( PDF ) Estudo fitoquímico do enxerto de Azadirachta indica sobre Melia azedarach: quantificação de substâncias inseticidas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

ESTUDO FITOQUÍMICO DO ENXERTO DE Azadirachta indica

SOBRE Melia azedarach: QUANTIFICAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS

INSETICIDAS

MOACIR ROSSI FORIM*

Tese apresentada como parte dos

requisitos para a obtenção do título de

DOUTOR EM CIÊNCIAS área de

concentração: QUÍMICA ORGÂNICA.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Fátima das Graças Fernandes da Silva

*Bolsista Fapesp

São Carlos – SP

2006

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Livros Grátis

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Milhares de livros grátis para download.

Dedico este trabalho a todas as

pessoas que em mim sempre

acreditaram. Em especial aos

meus pais, Moacir e Leonor, e

minha namorada Andréia.

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AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra. Maria Fátima das Graças Fernandes da Silva pela constante

orientação e apoio oferecido durante todos esses anos, por seus ensinamentos, por

seu exemplo profissional e por sua amizade;

À Profa. Dra. Quezia Bezerra Cass pelo apoio incondicional ao projeto, por sua

amizade e por toda a orientação cedida durante todos esses anos;

Aos professores Dr. João Batista Fernandes, Dr. Paulo Cezar Vieira, Dr. Edson

Rodrigues Filho e Dr. Antônio Gilberto Ferreira pela contribuição dada ao trabalho e

pela ótima convivência durante todos esses anos;

À Dra. Sueli de Souza Martinez por ter me recebido em seu instituto, pelo material

fornecido, pela contribuição e participação neste trabalho;

Aos amigos do Laboratório de Produtos Naturais, Laboratório de Síntese Orgânica e

CLAE, Laboratório de Espectrometria de Massas e Laboratório de Ressonância

Magnética Nuclear do Depto. Química da UFSCar por proporcionarem um excelente

ambiente de trabalho. Meu agradecimento se estende por todos que passaram pelo

laboratório durante esses quatro anos em que fiz parte destes grupos;

Aos técnicos Luciana, Paulo, Valdir e Doraí por terem contribuído imensamente com

esta tese através da realização de seus trabalhos;

Aos amigos de toda hora Oldair Donizete e José Fernando;

Aos meus pais Moacir e Leonor, a minha irmã Julyana e minha sobrinha Catharyna

pelo incentivo e ânimo dado ao longo da minha vida;

À Andréia por estar ao meu lado incondicionalmente.

As agências de Fomento: Fapesp, Capes e CNpq.

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APRESENTAÇÃO

A presente tese descreve a investigação fitoquímica do enxerto de

Azadirachta indica sobre Melia azedarach e quantificação de alguns metabólitos

característicos de A. indica via a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Para

facilitar a leitura e a compreensão dessas técnicas a tese encontra-se dividida em

capítulos. O Capítulo 01, basicamente trás uma introdução geral ao assunto,

descreve as espécies, o enxerto e os objetivos do projeto. O Capítulo 02 é dedicado

à investigação fitoquímica do enxerto. Nele encontra-se uma revisão bibliográfica

completa para as espécies, os procedimentos experimentais e os resultados obtidos.

Todo o estudo quantitativo é descrito no Capítulo 03. O desenvolvimento dos

métodos analíticos, os procedimentos experimentais e também os resultados obtidos

pela Cromatografia Líquida de Alta Eficiência são detalhados neste capítulo. Os

capítulos 02 e 03 podem ser lidos separadamente. Os dois últimos capítulos, 04 e 05

trazem, respectivamente, a conclusão geral do projeto e as referências bibliográficas

consultadas para a execução do trabalho. No final da tese podem ainda ser

encontrados os Apêndices.

Diversas siglas utilizadas no texto representando abreviações de

técnicas ou equipamentos, encontram-se descritas na mesma forma usados em

inglês. Algumas destas siglas ainda não possuem uma segunda equivalente em

português como, por exemplo, SPE. A tentativa de traduzir esta sigla para o

português, EFS, foi tão inviável como traduzir “samba” para o inglês. Deste modo,

algumas siglas foram mantidas no idioma de origem. Outras siglas, como HPLC,

foram propositalmente mantidas na forma de origem por serem siglas amplamente

descritas por toda a comunidade científica internacional.

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PRINCIPAIS SÍMBOLOS E ABREVIAÇÕES

kg - Kilograma

g - Grama

mg - Miligrama

µg - Micrograma

L - Litro

mL - Mililitro

- Centímetro cúbico

µL - Microlitro

v/v - Volume/volume

m - Metro

cm - Centímetro

mm - Milímetro

µm - Micrômetro

nm - Nanômetro

Å - Angstron

- Comprimento de onda

min - Minutos

s - Segundos

mol - Molar

ºC - Graus Celsius

% - Percentagem

A. indica - Azadirachta indica

M. azedarach - Melia azedarach

LDM - Sementes lavadas despolpadas e moídas

Hex - Hexano

DCM - Diclorometano

AcOEt - Acetato de Etila

MeOH - Metanol

EtOH - Etanol

ACN - Acetonitrila

THF - Tetraidrofurano

HM - Hidrometanólico

CC - Cromatografia em Coluna Aberta

CCD - Cromatografia em Camada Delgada

CCDA - Cromatografia em Camada Delgada Analítica

HPLC - High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência)

UV - Ultravioleta

IV - Infravermelho

DAD - Detector por Arranjo de Diodos

LLE - Liquid Liquid Extraction (Extração Líquido-Líquido)

SPE - Solid Phase Extraction (Extração em Fase Sólida)

- Diâmetro interno

h - Altura

k - Fator de Retenção

- Fator de separação

- Resolução

C18, C

- Coluna ocatadecil

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ODS - Octadecilsilano

CN - Cianopropil

rpm - Rotações por minuto

CV% - Coeficiente de variação

LQ - Limite de Quantificação

LD - Limite de Detecção

RMN

H - Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio-1

RMN

C - Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13

COSY - Correlation Spectroscopy

HSQC - Heteronuclear Single Quantum Correlation

HMBC - Heteronuclear Multiple Bond Correlation

DEPT 135º - Distortionless Enhacement by Polarization Transfer

DOSY - Diffusion Ordened Spectroscopy

RMN 1D - Ressonância Magnética Nuclear uma dimensão

RMN 2D - Ressonância Magnética Nuclear duas dimensões

Hz - Hertz

MHz - Mega-Hertz

J - Unidade de constante de acoplamento (em Hertz)

Me - Metila

- Deslocamento químico em partes por milhão

ppm - Partes por milhão

- Ligação sigma (ligação simples)

- Ligação pi (ligação dupla)

s - Singleto

sl - Singleto largo

d - Dubleto

dl - Dubleto largo

dd - Duplo dubleto

dt - Duplo tripleto

dq - Duplo quarteto

t - Tripleto

tl - Tripleto largo

m - Multipleto

CDCl

- Clorofórmio deuterado

MeOD - Metanol deuterado

-1

- Freqüência (número de onda)

[α]

- Rotação Ótica Específica

GC - Cromatografia Gasosa

GC/MS/MS - Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas

em seqüências

LC/MS/MS - Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas

em seqüências

MS/MS - Espectrometria de Massa-Massa

ESI

- Ionização por eletrospray no modo negativo

m/z - Relação massa/carga

MRM - Multiple Reaction Monitoring

[M-H]

- Pico do pseudo íon molecular

TIC - Cromatograma de Íons Totais

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LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1 – Cicloartanos, esteróides, protolimonóides, apo-protolimonóides e limonóides

isolados do Gênero Azadirachta...............................................................................................

......... 35

Tabela 2.1 – Cicloartanos, esteróides, protolimonóides, apo-protolimonóides e limonóides

isolados do Gênero Azadirachta...............................................................................................

......... 46

Tabela 2.3 – Divisão do enxerto e os extratos obtidos............................................................. ......... 51

Tabela 2.4 – Diferentes partes do enxerto analisados por LC-MS/MS.....................................

......... 66

Tabela 2.5 – Dados de RMN de

H e

C para o Nimbolido..................................................... ......... 78

Tabela 2.6 – Dados de RMN

H e

C para o 28-Desoxonimbolídeo....................................... ......... 83

Tabela 2.7 – Dados de RMN de

H e

C para o Salannina.................................................... ......... 94

Tabela 2.8 – Dados de RMN

H e

C para o 6-O-Acetilnibandiol........................................... ......... 101

Tabela 2.9 – Dados de RMN de

H e

C do 6-Desacetilnimbineno isolado........................... ......... 109

Tabela 2.10 – Dados de RMN

H e

C para a Nimbolina A isolada e dados literatura para a

Trichilinina D.............................................................................................................................. ......... 120

Tabela 2.11 – Dados de RMN

H e

C para a 6-Desacetilnimbina.......................................... ......... 125

Tabela 2.12 – Dados de RMN

H e

C para a azadirachtina A................................................ ......... 137

Tabela 2.13 – Dados de RMN

H e

C referentes a quercetina............................................... ......... 147

Tabela 2.14 – Dados de RMN

H e

C referentes a Quercitrina.............................................. ......... 150

Tabela 2.15 – Dados de RMN

H e

C para a azadirachtina B................................................ ......... 153

Tabela 2.16 – Dados de RMN

H e

C para o Nimbandiol e para o 6-O-acetilnimbandiol...... ......... 160

Tabela 2.17 – Dados de RMN

H e

C para o 1-tigloil-3-acetilazadirachtinina........................ ......... 177

Tabela 2.18 – Sesquiterpenos presentes no óleo essencial das folhas do enxerto................. ......... 183

Tabela 3.1 – Métodos típicos para pré-tratamento de amostras............................................. ......... 191

Tabela 3.2 – Tradicionais métodos de extração de amostras sólidas...................................... ......... 192

Tabela 3.3 – Testes de SPE para o extrato metanólico nos modos de operação normal e

reverso...................................................................................................................................... ......... 211

Tabela 3.4 – Preparo dos extratos para a quantificação da HC em sementes do Nim

(Catanduva-SP)......................................................................................................................... ......... 216

Tabela 3.5 – Precisão e exatidão determinada para a curva de calibração de HC.................. ......... 217

Tabela 3.6 – Valores quantificados nas amostras para a HC................................................... ......... 217

Tabela 3.7 – Padrões de HC analisados entre as eluições das amostras do Nim como

controles de eficiência............................................................................................................... ......... 218

Tabela 3.8 – Exatidão (%) e precisão (CV%) intradia e interdia para a análise do HC............ ......... 219

Tabela 3.9 – Precisão (CV%) e exatidão (%) do Teste Cego do protocolo de validação do

método de análise da hidrocortisona........................................................................................ ......... 219

Tabela 3.10 – Precisão (CV%) e exatidão (%) determinada para a curva de calibração do

padrão de azadirachtina............................................................................................................ ......... 221

Tabela 3.11 – Exatidão (%) e precisão (CV%) intradia e interdia para a análise da

azadirachtina A.......................................................................................................................... ......... 222

Tabela 3.12 – Precisão (CV%) e exatidão (%) do Teste Cego do protocolo de validação do

método de análise da azadirachtina......................................................................................... ......... 222

Tabela 3.13 – Preparo dos extratos para a quantificação da azadirachtina............................. ......... 223

Tabela 3.14 – Teor da azadirachtina A nas sementes do Nim quantificados pelo Método I.... ......... 224

Tabela 3.15 – Padrões de azadirachtina analisados entre as eluições das amostras do Nim

como controles de eficiência..................................................................................................... ......... 224

Tabela 3.16 – Precisão (CV%) e exatidão (%) determinada para as curvas de calibração

dos padrões de azadirachtina A e B......................................................................................... ......... 236

Tabela 3.17 – Exatidão (%) e precisão (CV%) intradia e interdia para a análise da

azadirachtina A.......................................................................................................................... ......... 237

Tabela 3.18 – Precisão (CV%) e exatidão (%) do Teste Cego do protocolo de validação do

método de análise da azadirachtina......................................................................................... ......... 237

Tabela 3.19 – Precisão (%) entre as replicatas das concentrações da curva de calibração

por adição de padrão............................................................................. ......... 239

Tabela 3.20 - Lotes de sementes do Nim analisadas....................... ......... 241

Tabela 3.21 - Distinção entre os lotes de sementes analisadas através do peso médio

unitário da semente, da porcentagem em peso referente ao peso médio da amêndoa na

semente e a porcentagem de gemas duplas encontradas....................................................... ......... 242

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Tabela 3.22 – Resultados da quantificação dos teores de azadirachtina A e B nas amostras

das sementes............................................................................................................................ ......... 243

Tabela 3.23 – Dados referentes a quantificação de sementes armazenadas.......................... ......... 247

Tabela 3.24 – Procedimentos de isolamento e limpeza usando cartuchos C18 no modo

reverso de eluição investigados para o óleo do Nim................................................................ ......... 255

Tabela 3.25 – Procedimentos de isolamento e limpeza usando cartuchos CN no modo

normal de eluição investigados para o óleo do Nim................................................................. ......... 257

Tabela 3.26 – Experimentos de escolha do solvente de remoção da azadirachtina dos

cartuchos CN investigados...................................................................................................... ......... 258

Tabela 3.27 – Procedimentos de isolamento e limpeza usando cartuchos CN no modo

normal de eluição investigados para o óleo do Nim usando MeOH na etapa de remoção do

analito de interesse................................................................................................................... ......... 259

Tabela 3.28 – Eluição gradiente binário para amostras preparados com o óleo do Nim......... ......... 260

Tabela 3.29 – Precisão (CV%) e exatidão (%) determinada para as curvas de calibração

dos padrões de azadirachtina A e B......................................................................................... ......... 268

Tabela 3.30 – Exatidão (%) e precisão (CV%) intradia e interdia para a análise da

azadirachtina A.......................................................................................................................... ......... 269

Tabela 3.31 – Precisão (CV%) e exatidão (%) do Teste Cego do protocolo de validação do

método de análise da azadirachtina......................................................................................... ......... 270

Tabela 3.32 – Precisão (%) entre os pontos da Curva de Adição de Padrão.......................... ......... 271

Tabela 3.33 – Teores de azadirachtina A encontrados para diversas amostras de óleos

comerciais do Nim..................................................................................................................... ......... 273

Tabela 3.34 – Teores de azadirachtina A e B em amostras do óleos comerciais do Nim........ ......... 273

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LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1 – Ciclização do óxido de esqualeno na conformação cadeira-barco-cadeira-

barco..................................................................................................................................... ......... 19

Figura 2.2 – Ciclização do óxido de esqualeno na conformação cadeira-cadeira-cadeira-

barco..................................................................................................................................... ......... 20

Figura 2.3 – Apo-rearranjo do protolimonóides..................................................................... ......... 21

Figura 2.4 – Possíveis rotas biosintéticas para a formação do anel furano.......................... ......... 22

Figura 2.5 – Classificação em grupos biogenéticos dos limonóides presentes no gênero

Azadirachta. Uma possível seqüência biogenética ……………………………………...........

......... 23

Figura 2.6 – Classificação em grupos biogenéticos dos limonóides presentes no gênero

Melia. Uma possível seqüência biogenética ……………………………...…………………….

......... 24

Figura 2.7 – Esquema de preparo dos extratos................................................................... ......... 52

Figura 2.8 – Esquema do fracionamento cromatográfico do extrato F4HD-D e de suas

frações.………………………………………………………….................................................. ......... 53

Figura 2.9 – Esquema do fracionamento cromatográfico do extrato F4HD-AE e de suas

frações.................................................................................................................................. ......... 54

Figura 2.10 – Extração Líquido-Líquido do extrato F4M....................................................... ......... 55

Figura 2.11 – Esquema do fracionamento cromatográfico do extrato F4M-D e de suas

frações.................................................................................................................................. ......... 56

Figura 2.11b – Esquema do fracionamento cromatográfico do extrato F4M-D e de suas

frações - continuação............................................................................................................

......... 57

Figura 2.12 – Esquema do fracionamento cromatográfico do extrato F4M-AE e F4M-B e

de suas frações.....................................................................................................................

......... 58

Figura 2.13 – Esquema de extração líquido-líquido do extrato C2P..................................... ......... 59

Figura 2.14 – Esquema do fracionamento cromatográfico do extrato C2P e de suas

frações.................................................................................................................................. ......... 60

Figura 2.15 – Esquema do fracionamento cromatográfico do extrato R2P e de suas

frações.................................................................................................................................. ......... 61

Figura 2.16 – Esquema de extração e isolamento dos padrões de Azadirachtina.............. ......... 62

Figura 2.17 – Esquema do fracionamento cromatográfico do extrato metanólico das

sementes do Nim, Catanduva-SP........................................................................................ ......... 63

Figura 2.18 – Aparelho de extração do tipo Clevenger modificado...................................... ......... 64

Figura 2.19 – Espectro de RMN

H do Nimbolido (CDCl

, 200 MHz)................................... ......... 79

Figura 2.20 – Espectro de RMN

C do Nimbolido (CDCl

, 100 MHz).................................. ......... 79

Figura 2.21 – Espectro de COSY do Nimbolido (CDCl

, 400 MHz)...................................... ......... 80

Figura 2.22 – Espectro de HSQC do Nimbolido (CDCl

, 100 MHz)...................................... ......... 80

Figura 2.23 – Espectro de HMBC do Nimbolido (CDCl

, 100 MHz)..................................... ......... 81

Figura 2.24 – Espectro de RMN

H do 28-Desoxonimbolido (CDCl

, 400 MHz).................. ......... 84

Figura 2.25 – Espectro de RMN

C do 28-Desoxonimbolido (CDCl

, 100 MHz)................. ......... 84

Figura 2.26 – Espectro de COSY do 28-Desoxonimbolido (CDCl

, 400 MHz)..................... ......... 85

Figura 2.27 – Espectro de HSQC do 28-desoxonimbolido (CDCl

, 100 MHz)...................... ......... 85

Figura 2.28 – Espectro de HMBC do 28-desoxonimbolido (CDCl

, 100 MHz)..................... ......... 86

Figura 2.29 – Espectro de RMN

H do Salannina (CDCl

, 400 MHz)................................... ......... 95

Figura 2.30 – Espectro de RMN

C do Salannina (CDCl

, 100 MHz).................................. ......... 95

Figura 2.31 – Espectro de COSY do Salannina (CDCl

, 400 MHz)...................................... ......... 96

Figura 2.32 – Espectro de HSQC do Salannina (CDCl

, 100 MHz)...................................... ......... 96

Figura 2.33 – Espectro de HMBC do Salannina (CDCl

, 100 MHz)..................................... ......... 97

Figura 2.34 – Espectro de RMN

H do 6-O-Acetilnimbandiol (CDCl

, 400 MHz).................. ......... 102

Figura 2.35 – Espectro de RMN

C do 6-O-Acetilnimbandiol (CDCl

, 100 MHz)................ ......... 102

Figura 2.36 – Espectro de RMN COSY do 6-O-Acetilnimbandiol (CDCl

, 400 MHz)........... ......... 103

Figura 2.37 – Espectro de HSQC do 6-O-Acetilnimbandiol (CDCl

, 100 MHz).................... ......... 103

Figura 2.38 – Espectro de HMBC do 6-O-Acetilnimbandiol (CDCl

, 100 MHz).................... ......... 104

Figura 2.39 – Espectro RMN

H do 6-Desacetilnimbineno (CDCl

, 200 MHz)..................... ......... 110

Figura 2.40 – Espectro RMN

C do 6-Desacetilnimbineno (CDCl

, 100 MHz).................... ......... 110

Figura 2.41 – Espectro COSY do 6-Desacetilnimbineno (CDCl

, 400 MHz)........................ ......... 111

Figura 2.42 – Espectro de HSQC do 6-Desacetilnimbineno (CDCl

, 100 MHz)................... ......... 111

Figura 2.43 – Espectro de HMBC do 6-Desacetilnimbineno (CDCl

, 100 MHz)................... ......... 112

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Figura 2.44 – Espectro RMN

H da Nimbolina A (CDCl

, 400 MHz)..................................... ......... 121

Figura 2.45 – Espectro RMN

C da Nimbolina A (CDCl

, 100 MHz)................................... ......... 121

Figura 2.46 – Espectro de COSY da Nimbolina A (CDCl

, 400 MHz)................................... ......... 122

Figura 2.47 – Espectro de HSQC da Nimbolina A (CDCl

, 100 MHz).................................. ......... 122

Figura 2.48 – Espectro de HMBC da Nimbolina A (CDCl

, 100 MHz).................................. ......... 123

Figura 2.49 – Espectro de RMN

H da 6-Desacetilnimbina (CDCl

, 400 MHz).................... ......... 126

Figura 2.50 – Espectro de RMN

C da 6-Desacetilnimbina (CDCl

, 100 MHz)................... ......... 126

Figura 2.51 – Espectro de COSY da 6-Desacetilnimbina (CDCl

, 400 MHz)....................... ......... 127

Figura 2.52 – Espectro de HSQC da 6-Desacetilnimbina (CDCl

, 100 MHz)....................... ......... 127

Figura 2.53 – Espectro de HMBC da 6-Desacetilnimbina (CDCl

, 100 MHz)...................... ......... 128

Figura 2.54 – Espectro de RMN

H da azadirachtina A (CDCl

, 400 MHz).......................... ......... 138

Figura 2.55 – Espectros: (a) RMN

C e (b) DEPT 135º para a azadirachtina A (CDCl

100 MHz)............................................................................................................................... ......... 138

Figura 2.56 – Espectro do COSY para a azadirachtina A (CDCl

, 400 MHz)....................... ......... 139

Figura 2.57 – Espectro de HSQC da azadirachtina A (CDCl

, 100 MHz)............................. ......... 139

Figura 2.58 – Espectro de HMBC da azadirachtina A (CDCl

, 100 MHz)............................. ......... 140

Figura 2.59 – Espectro de Infravermelho para a azadirachtina A......................................... ......... 141

Figura 2.60 – Eluição do padrão de azadirachtina A. Fase móvel ACN:H

O – 35:65;

coluna C

Phenomenex

Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm), coluna de segurança

Phenomenex

(4,0x3,0 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min, a alça de injeção de 20 µL.

Detector DAD no comprimento de onda de 217 nm............................................................

......... 142

Figura 2.61 – Espectro no Ultra-violeta da azadirachtina A. Comprimento de onda

máximo de absorção em 215 nm.......................................................................................... ......... 142

Figura 2.62 – Espectro de Massas da azadirachtina A (ESI

)............................................... ......... 144

Figura 2.63 – Espectro de Massas do padrão de azadirachtina A deuterada (ESI

)............ ......... 144

Figura 2.64 – Mecanismo de fragmentação proposta para a azadirachtina A...................... ......... 145

Figura 2.65 – Espectro RMN

H da Quercetina (MeOD, 200 MHZ)..................................... ......... 147

Figura 2.66 – Espectro RMN

C da Quercetina (MeOD, 50 MHZ)...................................... ......... 148

Figura 2.67 – Espectro de

H da Quercitrina (MeOD, 200 MHz)......................................... ......... 150

Figura 2.68 – Espectro de

C da Quercitrina (MeOD, 50 MHz).......................................... ......... 151

Figura 2.69 – Espectro de RMN

H da azadirachtina B (CDCl

, 400 MHz).......................... ......... 154

Figura 2.70 – Espectro de RMN

C da azadirachtina B (CDCl

, 100 MHz)......................... ......... 154

Figura 2.71 – Espectro de COSY da azadirachtina B (CDCl

, 400 MHz)............................. ......... 155

Figura 2.72 – Espectro de HSQC da azadirachtina B (CDCl

, 100 MHz)............................. ......... 155

Figura 2.73 – Espectro de HMBC da azadirachtina B (CDCl

, 100 MHz)............... ......... 156

Figura 2.74 – Eluição da azadirachtina B. Fase móvel H

O:MeOH:ACN:THF -

51,00:36,75:7,35:4,90; coluna C

Phenomenex

Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm), coluna de

segurança Phenomenex

(4,0x3,0 mm, 5 µm). Vazão 1,0 mL/min, a alça de injeção de

20 µL. Detector DAD no comprimento de onda de 217 nm.................................................

......... 157

Figura 2.75 – Espectro no Ultra-violeta da azadirachtina B. Comprimento de onda

máximo de absorção em 215 nm.......................................................................................... ......... 157

Figura 2.76 – Espectro de Massas da Azadirachtina B (ESI

).............................................. ......... 158

Figura 2.77 – Mecanismo de Fragmentação proposto para a Azadirachtina B.................... ......... 158

Figura 2.78 – Espectro de RMN

H do Nimbandiol (CDCl

, 200 MHz)................................. ......... 161

Figura 2.79 – Espectro de RMN

C do Nimbandiol (CDCl

, 100 MHz)............................... ......... 161

Figura 2.80 – Espectro de COSY do Nimbandiol (CDCl

, 400 MHz).................................... ......... 162

Figura 2.81 – Espectro de HSQC do Nimbandiol (CDCl

, 100 MHz)................................... ......... 162

Figura 2.82 – Espectro de HMBC do Nimbandiol (CDCl

, 100 MHz)................................... ......... 163

Figura 2.83 – Espectro de Massas para a Azadirachtina A (ESI

)........................................ ......... 165

Figura 2.84 - Full scan típico para as amostras, demonstrando a seletividade na

detecção da azadirachtina na técnica por LC-MRM............................................................. ......... 165

Figura 2.85 – Cromatograma obtido para as amostras por LC-MRM selecionando os

canais m/z 719 -> 485 e 719 -> 211.....................................................................................

......... 166

Figura 2.86 – Eluição cromatográfica de padrões de azadirachtina A e B e de amostras.

Coluna C

Phenomenex® Luna (II) (150x4,6 mm, 5 µm); coluna de segurança

Phenomenex® (4x3 mm, 5 µm); vazão de 0,8 ml/min.; λ = 217 nm e volume de injeção

de 20 µL. (a) Padrões de azadirachtina A e B. (c) Semente do Nim. Fase móvel para (a)

e (b): H

O:ACN:MeOH:THF – 61:34:4:1. (b) Padrões de azadirachtina A e B. (d)

Semente do Nim. Fase móvel para (b) e (d): H

O:MeOH:ACN:THF –

51:36,75:7,35:4,9..................................................................................................................

......... 169

Figura 2.87 – Espectro RMN

H da azadirachtina A obtido: a) antes e b) depois da

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degradação (CDCl

, 400 MHz).............................................................................................. ......... 171

Figura 2.88 – Espectro de DOSY da mistura de azadirachtina A e dos produtos

reacionais.............................................................................................................................. ......... 172

Figura 2.89 – Espectro de HSQC da mistura de degradação da azadirachtina A (CDCl

100 MHz)............................................................................................................................... ......... 175

Figura 2.90 – Espectro de HMBC da mistura de degradação da azadirachtina A (CDCl

100 MHz)............................................................................................................................... ......... 175

Figura 2.91 – Mecanismo reacional de degradação da azadirachtina A.............................. ......... 176

Figura 2.92 – Cromatogramas obtidos dos produtos de reação. (a) Cromatograma em 3

D da eluição monitorada entre 200 e 350 nm. (b) Cromatograma em 2 D da eluição em

206 nm. (c) Espectros de UV referente as três bandas de destaque do cromatograma b.

Os parâmetros de análise encontram-se descritos no Item 2.4.12....................................... ......... 179

Figura 2.93 – (a) Cromatograma de Íons Totais (TIC) da mistura. (b) Cromatograma

obtido monitorando o íon m/z 719. (c), (d) e (e) Cromatogramas obtidos monitorando os

íons m/z 673, 737 e 705 respectivamente.………………………………………………….......

......... 180

Figura 2.94 – Mecanismo reacional de degradação da azadirachtina A para o segundo

produto de reação................................................................................................................. ......... 181

Figura 2.95 - Mecanismo de degradação da azadirachtina A para formação de produtos

reacionais pela adição e eliminação de grupos funcionais................................................... ......... 182

Figura 2.96 – Espectro de massas ESI

. (a) [M-H]

m/z 719 – Azadirachtina A; (b) [M-H]

m/z 737; (c) [M-H]

m/z 705 e (c) [M-H]

m/z 673..................................................................

......... 182

Figura 2.97 – Estruturas sesquiterpenicas identificadas no óleo essencial das folhas do

enxerto.................................................................................................................................. ......... 184

Figura 2.98 – Cromatograma de íons totais do óleo essencial do enxerto........................... ......... 184

Figura 3.1 – Gradiente linear usado para o desenvolvimento do método. A %B na fase

móvel variou de 5 à 100% em 60 min................................................................................... ......... 205

Figura 3.2 – Gradientes exploratórios: (a) extrato DCM das sementes LDM do Nim; (b)

padrão de azadirachtina (80 µg/mL).....................................................................................

......... 206

Figura 3.3 – Separação isocrática do extrato DCM. Fase móvel ACN:H

O – 45:55; coluna

Phenomenex

Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm), coluna de segurança Phenomenex

(4,0x3,0 mm, 5 µm). Vazão 1 mL/min, a alça de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis

em 217 nm............................................................................................................................

......... 207

Figura 3.4 – Separação isocrática do extrato DCM. Fase móvel ACN:H

O – 35:65; coluna

Phenomenex

Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm), coluna de segurança Phenomenex

(4,0x3,0 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min, a alça de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis

em 217 nm............................................................................................................................

......... 208

Figura 3.5 – Separação isocrática do extrato DCM. Fase móvel ACN:H

O – 35:65; coluna

Phenomenex

Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm), coluna de segurança Phenomenex

(4,0x3,0 mm, 5 µm), a alça de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm.

Vazão: (a) 0,5 ml/min; (b) 0,8 mL/min: (c) 1,0 mL/min..........................................................

......... 208

Figura 3.6 – Procedimentos de extração/pré-tratamento para as sementes do Nim

descritos para o Método I.…................................................................................................. ......... 213

Figura 3.7 – Separação do extrato MeOH submetido ao pré-tratamento de filtração. Fase

móvel ACN:H

O – 35:65; coluna C

Phenomenex

Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm), coluna

de segurança Phenomenex

(4,0x3,0 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min, a alça de injeção

de 20 µL. Detector de Foto-diodo no comprimento de onda de 217 nm..............................

......... 214

Figura 3.8 – Separação do extrato MeOH com resolução para a azadirachtina e para a

HC. Fase móvel ACN:H

O – 35:65; coluna C

Phenomenex

Luna(II) (150x4,6 mm, 5

µm), coluna de segurança Phenomenex

(4,0x3,0 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min, a alça

de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm.........................................................

......... 215

Figura 3.9 – Curva de calibração por calibração externa de hidrocortisona. Faixa linear

de trabalho de 2,5 – 50,0 µg/mL. Cada ponto da curva (em triplicata) foi analisado sob os

mesmos parâmetros cromatográficos descritos na Figura 3.8............................................

......... 217

Figura 3.10 – Curva de calibração Externa de Azadirachtina. Faixa linear de trabalho de

2,5 – 50,0 µg/mL. Cada ponto da curva (em triplicata) foi analisado sob os mesmos

parâmetros cromatográficos descritos na Figura 3.8............................................................

......... 221

Figura 3.11 – Análise por HPLC do mesocarpo da semente do Nim. Fase móvel

THF:MeOH:ACN:H

O – 1:4:34:61; coluna C

Phenomenex

Luna(II) (150x4,6 mm, 5

µm), coluna de segurança Phenomenex

(4,0x3,0 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min, a alça

de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm.........................................................

......... 225

Figura 3.12 – Perda da resolução para a azadirachtina com o aumento da absorção da

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banda crítica adjacente. Fase móvel ACN:H

O – 35:65; coluna C

Phenomenex

(150x4,6 mm, 5 µm), coluna de segurança Phenomenex

(4,0x3,0 mm, 5µm). Vazão 0,8

mL/min, a alça de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm................................

......... 226

Figura 3.13 – Amostra de semente manipulada por SPE. Fase móvel:

O:ACN:MeOH:THF – 61:34:4:1. Coluna C18 Phenomenex® Luna(II) (150x4,6 mm, 5

µm); coluna de segurança C18 Phenomenex® ( 4x3 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min; alça

de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm.......................................................... ......... 229

Figura 3.14 – Eluição cromatográfica de amostras pré-tratadas pelos métodos I e II. Fase

móvel: H

O:ACN:MeOH:THF – 61:34:4:1. Coluna C18 Phenomenex® Luna(II) (150x4,6

mm, 5 µm); coluna de segurança C18 Phenomenex® ( 4x3 mm, 5 µm). Vazão 0,8

mL/min; alça de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm.................................... ......... 230

Figura 3.15 – Eluição cromatográfica de uma amostra preparada pela centrifugação de

100 mg de semente LDM. Os parâmetros cromatográficos são os mesmos descritos na

Figura 3.14............................................................................................................................ ......... 231

Figura 3.16 – Eluição cromatográfica de uma amostra do Nim preparada após a extração

de 15 mg de amêndoa em três alíquotas de 1,0 mL de MeOH. Fase móvel:

O:ACN:MeOH:THF – 61:34:4:1. Coluna C18 Phenomenex® Luna(II) (150x4,6 mm, 5

µm); coluna de segurança C18 Phenomenex® ( 4x3 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min; alça

de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm.......................................................... ......... 232

Figura 3.17 – Método proposto de preparo das amostras de análise para a quantificação

dos teores de azadirachtina em sementes do Nim............................................................... ......... 233

Figura 3.18 – Amostra de 10 mg de semente preparada seguindo os procedimentos

descritos na Figura 3.17, contudo, reconstituída em 10 mL de MeOH. Os parâmetros

cromatográficos são os mesmos descritos na Figura 3.16................................................... ......... 234

Figura 3.19 –Curva de calibração por padronização externa para: (a) azadirachtina A; (b)

azadirachtina B. Fase móvel: H

O:ACN:MeOH:THF – 61:34:4:1. Coluna C18

Phenomenex® Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm); coluna de segurança C18 Phenomenex® (

4x3 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min; alça de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em

217 nm.................................................................................................................................. ......... 236

Figura 3.20 – Curva de adição de padrão usando como matriz, sementes do Nim

coletada em Catanduva-SP. Os parâmetros cromatográficos são os mesmos descritos

na Figura 3.18....................................................................................................................... ......... 239

Figura 3.21 – Curva de armazenamento das sementes do Nim …………………………..... ......... 241

Figura 3.22 – Projeção em 2D da amostras analisando as componentes principais PC2 e

PC3....................................................................................................................................... ......... 249

Figura 3.23 – Projeção em 2D das parâmetros analisados que se destacaram entre as

amostras............................................................................................................................... ......... 250

Figura 3.24 – Dendograma demonstrando a estrutura dos dados baseado na análise

hierárquica das amostras...................................................................................................... ......... 251

Figura 3.25 – Cromatogramas demonstrando a perda de seletividade para a análise das

sementes usando os métodos desenvolvido para a quantificação das sementes. Coluna

C18 Phenomenex® Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm); coluna de segurança C18

Phenomenex® ( 4x3 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min; alça de injeção de 20 µL e detector

de UV-Vis em 217 nm. (a) Fase móvel: ACN:H

O – 35:65; (b) H

O:ACN:MeOH:THF –

61:34:4:1............................................................................................................................... ......... 253

Figura 3.26 – Eluição cromatográfica da amostra eluída com 2 mL da mistura de

MeOH:H

O – 1:9 do cartucho C18. Fase móvel: H

O:MeOH:ACN:THF – 60:30:6:4.

Coluna C18 Phenomenex® Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm); coluna de segurança C18

Phenomenex® ( 4x3 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min; alça de injeção de 20 µL e detector

de UV-Vis em 217 nm........................................................................................................... ......... 256

Figura 3.27 – Amostras preparadas pela SPE removidas do cartucho CN por: (a) 2,0 mL

de DCM; (b) 2,0 mL de ACN e (c) 2,0 mL de MeOH. Fase móvel: H

O: ACN – 65:35.

Coluna C18 Phenomenex® Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm); coluna de segurança C18

Phenomenex® ( 4x3 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min; alça de injeção de 20 µL e detector

de UV-Vis em 217 nm........................................................................................................... ......... 258

Figura 3.28 – Amostras preparadas com a fração metanólica usada na lavagem dos

cartuchos CN após a etapa de eluição do analito. Cartucho eluído inicialmente com: (a)

2,0 mL de DCM; (b) 2,0 mL de ACN e (c) 2,0 mL de MeOH. Os parâmetros

cromatográficos são os mesmos descritos na Figura 3.27................................................... ......... 258

Figura 3.29 – Eluição gradiente realizado para o óleo do Nim. Fase móvel: H

O: ACN –

variando de 0 à 30 min a concentração de ACN de 15% a 45%, permanecendo em 45%

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por 5 min, e aumentando de 45% à 100% em 10 min. Coluna C18 Phenomenex®

Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm); coluna de segurança C18 Phenomenex® ( 4x3 mm, 5

µm). Vazão 0,8 mL/min; alça de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm.…….. ......... 261

Figura 3.30 – Nomógrafo para alteração de solventes no modo reverso............................. ......... 262

Figura 3.31 – As três pontas do triangulo de seletividade de Snyder estabelecida pelo

Nomógrafo para um k = 6,37 para a azadirachtina............................................................... ......... 262

Figura 3.32 – Eluição cromatográfica da amostra do óleo do Nim nos três vértices do

triangulo de seletividade....................................................................................................... ......... 263

Figura 3.33 – Pontos analisados para a seleção da fase móvel ideal de separação

cromatográfica das amostras do óleo do Nim. As fases móveis avaliadas foram obtidas a

partir da mistura de A, B e C. Coluna C18 Phenomenex® Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm);

coluna de segurança C18 Phenomenex® ( 4x3 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min; alça de

injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm............................................................... ......... 264

Figura 3.34 – Eluição cromatográfica da amostra do óleo do Nim. Preparada seguindo os

procedimentos descritos para a quarta amostra da Tabela 3.27. Fase móvel

O:MeOH:ACN:THF - 60:30:6:4, coluna C18 Phenomenex® Luna(II) (150x4,6 mm, 5

µm); coluna de segurança C18 Phenomenex® ( 4x3 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min; alça

de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm.......................................................... ......... 265

Figura 3.35 – Eluição cromatográfica da amostra do óleo do Nim indiano. Preparada

seguindo os procedimentos descritos para a quarta amostra da Tabela 3.27. Fase móvel

O:MeOH:ACN:THF - 51,00:36,75:7,35:4,90, coluna C18 Phenomenex® Luna(II)

(150x4,6 mm, 5 µm); coluna de segurança C18 Phenomenex® ( 4x3 mm, 5 µm). Vazão

0,8 mL/min; alça de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm.............................. ......... 265

Figura 3.36 – Procedimentos modelo para o pré-tratamento de preparo das amostras dos

óleos do Nim......................................................................................................................... ......... 266

Figura 3.37 – (a) Curva de calibração externa para a azadirachtina A. (b) Curva de

calibração externa para a azadirachtina B. Fase móvel: H

O:MeOH:ACN:THF -

51,00:36,75:7,35:4,90. Coluna C18 Phenomenex® Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm); coluna

de segurança C18 Phenomenex® ( 4x3 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min; alça de injeção

de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm........................................................................... ......... 267

Figura 3.38 – Curva de adição de padrão usando como matriz, óleo do Nim de Barra da

Bahia-BA. Os parâmetros cromatográficos são os mesmos descritos na Figura 3.37......... ......... 271

Figura 3.39 – Cromatograma referente a análise do óleo do Nim: A) óleo nacional; B)

óleo importado. As análises foram realizadas usando uma coluna analítica C

Phenomenex®-Luna(II) (150x4,6mm, 5 µm) com a uma pré-coluna de segurança

Phenomenex® (4x3mm, 5 µm) acoplada, uma fase móvel quaternária composta de

O:MeOH:ACN:THF (51,00:36,75:7,35:4,90, v/v), numa vazão de 0,8 mL/min. e um

volume de injeção de 20 µL.……..........................................................................................

......... 275

Figura 3.39 – Cromatograma referente a análise do óleo do Nim: A) óleo nacional; B)

óleo importado. As análises foram realizadas usando uma coluna analítica C18

Phenomenex®-Luna(II) (150x4,6mm, 5 µm) com a uma pré-coluna de segurança

Phenomenex® (4x3mm, 5 µm) acoplada, uma fase móvel quaternária composta de

O:MeOH:ACN:THF (51,00:36,75:7,35:4,90, v/v), numa vazão de 0,8 mL/min. e um

volume de injeção de 20 µL..................................................................................................

......... 283

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RESUMO

ESTUDO FITOQUÍMICO DO ENXERTO DE AZADIRACHTA INDICA SOBRE MELIA

AZEDARACH: QUANTIFICAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS INSETICIDAS – O cultivo de

Azadirachta indica A. Jusseu (Nim) tem crescido rapidamente por todo o território

brasileiro. Este crescimento se justifica pelas diversas propriedades do Nim,

principalmente na agricultura, sendo considerado um promissor inseticida natural.

Ele tem se mostrado como uma alternativa, tanto por sua eficiência quanto por

questões econômicas, na redução e possivelmente eliminação do uso de inseticidas

orgânicos sintéticos nos cultivos agrícolas. Até 1995, a azadirachtina A, principal

metabólito secundário do Nim, já havia demonstrado algum tipo de atividade

biológica em mais de 400 espécies de insetos considerados pragas agrícolas.

Contudo, os sucessos dos cultivos são usualmente atribuídos a condições climáticas

como temperatura e umidade. Baixas temperaturas inibem o desenvolvimento e a

frutificação da espécie. Através do enxerto da Azadirachta indica sobre a Melia

azedarach, o Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR, Londrina, PR) tem buscado

uma alternativa para o cultivo do Nim em regiões climáticas não favoráveis ao seu

desenvolvimento. O presente trabalho buscou respostas químicas para caracterizar

a viabilidade comercial deste enxerto. Assim, os objetivos iniciais foram: a)

desenvolver um estudo fitoquímico do enxerto visando conhecer seu perfil químico e

compará-lo com aquele das plantas matrizes; b) verificar por HPLC se o teor de

azadirachtinas nos frutos do enxerto sofreu redução ou aumento em comparação

com a planta não enxertada. Também foi desenvolvido um método para

quantificação de azadirachtinas em óleos do Nim. Nove limonóides e dois

flavonóides foram caracterizados no enxerto sendo: nimbolídeo, 28-

deoxonimbolídeo, salannina, 6-O-acetilnimbandiol, 6-desacetilnimbineno, nimbolina

A, 6-desacetilnimbina, azadirachtinas A e B, quercetina e a quercitrina. Nenhum

metabólito novo foi isolado, indicando que as espécies envolvidas no enxerto têm

mantido as características das plantas a qual procedem. Três métodos de

quantificação de azadirachtinas por HPLC foram desenvolvidos, sendo dois para a

quantificação destas nas sementes e um terceiro porém óleo do Nim. As

quantidades de azadirachtina A e B em todas as sementes nacionais analisadas

oscilaram de 1.516 a 5.861 µg/kg para o isômero A e entre 240 a 1.175 µg/kg para o

isômero B. Esses valores se enquadram nos valores quantificados em sementes

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fora do Brasil. Não houve diferenças significativas na quantificação da azadirachtina

A entre plantas enxertadas e não enxertadas de mesma idade, cultivadas na mesma

região. Porém, uma grande diferença foi encontrada para o isômero B sendo o teor

quantificado nas plantas de enxerto, em média, três vezes inferior ao teor

quantificado nas plantas de pés não enxertados. Um aumento na biossíntese da

azadirachtina B é influenciado por baixas temperaturas, assim, estes resultados

demonstram claramente que o enxerto foi menos afetado pelas baixas temperaturas.

Foi demonstrado também que com o armazenamento das sementes, tanto a

temperatura ambiente quanto a 12 ºC, a azadirachtina A se degradou com o tempo e

a azadirachtina B se manteve constante durante o período analisado. Analisou-se a

presença de azadirachtina A nos diversos órgãos da planta, e sua presença só não

foi detectada nas folhas. Do óleo essencial destas folhas, foi caracterizada a

presença de vinte e quatro compostos, sendo, todavia, identificado apenas sete

deles. Atualmente vários óleos emulsionáveis do Nim já podem ser encontrados no

comércio disponível à agricultura orgânica. A quantificação de azadirachtinas em

alguns desses produtos nacionais e importados demonstraram uma grande

diferença. Em geral os teores de azadirachtina A nos óleos importados foram de

duas a oito vezes superiores aos teores nos óleos preparados pela prensa das

sementes cultivadas em território nacional. Como não há diferenças quantitativas de

azadirachtina A nas sementes nacionais e de outros países, o teor menor nos óleos

se deve a extrações apenas parciais de azadirachtina A durante o preparo desses

óleos. Investigando a estabilidade da azadirachtina A foi proposto um mecanismo de

degradação química que servirá de auxílio para futuras pesquisas na proteção dos

grupos funcionais deste composto.

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ABSTRACT

FITOCHEMICAL STUDY OF THE GRAFT OF Azadirachta indica ON Melia

azedarach: QUANTIFICATION OF INSECTICIDE SUBSTANCES - THE cultivation of

Azadirachta indicates A. Jusseu (Nim) it has been growing quickly for the whole

Brazilian territory. This growth is justified for the several properties of Neem, mainly in

the agriculture, being considered a promising natural insecticide. He has been

showing if as an alternative, so much for your efficiency as for economical subjects,

in the reduction and possibly elimination of the use of synthetic organic insecticides

in the agricultural cultivations. Up to 1995, the azadirachtin, main secondary

metabolity of Neem, had already demonstrated some type of biological activity in

more than 400 species of insects considered agricultural curses. However, the

successes of the cultivations are usually attributed to climatic conditions as

temperature and humidity. Low temperatures inhibit the development and the

frutification of the species. Through the graft of Azadirachta indica on the Melia

azedarach, the Agronomic Institute of Paraná (IAPAR, Londrina, PR) it has been

looking for an alternative for the cultivation of Neem in climatic areas not favorable to

your development. The present work looked for chemical answers to characterize the

commercial viability of this graft. Like this, the objectives initials were: a) to develop a

study fitoquímico of the graft seeking to know your chemical profile and to compare it

with that of the main plants; b) to verify for HPLC if the azadirachtins tenor in the

fruits of the graft not suffered reduction or increase in comparison with the plant

grafted. A method was also developed for azadirachtins quantification in oils of

Neem. Nine limonóides and two flavonóides were characterized in the graft being:

nimbolideo, 28-deoxonimbolideo, salannin, 6-O-acethyilnimbandiol, 6-

desacethylnimbinene, nimbolin A, 6-desacethylnimbina, azadirachtins A and B,

quercetin and the quercitrin. No new metabólito was isolated, indicating that the

species involved in the graft has been maintaining the characteristics of the plants

which they proceed. Three methods of azadirachtins quantification for HPLC were

developed, being two for the quantification of these in the seeds and a third however

oil of Neem. The amounts of azadirachtina A and B in all the analyzed national seeds

oscillated from 1,516 to ,.861 µg/kg for the isomeric A and enter 240 to 1,175 µg/kg

for isomeric B. Those values they are framed in the values quantified out in seeds of

Brazil. There were not significant differences in the quantification of the azadirachtina

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A among grafted plants and not grafted of same age, cultivated in the same area.

However, a great difference was found for isomeric B being the tenor quantified in

the graft plants, on average, three times inferior to the tenor not quantified in the

plants of feet grafted. An increase in the biossinthese of the azadirachtin B is

influenced by low temperatures, like this, these results demonstrate clearly that the

graft was less affected for the low temperatures. It was also demonstrated that with

the storage of the seeds, so much the temperature adapts with relationship to 12 ºC,

the azadirachtin A it was degraded with the time and the azadirachtin B it stayed

constant during the analyzed period. The azadirachtin presence was analyzed it in

the several organs of the plant, and your presence was not only detected in the

leaves. Of the essential oil of these leaves, the presence of twenty-four composed

was characterized, being, though, identified only seven of them. Now several oils

emulsified of Nim they can already be found in the available trade to the organic

agriculture. The azadirachtinas quantification in some of those national products and

mattered they demonstrated a great difference. In general the azadirachtin A tenors

in the imported oils was from two to eight times superiors to the tenors in the oils

prepared by the press of the seeds cultivated in national territory. As there are not

quantitative differences of azadirachtina A in the national seeds and of other

countries, the smaller tenor in the oils is just due to extractions partial of azadirachtin

A during the preparation of those oils. Investigating the stability of the azadirachtina

was proposed her a mechanism of chemical degradation that will serve as aid for

future researches in the protection of the functional groups of this composed.

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SUMÁRIO

Capítulo 01

1. Introdução........................................................................................................................ ......... 03

1.1 Inseticidas e o Meio Ambiente.................................................................................... ......... 03

1.2 Azadirachta indica A. Jussieu..................................................................................... ......... 05

1.3 Limitações ao Cultivo do Nim...................................................................................... ......... 08

1.4 Melia azedarach Linn…………………………………………………………………..…..

......... 09

1.5 Enxerto…………………………………………………………………………………….… ......... 10

1.6 Enxerto de Azadirachta indica sobre Melia azedarach...............................................

......... 12

1.7 Objetivos Gerais…………………………………………………………………………..... ......... 13

Capítulo 02

2. Investigação Fitoquímica do Enxerto da Azadirachta indica sobre a Melia

Azedarach........................................................................................................................

......... 17

2.1 Azadirachtina A........................................................................................................... ......... 18

2.2 Biogênese do Limonóides………………………………………………………………… ......... 18

2.3 Metabólitos Secundários Descritos na Literatura para os Gêneros da Tribo

Meliaea....................................................................................................................... ......... 25

2.3.1 Gênero Azadirachta……………………………………………………………….....

......... 25

2.3.2 Gênero Melia………………………………………………………………………….

......... 38

2.4 Procedimentos Experimentais…………………………………………………………….. ......... 49

2.4.1 Equipamentos………………………………………………………………………... ......... 49

2.4.2 Métodos Cromatográficos………………………………………………………...... ......... 50

2.4.3 Reveladores………………………………………………………………………….. ......... 50

2.4.4 Solventes……………………………………………………………………………... ......... 50

2.4.5 Material Botânico…………………………………………………………………….. ......... 50

2.4.6 Preparo dos Extratos………………………………………………………………... ......... 51

2.4.7 Fracionamento dos Extratos.............................................................................. ......... 52

2.4.7.1 Fracionamento dos Extratos da Folha (F4)........................................... ......... 52

2.4.7.2 Fracionamento do Extrato dos Galhos Maiores do Enxerto (C2P)........ ......... 58

2.4.7.3 Fracionamento do Extrato do Cerne da Raiz......................................... ......... 60

2.4.8 Fracionamento do Extrato Etanólico das Sementes do Nim- Brejinho do

Nazaré................................................................................................................ ......... 61

2.4.9 Extração de Padrões da Semente do Nim – Catanduva................................... ......... 63

2.4.10 Extração do Óleo Essencial………………………………………………………. ......... 64

2.4.11 Análise da Azadirachtina A nas Diferentes Partes do Enxerto........................ ......... 65

2.4.12 Degradação Assistida da Azadirachtina A....................................................... ......... 67

2.5 Resultados e Discussões………………………………………………………………..... ......... 68

2.5.1 Substâncias Isoladas………………………………………………………………... ......... 68

2.5.2 Determinação Estrutural das Substâncias Isoladas........................................... ......... 70

2.5.2.1 Determinação Estrutural do Nimbolido.. ............................................... ......... 71

2.5.2.2 Determinação Estrutural do 28-Desoxonimbolídeo............................... ......... 81

2.5.2.3 Determinação Estrutural da Salannina ................................................. ......... 86

2.5.2.4 Determinação Estrutural do 6-O-Acetilnimbandiol.................................

......... 97

2.5.2.5 Determinação Estrutural do 6-Desacetilnimbineno................................ ......... 104

2.5.2.6 Determinação estrutural da Nimbolina A............................................... ......... 112

2.5.2.7 Determinação estrutural do 6-Desacetilnimbina.................................... ......... 123

2.5.2.8 Determinação estrutural da Azadirachtina A.......................................... ......... 128

2.5.2.9 Determinação estrutural da Quercetina................................................. ......... 145

2.5.2.10 Determinação estrutural da Quercitrina............................................... ......... 148

2.5.2.11 Determinação Estrutural da Azadirachtina B....................................... ......... 151

2.5.2.12 Determinação Estrutural do Nimbandiol.............................................. ......... 159

2.5.3 Caracterização da Azadirachtina A em Diversas Partes do Enxerto................. ......... 163

2.5.4 Caracterização das Azadirachtinas A e B nas Sementes do Enxerto............... ......... 167

2.5.5 Degradação Assistida da Azadirachtina A......................................................... ......... 169

2.5.6 Análise do Óleo Essencial das Folhas…...……………………………………...... ......... 182

Capítulo 03

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3. Desenvolvimento de Métodos Cromatográficos para Quantificação da Azadirachtina A

em Sementes e Óleos Comerciais do Nim....................................... ......... 187

3.1 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.................................................................... ......... 190

3.2 Desenvolvimento dos Métodos de Pré-tratamento das Amostras.............................. ......... 191

3.3 Procedimento Experimental………………………………………………………………. ......... 193

3.3.1 Generalidades………………………………………………………………………... ......... 193

3.3.2 Coleta do Material Vegetal para Análise............................................................ ......... 194

3.3.2.1 Métodos de Coleta………………………………………………………….. ......... 195

3.3.3 Métodos Analíticos…………………………………………………………………... ......... 196

3.3.3.1 Preparo das Soluções Padrão…………………………………………...... ......... 196

3.3.3.2 Solução Padrão Estoque…………………………………………………... ......... 197

3.3.3.3 Solução Padrão de Análise………………………………………………... ......... 205

3.3.3.4 Obtenção das Curvas de Calibração po Padronização Externa............ ......... 198

3.3.3.5 Obtenção das Curvas por Adição de Padrão......................................... ......... 198

3.3.3.6 Seletividade, Eficiência de Extração (Recuperação), Precisão e

Exatidão................................................................................................ ......... 199

3.3.3.7 Limites de Quantificação e de Detecção................................................ ......... 200

3.3.4 Preparo das Amostras………………………………………………………………. ......... 200

3.3.4.1 Amostras de Sementes Método I........................................................... ......... 200

3.3.4.2 Amostras de Sementes Método II.......................................................... ......... 201

3.3.4.3 Amostras dos Óleos Comerciais………………………………………….. ......... 202

3.4 Resultados e Discussões………………………………………………………………..... ......... 203

3.4.1 Desenvolvimento do Método de Quantificação da Azadirachtina nas

Sementes do Nim - Preparo de Amostras e Otimização dos Parâmetros

Cromatográficos................................................................................................ ......... 203

3.4.1.1 Método I – Amostras Preparadas a partir da Extração Líquido-Sólido

da Semente do Nim – Pré-tratamento: Filtração.................................... ......... 204

3.4.1.1.1 Pré-tratamento do Extrato Metanólico da Semente do Nim.... ......... 209

3.4.1.1.2 Poder de Extração Estabelecido para o Método I................... ......... 214

3.4.1.1.3 Quantificação da Azadirachtina A Fazendo Uso do Método I. ......... 220

3.4.1.2 Método II – Quantificação da Azadirachtina A e B. Extração por

Centrifugação/SPE............................................................................... ......... 225

3.4.1.2.1 Modificações no Método de Extração para as Sementes....... ......... 226

3.4.1.2.2 Quantificação das Sementes de A. indica..............................

......... 240

3.4.1.2.3 Quantificação das Sementes do Enxerto de A. indica sobre

M. azedarach. Comparação com as Sementes de pés

Franco.................................................................................... ......... 244

3.4.1.2.4 Quantificação de Sementes Coletadas Diretamente da

Planta e Sementes Coletadas no Solo.................................. ......... 246

3.4.1.2.5 Quantificação de Sementes Armazenadas…………………… ......... 247

3.4.1.2.6 Análise Comparativa entre Lotes de Sementes das Diversas

Regiões Investigadas............................................................ ......... 248

3.4.2 Desenvolvimento do Método de Quantificação da Azadirachtina nos Óleos

Comerciais do Nim – Preparo de Amostras e Otimização dos Parâmentros

Cromatográficos................................................................................................ ......... 251

3.4.2.1 Desenvolvimento do Método de Isolamento dos Analitos de Interesse

do Óleo. Desenvolvimento do Pré-Tratamento das Amostras............. ......... 253

3.4.2.2 Quantificação de Óleos Comerciais de A. indica...................................

......... 272

Capítulo 04

4. Conclusões....................................................................................................................... ......... 279

Capítulo 05

5. Referências Bibliográficas……………………………………………………………………... ......... 283

Apêndices

Apêndice A - Espécies de pragas de interesse agrícola que mostraram sensibilidade aos

extratos de A. indica...............................................................................

......... 297

Apêndice B - Abreviações de grupos orgânicos funcionais................................................. ......... 301

Apêndice C - Lista de RMN

C dos metabólitos secundários isolados e identificados do

gênero Azadirachta.......................................................................................

......... 303

Apêndice D - Lista de RMN

C dos metabólitos secundários isolados e identificados do

gênero Melia................................................................................................

......... 310

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Introdução

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1. Introdução

1.1 Inseticidas e o Meio Ambiente

Desde os tempos romanos (1

século a.C.) até a metade do século XX,

o controle de insetos no hemisfério ocidental era realizado por produtos derivados de

plantas como a piretrina, a rotenona e nicotina (bioinseticidas). A descoberta do DDT

(diclorodifeniltriclorometano), inicialmente acreditando como sendo a solução contra

os ataques de insetos, demonstrou após um período prolongado de uso ser

desastroso. Rachel Carson em 1962 sinalizou para a eliminação da prática do uso

do DDT devido ser ele extremamente persistente, tóxico, bioacumulador com

tendências a causar doenças. Isto causou uma desesperada busca por compostos

sintéticos seguros a base de hidrocarbonetos clorados. Estes compostos, todavia,

apenas provaram ser excessivamente tóxicos, ecologicamente desastrosos, além de

permitirem que os insetos adquirissem resistências a tais produtos [01]. No Brasil,

seguindo a tendência mundial, o controle de pragas que até o início da década de 50

era feito por inseticidas de origem botânica, também passou a ser realizado

principalmente por compostos químicos sintéticos [02].

Desde o advento do DDT, muitos inseticidas têm sido desenvolvidos.

Essa prática já vem sendo utilizada há mais de 50 anos onde, nesse período, tornou

se a principal ferramenta inseticida [03]. Embora sua utilização tenha sido eficiente

no controle de algumas espécies de pragas, seu extensivo e algumas vezes

indiscriminado uso, tem provocado diversos problemas de repercussão social e

ambiental. Inúmeras e acumulativas são as conseqüências negativas do uso desses

compostos. Dentre elas, a contaminação do solo, do ar, da água resultando na

contaminação de peixes, animais e do próprio homem (tanto no campo quanto em

consumidores de produtos contaminados). Esses produtos têm provocado uma

prejuízo na biodiversidade e uma redução da população de inimigos naturais e de

polinizadores. Não são seletivos, além de que após meio século de uso, não

solucionou os problemas existentes. O uso indiscriminado desses produtos

sintéticos, aumenta a lista de motivos para a sua não utilização ou a implementação

de medidas de controle ao seu uso. O uso indiscriminado tem provocado o

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surgimento de pragas secundárias, exigindo a cada ano, investimentos em novos

produtos, pois as pragas adquirem após algum tempo de uso, resistência aos

produtos.

Um outro aspecto não menos importante, principalmente para o Brasil,

é a dependência econômica que os insumos externos trazem para o país e para a

propriedade, gerando perdas de divisas e afetando a auto-sustentabilidade [02].

Nas últimas duas décadas, tem ocorrido um aumento de interesse nas

possibilidades do uso de novos produtos bioativos e inseticidas naturais, os quais

apresentam menores possibilidades de danos ao meio ambiente e ao homem. Entre

os agentes alternativos de controle de pragas, há os inseticidas botânicos e

microbiológicos, disruptores e inibidores metabólicos em insetos, os feromônios e

outros modificadores do comportamento de insetos.

Comprovadamente as plantas são uma rica fonte de produtos

orgânicos bioativos, apesar de aproximadamente, apenas 10.000 metabólitos

secundários de plantas terem sido quimicamente identificados, em um universo que

pode exceder a 400.000 produtos. Eles são uma enorme abundância de compostos

químicos de defesa, incluindo repelentes, inibidores à alimentação e oviposição,

inibidores de crescimento, esterilizantes, toxicantes e outros [03]. Alguns dos mais

antigos e comuns inseticidas, como por exemplo, a nicotina, a piretrina e a rotenona

eram derivados de plantas.

A tendência de mudanças no campo, vem sendo observada

principalmente a partir do final da década de 90 e início do século XXI, pela procura

de meios alternativos para o controle de pragas, reflete a necessidade dos

consumidores cada vez mais preocupados com os riscos à saúde causados pelos

alimentos produzidos convencionalmente e pela contaminação dos recursos

naturais. Portanto, o controle químico de pragas agrícolas constituiu-se numa das

principais preocupações ecológicas atuais.

Essa realidade leva à necessidade urgente de métodos de controle

alternativos ao uso de agrotóxicos, menos poluentes, menos tóxicos ao homem, com

baixo poder residual, de baixo custo e, de preferência, que possam ser produzidos

localmente [02]. Assim, na procura por inseticidas naturais, a família Meliaceae foi

identificada como um dos grupos mais promissores uma vez que grande parte de

suas espécies, apresentam múltiplas ações no controle de pragas. Dentro da família

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Meliaceae, uma espécie em especial se destaca, a Azadirachta indica A. De

Jussieu, popularmente conhecida no Brasil por Nim.

1.2 Azadirachta indica A. Jussieu

Imagine uma planta que tenha poderes inseticidas sem ser tóxica ao

ser humano, que sirva de alimento ao homem e aos animais, sua madeira seja

excelente para a fabricação de móveis e ainda apresente poderes “milagrosos”

contra diversos tipos de doenças a ponto de ser adorada por uma nação. Anuncio

publicitário de algum louco que só pensa em ganhar dinheiro, ou realmente existe

uma planta com tais qualidades? Pois bem, estas são algumas das qualidades do

Nim que tem chamado a atenção mundial de cientistas nas mais variadas áreas de

conhecimento.

O Nim (Azadirachta indica A. Jussieu), sinônimo Antelara azadirachta

ou Melia azadirachta L., foi descrita em 1830 por De Jussieu sendo sua posição

taxonômica definida como sendo uma planta pertencente à Ordem Rutales,

Subordem Rutineae, Família Meliaceae, Subfamília Melioideae, Tribo Melieae, sob o

Gênero Azadirachta e denominada espécie indica [04]. Nativa de Burna (hoje

Myanmar) e das regiões áridas do subcontinente indiano, presente da Índia à

Indonésia, foi introduzida no continente africano em 1928 em Bornu, província da

Nigéria, sendo o cultivo dissipado, dada a sua grande rusticidade e facilidade de

adaptação, por todo o continente. Atualmente, além dos países asiáticos e africanos,

o Nim pode ser encontrado na Austrália, na região tropical da América do Norte, na

América Central e na América do Sul [05]. No Brasil, as primeiras plantas

introduzidas para estudo como planta inseticida foram feitas pelo Instituto

Agronômico do Paraná (IAPAR), em Londrina, em 1986 [02], sendo hoje cultivada,

de norte ao sul do país.

As árvores do Nim são frondosas cujo porte varia de 15 a 20 m de

altura, que normalmente apresenta fuste reto e diâmetro entre 25 e 30 cm aos oito

anos de idade podendo alcançar aos 80 cm. A madeira apresenta densidade

variando entre 0,56 e 0,85 g/cm

, estando a média em torno de 0,70 g/cm

, de

coloração avermelhada, dura e resistente ao ataque de cupins e ao apodrecimento.

O cerne é muito rico em tanino e sais inorgânicos de cálcio, potássio e ferro. A

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distribuição de seus galhos forma coroas de até 10 m de diâmetro. Ela apresenta

folhas verdes-escuras, compostas e imparipenadas, com freqüências aglomeradas

nos extremos dos ramos, simples e sem estípulas. As flores são de coloração

branca, aromáticas, reunidas em inflorescências densas, com estames crescentes

formando um tubo, pentâmeras e hermafroditas. A sua fecundidade é determinada

pela quantidade de luz e umidade, cuja ausência causa o aborto floral. O fruto é

glabro, elipsóide, com 1,5 a 2,0 cm de comprimento, e verde-claro enquanto se

desenvolve tornando-se amarelado à medida que amadurece. A polpa é macia,

amarga e doce, deixando cair a semente no solo quando o fruto amadurece. A

semente apresenta um invólucro (endocarpo) duro, porém fino, de coloração creme

esbranquiçada, medindo 1,5 cm de comprimento. No interior da semente contém

uma amêndoa marrom (raramente duas ou três) com altos percentuais de óleos [02,

06, 07]. A floração se inicia já no segundo ano de idade da planta passando a ser

significativa no terceiro ano superando 25 kg/planta no quinto ano [02].

O Nim tornou-se famoso por suas propriedades medicinais e agrícolas.

Por séculos tem sido desta forma explorado pelos povos indianos. Existem registros

autênticos do seu uso medicinal em Arthashastra (Tratado de Polity) por Kautilya no

quarto século antes de Cristo. Várias partes da árvore foram empregadas por

Ayuverda um famoso médico Hindu (1000 d.C.) [04,07]. Vários usos da árvore do

Nim no passado foram na medicina. As cascas, as folhas e as sementes têm sido,

amplamente usadas neste propósito. É muito comum o preparo de extratos com

estas partes da planta para o uso medicinal. Os valores medicinais de algumas

partes do Nim são brevemente descritos abaixo.

A casca é considerada um tônico amargo, adstringente, antipirético,

antiperiódico e febrífugo. Ela também é útil em casos de sede, náuseas, vômitos,

úlceras e doenças de pele. As folhas são usadas como antiséptico, antihelmíntico e

também em urticária, dor de ouvido, tumores glandulares, erupção pustural (bolhas

de pus), icterícia, erupções causadas por coceira, queimaduras e úlceras, além de

outras erupções posturais, leucoderma, diabetes, etc. Os frutos são usados como

purgante e emoliente. São também considerados úteis contra vermes internos

(vermífugo) e doenças urinárias. O óleo da semente é considerado um poderoso

remédio contra tuberculose, hanseníase, reumatismo (aplicação externa), vermífugo

e também tônico capilar e contraceptivo. As flores e os galhos, também apresentam

seus valores medicinais. Os ramos mais finos são usados como escova dental

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considerado muito refrescante e higiênico [04,05,07,08]. Apesar da grande aceitação

popular das propriedades medicinais do Nim, principalmente pela população do

sudeste asiático, poucos estudos científicos foram realizados comprovando sua

eficácia necessitando mais investimentos e pesquisas nesta área.

O grande interesse atual nas pesquisas envolvendo o Nim,

principalmente no mundo ocidental (Europa e Américas), são suas propriedades

inseticidas. O Nim foi descoberto para o ocidente pelos trabalhos publicados do Prof.

Dr. Heinrich Shmutterer, Universidade de Giessen, Alemanha, que constatou que

durante as migrações destruidoras dos gafanhotos nas regiões africanas, apenas

restavam intocadas as árvores do Nim. Desde então, centenas são os trabalhos

desenvolvidos na busca de comprovações científicas e entendimento de suas ações

biológicas. Atualmente o Nim tem ação comprovada sobre mais de 400 espécies de

insetos e ácaros, causando os mais diversos efeitos como, por exemplo, repelência,

redução da alimentação, repelência de postura, interrupção do desenvolvimento e

da acdise, atraso no desenvolvimento, redução da fertilidade e fecundidade e

diversas outras alterações no comportamento e na fisiologia dos insetos, que podem

levar à morte [02,04,09]. O principal composto ativo do Nim é o limonóide C-seco,

azadirachtina A. Algumas dessas atividades encontram-se listadas no Apêndice A.

Do ponto de vista prático, algumas características tornam o Nim

bastante promissor para o uso no controle de pragas: a planta não precisa ser

destruída para se produzirem os extratos, possui uma multiplicidade de compostos,

o que torna mais difícil aos insetos adquirirem resistência, a concentração dos

compostos ativos é alta, os compostos são solúveis em água, são fáceis de extrair e

com baixo custo, pela sua forma de ação os compostos são mais tóxicos às pragas

que aos inimigos naturais, os produtos são praticamente inócuos ao ambiente e ao

homem, são totalmente biodegradáveis, com baixa persistência no ambiente [02,10].

Azadirachtina A

Além das propriedades medicinais e inseticidas do Nim, seu óleo

também é usado em lamparinas e como lubrificante para máquinas. Suas folhas e

AcO

OOC

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ramos, no alimento de gado. Suas folhas e sementes também são utilizados na

reforma de solos desgastados e como adubo. A polpa do fruto é um rico substrato

para a produção de gás metano. Sua madeira é excelente para a fabricação de

mobílias, tábuas, painéis, brinquedos, arados e lenha. O Nim ainda é usado como

quebra vento e sombreamento às margens de plantações e em reflorestamento por

sua fácil adaptação em diversos tipos de solos e regiões climáticas [02,05,11].

1.3 Limitações ao Cultivo do Nim

O Nim pode ser adaptado em uma ampla extensão climática, de solos

e condições topográficas. Os solos favoráveis ao desenvolvimento do Nim são os

solos argilosos, pois através de seus poros, nas estações chuvosas, a água

facilmente é absorvida e penetra cerca de 3 a 4 metros de profundidade no solo

ficando disponível para as raízes durante as estações de seca. Contudo, o Nim pode

se desenvolver melhor que muitas outras espécies, em solos secos, rasos e

pedregosos. É uma planta de muito sucesso em zonas tropicais e subtropicais com

uma média anual de chuva de 450-1150 mm, podendo também sobreviver com

média anual de 150-250 mm sendo tolerante a longos períodos de secas [06].

Sendo uma planta de áreas tropicais e subtropicais, o Nim pode ser

encontrado facilmente em regiões com temperatura anual variando entre 21 e 32 ºC

onde atinge o potencial máximo de desenvolvimento. É uma planta principalmente

tolerante a temperaturas acima dessa faixa, como as temperaturas acima de 50 ºC

encontradas nas regiões Nordeste e Central da África. Invernos rigorosos e geadas

podem comprometer o desenvolvimento da planta e principalmente sua frutificação.

Devido a menores temperaturas encontradas em regiões de grande altitude, acima

de 1000 m, especialmente no inverno, o cultivo do Nim também pode ser

prejudicado [02,12].

Como observado, a temperatura é o principal fator limitante ao seu

desenvolvimento, principalmente à produção de frutos, e é o que limita sua

distribuição geográfica.

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1.4 Melia azedarach Linn.

A família Meliaceae possui 51 gêneros e cerca de 1400 espécies [13],

quase todas lenhosas, nativas de regiões tropicais e subtropicais dos dois

hemisférios. As meliáceas se destacam pela sua composição química semelhante,

contendo compostos com ação contra os insetos. Os gêneros do velho mundo Melia

e Azadirachta, os quais constituem a tribo Melieae, são os gêneros de maior

destaque em ações contra insetos, partilham um número de características

anatômicas interessantes, que nunca foram encontradas em outras Meliaceae [14].

Estes dois gêneros estão entre aqueles mais estudados do ponto de vista

fitoquímico. O interessante é que para estes gêneros, tem sido citado a ocorrência

da subclasse de limonóides C-seco. O limonóide C-seco de maior interesse nos

últimos anos tem sido a azadirachtina A encontrada apenas em Azadirachta indica e

Melia azedarach [15,16].

O gênero Melia é constituído por cinco espécies de ocorrência no velho

mundo, azedarach, toosendan, bubia, volkensii e composita [14]. A espécie mais

importante é Melia azedarach Linn., conhecida por Cinamomo, Santa-Bárbara, e

outros. Melia azedarach é uma planta nativa da Pérsia, China e da Índia presente

hoje em diversos países da Ásia, África, Oceania e Américas [17]. Esta espécie tem

ampla adaptação, rápido crescimento e produção abundante de frutos. Até o

momento nenhum composto inseticida mais potente que a azadirachtina A foi

isolado do Cinamomo. Apesar de ser uma planta com múltiplas ações contra

insetos, seu uso como inseticida natural precisa ser cauteloso, porque a planta

contém limonóides que são considerados tóxicos aos mamíferos [17]. Estes relatos

[17] dizem que folhas, galhos e flores são tóxicos, mas a maioria dos casos ocorrem

após a ingestão dos frutos. Há relatos de morte de crianças que ingeriram de seis a

oito frutos maduros. Experimentos com porco e ovelha mostraram que em alguns

casos uma quantidade pequena dos frutos, 0,5% do peso corporal, levou à morte,

enquanto em outros uma quantidade bem maior não levou a sintoma nenhum.

Assim, tem sido sugerido que a toxicidade pode variar com a localização e estágio

de desenvolvimento da planta. Na Argentina e Califórnia o povo tem os frutos como

inofensivos, pois as crianças e o gado têm acesso a eles e não há nenhum registro

de intoxicação e/ou morte. Contudo no oeste da Índia eles são considerados tóxicos

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[17]. Em 1983 um grupo de pesquisadores da Austrália trabalhando com os frutos,

mostrou que quatro limonóides, meliatoxinas A

, A

, B

e B

, com esqueletos intactos

foram os responsáveis pelo efeito tóxico a porcos e ratos [17].

Meliatoxina A

Meliatoxina B

R: CH

CH(CH

)CO R: CH

CH(CH

)CO

Meliatoxina A

Meliatoxina B

R: (CH

)

CHCO R: (CH

)

CHCO

1.5 Enxerto

A reprodução de plantas não é uma invenção da era moderna. As

técnicas básicas de enxerto provêm de tempos remotos, praticadas por chineses,

gregos e romanos para multiplicar certas plantas, como a videira. Acredita-se que

tais técnicas tenham sido inspiradas pela observação de galhos de espécies

diferentes postos em contato pelo crescimento, fenômeno comum nas matas.

Enxerto, ou enxertia é o processo de multiplicação vegetal que

consiste basicamente em soldar um galho ou broto (fragmento) de uma planta ao

tronco enraizado de outra, em geral mais resistente, para que nela se desenvolva

com características aprimoradas. A parte implantada, chamada garfo ou enxerto,

conserva as características da planta da qual procede. A parte que recebe o enxerto,

chamada cavalo ou porta-enxerto, extrai do solo os nutrientes necessários à

evolução do conjunto[18].

Entre as vantagens e importância do enxerto, que constitui na

prática uma relação de simbiose, sobressai a garantia de que as novas mudas

reproduzirão as qualidades da planta de origem. Outra vantagem é que o uso de

cavalos rústicos permite criar mudas vigorosas de espécies ou variedades muito

AcO

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suscetíveis a doenças e pragas. A enxertia é bastante comum na multiplicação de

híbridos que, se nascem de sementes pelo processo sexuado, ficam expostos aos

acasos da recombinação genética e podem sofrer mutações. A multiplicação

vegetativa por meio de enxerto se pratica também para tornar mais precoce o

florescimento e a frutificação, pois em geral os cavalos já têm um ano ou mais no

solo quando recebem a parte enxertada. Em geral, a enxertia reduz o porte das

plantas o que constitui considerável vantagem em relação às árvores frutíferas.

Pode-se transformar pela enxertia, plantas estéreis em produtivas ou restaurar

plantas danificadas e ameaçadas de morte. Outra vantagem da enxertia é a

possibilidade de adaptar plantas em solos ou climas através de cavalos adequados

[18,19].

Das várias regras a serem observadas para o bom êxito da

operação, duas são fundamentais. A primeira diz respeito à compatibilidade entre o

enxerto e o porta-enxerto, pois só plantas de espécies que tenham entre si certo

grau de parentesco e analogia entre suas estruturas anatômicas podem ser

enxertadas. A segunda regra recomenda a justaposição das camadas geratrizes

(câmbios) das duas plantas, para assegurar a perfeita união de seus tecidos [18,20].

Existem numerosas modalidades de enxerto, todas contidas, de

certo modo, nos três tipos principais que a fruticultura emprega. No enxerto por

aproximação ou encostia, dois galhos de duas plantas, ambas enraizadas, são

unidos em certo ponto onde parte da casca é removida. Depois que o enxerto

"pega", corta-se abaixo desse ponto ficando o galho que serviu como garfo.

O enxerto de garfo ou garfagem resume-se à implantação de um

pedaço de galho da planta a ser multiplicada sobre um porta-enxerto compatível,

mais rústico e já enraizado. A garfagem varia conforme a fenda aberta e a maneira

de encaixe: pode ser, em relação ao cavalo, lateral ou no topo. Por último, o enxerto

de borbulha que consiste na inserção de uma gema ou broto da planta, extraído com

casca e em forma de escudo, sob a casca fendida e levantada do porta-enxerto.

Para que um enxerto dê resultado, é fundamental que se ajustem perfeitamente às

partes interligadas.

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1.6 Enxerto de Azadirachta indica sobre Melia azedarach

Como já mencionado, no Brasil as primeiras introduções do Nim para

estudo como inseticida foram feitas pelo Instituto Agronômico do Paraná, em

Londrina, em 1986, com sementes originadas das Filipinas, e em 1989, com

sementes da Índia, Nicarágua e República Dominicana, como parte de um projeto de

pesquisas de controle alternativo de pragas com plantas inseticidas [02]. A

pesquisadora responsável por este projeto é a Dra. Sueli Souza Martinez.

Recentemente, visando obter frutos em plantas de Nim mais jovens, e em regiões

climáticas não favoráveis ao cultivo do Nim, esta pesquisadora adotou a técnica de

enxertia, similar a utilizada em citricultura, onde no enxerto as plantas se

desenvolvem menos, levando a uma copa maior, mais baixa e frutificando com

apenas um ano. Assim, ela vem desenvolvendo enxertos de Azadirachta indica

sobre Melia azedarach. São duas espécies afins morfologicamente, característica

morfológica necessária ao sucesso do enxerto. A Melia azedarach mostrou-se

melhor adaptada na região sul do país, mais resistente a invernos rigorosos, daí a

escolha desta como o cavalo do enxerto. A azadirachtina está presente

principalmente nos frutos de Azadirachta indica, o que explica esta constituir a parte

superior do enxerto. Outro motivo de Melia azedarach ter sido o cavalo, foram os

comentários acima sobre a toxicidade de seus frutos. As meliotoxinas citadas, até

dados recentes, não foram encontrados nos frutos de Azadirachta indica.

A enxertia foi feita por garfagem e, apesar de ser intergenérica, teve excelente

pegamento. Os enxertos foram realizados em 1998. Cerca de 150 plantas

encontram-se no campo, em estações experimentais do IAPAR em Xambrê, PR,

para avaliação do melhor método de enxertia, produção de frutos e composição

química.

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1.7 Objetivos Gerais

Os principais objetivos deste projeto de pesquisa são:

1. Estudo fitoquímico qualitativo e quantitativo do enxerto da

Azadirachta indica sobre a Melia azedarach investigando se este mantém o perfil

químico da planta da qual procede.

2. Verificar por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência se houve

alteração no teor de azadirachtinas nas sementes em comparação com as sementes

da planta não enxertada.

3. Desenvolvimento de métodos de quantificação por Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência para a determinação do teor de azadirachtina A em óleos

de Nim disponíveis comercialmente.

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Investigação Fitoquímica do Enxerto de

Azadirachta indica sobre Melia azedarach

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2. Investigação Fitoquímica do Enxerto da Azadirachta indica sobre a Melia

Azedarach

A procura de substâncias de plantas com atividade biológica, sempre

foi um desafio para a ciência e uma questão necessária à sobrevivência do homem

[01]. As plantas produzem metabólitos secundários que desempenham importante

função na manutenção da espécie. Os metabólitos secundários são úteis na defesa

da planta contra predadores e patógenos [21]. Alguns desses compostos possuem

valor agronômico, industrial e medicinal, de modo que as plantas podem ser

consideradas como uma fonte rica para a obtenção e descoberta de fármacos,

produtos agroquímicos e outros compostos, que possam ter um valor agregado, seja

pela natureza da atividade intrínseca, seja mediante transformações químicas que

acrescentem valor no mercado e potencializem a sua ação.

Os produtos metabólicos secundários de plantas desempenham um

importante papel no processo de descoberta de novos inseticidas, principalmente

aqueles considerados ecologicamente corretos. Inseticidas não tóxicos aos animais

nem ao homem e não persistentes, ou seja, que degradam-se com maior velocidade

que os sintéticos existentes não deixando resíduos nos alimentos ou no meio

ambiente. Dentro de um amplo universo de classes de compostos com

características ou potencial inseticida, destacam-se os limonóides.

Os limonóides são tetranortriterpenos modificados, também conhecidos

por meliacinas. Apesar de limonóides apresentarem estruturas bastante diversas,

tem como precursor comum, o ∆

-tirucalol [C-20(R)] ou ∆

-eufol [C-20(S)] (Figura

2.2). São compostos encontrados em plantas da ordem Rutales. Em particular,

caracterizam os membros da família Meliaceae, onde são diversos e abundantes.

Um número limitado de estruturas pode ainda ser encontrado nas famílias Rutaceae

e Cneoraceae [15,22].

Azadirachta indica (Nim) e Melia azedarach (Cinamomo) estão entre as

meliáceas mais estudas; aproximadamente 350 derivados do tirucalol ou eufol já

foram isolados e identificados. Entre os limonóides já isolados, que possuem

atividade contra insetos, a azadirachtina A é o mais investigado e considerado o

mais potente.

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2.1 Azadirachtina A

A história deste limonóide C-seco iniciou-se em 1968 quando foi pela

primeira vez isolada das sementes do Nim por Butterworth e Morgan [08,09]. O

primeiro debate demonstrando o progresso em sua elucidação estrutural ocorreu em

1971 durante um Simpósio de Produtos Naturais na University of the West Indes, em

Mona, Jamaica [23]. Em 1975 Zanno e colaboradores [09,23] descreveram uma

estrutura completa da azadirachtina usando a Ressonância Magnética Nuclear.

Contudo, cometeram alguns pequenos erros. A estrutura correta só apareceu após

17 anos de seu isolamento, em 1985 quando foram submetidos, quase que

simultaneamente para publicação, dois trabalhos de dois grupos de pesquisas,

Broughton e Kraus adub Mordue [09]. Porém, todos os detalhes da molécula só

foram finalmente descritos em 1987 por Kraus [09,23,24,25].

A azadirachtina, também conhecida por azadirachtina A, é um

limonóide que se concentra principalmente nos frutos, contudo, pode ser encontrado

em menores teores em toda a planta. Diversas publicações quantificam os teores da

azadirachtina em sementes variando entre 0,02 % e 0,66 %. Como muitos

limonóides, a azadirachtina A torna-se instável em meio ácidos e alcalinos, em altas

temperaturas e na presença de luz e umidade [02,26,27]. A azadirachtina é um

limonóide bastante oxidado com muitos grupos funcionais reativos, próximos um ao

outro, motivo que dificultou a sua elucidação estrutural e a torna muito instável

(estrutura 165 do gênero Azadirachta).

2.2 Biogênese do Limonóides

Os limonóides são compostos que se originam do óxido de esqualeno

[28]. O óxido de esqualeno pode se ciclizar sincronizadamente gerando um

carbocátion precursor das estruturas policíclicas terpênicas. Dependendo da enzima

envolvida, o óxido pode ser moldado e ciclizar na conformação cadeira-barco-

cadeira-barco gerando o cátion protoesteril (Figura 2.1) ou na conformação cadeira-

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cadeira-cadeira-barco, dando origem ao cátion dammarenila (Figura 2.2)

apresentando cada cátion uma estereoquímica diferente entre si.

Figura 2.1 – Ciclização do óxido de esqualeno na conformação cadeira-barco-

cadeira-barco [28].

O cátion protoesteril seguido por uma série de migrações simultâneas

de Wagner-Meerwein de metilas e hidretos dá origem aos triterpenóides lanosterol e

cicloartenol. O grupo cicloartenol se caracteriza pela presença de um ciclo propano

entre C-9 e C-10. Uma característica adicional ao cátion protoesteril é que a Me-19 e

o H-5, também estão na posição trans-axial podendo ocorrer outras migrações de

metilas e hidretos (rearranjo Wagner-Meerwein) não necessariamente levando a

Óxido de Esqualeno

cadeira-barco-cadeira-barco

Migrações em sequência

de hidretos e metilas

(Rearranjo Wagner-Meerwein)

finalizado pela perda de um próton

Cátion protoesteril

Cicloartenol

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formação da ligação dupla entre C-8/C-9, mas levando a formação de ligação dupla

entre C-5/C-6.

Figura 2.2 – Ciclização do óxido de esqualeno na conformação cadeira-cadeira-

cadeira-barco [28].

Com a migração de hidretos e metilas no cátion dammarenila obtêm-se

os isômeros eufol [C-20(S)] e o tirucalol [C-20(R)]. Muitos quassinóides e triterpenos

têm a configuração C-20(R) sugerindo o tirucallol como precursor, porém, Ekong

[15] demonstrou que nas folhas da Azadirachta indica o eufol C-20(S) foi convertido

para o limonóide nimbolido mais eficientemente que o tirucalol. Tanto o eufol quanto

o tirucalol são considerados precursores biossintéticos dos limonóides [08].

Num primeiro momento ocorre uma isomerização (migração) na dupla

ligação desses compostos para o C-7 formando uma classe de triterpenos

denominada protolimonóides representado pelo butirospermol. Os protolimonóides

Eufol [C-20(S)]

Tirucalol [C-20(R)]

Migrações em sequência

de hidretos e metilas

(Rearranjo Wagner-Meerwein)

finalizado pela eliminação de um próton

Óxido de Esqualeno

cadeira-cadeira-cadeira-barco

Cátion Dammarenila

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também são conhecidos por conterem a cadeia lateral intacta com 8 átomos de

carbono.

Derivado dos protolimonóides e precursores mais diretos dos

limonóides há o grupo dos apo-protolimonóides, grupo formado por protolimonóides

que apresentam uma dupla ligação em C-14, com um grupo metílico com

configuraçãem posição β em C-8, além de um grupo hidroxílico em posição α em C-

7. Acredita-se que os apo-protolimonóides são formados pela epoxidação na ligação

dupla entre C-7 e C-8 em posição α, com a formação de 7α,8α-epóxido, o qual é

aberto, induzindo um rearranjo Wagner-Merwein, deslocando o grupo metílico de C-

14 para C-8, formando a hidroxila em C-7 e formando uma ligação dupla em C-14

pela perda de um próton em C-15 como pode ser observado na Figura 2.3.

Figura 2.3 – Apo-rearranjo do protolimonóides [08].

Estruturalmente os limonóides são considerados derivados dos

protolimonóides por uma série de reações oxidativas acompanhadas de rearranjos

moleculares. As oxidações são preferencialmente epoxidações de ligações duplas

ou lactonizações do tipo Baeyer-Villiger de cetonas catalizadas pela enzima mono-

oxigenase [29]. Há interesse considerável na maneira pela qual a cadeia lateral do

triterpeno precursor dos limonóides é transformada no anel furano β-substituído com

a perda de quatro átomos de carbono. Duas propostas são bem aceitas (Figura 2.4),

Apo-protolimonóides

HO OH

Limonóides

Eufano

Tirucalano

Butirospermol

(Protolimonóide)

Epoxidação

Apo-rearranjo

HO OH

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ambas sugerindo transformações na cadeia lateral através de reações de oxidação

[30,31].

Proposta A:

Proposta B.

Figura 2.4 – Possíveis rotas biogenéticas para a formação do anel furano.

Tanto o gênero Azadirachta quanto o gênero Melia apresentam

inúmeros limonóides que foram divididos e classificados em grupos. Cada composto

foi alocado dentro de um grupo de acordo com suas características estruturais. A

seqüência dos grupos segue uma ordem biogenética proposta sendo cada nomeado

por seu principal representante. Dois esquemas gerais são propostos nas Figuras

2.5 e 2.6 para as rotas biogenéticas dos limonóides, uma para o gênero Azadirachta

e outra para o gênero Melia respectivamente.

HO O O

Oxidação

Baeyer-Villiger

(CH

)

CHCOOH

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Grupo Vilasinina

Grupo Gedunina

Grupo Nimbina

MeO

Grupo Nimbolídeo

MeO

Grupo da Salannina

AcO

OCin

MeO

MeOOC

Grupo

Azadirachtol

Grupo

Azadirachtina

Grupo Meliacarpina

Grupo Meliacarpina e

Azadirachtinina

Grupo Nimbolinina

MeO

Grupo Homoazadirono

ORO

Butirospermol

(Protolimonóide)

Azadirachnol

(apo-protolimonóide)

OAc

γ-Hidroxibutenolídeo

apo-protolimonóides

(Derivados da perda de 4 átomos

de carbono na cadeia lateral)

Grupo Azadirono

Figura 2.5 – Classificação em grupos biogenéticos dos limonóides presentes no

gênero Azadirachta. Uma possível seqüência biogenética.

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OHO

OAc

BzO

OAc

AcO

Grupo Meldenino

(Derivados da perda de 4 átomos

de carbono na cadeia lateral)

apo-protolimonóides

apo-protolimonóide

Butirospermol

(Protolimonóide)

ORO

Grupo Gedunina

AcO

OAc

COOMe

Grupo Nimbolino

Grupo B-seco

AcO

Grupo Azedarachina

O O

Grupo Meliatoxina

MeO

Grupo C-seco

AcO

Grupo Nimbolinina

Grupo Meliacarpina

O OH

MeOOC

CinO

AcO

OTIg

MeOOC

OMe

MeOOC

Grupo Meliacarpinina e

Azadirachtinina

Figura 2.6 – Classificação em grupos biogenéticos dos limonóides presentes no

gênero Melia. Uma possível seqüência biogenética.

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2.3 Metabólitos Secundários Descritos na Literatura para os Gêneros da Tribo

Meliaea

Pertencente à subfamília Melioideae da família Meliaceae, os gêneros

Azadirachta e Melia constituem a Tribo Meliaea. O gênero Azadirachta é composto

pelas espécies indica e excelsa e o gênero Melia formado pelas espécies

azedarach, toosendan, bubia, volkensii e composita.

A seguir encontra-se a revisão dos compostos isolados em cada

gênero. O nome comum ou usual dos limonóides, parte da planta de onde os

mesmos foram isolados e a referência de cada composto estão descritos nas

Tabelas 2.1 e 2.2. Nos Apêndices C e D encontram-se em tabelas os valores de

RMN

C para alguns destes compostos.

2.3.1 Gênero Azadirachta

2.3.1.1 Cicloartanos e Esteróides.

Compõe este grupo compostos derivados da rota biossintética dos

cicloartanos e esteróides. Os esteróides se caracterizam por não apresentarem

metilas ligadas ao C-4 e C-8 eliminadas em etapas posteriores a ciclização do óxido

de esqualeno (1-9).

OAc

3 β OH H

β OH

OAc

3 β OH H

β OH

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2.3.1.2 Protolimonóides, apo-protolimonóides e limonóides.

2.3.1.2.1 Grupo Protolimonóides: Os protolimonóides são

considerados os precursores biossintéticos dos limonóides contendo ainda os 8

átomos de carbono na cadeia lateral (10 – 17).

Protolimonóides derivados do eufol/tirucalol.

Protolimonóides derivados do Butirospemol.

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Protolimonóides derivados do Butirospemol oxidados no C-16.

2.3.1.2.2 Grupo Apo-protolimonóides: os apo-protolimonóides são

caracterizados pela presença de ∆

supostamente formados a partir dos

protolimonóides após um apo-rearranjo. São considerados os precursores mais

diretos dos limonóides uma vez que esses normalmente apresentam a mesma

insaturação ou uma posterior oxidação da ligação dupla.

Apo-protolimonóides com o anel D expandido após sofrerem uma

reação de Baeyer-Villiger.

Apo-protolimonóides com anel de 5 membros na cadeia lateral.

OAcO

OAc

OH OH

COOH

OAc

OMe

OAc

OAcO

OAc

OH OH

COOH

OAc

OMe

OAc

AcO

HOCH

OTig

COOH

OMe

OAc

MeO

AcO

HOCH

OTig

COOH

OMe

OAc

MeO

OAcO

OAc

OAcO

OAc

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Apo-protolimonóides com anéis de 6 membros na cadeia lateral.

Apo-protolimonóides derivados da perda de 4 átomos de carbono na

cadeia lateral.

Apo-protolimonóides derivados da perda de 4 átomos de carbono na

cadeia lateral com uma ponte éter entre C-28/C-6.

OAc

29 Me

30 CH

OAc

31 H

OBz

OMe

OFer

OCH

OAc

HO O

OAc

29 Me

30 CH

OAc

31 H

OBz

OMe

OFer

OCH

OAc

HO O

AcO

38 Tig

Sen

AcO

OTig

AcO

OSen

HO H

40 41

Cin H

43 Tig

Sen

Ac44

AcO

OTig

AcO

38 Tig

Sen

AcO

OTig

AcO

OSen

HO H

40 41

Cin H

43 Tig

Sen

Ac44

AcO

OTig

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Apo-protolimonóides com um grupo γ-hidroxibutenolídeo.

Apo-protolimonóides com um grupo γ-hidroxibutenolídeo com diversas

oxidações.

Apo-protolimonóides derivados da perda da cadeia lateral.

AcO OAc

OAc

H OH

50 H

OSen

OMe

OAc

AcO OAc

OAc

H OH

50 H

OSen

OMe

OAc

OMe

OAcO

OAc

HO O

OMe

OAc

HO O

AcO

OTig

AcO

OTig

OMe

OAcO

OAc

HO O

OMe

OAc

HO O

AcO

OTig

AcO

OTig

AcO

OTig

AcO

OTig

OAc

COOH

OCCHO

OMe

OAc

COOH

OAc

COOH

OCCHO

OMe

OAc

COOH

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2.3.1.3 Grupo Azadirono e seus análogos naturais: esse grupo é

constituído por limonóides com todos os anéis triterpênicos intactos.

Compostos oxidados do grupo azadirono.

2.3.1.4 Grupo homoazadirono: este é um grupo caracterizado por

compostos homólogos do azadirona tendo o anel A sete membros. A extensão

ocorreu pela incorporação de uma das metilas do C-4.

OAc

AcO

OAc

OH Ac

OAc

AcO

OAc

OH Ac

OAc

OH Ac

OAc

84 Ac

85 Bz

OAcO

OMe

OAc

ORO

82 H

83 Ac

84 Ac

85 Bz

OAcO

OMe

OAc

ORO

82 H

83 Ac

OAc

9190

OAc

9190

OAc

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2.3.1.5 Grupo Gedunina: compostos caracterizados por uma extensão

oxidativa do tipo Baeyer-Villiger no anel D.

2.3.1.6 Grupo Vilasinina: fazem parte deste grupo os limonóides com

o esqueleto triterpênico intacto apresentando uma ponte éter entre C-28/C-6.

Neste grupo pode ser acrescentado o meliacinol possivelmente

biossintetizado a partir da vilasinina (102;Tabela 2.1).

OAcO

OAc

OCin

AcO

(CH

)

OAc

98 H

100

OAc

101

OAcO

OAc

OCin

AcO

(CH

)

OAc

98 H

100

OAc

101

102

103

104

105

106

107

108

Tig

Sen

Cin

Tig

109

110

111

112

βOH

Tig

113 Ac H Cin H

114 Ac Ac Cin H

115 Ac H Bz H

116

117

H H

Tig

102

103

104

105

106

107

108

Tig

Sen

Cin

Tig

109

110

111

112

βOH

Tig

113 Ac H Cin H

114 Ac Ac Cin H

115 Ac H Bz H

116

117

H H

Tig

118

C CCO

118

C CCO

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2.3.1.7 Grupo Nimbina: grupo caracterizado pela presença de um anel

C-seco e uma ponte éter entre C-7/C-15.

2.3.1.8 Grupo Nimbolídeo: compostos C-secos com ponte éter entre

C-28/C-6.

2.3.1.9 Grupo Salannina: limonóides C-seco não apresentando o

grupo cetôno no anel A.

MeO

COOH

COOMe

MeOOC

MeO

119

120

121

122

123

COOMe

CHO

COOMe

CHO

OAc

MeO

MeCOO

124

125

MeO

126

127

MeO

128

129

MeO

OAc

130 131

MeO

COOH

COOMe

MeOOC

MeO

119

120

121

122

123

COOMe

CHO

COOMe

CHO

OAc

MeO

MeCOO

124

125

MeO

126

127

MeO

128

129

MeO

OAc

130 131

MeO

132

MeO

133

MeO

134

MeO

135 136

MeO

132

MeO

133

MeO

134

MeO

135 136

HOOC

MeO

OTig

AcO

145

137

138

139

140

141

Tig

i-Val

Sen

OAc

142 Cin OH

143 H H

Tig

i-Val

MeO

144

HOOC

MeO

OTig

AcO

145

137

138

139

140

141

Tig

i-Val

Sen

OAc

142 Cin OH

143 H H

Tig

i-Val

MeO

144

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2.3.1.10 Grupo Nimbineno: Grupo formado por 28-norlimonóides.

2.3.1.11 Grupo Nimbolinina: compostos derivados de limonóides C-

seco rearranjados em um anel C de 7 membros.

2.3.1.12 Grupo Azadirachtina: Constituído por limonóides C-seco com

variadas modificações no esqueleto triterpenico e diversos grupos funcionais. Seu

principal representante é a azadirachtina A (164).

MeO

OTig

AcO

MeO

OSen

146

MeO

OTig

AcO

147

MeO

SenO

148

MeO

OTig

AcO

149 150

MeO

OTig

AcO

MeO

OSen

146

MeO

OTig

AcO

147

MeO

SenO

148

MeO

OTig

AcO

149 150

MeO

151

152

MeO

153

154

OBz

155

156

MeO

151

152

MeO

153

154

OBz

155

156

AcO

OAc

OTig

AcO

OCin

157 Ac

158 Tig

159 Metacroil

160

161

AcO

OAc

Tig

162

163

Sen

Metacroil

AcO

MeO

OAc

AcO

OAc

OTig

AcO

OCin

157 Ac

158 Tig

159 Metacroil

160

161

AcO

OAc

Tig

162

163

Sen

Metacroil

AcO

MeO

OAc

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2.3.1.13 Grupo Azadirachtol: O principal composto deste grupo é a

azadirachitna B (3-tigloilazadirachtol – 183). Estes compostos se diferenciam do

grupo azadirachtina por não apresentarem um grupo hidroxila em C-11.

AcO

OTig

MeOOC

AcO

OTig

MeOOC

164

165

166

167

168

169

170

171

Tig

OAc

OTig

OCin

OAc

O O

172

AcO

OTig

173

174

COOMe

AcO

OTig

MeOOC

175

176

β OMe

α OMe

AcO

OTig

MeOOC

177

178

AcO OH

MeOOC

TigO

179

AcO OH

MeOOC

TigO

180

HO OH

MeOOC

OTig

181

AcO

OTig

MeOOC

AcO

OTig

MeOOC

164

165

166

167

168

169

170

171

Tig

OAc

OTig

OCin

OAc

O O

172

AcO

OTig

173

174

COOMe

AcO

OTig

MeOOC

175

176

β OMe

α OMe

AcO

OTig

MeOOC

177

178

AcO OH

MeOOC

TigO

179

AcO OH

MeOOC

TigO

180

HO OH

MeOOC

OTig

181

MeO

182

183

184

186

187

Tig

188 Tig

185 H

Tig

MeO

182

183

184

186

187

Tig

188 Tig

185 H

MeO

182

183

184

186

187

Tig

188 Tig

185 H

Tig

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2.3.1.14 Grupo Meliacarpina: estes compostos possuem um grupo

metílico e não o carboximetila em C-4 presentes nos compostos dos grupos

azadirachtina e azadirachtol.

2.3.1.15 Grupo Meliacarpinina e Azadirachtinina: os compostos

deste grupo são meliacarpinas e azadirachtinas rearranjadas através da formação

de uma ponte éter entre C-7/C-13 pela abertura do epóxido C-13/C-14.

Tabela 2.1 – Cicloartanos, esteróides, protolimonóides, apo-protolimonóides e

limonóides isolados do Gênero Azadirachta.

Nome Comum e/ou IUPAC

Origem

Ref.

Cicloartanos/esteróides

4,14α-Dimetil-5α-ergosta-8,24(28)dien-3β-ol

A. indica 08, 30

4α-Metil-5α-ergosta-8,24(28)dien-3β-ol

A. indica 08, 30

03 Cicloeucalenol

A. indica 08, 30

04 24-Metileno Cicloartanol

A. indica 08, 30

2β,3β,4β-Triidroxipregan-16-ona

A. indica – caroço de semente 32, 33

β-Nimolactona

A. indica – frutos 08, 33

β-Sitosterol

A. indica 30, 34, 35

08 Fucosterol

A. indica – folhas 36

(24ξ)-Isopropenil colesterol

A. indica – folhas 36

Protolimonóides

10 Limocinona

A. indica – frutos 08

11 Tirucalol

A. indica 37, 38

12 Meliantriol

A. indica – folhas e óleo 08, 29, 39

13 Odoratona

A. indica –caroço de semente 32, 40

14 Nimbocenona

A. indica – folhas 08, 38

15 Nimolinona

A. indica – frutos 08

16 Limocinol

A. indica – frutos 08

17 Kulactona

A. indica – frutos 08, 29, 41

TigO

MeOOC

189

190

191

Tig

i-Val

Tig

AcO

OTig

192 193

AcO

OTig

COOMe

194

AcO

OAc

MeOOC

195

AcO

OTig

196

TigO

MeOOC

189

190

191

Tig

i-Val

Tig

AcO

OTig

192 193

AcO

OTig

COOMe

194

AcO

OAc

MeOOC

195

AcO

OTig

196

TigO

MeOOC

AcO

OTIg

MeOOC

197

198

200199

AcO

MeOOC

TigO

MeOOC

AcO

OTIg

MeOOC

197

198

200199

AcO

MeOOC

TigO

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Apo-protolimonóides

1α,7α-Diacetoxiapotirucall-14-eno-3α,21,22,24,25-

pentaol

A. indica – caroço semente 32

19 Azadirol

A. indica – casca de frutos 08, 42

20 Ácido azadirolico

A. indica – casca de frutos 43

21 Azadiradionol

A. indica – casca de frutos 43

22 Meliatetraona

A. indica – folhas 44

23 Meliacinina

A. indica – frutos 33, 45

24 Limbonina

A. indica – caroço de semente 08

25 Azadirachtol (20,22-desidroazadirachnol)

A. indica – frutos 08

26 Azadirachnol

A. indica – frutos 08

27 Diepoxiazadirol

A. indica – flores 46

1α,7α-diacetil-17α-20S-21,24-epoxi-apotirucall-14-

eno-3α,23R,24S-25-tetrol

A. indica – sementes 121

29 Limocina A

A. indica – sementes 08, 33

30 Limocina C

A. indica – frutos 47

31 23-Desmetil limocina B

A. indica - sementes 48

32 Limocina B

A. indica - sementes 08, 33, 48

33 Limocina D

A. indica 47

34 Limocinina

A. indica – casca de frutos 08

35 Meliacinolactol

A. indica – casca de frutos 47

36 22,23-Diidronimocinol

A. indica – folhas 33, 49

37 Isonimolicinolido

A. indica – frutos 08

38 Desoxiazadirachtolido

A. indica – folhas 08

39 Não nomeado

40 1-Senecioil-3-acetilvilasinina lactol

A. indica 08

41 1-Tigloil-3-acetilvilasinina lactol

A. indica 08

42 1-Cinnamoilvilasinina lactona

A. indica 08

43 Azadirachtolido

A. indica - folhas 08

44 1-Senecioil-3-acetilvilasinina lactona

A. indica - folhas 08, 50

45 3-Acetil-7-tigloilvilasinina lactona

A. indica – sementes 08, 24, 51

46 Salimuzzalina

A. indica – casca de frutos 43

47 Nimocinolido

A. indica – folhas 08, 52

48 23-O-Metil nimocinolido

A. indica – folhas 53

49 Azadironolido

A. indica – casca de frutos 54

50 O-Metilazadironolido

A. indica – flores 46

51 7-O-Desacetal-23-O-metil-7-O-senecioilnimocinolido

A. indica – folhas 53

52 Isoazadironolido

A. indica – casca de frutos 54

53 Isonimocinolido

A. indica – folhas 08, 52

54 Meliatetraolenono

A. indica – folhas 40

55 Nimbocinolido

A. indica – folhas 08

56 Isonimbocinolido

A. indica – folhas 08

57 Azadiradionolido

A. indica – casca de frutos 54, 55

58 Isonimolido

A. indica – brotos 08

59 Isonimbolido

A. indica – brotos 08

60 Limbocinina

A. indica – sementes 08

61 Limbocidina

A. indica – sementes 08

Desfurano-6α-hidroxiazadiradiono

A. indica – folhas 33, 49

63 Ácido Nimolicinoico

A. indica – frutos 08

64 Ácido Azadironico

A. indica – frutos 33, 45

Limonóides

65 Azadironol

A. indica – frutos 43

66 Azadirono

A. indica – óleo 08, 15,37,38,45,51, 55

67 Nimocina

A. indica – frutos 08

6α-O-Acetil-7-desacetilnimocinol

A. indica – folhas 14

Nimonol (6α-hidroxiazadirona)

A. indica – folhas 08, 56, 57, 58

70 7-Acetilneotrichilenono

A. indica – sementes 08, 29, 59, 60

71 Neeflono

A. indica – flores 08

72 Meldenindiol

A. indica – folhas 08

73 Meldenina

A. indica – óleo de semente 08, 29, 52, 60

74 Isomeldenina

A. indica – folhas 08, 56

75 Nimbocinol (7-desacetil-azadiradiono)

A. indica – sementes 08, 33, 61

76 7-Benzoilnimbocinol

A. indica – sementes 08, 29

77 Azadiradiono

A. indica – sementes, óleo 08, 15, 29, 33, 37, 39,

60- 66

78 Azadirachtanina

A. indica – folhas 08, 38, 120

17β-Hidroxinimbocinol

(7-Desacetil-17β-hidroxiazadiradiono)

A. indica – sementes 08, 60, 61

17β-Hidroxiazadiradiono

A. indica – óleo, frutos 08, 29, 60-62, 66, 67

1α,2α-Epoxi-17β-hidroxiazadiradiono

A. indica – óleo sementes 68

82 17-Epi-nimbocinol

A. indica – óleo 08

83 17-Epi-azadiradiono

A. indica – óleo, frutos 08, 29, 62, 66

84 Nimbinina (14-epoxiazadiradiono)

A. indica – óleo, sementes 08, 29, 33, 39, 60, 62-

64, 66, 69-72

85 7-Desacetil-7-benzoilnimbinina

A. indica – sementes 08

14,15β-Epoxinimonol

A. indica – folhas 57

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1α-Metoxi-1,2-diidronimbinina

A. indica – sementes 08, 29

1β,2β-Diepoxiazadiradiono

(1β,2β-Epoxinimbinina)

A. indica – óleo de semente 08, 29, 59, 60

89 Vepinina

A. indica – óleo de semente 08, 29

1,2-Diidro-4α,6α-A-homoazadirono

(4α-Hidroxi-A-homo-isomeldenina)

A. indica 08

4α,6α-Diidroxi-A-homo-azadirono

A. indica – folhas 08

92 Desoxigedunina

A. indica – casca dos frutos 33

93 Azadirinina

A. indica – casca raíz 08

94 7-Desacetilnimolicinol

A. indica – óleo de sementes 68

95 Nimolicinol

A. indica – óleo de sementes 08, 68

96 Mahmoodina

A. indica – óleo de sementes 04, 08

1α,2α-Epoxinimolicinol

A. indica – óleo de sementes 68

98 Desacetilgedunina

A. indica – óleo 08, 39, 62, 60, 66

99 Gedunina

A. indica – óleo, casca 04, 08,15, 29, 30, 33,

39, 62, 72, 60, 66

100 7-Desacetil-7-benzoilgedunina

A. indica – sementes 08, 29, 60

101

6β-Hidroxigedunina

A. indica – caroço da semente 74

102 Vilasinina

A. indica – folhas 08, 39, 60

103 1,3-Diacetilvilasinina

A. indica – óleo de sementes 08, 30, 33, 39, 48, 75

104 Trichilinina B (1-tigloil-3-acetilvilasinina)

A. indica – sementes 08, 39, 55, 76

105 1-Senecioil-3-acetilvilasinina

A. indica – folhas 08

106 Vilasinina triacetato

A. indica – óleo de sementes 08, 29

107 Nimbolina A (1,3-Diacetil-7-cinnamoilvilasinina)

A. indica 08, 29, 60

108 1-Acetil-7-tigloilvilasinina

A. indica – sementes 08

109

1,3-Diacetil-12α-acetoxi-vilasinina

A. indica – sementes 08

110

7-Tigloil-12α-acetoxi-vilasinina

A. indica – sementes 08

111

1-Tigloil-3-acetil-12α-acetoxi-vilasinina

A. indica – sementes 08

112

1,3-Diacetil-7-tigloil-12β-hidroxivilasinina

A. indica – sementes 08, 48

113 Não nomeado

A. indica 39

114 Não nomeado

A. indica 39

115 Não nomeado

A. indica 39

116 Nimbidinina (12-Oxovilasinina)

A. indica – caroço da semente 08, 29, 38, 60, 67

117 1-Acetil-7-tigloylnimbidinina

A. indica – sementes 08

118 Meliacinol

A. indica – folhas 14

119 Nimbina

A. indica - sementes, óleo,

folhas

02, 08, 29, 33, 37-39,

44, 58, 60-63, 66, 72,

77-82

120 6-Desacetilnimbina

A. indica sementes, óleo, brotos 02, 08, 39, 58, 60, 62,

63, 66, 72, 77, 79, 81,

83, 84

121 Nimbinal (Nimbanal)

A. indica – sementes 08

122 6-Desacetilnimbanal

A. indica – folhas 08

123 Nimbinol

A. indica - caroço de semente 08

124 4-Epinimbina

A. indica - óleo de semente 08, 39

125 Desacetil-2,3-Ácido diidronimbico

A. indica 08

126 Nimbinolido

A. indica – sementes 08, 80

127 6-Desacetilnimbinolido

A. indica – brotos 08, 83

128 Isonimbinolido

A. indica – sementes, casca do

caule

08, 80

129 6-Desacetilnimbinolido

A. indica – brotos 08, 83

130 Nimbinolactono

131 Desfurano-desacetilnimbin-17-ono

A. indica – folhas 44

132 28-Desoxonimbolido

A. indica – folhas

A. excelsa - tronco

02, 08, 85

133 Nimbolido

A. indica – folhas

A. excelsa – tronco, casca,

sementes

08, 29, 33, 39, 60, 71-

73, 85-87,

134 2,3Diidronimbolido

A. excelsa – tronco 86

135 Margosinolido

A. indica – brotos 08, 88

136 Isomargosinolido

A. indica – brotos 08, 88

137 Salannina

A. indica – sementes, óleo 02,08, 38, 39, 55, 58,

62, 63, 65, 72, 73, 76,

77, 79, 80-82, 84, 89,

90-99

138 3-Desacetylsalannina

A. indica – sementes, óleo, folhas 02, 08, 29, 39, 62, 66,

72, 73, 84, 92, 93, 97

139 Salannol

A. indica – óleo sementes 08, 39

140 Acetato Salanno

A. indica – sementes 08, 39

141 2’,3’-Dehidrosalannol

A. indica – folhas 08

142 Ohchinina

A. indica 08, 67, 94

143 3-Desoximetilnimbidato

A. excelsa – caule 86

144 Ácido Nimbidico

A. indica – caroço semente 08, 66

145 Salannimolido

A. indica – sementes, óleo 02, 08, 80, 99

146 Isoazadirolido

A. indica – folhas 08

147 Salanninolactono

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148 Melianol

A. indica – folhas 39, 41, 44

149 Salannolactamo

A. indica – sementes 08, 39

150 Salannolactamo-23

A. indica – sementes 08, 39

151 Nimbineno

A. indica – óleo de semente,

folhas, casca

08, 29, 39, 67

152 6-Desacetilnimbineno

A. indica – óleo de semente,

folhas, casca

08, 39, 67

153 Nimbandiol

A. indica - óleo, folhas 08, 29, 62, 66, 67

154 6-O-Acetilnimbandiol

A. indica - óleo de semente 08, 29, 67, 92

155

4α-Benzoilnimbandiol

A. indica 08

156 Ácido Pironimbico

A. indica 07

157 1,3-Diacetil-7-cinnamoil-nimbolinina (Nimbolina B)

A. indica – madeira moída, casca

raiz

08, 29, 30, 60

158 1-Tigloil-3-acetil-7-cinnamoilnimbolinina (Nimbilina)

A. indica – casca raiz 08

159 1-Metacroil-3-acetil-cinnamoilnimbolinina(Nimbolicina)

A. indica – casca raiz 08

160 Ohchinolido B

A. indica – frutos 08, 29, 55, 60

161 21-Oxo-ohchinolido

A. indica 08

162 7Destigloil-7-senecioil-11desactilnimbolidina A

A. indica – folhas 08

163 7-Destigloil-7-metacroil-11-

desacetilnimbolidina A

A. indica – folhas 08

164 Azadirachtina A

A. indica – sementes, óleo

A. excelsa – sementes

02, 08, 24, 25, 29, 33,

37, 38, 48, 60, 63, 64,

67, 72, 77, 79, 80-82,

84, 87, 90-92, 100-113

165 11-Hidroxiazadirachtina B

A. indica – sementes 08, 48

166 3-Desacetilazadirachtina

A. indica – sementes 08

167 3-Desacetil-3-cinnamoilazadirachtina

A. indica – folhas 08, 25

168

1α-Destigloil-1α-benzoilazadirachtina

A. indica – sementes 08

169 2’,3-‘Diidrotigloil-azadirachtina

A. indica – sementes 08

170 1-Destigloil-1-1isobutiroilazadirachtina

A. indica – sementes 08

171 1-Destigloil-1-isocaproil-3-desacetil-3-

epoximetacroilazadirachtina

A. indica – sementes 08

172 Azadirachtina H

A. indica – sementes 08, 64, 100

173 11-Epi-azadirachtina H

A. indica – sementes 02, 08, 100, 109, 114

174 Azadirachtina M

A. indica – caroço de sementes 114

175 Vepaol

(22,23-Diidro-23β-metoxiazadirachtina)

A. indica – sementes 08, 25, 39

176 Isovepaol

A. indica 08

177 13,14-Desoxiazadirachtina A

A. indica – caroço de sementes 08, 115

178 Marrangina

A. excelsa –caroço de sementes 87

179 Azadirachtina K

A. indica – caroço de sementes 08

180 Não nomeado

A. excelsa –caroço de sementes 116

181 Desacetilazadirachtinol

A. indica – óleo 39, 92

182 Azadirachtol

A. indica – caroço de semente 117

183 Azadirachtina B

(3-Tigloilazadirachtol)

A. indica – sementes

A. excelsa - casca

02, 25, 39, 48, 63, 64,

82, 87, 90, 91, 118

184 2’,3-‘Diidrotigloilazadirachtol

A. indica – sementes 08

185 3-Isobutiroilazadirachtol

A. indica – sementes 08

186

3α-Acetoxi-1α-hidroxiazadirachtol

A. indica – sementes, folhas 08, 111

187 3-Desacetil-11-desoxiazadirachtina

A. indica – sementes 08, 24, 39

188 1-Tigloil-3-acetil-azadirachtol

A. excelsa – caroço de semente 87

189 Azadirachtina F

A. indica 08

190 Azadirachtina D

A. indica – sementes 02, 08, 64, 100

191 1-Destigloil-1-isovaleroilazadirachtina

A. indica – sementes 08

192 Azadirachtina I

A. indica – sementes 02, 08, 64

193 3-Tigloil-13,14-desepoxi-17-hidroxiazadirachtol

A. indica – sementes 08

194 11-Epi-azadirachtina D

A. indica – sementes 100

195 1,3-Diacetil-11,19-desoxo-11-oxo-melicarpina

A. indica – sementes, folhas 08, 107

196 11-Desmetoxi-carbonil-11-oxomeliacarpina

A. indica 08

197 1-Tigloil-3-acetilazadirachtinina

A. indica – sementes 02, 08, 48

198 1-Tigloil-3-acetil-11-metoxiazadirachtinina

A. indica – casca 08, 25, 38, 39, 96, 119

199 1-Tigloil-3-acetil-11-hidroximeliacarpinina

A. indica 08

200 Azadirachtina N

A. indica – caroço de semente 114

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2.3.2 Gênero Melia

Os compostos do gênero Melia foram agrupados por uma proposta

biogenética semelhante à proposta ao gênero Azadirachta seguindo o esquema

apresentado na Figura 2.6 (pg. 24).

2.3.2.1 Cicloartanos (1 – 3) e esteróides (4 – 10).

2.3.2.2 Grupo Protolimonóides: compõem este grupo os compostos

derivados do butirospemol.

1 β OH H

β OH

α OH

8 9

1 β OH H

β OH

α OH

8 9

β OH13

COOMe

15 CH

16 COOMe OH

17 COOMe O0H

COOMe

β OH13

COOMe

15 CH

16 COOMe OH

17 COOMe O0H

COOMe

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Protolimonóides derivados do butirospemol com anel lactônico de 5

membros fundido ao anel D.

Protolimonóides com anel de 5 ou 6 membros na cadeia lateral.

Me(CH

)nCOO

n = 10, 12, 14 e 16

30 β OH

31 H

∆

7,8

Me(CH

)nCOO

n = 10, 12, 14 e 16

30 β OH

31 H

∆

7,8

β H

α H

β H

α H

20 H

21 β OH

22 β OH

β OH

23 α OH H

MeO

20 H

21 β OH

22 β OH

β OH

23 α OH H

MeO

20 H

21 β OH

22 β OH

β OH

23 α OH H

MeO

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2.3.2.3 Grupo Apo-protolimonóides: grupo formado por

protolimonóides que sofreram um apo-rearranjo.

Apo-protolimonóides com a perda de 4 átomos de carbono na cadeia

lateral.

OHHO

MeO

OAc

BzOOHHO

AcO

OHHO

MeO

OAc

BzOOHHO

AcO

OMe

BzO

OAc

BzO

OAc

BzO

OAc

40 OH

41 42

BzO

OAc

OMe

BzO

OAc

BzO

OAc

44 45

OMe

BzO

OAc

BzO

OAc

BzO

OAc

40 OH

41 42

BzO

OAc

OMe

BzO

OAc

BzO

OAc

44 45

BzO

OAc

OAcO

BzO

OAc

OAcO

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2.3.2.4 Grupo Meldenino: grupo de limonóides de esqueleto triterpeno

intacto.

2.3.2.5 Grupo Nimbolino: grupo constituído por limonóides

provavelmente derivados do Meldenino se diferenciando por apresentar ponte éter

entre C-28/C-6.

2.3.2.6 Grupo Gedunina: os limonóides deste grupo são

caracterizados por um anel D de 6 membros estendido por uma oxidação do tipo

Baeyer-Villiger.

OHO

OAc

OAcO

49 50

OAc

Z =

52 H

Glucuronic Acid

OH L-Rhamnose

D-GlucoseOAc

OAcO

OHO

OAc

OAcO

49 50

OAc

Z =

52 H

Glucuronic Acid

OH L-Rhamnose

D-GlucoseOAc

OAcO

Tig

Cin

Tig

Cin

Tig

Cin

OAc

Tig

Cin

Tig

Cin

Tig

Cin

OAc

O O

OAc

OAcO

OTig

OAc

O O

OAc

OAcO

OTig

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2.3.2.7 Grupo B-seco: os compostos deste grupo, como o próprio

nome diz, contém um anel B-seco.

2.3.2.8 Grupo Azedarachina: grupo formado por limonóides tendo o

esqueleto triterpenico intacto, considerado como um grupo derivado do grupo

meldenino (48 – 55), porém, apresentando diversas oxidações.

2.3.2.9 Grupo Meliatoxina: as meliatoxinas se diferenciam das

azedarachinas por apresentarem o C-2 oxidado. As meliatoxinas são consideradas

tóxicas para os animais e para o homem [17].

AcO

O O

OAc

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)

OAc H

OAc

80 OAc

COCH(CH

)

COCH(CH

)

COCH(CH

)CH

AcO

O O

OH H

OAc

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)

OAc

AcO

O O

OAc

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)

OAc H

OAc

80 OAc

COCH(CH

)

COCH(CH

)

COCH(CH

)CH

AcO

O O

OH H

OAc

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)

OAc

AcO

O O

OAc

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)

OAc H

OAc

80 OAc

COCH(CH

)

COCH(CH

)

COCH(CH

)CH

AcO

O O

OH H

OAc

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)

OAc

AcO

COCH(CH

)

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)

COCH(CH

)CH

AcO

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)

COCH(CH

)

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)

COCH(CH

)CH

AcO

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)

COOCH

AcO

OAc

COOMe

COOCH

AcO

OAc

COOMe

COOCH

AcO

OAc

COOMe

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2.3.2.10 Grupo C-seco: os compostos deste grupo apresentam um

anel C-seco sendo seu principal representante a salannina (108).

2.3.2.11 Grupo Nimbolinina: grupo de limonóides C-seco sem a ponte

éter entre C-7/C-15 o que possibilita uma adição nucleofílica em C-12 formando um

anel de 7 membros.

AcO

OAc

MeO

CHO

OTig

OAc

106

107

MeO

108

109

Tig

OAc

110

111

Cin

OAc

Tig

AcO

OHC

OBz

112

MeO

OTig

AcO

113

114

AcO

OAc

MeO

CHO

OTig

OAc

106

107

MeO

108

109

Tig

OAc

110

111

Cin

OAc

Tig

AcO

OHC

OBz

112

MeO

OTig

AcO

113

114

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)

100

101

102

103

104

105 Ac Ac Ac Ac

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)

COCH(CH

)

COCH(CH

)

COCH(CH

)

20 21

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)

100

101

102

103

104

105 Ac Ac Ac Ac

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)CH

COCH(CH

)

COCH(CH

)

COCH(CH

)

COCH(CH

)

20 21

COCH(CH

)

124

125

126

127

Tig

115

116

117

118

119

120 H Tig

Tig

Cin

121 Me

Tig

122 Me Cin

123 Me H Bz

Tig

128

129

130

131

132

Tig

133

COCH(CH

)CH

Tig

COCH(CH

)

AcO

MeO

134

AcO

OAc

OTig

135

COCH(CH

)

X =

AcO

OTig

OAc

AcO

15 16

COCH(CH

)

124

125

126

127

Tig

115

116

117

118

119

120 H Tig

Tig

Cin

121 Me

Tig

122 Me Cin

123 Me H Bz

Tig

128

129

130

131

132

Tig

133

COCH(CH

)CH

Tig

COCH(CH

)

AcO

MeO

134

AcO

OAc

OTig

135

COCH(CH

)

X =

AcO

OTig

OAc

AcO

15 16

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2.3.2.12 Grupo Meliacarpina: forma este grupos limonóides C-seco

com variadas modificações no esqueleto triterpênico e diversos grupos funcionais se

diferenciando dos compostos do grupo azadirachtina do gênero Azadirachta (pg. 34)

principalmente por não possuírem o grupo carboximetila em C-29. Apesar de alguns

autores citarem a presença da azadirachtina A em Melia [15,16], neste levantamento

nenhum autor demonstrou o isolamento e a determinação estrutural da azadirachtina

quanto de compostos com esqueleto similares contendo o grupo carboximetila em

C-29 no gênero Melia, de maneira que não foi incluso na proposta de biogênese

para este gênero (Figura 2.6, pg. 24) o grupo azadirachtina.

2.3.2.13 Grupo Meliacarpina e Azadirachtinina: os compostos deste

grupo são meliacarpinas rearranjadas através da formação de uma ponte éter entre

C-7/C-13 pela abertura do epóxido C-13/C-14. Somente o composto 142 apresenta

o grupo carboximetila em C-29.

AcO

OTIg

MeOOC

OMe

MeOOC

142

143

144

145

146

147

148

149

OTig

OAc

OCin

Tig

OMe

MeOOC

OMe

MeOOC

OAc

150

151

Tig Ac

Ac Tig

AcO

OTIg

MeOOC

OMe

MeOOC

142

143

144

145

146

147

148

149

OTig

OAc

OCin

Tig

OMe

MeOOC

OMe

MeOOC

OAc

150

151

Tig Ac

Ac Tig

O OH

MeOOC

CinO

136

137

138

Cin

139 Fer

Methacrilila

140 H

HO OH

CinO

141

29 29

O OH

MeOOC

CinO

136

137

138

Cin

139 Fer

Methacrilila

140 H

HO OH

CinO

141

O OH

MeOOC

CinO

136

137

138

Cin

139 Fer

Methacrilila

140 H

HO OH

CinO

141

29 29

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Tabela 2.2 – Cicloartanos, esteróides, protolimonóides, apo-protolimonóides e

limonóides isolados do gênero Melia.

Nome comum e/ou IUPAC

Origem

Ref.

Cicloartanos/esteróides

01 Cicloeucalenol

M. azedarach 08, 30

02 Cicloeucalenono

M. azedarach 30

03 24-Metileno Cicloartanono

M. azedarach 30

04 Z-Volkendousina

M. volkensii – casca da raiz 117

05 E-Volkendousina

M. volkensii – casca da raiz 117

06 Toosendansterol A

M. toosendan – folhas 122

07 Toosendansterol B

M. toosendan – folhas 122

08 Toosendanosido

M. toosendan – folhas 123

09 Azedarachol

M. azedarach – casca da raíz 124

β-Sitosterol

M. azedarach – raiz 30, 34, 35

Protolimonóides

11 Kulonato (Metil Kulonato)

M. azedarach

M. volkensii – sementes

29, 125, 126

12 Kulinono

M. dubia – casca do galho 126

13 16-Hidroxibutirospermol

M. dubia – casca do galho 126

14 Kulinono

M. azedarach 29

15 Meliastatina 1

M. dubia – casca do galho 126

16 Meliastatina 2

M. dubia – casca do galho 126

17 Meliastatina 3

M. dubia – casca do galho 126

18 Meliastatina 4

M. dubia – casca do galho 126

19 Meliastatina 5

M. dubia – casca do galho 126

20 Kulactono

M. azedarach 08, 29, 41

6β-Hidroxi-Kulactono

M. azedarach – raíz

M. volkensii – sementes

41, 34, 97, 125

22 Cinamodiol

M. azedarach – sementes 29, 41,127

23 Kulolactono

M. azedarach 29, 41

12β-Hidroxi-Kulactono

M. volkensii – sementes 125

25 Sendanolactono

M. azedarach – raiz 29, 34, 41

2α-Hidroxi-3β-metoxi-6-oxo-13α,14β,17α-

lanosta-7,24-dien-21,16β-olido

M. azedarach – raiz 34

27 Melianol

28 Lipomelianol

n = 10 -O-stearoil

12 -O-palmitoil

14 -O-myristoil

16 -O-lauroil

M. toosendan – frutos 128

29 Melianono

M. azedarach – frutos 08, 29, 39, 59, 128

30 Melianol

M. azedarach 29

31 3-Desoximelianono

M. azedarach 29

32 Meliantriol

A. indica – folhas e óleo

M. azedarach

08, 29, 39

33 3-Episapelina A

M. volkensii – casca raiz 129

34 Dubiono A

M. dubia – casca do galho 126

35 Dubiono B

M. dubia – cascado galho 126

Apo-protoimonóides

36 21-O-Acetil-toosendantriol

M. toosendan – frutos 30, 130

37 Meliavolkenina

M. volkensii – casca raiz 131

38 21-O-Metiltoosendanpentol

M. toosendan – frutos 130

39 Melianina A

M. azedarach

M. composita

M. volkensii – casca da raiz

29, 30, 129, 132

40 Meliavolina

M. volkensii – casca da raiz 132

41 Meliavolkensina A

M. volkensii – casca da raiz 133

42 Meliavolkensina B

M. volkensii – casca da raiz 133

43 Meliavolena

M. volkensii – casca da raiz 129

44 Melianinono

M. volkensii – casca da raiz 129

45 Melianina B

M. volkensii – casca da raiz 29, 30, 75

46 Melianina C

M. volkensii – casca da raiz 75

47 Azadiradionolido

M. toosendan – casca da raiz 54, 55

Limonóides

48 Meldenina

M. azadirachta 08, 29, 52, 60

49 Azadiradiono

M. azedarach 08, 15, 29, 33, 37, 39,

60- 66

50 Acetiltrichilenono – Acetato Trichilenono

M. toosendan – casca da raíz 46, 55

6-Acetoxi-7α-hidroxi-3-oxo-14β,15β-

epoxymeliace-1,5-dieno

M. azedarach – raíz 39, 134

52 Azecina 3

M. azedarach – raiz 135

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6-Acetoxi-3α-hidroxi-7-oxo-14β,15β-

epoximeliac-1,5-dieno-3-O-D-

glucuranopiranoside

M. azedarach – raiz 39, 134

6-Acetoxi-11α-hidroxi-7-oxo-14β,15β-

epoximeliacin-1,5-dieno-3-O-α-L-

rhamnopiranosido

M. azedarach – sementes 136

6,11-Diacetoxi-7-oxo-14β,15β-epoximeliacin-

1,5-dieno-3-O-β-D-glucopiranosido

M. azedarach – sementes 137

56 1,3-Diacetilvilasinina

M. volkensii – casca da raiz 08, 30, 33, 39, 48, 75

57 Trichilinina C

M. toosendan – casca da raiz 39, 55, 76

58 Trichilinina B (1-tigloil-3-acetilvilasinina)

M. volkensii – casca da raiz 08, 39, 55, 76

59 Meliavolkinina

M. volkensii – casca da raiz 76

60 Meliavolkina

M. volkensii – casca da raiz 132

61 Nimbolina A

(1,3-Diacetil-7-cinnamoilvilasinina)

M. azedarach 08, 29, 60

62 1,7-Ditigloil-3-acetilvilasinina

M. composita - raiz 08, 99, 138

63 Trichilinina D

M. toosendan – frutos 55, 139, 140

64 1-O-Cinnamoiltrichilinina

M. volkensii – frutos

M. toosendan – frutos

139, 140

65 Trichilinina E

M. toosendan – frutos 55, 139, 140

66 Gedunina

M. azedarach 04, 08, 15, 29, 30, 33,

39, 62, 60, 66, 73

67 Oxogedinina (7-desacetil-7-oxogedunina)

M. azedarach – raiz 30, 59, 60, 141

68 Azecina 4

M. azedarach – raiz 135

7α-Acetoxi-14β,15β-epoxi-gedunan-1-eno-3-

O-β-D-glucopiranosido

M. azedarach – casca do caule 142

70 Não nomeado

Melia azedarach – frutos 143

71 Azecina 1

M. azedarach – raiz 135

72 Metil angolensato

M. azedarach – raiz 30, 58, 141

73 Azedarachina C

M. azedarach – casca raiz 95, 96, 144

74 12-hidroxiamoorastatina

(12-desacetil toosendanina)

M. azedarach e M. toosendan – casca do

caule, casca raiz, frutos

55, 59, 67, 95, 145-

148

75 Sendanina (29(S)-OAc)

M. azedarach 29, 59, 60, 95, 149

76 Azedarachina A

M. azedarach – casca da raiz

M. toosendan – casca do caule e da raiz

55, 95, 96, 144, 149,

150-152

77 Azedarachina B

M. azedarach

M. toosendan – casca do caule e da raiz

55, 148, 150

78 Toosendanina (28-deacetilsendanina/12-

acetoxiamoorastatina)

M. azedarach e M. toosendan – casca do

caule e da raiz e frutos

M. dubia

29, 55, 95, 140, 145,

147, 148, 153-155

79 12-O-Acetilazedarachina A

M. azedarach – casca da raiz

M. toosendan – casca do caule e da raiz

55, 95, 96, 144, 148,

149

80 12-O-Acetilazedarachina B

M. azedarach – casca da raiz

M. toosendan – casca do caule e da raiz

95, 96, 144, 145, 149,

151, 152, 154

81 Meliartenina

M. azedarach – frutos 146

82 Neoazedarachina A

M. toosendan – casca da raiz 55, 150

83 Neoazedarachina D

M. toosendan – casca da raiz 55, 150

84 Neoazedarachina B

M. toosendan – casca da raiz 55, 150

85 12-Hidroxiamoorastatono

M. azedarach – casca do caule

M. toosendan – casca da raíz

55, 147, 150

86 12-Acetato-iso-chuanliansu

M. toosendan – casca da raíz 55, 150

87 Toosendanal

M. toosendan – frutos 140, 154

88 Meliatoxina A

M. azedarach – frutos, casca da raiz 95, 96, 149, 156, 157

89 Meliatoxina A

(Trichilina D)

M. azedarach – frutos, casca da raiz 95, 96, 146, 149, 156,

157

90 Trichilina J

M. azedarach – casca do caule

M. toosendan – casca do caule e da raiz

55, 95, 151, 152

91 Trichilina K

M. toosendan – casca do caule e da raiz 55, 95, 152

92 Trichilina L

M. toosendan – casca do caule e da raiz 55, 95, 152

93 Meliatoxina B

M. azedarach – frutos

M. toosendan – frutos

154, 157, 158

94 Meliatoxina B

M. azedarach – frutos 157

95 12-Desacetiltrichilina I

M. azedarach – casca da raiz 158

96 Trichilina B

M. azedarach – casca da raiz

M. toosendan – casca da raiz

95, 96, 146, 148, 149,

157

97 Aphanastatin

M. azedarach – casca da raiz 59, 95, 96, 146

98 3-Desacetiltrichilina H

M. azedarach – casca da raiz 158

99 Trichilina I

M. azedarach – casca do caule

M. toosendan – casca do caule e da raiz

55, 95, 151, 152

100 1-Acetil-3-desacetiltrichilina H

M. azedarach – casca da raiz 158

101 Trichilina H

M. azedarach – casca da raiz

M. toosendan – casca da raiz e do caule,

frutos

55, 95, 96, 146, 149,

150, 158, 154

102 12-O-Acetil-trichilina B

M. azedarach – casca da raiz 95, 96, 146, 149

103 1-Acetil-2-desacetiltrichilina H

M. azedarach – casca da raiz 158

104 1-Acetiltrichilina H

M. azedarach – casca da raiz

M. toosendan – casca da raiz e do caule

55, 150, 151, 158,

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105 1,12-Di-O-acetiltrichilina B

M. azedarach – casca da raiz 95, 96, 146, 149, 158

106 Salannal

M. azedarach – casca da raiz 94, 97, 159

107 3-O-Acetilohchinolal

M. toosendan – casca da raiz 55, 94, 160

108 Salannina

M. azedarach – casca da raiz

M. toosendan

M. volkensii

M. dubia

02, 08,38, 39, 55, 58,

62, 63, 66, 72, 73, 76,

77, 80-82, 84, 89, 79,

90, 91, 93-99

109 3-Desacetilsalannina

M. azedarach – casca raiz 02, 08, 29, 39, 62, 66,

72, 73, 82, 84, 93, 97

110 Ohchinina

M. azedarach – frutos 08, 67, 94

111 Acetato Ohchinina

M. azedarach – frutos 29, 60, 93, 94

112 Ochinal

M. azedarach – frutos 79

113 Salannimolido

M. dubia – sementes 02, 08, 80, 88

114 Volkensinina

M. volkensinin – casca da raiz 161

115 1-Desacetilnimbolinina B

M. toosendan - frutos 55, 139, 140

116 1-Desacetilnimbolinina A

M. azedarach

M. toosendan – frutos

55, 139

117 Nimbolinina B

M. azedarach – frutos, casca raiz

M. toosendan - frutos

08, 29, 60, 96-98,

129, 139, 140

118 Nimbolinina A

M. toosendan – frutos 55, 140

119 1,3-Diacetil-7-cinnamoil-nimbolinina

(Nimbolina B)

M. azedarach 08, 29, 30, 60

120 Volkensina

M. volkensii – frutos 98

121 12-O-metilvolkensina

M. toosendan – frutos 140, 154

122 Nimbolinina C

M. toosendan – frutos 140

123 Nimbolinina D

M. toosendan – frutos 140

124 Azecina 2

M. azedarach – raíz 135

125 Ohchinolido B

A. indica – frutos

M. toosendan – frutos, casca da raiz

08, 29, 55, 60

126 Ohchinolido A

M. azedarach – frutos 08, 29, 60, 97

127 Ohchinolido C

M. toosendan – casca raiz 55, 98, 160

128 Nimbolidina B

M. azedarach – frutos, casca da raíz

M. toosendan – casca do caule e da raíz

08, 29, 55, 60, 76, 95,

97, 162

129 Nimbolidina A

M. azedarach – frutos 08, 29, 60

130 Nimbolidina C

M. toosendan – casca do caule e da raíz 95, 55, 76, 162

131 Nimbolidina D

M. toosendan – casca do caule e da raíz 95, 55, 148, 162

132 Nimbolidina E

M. toosendan – casca do caule e da raíz 95, 55, 76, 162

133 Nimbolidina F

M. toosendan – casca da raiz 55, 160

134 Melianolido

M. azedarach – casca da raiz 97

135 Spirosendana

M. toosendan – casca da raiz 55, 139, 163

136 1-Cinnamoil-3-acetil-11-hidroximeliacarpina

M. azedarach – folhas 164

137 1,3-Dicinnamoil-11-hidroximeliacarpina

M. azedarach – folhas 164

138 1-Cinnamoil-3-metacrilila-11-

hidroximeliacarpina

M. azedarach – folhas 164

139 1-Cinnamoil-3-feruloil-11-hidroximeliacarpina

M. azedarach – frutos 39, 107, 164

140 1-Cinnamoil-3,11-diidroximeliacarpina

Melia azedarach – fohas 215

141 1-Cinnamoil melianolono

M. azedarach – frutos 41

142 1-Tigloil-3-acetil-11-metoxiazadirachtinina

1-Tigloil-11-metoxi-3-acetilmeliacarpinina

M. azedarach – casca do caule, frutos,

raiz

08, 16, 25, 38, 39, 96,

166

143 Meliacarpinina D

M. azedarach – casca da raiz

M. toosendan – casca da raiz

55, 96, 145, 148

144 Meliacarpinina C

M. azedarach – casca da raiz

M. toosendan – casca da raiz

55, 96, 145, 148, 159

145 Meliacarpinina E

M. azedarach – casca da raiz 159

146 1-Cinnamoil-3-hidroxi-11-

metoximeliacarpinina

M. azedarach – casca da raiz 167

147 Meliacarpinina A (1-Cinnamoil-3-acetil-11-

metoximeliacarpinina)

M. azedarach – casca da raiz e do caule

M. toosendan – casca da raiz

55, 95, 96, 148, 166,

167

148 Meliacarpinina B

M. azedarach – casca da raiz 16, 95, 96

149 1-Desoxi-3-3metacrilila-11-

metoximeliacarpinina

M. azedarach – casca da raiz 167

150 1-Tigloil-3,20-diacetil-11-

metoximeliacarpinina

M. azedarach – casca da raiz 167

151 3-Tigloil-1,20-diacetil-11-

metoximeliacarpinina

M. azedarach – casca da raiz 167

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2.4 Procedimentos Experimentais

2.4.1 Equipamentos

Moinhos:

q Mionho TECNAL TE-631

q Moinho de facas Willey

Estufas:

q Estufa de ar circulante

Evaporadores:

q Büchi modelo rotavapor R

q Evaporador rotativo TECNAL (T120)

q Liofilizador – E.C. Modulyo – Pump Savant VBLP 80

Espectrofotômetro de Infravermelho:

q Bomem – FT/IR

Espectrômetros de RMN:

q Brüker DRX 400MHz (9,4 Tesla) usando TMS como padrão interno

q Brüker DRX 00MHz (4,7 Tesla) usando TMS como padrão interno

Espectrômetros de Massas:

q GC/MS VG Platform II

q Micromass Quattro LC

Equipamentos de HPLC:

q Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência Reciclante – Shimadzu LC-8A

equipado com válvula de injeção Rheodyne 7725i, alça de amostragem de

500 e 2000 µL, bomba Shumadzu LC-8A e detector de UV/Vis Shimadzu SPD

6AV

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q Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência Reciclante – Shimadzu SCL-10Avp

equipado com válvula de injeção Rheodyne 7725i, alça de amostragem de

200, 500 e 2000 µL, bomba Shimadzu LC-6AD, e detector de UV-Vis

Shimadzu SPD-10Avvp e detector Índice de Refração Shimadzu RID-10A

2.4.2 Métodos Cromatográficos

No monitoramento do trabalho assim como no fracionamento dos

extratos e frações foram utilizados os seguintes métodos cromatográficos:

q Cromatofolha MERCK: Sílica gel F

254

20x20cm (CCDA)

q Cromatografia em coluna (CC): Sílica gel 70 – 230 µm

q Cromatografia em coluna tipo “flash”: Sílica gel 230 – 400 µm

q Cromatografia em coluna: Florisil

(Mg

SiO

)

q Cromatografia em coluna: celulose microcristalina

q Cromatografia em coluna: Sephadex-LH20

q Cromatografia em camada delgada preparativa: Sílica gel 60 GF

254

– MERCK

(20X20 cm)

q Cromatografia líquida de Alta Eficiência – Preparativa

q Cromatografia líquida de Alta Eficiência – Semi-analítica

2.4.3 Reveladores

q Solução de vanilina

q Câmara de luz (λ = 254 nm e 365 nm)

2.4.4 Solventes

q Solventes comerciais destilados no DQ-UFSCar

q Solventes destilados grau P.A. e em grau HPLC Merck, Synth e J.T. Becker

q Solventes deuterados Acros e Fluka (CDCl

, Acetona e MeOD)

2.4.5 Material Botânico

Um enxerto completo desde raiz, tronco, galhos e folhas entre

Azadirachta indica e Melia azedarach foi coletada na Estação Experimental do

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Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR), localizada no município de Xambrê-PR-Br,

no mês de abril de 2002.

2.4.6 Preparo dos Extratos

A planta logo após a coleta foi dividida em diversas partes,

empacotada e encaminhada para o Laboratório da Química de Produtos Naturais da

UFSCar. Os brotos terminais das folhas foram armazenados sob gelo para a análise

de óleo essencial. O enxerto foi dividido em folhas, galhos, troncos, enxerto, colo da

raiz, raízes laterais e ápice da raiz. Com exceção das folhas e do ápice da raiz, foi

retirada a casca das demais divisões da planta para estudo fitoquímico. Todas as

partes foram secas em estufa de ar circulante a 40 ºC por 10 dias, trituradas após

este período, em um moinho tipo Willey. Cada divisão e seus respectivos extratos

preparados encontram-se ilustrados na Tabela 2.3.

Tabela 2.3 – Divisão do enxerto e os extratos obtidos.

Órgão da Planta Código Descrição Extratos

Folhas F4 H, D, M, HM

Galhos menores (ramos

finos)

C3C

C3P

Casca

Cerne

H, D, M, HM

Galhos maiores C2C

C2P

Casca

Cerne

Tronco C1C

C1P

Casca

Cerne

H, D, M, HM

Tronco logo acima do enxerto CiC

CiP

Casca

Cerne

H, D, M, HM

Parte superior do enxerto ECC

ECP

Casca

Cerne

Parte inferior do enxerto ERC

ERP

Casca

Cerne

Raiz logo abaixo do enxerto

(tronco)

RiC

RiP

Casca

Cerne

Parte superior do colo da raiz R1C

R1P

Casca

Cerne

Parte inferior do colo da raiz R2C

R2P

Casca

Cerne

H, D, M, HM

Raízes laterais R3C

R3P

Casca

Cerne

H, D, M, HM

Ápice da raiz R4 H, D, M, HM

H, extrato hexânico; D, extrato diclorometano; M, extrato metanólico, HM, extrato

hidrometanólico.

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Os extratos foram obtidos através da maceração do material moído em

solventes orgânicos, em ordem crescente de polaridade [Hexano (H), Diclorometano

(DCM), Metanol (MeOH) e Hidrometanólico (HM)]. Os extratos foram preparados

como mostra a Figura 2.7.

Figura 2.7 – Esquema de preparo dos extratos.

O material orgânico foi macerado por três dias em cada solvente por

três vezes seguidas, sendo os extratos concentrados em evaporador rotativo. Foi

obtido um total de 58 extratos. Além dos extratos do enxerto descritos, foram

preparados diversos extratos da semente de Azadirachta indica não enxertada

utilizados para o desenvolvimento da metodologia de quantificação de azadirachtina

2.4.7 Fracionamento dos Extratos

2.4.7.1 Fracionamento dos Extratos das Folhas (F4)

Extrato Hexano e DCM:

Os extratos das folhas, foram preparados a partir de 2.296 g do

material seco e triturado. Os extratos hexânico (F4H) e diclorometano (F4D) após

serem preparados, foram comparados por CCD e agrupados visto que os mesmos

Material Vegetal

Percolação com

Solvente por 72 hrs

Filtração

Concentração

do solvente

Obtenção do

extrato

Torta

Material Vegetal

Percolação com

Solvente por 72 hrs

Filtração

Concentração

do solvente

Obtenção do

extrato

Torta

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apresentavam semelhantes manchas de retenção (R

). Destes extratos, após serem

agrupados (fornecendo o extrato F4HD), uma massa de 70 g foi submetida a uma

coluna filtrante, de diâmetro interno (φ) de 6 cm e 25 cm de altura (h), utilizando

sílica gel 70-230 µm, eluída com: hexano, DCM, AcOEt e MeOH, fornecendo 4

novas frações, F4HD-H, F4HD-D, F4HD-AE e F4DH-M respectivamente.

As frações F4HD-D e F4HD-AE foram submetidas a diversos

refracionamentos por CC e por HPLC como mostrado nas Figuras 2.8 e 2.9. Foi

coletado um volume de 35 mL para cada fração. A escolha da fração a ser

trabalhada era realizada por uma análise inicial por RMN e CCDA. Assim, os

espectros referentes às frações, apresentavam indícios se era ou não viável

prosseguir o refracionamento da fração. As frações foram agrupadas após

comparadas por CCDA.

Figura 2.8 – Esquema do fracionamento cromatográfico do extrato F4HD-D e de

suas frações.

Sílica (230-400 µm)

φ = 3,8 cm, h = 30 cm

Hex/Acetona/MeOH (8:2:0,1)

Sílica (230-400 µm)

φ = 3,6 cm, h = 25 cm

Hex/DCM/MeOH (6:4:0,5)

Sílica (230-400 µm)/Florisil

(1:1)

φ = 4,6 cm, h = 34 cm

Hex/AcOEt (9:1),(7:3),(1:1);

AcOEt; AcOEt/MeOH (1:1); MeOH

72 frações

F4HD-D

27- 30 31 - 32 33 - 35

36 - 38

46-61

12,9 g

627 mg

31-32/ 29

Sílica (230-400 µm)

φ = 1,8 cm, h = 15 cm

DCM;DCM/AcOEt (8:2);(6:4)

DCM/AcOEt/MeOH (5:4:1),(5:2:3);MeOH.

29,9 mg

HPLC-Preparativa

Coluna sílica Shimadzu

(250x25mm, 15 µm)

Hex/iso-PrOH (8:2)

V = 9 ml/min, λ=217 nm

6 frações

10 frações

310 mg

42 frações

33–35/110

73 mg

Sílica (230-400 µm)

φ = 2,2 cm, h = 20 cm

Hex/DCM/Acetona (6:3:1)

108 mg

Sílica (230-400 µm)

φ = 3,6 cm, h = 19 cm

Hex/Acetona (7:3)

110 frações

Sílica (230-400 µm)

φ = 3,8 cm, h = 24 cm

Hex/AcOEt (8:2),(7:3),

(6:4),(1:1); AcOEt;

AcOEt/MeOH (9:1);MeOH

204 mg

39-45

156 mg

57 frações

Sílica (230-400 µm)

φ = 3,6 cm, h = 25 cm

Hex/DCM/MeOH (8:1,8:025)

36-38. 8

30 mg

Sílica (230-400 µm)

φ = 1,8 cm, h = 15 cm

DCM

16 frações

36-38/1-7 36-38/9-16

33–35/1-109

31-32/1-28

31-32/30-53

62-72

Sílica (230-400 µm)

φ = 3,8 cm, h = 30 cm

Hex/Acetona/MeOH (8:2:0,1)

Sílica (230-400 µm)

φ = 3,6 cm, h = 25 cm

Hex/DCM/MeOH (6:4:0,5)

Sílica (230-400 µm)/Florisil

(1:1)

φ = 4,6 cm, h = 34 cm

Hex/AcOEt (9:1),(7:3),(1:1);

AcOEt; AcOEt/MeOH (1:1); MeOH

72 frações

F4HD-D

27- 30 31 - 32 33 - 35

36 - 38

46-61

12,9 g

627 mg

31-32/ 29

Sílica (230-400 µm)

φ = 1,8 cm, h = 15 cm

DCM;DCM/AcOEt (8:2);(6:4)

DCM/AcOEt/MeOH (5:4:1),(5:2:3);MeOH.

29,9 mg

HPLC-Preparativa

Coluna sílica Shimadzu

(250x25mm, 15 µm)

Hex/iso-PrOH (8:2)

V = 9 ml/min, λ=217 nm

6 frações

10 frações

310 mg

42 frações

33–35/110

73 mg

Sílica (230-400 µm)

φ = 2,2 cm, h = 20 cm

Hex/DCM/Acetona (6:3:1)

108 mg

Sílica (230-400 µm)

φ = 3,6 cm, h = 19 cm

Hex/Acetona (7:3)

110 frações

Sílica (230-400 µm)

φ = 3,8 cm, h = 24 cm

Hex/AcOEt (8:2),(7:3),

(6:4),(1:1); AcOEt;

AcOEt/MeOH (9:1);MeOH

204 mg

39-45

156 mg

57 frações

Sílica (230-400 µm)

φ = 3,6 cm, h = 25 cm

Hex/DCM/MeOH (8:1,8:025)

36-38. 8

30 mg

Sílica (230-400 µm)

φ = 1,8 cm, h = 15 cm

DCM

16 frações

36-38/1-7 36-38/9-16

33–35/1-109

31-32/1-28

31-32/30-53

62-72

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Figura 2.9 – Esquema do fracionamento cromatográfico do extrato F4HD-AE e de

suas frações.

Nos sucessivos fracionamentos do extrato F4HD-D detectou-se a

presença de esteróides, ácidos graxos e o limonóide Nimbolido (substância 01).

Sílica (230-400 µm)

φ= 3,6 cm, h = 26 cm

Hex/Acetona (8:2)

Sílica (230-400 µm)

φ = 1,6 cm, h = 16 cm

Hex/Acetona/MeOH (8:2:0,1)

Sílica (230-400 µm)

φ= 4,6 cm, h = 34 cm

Hex/AcOEt (9:1),(7:3),(1:1);

AcOEt; AcOEt/MeOH (9:1); MeOH

F4HD-AE

12,0 g

507 mg

403 mg

HPLC-Preparativa

Coluna ODS Shimadzu

(250x22,5mm, 10 µm)

O:ACN:THF (6,5:3,5:2,5)

V = 5 ml/min.

6/1

6.2

6/3-7

315 mg

8 frações

1-5 7-8

Sílica (230-400 µm)/

Florisil

(1:1)

φ= 3,8 cm, h = 50 cm

Hex/Acetona (9:1),(7:3);

MeOH

6 frações

10-13

641 mg

Sephadex-LH20

φ= 3,0 cm, h = 37 cm

MeOH

20 frações

812 mg

Sílica (230-400 µm)/

Florisil

(1:1)

φ = 3,6 cm, h = 24 cm

Hex/Acetona (9:1),(8:2),(1:1);

Acetona; MeOH

15/1-7

15/8

15/9-16

15/17

15/18-19

18-21

23 mg

Sephadex-LH20

φ= 1,8 cm, h = 59 cm

DCM:MeOH (1:1)

6 frações

34,4 mg

Sephadex-LH20

φ = 1,8 cm, h = 59 cm

MeOH

11 frações

13 mg

Cristalizada

com AcOEt

Substância 01

11 mg

1,13 g

Sílica (230-400 µm)/

Florisil

(1:1)

φ= 3,0 cm, h = 16 cm

Hex/DCM/MeOH (3:3,8:0,2)

17/10

30 mg

17/6-9

7 frações

Sílica (230-400 µm)

φ = 1,8 cm, h = 15 cm

DCM/Acetona/MeOH (9,5:0,5:1)

17/1-4

17/5

20 mg

8 frações

Sílica (230-400 µm)

φ= 3,6 cm, h = 26 cm

Hex/Acetona (8:2)

Sílica (230-400 µm)

φ = 1,6 cm, h = 16 cm

Hex/Acetona/MeOH (8:2:0,1)

Sílica (230-400 µm)

φ= 4,6 cm, h = 34 cm

Hex/AcOEt (9:1),(7:3),(1:1);

AcOEt; AcOEt/MeOH (9:1); MeOH

F4HD-AE

12,0 g

507 mg

403 mg

HPLC-Preparativa

Coluna ODS Shimadzu

(250x22,5mm, 10 µm)

O:ACN:THF (6,5:3,5:2,5)

V = 5 ml/min.

6/1

6.2

6/3-7

315 mg

8 frações

1-5 7-8

Sílica (230-400 µm)/

Florisil

(1:1)

φ= 3,8 cm, h = 50 cm

Hex/Acetona (9:1),(7:3);

MeOH

6 frações

10-13

641 mg

Sephadex-LH20

φ= 3,0 cm, h = 37 cm

MeOH

20 frações

812 mg

Sílica (230-400 µm)/

Florisil

(1:1)

φ = 3,6 cm, h = 24 cm

Hex/Acetona (9:1),(8:2),(1:1);

Acetona; MeOH

15/1-7

15/8

15/9-16

15/17

15/18-19

18-21

23 mg

Sephadex-LH20

φ= 1,8 cm, h = 59 cm

DCM:MeOH (1:1)

6 frações

34,4 mg

Sephadex-LH20

φ = 1,8 cm, h = 59 cm

MeOH

11 frações

13 mg

Cristalizada

com AcOEt

Substância 01

11 mg

1,13 g

Sílica (230-400 µm)/

Florisil

(1:1)

φ= 3,0 cm, h = 16 cm

Hex/DCM/MeOH (3:3,8:0,2)

17/10

30 mg

17/6-9

7 frações

Sílica (230-400 µm)

φ = 1,8 cm, h = 15 cm

DCM/Acetona/MeOH (9,5:0,5:1)

17/1-4

17/5

20 mg

8 frações

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Extrato Metanólico:

O extrato metanólico das folhas (F4M, 182 g) foi submetido a um

fracionamento por Extração Líquido-Líquido fornecendo quatro novas frações: F4M-

D, F4M-AE, F4M-B E F4M-Aq conforme ilustrado na Figura 2.10. Uma vez concluída

a ELL, as frações F4M-D, F4M-AE, F4M-B foram submetidas à refracionamentos por

cromatografia em coluna. Estes refracionamentos podem ser observados nas

Figuras 2.11 e 2.12. No primeiro fracionamento do extrato F4M-D foi coletado um

volume de 250 mL. Nos refracionamentos seguintes, foram coletados um volume de

35 mL. Deste extrato foi isolado três limonóides, o 28-desoxonimbolido (substância

02), o 6-Desacetilnimbineno (substância 05) e o 6-Desacetilnimbina (substância 07).

Figura 2.10 – Extração Líquido-Líquido do extrato F4M.

Suspensão em MeOH:H

O (1:3)

Extração com DCM

Extração com AcOEt

Extração com n-BuOH

F4M

F4M-D

FRAÇÃO

HIDROALCOÓLICA

F4M-AE

FRAÇÃO

HIDROALCOÓLICA

F4M-Aq

(Fração aquosa)

F4M-B

Suspensão em MeOH:H

O (1:3)

Extração com DCM

Extração com AcOEt

Extração com n-BuOH

F4M

F4M-D

FRAÇÃO

HIDROALCOÓLICA

F4M-AE

FRAÇÃO

HIDROALCOÓLICA

F4M-Aq

(Fração aquosa)

F4M-B

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Figura 2.11 – Esquema do fracionamento cromatográfico do extrato F4M-D e de

suas frações.

Sílica gel (230-400 µm)

φ = 1,4 cm, h = 16 cm

DCM/AcOEt (8:2),(1:1);

DCM/AcOEt/MeOH (7,2:7,8:1);

MeOH

Sílica gel (230-400 µm)/

Florisil

(8:2)

φ = 2,0 cm, h = 10 cm

CF/ACN (9:1),(8:2),(7:3),(1:1);

ACN; ACN/MeOH (9,5:0,5),(9:1),

(8:2),(6:4); MeOH

Sílica (230-400 µm)

φ= 6,0 cm, h = 26 cm

Hex/Acetona/MeOH (9,75:0,25:0,06),(9,5:0,5:0,06),(9:1:0,06),

(9,2:0,8:0,06),(9:1:0,06),(8,5:1,5:0,06),(8:2:0,06),(1:1:0,06);

Acetona/MeOH (1:0,06),(9,5:0,5),(9:1),(1:1);MeOH

F4M-D

1-5 6-9

11 12-13 14 15-16 17-18 19-22

21,1 g

824 mg

(continua)

740 mg

Sephadex-LH20

φ= 3,0 cm

h = 52 cm

MeOH

32 frações

674 mg

ODS

φ= 3,4 cm, h = 26 cm

O/MeOH (7:3),(1:1);

MeOH;

MeOH/ACN (9:1),(7:3);

ACN

11/1-4 11/6-12

11/5

Substância 02

16 mg

697 mg

Sephadex-LH20

φ= 3,0 cm

h = 40 cm

MeOH

14/1-4

14/7-16

14/5

313 mg

Sephadex-LH20

φ= 3,0 cm

h = 40 cm

MeOH

14/5/4-5

112 mg

14/5/1-3 14/5/6-9

Sílica gel (230-400 µm)

φ= 1,4 cm, h = 21 cm

DCM/AcOEt (8:2),(1:1);

DCM/AcOEt/MeOH (7:7:1);

AcOEt/MeOH (8:2); MeOH

14/5/4-5/7-8

55 mg

14/5/4-5/

1-6

14/5/4-5/

9-13

Sílica (230-400 µm)

φ= 1,4 cm, h = 21 cm

Acetona/MeOH (9:1); MeOH

11 frações

14/6

107 mg

14/6/5-6

14/6/1-4 14/6/7-12

18 frações

25 mg

803 mg

Sephadex-LH20

φ = 3,0 cm

h = 62 cm

MeOH

23 frações

Sílica gel (230-400 µm)

φ = 1,4 cm, h = 16 cm

DCM/AcOEt (8:2),(1:1);

DCM/AcOEt/MeOH (7,2:7,8:1);

MeOH

Sílica gel (230-400 µm)/

Florisil

(8:2)

φ = 2,0 cm, h = 10 cm

CF/ACN (9:1),(8:2),(7:3),(1:1);

ACN; ACN/MeOH (9,5:0,5),(9:1),

(8:2),(6:4); MeOH

Sílica (230-400 µm)

φ= 6,0 cm, h = 26 cm

Hex/Acetona/MeOH (9,75:0,25:0,06),(9,5:0,5:0,06),(9:1:0,06),

(9,2:0,8:0,06),(9:1:0,06),(8,5:1,5:0,06),(8:2:0,06),(1:1:0,06);

Acetona/MeOH (1:0,06),(9,5:0,5),(9:1),(1:1);MeOH

F4M-D

1-5 6-9

11 12-13 14 15-16 17-18 19-22

21,1 g

824 mg

(continua)

740 mg

Sephadex-LH20

φ= 3,0 cm

h = 52 cm

MeOH

32 frações

674 mg

ODS

φ= 3,4 cm, h = 26 cm

O/MeOH (7:3),(1:1);

MeOH;

MeOH/ACN (9:1),(7:3);

ACN

11/1-4 11/6-12

11/5

Substância 02

16 mg

697 mg

Sephadex-LH20

φ= 3,0 cm

h = 40 cm

MeOH

14/1-4

14/7-16

14/5

313 mg

Sephadex-LH20

φ= 3,0 cm

h = 40 cm

MeOH

14/5/4-5

112 mg

14/5/1-3 14/5/6-9

Sílica gel (230-400 µm)

φ= 1,4 cm, h = 21 cm

DCM/AcOEt (8:2),(1:1);

DCM/AcOEt/MeOH (7:7:1);

AcOEt/MeOH (8:2); MeOH

14/5/4-5/7-8

55 mg

14/5/4-5/

1-6

14/5/4-5/

9-13

Sílica (230-400 µm)

φ= 1,4 cm, h = 21 cm

Acetona/MeOH (9:1); MeOH

11 frações

14/6

107 mg

14/6/5-6

14/6/1-4 14/6/7-12

18 frações

25 mg

803 mg

Sephadex-LH20

φ = 3,0 cm

h = 62 cm

MeOH

23 frações

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Figura 2.11b – Esquema do fracionamento cromatográfico do extrato F4M-D e de

suas frações - continuação.

CCDP

20x20 cm

Sephadex-LH20

φ= 3,0 cm, h = 62 cm

MeOH

6-9/6-9

341 mg

6-9/1-5

Sephadex-LH20

φ= 1,8 cm

h = 54 cm

MeOH

7 frações

6-9/10

130 mg

Sephadex-LH20

φ= 1,8 cm

h = 54 cm

MeOH

6-9/10/1-2

6-9/10/4-5

6-9/10/3

40 mg

Sílica (230-400 µm)

φ= 1,0 cm, h = 34 cm

Hex/Acetona (9:1),(8:2),(7:3);

Hex/DCM/Acetona (5:4:1);

DCM/Acetona/MeOH (5:4,75:0,25);

Acetona/MeOH (9:1),(7:3); MeOH

6-9/10/3/1-5

6-9/10/3/6

Substância 7

14,5 mg

6-9/10/3/7-9 6-9/10/3/11-26

6-9/10/3/10

16 mg

Sílica (230-400 µm)

φ= 0,8 cm, h = 14 cm

ACN; ACN/MeOH (1:1)

MeOH

6 frações

6-9/11

71 mg

Sephadex-LH20

φ= 1,8 cm

h = 58 cm

MeOH

6-9/11/1-6

6-9/11/7-8

6-9/11/9

6-9/11/10-11

12 frações

50 mg

Sephadex-LH20

φ= 1,8 cm

h = 58 cm

MeOH

10 mg

9 frações

Sílica (230-400 µm)

φ= 1,8 cm, h = 58 cm

Hex/DCM (8:2),(7:3,(1:1);

Acetona;

Acetona/MeOH (9:1);

MeOH

6-9/12 6-9/17-18

6-9/19-226-9/13-16

37 mg

Sephadex-LH20

φ= 1,8 cm

h = 56 cm

MeOH

6-9

824 mg

F4M-D (continuação)

6-9/12/6

17 mg

6-9/12/7-106-9/12/1-5

Sephadex-LH20

φ= 1,8 cm

h = 56 cm

MeOH

11 frações

1,14 g

Sephadex-LH20

φ= 1,8 cm

h = 56 cm

MeOH

6-9/17-18/11

6-9/17-18/15-17

Substância 7

7 mg

Substância 5

1,4 mg

60 mg

6-9/17-18/11/13 6-9/17-18/11/18

6-9/17-18/

11/1-12

6-9/17-18/

11/19-21

6-9/17-18/

11/14-17

Sephadex-LH20

φ= 1,8 cm

h = 45 cm

MeOH/Acetona (1:1)

148 mg

6-9/17-18/

18-30

12 frações

6-9/17-18/

15-17/7-11

51 mg

3 frações

CCDP

20x20 cm

Sephadex-LH20

φ= 3,0 cm, h = 62 cm

MeOH

6-9/6-9

341 mg

6-9/1-5

Sephadex-LH20

φ= 1,8 cm

h = 54 cm

MeOH

7 frações

6-9/10

130 mg

Sephadex-LH20

φ= 1,8 cm

h = 54 cm

MeOH

6-9/10/1-2

6-9/10/4-5

6-9/10/3

40 mg

Sílica (230-400 µm)

φ= 1,0 cm, h = 34 cm

Hex/Acetona (9:1),(8:2),(7:3);

Hex/DCM/Acetona (5:4:1);

DCM/Acetona/MeOH (5:4,75:0,25);

Acetona/MeOH (9:1),(7:3); MeOH

6-9/10/3/1-5

6-9/10/3/6

Substância 7

14,5 mg

6-9/10/3/7-9 6-9/10/3/11-26

6-9/10/3/10

16 mg

Sílica (230-400 µm)

φ= 0,8 cm, h = 14 cm

ACN; ACN/MeOH (1:1)

MeOH

6 frações

6-9/11

71 mg

Sephadex-LH20

φ= 1,8 cm

h = 58 cm

MeOH

6-9/11/1-6

6-9/11/7-8

6-9/11/9

6-9/11/10-11

12 frações

50 mg

Sephadex-LH20

φ= 1,8 cm

h = 58 cm

MeOH

10 mg

9 frações

Sílica (230-400 µm)

φ= 1,8 cm, h = 58 cm

Hex/DCM (8:2),(7:3,(1:1);

Acetona;

Acetona/MeOH (9:1);

MeOH

6-9/12 6-9/17-18

6-9/19-226-9/13-16

37 mg

Sephadex-LH20

φ= 1,8 cm

h = 56 cm

MeOH

6-9

824 mg

F4M-D (continuação)

6-9/12/6

17 mg

6-9/12/7-106-9/12/1-5

Sephadex-LH20

φ= 1,8 cm

h = 56 cm

MeOH

11 frações

1,14 g

Sephadex-LH20

φ= 1,8 cm

h = 56 cm

MeOH

6-9/17-18/11

6-9/17-18/15-17

Substância 7

7 mg

Substância 5

1,4 mg

60 mg

6-9/17-18/11/13 6-9/17-18/11/18

6-9/17-18/

11/1-12

6-9/17-18/

11/19-21

6-9/17-18/

11/14-17

Sephadex-LH20

φ= 1,8 cm

h = 45 cm

MeOH/Acetona (1:1)

148 mg

6-9/17-18/

18-30

12 frações

6-9/17-18/

15-17/7-11

51 mg

3 frações

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No refracionamento da fração F4M-AE foram isolados dois

flavonóides, a quercetina (substância 09) e a quercitrina (substância 10).

Figura 2.12 – Esquema do fracionamento cromatográfico do extrato F4M-AE e F4M-

B e de suas frações.

2.4.7.2 Fracionamento do Extrato dos Galhos Descascados do Enxerto (C2P)

Para o preparo do extrato C2P, utilizou-se uma massa de 1.335 g dos

galhos descascados e triturados. Foi preparado apenas o extrato metanólico,

macerando o material por nove dias sendo o solvente substituído a cada 72 horas.

Cada solvente retirado foi concentrado em rota-evaporador. Foram obtidos 31 g de

Celulose D Microcristalina

φ= 4,6 cm, h = 20 cm

Hex/DCM (9:1),(7,5:2,5),(6:4),(1:1);

DCM; DCM/MeOH (9,5:0,5),(8:2),(6,5:3,5),(1:1),

MeOH

F4M

Partição líquido-líquido

F4M-AE

F4M-B

4,9 g

Sephadex-LH20

φ= 3,0 cm

h = 58 cm

MeOH

230 mg

16 frações

1-9

10-11

12-18

120 mg

Sephadex-LH20

φ= 1,8 cm

h = 58 cm

MeOH

1-7

8 9

10 11

Substância 09

18 mg

26 mg

Sephadex-LH20

φ= 1,8 cm

h = 47 cm

MeOH

18 frações

14,5 mg

HPLC-Preparativo

Coluna Polimérica

φ= 2,5 cm, h = 50 cm

MeOH,

V= 1mL/min.;λ=217 nm.

1-5 6 7-8

Substância 10

4,3 mg

Celulose D Microcristalina

φ= 4,6 cm, h = 20 cm

Hex/DCM (9:1),(7,5:2,5),(6:4),(1:1);

DCM; DCM/MeOH (9,5:0,5),(8:2),(6,5:3,5),(1:1),

MeOH

F4M

Partição líquido-líquido

F4M-AE

F4M-B

4,9 g

Sephadex-LH20

φ= 3,0 cm

h = 58 cm

MeOH

230 mg

16 frações

1-9

10-11

12-18

120 mg

Sephadex-LH20

φ= 1,8 cm

h = 58 cm

MeOH

1-7

8 9

10 11

Substância 09

18 mg

26 mg

Sephadex-LH20

φ= 1,8 cm

h = 47 cm

MeOH

18 frações

14,5 mg

HPLC-Preparativo

Coluna Polimérica

φ= 2,5 cm, h = 50 cm

MeOH,

V= 1mL/min.;λ=217 nm.

1-5 6 7-8

Substância 10

4,3 mg

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extrato, sendo, em seguida, particionado em uma extração líquido-líquido, Figura

2.13. Com a extração, foram obtidas 5 frações: C2P-H (hexano), C2P-D

(diclorometano), C2P-AE (acetato de etila), C2P-B (butanol) e C2P-Aq (fração

aquosa). O Extrato C2P-D foi submetido a refracionamento por cromatografia em

coluna conforme ilustrado na Figura 2.14. Foi coletado um volume de 35 mL para

cada fração. Nesse extrato foram isolados três limonóides, sendo eles: 28-

deoxonimbolido (substância 02), Salannina (substância 03) e o 6-O-Acetilnimbandiol

(substância 04).

Figura 2.13 – Esquema de extração líquido-líquido do extrato C2P.

Suspensão em MeOH:H

O (1:3)

Extração com Hexano

Extração com AcOEt

Extração com n-BuOH

FRAÇÃO

HIDROALCOÓLICA

Extração com DCM

C2P-H

C2P-D

C2P-AE

C2P-B

C2P-Aq

FRAÇÃO

HIDROALCOÓLICA

FRAÇÃO

HIDROALCOÓLICA

C2P

Suspensão em MeOH:H

O (1:3)

Extração com Hexano

Extração com AcOEt

Extração com n-BuOH

FRAÇÃO

HIDROALCOÓLICA

Extração com DCM

C2P-H

C2P-D

C2P-AE

C2P-B

C2P-Aq

FRAÇÃO

HIDROALCOÓLICA

FRAÇÃO

HIDROALCOÓLICA

C2P

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Figura 2.14 – Esquema do fracionamento cromatográfico do extrato C2P e de suas

frações.

2.4.7.3 Fracionamento do Extrato do Cerne da Raiz

Os extratos R2Ps foram preparados pela maceração de 1.180 g de

material seco e triturado em ordem crescente de polaridade obtendo quatro frações:

R2P-H (hexano), R2P-D (diclorometano), R2P-M (metanol) e R2P-HM

Sílica gel (230-400 µm)

φ= 1,0 cm, h = 15 cm

DCM/Acetona/MeOH (9:1:0,2),

(7:3:0,2)(7:3:1);

Acetona/MeOH (9:1),(8:2);

MeOH

Sílica gel (230-400 µm)

φ = 5,0 cm, h = 26 cm

DCM/AcOEt (9:1),(8:2);

DCM/AcOEt/MeOH (7:3:0,2),(6:4:0,5),(5:5:2);

AcOEt/MeOH (8:2),(7:3); MeOH

C2P

6,8 g

1-3

4-5 6-10

11 12-17 18-99

4-5/7-94-5/4

10 frações

9 frações

64 mg

Sephadex-LH20

φ = 1,8 cm

h = 44 cm

MeOH

4-5/104-5/6-74-5/1-3

9 mg 18 mg

Sílica gel (230-400 µm)

φ= 1,0 cm, h = 30 cm

DCM/MeOH (500:6),

DCM/Acetona/MeOH (3:1:0,2),

(3:3:0,5),(1:1:1); MeOH

284 mg

Sephadex-LH20

φ= 3,0 cm

h = 50 cm

MeOH

6-10/6-9

6-10/10-18

6-10/1-5

70 mg

Celulose D Microcristalina

φ = 1,8 cm, h = 28 cm

Hex; Hex/DCM (9:1),(8:2),

(7:3),(1:1);DCM; DCM/MeOH

(9:1),(8:2),(1:1); MeOH

13 frações

361 mg

12-17/1-5

12-17/6-9

12-17/11-13

12-17/10 12-17/14-20

170 mg

Sílica gel (230-400 µm)

φ= 1,8 cm

h = 48 cm

DCM/Acetona (9:1)

DCM/Acetona/MeOH

(8:2:0,5),(7:3:0,5),(1:1:0,5);

Acetona/MeOH(9,5:0,5),(8:2)

MeOH

12-17/6-9/2

85 mg

12-17/6-9/

3-12

Sílica gel (230-400 µm)

φ= 2,0 cm

h = 12 cm

DCM; DCM/Acetona

(9:1),(7:3);

DCM/Acetona/MeOH

(7:3:2);

MeOH

12-17/6-9/2/8

23 mg

1 2-6 7 8-10 11 12-19

HPLC-semi-preparativo

Coluna Phenomenex

fenil-hexil (250x6 mm, 10 µm)

O:ACN (6,5:3,5)

V = 4 mL/min; λ = 217 e 254 nm

Substância 03

7 mg

Substância 04

4,5 mg

Substância 02

2,1 mg

53 mg

28 frações

Celulose D Microcristalina

φ = 2,4 cm, h = 12 cm

Hex; Hex/DCM (9:1),(8:2),

(7:3),(1:1);DCM; DCM/Acet.

(9:1),(7:3),(1:1); Acetona;

Acetona/ MeOH; MeOH

Sílica gel (230-400 µm)

φ= 1,0 cm, h = 15 cm

DCM/Acetona/MeOH (9:1:0,2),

(7:3:0,2)(7:3:1);

Acetona/MeOH (9:1),(8:2);

MeOH

Sílica gel (230-400 µm)

φ = 5,0 cm, h = 26 cm

DCM/AcOEt (9:1),(8:2);

DCM/AcOEt/MeOH (7:3:0,2),(6:4:0,5),(5:5:2);

AcOEt/MeOH (8:2),(7:3); MeOH

C2P

6,8 g

1-3

4-5 6-10

11 12-17 18-99

4-5/7-94-5/4

10 frações

9 frações

64 mg

Sephadex-LH20

φ = 1,8 cm

h = 44 cm

MeOH

4-5/104-5/6-74-5/1-3

9 mg 18 mg

Sílica gel (230-400 µm)

φ= 1,0 cm, h = 30 cm

DCM/MeOH (500:6),

DCM/Acetona/MeOH (3:1:0,2),

(3:3:0,5),(1:1:1); MeOH

284 mg

Sephadex-LH20

φ= 3,0 cm

h = 50 cm

MeOH

6-10/6-9

6-10/10-18

6-10/1-5

70 mg

Celulose D Microcristalina

φ = 1,8 cm, h = 28 cm

Hex; Hex/DCM (9:1),(8:2),

(7:3),(1:1);DCM; DCM/MeOH

(9:1),(8:2),(1:1); MeOH

13 frações

361 mg

12-17/1-5

12-17/6-9

12-17/11-13

12-17/10 12-17/14-20

170 mg

Sílica gel (230-400 µm)

φ= 1,8 cm

h = 48 cm

DCM/Acetona (9:1)

DCM/Acetona/MeOH

(8:2:0,5),(7:3:0,5),(1:1:0,5);

Acetona/MeOH(9,5:0,5),(8:2)

MeOH

12-17/6-9/2

85 mg

12-17/6-9/

3-12

Sílica gel (230-400 µm)

φ= 2,0 cm

h = 12 cm

DCM; DCM/Acetona

(9:1),(7:3);

DCM/Acetona/MeOH

(7:3:2);

MeOH

12-17/6-9/2/8

23 mg

1 2-6 7 8-10 11 12-19

HPLC-semi-preparativo

Coluna Phenomenex

fenil-hexil (250x6 mm, 10 µm)

O:ACN (6,5:3,5)

V = 4 mL/min; λ = 217 e 254 nm

Substância 03

7 mg

Substância 04

4,5 mg

Substância 02

2,1 mg

53 mg

28 frações

Celulose D Microcristalina

φ = 2,4 cm, h = 12 cm

Hex; Hex/DCM (9:1),(8:2),

(7:3),(1:1);DCM; DCM/Acet.

(9:1),(7:3),(1:1); Acetona;

Acetona/ MeOH; MeOH

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R2P

Cerne da Raíz

Preparo dos

extratos

R2P-H R2P-D

4,16 g

15,7 g

Sílica gel (230-400 µm)

φ= 5,0 cm, h = 19 cm

Hex; Hex/DCM (9,5:0,5),

(8,5:1,5); Hex/Acetona (8:2),

(7,5:2,5),(6,5:3,5); Acetona;

Acetona/MeOH (9:1),(7:3);

MeOH

24 frações

Sílica gel (230-400 µm)

φ= 5,0 cm, h = 18 cm

Hex/DCM (9:1),(7:3);(1:1);

DCM; DCM/Acetona (9,5:0,5),

(8,5:1,5),(7:3),(1:1); Acetona;

Acetona/MeOH (9:1),(7:3);

MeOH

1-5 6-7

8-21

21 mg

HPLC-semi-preparativo

Coluna Phenomenex

fenil-hexil (250x6 mm, 10 µm)

O:ACN (6,5:3,5)

V = 4 mL/min; λ = 217 e 254 nm

1-13 14

15-21

Substância 06

6,1 mg

R2P

Cerne da Raíz

Preparo dos

extratos

R2P-H R2P-D

4,16 g

15,7 g

Sílica gel (230-400 µm)

φ= 5,0 cm, h = 19 cm

Hex; Hex/DCM (9,5:0,5),

(8,5:1,5); Hex/Acetona (8:2),

(7,5:2,5),(6,5:3,5); Acetona;

Acetona/MeOH (9:1),(7:3);

MeOH

24 frações

Sílica gel (230-400 µm)

φ= 5,0 cm, h = 18 cm

Hex/DCM (9:1),(7:3);(1:1);

DCM; DCM/Acetona (9,5:0,5),

(8,5:1,5),(7:3),(1:1); Acetona;

Acetona/MeOH (9:1),(7:3);

MeOH

1-5 6-7

8-21

21 mg

HPLC-semi-preparativo

Coluna Phenomenex

fenil-hexil (250x6 mm, 10 µm)

O:ACN (6,5:3,5)

V = 4 mL/min; λ = 217 e 254 nm

1-13 14

15-21

Substância 06

6,1 mg

(hidrometanólico). Iniciou-se o refracionamento dos extratos R2P-H e R2P-D

isolando do extrato de diclorometano o limonóide Nimbolina A (substância 06). Foi

coletado um volume de 35 mL no fracionamento dos extratos R2P-H e R2P-D. No

fracionamento do extrato R2P-D foi coletado um volume de 250 mL para cada

fração. Estes refracionamentos podem ser observados na Figura 2.15.

Figura 2.15 – Esquema do fracionamento cromatográfico do extrato R2P e de suas

frações.

2.4.8 Fracionamento do Extrato Etanólico das Sementes do Nim - Brejinho do

Nazaré-TO.

Um lote de 250 g de sementes do Nim cultivado em Brejinho do

Nazaré-TO, foi previamente macerado em hexano para a remoção dos compostos

mais apolares. Em seguida, elas foram maceradas em etanol. A cada período de 12

horas o álcool foi substituído por um novo volume. Todo o etanol usado na extração

foi seco em rota-evaporador dando origem ao extrato etanólico. Este extrato foi

submetido a extração líquido-líquido através de uma partição entre éter de petróleo,

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metanol e água [900(3X300):190:10 mL]. A fração hidroalcóolica, foi novamente

particionada com acetato de etila. A fração de acetato de etila foi seca e submetida a

separação de seus compostos por Cromatografia em Coluna de Baixa Pressão. Um

esquema geral de extração e fracionamento pode ser observado na Figura 2.16.

Destas sementes foram isolados dois limonóides usados como padrão, a

azadirachtina A e a B, substâncias 08 e 11 respectivamente.

Figura 2.16 – Esquema de extração e isolamento dos padrões de Azadirachtina.

Sementes Moídas

Nim

950 g

Preparo dos Extratos:

Maceração com hexano: 1 L de hexano agitado por 10 min e deixado em repouso por 1 h.

Substituição e concentração do solvente. Procedimento repetido por 4 vezes.

Ext. Hex

Torta

Maceração com etanol: 1 L de etanol deixado em repouso por 12 hs.

Substituição e concentração do solvente. Procedimento repetido por 5 vezes.

Torta Ext. EtOH

Extração Líquido-Líquido:

Suspensão em MeOH (aq) 95 %

Extração com Éter de petróleo

Fração

Éter de Petróleo

Fração

Hidroalcoolica

Fração

Hidroalcoólica

Fração

AcOEt

Extração com AcOEt

Fração

AcOEt

Sílica (60-230 µm)

φ= 5,2 cm, h = 26 cm

Hex/AcOEt (3:1); AcOEt;

AcOEt/MeOH (9,5:0,5),(8:2),(1:1);

MeOH

28 g

1-3 4-9 10-21

7,1 g

Sílica gel (230-400 µm)

φ= 3,6 cm, h = 30 cm

CF:ACN (3:1),(1:1); ACN;

ACN/MeOH (9:1),(8:2),(1:1);

MeOH

4-9/1-4 4-9/5-11 4-9/12-20

4,5 g

Sílica gel (230-400 µm)

φ= 2,4 cm, h = 120 cm

CF:ACN (9,5:0,5),(9:1),(8,5:1,5),(8:2),

(7,75:2,25),(7:3),(1:1); ACN;

ACN/MeOH (9:1),(8:2),(1:1);

MeOH

4-9/5-11/

1-14

4-9/5-11/

16-25

4-9/5-11/

25-26

4-9/5-11/

27-69

HPLC-semi-preparativo

Coluna Phenomenex

fenil-hexil (250x7 mm, 10 µm)

O:MeOH:ACN:THF

(6,5:2:1,5:5)

V = 1,8 mL/min;

λ= 217 e 254 nm

(5 injeções de 12 mg)

60 mg

Substância 11

22 mg

HPLC-preparativo

Coluna Phenomenex

ODS

(250x22,5 mm, 10 µm)

ACN:H

O (3,5:6,5)

V = 16,3 mL/min;

λ= 217 e 254 nm

121 mg

Substância 08

30,6 mg

Sementes Moídas

Nim

950 g

Preparo dos Extratos:

Maceração com hexano: 1 L de hexano agitado por 10 min e deixado em repouso por 1 h.

Substituição e concentração do solvente. Procedimento repetido por 4 vezes.

Ext. Hex

Torta

Maceração com etanol: 1 L de etanol deixado em repouso por 12 hs.

Substituição e concentração do solvente. Procedimento repetido por 5 vezes.

Torta Ext. EtOH

Extração Líquido-Líquido:

Suspensão em MeOH (aq) 95 %

Extração com Éter de petróleo

Fração

Éter de Petróleo

Fração

Hidroalcoolica

Fração

Hidroalcoólica

Fração

AcOEt

Extração com AcOEt

Fração

AcOEt

Sílica (60-230 µm)

φ= 5,2 cm, h = 26 cm

Hex/AcOEt (3:1); AcOEt;

AcOEt/MeOH (9,5:0,5),(8:2),(1:1);

MeOH

28 g

1-3 4-9 10-21

7,1 g

Sílica gel (230-400 µm)

φ= 3,6 cm, h = 30 cm

CF:ACN (3:1),(1:1); ACN;

ACN/MeOH (9:1),(8:2),(1:1);

MeOH

4-9/1-4 4-9/5-11 4-9/12-20

4,5 g

Sílica gel (230-400 µm)

φ= 2,4 cm, h = 120 cm

CF:ACN (9,5:0,5),(9:1),(8,5:1,5),(8:2),

(7,75:2,25),(7:3),(1:1); ACN;

ACN/MeOH (9:1),(8:2),(1:1);

MeOH

4-9/5-11/

1-14

4-9/5-11/

16-25

4-9/5-11/

25-26

4-9/5-11/

27-69

HPLC-semi-preparativo

Coluna Phenomenex

fenil-hexil (250x7 mm, 10 µm)

O:MeOH:ACN:THF

(6,5:2:1,5:5)

V = 1,8 mL/min;

λ= 217 e 254 nm

(5 injeções de 12 mg)

60 mg

Substância 11

22 mg

HPLC-preparativo

Coluna Phenomenex

ODS

(250x22,5 mm, 10 µm)

ACN:H

O (3,5:6,5)

V = 16,3 mL/min;

λ= 217 e 254 nm

121 mg

Substância 08

30,6 mg

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2.4.9 Extração de Padrões da Semente do Nim – Catanduva-SP.

Devido a necessidade de uma maior quantidade de padrão de

azadirachtina A para o desenvolvimento dos métodos de quantificação, foi

preparado um nova extrato metanólico a partir das sementes de Nim da região de

Catanduva-SP. Foram utilizados 800 g de sementes congeladas em nitrogênio

líquido e moídas. Esta semente foi macerada em metanol obtendo 52 g de extrato.

Foi usado 25 g desse extrato sendo fracionando através do uso das técnicas de CC

e HPLC onde foi novamente isolado a azadirachtina A e o Nimbandiol (substância

12). Este fracionamento encontra-se descrito na Figura 2.17.

Figura 2.17 – Esquema do fracionamento cromatográfico do extrato metanólico das

sementes do Nim, Catanduva-SP.

Sílica gel (230-400 µm)

φ= 5,0 cm, h = 32 cm

CF; CF:ACN (9,5:0,5),(9:1),(8:2),

(7:3),(1:1); ACN;

ACN/MeOH (9,5:0,5),(9:1),(8:2);

MeOH

Extrato MeOH

25 g

1-21

22-54

704 mg

Sephadex-LH20

φ= 4,0 cm

h = 115 cm

MeOH

22/6

23 mg

HPLC-semi-preparativo

Coluna Phenomenex

fenil-hexil (250x6 mm, 10 µm)

O:MeOH:ACN:THF

(6,4:2:1,5:0,1)

V = 1,8 mL/min;

λ= 217 e 254 nm

65 mg

HPLC-semi-preparativo

Coluna Phenomenex

fenil-hexil (250x6 mm, 10 µm)

O:MeOH:ACN:THF

(6,1:3,4:4:1)

V = 1,8 mL/min;

λ= 217 e 254 nm

(5 injeções)

Substância 12

8 mg

Substância 08

47 mg

Sílica gel (230-400 µm)

φ= 5,0 cm, h = 32 cm

CF; CF:ACN (9,5:0,5),(9:1),(8:2),

(7:3),(1:1); ACN;

ACN/MeOH (9,5:0,5),(9:1),(8:2);

MeOH

Extrato MeOH

25 g

1-21

22-54

704 mg

Sephadex-LH20

φ= 4,0 cm

h = 115 cm

MeOH

22/6

23 mg

HPLC-semi-preparativo

Coluna Phenomenex

fenil-hexil (250x6 mm, 10 µm)

O:MeOH:ACN:THF

(6,4:2:1,5:0,1)

V = 1,8 mL/min;

λ= 217 e 254 nm

65 mg

HPLC-semi-preparativo

Coluna Phenomenex

fenil-hexil (250x6 mm, 10 µm)

O:MeOH:ACN:THF

(6,1:3,4:4:1)

V = 1,8 mL/min;

λ= 217 e 254 nm

(5 injeções)

Substância 12

8 mg

Substância 08

47 mg

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2.4.10 Extração do Óleo Essencial

A extração dos compostos voláteis das folhas desta planta, foi

realizada por arraste a vapor d’água, utilizando um aparelho tipo Clevenger

modificado (Figura 2.18) acoplado a um balão de duas bocas de dois litros aquecido

com uma manta à 100 ºC. Adicionou-se água ao balão até o nível da manta e

preencheu-se com água o tubo de retorno ao balão.

As folhas frescas e previamente moídas (200 g) foram adicionadas ao

balão e iniciou-se o aquecimento do sistema de extração. O sistema foi mantido em

refluxo por duas horas, controlando-se a temperatura em 100ºC. Após o término da

extração, adicionou-se uma pequena quantidade de éter etílico no extrator para a

coleta do óleo essencial. Devido à pequena quantidade de óleo obtido e da adição

do éter etílico não foi possível determinar o rendimento da extração.

Figura 2.18 – Aparelho de extração do tipo Clevenger modificado.

A análise do óleo essencial foi realizada por Cromatografia Gasosa

acoplada a um espectrômetro de massa (GC/MS), aparelho Shimadzu QP 5000. As

condições de análise utilizadas foram:

Temperatura do injetor: 225ºC

Temperatura do detector: 250ºC

Coluna: DB-5 (30m x 0,25mm x 0,25µm)

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Programação de temperatura: 60ºC (2min), 3ºC/min, 240ºC, 10ºC/min, 280ºC

Velocidade linear: 46,4

Pressão da cabeça da coluna: 100,0 kPa

Fluxo de gás: 1,6 ml/min (à 60ºC)

Tempo entre as varreduras (scans/s): 0,50

Intervalo de massas: 40,5 a 500 uma.

O óleo essencial puro foi injetado primeiramente e em seguida foi

injetado com uma mistura de padrões de hidrocarbonetos. Esta mistura de padrões

previamente preparados com n-alcanos foi de: C9/C10/C12/C14/C16/C18/C20 e

C22.

2.4.11 Análise da Azadirachtina A nas Diferentes Partes do Enxerto

A coleta do material para a análise da presença ou não da

azadirachtina A nas diversas partes do enxerto foi realizada em abril de 2005 na

Estação Experimental do IAPAR em Xambrê-PR. Foram coletados folhas, flores,

galhos e sementes em diversos estágios de maturação. Este material foi pesado e

submetido ao preparo de extratos. A massa de cada parte da planta usada para o

preparo dos extratos encontra-se ilustrada na Tabela 2.4. Os extratos foram

preparados seguindo o método descrito no próximo capítulo o qual descreve o

preparo das amostras das sementes para análise por HPLC. Este método

demonstrou excelente eficiência de extração para a azadirachtina A.

Cada extrato foi submetido a análise por LC/MS no modo de detecção

MRM.

A otimização da separação cromatográfica foi realizada utilizando um

Cromatógrafo Líquido modular Shimadzu equipado com controladora SCL-10Avp,

auto injetor Shimadzu SIL-10AF, duas bombas Shimadzu, modelo LC-10AD e

detector de Arranjo de Diodos Shimadzu DPD-M10Avp. Os cromatogramas foram

registrados pelo software CLASS-VP. A separação foi realizada usando coluna

analítica C

Phenomenex®-Luna(II) (150x4,6mm, 5 µm) com pré-coluna de

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segurança Phenomenex® (4x3mm, 5 µm) acoplada. A fase móvel foi composta de

O:ACN (60:40, v/v), numa vazão de 0,4 mL/min e um volume de injeção de 20 µL.

A fase móvel foi filtrada com filtro Millipore

0,45µm.

Para a análise MS/MS foi usado um Micromass Quattro LC (triple

quadrupole, APCI, ESI) operado como interface uma fonte padrão Z-spray adaptado

com um probe de eletrospray. A ionização foi realizada utilizando o eletrospray no

modo negativo de ionização (ESI

). Os parâmetros otimizados para as análises da

azadirachtina A foram: potencial do capilar de 2,94 kV para o modo negativo de

ionização, a temperatura do gás de dessolvatação (N

) de 300ºC e a temperatura do

bloco da fonte 135ºC. O potencial usado no cone foi de 39 V, no cone extrator de 5

V e o RF lens de 0,69 V. Os fluxos dos gases de Nebulização (N

) e dessolvatação

) foram de 51 e 350 L/hs respectivamente. O gás de colisão foi o Argônio 99,99%

(White Martins) e a voltagem da energia de colisão de 20 eV. Os dados totais foram

adquiridos usando um dwell time de 0,06s. As análises foram detectadas

monitorando a combinação precursor-produto na Multiple Reaction Monitoring

(MRM). Após a otimização, os canais de detecção selecionados foram m/z 719 →

486 e 719 → 211. O tempo de monitoramento para cada análise foi de 12 min sendo

o tempo de retenção da azadirachtina A de 8 min. Todos os dados foram

processados usando software MassLynx versão 3.5 NT Quattro.

Tabela 2.4 – Diferentes partes do enxerto analisados por LC-MS/MS.

Cód. Descrição

Massa de

material

usado (mg)

Massa de

extrato

usado (mg)

Conc. do

extrato

analisado

(mg/mL)

EM01 Amêndoa do fruto adulto 100,0 7,7 19,25

EM02 Cerne do galho (parte interna) 184,2 9,0 18,0

EM03 Casca do galho 176,0 15,6 22,3

EM04 Flores 185,0 Todo o extrato

EM05 Fruto infantil 346,8 7,2 18,0

EM06 Amêndoa do fruto adulto e maduro 100,0 9,1 18,2

EM07 Folhas 316,4 12,0 20,0

EM08 Palha da semente seca 304,7 2,6 13,0

EM09 Amêndoa da semente seca 100,0 7,0 17,5

EM10 Amêndoa do fruto jovem 100,0 7,9 19,75

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2.4.12 Degradação Assistida da Azadirachtina A

Um padrão puro de 5 mg de azadirachtina A foi solubilizado em 1.200

µL de solução H

O:MeOH (5:1, v/v). Esta solução foi exposta a luz solar por 20 dias.

Após este período, a solução foi seca e o resíduo dissolvido em clorofórmio

deuterado (CDCl

) e submetido a análise por Ressonância Magnética Nuclear

(RMN). Os espectros foram obtidos num equipamento Brüker DRX 400MHz 9,4

Tesla utilizando TMS como padrão interno, empregando um probe de detecção

indireta de 2,5 mm e equipado com uma bobina z-gradiente (máximo 53,5 G cm

-1

Os espectros foram processados usando o software Brüker Xwinnmr package

versão 3.5.

A análise MS/MS foi realizada usando um Micromass Quattro LC (triple

quadrupole, APCI, ESI) operado como interface uma fonte padrão Z-spray adaptado

com um probe de eletrospray. O volume de inserção foi de 10 µL. A ionização foi

realizada utilizando o eletrospray no modo negativo de ionização (ESI

). Os

parâmetros otimizados para as análises da azadirachtina A e dos artefatos gerados

foram: potencial do capilar de 2,83 kV para o modo negativo de ionização, a

temperatura do gás de dessolvatação (N

) de 300ºC e a temperatura do bloco da

fonte 130ºC. O potencial usado no cone foi de 28 V, no cone extrator de 5 V e o RF

lens de 0,50 V. Os fluxos dos gases de Nebulização (N

) e dessolvatação (N

) foram

de 51 e 350 L/hs respectivamente. O gás de colisão foi o Argônio 99,99% (White

Martins) e a voltagem da energia de colisão de 20 eV. Os dados totais foram

adquiridos usando um dwell time de 0,06s. Todos os dados foram processados

usando software MassLynx versão 3.5 NT Quattro. A análise LC-MS/MS foi realizada

através de uma sistema isocrático usando uma bomba Shimadzu LC-10AD, um

autoinjetor Shimadzu SIL10AD-vp e um detector foto-diodo SPDM10A-vp. Os dados

de HPLC-UV foram processados através do software Shimadzu Class VP 5.0. O

padrão de Azadirachtina A foi obtido conforme anteriormente descrito. Na eluição

isocrática foi utilizado como fase móvel água ultra-pura obtida num sistema de

purificação Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, U.S.A.) e acetonitrila (Mallinkrodt – St.

Louis, MO, U.S.A.) numa porporção de 6:4. A separação foi realizada numa coluna

C18 Phenomenex® (150x 4,6 mm, 5 µm, Terrance, CA, U.S.A.) com uma vazão de

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0,8 mL/min. Através de uma válvula splitess metade da vazão foi direcionada ao

Espectrômetro de Massas otimizado nos mesmos parâmetros acima descritos.

2.5 Resultados e Discussões

2.5.1 Substâncias Isoladas

MeOOC

Substância 01

Nimbolido

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Folhas

MeOOC

Substância 02

28-Desoxonimbolido

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Folhas

Cerne do Galho

Folhas

MeOOC

AcO

Substância 03

Salannina

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Cerne do Galho

Sementes

MeOOC

Substância 04

6-O-Acetilnimbandiol

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Cerne do Galho

Óleo das

Sementes

56, 60

MeOOC

Substância 01

Nimbolido

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Folhas

MeOOC

Substância 02

28-Desoxonimbolido

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Folhas

Cerne do Galho

Folhas

MeOOC

AcO

Substância 03

Salannina

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Cerne do Galho

Sementes

MeOOC

Substância 04

6-O-Acetilnimbandiol

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Cerne do Galho

Óleo das

Sementes

MeOOC

Substância 01

Nimbolido

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Folhas

MeOOC

Substância 02

28-Desoxonimbolido

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Folhas

Cerne do Galho

Folhas

MeOOC

Substância 02

28-Desoxonimbolido

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Folhas

Cerne do Galho

Folhas

MeOOC

AcO

Substância 03

Salannina

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Cerne do Galho

Sementes

MeOOC

AcO

Substância 03

Salannina

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Cerne do Galho

Sementes

MeOOC

Substância 04

6-O-Acetilnimbandiol

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Cerne do Galho

Óleo das

Sementes

MeOOC

Substância 04

6-O-Acetilnimbandiol

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Cerne do Galho

Óleo das

Sementes

56, 60

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MeOOC

Substância 05

6-Desacetilnimbineno

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Folhas

Enxerto

Óleo das Sementes

Folhas

Casca do caule

OCin

OAc

AcO

Substância 06

Nimbolina A

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Raízes

M. azedarach

Raízes

M. azedarach

Porta-enxerto

MeOOC

COOMe

6-Desacetilnimbina

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Sementes

Brotos

Folhas

Enxerto

Substância 07

Azadirachtina A

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

SementesSementes

Pé franco

Detectado no Enxerto

Substância 08

AcO

OOC

Quercetina

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Folhas

Enxerto

Substância 09

104

112

123

62, 63

128

Não citado

anteriormente

145

MeOOC

Substância 05

6-Desacetilnimbineno

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Folhas

Enxerto

Óleo das Sementes

Folhas

Casca do caule

OCin

OAc

AcO

Substância 06

Nimbolina A

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Raízes

M. azedarach

Raízes

M. azedarach

Porta-enxerto

MeOOC

COOMe

6-Desacetilnimbina

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Sementes

Brotos

Folhas

Enxerto

Substância 07

Azadirachtina A

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

SementesSementes

Pé franco

Detectado no Enxerto

Substância 08

AcO

OOC

Quercetina

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Folhas

Enxerto

Substância 09

MeOOC

Substância 05

6-Desacetilnimbineno

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Folhas

Enxerto

Óleo das Sementes

Folhas

Casca do caule

MeOOC

Substância 05

6-Desacetilnimbineno

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Folhas

Enxerto

Óleo das Sementes

Folhas

Casca do caule

OCin

OAc

AcO

Substância 06

Nimbolina A

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Raízes

M. azedarach

Raízes

M. azedarach

Porta-enxerto

OCin

OAc

AcO

Substância 06

Nimbolina A

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Raízes

M. azedarach

Raízes

M. azedarach

Porta-enxerto

MeOOC

COOMe

6-Desacetilnimbina

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Sementes

Brotos

Folhas

Enxerto

Substância 07

MeOOC

COOMe

6-Desacetilnimbina

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Sementes

Brotos

Folhas

Enxerto

Substância 07

Azadirachtina A

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

SementesSementes

Pé franco

Detectado no Enxerto

Substância 08

AcO

OOC

Azadirachtina A

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

SementesSementes

Pé franco

Detectado no Enxerto

Substância 08

AcO

OOC

Quercetina

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Folhas

Enxerto

Substância 09

Quercetina

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Folhas

Enxerto

Substância 09

104

112

123

62, 63

128

Não citado

anteriormente

145

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2.5.2 Determinação Estrutural das Substâncias Isoladas

No estudo fitoquímico foram isolados e identificados 12 metabólitos

secundários no enxerto característicos em pés francos. A seguir serão discutidas as

determinações estruturais para cada substância isolada. Apesar de serem

compostos conhecidos na literatura, para sua identificação precisa, foi necessária a

análise por RMN 1D e 2D.

Para uma simplificação nas discussões, os números representados

entre parênteses () representa o deslocamento químico em ppm de Hidrogênio e os

números entre colchetes [ ], os deslocamentos químicos em ppm de carbonos.

Azadirachtina B

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Sementes

Pé franco

Detectado no enxerto

Substância 11

OOH

OOC

Sementes

Quercitrina

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Folhas

Enxerto

Substância 10

Nimbandiol

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Sementes

Pé franco

Substância 12

Folhas

Sementes

MeOOC

Não citado

anteriormente

148

151

159

Azadirachtina B

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Sementes

Pé franco

Detectado no enxerto

Substância 11

OOH

OOC

Sementes

Azadirachtina B

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Sementes

Pé franco

Detectado no enxerto

Substância 11

OOH

OOC

Sementes

Quercitrina

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Folhas

Enxerto

Substância 10

Nimbandiol

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Sementes

Pé franco

Substância 12

Folhas

Sementes

MeOOC

Não citado

anteriormente

148

151

159

Quercitrina

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Folhas

Enxerto

Substância 10

Nimbandiol

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Sementes

Pé franco

Substância 12

Folhas

Sementes

MeOOC

Nimbandiol

Isolamento: pg.

Identificação: pg.

Isolado Literatura

Sementes

Pé franco

Substância 12

Folhas

Sementes

MeOOC

Não citado

anteriormente

148

151

159

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2.5.2.1 Determinação Estrutural do Nimbolido (Substância 01)

Para a determinação estrutural da substância 01, a definição de sua

estrutura foi iniciada analisando os espectros de RMN a partir de sinais bem

caracterizados para limonóides. Assim, iniciou-se a determinação estrutural a partir

dos supostos sinais de um anel furano.

Analisando os espectros de RMN

H, foi observado um sinal em δ

7,25, (t; 1,7 Hz) o qual se correlaciona aos carbonos δ143,1 (via HSQC) e δ126,5 e

138,8 (via HMBC). O carbono em δ 138,8 correlaciona-se com hidrogênio δ 7,15 (sl)

(via HSQC) e com os carbonos em δ 110,3; 126,5; e 143,1 (via HMBC). O carbono

em δ110,3 se correlaciona a

J com o hidrogênio δ6,19 (m) o qual se correlaciona a

J ou

J com os carbonos em δ 126,5; 138,8 e 143,1. O carbono δ 126,5 não

apresentou correlação a J

com hidrogênio apenas a

J ou

J com os hidrogênios em

δ 7,25 e 7,15. Estas correlações permitem propor o anel furano, onde, respeitando

as correlações o carbono em δ 126,5 é o C-20, o carbono em δ 110,3 é o C-22 e os

carbonos em δ143,1 e 138,8 devem ser os carbonos C-23 e C-21 ou o inverso, uma

vez, que é permitido obter correlações a duas ou três ligações (

J ou

J) nos

experimentos de HMBC. Assim, pode-se propor duas sub-estruturas iguais para as

atribuições do anel furano porém com correlações diferentes:

Além das correlações com os hidrogênios do anel furano os

carbonos δ 110,3 (C-22); 126,5 (C-20) e 138,8 apresentam correlações com um

hidrogênio em δ 3,60 (dl; 8,7 Hz) [δ 49,5], o qual pode ser definido como o H-17 dos

limonóides. Estas correlações permitiram diferenciar o C-23 e o C-21, uma vez que o

C-21 pode apresentar correlação com o H-17 a

J e o C-23 não, pois se encontra a

126

110

126

138

143

Sub-estrutura A

Sub-estrutura B

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quatro ligações do H-17 (

J). Desta forma o carbono em δ 138,8 vem a ser o C-21 e

a atribuição do anel furano é:

Conhecendo o H-17 foram verificadas quais outras correlações que

esse apresentava. Observou-se que o H-17 (δ 3,60) correlaciona os carbonos do

anel furano, com o carbono em δ 49,5 (via HSQC) e com um carbono em δ 144,8.

Por sua vez, o carbono em δ 49,5, correlaciona-se com três hidrogênios, um em δ

1,64 (d; 1,7 Hz) [δ12,9], outro hidrogênio em δ2,15 (dd;12,1 e 6,7 Hz) [δ41,2] e com

um hidrogênio em δ 2,05 (m) [δ 41,2]. Pelo HSQC observou-se que os hidrogênios

em δ 2,15 e 2,05 encontram-se ligados a um mesmo carbono [δ 41,2] indicando ser

um grupo metileno (CH

). Esses hidrogênios, apesar de estarem ligados ao mesmo

carbono são diastereotópicos, não são magneticamente equivalentes, o que justifica

a diferença em seus deslocamentos químicos. Isto ocorre porque cada um destes

hidrogênios possui um comportamento magnético próprio e não são permutáveis por

alguma operação de simetria (rotação, reflexão, etc.) ou um rápido mecanismo de

rotação. O experimento de COSY mostra que o hidrogênio em δ 2,05 acopla com o

H-17. Desta forma, estes sinais em δ 2,15 e 2,05 podem ser definidos como sendo

os H-16a e H-16b.

O H-16a (δ 2,15) se correlaciona com o carbono δ 126,5 (C-20) a

um J

, e com os carbonos em δ 134,5 e δ 144,8 indicando uma insaturação no anel

D deste limonóide. Esta insaturação juntamente com a correlação do C-17 com um

grupo metila em δ1,64 leva a propor um limonóide C-seco. Desta forma os carbonos

em δ 134,5 e 144,8 podem ser os carbonos C-13 e C-14 respectivamente, ou o

inverso, dependendo do J com o qual eles se correlacionam.

O carbono em δ 134,5 se correlaciona com o H-16a e com os três

hidrogênios metílicos em δ 1,64 a um

J ou

J. O carbono em δ 144,8 também se

correlaciona com o H-16a (δ2,15), com a metila em δ1,64 e com um segundo grupo

metílico em δ 1,30 (s) [δ 17,2]. Estas correlações permitem definir o C-13 e o C-14.

Sendo que o C-17 [δ 49,5] juntamente com os dois carbonos quaternários, em δ

144,8 e 134,5 se correlacionam com os hidrogênios da metila em δ 1,64 e apenas o

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carbono em δ 144,8 se correlaciona com os hidrogênios da metila em δ 1,30, pode

definir a metila em δ 1,64 como sendo a Me-18 que correlaciona seus hidrogênios a

J com o C-17 [δ 49,5] e com o C-14 [δ 144,8] e a

J com C-13 [δ 134,5]. A

correlação entre o carbono em δ 144,8 com o segundo grupo metílico em δ 1,30 (s)

permitiu diferenciar o C-13 do C-14. Isto porque, é comum nesta classe de

limonóides, a presença de um grupo metila (Me-30) ligada ao C-8 podendo se

correlacionar a

J apenas com o C-14 do anel D dos limonóides.

Definindo o C-13, C-14 e a Me-18, falta ainda definir o C-15 do anel

D. Pelo HMBC se observam duas correlações, pouco intensas, uma entre o H-16b (δ

2,05) e um carbono em δ 88,4 e outra entre o H-17 (δ 3,60) com este mesmo

carbono. Este carbono em δ 88,4, acopla via HSQC com um hidrogênio em δ 5,46

(tt; 6,7 e 1,8 Hz), e o hidrogênio em δ 5,46, por sua vez acopla (observado via

COSY) com os hidrogênios em δ 2,15 e 2,05 (H-16a e H-16b). Estas correlações

permitem propor serem estes o C-15 e H-15. Via HMBC o H-15 não apresentou

nenhuma correlação.

Pelos valores de deslocamento do H-15 e do C-15, observa-se um

carbono funcionalizado, possivelmente um carbinólico, permitindo propor a seguinte

estrutura para o anel D:

Definida a metila em δ 1,30 como sendo a Me-30, procurou-se

observar as correlações que esta apresentava. Os H

-30 se correlacionam com três

carbonos, um em δ 41,1, outro em δ 82,9 e um quaternário em δ 50,3. O carbono δ

41,1 se correlaciona com o hidrogênio em δ 2,67 (t; 5,8 Hz) e o carbono δ 82,9 com

um hidrogênio em δ 4,20 (d; 3,7 Hz) (ambos via HSQC). O carbono em δ 50,3 se

correlaciona com os hidrogênios da Me-30 (δ 1,30), com o hidrogênio em δ 2,67 (t;

5,8 Hz) [δ41,1] e com os hidrogênios um em δ3,18 (dd; 16,2 e 5,8 Hz) e outro em δ

2,30 (dd; 16,2 e 5,8 Hz) (via HMBC). Pelo HSQC se observa que estes dois últimos

144

134

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hidrogênios acoplam à um mesmo carbono em δ 32,1 sugerindo outro grupo

metileno (CH

Estas correlações sugerem ser o carbono em δ 50,3 o C-8 o qual

estaria se correlacionando a

J com os hidrogênios do grupo CH

(supostamente os

H-11a e H-11b) e a

J com os hidrogênios da Me-30 e com o hidrogênio em δ2,67 o

qual deve ser o H-9. Estas propostas foram confirmadas analisando as correlações

H-

H apresentadas no experimento COSY e suas respectivas constantes de

acoplamento. Analisando as constantes de acoplamento, observam-se dois

hidrogênios acoplados entre si por uma constante de acoplamento grande de 16,2

Hz, referente a um acoplamento geminal entre os dois hidrogênios do grupo

metileno atribuído ao C-11 [δ 32,1]. Novamente os hidrogênios deste grupo

metilênico não apresentam deslocamentos químicos equivalentes pelos mesmos

motivos apresentados para os hidrogênios do C-16. Também foi observado que

esses dois hidrogênios acoplam com um terceiro hidrogênio em δ 2,67 [δ 41,1] com

uma constante de acoplamento de 5,8 Hz. Este terceiro hidrogênio que só acopla

com os hidrogênios do C-11 como um tripleto, indicando ser um CH vizinho a outros

dois carbonos quaternários, um definido como C-8 [δ 50,3], confirmando ser o H-9.

Os acoplamentos dos spins do grupo de núcleos entre os hidrogênios 11 e 9,

interagem entre si, formando um sistema de spins ABX, ou seja, não há uma

equivalência de deslocamento químico. Estas deduções ficam mais evidentes

analisando o COSY, onde pode-se notar que os hidrogênios em δ 3,18 (H-11a) e δ

2,30 (H-11b) acoplam entre si, e que o hidrogênio em δ 3,18 acopla com o

hidrogênio em δ2,67 (H-9).

Ainda analisando os hidrogênios H-11a (3,18), H-11b (δ2,30) e H-9

(δ 2,67), observam-se que cada um se correlaciona com um carbono sp

com

deslocamento característico de éster em δ 172,9. Este carbono, por sua vez, se

correlaciona com hidrogênios metílicos em δ 3,47. Pelo HSQC, estes hidrogênios

metílicos acoplam com um carbono em δ 51,7. Visto ser esta a única correlação da

metila e do carbono em δ 172,9 sugere um grupo éster no anel C-seco, o que

permite propor a seguinte estrutura parcial:

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Ainda referente a Me-30, faltou definir a correlação que ela apresenta

com o carbono em δ 82,9. O experimento de HSQC demonstra um acoplamento

deste carbono com um hidrogênio em δ 4,20 (d; 3,7 Hz). Analisando o experimento

COSY, observa-se que este hidrogênio acopla com um outro vizinho em δ 4,55 (dd;

2,5 e 3,7 Hz) [δ 73,4], por sua vez, este hidrogênio vizinho, acopla com um terceiro

hidrogênio em δ 3,12 (d; 12,5 Hz) [δ 47,7]. Assim, respeitando a multiplicidade para

cada um destes hidrogênios é possível propor um sistema de spins AMX em um

anel de seis membros. A constante de acoplamento de 12,5 Hz é referente a um

acoplamento axial-axial entre os hidrogênios em δ 4,55 e 3,12 e a constante de 3,7

Hz é característica para um acoplamento axial equatorial.

Assim, o carbono em δ82,9 que acopla com a Me-30 (δ1,30), vem a

ser o C-7 e, conseqüentemente, os sinais δ73,4 e 47,7 são os carbonos C-6 e C-5

respectivamente. Desta forma, é possível propor a estrutura dos anéis B e C para o

limonóide faltando apenas definir C-10.

MeOOC

82,9

73,4

47,7

50,3

172

3,12 (d; 12,5 Hz)

4,55 (dd; 12,5; 3,7 Hz)

4,20 (d; 3,7 Hz)

47,7

73,4

82,9

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O H-5, δ3,12 (d; 12,5 Hz) [δ47,7] se correlaciona com os carbonos

em δ 15,1; 18,5; 43,6; 73,4 e 82,9. Como visto, este hidrogênio se correlaciona com

o C-6 [δ 73,4] a J

e com o C-7 [δ 82,9] a

J. Os carbonos δ 15,1 e δ 18,5,

respectivamente se correlacionam com os hidrogênios em δ 1,15 e em δ 1,41 (via

HSQC) sugerindo duas outras metilas. O carbono em δ 43,6 é um carbono

quaternário (não apresenta correlação no HSQC), e via HMBC correlaciona-se com

o H-5 (δ 3,12) e com a metila em δ 1,41 [δ 18,5]. Observou-se também, um outro

carbono quaternário em δ 45,2 que acopla com H-11a (δ 3,18) com H-9 (δ 2,67) e

com a metila em δ 1,15 [δ 15,1]. Estas correlações permitem propor o carbono

quaternário em δ 43,6 como sendo C-4 e o carbono em δ 45,2, também quaternário,

ser o C-10, visto que o C-10 encontra-se acoplando com o H-9 a um J

e com H-11a

a um

J, correlações não permitidas para C-4. Conseqüentemente o acoplamento

com a metila em δ1,15 permite propor ser esta a Me-19 uma vez que ela não pode e

não dá correlação com C-4. Assim, a outra metila em δ 1,41 vem a ser a M-29 que

também não acopla com C-10, distinguindo uma metila da outra.

Ainda analisando o experimento de HMBC, o C-5 [δ47,7] apresenta

uma correlação com um hidrogênio vinílico em δ7,21 (d; 9,7 Hz) [δ149,6] e o C-4 [δ

43,6] também apresenta uma correlação com outro hidrogênio vinílico em δ 5,86 (d;

9,7 Hz) [δ 131,0]. No COSY observa-se ainda que os hidrogênios δ 7,21 e 5,86

acoplam entre si. Este acoplamento apresenta com uma constante característica de

alceno cis num sistema de spins AX. O hidrogênio em δ 7,21 também se

correlaciona com um carbono em δ 200,8, sendo um carbono com deslocamento

característico de cetonas cíclicas α,β insaturadas. O carbono em δ200,8 por sua vez

se correlaciona com o H-5 (δ 3,12), com o H-9 (δ 2,67) e com a Me-19 (δ 1,15),

correlações que permitem definir este carbono como sendo o C-1 e os hidrogênios δ

7,21 e 5,86 como sendo o H-3 e o H-2 respectivamente. Desta forma, ambos, H-3 se

MeOOC H

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correlacionando com C-5 e, H-2 se correlacionando com C-4, apresentam uma

correlação de J

. Assim, através destas correlações pode-se propor o anel A do

limonóide como sendo:

Concluindo o anel A do limonóide, apenas falta atribuir as correlações

para o C-28 e os grupos funcionais do C-6, C-7 e C-15. Pelo HMBC ainda se

observou uma correlação entre a Me-29 (δ 1,41) em um carbono de deslocamento

característico sp

em δ 174,9 podendo ser um carbono de carbonila em um anel

lactônico formado entre o C-4 e o C-6. Numa pesquisa na literatura, observou-se

que pelos deslocamentos químicos do C-7 e do C-15, referem-se a uma ponte éter

entre estes dois carbonos. Deste modo, foram atribuídas todas as correlações

apresentadas nos experimentos 1D e 2D para esta substância permitindo propor a

seguinte estrutura:

A substância 01 é um composto conhecido na literatura

denominado por Nimbolído. Foi isolado das folhas do enxerto coletado em Xambrê-

PR e já havia sido anteriormente isolado das folhas do pé franco do Nim (pg. 68). Na

Tabela 2.5 encontram-se todos os valores dos deslocamentos químicos de

hidrogênio e de carbono referentes ao Nimbolido e os valores encontrados na

literatura [85], confirmando a estrutura proposta.

COOMe

200

MeOOC

20 21

2829

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A estereoquímica da Me-19 e Me-30 juntamente com o grupo funcional

do C-7, são definidas pela própria biossíntese do limonóide. Uma vez que o grupo

funcional do C-7 encontra-se em α seu hidrogênio só pode estar em β. O H-7 em β

acopla com uma constante pequena com o H-6, uma constante referente a um

acoplamento equatorial-axial colocando o H-6 também em β. O H-6 também

apresenta uma constante de acoplamento com o H-5, contudo, referente a um

acoplamento axial-axial, o que permite propor o H-5 em α. Estando o H-6 em β seu

grupo funcional se encontra em α formando um ciclo com C-4 na face α o que faz

com que a Me-29 esteja em β.

Tabela 2.5 – Dados de RMN de

H e

C para o Nimbolido.

Isolado (CDCl

) Literatura [85] (CDCl

)Carbono

H / J (Hz)

- 200,8 - 200,5

5,86 (d) 9,7 131,0 5,93 (d) 9,6 130,8

7,21 (d) 9,7 149,6 7,28 (d) 9,6 149,3

- 43,6 - 43,5

3,12 (d) 12,5 47,7 3,19 (d) 12,6 47,5

4,55 (dd) 12,5; 3,7 73,4 4,63 (dd) 12,6; 3,6 73,2

4,20 (d) 3,7 82,9 4,27 (d) 3,6 82,6

- 50,3 - 50,1

2,67 (t) 5,8 41,1 2,72 (t) 5,4 40,9

- 45,2 - 45,0

a. 3,18 (dd) 16,2; 5,8

b. 2,30 (dd) 16,2; 5,8

32,1 a. 3,25 (dd) 16,2; 5,4

b. 2,38 (dd) 16,2; 5,7

31,9

- 172,9 - 172,8

- 134,5 - 136,2

- 144,8 - 144,5

5,46 (tt) 7,3; 1,8 88,4 5,53 (t) 6,6 88,2

a. 2,15 (dd)

b. 2,05 (m)

41,2 a.2,21(ddd)8,4;6,6;1,0

b.2,10(ddd)8,4;6,8;1,2

41,3

3,60 (dl) 8,7 49,5 3,67 (dd) 8,4; 1,2 49,2

1,64 (d) 1,7 12,9 1,70 (s) 12,7

1,15 (s) 15,1 1,22 (s) 14,9

- 126,5 - 126,3

7,15 (sl) 138,8 7,22 (s) 138,6

6,19 (m) 110,3 6,26 (s) 110,1

7,25 (t) 1,7 143,1 7,51 (s) 142,9

- 174,9 - 174,8

1,41 (s) 18,5 1,48 (s) 18,3

1,30 (s) 17,2 1,37 (s) 16,9

OMe

3,47 (s) 51,7 3,54 (s) 51,5

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Figura 2.19 – Espectro de RMN

H do Nimbolido (CDCl

, 200 MHz).

Figura 2.20 – Espectro de RMN

C do Nimbolido (CDCl

, 100 MHz).

H-21

H-23

H-3

H-2

H-22

H-15

H-6

H-7

H-17

H-11a

H-5

H-11b

H-9

H-16

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

MeOOC

H-21

H-23

H-3

H-2

H-22

H-15

H-6

H-7

H-17

H-11a

H-5

H-11b

H-9

H-16

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

H-21

H-23

H-3

H-2

H-22

H-15

H-6

H-7

H-17

H-11a

H-5

H-11b

H-9

H-16

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

MeOOC

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Figura 2.21 – Espectro de COSY do Nimbolido (CDCl

, 400 MHz).

Figura 2.22 – Espectro de HSQC do Nimbolido (CDCl

, 100 MHz).

6/5

6/7

15/16

11a/9

17/16

11a/11b

9/11b

3/2

6/5

6/7

15/16

11a/9

17/16

11a/11b

9/11b

3/2

149,6

23 22

16 16

143,1

138,8

110,3

131,0

88,4

73,4

82,9

49,5

51,7

32,1 32,1

47,7

41,1

41,2

12,9

18,5

17,2

15,1

149,6

23 22

16 16

143,1

138,8

110,3

131,0

88,4

73,4

82,9

49,5

51,7

32,1 32,1

47,7

41,1

41,2

12,9

18,5

17,2

15,1

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Figura 2.23 – Espectro de HMBC do Nimbolido (CDCl

, 100 MHz).

2.5.2.2 Determinação Estrutural do 28-Desoxonimbolído (Substância 02)

O 28-desoxonimbolído foi isolado das folhas e do cerne dos galhos do

enxerto do Nim coletado em Xambrê-PR. É um composto conhecido na literatura,

anteriormente isolado das folhas de pés francos do Nim e do tronco de A. excelsa.

Sua estrutura foi determinada com base em experimentos de RMN

C, COSY,

HSQC e HMBC (Figuras 2.24, 2.25, 2.26, 2.27 e 2.28 respectivamente) assim como

também através da comparação com dados da literatura [85].

9, 16

23 22 21

17 11

16 16

29 30

15 11

OMe

9, 16

23 22 21

17 11

16 16

29 30

15 11

OMe

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O espectro de RMN

H (Figura 2.24) é bastante parecido com o

espectro do nimbolídeo discutido anteriormente, com exceção de que o espectro do

28-deoxonimbolídeo apresenta dois dubletos de constantes de acoplamento de 6,5

Hz, um em δ 3,73 e o outro em δ 3,81, e o deslocamento de alguns sinais para uma

região mais blindada do espectro devido a perda do cone de desblidagem do grupo

carbonila em C-28. Este efeito foi principalmente sentido pelos hidrogênios H-5, H-6

e H-7. Desta maneira, ao invés de um grupamento carboxialquílico em C-28, esta

substância apresenta um grupo oxi-metileno. Possivelmente, esta substância seja a

precursora biossintética da substância 01, uma vez que o consumo de energia é

bem menor para reações de oxidação em comparação a reações de redução.

O espectro de RMN

C (Figura 2.25) da substância 02 também é

muito parecido com o espectro da substância 01. As únicas diferenças significativas

são o desaparecimento do sinal de carbono em δ 174,9, referente ao carbono

lactônico C-28, e o aparecimento de um novo carbono carbinólico em δ 79,3. O

experimento de COSY (Figura 2.26) não apresentou a correlação entre os

hidrogênios do grupo metileno, não apresentando nenhuma nova correlação. O

experimento de HSQC (Figura 2.27) mostra a correlação

J entre o carbono δ 79,3

com os hidrogênios H-28a [δ 3,81 (d; 6,5 Hz)] e H-28b [δ 3,73 (d; 6,5 Hz)]

confirmando como hidrogênios de um único grupo metileno.

A confirmação da presença deste grupo metileno em C-28 ocorreu

através da análise do experimento de HMBC (Figura 2.28). Analisando o C-6 (δ

72,5), o C-5 (δ 49,3) e a Me-29 (δ 20,5) foi observado que ambos se correlacionam

com o hidrogênio em δ 3,81. A Me-29 também apresentou correlação com um outro

hidrogênio em δ 3,73. Estas correlações, permitiram então, propor uma ponte éter

entre o C-28 (metileno em δ 79,3) e o C-6 [δ 72,5]. Deste modo, a Me-29 estaria

acoplando com cada um dos hidrogênios, H-28a e H-28b, com um

J, e os C-5 e C-6

acoplando com o H-28a também com um

Da mesma forma que para a substância 01, a análise detalhada de

todos os experimentos permitiram propor a substância 02 como sendo o 28-

desoxonimbolído.

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Tabela 2.6 – Dados de RMN

H e

C para o 28-Desoxonimbolídeo.

Isolado (CDCl

) Literatura [85] (CDCl

)Carbono

H / J (Hz)

1 - 202,4 - 202,4

2 5,89 (d) 9,0 130,3 5,84 (d) 9,4 130,3

3 7,06 (d) 9,0 152,0 7,01 (d) 9,4 152,0

4 - 42,0 - 42,0

5 2,28 (d) 12,4 49,3 2,76 (d) 12,6 49,0

6 4,13 (d) 12,4 72,5 4,06 (dd) 12,6; 3,4 72,5

7 4,20 (s) 85,3 4,16 (d) 3,4 85,3

8 - 50,6 - 50,6

9 2,65 (t) 5,4 41,4 2,60 (t) 5,4 41,2

10 - 46,1 - 46,1

11 a. 2,81 (dd) 16,0; 5,4

b. 2,36 (dd) 16,0; 5,4

32,6 a. 3,20 (dd) 16,1; 5,4

b. 2,31 (dd) 16,1; 5,7

32,4

12 - 173,3 - 173,3

13 - 135,1 - 135,1

14 - 145,9 - 145,9

15 5,50 (sl) 87,8 5,45 (m) 87,8

16 2,13 (m) 41,2 a.2,15(ddd; 8,3;6,4;1,0)

b.2,10(ddd; 8,3;6,6;1,2)

41,5

17 3,65 (d) 8,2 49,5 3,59 (dd) 8,3; 1,2 49,4

18 1,69 (d) 1,7 12,8 1,67 (s) 12,9

19 1,15 (s) 14,6 1,17 (s) 14,6

20 - 126,8 - 126,8

21 7,06 (sl) 138,8 7,16 (s) 138,8

22 6,27 (m) 110,4 6,22 (s) 110,4

23 7,31 (t) 1,6 143,0 7,27 (s) 143,0

28 a. 3,80 (d) 6,2

b. 3,73 (d) 6,2

79,3 a. 3,75 (d) 7,2

b. 3,68 (d) 7,2

79,3

29 1,34 (s) 20,5 1,55 (s) 20,6

30 1,30 (s) 17,3 1,31 (s) 17,3

OMe 3,54 (s) 51,6 3,49 (s) 51,6

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Figura 2.24 – Espectro de RMN

H do 28-Desoxonimbolido (CDCl

, 400 MHz).

Figura 2.25 – Espectro de RMN

C do 28-Desoxonimbolido (CDCl

, 100 MHz).

H-21

H-23

H-3 H-2

H-22

H-15

H-6

H-7

H-17

H-11a

H-5

H-11b

H-9

H-16

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

H-28

2829

MeOOC

H-21

H-23

H-3 H-2

H-22

H-15

H-6

H-7

H-17

H-11a

H-5

H-11b

H-9

H-16

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

H-28

2829

MeOOC

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Figura 2.26 – Espectro de COSY do 28-Desoxonimbolido (CDCl

, 400 MHz).

Figura 2.27 – Espectro de HSQC do 28-desoxonimbolido (CDCl

, 100 MHz).

152,0

2 15 6

9 16 16

143,0

130,3

110,4

138,8

87,8

72,5

85,3

51,6

49,5

41,4

49,3

12,8

20,5

17,3

14,6

79,3

152,0

2 15 6

9 16 16

143,0

130,3

110,4

138,8

87,8

72,5

85,3

51,6

49,5

41,4

49,3

12,8

20,5

17,3

14,6

79,3

6/5

15/16

11a/9

17/16

11a/11b

9/11b

3/2

6/5

15/16

11a/9

17/16

11a/11b

9/11b

3/2

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Figura 2.28 – Espectro de HMBC do 28-desoxonimbolido (CDCl

, 100 MHz).

2.5.2.3 Determinação Estrutural da Salannina (Substância 03)

Ao analisar os espectros da substância 03 foram observados sinais

referentes a outro limonóide. Apesar de que esta substância apresenta sinais

parecidos com os limonóides discutidos anteriormente, não foram observados os

sinais característicos do anel A α,β-insaturado. Também foram observados novos

sinais de metilas. Assim, a determinação estrutural da substância 03 foi proposta

pela análise dos espectros de RMN

H (Figura 2.29),

C (Figura 2.30), e pelos

2 15 6

9 16 16

9, 16

4 5

OMe

2 15 6

9 16 16

9, 16

4 5

OMe

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experimentos de COSY, HSQC e HMBC (Figuras 2.31, 2.32 e 2.33

respectivamente).

No espectro de hidrogênio, observou-se um sinal em δ 7,29 (s) que se

correlaciona via HSQC com um carbono em δ142,9 e, via HMBC, com os carbono δ

138,7 e δ 127,1. O carbono em δ 138,7 correlaciona-se a

J à um hidrogênio em δ

7,22 (s). Este hidrogênio se correlaciona com três carbonos, δ 142,9, 127,1 e 110,6

(

J ou

J). Observa-se também que o carbono em δ 110,6 se correlaciona com o

hidrogênio em δ 6,26 (s) (via HSQC) que por sua vez, se correlaciona (via HMBC)

com os carbonos δ142,9, 138,7 e 127,1. Pela falta de correlações no HSQC,

observa-se que o carbono em δ 127,1 é referente a um carbono sem hidrogênio

diretamente ligado a ele, onde, pelas correlações, define como sendo o C-20. Assim,

pode-se propor duas sub-estruturas iguais para as atribuições do anel furano porém

com correlações diferentes

O carbono C-22 é facilmente reconhecido. Este carbono sofre um

efeito de blindagem eletrônica causada pela conjugação entre um par de elétrons

livres do oxigênio com a ligação π da dupla ligação entre C-22 e C-23. Porém as

posições C-21 e C-23, somente é possível defini-las observando qual destes

carbonos se correlaciona com o H-17. Somente o C-21 pode apresentar esta

correlação a três ligações (

J). Desta forma, analisando as correlações dos carbonos

do anel furano, os carbonos δ110,6 (C-22), δ127,1 (C-20) e entre o carbono δ138,8

apresentaram correlação com um hidrogênio em δ 3,60 (d; 8,8 Hz) [δ 49,4]. Estas

correlações permite definir o carbono δ138,8 como sendo o C-21 e o hidrogênio em

δ3,60, como sendo o H-17 e conseqüentemente seu carbono δ49,4 encontrado, via

HSQC, como sendo o C-17. Por estas correlações, o anel furano (A) proposto,

apresenta as corretas correlações para este limonóide.

Estrutura B

Estrutura A

142

138

127

110

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O H-17 apresenta diversas correlações. Além dos carbonos do anel

furano, se correlaciona com os carbonos sp

em δ 134,9 e 146,5, com um carbono

carbinólico δ 87,9, com um carbono de um grupo metílico δ 13,0 e com um carbono

de um grupo metileno δ 41,4. O carbono em δ 13,0 é definido com um carbono de

uma metila, observando que este carbono, mostra uma correlação de

J no

experimento de HSQC com três hidrogênios em δ 1,63(s). Apesar de uma região

magnética não equivalente, os hidrogênios deste grupo metílico, apresentam o

mesmo deslocamento químico. A equivalência química dos hidrogênios de um

grupamento CH

resulta da rotação rápida em torno da ligação simples carbono-

carbono. Esta rápida rotação ocorre em um tempo menor que 10

-3

segundos, e o

sistema de spins deste grupo metílico é denominado A

. O mesmo fenômeno ocorre

em todos os grupos metílicos desta molécula.

O grupo metileno é confirmado pelo experimento de HSQC, onde

se observa que o carbono δ 41,4 se correlaciona com dois hidrogênios não

equivalentes, um em δ 2,25 (m) e outro em δ 2,09 (m). O carbono carbinólico em δ

87,9 que também se correlaciona com o H-17 e a

J com um hidrogênio em δ 5,40

(tl; 7,0 Hz).

O hidrogênio de deslocamento químico de δ 2,25 se correlaciona

com o carbono δ 146,4 e acopla com o hidrogênio H-17 e com o hidrogênio

carbinólico em δ 5,40 via COSY. Estas correlações permitem por o grupo metileno

entre o H-17 e o hidrogênio δ5,40.

O hidrogênio δ5,40 se correlaciona com os carbonos sp

em δ134,9 e

em 146,5. Estas correlações, mais as correlações acima descritas, permitem propor

uma ligação dupla no anel D deste composto, lembrando que o carbono em δ 134,9

C CH

4 87

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também se correlaciona com os hidrogênios δ5,40, 3,60 e com a metila em δ 1,63 e

o carbono em δ 146,5 com os hidrogênios δ 5,40, δ 3,60, δ 2,25. Este carbono em δ

146,5 também se correlaciona com as metilas δ 1,63(s) e δ 1,26 (s) [δ 16,9]. A

correlação entre o carbono δ134,9 com apenas uma metila e as do carbono δ 146,5

com duas metilas permite distinguir ambos os carbonos, sendo que ao carbono δ

134,9 (C-13) somente é permitido, respeitando as correlações a

J, se correlacionar

apenas com a Me-18 ao passo, que ao C-14 (δ146,5) nos limonóides, é permitido se

correlacionar com as metilas 18 e 30, ambas em um

J. Desta forma, a metila em δ

1,63(s) é confirmada com sendo a M-18, pela correlação J

entre seus hidrogênios

com o C-13 e pela correlação

J com o C-14. Assim, a correlação entre C-14 com a

metila em 1,26(s) à

J finaliza o anel D da molécula. Esta metila em δ 1,26 se

correlaciona via HSQC com o carbono δ 16,9 permitindo propor a seguinte sub-

estrutura de um anel D para um limonóide C-seco.

A metila em δ1,26 (s) [δ 16,9] além de se correlacionar com C-14 (δ

146,5), apresenta correlações com um carbono quaternário δ 49,0, e com dois

carbonos terciários δ 39,4 e δ 85,6. O carbono δ 39,4 se correlaciona (via HSQC)

com um hidrogênio em δ2,71 (m) e o carbono δ85,6, por sua vez, com o hidrogênio

δ 4,41 (d; 3,1 Hz). O carbono δ 49,0 além de se correlacionar com os próprios

hidrogênios da Me-30 apresenta correlação com o hidrogênio δ 2,71 e com dois

hidrogênio metilênicos não equivalentes δ 2,25 (m) e δ 2,09 (m). Estes hidrogênios

são confirmados pelo HSQC como pertencentes a um mesmo grupo metileno.

O carbono δ 85,6 acopla com um hidrogênio δ 4,41. Esse hidrogênio

se correlaciona com os carbono δ 39,9 e 72,6 e com o carbono da M-30. Este

hidrogênio também acopla com um hidrogênio vizinho δ 3,95 (dd; 12,5 e 3,1 Hz) [δ

72,6] como pode ser observado no espectro de COSY. O hidrogênio δ 3,95 se

correlaciona com o carbono δ 85,6. O carbono δ 72,6 se correlaciona com um

134

146

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hidrogênio δ 2,77 (d; 12,6 Hz) [δ39,9] e com um hidrogênio metilênico em δ 3,57 (d;

7,5 Hz). Este hidrogênio δ 3,95 também acopla (observado via COSY) com o

hidrogênio em δ 2,77 (d; 12,6 Hz). A correlação

J do carbono terciário δ 39,4 com o

hidrogênio em δ 2,71 (dd; 8,2 e 4,2 Hz) e a correlação entre deste hidrogênio (δ

2,71) com os carbonos δ 146,5 (C-14), δ 30,7; 49,0; 40,6 e 172,8 conclui o anel B.

Uma vez que no experimento de HMBC realizado é permitido uma constante de

correlação máxima à três ligações entre hidrogênios e carbonos, este hidrogênio δ

2,71 pode ser definido como sendo o H-9. Esta afirmação pode ser racionalizada

uma vez que a classe de limonóides C-seco apresentam um C-8 quaternário e o C-7

como sendo um carbono funcionalizado. Desta maneira, pela correlação com a Me-

30, somente restou ser δ 4,41 o H-7 e o C-8 δ 49,0. Através das correlações via

COSY encontradas para o sistema de spins relacionado ao H-7, e através das

análises das constantes de acoplamento, os hidrogênios δ 3,95 e δ 2,77, permitem

caracterizar H-6 e H-5 respectivamente. Assim, pode-se propor a seguinte estrutura

para o anel B:

O anel C-seco foi caracterizado pelas correlações entre o grupo éster

metílico com H-9 (δ 2,77). Pelo espectro de HMBC observa-se o sinal do hidrogênio

de metila em δ 3,20 (s) se correlacionado com um carbono em δ 51,5. Esta metila

apresenta apenas uma correlação, com um carbono em δ 172,8 o mesmo carbono

que se correlaciona com o H-9. Este carbono carboxíalquílico também se

correlaciona com os hidrogênios metilênicos δ 2,25 (m) e 2,09 (m). Os hidrogênios

deste grupo metileno se correlaciona

J com o carbono δ 30,7 e a

J ou

J com C-8.

Estando o anel B e D totalmente atribuído, resta apenas ser este grupo metilênico o

C-11. Estas correlações permitem propor o anel C-seco como:

146

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O H-5, δ 2,77 (d; 12,6 Hz) [δ 39,9], ainda apresenta correlação com

duas metilas, uma em δ 0,95 (s) [δ 15,1] e outra em δ 1,18 (s) [δ 19,6]. Além das

metilas, ele se correlaciona com os carbonos quaternários δ 42,7 e 40,6. O carbono

em δ40,6, por se correlacionar com o H-11 que pode ser caracterizado como C-10 à

. A metila em δ0,95 se correlaciona com C-5, com C-10, com um sinal de carbono

em δ 71,3 e com δ C-9. A correlação com C-9 permite propor como sendo a Me-19.

A metila em δ 1,18 que se correlaciona com um sinal de carbono em δ 71,3, e

também com um carbono δ 77,6, o qual pelo HSQC observa ser um CH

, se

correlaciona com C-5 e com o carbono quaternário em δ 42,7, levando a propô-la

como sendo a Me-29 acoplando com C-3 (

J), C-28 (

J), C-5 (

J), C-4 (

respectivamente. Ambas as metilas, Me-29 e Me-19 se correlacionam com um

carbono em δ 71,3, o qual pelo HSQC acopla com dois hidrogênios. Assim, pela

distância entre as metilas não pode ser um grupo metilênico comum a ambas as

metilas, mas sim dois grupos C-H individuais que coincidiram o deslocamento

químico para o carbono.

Além disso, os hidrogênios da Me-29 se correlacionam com um

carbono em δ77,6, que pelo HSQC fornece um CH

, sendo um hidrogênio δ3,65 (d;

7,5 Hz) e outro em δ3,57 (d; 7,5 Hz), os quais no espectro de COSY acoplam entre

si. Anteriormente, foi mencionado a correlação entre C-6 e o hidrogênio δ3,57. Essa

correlação permite atribuir o sinal δ 77,6 para C-28 formando uma ponte éter entre

C-28 e C-6 [δ 72,6]. Desta forma, δ 3,65 vem a ser o H-28a e o hidrogênio δ 3,57 o

H-28b. Esta proposta é confirmada comparando os valores dos deslocamentos

químicos com os valores encontrados na literatura [174]. Os dados da literatura,

também permitem propor uma ponte éter entre o C-7 e o C-15. Por esta análise,

para concluir a estrutura deste limonóide, resta apenas definir o anel A.

172

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O experimento de HSQC apresenta a correlação do carbono δ 71,3

com o hidrogênio em δ4,92 (sl) e um segundo carbono, também em δ71,3, com um

hidrogênio em δ 4,75 (tl). O hidrogênio δ 4,92 se correlaciona com o carbono

quaternário δ 42,7 e com o C-5 [δ 39,9]. Estas correlações do hidrogênio δ 4,92

permitem definir este como H-3 e um dos carbonos em δ 71,3 como C-3 além de

confirmar o carbono em δ 42,7 como C-4. O experimento HMBC apresenta uma

correlação entre o H-3 e um carbono carboxialquílico em δ170,4. Este deslocamento

químico é bem característico na literatura para carbono de grupos acetato. Este

carbono se correlaciona com uma metila em δ 1,90 (s) [δ 20,8]. Esta metila, não

apresenta mais nenhuma correlação, o que permite propor um grupo acetato na

posição C-3 deste limonóide.

O hidrogênio em δ 4,75 (sl) [δ 71,3] se correlaciona com um

carbono em δ 166,8, com o outro carbono δ 71,3 (C-3) e com o C-5 [δ 39,9].

Respeitando as constantes de correlação, é possível propor este hidrogênio como

H-1. O carbono δ 166,8 se correlaciona com o próprio H-1, com um hidrogênio em δ

6,92 (dq; 7,1 e 1,5 Hz) [δ 137,2] e com duas metilas, uma em δ 1,90 (s) [δ 20,8] e

outra em δ 1,78 (d; 7,1 Hz) [δ14,4]. O hidrogênio em δ 6,92 se correlaciona com o

carbono δ 166,8 e com as metilas δ 1,90 e δ 1,78. Além destas correlações o

hidrogênio em δ 6,92 também se correlaciona com um carbono sp

em δ 129,0. As

metilas δ 1,78 e δ 1,90 também se correlacionam com este carbono além de se

correlacionarem com o carbono em δ 166,8. Estas correlações levam a um grupo

tigloila no C-1. Porém, este grupo apresenta duas metilas, uma em δ 1,78 e 1,90. A

posição destas metilas no grupo tigloila foram definidas analisando as constantes de

acoplamento de cada uma. O hidrogênio em δ 6,92 apresenta um duplo quarteto de

constantes 7,1 Hz e 1,5 Hz. A constante 7,1 Hz é uma constante característica de

MeOOC

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acoplamento entre um hidrogênio vinílico e uma metila vinílica geminados, e a

constante 1,5, característica para um acoplamento entre o hidrogênio vinílico e a

metila vinílica trans entre si. Deste modo, o fato da metila em δ 1,78 ter apresentado

um dubleto de constante 7,1 HZ, pode-se propor como sendo geminada com o

hidrogênio em δ 6,92 e este hidrogênio, na posição 3’ em relação ao C-1’, pois se o

hidrogênio estivesse na posição 2’, as metilas obrigatoriamente deveriam ser

geminais entre si. Assim, a metila em δ 1,90 que apresenta um singleto largo se

encontra na posição 5’, definindo o grupo tigloila. Restando apenas definir o anel A,

pode-se propor a seguinte estrutura:

Para concluir o anel A, resta apenas definir C-2. O espectro de

COSY, apresenta um hidrogênio em δ2,17 (m) [δ 27,6] acoplando com o H-1 e H-3,

ou seja, um hidrogênio vizinho comum a ambos os hidrogênios o que permite propor

como H-2 e conseqüentemente, pelo experimento de HSQC, o carbono em δ 27,6

como C-2. Esta correlação confirma o H-1 uma vez que este não apresentou

correlação nem com C-10, nem com C-9 e nem com a Me-19. Assim pode-se propor

a seguinte estrutura para a substância 03.

MeOOC

20 21

2829

170

166

129

137

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Esta substância 03 é metabólito secundário conhecido na literatura

[174] por Salannina, anteriormente já isolado das sementes do Nim. Neste estudo

fitoquímico do enxerto, ela foi isolado no cerne dos galhos do enxerto coletado em

Xambrê-PR. A confirmação final de sua estrutura pode ser obtida comparando os

dados dos espectros de RMN

H e

C obtidos com os dados da literatura

apresentados na Tabela 2.7.

Tabela 2.7 – Dados de RMN de

H e

C para o Salannina.

Isolado (CDCl

) Literatura [174] (CDCl

)Carbono

H / J (Hz)

1 4,75 (sl) 71,3 4,80 (t) 71,4

2 2,17 (m) 27,6 entre 2,05 e 2,35 27,4

3 4,92 (sl) 71,3 4,97 (t) 71,4

4 - 42,7 - 42,8

5 2,77 (d) 12,6 39,9 2,83 (d) 40,0

6 3,95 (dd) 12,5; 3,1 72,6 4,00 (dd) 72,7

7 4,14 (d) 3,1 85,6 4,18 (d) 85,8

8 - 49,0 - 49,1

9 2,71 (dd) 8,2; 4,2 39,4 2,76 (dd) 39,5

10 - 40,6 - 40,7

11 a. 2,25 (m)

b. 2,09 (m)

30,7 entre 2,05 e 2,35 30,7

12 - 172,8 - 172,8

13 - 134,9 - 134,9

14 - 146,5 - 146,7

15 5,40 (tl) 7,0 87,9 5,44 (m) 88,0

16 a. 2,25 (m)

b. 2,09 (m)

41,4 entre 2,05 e 2,35 41,5

17 3,60 (d) 49,4 3,66 (d) 49,5

18 1,63 (s) 13,0 1,67 (d) 13,0

19 0,95 (s) 15,1 0,99 (s) 15,1

20 - 127,1 - 127,1

21 7,22 (s) 138,7 7,33 (m) 138,9

22 6,26 (s) 110,6 6,30 (m) 110,6

23 7,29 (s) 142,9 7,26 (m) 143,0

28 a. 3,65 (d) 7,5

b. 3,57 (d) 7,5

77,6 a. 3,72 (m)

b. 3,58 (m)

77,7

29 1,18 (s) 19,6 1,22 (s) 19,6

30 1,26 (s) 16,9 1,30 (s) 16,9

OMe 3,20 (s) 51,5 3,24 (s) 51,5

OAc 1,90 (s) 170,4

20,8

1,94 (s) 170,3

20,8

1’ - 166,8 - 166,8

2’ - 129,0 - 129,2

3’ 6,90 (dq) 7,1; 1,5 137,2 6,96 (m) 137,2

4’-CH

1,78 (d) 7,1 14,4 1,81 (dd) 14,3

5’-CH

1,90 (s) 11,9 1,94 (s) 11,9

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Figura 2.29 – Espectro de RMN

H do Salannina (CDCl

, 400 MHz).

Figura 2.30 – Espectro de RMN

C do Salannina (CDCl

, 100 MHz).

H-21H-23

H-1

H-22

H-15 H-6

H-7

H-17 H-11; 16H-5

H-9

H-2

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

H-28

H-3

M-4’

M-5’

H-3’

MeOOC

20 21

2829

H-21H-23

H-1

H-22

H-15 H-6

H-7

H-17 H-11; 16H-5

H-9

H-2

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

H-28

H-3

M-4’

M-5’

H-3’

MeOOC

20 21

2829

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Figura 2.31 – Espectro de COSY do Salannina (CDCl

, 400 MHz).

Figura 2.32 – Espectro de HSQC do Salannina (CDCl

, 100 MHz).

6/5

15/16a

17/16

9/11

3/2 1/2

15/16b

7/6

6/5

15/16a

17/16

9/11

3/2 1/2

15/16b

7/6

23 1

15 6

7 17

11/165

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

M-4’

M-5’

3’

142,9

138,7 137,2

110,6

87,9

71,371,3

85,6

72,6

77,6

49,4

51,5

39,9

39,4

41,4

30,7

27,6

11,9

14,4

13,0

16,9

19,6

15,1

23 1

15 6

7 17

11/165

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

M-4’

M-5’

3’

142,9

138,7 137,2

110,6

87,9

71,371,3

85,6

72,6

77,6

49,4

51,5

39,9

39,4

41,4

30,7

27,6

11,9

14,4

13,0

16,9

19,6

15,1

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Figura 2.33 – Espectro de HMBC do Salannina (CDCl

, 100 MHz).

2.5.2.4 Determinação Estrutural do 6-O-Acetilnimbandiol (Substância 04)

O limonóide 6-O-Acetilnimbandiol foi isolado dos galhos do enxerto

coletado em Xambrê-PR. A literatura apresenta esta substância isolada no óleo das

sementes do Nim (Tabela 2.1). Sua estrutura foi determinada com base em

experimentos de RMN

C, COSY, HSQC e HMBC (Figuras 2.34, 2.35, 2.36,

2.37 e 2.38 respectivamente) assim como também através da comparação com

dados da literatura [92].

7 17

11/16

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

M-4’

M-5’

3’

1’

2’

1/3

OMe

OAc

5’

4’

3’

OAc

7 17

11/16

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

M-4’

M-5’

3’

1’

2’

1/3

OMe

OAc

5’

4’

3’

OAc

7 17

11/16

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

M-4’

M-5’

3’

1’

2’

1/3

OMe

OAc

5’

4’

3’

OAc

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Os espectros este metabólito não se diferenciam muito dos limonóides

C-seco já discutidos. Esta substância apresenta todos os acoplamentos e todas as

correlações características de um anel furano. O experimento de HSQC revela as

correlações entre os hidrogênios δ7,32, 7,23 e 6,32 com os carbonos δ143,1, 139,0

e 110,3 respectivamente. O experimento de HMBC trás as correlações entre estes

hidrogênios e carbonos, além das correlações

J e

J entre os hidrogênios e um

quarto carbono em δ 126,7 (C-20). As correlações entre C-20, C-21 e C-22 com um

hidrogênio em δ 3,64 (dl; 8,3 Hz) [δ 49,5] definem o anel furano e identifica o H-17 e

o C-17. Respeitando os acoplamentos e as correlações pode-se propor a seguinte

sub-estrutura.

Este limonóide também pertence a classe dos C-secos. Assim,

apresenta um anel D de cinco membros, um anel C-seco e um anel B sem nenhuma

modificação estrutural ou funcional comparado com as substânicas 01, 02 e 03, de

modo que a determinação estrutural desta região da molécula foi realizada como

nos casos anteriores. As poucas diferenças que ocorrem, são nos valores dos

deslocamentos químicos de hidrogênios e carbonos provenientes das modificações

na molécula como um todo. Deste modo, acompanhando os experimentos de 2D e

COSY para o limonóide, pode-se propor estes anéis como:

143

139

126

110

3,64

49,5

135

145

MeOOC

173

145

anel D anel C anel B

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Nos experimentos de HSQC e HMBC (Figuras 2.37 e 2.38) podem ser

observados as correlações dos C-13 [δ135,5] e C-14 [δ 145,7] , C-15 [δ 87,3], C-16

[δ 41,3] e da Me-18 [δ 1,68(s); δ 12,8] no anel D, além dos acoplamentos H-H no

espectro de COSY (Figura 2.36), exatamente como já descrito para as outras

substâncias. O mesmo ocorre no anel B, com os acoplamentos observados no

experimento COSY entre H-5 [δ 3,07 (d; 12,2 Hz)], H-6 [δ 5,46 (dd; 12,2 e 2,5 Hz)] e

H-7 (δ 4,08 (d; 2,5 Hz)], as correlações entre a Me-30 [δ 1,37(s); δ 17,1] com C-8 [δ

48,3], C-7 [δ 84,6] e C-9 [δ 38,6]; do H-9 [δ 2,79 (t; 5,1 Hz)] com Me-30, C-8 e C-7;

do H-7 com C-6 [δ 70,8] e C-8 e do C-5 [δ 48,1] e C-10 [δ 48,1] com Me-19 [δ 1,25

(s), δ 15,9]. No anel C podem ser observadas as correlações da Me-19 com H-9; do

C-10 com H-11a [δ 2,93 (dd; 16,2 e 5,1 Hz)] e com H-11b [δ 2,22(m)]; dos

hidrogênios H-9, H-11a, H-11b com C-12 [δ 173,4] e do grupo metoxila em δ 3,64 [δ

51,7] com C-12.

Esta substância também apresenta um anel A semelhante ao anel

descrito nas substâncias 01 e 02, ou seja, uma cetona α,β-insaturada nas posições

2 e 3. Podem ser observadas correlações entre H-5 e H-2 [δ 5,79 (d; 10,2 Hz)] com

C-4 [δ 70,1] e do H-3 [δ 6,49 (d; 10,2 Hz)] com C-1 [δ 201,8]. O carbono de

deslocamento químico δ 201,8 foi confirmado como sendo C-1 por apresentar

correlação com a Me-19. O H-2 também foi confirmado por apresentar correlação

com C-10. Além disso, os valores dos deslocamentos químicos de H-2 e H-3 são

justificados pela conjugação entre a ligação π da ligação dupla com o grupo

carbonílico, aonde, através de um efeito retirador de elétrons leva a uma

desblindagem maior ao H-3 que o H-2.

As modificações que ocorrem neste limonóide, principalmente em

relação às substâncias 02 e 03, são os valores dos deslocamentos químicos para H-

2, H-3 e H-6. Também foi notado uma elevada variação no deslocamento químico de

C-4. Contudo, a principal diferença neste limonóide é a ausência do C-28 e as

presenças de um grupo acetila e hidroxila. Analisando os experimentos 1D e 2D,

observa-se a correlação de H-3 com uma metila em δ 1,38 [δ 23,8]. Esta mesma

metila, também se correlaciona com H-5 permitindo propor ser ela a Me-28 ou a Me-

29 ligada ao C-4.

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Definindo estas correlações, as únicas correlações que restam nos

experimentos 2D a serem definidas, são referentes a um grupo acetila. Ou seja, há

no experimento de HMBC, um carbono carboxílico em δ 169,7 que se correlaciona

com um hidrogênio metílico em δ 2,22 [δ 21,7]. Além disso, a ausência de um

acoplamento no HSQC entre um sinal de carbono com um singleto largo de um

hidrogênio em δ 3,29 confirma a presença da hidroxila. Na molécula ainda falta

definir uma ligação para o C-4 (um carbono quaternário) e o grupo funcional de C-6.

O carbono C-4 e o hidrogênio H-6 apresentam deslocamentos de grupos

carbinólicos. Assim, a presença do grupo acetila ou da hidroxila em C-4 e em C-6,

justificam seus deslocamentos químicos e a ausência de C-28.

Desta maneira, pode-se ter a hidroxila em C-4 e o grupo acetil em C-6.

O inverso também pode ser verdadeiro, uma vez que nenhum destes grupos

apresentou correlação com outra parte da molécula. Contudo, a literatura para esta

classe de limonóides relata apenas a presença da hidroxila em C-4 e do grupo

acetila em C-6. Comprando os resultados do espectro de RMN

H com os dados da

literatura [92] (Tabela 2.8), observa-se uma grande semelhança nos deslocamentos

químicos permitindo propor a mesma substância. Assim, a estrutura molecular da

substância 03 pode ser descrita como:

COOMe

H OR

201

124

151

MeOOC

20 21

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Tabela 2.8 – Dados de RMN

H e

C para o 6-O-Acetilnibandiol.

Isolado (CDCl

) Literatura (CDCl

)Carbono

H / J (Hz)

H [92]

1 - 201,8 -

2 5,79 (d) 10,2 124,5 5,78 (d) 10,0

3 6,49 (d) 10,2 151,1 6,37 (d) 10,0

4 - 70,1 -

5 3,07 (d) 12,2 48,1 3,07 (d) 13,0

6 5,46 (dd) 12,2; 2,5 70,8 5,44 (dd) 13,0; 3,0

7 4,08 (d) 2,5 84,6 4,07 (d) 3,0

8 - 48,3 -

9 2,79 (t) 5,1 38,6 2,77 (t) 5,0

10 - 48,1 -

11 a. 2,93 (dd) 16,2; 5,1

b. 2,22 (m)

34,1 a. 2,18 – 2,23 (m)

b. 2,91 (dd)17,0; 5,0

12 - 173,4 -

13 - 135,5 -

14 - 145,7 -

15 5,55 (tl) 6,6 87,3 5,5 (tl) 7,0

16 a. 2,22 (m)

b. 2,04 (m)

41,3 a. 2,00 – 2,08 (m)

b. 2,18 – 2,23 (m)

17 3,64 (dl) 8,3 49,5 3,64 (dl) 7,0

18 1,68 (s) 12,8 1,67 (s)

19 1,25 (s) 15,9 1,23 (s)

20 - 126,7 -

21 7,23 (s) 139,0 7,30 (sl)

22 6,32 (s) 110,3 6,30 (sl)

23 7,32 (s) 143,1 7,21 (sl)

29 1,38 (s) 23,8 1,37 (s)

30 1,37 (s) 17,1 1,35 (s)

OMe 3,64 (s) 51,7 3,62 (s)

OAc 2,22 (s) 169,7

21,7

2,20 (s)

OH 3,29 - 3,27 (s)

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Figura 2.34 – Espectro de RMN

H do 6-O-Acetilnimbandiol (CDCl

, 400 MHz).

Figura 2.35 – Espectro de RMN

C do 6-O-Acetilnimbandiol (CDCl

, 100 MHz).

H-21

H-23

H-3

H-2

H-22

H-15

H-6

H-7

H-17

H-11a

H-5

H-11b

H-9 H-16

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

OAc

MeOOC

20 21

H-21

H-23

H-3

H-2

H-22

H-15

H-6

H-7

H-17

H-11a

H-5

H-11b

H-9 H-16

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

OAc

MeOOC

20 21

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Figura 2.36 – Espectro de RMN COSY do 6-O-Acetilnimbandiol (CDCl

, 400 MHz).

Figura 2.37 – Espectro de HSQC do 6-O-Acetilnimbandiol (CDCl

, 100 MHz).

6/5

15/16a 17/16

11a/11b

23/22

15/16b

6/7

9/11b

6/5

15/16a 17/16

11a/11b

23/22

15/16b

6/7

9/11b

23 3 2

15 6

11a

5 11b

9 16

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

OAc

151,1

143,1

139,0

110,3

124,5

87,3

70,8

84,6

49,5

51,7

48,1

34,1

38,6

41,3

21,7

12,8

34,1

41,3

23,8

17,1

15,9

23 3 2

15 6

11a

5 11b

9 16

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

OAc

151,1

143,1

139,0

110,3

124,5

87,3

70,8

84,6

49,5

51,7

48,1

34,1

38,6

41,3

21,7

12,8

34,1

41,3

23,8

17,1

15,9

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Figura 2.38 – Espectro de HMBC do 6-O-Acetilnimbandiol (CDCl

, 100 MHz).

2.5.2.5 Determinação Estrutural do 6-Desacetilnimbineno (Substância 05)

A substância 05, 6-Desacetilnimbineno, como o 6-O-

Acetilnimbandiol é um 28-norlimonóide. Nesse trabalho, ele foi isolado das folhas do

enxerto coletado em Xambrê-PR. A literatura descreve a presença deste limonóide

nas folhas, na casca e no óleo das sementes de pé franco da A. indica. A Tabela 2.9

apresenta todos os valores dos deslocamentos químicos de RMN

H e

referentes ao 6-Desacetilnimbineno. Os espectros de RMN

H e

C e os

experimentos de COSY, HSQC e HMBC usados na sua determinação estrutural

encontram-se nas Figuras 2.39, 2.40, 2.41, 2.42 e 2.43 respectivamente. Sua

determinação estrutural é discutida a seguir.

OMe

5/10/8

15 6

11a

11b

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

OAc

OMe

5/10/8

15 6

11a

11b

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

OAc

OMe

5/10/8

15 6

11a

11b

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

OAc

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Como nas substâncias anteriormente já discutidas, a melhor forma de

se iniciar a determinação estrutural para um limonóide é pelos sinais de hidrogênio

do anel furano. Estes sinais são bem característicos, além de se encontrarem em

uma região bem desblindada do espectro. Assim, analisando os experimentos do 6-

desacetilnimbineno observa-se um sinal em δ 7,32 (t; 1,5 Hz) se correlacionando a

J com um carbono δ 143,1, a

J ou

J com os carbonos em δ 138,9, 126,8 e 110,4.

O carbono δ 138,9 se correlaciona com o hidrogênio em δ 7,22 (s) (via HSQC) o

qual, por sua vez, se correlaciona com os carbonos δ 143,1, 126,8 e 110,4 (via

HMBC). Observa-se também que o carbono δ 110,4 se correlaciona a uma ligação

com o hidrogênio em δ6,29 (m). Este hidrogênio, se correlaciona com os carbonos δ

143,1, 138,9 e 126,8. O carbono em δ 126,1 não apresenta correlação com

hidrogênio a uma ligação como pode ser observado no experimento de HSQC.

Estas correlações são características para o anel furano de limonóides. Ao analisá-

las pode se concluir ser o carbono em δ 126,8 o C-20 do anel furano, o carbono em

δ 110,4 (δ6,29) C-22 e os carbonos δ 143,1 (δ 7,32) e δ 138,9 (δ 7,22) os carbonos

C-23 e C-21. As posições atribuídas para o carbono δ 143,1 e δ 138,9 podem estar

invertidas.

Além destas correlações, também se verifica que ambos os carbonos δ

138,9, 126,8 e 110,4 se correlacionam com um hidrogênio em δ 3,68 (dd; 5,2 e 1,3

Hz) [δ 49,5]. Estas correlações sugerem a presença de um hidrogênio vizinho ao

anel furano, que pode ser definido como sendo H-17. A correlação do carbono δ

138,9 com H-17 o confirma como sendo C-21 definindo o anel furano. O carbono em

δ 110,4 é facilmente atribuído a posição C-22, sendo este carbono afetado pelo

efeito de blindagem de elétrons em virtude da conjugação da ligação π da ligação

dupla entre C-22 e C-23 com o par de elétrons livres do oxigênio. Estas correlações

permitem propor o anel furano como sendo:

143

138

110

126

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O H-17 (δ3,68), além das correlações com os carbonos do anel furano,

exibe correlações com um carbono em δ 147,2, outro carbono em δ 86,4 e uma

terceira correlação com um carbono em δ41,3. Os experimentos de COSY e HSQC

descrevem o carbono em δ 41,3 como um carbono de um grupo metilênico. Este

carbono se correlaciona com dois hidrogênios (via HSQC), um em δ2,19 e outro em

δ 2,07 ambos sendo multipletos. O carbono δ 86,4 se correlaciona a

J com o

hidrogênio δ 5,45 (m) e este último acopla (observado via COSY), com os

hidrogênios do grupo metilênico. Estes dados novamente sugerem um limonóide

com um anel C-seco. Para tanto, deve haver uma metila (Me-18) se correlacionando

com o C-17 [δ 49,5]. Esta metia é encontrada em δ 1,69 (d; 1,3 Hz). Além de se

correlacionar com o C-17, esta metila apresenta correlações com mais dois

carbonos, um em δ 147,2 e outro em δ 134,9 o que confirma como sendo a Me-18 e

os carbonos δ 134,9 e 147,2 serem os carbonos C-13 e C-14 não respectivamente.

Porém, o carbono em δ147,2 apresenta uma correlação com outra metila em δ 1,33

(s) [δ17,4]. Considerando ser esta metila em δ1,33 a Me-30, identifica o carbono em

δ 147,2 como C-14 e o carbono δ 134,9 como C-13. Por estas correlações, é

possível propor a seguinte estrutura:

A Me-30, demonstra outras correlações. Ela apresenta correlações

com um carbono carbinólico em δ87,9, com um quaternário δ47,3 e um terciário em

δ 37,1. O carbono δ87,9 refere-se a um grupo funcionalizado em C-7. Este carbono

funcionalizado vem da biossíntese dos limonóides. Este carbono δ 87,9 se

correlaciona no HSQC com o hidrogênio em δ 4,06 (d; 5,1 Hz) (H-7). O H-7 também

se correlaciona na HMBC com carbonos em δ 47,3 e δ 37,1, os quais deram

correlações com a Me-30. Respeitando as constantes de correlação a

J e

conclui ser o carbono δ 47,3 como C-8 e o carbono δ 37,1 como C-9. O C-9 se

correlaciona via HSQC com um hidrogênio em δ2,66 (dd; 6,0 e 4,4 Hz).

147

134

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O experimento HSQC mostra que se sobrepondo ao sinal do H-7 existe

um outro sinal de hidrogênio carbinólico em δ 4,04 (dd; 16,0 e 5,1 Hz) [δ 66,4]. O

experimento de HSQC ainda demonstra um hidrogênio em δ 2,81 (d;16,0 Hz)

correlacionando com um carbono em δ 47,2. Tanto o carbono δ 66,4 quanto o

hidrogênio δ4,04 não apresentaram correlações no HMBC, porém, pelas constantes

de acoplamento, facilmente pode-se deduzir como sendo H-6, o qual acopla com H-

5 e com H-7 com constantes de 16,0 e 5,1 Hz respectivamente. Deste modo, foi

possível também atribuir ao hidrogênio em α 2,81 a posição H-5. Estas constantes

também informam sobre a estereoquímica destes grupos. Entre o H-7 e o H-6 há

uma constante referente a um acoplamento equatorial-axial e entre o H-6 e o H-5

uma constante referente a um acoplamento axial-axial. Sabendo pela biosíntese que

o grupo funcional do C-7 se encontra em α, o H-7 só pode estar em β (equatorial) o

que leva o H-6 estar numa posição axial, também em β, e o H-5 estar numa posição

axial ao H-6, estando na face α. Assim pode-se propor a seguinte estrutura para o

anel B:

Além das correlações já descritas, o C-9 correlaciona-se com uma

metila em δ 1,05 (s) [δ 14,0] e essa também correlaciona-se com C-5 [δ 47,2] e com

um carbono em δ49,4 identificando a metila Me-19 e C-10. O HSQC demonstra dois

hidrogênios um δ 2,80 (dd; 16,2 e 6,0 Hz) e outro em δ 2,24 (dd; 16,2 e 4,4 Hz)

correlacionando a um mesmo carbono, indicando um grupo metilênico. Por suas

constantes de acoplamento, uma de 16,2 Hz, referente ao acoplamento geminal, e

as outras de 6,0 e 4,4 Hz, caracterizam este grupo CH

, como vizinho ao H-9 o qual,

apresenta um duplo dubleto de constantes de acoplamento de 4,4 e 6,0 Hz. Assim,

estes hidrogênios δ2,80 e 2,24 seriam o H-11a e o H-11b respectivamente. O H-11a

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se correlaciona com um carbono carboxilíco em δ 173,7 o qual se correlaciona com

uma metoxila em δ3,59 (s) [δ51,7] levando a propor um grupo éster em C-12.

Definido o anel B e o anel C, só resta definir o anel A. Analisando os

espectros, observa-se que apenas faltava atribuir uma metila em δ 2,04 (sl) [δ 21,8],

um carbono em δ 138,6, um hidrogênio em δ 5,58 (m) [δ 119,1], um grupo metileno

em δ 2,92 (m) [δ 39,9] e um carbono carboxílico em δ 213,3. A metila δ 2,04, pelo

HMBC, se correlaciona com os carbonos δ 119,1 e 138,6, ou seja estaria se

correlacionando com dois carbono sp

sendo um deles, o carbono δ 119,1,

correspondente ao CH com sinal em δ 5,58. O experimento COSY não forneceu

muitas informações para esta estrutura, porém, aqui, apresentou uma correlação

muito importante, mostrando um acoplamento entre o hidrogênio δ 5,58 com os

hidrogênios em δ 2,92 (m) [δ 39,9]. Considerando estas correlações, pode-se

resumir:

Além destas correlações, observa-se uma correlação entre a Me-19 e o

carbono δ 213,3 e, entre a metila δ 2,04 com o C-5 [δ 47,2]. Estas correlações

permitem propor a seguinte estrutura para o anel A:

173

H Me

119

138

213

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Definindo o anel A, resta apenas definir os grupos funcionais para o C-

6, C-7 e C-15. Semelhantemente aos compostos 01, 02, 03 e 04, este limonóide

apresenta deslocamentos químicos para C-7 e C-15 que permite propor uma ponte

éter entre estes carbonos. O valor do deslocamento químico do C-6, comparado

com a literatura, permite propor uma hidroxila em C-6. Desta maneira Assim, a

estrutura do limonóide foi concluída como sendo a substância 05, denominado 6-

Desacetilnimbineno.

Tabela 2.9 – Dados de RMN de

H e

C do 6-Desacetilnimbineno isolado.

Carbono

H / J (Hz)(CDCl

)

C Carbono

H / J (Hz) (CDCl

)

1 - 213,3 14 - 147,2

2 2,92 (m) 39,9 15 5,45 (m) 86,4

3 5,58 (m) 119,1 16 a. 2,19 (m)

b. 2,07 (m)

41,3

4 - 138,6 17 3,68 (dd) 5,2; 1,3 49,5

5 2,81 (d) 16,0 47,2 18 1,69 (d) 1,3 12,9

6 4,04 (dd) 16,0; 5,1 66,4 19 1,05 14,0

7 4,06 (d) 5,1 87,9 20 - 126,8

8 - 47,3 21 7,22 (s) 138,9

9 2,66 (dd) 6,0; 4,0 37,1 22 6,29 (m) 110,4

10 49,4 23 7,32 (s) 143,1

11 a. 2,80 (dd)16,2; 6,0

b. 2,24 (dd)16,2; 4,4

33,6 29 2,04 (s) 21,8

12 - 173,7 30 1,33 (s) 17,4

13 - 134,9 OMe 3,59 (s) 51,7

MeOOC

20 21

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Figura 2.39 – Espectro RMN

H do 6-Desacetilnimbineno (CDCl

, 200 MHz).

Figura 2.40 – Espectro RMN

C do 6-Desacetilnimbineno (CDCl

, 100 MHz).

11a

11b

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

MeOOC

20 21

11a

11b

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

MeOOC

20 21

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Figura 2.41 – Espectro COSY do 6-Desacetilnimbineno (CDCl

, 400 MHz).

Figura 2.42 – Espectro de HSQC do 6-Desacetilnimbineno (CDCl

, 100 MHz).

6/5

15/16a 17/16

23/22

15/16b

3/2

6/5

15/16a 17/16

23/22

15/16b

3/2

3 222

11a

5 11b9

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

143,1

138,9

110,4

119,1

86,4

87,9

66,4

49,5

51,7

39,9

47,2

33,6

37,1

41,3

33,6

21,8

12,9

17,4

14,0

3 222

11a

5 11b9

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

143,1

138,9

110,4

119,1

86,4

87,9

66,4

49,5

51,7

39,9

47,2

33,6

37,1

41,3

33,6

21,8

12,9

17,4

14,0

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Figura 2.43 – Espectro de HMBC do 6-Desacetilnimbineno (CDCl

, 100 MHz).

2.5.2.6 Determinação estrutural da Nimbolina A (Substância 06)

A nimbolina A é um limonóide isolado das raízes do enxerto coletado

em Xambrê-PR. A raiz pertence ao porta enxerto (cavalo). Deste modo, a raiz deve

manter as características metabólicas da Melia azedarach. Esse composto não

refere-se a uma substância inédita, já tendo sido isolada anteriormente em M.

azedarach e M. birmanica. Esta substância diferencia-se das cinco outras

anteriormente discutidas por não apresentar o anel C-seco. Sua determinação

estrutural é discutida a seguir. Por falta de dados de

C não encontrados na

literatura, os valores de RMN

H e

C esta substância foram comparados com os

valores apresentados para a Trichilinina D, sendo esta, um limonóide de grande

semelhança estrutural. Estas substâncias apresentam uma grande similaridade

11a

2123

11b

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

OMe

5/8

10/17

21/4

11a

2123

11b

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

OMe

5/8

10/17

21/4

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entre si. A Tabela 2.10 apresenta todos os deslocamentos químicos de RMN

H e

C referentes à substância 06 e a Trichilinina D. Os espectros de RMN

H, RMN

C, COSY, HSQC e HMBC encontram-se nas Figuras 2.44, 2.45, 2.46, 2.47 e 2.48

respectivamente.

Os experimentos 1D e 2D para este composto foi realizado em um

microprobe de 60 µL devido a pouca quantidade de amostra. Assim, obteve-se uma

melhor relação sinal/ruído proveniente do aumento na concentração. Todavia, o uso

desta técnica, leva a perda da multiplicidade entre os acoplamentos

H-

proveniente da perda na resolução. Esta perda de resolução ocorre uma vez que

não há a rotação em torno do eixo vertical da amostra no rotor do equipamento.

Assim, sem este giro, não ocorre a compensação da não homogeneidade com

campo magnético.

O espectro de RMN

H apresenta os sinais característicos referentes

aos hidrogênios do anel furano. Assim, num primeiro momento foi definido este

primeiro anel. As correlações entre o hidrogênio δ7,34 (s) [δ142,5] com os carbonos

δ 139,7, 124,5 e 111,0.; o hidrogênio δ 7,19 (s) com os carbonos δ 142,5, 124,5 e

111,0 e o hidrogênio δ 6,24 (s) com os carbonos δ 142,5, 139,7 e 124,5, definem os

hidrogênios e carbonos do anel furano. A correta posição de cada um, é definida

analisando os deslocamentos químicos individuais. Devido a conjugação entre um

par de elétrons do oxigênio com os elétrons π define o carbono δ 111,0 como C-22.

O carbono δ 124,5 como C-20. A dúvida fica entre C-21 e C-23, uma vez que as

correlações permitem colocar tanto o carbono δ 142,5 quanto o δ 139,7 em ambas

as posições sem gerar erros de correlação. Contudo, a correlação a um

J entre C-

21 e H-17 define o carbono δ 139,7 como C-21 restando ao carbono δ 142,5 a

posição C-23. Estas correlações definem o anel furano e a posição 17 sendo o H-17

δ 2,81 e o seu respectivo carbono δ 51,5. Assim, respeitando as correlações pode-

se propor:

142

139

111

124

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O H-17 apresenta outras correlações além das já descritas. Ele se

correlaciona com um carbono quaternário δ 47,3, com um carbono de metila em δ

21,5, um carbono δ 34,2 e um outro δ 32,9. O carbono δ 34,2 correlaciona (via

HSQC) com um multipleto em δ 2,37. Este multipleto acopla (observado no COSY),

com o H-17. Assim, estas correlações permitem atribuir este multipleto como sendo

os H-16a e H16b e o carbono metilênico δ 34,2 ao C-16. O hidrogênio em δ 2,37 se

correlaciona com C-17 e com os carbonos δ 47,3, 157,3 e 120,7. O carbono δ 47,3

se correlaciona com a metila em δ 0,85 [δ 21,5]. Esta metila se correlaciona com C-

17 e com este carbono δ 47,3 posicionando-a como sendo a Me-18. O carbono δ

47,3, além das correlações já mencionadas, ainda se correlaciona com o H-16 (δ

2,37). Uma vez que os espectros de HMBC em geral é permitindo uma correlação

máxima entre H → C a três ligações de distância, o carbono em δ47,3 deve ser o C-

13 ou C-14 no anel D do limonóide. O H-16 ainda acopla (COSY) com um hidrogênio

em δ5,56. Visto que o H-17 já foi identificado, resta a este hidrogênio ser o H-15. O

H-15 correlaciona (observado via HSQC) com um carbono sp

em δ 120,7 [C-15].

Sendo C-15 um carbono insaturado deve haver outro carbono insaturado sp

visinho

a ele. Este carbono C-14 [δ157,3] é identificado pela sua correlação com H-16. O C-

14 também se correlaciona com a metila em δ 0,85 (Me-18). Sendo o carbono em δ

157,3 definido como C-14, sua correlação com o sinal em δ 0,85 confirma este para

Me-18. Assim, a Me-18 se correlacionando com δ 47,3 permite atribuí-lo ao C-13.

Através destas correlações se obtém a seguinte estrutura para o anel D:

O C-14 [δ157,3] apresenta uma importante correlação com uma metila

em δ 1,24 (s) [δ26,3]. Esta correlação confirma o carbono C-14 apresenta a Me-30.

Esta metila δ1,24 se correlaciona com os carbonos δ44,5, 74,2 e δ35,2. O carbono

δ 44,5 é um carbono quaternário que se correlaciona com a própria Me-30 e com os

hidrogênios em δ 5,72 (sl) [δ 74,3], δ 2,70 (m) [δ 35,2] e o H-14 em δ 5,56.

3734

120

157

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Principalmente esta correlação entre o carbono δ44,5 com o H-14, confirma ser este

o C-8. Uma vez definido C-8, as correlações da Me-30 com os carbonos δ 35,2 e δ

74,2 (mesmas correlações apresentadas pelo C-8) se pode definir estes carbonos,

respeitando a distância entre as ligações químicas, como sendo C-9 e C-7

respectivamente, posicionados no anel B. Assim, obtém-se :

O H-17 além das correlações já descritas, apresenta mais uma

correlação com um carbono em δ32,9, o qual (observado via HSQC) se correlaciona

a um hidrogênio em δ 2,34. O C-13 [δ 47,3] também se correlaciona com este

hidrogênio. Uma vez já definido H-16, pode-se propor para este sinal H-12 e,

conseqüentemente, o carbono em δ 32,9 para C-12. O C-12 além de se

correlacionar com o H-17, também se correlaciona com a Me-18 (δ 0,85)

confirmando sua posição. Definido C-12, para completar o anel C, falta definir C-11.

O C-9 [δ 35,2] demonstra correlações com hidrogênios em δ 2,66, 1,65, 1,39 e com

metilas em δ 1,24 e 1,05. O C-8, também demonstra correlação com o hidrogênio δ

1,39 . O H-9 (δ 2,70) se correlaciona com um carbono δ 39,1, com o carbono Me-30

[δ 26,3], e com um carbono em δ 15,3. O carbono em δ 39,1 é um carbono

quaternário. Uma vez determinado a Me-30 (δ1,24), esta segunda metila que C-9 se

correlaciona em δ 1,05, somente pode ser referente a Me-19. Determinando a Me-

19, toda a região vizinha a C-9 no anel encontra definida. O sinal do carbono δ 15,3

atribuído a Me-19, demonstra uma sobreposição de sinais, indicando outro carbono

de deslocamento químico de δ 15,3. Assim, Pelas correlações de C-9 com os

hidrogênios δ 1,65 e 1,39 somente podem ser esses referentes aos hidrogênios H-

11a e H-11b. Porém, estes hidrogênios não apresentaram correlações nos HSQC.

Assim, a confirmação de C-11 ocorreu pela comparação com dados apresentados

na literatura [55]. Até este momento, é possível propor a seguinte estrutura:

157

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O carbono definido como C-7 em δ74,3 via HSQC se correlaciona com

um hidrogênio em δ5,72 (sl) e via HMBC com um hidrogênio em δ4,26 (dl; 12,0 Hz).

Este hidrogênio δ 4,26 se correlaciona com um carbono em δ 72,7 (observado via

HSQC) e acopla o hidrogênio em δ 5,72 (observado via COSY). O hidrogênio em δ

5,72 ainda se correlaciona com o carbono δ 41,4 (via HMBC). O carbono em δ 72,7

também se correlaciona com um hidrogênio em δ 2,66 e com seu respectivo

hidrogênio (δ 4,26). Este hidrogênio em δ 4,26 acopla com o hidrogênio em δ 2,66

(observado via COSY). Esses acoplamentos do COSY indicam que o H-7 (δ 5,72)

acopla com o H-6 (δ4,26) e o H-6 acopla com H-7 e com H-5 (δ2,66), aliás este H-5

se correlaciona a um

J com C-9 [δ 35,2] confirmando sua posição. O HSQC mostra

H-5 correlacionando com um carbono em δ 41,4. Estas correlações concluem o anel

B como:

Nos limonóides anteriormente discutidos o C-7 apresentava uma ponte

éter com C-15. Este, todavia, apresenta uma nova correlação entre H-7 e um

carbono em δ 165,3. Este carbono carbonílico δ 165,3 se correlaciona com um

hidrogênio em δ7,71 (d; 15,8 Hz), com um hidrogênio em δ6,41 (d; 15,8 Hz) e com

o próprio H-7. O espectro de COSY demonstra o acoplamento entre estes

hidrogênios δ 7,71 e δ 6,41 indicando uma ligação dupla vizinha ao carbono

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carbonílico, ou seja, um éster α,β-insaturado. A constante de acoplamento entre os

hidrogênios, indica uma ligação dupla trans. O hidrogênio δ 7,71 (H-3’) correlaciona

(

J) com um carbono em δ143,7 [C-3’] e o hidrogênio δ 6,41 (H-2’) com um carbono

em δ 119,0 [C-2’]. O carbono 119,0 pode ser definido como C-2’ visto que,

semelhante ao efeito de blindagem que ocorre no anel furano para a posição C-22,

a conjugação dos elétrons π da dupla ligação com os elétrons π da carbonila,

apresenta a propriedade de desblindar a C-3’. É comum em Melia a presença de um

grupo cinnamoila. Este grupo apresenta um anel aromático ligado ao carbono C-3’.

Observando o hidrogênio em δ 7,71, nota-se que ele se correlaciona com os

carbonos C-1’ e C-2’ e com outros carbonos em δ 127,6 e 134,5. O H-2’ também se

correlaciona com o carbono δ 134,5. Este carbono em δ 134,5 é um carbono sp

totalmente substituído. Estas correlações entre os H-2’ e H-3’ com o carbono em δ

134,5 permite defini-lo para C-4’. Em δ 127,6 se observa um sinal referente a dois

carbonos equivalentes entre si e, devido a correlação entre estes carbonos com o H-

3’ é possível propor ser referente a dois carbonos equivalentes nas posições C-5’ e

C-9’ em um anel aromático mono substituído. O HSQC trás as correlações destes

carbonos com dois hidrogênios também equivalentes entre si em δ 7,43.

Observando os espectros de RMN

H e

C estes ainda apresentam um sinal em δ

130,0 o qual se correlaciona à um hidrogênio em δ 7,38 (observado via HSQC). O

hidrogênio δ 7,38 se correlaciona com o carbono em δ 127,6 [C-5’/C-9’] e com o

carbono δ 134,5 [C-4’] permitindo defini-lo como H-6’ ou H-8’. A intensidade do sinal

no espectro de RMN

C para este sinal em δ 130,0 permite atribuí-lo aos dois

carbonos C-6’ e C-8’. Anéis aromáticos mono substituídos apresentam um plano de

simetria onde os hidrogênios em uma face do plano, assim, podem, por um

elemento de simetria, se interconverterem nos hidrogênios do outro plano, sendo

estes hidrogênios equivalentes entre si. Além destas correlações o hidrogênio em δ

7,43 se correlaciona a

J com um carbono em δ 130,3. Este carbono, no HSQC

correlaciona-se a um hidrogênio em δ 7,34. Restando apenas definir o carbono para

em relação ao carbono substituído neste anel benzeno, este carbono e hidrogênio

podem ser então, definidos como C-7’ e H-7’ respectivamente. Considerando estas

correlações pode se propor um anel benzeno ligado ao grupo éster α,β-insaturado

propondo um grupo cinnamoíla em C-7. Deste modo, o grupo cinnamoíla pode ser

proposto sendo:

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Definindo o grupo funcional do C-7 falta ainda concluir o anel A e o

grupo funcional para C-6. O H-5 (δ 2,66) além das correlações já apresentadas com

o C-10 [δ 39,1], com C-6 [δ 72,7] e com a Me-19 [δ 1,05] se correlaciona com uma

metila em δ1,20 [δ19,2], com um carbono quaternário em δ42,1 e com um carbono

carbinólico δ 72,4. Os hidrogênios da metila em δ 1,20 [δ19,2] também se

correlacionam com o carbono δ 42,1 e com outros dois carbonos carbinólicos em δ

71,6 e 77,9. O carbono desta metila [δ 19,2] se correlaciona com o H-5 e com dois

hidrogênios, um em δ 3,51 (d; 7,3 Hz) e outro em δ 3,43 (d; 7,3 Hz). Pelo HSQC

observa-se que estes dois últimos hidrogênios se correlacionam com um único

carbono em δ 77,9 fornecendo um grupo CH

. O hidrogênio δ 3,51 se correlaciona

com C-5, com a metila δ 1,20 e com C-6. O hidrogênio δ 3,43 se correlaciona com o

carbono quaternário δ 42,1, com a metila δ 1,20 e com o carbono δ 71,6. Estas

correlações descrevem o carbono δ 42,1 como C-4, a metila δ 1,20 como Me-29 e

indica a presença de uma ponte éter entre o grupo metilênico em C-28 e o C-6. Esta

ponte éter justifica os valores de C-28 e C-6 como carbonos carbinólicos. Desta

forma, o hidrogênio δ 3,51 vem a ser o H-28a e o hidrogênio δ 3,43 o H-28b. Além

disto, a correlação de H-28b com o carbono em δ 71,6 identifica este carbono como

C-3 restando ao carbono δ 72,4 a posição C-1. O C-1 é confirmado observando sua

correlação com H-5 a

J. Assim, o seguinte anel A pode ser proposto:

165

127

134

130

H H

OCin

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O C-3 [δ 71,6] se correlaciona a

J com um hidrogênio em δ 4,93 (sl)

sendo o H-3. O H-3 se correlaciona com o C-1 e com a Me-29. O carbono em δ72,4

se correlaciona a

J com um hidrogênio em 4,78 (sl) sendo este o H-1. O espectro

de COSY demonstra o acoplamento de H-1 com um hidrogênio em δ 2,14 (sl) [δ

27,6] identificando o H-2 e o carbono C-2. Esta afirmação é confirmada observando

a correlação deste hidrogênio com C-10 e C-4. O H-3 se correlaciona com um

carbono em δ 169,6 e este carbono se correlaciona com uma metila em δ 2,14 [δ

21,3] fornecendo um grupo acetato ligado em C-3. Correlações semelhantes são

observadas entre H-1 e um carbono em δ 169,8 e, entre este carbono em δ 169,8 e

outra metila em δ1,83 [δ20,7] também fornecendo um grupo funcional acetila em C-

Assim, concluído o anel A e a estrutura do limonóide foi como sendo a

substância 06, denominada Nimbolina A.

Nimbolina A

Trichilinina D

OCin

169

OCin

OAc

20 21

1'"

2'"

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Tabela 2.10 – Dados de RMN

H e

C para a Nimbolina A isolada e dados literatura

para a Trichilinina D.

Isolado (CDCl

) Literatura (CDCl

)Carbono

H / J (Hz)

H / J (Hz)[139]

C [55]

1 4,78 (sl) 72,4 4,94 (tl) 2,8 73,9

2 2,14 (sl) 27,6

α. 2,09(ddd)16,5;2,8;2,6

β. 1,30 (dt) 16,5; 2,8

30,4

3 4,93 (sl) 71,6 3,87 (m) 73,8

4 - 42,1 - 43,8

5 2,66 (m) 41,4 2,70 (d) 12,1 38,6

6 4,26 (dl) 12,0 72,7 4,21 (dd) 12,1; 2,9 72,7

7 5,72 (sl) 74,3 4,25 (d) 2,9 71,2

8 - 44,5 - 45,2

9 2,70 (m) 35,2 2,81 (dd) 12,5; 7,3 34,8

10 - 39,1 - 39,7

11 a.1,65 (m)

b.1,39 (m)

15,3 a. 1,11 (ddd)15,1;73,;6,5

b. 2,18 (m)

24,5

12 2,34 (m) 32,9 5,05 (dd) 9,1; 6,5 77,6

13 - 47,3 - 51,4

14 - 157,3 - 157,1

15 5,56 (s) 120,7 5,70 (m) 122,8

16 2,37 (m) 34,2 a.2,55(ddd)15,6;10,6;1,4

b. 2,45(ddd)16,2;7,9;3,4

36,6

17 2,81 (sl) 51,5 3,00 (dd) 10,6; 8,3 50,5

18 0,85 (s) 21,5 0,95 (s) 26,8

19 1,05 (s) 15,3 1,04 (s) 15,3

20 - 124,5 - 124,4

21 7,19 (s) 139,7 7,16 (tl) 0,7 140,2

22 6,24 (s) 111,0 6,18 (m) 111,6

23 7,34 (s) 142,5 7,27 (m) 142,0

28 a. 3,51 (d) 7,3

b. 3,43 (d) 7,3

77,9 a. 4,14 (bl) 7,4

b. 3,66 (d) 7,4

78,2

29 1,20 (s) 19,2 1,17 (s) 20,0

30 1,24 (s) 26,3 1,13 (s) 15,8

OAc

2,14 (s) 169,6

21,3

1,86 (s) 170,9

21,3

OAc

1,83 (s) 169,8

20,7

- -

- - 2,21 (m), 2,35 (sl) -

Cin

1' 165,3 - 165,3

2’ 6,41 (d) 15,8 119,0 6,34 (d) 16,1 117,1

3’ 7,71 (d) 15,8 143,7 7,71 (d) 15,8 146,4

4’ - 134,5 - 133,9

5’, 9’ 7,43 (m) 127,6 7,40 (m) 128,3

6’, 8’ 7,38 (m) 130,0 7,50 (m) 129,0

7’ 7,34 (m) 130,3 7,40 (m) 130,8

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Figura 2.44 – Espectro RMN

H da Nimbolina A (CDCl

, 400 MHz).

Figura 2.45 – Espectro RMN

C da Nimbolina A (CDCl

, 100 MHz).

11a

11b9

M-18

M-29

M-30

M-19

OAc OAc

5’/9’

6’/8’

7’

2’3’

28a

28b

20 21

1'"

2'"

11a

11b9

M-18

M-29

M-30

M-19

OAc OAc

5’/9’

6’/8’

7’

2’3’

28a

28b

20 21

1'"

2'"

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Figura 2.46 – Espectro de COSY da Nimbolina A (CDCl

, 400 MHz).

Figura 2.47 – Espectro de HSQC da Nimbolina A (CDCl

, 100 MHz).

3’/2’

23/22

7/6

15/16

3/2

1/2 6/5

17/16

9/11b

9/11a

3’/2’

23/22

7/6

15/16

3/2

1/2 6/5

17/16

9/11b

9/11a

11a5

11b

M-18

M-29

M-30

M-19

OAcOAc

5’/9’

6’/8’

7’

2’3’

28a

28b

143,7

127,6

130.0

130.3

142.5 139,7

119,0 120.7

111.0

74.3

71.6

72.4

72.7

77.9

51.5

41.4

34.2

27.6

20.7

21.3

26.3

19.2

15.3

21.5

11a5

11b

M-18

M-29

M-30

M-19

OAcOAc

5’/9’

6’/8’

7’

2’3’

28a

28b

143,7

127,6

130.0

130.3

142.5 139,7

119,0 120.7

111.0

74.3

71.6

72.4

72.7

77.9

51.5

41.4

34.2

27.6

20.7

21.3

26.3

19.2

15.3

21.5

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Figura 2.48 – Espectro de HMBC da Nimbolina A (CDCl

, 100 MHz).

2.5.2.7 Determinação estrutural do 6-Desacetilnimbina (Substância 07)

A substância 07 após sua determinação estrutural observou-se ser o

limonóide conhecido na literatura como 6-desacetilnimbina. Esta substância foi

isolada das folhas do enxerto coletado em Xambrê-PR. A literatura descreve seu

isolamento em sementes, óleo de sementes e nos brotos do Nim. Os experimentos

RMN 1 D e 2 D para este composto, são muito parecidos com os experimentos da

substância 04, o 6-O-Acetilnimbandiol. Realmente, após a análise dos experimentos

11a

11b

M-18

M-29

M-30

M-19

OAc OAc

5’/9’

6’/8’

7’

2’

3’

28a

28b

11/19

OAc

1/6

2’

5’/9’

6’/8’

7’

4’

1’

OAc/OAc

11a

11b

M-18

M-29

M-30

M-19

OAc OAc

5’/9’

6’/8’

7’

2’

3’

28a

28b

11/19

OAc

1/6

2’

5’/9’

6’/8’

7’

4’

1’

OAc/OAc

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de RMN 1 D e 2 D para esta substância, concluiu-se que as únicas diferenças entre

ambas são os grupos funcionais em C-4 e C-6. A 6-Desacetilnimbina apresenta um

grupo carboximetila em C-4 e uma hidroxila em C-6 a passo que, o 6-O-

Acetilnimbandiol, apresenta a hidroxila em C-4 e um grupo acetil em C-6. Contudo, o

6-O-Acetilnimbandiol foi classificado como 28-norlimonóide pela perda do C-28. A 6-

Desacetilnimbina é um tetranortriterpenóide com o C-28 oxidado. Significativas

modificações ocorrem apenas no C-4, o qual apresenta um deslocamento químico

em uma região do espectro de RMN

C em δ 47,8. Este resultado era esperado,

uma vez que o carbono C-28 como carboxila possui uma eletronegatividade inferior

a um grupo hidroxila. Além desta, outras diferenças é a ausência do grupo acetil no

espectro, presente na substância 04, e o surgimento de um grupo carboximetila. A

posição do grupo carboximetila em C-4 foi bem definida, uma vez que a Me-29 em δ

1,59 apresenta correlação no experimento de HMBC com este grupo. Os valores de

deslocamento químico para a substância 06 isolada, juntamente com os dados

apresentados na literatura, encontram-se tabelados na Tabela 2.11. Os espectros de

RMN

C, COSY, HSQC e HMBC utilizados na determinação estrutural podem

ser observados nas figuras 2.49, 2.50, 2.51, 2.52 e 2.53 respectivamente.

A descrição da análise dos experimentos de RMN 1D e 2D realizadas

para a determinação estrutural para esta substância não foi aqui apresentada devido

sua grande similaridade, já referida com a substância 04. Portanto, após uma

análise detalhada dos dados e a comprovação pela comparação com os dados da

literatura, a substância 04 foi identificada como sendo a 6-Desacetilnimbina.

MeOOC

COOMe

20 21

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Tabela 2.11 – Dados de RMN

H e

C para a 6-Desacetilnimbina.

Isolado (CDCl

) Literatura [174] (CDCl

)Carbono

H / J (Hz)

1 - 202,2 - 202,2

2 5,86 (d) 10,2 126,4 5,86 (d) 126,4

3 6,42 (d) 10,2 148,1 6,42 (d) 148,1

4 - 47,8 - 47,8

5 3,40 (d) 11,4 43,7 3,40 (d) 43,7

6 3,90 (dd) 11,4; 3,4 66,2 3,93 (dd) 66,1

7 4,03 (d) 3,4 87,0 4,03 (d) 86,9

8 - 47,3 - 47,3

9 2,77 (dd) 5,6; 3,4 39,1 2,77 (m) 39,1

10 - 47,5 - 47,5

11 a. 2,91 (dd) 16,0; 5,6

b. 2,22 (dd) 16,0; 3,4

34,4 a. 2,93 (m)

b. 2,25 (m)

34,3

12 - 173,6 - 173,7

13 - 134,9 - 134,8

14 - 146,8 - 146,9

15 5,56 (m) 87,5 5,56 (m) 87,5

16 a. 2,18 (m)

b. 2,03 (m)

41,4 a. 2,21(m)

b. 2,03(m)

41,5

49,7

49,6

18 1,69 (d) 1,2 12,8 1,69 (s) 12,8

19 1,22 (s) 16,4 1,22 (s) 16,4

20 - 126,8 - 126,8

21 7,33 (d) 1,6 139,0 7,33 (m) 139,0

22 6,34 (m) 110,4 6,33 (m) 110,5

23 7,24 (sl) 143,0 7,24 (m) 143,0

28 - 175,5 - 175,7

29 1,59 (s) 16,4 1,59 (s) 16,4

30 1,29 (s) 17,2 1,29 (s) 17,2

12-OMe 3,66 (s) 51,6 3,66 (s) 51,6

28-OMe 3,71 (s) 53,0 3,70 (s) 52,9

a – sinal mascarado pela metoxila em δ3,66.

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Figura 2.49 – Espectro de RMN

H da 6-Desacetilnimbina (CDCl

, 400 MHz).

Figura 2.50 – Espectro de RMN

C da 6-Desacetilnimbina (CDCl

, 100 MHz).

2123

11a

11b9

16b

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

16a

MeOOC

COOMe

20 21

2123

11a

11b9

16b

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

16a

MeOOC

COOMe

20 21

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Figura 2.51 – Espectro de COSY da 6-Desacetilnimbina (CDCl

, 400 MHz).

Figura 2.52 – Espectro de HSQC da 6-Desacetilnimbina (CDCl

, 100 MHz).

6/5

15/16a

17/16

11a/11b

23/22

15/16b

6/7

9/11b

16a/16b

6/5

15/16a

17/16

11a/11b

23/22

15/16b

6/7

9/11b

16a/16b

2123

22 15

11a5 11b9

16b

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

16a

143.0

139.0

148.1

110.4

126.4

87.5

87.0

66.2

49.7

51.6

53.0

43.7

34.4 34.4

39.1

41.4

12.8

16.4

17.2

16.4

2123

22 15

11a5 11b9

16b

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

16a

143.0

139.0

148.1

110.4

126.4

87.5

87.0

66.2

49.7

51.6

53.0

43.7

34.4 34.4

39.1

41.4

12.8

16.4

17.2

16.4

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Figura 2.53 – Espectro de HMBC da 6-Desacetilnimbina (CDCl

, 100 MHz).

2.5.2.8 Determinação estrutural da Azadirachtina A (Substância 08)

A azadirachtina A, como os limonóides anteriormente discutidos,

também pertence a classe C-seco, todavia, apresenta diversas modificações em

seu esqueleto básico. Apesar de sua determinação estrutural ser bem explorada na

literatura, este limonóide foi empregado como padrão na realização deste trabalho. A

seguir encontra-se a descrição referente a interpretação dos experimentos de RMN

1 D e 2 D para esta substância servindo como confirmação de sua estrutura. Os

espectros de RMN

C, DEPT 135º, COSY, HSQC e HMBC encontram-se nas

Figuras 2.54, 2.55, 2.55, 2.56, 2.57 e 2.58 respectivamente.

2123

3 22

15 6

11a

11b9

16b

M-18

M-29 M-30

M-19

OCH

16a

OMe

7/15

5/8

19/29

OMe

2123

3 22

15 6

11a

11b9

16b

M-18

M-29 M-30

M-19

OCH

16a

OMe

7/15

5/8

19/29

OMe

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As modificações neste limonóide se iniciam no anel furano. Numa

análise no espectro de RMN

H observa-se a ausência dos sinais dos hidrogênios,

na região mais desblindada do espectro, referentes ao anel furano. Assim, a

determinação estrutural foi iniciada pelo hidrogênio em δ 6,46 (d; 2,9 Hz). Este

hidrogênio se correlaciona com o carbono sp

em δ 147,1 (

J) e com os carbonos δ

107,3, 108,8 e 83, 6 (

J ou

J). Os carbonos δ 107,3 e 108,8 se correlacionam (

aos hidrogênios δ 5,05 (d; 2,9 Hz) e 5,65 (sl) respectivamente. O carbono δ 83,6 no

HSQC não apresenta correlação com nenhum hidrogênio sendo definido como um

carbono quaternário. Os hidrogênios δ6,46 (d; 2,9 Hz) e δ5,05 (d; 2,9 Hz) acoplam

entre si (observado no COSY) indicando serem vizinhos. Assim, pode-se definir

como sendo hidrogênios olefínicos em uma ligação dupla. Contudo, apresenta uma

constante de acoplamento pequena (J = 2,9 Hz) característica de hidrogênios

geminais num mesmo carbono sp

. Esta hipótese pode ser facilmente descartada

uma vez que cada hidrogênio acopla a

J em um carbono específico. O ângulo

exigido para a formação do anel de cinco membros com um heteroátomo leva a um

J pequeno entre estes hidrogênios. Assim, é possível propor a seguinte estrutura:

O hidrogênio δ 5,05 também se correlaciona com os carbonos δ 108,8

e 83,6 além do carbono δ 147,1, carbono do hidrogênio δ 6,46. O hidrogênio δ 5,65

também se correlaciona com os carbonos δ 147,1 e 83,6. Estas correlações

sugerem a presença de um anel de cinco membros com a presença de um

heteroátomo. Assim, é possível propor um anel furano modificado para este

limonóide. Respeitando as constantes de correlação a

J e

J é possível propor duas

sub-estruturas (uma única sub-estrutura, porém, duas seqüências e de correlação

possíveis).

Sub-estrutura A Sub-estrutura B

6,46

5,05

C CR OR

H H

147

107

108

107

147

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O deslocamento químico de δ 108,8 é um valor característico de

carbono cetalíco. Este carbono se correlaciona com dois hidrogênios em δ 4,67 (dl;

3,3 Hz) e δ 2,38 (dl; 5,2 Hz). Estes hidrogênios se correlacionam no HSQC com os

carbonos δ 76.4 e δ 48,6 respectivamente. O carbono δ 48,6 ainda se correlaciona

com um hidrogênio em δ 2,94 (via HMBC). Este hidrogênio foi identificado como um

hidrogênio em um grupo hidroxila visto que ele não esta ligado a nenhum carbono.

Estas correlações permitem propor um grupo cetal no carbono δ 108,8 com uma

ponte éter ao carbono carbinólico δ 76,4 uma vez que este não apresenta

correlações com os hidrogênios olefínicos. Ainda, numa correlação à

J entre δ 5,65

e δ 48,6, pode-se atribuir então, o carbono δ 48,6 como vizinho ao carbono δ 83,6.

Assim, resta apenas atribuir uma ligação ao carbono δ 83,6. Sendo ele um carbono

carbinólico e tendo a correlação entre o hidrogênio de uma hidroxila com carbono δ

48,6, pode-se propor esta hidroxila ligada ao carbono δ83,6.

O hidrogênio δ 4,67 correlaciona-se com os carbonos δ 108,8 e 48,6

estando este carbono em δ 48,6 a no máximo três ligação. Este carbono δ 48,6 se

correlaciona a uma ligação com o hidrogênio δ 2,38 (dl; 5,2 Hz) o qual se

correlaciona (

J ou

J) com os carbono δ 83,6 e 76,4 confirmando a proximidade

entre os grupos em δ 76,4 e δ 48,6 e também a proximidade com os carbonos δ

108,8 e δ 83,6. O espectro de COSY apresenta os acoplamentos entre o hidrogênio

δ 2,38 com um hidrogênio δ 1,68 (m) e entre δ 1,68 com o hidrogênio δ 4,67. Estes

acoplamentos colocam este hidrogênios em δ 1,68 entre os dois grupos em δ 4,67 e

δ2,38 se correlacionando com estes grupos entre si a um

J. O hidrogênio δ1,68 no

HSQC demonstra uma correlação com o carbono em δ 24,9. Este carbono também

acopla a um segundo hidrogênio em δ 1,32 (d; 13,1 Hz) propondo um grupo

metilênico. Esta proposta observada no HSQC é confirmada pelo espectro de DEPT

135º. Assim, é possível propor um grupo metilênico entre os carbonos δ 76,4 e δ

48,6.

108

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O hidrogênio δ1,32 correlaciona-se com o carbono δ83,6 confirmando

a posição deste grupo metilênico à

J. O hidrogênio δ 1,32 também se correlaciona

com dois carbonos carbinólicos em δ 69,9 e δ 68,5. O hidrogênio δ 2,38 também se

correlaciona com estes mesmos carbonos carbinólicos e o hidrogênio δ 4,67 com o

carbono δ 68,5. A correlação destes carbonos com estes três hidrogênios, os

colocam vizinhos aos carbonos δ 76,4 e δ48,6 o que permite uma correlação

J com

o hidrogênio em δ 1,32. O carbono em δ 68,5 ainda apresenta uma correlação com

uma metila em 2,01 (s) [δ18,3]. Este grupo metílico ainda apresenta correlação com

o carbono δ 69,9 e com o carbono δ 48,6. Respeitando as correlações é possível

propor duas sub-estruturas bicíclicas:

Estas correlações demonstram uma estrutura formada por um anel

furano modificado fundido na posição 15 ao anel D dos limonóides. Assim, os

carbonos δ 69,9 e δ 68,5 são referentes aos C-13 e C-14 não respectivamente e, a

metila em δ 2,01 referente a Me-18. Esta metila é confirmada como Me-18 visto que

ela se correlaciona com C-17, caso contrário, poderia, ser a Me-30. Deste modo,

para diferenciar C-14 e C-13 é preciso observar qual deles acopla com a Me-30.

Observa-se uma correlação entre uma metila em δ 1,75 (s) [δ 21,3] com o carbono

em δ 69,9. Sendo esta metila a Me-30, e sabendo que esta correlação somente é

possível a

J com C-14, resta correlação confirma o carbono C-14. A ausência de

outras correlações para os carbonos carbinólicos δ 68,5 e δ 69,9 e restando ainda

108

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uma ligação para cada carbono, é possível propor um grupo epóxido nestes

carbonos. Assim o anel D pode ser definido como:

A Me-30 se correlaciona também com os carbonos δ74,4, 45,3 e 44,6.

O carbono δ45,3 é um carbono quaternário e os carbonos δ74,4 e 44,6 apresentam

correlações no HSQC com os hidrogênios δ 4,76 (m) e 3,33 (s) respectivamente.

Estes hidrogênios correlacionam-se com o carbono quaternário δ 45,3. Ainda o

hidrogênio δ 4,76 se correlaciona com o carbono δ 44,6 e o hidrogênio δ 3,33 com o

carbono δ 74,4. Estas correlações permitem propor o carbono quaternário entre os

carbonos metinicos, lembrando que ambos os carbonos se correlacionam com a Me-

30. Assim, pode propor o carbono δ 45,3 como sendo C-8 e pela biossíntese, o

carbono carbinólico δ74,4 como C-7 e o carbono δ44,6 como C-9.

O H-7 (δ 4,76) correlaciona-se com os carbonos δ 73,7 e δ 37,0. Estes

carbonos encontram-se ligados aos hidrogênios δ 4,61 (dd; 12,5 e 2,7 Hz) e δ 3,35

(d; 12,5 Hz) respectivamente. Observa-se no espectro de COSY que estes

hidrogênios δ 4,61 e 3,35 acoplam entre si. Ainda se observa no HMBC uma

correlação entre um hidrogênio em δ 2,87 (sl) com o C-8. Este hidrogênio não estão

ligados a carbonos (observado no HSQC) então, pode-se propor como pertencentes

a um grupo hidroxila. Estas correlações permitem propor parcialmente o anel B

como:

HRO

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Além das correlações já descritas, o H-9 (δ3,33) apresenta correlação

com os carbonos δ 104,1; 171,8; 50,1; 70,5 e 69,1. Os deslocamentos químicos

destes carbonos permitem propor como sendo referentes a carbonos de um grupo

cetal, um carbono carboxílico de éster, um quaternário e os dois últimos de carbonos

carbinólicos. O carbono δ70,5 se correlaciona a

J com um hidrogênio δ4,76(m) e o

carbono δ 69,1 com dois hidrogênios, um em δ 4,15 (d; 9,7 Hz) e outro em 3,63 (d;

9,7 Hz). A correlação deste último carbono com os dois hidrogênios indicam a

presença de um grupo metileno vizinho ao C-9. Os hidrogênios deste grupo acoplam

apenas entre si indicando não existir hidrogênios em carbonos vizinhos a este grupo,

estando, desta forma, à um

J do C-9. O carbono δ 171,8 se correlaciona com um

grupo metóxila em δ 3,69 (s) [δ 53,3]. Sendo esta a única correlação deste grupo

metóxila, propõe-se um grupo carboximetila.

O carbono δ 104,1, além de se correlacionar com H-9, apresenta uma

correlação com um hidrogênio em δ 5,04(s) e outra com o hidrogênio do grupo

metileno em δ 3,63. O hidrogênio δ 5,04 não se liga diretamente com nenhum

carbono (observado no HSQC) indicando uma nova hidroxila. O H-5 (δ3,35) também

se correlaciona com o carbono metileno δ 69,1 e com o carbono quaternário δ 50,1.

Um vez que estes carbonos se correlacionam tanto com C-5 como com C-9 permite

propor como sendo C-19 e C-10 respectivamente. Assim observa-se o C-19 como

um grupo metileno e não como um grupo metílico. Seu deslocamento químico [δ

69,1] permite propor uma oxidação neste carbono e, a correlação entre um de seus

hidrogênios em δ 3,63 com o carbono δ 104,1 permite propor uma ligação entre

ambos os carbonos. Sendo o carbono δ 104,1 referente a um cetal permitem propor

este carbono ligado ao grupo metileno por uma ponte éter e a hidroxila ligada nele

próprio. Estas correlações completam o anel B e propõem um anel C-seco.

OR H

O O

104

3337

171

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Retornando ao C-6 [δ 73,7], observa-se que ainda falta definir um

grupo funcional neste carbono. O carbono C-6 se correlaciona com os hidrogênios δ

4,08 (d; 8,9 Hz) e δ 3,77 (d; 8,9 Hz). Estes hidrogênios se correlacionam a uma

ligação ao mesmo carbono em δ 73,0. Este carbono é confirmado por DEPT 135º e

HSQC como sendo referente a um novo grupo metileno. Uma vez C-6 ser um

carbono carbinólico e seus vizinhos C-5 e C-7 bem definidos, este grupo metilênico

só pode ser C-28 o qual, possui uma ponte éter com C-6. Os hidrogênios desse

grupo metilênico acoplam entre si como pode ser observado no COSY.

O H-5 e o H-28b (δ 3,77) correlacionam-se com um carbono

quaternário em δ 52,5. Estas correlações indicam este carbono como C-4. Contudo,

C-4 pode estar se correlacionando com H-28 tanto à

J como à

J. Se a

J então C-

4 deve estar diretamente ligado a C-28, se a

J, deve haver um grupo entre eles.

O H-5 e os H-28a e H-28b também se correlacionam com um carbono

em δ 173,3. O carbono δ 173,3 se correlaciona com um grupo carboximetila em δ

3,80 indicando a presença de um novo grupo éster. Estas correlações permitem

propor este carbono em δ 173,3 como sendo C-1 ou C-29. Todavia, se fosse C-1

este limonóide apresentaria um anel A-seco o que não ocorre na biossíntese desta

planta. Assim, é possível propor o carbono carboxílico como sendo C-29. Estas

correlações também definem como C-28 estando ligado diretamente ao C-4. Caso

contrário, C-28 estaria a mais de três ligações de C-29. Além disso, o grupo metileno

COOMe

O H

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não apresenta mais nenhuma correlação. O hidrogênio H-5 ainda apresenta uma

correlação com um carbono em δ66,9. Estas correlações permitem propor:

O carbono δ 66,9 se liga com um hidrogênio em δ 5,50 (tl; 2,8 Hz) e

correlaciona-se com o hidrogênio em δ 4,76 (m) [δ 70,5]. Visto que este úlitmo

hidrogênio se correlaciona com C-9 e com C-5 permite propor os carbonos δ66,9 e δ

70,5 como sendo C-3 e C-1 respectivamente. Estas correlações confirmam C-1, C-3

e C-29.

Para concluir o anel A e conseqüentemente a molécula, ainda falta

definir C-2 e os grupos funcionais em C-1 e C-3. No espectro de COSY observa-se

dois hidrogênios em δ 2,32 (m) e em δ 2,26 (tl; 3,3 Hz) que que acoplam com H-1 e

H-3. Estes hidrogênios correlacionam-se à um mesmo carbono em δ 29,7 (via

HSQC) indicando um grupo metileno entre C-1 e C-3 completando o anel A.

O H-3 (δ 5,50) se correlaciona com um carbono em δ 169,6. Este

carbono se correlaciona com um grupo metila em δ 1,95. Sendo estas as únicas

correlações para este grupo, permitem propor um grupo acetila em C-3.

173

MeOOC

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O hidrogênio em δ4,76 (H-1) se correlaciona com um carbono em δ

166,2. O carbono δ 166,2 se correlaciona com o H-1, com um hidrogênio em δ 6,90

(dq; 7,1 e 1,2 Hz) [δ 137,8] e com duas metilas, uma em δ 1,86 (s) [δ 11,9] e outra

em δ 1,78 (d: 7,1 Hz) [δ14,3]. O hidrogênio em δ 6,90 se correlaciona com o próprio

carbono em δ 166,8, com as metilas δ 14,3 e 11,9 e com um carbono sp

em δ

128,6. As metilas δ 1,78 e 1,86 também se correlacionam com este último carbono

(δ 128,6) além de se correlacionarem com o carbono em δ 166,8. Estas correlações

levam a um grupo tigloíla no C-1. Porém, este grupo apresenta duas metilas, uma

em δ 1,78 e outra em δ 1,86. As posições destas metilas foram definidas analisando

as constantes de acoplamento individual de cada uma. O hidrogênio em δ 6,90

apresenta um duplo quarteto de constantes 7,1 Hz e 1,2 Hz. A constante 7,1 Hz é

uma constante característica de acoplamento entre um hidrogênio vinílico e uma

metila vinílica geminada, e a constante 1,2 Hz, característica para um acoplamento

entre o hidrogênio vinílico e a metila vinílica trans entre si. Deste modo, o fato da

metila em δ 1,78 ter apresentado um dubleto de constante 7,1 HZ, pode-se propor

como sendo geminada com o hidrogênio em δ 6,90 e este hidrogênio, na posição 3’

em relação ao C-1, pois se o hidrogênio estivesse na posição 2’, as metilas

obrigatoriamente deveriam ser geminadas entre si. Assim, a metila em δ 1,86 que

apresenta um singleto largo se encontra na posição 5’, definindo o grupo tigloila.

Definidas todas as correlações a substância 08 foi identificada como sendo a

Azadirachtina A.

AcO

COOC

COOCH

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Tabela 2.12 – Dados de RMN

H e

C para a azadirachtina A.

Isolado (CDCl

) Literatura [174] (CDCl

)Carbono

H / J (Hz)

C DEPT 135º

H / J (Hz)

1 4,76 (m) 70,5 CH 4,77 (m) 70,6

2 a. 2,32 (m)

b. 2,26 (tl) 3,3

29,7 CH

a. 2,32 (m)

b. 2,26 (m)

29,7

3 5,50 (tl) 2,8 66,9 CH 5,51 (tl) 67,0

4 - 52,5 - - 52,8

5 3,35 (d) 12,5 37,0 CH 3,34 (d) 37,0

6 4,61 (dd) 12,5; 2,7 73,7 CH 4,62 (dd) 73,9

7 4,76 (m) 74,7 CH 4,77 (m) 74,3

8 - 45,3 - - 45,6

9 3,34 (m) 44,6 CH 3,34 (s) 44,1

10 - 50,0 - - 50,2

11 - 104,1 - - 104,2

12 - 171,8 - - 171,8

13 - 68,5 - - 68,7

14 - 69,9 - - 70,0

15 4,67 (dl) 3,3 76,4 CH 4,67 (d) 76,7

16 a. 1,68 (m)

b. 1,32 (d) 13,1

24,9 CH

1,31 (d)

25,1

17 2,38 (dl) 5,2 48,6 CH 2,38 (d) 48,6

18 2,01 (sl) 18,3 CH

2,01 (s) 18,5

19 a. 4,15 (d) 9,7

b. 3,63 (d) 9,7

69,1 CH

a. 4,15 (d)

b. 3,63 (d)

69,0

20 - 83,1 - -

21 5,65 (sl) 108,8 CH 5,65 (s) 108,5

22 5,05 (d) 2,9 107,3 CH 5,05 (d) 107,6

23 6,46 (d) 2,9 147,1 CH 6,46 (d) 146,9

28 a. 4,08 (d) 8,9

b. 3,77 (d) 8,9

73,0 CH

a. 4,08 (d)

b. 3,75 (d)

72,9

29 - 173,3 - - 173,6

30 1,75 (s) 21,3 CH

1,75 (s) 21,4

7-OH 2,87 (sl) - - 2,83 (sl) -

11-OH 5,04 (s) - - 5,03 (d) -

20-OH 2,94 - - 2,89 (sl) -

12-OMe 3,69 (s) 53,3 CH

3,69 (s) 52,8

29-OMe 3,80 (s) 52,7 CH

3,80 (s) 53,2

OAc 1,95 (s) 169,6

20,9 CH

1,95 (s) 169,8

20,8

Tig

1’ - 166,2 - - 166,3

2’ - 128,6 - - 128,6

3’ 6,95 (m) 137,8 CH 6,92 (m) 137,9

4’ 1,78 (dd) 7,1; 0,8 14,3 CH

1,78 (dd) 14,3

5’ 1,85 (s) 11,9 CH

1,86 (s) 11,9

sinais não determinados.

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Figura 2.54 – Espectro de RMN

H da azadirachtina A (CDCl

, 400 MHz).

(a)

(b)

(a)

(b)

AcO

COOC

COOCH

3’

23 22

21 3

1/7

19a

28a

19b

28b

OMe

M18

OAc

M30

M4’

M5’

16a

16b

AcO

COOC

COOCH

3’

23 22

21 3

1/7

19a

28a

19b

28b

OMe

M18

OAc

M30

M4’

M5’

16a

16b

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Figura 2.55 – Espectros: (a) RMN

C e (b) DEPT 135º para a azadirachtina A

(CDCl

, 100 MHz).

Figura 2.56 – Espectro do COSY para a azadirachtina A (CDCl

, 400 MHz).

Figura 2.57 – Espectro de HSQC da azadirachtina A (CDCl

, 100 MHz).

3’/M4’

3’/M5’

3’

23 22

21 3

1/7

619a

28a

19b

28b

OMe

9 OH

M18

OAc

M30

M4’

M5’

16a

16b

3/2a

3/2b

23/22

1/2a

1/2b

6/5

15/16a

19a/19b

28a/28b

17/16a

16a/16b

3’/M4’

3’/M5’

3’

23 22

21 3

1/7

619a

28a

19b

28b

OMe

9 OH

M18

OAc

M30

M4’

M5’

16a

16b

3/2a

3/2b

23/22

1/2a

1/2b

6/5

15/16a

19a/19b

28a/28b

17/16a

16a/16b

3’

3 1/7

19a

28a 19b

28b

OMe

M18

OAc

M30

M4’

M5’

16a

16b

137.8

147.1

108.8

107.3

66.9

70.5

74.7

76.4

73.7

69.1 69.1

73.0 73.0

52.7

53.7

44.6

37.0

48.6

29.7

24.9 24.9

18.3

20.9

21.3

11.9

14.3

3’

3 1/7

19a

28a 19b

28b

OMe

M18

OAc

M30

M4’

M5’

16a

16b

137.8

147.1

108.8

107.3

66.9

70.5

74.7

76.4

73.7

69.1 69.1

73.0 73.0

52.7

53.7

44.6

37.0

48.6

29.7

24.9 24.9

18.3

20.9

21.3

11.9

14.3

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Figura 2.58 – Espectro de HMBC da azadirachtina A (CDCl

, 100 MHz).

Este padrão, além de ser identificado por RMN também foi

caracterizado por análise elementar, infravermelho, ultra-violeta, [α]

espectrometria de massa.

Na análise elementar ou micro-análise de 1,018 mg do padrão

encontrou-se uma percentagem de 53,87% para carbono e 5,69% para hidrogênio.

Sabendo que a azadirachtina possui uma massa molecular de 720,7 g.mol

-1

e sua

fórmula molecular C

, os cálculos indicam a presença de uma molécula de

presente na análise sendo a porcentagem encontrada referente a fórmula

molecular de C

.CH

. Este solvente é comum na bancada usado para

transferência de padrões, por exemplo, de um frasco para outro, uma vez que os

limonóides são bem solúveis neste tipo de solvente.

O Espectro de Infravermelho (Figura 2.59) demonstrou bandas de

absorção em 3432 cm

-1

, 2954 cm

-1

, 2923 cm

-1

e 2850 cm

-1

sendo a primeira, uma

banda larga, correspondente a deformação axial na vibração da ligação química

3’

23 22

21 3

1/7

19a

28a

19b

28b

OMe

M18

OAc

M30

M4’

M5’

16a

16bOH

5’

4’

OAc/30

4/OAc/OAc

13/19/14

1/28/6/7

3’

OAc

3’

23 22

21 3

1/7

19a

28a

19b

28b

OMe

M18

OAc

M30

M4’

M5’

16a

16bOH

3’

23 22

21 3

1/7

19a

28a

19b

28b

OMe

M18

OAc

M30

M4’

M5’

16a

16bOH

5’

4’

OAc/30

4/OAc/OAc

13/19/14

1/28/6/7

3’

OAc

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entre o oxigênio e o hidrogênio, e as demais referentes as deformações axiais

assimétricas e simétricas de grupamentos metila e metileno. Analisando o espectro

na região de 1738 cm

-1

encontram-se algumas bandas sobrepostas referentes a

vibração de deformação angular simétrica de grupamentos metilas, que ocorrem

próximos a 1735 cm

-1

, também referentes as deformações axiais de C=O de ésteres

alifáticos saturados (região de 1750 – 1735 cm

-1

) e ésteres α,β-insaturados (1730-

1715 cm

-1

). Estes ésteres também são confirmados pelas vibrações das

deformações axiais de C O que ocorrem na região de 1300 – 1000 cm

-1

estando

estas absorções, também presentes no espectro.

Figura 2.59 – Espectro de Infravermelho para a azadirachtina A.

Ainda no Espectro IV pode-se observar uma banda em 1645 cm

-1

referente a deformação axial de alcenos lineares conjugados (C=C C=O) onde pela

intensidade da banda indica ser trans. Também se encontra uma banda em 1619

-1

indicando a deformação axial de uma ligação dupla carbono-carbono de ésteres

vinílicos. Esta banda aparece com freqüência, como um dubleto em conseqüência

da absorção de isômeros rotacionais cis e trans. Este dubleto contém número de

ondas característicos na região de 1620 e 1640 cm

-1

estando ambas presente no

espectro.

Abaixo de 1450 cm

-1

encontram-se diversas bandas de absorção

sendo em geral referentes a deformações de O H (1430 – 1330 cm

-1

) e

Frequência (cm

-1

)Frequência (cm

-1

)

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deformações axiais de C O (1260 – 1000 cm

-1

) em álcoois e vibração de

deformação axial assimétrica do sistema C O C em éteres (1150 – 1085 cm

-1

Nesta região também se têm deformações axiais de C C, deformações angulares

C H e C O. A absorção no infravermelho auxilia na elucidação de estruturas nos

fornecendo informações sobre grupos funcionais presentes na molécula. Todos os

grupos identificados no espectro estão presentes na molécula da azadirachtina.

Uma eluição cromatográfica deste padrão em um HPLC (Figura2.60),

monitorado por um detector de Foto-diodo, avaliando toda a faixa espectral de

absorção na região do ultra-violeta (200 – 370 nm) foi observado uma única banda

de absorção. O detector de foto-diodo processando todos os cromatogramas obtidos

nesta faixa espectral, não identificou a presença de nenhum interferente co-eluído

com a banda de absorção do padrão confirmando o grau de pureza do mesmo. Além

disso, o foto-diodo forneceu um espectro de ultravioleta do padrão (Figura 2.61),

aonde não se observa a absorção de nenhum cromóforo interferente.

Figura 2.60 – Eluição do padrão de azadirachtina A. Fase móvel ACN:H

O – 35:65;

coluna C

Phenomenex

Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm), coluna de segurança

Phenomenex

(4,0x3,0 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min, a alça de injeção de 20 µL.

Detector DAD no comprimento de onda de 217 nm.

Figura 2.61 – Espectro no Ultra-violeta da azadirachtina A. Comprimento de onda

máximo de absorção em 215 nm.

0 3 6 9 12 15

mAbs

tempo/min

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O padrão de azadirachtina A foi analisado através de uma inserção

direta por Espectrometria Massas-eletrospray (ESI-MS) operado no modo negativo.

Foi usado um Espectrômeto de Massas, triplo quadrupolo Micromass - Quattro LC

operado como interface uma fonte padrão “Z-spray” adaptado com um probe de

eletrospray. Um full scan do padrão se mostrou composto basicamente do

pseudoíon molecular ([M-H]

719 Da) proveniente de uma desprotonação e, dos íons

em m/z 687, 659, 641 e 535. O pseudoíon molecular confirma a proposta estrutural

apresentada para a substância 08.

A análise ESI-MS/MS deste padrão permite propor a fragmentação

deste padrão e confirmar do full scan como íons filhos comprovando a ausência de

interferentes e a qualidade do padrão. Os parâmetros otimizados para as análises

da azadirachtina A foram: potencial do capilar de 3,6 kV para o modo negativo de

ionização, a temperatura do gás de dessolvatação (N

) de 350 ºC e a temperatura

do bloco da fonte 130 ºC. O potencial usado no cone foi de 42 V, no cone extrator

de 8 V e o RF lens de 0,50 V. Os fluxos dos gases de Nebulização (N

) e

dessolvatação (N

) foram de 80 e 450 L/hs respectivamente. O gás de colisão foi o

Argônio 99,99% (Whittin Martins) e a voltagem da energia de colisão de 20 eV. Os

dados totais foram adquiridos usando um dwell time de 0,06s. Todos os dados foram

processados usando software MassLynx versão 3.5 NT Quattro. Para auxiliar na

proposta de fragmentação a azadirachtina A, foi deuterada. Uma alíquota de 100 µg

foi solubilizada em 500 µL de MeOD. Esta solução foi analisada nas mesmas

condições do padrão. O full scan do padrão deuterado mostrou o pseudoíon

molecular ([M-D]

721 Da) proveniente de uma desdeuteração e, dos íons em m/z

689, 661, 642 e 536. O full scan e os íons filhos do padrão e do padrão deuterado

encontram-se ilustrados nas Figuras 2.62 e 2.63 respectivamente.

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Figura 2.62 – Espectro de Massas da azadirachtina A (ESI

Figura 2.63 – Espectro de Massas do padrão de azadirachtina A deuterada (ESI

As análises dos espectros de massas permitem propor a fragmentação

da azadirachtina A confirmando novamente a estrutura proposta. A fragmentação

pode ser observada na Figura 2.64. Nenhuma proposta foi encontrada na literatura

para a fragmentação da azadirachtina A ionizada por eletrospray no modo negativo

sendo, pela primeira vez descrita neste trabalho. A caracterização da molécula foi

concluída determinando o [α]

= - 71º para a substância.

220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720

m/z

100

AzadirachtinaNDa485_20eV 19 (0.513) Sm (Mn, 5x1.20); Cm (15:30-4:14) Daughters of 485ES-

1.31e4

229.1

211.1

485.3

243.2

273.1 441.4

455.2

AzadirachtinaNDa491_20eV 23 (0.615) Sm (Mn, 5x1.20); Cm (21:29-8:12) Daughters of 491ES-

1.20e4

491.4

211.1

217.2

473.4

261.2

235.2

447.2

AzadirachtinaNDa535_20eV 22 (0.589) Sm (Mn, 5x1.20); Cm (16:29-7:12) Daughters of 535ES-

5.96e4

535.4

491.3

AzadirachtinaNDa687_35eV 22 (0.589) Sm (Mn, 5x1.20); Cm (19:28-4:10) Daughters of 687ES-

6.65e4

213.1

687.4

385.3

285.2

491.4

AzadirachtinaNDa719_20eV 13 (0.358) Sm (Mn, 5x1.20); Cm (11:24-35:46) Daughters of 719ES-

4.17e4

687.4

535.4

485.3

211.1

229.1

469.4

273.2

243.2

455.4

441.4

423.4

491.3

517.4

499.4

659.5

641.4599.4

559.3 577.3 615.4

719.4

AzadirachtinaN 62 (1.989) Cm (60:76-42:49) Scan ES-

1.00e7

719.6

687.6

659.6

485.5

339.5

325.4

311.4

255.2

211.2

469.4

517.5

535.2

599.6

641.6

705.3

727.6

220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720

m/z

100

AzadirachtinaDeDa486_25eV 27 (0.717) Sm (Mn, 5x1.20); Cm (25:33-11:19) Daughters of 486ES-

7.63e3

486.4

229.1

211.6

243.0

442.2

273.3

AzadirachtinaDeDa492_25eV 20 (0.538) Sm (Mn, 5x1.20); Cm (14:28-3:7) Daughters of 492ES-

6.62e3

492.5

228.2

326.6

262.4

AzadirachtinaDeDa536_20eV 21 (0.564) Sm (Mn, 5x1.20); Cm (15:30-3:14) Daughters of 536ES-

2.72e4

536.4

492.4

AzadirachtinaDeDa689_35eV 19 (0.513) Sm (Mn, 5x1.20); Cm (19:29-5:26) Daughters of 689ES-

3.29e3

213.1

689.4

285.3

274.0

217.2

229.0

386.2

AzadirachtinaDeDa721_20eV 18 (0.487) Sm (Mn, 5x1.20); Cm (13:29-3:13) Daughters of 721ES-

6.93e3

689.4

229.2

211.3

536.5

488.4

470.3

273.4

262.2

442.5

492.4

518.3

493.5

661.5

600.8

579.4 642.6

721.5

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Figura 2.64 – Mecanismo de fragmentação proposta para a azadirachtina A.

2.5.2.9 Determinação estrutural da Quercetina (Substância 09)

As substâncias 09 e 10 pertencem a classe dos flavonóides. Os

flavonóides constituem um grupo de pigmentos vegetais de ampla distribuição na

natureza. São encontrados com muita freqüência nas frutas e outros vegetais e sua

presença nos mesmos parece estar relacionada com funções de defesa (proteção

contra raios ultravioletas, ação anfúngica e antibacteriana). São conhecidos mais de

4.200 flavonóides, sendo que os de origem natural apresentam-se freqüentemente

oxigenados e um grande número ocorre conjugado com açúcares [168]. Existe relato

MeOH

m/z 687.67

m/z 719

m/z 659.66

m/z 641.64

m/z 599.61

m/z 491.51

m/z 535.52

- -

---

- -

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de alguns flavonóides isolados do gênero Azadirachta como: quercetin-3-

galactosídeo, myrcetin-3’-arabinosídeo, kaempferol-3-glucosídeo, mimbaflavona, etc

[08]. Contudo, todos os flavonóides isolados apresentaram açúcares conjugados. A

substância 09 isolada da A. indica, denominada quercetina, é um flavonóide já

descrito na literatura [169,208], o qual não contém açúcar, e foi isolado pela primeira

vez nas folhas desta espécie.

A quercetina depois de isolada se apresentou na forma de um sólido

amorfo amarelo. Os espectros de RMN

H e

C referentes a quercetina encontram-

se nas Figuras 2.65 e 2.66 respectivamente. Estes espectros indicam a presença de

um flavonol. A ausência de sinal singleto em RMN

H próximo a δ 110,0 confirma a

presença de um flavonol. O sinal em δ 137,2 no espectro de RMN

C corrobora a

presença de hidroxila a C-3. A comparação dos demais dados de RMN

C do

composto 09 com aqueles publicados [208] para a quercetina, sugere a mesma

substância.

O espectro RMN

H apresenta sinais em δ 7,71 (d; 2,0 Hz), δ7,62 (dd;

8,4 e 2,0 Hz) e em δ6,87 (d; 8,4 Hz) que foram atribuídos aos hidrogênios 2’, 6’ e 5’

respectivamente. Pela multiplicidade e pelas constantes de acoplamento destes

sinais pode-se observar o acoplamento entre dois hidrogênios num acoplamento

orto entre si e um destes hidrogênios um acoplamento meta com um terceiro

hidrogênio, permitindo propor dois grupos substituintes nas posições 3’ e 4’ do anel

B de um flavonóide. Ainda observando os sinais de hidrogênio em δ6,37 (sl) e em δ

6,17 (sl) permite propor como sendo referentes aos hidrogênios 8 e 6 do anel A,

sendo um meta em relação ao outro. Comparando estes dados com os dados de

RMN

H apresentados na literatura [112,169,208] realmente confirma a substância

09 como sendo a Quercetina. Na Tabela 2.13 encontram-se ilustrada os valores

obtidos de RMN

H e

C para a quercetina isolada e os valores apresentados na

literatura. Uma vez definido a substância 09 pode-se propor sua estrutura como

sendo:

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Tabela 2.13 – Dados de RMN

H e

C referentes a quercetina.

Isolado (MeOD) Literatura

Quercetina

(5,7,3’,4’-tetrahidroxiflavonol)

Carbono

H / J (Hz)

H / J (Hz) [169]

C [208]

2 - 148,8 148,3

3 - 137,2 - 136,7

4 - 177,3 - 176,7

4a - 158,2 - 157,5

5 - 99,3 - 99,6

6 6,17 (sl) 165,7 6,21 (d) 2,0 164,5

7 - 94,4 - 95,0

8 6,37 (sl) 162,5 6,41 (d) 2,0 161,4

8a - 104,5 - 104,4

1’ - 124,1 - 123,7

2’ 7,64 (d) 2,0 116,0 7,63 (d) 2,0 116,5

3’ - 146,2 - 145,7

4’ - 148,0 - 148,0

5’ 6,87 (d) 8,4 116,2 6,85 (d) 8,3 116,9

6’ 7,71 (dd) 8,4; 2,0 121,7 7,64 (dd) 8,3; 2,0 122,0

Figura 2.65 – Espectro RMN

H da Quercetina (MeOD, 200 MHZ).

6’

2’

5’ 8

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Figura 2.66 – Espectro RMN

C da Quercetina (MeOD, 50 MHZ).

2.5.2.10 Determinação estrutural da Quercitrina (Substância 10)

Os espectros da substãncia 10 indicam a presença de um composto da

classe dos flavonóis com um açúcar ligado. Além disso, uma simples análise no

espectro de RMN

H observa-se sinais referentes a um grupo metila em δ 0,94 (d;

6,0 Hz), um dubleto em δ 5,34 (J = 1,3 Hz) referente ao H-1’’ anomérico e um

hidrogênio em δ4,20 (dd; 1,6 e 1,3 Hz) (H-2’’). Estes sinais confirmam a presença do

monossacarídeo sugerindo a presença do açúcar raminose neste flavonol. Os sinais

de carbonos referentes ao flavonol se apresentaram semelhantes os sinais da

quercetina acima descrita, permitindo propor ser a estrutura do flavonol idêntica a da

quercetina, apenas com uma modificação no grupo funcional ligado ao C-3.

O espectro de RMN

H confirma a estrutura do flavonol. Este composto

apresentou sinais de hidrogênios aromáticos δ 7,34 (d; 2,0 Hz); δ 7,31 (dd: 8,3 e 2,0

Hz); δ 6,92 (d; 8,3 Hz), δ 6,37 (d; 1,7 Hz) e δ 6,20 (d; 1,7 Hz). Os sinais em δ 7,34,

7,31 e 6,92 que foram atribuídos aos hidrogênios 2’, 6’ e 5’ respectivamente. Pela

multiplicidade e pelas constantes de acoplamento destes sinais pode-se propor dois

grupos substituintes no anel B nas posições 3’ e 4’ em um flavonóide. Analisando os

sinais de hidrogênio em δ6,37 e em δ 6,20 pode-se atribuí-los aos hidrogênios 8 e 6

do anel A, sendo um meta em relação a posição do outro. A ausência de novos

sinais de hidrogênio e as constantes de acoplamento deste últimos dois hidrogênios

6 8

4’

3’

1’

6’ 5’/2’

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indicam mais dois grupos substituintes nas posições C-5 e C-7 do anel A. Desta

forma, pode-se propor a substância 10 como sendo um flavonol com um açúcar

raminose conjugado na posição C-3. Os espectros de RMN

H e

C encontram-se

nas Figuras 2.67 e 2.68 respectivamente.

Além dos valores característicos apresentados no espectro de

hidrogênio para a raminose, ainda foi possível identificar os sinais dos hidrogênios

referente ao açúcar. No espectro de RMN

H observam-se sinais em δ 5,34 (d; 1,3

Hz), em 4,20 (dd; 3,5 e 1,3 Hz), em 3,75 (dd; 9,3 e 3,5 Hz), em 3,33 (t; 9,3 Hz), em

3,42 (dd; 9,3 e 6,0 HZ) e em 0,94 (d; 6,0 Hz). Respeitando a multiplicidade e as

constantes de acoplamento de cada hidrogênio que permitem propor serem

referentes a hidrogênios axiais e equatoriais entre si e considerando o anel do

açúcar como sendo um anel em cadeira, pode-se propor serem estes hidrogênios os

H-1”, H-2”, H-3”, H-4”, H-5” e a Me-6” respectivamente. Desta forma, é possível

propor o açúcar com sendo a raminose apresentando a seguinte estrutura:

A substância 10 é uma estrutura conhecida na literatura [112,169,208]

denominada quercetina-3-O-L-raminosídeo ou mais popularmente por Quercitrina.

Na Tabela 2.14 encontram-se os valores obtidos de hidrogênio e carbono para a

substância 10 isolada e os valores apresentados na literatura. Esta comparação

confirma a estrutura proposta. Sob estas observações, pode-se concluir a estrutura

da substância 10 como:

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Tabela 2.14 – Dados de RMN

H e

C referentes a Quercitrina.

Isolado (MeOD)Carbono

H / J (Hz)

C [208]**

2 - 149,8 156,4

3 - 136,2 134,4

4 - 179,5 177,7

4a - 158,6 161,2

5 - 100,1 98,6

6 6,20 (d) 1,7 163,1 164,0

7 - 94,9 93,5

8 6,37 (d) 1,7 159,2 157,0

8a - 103,5 104,2

1’ - 123,0 121,0

2’ 7,34 (d) 2,0 116,4 155,4

3’ - 146,4 145,1

4’ - 149,8 148,3

5’ 6,92 (d) 8,3 116,9 115,8

6’ 7,31 (dd) 8,; 2,0 122,8 121,0

Ram.

1” 5,34 (d) 1,3 103,5 101,9

2” 4,20 (dd) 3,5; 1,3 72,1 70,4

3” 3,75 (dd) 9,3; 3,5 72,0 70,6

4” 3,33 (t) 9,3 73,3 71,5

5” 3,42 (dd) 9,3; 6,0 71,9 70,1

6” 0,94 (d) 6,0 17,6 17,3

* MeOD; **DMSO-d

Figura 2.67 – Espectro de

H da Quercitrina (MeOD, 200 MHz).

2’

6’

5’

5”

2’

M-6”

3”

5”/4”

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Figura 2.68 – Espectro de

C da Quercitrina (MeOD, 50 MHz).

2.5.2.11 Determinação Estrutural da Azadirachtina B (Substância 11)

A azadirachtina B foi extraída e isolada das sementes de pés francos

da A. indica coletadas em Brejinho do Nazaré-TO. Este limonóide já havia

anteriormente sido isolado das sementes de A. indica e da casca da A. excelsa. É

um isômero funcional da azadirachtina A, descrita anteriormente no item 2.5.2.8.

Estes isômeros diferenciam entre si nos grupos funcionais nas posições C-1, C-3 e

C-11. Na azadirachtina A nestas posições encontram-se os grupos tigloila, acetila e

hidroxila respectivamente. No isômero B o grupo tigloila é substituído por um grupo

hidroxila, o grupo acetila pelo grupo tigloila e a hidroxila na posição 11 por um

hidrogênio que aparece no espectro de RMN

H em δ 4,47(sl). A estrutura da

substância 11 foi elucidada através das análises dos experimentos de RMN 1D e

2D, confirmada com os dados apresentados na literatura e por Espectrometria de

Massa. Devido a grande semelhança entre os isômeros e a determinação estrutural

para o isômero A já discutida anteriormente, a determinação estrutural para a

azadirachtina B não foi aqui descrita. Os espectros de RMN

C, COSY, HSQC e

HMBC para esta estrutura podem ser observados nas Figuras 2.69, 2.70, 2.71, 2.72

e 2.73, respectivamente.

2’/4’

3’ 3

1’/6’ 5’/2’

1”

M-6”

4”

2”/3”/5”

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A análise do experimento HMBC indicou o sinal δ 3,51 para H-1

confirmando a ausência de um grupo éster nesta posição, já que este se encontra

em uma região menos desblindada em relação à azadirachtina A (δ 4,76). A

correlação entre o sinal da Me-5’ (δ 1,84) e H-3 (δ 5,53) com C-1’, confirmam a

presença do grupo tigloíla em C-3. A correlação do sinal de H-11 (δ

4,47; δ

79,3)

com C-12 (δ174,0), comparando com a azadirachtina A onde esta posição refere-se

a um hemicetal (δ 104,4), permitiu confirmar uma ligação éter entre a Me-19 e C-11.

Todas as correlações observadas nos experimentos de HMBC e COSY para a

substância 11 podem ser observadas abaixo.

Os valores para os descolamentos químicos de RMN

H e

C podem

ser observados na Tabela 2.15. A análise dos espectros da substância 11 permite

propor a estrutura para a azadirachtina B como:

OOH

OOC

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Tabela 2.15 – Dados de RMN

H e

C para a azadirachtina B.

Isolado (CDCl

) Literatura [87] (CDCl

)Carbono

H / J (Hz)

1 3,51 (m) 69,2 3,52 (ddd) 2,3; 2,7;5,8 69,4

2 a. 2,31 (dt) 16,2; 2,75

b. 2,06 (dt) 16,2; 2,75

31,9 a. 2,32 (ddd) 16,3; 2,3; 2,8

b. 2,22(ddd) 16,3; 2,7; 2,8

32,1

5,53 (t) 2,75 [≈ dd 2,75]

67,5 5,53 (dd) 2,8; 2,8 67,7

4 - 53,2 - 53,3

5 3,34 (d) 12,58 35,0 3,33 (d) 12,7 35,2

6 4,54 (dd) 12,58; 2,83 74,2 4,55 (dd) 12,7; 2,6 74,3

7 4,73 (d) 2,83 73,6 4,72 (d) 2,5 73,7

8 - 43,9 - 44,0

9 3,20 (sl) 43,6 3,19 (d) 1,3 43,8

10 - 51,1 - 51,2

11 4,47 (sl) 79,3 4,47 (d) 1,3 79,5

12 - 174,0 - 173,5

13 - 66,5 - 66,6

14 - 69,3 - 69,4

15 4,58 (d) 3,2 76,0 4,58 (d) 3,9 76,2

16 a. 1,66 (ddd) 13,1; 4,1; 5,2

b. 1,33 (d) 13,1

24,9 a. 1,65 (ddd) 12,9; 3,9; 5,3

b. 1,33 (d) 12,9

25,1

17 2,36 (d) 5,26 48,8 2,36 (d) 5,3 49,0

18 2,04 (s) 18,1 2,04 (s) 18,6

19 a. 3,94 (d) 9,4

b. 3,50 (d) 9,4

71,2 a. 3,95 (d) 9,4

b. 3,49 (d) 9,4

71,4

20 - 83,5 - 83,7

21 5,66 (s) 108,98 5,66 (s) 109,2

22 5,04 (D) 2,92 107,4 5,03 (d) 2,9 107,5

23 6,44 (d) 2,92 146,6 6,43 (d) 2,9 146,8

28 a. 4,04 (d) 8,92

b. 3,83 (d) 8,92

73,1 a. 4,04 (d) 9,0

b. 3,83 (d) 9,0

29 - 173,4 - 174,1

30 1,45 (s) 21,3 1,45 (s) 21,3

1-OH 3,42 (sl) - 3,41 (dd) 5,8 -

7-OH 3,38 (sl) - 3,29 (sl) -

20-OH - 2,78 (sl) -

12-OMe 3,77 (s) 52,5 3,76 (s) 53,0

29-OMe 3,77 (s) 52,9 3,76 (s) 52,6

1’ - 166,9 - 167,1

2’ - 128,3 - 128,5

3’ 6,95 (qq) 7,09; 1,45 138,7 6,95 (qq) 7,0; 1,3 138,9

4’ 1,79 (dd) 7,09; 1,20 14,5 1,79 (dq) 7,0; 1,3 14,7

5’ 1,84 (t) 1,22 11,9 1,84 (dq) 1,3; 1,3 12,1

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Figura 2.69 – Espectro de RMN

H da azadirachtina B (CDCl

, 400 MHz).

Figura 2.70 – Espectro de RMN

C da azadirachtina B (CDCl

, 100 MHz).

3’

19a

28a 19b

28b

OMe

5 9

M18

M30

M4’

M5’

16a

16b

OOH

OOC

OMe

3’

19a

28a 19b

28b

OMe

5 9

M18

M30

M4’

M5’

16a

16b

OOH

OOC

OMe

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Figura 2.71 – Espectro de COSY da azadirachtina B (CDCl

, 400 MHz).

Figura 2.72 – Espectro de HSQC da azadirachtina B (CDCl

, 100 MHz).

23/22

3’

23 22

19a

28a

19b

28b

OMe

5 9

2 2

M18

M30

M4’

M5’

16a 16b

16a/16b

17/16a

1/2

28a/28b

19a/19b

11/9

15/16a

3/2a

3/2b

3’/M4’

7/6

OMe

23/22

3’

23 22

19a

28a

19b

28b

OMe

5 9

2 2

M18

M30

M4’

M5’

16a 16b

16a/16b

17/16a

1/2

28a/28b

19a/19b

11/9

15/16a

3/2a

3/2b

3’/M4’

7/6

OMe

3’

23 22

19a

28a

19b28b

OMe

2 2

M18

M30

M4’

M5’

16a 16b

138,7

146.6

109.0 107.4

67.5

76.0

73.6

74.2

79.3

73.1 73.1

71.2

69.2

52.552.9

OMe

48.8

18.1

11.9

14.5

24.9

3’

23 22

19a

28a

19b28b

OMe

2 2

M18

M30

M4’

M5’

16a 16b

138,7

146.6

109.0 107.4

67.5

76.0

73.6

74.2

79.3

73.1 73.1

71.2

69.2

52.552.9

OMe

48.8

18.1

11.9

14.5

24.9

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Figura 2.73 – Espectro de HMBC da azadirachtina B (CDCl

, 100 MHz).

Uma eluição cromatográfica desta substância em um HPLC (Figura

2.74), monitorado por um detector de Foto-diodo, avaliando toda a faixa espectral de

absorção na região do ultra-violeta (200 – 370 nm) foi observado, uma única banda

de absorção. O detector de foto-diodo processando todos os cromatogramas obtidos

nesta faixa espectral, não identificou a presença de nenhum interferente co-eluído

com a banda de absorção da substância confirmando o grau de pureza do mesmo.

Além disso, o arranjo de diodos forneceu a espectro de ultravioleta da substância

(Figura 2.75), aonde não se observa a absorção de nenhum cromóforo interferente.

Comparando as Figuras 2.61 (pg. 142) e 2.75 pode observar que ambos os

compostos possuem o mesmo espectro de ultravioleta indicando a semelhança

estrutural. Possuindo o mesmo espectro, indica que as substâncias possuem os

mesmos cromóforos de absorção relacionado a estrutura básica do limonóide não

sendo alterado pelos grupos funcionais.

23 22

7 15

19a

28a

19b28b

OMe

5 9

17 2

M18

M30

M4’

M5’

16a 16b

OMe

5’

4’

OMe/OMe

1/14

19/28

2’

3’

1’

6/7/15

23 22

7 15

19a

28a

19b28b

OMe

5 9

17 2

M18

M30

M4’

M5’

16a 16b

OMe

5’

4’

OMe/OMe

1/14

19/28

2’

3’

1’

6/7/15

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Figura 2.74 – Eluição da azadirachtina B. Fase móvel H

O:MeOH:ACN:THF -

51,00:36,75:7,35:4,90; coluna C

Phenomenex

Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm),

coluna de segurança Phenomenex

(4,0x3,0 mm, 5 µm). Vazão 1,0 mL/min, a alça

de injeção de 20 µL. Detector DAD no comprimento de onda de 217 nm.

Figura 2.75 – Espectro no Ultra-violeta da azadirachtina B. Comprimento de onda

máximo de absorção em 215 nm.

A azadirachtina B, como seu isômero A, foi analisada através de uma

inserção direta por Espectrometria Massas-eletrospray (ESI-MS) operado no modo

negativo. Foi utilizando o mesmo equipamento, um Espectrômeto de Massa, triplo

quadrupolo Micromass - Quattro LC operado como interface uma fonte padrão “Z-

spray” adaptado com um probe de eletrospray. Um full scan da substância se

mostrou composto basicamente do pseudoíon molecular ([M-H]

661 Da) proveniente

de uma desprotonação e, dos íons em m/z 643, 617, 517 e 487, 475 e 457. O

pseudoíon molecular confirma a proposta estrutural apresentada para a substância

11. A análise ESI-MS/MS desta substância permite propor sua fragmentação e

confirmar os picos do full scan como íons filhos comprovando a ausência de

interferentes e a pureza da substância. Os parâmetros otimizados para a análise

foram os mesmos usados na análise do padrão da azadirachtina A. O full scan e os

íons filhos da azadirachtina B encontram-se ilustrados na Figuras 2.76. O

mecanismo de fragmentação da azadirachtina B encontra-se ilustrada na Figura

2.77.

0 3 6 9 12 15

-20

100

120

140

mAbs

tempo/min

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Figura 2.76 – Espectro de Massas da Azadirachtina B (ESI

Figura 2.77 – Mecanismo de Fragmentação proposto para a Azadirachtina B.

200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660

m/z

100

AzadirachtinaBDa661_30eV 21 (0.564) Sm (Mn, 5x1.20); Cm (15:24-8:13) Daughters of 661ES-

8.08e3

193.2

475.4

211.0

427.4

219.0

305.4

257.3

229.3

365.0

457.3

439.3

661.4

487.4

617.5

517.6

643.7

AzadirachtinaBDa661_20eV 15 (0.410) Sm (Mn, 5x1.20); Cm (12:21-3:8) Daughters of 661ES-

1.02e5

661.5

AzadirachtinaBDa661_30eV 21 (0.564) Sm (Mn, 5x1.20); Cm (16:26-8:13) Daughters of 661ES-

8.65e3

193.2

475.4

211.0

427.4

219.0

305.4

247.3

257.3

365.0

457.4

439.3

661.4

487.4

617.6

517.6

643.7

m/z 475.47

m/z 457.45

m/z 661

m/z 643.66

m/z 617.62

m/z 517.50

m/z 487.49

m/z 427.43

m/z 475.47

m/z 457.45

m/z 661

m/z 643.66

m/z 617.62

m/z 517.50

m/z 487.49

m/z 427.43

m/z 475.47

m/z 457.45

m/z 661

m/z 643.66

m/z 617.62

m/z 517.50

m/z 487.49

m/z 427.43

m/z 475.47

m/z 457.45

m/z 661

m/z 643.66

m/z 617.62

m/z 517.50

m/z 487.49

m/z 427.43

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Nenhuma proposta foi encontrada na literatura para a fragmentação

da azadirachtina B ionizada por eletrospray no modo negativo, sendo, pela primeira

vez descrita neste trabalho.

2.5.2.12 Determinação Estrutural do Nimbandiol (Substância 12)

O limonóide C-seco Nimbandiol foi isolado das sementes do pé franco

do Nim. Sua estrutura foi determinada através da análise dos experimentos de RMN

1 D e 2 D (Figuras 2.78, 2.79, 2.80, 2.81 e 2.82). Nos espectros de RMN

H e

observam-se sinais semelhantes as estruturas do 6-O-Acetilnimbandiol (substância

04) e do 6-desacetilnimbina (substância 07). Realmente, após sua determinação

estrutural ficou evidente que a única diferença entre as estruturas 12, 04 e 07 era o

grupo funcional em C-4. Como no 6-O-Acetilnimbandiol a substância 12 também é

um 28-norlimonóide contendo um grupo hidroxila em C-4. A descrição da análise

dos experimentos de RMN que proporcionou a determinação estrutural para esta

substância, não foi aqui apresentada devido a grande similaridade entre as

estruturas 12 e 04. A única diferença encontrada foi no espectro de COSY o H-7

agora acoplado com um sinal em uma região mais blindada (δ 4,26) quando

comparado com o 6-O-acetilnimbandiol (δ 5,46), indicando a substituição de um

grupo acetila por uma hidroxila em C-6. Como pode ser observado na Tabela 2.16,

com exceções de pequenas variações nos deslocamentos químicos, praticamente

não há diferença entre os espectros de RMN

H e

C. A substância 12 foi

identificada e confirmada como sendo o Nimbandiol.

MeOOC

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Tabela 2.16 – Dados de RMN

H e

C para o Nimbandiol e para o 6-O-

acetilnimbandiol.

Nimbandiol isolado (CDCl

) 6-O-Acetilnimbandiol (CDCl

)

(pg. 101)

Carbono

1 - 202,4 - 201,8

2 5,76 (d) 10,4 125,0 5,79 (d) 10,2 124,5

3 6,53 (d) 10,4 151,7 6,49 (d) 10,2 151,1

4 - 71,0 - 70,1

5 2,67 (d) 12,0 50,7 3,07 (d) 12,2 48,1

6 4,26 (dd) 12,0; 3,6 67,8 5,46 (dd) 12,2; 2,5 70,8

7 4,01 (d) 3,6 87,1 4,08 (d) 2,5 84,6

8 - 47,6 - 48,3

9 2,71 (dd) 6,0; 3,6 38,8 2,79 (t) 5,1 38,6

10 - 47,9 - 48,1

11 a. 2,92 (dd) 16,6; 6,0

b. 2,18 (m)

34,2 a. 2,93 (dd) 16,2; 5,1

b. 2,22 (m)

34,1

12 - 173,5 - 173,4

13 - 135,3 - 135,5

14 - 146,5 - 145,7

15 5,55 (tl) 6,6 86,9 5,55 (tl) 6,6 87,3

16 a. 2,18 (m)

b. 2,04 (m)

41,4 a. 2,22 (m)

b. 2,04 (m)

41,3

17 3,66 (m) 49,6 3,64 (dl) 8,3 49,5

18 1,68 (s) 12,9 1,68 (s) 12,8

19 1,17 (s) 15,9 1,25 (s) 15,9

20 - 126,7 - 126,7

21 7,22 (m) 139,0 7,23 (s) 139,0

22 6,30 (m) 110,3 6,32 (s) 110,3

23 7,32 (t) 1,6 143,1 7,32 (s) 143,1

29 1,58 (s) 23,8 1,38 (s) 23,8

30 1,29 (s) 17,6 1,37 (s) 17,1

OMe 3,65 (s) 51,7 3,64 (s) 51,7

OAc - - 2,22 (s) 169,7

21,7

- 3,29 -

Os valores das Hidroxilas não foram identificados

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Figura 2.78 – Espectro de RMN

H do Nimbandiol (CDCl

, 200 MHz).

Figura 2.79 – Espectro de RMN

C do Nimbandiol (CDCl

, 100 MHz).

11a

5 11b

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

16a

16b

MeOOC

11a

5 11b

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

16a

16b

MeOOC

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Figura 2.80 – Espectro de COSY do Nimbandiol (CDCl

, 400 MHz).

Figura 2.81 – Espectro de HSQC do Nimbandiol (CDCl

, 100 MHz).

2123

11a

11b

M-18

M-29

M-30

M-19OCH

16a

16b

23/22

21/22

3/2

15/16b

15/16a

6/5

17/16 11a/11b

9/11b

9/11a

16a/16b

2123

11a

11b

M-18

M-29

M-30

M-19OCH

16a

16b

23/22

21/22

3/2

15/16b

15/16a

6/5

17/16 11a/11b

9/11b

9/11a

16a/16b

2123 3 222

15 6

11a 5

11b9

M-18

M-29 M-30

M-19

OCH

16a

16b

143.1

139.0

151.7

110.3

125.0

86.9

67.8

87.1

49.6

51.7

34.2 34.2

41.4 41.4

38.8

50.7

12.9

23.8

17.6

15.9

2123 3 222

15 6

11a 5

11b9

M-18

M-29 M-30

M-19

OCH

16a

16b

143.1

139.0

151.7

110.3

125.0

86.9

67.8

87.1

49.6

51.7

34.2 34.2

41.4 41.4

38.8

50.7

12.9

23.8

17.6

15.9

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Figura 2.82 – Espectro de HMBC do Nimbandiol (CDCl

, 100 MHz).

2.5.3 Caracterização da Azadirachtina A em Diversas Partes do Enxerto

A azadirachtina concentra-se principalmente nos frutos, porém,

menores quantidades também podem ser encontradas nas demais partes da planta

[02]. Com o objetivo de verificar se o enxerto da Azadirachta indica sobre a Melia

azedarach tem mantido as características da planta a qual procede, além dos

estudos fitoquímicos e quantitativos foi realizado um estudo com diversas partes da

planta e com frutos em diferentes graus de maturação verificando, se a

azadirachtina A encontra-se presente nos mesmos. Esta análise foi realizada por um

experimento de Cromatografia Líquida acoplado a um Espectrômetro Massa-Massa

(LC-MS/MS).

Foram preparados diversos extratos com as diversas partes do enxerto

por centrifugação, seguindo o método proposto de preparo desenvolvido para a

quantificação das sementes do Nim descrito no Item 3.4.1.2.1. Uma vez obtidos os

2123 3

17 11a

11b

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

16a

16b

OMe

7/15

10/8/17/5

2123 3

17 11a

11b

M-18

M-29

M-30

M-19

OCH

16a

16b

OMe

7/15

10/8/17/5

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extratos, foi preparada uma solução com cada extrato (Tabela 2.4 – pg. 66). Estas

soluções foram analisadas por LC-MS/MS.

Os extratos foram analisados por LC-MS/MS. Obtida a otimização dos

parâmetros de separação cromatográfica (pg. 65) foi realizado o ajuste dos

parâmetros do MS/MS. Estes parâmetros encontram-se descritos nos procedimentos

experimentais (pg. 66). Para a ionização foi usada uma fonte de eletrospray no

modo negativo promovendo a ionização e fragmentação na fonte utilizando para a

detecção do íon da azadirachtina A o modo Multiple Reaction Monitoring (MRM).

Neste modo, equivalente a um modo MS/MS, ambos os quadrupolos permanecem

estáticos promovendo um grande ganho em sensibilidade para um analito conhecido

(próximo à 100 vezes) comparado aos scanning MS/MS tradicionais. Uma vez que

se desejava apenas monitorar a presença ou não da azadirachtina A nos extratos, o

primeiro quadrupolo do equipamento (MS1) foi mantido estático para monitorar

apenas a entrada do íon [(M – H

) m/z 719] referente ao íon molecular da

azadirachtina A obtido no modo negativo de ionização por eletrospray (ESI

). Este

íon, num segundo quadrupolo é fragmentado após colidir com o gás de colisão. O

último quadrupolo (MS2) monitora apenas a passagem ou não dos íons filhos da

azadirachtina garantindo que o íon molecular selecionado no primeiro quadrupolo

seja realmente do composto de interesse. Foi realizada uma análise do padrão puro

da azadirachtina A definindo seu padrão de fragmentação e selecionando dois íons

filhos característicos (m/z 719 -> 486 e 719 -> 211) para serem monitorados no

quadrupolo MS2. Uma vez que o detector registra a presença do íon molecular [(M –

) m/z 719 Da] e dos íons filhos m/z 486 e 211 através de um tratamento

matemático ele registra a presença do composto. Com o uso desta técnica se obtém

um cromatograma altamente específico e com uma boa relação sinal/ruído (sensível)

como podem ser observados nas Figuras 2.83 e 2.84.

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Figura 2.83 – Espectro de Massas para a Azadirachtina A (ESI

Figura 2.84 - Full scan típico para as amostras, demonstrando a seletividade na

detecção da azadirachtina na técnica por LC-MRM.

Uma vez otimizados todos os parâmetros cromatográficos, foi realizada

a análise das amostras (Figura 2.85). Nas estruturas investigadas, exceto nas

folhas, foi identificada, em diferentes quantidades, a presença da azadirachtina A,

inclusive nas flores da planta. Diversos trabalhos na literatura demonstram a eficácia

de extratos da folhas em ensaios biológicos, porém, nenhum trabalho descreve o

isolamento da azadirachtina A nas folhas. Estes levantamentos bibliográficos,

juntamente com os resultados obtidos, vêem indicar que a azadirachtina realmente

não está presente nesta parte da planta ou, se presente, em quantidades ínfimas.

Estes resultados mais as atividades biológicas descritas para os extratos das folhas,

indicam que, não somente a azadirachtina A, mas também outros limonóides,

apresentam atividades biológicas. Assim, pode se estabelecer um sinergismo entre

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os compostos da planta, de modo que permita a planta, ser ativa em uma grande

gama de insetos considerados pragas agrícolas. Além disso, a ação de múltiplos

compostos e não apenas um específico dificulta que as pragas adquiram resistência,

o que causaria uma perda na eficiência dos produtos do Nim após alguns tempo de

uso.

Figura 2.85 – Cromatograma obtido para as amostras por LC-MRM selecionando os

canais m/z 719 -> 485 e 719 -> 211.

Amêndoa do fruto adulto

Cerne do galho (parte interna)

Casca do galho

Flores

Fruto infantil

Amêndoa do fruto adulto e maduro

Folhas

Palha da semente seca

Amêndoa da semente seca

Amêndoa do fruto jovem

Amêndoa do fruto adulto

Cerne do galho (parte interna)

Casca do galho

Flores

Fruto infantil

Amêndoa do fruto adulto e maduro

Folhas

Palha da semente seca

Amêndoa da semente seca

Amêndoa do fruto jovem

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2.5.4 Caracterização das Azadirachtinas A e B nas Sementes do Enxerto

Uma vez obtidos os padrões dos dois principais metabólitos

secundários do Nim, as azadirachtinas A e B, era preciso confirmar suas presenças

nas sementes do enxerto. Além disso, também era preciso confirmar as bandas

atribuídas nas eluições cromatográficas como realmente bandas de absorção destes

compostos. Com este objetivo foram realizadas análises por HPLC e LC-MS/MS

utilizando um equipamento de HPLC configurado com uma bomba Shimadzu LC-

10AD, auto-injetor Shimadzu SIL-10AD, um detector de arranjo de diodos Shimadzu

SPD-M10A. Após a saída do detector foi colocada uma válvula splitess a qual

permitia a ida da metade do fluxo do HPLC para um detector de MS/MS em série.

Os parâmetros utilizados na separação por HPLC encontram-se ilustrados na Figura

2.86. Os dados foram processados usando o software ClASS-VP.

Em análises individuais por HPLC observou-se o tempo de retenção e

o espectro de absorção de ultravioleta dos padrões de azadirachtinas A e B. Na

eluição cromatográfica de uma amostra de sementes, observou-se duas bandas

predominantes, uma em 10,8 min e outra em 11,8 min. A primeira banda apresentou

o mesmo tempo de retenção e espectro de UV do padrão da azadirachtina A e, a

segunda banda, o mesmo tempo de retenção e espectro de UV para o padrão de

azadirachtina B. A mesma análise foi repetida para uma amostra de óleo. Sob os

parâmetros estabelecidos para a análise dos óleos, a banda mais intensa do

cromatograma, com um tempo de retenção de 11,1 min demonstrou o mesmo tempo

que o padrão da azadirachtina A e, a segunda banda mais intensa em 14,3 minutos,

um tempo de retenção equivalente ao isômero B. Ambas as banda também

apresentaram os mesmo espectros de UV. Contudo, apesar das coincidências entre

os tempos de retenção e espectros de UV entre os padrões e as amostras, as

bandas de absorção acima descritas foram ainda confirmadas por LC-MS/MS.

O equipamento de MS/MS foi preparado para o uso nas seguintes

condições: potencial do capilar de 3,6 kV para o modo negativo de ionização, a

temperatura do gás de dessolvatação (N

) de 350 ºC e a temperatura do bloco da

fonte 130 ºC. O potencial usado no cone foi de 42 V, no cone extrator de 8 V e o RF

lens de 0,50 V. Os fluxos dos gases de Nebulização (N

) e dessolvatação (N

) foram

de 80 e 450 L/hs respectivamente. O gás de colisão foi o Argônio 99,99% (Whittin

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Martins) e a voltagem da energia de colisão de 20 eV. Os dados totais foram

adquiridos usando um dwell time de 0,06s. Todos os dados foram processados

usando software MassLynx versão 3.5 NT Quattro. Estes parâmetros foram os

mesmos usados na caracterização dos padrões. A ionização no Espectrômetro de

Massa ocorreu por eletrospray no modo negativo de ionização gerando íons

negativos a partir de espécies pouco voláteis presentes na fase líquida.

Assim, na análise por LC-MS/MS observa-se que as bandas em 10,8 e

11,1 min nas eluições das sementes e do óleo respectivamente, sob os parâmetros

de eluição descritos na Figura 2.86, apresentaram o pseudo íon molecular [M-H]

m/z 719 Da proveniente de uma desprotonação e os íons filhos m/z 687, 659, 641 e

535. O pseudo-íon molecular e os íons filhos gerados apresentam o mesmo perfil de

fragmentação caracterizado no padrão de azadirachtina A ilustrada na Figura 2.62

(pg. 144). As bandas de absorção em 11,8 e 14,3 min, nos cromatogramas das

sementes e dos óleos respectivamente, apresentaram o pseudo-íon molecular [M-H]

m/z 661 e íons filhos m/z 643, 617, 517 e 475 do padrão de azadirachtina B ilustrada

na Figura 2.76 (pg. 158). Assim, a análise de LC-MS/MS confirma a as bandas de

absorção das azadirachtina A e B nas análises por HPLC das sementes e dos óleos.

Apesar da concordância entre os dados por HPLC, a confirmação por LC-MS/MS

evitou o erro ou dúvidas da presença destes metabólitos nas sementes do enxerto e

em sua quantificação. Uma vez que a azadirachtina possuí uma grande variedade

de isômeros, não comum na mesma intensidade mas, que, poderiam apresentar o

mesmo tempo de retenção e mesmo espectro de UV. Contudo, estes isômeros não

poderiam apresentar o mesmo perfil de fragmentação. Assim, a análise por MS/MS

confirmou as bandas de absorção para as azadirachtina A e B e sua presença,

sendo, uma informação importante na caracterização do enxerto.

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Figura 2.86 – Eluição cromatográfica de padrões de azadirachtina A e B e de

amostras. Coluna C

Phenomenex® Luna (II) (150x4,6 mm, 5 µm); coluna de

segurança Phenomenex® (4x3 mm, 5 µm); vazão de 0,8 ml/min.; λ = 217 nm e

volume de injeção de 20 µL. (a) Padrões de azadirachtina A e B. (c) Semente do

Nim. Fase móvel para (a) e (b): H

O:ACN:MeOH:THF – 61:34:4:1. (b) Padrões de

azadirachtina A e B. (d) Semente do Nim. Fase móvel para (b) e (d):

O:MeOH:ACN:THF – 51:36,75:7,35:4,9.

2.5.5 Degradação Assistida da Azadirachtina A

Desde que foi pela primeira vez extraído, o óleo do Nim tem sido

extensivamente estudado em termos de sua eficácia como inseticida. Várias

formulações industriais têm sido produzidas através da emulsificação desse óleo

contendo o principal componente ativo a azadirachtina A. Estes produtos comerciais

têm sido usados na proteção de plantas e em estoques de alimentos. Suas

propriedades fazem da azadirachtina A uma opção muito boa como substituto dos

pesticidas sintéticos. Contudo o uso da azadirachtina em campo é limitado por sua

sensibilidade à luz, a umidade e a temperatura [02,27].

Com o objetivo de entender os processos de degradação e, num

futuro, propor meios de sua proteção ampliando seu tempo de atividade em campo,

5 mg da azadirachtina A pura foi dissolvida em 1 mL de água e 0,1 mL de MeOH

sendo, em seguida, intencionalmente exposta a luz solar por 20 dias. A primeira

mAbs

0 3 6 9 12 15

mAbs

tempo/min

3 6 9 12 15

tempo/min

(a)

(b)

mAbs

0 3 6 9 12 15

mAbs

tempo/min

3 6 9 12 15

tempo/min

(a)

(b)

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etapa neste estudo foi verificar os derivados reacionais obtidos buscando identificar

os seus grupos funcionais mais reativos. A quantidade de massa usada não foi

maior devido seu custo. Em vista da pequena quantidade de material disponível para

o estudo, sendo inviável sua separação, estes derivados foram identificados em

mistura fazendo uso dos experimentos de RMN 1D e 2D e da análise por inserção

direta em Espectrômetro de Massa. Os parâmetros utilizados para estas análises,

encontram-se descritas no item 2.4.12 (pg. 67).

Comparando o espectro de RMN

H do padrão puro com o espectro

após o período de degradação, pode-se observar a duplicação de sinais no

espectro. Isto ocorre porque apenas parte da molécula sofreu algum tipo de

modificação permanecendo o restante intacto. Contudo, mesmo pequenas

modificações são capazes de provocar alterações nas propriedades magnéticas de

todos os núcleos da molécula o que, resulta em pequenas modificações nos valores

dos deslocamentos químicos dos núcleos de hidrogênios. A Figura 2.87 ilustra os

espectros de hidrogênio obtido para o padrão puro e para a mistura de artefatos

mais a azadirachtina A.

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Figura 2.87 – Espectro RMN

H da azadirachtina A obtido: a) antes e b) depois da

degradação (CDCl

, 400 MHz).

As regiões em cinza na Figura 2.87 demonstram regiões do espectro

onde surgiram sinais provenientes dos produtos da degradação. Pode se observar

um padrão de duplicação nos sinais, principalmente na região mais desblindada do

espectro tendo um menor número de sinais. Para diferenciar os sinais desta mistura,

indicando quais sinais devem pertencer as moléculas da azadirachtina e quais são

de compostos degradados, foi usada a técnica de DOSY (Diffusion Ordened

Spectroscopy). Esta técnica permite, através dos coeficientes de difusão, identificar

os sinais de hidrogênio pertencentes a cada molécula em uma mistura. As

diferenças entre os coeficientes de difusão em uma mistura são provenientes dos

diferentes sistemas de spins presentes. Na Figura 2.88 pode ser observado o

experimento de DOSY para a mistura em investigação.

7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5

(a)

(b)

7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.57.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5

(a)

(b)

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Figura 2.88 – Espectro de DOSY da mistura de azadirachtina A e dos produtos

reacionais.

Através da análise do experimento de DOSY foi possível observar um

coeficiente de difusão para a azadirachtina em - 9,185, um derivado com

duplicações de sinais em – 9,25 além de outros derivados onde não houve uma total

duplicação dos sinais da molécula na região mas blindada do espectro. Estes

artefatos possuem um coeficiente de difusão próximos a - 9,29.

Observa-se no experimento de HMBC para a mistura o surgimento de

correlações entre hidrogênios e carbonos não existentes nos mesmos experimentos

do padrão puro. Um sinal de destaque é a correlação de um carbono em δ93,2 com

um sinal de hidrogênio em δ 1,68 e um segundo carbono em δ 95,0 se

correlacionando com um sinal de hidrogênio em δ 1,39. Estes sinais de hidrogênio

se correlacionam no HSQC com um carbono em δ 29,0 e podem ser atribuídos aos

sinais duplicados dos H-16a e H-16b. Os carbonos δ 93,2 e 95,0 não apresentaram

correlação com hidrogênio no HSQC. O hidrogênio em δ 1,68 também apresentou

correlação com carbonos em δ 82,3 e 51,0 os quais, se corelacionam a

J com

hidrogênios em δ 4,54 e 2,15 respectivamente. O carbono δ 82,3 se correlaciona

com um hidrogênio em δ 5,65 (via HMBC). Este hidrogênio (δ 5,65) via HSQC se

correlaciona com o carbono δ 108,0 e via HBMC com o carbono δ 86,0. Este

carbono em δ 86,0 não apresentou nenhum hidrogênio ligado a ele. Um hidrogênio

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em δ 4,88 se correlaciona a uma ligação, ao carbono δ 107,3 e a duas ou três

ligações com os carbonos δ 108,0, 86,0 e 145,2. Este carbono em δ 145,2 se

correlaciona (

J) ao hidrogênio δ 6,40 o qual se correlaciona com os carbonos δ

108,0, 107,3 e 86,0 (

J ou

J). Comparando estes resultados com a determinação

estrutural da azadirachtina A, respeitando as diferenças nos deslocamentos

químicos, observa-se o mesmo perfil de correlações atribuídas ao anel D modificado

na azadirachtina A. Todavia, neste metabólito degradado, os carbonos δ 95,0 e δ

93,2 que devem ser C-13 e C-14 respectivamente, apresentam uma variação no

deslocamento químico superior a 20 ppm indicando uma possível abertura no

epóxido formando um carbono carbinólico quaternário cetálico em um bicíclico. Além

destas correlações ainda há uma correlação entre um hidrogênio em δ 1,50 com um

carbono em δ 27,5 (via HSQC). Este hidrogênio se correlaciona com o carbono δ

51,0 permitindo propor serem sinais referentes a Me-18 se correlacionando com C-

17. Assim, respeitando estas correlações é possível propor:

O carbono C-14 (δ 93,2) é confirmado observando sua correlação com

um grupo metílico em δ 1,68 [δ 17,5]. Este grupo metílico se correlaciona também

com um hidrogênio em δ3,50 [δ47,0]. O hidrogênio em δ3,50 pode ser atribuído ao

H-9 confirmando a Me-30. Este hidrogênio, além da correlação com a Me-30

também se correlaciona com C-14 e com os carbonos em δ 51,0, δ 53,8, e δ 70,0.

Estas correlações podem ser atribuídas aos carbonos C-8, C-10 e C-19

respectivamente. O C-8 apresenta correlação com a Me-30 confirmando sua

posição. Ainda no HSQC pode se observar uma nova correlação entre um carbono δ

81,0 com um hidrogênio em δ 4,18 e um carbono δ 70,0 com dois hidrogênios em δ

4,25 e 3,80. O hidrogênio δ4,18 se correlaciona com um carbono em δ37,0 (δ3,15)

95.0

93.2

51.0

29.0

82.3

108.0

86.0

107.3

145.2

27.5

1.50

1.68

1.32

2.15

4.54

5.65

4.88

6.40

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e os hidrogênios δ 4,25 e 3,80 com um carbono δ 53,8 (C-10). Estas correlações

permitem propor o hidrogênio δ 4,18 sendo H-7 (conseqüentemente o carbono δ

81,0 será C-7) e os hidrogênios δ 4,25 e δ 3,80 como sendo H-19a e H-19b. Estas

correlações permitem propor a seguinte estrutura:

Assim, a análise dos experimentos de RMN, HMBC e HSCQ (Figuras

2.89 e 2.90, respectivamente) permitem propor o seguinte derivado reacional:

Produto de reação A

70.0

3.80

4.25

3.50

47.0

51.0

17.5 1.68

93.2

81.0

4.18

3.15

37.0

72.5

4.40

73.5

3.68

4.00

53.8

AcO

OTIg

MeOOC

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Figura 2.89 – Espectro de HSQC da mistura de degradação da azadirachtina A

(CDCl

, 100 MHz).

Figura 2.90 – Espectro de HMBC da mistura de degradação da azadirachtina A

(CDCl

, 100 MHz).

Correlações entre H e C de destaque que surgiram

com a degradação.

Correlações entre H e C de destaque que surgiram

com a degradação.

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Considerando o meio de decomposição, ou seja, uma solução

hidroalcóolica com o pH ligeiramente ácido, pode-se propor o mecanismo mostrado

abaixo para a formação do produto de reação A.

O mecanismo proposto é um mecanismo concertado, aonde a

protonação do oxigênio do epóxido assite a formação da ligação entre C-13 e O-7. O

formação da ligação entre C-14 e O-7 não é permitida, pois levaria a formação de

um anel de quatro membros de grande tensão estérica não sendo o produto formado

estável. O mecanismo proposto, comportasse como um mecanismo de substituição

nucleofílica bimolecular como pode ser observado na Figura 2.91.

Figura 2.91 – Mecanismo reacional de degradação da azadirachtina A.

Cruzando os dados de RMN

C deste produto com os dados

apresentados na literatura [48], encontra-se uma grande semelhança entre estes

dados e os referentes ao 1-tigloil-3-acetilazadirachtinina. Esta semelhança espectral

corrobora com o mecanismo de degradação proposto, uma vez que, o mecanismo,

leva ao próprio composto 1-tigloil-3-acetilazadirachtinina a partir da azadirachtina A.

Os dados de RMN

H e

C do 1-tigloil-3-acetilazadirachtinina são apresentados na

Tabela 2.17. Kumar et al. [48] descreve o isolamento deste composto a partir de do

extrato metanólico das sementes do Nim. No mesmo extrato ele descreve o

AcO

OTIg

MeOOC

O oxigênio recebe um

próton formando uma

nova ligação, ficando

eletronicamente

deficiente.

Sendo o oxigênio mais

eletronegativo que o

carbono, ele tende a

romper a ligação com o

carbono satisfazendo

sua deficiência.

Na realidade forma-se um

intermediário onde a

deficiência eletrônica do

oxigênio é compartilhada

entre dois carbonos

Com a formação da ligação

entre O-7 e C-13, rompe-se

a ligação do carbono com

o oxigênio do epóxido

O mais viável é a formação do anel de 5 membros

pela ligação entre o O-7 e C-13. A ligação entre O-

7 e C-14 não é termodinamicamente viável pois

levaria a um anel de 4 membros

Artefato A

AcO

OTIg

MeOOC

O oxigênio recebe um

próton formando uma

nova ligação, ficando

eletronicamente

deficiente.

Sendo o oxigênio mais

eletronegativo que o

carbono, ele tende a

romper a ligação com o

carbono satisfazendo

sua deficiência.

Na realidade forma-se um

intermediário onde a

deficiência eletrônica do

oxigênio é compartilhada

entre dois carbonos

Com a formação da ligação

entre O-7 e C-13, rompe-se

a ligação do carbono com

o oxigênio do epóxido

O mais viável é a formação do anel de 5 membros

pela ligação entre o O-7 e C-13. A ligação entre O-

7 e C-14 não é termodinamicamente viável pois

levaria a um anel de 4 membros

Artefato A

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isolamento da azadirachtina A. Este extrato foi submetido por extração líquido-

líquido e fracionamento em sílica-gel. A identificação agora deste composto

proveniente de uma degradação forçada da azadirachtina A sugere a possibilidade

do 1-tigloil-3-acetilazadirachtinina descrito na literatura como um produto natural ser

na verdade um derivado reacional.

Tabela 2.17 – Dados de RMN

H e

C para o 1-tigloil-3-acetilazadirachtinina.

Isolado (CDCl

) Literatura [48] Azadirachtina A [174]Carbono

1 * * 4,70 70,0 4,77 (m) 70,6

2 * * a. 2,27

b. 2,15

30,2 a. 2,32 (m)

b. 2,26 (m)

29,7

3 * * 5,45 67,9 5,51 (tl) 67,0

4 * * - 52,2 - 52,7

5 3,15 37,0 3,25 35,5 3,34 (d) 37,0

6 4,40 72,5 4,50 73,3 4,62 (dd) 73,9

7 4,18 81,0 4,60 81,9 4,77 (m) 74,3

8 - 51,0 - 50,9 - 45,6

9 3,50 47,0 3,40 47,7 3,34 (s) 44,1

10 - 53,8 - 49,2 - 50,2

11 * * - 104,8 - 104,2

12 * * - 172,5 - 171,8

13 - 95,0 - 94,0 - 68,7

14 - 93,2 - 92,9 - 70,0

15 4,54 82,3 4,20 81,5 4,67 (d) 76,7

16 a. 1,68

b. 1,32

29,0 a. 1,50

b. 1,98

30,2

1,31 (d)

25,1

17 2,15 51,0 2,18 50,8 2,38 (d) 48,6

18 1,50 27,5 1,50 27,4 2,01 (s) 18,5

19 a. 4,25

b. 3,80

70,0 a. 4,21

b. 3,64

70,4 a. 4,15 (d)

b. 3,63 (d)

69,0

20 - 86,0 - 85,7 - *

21 5,65 108,0 5,60 109,3 5,65 (s) 108,5

22 4,88 107,3 4,90 108,8 5,05 (d) 107,6

23 6,40 145,2 6,40 146,8 6,46 (d) 146,9

28 a. 4,00

b. 3,68

73,5 a. 4,03

b. 3,68

73,2 a. 4,08 (d)

b. 3,75 (d)

72,9

29 * * - 173,8 - 173,6

30 1,68 17,5 1,67 18,0 1,75 (s) 21,4

7-OH * * - - 2,83 (sl) -

11-OH * * - - 5,03 (d) -

20-OH * * - - 2,89 (sl) -

12-OMe * * 3,71 53,4 3,69 (s) 52,8

29-OMe * * 3,76 53,2 3,80 (s) 53,2

OAc * * 2,00 169,9 1,95 (s) 169,8

20,8

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Tig

1’ * * - 166,1 - 166,3

2’ * * - 128,7 - 128,6

3’ * * 6,90 138,2 6,92 (m) 137,9

4’ * * 1,80 14,2 1,78 (dd) 14,3

5’ * * 1,82 12,1 1,86 (s) 11,9

* Sinais não identificados.

A mistura de artefatos obtida na degradação da azadirachtina foi

também submetida a inserção direta num Espectrômetro Massas/Massas e à LC-

MS/MS. Os parâmetro otimizados para a inserção direta da amostra no MS/MS e

para a separação através da LC-MS/MS encontram-se descritas no item 2.4.12 (pg.

67).

A análise por LC-MS/MS revelou no cromatograma UV (Figura 2.92) a

presença de pelo menos três compostos de destaque. A banda de absorção em 40,7

min apresenta o mesmo espectro de UV da azadirachtina A. Esta banda foi

confirmada para a azadirachtina A através da análise de um padrão. Os outros dois

compostos de destaques, todavia, apresentavam modificações no espectro de UV

confirmando uma alteração no esqueleto do limonóide. Entretanto, apesar de ser

evidente a modificação estrutural, estes dois produtos reacionais apresentam o

mesmo pseudo íon molecular da azadirachtina não degradada de [M-H]

m/z 719 Da

como pode ser observado comparando o cromatograma obtido monitorando o

pseudo íon molecular m/z 719 com o cromatograma de íons totais (TIC) na Figura

2.93. Estes resultados sugerem uma modificação interna na molécula, contudo, sem

a perda ou adição de algum grupo funcional como, por exemplo, uma desidratação

ou hidratação nestes compostos. Os outros dois compostos de destaque

apresentaram um tempo de retenção de 48,5 e 53,5 min. Assim, a análise LC-

MS/MS vem confirmar a estrutura do 1-tigloil-3-acetilazadirachtinina que apresenta

uma massa molecular de 720 g.mol

-1

e, quando operando no modo negativo de

ionização por eletrospray, também deve gerar um pseudo íon molecular em [M-H]

m/z 719 Da. A diferença na fragmentação entre os compostos em 48,5 e 53,5 min

confirma a existência de diferenças entre suas estruturas.

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Figura 2.92 – Cromatogramas obtidos dos produtos de reação. (a) Cromatograma

em 3 D da eluição monitorada entre 200 e 350 nm. (b) Cromatograma em 2 D da

eluição em 206 nm. (c) Espectros de UV referente as três bandas de destaque do

cromatograma b. Os parâmetros de análise encontram-se descritos no Item 2.4.12.

Os íons monitorados no LC-MS/MS foram selecionados após a

inserção direta da mistura, onde se observou num full scan picos não referentes a

fragmentação da azadirachtina A, indicando novos compostos.

minut

irach

(a)

(b)

(c)

mAU

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Figura 2.93 – (a) Cromatograma de Íons Totais (TIC) da mistura. (b) Cromatograma

obtido monitorando o íon m/z 719. (c), (d) e (e) Cromatogramas obtidos monitorando

os íons m/z 673, 737 e 705 respectivamente.

O segundo produto de degradação de destaque, o qual, também

apresenta um pseudo íon molecular [M-H]

m/z 719, não foi possível determinar sua

estrutura através dos dados de RMN. Contudo, sabendo que ele apresenta o mesmo

pseudo íon molecular que a azadirachtina e que o 1-tigloil-3-acetilazadirachtinina

identificado, pode-se supor que, semelhantemente ao 1-tigloil-3-

acetilazadirachtinina, este composto não tenha sofrido adição nem eliminação de

grupos funcionais. Assim, uma segunda estrutura molecular (produto de reação B)

pode ser proposta pelo fechamento de um anel de seis membros entre o oxigênio

em C-11 e o carbono C-13 num mecanismo semelhante ao descrito anteriormente.

Ou seja, ocorre a protonação do oxigênio do epóxido o qual pode sofrer o ataque

nucleofílico da hidroxila do hemicetal como mostra a Figura 2.94.

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00

Time

100

HPLC_MS_MoacirAzad_0404_FS4 Sb (2,40.00 ); Sm (Mn, 4x3) Scan ES-

705

1.15e6

37.18

3.93

HPLC_MS_MoacirAzad_0404_FS4 Sb (2,40.00 ); Sm (Mn, 4x3) Scan ES-

737

4.54e5

38.07

28.21

HPLC_MS_MoacirAzad_0404_FS4 Sb (2,40.00 ); Sm (Mn, 4x3) Scan ES-

673

3.52e5

37.16

45.11

HPLC_MS_MoacirAzad_0404_FS4 Sb (2,40.00 ); Sm (Mn, 4x3) Scan ES-

719

5.27e6

40.90

HPLC_MS_MoacirAzad_0404_FS4 Sb (2,40.00 ); Sm (Mn, 4x3) Scan ES-

TIC

2.39e7

40.92

49.15

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

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Figura 2.94 – Mecanismo reacional de degradação da azadirachtina A para o

segundo produto de reação.

Sendo o detector de MS/MS mais sensível que o detector de UV, foi

possível identificar no TIC além de existência dos três compostos de pseudo íon

molecular [M-H]

m/z 719 outros compostos de [M-H]

m/z 737, 705 e 673. Numa

análise por inserção direta MS/MS, observa-se que o perfil de fragmentação destes

produtos são diferentes dos produtos em m/z 719. Através dos seus respectivos íons

moleculares é possível propor duas novas estruturas para produtos de degradação.

Novamente a protonação do epóxido pode assistir uma hidratação na molécula no

C-14 numa reação de substituição nucleofílica bimolecular. A posição C-14 neste

caso é preferível tendo uma adição não estérica. A posição C-13 possui um grupo

metílico que causa uma repulsão eletrônica na aproximação do nucleófilo. Assim, é

possível propor a hidratação em C-14 gerando o pseudo íon molecular [M-H]

m/z

737 (Produto de reação C). Uma vez formado este produto e, tendo uma livre

rotação na ligação C-8/C-14, este novo grupo hidróxido na face β do C-14 pode

reagir com a carboxíla em C-12 formando um anel lactônico, num mecanismo de

adição/substituição nucleofílica, eliminando uma unidade de metanol (32 g.mol

-1

)

permitindo propor um produto com um pseudo íon molecular [M-H]

m/z 705 (produto

de reação D). Estes dois novos produtos reacionais encontram-se ilustrados na

Figura 2.95.

OOC

TigO

AcO

OOC

Protonação do epóxido com

a formação de um

carbocátion em C-13

Produto de reação B

OCH

TigO

OAc

OOC

OCH

TigO

OAc

OOC

TigO

OAc

OCH

OOC

TigO

AcO

OOC

Protonação do epóxido com

a formação de um

carbocátion em C-13

Produto de reação B

OCH

TigO

OAc

OOC

OCH

TigO

OAc

OOC

TigO

OAc

OCH

OOC

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Figura 2.95 - Mecanismo de degradação da azadirachtina A para formação de

produtos reacionais pela adição e eliminação de grupos funcionais.

Figura 2.96 – Espectro de massas ESI

. (a) [M-H]

m/z 719 – Azadirachtina A; (b) [M-

m/z 737; (c) [M-H]

m/z 705 e (c) [M-H]

m/z 673.

2.5.6 Análise do Óleo Essencial das Folhas

A identificação dos componentes do óleo essencial foi feita através da

comparação de seus espectros de massas e cálculo de seus índices de retenção

[170]. O índice de retenção de Kovats foi calculado para cada componente

detectado no óleo essencial, segundo a equação de Van Den Dool e Kratz [171].

100

Moacir_Azad_0404_DIneg 4 (0.331) 2: Daughters of 705ES-

2.80e4

211.1

193.0

149.1

121.1

167.2

471.3

229.2

453.2

429.3

231.0

361.1

257.0

343.3 411.2

705.5

519.4

501.3

475.3

661.4

561.4

557.4

601.5

643.3

Moacir_Azad_0404_DIneg 7 (0.554) 1: Daughters of 719ES-

4.56e4

687.4

193.1

149.2

121.1

123.0

167.1

211.1

491.3

229.1

273.3

243.1

385.3

279.4

317.1

359.4

487.3

469.2

441.3

535.4

517.4

577.2

657.3

719.4

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950

m/z

100

Moacir_Azad_0404_DI3neg 17 (0.497) Daughters of 737ES-

2.04e4

139.1

125.1

737.4

257.2

167.1

211.1

221.0

277.2

377.2

301.2

363.2

347.2

705.4

437.5

385.3

631.5

537.1

507.4

465.1

677.2

100

Moacir_Azad_0404_DI5neg 7 (0.414) 2: Daughters of 673ES-

1.58e4

505.4

487.4

477.4

443.3

211.2

194.0

121.0

176.9

167.1

433.3

405.3

379.2353.4

335.2

461.4

673.5

547.4

519.4

583.4

601.6

(a)

(b)

(c)

(d)

MeO

O O

MeO

O O

+ H

O - MeOH

Produto de reação C Produto de reação D

MeO

O O

MeO

O O

MeO

O O

MeO

O O

+ H

O - MeOH

Produto de reação C Produto de reação D

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Equação de Van Den Dool e Kratz:

Onde:

IR = índice de retenção de Kovats

N = C

– C

n-1

= número de carbonos do n-alcano que elui após a substância analisada

n-1

= número de carbonos do n-alcano que elui antes a substância analisada

= tempo de retenção da substância analisada

= tempo de retenção do n-alcano que elui após a substância analisada

x-1

= tempo de retenção do n-alcano que elui antes a substância analisada

A partir da comparação dos índices de retenção calculados, dos

espectros de massas com os encontrados, com os dados descritos na literatura, fez-

se a identificação dos componentes do óleo essencial extraído das folhas do

enxerto. A Tabela 2.18 apresenta sete sesquiterpenos identificados no óleo

essencial, seus índices de retenção calculados (IR), índices de retenção

apresentados na literatura (IR lit.) [170] e seu tempo de retenção (t

). a Figura 2.97

ilustra a estrutura destes compostos identificados.

Tabela 2.18 – Sesquiterpenos presentes no óleo essencial das folhas do enxerto.

Composto t

IR IR lit.

δElemeno

18,158 1342 1338

β Elemeno

19,688 1395 1391

Cariofileno (Z) 20,452 1424 1409

γElemeno

20,807 1438 1437

α Humulene

21,365 1459 1455

Germacrene D 22,095 1488 1485

Germacrene B 24,089 1565 1561

Além dos sete compostos identificados o cromatograma de íon totais

do óleo apresentou outros 17 compostos que não foram identificados. Não foram

IR = 100.N.

+ 100.C

n-1

– t

n-1

)

– t

n-1

)

IR = 100.N.

+ 100.C

n-1

– t

n-1

)

– t

n-1

)

– t

n-1

)

– t

n-1

)

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encontrados espectros de massas na literatura com perfil semelhante aos espectros

de massas para estes compostos.

Figura 2.97 – Estruturas sesquiterpenicas identificadas no óleo essencial das folhas

do enxerto.

Estes compostos não foram encontrados na literatura como

identificados da A. indica. O cromatograma de íons totais do óleo essencial das

folhas do enxerto se encontra ilustrado na Figura 2.98 e foi obtido sob as condições

descritas no item 2.4.10.

Figura 2.98 – Cromatograma de íons totais do óleo essencial do enxerto.

δ-Elemeno β-Elemeno Cariofileno (Z) γ-Elemeno

α-Humuleno Germacreno D Germacreno B

δ-Elemeno β-Elemeno Cariofileno (Z) γ-Elemeno

α-Humuleno Germacreno D Germacreno B

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Quantificação do Enxerto de

Azadirachta indica sobre Melia azedarach e

de Óleos Comerciais do Nim

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3. Desenvolvimento de Métodos Cromatográficos para Quantificação da

Azadirachtina A em Sementes e Óleos Comerciais do Nim

O valor comercial do Nim (Azadirachta indica A. Juss) é conhecida pelo

homem desde os tempos de Vedia (aproximadamente 1500 a.C.). Todas as partes

do Nim, folhas, flores, frutos, sementes, amêndoas, casca, madeira, ramos, raízes,

etc, têm sido usadas, especialmente no sistema de medicina “Ayurvedica” no

tratamento de diversas enfermidades.

Hoje, as aplicações do Nim estão sendo confirmadas no moderno

formato da ciência e produtos, baseados tanto no conhecimento ancestral quanto no

conhecimento moderno. Alguns de seus produtos já se encontram comercialmente

disponíveis. As principais áreas em que o Nim tem encontrado aplicações são:

pesticidas e produtos agroquímicos relacionados, medicina, medicina veterinária,

produtos de toalete, cosméticos, nutrientes de plantas (fertilizantes), alimentação

animal, matéria prima para a indústria de papel, plásticos, etc. [172].

Devido ao grande número de aplicações e às possibilidades de

substituição das tecnologias existentes hoje por produtos originados do Nim, seu

cultivo tem sido rapidamente ampliado em diversos países ao redor do globo.

Juntamente com a confirmação científica das propriedades do Nim e a expansão de

seu cultivo, tem ocorrido o surgimento de uma grande variedade de produtos

comerciais formulados a base de extratos do Nim que, automaticamente, leva a

necessidade de controles qualitativos e quantitativos da qualidade desses cultivos e

dos produtos formulados.

Na prática duas partes da planta têm sido exploradas, as folhas e os

frutos. Isto ocorre por dois motivos principais. Primeiro, é que a planta não precisa

ser destruída para o preparo dos extratos e em segundo, é nestas partes que se

concentra os principais compostos ativos do Nim. Entre os compostos do Nim que

apresentam atividades biológicas (em sua grande maioria limonóides) se destaca a

azadirachtina A sendo o limonóide presente em maior quantidade na planta,

encontrada, principalmente nas sementes [173]. Como principal composto ativo do

Nim, responsável por diversas das atividades atribuídas à planta [03], diversos são

os trabalhos encontrados na literatura para a quantificação da azadirachtina A nas

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sementes e em óleos obtidos das sementes do Nim. Existem outros 13 compostos

considerados isômeros funcionais da Azadirachtina A.

Na grande diversidade de trabalhos publicados, variados são os

métodos de quantificação empregados. Estes métodos podem ser classificados em

métodos cromatográficos e métodos não cromatográficos. Entre os métodos não

cromatográficos, por exemplo, tem-se o método colorimétrico de quantificação

desenvolvido por Dai et al. [174]. Neste método proposto, é possível quantificar a

quantidade total de azadirachtinas e compostos relacionados nos extratos da

semente, contudo, sem uma possível caracterização/quantificação do isômero

azadirachtina A isoladamente. É uma técnica rápida de análise proposta para

estimar uma relação entre a atividade biológica de um extrato com o teor de

azadirachtinas e compostos relacionados no extrato. Contudo, é uma técnica não

seletiva. Este mesmo grupo desenvolveu também, outra técnica de quantificação

total das azadirachtinas, com propostas similares, usando ensaios com vanilina e

calibração multivariada [175,176]. Shütz et al. [173] desenvolveu um método

bastante sensível permitindo determinar a presença da azadirachtina em partes por

bilhão (ppb) usando Enzyme Linked Immunosorbente Assay (ELISA), porém, sem

ser possível sua quantificação.

Entre os métodos cromatográficos, podem-se destacar três técnicas

bastante estabelecidas que tem sido amplamente utilizadas para a quantificação da

azadirachtina sendo elas, a Cromatografia com Fluído Supercrítico (SFC),

Cromatografia Gasosa (GC) e a mais comum, a Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência (HPLC). Em comum, as técnicas são as necessidades de um

procedimento de extração eficiente e uma limpeza (clean up) prévia das amostras

antes de serem submetidas à análise. Ambrosino et al. [177] descrevem um método

para a extração da azadirachtina A usando um fluído supercrítico (CO

), sendo o

rendimento da extração monitorada por cromatografia líquida e por cromatografia

gasosa. A SFC é uma técnica de extração seletiva, não exigindo etapas de limpeza

para as amostras, contudo, não pode ser empregada para determinações de rotina,

sendo melhor aplicada para extrações em grandes quantidades de materiais, pois

exige alto custo de instalação e mão de obra especializada. Como Ambrosino,

Johnson et al. também fazem uso desta técnica em trabalhos com extratos do Nim

[178].

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Entre os métodos disponíveis, a HPLC é o método com maior

número de publicações usado para a determinação de teores de azadirachtina A em

sementes e em óleos de Nim. Variados são os procedimentos de extração e limpeza

adotados na literatura, como diversos são os parâmetros cromatográficos

estabelecidos. Schneider et al. [179] apresenta um método de quantificação por

HPLC em fase reversa com extração por Soxhlet, necessitando uma grande

quantidade de sementes e de solventes para esta extração além das possibilidades

de degradação do analito. Além disso, em seu método apresenta um tempo de

eluição da azadirachtina próximo a 6 min com baixa seletividade para o analito.

Outra proposta encontrada na literatura para a quantificação por HPLC foi a de

Schaaf et al. [180] que apresenta um método bastante sensível para baixas

concentrações, porém, usando como detector um Espectrômetro de Massas (MS)

acoplado a um HPLC no modo gradiente, sendo esta configuração instrumetal

pouco comum em análises de rotina. Nutan Kaushik [181] trás um método de HPLC-

UV-DAD utilizando uma fase móvel de ACN:H

O – 40:60 na vazão de 1 mL/min.,

obtendo um cromatograma com tempo reduzido de análise e possivelmente não

permitindo interação eficiente entre o analito e a fase estacionária, quantificando

uma banda obtida em tempo um pouco inferior a três minutos, provavelmente,

referente a vários compostos (a azadirachtina possui diversos isômeros que

absorvem similarmente no UV não sendo possível identificar a co-eluição no

fotodiodo). Sidhu et al. [182] apresenta um estudo sazonal quantificando a

azadirachtina A e B, porém, apesar de ser um método relativamente simples,

usando uma mistura isocrática terciária, de fácil aplicação, apresenta elevado tempo

de análise para um baixo fator de separação (α = 1,06) entre os isômeros. Diversos

outros métodos e técnicas de quantificação podem ser encontrados na literatura,

como, por exemplo, a cromatografia líquida por padronização interna (Thejavathi et

al. [183]) e cromatografia líquida de média pressão (Sharm et al. [184]). Cada

técnica descrita possui suas vantagens e desvantagens dependendo principalmente

da configuração instrumental disponível e do interesse de aplicação para o método

proposto.

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3.1 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

A cromatografia constituiu-se atualmente em um conjunto de técnicas

de separação com forte caráter interdisciplinar. Em suas diferentes formas (gasosa,

líquida e com fluído supercrítico) tem encontrado aplicações em praticamente todas

as áreas do conhecimento nas quais a análise qualitativa e/ou quantitativa de

espécies químicas deva ser realizada [185]. A cromatografia pode ser conceituada

como um método físico-químico de separação, ela esta fundamentada na migração

diferenciada dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes

interações entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária. A grande

variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias torna-a uma técnica

extremamente versátil e de grande aplicação [185].

Os primeiros trabalhos de separação cromatográfica datam do início do

século XX sendo os primeiros estudos sobre o assunto apresentado por Michael S.

Twett em 1903, quem também definiu mais tarde, corretamente o processo que deu

o nome à técnica. Hoje em dia, devido ao grande número de separações analíticas

necessárias e o enorme poder de separação da técnica, e sem dúvida devido ao

conhecimento adquirido sobre a técnica, a cromatografia líquida tem uma posição de

destaque nos laboratórios de caracterização e quantificação analíticas.

Em geral o desenvolvimento de métodos freqüentemente segue uma

série de etapas bem definidas que consistem em: obter informações sobre a

amostra definindo os objetivos de separação; a necessidade e qual os

procedimentos de pré-tratamento exigido pela amostra e pela instrumentação

facilitando assim a separação e protegendo o equipamento e as colunas de

separação; a seleção do detector; a otimização dos parâmetros de separação;

determinar a quantificação e a recuperação do método proposto e por último a

validação do método. Em resumo, a análise cromatográfica envolve as etapas de

preparo de amostras, separação cromatográfica e identificação.

Não diferente do esperado, todas as etapas citadas acima foram

investigadas para o desenvolvimento de uma técnica eficiente e robusta de

quantificação da azadirachtina A nas sementes e nos óleos do Nim.

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3.2 Desenvolvimento dos Métodos de Pré-tratamento das Amostras

O preparo de amostras (Pré-tratamento ou clean up) é parte essencial

para análises por HPLC que deve ser planejada provendo soluções reprodutivas e

homogêneas disponível para ser introduzida na coluna. O propósito do pré-

tratamento é de obter amostras (1) solúveis que (2) encontram-se relativamente

livre de interferentes, (3) não causem danos a coluna e (4) compatíveis com o

método HPLC planejado em concentrações que possam ser medidas [185,187,188].

A Tabela 3.1 resume um número de procedimentos de preparo inicial de amostras

gasosas, líquidas ou suspensões.

Tabela 3.1 – Métodos típicos para pré-tratamento de amostras.

Tipo da

Amostra

Métodos de

pré-tratamento

Princípios da técnica

Aprisionamento

em fase sólida

Amostra gasosa passada através de um tubo empacotado com um

adsorvente (p.ex.;sílica gel, carvão ativo); os analitos aprisionados

são eluídos com um solvente apropriado.

Orgânicos

Voláteis,

gases

Aprisionamento

líquido

Amostra gasosa é passada através de uma solução que seja um bom

solvente para os analitos.

Extração em

fase sólida

A amostra líquida é passada através de uma fase sólida que

seletivamente remove os analitos (ou interferentes); o analito pode ser

removido com um solvente apropriado. Em alguns casos os

interferentes são retidos e os analitos permitidos passar através da

fase sólida não sendo retidos; utiliza os mesmos mecanismos de

HPLC.

Extração

líquido-líquido

A amostra é particionada entre duas fases imiscíveis que são

escolhidas para maximizar diferenças na solubilidade.

Diluição

A amostra é diluída com um solvente compatível com a fase móvel da

HPLC para evitar sobrecarga na coluna ou se enquadrar a faixa linear

do detector.

Evaporação

O líquido é removido por um suave aquecimento a pressão

atmosférica com fluxo de ar ou um gás inerte sobre vácuo.

Procedimento adotado para solucionar problemas de sensibilidade do

detector.

Destilação

A amostra é aquecida até o ponto de ebulição do solvente sendo os

analitos concentrados na fase de vapor, condensados e coletados.

Micro-diálise

Uma membrana semipermeável é colocada entre duas fases aquosas

onde a amostra se transfere de uma fase líquida para outra baseada

sobre um diferencial de concentração.

Líquida

Liofilização

Amostras aquosas são congeladas e a água removia por sublimação

sob vácuo.

Filtração

O líquido é passado através de um filtro de papel ou membrana para

remover partículas suspensas.

Centrifugação

A amostra é colocada em tubos que são girados em alta velocidade

na centrífuga. O sobrenadante é decantado.

Suspensões

Sedimentação

A amostra é deixada em repouso em um tanque de sedimentação

provocando a decantação natural das partículas no meio.

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As amostras líquidas, em geral, são muito mais fáceis de serem

manipuladas que as amostras sólidas. Em alguns casos a amostra é facilmente

dissolvida estando pronta para injeção ou pré-tratamento. Em alguns casos a

amostra matriz pode ser insolúvel nos solventes comuns necessitando que os

analitos sejam primeiramente removidos e somente depois pré-tratados de modo a

estarem disponíveis para análise. Este problema com amostras insolúveis introduz

uma etapa anterior a do pré-tratamento, a etapa de extração, trazendo consigo,

novos problemas como a eficiência da extração. Na Tabela 3.2 podem ser

encontrados alguns métodos de extração de amostras sólidas.

Tabela 3.2 – Tradicionais métodos de extração de amostras sólidas.

Método Princípios da Técnica

Extração

Líquido-Sólido

A amostra é inserida em um recipiente estático adicionando-se um solvente para

dissolver os analitos de interesse; a solução é separada do sólido por filtração.

Extração Soxhlet

A amostra é inserida em um recipiente poroso (dedal); fluxos de solventes são

constantemente refluxados através do dedal sendo os analitos dissolvidos

coletados continuamente em frascos durante a ebulição.

Lixiviação por

Fluxo-forçado

A amostra é colocada em um tubo onde um solvente é fluído através dele. O tubo

é aquecido até próximo ao ponto de ebulição do solvente.

Homogeneização

A amostra é colocada em um liquidificador, o adiciona-se o solvente, procedendo

uma homogeneização para um estado finamente dividido; o solvente é removido

para mais adiante ser trabalhado.

Sonicação

Uma amostra num estado finamente dividido é imersa com solvente em um

banho de ultra-som sendo submetida a radiação ultra-sônica.

Dissolução

A amostra é tratada pela adição de um solvente formando imediatamente uma

solução com ou sem mudanças químicas.

Extração

Acelerada por

Solvente (ASE)

A amostra é colocada em um recipiente lacrado e aquecido acima do seu ponto

de ebulição, causando uma elevação na pressão do vasilhame. A amostra

extraída é automaticamente removida estando pronta para novos tratamentos.

Extração por

Soxhlet

Automatizado

É uma combinação entre a lixiviação por solvente aquecido e extração por

soxhlet; a amostra em um dedal é primeiramente imersa dentro de um solvente

em ebulição, posteriormente sendo o dedal elevado para convencional

extração/lavagem soxhlet com refluxo de solvente sendo, em seguida,

concentrado.

Extração com

Fluído

Supercrítico

A amostra é introduzida em um recipiente que permite um fluxo através dele,

sendo um fluído supercrítico (p.ex., CO

) passado através da amostra. Após a

despressurização, o analito extraído é coletado em solvente ou aprisionado em

um absorvente, seguindo por uma desorção ou lavagem com solvente.

Extração

assistida por

Microondas

A amostra é inserida em um recipiente, aberto ou fechado, aquecido com uma

energia proveniente de microondas, causando a extração do analito em um

solvente.

Extração Térmica

Uma forma amostragem por Headspace dinâmico, mas as amostras são

aquecidas com temperaturas (controlada) muito altas, acima de 350ºC.

Muito se confunde o desenvolvimento do pré-tratamento das amostras

com a otimização dos parâmetros de separação cromatográfica. Ambas as etapas

devem ser simultaneamente investigadas, observando como o pré-tratamento pode

auxiliar na seletividade e robustez do método.

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3.3 Procedimento Experimental

3.3.1 Generalidades

As análises cromatográficas foram realizadas nos seguintes

equipamentos:

01. Cromatógrafo líquido de Alta eficiência SHIMADZU, uma bomba LC

10-ATvp, com uma válvula seletora de solvente FCV-10Alvp, um detector de

ultravioleta de comprimento de onda variável SPD-10Avp e um auto-injetor SIL-

10AF. O equipamento está acoplado a uma interface SCL 10Avp e os

cromatogramas são registrados através do software CLASS-VP.

02. Cromatógrafo líquido de alta eficiência SHIMADZU com duas

bombas LC-10AD, um detector de ultravioleta de comprimento de onda variável

SPD-10A, um detector de arranjo de fotodiodos SPD-M10Avp e um auto-injetor SIL-

10A. O equipamento está acoplado a uma interface LC-10 e os cromatogramas são

registrados através do software Shimadzu Class LC 10.

03 . Cromatógrafo líquido de alta eficiência SHIMADZU com duas

bombas LC-10Atvp, com uma válvula seletora de solvente FCV-10Alvp, um

degaseificador de membrana DGU-14A, um detector de ultravioleta de comprimento

de onda variável SPD-10Avp, um auto-injetor SIL-10Advp e uma câmara para

controle de temperatura (Column Oven) CTO-10A. O equipamento está acoplado a

uma interface SCL-10Avp e os cromatogramas são registrados através do software

CLASS-VP.

A água utilizada na composição das fases moveis, foi obtida em um

sistema MILLI-Q

(MILLIPORE).

A centrifugação das amostras de sementes no preparo dos extratos

para quantificação, foram centrifugadas em uma centrífuga JOUAN B4i/BR4i

termostatizada. A homogeneização das amostras em MeOH foi realizada em vórtex

PHOENIX AP56. A secagem das amostras centrifugadas para a obtenção dos

extratos, foram realizadas em um evaporador de solvente à vácuo (SPEEDVAC) da

SAVANT SPEEDVAC PLUS SC 10 A acoplado com um refrigerador VAPOR TRAP

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RVT-400 SAVANT, uma bomba a vácuo SAVANT VLP-200 e um registrados Digital

VACUUM GAUGE DVG 50 SAVANT.

Para a pesagem dos padrões, foi utilizada uma balança analítica AND,

modelo HR200, com precisão de 0,0001 g.

Os solventes grau HPLC ou ultra-puros utilizados nas análises foram

adquiridos da MALLINCKRODT ou J.T.BAKER. Todos foram utilizados após serem

filtrados a vácuo em um sistema de filtração MILLIPORE com um funil de 300 mL e

frasco de 1 L, utilizando-se membranas de PTFE PHENOMENEX

47 mm de

diâmetro e poros de 0,47 µm e, posteriormente degaseificados em um ultra-som

BRANSON 1510.

Para o preparo de amostras por filtração, foram utilizados filtros PTFE

MILLIPORE

30 mm de diâmetro e poros de 0,45 µm. As amostras preparadas por

SPE utilizaram cartuchos BAKERBOND

SPE CYANO e BAKERBOND

SPE C18

da J.T.BAKER. Ambos os cartuchos usados eram de 100 mg de fase estacionária e

o leito com 1 mL de capacidade. Os cartuchos eram manuseados em um suporte

para cartucho (VACUUM MANIFOLD) de 20 posições da VARIAN no. 815 acoplado

a uma bomba de vácuo, TECNAL TE-058.

O padrão de Hidrocortisona utilizado foi adquirido da SIGMA-

ALDRICH. Os padrões de Azadirachtina A e B, foram extraídos, isolados e

caracterizados no Laboratório de Química de Produtos Naturais da UFSCar.

A coluna utilizada no desenvolvimento dos métodos e nas análises das

amostras, foi uma coluna C18 LUNA

(II) (150x0,46 mm, de 5 µm, 100 Å) adquirida

da PHENOMENEX

(Torrance, CA, USA). A coluna de segurança ou Pré-coluna

utilizada, foi um cartucho HOLDER

bicompartilhado contendo, em seu interior, um

cartucho de segurança C18 (4x3 mm, de 5 µm, 100 Å), adquirido da

PHENOMENEX

(Torrance, CA, USA).

3.3.2 Coleta do Material Vegetal para Análise

Os óleos analisados foram cedidos por quatro empresas nacionais, a

Dalquim Ind. Quím. Ltda., a Bioneem Tec. Conslt. Ind. Com. Ltda., a Base Fértil

Com. Agric. E a Baraúna Com. Ind. Ltda. Estes óleo foram obtidos pela prensa

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mecânica das sementes lavadas e despolpadas do Nim. Alguns óleos eram de

procedência estrangeira (indiano), importado e distribuído por algumas destas

empresas.

As sementes de Nim utilizadas na investigação quantitativa do

enxerto, foram coletadas para análise em Xambrê-PR, na Estação Experimental do

Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR) em abril de 2005. Além dessas sementes,

foram cedidas sementes coletadas em Brejinho do Nazaré-TO, Timbaúba-PE, Itinga-

MG, Catanduva-SP, Ariranha-SP, Urupês-SP e Belém-PA.

Todas as sementes foram submetidas ao mesmo procedimento de

extração, lavagem, despolpa, secagem e armazenamento.

3.3.2.1 Métodos de Coleta

Para que as possíveis variáveis experimentais de extração, lavagem,

despolpa, secagem e armazenamento não influenciassem nos resultados das

análises, esses procedimentos foram padronizadas sendo constantes em todas as

coletas. Foi elaborado um método de procedência experimental abaixo descrito.

Coleta. Colher cachos de frutos em três locais da propriedade,

contendo no mínimo 200 frutos por local. Manter sempre as amostras

de cada local, separadas.

Modo de Coleta. Colher os cachos quando os frutos se encontram

desenvolvidos e alguns já iniciaram a madurez. Deixar na sombra até

que todos os frutos estejam maduros. Retirar a polpa, esfregando os

frutos sobre uma peneira, sob jato de água. Lavar bem para tirar a

mucilagem e colocar em sol pleno por dois dias e secar mais quatro

dias à sombra.

Etiquetar as três amostras, numerando-as e colocando os seguintes

dados:

Experimento de Origens:

Colaborador:

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Local de coleta: Fazenda, cidade, estado, es especificação dentro da

propriedade

Idade do plantio:

Data de coleta:

3.3.3 Métodos Analíticos

3.3.3.1 Preparo das Soluções Padrão

a) Azadirachtina A: uma massa de 10 mg foi precisamente pesada e

transferida para um balão volumétrico de 10 mL. O padrão foi solubilizado em MeOH

e armazenado a – 20 ºC. A solução estoque preparada apresentou concentração

nominal de 1000 µg/mL.

b) Hidrocortisona: uma massa de 10 mg foi precisamente pesada e

transferida para um balão volumétrico de 10 mL. O padrão foi solubilizado em MeOH

e armazenado a – 20 ºC. A solução estoque preparada apresentou concentração

nominal de 1000 µg/mL.

c) Azadirachtina B: uma massa de 5 mg foi precisamente pesada e

transferida para um balão volumétrico de 5 mL. O padrão foi solubilizado em MeOH

e armazenado a – 20 ºC. A solução estoque preparada apresentou concentração

nominal de 1000 µg/mL.

3.3.3.2 Solução Padrão Estoque

A partir das soluções padrão foram preparadas soluções filhas

estoques padrão de calibração para a construção das curvas de calibração e para o

preparo das soluções estoque usadas nos controles de qualidade. As soluções

padrão de calibração e de controle de qualidade preparada para cada padrão foram:

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a) Azadirachtina A:

Soluções padrão de calibração: 25,0; 50,0; 100,0; 200,0; 300,0;

400,0 e 500,0 µg/mL.

Soluções padrão de controle de qualidade: 30,0; 250,0; 450,0 e

470,0 µg/mL.

Soluções padrão de calibração: 50,0; 100,0; 200,0; 300,0; 400,0;

500,0 e 600,0 µg/mL.

Soluções padrão de controle de qualidade: 60,0; 250,0 e 540,0

µg/mL.

b) Hidrocortisona:

Soluções padrão de calibração: 25,0; 50,0; 100,0; 200,0; 300,0;

400,0 e 500,0 µg/mL.

Soluções padrão de controle de qualidade: 30,0; 250,0 e 470,0

µg/mL.

c) Azadirachtina B:

Soluções padrão de calibração: 25,0; 50,0; 100,0; 200,0; 300,0;

400,0 e 500,0 µg/mL.

3.3.3.3 Solução Padrão de Análise

As soluções filhas (20 µL), usadas para a construção das curvas de

calibração e para a validação do método (3.3.3.2), foram secos e submetidos aos

mesmos procedimento de pré-tratamento aplicados as amostras (descritos nos itens

3.3.4.1, 3.3.4.2, 3.3.4.3). Após as etapas de pré-tratamento foram secos e

reconstituídos em 200 µL de MeOH fornecendo as soluções padrão de análise.

Cada solução padrão de análise foi analisada em concentração 10 vezes menor que

as respectivas soluções filhas.

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3.3.3.4 Obtenção das Curvas de Calibração por Padronização Externa

A partir das soluções padrão de calibração apropriadas foram

preparadas, em triplicatas, as curvas de calibração nas seguintes concentrações:

a) Azadirachtina A –quantificação das sementes pelo método I e

quantificação do óleo: 2,5; 5,0; 10,0; 20,0; 30,0; 40,0 e 50,0 µg/mL.

b) Azadirachtina A – método II para quantificação das sementes: 5,0;

10,0; 20,0; 30,0; 40,0; 50,0 e 60,0 µg/mL.

c) Azadirachtina B – quantificação das sementes e do óleo: 2,5; 5,0;

10,0; 20,0; 30,0; 40,0 e 50,0 µg/mL.

As curvas de calibração foram obtidas através da regressão linear,

considerando a área das bandas cromatográficas relativas às concentrações dos

analitos. Um mínimo de sete diferentes concentrações foi considerado em cada

curva de calibração. A linearidade foi obtida através do valor do coeficiente de

correlação.

3.3.3.5 Obtenção das Curvas por Adição de Padrão

A partir da solução padrão de 1.000 µg/mL de Azadirachtina A foram

preparadas soluções estoque de calibração nas seguintes concentrações: 30,0;

60,0; 90,0; 120,0 e 150,0 µg/mL para o método de quantificação do óleo e 50,0;

100,0; 150,0; 200,0 e 300,0 µg/mL para a quantificação da semente. Para a

obtenção das amostras, as soluções estoques (50 µL) foram adicionadas as

matrizes, 15 mg de óleo e 10 mg de semente respectivamente. Após a

homogeneização, as amostras foram secas e submetidas aos pré-tratamentos

estipulados para cada método. Concluído as etapas de pré-tratamento, as amostras

secas foram reconstituídas em 500 µL.

As curvas por adição de padrão foram então, obtidas através da

regressão linear, considerando a área das bandas cromatográficas relativas às

concentrações dos analitos. Um mínimo de cinco diferentes concentrações foi

considerado em cada curva de calibração. A linearidade foi obtida através do valor

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do coeficiente de correlação. Foram calculados os fatores de resposta para cada

curva e, através dos cálculos de retorno, o teor de azadirachtina A em cada amostra.

3.3.3.6 Seletividade, Eficiência de Extração (Recuperação), Precisão e Exatidão

(1) Seletividade: Cada seqüência de análise continha três amostras para assegurar

a seletividade do método.

(2) Eficiência de Extração (Recuperação): a recuperação foi determinada utilizando-

se do preparo de curvas por adição de padrão uma vez que não se possuíam

amostras isentas dos analitos de interesse nem, padrões similares aos analitos que

proporcionassem análises por padrão interno.

(3) Precisão (intra e interdias) e Exatidão: estes parâmetros foram avaliados

utilizando-se amostras preparadas, em quintuplicatas, a partir das soluções padrão

estoques nas seguintes concentrações: 3,0; 25,0 e 470,0 µg/mL (azadirachtina A e

hidrocortizona), 3,0; 25,0 e 45,0 µg/mL (azadirachtina A) e 6,0; 25,0 e 54,0 µg/mL

(azadirachtina A), preparadas em dias não consecutivos. As amostras foram obtidas

a partir das soluções estoques de controle de qualidade onde, 20 µL de cada

solução, foram secos e submetidos aos procedimentos de pré-tratamento

estabelecidos para o referente método em validação. Após as etapas de pré-

tratamento, cada amostra foi reconstituída em 200 µL de MeOH. A precisão do

método foi expressa como o coeficiente de variação (CV%) das replicatas. A

exatidão foi expressa em percentagem e considerada como a razão entre o valor

médio das concentrações encontradas e o valor médio das concentrações

adicionadas. A exatidão foi também determinada através do Teste Cego, a partir de

duas soluções de concentração desconhecida ao analista, que foram preparadas em

triplicata e injetadas. Para a precisão foram aceitos valores de CV menores ou iguais

a 2 % para as amostras preparadas a partir dos padrões estoque e 15 % para as

amostras de sementes e óleos. Para a exatidão, os desvios aceitos, também foram

inferiores a 2% do valor nominal da concentração, conforme critérios de aceitação

do método [191,199].

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3.3.3.7 Limites de Quantificação e de Detecção

O LQ foi estabelecido como a menor concentração, de três

amostras, onde a precisão não excedia o valor de 15 % de variabilidade e a

exatidão não ultrapassasse desvios de 15 % do valor nominal da concentração. O

LD foi estabelecido como a menor concentração em que se observa um sinal três

vezes maior que o ruído do detector.

3.3.4 Preparo das Amostras

3.3.4.1 Amostras de Sementes Método I

No laboratório, de cada lote de semente lavada, despolpada e moída,

eram preparadas em triplicata, três amostras para análise. Inicialmente, sementes

moídas eram pesadas em três amostras de 5 g cada. Essas amostras foram

submetidas a maceração com 100 mL MeOH por 9 dias sendo, o solvente

substituído a cada 72 horas. Todo o MeOH utilizado foi concentrado à vácuo em um

evaporado rotativo BÜCH R. De cada extrato obtido, era retirado uma alíquota de 10

mg sendo suspensas em 1,5 mL de uma solução preparada com 0,9 mL de MeOH e

0,6 mL de hexano. A suspensão foi agitada em um vórtex PHOENIX AP56 e filtrada

em filtros PTFE MILLIPORE

30 mm de diâmetro e poros de 0,45 µm sendo, em

seguida, o filtro lavado com mais 2,0 mL de MeOH. Toda a solução (3,5 mL) foi seca

e reconstituída em 200 µL de MeOH.

Estando as amostras prontas, foram analisadas usando uma coluna

analítica C18 Luna

(II) da Phenomenex® (150x4,6mm, 5 µm) com a uma pré-

coluna de segurança Phenomenex® (4x3mm, 5 µm) acoplada, fase móvel binária

composta de H

O:ACN (65:35, v/v), vazão de 0,8 mL/min e volume de injeção de 20

µL. O equipamento usado foi cromatógrafo líquido de alta eficiência SHIMADZU,

equipado com bomba LC 10-ATvp, válvula seletora de solvente FCV-10Alvp,

detector de ultravioleta de comprimento de onda variável SPD-10Avp e auto-injetor

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SIL-10AF. O equipamento foi acoplado à uma interface SCL 10Avp e os

cromatogramas registrados através do software CLASS-VP.O detector foi operado

selecionando o comprimento de onda de 217 nm.

As amostras foram quantificadas pela construção de uma curva de

calibração externa para a azadirachtina A.

3.3.4.2 Amostras de Sementes Método II

Após receber os lotes de sementes lavadas, despolpadas e secas, no

laboratório foi separado a revelia, vinte unidades de cada lote. Dessas sementes foi

separada a palha da amêndoa sendo cada parte pesada. Com isto foi possível

estabelecer o peso médio de cada semente e da amêndoa da semente, sendo

possível comparar as sementes de diversas origens.

Os extratos foram preparados pesando-se em um tubo falcon de 10

mL, 15 mg de sementes moídas de Azadirachta indica e adicionando em cada tubo

1,0 mL de MeOH sendo agitando por 30 segundos. Em seguida cada amostra foi

centrifugada (20º C) por 20 minutos a 10.000 rpm (Centrífuga Jouan Br4i). O

procedimento de extração foi repetido por mais duas vez. Toda a fase móvel

coletada (3 mL) foi adicionada em um tudo de ensaio de 5 mL e seca num

equipamento SpeedVac (Savant SpeedVac Plus SC 10 A) a 43ºC em 50 minutos,

obtendo-se um extrato seco.

Os extratos obtidos foram submetidos a SPE para a eliminação das

impurezas. Um cartucho BAKERBOND

CYANO DA J.T.BAKER

de 100 mg e leito

de 1 mL foi condicionado em 5 mL de hexano sem deixá-lo secar. Dissolveu-se o

extrato em 400 µL de hexano, aplicando-o ao cartucho. O tubo que continha o

extrato foi lavado com mais 200 µL de hexano o qual também foi aplicado ao

cartucho. Após aplicar a amostra no cartucho, eluiu-se o cartucho com 4 mL de

hexano retirando os interferentes mais apolares (lavagem), permitindo que o

cartucho seque no final dos 4 mL de hexano. Após a lavagem do cartucho com

hexano, lavou-se o tudo do extrato com outros 600 µL de MeOH o qual foi

transferido ao cartucho. Eluiu-se o cartucho com o MeOH sendo, em seguida,

novamente eluído com mais 400 µL de MeOH. O MeOH foi usado para a remoção

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dos analitos de interesse do cartucho. Foi usada uma câmara à vácuo (Manifold –

Varian) acoplada a uma bomba de vácuo, trabalhando a uma pressão próxima a 70

mmHg onde os cartuchos eram embutidos e o fluxo de lavagem e eluição mantidos

constantes. A fração metanólica foi seca sob um suave fluxo de ar comprimido

sendo, então, reconstituída em 1 mL de MeOH.

Estando as amostras prontas, foram analisadas usando uma coluna

analítica C18 Luna

(II) da Phenomenex® (150x4,6mm, 5 µm) com a uma pré-

coluna de segurança Phenomenex® (4x3mm, 5 µm) acoplada, fase móvel

quaternária composta de H

O:ACN:MeOH:THF (61:34:4:1, v/v), vazão de 0,8 mL/min

e um volume de injeção de 20 µL. O equipamento usado foi o mesmo descrito no

segundo parágrafo do ítem 3.3.4.1 na página 200.

As amostras foram quantificadas pela construção de uma curva de

calibração por padronização externa para a azadirachtina A e outra para a

azadirachtina B.

3.3.4.3 Amostras dos Óleos Comerciais

Cada amostra de óleo foi analisada por Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência (CLAE) sendo o número de repetições para cada lote igual a três. Após as

amostras serem pesadas (15 mg do óleo), foram submetidas aos procedimentos

limpeza pré-definidos dissolvendo-se o óleo em 200 µL de hexano, em seguida,

agitado e aplicado num cartucho de extração em fase sólida BAKERBOND

CYANO

da J.T.BAKER de 100 mg e 1 mL previamente condicionado com 5 mL de hexano. A

amostra foi aplicada ao cartucho previamente condicionado sem deixá-lo secar. O

tubo onde havia sido pesado o óleo, foi novamente lavado com mais 200 µL de

hexano que, também foi aplicado ao cartucho. Em seguida a amostra foi lavada com

4 mL de hexano permitindo a secagem do cartucho no final. Mais uma vez, o tubo da

amostra foi lavado, porém, agora, com 600 µL de MeOH e aplicado ao cartucho

seco, onde, eluiu-se o cartucho removendo o analito de interesse. Em seguida, o

cartucho foi novamente eluído com mais 400 µL de MeOH. Foi utilizada uma câmara

à vácuo (Manifold – Varian) acoplada a uma bomba de vácuo, trabalhando a uma

pressão próxima a 70 mmHg onde os cartuchos eram embutidos e o fluxo de

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lavagem e eluição mantido constante. A fração metanólica foi coletada e seca sob

um suave fluxo de ar comprimido e reconstituída em 500 µL de MeOH estando

pronta para a análise.

Estando as amostras prontas, foram analisadas usando uma coluna

analítica C

Luna

(II) da Phenomenex® (150x4,6mm, 5 µm) com a uma pré-coluna

de segurança Phenomenex® (4x3mm, 5 µm) acoplada, fase móvel quaternária

composta de H

O:MeOH:ACN:THF (51,00:36,75:7,35:4,90, v/v), vazão de 0,8

mL/min e um volume de injeção de 20 µL. O equipamento usado foi o mesmo

descrito no segundo parágrafo do ítem 3.3.4.1 na página 200.

As amostras foram quantificadas pela construção de uma curva de

calibração por padronização externa para a azadirachtina A e outra para a

azadirachtina B.

3.4 Resultados e Discussões

3.4.1 Desenvolvimento do Método de Quantificação da Azadirachtina nas

Sementes do Nim - Preparo de Amostras e Otimização dos Parâmetros

Cromatográficos

A primeira razão para um resultado inexato e impreciso em HPLC é a

natureza da amostra. As amostras para serem analisadas devem ser homogêneas e

representativas de um material total. Isto é particularmente verdadeiro para amostras

sólidas, embora, líquidos não homogêneos também podem ser problemáticos. O

preparo de amostras para HPLC tipicamente envolve o preparo de uma solução para

injeção.

Não diferentemente, foi necessário o preparo de uma solução

homogênea a partir de sementes do Nim com alta eficiência na extração dos analitos

(poder de extração) e reprodutibilidade na extração. Assim, foram desenvolvidos

dois métodos de extração e pré-tratamento para o preparo destas amostras e

conseqüentemente, dois métodos analíticos. Cada método, após a otimização dos

parâmetros de separação foi submetido aos procedimentos de validação.

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3.4.1.1 Método I – Amostras Preparadas a partir da Extração Líquido-Sólido da

Semente do Nim – Pré-tratamento: Filtração

A abertura de uma amostra vegetal é tradicionalmente realizada pela

técnica de extração líquido-sólido cujo o objetivo é a retirada das substâncias ativas

do tecido vegetal. Essa extração é efetuada via processo simples de contato do

solvente com os analitos num processo de difusão. O solvente penetra nos poros da

fase sólida e, devido a diferença de concentração, os analitos migram para a fase

menos saturada. A eficiência da extração depende das interações químicas entre a

substância e o solvente utilizado em relação à solubilidade no tecido. Neste caso, as

propriedades físicas do solvente influenciam diretamente a permeabilidade na

membrana celular [188,189].

Deste modo, como ponto de partida, foi macerado com solventes

orgânicos em ordem crescente de polaridade 10 g de sementes do nim, previamente

lavadas, despolpadas e moídas (LDM), obtendo os extratos hexânico, DCM e

metanólico. Sabendo que a azadirachtina é um composto que apresenta uma média

polaridade, foi escolhido o extrato DCM para o início dos trabalhos. Esta polaridade

é muito comum para os limonóides. Um exemplo disto é a quantidade e espectros

de RMN de limonóides realizados com CDCl

como descritos no Capítulo II.

Uma vez obtido o extrato, era agora necessário estabelecer alguns

parâmetros cromatográficos proporcionando seletividade para o analito em questão,

de modo que mais adiante, fosse possível investigar quais seriam as melhores

etapas de extração e pré-tratamento para a obtenção das amostras reprodutivas.

Esta investigação iniciou-se através de uma eluição cromatográfica gradiente, no

modo reverso. Entende-se por “eluição gradiente exploratória”, o procedimento

cromatográfico em fase reversa, na qual se emprega uma mistura de H

O (solvente

A) e um solvente orgânico (solvente B - MeOH ou acetonitrila - ACN) como

constituintes da fase móvel onde a composição da fase móvel é alterada

constantemente. Os procedimentos adotados seguiram a proposta apresentada por

Snyder & Dolan [190]. Neste trabalho os autores apresentam um método de HPLC

gradiente, como proposta para a eluição inicial da amostras em estudo, podendo

prever por este método, qual o modo de separação, gradiente ou isocrática, será

mais apropriada para uma certa amostra. Sendo o eluição isocrática possível, os

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autores também apresentam uma maneira de estimar a melhor força para a fase

móvel a ser utilizada ou, se realmente a eluição gradiente for necessária, permite

estimar a melhor extensão do gradiente.

Assim, foi inicialmente realizado um gradiente exploratório, eluíndo

uma amostra preparada com o extrato DCM diluído em MeOH, variando a força da

fase móvel (% B) de 5 a 100 % de ACN em água em 60 min. Em eluições gradientes

a força do solvente aumenta durante a separação cromatográfica [188]. Trabalhando

no modo reverso, com o aumento da fase orgânica (B) reduz a porcentagem de

água, diminuindo a polaridade da fase móvel aumentando a solubilidade dos analitos

mais apolares, conforme reduz a polaridade do meio, promovendo a separação (o

tempo de retenção de cada soluto está em função da composição da fase móvel). A

ACN foi escolhida como solvente orgânico inicial, preferivelmente sobre MeOH, por

apresentar menor viscosidade e por permitir o uso de detector de UV abaixo de 210

nm. A separação cromatográfica gradiente foi realizada usando uma coluna

octadecil (C

) Phenomenex

Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm) com uma coluna de

segurança Phenomenex

(4,0x3,0 mm, 5 µm) acoplada. A vazão da fase móvel foi

de 2 mL/min, a alça de injeção de 20 µL. A separação foi acompanhada por um

detector de UV-Vis em um comprimento de onda de 217 nm. Sob as mesmas

condições, foi realizada uma eluição gradiente com o padrão de azadirachtina, para

conhecer o tempo de retenção do analito de interesse e estabelecer a extensão da

análise.

Figura 3.1 – Gradiente linear usado para o desenvolvimento do método. A %B na

fase móvel variou de 5 à 100% em 60 min.

Tempo / (min)

(

)

100

Tempo / (min)

(

)

100

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0 10 20 30 40 50 60

100

200

300

400

500

600

Área/(mAbs)

Tempo/(min.)

(a) (b)

Figura 3.2 – Gradientes exploratórios: (a) extrato DCM das sementes LDM do Nim;

(b) padrão de azadirachtina (80 µg/mL). Ambos os cromatogramas foram obtidos

sob as condições descritas no parágrafo acima.

Conhecendo o tempo de retenção do analito e as características

hidrofílicas/hidrofóbicas da amostra (distribuição das bandas durante a separação)

observou-se que para a completa separação dos analitos da amostra, seria

necessária a separação gradiente. Contudo, apesar de a separação gradiente

apresentar algumas vantagens sobre a isocrática, como a possibilidade de

separação de amostras complexas (amostras com ampla faixa de k), a eluição

isocrática é normalmente preferida pois, geralmente, para uma separação gradiente

exige equipamentos mais complexos, não podendo ser usado com alguns

detectores, o desenvolvimento e a otimização são mais longos com maior número

de varáveis a serem investigadas e apresenta problemas com a linha de base e com

maiores tempos de análise entre outros.

Como o método a ser desenvolvido para quantificar apenas a

azadirachtina A, não necessitava de resolução para os demais compostos presentes

na matriz, optou-se pela separação isocrática. Com o tempo de retenção conhecido

para o analito, utilizou-se a separação gradiente para determinar a força da fase

móvel a ser usada na eluição isocrática. Como a primeira banda apresentou um

tempo de retenção de 9,5 min e a azadirachtina 22,5 min, foi possível estipular uma

fase móvel para promover a separação apenas dos compostos que eluiram até 30

min no gradiente, onde os demais interferentes da matriz poderiam ser lavados em

seguida, sendo excluídos da coluna. Com este objetivo, fez-se uso da proposta de

Snyder & Dolan [190] baseado no tempo de retenção do último pico, onde, estimou-

se uma fase móvel com 45% de ACN para uma eluição isocrática.

0 20 40 60 80

100

200

300

400

500

600

700

Área/(mAbs)

Tempo/(min.)

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Uma vez selecionada a faixa de interesse, inicio-se os experimetnos

isocráticos para otimizar os parâmetros de separação do extrato, buscando um

método seletivo e robusto.

Figura 3.3 – Separação isocrática do extrato DCM. Fase móvel ACN:H

O – 45:55;

coluna C

Phenomenex

Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm), coluna de segurança

Phenomenex

(4,0x3,0 mm, 5 µm). Vazão 1 mL/min, a alça de injeção de 20 µL e

detector de UV-Vis em 217 nm.

O teste realizado com a fase móvel proposta (ACN:H

O – 45:55)

mostrou-se ineficiente para a separação da azadirachtina – banda em 5 min –

exigindo modificações. Assim, foram testadas as possibilidades de redução na força

da fase móvel e alterações na vazão e na temperatura de análise na tentativa de

promover uma melhor interação entre o analito/fase estacionária, interferentes/fase

estacionária, competição solvente/matriz proporcionando assim, seletividade ao

método.

Entre as fases móveis testadas, a que apresentou a melhor resolução

foi ACN:H

O – 35:65 com vazão de 0,8 mL/min (Figura 3.4) entre as vazões de 0,5,

0,8 e 1,0 mL/min investigadas (Figura 3.5). Também foi testada a influência do THF

e o uso de um forno elétrico, contudo, não foram encontradas melhorias que

justificassem suas aplicações.

0 5 10 15 20

100

120

mAbs

tempo/min

AzadirachtinaAzadirachtina

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Figura 3.4 – Separação isocrática do extrato DCM. Fase móvel ACN:H

O – 35:65;

coluna C

Phenomenex

Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm), coluna de segurança

Phenomenex

(4,0x3,0 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min, a alça de injeção de 20 µL e

detector de UV-Vis em 217 nm.

(a) (b) (c)

Figura 3.5 – Separação isocrática do extrato DCM. Fase móvel ACN:H

O – 35:65;

coluna C

Phenomenex

Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm), coluna de segurança

Phenomenex

(4,0x3,0 mm, 5 µm), a alça de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis

em 217 nm. Vazão: (a) 0,5 ml/min; (b) 0,8 mL/min: (c) 1,0 mL/min.

Uma vez estabelecida o fator de separação (α) e a Resolução (R

)

para a azadirachtina, retornou-se à procura do melhor método de preparo da

amostra (clean up). Um método eficiente poderia proporcionar a resolução

(qualidade da separação) necessária para a azadirachtina garantindo robustez

(pouca sensibilidade a pequenas variações), repetibilidade e proteção/preservação

da coluna analítica.

Sendo a semente do Nim uma matriz sólida, como já discutido acima,

era necessário primeiramente definir a extração do analito para, somente após a

obtenção de uma nova matriz (extrato) solúvel, definir os procedimentos de limpeza.

Tradicionalmente para essas matrizes a extração ocorre por extração líquido-sólido

(macer) entre o material vegetal em o solvente. O solvente é coletado e concentrado

obtendo um extrato bruto. Neste caso é preciso definir qual o melhor caminho para

0 3 6 9 12 15 18

mAbs

tempo/min

0 4 8 12 16 20 24 28

mAbs

tempo/min

0 3 6 9 12 15 18

mAbs

tempo/min

AzadirachtinaAzadirachtina

0 4 8 12 16

mAbs

tempo/min

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obter uma eficiência máxima na extração dos princípios ativos. Schneider & Ermel

[179] em um trabalho publicado em 1986, investigaram qual o solvente com maior

poder de extração para a azadirachtina nas sementes. Realizando um trabalho

semelhante, foi investigado qual o solvente, entre clorofórmio, MeOH, MeOH:EtOH

(1:1) e EtOH apresentaria a maior eficiência de extração. Dez gramas de sementes

MDL foram maceradas por 9 dias em 100 mL de cada solvente mencionado em

triplicata. Cada solvente foi substituído após 72 horas de maceração. Cada extrato

(total de 12) foi analisado por HPLC nas condições previamente estabelecidas onde

se observou que numa comparação relativa, as áreas integradas referentes a

azadirachtina nos extratos metanólicos, foram as que se apresentaram maiores em

decorrência do maior teor de azadirachtina. O resultado encontrado foi o mesmo

resultado obtido e descrito por Schneider & Ermel. Todos os quatro extratos

preparados apresentaram coeficientes de variação, em massa, inferiores a 5%.

Definido qual o melhor solvente de extração para a obtenção de um extrato que

permitisse obter amostra líquida para análise, ainda era preciso definir o pré-

tratamento do extrato e a eficiência (poder) de extração do método.

3.4.1.1.1 Pré-tratamento do Extrato Metanólico da Semente do Nim

Dentre as diversas etapas envolvidas na análise de amostras

complexas, o pré-tratamento é um procedimento comum e necessário antes da

medida do analito de interesse. Sendo a maceração com solvente orgânico um

método de extração pouco seletivo, melhor deve ser o pré-tratamento usado,

promovendo a melhor seletividade possível ao método pela eliminação de

interferentes que podem co-eluir com o analito além de garantir a longevidade das

colunas analíticas. Dois foram os procedimentos de limpeza investigados para os

extratos metanólicos. O primeiro foi a extração em fase sólida (SPE).

A SPE é realizada pela retenção seletiva dos componentes de

interesse em uma fase estacionária (sorbente) previamente selecionada que,

dependendo do sorbente utilizado, apresenta um mecanismo próprio de separação

[185]. No tratamento do extrato metanólico foi testado cartuchos de SPE

empacotados com 100 mg de fases quimicamente ligadas (derivatizadas) em sílica.

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Os sorbentes usados foram a octadecil (C

) e a cianopropil (CN). Com estas fases,

dois foram os modos de operação na SPE investigados, o isolamento da matriz e o

isolamento do analito respectivamente.

Na SPE, análogo à cromatografia, se tem um volume de fase móvel,

constantemente se movimentando sobre a coluna (absorção e partição

líquido/sólido) sendo a cada momento renovado o volume da fase móvel sobre um

determinado volume da fase sólida, sendo o equilíbrio constantemente alterado,

satisfazendo sempre o valor do coeficiente de partição para os componentes

considerados. Nestas condições o sistema tenta atingir imediatamente o equilíbrio, e

o coeficiente de partição será dado pela relação da concentração do analito nas

fases consideradas (sólida e líquida). As substâncias existentes na amostra, com

diferentes valores do coeficiente de partição, viajarão com velocidades maiores ou

menores, dependendo do seu coeficiente de partição proporcionando a separação.

Estas fases derivatizadas em sílica surgiram no início da década de 60 para

substituir a sílica, a alumina ou outros adsorventes polares na análise de compostos

altamente polares onde poderia ocorrer adsorção irreversível entre o analito e a fase

estacionária.

O objetivo do uso dos cartuchos de C

foi de promover a retenção do

maior número de interferentes no cartucho e eluir o analito de interesse o qual

passava direto com o solvente da amostra. O modo de operação dos cartuchos de

CN propunha exatamente o inverso do C

, reter primeiramente o analito de

interesse na fase estacionária com a eliminação primária dos interferentes sendo em

seguida removido através do uso de um solvente apropriado. Os procedimentos de

condicionamento dos cartuchos, solubilização do extrato, remoção dos interferentes

e eluição do analito para os modos propostos encontram-se na Tabela 3.3.

Num primeiro momento, todos os testes realizados com SPE não se

mostraram reprodutíveis com grandes coeficientes de variações entre as amostras.

Um dos possíveis problemas que geraram esta perda na eficiência da técnica,

possivelmente ocorreu pela grande quantidade de matriz introduzida no cartucho,

uma vez que o fator concentração influencia diretamente na repetitividade da

técnica. Esta hipótese foi reforçada com novos testes realizados durante o

desenvolvimento dos métodos.

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Tabela 3.3 – Testes de SPE para o extrato metanólico nos modos de operação

normal e reverso.

Cartucho Fração Solubilização Condicionamento

dos cartuchos

Remoção dos

interferentes

Eluição do

analito

50 mg

Ext.DCM

200 µL hexano

50 µL MeOH

20 mL MeOH

2 mL H

2 mL MeOH 2 mL ACN*

50 mg

Ext.DCM

50 µL hexano

200 µL MeOH

20 mL MeOH

2 mL H

2 mL MeOH 2 mL ACN*

50 mg

Ext.DCM

200 µL hexano

50 µL MeOH

20 mL MeOH

2 mL H

3 mL MeOH 2 mL ACN*

30 mg

Ext.DCM

150 µL hexano

150 µL MeOH

2 mL MeOH

2 mL H

1 mL MeOH:H

(1:1)

2 mL ACN**

30 mg

Ext.DCM

150 µL hexano

150 µL MeOH

2 mL MeOH

2 mL H

1 mL MeOH:H

(1:1) – secar o

cartucho

2 mL ACN**

30 mg

Ext.DCM

100 µL hexano

100 µL MeOH

2 mL MeOH

2 mL H

3 mL MeOH:H

(5:95) – secar o

cartucho

3 mL ACN

30 mg

Ext.MeOH

100 µL hexano

100 µL MeOH

2 mL MeOH

2 mL H

3 mL MeOH:H

(5:95) – secar o

cartucho

3 mL ACN

CN 30 mg

Ext.DCM

150 µL hexano

150 µL MeOH

2 mL hexano 1 mL hexano 2 mL ACN

CN 30 mg

Ext.DCM

300 µL ACN

2 mL hexano 1 mL hexano 2 mL ACN

CN 30 mg

Ext.DCM

300 µL ACN

2 mL ACN 1 mL hexano 2 mL ACN

CN 30 mg

Ext.MeOH

300 µL ACN

2 mL hexano 1 mL hexano 2 mL ACN

CN 30 mg

Ext.DCM

100 µL hexano

100 µL MeOH

2 mL hexano 3 mL hexano

secar o cartucho

3 mL DCM***

CN 30 mg

Ext.MeOH

100 µL hexano

100 µL MeOH

2 mL hexano 3 mL hexano

secar o cartucho

3 mL DCM***

* Os cartuchos foram novamente lavados com mais 2 mL de ACN para verificar se havia ainda algum resíduo da azadirachtina retido. **

Cartuchos lavados com 2 mL de MeOH. *** Cartuchos lavados com 3 mL de MeOH.

Neste momento, devido às dificuldades iniciais encontradas, buscou-se

uma nova alternativa para o pré-tratamento do extrato, mais simples e menos

agressiva, através da técnica de filtração. Esta técnica consiste basicamente em

produzir uma suspensão do extrato em solvente e passar por um filtro de papel ou

membrana removendo as partículas suspensas. Esta técnica é recomendada para

prever entupimentos o que elevaria a pressão do sistema reduzindo o tempo de vida

da coluna [188]. Um procedimento simples foi elaborado consistindo em suspender

30 mg do extrato MeOH em 1500 µL de uma solução preparada com 900 µL de

MeOH e 600 µL de hexano. A suspensão era agitada (vortex) e filtrada com um filtro

millipole

de 0,45 µm sendo o filtro, em seguida, lavado com mais 2000 µL de

MeOH. Toda a solução (3600 µL) era seca e reconstituída em 200 µL de MeOH

estando pronta para a análise. Foi também investigada a reconstituição da amostra

com ACN, contudo, o MeOH mostrou-se mais eficiente produzindo bandas

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cromatográficas mais estreitas corroborando para a resolução. Com esta técnica

obtiveram-se bons resultados, com cromatogramas apresentando boas resoluções

tanto para a azadirachtina quanto para a hidrocortisona (para a hidrocortisona, veja

o próximo item).

Os testes com a SPE foram realizados com extratos preparados em

ordem crescente de polaridade, hexano, DCM e MeOH, porém, os testes para a

filtração foram realizados com extratos preparados pela maceração das sementes

LDM somente com MeOH.

Apesar da reprodutibilidade nos resultados obtidos com o método de

preparo de amostras por filtração, na aplicação do método para separação das

amostras, ficou evidente que ainda havia a necessidade de novas modificações. Em

primeiro, a faixa linear de trabalho da azadirachtina (faixa de concentração das

amostras), era muito elevada, de 25 à 500 µg/mL o que consumia grandes

quantidades de um padrão difícil de se obter e que pequenos erros operacionais ou

pessoais geravam grandes erros analitos dificultando a validação do método. Em

segundo, devido a grande quantidade de amostras injetadas, mesmo com a coluna

de segurança e a passagem de ACN 100% entre as análises, a cada 16 amostras

analisadas havia uma saturação da coluna com prejuízos a resolução necessitando

o interrompimento das análises para a realização de procedimentos de limpeza com

isopropanol e clorofórmio. Esta perda de resolução pode ser atribuída as grandes

quantidades de amostras injetadas que podem provocar uma o alargando ou a

forma das bandas dos analitos. Isto acontece porque a coluna tem um limite de

capacidade para reter a amostra.

Assim tornou-se necessário trabalhar com menores quantidades de

amostras, ou seja, promover a diluição das amostras diminuindo a faixa linear de

trabalho. Para isto, foi avaliado o limite de detecção do equipamento, o que permitiu

estabelecer uma faixa linear de trabalho entre 2,5 e 50 µg/mL (10 vezes mais diluído

que a faixa proposta inicialmente). Para garantir que a concentração do analito se

encaixasse dentro da faixa linear de trabalho, foram necessárias algumas alterações

nos procedimentos de extração e pré-tratamento. O respeito à faixa linear de

trabalho é importante, pois somente dentro desta faixa é possível garantir a

linearidade do método, ou seja, garantir que o método analítico em questão seja

capaz de gerar resultados proporcionais à concentração dos analitos dentro do

intervalo dinâmico investigado [187]. Assim, procedendo às modificações nos

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extratos ao invés de 10 g de sementes LDM foram usados 5 g para o preparo do

extrato. Dez miligramas do extrato obtido eram submetidos aos procedimentos de

solubilização/filtração e reconstituído, não mais 200 µL de MeOH, mas sim, em 5

mL. Esta diluição não pode ser menor, pois a concentração do analito fugia da faixa

linear de trabalho estabelecida. O uso de menores quantidades de sementes

demonstrou prejuízos ao preparo dos extratos por maceração afetando a

reprodutibilidade do método.

Este novo tratamento, após ser avaliado em relação a sua

reprodutibilidade, demonstrou-se coerente com a faixa de concentração estipulada,

além de reduzir a carga de compostos sobre a coluna analítica proporcionando um

aumento significativo na resolução, sensibilidade e seletividade. Este procedimento

é detalhado na Figura 3.6.

Figura 3.6 – Procedimentos de extração/pré-tratamento para as sementes do Nim

descritos para o Método I.

O método apresentou um fator de separação (α) de 1,08 para a

azadirachtina em relação à banda crítica em 15,35 min, e uma resolução (R

) de

2,06. O fator de separação mede a seletividade entre duas bandas adjacentes. Já a

resolução é uma medida da qualidade da separação entre estas bandas.

Resoluções de R

> 1,5 correspondem a uma resolução de linha de base, porém

para métodos aplicados dia-a-dia, uma resolução R

> 2 é indicada devido a

5 g semente

moída

Macerada

3 X 100 mL

MeOH

(3 dias cada)

Extrato

10 mg

Hexano

MeOH

600 µL

900 µL

Agitada

Fitrado

2,0 mL

Seca com ar

comprimido

Reconstituída

com 5 mL MeOH

analisada por CLAE

(0,45 µm)

5 g semente

moída

Macerada

3 X 100 mL

MeOH

(3 dias cada)

Extrato

10 mg

Hexano

MeOH

600 µL

900 µL

Agitada

Fitrado

2,0 mL

Seca com ar

comprimido

Reconstituída

com 5 mL MeOH

analisada por CLAE

(0,45 µm)

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pequenas alterações a que o método pode estar sujeito [187,188]. Empregando os

procedimentos de extração, pré-tratamento e análise otimizados, a seletividade na

separação da azadirachtina nas amostras de sementes, foi investigada pelo uso de

um Espectrofotômetro de Foto-diodo avaliando sua absorção na região do ultra-

violeta (200 – 370 nm). Nessa eluição cromatográfica (Figura 3.7) a banda de

absorção da azadirachtina não apresentou nenhuma co-eluição de interferentes. O

detector de Foto-diodo registra simultâneos cromatogramas em diferentes

comprimentos de onda em uma única eluição, podendo obter, selecionando-se a

faixa de início e fim, o espectro de UV para uma determinada banda de absorção. A

análise deste espectro de UV, para a banda de absorção selecionada, além de

permitir a escolha do melhor comprimento de onda para as análises seguintes,

permite avaliar a pureza da banda. Contudo, esta técnica também possui suas

limitações. Ela requer que os espectros no UV/Visível dos compostos co-eluídos

sejam diferentes entre si para serem detectados. Além disso, os sistemas

disponíveis no comércio são incapazes de detectar co-eluentes interferentes que

estejam numa concentração menor que 1% [188,192].

Figura 3.7 – Separação do extrato MeOH submetido ao pré-tratamento de filtração.

Fase móvel ACN:H

O – 35:65; coluna C

Phenomenex

Luna(II) (150x4,6 mm, 5

µm), coluna de segurança Phenomenex

(4,0x3,0 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min, a

alça de injeção de 20 µL. Detector de Foto-diodo no comprimento de onda de 217

nm.

3.4.1.1.2 Poder de Extração Estabelecido para o Método I

Como o método em desenvolvimento era um método que quantificaria

a azadirachtina no extrato e não diretamente a semente, era preciso verificar o

0 4 8 12 16 20

mAbs

tempo/min

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quanto o procedimento de extração era eficiente para, assim, conhecer o teor de

azadirachtina nas sementes. Uma alternativa encontrada foi o uso de um padrão de

referência. O padrão escolhido foi a hidrocortisona (HC).

A HC foi escolhida por apresentar uma estrutura esteroidal com

características físicas e estruturais próximas a dos limonóides. O objetivo do padrão

de referência era de conhecer a eficiência na extração deste composto, sendo ele

adicionado na matriz em quantidades conhecidas e quantificado juntamente com a

azadirachtina no final do processo. Assim, conhecendo a quantidade adicionada e a

quantidade quantificada seria possível prever a perda absoluta deste padrão durante

os processos de extração e pré-tratamento. Deste modo, conhecendo a perda para

o padrão de referência era possível extrapolar este resultado para a azadirachtina.

Desta forma, junto com o desenvolvimento do método para obter

resolução que permitisse a quantificação da azadirachtina o método foi desenvolvido

também promovendo uma resolução satisfatória para a HC (Figura 3.8). O método

desenvolvido foi validado para ambos os analitos confirmando a qualidade das

medições.

Figura 3.8 – Separação do extrato MeOH com resolução para a azadirachtina e

para a HC. Fase móvel ACN:H

O – 35:65; coluna C

Phenomenex

Luna(II)

(150x4,6 mm, 5 µm), coluna de segurança Phenomenex

(4,0x3,0 mm, 5 µm).

Vazão 0,8 mL/min, a alça de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm.

H H

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O poder de extração foi investigado em três concentrações distintas,

uma no início da faixa linear de trabalho, uma na região central e uma próxima ao

final. Deste modo foi possível extrapolar a eficiência da extração e possíveis perdas

no pré-tratamento para toda a faixa de trabalho. Para cada concentração foram

preparados extratos em triplicada pela adição e homogeneização da HC nas

sementes.

Tabela 3.4 – Preparo dos extratos para a quantificação da HC em sementes do Nim

(Catanduva-SP).

Extrato Semente / g Extrato / mg CV (%)

5 1,03 1,0

5 1,06 0,1

5 1,07 3,0

Uma vez obtidos os extratos foram preparadas as amostras e

analisadas sob os parâmetros cromatográficos otimizados e validados. Entre a

eluição das amostras foram intercalados padrões de controle de HC monitorando a

perda ou não da linearidade do método (Tabela 3.7). A curva de calibração por

padronização externa de HC foi construída com uma faixa linear de trabalho entre

2,5 – 50,0 µg/mL (Figura 3.9 e Tabela 3.5). As soluções padrão utilizadas para o

desenvolvimento do método foram preparadas através da dissolução da HC em

MeOH na concentração de 1000 µg/mL e, a partir desta, foram obtidas soluções

estoque nas concentrações de 25; 50,0; 100,0; 200,0; 300,0; 400,0 e 500,0 µg/mL

utilizadas no preparo de amostras para as curvas analíticas. Cada ponto da curva

analítica foi preparado a partir das soluções estoque sendo a concentração final de

cada amostra dez vezes diluídas. Também foram obtidas soluções estoques nas

concentrações de 30,0; 250,0 e 470,0 µg/mL utilizadas para a obtenção de amostras

de controle do método. Essas soluções foram armazenadas a –20 ºC e mantiveram

sua estabilidade por aproximadamente 3 meses onde não foi observada nenhuma

degradação durante o desenvolvimento do método.

A curva analítica foi obtida com amostras nas seguintes concentrações

de HC: 2,5; 5,0; 10,0; 20,0; 30,0; 40,0 e 50,0 µg/mL. Para a obtenção das amostras,

as soluções estoque (20 µL) foram evaporadas sob fluxo de ar comprimido e

submetidas aos mesmos procedimentos de pré-tratamento que as amostras das

sementes sendo, no final, reconstituídas com 200 µL de MeOH. Com os resultados

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obtidos da curva analítica foram estimados matematicamente os coeficientes de

regressão a e b e o coeficiente de correlação r através do método matemático

conhecido por regressão linear. Esse método permite obter uma relação linear

simples entre a resposta do detector e a concentração das amostras descrita pela

equação y = ax + b (conhecida por equação de reta). A equação de reta definida

para a HC foi y = 5,00239.10

-5

x + 0,22005 com um coeficiente de correlação de r =

0,99952. A precisão e a exatidão de cada ponto da curva encontra-se ilustrada na

Tabela 3.5. A precisão foi expressa pelo coeficiente de variação das replicatas e a

exatidão determinada através da interpolação dos valores obtidos com os

esperados.

Figura 3.9 – Curva de calibração por calibração externa de hidrocortisona. Faixa

linear de trabalho de 2,5 – 50,0 µg/mL. Cada ponto da curva (em triplicata) foi

analisado sob os mesmos parâmetros cromatográficos descritos na Figura 3.8.

Tabela 3.5 – Precisão e exatidão determinada para a curva de calibração de HC.

Ponto

Conc.

µg/mL

(%)

Exatidão

(%)

Ponto

Conc.

µg/mL

(%)

Exatidão

(%)

2,5 0,50 103,4

30,0 1,97 99,9

5,0 0,65 102,6

40,0 2,87 97,6

10,0 0,20 97,6

50,0 1,22 100,6

20,0 1,14 101,4

Tabela 3.6 – Valores quantificados nas amostras para a HC.

Controles Hidrocortisona

Conc. teórica

(µg/mL)

Conc. Nominal*

(µg/mL)

Conc. Quantificado

(µg/mL)

Precisão

(CV %)

Exatidão

(%)

3,0 2,91 1,59 4,88 54,6

25,0 23,58 16,65 5,94 70,6

47,0 43,12 32,64 1,91 75,7

* O cálculo da concentração nominal foi baseado na massa do extrato usado para o preparo das amostras considerando que toda a HC tenha

sido extraída estando presente no extrato total obtido.

0 10 20 30 40 50

200

400

600

800

1000

1200

Área / (mAbs)

Concentração de hidrocortisona / (ug/mL)

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Tabela 3.7 – Padrões de HC analisados entre as eluições das amostras do Nim

como controles de eficiência.

Controles Hidrocortisona

Conc. (µg/mL)

Precisão (CV %) Exatidão (%)

0,16 101,8

1,14 98,5

1,87 101,6

Com a quantificação observou-se uma pobre, porém reprodutiva

extração da hidrocortisona nas sementes. Foi encontrado um valor médio de

extração de 67%, ou seja, apenas 67% da hidrocortisona adicionada nas sementes

encontra-se nas amostras analisadas. Outro problema com o uso do padrão de

referência é que este padrão foi adicionado e homogeneizado na superfície das

sementes LDM que seriam submetidas a extração. Todavia, os compostos a serem

extraídos, normalmente encontram-se dentro desta matriz, permitindo esta técnica

apenas um resultado aproximado e não exato, podendo ser a eficiência da extração

para a azadirachtina ainda menor que para a HC.

Para a validação do método de quantificação da hidrocortisona além

da recuperação acima já discutida, foram avaliadas a precisão (intradia e interdia), a

exatidão e a seletividade. Também formam determinados os limites de quantificação

(LQ) e o limite de detecção (LD). Como controle de qualidade, foram escolhidas 3

concentrações da HC: uma baixa (3,0 µg/mL que corresponde a 120 % da primeira

concentração da curva analítica); uma concentração média (25,0 µg/mL que

corresponde a 50 % da concentração mais alta da curva analítica); e uma

concentração alta (47,0 µg/mL que corresponde a 94 % da maior concentração da

curva analítica). Para a obtenção das amostras, as respectivas soluções estoques

(20 µL) foram evaporadas sob fluxo de ar comprimido e também submetidas aos

mesmos procedimentos de pré-tratamento que as amostras das sementes sendo, no

final, reconstituídas com 200 µL de MeOH.

A precisão intradia foi avaliada através de análises em quintuplicata

dos 3 controles de qualidade em um mesmo dia e a precisão interdia, através de

análises feitas em 3 dias não consecutivos. A exatidão foi calculada para todas as

análises não excedendo o valor de 2 % (Tabela 3.8).

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Tabela 3.8 – Exatidão (%) e precisão (CV%) intradia e interdia para a análise do HC.

Precisão (CV%) Exatidão

(%)

(intradia) (interdia) (média)

Concentração

(µg/mL)

1º dia

(n=5)

2º dia

(n=5)

3º dia

(n=5)

(n=15) (n=15)

3,0 1,94 0,37 1,11 1,13 99,9

25,0 1,16 1,17 1,98 1,43 99,3

47,0 1,78 0,69 1,43 1,30 99,7

O limite de quantificação para o método foi de 1,0 µg/mL e o limite de

detecção inferior a 10 ng/mL. O limite de detecção representa a menor concentração

da substância em exame que pode ser detectada [191] e o limite de quantificação,

representa a menor concentração da substância em exame que pode ser medida

com uma precisão específica dentro dos critérios de aceitação do método [187].

Neste caso, inferiores a 20 %.

Completando a validação do método foi realizada uma análise de

amostras de HC em concentrações desconhecidas ao analista, comumente

chamada de Teste Cego e que é uma simulação da aplicação do método. Estes

dados encontram-se apresentados na Tabela 3.9.

Tabela 3.9 – Precisão (CV%) e exatidão (%) do Teste Cego do protocolo de

validação do método de análise da hidrocortisona.

Concentração (µg/mL) CV%

Exatidão

4,0 0,80 99,9

35,0 0,77 103,5

CV%: coeficiente de variação.

A seletividade do método foi avaliada através da análise de diversas

amostras da matriz utilizando detector de UV-Vis e Foto-diodo, o que demonstrou

que não existem compostos interferentes em 217 nm, o que viabilizou o método.

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3.4.1.1.3 Quantificação da Azadirachtina A Fazendo Uso do Método I

Os parâmetros de análises otimizados também foram validados para a

quantificação da azadirachtina A como para a hidrocortisona. Para a validação do

método foram avaliadas a precisão (intradia e interdia), a exatidão, a recuperação e

a seletividade. Também formam determinados os limites de quantificação (LQ) e o

limite de detecção (LD).

Uma curva de calibração por padronização externa foi construída e

validada para a azadirachtina com uma faixa linear de trabalho entre 2,5 – 50 µg/mL

sendo a equação de reta calculada em y = 4,74779.10

-5

x – 0,08705 e o coeficiente

de correlação r = 0,99982. (Figura 3.10 e Tabela 3.10). As soluções padrão

utilizadas para o desenvolvimento do método foi preparada através da dissolução da

azadirachtina em MeOH em uma concentração de 1000 µg/mL e, a partir desta,

foram obtidas soluções estoque nas concentrações de 25; 50,0; 100,0; 200,0; 300,0;

400,0 e 500,0 µg/mL utilizadas no preparo de amostras para as curvas analíticas.

Todos os pontos da curva analítica foram preparados a partir das soluções estoque

sendo a concentração final de cada amostra dez vezes diluídas. Também foram

obtidas soluções estoques nas concentrações de 30,0; 250,0 e 470,0 µg/mL

utilizadas para a obtenção de amostras de controle do método. Essas soluções

foram armazenadas a –20 ºC e também mantiveram sua estabilidade por

aproximadamente 3 meses onde não foi observada nenhuma degradação durante o

desenvolvimento do método. A curva analítica foi obtida com amostras nas

seguintes concentrações de azadirachtina: 2,5; 5,0; 10,0; 20,0; 30,0; 40,0 e 50,0

µg/mL. Para a obtenção das amostras, as soluções estoque (20 µL) foram

evaporadas sob fluxo de ar comprimido e submetidas aos mesmos procedimentos

de pré-tratamento que as amostras das sementes sendo, no final, reconstituídas

com 200 µL de MeOH.

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Figura 3.10 – Curva de calibração Externa de Azadirachtina. Faixa linear de trabalho

de 2,5 – 50,0 µg/mL. Cada ponto da curva (em triplicata) foi analisado sob os

mesmos parâmetros cromatográficos descritos na Figura 3.8.

Tabela 3.10 – Precisão (CV%) e exatidão (%) determinada para a curva de calibração do padrão de azadirachtina.

Ponto Concentração (µg/mL) CV (%) Exatidão (%)

2,5 0,10 98,4

5,0 0,96 99,8

10,0 2,00 98,8

20,0 0,37 101,0

30,0 1,29 99,9

40,0 1,34 99,1

50,0 0,36 100,4

Como controle de qualidade, foram escolhidas 3 concentrações de

azadirachtina: uma baixa (3,0 µg/mL que corresponde a 120 % da primeira

concentração da curva analítica); uma concentração média (25,0 µg/mL que

corresponde a 50 % da concentração mais alta da curva analítica); e uma

concentração alta (47,0 µg/mL que corresponde a 94 % da maior concentração da

curva analítica). Para a obtenção das amostras, as respectivas soluções estoques

(20 µL) foram evaporadas sob fluxo de ar comprimido e também submetidas aos

mesmos procedimentos de pré-tratamento que as amostras das sementes sendo, no

final, reconstituídas com 200 µL de MeOH.

A precisão intradia foi avaliada através de análises em quintuplicata

dos 3 controles de qualidade em um mesmo dia e a precisão interdia, através de

análises feitas em 3 dias não consecutivos. A exatidão foi calculada para todas as

análises não excedendo o valor de 2% (Tabela 3.11).

0 10 20 30 40 50

200

400

600

800

1000

Área / (mAbs)

Concentração / (ug/mL)

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Tabela 3.11 – Exatidão (%) e precisão (CV%) intradia e interdia para a análise da

azadirachtina A.

Precisão (CV%) Exatidão

(%)

(intradia) (interdia) (média)

Concentração

(µg/mL)

1º dia

(n=5)

2º dia

(n=5)

3º dia

(n=5) (n=15) (n=15)

3,0 1,11 0,85 2,43 1,46 93,7

25,0 1,51 0,10 2,18 1,26 99,1

47,0 3,71 0,31 0,30 1,44 100,8

O limite de quantificação para o método foi de 1,5 µg/mL com uma

precisão de 3,2 % entre as triplicatas e uma exatidão de 78 % e, o limite de detecção

inferior a 25 ng/mL. O limite de detecção representa a menor concentração da

substância em exame que pode ser detectada sendo o sinal do analito nessa

concentração três vezes maior que o ruído do equipamento [191] e o limite de

quantificação, representa a menor concentração da substância em exame que pode

ser medida com uma exatidão dentro dos critérios de aceitação do método [187].

Neste caso, inferiores a 20 %.

Os dados da análise de amostras de azadirachtina em concentrações

desconhecidas ao analista, Teste Cego, encontram-se apresentados na Tabela 3.12.

Tabela 3.12 – Precisão (CV%) e exatidão (%) do Teste Cego do protocolo de

validação do método de análise da azadirachtina.

Concentração (µg/mL) CV%

Exatidão (%)

4,0 0,94 93,4

35,0 0,16 100,7

CV%: coeficiente de variação.

A seletividade de um método instrumental de separação é a

capacidade de avaliar, de forma inequívoca, as substâncias em exame na presença

de componentes que podem interferir com uma determinação de uma amostra

complexa. Devido à ausência de matrizes isentas do analito de interesse, a

seletividade do método foi avaliada juntamente com a HC através da análise de

diversas amostras da matriz utilizando detector de UV-Vis e arranjo de diodos, o que

demonstrou há não existência de compostos interferentes em 217 nm, viabilizando o

método. A recuperação do método foi definida pela adição de um padrão na matriz,

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a hidrocortisona discutida no tópico 3.4.1.1.2. A recuperação média definida foi de

67%.

Estando os parâmetros do método otimizados e validados as sementes

do Nim foram submetidas à análise. As sementes do Nim após serem colhidas são

lavadas são despolpadas e secas por períodos de sol e sombra. Morfologicamente a

semente é formada por um mesocarpo duro com uma amêndoa em seu interior.

Estas sementes foram congeladas com nitrogênio líquido em trituradas em um

moinho. As sementes moídas submetidas à análise são originárias de Catanduva-

SP; Brejinho do Nazaré-TO; Paranavaí-PR e Xambrê-PR. Com o objetivo de verificar

a influência quantitativa do enxerto na espécie foram analisadas sementes coletadas

em Xambrê de pés enxertados e de um pé franco. Todas as análises foram

realizadas preparando extratos em triplicata (Tabela 3.13) avaliando a precisão do

método. As sementes do enxerto foram submetidas a dois tratamentos de secagem

diferentes.

Tabela 3.13 – Preparo dos extratos para a quantificação da azadirachtina.

Extrato Semente / g Extrato / mg CV (%)

Catanduva 5 1,06 0,1

Brejinho do Nazaré 5 1,09 2,65

Paranavaí 5 1,50 1,62

Xambrê – Enxerto (Trat. 01) 5 0,98 0,47

Xambrê – Enxerto (Trat. 02) 5 0,95 0,63

Xambrê – Pé franco 5 0,97 4,56

Os extratos foram submetidos aos procedimentos de limpeza e preparo

das amostras para análise. O método não demonstrou perdas de analito no

processo de pré-tratamento como observado pelos coeficientes de variação e

exatidão estipulados, demonstrando confiabilidade no método sendo estes

resultados confirmados na validação do método. Os resultados da quantificação das

sementes encontram-se ilustrados na Tabela 3.14.

Entre as análises das sementes, como procedimento padrão de

controle, foram intercalados e analisados padrões de azadirachtina (submetidos ao

pré-tratamento) monitorando a linearidade do método e a reprodutibilidade da coluna

analítica (Tabela 3.15).

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Tabela 3.14 – Teor da azadirachtina A nas sementes do Nim quantificados pelo

Método I.

mg/Kg

semente

CV (%)

Catanduva 890,4 4,20

Brejinho do Nazaré 615,8 12,5

Paranavaí 2.464,5 8,21

Xambrê – Enxerto (Trat. 01) 585,1 2,99

Xambrê – Enxerto (Trat. 02) 574,7 3,03

Xambrê – Pé franco 605,3 3,12

Tabela 3.15 – Padrões de azadirachtina analisados entre as eluições das amostras

do Nim como controles de eficiência.

HidrocortisonaControles

(µg/mL)

Precisão (CV %) Exatidão (%)

1,24 100,0

0,77 97,6

0,20 99,4

A análise das sementes apresentou um erro entre as replicatas inferior

a 10% (exceto Brejinho do Nazaré) podendo considerar o método reprodutivo uma

vez que o erro na precisão estabelecida para estas matrizes podem variar entre 15

e 20% dependendo das normas reguladoras [191]. Em cima dos resultados

adquiridos do teor de azadirachtina pode ser estipulado um acréscimo de 49%

referentes ao poder de extração estipulado para o método pelo uso do padrão de

referência HC. Esta extrapolação nos resultados eleva em geral os teores para uma

casa entre 850 – 1300 mg/Kg

semente

(exceto Paranavaí). Schneider & Ermel [179],

Shidu et al. [182] Kaushik, N. [181] apresentaram trabalhos de quantificação onde os

teores variam de 390 – 6650 mg/kg de amêndoa. Uma vez que diversos fatores

sazonais, armazenamento, enxerto, etc., podem afetar os teores de azadirachtina

nas sementes os resultados obtidos podem ser considerados satisfatórios. Outro

ponto que reforça a qualidade dos resultados é que a quantificação foi realizada com

a semente e os resultados da literatura, encontrados para as análises são referentes

somente para a amêndoa da semente. O mesocarpo da semente apresenta

baixíssimos teores de azadirachtina (Figura 3.11), contudo, contribui em média com

50% do peso da semente (variando entre 43 – 67%, veja Tabela 3.21) sendo a

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porcentagem restante referente ao peso da amêndoa. Extrapolando estas

porcentagens aos resultados, os teores de azadirachtina ficariam entre 1.700 e

2.600 mg/kg de amêndoa se enquadrando dentro da média mundial demonstrando

credibilidade quantitativa ao método.

Outro resultado importante a se destacar é a semelhança entre os

resultados do enxerto com as plantas não enxertadas, fornecendo dados científicos

para sua caracterização, demonstrando que este não vem sofrendo modificações

quantitativas em seu principal composto ativo.

Apesar de o método descrito não apresentar uma extração com 100%

de eficiência, o método apreenta procedimentos simples de preparo, manuseio e

análise das amostras não requerendo equipamentos sofisticados o que limitaria seu

uso a grandes centros de pesquisa. Sua principal desvantagem, apesar de

reprodutivo, é o longo tempo requerido para o preparo dos extratos, sendo um ponto

fraco para análises de rotina.

Figura 3.11 – Análise por HPLC do mesocarpo da semente do Nim. Fase móvel

THF:MeOH:ACN:H

O – 1:4:34:61; coluna C

Phenomenex

Luna(II) (150x4,6 mm, 5

µm), coluna de segurança Phenomenex

(4,0x3,0 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min, a

alça de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm.

3.4.1.2 Método II – Quantificação da Azadirachtina A e B. Extração por

Centrifugação/SPE

Alguns experimentos mostraram que o primeiro método desenvolvido

(método I) apesar de suas qualidades, por exemplo, sua simplicidade no pré-

tratamento e análise, mostrou ser pouco robusto para análises de amostras com

maiores teores de azadirachtina B (banda em 15,3 min na Figura 3.6) em relação

aos teores da azadirachtina A apresentando o cromatograma uma sobreposição

entre as bandas comprometendo a resolução na separação (R

= 1,43 -Figura 3.12).

4 6 8 10 12 14 16 18

mAbs

tempo/min

AzadirachtinaAzadirachtina

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Figura 3.12 – Perda da resolução para a azadirachtina com o aumento da absorção

da banda crítica adjacente. Fase móvel ACN:H

O – 35:65; coluna C

Phenomenex

(150x4,6 mm, 5 µm), coluna de segurança Phenomenex

(4,0x3,0 mm, 5µm). Vazão

0,8 mL/min, a alça de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm.

Um método cromatográfico ideal deve ser o mais simples possível,

porém, seletivo e robusto para rotinas. A robustez do método é definida como “a

capacidade do método de separação em não ser afetado por uma pequena, mas

importante variação dentro dos parâmetros definidos” [184]. Deste modo, o método

desenvolvido para analises rotineiras da semente do Nim não poderia ficar ao acaso

da sorte de nunca ser aplicado para quantificação de uma semente com elevados

teores de azadirachtina B o que comprometeria seu desempenho, perdendo

seletividade, não sendo o método robusto para variações nos teores de

azadirachtina B. Este resultado mais os baixos teores quantificados nas sementes

junto com a baixa recuperação determinada para o método pelo uso da HC,

demonstraram a necessidade de modificações desde a extração, passando pelos

processos de limpeza até a otimização dos parâmetros cromatográficos.

3.4.1.2.1 Modificações no Método de Extração para as Sementes

A análise cromatográfica envolve a investigação complexa de múltiplos

estágios. As três etapas importantes podem interferir diretamente na separação.

Estas etapas são: o isolamento do analito; a etapa de limpeza das amostras

(manipulação) e a otimização dos parâmetros cromatográficos.

A princípio, estava sendo utilizado o método de extração líquido-sólido

para o isolamento do analito, ou seja, macerando o material vegetal em solvente

4 8 12 16 20

mAbs

tempo/min

Azadirachtina AAzadirachtina A

Azadirachtina BAzadirachtina B

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orgânico por nove dias, sendo este solvente trocado a cada três dias. Além da

necessidade de um grande período de dias no preparo dos extratos, esta extração

não se mostrou muito eficiente. A etapa de limpeza, por sua vez, consistia apenas

em uma etapa de filtração, separando os interferentes de grande granulometria.

As modificações no método de quantificação da semente a fim de

garantir robustez se iniciaram redefinindo os procedimentos de limpeza da amostra.

As amostras aqui consideradas são os extratos da semente. Novamente foi testado

o método de extração por fase sólida (SPE).

Sendo a fase mais comum no mercado, a fase estacionária C18 (fase

onde um grupo octadecil é quimicamente ligado a um suporte de sílica) foi

descartada, uma vez que se buscava um método onde os analitos deveriam ficar

retidos nos cartuchos e os interferentes primeiramente excluídos. Uma vez que os

analitos de interesse são mais polares que os interferentes, um método ideal pode

ser otimizado com um cartucho polar sendo trabalhado no modo normal de eluição.

Trabalhando no modo normal de eluição, o solvente usado para eluir os analitos

pode ser um solvente orgânico, descartando o uso de água facilitando a

reconstituição das amostras para a análise por HPLC. Estes interferentes de baixa

polaridade poderiam interagir irreversivelmente com a fase estacionária da coluna

analítica. Assim, foi escolhida a fase estacionária denominada cianopropril (CN)

onde um grupo cianopropril é quimicamente ligado à sílica. Estes cartuchos de CN

(100 mg, 1 mL) foram adquiridos da J.T.Baker

. Com a seleção desta fase, numa

analogia aos métodos de separação por HPLC, o pré-tratamento da amostra foi

realizado numa separação em fase normal, ou seja, o solvente usado na separação,

deve ser menos polar que a fase estacionária. Deste modo, era possível

primeiramente a remoção dos interferentes menos polares, por exemplo, pela

passagem de hexano deixando, o analito de interesse, retido na fase estacionária

sendo, posteriormente eluído com o solvente apropriado [185,193]. Os parâmetros

para o uso deste cartucho no método de quantificação das sementes, bem como

seus condicionamentos, lavagem da amostra e eluição, foram adaptados do método

desenvolvido para a quantificação do óleo das sementes descrito no item a seguir.

Assim, após alguns testes, foi estabelecido que o tratamento ideal para

a amostra por SPE deve seguir os seguintes critérios: 10 a 15 mg do extrato deve

ser solubilizados em 400 µL de hexano e, com o auxílio de micropipeta, adicionado

ao cartucho já previamente condicionado com 5 mL de hexano. O condicionamento

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do cartucho garante a reprodutibilidade na extração pela ativação do material

empacotado. Após o condicionamento deve se tomar o cuidado de não deixar o

cartucho secar que, pode levar a formação de caminhos preferenciais,

comprometendo a separação. Uma vez aplicada a amostra, o frasco da amostra

deve ser lavado com mais 200 µL de hexano sendo em seguida, também adicionado

ao cartucho. Elui-se lentamente essa amostra sobre o cartucho de maneira que o

analito de interesse não seja removido. Em seguida, promove-se a remoção dos

interferentes mais apolares pela passagem de mais 4 mL de hexano sobre o

cartucho permitindo no final desta etapa a secagem do cartucho. Numa última etapa,

a remoção do analito é estabelecida pela passagem de MeOH. Assim, 600 µL de

MeOH devem lavar por uma última vez o frasco da amostra e deve ser adicionado

ao cartucho eluíndo o analito. Por último, adicionam-se mais 400 µL de MeOH ao

cartucho coletando todo a fração de MeOH juntas. Os cartuchos de SPE foram

manipulados em uma câmara acoplada a uma bomba de vácuo à pressão de 70

mmHg. O uso da câmara permite a reprodução da vazão nos cartuchos.

A fim de evitar erros na diluição da amostra para análise, a fração de

MeOH foi seca sob um suave fluxo de ar comprimido e, reconstituída novamente em

1,0 mL de MeOH. Este método de limpeza demonstrou reprodutível apresentando

um desvio padrão relativo entre as amostras inferior a 2 % para os padrões

investigados.

Como num processo análogo à extração líquido-líquido, observou-se

que a passagem de duas alíquotas do eluente em vez de uma única em volume

maior aumentou a eficiência da extração e a reprodutibilidade.

A análise desta amostra nos parâmetros cromatográficos otimizados no

método I, não demonstrou ganho significativo na separação entre os isômeros de

azadirachtina A e B. Assim, iniciou-se uma busca por um ganho na separação por

uma modificação na fase móvel. Não sendo um parâmetro ideal, contudo, para a

quantificação dos óleos comerciais, o uso de uma fase quaternária mostrou-se

eficiente. Novamente, transferindo este conhecimento para a eluição destas

amostras de semente comprovou-se a eficiência da fase quaternária. Os solventes

escolhidos e a porcentagem utilizada de cada solvente afetam diretamente a

seletividade da separação. O fator de retenção de um analito pode ser bruscamente

alterado apenas por uma pequena variação na fase móvel, numa modificação em

uma porcentagem ou pela troca de um solvente. Sendo esta matriz complexa, onde

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se tem um extrato vegetal bruto, com inúmeros compostos e diversas classes de

compostos presentes, onde, cada um, é um interferente potencial, a composição da

fase móvel passa ter grande relevância. A simples troca de solvente pode implicar

na inversão total da ordem de eluição dos analitos em uma amostra [188].

Deste modo, após alguns experimentos fazendo uso de fase orgânica

composta por ACN, MeOH e THF encontrou-se uma fase quaternária Ideal para esta

matriz composta de H

O:ACN:MeOH:THF nas proporções de 61:34:4:1. Nesta fase,

o tempo de retenção da azadirachtina A é de 10,3 min e do isômero B 11,6 min. O

fator de retenção (k

) calculado para a azadirachtina A é de 4,72 e o calculado para

a azadirachtina B (k

) de 5,44. Esta eluição apresentou um fator de separação (α) de

1,15 e uma resolução (R

) de 2,65. Uma separação cromatográfica para a amostra

preparada por SPE eluída na fase móvel quaternária pode ser observada na Figura

3.13.

Figura 3.13 – Amostra de semente manipulada por SPE. Fase móvel:

O:ACN:MeOH:THF – 61:34:4:1. Coluna C18 Phenomenex® Luna(II) (150x4,6 mm,

5 µm); coluna de segurança C18 Phenomenex® ( 4x3 mm, 5 µm). Vazão 0,8

mL/min; alça de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm.

O uso de uma fase móvel quaternária implica em um custo maior para

as análises, maior probabilidade de erros pessoais e perda de robustez. Além disso,

há os problemas ambientais decorrentes do uso de uma mistura de solventes

orgânicos. Todavia, houve um ganho na separação e uma redução no tendo de

análise o que justifica sua aplicação. O ganho no tempo de análise foi de

aproximadamente 5 minutos. Este tempo aplicado à análises de rotina pode

representar numa significativa economia de solvente e equipamento.

Comparando os dois métodos descritos para o pré-tratamento do

extrato (filtração e SPE), analisando alíquotas iguais de uma mesma amostra sob os

mesmos parâmetros cromatográficos, foi observada na eluição cromatográfica da

amostra preparada por SPE, uma área 104% superior à área da amostra preparada

0 3 6 9 12

mAbs

tempo/min

Azadirachtina AAzadirachtina A

Azadirachtina BAzadirachtina B

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por filtração (Figura 3.14). Estes resultados demonstram um ganho em eficiência

para o método já no pré-tratamento. Neste segundo método, toda a alíquota é

adicionada ao cartucho e, parte da amostra é eliminada na lavagem facilitando a

solubilização e remoção dos analitos de interesse do cartucho. No primeiro método,

apesar da repetibilidade nos resultados, apenas parte da amostra era solubilizada.

Figura 3.14 – Eluição cromatográfica de amostras pré-tratadas pelos métodos I e II.

Fase móvel: H

O:ACN:MeOH:THF – 61:34:4:1. Coluna C18 Phenomenex® Luna(II)

(150x4,6 mm, 5 µm); coluna de segurança C18 Phenomenex® ( 4x3 mm, 5 µm).

Vazão 0,8 mL/min; alça de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm.

Uma vez definido que a limpeza da amostra se mostra mais eficientes

e reprodutivas por SPE; também definido os parâmetros cromatográficos ideais para

a análise, resta ainda investigar a primeira etapa do desenvolvimento de um método

analítico, o isolamento do analito. Era preciso aumentar sua eficiência e reduzir o

tempo de extração. Assim, buscando-se esses objetivos, foi investigada a técnica de

extração por centrifugação.

Em tubos falcon de 10 mL foram pesados em triplicata 200, 100, 50,

20, 10 e 5 mg de sementes LDM da A. indica. Os testes foram realizados em

triplicata para avaliar a repetibilidade da extração. Em cada tubo, 2,0 mL de MeOH

foram adicionados e agitados em um vortex (agitador de tubos) por 30 s. Em

seguida, cada amostra foi centrifugada a 10.000 rpm por 20 min com uma

temperatura constante de 20 ºC. A fase líquida foi coletada e seca num equipamento

de SpeedVac a 43 ºC obtendo um extrato seco. Esses extratos foram submetidos

aos procedimentos de pré-tratamento descritos no último parágrafo da página 227,

reconstituídos em 1.000 µL de MeOH e analisados por HPLC sob os novos

parâmetros estabelecidos.

Este novo método de extração apresentou uma série de vantagens

sobre o método de maceração. Houve uma redução do tempo de preparo do extrato

Azadirachtina AAzadirachtina A

Azadirachtina BAzadirachtina B

0 3 6 9 12

Método II

Método I

mAbs

tempo/min

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de 9 dias para 100 min, uma redução no consumo de solvente de 300 mL para 2 mL,

redução na quantidade de amostra, e o principal, houve um ganho significativo em

eficiência (Figura 3.15). Foi observado que, conforme foi diminuindo a quantidade de

semente a ser extraída, houve um aumento na eficiência da extração. Contudo,

entre as amostras de 15, 10 e 5 mg, proporcionalmente, a eficiência da extração foi

constante.

Figura 3.15 – Eluição cromatográfica de uma amostra preparada pela centrifugação

de 100 mg de semente LDM. Os parâmetros cromatográficos são os mesmos

descritos na Figura 3.14.

A partir de uma amostra bruta representativa, a amostragem de

pequenas quantidades para o preparo da amostra laboratorial, 15 ou 10 mg, implica

em possíveis erros quantitativos caso a amostra laboratorial não seja homogênea.

Assim, com a intenção de garantir que a amostra laboratorial seja homogênea e

representativa, a partir do lote de semente, eram retirados, aproximadamente 10

gramas de sementes LDM. Destas sementes, era separado o mesocarpo da

amêndoa. A amêndoa, em seguida, era triturada. Deste modo a quantificação

ocorreria apenas nas amêndoas sem a interferência do mesocarpo durante o

processo de pesagem homogeneizando a amostra.

A amostra do laboratório, então, passou a ser preparada pela pesagem

apenas da amêndoa da semente em uma balança analítica com uma sensibilidade

de 0,1 mg. Também, tomou-se o cuidado de se verificar a incerteza de todas as

medidas preparando as amostras sempre em replicatas avaliando a variabilidade na

análise.

Ainda com o objetivo de se obterem extratos mais homogêneos

possíveis através de uma máxima eficiência na extração da azadirachtina, as

amêndoas das sementes (15 mg), foram submetidas ao procedimento de extração

0 3 6 9 12 15 18

-50

100

150

200

250

300

mAbs

tempo/min

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por centrifugação, não mais suspensas em uma alíquota de 2,0 mL de MeOH, mas

sim, em três alíquotas seqüenciais de 1,0 mL. Em apenas uma única alíquota, pode

ocorrer um equilíbrio entre a fase sólida e a líquida. Esse equilíbrio (saturação) pode

inibir a remoção dos analitos de interesse pelo solvente. Uma vez removido o

solvente e, adicionado uma segunda alíquota, o sistema tende novamente a tingir o

equilíbrio proporcionando a remoção de uma nova quantidade de analitos.

Por exemplo, a quantificação de um lote de semente qual, a amostra

laboratorial (sementes LDM) foi submetida a extração com apenas uma alíquota de

2,0 ml de MeOH, apresentou o teor de 1.457,8 mg/kg. Este mesmo lote, submetido a

quantificação das amêndoas e a extração seqüencial, apresentou o teor de 3.961,7

mg/kg. Estas pequenas alterações, quantificação da amêndoa e extração

sequencial, proporcionou um ganho de aproximadamente 170 % de eficiência. Além

da eficiência, estas modificações colaboraram para um ganho em seletividade ao

método passando ser as azadirachtinas A e B os compostos majoritários como pode

ser observado na Figura 3.16.

Figura 3.16 – Eluição cromatográfica de uma amostra do Nim preparada após a

extração de 15 mg de amêndoa em três alíquotas de 1,0 mL de MeOH. Fase móvel:

O:ACN:MeOH:THF – 61:34:4:1. Coluna C18 Phenomenex® Luna(II) (150x4,6 mm,

5 µm); coluna de segurança C18 Phenomenex® ( 4x3 mm, 5 µm). Vazão 0,8

mL/min; alça de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm.

Um resumo dos procedimentos de extração, pré-tratamento e

reconstituição das amostras para serem analisadas por HPLC encontra-se ilustrada

na Figura 3.17.

0 3 6 9 12

mAbs

tempo/min

Azadirachtina AAzadirachtina A

Azadirachtina BAzadirachtina B

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Figura 3.17 – Método proposto de preparo das amostras de análise para a

quantificação dos teores de azadirachtina em sementes do Nim.

Uma vez estabelecida a extração, o pré-tratamento e os parâmetros

cromatográficos, foi verificada a repetibilidade da separação analítica através da

diluição das amostras. Assim, foram preparadas duas amostras de 10 mg de

semente (em triplicata) seguindo o método ilustrado na Figura 3.17. Contudo, essas

amostras ao invés de serem reconstituídas em 1,0 mL de MeOH foram,

MeOH

1 mL

15 mg

amêndoa

Agitar (30 s)

10000

20 º C

Centrifugar

(20ºC/20 min.)

Fase

líquida

Fase

sólida

SpeedVac

(43ºC/50 min.)

Extrato

seco

(a)

Hexano

5 mL

200 µL

(e) 400 µL

(f)

(d)

(g) 4 mL

Após a etapa d não

deixar secar o cartucho

antes de aplicar a

amostra

(h) 600 µL400 µL (i)

Seca com ar

comprimido

Reconstituída

em 1000 µL MeOH

Análise por

HPLC

Após a etapa i,

eluir o cartucho até

estar totalmente seco

3 mL

(b) 1 mL

Bomba Injetor Coluna Detector DadosBomba Injetor Coluna Detector Dados

MeOH

1 mL

15 mg

amêndoa

Agitar (30 s)

10000

20 º C

Centrifugar

(20ºC/20 min.)

Fase

líquida

Fase

sólida

SpeedVac

(43ºC/50 min.)

Extrato

seco

(a)

Hexano

5 mL

200 µL

(e) 400 µL

(f)

(d)

(g) 4 mL

Após a etapa d não

deixar secar o cartucho

antes de aplicar a

amostra

(h) 600 µL400 µL (i)

Seca com ar

comprimido

Reconstituída

em 1000 µL MeOH

Análise por

HPLC

Após a etapa i,

eluir o cartucho até

estar totalmente seco

3 mL

(b) 1 mL

MeOHMeOH

1 mL

15 mg

amêndoa

Agitar (30 s)

10000

20 º C

10000

20 º C

Centrifugar

(20ºC/20 min.)

Fase

líquida

Fase

sólida

SpeedVac

(43ºC/50 min.)

Extrato

seco

(a)

HexanoHexano

5 mL

200 µL

(e) 400 µL

(f)

(d)

(g) 4 mL

Após a etapa d não

deixar secar o cartucho

antes de aplicar a

amostra

(h) 600 µL400 µL (i)

Seca com ar

comprimido

Reconstituída

em 1000 µL MeOH

Análise por

HPLC

Após a etapa i,

eluir o cartucho até

estar totalmente seco

3 mL

(b) 1 mL

Bomba Injetor Coluna Detector DadosBomba Injetor Coluna Detector Dados

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reconstituídas em 5,0 e 10,0 mL. A análise de ambas as amostras manteve a

seletividade durante a eluição cromatográfica (Figura 3.18).

Figura 3.18 – Amostra de 10 mg de semente preparada seguindo os procedimentos

descritos na Figura 3.17, contudo, reconstituída em 10 mL de MeOH. Os parâmetros

cromatográficos são os mesmos descritos na Figura 3.16.

Otimizados os procedimentos de extração, pré-tratamento e separação

iniciou-se a construção das curvas de calibração e validação do método. O método

mostrou-se seletivo tanto a azadirachtina A quanto ao isômero B. Assim, foram

construídas duas curvas de calibração, uma para cada isômero. Contudo, devido a

grande semelhança estrutural, por apresentarem comportamentos similares em

todas as etapas investigadas e, principalmente a pequeno quantidade de padrão

obtido, foi o método desenvolvido foi submetido a uma validação completa apenas

para a azadirachtina A.

Uma curva de calibração externa foi construída e validada para a

azadirachtina A com uma faixa linear de trabalho entre 5,0 – 60 µg/mL sendo a

equação de reta determinada matematicamente y = 5,8763.10

-5

x + 1,48175 e o

coeficiente de correlação r = 0,9994. Esta curva foi construída plotando a área dos

padrões vs. a concentração e encontra-se ilustrada na Figura 3.19. Os dados de

exatidão e precisão obtidos para cada ponto em triplicata encontra-se ilustrado na

Tabela 3.16. As soluções padrão utilizadas para o desenvolvimento do método

foram preparada através da dissolução da azadirachtina A em MeOH em uma

concentração de 1000 µg/mL e, a partir desta, foram obtidas soluções estoque nas

concentrações de 50,0; 100,0; 200,0; 300,0; 400,0; 500,0 e 600,0 µg/mL utilizadas

no preparo de amostras para a curva analítica. Cada ponto da curva analítico foi

preparado em triplicata a partir das soluções estoque sendo a concentração final de

cada amostra dez vezes diluídas. Também foram obtidas soluções estoques nas

0 2 4 6 8 10 12 14

-2,5

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

mAbs

tempo/min

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concentrações de 60,0; 250,0 e 540,0 µg/mL utilizadas para a obtenção de amostras

de controle do método. Essas soluções foram armazenadas a –20 ºC e também

mantiveram sua estabilidade por aproximadamente três meses onde não foi

observada nenhuma degradação durante o desenvolvimento do método. A curva

analítica foi obtida com amostras nas seguintes concentrações de azadirachtina: 5,0;

10,0; 20,0; 30,0; 40,0; 50,0 e 60,0 µg/mL. Para a obtenção das amostras, as

soluções estoque (20 µL) foram evaporadas sob fluxo de ar comprimido e

submetidas aos mesmos procedimentos de pré-tratamento que as amostras das

amêndoas sendo, no final, reconstituídas com 200 µL de MeOH.

Similarmente, foi construída uma curva de calibração externa para a

azadirachtina B (Figura 3.19), contudo, a faixa linear de trabalho estabelecida ficou

entre 2,5 – 50,0 µg/mL. A equação de reta determinada para esta curva foi y =

4,18515.10

-5

x + 0,403579 e o coeficiente de correlação r = 0,9989. As soluções

padrão utilizadas para a construção da curva foram preparadas através da

dissolução da azadirachtina B em MeOH em uma concentração de 1000 µg/mL e, a

partir desta, foram obtidas soluções estoque nas concentrações de 25; 50,0; 100,0;

200,0; 300,0; 400,0 e 500,0 µg/mL utilizadas no preparo de amostras para as curvas

analíticas. Cada ponto da curva analítico foi preparado em triplicata a partir das

soluções estoque sendo a concentração final de cada amostra dez vezes diluídas.

Essas soluções foram armazenadas a –20 ºC e também mantiveram sua

estabilidade por aproximadamente 3 meses. A curva analítica foi obtida com

amostras nas seguintes concentrações de azadirachtina B: 2,5; 5,0; 10,0; 20,0; 30,0;

40,0; e 50,0 µg/mL. Os dados de exatidão e precisão referentes aos pontos da curva

da azadirachtina B encontram-se na Tabela 3.16. Para a obtenção das amostras, as

soluções estoque (20 µL) foram evaporadas sob fluxo de ar comprimido e

submetidas aos mesmos procedimentos de pré-tratamento que as amostras das

amêndoas sendo, no final, reconstituídas com 200 µL de MeOH.

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(a) (b)

Figura 3.19 –Curva de calibração por padronização externa para: (a) azadirachtina

A; (b) azadirachtina B. Fase móvel: H

O:ACN:MeOH:THF – 61:34:4:1. Coluna C18

Phenomenex® Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm); coluna de segurança C18

Phenomenex® ( 4x3 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min; alça de injeção de 20 µL e

detector de UV-Vis em 217 nm.

Tabela 3.16 – Precisão (CV%) e exatidão (%) determinada para as curvas de

calibração dos padrões de azadirachtina A e B.

Azadirachtina A Azadirachtina BConcentração

(µg/mL)

CV (%) Exatidão (%) CV (%) Exatidão (%)

2,5 - - 2,38 104,2

5,0 1,05 99,0 0,36 100,9

10,0 2,94 99,1 2,16 100,4

20,0 1,32 101,2 0,77 99,3

30,0 0,26 102,6 0,60 97,2

40,0 1,67 98,0 0,57 101,0

50,0 1,52 100,7 1,74 100,4

60,0 1,00 99,8 - -

Após a construção das curvas de calibração, para a validação do

método foram avaliadas a precisão (intradia e interdia), a exatidão, a recuperação e

a seletividade referentes azadirachtina A. Também formam determinados os limites

de quantificação (LQ) e o limite de detecção (LD).

Como controle de qualidade, foram escolhidas 3 concentrações de

azadirachtina A: uma baixa (6,0 µg/mL que corresponde a 120 % da primeira

concentração da curva analítica); uma concentração média (25,0 µg/mL que

corresponde a 41,67 % da concentração mais alta da curva analítica); e uma

concentração alta (54,0 µg/mL que corresponde a 90 % da maior concentração da

0 10 20 30 40 50 60

200

400

600

800

1000

1200

Área (mAbs)

Concentração da Azadirachtina (ug/mL)

0 10 20 30 40 50

200

400

600

800

1000

1200

Área / (mAbs)

Concentração da azadirachtina B / (µg/mL)

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curva analítica). Para a obtenção das amostras, as respectivas soluções estoques

(20 µL) foram evaporadas sob fluxo de ar comprimido e também submetidas aos

mesmos procedimentos de pré-tratamento que as amostras das amêndoas sendo,

no final, reconstituídas com 200 µL de MeOH.

A precisão intradia foi avaliada através de análises em quintuplicata

dos 3 controles de qualidade em um mesmo dia e a precisão interdia, através de

análises feitas em 3 dias não consecutivos. A exatidão foi calculada para todas as

análises não excedendo o valor de 2% (Tabela 3.17).

Tabela 3.17 – Exatidão (%) e precisão (CV%) intradia e interdia para a análise da

azadirachtina A.

Precisão (CV%) Exatidão (%)

(intradia) (interdia) (média)

Concentração

(µg/mL)

1º dia

(n=5)

2º dia

(n=5)

3º dia

(n=5)

(n=15) (n=15)

6,0 1,19 2,62 1,85 1,89 101,0

25,0 1,01 1,50 1,81 1,44 99,0

54,0 1,23 1,97 0,99 1,40 100,3

Os limites de quantificação e detecção encontrados para o método

foram os mesmos encontrados para o primeiro método discutido no item 3.4.1.1

(página 204) sendo de 1,5 µg/mL e 25 ng/mL respectivamente. Os dados da análise

de amostras de azadirachtina A em concentrações desconhecidas ao analista, Teste

Cego, encontram-se apresentados na Tabela 3.18.

Tabela 3.18 – Precisão (CV%) e exatidão (%) do Teste Cego do protocolo de

validação do método de análise da azadirachtina.

Concentração (µg/mL) CV% Exatidão (%)

9,0 3,94 103,6

32,0 1,80 100,0

A seletividade de um método instrumental de separação é a

capacidade de avaliar, de forma inequívoca, as substâncias em exame na presença

de componentes que podem interferir com uma determinação de uma amostra

complexa. Devida a ausência de matrizes isenta do analito de interesse, a

seletividade do método foi avaliada através da análise de diversas amostras da

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matriz utilizando detector de UV-Vis e arranjo de diodos, que demonstrou há não

existência de compostos interferentes em 217 nm, viabilizando o método. A

seletividade do método também foi avaliada pela construção de uma curva de

adição de padrão. Esta técnica também permitiu observar a recuperação do método.

Numa curva de calibração por adição de padrão, quantidades

conhecidas do analito de interesse são adicionados à uma amostra desconhecida

antes de seu preparo. Essas amostras com o padrão incorporado são utilizadas para

a obtenção dos cromatogramas. A adição de padrão é especialmente apropriada

quando se é difícil ou impossível obter um branco da matriz sem os analitos de

interesse. Como não existem sementes do Nim sem a azadirachtina A, esse método

vem ser o ideal para determinar a recuperação. Assim, a recuperação pode ser

determinada relacionando os resultados obtidos para a amostra sem a adição de

padrão com cada uma das amostras com o padrão adicionado. A seletividade, por

sua vez, pode ser determinada comparando a curva de calibração externa com a

curva de adição de padrão. Caso sejam paralelas, pode-se dizer que não há

interferência da matriz na determinação da substância de interesse.

Assim, foi construída uma curva da adição de padrão utilizando as

sementes de Catanduva. A partir de uma solução padrão de 1.000 µg/mL foram

preparados soluções estoques de azadirachtina A de 50,0; 100,0; 150,0; 200;0 e

300,0 µg/mL. Em uma série de 15 amostras de 10 mg de sementes, adicionou-se

em cada três amostras 50 µL de cada solução estoque obtendo, assim, uma curva

de adição de padrão com 5 pontos em triplicata. Estas sementes com os padrões

foram secas e, em seguida, submetidas aos procedimentos de extração e

quantificação representados na Figura 3.17, contudo, reconstituídas em 500 µL. As

amostras foram analisadas por HPLC e construída uma Curva de Adição de Padrão.

Esta curva encontra-se ilustrada na Figura 3.20 e a exatidão entre os pontos

analisados em triplicada descritos na Tabela 3.19.

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Figura 3.20 – Curva de adição de padrão usando como matriz, sementes do Nim

coletada em Catanduva-SP. Os parâmetros cromatográficos são os mesmos

descritos na Figura 3.18.

Tabela 3.19 – Precisão (%) entre as replicatas das concentrações da curva de

calibração por adição de padrão.

Concentração do Padrão

adicionado (50 µL) à

10 mg de semente

Precisão (CV %) entre as

amostras referentes a cada

concentração

5 µg/mL

2,00

10 µg/mL

4,64

15 µg/mL

0,11

20 µg/mL

3,42

30 µg/mL

4,05

Para esta curva analítica, foi determinada um coeficiente de correlação

r = 0,9921 considerado muito bom, vista a grande manipulação de cada amostra

analisada. Comparando os resultados obtidos para a análise da semente de

Catanduva por uma curva analítica de calibração externa com os resultados obtidos

para a mesma semente através da curva de adição de padrão, observou-se uma

concordância entre os resultados superior a 95 %, ou seja, uma recuperação de

95% nos resultados, demonstrando ser o método confiável, sem perdas de analito

durante os procedimentos de manipulação e sem a interferência da matriz nas

análises, confirmado a seletividade do método. Os resultados encontrados foram

satisfatórios demonstrando ser o método desenvolvido eficaz na quantificação da

Azadirachtina.

Completando a validação do método, foi verificada a estabilidade do

padrão de azadirachtina A no auto-injetor e de degelo. A estabilidade no auto-injetor

5 10 15 20 25 30

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

Área (mAbs)

Concentração de Azadirachtina Adicionada à semente

(ug/mL)

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foi observada pela análise de um padrão de azadirachtina A preparado na

concentração de 180 µg/mL. O padrão foi analisado a cada 2 horas durante o

período total de 24 horas. As 13 analises realizadas apresentavam uma variação na

precisão de apenas 0,64 % e na exatidão de 100,9 %. Esse resultado comprova a

estabilidade do padrão durante o período de permanência para análise no auto-

injetor. O mesmo padrão, mantido a uma temperatura de – 20 ºC foi analisado nos

tempos t=0; t=24 hrs; t=48 hrs; t=72 hrs; t=96 hrs; t=120 hrs; t=144 hrs e t = 168 hrs,

ou seja, sua estabilidade em condições de armazenamento foi avaliada por sete

dias. Com base nos CV (%) encontrados para cada triplicata analisada nestes

períodos de tempo estabelecidos, foi determinada variação na precisão (CV%)

apenas de 0,46 % e a exatidão (%) de 101,5.

3.4.1.2.2 Quantificação das Sementes de Azadirachta indica.

Alguns produtores nacionais de semente de Nim, de diversas

localidades brasileiras, se comprometeram a fornecer um ou mais lotes de sementes

para análise. Foi estabelecido um procedimento padrão aos produtores contendo

prazos de colheita, métodos de secagem e de armazenamento, de tal maneira que

as variáveis não viessem a interferir na comparação do teor de azadirachtina A e B

entre as sementes. Este procedimento encontra-se descrito nos Procedimentos

Experimentais.

Os colaboradores que forneceram as sementes do Nim foram:

Instituição Colaborador Código

Agropecuária Santa Angelina Sr. Jonh George de Carle

Gottheiner

Col. 01

Cruangi Neem do Brasil Ltda. Sr. Pedro Luiz Pessoa de Melo

Neto

Col. 02

Bioneem Tec. Cons. Ind. Com.

Ltda

Sra. Sueli Rodrigues Col. 03

Baraúna Com. Ind. Ltda. Sr. Roberto Antônio Mallimpence Col. 04

Instituto Agronômico do Paraná

(IAPAR)

Dra. Sueli de Sousa Martinez Col. 05

Universidade Federal do Pará Depto. de Química Col. 06

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O período de coleta destas sementes foi estipulado para o mês de

março, mês próximo do final do final do período de cultivo. Neste mês se tem o auge

da colheita das sementes. Uma vez coletado o material, despolpado, lavado e seco

foi enviado para análise. Foi analisado um total de 40 lotes de sementes. A origem

de cada lote encontra-se detalhada na Tabela 3.20.

Tabela 3.20 - Lotes de sementes do Nim analisadas.

Plantio

Cód. Colab.

Local UF Região

Idade

(anos)

Descrição

001

Col. 01 Brejinho do

Nazaré

TO Norte 5 Plantio de 2

. ano

002

Col. 01 Brejinho do

Nazaré

TO Norte 4 Plantio de 3

. ano

003

Col. 01 Brejinho do

Nazaré

TO Norte 6 Plantio de 1

. ano

004

Col. 02 Timbaúba PE Nordeste 5 Propriedade Triunfo

005

Col. 02 Timbaúba PE Nordeste 5 Propriedade Triunfo

006

Col. 02 Timbaúba PE Nordeste 8 Propriedade

Genipapo

007

Col. 03 Itinga MG Sudeste 8 Plantio velho

008

Col. 03 Itinga MG Sudeste 5 Campineira

009

Col. 03 Itinga MG Sudeste 2 Beira rio

010

Col. 04 Catanduva SP Sudeste 5 1

. floração

011

Col. 04 Ariranha SP Sudeste 6 2

. floração

012

Col. 04 Urupês SP Sudeste 5 1

. floração

013

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Pé franco 1

014

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Pé franco 2

015

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Pé franco 3

016

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Pé franco 4

017

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Enxerto 1

018

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Enxerto 2

019

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Enxerto 3

020

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Enxerto 4

021

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Sem. pé planta 01/1

022

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Sem. pé planta 01/2

023

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Sem. pé planta 01/3

024

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Sem. pé planta 01/4

025

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Sem.solo planta 01/1

026

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Sem. olo planta 01/2

027

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Sem.solo planta 01/3

028

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Sem.solo planta 01/4

029

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Sem. pé planta 02/1

030

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Sem. pé planta 02/2

031

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Sem. pé planta 02/3

032

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Sem. pé planta 02/4

033

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Sem.solo planta 02/1

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034

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Sem.solo planta 02/2

035

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Sem.solo planta 02/3

036

Col. 05 Xambrê PR Sul 5 Sem.solo planta 02/4

037

Col. 06 Belém PA Norte

038

Col. 05 Paranavaí PR Sul Plantação antiga

039

Col. 05 Paranavaí PR Sul Plantação antiga

040

Col. 05 Paranavaí PR Sul Plantação antiga

Estando as sementes no laboratório, separou-se o total de 20 unidades

de cada lote de sementes para análise. As 20 sementes foram pesadas sendo em

seguida, separada a palha (mesocarpo) da amêndoa, determinando-se o peso

médio de cada uma destas partes. Assim foi possível verificar a diferença média

entre o peso das sementes e o peso da amêndoa entre os diversos cultivos

analisados. A Tabela 3.21 ilustra esses resultados.

Tabela 3.21 - Distinção entre os lotes de sementes analisadas através do peso

médio unitário da semente, da porcentagem em peso referente ao peso médio da

amêndoa na semente e a porcentagem de gemas duplas encontradas.

Cód.

Peso

unitário

médio (mg)

% em

peso da

amêndoa

% dupla

gema

Cód.

Peso

unitário

médio

(mg)

% em

peso da

amêndoa

% dupla

gema

001

208,7 54,7 10

021

241,0 48,1 0

002

196,6 52,6 0

022

251,6 48,9 0

003

196,7 54,4 0

023

211,8 49,6 0

004

119,5 66,6 0

024

231,7 49,9 0

005

209,0 65,8 5

025

265,5 45,1 0

006

209,1 63,9 5

026

266,3 46,9 0

007

149,2 54,3 10

027

288,3 47,3 5

008

100,8 54,7 5

028

279,0 46,7 5

009

205,9 50,2 5

029

187,1 53,8 5

010

128,4 45,6 5

030

186,2 52,9 5

011

203,7 59,6 5

031

177,0 53,8 10

012

200,4 54,6 0

032

202,8 52,6 0

013

143,8 54,5 5

033

239,9 55,5 5

014

247,8 49,3 0

034

237,2 55,2 5

015

190,3 55,6 0

035

251,4 53,5 0

016

209,0 49,8 0

036

238,5 54,5 0

017

199,0 48,9 0

037

018

200,2 49,3 0

038

138,4 44,6 0

019

197,8 47,7 0

039

162,9 43,8 0

020

189,8 50,0 0

040

141,3 43,1 0

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As sementes após serem pesadas, suas amêndoas foram trituradas

para posteriormente serem analisadas. Neste processo foi possível observar

diferenças físicas entre diversas amêndoas, sendo umas amareladas, outras

amarelo-esverdeadas e outras mais para um verde-folha. Foi possível observar

diferenças em sua dureza, sendo algumas muito duras e quebradiças e outras

macias e bastante oleosas. Contudo, estas observações não foram qualificadas.

Foram preparadas três amostras para cada lote de semente, sendo

submetidas aos procedimentos de preparo dos extratos. Numa segunda etapa, os

extratos obtidos, foram submetidos aos procedimentos de limpeza estabelecidos

para este método, eliminando possíveis interferentes. Uma vez estando cada

amostra pronta, foram analisados os teores de azadirachtina A e B por

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. As determinações dos teores foram

realizadas através da construção de duas curvas de calibração por padronização

externa, uma para o isômero A e outra para o isômero B. Cada curva construída foi

preparada com descrito no item 3.4.1.2.1. As amêndoas e os pontos das curvas de

calibração foram analisados seguido os procedimentos descritos no método

desenvolvido usando uma coluna analítica C

Phenomenex®-Luna(II) (150x4,6mm,

5 µm) com a uma pré-coluna de segurança Phenomenex® (4x3mm, 5 µm) acoplada,

uma fase móvel quaternária composta de H

O:ACN:MeOH:THF (61:34:4:1, v/v),

numa vazão de 0,8 mL/min. e um volume de injeção de 20 µL. Os cromatrogramas

foram registrados através do software CLASS-VP. Os resultados da quantificação

podem ser observados na Tabela 3.22.

Tabela 3.22 – Resultados da quantificação dos teores de azadirachtina A e B nas

amostras das sementes.

Teor médio Azad. A Teor médio Azad. B

Amostra

(mg/kg)

CV (%)

(n=3)

(mg/kg)

CV (%)

(n=3)

Razão

média

(A/B)

CV (%)

Razão

001

3.475,8 6,78 818,5 3,02 4,25 5,20

002

3.180,6 5,64 673,2 4,54 4,72 1,23

003

4.230,7 1,95 685,9 0,92 6,17 2,14

004

2.484,8 5,47 350,5 4,11 7,09 1,44

005

2.770,6 2,76 437,0 2,67 6,34 5,43

006

3.578,3 7,55 396,4 5,76 9,03 0,29

007

3.454,1 1,47 445,3 0,23 7,76 1,70

008

3.377,0 3,09 791,4 5,56 4,27 5,00

009

3.999,9 0,84 681,4 3,21 5,87 2,41

010

4.320,9 5,28 728,5 2,92 5,93 1,61

011

1.516,4 11,08 441,3 3,38 3,44 7,70

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012

3.167,1 4,85 505,0 12,38 6,27 12,54

013

5.545,6 2,58 922,9 7,64 6,01 6,28

014

4.777,1 1,80 705,4 1,80 6,76 1,18

015

4.284,2 4,01 825,1 1,43 5,19 5,31

016

5.861,4 3,89 889,1 8,76 6,59 5,81

017

5.358,4 5,77 290,5 7,76 18,44 2,96

018

3.489,1 3,02 240,4 6,00 14,51 2,98

019

4.540,7 3,12 282,5 1,77 16,07 4,70

020

4.964,7 10,64 281,3 11,09 17,65 0,45

021

4.009,5 0,92 726,7 10,68 5,52 9,49

022

3.671,2 8,91 669,9 8,19 5,48 1,14

023

3.472,6 3,44 598,3 4,07 5,80 5,18

024

3.310,3 6,83 640,0 3,83 5,17 1,59

025

3.872,1 2,97 557,3 9,21 6,95 7,03

026

3.243,7 1,74 635,5 6,14 5,10 4,40

027

3.398,9 1,03 637,8 2,49 5,33 2,97

028

3.504,3 2,76 664,6 5,35 5,27 2,59

029

3.315,9 7,74 840,8 7,07 3,94 1,42

030

3.736,0 4,76 752,1 4,28 4,97 1,80

031

5.304,6 2,64 849,3 6,00 6,25 6,37

032

4.862,5 5,52 825,4 8,17 5,89 5,23

033

3.335,9 4,70 877,0 6,11 3,80 7,60

034

3.318,4 0,30 763,0 8,13 4,11 8,47

035

3.346,9 8,41 813,4 1,90 4,11 6,52

036

3.139,9 0,16 621,8 12,78 5,05 12,72

037

n.d. - - - - -

038

5.251,1 4,72 1.120,8 8,60 4,69 3,89

039

4.532,5 2,64 1.175,1 0,28 3,86 2,80

040

3.593,5 8,01 974,9 9,64 3,69 1,63

Sidhu et.al apresentaram um trabalho [182] descrevendo o resultado

da quantificação das sementes do Nim em sementes de plantas cultivadas na Índia,

país de origem do Nim. Neste trabalho os teores quantificados da azadirachtina A

variaram entre 556,9 até 3.030,8 mg/kg de amêndoa e os teores de azadirachtina B

entre 43,1 até 590,6 mg/kg de amêndoa. A variação destes teores para as plantas

nacionais foram entre 1.516,4 para 5.861,4 mg/kg de amêndoa para o isômero A e

entre 240,4 para 1.175,1 para o isômero B. Estes resultados demonstram que o

cultivo nacional têm se desenvolvido com excelentes resultados quanto ao seu

objetivo de se tornar uma nova alternativa para o desenvolvimento da agricultura

orgânica.

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3.4.1.2.3 Quantificação das Sementes do Enxerto de Azadirachta indica sobre

Melia azedarach. Comparação com as Sementes de pés Franco.

Com um dos principais objetivos deste trabalho foi proposto o

desenvolvimento do método de quantificação para verificar se a planta enxertada

sendo desenvolvida tem mantido suas características quantitativas quando

comparado com a planta não enxertada. Nas análises realizadas, entre as amostras

013 a 020 referem-se a essa comprovação. As amostras 013 à 016 são referentes a

quatro plantas pé franco e as 017 a 020 são outras quatro plantas enxertadas sendo

que cada amostra se refere a uma planta. Todas estas plantas apresentam as

mesmas origens, cultivadas pelo IAPAR dentro da mesma Estação Experimental

(Xambrê-PR), apresentam a mesma idade, sujeitas as mesmas variações

ambientais. A colheita semente foi realizada no mesmo dia e submetidas aos

mesmos procedimentos de manipulação.

A quantificação das sementes não mostrou diferenças significativas no

teor de azadirachtina A entre as plantas enxertadas e não enxertadas. Apenas um

exemplar enxertado não apresentou um bom resultado que possivelmente numa

avaliação estatística ampla poderia este exemplar estar sendo descartado. Os

teores da azadirachtina A encontrados foram bastante elevados numa média de

4.588,2 mg/kg e 5.115,7 mg/kg respectivamente para as plantas enxertadas e não

enxertadas demonstrando um excelente resultado para o cultivo. A média das

plantas enxertadas pode ser elevada para 4.954,6 mg/kg com a eliminação do

resultado quantificado para uma planta que não se mostrou satisfatório (018). Desta

forma pode se concluir que as plantas enxertadas têm mantido as mesmas

qualidades quanto a sua produção do metabólito secundário Azadirachtina A.

Um dado surpreendente quantificado entre as plantas enxertadas e

as não enxertadas foi a diferença entre os teores de azadirachtina B sendo a razão

média entre o isômero A sobre o B nas plantas enxertadas de 16,7 e nas plantas

não enxertadas de 6,2. Estes resultados demonstram um teor de azadirachtina B

três vezes maior na planta não enxertada. As variações climáticas afetam o

metabolismo secundário das plantas. Condições climáticas mais frias favorecem a

biosíntese da azadirachtina B nas sementes [182]. Uma vez que todas estas plantas

foram submetidas as mesmas variações climáticas se pode pré-supor que as plantas

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enxertadas foram menos afetadas com o inverno naquela região do que as plantas

pé franco comprovando a eficácia do enxerto quanto a transferência de resistência

da Melia azedarach para a Azadirachta indica sendo que a Melia já é uma planta já

bem adaptada a condição climática mais fria do país. Este resultado pode ser

confirmado comparando os resultados destas plantas enxertadas e não enxertadas

com as plantas cultivadas em outras localidades de climas tropicais do país

(amostras 001 à 012) estando o teor da azadirachtina B destas regiões tropicais

(região mais quente e menos favorável à biosíntese do isômero B) inferior aos teores

das plantas não enxertadas cultivadas em Xambrê. Em geral, os teores de

azadirachtina B nas sementes, não ultrapassam 20 % do valor do isômero A [09].

3.4.1.2.4 Quantificação de Sementes Coletadas Diretamente da Planta e

Sementes Coletadas no Solo.

As amostras 021 a 036 são referentes a um experimento que tinha

como objetivo observar ou não diferenças entre sementes coletadas ainda no pé e

sementes coletadas já no solo num estagio avançado de maturação. Para isto foram

escolhidas aleatoriamente duas plantas não enxertadas também cultivadas na

Estação Experimental do IAPAR em Xambrê-PR. As amostras 021 a 024 são

referentes as sementes coletadas na planta 01 e as amostras 025 à 028 referentes

as sementes coletadas no solo da planta 01. De maneira similar, as amostras 029 a

032 são referentes as sementes coletadas na planta 02 e as amostras 033 a 036

referentes as sementes coletadas no solo da planta 02.

Para a planta 01 não foi observada diferença entre a quantificação das

sementes coletadas no pé e as recolhidas do solo. Na planta 02 foi quantificado na

média, um valor 33% maior da azadirachtina A nas sementes coletados no pé em

relação às recolhidas no solo, possivelmente estando estas sementes do solo já com

um período maior de degradação do que as sementes recolhidas no solo da planta

01. Em vista da dificuldade de se controlar há quanto tempo as sementes se

encontram em degradação, com o objetivo de se obter melhores teores de

azadirachtina é então recomendado que o fruto seja coletado na copa da planta.

Tendo o cultivo do Nim um objetivo claro de produção de frutos, novamente se

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destaca o enxerto que tem produzido plantas com uma copa maior e mais próxima

ao solo facilitando a colheita.

3.4.1.2.5 Quantificação de Sementes Armazenadas.

Como observado no item anterior, as sementes coletadas

diretamente da planta, apresentaram teores relativamente superiores quando

comparado com os valores quantificados de sementes coletadas no solo em estágio

avançado de maturação. Com o início da degradação do fruto possivelmente ocorra

também o início da degradação de seus metabólitos. Assim, com o objetivo de

verificar a degradação da azadirachtina A e B nas sementes quando armazenadas,

um lote de semente analisada logo após a coleta foi dividido em dois lotes sendo um

armazenado a temperatura ambiente e o outro a 12 ºC. Estas sementes foram

analisadas a logo após a coleta e após 2 e 5 meses de armazenamento. Todas as

análises foram realizadas seguindo os procedimentos de extração e pré-tratamento

exemplificado na Figura 3.17 e os parâmetros cromatográficos validados para o

método. Estes resultados podem ser observados na Tabela 3.23 e na Figura 3.21.

Tabela 3.23 – Dados referentes a quantificação de sementes armazenadas.

Temperatura Ambiente Temperatura 12 ºC

Azadirachtina A Azadirachtina B Azadirachtina A Azadirachtina B

Tempo

(meses)

(mg/kg) CV(%) (mg/kg) CV(%) (mg/kg) CV(%) (mg/kg) CV(%)

0 5.117,1 2,35 835,6 4,91 - - - -

2 4.609,1 10,2 851,4 10,6 4.619,8 7,85 898,7 4,0

5 3.062,2 11,1 894,0 5,6 2.981,0 7,11 851,5 6,7

Os dados exemplificados na Figura 3.21 demonstram claramente a

degradação da azadirachtina A com o armazenamento tanto à temperatura ambiente

quanto sob refrigeração. Contudo, a azadirachtina B se mostrou estável neste

período não apresentando diferenças entre o armazenamento a temperatura

ambiente ou a 12 ºC. Com a perda no teor de azadirachtina A as sementes

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imediatamente perdem seu valor comercial. Assim, estes dados sugerem a busca de

novos métodos de armazenamento ou a utilização imediata dos frutos após sua

coleta para a produção dos óleos comerciais. Estes óleos são constituídos

principalmente por lipídios e, apresentam propriedades de preservação da

azadirachtina A contra a umidade e contra a fotodegradação.

Figura 3.21 – Curva de armazenamento das sementes do Nim.

3.4.1.2.6 Análise Comparativa entre Lotes de Sementes das Diversas Regiões

Investigadas

Uma análise exploratória do conjunto de dados obtidos (Tabelas 3.20,

3.21 e 3.22) para todas as sementes analisadas foi realizada utilizando o programa

computacional PIROUETTE 2.02.

Antes de proceder à análise, todos os dados foram auto escalonados

para obter variáveis (teores) com média zero e variância igual a um. Este

procedimento tem a finalidade de atribuir a todas as variáveis a mesma informação

estatística, evitando distorções que possam ocorrer na análise dos dados devido à

diferença de unidades ou grandezas de valores.

Com o objetivo de verificar a discriminação das amostras com relação

à região de cultivo, utilizou-se a Análise de Componentes Principais (ACP). As três

primeiras componentes explicam 80,84% da variância contida nos dados, e até a

sétima componente 99,77%. A Figura 3.22, apresenta a projeção das amostras, ou

0 1 2 3 4 5

1000

2000

3000

4000

5000

Azadirachtina A - Temp. Ambiente

Azadirachtina B - Temp. Ambiente

Azadirachtina A - Temp. 12 ºC

Azadirachtina B - Temp. 12 ºC

Teores de azadirachtinas A e B / (µg/kg)

Tempo de armazenamento / (meses)

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seja, um gráfico em 2D correlacionando a segunda (PC2) e terceira (PC3) variável

criadas pelo programa diferenciando as amostras entre si. A Figura 3.23 apresenta

os dados mais influentes das amostras que permite a distinção de uma amostra de

outra no conjunto total de dados.

Nestas análises pode-se observar uma diferenciação do conjunto total

de amostras das sementes oriundas de Paranavaí-PR, se destacando por seu

elevado teor de azadirachtina B em relação às demais sementes, possivelmente

porque este cultivo se encontra na região sul do país sujeito a períodos de menores

temperaturas que as demais localidades. Também se destacam as sementes

coletadas em Timbaúba-PE, pela sua diferença na porcentagem de peso entre o

peso da amêndoa e da palha da semente (Tabela 3.21) sendo que estas sementes

apresentam um peso médio de amêndoa acima de 60% quanto que a média geral é

próxima aos 50%. Este resultado diminui o interesse comercial desta semente uma

vez que ela é prensada com a palha presente, onde produzirá uma maior quantidade

de óleo, porém, com menores teores de azadirachtina A. Um último grupo que se

destaca é exatamente das sementes analisadas do enxerto se diferenciando das

demais amostras pela diferença na razão entre os isômeros A e B da azadirachtina.

Nestas figuras pode-se observar que nenhum grupo apresentou um

destaque expressivo quanto ao teor de azadirachtina A estando dentro da média

mundial descritos na literatura. Contudo as sementes (011) coletadas em Ariranha-

SP, apresentaram um pobre teor em relação as outras possivelmente decorrente de

problemas de má preservação.

Figura 3.22 – Projeção em 2D da amostras analisando as componentes principais

PC2 e PC3.

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As sementes de Paranavaí, Xambrê e Timbaúba respectivamente

difereciam-se das demais em relação a: teores de azadirachtina B, razão entre o

teor de azadirachtinas A e B na semente, diferença na porcentagem em peso entre a

amêndoa e a palha da semente.

Figura 3.23 – Projeção em 2D das parâmetros analisados que se destacaram entre

as amostras.

Após estes resultados, investigou-se a aplicação da Análise

Hierárquica, a qual foi baseada no valor de similaridade, com o objetivo de confirmar

o resultado da ACP. A vantagem deste método é que não existe perda de

informação estatística, uma vez que é baseada no cálculo da distância Euclidiana

[194].

A estrutura dos dados para as amostras é apresentada através de um

dendrograma na Figura 3.24. Os dados do dendrograma demonstram uma

diferenciação para as amostras de Timbaúba, do enxerto e de Ariranha formando

dois grupos abaixo do dendograma confirmando os resultados encontrados na

análise das Variáveis Principais.

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Figura 3.24 – Dendograma demonstrando a estrutura dos dados baseado na análise

hierárquica das amostras.

3.4.2 Desenvolvimento do Método de Quantificação da Azadirachtina nos

Óleos Comerciais do Nim – Preparo de Amostras e Otimização dos

Parâmentros Cromatográficos

Os óleos comerciais do Nim, são produtos preparados pela prensa

mecânica das sementes do Nim. Em sua composição contêm principalmente os

ácidos graxos palmítico (~20%), esteárico (~15 %); oléico (~ 40%) e linoleico (~

25%) [181,195].

Juntamente com a extração dos lipídeos ocorre a remoção de alguns

outros metabólitos secundários. Apesar de a azadirachtina possuir muitos isômeros,

A – K, tem sido descrito na literatura que o azadirachtina A é o isômero mais

importante e presente em maiores quantidades sendo ele, usado como padrão para

expressar a atividade dos óleos e sementes do Nim, extratos e formulações. Deste

modo, partindo-se do mesmo princípio, para o desenvolvimento de um método

quantitativo que expressasse a qualidade dos óleos do Nim, a azadirachtina A foi

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escolhida como marcador de qualidade. Sendo a azadirachtina A escolhida como

marcador, o método desenvolvido deveria apresentar seletividade a este analito.

Sendo o óleo preparado pela simples prensa mecânica das sementes,

era de se esperar que o método desenvolvido para a quantificação das sementes

também fosse seletivo para a quantificação do óleo, uma vez, que os mesmos

metabólitos devam estar presente em ambas amostras. Contudo, na prática, esta

afirmação não se mostrou verdadeira. Apesar de ser a mesma matriz (semente) os

procedimentos de extração são diferentes. Para a quantificação da semente se

obtém primeiramente um extrato metanólico. O MeOH é capaz de extrair

principalmente compostos de média a alta polaridade. A prensa mecânica das

sementes, promove a extração de ácidos graxos de baixa polaridade que arrasta

consigo alguns produtos secundários. Esta afirmação pode ser comprovada

observando a diferença nos teores de azadirachtina A e B nas sementes e nos

óleos. Nas sementes, em média, o teor de azadirachtina B não ultrapassa 20% do

teor de azadirachtina A, enquanto, nos óleos, este teor pode chegar a 50 %. Isso

ocorre porque a azadirachtina B é menos polar que o isômero A, sendo então, a

extração do isômero B mais eficiente no preparo do óleo que do extrato. Além disso,

com a prensa mecânica, não mais que 10 % do total de azadirachtina A presente na

semente é extraída, restando à torta (restos sólidos das sementes prensadas) os

outros 90% [02].

Assim, devido à diferença no preparo dos extratos, os analitos de

interesse e os interferentes presentes na amostra encontram-se em quantidades

diferentes das quantidades médias presentes no extrato. Esta modificação na

amostra, implicou na perda de seletividade para a azadirachtina A quando uma

amostra de óleo foi analisada nos métodos desenvolvidos para a quantificação das

sementes. Esta perda de seletividade pode ser atribuída à interferência da matriz na

análise. Assim, tornou-se necessário o desenvolvimento de novo método que fosse

seletivo ao analito de interesse e que gerasse resultados confiáveis. Os testes

realizados nos óleos, fazendo uso dos métodos definidos para a semente,

encontram-se ilustrados na Figura 3.25.

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0 4 8 12 16

mAbs

tempo/min

0 4 8 12 16 20 24

100

200

300

400

500

600

700

800

mAbs

tempo/min

(a) (b)

Figura 3.25 – Cromatogramas demonstrando a perda de seletividade para a análise

das sementes usando os métodos desenvolvido para a quantificação das sementes.

Coluna C18 Phenomenex® Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm); coluna de segurança C18

Phenomenex® ( 4x3 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min; alça de injeção de 20 µL e

detector de UV-Vis em 217 nm. (a) Fase móvel: ACN:H

O – 35:65; (b)

O:ACN:MeOH:THF – 61:34:4:1.

3.4.2.1 Desenvolvimento do Método de Isolamento dos Analitos de Interesse

do Óleo. Desenvolvimento do Pré-Tratamento das Amostras

Não obtendo a resolução esperada para o óleo, foi iniciado a busca

para a otimização dos parâmetros de extração, pré-tratamento e eluição

cromatográfica, ou seja, iniciou-se o desenvolvimento de um novo método de

quantificação, agora, para o óleo do Nim.

A preparação da amostra é, possivelmente, a maior dificuldade em

uma análise, principalmente em matrizes complexas, como extratos vegetais, onde,

a análise direta freqüentemente é impossível [186, 196, 197]. A extração líquido-

líquido é uma das técnicas analíticas mais usadas no preparo de amostras

complexas. Esta se baseia na solubilidade relativa dos analitos presentes na

amostra em dois solventes, idealmente imiscíveis. Contudo, como toda técnica

analítica de extração, a seletividade e eficiência são fundamentais. Esta técnica foi

utilizada como extração os analitos de interesse a matriz (óleo) e, também, para

promover limpeza parcial da amostra.

Azadirachtina AAzadirachtina A

Azadirachtina BAzadirachtina B

Azadirachtina AAzadirachtina A

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A LLE mostrou-se uma técnica tediosa, demorada, com consumo de

grandes volumes de solventes orgânicos e de difícil repetibilidade em decorrência

das várias etapas envolvendo os analitos de interesse. Além disso, a técnica não

possibilitou melhoras significativas na separação cromatográfica. Deste modo, se

iniciou novos testes fazendo uso dos cartuchos de extração SPE.

O preparo de uma amostra fazendo uso dos cartuchos de SPE o

tempo total de aproximadamente 5 min, enquanto, por LLE, era próximo a um hora.

Outra diferença importante, foi a quantidade de solvente consumido, de

aproximadamente 500 mL na LLE e, aproximadamente 10 mL na SPE. Contudo, a

principal diferença notada, foi a eficiência na extração. Com mesma quantidade de

óleo, foram preparadas duas amostras para serem analisadas por HPLC, uma sendo

preparada por LLE e a outra por SPE. Ambos os métodos mostraram-se

reprodutivos, contudo, a eficiência na extração por SPE foi superior a eficiência da

extração por LLE. Este resultado, somado às desvantagens da técnica de LLE,

direcionou o desenvolvimento do método ao uso da SPE no preparo das amostras.

A SPE é uma técnica bem consolidada que tem sido cada vez mais

aplicada à substituição da LLE. Por exemplo, a Agência de Proteção Ambiental dos

Estados Unidos (US EPA) já aprovou o uso da SPE como alternativo A LLE em 22

de seus métodos oficiais de análise [198].

O uso dos cartuchos de SPE com a finalidade de eliminação de

interferentes geralmente envolve quatro etapas [185,188,198]:

1. Condicionamento do cartucho, preparando-o para interagir com a

amostra;

2. Aplicação da amostra, eluíndo-a através do absorvente contido no

cartucho. Nesta fase, os componentes de interesse das amostras permanecem

adsorvidos na fase estacionária;

3. Lavagem do cartucho, para a retirada dos interferentes da matriz;

4. Recuperação da amostra, através da eluição seletiva dos compostos

de interesse.

Definido o uso da SPE ao invés de LLE no preparo das amostras, era

então, preciso otimizar as quatro etapas acima descritas que a técnica eficiente e

reprodutiva.

Entre os adsorventes mais populares utilizados como fases

estacionárias nos cartuchos de SPE encontram-se os preparados pela derivação de

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fases orgânicas em um suporte de sílica dando origem as “fases quimicamente

ligadas”. Entre estas fases, as mais comumente empregadas, se sobressaem as

formadas por grupos ocatadecil e cianopropil derivadas em sílica. Estas fases são

conhecidas por C18 e CN respectivamente [187,193]. Ambas as fases foram

investigadas na busca de um pré-tratamento ideal para o óleo. Foram usados

cartuchos da J.T.Baker Bakerbond

de 100 mg e 1 mL.

Em paralelo aos testes para a escolha da melhor espécie de cartucho

a ser aplicado na manipulação do óleo do Nim, era preciso investigar o melhor

solvente de condicionamento, de lavagem e de eluição. Do ponto de vista prático, a

SPE comporta-se como uma técnica de cromatografia líquida em coluna aberta.

Assim, os cartuchos C18 e CN devem ser manipulados no modo reverso e no modo

normal de eluição respectivamente. Nas Tabelas 3.24 e 3.25 encontram-se descritos

os procedimentos de condicionamento, lavagem e eluição investigados para o pré-

tratamento da matriz. O solvente de eluição do analito, após a extração, era seco e

reconstituído em 500 µL de MeOH para análise.

Tabela 3.24 – Procedimentos de isolamento e limpeza usando cartuchos C18 no

modo reverso de eluição investigados para o óleo do Nim.

Amostra de

óleo

Solubilizado em: Condicionamento

do cartucho

Eluição do

analito

15 mg

100 µL Hex.

3 mL H

3 mL MeOH

3 mL H

2 mL H

15 mg

100 µL Hex.

3 mL H

3 mL MeOH

3 mL H

2 mL H

O:MeOH

(9:1)

15 mg

100 µL Hex.

3 mL H

3 mL MeOH

3 mL H

2 mL H

O:MeOH

(8:2)

15 mg

100 µL Hex.

3 mL H

3 mL MeOH

3 mL H

2 mL H

O:MeOH

(7:3)

15 mg

100 µL Hex.

3 mL H

3 mL MeOH

3 mL H

2 mL H

O:MeOH

(1:1)

15 mg

100 µL Hex.

3 mL H

3 mL MeOH

3 mL H

2 mL MeOH

15 mg

100 µL Hex.

3 mL H

3 mL MeOH

3 mL H

2 mL DCM

15 mg

100 µL Hex.

3 mL H

3 mL MeOH

3 mL H

2 mL Isopropanol

15 mg

100 µL Hex.

3 mL H

3 mL MeOH

3 mL H

2 mL ACN

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O cartucho C18, deve ser primeiramente condicionado com uma fase

fraca e, em seguida, promover a remoção dos analitos de interesse com uma fase

polar deixando os interferentes mais apolares retido no cartucho. Assim, após o

condicionamento dos cartuchos C18 com uma fase orgânica polar, a amostra foi

aplicada ao cartucho e investigada o melhor solvente para a remoção total do analito

de interesse, de maneira, que menor quantidade possível de interferentes fosse co-

eluida junto com o analito. Foram testados diversos solventes e diversas misturas de

solvente a fim de encontrar a força ideal para remoção da azadirachtina. Nestes

testes não foi encontrada uma força ideal para a remoção completa da

azadirachtina. O uso de pequenas quantidades de MeOH, não era suficiente para a

remoção total da azadirachtina do cartucho. Com grandes quantidades de MeOH,

grandes quantidades de interferentes eram co-eluídos. Estes testes não

apresentaram melhoras significativas no preparo das amostras e na seletividade do

método sendo descartados, como, por exemplo a amostra demonstrada na Figura

3.26.

Figura 3.26 – Eluição cromatográfica da amostra eluída com 2 mL da mistura de

MeOH:H

O – 1:9 do cartucho C18. Fase móvel: H

O:MeOH:ACN:THF – 60:30:6:4.

Coluna C18 Phenomenex® Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm); coluna de segurança C18

Phenomenex® ( 4x3 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min; alça de injeção de 20 µL e

detector de UV-Vis em 217 nm.

O cartucho CN, apresenta uma fase estacionária polar que deve ser

condicionado com um solvente fraco, contudo, há uma inversão no conceito de força

do solvente em relação aos métodos de uso dos cartuchos C18. Para os cartuchos

C-18, solventes fracos, são os solventes polares e, para os cartuchos CN, são os

solventes apolares. Esta inversão ocorre porque há uma inversão na polaridade dos

adsorventes. Após serem condicionado, os cartuchos de CN devem ser lavados com

um solvente fraco que não possua força suficiente para remover os analitos de

0 4 8 12 16 20

-4

mAbs

tempo/min

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interesse, os quais, devem permanecer retidos na fase estacionária sendo,

posteriormente removidos pela eluição de um solvente ideal. Os procedimentos

investigados para o cartucho CN encontra-se descrito na Tabela 3.25. Novamente, o

solvente de eluição do analito, após a extração, era seco e reconstituído em 500 µL

de MeOH para análise.

Tabela 3.25 – Procedimentos de isolamento e limpeza usando cartuchos CN no

modo normal de eluição investigados para o óleo do Nim.

Amostra

de óleo

Solubilizado em: Condicionamento

do cartucho

Eluição do analito Fase

analisada

50 mg

100 µL Hex.

50 µL MeOH

4 mL Hexano 4 mL Hex:DCM (9:1)

2 mL DCM

Hex:DCM

(9:1)

50 mg

100 µL Hex.

50 µL MeOH

4 mL Hexano 4 mL Hex:DCM (8:2)

2 mL DCM

Hex:DCM

(8:2)

50 mg

100 µL Hex.

50 µL MeOH

4 mL Hexano 4 mL Hex:DCM (7:3)

2 mL DCM

Hex:DCM

(7:3)

15 mg

200 µL Hex.

(100 + 100)

4 mL Hexano 2 mL Hex:DCM (9:1)

2 mL DCM

Hex:DCM

(9:1)

15 mg

200 µL Hex.

(100 + 100)

4 mL Hexano 2 mL Hex:DCM (9:1)

2 mL DCM

Hex:DCM

(9:1)

15 mg

200 µL Hex.

(100 + 100)

4 mL Hexano 2 mL Hex:DCM (9:1)

2 mL DCM

DCM

20 mg

100 µL Hex.

3 mL Hexano 3 mL Hex:AcOEt (9:1)

2 mL MeOH

Hex:AcOEt

MeOH

20 mg

100 µL Hex.

3 mL Hexano 3 mL Hex:AcOEt (8:2)

2 mL MeOH

Hex:AcOEt

MeOH

20 mg

100 µL Hex.

3 mL Hexano 3 mL Hex:AcOEt (7:3)

2 mL MeOH

Hex:AcOEt

MeOH

Estas amostras, foram analisadas por HPLC usando como fase móvel

misturas binárias e ternárias como: H

O:ACN (70:30), (60:40) e H

O:ACN:MeOH

(70:27:3), (60:35:5), (60:36:4), (55:30:5), (65:27:8) e (60:30:10). Nenhum dos testes

descritos na Tabela 3.25 analisados por HPLC foram satisfatórios. Nenhum deles

apresentaram melhoras na seletividade do método ou melhoras na eficiência de

extração dos analitos de interesse dos cartuchos.

Assim, num primeiro momento, passou a ser investigado qual deve ser

o solvente ideal para a remoção da azadirachtina do cartucho. Foram testados como

solventes de eluição 2 mL de DCM, 2 mL de ACN e 2 mL de MeOH (Tabela 3.25).

Após a eluição de cada um destes cartuchos até a secura, cada cartucho,

novamente foi eluído com mais 2 mL de MeOH. A Figura 3.27 apresenta as eluições

cromatográficas das amostras preparadas pela remoção da azadirachtina com os

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três solventes investigados e, a Figura 3.28 os cromatogramas das amostras

preparadas pela eluição dos 2 mL de MeOH usado na lavagem dos cartuchos após

a primeira extração. Todos os solventes de eluição e lavagem para serem

analisados por HPLC foram secos e reconstituídos em 500 µL de MeOH.

Tabela 3.26 – Experimentos de escolha do solvente de remoção da azadirachtina

dos cartuchos CN investigados.

Amostra

de óleo

Solubilizado

em:

Condicionamento

do cartucho

Remoção

interferentes

Eluição Lavagem

cartucho

100 mg

200 µL Hex.

50 µL MeOH

3 mL Hexano 3 mL Hex. 2 mL DCM MeOH

100 mg

200 µL Hex.

50 µL MeOH

3 mL Hexano 3 mL Hex. 2 mL ACN MeOH

100 mg

200 µL Hex.

50 µL MeOH

3 mL Hexano 3 mL Hex. 2 mL MeOH MeOH

(a) (b) (c)

Figura 3.27 – Amostras preparadas pela SPE removidas do cartucho CN por: (a) 2,0

mL de DCM; (b) 2,0 mL de ACN e (c) 2,0 mL de MeOH. Fase móvel: H

O: ACN –

65:35. Coluna C18 Phenomenex® Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm); coluna de

segurança C18 Phenomenex® ( 4x3 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min; alça de injeção

de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm.

(a) (b) (c)

Figura 3.28 – Amostras preparadas com a fração metanólica usada na lavagem dos

cartuchos CN após a etapa de eluição do analito. Cartucho eluído inicialmente com:

(a) 2,0 mL de DCM; (b) 2,0 mL de ACN e (c) 2,0 mL de MeOH. Os parâmetros

cromatográficos são os mesmos descritos na Figura 3.27.

0 4 8 12 16 20

100

150

200

250

300

mAbs

tempo/min

0 4 8 12 16 20

100

150

mAbs

tempo/min

0 4 8 12 16 20

-10

mAbs

tempo/min

0 4 8 12 16 20

100

150

200

250

300

mAbs

tempo/min

0 4 8 12 16 20

100

150

mAbs

tempo/min

0 4 8 12 16 20

-10

mAbs

tempo/min

0 4 8 12 16 20 24

100

200

300

400

500

600

700

800

mAbs

tempo/min

0 4 8 12 16 20 24

100

200

300

400

500

600

700

800

mAbs

tempo/min

0 4 8 12 16 20 24

100

200

300

400

500

600

700

800

mAbs

tempo/min

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Observando cromatogramas das Figuras 3.28a e 3.28b, pode se

observar resíduos de azadirachtina extraídos após a lavagem do cartucho com 2,0

mL de MeOH adicionais. Estes resultados, demonstram ser o MeOH o melhor

solvente para a remoção da azadirachtina dos cartuchos CN na etapa de eluição.

Assim, definido o solvente de eluição, ainda é preciso buscar as melhores opções de

condicionamento destes cartuchos, aplicação da amostra e remoção dos

interferentes. Estes novos testes encontram-se descritos na Tabela 3.27.

Tabela 3.27 – Procedimentos de isolamento e limpeza usando cartuchos CN no

modo normal de eluição investigados para o óleo do Nim usando MeOH na etapa de

remoção do analito de interesse.

Amostra

de óleo

Solubilizado

em:

Condicionamento

do cartucho

Remoção dos

interferentes

Fase de

eluição

50 mg

100 µL Hex.

50 µL Hex.

5 mL Hexano 4mL Hex 2 mL MeOH

50 mg

100 µL Hex.

50 µL Hex.

5 mL Hexano 4mL Hex 1 mL MeOH

25 mg

100 µL Hex.

50 µL Hex.

5 mL Hexano 4mL Hex 1 mL MeOH

15 mg

100 µL Hex.

50 µL Hex.

5 mL Hexano 4mL Hex 1 mL MeOH

10 mg

100 µL Hex.

50 µL Hex.

5 mL Hexano 4mL Hex 1 mL MeOH

5 mg

100 µL Hex.

50 µL Hex.

5 mL Hexano 4mL Hex 1 mL MeOH

15 mg

200 µL Hex.

100 µL Hex.

200 µL MeOH

5 mL Hexano 4mL Hex 1 mL MeOH

10 mg

200 µL Hex.

100 µL Hex.

200 µL MeOH

5 mL Hexano 4mL Hex 1 mL MeOH

O MeOH usado como fase de eluição na Tabela 3.27 foi seco e

reconstituído em 500 µL de MeOH para análise. Alguns dos experimentos descritos

na Tabela 3.27 principalmente os realizados com 15 e 10 mg de óleo demonstraram

uma excelente reprodutibilidade. Contudo, a seletividade do método ainda precisa

ser melhorada. Além dos procedimentos de pré-tratamento, esta busca de

seletividade, pode ser encontrada nos parâmetros de separação cromatográficos. A

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grande maioria dos ensaios acima descritos, foram realizados sob os seguintes

parâmetros: Fase móvel: H

O: ACN – 65:35. Coluna C18 Phenomenex® Luna(II)

(150x4,6 mm, 5 µm); coluna de segurança C18 Phenomenex® ( 4x3 mm, 5 µm).

Vazão 0,8 mL/min; alça de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm.

Todavia, algumas das análises foram realizadas modificando-se a fase móvel

usando além de H

O e ACN, MeOH e THF. Novamente, não houve sucesso nestas

análises.

Em virtude da dificuldade encontrada para se obter seletividades no

método isocrático através de uma boa resolução para a azadirachtina, foram

investigadas algumas eluições gradientes binárias. A fase móvel utilizada foi H

O e

ACN, variando-se a porcentagem de ACN. Dois gradientes realizados encontram-se

descritos na Tabela 3.28.

Tabela 3.28 – Eluição gradiente binário para amostras preparados com o óleo do

Nim.

Tempo (min)

Variação na fase móvel

(aumento da % de ACN em água)

0 à 30 15 % À 45 % 25% à 50%

30 a 35 Estável em 45 % Estável em 50 %

35 à 45 45% à 100 % 50% à 100%

As eluições gradientes apresentaram uma pequena melhora na

seletividade do método, porém, com um elevado tempo de análise. A azadirachtina

foi eluída em um tempo superior a 30 minutos. Esta pequena melhora na

seletividade não justificou o uso do gradiente, sendo esta técnica descartada

principalmente pelas desvantagens do uso do gradiente em análises de rotina

(Figura 2.29).

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Figura 3.29 – Eluição gradiente realizado para o óleo do Nim. Fase móvel: H

ACN – variando de 0 à 30 min a concentração de ACN de 15% a 45%,

permanecendo em 45% por 5 min, e aumentando de 45% à 100% em 10 min.

Coluna C18 Phenomenex® Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm); coluna de segurança C18

Phenomenex® ( 4x3 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min; alça de injeção de 20 µL e

detector de UV-Vis em 217 nm.

A cromatografia em fase reversa permite o uso de fases móveis

aquosas. A fase aquosa mais comumente utilizada é uma mistura de ACN:H

sendo a ACN, quando necessário, substituída por MeOH ou THF. O uso apenas

destes três solventes deve-se a pequena quantia de solventes orgânicos miscíveis

em água disponíveis. A força do solvente em fase reversa depende de dois fatores,

a porcentagem e o solvente orgânico utilizado. Contudo, em todos os testes

realizados para o óleo, não foi obtido um fator de separação (α) satisfatório para a

azadirachtina. Assim, passou-se a analisar o óleo, fazendo uso do triângulo de

seletividade no modo reverso proposto por Snyder [187,188].

Nesta proposta, buscam-se os ajustes na seletividade da separação

mantendo o fator de retenção constante. Deste modo, o k deve ter sido previamente

estabelecido. Assim, as alterações em α são feitas levando-se em consideração as

interações do soluto com o solvente.

Para este fim, foi utilizado o monógrafo de fase reversa ilustrado na

Figura 3.30. A fase 35:65 ACN:H

O forneceu um bom fator de retenção (k=6,37)

para a azadirachtina. Pelo Nomógrafo, esta fase foi convertida modificando o

solvente orgânico, contudo, mantendo constante a força da fase. Assim, foram

obtidas as fases constituídas entre MeOH:H

O e entre THF:H

O. Desta maneira,

obteve-se três pontas de um triângulo de seletividade, sendo elas: ACN:H

O –

35:65; MeOH:H

O – 55:45 e THF:H

O – 74:26 (Figura 3.31). É importante ressaltar

que a força do solvente em fase reserva aumenta com o decréscimo da polaridade

20 24 28 32 36 40

100

150

200

250

300

350

400

450

500

mAbs

tempo/min

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do solvente. Assim, para se manter a mesma força para a fase móvel e

conseqüentemente o mesmo k para a azadirachtina, precisa-se, em diferentes

solventes, alterar a porcentagem do solvente orgânico em água.

Figura 3.30 – Nomógrafo para alteração de solventes no modo reverso.

O uso de diferentes solventes orgânicos implica em diferentes

mecanismos de retenção para uma mesma amostra. Isto porque com a modificação

do solvente orgânico ou mesmo sua porcentagem, altera as constantes de

solubilidade e o coeficiente de solubilidade dos analitos presentes na amostra.

Figura 3.31 – As três pontas do triangulo de seletividade de Snyder estabelecida

pelo Nomógrafo para um k = 6,37 para a azadirachtina.

As três fases móveis foram testadas para uma mesma amostra. A

amostra foi preparada por SPE seguindo os procedimentos descritos na quarta

amostra da Tabela 3.27. Os demais parâmetros cromatográficos foram mantidos

constantes sendo: coluna C18 Phenomenex® Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm); coluna

de segurança C18 Phenomenex® ( 4x3 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min; alça de

injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm. Estes testes podem ser

observados na Figura 3.32.

ACN:H

THF:H

MeOH:H

(35:65)

(26:74)

(45:55)

ACN:H

THF:H

MeOH:H

(35:65)

(26:74)

(45:55)

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Figura 3.32 – Eluição cromatográfica da amostra do óleo do Nim nos três vértices do

triangulo de seletividade.

Nos cromatogramas ilustrados na Figura 3.32 observou-se a total

separação entre a azadirachtina A e B pela substituição da ACN por MeOH.

Todavia, a banda cromatográfica para estes isômeros, agora, passou a sofrer a

interferência de outros compostos não obtendo a seletividade necessária para a

quantificação. De modo geral, a seletividade pode ser obtida variando a composição

dos solventes de um ápice a outro do triângulo. Na Figura 3.33 mostra um esquema

sugerido por Kirkland para a otimização sistemática da separação através da mistura

em todas as proporções entre as três fases dos vértices do triangulo de seletividade

ilustrado na Figura 3.31 [187,188].

Deste modo, foi analisada a seletividade de separação para a

azadirachtina no óleo do Nim para cada ponto marcado entre os seguimentos AB,

AC e BC dos lados do triângulo na Figura 3.33. As fases móveis analisadas nestes

pontos eram obtidas, por exemplo, misturando-se 50 % de A com 50 % de B

obtendo, assim, o ponto m. Os novos pontos analisados formavam novos triângulos

entre si, obtendo-se novos seguimentos com novas fases móveis, direcionando a

procura por uma fase ideal de separação. Nestes pontos analisados, foram obtidos

solventes binários, ternários e quaternários. Sabendo que o THF é um solvente forte

e bastante prejudicial ao equipamento, a busca por uma seletividade ideal foi

direcionada mais próxima possível do seguimento AB, sendo nesta região, menor a

concentração de THF.

0 10 20 30 40 50

100

125

Área (mAbs)

Tempo (min.)

0 5 10 15 20 25 30

-50

-25

Área (mAbs)

tempo (min.)

MeOH:H

O – 45:55

ACN:H

O – 35:65

THF:H

O – 26:74

0 5 10 15 20

100

125

150

175

200

225

250

Área (mAbs)

tempo (min.)

0 10 20 30 40 50

100

125

Área (mAbs)

Tempo (min.)

0 5 10 15 20 25 30

-50

-25

Área (mAbs)

tempo (min.)

MeOH:H

O – 45:55

ACN:H

O – 35:65

THF:H

O – 26:74

0 5 10 15 20

100

125

150

175

200

225

250

Área (mAbs)

tempo (min.)

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Figura 3.33 – Pontos analisados para a seleção da fase móvel ideal de separação

cromatográfica das amostras do óleo do Nim. As fases móveis avaliadas foram

obtidas a partir da mistura de A, B e C. Coluna C18 Phenomenex® Luna(II) (150x4,6

mm, 5 µm); coluna de segurança C18 Phenomenex® ( 4x3 mm, 5 µm). Vazão 0,8

mL/min; alça de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm.

Após as análises realizadas, foi encontrada no ponto “r”, uma boa

resolução para a banda cromatográfica da azadirachtina, porém, com um tempo de

retenção muito elevado próximo à 38 minutos, onde, considerando o tempo de

limpeza e recondicionamento da coluna torna o método não muito funcional para

análises de rotina (Figura 3.34). Neste ponto, a fase móvel calculada é uma fase

quaternária composta por H

O:MeOH:ACN:THF na proporção de 60:30:6:4.

Encontrando uma fase móvel capaz de prover seletividade para a azadirachtina,

agora era preciso reduzir o tempo de análise. Na melhor fase móvel encontrada,

pode-se notar ser ela composta por 60% de fase aquosa e 40% de fase orgânica

O:MeOH:ACN:THF - 60:30:6:4), sendo que nos 40 % da fase orgânica, era

composta por 75 % de MeOH, 15% de ACN e 10% de THF (Figura 3.34).

Mantendo a proporção dos solventes orgânicos entre si, foi aumenta a

força da fase orgânica, reduzindo a porcentagem de água com o objetivo de reduzir

o tempo das análises. Nestes procedimentos testou-se as seguintes composições:

Fase aquosa (%) Fase orgânica (%)

55 45

53 47

52 48

51 49

50 50

B C

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Figura 3.34 – Eluição cromatográfica da amostra do óleo do Nim. Preparada

seguindo os procedimentos descritos para a quarta amostra da Tabela 3.27. Fase

móvel H

O:MeOH:ACN:THF - 60:30:6:4, coluna C18 Phenomenex® Luna(II)

(150x4,6 mm, 5 µm); coluna de segurança C18 Phenomenex® ( 4x3 mm, 5 µm).

Vazão 0,8 mL/min; alça de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm.

A fase formada por 51 % de água e 49 % da fase orgânica, apresentou

uma excelente resolução para a azadirachtina A e B (Figura 3.35), com um tempo de

retenção de 11,2 e 14,3 min e um fator de retenção (k) de 5,08 e 6,74

respectivamente. O fator de separação (α) e a resolução (R

) calculados entre estes

dois analitos foram 1,66 e 6,0 respectivamente. Apresentando a separação

cromatográfica seletividade para a azadirachtina e um baixo tempo de análise, esta

fase foi então escolhida para a realização das análises. Esta fase móvel, preparada

por 51% de água e 49 % de fase orgânica, é composta por H

O:MeOH:ACN:THF

nas proporções de 51,00:36,75:7,35:4,90 respectivamente (Figura 3.35).

Figura 3.35 – Eluição cromatográfica da amostra do óleo do Nim indiano. Preparada

seguindo os procedimentos descritos para a quarta amostra da Tabela 3.27. Fase

móvel H

O:MeOH:ACN:THF - 51,00:36,75:7,35:4,90, coluna C18 Phenomenex®

Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm); coluna de segurança C18 Phenomenex® ( 4x3 mm, 5

µm). Vazão 0,8 mL/min; alça de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm.

Sendo encontrada seletividade para a amostra ilustrada na Figura 3.35

preparada seguindo os procedimentos descritos para a quarta amostra da Tabela

0 8 16 24 32 40

-25

100

125

150

175

200

Área (mAbs)

tempo (min.)

0 4 8 12 16 20

mAbs

tempo/min

Azadirachtina AAzadirachtina A

Azadirachtina BAzadirachtina B

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3.26, estes parâmetros de isolamento, pré-tratamento e análise foram avaliados

quanto a sua repetibilidade. Foram preparadas duas séries de três amostras

(triplicata). Uma série de análise foi preparada com 10 mg e óleo e a segunda série

com 15 mg. Ambos os resultados foram satisfatórios obtendo coeficientes de

variação (CV%) em cada série, inferiores a 10 %. Segundo as normas de validação

de métodos analíticos da ANVISA [191,199], em matrizes vegetais são aceitos

valores de até 15 %. Com estes resultados foram concluídos os procedimentos de

preparo das amostras e eluição cromatográfica. Os procedimentos de preparo das

amostras envolvem a extração e isolamento dos analitos de interesse da matriz

(óleo) e os procedimentos de limpeza. Estes procedimentos encontram-se

exemplificados na Figura 3.36 e no item 3.3.3.3.

Figura 3.36 – Procedimentos modelo para o pré-tratamento de preparo das

amostras dos óleos do Nim.

Otimizados os procedimentos de extração, pré-tratamento e separação

iniciaram-se a construção das curvas de calibração e validação do método. Como

ocorreu no método desenvolvido para a quantificação das sementes, o método

mostrou-se seletivo tanto a azadirachtina A quanto ao isômero B. Assim, foram

construídas duas curvas de calibração, uma para cada isômero. Contudo, devido à

10 ou 15 mg

do óleo

agitador

Hexano

MeOH

200 µL

5 mL

(a)

(b) (c)

Em c repete o procedimento b

(d)

4 mL

Condicionamento Lavagem

Cartucho

Ciano

(100 mg,

1mL)

(e)

600 µL

(f)

Seca com ar

comprimido

Reconstituída

em 500 µL MeOH

Análise por

CLAE

1 mL

10 ou 15 mg

do óleo

agitador

HexanoHexano

MeOHMeOH

200 µL

5 mL

(a)

(b) (c)

Em c repete o procedimento b

(d)

4 mL

Condicionamento Lavagem

Cartucho

Ciano

(100 mg,

1mL)

(e)

600 µL

(f)

Seca com ar

comprimido

Reconstituída

em 500 µL MeOH

Análise por

CLAE

1 mL

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grande semelhança estrutural, por apresentarem comportamentos similares em

todas as etapas investigadas e, principalmente pela pequena quantidade de padrão

obtido, foi o método desenvolvido foi submetido a uma validação completa apenas

para a azadirachtina A.

Uma curva de calibração por padronização externa foi construída e

validada para a azadirachtina A e outra para a azadirachtina B com uma faixa linear

de trabalho entre 2,5 – 50 µg/mL para cada uma. Uma vez obtida as curvas

analíticas foram determinados matematicamente os coeficientes de regressão

através do método matemático conhecido por regressão linear. Esse método permite

obter uma relação linear simples entre a concentração da amostra e a resposta do

detector descrita pela equação y = ax + b (conhecida por equação de reta). Além

dos coeficientes de regressão a e b é possível calcular, a partir dos pontos

experimentais, o coeficiente de correlação r. Este parâmetro permite uma estimativa

da qualidade da curva obtida, pois quanto mais próximo de 1,0, menor a dispersão

do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de

regressão estimados. Para as curvas de calibração obtidas, foram determinada as

equações y = 5,11385.10

-5

x – 0,06881 e y=3,44062.10

-5

x + 0,210797 para o isômero

A e B respectivamente. Os coeficientes de correlação determinados foram r =

0,99985 e r=0,9982. Estas curvas encontram-se ilustradas na Figura 3.37.

Figura 3.37 – (a) Curva de calibração externa para a azadirachtina A. (b) Curva de

calibração externa para a azadirachtina B. Fase móvel: H

O:MeOH:ACN:THF -

51,00:36,75:7,35:4,90. Coluna C18 Phenomenex® Luna(II) (150x4,6 mm, 5 µm);

coluna de segurança C18 Phenomenex® ( 4x3 mm, 5 µm). Vazão 0,8 mL/min; alça

de injeção de 20 µL e detector de UV-Vis em 217 nm.

Os dados de exatidão e precisão obtidos para cada ponto em triplicata

encontram-se ilustrado na Tabela 3.29. A solução padrão utilizada para o

0 10 20 30 40 50

200

400

600

800

1000

Área (mAbs)

Concentração da azadirachtina (ug/mL)

0 10 20 30 40 50

200

400

600

800

1000

1200

Área / (mAbs)

Concentração da azadirachtina B / (µg/mL)

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desenvolvimento do método foram preparadas através da dissolução da

azadirachtina A em MeOH em uma concentração de 1000 µg/mL e, a partir desta,

foram obtidas soluções estoque nas concentrações de 50,0; 100,0; 200,0; 300,0;

400,0; 500,0 e 600,0 µg/mL utilizadas no preparo de amostras para a curva analítica.

Similarmente, foi preparada uma solução padrão e soluções estoques nas mesmas

concentrações para a azadirachtina B. Cada concentração da curva analítica foi

preparada em triplicata a partir das soluções estoque sendo, a concentração final de

cada amostra dez vezes diluídas. Também foram obtidas soluções estoques para a

azadirachtina A nas concentrações de 30,0; 250,0 e 450,0 µg/mL utilizadas para a

obtenção de amostras de controle do método. Todas as soluções foram

armazenadas a –20 ºC e mantiveram sua estabilidade por todo o período de

aplicação onde não foi observada nenhuma degradação. As curvas analíticas foram

obtidas com amostras nas seguintes concentrações de azadirachtina A e B: 2,5; 5,0;

10,0; 20,0; 30,0; 40,0 e 50,0 µg/mL. Para a obtenção das amostras, as soluções

estoque (20 µL) foram evaporadas sob fluxo de ar comprimido e submetidas aos

mesmos procedimentos de pré-tratamento que as amostras das amêndoas sendo,

no final, reconstituídas com 200 µL de MeOH.

Tabela 3.29 – Precisão (CV%) e exatidão (%) determinada para as curvas de

calibração dos padrões de azadirachtina A e B.

Azadirachtina A Azadirachtina BConcentração

(µg/mL)

CV (%) Exatidão (%) CV (%) Exatidão (%)

2,5 0,50 98,8 1,03 100,7

5,0 0,62 101,0 0,71 98,9

10,0 0,50 98,2 0,38 100,6

20,0 0,46 101,5 1,57 101,0

30,0 0,74 99,7 1,15 97,8

40,0 0,58 99,8 2,23 101,9

50,0 1,95 100,0 1,67 100,2

Após a construção das curvas de calibração, para a validação do

método foram avaliadas a precisão (intradia e interdia), a exatidão, a recuperação e

a seletividade referentes azadirachtina A. Também formam determinados os limites

de quantificação (LQ) e o limite de detecção (LD).

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Como controle de qualidade, a partir das soluções estoque de 30,0;

250,0 e 450,0 µg/mL foram escolhidas 3 concentrações de azadirachtina A: uma

baixa (3,0 µg/mL que corresponde a 120 % da primeira concentração da curva

analítica); uma concentração média (25,0 µg/mL que corresponde a 50 % da

concentração mais alta da curva analítica); e uma concentração alta (45,0 µg/mL

que corresponde a 90 % da maior concentração da curva analítica). Para a obtenção

das amostras, as respectivas soluções estoques (20 µL) foram evaporadas sob ar

comprimido e também submetidas aos mesmos procedimentos de pré-tratamento

que as amostras das amêndoas sendo, no final, reconstituídas com 200 µL de

MeOH.

A precisão intradia foi avaliada através de análises em quintuplicata

dos 3 controles de qualidade em um mesmo dia e a precisão interdia, através de

análises feitas em 3 dias não consecutivos. A exatidão foi calculada para todas as

análises não excedendo o valor de 2% (Tabela 3.30).

Tabela 3.30 – Exatidão (%) e precisão (CV%) intradia e interdia para a análise da

azadirachtina A.

Precisão (CV%) Exatidão

(%)

(intradia) (interdia) (média)

Concentração

(µg/mL)

1º dia

(n=5)

2º dia

(n=5)

3º dia

(n=5)

(n=15) (n=15)

3,0 1,07 0,94 1,06 1,02 99,8

25,0 1,66 0,36 0,35 0,79 100,2

45,0 1,03 0,42 0,47 0,64 100,9

O limite de detecção (LD) representa a menor concentração da

substância que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada. Para a

determinação do LD foi usado o método da relação sinal-ruído, onde se comparou a

altura do sinal da amostra em baixas concentrações com a altura do sinal do ruído.

Assim, foi estabelecido como sendo a concentração mínima para a detecção da

azadirachtina neste método, um sinal três vezes maior que o sinal do ruído do

equipamento, sendo este valor de 100 ng/mL.

O limite de quantificação (LQ) representa a menor concentração que a

azadirachtina pode ser medida neste método proposto. Para o LQ foram preparadas

diversas amostras em concentrações diferentes, em triplicatas, podendo assim

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determinar também a precisão e exatidão. O LQ foi baseado nos parâmetros da

curva analítica, representando um compromisso entre a concentração, a precisão e

a exatidão. O LQ estabelecido foi de 1,5 µg/mL, com uma precisão (CV %) de 1,81

% e uma exatidão de 90 %.

Os dados da análise de amostras de azadirachtina A em

concentrações desconhecidas ao analista, Teste Cego, encontram-se apresentados

na Tabela 3.31.

Tabela 3.31 – Precisão (CV%) e exatidão (%) do Teste Cego do protocolo de validação do método de análise da azadirachtina.

Concentração (µg/mL) CV% Exatidão (%)

4,0 0,29 102,1

27,5 0,28 101,6

A não existência de matrizes isentas de azadirachtina, a seletividade e

recuperação do método foram verificadas pela técnica de adição de padrão. A

seletividade do método de separação também foi avaliada através da análise de

diversas amostras utilizando detector de UV-Vis e arranjo de diodos que,

demonstrou há não existência de compostos interferentes em 217 nm, viabilizando o

método.

Numa curva de adição de padrão, quantidades conhecidas do analito

de interesse são adicionadas a uma amostra desconhecida antes de seu preparo.

Estas amostras com o padrão incorporado são utilizadas para a obtenção dos

cromatogramas. A recuperação pode ser determinada relacionando os resultados

obtidos para a amostra sem a adição de padrão com cada uma das amostras com o

padrão adicionado. A seletividade, por sua vez, pode ser determinada comparando a

curva de calibração externa com a curva de adição de padrão. Caso sejam

paralelas, pode-se dizer que não há interferência da matriz na determinação da

substância de interesse.

Assim, foi construída uma curva analítica de adição de padrão

relacionando as concentrações adicionadas do padrão com a respectivas respostas

do detector. Foi utilizada uma amostra de óleo de sementes de Barra da Bahia-BA.

A partir de uma solução padrão de 1.000 µg/mL de azadirachtina A foram

preparados soluções estoques de 30,0; 60,0; 90,0; 120;0 e 150,0 µg/mL. Em uma

série de 15 amostras de 15 mg de óleo, adicionou-se para cada três amostras 50 µL

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de cada solução estoque obtendo, assim, uma curva de adição de padrão com 5

pontos em triplicata. Estes óleos com os padrões foram secos e, em seguida,

submetidas aos procedimentos de extração e quantificação representados na Figura

3.36. As amostras foram analisadas por HPLC e construída uma Curva de Adição de

Padrão. Esta curva encontra-se ilustrada na Figura 3.38 e a exatidão entre os pontos

analisados em triplicada, descritos na Tabela 3.32.

Figura 3.38 – Curva de adição de padrão usando como matriz, óleo do Nim de Barra

da Bahia-BA. Os parâmetros cromatográficos são os mesmos descritos na Figura

3.37.

Tabela 3.32 – Precisão (%) entre os pontos da Curva de Adição de Padrão.

Concentração do Padrão

adicionado (50 µL) à

10 mg de semente

Precisão (CV %) entre as

amostras referentes a cada

concentração

3 µg/mL

1,14

6 µg/mL

2,77

9 µg/mL

0,56

12 µg/mL

1,23

15 µg/mL

2,26

Para esta curva analítica, foi determinada um coeficiente de correlação

r = 0,9968. A mesma amostra analisada pela curva de calibração externa apresentou

um teor de azadirachtina A igual a 475,5 mg/kg. Quantificada pela técnica de adição

de padrão, esta mesma amostra apresentou um teor de 467,1 mg/kg. Comparando

ambos os resultados, observou-se uma concordância superior a 98 %, ou seja, uma

recuperação de 98% nos resultados, demonstrando ser o método confiável, sem

perdas de analito durante os procedimentos de manipulação e sem a interferência

da matriz nas análises, confirmado a seletividade do método. Os resultados

encontrados foram satisfatórios demonstrando ser o método desenvolvido eficaz na

quantificação da Azadirachtina.

2 4 6 8 10 12 14 16

300

350

400

450

500

550

Área / (mAbs)

Concentração / (ug/mL)

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3.4.2.2 Quantificação de Óleos Comerciais de Azadirachta indica.

Algumas amostras de óleos nacionais e importados foram concedidas

por fornecedores nacionais que já os comercializam no agronegócio. Os

fornecedores foram:

Dalquim Ind. Química Ltda

Forn. 01

Bioneem Tec. Consult. Ind. E Com. Ltda. Forn. 02

Base Fértil Comercial Agrícola Forn. 03

Baraúna Com. Ind. Ltda. Forn. 04

As amostras de óleos foram submetidas aos procedimentos de limpeza

estabelecidos para esse método, eliminando possíveis interferentes aumentando

sua seletividade. Como as amostras não foram analisadas em datas próximas, foi

preciso construir mais de uma curva de calibração. As curvas de calibração foram

preparadas semelhantemente à curva construída e validada para o método. Todas

as amostras foram analisadas em triplicata avaliando a dispersão dos resultados,

expressando a precisão do método. Esta precisão foi demonstrada calculando o

desvio padrão e desvio padrão relativo entre os ensaios independentes da mesma

amostra. O desvio padrão relativo ou coeficiente de variação é demonstrado nas

tabelas abaixo pelo símbolo CV (%)(Tabela 3.33).

As amostras dos óleos e as concentrações das curvas de calibração

foram analisados usando uma coluna analítica C

Phenomenex®-Luna(II)

(150x4,6mm, 5 µm) com uma pré-coluna de segurança Phenomenex® (4x3mm, 5

µm) acoplada, fase móvel quaternária composta de H

O:MeOH:ACN:THF

(51,00:36,75:7,35:4,90, v/v), vazão de 0,8 mL/min e volume de injeção de 20 µL. O

equipamento usado foi cromatógrafo à líquido modular equipado com uma

controladora SCL-10Avp, auto-injetor SIL-10AF, bomba LC-10ATvp, válvula seletora

de canais de solvente FCV-10Alvp e um detector UV-Vis SPD-10Avp. O detector foi

operado selecionando o comprimento de onda de 217 nm. Os cromatogramas foram

registrados através do software CLASS-VP. Os teores de azadirachtina A

encontrados nos óleos encontram-se ilustrados na Tabela 3.33.

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Tabela 3.33 – Teores de azadirachtina A encontrados para diversas amostras de

óleos comerciais do Nim.

Amostra

Fornecedor

Procedência

Teor de Azad. A

(mg/Kg óleo)

CV (%)

(n=3)

Lote 01 Forn. 01 Importado 874,4 1,21

Lote 02 Forn. 01 Importado 1.063,81 5,13

Óleo prensado –

sementes de Barra

da Bahia–BA

Forn. 01 Nacional 475,5 1,65

Óleo preparado em

12/2004 –

sementes de Itinga-

Forn. 02 Nacional 228,5 3,30

Óleo preparado em

02/2005 –

sementes de Itinga-

Forn. 02 Nacional 167,0 2,46

Óleo do Nim com a

adição de Extrato

alcoólico das

Folhas

Forn. 02 Nacional

Teor abaixo do

limite de

quantificação

- o -

Lote 01/05 Forn. 03 Importado 1.011,7 1,14

Lote 02/05 Forn. 03 Importado 874,4 1,79

Lote 03/05 Forn. 03 Importado 912,4 2,44

Dentre uma grande quantidade de limonóides já isolados no Nim, se

destacam-se os limonóides do grupo azadirachtinas por suas inúmeras atividades

biológicas já descritas na literatura. Neste grupo, os isômeros A e B são

considerados os principais metabólitos ativos e os presentes em maiores

quantidades. Essas características estimulam o interesse comercial no teor do

isômero B nas amostras. Uma vez que os métodos desenvolvidos apresentaram

seletividade para os dois isômeros, A e B, e tendo-se os padrões, era possível a

quantificação de ambos.

Desta maneira, em algumas amostras também foram analisados os

teores da azadirachtina B apresentados na Tabela 3.34.

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Tabela 3.34 – Teores de azadirachtina A e B em amostras do óleos comerciais do

Nim.

Fornecedor

Procedência

Azad. A

(mg/Kg óleo)

CV (%)

(n=3)

Azad. B

(mg/Kg óleo)

CV (%)

(n=3)

003 Importado 912,4 2,44 845,1 2,69

003 Importado 982,0 3,47 683,7 4,12

003 Nacional 136,4 7,82 114,4 6,59

004 Nacional 461,9 10,73 313,4 5,01

A análise dos óleos vem auxiliar as empresas nas decisões de

aquisição entre um produto importado ou nacional, ou mesmo verificando se as

diferenças de preços encontradas no mercado justificam a qualidade do produto

oferecido. Atualmente, algumas empresas preferem importar o óleo do Nim da Índia

devido à certificação destes e à qualidade apresentada pelos fornecedores. Com o

método, agora é possível a indústria nacional buscar melhorias em seus produtos

atingindo os índices encontrados nos produtos importados além de fornecer um

controle de qualidade.

Nestas amostras analisadas ficou evidente a superioridade do

produto importado em relação aos teores de azadirachtina A e Bnos produtos

nacionais. Na quantificação das sementes nacionais não se observara diferenças

significativas entre os teores quantificados entre as sementes nacionais e aos teores

divulgados na literatura referentes às estrangeiras, o que, levar a acreditar, que a

diferença no teor entre os óleos nacionais e os importados foi decorrente do

processamento das sementes. Assim, se faz necessário um maior investimento pela

indústria nacional na busca e desenvolvimento de produtos com maiores valores

agregados.

Além da diferença dos teores de azadirachtina entre os óleos

nacionais e importados, foi possível observar diferenças em seus cromatogramas,

sendo que as amostras importadas demonstraram muitos menos metabólitos

interferentes, apresentando cromatogramas com menor número de bandas

cromatográficas decorrente da eluição de analitos. Esta diferença pode ser

observada na Figura 3.39.

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(A) (B)

Figura 3.39 – Cromatograma referente a análise do óleo do Nim: A) óleo nacional;

B) óleo importado. As análises foram realizadas usando uma coluna analítica C

Phenomenex®-Luna(II) (150x4,6mm, 5 µm) com a uma pré-coluna de segurança

Phenomenex® (4x3mm, 5 µm) acoplada, uma fase móvel quaternária composta de

O:MeOH:ACN:THF (51,00:36,75:7,35:4,90, v/v), numa vazão de 0,8 mL/min. e um

volume de injeção de 20 µL.

Novamente, esta diferença nos cromatogramas, indica que os óleos

importados estão sujeitos a diferentes processos de manipulação que os óleos

nacionais.

0 10 20

-25

100

125

150

Área (mAbs)

tempo (min)

0 3 6 9 12 15

mAbs

tempo/min

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Conclusões

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4. Conclusões

Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que foram atingidos

os objetivos inicialmente propostos. O estudo fitoquímico do enxerto de Azadirachta

indica sobre Melia azedarach proporcionou o isolamento e identificação estrutural de

11 substâncias sendo, 9 limonóides e 2 flavonóides. Os limonóides isolados foram:

nimbolídeo, 28-desoxonimbolídeo, salannina, 6-O-acetilnimbandiol, 6-

desacetilnimbineno, nimbolina A, 6-desacetilnimbina e as azadirachtinas A e B. Os

flavonóides isolados foram a quercetina e a quercitrina. Além destes compostos foi

isolado do pé franco o nimbandiol. Todos os compostos isolados foram descritos

anteriormente na literatura para essas espécies, portanto, nenhum metabólito

secundário novo foi encontrado. Estes resultados (exceto o nimbandiol) apresentam

os primeiros indícios de que a técnica de enxertia não tem afetado as

características metabólicas de ambas as espécies envolvidas.

Reforçam as conclusões, os trabalhos de quantificação das sementes

de plantas enxertadas comparadas com os resultados de sementes de pé francos,

ou seja, de plantas não enxertadas. Não houve diferenças significativas na

quantificação do principal metabólito da A. indica, a azadirachtina A entre plantas

enxertadas e não enxertadas de mesma idade, cultivadas na mesma região. Assim,

pode-se concluir que a enxertia pouco afetou a característica quantitativa, pelo

menos, deste metabólito. Este resultado colabora para o incentivo do cultivo do

enxerto, pois, mantendo na planta os teores de azadirachtina A, não há prejuízos na

qualidade comercial de eventuais óleos preparados pela prensa destas sementes.

Um dos objetivos da enxertia era o desenvolvimento de plantas menos

susceptíveis aos climas de regiões mais frias, aonde o desenvolvimento da planta e

principalmente a frutificação podem ser prejudicados. Quantificando a azadirachtina

B em plantas enxertadas e não enxertadas de mesma idade e cultivadas na mesma

região, observaram-se os menores teores para este isômero nas plantas enxertadas.

Sabe-se que condições climáticas mais frias favorecem a biossíntese da

azadirachtina B [182], assim, esses resultados demonstram que as espécies

enxertadas têm sido menos susceptíveis as baixas temperaturas do que, as plantas

não enxertadas. A caracterização da azadirachtina A no enxerto mostrou a presença

deste metabólito em diversos órgãos, contudo, sua presença não foi observada nas

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folhas. A quantificação da azadirachtina A em sementes armazenadas, tanto a

temperatura ambiente quanto a 12 ºC, demonstrou que ela vai se degradando com o

aumento do tempo de estocagem, perdendo seu valor comercial. Todavia, o teor do

isômero B não mostrou alterações em todo o período avaliado.

Os teores das azadirachtinas A e B, quantificados nas sementes

nacionais, se enquadram entre os valores descritos em trabalhos internacionais

semelhantes. Houve diferenças entre sementes cultivadas em regiões diferentes.

Temperatura, precipitação pluviométrica, insolação, solo, etc, são fatores que afetam

diretamente o cultivo e, conseqüentemente, o metabolismo e os teores dos

princípios ativos. Assim, para prever a qualidade de um cultivo, todos estes fatores

devem ser considerados. Os piores resultados quantificados foram em um cultivar do

Estado de Pernambuco e os melhores do Estado do Paraná.

Os teores de azadirachtina A quantificados nos óleos nacionais,

representaram aproximadamente 10 % do total disponível nas sementes. Este

resultado demonstra a clara necessidade de melhorias industriais nas técnicas de

extração. Na quantificação de óleos importados, foram encontrados teores variando

de 2 a 8 vezes maiores que aos teores encontrados nos óleos preparados de

sementes nacionais. Estes dados reforçam a tese da necessidade na melhora da

extração para a obtenção de produtos comerciais com a mesma qualidade dos

produtos importados. Sendo que, as sementes nacionais apresentam os mesmos

teores que as sementes cultivadas em outros países, os baixos teores de

azadirachtina A nos óleos nacionais, se deve sim, não a problemas de cultivo, mas,

a problemas industriais.

Todos os métodos desenvolvidos mostraram linearidade, precisão, exatidão,

seletividade e sensibilidade adequada para serem utilizados em estudos de cultivo

ou em aplicações comerciais para análises de rotina. Os métodos desenvolvidos e

validados podem ser eficientemente usados para a quantificação da azadirachtina A

e B no óleo e na semente do Nim dentro das características peculiares a cada um.

Cada método apresenta suas vantagens e desvantagens devendo o mesmo ser

escolhido de acordo com a precisão de resposta exigida. Entre os métodos também

há uma grande diferença operacional, exigindo mais ou menos equipamentos,

tempo de análise e custo, devido a um maior ou menor número de etapas envolvidas

na manipulação.

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Referências Bibliográficas

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5. Referências Bibliográficas

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Apêndices

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Apêndice A - Espécies de pragas de interesse agrícola que mostraram

sensibilidade aos extratos de Azadirachta indica [2].

Espécie Nome comum Estágio Hospedeiro Teste Produto Efeito

Ortópteros

Periplaneta americana

Barata A, N Ração Lab. PC(Ma) Rep, M, DCr

Locusta migratória

Gafanhoto A, N Capim Lab. Aza RFec, M,

DCr

Schistocerca gregaria

Gafanhoto A, N Repolho, trigo Lab. EA Rep, DCr, M

Tisanópteros (tripes)

Caliothrips sp.

Tripes N Amendoim Campo EA Rpop

Franklinilla schultzei

Tripes A, N Amendoim Lab. O Rpop, RTrVir

Thrips tabaci

Tripes N Repolho Campo PC(Ma) RAlim, RPop

Hemípteros (percevejos)

Dysdercus sp.

Percevejo-do-

algodão

A, N Algodão Lab. EA, Aza DCr, RFec,

Euschistus bifibulus

Percevejo-do-

tomate

N Tomate Campo O, EA DCr

Nezara viridula

Percevejo-verde N Tomate Lab./Campo O, EA DCr

Triatoma infestans

Barbeiro N Sangue Lab. Aza DCr

Homópteros (pulgões, cochonilhas, cigarrinhas)

Acyrtosiphon gossypii

Pulgão A, N Caupi Campo O, EA RPop

Acyrtosiphon pisum

Pulgão-da-ervilha A, N Feijão vagem Lab. EE DCr, RFec,

Aphis craccivora

Pulgão A, N Caupi Lab. O M

Aphis fabae

Pulgão N Feijão vagem Lab. EE M

Aphis gosssypii

Pulgão-do-algodão A, N Abóbora Campo EA M

Brevicoryne brassicae

Pulgão-da-couve A, N Couve, repolho Campo O, EA

Rep

RFec, RPop

Macrosiphum

euphorbiae

Pulgão A, N Alface Lab. Aza RFec, M

Metopolophium

dirhodum

Pulgão N Milho Lab. Aza M

Myzus persicae

Pulgão A Repolho Campo O, EA RPop

Ropalosiphum maidis

Pulgão A Sorgo Campo O M

Ropalosiphum padi

Pulgão A Aveia Lab. Aza Rep

Sitobium avenae

Pulgão A Aveia Campo Aza RAlim

Empoasca kerri

Cigarrinha-verde N Mamona Campo EA RPop

Bemisia tabaci

Mosca-branca A, N Abobrinha Campo O, EA Rep, RPop

Trialeurodes vaporiorum

Mosca-branca Bico-de-

papagaio

L, Cveg Pcom M

Aleurothrixus floccosus

Cochonilha A Citrus Lab. EH RPop, RFec

Diaphorina citri

Cochonilha A Citrus Lab./ Campo O Rep

Saissetia oleae

Cochonilha A Maçã Campo Aza (solo) RPop

Toxoptera citricidus Cochonilha A, N Citrus Campo EA RPop

Colépteros (besouros)

Diabrotica balteata

Vaquinha A Caupi Lab./Campo EA RFec, RtrVir,

Diabrotica v. virgifera

Vaquinha A - Lab. Aza M

Epilachna varivestris

L Feijão Lab. EEFo DCr, RFec

“ “

A Feijão Lab. Aza RFec, M

Hypothenemus hampei

Broca-do-café A Café Lab./ Campo O, O+EAE M

Coleópteros de grãos armazenados (gorgulhos e carunchos)

Acanthoscelides

obtectus

Caruncho do feijão A Feijão Lab. O, Aza Rep, RFec,

RPop, DCr

Callosobruchus

maculatus

Caruncho do caupi O., L, A Caupi Lab. O M, RFec

Oryzophagus oryzae

Gorgulho do arroz A Arroz Lab. O RFec

Rhyzopertha dominica

L,P Papel de filtro Lab. O, RAlim, RPop

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PC(Ma)

“ “

L,P Milho Lab. PF, PS M

Sitophilus oryzae

Gorgulho L,P Trigo Lab. O, EAF,

E, A

Sitophilus zeamais

Gorgulho L,P Milho Lab. PS, PF,

Tenebrio molitor

P - Lab. Aza DCr

Tribolium castaneum

A Milho Lab. PF, PT M

Tribolium confusum

A Milho Lab. O, PS Rep, M

Zabrotes subfasciatus

Caruncho do feijão A Feijão Lab. F, PF RFec

Lepidópteros (lagartas, borboletas e mariposas)

Agrotis ipsilon

Lagarta-rosca L Batata Campo EA, EAF RFec

Anticarsia gemmatalis

Lagarta-da-soja L Amendoim Campo EA RFec

Cydia pomonella

L Deita artificial Lab. Aza M

Diaphania nitidalis

Lagarta-das-

crucíferas

L Pepino Campo EA, O RFec, RPop

Diaphania saccharalis

Broca-da-cana L Dieta artificial Lab. PS, O RFec, M

Etiella sp.

L Caupi Campo EA RFec, RPop

Galleria mellonella

Traça-do-mel L Dieta artificial Lab. Aza DCr, M

Helicoverpa zea

Lagarta-do-milho L Milho Campo EA RFec, RPop

Heliothis virescens

Lagarta-do-

algodão

L Dieta artificial Lab. Aza DCr

Manduca sexta

L Tomate Campo EA, O RPop

Maruca testulalis

Lagarta de vagem L Caupi Campo EA RPop

Mocis latipes

Lagarta-dos-

capinzais

L Milho Lab./ Campo EA RPop, RFec,

Pectinophora

gossypiella

Lagarta-rosada L Dieta artificial Lab. Aza DCr

Pieris brassicae

Lagarta-da-couve L Repolho Lab. Aza RPop

Plusia sp.

Lagarta-mede-

palmo

L Soja Campo EA, O RPop

Plutella xylostella

Traça-da-couve L Repolho Campo EA, EAC DCr, RFec,

RPop

Pseudoplusia includens

L Tomate Campo EA, O RPop

Spodoptera frugiperda

Lagarta-do-

cartucho

L Dieta artificial Lab. Aza DCr, RFec,

Spodoptera littoralis

L Dieta artificial Lab. Aza DCr, Ra1,

RFec, M

Tineola bisselliella

Traça de tecido L Dieta artificial Lab. Aza RFec

Utheteisa pulchella

L Girassol Lab. EA DCr, M

Lepidópteros de grãos armazenadaos (traças)

Corcyra cephalonica

L Farinha de trigo Campo PS DCr, M

Ephestia kuechniella

L Farinha de trigo Lab. EE DCr, M

Sitotroga cerealella

O, L, A Grãos Lab. O, T RFec, RPop

Dípteros (moscas e mosquitos)

Ceratitis capitata

A Dieta artificial Lab. EE DCr, RFec

Liriomyza sativae

O, L Tomate Lab. EE M

Ophiomya phaseoli

L Feijão Campo TA+O RPop

Dípteros de importância ou veterinária

Aedes aegyptii

L, P Ração Lab. EA, Aza,

DCr, M

Anopheles subpictus

L, P Placton (arroz) Campo TP RPop

Culex pipiens

L Placton Campo EAC Rov, M

Culex quinquefasciatus

L, P Biscoito cão Lab. DCr, RFec,

Hematobia irritans

L Esterco Lab. DCr, RPop

H. irritans exigua

L Esterco - Aza RPop

Tabanus sp e outras

A Sangue - O Rep

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Piolho

Pediculus capitis

A, N Humanos PC RPop

Estágio: A = adulto; L = larva; N = ninfa; O = ovo. Produto: Aza = azadiractina; O = óleo; F = folha; PF

= folha em pó; PS = semente em pó; PT = fruto em pó; T = torta; TP = torta em pó; EA = extrato

aquoso de fruto ou de semente; EAF = extrato aquoso de folha; TA = extrato aquoso de torta; EE =

extrato etanólico; EAC = extrato enriquecido do fruto ou de semente; PC(Ma) = produto comercial

Margosan. Efeito: DCr = distúrbio de crescimento; M = mortalidade; ARS = altera razão sexual; RAlim

= reduz alimentação; RFec = reduz fecundidade; Rep = repele; RPop = reduz população; RTrVir =

reduz transmissão de vírus.

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Apêndice B – Abreviações de grupos orgânicos funcionais.

Sen

Tig

Cin

Fer

i-Bu

Metacrilila

i-Val

sec-metilbutirato

i-Ps

Sen

Tig

Cin

Fer

i-Bu

Metacrilila

i-Val

sec-metilbutirato

i-Ps

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Apêndice C – Lista de RMN

C dos metabólitos secundários isolados e

identificados do gênero Azadirachta.

Grupo Protolimonóides:

C13 13 17 C13 13 17

1 34.1 38.4 16 18.3 82.5

2 34.9 34.9 17 52.4 58.15

3 216.0 215.1 18 12.4 12.5

4 37.5 47.9 19 14.0 21.4

5 49.3 52.7 20 48.5 45.5

6 24.3 26.0 21 12.8 180.3

7 117.8 118.75 22 83.7 29.85

8 146.6 143.6 23 72.9 26.1

9 46.5 48.0 24 77.4 123.5

10 35.0 35.1 25 80.8 132.7

11 27.7 24.3 26 27.6 17.75

12 33.8 29.25 27 28.4 25.75

13 43.5 39.7 28 21.8 24.3

14 51.2 55.3 29 24.5 21.5

15 38.5 35.8 30 21.3 32.15

Solvente CDCl

CDCl

MHz 75.0

Grupo Apo-protolimonóides:

C13 18 20 22 27 28 31 36

1 75.3 157.9 203.1 158.1 75.1 158.09 157.0

2 29.3 125.8 126.0 125.5 29.1 125.57 124.0

3 76.2 203.5 147.6 204.6 76.0 204.00 205.0

4 38.0 44.0 40.0 44.1 37.9 44.19 40.0

5 37.6 52.4 49.2 46.2 37.4 46.23 50.3

6 24.1 76.7 68.0 23.8 24.1 23.82 67.3

7 77.5 75.6 79.0 74.6 77.2 74.53 79.0

8 43.5 44.7 45.4 42.8 43.3 42.75 46.0

9 36.9 47.7 42.1 38.5 36.7 37.48 37.3

10 41.6 41.0 47.9 39.8 41.4 39.91 34.5

11 17.4 17.8 33.4 16.7 17.2 16.48 16.0

12 36.1 31.6 208.1 33.9 36.2 33.56 32.0

13 47.8 46.5 59.5 45.8 47.7 46.78 46.0

14 161.2 157.7 192.2 158.7 161.0 158.81 158.0

15 120.5 118.2 126.0 119.2 120.1 119.09 119.0

16 35.7 38.5a 206.0 34.5 34.2 35.34 33.8

17 57.3 55.6 57.8 57.6 58.5 58.98 51.0

18 20.8 12.8 25.0 21.3 20.5 58.28 21.8

19 16.6 21.6 18.9 20.0 16.6 21.16 21.8

20 40.6 145.6 142.9 29.8 30.9 38.39 123.0

21 65.2 24.5 65.4 66.2 72.23 142.0

22 71.1 129.6 131.3 34.9 34.8 35.34 29.5

23 38.0 34.9a 197.1 67.5 69.0 97.81 67.0

24 78.7 24.41 23.0 95.9 96.4

25 74.7 173.5 76.3 77.3

26 26.4 23.1 25.3

27 24.1 24.4 23.5

28 28.6 26.4 24.9 21.3 28.6 21.34 27.0

29 22.6 24.5 21.0 27.1 22.6 22.09 24.0

30 27.5 26.4 26.0 27.4 27.6 27.39 20.0

OAc C1 172.3 172.9 169.2 170.0 172.4' 170.13 172.0

172.4 21.6 20.1 172.2'

OAc C2 21.6 21.2 21.3'' 20.14 21.0

21.7''

12-OCH3 21.3

6-OCH3 53.1

MHz 100 75 125 100 100 100/125 125

Solvente CD

OD CDCl

CDCl

OD CDCl

CDCl

C13 39 44 46 48 49 50 51 52

1 71.2 71.2 156.8 157.1 158.1 158.1 157.1 158.1

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2 27.5 27.6 126.0 126.0 125.5 125.2 126.3 125.1

3 71.8 71.8 204.1 200.0 204.0 203.8 205.6 203.8

4 42.3 42.3 46.0 34.0 45.3 45.3 43.4 45.3

5 39.8 39.8 44.8 50.6 46.2 46.6 36.8 46.6

6 74.1 74.0 24.8 68.3 23.8 23.9 68.3 23.9

7 73.0 72.8 72.0 79.0 71.6 72.0 79.1 72.0

8 45.7 45.5 44.6 46.5 42.7 42.8 47.5 42.8

9 33.4 33.2 35.0 33.7 38.6 38.6 33.9 38.6

10 39.7 39.3 38.5 37.7 40.0 41.1 40.6 41.1

11 15.6 15.2 15.6 16.3 16.3 16.3 32.6 16.3

12 34.4 34.0 29.7 32.7 33.9 34.0 16.4 34.0

13 46.7 46.7 47.5 47.4 48.9 46.9 45.5 46.9

14 160.5 160.0 161.5 158.6 156.9 157.6 158.6 157.6

15 120.6 120.0 120.1 118.0 119.9 119.6 119.0 119.9

16 34.8 34.7 34.0 33.9 34.6/34.7 34.9 34.0 34.9/35.0

17 54.4 58.1 52.6 50.1 51.9/52.0 54.4 50.0 54.4/53.1

18 19.9 20.1 20.0 20.7 19.9 20.0 21.0 20.0

19 15.4 15.4 19.1 20.9 19.0 19.0 21.0 19.0

20 39.3 37.5 158.2 137.0 130.8/128.8 158.7 138.3 158.7/161.6

21 64.2 72.4 104.6 171.1 169.5/169.1 169.7 172.0 97.4/97.6

22 33.4 33.8 119.6 142.0 145.6/145.8 119.2 144.3 119.2/119.1

23 60.8 176.0 109.2 102.2 97.4/96.0 97.4 102.5 169.7/169.4

28 77.8 77.9 27.0 21.2 21.2 21.3 27.3 27.0

29 19.6 19.6 21.2 19.3 27.1 27.1 31.9 21.3

30 26.3 26.3 26.3 27.3 29.7 29.7 20.3 26.6

OAc C1 170.5 171.0 189.4 171.9 170.0 170.0 169.4

21.0 189.2 21.2 21.1 20.9

OAc C2 21.0 22.4 21.5

21.2

12-OCH3 55.9

23-OCH3 57.0 57.5

Grupos Sen Sen Sen

1'-165.7 1'-166.0 1' 171.0

2'-116.0 2'-116.0 2' 113.0

3'-157.5 3'-157.4 3' 158.8

4'-27.5 4'-27.4 4' 21.1

5'-20.5 5'-20.4 5' 27.1

MHz 75 75 75 125 100 100 125 100

Solvente CDCl

CDCl

C13 54 57 62 64 C13 54 57 62 64

1 205.0 156.7 156.2 157.0 17 57.0 59.5 57.0 54.8

2 126.5 126.0 125.9 126.1 18 20.3 26.2 28.5 21.1a

3 148.5 203.6 204.5 203.5 19 21.9 19.0 18.3 18.0

4 40.0 44.1 44.5 44.4 20 142.5 128.7 140.0

5 49.5 46.3 46.2 45.4 21 97.5 174.6 22.4

6 69.5 23.5 65.0 23.6 22 126.0 150.1 125.0

7 79.6 74.1 78.5 73.6 23 96.0 71.1 190.8

8 44.7 44.9 43.2 42.0 28 26.3 27.0 27.0 22.7

9 47.3 38.1 37.9 38.0 29 22.8 21.3 21.5 27.0b

10 48.5 40.0 39.5 40.1 30 31.6 26.6 25.9 27.3b

11 73.5 15.9 16.5 17.4 OAc C1 172.0 169.4 169.5 170.0

12 71.0 30.6 33.0 29.7 OAc C2 115.0 20.9 21.6 21.6a

13 51.0 47.9 45.2 45.5 158.0

14 189.0 193.2 193.5 158.8 21.5

15 125.3 123.5 123.0 118.6 11-OCH3 25.2

16 207.0 203.8 208.0 34.0 12-OCH3 52.4

Solvente CDCl

CDCl

MHz 75.0 75 125 75

Grupo Azadirona:

C13 66 68 69 73 78 79 81 86

1 158.2 157.3 157.40 38.1 70.2 157.5 62.9 157.60

2 125.5 126.1 126.14 32.6 36.6 125.7 56.5 126.26

3 204.6 205.9 205.96 217.7 74.1 204.7 211.3 205.84

4 44.2 40.5 40.51 46.3 39.8 44.1 44.1 40.28

5 46.2 49.8 49.88 47.7 29.1 44.4 39.9 50.41

6 23.85 76.0 68.08 72.2 26.6 25.5 25.1 68.73

7 74.6 68.5 79.08 73.3 71.2 71.7 73.8 77.74

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8 42.9 45.4 45.43 44.5 43.2 46.8 47.0 42.92

9 38.8 37.1 37.13 39.7 49.4 36.9 44.4 39.04

10 40.0 43.1 43.11 38.1 43.3 40.2 41.4 41.87

11 16.6 16.3 16.39 16.0 208.8 15.6 16.2 16.47

12 33.1 33.6 32.72 32.3 79.0 22.2 38.8 29.31

13 47.2 47.0 47.08 47.1 50.8 50.4 44.42 45.68

14 159.0 158.6 158.53 160.1 159.3 195.4 193.0 73.03

15 119.2 119.0 119.55 120.4 123.0 120.2 120.0 57.39

16 34.5 34.3 34.30 34.3 36.3 206.2 206.2 32.13

17 51.7 51.6 51.62 51.5 50.1 80.7 80.5 39.41

18 20.7 20.7 20.4 19.9 30.2 23.4

19 19.1 14.0 16.3 66.2 19.1 21.3

20 124.6 124.5 124.37 124.2 123.8 122.5 125.7 123.63

21 139.7 142.5 142.57 139.6 142.0 141.4 142.7 142.96

22 111.1 110.9 110.94 110.9 111.3 109.5 109.5 110.92

23 142.6 139.6 139.64 142.5 140.5 142.8 141.3 139.56

25 C-Me C-Me

26 31.87 21.86

27 27.08 21.65

28 21.3 27.0 20.84 31.1 16.2 21.4 21.2 19.31

29 27.1 19.6 20.79 19.4 95.4 27.1 27.3 31.90

30 27.4 20.2 20.23 25.4 18.6 25.5 24.9 19.97

OAc C1 170.1 171.9 172.02 170.2 170.1 169.8 171.74

21.6 170.6

170.9

OAc C2 21.2 21.2 21.16 20.8 21.0 21.40

21.3

22.7

MHz 75 125 75 25.15 125.0 125 50

Solvente CDCl

CDCl

Grupo Gedunina:

C13 94 97 C13 94 97 C13 94 97

1 157.1 62.6 11 18.2 15.3 21 143.1 142.7

2 125.2 56.4 12 35.6 38.8 22 110.0 110.1

3 204.7 211.4 13 44.1 44.6 23 141.8 141.7

4 44.1 44.1 14 173.2 170.7 28 21.5 20.8

5 40.8 39.3 15 111.2 110.9 29 27.2 26.9

6 25.3 24.1 16 164.4 164.9 30 23.2 23.2

7 70.6 73.2 17 104.7 104.7 OAc C1 170.1

8 46.5 44.0 18 23.5 23.8 OAc C2 20.8

9 46.5 44.2 19 19.1 20.3 MHz 125 125

10 42.3 42.1 20 126.0 125.0 Solvente CDCl

CDCl

Grupo Vilasinina:

C13 104 107 111 112 118

1 71.9 72.4 71.5 72.80 72.0

2 27.4 27.6 27.4 27.22 29.6

3 73.9 71.6 73.9 72.00 71.0

4 42.4 42.1 43.4 42.40 44.2

5 39.6 41.4 39.6 40.40 39.4

6 72.4 72.7 72.4 72.60 72.3

7 71.7 74.3 71.7 72.80 84.0

8 45.4 44.5 45.4 44.30 44.2

9 34.3 35.2 34.3 36.80 39.0

10 39.5 39.1 39.5 40.20 40.6

11 24.2 15.3 24.2 30.00 17.3

12 77.2 32.9 71.2 78.00 30.5

13 51.4 47.3 51.4 51.80 49.4

14 157.4 157.3 157.4 155.75 173.0

15 122.7 120.7 122.7 122.80 115.0

16 36.6 34.2 36.6 36.26 164.0

17 50.3 51.5 50.3 50.60 88.9

18 26.9 21.5 26.9 19.00 19.7

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19 15.2 15.3 15.2 24.40 15.2

20 124.5 124.5 124.5 125.00 129.8

21 140.3 139.7 140.3 140.30 138.8

22 111.7 11.0 111.7 112.00 111.0

23 142.1 142.5 142.1 142.00 143.0

28 78.0 77.9 78.0 78.00 77.8

29 19.7 19.2 19.7 15.60 20.4

30 15.3 26.3 15.3 15.80 30.8

OAc C1 170.2 169.6 170.2 169.00

170.9 169.8 170.9 171.00

OAc C2 20.9 20.7 20.9 21.00

21.3 21.3 21.3 21.40

Grupos Trimethyl

Tig Cin Tig acrylate

166.5 1'-165.3 166.5 166.80 1' - 172.0

128.7 2'-119.0 128.7 124.00 2' - 146.6

138.0 3'-143.7 138.0 137.00 3' - 158.0

14.4 4'-134.5 14.2 14.75 4' - 27.7

11.9 5',9'-127.6 11.9 12.40 5' - 20.9

6',8'-130.0 6' - 13.5

7'-130.3

MHz 100 100 100/125 125

Solvente CDCl

CDCl

Grupo Nimbina:

C13 119 120 127 129 131

1 202.19 202.4 202.4 202.0 202.0

2 126.49 126.5 126.2 126.3 127.2

3 148.13 148.20 148.1 148.4 148.0

4 46.8 47.80 39.1 39.1 38.7

5 43.7 43.60 48.9 50.0 50.3

6 66.2 66.25 65.9 66.1 65.1

7 87.0 87.02 86.4' 87.6' 89.1

8 48.0 47.30 47.9'' 47.9'' 47.9

9 39.1 38.93 39.8 39.8 38.7

10 47.2 47.40 47.5' 47.5'' 48.5

11 34.4 34.30 34.6 34.1 32.9

12 173.67 173.85 175.4 175.4 172.3

13 135.10 135.00 131.1 131.1 143.5

14 146.91 147.01 145.0 145.0 192.0

15 87.5 87.45 87.8' 88.0' 85.0

16 41.40 41.40 39.8 39.8 42.1

17 49.7 49.59 52.1 52.2 207.0

18 12.89 12.70 13.1 13.0 16.0

19 16.70 16.30 17.1''' 17.1''' 19.5

20 126.84 126.95 137.0/137.2 162.0/162.1

21 139.07 139.18 169.9/171.0 96.9/97.1

22 110.50 110.50 142.0/142.3 120.8/120.9

23 143.00 143.20 96.9/97.0 171.0/171.2

28 175.56 175.75 172.0 172.0 172.0

29 17.2 16.30 20.5 20.6 21.2

30 16.40 17.0 16.1''' 16.1''' 16.0

OAc C1 170.67

OAc C2 17.57

12-OCH3 52.9 52.90 53.0 52.9 52.2a

28-OCH3 53.1 53.1 53.2a

29-OCH3 51.5 51.60

MHz 75 75 125

Solvente CDCl

CDCl

Grupo Nimbolídeo:

C13 132 133 134 135 136

1 202.4 200.8 210.5 152.2 152.3

2 126.5 131.0 34.4 130.0 130.2

3 148.20 149.6 33.2 202.4 202.7

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4 47.80 43.6 40.8 39.0 38.9

5 43.60 47.7 49.3 41.3 41.5a

6 66.25 73.4 72.8 72.4 72.4

7 87.02 82.9 82.7 87.4 87.2

8 47.30 50.3 50.0 46.3 46.0

9 38.93 41.1 40.8 40.0a 40.0a

10 47.40 45.2 49.6 42.1 42.2

11 34.30 32.1 32.9 32.1 32.5

12 173.85 172.9 172.9 174.9 175.0

13 135.00 134.5 136.0 133.2 133.2

14 147.01 144.8 144.9 147.5 148.7

15 87.45 88.4 88.3 85.4/85.7 85.5/85.7

16 41.40 41.2 41.2 40.0/40.1 39.8/40.0

17 49.59 49.5 49.5 48.9/50.0 48.7/48.9

18 12.70 12.9 12.9 14.5b 14.4b

19 16.30 15.1 15.1 16.8 17.1

20 126.95 126.5 126.5 137.8/138.0 164.5/164.9

21 139.18 138.8 138.9 171.4/171.5 97.5/97.7

22 110.50 110.3 110.4 142.4/142.6 119.7/119.9

23 143.20 143.1 143.0 96.9/97.1 170.0/170.5

28 175.75 174.9 177.7 79.4 79.4

29 16.30 18.5 15.8 20.5 20.5

30 17.0 17.2 17.1 13.2b 13.0b

12-OCH3 52.90 51.7 51.7 52.4 51.8

29-OCH3 51.60

MHz 100 90.8 75 75

Solvente CDCl

CDCl

Grupo Salannina:

C13 137 142 143 148 C13 137 142 143 148

1 71.3 73.4 70.6 37.6 22 110.6 110.8 110.2 145.3

2 27.6 30.7 25.9 28.5 23 142.9 143.0 143.0 77.0

3 71.3 72.7 29.3 72.3 24 79.8

4 42.7 44.4 39.5 42.5 25 23.0

5 39.9 39.7 43.4 40.3 26 24.1

6 72.6 71.1 72.8 71.3 27

7 85.6 86.3 86.1 86.1 28 77.6 78.1 83.5 78.0

8 49.0 49.2 49.3 47.0 29 19.6 20.0 15.3 19.5

9 39.4 39.1 39.5 39.5 30 16.9 13.2 18.8 20.9

10 40.6 41.2 41.3 41.8 OAc C1 170.4

11 30.7 30.8 30.7 34.4 OAc C2 20.8

12 172.8 172.8 176.3 173.9 12-OCH3 51.5 51.6 52.3 52.0

13 134.9 134.6 134.3 135.3 Grupos Tig Cin Sen

14 146.5 146.7 146.9 145.8 166.8 1'-165.7 1'-171.0

15 87.9 88.2 87.7 87.1 129.0 2'-118.3 2'-113.0

16 41.4 41.3 41.5 39.7 137.2 3'-145.6 3'-158.8

17 49.4 49.7 49.4 50.1 14.4 4'-135.1 4'-27.1

18 13.0 15.4 12.8 14.0 11.9 5'-128.4 5'-21.0

19 15.1 17.0 17.1 17.5 6'-129.2

20 127.1 127.3 127.0 137.0 7'-130.7

21 138.7 138.9 138.5 170.1

Solvente CDCl

CDCl

MHz 100 100 90.8 125

Grupo Nimbineno:

C13 152 154 156 C13 152 154 156

1 213.3 201.8 143.0 16 41.3 41.3 41.35

2 39.9 124.5 102.5 17 49.5 49.5 49.56

3 119.1 151.1 119.92 18 12.9 12.8 10.88

4 138.6 70.1 138.06 19 14.0 15.9 22.13

5 47.2 48.1 47.42 20 126.8 126.7 126.84

6 66.4 70.8 67.07 21 138.9 139.0 138.46

7 87.9 84.6 86.29 22 110.4 110.3 109.80

8 47.3 48.3 48.52 23 143.1 143.1 143.51

9 37.1 38.6 38.12 28 21.8

10 49.4 48.1 39.72 29 23.8 13.01

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11 33.6 34.1 29.57 30 17.4 17.1 16.30

12 173.7 173.4 175.49 OAc C1 169.7

13 134.9 135.5 137.65 OAc C2 21.7

14 147.2 145.7 146.32 12-OCH3 51.7 51.7

15 86.4 87.3 89.27

Solvente CDCl

CDCl

MHz 100 100

Grupo Nimbolinina:

C13 160 C13 160 C13 160

1 71.7 13 138.4 29 19.2

2 27.6 14 147.9 30 20.1

3 71.8 15 83.9 OAc C1 169.1

4 42.4 16 37.7 169.6

5 40.6 17 47.0 OAc C2 20.1

6 71.8 18 16.0 21.0

7 75.6 19 15.4 Grupos Tig

8 45.1 20 126.5 166.0

9 37.0 21 139.2 128.6

10 40.1 22 110.0 137.2

11 32.5 23 143.4 14.5

12 171.2 28 78.0 12.1

Grupo Azadirachtina:

C13 164 165 167 174 175 177 178 181

1 70.5 69.60 71.20 74.3 70.39 70.52 71.23 67.5

2 29.7 32.19 29.98 28.6 29.74 29.91 30.64 31.9

3 66.9 67.92 67.72 68.8 66.94 68.23 67.12 69.2

4 52.5 52.19 52.94 49.1 52.43 51.34 52.47 43.9

5 37.0 35.62 37.55 35.1 37.19 34.22 36.90 35.0

6 73.7 74.32 74.27 75.0 73.82 72.56 74.03 76.0

7 74.7 75.18 76.75 74.0 74.19 72.92 72.99 73.5

8 45.3 45.18 45.18 45.2 45.07 47.91 43.26 51.1

9 44.6 44.71 45.85 48.9 44.69 47.56 47.10 43.6

10 50.0 49.23 50.0 49.1 50.05 51.33 47.40 53.2

11 104.1 104.83 104.54 101.7 104.23 109.12 99.64 79.3

12 171.8 173.46 172.25 171.68 172.73 - 173.3a

13 68.5 69.00 69.45 69.4 68.38 92.36 66.51 66.4

14 69.9 71.99 70.64 71.2 69.34 94.92 69.36 69.4

15 76.4 76.55 74.74 76.5 77.05 76.83 76.18 74.2

16 24.9 25.16 25.63 27.0 24.47 25.33 25.14 24.9

17 48.6 52.76 49.02 49.3 49.95 48.57 48.28 48.8

18 18.3 18.41 18.71 19.7 18.39 18.48 18.93 18.1

19 69.1 70.36 69.36 71.7 69.09 69.34 71.12 21.2

20 83.1 83.74 83.76 83.2 80.96 86.36 83.57 83.5

21 108.8 109.33 109.03 109.1 106.87 109.12 108.76 109.0

22 107.3 107.81 107.99 109.5 48.10 107.71 107.53 107.4

23 147.1 146.84 147.17 146.7 105.75 145.95 147.15 146.6

28 73.0 73.2 72.1 70.52 73.2

29 173.3 173.82 173.91 61.2 173.25 175.66 173.26 173.9a

30 21.3 21.22 21.59 21.5 21.26 20.95 20.54 71.3

OAc C1 169.6 170.2 169.57 166.19 169.71

170.00

OAc C2 20.9 20.8 20.86 20.92 20.54

20.96

12-OCH3 53.3 53.45 53.25 52.22 53.23 52.5b

29-OCH3 52.7 53.18 52.76 52.77 52.64 52.72 52.9b

23-OMe 55.79

Grupos Tig Tig Cin Tig Tig Tig Tig

166.2 167.06 166.15 166.7 166.15 163.26 165.87 1'-166.9

128.6 128.73 117.63 129.4 128.67 127.71 128.77 2'-128.3

137.8 138.75 146.02 137.7 137.41 139.58 137.44 3'-138.7

14.3 14.57 130.97 14.2 14.29 14.72 14.27 4'-14.5

11.9 12.05 129.30 12.1 11.94 12.15 11.96 5'-11.9

128.41

134.50

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Tig

166.15

128.83

138.29

14.50

12.11

MHz 100 100/125 62,89 100 62.89 150 62,89 100

Solvente CDCl

CDCl

Grupo Azadirachtol:

C13 183 186 188 C13 183 186 188

1 69.2 70.7 70.26 19 71.2 73.0 69.50

2 31.9 30.8 30.20 20 83.5 83.6 83.60

3 67.5 67.0 66.99 21 108.98 108.7 108.68

4 53.2 52.4 52.50 22 107.4 107.3 107.52

5 35.0 36.7 36.97 23 146.6 146.9 147.14

6 74.2 73.6 76.49 28 73.1 73.2

7 73.6 74.5 73.73 29 173.4 172.3 173.31

8 43.9 48.5 44.39 30 21.3 21.1 21.03

9 43.6 44.3 44.97 OAc C1 169.5 169.72

10 51.1 52.7 49.26 OAc C2 20.9 20.91

11 79.3 79.4 79.19 12-OCH3 52.5 53.1 52.72

12 174.0 173.1 172.58 29-OCH3 52.9 52.6 52.72

13 66.5 66.9 66.79 Grupos Tig Tig

14 69.3 70.0 69.50 166.93 166.14

15 76.0 76.1 76.17 128.31 128.65

16 24.9 25.2 25.22 138.7 137.52

17 48.8 49.0 48.39 14.5 14.33

18 18.1 18.0 16.10 11.9 11.97

Solvente CDCl

CDCl

MHz 100 75 62,89

Grupo Meliacarpina e Grupo Meliacarpinina e Azadirachtinina:

C13 190 194 197 198 200

1 70.90 70.9 69.96 70.26 69.4

2 27.99 28..0 30.19 30.15 32.8

3 70.32 70.3 67.92 66.97 68.3

4 42.44 42.4 52.19 52.87 53.3

5 35.47 35.5 65.52 36.34 34.3

6 72.81 72.7 73.32 71.93 72.5

7 74.87 74.9 81.90 82.70 80.9

8 45.08 45.0 50.90 51.46 48.7

9 44.71 44.7 47.71 47.92 47.5

10 49.96 49.9 49.23 49.78 51.4

11 103.99 104.0 104.83 107.25 77.5

12 171.76 171.7 172.46 170.14 175.5

13 68.50 69.0 94.00 95.10 92.3

14 69.90 70.0 92.90 93.26 95.0

15 76.38 76.3 81.55 81.42 80.3

16 24.97 25.0 30.16 29.63 28.4

17 48.98 48.9 50.76 50.81 53.3

18 18.42 18.3 27.41 26.67 25.4

19 69.97 70.0 70.36 70.44 70.6

20 83.62 83.6 85.74 86.44 83.0

21 108.72 108.8 109.33 109.41 106.7

22 107.33 107.3 108.81 108.24 49.4

23 146.82 146.9 146.84 96.4

28 76.88 76.7 73.2 73.0

29 18.95 19.0 173.82 173.34 172.7

30 21.14 21.1 18.00 17.63 15.5

OAc C1 170.09 170.0 169.90 169.72

OAc C2 20.88 20.9 21.07

11-OCH3 52.49

12-OCH3 53.20 53.2 53.45 52.87 53.3

29-OCH3 53.18 53.70 52.5

Grupos Tig Tig Tig Tig Tig

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166.34 166.3 166.06 166.84 166.1

128.56 128.6 128.70 128.84 127.8

137.59 137.4 138.17 138.18 139.4

14.34 14.3 14.17 14.18 14.6

11.96 11.9 12.06 12.16 12.1

MHz 100 100 100/125 62,89 100

Solvente CDCl

CDCl

Apêndice D – Lista de RMN

C dos metabólitos secundários isolados e

identificados do gênero Melia.

Grupo Cicloartenol:

C13 6 7 8 C13 6 7 8

1 36.7 31.9 38.7 15 39.0 39.0 38.7

2 31.4 29.0 78.4 16 222.9 223.0 71.8

3 71.2 66.4 68.4 17 66.1 66.1 64.2

4 38.1 35.8 34.9 18 13.6 13.6 14.4

5 44.8 39.1 38.9 19 12.3 11.2 12.6

6 28.4 28.3 28.2 20 69.3 69.3 66.5

7 32.15 32.1 32.5 21 21.6 21.65 24.7

8 34.2 34.2 34.75 Grupos Hexose

9 54.2 54.15 55.0 C1'-104.0

10 35.7 36.25 37.2 C2'-75.3

11 20.65 20.2 21.1 C3'-79.3

12 38.8 38.8 40.8 C4'-71.8

13 41.9 41.9 43.3 C5'-78.55

14 50.8 50.8 54.3 C6'-62.8

Solvente CDCl

CDCl

Piridina MHz 100 100 100

Grupo Protolimonóides:

C13 15 16 17 18 19

1 38.5 38.5 38.5 38.5 38.5

2 65.1 34.9 34.9 34.9 34.9

3 216.8 216.7 216.7 216.7 216.8

4 47.9 47.9 47.9 47.9 47.9

5 52.4 52.4 52.4 52.4 52.4

6 24.4 24.4 24.4 24.4 24.4

7 118.2 118.6 118.7 118.6 118.1

8 145.0 114.6 144.5 144.6 145.2

9 47.9 47.9 47.9 47.9 47.9

10 34.9 35.1 35.1 35.1 35.6

11 18.2 18.0 18.0 18.0 18.2

12 33.2 33.1 33.0 33.0 33.2

13 45.4 45.5 45.5 45.5 45.4

14 49.9 49.9 49.9 49.8 49.9

15 45.7 44.5 44.6 44.7 45.7

16 77.9 76.4 77.2 77.1 78.1

17 62.1 58.2 57.9 58.9 62.6

18 23.6 23.7 23.6 23.5 23.5

19 12.8 12.8 12.8 12.8 12.8

20 34.3 47.9 48.1 47.5 34.2

21 18.7 176.8 177.0 177.5 18.6

22 38.0 34.0 34.2 27.3 30.9

23 125.4 123.0 127.7 32.2 32.0

24 139.7 140.8 136.4 75.8 76.4

25 70.7 70.6 81.8 147.1 147.6

26 29.9 29.8 24.4 111.6 11.3

27 30.0 29.9 24.2 17.3 17.4

28 24.5 24.5 24.5 24.5 24.5

29 21.6 21.6 21.6 21.6 21.6

30 27.9 27.8 27.8 27.9 27.8

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21-OCH3 51.6 51.8 51.8

MHz 125 125 125 125 125

Solvente CDCl

CDCl

C13 20 21 22 24 25

1 38.4 40.0 36.9 38.6 37.4

2 34.9 34.6 27.4 34.9 33.9

3 215.1 215.8 78.9 216.3 214.0

4 47.9 48.2 38.9 48.1 47.15

5 52.7 56.8 50.6 52.6 65.8

6 26.0 67.05 23.9 24.6 197.6

7 118.75 122.1 119.2 119.4 124.7

8 143.6 146.15 142.7 143.2 167.3

9 48.0 48.85 48.4 48.2 49.3

10 35.1 36.2 35.2 35.5 43.8

11 24.3 16.85 29.1 30.3 16.7

12 29.25 29.3 72.0 72.2 29.0

13 39.7 39.45 44.3 55.2 39.4

14 55.3 55.2 54.8 44.9 56.1

15 35.8 35.5 36.1 36.5 35.0

16 82.5 82.2 82.2 82.3 81.4

17 58.15 58.6 53.2 53.5 57.7

18 12.5 21.4 12.85 20.1 21.4

19 21.4 15.1 19.75 12.8 13.6

20 45.5 45.4 45.5 45.7 45.3

21 180.3 180.4 180.9 180.6 180.0

22 29.85 29.5 30.0 29.3 29.2

23 26.1 26.1 25.9 26.2 26.0

24 123.5 123.4 123.6 123.8 123.2

25 132.7 132.8 132.6 133.0 132.9

26 17.75 17.9 17.85 26.0 17.9

27 25.75 25.7 25.7 18.1 25.7

28 24.3 23.9 27.3 21.6 25.3

29 21.5 24.7 14.6 24.6 21.6

30 32.15 31.4 33.6 34.0 29.7

MHz 100 50 75.4 100

Solvente CDCl

CDCl

C13 27 28 29 34 35

1 37.3 36.8 38.5 38.5 38.5

2 27.7 23.8 35.1a 34.9 34.9

3 79.2 80.8/80.7 216.8/216.7 216.7 216.7

4 39.0 37.9 47.9 47.9 47.9

5 50.85 50.9/50.8a 52.5/52.4 52.4 52.4

6 23.3 23.2 23.2 24.3 24.4

7 118.3 118.1/118.0 118.2/118.1 118.8 118.7

8 145.7 145.7/145.5 145.8/145.6 144.6 144.5

9 49.7 49.7/48.7 49.7/48.4 48.1 48.1

10 35.1 35.0 34.9 35.0 35.1

11 17.6 17.6 17.8 18.3 18.2

12 35.2 35.2 35.2a 33.8 33.5

13 43.9 43.8/43.6 43.8/43.6 46.2 45.9

14 50.8 50.8/50.5a 50.8/50.5 49.4 49.9

15 34.3 34.3 34.3 44.1 43.9

16 27.4 27.5/27.1 27.5/27.3 77.6 77.6

17 47.2 47.1/45.2 47.1/45.2 58.8 58.2

18 13.15 13.12 12.7 23.0 23.2

19 24.1 24.2 24.6 12.8 12.8

20 33.9 33.8/32.0 33.8/33.7 44.4 41.9

21 101.8 101.8/97.8 101.8/97.8 176.3 178.1

22 31.6 31.54/31.46 31.5/31.3 25.3 22.9

23 78.5 78.5/77.1 78.4/77.0 27.4 26.1

24 67.85 67.8/65.4 67.8/65.4 83.8 80.0

25 58.0 58.0/57.2 58.0/57.2 142.7 141.6

26 19.5 25.0/24.9b 25.0/24.9 113.0 113.6

27 25.05 19.4/19.2b 19.5/19.2 18.0 18.1

28 27.55 27.6 24.4 24.5 24.5

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29 14.8 15.9 21.6 21.6 21.6

30 22.6 22.7 22.6 28.0 27.4

OAc C1 173.7

OAc C2

MHz 100 100 125 125

Solvente CDCl

CDCl

Grupo Apo-protolimonóides:

C13 37 39 40 41 42

1 72.7 72.6 72.7 72.6 72.6

2 25.5 25.6 25.4 25.5 25.5

3 77.1 77.1 77.1 77.25 77.1

4 36.6 36.6 36.5 36.6 36.6

5 37.5 37.5 37.4 37.4 37.4

6 22.8 22.9 22.8 22.8 22.8

7 75.3 75.75 75.5 75.5 75.5

8 42.1 42.2 42.0 42.2 42.15

9 35.15 35.6 35.3 35.4 35.4

10 40.3 40.35 40.2 40.3 40.3

11 16.0 16.3 16.0 16.1 16.1

12 35.05 35.3 34.7 35.4 35.4

13 46.3 46.4 46.4 46.5 46.4

14 159.1 159.2 158.9 159.1 159.1

15 119.0 119.7 119.3 119.3 119.2

16 33.6 34.9 33.8 34.7 34.8

17 56.6 52.3 56.9 55.1 56.7

18 16.2 20.6 20.0 20.1 20.0

19 20.3 16.1 16.1 16.2 16.2

20 46.7 35.9 29.2 38.1 40.1

21 96.7 70.0 65.4 65.0 65.2

22 29.95 36.4 32.7 34.3 33.7

23 78.6 64.4 67.5 43.1 43.0

24 73.6 86.5 95.7 100.8 99.6

25 74.9 74.3 76.3 75.5 75.6

26 26.95 24.1 23.2 25.0 24.8

27 26.8 28.7 24.1 25.4 25.2

28 28.1 28.1 28.0 28.1 28.1

29 21.6 21.5 21.4 21.5 21.5

30 26.7 26.8 26.9 26.8 26.8

OAc C1 169.7 169.7 169.7 169.7 169.7

170.05 169.95 170.1 170.0 170.0

OAc C2 21.1 21.1 20.9 20.0 21.0

21.1 20.1 21.0 21.1 21.05

24-OMe 52.4 52.6

Grupos Bz Bz Bz Bz Bz

1'-165.1 1'-165.1 1'-165.2 1'-165.2 1'-165.2

2'-130.7 2'-130.7 2'-130.6 2'-130.7 2'-130.7

3',7'-129.4 3',7'-129.5 3',7'-129.4 3',7'-129.5 3',7'-129.5

4',6'-128.2 4',6'-128.2 4',6'-128.2 4',6'-128.3 4',6'-128.3

5'-132.9 5'-132.8 5'-133.0 5'-133.0 5'-133.05

MHz 125 125 125 125 125

Solvente CDCl

C13 43 44 45 46 47

1 72.6 72.4 72.6 72.6 156.7

2 25.5 25.4 25.5 25.4 126.0

3 77.0 77.2 77.1 77.2 203.6

4 36.6 36.6 36.6 36.6 44.1

5 37.4 37.4 37.4 37.4 46.3

6 22.8 22.8 22.8 22.7 23.5

7 75.45 75.4 75.6 75.2 74.1

8 42.3 42.1 42.1 42.1 44.9

9 35.75 35.3 35.4 35.1 38.1

10 40.3 40.3 40.3 40.3 40.0

11 16.0 16.0 16.1 15.7 15.9

12 35.4 34.5 35.0 33.8 30.6

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13 46.4 46.6 46.25 46.5 47.9

14 159.0 159.0 159.4 159.0 193.2

15 119.3 119.1 119.2 118.95 123.5

16 34.7 34.4 34.3 34.7 203.8

17 56.6 56.5 54.2 58.0 59.5

18 20.6 20.1 20.05 16.1 26.2

19 16.2 16.2 16.18 19.7 19.0

20 35.75 36.4 36.4 34.8 128.7

21 70.1 68.7 64.3 72.5 174.6

22 34.0 43.3 37.7 34.05 150.1

23 43.55 213.0 68.2 176.60 71.1

24 159.1 86.3 80.8

25 144.9 72.6 76.2

26 19.9 24.8 22.25

27 21.0 26.4 26.4

28 28.1 28.1 28.0 28.1 27.0

29 21.5 21.5 21.5 21.5 21.3

30 26.8 26.9 26.8 26.9 26.6

OAc C1 169.7 169.6 169.7 169.7 169.4

170.05 170.05 170.1 170.1

OAc C2 20.2 21.0 21.0 21.0 20.9

21.1 21.05 21.0 21.0

24-OMe

Grupos Bz Bz Bz Bz

1'-165.2 1'-165.2 1'-165.2 1'-165.2

2'-130.7 2'-130.7 2'-130.6 2'-130.7

3',7'-129.5 3',7'-129.5 3',7'-129.4 3',7'-129.5

4',6'-128.3 4',6'-128.3 4',6'-128.2 4',6'-128.3

5'-133.0 5'-133.0 5'-133.0 5'-133.1

MHz 125 125 75 75 75

Solvente CDCl

Grupo Meldenino:

C13 48 50 52 C13 48 50 52

1 38.1 158.4 157.5 15 120.4 57.4 68.6

2 32.6 125.5 125.3 16 34.3 32.2 37.5

3 217.7 204.6 78.5 17 51.5 39.6 50.5

4 46.3 44.3 38.2 18 20.4 21.9 22.2

5 47.7 46.7 170.0 19 16.3 19.4 15.6

6 72.2 24.4 138.0 20 124.2 123.8 154.5

7 73.3 74.0 203.8 21 139.6 139.5 140.3

8 44.5 42.7 44.7 22 110.9 111.0 111.6

9 39.7 40.4 43.6 23 142.5 142.9 141.4

10 38.1 39.8 42.2 28 31.1 19.9 28.0

11 16.0 16.3 25.8 29 19.4 21.4 15.4

12 32.3 29.6 78.0 30 25.4 27.1 27.1

13 47.1 42.0 51.5 OAc C1 170.2 169.9 170.4

14 160.1 73.2 80.2 OAc C2 21.6 21.1 21.2

Solvente CDCl

CDCl

MHz 75 100 125

Grupo Nimbolino:

C13 58 59 60 61 63 65

1 71.9 72.5 72.1 72.4 73.9 71.1

2 27.4 27.6 27.5 27.6 30.4 30.5

3 73.9 71.7 71.7 71.6 73.8 74.0

4 42.4 42.4 42.4 42.1 43.8 43.8

5 39.6 39.7 39.6 41.4 38.6 38.6

6 72.4 73.9 73.9 72.7 72.7 73.9

7 71.7 72.8 72.8 74.3 71.2 72.7

8 45.4 46.0 45.9 44.5 45.2 45.3

9 34.3 33.55 33.5 35.2 34.8 34.6

10 39.5 39.7 39.5 39.1 39.7 39.9

11 24.2 15.2 15.1 15.3 24.5 24.6

12 77.2 32.6 32.7 32.9 77.6 77.1

13 51.4 47.2 47.3 47.3 51.4 51.3

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14 157.4 160.3 160.1 157.3 157.1 157.2

15 122.7 120.5 120.5 120.7 122.8 122.7

16 36.6 34.2 34.2 34.2 36.6 36.6

17 50.3 51.5 51.5 51.5 50.5 50.5

18 26.9 20.7 20.7 21.5 26.8 26.9

19 15.2 15.3 15.3 15.3 15.3 15.3

20 124.5 124.4 124.3 124.5 124.4 124.5

21 140.3 139.6 139.6 139.7 140.2 140.2

22 111.7 111.0 110.9 11.0 111.6 111.7

23 142.1 142.4 142.4 142.5 142.0 142.0

28 78.0 77.9 77.8 77.9 78.2 78.2

29 19.7 19.6 19.5 19.2 15.8 20.2

30 15.3 26.3 26.3 26.3 21.3 15.4

OAc C1 170.2 170.0 170.2 169.6 170.9 170.3

170.9 169.8

OAc C2 20.9 20.43 21.9 20.7 21.3 21.3

21.3 21.3

Grupos Tig Bz Cin Cin Cin Bz

166.5 1'-165.3 1'-165.4 1'-165.3 1'-165.3 1'-165.3

128.7 2'-129.8 2'-117.8 2'-119.0 2'-117.1 2'-130.5

138.0 3',7'-129.7 3'-145.6 3'-143.7 3'-146.4 3',7'-129.6

14.4 4',6'-128.3 4'-124.3 4'-134.5 4'-133.9 4',6'-128.8

11.9 5'-133.2 5',9'-128.9 5',9'-127.6 5',9'-128.3 5'-133.7

6',8'-127.9 6',8'-130.0 6',8'-129.0

7'-130.4 7'-130.3 7'-130.8

MHz 100 75 125 100 125

Solvente CDCl

CDCl

Grupo Gedunina:

C13 68 C13 68 C13 68

1 159 11 25.7 20 120.5

2 126.3 12 77.9 21 142.1

3 74.0 13 47.0 22 110.0

4 38.3 14 80.2 23 142.6

5 46.1 15 68.6 28 _

6 23.8 16 174.0 29 _

7 71.9 17 15.3 30 _

8 43.9 18 21.9 OAc C1 173.8

9 43.2 19 15.3 OAc C2 21.3

10 42.1 Solvente CDCl

MHz 125

Grupo B-seco:

C13 71 C13 71 C13 71

1 78.0 12 69.0 22 110.2

2 28.5 13 47.0 23 143.0

3 74.0 14 80.2 28 26.50

4 38.5 15 68.5 29 15.5

5 42.1 16 174.1 30 114.5

6 33.2 17 79.0 OAc C1 169.0

7 173.5 18 10.0 150.0

8 140.5 19 22.0 OAc C2 20.0

9 49.5 20 121.0 21.0

10 43.0 21 142.0 7-OCH3 51.5

11 30.0 Solvente CDCl

MHz 125

Grupo Azedarachina:

C13

74 75 76 77 78 80

1 70.14 70.4 70.6 70.2 70.3 70.1

2 36.28 33.9 33.4 33.1 35.4/36.2 35.0

3 73.34 74.0 74.0 73.6 73.6/76.3 73.6

4 40.15 39.5 39.8 39.4 40.0/40.1 39.5

5 28.55 28.3 41.4 34.1 25.5/27.9 28.0

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6 25.28 26.0 25.7 25.3 25.5/27.4 25.8

7 70.00 70.7 70.4 70.1 70.5 70.4

8 42.70 41.8 41.9 41.6 42.4/42.5 42.6

9 48.53 48.7 48.1 47.7 48.4/48.7 48.4

10 42.00 42.8 42.5 42.1 41.8 41.5

11 214.29 206.9 207.1 213.4 206.8 206.7

12 79.35 78.9 79.2 78.8 78.5/78.7 78.6

13 46.62 46.2 46.4 46.0 45.7/45.8 46.0

14 66.12 72.3 71.4 72.9 72.1/72.3 72.0

15 58.83 58.8 59.5 59.2 58.7 58.5

16 33.32 35.4 35.7 35.3 33.6 33.6

17 39.46 38.7 38.9 38.5 38.2 38.4

18 14.21 22.7 23.1 22.7 20.8 20.7

19 64.37 65.0 65.0 64.6 58.7/63.9 64.7

20 124.86 122.8 121.1 123.5 122.5/122.6 122.5

21 141.31 142.8 142.6 142.3 142.4 142.5

22 113.56 112.2 113.1 112.7 111.9 111.9

23 142.52 141.0 141.0 140.6 140.7 140.7

28 19.27 19.6 19.5 19.2 15.6 15.8

29 96.27 94.8 94.6 94.2 96.1/96.4 94.4

30 22.59 16.1 14.7 14.4 18.5/19.6 19.4

OAc C1 170.69 170.1 169.7 169.8 170.1 169.9

170.2 170.6 170.4

170.7

OAc C2 21.11 21.0 21.8 21.4 22.5/22.8 21.5

21.4 22.3

21.8 21.4/21.5

Grupos 2(Me)Bu iso-Bu iso-Bu

1'-175.6 1'-175.7 1' 175.7

2'-28.3 2'-28.0 2' 34.2

3'-26.9 3'-18.6 3' 18.6

(Me2')-16.8 4'-18.9 4' 18.9

(Me3')-11.7

MHz 125 100 100 100 100 100

Solvente CD

CN CDCl

CDCl

C13 81 82 83 85 87

1 70.38 70.8 70.7 71.4 70.7

2 36.69 36.1 36.3 37.2 37.2

3 73.19 73.9 76.3 74.9 74.3

4 40.28 43.5 43.4 41.0 40.5

5 25.94 41.3 25.8 29.3 28.8

6 27.44 23.2 25.0 24.0 24.3

7 69.7 69.6 70.1 69.4

8 42.76 41.3 41.0 42.7 45.1

9 48.30 48.8 48.7 49.0 47.5

10 41.97 39.5 40.4 43.7 42.9

11 79.26 212.4 212.5 213.8 208.8

12 214.18 79.3 79.0 78.9 79.

13 46.56 45.7 45.7 47.4 47.9

14 66.04 60.9 60.3 59.5 59.3

15 58.93 219.0 218.5 220.6 217.3

16 44.9 44.7 46.3 44.6

17 39.41 41.7 41.2 39.7 38.4

18 14.18 21.7 21.2 22.1 21.8

19 64.2 57.7 65.0 64.8

20 124.88 124.2 121.4 126.3 123.9

21 140.4 140.1 141.5 141.1

22 111.3 111.0 111.9 111.3

23 142.51 143.4 143.0 144.2 143.6

28 18.51 19.0 18.3 97.3 20.0

29 96.01 94.2 102.9 19.9 96.6

30 22.82 22.8 22.4 22.1 20.6

OAc C1 170.60 170.1 169.9 172.8 170.6

170.7

OAc C2 21.08 21.6 21.4 21.3 20.7

28.8

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29-OCH3 55.6

Grupos 2(Me)Bu

1'-175.6

2'-28.6

3'-26.8

(Me2')-16.8

(Me3')-11.7

MHz 125 100 100 125 100

Solvente CD

CN CDCl

CDCl

Grupo Meliatoxina:

C13 88 89 92 93 C13 88 89 92 93

1 70.8 70.8 73.1 69.3 19 64.6 64.4 64.3 63.9

2 68.5 68.5 71.0 68.8 20 123.1 123.1 123.3 121.8

3 73.2 73.2 73.5 71.9 21 143.2 143.2 143.3 143.4

4 40.9 40.8 39.2 40.7 22 110.7 110.7 110.8 110.3

5 34.1 41.0 33.7 41.0 23 139.7 139.7 139.8 140.2

6 25.9 26.6 26.8 23.0 28 18.8 18.9 19.5 20.2

7 71.7 71.7 71.0 73.4 29 93.5 93.5 94.2 93.1

8 42.3 42.2 41.2 43.1 30 20.9 21.0 14.2 18.5

9 48.3 48.3 48.7 51.4 OAc C1 168.8 168.8 166.6 168.9

10 42.0 42.0 41.2 42.7 170.0 170.0 169.9

11 211.1 211.1 205.4 209.9 OAc C2 20.7 20.7 20.8 20.8

12 48.5 48.9 48.6 50.5 20.7 20.7 20.9

13 43.6 43.6 43.6 44.8 Grupos iso-Bu 2(Me)Bu 2(Me)Bu 2(Me)Bu

14 72.6 72.6 72.7 62.4 1'-175.8 1'-175.4 1'-175.7 1'-175.3

15 57.8 57.8 58.0 219.4 2'-28.0 2'-28.0 2'-28.2 2'-28.1

16 32.1 32.1 32.0 43.3 3'-18.7 3'-25.9 3'-22.8 3'-26.5

17 39.1 39.1 39.2 41.9 4'-18.7 (Me2')-16.3 4’-16.4 4'-16.3

18 21.7 21.7 21.7 20.9 (Me3')-11.3 5’-11.5 5'-11.3

Solvente CDCl

CDCl

MHz 100 100 100 100

C13 95 96 98 100 101 103 104 105

1 70.9 72.8 70.2 70.2 71.6 70.2 72.0 70.1

2 66.7 68.6 66.7 68.8 68.5 66.7 66.8 66.8

3 72.9 73.0 74.6 73.5 73.0 74.6 72.2 72.1

4 40.6 40.7 40.4 41.1 40.7 40.4 40.6 40.6

5 41.1 41.2 34.1 34.2 34.1 34.1 34.1 40.1

6 25.5 26.4 25.9 26.4 25.6 25.9 26.2 26.6

7 70.0 71.7 73.8 71.9 70.2 73.8 71.3 72.2

8 42.4 42.4 43.1 43.0 42.5 43.0 43.0 43.1

9 47.8 46.2 48.0 47.9 48.0 48.0 47.9 47.9

10 41.5 42.3 40.9 41.5 42.3 40.8 40.9 41.0

11 213.5 213.2 205.6 205.5 206.3 205.6 205.5 205.6

12 78.9 78.9 77.2 77.0 77.9 77.2 77.2 77.0

13 46.2 47.3 45.3 45.3 45.6 45.3 45.3 45.3

14 70.1 70.0 71.4 71.4 71.9 71.4 70.1 71.3

15 58.9 59.2 58.1 58.0 58.8 58.1 57.9 57.9

16 33.1 33.1 33.4 33.4 33.8 33.4 33.4 33.4

17 38.9 38.6 38.6 38.7 38.1 38.6 28.7 28.7

18 22.6 25.3 22.3 22.0 22.4 22.2 22.0 21.9

19 64.0 64.1 64.1 63.7 64.1 64.1 63.7 63.7

20 123.5 123.5 122.3 122.3 122.5 122.3 122.3 122.3

21 142.3 142.3 142.6 142.5 142.4 142.6 142.6 142.6

22 112.7 112.8 111.7 111.7 111.9 111.7 111.7 111.7

23 140.7 140.8 140.6 140.6 140.7 140.6 140.6 140.6

28 19.3 18.6 20.8 19.3 18.8 18.9 19.0 19.1

29 94.2 93.5 93.5 94.2 93.5 93.5 93.4 93.5

30 16.5 22.7 15.7 15.7 15.5 15.7 15.7 15.6

OAc C1 170.1 169.0 170.2 168.9 168.9 170.2 169.0 169.0

170.1 170.8 169.0 170.0 170.4 169.2 169.2

170.1 170.2 170.8 170.1 170.0

170.2 170.1

OAc C2 21.2 20.6 21.0 20.7 20.7 20.7 20.8 20.4

20.8 21.0 20.7 20.7 20.9 20.8 20.7

21.8 20.9 21.1 20.8 20.8

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20.8 20.9

Grupos 2(Me)Bu 2(Me)Bu iso-Bu iso-Bu iso-Bu iso-Bu iso-Bu 2(Me)Bu

1'-175.0 1'-175.3 1'-175.6 1'-175.7 1'-175.7 1'-175.6 1'-175.8 1'-175.3

2'-27.9 2'-27.7 2'-29.3 2'-27.8 2'-27.7 2'-29.3 2'-29.1 2'-29.0

3'-26.5 3'-26.4 3'-18.6 3'-18.6 3'-18.7 3'-18.6 3'-18.7 3'-26.3

4'-16.3 (Me2')-16.3 4'-19.0 4'-18.8 4'-18.7 4'-18.7 4'-18.7 4'-16.3

5'-11.5 (Me3')-11.3 5'-11.3

MHz 100 100 100 100 100 100 100 100

Solvente CDCl

CDCl

Grupo C-seco:

C13 107 108 110 111 112 114

1 70.8 71.3 73.4 71.7 72.1 72.0

2 30.5 27.6 30.7 27.7 28.2 28.1

3 75.1 71.3 72.7 72.6 72.7 71.4

4 47.1 42.7 44.4 42.7 42.9 42.7

5 39.5 39.9 39.7 39.9 40.2 39.0

6 69.1 72.6 71.1 71.3 71.3 74.3

7 85.3 85.6 86.3 85.8 85.8 67.5

8 47.5 49.0 49.2 49.1 48.7 60.5

9 35.9 39.4 39.1 39.5 38.3 35.4

10 41.9 40.6 41.2 40.7 40.9 39.0

11 25.0 30.7 30.8 30.7 40.7 33.6

12 172.5 172.8 172.8 172.6 199.1 76.3

13 135.7 134.9 134.6 134.9 136.9 81.15

14 146.1 146.5 146.7 146.4 145.1 96.1

15 87.6 87.9 88.2 88.0 88.1 80.55

16 41.2 41.4 41.3 41.3 41.8 32.2

17 49.6 49.4 49.7 49.4 49.7 45.05

18 17.0 13.0 15.4 15.2 15.4 20.5

19 16.7 15.1 17.0 16.9 16.9 16.55

20 126.9 127.1 127.3 126.9 126.6 123.4

21 143.0 138.7 138.9 138.6 138.3 139.5

22 110.6 110.6 110.8 110.4 109.7 111.0

23 138.9 142.9 143.0 142.8 143.2 142.4

28 204.3 77.6 78.1 7.6 77.9 78.73

29 14.4 19.6 20.0 19.6 19.7 21.0

30 13.0 16.9 13.2 13.0 13.4 42.3

OAc C1 169.1 170.4 170.3 170.4 169.6

170.1 170.3

170.4

OAc C2 20.5 20.8 21.1 21.0 21.0

20.9 21.5

21.8

12-OCH3 51.6 51.5 51.6 51.5

Grupos Tig Tig Cin Cin Bz

166.6 166.8 1'-165.7 1'-165.4 1'-165.0

128.9 129.0 2'-118.3 2'-118.7 2'-129.7

137.7 137.2 3'-145.6 3'-144.6 3'-129.7

14.1 14.4 4'-135.1 4'-134.3 4'-128.7

12.0 11.9 5'-128.4 5'-127.9 5'-133.7

6'-129.2 6'-129.0

7'-130.7 7'-130.3

MHz 100 100 100

Solvente CDCl

CDCl

Grupo Nimbolinina:

C13 115 116 118 121 122 123

1 71.2 71.3 71.6 70.9 71.1 71.1

2 29.3 29.3 27.9 27.7 27.8 29.2

3 72.5 72.5 72.4 71.6 71.6 72.3

4 42.4 42.5 42.6 42.7 42.7 42.5

5 39.2 39.3 40.2 38.5 38.6 39.1

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6 72.6 72.6 72.4 74.0 73.5 72.8

7 74.6 75.4 75.3 73.4 74.0 75.6

8 45.2 45.3 45.4 46.1 46.1 45.5

9 38.2 36.0 35.5 34.8 34.9 36.5

10 41.0 41.1 40.4 40.7 40.7 41.3

11 31.1 31.1 31.6 37.9 31.6 30.8

12 92.4 92.0 91.4 98.0 97.9 98.7

13 142.2 142.4 141.5 139.1 139.1 142.4

14 142.7 143.0 142.7 144.5 144.1 143.0

15 77.8 77.9 78.0 77.0 77.7 77.7

16 38.2 38.0 38.1 31.5 37.9 37.7

17 46.8 46.7 46.4 46.8 46.9 46.8

18 16.4 16.4 16.2 16.1 16.2 16.4

19 16.2 16.2 16.1 16.0 16.1 16.2

20 128.2 128.1 128.4 128.7 128.7 128.2

21 139.0 142.7 142.8 139.0 142.7 142.8

22 110.3 110.3 110.2 110.5 110.5 110.4

23 142.9 138.9 138.9 142.8 139.0 139.0

28 77.9 78.0 77.6 78.0 78.0 78.1

29 18.8 18.8 19.2 19.7 19.6 19.0

30 20.7 20.7 20.7 20.7 20.8 21.1

OAc C1 170.1 170.2 169.7 170.3 170.3 170.7

170.0

OAc C2 21.1 21.1 20.8 20.8 21.1 20.6

21.8

12-OCH3 53.9 54.2 54.4

Grupos Tig Bz Bz Tig Cin Bz

166.5 1'-164.9 1'-164.7 166.8 1'-166.0 1'-164.9

128.8 2'-130.5 2'-130.4 129.4 2'-119.3 2'-130.6

136.7 3',7'-129.4 3',7'-129.3 136.5 3'-144.1 3',7'-129.5

14.5 4',6'-128.5 4',6'-128.4 14.3 4'-130.2 4',6'-128.4

12.2 5'-132.9 5'-133.0 11.9 5',9'-127.9 5'-132.8

6',8'-129.0

7'-128.7

MHz

125 100 100 100 100

Solvente CDCl

CDCl

C13 124 125 127 130 132 134 135

1 71.8 71.7 71.5 71.5 71.9 71.5 72.2

2 27.5 27.6 27.8 27.2 27.7 28.1 28.4

3 72.0 71.8 71.8 72.8 72.0 67.0 71.8

4 42.5 42.4 42.4 42.6 42.7 42.7 43.0

5 40..5 40.6 40.6 40.0 40.5 39.0 39.4

6 71.2 71.8 70.8 71.8 72.0 71.9 74.9

7 75.1 75.6 73.9 75.2 75.3 74.6 67.3

8 45.4 45.1 45.0 47.4 47.3 44.9 60.3

9 37.0 37.0 37.3 38.7 38.9 35.6 35.9

10 40.2 40.1 40.8 40.7 40.9 39.1 39.3

11 32.5 32.5 32.7 32.0 32.0 32.3 34.0

12 171.2 171.2 171.2 173.6 173.2 96.4 76.6

13 138.5 138.4 138.6 133.5 133.5 81.3 81.6

14 148.0 147.9 146.8 148.5 148.7 77.7 96.7

15 85.8 83.9 85.4 82.0 82.2 80.3 80.7

16 37.5 37.7 37.6 36.7 36.7 33.7 32.6

17 47.0 47.0 47.0 47.5 47.4 44.9 45.2

18 15.5 16.0 16.0 16.9 17.0 16.6 20.7

19 110.0 15.4 15.5 16.0 16.4 16.6 16.9

20 126.5 126.5 126.5 127.8 127.9 123.6 123.9

21 139.1 139.2 139.2 139,5 143.2 142.4 142.7

22 110.0 110.0 110.0 109.8 109.9 111.1 111.4

23 143.5 143.4 143.5 143.2 139.5 139.6 139.9

28 78.1 78.0 78.0 77.8 77.8 78.8 79.1

29 19.5 19.2 18.9 20.0 20.1 20.4 20.8

30 20.3 20.1 20.5 20.1 20.2 20.5 42.6

OAc C1 169.5 169.1 170.3 169.7 169.9 168.8 170.7

169.6 170.0 171.0 170.2 170.7

170.0

OAc C2 21.0 20.1 20.8 20.7 20.7 21.6 21.3

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21.0 21.3 21.6 21.0 21.9

21.6

12-OCH3 52.0

Grupos Tig Tig Tig iso-Bu Tig Tig Tig

164.5 166.0 165.2 1'-174.7 166.5 167.3 167.6

130.2 128.6 129.0 2'-33.5 129.4 129.0 129.3

128.6 137.2 137.6 3'-17.6 136.4 138.2 138.5

a 14.5 14.4 4'-19.9 14.1 14.7 15.0

a 12.1 12.2 12.0 12.2 12.5

iso-Bu

1'-174.8

2'-34.7

3'-19.5

4'-19.5

MHz 125 100 100 100 125

Solvente CDCl

CDCl

Grupo Meliacarpina:

C13 137 138 139 141

1 71.06a 70.98 71.03 74.4

2 27.98 28.04 27.76 29.7

3 70.96a 71.25 70.87 70.3

4 42.82 42.85 42.74 40.95

5 35.69 35.81 35.44 36.8

6 72.72 72.71 72.97 73.3

7 75.39 75.34 75.21 74.6

8 44.97 44.86 45.12 44.2

9 44.83 44.78 44.72 47.4

10 50.12 50.02 50.12 48.6

11 104.11 104.12 104.08 209.0

12 171.86 171.78 171.87 21.4a

13 68.83 68.71 68.92 67.2

14 70.03 70.03 70.07 69.5

15 76.29 76.32 76.19 76.1

16 25.18 25.06 25.28 25.1

17 49.00 49.11 48.84 48.0

18 18.33 18.28 18.32 18.2a

19 69.92 69.93 69.87 70.0

20 83.71 83.68 83.62 83.55

21 109.05 109.07 108.81 108.7

22 107.39 107.35 107.54 107.7

23 147.00 146.93 146.83 147.0

28 77.19 77.17 77.85 78.1

29 19.00 19.06 18.81 20.4b

30 21.33 21.30 21.36 17.1b

12-OCH3 53.33 53.34 53.34

Grupos Cin Cin Cin Cin

1''-166.00 1'-165.73 1'-165.59 1'-165.7

2''-117.69 2'-117.27 2'-117.62 2'-116.7

3''-145.95 3'-145.60 3'-145.56 3'-146.6

4''-130.57 4'-130.60 4'-130.45 4'-133.7

5'',9''-129.11 5',9'-129.08 5',9'-128.91 5',9'-128.2

6'',8''-128.14 6',8'-127.98 6',8'-127.97 6',8'-129.1

7''-134.03 7'-134.14 7'-133.9 7'-130.95

Cin Methacryl.

1'-165.47 1''-166.34

2'-117.20 2''-135.93

3'-145.66 3''-126.01

4'-130.37 4''-18.20

5',9'-128.79

6',8'-128.00

7'-133.76

MHz 100 100 62.89 50.3

Solvente CDCl

CDCl

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Grupo Meliacarpinina e Azadirachtinina:

C13 142 143 144 146 147 148 149 150 151

1 70.26 70.2 71.1 72.2a 70.8 24.9 24.7 70.2 71.1

2 30.15 28.3 28.0 30.8 28.0 33.5 33.4 28.2 28.0

3 66.97 70.7 70.4 70.3a 70.9 70.7 70.6 70.8 70.5

4 52.87 42.4 42.7 43.9 42.3 42.7 42.7 42.3 42.9

5 36.34 35.1 35.1 33.9 35.0 39.7 39.6 35.1 34.8

6 71.93 71.1 71.1 71.1a 71.1 71.0 71.1 71.8 71.8

7 82.70 83.2 83.8 83.7 83.5 84.3 84.2 82.9 83.0

8 51.46 51.3 51.2 51.5 51.5 51.0 51.3 52.0 51.9

9 47.92 47.9 47.9 47.9 47.8 54.8 54.6 48.1 48.1

10 49.78 49.8 49.7 50.2 49.9 49.5 46.1 49.9 49.9

11 107.25 106.7 107.0 106.8 106.7 106.7 106.6 106.7 107.0

12 170.14 169.0 169.4 169.2 170.1 170.1 170.0 169.1 169.5

13 95.10 94.9 94.9 94.9 94.9 94.8 94.7 93.6 93.8

14 93.26 93.0 93.3 93.2 93.1 93.0 93.0 92.9 92.7

15 81.42 81.2 81.1 81.2 81.2 81.1 81.1 82.0 82.0

16 29.63 29.6 29.7 29.7 29.8 29.8 29.7 28.9 28.9

17 50.81 50.7 50.8 50.9 50.8 51.3 50.9 48.1 48.1

18 26.67 26.5 25.9 26.4 26.4 26.3 26.3 25.9 25.3

19 70.44 70.5 70.7 70.5 70.4 71.0 71.1 70.6 70.7

20 86.44 86.2 86.3 86.3 86.3 86.2 86.2 91.8 91.8

21 109.41 109.2 109.3 109.4 109.3 109.4 109.3 105.9 106.0

22 108.24 108.0 107.9 108.1 108.0 108.0 108.0 105.5 105.5

23 145.7 145.8 145.7b 145.7 146.0 145.8 146.7 146.8

28 76.5 76.6 76.6 76.4 76.8 75.5 76.1 76.1

29 173.34 18.3 18.1 18.8 18.3 18.4 18.4 18.1 18.0

30 17.63 17.8 17.7 17.7 17.7 17.2 17.3 18.1 17.8

OAc C1 169.72 170.1 170.1 169.2 170.1 170.2

171.4 171.3

OAc C2 21.07 21.0 21.0 21.0 20.9 21.0

21.4 21.2

11-OCH3 53.2a 53.1a 52.4 52.5 52.3 52.4 52.3 52.4

12-OCH3 52.87 52.4a 53.8a 53.3 53.3 52.9 52.8 53.1 53.1

29-OCH3 53.70 52.3

Grupos Tig Tig Tig Cin Cin Tig Methacryl. Tig Tig

166.84 166.6 166.7 1'-165.6 1'-165.6 167.0 1''-166.2 166.7 166.8

128.84 128.5 128.4 2'-117.0 2'-117.3 128.5 2''-136.2 128.3 128.4

138.18 137.9 138.1 3'-146.4b 3'-145.8 138.1 3''-126.1 138.0 138.3

14.18 14.4 14.4 4'-130.8 4'-133.9 14.5 4''-18.3 14.3 14.4

12.16 12.1 11.9 5',9'-128.2 5',9'-128.0 12.1 12.1 11.9

52.49 6',8'-129.0 6',8'-129.1

7'-134.0 7'-130.8

MHz 62,89 100 100 100 100 100 100 100

Solvente CDCl

CDCl

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