Download PDF
ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
CENTRO
DE CIÊNCIAS MÉDICAS
CURSO
DE MESTRADO EM CLÍNICA VETERINÁRIA
MARIANA TAVARES DIAS
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE
ESCHERICHIA COLI PRODUTORA DA LESÃO “ATTACHING
AND EFFACING” (AEEC) ISOLADAS DE AMOSTRAS FECAIS DE
BOVINOS SADIOS.
N
ITERÓI – RJ
2006
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
2
MARIANA TAVARES DIAS
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE
ESCHERICHIA COLI PRODUTORA DA LESÃO “ATTACHING
AND EFFACING” (AEEC) ISOLADAS DE AMOSTRAS FECAIS DE
BOVINOS SADIOS.
Dissertação apresentada ao
Curso de Mestrado em
Clínica Veterinária / Área de
Concentração Microbiologia
da Universidade Federal
Fluminense, como requisito
parcial para a obtenção do
Grau de Mestre.
Orientador: Prof. Dr.Aloysio de Mello Figueiredo Cerqueira
Niterói- RJ
2006
ads:
3
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE ESCHERICHIA COLI PRODUTORA
DA LESÃO “ATTACHING AND EFFACING” (AEEC) ISOLADAS DE AMOSTRAS FECAIS
DE BOVINOS SADIOS.
DIAS, Mariana Tavares
Dissertação de Conclusão do Curso de Mestrado em Clínica Veterinária/Área de Concentração
Microbiologia
Palavras chave;
1. AEEC 2. Bovinos
3. Virulência
4
MARIANA TAVARES DIAS
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE
ESCHERICHIA COLI PRODUTORA DA LESÃO “ATTACHING AND
EFFACING” (AEEC) ISOLADAS DE AMOSTRAS FECAIS DE
BOVINOS SADIOS.
Dissertação apresentada ao
Curso de Mestrado em
Clínica Veterinária / Área de
Concentração Microbiologia
da Universidade Federal
Fluminense, como requisito
parcial para a obtenção do
Grau de Mestre.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr.Aloysio de Mello Figueiredo Cerqueira
Universidade Federal Fluminense
__________________________________
Prof. Dr. Luiz Antônio Trindade de Oliveira
Universidade Federal Fluminense
___________________________________
Prof. Dr. João Ramos Costa Andrade
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
___________________________________
Profa. Dra. Alice Gonçalves Martins Gonzalez
Universidade Federal Fluminense
Niterói-RJ
2006
5
Agradecimentos
Agradeço a Deus, o “orientador” de toda minha vida, por ter permitido a
realização desse projeto, por se fazer presente ao longo da minha caminhada e ter me
levado nos braços nos momentos difíceis, dando-me sustento para nunca desistir.
À minha família pelo carinho, apoio e incentivo, estando sempre a meu lado e
acreditando no meu trabalho.
Ao Professor Dr. Aloysio de Mello Figueiredo Cerqueira, pela orientação,
atenção e tempo dispensados à realização desse trabalho.
Ao Prof. Dr. João Costa Andrade e à Dra. Kinue Irino, pela atenção e
colaboração prestadas.
Aos professores da banca e aos meus antigos professores, hoje colegas, que tanto
me incentivaram e despertaram em mim a admiração pela vida acadêmica.
Aos colegas Analy, Rafael, Cecília e Kelly, que dividiram comigo
responsabilidades e conquistas ao longo desse caminho. À amiga Patrícia, companheira
nas alegrias e nos momentos difíceis, que compartilhou de expectativas e realizações no
decorrer desses dois anos.
Aos amigos que estiveram sempre ao meu lado, me incentivaram e torceram por
mim nessa jornada. Ao meu Ovídio, mais ovídio de todos os ovídios, que com muita
paciência, carinho e noites sem dormir chegou junto comigo ao final dessa etapa. Muito
obrigada!
Aos técnicos Laura e Sérgio pela colaboração fundamental para o bom
andamento dos projetos de pesquisa realizados no laboratório de bactérias
enteropatogênicas da UFF.
A todos que dividem comigo essa alegria, meu sincero
MUITO OBRIGADA!!!
6
Sumário
LISTA DE ILUSTRAÇÕES 8
RESUMO 9
ABSTRACT 11
1. INTRODUÇÃO 13
2. REVISÃO DE LITERATURA 16
2.1. Generalidades 16
2.2. Patogenicidade bacteriana 17
2.3. Escherichia coli produtora da lesão “attaching and effacing”-A/E (AEEC) 19
2.4. AEEC em animais 20
2.5. AEEC em bovinos 20
2.6. Estrutura genética do Locus Enterocyte Effacement – locus LEE 21
2.7. Histopatologia da lesão “attaching and effacing”- A/E 23
3. MATERIAL E MÉTODOS 26
3.1. Meios de cultura, reagentes e soluções 26
3.2. Procedência das amostras 26
3.3. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para
detecção de seqüências genéticas stx1, stx2 e eae 27
3.3.1. Processamento das amostras 27
3.3.2. Protocolo básico da reação de PCR 28
3.4. Isolamento a partir de amostras positivas para o gene eae à PCR 28
3.5. Caracterização genotípica de isolamentos AEEC 29
3.5.1. Reações de PCR 29
3.5.2. Caracterização das variantes α, β e γ dos genes eae, tir, espA e espB 29
3.5.3. PCR para o plasmídio EAF o gene e bfp 30
3.5.4. PCR para as variantes δ e
ε
da intimina 30
3.5.5. Inserção do locus LEE em selC ou pheU 31
3.5.6. PCR para enterohemolisina 31
3.6. Caracterização fenotípica das amostras AEEC 36
3.6.1. Sorotipagem 36
3.6.2. Teste de adesão com células HeLa 36
7
3.6.3. Teste FAZ 37
3.6.4. Pesquisa da produção de hemolisinas 37
4. RESULTADOS 39
4.1. Detecção de seqüências genéticas de stx1, stx2 e eae
em amostras fecais origináris de bovinos sadios 39
4.2. Caracterização genotípica 39
4.2.1. Tipagem do gene eae 39
4.2.2. Tipagem dos genes tir, espA e espB 40
4.2.3. Pesquisa de EAF e bfp 42
4.2.4. Investigação do sítio de inserção do locus LEE 42
4.2.5. Detecção do gene EhlyA 44
4.3. Caracterização fenotípica 46
4.3.1. Teste de adesão celular e Teste FAZ 46
4.3.2. Avaliação sorológica 47
4.3.3. Teste para pesquisa de hemolisinas 47
5. DISCUSSÃO 54
6. CONCLUSÃO 60
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 61
8
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
TABELA 1
Genes ou marcadores, “primers”, protocolos e produtos da PCR utilizados nesse estudo 32
TABELA 2
Caracterização genotípica das amostras AEEC originárias de bovinos sadios 45
TABELA 3
Caracterização fenotípica das amostras AEEC originária de bovinos sadios 49
TABELA 4
Caracterização genotípica e fenotípica das amostras AEEC originária de bovinos sadios 51
FIGURA 1
Eletroforese em gel de agarose de amostras AEEC
originárias de bovinos sadios exibindo os subtipos γ e β do gene eae 40
FIGURA 2
Eletroforese em gel de agarose de amostras AEEC
originárias de bovinos sadios exibindo os subtipos α e β do gene tir. 41
FIGURA 3
Eletroforese em gel de agarose de amostras AEEC
originárias de bovinos sadios exibindo os subtipos α e β do gene espA 41
FIGURA 4
Eletroforese em gel de agarose de amostras AEEC
originárias de bovinos sadios exibindo os subtipos α e β do gene espB 42
FIGURA 5
Eletroforese em gel de agarose de amostras AEEC
originárias de bovinos sadios exibindo selC intacto e inserido 43
FIGURA 6
Eletroforese em gel de agarose de amostras AEEC
originárias de bovinos sadios exibindo pheU intacto e inserido 43
FIGURA 7
Placas representativas do perfil enterohemolítico 48
9
RESUMO
Uma grande variedade quanto aos mecanismos e patogenia relacionados à
doença no homem e nos animais pode ser observada em amostras patogênicas de E.
coli, que de acordo com as manifestações clínicas que determinam e os fatores de
virulência que possuem, são classificadas em seis categorias: E. coli enteropatogênica
(EPEC), E.coli enteroinvasora (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC), E.coli
enterotoxigênica (ETEC), E.coli produtora de toxina Shiga (STEC) e E.coli produtora
de aderência difusa (DAEC).
Entre as cinco categorias de E. coli diarréiagenicas, EPEC e ETEC estão
claramente associadas a doenças entéricas em bovinos.
As EPEC animais normalmente apresentam como fator de virulência apenas a
capacidade de promover a lesão “attaching and effacing” - A/E, sendo denominada
como E.coli produtora da lesão A/E – AEEC. Diversos estudos revelam a importância
da AEEC na diarréia dos bezerros, podendo ainda haver ocorrência da infecção mesmo
em animais sadios.
Através do presente estudo objetivamos isolar amostras de E.coli produtora da
lesão “attaching and effacing” - AEEC em amostras fecais de bovinos sadios,
caracterizando o perfil de virulência e avaliando o potencial zoonótico desse agente. Um
total de 79 suspensões bacterianas foi analisado nesse trabalho. Dessas suspensões, 50
são originárias do Estado do Rio de Janeiro e 29 do Estado de São Paulo. A partir do
esgotamento das suspensões em placas de Agar Mac Conkey, 20 colônias típicas de
E.coli (para cada amostra) foram selecionadas. Um total de 36 amostras foram
confirmadas eae + e submetidas à caracterização genotipica através de ensaios da
reação em cadeia da polimerase (PCR) quanto ao sitio de inserção e a tipagem dos
genes eae, tir, espA e espB do locus LEE , a presença de EAF e bfp e a produção de
enterohemolisina. A caracterização fenotípica incluiu teste de aderência em cultivos
celulares, teste FAS (“fluorescente actin staining”), pesquisa de hemolisinas e
sorotipagem. Na caracterização genotípica de LEE os tipos de intimina variaram entre
as amostras, entretanto, para o gene eae o perfil predominante foi o tipo γ, com 18
isolados, seguido pelo tipo β, com 12. Cinco isolados não foram tipados para nenhum
dos subtipos de intimina testados (α, β, γ, δ e ε), apenas uma amostra foi caracterizada
10
como sendo do subtipo ε e nenhum isolado foi positivo para o tipo α. O perfil dos
marcadores tir, espA e espB também apresentou variações, porém, os perfis
predominantes foram os tipos α e β . O locus LEE foi testado para 2 sitios de inserçãos,
selC e pheU, demonstrando 5 isolados inseridos em selC, 12 inseridos em pheU e 19
que não estão inseridos nem em SelC nem em PheU, estando provavelmente inseridos
em um terceiro sítio de inserção, PheV. Todos os isolados foram negativos para EAF e
bfp. Para o teste de aderência, nenhuma das amostras exibiu um padrão de aderência
intenso e típico, nem tampouco se mostrou positiva no teste FAS. Diversos sorotipos
foram encontrados, entretanto, 6 amostras apresentaram o sorotipo O26:H11, sorotipo
esse já previamente reportado como patógeno em humanos e animais.
Achados como estes contribuem ainda mais para a sustentação da hipótese de
que animais domésticos podem ser potenciais reservatórios de AEEC, principalmente
no perfil de EPEC atípicas, entre outros, para o homem.
11
ABSTRACT
Pathogenic strains of E. coli may present a great variety of producing
mechanisms of disease in man and animals. According to clinical manifestations they
produce and to their virulent factors, these strains are classified in six groups:
enteropathogenic E. coli (EPEC), enteroinvasive E. coli (EIEC), enteroaggregative E.
coli (EAEC), enterotoxigenic E. coli (ETEC), Shiga toxin producing E. coli (STEC) and
diffuse adherence producing E. coli.
Among the five types of E. coli that cause diarrhea, EPEC and ETEC are clearly
associated to enteric diseases in man.
Animal EPEC normally have as a virulence factor only the capacity of produce the
attaching and effacing lesion – A/E, and are named A/E lesion producing E. coli –
AEEC. Several studies show the importance of AEEC in calf’s diarrhea and yet
infection may occur in healthy animals.
In the present study we intended to isolate E. coli attaching and effacing lesion
producing strains – AEEC in stools samples of healthy bovine, characterizing their
virulence outline and assessing their potential to infect other animals and man. There
were analyzed 79 bacterial suspensions. Of these, 50 have come from Rio de Janeiro
State and 29 from Sao Paulo State. There were selected 20 typical colonies of E. coli,
for each sample, from the spreading of the suspensions in Agar Mac Conkey plates. The
presence of the gene eae was confirmed in 36 samples and these were submitted to
genotypic characterization by means of polymerase chain reaction (PCR), according to
the insertion sites, typing of genes eae, tir, espA and espB of locus LEE, presence of
EAF and bfp and production of enterohemolysin. The phenotypic characterization
included the adherence test in cellular cultures, the FAS test (fluorescent actin staining),
hemolysins search and serotyping. The intimin types varied at the genotypic
characterization of locus LEE; nevertheless, the g type predominated for gene eae (18
isolates), followed by b type (12 isolates). Five isolates were not typed to anyone of the
subtypes of intimin that were tested (a,b, g,d and e), only one sample was characterized
as of e subtype and no one has the a subtype. The outline of markers tir, espA and espB
also varied. However, the predominant types were a and b . Two insertion sites were
tested in locus LEE: selC and pheU . Five isolates were inserted in selC, 12 in pheU and
19 were not inserted neither in selC nor in pheU, being inserted in a third site, probably
12
pheV. EAF and bfp were absent in all the isolates. In the adherence test, none of the
samples has shown a strong and typical pattern of adherence. Also, none of the samples
has shown a positive FAS test. Several serotypes were found, however 6 samples have
the serotype O26:H11, previously reported as a pathogen in humans and animals.
Findings like these contribute yet to reforce the hypothesis that domestic animals
may be potential reservoirs of AEE, principally in the pattern of atypical EPEC, among
others, for the man.
13
INTRODUÇÃO
1.
Escherichia coli é a espécie predominante da microbiota normal aeróbia e
anaeróbia facultativa do tubo digestivo da maior parte dos mamíferos, e chega ao meio
exterior por eliminação fecal. Pode ser encontrada no meio ambiente, já que é capaz de
sobreviver durante certo tempo em água e alimentos, de maneira que sua presença é um
indicador de contaminação fecal recente.
E. coli provoca em seres humanos cerca de 630 milhões de casos de diarréia no
mundo, e aproximadamente 775.000 mortes por ano, acometendo principalmente a
população infantil do terceiro mundo (Blanco et al.,2006). Em animais domésticos,
especialmente bezerros, as colibaciloses são muito freqüentes, afetando principalmente
os animais com poucos dias de vida e os recém desmamados, ocasionado importantes
perdas econômicas nas exportações de gado bovino, suínos e pequenos ruminantes,
assim como nas criações intensivas de aves.
Uma grande variedade quanto aos mecanismos e patogenia relacionados à
doença no homem e nos animais pode ser observada em amostras patogênicas de E.
coli, que de acordo com as manifestações clínicas que determinam e os fatores de
virulência que possuem, são classificadas em seis categorias: E. coli enteropatogênica
(EPEC), E.coli enteroinvasora (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC), E.coli
enterotoxigênica (ETEC), E.coli produtora de toxina Shiga ou E. coli
enterohemorrágica(STEC/ EHEC) e E.coli produtora de aderência difusa (DAEC).
Entre as seis categorias de E. coli diarréiagenicas, EPEC e ETEC estão
claramente associadas a doenças entéricas em bovinos (Beutin, L., 1999). As EPEC
14
apresentam como principal fator de virulência a capacidade de induzir a lesão “attaching
and effacing”-A/E compondo juntamente com as EHEC, que adicionalmente produzem
a toxina Shiga, o grupo deominado de E. coli produtora da lesão A/E (AEEC). Com
base na identificação da lesão A/E como principal fator de agressão, outras amostras de
E.coli produtoras desta lesão (AEEC) vêm sendo identificadas em diversas espécies
animais.
“Attaching and effacing” é um termo utilizado para descrever a lesão intestinal
produzida por essa categoria de E. coli: “attaching” indicando a íntima aderência da
bactéria ao enterócito e “effacing” relativo ao apagamento das microvilosidades
intestinais. Observa-se uma reorganização das proteínas do citoesqueleto da célula
hospedeira, formando uma estrutura semelhante a um pedestal que incrementa a
aderência (Knutton et al., 1989; Moon et al., 1983; Rothbaum et al., 1982). Os genes
determinantes da lesão A/E estão localizados no “locus of enterocyte effacement” –
LEE, uma ilha de patogenicidade que tem sido associada à patógenos intestinais, tais
como EPEC e EHEC, sendo o gene eae, codificador da proteína intimina, utilizado co
maior freqüência como marcador da presença deste lócus gênico (Nataro and
Kaper,1998).
Entre as EPEC distinguem-se aquelas denominadas típicas, mais freqüentemente
isoladas de humanos e as atípicas, isoladas tanto de humanos como de animais,
destacando mais uma vez a natureza zoonótica dessas cepas. As AEEC são associadas à
doença diarréica em uma grande variedade de espécies. Bovinos, ovinos e suínos vêm
tendo um destaque especial em diversos estudos, como as espécies mais envolvidas na
transmissão de AEEC. Entretanto, macacos, cães, gatos, coelhos, aves e caprinos
também já foram reportados como reservatórios naturais de AEEC.
Vários estudos relatam a importância da AEEC na diarréia dos bezerros,
podendo no entanto, haver ocorrência da infecção em animais sadios. Dados anteriores
com relação a bovinos no Estado do Rio de Janeiro revelaram a presença de amostras
AEEC, parecendo, no entanto, ser mais comum a ocorrência de STEC eae
+
.
O isolamento de EPEC atípica em bovinos vem sendo freqüentemente relatado
por diversos autores, sustentando a hipótese de que animais domésticos podem ser
potenciais reservatórios de AEEC, entre outros, para o homem (Trabulsi et al., 2002).
O presente estudo teve como objetivo geral caracterizar fenotipicamente e
genotipicamente fatores e marcadores de virulência de amostras AEEC não produtoras
de toxina Shiga isoladas de amostras fecais de bovinos sadios dos Estados do Rio de
15
Janeiro e São Paulo, de modo a avaliar potencial zoonótico desses agentes. Para o
alcance deste objetivo buscou-se especificamente: a) caracterizar geneticamente o locus
LEE através da tipagem de genes marcadores e da avaliação de seu sítio de inserção; b)
investigar fenotipica e/ou genotipicamente a presença de marcadores e fatores de
virulência associados as categorias EPEC e EHEC.
16
REVISÃO DE LITERATURA
2.
2.1. Generalidades
Escherichia coli é provavelmente o organismo vivo mais estudado e conhecido
do mundo, pois vem sendo utilizado como modelo para pesquisas de aspectos genéticos
e fisiológicos em todo mundo. Seu genoma inteiro já é conhecido há alguns anos
(Blattner et al. 1997) e sua biologia geral está bem estudada, como demonstram
claramente as diferentes edições do trabalho clássico coordenado por Neidhardt et al.
(1987; 1996).
E.coli é um membro típico da família Enterobacteriaceae (Logan, 1994), que é
constituída por bacilos Gram negativos, anaeróbios facultativos, fermentadores da
glicose, redutores de nitrato a nitrito e oxidase-negativos (Trabulssi et al., 2004). Ainda
como característica geral desta família, observamos a capacidade de metabolizar uma
variedade de substâncias como carboidratos, proteínas, aminoácidos, lipídios e ácidos
orgânicos. Essas propriedades metabólicas são de grande importância e extensivamente
usadas na classificação e identificação dos gêneros e espécies da família (Trabulssi et
al., 2004). Amostras típicas da espécie fermentam a lactose, com produção de ácido e
gás, são positivas para a prova de vermelho de metila (VM) e negativas para a prova de
Voges-Proskauer (VP), não utilizam citrato, não produzem H
2
S e produzem indol a
partir do triptofano (Trabulsi et al., 2004).
E. coli de um modo geral é um comensal inofensivo (Jay, 1999), no entanto,
diversas amostras dessa espécie podem apresentar potencial patogênico (Nataro &
Kaper, 1998). Esse organismo, em especial, apresenta uma diversidade patogênica
extraordinária compreendendo numerosos grupos e sorotipos, sendo capaz de causar
17
infecções intestinais e extra-intestinais por diferentes mecanismos, assim como infecção
do trato urinário e meningites (Trabulsi et al., 2004). Segundo Hirsh & Zee (2003)
E.coli pode ser causa de doença septicêmica em potros, bezerros, leitões, filhotes de
cães e cordeiros; de diarréia enterotoxigênica em neonatos de animais de produção, com
grande ocorrência em bezerros; e doença edematosa em suínos.
As amostras diarréiagênicas de E.coli são classificadas em categorias de acordo
com os mecanismos de virulência que apresentam e com o conjunto de sinais e sintomas
das doenças que provocam. O isolamento e identificação dessas amostras baseiam-se na
presença de fatores e/ou marcadores de virulência associados a cada categoria,
detectáveis através de teste fenotípicos ou genotípicos (Nataro & Kaper, 1998).
Dentre as amostras diarreiagênicas decritas, encontramos: E. coli
enteropatogênica (EPEC), E.coli enteroinvasora (EIEC), E. coli enteroagregativa
(EAEC), E.coli enterotoxigênica (ETEC), E.coli produtora de toxina Shiga (STEC) e
E.coli produtora de aderência difusa (DAEC) (Nataro & Kaper, 1998). Esta última,
porém ainda hoje não está claramente definida.
As bactérias dessa família são de grande importância como patógenos em
animais, que por sua vez, freqüentemente se comportam como reservatórios de
patógenos humanos (Trabulsi et al., 2004).
2.2. Patogenicidade bacteriana
A virulência bacteriana é um fenômeno multifatorial. As cepas patogênicas de
Escherichia coli possuem diferentes tipos de fatores de virulência que contribuem
conjuntamente para potencializar sua patogenicidade. Essas cepas apresentam
mecanismos patogênicos específicos, sorotipos distintos e produzem infecções e
síndromes diferentes (Blanco, et al., 2006).
Atualmente, a definição de mecanismos moleculares e celulares enfatizando a
forma pelas quais os microrganismos causam doença, tem levado a uma nova forma de
apreciação da patogênese bacteriana (Finlay & Vallance, 2000).
Análises comparativas entre genomas bacterianos seqüenciados (Blattner et al.
1997; Decker et al., 1998; Kalman et al., 1999; Parkhill et al., 2000) e o estudo da
estrutura genética de numerosas bactérias (Caugant et al., 1981; 1983; Musser et al.
1986; Istock et al., 1992) indicam de maneira definitiva que as bactérias não são
organismos estáveis. Sugere-se que ao menos 17% dos genes de E.coli são de aquisição
18
relativamente recente (Lawrence y Ochman, 1998), com uma taxa de transferência
horizontal de aproximadamente 16kb a cada milhão de anos (Martin, 1999).
A grande diversidade genômica da E.coli lhe confere uma notável plasticidade
ecológica, e graças a ela podem adaptar-se rapidamente a viver em diferentes ambientes,
podendo dessa forma passar de organismo de vida livre a comensal do trato intestinal
dos animais de sangue quente e até a patógenos mortais em humanos e animais ( Souza
et al., 1999).
Dentre as bactérias causadoras de enfermidades importantes, destacamos a
Escherichia coli, responsável por quadros diarréicos e enfermidades que podem ser de
extrema gravidade como as colites hemorrágicas e síndromes urêmico-hemolíticas
(Donnenberg y Kaper, 1992). Entretanto, existem várias maneiras de interagir com o
epitélio intestinal e causar diarréia por E. coli (Caron et al., 1989).
As cepas enteropatogênicas de Escherichia coli (EPEC) representam um
interesse particular no estudo da evolução da patogênese bacteriana pela estreita
interação que apresenta com a célula hospedeira. Essas cepas determinam um padrão
característico de lesão localizada, onde as bactérias se aderem ao tecido e “apagam” as
microvilosidades intestinais.
Os fatores de virulência correspondem a estruturas, produtos ou estratégias que
potencializam a capacidade da bactéria causar infecção. Mediada por adesinas -
estruturas protéicas da superfície celular bacteriana - a adesão é uma estratégia que a
bactéria utiliza para fixar-se nas células hospedeiras. Estas adesinas, por sua vez,
necessitam de um receptor presente no hospedeiro, que de modo geral também é uma
proteína que está localizada na superfície da célula alvo. Portanto, a interação entre
patógenos bacterianos e célula hospedeira é mediada por proteínas expostas na
superfície celular ou secretadas para o espaço extracelular (Trabulsi et al., 2004).
EPEC é um patógeno extracelular que determina infecção através de sua ligação
a superfície da célula hospedeira, seguida pela injeção de fatores de virulência no
interior desta célula através do sistema de secreção tipo III (De Viney et al., 1999).
19
2.3. Escherichia coli produtora da lesão “attaching and effacing”-A/E
(AEEC)
As EPEC têm sido caracterizadas com base em seu sorotipo, sua lesão – que
pode ser observada através de biopsias do epitélio intestinal – e a ausência da toxina
Shiga. A histopatologia é conhecida como lesão de aderência e esfacelamento (A/E). A
presença do plasmídio EAF não era considerada marcador de virulência dessas cepas,
uma vez que alguns genotipos de EPEC não o possuíam, sobretudo as cepas associadas
a animais (Rocha et al., 1999). O que se debatia, era se as cepas que não apresentavam o
plasmídio EAF podiam ser consideradas patógenos verdadeiros (Kaper, 1996).
Finalmente em 1995, durante o Segundo Simpósio internacional sobre EPEC, uma
definição consensual foi proposta: “As cepas produtoras da lesão A/E, negativas para
toxina Shiga e possuidoras do plasmídio EAF são consideradas EPEC típicas, entretanto
as que não possuem o plasmídio são cepas EPEC atípicas” (Nataro & Kaper, 1998;
Trabulssi, 2002). A característica comum aos dois grupos é a capacidade de causar
lesão A/E no epitélio intestinal e as principais diferenças referem-se aos sorotipos e à
presença do plasmídio EAF somente nas EPEC típicas (Trabulsi, 2002).
Na presença de células epiteliais, as amostras de EPEC típicas ou clássicas são
caracterizadas pelo padrão de aderência localizada (“localized adherence” - LA),
enquanto EPEC atípicas apresentam, em geral, um padrão de aderência que se
assemelha ao padrão localizado conhecido como aderência localizada-like (“localized
adherence-like”-LAL) (Trabulsi, 2002).
Amostras de E.coli de origem animal, possuidoras de gene eae e
apresentando a capacidade de induzir a lesão A/E, são designadas como “attaching and
effacing” E.coli – AEEC (Moon et al., 1983).
Amostras AEEC que apresentam a expressão da intimina, a toxina Shiga e a
capacidade de provocar a lesão A/E, são equivalentes à E.coli enterohemorrágica
(EHEC) humana (Levine, 1987; Knutton et al., 1994). Sendo assim, duas classes de
AEEC bovina tem sido descritas, uma onde os genes eae e stx estão presentes (EHEC) e
outra em que o gene stx não aparece (EPEC) (Mainil et al., 1993).
20
2.4. AEEC em animais
Animais domésticos de diferentes espécies têm sido investigados como
reservatórios naturais de AEEC (Gladys et al., 2004).
China et al (1999) relatam a presença desse agenete em animais sadios,
podendo representar um problema de segurança alimentar. AEEC pode ser transmitida
para humanos através da ingestão de alimentos de origem animal contaminados ou
ainda através do contato direto com os animais.
Diversos estudos têm demonstrado a predominância de EPEC associada a
animais jovens, como relatam Fuente et al, (2002).
Bovinos, ovinos e suínos vêm tendo um destaque especial em diversos estudos,
como as espécies mais envolvidas na transmissão de AEEC. Entretanto, macacos, cães,
gatos, coelhos, aves e caprinos também já foram reportados como reservatórios naturais
de AEEC. Almeida et al. (2005), trabalhando com amostras AEEC de origem canina,
relataram a detecção do gene bfp , ainda não detectado em outras espécies, sugerindo
um a proximidade com as amostras EPEC típicas humanas.
2.5. AEEC em bovinos
Escherichia coli é uma das primeiras espécies a colonizar os mamíferos recém
natos, que adquire as primeiras cepas do canal do parto e das fezes de sua mãe
(Bettelheim,1994). As colonizações posteriores se devem geralmente pela ingestão de
alimentos contaminados. Usualmente existe uma cepa dominante de E. coli por
hospedeiro, entretanto, a aparição de novos genotipos, seja por mutação ou por ingestão,
faz com que essa dominância seja temporária e que essa dinâmica seja determinada
tanto por processos aleatórios (derivação genética) como adaptativos (seleção periódica)
(Levin,1981; Caughant et al., 1981).
As diarréias em bezerros são normalmente causadas pela E.coli enterotoxigênica
(ETEC), porém alguns estudos demonstram que a attaching and effacing E.coli (AEEC)
e a E.coli produtora de toxina Shiga (STEC) tem sido identificadas como causadoras
dessa diarréia (Mainil et al., 1993; Butler and Clarke, 1994).
As EPEC animais normalmente apresentam como fator de virulência apenas a
capacidade de promover a lesão “attaching and effacing”- A/E, sendo denominada como
E.coli produtora da lesão A/E – AEEC. Bovinos, principalmente bezerros, têm surgido
21
como principais reservatórios de STEC, entretanto, diversos autores tem relatado a
importância da AEEC na diarréia dos bezerros (Chanter et al.,1984,1986; Sherwood et
al.,1985; Hall et al.,1985,1990; Moxley and Francis,1986; Mohammad et al.,1985,
1985; Pospischil et al.,1987; Blanco et al.,1988,1993; Schoonderwoerd et al.,1988;
Wray et al., 1989; Janke et al., 1990; Synge and Hopkins, 1992; Dorn et al., 1993;
Mainil et al.,1993; Knutton,1994; Fisher et al.,1994; Wieler et al., 1996; Saridakis et
al,1997). Alguns ainda têm reportado a ocorrência da infecção pela AEEC, tanto em
bezerros sadios quanto em bezerros diarréicos (Mohammad et al.,1985; Wieler et
al.,1992; Blanco et al,1993,1994).
O isolamento de EPEC atípica na espécie bovina em diferentes países tem sido
freqüentemente relatado (Beutin,1999; Beutin et al, 2004) e a transmissão de E. coli
patogênica entre homens e animais, como bovinos, já foram reportadas (Beutin,1999;
Griffin & Tauxe,1991).
2.6. Estrutura genética do Locus Enterocyte Effacement – locus LEE
Em 1983, a histopatologia da lesão da mucosa intestinal determinada por
cepas de EPEC foi denominada lesão A/E por Moon e colaboradores. A íntima
aderência da bactéria à célula do epitélio intestinal e o “apagamento” das
microvilosidades da mucosa do intestino delgado, caracterizam o fenótipo da lesão. Os
genes que codificam essa lesão encontram-se juntos, formando uma ilha de
patogenicidade, nesse caso chamada LEE - “Locus Enterocyte Effacement”. LEE foi
primeiramente descrita em Eschrichia coli enteropatogenica clássica (EPEC) como
sendo uma região de aproximadamente 35 Kb (Mac Daniel et al., 1995; Perna et al.,
1998), responsável por codificar os fatores que caracterizam o fenótipo A/E em vários
patógenos entéricos, como E. coli enteropatogênica (EPEC) e E. coli enterohemorrágica
(EHEC), entre outros como Citrobacter rodentium e Hafnia alvei (Mac Daniel et al.,
1995). Este locus mostrou que codificava informações suficientes para tornar
patogênica, uma E. coli não patogênica (McDaniel & Kaper, 1997).
O LEE de EPEC típica foi descrito inserido em dois possíveis locais
correspondentes ao DNA codificador dos RNA transportadores da selenocisteína (selC),
e fenilelanina (pheU) (Sperandio et al., 1998). Um terceiro locus para inserção de LEE
em pheV, homólogo mas distinto a pheU, foi reportado em STEC eae positiva do
sorotipo O103:H2 (Jores et al., 2001).
22
Dentro da ilha LEE, os genes eae, esp, tir e esc têm sido estudados por diversos
autores ((Nataro & Kaper, 1998; Goosney et al.). A região LEE encontra-se organizada
em três domínios com funções conhecidas. Na região central, encontra-se o gene eae,
que codifica uma proteína de membrana externa de 94 a 97 kilodaltones, denominada
intimina , responsável pela íntima aderência entre a bactéria e o enterócito ( Beebakhee
et al., 1992; Yu & Kaper,1992). Este foi o primeiro gen de virulência confirmado nas
EPEC ( Jerse et al., 1990). Em 1999, Higgins et al., demonstraram experimentalmente
que a intimina estimulava a inflamação e a hiperplasia do intestino, favorecendo a
colonização no intestino delgado. De acordo com Mc Graw et al.(1999), existem três
alelos dessa proteína, α , β e γ , sendo cada um deles característico de um grupo clonal
de EPEC e EHEC. Atualmente, graças à variação na porção carboxi-terminal da
intimina, distinguem-se 14 variantes imunológicas dessa protína, de alfa (
α
) a csi (ξ),
sendo os tipos
α
e
β
, mais freqüentes entre as EPEC típicas (Adu-Bobie et al., 1998;
Oswald et al., 2000; Tarr & Whittam, 2002; Zhang et al., 2002). Localizados à direita
do gene eae, encontram-se os genes esp (EPEC secreted proteins), responsáveis pela
codificação das proteínas espA, espB e espD, que induzem na célula epitelial uma
cascata de eventos de transdução de sinais que terminam por determinar a destruição
das vilosidades intestinais ( Frankel et al., 1996) . EspB é o sinal de transdução que é
exportado por um sistema de secreção tipo III e então, entra no citoplasma da célula
intestinal e determina “destruição” do citoesqueleto (Taylor et al.,1998). Kenny, et
al.(1997) propuseram a existência de uma proteína produzida e exportada pelas EPEC,
que depois de ser fosforilada seria inserida na membrana do epitélio intestinal e
funcionaria como receptor para a intimina. Essa proteína de aproximadamente 90 KDa
(quando fosforilada) e codificada pelo gene tir é chamada proteína Tir (Translocated
intimin receptor). De acordo com Rosenshine et al. (1992), anteriormente essa proteína
era conhecida como Hp90, e suspeitavam que sua origem fosse epitelial e não
bacteriana como posteriormente foi relatado por Kenny, et al.(1997). Em 1996, Mecsas
e Strauss, descreveram que as proteínas secretadas têm efeito direto sobre as células e
que as modificam para beneficiamento do patógeno. À esquerda de eae e tir estão
presentes os genes esc e sep, que codificam um sistema de secreção tipo III, envolvidos
na secreção das proteínas Esp e Tir.
As diferenças observadas em genes do locus LEE, bem como nos seus sítios de
inserção, determinam alterações filogenéticas e podem representar uma especialização
ou adaptação às diferentes espécies infectadas (Jores et al., 2004).
23
2.7. Histopatologia da lesão “attaching and effacing”- A/E
Várias etapas são necessárias para o desenvolvimento da lesão A/E. Entretanto,
destacamos duas: a íntima aderência entre a célula bacteriana e a célula alvo e a
destruição das microvilosidades intestinais (Donnenberg & Kaper, 1992; Robins-
Browne et al., 1994).
Frankel et al., 1998; Nataro e Kaper, 1998; Finlay & Vallance, (2000), através
de estudos sobre fatores de virulência em culturas celulares, descreveram a capacidade
patogênica das EPEC, e no início dos anos 90, Donnenberg et al. (1993) e Jerse et al.
(1990), identificaram o primeiro gene associado à virulência em EPEC, o gene eae.
Um modelo de três estágios foi proposto para formação da lesão A/E em EPEC
(Donnenberg & Kaper, 1992; Nataro & Kaper, 1998), o primeiro caracterizado por uma
aderência localizada, com a formação de microcolônias bacterianas sobre as células,
mediada por um pili tipo IV denominado BFP (bundle-forming pili), codificado por
genes bfp localizados em um plasmídio de alto peso molecular (60 megadaltons- Mda)
( Baldini et al.,1983), denominado EAF ( EPEC adherence fator) ( Stone et al., 1996),
embora outras adesinas pareçam estar envolvidas (Girón et al., 1993,1994). Esse
primeiro passo é conhecido como “aderência localizada”. Em 1998 Nataro & Kaper, em
seus estudos, sugeriam que o BFP era necessário para a aderência entre as células
bacterianas, porém não existe nenhuma prova definitiva de que o BFP medie realmente
a aderência às células epiteliais. Atualmente, já se demonstrou que as EPEC atípicas
também são capazes de aderirem-se intimamente à célula hospedeira, reafirmando
assim, que tanto EAF quanto bfp estejam envolvidos principalmente na aderência entre
as próprias células bacterianas, dando às EPEC típicas o padrão de aderência localizada
(LA) com presença de microcolônias. Esse padrão não é característico nas amostras
atípicas (AEEC), nas quais o gene estrutural bfp e/ou o plasmídio EAF estão ausentes.
Nessas amostras, a aderência demonstra um espaçamento maior entre as células
bacterianas (Girón et al., 2002).
O segundo estágio é caracterizado pela transdução de sinais da bactéria à célula
hospedeira (Donnenberg & Kaper, 1992; Nataro & Kaper, 1998). Imediatamente após a
aderência inicial, as EPEC disparam uma série de sinais nas células epiteliais que vão
promover a aderência íntima das bactérias: a fosforilação de uma proteína de 90 KDa, a
proteína Tir, que funciona como receptor para a proteína intimina na membrana das
24
células epiteliais (Kenny, et al.,1997). Essa informação gera um aumento no fluxo
intracelular de cálcio, induzido pelo inositol trifosfato (ITP), determinando alterações
importantes no citoesqueleto do enterócito devido ao rompimento ou polimerização dos
filamentos de actina das microvilosidades. O ITP resulta do rompimento do fosfatidil
inositol pela enzima fosfolipase C, que parece ser ativada pela bactéria (Baldwin et al.,
1991). O rompimento dessa estrutura epitelial e a inflamação produzida pela resposta
imune, provocam uma reação que determina a formação de uma estrutura semelhante a
um pedestal na superfície da célula epitelial, característica dessa patogênese (Goosney
et al., 1999). Tal estrutura pode ser facilmente observada através do teste FAS
(Fluorescente Actin Staining), que pode ser usado na detecção da expressão da lesão
A/E em EPEC e EHEC (Knutton et al., 1989; Knutton et al., 1991; Scotland et al.,
1990). Os genes responsáveis por esses eventos são os genes do grupo esp e os do
sistema de secreção, os esc (Nataro & Kaper, 1998) e que representam a primeira região
de LEE. O sistema de secreção tipo III é responsável pela secreção extracelular das
proteínas EspA, EspB e EspD, que são codificadas pelos genes esp e compõem a
terceira região do locus LEE. A segunda região compreende os genes eae e tir,
codificadores da intimina e de seu receptor que é translocado para a célula hospedeira, a
proteína Tir (Rosenshine et al. 1996; Kenny et al., 1997).
Como todo patógeno Gram negativo, EPEC apresenta uma membrana extra em
sua composição estrutural, o que dificulta a secreção de proteínas. Numa tentativa de
“driblar” essa situação, tais microorganismos desenvolveram um mecanismo de
secreção mais complexo, como esse citado anteriormente, o sistema de secreção tipo III
(Finlay et al.,2002), no qual as moléculas efetoras são injetadas na célula alvo através
da formação de uma estrutura protéica complexa, denominada “translocom”, que se
estende desde a membrana bacteriana interna até a célula hospedeira, formando um
canal tubular entre ambas (Knutton et al., 1998).
Sabemos hoje, que a produção das proteínas Esp pelas EPEC é necessária para
formação da lesão A/E, entretanto, ainda não há um esclarecimento completo de seu
envolvimento na patogenia das EPEC. Sabe-se que EspA constitui apêndices
filamentosos transitórios ao redor da bactéria, que ao interagirem com a célula epitelial
possibilitam a formação de um tubo translocador (Hartland et al., 2000; Kresse et al.,
1999; Wachter et al., 1999; Warawa & Kenny, 2001; Knutton et al., 1998; Wolff et al.,
1998), através do qual é “transportada” para o hospedeiro as proteínas Tir, EspB (Taylor
et al., 1998), EspF (McNamara et al., 2001), EspG (Elliot et al., 2001) e Map (Kenny &
25
Jepson, 2000). Ainda na membrana enterocitária encontramos inserida EspD, entretanto,
assim como para EspB sua função exata não esta determinada, porém, acredita-se que
elas atuem como integrantes do aparato de translocação contribuindo para a formação
de um poro na membrana do epitélio intestinal, possibilitando a entrada de outros
fatores de virulência no interior da célula hospedeira (Knutton et al., 1998 e Kresse et
al., 1999).
Assim como a Tir, as proteínas EspF e Map (“mitochondrial-associated
protein”) determinam alterações celulares no hospedeiro, a primeira rompendo a
barreira celular intestinal e determinando morte da célula, porém não temos ainda
maiores detalhamentos de sua ação (Crane et al., 2001; McNamara et al., 2001), a
segunda alterando o potencial de membrana da mitocôndria (Kenny & Jepson, 2000).
O terceiro estágio é caracterizado, pela íntima aderência da bactéria com a célula
do epitélio intestinal, mediada pela intimina. Como dito anteriormente, o principal
receptor para a intimina na célula hospedeira é a Tir - uma proteína de origem
bacteriana translocada para o interior do enterócito e codificada pelo gene tir – cuja
fosforilação no hospedeiro é essencial para sua capacitação funcional (Rosenshine et al.
1996; Kenny et al., 1997).
A dinâmica da lesão A/E in vivo não está inteiramente descrita, no entanto
Knutton et al., (1998), Ebel et al. (1998) e Hicks et al. (1998) relataram que estudo in
vitro realizado com cultura de tecido intestinal de criança, sugeriu um novo modelo de
quatro estágios em EPEC, onde BFP seria responsável por atuar na fase final da lesão,
conectando uma bactéria a outra, mantendo e estabilizando a microcolônia,
caracterizando um aspecto tridimensional, visualizado como o fenótipo de aderência
localizada (AL). O estágio inicial envolveria a adesão da bactéria aos enterócitos
mediada por outras adesinas, que não BFP ou intimina.
26
MATERIAL E MÉTODOS
3.
3.1. Meios de cultura, reagentes e soluções.
Quando não especificados, os meios de cultura empregados foram Britania
(B.Aires, Argentina) ou Merck (Rio de Janeiro, Brasil) e apresentados sob a forma
desidratada, sendo preparados segundo orientações dos fabricantes.
Todos os reagentes utilizados foram de procedência Merck, Sigma (Steinheim,
Germany), Gibco-BRL (RJ, Brasil) ou New England Biolabs (MA, USA).
Água destilada foi utilizada para a preparação dos meios e soluções, exceto nas
soluções e reagentes envolvidos nas reações de PCR, onde se utilizou água ultra pura
obtida em sistema de purificação Milli Q
TM
(Millipore Corporation, MA, USA). Sempre
que necessário todos os meios de cultura, soluções e reagentes foram esterilizados em
autoclave a 121
0
C durante 15 a 20 minutos.
3.2. Procedência das amostras
Os isolamentos de AEEC estudados nesse trabalho foram provenientes de 50
amostras fecais de bovinos sadios do Estado do Rio de Janeiro, previamente analisadas
e positivas quanto à seqüência genética do gene eae (Cerqueira et al., 2003). Tais
amostras foram obtidas no período de 1999 / 2000, e as suspensões bacterianas
estocadas em meio Tryptic Soy Broth (TSB; Difco – Michigan, USA) em dupla
concentração e 20% de glicerol e mantidas congeladas a -25ºC.
Adicionalmente, foram estudados isolamentos AEEC provenientes de 29
amostras fecais de bovinos sadios do Estado de São Paulo (Vicente et al., 2005). Tais
27
amostras foram também previamente analisadas, positivas para a seqüência genética do
gene eae e mantidas sob as mesmas condições de estoque e congelamento acima
descritas.
Todas as suspensões bacterianas foram novamente testadas, objetivando a
confirmação dos resultados anteriores e submetidos a protocolo para isolamento de
AEEC descrito a seguir (item 3.4).
Deste modo, um total de 36 isolamentos AEEC foram selecionadas para
caracterização fenotipica e gentipica.
3.3. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para detecção de seqüências
genéticas stx1, stx2 e eae .
3.3.1. Processamento das amostras
A partir das suspensões bacterianas estocadas, uma alíquota de 200 µL foi
semeada de forma confluente em meio não inibidor (agar CLED; Difco) e incubados em
estufa a 37
0
C durante 24 horas, para novo estoque e obtenção de DNA. O crescimento
foi então suspenso em solução salina tamponada fosfatada (PBS, pH 7,2). Duas
alíquotas da suspensão foram separadas, sendo uma para estocagem e outra para
extração do DNA. A alíquota de 0,1 mL da suspensão bacteriana referente à extração do
DNA foi mistura a 0,9 mL de PBS e aquecida a 100ºC durante 10 minutos, sendo
utilizada como DNA alvo para PCR multiplex envolvendo três pares de “primers”
específicos para stx1, stx2 e eae. Quando do preparo das suspensões bacterianas densas
em PBS, uma outra alíquota de 1ml foi misturada com idêntico volume de meio Tryptic
Soy Broth (TSB; Difco) em dupla concentração e com 20% de glicerol. Após
homogeneização, a suspensão bacteriana foi imediatamente congelada e mantida a -
25ºC e estocada para posterior análise.
28
3.3.2. Protocolo básico da reação de PCR
Reações de PCR multiplex foram realizadas objetivando a amplificação de
seqüências genéticas dos genes eae (B52 e B53), stx1 (B54 e B55) e stx2 (B56 e B57)
conforme descrito por CHINA, PIRSON & MAINIL (1996). Os genes ou marcadores,
“primers”, protocolos e produtos da PCR estão detalhados na TABELA 1. A mistura da
reação foi preparada com de 5µL de DNA alvo ou molde, 1µL de cada iniciador, 4µL
de dNTPs(2,5 mM), 1µL de Taq DNA polimerase (1U), 5µL de tampão PCR 10x, 2µL
de MgCl
2
(1,5 mM) e 27µL de água ultra pura, no volume total de 50µL. Os produtos
da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose na concentração de 1,0 %
em tampão de TBE 1X (Trizma base 89 mM; H
3
BO
3
8,9 mM; Na
2
EDTA 2,5 mM pH
8,2) e a corrida realizada em cuba de eletroforese Horizon 11-14 (Gibco-BRL) a 130 V
por 45 minutos. A presença das bandas de amplificação de stx1, stx2 e eae foi revelada
sob luz ultravioleta após coloração do gel por 15 a 20 minutos em solução aquosa de
brometo de etídio a 0.5µg/mL, e o tamanho foi estimado por comparação com padrão de
peso molecular (1,5 Kb DNA “ladder”; Gibco-BRL). As amostras positivas foram
retestadas ao menos uma vez para confirmação da reação.
3.4. Isolamento a partir de amostras positivas para o gene eae à PCR.
As suspensões bacterianas estocadas e congeladas correspondentes às amostras
eae positivas à PCR, foram inoculadas em caldo TSB e incubadas a 37
0
C por 24 horas.
A partir do crescimento bacteriano foram feitas semeaduras por esgotamento em placas
de agar MacConkey, e essas incubadas a 37
0
C por 24 horas. Destas placas, foram
selecionadas até 20 colônias típicas de E coli, essas então, semeadas em agar Tripticase
de Soja (TSA) e incubadas a 37
0
C por 24 horas. Feitos dois “pools” de 10 colônias para
cada amostra, realizou-se a PCR, utilizando o mesmo protocolo descrito no item
anterior. As colônias correspondentes aos “pools” positivos foram recuperadas da placa-
mestre de TSA (mantida a 4°C) e testadas também por PCR, para identificar quais
colônias eram positivas para o gene eae. Tais colônias foram semeadas em tubo
contendo agar TSA inclinado, e incubadas a 37°C por 24 horas. A partir do crescimento
em TSA preparou-se a suspensão bacteriana densa em PBS, da qual foi retirada uma
alíquota de 1 mL misturada com idêntico volume de meio Tryptic Soy Broth (TSB;
Difco) em dupla concentração e com 20% de glicerol. Após homogeneização, a
29
suspensão bacteriana foi congelada e mantida a -25ºC, para posterior análise.
Todas as amostras AEEC isoladas foram submetidas a testes bioquímicos para
confirmação da espécie. A partir do estoque congelado e mantido a -25°C as amostras
foram repicadas em caldo TSB e incubadas a 37°C por 24 horas. O crescimento
bacteriano foi semeado por esgotamento em placas de agar MacConkey incubadas a
37°C por 24 horas. Colônias típicas de E. coli foram selecionadas e submetidas às
provas de motilidade, indol, produção de H
2
S, fermentação da glicose e lactose,
descarboxilação da lisina e citrato (Ewing, 1986).
3.5. Caracterização genotípica de isolamentos AEEC
3.5.1. Reações de PCR
Ensaios de PCR foram realizados a partir das colônias isoladas positivas para
gene eae para caracterização de 5 subtipos de intiminas: α, β, γ, δ e ε (Adu-Bobbie et al.,
1998; China et al, 1999; Oswald et al., 2000), caracterização das variantes α, β, γ de tir,
espA e espB (China et al, 1999), inserção do locus LEE (Wieler et al. 1997; Sperandio
et al., 1998), presença de EAF (Franke et al, 1994) e bfp (Riley et al, 1995) e
determinação da presença de enterohemolisina (Paton & Paton,1998).
Os genes ou marcadores, “primers”, protocolos e produtos da PCR estão
detalhados na TABELA 1.
3.5.2. Caracterização das variantes α, β e γ dos genes eae, tir, espA e espB
A parir das colônias isoladas foi realizada reação de PCR contendo “primers”
para amplificação de cada variante do gene pesquisado (China et al, 1999). As reações
de PCR multiplex para cada gene foram feitas separadamente, utilizaram o mesmo
protocolo e um iniciador comum. A mistura da reação foi preparada com 5µl de DNA
molde, 0,5µl de cada iniciador (400 mM), 4µL de dNTP(2,5 mM) e 2µL de Taq DNA
polimerase (1U), 5µl de tampão PCR 10x e 1,5µL de MgCl
2
(1,5 mM) e 30,5µL de
água Milli Q
TM
, para um volume total de 50µl. Os produtos da PCR foram submetidos a
eletroforese em gel de agarose a 1,0%, os géis corados com brometo de etídio e
visualizados em transiluminador UV. Para estas reações foram utilizadas como
controles positivos as amostras E.coli 2348/69 para o tipo α, 40705 para o tipo γ e H-30
30
para o tipo β. A amostra E.coli DH5α foi usada como controle negativo em todas as
reações.
3.5.3. PCR para o plasmídio EAF o gene e bfp
A partir das colônias AEEC isoladas foi realizada reação de PCR contendo
"primers" para detecção de EAF (Franke et al, 1994) e bfp (Riley et al, 1995). A mistura
da reação foi preparada com 5µl de DNA molde, 0,5µl de cada iniciador (400 mM),
4µL de dNTPs (2,5 mM) e 2,5µL de Taq DNA polimerase (1U), 5µl de tampão PCR
10x e 1,5µL de MgCl
2
(1,5 mM) e 31µL de água Milli Q
TM
para um volume total de
50µl. Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1,0%,
os géis corados com brometo de etídio e visualizados em transiluminador UV. Para esta
reação foram utilizadas as amostras E.coli 2348/69 como controle positivo e E.coli
DH5α como controle negativo.
3.5.4. PCR para as variantes δ e
ε
da intimina
A PCR realizada para detectar a variante δ está descrito por Adu Bobie et al.
(1998) e a variante ε por Oswald et al. (2000). A mistura da reação para intimina δ foi
preparada com 5µl de DNA molde, 0,5µl de cada iniciador (400 mM), 3,2µL de
dNTP(2,5 mM) e 1,5µL de Taq DNA polimerase (1U), 5µl de tampão PCR 10x e 1,5µL
de MgCl
2
(1,5 mM) e 32,8µL de água Milli Q
TM
para um volume total de 50µl. Na
mistura da reação para intimina
ε
foram utilizados 5µl de DNA molde, 1µl de cada
iniciador (400 mM), 3,2µL de dNTP(2,5 mM) e 2,5µL de Taq DNA polimerase (1U),
5µl de tampão PCR 10x e 1,5µL de MgCl
2
(1,5 mM) e 30,8µL de água Milli Q
TM
para
um volume total de 50µl. Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel
de agarose a 1,0%, os géis corados com brometo de etídio e visualizados em
transiluminador UV. Para estas reações foram utilizadas as amostras controle E. coli
ICC95 como positiva para eae tipo δ e E. coli PMK5 para eae tipo ε. A amostra E.coli
DH5α foi usada como controle negativo das reações.
31
3.5.5. Inserção do locus LEE em selC ou pheU
Sperandio et al. (1998) e Wieler et al.(1997) descreveram a reação para inserção
do locus LEE. A mistura da reação para selC foi preparada com 5µl de DNA molde, 1µl
de cada iniciador (400 mM), 4µL de dNTP(2,5 mM) e 1,5µL de Taq DNA polimerase
(1U), 2,5µl de tampão PCR 10x e 1,5µL de MgCl
2
(1,5 mM) e 30,5µL de água Milli
Q
TM
para um volume total de 50µl. Na mistura da reação para pheU foram utilizados
5µl de DNA molde, 1µl de cada iniciador (400 mM), 4µL de dNTP(2,5 mM) e 2,5µL de
Taq DNA polimerase (1U), 5µl de tampão PCR 10x e 1,5µL de MgCl
2
(1,5 mM) e
30µL de água Milli Q
TM
para um volume total de 50µl. Para esta reação foram
utilizadas as amostras E.coli 2348/69 como controle positivo e E.coli DH5α como
negativo. Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a
1,0%, os géis corados com brometo de etídio e visualizados em transiluminador UV.
3.5.6. PCR para enterohemolisina
As amostras AEEC isoladas foram testadas por reação de PCR para detecção da
presença de enterohemolisina (Paton & Patom,1998). Para esta reação foram utilizadas
as amostras E. coli 40705 como controle positivo e E.coli DH5α como controle
negativo.
TABELA DE PRIMERS – 4 PG
TABELA 1: Genes ou marcadores, “primers”, protocolos e produtos da PCR utilizados nesse estudo.
Protocolo Genes ou
Marcadores
“Primers” e Seqüências Produto
(Pb)
Ciclos Temperatura/
Tempo
Referência
eae
B52 5’AGG CTT CGT CAC AGT TG 3’
B53 5’CCA TCG TCA CCA GAG GA 3
570 30
94°C / 1 min
55°C /1:30min
72°C / 1:30 min
China, et al.,1996
stx1
B54 5’AGA GCG ATG TTA CGG TTT G 3’
B55 5’TTG CCC CCA GAG TGG ATG 3
388 30
94°C / 1 min
55°C /1:30min
72°C / 1:30 min
China, et al.,1996
stx2
B56 5’TGG GTT TTT CTT CGG TAT C 3’
B57 5’GAC ATT CTG GTT GAC TCT CTT3’
807 30
94°C / 1 min
55°C /1:30min
72°C / 1:30 min
China, et al.,1996
eae
α
B73 5’- TAC TGA GAT TAA GGC TGA TAA 3’
B138 5’- GAC CAG AAG AAG ATC CA – 3’
452
30 94°C / 5 min
94°C / 30 s
50°C / 30 s
72°C / 30 s
China, et al.,1999
eae
β
B73 5’- TAC TGA GAT TAA GGC TGA TAA–3’
B137 5’- TGT ATG TCG CAC TCT GAT T – 3’
520
30
94°C / 5 min
94°C / 30 s
50°C / 30 s
72°C / 30 s
China, et al.,1999
eae
γ
B73 5’- TAC TGA GAT TAA GGC TGA TAA 3’
B74 5’- AGG AAG AAG GTT TTG TGT T –3’
778
30 94°C / 5 min
94°C / 30 s
50°C / 30 s
72°C / 30 s
China, et al.,1999
tir
α
B139 5’- C(AG)C C(TG)C CA(CT) TACCTTCAC 3’
B152 5’- CGC TAA CCT CCA AAC CAT T –3’
342
30 94°C / 5 min
94°C / 30 s
50°C / 30 s
72°C / 30 s
China et al, 1999
2
TABELA 1: Continuação
tir
β
B139 5’- C(AG)C C(TG)C CA(CT) TAC CTT CACA3’
B140 5’- GAT TTT TCC CTC GCC ACT A –3’
560
30 94°C / 5 min
94°C / 30 s
50°C / 30 s
72°C / 30 s
China et al, 1999
tir
γ
B139 5’- C(AG)C C(TG)C CA(CT)TAC CTTCAC A –3’
B141 5’- GTC GGC AGT TTC AGT TTC AC –3’
781
30 94°C / 5 min
94°C / 30 s
50°C / 30 s
72°C / 30 s
China et al, 1999
espB
α
B148 5’- GCC GTT TTT GAG AGC CA –3’
B151 5’- TCC CCA GGA CAG ATG AGA T –3’
94
30 94°C / 5 min
94°C / 30 s
50°C / 30 s
72°C / 30 s
China et al, 1999
espB
β
B148 5’- GCC GTT TTT GAG AGC CA –3’
B149 5’- CTT TCC GTT GCC TTA GT –3’
233
30 94°C / 5 min
94°C / 30 s
50°C / 30 s
72°C / 30 s
China et al, 1999
espB
γ
B148 5’- GCC GTT TTT GAG AGC CA –3’
B150 5’- GCC GTT TTT GAG AGC CA –3’
188
30 94°C / 5 min
94°C / 30 s
50°C / 30 s
72°C / 30 s
China et al, 1999
espA
α
B163 5’- TGA GGC ATC TAA (AG)G(AC) GTC –3’
B165 5’- GCT GGC TAT TAT TGA CCG –3’
269
30 94°C/5min
94°C/30s
48°C/30s
72°C/30s
China et al, 1999
espA
β
B163 5’- TGA GGC ATC TAA (AG)G(AC) GTC –3’
B166 5’- TGC CTT TCT TAT TCT TGT CA –3’
101
30 94°C/5min
94°C/30s
48°C/30s
72°C/30s
China et al, 1999
3
TABELA 1: Continuação
espA
γ
B163 5’- TGA GGC ATC TAA (AG)G(AC) GTC –3’
B164 5’- ATC ACG AAT ACC AGT TAC CA –3’
172
30 94°C/5min
94°C/30s
48°C/30s
72°C/30s
China et al, 1999
EAF-1
EAF-1 5’- CAG GGT AAA AGA AAG ATG ATA A -3’
397 30 94°C/5min
94°C/30s
50°C/30s
72°C/30s
Franke et al, 1994
EAF-2
EAF-2 5’- TAT GGG GAC CAT GTA TTA TCA –3’
397 30 94°C/5min
94°C/30s
50°C/30s
72°C/30s
Franke et al, 1994
bfp
BFP-1 5’- AAT GGT GCT TGC GCT TGC TGC -3’
324 30 94°C/5min
94°C/30s
50°C/30s
72°C/30s
Riley et al, 1995
bfp
BFP-2 5’- GCC GCT TTA TCC AAC CTG GTA -3’
324 30 94°C/5min
94°C/30s
50°C/30s
72°C/30s
Riley et al, 1995
eae δ
Int-δ 5’- TAC GGA TTT TGG GGC AT -3’
545 30 94ºC/20s
45ºC/60s
74ºC/60s.
Adu Bobie et al., 1998
eae δ
Int-Ru 5’- TTT ATT TGC AGC CCC CCA T –3’
545 30 94ºC/20s
45ºC/60s
74ºC/60s
Adu Bobie et al., 1998
4
TABELA 1: Continuação
eae ε
SK15’- CCC GAA TTC GGC ACA AGC ATA AGC -3’
2608 30 94ºC/45s
48ºC/60s
72ºC/150s
Oswald et al., 2000
eae ε
LP55’-AGC TCACTC GTA GAT GAC GGC AAG CG -3’
2608 30 94ºC/45s
48ºC/60s
72ºC/150s
Oswald et al., 2000
selC
direito
K255-5’-GGTTGAGTCGATTGATCTCTGG-3’ K260-5’-
GAGCGAATATTCCGATATCTGGTT-3’
418 30 94ºC/1min
52ºC/1min 72ºC/3
min
Sperandio et al., 1998
selC
esquerdo
K296-5’-CATTCTGAAACAAACTGCTC-3’
K295-5’-CGCCGATTTTTCTTAGCCCA
405 30 94ºC/1min
52ºC/1min 72ºC/3
min
Sperandio et al., 1998
selC
intacto
K260-5’-GAGCGAATATTCCGATATCTGGTT-3’ K261-5’-
CCTGCAAATAAACACGGCGCAT-3’
527 30 94ºC/1min
52ºC/1min 72ºC/3
min
Sperandio et al., 1998
PheU
intacto
K913-5’-CATCGGCTGGCGGAAGATAT-3’
K914-5’-CGCTTAAATCGTGGCGTC-3’
300 30 94ºC/1min
52ºC/1min 72ºC/3
min
Sperandio et al., 1998
Ehly
Ehly
Ehly R 5’- AATGACCCAAGCTGGTTAAGCT-3’
Ehly F 5’- CGGACATCCATGTGATATGG-3’
534
534
35
35
10x 95°C/1min
65°C/2min
72°C/1:30min
15x 95°C/1min
60°C/2min
72°C/1:30min
10x 95°C/1min
60°C/2min
72°C/2:30min
Paton & Paton,1998
3.6. Caracterização fenotípica das amostras AEEC
3.6.1. Sorotipagem
Os isolamentos AEEC foram submetidos à sorotipagem para identificação do
antígeno somático O e do antígeno flagelar H no Instituto Adolfo Lutz em São Paulo em
colaboração com a Dra. Kinue Irino. Foi utilizada metodologia de soroaglutinação em
tubos recomendada por EWING (1986), empregando antisoros O1 a O186 e H1 a H56.
3.6.2. Teste de adesão com células HeLa
Células HeLa (carcinoma epitelial de cérvix humana, ATCC:CCL2) foram
cultivadas em frascos de cultura com faces planas, contendo meio MEM (Sigma)
suplementado com antibióticos e 5 % de soro fetal bovino (Gibco), mantidos em estufa
de CO
2
durante 3 a 4 dias. Para realização dos testes de adesão os cultivos celulares
foram tripsinizados para obtenção de uma suspensão celular em meio novo e cerca de
10
5
células/mL foram distribuídos em câmaras de cultura de placas de 24 poços
contendo lamínulas de vidro, e incubados por 48 horas até mostrarem crescimento do
tapete celular em monocamada semi-confluente.
No momento do teste de adesão, o meio de crescimento das células foi retirado e
lavado 2 vezes com PBS-D, a seguir foi adicionado 1 mL de D-MEM (Gibco)
suplementado com 2% de soro fetal de bezerro e 1% de D-manose para inibição da
adesão mediada pela fímbria tipo 1. A infecção celular foi executada utilizando isolado
bacteriano crescido em cultivo por 18 horas a 37ºC em TSB no volume de 35µL. Após
3 horas de incubação a 37ºC, em microaerofilia (5% CO
2
), cada placa foi lavada com
PBS-D por 2 vezes, 1 mL de meio D-MEM fresco e a incubação continuou por mais um
período de 3 horas. Ao término dessas 6 horas, nova lavagem com PBS-D foi realizada
por 2 vezes e a monocamada fixada com 1 mL de Metanol (Merck) por 15 minutos,
imediatamente após, foi corada com Giemsa na diluição 1:3 e mantida à 4°C por 24
horas para posterior observação em microscopia óptica (Cravioto et al., 1979).
Os resultados foram considerados a partir dos padrões de aderência localizada
(LA); aderência difusa (DA) e aderência agregativa (AA). Foram utilizadas amostras
2
bacterianas controle apresentando cada um dos fenótipos citados acima: Amostras E.
coli 2348/69 (LA), H1/1(DA) e H114 (AA). Como controle negativo utilizou-se a
amostra E. coli C600.
Os testes de adesão foram realizados na Universidade do Estado do Rio de
Janeiro (UERJ) em colaboração com o Prof. Dr. João Ramos Costa Andrade.
3.6.3. Teste FAS
Para realização do teste FAS seguiu-se o mesmo protocolo adotado no teste de
adesão, porém a finalização do teste se deu com a fixação da monocamada pela solução
de formaldeído a 5% em PBS na geladeira por 24 horas, seguida de 3 lavagens com
PBS-D por 5 minutos cada. Foi feito tratamento com Triton X-100 a 0,1% em PBS
durante 4 minutos para permeabilização da membrana celular. Repetiu-se as 3 lavagens
com PBS-D por 5 minutos cada e prossegui-se com a cobertura do tapete com 10 µL de
FITC-faloidina a 5 µg/mL ao abrigo da luz por 30 minutos em câmara úmida. Uma
nova lavagem com PBS-D foi realizada por 3 vezes durante 10 minutos cada. As
lâminas foram montadas com glicerol bidestilado diluído em PBS na proporção de 9:1 e
adicionado de 0,1% de p-dimetilfenilenodiamina. A observação das lâminas foi feita
através de microscopia óptica de contraste de fase, para visualização dos filamentos de
actina sob o local de adesão bacteriana (pedestal).
Amostras E. coli 2348/69 (LA), H1/1(DA) e H114(AA) foram usadas como
controle positivo e a amostra E. coli C600 como controle negativo.
Os testes FAS foram realizados na Universidade do Estado do Rio de Janeiro
(UERJ) em colaboração com o Prof. Dr. João Ramos Costa Andrade.
3.6.4 Pesquisa da produção de hemolisinas
A partir das amostras AEEC isoladas, pesquisou-se as atividades de α-
hemolisinas e enterohemolisinas. Do estoque a –25°C, as colônias AEEC foram
semeadas em caldo TSB e incubadas a 37°C por 24 horas. Desse crescimento, uma
alíquota de 1 µL foi semeada em placa de ágar sangue triptose, suplementado com
CaCl
2
(10mM) e 5% de papa de hemácias, previamente lavadas por 3 vezes em PBS e
obtidas de sangue desfibrinado de carneiro. A incubação se deu a 37°C, e após um
3
período de 3 horas, realizou-se a primeira leitura para observação de α-hemólise. A
segunda leitura realizou-se após 18 horas de incubação, para a observação de
enterohemólise. Essas observações são feitas ao redor da área do inóculo. Foram
utilizados como controle positivo amostras de E. coli C3888 (enterohemolíticas) e
amostras de E. coli U4-41 (α-hemolítica) e como controle negativo as E. coli K12C600
(não-hemolítica) (BEUTIN, et al., 1999).
4
Resultados
4.
4.1. Detecção de seqüências genéticas de stx1, stx2 e eae em amostras fecais
origináris de bovinos sadios.
Um total de 79 suspensões bacterianas foi testado, sendo 50 provenientes do
Estado do Rio de Janeiro e 29 originárias do Estado de São Paulo. Todas as suspensões
foram confirmadas como positivas para a presença de seqüência genética de eae
conforme dados prévios. Após triagem de 20 colônias típicas de E. coli isoladas de cada
suspensão, foram recuperados 36 isolamentos positivos para o gen eae. Todos os
isolamentos foram submetidos à caracterização genotípica e genotípica.
4.2. Caracterização genotípica
Os dados acumulados do perfil genotípico das amostras AEEC originárias de
bovinos sadios, encontram-se na TABELA 2.
4.2.1. Tipagem do gene eae
Cinco tipos de intimina foram investigados - α, β, γ, δ e ε. Na caracterização
genotípica do gene eae observou-se grande variação no perfil dos isolamentos, porém, o
tipo γ foi predominante. Deste modo, 18 (50%) isolados foram positivos para o tipo
γ
e
12 (33,33%) positivos para o tipo
β
(FIGURA 1). Cinco isolados (13,88%) não foram
tipados para nenhum dos tipos de intimina testados e apenas 1 (2,77%) foi positivo para
o tipo ε. Em relação ao tipo α, nenhum dos isolamentos se mostrou positivo.
5
FIGURA 1 - Eletroforese em gel de agarose de amostras AEEC originárias de bovinos
sadios exibindo os subtipos γ e β do gene eae.
1 2 3 4 5 6 7 8
520 Pb
→
452 Pb →
1-amostra 28; 2-amostra 29; 3-amostra 32; 4-amostra 33; 5-marcador de peso molecular- Kb ; 6-controle
E. coli H30-β; 7-controle E. coli 2348-α; 8-controle E. coli 40705- γ
4.2.2. Tipagem dos genes tir, espA e espB
Os tipos α, β e γ dos genes tir, espA e espB foram investigados. Para esses 3
genes do locus LEE o tipo α foi predominante, com ocorrência de 55,55% em cada um
deles. Em relação à variante β, estes mesmos genes apresentaram percentuais de
30,55%, 27,77% e 8,33% respectivamente. Em relação ao gene tir, 20 (55,55%)
isolamentos foram positivos para o tipo α (46%), 11 (30,55%) para o tipo β e 3 (8,33%)
para o tipo γ. Dois (5,55%) isolados não foram tipados. FIGURA 2. Quanto ao gene
espA, 20 (55,55%) isolamentos foram positivos para o tipo α,10 (27,77%) para o tipo β
e 6 (16,66%) não foram tipados. FIGURA 3. Para o gene espB, 20 (55,55%)
isolamentos foram positivos para o tipo α,seguido do tipo β, com 3 isolados (8,33%).
Treze (36,11%) dos isolamentos não foram tipados. FIGURA 4.
6
FIGURA 2 - Eletroforese em gel de agarose de amostras AEEC originárias de bovinos
sadios exibindo os subtipos α e β do gene tir.
560 Pb
→
342 Pb →
1-água; 2-controle negativo; 3-amostra 28; 4-amostra 29;5-amostra 30; 6-amostra 36; 7- marcador de
peso molecular-Kb; 8-controle E.coli H30-β; 9-controle E.coli 2348- α
FIGURA 3 - Eletroforese em gel de agarose de amostras AEEC originárias de bovinos
sadios exibindo os subtipos α e β do gene espA
1 2 3 4 5 6 7 8
269 Pb
→
101 Pb →
1-controle negativo; 2-amostra 2; 3-amostra 6; 4-amostra 32; 5-amostra 33; 6- marcador de peso
molecular -Kb; 7-controle E.coli H30- β; 8-controle E.coli 2348-α
1 2 3 4 5 6 7 8 9
7
FIGURA 4 - Eletroforese em gel de agarose de amostras AEEC originárias de bovinos
sadios exibindo os subtipos α e β do gene espB.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
233 Pb
→
94 Pb
→
1-água; 2-controle negativo; 3-amostra 7; 4-amostra 8; 5-amostra 14; 6-amostra 15;
7- marcador de peso molecular -Kb; 8-controle E.coli H30-β; 9-controle E.coli 2348-α
4.2.3. Pesquisa de EAF e bfp
Ao ensaio de PCR, todos os isolamentos estudados foram negativos para os dois
genes.
4.2.4. Investigação do sítio de inserção do locus LEE
O sitio de inserção do locus LEE foi testado para 2 locais, selC e pheU. Dos 36
isolados testados, 5 (13,88) encontram-se inseridos em selC – FIGURA 5 e 12 (33,33)
inseridos em pheU (21%)- FIGURA 6. Os demais isolamentos ,19 (52,77%)
apresentaram amplificação para selC intacto e amplificação para pheU intacto,
sugerindo que elas estejam inseridas em pheV, o qual não foi testado neste trabalho.
8
FIGURA 5 - Eletroforese em gel de agarose de amostras AEEC originárias de bovinos
sadios exibindo selC intacto e inserido.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
418 Pb
→
1-água; 2-DH5 α; 3-amostra 6; 4-amostra 7; 5-amostra 9; 6-amostra 11; 7-amostra 12;
8-amostra 14; 9-amostra 15; 10-amostra 16; 11-amostra 18; 12-amostra 19; 13-amostra 22;
14-amostra 24; 15-amostra 30; 16-amostra 33; 17- amostra; 18-amostra 43;
19- marcador de peso molecular-Kb; 20-controle selC inserido
FIGURA 6 - Corrida de eletroforese em gel de agarose de amostras AEEC originárias
de bovinos sadios exibindo pheU intacto e inserido.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
300 Pb
→
1-água; 2-controle negativo; 3- controle E. coli 2348; 4-amostra 27; 5-amostra 28;
6-amostra 29; 7-amostra 30; 8-amostra 32; 9- marcador de peso molecular -Kb
9
4.2.5. Detecção do gene EhlyA
Todos os 36 isolamentos AEEC estudados, foram submetidos à ensaios de PCR
para detecção do gene EhlyA. Vinte e oito (77,77%) dos isolamentos foram positivos
para a produção de enterohemolisinas. Em apenas 8 (22,22%) dos isolamentos não foi
detectada a presença do gene EhlyA.
10
TABELA 2 – Caracterização genotípica das amostras AEEC originárias de bovinos
sadios.
Amostra
eae Tir esp A esp B
Inserção
LEE
1
eae EhlyA
M06
γ
Α α α
- + +
M07
γ
Α α α
- + +
M08
γ
Α α α
- + +
M09
γ
Α α α
- + +
M10
γ
Α α α
- + +
M11
β
NT NT NT
- + +
M12
β
Β
NT
NT
- + +
M14
γ
Γ
NT
β
selC
+ +
M15
γ
Γ
NT
β
selC
+ +
M16
γ
Γ
NT
β
selC
+ +
M17
β
Β β
NT
- + +
M18
NT
Α α α
- + +
M19
NT
Α α α
- + +
M20
NT
Α α α
pheU
+ +
M22
ε
NT NT NT
- + -
M23
γ
Α α α
- + -
M24
γ
Α α α
- + -
M26
γ
Α α α
- + -
M27
γ
Α α α
- + -
M28
γ
Α α α
- + -
M29
γ
Α α α
- + -
M30
γ
Α α α
- + -
M32
β
Β β
NT
pheU
+ +
11
TABELA 2 – Continuação
Amostra eae Tir esp A esp B
Inserção
LEE
1
eae hlyA
M34
β Β β
NT
selC
+ +
M35
β Β β
NT
pheU
+ +
M36
β Β β
NT
pheU
+ +
M37
γ
Α α α
pheU
+ +
M38
γ
Α α α
pheU
+ +
M39
NT
Α
α α
pheU
+ +
M41
NT
Α α α
pheU
+ +
M42
β Β β
NT
pheU
+ +
M43
β Β β
NT
pheU
+ +
M44
β Β β
NT
selC
+ +
M46
β Β β
NT
selC
+ +
1,
Para os isolamentos onde os resultados da Inserção LEE foram negativos, segere-se inserção em
pheV
Nota: Todas os isolamentos testados foram negativos para os genes EAF, bfp, stx1 e
stx2
4.3. Caracterização fenotípica
Os dados acumulados do perfil fenotípico das amostras AEEC originárias de
bovinos sadios, encontram-se na TABELA 3.
4.3.1. Teste de adesão celular e Teste FAS
Todos os isolamentos estudados foram submetidos ao teste de adesão em células
HeLa e Caco2 em ensaio de 6 horas. Entretanto, nenhuma das amostras exibiu um
padrão de aderência intenso e típico, nem tampouco se apresentou positiva ao teste
FAS.
12
4.3.2. Avaliação sorológica
Dos 36 isolados estudados, 15 sorotipos foram identificados, 8 sorogrupos O
diferentes e 9 antígenos H distintos foram detectados, sendo H7
o mais freqüente com
ocorrência em 14 isolamentos (38,88%) provenientes de animais diferentes, seguido
pelo H11 em 9 isolamentos (25%) também provenientes de animais diferentes. H25 e
H- foram observados em 3 isolamentos cada um deles, correspondendo a (8,3%) e essas
repetições foram originárias de diferentes animais. H49 e H 2, também se repetiram em
5,55% dos isolamentos, entretanto o primeiro teve origem de animais diferentes e o
segundo do mesmo animal. H43, H21 e H34 só ocorreram em um isolamento (2,77%)
cada um. Dentre os sorotipos, algumas repetições foram observadas, porém os sorotipos
ONT:H7 e O26:H11 predominaram em 12 e 5 isolamentos respectivamente. Essas
repetições foram detectadas nos sorotipos O76:H7, ONT:H-, O98:H25, ONT:H2,
O166:H49, O26:H11 , ONT:H11 e ONT:H7. Esse último predominou em 12 dos
isolamentos e foram obtidos de 4 animais diferentes. O sorotipo O26:H11 se repetiu em
5 dos isolados (13,88%) e originários de 2 animais diferentes. Os 4 primeiros sorotipos
repetidos citados foram originários do mesmo animal e ocorreram em 5,55% cada um
deles, e os 4 últimos foram provenientes de animais diferentes e apresentaram
percentuais de 5,55%, 13,88%, 5,55% e 33,33% respectivamente. Os outros 5 sorotipos
encontrados não se repetiram. Quanto aos sorogrupos detectados, o O26 foi o mais
freqüente, com ocorrência em 5 (13,88%) dos isolados e provenientes de animais
diferentes, seguido do sorogrupo O98 com ocorrência em 3 (8,33%) dos isolados. Os
sorogrupos O76 e O166 se repetiram em 5,55% cada um deles. Os outros 4 sorogrupos
encontrados não se repetiram
Nenhum dos isolamentos testados foi positivo para o
sorogrupo O- . Vinte (55,55%) dos isolamentos estudados não foram tipados para
nenhum dos sorogrupos O testados.
4.3.3. Teste para pesquisa de hemolisinas
Vinte e cinco (69,44%) dos 36 isolamentos estudados foram positivos para o
fenótipo entero-hemolítico, no entanto, em 28 isolamentos (77,77%) detectou-se a
presença do gene enterohemolítico, concluindo-se essas 3 amostras (M11, M12, M18)
apresentaram o genótipo mas não o expressaram fenotipicamente. A observação de α-
hemólise não ocorreu em nenhum deles dos isolamentos testados. O perfil α-hemolítico
13
somente foi observado em placa de agar sangue lavado, como demonstrado pela
amostra controle na Placa. (FIGURA 7).
FIGURA 7 – Placas representativas do perfil enterohemolítico.
Placa 1 Placa 2
Placa 1- Placa de agar sangue lavado
Placa 2- Placa de agar sangue não lavado
Os dados acumulados dos perfis genotípico e fenotípico das amostras AEEC
originárias de bovinos sadios testadas, encontram-se na TABELA 4.
14
TABELA 3 - Caracterização fenotípica das amostras AEEC originária de bovinos
sadios.
hemolisina
T.Adesão
1
Amostra
alfa EHEC
Sorotipo
HeLa/Caco2
FAS
2
M02 - + ONT:H7 - -
M06 - + ONT:H7 - -
M07 - + O76:H7 - -
M08 - + ONT:H7 - -
M09 - + ONT:H25 - -
M10 - + O76:H7 - -
M11 - - O174:H43 - -
M12 - - O102:H21 - -
M14 - + ONT:H- - -
M15 - + O166:H49 - -
M16 - + ONT:H- - -
M17 - + ONT:H34 - -
M18 - - O166:H49 - -
M19 - + O98:H25 - -
M20 - + O98:H25 - -
M22 - - O4:H11 - -
M23 - - ONT:H2 - -
M24 - - ONT:H2 - -
M26 - - ONT:H7 - -
M27 - - ONT:H7 - -
M28 - - ONT:H7 - -
M29 - - ONT:H7 - -
M30 - - ONT:H7 - -
15
TABELA 3 – Continuação
hemolisina
T.Adesão
1
Amostra
alfa EHEC
Sorotipo
HeLa/Caco2
FAS
2
M32 - + O26:H11 - -
M33 - + O26:H11 - -
M34 - + O26:H11 - -
M35 - + O26:H11 - -
M36 - + O26:H11 - -
M37 - + ONT:H7 - -
M38 - + ONT:H7 - -
M39 - + ONT:H7 - -
M41 - + ONT:H7 - -
M42 - + ONT:H11 - -
M43 - + O123:H11 - -
M44 - + ONT:H11 - -
M46 - + O98:H- - -
1,
ensaio de interação de 6 horas.
2,
FAS, “fluorescent actin staining”, após 6 horas de interação celular.
TABELA 4 - Caracterização genotípica e fenotípica das amostras AEEC originária de bovinos sadios.
PCR hemolis. T.Adesão
Amostra Proc.
eae tir esp A esp B EAF bfp LEE stx1 stx2 eae hlyA alfa EHEC
Sorotip.
HeLa/Caco2
FAS
M02 -
SP
γ
α α α
- - - - - + + - + ONT:H7 - -
M06 -
SP
γ
α α α
- - - - - + + - + ONT:H7 - -
M07 -
SP
γ
α α α
- - - - - + + - + O76:H7 - -
M08 -
SP
γ
α α α
- - - - + + + - + ONT:H7 - -
M09 -
SP
γ
α α α
- - - - - + + - + ONT:H25 - -
M10 -
SP
γ
α α α
- - - - - + + - + O76:H7 - -
M11 -
SP
β
NT NT NT
- - - - - + + - - O174:H43 - -
M12 -
SP
β β
NT NT
- - - - - + + - - O102:H21 - -
M14
RJ
-
γ γ NT
β
- -
SelC
- - + + - + ONT:H- - -
M15
RJ
-
γ γ NT
β
- -
SelC
- + + + - + O166:H49 - -
M16
RJ
-
γ γ NT
β
- -
SelC
- + + + - + ONT:H- - -
M17
RJ
-
β β β
NT
- - - - + + + - + ONT:H34 - -
M18
RJ
-
NT
α α α
- - - - - + + - - O166:H49 - -
M19
RJ
-
NT
α α α
- - - - - + + - + O98:H25 - -
M20
RJ
-
NT
α α α
- -
PheU
- - + + - + O98:H25 - -
2
TABELA 4 – Continuação
PCR hemolis. T.Adesão
Amostra Proc.
eae tir esp A esp B EAF bfp LEE stx1 stx2 eae hlyA alfa EHEC
Sorotip.
HeLa/Caco2
FAS
M22
RJ
-
ε
NT NT NT
- - - - + + - - - O4:H11 - -
M23
RJ
-
γ
α α α
- - - - - + - - - ONT:H2 - -
M24
RJ
-
γ
α α α
- - - - - + - - - ONT:H2 - -
M26
RJ
-
γ
α α α
- - - - - + - - - ONT:H7 - -
M27
RJ
-
γ
α α α
- - - - - + - - - ONT:H7 - -
M28
RJ
-
γ
α α α
- - - - - + - - - ONT:H7 - -
M29
RJ
-
γ
α α α
- - - - - + - - - ONT:H7 - -
M30
RJ
-
γ
α α α
- - - - - + - - - ONT:H7 - -
M32
RJ
-
β β β
NT
- -
PheU
- - + + - + O26:H11 - -
M33
RJ
-
β β β
NT
- -
PheU
- - + + - + O26:H11 - -
M34
RJ
-
β β β
NT
- -
PheU
- - + + - + O26:H11 - -
M35
RJ
-
β β β
NT
- -
PheU
- - + + - + O26:H11 - -
M36
RJ
-
β β β
NT
- -
PheU
- - + + - + O26:H11 - -
M37
RJ
-
γ
α α α
- -
PheU
- - + + - + ONT:H7 - -
3
TABELA 4 – Continuação
PCR hemolis. T.Adesão
Amostra
Proc.
eae tir esp A esp B EAF bfp LEE stx1 stx2 eae hlyA alfa EHEC
Sorotip.
HeLa/Caco2
FAS
M38
RJ
-
γ
α α α
- -
PheU
- - + + - + ONT:H7 - -
M39
RJ
-
NT
α α α
- -
PheU
- - + + - + ONT:H7 - -
M41
RJ
-
NT
α α α
- -
PheU
- - + + - + ONT:H7 - -
M42
RJ
-
β β β
NT
- -
PheU
- - + + - + ONT:H11 - -
M43
RJ
-
β β β
NT
- -
PheU
- - + + - + O123:H11 - -
M44
RJ
-
β β β
NT
- -
SelC
- - + + - + ONT:H11 - -
M46
RJ
-
β β β
NT
- -
SelC
- - + + - + O98:H- - -
DISCUSSÃO
5.
Infecções humanas causadas por EPEC típica representam a maior causa de
mortalidade neonatal em regiões onde as condições higiênico-sanitárias são precárias
(Trabulsi et al., 2002). EPEC típicas foram raramente isoladas de animais, e os humanos
são o principal reservatório natural para esses patógenos (Goffaux et al., 2000; Trabulsi
et al., 2002; Nakazato et al., 2004). Entretanto, amostras EPEC atípicas foram
encontradas em homens e em animais (Goffaux et al., 2000; Cid et al., 2001; Beutin et
al., 2003; Regua-Mangia et al., 2004; Aktan et al., 2004) e conseqüentemente, animais
poderiam se apresentar como origem das infecções humanas (Goffaux et al., 2000;
Nakazato et al., 2004).
Amostras E.coli possuidoras do gene eae e apresentando a capacidade de induzir
a lesão “attaching and effacing” – A/E são designadas como “attaching and effacing”
Escherichia coli - AEEC (Moon et al., 1983). Em bezerros, o gene eae e a intimina -
uma proteína de membrana externa, codificada por esse gene - têm sido descritos como
responsáveis pela determinação dessa lesão (Tzipori et al.,1987, Hall et al, 1990).
Autores como Knutton et al (1994), Wieler et al (1996) e Saridakis et al. (1997),
documentam a importância da AEEC na diarréia dos bezerros. Outros, porém, como
Wieler et al (1992), Blanco et al (1993,1994) têm reportado a ocorrência da infecção
pela AEEC também em bezerros sadios. Assim como vem demonstrando o presente
estudo.
2
Amostras AEEC bovinas que apresentam a expressão da intimina, a toxina Shiga
e a capacidade de provocar a lesão A/E, são equivalentes à E.coli enterohemorrágica
(EHEC) humana (Levine, 1987; Knutton et al., 1994). Sendo assim, duas classes de
AEEC bovina têm sido descritas (Mainil et al., 1993), uma onde os genes eae e stx estão
presentes (EHEC) e outra em que o gene stx não aparece (EPEC).
Dados da Sociedade Boliviana de Pediatria (Sánchez et al.,2004) revelam a
presença do perfil patogênico de AEEC em fezes diarréicas de crianças menores de 5
anos, com a prevalência das cepas EPEC (95%) em relação às EHEC. Relatam ainda
uma maior proporção de cepas EPEC atípicas (83%) sobre as típicas.
O presente trabalho procurou isolar amostras de E. coli produtora da lesão A/E
em amostras fecais de bovinos sadios, caracterizando fenotipicamente e
genotipicamente seus fatores e marcadores de virulência, avaliando o potencial
zoonótico desses agentes.
Alguns autores, como China et al (1999) e Gladys et al (2005), relatam a
presença de AEEC em animais sadios, que sendo reservatórios naturais desse agente,
podem representar um problema de segurança alimentar. AEEC pode ser transmitida
para humanos através da ingestão de alimentos de origem animal contaminado ou ainda
através do contato direto com os animais.
Segundo Gladys et al (2005), bovinos, ovinos e suínos vêm tendo um destaque
especial em diversos estudos, como as espécies mais envolvidas na transmissão de
AEEC. Entretanto, macacos, cães, gatos, coelhos, aves e caprinos também já foram
reportados como reservatórios naturais de AEEC (Blanco et al., 2006; Fuente et al.,
2002; Almeida , 2005).
Estudos prévios realizados por Cerqueira et al., (2003) com bovinos no Estado
do Rio de Janeiro demonstram, assim como Beutin et al., (1999), Goffaux et al., (2000)
e Nakazato et al., (2004), a grande incidência de EPEC associadas a animais jovens,
entre eles bovinos. No presente trabalho, concordando com os autores acima citados,
83% dos animais estudados e positivos para o gene eae são bezerros.
Estudos anteriores realizados por Holland et al., (1999) com bovinos e por
Fuente et al., (2002) com pequenos ruminantes, demonstram a maior ocorrência de
AEEC em sadios e relação aos diarréicos.
Todos os isolamentos de AEEC estudados nesse trabalho foram provenientes de
amostras fecais de bovinos sadios e apresentaram marcadores de virulência compatíveis
com o perfil capaz de determinar doença humana.
3
Quanto à caracterização de LEE, uma grande variedade de prefis foi observada.
Nesse estudo, em relação ao gene eae , o tipo predominante foi o γ (50%) e nenhuma
colônia foi positiva para o tipo α, que de acordo com Trabulsi (2002) é o tipo
predominante de intimina na EPEC típicas, entretanto, estudos relataram a detecção do
tipo α em bovinos (Blanco et al., 2005; Stephan et al., 2004) e em amostras isoladas de
macacos (Tarr et al., 1996), esses achados discordam com a sugestão de que o tipo α de
intimina esteja limitado à cepas STEC humanas (Adu-Bobie et al ., 1998; Oswald et al.,
2000). Atualmente distinguem- se 17 variantes imunológicas de intimina, sendo a mais
recente o tipo η
2
, descrito por Blanco et al., (2005) e mostrou-se relacionada ao sorotipo
ONT:H45 e positivas para o gene bfp. O tipo ε foi descrito pela primeira vez em
humanos e cepas STEC bovinas Oswald et al., (2000) , no entanto, Blanco et al.,
(2005), como neste estudo, detectaram esse tipo de intimina em cepas EPEC
provenientes de bovinos. As amostras não tipadas podem pertencer a um dos 9 tipos
adicionais de intimina descritos, de ocorrência mais rara ou serem variantes ainda não
descritas. Para os genes tir, espA e espB a variante α foi predominante, com ocorrência
de 55,55% em cada um deles. A ausência de EAF e bfp foi observada em todos os
isolados analisados, entretanto, Blanco et al., (2005) relataram a detecção de EAF e bfp
em amostras bovinas. A presença de EAF mostrou-se relacionada ao sorotipo
O157:H45 . Apesar desses achados, a prewsença de bfpA tem sido muito raramente
descrita em amostras EPEC bovinas, no entanto, em estudos recentes na Suíça (Stephan
et al., 2004) isolaram 11 amostras EPEC originárias de bovinos que apresentaram o
sorotipo O157:H45, e entre elas, 10 amostras se mostraram positivas para o gene bfp,
demonstrando similaridade com EPEC humanas. O predomínio dos subtipos γ para
intimina e α para tir, espA e espB já foi descrito em bovinos sadios por China et al
(1999) em estudo comparativo entre os patotipos encontrados a partir de amostras
isoladas de bovinos sadios e diarréicos. Cabe ainda relembrar que as EPEC típicas
apresentam, em geral, um perfil de aderência LA, presença de EAF e bfp, e predomínio
de intiminas do tipo α e β (Trabulsi, 2002).
A presença de diferentes perfis genéticos em amostras contendo o gene eae e
ausência de demais genes como stx e EAF, tem sido relatada não apenas em amostras
isoladas de animais, mas também em amostras oriundas de seres humanos, ocorrendo
tanto em indivíduos sadios quanto em diarréicos (Pelayo et al., 2003; Gomes et al.,
2004; Vieira et al., 2001; Krause et al. 2005). Tal fato reforça a semelhança entre o
perfil das amostras de EPEC atípica que estão circulando entre animais e seres
4
humanos, ressaltando o potencial zoonótico destas bactérias.
Assim como neste estudo, outros trabalhos demonstraram que o gene bfp ainda
não foi detectado em bovinos, suínos e coelhos (Pohl et al., 1993; Zhu et al., 1994).
Entretanto, em amostras caninas esse gene já foi observado, sugerindo proximidade com
as amostras EPEC típicas humanas (Almeida, 2005; Gladys et al., 2005). Em seus
estudos Gladys et al., (2005) detectaram também a presença do gene bfp em gatos.
Todos os isolamentos e estudados neste trabalho foram submetidos ao teste de
adesão em células HeLa e Caco2 por um período de 6 horas. Observações prévias
relativas a baixa capacidade de adesão celular em ensaios de 3 horas, determinaram que
o teste de 6 horas fosse utilizado para a caracterização do perfil (Andrade –
comunicação pessoal). Entretanto, nenhuma das amostras exibiu um padrão de
aderência intenso e típico, nem tampouco se apresentou positiva ao teste FAS. A
suposta contradição de amostras portadoras de locus LEE íntegro e a aparente não
expressão desta característica pode ser explicada pela baixa interação celular. Esse perfil
de aderência das amostras atípicas tem sido descrito em outros estudos.
A produção de hemolisinas foi testada fenotípica e genotipicamente. A produção
de α hemolisina não foi observada em nenhuma das amostras, no entanto, a presença de
enterohemolisinas foi observada em ambos os testes. Vinte e oito (77,77%) dos isolados
estudados foram positivos para o gene hlyA e 25 (69,44%) positivos fenotípicamente.
A síntese de enterohemolisinas por amostras STEC já vem há tempos sendo
relatada (Beutin et al., 1986, 1988, 1989). Porém a influência da enterohemolisina na
doença intestinal bovina não está bem definida, e se tem sugerido que essa venha a ser
um complicador dos efeitos da toxina Shiga ( Nataro e Kaper, 1998). Entretanto,
Holland et al (1999), Ramachandran et al. (2003), Leomil, et al. (2005) em estudos
anteriores demonstraram, como no presente estudo, que amostras provenientes de
bovinos sadios e positivos somente para o gene eae podem apresentar atividade de
enterohemolisina.
Beutin et al., (1993); Brett et al., (2003); Muniesa et al., (2004), descrevem que
amostras AEEC stx negativas podem apresentar o mesmo tipo de intimina e produzir
enterohemolisinas como as amostras STEC de mesmo sorotipo. Além disso sugerem
que amostras EPEC poderiam se converter em EHEC ao receberem o gene stx, e que
STEC, que são freqüentemente encontradas em fezes de animais domésticos, poderiam
servir como fonte de bacteriófagos que codificam stx.
Dos 36 isolados estudados, 15 sorotipos foram identificados, 8 sorogrupos O
5
diferentes foram detectados e 9 antígenos H distintos, sendo H7
o mais freqüente
(38,88%). Dentre os sorotipos, algumas repetições foram observadas, a saber, O76:H7,
ONT:H-, O166:H49, O98:H2, ONT:H2, O26:H11, ONT:H11 e ONT:H7. Esse último
predominou em 12 (33,33%) dos isolamentos, entretanto, esses isolados foram obtidos
de 4 animais diferentes. A maior parte dos sorotipos repetidos foi observada somente
duas vezes e foram provenientes de animais diferentes, entretanto os sorotipos
O98:H25, ONT:H2 e O76:H7 repetidos foram originários do mesmo animal.
O sorotipo O26:H11 se repetiu em 5 dos isolados (13,88) e originários de 2
animais diferentes. Esse sorotipo tem sido reportado como patógeno em humanos e
animais (Bitzan et al., 1991. McGraw et al., 1999; Pearson et al., 1999; Oswald et al.,
2000; Régua-Mangia et al., 2004). Gladys et al (2004) relataram que em seus estudos,
AEEC O26:H11 foi o mais freqüente tipo de AEEC encontrado entre as espécies
bovinos, ovinos, suínos e aves domésticas. Os isolamentos AEEC O26:H11 observados
nesse estudo se encontram relacionados com o tipo β da intimina , tir, espA e espB, essa
mesma relação é encontrada principalmente em amostras bovinas diarréicas, entretanto
essa associação também foi observada em animais sadios porém em menor proporção
(China et al., 1999).
Dentre os sorotipos encontrados, vários já foram detectados em outras espécies,
a saber, ONT:H2 em suinos e gatos, O26: H11 em ovinos, aves, suínos e humanos,
ONT:H11 em suinos e ONT:H7 em gatos. Os outros sorotipos encontrados ocorreram
em menor freqüência e sem repetições.
Quanto aos 8 sorogrupos distintos detectados, o O26 foi o mais freqüente, com
ocorrência em 5 (13,88%) dos isolados, seguido do sorogrupo O98 com ocorrência em 3
(8,33%) dos isolados.. Aktan et al (2004) revelam a freqüente ocorrência de AEEC O26
entre os bovinos, ovinos e suínos do Reino Unido e Almeida (2005) e Krause et al
(2005) relataram a presença do sorogrupo O4 em amostras de origem canina. Esse
sorogrupo foi também detectado em bovinos com mastite nos quais ainda 4 sorogrupos
de EPEC clássica foram descritas, a saber, O26, O55, O111, O119. O sorogrupo O26 já
foi descrito em amostras de origem humana (Oswald et al., 2000; Régua-Mangia et al.,
2004). Nenhum dos isolamentos testados foi positivo para o sorogrupo O-.
Em relação ao local de inserção de LEE, a maior parte dos isolados
encontram-se inseridos em selC (13,88) ou provavelmente em pheV (52,77%)
provavelmente e apresentam relação com o subtipo γ de intimina. De acordo com Jores
et al (2004), esse perfil é compatível com amostras de origem humana e com o perfil
6
encontrado em linhagens de EHEC.
Os resultados encontrados nos isolamentos AEEC estudados, demonstraram uma
grande positividade para o gene hlyA , comumente descrito em amostras STEC, e uma
predominância do tipo γ de intimina, perfil frequentemente relatado em amostras EHEC.
O conjunto desses dados poderia sugerir um perfil intermediário entre os perfis EHEC e
EPEC, entretanto, estudos adicionais deveriam ser realizados a fim de melhor esclarecer
essa possibilidade.
De modo semelhante aos relatos de Nazakato et al., (2004), o presente trabalho
descreveu a ocorrência de amostras distintas de AEEC provenientes de um mesmo
animal, ressaltando a relevância de se buscar o isolamento de mais de uma colônia
AEEC por animal de modo a detectar o maior número possível de agentes presentes.
A certeza da circulação de EPEC atípica entre homens e animais vem sendo há
tempos descrita. Concordando com essa afirmação, os achados desse estudo
demonstram a presença de cepas EPEC atípicas provenientes de bovinos sadios que
apresentam um perfil compatível com a virulência em animais e humanos. Deste modo
a possibilidade da transmissão entre animais e seres humanos não pode ser excluída,
sendo aconselhável que as estratégias de fiscalização já estabelecidas para o controle
das infecções por STEC sejam ampliadas para o grupo das EPEC. Por outro lado a
compreensão da estrutura genética e da evolução dos genes envolvidos na lesão A/E
determinada por E.coli EPEC e EHEC será de relevante importância para o combate dos
problemas de saúde pública determinados por essa bactéria.
7
CONCLUSÃO
6.
A partir do conjunto dos resultados obtidos, concluímos:
As amostras AEEC provenientes de bovinos sadios dos Estados do Rio de
Janeiro, e de São Paulo, em função do perfil fenotípico e genotípico observado,
correspondem a EPEC atípicas;
Animais domésticos, especialmente bezerros, constituem importantes
reservatórios naturais de AEEC.
Bovinos também podem ser considerados reservatórios de EPEC atípica para
humanos.
Cepas EPEC atípicas provenientes de bovinos sadios, em função da similaridade
dos marcadores fenotípicos e genotípicos detectados, apresentam um perfil compatível
com a virulência em animais e humanos, reforçando o potencial zoonótico desses
agentes.
8
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
7.
ADU-BOBIE, J., FRANKEL, G., BAIN, C., GONÇALVES, A.G., TRABULSI, L.R.,
DOUCE, G., KNUTTON, S., DOUGAN, G. Detection of intimins α, β, γ and δ, four
intimin derivates expressed by attaching and effacing microbial pathogens. J. Clin.
Microbiol., 36, 662-668, 1998.
AKTAN, I., SPRIGINGS, K.A., LA RAGIONE, R.M., FAULKNER, L.M., PAIBA,
G.A., WOODWARD, M.J., 2004. Characterization of attachingeffacing Escherichia coli
isolated from animals at slaughter in England and Wales. Vet. Microbiol. 102, 43–53.
ALMEIDA, P.M.P., caracterização fenotípica e genotípica de escherichia coli produtora
da lesão “attaching and effacing”(AEEC) isoladas de cães na região metropolitana do
estado do Rio de Janeiro, 2005. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal
Fluminese –RJ.
BALDINI, M. M.; KAPER, J. B.; LEVINE, M. M.; CANDY, D. C. & MOON, H.
W.. Plasmid-mediated adhesion in enteropathogenic Escherichia coli. J. Pediatr.
Gastroenterol. Nutr. , 2:534-538, 1983.
9
BALDWIN, T. J., W. WARD, A. AITKEN, S. KNUTTON Y P. H. WILLIAMS. 1991.
Elevation of intracellular free Calcium levels in Hep-2 cells infected with
enteropathogenic Escherichia coli. Infect. and Inmun. 59:1599-1604.
BETTELHEIM K. A. 1994. Biochemical characteristics of Escherichia coli. p. 3-30. In:
c. L. Gyles (ed), Escherichia coli in domestic animals and humans. CAB International,
Wallingford, United Kingdom.
BEUTIN, L. Escherichia coli as a pathogen in dogs and cats. Vet. Res. 30:285-298,
1999.
BEUTIN, L., MARCHES, O., BETTELHEIM, K.A., GLEIER, K., ZIMMERMANN,
S., SCHMIDT, H., OSWALD, E., 2003. HEp-2 cell adherence, actin aggregation, and
intimin types of attaching and effacing Escherichia coli strains isolated from healthy
infants in Germany and Australia. Infect. Immun. 71, 3995–4002.
BEUTIN, L., KRAUSE, G., ZIMMERMANN, S., KAULFUSS, S., GLEIER, K.
haracterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli strains isolated from human
patients in Germany over a 3-year period. J.Clin. Microbiol., 42, 1099-1108, 2004.
BLANCO, J., GONZALEZ, E.A., GARCIA, S., BLANCO, M., REGUEIRO, B.,
BERNARDEZ, I., 1988. Production of toxins by Escherichia coli strains isolated from
calves with diarrhoea in Galicia (North-western Spain). Vet.Microbiol. 18, 297±311.
BLANCO, M., BLANCO, J., BLANCO, J.E., RAMOS, J., 1993. Enterotoxigenic,
verotoxigenic, and necrotoxigenic Escherichia
BLANCO, M., BLANCO, J., BLANCO, J.E., GONZALEZ, E.A., GOMES, T.A.T.,
ZERBINI, L.F., YANO, T., PESTANA DE CASTRO,A.F., 1994. Genes coding for
Shiga-like toxins in bovine verotoxin-producing Escherichia coli (VTEC) STRAINS
belonging to different O : K : H serotypes. Vet. Microbiol. 42, 105±110.
10
BLANCO M, BLANCO JE, BLANCO J, CARVALHO VM, LOPES ONUMA D,
PESTANA DE CASTRO AF: Typing of intimin (eae) genes in attaching and
effacing Escherichia coli strains from Monkeys. J Clin Microbiol2004, 42:1382-1383.
BLANCO , M., M., DE SIMON, M, J.E., SERRA-MORENO, R.,BLANCH, A.R.,
JOFRE, J., 2004. Diversity of stx2 converting bacteriophages induced from Shiga-
toxin-producing Escherichia coli strains isolated from cattle. Microbiology 150,
2959–2971.
BLANCO, M., SCHUMACHER, S., TASARA ,T., ZWEIFEL C., BLANCO J. E.,
DAHBI, G., BLANCO J., STEPHAN R. Serotypes, intimin variants and other
virulence factors of eae positive Escherichia coli strains isolated from healthy cattle in
Switzerland. Identification of a new intimin variant gene (eae-η2) BMC Microbiology
2005, 5:23
BLANCO, J., BLANCO, M., BLANCO, J.E., MORA, A., ALONSO, M.P.,
GONZÁJEZ, E. A., HERMIDA, M.I. B. Escherichia coli patógenos para seres humanos
y animals, - Laboratorio de referencia de E. coli (LREC). Disponível em
www.lugo.USC.ES/ecoli/E.coli.html . Acesso em Janeiro/2006
BLATTNER, F. R., I. G. PLUNKETT, C. A. BLOCH, N. T. PERNA, V. BURLAND,
M. RILEY, J. COLLADO-VIDES, J. D. GLASNER, C. K. RODE, G. F. MAYHEW, J.
GREGOR, N. W. DAVIS, H. A. KIRKPATRICK, M. A. GOEDEN, D. J. ROSE, B.
MAU, Y Y. SHAO. 1997. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12.
Science 277:1453-1462.
BRETT, K.N.V., RAMACHANDRAN, M.A., HORNITZKY, K.A., BETTELHEIM,
M.J., WALKER, S.P., DJORDJEVIC, 2003. stx1c is the most common Shiga toxin1
subtype among Shiga toxin-producing Escherichia coli isolates from sheep but not
among isolates from cattle. J. Clin. Microbiol. 41, 926–936.
BUTLER, D. G., and R. C.CLARKE.1994 Diarrhea and dysentery in calves,p.91-116.
In C. L. GYLES (ed), Escherichia coli in domestic animals and humans. CAB
International, Waltingford, United Kingdom
11
CARON, J., L. M. COFFIELD Y J. R. SCOTT. 1989. A plasmid-encoded regulatory
gene, rns, required for expression of the CS1 and CS2 adhesins of enterotoxigenic
Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 86(3):963-967.
CAUGANT, D. A., B. R. LEVIN Y R. K. SELANDER. 1981. Genetic diversity and
temporal variation in the E. coli population of a human host. Genetics 98:467-490.
CHANTER, N., MORGAN, J.H., BRIDGER, J.C., HALL, G.A., REYNOLDS, D.J.,
1984. Dysentery in gnotobiotic calvescaused by atypical Escherichia coli. Vet. Record
114, 71.
CHANTER, N., HALL, G.A., BLAND, A.P., HAYLE, A.J., PARSONS, K.R., 1986.
Dysentery in calves caused by an atypicalstrain of Escherichia coli (S102-9). Vet.
Microbiol. 12, 241±253.
CHINA, B., PIRSON, V., MAINIL, J. Typing of bovine attaching and effacing
Escherichia coli by multiplex in vitro amplification of virulence-associated genes.
Appl. Environ.Microbiol., 62, 3462-3465, 1996.
CHINA, B., GOFFAUX, F., PIRSON, V., MAINIL, J. Comparasion of eae, tir, espA
and espB genes of bovine and human attaching and effacing Escherichia coli by
multiplex polymerase chain reaction. FEMS Microbiol. Letters, 178, 177-182, 1999.
CID, D., RUIZ-SANTA-QUITERIA, J.A., MARIN, I., SANZ, R., ORDEN, J.A.,
AMILS, R., DE LA, R., FUENTE, 2001. Association between intimin(eae) and EspB
gene subtypes in attaching and effacing Escherichia coli strains isolated from diarrhoeic
lambs and goat kids. Microbiology 147, 2341–2353.
CORREAM.G.P. A, MARINB J.M O-serogroups, eae gene and EAF plasmid in
Escherichia coli isolates from cases of bovine mastitis in Brazil Veterinary
Microbiology 85 (2002) 125–132
12
CRANE, J.K., MCNAMARA, B.P., DONNENBERG, M.S. Role of EspF in host cell
death induce by enteropathogenic Escherichia coli. Cell. Microbiol., 3, 197-211, 2001.
CRAVIOTO, A., GROSS, R.J., SCOTLAND, S.M. ROWE, B. An adhesive factor
found in strains of Escherichia coli belonging to the traditional infantile
enteropathogenic serotypes. Curr. Microbiol., 3, 95-99, 1979.
DECKERT G., P.V. WARREN, T. GAASTERLAND, W.G. YOUNG, A.L. LENOX,
D.E. GRAHAM, R. OVERBEEK, M.A. SNEAD, M. KELLER, M. AUJAY, R.
HUBER, R.A. FELDMAN, J.M. SHORT, G.J. OLSEN Y R.V. SWANSON. 1998. The
complete genome of the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. Nature.
392(6674):353-358.
DE VINNEY, R., STEIN, M., REINSCHEID, D., ABE, A., RUSCHKOWSKI, S.,
FINLAY, B.B. Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 produces Tir, wich is
translocated to the host cell membrane but is not tyrosine phosphorylated. Infect.
Immun., 67, 2389-2398, 1999.
DONNENBERG, M.S., KAPER, J.B., 1992. Enteropathogenic Escherichia coli. Infect.
Immun. 60, 3953±3961.
DONNENBERG, M.S.; YU, J.; KAPER, J.B. A second chromosomal gene necessary
for intimate attachment of enteropathogenic Escherichia coli to epithelial cells. J.
Bacteriol. 175:4670-4680, 1993.
DORN, R.C., FRANCIS, D.H., ANGRICK, E.J., WILLGOHS, J.A., WILSON, R.A.,
COLLINS, J.E., JENKE, B.H., SHAWD, S.J.,1993. Characteristics of verocytoxin
producing Escherichia coli associated with intestinal colonization and diarrhea in
calves. Vet. Microbiol. 36, 149±159.
13
EBEL, F.; PODZADEL, T.; ROHDE, M.; KRESSE, A. U.; KRAMER, S.; DEIBEL, C.;
GUZMA, C.A. & CHAKRABORTY, T. Initial binding of Shiga toxin-producing
Escherichia coli to host cells and subsequent induction of actin rearrangements depend
on filamentous Esp-A-containig surface appendages. Mol. Microbiol., 30: 146-161,
1998.
ELLIOT, S.J., KREJANY, E.O., MELLIES, J.L., ROBINS-BROWNE, R.M.,
SASAKAWA, C., KAPER, J.B. EspG, a novel type III system-secreted protein from
enteropathogenic Escherichia coli with similarities to VirA of Shigella flexneri. Infect.
Immun., 69, 4027-4033, 2001.
EWING, W.H. Edwards & Ewing's identification of Enterobacteriaceae. 4
th
ed.,
Elsevier Science Publishers, New York, NY, 1986.
FINLAY, B.B., VALLANCE, B.A. Exploitation of host cells by enteropathogenic
Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 97, 8789-8806, 2000.
FINLAY, B.B., ZAHARIK, M.L., GRUENHEID, S., PERRIN, A.J. Delivery of
dangerous goods: Type III secretion in enteric pathogens. Int. J. Med. Microbiol., 291,
593-603, 2002.
FISHER, J., MADDOX, C., MOXLEY, R., KINDEN, D., MILLER, M., 1994.
Pathogenicity of a bovine attaching effacing Escherichia coli isolate lacking shiga-like
toxins. Am. J. Vet. Res. 55, 991±999.
FRANKE, J., FRANKE, S., SCHMIDT, H., SHWARZKOPF, A., WIELER, L.H.,
BALJER, G., BEUTIN, L., KARCH, H. Nucleotide sequence analysis of
enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) adherence factor probe and development of
PCR for rapid detection of EPEC harboring virulence plasmids. J. Clin. Microbiol., 32,
2460-2463, 1994.
14
FRANKEL, G., LIDER, O., HERSHKOVIZ, R., MOULD, A.P., KACHALSKY, S.G.,
CANDY, D.C.A., CAHALON, L., HUMPHRIES, M.J., DOUGAN, G., 1996. The cell-
binding domain of intimins from enteropathogenic Escherichia coli binds to β1
integrins. J. Biol. Chem. 271, 20359-20364.
FRANKEL, G., PHILLIPS, A.D., ROSENSHINE, J., DOUGAN, G., KAPER, J.B.,
KNUTTON, S. Enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli: more
subversive elements. Mol. Microbiol., 30, 911-921, 1998.
FUENTE, R., GARCIA, S., ORDEN, J. A., RUIZ-SANTA-QUITERIA, J. A., DÍEZ,
R., CID, D., 2002. Prevalence and characteristics of attaching and effacing strains of
Escherichia coli isolated from diarrheic and healthy sheep and goats. Am. J. Vet. Res.
2, 262-266.
GIRÓN, J. A.; HO, A. S. Y.; & SCHOOLNIK, G. K. Characterization of fimbriae
produced by enteropathogenic Escherichia coli. J. Bacteriol., 175: 7391-7403, 1993.
GIRÓN, J. A.; LEVINE, M. M.& KAPER, J. B. Longus a lon pili ultrastructure
produced by human enterotoxigenix Escherichia coli. Mol. Microbiol., 12: 71-82, 1994.
GIRÓN, J.A., GISMERO-ORDOÑEZ, J., DALL’AGNOL, M., TRABULSI, L.R.
Expression of the bundle-forming pilus by enteropathogenic Escherichia coli strains of
heterologous serotypes. J. Clin. Microbiol., 40, 2291-2296, 2002.
GLADYS K., SONJA Z., LOTHAR B., Investigation of domestic animals and pets as a
reservoir for intimin- (eae) gene positive Escherichia coli types. Veterinary
Microbiology 106, 87–95 (2005).
GOMES, A.T., IRINO, K., GIRÃO, D.M., GIRÃO, V.B.C., GUTH, B.E.C., VAZ,
T.M.I., MOREIRA, F.C., CHINARELLI, S.H., VIEIRA, M.A.M. Emerging
enteropathogenic Escherichia coli strains. Emerg. Infect. Dis., 10, 2004.
15
GOFFAUX, F., CHINA, B., JANSSEN, L., MAINIL, J., 2000. Genotypic
characterization of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) isolated in Belgium from
dogs and cats. Res. Microbiol. 151, 865–871
GOOSNEY, D. L., D. L. KNOECHEL Y B. FINLAY. 1999. Enteropathogenic E. coli,
Salmonella and Shigella: Masters of host cell cytoskeletal exploitation. Emer. Infect
disea.. 5:216-223.
GRIFFIN, P.M.; TAUXE, R.V. The epidemiology of infections caused by Escherichia
coli O157:H7, other enterohemorrhagic Escherichia coli, and the associated hemolytic
uremic syndrome. Epidemiol. Rev. 13:60-98, 1991.
HALL, G.A., REYNOLDS, D.J., CHANTER, N., MORGAN, J.H., PARSONS, K.R.,
DEBNEY, T.G., BLAND, A.P., BRIDGER, J.C.,1985. Dysentery caused by
Escherichia coli (S102-9) in calves: natural and experimental disease. Vet.Pathol. 22,
156±163.
HALL, G. H., DORN, C. R. CHANTER, N.SCOTLAND, S. M., SMITH,H. R.,
ROWE, B., 1990. Attaching and effacing lesions in vivo and adhesion to tissue culture
cells of vero-cytoxin-producing Escherichia coli belongin to serogroup O5 and O103. J.
Gen. Microbiol.136, 779-786.
HARTLAND, E.L., DANIELL, S.J., DELAHAY, R.M., NEVES, B.C., WALLIS, T.,
SHAW, R.K. HALE, C., KNUTTON, S., FRANKEL, G. The type III protein
translocation system of enteropathogenic Escherichia coli involves EspA-EspB protein
interactions. Mol. Microbiol., 35, 1483-1492, 2000.
HICKS, S.; FRANKEL, G.; KAPER, J.B.; DOUGAN, G. & PHILLIPS, A. Role of
intimin and Bundle-forming Pili in Enteropathogenic Escherichia coli adhesion to
pediatric intestinal tissue in vitro. Infect. Immun., 66: 1570-78, 1998.
HIRSH, D.C., ZEE, Y.C. Microbiologia Veterinária. Editora Guanabara Koogan, 59-68,
2003.
16
HOLLAND, R., WILSON, R. A., HOLLAND, M., YUZBASIYAN-GURKAN, V.,
MULLANEY, T. P., WHITE, D.G. Characterization of eae Escherichia coli isolated
from healthy and diarrheic calves. Veterinary Microbiology 66 (1999) 251±263
K. IRINOA,*, M.A.M.F. KATOA, T.M.I. VAZA, I.I. RAMOSA, M.A.C. SOUZAB,
A.S. CRUZA, T.A.T. GOMESC, M.A.M. VIEIRAC, B.E.C. GUTH Serotypes and
virulence markers of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) isolated from
dairy cattle in São Paulo State, Brazil. Veterinary Microbiology 105 (2005) 29–36
ISTOCK,C.A., K.E.DUNCAN, N.FERGUSON Y X.ZHOU. 1992. Sexuality in a
natural population of bacteria -Bacillus subtilis challenges the clonal paradigm.
Mol.Ecol. 1:95-103.
JANKE, B.H., FRANCIS, D.H., COLLINS, J.E., LIBAL, M.C., ZEMAN, D.H.,
JOHNSON, D.D., NEIGER, R.D., 1990.Attaching and effacing Escherichia coli
infection as a cause of diarrhea in young calves. J. Am. Vet. Med.Assoc. 196
JAY, J. M. Microbiologia moderna de los alimentos. 3 ed. Zaragoza: Acribia, 1994.
537 – 670p.
JERSE, A.E.; YU, J.; TALL, B.D.; KAPER, J.B. A genetic locus of enteropathogenic
Escherichia coli necessary for the production of attaching and effacing lesions on tissue
culture cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 87:7839-7843, 1990.
JORES, J., RUMER, L., KIEBLING, S., KAPER, J.B., WIELER, L.H. A novel locus of
enterocyte effacement (LEE) pathogenicity island inserted at pheV in bovine Shiga-like-
producing Escherichia coli strains O103:H2. FEMS Microbiol. Letters, 204, 75-79,
2001.
JORES, J., RUMER, L., WIELER, L.H. Impact of locus of enterocyte affacement
pathogenicity island on the evolution of pathogenic Escherichia coli. IJMM, 294, 103-
113, 2004.
17
KALMAN S., W. MITCHELL, R. MARATHE, C. LAMMEL, L. FAN, R.W.
HYMAN, L. OLINGER, L. GRIMWOOD, R.W. DAVIS Y R.S. STEPHENS. 1999.
Comparative genomes of Chlamydia pneumoniae and C-trachomatis. Nature Genetics.
21:385-389.
KAPER, J. B. 1998. EPEC delivers the goods. Trends Microbiol. 6:169-172.
KENNY, B.; DEVINNEY, R.; STEIN, M.; REINSCHEID, D.J.; FREY, E.A.;
FINLAY, B.B. Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) transfers its receptor for
intimate adherence into mammalian cells. Cell. 91:511-520, 1997.
KENNY, B., JEPSON, M. Targeting of an enteropathogenic E.coli (EPEC) effector
protein to host mitochondria. Cell. Microbiol., 2, 579-590, 2000.
KNUTTON, S., BALDWIN, T., WILLIANS, P.H., MCNEISH, A.S. Actin
accumulation at sites of bacterial adhesion to tissue culture cells: basis of a new
diagnostic test for enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Infect.
Immun., 57, 1290-1298, 1989.
KNUTTON, S., PHILLIPS, A.D., SMITH, H.R., GROSS, R.J. SHAW, R., WATSON,
P., PRICE, E. Screening for enteropathogenic Escherichia coli in infants with diarrhea
by the fluorescent-actin staining test. Infect. Immun., 59, 365-371, 1991.
KNUTTON, S., 1994. Attaching and effacing Escherichia coli. In: Gyles C.L. (Ed.),
Escherichia coli in DomesticAnimals and Humans. CAB International, Wallingford,
UK, pp. 567±591.
KNUTTON, S.; ROSENSHINE, I.; PALLEN, M.J.; NISAN; NEVES, B.C.; BAIN, C.;
WOLFF, C.; DOUGAN, G.; FRANKEL, G. A novel EspA-associated surface organelle
of enteropathogenic Escherichia coli involved in protein translocation into epithelial
cells. EMBO. 17:2166-2176, 1998.
18
KRAUSE, G., BEUTIN, L, ZIMMERMMAN. Investigation of domestic animals and
pets as a reservoir for intimin- (eae) gene positive Escherichia coli types. Vet.
Microbiol., 106, 87-95, 2005.
KRESSE, A.U., ROHDE, M., GUZMAN, C.A. The EspD protein of enterohemorrhagic
Escherichia coli is required for the formation of bacterial surface appendages and is
incorporated the cytoplasmic membranes of target cells. Infect. Immun., 67, 4834-4842,
1999.
LAWRENCE, J. G. Y H. OCHMAN. 1998. Molecular archaeology of the Escherichia
coli genome. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 9413-9417.
LEOMIL, L., PESTANA DE CASTRO, A. F., KRAUSE, G., SCHMIDT, H.,BEUTIN,
L. Characterization of two major groups of diarrheagenicEscherichia coli O26 strains
which are globally spread in human patients and domestic animals of different species
FEMS Microbiology Letters 249 (2005) 335–342
LEVIN, B. R. 1981. Periodic selection, infectious gene exchange and the genetic
structure of E. coli populations. Genetics 99:1-23.
LOGAN, N. A. 1994. Bacterial systematics. Blackwell scientific publications, Oxford,
263pp.
MAC GRAW, E. A., J. LI, R. K. SELANDER Y T. S. WHITTAM. 1999. Molecular
evolution and mosaic structure of a, b and g intimins of pathogenic Escherichia coli.
Mol. Evol. Biol. 16: 12-22.
MAINIL, J.Q., JACQUEMIN, E.R., KAECKENBEECK, A.E., POHL, P.H., 1993.
Association between the effacing (eae) gene and the shiga-like toxin-encoding genes in
Escherichia coli isolates from cattle. Am. J. Vet. Res. 54:1064±1068.
MARTIN, W. 1999. Mosaic bacterial chromosomes: a challenge en route to a tree of
genomes. BioEssay 21: 99-104.
19
MC DANIEL, T.K.; JARVIS, K.G.; DONNENBERG, M.S.; KAPER, J.B. A genetic
locus of enterocyte effacementt conserved among diverse enterobacterial pathogens.
Proc. Natl. Acad. Sci. 92:1664-1668, 1995.
MCDANIEL, T.K., KAPER, J.B. A cloned pathogenicity island from enteropathogenic
Escherichia coli confers the attaching and effacing phenotype on E. coli K-12. Mol.
Microbiol., 23, 399-407, 1997.
MCNAMARA, B.P., KOUTSOURIS, A., O’CONNELL, C.B., NOUGAYREDE, J.P.,
DONNENBERG, M.S., HECHT, G. Translocate EspF protein from enteropathogenic
Escherichia coli disrupts host intestinal barrier function. J. Clin. Invest., 107, 621-629,
2001.
MECSAS, J. Y E. J. STRAUSS. 1996. Molecular mechanisms of bacterial virulence:
type III secretion and pathogenicity islands. Emerg. Inf. dis. 2: 271-288.
MOHAMMAD, A., PEIRIS, J.S.M., WIJEWANTA, E.A., MAHALINGAM, S.,
GUNASEKARA, G., 1985. Role of verocytogenic Escherichia coli in cattle and buffalo
calf diarrhoea. FEMS Microbiol. Lett. 26, 281±283.
MOHAMMAD, A., PEIRIS, J.S.M., WIJEWANTA, E.A., 1986. Serotypes of
verocytotoxigenic Escherichia coli isolated
from cattle and buffalo calf diarrhoea. FEMS Microbiol. Lett. 35, 261±265.
MOON, H.W.; WHIPP, S.C. ARGENZIO, R.A.; LEVINE, M.M.; GIANELLA, R.A.
Attaching and effacing activities of rabbit and humam enteropathogenic Escherichia
coli in pig and rabbit intestines. Infect. Immun. 41:1340-1351, 1983.
MOXLEY, R.A., FRANCIS, D.H., 1986. Natural and experimental infection with an
attaching and effacing strain of Escherichia coli in calves. Infect. Immun. 53, 339±346.
MUSSER, J. M., S. J. BARENKAMP, D. M. GRANOFF, Y R. K. SELANDER. 1986.
Genetic relationships of serologically nontypable and serotype b strains of Haemophilus
influenzae. Infect. Immun. 52:183-191.
20
NAKAZATO, G., GYLES, C., ZIEBELL, K., KELLER, R., TRABULSI, L.R.,
GOMES, T.A., IRINO, K., DA SILVEIRA, W.D., PESTANA DE CASTRO, A.F.,
2004. Attaching and effacing Escherichia coli isolated from dogs in Brazil:
characteristics and serotypic relationship to human enteropathogenic E. coli (EPEC).
Vet. Microbiol. 101,269–277.
NATARO, J.P. & KAPER, J.B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin. Microbiol. Rev.
11:142-201, 1998.
NEIDHARDT, F. C., J. L. INGRAHAM., K. B. LOW, B. MAGASANIK, M.
SCHAECHTER Y H. E. UMBARGER (eds.). 1987. Escherichia coli and Salmonella
typhimurium: cellular and molecular biology. American Society for Microbiology,
Washington, D.C., EUA.
NEIDHARDT, F. C., R. CURTISS, J. L. INGRAHAM., E. C. C. LIN, K. B. LOW, B.
MAGASANIK, W. S. REZNIKOFF, M. RILEY, M. SCHAECHTER Y H. E.
UMBARGER (eds.). 1996. Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular
biology. American Society for Microbiology, Washington, D.C., EUA.
OSWALD, E., SCHMIDT, H., MORABITO, S., KARCH, H., MARCHÉS, O.,
CAPRIOLI, O. Typing of intimin genes in human and animal enterohemorrhagic
Escherichia coli: characterization of a new intimin variant. Infect. Immun., 68, 64-71,
2000.
PARKHILL J., M, ACHTMAN K.D JAMES, S.D. BENTLEY, C. CHURCHER, S.R.
KLEE, G. MORELLI, D. BASHAM, D. BROWN, T. CHILLINGWORTH, R.M.
DAVIES, P. DAVIS, K. DEVLIN, T. FELTWELL, N. HAMLIN, S. HOLROYD, K.
JAGELS, S. LEATHER, S. MOULE, K. MUNGALL, M.A. QUAIL, M.A.
RAJANDREAM, K.M. RUTHERFORD, M. SIMMONDS, J. SKELTON, S.
WHITEHEAD, B.G. SPRATT Y B.G. BARRELL. 2000. Complete DNA sequence of a
serogroup A strain of Neisseria meningitidis Z2491. Nature 404:502-506.
21
PATON, J. C. & PATON , A. W. Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producing
Escherichia coli infections. Clin. Microbiol. Rev., 11: 450-479, 1998.
PEARSON, G.R., BAZELEY, K.J., JONES, J.R., GUNNING, R.F., GREEN,
M.J., COOKSON, A., WOODWARD, M.J., 1999. Attaching and effacing lesions in the
large intestine of an eight-month-old heifer associated with Escherichia coli O26
infection in a group of animals with dysentery. Vet. Rec. 145, 370–373.
PELAYO, J.S., NUNES, E.B., SARIDAKIS, H.O., IRINO, K. Genotypic and
phenotypic characterization of attaching and effacing Escherichia coli (AEEC) isolated
from children with and without diarrhea in Londrina, Brazil. J. Med. Microbiol., 52,
499-504, 2003.
PERNA, N. T., G. F. MAYHEW, G. POSFAL, S. ELLIOT, M. S. DONNENBERG, J.
KAPER, Y F. R. BLATTNER. 1998. Molecular evolution of a pathogenic island from
enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Infec. and Inmun. 66:3810-3817.
POHL, P., OSWALD, E., VAN MUYLEM, K., JACQUWMIN, E., LINTERMANS, P.,
MAINIL, J. Escherichia coli producing CNF1 and CNF2 cytotoxins in animals with
different disorders. Vet. Res., 24, 311-315, 1993.
POSPISCHIL, A., MAINIL, J.G., BALJER, G., MOON, H.W., 1987. Attaching and
effacing bacteria in the intestine of calves with diarrhea. Vet. Pathol. 24, 330±334.
RAMACHANDRAN, V., BRETT , K., HORNITZKY , M. A., DOWTON, M.,
BETTELHEIM, K. Distribution of Intimin Subtypes among Escherichia coli Isolates
from Ruminant and Human Sources Mark J. Walker,2 and Steven P. Djordjevic1*
Journal of clinical microbiology, Nov. 2003, p. 5022–5032
REGUA-MANGIA, A.H., GOMES, T.A., VIEIRA, M.A., ANDRADE, J.R., IRINO,
K., TEIXEIRA, L.M., 2004. Frequency and characteristics ofdiarrhoeagenic Escherichia
coli strains isolated from children with and without diarrhoea in Rio de Janeiro. Brazil.
J. Infect. 48, 161–167.
22
RILEY, L.W., S.T., GUNZBURG, N.G., TORNIEPORTH. Identification of
enteropathogenic Escherichia coli by PCR-based detection of the bundle-forming pilus
gene. J. Clin. Microbiol., 33, 1375-1377, 1995.
ROBINS-BROWNE, R.M., TOKHI, A.M., ADAMS, L.M., BENNETT-WOOD, V.,
MOISIDIS, A.V., KREJANY, E.O., O’GORMAN, L.E. Adherence characteristics of
attaching and effacing strains of Escherichia coli from rabbits. Infect. Immun., 62,
1584-1592, 1994.
ROCHA, M. 1999. Plásmidos en Escherichia coli y su importancia en la evolución de la
patogénesis. Tesis de maestría. Facultad de Ciencias, UNAM. 69pp.
ROSENSHINE, I. M. S. DONNENBERG, J. B. KAPER Y B. B. FINLAY. 1992.
Signal transduction between enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and epithelial
cells: EPEC induces tyrosine phosphorylation of host cell proteins to initiate
cytoskeletal rearrangement and bacterial uptake. EMBO J 11(10):3551-3560.
ROSENSHINE, I.; RUSCHKOWSKI,. S.; STEIN, M.; REINSCHEID, D.; MILLS, S.
D. & FINLAY, B. B. A pathogenic bacterium triggers epithelial signals to form a
functional bacterial receptor that mediates actin pseudopod formation. EMBO J., 13:
2613-2624, 1996.
ROTHBAUM, R., MCADAMS, A.J., GIANELLA, R., PARTIN, J.C. A
clinicopathologic study of enterocyte-adherent Escherichia coli: a cause of protracted
diarrhea in infants. Gastroenterology, 83, 441-454, 1982.
SANCHÉZ, S., ROPMECIN, P., GUACHALLA, L. M., IÑIGUEZ, V. Caracterizacion
geno-fenotipica de aislados de Escherichia coli AEEC de pacientes pediátricos con
proceses diarreicos infecciosos en la ciudad de La Paz: implicancias para el dizgnóstico
y epidemiología de las enfermedades diarreicas agudas – Revista Sociedad boliviana de
Pediatría vol.43, n°3, 2004.
23
SARIDAKIS, H.O., EL GARED, S.A., VIDOTTO, M.C., GUTH, B.E.C., 1997.
Virulence properties of Escherichia coli strains belonging to enteropathogenic (EPEC)
serogroups isolated from calves with diarrhea. Vet.Microbiol. 54, 145±153.
SCHOONDERWOERD, M., CLARKE, R.C., VAN DREUMEL, A.A., RAWLUK,
S.A., 1988. Colitis in calves: Natural and experimental infection with a verotoxin-
producing strain of Escherichia coli O111:NM. Can. J. Vet. Res.52, 484±487.
SCOTLAND, S.M., WILLSHAW, G.A., SMITH, H.R., ROWE, B. Properties of strains
of Escherichia coli O26:H11 in relation to their enteropathogenic or enterohemorrhagic
classification. J. Infect. Dis., 162, 1069-1074, 1990.
SHERWOOD, D., SNODGRASS, D.R., O'BRIEN, A.D., 1985. Shiga-like toxin
production from Escherichia coli associated with calf diarrhea. Vet. Record. 116, 217.
SOUZA, V. M. ROCHA, A. VALERA Y L.E. EGUIARTE. 1999. Genetic structure of
natural populations of Escherichia coli in wild hosts on different continents. App. and
Environm. Microbiol. 65: 3373-3385.
SPERANDIO, V., KAPER, J.B., BORTOLINI, M.R., NEVES, B.C., KELLER, R.,
TRABULSI, L.R. Characterization of the locus of enterocyte effacement (LEE) in
different enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and Shiga-toxin producing
Escherichia coli. FEMS Microbiol. Letters, 164, 133-139, 1998.
STEPHAN R, BOREL N, ZWEIFEL C, BLANCO M, BLANCO JE: First isolation
and further characterization of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) O157:H45
strains from cattle. BMC Microbiol 2004, 4:10.
STONE, K.D., ZHANG, H.Z., CARLSON, L.K., DONNENBERG, M.S., 1996. A
cluster of fourteen genes from enteropathogenic Escherichia coli is sufficient for the
biogenesis of a type IV pilus Mol Microbiol. 20, 325-337.
24
SYNGE, B.A., HOPKINS, G.F., 1992. Verotoxigenic Escherichia coli O.157 in
Scottish calves. Vet. Record 130, 583.262 R.E. Holland et al. / Veterinary Microbiology
66 (1999) 251±263
TARR, C.L., WHITTAM, T.S. Molecular evolution of the intimin gene in O111 clones
of enteropathogenic Escherichia coli. J. Bacteriol., 184, 476-487, 2002.
TAYLOR, K.A., O’CONNEL, C.B., LUTHER, P.W., DONNENBERG, M.S. The
EspB protein of enteropathogenic Escherichia coli is targeted to the cytoplasm of
infected HeLa cells. Infect. Immun., 66, 5501-5507, 1998.
TRABULSI, L.R.; KELLER, R.; GOMES, T.A.T. Typical and atypical
enteropathogenic Escherichia coli. Emerg. Infect. Dis. 8:508-513, 2002.
TRABULSI, L.R., MARTINEZ, M.B., CAMPOS, L.C., ALTERTHUM, F.,
GOMPERTZ, O.F., RÁCZ, M.L. Microbiologia. Editora Atheneu, 4
º
Ed., 269-310,
2004.
VIEIRA, M.A.M., ANDRADE, J.R.C., TRABULSI, L.R., ROSA, A.C.P., DIAS,
A.M.G., RAMOS, S.R.T.S. FRANKEL, G., GOMES, T.A.T. Phenotypic and genotypic
characteristics of Escherichia coli strains of non-enteropathogenic E. coli (EPEC)
serogroups that carry eae and lack the EPEC adherence factor and shiga-toxin DNA
probe sequences. J. Infect. Dis., 183, 762-772, 2001.
WACHTER, C., BEINKE, C., MATTES, M., SCHMIDT, M.A. Insertion of EspD into
epithelial target cell membranes by infectin enteropathogenic Escherichia coli. Mol.
Microbiol.,31, 1695-1707, 1999.
WALES A. D., WOODWARD M. J., PEARSON, G. R. Attaching-effacing Bacteria in
Animals. J. Comp. Path. 2005, Vol. 132, 1–26
WARAWA, J., KENNY, B. Phosphoserine modification of the enteropathogenic E. coli
Tir molecule is required to trigger conformational and efficient pedestal elongation.
Mol. Microbiol., In press, 2001.
25
WIELER, L.H., BAUERFEIND, R., BALJER, G., 1992. Characterization of shiga-like
toxin producing Escherichia coli (SLTEC) isolated from calves with and without
diarrhea. Zbl. Bakt. 276, 243±253.
WIELER, L.H., VIELER, E., ERPENSTEIN, C., SCHLAPP, T., STEINRUCK, H.,
BAUERFEIND, R., BYOMI, A., BALJER, G., 1996.Shiga toxin-producing
Escherichia coli strains from bovines: association of adhesion with carriage of eae and
other genes. J. Clin. Microbiol. 34, 2980±2984.
WIELER, L.H., MCDANIEL, T.K., WHITTAM, T.S., KAPER, J.B. Insertion site of
locus of enterocyte effacement in enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia
coli differs in relation to the clonal phylogey of strains. FEMS Microbiol. Letters, 156,
49-53, 1997.
WOLFF, C., NISAN, I., HANSKI, E., FRANKEL, G., ROSENSHINE, I. Protein
translocation into host epithelial cells by infecting enteropathogenic Escherichia coli.
Mol. Microbiol., 28, 143-155, 1998.
WRAY, C., MCLAREN, I., PEARSON, G.R., 1989. Occurrence of `attaching and
effacing' lesions in the small intestine of calves experimentally infected with bovine
isolates of verocytotoxic E. coli. Vet. Record 125, 365±368.R.E. Holland et al. /
Veterinary Microbiology 66 (1999) 251±263 263
YU, J. & KAPER, J. B. Cloning and characterization of the eae gene of
enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Mol. Microbiol., 6: 411-417, 1992.
ZHANG, W.L., KOHLER, B., OSWALD, E., BEUTIN, L., KARCH, H., MORABITO,
S., CAPRIOLI, A., SUERBAUM, S., SCHMIDT, H. Genetic diversity of intimin genes
of attaching and effacing Escherichia coli strains. J. Clin. Microbiol., 40, 4486-4492,
2002.
26
ZHU, C., HAREL, J., JACQUES, M., DESAUTELS, C., DONNENBERG, M.S.,
BEAUDRY, M., FAIRBROTHER, J.M. Virulence properties and attaching –effacing
activity of Escherichia coli O45 from swine postweaning diarrhea. Infect. Immun., 62,
4153-4159, 1994.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo