 1986;
apud Barros et al., 2002).
A utilização das funções discriminantes de Anderson na alocação de
acessos “desconhecidos” gerou alguns resultados consistentes. Por exemplo,
dos três acessos alocados no grupo ‘othonianum’ dois já haviam recebido esta
mesma alocação quando foram classificados por meio das funções
discriminantes de ecótipos (Tabela 1) e dos três acessos coletados na região
Nordeste, mas não incluídos a priori por se encontrarem indeterminados ao
nível de espécie, dois foram alocados no grupo ‘Nordeste’. Por outro lado,
resultados aparentemente contraditórios foram obtidos na alocação de acessos
oriundos da Venezuela, Pará e São Paulo. Nestes casos, acessos de um
mesmo local de origem foram alocados em grupos diferentes.
4.3 Análises de agrupamento
O padrão de agrupamento das populações observado na Figura 5,
parece representar bem o grau de similaridade esperado entre as populações,
considerando as evidências históricas e biológicas disponíveis. As populações
com o maior grau de similaridade, ‘Nordeste’ e ‘anão precoce’, embora distintas
possuem a mesma origem geográfica, que é a região Nordeste do Brasil,
principalmente o Estado do Ceará. O terceiro grupo mais similar foi a ‘Índia’
que é o geograficamente mais distante, mas onde A. occidentale é uma
73
espécie introduzida pelos portugueses a partir da segunda metade do século
XVI, provavelmente a partir de sementes coletadas no nordeste brasileiro
(Jonhson, 1974; Ferrão, 1995). A seguir, são agrupadas as populações de
‘Roraima’ e do ‘Rio de Janeiro’, localizações onde A. occidentale é considerada
uma espécie indígena ou nativa, ou seja, de ocorrência anterior à colonização
européia da América (Mitchell e Mori, 1987). O conjunto destas populações
difere substancialmente da população ‘othonianum’, que consiste uma espécie
distinta ou, de acordo Mitchell e Mori, (1987), em ecótipo distinto de A.
occidentale, associado à região dos cerrados.
A análise de diversidade, por componentes principais, entre os 92
acessos, mostrou que as variáveis de maior peso no primeiro componente
principal (Tabela 6) são aquelas relativas ao pedúnculo e à castanha, portanto,
este componente exprime um fator relativo às dimensões do pedúnculo e da
castanha, enquanto as variáveis relativas à inflorescência foram mais
importantes no segundo componente que, neste caso, exprime um fator relativo
às dimensões da inflorescência.
No que se refere aos agrupamentos apresentados na Figura 6, a
discordância entre os dois critérios utilizados é evidente. Os acessos do grupo
1 (NE) foram distribuídos em quatro grupos segundo o método de Tocher. Por
outro lado, a maioria dos acessos deste grupo e dos grupos 2 (AP), 3 (RJ), 4
(RR) e 5 (ID) formaram um único grupo (grupo 1 de Tocher). Já os acessos do
grupo 6 (OT) foram distribuídos em três grupos. Dois destes grupos foram
formados por cinco indivíduos cada, sendo um constituído exclusivamente por
membros de A. othonianum, e outro por membros das populações 3, 4 e 6. Os
dois acessos restantes foram alocados no grupo 1 de Tocher. A despeito de
todas estas discrepâncias, a tendência de agrupamento entre os acessos da
população ‘othonianum’ e da população ‘Rio de Janeiro’ ainda é percebida na
Figura 6.
5 CONCLUSÕES
a) Análises discriminantes, aplicadas a variáveis morfométricas, são
ferramentas eficientes na caracterização de grupos de Anacardium,
sejam eles espécies, ecótipos ou populações de origens diferentes.
74
b) A utilização de funções discriminantes de Anderson, em comparação
com a técnica baseada em componentes principais, possibilitou melhor
discriminação dos grupos, além de permitir a classificação de acessos
desconhecidos ou cujas informações foram consideradas duvidosas.
c) Foi confirmado que a região Nordeste é um centro de diversidade de A.
occidentale.
d) A alocação da metade dos acessos de Roraima no grupo ‘anão’ é mais
uma evidência da origem amazônica desse ecótipo ou variedade,
destacando a necessidade da realização de novas coletas na região,
com o propósito de ampliar a base genética deste grupo.
e) A. othonianum, apesar de ser considerado por alguns autores apenas
um ecótipo de A. occidentale, constituiu-se em um grupo
morfologicamente muito distinto dos demais. Considerando que
divergência foi observada entre indivíduos cultivados em um mesmo
ambiente, ou seja, o Banco Ativo de Germoplasma do Cajueiro, pode-se
assumir que ela é majoritariamente de natureza genética.
f) O padrão de agrupamento exibido pelas populações analisadas refletiu
adequadamente o grau de relacionamento esperado entre elas,
considerando as evidências biológicas e históricas disponíveis.
g) Por outro lado, o agrupamento dos acessos pelo método de otimização
de Tocher produziu resultados muito diferente dos grupos estabelecidos
a priori, nas análises discriminantes. Possivelmente, a maior proporção
da divergência acessada não está relacionada com a origem geográfica
dos acessos.
75
CAPÍTULO 2
ANÁLISE DA DIVERSIDADE EM Anacardium spp.
BASEADA EM MARCADORES MOLECULARES ISSR
76
1 INTRODUÇÃO
A utilização de marcadores moleculares de diversos tipos tornou
possível a identificação e caracterização de germoplasma, a construção de
mapas genéticos e a obtenção de estimativa da distância genética entre
indivíduos e/ou populações de várias espécies vegetais. Tais tecnologias
podem permitir uma aceleração de ganhos genéticos para plantas de interesse,
especialmente em culturas com informações genéticas limitadas, como é caso
da maioria das espécies arbóreas tropicais (Federezzi, 1998; Ferreira e
Grattapaglia, 1998; Picoli et al., 2001). De modo semelhante, as informações
de diversidade e distância genética têm sido avaliadas para a identificação das
melhores combinações híbridas e na organização de bancos de germoplasma;
indicando redundâncias e deficiências das coleções, além de gerar dados
sobre a eficiência do processo de coleta, manutenção e ampliação destes
recursos genéticos (Barbosa-Neto e Bered, 1998; Ferreira e Grattapaglia,
1998).
O desenvolvimento de marcadores bioquímicos e moleculares
proporcionou um salto qualitativo e quantitativo em estudos da estrutura
populacional e do sistema reprodutivo de diversas espécies. Vários parâmetros
populacionais, como grau de endogamia e sistema reprodutivo predominante,
entre outros, podem ser obtidos e são de grande importância na determinação
de estratégias de conservação da variabilidade genética na natureza, bem
como para sua melhor utilização em programas de melhoramento genético das
espécies domesticadas (Carlini-Garcia et al., 2001; Reif et al., 2005).
Barbosa-Neto e Bered (1998) argumentam que não há sérias restrições
quanto aos marcadores moleculares preferenciais para utilização em estudos
de diversidade genética. De modo geral, os marcadores devem ser confiáveis
em termos de repetibilidade, ter baixo custo e serem fáceis e rápidos de
analisar. Neste sentido, os marcadores baseados em técnicas de PCR (reação
em cadeia da polimerase) são mais atrativos, principalmente aqueles que
apresentam grande polimorfismo como microssatélites e AFLP.
Em um trabalho de compilação de dados, de 307 estudos de avaliação
de diversidade inter e intrapopulacional de espécies de plantas selvagens,
baseados em marcadores de DNA nuclear, Nybom (2004) observou que as
77
estimativas de diversidade derivadas de marcadores de herança dominante
(RAPD, AFLP e ISSR) são muito similares e podem ser comparáveis
diretamente. Por outro lado, marcadores de herança co-dominante
(microssatélites) produziram valores de diversidade intrapopulacional quase
três vezes superiores, enquanto que as estimativas de diversidade
interpopulacionais foram similares àquelas obtidas pelos marcadores de
herança dominante. A distância geográfica máxima entre populações
amostradas, produziu acentuado efeito positivo na diversidade
interpopulacional e, para espécies perenes, alógamas e/ou de sucessão tardia,
a maior parte da variabilidade é de natureza intrapopulacional. A autora
também observou que o número de plantas amostradas por população e o
número de alelos de microssatélite detectados foram correlacionados com
alguns parâmetros genéticos populacionais.
Os marcadores ISSR (Zietkiewicz et al. 1994; Gupta, et al.,1994; Wu et
al. 1994) são produtos de uma técnica baseada no método de amplificação de
DNA pela reação em cadeia da polimerase (PCR) (Reddy et al., 2002) e,
basicamente, envolve a amplificação de regiões entre seqüências de
microssatélites adjacentes, inversamente orientadas. Nenhum conhecimento a
priori do genoma é necessário e primers baseados numa seqüência repetitiva,
tal como (CA)
n
, podem ser desenhados considerando apenas o motivo
existente na própria seqüência tais como (CA)
8
ou (CA)
9
(Gupta et al., 1994;
Bornet e Branchard, 2001) ou com uma ancoragem, formada por um pequeno
segmento de bases arbitrárias e/ou degeneradas, localizado em uma das
extremidades (3’ ou 5’) da seqüência repetitiva, tais como (CA)
8
RG e (CA)
8
YT
ou BDB(CA)
7
(onde R=purinas, Y=pirimidinas, B=C, G ou T e D=A, G, ou T)
(Zietkiewicz et al., 1994; Godwin et al., 1997, Fang et al., 1997, Reddy et al.,
2002).
De acordo com Reddy et al. (2002), as fontes de variabilidade e o nível
de polimorfismo obtido pelos marcadores ISSR são decorrentes dos seguintes
fatores: a) elevada taxa de mutação das seqüências microssatélites, alvos do
anelamento do primer empregado; b) natureza do primer utilizado, isto é,
seqüência repetitiva ou motivo, existência ou não de região de ancoragem,
assim como localização (5’ ou 3’), extensão e composição da seqüência de
ancoragem; d) método de resolução utilizado, isto é, gel desnaturante de
78
poliacrilamida (PAGE) em combinação com marcação radiativa ou coloração
com nitrato de prata ou gel de agarose, corado com brometo de etídio.
A utilização de marcadores moleculares na caracterização de recursos
genéticos de cajueiro ainda é bastante restrita, se limitando a um pequeno
número de trabalhos conduzidos em coleções de bancos de germoplasma da
Tanzânia e da Índia. O primeiro destes estudos foi realizado por Mneney et al.
(2001), que avaliaram a divergência genética, baseada em marcadores RAPD,
de parte da coleção do banco de germoplasma do Cashew Development
Centre (Tanzânia), constituído por acessos provenientes da Tanzânia, Sri
Lanka, Moçambique, Índia, Brasil e Cook Islands. Os autores verificaram que
os acessos brasileiros formaram um grupo separado e mais distinto em relação
aos das demais procedências.
Dhanaraj et al (2002) estimaram a diversidade genética entre 90
acessos do Banco Nacional de Genética do Cajueiro da Índia, também
utilizando marcadores RAPD. De acordo com os autores, este estudo
demonstrou que diversidade do banco indiano de germoplasma de caju pode
ser considerada de moderada a alta. Os resultados também permitiram
estabelecer uma coleção nuclear (core colletion) menor, com representação da
mesma diversidade da população inteira.
Archak et al. (2003a) compararam a eficiência e utilidade de três tipos
marcadores moleculares (RAPD, ISSR e AFLP) e de descritores morfológicos
na medida de variação e discriminação genotípica de germoplasma de caju. Os
autores verificaram que, a partir de cada um dos três marcadores moleculares
utilizados, foi possível discriminar os 19 acessos avaliados, com maior
eficiência para os marcadores AFLPs. Por outro lado, não foi observada a
ocorrência de correlação entre o conjunto de 27 descritores morfométricos
utilizados e os marcadores moleculares. Apenas os marcadores RAPD e ISSR
apresentaram correlação significativa (r=0,63; p<0,01). Archak et al. (2003b)
também utilizaram marcadores RAPD e ISSR na caracterização fingerprinting
de 35 variedades elites, sendo 24 seleções e 11 híbridos, desenvolvidas por
diferentes centros de pesquisa da Índia. A partir de 94 locos amplificados foi
possível diferenciar, com alto grau de certeza, todos os genótipos. Por lado, os
resultados evidenciaram que a base genética entre eles é muito estreita,
apesar da grande amplitude geográfica entre os locais de obtenção dos
79
cultivares, fato atribuído ao intenso intercâmbio de material genético entre os
centros de pesquisa e ao número reduzido de parentais empregados nos
programas de produção de híbridos.
Este trabalho teve por finalidade avaliar a diversidade genética de
Anacardium spp. a partir de acessos mantidos pelo Banco Ativo de
Germoplasma do Cajueiro (BAG – Embrapa CNPAT) e de indivíduos
amostrados em uma população subespontânea de cajueiro (Anacardium
occidentale L.), localizada no estado do Rio de Janeiro, utilizando marcadores
moleculares ISSR. Especificamente, os objetivos foram:
- Caracterizar e quantificar a variabilidade genética existente entre
acessos e dentro de populações de cajueiro, através de marcadores
moleculares ISSR;
- Estimar as distâncias genéticas entre as populações e avaliar suas
relações com a origem geográfica;
- Estabelecer relações fenéticas entre as espécies e/ou ecótipos
estudados;
- Comparar diferentes estratégias de análises multivariadas aplicadas a
dados moleculares binários.
80
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Material vegetal
As informações utilizadas para este estudo foram obtidas de 91 acessos
do Banco Ativo de Germoplasma do cajueiro e de 45 indivíduos de uma
população subespontânea, de uma área de restinga do litoral norte do estado
do Rio de Janeiro. Cada acesso foi representado por um indivíduo apenas,
perfazendo um total de 136 genótipos analisados, os quais serão referidos
daqui em diante simplesmente como acessos, independentemente da origem.
No Quadro 1 estão descritos a procedência, espécie/ecótipo e local de coleta
dos acessos do BAG do cajueiro.
O material foi coletado no final da fase reprodutiva, durante a emissão
de folhagem nova, nos meses de novembro e dezembro de 2004, para os
acessos do Rio de Janeiro e novembro de 2005, para os acessos do BAG.
A coleta consistiu de folhas jovens completamente expandidas, que
foram identificadas e envolvidas em papel de filtro umedecido, acondicionadas
em sacos plásticos e mantidas resfriadas até a chegada ao Laboratório de
Genética Molecular de Plantas (Biomol), do Instituto de Biotecnologia Aplicada
à Agropecuária (Bioagro) da UFV.
No Biomol, as folhas foram submetidas à extração imediata do DNA
total, sendo mantidas por um período máximo de cinco dias sob refrigeração a
4ºC. Alternativamente, parte das amostras foi armazenada à temperatura de
80ºC negativos, até o momento apropriado para a operação de extração do
DNA.
2.2 Extração do DNA
Diversos protocolos de extração de DNA, baseados no método CTAB,
foram testados com o objetivo de obter DNA em quantidade e qualidade
adequados para reações de PCR. O protocolo adotado foi baseado, com
modificações, no ajustado por Cavalcanti (2004) para A. occidentale, o qual é
descrito a seguir.
81
Quadro 1 – Informações das coleções e dos acessos do Banco Ativo de
Germoplasma do Cajueiro empregados na análise de diversidade
Nome da coleção,
procedência e data
da introdução
Número
da planta
no BAG
Espécie
Local da Coleta
08
A. occidentale
-
37
A. occidentale
-
70
A. occidentale
-
Coleção C-01, Índia,
Introdução por
sementes em 1973
72
A. occidentale
-
29
A. othonianum
Campos Belos (GO)
67
A. humile
Cavalcanti (GO)
100
A. othonianum
São Domingos (GO)
109 A. humile (?) Cavalcanti (GO)
122
A. humile
São João d’Aliança (GO)
131
A. humile
São João d’Aliança (GO)
138
A. othonianum
Arraias (GO)
148
A. othonianum
Galheiros (GO)
151
A. othonianum
Arraias (GO)
163
A. humile
Alto Paraíso (GO)
197 Anacardium sp. Cristalina (PI)
205
A. occidentale
Itaituba (PA)
209 Anacardium sp. Eliseu Martins (PI)
219
A. othonianum
Cavalcanti (GO)
226
A. othonianum
Barra do Garças (MT)
229
A. humile
Jaciara (GO)
241
A. occidentale
Itaituba (PA)
245
A. occidentale
Itaituba (PA)
Coleção C-02,
“Cerrado”
Goiás, Mato Grosso,
Pará e Piauí.
Introdução por
sementes em 1975
281 A. othonianum (?) Água Boa (MT)
05
A. occidentale
Venezuela - El Tigre
09
A. occidentale
Venezuela – El Tigre
10
A. occidentale
Índia - Ullal
12
A. occidentale
Índia - Ullal
16
A. occidentale
Índia - Ullal
19
A. occidentale
Índia - Ullal
25
A. occidentale
Valinhos (SP)
Coleção C-03
Venezuela, Índia e
Valinhos
Introdução por
sementes em 1973
30
A. occidentale
Valinhos (SP)
01 Anacardium sp. Rio Tacutu / Faz. Caju
06 Anacardium sp. Rio Tacutu / Faz. Caju
18 Anacardium sp. Est. Tabalascada - Cantá
19 Anacardium sp. Est. Normandia Km 25
24 Anacardium sp. Est. Normandia Km 25
30 Anacardium sp. Maloca do Sucuba
38 Anacardium sp. Est. Normandia Km 25
46 Anacardium sp. Est. Normandia Km 25
51 Anacardium sp. Est. Taiano km 20
Coleção C-04 Roraima
Introdução por
sementes em 1983
54 Anacardium sp. Rio Tacutu / Faz. Caju
03
A. occidentale
-
Coleção C-05 Paraíba
22
A. occidentale
-
82
29
A. occidentale
-
40
A. occidentale
-
Introdução por
sementes em 1990
53
A. occidentale
-
11
A. occidentale
Pacajus
28
A. occidentale
Aracati
34
A. occidentale
Trairi
47
A. occidentale
Trairi
55
A. occidentale
Aracati
65
A. occidentale
Aracati
75
A. occidentale
Trairi
78
A. occidentale
Aracati
102
A. occidentale
Aracati
118
A. occidentale
Trairi
174
A. occidentale
Cascavel
184
A. occidentale
Russas
187
A. occidentale
Russas
195
A. occidentale
Aracoiaba
196
A. occidentale
Aracoiaba
223
A. occidentale
Russas
236
A. occidentale
-
261
A. occidentale
Russas
Coleção C-06 Ceará
Introdução por
enxertia em 1979
275
A. occidentale
Aracoiaba
C-07 Camocin -1979 01 Anacardium sp. Camocin (CE)
-
A. microcarpum
Ceará
A. microcarpum
sementes - 1964
-
A. microcarpum
Ceará
08 A. othonianum -
14
A. othonianum
-
18
A. othonianum
-
24
A. occidentale
-
30
A. occidentale
-
Coleção C-09 Goiás
Introdução por
sementes em 1975
38
A. humile
-
CP12
A. occidentale
Pacajus
64
A. occidentale
Pacajus
63 (CP77)
A. occidentale
Pacajus
67 (CP137)
A. occidentale
Pacajus
09 (CP138)
A. occidentale
Pacajus
54 (CP96)
A. occidentale
Pacajus
Coleção Pacajus – CE
Introdução por
sementes entre 1956 e
1959
CP 136
A. occidentale
Pacajus
14
A. occidentale
Maranguape
15
A. occidentale
Maranguape
16 (CP76)
A. occidentale
Maranguape
22 (CP06)
A. occidentale
Maranguape
23 (CP09)
A. occidentale
Maranguape
25(CP1001)
A. occidentale
Maranguape
28
A. occidentale
Maranguape
29
A. occidentale
Maranguape
30
A. occidentale
Maranguape
Coleção Maranguape –
CE
Introdução por
sementes em 1956
35
A. occidentale
Maranguape
83
Folhas frescas ou congeladas foram maceradas em nitrogênio líquido,
utilizando almofariz de porcelana. Aproximadamente 50 mg de tecido
pulverizado foi transferido para um tubo Eppendorf de 2 mL, previamente
identificado e também congelado em nitrogênio líquido. Em seguida, foi
adicionado 1 mL do tampão de extração, pré-aquecido a 65ºC, composto da
seguinte mistura: 100 mM de Tris-HCl pH 8,0, 20 mM de EDTA
(ethylenediaminetetracetate), 1,4 M de NaCl, 2% de CTAB ( Cationic Hexadecyl
Trimethyl Ammonium Bromide) , 2% de PVP 40 (Polivinilpirrolidona) e 0,1% de
β-Mercaptoetanol. O material foi homogeneizado em vortex e incubado em
banho-maria por aproximadamente cinco minutos, com uma a duas inversões
dos tubos durante este período. Depois de retirados do banho-maria, os tubos
foram mantidos em repouso à temperatura ambiente por cerca de 10 minutos.
Em seguida adicionou-se 900 μL de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) em
cada tubo e procedeu-se a mistura das soluções por inversões suaves durante
dois a três minutos.
Posteriormente, as amostras foram centrifugadas em microcentrífuga
Eppendorf, modelo 5415C, a 13.500 rpm por 10 minutos e 800 μL da fase
aquosa superior foi transferido para um novo tubo de 1,5 mL. O DNA foi
precipitado pela adição de 600 μL de isopropanol gelado, seguido da inversão
suave dos tubos e seu armazenamento a 20ºC por duas horas, no mínimo. O
precipitado foi recuperado através de nova centrifugação dos tubos a 13.600
rpm durante cinco minutos. Depois do descarte do sobrenadante, o precipitado
e as paredes internas foram lavados com 500 μL etanol 95%, através da
inversão cuidadosa, por duas vezes, de cada tubo. Para evitar a perda do
precipitado procedeu-se a uma nova centrifugação de 13.600 rpm durante um
minuto. A solução de lavagem foi descartada e os precipitados foram secos à
temperatura ambiente por uma hora, aproximadamente.
Os precipitados foram resuspensos em 30 μL de TE (10 mM de Tris-HCl
pH 8,0; 1 mM de EDTA pH 8,0) contendo RNAse A na concentração final igual
a 30 μg/mL e incubados a 37ºC por 30 minutos, com agitações leves até o
desaparecimento completo de qualquer partícula sólida na suspensão.
84
2.3 Quantificação e qualidade do DNA
A avaliação da concentração e da qualidade do DNA das amostras foi
realizada em géis de agarose, na concentração de 0,8% (p/v), corados com 1
μL/50mL de solução de brometo de etídio (10 mg/mL). Alíquotas de cada
amostra de DNA foram aplicadas no gel ao lado de concentrações conhecidas
de DNA do fago λ (10, 20, 30, 50 e 100 ng). As bandas de DNA foram
visualizadas sob luz ultravioleta e fotodocumentadas pelo sistema de captura
de imagens ‘Eagle Eye’ (Stratagene). Amostras de trabalho foram diluídas para
a concentração de 10 ng/μL. Tanto o DNA estoque quanto as amostras de
trabalho foram mantidas a -20ºC.
2.4 Seleção de primers
Testes preliminares de amplificação foram conduzidos com 11 primers
não ancorados, utilizados por Archak et al. (2003a) na analise de diversidade
de germoplasma de cajueiro, e 72 primers ancorados desenvolvidos pelo
Laboratório de Biotecnologia da Universidade da Columbia Britânica (coleção
nº 9). Um total de cinco primers não ancorados e 16 ancorados (Tabela 1), que
produziram melhores amplificações em termos de quantidade e nitidez de
bandas, foram pré-selecionados para determinação da melhor temperatura de
anelamento e nível de polimorfismo produzidos. A amplitude de temperatura de
anelamento testada foi entre 45 e 60°C, utilizando termociclador de gradiente
modelo ‘Robocycler Gradient 96’ (Stratagene). Apenas nove primers (6
ancorados e 3 não ancorados) foram utilizados no trabalho final de
amplificação de todas as amostras.
2.5 Otimização das condições de amplificação
Diversas condições de amplificação relacionadas na literatura foram
testadas, como diferentes concentrações de primer e DNA molde, número de
ciclos e duração de cada etapa dos ciclos, assim como diferentes
concentrações de reagentes.
85
Tabela 1 – Lista de primers de marcadores ISSR avaliados em amplificações
de DNA genômico de Anacardium spp.
Primers não
ancorados
Seqüência completa (5’-3’) Nº. de
nucleotídeos
T
A
(ºC)
*(GACA)
4
GACAGACAGACAGACA 16 45-60
*(GAAGTGGG)
2
GAAGTGGGGAAGTGGG 16 50-60
(AGG)
6
AGGAGGAGGAGGAGGAGG 18 49-60
*(GTG)
6
GTGGTGGTGGTGGTGGTG 18 50-60
(ACTG)
4
ACTGACTGACTGACTG 16 45-60
Primers UBC
(ancorados)
Seqüência completa (5’-3’) Nº. de
nucleotídeos
T
A
(ºC)
P808 - (AG)
8
C AGA GAG AGA GAG AGA GC 17 49-55
P810 - (GA)
8
T GAG AGA GAG AGA GAG AT 17 49-55
*P812 - (GA)
8
A GAG AGA GAG AGA GAG AA 17 49-55
*P840 - (GA)
8
YT GAG AGA GAG AGA GAG AYT 18 49-55
*P841 - (GA)
8
YC GAG AGA GAG AGA GAG AYC 18 49-55
*P842 - (GA)
8
YG GAG AGA GAG AGA GAG AYG 18 49-55
*P834 - (AG)
8
YT AGA GAG AGA GAG AGA GYT 18 49-55
P835 - (AG)
8
YC AGA GAG AGA GAG AGA GYC 18 49-55
P836 - (AG)
8
YA AGA GAG AGA GAG AGA GYA 18 49-55
P827 - (AC)
8
G ACA CAC ACA CAC ACA CG 18 49-55
P855 - (AC)
8
YT ACA CAC ACA CAC ACA CYT 18 49-55
P884 - HBH(AG)
7
HBH AGA GAG AGA GAG AG 17 49-55
P885 - BHB(GA)
7
BHB GAG AGA GAG AGA GA 17 49-55
*P886 - VDV(CT)
7
VDV CTC TCT CTC TCT CT 17 49-55
P888 - BDB (CA)
7
DVD TCT CTC TCT CTC TC 17 49-55
P889 - BDB (AC)
7
DBD ACA CAC ACA CAC AC 17 49-55
*Primers efetivamente utilizados no trabalho
T
A
= Intervalo de temperaturas de anelamento testado
Y = (C ou T); B = (C, G ou T); D = (A, G ou T); H = (A, C, ou T); V = (A, C ou G)
As concentrações adotadas para um volume final de reação de 15 μl,
consistiram em: 10 mM de Tris-HCl pH 8,3; 50 mM de KCl; 1,5 mM de MgCl
2
;
0,2 mM de cada dNTP; 0,5 μM de primer; 15 ng de DNA molde; 0,6 unidades
de Taq polimerase e 0,5% de BSA (albumina de soro bovino). No caso dos
primers não ancorados, a concentração utilizada foi de 1 μM de primer,
mantendo-se inalteradas as concentrações dos demais reagentes. Algumas
reações foram realizadas com um volume final de 20 μl, neste caso foram
utilizados 20 ng DNA molde e 1 unidade de Taq polimerase, ajustando-se,
proporcionalmente, as concentrações dos demais reagentes para este volume.
A reação de PCR consistiu de uma fase inicial de desnaturação a 94ºC
por três minutos, seguida por 35 ciclos de desnaturação (94ºC/1 minuto),
anelamento (1 minuto, com temperatura dependente do primer) e extensão
86
(72°C/2 minutos) e uma fase de extensão final de 72°C por sete minutos.
Todas as reações foram realizadas em termocicladores modelo ‘GeneAmp
PCR System 9600’ (Applied Biosystem 9600).
2.6 Resolução e visualização dos fragmentos amplificados
Os produtos das reações de PCR foram separados e visualizados
utilizando um de dois sistemas distintos: gel desnaturante de poliacrilamida,
corado com nitrato de prata ou gel de agarose, corado com brometo de etídio.
2.6.1 Sistema em gel desnaturante de poliacrilamida
Os géis desnaturantes de poliacrilamida foram confeccionados de
acordo com as recomendações de Creste et al. (2001). A solução estoque de
poliacrilamida a 30% (29:1) foi preparada pela adição de 290 g de acrilamida e
30 g de bisacrilamida em água ultrapura, com um volume final de 1 litro. Na
confecção de 500 mL de solução matriz de poliacrilamida a 6% e 7 M de uréia,
foram utilizados 100 mL da solução estoque de poliacrilamida a 30%, 210 g de
uréia ultra pura, 100 mL de TBE 5X (445 Mm de Tris, 445 mM de ácido bórico,
10 mM de EDTA) e água ultrapura até completar o volume final de 500 mL. A
solução foi filtrada em papel de filtro e transferida para frasco âmbar, envolvido
por papel alumínio e armazenado em geladeira.
Para montagem do gel foram utilizadas placas de vidro temperado de 6
mm de espessura. As placas foram lavadas com detergente neutro a 2% e
enxaguadas em água corrente de torneira e água destilada e deixadas na
posição vertical para secagem. Posteriormente, cada placa foi limpa por três
vezes com etanol a 95% esfregando-se lenços de papel, com movimentos
horizontais e verticais. Depois de seca à temperatura ambiente, a placa maior
foi tratada com uma solução composta de 1,1 mL de etanol a 95% e ácido
acético glacial a 0,5% mais 2,2 μl de Bind Silane. Antes da aplicação, os dois
reagentes foram colocados em um tubo Eppendorf e homogeneizados em um
vortex. O produto foi aplicado à placa e depois de 10 minutos o excesso foi
removido com um lenço de papel umedecido em álcool a 95%. A placa menor
foi tratada com 200 μl, aproximadamente, de uma solução anti-chuva utilizada
87
em vidros de carros. Após a secagem por 10 minutos o excesso foi removido
pela limpeza da placa, por três vezes, com etanol a 95% e lenços de papel. As
placas foram montadas utilizando espaçadores de 0,5 mm e vaselina como
agente de vedação.
O gel foi preparado utilizando 80 mL de solução matriz, 400 μl de
persulfato de amônio a 10% e 168 μl de TEMED (Promega). A solução foi
homogeneizada em um béquer e vertida diretamente no aparato das placas,
posicionado com uma inclinação de 30º, aproximadamente. Em seguida, o
pente com 60 poços foi posicionado e o aparato de placas foi mantido na
posição horizontal por uma hora para permitir a polimerização do gel. Após a
polimerização, as placas foram montadas na cuba de eletroforese e os poços
foram limpos com auxílio de uma pipeta automática.
Antes da aplicação das amostras, o gel foi submetido a uma pré-corrida,
sob potência constante de 50W, por uma hora ou até a placa atingir uma
temperatura de 50°C. Na parte superior da cuba foi utilizado TBE 1X (89 Mm
deTris, 89 mM de ácido bórico, 2 mM de EDTA)e na parte inferior TBE 1X e
acetato de sódio a 0,375 M (Resende, 2004). Antes da aplicação das amostras
procedeu-se a uma nova limpeza dos poços, através da injeção de tampão de
corrida com auxílio de uma pipeta automática.
À reação de PCR com volume igual a 15 μl foi adicionado 6 μl tampão
de carregamento (98% de formamida, 10mM EDTA, azul de bromofenol
1mg/mL e xileno cianol 1mg/mL). Em seguida, as amostras foram
desnaturadas a 94°C por 5 minutos e transferidas para um recipiente com gelo,
uma alíquota de 8 μl foi aplicada em cada poço do gel. Em todos os géis
também foram aplicados 5 μl de marcador 100 pb (Invitrogen), preparado na
concentração 25 ng/μl em solução tampão de carregamento e água ultrapura
(1:2,33). As alíquotas do marcador foram submetidas às mesmas condições de
desnaturação dos produtos de PCR. Após aplicação de todas as amostras, o
sistema foi submetido à eletroforese sob potência constante de 50 W por 3
horas, aproximadamente, ou até a chegada do xileno cianol na borda inferior
do gel.
A coloração dos géis foi realizada com nitrato de prata, utilizando o kit
Silver Sequence
TM
DNA staining reagents (Q 4132) da Promega. Após a
88
separação das placas, o gel (aderido na placa maior) foi imerso em dois litros
de solução fixadora gelada (ácido acético glacial a 10%, em água ultra pura)
por 40 minutos, sob agitação orbital leve. Em seguida a solução fixadora foi
removida e novamente armazenada em geladeira. O gel foi lavado três vezes,
por três minutos cada vez, em dois litros de água destilada, sempre com o
auxílio de agitador orbital. Após as lavagens o gel foi imerso em dois litros
solução de nitrato de prata 1 g/l e formaldeído 37% 1,5mL/l, mantido sob
agitação por 20 minutos. Após a remoção da solução de nitrato de prata,
procedeu-se a uma lavagem em água destilada por 10 segundos. A revelação
foi realizada pela imersão em um litro de solução gelada contendo 3% (p/v) de
carbonato de cálcio anidro, 1,5ml/l de formaldeído a 37% e 400 μl/l de
thiossulfato de sódio a 10%. A placa foi agitada manualmente até o
aparecimento das primeiras bandas, acrescentando-se mais um litro da
solução reveladora e continuando a agitação até se atingir o padrão de
coloração desejado. Em seguida, um litro da solução fixadora foi adicionado
para bloquear o processo de revelação. A placa foi novamente lavada por duas
vezes com água destilada e armazenada na posição vertical em local arejado
para secagem do gel.
Após a secagem os géis foram fotodocumentados com auxílio de um
scanner. A anotação dos dados foi realizada a partir do exame direto do gel
sobre transiluminador de luz branca, auxiliada pela imagem digital obtida.
2.6.2 Sistema em gel de agarose
Neste sistema os géis foram confeccionados com 1,5% (p/v) de agarose
ultra pura (Invitrogen) em tampão TBE 1X. Os produtos de reação de PCR
(volume de 20μl) foram misturados com 3 μl do corante tipo IV (Sambrook et
al., 1989) e o volume resultante foi aplicado a cada um dos poços. Em seguida,
o sistema foi submetido à eletroforese sob voltagem constante de 4V/cm, por
um período aproximado de 4 horas. Em todos os géis foram aplicados 4 μl de
marcador de 100 pares de bases (Invitrogen), na concentração de 0,1μg/μl.
Após a corrida, os géis foram imersos em uma solução de brometo de etídio
(0,6 ng/ml) e mantidos sob agitação leve, em agitador orbital, por 30 minutos.
89
Após a retirada da solução de brometo, os géis foram enxaguados em água de
torneira, visualizados e fotodocumentados sob luz ultravioleta pelo sistema de
captura de imagens ‘Eagle Eye’ (Stratagene).
2.7 Análise dos dados
A interpretação dos padrões de bandas exibidos pelos géis, para ambos
os sistemas de resolução, levou em consideração o princípio em que bandas
geradas por um mesmo primer e que ocupam a mesma posição relativa
referem-se à amplificação do mesmo fragmento de DNA, ou seja, pertencem
ao mesmo loco gênico, enquanto bandas ocupando posições relativas
diferentes são de locos distintos. Dessa forma, foi construída uma matriz de
dados envolvendo todos os acessos, atribuindo-se valor igual a 1, se banda
homóloga estivesse presente e 0, caso contrário.
A não ser quando explicitamente mencionado, todas as análises
estatísticas foram realizadas com auxílio do aplicativo computacional GENES
(Cruz, 2001, 2006a, 2006b).
2.7.1 Análises preliminares e descritivas
A matriz binária de dados, obtida a partir da leitura dos géis, foi utilizada
para o cálculo do coeficiente de similaridade de Sorenso ou Nei e Li entre
pares de acessos, obtido pela expressão (Cruz e Carneiro, 2003):
cba
a
S
ii
++
=
2
2
'
Onde:
'ii
S : similaridade entre os acessos i e i’;
a: valor que quantifica o número de coincidências do tipo 1-1 para cada
par de acessos;
b: valor que quantifica o número de coincidências do tipo 1-0 para cada
par de acessos;
c: valor que quantifica o número de coincidências do tipo 0-1 para cada
par de acessos.
90
Este coeficiente
()
ii
S
′
ou seu complemento
(
)
ii
S
′
−
1 foi empregado na
construção de matrizes de similaridade ou de dissimilaridades,
respectivamente, entre os acessos. Tais matrizes foram utilizadas na avaliação
do número ótimo de marcadores, necessário para discriminar adequadamente
os acessos avaliados; na análise discriminante, baseada em k vizinhos mais
próximos; e, na análise da projeção gráfica das distâncias entre acessos.
A partir da matriz de dados binários também foram obtidas as seguintes
estatísticas descritivas:
a) Porcentagem de polimorfismo de cada primer, obtida pela equação:
bt
pb
N
N
P =
Onde:
P: porcentagem de locos polimórficos;
N
bp
: número de bandas polimórficas;
N
bt
: número de bandas totais.
b) Número de locos ou bandas exclusivas
N
be
: número total de bandas restritas a um grupo ou população;
2.7.2 Estimação do número ótimo de marcadores
O número mínimo de marcadores, necessário para a caracterização da
dissimilaridade genética dos acessos avaliados, foi estimado a partir de
correlações entre matrizes de dissimilaridades. Foram obtidas, por
amostragem, diversas matrizes de dissimilaridades a partir de subconjuntos, de
diferentes tamanhos, de marcadores moleculares. Os dados de cada uma
destas matrizes foram correlacionados com dados da matriz de dissimilaridade
obtida a partir de todos os locos analisados no estudo.
O procedimento foi iniciado com matrizes de dissimilaridade estimadas a
partir de amostras de 10 locos, sendo repetido com incrementos de cinco locos
marcadores, no intervalo entre 10 e 220 locos. Para cada tamanho amostral
foram realizadas 50 réplicas e os resultados obtidos foram apresentados
graficamente, considerando as correlações entre as diversas matrizes com m
i
marcas amostradas e a matriz original com m marcas
(
)
mm
i
< .
91
2.7.3 Análise discriminante
Análises discriminantes, baseadas no método não paramétrico de k
vizinhos mais próximos, foram aplicadas considerado dois critérios de
classificação a priori: espécies ou ecótipos apenas ou espécies, ecótipos e
origem geográfica das populações.
No método dos k vizinhos mais próximos, o valor de k é definido a priori
de maneira arbitrária. Supondo que se deseje alocar um indivíduo, cujo valor
observado seja igual a x, em uma de duas ou mais populações, a partir de
todas as distâncias genéticas entre pares de indivíduos, define-se os k
indivíduos mais próximos daquele que se deseja classificar. Supondo que
dentre esses k indivíduos, k
t
são provenientes da população t, cuja
probabilidade a priori é
t
π
. Então, a probabilidade a posteriori de que este
indivíduo pertença a t-ésima população é estimada por:
∑
=
=
p
s
sss
ttt
nk
nk
P
1
)/(
)/(
π
Onde
s: é número de populações avaliadas (
ps ,,1 L
=
);
n: é o número de indivíduos de cada população.
A observação x será classificada na t-ésima população se
ttt
nk
for maior
que
sss
nk
para todo s (Khattree e Naik, 2000).
Neste trabalho foi pré-estabelecido um valor k=3, no caso de ocorrência
de empate entre probabilidades, a observação x foi alocada uma população
designada de “desconhecida”.
A classificação a priori dos acessos estudados, de acordo com o critério
baseado em espécies ou ecótipos, foi assim estabelecida:
a) A. occidentale ‘Comum’ – 93 acessos;
b) A. occidentale ‘Anão Precoce – 10 acessos;
c) A othonianum – 10 acessos;
d) A. humile – 06 acessos.
92
Os 17 acessos restantes foram alocados a posteriori, por não atenderem aos
critérios de inclusão nas populações pré-definidas.
A classificação dos acessos pelo critério baseado na origem geográfica,
além do critério de espécie e/ou ecótipo, possibilitou a alocação prévia dos
acessos em sete populações diferentes:
a) Nordeste (NE) – 31 acessos;
b) Ano Precoce (AP) – 10 acessos;
c) Rio de Janeiro (RJ) – 45 acessos;
d) Roraima (RR) – 10 acessos;
e) Índia (ID) – 08 acessos;
f) othonianum (OT) – 10 acessos;
g) humile (HU) – 06 acessos.
Os 16 acessos remanescentes foram alocados a posteriori, uma vez que não
atenderam aos critérios para inclusão em uma das populações pré-definidas.
2.7.4 Projeção gráfica das distâncias
A partir da matriz de distâncias, obtida do complemento do coeficiente
de similaridade de Nei e Li, e da alocação de todos os genótipos nos grupos
definidos pela análise discriminante descrita anteriormente, foi realizada a
projeção gráfica dos acessos no espaço tridimensional. De acordo com Cruz
(2006a), neste procedimento as distâncias entre genótipos são convertidas em
escores relativos a três variáveis (X, Y e Z), que, quando representadas em
gráficos de dispersão tridimensional, irão refletir as distâncias originalmente
obtidas a partir do espaço n-dimensional (n=número de caracteres avaliados).
As coordenadas dos genótipos ou acessos são estabelecidas
considerando a ordem decrescente da divergência média de cada um. As
coordenadas dos dois primeiros acessos (i e j) são estabelecidas
arbitrariamente, enquanto as coordenadas do quarto e quinto acessos são
estabelecidas matematicamente, baseadas nas propriedades de um triângulo.
Para os demais acessos, as coordenadas são estimadas estatisticamente, a
partir de um sistema de equações, visando minimizar a distorção entre as
distâncias originais e as distâncias gráficas (Cruz e Carneiro, 2003; Cruz,
2006a).
93
A eficiência da projeção gráfica dos dados foi estimada através das
seguintes estatísticas (Cruz, 2006a):
a) Coeficiente de correlação entre as distâncias originais e as que foram
representadas no gráfico de dispersão;
b) Grau de distorção (1-α), considerando que:
∑∑
∑∑
<
<
=
i
oii
ií
gii
d
d
2
'
'
2
'
α
Onde
2
'gii
d
e
2
'oii
d são as distâncias gráficas (espaço tridimensional) e originais,
respectivamente, de todos os pares de indivíduos i e i’.
c) Coeficiente de estresse, definido por Kruskal (1964), dado por:
()
∑∑
∑∑
<
′
′
<
′
′′
−
=
ii
ioi
ii
igiioi
d
dd
s
2
2
2.7.5 Análise de variância molecular
A análise de variância molecular (AMOVA) foi delineada por Excoffier et
al. (1992) e é baseada em um esquema de análise de variância hierarquizada
produzindo estimativas de componentes de variância análogas às estatísticas F
de Wright, denominadas de “estatísticas
Φ
”. O método parte de uma matriz
com os quadrados das distâncias entre todos os pares de haplótipos que, neste
contexto, referem-se à combinação de marcadores moleculares presentes em
alguma área definida do genoma. Assim, o haplótipo de um indivíduo é
representado por um vetor p, com valores 1, se a banda homóloga estiver
presente e 0, caso contrário (Excoffier et al.,1992).
Considerando o caso presente, em que é assumido que os indivíduos
amostrados são oriundos de diferentes populações independentes, os
haplótipos podem ser representados pelo modelo linear:
ijjij
baxx +
+
=
Onde:
x
ij
: é a freqüência do vetor do i-ésimo haplótipo, da j-ésima população;
x: é o valor esperado desconhecido de x
ij
;
94
a: é o efeito de populações e
c: é o efeito de indivíduos ou haplótipos.
Tais efeitos são assumidos como sendo aditivos, aleatórios, não
correlacionados, associados aos componentes de variância σ
2
a
e σ
2
b
,
respectivamente, que são utilizados na obtenção da estatística
ST
φ
. O esquema
de análise de variância baseada neste modelo é apresentado na Tabela 2.
Tabela 2 – Esquema de Análise de Variância Molecular (AMOVA), para o caso
de um grupo de populações independentes.
Fonte de Variação GL SQ QM E(QM) Componentes
de variância
Entre populações P-1 SQa QMa
22
ab
n
σσ
+
222
baT
σσσ
+=
Dentro de
Populações
N-P SQb QMb
2
b
σ
2
2
T
a
ST
σ
σ
φ
=
Total N-1 - - - -
1
2
−
−
=
∑
P
N
N
N
n
P
P
Onde:
P: é número de populações;
N: é número total de indivíduos ou acessos;
Np: é o número de indivíduos ou acessos na população P.
Neste trabalho a AMOVA foi realizada considerando os 120 acessos
alocados a priori em sete populações de Anacardium spp.: 'Nordeste', ‘Anão
Precoce’, ‘Rio de Janeiro’, ‘Roraima’, ‘Índia’ ‘othonianum’ e ‘humile’. As análises
foram realizadas com auxílio dos aplicativos Arlequin (Schineider et al., 2000) e
Genes (Cruz, 2006a, 2006b).
A significância de
ST
φ
global foi testada por 10.000 permutações de
haplótipos entre as populações, enquanto as significâncias dos
ST
φ
entre pares
de populações foram testadas através de 1000 permutações de haplótipos
entre as populações.
95
2.7.6 Análise de agrupamento entre populações e acessos
Os valores de
ST
φ
entre pares de populações foram utilizados para
construir um dendrograma que evidenciasse melhor as similaridades relativas
entre os grupos. Foram utilizados os métodos de agrupamento UPGMA e o
baseado na variância mínima de Ward (Cruz et al., 2004). A adequação dos
agrupamentos foi testada através do cálculo do coeficiente de correlação
cofenética.
O agrupamento entre os 91 acessos de Anacardium, do BAG do
Cajueiro, foi obtido pelo método UPGMA, a partir do complemento dos
coeficientes de similaridade de Nei e Li (Cruz e Carneiro, 2003).
3 RESULTADOS
3.1 Padrões da variabilidade acessada
A relação dos primers ISSR selecionados para a análise da diversidade
é apresentada na Tabela 3, onde também são informados as respectivas
temperaturas de anelamento, o sistema de resolução dos produtos
amplificados, o número de locos amplificados, o percentual de polimorfismo e a
amplitude aproximada dos fragmentos amplificados.
O número de locos distinguíveis com o uso gel desnaturante de
poliacrilamida, corado com nitrato de prata, foi três vezes superior, em média,
que no sistema de gel de agarose, corado com brometo de etídio, muito
embora esta comparação seja feita entre primers de seqüências distintas.
O nível de polimorfismo detectado foi elevado e, de maneira geral,
independente do sistema de resolução empregado. O sistema de resolução
também não apresentou influência relevante na amplitude dos fragmentos
amplificados (Tabela 3).
Outro aspecto a ser destacado é a prevalência do motivo ‘GA’ nas
seqüências dos primers selecionados. Esta prevalência já era evidente a partir
dos primers relacionados na Tabela 1, que também mostra uma freqüência
igualmente elevada do motivo ‘AG’. Entretanto, conforme ilustrado pela Figura
96
1, primers com motivos iguais, mas diferindo apenas nas seqüências de
ancoragem, produzem perfis de amplificação muito diferentes.
A Tabela 4 mostra, de maneira detalhada, o número de locos fixados
()
01 == fouf ou com freqüências 9,0≥f e 1,0
≤
f para os produtos da
amplificação dos nove primers ISSRs, considerado os quatro grupos de
acessos de Anacardium spp., definidos segundo a espécie e / ou ecótipo.
Verifica-se que o grupo ‘Anão Precoce’ é o que apresenta o maior número
locos fixados e o grupo ‘Comum’ o menor, mas com grande prevalência de
locos com 9,0≥f e 1,0
≤
f . Comparativamente, o grupo ‘othonianum’
apresentou maior proporção de locos com freqüências intermediárias, isto é,
1,09,0 ≥≥ f , além de poucos locos fixados.
Tabela 3 – Relação de primers utilizados com respectivas temperaturas de
anelamento (T
A
), sistema de resolução dos produtos amplificados,
número de bandas registradas, porcentagem de polimorfismo e
amplitudes aproximadas, em pares de bases (pb), dos fragmentos
amplificados.
Primer
T
A
(°C)
Sistema de
Resolução
Nº de marcas
registradas
% de
Polimorfismo
Amplitude dos
fragmentos (pb)
(GACA)
4
48 Agarose 16 87,50 370-2000
(GAAGTGGG)
2
52 Agarose 16 100 230-2000
(GTG)
6
60 Agarose 11 72,73 280-1200
812 - (GA)
8
A
50 Poliacrilamida 26 92,30 250-2200
840 - (GA)
8
YT
50 Agarose 14 100 380-1500
841 - (GA)
8
YC
50 Poliacrilamida 78 100 180-2200
842 - (GA)
8
YG
50 Agarose 14 92,28 190-1100
834 - (AG)
8
YT
50 Poliacrilamida 30 100 270-2100
886 - VDV(CT)
7
50 Agarose 18 100 450-1500
Total 223 96,40 180-2200
Na Tabela 4 verifica-se também que o primer (GTG)
6
amplificou o
menor número de locos (n=11), além de ter apresentado o maior número de
locos fixados para o conjunto de acessos. Por outro lado, este primer
amplificou três locos exclusivos ou privados, um para o grupo ‘Comum’
()
05,0=f , um para o grupo ‘othonianum’
(
)
1,0
=
f e um para A. occidentale
97
()
88,0=f , considerando ‘Comum’ e ‘Anão ‘Precoce’, em conjunto. Bandas
exclusivas também obtidas com os primers GACA para ‘humile’
()
17,0
=
f ,
GAA para ‘othonianum 20,0
=
f e 841 para ‘Comum’
(
)
11,0
=
f .
Primer 842 (GA)
8
YG
Primer 840 (GA)
8
YT
Figura 1 – Diferenças nos perfis de bandas amplificadas pelos primers
(GA)
8
YG e (GA)
8
YT, em DNA nuclear de Anacardium spp, com
resolução em gel de agorose (1,5%), corado com brometo de
etídio.
98
Tabela 4 – Número de locos fixados
(
)
01
=
=
fouf e com freqüências
9,0≥f e 1,0
≤
f para os produtos da amplificação de nove
primers ISSR, considerado quatro grupos de acessos de
Anacardium spp.
Primer
Freq.
de
bandas
Anacardium
occidentale
Comum (n=93)
Anacardium
occidentale
Anão (n=10)
Anacardium
othonianum
(n=10)
Anacardium
humile
(n=6)
Conjunto
acessos
(N=119)
1=f 2 4 2 2 2
0=f
1 3 3 0 -
,0≥f 9 1 1 1 - 0
(GACA)
4
n =16
1,0
≤
f 1 2 0 - 0
1=f 1 7 2 2 0
0=f
2 3 0 2 -
,0≥f 9 6 3 3 - 1*
(GAAGT
GGG)
2
n=16
1,0
≤
f 2 1 2 - 1
1=f 3 4 4 4 3
0=f
0 2 2 2 -
,0≥f 9 3 0 0 - 1
(GTG)
6
n=11
1,0
≤
f 3 1 1 - 2
1=f 2 11 5 8 2
0=f
0 4 2 1 -
,0≥f 9 10 4 1 - 3
812
(GA)
8
A
n=26
1,0
≤
f 1 0 1 - 0
1=f 0 2 1 1 0
0=f
1 4 1 1 -
,0≥f 9 3 2 1 - 1
840
(GA)
8
YT
n=14
1,0
≤
f 1 1 7 - 1
1=f 0 4 2 5 0
0=f
0 9 8 6 -
,0≥f 9 9 8 2 - 2*
841
(GA)
8
YC
n=78
1,0
≤
f 6 13 8 - 1
1=f 2 5 3 2 1
0=f
0 2 0 4 -
,0≥f 9 1 0 0 - 1*
842
(GA)
8
YG
n=14
1,0
≤
f 1 0 2 - 0
1=f 1 14 5 4 0
0=f
0 4 0 1 -
,0≥f 9 12 3 1 - 4
834
(AG)
8
YT
n=30
1,0
≤
f 1 0 1 - 0
1=f 1 3 1 0 0
0=f
0 3 1 3 -
,0≥f 9 2 2 0 - 0
886
VDV(CT)
7
n=18
1,0
≤
f 4 1 2 - 0
1=f 12 54 25 28 8
0=f 4 34 17 20 -
,0≥f
9 47 23 9 - 13
1,0
≤
f 20 19 24 - 5
Totais
N=223
Geral
(%)
83
(37,2)
130
(58,3)
75
(33,6)
48
(21,5)
26
(111,7)
(-) valor não estimado, (*) incluindo casos com 83,0
=
f no grupo A. humile.
99
3.2 Estimação do número ótimo de marcadores
A relação entre o número de locos marcadores investigados e o número
mínimo necessário para acessar o mesmo nível de variabilidade é apresentada
na Figura 2. A estabilização do coeficiente de correlação de Pearson (r) em
patamares iguais ou superiores a 0,90 e 0,95 ocorreu, respectivamente, com
tamanhos amostrais de 115 e 155 locos. Os coeficientes médios de estresse
para matrizes de distâncias obtidas a partir de amostras com 115 e 155 locos
foram, respectivamente, 4,81% e 2,88%.
Figura 2 – Representação gráfica do número ótimo de marcadores para
acessar a diversidade entre 136 acessos de Anacardium spp.
Pontos referem-se à correlação entre matrizes com m
i
marcas
amostradas
(
)
22310
≤
≤
i
m e a matriz original com m marcas
()
223=m .
3.3 Análise discriminante
Os resultados das análises discriminantes, baseadas em k vizinhos mais
próximos são apresentados nas Tabelas 5 e 6. A discriminação dos acessos
segundo a espécie e/ou ecótipo, apresentada na Tabela 5 evidencia que os
100
acessos dos grupos ‘Comum’ e ‘Anão Precoce’ foram eficientemente alocados
nos seus grupos de origem. Entretanto, o método foi ineficiente para
discriminar os acessos dos grupos ‘othonianum’ e ‘humile’. A taxa de erro
aparente foi de 12,6%. Embora relativamente baixo, este valor é resultante,
quase que exclusivamente, da má classificação dos acessos dos grupos
‘othonianum e ‘humile’.
A maior parte (13) dos 17 acessos classificados a posteriori foi alocada
no grupo ‘Comum’. Dez destes acessos são originários do Estado de Roraima
e, embora estejam identificados apenas como Anacardium sp., apresentam
fenótipo típico de A. occidentale, mas com porte reduzido e copa compacta
como do grupo ‘Anão Precoce’. Entre os acessos alocados no grupo ‘Anão
Precoce’, dois estão identificados como A. microcarpum, cujas origens são
desconhecidas, e o terceiro como Anacardium sp. coletado em Camocin-CE. O
acesso alocado no grupo ‘othonianum’ está identificado como A. humile, mas
seu fenótipo é de A. othonianum, tratando-se possivelmente de um erro de
identificação.
Tabela 5 – Análise discriminante de quatro populações de Anacardium spp.,
baseada na metodologia de k vizinhos mais próximos (k=3),
estimados a partir de 223 marcadores moleculares binários. Os
Valores destacados em negrito referem-se aos percentuais de
alocação dos acessos nos seus respectivos grupos de origem.
Percentuais de alocação nos diferentes grupos
Grupo de
origem
Nº de
acessos
‘Comum’ ‘Anão’ ‘othonianum’ ‘humile’
A. occidentale
‘Comum’
93
97,85
1,08 0,00 1,08
A. occidentale
‘Anão Precoce’
10 0,00
100
0,00 0,00
A. othonianum
‘othonianum’
10 30,00 0,00
30,00
40,00
A. humile
‘humile’
06 50,00 0,00 50,00
0,00
Alocados a
posteriori
17 76,47 17,65 5,88 0,00
Total de acessos
alocados
136 110 14 07 05
A discriminação dos acessos considerando, além da espécie e/ou
ecótipo, o local de origem das populações é apresentada na Tabela 6. À
exceção do grupo ‘Nordeste’, todas as demais populações de A. occidentale
101
foram bem discriminadas, em termos de alocação correta de seus acessos. A
população mais distinta foi ‘Rio de Janeiro’, uma vez que 100% de seus
acessos foram alocados no próprio grupo, além de não ter recebido a alocação
de nenhum acesso de outra população. Todos os acessos das populações
‘Anão Precoce’ e ‘Índia’ também foram corretamente alocados. Por outro lado,
vários acessos de outras populações foram incorretamente alocados no grupo
‘Índia’, principalmente acessos do grupo ‘Nordeste’. A maior parte dos acessos
classificados a posteriori também foi alocada no grupo ‘Índia’, embora quase
todos eles sejam originários do Brasil.
Assim como na situação anterior, a análise não proporcionou uma
discriminação adequada das populações ‘othonianum’ e ‘humile’. Nos dois
casos nenhum acesso de ‘humile’ foi alocado nesta população, mas apenas
acessos do grupo ‘othonianum’. Entretanto, a maior parte dos acessos de
‘humile’ foram alocados no grupo ‘othonianum’. Além disso, muitos acessos
destes dois grupos foram alocados nas populações ‘Nordeste’, ‘Roraima’ e
‘Índia’.
Tabela 6 – Análise discriminante de sete populações de Anacardium spp.,
baseada na metodologia de k vizinhos mais próximos (k=3),
estimados a partir de 223 marcadores moleculares binários. Os
Valores destacados em negrito referem-se aos percentuais de
alocação dos acessos nos seus respectivos grupos de origem.
Percentuais de alocação nos diferentes grupos
Grupo de
origem
Nº de
Acessos
NE AP RJ RR ID OT HU
Nordeste
(NE)
31
54,84
3,23 0,00 9,68 32,26 0,00 0,00
Anão Precoce
(AP)
10 0,00
100
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Rio de Janeiro
(RJ)
45 0,00 0,00
100
0,00 0,00 0,00 0,00
Roraima
(RR)
10 0,00 0,00 0,00
90,00
10,00 0,00 0,00
Índia
(ID)
8 0,00 0,00 0,00 0,00
100
0,00 0,00
othonianum
(OT)
10 30,00 0,00 0,00 0,00 20,00
30,00
20,00
humile
(HU)
6 16,67 0,00 0,00 16,67 0,00 66,67
0,00
Alocados a
posteriori
16 0,00 18,75 0,00 0,00 68,75 6,25 6,25
Total de
acessos
136 21 14 45 13 32 8 3
102
Por outro lado, a classificação a posteriori dos acessos alocados nos
grupos ‘Anão Precoce’ e ‘othonianum’ mostrou-se consistente. Uma vez que
nas duas análises discriminantes estes acessos foram alocados nos mesmos
grupos.
3.4 Projeção gráfica das distâncias
A projeção das dissimilaridades entre os 136 acessos é apresentada na
Figura 3. As cores evidenciam os grupos de classificação dos acessos,
considerando as alocações a priori e a posteriori. As elipses destacam a
dispersão dos grupos ‘Rio de Janeiro’(3), ‘Anão Precoce’ (2) e a região onde se
concentra a dispersão da maior parte dos acessos avaliados, mas,
principalmente, daqueles pertencentes aos grupos 1, 2, 4 e 5. Dessa forma,
fica claro a maior divergência do grupo ‘Rio de Janeiro’ e a sobreposição dos
grupos ‘Nordeste’, ‘Anão Precoce’, ‘Roraima’ e ‘Índia. Os acessos, dos grupos
‘othonianum’ e ‘humile’, por outro lado, apresentaram padrões de dispersão
que impossibilita o delineamento de qualquer tipo de grupo.
O coeficiente de correlação entre as distâncias originais e as estimadas
para o espaço tridimensional foi de 0,73 enquanto a grau de distorção e o
coeficiente de estresse foram, respectivamente, 47,6% e 50,85%. Os valores
elevados destes dois últimos coeficientes implicam em considerar com cautela
os resultados da Figura 3.
3.5 Análise de variância molecular
Os resultados da AMOVA, apresentados na Tabela 7, indicam que
27,5% da variação, em média, foi devido às diferenças entre populações
()
2749,0=
ST
φ
, enquanto 72,5% resultou de diferenças entre acessos dentro
das populações.
103
Figura 3 – Projeção gráfica de 136 acessos de Anacardium spp., alocados em
sete populações diferentes através de análise discriminante não
paramétrica, baseada em k vizinhos mais próximos. Populações ou
grupos: 1 Nordeste, 2 Anão Precoce, 3 Rio de Janeiro, 4 Roraima,
5 Índia, 6 othonianum e 7 humile.
Tabela 7 - Análise de variância molecular (AMOVA), de 120 acessos
amostrados de sete populações Anacardium spp., utilizando 221
locos marcadores ISSR.
Fonte de
Variação
GL SQ QM Componente
de Variância
Porcentagem
(total)
P
Entre
Populações
6 965,57 160,93 8,97 27,49 (<0,001)
Dentro de
Populações
113 2674,40 23,67 23,67 72,51 (<0,001)
Total 119 3639,97 30,59 - 100 -
Na Tabela 08 são apresentados, na diagonal principal, os índices
ST
φ
específicos de cada população, que é uma medida da variabilidade
intrapopulacional. No restante da tabela são apresentados os índices
ST
φ
estimados entre pares de populações. Estes valores variaram de 0,004 a
0,4289 e todos eles foram significativos com probabilidades inferiores a 0,1%,
com exceção dos pares de populações ‘Nordeste’ x ‘Índia’, cuja probabilidade
104
foi 0,001<P<0,01, e ‘othonianum’ x ‘humile’, que apresentou
ST
φ
não
significativo.
Portanto, à exceção do par ‘othonianum’ x ‘humile’ todas as populações
podem ser consideradas diferentes entre si, com ‘Rio de Janeiro’ apresentado
o maior grau de divergência médio relativo.
Tabela 08 – Índices
ST
φ
específicos (diagonal principal) e entre pares de
populações de sete populações de Anacardium spp., estimados
a partir de 221 locos marcadores ISSR.
Pop. NE AP RJ RR ID OT HU
NE
0,2700
AP
0,1290***
0,2740
RJ
0,2916*** 0,2950***
0,2826
RR
0,1146*** 0,2471*** 0,4289***
0,2815
ID
0,0600** 0,2476*** 0,4011*** 0,1907***
0,2873
OT
0,2010*** 0,1625*** 0,3624*** 0,2610*** 0,2673***
0,2518
HU
0,2472*** 0,2080*** 0,4052*** 0,3217*** 0,3225*** 0,0040
ns
0,2552
**P<0,01; ***P<0,001;
ns
P não significativo.
3.6 Análise de agrupamento
Os dendrogramas obtidos pelos métodos de agrupamento baseados na
variância mínima de Ward e UPGMA são apresentados, respectivamente, nas
Figuras 4 e 5. Os dois dendrogramas foram construídos a partir dos valores
ST
φ
entre pares de populações, apresentados na Tabela 8. Embora exista
congruência nas associações entre as populações ‘othonianum’, ‘humile’ e
‘Anão Precoce’ de um lado, ‘Nordeste’, ‘Índia’ e ‘Roraima’ de outro, os dois
dendrogramas diferem no posicionamento da população ‘Rio de Janeiro’. Por
outro lado, os resultados dos dois agrupamentos são concordantes com
aqueles obtidos na análise discriminante e projeção das distâncias entre os
acessos, porque apresentam a população ‘Rio de Janeiro’ como a mais
divergente, seguida de ‘Anão Precoce’. Enquanto ‘Nordeste’, ‘Índia’ e ‘Roraima’
são menos diferenciadas entre si e ‘othonianum’ e ‘humile’, são praticamente
indistintas, mas diferentes de todas as demais.
105
Os coeficientes de correlação cofenética foram iguais a 65,16%, para o
agrupamento de Ward, e 89,56% para o agrupamento obtido por UPGMA,
ambos significativos a 1% de probabilidade pelos testes t e de Mantel.
Figura 4 – Dendrograma de sete populações de Anacardium spp., obtido pelo
método de agrupamento baseado na variância mínima de Ward, a
partir da matriz de valores de
ST
φ
entre pares de populações.
Figura 5 – Dendrograma de sete populações de Anacardium spp., obtido pelo
método de agrupamento UPGMA, a partir da matriz de valores de
ST
φ
entre pares de populações.
A Figura 6 apresenta o dendrograma formado pelos 91 acessos de
Anacardium avaliados do BAG do Cajueiro. Este agrupamento foi obtido pelo
método UPGMA, a partir do complemento dos coeficientes de similaridade de
Nei e Li, estimados entre pares de acessos. Embora não tenha ocorrido uma
separação clara dos acessos, segundo a origem ou espécie, é percebida uma
tendência ao agrupamento dos acessos de algumas populações. Conforme
destacado na Figura, a maior parte dos acessos do ‘Nordeste’ se concentrou
em dois subgrupos distintos, assim como os acessos da ‘Índia’. Os acessos de
‘Anão Precoce’ formaram apenas um grupo principal, enquanto os acessos de
‘Roraima’ não formaram nenhum subgrupo principal, embora a maior parte
deles se encontrem posicionados na parte superior do dendrograma, juntos
com um subgrupo do ‘Nordeste’ e os dois subgrupos da ‘Índia’. Por outro lado,
os acessos de várias procedências, não agrupados a priori, e cuja maioria foi
0,740,660,590,44 0,510,370,290,220,140,070,00
0,360,00 0,03 0,07 0,10 0,14 0,18 0,21 0,25 0,29 0,33
106
alocada no grupo da ‘Índia’ na análise discriminante, apresentam distribuição
dispersa ao longo do dendrograma. Estes acessos estão codificados por
iniciais em letras maiúsculas: SP – São Paulo; MT – Mato Grosso; PI – Piauí;
PA – Pará, CE – Ceará; GO – Goiás; VNZ – Venezuela.
Os acessos de ‘othonianum’ e ‘humile’, posicionados na parte inferior da
Figura, não apresentaram nenhuma tendência à formação de grupos entre si,
além de serem mais divergentes, de um modo geral, em relação aos acessos
das populações de A. occidentale.
Os acessos do ‘Rio de Janeiro’, quando foram incluídos na análise de
agrupamento, formaram um grupo único, posicionado na extremidade superior
do dendrograma.
107
Figura 6 - Dendrograma UPGMA, baseado no coeficiente de Nei e Li, de 91 acessos
do BAG do Cajueiro, Embrapa-CNPAT-CE. Grupos em destaque: NE-
Nordeste, AP- Anão Precoce, ID – Índia, OT – ‘othonianum’, HU – ‘humile’.
ID
ID
NE
NE
A
P
OT
+
HU
108
4 DISCUSSÃO
4.1 Aspectos da variabilidade acessada
Os marcadores ISSR têm sido utilizados com sucesso em diversos
estudos envolvendo a caracterização molecular em plantas, tais como
fingerprinting de cultivares (Eiadthong et al.,1999; Prevost e Wilkinson, 1999;
Charters e Wilkinson, 2000; Ruas et al., 2003); divergência entre acessos de
bancos de germoplasma (Fang et al.,1997; Blair et al.,1999; Huang e Sun,
2000; Joshi et al.,2000; Assefa et al., 2003); diversidade entre e dentro de
populações co-especificas ou interespecíficas (Ge e Sun, 1999; Deshpande et
al., 2001; Mattioni et al. 2002; Vijayan et al., 2004; Aga, et al., 2005; Ge et al.,
2005).
No presente trabalho também foi confirmada a utilidade desta classe de
marcadores na caracterização de germoplasma de cajueiro. Do conjunto de
nove primers utilizados, três amplificaram 134 locos (resolução em PAGE,
corado com nitrato de prata) e os outros seis amplificaram 89 locos (resolução
em gel de agarose, corado com brometo de etídio). A proporção de locos
polimórficos foi bastante elevada (96,4%) considerando o conjunto de acessos
avaliados. Por outro lado, o percentual de locos fixados dentro de cada ecótipo
ou espécie variou de 7,17%, no grupo ‘Comum’, a 39,46%, no grupo ‘Anão
Precoce’. O número de locos com baixo conteúdo médio de informação
polimórfica, ou seja, locos com freqüências 9,0≥f e 1,0≤f também foi
elevado dentro dos grupos. Entretanto, a existência de locos privados ou
exclusivos, além de ter sido pouco freqüente, foi restrita a locos raros dentro
dos grupos, com exceção de um loco amplificado pelo primer (GTG)
6
, exclusivo
para A occidentale. Mesmo locos comuns, mas com grande divergência de
freqüências entre os grupos não foram observados. Tais resultados apontam
para certas restrições na capacidade discriminatória dos grupos proporcionada
pelos locos amplificados. Muito embora o aumento no número de locos
amostrados não exerça impacto significativo nos resultados obtidos, conforme
ficou demonstrado através da avaliação do número ótimo de marcadores.
109
4.2 Análises discriminantes
Os resultados obtidos pelas análises discriminantes, baseada no
método de k vizinhos mais próximos, mostraram que os locos marcadores
ISSR obtidos foram apropriados para diferenciar populações da espécie A.
occidentale, mas inadequados para discriminar acessos das espécies A.
othonianum e A. humile, tanto entre si quanto em relação a A. occidentale.
Estes resultados foram, de certa forma, surpreendentes, uma vez que os
grupos ‘othonianum’ e ‘humile’, são morfologicamente mais divergentes, tanto
entre si quanto em ralação aos demais grupos.
Muitos trabalhos envolvendo a caracterização de indivíduos de
diferentes espécies, através de marcadores ISSR têm produzidos resultados
satisfatórios e sem ambigüidades. Por exemplo, Mattioni et al. (2002)
conseguiram agrupar corretamente 125 indivíduos de diferentes populações,
pertencentes a três espécies arbóreas produtoras de madeira do gênero
Nothofagus, utilizando apenas 6 primers ISSR da coleção UBC, que
produziram um total de 63 bandas. Huang e Sun (2000), utilizando 15 primers
ISSR, descreveram a divergência genética de 40 acessos de germoplasma de
batata doce, pertencentes a 10 espécies diferentes. A analise de agrupamento
dos dados demonstrou que os acessos de uma mesma espécie foram mais
similares entre si do que acessos de espécies diferentes. Resultados
semelhantes foram obtidos por Joshi et al. (2000), trabalhando com acessos de
germoplasma de arroz de diferentes espécies selvagens e cultivadas do gênero
Oriza.
Archak et al. (2003a) compararam a eficiência de três tipos de
marcadores moleculares (RAPD, ISSR e AFLP) na medida de variação e
discriminação genotípica de germoplasma de caju. Os autores verificaram que,
a partir de cada um dos três tipos de marcadores utilizados, foi possível
discriminar os 19 acessos de A. occidentale avaliados, com maior eficiência
para os marcadores AFLPs. Foram empregados 12 primers ISSR não
ancorados, sendo três deles com seqüências idênticas aos utilizados neste
trabalho, que produziram 171 bandas (73,7% polimórficas). Em um outro
estudo, conduzido por Archak et al. (2003b), cinco primers RAPD e quatro
ISSR não ancorados foram utilizados na caracterização fingerprinting de 35
110
variedades elites de cajueiro, sendo 24 seleções e 11 híbridos, desenvolvidas
por diferentes centros de pesquisa da Índia. A partir de 94 locos amplificados
foi possível diferenciar, com alto grau de certeza, todos os genótipos. Por lado,
os resultados evidenciaram que base genética entre eles é muito estreita,
apesar da grande amplitude geográfica entre os locais de obtenção dos
cultivares.
No trabalho de revisão taxonômica do gênero Anacardium, Mitchell e
Mori (1987) consideram A. othonianum e A. occidentale como ecótipos da
mesma espécie, com o primeiro circunscrito à região dos cerrados do Brasil
Central e o último tendo evoluído e sido domesticado nas áreas de dunas e
restingas das zonas costeiras da América do Sul. Por outro lado, os autores
reconhecem A. humile como uma espécie válida de Anacardium, simpátrica a
A. othonianum, embora com distribuição geográfica mais ampla. Mitchell e Mori
(1987) relatam ainda a ocorrência ocasional de híbridos entre estas duas
espécies, uma vez que elas apresentam morfologia floral muito similar e
sobreposição nas épocas de florescimento. Entretanto, as duas espécies são
facilmente distinguíveis pelo hábito de crescimento: A. humile é sempre um
subarbusto com tronco subterrâneo e ramos ascendentes rígidos de 30 a 150
cm de altura, enquanto A. othonianum é uma árvore de porte mediano de 3 a 6
metros de altura, com tronco fissurado de 20 a 40 cm de diâmetro e folhas
coriáceas.
Dentre os acessos mantidos pelo BAG, e utilizados no presente trabalho,
todos os indivíduos de A. humile e A. othonianum apresentam os fenótipos
típicos descritos para as respectivas espécies. Entretanto, esses indivíduos
foram introduzidos por sementes coletadas de populações naturais de
diferentes localidades, conforme descrito no Quadro 1. Este último aspecto
poderia explicar a grande divergência relativa apresentada pelos acessos
destas duas espécies, evidenciada no gráfico de projeção das distâncias da
Figura 2. Esta maior divergência relativa, associada a um número reduzido de
indivíduos amostrados, pode ter contribuído para má classificação destes
acessos, nas análises discriminantes baseada no método de k vizinhos mais
próximos. Também é importante destacar que, apesar da grande proporção de
classificações errôneas de acessos de ‘humile’ e ‘othonianum’ em grupos de A.
111
occidentale, apenas um acesso de A. occidentale foi classificado erradamente
como ‘humile’, na análise discriminante envolvendo ecótipos e / ou espécies.
4.3 Análise de variância molecular e de agrupamento entre as populações
A maior parte da variabilidade genética acessada se encontra dentro das
populações de Anacardium, enquanto 27,5% da variação é resultante da
diferença entre populações
(
)
2749,0
=
ST
φ
. Este valor é compatível com dados
médios de
ST
φ
estimados por Nybom (2003), para populações de espécies
perenes, alógamas e de sucessão tardia, a partir de diversos estudos
conduzidos com marcadores RAPD em espécies de plantas silvestres. A média
de
ST
φ
, obtida a partir de trabalhos conduzidos com marcadores ISSR, mas
sem levar em conta diferenças de histórias de vida das espécies, foi igual a
25,035,0 ± (Nybom, 2003). Este valor não diferiu das estimativas de
ST
φ
compiladas pela autora a partir de trabalhos conduzidos com marcadores
RAPD ou AFLP. Portanto, segundo a autora, o tipo de marcador dominante
seria de pouca importância nos valores estimados de
ST
φ
.
Por outro lado, em um trabalho realizado com populações de pimenta
longa (Piper hispidinervum), uma espécie arbustiva pioneira da região
amazônica, Wadt e Kageyama (2004) obtiveram um valor de 281,0=
ST
φ
, a
partir de marcadores RAPD. Por sua vez, Lacerda et al. (2001) estimaram
123,0=
ST
φ
, para populações de vinhático (Plathymenia reticulata), uma
leguminosa arbórea comum do cerrado do sudeste brasileiro. Enquanto Cavers
et al. (2003) obtiveram estimativas de
20,0
=
ST
φ
e 47,0
=
ST
φ
entre populações
de cedro (Cedrela odorata) pertencentes à ecótipos de regiões áridas e
úmidas, respectivamente, da Costa Rica. Embora todos estes trabalhos
envolvam a avaliação de espécies arbóreas tropicais e predominantemente
alógamas, os resultados obtidos ilustram o quão variáveis podem ser as
estimativas de
ST
φ
.
As “populações” de Anacardium do presente trabalho não constituem,
necessariamente, amostras de unidades biológicas intercruzantes, mas
conjuntos de genótipos que compartilham uma origem geográfica comum, não
112
obstante muito amplas e delimitadas de maneira arbitrária. A única exceção é a
população ‘Rio de Janeiro’. Por isso, era esperado que a maior parte da
variabilidade acessada se concentrasse mesmo dentro das populações. Por
outro lado, o fato do trabalho incluir “populações” de espécies diferentes
contribuiria para a obtenção de um valor de
ST
φ
superestimado, comparado
com o valor que seria obtido se o estudo envolvesse apenas grupos intra-
específicos. Entretanto, a comparação estatística entre os pares de populações
analisadas mostrou que a população mais divergente foi ‘Rio de Janeiro’,
enquanto as populações constituídas por acessos de A. humile e A.
othonianum não diferiram entre si.
Anacardium humile se constitui em uma espécie válida de Anacardium,
segundo todos os autores que estudaram o gênero. Enquanto A. othonianum
seria outra espécie ou, no mínimo, um ecótipo de A. occidentale, isolado
evolutivamente do ecótipo de restinga, ao qual pertenceriam as demais
populações avaliadas, inclusive ‘Rio de Janeiro’. Sob estas circunstâncias seria
esperado que os maiores níveis de divergência, em ordem decrescente de
grandeza, fossem observados entre populações pertencentes a espécies e
ecótipos diferentes, respectivamente.
5 CONCLUSÕES
a) Os dois sistemas de resolução empregados, gel de poliacrilamida e gel de
agarose, foram adequados para detectar níveis elevados de polimorfismos,
gerados pelos diferentes primers utilizados;
b) O número mínimo de locos marcadores, necessário para acessar o mesmo
nível de variabilidade, foi estimado em 155, considerando um coeficiente de
correlação de Pearson (r) igual a 95%;
c) A análise discriminante pelo método de k vizinhos mais próximos mostrou-se
adequada apenas na classificação de acessos de diferentes populações de
A. occidentale;
113
d) Os padrões de divergência observados entre os acessos de A. othonianum e
de A. humile não foram consistentes com os esperados para espécies
distintas;
e) Apesar da ampla diversidade observada entre os acessos do BAG do
cajueiro, verificou-se que a variabilidade exibida pela população ‘Rio de
Janeiro’ não está representada nesta coleção;
f) Os percentuais da variação entre e dentro de populações, obtidos pela
decomposição da variação total por meio da AMOVA, foram compatíveis
com o esperado para espécies perenes de polinização mista;
g) O padrão de agrupamento dos acessos pelo método UPGMA não refletiu,
inequivocamente, a similaridade inferida na definição a priori das
populações analisadas, à exceção da população ‘Rio de Janeiro’.
114
CAPÍTULO 3
ANÁLISE DA DIVERSIDADE EM Anacardium spp.
BASEADA EM CARACTERES FENOTÍPICOS
DISCRETOS
Desenhos esquemáticos extraídos de Cashew Descriptors (IBPGR, 1986)
115
1 INTRODUÇÃO
Em taxonomia de plantas, características não métricas tais como forma,
cor e textura são utilizadas com freqüência. Este tipo de descritor fenotípico
apresenta, em geral, estados de caráter que são mutuamente exclusivos, isto
é, se expressam de modo descontínuo ou semidescontínuo. Por isso, tais
descritores desempenham papel importante na classificação de unidades
taxonômicas, uma vez que a probabilidade de erro é pequena (Engels, 1983a).
Esta classe de caracteres também é muito importante na caracterização de
recursos genéticos vegetais uma vez que são, em geral, altamente herdáveis,
se expressam de modo consistente em todos os ambientes e podem ser
avaliadas de forma rápida e direta à vista desarmada. Por isso, listas de
descritores têm sido elaboradas por órgãos internacionais como o IPGRI
(International Plant Genetic Resources Institute) para várias espécies
cultivadas e suas afins silvestres, envolvendo características tais como cor da
flor, formato e tamanho dos frutos, formato das folhas, época de florescimento
etc. (Perry e Bettencourt, 1995).
Além da facilidade de avaliação, características fenotípicas discretas
apresentam, em muitos casos, importância agronômica, industrial ou
mercadológica, relacionadas com aspectos tais como facilidade no manejo da
cultura, processamento da produção e aceitação comercial do produto. Para a
cultura do cajueiro (Anacardium occidentale L.), uma lista de descritores foi
disponibilizada pelo IBPGR (atual IPGRI) em 1986 (IBPGR, 1986). Estes
descritores são divididos nas seguintes categorias: dados de passaporte,
caracterização e avaliação preliminar e caracterização e avaliação adicional.
Neste trabalho foi secionado um subconjunto de descritores fenotípicos
discretos da lista elaborada pelo IBPGR (1986) para a cultura do cajueiro,
considerando a facilidade de observação e possível importância econômica dos
caracteres, com objetivo de avaliar sua eficiência na discriminação de acessos
Anacardium spp. de bancos de germoplasma.
116
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Material vegetal
As informações utilizadas para o estudo foram obtidas de 69 acessos do
Banco Ativo de Germoplasma do Cajueiro da Embrapa Agroindústria Tropical,
localizado no município de Pacajus – CE. Cada acesso foi representado por um
indivíduo apenas, cujas denominações e origens geográficas são relacionadas
a seguir:
a) A. occidentale tipo comum – 49 acessos: Ceará (26), Roraima (8),
Pará (3), São Paulo (2), Goiás (1), Mato Grosso (1), Piauí (1),
Paraíba (1), Índia (4) e Venezuela (2);
b) A. occidentale tipo anão precoce - 10 acessos coletados no Ceará;
c) A. othonianum (Rizzini) – 7 acessos: Goiás (5), Mato Grosso (1) e
Piauí (1);
d) A. microcarpum (Ducke) – 2 acessos coletados no Ceará;
e) Anacardium sp. – 1 acesso coletado no Ceará.
2.2 Coleta de dados
As avaliações foram realizadas durante a fase reprodutiva, nos meses
de outubro e novembro de 2005. As características avaliadas foram
selecionadas a partir da lista de descritores do cajueiro, definida pelo IBPGR
(1986), totalizando 18 variáveis referentes à folha, inflorescência, pedúnculo,
castanha e hábito de crescimento, conforme descrito a seguir:
- Folha
a) Formato do limbo:1-obovado, 2-ovado, 3-oblongo, 4-circular;
b) Formato do ápice do limbo: 1-pontiagudo, 2-arredondado, 3-indentado;
c) Ângulo de inserção no caule: 1-agudo, 2-obtuso;
d) Plano de secção do limbo: 1-plano, 2-reflexo, 3-encurvado, 4-torcido;
- Pedúnculo
a) Formato geral: 1-cilíndrico, 2-cônico a obovado, 3-redondo, 4-piriforme;
b) Formato da base: 1-angular, 2-arredondado, 3-aplanado, 4-
obliquamente aplanado;
117
c) Formato do ápice: 1-nivelado, 2-oblíquo;
d) Cavidade do ápice: 1-ausente, 2-superficial, 3-profunda;
e) Cor do pedúnculo maduro: 1-amarelo, 2-amarelo-laranja, 3-laranja, 4-
vermelho-laranja, 5-vermelho;
-Castanha
a) Formato da base: 1-arredondado, 2-aplanado, 3-obliquamente aplanado,
4-angular;
b) Sutura: 1-arredondada, 2-angular;
c) Posição relativa sutura x ápice:1-sutura à frente do ápice, 2-sutura
alinhada com ápice, 3-ápice à frente da sutura;
d) Flancos: 1-aplanado, 2-arredondado, 3-alargado;
e) Formato do ápice: 1-arredondado, 2-intermediário, 3-pontiagudo;
-Inflorescência
a) Formato geral: 1-cônica, 2-deltóide, 3-piramidal;
b) Grau de compactação: 1-compacta, 2-frouxa;
c) Tipo de ramificação: 1-ao redor de todo o eixo principal, 2-ao longo de
dois lados em um plano;
-Hábito de crescimento
a) Formato da copa: 1-ereta e compacta, 2-ereta e aberta, 3-aberta e
projetada horizontalmente.
A determinação das categorias de cada acesso, para cada variável
considerada, foi realizada com o auxílio de desenhos esquemáticos da lista de
descritores do cajueiro (IBPGR, 1986).
2.3 Análises estatísticas
Os dados foram codificados para um sistema binário, de modo que as
múltiplas categorias de uma variável foram representadas por diferentes
colunas da matriz, utilizando valores iguais a 1 na coluna correspondente ao
estado de caráter do acesso em questão e zeros nas demais (Cruz, 2006a).
Para cada variável, foram calculadas as freqüências relativas dos
diferentes estados de caráter e estimados os índices de diversidade de
Shannon-Wiener normalizados, obtidos pela expressão (Bekele e Bekele,
1996):
118
()
()
n
PP
H
n
i
ii
log
log
1
'
∑
=
−
=
, onde
n = número de classes de estados de caráter da variável;
P
i
= freqüência do estado de caráter i da variável em análise;
log = logaritmo (podendo ser de base 2, base e ou base 10).
A partir da matriz de dados codificados foram calculadas as
dissimilaridades entre todos os pares de acessos, por meio das seguintes
informações (Cruz, 2006a):
aj: número de concordância do tipo 1-1 para a j-ésima variável;
bj: número de discordância do tipo 1-0 para a j-ésima variável;
cj: número de discordância do tipo 0-1 para a j-ésima variável.
O índice de dissimilaridade (d
ii’
) foi obtido pela expressão:
∑
=
++
+
=
v
j
jjj
jj
ii
cba
cb
d
1
'
A partir da matriz de dissimilaridade entre os acessos foi realizada a
análise discriminante, baseada no método não paramétrico de k vizinhos mais
próximos, considerado como critério de classificação a priori a espécie dos
acessos, ou seja:
a) A. occidentale – 58 acessos;
b) A. othonianum – 7 acessos.
Três acessos não foram incluídos nesta análise, dois identificados como A.
microcarpum e um como Anacardium sp.
O valor de k foi pré-estabelecido, arbitrariamente, em k=3 e a
probabilidade a posteriori, de que um dado indivíduo pertença a t-ésima
população, é estimada por:
∑
=
=
p
s
sss
ttt
nk
nk
P
1
)/(
)/(
π
Onde
s: é número de populações avaliadas (
ps ,,1 L
=
);
n: é o número de indivíduos de cada população
119
t
π : é a probabilidade a priori de um indivíduo pertencer à população t
A observação x é classificada na t-ésima população se
ttt
nk
for maior que
sss
nk
para todo s (Khattree e Naik, 2000).
A relação entre os acessos foi também avaliada através da projeção
gráfica das distâncias no espaço tridimensional e por métodos de agrupamento
hierárquicos.
Na análise de projeção, as distâncias entre genótipos foram convertidas
em escores relativos a três variáveis (X, Y e Z), de modo que, na
representação gráfica de dispersão tridimensional, refletissem as distâncias
originalmente obtidas a partir do espaço n-dimensional, sendo n o número de
caracteres avaliados (Cruz e Carneiro, 2004; Cruz, 2006a). Neste estudo foram
considerados os acessos e respectivos grupos envolvidos na análise
discriminante e a eficiência da projeção foi estimada através das seguintes
estatísticas (Cruz, 2006a):
a) Coeficiente de correlação entre as distâncias originais e as que foram
representadas no gráfico de dispersão;
b) Grau de distorção (1-α), considerando que:
∑∑
∑∑
<
<
=
ii
oii
ií
gii
d
d
´
2
'
'
2
'
α
Onde
2
'gii
d e
2
'oii
d são as distâncias gráficas (espaço tridimensional) e originais,
respectivamente, de todos os pares de indivíduos i e i’.
c) Coeficiente de estresse, de Kruskal (1964), dado por:
()
∑∑
∑∑
<
<
−
=
ii
oii
ii
gijoij
d
dd
s
'
2
'
'
2
A análise de agrupamento por métodos hierárquicos foi realizada
considerando os 69 acessos avaliados. Foram utilizados os métodos UPGMA
(médias aritméticas entre todos os pares de acessos) e da variância mínima de
Ward (Ward, 1963).
120
3 RESULTADOS
3.1 Distribuição e Índices de Diversidade dos Caracteres
Houve ampla variação para a grande maioria das características
avaliadas. Apenas um descritor, ‘formato do ápice do pedúnculo’, foi
monomórfico, enquanto o caráter ‘tipo de ramificação da inflorescência’,
apresentou o estado alternativo em apenas um acesso e o caráter ‘formato do
ápice da castanha’ apresentou apenas duas das três classes possíveis. As
demais características, além de variáveis, apresentaram freqüências de
estados de caráter relativamente eqüitativas, conforme atestam os índices de
diversidade de Shannon-Wiener que, na maioria dos casos, foi superior a 0,7
(Tabela 1).
3.2 Análise discriminante e projeção das distâncias
Os resultados da análise discriminante (Tabela 2) demonstram que a
discriminação pelo método do k vizinhos mais próximos produziu proporção de
alocações incorretas maior entre os acessos de A. othonianum, enquanto na
alocação pelo método do vizinho médio todos os acessos de A. othonianum
foram classificados de maneira apropriada, mas grande parte dos acessos de
A. occidentale foi alocada incorretamente no grupo othonianum. Por outro lado,
a taxa erro aparente (TEA) global entre dois métodos mostra que o método de
k vizinhos mais próximos foi mais eficiente na alocação dos acessos que o
método do vizinho médio, com um valor de TEA quase três vezes menor.
A projeção gráfica das distâncias, apresentada na Figura 1, evidencia
sobreposição na dispersão dos acessos das duas populações, o que dificulta
uma discriminação adequada dos grupos. Por outro lado, a correlação entre
distâncias originais e estimadas foi apenas de 0,46, enquanto o grau de
distorção foi 40,01% e o coeficiente de stress igual a 46,3%. Por isso, a análise
destas relações deve ser realizada com a devida cautela, considerando as
restrições de confiabilidade que elas apresentam.
121
Tabela 1 - Freqüências relativas e índices de diversidade Shannon-Wiener
normalizados de 18 variáveis fenotípicas discretas, avaliadas em
69 acessos de Anacardium sp. do BAG do cajueiro, Embrapa-
CNPAT
Freqüências de Estados de Caráter
Caracteres Avaliados
1 2 3 4 5
Índice
Shannon-
Wiener
Folha
Formato do limbo 0,41 0,10 0,41 0,08 - 0,8486
Formato do ápice 0,03 0,59 0,38 - - 0,7097
Ângulo de inserção 0,64 0,36 - - - 0,9446
Plano de secção 0,25 0,42 0,07 0,26 - 0,9018
Pedúnculo
Formato geral 0,10 0,59 0,28 0,03 - 0,7207
Formato da base 0,39 0,28 0,17 0,16 - 0,9516
Formato do ápice 1,00 0,00 - - - Indet.
Cavidade do ápice 0,16 0,68 0,16 - - 0,7710
Cor do pedúnculo 0,35 0,12 0,17 0,23 0,13 0,9481
Castanha
Formato da base 0,36 0,27 0,25 0,12 - 0,9507
Formato da sutura 0,49 0,51 - - - 0,9998
Posição sutura x ápice 0,54 0,43 0,03 - - 0,7272
Angulação dos flancos 0,14 0,41 0,45 - - 0,9151
Formato do ápice 0,65 0,35 0,00 - - 0,5893
Inflorescência
Formato geral 0,01 0,35 0,64 - - 0,6514
Grau de compactação 0,29 0,71 - - - 0,8685
Tipo de ramificação 0,99 0,01 - - - 0,1093
Hábito de Crescimento
Formato da copa 0,09 0,68 0,23 - - 0,7399
(-) estados não aplicáveis ao caráter em questão.
122
Tabela 2 – Análise discriminante de acessos de duas espécies de Anacardium,
baseada nos métodos de k vizinhos mais próximos (k=3) e vizinho
médio, considerando a matriz de distâncias obtida da avaliação de
17 variáveis fenotípicas discretas.
Percentuais de Alocação nos grupos*
Método k vizinhos mais
próximos
Método do vizinho médio
Grupo de
Origem
Nº de
Indivíduos
A. occidentale
A. othonianum
A. occidentale
A. othonianum
A. occidentale
59
91,53
8,47
66,10
33,90
A. othonianum
7 28,57
71,43
0,00
100
Total de Indiv.
alocados
66 56 10 39 27
Taxa de erro
aparente (%)
10,60 30,3
* valores em negrito destacam os percentuais de alocação de acessos nos respectivos grupos
de origem.
Figura 1 – Projeção gráfica das distâncias entre 66 acessos de Anacardium
spp., discriminados em duas populações diferentes. Populações ou
grupos: 1 - A. occidentale; 2 - A. othonianum. Nota: elipse delimita a
região de dispersão da maioria dos acessos de A. othonianum.
123
3.3 Análise de agrupamento
Os dendrogramas de agrupamento dos 69 acessos obtidos pelos
métodos UPGMA e Ward são apresentados, respectivamente, nas Figuras 2 e
3. Conforme evidenciado pelos dois métodos, as medidas de dissimilaridades
entre pares de acessos, obtidas pela combinação das 17 variáveis
consideradas, possibilitou a distinção de todos os indivíduos avaliados sem
ambigüidades.
Uma linha de corte traçada a 75% da variação total, evidencia a
formação de seis subgrupos maiores, isto é, com cinco ou mais acessos
(destacados pelas barras verticais à esquerda) e vários subgrupos menores, no
agrupamento obtido por UPGMA. Por outro lado, o mesmo ponto de corte no
dendrograma de Ward produz apenas sete subgrupos que abrangem todos os
acessos.
Nos dois dendrogramas não houve a formação de subgrupos que
envolvessem a maioria dos acessos de uma espécie ou ecótipo. Pelo contrário,
os acessos de cajueiro anão precoce (AP) ficaram dispersos em vários
subgrupos, assim como os acessos de A. othonianum (OT). Embora, neste
último caso, tenha ocorrido uma tendência de agrupamento dos acessos OT
nos dois subgrupos localizados na parte superior do dendrograma.
124
Figura 2 - Agrupamento UPGMA de 69 acessos do BAG do Cajueiro, Embrapa-
CNPAT-CE, gerado a partir da matriz de distâncias obtida da avaliação de
17 variáveis fenotípicas discretas. Códigos: OT – A. othonianum, CC
cajueiro comum (A. occidentale), AP – cajueiro anão precoce (A.
occidentale), MC – A. microcarpum, SP – Anacardium sp.
125
Figura 3 – Dendrograma de agrupamento, baseado no método da variância mínima de
Ward, de 69 acessos do BAG do Cajueiro, Embrapa-CNPAT-CE, gerado a
partir da matriz de distâncias obtida da avaliação de 17 variáveis
fenotípicas discretas. Códigos: OT – A. othonianum, CC cajueiro comum
(A. occidentale), AP – cajueiro anão precoce (A. occidentale), MC – A.
microcarpum, SP – Anacardium sp.
126
4 DISCUSSÃO
Estudos de diversidade genética utilizando descritores morfológicos não
métricos são comuns em trabalhos envolvendo a caracterização de recursos
genéticos vegetais (Engels, 1983b; Bekele e Bekele, 1996; Colombo et al.,
1998; Bajracharya et al., 2005; Duran et al., 2005). Por outro lado, os
resultados obtidos nem sempre são satisfatórios no que se refere à
diferenciação de todos os acessos analisados (Colombo et al., 1998;
Bajracharya et al., 2005). Engels (1983a) afirma que a utilidade de um
descritor qualitativo depende do número de estados de caráter que esse
descritor pode assumir, assim como da quantidade de informação que ele
compartilha com outros descritores utilizados no mesmo estudo.
Neste trabalho foram utilizados 18 descritores fenotípicos discretos
selecionados da lista de descritores elaborada pelo IBPGR (1986) para o
cajueiro. A seleção teve como principais critérios a facilidade de determinação
do estado do caráter do descritor e sua associação aos produtos de
importância econômica da planta, ou seja, castanha e pedúnculo. Das 56
classes fenotípicas esperadas, para o conjunto dos 18 descritores avaliados,
foram observadas 54. Apenas um descritor, formato do ápice do pedúnculo, foi
monomórfico, enquanto o caráter ‘formato do ápice da castanha’ apresentou
apenas duas das três classes possíveis.
Os índices normalizados de diversidade de Shannon-Wiener
apresentaram valores acima de 0,50 para 16 descritores e a acima de 0,8 para
nove dos 18 descritores. Estes valores indicam que, além de variáveis, a
maioria dos descritores apresentou freqüências de classes relativamente
eqüitativas, atributos que lhes conferem elevado poder de discriminação. O
poder discriminatório de descritores com estas características foi observado por
Bekele e Bekele (1996) ao avaliarem 100 acessos do banco internacional de
germoplasma do cacaueiro, utilizando 28 variáveis quantitativas e 26
qualitativas. Entre os descritores fenotípicos discretos, 69% apresentaram
índices de diversidade maior que 0,5. Por isso, de acordo com os autores, este
conjunto de variáveis teve um peso muito maior que os descritores
morfométricos na discriminação dos acessos avaliados. Por outro lado,
Bajracharya et al. (2005) não conseguiram discriminar adequadamente 147
127
raças locais de arroz do Nepal, utilizando 27 descritores fenotípicos discretos,
uma vez que apenas 12 apresentaram alguma variação, mas com índice médio
de diversidade Shannon-Wiener igual a 0,23.
Os descritores utilizados no presente estudo apresentaram variação
suficiente para discriminar adequadamente os 69 acessos de Anacardium
avaliados, conforme evidenciado pelas Figuras 2 e 3. De acordo com os
resultados da Tabela 2, estes descritores também foram razoavelmente
eficientes na diferenciação de acessos pertencentes a A. occidentele e A.
othonianum, quando empregados na análise discriminante pelo método não
paramétrico baseado em k vizinhos mais próximos. Em um trabalho de
caracterização de 31 cultivares de mandioca, através de 27 descritores
fenotípicos discretos, realizado por Colombo et al. (1998), foi possível
diferenciar um grupo de cultivares plantados para consumo in natura de outro
grupo constituído por cultivares destinados à fabricação de farinha. Duran et al.
(2005) ao avaliarem 65 raças locais de feijão comum da região do Caribe,
utilizando sete descritores fenotípicos discretos e seis morfométricos,
conseguiram distinguir os acessos de origem Andina daqueles de origem
Mesoamericana, resultados que foram confirmados pela análise molecular dos
tipos proteína faseolina dos acessos e por marcadores RAPD. Os padrões de
agrupamento exibidos pelos dendrogramas das Figuras 2 e 3, por outro lado,
demonstram que não houve a formação de subgrupos associados com a
espécie, ecótipo ou origem geográfica dos acessos. Estes resultados indicam
que tais descritores são adequados para discriminar acessos, mas
inapropriados para discriminar grupos. Isto ocorreu porque, aparentemente,
não houve classes fenotípicas mutuamente exclusivas dos descritores entre os
grupos avaliados. Dessa forma, a variabilidade acessada encontra-se dispersa
entre todos os acessos avaliados, indicando que a divergência genética não
está associada com grupo de origem.
128
5 CONCLUSÕES
a) A maioria dos descritores analisados apresentou ampla variabilidade
entre os acessos avaliados.
b) As informações geradas pelo conjunto de descritores foram adequadas
para discriminar, sem ambigüidades, todos os acessos de Anacardium
avaliados.
c) A utilização de um número menor de descritores, do que o inicialmente
recomendado para avaliar os recursos genéticos do cajueiro, parece ser
apropriada, resultando em economia de tempo e esforços no processo
de caracterização preliminar dos acessos.
d) Por outro lado, os padrões de distribuição da variabilidade acessada
foram inadequados para caracterizar grupos de acessos de origem
comum, exceto no caso dos grupos acessos de A. occidentale x A.
othonianum, que puderam ser razoavelmente distinguidos através da
análise discriminante pelo método não paramétrico de k vizinhos mais
próximos.
129
CAPÍTULO 4
ANÁLISE COMPARATIVA DA DIVERSIDADE EM Anacardium
spp. ACESSADA POR MEIO DE DADOS MORFOMÉTRICOS,
FENOTÍPICOS DISCRETOS E MOLECULARES
(1) (2) (3) (4)
largura
comprimento
espessura
130
1 INTRODUÇÃO
O estudo da diversidade genética é um processo através do qual a
variação entre indivíduos ou entre populações é examinada empregando um
método específico ou combinação de métodos (Mohammadi e Prasanna,
2003). Atualmente, existe grande número de métodos disponíveis para análise
da diversidade genética, seja em avaliações de acessos de bancos de
germoplasma, cultivares melhoradas ou populações. De acordo com Franco et
al. (2001), para alcançar os objetivos almejados, vários tipos de atributos são
medidos em cada genótipo: (1) variáveis fenotípicas contínuas, tais como
características morfoagronômicas; (2) variáveis fenotípicas discretas ou
fenotípicas discretas e (3) marcadores moleculares discretos binários, tais
como RFLPs, AFLPs, RAPDs, entre outros. Assim, para um total de p
atributos, cada genótipo pode ser visualizado como sendo localizado em um
espaço p multidimensional no qual cada dimensão é representada por um
atributo.
De um modo geral, de acordo com Franco et al. (2001), quando se
dispõe de dados fenotípicos morfológicos e de marcadores moleculares para
um conjunto de genótipos, os estudos de diversidade e de classificação
hierárquica são realizados de forma independente. Uma análise é baseada nos
dados morfológicos, através do cálculo de uma distância métrica padrão (tal
como o quadrado da distância Euclidiana) e da aplicação de uma estratégia de
agrupamento como UPGMA ou Ward. Outra classificação é obtida baseada
nos atributos moleculares, através da determinação da similaridade (ou
dissimilaridade) genética entre os indivíduos, também seguido da aplicação de
uma estratégia de agrupamento dos genótipos (p. ex. Colombo et al., 1998;
Nielsen et al., 2003; Baxevanis et al., 2005).
Por outro lado, em muitos casos em que são realizadas avaliações de
caracteres morfométricos e fenotípicos discretos, os dados são analisados
como um único conjunto de atributos, assumindo que a ordenação arbitrária
atribuída às variáveis discretas constitui diferenças de grau entre os acessos
(p. ex. Barros, 1991; Bekele e Bekele, 1996; Duran et al., 2005). Apesar da
atribuição de valores numéricos tais como 1, 2, 3 etc. para cada categoria de
uma variável discreta não é apropriada a utilização de uma medida de distância
131
padrão, como as aplicadas a caracteres de variação contínua, uma vez que
não é possível assumir que um par de genótipos com valores 1 e 4 sejam mais
distantes que outro com valores 1 e 2, por exemplo (Cruz e Carneiro, 2003).
Alguns autores têm proposto métodos para combinar diferentes classes
de dados, de modo que se possa obter uma única matriz de distâncias ou de
dissimilaridades, que será empregada na classificação e agrupamento dos
genótipos investigados em um único procedimento. Engels (1983a) propôs um
método para combinar descritores quantitativos e qualitativos de germoplasma
de cacau, baseado no cálculo do valor discriminatório de cada atributo
avaliado. Cole-Rodgers et al. (1997) também propuseram uma forma de
combinar dados fenotípicos qualitativos e quantitativos de modo que pudessem
ser submetidos a análises estatísticas. Os autores utilizaram caracteres de
germoplasma de Capsicum para ilustrar a aplicabilidade do método, mas
afirmaram que sua utilidade é extensível a qualquer trabalho envolvendo a
análise de recursos genéticos. Uma estratégia que possibilita a combinação de
informações moleculares binárias e atributos fenotípicos foi proposta por
Franco et al. (2001). Neste método, inicialmente é buscado um número mínimo
de fragmentos relevantes na diferenciação dos genótipos analisados que são,
posteriormente, combinados com atributos morfoagronômicos disponíveis.
De acordo com Mohammadi e Prasanna (2003), duas questões
assumem considerável importância na decisão de analisar diferentes grupos de
dados individualmente ou de forma combinada: (a) se a análise e a
interpretação dos resultados deveriam ser baseadas nos dados de grupos
individuais ou nos dados combinados dos diversos grupos, quando múltiplos
grupos de dados estão disponíveis; (b) como combinar eficientemente
diferentes grupos de dados.
O ponto mais importante a ser considerado, antes da combinação de
grupos de dados, é a congruência ou correspondência entre os resultados
derivados dos diferentes grupos de dados (Mohammadi e Prasanna, 2003).
Entretanto, Burstin e Charcosset (1997) concluíram que as distâncias
fenotípicas e moleculares entre genótipos não apresentam relação linear, mas
“triangular” para caracteres de herança poligênica, que são normalmente
utilizados para computar as distâncias fenotípicas. Assim, distâncias pequenas
estimadas por marcadores moleculares são, sistematicamente, associadas
132
com pequenas distâncias fenotípicas, enquanto distâncias moleculares
elevadas correspondem tanto a distâncias fenotípicas baixas quanto elevadas.
Burst e Charcosset (1997) demonstram que a magnitude do coeficiente de
correlação entre distâncias fenotípicas e moleculares depende da associação
entre locos marcadores e caracteres de herança quantitativa (QTLs). Por isso,
quando a associação entre locos marcadores e QTLs é baixa, o coeficiente de
correlação linear entre estas duas distâncias decresce com aumento do
número de QTLs envolvidos no controle das características avaliadas.
Diversos estudos analisaram as correlações entre matrizes de distâncias
ou de similaridades genéticas, derivadas da aplicação de diferentes tipos de
marcadores moleculares. Por outro lado, poucos trabalhos envolvendo análises
de diversidade tentaram comparar os resultados derivados de grupos
individuais vs combinados de diferentes classes de dados (Mohammadi e
Prasanna, 2003). Pejic et al. (1998) realizaram análise comparativa da
similaridade genética entre linhas endogâmicas de milho, estimadas a partir de
quatro sistemas diferentes de marcadores moleculares (RAPD, RFLP, SSR e
AFLP). Os coeficientes de correlação entre as diferentes matrizes de
similaridade foram todos significativos variando entre 0,51 e 0,70. Trabalho
semelhante foi realizado por Russell et al. (1997) em cevada. Zucchi (2002)
observou a existência correlações significativas e elevadas entre distâncias
genéticas e congruência entre estimativas de diversos parâmetros
populacionais de Eugenia dysenterica, uma frutífera nativa do cerrado,
estimados a partir de dados isoenzimáticos, marcadores SSR e RAPD. Por
outro lado, em uma análise de genótipos de cajueiro através de variáveis
morfométricas e de marcadores AFLP, RAPD e ISSR, Archak et al. (2003a)
verificaram a existência de correlação significativa apenas entre as matrizes de
similaridade derivadas de dados de RAPD e ISSR. Kamada (2006) comparou
matrizes de dissimilaridades e padrões de agrupamento obtidos de dados
morfométricos, fenotípicos discretos e de RAPD, avaliados em quatro
populações de fáfia (Pfaffia glomerata). O autor verificou que as correlações
entre as diferentes matrizes foram fracas, com o maior valor para matrizes de
distâncias entre dados fenotípicos discretos e de RAPD. Correlações nulas
entre dados moleculares e fenotípicos foram também observadas por Roldán-
133
Ruiz et al (2001) em estudo envolvendo a caracterização de variedades de
centeio forrageiro.
De acordo com Mohammadi e Prasanna (2003), diante de tantos
resultados contraditórios, as opiniões divergem a respeito da utilidade de se
combinar grupos de dados de diferentes tipos de variáveis, com o propósito de
analisar a diversidade genética. Os autores ainda chamam a atenção para o
cuidado que deve ser tomado ao combinar dados de medidas quantitativas e
qualitativas, em razão de possíveis vieses nas medidas de distância, baseadas
em caracteres quantitativos e da alta correlação entre os caracteres
qualitativos.
Neste trabalho foram comparadas as matrizes de distâncias ou
dissimilaridades entre acessos de Anacardium, obtidas a partir de dados
morfométricos, fenotípicos discretos e de marcadores ISSR. Análises
discriminantes e de agrupamento dos acessos também foram realizadas,
considerando as diferentes classes de dados e de suas combinações, através
da soma de matrizes de divergência padronizadas.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Material vegetal
As informações utilizadas para o estudo foram obtidas de 69 acessos do
Banco Ativo de Germoplasma do Cajueiro da Embrapa Agroindústria Tropical,
localizado no município de Pacajus – CE. Cada acesso foi representado por um
indivíduo apenas, cujas denominações e origens geográficas foram descritas
no item 2.1 do Capítulo 3.
2.2 Coleta de dados
As informações referentes a características morfométricas e fenotípicas
discretas foram obtidas durante a fase reprodutiva, nos meses de outubro e
novembro de 2005. As características avaliadas foram selecionadas a partir da
lista de descritores do cajueiro, definida pelo IBPGR (1986), totalizando 13
variáveis morfométricas, relativas à inflorescência (3), pedúnculo (4), castanha
134
(4) e hábito de crescimento (2) e 18 variáveis fenotípicas discretas referentes à
folha (4), inflorescência (3), pedúnculo (5), castanha (5) e hábito de
crescimento (1), conforme descrito nos itens 2.2 dos Capítulos 1 e 3,
respectivamente.
Os dados moleculares de marcadores ISSR foram produzidos no
Laboratório de Genética Molecular de Plantas (Biomol), do Instituto de
Biotecnologia Aplicada à Agropecuária (Bioagro) da UFV. O material foi
coletado no final da fase reprodutiva, durante a emissão de folhagem nova, no
mês de novembro de 2005. Os métodos referentes aos processos de extração
DNA, seleção de primers, otimização das condições de amplificação e
interpretação dos produtos amplificados foram descritos nos itens 2.2 a 2.7 do
Capítulo 2.
2.3 Análises estatísticas dos dados
Matrizes de dissimilaridades entre todos os pares de acessos foram
obtidas para cada uma das classes de dados. A matriz de dissimilaridade dos
dados morfométricos foi gerada a partir do cálculo das distâncias Euclidianas
médias padronizadas (Cruz e Carneiro, 2003; Cruz, 2006a). A matriz de
dissimilaridade dos dados fenotípicos discretos foi estimada a partir do modelo
binário qualitativo descrito no item 2.3 do Capítulo 3 e a matriz de
dissimilaridade dos dados moleculares foi obtida a partir do complemento do
coeficiente de similaridade de Sorenso ou Nei e Li, conforme descrito no item
2.7.1 do Capítulo 2.
As diferentes medidas de distâncias entre pares de acessos foram
combinadas através da soma de matrizes, considerando todas as combinações
de pares de matrizes assim como matriz soma dos três conjuntos de dados.
As associações entre as medidas de dissimilaridades obtidas das três
classes de variáveis foram verificadas através da correlação entre matrizes,
cujas significâncias foram testadas através do teste Z de Mantel, descrito por
Manly (1986, 1998) para matrizes envolvendo dados biológicos. O valor de Z é
dado por:
ij
n
ji
ij
YXZ
∑
=
=
1,
135
onde
ij
X
e
ij
Y
são elementos das matrizes X e Y a serem comparadas. A
significância de Z é testada comparando-se o valor obtido a partir dos dados
observados com uma distribuição nula, construída a partir do cálculo de Z de
diversas correlações entre uma das matrizes na forma original com outra sendo
aleatorizada a cada cálculo do novo coeficiente de correlação. Neste trabalho,
a significância de Z foi avaliada com base em 1000 simulações aleatórias.
A utilidade na discriminação de grupos de acessos de Anacardium,
constituídos por espécies ou ecótipos distintos, foi avaliada para cada uma das
três classes de variáveis isoladamente, assim como pela suas combinações em
matrizes de dissimilaridades. Os grupos definidos a priori foram constituídos
por 66 dos 69 acessos avaliados assim distribuídos:
a) 49 acessos de A. occidentale tipo comum, com diversas origens geográficas;
b) 10 acessos de A. occidentale tipo anão precoce, coletados no município de
Maranguape – CE;
c) Sete acessos de A. othonianum, coletados em diferentes locais do Cerrado
do Brasil Central.
Em todos os casos foi aplicado o método não paramétrico de análise
discriminante baseado em k vizinhos mais próximos (k=3), considerando os
dados da matriz de distâncias genéticas, conforme metodologia descrita no
item 2.3 do Capítulo 3.
As diferentes medidas de dissimilaridade também foram comparadas
quanto aos padrões de agrupamento dos acessos, produzidos pelo método de
otimização de Tocher.
Todas as análises foram realizadas com auxílio do aplicativo
computacional Genes (Cruz, 2001; 2006a).
3 RESULTADOS
3.1 Correlações entre medidas de dissimilaridades
As correlações entre as medidas de dissimilaridades são apresentadas
na Tabela 1. Apenas as medidas de dados morfométricos e moleculares
demonstraram ser, de alguma forma, correlacionadas, exibindo um coeficiente r
136
relativamente baixo (r=0,365), mas significativo pelo teste de Mantel (p<0,01).
A matriz de dissimilaridades dos dados fenotípicos discretos apresentou
correlações nulas com as outras matrizes de dissimilaridades.
Tabela 1 – Coeficientes de correlação e intervalos de confiança do teste de
Mantel (1000 simulações) entre matrizes de dissimilaridade de
caracteres morfométricos (matriz 1), fenotípicos discretos (matriz
2), moleculares (matriz 3), obtidas da avaliação de 69 acessos de
Anacardium spp. do Banco Ativo de Germoplasma do Cajueiro.
Teste de Mantel - níveis críticos Matrizes Coeficientes de
correlação
5% 1%
1 X 2 0,0769 0,0163 - 0,0817 0,0221 - 0,0718
1 X 3 0,3650 0,2457 - 0,3204 0,2558 - 0,3071
2 X 3 0,0043 -0,0299 - 0,0154 -0,0404 - 0,0313
A Figura 1 apresenta a relação entre as distâncias fenotípicas (matriz 1)
e moleculares (matriz 3). A dispersão gráfica dos pontos não apresenta uma
configuração “triangular”, diferentemente do que foi preconizado por Burstin e
Charcosset (1997).
Figura 1 – Dispersão dos valores de distâncias estimadas a partir de dados
morfométricos (abscissa) e moleculares (ordenada) de 69 acessos
de Anacardium spp.
3.1 Análises discriminantes
As classificações dos acessos através de análise discriminante pelo
método dos k vizinhos mais próximos, considerando as diferentes matrizes de
dissimilaridades estimadas, são apresentadas na Tabela 2. As matrizes que
proporcionaram menores taxas de erros aparentes foram, respectivamente, a
0,5
137
de dados moleculares (1) e a matriz soma entre dados moleculares e
morfométricos (1+3). Enquanto a matriz de dados fenotípicos discretos (2) e a
matriz soma entre dados fenotípicos discretos e morfométricos (1+2)
resultaram nas maiores proporções de classificações incorretas, com TEA de
37,88% e 40,91%, respectivamente. Por outro lado, a matriz soma (1+2) foi a
única que proporcionou a discriminação correta de todos os acessos de A.
othonianum, enquanto a matriz soma (1+3) possibilitou melhor discriminação
média entre todos os grupos investigados.
Tabela 2 – Análises discriminantes de três populações de Anacardium spp.
obtidas pelo método não paramétrico de k vizinhos mais próximos
(k=3), a partir de matrizes de distâncias de dados morfométricos
(1), fenotípicos discretos (2), moleculares (3) e da combinação de
medidas de distâncias, através da soma de matrizes.
Percentuais de
alocação nos grupos
1
Dados da
matriz de
distâncias
Grupo de origem
Nº de
indivíduos
CC AP OT
Taxa de
erro
aparente
(%)
Cajueiro comum (CC)
49
67,35
32,65 0,00
Anão precoce (AP)
10 10,00
80,00
10,00
Métricos
(1)
A. othonianum (OT)
07 0,00 14,29
85,71
28,79
Cajueiro comum (CC)
49
67,35
22,45 10,20
Anão precoce (AP)
10 70,00
30,00
0,00
Categóricos
(2)
A. othonianum (OT)
07 28,57 0,00
71,43
37,88
Cajueiro comum (CC)
49
95,92
4,08 0,00
Anão precoce (AP)
10 0,00
100
0,00
Moleculares
(3)
A. othonianum (OT)
07 42,86 14,29
42,86
9,09
Cajueiro comum (CC)
49
57,14
34,69 8,16
Anão precoce (AP)
10 50,00
40,00
10,00
Soma
(1+2)
A. othonianum (OT)
07 0,00 0,00
100
40,91
Cajueiro comum (CC)
49
87,76
12,24 0,00
Anão precoce (AP)
10 0,00
100
0,00
Soma
(1+3)
A. othonianum (OT)
07 0,00 14,29
87,71
10,60
Cajueiro comum (CC)
49
81,63
18,37 0,00
Anão precoce (AP)
10 10,00
90,00
0,00
Soma
(2+3)
A. othonianum (OT)
07 28,57 0,00
71,43
18,18
Cajueiro comum (CC)
49
85,71
14,29 0,00
Anão precoce (AP)
10 10,00
90,00
0,00
Soma
(1+2+3)
A. othonianum (OT)
07 28,57 0,00
71,43
15,15
1
Valores destacados em negrito referem-se aos percentuais de alocação de acessos nos seus
respectivos grupos de origem.
138
Na Figura 2 são apresentadas as projeções das distâncias no espaço
tridimensional das distâncias genéticas estimadas pela matriz soma (1+3).
Nesta figura é possível delimitar claramente o agrupamento formado pelos
acessos de A. othonianum, apesar da grande amplitude de dispersão entre
eles. Por outro lado, os acessos de cajueiro anão precoce se encontram
circunscritos dentro da área de dispersão dos acessos de cajueiro comum não
formando, portanto, grupos visualmente distintos no espaço tridimensional.
A correlação entre as distâncias originais e as projetadas na Figura 1 foi
a igual a 85,6%, enquanto o grau de distorção e o coeficiente de stresse foram,
respectivamente, iguais a 49% e 50,3%.
Figura 01 – Projeção gráfica das distâncias entre 66 acessos de Anacardium
spp., discriminados em três populações diferentes. Populações ou
grupos: 1 - A. occidentale tipo comum; 2 A. occidentale tipo anão
precoce; 3 - A. othonianum.
3.3 Análises de agrupamento dos acessos
Diferentes padrões de agrupamento dos acessos, pelo método de
otimização de Tocher, foram obtidos para cada uma das matrizes de
dissimilaridades empregadas. A matriz de dissimilaridades de dados
139
moleculares proporcionou o agrupamento com o menor número de grupos e
com o grupo que abrangeu o maior número de acessos. Por outro lado, os
dados fenotípicos discretos proporcionaram o maior número de grupos e o
menor entre os maiores grupos de cada padrão de agrupamento (Tabelas 2 e
3).
Tabela 2 – Agrupamentos pelo método de otimização de Tocher, de 69
acessos de Anacardium spp., obtidos por diferentes matrizes de
dissimilaridades. Acessos: 1 a 49 – cajueiro comum; 50 a 59 –
cajueiro anão precoce; 60 a 66 A. othonianum; 67 e 68 A.
microcarpum e 69 Anacardium sp.
Natureza dos Caracteres da Matriz de Dissimilaridade
Grupos
Métricos (1) Fenotípicos
discretos (2)
Moleculares (3)
1 13 39 40 44 19
48 16 28 18 29
12 41 46 42 11
68 8 32 3 4 35
58 7 17 1 55 59
6 51 34 36 37 2
45 30 27 54 53
15 31 33 56 66
57 43 52 9 50
9 33 19 35 46 63
61 66 50 62 11
40 6 31 58 57 2
32 33 10 17 11 2 5 9
16 40 38 39 12 42 41
19 18 1 31 3 44 29
13 37 4 28 36 7 8 21
26 46 20 34 6 22 27
56 54 50 68 15 14 57
47 67 51 24 59 23 25
43 58 30 69 35 45 53
55 49 62 52 64 48
2 49 69 67 61 12 68 32 60 61
3 60 64 65 62 63 20 22 10 28 24 63
4 24 25 23 14 26
47
36 43 55 26 66
5 20 22 3 34 44 65
6 21 5 48 59 14 29
7 38 18 45 54 23
8 5 1 4 52 49
9 10 8 25
10 13 60
11 17 65
12 21 30
13 27 37 39 53
14 41 42
15 16 67
16 47 64
17 7
18 15
19 56
20 69
21 38
22 51
Os agrupamentos com dados combinados (Tabela 3), através da soma
de matrizes de dissimilaridade, apresentaram padrões que foram dependes do
tipo de dado envolvido, ou seja, agrupamentos que levaram em consideração
matrizes de distâncias de informações fenotípicas discretas, formaram muitos
140
grupos (14 a 16 grupos), enquanto que o agrupamento obtido a partir dos
dados morfométricos e moleculares foram apenas oito grupos, com mais de
80% dos acessos alocados em um único grupo. Por outro lado, tanto os dados
morfométricos quanto os moleculares discriminaram melhor os acessos de A.
othonianum, o que pode ser visualizado melhor pelo exame da Figura 3, que
apresenta o agrupamento pelo método UPGMA, a partir da matriz soma entre
as distâncias estimadas por estas duas classes de dados.
Tabela 3 – Agrupamentos pelo método de otimização de Tocher, de 69
acessos de Anacardium spp., obtidos de matrizes de
dissimilaridade resultantes da soma matrizes de distâncias de
dados morfométricos (1), fenotípicos discretos (2) e moleculares
(3). Acessos: 1 a 49 – cajueiro comum; 50 a 59 – cajueiro anão
precoce; 60 a 66 A. othonianum; 67 e 68 A. microcarpum e 69
Anacardium sp.
Natureza dos Caracteres da Matriz de Dissimilaridade
Grupos
Matriz 1+2 Matriz 1+3 Matriz 2+3 Matriz 1+2+3
1 44 57 28 58
42 31 11 2 40
19 8 41 6 46
66 33 35 9 48
18 43 29 59
53 55 56 36
39 40 13 12
19 42 41 16
11 2 44 18 29
32 28 3 1 46
8 17 4 31 37
7 36 33 34 9
6 68 5 38 27
54 15 10 51
56 35 59 50
57 58 30 14
67 47 43 45
55 24 26 53
48 25 23
2 11 8 19 9
33 31 40 41
46 42 28 39
44 10 5 57 34
3 50 6 38 29
32 27 20 37 1
21 58 26 16
56
2 11 8 19 40
41 42 46 9 31
28 33 39 44
29 32 12 3 34
18 16 1 57 6
58 4 36 68 56
17 13 43 35
37 10 5 50 38
59 54 27
2 12 68 32 39
13 27 37
20 22 21 12 13 68 4 22
47
20 22 26 23
21
3 20 22 26 49 69 36 43 35 45
18 17 59 23
54
14 15 7 47
4 50 52 23 47 62 63 64 14 15 67 7 60 61
5 14 15 7 3 16 60 61 60 61 24 25 53
6 60 61 62 63
64
66 24 25 45 51
7 1 4 30 49 69 65 62 63 62 63
8 45 51 34 54 52 52 69 49 69
9 10 24 5 53 55 52 55
10 17 65 51
66 67
11 67 30 30
12 38 49 48
13 21 48 65
14 25 66 64
15 64
16 65
141
Figura 3 – Agrupamento de 69 acessos de Anacardium spp. , pelo método
UPGMA, a partir da matriz soma de distâncias baseadas em dados
morfométricos e divergência baseada em marcadores moleculares
ISSR. Acessos: 1 a 49 – cajueiro comum; 50 a 59 – cajueiro anão
precoce; 60 a 66 A. othonianum; 67 e 68 A. microcarpum e 69
Anacardium sp.
142
4 DISCUSSÃO
A incongruência entre as matrizes de distâncias de dados morfométricos
e dados fenotípicos discretos, assim como entre dados fenotípicos discretos e
dados moleculares é praticamente absoluta, conforme foi evidenciado pelos
coeficientes nulos de correlação (Tabela 1). Por outro lado, as matrizes de
distâncias de dados morfométricos e moleculares foram positiva e
significativamente correlacionadas, mas com um valor de r relativamente baixo
(r=0,365). Estes resultados diferem, em certa medida, dos encontrados por
Archak et al. (2003a) que não observaram correlações significativas entre
dados morfométricos e diferentes tipos de matrizes de dados moleculares
(AFLP, ISSR e RAPD), ao analisarem a divergência genética de 19 genótipos
de cajueiros, consistindo de cultivares comercial e linhas melhoradas,
selecionados aleatoriamente de um banco de germoplasma com mais de 300
acessos. Ausência de correlações significativas entre divergência genética
molecular e divergência fenotípica é relatada em diversos trabalhos na
literatura, tanto em estudos plantas silvestres (Nielsen et al., 2003; Kamada,
2006) quanto de plantas cultivadas (Roldán-Ruiz et al., 2001).
A dispersão de pontos da Figura 1 não apresenta uma relação linear,
mas também não remete a uma configuração “triangular”, nos moldes
propostos por Burstin e Charcosset (1997). Esta relação “triangular” foi
verificada por Dillmann et al., que correlacionaram distâncias morfológicas e
moleculares em linhas endogâmicas de milho e também por Lefebvre et al.
(2001), ao avaliarem acessos de pimenta (Capsicum annum) através de
caracteres fenotípicos e moleculares, constituídos por marcadores AFLP e
RAPD. Todos estes casos, contudo, referem-se a análises de genótipos
homozigotos ou altamente endogâmicos, diferentemente de que se espera em
Anacardium, conforme destacado por Archak et al. (2003a).
As análises discriminantes conduzidas com as diferentes classes de
dados demonstraram que a maior proporção de classificações corretas foi
obtida com a matriz de dissimilaridade construída com os marcadores ISSR.
Enquanto a matriz de distâncias construída com os dados fenotípicos discretos
proporcionou o maior percentual de erros de classificação geral dos acessos.
Por outro lado, a classificação com base nos dados moleculares resultou na
143
menor proporção de alocações corretas para o grupo A. othonianum, indicando
incongruência entre divergência fenotípica e molecular dentro do grupo.
A combinação, através da soma de matrizes, dos dados moleculares
com os fenotípicos morfométricos ou fenotípicos discretos, resultou na melhoria
significativa da discriminação dos grupos, em comparação ao uso de matrizes
de dados fenotípicos isoladamente. No caso da matriz soma (1+3), que
combinou dados morfométricos e moleculares, houve uma melhoria na
classificação dos acessos de A othonianum com a manutenção do baixo
percentual da taxa de erro aparente (TEA), proporcionado pela classificação
baseada nos dados moleculares isoladamente. No caso da combinação dos
dados morfométricos com dados fenotípicos discretos, entretanto, a TEA foi
superior à observada para qualquer uma das classificações realizadas com as
diferentes matrizes isoladamente. Ainda que este tenha sido o único caso que
discriminou todos os acessos de A. othonianum de maneira correta. Nielsen et
al. (2002) aplicaram análise discriminante para classificar indivíduos de seis
populações naturais pertencentes ao gênero Scalesia, sendo duas de S. divisa,
duas de S. incisa e duas de indivíduos com características intermediárias. Os
autores observaram aumento significativo na discriminação correta dos
indivíduos, em cinco das seis populações, quando a análise foi realizada a
partir de marcadores AFLPs, em comparação com a análise realizada com
dados morfométricos. A caracterização da diversidade genética e
diferenciação de cultivares de mandioca, por marcadores moleculares RAPD,
também foi mais eficiente, em comparação com aquela obtida através de
descritores botânicos fenotípicos discretos (Colombo et al., 1998).
Nas análises de agrupamento por Tocher observou-se, de modo geral,
que os acessos de A. othonianum (acessos 60 a 66) foram suficientemente
distintos para não serem incluídos no grupo principal (ou grupo 1) dos
diferentes agrupamentos, considerando as dissimilaridades dos dados
morfométricos e moleculares, isoladamente ou combinados. Estes acessos
formaram pequenos grupos, isolados ou associados com acessos de cajueiro
comum. Por outro lado, a maioria dos acessos de cajueiro anão precoce
(acessos 50 a 59) foi sempre alocado no primeiro grupo, juntamente com a
maior parte dos acessos de cajueiro comum, evidenciando pouca divergência
144
fenotípica e molecular entre os dois tipos. Este padrão de agrupamento dos
acessos também é nitidamente percebido no dendrograma da Figura 3.
Apesar das correlações fracas ou ausentes entre medidas de
divergência, Kamada (2006) verificou que os padrões de agrupamento dos
acessos de fáfia, pelo método de otimização de Tocher, foram
aproximadamente correspondentes, quando gerados a partir das matrizes de
distâncias obtidas de dados morfométricos, moleculares ou da matriz soma,
envolvendo as três classes de dados. Neste trabalho, por outro lado,
comportamento semelhante foi observado apenas entre os agrupamentos
produzidos a partir das matrizes 1 e 3 e da matriz soma (1+3), ou seja, entre as
matrizes de dados que foram correlacionados.
Dessa forma, fica evidente que a combinação de classes de dados não
correlacionados em uma única matriz de distâncias não é recomendável, uma
vez que a cada uma destas classes parece acessar porções da variabilidade
total com padrões de distribuição completamente diversos.
5 CONCLUSÕES
a) Apenas os dados morfométricos e moleculares apresentaram correlação
significativa, ainda que em um patamar relativamente baixo.
b) As correlações baixas ou nulas entre as diferentes classes de dados
indicam que eles acessam informações de diferentes partes do genoma.
c) A discriminação dos acessos por marcadores moleculares foi superior às
verificadas com base em dados fenotípicos, embora a combinação entre
dados moleculares e morfométricos tenha proporcionado uma melhor
discriminação média entre os grupos.
d) As analises de agrupamento pelo método de otimização de Tocher
apresentaram resultados discrepantes para as diferentes matrizes de
distâncias empregadas, relativa congruência foi verificada apenas entre
agrupamentos com base em dados morfométricos e / ou moleculares.
145
CONCLUSÕES GERAIS
• Técnicas de análise discriminante por componentes principais e por
função discriminante de Anderson mostraram-se adequadas na
caracterização dos grupos de Anacardium avaliados, quando
aplicadas a variáveis morfométricas.
• Apesar de ser considerado por alguns autores apenas um ecótipo de
A. occidentale, os acessos de A. othonianum constituíram um grupo
morfologicamente muito distinto dos demais e, considerando que
esta divergência foi observada entre indivíduos cultivados em um
mesmo ambiente, pode-se assumir que ela é majoritariamente de
natureza genética.
• O padrão de agrupamento UPGMA, baseado em dados
morfométricos, exibido pelas populações analisadas refletiu
adequadamente o grau de relacionamento esperado entre elas,
considerando as evidências biológicas e históricas disponíveis.
• A análise discriminante, baseada em dados moleculares, pelo
método de k vizinhos mais próximos, mostrou-se adequada apenas
na classificação de acessos de diferentes populações de A.
occidentale, uma vez que os padrões de divergência observados
entre os acessos de A. othonianum e de A. humile não foram
consistentes com os esperados para espécies distintas.
• Os percentuais da variação entre e dentro de populações, obtidos
pela decomposição da variação total por meio da AMOVA, foram
compatíveis com o esperado para espécies perenes de polinização
mista.
• No agrupamento pelo método UPGMA, baseado em dados
moleculares, a população ‘Rio de Janeiro’ apresentou a maior
146
divergência relativa, situação discordante do padrão obtido com base
nas informações morfométricas.
• A maioria dos descritores fenotípicos discretos analisados
apresentou ampla variabilidade, possibilitando a discriminação de
todos os acessos de Anacardium avaliados, sem ambigüidades. Por
outro lado, os padrões de distribuição desta foram inadequados para
caracterizar grupos de acessos de origem geográfica comum.
• A análise comparativa das diferentes classes de dados mostrou que
apenas os descritores morfométricos e os marcadores moleculares
foram correlacionados, enquanto os descritores fenotípicos discretos
apresentaram correlações nulas com os dados morfométricos e
moleculares.
• A discriminação dos acessos por marcadores moleculares, pelo
método de k vizinhos mais próximos, foi superior às verificadas com
base em dados fenotípicos, embora a combinação entre dados
moleculares e morfométricos tenha proporcionado uma melhor
discriminação média entre os grupos.
• A combinação de diferentes classes de dados, através da soma de
matrizes de distâncias, parece ser pertinente apenas quando há
congruência entre as estimativas de divergência.
• Foi confirmado que a Região Nordeste é um importante centro de
diversidade para A. occidentale. Por outro lado, o Norte Fluminense e
o Estado de Roraima apresentam populações naturais que diferem
daquelas encontradas nos Estados do Nordeste, o que aponta para a
necessidade da realização trabalhos adicionais com vistas à coleta,
caracterização e conservação destes recursos genéticos.
147
• Mais estudos envolvendo acessos e populações naturais de A.
othonianum e A. humile também necessitam ser realizados, tanto
para elucidar melhor o status taxonômico destas espécies, quanto
para fins de utilização e conservação destes recursos genéticos,
considerando o ritmo acelerado de destruição dos Cerrados.
148
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