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EVA GLÓRIA ABRÃO SIUFI DO AMARAL
EXPRESSÃO DE SUPERÓXIDO DISMUTASE EM FOCOS
DE CRIPTAS ABERRANTES INDUZIDAS PELO
AZOXIMETANO EM RATOS WISTAR E INIBIÇÃO PELO
INOSITOL HEXAFOSFATO
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo – Escola Paulista de Medicina para a
obtenção do título de Mestre em Ciência.
SÃO PAULO
2006
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EVA GLÓRIA ABRÃO SIUFI DO AMARAL
EXPRESSÃO DE SUPERÓXIDO DISMUTASE EM FOCOS
DE CRIPTAS ABERRANTES INDUZIDAS PELO
AZOXIMETANO EM RATOS WISTAR E INIBIÇÃO PELO
INOSITOL HEXAFOSFATO
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo – Escola Paulista de Medicina para a
obtenção do título de Mestre em Ciência.
ORIENTADOR: PROF. DR. DJALMA JOSÉ FAGUNDES
SÃO PAULO
2006
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Amaral, Eva Gloria Siufi
Expressão de superóxido dismutase em focos de criptas aberrantes
induzidas pelo azoximetano em ratos Wistar e inibição pelo inositol hexafosfato/
Eva Glória Abrão Siufi do Amaral – São Paulo, 2006
Xiii, 39f
Tese de (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de
Medicina. Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação.
Superoxide dismutase expression in azoxymethane-induced colonic aberran
t
cruypt foci of Wistar rats and inhibition by inositol hexaphosphate.
1. Inositol Hexafosfato 2. Superóxido dismutase 3. Azoximetano 4. Ratos 5.
Cólon 6. Carcinogênese
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
UNIFESP-EPM
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
CIRURGIA E EXPERIMENTAÇÃO
COORDENADOR: Prof. Dr. José Luiz Martins
TESE DE MESTRADO
AUTOR: Eva Glória Abrão Siufi do Amaral
ORIENTADOR: Prof. Dr. Djalma José Fagundes
CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Celso Massaschi Inouye
TÍTULO: Expressão de superóxido dismutase em focos de criptas aberrantes induzidas pelo
azoximetano em ratos Wistar e inibição pelo inositol hexafosfato.
BANCA EXAMINADORA:
1- Presidente: Prof. Dr. Djalma José Fagundes
Professor Adjunto da Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP-
EPM.
MEMBROS EFETIVOS:
2 – Prof. Dr. João Ricardo Filgueiras Tognini
Professor Titular do Departamento de Clínica Cirúrgica da Universidade Federal do Mato
Grosso do Sul - UFMS
3 – Prof. Dr. Ismael Dale Cotrin Guereiro da Silva
Professor Livre Docente e Assistente da Disciplina de Ginecologia UNIFESP-EPM.
4 – Profa. Dra. Adriane Cristina Bovo.
Professora da Faculdade de Medicina da Universidade para o Desenvolvimento do Pantanal –
UNIDERP – MS.
MEMBRO SUPLENTE
1- Prof. Dr. Murched Omar Taha
Professor Afiliado da Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP-
EPM
i
DEDICATÓRIA
Aos meus pais JOÃO (in memorian) e
ASCINA pela formação moral, ética e
profissional.
Ao meu esposo JOÃO PAULO, principal
apoio para a realização deste trabalho, por
sua ajuda, carinho e amor sempre presentes.
Aos meus filhos JOÃO PAULO E
MARIA LAURA pelo carinho e
compreensão
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao Prof. Dr. Djalma José Fagundes, Professor Adjunto IV da Disciplina de
Técnica Operatória e Cirurgia Experimental do Departamento de Cirurgia da
Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP-EPM, antigo Coordenador do
Programa de Pós – Graduação em Cirurgia e Experimentação da UNIFESP-
EPM, orientador deste trabalho pela demonstração de competência e apoio para
a realização desta pesquisa.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina-
UNIFESP-EPM, por ter me recebido como aluna do Programa de Pós-Graduação
em Cirurgia e Experimentação, possibilitando minha titulação.
À Universidade Federal de Mato Grosso do Sul - UFMS, por ter criado
condições para seus Professores terem acesso ao Programa de Pós-Graduação em
Cirurgia e Experimentação da UNIFESP - EPM.
À Coordenação de Aperfeiçoamento do Pessoal de Nível Superior -
CAPES, pelo apoio financeiro concedido pela bolsa de mestrado.
Ao Prof. Dr. Celso Massaschi Inouye, Professor Titular da Disciplina de
Ortopedia da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul; pelo apoio e incentivo do
ensino de Pós-Graduação no Estado de Mato Grosso do Sul
Ao Prof. Dr. Adalberto Abrão Siufi, Professor Titular da Disciplina de
Oncologia Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, pelo incentivo e ensinamentos.
Ao mestre Guido Marks, Professor Auxiliar da Disciplina de Oncologia da
Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, pelo apoio e colaboração para a execução
deste trabalho.
Ao mestre Luiz Carlos Takita, Professor Assistente da Disciplina de Patologia
da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, pela ajuda na realização da análise
imunoistoquímica.
Ao médico patologista Gustavo Falcão, pela ajuda na realização da análise
imunoistoquímica.
Á Srta Carolina Vieira ,Tecnóloga em processamento de dados, pela paciência e
ajuda na digitação da tese.
Á Profa. Dra Elenir Rose Jardim Cury Pontes, Professora Adjunto do
Departamento de Tecnologia em Alimentos e Saúde Pública da Universidade Federal de
Mato Grosso do SUL, pelo tratamento estatístico do9s dados desta pesquisa.
Aos Profs. Drs. Olavo de Oliveira Rodrigues, Manoel de Jesus Simões,
Edna Frasson de Souza Monteiro, Murched Omar Taha e Mirian Ghiraldini,
pelos ensinamentos e colaboração na formação do pensamento científico durante o
programa de pós-graduação.
À Sra. Rosely de Fátima Pellizzon, Bibliotecária responsável pela BIREME
da Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, pelos
ensinamentos e colaboração na pesquisa bibliográfica nas principais bases de dados
biomédicas.
Às secretárias da UNIFESP-EPM, Elaine Maria Alves Bazzi Dantas e
Valdelice Justiniao Soares, pela colaboração durante a confecção do presente
trabalho e ajuda inestimável nos trâmites burocráticos da pós-graduação.
Aos colegas do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação
que colaboraram com idéias e críticas ao trabalho e incentivaram o seu
prosseguimento.
Aos todos os funcionários da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul –
UFMS, que em diferentes etapas colaboraram para a execução deste trabalho.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fluxograma da distribuição dos animais nos diversos grupos de estudo...
07
Figura 2 - Esquema de aplicação das drogas aos animais ao longo das seis semanas
de observação. ...........................................................................................
08
Figura 3 - Foto da peça operatória mostrando: 1) íleo terminal e o ceco direito; 2)
segmento de cólon direito e a secção do ceco a partir da válvula íleo
cecal e aberto pela borda anti-mesentérica. ...............................................
09
Figura 5 – Foto de uma imagem capturada para exemplificar a quantificação da
área com a expressão SOD1 (área azul). .............................................
12
Figura 6 - Identificação de um foco de cripta aberrante segundo o critério de
alargamento do eixo maior da abertura do óstio do lúmen (seta).
Imunoistoquímica. 400X. ........................................................................
13
Figura 7 - Identificação de um foco de cripta aberrante segundo o critério de
espessamento do epitélio (setas). Imunoistoquímica. 400X. ....................
14
Figura 8 - Identificação de um foco de cripta aberrante segundo o critério de
extensão do eixo maior da cripta em relação às adjacentes (seta).
Imunoistoquímica. 400X. ..........................................................................
15
Figura 9 – Fotomicrografia característica de um animal do grupo I (controle)
mostrando um foco de cripta aberrante (FCA) com a corresponde
expressão de SOD-1 em coloração marrom decorrente do revelador
DAB utilizado na imunoistoquímica.(400X). .........................................
20
Figura 10 – Fotomicrografia característica de um animal do grupo I (controle)
mostrando um foco de cripta aberrante (FCA) com a corresponde
expressão de SOD-1 em coloração azul decorrente do processamento de
imagem assistida por computador. (400X). ..............................................
20
Figura 11 – Fotomicrografia característica de um animal do grupo II (AOM)
mostrando um foco de cripta aberrante (FCA) com a corresponde
expressão de SOD-1 em coloração marrom decorrente do revelador
DAB utilizado na imunoistoquímica.(400X). .........................................
21
Figura 14 – Fotomicrografia característica de um animal do grupo III (IP6)
mostrando um foco de cripta aberrante (FCA) com a corresponde
expressão de SOD-1 em coloração azul decorrente do processamento de
imagem assistida por computador. (400X). ..............................................
22
Figura 15 – Fotomicrografia característica de um animal do grupo IV (IP6/AOM)
mostrando um foco de cripta aberrante (FCA) com a corresponde
expressão de SOD-1 em coloração marrom decorrente do revelador
DAB utilizado na imunoistoquímica.(400X). .........................................
23
Figura 16 – Fotomicrografia característica de um animal do grupo IV (IP6/AOM)
mostrando um foco de cripta aberrante (FCA) com a corresponde
expressão de SOD-1 em coloração azul decorrente do processamento de
imagem assistida por computador. (400X). ..............................................
23
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Distribuição do peso (em gramas) inicial, média da variação ponderal e
desvio padrão dos animais no Grupo I (controle), Grupo II (AOM),
Grupo III (IP6) e Grupo IV (IP6/AOM). ..................................................
16
Tabela 2 - Distribuição dos valores individuais da porcentagem da expressão de
SOD em FCA, quantificada por meio de processamento de imagem
assistida por computador,
nos diversos animais do Grupo I (controle),
Grupo II (AOM), Grupo III (IP6) e Grupo IV (IP6/AOM), com
respectivas médias, desvio-padrão e coeficiente de variância. .................
17
Tabela 3 - Distribuição da média e desvio-padrão da porcentagem de expressão de
SOD em FCA, quantificada por meio de processamento de imagem
assistida por computador, nos diversos animais do Grupo I (controle),
Grupo II (AOM), Grupo III (IP6) e Grupo IV (IP6/AOM). .....................
18
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - Distribuição do peso (em gramas) inicial, média da variação ponderal
nos animais do Grupo I (controle), Grupo II (AOM), Grupo III (IP6) e
Grupo IV (IP6/AOM). .............................................................................
16
Gráfico 2 – Distribuição dos valores médios e do desvio-padrão da porcentagem
da expressão de SOD, quantificada por meio de processamento de
imagem assistida por computador, comparando os Grupos entre si, dois à
dois, de acordo com a significância estatística encontrada e mostrada na
Tabela 2. .....................................................................................................
18
Gráfico 3 - Distribuição da média e desvio-padrão da porcentagem de expressão de
SOD em FCA, quantificada por meio de processamento de imagem
assistida por computador, nos diversos animais do Grupo I (controle),
Grupo II (AOM), Grupo III (IP6) e Grupo IV (IP6/AOM). .......................
19
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
AOM Azoximetano
ATP Adenosina trifosfato
CuZnSOD Cobre, zinco, superóxido dismutase
DAB Diaminobenzidina
DNA Ácido Desoxirribonucléico
ERO Espécie reativa de oxigênio
FCA Foco de cripta aberrante
GSH Glutationa
HD Do inglês Hard Disc, disco rígido
IP6 Inositol hexafosfato
Kg Quilograma
mg Miligrama
ml Mililitro
MnSOD Manganês superóxido dismutase
RGB Do inglês Red, Green, Blue, vermelho, azul, verde.
S.F. Soro fisiológico
SOD Superóxido Dismutase
SOD1 Superóxido Dismutase-1
UFMS Universidade Federal do Mato Grosso do Sul
UNIFESP Universidade Federal de São Paulo
RESUMO
Objetivo: desenvolver um modelo experimental de carcinogênese em colo de rato
induzido pelo azoximetano e estabelecer um padrão de ação protetora do hexafosfato de
inositol, pela expressão da enzima superóxido dismutase em foco de cripta aberrante.
Métodos: 48 ratos Wistar, adultos, machos, foram mantidos em observação por seis
semanas. GI (n=12) recebeu injeções de solução salina subcutânea durante a terceira e
quarta semanas, enquanto que o GII (n=12), no mesmo período, recebeu azoximetano
(AOM) na dose 20mg.Kg
-1
subcutânea. O GIII (n=12) recebeu inositol hexafosfato 1%
(IP6) na água de beber durante as seis semanas, enquanto que o GIV, além do IP6 na
água de beber, recebeu também as injeções subcutâneas de AOM durante a terceira e
quarta semanas. Ao término da sexta semana os animais sofreram a eutanásia e foram
coletados segmentos de intestino grosso à cerca de um centímetro da transição íleo-
cólica. Fragmentos foram preparados e submetidos à coloração imunoistoquímica para
de anticorpo primário anti-SOD1 (superóxido dismutase1) e anticorpo secundário anti-
rato, revelador de cor DAB (diamino-benzidina) com obtenção de expressão SOD1 na
coloração marrom. A porcentagem da expressão de SOD em FCA (foco de cripta
aberrante) foi quantificada por meio de processamento de imagem assistida por
computador (ImageLab). Os resultados foram submetidos aos testes de análise de
variância (ANOVA) e estabelecido o nível de 5% (p≤0,05) para rejeição da hipótese de
nulidade. Resultados: a porcentagem média da expressão da SOD no GI (16,0 ± 3,7)
foi semelhante ao GIII (16,9 ± 3,1) mostrando que a solução salina (controle) e o IP6
não provocaram alterações em FCA; o grupo II (26,7 ± 3,5) mostrou uma significante
porcentagem de expressão da SOD em FCA, demonstrando sua capacidade de provocar
lesões pré-malignas em cólon de roedores; por outro lado este estímulo de indução
carcinogênica foi protegido pela administração de IP6 representada pelos resultados do
GIV (20,9 ± 3,3). Conclusões: O estímulo carcinogênico do AOM proporcionou um
modelo de carcinogênese em colo de rato Wistar que foi protegido pela administração
do IP6, sendo que a expressão da SOD em FCA mostrou-se um parâmetro
imunoistoquímico confiável para representar as lesões pré-neoplásicas em FCA.
ABSTRACT
Objective: to develop an experimental model of carcinogenesis in Wistar rats induced
by the azoximethane and to establish a pattern of protecting action of the inositol
hexafosfate, for the expression of the enzyme superoxide dismutase in foci of aberrant
crypts. Methods: 48 Wistar male rats, adults, were maintained in observation by six
weeks. GI (n=12) received injections of subcutaneous saline solution during the third
and fourth weeks, while GII (n=12), in the same period, received 20mg.Kg-1 of
subcutaneous azoximetano (AOM). GIII (n=12) received inositol hexafosfato 1% (IP6)
in the drinking water during the six weeks, while GIV, besides IP6 in the drinking
water, also received the subcutaneous injections of AOM during the third and fourth
weeks. At the end of the sixth week large intestine segments were collected to the about
a centimeter of the ileo-colic transition. Fragments were prepared and submitted to the
imunohistochemical process to antibody primary anti-SOD1 (superoxide dismutase1)
and antibody secondary anti-rat, color discloser DAB (diamino-benzidina) with
expression obtaining SOD1 in the brown coloration. The percentage of the expression
of SOD in FCA (focus of aberrant crypt) was quantified through image processing
attended by computer (ImageLab). The results were submitted to the tests of variance
analysis (ANOVA) and established the level of 5% (p≤0.05) for rejection of the nullity
hypothesis. Results: the medium percentage of the expression of SOD in GI (16.0 ±
3.7) was similar to GIII (16.9 ± 3.1) showing that the saline solution (controls) and IP6
didn't provoke alterations in FCA; the group II (26.7 ± 3.5) showed a significant
percentage of expression of SOD in FCA, demonstrating the capacity to provoke
preneoplasic lesions in colon of rodents; on the other hand this promotion of
carcinogenic induction was protected by the administration of IP6 showed by the results
of GIV (20.9 ± 3.3). Conclusions: The carcinogenic action of AOM provided a
carcinogênese model in colon of Wistar rat that was protected by the administration of
IP6, and the expression of SOD in FCA was a histochemical parameter reliable to
represent the preneoplasic lesions in FCA.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................
01
2. OBJETIVOS.....................................................................................................
05
3. MÉTODOS........................................................................................................
06
4. RESULTADOS.................................................................................................
18
5. DISCUSSÃO.....................................................................................................
26
6. CONCLUSÕES.................................................................................................
31
7. REFERÊNCIAS................................................................................................
32
8. NORMAS ADOTADAS...................................................................................
36
APÊNDICE.......................................................................................................
37
1. INTRODUÇÃO
A prevalência e a incidência do câncer de colo são variáveis entre as diferentes
populações humanas. Evidências epidemiológicas indicam que estas diferenças são
influenciadas fortemente pela área geográfica, cultura e hábitos alimentares
1,2
.
A ocorrência de lesões pré-neoplásicas e neoplásicas no cólon e reto estão
associadas com a biotransformação, bem como a ativação ou detoxicação de produtos
químicos exógenos ingeridos na dieta
3
.
O entendimento das lesões pré-neoplásicas ou pré-cancerosas do cólon e reto é
fundamental para o esclarecimento dos mecanismos da carcinogênese colorretal e a
prevenção da ocorrência do câncer colorretal, a maior causa de doença e morte em muitos
países
3
.
Focos de criptas aberrantes (FCA), inicialmente identificadas na mucosa colorretal
de roedores expostos à ação de substâncias carcinogênicas
4,5
foram também reconhecidos e
identificados em humanos
6
e desde então considerados como um marcador biológico
confiável de lesões pré-cancerosas ou pré-neoplásicas do intestino grosso
3
.
FCA são conceituados como criptas simples ou múltiplas que têm a abertura
luminal alterada, epitélio mais espesso e são maiores que as criptas adjacentes
7,8
. Os FCA
aumentam com os indutores carcinogênicos em mucosa colônica de hamsters e
camundongos, mas são praticamente evidenciados no cólon de todos os animais expostos à
carcinógenos específicos
6-10
. O rato da linhagem Fisher 344 é o que mais freqüentemente
citado na literatura como modelo animal na indução de FCA, pois nestes animais a
ocorrência espontânea de FCA é praticamente nula e são mais susceptíveis aa indução de
carcinogênese colônica por drogas
11,12
.
Dentre as drogas associadas à indução de FCA o azoximetano (AOM) é a que mais
largamente tem sido referida na literatura pertinente. Tem-se atribuído ao aumento da
expressão do gene c-fos e a diminuição do gene c-myc, assim como a mutação do gene K-
ras a responsabilidade pelo mecanismo de indução de lesões pré-neoplásicas do AOM
13-16.
Além disso, há uma relação estabelecida entre o estresse oxidativo e a lesão de estruturas
celulares na gênese das neoplasias
17
.
2
Evidências que apóiam o envolvimento de radicais livres em promoção de tumor
incluem: (a) várias combinações geradoras de radicais livres estão associadas aos
promotores de tumor em vários modelos de sistemas em animais; (b) sistemas geradores
espécies reativas de oxigênio (EROs) podem imitar a ação bioquímica de promotores de
tumor, (c) alguns promotores de tumor estimulam a produção de EROs, (d) os promotores
de tumor modulam os sistemas de defesa de antioxidantes celulares, e (e) remoção de
radicais livres, detoxificadores e antioxidantes inibem o processo de promoção de tumor. O
papel de EROs na progressão organizada da carcinogênese é evidente pelo fato que vários
radicais livres em diferentes combinações geradoras aumentam a conversão maligna de
papiloma benigno para carcinoma e a sua efetividade pode ser relacionada ao tipo de
radicais produzido no sistema biológico
17
.
A superóxido dismutase (SOD) é uma enzima responsável pela eliminação de
radicais superóxido e é considerada enzima antioxidante chave em células aeróbicas.
Consumo celular de oxigênio é essencial para fosforilação durante a geração ATP na
mitocôndria, já este metabolismo celular leva a produção de espécies reativas oxigênio,
incluindo o radical superóxido (O
²
-
) e hidrogênio peroxidase (H
²
O
²
-
). O acúmulo de Eros
resulta em estresse oxidativo, e se não corrigido, pode levar dano biomolecular da
membrana lipídica, proteínas citoplasmáticas e do DNA nuclear. Uma vez que a SOD é
enzima chave no primeiro degrau da eliminação de superóxido, deficiência de SOD ou
inibição da atividade enzimática pode causar acúmulo de radicais livres de oxigênio
e levar
à morte celular. Então a inibição da SOD pode ser uma nova forma de morte de células
cancerosas. Há hipótese de que inibição da SOD pode preferencialmente destruir células
malignas através de mecanismo mediado por radicais livres
18
.
Está demonstrado tanto in vivo quanto in vitro que os níveis de enzimas
antioxidantes estão alteradas no câncer. O achado mais consistente em estudos bioquímicos
têm sido a óxidodismutase-manganês (MnSOD), uma enzima antioxidante mitocondrial,
que está diminuída em muitos tipos de cânceres primários e linhagens de células de câncer
examinados
18
.
Entretanto, em outros tumores a SOD encontra-se elevada e o entendimento
de sua regulação no câncer é explicado pelo polimorfismo na seqüência do gene MnSOD
18
.
3
As características biológicas, patológicas e bioquímicas do mecanismo de
carcinogênese induzida ainda precisam ser melhor esclarecidas
13-15, 19
.
A análise do FCA na superfície da mucosa intestinal é simples e permite um
conveniente estudo in vivo da influência de agentes quimioprotetores e de outros
parâmetros como a inibição da proliferação celular e apoptose celular. Dentre estes
protetores inclui-se uma série de agentes naturais como os ácidos polifenólicos,
flavonóides, carotenóides e compostos organo sulfurados, assim como produtos químicos
sintéticos como os inibidores da ciclooxigenase2 (COX2), inibidores da enzima óxido
nítrico sintetase
3,20,21
.
Há uma relação inversa entre o consumo de dietas ricas em fibras derivadas de
grãos de cereais e o risco do câncer de cólon. Modelos em animais demonstraram que o
efeito protetor no desenvolvimento do câncer de cólon depende da fonte e da natureza da
fibra. Fibras do trigo inibem a carcinogênese colônica mais eficazmente que as fibras do
milho e da aveia
22
.
A propriedade das fibras de serem moduladoras da gênese tumoral está associada à
quantidade de ácido fítico ou hexafosfato de inositol (IP6). O ácido fítico é um constituinte
de ocorrência natural nas plantas, sendo encontrado em sua grande maioria nas leguminosas
e cereais, em especial no trigo e soja
23
.
O IP6 é um carboidrato polifosforilado presente em considerável quantidade em
quase todas as plantas e células dos mamíferos. Recentemente foi reconhecido como sendo
possuidor de múltiplas funções biológicas
24
.
Sua natural capacidade de anticancerígena foi demonstrada em diferentes modelos
experimentais. Acrescida à capacidade de reduzir a proliferação celular, o IP6 aumenta a
diferenciação das células malignas, freqüentemente resultando em reversão ao fenótipo
normal. Administrada por via exógena é rapidamente defosfoforilado em fostatos inusitois
de cadeia mais baixa as quais interferem no sinal das vias transdutoras do ciclo de
reprodução celular. Estimula as propriedades imunológicas e antioxidantes contribuindo
para a destruição das células tumorais. Por ser abundante na dieta regular, ser
eficientemente absorvido pelo trato gastrintestinal e seguro, o IP6 tem grandes perspectivas
na elaboração de estratégias para a prevenção e tratamento do câncer
24
.
4
O IP6 tem sido referido como tendo significantes efeitos inibitórios contra uma
variedade de tumores primários incluindo o de mama e de cólon
25
. Uma revisão na base de
dados Medline entre 1996 e 2002 revelou que, em modelos experimentais, o IP6 tem
propriedades anticancerígenas na mama, no cólon, no fígado, na próstata, na pele, em
leucemia e sarcomas
23
. Estas evidências em animal de experimentação dão suporte à
extensão da pesquisa em seres humanos nas fases clínicas I e II
23-25
.
Contudo muitos pontos ainda não esclarecidos do mecanismo de ação do IP6 podem
e devem continuar a serem testados em animal de experimentação. Existem na literatura
numerosas referências à diferentes tipos de modelos de experimentação animal testando as
propriedades do inositol hexafosfato (IP6).
É fundamental para testar-se os efeitos do IP6 a existência de um modelo de
carcinogênese in vivo que seja simples, confiável, exeqüível e em situações que exijam
pouco recursos tecnológicos. Um modelo de avaliação para estudo de câncer de cólon
usando biomarcadores como os FCA podem preencher estes requisitos.
O Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação dentro de uma linha
de pesquisa inicial em modelo animal de carcinogênese intestinal, em que tem a intenção de
estudar o efeito de drogas indutoras e protetoras de lesões précancerosas, propõe-se a
elaborar um modelo animal de carcinogênese que possa ser reprodutível e exeqüível em
nosso meio. Assim, a proposta desta pesquisa é utilizar o rato Wistar (Rattus norvegicus
albino) que submetido à ação do azoximetano possa produzir lesões colônicas típicas como
os FCA. Além disto, a proposta é também verificar a possibilidade de se utilizar a SOD
como marcador de estresse oxidativo nestes FCA e estabelecer sua relação com eventuais
drogas protetoras tendo como padrão de comparação o IP6.
5
2. OBJETIVOS
Geral: estudar a carcinogênese intestinal induzida por agentes oxidantes.
Específico: desenvolver um modelo experimental de carcinogênese em colo de rato
induzido pelo azoximetano e estabelecer um padrão de ação protetora do
hexafosfato de inositol, pela expressão da enzima superóxido dismutase em foco de
cripta aberrante.
3. MÉTODOS
O projeto de pesquisa foi aprovado pela Comissão de Ética Médica do Hospital São
Paulo – UNIFESP-EPM, sob o n° 28/05 e pela Comissão de Ética no Uso de
Animais/CEUA da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul – UFMS, protocolado sob
o n° 61/04.
Amostra
Foram utilizados 48 ratos Wistar (Rattus norvegicus albinus), machos, com oito
semanas de idade, peso médio de (156 ± 26) gramas, originários do Biotério Central da
Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS – Campus de Campo Grande).
Os animais foram alojados no Laboratório de Carcinogênese Experimental, Biotério
da UFMS em caixas de polipropileno com tampa de arame galvanizado, tamanho padrão
para cinco animais, ficando quatro animais em cada gaiola. A distribuição de animais nas
gaiolas foi por sorteio e as gaiolas foram distribuídas aleatoriamente na estante. Observou-
se período de sete dias para a adaptação dos animais ao ambiente. Exposição sob luz
artificial (130 a 325 lux) e com ciclos claro/escuro de doze horas. Temperatura média de
(24 ± 2)°C; umidade média entre (52 ± 8)%. Alimentação com ração própria para a espécie
(Nuvilab
®
, CR 01) oferecida à vontade; água filtrada oferecida à vontade.
Os animais foram distribuídos em quatro grupos por sorteio e ficaram em
observação por seis semanas. A identificação dos animais foi realizada por meio de
tatuagem na cauda, utilizando-se caneta de tinta indelével permanente, cor preta,
identificando-se os grupos de 1 a 4 e com a numeração alfabética crescente de A até M em
cada grupo.
Grupo I (controle): os animais (n=12) receberam a administração semanal de
solução salina de cloreto de sódio a 0,9%, via subcutânea, em volume equivalente 10ml.Kg
-
1
iniciando-se na terceira semana e por um período de duas semanas.
Grupo II (AOM): os animais (n=12) receberam a administração semanal de
azoximetano (AOM), via subcutânea, em volume equivalente a 10ml.Kg
-1
iniciando-se na
terceira semana e por um período de 2 semanas.
Grupo III (IP6): os animais (n=12) receberam a administração de hexafosfato de
7
inositol (IP6), iniciando-se na primeira semana por um período de seis semanas.
Administração semanal solução salina de cloreto de sódio a 0,9% via subcutânea,
iniciando-se na terceira semana e por um período de duas semanas, em volume equivalente
a 10ml.Kg
-1
.
Grupo IV (AOM + IP6): os animais (n=12) receberam a administração de
hexafosfato de inositol (IP6) iniciando-se na primeira semana por um período de seis
semanas. Administração semanal de azoximetano, iniciando-se na terceira semana e por um
período de duas semanas, em volume equivalente a 10ml.Kg
-1 i6
.
Grupo I
(n = 12)
Controle
Grupo II
(n = 12)
AOM
Grupo III
(n = 12)
IP6
Grupo IV
(n = 12)
IP6 + AOM
Ratos
n = 48
Figura 1 - Fluxograma da distribuição dos animais nos diversos grupos de estudo.
Procedimentos
Administração de drogas (Figura 2)
1- Hexafosfato de inositol - o IP6 (Sigma®, P3168) foi administrado em
água de beber com solução a 1% e oferecido à vontade aos animais dos
grupos III(IP6) e IV(AOM + IP6), durante as seis semanas de
observação.
2- Azoximetano – o AOM (Sigma®, lote 70K0847) foi administrado na
dose de 20mg.Kg
-1
(tendo-se: 100mg de AOM/0,1ml + 49,9ml de solução
salina de cloreto de sódio a 0,9%; resultando em 2mg AOM/ml), via
subcutânea, nos animais dos grupos II(AOM) e IV(AOM + IP6),
iniciando-se na terceira semana e por um período de duas semanas.
8
3- Solução salina de cloreto de sódio a 0,9% - aos animais dos grupos
I(controle) e III(IP6) foi administrada solução salina de cloreto de sódio a
0,9% em volume de 10ml.Kg
-1
, via subcutânea; corresponde ao volume
de diluição do AOM nos animais dos grupos II(AOM) e IV(AOM+IP6),
iniciando-se na terceira por um período de duas semanas.
Semanas
01 02 03 04 05 06
Grupo I
S.F.0,9% S.F.0,9%
Grupo II
AOM AOM
Grupo III
IP6 IP6 IP6 IP6 IP6 IP6
Administração
de substancias
Grupo IV
IP6 IP6 IP6+AOM IP6+AOM IP6 IP6
Figura 2 - Esquema de aplicação das drogas aos animais ao longo das seis semanas de
observação.
Período de observação
Os animais dos quatro grupos foram avaliados diariamente pelo tratador e pelo
pesquisador. Foram pesados semanalmente e avaliados quanto à capacidade de
movimentação espontânea e estimulada na gaiola, aceitação e consumo da dieta e água,
aspectos da pelagem, características das fezes e sinais de sofrimento (imobilização,
freqüência respiratória e presença de secreção ocular).
Eutanásia
9
Ao final do período de seis semanas, os animais devidamente identificados foram
pesados e submetidos a administração de tiopental sódico na dose de 150mg.Kg
-1
, via
intraperitoneal, cuja dose letal causou o óbito de modo rápido e indolor por ação nervosa
central com parada cardio-respiratória.
Coleta de material
O rato foi imediatamente posicionado em decúbito dorsal, procedeu-se a incisão
longitudinal mediana na pele, estendendo-se do processo xifóide até o púbis; diérese dos
planos da parede abdominal; identificação região ileocecal; enterotomia completa em nível
do íleo terminal; à cerca de cinco centímetros da transição ileocecal, colectomia direita após
secção de toda extensão do meso-cólon direito e retirada da peça operatória.
Preparo da peça operatória para fixação
Abertura do cólon pela borda anti-mesentérica; lavagem da mucosa com solução de
Ringer; ressecção de um segmento de cólon direito com extensão de 1cm de comprimento,
distal à transição ileocecal (Figura 2); afixação do retalho de cólon pelas suas extremidades
entre duas placas de molde plástico duplo e rígido para manter o segmento intestinal
retificado em um plano uniforme; colocação da peça em frasco contendo formol tamponado
a 10% em volume suficiente para cobri-la completamente, permanecendo assim durante 24
horas.
10
1
2
Figura 3 - Foto da peça operatória mostrando: 1) íleo terminal e o ceco direito; 2)
segmento de cólon direito e a secção do ceco a partir da válvula íleo cecal e
aberto pela borda anti-mesentérica.
Preparo de blocos e lâminas
As peças foram incluídas em parafina (mantendo-se identificação da amostra);
seguindo rotina de preparo padronizado dos procedimentos histológicos. As peças
emblocadas de modo a manter a forma de um plano retificado, foram seccionadas com
micrótomo em corte sagital da parede do cólon, interessando três micrômetros de espessura.
Fixação em lâmina de vidro silanizada do corte e identificação do grupo e correspondente
animal.
Procedimento de coloração imuno-histoquímica
O processamento imuno-histoquímico foi realizado com a utilização de anticorpo
primário anti-SOD1 (SantaCruz Biotechnology Inc®) diluição 1:500. Anticorpo secundário
anti-rato. Revelador de cor DAB (diamino-benzidina); e obtenção de expressão SOD1 na
coloração marrom.
11
Seqüência da coloração imuno-histoquímica:
a) Preparação dos cortes histológicos (desparafinização e hidratação):
- Xilol a 60 °C por 15 minutos
- Xilol a temperatura ambiente por 15 minutos
- Etanol 100% (3x) por 30 segundos
- Etanol 95% por 30 segundos
- Etanol 80% por 30 segundos
- Etanol 70% por 30 segundos
b) Recuperação antigênica:
- Incubação das lâminas em solução de recuperação antigênica em panela à
vapor a 95 °C na diluição 1:10 durante 20 minutos.
c) Bloqueio da peroxidase endógena com solução de peróxido de hidrogênio a 3%
em metanol, em dois banhos de 10 minutos cada; após realizar lavagem em água
corrente e destilada e tampão TRIS.
d) Diluição de anticorpo primário anti-SOD1 a 1:100 com diluente de anticorpo
marca Dako, código K0609-1.
e) Aplicação do anticorpo primário anti-SOD1 (Santa Cruz, código SC11047) nas
lâminas por 30 minutos.
f) Lavagem com tampão TRIS.
g) Aplicação do polímero conjugado à peroxidase, por 30 minutos.
h) Lavagem com tampão TRIS.
i) Aplicação da solução de substrato-cromógeno DAB, diluída a 1:10 por 5 minutos.
j) Lavagem em água destilada.
k) Contra coloração das lâminas com hematoxilina de GILL II, por um minuto.
l) Lavagem das lâminas em água destilada por 2 minutos.
m) Hidratação das lâminas em passagem de 30 segundos cada, em etanol, conforme
o passo (a) da seqüência de coloração.
n) Montagem com lamínula com resina de Entellan.
Equipamento de captura de imagens da microscopia óptica.
12
Microscopia óptica realizada utilizando-se Microscópio (Nikon®, modelo Elipse
E200), lente binocular com aumento 10X e objetiva aumento 10X/0,25. Acoplado à câmera
de vídeo (Samsung®, modelo SCC131); conexão ao microcomputador via placa de vídeo
Pinnacle Studio® PCTV – USB; microcomputador Duron® 750 Mhz, 128 Mb Ram, HD
20 Gigabytes e sistema operacional Microsoft Windows® 98 SE.
Figura 4 - Foto da imagem da tela de computador onde são identificadas as diversas etapas
da captura e cálculo da quantificação da superóxido dismutase.
Procedimento de leitura e quantificação da expressão de SOD.
Realizou-se a quantificação da SOD1 através de processamento de imagem assistida
por computador com a utilização do Software ImageLab®, em dez imagens capturadas em
cada animal; cada imagem capturada arquivada (para documentação) seguindo-se
codificação elaborada
26
. Quantificação da densidade de cor marrom (utilizando o filtro
13
RGB, cor de fundo azul, intervalo de cor de 0 a 147) que corresponde à fração de área
capturada-T2 com a expressão SOD1, pela área total capturada
26
(Figura 3). Para
quantificação foram examinadas e selecionadas as criptas e FCA ,dependendo do grupo,
(Figura 4), sendo que na presença de vários FCA foram escolhidos os FCA com duas
criptas. Na ausência de FCA (com 2, 3 e 4 criptas), foram selecionadas criptas
aleatoriamente (cripta ou FCA com uma cripta).
14
Figura 5 – Foto de uma imagem capturada para exemplificar a quantificação da área com a
expressão SOD1 (área azul). Imunoistoquímica. 400X.
Critérios de identificação dos FCA
Focos de cripta aberrante são conceituados como criptas simples ou múltiplas que
têm a abertura luminal alterada, epitélio mais espesso e são maiores que as criptas
adjacentes. As figuras 6, 7 e 8 são representativas destes critérios de identificação.
Figura 6 - Identificação de um foco de cripta aberrante segundo o critério de alargamento
do eixo maior da abertura do óstio do lúmen (seta). Imunoistoquímica. 400X.
15
Figura 7 - Identificação de um foco de cripta aberrante segundo o critério de espessamento
do epitélio (setas). Imunoistoquímica. 400X.
16
Figura 8 - Identificação de um foco de cripta aberrante segundo o critério de extensão do
eixo maior da cripta em relação às adjacentes (seta). Imunoistoquímica. 400X.
Estudo Estatístico
A Análise Estatística desse estudo foi realizado na Disciplina de Bioestatística da
UFMS. De acordo com a natureza das variáveis foram usados os testes:
17
- teste ANOVA para avaliação da média dos pesos por ocasião da distribuição
aleatória dos grupos no início do experimento e da diferença do ganho de peso entre os
grupos;
- o teste ANÁLISE DE VARIÂNCIA foi usado para avaliar a quantificação da
expressão de superóxido dismutase entre os grupos do experimento.
Estabeleceu-se o nível de 5% (p≤0,05) para rejeição da hipótese de nulidade
assinalando com um asterisco os valores significantes.
4. RESULTADOS
Tabela 1 - Distribuição do peso (em gramas) inicial, média da variação ponderal e desvio
padrão dos animais no Grupo I (controle), Grupo II (AOM), Grupo III (IP6) e
Grupo IV (IP6/AOM).
Peso (g)
Grupos
Administração
Substâncias
n
inicial final média
desvio
padrão
p
I
Controle
12 1855 3420
140,3
± 22,8
II AOM 12 2061 3619 129,8 ± 13,4
III IP6 12 1932 3420 124,0 ± 25,5
IV IP6/AOM 12 1876 3420 128,7 ± 22,9
0,3196
Gráfico 1 - Distribuição do peso (em gramas) inicial, média da variação ponderal nos animais
do Grupo I (controle), Grupo II (AOM), Grupo III (IP6) e Grupo IV (IP6/AOM).
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
I II III IV
peso inicial
peso final
média da variação
ponderal
19
Tabela 2 - Distribuição dos valores individuais da porcentagem da expressão de SOD em
FCA, quantificada por meio de processamento de imagem assistida por
computador,
nos diversos animais do Grupo I (controle), Grupo II (AOM),
Grupo III (IP6) e Grupo IV (IP6/AOM), com respectivas médias, desvio-
padrão e coeficiente de variância.
GRUPOS
AMOSTRA
I II III IV
A
13,3 24,8 18,9 20,7
B 22,8 21,2 14,3 21,4
C 14,6 24,9 19,7 23,3
D 9,9 24,7 16,9 19,9
E 12,4 24,2 16,7 22,8
F 21,7 32,6 15,1 17,1
G 16,0 33,1 15,5 25,1
H 15,8 24,5 21,4 23,9
I 17,0 26,5 17,3 16,4
J 15,5 26,8 20,7 23,3
L 13,5 30,2 16,0 14,7
M 18,9 25,4 10,2 22,1
Média +
Desvio Padrão
16,0 ± 3,7 26,7 ± 3,5 16,9 ± 3,1 20,9 ± 3,3
Coeficiente de
variância
13,3 23,5 18,2 15,7
G I < G II*
G I = G III
G I < G IV*
G II > G III*
G II > G IV*
G III < G IV*
20
Gráfico 2 – Distribuição dos valores médios e do desvio-padrão da porcentagem da expressão
de SOD, quantificada por meio de processamento de imagem assistida por
computador, comparando os Grupos entre si, dois à dois, de acordo com a
significância estatística encontrada e mostrada na Tabela 2.
0
5
10
15
20
25
30
35
Média e
desvio-
padrão da
expressão
de SOD
GI<GII GI=GIII
GI<GVI
GII>GIII
GII>GIV
GIII>GIV
Comparação entre os grupos dois à dois
Tabela 3 - Distribuição da média e desvio-padrão da porcentagem de expressão de
SOD em FCA, quantificada por meio de processamento de imagem
assistida por computador, nos diversos animais do Grupo I (controle),
Grupo II (AOM), Grupo III (IP6) e Grupo IV (IP6/AOM).
Variáveis de estudo
Expressão SOD1
Média
p*
Grupo I 16,0 ± 3,7
Grupo II 26,7 ± 3,5
Grupo III 16,9 ± 3,1
Grupo IV 20,9 ± 3,3
0,0078
F= 4,5085. * significância, p ≤ 0,05
21
Gráfico 3 - Distribuição da média e desvio-padrão da porcentagem de expressão de SOD em
FCA, quantificada por meio de processamento de imagem assistida por
computador, nos diversos animais do Grupo I (controle), Grupo II (AOM),
Grupo III (IP6) e Grupo IV (IP6/AOM).
0
5
10
15
20
25
30
35
Média e
desvio-padrão
da
porcentagem
da expressão
de SOD
I II III IV
Grupos de estudo
22
Figura 9 – Fotomicrografia característica de um animal do grupo I (controle) mostrando um
foco de cripta aberrante (FCA) com a corresponde expressão de SOD-1 em
coloração marrom decorrente do revelador DAB utilizado na
imunohistoquímica.(400X).
Figura 10 – Fotomicrografia característica de um animal do grupo I (controle) mostrando um
foco de cripta aberrante (FCA) com a corresponde expressão de SOD-1 em
coloração azul decorrente do processamento de imagem assistida por computador.
(400X).
23
Figura 11 – Fotomicrografia característica de um animal do grupo II (AOM) mostrando um
foco de cripta aberrante (FCA) com a corresponde expressão de SOD-1 em
coloração marrom decorrente do revelador DAB utilizado na
imunohistoquímica.(400X).
Figura 12 – Fotomicrografia característica de um animal do grupo II (AOM) mostrando um
foco de cripta aberrante (FCA) com a corresponde expressão de SOD-1 em
coloração azul decorrente do processamento de imagem assistida por computador.
(400X).
24
Figura 13 –
Fotomicrografia característica de um animal do grupo III (IP6) mostrando um foco de
cripta aberrante (FCA) com a corresponde expressão de SOD-1 em coloração marrom
decorrente do revelador DAB utilizado na imunohistoquímica.(400X).
Figura 14 –
Fotomicrografia característica de um animal do grupo III (IP6) mostrando um foco de
cripta aberrante (FCA) com a corresponde expressão de SOD-1 em coloração azul
decorrente do processamento de imagem assistida por computador. (400X).
25
Figura 15 – Fotomicrografia característica de um animal do grupo IV (IP6/AOM) mostrando um
foco de cripta aberrante (FCA) com a corresponde expressão de SOD-1 em coloração
marrom decorrente do revelador DAB utilizado na imunohistoquímica.(400X).
Figura 16 –
Fotomicrografia característica de um animal do grupo IV (IP6/AOM) mostrando um
foco de cripta aberrante (FCA) com a corresponde de expressão SOD-1 em coloração azul
decorrente do processamento de imagem assistida por computador. (400X).
5. DISCUSSÃO
O entendimento sobre a natureza e desenvolvimento das lesões pré-neoplásicas
ou pré-cancerosas que ocorrem na mucosa do cólon e reto são fundamentais para o
esclarecimento dos mecanismos da carcinogênese colorretal
4
.
O intestino delgado e o grosso são importantes barreiras contra agentes exógenos
incluindo as substâncias carcinogênicas. A ocorrência de lesões pré-neoplásicas está
relacionada à biotransformação, ativação ou detoxicação e ingestão de substâncias
químicas exógenas
4
.
A lesão pré-neoplásica ou pré-cancerosa do cólon pode ser caracterizada em
termos morfológicos e pelo fenótipo histoquímico. Entretanto, a histogênese e as
relações das diversos tipos de lesões malignas ainda não estão inequivocamente
determinadas. Focos de cripta aberrante (FCA) identificados na mucosa do cólon de
roedores e seres humanos é frequentemente usado como um confiável biomarcador para
detecção experimental de agentes quimiopreventivos contra câncer colorretal, embora a
natureza da instalação da FCA e sua valorização como biomarcador em roedores e
humanos ainda seja motivo de maiores esclarecimentos
4-6.
.
A ocorrência espontânea de FCA em ratos tem uma freqüência baixa
19,27,28
, mas
existe uma clara associação do aumento do número de criptas isoladas ou múltiplas com
aberrações morfológicas após a exposição à substâncias carcinogênicas
7-10
.
Considerando a relevância da doença neoplásica e a importância das propostas
preventivas, assim como da necessidade de maiores informações sobre o mecanismo de
instalação e manifestação das lesões pré-neoplásicas, procurou-se estabelecer um
modelo experimental em ratos com o intuito de iniciar uma linha de pesquisa em
carcinogênese.
O rato da linhagem Fisher 344 é o que mais freqüentemente citado na literatura
como modelo animal na indução de FCA, pois nestes animais a ocorrência espontânea
de FCA é praticamente nula e são mais susceptíveis à indução de carcinogênese
colônica por drogas
11,12
. Há poucos relatos utilizando o rato Sprague-Dawley
29, 30
ou o
rato Wistar
31
. Para desenvolver um modelo experimental foi escolhido o rato Wistar,
pelo seu uso difundido e fácil obtenção adequando-se assim às condições do nosso
meio. Os resultados, que serão analisados detalhadamente mais adiante, mostraram que
27
foi possível identificar os focos de cripta aberrante na mucosa do cólon distal e
passiveis de diferenciar os grupos de indução por droga carcinogênica e os grupos
controle e sob ação de drogas quimioprotetoras.
O modelo estudado deu enfoque para a indução de curta duração com o emprego
do azoximetano recomendado pela Organização Mundial de Saúde (Internacional
Agency for Research on Cancer – IARC)
32
também já estabelecido como um
procedimento padrão para estudos de carcinogênese de cólon
33
.A manifestação de
criptas únicas ou múltiplas com características morfológicas aberrantes já está também
plenamente referendada pela literatura pertinente como um parâmetro confiável para
avaliação da indução de lesões pré-neoplásicas e seu controle por substâncias
quimioprotetoras
33-38
.
O desenvolvimento de estratégias para quimioprevenção do câncer colorretal
tem sido facilitado pelos relevantes modelos em animais de experimentação que
mimetizam os processos neoplásicos que ocorrem em humanos, incluindo similaridades
na histopatologia e nas lesões moleculares e genéticas durante os estágios iniciais e de
promoção e manutenção da carcinogênese
33
.
Estudos com o azoximetano em ratos têm mostrado que determinadas
substâncias naturais ou sintéticas podem influir de modo decisivo na manifestação de
lesões pré-neoplásicas, diminuindo ou abolindo suas manifestações
33
. Estas substâncias
devem combinar benefícios clínicos com mínina toxicidade. A história natural do câncer
colorretal, desde as criptas aberrantes displásicas até adenomas e adenocarcinomas,
oferece múltiplas oportunidades para avaliar e intervir. É preciso identificar os alvos
moleculares que são críticos no crescimento e sobrevivência da célula maligna
colorretal e os fatores que modulam este mecanismo
33
.
Há uma vasta gama de agentes que foram identificados no desenvolvimento de
câncer de cólon em animais. Isto sugere que o câncer de cólon em humanos pode ser
conseqüência de diversos tipos de deficiências no estilo de vida, uma vez que
determinadas substâncias presentes na dieta quando suprimidas aumentam o
aparecimento de displasia em criptas do cólon. Por outro lado dietas contendo gordura
ômega 3 (
3 fatty acids -3 PUFAs), antiinflamatórios não hormonais, inibidores da
COX2 e inibidores da óxido nítrico sintetase (iNOS) e curcumin podem reduzir a
incidência de câncer colorretal
33
.
O inositol hexafosfato (IP6) é um carboidrato polifosoforilado encontrado em
fontes alimentícias naturais ricas em fibras, embora esteja praticamente presente em
28
todas as espécies de plantas em quantidades variáveis. Também é identificável em
várias células animais. O IP6 tem sido associado com efeitos inibitórios sobre uma
grande variedade de tumores inclusive de mama, pâncreas e cólon. O IP6 age reduzindo
a proliferação celular e aumentando a diferenciação de células malignas, o que
frequentemente resulta em regressão ao fenótipo normal. Estimula as propriedades
imunológicas do organismo contribuindo para a destruição das células tumorais. Tem
ação antioxidante uma vez que o IP6 exógeno uma vez administrado é desfosforilado
em inositol fosfatos, o que interfere no sinal de transdução e no ciclo vital da célula.
Uma vez que é abundante na dieta regular, é eficazmente absorvido pelo trato
gastrointestinal e é seguro, quase isento de toxicidade, figura como uma opção atraente
nas estratégias de prevenção e tratamento do câncer ou na melhora da qualidade de vida
em pacientes com metástases e/ou em tratamento com quimioterapia
24
.
Contudo para a consecução do modelo experimental a identificação e contagem
dos focos de criptas aberrantes mostrou-se um procedimento trabalhoso e sujeito à
variações e vieses comuns às contagens que dependem de uma caracterização
qualitativa. Informações da literatura sugerem que o estresse oxidativo é um evento
precoce na carcinogênese e que a expressão da superóxido dismutase (SOD) está
alterada em diversos tecidos com neoplasia
40
. Deste modo procurou-se inovar o
processo de identificação e quantificação dos focos de criptas aberrantes à partir de um
projeto piloto que mostrou haver correlação entre a expressão da SOD, marcada por
imunoistoquímica e a mensuração por colorização computacional das áreas
correspondentes a imunomarcação.
A contagem de dez campos aleatórios com arquivamento e contagem total de
cada animal permitiu um tratamento estatístico confiável para os resultados obtidos. A
padronização do filtro RBG (red-blue-green) e da intensidade da imunocoloração
permitiu uma uniformidade dos resultados minimizando ou impedindo as eventuais
falhas na mensuração das áreas e no cálculo dos porcentuais da expressão da SOD
26
.
As figuras 5 à 12 apresentam fotomicrografias características de cada grupo de
animais, tanto na fase de imunocoloração quanto na fase de marcação colorimétrica para
a leitura computacional. É possível identificar as criptas aberrantes e a coloração
marrom permite verificar a expressão da SOD nestas mesmas criptas.
Os resultados referentes à evolução ponderal dos animais mostraram que houve
um ganho de peso em todos os grupos, uma vez que se tratava de animais adultos jovens
(três meses de idade) e que normalmente ganham peso até por volta do sexto mês de
29
vida. A média da variação ponderal foi semelhante para todos os grupos, sem diferença
estatisticamente significante (Tabela 1 e Gráfico1). Deste modo pode-se inferir que o
IP6 ou mesmo o azoximetano (AOM), nas doses empregadas não apresentaram efeitos
tóxicos, o que certamente influiria na ingestão alimentar destes animais e
consequentemente no peso corporal.
A expressão da SOD nos animais do grupo I (16,0 ± 3,7), em que nenhuma
droga foi ministrada permite verificar que a superóxido dismutase é uma enzima
presente nas células das criptas intestinais do cólon e que podem estar relacionadas com
a atividade exercida por este tecido de funcionar como uma barreira aos fatores
agressivos exógenos em que existem em quantidade variável no lúmen intestinal.
Devido ao processo de mensuração empregado não foi possível comparar estes achados
com os de outros na literatura que usam metodologia diversa. No entanto, é referida na
literatura alta atividade de SOD em diversos tecidos em condições fisiológicas tais
como tecido hepático, células do miocárdio, células de músculos estriados, células
acinares do pâncreas, células epiteliais do túbulo renal, células epiteliais do intestino
delgado e cólon.
41-43
.
Os animais do grupo III, que receberam o IP6 (16,9 ± 3,1) na água de beber, não
mostraram diferença estatisticamente significante na expressão da SOD em relação aos
animais do grupo I (16,0 ± 3,7). Isto significa que o IP6 em condições fisiológicas não
interfere na manifestação da SOD e, portanto não interfere nos processos do estresse
oxidativo em condições fisiológicas.
Por outro lado os animais do grupo II (26,7 ± 3,5) que receberam o azoximetano
em duas doses subcutâneas mostraram uma diferença estatisticamente significante na
expressão da SOD em relação aos grupos I (16,0 ± 3,7 ) e II (16,9 ± 3,1 ), identificando
que o processo de lesão pré-neoplásica, caracterizado pela presença do foco de cripta
aberrante está associado ao estresse oxidativo de forma marcante. Assim para o
desenvolvimento do modelo experimental mostrou-se que há uma relação entre a
presença de cripta aberrante e a expressão da SOD e que esta relação pôde ser
estabelecida pela metodologia proposta por esta pesquisa.
A expressão da SOD nos animais do grupo IV (20,9 ± 3,3), que receberam a
injeção de azoximetano (AOM) e concomitante ingestão oral de IP, mostrou diferença
estatisticamente significativa em comparação com os animais do grupo II (26,7 ± 3,5),
que não receberam o IP6. Deste modo ficou demonstrado que o IP6 tem ação
30
antioxidativa, diminuindo a expressão da SOD nas criptas aberrantes e, portanto
favorecendo uma ação protetora contra as lesões pré-neoplásicas.
De acordo com a estratégia de organizar um modelo experimental para estudo da
carcinogênese em mucosa de cólon de rato mostraram-se pertinentes as escolhas
realizadas para o tipo de animal (rato Wistar), para o tipo de indutor carcinogênico
(azoximetano), para o tipo de critério de avaliação do mecanismo de carcinogênese
(focos de cripta aberrante) e o tipo de substância inibidora (IP6) para testar a eficácia do
modelo. A inovação ficou por conta da medição da expressão da superóxido dismutase
tanto na sua concepção de associação com o estresse oxidativo e carcinogênese como
pelo método de associar a imunoistoquímica com a coloração e medição por
computador
Os resultados encontrados mostraram que o modelo proposto é factível e
confiável, reforçando o uso do rato Wistar como animal de experimentação na pesquisa
de focos de cripta aberrante, e que estes resultados se sobrepõe à outros trabalhos
referidos na literatura.
O modelo proposto, no entanto precisa ser testado mais vezes e aprimorado em
alguns aspectos práticos de sua execução, mas contribuiu para estabelecer um modelo
adaptado às condições do nosso meio. Deverá ser aplicado para esclarecer os relevantes
mecanismos envolvidos no desencadeamento e manutenção das lesões pré-neoplásicas e
nos fatores protetores e inibidores destas lesões.
6. CONCLUSÕES
1 – O rato Wistar (Rattus norvergicus albinus) mostrou ser um modelo viável e confiável de
indução de foco de cripta aberrante (FCA) induzido pelo azoximetano (AOM).
2- O azoximetano (AOM) induziu a formação de focos de cripta aberrantes (FCA) em
proporção estatisticamente significante em colo distal de ratos Wistar.
3- O fosfato de inositol (IP6) mostrou ser uma substância capaz de inibir a manifestação de
focos de cripta aberrantes em colo de ratos Wistar, induzidas pelo azoximetano.
4- A expressão da enzima superóxido dismutase (SOD) por marcação imunohistoquímica
mostrou ser um método confiável para marcação biológica de estresse oxidativo em focos de
cripta aberrantes (FCA) induzidos pelo azoximetano (AOM).
7. REFERÊNCIAS
1- Furtunato DMN, Trigueiro, INS, Góes JAW. Fitatos na alimentação humana: uma visão
abrangente. Hig Aliment. 2003;17(107):16-20.
2 - Domínguez, BM, Gómez MVI, León FR. Phytic acid: nutritional aspects and analytical
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8. NORMAS ADOTADAS
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. Apresentação
de originais:NB-1139. Rio de Janeiro, 2000.
CONSELHO NACIONAL DE SAÚDE - n°. 01/88: Normas de pesquisas em
saúde. Bioética 1955, 3:137-54.
DeCS – Descritores em Ciências de Saúde. 3
ª
. ed. São Paulo. Bireme; 1992.
FAGUNDES DJ. NORMAS PARA ELABORAÇÃO DE RELATÓRIO DE PESQUISA.
São Paulo: UNIFESP-EPM-TOCE; 2001. Disponível em http://www.unifesp.br/dcir/toce/pg
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FAGUNDES DJ. NORMAS PARA CITAÇÕES E REFERÊNCIAS. São Paulo: Unifesp-
EPM-TOCE, 2001. Disponível em http://www.unifesp.br/dcir/toce/pg
.
UNIFORM REQUIREMENTS FOR MANUSCRIPTS SBMITTED TO BIOMEDICAL
JOURNALS. INTERNATIONAL COMMITTEE OF MEDICAL EDITORS. Ann Intern
Med 1997, 126:36-47.
9. APÊNDICE
PROTOCOLO
Data de início de administração de drogas: ...... / ......../ ..........
Grupo (sorteio): GI GII GII GIV
Animal Número (sorteio): 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Sexo: ....................... Peso: ................. gramas Idade: ....................
Droga: Solução salina IP6 Azoximetano
Semanas:
1 ...... / ......../ .......... 2 ...... / ......../ .......... 3 ...... / ......../ ..........
4...... / ......../ .......... 5...... / ......../ .......... 6...... / ......../ ..........
Volume: ......................... Dose: .................................
Coleta de segmento intestinal Data: ...... / ......../ ..........
Anestésico: .............................Volume: ...................................Dose: ................................
Número do frasco de coleta: ..............
Processamento da Microscopia Óptica – Data: ...... / ......../ .........
Descrição do FCA: ...........................................................................................................
..........................................................................................................................................
Porcentagens da Expressão da SOD: ...............................................................................
...........................................................................................................................................
Observações :
Figura 14 –Apêndice – Cópia do ficha padronizada para as anotações pertinentes a cada
animal em cada grupo de estudo.
38
PLANILHAS DOS RESULTADOS DA IMUNOISTOQUÍMICA EM 10 FOCOS DE
CRIPTAS ABERRANTES DE CADA ANIMAL
Grupo I - controle
Grupo 1
RATO
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
Média G1
A 14,3 18,6 12,3 9,8 8,3 6,3 9,8 26,6 16,4 11 13,
3
B 23,8 36 34,2 32,4 15,9 26,8 17,4 11,3 13,6 16,4 22,
8
C 14,8 13,9 15,1 14,9 11,2 11 9,6 21,4 17,7 15,9 14,
6
D 9,4 7,5 8,8 8,3 5,6 9,2 9,1 12,7 15,4 13,2 9,9
E 10,6 14,7 12,8 11,3 9 21 10,2 10,7 13,4 10,2 12,
4
F 19,8 26,9 29,8 19,6 26,7 16,9 13,5 24,7 18,3 21 21,
7
G 19,5 14 13,5 13,6 13,6 15,3 13,5 18,2 18 21,9 16,
0
H 15,8 16,9 17,7 18,2 11,9 12,4 13 22,1 14,2 15,6 15,
8
I 19,9 13,4 14 17,3 18,4 21,5 18 12,6 17,6 17,3 17,
0
J 16,4 6,7 7,7 14,3 18,1 16,5 21,4 18,4 17,9 17,4 15,
5
L 11 12,4 11,4 11,5 11,1 8,3 9,9 16,1 25,7 17,9 13,
5
M 11,6 15,4 21,2 26,9 23,6 19,8 21,1 17,9 16,4 15 18,
9
Média 16,
0
39
PLANILHAS DOS RESULTADOS DA IMUNOISTOQUÍMICA EM 10 FOCOS DE
CRIPTAS ABERRANTES DE CADA ANIMAL
Grupo II - AOM
Grupo 2
RATO
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
Média G2
A 9,7 23,6 24,7 25,6 22,2 21,9 24,4 38,5 30 27,2 24,8
B 19,7 27,8 19 15,8 16,3 16,7 21,3 33,5 20,2 21,4 21,2
C 26,2 18,4 32,8 25,8 26,5 28 29,1 24 19,8 18,8 24,9
D 28,1 14 24,2 20,8 20,9 20 15,9 29,3 36,5 37,7 24,7
E 23,9 26,8 29,8 23,7 27,9 27,1 12,1 31,2 25,1 24,7 25,2
F 29,8 29,7 19,9 21,6 30,2 363,4 32,9 51,5 34,9 39,2 32,6
G 28,7 28,1 17,4 16,5 26,5 27 37,1 56,6 49,2 44 33,1
H 16,1 19,7 15,5 19 21,2 24,9 20,7 42,2 32,2 33,3 24,5
I 27 19 27,6 17,4 20,3 26,1 31,9 19,8 30 46,3 26,5
J 12,1 33,7 26,3 28,5 21,8 24,3 12,6 33,9 36,4 38,3 26,8
L 17,1 27 26,5 21,7 29,2 31 29,1 32,3 45,8 41,8 30,2
M 18,7 30,8 33,9 33,4 26,1 35,1 18,5 21,2 12,8 23,9 25,4
Média 26,7
40
PLANILHAS DOS RESULTADOS DA IMUNOISTOQUÍMICA EM 10 FOCOS DE
CRIPTAS ABERRANTES DE CADA ANIMAL
Grupo III – IP6
Grupo 3
RATO
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
Média G3
A 24,4 18,8 20 23,9 23,8 21,1 13,9 16,4 13,7 12,9 18,9
B 27,1 10,7 14 11,6 13,4 13,8 13,2 12,6 15,1 11,1 14,3
C 15,7 19,5 17,4 17,7 22,8 24,1 18,4 21,9 21,1 18,2 19,7
D 23,2 13,1 10,2 9,4 15,2 12,6 12,1 23 24,9 25,3 16,9
E 16,9 18,7 21,2 20,1 12,9 16,2 13,7 15 16,6 16 16,7
F 22,6 17,8 18,6 12 12,3 12,9 12,6 14,3 15,4 12,1 15,1
G 22 9,5 10,6 11 12,6 10,9 10,9 23,4 20,8 23,3 15,5
H 19,9 19,2 21,2 18,2 29,4 22,5 31,2 13,5 20,4 18 21,4
I 22,4 16,3 15,3 14,1 15,6 19,9 12,5 21,4 14,8 20,2 17,3
J 25,4 20,1 29,2 20,7 20,7 19,9 22,4 16,1 16,3 15,9 20,7
L 17,1 12,9 15,6 15,6 12,7 13,8 11,6 19,1 21,8 20,2 16,0
M 20,2 9,1 9,1 6 7,2 11,9 5,9 9,5 10,1 12,5 10,2
1 Média 16,9
41
PLANILHAS DOS RESULTADOS DA IMUNOISTOQUÍMICA EM 10 FOCOS DE
CRIPTAS ABERRANTES DE CADA ANIMAL
Grupo IV – AOM/IP6
Grupo 4
RATO
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
Média G4
A 11,6 18 22,6 29,1 14,4 17,4 21,2 26,1 21 25,6 20,7
B 20,1 28,7 22,2 18,2 37,7 19,1 21,6 10,8 18,9 16,4 21,4
C 22,2 30,6 27,6 23,7 21,7 21,6 24,4 17,5 20,3 23,8 23,3
D 25,4 24,9 16,8 13,6 9,5 24 18,7 15,7 25,1 25,3 19,9
E 20,2 20,6 17,8 12,9 34,5 23,4 28,6 27,1 27 16,1 22,8
F 25 17,7 9 16,6 26,3 13,1 9,9 15,8 16,7 20,8 17,1
G 31,5 19,7 24,4 21,1 21,2 30,9 25,6 30 25 31,4 25,1
H 28 18,9 21,5 22,5 17,9 25,7 21,6 26 29,9 27 23,9
I 16,5 20,7 18,3 13,6 15,8 15,2 18,1 16,9 15,2 13,8 16,4
J 28,6 26,7 17,4 12,9 17,2 27,8 33,7 16,9 26,5 25 23,3
L 18,6 13,4 10,6 15,1 14,5 16 17,5 13,7 13,6 13,6 14,7
M 23,7 29,3 26,2 20,4 22,3 15,3 26,5 18 19,5 20 22,1
Média 20,9
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