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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DOENÇAS INFECCIOSAS
Ana Cláudia Carvalho Gouveia
AVALIAÇÃO DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE PARA
IDENTIFICAÇÃO DO COMPLEXO Mycobacterium tuberculosis EM
CULTURA DE ESCARRO NO MEIO BACTEC 12B
Vitória
2006
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ANA CLÁUDIA CARVALHO GOUVEIA
AVALIAÇÃO DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE PARA
IDENTIFICAÇÃO DO COMPLEXO
Mycobacterium tuberculosis
EM
CULTURA DE ESCARRO NO MEIO BACTEC 12B
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação
em Doenças Infecciosas do Centro de Ciências da Saúde
da Universidade Federal do Espírito Santo, como requisito
parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências -
Patologia das Doenças Infecciosas.
Orientador: Prof. Dr. Moisés Palaci
Co-orientadora: Prof
a
. Solange A. Vinhas
Apoio: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
- CAPES –
Vitória
2006
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Dados Internacionais de Catalogação-na-publicação (CIP)
(Biblioteca Central da Universidade Federal do Espírito Santo, ES, Brasil)
Gouveia, Ana Cláudia Carvalho, 1969-
G719a Avaliação da reação em cadeia da polimerase para identificação do
complexo Mycobacterium tuberculosis em cultura de escarro no meio
BACTEC 12B / Ana Cláudia Carvalho Gouveia. – 2006.
94 f. : il.
Orientador: Moisés Palaci.
Co-Orientadora: Solange A. Vinhas.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Espírito Santo,
Centro de Ciências da Saúde.
1. Tuberculose. 2. Mycobacterium tuberculosis. 3. Reação em cadeia
de polimerase. 4. Identificação. I. Palaci, Moisés. II. Vinhas, Solange A.
III. Universidade Federal do Espírito Santo. Centro de Ciências da Saúde.
IV. Título.
CDU: 61
A Deus,
Pela bênção da vida
E da capacidade de pensar.
Aos meus pais Hélio e Catharina,
Fontes da minha vida e da minha formação ética.
Aos meus irmãos,
Por crescermos juntos e pelos
momentos de alegria.
Ao amor de minha vida,
por me fazer feliz,
Zé Flávio.
E às minhas maiores riquezas,
Isabela e Matheus,
para que aprendam que nem só de pão vive o homem,
mas de sonhos e esperanças.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Moisés Palaci, pela disposição para ensinar e, sobretudo, pela paciência
e compreensão no decorrer desta jornada.
À Prof
a
. Solange Alves Vinhas, por seu estímulo e ajuda durante o desenvolvimento
deste trabalho.
Às biólogas Renata L. Peres e Fabíola K. C. Ribeiro, e às farmacêuticas-bioquímicas
Tatiana R. Có e Elenice M. Lemos, pelo estímulo constante e pelo apoio técnico e
científico.
À Marcela, minha amiga incondicional, por sua amizade, seu apoio e estímulo,
fundamentais nos momentos mais difíceis.
Às amigas do Laboratório de Imunologia do Núcleo de Doenças Infecciosas da
UFES: Eneida, Carlinha e Valéria, pelo apoio, fraterna convivência e por ter me
acolhido com tanto carinho.
Ao Prof. Dr. Fausto Edmundo. Lima. Pereira, pelos inestimáveis ensinamentos
transmitidos e pela determinação incansável de ensinar.
A todos os professores do curso de pós-graduação, pelo aprendizado proporcionado.
Aos amigos e colegas do mestrado, pelos momentos de convivência enriquecedores.
Aos colegas do NDI João Batista P. Silva, Hildete N. Silva, Maria Guimarães, Rafael
Vieira, Gustavo Morais e Fátima A. Pereira, pela amizade e disposição em me ajudar.
Ao Prof. Dr. Reynaldo Dietze, por nos acolher no Núcleo de Doenças Infecciosas.
Aos pacientes com tuberculose que, indiretamente, participaram desta pesquisa e
que vivem com coragem os dias de hoje, sonhando com as esperanças do amanhã.
Aos meus pais Catharina e Hélio, pela dedicação, esforço e determinação na nossa
educação. Obrigada por todas as oportunidades e apoio que me deram. É de vocês
minha vitória.
Aos meus irmãos, cunhados e sobrinhos, que torceram por mim e me incentivaram
na busca deste ideal.
Ao meu marido José Flávio e meus filhos Isabela e Matheus, obrigada pela
paciência e compreensão durante os períodos de stress. Vocês foram fundamentais
para que eu chegasse até aqui.
À CAPES – Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pelo
suporte financeiro que possibilitou a realização desta dissertação.
Depois de escalar uma montanha muito alta,
descobrimos que há muitas outras montanhas por escalar.
Nelson Mandela
RESUMO
A utilização de métodos laboratoriais rápidos para a detecção e identificação do
Mycobacterium tuberculosis é crucial para a prevenção e o controle da tuberculose.
Embora técnicas baseadas na amplificação de ácidos nucléicos apresentem alta
sensibilidade e reduzam consideravelmente o tempo de identificação deste bacilo,
há uma grande carência de estudos sobre a avaliação de primers específicos para
detecção de M. tuberculosis em meios de culturas líquido (BACTEC 12B e ou MGIT)
em condições de rotina diagnóstica. Diante deste fato, propusemo-nos a avaliar a
reação em cadeia da polimerase utilizando um par de primers específico para a
IS6110 (PCR IS6110), para detecção do Complexo Mycobacterium tuberculosis em
culturas em meios BACTEC 12B. Um total de 107 amostras de escarro foi
processado e inoculado em meio de Ogawa e BACTEC 12B. Uma alíquota dos
cultivos em meio 12B que apresentaram índice de crescimento (IC) igual ou maior a
30 foi submetida à amplificação através da PCR IS6110. Os resultados do método
molecular foram comparados à identificação obtida através de métodos fenotípicos.
Das 107 culturas avaliadas, 90 foram identificadas através dos métodos fenotípico e
molecular como M. tuberculosis, e todas as culturas (n = 8) com crescimento de
outras micobactérias que não M. tuberculosis apresentaram resultado de PCR
negativo, com exceção de uma amostra. A identificação fenotípica não foi possível
em dois cultivos que apresentaram crescimento concomitante de micobactérias e
microrganismos contaminantes, sendo que estas duas culturas apresentaram
resultado negativo de PCR. Os resultados das demais sete culturas foram negativos
por ambos os métodos. A identificação molecular do M. tuberculosis foi
especialmente relevante em 44 culturas provenientes de escarros que apresentaram
baciloscopia negativa e em três culturas de BACTEC 12B contaminadas, sendo que,
em média, a identificação ocorreu 5,5 e 16 dias, respectivamente, mais rápido
quando comparada à identificação fenotípica. Os resultados obtidos em nosso
estudo demonstram a eficácia da PCR IS6110 na identificação rápida de M.
tuberculosis em cultivos de meios 12B (100% de sensibilidade e 87,5% de
especificidade), e evidenciam a relevância da técnica no diagnóstico precoce da
tuberculose pulmonar, sobretudo em pacientes paucibacilíferos.
ABSTRACT
Use of the most rapid and reliable laboratory tests for Mycobacterium tuberculosis
detection and identification is important for tuberculosis (TB) control. Diagnostic
techniques based on molecular biology methods are able to dramatically reduce the
time of detection as well as increase the sensitivity for detecting the bacilli. A
polymerase chain reaction DNA amplification method for direct detection of
Mycobacterium tuberculosis Complex (PCR IS6110) in BACTEC 12B broth cultures
was evaluated. A total of 107 sputum samples were processed by standard methods,
and then inoculated into Ogawa slants and BACTEC 12B vials. The PCR assay was
used on BACTEC 12B broth cultures with a growth index (GI) of equal to or greater
than 30. Molecular results were compared to those obtained by phenotypic
identification methods. Of the 107 broth cultures evaluated, 90 were all culture and
PCR positive for M. tuberculosis. Except for one, all cultures (n = 8) which grew
mycobacteria other than M. tuberculosis were PCR negative. In two cultures which
grew both mycobacteria and other organisms than acid-fast bacilli a phenotypic
identification was not possible, and both of them were PCR negative. The remaining
seven cultures that did not contain mycobacteria were PCR negative. Of particular
interest were all 44 cultures positive from smear-negative sputum specimens and
three contaminated BACTEC 12B broth cultures yielding mycobacterial growth which
a M. tuberculosis Complex, which were successfully identified by PCR, resulting in a
mean time to identify M. tuberculosis of 5,5 and 16 days before phenotypic
identification, respectively. In light of an overall sensitivity and specificity of 100%
and 87,5%, respectively, coupled with the ability to identify the bacilli days or weeks
before other methods can be applied, we conclude that PCR might prove to be a
rapid alternative for identification of M. tuberculosis Complex in culture, even in the
context of paucibacillary patients.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATCC do inglês “American Type Culture Collection’
BAAR bacilo álcool-ácido resistente
BCG bacilo de Calmette-Guérin
CDC do inglês “Centers for Disease Control and Prevention”
ºC grau Celsius
dATP desoxiadenosina trifosfato
dCTP desoxicitidina trifosfato
dGTP desoxiguanosina trifosfato
dTTP desoxitimidina trifosfato
DNA ácido desoxiribonucléico
DTT dithiotreitol
et al. e colaboradores
X g força centrífuga
h horas
hab habitantes
HIV do inglês “Human Immunodeficiency Vírus” ou Vírus da
Imunodeficiência Humana
IC índice de crescimento microbiano
IS6B primer 5’ GGC TGT GGG TAG CAG ACC 3’
IS7B primer 5’ CGG GTC CAG ATG GCT TGC 3’
Kb kilobase
kDa kilodalton
MDR-TB do inglês “Multidrug Resistant Tuberculosis” ou tuberculose
multirresistente
MgCl
2
cloreto de magnésio
min minutos
mL mililitros
mM milimolar
µg/mL microgramas por microlitro
µL microlitros
µm micromilímetros
MS Ministério da Saúde
MTB Mycobacterium tuberculosis
NALC-NaOH N-acetil-L-cisteína com hidróxido de sódio
NAP ρ-nitro-α-acetilamino-β-hidroxipropriofenona
NTM micobactéria não causadora de tuberculose
OMS Organização Mundial da Saúde
O
2
oxigênio
PANTA polimixina B, anfotericina B, ácido nalidíxico, trimetoprim e
azlocilina
PAS placa de agar sangue
pb pares de base
PBS solução de tampão fosfato
PCR do inglês “Polymerase Chain Reaction” ou Reação em
Cadeia da Polimerase
pmol picomolar
PNB ácido ρ-nitrobenzóico
RNA ácido ribonucléico
seg segundos
SVS Secretaria de Vigilância em Saúde
SIDA Sindrome de Imunodeficiência Adquirida
SINAM Sistema de Informação de Agravos de Notificação
Taq bactéria termofílica Thermus aquaticus
TCH ácido 2-tiofenocarboxílico
U unidades
UFC Unidade Formadora de Colônia
UFES Universidade Federal do Espírito Santo
ZN Ziehl-Neelsen
14
C radioisótopo do carbono
14
CO
2
dióxido de carbono radioativo
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Diferenciação entre o Complexo M. tuberculosis e
micobactérias não causadoras de tuberculose
(NTM) .................................................................................. 30
Tabela 2
Resultados da reação em cadeia da polimerase
(PCR IS6110) em relação aos microrganismos isolados e
identificados, através dos métodos fenotípicos, no meio de
cultura BACTEC 12B ...................................................... 55
Tabela 3 Resultados da reação em cadeia da polimerase
(PCR IS6110) em relação ao exame microscópico e
índice de crescimento (IC) no meio de cultura
BACTEC 12B .................................................................... 56
Tabela 4
Comparação entre a média de tempo (em dias) para a
identificação do M. tuberculosis pelos métodos
molecular e fenotípico (NAP) ............................................. 58
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estimativa da taxa incidência de tuberculose em 2003 ....... 20
Figura 2
Algoritmo do processamento das amostras de
escarro analisadas .............................................................. 45
Figura 3
Seqüência de inserção IS6110, de 1,35kb, presente
no genoma de membros do Complexo M. tuberculosis ....... 46
Figura 4
Eletroforese em gel de poliacrilamida a 4% dos
produtos amplificados pela reação em cadeia da
polimerase ........................................................................... 52
Figura 5 Resultado da avaliação da especificidade dos primers
na amplificação do fragmento de 123pb do IS6110.............. 53
Figura 6 Resultado da reação de amplificação do DNA de
M. tuberculosis em meios 12B.............................................. 54
GRÁFICO
Gráfico 1 Resultados de baciloscopia dos escarros
submetidos à cultura de micobactérias
no sistema BACTEC 460 TB .......................................... 59
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA
AGRADECIMENTOS
RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE GRÁFICO
SUMÁRIO
1. Introdução .............................................................................................. 18
1.1. Situação epidemiológica da tuberculose………………………… 19
1.2. Patogenia e transmissão da tuberculose……………………….. 21
1.3. O agente etiológico………………………….…………………..... 22
1.4. Diagnóstico da tuberculose pulmonar………..……….………… 23
1.4.1. Diagnóstico clínico………………………………………....... 23
1.4.2. Diagnóstico radiológico…………………………………....... 24
1.4.3. Diagnóstico microbiológico………………………………..... 25
1.4.3.1. Baciloscopia………………………………………....... 25
1.4.3.2. Cultura……………………………………………......... 26
1.4.3.3. Identificação fenotípica…………………………......... 29
1.4.4. Diagnóstico molecular……………………………………..... 31
1.4.4.1. Métodos de amplificação de ácidos nucléicos a
partir de espécimes clínicos ……………………........ 31
1.4.4.2. Métodos moleculares de identificação a partir de
do cultivo de micobactérias………………………....... 33
2. Objetivos ................……………………………………………………........ 36
2.1 Objetivo geral............................................................................. 37
2.2 Objetivos específicos................................................................. 37
3. Material e métodos……………………………………………………......... 38
3.1. Caracterização das amostras…………….................................. 39
3.2. Coleta das amostras ………………………………….................. 39
3.3. Exames laboratoriais …………………....................................... 40
3.3.1. Digestão e descontaminação das amostras…………....... 40
3.3.2. Exame microscópico
dos esfregaços de escarro
(baciloscopia)................................................................ 40
3.3.3. Cultura…………................................................................ 41
3.3.3.1 Cultura em meio de Ogawa...................................... 41
3.3.3.2 Cultura em meio BACTEC 12B (sistema semi-
automatizado)........................................................... 41
3.3.3.2.1 Culturas com crescimento de
microrganismos (índice de crescimento
igual ou maior a 30)................................. 42
3.3.4. Identificação do Mycobacterium. tuberculosis
por métodos fenotípicos.................................................... 43
3.3.4.1 Aspéctos fenotípicos das colônias............................ 43
3.3.4.2
Inibição do crescimento bacteriano em
presença de ácido ρ- nitrobenzóico (PNB)
e ácido 2-tiofenocarboxílico (TCH)........................ 43
3.3.4.3
Inibição do crescimento bacteriano em
presença de
ρ-nitro-α-acetilamino-β-
hidroxipropriofenona (NAP)....................................... 44
3.3.4.4
Interpretação dos resultados fenotípicos.............. 44
3.3.5. Identificação do Complexo M. tuberculosis por método
molecular.......................................................................... 45
3.3.5.1 Extração do DNA. ...... ............................................. 45
3.3.5.2 Reação em cadeia da polimerase............................ 46
3.3.5.2.1 Primers.................................................... 46
3.3.5.2.2 Amplificação pela técnica de
PCR IS6110............................................ 47
3.3.5.2.3 Detecção do produto amplificado............ 47
3.3.5.3 Avaliação prévia da técnica de PCR IS6110 .......... 48
3.3.5.3.1 Avaliação da especificidade dos
primers ........................................... 48
3.3.5.3.2 Avaliação da capacidade da
PCR IS6110 em detectar
M. tuberculosis H37Ra em meios
BACTEC 12B com diferentes índices
de crescimento ..................................... 49
4. Resultados……………………………………………………………........... 50
4.1 Avaliação prévia da técnica de PCR IS6110................... ......... 51
4.1.1 Avaliação da especificidade dos primers........................... 51
4.1.2 Avaliação da capacidade da PCR IS6110 em detectar
M. tuberculosis H37Ra em meios BACTEC 12B com
diferentes índices de crescimento ................................. 53
4.2 Análise do desempenho da reação em cadeia da polimerase
(PCR IS6110) para identificação do M. tuberculosis a partir
de cultura de escarros em meios BACTEC 12B ...................... 54
5. Discussão……………………………………………………………............ 60
6. Conclusões…………………………………………………………….......... 74
7. Referências bibliográficas……………………………………………......... 76
I. Introdução
Introdução
________________________________________________________________________
19
1 INTRODUÇÃO
1.1 Situação Epidemiológica da Tuberculose
Dentre os longos anos de existência da tuberculose (TB), o último século foi
marcado por incontestáveis avanços científicos, objetivando o combate à doença.
Entretanto, nas últimas décadas, o mundo tem testemunhado o aumento do número
de novos casos e uma falha no controle da doença, manifestada pelo aparecimento
da tuberculose multirresistente às drogas (MDR-TB). Nos países em
desenvolvimento, a infecção pelo Mycobacterium tuberculosis é a segunda maior
causa de mortes por doença infecciosa em adultos, perdendo somente para a
infecção com o vírus da imunodeficiência humana - HIV (DYE, 2006; WHO, 1998).
A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que em 2004, em todo o mundo,
surgiram cerca de 8,9 milhões novos casos da doença, sendo que aproximadamente
1,7 milhões de mortes foram atribuídos à tuberculose. Cerca de cem milhões de
pessoas são infectadas com o bacilo a cada ano. Mais de 95% dos casos de TB
ocorrem nos países subdesenvolvidos, onde, entre 30 e 60 % dos adultos estão
infectados (WHO, 2006a; DYE, 1999). Destes, entre 8 e 10 milhões desenvolverão a
doença durante toda a vida, sendo que cerca da metade apresentará as formas
contagiantes. Em algumas partes do mundo, a tuberculose é epidêmica,
principalmente devido à coinfecção pelo HIV e o aumento da multirresistência às
drogas, fatores que contribuem para a disseminação da doença (DYE, 2006;
CORBETT, 2003; HARRIES, 2001).
Introdução
________________________________________________________________________
20
Figura 1 - Estimativa da taxa incidência de tuberculose em 2003.
Fonte: WHO, 2006
Nas Américas, entre 1994 e 2004 foram notificados, anualmente, entre 230.000 e
260.000 casos de tuberculose, com notáveis diferenças entre as regiões mais
desenvolvidas e os países em desenvolvimento (WHO, 2006a). Felizmente, entre
1994 e 2003, a incidência da doença em alguns países da região mostrou uma
tendência de queda em torno de 1,6% ao ano, decorrente da implantação de
programas nacionais de controle à doença (DYE, 2006; WHO, 2006a).
O Brasil é o único país das Américas situado entre os 22 responsáveis por 80% dos
casos de tuberculose no mundo, ocupando a 16ª posição (WHO, 2006a). O
Ministério da Saúde estima uma prevalência de 58 casos / 100.000 hab, com cerca
de 50 milhões infectados e 111.000 casos novos anualmente. Segundo dados do
Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN/MS), por ano, são
notificados 85 mil novos casos, correspondendo a uma taxa de incidência de 47,2 /
100.000 habitantes. A cada ano, a doença é responsável por cerca de 6 mil óbitos
no país e a região Sudeste apresenta, atualmente, o maior número de casos
notificados.
Introdução
________________________________________________________________________
21
Em 1999, o Espírito Santo ocupou o 2º lugar da região sudeste em incidência de
formas bacilíferas da doença (30,1 / 100.000 hab) (RUFFINO-NETO, 2001).
Segundo a Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS/MS), em 2003, a taxa de
incidência no Espírito Santo foi de 40,4 / 100.000 hab, sendo que os casos
bacilíferos corresponderam a 24,6 casos / 100.000 hab (BRASIL, 2005).
1.2 Patogenia e transmissão da tuberculose
A tuberculose é uma doença infecciosa causada pelo Mycobacterium tuberculosis
(M. tuberculosis), caracterizada por apresentar evolução crônica e comprometimento
dos pulmões e ou outros sítios extrapulmonares. Geralmente, os sinais e sintomas
da tuberculose pulmonar são os mesmos observados em outras doenças
respiratórias (tosse, febre e suores noturnos), sendo a extensão temporal destas
manifestações um dado indicativo da doença (GARAY, 2004).
Características relacionadas ao microrganismo, ao hospedeiro e às interações entre
ambos influenciam as manifestações clínicas da doença (STEWART et al., 2003;
RUSSELL, 2001). Em função da multiplicação lenta do M. tuberculosis, o processo
inflamatório é brando e a doença tem evolução crônica. Os sintomas tendem a ser
insidiosos, de intensidade crescente, podendo apresentar períodos de remissão
(BRASIL, 2002).
A doença pode se manifestar em qualquer tecido. No entanto, os pulmões
representam a principal via de entrada do bacilo e o local mais comum de
manifestação da doença. Menos de 10% de todos os casos da doença desenvolverá
tuberculose extrapulmonar, resultante da disseminação bacilar por via linfática e/ou
hematogênica, preferencialmente para locais com maior suprimento de oxigênio,
como cérebro, rins, ossos e linfonodos (GARAY, 2004).
A transmissão da tuberculose ocorre através da inalação de partículas contendo o M.
tuberculosis (
partículas-núcleo de Wells
), transmitidas através da tosse, espirro ou
fala de pessoas com TB pulmonar ou laríngea. Quando inalados, os bacilos chegam
Introdução
________________________________________________________________________
22
aos alvéolos pulmonares, onde originam a lesão primária da TB (ADLER & ROSE,
1996; HAAS & DES PREZ, 1990).
Vários fatores influenciam a transmissão da doença, como a quantidade de
partículas infecciosas liberadas pelo doente, através de aerossóis, o tempo de
contato com o indivíduo infectado, a viabilidade e a virulência do bacilo, além de
fatores relacionados ao ambiente (aglomeração, ventilação, umidade, luz solar). O
indivíduo com a forma pulmonar da doença cujo exame baciloscópico de escarro
apresente bacilos álcool-ácidos resistentes (baciloscopia positiva) é denominado
bacilífero
. Estes doentes eliminam grande quantidade de bacilos para o meio
exterior e são a principal fonte de infecção da tuberculose (LOUDON et al., 1969;
LOUDON et al., 1968).
1.3 O agente etiológico
Os bacilos que causam a tuberculose estão agrupados no Complexo Mycobacterium
tuberculosis, composto por M. tuberculosis, responsável pela maioria dos casos de
TB humana; M. bovis, causador da doença em gado e eventualmente pode
acometer outros tipos de animais, inclusive o homem; a cepa atenuada M. bovis
BCG (Bacilo Calmette-Guérin), utilizada para vacinação; M. africanum, um grupo
heterogêneo de isolados responsáveis por tuberculose na África (METCHOCK et al.,
1999); M. microti, um patógeno isolado com pouca freqüência, causador da doença
em imunocomprometidos (VAN SOOLINGEN et al., 1998); M. pinnipedii, isolado em
animais marinhos (COUSINS et al., 2003); e as subespécies recentemente
identificadas - M. tuberculosis subsp. caprae, encontrado principalmente em
caprinos (ARANAZ et al., 1999) e M. tuberculosis subsp. canetti, isolado na África e
na Europa (MILTGEN et al., 2002).
As micobactérias são bacilos retos ou ligeiramente curvos, com dimensões de 0.2 -
0.6 x 1.0 - 10 µm, imóveis, não esporulados, não encapsulados e aeróbios estritos
(METCHOCK et al., 1999). Estas bactérias diferem de outros gêneros bacterianos
em uma série de propriedades, algumas diretamente relacionadas com a quantidade
Introdução
________________________________________________________________________
23
e tipos de lipídeos presentes em sua parede celular. Aproximadamente 60% do peso
seco de sua parede são devidos a ácidos graxos (LEDERER et al., 1975;
ASSELINEAU & LEDERER, 1950), que formam uma barreira hidrofóbica que lhes
conferem uma resistência peculiar à dessecação, a diversos agentes químicos e
antibióticos e à descoloração por álcool e ácido, evidenciada pela técnica de
coloração de Ziehl-Neelsen (KENT & KUBICA, 1985). O M. tuberculosis tem um
tempo de geração longo, entre 15 e 22 horas. De acordo com o meio de cultura
empregado, podem ser necessárias até 8 semanas de incubação para a
visualização de colônias no meio de cultura (METCHOCK et al., 1999). Este
crescimento lento forma a base para a natureza crônica da infecção, com
diagnóstico microbiológico demorado e de tratamento prolongado (KAUFMANN,
2001).
1.4 Diagnóstico da tuberculose pulmonar
1.4.1 Diagnóstico clínico
Dependendo da evolução da doença, o paciente pode ser assintomático ou
manifestar-se clinicamente com tosse, febre, perda de peso, sudorese noturna e
inapetência. A febre apresenta uma variação ao longo do dia. Geralmente, é baixa
ou normal durante a manhã, aumentando gradativamente até o final da tarde. À
noite, a temperatura volta ao normal e é acompanhada de sudorese. A tosse está
presente na maioria dos casos, sendo inicialmente seca. Conforme a doença
progride, evolui para uma expectoração purulenta. Ocasionalmente, em função da
extensão do processo patológico, o escarro pode estar acompanhado de sangue
(hemoptise), o que evidencia um comprometimento de vasos pulmonares,
principalmente de artérias. O volume do sangramento é variável e não indica
necessariamente uma tuberculose ativa (GARAY, 2004). A tosse com expectoração
por mais de três semanas é um sinal importante, e caracteriza o
paciente
sintomático respiratório (BRASIL, 2002).
Introdução
________________________________________________________________________
24
Todos esses sintomas e sinais são inespecíficos, podendo estar relacionados a
doenças coexistentes, o que dificulta o diagnóstico e retarda o tratamento,
principalmente em coinfectados com o HIV (AMERICAN THORACIC SOCIETY,
2000).
1.4.2 Diagnóstico radiológico
A maioria dos pacientes com tuberculose pulmonar ativa apresenta alterações
radiográficas sugestivas (GARAY, 2004; BRASIL, 2002). Na TB primária, o processo
infeccioso recente é visto geralmente como um infiltrado no lobo médio ou inferior do
pulmão (MCGUINNESS & RUBINOWITZ, 2004; AMERICAN THORACIC SOCIETY,
2000). A imagem radiográfica sugestiva é o aspecto bipolar, de aumento hilar, em
decorrência da hipertrofia dos linfonodos regionais, conseqüência da disseminação
linfática do foco de Ghon. A principal alteração parenquimatosa é representada por
uma opacidade, com limites mal definidos, freqüentemente associada com
adenopatia hilar ipsi-lateral. Raramente, os linfonodos aumentados podem comprimir
os brônquios, dando origem a atelectasias (GARAY, 2004). Com a progressão da
doença, imagens cavitárias podem surgir, indicando uma forma mais grave. As
lesões podem regredir espontaneamente, resultando em seqüelas como alterações
parenquimatosas calcificadas ou não. Os principais linfonodos acometidos são os da
região paratraqueal e hilar direita (BRASIL, 2002).
A apresentação radiográfica mais comum da reativação de uma infecção latente é a
presença de infiltrados nos segmentos apicais dos lobos inferiores ou dorsais dos
lobos superiores, em um ou ambos os pulmões, acompanhados de um processo
inflamatório de tamanho variável (BRASIL, 2002; AMERICAN THORACIC SOCIETY,
2000). A lesão inicial caracteriza-se por pequenas opacidades nodulares, que
tendem a envolver todo o lobo. Conforme a lesão progride, ocorre caseificação de
áreas mais ou menos extensas, detectada pelo aparecimento de imagens cavitárias.
As cavidades podem ser únicas ou múltiplas, têm parede espessa e representam o
achado radiográfico mais importante nessa forma da doença. Frequentemente, a
formação de cavidades causa a disseminação brônquica dos bacilos, manifestada
Introdução
________________________________________________________________________
25
por opacidades acinares, denominadas lesões satélites, presentes na radiografia de
50% dos casos. A presença de calcificação no infiltrado não significa
necessariamente doença inativa (GARAY, 2004).
1.4.3 Diagnóstico microbiológico
Atualmente, a confirmação do diagnóstico de tuberculose é feita somente através do
exame bacteriológico, que consiste na detecção, isolamento e identificação da
micobactéria a partir de espécimes clínicos (AMERICAN THORACIC SOCIETY,
2000; TENOVER et al., 1993). Os métodos convencionais incluem a baciloscopia e a
cultura, que consiste no isolamento do microrganismo a partir de espécimes clínicos.
A baciloscopia apresenta baixa sensibilidade, porém, é uma técnica simples, de
baixo custo e rápida. A cultura é indispensável para a identificação do bacilo e o
estudo do padrão de sensibilidade aos quimioterápicos. No entanto, a maior
desvantagem do cultivo do patógeno é a demora na obtenção de resultados
(DROBNIEWSKI et al., 2003).
1.4.3.1 Baciloscopia
A detecção microscópica de bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) é a primeira
evidência bacteriológica da presença de micobactérias no material clínico analisado.
A baciloscopia fornece uma estimativa do número de bacilos eliminados pelo doente
e é uma ferramenta importante no controle da transmissão da doença
(WATTERSON & DROBNIEWSKI, 2000; AMERICAN THORACIC SOCIETY, 2000).
As técnicas utilizadas para corar o bacilo baseiam-se na capacidade de sua parede
celular reter o corante, resistindo à descoloração com uma solução de ácido
clorídrico em álcool. O método de Ziehl-Neelsen é o mais usado e, juntamente com
a técnica de Kinyoun, utiliza o corante carbol-fucsina. Essas técnicas devem ser
visualizadas em objetiva de grande aumento, sendo necessário o exame mínimo de
300 campos microscópicos, antes da pesquisa de BAAR ser considerada negativa
(KENT & KUBICA, 1985). Métodos que utilizam corante fluorescente, como
Introdução
________________________________________________________________________
26
auramina-rodamina ou auramina O, podem ser examinados com objetiva de menor
aumento, permitindo a observação de um número maior de campos microscópicos
(METCHOCK et al., 1999). Assim, a baciloscopia feita a partir de corantes
fluorescentes é mais rápida que os métodos que utilizam o corante carbol-fucsina
(HANNA, 2004; BA & RIEDER, 1999). Entretanto, essa técnica requer microscópio
de fluorescência, equipamento caro e não disponível na maioria dos laboratórios do
país (BRASIL, 2004).
Apesar das vantagens da baciloscopia, a técnica tem limitações referentes à baixa
sensibilidade e especificidade limitada. Para que um exame seja positivo, é
necessário um número mínimo de 5.000 bacilos por mililitro de secreção (HOBBY et
al., 1973). Esta concentração de bacilos é alcançada apenas em lesões
razoavelmente extensas. Doentes com infiltrados iniciais raramente apresentarão
exame positivo (GARAY, 2004). Em casos de tuberculose pulmonar, a sensibilidade
da baciloscopia varia entre 33% e 80% (GOESSENS et al., 2005; PETERSON et al.,
1999; LIPSKY et al., 1984; BURDASH et al., 1976), dependendo da metodologia
empregada e da prevalência local da doença. O método também não distingue o M.
tuberculosis de outras micobactérias, sendo necessárias outras técnicas para o
diagnóstico definitivo (GARG et al., 2003).
1.4.3.2 Cultura
O isolamento e a identificação do M. tuberculosis através da cultura de espécimes
clínicos é a metodologia que permite a confirmação do diagnóstico, sendo por isso
considerado o padrão ouro para o diagnóstico de tuberculose (KENT & KUBICA,
1985). A cultura é capaz de detectar entre 10 e 100 bacilos viáveis por mililitro de
secreção, sendo, portanto, mais sensível que a baciloscopia, além de permitir o
isolamento da micobactéria, necessário para a identificação da espécie e para o
teste de sensibilidade às drogas (PALOMINO, 2005). A sensibilidade da cultura varia
entre 80% e 85% (STAGER et al., 1991; MORGAN et al., 1983; ROBERTS et al.,
1983), e sua especificidade é de 98% (SCHIRM et al., 1995).
Introdução
________________________________________________________________________
27
O isolamento do bacilo requer cuidados específicos, visto que grande parte dos
espécimes analisados contém outros microrganismos, além das micobactérias. A
desproporção entre a velocidade de crescimento das micobactérias e das outras
bactérias torna necessária uma descontaminação prévia de espécimes clínicos
contendo flora associada, que, quando presente, pode impedir a multiplicação dos
bacilos (BUIJTELS & PETIT, 2005). Além deste procedimento, alguns materiais
biológicos, como o escarro, devem ser tratados com um agente mucolítico, para
liquefazer os restos orgânicos e liberar os bacilos intracelulares. O método que
utiliza N-acetil-L-cisteína a 2% com hidróxido de sódio (NALC-NaOH) associa um
agente descontaminante a um mucolítico e é o mais empregado. Espécimes clínicos
provenientes de locais normalmente estéreis devem ser inoculados diretamente no
meio de cultura. Antes de serem cultivados, os bacilos devem também ser
concentrados por centrifugação (KENT & KUBICA, 1985).
Existem disponíveis vários meios de cultura para micobactérias. Nos meios sólidos à
base de ovo, como o meio de Löwenstein-Jensen ou de Ogawa, o crescimento
micobacteriano possibilita a avaliação das características morfológicas das colônias
(LIU et al., 1973). Entretanto, em meios sólidos à base de ágar, como alguns meios
de Middlebrook (7H10 e 7H11), o isolamento dos bacilos é mais rápido. Menor
tempo de crescimento é alcançado com a utilização de meios líquidos, como os
Middlebrook 7H9 e 7H12 (SOMOSKOVI & MAGYAR, 1999). Porém, a utilização
destes meios para o isolamento primário a partir de espécimes não estéreis requer a
adição de antibióticos, além de não possibilitarem a observação da morfologia das
colônias (AMERICAN THORACIC SOCIETY, 2000). O meio mais utilizado no Brasil
é o Löwenstein-Jensen. Neste meio, são necessárias entre 3 e 6 semanas de
incubação para obtenção de crescimento adequado para os testes de identificação
do M. tuberculosis (KENT & KUBICA, 1985).
O uso de métodos automatizados ou semi-automatizados tem diminuído
consideravelmente o tempo de detecção do crescimento micobacteriano (THORPE
et al., 1990; MORGAN et al., 1983). Esses sistemas utilizam um meio líquido e o
crescimento do microrganismo é detectado através de métodos radiométricos ou
não-radiométricos.
Introdução
________________________________________________________________________
28
O sistema semi-automatizado BACTEC 460 TB
®
(Becton Dickinson Diagnostic
Instrument Systems, Sparks, MD), desenvolvido em 1977, utiliza o meio Middlebrook
7H12 contendo ácido palmítico marcado com um radioisótopo do carbono (
14
C),
denominado meio
BACTEC 12B
. Durante o crescimento, o bacilo utiliza o ácido
palmítico em seu metabolismo, liberando o dióxido de carbono radioativo (
14
CO
2
). O
equipamento converte a concentração de
14
CO
2
em índices de crescimento (IC),
indicando que houve crescimento microbiano, o que ocorre entre 7 e 14 dias
(MORGAN et al., 1983; ROBERTS et al., 1983). Este método foi validado
internacionalmente e é aprovado pela Organização Mundial da Saúde . Pode ser
empregado para a pesquisa do bacilo em todos os espécimes clínicos, incluindo
sangue. A identificação e o teste de sensibilidade do bacilo às drogas podem ser
feitos diretamente no meio BACTEC 12B (LASZLO & SIDDIQI, 1984; MORGAN et
al., 1983; ROBERTS et al., 1983).
Outros métodos baseiam-se na detecção não radiométrica do crescimento
micobacteriano, como os sistemas MB/BactT (Organon Teknika, Durham, NC),
MGIT
TM
(Mycobacteria Growth Indicator Tube, BBL
®
, Becton Dickinson, Cockeysville,
MD) e ESP
®
II (Trek Diagnostic Systems, Westlake, OH). O sistema MGIT
TM
tem
como princípio a detecção do consumo de oxigênio (O
2
) por fluorescência, como
indicador de crescimento micobacteriano. O tubo BBL MGIT
TM
contém meio
Middlebrook 7H9 modificado e possui uma base de silicone impregnada com um
composto fluorescente sensível à presença de oxigênio, o rutênio. Este metal é o
indicador do crescimento da micobactéria, cujo metabolismo causa a diminuição da
concentração de oxigênio no meio, resultando na emissão de fluorescência. A fusão
da tecnologia BACTEC com o MGIT resultou no sistema BACTEC
TM
MGIT
TM
960
(BM960, Becton Dickinson Microbiology Systems), que tem a capacidade de
incubação de até 960 culturas, com monitoramento contínuo. O tempo de detecção
do crescimento bacteriano é comparável ao obtido pelo BACTEC 460 TB
(CRUCIANI et al., 2004). Apesar de ter sido validado internacionalmente , o método
apresenta altas taxas de contaminação, entre 7% e 15% (LEE et al., 2003; LEITRITZ
et al., 2001; CORNFIELD et al., 1997; PALACI et al., 1996). Outros fatores ainda
limitantes da utilização desse método são o custo elevado e a impossibilidade de
identificação das micobactérias detectadas.
Introdução
________________________________________________________________________
29
Muitos estudos têm avaliado o desempenho dos diferentes sistemas de cultura
disponíveis. O BACTEC 460 TB
®
continua sendo o sistema mais rápido e sensível,
seguido pelos sistemas automatizados de detecção não radiométrica (CRUCIANI et
al., 2004; LEITRITZ et al., 2001; CORNFIELD et al., 1997; CASAL et al., 1997). No
entanto, a utilização dos métodos rápidos não dispensa o cultivo em meio sólido.
Este deve ser feito concomitantemente, pois garante o isolamento de micobactérias
que não crescem em outros meios, além de permitir a visualização da morfologia da
colônia e preservar o microrganismo para estudos posteriores (HANNA, 2004;
AMERICAN THORACIC SOCIETY, 2000; STAGER et al., 1991; MORGAN et al.,
1983).
1.4.3.3 Identificação fenotípica
Após a detecção do crescimento bacteriano, deve-se identificar a micobactéria
isolada, diferenciando-a entre o Complexo M. tuberculosis e micobactérias não
causadoras de tuberculose (NTM, do termo inglês non-tuberculosis mycobacteria)
(AMERICAN THORACIC SOCIETY, 2000). Os métodos convencionais de
identificação das micobactérias baseiam-se nos aspectos fenotípicos, como
caracterização morfológica, bioquímica e crescimento em presença de agentes
inibidores. Uma identificação presuntiva pode ser feita através da observação da
temperatura e tempo de crescimento, da morfologia das colônias e da produção de
pigmentos. O crescimento do M. tuberculosis em meio à base de ovo é lento, sendo
que a visualização de colônias ocorre em torno de 21 dias. As colônias são rugosas,
opacas e de cor bege. Não ocorre produção de pigmentos, mesmo após exposição à
luz (RUNYON, 1970).
Várias provas bioquímicas identificam o M. tuberculosis (Tabela 1). O teste para
detecção da niacina é o mais utilizado, juntamente com o teste de detecção da
nitratoredutase e da produção de catalase (WAYNE & DOUBEK, 1968). A
capacidade das micobactérias crescerem em meios contendo agentes inibidores
seletivos é utilizada como ferramenta para a identificação das diferentes espécies. O
crescimento de bactérias pertencentes ao Complexo M. tuberculosis é inibido em
Introdução
________________________________________________________________________
30
meios contendo 500 µg/mL de ácido ρ-nitrobenzóico (PNB), o que não ocorre com
outras micobactérias. A distinção entre M. bovis e M. tuberculosis pode ser feita
através do uso de meios contendo 5µg/mL de hidrazida do ácido 2-tiofenocarboxílico
(TCH), onde ocorre a inibição do crescimento do M. bovis (GIAMPAGLIA et al.,
2005). Apesar de amplamente utilizados, esses métodos são demorados, pois
requerem um crescimento bacteriano em meio sólido suficiente para uma
identificação correta, o que pode demorar entre 4 e 8 semanas a partir da cultura
primária (WOODS, 2002).
Tabela 1 - Diferenciação entre o Complexo M. tuberculosis e micobactérias não
causadoras de tuberculose (NTM)
Suscetibilidade
Identificação
PNB TCH NAP
Atividade de
nitratoredutase
Produção
de
pigmento
Niacina
Complexo M. tuberculosis:
M. tuberculosis Sensível Resistente
Sensível Positiva Ausente
Positiva
M. bovis Sensível Sensível Sensível Negativa Ausente Negativa
M. africanum Sensível Variável Sensível Negativa Ausente Negativa
NTM Resistente
Resistente
Resistente
Variável Variável
Negativa
(maioria)
Uma rápida identificação de micobactérias pode ser feita a partir do meio de cultura
líquido BACTEC 12B, utilizando-se o teste BACTEC NAP. O ρ-nitro-α-acetilamino-β-
hidroxipropriofenona (NAP) é um composto intermediário da síntese do cloranfenicol
e, a uma concentração de 5µg/mL, inibe seletivamente o crescimento de bacilos
pertencentes ao Complexo M. tuberculosis, havendo pouca ou nenhuma inibição
sobre outras micobactérias. A bactéria sensível ao NAP é incapaz de metabolizar
em sua presença, o que causa pouca liberação de
14
CO
2
. Conseqüentemente, a
leitura do meio BACTEC NAP pelo sistema BACTEC 460 TB
®
apresentará
uma
diminuição significativa no índice de crescimento bacteriano (SIDDIQI, 1989). A
presença de culturas mistas ou de outros microrganismos que não micobactérias
deverá ser excluída através de microscopia pelo método de Ziehl-Neelsen. Em 1984,
LASZLO & SIDDIQI avaliaram o desempenho dessa técnica para diferenciar
Introdução
________________________________________________________________________
31
bactérias do Complexo M. tuberculosis de outras micobactérias. O método mostrou-
se rápido e eficaz, fornecendo resultados dentro de 4 dias.
1.4.4 Diagnóstico molecular
1.4.4.1 Métodos de amplificação de ácidos nucléicos a partir de
espécimes clínicos
Nas últimas décadas, pesquisas na área da biologia molecular criaram
oportunidades para o desenvolvimento de novos métodos aplicados ao diagnóstico
de doenças infecciosas (WOLK et al., 2001; TANG & PERSING, 1999). As técnicas
moleculares baseiam-se na detecção de uma seqüência alvo específica do DNA ou
RNA do patógeno, através de sua ligação (hibridação) a uma seqüência
complementar, formando um híbrido. Com as vantagens de serem muito sensíveis e
rápidos, os métodos moleculares surgiram como alternativa promissora para a
detecção e identificação de M. tuberculosis.
Desenvolvida em 1983 por Kary B. Mullis, a reação em cadeia da polimerase (PCR)
é uma técnica que permite a amplificação de segmentos de DNA, levando à
produção de grande quantidade deste fragmento. Essa técnica revolucionou as
pesquisas na área de biologia molecular e lançou uma ampla e nova perspectiva no
estudo de várias doenças (WOLK et al., 2001). Na tuberculose, a aplicação da PCR
e de técnicas nela baseadas dá-se em qualquer área, desde a epidemiologia até a
prevenção, sendo especialmente relevante no diagnóstico (PALOMINO, 2005).
Para a utilização da técnica de PCR, é necessária a identificação de seqüências-
alvo específicas para a amplificação. Para o estudo da tuberculose, foram
desenvolvidos vários primers, que são oligonucleotídeos sintéticos, direcionados a
diferentes regiões do genoma micobacteriano, presentes em qualquer bactéria do
gênero Mycobacterium ou apenas em membros do Complexo M. tuberculosis (SOINI
& VILJANEN, 1992; THIERRY et al., 1990b; BRISSON-NOËL et al., 1989;
EISENACH et al., 1988).
Introdução
________________________________________________________________________
32
Uma seqüência repetitiva presente exclusivamente no DNA de bactérias do
Complexo M. tuberculosis, de significado funcional desconhecido, foi descrita por
THIERRY et al. (1990a). Esta seqüência, denominada IS6110, pertence a uma
classe de moléculas chamadas transposons, que são fitas de DNA capazes de auto-
replicação e que podem se integrar permanentemente ao genoma do hospedeiro. O
DNA do M. tuberculosis apresenta entre 10 e 20 cópias da seqüência, enquanto
apenas uma cópia foi encontrada no genoma de M. bovis e M. bovis BCG. Algumas
espécies de M. tuberculosis isoladas no Sudeste Asiático não apresentaram essa
seqüência de inserção (VAN SOOLINGEN et al., 1993; YUEN et al., 1993).
Em 1991, EISENACH et al. avaliaram o desempenho da PCR na pesquisa do M.
tuberculosis diretamente do escarro, a partir da amplificação de um fragmento do
IS6110, gerando um amplicon de 123 pares de bases (pb). O método apresentou
resultados comparáveis aos da cultura, com sensibilidade e especificidade próximas
a 100%. Desde então, esta seqüência tem sido amplamente utilizada para pesquisa
molecular de bactérias do Complexo M. tuberculosis (SAVELKOUL et al., 2005; VAN
EMBDEN et al., 1993).
Visando avaliar a presença das seqüências de DNA alvo, relatadas na literatura, em
cepas de M. tuberculosis existentes no estado do Amazonas (Brasil), OGUSKU &
SALEM (2004) analisaram a utilização de primers específicos para as seqüências
IS6110 e para os genes que codificam os antígenos de 68kDa, 38kDa e MPB64.
Todas as seqüências alvo foram encontradas no genoma das cepas de M.
tuberculosis analisadas. Os primers específicos utilizados para amplificação do
fragmento 123pb da seqüência IS6110 demonstraram maior eficiência no
diagnóstico da tuberculose pulmonar. Os autores concluíram que estes primers são
os mais indicados, naquela região, para a realização da PCR em amostras clínicas e
em cepas de M. tuberculosis visando o diagnóstico da tuberculose pulmonar.
Os testes de amplificação do ácido nucléico podem ser realizados a partir da
utilização de kits comerciais ou através da PCR in-house, cujo protocolo é
desenvolvido pelo próprio laboratório. Algumas técnicas para a pesquisa direta do
Complexo M. tuberculosis, a partir de material biológico, foram desenvolvidas
comercialmente (SU, 2002), como o AMPLICOR
®
MTB Test (Roche Molecular
Introdução
________________________________________________________________________
33
Systems, NJ, EUA), que amplifica uma seqüência específica do M. tuberculosis,
presente no gene do RNA ribossomal 16S (BÖDDINGHAUS et al., 1990). O
Amplified MTD
®
Test (Gen-Probe, CA, EUA) utiliza a enzima transcriptase reversa
para transcrição do RNA ribossomal e detecta o segmento transcrito através de PCR
(ABE et al., 1993). Os dois testes apresentam altas especificidade e sensibilidade
quando realizados em amostras de pacientes bacilíferos. No entanto, apenas o
Amplified MTD
®
apresenta sensibilidade satisfatória para ser utilizado a partir de
espécimes com baciloscopia negativa (MICHOS et al., 2006; PIERSIMONI &
SCARPARO, 2003; WATTERSON & DROBNIEWSKI, 2000).
O desempenho das diversas técnicas de PCR para a detecção direta do DNA de M.
tuberculosis em materiais biológicos não é homogêneo. A baixa sensibilidade
encontrada se deve, sobretudo, à presença de substâncias inibidoras da
amplificação nos espécimes analisados (SARMIENTO et al., 2003; FORBES &
HICKS, 1996). As variações encontradas nos testes de PCR in house são devidas,
principalmente, a diferenças metodológicas, como o preparo da amostra e o primer
utilizado (FLORES et al., 2005; NOORDHOEK et al., 1996; NOORDHOEK et al.,
1994; CLARRIDGE et al., 1993).
1.4.4.2 Métodos moleculares de identificação a partir do cultivo de
micobactérias
Técnicas de biologia molecular para detecção e identificação de micobactérias em
meios de cultura têm sido aplicadas nos últimos anos, sobretudo em países
desenvolvidos, com o intuito de reduzir o tempo do diagnóstico das doenças
causadas por estes microrganismos. Dentre os métodos utilizados, encontram-se a
PCR in house, com adaptações para uso no próprio laboratório, e os métodos
comerciais baseados na PCR ou na hibridação de ácidos nucléicos. O principal
método comercial designado AccuProbe
®
System (AccuProbe
®
M. tuberculosis
Complex Culture Identification Test, Gen-Probe, CA, EUA) utiliza uma sonda de DNA
marcada, complementar a um fragmento do RNA ribossômico específico de
micobactérias pertencentes ao Complexo M. tuberculosis . Este método apresenta
Introdução
________________________________________________________________________
34
sensibilidade e especificidade elevadas (BADAK et al., 1999), porém, requer uma
quantidade mínima de 10
5
microrganismos (HALE et al., 2001; AMERICAN
THORACIC SOCIETY, 2000), não pode ser utilizado em culturas mistas e seu custo
financeiro é relativamente elevado (BRASIL, 2004; DOWDY et al., 2003; WOODS,
2002; TANG & PERSING, 1999). Além destes, outros inconvenientes relacionados à
especificidade do teste também têm sido relatados. Utilizando sondas de DNA
específicas para o Complexo M. tuberculosis, LIM et al. (1991) identificaram
corretamente 62 culturas de M. tuberculosis e 11 de M. bovis. Entretanto, 2 cepas de
M. terrae e uma do Complexo M. avium apresentaram resultado positivo para
Complexo M. tuberculosis. Em um estudo feito por BUTLER et al. (1994), o sistema
AccuProbe
®
apresentou reação cruzada com 8 das 20 cepas de Mycobacterium
celatum analisadas. Através do seqüenciamento genético, foi demonstrado que esta
bactéria apresenta grande homologia com a sonda usada no teste. Apesar de
raramente isolada, evidências clínicas têm indicado que a espécie M. celatum, pode
causar uma doença fatal, tanto em pacientes imunocompetentes quanto em
imunossuprimidos (BUX-GEWEHR et al., 1998; TORTOLI et al., 1995), o que
acentua a relevância dos resultados falso-positivos encontrados pelos
pesquisadores.
Além dos métodos de hibridação de ácidos nucléicos, outros métodos comerciais
baseados na PCR também têm sido utilizados, porém de forma limitada. SMITH et al.
(1997) empregaram o teste AMPLICOR
®
MTB em culturas de escarros em meios
BACTEC 12B, com índices de crescimento iguais ou maiores que 20. Os autores
observaram uma excelente sensibilidade e especificidade e uma diminuição
significativa no tempo de identificação do M. tuberculosis. Contudo, a exemplo do
AccuProbe
®
System, esse sistema possui como grande desvantagem seu custo
elevado.
Em relação às técnicas in house para detecção e identificação de micobactérias a
partir de cultivo, embora sejam consideradas extremamente interessantes
e promissoras, seu uso é ainda bastante restrito. No Brasil, a partir de um
estudo realizado em 2005, LIMA et al. afirmaram que o método de PCR in hous e
pode ser útil na identificação rápida de M. tuberculosis, M. avium e M. intracellulare
em culturas de escarro contaminadas no meio de Löwenstein-Jensen. Já com
Introdução
________________________________________________________________________
35
referência à utilização de PCR in house para identificação do bacilo a partir
de meios BACTEC 12B, encontramos apenas quatro estudos na
literatura pesquisada (RYANG et al., 1996; FORBES & HICKS, 1994; MORRIS
et al., 1994; CORMICAN et al., 1992). Os resultados destes trabalhos apresentaram
excelentes sensibilidade e especificidade. No entanto, estes estudos foram limitados
a países desenvolvidos.
Desenvolvida com insumos produzidos no próprio laboratório, a PCR in house é uma
alternativa economicamente viável e relativamente simples, quando comparada aos
métodos comerciais de amplificação. Diferentes protocolos de PCR utilizando
primers específicos para a seqüência de inserção IS6110 têm sido descritos. Muitos
apresentaram sensibilidade comparável à da cultura (COHEN et al., 1998; QUEROL
et al., 1995; SCHIRM et al., 1995; CLARRIDGE et al., 1993). Entretanto, a difusão
da técnica de PCR in house tem sido bastante limitada. Há uma grande carência de
estudos sobre a avaliação desta técnica e da utilização de primers específicos para
a seqüência de inserção IS6110, visando a detecção de M. tuberculosis em meios
de culturas líquido (BACTEC 12B e ou MGIT) em condições de rotina diagnóstica,
assim como estudos sobre análise crítica de sua aplicação e condições de uso.
Considerando, portanto, que, apesar de eficientes, os métodos moleculares
comerciais apresentam um elevado custo econômico, torna-se necessário a
avaliação de métodos alternativos de identificação de micobactérias em meios de
cultura, com vistas à sua utilização em um maior número de laboratórios de
micobacteriologia clínica, sobretudo em paises em desenvolvimento.
II. Objetivos
Objetivos
_______________________________________________________________________
37
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar o desempenho da reação em cadeia da polimerase (PCR IS6110) na
identificação do Complexo Mycobacterium tuberculosis em cultura de escarro no meio
BACTEC 12B.
2.2 Objetivos específicos
• Avaliar a especificidade dos primers IS6B e IS7B na amplificação do fragmento
de 123 pb da seqüência de inserção IS6110, presente no genoma de espécies
pertencentes ao Complexo M. tuberculosis.
• Determinar a sensibilidade e a especificidade da técnica de PCR IS6110 na
identificação de M. tuberculosis em culturas de escarro no meio BACTEC 12B
com índice de crescimento igual ou acima de 30.
• Comparar o tempo necessário para identificação do M. tuberculosis através da
utilização de técnicas fenotípicas e da PCR IS6110.
III. Material & Métodos
Material & Métodos
_________________________________________________________________________ 39
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Caracterização das amostras
No período entre março de 2004 e março de 2006, foram aleatoriamente
selecionadas e analisadas 107 amostras de escarro provenientes de 95 pacientes
com suspeita de tuberculose atendidos no Centro de Pesquisa Clínica do Hospital
Antonio Cassiano Moraes, Espírito Santo, Brasil, arrolados no protocolo CEPE/CSS-
UFES nº DMID01 – 009, “Estudo prospectivo, multicêntrico, controlado, randomizado,
para avaliação de esquema encurtado do tratamento padrão da tuberculose de 6
meses para 4 meses, em pacientes HIV-negativos, infectados com cepas sensíveis
às drogas, sem doença cavitária e com cultura negativa no segundo mês de
tratamento”.
3.2 Coleta das amostras
O número de amostras analisadas baseou-se em um cálculo do tamanho da amostra,
para o qual foi utilizado um nível de significância de 5% e um poder do teste de 80%.
Através deste cálculo, obtivemos um tamanho de 77 amostras. No entanto, em
decorrência do tempo disponível para a conclusão da pesquisa, foram analisadas 107
amostras de escarro dos pacientes selecionados. Os escarros foram coletados em
frascos estéreis, sob orientação da equipe de enfermagem, e mantidos entre 2 a 10
ºC até o seu processamento no laboratório.
Material & Métodos
_________________________________________________________________________ 40
3.3 Exames laboratoriais
Todos os procedimentos laboratoriais foram realizados no Laboratório de
Micobactérias do Núcleo de Doenças Infecciosas da Universidade Federal do Espírito
Santo (UFES), sob condições de biossegurança.
3.3.1 Digestão e descontaminação das amostras
As amostras de escarro foram submetidas à digestão com dithiotreitol (DTT) a uma
concentração final de 0,1%, por 5 min, em um agitador. Posteriormente, foram
descontaminadas com igual volume de uma solução citrato de sódio / hidróxido de
sódio a uma concentração final de 0.7 / 1.25 %, por 15 min, à temperatura ambiente.
Após a descontaminação, foi adicionado, a cada amostra, tampão fosfato (PBS) até
um volume final de 50 mL. As amostras foram centrifugadas a 4,000 x g, por 15 min,
a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e ao sedimento foram adicionados 2,0 mL de
PBS (KENT & KUBICA, 1985).
3.3.2 Exame microscópico dos esfregaços de escarro (baciloscopia)
Os esfregaços de escarro foram feitos com 30 µL do sedimento das amostras
processadas. As lâminas foram coradas pela técnica de Auramina O (COLLINS et al.,
1997) e a leitura microscópica foi realizada de acordo com as recomendações do
Manual de Bacteriologia da Tuberculose do Ministério da Saúde (Brasil, 1994).
Material & Métodos
_________________________________________________________________________ 41
3.3.3 Cultura
3.3.3.1 Cultura em meio de Ogawa
A cultura em meio sólido foi realizada inoculando-se um volume de 0,2 mL do
sedimento das amostras processadas em um frasco contendo meio de cultura de
Ogawa. As culturas foram incubadas em estufa a 37ºC e examinadas semanalmente
para verificação de crescimento microbiano. Após 6 semanas de incubação, as
culturas que não apresentaram crescimento de micobactérias foram consideradas
negativas (KENT & KUBICA, 1985).
3.3.3.2 Cultura em meio BACTEC 12B (sistema semi-automatizado)
As amostras foram cultivadas pelo método radiométrico BACTEC 460 TB
®
, seguindo
recomendações do fabricante (SIDDIQI, 1989). Em um frasco de meio BACTEC 12B
contendo 0,1mL de solução antimicrobiana PANTA (polimixina B, anfotericina B,
ácido nalidíxico, trimetoprim e azlocilina), foi inoculado 0,5mL do sedimento das
amostras processadas. Os frascos foram incubados a 37ºC e a leitura radiométrica foi
feita diariamente durante os 14 dias iniciais, através do aparelho BACTEC 460 TB
®
(Becton Dickinson Diagnostic Instrument Systems, Sparks, MD), com a determinação
do índice de crescimento microbiano (IC). Depois de 14 dias de incubação, os frascos
negativos foram lidos as segundas, quartas e sextas-feiras, até completar 6 semanas,
quando as culturas com leitura de IC menor que 30 foram consideradas negativas e
descartadas.
Material & Métodos
_________________________________________________________________________ 42
3.3.3.2.1 Culturas com crescimento de microrganismos (índice
de crescimento igual ou maior a 30)
As culturas em meio BACTEC 12B cujo IC foi igual ou maior a 30 foram examinadas
microscopicamente para a verificação da presença de BAAR. O esfregaço foi
realizado com 30
µ
L do meio 12B e foi corado pela técnica de Ziehl-Neelsen
(COLLINS, 1997). Uma alíquota de 0,1mL das culturas com IC maior ou igual a 30 foi
inoculada em ágar sangue de carneiro a 5%. O meio foi incubado a 37ºC durante 24h,
quando foi verificado o crescimento de microrganismos contaminantes (fungos e/ou
outras bactérias que não micobactérias).
A interpretação das culturas em meio 12B foi feita baseada nos resultados de Ziehl-
Neelsen e do crescimento microbiano em placa de ágar sangue (PAS), conforme a
seguir:
I - Culturas puras (positivas) - Presença de BAAR ao exame microscópico e ausência
de outros microrganismos (contaminantes) em PAS.
II - Culturas mistas (positivas com contaminação) - Presença de BAAR ao exame
microscópico e presença de outros microrganismos (contaminantes) em PAS.
III - Culturas contaminadas - Ausência de BAAR ao exame microscópico e presença
de outros microrganismos (contaminantes) em PAS.
As culturas mistas foram submetidas à nova descontaminação alcalina. O meio 12B
das culturas mistas foi removido e colocado em um tubo de centrífuga de 50mL. Um
volume igual de hidróxido de sódio a 6% foi adicionado e a amostra foi agitada
periodicamente durante 20 min. Posteriormente, o volume foi completado para 50mL
com tampão fosfato (PBS). O tubo foi homogeneizado por inversão e centrifugado a
3.000 x g por 15 min. O sobrenadante foi descartado. Ao sedimento foi adicionado
0,5mL de PBS. O tubo foi agitado e a suspensão foi inoculada em um novo frasco de
Material & Métodos
_________________________________________________________________________ 43
meio 12B adicionado de PANTA, seguindo os procedimentos de incubação e leitura
conforme item 3.3.3.2.
3.3.4 Identificação do
Mycobacterium tuberculosis
por métodos
fenotípicos
3.3.4.1 Aspectos fenotípicos das colônias
Para todas as culturas com crescimento de micobactérias em meio de Ogawa foi
realizada uma análise fenotípica baseada nas seguintes características: aspecto
morfológico, pigmentação e tempo de crescimento das colônias.
3.3.4.2 Inibição do crescimento bacteriano em presença de ácido
ρ- nitrobenzóico (PNB) e ácido 2-tiofenocarboxílico (TCH)
Todas as culturas puras (positivas) de BACTEC 12B foram identificadas através da
avaliação da inibição do crescimento bacteriano em presença de PNB e TCH. As
drogas foram adicionadas separadamente em meio Ogawa, a uma concentração final
de 500 µg/mL de PNB e 5 µg/mL de TCH. Três frascos de meio de Ogawa receberam
um inóculo de 0,2 mL da cultura positiva. Dois meios continham PNB ou TCH. O
terceiro meio foi usado como controle e não continha agente inibidor. As culturas
foram incubadas a 37ºC e observadas a partir do 12º dia de inoculação. Foram
identificadas como M. tuberculosis as bactérias que apresentaram crescimento no
frasco controle, um padrão similar de crescimento no meio contendo TCH e ausência
de crescimento no meio contendo PNB (GIAMPAGLIA et al., 2005).
Material & Métodos
_________________________________________________________________________ 44
3.3.4.3 Inibição do crescimento bacteriano em presença de ρ-
nitro-α-acetilamino-β-hidroxipropriofenona (NAP)
O teste BACTEC NAP foi realizado com todas as culturas puras de BACTEC 12B,
seguindo-se instruções do fabricante (SIDDIQI, 1989). As culturas puras com IC ≥ 50
foram diluídas, de acordo com o índice de crescimento apresentado. Um mililitro
desta diluição foi inoculado em um frasco vazio contendo um disco de papel
impregnado com 5µL de ρ-nitro-α-acetilamino-β-hidroxipropriofenona. O meio 12B
contendo a cultura diluída foi usado como controle. As culturas foram incubadas a
37ºC e a leitura radiométrica foi feita diariamente, por até 5 dias. Foram consideradas
do Complexo M. tuberculosis as bactérias cujo crescimento foi inibido em presença
do NAP.
3.3.4.4 Interpretação dos resultados fenotípicos
As cepas selecionadas foram
identificadas como
M. tuberculosis
, com base nas
características fenotípicas das colônias (rugosas, cremes e opacas), na
resistência à hidrazida do ácido tiofeno-2-carboxílico (5
µ
g/mL) e nas
sensibilidades ao ácido
ρ
-nitrobenzóico (500
µ
g/mL) e ao
ρ-nitro-α-acetilamino-β-
hidroxipropriofenona
(KENT & KUBICA, 1985; COLLINS et al., 1997). As culturas
que apresentaram crescimento micobacteriano, cuja identificação fenotípica não
foi possível, foram excluídas do estudo.
Material & Métodos
_________________________________________________________________________ 45
3.3.5 Identificação do complexo
Mycobacterium tuberculosis
por
método molecular
3.3.5.1 Extração do DNA
Todas as culturas em meio BACTEC 12B que apresentaram crescimento microbiano
foram submetidas à amplificação do DNA através da técnica de PCR IS6110. As
reações de amplificação foram realizadas a partir das culturas em meio 12B com
Figura 2
-
Algoritmo do processamento das amostras de escarro analisadas.
(IC: índice de crescimento; AS: ágar sangue de carneiro; ZN:
coloração pela técnica de Ziehl-Neelsen; + : positivo; - : negativo)
Amostras
12B
Cultura
Baciloscopia
Ogawa
Identificação
molecular
ZNAS
AS –
ZN +
AS +
ZN –
AS +
ZN +
Positiva
Positiva
contaminada
Contaminada
Identificação fenotípica
NAP
-
TCH
+
PNB
-
PCR-IS6110
Complexo M. tuberculosis Mycobacterium tuberculosis
Digestão
Descontaminação
IC = 30
Interpretação das culturas
Descontaminação
alcalina
Material & Métodos
_________________________________________________________________________ 46
índice de crescimento igual ou maior a 30, independentemente do resultado da
identificação fenotípica. Uma alíquota de 1,0 mL do meio 12B foi retirada e
armazenada a - 20ºC até ser realizada a extração do DNA, quando as amostras
congeladas foram aquecidas entre 90ºC e 100ºC, durante 1 hora e 30 minutos.
Posteriormente, as amostras foram centrifugadas a 13.000 x g por 2 minutos. O
sobrenadante foi descartado e ao sedimento foram adicionados 5 µL de água estéril.
No teste de amplificação foram utilizados 2 µL deste sedimento.
3.3.5.2 Reação em cadeia da polimerase
3.3.5.2.1
Primers
O par de primers IS6B (5’ GGC TGT GGG TAG CAG ACC 3’) e IS7B (5’ CGG GTC
CAG ATG GCT TGC 3’) (Invitrogen) foi usado na amplificação de uma porção da
seqüência de inserção IS6110 do genoma das micobactérias do Complexo M.
tuberculosis (Figura 3). Os produtos da amplificação da PCR IS6110 são fragmentos
de 123 pares de base (pb).
1
1355
(799-816) (943-960)
Alvo
123pb
IS6110
IR
IR
Figura 3
- Seqüência de inserção IS6110
, de 1,35kb, presente no genoma de
membros do Complexo M. tuberculosis. A
região da seqüência
amplificada pelos primers IS6B e IS7B está demonstrada em destaque.
(IR: seqüências terminais de repetição invertida)
Material & Métodos
_________________________________________________________________________ 47
3.3.5.2.2 Amplificação pela técnica de PCR IS6110
A amplificação foi realizada em tubos de 0,2 mL, com um volume final de 25 µL por
reação, em um termociclador (LCx Thermal Cycler - Abbott Diagnostic Division ,
Abbott Park, IL, USA). Cada tubo de reação continha 2 µL do DNA extraído, 5 pmol
de cada primer, 4mM MgCl
2
, 2,5 µL de tampão 10X (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD,
USA), 0,1mg/mL de soro albumina bovina (BSA), 200 µm de cada dATP, dTTP, dCTP
e dGTP e 1,25U de Taq DNA polimerase (CENBIOT, Brasil), cobertos com 10 µL de
óleo mineral estéril. O termociclador foi programado para fazer a PCR usando as
seguintes condições: 94ºC por 5 min, 34 ciclos de 94ºC por 30 seg, 65 ºC por 30 seg
e 72ºC por 45 seg, com uma extensão final a 72ºC por 10 min. Como controles
negativos e positivos da reação foram utilizadas, respectivamente, culturas das cepas
de referência Escherichia coli (ATCC 29522) e de M. tuberculosis H37Ra (ATCC
25177) em meio 12B.
3.3.5.2.3 Detecção do produto amplificado
Foi realizada eletroforese em gel de poliacrilamida a 4% com 10 µL do produto da
reação de amplificação. Os géis foram corados com brometo de etídeo (GIBCO-BRL,
Gaithersburg, MD, USA), visualizados e fotografados em um transiluminador de luz
ultravioleta (Eagle eye II – Stratagene, CA, USA). O tamanho do amplicon (123pb) foi
comparado com um marcador de DNA (100bp DNA ladder - Gibco
®
) onde cada
fragmento é separado por uma diferença de 100 pb. O resultado da reação de
amplificação foi considerado positivo para o Complexo Mycobacterium tuberculosis
quando um produto de 123pb do IS6110 estava presente no gel (PCR positiva).
A análise da concordância entre os métodos de identificação fenotípico e molecular
foi realizada através da estatística kappa (k) com grau de confiança de 95%. Os
dados foram analisados no programa STATA 6,0. Foram também calculadas a
Material & Métodos
_________________________________________________________________________ 48
sensibilidade e a especificidade da técnica de PCR IS6110 em relação à identificação
fenotípica.
3.3.5.3 Avaliação prévia da técnica de PCR IS
6110
Antes de serem realizadas as identificações moleculares das culturas de escarro
provenientes dos pacientes incluídos no estudo, foram realizados experimentos com
o objetivo de avaliar, previamente, a especificidade dos primers utilizados e a
capacidade da técnica de PCR IS6110 em detectar o DNA de microrganismos do
Complexo M. tuberculosis em meio BACTEC 12B. Para este objetivo, foram utilizadas
as cepas de referência American Type Culture Collection (ATCC) e as reações de
amplificação foram realizadas seguindo-se os procedimentos descritos no item
3.3.5.2.
3.3.5.3.1 Avaliação da especificidade dos
primers
A avaliação da especificidade dos primers empregados na técnica de amplificação foi
realizada em duas etapas. A primeira etapa consistiu na aplicação da técnica da PCR
IS6110 em amostras de diferentes espécies bacterianas puras. Inicialmente, foram
cultivadas em meio de Ogawa cepas de M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177), M.
africanum (ATCC 25420), M. bovis (ATCC 35721), M. chelonae (ATCC 35752), M.
kansasii (ATCC 12478), M. marinum (ATCC 927); e em meio de MacConkey a cepa
de referência de Escherichia coli (ATCC 29522). A partir destes cultivos, foram feitas
suspensões equivalentes ao padrão nº 0,5 da escala de McFarland
(aproximadamente 1,5 x 10
8
unidades
formadoras de colônias/mL). Um volume de
0,05mL de cada suspensão foi inoculado em frascos individuais de meio 12B, com
exceção do M. tuberculosis H37Ra, que foi inoculado em cinco frascos do meio,
sendo utilizado 0,2mL da suspensão. Todos os meios foram cultivados e lidos pelo
método radiométrico BACTEC 460 TB
®
, conforme item 3.3.3.2. As culturas foram
Material & Métodos
_________________________________________________________________________ 49
submetidas à amplificação do DNA através da técnica de PCR IS6110 (item 3.3.5.2)
apresentando os seguintes índices de crescimento: M. africanum (IC de 146 e 774),
M. chelonae (IC de 61 e 375), M. kansasii (IC de 502 e 536), M. marinum (IC de 54 e
297), H37Ra (IC de 41 e 117), M. bovis (IC de 370) e E. coli (IC de 381).
A segunda etapa consistiu na aplicação da técnica PCR IS6110 em amostras
contendo M. tuberculosis e uma outra espécie bacteriana. Para obtenção deste tipo
de cultura mista, uma alíquota de cada cultura bacteriana descrita anteriormente foi
transferida para um microtubo e, a esta suspensão, foi adicionado um volume de 0,1
mL de uma cultura de H37Ra em meio de BACTEC 12B (IC=50). As culturas mistas
obtidas foram novamente cultivadas e lidas pelo método radiométrico BACTEC 460
TB
®
, conforme item 3.3.3.2. A reação de amplificação foi realizada a partir de
alíquotas dessas culturas, cujos índices de crescimento variaram de 148 a 451.
3.3.5.3.2 Avaliação da capacidade da PCR IS
6110
em detectar
Mycobacterium tuberculosis
H37Ra em meios BACTEC
12B com diferentes índices de crescimento
Para avaliar a capacidade da técnica de PCR IS6110 em detectar diferentes
concentrações do DNA de M. tuberculosis em meio BACTEC 12B, foram testados
diferentes índices de crescimento (66, 88, 105, 121 e 552) das culturas de H37Ra,
descritas no item 3.3.5.3.1. Após a extração do DNA, as amostras foram
centrifugadas a 13.000 x g por 2 minutos. Para essa avaliação, o sobrenadante do
DNA extraído não foi descartado e a reação de amplificação foi realizada em
alíquotas tanto do sedimento quanto do sobrenadante dessas culturas.
IV. Resultados
Resultados
________________________________________________________________________
51
4 RESULTADOS
Para avaliar a especificidade dos primers e a capacidade da técnica de PCR IS6110
em detectar o DNA das micobactérias do Complexo M. tuberculosis em meio
BACTEC 12B, realizou-se os ensaios do estudo em duas etapas. A primeira etapa
constituiu-se da análise prévia da PCR IS6110, com cepas de referência de
Escherichia coli e de micobactérias, e a segunda etapa, da análise da performance
da reação em cadeia da polimerase (PCR IS6110) para identificação do M.
tuberculosis a partir da cultura de escarros em meios BACTEC 12B.
4.1 Avaliação prévia da técnica de PCR IS6110
4.1.1 Avaliação da especificidade dos
primers
A avaliação da especificidade dos primers utilizados foi realizada em duas fases.
Inicialmente, a PCR foi realizada a partir do DNA extraído das culturas das cepas de
referência H37Ra, M. africanum, M. bovis, M. chelonae, M. kansasii, M. marinum e
Escherichia coli. Como demonstrado na Figura 4, os primers utilizados mostraram-se
específicos para a amplificação do fragmento de 123pb do IS6110 das micobactérias
pertencentes ao Complexo M. tuberculosis. Nenhum resultado de PCR foi positivo
nas culturas das demais micobactérias e de E. coli. Os índices de crescimento
variaram de 54 (M. marinum) a 502 (M. kansasii).
Resultados
________________________________________________________________________
52
A especificidade dos primers IS6B e IS7B foi confirmada através da PCR das
culturas mistas obtidas a partir da adição de H37Ra às culturas das cepas de
referência descritas acima. O gel de poliacrilamida apresentado na Figura 5 mostra a
amplificação das culturas das cepas de referência antes e após a adição de H37Ra.
A técnica PCR IS6110 detectou e amplificou especificamente o fragmento de DNA
de todas as culturas mistas, incluindo as culturas das micobactérias não
pertencentes ao Complexo M. tuberculosis (M. chelonae/H37Ra, M. kansasii/H37Ra
e M. marinum/H37Ra). A cultura mista de Escherichia coli/H37Ra também
apresentou resultado de PCR positiva.
Figura 4 -
Eletroforese em gel de poliacrilamida a 4% dos produtos amplificados pela
reação em cadeia da polimerase. Colunas –
1: marcador de DNA (100pb); 2:
controle negativo (água); 3: M. marinum; 4: M. africanum; 5: M. kansasii
; 6:
M. chelonae; 7: M. bovis; 8: H37Ra; 9: E. coli.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
123pb
500pb
Resultados
________________________________________________________________________
53
4.1.2 Avaliação da capacidade da PCR IS
6110
em detectar
Mycobacterium tuberculosis
H37Ra em meios BACTEC 12B
com diferentes índices de crescimento
A capacidade da técnica de PCR IS6110 em detectar microrganismos do Complexo
M. tuberculosis cultivados em BACTEC 12B foi avaliada a partir da amplificação do
DNA presente no sedimento e no sobrenadante das culturas de H37Ra em meio
12B. Diferentes índices de crescimento foram testados, variando de 66 a 552, o que
corresponde, aproximadamente, a 1x10
3
e 1x10
6
unidades formadoras de colônias
por mililitro (UFC/mL), respectivamente (SIDDIQI, 1989). A Figura 6 ilustra o gel de
poliacrilamida da reação de amplificação das culturas de H37Ra testadas. Com
exceção da E. coli, todas as amostras apresentaram PCR positiva. A PCR IS6110
mostrou-se sensível para a detecção de DNA no sedimento e no sobrenadante das
culturas de H37Ra. As bandas de 123pb apresentadas foram homogêneas em todas
as amostras positivas, incluindo o sobrenadante das culturas, independentemente
do índice de crescimento analisado.
Figura 5
-
Resultado da avaliação da especificidade dos primers
na amplificação do
fragmento de 123pb do IS6110. Colunas –
1: marcador de DNA (100pb); 2:
E. coli / H37Ra ; 3: E. coli; 4: M. marinum / H37Ra ; 5: M. marinum; 6:
M.
chelonae / H37Ra;7: M. chelonae; 8: M. africanum / H37Ra; 9:
M.
africanum; 10: M. bovis / H37Ra ; 11: M. bovis; 12: M. kansasii / H37Ra;
13:
M. kansasii; 14: H37Ra; 15: Controle negativo (água).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
500pb
123pb
Resultados
________________________________________________________________________
54
4.2 Análise do desempenho da reação em cadeia da polimerase
(PCR IS
6110
) para identificação do
M. tuberculosis
a partir da
cultura de escarros em meios BACTEC 12B
Um total de 107 amostras de escarro provenientes de 95 pacientes com suspeita de
tuberculose foi submetido à baciloscopia e à cultura em meio de Ogawa e BACTEC
12B. O sistema radiométrico BACTEC 460 TB
®
detectou crescimento microbiano em
todas as amostras e a amplificação pela técnica da PCR IS6110 foi realizada em
todos os meios 12B cujo índice de crescimento foi igual ou maior a 30.
Os resultados de identificação pelos métodos fenotípico e molecular encontram-se
na Tabela 2. Das 91 amostras com resultados positivos de PCR, 90 (98,90%)
culturas foram identificadas como Mycobacterium tuberculosis pelo método
fenotípico. Uma amostra (1,10%), identificada como outra micobactéria que não M.
tuberculosis pelo método fenotípico, apresentou resultado de PCR positivo. Este
provável resultado falso positivo ocorreu em uma amostra com IC igual a 65, cujo
paciente foi previamente diagnosticado com tuberculose e estava recebendo
Figura 6
-
Resultado da reação de amplificação do DNA de M. tuberculosis
em meios
12B. Colunas - 1: marcador de DNA (100pb);
2 a 13: sedimento e
sobrenadante
das culturas de H37Ra em meios 12B com índices de
crescimento de 121,105,552,129,66 e 88, respectivamente; 14: E. coli.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
500pb
123pb
Resultados
________________________________________________________________________
55
tratamento para a doença há dois meses. Dentre as 16 amostras com resultado de
PCR negativo, 07 foram identificadas como micobactérias outras que não o M.
tuberculosis pelo método fenotípico, 07 culturas contaminaram com outros
microrganismos e 02 culturas apresentaram crescimento de micobactérias associado
a microrganismos contaminantes. Estas duas culturas mistas foram provenientes de
dois pacientes com diagnóstico prévio de tuberculose e em tratamento há cinco
meses. Apesar de serem novamente descontaminadas e incubadas, as
micobactérias não foram isoladas, não sendo possível sua identificação pelo método
fenotípico. Como pode ser observado ainda na Tabela 2, das 90 bactérias
identificadas como M. tuberculosis pelo método fenotípico, todas (100%)
apresentaram resultado de PCR positivo. Dentre estes, o fragmento de 123pb do
IS6110 foi amplificado diretamente em três (3,33%) culturas mistas de BAAR com
microrganismos contaminantes. A identificação fenotípica destas culturas somente
foi possível após serem submetidas à nova descontaminação alcalina e incubação
por cerca de duas semanas. A técnica da PCR IS6110 apresentou sensibilidade de
100% e especificidade de 93,3% em relação ao método fenotípico de identificação.
A estatística de kappa (grau de concordância corrigido) foi de 0,96, com uma taxa de
concordância de 99,05%.
Tabela 2
-
Resultados da reação em cadeia da polimerase (PCR IS6110
) em relação
aos microrganismos isolados e identificados, através dos métodos
fenotípicos, no meio de cultura BACTEC 12B.
a
Não incluídas 02 culturas mistas cuja identificação fenotípica não foi possível.
Sensibilidade = 100%
Especificidade = 93,3%
7
RESULTADO DE PCR
Positivo
Negativo
M. tuberculosis
Outra micobactéria que não
M. tuberculosis
Outros
IDENTIFICAÇÃO FENOTÍPICA
TOTAL
a
90 8 7
90 1 0
0 7
Resultados
________________________________________________________________________
56
As culturas de meio 12B foram interpretadas de acordo com os resultados de
microscopia pelo método de Ziehl-Neelsen, juntamente com a presença de
crescimento microbiano em placa de ágar sangue. Das 107 amostras com
crescimento microbiano em meio 12B, 94 (87,85%) culturas estavam puras,
apresentando somente BAAR à microscopia, 04 (3,74%) amostras apresentaram
cultura mista de BAAR com microrganismos contaminantes, 08 (7,48%)
apresentaram somente microrganismos contaminantes e em uma (0,93%) não foram
visualizados microrganismos à microscopia e à cultura em ágar sangue (Tabela 3).
Do total de 107 culturas analisadas, 91 (85,05%) amostras apresentaram resultado
de PCR positiva e, destas, 87 (95,60%) culturas apresentaram somente BAAR à
microscopia. A técnica detectou e amplificou o fragmento de 123pb do IS6110 em 03
(3,30%) amostras que apresentaram cultura mista de BAAR com outros
microrganismos, sendo que, em uma destas foram visualizados somente
microrganismos contaminantes ao exame microscópico do meio 12B.
*a
aproximadamente 1 x 10
3
CFU/mL
b
aproximadamente 1 x 10
4
CFU/mL
c
aproximadamente 1 x 10
6
CFU/mL
* Segundo SIDDIQI (1989)
Tabela 3
-
Resultados da reação em cadeia da polimerase (PCR IS6110
) em relação ao
exame microscópico e índice de cr
escimento (IC) no meio de cultura
BACTEC 12B
30 a 50
a
51 a 100
b
101 a 600
c
30 a 50
a
51 a 100
b
101 a 600
c
BAAR 27 30 30 2 1 4
BAAR +
Microrganismos
contaminantes
0 1 1 0 0 2
Microrganismos
contaminantes
0 1 0 3 2 2
Ausência de
microrganismos
1 0 0 0 0 0
EXAME
MICROSCÓPICO
(meio 12B)
RESULTADO DE PCR
Positivo Negativo
intervalo de Índice de crescimento intervalo de Índice de crescimento
Resultados
________________________________________________________________________
57
Como demonstrado na Tabela 3, dentre os 91 resultados de PCR positivos, a
técnica de PCR IS6110 foi capaz de detectar e amplificar o DNA de 28 (30,76%)
amostras cujo índice de crescimento foi menor que 50, correspondendo
aproximadamente a 1 x 10
3
unidades formadoras de colônias por mililitro (CFU/mL)
(SIDIQQI, 1989). Dentre essas 28 culturas está incluída uma cultura de M.
tuberculosis cuja microscopia do meio 12B não detectou a presença de
microrganismos. A PCR também foi positiva em uma cultura de BAAR com
microrganismos contaminantes cujo 12B apresentou IC abaixo de 100. A menor e
maior leitura de IC com PCR positiva foram 32 e 583, respectivamente.
Das 107 culturas analisadas, a PCR foi negativa em 16 (14,95%) amostras. Dentre
essas, 07 (43,75%) apresentaram somente BAAR à microscopia (Tabela 3). Do total
de culturas com resultado de PCR negativo, 09 (56,25%) apresentaram
microrganismos contaminantes à microscopia, sendo que 02 dessas culturas eram
mistas (presença de BAAR e microrganismos contaminantes).
Com o propósito de comparar o tempo necessário para identificação do M.
tuberculosis pelos métodos fenotípico e molecular foram utilizados os seguintes
paramêtros: (i) tempo de identificação do M. tuberculosis com base na média de dias
para se obter a conclusão dos exames fenotipico (NAP) e molecular a partir da
inoculação da amostra no meio de cultura (Tabela 4) e (ii) capacidade da PCR
IS6110 de identificar o M. tuberculosis em culturas cujos escarros semeados
apresentaram resultados de baciloscopia negativos (Gráfico 1). Para ambos os
parâmetros, houve diferença significativa entre os métodos (p<0,05). Considerando-
se que o teste NAP BACTEC é realizado a partir de meio 12B com IC ≥ 50 e que a
identificação do Complexo M. tuberculosis é obtida cerca de quatro dias após a
inoculação no frasco contendo o NAP (SIDDIQI, 1989), a identificação por
intermédio da técnica molecular ocorreu, em média, 9,7 dias antes do que a
identificação pelo método fenotípico. Nos casos que em que os meios 12B estavam
contaminados com outros microrganismos, ocorreu em média, 14 dias mais rápido
do que o método fenotípico.
Resultados
________________________________________________________________________
58
a
Não foram incluídas as culturas cujos resultados foram negativos para micobactérias.
b
Não foram incluídas 02 culturas mistas de BAAR com microrganismos contaminantes em
que não foi possível a identificação fenotípica.
Positivo Tempo (dias) Positivo Tempo (dias)
BAAR 87 11,6 86 15,5
BAAR +
Microrganismos
contaminantes
2 10
2
b
25
Microrganismos
contaminantes
1 17 1 30
Ausência de
microrganismos
1 27 1 34
TOTAL 91 - 90 -
IDENTIFICAÇÃO DE M. tuberculosis
Método molecular
a
Método fenotípico
a
EXAME
MICROSCÓPICO
(meio 12B)
Tabela 4
-
Comparação entre a média de tempo (em dias) para a identificação do
M.
tuberculosis pelos métodos molecular e fenotípico (NAP).
Resultados
________________________________________________________________________
59
No
Gráfico 1
podem ser observados os resultados de baciloscopia das 107 amostras
de escarro que foram submetidas ao exame de cultura de micobactérias pelo
sistema BACTEC 460. Das 61 amostras de escarro consideradas para o segundo
parâmetro de avaliação, ou seja, com baciloscopia negativa, a técnica da PCR
IS6110 detectou e amplificou o DNA do bacilo em 45 culturas, das quais 44 foram
identificadas como M. tuberculosis pelos métodos fenotípicos. Considerando-se os
resultados de amplificação obtidos a partir das amostras paucibacilares, a técnica
apresentou sensibilidade e especificidade relativamente elevadas (100% e 94,1%,
respectivamente). Nestes casos, a identificação por intermédio da técnica molecular
ocorreu, em média, 5,5 dias antes do que a identificação pelo método fenotípico. Em
relação às 46 culturas cujos espécimes clínicos apresentaram baciloscopia positiva,
todas foram identificadas como M. tuberculosis através dos métodos fenotípicos e
molecular (sensibilidade e especificidade iguais a 100%).
46
45
a
0
16
b
0
20
40
60
BAAR positivo
BAAR negativo
PCR positivo
PCR negativo
Gráfico 1 -
Resultados de baciloscopia dos escarros submetidos à cultura de
micobactérias no sistema BACTEC 460 TB.
a
Uma cultura com resultado positivo pela PCR IS6110
foi
identificada como NTM através dos métodos fenotípicos.
b
Culturas identificadas como outros microrganismos.
V. Discussão
Discussão
________________________________________________________________________
61
5 DISCUSSÃO
O ressurgimento da tuberculose nos países desenvolvidos e o aumento mundial no
número de casos novos, associado à epidemia da SIDA (CORBETT et al., 2003),
reafirmaram a necessidade da adoção de medidas visando o combate à doença. O
diagnóstico laboratorial precoce é essencial para o controle da tuberculose, visto que
possibilita a instituição de terapia adequada, resultando na diminuição da
infecciosidade do doente, além de permitir a adoção de medidas profiláticas para o
combate à transmissão do Mycobacterium tuberculosis (WHO, 2006; PASCOPELLA
et al., 2004; DROBNIEWSKI et al., 2003; TENOVER et al., 1993).
Nos Estados Unidos, o CDC recomenda que o tempo total entre a chegada do
espécime clínico no laboratório e a identificação do bacilo seja de, no máximo, 21
dias (CDC, 2005). Apesar de ser o padrão para a confirmação diagnóstica da
tuberculose, a cultura requer entre 4 e 8 semanas para um diagnóstico definitivo. A
necessidade de um teste para o diagnóstico laboratorial rápido da doença
impulsionou o desenvolvimento de novas metodologias, incluindo as técnicas
moleculares para detecção e identificação do M. tuberculosis (WOODS, 2002; HALE
et al., 2001; SCHLUGER, 2001; CDC, 1999). A reação em cadeia da polimerase é
capaz de detectar até uma cópia de DNA de M. tuberculosis (EISENACH et al., 1990)
e, por utilizar seqüências oligonucleotídicas que são específicas para o patógeno, é
uma técnica que apresenta alta especificidade. Além destas características, a PCR é
capaz de definir, em poucas horas, sobre a presença ou não do patógeno na
amostra, o que justificaria seu amplo emprego no diagnóstico das micobacterioses
(SOMOSKOVI et al., 2003; MONTORO et al., 1998; IEVEN & GOOSSENS, 1997).
Na expectativa de se obter um diagnóstico rápido de tuberculose, a tecnologia da
amplificação de ácidos nucléicos foi empregada no desenvolvimento de métodos
comerciais e não comerciais (PCR in house), visando a detecção de M. tuberculosis
diretamente de espécimes clínicos. Entretanto, diversos estudos demonstraram uma
grande variabilidade no desempenho dessas técnicas, não permitindo a utilização
exclusiva desses métodos para o diagnóstico de tuberculose pulmonar (FLORES et
Discussão
________________________________________________________________________
62
al., 2005; GOESSENS et al., 2005; BOGARD, 2001; KAUL, 2001; NOORDHOEK et
al., 1996; SCHIRM et al., 1995; NOORDHOEK et al., 1994).
A amplificação do DNA a partir do cultivo do bacilo apresenta melhores resultados
quando comparada à PCR realizada diretamente a partir de amostras clínicas. A
utilização de métodos moleculares comerciais diretamente em cultivos de M.
tuberculosis em meios BACTEC 12B tem apresentado boa especificidade (98% a
100%) e sensibilidade (93% a 100%) (DESMOND & LORETZ, 2001; PIERSIMONI et
al., 2001; BERGMANN & WOODS, 1999; NINET et al., 1999; SMITH et al., 1997).
No entanto, apesar dos resultados obtidos, esses métodos têm como grande
desvantagem seu alto custo, o que torna inviável sua utilização rotineira em países
em desenvolvimento (DOWDY et al., 2003).
No presente estudo, propusemo-nos a avaliar o desempenho de uma técnica de
PCR na detecção de micobactérias do Complexo M. tuberculosis em culturas de
meios BACTEC 12B com índice de crescimento igual ou maior a 30. Apesar do uso
do sistema semi-automatizado BACTEC 460 TB
®
estar sendo gradualmente
descontinuado e substituído por métodos não radiométricos, optamos por empregar
o meio líquido BACTEC 12B devido à utilização rotineira deste sistema no
Laboratório de Micobacteriologia do Núcleo de Doenças Infecciosas da UFES,
desde 1992. Acreditamos que a técnica aqui avaliada possa ser utilizada em culturas
de meio BBL MGIT
TM
, cuja incubação e leitura são feitas através do sistema não
radiométrico BACTEC-MGIT 960
®
(Becton Dickinson Microbiology Systems), em
decorrência da semelhança entre os dois meios de cultura.
Para o estudo proposto, julgamos necessária uma avaliação prévia da
especificidade dos primers utilizados, cujo alvo de amplificação é a seqüência de
inserção IS6110. Como está presente no genoma do M. tuberculosis em múltiplas
cópias (THIERRY et al., 1990a), técnicas de PCR baseadas na amplificação desta
região têm apresentado melhor sensibilidade, quando comparadas à utilização de
outras seqüências alvo (FLORES et al., 2005).
A existência de cepas de M. tuberculosis cujo genoma não possui IS6110 tem sido
raramente observada. Um estudo realizado por YUEN et al. (1993) demonstrou a
Discussão
________________________________________________________________________
63
ausência da seqüência em quatro (9,8%) de 41 cepas de M. tuberculosis
provenientes do Vietnan. Através da técnica de fingerprinting, VAN SOOLINGEN et
al. (1993) analisaram 63 cepas de M. tuberculosis procedentes da Índia, detectando
a ausência de IS6110 em uma (1,6%) delas. Utilizando a mesma técnica de
genotipagem, AGASINO et al. (1998) analisaram todos os casos de tuberculose
notificados em São Francisco, EUA, entre janeiro de 1991 e dezembro de 1996. Das
1390 cepas analisadas, apenas quatro (0,28%) não apresentaram a seqüência
IS6110. Os autores inferem que essas cepas localizam-se em determinadas áreas
geográficas, como o Sudeste Asiático. No Brasil, OGUSKU & SALEM (2004)
detectaram a presença da IS6110 em 81 espécimes clínicos provenientes de
pacientes do estado do Amazonas, ratificando a utilização desta seqüência para a
identificação de micobactérias do Complexo M. tuberculosis. Atualmente, muitas
técnicas de identificação e genotipagem do M. tuberculosis empregam esta
seqüência como região alvo da amplificação (SAVELKOUL et al., 2005; TANAKA et
al., 2000; VAN EMBDEN et al., 1993; THIERRY et al., 1990b). Em nosso estudo,
optamos por utilizar um par de primers (IS6B e IS7B) que amplifica um fragmento de
123pb da seqüência IS6110.
A especificidade dos primers utilizados foi confirmada a partir dos resultados obtidos
durante a avaliação prévia da técnica de PCR IS6110. A amplificação do fragmento
de 123pb da seqüência IS6110 ocorreu exclusivamente no DNA extraído das
micobactérias pertencentes ao Complexo M. tuberculosis (M. tuberculosis H37Ra, M.
africanum e M. bovis). Apesar desta seqüência não permitir a distinção entre as
espécies do Complexo M. tuberculosis, em regiões com alta prevalência de
tuberculose, como no Brasil, a especificidade da IS6110 para M. tuberculosis é alta,
visto que esta espécie é a responsável pela maioria dos casos da doença nestas
regiões (COUSINS et al., 2003). O fato de haver apenas uma cópia da IS6110 no
genoma do M. bovis (THIERRY et al.,1990a) não influenciou o resultado da
amplificação, cujas bandas, visualizadas no gel de poliacrilamida a 4%, foram
uniformes nas três espécies analisadas. Nossos resultados confirmaram a
especificidade desta seqüência para a detecção de M. tuberculosis, conforme dados
encontrados em vários estudos apresentados na literatura (SCHIRM et al., 1995;
CLARRIDGE et al., 1993).
Discussão
________________________________________________________________________
64
A seqüência IS6110 possui homologia com seqüências relacionadas à família IS3
(THIERRY et al., 1990a), que está presente em diversas bactérias, incluindo
membros da família Enterobacteriaceae (MAHILLON & CHANDLER, 1998) e em
algumas micobactérias não causadoras de tuberculose (NTM). A ocorrência de
reação cruzada entre essas seqüências foi demonstrada por alguns autores.
Utilizando uma técnica de nested PCR específica para uma região da seqüência
IS6110, KENT et al. (1995) obtiveram resultados falso-positivos com NTM. A
utilização dessa seqüência para o estudo de micobactérias do Complexo M.
tuberculosis foi, então, questionada pelos autores. Visando confirmar os resultados
de KENT et al., HELLYER et al. (1996) avaliaram três métodos de amplificação
baseados na seqüência IS6110 e não encontraram nenhuma reação cruzada em 27
micobactérias não causadoras de tuberculose testadas, incluindo 26 NTM utilizadas
no estudo de KENT et al. Os autores sugerem que a homologia com outras espécies
esteja restrita à região central da IS6110, cuja amplificação origina um fragmento de
181pb. KENT et al utilizaram primers específicos para esta região e HELLYER et al.
concluíram que a região da IS6110 a ser amplificada influencia a especificidade da
reação, devendo ser criteriosamente selecionada. HELLYER et al. (1998)
recomendam a inclusão do DNA de M. tuberculosis, como controle positivo, e do
DNA de microrganismos não relacionados, que possuam seqüências homólogas à
IS3, como controle negativo, com o objetivo de monitorar a ocorrência de reações
cruzadas.
Em conformidade com HELLYER et al. (1998), escolhemos a Escherichia coli como
controle negativo, em virtude da ampla distribuição de IS3 nesta enterobactéria
(MAHILLON & CHANDLER, 1998). Em nosso estudo, nenhuma reação de
amplificação apresentou reação cruzada com esta bactéria, confirmando a
especificidade dos primers utilizados, visto que não ocorreu homologia da IS3 com o
fragmento de 123pb da IS6110.
De acordo com WILSON (1997), alguns fatores podem resultar em inibição da PCR,
como a presença de debris celulares e de DNA não alvo da amplificação na amostra
analisada. Para avaliar a possibilidade de ocorrer inibição da PCR IS6110 nas
condições descritas acima, submetemos culturas mistas de H37Ra com bactérias
não M. tuberculosis à reação de amplificação. Dentre as culturas testadas,
Discussão
________________________________________________________________________
65
destacamos o cultivo de E. coli / H37Ra. Esta cultura apresentou índice de
crescimento de 451, que, de acordo com SIDDIQI (1989), corresponde
aproximadamente a 1 x 10
6
CFU/mL. Apesar de não podermos precisar a
quantidade proporcional de cada bactéria presente nesta cultura mista, supomos
que, em virtude do lento crescimento do M. tuberculosis, a quantidade de DNA de E.
coli seja superior à de DNA de H37Ra. Não obstante este fato, houve amplificação
do DNA de M. tuberculosis presente nesta e em todas as culturas mistas,
confirmando o bom desempenho da técnica testada.
Diante dos resultados obtidos na avaliação da especificidade dos primers,
prosseguimos o estudo avaliando a capacidade da PCR IS6110 em detectar M.
tuberculosis em meios de cultura BACTEC 12B. Para este objetivo, utilizamos
culturas de M. tuberculosis H37Ra em 12B apresentando diversos índices de
crescimento, sendo que todas apresentaram reação de amplificação positiva. A PCR
IS6110 foi capaz de detectar o DNA de M. tuberculosis em culturas que
apresentaram índices de crescimento entre 41 e 552, que, de acordo com SIDDIQI
(1989), correspondem, aproximadamente, a concentrações bacterianas de 1 x 10
3
CFU/mL e 1 x 10
6
CFU/mL, respectivamente. Este fato demonstra a eficácia desta
técnica em detectar pequenas quantidades do bacilo no meio BACTEC 12B e, ainda,
que o excesso de ácidos nucléicos não acarretou inibição da PCR.
A amplificação do DNA presente nos sobrenadantes das culturas de H37Ra
certificou a capacidade de detecção da técnica, sugerindo que a extração do DNA
dos meios 12B possa prescindir da etapa de centrifugação.
Os resultados obtidos na avaliação prévia da PCR IS6110 validaram sua utilização
na amplificação de M. tuberculosis provenientes de culturas de escarro em meios
12B. Em nosso estudo, optamos por amplificar culturas em meios 12B que
apresentaram IC igual ou maior a 30, visto que o sistema BACTEC 460 TB
®
utilizado
no Laboratório de Micobacteriologia do Núcleo de Doenças Infecciosas da UFES
está programado para apresentar resultados positivos a partir deste valor de IC.
Alguns autores realizaram a PCR em meios 12B cujos índices de crescimento foram
inferiores (DESMOND & LORETZ, 2001; SMITH et al., 1997; RYANG et al., 1996;
FORBES & HICKS, 1994; MORRIS, 1994). No entanto, a principal vantagem
Discussão
________________________________________________________________________
66
encontrada na utilização este procedimento é a diminuição dos resultados de
crescimento falso positivos.
Em nosso trabalho, um total de 107 culturas de escarro provenientes de 98
pacientes com suspeita clínica e/ou radiológica de tuberculose foi analisado, sendo
que todos os 107 meios 12B apresentaram crescimento microbiano. A técnica da
PCR IS6110 foi positiva em todas as 90 culturas identificadas como M. tuberculosis
pelos métodos fenotípicos. Os resultados de PCR obtidos demonstraram
sensibilidade de 100%, especificidade de 93,3% e concordância de 99,05%.
Em conformidade com nossos resultados, semelhante sensibilidade foi encontrada
em alguns estudos que utilizaram os métodos moleculares comerciais em cultivos de
M. tuberculosis (SOMOSKOVI et al., 2003; DESMOND & LORETZ, 2001;
PIERSIMONI et al., 2001; BADAK et al., 1999; BERGMAN & WOODS, 1999; NINET
et al., 1999; SMITH et al.,1997). Já com relação à utilização de técnicas de PCR in
house a partir de culturas de meios 12B, os quatro estudos encontrados na literatura
pesquisada apresentaram sensibilidades comparáveis à obtida em nosso trabalho. O
estudo pioneiro foi realizado por CORMICAN et al. (1992), que amplificaram
corretamente 15 de 15 culturas de M. tuberculosis em meio 12B. Em 1994,
FORBES & HICKS testaram culturas de diferentes micobactérias em meio 12B e
utilizaram dois pares de primers, sendo um deles baseado na seqüência de inserção
IS6110. A técnica de PCR foi 100% sensível e 99,7% específica. Em um estudo
retrospectivo, MORRIS et al. (1994) obteve 100% de sensibilidade e especificidade.
Utilizando um número maior de amostras, RYANG et al. (1996) analisou 262 culturas
de meios 12B, obtendo uma sensibilidade de 99,5% e uma especificidade de 100%.
Dentre as 107 culturas analisadas em nosso estudo, oito foram identificadas
fenotipicamente como outras micobactérias que não M. tuberculosis. Dentre essas,
em uma houve a amplificação do fragmento de 123pb através da PCR IS6110,
representando uma perda de 6,7% de especificidade. Alguns estudos apresentaram
menor especificidade. No Brasil, ao avaliar uma técnica de PCR in house, BOLLELA
et al. (1999a) obtiveram uma especificidade de 81%. Já na avaliação final dos
trabalhos analisados por SUFFYS et al. (2000), a especificidade foi de apenas
71,6%.
Discussão
________________________________________________________________________
67
O método utilizado em nosso estudo é descrito como altamente sensível (WOLK et
al., 2001; IEVEN & GOOSSENS, 1997; PERSING, 1991) e, se considerarmos este
fato, a chance do aparecimento de resultados falso-positivos é proporcionalmente
maior. Em nossa pesquisa, as estratégias recomendadas para o controle de falso-
positivos foram rigorosamente seguidas, dentre elas a separação física das áreas de
preparo da amostra, dos reagentes da reação e dos procedimentos pós-amplificação;
utilização de cabines de segurança biológica, luvas, materiais descartáveis e
aplicação de boas práticas laboratoriais (WOLK et al., 2001; TANG & PERSING,
1999). Este fato, aliado ao critério utilizado para identificação de cepa de M.
tuberculosis, baseado somente nos métodos fenotípicos, nos faz questionar se esse
resultado tenha ocorrido devido a uma contaminação laboratorial e/ou a uma
inespecificidade do primer.
Quando o desempenho de um novo método diagnóstico é avaliado, o rendimento do
teste diagnóstico usado como padrão ouro é um parâmetro crítico. A cultura
convencional, como o cultivo em meio de Löwenstein-Jensen ou BACTEC 12B, é
considerada o padrão ouro para a detecção de M. tuberculosis. O método BACTEC
tem apresentado sensibilidade e especificidade acima de 90% (CASAL et al., 1997;
STAGER et al., 1991; ROBERTS et al., 1983). No entanto, quando procedimentos
de amplificação de ácidos nucléicos são utilizados, o diagnóstico clínico deve
também ser considerado. A cultura identificada como NTM que apresentou o
resultado de PCR positivo foi proveniente de um paciente em tratamento contra
tuberculose há dois meses, em decorrência de diagnóstico confirmado da doença.
Na época do diagnóstico, uma das amostras de escarro deste paciente, submetida
ao exame microbiológico, foi incluída no nosso estudo e apresentou resultado
positivo através da PCR IS6110. Assim, é possível que o resultado de PCR falso-
positivo seja proveniente de uma cultura mista de NTM e M. tuberculosis, cuja
quantidade não tenha sido detectada através do cultivo, devido à sua menor
sensibilidade. Neste caso, o resultado positivo de amplificação estaria correto.
Infelizmente, em decorrência de uma falha no processo de armazenamento do DNA
extraído desta cultura, não foi possível confirmar esse resultado de PCR.
Discussão
________________________________________________________________________
68
Uma outra explicação para o fato é a presença de bacilos inviáveis na amostra do
paciente. Esta situação é comum, visto que a PCR é capaz de detectar o material
genético de microrganismos mortos, comumente presentes em pacientes sob
tratamento quimioterápico. Na literatura, são encontrados vários estudos que
relatam a persistência de positividade da PCR durante e após o tratamento
quimioterápico (YUEN, 1993). Em 2001, KAUL observou resultados de PCR
positivos em amostras de pacientes dois anos após terminada a terapia (dados não
publicados). Em um estudo conduzido por RAJALAHTI et al. (2001), o tempo de
conversão do resultado positivo de PCR após o início de tratamento foi, em média,
de 110 dias. Assim sendo, a utilização da PCR para monitoramento do tratamento
de pacientes com tuberculose não é recomendada. Inicialmente, este fato não foi
considerado no planejamento de nosso estudo, que incluiu amostras de escarro
provenientes de pacientes não diagnosticados e de pacientes previamente
diagnosticados em tratamento. De acordo com nossos resultados, a utilização da
técnica de PCR IS6110 em amostras provenientes de pacientes submetidos à
terapia contra tuberculose não é aconselhável. Além deste fato, os resultados de
PCR devem ser interpretados juntamente com os dados clínicos do paciente, como
demonstrado por LIM et al. (2003). No estudo de QUEROL et al. (1995), a
especificidade da PCR in house em relação ao diagnóstico clínico inicial de
tuberculose foi de 100%, sendo que, ao se considerar somente a cultura como
diagnóstico de tuberculose, a especificidade foi de 90,5%.
A capacidade de um teste diagnóstico em detectar rapidamente o M. tuberculosis
em amostras com baciloscopia negativa, a partir de pacientes com suspeita clínica
de tuberculose pulmonar, é de relevância evidente. Um estudo retrospectivo
realizado por CONATY et al. (2005) encontrou forte relação entre o resultado de
amplificação positivo em amostras paucibacilares e o valor diagnóstico do teste.
Segundo SCHLUGER (1996), o desenvolvimento de técnicas de PCR sensíveis e
específicas para o diagnóstico da forma paucibacilar de tuberculose pulmonar terá
grande impacto na prática clínica, ao possibilitar a instituição precoce de terapia
adequada, além de reduzir a necessidade de técnicas invasivas para o diagnóstico
dessa forma da doença. Entretanto, muitos estudos demonstram que os métodos
atuais de diagnóstico apresentam baixa sensibilidade (de 50% a 71%) em amostras
com baciloscopia negativa (SARMIENTO et al., 2003). Em nosso estudo, a alta
Discussão
________________________________________________________________________
69
sensibilidade da PCR IS6110 foi especialmente relevante para as 44 culturas de M.
tuberculosis cujas amostras apresentaram baciloscopia negativa, sendo que todas
as 44 (100%) foram identificadas pela técnica de PCR.
Na expectativa de se obter uma rápida identificação de micobactérias pertencentes
ao Complexo M. tuberculosis, o desempenho dos métodos moleculares em culturas
positivas de meios 12B tem sido avaliado através de vários estudos. Dentre os
métodos comerciais, a tecnologia das sondas genéticas é a mais utilizada,
apresentando sensibilidades entre 83,0% e 100% (DESMOND & LORETZ, 2001;
PIERSIMONI et al., 2001; BERGMANN & WOODS, 1999; PETERSON et al., 1989).
Com o mesmo objetivo, o teste AMPLICOR
®
MTB também tem sido avaliado,
obtendo sensibilidades entre 92,0% e 100%, e especificidades entre 97,6% e 100%
(NINET et al., 1999; HERNANDEZ et al., 1997; SMITH et al., 1997).
Apesar dos bons resultados apresentados, os métodos moleculares comerciais
possuem algumas desvantagens, além de serem relativamente caros. No caso das
sondas genéticas, alguns estudos demonstraram que podem ocorrer reações
cruzadas entre a sonda utilizada para identificação do bacilo e o DNA de
micobactérias não pertencentes ao Complexo M. tuberculosis, como o M. cellatum
(BUTLER et al., 1994), M. avium e M. terrae (LIM et al., 1991). Somando-se a este
fato, a utilização deste método ainda requer uma quantidade mínima de 10
5
bacilos
puros em cultura (AMERICAN THORACIC SOCIETY, 2000). Em seus trabalhos,
DESMOND & LORETZ (2001) e BERGMANN & WOODS (1999) descreveram que
os métodos moleculares foram aplicados em meios 12B com índices de crescimento
iguais ou maiores a 10 e 50, respectivamente. No entanto, os autores não
especificaram os índices de crescimento dos cultivos que apresentaram identificação
molecular positiva. Em 1990, BODY et al. demonstraram que a sensibilidade do
método de sondas genéticas aplicado em cultivos de meios 12B, com índices de
crescimento entre 400 e 999, foi de 70%. Uma redução significativa da sensibilidade
ocorreu quando os índices de crescimento foram menores a 400, e o método
detectou apenas 33% das culturas de M. tuberculosis. Segundo recomendações do
fabricante, para o teste AccuProbe
®
ser realizado a partir do meio 12B, este deve
apresentar turbidez equivalente ou maior que o padrão número um da escala de
Discussão
________________________________________________________________________
70
McFarland (BADAK et al., 1999), o que corresponde a uma quantidade mínima de 3
x 10
8
UFC / mL (BOLLELA et al., 1999b).
Em nosso trabalho, o índice de crescimento foi menor do que 50 em 30,76% (28 de
91) das culturas com resultado de PCR positivo. A técnica de PCR IS6110 foi capaz
de detectar e amplificar o DNA em cultivos contendo, aproximadamente, 1 x 10
3
UFC/mL (SIDIQQI,1989), o que ratifica a excelente sensibilidade desta técnica.
FORBES & HICKS (1994) obtiveram resultado semelhante através de uma técnica
de PCR in house. Como pretendíamos avaliar o desempenho da PCR IS6110 a
partir de diversos índices de crescimento dos meios 12B, o intervalo dos ICs
submetido à amplificação foi amplo. O maior IC testado foi 583. Acreditamos que a
porcentagem citada acima seria maior, caso a seleção dos meios 12B submetidos à
amplificação contemplasse maior número de cultivos com IC ≤ 50.
Devido à praticidade e visando otimizar custos, a freqüência com que as reações de
amplificação de nosso estudo foram realizadas foi determinada pela demanda dos
cultivos selecionados. Portanto, nem todas as amostras foram submetidas à PCR no
mesmo dia em que suas alíquotas foram retiradas dos meios 12B. No entanto, para
avaliarmos a diferença entre o tempo de identificação através dos métodos
fenotípicos e molecular, consideramos que a PCR foi realizada no mesmo dia da
seleção da amostra, visto que o tempo total entre a extração do DNA e o resultado
final da PCR é de aproximadamente um dia. Assim sendo, a utilização da PCR
IS6110 resultou em um tempo médio de detecção e identificação de 16,4 dias, a
partir do processamento e inoculação do espécime clínico, comparados aos 26,1
dias necessários para a identificação fenotípica do bacilo através do NAP, com uma
diferença significativa de 9,7 dias entre os dois métodos. Tempo de identificação
semelhante foi encontrado por BERGMANN & WOODS (1999) e SMITH et al. (1997).
A identificação molecular de M. tuberculosis nas 44 culturas, cuja baciloscopia do
escarro foi negativa, ocorreu, em média, 5,5 dias mais rápido que a identificação
fenotípica. Se analisarmos somente os 87 meios 12B cuja microscopia evidenciou
presença exclusiva de BAAR, o tempo médio de identificação é reduzido para 11,6
dias, cerca de quatro dias mais rápido quando comparado à identificação pelo NAP.
Discussão
________________________________________________________________________
71
No estudo de FORBES & HICKS (1994), a incorporação da PCR na rotina
laboratorial resultou em uma significativa redução de 15 dias no tempo de
identificação do bacilo.
Do total de 107 culturas de meios 12B analisadas em nosso estudo, sete (8,4%)
apresentaram crescimento exclusivo de outros microrganismos que não
micobactérias. Os índices de crescimento apresentados por estes cultivos variaram
entre 30 e 167. A PCR IS6110 foi negativa em todos os 7 cultivos em meios 12B.
Este fato demonstra, mais uma vez, que os primers IS6B e IS7B são específicos
para a amplificação da região IS6110 e, ainda, que não ocorreu reação cruzada com
o DNA dos microrganismos presentes nestes cultivos.
Ressaltamos ainda que de todos os 107 meios 12B analisados, cinco culturas
(4,67%) apresentaram crescimento concomitante de BAAR com microrganismos
contaminantes. A relevância da utilização da PCR IS6110 na redução do tempo de
identificação do bacilo foi demonstrada, sobretudo, nestes cultivos, visto que a
técnica foi eficaz na detecção direta do M. tuberculosis em três destas culturas
mistas. A identificação pelo método molecular foi, em média, 14 dias mais rápida,
quando comparada à identificação fenotípica, cuja realização foi possível somente
após novos procedimentos de descontaminação e incubação. Utilizando um método
de amplificação comercial em culturas de meios 12B contaminadas, ZHENG et al.
(2001) reduziram o tempo de identificação do bacilo em 12 dias. No entanto, o teste
apresentou uma reação falso-positiva com M. cellatum. Embora com objetivos
diferentes, LIMA et al. (2005) demonstraram que a utilização de PCR possibilitou a
identificação rápida de 96% das micobactérias presentes em culturas de escarro
contaminadas no meio de Löwenstein-Jensen. Devemos enfatizar que em razão do
reduzido número de culturas mistas ocorridas em nosso estudo e diante dos bons
resultados obtidos, seria interessante a realização de outros estudos dirigidos
especificamente a este propósito.
A contaminação microbiana presente em duas das cinco culturas mistas de nosso
trabalho não permitiu a identificação fenotípica da espécie micobacteriana presente
nestas amostras, apesar das mesmas terem sido submetidas a novo processo de
descontaminação. A PCR de ambos os cultivos foi negativa e este resultado foi
Discussão
________________________________________________________________________
72
confirmado através de nova amplificação. Estas culturas foram procedentes de
pacientes com diagnóstico confirmado de tuberculose e sob terapia
antimicobacteriana há cinco meses. Diante de todos os resultados obtidos em nosso
estudo, supomos que a não amplificação dessas amostras represente a ausência de
M. tuberculosis nas mesmas. Porém, de acordo com WILSON (1997), além da
presença de substâncias inibidoras, outros fatores, como degradação do DNA,
extração ineficaz e distribuição não homogênea do microrganismo na amostra,
podem resultar em PCR negativa. Infelizmente, em decorrência de um erro de
planejamento, a não inclusão de um controle interno da amplificação em nossas
reações acarretou a impossibilidade de chegarmos a uma conclusão definitiva sobre
a identificação molecular das duas culturas acima descritas, já que a ausência de
amplificação nem sempre indica a inexistência do bacilo na amostra
(ROSENSTRAUS et al.,1998). Apesar deste fato, acreditamos que os demais
resultados negativos de PCR obtidos em nosso trabalho sejam fidedignos, sobretudo
em decorrência da ótima sensibilidade apresentada pela PCR IS6110 e do alto grau
de concordância entre os métodos de identificação.
Convém salientar ainda que dentre os três cultivos mistos que apresentaram
resultado de PCR positivo, dois foram provenientes de amostras de escarro com
baciloscopia negativa. Em uma destas culturas, o crescimento microbiano foi
detectado apenas um dia após a inoculação da amostra clínica no meio 12B. A
excelente sensibilidade da técnica foi efetivamente demonstrada através da
identificação molecular do bacilo neste cultivo, cujo IC foi de 56, indicando que a
presença do DNA de microrganismos contaminantes não interferiu na eficácia da
amplificação.
Apesar de ser uma técnica promissora para um diagnóstico rápido de tuberculose
(CLEEF et al.,2005) , em países em desenvolvimento, como o Brasil, a avaliação de
técnicas de PCR para o diagnóstico da doença não tem sido priorizada,
principalmente devido à ausência de informações acerca de sua pertinência clínica
e/ou de sua relação de custo-efetividade.
Os resultados obtidos em nosso estudo demonstram a eficácia da PCR IS6110 na
identificação rápida de M. tuberculosis em cultivos de meios 12B e evidenciam a
Discussão
________________________________________________________________________
73
relevância da técnica no diagnóstico precoce da tuberculose pulmonar, sobretudo
em pacientes paucibacilíferos. Acreditamos que os benefícios resultantes da
utilização da PCR IS6110, associados à rapidez e à simplicidade do protocolo de
amplificação, viabilizem a incorporação da mesma à rotina de laboratórios de
microbiologia clínica, principalmente em locais onde o diagnóstico molecular de
outras doenças infecciosas esteja estabelecido.
VI. Conclusões
Conclusões
________________________________________________________________________
75
6 CONCLUSÕES
De acordo com os nossos resultados, podemos concluir que:
1.
Os primers IS6B e IS7B são específicos para a amplificação do fragmento
de 123pb da seqüência de inserção IS6110;
2. Os métodos de identificação molecular e fenotípicos apresentam elevado grau
de concordância;
3. A utilização da PCR IS6110 diminui significativamente o tempo de
identificação do M. tuberculosis em culturas, quando comparado aos métodos
fenotípicos;
4. O método de PCR IS6110 é eficiente na identificação direta do M. tuberculosis
em meio BACTEC 12B, sobretudo em culturas que apresentem crescimento
concomitante do bacilo com microrganismos contaminantes;
5. A PCR IS6110 constitui uma técnica importante na confirmação precoce do
diagnóstico de tuberculose pulmonar, principalmente das formas
paucibacilares da doença;
6. A PCR IS6110 pode ser particularmente útil na exclusão do Complexo M.
tuberculosis em culturas cujas amostras de escarro sejam provenientes de
pacientes infectados com outras espécies de micobactérias.
VII. Referências
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