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FRANCISMAR CORRÊA MARCELINO
AVALIAÇÃO DE RESÍDUOS DE TRANSGÊNICOS EM
ALIMENTOS NO BRASIL E DESENVOLVIMENTO DE
METODOLOGIAS DE ANÁLISE
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação em Genética e
Melhoramento, para obtenção do título
de Doctor Scientiae.
VIÇOSA
MINAS GERAIS - BRASIL
2006
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FRANCISMAR CORRÊA MARCELINO
AVALIAÇÃO DE RESÍDUOS DE TRANSGÊNICOS EM
ALIMENTOS NO BRASIL E DESENVOLVIMENTO DE
METODOLOGIAS DE ANÁLISE
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação em Genética e
Melhoramento, para obtenção do título
de Doctor Scientiae.
APROVADA: 07 de agosto de 2006.
_____________________________ __________________________
Dra. Marta Fonseca M. Guimarães Prof. Wagner Campos Otoni
(Co-orientadora) (Co-orientador)
_____________________________ __________________________
Profª Valéria Monteze Guimarães Prof. Luiz Orlando de Oliveira
__________________________________
Prof. Everaldo Gonçalves de Barros
(Orientador)
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ii
AGRADECIMENTOS
Agradecer é reconhecer a importância dos outros em nossas vidas...
À Universidade Federal de Viçosa e à Coordenação do Programa de Pós-
Graduação em Genética e Melhoramento por serem responsáveis por toda
minha formação acadêmica. Em especial ao Núcleo de Biotecnologia Aplicada à
Agropecuária (BIOAGRO) por fornecer a estrutura e ambiente para realização
de parte deste trabalho.
Ao Laboratório de Análises Genéticas pela possibilidade de concretizar
meus experimentos e proporcionar o início de minha carreira profissional.
Ao Centro Nacional de Pesquisa de Trigo – Embrapa Trigo, pela minha
liberação para conclusão deste trabalho.
Aos meus pais Fátima e Manoel, pelo incentivo e compreensão nos
momentos de ausência e por torcerem sempre pelo meu sucesso.
Aos meus irmãos pela amizade.
À minha tia Geralda, pelo carinho e preocupação.
Ao meu querido Sandro, pelo carinho, apoio, dedicação e cuidado
constante.
Ao meu querido orientador, Professor Everaldo G. de Barros, pelo exemplo
de profissionalismo e todos os ensinamentos no decorrer dos anos em que foi
meu orientador. Obrigada pela confiança, liberdade de trabalho, apoio e por ter
contribuído para o meu crescimento intelectual e profissional.
À Doutora Marta F. M. Guimarães, pela amizade, confiança, incentivo,
sugestões, por sempre estar presente nas mais importantes decisões de minha
vida e pela oportunidade de executar grande parte do meu trabalho no
Laboratório de Análises Genéticas.
À querida Professora Elza Fernandes de Araújo e Lúcio Antônio de Oliveira
Campos, pelo carinho, apoio, preocupação e ensinamentos.
iii
Ao professor Wagner Campos Otoni, Valéria Monteze Guimarães e Luiz
Orlando de Oliveira por terem aceitado participar em minha banca examinadora.
À Mariana e ao James pela ajuda e auxílio na condução dos experimentos,
dedicação e amizade.
À Andréia Barcelos e Márcio Mendes pela torcida, amizade e pelas
palavras de carinho e otimismo.
Aos amigos do Laboratório de Análises Genéticas: Wilton, Lílian, James e
Sandra, pelos anos de convivência, companheirismo e união.
Aos meus queridos Irinéia e Walter Guimarães, por terem me acolhido em
sua casa e por me darem total apoio no final desta jornada.
Às minha amigas Cida, Mirian, Wanessa e as Anas pelos momentos de
descontração e torcida para meu sucesso.
Aos colegas do Laboratório de Sequenciamento, Biomol e Proteínas.
Aos amigos do Laboratório de Biologia e Controle de Hematozoários
Sidimar Sossai, Márcio Mendes e Professor Joaquin Patarroyo.
À Maurecilne, Daniela e Andréia pelo auxílio no Laboratório de Cultura de
Tecidos.
Aos funcionários, Aloísio, Alessandra, Fausto, Gláucia, Luzia e Expedito,
pela amizade, atenção e presteza.
E a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste
trabalho.
iv
BIOGRAFIA
FRANCISMAR CORRÊA MARCELINO, filha de Manoel Ferreira Marcelino
e Fátima de Lurdes Corrêa Marcelino, nasceu em 12 de fevereiro de 1977, em
Carmo, Rio de Janeiro.
Em 1995, concluiu o Ensino Médio na Escola Estadual Professor Aurélio
Duarte, em Carmo, RJ.
Em 1996, iniciou o curso superior na Universidade Federal de Viçosa, onde,
em 12 de outubro de 2000, concluiu o curso de Bacharelado e Licenciatura em
Ciências Biológicas. Durante a graduação participou do Programa Especial de
Treinamento – PET/BIOLOGIA (1998/2000), além de desenvolver atividades de
Iniciação Científica nas linhas de pesquisa de Imunologia de Hematozoários
(1997/98) e Genética Molecular de Plantas (1998/2000).
Em outubro de 2000, iniciou o curso de Mestrado em Genética e
Melhoramento na Universidade Federal de Viçosa, submetendo-se a defesa em
11 de novembro de 2002. No mesmo mês iniciou sua vida profissional atuando
como Responsável Técnica do Laboratório de Análises Genéticas –
AgroGenética, em Viçosa, MG, onde trabalhou durante três anos.
Em agosto de 2004 iniciou o curso de Doutorado em Genética e
Melhoramento na UFV, submetendo-se a defesa em 07 de agosto de 2006.
Em dezembro de 2005 ingressou na Embrapa Trigo (Passo Fundo, RS),
por meio de concurso público, no cargo de Técnica de Nível Superior III.
Em 2006 prestou concurso para o cargo de Pesquisador III para a Embrapa
soja, sendo aprovada.
v
CONTEÚDO
LISTA DE ABREVIAÇÕES ...........................................................................
viii
RESUMO ......................................................................................................
ix
ABSTRACT ..................................................................................................
xi
1. INTRODUÇÃO .........................................................................................
1
2. OBJETIVOS ................................... .........................................................
3
3. REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................
4
3.1. Organismos Geneticamente Modificados: Situação atual no Brasil
e no Mundo .............................................................................................
4
3.2. Organismos Geneticamente Modificados e a Legislação Nacional ..
5
3.3. Detecção e Quantificação de Alimentos Geneticamente
Modificados .............................................................................................
7
3.3.1. Metodologias para Extração de DNA em Alimentos ......................
8
3.3.2. Detecção de Organismos Geneticamente Modificados em
Alimentos pela Técnica de PCR ..............................................................
12
3.3.3. Quantificação de Organismos Geneticamente Modificados em
Alimentos ..................................................................................................
13
3.3.3.1. Ensaio Fluorogênico da Atividade 5´ Exonucleásica
(Metodologia TaqMan) ..................................................................
15
3.3.3.2. SYBR Green ....................................................................
15
3.3.3.3. Beacons Moleculares ......................................................
16
3.3.3.4. Lux Primers ......................................................................
16
3.3.4. Quantificação Absoluta X Quantificação Relativa ..........................
17
3.3.5. PCR Quantitativo em Tempo Real na Quantificação de
Organismos Geneticamente Modificados em Alimentos ..........................
19
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .........................................................
21
vi
CAPÍTULO I
Panorama Nacional da Presença de Resíduos Transgênicos em
Alimentos no período 2000-2005
RESUMO ......................................................................................................
25
1. INTRODUÇÃO .........................................................................................
27
2. MATERIAL E MÉTODOS...........................................................................
29
2.1. Material de Referência .....................................................................
29
2.2. Material para Análise .......................................................................
29
2.3. Extração de DNA .............................................................................
29
2.4. Oligonucleotídeos e Condições de Amplificação por PCR
Qualitativo e Quantitativo ........................................................................
30
2.5. Avaliação da Demanda e Perfil das Amostras Analisadas para a
Presença de Resíduos Transgênicos .....................................................
31
2.6. Avaliação das Amostras quanto à Presença de Resíduos
Transgênicos ..........................................................................................
32
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ……………………………………………..
34
4. CONCLUSÕES ………………………………………………………………..
54
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ………………………………………...
58
CAPÍTULO 2
Detection and quantification of Roundup Ready
®
soybean residues in
sausage samples by conventional and Real-Time PCR
ABSTRACT ..................................................................................................
60
1. INTRODUCTION ......................................................................................
62
2. MATERIALS AND METHODS ……………………………………………….
64
3. RESULTS AND DISCUSSION ................................................................
67
4. CONCLUSIONS .......................................................................................
77
5. ACKNOWLEDGMENT .............................................................................
77
6. REFERENCES .........................................................................................
78
vii
CAPÍTULO 3
Construção de padrões de calibração baseados em número de cópias
de plasmídios recombinantes para a quantificação de OGMs em
alimentos pela técnica de PCR quantitativo
RESUMO.........................................................................................................
81
1. INTRODUÇÃO ..........................................................................................
83
2. MATERIAL E MÉTODOS ..........................................................................
87
2.1. Material de Referência .....................................................................
87
2.2. Extração de DNA Genômico ............................................................
87
2.3. Oligonucleotídeos e Condições de Amplificação por PCR
Qualitativo e Quantitativo ........................................................................
88
2.4. Obtenção dos Fragmentos ..............................................................
89
2.5.Clonagem dos Fragmentos ................................................................
89
2.6. Extração do DNA Plasmidial ............................................................
91
2.7. Quantificação do DNA Plasmidial ....................................................
91
2.8. Construção das Curvas de Calibração Baseadas em p-DNA para a
Quantificação de OGMs ..........................................................................
91
2.9. Determinação da Acuracidade e Precisão da Quantificação de
OGMs Utilizando Curvas de Calibração Baseadas em p-DNA ...............
93
2.10. Determinação do Conteúdo de Soja GM em Amostras de
Alimentos utilizando Curvas de Calibração Baseadas em p-DNA ..........
94
3. RESULTADOS .........................................................................................
95
4. DISCUSSÃO .............................................................................................
124
5. CONCLUSÕES .........................................................................................
128
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .........................................................
129
viii
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
Ct Cicle threshold
CRM material de referência certificado
CTAB brometo de cetiltrimetilamônio
CTNBio Comissão Técnica Nacional de Biossegurança
CV (%) Coeficiente de variação
Ct Ct do alvo menos o Ct da referência endógena
EPSPS enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase
gDNA DNA genômico
GM Geneticamente modificados
LOD Limite de detecção
LOQ Limite de quantificação
MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
OD Densidade ótica
OGMs Organismos geneticamente modificados
PCR Reação em cadeia da DNA polimerase
pDNA DNA plasmidial
RR Roundup Ready
R (%) Taxa de recuperação
R
2
Coeficiente de Correlação
SD Desvio padrão
SDS Duodecil sulfato de sódio
ix
RESUMO
MARCELINO, Francismar Corrêa, D. S. Universidade Federal de Viçosa, agosto
de 2006. Avaliação de resíduos de transgênicos em alimentos no
Brasil e desenvolvimento de metodologias de análise. Orientador:
Everaldo Gonçalves de Barros. Co-Orientadores: Marta Fonseca M.
Guimarães e Wagner Campos Otoni.
Desde a liberação da primeira variedade transgênica para consumo
humano, o tomate “Flavr savr”, em 1995, o aumento no plantio e
comercialização de organismos geneticamente modificados (OGMs) já
aumentou mais de 50 vezes, atingindo em 2005 a cifra de 90 milhões de
hectares plantados com algum tipo de OGM em 21 países. Estima-se que em
2006 esta cifra supere 100 milhões de hectares. No Brasil, a liberação do plantio
e comércio de OGMs ocorreu apenas em 2003, com a soja Roundup Ready
®
(RR). O aumento do cultivo e comércio de OGMs é refletido no aumento da
presença destes na composição dos alimentos. Neste trabalho é apresentado o
panorama nacional da presença de OGMs em diferentes produtos analisados
pela Empresa AgroGenética, no período de 2000 a 2005. Foram analisados
diferentes tipos de alimentos que apresentam, principalmente, soja e/ou milho
em sua composição, bem como grãos e produtos in natura, oriundos de diversas
regiões do país. De acordo com os resultados, resíduos de OGMs estão
presentes nos alimentos comercializados no país desde o primeiro ano em que
estes começaram a ser analisados pela empresa; a cada ano, o número de
amostras contendo resíduos transgênicos foi se elevando com relação ao total
de amostras analisadas, sendo principalmente detectados em alimentos que
apresentam alto conteúdo de soja em sua composição, como amostras de
salsichas e empanados. Tal situação tem levado à necessidade do
desenvolvimento de metodologias que permitam a detecção, quantificação e
identificação destes resíduos. Uma das principais dificuldades da análise de
resíduos transgênicos em alimentos é a necessidade de extrair DNA em
quantidade e com qualidade satisfatória para a análise. Deste modo, o presente
trabalho também apresenta o processo de validação da extração de DNA para a
x
análise da presença e quantificação de resíduos transgênicos em amostras de
salsichas, a classe de produto analisada que apresentou o maior número de
amostras positivas para a presença de resíduos transgênicos (70,73%). Além da
obtenção de DNA de boa qualidade, outra etapa crítica para a quantificação de
OGMs, pela técnica de PCR quantitativo é a construção da curva de calibração a
ser empregada para a análise. O percentual da presença de OGMs em uma
amostra é dada em termos absolutos, de modo que uma curva de calibração
deve ser construída com padrões que apresentem percentuais de OGMs
cuidadosamente definidos. Os padrões de referência são essencias para a
determinação do percentual de OGM presente nas amostras, e são específicos
para cada tipo de evento e organismo. Atualmente, não se encontram
disponíveis no mercado internacional padrões de referência certificados para
todos os eventos e variedades transgênicas, e os únicos padrões
comercializados são padrões de calibração que variam apenas de 0,1 a 5% em
peso de farinha do grão geneticamente modificado (GM) com relação ao peso
de farinha do grão normal da espécie em questão. Na etapa final deste trabalho
é descrito o desenvolvimento de padrões de calibração baseados em DNA
plasmidial. A curva construída com base em DNA plasmidial permitiu a
quantificação precisa do percentual de resíduos transgênicos nas amostras
quando comparada com a quantificação utilizando DNA genômico obtido de
padrões de referência certificados.
xi
ABSTRACT
MARCELINO, Francismar Corrêa, D. S. Universidade Federal de Viçosa, August
2006. Evaluation of transgenic residues in foods in Brazil and
development of analytical methodologies. Adviser: Everaldo Gonçalves
de Barros. Co-Advisers: Marta Fonseca M. Guimarães and Wagner
Campos Otoni.
Since the liberation of the first transgenic variety for human consumption,
the tomato “Flavr savr”, in 1995, the plantation and commercialization of
genetically modified organisms (GMOs) has increased over 50 times, reaching
90 million hectares planted with some kind of GMO in 21 countries, in 2005. It is
estimated that in 2006 this value will surpass 100 million hectares. In Brazil, the
liberation of plantation and commercialization of GMOs only occurred in 2003,
with the soybean Roundup Ready® (RR). The increase on planting and
commercialization of GMOs is reflected on the increase of their presence in the
composition of foods. In the present work, the national panorama of the presence
of GMOs in different products, analyzed by the company AgroGenética, between
the years 2000 and 2005, is shown. Different types of food were analyzed which
presented, mainly, soybean and/or maize in their composition, as well as grains
and products in natura, derived from different regions of the country. According to
the results, GMO residues are present in foods commercialized in the country
since the first year of their analysis by the company; each year, the number of
samples containing transgenic residues has increased, being mainly detected in
foods with high soybean content in their composition, such as sausages and
breaded foods. This situation has led to the necessity of developing
methodologies that allow the detection, quantification and identification of these
residues. One of the main difficulties in the analysis of transgenic residues in
food is the need of extracting satisfactory amounts of DNA and with good quality
for analysis. This work also presents the process of validation of DNA extraction
procedures for analysis of presence and quantification of transgenic residues in
sausages, the product class that presented the greatest number of positive
xii
samples for the presence of transgenic residues (70.73%). In addition to the
availability of good quality DNA, another critical stage for the GMO quantification
by the quantitative PCR technique is the establishment of a calibration curve to
be employed in the analysis. The presence of GMOs in a sample is given in
absolute terms, so that a calibration curve must be established with standards
that present carefully defined GMO concentration. The reference standards are
essential for the determination of the percentage of GMOs present in the
samples, and are specific for each type of event and organism. Currently,
certified reference standards are not available in the international market for all
events and transgenic varieties, and the only commercialized ones are
calibration standards that vary only from 0.1 to 5% in flour weight of the
genetically modified grain in relation to the flour weight of the normal grain of the
species in question. At the final stage of this work, the development of calibration
standards based on plasmid DNA is described. The established curve based on
plasmid DNA allowed the precise quantification of the percentage of transgenic
residues in the samples, when compared to the quantification using genomic
DNA obtained from certified reference standards.
1
1. INTRODUÇÃO
Com o aumento do plantio e comércio de organismos geneticamente
modificados (OGMs), alimentos contendo resíduos destes passaram a ser
consumidos em larga escala em muitos países, muitas vezes sem o conhecimento
do consumidor. Desta forma, questões referentes ao direito à informação da origem
transgênica dos produtos tornam-se relevantes.
No Brasil, a rotulagem é obrigatória
para produtos embalados, a granel ou
in natura
, que contenham ou que sejam
produzidos com OGMs, a partir do limite de 1,0% do produto final, conforme
determina o decreto Nº 4.680 de 25 de abril de 2003. Deste modo, a necessidade de
monitorar a presença e determinar o percentual de resíduos transgênicos em
diversos alimentos, tem gerado a demanda pelo desenvolvimento de metodologias
capazes de detectar, identificar e quantificar DNA exógeno ou proteínas
características dos OGMs. Tais metodologias necessitam ser desenvolvidas,
aprimoradas e, principalmente, validadas, para que os resultados obtidos sejam
confiáveis, robustos e precisos.
Dentre as metodologias de detecção de resíduos transgênicos em alimentos
destacam-se aquelas que se baseiam na detecção de moléculas de DNA ou da
proteína expressa. Metodologias baseadas na presença da proteína expressa são
apenas empregadas para a análise de grãos ou produtos
in natura
. Para a análise
de alimentos processados, técnicas que permitem a detecção de moléculas de DNA
alvo são utilizadas. Dentre estas, a técnica da reação em cadeia da polimerase
(PCR) é a metodologia mais aceita internacionalmente. A técnica de PCR, além de
apresentar um custo relativamente baixo, possui alta sensibilidade e o DNA alvo
para a análise pode ainda apresentar certo nível de degradação, comum em
amostras de alimentos.
Apesar de ser bastante sensível, em uma primeira etapa a técnica só permite
detectar e/ou identificar a presença do transgene. Para a detecção são utilizados
primers
específicos para alvos comuns nos cassetes de transformação, entre estes
se destacam o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor e o terminador NOS
de
Agrobacterium
sp. A utilização de
primers
específicos para estas regiões permite
um
screening
inicial da presença de resíduos transgênicos na amostra, no entanto,
nessa primeira etapa não é possível discriminar a presença de resíduos
2
transgênicos provenientes de eventos específicos, até mesmo provenientes de
diferentes matrizes, como a soja e o milho.
Para a identificação do evento transgênico é necessário que a amplificação
do DNA seja realizada com
primers
específicos para a região codificadora, sendo
que o emprego de
primers
que pareiam nas junções entre a região promotora ou da
seqüência líder com a região codificadora, garantem maior especificidade. Análises
de identificação de eventos transgênicos são importantes principalmente em
alimentos compostos de diferentes matrizes. São também importantes em locais em
que haja alguns eventos transgênicos liberados enquanto outros não, como ocorre
no Brasil. No entanto, uma vez que o teste inicial tenha sido positivo, a determinação
do percentual do resíduo GM presente no produto só é possível por uma análise de
quantificação do DNA alvo.
A quantificação de moléculas de DNA GM presentes em alimentos pode ser
realizada por diferentes metodologias, no entanto, a técnica de PCR quantitativo
vem sendo a mais utilizada. Embora seja uma técnica de custo elevado, a PCR
quantitativo é altamente precisa, com altos níveis de repetibilidade e
reprodutibilidade, garantindo sua grande eficiência em análises de fiscalização, em
cumprimento à legislação nacional e internacional específicas.
Atualmente, no Brasil não existem estudos de validação de metodologias para
a detecção e quantificação de resíduos transgênicos em alimentos e poucos são os
laboratórios privados e públicos que têm trabalhado neste sentido. Apenas um
estudo de proficiência, sob coordenação da Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA), realizado no ano de 2002, analisou o desempenho de laboratórios
nacionais quanto à repetibilidade e reprodutibilidade da detecção de OGM em
farinha de soja. Devido à tendência de que novos produtos oriundos da
biotecnologia cheguem cada vez mais ao consumidor, é imprescindível que haja
metodologias validadas para a detecção, identificação e quantificação de OGMs
para os mais diferentes tipos de alimentos, desde grãos, produtos
in natura
e
processados.
3
2. OBJETIVOS
O presente trabalho teve como objetivo geral estabelecer metodologias para a
detecção e quantificação de resíduos transgênicos em alimentos e traçar o
panorama nacional da presença destes resíduos em alimentos comercializados no
país.
Os objetivos específicos foram:
1) Fornecer uma visão sobre a presença de resíduos OGMs em diferentes
produtos alimentícios comercializados no mercado nacional, desde grãos, produtos
in natura
e processados, com base na análise amostral de produtos de diferentes
origens recebidas pelo Laboratório de Análises Genéticas – AgroGenética, empresa
graduada pelo Sistema de Incubadora de Empresas de Base Tecnológica da
Universidade Federal de Viçosa, durante o período de 2000 a 2005.
2) Validação de uma metodologia para detecção e quantificação de resíduos
transgênicos em amostras de produtos processados (salsichas), utilizando as
técnicas de PCR Convencional e em Tempo Real.
3) Construção de padrões de calibração baseados no número de cópias de
plasmídios recombinantes para a quantificação de OGMs em alimentos.
4
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Organismos Geneticamente Modificados: Situação Atual no Brasil e
no Mundo
A biotecnologia tem possibilitado a obtenção de respostas rápidas e seguras
na resolução de questões importantes, como a susceptibilidade de plantas e animais
a pragas, doenças e estresses ambientais. Possibilita, também, o desenvolvimento
de espécies mais produtivas e com maior valor nutricional. Um dos principais frutos
da biotecnologia é o desenvolvimento dos OGMs, que passaram a oferecer
alternativas importantes para vários problemas de caráter econômico e relacionados
à melhoria na qualidade de vida humana e do ambiente.
A primeira variedade vegetal GM a atingir o mercado consumidor foi o tomate
“
Flavr savr
”, em 1995. Nesta variedade o gene que codifica a proteína
poligalacturonase, responsável pela hidrólise de componentes da parede celular, foi
inativado pela técnica de RNA anti-senso, levando ao amadurecimento tardio do
fruto (KRAMMER
et al.
, 1994). Posteriormente, novas variedades de outras
espécies, como a soja, milho, canola e algodão foram desenvolvidas (DUIJN
et al
.,
1999).
Segundo os dados da
International Service for the Acquisition of Agri-biotech
Applications
(ISAAA) (JAMES, 2006), durante o período de dez anos, entre 1996 e
2005, a área total cultivada com lavouras transgênicas cresceu mais de 50 vezes,
passando de 1,7 milhão de hectares em 1996 para 90,0 milhões de hectares em
2005, com a crescente participação dos países em desenvolvimento. De 2004 para
2005 houve aumento de 9 milhões de hectares, o que equivale a uma taxa anual de
crescimento de 11%.
Em 2005, 21 países plantaram cultivos GM, comparativamente aos 17 países
em 2004. Três destes foram países pertencentes à União Européia, Portugal, França
e a República Tcheca, enquanto o quarto foi o Irã. Dos 21 países que plantaram
cultivo GM, estavam incluídos 11 países em desenvolvimento e 10 países
industrializados. Em ordem decrescente por número de hectares plantados com
cultivos GM estão: Estados Unidos, Argentina, Brasil, Canadá, China, Paraguai,
Índia, África do Sul, Uruguai, Austrália, México, Romênia, Filipinas, Espanha,
Colômbia, Irã, Honduras, Portugal, Alemanha, França e a República Tcheca.
5
O país que mais aumentou o cultivo de plantas GM em 2005 foi o Brasil, com
um aumento de área estimado em 4,4 milhões de ha (9,4 milhões de ha em 2005
comparados aos 5 milhões em 2004), seguido pelos Estados Unidos (2,2 milhões de
ha), Argentina (0,9 milhões de ha) e Índia (0,8 milhões de ha). A Índia apresentou o
maior aumento proporcional anual, quase triplicando sua área de 500.000 ha em
2004 para 1,3 milhões de ha em 2005.
As principais espécies de transgênicos plantadas foram: a soja resistente ao
herbicida glifosato, o milho e o algodão resistentes a inseto e a canola resistente a
herbicida. Em 2005, a soja GM ocupou 54,4 milhões de ha comparados com os 48,4
milhões de ha registrados em 2004; o milho GM foi plantado em 21,2 milhões de ha
em comparação com os 19,3 milhões de ha de 2004; o algodão transgênico foi
cultivado em 9,8 milhões de ha, acima dos 9,0 milhões de ha plantados em 2004; e
a canola GM ocupou 4,6 milhões de ha, enquanto, em 2004, ficou na casa dos 4,3
milhões de ha.
Em 2005, a soja GM continuou a ser o principal cultivo desenvolvido pela
biotecnologia, ocupando 54,4 milhões de ha (60% da área mundial de cultivos GM),
seguida pelo milho (21,2 milhões de ha, 24% da área total), algodão (9,8 milhões de
ha, 11% da área total) e canola (4,6 milhões de ha, 5% da área total).
No Brasil, o plantio e comércio da soja Roundup Ready
®
foram aprovados por
três anos consecutivos, 2003, 2004 e 2005 pelas leis Nº 10.688, 10.814 e 11.092,
respectivamente. Em 2003, 3 milhões de hectares foram plantados com soja GM;
em 2004 este número atingiu 5 milhões de hectares, e, em 2005, o aumento foi
altamente expressivo, atingindo 9,4 milhões de hectares (JAMES, 2006). Este
aumento pode ser explicado pela publicação da nova Lei de Biossegurança (Lei Nº
11.105) em março de 2005, que regulamentou a liberação do plantio e comércio da
soja RR no país.
3.2. Organismos Geneticamente Modificados e a Legislação Nacional
No Brasil, a partir de janeiro de 1995, a Lei de Biossegurança (Nº 8.974),
regulamentada por meio do Decreto Nº 1.752, passou a estabelecer e impor
condições de segurança e regulamentar as atividades de biotecnologia,
estabelecendo a Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio), suas
atribuições e competências. Recentemente, foi aprovada pela Câmara uma nova Lei
6
de Biossegurança (Nº 11.105/2005), que revoga a anterior e estabelece novas
normas de segurança e mecanismos de fiscalização de atividades que envolvam
OGMs e seus derivados, reestrutura a CTNBio e cria o Conselho Nacional de
Biossegurança.
No Brasil, a primeira liberação legal de um OGM foi em 2003, por intermédio a
Lei Nº 10.688, de 13 de junho de 2003, quando a soja RR foi liberada para
comercialização como grão até 31 de janeiro de 2004. Nos anos posteriores, novas
liberações para plantio e comercialização de soja GM foram realizadas, em 2004
(Lei Nº 10.814) e em 2005 (Lei Nº 11.092). Nestes dois últimos anos, os agricultores
que vinham plantando soja GM firmaram um Termo de Compromisso,
Responsabilidade e Ajustamento de conduta, junto ao Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento (MAPA), mediante o Decreto Nº 4.846, que define área,
localidade do plantio e responsabilidades do agricultor advindas do uso da
Biotecnologia.
À medida que se intensificou o plantio de soja GM no país, a sua presença
em alimentos e produtos finais destinados ao consumo humano ou animal também
se intensificou. A soja participa da composição de grande parte dos produtos
comercializados no mercado nacional, e sua adição ocorre na forma natural do grão
ou como proteína, gordura, óleo, extrato ou lecitina. Sendo assim, alimentos
contendo OGM passaram a ser consumidos em larga escala, tanto no Brasil como
em outros países, muitas vezes de forma ilegal ou sem o conhecimento do
consumidor. Desta forma, tornou-se necessário a normatização de questões
referentes ao direito à informação, assegurado pelo Código de Defesa do
Consumidor (Lei Nº 8.078 de 11 de setembro de 1990). Segundo esta Lei, no artigo
31, a oferta e apresentação de produtos devem assegurar informações corretas,
claras, precisas, em língua portuguesa, e ainda informar sobre suas qualidades,
quantidade, composição, preço, garantia, prazos de validade e origem, bem como os
riscos que apresentam à saúde e segurança dos consumidores. Ainda, qualquer
alimento que seja comercializado, independente de sua origem, e que seja
embalado na ausência do consumidor, deve obedecer aos regulamentos técnicos
para rotulagem de alimentos em geral, publicados na Resolução RDC Nº 259-
ANVISA/MS/2002. No caso dos OGMs, ainda se aplica, de maneira complementar,
uma regulamentação específica para rotulagem de alimentos GM.
7
Em vários países, assim como no Brasil, a legislação para a rotulagem de GM
estabelece limites específicos para a presença do OGM na composição do alimento.
Quando a alimento apresentar valores percentuais da presença do OGM acima do
limite estabelecido, esta informação deve constar no rótulo.
A rotulagem é uma importante ferramenta de proteção ao consumidor,
principalmente por oferecer condições de rastreabilidade até o produto final. No
Brasil, a rotulagem é obrigatória para produtos embalados, a granel ou
in natura
, que
contenham ou que sejam produzidos a partir de OGM, a partir do limite de 1,0% do
produto final, conforme determina o Decreto Nº 4.680 de 25 de abril 2003, que
revogou o anterior (Decreto Nº 3.871 de 18 de julho de 2001), que estabelecia o
limite de 4,0% e somente para produtos embalados. O decreto estabelece ainda que
no rótulo deva constar, juntamente com as expressões, “pode conter soja
transgênica” e “pode conter ingrediente produzido a partir de soja transgênica”, o
símbolo “T” , definido pela Portaria Nº 2.658 de 22 de dezembro de 2003, pelo
Ministério da Justiça.
Outra imposição do decreto é que alimentos e ingredientes produzidos a partir
de animais alimentados com ração contendo ingredientes transgênicos deverão
trazer no painel um dos seguintes avisos: ”nome do animal” alimentado com ração
contendo ingrediente transgênico “nome do ingrediente” ou produzido a partir de
animal alimentado com ração contendo ingrediente transgênico.
A obrigatoriedade destas informações nos rótulos indica claramente a
necessidade de metodologias confiáveis de detecção e quantificação em alimentos.
Deste modo, metodologias vêm sendo desenvolvidas e aprimoradas para garantir o
cumprimento da legislação e padronização dos resultados.
3.3. Detecção e Quantificação de Alimentos Geneticamente Modificados
A detecção de um organismo com uma determinada alteração em seu
material genético pode ser realizada a partir das diferentes moléculas envolvidas na
expressão gênica: a molécula de DNA contendo a alteração genética propriamente
dita, o mRNA ou proteína expressos e, ainda, com base na alteração fenotípica
decorrente da modificação inserida. As alterações no fenótipo não são facilmente
observáveis em muitos casos, uma vez que se manifestam somente na presença de
8
uma determinada condição ambiental, como no caso da soja resistente ao glifosato
e do milho resistente a inseto.
A detecção de OGMs com base no mRNA é inviabilizada, principalmente
devido à grande instabilidade desse tipo de molécula. De modo semelhante à
detecção baseada em mRNA, a detecção de proteínas está na dependência da
especificidade temporal e tecidual da expressão do transgene. Além destas
limitações, ambas as moléculas apresentam restrições ao serem manuseadas, e no
caso de proteínas, a manutenção de sua estabilidade é crucial para ser possível a
sua detecção. Deste modo, os principais métodos de detecção de OGMs se
baseiam na análise do DNA, que está presente em todas as células do organismo e
apresenta uma razoável estabilidade
in vitro
.
No caso específico de detecção e quantificação de resíduos de OGMs em
alimentos, métodos baseados na presença do DNA ou da proteína exógena vêm
sendo utilizados. Os métodos baseados na detecção ou quantificação da proteína
alvo exploram a capacidade de interação altamente específica entre antígeno e
anticorpo. Dentre os métodos disponíveis destacam-se o teste da tira de fluxo lateral
e o ELISA. Estes são utilizados principalmente para produtos
in natura
, devido à
necessidade da manutenção de estrutura da proteína.
Os métodos baseados no DNA utilizam a técnica da PCR para a detecção e
quantificação de resíduos transgênicos, tanto em produtos
in natura
como produtos
processados. Devido sua alta eficiência, repetibilidade e sensibilidade, a técnica de
PCR vem sendo a principal metodologia empregada para a detecção de resíduos
transgênicos em alimentos. Neste estudo será abordado a metodologia de detecção
e quantificação de resíduos transgênicos em alimentos utilizando a técnica de PCR
convencional e quantitativo em tempo real.
3.3.1. Metodologias para Extração de DNA em Alimentos
Os mais importantes pré-requisitos para a aplicação de métodos de detecção
e quantificação de OGMs em alimentos, utilizando a metodologia de PCR, são o
conhecimento da construção genética exógena a ser detectada e a habilidade em
extrair quantidades suficientes de DNA amplificável da amostra a ser investigada.
Cumpridos esses dois pré-requisitos, a detecção e quantificação baseada em PCR
podem ser rapidamente estabelecidas para qualquer OGM (WURZ
et al
., 1999).
9
Como as Leis de Rotulagem em vigor no Brasil se aplicam à quantidade de
transgênico presente no produto final, e não na matéria-prima adicionada ao
produto, metodologias de extração de DNA para os mais variados tipos de produtos
e matrizes, como biscoitos, produtos cárneos, temperos, bebidas lácteas, sucos,
entre outros, necessitam ser desenvolvidas e validadas. Considerando-se apenas a
soja e o milho, as duas principais culturas GM cultivadas no mundo, grande parte
dos produtos alimentícios industrializados apresenta em sua composição uma
destas matérias prima, que são adicionadas como extrato, proteína, gordura vegetal,
lecitina, amido ou óleo.
Produtos finais altamente processados, devido aos mais variados métodos de
tratamentos que sofrem ao longo da cadeia produtiva, bem como a adição dos mais
diferentes tipos de ingredientes, apresentam maiores dificuldades para serem
analisados. Alguns ingredientes como proteínas, polissacarídeos, gorduras, sal,
dentre outros, presentes na composição do alimento, podem atuar como inibidores
da PCR. Tratamentos químicos ou físicos, atividades enzimáticas ou extremos de
pH podem levar à fragmentação do DNA de maneira a torná-lo inviável para a
análise.
Estes efeitos implicam que a sensibilidade da detecção e quantificação de
transgênicos, estabelecida durante a validação do método, deve ser específica para
a matriz utilizada durante a validação, não podendo ser extrapolada para outras
matrizes. Decréscimo na quantidade de DNA extraída da matriz alvo ou o
comprometimento da integridade das moléculas de DNA levam a uma elevação nos
limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ), expressos em termos da
quantidade de DNA GM em relação ao DNA total da matriz alvo. Em casos
extremos, onde a eficiência de extração de DNA é extremamente baixa, como no
caso de amostras de óleos refinados e amido, a reprodutibilidade do método é baixa
e os valores de LOD e LOQ desconhecidos, sendo freqüentes resultados falsos
negativos (LIPP
et al
., 2005).
Outro fator a considerar é a quantidade da matriz que pode conter OGM
adicionado ao produto. Esta matriz pode representar apenas uma pequena fração do
produto final. Em amostras de salsicha, por exemplo, apenas 2,0% a 7,5% da
composição é originada de proteína de soja, a maior parte é de origem animal.
Quanto menor for a quantidade do ingrediente alvo, da qual se pretender extrair
10
DNA ou proteína para análise, em relação aos outros ingredientes presentes no
produto, mais difícil será a detecção de resíduos transgênicos. A maneira como a
matriz GM se apresenta dispersa entre as diferentes matrizes que compõem o
produto final, se de modo aleatório ou não, deve ser também levada em
consideração, para se evitar problemas de homogeneização e amostragem
(ANLKLAM
et al
., 2002; REMUND
et al
., 2001).
Sendo assim, cada produto a ser analisado deve ser previamente avaliado
com relação ao seu nível de processamento, composição, distribuição das diferentes
matrizes e capacidade de se extrair DNA em quantidade e com qualidade para ser
amplificado pela técnica de PCR. A extração do DNA constitui uma das etapas mais
importantes no processo de validação do método.
A extração de DNA compreende três principais etapas: (1) a lise da célula,
(2) inativação de nucleases celulares e (3) separação do DNA dos outros
componentes celulares por precipitação ou filtração. A lise deve ser rigorosa o
suficiente para romper as membranas celulares liberando o material genético e, ao
mesmo tempo, gentil o suficiente para preservar o ácido nucléico. A lise pode ser
feita de modo mecânico, por tratamento químico com agentes caotrópicos,
detergentes e ainda por digestão enzimática. A lise e a inativação das nucleases
celulares podem ser combinadas em uma única etapa, pelo emprego de uma
solução que contenha um detergente para solubilizar os componentes da membrana
celular e um sal para inativar enzimas intracelulares.
Para a separação do ácido nucléico do extrato celular podem ser combinadas
duas ou mais metodologias, como: (1) extração e precipitação, por exemplo, a
combinação de fenol e clorofórmio para remoção de proteínas, seguida da
precipitação com isopropanol ou etanol, ou utilizando altas concentrações de sal ou
mudanças no pH; (2) cromatografia que pode utilizar diferentes técnicas de
separação como filtração de gel, troca iônica ou adsorção seletiva. Na cromatografia
por filtração em gel a molécula alvo é recuperada em função de seu tamanho
molecular, de acordo com o tamanho dos poros do gel. Na cromatografia de troca
iônica são utilizadas interações eletrostáticas entre a molécula alvo e grupos
funcionais da matriz. No caso dos ácidos nucléicos, negativamente carregados,
podem ser eluídos com um tampão salino ou água. No processo de adsorção, o
ácido nucléico é adsorvido seletivamente em sílica ou vidro em presença de
11
determinados sais caotrópicos. Uma solução salina de baixa concentração ou água
são capazes de eluir o DNA; (3) centrifugação em gradiente de CsCl ou combinada
com uma coluna cromatográfica de adsorção ao qual o DNA fica adsorvido por
afinidade. Após a centrifugação o DNA é recuperado livre de contaminantes menos
conspícuos, como sais e nucleotídeos (ZIMMERMANN
et al.
, 2000). Embora permita
a purificação de DNA de alta qualidade, a centrifugação em gradiente de CsCl é uma
estratégia muito trabalhosa o que a torna pouco comum.
Um método de extração que vem sendo largamente utilizado para a extração
de DNA para análise de OGM de matérias primas vegetais (LIPP
et al
., 1999) e para
alguns produtos processados, como tofu e farinha de soja (ZIMMERMANN
et al
.,
1998), é o que utiliza brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB). Tal método foi descrito
primeiramente por MURRAY e THOMPSON (1980), mas várias adaptações também
já foram descritas (HUPFER
et al
., 1998; HOTZEL
et al
., 1999; MEYER
et al
., 1996;
MEYER
et al
., 1997). Esse método é eficiente, particularmente para eliminação de
polissacarídeos e compostos fenólicos que afetam severamente a pureza do DNA.
Outro método também validado para extração de produtos processados para
detecção de OGM é o Wizard, comercializado na forma de um
kit
pela Promega. O
método utiliza uma resina que tem afinidade de ligação ao DNA, de modo que este é
diretamente purificado da solução após digestão enzimática com proteinase K e
tratamento químico com SDS (duodecil sulfato de sódio).
Para alguns alimentos processados, tratamentos prévios à extração são
recomendados para garantir melhor eficiência e pureza no DNA isolado. Amostras
ácidas, como sucos de frutas e molho de tomate, podem ser neutralizadas por meio
de um pré-tratamento com hidróxido de sódio (BOURKE
et al.
, 1999). Amostras ricas
em gorduras, como óleos brutos e lecitinas, que não se dispersam na fase aquosa
do tampão de lise, devem ser previamente tratadas com um composto orgânico,
como por exemplo, o hexano (SOLFRIZZO
et al.
, 1998). Ainda, amostras ricas em
polissacarídeos, um forte inibidor da reação de PCR, como as de amido de milho,
devem ser previamente tratadas com uma enzima glicosilase (CARRE
et al
., 1988).
Alguns reagentes químicos, como fenol, SDS, CTAB, utilizados na própria
extração do DNA, atuam como fortes inibidores da reação de PCR, de modo que
devem ser eliminados no final do processo, durante a precipitação do DNA e
lavagem com etanol.
12
Embora grande esforço seja empregado para a obtenção de DNA de boa
qualidade a partir de produtos processados, é esperado que o DNA obtido apresente
forte degradação. Mesmo assim, de um modo geral, ele é passível de ser analisado,
uma vez que os produtos alvos de amplificação esperados apresentam, em média,
200 pb. Para aumentar a eficiência da precipitação do DNA, por exemplo, em
amostra com pouca quantidade de DNA ou altamente degradada, com fragmentos
inferiores a 200 pb, onde a precipitação com etanol é ineficiente (WINFREY
et al
.,
1997), é recomendado o uso de MgCl
2
10 mM ou glicogênio a 10 µg/mL.
3.3.2. Detecção de Organismos Geneticamente Modificados em
Alimentos pela Técnica de PCR
Alguns métodos analíticos que utilizam a PCR têm sido desenvolvidos para
detectar qualitativamente a presença de seqüências modificadas de ácidos nucléicos
em alimentos transgênicos (EHLERS
et al
., 1997; KOPPEL
et al
., 1997). A análise
qualitativa baseia-se na amplificação de um fragmento de DNA específico do
transgene: da região promotora, da região terminadora, do gene marcador ou algum
segmento de DNA exógeno a ele associado. A amplificação é feita pela enzima DNA
polimerase, que utiliza pequenas sequências iniciadores específicas de DNA,
denominadas
primers
, que flanqueiam a região que se deseja amplificar. Além da
molécula alvo, dos iniciadores e da enzima DNA polimerase, também é necessária a
adição dos desoxinucleosídeos trifosfatados e de Mg
+2
, que atua como cofator da
polimerase. Em princípio, em uma PCR o número de seqüências alvo amplificadas
aumenta exponencialmente a cada ciclo, que é constituído de três diferentes etapas.
Na primeira etapa, a molécula de DNA alvo é desnaturada a uma temperatura em
torno de 94
°
C, seguida de uma redução em torno de 50 a 60
°
C, para o anelamento
dos
primers
. Finalmente, a temperatura é elevada a 72
°
C, para que haja a
polimerização pela DNA polimerase. Os ciclos são repetidos 20 até 45 vezes,
dependendo da quantidade de DNA alvo ou do tamanho do fragmento a ser
amplificado. Após cada ciclo, as moléculas obtidas são utilizadas como molde para
um novo ciclo de amplificação, obtendo-se amplificação exponencial do número de
fragmentos. Isto resulta na obtenção de até um bilhão de cópias da seqüência alvo
após x ciclos.
13
Rotineiramente são realizados
screening
para detecção de alimentos GM com
primers
que flanqueiam na região promotora 35S do vírus do mosaico da couve flor
e da região terminadora
NOS
de
Agrobacterium tumefaciens
, ambos presentes na
maioria dos transgênicos atualmente comercializados. No entanto, para a
identificação do evento transgênico, são necessários
primers
específicos que
flanqueiem a região codificadora ou alguma região que seja específica do transgene,
ou ainda os sítios de inserção e regiões terminais do cassete de clonagem.
As características mais marcantes do método de detecção de transgenes,
baseado na reação de PCR convencional, são a sua precisão e a sua sensibilidade.
No entanto, este método é incapaz de fornecer informação acurada sobre a
quantidade do alvo que esta sendo amplificado devido a oscilações na eficiência de
amplificação em diferentes reações, bem como nos diferentes ciclos de uma mesma
reação. Estas variações estão relacionadas com o acúmulo de inibidores, perda da
processividade da enzima DNA polimerase e escassez dos reagentes ao longo dos
ciclos. Em especial, nos últimos ciclos da PCR os produtos de amplificação são
produzidos de modo não exponencial, o que torna inviável a correlação da
quantidade inicial de alvo com a quantidade de alvo amplificado no decorrer dos
ciclos de amplificação.
3.3.3. Quantificação de Organismos Geneticamente Modificados em
Alimentos
Variações na metodologia da PCR convencional passaram a ser empregadas
no início da década de 90, com o objetivo de permitir a quantificação do alvo
amplificado por PCR. Um dos primeiros métodos a ser descrito foi a PCR
Competitivo (STUDER
et al
., 1998; CALLAWAY
et al
., 2002). Esta técnica se baseia
na co-amplificação do alvo e de um DNA competidor, que apresenta os mesmos
sítios de anelamento para os
primers
do fragmento alvo. Assumindo-se que a
quantidade inicial do competidor seja conhecida e que a eficiência de amplificação
do alvo e do competidor sejam similares, a razão da quantidade dos dois produtos
de amplificação, determinada em gel de eletroforese, é representativa da razão do
alvo e do competidor presentes na reação. Este procedimento é bastante trabalhoso
e apresenta grandes variações quando reproduzido. É necessário construir e
caracterizar o DNA competidor para cada alvo a ser quantificado, pois mesmo leves
14
variações na eficiência de amplificação entre o alvo e o competidor pode acarretar
severamente na acuracidade e precisão da quantificação. A PCR competitivo é
considerado como método semi-quantitativo no sentido que necessita de um
calibrador a ser comparado com a amostra em análise. Os resultados podem
apenas revelar valores abaixo, similares ou superiores ao competidor.
A técnica de PCR Quantitativo em Tempo Real é extremamente precisa e
menos trabalhosa do que a de PCR Competitivo (HEID
et al
., 1996). Em contraste
com quantificações nos ciclos finais da PCR (end points), a PCR em tempo real
monitora a reação ciclo a ciclo, associando a amplificação do alvo em cada ciclo
com a emissão de uma determinada quantidade de fluorescência. A fluorescência é
originada durante a hibridização do DNA alvo com sondas ou
primer
s marcados com
fluoróforos específicos. A intensidade de sinal emitida é proporcional à quantidade
de DNA alvo amplificado e aumenta exponencialmente em cada ciclo de
amplificação. Deste modo, é possível monitorar a quantidade de produto gerada em
cada ciclo, e durante a fase exponencial da reação, onde a quantidade de fragmento
gerado é proporcional à quantidade inicial
.
Durante a fase exponencial de amplificação é possível determinar um valor de
intensidade de fluorescência, na qual todas as amostras podem ser comparadas.
Este valor é denominado Limiar ou
threshold
e é calculado em função da quantidade
de fluorescência basal (
background
). Neste ponto, o sinal de fluorescência gerado
pela amostra é significativamente maior que a fluorescência basal. A quantidade de
ciclos de PCR requerida para que cada amostra emita fluorescência suficiente para
alcançar este ponto é definido
cycle threshold
ou Ct. O Ct é específico para cada
amostra e é inversamente proporcional à quantidade inicial do alvo presente na
reação. Este valor é a base para a quantificação pela PCR quantitativo.
Várias metodologias de quantificação baseadas em PCR em tempo real vêm
sendo desenvolvidas. Estas variam na especificidade do alvo de amplificação, custo
e precisão. Dentre estas metodologias, podem ser citadas:
TaqMan, Sybr Green
,
Beacons
Moleculares e
Lux primers
.
15
3.3.3.1. Ensaio Fluorogênico da Atividade 5’ Exonucleásica (Metodologia
TaqMan)
Uma metodologia que vem sendo largamente empregada para a
quantificação de OGM em alimentos é a metodologia
TaqMan
, que além dos
primers
de PCR usuais, utiliza uma sonda fluorescente que hibridiza dentro da sequência
alvo. A sonda contém um corante fluorescente ligado ao seu terminal 5’ (
reporter
) e
um inibidor da fluorescência (
quencher
) ligado ao seu terminal 3’. Durante o
processo de amplificação, a atividade de exonuclease 5’-3’ da DNA
polimerase
degrada a sonda, separando fisicamente o corante fluorescente do inibidor,
aumentando a emissão de fluorescência. A intensidade de fluorescência emitida é
diretamente proporcional à quantidade de DNA do transgene presente na amostra
(HOLLAND
et al
., 1991). Devido ao emprego simultâneo de
primers
e sondas esta
metodologia é uma das mais precisas para quantificação de OGM em alimentos.
3.3.3.2. Sybr Green
Este método não necessita de sondas específicas, apenas de
primers
específicos que irão determinar o alvo de amplificação. Nos tubos de reação de PCR
adiciona-se além dos componentes para a amplificação uma substância
fluorescente, denominada
Sybr Green,
que se liga ao DNA dupla fita durante o seu
processo de amplificação. Esta substância tem afinidade por DNA dupla fita, não
havendo nenhum mecanismo de seleção das sequências no qual irá interagir, de
modo que qualquer molécula dupla fita amplificada durante a reação contribuirá para
o sinal de fluorescência emitido. Uma alternativa para verificação se parte da
fluorescência gerada teve a paticipação de produtos de amplificação inespecíficos,
ou até mesmo dímeros de
primers,
é a construção de uma curva de dissociação ao
final da PCR. Os produtos são vagarosamente desnaturados e considerando que
cada molécula de DNA dupla fita apresenta um temperatura de desnaturação
específica, é possível identificar a existência de amplificação inespecífica (AMUTAN
& BATEY, 1999). A intensidade da fluorescência emitida será diretamente
proporcional à quantidade de DNA transgênico, alvo de amplificação, presente na
amostra. Como não utiliza sonda, esta metodologia é menos precisa que a
TaqMan.
16
3.3.3.3. Beacons Moleculares
Beacons
Moleculares
se refere à metodologia de amplificação por PCR em
tempo real, que utiliza sondas de DNA complementares à sequência alvo, além de
primers
. Diferentemente das sondas utilizadas na metodologia
TaqMan
, estas não
são hidrolisadas durante a amplificação, e por isso são também conhecidas como
sondas de hibridização, enquanto as utilizadas na metodologia
TaqMan
como
sondas de hidrólise (ZHANG
et al
., 2003; BUSTIN, 2000)
.
Estas sondas apresentam
nas extremidades seqüências de DNA complementares, que levam a formação de
uma estrutura na forma de grampo ou alça, quando estas extremidades se pareiam.
No interior da alça está localizada parte da sequência que apresenta homologia com
o alvo de interesse. Similar às sondas
TaqMan
estas também apresentam um
corante fluorescente ligado ao seu terminal 5’ (
reporter
) e um inibidor da
fluorescência (
quencher
) ligado ao seu terminal 3’. Quando há formação da alça, os
dois corantes se apresentam muito próximos e não há emissão de fluorescência.
Em solução, estas sondas adotam a estrutura em alça, não havendo emissão de
fluorescência. Durante a PCR, com a elevação da temperatura esta estrutura se
desfaz, e com a diminuição da temperatura até a ideal para anelamento dos
primers
,
há a possibilidade de anelamento da sonda com a sequência alvo a ser amplificada.
Neste momento, devido a separação espacial dos fluoróforos, há a emissão da
fluorescência. A cada ciclo há duplicação da quantidade de alvo disponível de modo
que ciclo a ciclo a intensidade de fluorescência vai aumentando proporcionalmente à
quantidade de alvo. Quando ocorre um novo ciclo de amplificação, com elevação da
temperatura, a sonda desnatura e se desliga da sequência alvo, havendo então
queda da fluorescência emitida.
Deve haver perfeita complementaridade entre a sonda e a seqüência alvo,
pois um pareamento imperfeito pode levar ao desligamento da sonda antes que se
tenha terminado o ciclo de amplificação.
3.3.3.4. Lux Primers
A metodologia para a quantificação por PCR em tempo real conhecida como
Lux primers
é bem recente e prática. Nesta metodologia utiliza-se apenas o par de
primers
, que irá definir o alvo de amplificação, sendo que um dos
primers
apresenta
17
um fluoróforo ligado no terminal 3´. Este
primer
é denominado de fluorogênico e
apresenta uma pequena cauda de 4 a 6 nucleotídeos no terminal 5´, que é
complementar ao terminal 3´. Da mesma maneira que na metodologia
Beacons
Moleculares
, uma estrutura em forma de alça é formada, porém no próprio
primer
.
Nesta conformação, os
primers
se encontram em solução e não emitem
fluorescência. Não há existência de um fluoróforo
quencher
nem de sondas. Neste
estado, a ausência de fluorescência está relacionada com a estrutura assumida pelo
primer
. Durante a reação de PCR esta estrutura é desfeita com o aumento da
temperatura, sendo então possível o pareamento dos
primers
com sua sequência
alvo. À medida que a estrutura do
primer
vai se tornando mais linear há um aumento
significativo na quantidade de fluorescência emitida. Deste modo, quanto maior for a
incorporação dos
primers
, maior será a quantidade de fluorescência emitida. O
aumento da quantidade de fluorescência emitida no decorrer dos ciclos da PCR
pode ser então correlacionado com o aumento da quantidade do fragmento alvo
amplificado.
3.3.4. Quantificação Absoluta x Quantificação Relativa
A determinação do número de cópias de um fragmento alvo amplificado pela
técnica de PCR em tempo real pode ser realizada de modo absoluto ou relativo. Na
quantificação relativa o número de cópias ou porcentagem do gene alvo em um
determinado ensaio é normalizado pelo número de cópias de uma referência
endógena, ou seja, um gene espécie-específico, de expressão constitutiva. Após a
normalização, o número de cópias do gene alvo é determinado em relação a um
calibrador, que corresponderia à amostra usada como base para resultados
comparativos. O calibrador pode ser um controle não tratado ou uma amostra no
tempo zero durante a condução do experimento; no caso da quantificação de
alimentos GM, corresponderia aos padrões de referência que variam de 0,1% a 5%
da presença do resíduo transgênico. Tanto o calibrador quanto as amostras em teste
são normalizadas com relação à referência endógena.
A quantificação relativa poder ser feita usando dois métodos:
a)
Método da curva padrão
: Inicialmente há a necessidade de otimização e
determinação da eficiência de amplificação do alvo e da referência endógena. É
crucial que as amplificações do fragmento alvo e da referência sejam similares, caso
18
contrário os resultados podem apresentar valores sobre ou subestimados
(GINZINGER
et al
., 2002).
Assim como na quantificação absoluta, na quantificação relativa pelo método
da curva padrão é necessário construir uma curva de calibração, tanto para o gene
alvo como para a referência endógena. O número de cópias do alvo, normalizado
pela referência endógena, é comparado ao do calibrador. Em todas as amostras
experimentais, as quantidades do alvo e da referência endógena são determinadas
a partir de suas respectivas curvas padrão. A quantidade do alvo é normalizada por
sua divisão pela quantidade de cópias da referência endógena, ambos amplificados
em cada amostra, no mesmo tubo ou placa de reação. O valor normalizado é
dividido pelo valor do calibrador. Assim, o calibrador torna-se 1X da quantidade do
alvo, e todas as outras quantidades são expressas como
n
X da diferença relativa ao
calibrador. No caso do estudo do efeito de uma droga sobre a expressão de um
determinado gene, por exemplo, o controle não tratado poderia ser um calibrador
apropriado.
Pelo fato da quantidade da amostra ser dividida pela quantidade do
calibrador, a unidade da curva padrão desaparece. Portanto, o pré-requisito principal
é que as diluições do padrão utilizado sejam conhecidas. Para a quantificação
relativa, qualquer estoque de RNA ou DNA contendo um alvo apropriado pode ser
usado no preparo de padrões.
b)
Método ∆CT
: Este método é similar ao da curva padrão, mas utiliza uma
fórmula aritmética para alcançar o mesmo resultado de quantificação relativa. Não
há necessidade de curva padrão, desde de que se tenha validado a eficiência de
amplificação do alvo e da referência endógena. A quantidade do alvo, normalizada
para uma referência endógena e em relação ao calibrador é dada pela fórmula 2
-∆∆Ct
(LIVAK
et al
., 2001)
Na quantificação absoluta, o número de cópias do fragmento alvo é dado em
termos absolutos e requer quantidades absolutas de um padrão a ser utilizado na
preparação da curva padrão. DNA plasmidial e RNA sintetizado
in vitro
são
normalmente utilizados para preparar padrões absolutos. A concentração é medida
em espectrofotômetro (A
260 nm
) e convertida em número de cópias, usando o peso
molecular do DNA ou RNA. Essas quantidades conhecidas devem ser inicialmente
determinadas por métodos independentes e, então, serem utilizadas para a
19
construção da curva padrão. Neste tipo de quantificação, normalmente não é
empregada uma referência endógena, somente é elaborada uma curva padrão onde
os valores de Ct ou intensidade de fluorescência de uma diluição seriada, são
plotados com relação à quantidade presente em cada ponto da diluição.
3.3.5. PCR quantitativo em tempo real na quantificação de organismos
geneticamente modificados em alimentos
Para a quantificação do percentual de DNA GM em um determinado produto,
o número de cópias do transgene é dado em função do número de cópias de um
gene endógeno espécie-específico
A quantificação relativa pelo método da curva padrão é a metodologia
comumente utilizada para a determinação do percentual de DNA GM presente nas
amostras. O percentual de OGM é definido como sendo a razão entre a quantidade
em peso do ingrediente GM com relação a quantidade total do ingrediente. No
entanto, como esse percentual é, na realidade, determinado pela amplificação por
PCR de um fragmento do DNA exógeno, bem como de um gene endógeno utilizado
como referência, o que ocorre, na verdade, é uma extrapolação da razão entre o
número de cópias de DNA GM e número de cópias de DNA não transgênico da
espécie em questão, amplificados por PCR. Tanto o fragmento de DNA exógeno
como o utilizado como referência endógena devem apresentar a mesma eficiência
de amplificação por PCR quantitativo. Esta eficiência deve ser demonstrada
inicialmente em reações simples e
multiplex
, e pela construção de curvas de
calibração com valores de de coeficiente de correlação acima de 0,98, e ambas
eficiências acima de 90%. Durante as análises a amplificação de ambos os alvos em
reações
multiplex
os desvios referentes à eficiência de amplificação são
minimizados.
A quantificação relativa pelo método da curva padrão pode ser realizada pela
construção de curvas de calibração independentes, uma para cada alvo, transgene e
a referêcia endógena, ou apenas uma curva considerando a amplificação dos dois
alvos. No primeiro caso, as curvas de calibração são obtidas pela amplificação de
quantidades absolutas de uma amostra padrão. Moléculas de DNA recombinantes,
contendo os fragmentos transgene e/ou a referência endógena clonados, podem ser
utilizadas para preparar os padrões absolutos. A concentração é medida em
espectrofotômetro (A
260 nm
) e convertida em número de cópias, usando o peso
20
molecular. Em ambas as curvas os valores de Ct de cada alvo são plotados em
função do logarítimo da concentração ou do número de cópias. O número de cópias
do transgene por cópias do genoma da espécie será obtido pela razão entre o
número de cópias do transgene pelo número de cópias do gene endógeno em cada
amostra. Deste modo a quantificação relativa pelo método da curva padrão é obtida
pela razão entre duas quantificações absolutas.
No segundo caso, uma única curva de calibração construída utiliza os valores
de delta Ct (Ct do transgene menos o Ct da referência endógena) em função do
logarítimo da concentração, percentual de OGM ou número de cópias. Deste modo
os valores são normalizados previamente à elaboração da curva. O percentual de
OGM das amostras é diretamente obtido pela equação derivada da curva. Este
método de quantificação relativa pela curva padrão muitas vezes é descrito como
método do delta Ct, no entanto difere do método de quantificação relativa tradicional,
em que há o emprego de uma fórmula aritmética para expressar diferenças entre a
quantidade do gene alvo e amostras calibradoras em estudos de expressão gênica.
21
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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25
Capítulo I
Panorama nacional da presença de resíduos transgênicos em
alimentos no período 2000-2005
RESUMO
No período de 2000 a 2005, foram amostradas 3.944 amostras dos mais variados
produtos, industrializados,
in natura
e grãos
,
principalmente compostas pela matriz
soja, para análise de detecção de resíduos transgênicos. Nos anos iniciais, as
amostras foram enviadas principalmente pelos estados da região Sul do país,
principalmente Paraná e Santa Catarina. Já em 2005, 45,27% das amostras foram
enviadas por clientes do estado de São Paulo. Inicialmente a demanda pela análise
era concentrada principalmente em produtos
in natura
e grãos. Nos anos de 2004 e
2005, houve inversão dessa tendência: amostras de produtos processados
representaram mais da metade da demanda. A elevação da demanda pela análise
de produtos processados, concomitante com a elevação da demanda de amostras
enviadas pelo estado de São Paulo, indica um possível efeito da publicação de
decreto de rotulagem, em abril de 2003. Em 2000 apenas 5% das amostras
continham resíduos de OGM, consistindo de 1,11% de amostras de farelo de soja e
3,89% soja grão. Em 2001, esse percentual subiu para 11,39% e a presença de
resíduos transgênicos já foi detectada em amostras processadas de produtos
matinais a base de soja. O percentual de amostras positivas atingiu 28,45% em
2002, seguida de uma redução deste valor para 28,23%, em 2003. Em 2002, outras
classes de produtos processados mostraram-se positivas para a presença de
resíduos transgênicos, entre estas as de condimentos e temperos, óleos e gorduras
e produtos cárneos. Em 2003 as primeiras amostras de milho transgênico foram
detectadas e representaram 0,80% do total de 28,29% de amostras positivas. Em
2004 o percentual sofreu uma leve redução para 25,69%, o que pode ser devido à
26
publicação do decreto de rotulagem em abril do ano anterior, e, no ano seguinte,
2005, o percentual de amostras positivas continuou a subir atingindo o valor de
28,17%. O aumento gradual no número de amostras positivas demonstra que
mesmo quando o plantio e a comercialização de OGM eram proibidos no país, estes
estavam presentes no mercado, pelo menos, desde o ano de 2000. Amostras
incluídas nas classes de soja grão, farelo de soja, salchichas e empanados foram as
que apresentaram as maiores proporções de resultados positivos com relação ao
total de amostras analisadas dentro de cada classe. Do total de 626 amostras que
tiveram os níveis de resíduos de DNA GM quantificados, cerca de 46,01%
apresentou resíduos de transgênicos acima de 1,0%, sendo que 27,48% delas,
acima de 5,0% do DNA total da espécie analisada.
27
1. INTRODUÇÃO
As principais culturas GM cultivadas no mundo, em 2005, em escala de
predominância, foram a soja resistente ao glifosato, o milho e o algodão resistentes
a inseto e/ou a herbicida, e a canola resistente a herbicida. Outras culturas, porém
menos expressivas, também são ou já foram liberadas para cultivo em alguns
países, dentre estas o tomate com amadurecimento tardio, a batata resistente a
inseto e vírus, a chicória, o arroz e a beterraba tolerantes a herbicida e o mamão
resistente a vírus. Considerando todos os eventos de vegetais GM já liberados para
plantio em escala comercial, para consumo humano ou animal, mesmo que por
apenas um determinado período, o total é de 83 eventos em pelo menos 27 países
(Agbios Database, 2006).
No Brasil, apenas dois eventos transgênicos foram liberados para plantio e
comércio, a soja resistente ao glifosato, em 2003, e o algodão resistente a inseto,
em 2005. Apesar disso, grãos e farelo de soja GM têm sido detectados no país
desde o ano de 2000. Grãos de milho GM foram detectados inicialmente em 2003,
apesar de até o momento não ter sido liberado nem para cultivo nem para comércio
no país (MARCELINO
et al
., 2003). A análise de sementes de soja fiscalizadas e
certificadas, que foram utilizadas para o plantio na safra 2002/2003, nos principais
estados produtores (RS, PR, MT e MG), revelou que 19,69% das sementes
analisadas, oriundas do estado do RS, eram transgênicas (PIMENTA, 2003).
Segundo JAMES (2006), o Brasil foi o país que mais aumentou o cultivo de plantas
28
GM em 2005, passando de 5 milhões de hectares plantados em 2004 para 9,4
milhões de hectares em 2005.
A ampliação mundial de culturas GM, em especial no Brasil, reflete-se
também no aumento da presença de resíduos transgênicos em produtos
alimentícios. Este fato gerou a necessidade do estabelecimento de normas
referentes ao direito à informação. No Brasil, uma legislação específica para
rotulagem de alimentos GM foi inicialmente publicada em 2001, e estabelecia o
limite de 4% para presença acidental de soja transgênica entre os grãos
comercializados no país. Em 2003, mediante decreto Nº 4.680 de 25 de abril, a
rotulagem passou a ser obrigatória para produtos embalados, a granel ou
in natura
,
que contenham ou que sejam produzidos de OGM, a partir do limite de 1,0% do
produto final.
Desde a introdução de culturas transgênicas e a publicação de normas de
rotulagem no país, nenhum estudo referente à detecção e quantificação de resíduos
transgênicos em alimentos, rotineiramente consumidos pela população, foi realizado.
Órgãos responsáveis pela fiscalização como o Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento, Mistério da Justiça, Ministério do Meio Ambiente, Ministério da
Saúde e Secretaria Especial de Aqüicultura e Pesca, vêm realizando trabalhos de
fiscalização dos mais variados tipos de produtos, no que se refere a presença de
resíduos transgênicos acima do limite de 1% do produto final, no entanto nenhuma
informação existe em termos da abrangência deste trabalho.
Informações a cerca do nível médio da presença de resíduos transgênicos em
diferentes tipos de produtos, compostos pelos mais variados tipos de matrizes, são
importantes para dar suporte a trabalhos de fiscalização e rastreabilidade dos tipos
de resíduos transgênicos que já vêm sendo consumidos pela população e por qual
período.
Este trabalho tem como objetivo apresentar um quadro panorâmico dos
principais tipos de produtos, compostos pelas mais variadas matrizes, em que foi
detectada a presença de resíduos transgênicos dentre diversos tipos de alimentos
comercializados no país, e ainda, quais destes apresentaram percentuais acima do
limite estabelecido pela legislação nacional, no período de 2000 a 2005.
29
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Material de referência
Como material de referência para determinação da concentração de resíduos
de OGMs foram utilizados padrões de referência certificados (CRMs) produzidos
pelo IRMM (
Institute for
Reference Materials and Measurement
) e comercializados
pela Fluka. Os padrões contém 0,0%, 0,1%, 0,5%, 1,0%, 2,0% ou 5,0% (p/p) de
farinha de soja Roundup Ready
®
ou milho Bt11.
2.2. Material para análise
Todas as amostras foram analisadas pelo Laboratório de Análises Genéticas
– AgroGenética, empresa que foi criada no sistema de Incubadora de Empresas de
Base Tecnológica da Universidade Federal de Viçosa. Os produtos analisados
constituem uma amostragem aleatória daqueles enviados para análise de detecção
e quantificação de resíduos transgênicos por clientes nacionais, tais como,
produtores, associações, portos, beneficadora de grãos e empresas alimentícias, de
diferentes regiões do país. A amostragem buscou representar a demanda dos tipos
de produtos, estado de origem das amostras, matriz e tipo de análise da empresa. O
material utilizado nas análises é constituído por grãos, produtos
in natura
e
alimentos processados.
2.3. Extração de DNA
O DNA genômico dos padrões de referência foi extraídos pelo método
PrepMan
(Applied Biosystems), conforme recomendações do fabricante. O DNA das
30
amostras foi extraído pelas metodologias CTAB (ROGERS
et al
., 1988) e Wizard
(Promega).
A extração de DNA de produtos com alto nível de processamento foi realizada
pelos métodos CTAB ou Wizard, com diferentes adaptações, segundo
características específicas dos produtos. A quantidade inicial utilizada para a
extração foi elevada cerca de cinco vezes em relação às amostras não processadas.
Amostras com alto teor de carboidratos foram tratadas com 10 mg de amilase por 30
min a 55ºC. Para amostras ricas em lipídeos, cerca de 500 mg eram tratados com 10
mL de hexano juntamente com o tampão de lise, seguida de uma precipitação
adicional com glicogênio a 2 µg/mL.
2.4. Oligonucleotídeos e condições de amplificação por PCR qualitativo
e quantitativo
Para a verificação da qualidade do DNA, as amostras contendo soja em sua
composição foram amplificadas com os
primers
específicos para o gene da
referência endógena lectina (MEYER
et al.,
1994), as contendo milho para o gene da
delta zeína (
STUDER
et al.,
1997), algodão para o gene que codifica a proteína
carreadora acil fibra específica (MONSANTO, 2000) e as contendo canola para o
gene
acetil-CoA carboxilase (ACC
) (HERNANDEZ
et al
., 2001). Produtos para os
quais nenhuma referência endógena tenha sido descrita, a qualidade do DNA foi
verificada pela sua amplificação com
primers
RAPD (
Random Amplification of
Polymorphic
DNA). Para a detecção da presença de resíduos GM na composição
das amostras, estas foram amplificadas com
primers
específicos para a região
promotora CaMV35S (EMBL AJ308514), e terminadora NOS (EMBL 308515),
ambas presentes na maioria das construções transgênicas existentes. Para a
identificação do evento de soja RR, foram utilizados
primers
específicos para a
região promotora de CaMV35S e
primers
que pareiam na sequência que codifica o
peptídeo de trânsito de
Petunia hybrida
e a região codificadora ESPS (EMBL
AY592954). Para a identificação do evento de milho Bt11 ou Bt176, foram utilizados
primers
específicos para a região codificadora da endotoxina Cry1A (ZIMMERMANN
et al
., 2000). As seqüências dos
primers
, bem como os tamanhos esperados dos
fragmentos amplificados estão apresentados no Quadro 1.
31
As reações de PCR convencional foram conduzidas em termociclador modelo
7900 (Applied Biosystems), com período inicial de desnaturação a 94
°
C, por 4 min,
seguido por 35 ciclos de polimerização, (94
°
C por 30 s, 55
°
C por 1 min e 72
°
C por 2
min) e período adicional de polimerização a 72
°
C por 7 min. Para cada par de
primers
foi utilizada a temperatura de pareamento mais apropriada. As reações
foram realizadas em um volume final de 25
µ
L contendo 2,5 mmoles/L de cada
dNTP, 1 U de
Taq
DNA polimerase, 0,2 pmoles de cada
primer
, 0,01 ng a 2000 ng
DNA molde, KCl 50 mmoles/L, Tris-HCl 10 mmoles/L pH 8,3 e MgCl
2
1,5 ou 2,0
mmoles/L. Os fragmentos amplificados foram separados por eletroforese em géis
de agarose 2,0% (p/v), contendo 0,1 mg/mL de brometo de etídeo imerso em
tampão TBE 1X (Tris-borato 90 mmoles/L, EDTA 1 mmoles/L pH 8,0), e visualizados
por meio de luz ultravioleta.
As reações de PCR quantitativo foram efetuadas no equipamento ABI
PRISM
®
7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems). As amostras
contendo soja foram amplificadas com o kit
TaqMan GMO Soy 35S Detection Kit
e
as contendo milho, com o
kit TaqMan GMO Maize 35S Detection Kit
(Applied
Biosystems). As condições de termociclagens e concentrações dos reagentes foram
realizadas conforme recomendações do fabricante. Estes kits empregam a
metodologia
TaqMan
para a quantificação da soja e/ou milho GM presentes nas
amostras.
2.5. Avaliação da demanda e perfil das amostras analisadas para a
presença de resíduos transgênicos
As amostras foram organizadas em 20 diferentes classes, de acordo com
suas propriedades particulares, como composição e finalidade, e ainda, em 3
diferentes grupos de acordo com o nível de processamento das amostras: grãos,
produtos
in natura
e processados.
A distribuição da frequência de cada uma das 20 diferentes classes de
produtos foi apresentada anualmente, no período de 2000 a 2005. No mesmo
período, as amostras foram distruídas de acordo com seus níveis de processamento
e tipo de matriz(es) que as compunham.
32
A demanda de amostras para análise de deteção de resíduos transgênicos foi
ainda avaliada em termos de distribuição por estado e percentual de amostras
fiscais.
QUADRO 1 -
Sequência de
primers
e sondas utilizados nas reações de PCR
qualitativo
Primers Alvo Sequência Amplicon
Lec-F
5´GCCCTCTACTCCACCCCCATCC 3´
118 pb
Lec-R
Gene da lectina da soja
5´GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG 3´
Nos-Long F
5´ATTGCGGGACTCTAATCATAAAAA 3´
180 pb
Nos Long-R
Região terminadora NOS
5´ATCGTTCAAACATTTGGCAATAA 3´
RR-F
5´TGATGTGATATCTCCACTGACG 3´
172 pb
RR-R
Região codificadora EPSPS
5´TGTATCCCTTGAGCCATGTTGT 3´
Zei-F
5´AGTGCGACCCATATTCCAG 3´
277 pb
Zei-R
Gene da delta zeína do milho
5´GACATTGTGGCATCATCATTT 3´
Bt 11-F
5´TATCATCGACTTCCATGACCA 3´
128 pb
Bt11-R
Região codificadora Cry1Ab
5´AGCCAGTTACCTTCGGAAAA 3´
Acc1-F
5’GGCGCAGCATCGGCT 3’
82 pb
Acc1-F
Gene da acetyl-CoA carboxilase
da canola
5’GGTGAGCTGTATAATCGAGCGA 3’
Acp1-F
5’ATTGTGATGGGACTTGAGGAAGA 3’
76 pb
Acp1-R
Gene que codifica a proteína
carreadora acil fibra específica do
algodão
5’CTTGAACAGTTGTGAATGGATTGTG 3’
35-S
5´GATAGTGGGATTGTGCGTCA 3´
195 pb
35-R
Região promotora 35S do vírus
do mosaico da couve flor
5´GCTCCTACAAATGCCATCATTGCG 3´
2.6. Avaliação das amostras quanto à presença de resíduos
transgênicos
Os resultados referentes ao percentual de amostras positivas foi avaliado em
relação ao total de amostras analisadas e em relação ao total de produtos
analisados dentro de cada classe. Os dados são apresentados anualmente, durante
o período de 2000 a 2005, e com valores acumulados no período de seis anos que
as amostras foram analisadas.
As amostras também foram avaliadas de acordo com o tipo de metodologia
empregada, qualitativa ou quantitativa, para análise de resíduos transgênicos. A
partir do total de amostras positivas, que foram quantificados, foi estabelecido o
33
percentual e classes das amostras que apresentaram resíduos de transgênicos
acima de 1% do total de DNA da espécie em questão.
Baseado nos resultados, foi traçado um perfil dos principais produtos
passíveis de análise e estabelecida uma visão do percentual e tipos de produtos
positivos que já se encontram no mercado brasileiro desde o ano de 2000.
34
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Avaliação da demanda e perfil das amostras analisadas
Para a avaliação do panorama nacional da presença de resíduos
transgênicos em amostras de alimentos comercializados no país, foram analisadas
3.944 amostras dos mais variados produtos, durante o período de 2000 a 2005. A
distribuição das amostras no decorrer dos anos foi: 180 amostras em 2000, 439 em
2001, 730 em 2002, 751 em 2003, 1347 em 2004 e 497 em 2005. As amostras
foram organizadas em 20 diferentes classes, de acordo com suas propriedades
particulares, tais como composição e finalidade, e ainda em três diferentes grupos
de acordo com o nível de processamento, grãos, produtos
in natura
e processados.
Os produtos presentes em cada classe e o correspodente nível de processamento
atribuído encontra-se no Quadro 2. Amostras com baixa demanda de análise,
inferior a 0,5% do total de amostras analisadas no ano, foram classificadas como
“outros”.
A demada pela análise dos produtos presentes em cada classe foi expressa em
valores percentuais com relação ao total de amostras analisadas em cada ano
(Tabela 1).
Pode-se observar que inicialmente a demanda por análise concentrava-se em
amostras de grãos e produtos
in natura
. Em 2000, apenas 10,56% das amostras
eram constituídas por produtos processados, que consistiam de amostras de mistura
para bolo, amido de milho e matinais. Do restante, cerca de 46,11% das amostras
eram de produtos
in natura
e 43,33% de grãos, abrangendo principalmente as
classes de soja grão, proteína e farelo de soja.
35
QUADRO 2 – Classificação dos produtos analisados e nível de processamento.
Classes de Produtos Produtos Nível de Processamento
Amido de Milho
Amido de Milho Processado
Bebidas Lácteas
pudins, cremes de vários sabores, fermentados
Processado
Biscoitos
Maizena, água e sal, recheado, wafer Processado
Condimentos e Temperos
Pimenta, realçador de sabor, caldo de carne
e galinha em tabletes, molho de soja, molho shoyo,
coentro em pó, cebola em pó
Processado
Empanados
Peito de frango empanado, embutidos
Processado
Farelo de Soja
Farelo de Soja In natura
Fubá Fubá de milho
In natura
Lecitina
Lecitina de soja In natura
Macarrão e massas
Espaguete, sêmola, talharim, macarrão instantâneo Processado
Matinais
Achocolatados e
shakes a base de soja, extrato hidrosolúvel de soja
Processado
Mistura para empanados
Ligante para empanados, breeding,
Intermediário, tempura batter,
Processado
Mistura para bolo
Mistura para bolos de diferentes sabores e marcas
Processado
Milho Grão
Milho Grão Grão
Óleos e Gorduras
Óleo de soja, gordura vegetal, gordura hidrolisada,
margarina, óleo essencial de louro e cravo
Processado
Outros
Semente de braquiária, sorgo grão, ovo desidratado,
cacau em pó, barra de cereais, amido de batata, glúten
de trigo, leite fermentado, batata chips, trigo grão,
algodão grão, óleo de canola,
Todas as três classes
Produtos Cárneos
Patê, chester, peito de frango e peru, lingüiça,
mortadela, presunto, pernil, almôndegas
Processado
Ração
Ração In natura
Salsicha
Salsicha e salsichão Processado
Soja Grão
Soja grão Grão
Produtos Protéicos de Soja
Proteína isolada, proteína texturizada, extrato protéico,
farinha integral de soja, fibra de soja
In natura
36
TABELA 1 – Percentual de cada classe de produtos analisados para detecção de resíduos transgênicos durante o período 2000-2005.
Percentual de cada Classe de Produtos Analisados
2000 2001 2002 2003 2004 2005
Classes de Produtos
Analisados Total (%) Total (%) Total (%) Total (%) Total (%) Total (%)
Amido de Milho 0 0,00 0 0,00 0 0,00 65 8,66 22 1,63 10 2,01
Bebidas Lácteas 0 0,00 0 0,00 0 0,00 8 1,07 18 1,34 12 2,41
Biscoitos 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 16 1,19 12 2,41
Condimentos e Temperos 0 0,00 2 0,46 11 1,50 17 2,26 95 7,05 12 2,41
Empanados 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,0 23 1,71 10 2,01
Farelo de Soja 17 9,44 41 9,34 106 14,50 90 11,98 59 4,38 23 4,63
Farinha de Trigo 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 70 5,20 69 13,88
Fubá de Milho 0 0,00 0 0,00 0 0,00 7 0,93 0 0,00 0 0,00
Lecitina 6 3,33 13 2,96 8 1,09 0 0,00 5 0,37 3 0,60
Matinais 6 3,33 21 4,78 27 3,69 8 1,07 56 4,16 23 4,63
Macarrão e Massas 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,0 27 2,00 4 0,80
Milho Grão 24 13,33 70 15,95 57 7,80 108 14,38 337 25,02 130 26,16
Mistura para Bolo 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 44 3,27 14 2,82
Mistura para Empanados 12 6,67 0 0,00 0 0,00 24 3,20 132 9,80 12 2,41
Óleos e Gorduras 0 0,00 1 0,23 5 0,68 5 0,67 35 2,60 2 0,40
Outros 22 12,22 45 10,25 34 4,65 34 4,53 95 7,05 42 8,45
Produtos Cárneos 0 0,00 5 1,14 92 12,59 14 1,86 22 1,63 5 1,01
Ração 2 1,11 37 8,43 53 7,25 47 6,26 68 5,05 22 4,43
Salsicha 0 0,00 0 0,00 0 0,00 35 4,66 90 6,68 62 12,47
Soja Grão 54 30,00 96 21,87 142 19,43 104 13,85 33 2,45 19 3,82
Sopas 0 0,00 4 0,91 17 2,33 0 0,00 0 0,00 0 0,00
Sucos Naturais 0 0,00 0 0,00 0 0,00 5 0,67 0 0,00 3 0,60
Produtos Protéicos de Soja 37 20,56 104 23,69 179 24,49 180 23,97 100 7,42 8 1,61
Total 180 439 731 751 1.347 497 3.944
37
Ainda no ano de 2000, destacaram-se entre os produtos processados, a
demanda pela análise de amostras de mistura para bolos, constituindo 6,67% do
total de produtos analisados.
Em 2001, quando o primeiro decreto de rotulagem foi publicado, que
estabelecia o limite de 4% para a contaminação acidental de soja RR, apenas em
produtos embalados, o percentual da demanda de produtos processados não
ultrapassou a 15,5%. A demanda de análise para produtos
in natura
apresentou uma
leve redução, para cerca de 46,24%, mas continuou superando a demanda pela
análise de grãos, que ficou em 38,27%. Naquele ano, pela primeira vez, houve a
demanda pela análise de produtos cárneos, correspondendo a 1,14% do total de
produtos analisados, no entanto, dentre os produtos processados as amostras de
produtos matinais foram as que mais se destacaram, com 4,78% do total de
amostras analisadas.
Em 2002, a demanda pela análise de produtos
in natura
continuou se elevando,
e atingiu seu clímax, superando cerca de 50% do total de amostras analisadas
naquele ano. A queda deste percentual ocorreu nos três anos seguintes, atigindo os
percentuais 45,41%, 19,15% e 15,29% nos anos 2003, 2004 e 2005,
respectivamente. Naquele ano as classes de produtos cárneos foi a superior entre
os produtos processados, seguida da classe de hidrolisados de soja, atingindo os
percentuais de 12,59% e 3,69% respectivamente.
Em 2003, ano de primeira liberação do comércio da soja RR plantada
ilegalmente no país e também da publicação do novo decreto de rotulagem, que
estabeleceu o limite de 1% da presença de resíduos transgênicos, tanto para os
produtos embalados como os comercializados a granel, o percentual da demanda de
análise por produtos processados atingiu 26,23%. Dentre a demanda de produtos
analisados naquele ano percebe-se uma diversificação dos tipos de produtos, dentre
estes destacam-se as amostras de salsicha, amido de milho e misturas para
empanados, que atingiram os percentuais de 4,66%, 8,66% e 3,20% do total de
amostras analisadas, respectivamente.
Em 2004, ano posterior à publicação do decreto de rotulagem, a demanda pela
análise de produtos processados atingiu o percentual de 51,97% do total de
amostras analisadas, com uma leve elevação no ano seguinte, 2005, para 53,72%.
Em contrapartida à elevação do percentual de análise de produtos processados, a
38
Ainda no ano de 2000, destacaram-se entre os produtos processados, a
demanda pela análise de amostras de mistura para bolos, constituindo 6,67% do
total de produtos analisados.
Em 2001, quando o primeiro decreto de rotulagem foi publicado, que
estabelecia o limite de 4% para a contaminação acidental de soja RR, apenas em
produtos embalados, o percentual da demanda de produtos processados não
ultrapassou a 15,5%. A demanda de análise para produtos
in natura
apresentou uma
leve redução, para cerca de 46,24%, mas continuou superando a demanda pela
análise de grãos, que ficou em 38,27%. Naquele ano, pela primeira vez, houve a
demanda pela análise de produtos cárneos, correspondendo a 1,14% do total de
produtos analisados, no entanto, dentre os produtos processados as amostras de
produtos matinais foram as que mais se destacaram, com 4,78% do total de
amostras analisadas.
Em 2002, a demanda pela análise de produtos
in natura
continuou se elevando,
e atingiu seu clímax, superando cerca de 50% do total de amostras analisadas
naquele ano. A queda deste percentual ocorreu nos três anos seguintes, atigindo os
percentuais 45,41%, 19,15% e 15,29% nos anos 2003, 2004 e 2005,
respectivamente. Naquele ano as classes de produtos cárneos foi a superior entre
os produtos processados, seguida da classe de hidrolisados de soja, atingindo os
percentuais de 12,59% e 3,69% respectivamente.
Em 2003, ano de primeira liberação do comércio da soja RR plantada
ilegalmente no país e também da publicação do novo decreto de rotulagem, que
estabeleceu o limite de 1% da presença de resíduos transgênicos, tanto para os
produtos embalados como os comercializados a granel, o percentual da demanda de
análise por produtos processados atingiu 26,23%. Dentre a demanda de produtos
analisados naquele ano percebe-se uma diversificação dos tipos de produtos, dentre
estes destacam-se as amostras de salsicha, amido de milho e misturas para
empanados, que atingiram os percentuais de 4,66%, 8,66% e 3,20% do total de
amostras analisadas, respectivamente.
Em 2004, ano posterior à publicação do decreto de rotulagem, a demanda pela
análise de produtos processados atingiu o percentual de 51,97% do total de
amostras analisadas, com uma leve elevação no ano seguinte, 2005, para 53,72%.
Em contrapartida à elevação do percentual de análise de produtos processados, a
39
demanda pela análise de produtos
in natura
apresentou radical queda, passando de
45,41% em 2002 para 15,29% em 2005. A demanda pela análise de grãos
apresentou uma tênue elevação, passando de 27,22% em 2002 e atingindo 30,99%
em 2005. A demanda pela análise dos produtos classificados em cada nível de
processamento, no período de 2000 a 2005, pode ser observada na Figura 1.
A elevação da demanda pela análise de produtos processados, principalmente
nos anos de 2004 e 2005, anos posteriores à publicação do decreto de rotulagem,
pode ser interpretada como sendo reflexo deste. Embora não se tenham dados
concretos se a fiscalização tenha efetivamente se intensificado no país, percebeu-se
uma maior atenção pelas empresas que utilizam soja e/ou milho na constituição de
seus produtos, em relação à rastreablidade e percentuais de resíduos de OGM em
seus produtos.
Do total de 3.494 amostras analisadas durante o período, apenas 74 amostras,
representando em torno de 1,90% do total, foram análises fiscais, ou seja, enviadas
pelos órgãos federais responsáveis pela fiscalização da presença de resíduos
transgênicos no país. Deste modo, é ainda questionável quais fatores têm levado à
demanda pela análise de detecção de OGMs em alimentos, se a legislação vigente
ou preferência do mercado consumidor que, de modo geral, ainda não é favorável ao
consumo de OGM.
Distribuição das Amostras por Níveis de Processamento
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
2000 2001 2002 2003 2004 2005
Ano
Percentual
Processados
Grãos
In natura
FIGURA 1 – Percentual de produtos analisados de acordo com os níveis de processando no
período de 2000 a 2005.
40
Em 2004 e 2005, a diversificação dos tipos de produtos analisados foi similar a
2003. Em 2004, destacaram-se entre os produtos processados as classes das
amostras de misturas para empanar, condimentos e temperos com percentuais de
9,80% e 7,05%, respectivamente, e, em 2005, as classes de farinha de trigo e
salsichas com os percentuais de 13,88% e 12,47%, respectivamente.
No ano de 2005 também foi observada uma queda no número de amostras
analisadas, e consequentemente refletiu numa menor amostragem de produtos para
serem analisados. Tal fato pode ser reflexo da liberação da soja RR no país desde a
publicação da nova Lei de Biossegurança, em março de 2005, ou mesmo devido ao
grande período em que a CTNBio esteve sem atuar, até a publicação do decreto
5.591, em novembro de 2005, que regulamentou a lei.
3.2. Tipos de matrizes
Durante o período de seis anos em que as amostras foram analisadas para a
detecção e quantificação de resíduos transgênicos, a principal demanda foi de
amostras que apresentavam soja em sua composição, atingindo o percentual médio
de 60,47% do total de amostras analisadas durante todo o período. No entanto, a
partir de 2003, a demanda por amostras que apresentam apenas a matriz soja em
sua composição decresceu, passando do percentual de 80,16% em 2002, 64,18%
em 2003, 40,68% em 2004, e 34,41% em 2005. A distribuição das amostras por tipo
de matriz no decorrer dos anos em que estas foram analisadas está apresentada na
Figura 2.
Como esperado, a demanda pela análise de amostras que apresentavam milho
em sua composição foi imediatamente inferior à dos produtos que continham soja,
atingindo o percentual médio de 25,43% do total de amostras analisadas no período.
A terceira maior demanda foi pela análise de amostras que continham as duas
matrizes em sua composição, que atingiu o percentual médio de 18,18%.
Grãos e produtos contendo soja RR em sua composição foram somente
liberados para comércio no país em 2003, no entanto, a demanda pela análise
desses produtos já havia se iniciado bem anteriormente, inclusive de produtos que
apresentavam além de soja, outras matrizes em sua composição, como por
exemplo, as contendo milho ou ambos. A demanda pela detecção de milho
transgênico ocorreu no mesmo ano em que foram feitas as primeiras análises de
41
soja, em 2000. Neste ano o percentual de amostras analisadas que apresentavam
soja em sua composição foi de 76,67% comparados com apenas 15,56% das
amostras de milho. No decorrer dos seis anos houve elevação da demanda de
amostras de milho, com exceção do ano de 2002, e culminou com o estabelecimeto
de níveis similares da demanda para as duas matrizes em 2005, em 34,41% para
soja e 30,58% para milho.
A demanda de análise de produtos que apresentavam milho e soja em sua
composição também foi se elevando durante o período, estando em 2000 em cerca
de 7,78% e atingindo, em 2005, 18,91% do total de amostras analisadas.
Porcentagem das Amostras Analisadas por Tipo de Matriz
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
2000 2001 2002 2003 2004 2005
Ano
Percentual
Soja
Milho
Mista (soja + milho)
Mista (soja + milho + trigo)
FIGURA 2 – Percentual de produtos analisados de acordo com o tipo de matriz no
período de 2000 a 2005.
A demanda pela análise de produtos que contêm simultaneamente as
matrizes soja, milho e trigo iniciou em 2003, inicialmente correpondendo apenas a
0,40% do total de amostras, e, atingindo, em 2005, 15,09%. Embora não haja
nenhum evento de trigo GM liberado para plantio e comércio no mundo, percebeu-se
a maior freqüência pela demanda de análise de amostras contendo esta matriz,
principalmente caracterizada pelas amostras de farinha de trigo, que correponderam
a 13,88% do total de amostras analisadas em 2005. Um fato que parece ter
42
contribuído para elevação desta demanda é a ocorrência de contaminação cruzada
durante as etapas de colheita, trasporte e processamento de grãos de trigo com
grãos de soja GM nos Estados do Sul do país, onde as duas culturas são plantadas
lado a lado ou no estilo de rotação de culturas. Os níveis de contaminação dos grãos
de trigo com grãos de soja podem chegar a cerca de 5% (comunicação pessoal). A
utilização de grãos de soja no processo de branqueamento da farinha também é um
fator que justifica a presença desta matriz em produtos a base de trigo. Deste modo
tornou-se possível a detecção de resíduos de soja RR em amostras de farinha de
trigo. Atualmente, há em trigo apenas três eventos com alterações genética obtidas
por mutagênese química, que oferecem resistência ao herbicida imidazolina
(AgdataBios, 2006).
A análise de produtos contendo outras matrizes que já apresentam eventos
GM liberados em alguns países, como batata, canola, algodão e arroz foi verificada
no decorrer dos cinco anos, no entanto, a freqüência foi bastante baixa e nenhuma
das amostras contendo estas matrizes apresentou resultado positivo para a
presença de resíduos de transgênicos.
3.3. Demanda pela análise por região do país
No período de seis anos, de 2000 a 2005, foram analisadas 3.944 enviadas de
diferentes regiões do país e por clientes dos mais variados tipos de perfis, desde
produtores de médio e grande porte, empresas que utilizavam soja e/ou milho na
composição de seus produtos, portos, cooperativas e criadores de animais.
A distribuição da demanda de amostras para análise de detecção e
quantificação de resíduos transgênicos por estado, no período de 2000 a 2005, pode
ser observada na Tabela 2. De acordo com os resultados, os principais estados em
que houve demanda para análises de resíduos de transgênicos, durante todos os
anos em que estas foram conduzidas, foram Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do
Sul, Minas Gerais, São Paulo e Bahia. Os estados do Ceará e Goiás
esporadicamente tiveram uma demanda um pouco mais significativa que os estados
do Amazonas, Espírito Santo,Pernambuco e Mato Grosso.
Segundo dados da CONAB, os principais estados produtores de soja no país
são, em ordem de produção, Mato Grosso, Paraná, Rio Grande do Sul e Minas
Gerais. Todos estes estados apresentaram alguma demanda para análise de
transgênicos, sendo que o estado de Santa Catarina foi o que mais se destacou em
43
número de amostras enviadas para análise (1.440), seguido do estado de São Paulo
(1.211). Em contrapartida, o estado de Mato Grosso, embora seja o maior produtor
de soja do país, contribuiu de modo incipiente no total de amostras analisadas, o que
pode ser inferido pelo fato do estado ser o que mais utiliza sementes de soja
fiscalizada. Na safra 2001/2002, 95% das sementes utilizadas para plantio foram
certificadas, o que reduz a probabilidade de transgênicos na região (PIMENTA
2003). Embora o estado do Rio Grande do Sul não tenha se destacado pela
demanda de análise, segundo estivamativas da Associação Brasileira de Produtores
de Sementes (ABRASEM), este estado é o que apresenta o maior índice de
utilização de soja transgênica nos últimos anos.
Nos anos iniciais em que as amostras foram analisadas, estas foram
principalmente enviadas por clientes de estados da região Sul do país, destacando-
se o estado do Paraná em 2000 e 2001, responsável pela demanda de 64,44% e
47,84% das amostras enviadas para análise, respectivamente, e Santa Catarina em
2002 e 2003, com a demanda de 51,64% e 47,00% , respectivamente.
Durante todo o período percebeu-se um aumento gradativo do percentual de
amostras enviadas por clientes do estado de São Paulo, sendo responsável em
2000 por apenas 10% das amostras enviadas para análise e atingindo os valores de
44,91% e 45,27% do total de amostras em 2004 e 2005, respectivamente. Em
contrapartida, os estados de Santa Catarina e Paraná apresentaram um declínio
acentuado durante o mesmo período, atingindo os percentuais de 33,78% e 7,72%
em 2004, 20,72% e 16,90% em 2005, respectivamente.
Tal panorama pode ser compreendido pela ocorrência da normatização de
questões referentes à rotulagem, que passou a exigir a informação referente ao
percentual da presença de resíduos transgênicos a partir do produto final, tanto para
produtos a granel como para embalados. Deste modo, um maior número de
empresas que utilizavam alguma matriz potencialmente GM, na sua grande maioria
no estado de São Paulo, passou a se preocupar com os níveis destes resíduos em
suas amostras nas prateleiras dos supermercados. Tal fato corrobora com a
distribuição da demanda de produtos de acordo com os níveis de processamento,
que atingiu os percentuais mais elevados de 51,97% e 53,72%, em 2004 e 2005,
respectivamente. Em contrapartida à elevação do percentual de análise de produtos
processados, a demanda pela análise de produtos
in natura
apresentou radical
queda no mesmo período, passando de 45,41% em 2002 para 15,29% em 2005.
44
TABELA 2 - Distribuição da demanda de amostras para análise de detecção e quantificação de resíduos transgênicos por Estado
no período de 2000 a 2005.
2000 2001 2002 2003 2004 2005
ESTADO
Número
de
Amostras %
Número
de
Amostras %
Número de
Amostras %
Número de
Amostras %
Número
de
Amostras %
Número de
Amostras %
AM 0 0,00 0 0,00 0 0,00 2 0,27 1 0,07 2 0,40
BA 0 0,00 16 3,64 0 0,00 0 0,00 83 6,16 23 4,63
CE 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 15 1,11 17 3,42
ES 0 0,00 0 0,00 0 0,00 1 0,13 1 0,07 0 0,00
GO 4 2,22 0 0,00 0 0,00 3 0,40 10 0,74 1 0,20
MG 7 3,89 33 7,52 1 0,14 9 1,20 28 2,08 28 5,63
MS 0 0,00 0 0,00 0 0,00 2 0,27 0 0,00 0 0,00
MT 0 0,00 0 0,00 1 0,14 0 0,00 0 0,00 0 0,00
PR 116 64,44 210 47,84 146 20,00 112 14,91 104 7,72 84 16,90
PE 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 3 0,22 1 0,20
RS 13 7,22 20 4,56 100 13,70 71 9,45 42 3,12 13 2,62
SC 22 12,22 100 22,78 377 51,64 353 47,00 455 33,78 103 20,72
SP 18 10,00 60 13,67 105 14,38 198 26,36 605 44,91 225 45,27
TOTAL 180 439 730 751 1347 497
45
3.4. Avaliação das amostras quanto a presença de resíduos
transgênicos
Ao longo dos anos em que grãos e diferentes tipos de alimentos
in natura
e
processados foram analisados para a presença de resíduos GM, pôde-se observar
um aumento gradual no número de amostras positivas, demonstrando que mesmo
quando o plantio e a comercialização de OGM eram proibidos no país, estes de
alguma forma estavam presentes no mercado, pelo menos, desde o ano de 2000.
Em 2000 apenas 5% do total das amostras analisadas foram positivas. Em
2001, esse percentual subiu para 11,39%, e atingiu o percentual de 28,45% em
2002. Em 2003 o percentual permaneceu constante em torno de 28,23%, sofrendo
uma leve redução em 2004 para 25,69%, o que pode ser devido à publicação do
decreto de rotulagem em abril do ano anterior ou devido a um maior volume de
amostras analisadas durante este ano, totalizando 1.347 amostras. No ano seguinte,
2005, o percentual de amostras positivas continuou a subir atingindo o valor de
28,17%. A distribuição do percentual de amostras positivas com relação ao total de
amostras analisadas durante os seis anos, bem como a distribuição deste percentual
dentro de cada grupo de produto (grãos,
in natura
e processados) pode ser
observada na Figura 3.
A cada ano foi possível determinar quais classes de produtos contribuíram
para elevação do percentual de amostras positivas com relação ao total de amostras
analisadas no ano, conforme os dados apresentados na Tabela 3.
Em 2000, apenas duas classes de produtos, farelo de soja e soja grão,
apresentaram amostras positivas, consistindo de 1,11% e 3,89% do total de
amostras analisadas, e conseqüentemente responsáveis pelo total de 5,0% de
amotras positivas detectadas naquele ano. Estas duas classes apresentaram
amostras positivas durante todo o período em que as amostras foram analisadas,
sendo que grandes variações nos percentuais de amostras positivas foram
observadas. Até 2003 estas duas classes apresentaram o maior número de
amostras positivas com relação ao total de amostras analisadas, sendo o valor mais
elevado para as amostras da classe de soja grão detectado em 2001, representando
7,74% do total de 11,39% de amostras positivas detectadas no ano, enquanto as da
classe de farelo de soja em 2002, representando 7,93% do total de 28,45% de
amostras positivas detectadas naquele ano. Estes dados evidenciam que o Brasil
46
cultivou soja GM de forma ilegal durante o período de 2000 a 2005, parte desta soja
provavelmente contrabandeada de países onde sua liberação já havia ocorrido na
época, como a Argentina. Esta situação culminou com a publicação das Leis Nº
10.688, Nº 10.814 e Nº 11.092, nos anos 2000, 2004 e 2005 repectivamente,
autorizando a comercialização da safra. Apenas em março de 2005, com a
publicação da nova Lei de Biossegurança Nº 11.105, foi que a soja resistente ao
glifosato passou a ser cultivada e comercializada legalmente no país. No entanto,
qualquer produto que contenha resíduos transgênicos acima de 1% do produto final
deve trazer esta informação no rótulo para conhecimento do consumidor.
0
5
10
15
20
25
30
Percentual de amostras positivas
2000 2001 2002 2003 2004 2005
Ano
Percentual de amostras positivas por grupos de produtos
no período 2000-2005
Processados
In natura
Grão
FIGURA 3 – Distribuição percentual de amostras positivas para a presença de resíduos
transgênicos, por grupo de produtos, com relação ao total de amostras
analisadas durante o período de 2000 a 2005.
47
A partir de 2001, além destas duas classes, amostras incluídas na classe
ração também passaram a apresentar amostras positivas para a presença de
resíduos transgênicos anualmente, sendo que no ano de 2002 este número atingiu
seu clímax, representando 3,56% do total de amostras analisadas. Nos três anos
seguintes em que as amostras foram analisadas, o percentual de amostras positivas
nesta classe foi decaindo gradativamente, apresentando os percentuais de 1,73%,
1,41% e 0,80% de amostras positivas com relação ao total de amostras analisadas
nos anos 2003, 2004 e 2005, respectivamente.
Em 2001, as primeiras amostras incluídas no grupo de produtos processados,
representada pela classe de matinais, apresentou resultado positivo para a presença
de resíduos transgênicos. Naquele ano estas amostras contribuíram com 0,23% do
total de 11,39% de amostras positivas detectadas. Em 2002, outras classes de
produtos processados passaram a apresentar resíduos transgênicos, são elas:
condimentos e temperos, óleos e gorduras e produtos cárneos. As amostras de
produtos cárneos se destacaram, representando 7,93% do total de 28,45% de
amostras positivas detectadas no ano. Ainda em 2002, além da classe ração, as
classes produtos protéicos de soja e lecitina, representando o grupo de produtos
in
natura
, apresentaram os percentuais de 0,96% e 0,82% de amostras positivas,
respectivamente.
Em 2003, as primeiras amostras de milho transgênico foram detectadas e
representaram 0,80% do total de 28,23% de amostras positivas detectadas no ano.
Nos dois anos seguintes, 2004 e 2005, amostras de milho GM continuaram a ser
detectadas, atingindo os percentuais de 0,52% e 1,61% do total de amostras
analisadas, repectivamente. Amostras processadas contendo a matriz milho em sua
composição, como as de fubá de milho, analisadas em 2003, e as de amido em
2004 e 2005, também apresentaram milho GM em sua composição, sendo
responsáveis por 0,13%, 0,67% e 0,60% das amostras positivas detectadas nos
respectivos anos. Até a presente data, nenhum evento de milho GM tem autorização
para ser cultivado ou comercializado no país. Apenas em abril de 2004, a CTNBio
aprovou a importação de 400.000 toneladas de milho GM, para os eventos, Bt11,
LibertyLink
e NK603, pela Associação Avícola de Pernambuco. No entanto, todo o
carregamento deveria apenas ser utilizado como ração e para consumo próprio da
associação (Parecer 530 da CTNBio/2004).
48
TABELA 3 - Distribuição de amostras positivas com relação ao total de amostras analisadas durante o período de 2000-2005.
2000 2001 2002
Produtos N Negativo Positivo % (Positivo/total) N Negativo Positivo % (Positivo/total) N Negativo Positivo % (Positivo/total)
Amido de Milho
0 0 0 0,00 0 0 0 0,00 0 0 0 0,00
Bebidas Lácteas
0 0 0 0,00 0 0 0 0,00 0 0 0 0,00
Biscoitos
0 0 0 0,00 0 0 0 0,00 0 0 0 0,00
Condimentos e Temperos
0 0 0 0,00 2 2 0 0,00 11 7 4 0,55
Empanados
0 0 0 0,00 0 0 0 0,00 0 0 0 0,00
Farelo de Soja
17 15 2 1,11 41 35 6 1,37 106 48 58 7,93
Farinha de Trigo
0 0 0 0,00 0 0 0 0,00 0 0 0 0,00
Lecitina
6 6 0 0,00 13 13 0 0,00 8 2 6 0,82
Macarrão e Massas
0 0 0 0,00 0 0 0 0,00 0 0 0 0,00
Matinais
6 6 0 0,00 21 20 1 0,23 27 27 0 0,00
Milho Grão
24 24 0 0,00 0 0 0 0,00 57 57 0 0,00
Mistura para Bolo
12 12 0 0,00 0 0 0 0,00 0 0 0 0,00
Mistura para Empanados
0 0 0 0,00 0 0 0 0,00 0 0 0 0,00
Óleos e Gorduras
0 0 0 0,00 1 1 0 0,00 5 3 2 0,27
Outros
22 22 0 0,00 45 44 1 0,23 34 32 2 0,27
Produtos Cárneos
0 0 0 0,00 5 5 0 0,00 92 34 58 7,93
Ração
2 2 0 0,00 37 29 8 1,82 53 27 26 3,56
Salsicha
0 0 0 0,00 0 0 0 0,00 0 0 0 0,00
Soja Grão
54 47 7 3,89 96 62 34 7,74 142 97 45 6,16
Sopas
0 0 0 0,00 4 4 0 0,00 17 17 0 0,00
Sucos Naturais
0 0 0 0,00 0 0 0 0,00 0 0 0 0,00
Produtos Protéicos de
Soja
37 37 0 0,00 104 104 0 0,00 179 172 7 0,96
Total
180 171 9 5,00 439 389 50 11,39 731 523 208 28,45
N – número de amostras analisadas
49
continuação da Tabela 3
2003 2004 2005
Produtos N Negativo Positivo % (Positivo/total) N Negativo Positivo % (Positivo/total) N Negativo Positivo % (Positivo/total)
Amido de Milho
65 65 0 0,00 22 13 9 0,67 10 7 3 0,60
Bebidas Lácteas
8 8 0 0,00 18 14 4 0,30 12 12 0 0,00
Biscoitos
0 0 0 0,00 16 16 0 0,00 12 7 5 1,01
Condimentos e Temperos
17 7 10 1,33 95 65 30 2,23 12 11 1 0,20
Empanados
0 0 0 0,00 23 13 10 0,74 10 0 10 2,01
Farelo de Soja
90 39 51 6,79 59 38 21 1,56 23 12 11 2,21
Farinha de Trigo
0 0 0 0,00 70 48 22 1,63 69 61 8 1,61
Fubá de Milho
7 6 1 0,13 0 0 0 0,00 0 0 0 0,00
Lecitina
0 0 0 0,00 5 4 1 0,07 3 2 1 0,20
Macarrão e Massas
0 0 0 0,00 27 11 16 1,19 4 2 2 0,40
Matinais
8 5 3 0,40 56 52 4 0,30 23 17 6 1,21
Milho Grão
108 102 6 0,80 337 330 7 0,52 130 122 8 1,61
Mistura para Bolo
0 0 0 0,00 44 29 15 1,11 14 8 6 1,21
Mistura para Empanados
24 16 8 1,07 132 82 50 3,71 12 1 11 2,21
Óleos e Gorduras
5 5 0 0,00 35 25 10 0,74 2 2 0 0,00
Outros
34 29 5 0,67 95 84 11 0,82 42 38 4 0,80
Produtos Cárneos
14 6 8 1,07 22 10 12 0,89 5 2 3 0,60
Ração
47 34 13 1,73 68 49 19 1,41 22 18 4 0,80
Salsicha
35 6 29 3,86 90 38 52 3,86 62 7 55 11,07
Soja Grão
104 47 57 7,59 33 19 14 1,04 19 17 2 0,40
Sopas
0 0 0 0,00 0 0 0 0,00 0 0 0 0,00
Sucos Naturais
5 5 0 0,00 0 0 0 0,00 3 3 0 0,00
Produtos Protéicos de
Soja
180 159 21 2,80% 100 61 39 2,90 8 8 0 0,00
Total
751 539 212 28,23 1347 1001 346 25,69 497 357 140 28,17
N – número de amostras analisadas
50
Nos anos de 2004 e 2005, a diversificação das classes de produtos que
apresentavam resíduos transgênicos ampliou-se, destacando-se as amostras da
classe salsicha, que desde 2003, quando foram inicialmente analisadas, passaram a
apresentar amostras positivas, atingindo o percentual de 11,07% do total de 28,07%
de amostras positivas detectadas em 2005.
A partir de 2004 também se iniciou a demanda pela análise de amostras de
farinha de trigo, composta pelas matrizes soja, milho e trigo. A partir da análise
evento específica foi possível detectar tanto soja como milho GM compondo o
produto. Em 2004, amostras de farinha de trigo contendo resíduos trangênicos
atingiram 1,63% do total de amostras analisadas. Este percentual praticamente
permaneceu o mesmo em 2005, em 1,61%.
Os percentuais acumulados de amostras positivas com relação ao total de
amostras analisadas dentro de cada classe, no decorrer dos seis anos, também
foram determinados (Tabela 4). Esta informação, aliada ao percentual acumulado da
demanda destes produtos no mesmo período, permite obter valores reais da
distribuição de amostras positivas em cada classe de produto, uma vez que a
distribuição do número de amostras não foi constante durantes os anos, mas em
função da demanda das mesmas.
De acordo com os resultados, as principais classes de produto analisadas
durante os seis anos estão concentradas nas amostras de grãos e produtos
in
natura
. Estas classes foram, de acordo com ordem de predominância, milho grão
(18,41%), diferentes produtos protéicos de soja (15,42%), soja grão (11,36%)
farelode soja (8,52%) e ração (5,81%). Considerando o nível de predominância, a
classe de farelo de soja e soja grão foram as que mais se destacaram com relação
ao percentual de amostras positivas por classe, atingindo os valores de 44,35% e
35,49%, respectivamente. Em contrapartida, as amostras de milho grão
apresentaram um baixo percentual de amostras positivas dentro da classe, apenas
2,89%, o que representa apenas 21 amostras positivas do total de 726 amostras
analisadas, uma vez que a predominância da demanda por este tipo de amostra foi a
mais elevada, se considerando o total de amostras analisadas nos seis anos.
Dentre os produtos processados, a demanda de análise de amostras da classe
de salsicha foi a que mais se destacou, atingindo o total de 4,74% do total de
amostras analisadas. Da mesma forma, o percentual de amostras positivas dentro
desta classe também foi significativamente mais elevado, superando o total de 72%
51
das amostras de salsichas analisadas. Na classe de produtos cárneos, com
predominância de 3,50% do total de produtos analisados, o percentual de amostras
positivas com relação ao total de amostras da classe, também superou o percentual
acumulado de 50%.
Excetuando-se as amostras pertencentes às classes de sucos naturais e sopas,
pelo menos uma amostra positiva para a presença de resíduos de transgênicos foi
detectada dentro de cada classe em um determinado momento.
3.5. Demada de Análise Qualitativa x Análise Quantitativa
O Laboratório de Análises Genéticas passou a receber amostras para análise
de resíduos de transgênicos a partir do ano 2000. Inicialmente o Laboratório
somente oferecia o serviço de detecção de transgênicos, iniciando as análises de
quantificação destes resíduos em abril de 2002, de modo que todas as amostras
analisadas nos anos anteriores foram apenas qualitativas. Até então, embora já
houvesse sido estabelecido o percentual de 4% para a presença acidental de
resíduos transgênicos em amostras embaladas comercializadas no país, não havia
nenhum laboratório, tanto nacional ou internacional, público ou privado, que
oferecesse tal serviço.
A partir de 2002, a AgroGenética passou a receber amostras para
quantificação, e já neste ano a demanda pela análise quantitativa representou
45,92% do total de amostras analisadas. No ano seguinte, a demanda pela análise
quantitativa superou o percentual de 50%, atingindo o valor de 57,15% do total de
amostras analisadas. Justamente em 2003 estabeleceu-se o decréscimo no limite
permitido para presença de resíduos transgênicos em alimentos de 4% para 1% do
produto final. Em termos de rastreabilidade da cadeia produtiva, este descréscimo
acarreta medidas mais efetivas para monitoramento dos níveis de resíduos GM que
podem estar inerentes na composição dos produtos. Mesmo resíduos provenientes
de contaminação cruzada se tornaram grandes riscos para contaminação de lotes
não GM.
Em 2004, observou-se uma redução no percentual da demanda pela análise
quantitativa para 38,63%, mas superior, em termos absolutos, aos anos anteriores,
representando 520 amostras do total de 1347 analisadas no ano, comparadas com
os valores de 335 e 429 analisadas nos anos 2002 e 2003, respectivamente.
52
TABELA 4 - Distribuição acumulada de amostras positivas com relação ao total de amostras analisadas dentro de cada classe
durante o período de 2000 a 2005.
Produto
Total de Amostras
Negativas
Total de Amostras
Positivas
Total de Amostras
da Classe
% (Classe / Total de Amostras
Analisadas)
% (Positiva / Classe)
Amido de Milho 85 12 97 2,46 12,37
Bebidas Lácteas 34 4 38 0,96 10,53
Biscoitos 23 5 28 0,71 17,86
Condimentos e Temperos 92 45 137 3,47 32,85
Empanados 13 20 33 0,84 60,61
Farelo de Soja 187 149 336 8,52 44,35
Farinha de Trigo 109 30 139 3,52 21,58
Fubá de Milho 6 1 7 0,18 14,29
Lecitina 27 8 35 0,89 22,86
Matinais 127 14 141 3,58 9,93
Macarrão e Massas 13 18 31 0,79 58,06
Milho Grão 705 21 726 18,41 2,89
Mistura para Bolo 49 21 70 1,77 30,00
Mistura para Empanados 99 69 168 4,26 41,07
Óleos e Gorduras 36 12 48 1,22 25,00
Outros 249 23 272 6,90 8,46
Produtos Cárneos 57 81 138 3,50 58,70
Ração 159 70 229 5,81 30,57
Salsicha 51 136 187 4,74 72,73
Soja Grão 289 159 448 11,36 35,49
Sopas 21 0 21 0,53 0,00
Sucos Naturais 8 0 8 0,20 0,00
Produtos Protéicos de Soja 541 67 608 15,42 11,02
TOTAL 2.980 965 3.944
53
Em 2005, o percentual de amostras analisadas quantitativamente foi de
49,53%, representando 246 do total de 497 amostras analisadas no ano.
O número total de amostras analisadas quantitativamente foi de 1530 do total
de 3.325 amostras analisadas no período de 2002 a 2005. Outo fator que pode
restringir a demanda pela análise quantativa é o custo, que pode chegar a 30% a
mais do valor da análise qualitativa.
A distribuição da demanda de análise quantitativa e qualitativa, no período de
2002 a 2005 está represetada na Figura 4.
3.5. Avaliação das amostras quanto a presença de resíduos
transgênicos acima do limite de 1%
A partir de abril de 2003, o percentual permitido para a ocorrência de resíduos
transgênicos em alimentos, para que não seja necessária a rotulagem do produto, é
de 1% do produto final. Deste modo as análises de quantificação, principalmente as
baseadas na técnica de PCR quantitativo, tem se revelado importantes ferramentas
para auxílio em medidas de fiscalização e rastreabilidade da cadeia produtiva.
Durante o período de 2002 a 2005, 1530 amostras foram quantificadas, e
destas, cerca de 626 (40,92%) apresentaram resíduos de DNA GM acima de 0,1% do
total de DNA da espécie analisada.
Do total de 626 amostras, analisadas durante o período de 2002 a 2005, que
apresentaram resultados positivos para a presença de DNA GM, cerca de 46,01%
apresentou resíduos de transgênicos acima de 1,0% e 27,48% acima de 5,0%. Dentre
os quatro anos em que as amostras foram analisadas, o ano de 2003 apresentou o
maior percentual de amostras com resíduos GM superiores a 1,0%, superando 60%
do total de amostras positivas quantificadas, enquanto 2005 apresentou o menor
percentual, com cerca de 25% de amostras.
O ano de 2003 também se destacou com o maior percentual de amostras
contendo resíduos de transgênicos acima de 5,0% do total de DNA da espécie
analisada, atingindo o percentual de 39,78%. Em contrapartida, em 2005, amostras
contendo resíduos de transgênicos acima de 5% foi de apenas 14,63%.
A distribuição da amostras quantitativas, positivas e negativas para a presença
de resíduos de transgênicos, e ainda de acordo com os níveis percentuais da
54
presença de resíduos transgênicos, 1% e 5%, analisadas durante o período de 2002 a
2005, encontra-se na Tabela 5.
Embora tenham sido detectadas amostras contendo percentuais de DNA GM
acima de 1% e 5% do total de DNA da espécie analisada, acima de 50% do total 626
amostras analisadas por PCR quantitativo apresentaram resíduos transgênicos com
percentuais inferiores a 1%, logo não necessitariam ser rotulados. Com relação às
amostras com níveis de DNA GM superiores a 1% e 5% do DNA total da espécie
analisada, para se inferir sobre a necessidade de rotulagem, segundo os critérios
legislativos nacionais, seria necessário verificar quanto da composição do produto é
atribuída à espécie analisada. Isto ocorre pelo fato da legislação nacional sobre
rotulagem se referir ao percentual de resíduo transgênico com relação ao produto final
e a técnica de quantificação baseia-se apenas no DNA da espécie em questão.
Este tipo de legislação é apenas empregada no Brasil. Todos os demais países
que adotaram níveis permitidos para a presença de resíduos transgênicos, o
estabeleceram com base no percentual em que a matriz contribui para o produto final,
e não considerando o produto final como um todo (MACKENZIE, 2000).
45,92
54,08
57,15
42,85
38,63
61,37
49,53
50,47
0
10
20
30
40
50
60
70
Percentual de Análises
2002 2003 2004 2005
Ano
Demanda pelas Análises Qualitativas e Quantitativas
Análises Quantitativas
Análises Qualitativas
FIGURA 4 – Distribuição percentual da demanda de análise quantitativa e qualitativa com
relação ao total de amostras analisadas durante
o período
de 2000 a 2005.
55
TABELA 5 - Distribuição das amostras positivas com relação aos níveis percentuais
da presença de resíduos transgênicos no período de 2002 a 2005.
Ano Amostras Negativas Amostras Positivas >1,0%
% <1,0%
% >5,0% %
2002 220 115 51 44,35 64 55,65 28 24,35
2003 248 181 109 60,22 72 39,78 72 39,78
2004 313 207 97 46,86 110 53,14 54 26,09
2005 123 123 31 25,20 92 74,80 18 14,63
Total 904 626 288 46,01 338 53,99 172 27,48
56
4. CONCLUSÕES
- Produtos contendo resíduos de transgênicos estão presentes em amostras de
alimentos consumidas no Brasil, pelo menos, desde o ano 2000. Dentre estes,
destacam-se a soja RR e o evento de milho Bt11.
- A presença de resíduos transgênicos foi detectada nos três diferentes
gruupos de produtos analisados, grãos
, in natura
e processados. Dentre as diferentes
classes de produtos processados analisadas, considerando o nível de predominância
da demanda pela análise, as classes de farelo de soja e soja grão foram as que mais
se destacaram com relação ao percentual de amostras positivas por classe. Dentre os
produtos processados, as classes de salsichas, empanados, produtos cárneos,
mistura para empanados e condimentos foram as que apresentaram os maiores
percentuais de resíduos transgênicos do total de amostras analisadas dentro da
classe.
- A demanda de análise de resíduos transgênicos ocorreu, principalmente, para
produtos
in natura
e grãos até o ano de 2003. A partir deste ano, a demanda se
concentrou em amostras de produtos processados, que nos anos de 2004 e 2005
superou o percentual de 50% dos produtos analisados. Nestes anos também houve
uma elevação do percentual de amostras provenientes do estado de São Paulo,
sugerindo maior interesse por parte de empresas que utilizam matrizes
potencialmente GM na composição de seus produtos a rastrearem sua cadeia
produtiva. Tal comportamento parece ter sido influenciado principalmente pela
preferência do mercado consumidor em amostras livres de transgênicos ao invés de
medidas fiscais realizadas pelos Órgãos públicos. No entanto, a publicação do
decreto de rotulagem em 2003, que determinou a exigência de rotulagem dos
57
produtos, com informações a cerca do tipo de evento transgênico e espécie doadora,
caso o produto apresentasse resíduos de transgênicos acima de 1% do produto final,
parece ter norteado ações efetivas de rastreabilidade da cadeia produtiva e
certificação das matrizes constituintes dos produtos.
- De todas as classes de produtos analisadas durante os seis anos, excetuando-
se as classes de sucos naturais e sopas, pelo menos uma amostra positiva para a
presença de resíduos de transgênicos, foi detectada dentro de cada classe, em um
determinado momento.
58
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ZIMMERMANN, A. LUTHY, J.; PAULI, U. (2000). Event specific transgene detection in
Bt11 corn by quantitative PCR at the integration site. Lebensm. Wiss.Technol.,
33: 210-216.
60
Capítulo II
Detection and Quantification of Roundup Ready
®
soybean residues
in sausage samples by conventional and Real-Time PCR
Francismar Corrêa Marcelino
a, b, c
, Everaldo G. de Barros
b, d,
, Marta F. M.
Guimarães
a, e
a
AgroGenética,
b
Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária,
c
Embrapa Trigo,
d
Department of General Biology , Federal University of Viçosa,
e
Embrapa Gado de Leite, Brazil
Abstract
The increasing presence of products derived from genetically modified (GM) plants in
human and animal diets has led to the development of detection methods to
distinguish biotechnology-derived foods from the conventional ones. The conventional
and real-time PCR have been used, respectively, to detect and quantify GM residues
in highly processed foods. DNA extraction is a critical step during the analysis process.
Some factors such as DNA degradation, matrix effects, and presence of PCR
inhibitors imply that a detection or quantification limit, established for a given method,
is restricted to a matrix used during validation and cannot be projected to any other
matrix outside the scope of the method. In Brazil, sausage samples were the main
class of processed products in which Roundup Ready
®
(RR) soybean residues were
detected. Thus, the validation of methodologies for detection and quantification of
these residues is urgent. Sausage samples were submitted to two different methods of
DNA extraction: modified Wizard and the CTAB method. The yield and quality were
compared for both methods. DNA samples were analyzed by conventional and real-
time PCR for detection and quantification of Roundup Ready
®
soybean in the samples.
At least 200 ng of total sausage DNA was necessary for a reliable quantification.
Reactions containing DNA amounts below this value led to large variations on the
61
expected GM percentage value. In conventional PCR the detection limit varied from
1.0 to 500 ng, depending on the GM soybean content in the sample. The precision,
performance and linearity were relatively high, indicating that the method used for
analysis was satisfactory.
Keywords: Real-time PCR, GMO, Sausage
62
1. Introduction
The cultivation of genetically modified (GM) plant species has dramatically
increased within the last 10 years. The area planted with GM crops has increased from
1.7 million ha in 1996 to 90 million ha in 2005 (James, 2006). In Brazil, growers were
first authorized to sell RR
®
soybean in 2003. In 2004 and 2005 both cultivation and
commercialization of RR
®
soybean were authorized by the Brazilian government. As
GM soybean cultivation increased in the country, the presence of GM residues in
human and animal food proportionally rose. According to the Brazilian legislation the
presence of GM residues exceeding the threshold limit of 1% needs to be informed on
the food label.
A screening for the presence of transgenic residues, during the period from
2003 to 2005, in different processed products commercialized in the national market,
revealed that sausages constitute the main product class in which these residues were
detected (MARCELINO, 2006). From the analyses of about 200 sausage samples of
different brands, randomly collected in the national market, over 70% were positive for
the presence of residues of RR
®
soybean. Considering this high percentage, the
present work proposes the validation of a methodology for detection and quantification
of residues of RR
®
soybean in these samples.
RR
®
soybean residues in non-processed foods can be detected and quantified
based on the presence of the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase protein
(EPSPS) by immunological methods (Duijn, Biert, Marcelis, Peppelman, & Hessing,
1999; Lipp, Anklam & Stave, 2000). Processed foods are usually analyzed with DNA-
based procedures. The DNA-based methods make use of the polymerase chain
reaction (PCR) technique and can be applied both to products
in natura
and to highly
processed foods. However, some products offer many inconveniences for obtention of
DNA extract with satisfactory amplificability
(
Vaitilingom, Pijnenburg, Gendre &
Brignon, 1999; Lipp, Bluth, Eyquem, Kruse, Schimmel, Van den eed, & Anklam, 2001;
Hübner, Studer & Lüthy, 1999; Vollenhofer, Burg, Schmidt, & Kroath, 1999; Cardarellli,
Branquinho, Ferreira, Cruz & Gemal, 2005).
The analysis of processed foods presents some difficulties because of the
several treatments that the original ingredients have to undergo during processing;
besides, several ingredients may be present in the final product. Some ingredients,
63
such as proteins, polysaccharides, fat, salt, colorings, and others, may inhibit the PCR
reaction (Terry, Harris & Parkes, 2002). Chemical and physical treatments may lead to
extensive DNA fragmentation preventing its use as template in the PCR reaction
(Meyer, 1999
).
These effects imply that a detection or quantification limit, established
for a given method, is restricted to a matrix used during validation and cannot be
projected to any other matrix outside the scope of the method (Lipp
et al
., 2005).
Sausage samples undergo physical and chemical treatments during their
production, as well as addition of different ingredients.
Sausages are an industrial meat product obtained by emulsification of meat
from one or several animal species. Coloring may be added to the sausages and they
may also undergo smoking and/or peeling. In Brazil, sausages can contain up to 7.5%
(dry basis) or 22.5% (wet basis) of textured soybean protein. Moreover, other
ingredients may be added to the sausage, such as animal fat or vegetable oil, salt,
water, emulsifiers, colorings, sugars, aromatic substances, and seasonings. During its
preparation the product undergoes cooking at 72°C for at least 0.5 hour.
The aim of the present work was the establishment of a methodology for
detection and quantification of RR
®
soybean residues in samples of sausages
commercialized in the national market, using the PCR technique.
The sausage samples were submitted to two different methods for DNA
extraction, and the DNA was analyzed by conventional and real-time PCR for
detection and quantification of Roundup Ready
®
soybean in the samples. The
detection and quantification limits were established. The precision, performance and
linearity were relatively high, indicating that the employed method of analysis was
satisfactory.
64
2. Materials and Methods
2.1. Soybean food samples
Sausage samples of different brands and batches were randomly collected in
the national market.
2.2. Soybean Reference samples
Certified reference material (CRM), i.e., soybean powder containing 0.1 to 5.0%
Roundup Ready
soybean (Fluka), was used for qualitative and quantitative analyses.
RR
soybean grains were also used as a control.
2.3. Genomic DNA Extraction
Duplicate samples of approximately 500 g of sausage were homogenized in an
electric blender. The DNA extraction was tested by two different methodologies:
modified Wizard and the CTAB method.
Modified Wizard Method
: In the modified Wizard method, 1,290 µL extraction
buffer [10mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, and 1% SDS], 150 µL 5M
guanidine hydrochloride and proteinase K (20 mg/mL) were added to 500 mg of each
sample and vortexed until a homogeneous mixture was obtained. The samples were
incubated at 55ºC for 12 h and centrifuged for 15 min at 6,000
g
. About 500 µL of the
supernatant was mixed with 1 mL of Wizard resin (Promega) and then applied to a
Wizard mini column. The column was washed with 2 mL 80% ethanol and then
centrifuged at 10.000
g
for 2 min to eliminate residual ethanol. The nucleic acids were
eluted with 50 µL of water at 70ºC and stored at –20ºC.
CTAB Method
: In the CTAB method approximately 100 mg of homogenized
sausage samples were mixed with 500 µL CTAB buffer [50 mM CTAB, 1.4 M NaCl,
100 mM Tris-HCl (pH 8), 20 mM EDTA] and incubated at 65ºC for 20 min. The
samples were deproteinized with 520 µL chloroform: isoamylic alcohol (24:1), vortexed
and centrifuged for 10 min at 10.000
g
. The supernatant was transferred to a new 1.5-
mL eppendorf tube, the nucleic acids were precipitated with 1 volume of isopropanol
and 0.5 volume of 7.5 M ammonium acetate and centrifuged for 10 min at 10.000
g
.
The supernatant was discarded and the pellet washed once with 500 µL 70% ethanol.
65
The pellet was dried at room temperature for approximately 10 min, resuspended in 50
µL water and stored at –20ºC until use.
2.4. Yield and quality of nucleic acid extracts
The nucleic acid concentration in the extracts was estimated by
spectrophotometry at A
260nm
using the Gene Quant Pro spectrophotometer
(Amersham). One absorbance unit at 260 nm was considered to correspond to 50 ng
of nucleic acid per µL of solution. Sample purity was estimated by the A
260
/A
280
ratio.
The extracts were further analyzed by electrophoresis in 1.2% agarose gels
containing 0.1 µg/mL ethidium bromide. The presence of inhibitors in the PCR
reactions was determined by amplifying a portion of the soybean lectin gene used as
an endogenous reference (Meyer, Chardonnens, Hubner & Luthy, 1996; Duijn, Biert,
Marcelis, Peppelman, & Hessing, 1999).
2.5. Quantitative PCR analysis of transgenic sequences
Real time PCR analyses were carried out in an SDS 7000 equipment (Applied
Biosystems). Samples were amplified with the aid of the
Taq
Man GMO Soy 35S
Detection Kit (Applied Biosystems). This kit is especially designed for the simultaneous
amplification of the 35S promoter and the soybean lectin
gene targets. The kit contains
Ampli
Taq
Gold polymerase and a master mix including MgCl
2
, dNTPs, uracyl
N
-
glycosylase (UNG), the passive reference dye ROX, and primers and probes for both
target sequences. The 35S probe is labeled with FAM at the 5 end while lectin probe
is labeled with VIC. Reactions were carried out in 96-well microtiter plates in a total
volume of 25 µL, containing 22 µL master mix, 0.5 µL Ampli
Taq G
old, and 2.5 µL DNA
extract (500 ng). For each plate, a no-template control, a negative control and the 0.1
to 5.0% CRMs were analyzed together. After the initial steps at 50°C for 2 min (UNG
activity) and at 95°C for 10 min (activation of the Ampli
Taq
Gold polymerase), a two-
step program of 95°C for 15 s and 60°C for 1 min was conducted for 40 cycles. Details
about primer and probe sequences, amplicon sizes, and concentrations of reaction
components are not provided by the manufacturer in the kit.
The percentage of GM soybean in the sausage samples was determined by the
delta Ct relative quantification method. The difference between the Ct values for the
transgenic target and the endogenous reference was plotted as a logarithm function of
the GM percentage. Samples with Ct values 40 or above were considered negative for
66
the target sequence. Each sample was extracted in duplicate in three different
extractions, and amplified in three independent runs. Precision was estimated by the
standard deviation value (SDV) and relative standard deviation (% RSD).
2.6. Qualitative PCR analysis of transgenic sequences
After quantification, the sausage samples were also amplified by conventional
PCR with specific primers that flanked portions of the following target regions: 35S
promoter (GenBank Accession AJ308514), NOS terminator (GenBank Accession
308515), and coding region of the EPSPS gene (GenBank Accession AB180963). In
order to test if the DNA samples could be amplified, preliminary amplification reactions
with the lectin gene primers were conducted. The primer sequences and the sizes of
the expected fragments are listed in Table 1.
Amplification reactions were performed in a thermocycler model 7900 (Applied
Biosystems), in a final volume of 25 µL containing 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM
KCl, 1.5 or 2.0 mM MgCl
2,
2.5 mM of each dNTP, 1 U of
Taq
DNA polymerase, 0.2
pmoles of each primer, and 0.01 ng to 1,000 ng of template DNA. Amplification
conditions for the lectin gene were 95
°
C for 4 min, followed by 35 cycles of 95
°
C for 30
s, 58
°
C for 30 s and 72
°
C for 40 s. An additional extension step at 72
°
C for 3 min
was performed after the last cycle. Amplification conditions for the 35S promoter and
the EPSPS regions were essentially the same as those used for the lectin gene,
except that the number of cycles was raised to 40 and the annealing temperature for
the 35S promoter region was 62ºC. To amplify the NOS terminator region a
“touchdown” program was used: one step at 95
°
C for 4 min, one cycle at 95
°
C for 20
s, 68
°
C for 40 s and 72
°
C for 1 min followed by nine cycles in which the annealing
temperature was decreased by 1ºC at each cycle. When the annealing temperature
reached 58ºC, 20 additional cycles were conducted. An additional extension step at
72
°
C for 3 min was performed after the last cycle.
2.7. Sensitivity of qualitative and quantitative PCR
DNA extracted by the two methods used (modified Wizard and CTAB) was
diluted and tested in the following amounts in the PCR reactions: 1,000, 500, 200, 100,
10, 0.1 and 0.01 ng. Each dilution was tested in duplicate in three independent
amplification reactions. The LOD (limit of detection) was defined as the minimum
67
amount of DNA in the reaction that led to the amplification of the fragment with the
expected size in an agarose gel in all repetitions.
Quantitative multiplex reactions with primers for the 35S promoter region and
the endogenous lectin gene labeled with different fluorescent dyes were also
performed to establish the sensitivity for the quantification of RR
®
soybean present in
the sausage samples. The conversion of mass to genome copy number was based on
the haploid genome mass (1C value) for
Glycine max,
which is 1.25 pg, obtained from
the Plant DNA C-values Database (Bennett & Leitch, 2003).
In addition to the amount tested for LOD determination, the amounts of 2,000
and 5,000 ng were also used. Based on the average Ct values obtained for each DNA
amount, the quantification sensitivity, the linearity, and the coefficient of correlation
were estimated.
TABLE 1 - Sequences of primers used in the qualitative PCR.The respective size of the PCR products
is given in base pairs.
Primers Target Sequence Amplicon size
Lec-F
5´GCCCTCTACTCCACCCCCATCC 3´
118 bp
Lec-R
Lectin gene
5´GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG 3´
Nos-Long F
5´ATTGCGGGACTCTAATCATAAAAA 3´
180 bp
Nos Long-R
NOS terminator
5´ATCGTTCAAACATTTGGCAATAA 3´
RR-F
5´TGATGTGATATCTCCACTGACG 3´
172 bp
RR-R
Region of the EPSPS gene
5´TGTATCCCTTGAGCCATGTTGT 3´
35-S
5´GATAGTGGGATTGTGCGTCA 3´
195 bp
35-R
35S promoter
5´GCTCCTACAAATGCCATCATTGCG 3´
3. Results and Discussion
DNA extraction from sausage samples was tested with two different methods,
the CTAB and the modified Wizard. Both methods yielded DNA with good quality;
however, the samples obtained with the modified Wizard method were less degraded
and presented fragments larger than 500 bp (FIGURE 1). For PCR detection and
quantification of GMO in foodstuffs the recommended amplicon size lies within the
range of 70 to 200 bp. The reduced size of DNA molecules extracted from a
68
processed matrix is of concern if a considerable portion of the fragments cannot
function as PCR templates because their insufficient size does not span the entire
target sequence (Lipp
et al
., 2005).
The ratio A
260
/A
280
, a measure of DNA purity, indicated that samples extracted
by the Wizard method presented a lower degree of contaminants. The average
A
260
/A
280
ratio value for the samples extracted by the Wizard method was 1.70,
whereas for the samples extracted by the CTAB method the average ratio was 1.48.
The average DNA yields were 31.5 µg (Wizard) and 75 µg (CTAB), most probably
because in the latter case there were more A
260
absorbing contaminants than in the
samples obtained by the Wizard method.
The presence of inhibitors during the PCR reactions was tested by amplification
of a specific region of the endogenous soybean lectin gene. Amplification was done
with at least 100 ng of sausage DNA samples obtained by both extraction methods. As
for DNA extracted from soybean grains, amplification products were visualized when
at least 0.1 ng of target DNA was added to the reaction mix (FIGURE 2). This
corresponds to approximately 80 copies of the soybean genome.
3.2. Quantitative PCR
The percentage of GM soybean in the sausage samples was determined by the
relative quantification delta Ct method. The calibration curve was established with
certified reference materials (Fluka) containing 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 and 5.0% RR
®
soybean. The obtained correlation coefficient (R
2
) was 0.9957, which is above the
minimum acceptable value of 0.98. The delta Ct values obtained varied from 12.96 for
the negative control to 4.54 for the 5% reference sample. The characteristics of the
delta Ct curves are summarized in Table 2 and Figure 3.
69
FIGURE 1 – Electrophoretic profile of sausage DNA samples extracted by the modified Wizard
(lanes 1 to 6) and the CTAB (lanes 7 to 12) methods. M: 100 bp DNA Ladder (Invitrogen).
FIGURE 2 – Electrophoretic analysis of the quality of sausage DNA samples. Total DNA was
amplified with specific primers for the soybean lectin gene (118 bp). Different amounts of
sausage DNA were tested in the amplification reactions: 0.01, 0.1, 1.0, 10, 100, 200, 500 and
1,000 ng (lanes 1 through 8, respectively). Lanes 10 through 14 were loaded with soybean
grain DNA: 0.01, 0.1, 1.0, 10, and 100 ng, respectively. Lanes 9 and 15: no DNA. Lane M:
100 bp DNA Ladder (Invitrogen).
600 bp
100 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M
1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12
600 bp
70
TABLE 2 – Valores de Ct e delta Ct para os alvos transgênico e referência endógena, obtidos
a partir da amplificação dos padrões de referência certificados, por PCR quantitativo.
CRM’s Ct 35S Ct Lectina delta Ct
a
Mean delta Ct delta Ct SDV
b
Standard 0.0 % 40.00 27.00 13.00 12.96 0.05
Standard 0.0 %
39.47 26.54 12.93
Standard 0.1 %
37.68 26.91 10.78 10.32 0.65
Standard 0.1 %
37.10 27.24 9.86
Standard 0.5 %
34.47 27.19 7.28 7.61 0.47
Standard 0.5 %
35.48 27.55 7.94
Standard 1.0 %
32.95 26.34 6.62 6.91 0.42
Standard 1.0 %
33.83 26.62 7.21
Standard 2.0 %
32.53 26.62 5.91 5.81 0.15
Standard 2.0 %
32.67 26.96 5.71
Standard 5.0 %
31.19 26.80 4.39 4.54 0.22
Standard 5.0 %
31.20 26.50 4.69
a
Ct, Cycle threshold
b
SDV, Standard deviation value.
Calibration Curve
7,61
6,91
10,32
5,81
4,54
y = -1.4648Ln(x) + 6.8352
R
2
= 0.9957
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
0,10 1,00 10,00
% GMO
Delta Ct
FIGURE 3 - The delta Ct calibration curve obtained with certified reference materials (Fluka)
containing 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 and 5.0% RR
®
soybean. The difference between the Ct values for
the transgenic target and the endogenous reference was plotted as a function of logarithm of
the GM percentage The coefficient of correlation obtained (R
2
) was 0.9957, above the
minimum acceptable value of 0.98.
71
Table 3 shows the quantitative data for the sausage samples. For the delta Ct
method, unknown percentages of GMO are directly derived from the determined delta
Ct values. Mean relative values of GMO % for the three analyzed samples were 39.84,
24.28 and 0.62. The mean values of the RSD % for the samples which presented
more than 5% RR
®
soybean were all below 10% both within and among the runs,
except in the third replicate of the second run. However, for the sample with the lowest
GMO content, close to 0.5%, the RSD % values were higher. The highest value
(42.79%) was obtained for the repetition in the third run. The mean RSD % value was
33.07%. Although the RSD % values for the sample with low GMO content was
relatively high, the precision of the experiment is still considered acceptable. For
methods of GMO analysis, the precision and trueness of the quantitative estimates are
acceptable if values for RSD % and error are not higher than 20% (Taverniers,
Bockstale & Loose, 2004; Taverniers, Windels, Bockstaele & Loose, 2001). Values
varying from 20 to 35% for intra-lab imprecision and bias in quantitative real-time PCR
data have also been reported in other studies, especially if concentrations at the 0.1%
level are considered (Dahinden, Zimmermann, Liniger, & Pauli, 2002; Pardigol, Guillet,
& Pöpping, 2003). In all runs the SDV was very low, indicating high accuracy of the
results.
To test the sensitivity of the quantification method, total DNA of the sausage
samples containing 24.28% and 0.62% RR
®
soybean was diluted and different
amounts of DNA (0.01 to 5,000 ng) were used in multiplex reactions in which the
targets were the 35S promoter region and the lectin gene. At least 100 ng of total
sausage DNA was necessary for a reliable quantification of the sample containing
more than 5.0% of RR
®
soybean. When the amount of DNA was decreased to 100 ng
or less, the Ct value would slightly deviate from the calculated standard curve, which
indicated that the quantification was not accurate. Mean GMO % value of 24.44 was
obtained for dilutions containing 100 to 5,000 ng total sausage DNA, with an SDV 4.56
and a CV % of 18.66. This value differs only by 0.16% in relation to the originally
determined value (24.28%). However, for the sample containing 0.62% RR
®
soybean
at least 200 ng of total sausage DNA were necessary for a reliable quantification of the
sample. When only 100 ng of total sausage sample were used, the RSD % and SDV
values were higher (0.44 and 45.44%, respectively), in contrast with the values of 0.18
and 22.23% when 200 ng were added (Table 4). This
sensitivity is well above the
experimentally determined LOQ (30 copies of the
72
TABLE 3 – Percentage estimate of RR
®
soybean in sausage samples. Positive samples for the presence of GM soybean were quantified by
real-time PCR using the delta Ct method. Each sample was amplified in duplicate in three independent PCR runs.
Runs Sample Name delta Ct
a
%GMO %GMO Mean per run SDV per run
b
% RSD per run
c
%GMO Mean SDV Mean Mean % RSD
1
Sample 1.1 1.37 41.01 41.56 0.78 1.88 39.8415 6.9963 6.2770
Sample 1.2 1.33 42.11
2
Sample 1.3 1.83 29.96 31.71 2.48 7.83
Sample 1.4 1.67 33.47
3
Sample 1.5 1.10 49.23 46.25 4.22 9.12
Sample 1.6 1.29 43.27
1 Sample 2.1 1.93 28.02 27.81 0.29 1.04 24.2801 4.0593 8.8711
Sample 2.2 1.95 27.61
2
Sample 2.3 2.46 19.53 20.33 1.12 5.53
Sample 2.4 2.35 21.12
3
Sample 2.5 1.92 28.20 24.70 4.95 20.05
Sample 2.6 2.34 21.20
1 Sample 3.1 6.93 0.94 0.80 0.19 24.29 0.6282 0.2432 33.0750
Sample 3.2 7.44 0.66
2
Sample 3.3 8.52 0.32 0.41 0.13 32.14
Sample 3.4 7.84 0.50
3
Sample 3.5 7.02 0.88 0.68 0.29 42.79
Sample 3.6 7.94 0.47
a
Ct, Cycle threshold
b
SDV, Standard deviation value.
c
RSD, relative standard deviation.
73
TABLE 4 – Sensitivity of RR
®
soybean quantification in sausage samples containing close to
0.5% and more 5.0% of RR®
Sample Name DNA Amount
Ct 35S
a
Ct Lec delta Ct %GMO %GMO Mean
SVD
b
RSD
c
5000 ng 33,23 25,68 7,55 0,61 0,80 0,18 22,23
2000 ng 34,16 26,91 7,25 0,76
0,97 * 0,44 * 45,44 *
1000 ng 36,08 28,66 7,42 0,67
500 ng 37,11 30,29 6,82 1,01
200 ng 38,68 31,82 6,87 0,98
100 ng 38,96 33,01 5,96 1,81
10 ng 39,44 34,75 4,69 4,29
1.0 ng 38,93 38,59 0,34 82,40
0.1 ng 40,00 40,00 0,00 103,97
Sample containing
close to 0.5% of RR
®
soybean
0.01 ng
40,00 40,00 0,00 103,97
5000 ng 27.33 25.47 1,87 29,25 24,44 4,56 18,66
2000 ng 29.07 26.68 2,39 20,49
1000 ng 29.20 27.13 2,06 25,55
500 ng 30.14 28.31 1,82 30,15
200 ng 31.15 28.70 2,45 19,64
100 ng 31.60 29.28 2,31 21,56
10 ng 36.46 33.33 3,12 12,47
1.0 ng 38.98 35.31 2,67 16,93
0.1 ng 38.86 36.19 6,67 1,12
Sample containing
more than
5.0% of RR
®
soybean
0.01 ng 39.28 38.06
1,22 45,50
a
Ct, Cycle threshold.
b
SDV, Standard deviation value.
c
RSD, relative standard deviation.
*
Values obtained when 100 ng of DNA was
tested.
74
target) for a pure (100%) soy product (Berdal & Holst-jensen, 2001
).
However, this
limit is only applicable if DNA is of sufficient purity and quality. DNA samples
extracted from a typical food matrix will usually be of lower purity than the DNA
typically used for validating PCR methods, such as plasmid DNA or DNA extracted
from raw or low-processed materials. Thus, the relative detection and quantification
limits are functions of the DNA template. For real food analysis it is necessary to
define the functional limits to be used. In addition to the low copy number, the harsh
conditions during processing of the samples lead to fragmented DNA. It is known that
measurement uncertainty generally increases with a decrease on the number of
target copies or GMO content (Pardigol, Guillet & Pöpping, 2003). In conclusion, the
quantification of RR
®
soybean in sausage samples was highly precise if the starting
amount of total sausage DNA was at least 100 ng for samples containing more than
5.0% and at least 200 ng for samples containing close to 0.5% of RR soybean. The
delta Ct values for the different dilutions are presented in Table 4.
To test the linearity of the method, Ct-values were plotted against the
logarithm of DNA concentration (Figure 4). Both PCR systems, for lectin and 35S
promoter region, were linear within the dynamic working range defined by the Ct-
values for the highest and lowest target concentrations, as indicated by the
correlation coefficient value which was greater than 0.98. A linear relationship with a
slope of -2.406 and -2.066 for lectin and 35S promoter region, respectively, were
obtained between the Ct value and the starting DNA quantity.
3.3. Qualitative PCR
The sausage samples previously quantified were analyzed by conventional
PCR. The DNA extracted by both methods was amplified with specific primers for the
35S promoter region, the NOS terminator and the coding region of the EPSPS gene
(FIGURES 5, 6 and 7, respectively). The target regions were detected in the different
samples tested; however, the detection sensitivity varied according to the percentage
of GM soybean in the samples. LOD values for the EPSPS gene fragment, the 35S
promoter region and the NOS terminator were 1.0 ng, 100 ng and 100 ng,
respectively, for samples with a GM soybean content higher than 5%. Nonetheless,
for samples with GM soybean content close to 0.5%, the LOD values increased to
10, 500, and 500 ng, respectively. In all reactions, non-GM soybean samples were
used as negative controls. In addition, the intensity of the obtained DNA bands was
75
compared with those of standard references containing 0.5 and 1.0% of RR
®
soybean and of DNA extracted from soybean grains which were 100% GM
LOQ 35S
y = -2,1406x + 35,823
R
2
= 0,9858
20
23
25
28
30
33
35
38
40
43
-3 -1 1 3 5
Starting Quantity
Threshold Cycle (Ct)
LOQ Lectina
y = -2,7066x + 35,377
R
2
= 0,9911
20
23
25
28
30
33
35
38
40
43
-3 -1 1 3 5
Starting Quantity
Threshold Cycle (Ct)
FIGURE 4 – Linearity test of the quantification of RR
®
soy em sausages samples. Diferents
amounts of DNA (0.01 to 5.000 ng) were used in multiplex reactions in which the targets
were the 35S promoter region and the lectin gene. The Ct-values were plotted against the
logarithm of DNA concentration. The amplication for lectin and 35S promoter region were
linear within the dynamic working as indicated by the correlation coefficient value which was
greater than 0.98.
FIGURE 5 – Electrophoretic analysis of qualitative PCR products of GM soybean in
sausage samples. The DNA was amplified with specific primers for the EPSPS coding
region (172 bp) which is present in RR
®
soybean. DNA from sausage samples containing
more than 5% (lanes 1 to 16) or close to 0.5% (lanes 17 to 25) RR
®
soybean. Total
sausage DNA: 1,000 ng (lanes 1, 9, and 17), 500 ng (lanes 2, 10 and 18), 200 ng (lanes 3,
11 and 19), 100 ng (lanes 4, 12, and 20), 10 ng (lanes 5, 13, and 21), 1 ng (lanes 6, 14 and
22), 0.1 ng (lanes 7, 15, and 23), 0.01 ng (lanes 8, 16, and 24). Lanes 25 (no DNA), 26
(CRM 0.5%), 27 (CRM 1.0%), 28 (DNA from 100% GM soybean grains), 29 (DNA from
non-GM soybean grains), 30 (no DNA), M: 100 bp size marker (Invitrogen).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 M
600 bp
100 bp
76
FIGURE 6 – Electrophoretic analysis of qualitative PCR products of GM soybean in
sausage samples. The DNA was amplified with specific primers for 35S promoter region
(195 bp) which is present in RR
®
soybean. DNA from sausage samples containing more
than 5% (lanes 1 to 16) or close to 0.5% (lanes 17 to 25) RR
®
soybean. Total sausage
DNA: 1,000 ng (lanes 1, 9, and 17), 500 ng (lanes 2, 10 and 18), 200 ng (lanes 3, 11 and
19), 100 ng (lanes 4, 12, and 20), 10 ng (lanes 5, 13, and 21), 1 ng (lanes 6, 14 and 22),
0.1 ng (lanes 7, 15, and 23), 0.01 ng (lanes 8, 16, and 24). Lanes 25 (no DNA), 26 (CRM
0.5%), 27 (CRM 1.0%), 28 (DNA from 100% GM soybean grains), 29 (DNA from non-GM
soybean grains), 30 (no DNA), M: 100 bp size marker (Invitrogen).
FIGURE 7 – Electrophoretic analysis of qualitative PCR products of GM soybean in
sausage samples. The DNA was amplified with specific primers for the NOS terminator
(180 bp) which is present in RR
®
soybean. DNA from sausage samples containing more
than 5% (lanes 1 to 16) or close to 0.5% (lanes 17 to 25) RR
®
soybean. Total sausage
DNA: 1,000 ng (lanes 1, 9, and 17), 500 ng (lanes 2, 10 and 18), 200 ng (lanes 3, 11 and
19), 100 ng (lanes 4, 12, and 20), 10 ng (lanes 5, 13, and 21), 1 ng (lanes 6, 14 and 22),
0.1 ng (lanes 7, 15, and 23), 0.01 ng (lanes 8, 16, and 24). Lanes 25 (CRM 0.5%), 26
(CRM 1.0%), 27 (DNA from 100% GM soybean grains), 28 (DNA from non-GM soybean
grains), 29 (no DNA), M: 100 bp size marker (Invitrogen).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 M
600 bp
100 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 M
77
4. Conclusions
RR
®
soybean present in sausage samples could be detected and quantified by
PCR using DNA samples extracted with the modified Wizard and the CTAB methods.
Previous studies have reported difficulties in extracting amplifiable DNA from many
foods; however, by using samples of at least 100 mg of homogenized sausage, both
methods yielded enough DNA for analysis. The DNA obtained by both methods
presented good quality and samples with GMO content close to 0.5% could be
detected and quantified with precision.
Usually a large amount of DNA (100-500 ng) is needed for detection and
quantification of GMO in foodstuffs. Nevertheless, for sausage samples low
quantities of RR
®
soybean could be detected and quantified in relatively small
amounts of total DNA: 1.0 ng for the EPSPS target in the qualitative analysis and 200
ng for the 35S promoter region in the quantitative analysis.
5. Acknowledgment
The authors would like to thank Federal University of Viçosa and the Genetic
Analyses Laboratory – AgroGenética.
78
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81
Capítulo III
Construção de padrões de calibração baseados em número de
cópias de plasmídios recombinantes para a quantificação de OGMs
em alimentos pela técnica de PCR quantitativo
RESUMO
A determinação do percentual de resíduos transgênicos (%OGM) pela técnica
de PCR quantitativo requer o emprego de padrões de calibração apropriados. Estes
são utilizados para a construção de curvas de calibração para a quantificação
relativa do número de moléculas de DNA geneticamente modificado (GM). Amostras
calibradoras comerciais, conhecidas como materiais de referência certificados
(CRMs) são as mais utilizadas. No entanto, devido a algumas características
intrínsecas, estes padrões apresentam problemas na reprodutibilidade,
principalmente atribuídos à extropolação dos percentuais de OGM estimados em
massa para número de moléculas de DNA. Além disso, estão disponíveis apenas na
faixa de concentração variando de 0,1 a 5,0%, apresentam alto custo e não atendem
a demanda dos vários tipos e eventos GM comercializados. Deste modo, o objetivo
deste trabalho foi o desenvolvimento de padrões de calibração alternativos,
baseados no número de cópias de plasmídios recombinantes. Dois fragmentos de
DNA, contendo partes da região promotora 35S e do gene lectina da soja, foram
clonados e os plasmídios foram utilizados para a construção de curvas de calibração
para a quantificação relativa pelos métodos da curva padrão e do delta Ct. Ambas as
curvas mostraram eficiência de amplificação dos diferentes alvos, coeficiente de
correlação, índice de inclinação da reta e y-intercepto satisfatórios quando
comparadas com curvas baseadas em DNA genômico (gDNA), construídas a partir
do DNA dos CRMs. Os desvios com relação à repetibilidade dos valores de Ct ou
delta Ct obtidos nas diferentes repetições, também foram inferiores a limites
aceitáveis estabelecidos para a quantificação de %OGM. As curvas construídas com
DNA plasmidial (pDNA) foram capazes de quantificar com precisão as amostras
82
CRMs. No entanto, o método do delta Ct apresentou os valores mais expressivos de
estabilidade e consistência dos resultados. A acuracidade das curvas foi avaliada
pela quantificação de amostras de alimentos. Além das curvas baseadas em pDNA,
curvas construídas com os CRMs foram utilizadas para a quantificação das
amostras. A %OGM das amostras de alimentos não apresentou variação
significativa entre as diferentes curvas utilizadas, concluindo-se que as curvas pDNA
são tão precisas quanto as baseadas em gDNA para a quantificação de resíduos
transgênicos em alimentos. Mesmo quando amostras que apresentavam baixos
níveis de contaminação de resíduos transgênicos foram analisadas, os valores
estimados da %OGM foram estáveis nas diferentes repetições. No entanto, os
valores estimados de %OGM para a maioria das amostas analisadas, apresentaram
maiores similaridades quando foi empregado o mesmo método de quantificação, o
delta Ct. Os desvios obtidos com relação aos resultados de quantificação foram
maiores dentro das repetições de cada curva do que entre as curvas pDNA e gDNA,
quando o método do delta Ct foi utilizado.
83
1. INTRODUÇÃO
A técnica de PCR quantitativo vem sendo a metodologia comumente
empregada para quantificação de resíduos transgênicos em alimentos. Em contraste
com quantificações chamadas de “
end point
”, a quantificação em tempo real é
baseada na intensidade de fluorescência emitida nos ciclos iniciais da PCR, durante
a fase logarítimica, quando dois alvos são co-amplificados, o transgene e um gene
endógeno. A fluorescência é originada durante a hibridização do DNA com sondas
ou
primers
específicos, marcados com fluoróforos. A intensidade de sinal emitida é
proporcional à quantidade de DNA amplificada de cada alvo e aumenta
exponencialmente a cada ciclo de amplificação. Quando a intensidade de
flurescência emitida ultrapassa um valor específico, a quantidade de ciclos
necessários para tal é definida como Ct (Cycle treshold). O valor de Ct é
inversamente proporcional à quantidade de DNA alvo presente nas amostras.
O percentual de DNA GM presente nas amostras é determinado pela
quantificação relativa, que pode ser realizada pelo método da curva padrão ou do
delta Ct (Ct do alvo transgene menos o Ct da referência endógena). No primeiro
caso, a curva de calibração é contruída plotando-se o número de cópias ou
concentração de amostras padrões em função dos valores de Ct, para ambos os
alvos, endógeno e transgênico. O número de cópias ou massa dos alvos são
derivados da amplificação de parte do cassete transgene e de um gene endógeno,
espécie específico. O percentual de OGM das amostras é obtido pela divisão do
número de cópias ou massa do alvo transgênico pelo número de cópias ou massa
84
da referência engógena, e multiplicado por 100. Neste caso, o percentual relativo de
OGM é derivado de duas quantificações absolutas, uma para cada alvo (HOLST-
JENSEN
et al
., 2003).
Pela segunda estratégia, a construção das curvas de calibração utiliza
padrões com percentuais de OGM definidos, obtidos pela mistura de ambos os
alvos, seja utilizando o DNA ou a farinha de grãos GM ou não GM moídos, em
função dos valores de delta Ct. Os valores de delta Ct são diretamente utilizados
para determinar o percentual de OGMs presente nas amostras. Este método de
quantificação relativa é denominado como método do delta Ct, no entanto, difere do
método delta Ct tradicional, em que há apenas o emprego de uma fórmula aritmética
para expressar diferenças entre a quantidade do gene alvo e amostras calibradoras
em estudos de expressão gênica (LIVAK
et al
., 2001).
Um fator decisivo para o sucesso da técnica de PCR quantitativo na
quantificação de OGMs se refere ao tipo de padrões utilizados para a construção
das curvas de calibração. Os padrões são amostras contendo quantidade
específicas de DNA GM, expressos nas diferentes unidades, nanogramas, número
de cópias ou percentual, que devem ser concomitantemente amplificados com as
amostras do ensaio. Apenas com a amplificação destes padrões é possível a
construção das curvas de calibração que permitem a determinação do percentual de
resíduos transgênicos nas amostras.
Os padrões de calibração mais utilizados para a quantificação de resíduos
transgênicos são os baseados em DNA genômico (gDNA), extraídos dos materiais
de referência certificados (CRMs) pelo Institute for Reference Materials and
Measurements (IRMN, Bélgica) (WURZ
et al
., 1999; ZIMMERMANN
et al
., 2000;
BERDAL et al., 2001; TERRY
et al
., 2001). Estes padrões são obtidos pela mistura,
em proporções específicas, normalmente 0,1% a 5,0%, de farinha do material GM
com farinha do material não GM da espécie em questão. Além dos CRMs, diluições
de DNA genômico de amostras 100% GM são também utilizadas em muitos ensaios
descritos (VAÏTILINGOM
et al
., 1999; ALARY
et al.
, 2002; ZEITLER
et al
., 2002;
DAHINDEN
et al
., 2002; TERZI
et al.
, 2003).
O emprego de padrões de calibração baseados em gDNA apresenta algumas
limitações e problemas de reprodutilibilidade. Além das variações inerentes nas
etapas de mistura e homogeneização das farinhas, existem ainda outras fontes de
variações que podem interferir na precisão, como por exemplo, variações entre os
85
lotes de grãos utilizados. Estas variações podem ocorrer devido ao tipo de cultivar
utilizado, quantidade de DNA por unidade de massa entre os grãos GM e não GM,
níveis de heterozigosidade dos grãos com relação ao transgene, e ainda, no caso de
plantas alógamas, qual a origem do endosperma (3C) dos grãos utilizados, se a
planta GM utilizada era o genitor masculino ou feminino (TRIFA
et al
., 2004).
Dentre as limitações, destaca-se o fato de que os CRMs disponíveis no
mercado internacional variam apenas de 0,1% a 5% em peso de farinha do grão GM
com relação ao peso de farinha do grão normal. Deste modo, a quantificação de
amostras com percentuais superiores a 5% extrapola o intervalo de confiança da
curva gerada. Outro fator crítico é que nem todos os eventos transgênicos liberados
apresentam CRMs disponíveis e o custo destes padrões é bastante elevado.
Devido a estas limitações o desenvolvimento de padrões de calibração
alternativos tem possibilitado a quantificação de eventos recentemente liberados em
alguns países, como o caso do evento de milho MON 810. HOLCK
et al.
(2002)
desenvolveram um método para a quantificação evento-específica do milho MON
810 utilizando amplicons híbridos, contendo os dois alvos, referência endógena e
transgene, como padrões para a construção das curvas de calibração. A mesma
metodologia foi utilizada por PARDIGOL
et al
. (2003) para a quantificação de soja
Roundup Ready
®
(RR). Partes das regiões codificadora do gene da 5-
enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) e do gene da lectina foram
amplificadas por PCR, purificadas e utilizadas como padrões. O emprego de
plasmídios recombinantes contendo os fragmentos alvos clonados também tem sido
descrito para quantificações eventos-específicas da soja RR. O sítio de integração
do cassete transgene foi identificado e a região de junção entre o cassete e o
genoma da soja foi clonado. As curvas de calibração obtidas foram capazes de
quantificar com precisão amostras de CRMs e de alimentos que apresentavam
percentuais de OGM previamente conhecidos (TAVANIERS
et al
., 2001).
Como alternativa para a quantificação de resíduos transgênicos para os mais
variados tipo de eventos GM liberados, o presente trabalho teve como objetivo o
desenvolvimento de padrões de calibração baseados em pDNA, utilizando como
alvo o promotor 35S do vírus do mosaico da couve flor. Este promotor está presente
na maioria dos eventos transgênicos liberados e, inclusive, nos dois eventos
liberados para plantio e comércio no Brasil, a soja RR e o algodão Bollgard,
resistentes ao herbicida glifosato e a lepdópteros (
Alabama argillacea, Pectinophora
86
gossypiellia
e
Heliothis virescens
), respectivamente. Espera-se a obtenção de
curvas de calibração que permitam a quantificação do percentual de resíduos
transgênicos, em diferentes tipos de alimentos, tanto pelo método da curva padrão
como pelo método delta Ct, com precisão e acuracidade.
87
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Material de referência
Como material de referência para concentração de OGMs foram utilizados
padrões de referência certificados (CRMs) produzidos pelo IRMM (
Institute for
Reference Materials and Measurement
) e comercializados pela Fluka, contendo as
porcentagens de 0,1%, 0,5%, 1,0%, 2,0% e 5,0% em peso para a presença do
evento transgênico de soja RR, com relação ao peso de farinha de soja normal.
2.2. Extração de DNA genômico
O DNA genômico dos CRMs foi extraído pelo método PrepMan (Applied
Biosystems), conforme recomendações do fabricante. O DNA de grãos e produtos
in
natura
foi extraído pelos métodos CTAB (ROGERS
&
BENEDICH, 1988) ou
Wizard
, este último disponível comercialmente (Promega). A extração de DNA de
produtos com alto nível de processamento foi realizada pelos métodos CTAB ou
Wizard, porém com diferentes adaptações, segundo características específicas dos
produtos.
Após a extração, o DNA das amostras foi quantificado em espectrofotômetro
na A
260
. O fator de conversão de 1 OD
260
=50 ng/uL foi utilizado para converter
absorbância em unidades de concentração. Posteriormente, as amostras de DNA
foram separadas por eletroforese em géis de agarose 1,8% (p/v), contendo 0,1
mg/mL de brometo de etídeo imerso em tampão TBE 1X (Tris-borato 90 mmoles/L,
EDTA 1 mmoles/L pH 8,0), e visualizadas por meio de luz ultravioleta.
88
2.3. Oligonucleotídeos e condições de amplificação por PCR qualitativo e
quantitativo
Para a obtenção dos fragmentos a serem clonados, foram utilizados
primers
específicos para o gene da lectina, utilizado como controle endógeno (MEYER
et al
.,
1994; GenBank M30884), para a região promotora 35S (GenBank AJ308514), e
ainda
primers
evento-específico para a região EPSPS da soja RR (GenBank
AB180963).
As reações de PCR qualitativo foram realizadas em um volume final de 25 µL
contendo 2,5 mmoles/L de cada dNTP, 1 U de Taq DNA polimerase, 0,2 pmoles de
cada
primer
, KCl 50 mmoles/L, Tris-HCl 10 mmoles/L pH 8,3 e MgCl
2
1,5 ou 2,0
mmoles/L e cerca de 100 ng de DNA das amostras. A amplificação foi conduzida
em termociclador GeneAmp
®
9700 PCR System (Applied Biosystems), com período
inicial de desnaturação a 94ºC, por 4 min, seguido por 35 ciclos de polimerização
(94°C por 30 s, 55°C por 1 min e 72°C por 2 min) e período adicional de
polimerização a 72° C por 7 min. Para cada par de oligonucleotídeos foi utilizada a
temperatura de anelamento mais apropriada.
Reações de PCR em tempo real foram conduzidas em equipamento ABI
PRISM
®
7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems). A amplificação
dos fragmentos 35S e Lectina, foi realizada utilizando-se a metodologia SYBR
Green. As amostras foram amplificadas para ambos os alvos, transgene e referência
endógena, em diferentes tubos, na mesma placa de reação. Diferentes quantidades
do DNA plasmidial alvo ou cerca de 200 ng das amostras de alimentos, e 0,2 pmoles
de cada
primer
foram adicionados ao tampão SYBR Green master mix, contendo
todos os componentes necessários à amplificação (as enzimas uracil N-glicosilase e
Ampli
Taq G
old, MgCl
2
, dNTPs, KCl e o fluoróforo SYBR green), em um volume final
de 50 µL.
Em cada placa, foram amplificadas amostras controle, que apresentavam
todos os reagentes necessários à amplificação, exceto DNA. As condições de
termociclagem foram 50ºC por 2 min, para permitir a ação da uracil
N
-glicosilase,
95ºC por 10 min para a ativação da DNA polimerase e 40 ciclos de desnaturação a
95ºC por 15 s, seguida de 60ºC por 1 min, para anelamento dos
primers
e
amplificação. Ao final dos 40 ciclos de amplificação, um período adicional de 30 min,
com elevação gradual da temperatura de 60ºC a 94ºC , foi utilizado para obtenção
da curva de dissociação.
89
2.4. Obtenção dos fragmentos
A amostra de material de referência certificado (CRM), contendo 5,0% do
evento soja RR (Fluka), foi amplificada com os
primers
Lec-F QT e Lec-R QT, RR-F
QT e RR-R QT e 35S-F e 35S-R para obtenção dos fragmentos a serem clonados
(Quadro 1). Após a amplificação, os fragmentos foram purificados do gel de agarose,
pela técnica de absorção de DNA em membrana de sílica-gel, utilizando-se o
“QIAquick Gel Extraction Kit” (Qiagen), conforme as recomendações do fabricante.
Os fragmentos de DNA purificados foram quantificados, após a separação por
eletroforese em géis de agarose 1%, contendo 0,1 mg/mL de brometo de etídeo,
imerso em Tampão TBE 1X, e visualizadas por meio de luz ultravioleta.
QUADRO 1 - Sequência de primers e sondas utilizados nas reações de PCR qualitativo e
quantitativo.
Alvo Primers Sequência Amplicon
Lec-F QT
5´-TCCACCCCCATCCACATTT-3´
Lec-R QT
5´-GGCATAGAAGGTGAAGTTGAAGGA-3´
Gene
Lectina
Sonda-Lec
5´-VIC-ACCCGGTAGCGTTGCCAGCTTCG-TAMRA-3´
92 pb
RR-F QT
5´-GCCATGTTGTTAATTTGTGCCAT-3´
RR-R QT
5´-GAAGTTCATTTCATTTGGAGAC-3´
Região
codificadora
EPSPS
Sonda-RR
5´-6-FAM-CTTGAAAGATCTGCTAGAGTCAGCTTGTCAGCG-
TAMRA-3´
82 pb
35-S
5´-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3´
Promotor
35S
35-R
5´-GCTCCTACAAATGCCATCATTGCG-3´
209 pb
2.5. Clonagem dos fragmentos
O vetor utilizado para as clonagens dos fragmentos foi o pGEM
-TEasy
(Promega). As reações de ligação dos fragmentos de DNA ao vetor foram realizadas
usando-se a enzima T4 DNA ligase em volume final de 10-15
µ
L, de acordo com as
técnicas de clonagem descritas por SAMBROOK
et al
. (1989) e por AUSUBEL
et al
.
(1998). As reações de ligação foram conduzidas em Tris-HCl 50 mmol/L pH 7,6;
MgCl
2
10 mmol/L; ATP 1 mmol/L; DTT 1 mmol/L; polietilenoglicol 8.000 5%; o
90
fragmento de DNA a ser clonado e o vetor, na relação de 3:1; e T4 DNA ligase. A
reação foi incubada a 4
°
C por 24 horas. As células competentes,
E. coli
DH5
α
,
foram preparadas de acordo com INOUE
et al
. (1990). A transformação foi realizada
por choque térmico, adicionando-se 10 a 15
µ
L da reação de ligação a 200
µ
L de
células competentes, sendo a suspensão mantida no gelo, por 30 minutos. Após o
choque térmico de dois minutos, a 42
°
C, 800
µ
L de meio SOB (extrato de levedura
0,5%, triptona 2%, NaCl 10 mmoles/L, KCl 2,5 mmoles/L, MgCl
2
10 mmoles/L,
MgSO
4
10 mmoles/L e glicerol 10%) foi adicionado, prolongando-se a incubação por
mais 1 hora a 37
°
C. As células foram concentradas por centrifugação, ressuspensas
em 100
µ
L de meio SOB e espalhadas em placas contendo meio LB com ampicilina
a 100
µ
g/mL, X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-
β
-D-galactosídeo) e IPTG (isopropiltio-
β
-galactosídeo), para a seleção dos clones transformantes e recombinantes.
A confirmação da clonagem se deu pela clivagem do DNA plasmidial para a
liberação dos fragmentos e sequenciamento. Cerca de 600 ng de DNA plasmidial
foram digeridos com 2,5 U da enzima
Eco
R I, por 3 horas a 37ºC. Os fragmentos
foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,2% (p/v), contendo 0,1
mg/mL de brometo de etídeo. Os clones foram sequenciados usando-se o ABI
PRISM BigDye III Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied
Biosystems). Este kit é adequado para o seqüenciamento de DNA usando o ABI
PRISM 377 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). As seqüências de nucleotídeos
dos clones isolados foram analisadas pelo Programa
Seqman
do pacote DNASTAR
(DNASTAR Inc.) e a busca por similaridades com outras seqüências de DNA
depositadas no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) foi feita usando o
programa
BLASTn
(ALTSCHUL
et al
., 1997).
2.6. Extração de DNA plasmidial
Inicialmente as células hospedeiras
E. coli
DH5 foram rompidas pelo
método de lise alcalina e o volume das soluções ajustado de acordo com o volume
inicial da cultura. Basicamente, a bactéria transformada foi crescida em meio LB a
37
°
C, contendo 100
µ
g/mL de ampicilina, por 12 a 16 h. Após centrifugação a 5.000
g
, por 2 min, a 4
°
C, as células foram ressuspensas na solução I (glicose 50
mmoles/L, Tris-HCl 25 mmoles/mL pH 8,0, EDTA 20 mmoles/L e RNase A 100
µ
g/mL). Em seguida, a solução II (lise) (NaOH 0,2 moles/L e SDS 1%) foi
91
adicionada e a mistura foi incubada por 5 min à temperatura ambiente. A essa
mistura foi adicionada a solução III (acetato de potássio 1mol/L), prolongando-se a
incubação por mais 15 min. O DNA foi separado dos resíduos insolúveis e do DNA
cromossômico por meio de centrifugação a 11.000
g
, por 10 min. O DNA plasmidial
foi isolado do sobrenadante usando a resina pré-empacotada “QIAprep Spin” e
“QIAGEN tipo 100” (Qiagen), conforme as recomendações do fabricante.
2.7. Quantificação do DNA plasmidial
Após extração, o DNA plasmidial foi cuidadosamente quantificado utilizando
o equipamento Gene Quant Pro spectrophotometer (Amersham). O fator de
conversão da absorbância em unidades de concentração foi 1 OD
260
=50 ng/uL.
Cada amostra de DNA plasmidial foi quantificada em triplicata, e em diferentes
diluições: 1:10; 1:25 e 1:50. A pureza foi constatada pela razão A
260
/
A
280
e A
230.
A
subtração do
background
no comprimento de onda a 320 nanômetros foi
realizada.
A concentração média obtida por espectrofotômetro foi também avaliada em
géis de agarose 1,8% (p/v), contendo 0,1 mg/mL de brometo de etídeo. Um
gradiente de concentração conhecido do DNA do fago lambda (Sigma) foi utilizado
para comparação visual.
2.8. Construção das curvas de calibração baseadas em p-DNA para
Quantificação de OGMs
a) Quantificação Relativa pelo Método da Curva Padrão
Para a construção das curvas de calibração baseadas em número de cópias
de pDNA para a quantificação relativa pelo “método da curva padrão”, uma diluição
seriada foi preparada variando de 10
6
, 5 x 10
5
, 10
5
, 5 x 10
4
, 10
4
, 10
3
, 10
2
, 10 a 1
molécula de DNA plasmidial por reação de amplificação para cada um dos alvos:
35S e lectina. A determinação da massa de DNA plasmidial presente em cada
diluição foi estimada considerando-se o tamanho do plasmídio recombinante (vetor +
fragmento) e seu peso molecular (HERNANDEZ
et al.
, 2003; APPLIED
BIOSYSTEMS, 2003). No caso do plasmídio contendo o alvo 35S, com tamanho
total de 3210 pb, a massa correspondente a uma cópia do plamídeo recombinante
92
foi estimada em 3,518 x 10
-6
pg. Seguindo o mesmo raciocínio, uma cópia do
plasmídio recombinante para o alvo lectina apresenta a massa de 3,21 x 10
-6
pg.
Em cada curva, o logarítimo do número inicial de cópias de cada diluição foi
plotado em função dos valores de Ct e a equação que descreve a variação dos
valores de Ct em função do número de cópias amplificadas foi gerada. Cada diluição
da curva foi amplificada em duplicata em três reações independentes, de modo que
foram geradas três diferentes curvas para cada um dos alvos.
A reprodutibilidade das curvas foi demonstrada pela comparação dos valores
médios de Ct obtidos, em cada diluição, entre as três curvas geradas, e seus
respectivos valores de desvio padrão (SD) e coeficiente de variação (CV (%) ).
Foram ainda determinados o coeficiente de correlação (R
2
), índice de inclinação da
reta, valor em que a reta cruza o eixo y (y-intercepto) e a eficiência de amplificação
de cada alvo, parâmetros considerados relevantes nas análises de quantificação por
PCR em tempo real.
b) Quantificação Relativa pelo Método do delta Ct
Para a construção da curva de calibração baseada em número de cópias de
pDNA para a quantificação relativa pelo “método do delta Ct”, os dois plasmídios, um
contendo a referência endógena e o outro o fragmento transgênico 35S, foram
misturados nas devidas proporções a fim de se obter padrões com 100%, 50%, 25%,
10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,5%, 0,1% e 0,01% do alvo transgênico com relação ao alvo
endógeno. O número total de cópias do alvo lectina em cada padrão foi 2 x 10
5
cópias, enquanto do alvo 35S variou de 2 x 10
5
, 1 x 10
5
, 5 x 10
4
, 2 x 10
4
, 1 x 10
4
, 5 x
10
3
, 2 x 10
3
, 1 x 10
3
, 2 x 10 a 20 cópias.
Em cada curva, o logarítimo do número de cópias inicial de cada diluição foi
plotado em função dos valores de delta Ct e a equação que descreve a variação dos
valores de delta Ct em função do número de cópias amplificadas foi gerada. Cada
padrão foi amplificado em duplicata em três reações independentes.
A reprodutibilidade das curvas foi demonstrada pela comparação dos valores
médios de delta Ct obtidos, em cada diluição, entre as três curvas geradas, e seus
respectivos valores de SD e CV%. Foram também determinados o valor de R
2
, o
índice de inclinação da reta, o y-intercepto e a eficiência de amplificação.
Para a avaliação do potencial uso das curvas de calibração baseadas em
pDNA na quantificação relativa de OGM, ambas as curvas geradas com pDNA, as
93
que usam os valores de Ct e delta Ct, foram comparadas com uma curva baseada
em gDNA construída com os CRMs 0,1% a 5,0%. Para a construção da curva
baseada em gDNA, cerca de 100 ng de cada um dos CRMs foram utilizados para a
amplificação por PCR quantitativo utilizando os mesmos
primers
e condições de
amplificação utilizados para gerar as curvas com pDNA. Cada CRM foi amplificado
em duplicata em três diferentes corridas. A diferença entre os valores de Ct para o
alvo transgênico e para a referência endógena, foi plotada em função do logarítimo
da porcentagem de OGM.
2.9. Determinação da acuracidade e precisão da quantificação de OGMs
utilizando curvas de calibração baseadas em pDNA
As curvas de calibração baseadas no número de cópias plasmidias foram
avaliadas quanto à acuracidade e precisão pela determinação do percentual de
resíduos transgênicos presente nos CRMs contendo valores definidos de 0,1%,
0,5%, 1,0%, 2,0% e 5,0% de soja RR. Os CRMs foram tratados como amostras com
percentuais de OGM desconhecidos. Foram utilizadas as curvas baseadas em
pDNA obtidas previamente e a quantificação relativa foi determinada pelo método da
curva padrão e do delta Ct.
Para a quantificação relativa baseada no “método da curva padrão”, o
conteúdo de DNA GM, expresso em porcentagem relativa ao conteúdo total de DNA
de soja, foi calculado pela razão entre o número de cópias do alvo 35S e o número
de cópias do alvo lectina para cada amostra avaliada. O número de cópias de cada
alvo foi determinado pelo emprego das cuvas p-DNA para os alvos trangene e
referência endógena, que empregaram o método da curva padrão, obtidas
previamente.
Para a quantificação relativa baseada no “método do delta Ct”, foram
utilizadas as curvas de calibração construídas anteriormente a partir da amplificação
da mistura dos dois plasmídios, um contendo a referência endógena e o outro o
fragmento transgênico 35S clonado, nas proporções de 100%, 50%, 25%, 10%, 5%,
2,5%, 1%, 0,5%, 0,1% e 0,01% do alvo transgênico com relação ao alvo endógeno.
Cada CRM foi quantificado em duplicata em três reações de amplificação
independentes. A partir dos dados obtidos, estabeleceu-se uma comparação entre
os percentuais de DNA GM presente em cada CRM, de acordo com a curva de
calibração empregada. A acuracidade e precisão referente aos percentuais da
94
presença de OGM obtidos para cada CRM será estimada pelo SD, CV (%), erro
médio e taxa de recuperação (%R).
2.10. Determinação do conteúdo de soja GM em amostras de alimentos
utilizando curvas de calibração baseadas em pDNA
O potencial uso das curvas de calibração baseadas em pDNA, previamente
desenvolvidas, na quantificação de resíduos transgênicos em amostras de
alimentos, foi testado em sete diferente produtos: salsicha, empanado, matinais,
farinha de trigo, ração, farelo de soja e soja grão. A quantificação do percentual de
soja GM nas diferentes amostras utilizando as curvas pDNA, pelos métodos do delta
Ct e da curva padrão, foi comparada com a curva baseada em gDNA, pelo método
delta Ct, construída com os CRMs de 0,1%, a 5,0% de soja RR.
Cada amostra foi quantificada em duplicata em três reações de amplificação
independentes. A partir dos dados obtidos foi estabelecida uma comparação entre
os percentuais de DNA GM obtidos para cada amostra pelo emprego de cada uma
das curvas de calibração. A precisão referente aos percentuais da presença de OGM
obtidos para cada amostra foi estimada pelo SD e CV (%).
95
3. RESULTADOS
3.1. Obtenção dos fragmentos e clonagem
Os amplicons de 92, 82 e 209 pb foram obtidos após a amplificação com os
primers
específicos para os alvos: gene que codifica para a referência endógena
lectina, região codificadora EPSPS e região promotora 35S, respectivamente (Figura
1 e 2). Após a amplificação, os fragmentos foram purificados do gel de agarose e
clonados no vetor pGEM
-TEasy (Promega).
1 2 CE B M
FIGURA 1 – Análise eletroforética dos fragmentos de PCR clonados. As amostras
foram amplificadas com primers específicos para o gene lectina (1) e região codificadora
EPSPS (2). CE: Controle de Extração; B: Branco e M: marcador de tamanho (50 bp DNA
Ladder - Promega).
50 pb
96
M 1
FIGURA 2 – Análise eletroforética dos fragmentos de PCR a serem clonados. A
amostra foi amplificada com os primers específicos para a região promotora 35S (1); M:
marcador de tamanho (100 bp DNA Ladder - Invitrogen).
A confirmação da clonagem se deu pela clivagem do DNA plasmidial e
liberação dos fragmentos, seguida do seqüenciamento dos clones (Figura 3 e
Quadro 2, respectivamente). Todos os três clones apresentaram os tamanhos
esperados e foram denominados de p-35S, p-Lec e p-RR, contendo os fragmentos,
parte do promotor 35S, do gene de lectina de soja e da região codificadora EPSPS,
respectivamente. Para confirmar se os fragmentos clonados realmente se referiam
aos esperados, as seqüências obtidas foram analisadas no programa
Seqman
(DNASTAR Inc.) e comparadas com as seqüências depositadas no
GenBank
utilizando a ferramenta de alinhamento de nucleotídeos
Blastn
. Os três clones, p-
35S, p-Lec e p-RR, apresentaram elevados graus de identidade e similaridade com
as sequências dos respectivos genes, conforme demonstrado pelos valores P
(Quadro 2).
3.2. Quantificação do DNA plasmidial
Para a construção das curvas de calibração baseadas no número de cópias
de plasmídios recombinantes, o DNA plasmidial de cada um dos clones foi
cuidadosamente quantificado por espectrofotômetro e em géis de agarose contendo
padrões de concentração de DNA conhecidos.
100 pb
97
M 1 2 3
FIGURA 3 – Análise de restrição para confirmação da clonagem dos fragmentos.
Cerca de 600 ng de DNA plasmidial de cada um dos clones: p-35S (1), p-Lec (2) e p-RR (3),
foram clivados com a enzima Eco RI por 3 h a 37ºC, para liberação dos fragmentos. M:
marcador de tamanho (100 bp DNA Ladder - Invitrogen).
O
DNA foi preparado em diferentes diluições, cada uma delas em três
repetições, para a quantificação nos comprimentos de onda de 230, 260 e 280
nanômetros. A subtração do
background
no comprimento de onda a 320 nm foi
realizada.
Os valores de absorbância para cada umas das diluições, bem como as
concentrações obtidas, podem ser observadas na Tabela 1. A concentração média
para o clone p-Lec foi de 60,18 ng/µL e para o p-35S foi de 50,00 ng/µL. Os valores
médios de concentração obtidos para cada um dos clones foram confirmados pela
comparação visual com diferentes concentrações de DNA do fago lambda em gel de
agarose.
Em todas as diluições avaliadas, a pureza do DNA dos clones foi satisfatória,
com a razão A
260
/A
280
compreendidas entre os valores de 1,8 e 2,0. Uma razão
menor que o intervalo indica contaminação com proteínas, e maior, com compostos
orgânicos. O valor da absorbância a 230 nm também é uma indicação da pureza
das amostras. Uma elevada absorbância a 230 nm indica contaminação com
impurezas que podem afetar reações enzimáticas (PCR e digestão com enzimas de
restrição) ou com tampões como Tris ou EDTA (ácido etileno diamino tetracético)
(BRASILEIRO
&
CARNEIRO., 1998), que podem interferir na eficiência de
amplificação. Em todas as diluições testadas os valores de A
230
foram inferiores a
0,055.
100 pb
98
QUADRO 2 – Seqüências de DNA dos clones p-35S, p-Lec e p-RR e suas respectivas similaridades com
seqüências depositadas no GenBank.
Clone Sequência Região Gênica Valor P
Número de
Acesso no
GenBank
1
ACTAGTGATTGCTCCTACAAATGNCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCAT
50
51
CGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTAGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCA
100
101
CGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAA
150
151
GTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCA
200
201
CTATCAATC – 209
p-35S
Região de interseção entre o
promoter 35S e o peptídeo
sinal para cloroplasto da soja
transgênica (Glycine max)
Roundup Ready CP4-
EPSPS
3e
-100
AB209952
1
GGCATAGAAGGTGAAGTTGAAGGAAGCGGCGAAGCTGGCAACGCTACCGG
50
51
TTTCTTTGTCCCAAATCTTGATGGGTGTGGAATCATTGTAGA - 92
p-Lec
Gene Lectina da soja
(Lec 1)
6e
-30
M30884
1
TATGTTGTTAATTTGGCCATTCTTGAAAGATCTGCTAGAGTCAGCTTGTC
50
51
GCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCATC – 82
p-RR
Cultivar de soja (Glycine
max) transgênica Roundup
Ready CP4-EPSPS
5e
-27
AY592954
Valor P – probabilidade de que a similaridade entre as seqüências seja devido ao acaso;
99
TABELA 1 – Determinação da pureza e concentração das amostras de DNA plasmidial dos clones p-Lec e p-35S por
espectrofotômetro. Cada plasmídio foi quantificado nas diluições 1:10, 1:25 e 1:50 e cada diluição foi quantificada em triplicata
nos comprimentos de onda 230, 260 e 280 nanômetros. A subtração do
background
no comprimento de onda a 320 nanômetros
foi realizada.
Amostra Diluição A
230
A
260
A
280
A
260
/A
280
ng/ul Concentração Média (ng/µL) Média Geral (ng/µL)
p-Lec.1
1:10 0,0150 0,1235 0,0686 1,80 61,73 59,99
p-Lec.2 0,0240 0,0977 0,0493 1,98 48,87
p-Lec.3 0,0000 0,1388 0,0770 1,80 69,39
p-Lec.1 1:25 0,0180 0,0500 0,024 2,08 62,50 53,28
p-Lec.2 0,0000 0,0399 0,021 1,89 49,84
p-Lec.3 0,0000 0,0380 0,021 1,80 47,50
p-Lec.1 1:50 0,0000 0,0302 0,0170 1,78 75,50 67,27
p-Lec.2 0,0000 0,0285 0,0169 1,69 71,35
p-Lec.3 0,0000 0,0220 0,0112 1,96 54,95
60,18
p-35S.1
1:10 0,0495 0,0913 0,0471 1,94 45,67 56,35
p-35S.2 0,0549 0,1280 0,0694 1,85 64,00
p-35S.3 0,0057 0,1188 0,0655 1,81 59,39
p-35S.1 1:25 0,0080 0,0380 0,0200 1,90 47,50 49,91
p-35S.2 0,0000 0,0422 0,0222 1,90 52,73
p-35S.3 0,0000 0,0396 0,0209 1,89 49,50
p-35S.1 1:50 0,0150 0,0150 0,0079 1,90 37,39 43,75
p-35S.2 0,0000 0,0185 0,0096 1,94 46,35
p-35S.3 0,0000 0,0190 0,0107 1,78 47,50
50,00
100
A pureza das amostras tem influência significativa nos resultados de
quantificação por espectrofotômetro. Algumas substâncias contaminantes, como por
exemplo, proteínas, RNA e compostos orgânicos, absorvem luz em comprimentos
de onda próximos a 260 nm
,
elevando os valores da concentração de DNA obtidos.
Uma das vantagens de se utilizar DNA plasmidial na construção das curvas de
calibração é a obtenção de DNA de melhor qualidade quando comparado às
amostras extraídas de material vegetal. Amostras plasmidiais apresentam menor
contaminação com compostos fenólicos e polissacarídeos (BRASILEIRO
&
CARNEIRO, 1998).
3.2. Construção das curvas de calibração baseada em pDNA
a) Curva para quantificação relativa baseda no método da curva padrão
Para a construção das curvas de calibração baseadas em pDNA para a
quantificação relativa pelo método da curva padrão, os valores médios de Ct obtidos
para as diferentes diluições dos plasmídios p-35S e p-Lec foram plotados em função
do logarítimo do número de cópias. Os valores médios de Ct obtidos nas três
diferentes corridas, bem como os valores de SD e CV (%) correspondentes, podem
ser visualizados nas Tabelas 2 e 3, respectivamente, enquanto que as curvas
geradas estão apresentadas na Figura 4.
A comparação entre os valores médios de Ct obtidos em cada diluição
demonstrou alto índice de estabilidade, o que resultou na elaboração de curvas com
significativa reprodutibilidade para ambos os alvos. Os valores de CV (%) para as
curvas p-Lec e p-35S variaram apenas de 0,16% a 3,26%, enquanto que os de SD
ficaram entre 0,06 e 1,11. Os valores médios de Ct mínimo e máximo, que refletem a
quantidade de DNA alvo presente nos pontos extremos da curva, foram obtidos
conforme o esperado, nas diluições com 1.000.000 e 1 cópia do pDNA,
respectivamente, para ambos os alvos, refletindo a linearidade das curvas (KURNET
et al
., 2006). Para as diluições do p-35S, o Ct mínimo foi 20,85 e o máximo 39,96,
enquanto para as de p-Lec foram de 19,24 e 39,61, respectivamente.
101
TABELA 2 – Repetibilidade das curvas de calibração pDNA obtidas para alvo p-35S. Os valores médios de Ct, desvio
padrão (SD) e coeficiente de variação (CV %) para cada diluição dos plasmídios recombinantes foram calculados utilizando o
total de seis diferentes medidas.
Valores de Ct
Número de Cópias do Alvo 35S Replicatas Corrida 1 Corrida 2 Corrida 3 Média SD CV (%)
1.000.000 1 21,45 20,51 20,50 20,85 0,46 2,21
2 21,38 20,41 20,89
500.000
1 22,10 21,37 21,21 21,50 0,47 2,20
2 22,07 21,25 20,98
100.000 1 23,89 24,30 24,24 24,08 0,19 0,80
2 23,83 24,17 24,03
50.000
1 26,21 25,37 25,31 25,91 0,72 2,77
2 26,96 25,19 26,39
10.000 1 28,28 28,26 28,34 28,39 0,32 1,14
2 28,19 28,23 29,05
1.000 1 30,41 31,39 31,54 30,85 0,90 2,92
2 29,27 31,62 30,87
100
1 34,96 34,78 34,80 35,06 0,46 1,31
2 34,82 35,02 35,98
10 1 36,89 38,69 38,32 38,05 0,65 1,70
2 37,91 37,96 38,53
1 1 39,89 40,00 40,00 39,96 0,06 0,16
2 39,87 40,00 40,00
NTC 39,91 39,72 40,00
Coeficiente de Correlação (R
2
) 0,9888 0,9928 0,9886 0,9926
102
TABELA 3 – Repetibilidade das curvas de calibração pDNA obtidas para alvo p-Lec. Os valores médios de Ct, desvio
padrão (SD) e coeficiente de variação (CV %) para cada diluição dos plasmídios recombinantes foram calculados utilizando o
total de seis diferentes medidas.
Valores de Ct
Número de Cópias do Alvo Lectina Replicatas Corrida 1 Corrida 2 Corrida 3 Média SD CV (%)
1.000.000 1 18,77 19,69 19,69 19,24 0,61 3,17
2 18,53 18,78 19,97
500.000
1 19,86 21,33 21,63 20,99 0,68 3,26
2 20,52 21,54 21,06
100.000 1 22,53 24,19 24,10 23,67 0,70 2,95
2 23,08 24,20 23,90
50.000 1 25,78 25,18 26,14 25,58 0,48 1,88
2 25,20 26,10 25,10
10.000
1 28,46 27,79 27,91 27,94 0,49 1,75
2 28,36 28,02 27,09
1.000
1 31,57 31,51 31,98 31,43 0,56 1,79
2 31,12 31,75 30,64
100
1 33,52 35,62 35,63 35,00 1,11 3,18
2 33,63 35,63 35,98
10 1 36,58 37,97 37,99 37,34 0,77 2,06
2 36,28 38,00 37,24
1 1 40,00 40,00 39,81 39,61 0,71 1,79
2 38,19 39,63 40,00
NTC
40,00 39,91 40,00
Coeficiente de Correlação (R
2
) 0,9765 0,9849 0,9882 0,9881
103
p-35S 1
y = -3,1497x + 40,342
R
2
= 0,9888
15
20
25
30
35
40
45
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
Log do Número de Cópias
Ct
p-Lec1
y = -3,3602x + 40,165
R
2
= 0,9765
15
20
25
30
35
40
45
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
Log do Número de Cópias
Ct
p-35S 2
y = -3,419x + 41,269
R
2
= 0,9904
15
20
25
30
35
40
45
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
Log do Número de Cópias
Ct
p-Lec 2
y = -3,4526x + 41,319
R
2
= 0,9849
15
20
25
30
35
40
45
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
Log do Número de Cópias
Ct
p-35S 3
y = -3,3892x + 41,323
R
2
= 0,9886
15
20
25
30
35
40
45
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
Log do Número de Cópias
Ct
p-Lec 3
y = -3,4178x + 41,137
R
2
= 0,9882
15
20
25
30
35
40
45
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
Log do Número de Cópias
Ct
FIGURA 4 – Curvas de calibração para quantificação relativa pelo método da curva
padrão. As curvas foram obtidas pela interpolação do logarítimo do número de cópias dos
plasmídios p35S e p-Lec em função dos valores de Ct. Cada curva foi gerada em três
corridas independentes sob condições de repetibilidade
.
104
Dentre os parâmetros que indicam a qualidade das curvas de calibração
destacam-se os valores de R
2
. Este coeficiente indica o nível de correlação entre o
número de cópias de pDNA em cada diluição e os valores de Ct obtidos. Para a
quantificação do percentual de resíduos transgênicos utilizando curvas de
calibração, o valor mínimo aceitável de R
2
é de 98% (TAVANIERS
et al
., 2004). Em
todas as três curvas geradas para o alvo 35S os valores de R
2
foram superiores
a 98%. Para o alvo lectina, apenas na primeira repetição, a curva gerada
apresentou valor de R
2
inferior, de 97,65%. Os valores médios de R
2
para o p-35S
foi de 99,26% enquanto para o p-Lec foi de 98,59%.
b) Curva para quantificação relativa baseda no método do delta Ct
As curvas de calibração para quantificação relativa pelo método do delta Ct
foram construídas misturando-se os dois plasmídios, p-35S e p-Lec, nas devidas
proporções, a fim de se obter padrões com 100%, 50%, 25%, 10%, 5%, 2,5%, 1%,
0,5%, 0,1% e 0,01% do alvo transgênico com relação ao alvo endógeno (%OGM). A
partir dos valores de Ct, obtidos para cada um dos alvos, os valores de delta Ct
foram determinados. Nas três diferentes curvas geradas os valores médios de delta
Ct para cada um dos padrões foi plotado em função do logarítimo da %OGM. Os
valores médios de delta Ct obtidos nas três diferentes corridas, bem como os valores
de SD e CV (%) correspondentes, podem ser visualizados na Tabela 4, enquanto
que as curvas geradas estão apresentadas na Figura 5.
Os valores médios de delta Ct obtidos para cada um dos padrões foram
similares nas diferentes repetições, conforme demonstrado pelos valores de SD, que
não ultrapassaram 1,5. A estabilidade das curvas também foi confirmada pelos
valores de CV (%). Excetuando-se a amostra com 25% de OGM, todos os demais
desvios em relação às médias foram inferiores à 10%. De acordo com os
requerimentos de performance para validação de metodologias para quantificação
de OGMs, os valores de CV (%) não devem ser superiores a 20% (PUUMALAINEM
et al
., 2003). No entanto, desvios variando de 20% a 35% são reportados como
comuns para experimentos de quantificação de OGMs que sejam validados apenas
intralaboratorialmente (TAVANIERS
et al
., 2004). Deste modo, embora o padrão
25% tenha apresentado desvios elevados entre os valores de delta Ct, também
caracterizado pelo CV (%) de 28,22%, o valor obtido ainda foi considerado aceitável.
105
TABELA 4 – Repetibilidade das curvas de calibração pDNA baseadas no método delta Ct. Os valores médios de delta Ct entre
os alvos p-35S e p-Lec, desvio padrão (SD) e coeficiente de variação (CV %) para cada um dos padrões obtidos pela mistura
dos plasmídios recombinantes foram calculados utilizando o total de seis diferentes medidas.
Valores de delta Ct
% OGM Replicatas Corrida 1 Corrida 2 Corrida 3 Média SD CV (%)
100 1 0,40 0,36 0,38 0,40 0,04 8,83
2 0,42 0,46 0,39
50 1 1,19 1,06 1,15 1,17 0,11 9,18
2 1,37 1,16 1,10
25 1 2,76 1,64 1,86 2,09 0,59 28,22
2 2,94 1,69 1,69
10 1 4,14 3,30 3,98 3,76 0,30 8,06
2 3,84 3,54 3,77
5 1 5,94 5,41 4,90 5,42 0,41 7,56
2 5,82 5,07 5,36
2,5 1 6,64 6,82 6,12 6,43 0,44 6,91
2 5,83 6,19 6,95
1,00 1 8,45 8,67 7,86 8,46 0,33 3,88
2 8,73 8,69 8,38
0,50 1 9,57 10,02 9,32 9,75 0,60 6,17
2 10,70 9,91 8,98
0,10 1 12,80 12,67 11,66 12,29 0,68 5,55
2 12,60 12,80 11,21
0,01 1 16,73 16,17 13,95 15,54 1,33 8,58
2 17,01 15,38 14,00
0,00 1 18,10 18,25 15,51 18,40 1,36 7,37
2 19,02 18,40 18,32
Coeficiente de Correlação (R
2
) 0,9967 0,9918 0,9987 0,9957
106
Delta Ct 1
y = -4,1789x + 8,5208
R
2
= 0,9967
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
-2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Log % GMO
Delta Ct
Delta Ct 2
y = -4,1083x + 8,1998
R
2
= 0,9918
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
-2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Log % GMO
Delta Ct
Delta Ct 3
y = -3,6173x + 7,5585
R
2
= 0,9887
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
-2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Log % GMO
Delta CT
FIGURA 5 – Curvas de calibração para quantificação relativa pelo método do delta
Ct. As curvas foram obtidas pela interpolação do logarítimo do percentual de OGM em
função dos valores de delta Ct. Cada curva foi gerada em três corridas independentes sob
condições de repetibilidade.
107
Nas curvas contruídas com os valores de delta Ct, o ponto máximo da curva
deve apresentar o valor mínimo de delta Ct, e vice versa. Nas três diferentes curvas
geradas os padrões contedo 0,01% apresentaram o valor médio de delta Ct de
15,54, enquanto que os de 100% apresentaram o valor de 0,40, caracterizando os
extremos da curva, conforme esperado para curvas que apresentam níveis
satisfatórios de linearidade. Além de ter sido possível ampliar a faixa de trabalho da
curva, de 0,01% a 100%, quando comparados com os CRMs que variam apenas de
0,1 a 5,0%, a curva apresentou uma linearidada satisfatória, que pode ser
confirmada pelos valores de R
2
, que atingiu o valor médio de 99,57%.
3.3. Construção das curvas de calibração baseada em gDNA
DNA genômico extraído dos CRMs, contendo de 0,1 a 5,0% de resíduo
transgênico, foi utilizado para construção curvas de calibração pelo método do delta
Ct. Estas curvas foram utilizadas para a análise comparativa com as baseadas em
pDNA. Os valores médios de delta Ct obtidos nas três diferentes corridas, bem como
os valores de SD e CV (%) correspondentes, podem ser visualizados na Tabela 5,
enquanto que as curvas geradas estão apresentadas na Figura 6.
Assim como as curvas baseadas em pDNA, as curvas construídas a partir de
gDNA também apresentaram elevado índice de repetibilidade, com os valores de SD
variando de 0,25 a 1,28, enquanto que os de CV (%) permaneceram entre 4,89% e
9,80%. Os CRMs 0,1% e 5,0% apresentaram os valores máximo e mínimo de delta
Ct de 11,70 e 5,20, repectivamente, condizentes com os pontos extremos da curva.
O valor médio de R
2
de 99,51%, evidenciou a alta correlação entre os diferentes
CRMs e os valores de delta Ct correspondentes.
Com base nos resultados conclui-se que as curvas de calibração construídas
a partir de DNA plasmidial, obtidas tanto com os plasmídios sozinhos (método da
curva padrão) quanto em uma mistura (delta Ct), apresentaram níveis de
repetibilidade similares quando foram empregados os CRMs. Os menores valores de
SD e CV (%) foram estimados para as curvas baseadas em pDNA, quando utilizada
a metodologia da curva padrão, enquanto que o maior valor médio de R
2
foi obtido a
partir das curvas de pDNA pelo método do delta Ct.
108
TABELA 5 – Repetibilidade das curvas de calibração baseadas gDNA. Os valores
médios de delta Ct, desvio padrão (SD) e coeficiente de variação (CV %) para cada um dos
dos CRMs foram calculados utilizando o total de seis diferentes medidas.
Valores de delta Ct
% OGM Replicatas Corrida 1 Corrida 2 Corrida 3 Média SD CV (%)
5,00 1 5,36 5,22 4,87 5,20 0,25 4,89
2 5,52 5,28 4,92
2,00 1 6,82 7,01 6,21 6,57 0,51 7,77
2 6,99 6,65 5,72
1,00 1 8,21 7,90 6,78 7,67 0,66 8,61
2 8,42 7,75 6,97
0,50 1 8,79 9,79 8,76 9,30 0,58 6,22
2 9,16 10,20 9,08
0,10 1 11,26 12,49 11,20 11,70 0,72 6,14
2 12,39 12,09 10,76
0,00 1 13,01 14,63 11,46 13,05 1,28 9,80
2 12,91 14,39 11,89
Coeficiente de Correlação (R
2
) 0,9951 0,9857 0,9783 0,9951
Alguns parâmetros derivados das curvas de calibração, além de permitirem
verificar a qualidade das curvas, como o R
2
, também proporcionam medidas
comparativas. Dentre estes, destacam-se o valor do y-intercepto e o índice de
inclinação da reta. Uma comparação entre os valores de R
2
, eficiência de
amplificação, índice de inclinação, desvio do valor do intercepto obtido em cada uma
das curvas pDNA e gDNA pode ser observada na Tabela 6.
A inclinação da reta em cada curva de calibração obtida permite estimar os
valores de eficiência de amplificação de cada alvo amplificado por PCR. Uma
inclinação de -3,32 indica uma eficiência de amplificação teórica de 100%
(GINZINGER, 2002). Nas curvas pDNA obtidas pelo método da curva padrão, os
plasmídios contendo o alvo 35S apresentaram uma eficiência média de amplificação
de 100%, enquanto os contendo o alvo lectina a eficiência foi inferior, com 96,38%.
O valor máximo de eficiência para o alvo lectina foi de 98,40%, obtida na primeira
repetição da curva. O emprego da quantificação relativa requer que ambos os alvos
apresentem eficiência de amplificação por PCR similares e preferencialmente
superiores a 90%. Embora tenham sido detectadas diferenças nas eficiências de
amplificação entre os alvos p-Lec e p-35S, diferenças similares foram consideradas
aceitáveis em ensaios de validação de curvas baseadas em pDNA para a
109
gDNA 1
y = -3,7201x + 8,0655
R
2
= 0,9951
0
2
4
6
8
10
12
14
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0
Log % OGM
Delta Ct
gDNA 2
y = -4,2544x + 8,1808
R
2
= 0,9857
0
2
4
6
8
10
12
14
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0
Log % OGM
Delta Ct
gDNA 3
y = -3,7452x + 7,3023
R
2
= 0,9783
0
2
4
6
8
10
12
14
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0
Log % OGM
Delta Ct
FIGURA 6 – Curvas de calibração para quantificação relativa pelo método do delta
Ct. As curvas foram obtidas pela interpolação do logarítimo do percentual de OGM em
função dos valores de delta Ct. Cada curva foi gerada em três corridas independentes sob
condições de repetibilidade.
110
quantificação evento específica de canola
LibertyLink
(BLOCK
et al
., 2003). A
influência da variação das eficiências de amplificação entre os alvos p-35S e p-Lec
na quantificação de resíduos transgênicos também foi avaliada em etapas
posteriores deste trabalho.
Nas curvas pDNA e gDNA, construídas pelo método do delta Ct, somente foi
possível determinar a eficiência de amplificação do sistema, uma vez que ambos os
alvos contribuem para a elaboração de uma única curva de calibração. Para as
curvas obtidas com os pDNA, a eficiência média foi de 78,84% enquanto que para
as com gDNA, foi de 81,81%. Este decréscimo na eficiência pode ser explicado pela
presença de um alto número de cópias de ambos os plasmídios contidos nos
padrões pDNA de %OGM, que podem ter influenciado na eficiência da reação de
PCR, comparada quando cada plasmídio foi diluído independentemente. Embora
ambos os plasmídios estivessem compondo o padrão de %OGM, cada um deles foi
amplificado independentemente em diferentes reações. Deste modo o declínio na
eficiência não pode ser atribuída à competição entre a amplificação entre os alvos,
mas sim com o
background
das diluições, também conhecido como efeito de matriz.
(KURNET
et al
., 2006). No caso das curvas baseadas em gDNA a menor eficiênica
pode ser atribuída a menor qualidade do DNA amplificado quando comparado com
DNA plasmidial.
Os valores do Y-intercepto permitem a determinação dos valores de Ct ou
delta Ct necessários para amplificar uma vez a unidade empregada na obtenção da
curva (TAVANIERS
et al
., 2004). Quando as curvas são construídas plotando-se os
números de cópias do alvo em função dos valores de Ct, o valor em que a
reta corta o eixo y correponde ao número de ciclos necessários para que uma cópia
do alvo seja amplificada. Teoricamente, considerando uma reação de PCR com 45
ciclos, é assumido que para uma cópia ser detectada sejam necessários 40 ciclos.
Caso a curva empregue os valores de delta Ct em função da %OGM, o valor ideal
de delta Ct seria de 6,644 para a detecção de uma amostra com 1% de OGM. Uma
análise comparativa das três diferentes curvas avaliadas demonstra que as curvas
pDNA construídas pelo método da curva padrão apresentam os menores desvios
quando comparados aos valores ideais do y-intercepto, e ainda os valores mais
elevados de eficiência de amplificação.
111
TABELA 6 – Análise comparativa entre os principais parâmetros que definem a qualidade das curvas de calibração para
quantificação de OGMs. As curvas pDNA e gDNA foram compadas em relação aos valores do coeficiente de correlação (R
2
), Y-
intercepto, índice de inclinação da reta e eficiência de amplificação por PCR. As curva pDNA foram avaliadas pelo método do delta
Ct e da curva padrão, enquanto as gDNA apenas pelo delta Ct. Cada curva foi gerada em três corridas independentes.
Padrões de Calibração Corrida Método R
2
Y-Intercepto
Desvio do valor ideal
do Y-intercepto (%) *
Índice de Inclinação
da reta
Eficiência (%) **
gDNA (0,1%-5%) 1 Delta Ct 0,9951 8,0655 21,39 -3,7201 85,69
2 Delta Ct 0,9857 8,1808 23,13 -4,2544 71,81
3 Delta Ct 0,9783 7,3023 9,90 -3,7452 84,93
pDNA (0,01%-100%)
1
Delta Ct 0,9967 8,5208 28,24 -4,1789 73,34
2 Delta Ct 0,9918 8,1998 23,41 -4,2083 72,83
3 Delta Ct 0,9987 7,5585 13,76 -3,6173 88,99
pDNA
1 p-35S 0,9888 40,342 0,85 -3,1497 100
p-Lec 0,9765 40,165 0,41 -3,3602 98,42
2 p-35S 0,9928 41,189 2,97 -3,3898 97,24
p-Lec 0,9849 41,319 3,29 -3,4526 94,82
3 p-35S 0,9886 41,323 3,30 -3,3892 97,26
p-Lec 0,9882 41,137 2,84 -3,4178 94,64
* O valor ideal do y-intercepto é 6,644 para as curvas geradas pelo método do delta Ct e 40 para as geradas pelo método da curva padrão;
** Os valores da eficiência foram estimados em função do índice de inclinação da reta (E = 10
-1/indice de inclinação
– 1).
112
3.3. Determinação da acuracidade e precisão da quantificação de OGMs
utilizando curvas de calibração baseadas em pDNA
Para verificar a acuracidade das curvas de calibração construídas com os
plasmídios recombinantes, estas foram utilizadas para a determinação do
percentual de resíduos transgênicos presentes nos CRMs, contendo 0,1 a 5,0%
de OGMs. Os CRMs foram tratados como amostras com %OGM desconhecidos.
Cada padrão foi quantificado em duplicata em três diferentes corridas, tanto pelo
método da curva padrão quanto pelo delta Ct. As Tabelas 7 e 8 apresentam os
resultados médios de quantificação para cada um dos padrões, pelos métodos do
delta Ct eda curva padrão, respectivamente.
Os resultados estimados de %OGM obtidos a partir das curvas pDNA
construídas pelo método do delta Ct foram apresentaram elevada acuracidade.
Os valores médios de %OGM obtidos para os CRMs contendo 0,1%, 0,5%, 1%,
2% e 5% de soja RR foram 0,13%, 0,53%, 1,30%, 2,45% e 5,35%,
respectivamente. Os valores de SD, que variaram apenas de 0,03 a 0,31, e o CV
(%) médio de 19,89%, confirmam a precisão das curvas. Os maiores valores de
CV (%) foram obtidos para a quantificação dos padrões 0,1% (25,04%) e 0,5%
(42,52%). Caso estes padrões fossem excluídos o CV (%) médio decresceria
para 10,63%. As maiores variaçãos nos resultados são esperadas para estes
padrões, uma vez que a incerteza da medição se eleva a medida que o conteúdo
de OGMs decresce nas amostras (PARDIGOL
et al
., 2003).
O erro médio atingiu o valor extremo de 30,06% para o padrão 1%, o que
pode ser considerado elevado para alguns autores, que afirmam que os valores
dos desvios com relação à média e com relação aos valores esperados não
devem ultrapassar 20% (PUUMALAINEM et al., 2003). No entanto, valores de
erro e CV (%) variando de 20% a 35% tem sido descritos com alta frequência
para experimentos de quantificação de OGMs que sejam validados apenas
intralaboratorialmente (TAVANIERS
et al
., 2004; PARDIGOL
et al
, 2003).
113
TABELA 7 – Acuracidade e precisão da quantificação dos CRMs pelo emprego de curvas baseadas em pDNA pelo método
do delta Ct. As curvas baseadas em pDNA foram utilizadas para quantificação de amostras com %OGM definidos. Cada CRM foi
quantificado em duplicata em três corridas independentes. A partir da %OGM obtida para cada um dos CRMs, foram estimados os
valores dos erros com relação à %OGM esperada, coeficiente de variação (CV %), desvio padrão (SD) e taxa de recuperação
(R%).
CRMs Corrida Delta Ct %GMO Média SD CV (%) CV (%) Médio
* Erro Médio ** R (%)
0,10% 1 11,82 0,16 0,13 0,03 25,04 19,89 26,79 126,79
2 12,29 0,10
3 10,98 0,12
0,50%
1 8,97 0,78 0,53 0,22 42,52 5,20 105,20
2 9,99 0,37
3 8,92 0,43
1,00%
1 8,31 1,12 1,30 0,22 16,98 30,06 130,06
2 7,82 1,23
3 6,88 1,55
2,00% 1 6,91 2,43 2,45 0,31 12,51 22,36 122,36
2 6,83 2,15
3 5,96 2,76
5,00% 1 5,44 5,46 5,35 0,13 2,41 7,09 107,09
2 5,25 5,21
3 4,90 5,39
* Erro = (valor obtido – valor esperado / valor esperado) x 100;
** Taxa de recuperação = (média do valor obtido / valor esperado) x 100.
114
TABELA 8 – Acuracidade e precisão da quantificação dos CRMs pelo emprego de curvas baseadas em pDNA pelo método
curva padrão. As curvas baseadas em pDNA foram utilizadas para quantificação de amostras com %OGM definidos. Cada CRM foi
quantificado em duplicata em três corridas independentes. A partir dos %OGM obtidos foram estimados os valores dos erros com
relação ao valor de %OGM esperados, coeficiente de variação (CV %), desvio padrão (SD) e taxa de recuperação (R%).
CRMs Corrida Cópias do p-35S Cópias do p-Lec %GMO Média SD CV (%) CV (%) Médio
* Erro Médio ** R (%)
0,10% 1 1,57 4.467,89 0,04 0,04 0,02 45,40 35,31 57,27 42,73
2 256,90 911.618,01 0,03
3 16,86 26.042,14 0,06
0,50% 1 3.932,13 967.344,61 0,41 0,27 0,14 50,28 45,63 54,37
2 2.072,37 1.555.655,18 0,13
3 16.085,81 5.832.742,23 0,28
1,00% 1 12.210,64 1.787.442,21 0,68 0,78 0,26 33,91 21,92 78,08
2 28.651,75 4.950.020,11 0,58
3 7.619,74 705.146,89 1,08
2,00% 1 7.760,58 446.796,86 1,74 1,62 0,46 28,17 18,78 81,22
2 28.268,42 2.521.470,12 1,12
3 10.557,02 523.812,77 2,02
5,00% 1 7.760,58 162.961,72 4,76 4,04 0,76 18,77 19,24 80,76
2 89.422,70 2.751.210,61 3,25
3 6.172,90 150.521,88 4,10
* Erro = (valor obtido – valor esperado / valor esperado) x 100;
** Taxa de recuperação = (média do valor obtido / valor esperado) x 100.
115
A quantificação dos CRMs a partir das curvas baseadas no método da
curva padrão apresentou acuracidade intermediária. Os valores estimados para
os CRMs com 0,1 a 5% de de resíduos transgênicos foram de 0,04%, 0,27%,
0,78%, 1,62% e 4,04%, respectivamente. Os desvios foram comparativamente
mais elevados, sendo que o SD variou de 0,02 a 0,76 e o CV (%) médio atingiu
o valor de 35,31%. O erro médio foi a medida que apresentou valores mais
elevados, atingindo 57,27% para o CRM 0,1% e 45,63 para o CRM 0,5%.
Novamente percebe-se a influência dos padrões com baixos percentuais de
OGM na acuracidade das curvas. Estes valores, embora elevados, são
considerados aceitáveis quando comparados a outros ensaios de validação de
sistemas de quantificação de OGMs, que toleraram desvios nos resultados de
quantificação de amostras padrões variando de 70% a 79% de erro e 25% a
50% de CV (%) , para padrões de soja e milho GM, respectivamente (ANKLAN
et
al
., 2002; VAN DEN EEDE
et al
., 2000).
A taxa de recuperação foi também utilizada para verificar a acuracidade
das curvas pDNA. Ela é obtida pela razão entre os valores estimados e os
esperados e atinge 100% quando os valores estimados são iguais aos esperados
(x=y). Esta taxa pode ser descrita por uma equação de regressão linear entre os
valores esperados e estimados de %OGM (HÄDRICH
et al
., 1999). A inclinação
da reta obtida a partir da regressão indica uma acuracidade satisfatória quando
os valores estão entre 0,7-1,2, sendo de 100% quando a inclinação é igual a 1
(BLOCK
et al
., 2003). Apenas quando a quantificação dos CRMs foi realizada
pelo método do delta Ct é que a equação da reta apresentou uma inclinação
dentro do intervalo esperado (0,9349). Todos os CRMs quantificados por este
método também apresentaram taxas de recuperação próximas a 100%. Pelo
método da curva padrão a inclinação foi levemente superior à máxima esperada,
atingindo 1,2135, e os valores estimados dos CRMs corresponderam a cerca de
80% dos valores esperados.
A representação gráfica da distribuição das taxas de recuperação obtidas
na quantificação de cada um dos padrões, pelos métodos da curva padrão e do
delta Ct, pode ser observada na Figura 7. Para comparação, a taxa de
recuperação de 100% foi também representada. Estes dados confirmam a
maior acuracidade e precisão das curvas pDNA na quantificação dos CRMs
quando foi utilizado o método do delta Ct.
116
Acuracidade das curvas pDNA na quantificação de OGMs
y = x
y = 1,2135x + 0,0799
y = 0,9349x - 0,104
0,0
2,0
4,0
6,0
0,0 2,0 4,0 6,0
% OGM Estimada
% OGM
pDNA Ct
pDNA deltaCt
100% de recuperação
FIGURA 7 – Comparação da acuracidade da quantificação de OGM utilizando curvas
pDNA pelo método do delta Ct e da curva padrão. A equação de regressão foi gerada
plotando-se os valores de %OGM estimados em função dos observados. A equação que
indica 100% de taxa de recuperação é mostrada para comparação.
3.5. Determinação do conteúdo de resíduos transgênicos em amostras de
alimentos utilizando as curvas de calibração baseadas em pDNA
As curvas de calibração baseadas em pDNA foram avaliadas na quantificação
de sete diferentes tipos de amostras: salsicha, empanado, matinais, farinha de trigo,
ração, farelo de soja e soja grão. A quantificação do percentual de soja GM nas
diferentes amostras foi realizada utilizando-se as curvas de calibração baseadas em
pDNA, pelo método do delta Ct e da curva padrão, e em gDNA, pelo método delta
Ct, construída com os CRMs. O resultado da determinação do percentual de
resíduos transgênicos nas diferentes amostras, utilizando as três diferentes curvas, e
os valores de SD e CV (%) correspondentes podem ser observados na Tabela 9.
117
TABELA 9 – Acuracidade da quantificação da %OGM em amostras de alimentos utilizando as curvas pDNA e gDNA. Cada
amostra foi quantificada em três diferentes corridas sob condições de repetibilidade. Foram empregadas as curvas pDNA, baseada
no método da curva padrão, e as curvas pDNA e gDNA que utilizaram o método do delta. Os valores médios do % de OGM das
amostras e os desvio padrão (SD) e coeficiente de variação (CV % ) foram calculados utilizando o total de seis diferentes medidas.
gDNA Método do Delta Ct (0,1 - 5%) pDNA Método do Delta Ct (0,01 - 100%) pDNA Método da Curva Padrão
Amostra Corrida
Delta
Ct
%OGM Média SD CV (%)
CV (%)
Médio
%GMO Média SD CV (%)
CV
Médio
%GMO Média SD CV (%)
CV (%)
Médio
1 3,98 12,50 11,80 1,03 8,72 18,91 12,17 13,11 0,81 6,17 15,90 11,01 11,01 0,61 5,58 15,73
2 3,55 12,28 13,56 10,39
Salsicha
3 3,46 10,62 13,59 11,62
1 9,84 0,33 0,42 0,17 40,18 0,48 0,48 0,13 26,98 0,14 0,19 0,05 25,22
2 9,10 0,61 0,61 0,23
Empanado
3 9,22 0,31 0,35 0,21
1 4,30 10,31 8,45 1,81 21,40 10,25 9,26 0,92 9,96 8,02 6,76 1,11 16,40
2 4,26 8,35 9,10 5,93
Hidrolisados de
soja
3 4,21 6,70 8,43 6,33
1 6,59 2,49 2,45 0,39 16,07 2,89 2,77 0,27 9,80 2,09 1,82 0,24 13,39
2 6,26 2,82 2,96 1,61
Ração
3 6,15 2,04
2,46
1,77
1 5,22 5,83 4,01 1,62 40,45 6,18 4,39 1,56 35,47 3,86 2,74 0,99 36,11
2 5,88 3,48 3,68 1,99
Farinha de trigo
3 5,68 2,72
3,32
2,37
1 15,26 0,0119 0,01 0,0025 0,0000 0,02 0,02 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
2 16,11 0,0146 0,01 0,00
Farelo de soja
3 15,02 0,0096
0,01
0,00
1 1,01 78,95 76,57 4,28 5,59 71,81 94,96 21,76 22,91 125,62 108,82 14,58 13,40
2 0,10 79,13 114,99 101,41
Soja grão
3 0,35 71,63 98,07 99,44
118
Todas as três curvas permitiram uma quantificação de resíduos transgênicos
com elevada precisão. No entanto, os menores desvios entre os percentuais de
OGM estimados para cada uma das amostras foram observados quando a curva
pDNA, baseada no método da curva padrão, foi empregada. Nesta curva,
excetuando-se a amostra de soja grão, que apresentou o percentual médio de OGM
de 108,92%, e obteve o desvio padrão mais elevado, de 14,58, todas as demais
amostras testadas os desvios entre os resultados estimados entre as três repetições
não ultrapassaram 1,11. Os menores valores de repetibilidade na quantificação do
percentual de resíduos transgênicos também foram observados para a amostra de
soja grão quando foram empregadas as curvas baseadas no método do delta Ct. Os
desvios atigiram os valores de 21,76 e 4,28, nas curvas pDNA e gDNA,
respectivamente. Caso esta amostra fosse desconsiderada, os desvios máximos
seriam de 1,56 e 1,81, respectivamente. No entanto, considerando o percentual
mínimo aceitável para os desvios dos resultados em torno de 20%, estes valores
ainda garantem alta precisão (TAVANIERS
et al
., 2004). No caso das curvas gDNA,
onde os padrões variam apenas de 0,1 a 5,0% de OGM, este resultado é esperado,
uma vez que valores de %OGM acima de 5,0% extrapolam o intervalo de confiança
da curva. Nas curvas pDNA esta variação pode ser atribuída à falta de precisão dos
padrões pDNA que apresentavam elevado número de cópias. A variação entre as
eficiências de amplificação dos padrões p-Lec e p-35S, estimados a partir do índice
de inclinação das curvas obtidas, pode ter tido maior influência na quantificação de
amostras que apresentavam alto número de cópias do alvo, nas quais grande parte
do DNA da espécie analisada é GM.
A alta precisão das curvas pode ser também observada a partir dos valores
de CV (%) médio, que foi menor nas curvas pDNA que utilizaram o método da curva
padrão, com cerca de 15,73%, e de 15,90% e 18,91% para as curvas pDNA e
gDNA, que utilizaram o método do delta Ct, respectivamente. Mesmo para as
amostras que apresentaram menores percentuais de resíduos de soja GM em sua
composição, como as de farelo de soja ou empandado, ou mesmo baixos
percentuais de soja na composição do produto, como as de matinais e farinha de
trigo, os valores estimados da %OGM foram estáveis nas diferentes repetições.
Deste modo pode-se concluir que as curvas baseadas em pDNA foram capazes de
estimar o percentual de resíduos transgênicos com níveis de repetibilidade similares
quando comparadas com as baseadas em gDNA. Tal fato, no entanto, não pode
119
garantir a certeza dos resultados, uma vez que o percentual das amostras é
desconhecido e as amostras CRMs não estão sendo assumidas como apresentando
100% de acuracidade. Isto decorre do grande número de variávies inerentes no
processo de obtenção dos padrões baseados em gDNA.
A comparação dos valores percentuais de resíduos transgênicos das
amostras entre as curvas pDNA com a curva gDNA, revela uma maior similaridade
entre os resultados obtidos pelas curvas pDNA e gDNA, quando o mesmo método
de quantificação foi utilizado, o delta Ct. A alta similaridade entre as curvas que
empregaram o método do delta Ct tornou os desvios dos resultados de %OGM das
amostras menores entre estas diferentes curvas, quando comparados com os
desvios estimados dentro de cada uma destas curvas. Excetuando-se a amostra de
soja grão, os desvios obtidos entre estas duas curvas, variaram apenas de 0,002 a
0,93, com o CV (%) não ultrapassando 7,7%, enquanto dentro de cada uma das
curvas, pDNA e gDNA, os desvios variaram de 0,01 a 1,56 e de 0,002 a 1,81,
respectivamente. Os valores de CV (%) médio também foram mais elevados,
superiores a 15% para ambas as curvas. Em contrapartida, quando os valores de
quantificação das amostras entre as curvas pDNA e gDNA, utilizaram diferentes
métodos de quantificação, o da curva padrão ou o do delta Ct, os valores de desvios
obtidos variaram de 0,01 a 1,19, sendo que o desvio em relação à média dos
resultados obtidos atingiu o valor mais elevado de 20,78%. Este valor foi até mesmo
superior ao de 18,18%, obtido quando as três diferentes curvas foram comparadas.
As comparações nos resultados de quantificação obtidos entre cada curva pDNA
com a curva gDNA, bem como entre as três diferentes curvas, podem ser
observadas as Tabelas 10, 11 e 12, respectivamente
Embora os padrões utilizados para a construção das curvas pDNA e gDNA
apresentem diferentes origens, a presença de ambos os alvos na composição de
cada padrão de %OGM parece ter levado à maior similaridade nos resultados
estimados de delta Ct. Nas curvas pDNA, baseadas no método do delta Ct, os
plasmídios p-35S e p-Lec foram misturados em proporções específicas para o
obtenção dos padrões de %OGM. Embora cada alvo tenha sido amplificado
independentemente, em reações simples, o
background
parece ter influenciado na
eficiência e, conseqüentemente, na quantificação dos padrões. Estes padrões,
embora constituídos de DNA plasmidial, apresentaram maior semelhança aos
baseados em gDNA e às amostras a serem quantificadas, onde ambos os alvos
120
estão presentes. Deste modo, embora os padrões baseados em pDNA sejam mais
puros e apresentem maiores potencialidades em termos de precisão e qualidade das
curvas obtidas, isto pode acarretar uma grande dissimilaridade com as amostras de
interesse a serem quantificadas. Tal fato foi demonstrado pela menor acuracidade
destes padrões na quantificação dos CRMs e das amostras de alimentos.
121
TABELA 10 – Acuracidade da quantificação da %OGM entre as curvas pDNA e gDNA. A %OGM das diferentes amostras
foram comparadas entre curvas pDNA e gDNA, ambas baseadas no método do delta Ct. Os valores de desvio padrão (SD) e
coeficiente de variação (CV % ) foram calculados entre as médias dos valores de %OGM obtidas em cada curva.
Amostra
gDNA Método do
Delta Ct (0,1 – 5%)
pDNA Método do
Delta Ct (0,01 - 100%) Média
SD Entre
Métodos
CV (%) Entre os
Métodos
CV (%) Médio Entre
os Métodos
11,80
13,11 12,46 0,93 7,44
7,67
Salsicha
0,42
0,48 0,45 0,04 9,41
Empanado
8,45
9,26 8,86 0,58 6,50
Matinais
2,45 2,77 2,61 0,23 8,76
Ração
4,01 4,39 4,20 0,27 6,40
Farinha de trigo
0,00 0,02 0,01 0,002 0,00
Farelo de soja
76,57 94,96 85,77 13,00 15,16
Soja grão
122
TABELA 11 – Acuracidade da quantificação da %OGM entre as curvas pDNA e gDNA. A %OGM das diferentes amostras
foram comparadas entre curvas de calibração utilizadas. Foram empregadas as curvas pDNA, baseada no método da curva
padrão, e a curva gDNA que o método do delta Ct foi utilizado. Os valores de desvio padrão (SD) e coeficiente de variação (CV %)
foram calculados entre as médias dos valores de %OGM obtidas em cada método.
Amostra
gDNA Método do
Delta Ct (0,1 – 5%)
pDNA Método da
Curva Padrão Média
SD Entre
Métodos
CV (%) Entre os
Métodos
CV (%) Médio Entre
os Métodos
11,80 11,01 11,40 0,56 4,90
20,78
Salsicha
0,42 0,19 0,31 0,16 52,92
Empanado
8,45 6,76 7,61 1,19 15,71
Hidrolisados de
soja
2,45 1,82 2,14 0,44 20,68
Ração
4,01 2,74 3,37 0,90 26,65
Farinha de trigo
0,00 0,00 0,01 0,01 0,00
Farelo de soja
76,57 108,82 92,70 22,81 24,60
Soja grão
123
TABELA 12 – Acuracidade da quantificação da %OGM entre as curvas pDNA e gDNA. A %OGM das diferentes amostras
foram comparadas entre curvas de calibração utilizadas. Foram empregadas as curvas pDNA, baseada no método da curva
padrão, e as curvas pDNA e gDNA que utilizaram o método do delta. Os valores de desvio padrão (SD) e coeficiente de variação
(CV % ) foram calculados entre as médias dos valores de %OGM obtidas em cada método.
Amostra
gDNA Método do
Delta Ct (0,1 – 5%)
pDNA Método do
Delta Ct (0,01 - 100%)
pDNA Método da
Curva Padrão Média
SD Entre
Métodos
CV (%) Entre os
Métodos
CV (%) Médio Entre
os Métodos
11,80 13,11 11,01 11,97 1,06 8,86
18,18
Salsicha
0,42 0,48 0,19 0,36 0,15 41,70
Empanado
8,45 9,26 6,76 8,16 1,28 15,65
Hidrolisados de
soja
2,45 2,77 1,82 2,35 0,48 20,46
Ração
4,01 4,39 2,74 3,71 0,87 23,30
Farinha de trigo
0,00 0,02 0,00 0,01 0,01 0,00
Farelo de soja
76,57 94,96 108,82 93,45 16,18 17,31
Soja grão
124
4. DISCUSSÃO
Dois tipos de padrões vêm sendo utilizados na quantificação relativa de
resíduos transgênicos, os baseados em gDNA, também conhecidos como CRMs, e
os baseados em pDNA (ALARY
et al.
, 2002; HIRD
et al
., 2003; TERRY
et al
., 2001;
TOYOTA
et al
., 2006).
Os CRMs atualmente disponíveis variam apenas de 0,1% a 5,0% de OGM e
são produzidos pela equivalência em massa de farinha de grãos GM e não GM,
enquanto que na amplificação por PCR a equivalência da %OGM é dada em termos
de número de moléculas de DNA amplicadas. A extrapolação da equivalência do
número de moléculas de DNA para massa não é exata, uma vez que o número de
moléculas de DNA em uma unidade de material GM pode ser diferente da
quantidade de DNA em uma unidade de material não GM. Tal fato tem levado a
validação de métodos de quantificação de OGM baseados no número de cópias de
moléculas de DNA. As moléculas de DNA plasmidial, contendo os fragmentos
transgênicos e endógenos clonados, se tornaram grandes candidatos para a
obtenção de padrões baseados em número de cópias para quantificação de OGM
(BLOCK
et al.
, 2003; TERRY
et al
., 2001; HERNANDEZ
et al.
, 2003). Estas
moléculas apresentam, dentre outras características que favorecem seu uso no lugar
dos padrões baseados em gDNA, fácil manipulação, DNA de boa qualidade e
estabilidade, baixo custo quando comparadas aos CRMs, ampla faixa de trabalho
(0,01% a 100%) e não necessitam de etapas exaustivas de homogeneização para
125
serem produzidas, que podem levar a severa degradação do DNA. Os padrões
baseados em DNA plasmidial também independem de variações comumente
encontradas nos padrões gDNA, como por exemplo, níveis de heterozigosidade,
variedades dos grãos, quantidade de DNA por massa dos grãos GM com relação ao
não GM.
No presente trabalho os fragmentos de DNA correspondentes a partes da
região promotora 35S e do gene da lectina de soja foram clonados e utilizados para
a produção de padrões de OGM. Estes padrões baseados em pDNA foram utilizados
para a construção de curvas de calibração para quantificação de OGM pelo método
da curva padrão e delta Ct. Baseados nos resultados obtidos, ambas as curvas
construídas com pDNA, que empregam os métodos da curva padrão ou do delta Ct,
foram capazes de quantificar com precisão amostras com percentuais de OGM
definidos. No entanto, quando foi empregado o método do delta Ct, a acuracidade da
quantificação dos CRMs foi mais elevada em todos os parâmetros avaliados. Uma
explicação para a menor acuracidade das curvas baseadas no método da curva
padrão se refere à forma de preparo dos padrões. Neste método, cada uma das
curvas p-Lec e p-35S foram construídas independentemente e não houve mistura
dos plasmídios, levando a uma alta eficiência de ambos os alvos amplificados. Em
contrapartida, nas curvas baseadas no método do delta Ct, os plasmídios p-35S e p-
Lec foram misturados em proporções específicas para a obtenção dos padrões de
%OGM. Embora cada alvo tenha sido amplificado independentemente, em reações
simples, o
background
parece ter influenciado na eficiência e, conseqüentemente, na
quantificação dos padrões. Estes padrões apresentam maior semelhança aos
baseados em gDNA, onde ambos os alvos estão presentes, no entanto, isto não
garante a precisão dos resultados.
A interferência na sensibilidade do PCR quantitativo, e, consequentemente,
variações nos resultados de quantificação, devido ao efeito de matriz ou do
background
das diluições de padrões baseados em pDNA, tem sido descritas
principalmente quando é empregada a metodologia SYBR green (KUNERT
et al
.,
2006). No presente trabalho alterações na sensibilidade podem ser observadas pela
variação entre as eficiências de amplificação dos plasmídeos p-Lec e p-35S. Quando
cada padrão continha apenas um dos plasmídios, nas curvas pDNA baseadas no
método da curva padrão, os valores médios de eficiência de amplificação das curvas
p-35S e p-Lec foram de 100% e 96,38%, respectivamente. No entanto, quando
126
ambos os plasmídios foram misturados para a obtenção dos padrões utilizados para
quantificação pelo método do delta Ct, os valores médios de eficiência não
ultrapassaram a 80%.
Deste modo, embora os padrões baseados em pDNA sejam mais puros e
apresentem maiores potencialidades em termos de precisão, isto pode acarretar
uma grande dissimilaridade com as amostras de interesse a serem quantificadas,
como as de alimentos e grãos. Tal pressuposição também foi confirmada a partir dos
resultados de quantificação das amostras de alimentos. Os valores estimados de
resíduos transgênicos nas amostras avaliadas foram significativamente mais
similares quando empregadas as curvas pDNA e gDNA, pelo método do delta Ct,
comparados com aqueles obtidos nas curvas pDNA pelo método da curva padrão.
Uma alternativa para a obtenção de padrões pDNA mais similares às
amostras de interesse seria a diluição dos padrões pDNA em DNA genômico da
espécie selvagem em questão, em lugar de água. Esta estratégia foi empregada por
BLOCK
et al
. (2003), e resultou em padrões pDNA altamente precisos na
quantificação dos CRMs. Com a legislação de rotulagem vigente, a demanda de
quantificação de resíduos transgênicos em diferentes tipos de produtos, compostos
por diferentes tipos de matrizes e níveis de processamento, o emprego dos padrões
baseados em pDNA oferece a alternativa para a obtenção de padrões pDNA
específicos para cada tipo de produto. As amostras de DNA plasmidial podem ser
facilmente diluídas nas mais diferentes matrizes de alimentos, como produtos
cárneos, ração, bebidas lácteas, entre outras, desde que se tenha a matriz não GM
do produto em questão.
Devido à alta acuracidade demonstrada pelos padrões pDNA, principalmente
quando empregado o método do delta Ct, uma etapa complementar da validação
deste sistema para a quantificação de resíduos GM em alimentos, seria a submissão
deste padrões a testes interlaboratoriais, também conhecidos como testes de
proficiência. Estes testes são imprescindíveis se o sistema for submetido à
apreciação de órgãos de padronização internacionais, no caso de análises em
alimentos, o
Codex Alimentarius
.
A organização e participação de testes de proficiência para quantificação de
resíduos transgênicos ainda é pouco freqüente no Brasil, bem como a existência de
laboratórios com capacidade técnica para o desenvolvimento de metodologias
alternativas. Os testes interlaboratoriais mais comuns são desenvolvidos por
127
organizações internacionais e se atêem a metodologias que empregam kits
comerciais e apenas CRMs.
128
5. CONCLUSÕES
- As curvas de calibração construídas a partir de DNA plasmidial, obtidas tanto com
os plasmídios sozinhos (método da curva padrão) quanto em uma mistura (delta Ct),
apresentaram níveis de repetibilidade similares quando foram empregados os
CRMs. No entanto, Os menores valores de SD e %CV foram estimados para as
curvas baseadas em pDNA, quando utilizada a metodologia da curva padrão.
- A avaliação da qualidade das curvas quanto inclinação da reta, y-intercepto e
eficiência de amplificação foram superiores para as curvas pDNA obtidas pelo
método da curva padrão.
- A acuracidade das curvas pDNA pelo método da curva padrão na quantificação dos
CRMs foi intermediária. O Erro médio para CRM 0,1% foi de 57,27. No entanto pelo
método do delta Ct a acuracidade foi elevada, conforme confirmado pelos valores de
SD, %CV, Erro e %R.
- A %OGM das amostras de alimentos não apresentou variação significativa entre as
diferentes curvas utilizadas, concluindo-se que as curvas pDNA são tão precisas
quanto as baseadas em gDNA para a quantificação de resíduos transgênicos em
alimentos. No entanto, houve uma maior similaridade dos resultados quando foi
empregado o mesmo método de quantificação, o delta Ct.
129
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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