( PDF ) Avaliação do crescimento de poucas colônias de Mycobacterium tuberculosis em meio de cultura sólido como indicador de contaminação cruzada, utilizando técnicas de tipagem molecular

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DOENÇAS INFECCIOSAS

Fabíola Karla Corrêa Ribeiro

AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO DE POUCAS COLÔNIAS DE

Mycobacterium

tuberculosis

EM MEIO DE CULTURA SÓLIDO COMO INDICADOR DE

CONTAMINAÇÃO CRUZADA, UTILIZANDO TÉCNICAS DE TIPAGEM

MOLECULAR

Vitória

2006

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Milhares de livros grátis para download.

Fabíola Karla Corrêa Ribeiro

AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO DE POUCAS COLÔNIAS DE

Mycobacterium

tuberculosis

EM MEIO DE CULTURA SÓLIDO COMO INDICADOR DE

CONTAMINAÇÃO CRUZADA, UTILIZANDO TÉCNICAS DE TIPAGEM

MOLECULAR

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Doenças Infecciosas do

Centro de Ciências da Saúde da Universidade

Federal do Espírito Santo, como requisito parcial

para obtenção do Grau de Mestre em Doenças

Infecciosas.

Orientador: Prof. Dr. Moisés Palaci

Co-orientadora: Prof

. Dr

. Elenice Moreira Lemos

Vitória

2006

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Aos meus pais, que sempre acreditaram em mim, e nunca

pouparam esforços, fazendo o possível, e muitas vezes até o

impossível, para que eu jamais deixasse de trilhar os caminhos

do conhecimento.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por andar sempre ao meu lado dia e noite, por me encher de bênçãos todos

os dias sem que eu ao menos tenha que pedir e por me carregar no colo quando o

fardo parece pesado demais.

Ao Prof. Dr. Moisés Palaci, minha profunda gratidão. Inicialmente, por ter acreditado

na minha capacidade e me acolhido como parte da sua equipe: seus ensinamentos

fizeram de mim uma verdadeira profissional. E nestes dois últimos anos, pela sua

orientação: obrigada por me fazer acreditar que sempre posso ir mais além.

À Prof

Elenice Moreira Lemos, mais do que co-orientadora, uma amiga sempre

presente, solícita e disposta a somar com seus conhecimentos. Obrigada pelo seu

apoio constante, carinho e orientação.

Ao Prof. Dr. Reynaldo Dietze, coordenador do Núcleo de Doenças Infecciosas, por

ter me dado a primeira oportunidade de atuar como profissional e por enxergar em

nós pesquisadores competentes.

Ao Dr. David Jamil Haddad, pela ajuda na análise dos dados clínicos dos pacientes

e pelas sugestões valiosas no decorrer deste estudo.

À Prof

Sylvia Cardoso Leão, da Universidade Federal de São Paulo, por ter me

recebido tão carinhosamente em seu laboratório para que eu pudesse realizar os

experimentos finais desta pesquisa.

A Cristina e Michelle, que fazem parte da equipe da Prof

Sylvia, pela paciência,

atenção e boa vontade ao me ensinarem o RFLP, e por tornarem minha estadia

mais gostosa me acompanhando nos lanchinhos da tarde.

Aos meus pais, Nair Corrêa Ribeiro e Manoel Gomes Ribeiro, por terem me

ensinado que nada na vida se consegue sem esforço.

Ao meu esposo Albertone Sant`Ana Pereira, todo o meu amor e admiração.

Obrigada pela sua paciência, compreensão, carinho e incentivo ao longo destes dois

anos e por tornar minha vida mais feliz e meus dias mais amenos.

Aos meus irmãos, Pollyana e Fábio, pelo amor e confiança que sempre tiveram em

mim. A Gabriel, meu anjinho da guarda de plantão, capaz de transformar, em um

segundo, uma ruga em um sorriso.

A Renata Lyrio Peres, minha querida amiga, meus mais sinceros agradecimentos

por seu desprendimento, apoio e solidariedade. Sem a sua ajuda, sempre me dando

respaldo nos momentos mais difíceis, não teria sido possível realizar este trabalho.

Espero um dia poder retribuir da mesma forma.

A Tatiana de Resende Có, amiga fiel de todas as horas, dentro e fora do NDI.

Obrigada por estar sempre pronta a ouvir, pelos conselhos, pela força e... vamos

superar mais esta fase amiga!

Aos meus amigos do Laboratório de TB: João, Maria, Solange, Gustavo, Hildete,

Rafael, por estarem sempre presentes nos momentos em que precisei e por

tornarem nossos dias de trabalho tão mais divertidos!

Às amigas da Carga Viral: Carlinha, Valéria e Eneida pela torcida constante e pelo

“bom-dia” sempre tão animado.

Aos colegas dos outros laboratórios: Marcela, Jauber, Bianca, Cris, Ketene, Rômulo,

pessoas de bem com a vida, sempre prontos a dar uma palavra de estímulo.

A todos os funcionários do NDI, pelos sorrisos no corredor, pelo bate-papo na

cozinha, enfim, por fazerem deste lugar um ambiente sempre alegre.

Aos nossos professores, por terem dividido conosco seus conhecimentos e por

terem nos incentivado a dar sempre o melhor de nós.

Aos colegas de turma que partilharam comigo novos ensinamentos e tantas

experiências. Juntos fizemos das aulas momentos de aprendizado, mas também de

descontração.

Aos amigos do Movimento de Cursilhos de Cristandade. Nossos encontros semanais

me enchem de coragem e esperança para superar os obstáculos que encontro pelo

caminho.

Aos pacientes com tuberculose que, indiretamente, participaram desta pesquisa e

que depositam em nós a esperança de viverem dias melhores.

“Debaixo do céu há momento para tudo, e tempo certo

para cada coisa: Tempo para nascer e tempo para

morrer. Tempo para plantar e tempo para arrancar a

planta. Tempo para matar e tempo para curar. Tempo

para destruir e tempo para construir. Tempo para chorar e

tempo para rir. Tempo para gemer e tempo para bailar.

Tempo para atirar pedras e tempo para recolher pedras.

Tempo para abraçar e tempo para se separar. Tempo

para procurar e tempo para perder. Tempo para guardar

e tempo para jogar fora. Tempo para rasgar e tempo para

costurar. Tempo para calar e tempo para falar. Tempo

para amar e tempo para odiar. Tempo para a guerra e

tempo para a paz.”

Eclesiastes 3, 1-8

RESUMO

Apesar da importância do diagnóstico clínico, da baciloscopia, e das técnicas

inovadoras de biologia molecular, a cultura positiva em meio sólido e/ou líquido

continua sendo o padrão-ouro para o diagnóstico definitivo da tuberculose (TB).

Entretanto, nos últimos anos, a utilização de métodos moleculares proporcionou um

aumento na detecção de episódios de contaminação cruzada que, na maioria das

vezes, estão relacionados a procedimentos laboratoriais. Alguns critérios são

considerados indicadores de contaminação cruzada: resultado positivo de apenas

uma das culturas do paciente, resultado de cultura não compatível com a história

clínica do paciente, observação de um padrão inesperado de resistência a drogas na

cepa isolada e o crescimento de poucas colônias de M. tuberculosis em meio sólido.

No entanto, culturas de pacientes paucibacilíferos, infectados pelo HIV ou em

tratamento, também podem apresentar as mesmas características descritas acima.

No presente estudo, avaliamos se o crescimento de poucas colônias em meio de

cultura sólido pode ser considerado um indicador de contaminação cruzada,

utilizando técnicas de tipagem molecular (RAPET e RFLP). De Janeiro de 2003 a

Janeiro de 2005, foram avaliadas 109 cepas isoladas de culturas (UFC < 20)

provenientes de 97 pacientes e processadas em 94 diferentes dias. O índice de

falso-positividade encontrado neste estudo foi de 1,8% e 2,0% por amostras e por

pacientes, respectivamente. Estes resultados sugerem que crescimento de poucas

colônias em meio sólido não pode ser considerado um marcador de contaminação

cruzada, especialmente em laboratórios de micobacteriologia que realizam ensaios

clínicos e/ou desenvolvem suas atividades seguindo as normas de Boas Práticas

Clínicas e Laboratoriais. Também foi demonstrado que a técnica RAPET modificada

é um método rápido (realizado em 1-2 dias), reprodutível e valioso na identificação

de possíveis episódios de contaminação cruzada.

ABSTRACT

For many years, it has been thought that a positive culture of Mycobacterium

tuberculosis is a definitive diagnostic evidence of tuberculosis (TB). However, the

recent use of molecular tools have resulted in increased recognition of cross-

contamination events linked, most of the times, to laboratory procedures. Features of

cross-contamination include: culture results not consistent with the clinical course of

the patient, isolates with unexpected drug resistance, single culture-positive

specimen and low colony count on solid medium. Nonetheless, true-positive cultures

of specimens from some groups of patients (with preliminary active pulmonary

tuberculosis, HIV infection, or under treatment) can also have some of the

characteristics outlined above. The evaluation of low-yield growth cultures as a

microbiological marker of cross-contamination would be very helpful in confirming or

excluding TB cases. In the present study, we assessed whether or not low-yield

growth cultures could be considered a cross-contamination marker, using molecular

typing methods (RAPET e RFLP). From January 2003 to January 2005, we

evaluated 109 low-yield growth cultures (less than 20 colonies) from 97 patients that

were processed in 94 different days. The false-positive rate found in this study was of

1,8% and 2,0% per samples and patients, respectively. These results suggest that

low-yield growth cultures do not seem to be a considerable marker for cross-

contamination, especially in a clinical trial mycobacteriology laboratory or in

laboratories working under the good laboratory and clinical practices (GLCP). It has

also been shown that the modified RAPET method is rapid (1 to 2 days),

reproducible, and valuable in identifying episodes of possible laboratory cross-

contamination.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1.

Dados relativos aos grupos avaliados....................................... 38

Tabela 2.

Análise comparativa entre as técnicas de DRE-PCR e RAPET...

Tabela 3.

Dados bacteriológicos das cepas isoladas nos dias em que

foram detectados possíveis casos de contaminação cruzada

(Grupo A)......................................................................................

Tabela 4.

Dados bacteriológicos das cepas isoladas nos dias em que

foram detectados possíveis casos de contaminação cruzada

(Grupo B)......................................................................................

Tabela 5.

Índice de contaminação cruzada nos grupos de pacientes

avaliados no estudo......................................................................

Tabela 6.

Índice de contaminação cruzada em amostras de pacientes s

investigação diagnóstica e em tratamento...................................

Tabela 7.

Contaminação cruzada em relação à presença de única cultura

positiva do paciente e o número de colônias isoladas na

mesma..........................................................................................

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.

Fluxograma de seleção das cepas utilizadas no estudo...............

Figura 2.

Perfis genéticos de cepas de M. tuberculosis

definidos pelo

método (A) DRE-PCR, (B) RAPET –

antes da digestão do

produto de PCR pela enzima HaeIII e (C) RAPET –

após a

digestão do produto de PCR pela enzima HaeIII.........................

Figura 3.

Perfis genéticos da cepa padrão H37Rv definidos pelo mét

odo

RAPET (A) antes da digestão do produto de PCR pela enzima

Hae

III e (B) após a digestão do produto de PCR pela enzima

Hae

III, após amplificação da mesma em diferentes

reações.........................................................................................

Figura 4.

Perfis genéticos de pares de cepas de diferentes pacientes

definidos pelo método RAPET.....................................................

Figura 5. Perfis genéticos de cepas de M. tuberculosis

pertencentes ao

Gru

po A, definidos pelo método RAPET (A) antes da digestão

do produto de PCR pela enzima Hae

III e (B) após a digestão do

produto de PCR pela enzima HaeIII.............................................

Figura 6.

Perfis genéticos de cepas de M. tuberculosis

pertencentes ao

Grupo B, definidos pelo método RAPET (A) antes da digestão

do produto de PCR pela enzima Hae

III e (B) após a digestão do

produto de PCR pela enzima HaeIII.............................................

Figura 7.

Perfis genéticos de cepas de M. tuberculosis

pertencentes aos

Grupo A e B, definidos pelo método RFLP..................................

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Anti-TB:

anti-tuberculose

BCG:

Bacilo de Calmette-Guérin, variante atenuada do Mycobacterium bovis

CDC:

Centers for Disease Control and Prevention

gás carbônico

DNA:

Ácido desoxiribonucleico

DRE-PCR: Double Repetitive Element - Polimerase Chain Reaction

HIV:

Vírus da Imunodeficiência Humana

HUCAM:

Hospital Universitário Cassiano Antônio Moraes

6110:

Sequência de inserção 6110

Kb:

Kilo-base

Mtb/HIV:

co-infecção Mycobacterium tuberculosis/Vírus da imunodeficiência humana

NDI: Núcleo de Doenças Infecciosas

oxigênio

OMS:

Organização Mundial de Saúde

pb: pares de base

PCR:

Reação em Cadeia da Polimerase

RAPET:

Rapid PCR-based Epidemiological Typing Method

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

r.p.m:

Rotações por minuto

SIDA:

Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

TB:

Tuberculose

UFC:

Unidade Formadora de Colônia

UFES:

Universidade Federal do Espírito Santo

WHO:

World Health Organization

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO

…………………………………………………………………

1.1 Tuberculose……………………………………………………..………..…......

1.1.1 Aspectos Epidemiológicos.................................................

.........................

1.1.2 Etiologia e transmissão da infecção...........................................................

1.1.3 Características gerais da doença...............................................................

1.2 Diagnóstico................................................................................................

1.2.1

Diagnóstico clínico......................................................................................

1.2.2 Diagnóstico radiológico………………………………………………………...

1.2.3 Diagnóstico bacteriológico ………………………………………………….…

1.2.3.1

Baciloscopia ………………………………………………………..……..…….

1.2.3.2

Amplificação de ácidos nucléicos…………………………………………..…

1.2.3.3

Cultura……………………………………………………………………….…..

1.3

Contaminação cruzada de culturas para micobactérias.............................

1.3.1 Fatores relacionados à contaminação cruzada..........................................

1.3.2

Técnicas de biologia molecular utilizadas para estudo de contaminação

uzada.......................................................................................................

1.3.3 Indicadores de contaminação cruzada…………………….…………………

1.4 Antecedentes e justificativa do Projeto......................................

.................

2 OBJETIVOS…………………………………………………………………….

2.1 Objetivo geral…………………………………………………………..………..

2.2 Objetivos específicos………………………………….………………...……..

3 MATERIAL E MÉTODOS

.................................................

..........................

3.1

Caracterização da amostra.........................................................................

3.2

Processamento dos espécimes clínicos.....................................................

3.3 Identificação das cepas isoladas de culturas positivas..............................

3.4

Subcultivo das cepas..................................................................................

3.5 Double Repetitive Element PCR (DRE-PCR) modificado……………....….

3.5.1 Extração do DNA………………………………………………….……………

3.5.2 PCR………………………………………………………………………………

3.6 Rapid PCR-

based Epidemiological Typing Method (RAPET)

modificado……………………………………………………………..………...

3.6.1 Extração do DNA..................................

......................................................

3.6.2

PCR............................................................................................................

3.6.3 Digestão dos produtos amplificados por enzima de restrição....................

3.7 Restriction Fragment Lengh Polymorphism (RFLP-IS6110) …………..….

3.7.1 Extração e purificação do DNA bacteriano.................................................

3.7.2 Quantificação e digestão............................................................................

3.7.3 Separação e transferência para membrana...............................................

3.7.4

Preparo da sonda genética.........................................................................

3.7.5 Purificação e marcação da sonda de DNA.................................................

3.7.6 Hibridação do DNA bacteriano com a sonda de DNA marcada.................

3.7.7 Detecção.......................................................................

..............................

3.7.8 Análise do perfil genético das cepas..........................................................

3.8 Análise final dos dados............................................................

...................

4 RESULTADOS

…………………………………………………………………

4.1 Análise comparativa do desempenho das técnicas DRE-

PCR e

RAPET.......................................................................................................

4.2 Avaliação da reprodutibilidade da técnica RAPET.....................................

4.3 Investigação de possíveis episódios de Contaminação cruzada

utilizando o método RAPET........................................................................

4.4 Análise molecular dos possíve

is casos de contaminação cruzada

utilizando o método RFLP..........................................................................

4.5

Análise dos dados clínicos e bacteriológicos dos pacientes envolvidos

nos possíveis casos de contaminação cruzada........................................

4.6 Análise final dos resultados………………………………………………..….

5 DISCUSSÃO…………………………………………………………………….

CONCLUSÕES

………………………………………………………………...

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

................................................

..........

ANEXOS

....................................................................................................

Introdução

IntroduçãoIntrodução

Introdução

1 INTRODUÇÃO

1.1 Tuberculose

1.1.1 Aspectos Epidemiológicos

A tuberculose, conhecida no passado como Peste Branca, constitui um grave

problema de saúde pública mundial, especialmente nos países em desenvolvimento.

O aumento na incidência da tuberculose nas últimas duas décadas é atribuído à

deterioração dos sistemas de saúde pública, à pandemia da síndrome da

imunodeficiência adquirida (SIDA), ao surgimento de cepas resistentes aos fármacos

e à grande correlação entre a doença e a pobreza (SEPKOWITZ et al., 1995).

A Organização Mundial de Saúde estima que um terço da população mundial esteja

infectada pelo Mycobacterium tuberculosis. Em 2004, estimou-se a ocorrência de 8,9

milhões de casos novos de tuberculose com um saldo de 1,7 milhões de óbitos. No

Brasil, neste mesmo ano, foram estimados 110.000 casos novos, resultando em um

coeficiente de incidência anual médio de 60 casos/100.000 habitantes. O país ocupa

a décima sexta posição entre os 22 países que abrigam cerca de 80% de todos os

casos de tuberculose no mundo (WHO, 2006). No Estado do Espírito Santo, 1.301

novos casos foram estimados, o que representa uma incidência de 39,4

casos/100.000 habitantes, para todas as formas de tuberculose. A incidência média

do estado está, portanto, abaixo da média nacional e da Região Sudeste, que é de

53 casos/100.000 habitantes/ano (BRASIL, 2006).

Neste cenário epidemiológico, a co-infecção M. tuberculosis/Vírus da

imunodeficiência humana (Mtb/HIV) ocupa lugar de destaque, sendo descrita por

muitos como o “dueto amaldiçoado”, devido ao seu grande impacto econômico e

social (SHARMA et al., 2005). Nos pacientes co-infectados pelo Mtb/HIV, o risco de

desenvolver a tuberculose após a infecção primária é extremamente alto (HAVLIR;

BARNES, 1999; LIBERATO et al., 2004), podendo ainda ocorrer a reativação de

uma infecção latente (NUNN et al., 2005). Diversas evidências sugerem que a co-

infecção Mtb/HIV seja responsável pelo aumento na incidência da tuberculose em

várias regiões do mundo. Nos países em desenvolvimento, a tuberculose representa

a infecção oportunista mais frequente em pacientes HIV/SIDA (NARAIN; LO, 2004).

No Brasil, entre os casos de SIDA notificados pelo Ministério da Saúde, a

tuberculose passou a ocupar, desde 1996, o segundo lugar entre as infecções

oportunistas mais frequentes, sendo superada apenas pela candidíase oral e

suplantando a infecção mais frequente até aquela data, a pneumonia por

Pneumocystis jiroveci (BRASIL, 2000).

Além destes indicadores expressivos e de suas implicações para a humanidade,

existe também uma crescente preocupação com o fenômeno de resistência do M.

tuberculosis às drogas do tratamento (CHAULET et al., 1996; PABLO-MENDES et

al., 1998). Este fenômeno é, em grande parte, justificado pela irregularidade ou

abandono do tratamento, além do alto custo e escassez de drogas alternativas

eficientes contra estes microrganismos; e responsável por diminuir, de forma

acentuada, a probabilidade de cura dos doentes acometidos pelos mesmos.

1.1.2 Etiologia e transmissão da infecção

O termo “tuberculose” foi possivelmente utilizado pela primeira vez por Shönlein em

1839 (GRANGE, 1996). Esta denominação tornou obsoletos os termos “Tísica” ou

“Consumpção”, antes utilizados em alusão à exuberante caquexia característica dos

estágios mais avançados desta enfermidade. Um dos mais significativos e completos

estudos sobre a tuberculose foi realizado pelo cientista alemão Robert Koch. Em

1882, Koch apresentou à comunidade científica o isolamento e forma de cultivo, a

partir de trabéculos macerados, do Mycobacterium tuberculosis, identificado como o

agente etiológico da doença, e que ficou mais conhecido como bacilo de Koch. Por

sua contribuição científica, Koch recebeu o prêmio Nobel de Medicina em 1905. O

bacilo de Hansen, descoberto alguns anos antes, e o bacilo da tuberculose foram as

primeiras espécies incluídas no gênero Mycobacterium, descrito, taxonomicamente,

por Lehmann e Neumman em 1896 (LEHMANN; NEUMMAN, 1896; apud GRANGE,

1996).

O gênero Mycobacterium compreende pequenos microrganismos em forma de

bastão, com dimensões de 0,2-0,7 x 1,0-10 µm, que não possuem flagelos, não

formam esporos e não possuem cápsula. Estes microrganismos diferem dos demais

gêneros bacterianos em uma série de aspectos, muitos dos quais relacionados à

composição de sua parede celular, formada por uma grande quantidade e variedade

de lipídeos. Estima-se que, aproximadamente, 60% do peso seco sejam devidos a

ácidos graxos tais como ácidos micólicos e ceras, o que lhe confere resistência

peculiar ao álcool-ácido, evidenciada pela técnica de coloração de Ziehl-Neelsen, e

resistência a álcalis, ácidos, antissépticos e a um amplo espectro de antibióticos

(WAYNE; KUBICA, 1986).

Apesar da abundância de espécies existentes no gênero, apenas algumas

representantes do mesmo se adaptaram a algum tipo de hospedeiro ou se tornaram

patogênicas para animais e humanos. Dentre as que merecem destaque, está o M.

tuberculosis que, sem hospedeiros intermediários, reservatórios no meio ambiente

ou vetores, encontrou no homem o seu reservatório natural e mantenedor da

espécie (WOLINSKY, 1979).

O M. tuberculosis é um bacilo aeróbio estrito, considerado intracelular facultativo por

sua capacidade de multiplicar e sobreviver no interior de células fagocitárias. Seu

tempo de geração é longo, de aproximadamente 18 horas, em temperaturas

próximas a 37ºC. Isso explica a predileção desta bactéria pelos pulmões (devido à

tensão de oxigênio existente neste orgãos), e a demora na sua detecção em meios

de cultura e na ação eficiente das drogas utilizadas no tratamento.

Os indivíduos portadores da tuberculose pulmonar são classificados como bacilíferos

e não-bacilíferos. Os indivíduos bacilíferos são assim denominados por eliminarem

uma quantidade superior a 5.000bacilos/ml de escarro, o que permite a detecção

destes microrganismos pela baciloscopia. Os indivíduos denominados não-

bacilíferos, ou paucibacilíferos, eliminam menores quantidades de bacilos no

escarro, resultando na não detecção dos mesmos pela baciloscopia. É importante

ressaltar ainda, que alguns estudos relatam a existência de uma correlação positiva

entre a quantidade de bacilos eliminados pelo paciente e a extensão da doença (KIM

et al., 1984; CÓ et al., 2004).

A principal fonte de infecção humana é o indíviduo portador da forma pulmonar

bacilífera da tuberculose, ou seja, aquele que elimina bacilos no escarro. Ao falar ou

tossir, esse indivíduo lança no ar gotículas contaminadas de tamanhos variados que

podem ser inaladas pelos seus contactantes. Apenas as gotículas com diâmetro de

2 a 10µm e poucos bacilos (1 ou 2) conseguem alcançar os bronquíolos e alvéolos

pulmonares onde iniciam sua multiplicação. As gotículas maiores são depositadas

no trajeto bifurcado da árvore traqueobrônquica e eliminadas pelo mecanismo de

defesa mucociliar, sendo deglutidas, inativadas pelo suco gástrico e eliminadas

pelas fezes (TARANTINO; LEITÃO DE OLIVEIRA, 1990).

Do ponto de vista epidemiológico, os indivíduos de uma população podem ser

classificados em diferentes categorias, segundo suas relações com o agente causal

e o ambiente, e em função dos mecanismos patogenéticos da doença. Segundo

Arantes (1985), o modelo epidemiológico da história natural da tuberculose é

constituído pelos seguintes grupos de indivíduos: não infectados, recém-infectados,

doentes primários, doentes não-primários, antigos infectados, ex-doentes e crônicos.

Indivíduos não infectados podem tornar-se recém-infectados dependendo do tipo e

da intensidade do contato a que forem submetidos. A grande maioria dos infectados

recentes (cerca de 95%) permanece nesta condição, ou seja, não desenvolve a

doença. Entretanto, a maior parte dos indivíduos que evoluem para a doença

primária, o faz nos dois primeiros anos após a infecção (SMITH; MOSS, 1994).

Fatores como a desnutrição, intensidade do contágio, condições de moradia e uso

de drogas imunossupressoras estão intimamente relacionados com o

comprometimento do estado imunológico do indivíduo e, como consequência, com o

desenvolvimento da tuberculose primária.

1.1.3 Características gerais da doença

A tuberculose é uma síndrome infecciosa de curso crônico, que acomete com maior

frequência os pulmões, e apresenta como principais sinais e sintomas: tosse,

expectoração por mais de 3 semanas, febre baixa e emagrecimento. O quadro

clínico da tuberculose pulmonar pode incluir ainda outras manifestações respiratórias

como dispnéia, dor torácica e hemoptise. Esta doença também pode comprometer

sítios extrapulmonares. Nesse caso, os principais sítios de implantação são aqueles

com maior suprimento sanguíneo e, portanto, de oxigênio, como o córtex renal, o

córtex cerebral, as extremidades de crescimento dos ossos longos, as vértebras e

adrenais. Na tuberculose disseminada ou miliar, ocorre o comprometimento

extensivo dos pulmões, fígado e medula óssea. Algumas condições debilitantes

(desnutrição, idade avançada, estresse), a dependência química (drogas e

alcoolismo), doenças degenerativas e imunossupressoras são consideradas fatores

intrínsecos ao organismo que constituem riscos para o desenvolvimento de ambos

os tipos de tuberculose (FIÚZA DE MELO; AFIUNE, 1993).

1.2 Diagnóstico

O diagnóstico da tuberculose tem como base um conjunto de evidências clínicas,

epidemiológicas e sociais, seguido da confirmação bacteriológica obtida através da

utilização de exames complementares. Os exames utilizados na investigação

diagnóstica da tuberculose podem ser presuntivos ou confirmatórios. Do primeiro

grupo fazem parte os exames radiográficos, bioquímicos, citológicos,

histopatológicos e imunológicos, incluindo as sorologias. O segundo grupo consiste

dos exames bacteriológicos (baciloscopia e cultura), que detectam a bactéria ou

componentes de sua estrutura, e dos testes moleculares, que detectam seqüências

específicas de ácidos nucléicos por intermédio de técnicas de biologia molecular.

Apesar dos avanços tecnológicos e de todos os esforços direcionados à pesquisa de

novas técnicas de diagnóstico, até o momento ainda não foi possível desenvolver

uma técnica simples, rápida, que apresente alta sensibilidade e especificidade, e

que seja capaz de diferenciar pacientes com tuberculose ativa daqueles indivíduos

com tuberculose latente e/ou acometidos por outras doenças.

1.2.1 Diagnóstico clínico

O diagnóstico clínico da tuberculose segue o caminho da anamnese e do exame

físico do paciente. A história familiar, informações sociais, doenças anteriores e a

história de contato prévio com pacientes portadores da doença, constituem dados

importantes, que conduzem à formulação de hipóteses acerca do diagnóstico. É

recomendado que o diagnóstico clínico seja confirmado com o auxílio de exames

complementares, contudo, alguns pacientes podem ser diagnosticados com base

apenas na forte suspeita clínica e resposta ao tratamento anti-TB, mesmo na

ausência da confirmação bacteriológica (CHAN et al., 2000).

1.2.2 Diagnóstico radiográfico

O exame radiográfico do tórax constitui um relevante instrumento diagnóstico, uma

vez que a tuberculose causa anormalidades radiográficas na maioria dos pacientes.

Seu potencial em detectar um caso de doença ativa deve ser reconhecido

principalmente quando existe a suspeita de erro ou atraso na liberação dos

resultados de outros testes e/ou quando estes estão negativos.

Duas situações distintas devem ser consideradas: a tuberculose primária e a

tuberculose pós-primária (ou secundária), pois estas se manifestam, clínica e

radiologicamente, de diferentes formas (DUNLAP et al., 2000). A tuberculose pós-

primária é praticamente exclusiva do adulto, tendo localização preferencial pelos

segmentos dorsais dos lobos superiores e pelos segmentos apicais dos lobos

inferiores. Quanto maior a extensão da doença maior a chance do paciente

apresentar doença cavitária, caracterizada pela presença de um espaço, de pelo

menos 1cm de diâmetro, transparente, contendo ar no parênquima pulmonar,

circundado por um infiltrado ou parede fibrótica de espessura maior que 1mm.

Nas situações em que as apresentações radiográficas são consideradas atípicas

(alguns casos de tuberculose extrapulmonar ou TB/HIV), a tomografia

computadorizada do tórax contribui para demonstrar alterações não visualizadas

através da radiografia.

1.2.3 Diagnóstico bacteriológico

1.2.3.1 Baciloscopia

Nos países em desenvolvimento, a baciloscopia, ou exame direto do escarro, é o

método diagnóstico mais empregado nos serviços de saúde em função de sua

simplicidade, rapidez e baixo custo. A técnica de Ziehl-Neelsen é a mais utilizada e

recomendada pela OMS devido à sua ampla aplicabilidade (WHO, 1998). Entretanto,

desde 1989, o microscópio fluorescente vem substituindo os microscópios

convencionais, principalmente em laboratórios que contam com uma estrutura mais

complexa. Neste caso, a técnica utilizada para realização da baciloscopia utiliza a

auramina como corante. Alguns trabalhos defendem que esta técnica contribui para

o aumento da sensibilidade do exame direto (SALFINGER; MORRIS, 1994;

RICHELDI et al., 1995).

A baciloscopia apresenta boa especificidade em áreas de alta taxa de prevalência,

porém sua sensibilidade é limitada, pois a presença de bacilos só é detectada se

estes estiverem em grande número (5.000 – 10.000bacilos/ml) na amostra

examinada (HOBBY et al, 1973). Como consequência, apenas 34 – 80% dos casos

de tuberculose são diagnosticados por este método, considerado bastante sensível

para a detecção de pacientes com doença cavitária, porém pouco sensível para o

diagnóstico de pacientes paucibacilíferos (BRODIE; SCHLUGER, 2005). No entanto,

um estudo realizado por Behr et al. (1999), na cidade de São Francisco (EUA),

mostra que estes pacientes podem ser responsáveis pela transmissão do M.

tuberculosis em 17% dos casos diagnosticados. Esta é a razão pela qual o resultado

negativo da baciloscopia não elimina o diagnóstico de tuberculose pulmonar ativa,

principalmente quando existe forte suspeita clínica.

1.2.3.2 Amplificação de ácidos nucléicos

As técnicas de amplificação de ácidos nucleicos, que têm como alvo sequências

específicas do DNA das micobactérias, surgiram como uma alternativa promissora

para o diagnóstico da tuberculose (HUGGETT et al., 2003). Estas técnicas podem

ser aplicadas diretamente ao espécime clínico, tornando possível o diagnóstico em

menos de 24 horas (GARG et al., 2003). Apesar de apresentarem, em média,

elevadas sensibilidade e especificidade (95 - 98%) em amostras com baciloscopia

positiva, o seu rendimento diagnóstico é inferior em amostras com baciloscopia

negativa, nas quais a sensibilidade varia de 48 – 53% (FRIEDEN et al., 2003).

Portanto, a interpretação dos resultados obtidos por estas técnicas deve ser feita de

forma cuidadosa, sendo importante destacar que sua utilização não se aplica em

casos de controle de tratamento, nem tampouco substitui a realização da cultura

(RIBEIRO et al., 2004a).

1.2.3.3 Cultura

O cultivo in vitro de micobactérias é considerado um processo fundamental e

bastante eficaz no diagnóstico da tuberculose. A realização da cultura compreende

uma etapa inicial de digestão e descontaminação da amostra, uma etapa de

concentração da amostra por intermédio de centrifugação e, por fim, a inoculação da

mesma no meio de cultura de escolha.

Existem diferentes tipos de meios de cultura disponíveis para o cultivo das

micobactérias. O mais utilizado no Brasil é o de Lowenstein-Jensen, um meio sólido

à base de ovo; porém, o meio de Ogawa (Anexo I), também à base de ovo, vem

sendo utilizado por alguns laboratórios em sua rotina. Outros meios de cultura à

base de ágar, tais como o Middlebrook 7H10 e 7H11, além de meios líquidos, como

o 7H9 e 7H12, também podem ser utilizados para o cultivo destes microrganismos.

Dentre os meios sólidos, o crescimento de colônias nos meios à base de ovo é mais

lento, porém, levemente melhor do que o observado para os meios à base de agar.

Em relação aos meios líquidos, o crescimento nestes se dá mais rapidamente do

que em meios sólidos, mas os mesmos só devem ser utilizados para o isolamento

primário da micobactéria se a eles forem adicionados antibióticos. Por estas razões,

a cultura em meio sólido é o método mais utilizado no diagnóstico da tuberculose.

Entretanto, é necessário um período de 2 a 8 semanas para que se observe o

crescimento de colônias de M. tuberculosis neste meio (FURIN; JOHNSON, 2005).

Além de apresentar alta especificidade, a cultura possui sensibilidade superior à

observada para a baciloscopia. Em geral, a sensibilidade da cultura é de 80-85%,

com especificidade de aproximadamente 98% (MORGAN et al., 1983; ICHIYAMA et

al., 1993). Isto se deve ao fato deste método ser capaz de detectar um pequeno

número de bacilos (10 - 100/ml) na amostra examinada (YEAGER et al., 1967), além

de permitir a identificação da micobactéria isolada. Um estudo realizado na região da

Grande Vitória – Espírito Santo, mostrou que houve um aumento de 23,4% no

diagnóstico bacteriológico de casos novos da doença, a partir do momento em que a

cultura pelo método de Ogawa-Kudoh foi introduzida nos laboratórios das prefeituras

como técnica de rotina complementar ao uso da baciloscopia (RIBEIRO et al.,

2004b).

Existem, ainda, sistemas semi-automatizados, como o BACTEC 460 (Becton

Dickinson, EUA), e automatizados, como o MGIT (Becton Dickinson, EUA),

disponíveis no mercado. O BACTEC 460 é um sistema radiométrico que permite a

detecção do CO

radioativo liberado pela bactéria quando da utilização do ácido

palmítico presente no meio de cultura BACTEC 12B modificado. Já no sistema

MGIT, o consumo de O

é detectado por um sensor fluorimétrico localizado na

extremidade inferior do frasco. Este sistema também utiliza meio líquido, porém a

detecção é não-radioativa. Métodos de cultura semi-automatizados e automatizados

são mais sensíveis que os tradicionais (MITCHISON, 2005) e possibilitam um

diagnóstico mais precoce, com detecção do bacilo entre 7-21 dias (MORGAN et al.,

1983). No entanto, o custo elevado não permite a utilização dos mesmos pela

grande maioria dos serviços de saúde.

1.3 Contaminação cruzada de culturas para micobactérias

Apesar da importância do diagnóstico clínico, da baciloscopia, e das técnicas

inovadoras de biologia molecular, a cultura positiva em meio sólido e/ou líquido

continua sendo o padrão-ouro para o diagnóstico definitivo da tuberculose (BOER et

al., 2002). Com efeito, a cultura é o único método que, além de apresentar alta

sensibilidade, permite ainda o isolamento e a identificação do agente etiológico, a

realização de testes de sensibilidade a drogas, o monitoramento da resposta

terapêutica (o que explica sua ampla utilização em ensaios clínicos) e, se

necessário, a caracterização genotípica destes microrganismos para estudos

epidemiológicos (DUNLAP et al., 2000)

Deste modo, a valorização de uma cultura positiva é de extrema importância para a

confirmação do diagnóstico da doença, principalmente quando o paciente é

paucibacilífero e apresenta lesões iniciais. Entretanto, em alguns casos, uma cultura

positiva pode ser resultado da contaminação cruzada entre amostras de diferentes

pacientes. O termo contaminação cruzada, do anglo-saxão “cross contamination”, é

utilizado para caracterizar a contaminação da amostra de determinado paciente com

microrganismos provenientes da amostra de um outro paciente. Nesse caso, o

resultado da cultura é considerado falso-positivo, e a valorização deste resultado

pode causar muitos transtornos ao paciente, tais como o tratamento desnecessário

com drogas potencialmente tóxicas (BURMAN; REVES, 2000; ORMEROD;

HORSFIELD, 1996), além da submissão do mesmo a outras intervenções médicas,

como hospitalização e procedimentos diagnósticos (BURMAN et al., 1997). É

importante ainda ressaltar as consequências no âmbito sócio-econômico e

emocional: o diagnóstico da tuberculose pode levar à estigmatização, isolamento

social (KELLY, 1999), interrupção das atividades profissionais, além de gerar

despesas excessivas com o tratamento do paciente. Na Holanda, no período de

1995 a 1999, estes gastos foram calculados em mais de U$100.000,00. (BOER et

al., 2002). Também é necessário mencionar que a ocorrência de contaminação

cruzada faz aumentar a estimativa da incidência da doença (CDC, 2000) e reduz a

confiabilidade no laboratório responsável pelo recebimento e processamento dos

espécimes clínicos.

1.3.1 Fatores relacionados à contaminação cruzada

Muitos fatores podem estar relacionados a resultados de cultura falso-positivos. A

contaminação cruzada pode ocorrer desde o momento de coleta e transporte dos

espécimes clínicos até o término do processamento dos mesmos no laboratório.

Durante a coleta do escarro, a utilização de frascos estéreis com tampas de rosca,

que facilitem a vedação dos mesmos, é fundamental para evitar que haja vazamento

e possível contato entre os espécimes, principalmente no momento do transporte. O

vazamento de um dos frascos ou o contato entre eles poderiam ser a causa de uma

contaminação cruzada. Outra grande causa de contaminações é a utilização de

equipamentos contaminados. O broncoscópio de fibra ótica, por exemplo, possui

canalículos delgados, de difícil esterilização, e uma vez contaminado pela

micobactéria de determinado paciente, pode vir a contaminar espécimes de outros

pacientes ou até mesmo infectar pacientes saudáveis (WHEELER et al., 1989;

BROWN et al., 1993; AGERTON et al., 1997).

Após a coleta, a identificação dos recipientes que contêm os espécimes clínicos e/ou

o registro incorreto dos pacientes também são procedimentos que podem gerar

resultados falso-positivos (NITTA et al., 1996; BURMAN et al., 1997).

O processamento destes espécimes no laboratório, para realização de cultura, é um

procedimento importante que inclui a realização de etapas relativamente complexas

(WURTZ et al., 1996). A primeira etapa deste procedimento é a digestão do

espécime clínico, que o torna mais liquefeito. Posteriormente, é realizada a

descontaminação, que tem como objetivo eliminar a microbiota associada que, por

se desenvolver muito mais rapidamente, contamina o meio de cultura e impede a

multiplicação dos bacilos. Esta etapa requer a adição de uma solução

descontaminante ao tubo e, em seguida, sua neutralização e centrifugação. É

necessário, ainda, controlar o tempo gasto em cada uma destas atividades. Por esse

motivo, na tentativa de se otimizar o tempo, os espécimes não são processados

individualmente, mas em conjunto. Porém, quando espécimes positivos e negativos

são processados concomitantemente, o risco de contaminação cruzada é

aumentado (BAUER et al., 1997; CARROLL et al., 2002).

Existem ainda alguns estudos que descrevem a contaminação de culturas através

das agulhas do sistema BACTEC (BURMAN et al., 1997; SMALL et al., 1993a).

Estas agulhas são esterilizadas pelo próprio equipamento no momento da

perfuração de cada frasco durante a leitura dos mesmos e, quando a esterilização

não é obtida, pode ocorrer a contaminação.

Dentre os procedimentos anteriormente citados, o processamento dos espécimes

clínicos no laboratório é o que envolve os maiores riscos de contaminação cruzada.

Durante este procedimento, existe a possibilidade de que bacilos viáveis,

provenientes de amostras positivas, sejam transferidos para as amostras negativas

processadas no mesmo grupo. Esta transferência pode ocorrer através de pipetas

e/ou reagentes contaminados por estes bacilos, pelo contato direto entre os tubos

que contêm as amostras, ou ainda, pelos aerossóis gerados em algumas das etapas

do processo (BURMAN; REVES, 2000).

Vários estudos têm sido realizados com o objetivo de se estimar o índice de

contaminação em laboratórios de micobacteriologia públicos e privados. Burman e

Reves (2000), revisaram 14 estudos sobre contaminação cruzada. Nesta revisão

foram incluídos apenas estudos que avaliaram um número superior a 100 pacientes,

e a média de resultados falso-positivos encontrada foi de 3,1%. Mais recentemente,

Jasmer et al. (2002) relataram que a maioria dos estudos de contaminação cruzada

apresentam índices de falso-positividade que variam entre 0,9% e 3,5%. No entanto,

destacam que estes estudos são retrospectivos e não avaliam a extensão do

problema nos diferentes tipos de laboratórios de pesquisa micobacteriológica.

1.3.2 Técnicas de biologia molecular utilizadas para estudo de contaminação

cruzada

Até a década de 80, os estudos de contaminação cruzada eram realizados com

base nos dados clínicos/radiográficos dos pacientes, nos padrões incomuns de

sensibilidade a drogas, características bioquímicas e fagotipagem das cepas.

Porém, muitas cepas apresentam os mesmos fenótipos bioquímicos e de

sensibilidade. Além disso, a alta incidência de cepas multiresistentes em alguns

hospitais (SMALL et al., 1993b) também limita a utilização de perfis de sensibilidade

para identificação de clusters. A fagotipagem, definida como a caracterização de

uma bactéria pela identificação de sua suscetibilidade a determinados bacteriófagos,

foi por muito tempo utilizada com sucesso para confirmar episódios de contaminação

cruzada (JONES, 1988; MAURER et al., 1984). Embora tenha fornecido um melhor

entendimento sobre a transmissão da tuberculose, esta última técnica apresenta

várias limitações, como o tempo de execução e o número de fagotipos identificáveis

(Van SOOLINGEN; HERMANS, 1995).

Porém, estes marcadores fenotípicos foram substituídos por técnicas de biologia

molecular tais como o DNA fingerprinting. Neste caso, a tipagem das cepas é

baseada na seleção de marcadores genéticos encontrados no cromossomo do M.

tuberculosis. Com base no princípio de que existem diferenças fenotípicas e

genotípicas entre diferentes cepas, mas não em uma mesma cepa, as técnicas de

genotipagem possibilitam a detecção do polimorfismo do DNA entre cepas através

da análise dos perfis genéticos das mesmas.

Atualmente, o “Restriction Fragment Lenght Polymorphism” (RFLP) é considerado o

padrão-ouro para estudos em epidemiologia e patogênese da tuberculose (Van

EMBDEN et al., 1993). Esta técnica se baseia na detecção da sequência de

inserção 6110 (IS6110), pertencente à família IS3 das enterobactérias (McADAM et

al., 1990). A IS6110 é uma sequência longa, composta por 1361 pb, observada

unicamente nas micobactérias do complexo M. tuberculosis (THIERRY et al., 1990)

e caracterizada pela presença de repetições invertidas separadas pelo gene da

transposase. A distribuição desta sequência de inserção, em geral, é aleatória ao

longo do genoma e o número de cópias da IS6110 é espécie- e cepa-dependente,

podendo variar de clones raros, que não possuem nenhuma inserção (Van

SOOLINGEN et al., 1993), àqueles que possuem até 20 cópias, sendo que a maior

parte das cepas de M. tuberculosis possui entre 8 e 15 cópias (KANDUMA et al.,

2003).

A técnica de RFLP é utilizada na diferenciação de cepas de M. tuberculosis, no

monitoramento da transmissão da doença, na identificação de clusters dentro de

uma população, na diferenciação de reinfecção exógena e recidiva, no estudo da

evolução molecular e também na identificação de contaminações intralaboratoriais

(PALOMINO, 2005). Por outro lado, apresenta elevado custo e requer um período de

semanas até a obtenção do resultado final. Isto ocorre porque este método não

envolve uma etapa de amplificação e, dessa forma, é necessário aguardar o

crescimento das culturas para que se obtenha uma quantidade suficiente de DNA

para a realização do teste; o que pode levar de 2 a 6 semanas. Além disso, são

necessários de 3 a 5 dias para a realização do teste.

Devido às dificuldades acima descritas, iniciou-se uma crescente busca por outras

técnicas que tornassem estes estudos mais simples e acessíveis a todos os

laboratórios. Dentre estas, destaca-se o “Double-Repetitive-Element PCR” (DRE-

PCR), descrito por Friedman et al. (1995). Esta técnica tem base na amplificação de

segmentos localizados entre duas seqüências que se repetem ao longo do genoma

do M. tuberculosis: a IS6110 e a seqüência polimórfica rica em GC. O DRE-PCR é

considerado um método rápido, de fácil realização e já utilizado em estudos de

contaminação cruzada (RITACCO et al., 2002; FILHO et al., 2002).

Outras técnicas mais recentes têm associado a PCR ao uso de enzimas de restrição

(PCR-RFLP) criando uma metodologia alternativa para análise genotípica de

diferentes cepas. Dentre estas, a técnica descrita por Yates et al. (2001) e

denominada “Rapid PCR-based Epidemiological Typing Method” (RAPET), tem se

mostrado bastante promissora. Segundo estes autores este é um método rápido

(com obtenção de resultados em 1-2 dias), de fácil realização, reprodutível e com

resultados compatíveis aos obtidos pelo RFLP em estudos de biologia molecular.

1.3.3 Indicadores de contaminação cruzada

Alguns critérios podem ser considerados indicadores de um resultado falso-positivo.

Dentre eles, podemos ressaltar (i) o resultado positivo de apenas uma das culturas

do paciente, (ii) resultado de cultura não compatível com a evolução clínica do

paciente, (iii) a observação de um padrão inesperado de resistência a drogas da

cepa isolada e (iv) o crescimento de poucas colônias de M. tuberculosis em meio

sólido (BURMAN; REVES, 2000).

O resultado positivo de apenas uma das culturas de um mesmo paciente, primeiro

critério citado acima, é considerado o indicador mais sugestivo da ocorrência de

contaminação. Um estudo realizado por Frieden et al. (1996) mostrou que 44% dos

pacientes avaliados por terem uma única cultura positiva, tiveram, na realidade, seus

espécimes contaminados. Este mesmo critério foi responsável pela identificação de

dois surtos de contaminação cruzada que não haviam sido detectados pelos clínicos

e técnicos responsáveis pelos laboratórios avaliados (NIVIN et al., 1998; FINE et al.,

1997). Entretanto, apesar deste ser considerado um critério sensível para a detecção

de culturas falso-positivas, é também pouco específico, pois pacientes

diagnosticados com tuberculose pulmonar ativa também podem ter apenas uma de

suas culturas positiva para o M. tuberculosis (JASMER et al., 2002).

O segundo critério citado como forte indicador de que houve contaminação cruzada

é o resultado positivo de cultura não compatível com a história clínica (sinais e

sintomas) do paciente (FITZPATRICK et al., 2004), principalmente quando observa-

se a melhora clínica do indivíduo sem que este tenha iniciado a terapia com drogas

anti-tuberculose (anti-TB). Este critério foi aplicado em alguns estudos para

investigação da ocorrência de contaminação cruzada e a suspeita foi confirmada

(SMALL et al., 1993b; FISCHL et al., 1992).

A contaminação cruzada também pode ser detectada quando, após a realização do

teste de sensibilidade, observa-se um padrão de resistência a drogas considerado

incomum ou inesperado para a cepa isolada daquele paciente, de acordo com sua

história clínica e epidemiológica (WURTZ et al., 1996), o que caracteriza o terceiro

critério citado acima. Neste caso, se a contaminação for detectada, é possível evitar

que um paciente infectado por uma cepa sensível às drogas anti-tuberculose e,

portanto, recebendo tratamento padrão, tenha seu tratamento prolongado, além de

utilizar drogas alternativas.

O quarto critério considerado um possível indicador de contaminação cruzada é o

crescimento de poucas colônias de M. tuberculosis em meio sólido (BRADEN et al.,

1997; ABER et al., 1980; BAUER et al., 1997; BURMAN et al., 1997; WURTZ et al.,

1996). Esta relação entre o baixo número de unidades formadoras de colônia (UFC)

e a contaminação está fundamentada na hipótese de que o inóculo responsável pela

contaminação de uma amostra é geralmente muito pequeno (uma gotícula ou

aerosol), contendo um número bastante reduzido de bacilos. Como consequência, a

amostra contaminada apresenta resultado de baciloscopia negativo, tempo de

incubação prolongado em meio líquido e/ou crescimento de poucas colônias em

meio sólido.

Entretanto, apenas dois trabalhos foram realizados na tentativa de avaliar este último

critério. Mac Gregor et al. (1975), foram os primeiros a descrever esta associação

entre crescimento de poucas colônias em meio sólido e contaminação cruzada.

Neste estudo, foram avaliados pacientes cujas culturas em meio sólido

apresentaram crescimento de UFC < 5. Contudo, esta avaliação foi feita apenas com

base nos critérios clínicos e radiográficos destes pacientes e nenhuma técnica de

biologia molecular foi utilizada para confirmar os casos de contaminação. Braden et

al. (1997) realizaram um estudo para estabelecer o índice de falso-positividade em

seu laboratório. Porém, a relação número de colônias/contaminação só foi avaliada

para os 15 pacientes cujos dados de cultura eram disponíveis. Neste estudo, apesar

da técnica de RFLP ter sido utilizada para identificar os possíveis casos de

contaminação, o número de culturas avaliadas foi muito pequeno.

1.4 Antecedentes e Justificativa do Projeto

O Laboratório de Micobacteriologia do Núcleo de Doenças Infecciosas da

Universidade Federal do Espírito Santo (NDI/UFES) é referência na realização de

ensaios clínicos diagnósticos e terapêuticos em TB. Desde dezembro de 2002, este

laboratório participa de um estudo multicêntrico denominado Protocolo DMID01 –

009 (Estudo prospectivo, multicêntrico, controlado, randomizado, para avaliação de

esquema encurtado do tratamento padrão da tuberculose de 6 meses para 4 meses,

em pacientes HIV-negativos, infectados com cepas sensíveis às drogas, sem

doença cavitária e com cultura negativa no segundo mês de tratamento).

Um dos critérios de inclusão, para o arrolamento de pacientes neste estudo,

determina que a confirmação diagnóstica através do resultado da cultura só

acontece quando ocorre o crescimento de mais do que 10 UFC em meio sólido ou o

crescimento micobacteriano em meio líquido BACTEC. Para a avaliação da

conversão do resultado da cultura (de positivo para negativo), falência de tratamento

ou recidiva bacteriológica, o mesmo crescimento (UFC>10) também é necessário

para que a cultura seja considerada positiva. Este critério de inclusão foi adotado

com base nos estudos citados anteriormente, que sugerem o baixo número de UFC

como indicador de contaminação cruzada.

Entretanto, se por um lado, a utilização deste critério tenta impedir a valorização de

uma cultura falso-positiva, principalmente no momento do diagnóstico, por outro

lado, pode estar também impedindo que novos casos da doença sejam notificados

precocemente, ou que casos de falência e/ou recidiva sejam detectados e

confirmados. É importante lembrar que indivíduos co-infectados pelo Mtb/HIV

também apresentam carga bacilar reduzida em seus espécimes devido à menor

frequência na formação de cavidades pulmonares, o que resulta no crecimento de

um menor número de colônias nas culturas realizadas (NUNN et al., 2005). Além

disso, indivíduos paucibacilíferos, com tuberculose pulmonar ativa em fase inicial,

também podem apresentar resultado de cultura com as mesmas características

mencionadas acima (BURMAN et al., 1997; FRIEDEN et al., 1996); e, segundo

Dunlap et al. (1995), como o M. tuberculosis não coloniza simbioticamente o trato

respiratório, a detecção de uma única colônia em meio sólido sugere doença.

Neste contexto, torna-se necessário verificar, com base em dados clínicos e

moleculares, se o crescimento de poucas colônias em meio de cultura sólido pode

ser considerado indicador de contaminação cruzada, especialmente em laboratórios

que desenvolvem suas atividades seguindo as normas de Boas Práticas Clínicas e

Laboratoriais.

Objetivos

ObjetivosObjetivos

Objetivos

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Avaliar o crescimento de poucas colônias de M. tuberculosis em meio de cultura

sólido como indicador microbiológico de contaminação cruzada, utilizando técnicas

de tipagem molecular.

2.2 Objetivos Específicos

Avaliar a utilização do RAPET como método de tipagem molecular de cepas de M.

tuberculosis na investigação de episódios de contaminação cruzada.

Avaliar o índice de contaminação cruzada nos espécimes coletados de pacientes

arrolados em ensaios clínicos e de pacientes atendidos em um Serviço de

Referência Ambulatorial de Tuberculose.

Avaliar o crescimento de poucas colônias de M. tuberculosis em meio de cultura

sólido como indicador de contaminação cruzada em espécimes coletados de

pacientes sob investigação diagnóstica e de pacientes em tratamento.

Descrever possíveis indicadores relacionados aos episódios de contaminação

cruzada encontrados.

Material e Métodos

Material e MétodosMaterial e Métodos

Material e Métodos

3 MATERIAL E MÉTODOS

Este estudo foi caracterizado como um estudo descritivo retrospectivo e foi

conduzido no Laboratório de Micobacteriologia do Núcleo de Doenças Infecciosas

(NDI) da Universidade Federal do Espírito Santo. Este laboratório realiza Ensaios

Clínicos e todas as suas atividades são conduzidas obedecendo as normas de Boas

Práticas Clínicas e Laboratoriais.

3.1 Caracterização da amostra

No período de janeiro de 2003 a janeiro de 2005, foi processado um total de 12.984

espécimes clínicos provenientes de pacientes com suspeita de tuberculose

atendidos no Hospital Universitário Cassiano Antônio de Moraes (HUCAM).

Neste mesmo período, foi obtida, a partir do banco de dados (TB Notes) do

Laboratório de Micobacteriologia do NDI, uma relação contendo 2.399 resultados de

cultura positivos para micobactérias. Para inclusão neste estudo, foram selecionadas

as cepas de M. tuberculosis que obedeciam a três critérios fundamentais: (i)

resultado de baciloscopia negativo, (ii) crescimento inferior a 20 unidades

formadoras de colônias (UFC) em meio de cultura sólido e (iii) disponibilidade dos

dados clínicos do paciente. Devido ao crescimento de poucas colônias na cultura,

estas cepas poderiam representar possíveis casos de contaminação cruzada. Após

a seleção, foram obtidas 109 cepas isoladas de espécimes pulmonares coletados de

97 pacientes. Estes espécimes foram processados em 94 dias diferentes ao longo

deste período.

As cepas foram divididas em dois grupos distintos (A e B) de acordo com as

características dos pacientes dos quais eram provenientes, e como descrito a seguir:

• Grupo A - constituído por 56 cepas de M. tuberculosis provenientes de 44

pacientes não-cavitários, arrolados no protocolo DMID01 – 009 e atendidos no

Centro de Pesquisa Clínica (CPC) do HUCAM. Estes pacientes apresentavam

diagnóstico precoce de tuberculose pulmonar não-cavitária, iniciaram o

tratamento anti-tuberculose e foram acompanhados por 30 meses. Das 56 cepas

selecionadas, 28 eram provenientes de espécimes clínicos coletados para

diagnóstico e 28 eram provenientes de espécimes coletados 1, 2 ou 6 meses

após o início do tratamento.

• Grupo B - constituído por 53 cepas de M. tuberculosis provenientes de 53

pacientes com ou sem tuberculose pulmonar cavitária, atendidos no Ambulatório

de Pneumologia e Tisiologia do HUCAM. Todas as cepas selecionadas eram

provenientes de espécimes clínicos coletados para o diagnóstico.

12.984 espécimes clínicos processados

2.399 resultados positivos de culturas

109 cepas selecionadas

Grupo A - Projeto Grupo B - Rotina

(56 cepas) (53 cepas)

Figura 1 – Fluxograma de seleção das cepas utilizadas no estudo

A Tabela 1 mostra os dados relativos aos grupos avaliados. Como pode ser

observado, apesar do número de espécimes processados pelos técnicos da rotina

ser maior do que o número de espécimes processados pelos técnicos que

participam do projeto, a média de cultura positivas obtidas por dia é praticamente a

mesma em ambos os grupos. A investigação de contaminação cruzada foi realizada

em cada um dos dias em que foram observadas culturas com crescimento menor

que 20 UFC (supostamente contaminadas). Para tal, foram utilizadas: (i) a(s) cepa(s)

supostamente contaminada(s) e (ii) as demais cepas de M. tuberculosis isoladas dos

espécimes clínicos processados no mesmo dia (possíveis contaminantes),

perfazendo um total de 285 cepas avaliadas (133 no grupo A e 152 no grupo B).

Caso a cepa supostamente contaminada tenha sido a única isolada num

determinado dia, foi utilizada uma outra cepa do mesmo paciente que tenha sido

isolada em uma outra data.

Tabela 1 – Dados relativos aos grupos avaliados.

№ Dias

avaliados

Amostras

processadas/

dia

Culturas

positivas/

dia

Total de

culturas

positivas

Método

digestão

Nº

Técnicos

Grupo A 46 8,4 2,7 133 DTT 2

Grupo B 48 22,7 3,0 152 NALC 2

3.2 Processamento dos espécimes clínicos

Os espécimes clínicos do Grupo A foram submetidas à digestão pelo dithiotreitol

(DTT) a uma concentração final de 0,1%, por 5 minutos em um agitador.

Posteriormente, foram descontaminados com NaC/NaOH a uma concentração final

de 0,7/1,25%, por 15 minutos, à temperatura ambiente. Após a descontaminação, foi

adicionado, a cada tubo, tampão fosfato (PBS) até um volume final de 50 ml. As

amostras foram centrifugadas a 4000 x g, por 15 minutos, a 4ºC. O sedimento

formado foi ressuspenso em 2 ml de PBS.

As amostras pulmonares do Grupo B foram submetidas à digestão e

descontaminação pelo N-acetil-L-cisteína (NALC) 0,5% em solução de

NaC/NaOH

(Anexo IIa) por 15 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente, foi adicionado,

a cada tubo, PBS (Anexo IIb) até um volume final de 50 ml e procedeu-se o

processamento como descrito acima.

A partir do sedimento ressuspenso em tampão foram confeccionados esfregaços.

Após o período de fixação, os mesmos foram corados pela técnica de Auramina O e

a leitura ao microscópio foi realizada de acordo com as recomendações técnicas do

Ministério da Saúde (BRASIL, 2005).

Também foram inoculados 0,2 ml e 0,5 ml do sedimento ressuspenso em frascos de

LJ e BACTEC 12B, respectivamente. Estes frascos foram incubados a 37ºC por até

6 semanas. As culturas em meio sólido foram examinadas semanalmente para

detecção de micobactérias ou de organismos contaminantes. As culturas em meio

líquido foram examinadas três vezes por semana no sistema BACTEC 460, segundo

recomendações do fabricante (BACTEC TB 460 System, 1996).

3.3 Identificação das cepas isoladas de culturas positivas

Todas as cepas selecionadas para este estudo foram identificadas como M.

tuberculosis com base nas caracterísicas fenotípicas das colônias (rugosas, cremes

e opacas), na sensibilidade ao ρ-nitro-α-acetilamino-β-hidroxipropiofenona (NAP)

e/ou ao ácido ρ-nitrobenzóico (500µg/ml) e na resistência à hidrazida do ácido

tiofeno-2-carboxílico (2µg/ml) (KENT & KUBICA, 1995; COLLINS et al., 1997).

3.4 Subcultivo das cepas

No Laboratório de Micobacteriologia do NDI, todas as cepas identificadas, são

armazenadas em meio líquido 7H9/glicerol 10%, a uma temperatura de

aproximadamente –70 ºC. As cepas selecionadas para a análise molecular foram

descongeladas à temperatura ambiente, subcultivadas em dois frascos contendo

meio de Ogawa e incubadas em estufa a 37ºC. Após o crescimento das colônias, um

dos frascos foi utilizado para posterior recongelamento da cepa, enquanto o outro foi

utilizado para proceder a extração do DNA.

3.5 Rapid PCR-based Epidemiological Typing Method (RAPET) modificado

Para análise dos perfis genéticos das 285 cepas avaliadas no estudo, foi utilizada a

técnica de RAPET, descrita por Yates et al. (2002), com algumas modificações.

3.5.1 Extração do DNA

Com o auxílio de uma alça descartável, uma pequena porção de colônias foi retirada

do meio de cultura sólido. Estas colônias foram depositadas em um tubo de

microcentrífuga contendo 1 ml de água deionizada estéril e, em seguida,

homogeneizadas em vortex por 10 segundos. Os tubos foram aquecidos a

aproximadamente 95ºC em bloco aquecedor, por 20 minutos, e imediatamente

submetidos a uma temperatura de -20ºC por um período mínimo de 20 minutos ou

até o momento de sua utilização.

3.5.2 PCR

Um volume de 10 µl de DNA foi adicionado a tubos mantidos em banho de gelo em

uma câmara de fluxo laminar, contendo os seguintes reagentes para PCR

(Invitrogen): solução tampão (Tris-HCl 20 mM - pH 8,4, KCl 50 mM), MgCl

2,5 mM,

0,2 mM de cada desoxirribonucleotídeo trifosfatado (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 40

pmoles do iniciador, 1 U de Taq DNA-polimerase e água ultrapura esterilizada para

o volume final de 40 µl. Um único iniciador complementar à região invertida da

IS6110 (5’- GAG TCT CCG GAC TCA CCG G) foi utilizado.

Para a reação de PCR foram utilizadas as seguintes condições: desnaturação inicial

a 95ºC por 120 segundos; um ciclo a 95ºC por 20 segundos, 45ºC por 360 segundos

e 72ºC por 120 segundos; seguidos de 30 ciclos a 95ºC por 20 segundos, 62ºC por

30 segundos e 72ºC por 180 segundos; e uma extensão final a 72ºC por 10 minutos.

Os produtos da PCR foram aplicados em gel de poliacrilamida 6%. Este gel foi

corado com brometo de etídeo a uma concentração de 0,5 µg/ml por 5 minutos e,

em seguida, lavado em água por mais 5 minutos. Os perfis moleculares das cepas

foram visualizados no sistema Eagle Eye II (Stratagene). Os produtos que

apresentaram perfis genéticos semelhantes (até 5 bandas de diferença) foram,

posteriormente, submetidos à análise pela enzima de restrição HaeIII.

3.5.3 Digestão dos produtos amplificados por enzima de restrição

Para a digestão, foram adicionados 10 µl do produto da PCR a um tubo de

microcentrífuga contendo 6 µl de água destilada, 2 µl da enzima HaeIII (Invitrogen) e

2 µl do tampão correspondente. Esta mistura foi incubada a 37ºC em banho-maria

por 1-2 horas. Os produtos digeridos foram aplicados em gel de poliacrilamida 6%.

Este gel foi corado com brometo de etídio a uma concentração de 0,5 µg/ml por 5

minutos e, em seguida, lavado em água por mais 5 minutos. Os perfis moleculares

das cepas foram visualizados e fotografados utilizando o sistema de foto-

documentação (Eagle Eye II, Stratagene).

3.6 Double-Repetitive-Element PCR (DRE-PCR) modificado

Os perfis genéticos de 104 das 285 cepas também foram analisados pela técnica de

DRE-PCR modificada descrita por Montoro et al. (1998) para a realização da análise

comparativa do desempenho desta técnica quando comparada ao RAPET. Para

realizar esta análise foi utilizado o Sign Test.

3.6.1 Extração do DNA

Com o auxílio de uma alça descartável, uma pequena porção de colônias foi retirada

do meio de cultura sólido. Estas colônias foram depositadas em um tubo de

microcentrífuga contendo 1 ml de água deionizada estéril e, em seguida,

homogeneizadas em vortex por 10 segundos. Os tubos foram aquecidos a 95ºC em

bloco aquecedor, por 20 minutos, e imediatamente submetidos a uma temperatura

de -20ºC por aproximadamente 18 horas.

3.6.2 PCR

Um volume de 10 µl de DNA foi adicionado a tubos mantidos em banho de gelo em

uma câmara de fluxo laminar, contendo os seguintes reagentes para PCR

(Invitrogen): solução tampão (Tris-HCl 20 mM - pH 8,4, KCl 50 mM), MgCl

2,5 mM,

0,2 mM de cada desoxirribonucleotídeo trifosfatado (dATP, dCTP, dGTP, dTTP),

8,75 pmoles de cada iniciador, 6% DMSO, 1 U de Taq DNA-polimerase e água

ultrapura esterilizada para o volume final de 25

l. Os iniciadores utilizados foram os

seguintes: Ris1, 5’ GGC TGA GGT CTC AGA TCA G; Ris2, 5’ ACC CCA TCC TTT

CCA AGA AC; Pntb1, 5’ CCG TTG CCG TAC AGC TG; Pntb2, 5’ CCT AGC CGA

ACC CTT TG.

Para a reação de PCR foram utilizadas as seguintes condições: desnaturação inicial

a 95ºC por 10 minutos, seguida de 30 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 56ºC por 2

minutos e 72ºC por 3 minutos.

Os produtos da PCR foram aplicados em gel de poliacrilamida 6% corado com

brometo de etídio e analisados como descrito no item 3.5.2.

3.7 Restriction Fragment Lengh Polymorphism – RFLP-IS

6110

Esta técnica foi utilizada para analisar apenas as cepas que apresentaram perfis

genéticos semelhantes após a realização do RAPET. A análise do número e do

polimorfismo no comprimento dos fragmentos de DNA gerados após digestão com

enzimas de restrição foi realizada de acordo com o método descrito por Van

Embden et al. (1993).

3.7.1 Extração e purificação do DNA bacteriano

Uma porção das colônias de cada um das cepas de M. tuberculosis e da cepa

padrão H37Rv crescidas em meio de Ogawa, foi transferida com o auxílio de uma

alça descartável para microtubos contendo 400 µl de tampão TE 1X (Anexo IIIa) e

incubada em bloco aquecedor a 80°C por 20 minutos. Após resfriamento à

temperatura ambiente, foram adicionados 50 µl da solução de lisozima (Anexo IIIb)

e os tubos incubados a 37°C por no mínimo 2 horas. Um volume de 75 µl da

solução de proteinase K/SDS 10% (Anexo IIIc) foi adicionado a cada tubo, e estes

foram incubados em bloco aquecedor a 65°C por 10 minutos. Em seguida, foram

adicionados 100

l de uma solução de NaCl 5M e 100

l da solução CTAB/NaCl

(Anexo IIId) previamente aquecida, e estes foram novamente incubados a 65°C por

10 minutos. Posteriormente, foram adicionados 750 µl de uma mistura de

clorofórmio/álcool isoamílico na proporção de 24:1, e as preparações foram

centrifugadas a 12.000 rpm por 10 minutos. A fase superior de cada preparação foi

transferida para microtubos esterilizados e, em seguida, foram adicionados 450

de isopropanol (Merck). A mistura foi homogeneizada delicadamente e, após

precipitação do DNA a -20°C por aproximadamente 18 horas, os tubos foram

submetidos à centrifugação a 12.000 g por 20 minutos à temperatura ambiente.

Após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o sedimento foi lavado com

500 µl de etanol 70% por centrifugação a 12.000 rpm por 5 minutos à temperatura

ambiente. Após a lavagem, o sobrenadante foi descartado e a secagem realizada a

temperatura ambiente. O DNA foi ressuspenso em 25 µl de solução tampão TE,

mantido sob refrigeração por 2 horas e, em seguida, armazenado a -20°C.

3.7.2 Quantificação e digestão

Para determinar a concentração de DNA, 1

l das amostras purificadas foi diluído

em 99

l de água purificada esterilizada e submetido à leitura da absorbância em

espectrofotômetro específico (GeneQuant II, Pharmacia Biothec). Para clivagem do

DNA, aproximadamente 3 µg das mesmas foram transferidas para microtubos

contendo 5 unidades (U) da enzima de restrição Pvu II (Invitrogen), 2 µl da solução

tampão específica (NaCl 50 mM, Tris-HCl 10mM, MgCl

10 mM, DTT 1mM, pH 7,9)

e um volume de água purificada esterilizada para um volume final de 20 µl. Os

tubos foram incubados a 37°C por uma hora. O DNA digerido foi submetido a

eletroforese em gel de agarose 0,8%, contendo 0,5 µg/ml de brometo de etídio em

tampão TBE 1X (Anexo IIIe).

3.7.3 Separação e transferência para membrana

A separação por eletroforese foi realizada em gel de agarose 0,8% (20 X 20 cm) a

50 volts durante um período de aproximadamente 15 horas. Na primeira canaleta do

gel foram aplicados 10 µl da mistura Lambda-HindIII/PhiX174-HaeIII (Anexo IIIf)

como marcador externo para monitorar a migração do DNA durante a eletroforese.

Quando o fragmento de 603 pb do marcador PhiX174-HaeIII atingiu uma distância

de aproximadamente 13 cm da canaleta onde foi aplicado, a eletroforese foi

interrompida. O DNA foi depurinado submergindo-se o gel em solução de HCl 0,25

M durante 10 minutos e, em seguida, o gel foi lavado em água destilada. O DNA foi,

então, desnaturado pelo tratamento com uma solução de NaOH 0,4 M por 20

minutos e o gel foi lavado em água destilada.

Finalmente foi feita a transferência dos fragmentos de DNA separados no gel de

agarose para uma membrana de náilon Hybond N

(Amersham), por 2 horas, à

vácuo, utilizando-se o aparelho Vacuum Blotter (Bio-Rad).

3.7.4 Preparo da sonda genética

O DNA utilizado para preparo da sonda consiste em uma seqüência de 245 pb do

elemento de inserção IS6110 e foi preparado pela reação em cadeia da polimerase

(PCR) com a utilização dos iniciadores: INS1 (5’ CGT GAG GGC ATC GAG GTG

GC) e INS2 (5’ GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA) (Van EMBDEN et al., 1993).

Após extração do DNA da cepa de M. tuberculosis H37Rv conforme descrito no

item 3.7.1., este foi diluído para a concentração de 100ng/

l. Um volume de 2

desta preparação foi adicionado a 6 tubos com capacidade para 200

l e a seguir

foram mantidos em banho de gelo em uma câmara de fluxo laminar, contendo os

seguintes reagentes para PCR: solução tampão (Tris-HCl 10 mM - pH 8,3, KCl 50

mM, MgCl

1,5 mM), MgCl

1,5 mM, 0,1 mM de cada desoxirribonucleotídeo

trifosfatado (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 25 pmoles de cada oligonucleotídeo

iniciador (INS1 e INS2), 1 U de Taq DNA-polimerase e água ultrapura esterilizada

para um volume final de 50 µl. Em um tubo, no lugar da preparação de DNA da

cepa de referência, foram colocados 2 µl de água ultrapura esterilizada como

controle negativo da reação.

Os tubos foram transferidos para um termociclador e então aquecidos a 96°C por 5

minutos para a desnaturação do DNA, submetidos a 35 ciclos de amplificação,

constituídos de 1 minuto a 96°C, 1 minuto a 65°C e 1 minuto a 72°C, seguidos de

um ciclo de extensão final a 72°C por 6 minutos. Um volume de 10 µl da

preparação foi submetido à eletroforese em gel de agarose como descrito no item.

Como padrão de tamanho molecular foi adotado o marcador de DNA “Ladder” de

100 pb (Pharmacia Biothec). O fragmento amplificado foi considerado correto,

quando uma banda de 245 pb foi observada contra o marcador de DNA “Ladder”

100 pb acima mencionado.

3.7.5 Purificação e marcação da sonda de DNA

Um volume de 50 µl do material amplificado (item 3.5.4) foi purificado utilizando-se

o QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) de acordo com as recomendações do

fabricante. A sonda foi marcada com peroxidase de acordo com as recomendações

do kit ECL

RPN 3000 (Amersham). Em resumo, a sonda foi diluída a uma

concentração de 10 ng/µl, submetida a uma temperatura de 100°C por 5 minutos

para desnaturação, e imediatamente resfriada em gelo por 5 minutos. Foram

adicionados ao tubo 30

l do reativo de marcação e o mesmo volume da solução de

glutaraldeído, ambos fornecidos pelo kit. Posteriormente, esta mistura foi incubada

em banho-maria a 37°C por 10 minutos.

3.7.6 Hibridação do DNA bacteriano com a sonda de DNA marcada

As membranas contendo os fragmentos de DNA preparadas como descrito no item

3.7.3 foram colocadas em tubos de vidro específicos, com a face contendo DNA

voltada para cima. Estas membranas foram pré-hibridadas a 42°C, com o tampão

de hibridação do kit, por uma hora em forno de hibridação. Em seguida, este

tampão foi retirado e foram adicionados 10 ml de tampão de hibridação contendo 10

ηg da sonda de DNA marcada e previamente desnaturada. Após hibridação a 42°C

por um período de 16 - 18 horas, as membranas foram lavadas quatro vezes. As

duas primeiras lavagens foram realizadas com SSC/DSS (Anexo IIIg) previamente

aquecido a 55°C, por 10 minutos e as demais lavagens foram realizadas com SSC

2X (Anexo IIIh) à temperatura ambiente por 5 minutos.

3.7.7

Detecção

Um volume de 3 ml do reagente de detecção 1 foram misturados ao mesmo volume

do reagente de detecção 2, ambos fornecidos pelo kit. Em um pirex de vidro, a

membrana (com a face contendo DNA voltada para cima) foi banhada com esta

solução de detecção por 1 minuto. Posteriormente, retirou-se o excesso de líquido

da membrana em um papel de filtro, e esta foi colocada no cassete, sempre com a

face contendo DNA voltada para cima. Sobre a membrana, foi colocado um filme de

Rx (Biomax ML-Kodak) e o cassete foi fechado por 1 minuto. Em seguida, o filme foi

imerso por 1 minuto em solução reveladora e lavado em água corrente. Após a

lavagem, o filme foi imerso por 1 minuto em solução fixadora e lavado novamente.

Todos os procedimentos de detecção dos fragmentos de DNA foram realizados em

uma sala escura.

3.7.8 Análise do perfil genético das cepas

Os perfis genéticos das cepas de M. tuberculosis foram analisados e comparados

entre si através da utilização do programa de computação GelCompar, versão 4.0

para “Windows” (Apllied Maths, Kortrijk, Bélgica) do Laboratório de Microbiologia da

Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP).

3.8 Análise final dos dados

As cepas que apresentaram perfis genéticos idênticos definidos pelo RFLP foram

consideradas como potencialmente contaminadas. Nestes casos, foi preenchido um

questionário (Anexo IV) com informações clínicas e bacteriológicas sobre o paciente

para uma avaliação criteriosa do caso de contaminação cruzada e confirmação ou

não do mesmo.

Resultados

ResultadosResultados

Resultados

4 RESULTADOS

O presente estudo foi realizado em 4 etapas. Num primeiro momento, o

desempenho da técnica de biologia molecular já utilizada pelo laboratório (DRE-

PCR) foi comparado ao desempenho de uma nova técnica. Em seguida, a análise

da reprodutibilidade da técnica de melhor desempenho foi realizada, para garantir a

confiabilidade dos dados. Posteriormente, os perfis genéticos de todas as cepas

foram analisados e os casos suspeitos de contaminação investigados. Finalmente,

foi realizada uma análise global dos resultados obtidos.

4.1 Análise comparativa do desempenho das técnicas DRE-PCR e RAPET

Em estudos que investigam possíveis episódios de contaminação cruzada, a escolha

da técnica de biologia molecular mais apropriada é de fundamental importância. Até

o início deste estudo, o DRE-PCR era a técnica utilizada pelo Laboratório de

Micobacteriologia do NDI para avaliar casos isolados de contaminação. No entanto,

recentemente, a técnica RAPET tem sido utilizada em outros laboratórios para este

mesmo fim. Por este motivo, a primeira fase deste estudo consistiu em utilizar

ambos os métodos para realizar a análise do perfil genético de 104 cepas de M.

tuberculosis avaliadas para detecção de possíveis casos de contaminação cruzada

ocorridos em 33 dias. Desta forma, foi possível determinar qual das técnicas

apresentava melhor desempenho.

A Tabela 2 mostra que, utilizando a técnica RAPET, foi possível amplificar o DNA de

todas as cepas avaliadas. Entretanto, utilizando o DRE-PCR não foi possível

amplificar o DNA de 4 das 104 cepas analisadas, o que tornou inviável a

investigação de possíveis casos de contaminação em 4 (12%) dos 33 dias avaliados.

A análise estatística mostrou não haver diferença significativa entre as duas técnicas

quanto a amplificação do DNA (p = 0,125). Perfis genéticos gerados pelo RAPET

apresentaram sempre um número de bandas superior a 6. O número de bandas

inferior a 4, considerado insuficiente para estabelecer a similaridade entre cepas, só

foi observado quando da utilização do DRE-PCR. Oito (7,7%) cepas apresentaram

este padrão. O número de pares de cepas com perfis genéticos semelhantes entre si

foi de 7, após a análise pelo DRE-PCR, e 8, após a primeira etapa do RAPET,

sugerindo possíveis casos de contaminação. Entretanto, após a digestão do produto

de PCR pela enzima HaeIII (segunda etapa do RAPET), foi possível observar

diferenças nos perfis genéticos de 7 dos 8 pares de cepas suspeitos e a hipótese de

contaminação, nestes casos, foi descartada. Apenas um par de cepas apresentou

perfis idênticos mesmo após a digestão, representando um caso de contaminação

cruzada em potencial. Para estas duas últimas variáveis (número de bandas < 4 e

cepas com perfis genéticos semelhantes) o Sign Test demonstrou haver diferença

significativa entre esta técnicas (p = 0,008 e p = 0,031, respectivamente), mostrando

que o RAPET apresenta melhor poder discriminatório.

Tabela 2 – Análise comparativa entre as técnicas de DRE-PCR e RAPET

DRE-PCR RAPET

Teste

estatístico

Cepas com DNA amplificado 100 104 0,125

Perfis genéticos com nº bandas < 4 8 0 0,008

Pares de cepas com perfis genéticos

semelhantes (suspeitas de contaminação)*

7 1** 0,031

* Para o DRE-PCR foram consideradas semelhantes as cepas com perfis genéticos

apresentando no máximo uma banda de diferença. Para o RAPET, este critério não está

descrito.

** confirmado pelo RFLP

a - Sign Test

A figura 2 exemplifica os perfis genéticos de 10 cepas definidos pelas técnicas de

DRE-PCR e RAPET. Como observado, o perfil genético da cepa 1 não pôde ser

visualizado após realização do método DRE-PCR, porém sua amplificação foi bem

visível após a realização do RAPET. As cepas 4 e 5 mostraram perfis genéticos

idênticos definidos pelos dois métodos, permanecendo idênticos após a digestão

dos produtos de PCR pela enzima HaeIII. As cepas 9 e 10 mostraram perfis muito

semelhantes definidos por ambos os métodos. Entretanto, a etapa de digestão dos

produtos de PCR realizada no RAPET, permitiu uma melhor visualização destes

perfis, que mostraram-se claramente distintos.

Figura 2 – Perfis genéticos de cepas de M. tuberculosis definidos pelo método (A) DRE-

PCR, (B) RAPET – antes da digestão do produto de PCR pela enzima HaeIII e (C) RAPET –

após a digestão do produto de PCR pela enzima HaeIII. Os números 1-5, 6-8 e 9-10 indicam

as cepas processadas em 3 diferentes dias em que houve uma suspeita de contaminação

cruzada.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

4 5 9 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

4.2. Avaliação da reprodutibilidade da técnica RAPET

Devido a técnica RAPET ter sido utilizada com algumas modificações, foi avaliada a

reprodutibilidade da mesma. Para esta avaliação foram utilizados 2 ensaios. O

primeiro ensaio consistiu em amplificar o DNA extraído da cepa padrão H37Rv em

cada reação realizada no estudo. Como observado na figura 3, esta cepa

apresentou perfis genéticos idênticos mesmo quando seu DNA foi amplificado em

diferentes reações.

Figura 3 – Perfis genéticos da cepa padrão H37Rv definidos pelo método RAPET (A) antes

da digestão do produto de PCR pela enzima HaeIII e (B) após a digestão do produto de

PCR pela enzima HaeIII, após amplificação da mesma em diferentes reações.

Para a realização do segundo ensaio, a extração do DNA foi feita a partir de

espécimes clínicos de um mesmo paciente, porém coletados em dias diferentes. A

Figura 4 exemplifica os perfis genéticos de 7 pacientes avaliados. Como observado,

os perfis genéticos das cepas de um mesmo paciente se mostraram idênticos,

mesmo quando estas eram oriundas de diferentes espécimes.

Figura 4 – Perfis genéticos de pares de cepas de diferentes pacientes definidos pelo

método RAPET.

4.3 Investigação de possíveis episódios de contaminação cruzada utilizando o

método RAPET

Para investigar possíveis episódios de contaminação cruzada entre as cepas

pertencentes aos pacientes arrolados no Protocolo DMID – 01 009 (Grupo A), foram

analisados os perfis genéticos de 133 cepas isoladas de espécimes clínicos

processados em 46 dias. Destas, 56 cepas foram isoladas de culturas com UFC <

20, e, portanto, eram inicialmente suspeitas de contaminação. As demais cepas

correspondiam àquelas isoladas de espécimes clínicos processados nos mesmos

dias em que houve estas suspeitas. Após análise molecular, verificou-se que em 9

dos 46 dias avaliados foram observadas cepas que apresentaram perfis genéticos

semelhantes, ou seja, poderiam representar possíveis casos de contaminação

cruzada. Entretanto, apenas em 3 destes dias a suspeita de contaminação envolvia

uma cepa isolada de cultura com UFC < 20 (Tabela 3).

1 2 3 4 5 6 7

Tabela 3 – Dados bacteriológicos das cepas isoladas nos dias em que foram

detectados possíveis casos de contaminação cruzada (Grupo A)

Data

Processamento

Registro

Baciloscopia

Ogawa

(UFC)

12B RAPET

15431 3+ >200

pos

diferente

15432 0 1

pos diferente

15433 3+

>200

pos semelhante

12/6/2003

15446 3+

>200

pos semelhante

15528 0 0

pos semelhante

17/6/2003

15527 0 2

pos semelhante

16356 0 0

pos semelhante

16359 0 1

diferente

15/8/2003

16360 3+ >200

semelhante

16386 0 0

pos

diferente

16387 0 2

pos

diferente

16388 0 1

pos

diferente

16389 3+

>200 pos

semelhante

19/8/2003

16390 3+

>200 pos

semelhante

17768 3+

>200 pos

diferente

17771 1+

>200 pos

diferente

17772 0 12

diferente

17773 0 0

pos

semelhante

17774 3+

>200 pos

semelhante

5/11/2003

17775 3+

>200 pos

diferente

17925 0 13

pos

diferente

17926 0 4

diferente

17927 0

>200 NR

semelhante

17928 3+

>200 pos

semelhante

12/11/2003

17929 0 0

pos

diferente

18340 3+ >200

diferente

18341 3+ 0

pos

diferente

18344 0 4

pos

diferente

18345 0 0

pos

semelhante

2/12/2003

18347 0 2

semelhante

20766 0 0

pos

diferente

20767 0 12

pos

diferente

20768 0 0

pos

semelhante

15/4/2004

20769 3+ >200

pos

semelhante

26071 0 1

pos

diferente

26072 0 4

pos

semelhante

26073 0 3

diferente

21/1/2005

26074 2+ >200

semelhante

a – 0 (negativo),1+ (1 a 9 bacilos/100 campos), 2+ (1 a 9 bacilos/campo), 3+ (>9 bacilos/campo)

b – todas as cepas isoladas foram identificadas como M. tuberculosis

NR = não realizado

RAPET = Rapid PCR-based Epidemiological Typing Method

Linhas sombreadas destacam as culturas com UFC < 20 envolvidas nos possíveis episódios de

contaminação

A figura 5 mostra os perfis genéticos dos possíveis casos de contaminação cruzada

definidos pelo RAPET, antes e após a digestão dos produtos de PCR com a enzima

HaeIII. Foi observado que os pares de cepas 16356/16360, 16389/16390 e

18345/18347 apresentaram perfis semelhantes antes da digestão com a enzima de

restrição (Figura 5A). Porém, após a digestão foi possível notar pequenas diferenças

entre as cepas 16356/16360 e 16389/16390, enquanto as cepas 18345/18347

mostraram perfis genéticos idênticos, o que indica um provável episódio de

contaminação (Figura 5B). Os demais pares de cepas mostraram perfis genéticos

bastante distintos entre si.

Figura 5 – Perfis genéticos de cepas de M. tuberculosis pertencentes ao Grupo A, definidos

pelo método RAPET (A) antes da digestão do produto de PCR pela enzima HaeIII e (B)

após a digestão do produto de PCR pela enzima HaeIII. PM indica o padrão de peso

molecular de 100pb.

1635

6 16360 20768 20769 26074 26072 15433 15446 17928 17927 16389 16390 15528 15527 18347 18345 17773 17774 PM

16356 16360 20768 20769 26074 26072 15433 15446 17928 17927 16389 16390 15528 15527 18347 18345

17773 17774 PM

Para investigar possíveis episódios de contaminação cruzada entre as cepas

pertencentes aos pacientes atendidos na rotina (Grupo B), foram analisados os

perfis genéticos de 152 cepas isoladas de espécimes clínicos processados em 48

dias. Destas, 53 cepas foram isoladas de culturas com UFC < 20 e, portanto,

inicialmente suspeitas de contaminação. As demais cepas correspondiam àquelas

isoladas de espécimes clínicos processados nos mesmos dias em que houve estas

suspeitas. Após análise molecular verificou-se que em 7 dos 48 dias avaliados foram

observadas cepas que apresentaram perfis genéticos semelhantes, ou seja,

poderiam representar possíveis casos de contaminação cruzada. Em apenas 5 dias,

a suspeita de contaminação envolvia uma cepa isolada de cultura com UFC < 20

(Tabela 4).

Tabela 4 – Dados bacteriológicos das cepas isoladas nos dias em que foram

detectados possíveis casos de contaminação cruzada (Grupo B)

Data Processamento N

Registro Baciloscopia

Ogawa

(UFC)*

RAPET

13690 0 150-200

semelhante

13701 1+ 150-200

diferente

5/2/2003

13704 0 1

semelhante

17640 2+ 150-200

diferente

17642 0 1

semelhante

17644 3+ 150-200

semelhante

29/10/2003

17652 0 3

diferente

19677 0 1

diferente

19685 3+ 150-200

semelhante

19689 0 7

diferente

19697 0 50-100

semelhante

18/2/2004

19698 1+ 100-150

diferente

20807 3+ >200

semelhante

20816 1+ 150-200

diferente

20824 0 4

semelhante

16/4/2004

20826 1+ 50-100

diferente

21057 3+ >200

diferente

21061 3+ 20

semelhante

21064 0 10

semelhante

4/5/2004

21066 3+ 150-200

diferente

25657 3+ >200

semelhante

25660 0 >200

semelhante

25661 0 1

diferente

27/12/2004

25666 0 1

diferente

26262 0 2

diferente

26263 0 1

semelhante

26266 0 10

diferente

26267 3+ >200

semelhante

28/1/05

26268 3+ 150-200

diferente

a – 0 (negativo), 1+(1 a 9 bacilos/100 campos), 2+(1 a 9 bacilos/campo), 3+(>9 bacilos/campo)

b – todas as cepas isoladas foram identificadas como M. tuberculosis

* Culturas em meio líquido 12B não são realizadas como procedimento de rotina

RAPET = Rapid PCR-based Epidemiological Typing Method

Linhas sombreadas destacam as culturas com UFC < 20 envolvidas nos possíveis episódios de

contaminação

A figura 6 mostra os perfis genéticos dos possíveis casos de contaminação cruzada

definidos pelo RAPET, antes e após a digestão dos produtos de PCR com a enzima

HaeIII. Foi observado que os pares de cepas 17642/17644 e 21061/21064

apresentaram perfis semelhantes antes da digestão com a enzima de restrição

(Figura 6A). Porém, após a digestão foi possível notar pequenas diferenças entre as

cepas 17642/17644, enquanto as cepas 21061/21064 mostraram perfis genéticos

idênticos, o que indica um provável episódio de contaminação (Figura 6B). Os

demais pares de cepas mostraram perfis genéticos bastante distintos entre si.

Figura 6 – Perfis genéticos de cepas de M. tuberculosis pertencentes ao Grupo B, definidos

pelo método RAPET (A) antes da digestão do produto de PCR pela enzima HaeIII e (B)

após a digestão do produto de PCR pela enzima HaeIII. PM indica o padrão de peso

molecular de 100pb.

21061 21064 19697 19685 13704 13690 20807 20824 17642 17644 25657 25660 2

6263 26267 PM

21061 21064 19697 19685 13704 13690 20807 20824 17642 17644 25657 25660 26263 26267 PM

21061 2106 19697 19685 13704 13690 20807 20824 17642 17644 25657 25660 26263 26267 PM

4.4. Análise molecular dos possíveis casos de contaminação cruzada

utilizando o método RFLP

Por ser considerada o padrão-ouro, devido ao seu grande poder discriminatório, o

RFLP foi utilizado para confirmar ou refutar os resultados obtidos até o momento.

Deste modo, os 9 pares de cepas pertencentes ao grupo A e os 7 pares de cepas

pertencentes ao grupo B, que apresentaram perfis genéticos semelhantes após a

realização da primeira etapa do RAPET, foram reavaliadas por esta técnica.

A figura 7 mostra a análise dos perfis genéticos realizada pelo programa GelCompar,

versão 4.0 para “Windows” (Apllied Maths, Kortrijk, Bélgica). Esta análise

estabeleceu um coeficiente de similaridade de 100% para 5 pares de cepas e para o

controle (H37Rv). Ao avaliarmos a possibilidade de contaminação cruzada entre

estas cepas, observamos que as cepas 16360/16389 foram isoladas de espécimes

de um mesmo paciente processadas em dias diferentes. As cepas 26072/15446

pertenciam a diferentes pacientes, porém a possibilidade de contaminação foi

descartada quando observamos que as mesmas foram isoladas de espécimes

processados com 18 meses de diferença. O mesmo aconteceu com as cepas

20768/19697, que apresentavam diferença de 2 meses no processamento. Portanto,

apenas os pares de cepas 18345/18347 e 21061/21064 foram caracterizados como

prováveis casos de contaminação cruzada, por pertencerem a pacientes diferentes e

terem sido isoladas de espécimes processados no mesmo dia. Estes dados

confirmaram os resultados obtidos anteriormente com a utilização do RAPET.

Figura 7 - Perfis genéticos de cepas de M. tuberculosis pertencentes aos Grupo A e B,

definidos pelo método RFLP.

D ice ( Op t:1.00% ) (T ol 1. 0%-1.0% ) (H> 0.0% S>0.0 %) [0.0% -1 00.0% ]

IS611 0

100

IS6110

15528

17642

15433

26072

15446

15527

25660

13690

13704

17644

25657

26074

17927

26263

26267

20807

16360

16389

16356

16390

18345

18347

17773

17774

20768

19697

17928

20824

20769

19685

H37Rv

21061

21064

17/06/03

29/10/03

12/06/03

21/01/05

12/06/03

17/06/03

27/12/04

05/02/03

29/10/03

27/12/04

21/01/05

12/11/03

28/01/05

16/04/04

15/08/03

19/08/03

15/08/03

19/08/03

02/12/03

05/11/03

15/04/04

18/02/04

12/11/03

16/04/04

15/04/04

18/02/04

04/05/04

Serra

Vila Velha

Serra

Cariacica

Vitória

Viana

Cariacica

Serra

Cariacica

Serra

Vitória

Viana

Cariacica

Vila Valério

Serra

Vila Velha

Cariacica

Vila Velha

Vitória

Vila Velha

Vitória

Guaçuí

Cariacica

4.5 Análise dos dados clínicos e bacteriológicos dos pacientes envolvidos nos

possíveis casos de contaminação cruzada

Após a análise dos perfis genéticos das 109 cepas incluídas neste estudo, 2

possíveis casos de contaminação cruzada foram encontrados. Considerando que a

confirmação de um caso de contaminação não pode estar fundamentada apenas em

dados moleculares, foi realizada uma avaliação criteriosa com base nas informações

clínicas e bacteriológicas dos pacientes dos quais estas cepas foram isoladas.

O primeiro caso foi relacionado às cepas 18345 e 18347 (possível caso de

contaminação cruzada) isoladas dos pacientes pertencentes ao Grupo A e

denominados 1 e 2, respectivamente, os quais não apresentavam nenhuma relação

epidemiológica aparente.

O paciente 1, notificado com base em informações clínicas, radiográficas e

bacteriológicas como caso novo de tuberculose pulmonar, apresentava-se no

primeiro mês de tratamento, quando sua amostra de escarro (18345), envolvida no

suposto episódio de contaminação cruzada, apresentou resultado positivo apenas

no meio líquido 12B. Contudo, deve ser mencionado, que amostras anteriores de

escarro deste paciente apresentaram resultados positivos de baciloscopia e cultura

em meio sólido.

A paciente 2, sintomática respiratória, com exame radiográfico com ausência de

imagem sugestiva de TB, encontrava-se sob investigação clínica no momento em

que sua amostra de escarro (18347), envolvida no suposto episódio de

contaminação cruzada, apresentou resultado positivo (2 colônias no meio sólido). A

cultura em questão foi a única com resultado positivo. Duas outras amostras

apresentaram resultados positivos de baciloscopia, porém as respectivas culturas

foram negativas e/ou contaminadas. Esta paciente foi notificada como um caso novo

de tuberculose pulmonar e houve melhora clínica após a instituição da quimioterapia

anti-tuberculose.

O segundo caso foi relacionado às cepas 21061 e 21064 (possível caso de

contaminação cruzada) isoladas dos pacientes pertencentes ao Grupo B e

denominados 3 e 4, respectivamente, os quais não apresentavam nenhuma relação

epidemiológica aparente.

A paciente 3, notificada em 2002 com base em informações clínicas, radiográficas e

bacteriológicas como caso novo de tuberculose pulmonar ainda encontrava-se em

tratamento, quando sua amostra de escarro (21061 coletada em 2004), envolvida no

suposto episódio de contaminação cruzada, apresentou resultado positivo de

baciloscopia e cultura. Neste período de dois anos, a paciente apresentou vários

exames de baciloscopia e cultura positivas, e a cepa de M. tuberculosis isolada da

mesma mostrou-se resistente à isoniazida e rifampicina.

A paciente 4, assintomática, com exame radiográfico com ausência de imagem

sugestiva de TB, encontrava-se sob investigação clínica no momento em que sua

amostra de escarro (21064), envolvida no suposto episódio de contaminação

cruzada, apresentou resultado positivo (10 colônias no meio sólido). A cultura em

questão foi a única com resultado positivo dentre as duas amostras coletadas neste

período. Diante da inconsistência dos achados clínicos e laboratoriais esta paciente

não foi notificada como um caso novo de tuberculose pulmonar.

Após análise dos dados clínicos e bacteriológicos, verificou-se que o primeiro caso

de contaminação não poderia ser confirmado nem descartado. Isso porque, apesar

da paciente ter sido notificada como caso novo de TB, não é possível descartar a

hipótese de que sua amostra tenha sido contaminada pela cepa do paciente 1. Por

essa razão, este caso foi considerado e mantido na análise.

4.6 Análise final dos resultados

A tabela 5 mostra o índice de contaminação cruzada encontrado a partir da análise

de 109 cepas de 97 pacientes isoladas de culturas com CFU < 20 (suspeitas de

contaminação cruzada). Como pode ser observado nesta tabela, apenas 2 (1,9%)

destas culturas foram consideradas contaminadas. Quando considerada a análise

por grupo, foi encontrado apenas 1 caso de contaminação no Grupo A e 1 caso no

Grupo B, mostrando não existir diferença no índice de contaminação entre os

grupos.

Tabela 5 – Índice de contaminação cruzada nos grupos de pacientes avaliados no

estudo.

Condição

Nº

Culturas

Nº

Pacientes

Média

amostra/

paciente

Cont./

amostras

n (%)

Cont./

pacientes

n (%)

Grupo A

56 44 1,2 1 (1,8) 1 (2,3)

Grupo B

53 53 1 1 (1,9) 1 (1,9)

Total 109 97 1,1 2 (1,8) 2 (2,0)

a – grupo de pacientes arrolados no Protocolo DMID01 – 009 (projeto)

b – grupo de pacientes atendidos no HUCAM (rotina)

Cont. = contaminação

Quando os 97 pacientes foram estratificados de acordo com o momento da coleta,

ou seja, no diagnóstico ou em tratamento, foi observado que os 2 casos de

contaminação encontravam-se no momento do diagnóstico representando 2,7% do

total de pacientes avaliados (Tabela 6).

Tabela 6 - Índice de contaminação cruzada em amostras de pacientes sob

investigação diagnóstica e em tratamento.

Condição

Nº

Culturas

Nº

Pacientes

Média

amostra/

paciente

Cont./

amostras

n (%)

Cont./

pacientes

n (%)

Diagnóstico

81 74 1,06 2 (2,5) 2 (2,7)

Tratamento

28 23 1,2 0 (0,0) 0 (0,0)

Cont = contaminação

Convém ainda mencionar que das 109 culturas analisadas, 9 eram provenientes de

pacientes que apresentaram uma única cultura positiva, e que os 2 únicos casos de

contaminação considerados ocorreram em associação com esta condição. Também

foi possível observar que a contaminação foi detectada apenas em culturas com

crescimento de menos de 10 colônias (Tabela 7).

Tabela 7 – Contaminação cruzada em relação à presença de única cultura positiva

do paciente e o número de colônias isoladas na mesma.

Variável Contaminação cruzada

Única cultura positiva do paciente apresentando

0-5 colônias

6-10 colônias

11-17 colônias

Total

1/5

1/3

0/1

2/9

a – número de culturas contaminadas dividido pelo número de culturas caracterizadas por

serem as únicas culturas positivas do paciente

Discussão

DiscussãoDiscussão

Discussão

5 DISCUSSÂO

Na última década, o desenvolvimento das técnicas de biologia molecular tem

contribuído para melhorar os procedimentos diagnósticos de várias doenças.

Entretanto, apesar deste avanço tecnológico, o padrão-ouro para o diagnóstico

definitivo da tuberculose continua sendo a cultura positiva, seguida da identificação

do M. tuberculosis (de BOER et al., 2002). O resultado da cultura é, portanto,

imprescindível para o clínico estabelecer o diagnóstico e iniciar o tratamento dos

pacientes, além de auxiliar na detecção de casos de falência de tratamento. Em

alguns casos, porém, observa-se que uma cultura positiva pode ser resultado de

contaminação cruzada e, nos últimos anos, com o auxílio de técnicas moleculares,

verificou-se que estes casos não são raros. Um estudo de metanálise realizado por

Burman e Reves (2000), relatou a ocorrência de culturas falso-positivas em 93% dos

estudos revisados por estes autores, que investigavam possíveis casos de

contaminação cruzada.

Na maioria dos casos, uma suspeita de contaminação cruzada ocorre quando

observa-se um ou mais dos seguintes fatores: história clínica do paciente

incompatível com TB, resultado de teste de sensibilidade a drogas inesperado,

resultado positivo em apenas uma das culturas do paciente e/ou crescimento de

poucas colônias em meio de cultura sólido (BURMAN; REVES, 2000).

Entretanto, o fato de uma cultura apresentar crescimento de poucas colônias

não está associado exclusivamente a casos de contaminação. Ao contrário,

diversos estudos relatam que culturas realizadas a partir de espécimes

coletados de pacientes portadores do HIV, paucibacilíferos e/ou em tratamento

também podem podem apresentar crescimento de poucos organismos (NUNN et

al., 2005; BURMAN et al., 1997; FRIEDEN et al., 1996) sem representar,

necessariamente, um indício de contaminação cruzada.

Por este motivo, no presente estudo, propusemo-nos a avaliar se o crescimento de

poucas colônias em meio sólido pode ser considerado um indicador de

contaminação cruzada, especialmente em laboratórios que desenvolvem suas

atividades seguindo as normas de Boas Práticas Clínicas e Laboratoriais.

Para o efetivo cumprimento destes propósitos, julgamos indispensável a seleção

cuidadosa das cepas, a utilização de um critério adequado para investigação dos

possíveis episódios de contaminação cruzada e a escolha de uma técnica

molecular apropriada para a investigação dos mesmos.

Para a realização do primeiro passo foram selecionadas apenas as cepas

isoladas de culturas com número de colônias menor que 20. O número máximo

de colônias foi estabelecido com base em vários estudos de contaminação

cruzada que consideram o crescimento de até 17 colônias como reduzido

(BRADEN et al., 1997; ABER et al., 1980; BAUER et al., 1997; BURMAN et al.,

1997; WURTZ et al., 1996). Das cepas selecionadas, foram incluídas no estudo

apenas aquelas para as quais os dados clínicos do paciente estavam

disponíveis, caso fosse necessário utilizá-los. Este processo de seleção não

gerou a exclusão de nenhuma cepa no grupo dos pacientes pertencentes ao

projeto DMID01- 009(Grupo A), pois neste grupo o acompanhamento dos

mesmos é bastante rigoroso. No grupo de pacientes atendidos na rotina do

HUCAM (Grupo B) foram excluídas as cepas de pacientes em tratamento devido

à dificuldade encontrada pelo laboratório em obter informações sobre os

mesmos.

Após a seleção das cepas, foi estabelecido o critério a ser utilizado para

investigação dos possíveis casos de contaminação cruzada. Para esta investigação

comparou-se os perfis genéticos das cepas isoladas das culturas supostamente

contaminadas (UFC < 20) aos perfis genéticos das cepas isoladas dos demais

espécimes processados no mesmo dia. Alguns estudos consideram esta análise

como muito restritiva, por avaliar apenas os espécimes processados no dia da

suposta contaminação (BURMAN et al., 1997; van DUIN et al., 1998). Estes autores

consideram que grandes volumes de reagentes contaminados poderiam estar

contaminando amostras por um longo período de tempo. Entretanto, em nosso

laboratório todos os reagentes são aliquotados em pequenas quantidades e

descartados diariamente após a sua utilização, minimizando assim a possibilidade

de contaminação a partir de reagentes.

Para a investigação dos casos de contaminação, a escolha de uma técnica de

biologia molecular apropriada para este tipo de estudo é fundamental. O RFLP,

considerado o padrão-ouro para estudos de epidemiologia molecular e

contaminação cruzada, representa uma excelente ferramenta para a tipagem de

cepas de M. tuberculosis, principalmente devido ao seu excelente poder

discriminatório (van EMBDEN et al., 1992). No entanto, existem limitações para sua

utilização na rotina, por ser este um método bastante trabalhoso, demorado e de

custo elevado. Frente a essas limitações, optamos por utilizar uma técnica

alternativa baseada em PCR, simples, rápida e de baixo custo, para a triagem de

possíveis casos de contaminação que seriam posteriormente confirmados pelo

RFLP.

Até o início deste estudo, por apresentar as características descritas acima e por já

ter sido utilizada em alguns estudos para investigação de episódios de

contaminação cruzada (RITACCO et al., 2002; FILHO et al., 2002), a técnica de

DRE-PCR modificada, descrita por Montoro et al. (1998), era utilizada no laboratório

do NDI/UFES para identificar culturas supostamente falso-positivas. No entanto,

após uma revisão da literatura, encontramos uma nova técnica de PCR-RFLP

denominada RAPET descrita por Yates et al. (2001). Estes autores a descreveram

como uma técnica rápida, simples, reprodutível e com resultados compatíveis aos

obtidos pelo RFLP na detecção de casos de contaminação intralaboratorial.

Devido a algumas limitações apresentadas pela técnica DRE-PCR e ao fato do

RAPET se mostrar uma técnica promissora segundo Yates et al. (2001),

comparamos o desempenho destas duas técnicas avaliando os perfis genéticos de

104 cepas. Nossos resultados mostraram que as limitações observadas para o DRE-

PCR estão de acordo com aquelas descritas por Kremer et al. (1999), que relataram

que esta técnica apresenta reprodutibilidade (devido à pouca intensidade das

bandas produzidas e às diferenças na intensidade dos padrões em si) e poder

discriminatório baixos. Friedman et al. (1995) ressaltam, ainda, que perfis genéticos

definidos pelo DRE-PCR apresentando menos que 4 bandas não podem ser

comparados, sendo necessária a realização de uma outra técnica para avaliação

destes perfis. Nosso estudo mostrou uma diferença estatisticamente significativa

entre o número de bandas obtidos por estas técnicas. Além disso, como a análise

de contaminação depende da comparação dos perfis genéticos de todas as cepas

isoladas em um mesmo dia, a não amplificação do DNA de 4 cepas pela técnica

DRE-PCR, tornou inviável a análise nestes dias. Por outro lado, o RAPET permitiu a

análise dos perfis genéticos de todas as cepas avaliadas e mostrou excelente poder

discriminatório, principalmente após a realização da etapa de digestão dos produtos

de PCR pela enzima HaeIII. Esta técnica permitiu que várias suspeitas de

contaminação fossem excluídas. Deste modo, o RAPET mostrou-se uma ferramenta

importante para triagem de cepas em estudos de contaminação cruzada e de fácil

implementação na rotina do laboratório, corroborando com o descrito por Yates et al.

(2001) em seu estudo.

Devido às características descritas acima, e por apresentar uma boa

reprodutibilidade, esta técnica foi utilizada, neste estudo, para detectar possíveis

casos de contaminação cruzada em um grupo de 109 cepas isoladas de culturas

(UFC < 20) de espécimes clínicos coletados de 97 pacientes. A utilização desta

técnica molecular, permitiu detectar 2 possíveis casos de contaminação cruzada.

Considerando que a confirmação destes casos de contaminação não pode estar

fundamentada apenas em dados moleculares, analisamos os dados clínicos e

bacteriológicos dos pacientes envolvidos. Ao analisarmos o primeiro caso,

concluímos que não haviam provas ou evidências suficientes para confirmar ou

descartar a possibilidade de contaminação. Entretanto, para não subestimarmos o

índice de contaminação encontrado, decidimos manter este caso na análise. Em

relação ao segundo caso analisado, a suspeita de contaminação cruzada foi

confirmada, pois envolvia um paciente assintomático e não notificado como caso de

TB. Considerando que inicialmente todas as 109 cepas avaliadas estavam sob

suspeita de contaminação por apresentarem crescimento de poucas colônias, o

índice de contaminação cruzada encontrado foi considerado muito baixo (1,8%).

Estes resultados diferem daqueles relatados por Mac Gregor et al. (1975) que,

avaliando um total de 36 culturas com menos de 5 UFC (UFC < 5) provenientes de

31 pacientes, observaram um índice de falso-positividade de 33,3%. É importante

mencionar que este estudo foi realizado com base apenas nos dados clínicos e

bacteriológicos dos pacientes e que o laboratório em questão provavelmente não

dispunha dos mesmos recursos atualmente disponíveis em nosso laboratório.

Convém mencionar que foi a partir deste estudo realizado por Mac Gregor et al.

(1975) que se difundiu o conceito de que o crescimento de poucas colônias em meio

sólido estaria associado à episódios de contaminação cruzada. Este conceito, tem

se perpetuado por muitas décadas através de outros estudos (BAUER et al., 1994;

BURMAN et al., 1997; SCHOCH et al., 2003) que não avaliam esta associação mas

concordam em um mesmo aspecto: as culturas falso-positivas identificadas em seus

laboratórios apresentavam crescimento de poucas colônias em meio sólido.

Contudo, se por um lado, é pertinente afirmar que culturas falso-positivas têm maior

probabilidade de apresentar crescimento de poucas colônias, o oposto não é

verdadeiro. Devemos destacar que 98,1% das culturas com UFC < 20 avaliadas em

nosso estudo eram realmente positivas para o M.tuberculosis, o que nos leva a

acreditar que este critério não pode ser utilizado como indicador de contaminação

cruzada. Braden et al. (1997) também demonstraram que o número de colônias não

parece ser um bom indicador de contaminação. Estes autores observaram que

culturas com UFC < 5 foram encontradas tanto em amostras coletadas de pacientes

infectados quanto em culturas falso-positivas. Embora este estudo tenha utilizado

técnicas de biologia molecular, foram avaliadas culturas de apenas 15 pacientes.

Segundo alguns autores (FRIEDEN et al., 1996; NIVIN et al., 1998; FINE et al.,

1997; JASMER et al., 2002), o resultado positivo de apenas uma das culturas de um

determinado paciente é considerado o indicador mais sugestivo da ocorrência de

contaminação cruzada. Por essa razão, consideramos oportuno investigar quais das

culturas com UFC < 20 também eram a única cultura positiva do paciente.

Verificamos que apenas 9 do total de 109 cepas, apresentavam esta condição e que

as 2 culturas consideradas falso-positivas, eram também as únicas culturas positivas

dos pacientes cujas amostras foram contaminadas. Deve ser enfatizado, que em

decorrência do pequeno número de pacientes, não pudemos avaliar estatisticamente

esta associação. Portanto, a realização de estudos futuros seriam importantes para

elucidar esta possível associação.

Com base nos nossos resultados, consideramos que o baixo índice de

contaminação cruzada encontrado nos grupos selecionados poderia ser justificado

por algumas importantes medidas adotadas pelo nosso laboratório tais como a

estruturação da área física, a capacitação dos profissionais e a observação às

normas de Boas de Práticas Clínicas e Laboratoriais.

A primeira medida a ser comentada, se refere à estruturação laboratório, e nesse

contexto, deve ser ressaltado que os espécimes foram processados em uma sala

com pressão negativa e em cabines de segurança biológica utilizadas

exclusivamente para este fim (e não para a preparação de meios, por exemplo).

Segundo Nivin et al (1998), esas medidas reduzem o risco de contaminação

cruzada.

Quanto à segunda medida, cabe destacar que todos os técnicos responsáveis pelo

processamento dos espécimes em nosso laboratório foram capacitados

tecnicamente para a realização das suas atividades. O treinamento dos técnicos é

crucial para diminuir o risco de contaminação cruzada. Este fato é confirmado por

alguns trabalhos que relatam que em laboratórios de microbiologia geral, que

processam poucos espécimes, a possibilidade de ocorrer uma contaminação se

torna maior do que em laboratórios dedicados exclusivamente à micobacteriologia,

cujos profissionais são treinados e preparados para lidar diariamente com o

processamento de muitos espécimes (BURMAN et al., 1997, CRONIN et al., 1998,

BOER et al., 2002).

A terceira medida a ser abordada se refere aos procedimentos adotados para o

processamento dos espécimes. Em nosso laboratório, as ponteiras e/ou pipetas

foram descartadas após a adição dos reagentes a cada tubo. Dessa forma,

procurava-se evitar a contaminação através destes utensílios. Além disso, todos os

reagentes utilizados no processamento das amostras foram divididos em alíquotas

menores, e cada alíquota foi utilizada para um espécime diferente. Esta estratégia foi

estabelecida com o intuito de minimizar o risco de contaminação através do uso de

reagentes previamente contaminados por organismos viáveis de outros espécimes,

pois, quando um mesmo frasco, de grande volume, é utilizado para dispensar os

reagentes, o risco de contaminação cruzada é maior (MAURER et al., 1984; van

DUIN et al., 1998; RAMOS et al., 1999). Um outro procedimento adotado para

reduzir os riscos de contaminação, foi a abertuta individual dos frascos contendo as

amostras. Esta estratégia impossibilita a troca de tampas ou contato entre dois tubos

abertos. A utilização de todos estes procedimentos citados acima foi avaliada por

Small et al. (1993a) e estes autores observaram uma redução significativa nos

episódios de contaminação em seu laboratório.

É possível que os procedimentos realizados acima sejam os responsáveis por não

terem sido encontradas diferenças no número de contaminações obtidas nos grupos

A (projeto) e B (rotina). Apesar destes espécimes serem processados por técnicos

diferentes, em diferentes fluxos laminares e utilizando diferentes métodos de

digestão do espécime, a qualidade dos procedimentos realizados no laboratório,

durante o período do estudo, foi constante.

Uma outra análise foi realizada quando redistribuímos as culturas acima de acordo

com o momento em que os espécimes dos pacientes foram coletados (diagnóstico e

tratamento). Nossos resultados mostraram que ambos os casos de contaminação

considerados no estudo se encontravam no grupo de pacientes sob investigação

diagnóstica. Contudo, devido ao pequeno número de amostras analisadas de

pacientes em tratamento, não foi possível avaliar se culturas com menos de 20 UFC,

realizadas a partir destas amostras, apresentavam menor risco de estarem

contaminadas.

Um outro aspecto a ser considerado, é a quantidade de amostras contendo bacilos

viáveis processadas por dia no laboratório. Segundo Carroll et al. (2002), quanto

maior este número, maior a possibilidade de haver a contaminação, tendo em vista

que estes espécimes são processados juntamente com espécimes negativos. No

presente estudo, não foi possível fazer esta comparação pois, apesar da média de

espécimes processados por dia ter sido maior no Grupo B, a média de espécimes

positivos processados por dia foi semelhante nos dois grupos (2,7 e 3,0 para os

grupos A e B, respectivamente) e o número de episódios de contaminação foi o

mesmo (1 em cada grupo).

Com base nos resultados obtidos em nosso estudo, podemos inferir que, em

laboratórios que realizam seus procedimentos obedecendo as normas de boas

práticas clínicas e laboratoriais e/ou participam de ensaios clínicos, o fato de uma

cultura apresentar crescimento de poucas colônias (UFC < 20) não sugere

contaminação da mesma. Pelo contrário, nossos achados revelam que, na grande

maioria dos casos, estas cepas foram isoladas de pacientes realmente infectados.

Por esse motivo, concluímos que o clínico não deve se utilizar apenas deste critério

para excluir casos suspeitos de TB e/ou de falência terapêutica. É importante

destacar aqui que, durante a realização deste estudo, a utilização deste critério

induziu a não valorização de um resultado de cultura positivo (1 UFC) de um

paciente no sexto mês de tratamento, e que veio a recidivar um ano mais tarde.

Diante de todas as considerações aqui apresentadas, julgamos que, valorizando o

resultado da cultura, o médico estaria se resguardando de um diagnóstico incorreto,

o que seria fundamental, pois a não detecção de um caso de TB pode levar ao

abandono primário e evolução da doença, resultando na transmissão desta a outros

indivíduos saudáveis. Devemos ainda, considerar que, para pacientes em

tratamento, uma cultura positiva pode indicar falência ou maior risco de recidiva,

como demonstrado acima.

Conclusões

ConclusõesConclusões

Conclusões

6 CONCLUSÕES

1. O crescimento de poucas colônias de M. tuberculosis em meio de cultura sólido

não pode ser considerado um indicador microbiológico de contaminação cruzada em

laboratórios que realizam suas atividades segundo às normas de Boas de Práticas

Clínicas e Laboratoriais.

2. O RAPET mostrou-se um método rápido, simples, reprodutível e útil para análise

de casos suspeitos de contaminação cruzada em laboratórios de micobacteriologia

3. Não houve diferença entre os índices de contaminação cruzada nos espécimes

coletados dos pacientes arrolados em ensaios clínicos e dos pacientes atendidos em

um Serviço de Referência Ambulatorial de Tuberculose.

4. O crescimento de poucas colônias de M. tuberculosis em meio de cultura sólido

não pode ser considerado um indicador microbiológico de contaminação cruzada no

momento do diagnóstico e nem durante o tratamento do paciente.

5. Embora os casos de contaminação cruzada tenha sido encontrados em pacientes

que possuíam uma única cultura positiva com crescimento de menos de 10 UFC,

não foi possivel estabelecer estatisticamente associação entre estas varíaveis em

razão do pequeno número de pacientes.

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Anexos

Anexos Anexos

Anexos

ANEXOS

Anexo I. Meio de cultura Ogawa-Kudoh

Di-hidrogeno fosfato monopotássico…………………..……

6 g

Citrato de magnésio …………………………….....…………

0,3 g

Glutamato de sódio ………………………………………......

1,5 g

Glicerol ………………………………………………………...

12 ml

Solução de verde malaquita 2% …………………………….

12 ml

Água deionizada ………………………………………...……

300 ml

Os sais foram dissolvidos em água destilada, até sua completa dissolução. Ainda em

agitação foram adicionados o glicerol e o verde malaquita. A solução foi esterilizada

em autoclave a 127ºC por 15 minutos. Os ovos de galinha, previamente

desinfetados com álcool 70% por 30 minutos, foram homogeneizados e adicionados

à solução esterilizada. Para a coagulação, aproximadamente 8 ml do meio foram

distribuídos em frascos e incubados na posição inclinada a 85ºC por uma hora. Feito

o controle de esterilidade do meio, os mesmos foram armazenados à temperatura

ambiente.

Anexo II. Soluções utilizadas no processamento das amostras

Anexo IIa. Solução de NALC / NaOH / Citrato de sódio

NALC ……………………………………………………………...

0,25 mg

NaOH 5% / NaC 1,45%..... ……………………………….…….

50 ml

Foi adicionado o NALC à solução NaOH 5% / Citrato de sódio 1,45% e

homogeneizado até dissolução completa.

Anexo IIb. Tampão fosfato 0,067M (pH 6,8)

Solução alcalina:

HPO

…………………………….....…….................……

4,735 g

Água destilada q.s.p...……………………………………......

500 ml

Solução ácida:

……….....................................…………………….

4,535 g

Água destilada q.s.p …………………………………...…… 500 ml

Foram adicionados volumes iguais de solução alcalina e solução ácida em um

béquer de tamanho apropriado, sob agitação magnética. Verificou-se se o pH estava

em 6,8. A solução foi autoclavada a 127ºC por 15 minutos.

Anexo III. Soluções utilizadas no método RFLP-IS6110

Anexo IIIa. Solução tampão tris-EDTA (TE)

Tris (hidroximetil) aminometano (Tris base) ……………….....… 10 mM

Sal dissódico do ácido etilenodiamino tetra- acético (Na

EDTA) 1 mM

Após a dissolução dos sais em água destilada, o pH da solução foi ajustado para

8,0. Em seguida a solução foi esterilizada em autoclave a 120ºC por 15 minutos e

armazenada à temperatura ambiente.

Anexo IIIb. Solução de lisozima

Lisozima ……………………………………………..…………...

10 mg

Água ultrapura esterilizada ……………………………………..

1 ml

A enzima foi dissolvida em água ultrapura esterilizada, obtida do Sistema Milli Q de

purificação de água (Millipore Corporation). A solução foi distribuída em tubos tipo

Eppendorf e armazenada a -20

Anexo IIIc. Solução de proteinase K

Proteinase K ……………………………………………………...

10 mg

Água ultrapura esterilizada ……………………………….…….

1 ml

Após completa dissolução da enzima, a solução foi distribuída em tubos tipo

Eppendorf e armazenada a -20

Anexo IIId. Solução de CTAB – NaCl

Hexadecil trimetil brometo de amônio (CTAB) …………...…..

10 %

Cloreto de sódio (NaCl) ………………………………….……...

0,7 M

O CTAB foi adicionado à solução de NaCl, e a mistura foi aquecida a 65

C até

completa dissolução. A solução foi esterilizada em autoclave a 120

C por 15 minutos

e armazenada à temperatura ambiente.

Anexo IIIe. Tampão TBE 1X

Tris-base ……………………………………………………… 89 mM

Ácido bórico …………………………………..........…………

89 mM

EDTA ……………………………………………….………….

2,5 mM

Após a dissolução dos reagentes em água destilada, o pH da solução foi ajustado

para 8,0. Em seguida a solução foi esterilizada em autoclave a 120ºC por 15 minutos

e armazenada à temperatura ambiente.

Anexo IIIf. Mistura Lambda-

Hind

III/PhiX174-

Hae

III

Lambda-HindIII……………………………....…….........……

40 ng/

PhiX-HaeIII ……………………………………………...........

50 ng/

TE 1X ………………………………………………….……….

130

Tampão de amostra de DNA 5X.........................................

Anexo IIIg. Solução SSC/DSS

Solução SSC 2X………………………………………….....…..

1000 ml

Solução de DSS ………………………………………………....

10 ml

A solução SSC 20X foi diluída dez vezes em água destilada e acrescida da solução

de DSS. Depois a solução foi armazenada à temperatura ambiente.

Anexo IIIh. Solução salina com citrato (SSC) – 2 vezes

NaCl ……………………………………………………………. 0,3 M

Citrato trissódico ……………………………………………….. 0,03 M

Os sais foram dissolvidos em água destilada, o pH foi ajustado para 7,0 com ácido

cítrico e o volume da solução completado para 1000 ml. A solução foi esterilizada em

autoclave a 120ºC durante 15 minutos e armazenada à temperatura ambiente.

Anexo IV. Questionário

Questionário Básico para Determinar Risco de Contaminação Intralaboratorial do

Exame de Cultura

No Exame: ________________ Data: ______/______/______

Nome: ______________________________________ Espécime:_______________

Possível contaminação cruzada entre amostras:

No _______________ / No _______________ / No _______________

Informações Laboratoriais:

1) Exame Radiográfico:

Suspeito  Normal 

2) A amostra teste apresenta Baciloscopia Negativa e Cultura Positiva?

Sim



Não



3) Amostra teste apresenta Baciloscopia Positiva e Cultura Positiva ?

Sim



Não



4) O paciente possui pelo menos duas amostras com resultado de Baciloscopia

Negativa e Cultura Negativa anteriores ao exame da amostra teste?

Sim  Não 

5) A amostra teste no dia do seu processamento está precedida ou sucedida de

amostra com baciloscopia e/ou cultura positiva?

Sim  Não 

6) Além da amostra teste havia(m) outra(s) amostra(s) com baciloscopia e/ou

cultura positiva no mesmo dia?

Sim  Não 

7) Além da amostra teste o paciente possui outras amostras no mesmo mês com

resultado de Baciloscopia Positiva e/ ou Cultura Positiva ?

Sim  Não 

8) No dia em que a amostra teste foi tratada o laboratório processou um número

de amostras superior à sua media diária?

Sim  Não 

9) O perfil polimórfico dos fragmentos de DNA (fingerprint) do M. tuberculosis da

amostra teste é semelhante ao encontrado em outra(s) amostra(s) do mesmo

dia da rotina?

Sim  Não 

10) A amostra teste no dia do seu processamento está precedida ou sucedida de

amostra com cultura positiva cujo(s) perfil(is) polimórfico(s) dos fragmentos de

DNA (fingerprint) do M. tuberculosis é (são) semelhante(s) ao seu?

Sim



Não



Informações Clínicas

11) O paciente foi confirmado como caso de tuberculose?

Sim



Não



12) O paciente apresentava sintomas e sinais clínicos fortemente sugestivos de

tuberculose?

Sim



Não



13) O paciente melhorou clínica e radiologicamente com a instituição do esquema

de tratamento para tuberculose?

Sim



Não



14) Houve mudança no diagnóstico do paciente em razão do mesmo apresentar

outra pneumopatia com quadro clínico e radiológico semelhante aos da TB?

Sim  Não 

15) O médico considerou o resultado da cultura para definir o caso de TB?

Sim



Não



Informações Complementares (Controle de Qualidade laboratorial)

16) Suspeita de ter ocorrido: identificação errônea das amostras na unidade de

saúde, troca de amostras durante o processamento, registro errôneo de

resultado?

Sim



Não



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