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ELIANE ALENCAR DO NASCIMENTO FEITOSA
ESTUDO DA ESTRUTURA RENAL NA SÍNDROME DE ISQUEMIA
E REPERFUSÃO EM MEMBROS POSTERIORES DE RATOS
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo – Escola Paulista
de Medicina para a obtenção do título de
Mestre em Ciências.
SÃO PAULO
2005
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ELIANE ALENCAR DO NASCIMENTO FEITOSA
ESTUDO DA ESTRUTURA RENAL NA SÍNDROME DE ISQUEMIA
E REPERFUSÃO EM MEMBROS POSTERIORES DE RATOS
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo – Escola Paulista
de Medicina para a obtenção do título de
Mestre em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Murched Omar Taha
Co-orientadora: Profa. Dra. Cristina Maeda Takiya
SÃO PAULO
2005
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Feitosa, Eliane Alencar do Nascimento
Estudo da estrutura renal na síndrome de isquemia e reperfusão em
membros posteriores de ratos./ Eliane Alencar do Nascimento Feitosa. –
São Paulo, 2005.
xiv, 41f.
Tese de Mestrado – Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista
de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Técnica Operatória e Cirurgia
Experimental.
Título em inglês: Study of renal structure on hindlimbs ischemia-
reperfusion injury in rats.
1.Estrutura 2. Rim 3. Isquemia 4. Membros Posteriores 5. Ratos
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
UNIFESP - EPM
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TÉCNICA OPERATÓRIA
E CIRURGIA EXPERIMENTAL
Coordenador: Prof. Dr. Djalma José Fagundes
TESE DE MESTRADO
Autor: Eliane Alencar do Nascimento Feitosa
Orientador: Prof. Dr. Murched Omar Taha
Co-orientadora: Profa. Dra. Cristina Maeda Takiya
Título: ESTUDO DA ESTRUTURA RENAL NA SÍNDROME DE ISQUEMIA E
REPERFUSÃO EM MEMBROS POSTERIORES DE RATOS
BANCA EXAMINADORA:
1-Presidente: Prof. Dr. Murched Omar Taha
Professor Afiliado do Departamento de Cirurgia da UNIFESP-EPM
MEMBROS EFETIVOS
2– Prof.Dr. João Francisco Júnior
Professor Adjunto da Disciplina Técnica Operatória e Cirurgia Experimental-UNIFESP-
EPM
3 -Prof. Dr. José Carlos Baptista Silva
Professor Adjunto Livre-Docente da Disciplina Cirurgia Vascular - UNIFESP – EPM
4 – Prof.Dr. Agostinho Manuel da Silva Ascenção
Professor Titular de Clínica Cirúrgica do Departamento de Cirurgia Geral e Especializada
da Escola de Medicina e Cirurgia da Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro
MEMBROS SUPLENTES
Prof. Dr. Cesar Orlando Peralta Bandeira
Professor Adjunto Departamento de Cirurgia da Universidade Estadual de Maringá
UNIFESP
iv
Dedicatória
Aos meus pais,
TEREZINHA e JOSÉ ALENCAR
Aos meus irmãos,
EVERALDO, ELAINE e ERALDO
Aos meus sobrinhos,
CYNTHIA, TIAGO, ARTHUR, LEANDRO, GLAUBER e
GABRIEL
Com o constante e imenso carinho sempre presente, sem os
quais não teria forças para continuar.
v
Agradecimentos especiais
Ao Prof. Dr. MURCHED OMAR TAHA, Professor do Programa de Pós-Graduação
em Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM, meu orientador
que, com toda a sua paciência, conhecimento e perseverança muito me ajudou nesta
jornada.
À Profa. Dra. CRISTINA MAEDA TAKIYA, Professora Adjunta do Departamento
de Histologia e Embriologia da UFRJ, minha co-orientadora que não mediu esforços
para a realização deste trabalho, sempre pronta a orientar a qualquer hora e em
qualquer dia.
Ao Prof. Dr. DJALMA JOSÉ FAGUNDES, Professor Adjunto da Disciplina de
Técnica Operatória e Cirurgia Experimental e Coordenador do Programa de Pós-
Graduação em Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM, por sua
contribuição para minha formação como pesquisadora.
Ao Dr. ARMANDO MESQUITA DE ARRUDA (in memoriam), inesgotável fonte
não só na área da Cirurgia Vascular, mas também em tudo que cerca um ser humano.
Sempre com o olhar voltado para o paciente como um todo, seu verdadeiro
ecossistema. Presença constante, apoiando, incentivando e orientando os meus
primeiros passos na cirurgia vascular.
vi
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. PAULO DE OLIVEIRA GOMES, a primeira pessoa que me recebeu na
UNIFESP-EPM, verdadeiro mestre que nos transmite a sua sabedoria com segurança,
carinho e respeito.
Ao Prof. Dr. JOÃO LUZ MOREIRA COUTINHO DE AZEVEDO, professor
sempre atento aos pequenos detalhes e dono de um entusiasmo imensurável.
À Profa. Dra. EDNA FRASSON DE SOUZA MONTERO, eminente professora e
pesquisadora
À Profa. Dra. YARA JULIÃO, Professora Adjunta da Disciplina de Bioestatística do
Departamento de Medicina Preventiva da UNIFESP-EPM, que demonstrou
sensibilidade, conhecimento e força de vontade ao realizar o estudo estatístico deste
trabalho.
Ao Prof. Dr. NEIL FERRIRA NOVO, Professor Adjunto do Departamento de
Medicina Preventiva da UNIFESP-EPM, que com simples e cotidianos exemplos faz
com que a bioestatística seja compreensível.
Ao Prof. Dr. ANTÔNIO LUIZ DE MEDINA, Professor Titular do Curso de
Especialização em Cirurgia Vascular da Pontifícia Universidade Católica do Rio de
Janeiro - PUC, pelo espírito nato de professor, chamando sempre atenção aos pequenos
detalhes para um melhor aprendizado.
Ao Prof. Dr. CARLOS ALBERTO BASÍLIO, Professor Titular do Departamento de
Anatomia Patológica do Hospital Universitário Gaffrée Guinle, pela acessibilidade e
paciência nos ensinamentos transmitidos durante o projeto piloto.
vii
Aos Drs. EDUARDO ROSALVO, MÁRIO ADRIANO, GUSTAVO BERTINO,
EDUARDO SIMAS, LÚCIA ABDOM, ROBERTO YOUNG, VASCO LAURINA,
GERALDO SHULZE e LYGIA JAQUELINE, pelo estímulo e apoio.
Ao Prof. Dr. AGOSTINHO ASÇENÇÃO e Prof. Dr. MARILSON DE SOUZA,
pelo incentivo nos primeiros passos deste trabalho.
Ao Prof. Dr. RONALD, veterinário responsável pelo Biotério da Universidade Iguaçu,
pelo acesso às instalações.
À Dra. GILSY, bióloga do Biotério da Universidade Iguaçu, pela ajuda constante
durante toda a fase de experimentação animal.
Aos técnicos de laboratório ARNALDO, FÁTIMA e EDMILSON, pelo trabalho
realizado.
Aos técnicos do Biotério da Universidade Iguaçu, ISMAEL e ANDRÉ, pelos cuidados
prestados aos animais.
À Sra. NEIDE COLLARES DE NOVAES, pelo constante carinho.
Aos amigos BERNARDO, PRISCILA, FERNANDO, SÔNIA, DORIS, LEANDRO
e ALEX, pela ajuda, convívio e apoio no Departamento de Histologia e Embriologia da
UFRJ.
Às secretárias do Programa de Pós-Graduação em Técnica e Experimentação da
UNIFESP-EPM, BENEDITA SALETE VALVERDE, ELAINE MARIA ALVES
BAZZI e VALDELICE SOARES, pelos incentivos, carinho e amizade durante toda a
jornada.
viii
Lista de figuras
Figura 1 - Representação esquemática da distribuição dos animais nos grupos e
subgrupos......................................................................................................
4
Figura 2 - Fotomicrografia do rim de animal do grupo IIIA. Túbulos renais exibindo
irregularidade no bordo apical das células e edema intersticial (HE X 400)............
11
Figura 3 - Fotomicrografia do rim de animal do grupo IIIB. Irregularidade do bordo
apical que por vezes se apresenta solto na luz tubular e importante edema
intersticial (HE X 400)........................................................................................
12
Figura 4 - Fotomicrografia do rim de animal do grupo IIIA. Células epiteliais tubulares
medulares marcadas pelo anticorpo Bcl-2 (400 X)............................................
25
Figura 5 - Fotomicrografia do rim do animal do grupo IIIB. Células epiteliais tubulares
corticais marcadas pelo anticorpo Bax (400 X)..................................................
26
ix
Lista de tabelas
Tabela 1 - Ratos do grupo GI, GII e GIII com os respectivos subgrupos (30 minutos e
60 minutos) segundo os valores das alterações histológicas tubulares renais..
9
Tabela 2 - Ratos do grupo GI, GII e GIII com os respectivos subgrupos (30 minutos e
60 minutos) segundo os valores das alterações histológicas intersticiais
renais...............................................................................................................
10
Tabela 3 - Ratos do grupo GI, GII e GIII com os respectivos subgrupos (30 minutos e
60 minutos) segundo os valores do anticorpo Bcl-x quantificados na região
cortical dos rins dos animais............................................................................
13
Tabela 4 - Ratos do grupo GI, GII e GIII com os respectivos subgrupos (30 minutos e
60 minutos) segundo os valores do anticorpo Bcl-x quantificados na região
medular dos rins dos animais..........................................................................
14
Tabela 5 - Ratos do grupo GI, GII e GIII com os respectivos subgrupos (30 minutos e
60 minutos) segundo os valores do anticorpo Bax quantificados na região
cortical dos rins dos animais............................................................................
15
Tabela 6 - Ratos do grupo GI, GII e GIII com os respectivos subgrupos (30 minutos e
60 minutos) segundo os valores do anticorpo Bax quantificados na região
medular dos rins dos animais..........................................................................
16
Tabela 7 - Ratos do grupo GI, GII e GIII com os respectivos subgrupos (30 minutos e
60 minutos) segundo os valores do anticorpo Bcl-2 quantificados na região
cortical dos rins dos animais............................................................................
17
Tabela 8 - Ratos do grupo GI, GII e GIII com os respectivos subgrupos (30 minutos e
60 minutos) segundo os valores do anticorpo Bcl-2 quantificados na região
medular dos rins dos animais...........................................................................
18
Tabela 9 - Ratos submetidos à simulação da oclusão da aorta abdominal infra-renal por
30 minutos (Grupo IA) segundo os valores dos anticorpos Bcl-x, Bax e Bcl-
2 quantificados nas regiões corticais e medulares dos rins dos animais..........
19
Tabela 10 - Ratos submetidos à simulação da oclusão da aorta abdominal infra-renal por
60 minutos (Grupo IB) segundo os valores dos anticorpos Bcl-x, Bax e Bcl-
2 quantificados nas regiões corticais e medulares dos rins dos
animais...........................................................................................................
20
Tabela 11 - Ratos submetidos à oclusão da aorta abdominal infra-renal por 30 minutos
(Grupo IIA) segundo os valores dos anticorpos Bcl-x, Bax e Bcl-2
quantificados nas regiões corticais e medulares dos rins dos animais............
21
x
Tabela 12 - Ratos submetidos à oclusão da aorta abdominal infra-renal por 60 minutos
(Grupo IIB) segundo os valores dos anticorpos Bcl-x, Bax e Bcl-2
quantificados nas regiões corticais e medulares dos rins dos animais..........
22
Tabela 13 - Ratos submetidos à oclusão da aorta abdominal infra-renal por 30 minutos
seguido de reperfusão por 30 minutos (Grupo IIIA) segundo os valores dos
anticorpos Bcl-x, Bax e Bcl-2 quantificados nas regiões corticais e medulares
dos rins dos animais......................................................................................
23
Tabela 14 - Ratos submetidos à oclusão da aorta abdominal infra-renal por 60 minutos
seguido de reperfusão por 60 minutos (Grupo IIIB) segundo os valores dos
anticorpos Bcl-x, Bax e Bcl-2 quantificados nas regiões corticais e medulares
dos rins dos animais......................................................................................
24
xi
Lista de abreviaturas
% Porcentagem
A Subgrupo A
B Subgrupo B
Calc Calculado
DAB Diaminobenzidine
GI Grupo I
GII Grupo II
GIII Grupo III
30 30 minutos
60 60 minutos
H.E. Hematoxilina-eosina
N Número
NS Não significativo
X Vezes
xii
Resumo
As alterações morfológicas renais na síndrome de isquemia e reperfusão em membros
posteriores foram estudadas em ratos Wistar (N=60) machos, pesando entre 200 e 250
gramas, distribuídos em 3 grupos: I (sham); II (isquemia); III (isquemia + reperfusão); e
cada grupo redistribuído em 2 subgrupos: A (30 min); B (60 min). Foi realizada a isquemia
utilizando clampe vascular (8mm) na aorta abdominal infra-renal de acordo com o grupo
estudado. Ao final de cada experimento realizou-se o sacrifício sob anestesia. A análise
histológica renal cortical e medular (descritiva e morfométrica) foi realizada através de
metodologia convencional (parafina-hematoxilina-eosina) e técnica de imuno-histoquímica
para a detecção de proteínas reguladoras da apoptose: Bcl-x, Bax e Bcl-2. A análise
semiquantitativa de lesão tubular e intersticial foi realizada de acordo com o grau de lesão
tubular e grau de lesão intersticial. Para a análise estatística foram aplicados os seguintes
testes: Mann-Whitney, Kruskal-Wallis e Teste de Wilcoxon. Foram observadas no grupo
IIIB alterações histológicas tubulares e intersticiais significativas com relação aos outros
grupos, além de uma maior expressão das proteínas Bcl-x e Bcl-2 na região medular,
também no grupo IIIB. Sendo assim, conclui-se que a síndrome de isquemia e reperfusão
em membros posteriores de ratos está associada a lesões estruturais renais tubulares,
principalmente na fase de reperfusão.
xiii
Abstract
Morphologic changes in the ischemia and reperfusion syndrome in posterior limbs were
studied in Wistar rats (N=60), male, weighing between 200 and 250 grams, and
distributed in 3 groups: I (sham); II (ischemia); III (ischemia + reperfusion); being each
group further distributed into 2 subgroups: A (30 min); B (60 min). Ischemia was caused
using a vascular clamp (8 mm) in the infrarenal aorta, according to the group studied. At
the end of each experiment, the rats were euthanized under anesthesia. Cortical and
medullar histological analyses (descriptive and morphometric) were carried out using
conventional methodology (paraffin-hematoxiline-eosine) and immunohistochemistry
technique was used for detection of the apoptosis-regulating proteins: Bcl-x, Bax, and
Bcl-2. Semi-quantitative analysis of the tubular and interstitial lesion was carried out
according to the degree of tubular lesion and the degree of interstitial lesion. The
following tests were used for the statistical analysis: Mann-Whitney, Kruskal-Wallis, and
Wilcoxon Test. Relevant tubular and interstitial histological alterations were observed in
group IIIB compared to the other groups, besides a greater expression of proteins Bcl-x
and Bcl-2, also in group IIIB. We may therefore conclude that the ischemia and
reperfusion syndrome in rat’s posterior limbs is associated to tubular structural renal
lesions, especially during the reperfusion phase.
xiv
Sumário
1. INTRODUÇÃO...................................................................................................... 1
2. OBJETIVOS........................................................................................................... 3
3. MÉTODOS............................................................................................................. 4
4. RESULTADOS....................................................................................................... 9
5. DISCUSSÃO.......................................................................................................... 27
6. CONCLUSÃO........................................................................................................ 32
7 REFERÊNCIAS....................................................................................................... 33
8. NORMAS ADOTADAS........................................................................................ 37
ANEXO.................................................................................................................. 38
APÊNDICE............................................................................................................ 39
1. INTRODUÇÃO
Desde a primeira metade do século XX, estudos associam as lesões
musculares traumáticas extensas a uma síndrome representada por: urina escura
(mioglobinúria), dor muscular, fraqueza muscular (hipercalemia) e insuficiência renal
aguda
1,2
. Esta condição clínica foi denominada síndrome mionefropata ou síndrome de
reperfusão
3,4
.
Em 1983, Francisco Jr. et al.
5,6
relataram que a incidência da síndrome pós-
revascularização depende mais da massa muscular envolvida, isto é, do nível de
obstrução arterial, do que do tempo de isquemia, ou seja, quanto mais proximal a
oclusão, maior a massa muscular envolvida; conseqüentemente, maior a tendência de
desenvolver a síndrome. Segundo estes autores, a incidência da síndrome foi de 7,9% e,
no trabalho de Cormier et al.
7
, a incidência da síndrome de reperfusão após as oclusões
arteriais agudas foi de aproximadamente 7,5%.
Haimovici
8
, constatou que a síndrome mionefropática metabólica ocorre em
36,7% dos casos em que o êmbolo está alojado na aorta abdominal, 9,5% na artéria ilíaca
comum e, em 6,3% dos casos, na artéria femoral.
A taxa de mortalidade na síndrome mionefropata é alta, especialmente quando
associada à presença de diabetes, senilidade e insuficiência renal
9
. Francisco Jr. et al.
5
relataram uma taxa de mortalidade de 60% .
Dois fatores relevantes têm importância na síndrome de isquemia e
reperfusão: 1. Lesão celular direta pela produção de radicais livres, peroxidação lipídica
e interação com células inflamatórias; 2. Lesão celular indireta, ou seja, a incapacidade
de restaurar a perfusão microvascular durante a reperfusão dos tecidos isquêmicos devido
a depósitos de fibrina, formação de trombos, edema endotelial e empilhamento
leucocitário. Estas alterações afetam órgãos distantes do local da lesão, principalmente os
rins e os pulmões
9,10,11,12
.
Vários mecanismos de lesão de parênquima renal decorrentes de isquemia e
reperfusão da musculatura esquelética de membros inferiores têm sido descritos na
literatura, como:
2
1. Diminuição do fluxo plasmático renal: ocasionado pela hipotensão
depois de restaurada a perviedade arterial, levando à redução primária
na taxa de filtração glomerular. Ocorre uma alteração na hemodinâmica
renal devido ao aumento dos níveis de vasopressina, à ativação
simpática e à diminuição de prostaglandinas renais vasodilatadoras
13,14
;
2. Espasmo de pequenos vasos: devido às substâncias provenientes da
área em rabdomiólise, ou seja, a área do músculo esquelético que está
em desintegração
15
;
3. Precipitação da mioglobina nos túbulos renais levando a necrose
tubular aguda, devido à obstrução dos túbulos por cilindros de
mioglobina
16
;
4. Nefrotoxidade direta da mioglobina no túbulo renal, principalmente em
condições de baixo fluxo renal, em estudos clínicos e experimentais
17
;
5. Vazamento do fluido tubular através do epitélio danificado,
principalmente por ação de radicais livres derivados do oxigênio e pela
mioglobina, levando à diminuição da função renal
17,18,19
.
A lesão renal ocasionada por isquemia ou por toxinas é expressa,
tradicionalmente e do ponto de vista morfológico, pela necrose tubular. Porém, sabe-se
que a morte celular pode ocorrer não só devido à necrose, mas também à apoptose
14,16,20
.
Desta maneira, a proposta deste estudo é observar as alterações
morfológicas renais em ratos submetidos à isquemia e reperfusão de membros
posteriores por meio da oclusão da aorta abdominal infra-renal.
2. OBJETIVOS
Geral
Estudo da estrutura renal na síndrome de isquemia e reperfusão em
membros posteriores de ratos.
Específico
Observar a ocorrência de lesões estruturais no compartimento túbulo-
intersticial renal em ratos submetidos à isquemia e reperfusão de membros posteriores
através da oclusão da aorta abdominal infra-renal.
3. MÉTODOS
Amostra
Foram utilizados 60 ratos (Rattus norvegicus albinus), originários do
Biotério da FIOCRUZ, no Rio de Janeiro, machos, com peso variando entre 200 e 250g
e idade entre três e quatro meses (adultos).
Os animais foram mantidos no Biotério da Universidade Iguaçu (UNIG)
durante quinze dias para observação e adaptação, onde receberam água e ração balanceada
à vontade e ficaram alojados em gaiolas de 40x30x25 cm, com dois animais por gaiola,
sendo as gaiolas higienizadas diariamente.
Os procedimentos operatórios foram realizados no Laboratório do Biotério
da UNIG e no Laboratório de Patologia Celular do Departamento de Histologia e
Embriologia da UFRJ, após terem sido aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
UNIFESP-EPM (protocolo n.836/01) e ratificados pela Comissão de Ética da UNIG
(Anexo 1).
Os ratos foram sorteados e distribuídos em três grupos iguais de 20 animais,
sendo cada grupo constituído de 2 subgrupos (Figura 1).
Antes do experimento, os animais não foram submetidos a jejum para
alimentos sólidos, nem a retirada da água.
Figura 1 – Representação esquemática da distribuição dos animais nos grupos e subgrupos.
RATOS
n=60
A
30min
n=10
B
60 min
n=10
A
30min
n=10
B
60 min
n=10
A
30min
n=10
B
60 min
n=10
Grupo II
Isquemia
n=20
Grupo I
Sham
n=20
Grupo III
Isquemia + Reperfusão
n=20
5
Procedimentos
Os animais foram anestesiados por inalação de éter dietílico e em seguida
pesados. Iniciou-se o ato operatório somente após ter sido constatada a perda dos
reflexos de endireitamento e retração do membro pélvico ao estímulo doloroso
provocado por pressão e do reflexo palpebral.
Os animais foram colocados sobre uma prancha, em decúbito dorsal
horizontal, com imobilização dos membros anteriores e posteriores por meio de fita
adesiva.
Os pêlos da região abdominal foram secionados rente à pele com bisturi
lâmina 24. Realizou-se assepsia da área operatória com tintura de polivilpirrolidona
iodo. Foi realizada laparotomia mediana de aproximadamente 4 centímetros, com
bisturi lâmina 15, e em seguida as alças intestinais foram afastadas para a direita.
A dissecção da aorta abdominal infra-renal foi realizada através de gazes,
cotonetes e pinças hemostáticas apropriadas.
Em seguida foi realizada heparinização sistêmica na dose de 10 a 15
U/100g/peso por punção da veia cava utilizando uma seringa de 1ml acoplada à agulha
13x3 (30G ½).
Após três minutos, a aorta abdominal infra-renal foi ocluida através de
clampe vascular (8mm) nos animais pertencentes aos grupos II e III. Nos animais do
grupo I (Sham), a artéria não foi ocluída. Ao término do tempo de oclusão da aorta
abdominal, de acordo com o subgrupo estudado (A= 30 min; B= 60min), foi realizada a
reperfusão dos membros posteriores, retirando-se o clampe nos animais pertencentes ao
grupo III e respeitando-se o tempo de cada subgrupo (A= 30 min; B= 60min). Nos
animais do grupo II não foi realizada a reperfusão dos membros posteriores.
A eutanásia foi realizada por exangüinação com nefrectomia bilateral, ao
término de cada experimento. (Apêndice 1)
6
Análise histológica
Os rins permaneceram por 48 horas em formaldeído tamponado, sendo em
seguida introduzidos em parafina.
O estudo histológico foi realizado no Laboratório de Patologia Celular do
Departamento de Histologia e Embriologia – UFRJ.
Os cortes histológicos foram feitos em micrótomo com 4cm de espessura.
Os referidos cortes foram corados pelo método da hematoxilina e eosina
(HE), e a identificação das proteínas reguladoras da apoptose Bcl-x, Bax e Bcl-2 foi
realizada por técnica imuno-histoquímica.
Nas lâminas coradas pela hematoxilina e eosina foram analisadas as
alterações do compartimento túbulo-intersticial renal (Apêndice 2), abrangendo:
- compartimento intersticial: edema intersticial, congestão capilar,
hemorragia intersticial, inflamação.
- compartimento tubular: vacuolização, descamação celular, alteração
nuclear.
Estas alterações foram analisadas sob o ponto de vista qualitativo e
semiquantitativo. A avaliação semiquantitativa de cada parâmetro foi realizada
utilizando uma escala de 0 a 3 cruzes, respectivamente, ausente, leve, moderado e
intenso. (Apêndice 2)
Os resultados também foram expressos como grau de lesão intersticial e
grau de lesão tubular, sendo a somatória de pontos conferida para cada parâmetro
correspondente. (Apêndice 2):
- grau de lesão intersticial: valor máximo = 12
- grau de lesão tubular: valor máximo = 9
As lâminas foram analisadas por microscopia de luz, sendo 10 campos
corticais e cinco campos medulares por animal. As imagens foram capturadas por
máquina fotográfica digital (Nikon Coolpix 990).
7
Técnica de imuno-histoquímica
As lâminas foram colocadas de véspera na estufa a uma temperatura de
58°C para conferir maior aderência do corte à lâmina.
No dia seguinte, os cortes foram submetidos a desparafinação em xileno 1,
xileno 2 e xileno 3 por 10 minutos cada e, em seguida, em álcool 1, álcool 2 e álcool 3
por 5 minutos cada. Depois, os cortes foram banhados em água destilada e deixados na
solução de bórax a 1% por 15 minutos e, em seguida, em água destilada por 15 minutos.
A recuperação antigênica foi realizada com tampão citrato pH = 6.0 no
forno de microondas por dois ciclos de cinco minutos (potência de 800 W).
Para a inibição da peroxidase endógena foi utilizado peróxido de hidrogênio
(H
2
O
2
) 70% em metanol.
A avidina e biotina endógena foram bloqueadas (Blocking Kit No. SP-2001-
VECTOR LAB).
Em seguida, foram incubados os anticorpos primários: Bcl-x (diluição 1:50;
mouse anti-human – Lab Vision cód: MS-715-P1-monoclonal), Bax (diluição 1:50; mouse
monoclonal, Dako) e Bcl-2 (diluição 1:50; mouse monoclonal, Dako). Os controles
negativos foram preparados em todas as reações.
Os cortes incubados com os anticorpos primários foram deixados na
geladeira por 12 horas (OVERNIGHT).
No dia seguinte, os cortes foram retirados da geladeira e deixados à
temperatura ambiente por 30 minutos para, a seguir ser incubado o anticorpo secundário
(2º biotinilado) por uma hora, seguindo-se a reação de ABC peroxidase por 50 minutos.
O cromógeno utilizado foi diaminobenzidine 0,01% H
2
O
2
(DAB) por sete
minutos.
Os cortes foram corados por hematoxilina e eosina (HE).
A análise morfométrica foi realizada utilizando microscopia de luz
(microscópio Nikon E 400), sendo 10 campos corticais e 10 campos medulares por animal.
As imagens foram capturadas por máquina fotográfica digital (Nikon Coolpix 990).
8
A região de interesse de cada imagem capturada foi indicada pelo operador,
sendo sua área pré-determinada e fixa para todas as imagens.
No aumento de 40X foram quantificados os núcleos das células tubulares
com marcações positivas para cada anticorpo. (Apêndice 3)
Os resultados foram anotados em planilha, sendo em seguida calculada a
média dos dez valores para cada imagem. (Apêndice 3)
Análise estatística
A análise estatística dos resultados obtidos foi realizada pela Disciplina de
Bioestatística do Departamento de Medicina Preventiva da UNIFESP-EPM.
Para a análise estatística, de acordo com a natureza das variáveis estudadas,
foram aplicados os seguintes testes:
1. Teste de Mann-Whitney para duas amostras independentes
21
, com a
finalidade de comparar os subgrupos A e B de cada grupo.
2. Análise de variância por posto de Kruskal-Wallis
21
, com o objetivo de
comparar os grupos I, II e III em função do tempo. Quando esta análise
mostrou diferença relevante, foi complementada pelo teste de
Comparações Múltiplas
21
.
3. Teste de Wilcoxon, com o objetivo de comparar as regiões corticais e
medulares dos grupos
21
.
4. Fixou-se em 0.001 o nível de rejeição da hipótese de nulidade,
assinalando-se com um asterisco (*) os valores relevantes.
4. RESULTADOS
Tabela 1 – Ratos do grupo GI, GII e GIII com os respectivos subgrupos (30 minutos e 60
minutos) segundo os valores das alterações histológicas tubulares renais
Grupo I Grupo II Grupo III
30 60 30 60 30 60
0 1 2 1 3 5
0 1 1 1 3 5
0 1 1 2 3 5
0 1 1 1 2 4
0 1 1 1 2 5
0 1 1 1 3 6
0 1 1 1 3 5
0 1 1 1 2 5
0 1 1 1 2 5
0 1 0 1 3 5
Média
0,00 1,00 1,00 1,10 2,60 5,00
Análise de Variância de Kruskal-Wallis
(GI x GII x GIII)
30 min 60 min
H calc= 26,14* H calc= 26,69*
(p<0,001) (p<0,001)
I e II <III I e II < III
Teste de Mann-Whitney
(30 x 60)
GI GII GIII
Z calc= 4,36 Z calc= 0,55 Z calc= 3,98*
(N/S) (N/S) (p<0,001)
30 < 60
10
Tabela 2 – Ratos do grupo GI, GII e GIII com os respectivos subgrupos (30 minutos e 60
minutos) segundo os valores das alterações histológicas intersticiais renais
Grupo I Grupo II Grupo III
30 60 30 60 30 60
1 1 2 3 3 6
1 1 3 2 3 5
2 2 2 2 4 6
1 2 4 2 4 5
1 1 2 2 3 7
2 2 2 2 3 8
1 2 2 1 4 5
3 3 3 3 3 5
1 2 2 2 4 6
2 3 2 3 4 6
Média
1,50 1,90 2,40 2,20 3,50 5,90
Análise de Variância de Kruskal-Wallis
(GI x GII x GIII)
30 min 60 min
H calc= 18,76* H calc= 20,96*
(p<0,001) (p<0,001)
I < III I e II < III
Teste de Mann-Whitney
(30 x 60)
GI GII GIII
Z calc= 1,28 Z calc= 0,44 Z calç = 3,87*
(NS) (NS) (p<0,001)
30 < 60
11
Análise da Microscopia Óptica
A microscopia de luz, com lâminas coradas pela H.E. evidenciou histologia
preservada semelhante ao normal nos animais do grupo IA. Foi verificado haver uma
pequena alteração do contorno apical de células tubulares, e um diminuto alargamento
do interstício renal por edema nos animais do grupo IB.
Nos animais dos grupos IIA e IIB assim como nos dos grupos IIA e IIIB
foram verificadas intensificação das lesões tubulares, irregularidade na borda apical
chegando à perda focal do citoplasma apical nos grupos IIIA e IIIB (Figuras 2 e 3)
Figura 2 – Fotomicrografia do rim de animal do grupo IIIA. Túbulos renais exibindo irregularidade no
bordo apical das células e edema intersticial (HE X 400).
IIIA
12
Figura 3 - Fotomicrografia do rim do animal do grupo IIIB. Irregularidade do bordo apical que por vezes se
apresenta solto na luz tubular e importante edema intersticial (HE X 400).
IIIB
13
Tabela 3 – Ratos do grupo GI, GII e GIII com os respectivos subgrupos (30 minutos e 60
minutos) segundo os valores do anticorpo Bcl-x quantificados na região cortical dos rins
dos animais
Grupo I Grupo II Grupo III
30 60 30 60 30 60
3,2 5,1 9,1 7,7 11,4 16,8
3,1 9,5 10,1 10,0 14,5 19,2
2,5 4,6 6,7 11,2 17,0 16,2
1,5 3,3 8,7 6,6 14,0 18,4
4,6 3,5 11,9 11,6 14,4 17,2
3,0 2,4 16,7 15,0 19,1 19,0
2,8 4,1 14,3 12,9 18,4 17,0
9,0 2,9 12,4 19,5 15,8 16,5
6,7 2,9 12,5 16,9 13,5 17,5
5,2 8,1 13,9 12,8 13,7 16,0
Média
4,16 4,64 11,63 12,42 15,18 17,38
Análise de Variância de Kruskal-Wallis
(GI x GII x GIII)
30 min 60 min
H calc= 21,43* H calc= 21,57*
(p<0,001) (p<0,001)
I < II e III I <II e III
Teste de Mann-Whitney
(30 x 60)
GI GII GIII
Z calc= 0,57 Z calc= 0,38 Z calc= 2,12*
(NS) (NS) (p<0,001)
30 < 60
Z crítico= 1,96
14
Tabela 4 - Ratos do grupo GI, GII e GIII com os respectivos subgrupos (30 minutos e
60 minutos) segundo os valores do anticorpo Bcl-x quantificados na região medular dos
rins dos animais
Grupo I Grupo II Grupo III
30 60 30 60 30 60
1,5 1,4 6,1 9,7 12,3 30,2
1,8 1,3 5,4 17,5 19,4 35,8
2,2 1,2 9,3 10,0 23,1 30,2
2,0 3,0 8,4 14,7 20,1 29,6
2,8 4,4 7,1 18,5 19,1 28,6
3,4 3,6 8,5 14,5 18,1 32,6
2,0 2,7 7,3 9,7 19,3 34,8
2,8 2,8 6,9 18,8 21,2 30,5
9,2 1,7 11,9 14,0 18,0 30,5
9,4 1,7 6,4 19,2 20,1 28,1
Média
3,71 2,38 7,73 14,66 19,06 30,94
Análise de Variância de Kruskal-Wallis
(GI x GII x GIII)
30 min 60 min
H calc= 22,18* H calc= 25,82*
(p<0,001) (p<0,001)
I e II < III I < II e III
II < III
Teste de Mann-Whitney
(30 x 60)
Z crítico= 1,96
GI GII GIII
Z calc= 1,06 Z calc= 3,56* Z calc= 3,79*
(NS) 30<60 30 < 60
15
Tabela 5 – Ratos do grupo GI, GII e GIII com os respectivos subgrupos (30 minutos e 60
minutos) segundo os valores do anticorpo Bax quantificados na região cortical dos rins dos
animais
Grupo I Grupo II Grupo III
30 60 30 60 30 60
8,7 7,1 9,9 6,4 20,4 29,8
12,2 5,7 10,1 7,7 8,4 48,0
10,7 4,5 17,3 8,5 8,5 44,0
12,5 3,3 15,8 6,2 10,6 38,2
13,6 3,3 9,6 6,0 19,4 33,8
16,2 5,0 10,1 8,0 15,9 37,0
8,2 5,7 10,7 7,7 18,5 47,5
6,4 6,7 8,6 6,7 17,4 26,5
1,5 8,0 11,0 11,9 10,6 21,5
4,8 10,3 14,2 6,8 22,1 33,0
Média
9,44 5,96 11,73 7,59 15,18 35,93
Análise de Variância de Kruskal-Wallis
(GI x GII x GIII)
30 min 60 min
H calc= 4,89* H calc= 20,1*
(p<0,001) (p<0,001)
(NS) I e II < III
Teste de Mann-Whitney
(30 x 60)
GI GII GIII
Z calc= 20,4* Z calc= 3,25* Z calc= 3,70*
30<60 30>60 30 < 60
Z crítico= 1,96
16
Tabela 6 – Ratos do grupo GI, GII e GIII com os respectivos subgrupos (30 minutos e
60 minutos) segundo os valores do anticorpo Bax quantificados na região medular dos
rins dos animais
Grupo I Grupo II Grupo III
30 60 30 60 30 60
2,3 6,3 10,9 24,8 6,2 20,9
8,2 8,0 14,5 23,0 25,3 22,6
10,0 5,8 25,4 17,1 13,2 22,7
9,1 5,2 27,3 15,2 7,0 24,0
17,0 3,9 10,7 17,6 11,2 42,3
9,2 5,1 15,4 29,0 12,8 24,2
9,2 4,1 16,8 12,4 18,0 24,8
6,3 6,7 15,7 38,7 9,3 26,5
5,0 5,2 13,7 12,0 9,2 19,5
5,2 4,6 21,2 13,0 10,6 26,2
Média
8,15 5,49 17,16 20,28 12,28 25,37
Análise de Variância de Kruskal-Wallis
(GI x GII x GIII)
30 min 60 min
H calc= 13,20* H calc= 20,56*
(p<0,001) (p<0,001)
I e II < III I < II e III
Teste de Mann-Whitney
(30 x 60)
Z crítico= 1,96
GI GII GIII
Z calc= 1,93 Z calc= 0,76* Z calc= 3,25*
(NS) (NS) 30 < 60
17
Tabela 7 – Ratos do grupo GI, GII e GIII com os respectivos subgrupos (30 minutos e
60 minutos) segundo os valores do anticorpo Bcl-2 quantificados na região cortical dos
rins dos animais
Grupo I Grupo II Grupo III
30 60 30 60 30 60
8,1 6,2 11,4 12,1 9,7 34,8
9,7 10,1 17,9 8,2 1,7 32,1
2,2 8,4 10,7 10,9 2,6 32,6
4,8 8,0 14,5 10,8 1,9 32,0
3,5 8,2 11,9 12,0 2,3 31,2
3,0 4,1 6,4 12,2 5,7 33,4
3,1 4,4 8,1 13,3 9,6 29,6
17,0 5,0 6,6 9,7 8,7 32,9
7,4 4,9 7,2 12,0 7,5 36,0
5,2 4,9 9,9 11,5 5,3 32,7
Média
6,40 6,42 10,46 11,27 5,50 32,73
Análise de Variância de Kruskal-Wallis
(GI x GII x GIII)
30 min 60 min
H calc= 8,43* H calc= 24,96*
(p<0,001) (p<0,001)
I e III < II I e II < III
Teste de Mann-Whitney
(30 x 60)
GI GII GIII
Z calc= 0,83 Z calc= 1,20* Z calc= 3,79*
(NS) (NS) 30 < 60
Z crítico= 1,96
18
Tabela 8 – Ratos do grupo GI, GII e GIII com os respectivos subgrupos (30 minutos e
60 minutos) segundo os valores do anticorpo Bcl-2 quantificados na região medular dos
rins dos animais
Grupo I Grupo II Grupo III
30 60 30 60 30 60
3,2 7,3 13,2 17,4 27,6 60,4
2,0 5,2 15,9 11,2 24,6 37,6
5,1 4,5 17,6 16,0 23,9 42,7
1,7 4,3 17,0 15,0 18,7 41,7
1,7 5,6 12,0 15,2 17,0 41,4
4,7 4,8 9,8 17,3 21,7 47,9
4,2 4,6 10,4 15,7 22,2 38,0
2,6 4,1 11,7 18,3 15,0 46,4
3,2 4,9 13,3 16,6 16,3 50,8
7,4 4,2 11,7 17,6 16,4 33,4
Média
3,58 4,95 13,27 16,03 20,34 44,03
Análise de Variância de Kruskal-Wallis
(GI x GII x GIII)
30 min 60 min
H calc= 23,70* H calc= 25,80*
(p<0,001) (p<0,001)
I < II e III I < II e III
II < III
Teste de Mann-Whitney
(30 x 60)
GI GII GIII
Z calc= 2,00* Z calc= 2,00* Z calc= 3,78*
30 < 60 30<60 30 < 60
Z crítico= 1,96
19
Tabela 9 – Ratos submetidos à simulação da oclusão da aorta abdominal infra-renal
por 30 minutos (Grupo IA) segundo os valores dos anticorpos Bcl-x, Bax, Bcl-2
quantificados nas regiões corticais e medulares dos rins dos animais
Bcl-x Bax Bcl-2
Cort Med Cort Med Cort Med
3,2 1,5 8,7 2,3 8,1 3,2
3,1 1,8 12,2 8,2 9,7 2,0
2,5 2,2 10,7 10,0 2,2 5,1
1,5 2,0 12,5 9,1 4,8 1,7
4,6 2,8 13,6 17,0 3,5 1,7
3,0 3,4 16,2 9,2 3,0 4,7
2,8 2,0 8,2 9,2 3,1 4,2
9,0 2,8 6,4 6,3 17,0 2,6
6,7 9,2 1,1 5,0 7,4 3,2
5,2 9,4 4,8 5,2 5,2 7,4
X 4,16 3,71 9,44 8,15 6,40 3,60
DP 2,27 3,00 4,51 4,00 4,50 1,80
Mi 3,15 2,50 9,80 8,65 5,00 3,20
Teste de Wilcoxon
Cort x Med
Z crít= 1,96
Bcl-x Bax Bcl-2
Z calc= 0,56 Z calc= 0,91 Z calc+ 1,58
(NS) (NS) (NS)
20
Tabela 10 – Ratos submetidos à simulação da oclusão da aorta abdominal infrarenal por
60 minutos (Grupo IB) segundo os valores dos anticorpos Bcl-x, Bax e Bcl-2 quantificados
nas regiões corticais e medulares dos rins dos animais.
Bcl-x Bax Bcl-2
Cort Med Cort Med Cort Med
5,1 1,4 7,1 6,3 6,2 7,3
9,5 1,3 5,7 8,0 10,1 5,2
4,6 1,2 4,5 5,8 8,4 4,5
3,3 3,0 3,3 5,2 8,0 4,3
3,5 4,4 3,3 3,9 8,2 5,6
2,4 3,6 5,0 5,1 4,1 4,8
4,1 2,7 5,7 4,1 4,4 4,6
2,9 2,8 6,7 6,7 5,0 4,1
2,9 1,7 8,0 5,2 4,9 4,9
8,1 1,7 10,3 4,6 4,9 4,2
X 4,64 2,40 6,00 5,50 6,42 4,95
DP 2,40 1,10 2,20 1,25 2,10 0,94
Mi 3,80 2,20 5,70 5,20 5,60 4,70
Teste de Wilcoxon
Cort x Med
Z crít= 1,96
Bcl-x Bax Bcl-2
Z calc= 20,4 Z calc= 0,29 Z calc+ 1,66
Cort > Med (NS) (NS)
21
Tabela 11 – Ratos submetidos à oclusão da aorta abdominal infrarenal por 30 minutos
(Grupo IIA) segundo os valores dos anticorpos Bcl-x, Bax e Bcl-2 quantificados nas
regiões corticais e medulares dos rins dos animais
Bcl-x Bax Bcl-2
Cort Med Cort Med Cort Med
9,1 6,1 9,9 10,9 11,4 13,2
10,1 5,4 10,1 14,5 17,9 15,9
6,7 9,3 7,3 25,4 10,7 17,6
8,7 8,4 15,8 27,3 14,5 17,1
11,9 7,1 9,6 10,7 11,9 12,0
16,7 8,5 10,1 15,4 6,4 9,8
14,3 7,3 10,7 16,8 8,1 10,4
12,4 6,9 8,6 15,7 6,6 11,7
12,5 11,9 11,0 13,7 7,2 13,3
13,9 6,4 14,2 21,2 9,9 11,7
X 11,66 7,73 11,73 17,20 10,50 13,30
DP 3,00 1,90 2,94 5,70 3,70 2,73
Mi 12,15 7,20 10,40 15,55 10,30 12,60
Teste de Wilcoxon
Cort x Med
Z crít= 1,96
Bcl-x Bax Bcl-2
Z calc= 2,49 Z calc= 2,80* Z calc+ 2,39*
Cort > Med Med > Cort Med > Cort
22
Tabela 12 – Ratos submetidos à oclusão da aorta abdominal infrarenal por 60 minutos
(Grupo IIB) segundo os valores dos anticorpos Bcl-x, Bax e Bcl-2 quantificados nas
regiões corticais e medulares dos rins dos animais.
Bcl-x Bax Bcl-2
Cort Med Cort Med Cort Med
7,7 9,7 6,4 24,8 12,1 17,4
10,0 17,5 7,7 23,0 8,2 11,2
11,2 10,0 8,5 17,1 10,9 16,0
6,6 14,7 6,2 15,2 10,8 15,0
11,6 18,5 6,0 17,6 12,0 15,2
15,0 14,5 8,0 29,0 12,2 17,3
12,9 9,7 7,7 12,4 13,3 15,7
19,5 18,8 6,7 38,7 9,7 18,3
16,9 14,0 11,9 12,0 12,0 16,6
12,8 19,2 6,8 13,0 11,5 17,6
X 12,42 14,70 7,60 20,30 11,30 16,0
DP 4,00 3,82 1,72 8,62 1,45 2,01
Mi 12,20 14,60 7,25 17,35 11,75 16,30
Teste de Wilcoxon
Cort x Med
Z crít= 1,96
Bcl-x Bax Bcl-2
Z calc= 1,07 Z calc= 2,80* Z calc+ 2,80*
NS Cort < Med Cort < Med
23
Tabela 13 – Ratos submetidos à oclusão da aorta abdominal infrarenal durante 30
minutos seguido de reperfusão por 30 minutos (Grupo IIIA) segundo os valores dos
anticorpos Bcl-x, Bax e Bcl-2 quantificados nas regiões corticais e medulares dos rins
dos animais
Bcl-x Bax Bcl-2
Cort Med Cort Med Cort Med
11,4 12,3 20,4 6,2 9,7 27,6
14,5 19,4 8,4 25,3 1,7 24,6
17,0 23,1 8,5 13,2 2,6 23,9
14,0 20,1 10,6 7,0 1,9 18,7
14,4 19,1 19,4 11,2 2,3 17,0
19,1 18,1 15,9 12,8 5,7 21,7
18,4 19,3 18,5 18,0 9,6 22,2
15,8 21,2 17,4 9,3 8,7 15,0
13,5 18,0 10,6 9,2 7,5 16,3
13,7 20,1 22,1 10,6 5,3 16,4
X 15,20 19,06 15,20 12,30 5,50 20,34
DP 2,40 2,80 5,20 5,70 3,24 4,25
Mi 14,45 19,35 16,65 10,90 5,50 20,20
Teste de Wilcoxon
Cort x Med
Z crít= 1,96
Bcl-x Bax Bcl-2
Z calc= 2,49* Z calc= 1,27 Z calc+ 2,80*
Cort < Med NS Cort < Med
24
Tabela 14 – Ratos submetidos à oclusão da aorta abdominal infrarenal durante 60
minutos seguido de reperfusão por 60 minutos (Grupo IIIB) segundo os valores dos
anticorpos Bcl-x, Bax e Bcl-2 quantificados nas regiões corticais e medulares dos rins
dos animais
Bcl-x Bax Bcl-2
Cort Med Cort Med Cort Med
16,8 30,2 29,8 20,9 34,8 60,4
19,2 35,8 48,0 22,6 32,1 37,6
16,2 30,2 44,0 22,7 32,6 42,7
18,4 29,6 38,2 24,0 32,0 41,7
17,2 28,6 33,8 42,3 31,2 41,4
19,0 32,6 37,0 24,2 33,4 47,9
17,0 34,8 47,5 24,8 29,6 38,0
16,5 30,5 26,5 26,5 32,9 46,4
17,5 29,0 21,5 19,5 36,0 50,8
16,0 28,1 33,0 26,2 32,7 33,4
X 17,38 30,94 35,93 25,40 32,73 44,03
DP 1,13 2,61 8,81 6,33 1,80 7,74
Mi 17,10 30,20 35,40 24,10 32,65 42,20
Teste de Wilcoxon
Cort x Med
Z crít= 1,96
Bcl-x Bax Bcl-2
Z calc= 2,80* Z calc= 2,31* Z calc+ 2,80*
Cort < Med NS Cort < Med
25
Análise Imuno-histoquímica
A análise imuno-histoquímica dos rins dos animais estudados chama a
atenção a não detecção de expressão das proteínas Bcl-x, Bax e Bcl-2 nos glomérulos.
Nota-se também que, mesmo no grupo sham há uma expressão destas proteínas, porém
com uma menor intensidade quando comparada aos outros grupos (GII e GIII).
A partir do grupo IIIA há uma certa uniformidade de expressão das
proteínas anti-apoptóticas (Bcl-x e Bcl-2), ou seja, uma maior expressão na região
medular. (Figuras 4 e 5)
Figura 4 - Fotomicrografia do rim do animal do grupo IIIA. Células epiteliais tubulares medulares
marcadas pelo anticorpo Bcl-2 (400 X).
IIIA
26
Figura 5 – Fotomicrografia do rim do animal do grupo IIIB. Células epiteliais tubulares corticais marcadas
pelo anticorpo Bax (400 X).
IIIB
5. DISCUSSÃO
A disfunção renal passou a ser estudada de forma sistemática durante a
Segunda Guerra Mundial. Na tentativa de subjugar a Inglaterra, os alemães bombardearam
com grande intensidade a cidade de Londres. Observou-se que muitos indivíduos
previamente saudáveis, que eram resgatados dos escombros e sobreviviam aos ferimentos
iniciais, desenvolviam importante diminuição do volume urinário (oligúria)
1,2,3,4
.
Autópsias realizadas nesses pacientes revelaram a presença de necrose focal
em segmentos dos túbulos renais, em contraste com os glomérulos, cujo aspecto era
normal. Denominou-se esse quadro, que apresentava altíssima mortalidade, síndrome do
esmagamento (Crush Syndrome)
1,2,3,25
.
Bywatersem (1944)
47
, descreveu a ocorrência de complicações graves
quando uma grande massa muscular é lesada, demonstrando nestes casos a ocorrência
de mioglobinúria, seguida de insuficiência renal aguda.
Haimovici
48
observou que dois pacientes submetidos a embolectomia
apresentaram dor no membro, edema, rigidez muscular, mioglobinúria e insuficiência
renal aguda. Na época, relacionou seus achados aos de Bywaters
47
, atribuindo-os à
isquemia muscular.
Dois anos após as observações de Haimovici
48
, Cormier, Legrain
7
indicaram
como complicação de revascularização a hiperpotassemia e suas conseqüências. Por isto,
Lacan et al.
49
, ao descreverem mais três casos desta síndrome, propuseram o nome de
Síndrome de Legrain e Cormier.
Embora a patogênese da síndrome de revascularização não esteja
inteiramente definida, acredita-se com base nos achados bioquímicos que, em resposta
à isquemia muscular, ocorre a acidose, seguida de lise muscular com liberação de
potássio, enzimas intracelulares e mioglobina, conduzindo ao quadro clínico de dor,
edema duro muscular, acidose metabólica, hiperpotassemia e mioglobinúria. A
deposição da mioglobina nos túbulos renais leva à insuficiência renal aguda.
28
Segundo Francisco Jr. et al.
5
, a incidência da síndrome de revascularização
depende mais da massa muscular envolvida, isto é, do nível da obstrução, que do tempo
de isquemia. Isto porque tal incidência é muito mais freqüente nas embolias aorto-ilíacas,
mesmo nos casos operados precocemente, onde a massa muscular envolvida é maior, do
que nas embolias mais distais realizadas tardiamente, em que a massa muscular é menor.
É difícil quantificar a tolerância das extremidades à isquemia, em virtude da
variável suscetibilidade dos diferentes tecidos à anóxia. A resistência dos tecidos à
anóxia é inversamente proporcional à nobreza dos mesmos
31,40
.
Assim, o sistema nervoso periférico é o primeiro tecido a sofrer com a
hipóxia. Em seguida, a musculatura esquelética é afetada, demonstrando alterações
irreversíveis após quatro a seis horas de isquemia. A pele, o tecido celular subcutâneo, o
tecido ósseo e o cartilaginoso apresentam grande resistência à isquemia, provavelmente
devido ao seu baixo metabolismo, sendo a isquemia cutânea passível de reversão após
quarenta e oito horas
40,50
.
A síndrome de revascularização é uma das complicações pós-operatórias mais
temidas pelos cirurgiões vasculares e pode estar presente tanto nas oclusões arteriais
agudas quanto nas oclusões de enxertos vasculares.
Mais de 50 anos se passaram e, a despeito do enorme avanço tecnológico
experimentado nas últimas décadas, a mortalidade dos indivíduos que desenvolvem a
síndrome mionefropática após operações de revascularização de membros inferiores ainda
está em torno de 60%, especialmente quando associada a diabetes, senilidade e
insuficiência renal
2,6,9
.
Diante disto, pareceu pertinente investigar as alterações morfológicas renais
decorrentes da oclusão da aorta abdominal infra-renal.
Como modelo animal, utilizou-se o rato, por ser de pequeno porte, de fácil
manuseio e por ocupar pequenos espaços, o que facilitou a manipulação, controle e
observação dos animais e permitiu a obtenção de uma amostra uniforme.
A fim de obter maior homogeneização da amostra e para que não houvesse
interferência do ciclo hormonal sobre as observações analisadas, optou-se pela
utilização de ratos machos com idade variando entre três e quatro meses, ratos adultos.
29
O modelo de isquemia e reperfusão da musculatura esquelética das
extremidades posteriores dos ratos proposto por Takito
26
foi realizado utilizando a ligadura
da aorta abdominal terminal. Neste estudo, foi escolhido o clampe vascular, por apresentar
maior similaridade à condição de reparação cirúrgica.
Chama-se atenção para o fato de que no presente estudo não foi realizada a
oclusão dos ramos da aorta, como a artéria mesentérica inferior, a artéria sacral média e
as artérias lombares. Segundo Hebel et al.
28
, a vascularização do membro posterior do
rato apresenta exuberante circulação colateral ao nível da artéria ilíaca externa e da
artéria femoral comum.
É bem conhecido o fato de que alterações morfológicas compatíveis com
necrose isquêmica de células renais tubulares são verificadas após pelo menos 30 minutos
de isquemia e mais de uma hora de reperfusão
29,30,41
. As modificações, reflexo da
irreversibilidade da injúria, consistem na presença de alterações nucleares como picnose,
cariólise ou cariorréxis associadas à homogeneidade e à acidofilia citoplasmática
31
.
Segundo Rosenberg et al.
22
, assim como Robbins et al.
40
, muitas vezes as
células agredidas ainda conseguem sobreviver, apresentando somente alterações
subletais que consistem em degeneração hidrópica ou vacuolar com modificações
metabólicas discretas, mas ainda compatíveis com a sobrevivência celular.
Entretanto, com o aporte de oxigênio quando do restabelecimento do fluxo
sanguíneo, as lesões se exarcebam pelo fato dessas células já estarem metabolicamente
comprometidas e não terem, portanto, a capacidade de exercer suas funções no sentido
de manter o equilíbrio iônico e suas defesas antioxidantes
4,29,30
. Devido à morte celular
por necrose, genes reguladores da apoptose também são ativados, culminando com
maior perda de células ao longo dos segmentos dos nefrons, o que contribui para o
estabelecimento da insuficiência renal
31,33,34,35,36,39
.
Nosso protocolo experimental, empregando animais sacrificados logo após a
isquemia ou logo após a liberação do clampe, permitiu a demonstração de que com 30
minutos de isquemia já ocorrem alterações tubulares que são agravadas com 30 minutos
de reperfusão (Tabelas 1 e 2, Figuras 2 e 3). Em estudo semelhante ao nosso, porém com
exploração ultra-estrutural, Arendshorst et al.
29
comprovaram que após uma a três horas
de isquemia surgiram modificações subletais (tumefação mitocondrial de baixa
amplitude, condensação da matrix e dilatação das cristas) nos túbulos, o que corrobora os
nossos achados. Porém, Shumer et al.
21
constataram a presença de necrose tubular aguda
morfológica apenas após dois dias de reperfusão.
30
Tanto Osvaldo et al.
37
quanto Robbins et al.
40
defendem que os tecidos
fixados por imersão podem apresentar artefatos que são facilmente confundidos com
alterações patológicas. Porém, Donahe et al.
38
, em estudo realizado considerando a
reação das células renais durante autólise in vitro, evidenciaram que, mesmo em tecidos
fixados imediatamente após a retirada do organismo, ocorrem alterações mais
proeminentes nos túbulos proximais.
Não utilizamos uma fixação por perfusão devido ao fato de que esta, quando
realizada com animais ainda vivos, poderia alterar o tempo de reperfusão ou provocar
reperfusão nos animais submetidos somente a isquemia, o que alteraria o protocolo do
nosso experimento. Igualmente, em nosso material levamos em consideração a
presença destes artefatos.
As modificações consideradas foram comparativas em relação aos animais do
grupo sham. Por este motivo, optamos por utilizar, assim como em Takito
26
, uma análise
semiquantitativa de imagens digitalizadas, com o propósito de diminuir a margem de erro.
O achado de modificações no compartimento tubular no grupo IB, apesar de ser um
controle, pode ter sido provocado pelo maior tempo de exposição do rim, como foi descrito
por Donahe et al.
38
.
Em 1987, Gobé et al.
39
foram os primeiros a definir a presença de células
em apoptose no estudo da hidronefrose. Desde então, a apoptose renal tem sido descrita
em diversas doenças renais, como: glomerulonefrites, displasias, neoplasias, doenças
imunológicas e estenose da artéria renal.
Por esta razão, decidimos incluir no nosso protocolo a técnica de imuno-
histoquímica para detecção das proteínas reguladoras da apoptose: Bcl-x, Bax e Bcl-2.
A proporção relativa das proteínas anti-apoptóticas (Bcl-x e Bcl-2) e da
proteína pró-apoptótica (Bax) parece ser um fator importante que contribui
determinando a morte celular ou a sua sobrevivência
22,23,39,43,44,45
.
Segundo Yu et al.
4
e Gobé et al.
23
, o rim recebe uma quantidade de oxigênio
muito superior à necessária, porém a região medular externa consome mais de 80% do
aporte de oxigênio, superando o cérebro e o miocárdio. Portanto, a região medular
externa vive constantemente à beira da hipóxia, sendo a primeira a ser afetada por um
processo de isquemia renal. Essa vulnerabilidade é ainda agravada pelo fato de que a
31
isquemia renal decorrente de uma hipovolemia não é homogênea: enquanto o fluxo
sanguíneo diminui para 60% dos níveis basais no córtex superficial, a redução é
superior a 80% na região medular externa.
Chien et al.
43
, assim como no nosso experimento, detectaram expressão de
Bax mesmo no grupo sham, porém evidenciamos que foi relevante apenas nos túbulos
corticais quando comparados IA e IB (Tabelas 5 e 6). Entretanto, ao serem comparadas
às regiões cortical e medular, não houve significância estatística (Tabelas 9 e 10).
De acordo com os nossos resultados (Tabelas 13 e 14), houve uma maior
expressão das proteínas anti-apoptóticas Bcl-x e Bcl-2 na região medular do que na cortical
(Figura 4) e, em contrapartida, encontrou-se uma maior expressão da proteína pró-
apoptótica Bax na região cortical em relação à medular (Figura 5). Resultados semelhantes
obtiveram Gobé et al.
24
e Cuttle et al.
25
, sendo este último em estudo in vitro.
A região medular renal é um importante reservatório dos fatores de
crescimento. Com isto, estes fatores podem agir em sinergia com as proteínas
reguladoras da apoptose, minimizando, assim, a morte celular via mecanismo autócrino
ou parácrino
4,24,35
.
Nosso trabalho, assim como em Oberbauer et al.
44
, sugere que a apoptose nas
células epiteliais tubulares renais começa antes de uma hora de reperfusão (Tabelas 11 e
12), porém não podemos afirmar a duração deste processo.
Diante destas evidências, Kelly et al.
42
e Wei et al.
46
sugerem, em estudo
experimental, o uso de substâncias para inibir a apoptose, como a tetraciclina e o zinco,
e assim minimizar a disfunção após períodos de isquemia e reperfusão.
Com base neste trabalho fica claro que, nas condições do experimento,
ocorreram diferenças estatisticamente significativas entre os grupos de animais, o que
leva a concluir que a isquemia e reperfusão de membros posteriores através da oclusão
da aorta abdominal infra-renal de ratos estão associadas a modificações morfológicas
renais, principalmente na fase de reperfusão.
Deve-se lembrar que o experimento é limitado, pois o sacrifício do animal
foi realizado logo após o grupo estudado.
Espera-se também que esta pesquisa possa contribuir para o esclarecimento
de alguns pontos ainda obscuros das lesões que envolvem a isquemia e a reperfusão.
6. CONCLUSÃO
A oclusão da aorta abdominal infra-renal predispõe à lesão renal proporcional
ao tempo de isquemia e reperfusão.
7. REFERÊNCIAS
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Universidade Federal de São Paulo; 1983, 76 p.
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Vascular surgery – a comprehensive review. Pennsylvania: W.B. Sauders
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51. Feitosa EAN, Taha MO, Fagundes DJ, Takiya CM, Cardoso LR, Campos DM.
Estudo da morfologia renal após oclusão da aorta abdominal infra-renal em ratos.
Rev Col Bras Cir 2005;32(4):178-82.
37
8. NORMAS ADOTADAS
Conselho Nacional de Saúde – Resolução n.01/88: Normas de pesquisa em saúde.
Bioética 1995; 3: 137-54.
DeCS – Descritores em Ciências da Saúde. 3ed. São Paulo, Bireme, 1996 114p.
Fagundes DJ. Normas para elaboração de relatório de pesquisa [edição eletrônica-
disquete]. São Paulo: Unifesp-EPM-TOCE; 2001.
International Committee on Veterinary Anatomical Nomenclature – Nomina Anatomica
Veterinaria. 3ed. New York, Ithaca, 1983. 216p.
Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical Journals.
International Committee of Medical Journal Editors. Ann Intern Med 1997; 126:36-47.
Anexo
Carta de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa.
Apêndice
PROTOCOLO I
Data do procedimento:
Identificação do animal:
Grupo: Subgrupo: Peso:
Anestesia:
Descrição do Ato Operatório:
Tempo de Oclusão - Início: Término:
Intercorrências:
Avaliação macroscópica dos rins:
Eutanásia:
Processamento do material:
40
PROTOCOLO II
ANÁLISE HISTOLÓGICA
ANIMAL:……...
*COMPARTIMENTO INTERSTICIAL:
1.EDEMA:………………………………………………………………………..
2.INFLAMAÇÃO:………………………………………………………………..
3.CONGESTÃO VASCULAR:…………………………………………………
4.HEMORRAGIA:……………………………………………………………….
TOTAL:…………
0 = ausente
1 = leve
2 = moderado
3 = intenso
*COMPARTIMENTO TUBULAR:
1. VACUOLIZAÇÃO:……………………………………………………………
2. DESCAMAÇÃO CELULAR:………………………………………………...
3. ALTERAÇÃO NUCLEAR:…………………………………………………...
TOTAL:…………
ÍNDICE DE LESÃO: INTERSTICIAL:…….TUBULAR:…….
*grau de lesão intersticial máximo= 12
*grau de lesão tubular máximo= 9
41
PROTOCOLO III
ANÁLISE DAS IMAGENS
GRUPO: ANTICORPO: ANIMAL:
IMAGENS CORTICAL MEDULAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
TOTAL
MÉDIA
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