( PDF ) Estudo fitoquímico de Rauia sp e Conchocarpus macrophyllus (Rutaceae) e avaliação da atividade antiparasitária de extratos e substâncias isoladas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Estudo Fitoquímico de Rauia sp e Conchocarpus

macrophyllus (Rutaceae) e Avaliação da Atividade

Antiparasitária de Extratos e Substâncias Isoladas

Tatiane Regina Albarici*

Tese apresentada como parte dos

requisitos para a obtenção do título

de DOUTOR EM CIÊNCIAS (área

QUÍMICA ORGÂNICA).

Orientador: Prof. Dr. Paulo Cezar Vieira

*Bolsista FAPESP

SÃO CARLOS-SP

2006

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Milhares de livros grátis para download.

Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da

Biblioteca Comunitária/UFSCar

A327ef

Albarici, Tatiane Regina.

Estudo fitoquímico de Rauia sp e Conchocarpus

macrophyllus (Rutaceae) e avaliação da atividade

antiparasitária de extratos e substâncias isoladas / Tatiane

Regina Albarici. -- São Carlos : UFSCar, 2007.

182 f.

Tese (Doutorado) -- Universidade Federal de São Carlos,

2006.

1. Química orgânica. 2. Rutacea. 3. Ensaios enzimáticos.

4. Ensaios biológicos. 5. Produtos naturais. I. Título.

CDD: 547 (20

)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

Centro de Ciências Exatas e de Tecnologia

Departamento de Química

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Curso de Doutorado

Assinaturas dos membros da banca examinadora que avaliou e

aprovou a defesa de tese de doutorado da candidata Tatiane Regina Albarici

realizado em 17 de maio de 2006:

d?J~J~

Prof. Dr. Paulo Cezar Vieira

Prof. Df. ~ge Kato

,J.ro'~ feLtvUJ-

Profa. Dra. Ana H

t'.

C\"1f\.MCv lA--o

a Januário

!!!

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Prof. Dr. João Batista Femandes

Dedico este trabalho aos meus pais,

Celso e Fátima e aos meus irmãos Fábio,

Felipe e Viviane pelo carinho, apoio e

incentivo.

Agradecimentos

Ao Prof. Dr. Paulo Cezar Vieira pela orientação, amizade e ensinamentos.

Aos demais professores do Laboratório de Produtos Naturais da UFSCar Dra Maria

Fátima das G. Fernandes da Silva, demais Dr. João Batista Fernandes e Dr. Edson

Rodrigues Filho pela colaboração e contribuição na minha formação.

Aos demais professores do DQ-UFSCar pela contribuição na minha formação.

Aos professores Dr. Otávio H. Thiemann e Dr. Glaucius Oliva do IFSC-USP pela

realização dos ensaios enzimáticos.

Aos Prof. Dr. Sérgio Albuquerque da FCFRP-USP pela realização dos ensaios

tripanocidas.

Aos funcionários e técnicos do DQ-UFSCar, em especial para a Luciana e ao Paulo

pela obtenção dos espectros de RMN.

A todos os meus amigos do Laboratório de Produtos Naturais, onde nunca me faltou

amizade, companhia, apoio e incentivo.

Aos amigos dos demais laboratórios do DQ-UFSCar pela amizade e

companheirismo.

Aos amigos da Química 98 pela amizade de sempre e companheirismo.

À minha família pelo incentivo constante.

À minha irmã Viviane pela amizade, conselhos e por me apoiar e incentivar sempre.

À FAPESP pela bolsa concedida.

Resumo

ESTUDO FITOQUÍMICO DE RAUIA SP E CONCHOCARPUS MACROPHYLLUS

(RUTACEAE) E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPARASITÁRIA DE EXTRATOS E

SUBSTÂNCIAS ISOLADAS - Este trabalho envolveu estudo fitoquímico de plantas

pertencentes à família Rutaceae. Foram testados 16 extratos de plantas

pertencentes à família Rutaceae em ensaios sobre as enzimas GAPDH de T. cruzi e

APRT de L. tarentolae e sobre formas tripomastigotas de T. cruzi quatro

apresentaram atividades satisfatórias em pelo menos um dos ensaios a que foram

submetidos. O extrato em éter de petróleo do caule de Conchocarpus macrophyllus

(CMCE) e o extrato metanólico das folhas de Rauia sp (RFM) apresentaram 94% e

75% de lise parasitária frente às formas tripomastigotas de T. cruzi. O extrato

metanólico das folhas de Rauia sp1 (RF1M) apresentou 74% de inibição frente à

enzima GAPDH e o extrato diclorometânico do caule de Conchocarpus macrophyllus

(CMCD) apresentou 77% de inibição sobre a enzima APRT. O extrato metanólico

das folhas de Rauia sp1 (RF1M) apresentou resultado próximo ao considerado

satisfatório (67,9% de inibição) no ensaio sobre a enzima APRT. O estudo

fitoquímico de Rauia sp resultou no isolamento de 30 substâncias. Destas, 4 são

inéditas na literatura; as cumarinas 3-etilrauianina e 5-metoxirauianina e os

alcalóides 7-hidroxi-8-metoxi-N-metilflindersina e 8-hidroxi-N-metilflindersina, este

último não foi ainda relatado como produto natural e 26 já foram descritas na

literatura; as cumarinas murranganona, 7-metoxi-8-(2-acetoxi-3-metil-1-oxobut-2-

enil)-cumarina, isomurranganona, murralongina, murrangatina, munomicrolina,

acetato de murrangatina, rauianina, umbeliferona e isoescopoletina, os alcalóides N-

metil-4-metoxi-2-quinolona, mirtopsina, dictamina, γ-fagarina, esquimianina, Z-

rhoifolinato de dimetila, zantobungeanina, zantodiolina e veprissina, as amidas

paprazina e N-trans-feruloiltiramina, a flavona 3,7,4’-trimetoxi-5-hidroxi flavona, a

lignana siringaresinol, o composto fenólico ácido vanílico e a mistura dos esteróides

sitosterol e estigmasterol. O estudo de Conchocarpus macrophyllus resultou no

isolamento de 4 substâncias, os alcalóides acridônicos arborinina e metilarborinina e

a mistura dos esteróides sitosterol e estigmasterol. Dentre as substâncias que

tiveram o potencial biológico avaliado frente a um ou mais ensaios nenhuma

apresentou resultado satisfatório.

Abstract

PHYTOCHEMICAL INVESTIGATION OF RAUIA SP AND CONCHOCARPUS

MACROPHYLLUS (RUTACEAE) AND EVALUATION OF ANTIPARASITIC

ACTIVITY OF EXTRACTS AND ISOLATED SUBSTANCES– This work involved the

study of plant extracts of the Rutaceae species. Among 16 extracts tested in assays

carried out with T. cruzi gGAPDH and L. tarentolae APRT enzymes and

trypomastigote forms of T. cruzi, four showed significant activities at least in one of

them. The petroleum ether extract of stems of Conchocarpus macrophyllus (CMCF)

and the methanolic extract of leaves of Rauia sp (RFM) showed 94% and 75% of

parasitic lyses on trypomastigote forms of T. cruzi. The methanolic extract of leaves

of Rauia sp1 (RF1M) showed 74% of inhibition of gGAPDH enzyme and the

dichloromethane extract of stems of Conchocarpus macrophyllus (CMCD) showed

74% of inhibition of APRT enzyme. The methanolic extract of leaves of Rauia sp1

(RF1M) showed 67,9% of inhibition on the APRT enzyme assay. The phytochemical

study of Rauia sp allowed the isolation of 30 substances among them 4 are

described for the first time, the coumarins 3-ethylrauianin and 5-methoxyrauianin and

the alkaloids 7-hydroxy-8-methoxy-N-methylflindersine and 8- hydroxy-N-

methylflindersine that is described as a natural product at first time. Among them 26

have already been described in the literature the coumarins murranganone, 7-

methoxy-8-(2-acetyloxy-3-methyl-1-oxobut-2-enyl)-coumarin, isomurranganone,

murralongin, murrangatin, munomicrolin, murrangatin diacetate, rauianin,

umbeliferone e isoescopoletin, the alkaloids N-methyl-4-methoxy-2-quinolone,

mirtopsine, dictamine, γ-fagarine, skimmianine, Z-dimethylrhoifolinate,

zantobungeanine, zantodioline and veprissine, the amides paprazine and N-trans-

feruloyltyramine, the flavone 3,7,4’-trimethoxy-5-hydroxyflavone, the lignan

siringaresinol, the fenolic coumpound vanilic acid and the steroids β-sitosterol and

stigmasterol. The phytochemical study of Conchocarpus macrophyllus allowed the

isolation of 4 substances the alkaloids arborinine and methylarborinine and the

steroids β-sitosterol and stigmasterol. Among the substances tested in one or more

assays none of them showed satisfactory results, leading to conclude that either the

active compounds have not been isolated or their activity is related to the

combination effects.

Abreviaturas e Símbolos

δ = deslocamento químico em partes por milhão

h= altura

φ = diâmetro

[α]

= rotação ótica específica

AMP = adenosina monofosfato

APRT= enzima adenosina fosforribosiltransferase

CC = cromatografia de adsorção em coluna aberta

CEC = cromatografia de exclusão em coluna aberta

CCDP = cromatografia em camada delgada preparativa

CCDPR =cromatografia em camada delgada preparativa rotativa

CLAE = cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CCDA =cromatografia em camada delgada analítica

CDCl

= clorofórmio deuterado

CG-EM = cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas.

DMSO = dimetilsulfóxido

O = água deuterada

DEPT= distortionless enhancement by polarization transfer

gGAPDH =Gliceraldeído 3-fosfato Desidrogenase

HMBC = heteronuclear multiple quantum correlation

HSQC = heteronuclear single quantum correlation

Hz = hertz

J = constante de acoplamento

MeOD = metanol deuterado

m/z = relação massa carga

NAD

= nicotinamida adenina dinucleotídeo

PNP = purina nucleosídeo fosforilase

RMN= ressonância magnética nuclear

RMN

H= ressonância magnética nuclear de hidrogênio

RMN

C= ressonância magnética nuclear de carbono 13

Tio-NAD

= tionicotinamida adenina dinucleotídeo

UV= ultravioleta

Lista de Tabelas

vii

Lista de Tabelas

TABELA 5.1-Dados de RMN de

H e

C da murranganona 59

TABELA 5.2-Dados de RMN

H e de

C da 7-metoxi-8-(2-acetoxi-3-metil-1-

oxobut-2-enil)-cumarina.

TABELA 5.3-Dados de RMN de

H e

C da isomurranganona 73

TABELA 5.4 - Dados de RMN de

H e

C da murralongina. 79

TABELA 5.5-Dados de RMN de

H e

C da murrangatina. 82

TABELA 5.6-Dados de RMN de

H munomicrolina 84

TABELA 5.7-Dados de RMN

H do acetato de murrangatina 86

TABELA 5.8-Dados de RMN de

H e

C da rauianina. 89

TABELA 5.9- Dados RMN

H e RMN

C da rauianina e da 3-etilrauianina 95

TABELA 5.10-Dados de RMN de

H da rauianina e da 5-metoxirauianina 97

TABELA 5.11-Dados de RMN

H da umbeliferona. 98

TABELA 5.12-Dados de RMN

H da isoescopoletina. 100

TABELA 5.13 - Dados de RMN de

H da N-metil 4-metoxi-2 quinolona. 106

TABELA 5.14- Dados de RMN de

H e

C da mirtopsina. 112

TABELA 5.15 - Dados de RMN de

H da dictamina 113

TABELA 5.16 - Dados de RMN de

H da γ-fagarina.

115

TABELA 5.17 - Dados de RMN de

H da esquimianina 117

TABELA 5.18 - Dados de RMN de

H do Z-rhoifolinato de dimetila 118

TABELA 5.19 - Dados de RMN

H e de

C da substância 19 e da 8-

metoxiflindersina (19ª)

121

TABELA 5.20 - Dados de RMN de

H da zantobungeanina. 123

TABELA 5.21-Dados de RMN de

H e

C da zantodiolina 128

TABELA 5.22 - Dados de RMN

H e de RMN

C da 7-hidroxi-8-hidroxi-N-

metilflindersina

134

TABELA 5.23 - Dados de RMN de

H da veprissina 136

TABELA 5.24 – Dados de RMN de

H e

C da substância arborinina 139

TABELA 5.25 – Dados de RMN

H e

C da substância metilarborinina. 141

TABELA 5.26-Dados de RMN de

H e

C da paprazina 147

TABELA 5.27-Dados de RMN de

H e

C da N-trans-feruloiltiramina 149

TABELA 5.28-Dados de RMN

H da 5-hidroxi-3,7,4’-trimetioxiflavona 152

TABELA 5.29-Dados de RMN

H e de

C do siringaresinol 154

Lista de Tabelas

viii

TABELA 5.30-Dados de RMN de

H e

C do ácido vanílico 157

TABELA 6.1- Códigos dos extratos 161

TABELA 6.2- Resultados dos testes sobre a forma tripomastigota de T. cruzi. 166

TABELA 6.3- Resultados de inibição da atividade da enzima gGAPDH 168

TABELA 6.4- Resultados de inibição da atividade de APRT 169

TABELA 6.5- Resultados de inibição da atividade de PNP 170

Lista de Figuras

FIGURA 1.1- metabolismo do glicerol no glicossomo 8

FIGURA 1.2- Via de recuperação de purinas em células de parasitas do gênero

Leishmania .

FIGURA 1.3- Estruturas químicas das substâncias isoladas de Rauia resinosa 15

FIGURA 1.4- Estruturas químicas das substâncias isoladas de Rauia resinosa 16

FIGURA 1.5- Estruturas químicas das substâncias isoladas de Conchocarpus

cuneifolius

FIGURA 1.6- Estruturas químicas das substâncias isoladas de Conchocarpus

inopinanatus

FIGURA 1.7- Estruturas químicas das substâncias isoladas de Conchocarpus

longifolius

FIGURA 1.8- Estruturas químicas das substâncias isoladas de Conchocarpus

macrocarpus.

FIGURA 1.9- Estruturas químicas das substâncias isoladas de Conchocarpus

heterophyllum

FIGURA 1.10- Estruturas químicas das substâncias isoladas de Conchocarpus

gaudichaudianus.

FIGURA 5.1-Região aromática do espectro de RMN

H de cumarinas

substituídas na posição 8.

FIGURA 5.2- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) do murranganona. 57

FIGURA 5.3.- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

+ D

O) do murranganona. 58

FIGURA 5.4-Espectro de RMN

C (100 MHz, CDCl

) do murranganona 58

FIGURA 5.5-Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 2. 60

FIGURA 5.6-Espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) da substância 2. 60

FIGURA 5.7-Expansão do mapa de contorno de HMBC (100 MHz, CDCl

) da

substância 2

FIGURA 5.8- Expansão do mapa de contorno de HMBC da substância 2. 62

FIGURA 5.9- Expansão do mapa de contorno de HMBC da substância 2. 63

FIGURA 5.10- Expansão do mapa de contorno de HMBC da substância 2. 64

FIGURA 5.11-Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 3. 66

FIGURA 5.12-Espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) da substância 3. 67

FIGURA 5.13- 68

FIGURA 5.14- Mapa de contorno de HMBC da substância 3 69

FIGURA 5.15- Expansão do mapa de contorno de HMBC da substância 3. 70

FIGURA 5.16- Expansão do mapa de contorno de HMBC da substância 3. 71

Lista de Figuras

FIGURA 5.17-espectro de massas da substância 3. 72

FIGURA 5.18-Proposta de fragmentação para a substância 3. 72

FIGURA 5.19- Espectro de RMN

H (400 MHz, CDCl

) da substância 4. 74

FIGURA 5.20- Espectro de RMN 13C (50 MHz, CDCl3) da substância 4. 74

FIGURA 5.21- Mapa de contorno de HSBC (100 MHz, CDCl3) da substância 4. 75

FIGURA 5.22- Mapa de contorno de HMBC (100 MHz, CDCl

) da substância 4. 76

FIGURA 5.23- Expansão do mapa de contorno de HMBC (100 MHz, CDCl

) da

substância 4.

FIGURA 5.24- Expansão do mapa de contorno de HMBC (100 MHz, CDCl

) da

substância 4.

FIGURA 5.25- Expansão do mapa de contorno de HMBC (100 MHz, CDCl

) da

substância 4

FIGURA 5.26- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da murrangatina. 81

FIGURA 5.27- Espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) da murrangatina. 81

FIGURA 5.28- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da munomicrolina. 84

FIGURA 5.29-Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) do acetato de

murrangatina.

FIGURA 5.30- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da rauianina. 88

FIGURA 5.31- Espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) da rauianina 88

FIGURA 5.32- Espectro de DEPT 135 da rauianina 89

FIGURA 5.33- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 9. 90

FIGURA 5.34- Espectro de RMN

H (50 MHz, CDCl

) da substância 9. 91

FIGURA 5.35- Mapa de contorno de HSQC da substância 9. 92

FIGURA 5.36- Mapa de contorno de HMBC da substância 9. 93

FIGURA 5.37- Espectro de massas de alta resolução da substância 9. 94

FIGURA 5.38- Espectro de RMN

H (400 MHz, CDCl

) da substância 10 96

FIGURA 5.39- Espectro de RMN

H (200 MHz, MeOD) da umbeliferona. 98

FIGURA 5.40- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 12. 99

FIGURA 5.41- Espectro de massas da isoescopoletina. 100

FIGURA 5.42- Espectro de RMN de

H (200 MHz, CDCl

) da N-metil 4-metoxi-2

quinolona.

105

FIGURA 5.43- Espectro de RMN de

H (50 MHz, CDCl

) da N-metil 4-metoxi-2

quinolona.

106

FIGURA 5.44- Espectro de RMN de

H (400 MHz, CDCl

+ gotas de MeOD) da

substância 14.

107

Lista de Figuras

FIGURA 5.45- Espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

+gotas de MeOD) da

substância 14

108

FIGURA 5.46- Mapa de contorno de HSQC (100 MHz, CDCl

+gotas de MeOD)

da substância 14.

109

FIGURA 5.47- Mapa de contorno de HMBC (100 MHz, CDCl

+gotas de MeOD)

da substância 14.

110

FIGURA 5.48- Expansão do mapa de contorno de HMBC (100 MHz, CDCl

+gotas de MeOD) da substância 14.

111

FIGURA 5.49- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da dictamina. 113

FIGURA 5.50- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da γ-fagarina.

115

FIGURA 5.51- Espectro de RMN de

H (200 MHz, CDCl

) da esquimianina 116

FIGURA 5.52- Espectro de RMN de

H Z-rhoifolinato de dimetila 118

FIGURA 5.53- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da 8-hidroxi-N-metil

flindersina

119

FIGURA 5.54- Espectro de massas de alta resolução da 8-hidroxi-N-metil

flindersina

120

FIGURA 5.55- Espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) da 8-hidroxi-N-metil

flindersina

120

FIGURA 5.56- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da zantobumgeanina. 122

FIGURA 5.57- Espectro de RMN

H (400 MHz, CDCl

) da substância 21. 124

FIGURA 5.58.- Espectro de RMN

H (100 MHz, CDCl

) da substância 21. 125

FIGURA 5.59- Mapa de contorno de HSQC (100 MHz, CDCl

) da substância 21 126

FIGURA 5.60- Mapa de contorno de HMBC (100 MHz, CDCl

) da substância 21 127

FIGURA 5.61- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 22. 129

FIGURA 5.62- Espectro de massas de alta resolução da substância 22. 130

FIGURA 5.63- Espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) da substância 22 130

FIGURA 5.64- Mapa de contorno de HSQC (100 MHz, CDCl

) da substância 22 131

FIGURA 5.65- Mapa de contorno de HMBC (100 MHz, CDCl

) da substância 22 132

FIGURA 5.66- Expansão do mapa de contorno de HMBC (100 MHz, CDCl

) da

substância 22.

133

FIGURA 5.67- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 23. 135

FIGURA 5.68- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) substância 24. 137

FIGURA 5.69- Espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) da substância 24. 138

FIGURA 5.70- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da metilarborinina 140

FIGURA 5.71- Espectro de RMN

H (200 MHz, (CD

)

CO) substância 26 145

Lista de Figuras

xii

FIGURA 5.72.- Espectro de RMN

H (50 MHz, (CD

)

CO) substância 26. 146

FIGURA 5.73- Espectro de RMN

H (200 MHz, (CD

)

CO) da substância 27. 148

FIGURA 5.74.-Espectro de RMN

C (50 MHz, (CD

)

CO) da substância 27. 148

FIGURA 5.75- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 28. 151

FIGURA 5.76- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) substância 29 153

FIGURA 5.77- Espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) substância 29. 154

FIGURA 5.78- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) substância 30. 156

FIGURA 5.79- Espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) da substância 30 156

FIGURA 5.80- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da mistura das

substâncias 31 e 32

158

FIGURA 5.81- Espectro de massas do β-sitosterol

158

FIGURA 5.82- Espectro de massas do estigmasterol 159

Lista de Tabelas

xiii

Lista de Esquemas

ESQUEMA 3.1- Particionamento do extrato metanólico do caule de Rauia sp. 26

ESQUEMA 3.2- Fracionamento da fração hexânica do extrato metanólico do

caule de Rauia sp (RCMH)

ESQUEMA 3.3- Fracionamento da fração diclorometânica do extrato metanólico

do caule de Rauia sp (RCMD)

ESQUEMA 3.4- Fracionamento da fração RCMD2 29

ESQUEMA 3.5- Fracionamento da fração RCMD3 30

ESQUEMA 3.6- Fracionamento da fração RCMD4 31

ESQUEMA 3.7- Fracionamento da fração RCMD6 32

ESQUEMA 3.8- Particionamento do extrato metanólico das folhas de Rauia sp1 33

ESQUEMA 3.9- Fracionamento da fração diclorometânica do extrato metanólico

das folhas de Rauia sp (RF1MD)

ESQUEMA 3.10- Fracionamento das frações RF1MD 2, RF1MD 3, RF1MD 4 e

RF1MD 5

ESQUEMA 3.11- Fracionamento das frações RF1MD 6, RF1MD 7, RF1MD 8 e

RF1MD 9

ESQUEMA 3.12- Particionamento do extrato metanólico das folhas de Rauia sp. 36

ESQUEMA 3.13- Fracionamento da fração diclorometânica do extrato

metanólico das folhas de Rauia sp (RFMD).

ESQUEMA 3.14- Fracionamento do extrato diclorometânico do caule da

Conchocarpus macrophyllus

ESQUEMA 5.1- Proposta biogenética para as substâncias 11e 12 101

ESQUEMA 5.2- Proposta biogenética para as substâncias 1, 2 e 3 102

ESQUEMA 5.3- Proposta biogenética para as substâncias 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10. 103

ESQUEMA 5.4- Proposta biogenética para as substâncias 13, 14, 15, 16, 17 e

18.

143

ESQUEMA 5.5- Proposta biogenética para as substâncias 19, 20, 21, 22 e 23. 144

ESQUEMA 5.6- Proposta biogenética para as substâncias 24 e 25. 144

Lista de gráficos

GRÁFICO 6.1- Resultados dos testes “in vitro” sobre a forma tripomastigota de

T. cruzi.

162

GRÁFICO 6.2- Resultados de inibição da atividade da enzima gGAPDH 163

GRAFICO 6.3- Resultados de inibição da atividade de APRT para extratos. 164

GRAFICO 6.4- Resultados de inibição da atividade de APRT para frações 165

Lista de Tabelas

Sumário

1- Introdução 1

1.1-Produtos Naturais na Produção de Fármacos 1

1.2- A doença de Chagas 4

1.2.1-Fases da Doença 5

1.2.2-Fármacos Utilizados no Controle da Doença 5

1.2.3- Método para busca de compostos antichagásicos 7

1.3- Leishmaniose 9

1.3.1-Fármacos utilizados no controle da doença 10

1.3.2- Método para busca de compostos antileishmaniose 12

1.4-A Família Rutaceae 13

1.4.1- Características químicas e biológicas da família Rutaceae 13

1.4.2- O gênero Rauia 14

1.4.3- O gênero Conchocarpus 16

2- Objetivos 21

3- Procedimento Experimental 23

3.1- Materiais e Métodos 23

3.2- Equipamentos 24

3.3 Material botânico 25

3.3.1- Obtenção dos extratos 25

3.3.1.1- Particionamento dos extratos brutos 25

3.3.1.2- Estudo fitoquímico do extrato metanólico do caule de Rauia sp 26

3.3.1.2.1- Estudo fitoquímico da fração hexânica do extrato metanólico do caule

de Rauia sp

3.3.1.2.2- Estudo fitoquímico da fração diclorometânica do extrato metanólico do

caule de Rauia sp

3.3.1.3- Estudo fitoquímico do extrato metanólico das folhas de Rauia sp1 32

3.3.1.3.1- Estudo fitoquímico da fração diclorometânica do extrato metanólico do

das folhas de Rauia sp1

3.3.1.4- Estudo fitoquímico do extrato metanólico das folhas de Rauia sp 36

3.3.1.4.1- Estudo fitoquímico da fração diclorometânica do extrato metanólico do

das folhas de Rauia sp

3.3.1.5- Estudo fitoquímico do extrato diclorometano do caule da Conchocarpus

macrophyllus.

3.4- Ensaios Biológicos 39

3.4.1- Ensaio tripanocida “in vitro” sobre a forma tripomastigota de T. cruzi 39

Lista de Tabelas

3.4.2- Ensaio de inibição da atividade da enzima gGAPDH gliceraldeído-3-

fosfato desidrogenase de T. cruzi

3.4.3- Ensaio de inibição da atividade da enzima gGAPDH gliceraldeído-3-

fosfato desidrogenase de T. cruzi (novo protocolo)

3.4.4- Ensaio de inibição da atividade da enzima gGAPDH gliceraldeído-3-

fosfato desidrogenase de T. cruzi (utilizando Tio-NAD como cofator)

3.4.5- Ensaio de inibição da atividade de APRT Adenina Fosforibosiltransferase

de Leishmania tarentolae

4- Substâncias Isoladas 45

5- Determinação estrutural 55

5.1- Cumarinas 55

5.1.1-Determinação Estrutural da Substância 1 56

5.1.2-Determinação Estrutural da Substância 2 59

5.1.3- Determinação Estrutural da Substância 3 66

5.1.4- Determinação Estrutural da Sustância 4 73

5.1.5-Determinação Estrutural da Substância 5 80

5.1.6-Determinação Estrutural da Substância 6 83

5.1.7-Determinação Estrutural da Substância 7 85

5.1.8-Determinação Estrutural da Substância 8 87

5.1.9- Determinação Estrutural da Substância 9 90

5.1.10- Determinação Estrutural da Substância 10 95

5.1.11-Determinação Estrutural da Substância 11 97

5.1.12-Determinação Estrutural da Substância 12 98

5.1.13-Biogênenese das cumarinas 100

5.2 - Alcalóides 104

5.2.1-Determinação Estrutural da Substância 13 104

5.2.2-Determinação Estrutural da Substância 14 107

5.2.3-Determinação Estrutural da Substância 15 112

5.2.4-Determinação Estrutural da Substância 16 114

5.2.5-Determinação Estrutural da Substância 17 115

5.2.6-Determinação Estrutural da Substância 18 117

5.2.7- Determinação Estrutural da Substância 19 119

5.2.8- Determinação Estrutural da Substância 20 122

5.2.9- Determinação Estrutural da Substância 21 124

5.2.10- Determinação Estrutural da Substância 22 129

5.2.11- Determinação Estrutural da Substância 23 135

5.2.12- Determinação Estrutural da Substância 24 136

Lista de Tabelas

5.2.13- Determinação Estrutural da Substância 25 140

5.2.14- A biogênese dos alcalóides 142

5.3- Amidas 145

5.3.1- Determinação Estrutural da Substância 26 145

5.3.2- Determinação Estrutural da Substância 27 147

5.4- Flavonóide 150

5.4.1- Determinação Estrutural da Substância 28 150

5.5- Lignana 152

5.5.1- Determinação Estrutural da Substância 29 152

5.6- Composto fenólico 155

5.6.1- Determinação Estrutural da Substância 30 155

5.6- Esteróides 157

5.6.1- Determinação Estrutural da Substância 31 e 32 157

6- Atividades Biológicas 161

6.1- Atividades Biológicas dos Extratos Brutos 161

6.1.1- Ensaio tripanocida “in vitro” sobre a forma tripomastigota de T. cruzi 162

6.1.2- Ensaio de inibição da atividade da enzima gGAPDH gliceraldeído-3-

fosfato desidrogenase de T. cruzi

161

6.1.3- Ensaio de inibição da atividade de APRT Adenina Fosforibosiltransferase

de Leishmania tarentolae

164

6.2- Atividades Biológicas das Frações do extrato diclorometânico do caule de

Conchocarpus macrophyllus

164

6.3- Atividades Biológicas das Substâncias puras 165

6.3.1- Ensaio tripanocida “in vitro” sobre a forma tripomastigota de T. cruzi 165

6.3.2- Ensaio de inibição da atividade da enzima gGAPDH gliceraldeído-3-

fosfato desidrogenase de T. cruzi

167

6.3.3- Ensaio de inibição da atividade de APRT Adenina Fosforibosiltransferase

de Leishmania tarentolae

169

6.3.4- Ensaio de inibição da atividade da enzima PNP purina nucleosídeo

fosforilase de Schistosoma mansoni

170

7- Conclusões 173

8- Referências Bibliográficas 175

Introdução

1- Introdução

1.1-Produtos Naturais na Produção de Fármacos

O uso de produtos naturais com propriedades terapêuticas é tão antigo

quanto a civilização humana (RATES, 2001). Uma estreita relação entre o homem e

as plantas consideradas curativas sempre existiu em todas as fases de

desenvolvimento das várias civilizações (GOTTLIEB & KAPLAN, 1993).

Os produtos naturais fornecem medicamentos úteis cuja produção na forma

sintética é difícil ou muitas vezes inviável economicamente. De fontes naturais

também podem ser retirados compostos básicos que modificados tornam-se mais

eficazes ou menos tóxicos (ROBBERS et al., 1997).

A procura de fármacos através de “screening” de uma grande variedade de

vegetais para testes biológicos específicos é uma das formas racionais adotadas

para a procura de fármacos de origem vegetal. A busca de substâncias que possam

se tornar um fármaco em fontes vegetais difere dos meios sintéticos principalmente

pela diversidade molecular e pela funcionalidade biológica (NISBET & MOORE,

1997).

A aspirina ou ácido acetilsalicílico tem sua origem relacionada aos produtos

naturais. A salicina e saligenina, derivados do áacido salicílico, isoladas de Salix

alba e Filipendula ulmaria apresentam propriedades antiinflamatórias e analgésicas

reconhecidas e deram origem a aspirina. O ácido acetilsalicílico porém, não é

encontrado tal qual nessas plantas, trata-se de uma modificação estrutural

(HOSTETTMANN et al., 2003; ROBBERS et al. , 1997).

As cascas de algumas espécies de Cinchona spp eram utilizadas como

antitérmicos. Destas espécies de plantas foi isolada a quinina, um alcalóide utilizado

durante muito tempo como antimalárico e que serviu como protótipo para a

COOH

OCOCH

ÁCIDO ACETILSALICÍLICO

OGlc

SALICINA

SALIGENINA

COOH

ÁCIDO SALICÍLICO

Introdução

descoberta de derivados antimalariais como a cloroquina e a mefloquina

(BARREIRO & FRAGA, 2001).

A artemisinina, isolada de Artemisia annua, planta utililizada há mais de 2000

anos na China como antipirético e no tratamento de malária, é outro exemplo de

composto protótipo natural para antimaláricos. Esse sesquiterpeno apresenta

propriedades farmacocinéticas inadequadas ao uso terapêutico e baixa solubilidade

motivando a modificação estrutural dessa substância. Dentre os derivados

sintetizados o artemeter, arteéter e artesunato de sódio foram aprovados como

antimaláricos em vários países (BARREIRO e FRAGA, 2001 e HOSTETTMANN et

al., 2003).

Exemplos importantes de fármacos obtidos de plantas são os alcalóides

bisindólicos vinblastina e vincristina isolados de Catharantus roseus (Apocynaceae)

que são utilizados no tratamento de leucemia e o paclitaxel, isolado de Taxus

brevifolia utilizado no tratamento de câncer de mama e de pulmão (BARREIRO e

FRAGA, 2001 e HOSTETTMANN et al., 2003).

QUININA

CLOROQUINA

MEFLOQUINA

ARTEMISININA

ARTEMETER R=CH

ARTEÉTER R=C

ARTESUNATO DE SÓDIO R=COCH

Introdução

Apesar da competição com outros métodos de descoberta de fármacos,

produtos naturais ainda fornecem sua considerável contribuição em candidatos a

testes clínicos e fármacos (Buttler, 2004).

Aproximadamente 25% dos fármacos prescritos mundialmente são

provenientes de plantas. Dos 252 fármacos considerados como básicos e essenciais

pela Organização Mundial da Saúde 11% são de origem vegetal e um número

significativo são substâncias sintéticas obtidas de precursores naturais (RATES,

2001).

Além disso, 119 compostos de origem natural obtidos a partir de cerca de 90

espécies de plantas podem ser considerados fármacos importantes e são utilizados

na terapia moderna e 74% destes compostos são derivados de plantas (CRAGG et

al., 1997).

Estima-se que existam entre 215.000 e 500.000 espécies de angiospermas

no mundo. No entanto apenas 15 a 17% de todas as espécies de angiospermas

tiveram seu potencial terapêutico estudado em algum alvo de interesse (RATES,

2001; SOEJARTO, 1996).

O Brasil está entre os 12 países com maior biodiversidade. A variedade de

espécies de plantas é impressionante e o Brasil é particularmente rico em plantas

medicinais. Aproximadamente 22% de todas as angiospermas estão distribuídas na

Floresta Amazônica, Mata Atlântica e Cerrado. A exploração racional e a

conservação da diversidade biológica é uma questão de prioridade e urgência

(BOLZANI et al., 1999).

TAXOL

OOC

OCOCH

R=CH

VINBLASTINA

R=CHO VINCRISTINA

Introdução

1.2- A Doença de Chagas

A Doença de Chagas também denominada tripanosomíase americana, foi

descrita por CHAGAS (1909), o qual descreveu a infecção humana, a morfologia do

parasita na corrente sanguínea, o ciclo do parasita no trato digestivo do vetor a

transmissão dos parasitas flagelados que ocorre dos triatomíneos para os

vertebrados (WENDEL et al., 1992).

A Organização Mundial da Saúde estima que existam 16 – 18 milhões de

pessoas infectadas pela Doença de Chagas, distribuídaos entre o México, América

Central e América do Sul e que aproximadamente 120 milhões de pessoas vivem

em áreas de risco (WHO, 2001).

O agente causador da Doença de Chagas é o Trypanosoma cruzi, um

protozoário da família Trypanosomatidae e da ordem Kinetoplastida, para o qual o

ciclo de vida envolve obrigatoriamente a passagem por hospedeiros vertebrados e

invertebrados em uma série de estágios. Ele apresenta-se sob forma flagelada

(epimastigota e tripomastigota) e aflagelada (amastigota) dependendo do hospedeiro

(VERONESSI, 1991; COURA & CASTRO, 2002).

Nos mamíferos as formas amastigotas encontram-se nos tecidos e são

capazes de se multiplicar e posteriormente são liberadas no sistema sanguíneo na

forma tripomastigota. A forma tripomastigota pode infectar novas células

hospedeiras ou ser ingerida por insetos vetores. Quando ingerida pelos insetos

vetores, estas formas podem se diferenciar na forma epimastigota, que se multiplica

no invertebrado e quando atinge o intestino do inseto se desenvolve em formas

tripomastigotas metacíclicas. Quando o inseto suga o sangue do mamífero, ele

deposita suas fezes que contém a forma tripomastigota metacíclica que, ao cair no

sistema sangüíneo do mamífero invade células hospedeiras na forma amastigota,

dando continuidade ao ciclo (COURA & CASTRO, 2002; SEPÚLVEDA-BOZA &

CASSELS, 1996; GARCIA, 1999).

O transmissor da Doença de Chagas é um inseto da ordem Hemiptera, família

Reduviidae, subfamília Triatominae geralmente denominado triatomídeo e

popularmente conhecido como barbeiro (VERONESSI, 1991).

Com o controle do inseto vetor, alguns países já se declararam livres do vetor

da doença (WHO, 2001). É um erro, entretanto, afirmar que a Doença de Chagas

está controlada, já que ainda existem focos de transmissão em muitas áreas.

Introdução

Mesmo em áreas onde foi declarada que a transmissão é nula, há um risco de

reincidência dos focos de transmissão devido a diminuição prematura das inspeções

epidemiológicas e atividades de vigilância (DIAS et al., 2002).

Além da principal forma de contaminação através do vetor que é responsável

por 80% da transmissão, há também a contaminação através da transfusão de

sangue contaminado que é responsável por 15% das infecções e por transplante de

órgãos. Também podem ocorrer transmissão congênita (5000 novos casos por ano)

e via oral através da ingestão de alimentos contaminados (DIAS & SCHOFIELD,

1999 e VERONESSI, 1991). Esta ultima forma de contaminação é rara, porém, no

início de 2005 foi constatada a contaminação através do consumo de caldo de cana

em Santa Catarina. Episódios como esse já haviam sido registrados na Amazônia

Oriental Brasileira, em Teutônia (Rio Grande do Sul) e em Catolé do Rocha

(Paraíba) (Ministério da Saúde, 2005).

1.2.1-Fases da Doença

Quando o indivíduo é infectado ocorre um período de incubação de no

mínimo quatro dias e em seguida tem início a fase aguda da doença que raramente

é fatal (taxa de mortalidade de 2 a 8%). O parasita invade diferentes células

hospedeiras que se rompem, causando uma inflamação nos tecidos, o fígado e o

baço apresentam aumento de volume, o coração sofre dilatação global (COURA &

CASTRO, 2002; VERONESSI, 1991).

Após a fase aguda ocorre uma forte tendência de imunidade, mas o indivíduo

permanece infectado. Posteriormente tem início a fase crônica onde, a maioria dos

pacientes desenvolve distúrbios cardíacos, neurológicos e digestivos.

(SEPÚLVEDA-BOZA & CASSELS, 1996; COURA & CASTRO, 2002).

1.2.2-Fármacos Utilizados no Controle da Doença

O Nifurtimox® e o Benzonidazol® são utilizados no tratamento dos pacientes

e são capazes de curar 50% das infecções recentes. (WHO, 2002). Porém desde os

anos 80 o Nifurtimox teve sua comercialização descontinuada no Brasil, pois ele age

via redução do grupo nitro a um radical nitroânion instável que por sua vez reage

com oxigênio gerando intermediários altamente reativos. O T. cruzi é deficiente na

Introdução

detoxificação de radicais livres, portanto, é sucetível ao ataque destes

intermediários. Porém estes intermediários reativos também podem reagir no

organismo do hospedeiro causando danos oxidativos (COURA & CASTRO, 2002 e

URBINA & DOCAMPO, 2003).

O mecanismo de ação do Benzonidazol parece estar relacionado com a ação

em uma via que envolve a ligação covalente de intermediários nitroreduzidos e as

macromoléculas do parasita (URBINA & DOCAMPO, 2003).

Tanto o Nifurtimox quanto o Benzonidazol são ineficientes na fase crônica da

doença e não produzem a cura parasitológica (DOCAMPO & SCHMUÑIS, 1997).

Além disso, ambos produzem efeitos colaterais similares nos pacientes, como febre

e alterações neurológicas. Com o Nifurtimox, anorexia, náusea, vômito e perda de

peso são mais freqüentes, enquanto reações na pele são mais freqüentes com o

Benzonidazol (LUQUETTI et al., 1997; RIVAS et al., 1999).

Para a esterilização do sangue em bancos de sangue a violeta genciana é a

única substância utilizada, porém alguns efeitos inconvenientes foram observados: a

violeta genciana deve ser adicionada ao sangue 24 horas antes da utilização do

mesmo impossibilitando as transfusões emergenciais e o sangue adquire coloração

azulada que posteriormente é observada no tecido do transfundido (DIAS &

SCHOFIELD, 1999).

N(CH

)

CCH

VIOLETA GENCIANA

BENZONIDAZOL

NIFURTIMOX

Introdução

Com a ineficácia das substâncias tanto para tratamento de doentes quanto

para esterilização do sangue, é necessária a busca de novas substâncias para estes

fins. Vários metabolitos de plantas vêm sendo testados contra o T. cruzi

(SEPÚLVEDA-BOZA & CASSELS, 1996).

1.2.3- Método para busca de compostos antichagásicos

Uma linha de pesquisa promissora é a busca de compostos que inibam o

ciclo biológico do parasita. Deste modo, as enzimas que atuam no metabolismo do

parasita são alvos interessantes. OPPERDOES e BORST em 1977 constataram que

as formas tripomastigotas (formas presentes na corrente sanguínea do mamífero

hospedeiro) de parasitas da família Tripanomastidae possuem uma organela

denominada glicossomo onde se encontram nove enzimas envolvidas na glicólise.

Sabe-se que o parasita é altamente dependente da glicólise para a formação de

ATP (HAMMOND et al., 1985; SOUZA et al., 1998). Já que o parasita é altamente

dependente da via glicolítica como fonte de energia, as enzimas envolvidas nesta via

são alvos interessantes na busca de compostos que inibam o ciclo biológico do

parasita (BAKKER et al., 2000).

Este interesse pelas enzimas da via glicolítica levou à determinação estrutural

das enzimas triosefosfato isomerase (TIM) e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase

(GAPDH) (WIRENGA et al., 1991; VELLIEUX et al., 1993).

A comparação entre a enzima GAPDH de T. cruzi e a GAPDH humana

mostrou diferenças significativas em resíduos nos sítios ativos (SOUZA et al., 1998).

Além disso, experimentos de inibição da glicólise em eritrócitos humanos mostraram

que a inibição da enzima GAPDH em até 95% não leva a sintomas clínicos. Estes

fatos sugerem o uso da GAPDH de T. cruzi como alvo (BAKKER et al., 1999).

A GAPDH catalisa a reação de fosforilação do gliceraldeído 3-fosfato a

1,3-

bifosfoglicerato.

Introdução

FIGURA 1.1- Metabolismo do glicerol no glicossomo.

* os compostos permeáveis a membrana são mostrados com setas

** HK= hexoquinase; PGI= fosfoglucose isomerase; PFK= 6-fosfofrutoquinase; ALDO=

frutosebifosfato aldolase; GDH= glicerol 3-fosfato desidrogenase; GK= glicerol quinase; TIM= triose

fosfato isomerase; GAPDH= gliceraldeido 3-fosfato desidrogenase; PGK= 3-fosfogliceratoquinase.

Introdução

1.3- Leishmaniose

As diferentes formas clínicas de Leishmania constituem um grave problema

de saúde pública. Leishmaniose é uma doença que afeta 88 países, 90% da

leishmaniose visceral ocorre em cinco países: Bangladesh, Índia, Nepal, Sudão e

Brasil e 90% dos casos de leishmaniose cutânea ocorrem em sete países:

Afeganistão, Argélia, Brasil, Irã, Peru, Arábia Saudita e Síria. A incidência anual

estimada é de 1-1,5 milhões de casos de leishmaniose cutânea e 500.000 casos de

leishmaniose visceral. Estima-se que existam 12 milhões de pessoas infectadas e

350 milhões de pessoas vivendo em áreas de risco (WHO 2001).

A leishmaniose é causada por protozoários do gênero Leishmania e sua

transmissão se dá por insetos hematófagos, denominados flebotamíneos,

popularmente conhecidos como mosquito palha (BARATA et al, 2000).

Durante o ciclo biológico o parasita do gênero Leishmania existe em duas

formas que se desenvolvem em diferentes hospedeiros: uma forma flagelada

extracelular conhecida como promastigota e uma forma intracelular denominada

amastigota. A forma que infecta o homem e outros hospedeiros vertebrados é a

promastigota, que se encontra no trato digestivo do inseto transmissor da doença. A

forma amastigota está localizada no macrófago do hospedeiro. O hospedeiro

intermediário é infectado, através da picada do inseto, com a forma promastigota.

Posteriormente estas formas promastigotas são rapidamente fagocitadas pelos

macrófagos do hospedeiro e no interior dos macrófagos mudam para a forma

amastigota. A manifestação clínica da doença é resultado da multiplicação das

formas amastigotas dentro dos macrófagos (CHAN-BACAB E PEÑHA-RODRIGEZ,

2001).

Segundo a Organização Mundial da saúde, a Leishmaniose pode ser

classificada em quatro formas clínicas: leishmaniose visceral ou calazar;

leishmaniose cutâneo-mucosa ou leishmaniose tegumentar americana; leishmaniose

cutâneo difusa e leishmaniose cutânea ou botão do Oriente (WHO 2001).

A leishmaniose visceral ou calazar é a forma clínica mais grave da doença

(CHAN-BACAB e PEÑHA-RODRIGUEZ, 2001). Este tipo de Leishmaniose é

causado pelo protozoário Leishmania donovani e pode ser fatal se não tratada. É

caracterizada pelos seus efeitos nos órgãos internos, como o fígado, baço e medula

óssea. Os sintomas mais freqüentes são: anemia, febre constante, perturbações

Introdução

digestivas, tosse, dores lombares, cefaléia, edemas nos membros e nas faces e

hemorragias (VERONESSI 1991).

A leishmaniose cutâneo-mucosa, também conhecida como úlcera de Bauru, é

uma doença crônica que acomete pele e mucosas, causada pelo protozoário

Leishmania brasiliensis. Esta doença geralmente resulta em desfiguração facial

devido às lesões que ocorrem principalmente no nariz e na boca. A leishmaniose

cutâneo difusa caracteriza-se pela presença de nódulos isolados ou agrupados,

múltiplas protuberâncias, placas ou alguns casos de lesões verrucosas

especialmente na face e na superfície externa dos braços e pernas. A doença é

transmitida pelo protozoário Leishmania mexicana. A leishmaniose cutânea é

causada pelo protozoário Leishmania tropica e é a forma menos grave da doença, é

geralmente curada espontaneamente (VERONESSI, 1991; CHAN-BACAB e

PEÑHA-RODRIGUEZ, 2001).

1.3.1-Fármacos utilizados no controle da doença

Os principais medicamentos utilizados no tratamento da leishmaniose visceral

e cutânea são antimoniais como o Pentozan e Glucantina. O mecanismo de ação

dos antimoniais é baseado na interferência no processo bioenergético das formas

amastigotas de Leishmania, inibindo particularmente as enzimas na glicolise e

oxidação de ácidos graxos, reduzindo a geração de ATP e GTP. Entretanto, este

tipo de medicamento pode causar efeitos colaterais como problemas

gastrointestinais, enrijecimento das juntas e em alguns casos insuficiência renal e

hepática. Além disso, é comum o aparecimento de resistência a este tipo de

medicamento, o tratamento é longo e tem um alto custo (CHAN-BACAB e PEÑHA-

RODRIGUEZ, 2001; KAMINSKY, 2002; GARNIER & CROFT, 2002).

GLUCANTINA

NHCH

CHOH

(OH)

SbO

PENTOSAN

HCO

OSb Sb

OCH

CHOH

COO

CHOH

COO

Introdução

O antibiótico anfotericina B é utilizado no tratamento de Leishmaniose visceral

nos casos de resistência aos antimoniais. Seu mecanismo de ação consiste em

ligar-se à fração ergosterol da membrana celular do parasita, aumentando sua

permeabilidade. Entretanto este fármaco tem seu uso limitado, pois além de 80%

dos usuários desenvolverem alterações na função renal, ele depende de

administração parenteral (CHAN-BACAB e PENHA-RODRIGUEZ, 2001; BARATA et

al., 2000).

A miltefosina, que é um derivado de fosfolipídeo que foi desenvolvido para o

tratamento de câncer, se mostrou eficiente em ensaios sobre leishmaniose e está

em fase de testes clínicos onde 95% dos pacientes com leishmaniose viceral foram

curados na fase III de triagem, na Índia. A vantagem da miltefosina é que ela é um

fármaco de administração oral e apresenta a mesma eficácia dos antimoniais.

Porém, efeitos colaterais foram observados em 62% dos pacientes. Os efeitos

colaterais mais comuns são gastrointestinais, principalmente vômito e diarréia. A

miltefosina não pode ser administradas emhb mulheres grávidas e doses maiores

que as doses recomendadas podem levar a morte. Não foi observado o mesmo

potencial para o tratamento de leishmaniose cutânea (GARNIER & CRAFT, 2002;

KAMINSKY 2002).

OCH

MILTEFOSINA

OHOH

OHOHO

ANFOTERICINA B

Introdução

1.3.2- Método para busca de compostos antileishmaniose

Um alvo potencial na busca de compostos capazes de interromper o ciclo

biológico do parasita no ser humano é a via de obtenção de purino nucleotídeos. A

via das bases nitrogenadas purínicas é indispensável para a formação do Ácido

desoxirribonucléico (DNA) como também do ácido ribonucléico (RNA). Estas

reações são catalisadas por enzimas conhecidas como PRTases (SILVA et al.,

2004; Craig III & EAKIN, 1997).

Na maioria dos organismos as purinas e pirimidinas podem ser sintetizadas

por duas vias. A primeira envolve dez reações enzimáticas seqüenciais levando à

“síntese de novo” dos nucleotídeos purinicos e pirimidínicos a partir de precursores

monocleotídicos. A segunda cadeia metabólica, “via de recuperação”, se utiliza dos

purinos-nucleotídeos formados (adenina, guanina e/ou hipoxantina) derivados da

degradação de ácidos nucléicos ou nucleotídeos livres. Já a sobrevivência do

protozoário depende exclusivamente da recuperação de purinas provenientes do

hospedeiro (FIGURA 1.2) (SILVA et al., 2004; Craig III & EAKIN, 1997).

FIGURA 1.2- Via de recuperação de purinas em células de parasitas do gênero

Leishmania.

AMP

IMP

Adeni na

Guanin

APRT HGPRT

XMP

GMP

PRPP

oxantin

Xantina

Hipoxantina

Guanina

XPRT

PRPP

GDP

GTP

ADP

ATP

Adenil osuccinato

PRPP

AAH

ADSL

ADSS

AMD

GMR

GMS

MDh

PRS-I

Ribose-6-fosfato

PRPP

Síntese de Novo

(hospedeiro vertebrado)

PPi

Introdução

A dependência do parasita pela recuperação de purinas provenientes do

hospedeiro torna as enzimas PRTases alvos interessantes na busca de compostos

que sejam capazes de interromper o ciclo biológico do parasita no ser humano.

A enzima adenina-fosforribosil-transferase (APRT) enzima catalisa a remoção

do grupo pirofosfato (PPi) do 5-fosforribosil-1-pirofosfato (PRPP) e a condensação

de ribose a base purínica (adenina), formando adenosina monofosfato (AMP) numa

reação de substituição nucleofílica SN

(NOYES et al., 1997).

1.4- A família Rutaceae

A família Rutaceae é constituída de aproximamente 150 gêneros e 1600

espécies de árvores e arbustos distribuídas nas regiões tropicais e temperadas do

globo terrestre (WATERMAN & GRUNDON, 1983). No Brasil estão citadas

aproximadamente 176 espécies (ALBUQUERQUE, 1968).

1.4.1- Características químicas e farmacológicas da família Rutaceae

A família Rutaceae é conhecida por apresentar uma grande diversidade de

metabólitos secundários, destacando-se os alcalóides, especialmente os derivados

do ácido antranílico, cumarinas, lignanas, flavonóides, terpenos e limonóides com

largo espectro de atividades biológicas (WATERMAN & GRUNDON, 1983;

WATERMAN, 1999).

AMBROZIN el al. (2004), MAFEZOLI et al. (2000) e VIEIRA et al. (2001)

demonstraram a atividade tripanocida de plantas pertencentes às famílias Rutaceae

e Meliaceae.

VIEIRA et al. (2001) demonstrou ainda a atividade de extratos de plantas

pertencentes às famílias Rutaceae e Meliaceae na enzima GAPDH de T. cruzi e

neste mesmo trabalho são relatadas as atividades de 13 cumarinas sobre essa

enzima onde a substância que apresentou maior atividade foi a chalepina

(IC

=64µM) uma cumarina isolada de Pilocarpus spicatus (Rutaceae). Foram

descritas ainda atividades significativas da flavona 3’,4’,5’,5,7-pentametoxiflavona

(TOMAZELA et al. 2000) e de flavonóides polimetoxilados frente a GAPDH

(MORAES et al., 2003).

Introdução

Lignanas isoladas de Zantoxylum naranjillo (Rutaceae) mostraram alta

atividade tripanocida sendo que o (-)metilpluviatolídeo foi o mais ativo sobre as

formas tripomastigotas T. cruzi (BASTOS et al., 1999).

1.4.2- O gênero Rauia

O gênero Rauia é ainda pouco conhecido com relação ao seu potencial

químico. De Rauia resinosa foram isoladas cumarinas substituídas nas posições 7 e

8, alcalóides, um esteróide, um flavonol e uma flavona ( VELOSO, 1995; VELOSO et

al., 1997; OLIVEIRA, 1996). De uma espécie não identificada de Rauia foi isolada

uma cumarina e quatro alcalóides (FACCHINI, 2005).

CHALEPINA

OCH

3',4',5',5,7-PENTAMETOXIFLAVONA

(-)-METILPLUVIATOLÍDEO

Introdução

Figura 1.3- Estruturas químicas das substâncias isoladas de Rauia resinosa.

rauianina

OOO

murrangatina

acetato de murrangatina

OOCH

munomicrolina

OOO

8-prenil-7-geraniloxi-cumarina

OCH

4', 5, 7-trimetoxi-flavonol

OOCH

OCH

lemobilina

7,3,4'-trimetil-campeferol

γ−fagarina

OCH

esquimianina

β−sitosterol

Introdução

Figura 1.4- Estruturas químicas das substâncias isoladas de Rauia sp.

1.4.3- O gênero Conchocarpus

Em 1998 KALLUNKI e PIRANI reclassificaram algumas espécies do gênero

Angostura no gênero Conchocarpus. Entre estas espécies encontrava-se a

Angostura macrophylla que foi reclassificada como Conchocarpus macrophyllus.

Várias espécies de Conchocarpus já foram estudadas no Laboratório de

Produtos Naturais da UFSCar e várias classes de substâncias foram isoladas. De

Conchocarpus macrophyllus foi encontrado o relato de apenas uma substância

isolada, o alcalóide acridônico conhecido como arborinina (VELOSO, 1995).

O estudo de Conchocarpus cuneifolius levou ao isolamento de acetofenonas

e flavonóides glicosilados (FIGURA 1.5) (VELOSO, 1995). De Conchocarpus

inopinatus foram isolados sete alcalóides acridônicos e uma cumarina (MAFEZOLI,

2001) que tem as estruturas químicas representadas na FIGURA 1.6.

OCH

arborinina

OCH

megistoquinona

7-hidroxi-8-

metoxiflindersina

OCH

N-metil-4-metoxi-

2-quinolona

OCH

araliopsina

rauianina

OOO

Introdução

FIGURA 1.5- Estruturas químicas das substâncias isoladas de Conchocarpus

cuneifolius.

FIGURA 1.6- Estruturas químicas das substâncias isoladas de Conchocarpus

inopinanatus.

OCH

OOH

escoparona

1-hidroxi-3-metoxi-

N-metilacridona

1-hidroxi-3-metoxi-N-

metilenoacetoxiacridona

xanthoxolina

arborinina

1,2,3,5-tetrametoxi-

N-metilacridona

metilarborinina

inopinatina

OCH

hidroxi-2,2-

dimetilcromenoacetofenona

hidroxi-2,2-

dimetilcromenoacetofenona

2,2-dimetilcromeno-

metoxi-acetofenona

2,2-dimetilcromeno-

metoxi-acetofenona

6,8-diglicosil-

7,4'-hidroxiflavona

6-glicosil-7,metoxi-

4'-hidroxi-flavona

6-acetoxiglicosil-7,metoxi-

4'-acetil-flavona

Introdução

Foram isoladas onze cumarinas e sete alcalóides de Conchocarpus longifolius

(MAFEZOLI, 2001; FACCHINI, 2005) (FIGURA 1.7) e quatro alcalóides do tipo

indoloquinazolina de Conchocarpus macrocarpus (VELOSO, 1995) ( FIGURA 1.8).

FIGURA 1.7- Estruturas químicas das substâncias isoladas de Conchocarpus

longifolius.

OCH

3-metoxiangelicina

3,6-dimetoxiangelicina

esfodina

OCH

pinpinelina

OCH

isobergapteno

OOHO

umbeliferona

OOO

OAc

quiahucumarina D

OOO

aurapteno

OCH

esquimianina

N-metilhaplamina N-metoxihaplamina

OCH

candicina

6-metoxihaplotusina

N-metil-4,6-dimetoxi-

2 quinolona

4,6-dimetoxi-2 quinolona

OOHO

escopoletina

OOH

escoparona

Introdução

FIGURA 1.8- Estruturas químicas das substâncias isoladas de Conchocarpus

macrocarpus.

De Conchocarpus heterophyllum foram isolados um esteróide, quatro flavonas

e dois alcalóides do tipo 4 quinolona (AMBROZIN, 2004) que tem as estruturas

químicas representadas na FIGURA 1.9.

FIGURA 1.9- Estruturas químicas das substâncias isoladas de Conchocarpus

heterophyllum.

hidroxi-indoloquinazolina

haplotusina

OCH

benzoato de β−sitosterila

OOH

2-fenil-1-metil-4-quinolona

flavona

7-metoxiflavona

5-hidroxiflavona

Introdução

De Conchocarpus gaudichaudianus foram isolados dois alcalóides do tipo

indoloquinazolina, aminas e alcalóides quinolônicos (CORTEZ, 2002) que tem as

estruturas químicas representadas na FIGURA 1.10.

FIGURA 1.10- Estruturas químicas das substâncias isoladas de Conchocarpus

gaudichaudianus.

9,10-(2,2-dimetilcromeno)-

14demetilgoshyyuamida II

9,10-(2,2-dimetilcromeno)-14hidroxi

14demetilgoshyyuamida II

9,10-(2,2-dimetilcromeno)-

goshyyuamida II

9,10-(2,2-dimetilcromeno)-3hidroxi

14demetilgoshyyuamida II

OCH

4-hidroxi-1-metil-3-

(3',7'-dimetil-6',7' diidroxi-2'-octenil)-

2-quinolona

4-hidroxi-1-metil-3-

(3',7'-dimetil-6',7' diidroxi-2'-nonenil)-

2-quinolona

N-trans-cumaroiltiramina

N-trans-feruloylltiramina

N-trans-4-O-metilferuloylltiramina

Objetivos

2- Objetivos

A proposta deste trabalho foi o estudo fitoquímico de extratos de Rauia

sp e Conchocarpus macrophyllus (Rutaceae) e a avaliação da atividade

antiparasitária dos extratos e das substâncias isoladas, avaliada através de

ensaios bioquímicos nas enzimas adenina fosforibosiltransferase (APRT) de

Leishmania tarentolae, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) de

Trypanosoma cruzi e também através do ensaio biológico in vitro sobre as

formas tripomastigotas de T. cruzi.

Outro objetivo foi contribuir para o melhor conhecimento da composição

química do gênero Rauia.

Procedimento experimental

3- Procedimento Experimental

3.1- Materiais e Métodos

Métodos Cromatográficos

Para o fracionamento das partições e frações foram utilizadas várias técnicas

cromatográficas:

 cromatografia de adsorção em coluna aberta (CC) utilizando como suporte gel

de sílica 60 comum (70-230 mesh) e “flash”(230-400 mesh)-Merck;

 cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP); utilizando placas de

vidro de 20x20 cm com espessura da camada de 1,5 mm, preparadas no

próprio laboratório, utilizando como fase estacionária sílica gel 60 F

254

-Merck,

com revelador.

 cromatografia de exclusão em coluna aberta (CEC) utilizando como suporte

sephadex LH 20 –Amershan Pharmacia Biotech AB

 cromatografia em camada delgada preparativa rotativa (CCDPR) utilizando

placas de vidro de 26 cm de diâmetro com espessura de filme de 1,5 mm,

preparadas no próprio laboratório, utilizando como fase estacionária sílica gel

60 F

254

–Merck com revelador ou sílica gel 60 F

254

– Merck com revelador e

florisil na proporção 1:1.

 cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) utilizando coluna empacotada

com fase polimérica Shodex GS-310 2G Asahipak, foi realizada no modo

preparativo num fluxo de 7 mL/min, a corrida foi acompanhada por detector

de UV em dois comprimentos de onda simultaneamente 365 nm e 254 nm,

utilizando metanol como fase móvel.

 cromatografia em camada delgada analítica (CCDA) utilizando sílica gel 60

254

, em folhas de alumínio da Merck.

 cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM) coluna

capilar DB5 (J&W),(30m x 0.25mm,i.d.0,25), ionização por impacto eletrônico

a 70 eV utilizando a seguinte rampa 80(1)/10/250 (20).

Procedimento experimental

Reveladores

Como reveladores para CCDA foram utilizadas solução de vanilina em ácido

sulfúrico, reagente de Dragendorff e câmara de radiação ultravioleta nos

comprimentos de onda 254 e 360 nm.

Para CCDP e CCDPR foi utilizada câmara de radiação ultravioleta, nos

comprimentos de onda 254 e 360 nm.

Solventes

Foram utilizados solventes comerciais destilados na sala de destilação do

DQ-UFSCar, solventes grau HPLC e solventes deuterados para obtenção de

espectros de RMN.

3.2- Equipamentos

Equipamentos de CLAE

A cromatografia líquida de alta eficiência foi realizada em equipamento

SCL10A vp SHIMADZU, utilizando bomba LC 6AD SHIMADZU, detector de

ultravioleta modelo SPD 10AV vp SHIMADZU e válvula de injeção Rheodyne 7725i.

Equipamento de CCDPR

A cromatografia em camada delgada preparativa rotativa foi realizada em

aparelho CROMATOTROM modelo 8924-Harrison Research, utilizando bomba

modelo RHSY- Fluid Metering inc.

Equipamento de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)

Os espectros de ressonância magnética nuclear foram obtidos nos aparelhos

ARX 200 MHz e DRX 400 MHz da Bruker.

Equipamento de CG-EM

Os espectros de CG-EM foram obtidos em aparelho CG-EM SHIMADZU

modelo QP5000.

Procedimento experimental

Evaporadores rotativos

Os extratos e frações foram evaporados em evaporadores rotativos Buchi

modelo Rotavapor R-114, equipados com banhos BÜCHI B-480 e recirculador

refrigerado NESLAB, modelo CFT-25 mantido a 5 ºC e BÜCHI, Rotavapor ELB1,

equipado com banho BÜCHI 461 e recirculador refrigerado NESLAB, modelo CFT-

25 mantido a 5 ºC.

3.3 Material botânico

O material botânico de procedência variada foi coletado e devidamente

identificado pelo Prof. Dr. José Rubens Pirani do Departamento de Botânica,

Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo.

3.3.1- Obtenção dos extratos

Os extratos das plantas escolhidas já se encontravam preparados e

congelados no próprio laboratório. Estes extratos foram preparados a partir da

adição de solventes orgânicos ao material vegetal seco e moído. Estes solventes

foram adicionados em ordem crescente de polaridade. Para cada solvente

adicionado foram feitas 3 extrações num intervalo de no mínimo 2 dias. Os extratos

foram concentrados por destilação de solventes sob pressão reduzida.

3.3.1.1- Particionamento dos extratos brutos

Os extratos com atividades biológicas satisfatórias (maiores que 70%) foram

suspensos em uma mistura água destilada e 25% de metanol e transferidos para um

funil de separação de 1L, em seguida foi adicionado hexano e após agitação e

formação de fase a fração hexânica foi separada. Posteriormente, o procedimento

foi repetido adicionando diclorometano e acetato de etila respectivamente a fase

metanol-água restante. As fases orgânicas obtidas foram concentradas por

destilação do solvente sob pressão reduzida em evaporadores rotativos.

Procedimento experimental

3.3.1.2- Estudo fitoquímico do extrato metanólico do caule de Rauia sp

O extrato metanólico do caule de Rauia sp (RCM) foi submetido à partição

líquido-líquido seguindo o procedimento descrito no item anterior, gerando quatro

frações: fração hexânica (RCMH), fração diclorometânica (RCMD), fração acetato de

etila (RCMA) e fração hidroalcoólica (RCM-hidro) (ESQUEMA 3.1).

ESQUEMA 3.1- Particionamento do extrato metanólico do caule de Rauia sp.

3.3.1.2.1- Estudo fitoquímico da fração hexânica do extrato metanólico do

caule de Rauia sp

A fração hexânica do extrato metanólico do caule de Rauia sp (RCMH) foi

estudada fitoquimicamente utilizando diversas técnicas cromatográficas. O

fracionamento levou ao isolamento do alcalóide N-metil-4-metoxi-2-quinolona (13) e

da mistura dos esteróides β-sitosterol e estigmasterol (31+32). O esquema 3.2

mostra de forma resumida como este estudo foi realizado.

RCM

103,0g

RCMH

3,0g

RCMD

10,5g

RCMA

15,0g

RCM-hidro

Procedimento experimental

(a) CC, φxh= 4,0x23,0 cm, sílica comum, eluição gradiente iniciando com hexano e acetato de etila

15% até 100% de acetato de etila.

(b) CC, φxh = 3,0x40,0 cm, sílica flash, eluição gradiente iniciando com hexano e acetato de etila

10% até 100% de acetato de etila.

até 100% de acetato de etila.

(d) CC, φxh =2,5x55,0 cm, sílica flash, eluição gradiente iniciando com hexano e acetato de etila

50% até 100% de metanol.

ESQUEMA 3.2- Fracionamento da fração hexânica do extrato metanólico do caule

de Rauia sp (RCMH).

3.3.1.2.2- Estudo fitoquímico da fração diclorometânica do extrato metanólico

do caule de Rauia sp

A fração diclorometânica do extrato metanólico do caule de Rauia sp (RCMD)

foi estudada fitoquimicamente utilizando diversas técnicas cromatográficas. O

fracionamento levou ao isolamento das cumarinas murralongina (4), murrangatina

(5), munomicrolina (6), acetato de murrangatina (7), rauianina (8), 3-etil rauianina (9)

e umbeliferona (11)e dos alcalóides N-metil-4-metoxi-2-quinolona (13), mirtopsina

(14), dictamina (15), fagarina (16), esquimianina (17), Z-rhoifolinato de dimetila (18),

RCMH

3,0g

RCMH 4

216,0mg

RCMH 1

131,0 mg

RCMH 2

264,3 mg

RCMH 3

315,7mg

RCMH 6

185,0 mg

RCMH 7

179,8 mg

RCMH 5

46,0mg

RCMH 12

230,7 mg

RCMH 8

328,9 mg

RCMH 9

229,0 mg

RCMH 11

259,0 mg

RCMH 10

233,7 mg

Substâncias

31 e 32

15,0 mg

Substâncias

31 e 32

50,0 mg

Substância

26,0g

Procedimento experimental

8-hidroxi-N-metilflindersina (19), zantobungeanina (20), zantodiolina (21), 7-hidroxi-

8-metoxi-N-metilflindersina (22) e veprissina (20). Os esquemas 3.3, 3.4, 3.5, 3.6 e

3.7 mostram de forma resumida como este estudo foi realizado.

(a) CC, φxh= 4,2x52,0 cm, sílica comum, eluição gradiente iniciando com diclorometano e metanol a

2% até 100% de metanol.

ESQUEMA 3.3- Fracionamento da fração diclorometânica do extrato metanólico do

caule de Rauia sp (RCMD).

RCMD

10,5 g

RCMD 1

231,0 mg

RCMD 2

1,0 g

RCMD 3

884,0 mg

RCMD 5

865,0 mg

RCMD 7

745,0 mg

RCMD 9

439,0mg

RCMD 11

612,0 mg

RCMD 4

660 mg

RCMD 6

676,0 mg

RCMD 8

1,64 g

RCMD 10

768,0 mg

RCMD 12

679,0 mg

RCMD 13

591,0mg

Procedimento experimental

(a) CC, φxh =3,5x27,0 cm, sílica flash, eluição gradiente iniciando com hexano e acetato de etila 5%

até 100% de metanol.

(b) CC, φxh =1,8x30,0 cm, sílica flash, eluição gradiente iniciando com diclorometano e metanol 5%

até 100% de metanol.

(d) CLAE, coluna polimérica, eluente metanol, no modo preparativo isocrático, fluxo de 7 mL/min,

detector UV λ= 340 nm e 254 nm.

(e) CCDP, eluente diclorometano e metanol 2%

(f) CCDP, eluente diclorometano e acetato de etila 25%

(g) CCDP, eluente diclorometano

(h) CCDP, eluente diclorometano

(i) CC, φxh = 3,5x30,0, sílica flash, eluição gradiente iniciando com hexano e diclorometano 50% até

metanol 100%

(j) CCDP, eluente hexano e acetato de etila na proporção 1:1

(k) CCDP, eluente hexano e acetato de etila na proporção 1:1

(l) CCDP, eluente hexano e acetato de etila na proporção 1:1

(m) CC, φxh =1,7x34,5,0 cm, sílica flash, eluição gradiente iniciando com diclorometano e acetato de

etilal 6% até 100% de metanol.

(n) CCDP, eluente hexano e acetato de etila na proporção 1:1

ESQUEMA 3.4- Fracionamento da fração RCMD2.

RCMD 2

1,0 g

RCMD 2.1

25,0 mg

RCMD 2.2

18,0 mg

RCMD 2.3

18,8 mg

RCMD 2.4

106,9 mg

RCMD 2.5

500,0 mg

RCMD 2.6

234,7 mg

Substância

3,1 mg

Substância

2,7 mg

Substância

4,1 m

Substância

2,4 mg

RCMD

.4.3

RCMD

.4.3

Substância

1,0 mg

RCMD

.4.7

RCMD

.4.9

RCMD

.4.10

RCMD

.4.11

Substância

2,9 m

RCMD

.5.

RCMD

.5.5.1

Substância

1,0 mg

Substância

1,0 mg

RCMD

.5.5.2

Substância

1,0 mg

Substância

368

Substância

1,6 m

RCMD

.5.5

RCMD

.5.6.3

Substância

2,3 mg

Procedimento experimental

(a) CC, φxh =4,5x30,0 cm, sílica flash, eluição gradiente iniciando com hexano diclorometano 50% até

metanol 100%

(b) CC, φxh =4,3 x40,0cm, sílica flash, eluição gradiente iniciando com diclorometano e metanol 1%

até metanol 100%

metanol 100%

(d) CCDP, eluente diclorometano e metanol 4%

(e) CCDP, eluente diclorometano e metanol 4%

(f) CC, φxh =1,1x20,0 cm, sílica flash, eluição gradiente iniciando com hexano e acetato de etila 30%

até acetato de etila 100%

(g) CCDP, eluente diclorometano e metanol 4%

(h) CCDP, eluente hexano e acetato de etila na proporção 1:1

RCMD 3

884,0 mg

RCMD 3.1

23,7 mg

RCMD 3.2

27,7 mg

RCMD 3.3

14,6 mg

RCMD 3.5

10,0 mg

RCMD 3.7

100,5 mg

RCMD3.8

27,4 mg

Substância

10,0 mg

Substância

2,8 mg

Substância

7,6 mg

Substância

2,9 mg

Substância

1,9 mg

RCMD

3.6.4

RCMD

3.6.5

RCMD

3.6.7

Substância

6,6 mg

Substância

2,6 mg

Substância

5,0 mg

Substância

9,7 mg

RCMD3.4

24,8 mg

RCMD 3.6

640,0 mg

Substância

3,2 mg

Substância

2,2 mg

RCMD

3.6.4.4

RCMD

3.6.4.5

RCMD

3.6.4.6

RCMD

3.6.4.5.B

Substância

2,5 mg

RCMD

3.6.4.5.C

RCMD

3.6.4.5.C.2

RCMD

3.6.4.5.C.1

Substância

6,9 mg

Substância

2,0 mg

RCMD

3.6.5.5

RCMD

3.6.5.5.3

Substância

3,8 mg

Substância

35,5mg

Procedimento experimental

(i) CCDP, eluente hexano e acetato de etila na proporção 1:1

(j) CC, φxh =1,5x25,0 cm, sílica flash, eluição gradiente iniciando com hexano e acetato de etila 30%

até acetato de etila 100%

(K) CC, φxh =2,5x27,0 cm, sílica flash, eluição gradiente iniciando com diclorometano e metanol 3%

até metanol 100%

(l) CC, φxh =1,4x30,0 cm, sílica flash, eluição gradiente iniciando com diclorometano e metanol 3%

até metanol 100%

(m) CCDP, eluente diclorometano e metanol 2%

(n) CC, φxh =1,5x30,0 cm, sílica flash, eluição gradiente iniciando com hexano e acetato de etila 30%

até acetato de etila 100%

ESQUEMA 3.5- Fracionamento da fração RCMD3.

(a) CC, φxh =4,3x35,0 cm, sílica flash, eluição gradiente iniciando com diclorometano e metanol 1%

até metanol 100%

(b) CCDP, eluente diclorometano e metanol 4%

(d) CCDP, eluente hexano e acetato de etila na proporção 1:1

(e) CC, φxh =2,3x30,0 cm, sílica flash, eluição gradiente iniciando com diclorometano e metanol 3%

até metanol 100%

RCMD 4

660,0 mg

RCMD4.1

15,7 mg

RCMD 4.2

30,7 mg

RCMD 4.3

13,1 mg

RCMD 4.5

351,0 mg

RCMD 4.9

18,5 mg

RCMD4.10

27,4 mg

RCMD 4.4

39,8 mg

RCMD 4.8

31,1 mg

RCMD 4.6

109,5 mg

RCMD4,7

21,8 mg

RCMD

4.4.4

Substância

3,5 mg

RCMD

4.4.4.A

Substância

1,5 mg

RCMD

4.5.4

RCMD

4.5.4.2

Substância

1,0 mg

RCMD

4.5.4.2

Substância

2,5 mg

Procedimento experimental

(f) CC, φxh =1,9x51,0 cm, sílica flash, eluição gradiente iniciando com diclorometano e metanol 4%

até metanol 100%

(g) CC, φxh =1,8x31,0 cm, sílica flash, eluição gradiente iniciando com diclorometano e metanol 1%

até metanol 100%

(h) CCDP, eluente H:A na proporção 1:1

ESQUEMA 3.6- Fracionamento da fração RCMD4

(a) CEC, φxh = 3,5x34,0 cm, sephadex LH 20, eluição isocrática com metanol

(b) CC, φxh =3,5x30,0 cm, sílica flash, eluição gradiente iniciando com diclorometano e metanol 5%

até metanol 100%

(d) CLAE, coluna polimérica, eluente M, no modo preparativo, fluxo de 7 mL/min, detector UV λ= 340

nm e 254 nm.

ESQUEMA 3.7- Fracionamento da fração RCMD6.

3.3.1.3- Estudo fitoquímico do extrato metanólico das folhas de Rauia sp1

O extrato metanólico folhas de Rauia sp1 (RF1M) foi submetido a partição

líquido-líquido seguindo o procedimento descrito no item anterior, gerando quatro

RCMD 6

676,0 mg

RCMD 6.1

16,0 mg

RCMD 3.2

69,3 mg

RCMD 6.3

347,1 mg

RCMD 3.5

33,0 mg

RCMD 3.7

2,6 mg

RCMD3.4

125,7 mg

RCMD 6.6

7,9 mg

RCMD

6.3.5

RCMD

6.3.5.3

Substância

2,5 mg

Procedimento experimental

frações: fração hexânica (RF1MH), fração diclorometânica (RF1MD), fração acetato

de etila (RFMA) e fração hidroalcoólica (RF1M-hidro) (ESQUEMA 3.8).

ESQUEMA 3.8- Particionamento do extrato metanólico das folhas de Rauia sp1.

3.3.1.3.1- Estudo fitoquímico da fração diclorometânica do extrato metanólico

do das folhas de Rauia sp1

A fração diclorometânica do extrato metanólico das folhas de Rauia sp

(RF1MD) foi estudada fitoquimicamente utilizando diversas técnicas cromatográficas.

O fracionamento levou ao isolamento das cumarinas murpaniculol (1), 7-metoxi-8-(2-

acetoxi-3-metil-1-oxobut-2-enil)-cumarina (2), isomurranganona (3), murralongina (4).

murrangatina (5), munomicrolina (6), acetato de murrangatina (7), rauianina (8), 5-

metoxirauianina (10), umbeliferona (11) e isoesquimianina (12) e do alcalóide

dictamina (15), das amidas paprazina (26) e N-trans-feruloiltiramina (27), do

flavonóide 3,7,4’-trimetoxi-5-hidroxiflavona (28) da lignana siringaresinol (29) e do

composto fenólico ácido vanílico (30). Os esquemas 3.9, 3.10 e 3.11 mostram de

forma resumida como este estudo foi realizado.

RF1M

67,7,0g

RF1MH

5,0g

RF1MD

7,3 g

RF1MA

21,0g

RF1M-hidro

Procedimento experimental

(a) CC, φxh= 5,3x53,0 cm, sílica comum, eluição gradiente iniciando com hexano 100% até metanol

100%

ESQUEMA 3.9- Fracionamento da fração diclorometânica do extrato metanólico das

folhas de Rauia sp (RF1MD).

(a) CC, φxh= 5,3x53,0 cm, sílica comum, eluição gradiente iniciando com hexano 100% até metanol

100%

(b) CCDPR, fase estacionária sílica eluição gradiente iniciando com hexano 100% até acetato de etila

100%

RF1MD

7,3 g

RF1MD 1

24,0 mg

RF1MD 2

147,9 mg

RF1MD 3

100,3 mg

RF1MD 5

139,2 mg

RF1MD 7

100,4 mg

RF1MD 9

928,8 mg

RF1MD 11

571,6 mg

RF1MD 4

120,5 mg

RF1MD 6

91,2 mg

RF1MD 8

524,4 mg

RF1MD 10

309,8 mg

RF1MD 12

322,5 mg

RF1MD 13

836,6mg

RF1MD 14

2,3,0 g

RF1MD

7,3 g

RF1MD 2

147,9 mg

RF1MD 3

100,3 mg

RF1MD 4

120,5 mg

RF1MD

2.3

Substância

2,5 mg

Substância

1,6 mg

Substância

10,0 mg

RF1MD 5

139,2 mg

Substância

2,5 mg

RF1MD

4.9

RF1MD

4.10

Substância

2,4 mg

RF1MD

4.9.4

Substância

1,3 mg

Substância

6,6 mg

RF1MD

5.8

Substância

1,4 mg

Substância

2,0 mg

Substância

2,5 mg

Substância

2,2 mg

RF1MD

5.8.1

Procedimento experimental

diclorometano e metanol 50%

(d) CC, φxh =2,3x30,0 cm, sílica flash, eluição gradiente iniciando com diclorometano 100% até

metanol 100%

(e) CCDPR, fase estacionária sílica eluição gradiente iniciando com hexano e diclorometano 50% até

diclorometano e metanol 50%

(f) CCDP, eluente diclorometano 100%

(g) CLAE, coluna polimérica, eluente metanol, no modo preparativo, fluxo de 7 mL/min, detector UV

λ= 340 nm e 254 nm.

(h) CCDPR, fase estacionária sílica eluição gradiente iniciando com hexano e acetato de etila 50%

até acetato de etila e metanol 50%

(i) CCDPR, fase estacionária sílica eluição gradiente iniciando com hexano 100% até acetato de etila

100%

(j) CC, φxh =1,5x20,0 cm, sílica flash, eluição gradiente iniciando hexano e diclorometano 50% até

metanol 100%

(k) CLAE, coluna polimérica, eluente metanol, no modo preparativo, fluxo de 7 mL/min, detector UV

λ= 340 nm e 254 nm.

ESQUEMA 3.10- Fracionamento das frações RF1MD 2, RF1MD 3, RF1MD 4 e

RF1MD 5.

(a) CC, φxh= 5,3x53,0 cm, sílica comum, eluição gradiente iniciando com hexano 100% até metanol

100%

RF1MD

7,3 g

RF1MD 6

91,2 mg

RF1MD 7

100,4 mg

RCMD 8

524,4 mg

Substância

2,6 mg

Substância

15,0 mg

RF1MD 9

928,8 mg

Substância

14,5 mg

RF1MD

8.9

Substância

6,4 mg

Substância

14,1 mg

RF1MD

9.4

Substância

2,2 mg

Substância

2,0 mg

RF1MD

8.9.3

Procedimento experimental

(b) CCDPR, fase estacionária sílica eluição gradiente iniciando com diclorometano 100% até

diclorometano e metanol 50%

(d) CCDPR, fase estacionária sílica eluição gradiente iniciando com diclorometano 100% até

diclorometano e metanol 50%

(e) CC, φxh =1,2x32,0 cm, sílica flash, eluição gradiente iniciando com hexano e acetato de etila 50%

até metanol 100%

(f) CCDP, eluente diclorometano 100%

(g) CC, dxh=5,2x48,0 cm, sílica comum, eluição gradiente iniciando com hexano e diclorometano

50% até metanol 100%

(h) CCDPR, fase estacionária sílica eluição gradiente iniciando com diclorometano 100% até

diclorometano e metanol 50%

ESQUEMA 3.11- Fracionamento das frações RF1MD 6, RF1MD 7, RF1MD 8 e

RF1MD 9.

3.3.1.4- Estudo fitoquímico do extrato metanólico das folhas de Rauia sp

O extrato metanólico das folhas de Rauia sp (RFM) foi submetido à partição

líquido-líquido seguindo o procedimento descrito no item anterior, gerando quatro

frações: fração hexânica (RFMH), fração diclorometânica (RFMD), fração acetato de

etila (RFMA) e fração hidroalcoólica (RFM-hidro) (ESQUEMA 3.12).

ESQUEMA 3.12- Particionamento do extrato metanólico das folhas de Rauia sp.

RFM

85,7 g

RF1MH

4,0g

RFMD

4,8 g

RF1MA

15,0g

RF1M-hidro

Procedimento experimental

3.3.1.4.1- Estudo fitoquímico da fração diclorometânica do extrato metanólico

do das folhas de Rauia sp

A fração diclorometânica do extrato metanólico das folhas de Rauia sp

(RFMD) foi estudada quimicamente utilizando diversas técnicas cromatográficas. O

fracionamento levou ao isolamento das cumarinas rauianina (8) e umbeliferona (11).

O esquema 3.13 mostra de forma resumida como este estudo foi realizado.

(a) CC, φxh= 5,0x50,0 cm, sílica comum, eluição gradiente iniciando com hexano 100% até metanol

100%

(b) CCDPR, fase estacionária sílica eluição gradiente iniciando com hexano e diclorometano 50% até

diclorometano e metanol 50%

ESQUEMA 3.13- Fracionamento da fração diclorometânica do extrato metanólico

das folhas de Rauia sp (RFMD).

RFMD

4,8g

RFMD 4

291,0 mg

RFMD 1

268,5 mg

RFMD 2

100,7 mg

RFMD 3

105,5

RFMD 6

134,0 mg

RFMD 7

159,2 mg

RFMD 5

233,4mg

RFMD 8

258,9 mg

RFMD 9

892,3 mg

RFMD 10

273,1 mg

Substância

34,4 mg

Substância

20,0 mg

Substância

26,4 mg

Substância

12,5 mg

Procedimento experimental

3.3.1.5- Estudo fitoquímico do extrato diclorometano do caule da

Conchocarpus macrophyllus.

O extrato diclorometanânico do caule da Conchocarpus macrophyllus foi

estudado fitoquimicamente utilizando diversas técnicas cromatográficas. O

fracionamento levou ao isolamento dos alcalóides acridônicos arborinina (24) e

metilarborinina (25). O esquema 3.14 mostra de forma resumida como este estudo

foi realizado.

(a) CC, φxh = 5,5x35,0 cm, sílica comum, eluição gradiente iniciando com hexano e acetato de etila

10% até metanol 100%

(b) CC, φxh = 3,2x35,0 cm, sílica comum, eluição gradiente iniciando com hexano 100% até metanol

100%

diclorometano e metanol 50%

(d) CEC, φxh = 3,5x27,0 cm, sephadex LH 20, eluição isocrática com metanol e diclorometano 25%

(e) CCDP, eluente diclorometano 100%

ESQUEMA 3.14- Fracionamento do extrato diclorometânico do caule da

Conchocarpus macrophyllus.

CMCD

4,8g

CMCD 1

147,9 mg

CMCD 2

61,1 mg

CMCD 3

230,0

CMCD5

100,0 mg

CMCD 6

331,9 mg

CMCD 7

733,1 mg

CMCD 10

418,8 mg

CMCD 4

198,7 mg

CMC 8

258,5 mg

CMC 9

1,2 g

Substância

1,5 mg

Substância

4,7 mg

Substância

1,2 mg

CMCD

9.9

Substâncias

31 e 32

200,0 mg

Procedimento experimental

3.4- Ensaios Biológicos

3.4.1- Ensaio tripanocida “in vitro” sobre a forma tripomastigota de T. cruzi

Os ensaios foram realizados no Departamento de Análises Clínicas,

Toxicológicas e Bromatológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de

Ribeirão Preto (USP).

Para a realização do ensaio foi utilizado sangue de camundongos albinos

Swiss experimentalmente infectados com a cepa Y do parasita. O sangue dos

camundongos foi obtido através de punção cardíaca após sete dias de infecção,

onde ocorre o pico de parasitemia. O sangue contaminado foi diluído em sangue de

um animal sadio a fim de obter uma concentração de 2x10

formas tripomastigotas

por mL de sangue. Como anticoagulante foi utilizado citrato de sódio a 3,8% e pH

7,3 na proporção de um volume de citrato para três de sangue infectado. Os extratos

e as substâncias puras foram solubilizados em DMSO. Os ensaios foram realizados

em microplacas de titulação (96 poços) onde foram colocados o sangue

contaminado e os extratos ou substâncias puras solubilizados em DMSO. Em

seguida o material foi incubado por um período de 24 horas a 4

C. Como controle

foram utilizados sangue infectado e sangue infectado com adição de 250 ug/ml de

violeta genciana. Após o período de incubação o numero de parasitas foi

determinado colocando-se uma alíquota de 5 µL de sangue sobre uma lâmina

coberta com uma lamínula de 22 x 22 mm e contando-se os parasitas em 50

campos microscópicos. Todos os ensaios foram realizados em triplicata. O resultado

do ensaio foi expresso em porcentagem de lise parasitária.

Os extratos foram ensaiados numa concentração de 4mg/mL e as

substâncias puras nas concentrações de 100, 250 e 500 µM.

3.4.2- Ensaio de inibição da atividade da enzima gGAPDH gliceraldeído-3-

fosfato desidrogenase de T. cruzi

A enzima glicolítica gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase é uma enzima

recombinamte obtida em um sistema de expressão de Escherichia coli. A

preparação e purificação da mesma são feitas rotineiramente no Laboratório de

Cristalografia de Proteínas e Biologia Estrutural do Instituto de Física de São Carlos

Procedimento experimental

(IFSC-USP), de acordo com procedimentos estabelecidos por SOUZA et aI. (1998).

Essa enzima catalisa a conversão de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) a 1,3-

bifosfoglicerato, na presença de fosfato inorgânico e cofator NAD

. Os ensaios de

inibição enzimática estão baseados nesta reação, e nestes são feitas medidas

espectrofotométricas de NADH formado, durante 30 s a 340 nm.

O teste baseia-se no procedimento desenvolvido por BARBOSA e NAKANO

(1987) e descrito por VIEIRA et aI. (2001). A mistura reacional (1 mL) contém 50 mM

de tampão tris-HCI (pH 8,6) com 1mM de β-mercaptoetanol e EDTA, 30 mM de

arseniato de sódio, 2,5 mM de NAD

, 4-9 µg de gGAPDH e 0,3 mM de G3P (que é

adicionado por último).

Para a realização dos ensaios, preparam-se soluções de 1,0 mg/mL dos

extratos brutos, frações ou substâncias puras em DMSO, que são adicionadas ao

meio reacional descrito. A concentração final de DMSO é de 10%, o que não

interfere na atividade da enzima. Sempre são realizados ensaios controle na

ausência das substâncias a serem testadas com igual volume de DMSO, que são

considerados como "branco". Todas as medidas são feitas em triplicata e a atividade

específica da enzima (AE) é calculada através da formula a seguir:

Onde:

b= coeficiente angular de uma reta obtida através da plotagem dos valores de

Abs versus t

cubeta

=volume da cubeta em mL

enzima

=volume da enzima na cubeta em mg/ mL

enzima

=concentração da enzima em mg/ mL

NADH

= 6,22mM

-1

AE(U/mg)= b.V

cubeta

6,22. V

enzima

. C

enzima

Procedimento experimental

Após obter os valores de AE do inibidor e do DMSO, a porcentagem de

atividade inibitória (% AI), é calculada pela fórmula:

As medidas do potencial inibitório dos extratos foram realizados na

concentração de 200 µg/mL.

3.4.3- Ensaio de inibição da atividade da enzima gGAPDH gliceraldeído-3-

fosfato desidrogenase de T. cruzi (novo protocolo)

Durante a realização do trabalho as condições do ensaio sobre a enzima

gGAPDH foram modificadas, utilizando como tampão o TEA (trietanolamina)

garantindo melhor reprodutibilidade e confiabilidade dos resultados analisados, o pH

passou de 8,6 para 7,5 para mimetizar as condições fisiológicas. Neste caso a

mistura reacional passou a conter tampão TEA (trietanolamina) pH 7,5 concentração

final de 100 mMol/L, 1mM de β-mercaptoetanol e EDTA, 30 mM de arseniato de

sódio, NAD concentração final de 400 µMol/L, G3P com concentração final de 600

µM, enzima com concentração final de 13 nMol/L.

Neste caso também são feitas medidas espectrofotométricas de NADH

formado durante 30 s, a 340 nm. A porcentagem de atividade inibitória é calculada

da mesma forma descrita no item anterior.

As substâncias puras foram testadas na concentração final de 200µM.

3.4.4- Ensaio de inibição da atividade da enzima gGAPDH gliceraldeído-3-

fosfato desidrogenase de T. cruzi (utilizando Tio-NAD como cofator)

Considerando que várias substâncias apresentam absorção no mesmo

comprimento de onda do NADH (340nm) causando interferência na análise uma

alternativa adotada foi mudar o cofator da reação. Para isso foi desenvolvido um

ensaio utilizando Tio-NAD como cofator. A estrutura do Tio-NAD difere da estrutura

do NAD devido a presença de um átomo de enxofre no lugar do oxigênio da amida.

% AI= AE

inibidor

-AE

DMSO

x.100

DMSO

Procedimento experimental

Neste caso a mistura reacional contem tampão TEA (trietanolamina) pH 7,5

concentração final de 100 mMol/L, 1 mM de β-mercaptoetanol e EDTA, 30 mM de

arseniato de sódio, Tio-NAD

concentração final de 250 µMol/L, G3P com

concentração final de 800 µM, enzima com concentração final de 41nMol/L.

Neste caso são feitas medidas espectrofotométricas de Tio-NADH formado,

durante 30 s a 400 nm. A porcentagem de atividade inibitória é calculada da mesma

forma descrita no item anterior.

3.4.5- Ensaio de inibição da atividade de APRT Adenina Fosforibosiltransferase

de Leishmania tarentolae

A enzima adenina fosforibosiltransferase (APRT) foi obtida de Leishmania

tarentolae. Esta enzima foi isolada de lagartos e não é capaz de infectar seres

humanos (CROAN et al, 1997; NOYES et al., 1997). Porém estudos envolvendo

sequenciamento do gene de APRT de Leishmania tarentolae revelaram grande

identidade com a proteína homologa de Leishmania donovani (PHILLIPIS, et al.,

1999). A identidade de 85% nas seqüências de aminoácidos dessas duas APRTs

permite que as estruturas tridimensionais também sejam similares e dessa forma,

as informações obtidas com APRT de L. tarentolae podem ser usadas na busca de

novos fármacos contra a leishmaniose humana.

A APRT é expressa em Escherichia coli e purificada no Laboratório de

Cristalografia de Proteínas e Biologia Estrutural do Instituto de Física de São Carlos

(IFSC-USP).

Ela catalisa a reação nucleofílica entre a adenina e o fosforribosilpirofosfato

(PRPP), com a formação de adenosina-monofosfato(AMP). Os ensaios de inibição

enzimátiva estão baseados nesta reação e nestes são feitas as medidas

espectrométricas de AMP formado durante 60 s, a 259 nm.

O ensaio baseia-se no procedimento descrito por TUTLE e KRENITSKY

(1980) com algumas modificações. A mistura reacional (0,5mL) contem 0,01 mM de

adenina, 0,5 mM de PRPP, 5mM de MgCl

e 100 nM de tampão tris-HCl (pH 7,4).

Para cada teste são utilizados 475 µL da mistura reacional e 25 µL das soluções dos

possíveis inibidores.

Procedimento experimental

As medidas foram feitas em triplicata e os valores de absorbância obtidos

foram avaliados como anteriormente descrito para a enzima gGAPDH. Entretanto, o

valor de ε do AMP na fórmula para o cálculo da AE é 1,24 mM

-1

As medidas do potencial inibitório dos extratos foram realizados na

concentração de 100 µg/mL e das substâncias em concentrações variadas.

3.4.5- Ensaio de inibição da atividade da enzima PNP purina nucleosídeo

fosforilase de Schistosoma mansoni

A enzima PNP atua na via de salvação de purinas convertendo inosina a

hipoxantina, que é um dos precursores para a formação dos ácidos nucleicos.

A mistura reacional contem 50 mM de tampão fosfato pH 7,4, 100 mM de

tampão tris-HCl pH 7,4 , 10 µM de inosina, xantina oxidase e 12 nM da PNP. As

reações foram monitoradas a 293 nm, usando um ensaio padrão combinado.

Substâncias Isoladas

4- Substâncias Isoladas

O estudo fitoquímico de Rauia sp e Conchocarpus macrophyllus permitiu o

isolamento de 32 substâncias pertencentes a diferentes classes , cumarinas,

alcalóides, amidas, flavonóides, lignanas, compostos fenólicos e esteróides. Para

facilitar a determinação estrutural dos metabólitos isolados, estes serão discutidos

por classes.

Cumarinas

OOCH

Murranganona (1)

2,5 mg

Procedência: folhas de Rauia sp1

Isolamento: p. 34

Identificação: p. 54-57

Atividades Biológicas p. 166 e 168

OOCH

7-metoxi-8-(2-acetoxi-3-metil-1-oxobut-

2-enil)-cumarina (2)

6,6 mg

Procedência: folhas de Rauia sp1

Isolamento: p. 34

Identificação: p. 57-63

Atividades Biológicas: p. 166 e 168

Isomurranganona (3)

2,4 mg

Procedência: folhas de Rauia sp1

Isolamento: p. 34

Identificação: p. 57-63

Atividades Biológicas: p. 166 e 168

OOCH

Substâncias Isoladas

Murralongina (4)

2,4 mg

Procedência: folhas de Rauia sp1 e caule de

Rauia sp

Isolamento: p. 29 e 34

Identificação: p.71-77

Atividades Biológicas: p. 166, 167 e 168

OOCH

Acetato de murrangatina (7)

3,0 mg

Procedência: caule de Rauia sp

Isolamento: p. 34

Identificação: p. 83-84

Atividades Biológicas: p. 166 e 168

Munomicrolina (6)

14,2 mg

Procedência: folhas de Rauia sp e caule de

Rauia sp

Isolamento: p. 30 e 35

Identificação: p. 81-83

Atividades Biológicas: p. 166, 167 e 168

Murrangatina (5)

34,5 mg

Procedência: folhas de Rauia sp e caule de

Rauia sp

Isolamento: p. 30, 31 e 35

Identificação: p.78-81

Atividades Biológicas: p. 164, 166, 167 e 168

Substâncias Isoladas

Rauianina (8)

453,8 mg

Procedência: folhas de Rauia sp1, folhas e

caule de Rauia sp

Isolamento: p. 34, 35 e 37

Identificação: p. 85-87

Atividades Biológicas: p.164, 166, 168

OOO

OCH

OOHO

Umbeliferona (11)

35,4 mg

Procedência: caule e folhas de Rauia sp

Isolamento: p. 37

Identificação: p.95-96

Atividades Biológicas: p. 166 e 168

5-Metoxirauianina (10)

1,3 mg

Procedência: folhas de Rauia sp1

Isolamento: p. 34

Identificação: p. 93-95

3-Etilrauianina (9)

1,0 mg

Procedência: caule de Rauia sp

Isolamento: p. 29

Identificação: p.88-93

Substâncias Isoladas

OOH

Alcalóides

OCH

Isoescopoletina (12)

2,2 mg

Procedência: folhas de Rauia sp1

Isolamento: p. 34

Identificação: p.96-98

Dictamina (15)

6,6 mg

Procedência: caule de Rauia sp

Isolamento: p.34

Identificação: p.110-111

Atividades Biológicas: p.164, 166, 167 e 168

Mirtopsina (14)

2,5 mg

Procedência: caule de Rauia sp

Isolamento: p. 32

Identificação: p. 105-110

Atividades Biológicas: p. 166 e 168

N-Metil-4-metoxi-2-quinolona (13)

72,6 mg

Procedência:caule de Rauia sp

Isolamento: p.27, 30 e 31

Identificação: p.102-104

Atividades Biológicas: p. 164, 166, 167 e 168

Substâncias Isoladas

OCH

Esquimianina (17)

6,6 mg

Procedência: folhas de Rauia sp

Isolamento: p. 30

Identificação: p.113-115

Atividades Biológicas: p. 164, 166, 167 e 168

8-Hidroxi-N-metilflindersina (19)

2,5 mg

Procedência: caule de Rauia sp

Isolamento: p.31

Identificação: p. 117-119

Atividades Biológicas: p. 166 e 168

Z-Rhoifolinato de dimetila (18)

2,3 mg

Procedência: folhas de Rauia sp

Isolamento: p. 30

Identificação: p. 115-116

Atividades Biológicas: p.166 e 168

OCH

γ-Fagarina (16)

3,2 mg

Procedência: caule de Rauia sp

Isolamento: p. 30

Identificação: p. 112-113

Atividades Biológicas: p. 164, 166, 167 e 168

Substâncias Isoladas

OCH

7-Hidroxi-8-metoxi-N-metilflindersina (22)

22,6 mg

Procedência: caule de Rauia sp

Isolamento: p. 30

Identificação: p. 127-132

Atividades Biológicas: p. 166, 167 e 168

OCH

Zantobungeanina (20)

5,8 mg

Procedência: caule de Rauia sp

Isolamento: p. 29

Identificação: p. 120-121

Atividades Biológicas: p.167

HOCH

Zantodiolina (21)

1,0 mg

Procedência: caule de Rauia sp

Isolamento: p. 31

Identificação: p. 122-126

OCH

Veprissina (23)

6,5 mg

Procedência: caule de Rauia sp

Isolamento: p. 29

Identificação: p. 133-134

Atividades Biológicas: p. 167

Substâncias Isoladas

Amidas

OOH

OCH

Arborinina (24)

6,2 mg

Procedência: caule de C. macrophyllus

Isolamento: p. 38

Identificação: p.134-137

Atividades Biológicas: p.167

Metilarborinina (25)

1,2 mg

Procedência: caule de C. macrophyllus

Isolamento: p. 38

Identificação: p. 138-139

Atividades Biológicas: p.164

N-trans feruloiltiramina (27)

6,4 mg

Procedência: folhas de Rauia sp1

Isolamento: p.35

Identificação: p. 145-147

Atividades Biológicas: p. 164 e 167

Paprazina (26)

2,6 mg

Procedência: folhas de Rauia sp1

Isolamento: p. 35

Identificação: p. 143-145

Atividades Biológicas: p. 164 e 167

Substâncias Isoladas

Flavonóide

Lignana

Composto Fenólico

3,7,4’-Trimetoxi-5-hidroxi flavona (28)

1,6 mg

Procedência: folhas de Rauia sp1

Isolamento: p. 34

Identificação: p. 148-150

Atividades Biológicas: p. 166 e 168

OCH

Siringaresinol (29)

14,1 mg

Procedência: folhas de Rauia sp1

Isolamento: p. 38

Identificação: p.138-139

Atividades Biológicas: p. 164

CO O

OOH

OCH

OHO

Ácido vanílico (30)

2,2 mg

Procedência: folhas de Rauia sp1

Isolamento: p. 35

Identificação: p. 145-147

Atividades Biológicas: p. 164 e 167

Substâncias Isoladas

Esteróides

estigmasterol

β−sitosterol

Mistura do sitosterol(31) e

estigmasterol (32)

265 mg

Procedência: folhas de Rauia sp e

caule de C. macrophyllus

Isolamento: p. 34

Identificação: p.148-150

Atividades Biológicas: p. 166 e 168

Determinação Estrutural

5- Determinação estrutural

5.1- Cumarinas

As cumarinas são substâncias amplamente encontradas em plantas.

Entretanto, espécies pertencentes às famílias Rutaceae e Umbelliferae representam

as fontes mais ricas destes metabólitos, onde ocorrem com grande diversidade

estrutural (GRAY & WATERMAN, 1978; ESTÉVEZ-BRAUM & GONZÁLEZ, 1997).

Foram isoladas de Rauia sp oito substâncias que apresentaram o mesmo

padrão de sinais na região aromática do espectro de RMN

H, sendo quatro dubletos

integrando para um hidrogênio cada, característicos de sistema AX. Dois deles em δ

6,1-6,4 e δ 7,5-8,3, com constante de acoplamento da ordem de 9,5 Hz, referentes

aos hidrogênios nas posições 3 e 4 respectivamente e outros dois com constante de

acoplamento da ordem de 8,5 Hz ocorrendo em δ 6,6-6,9 e em δ 7,1-7,5 indicam

substituição no carbono 8 (MURRAY et al., 1982).

FIGURA 5.1- Região aromática do espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) de

cumarinas substituídas na posição 8.

Os espectros de RMN

C de cumarinas substituídas nas posição 8

apresentam sinais característicos para o esqueleto cumarínico: δ 160,8-160,0 (C-2);

δ 113,6-112,8 (C-3); δ 143,9-143,3 (C-4); δ 113,6-111,8 (C-4a); δ 130-126,6 (C-5); δ

108,1-107,1 (C-6); δ 161,6-159,7 (C-7); δ 116,1-112,1 (C-8); δ 154,7-152,0 (C-8a); δ

56,4-55,8 (C7-OMe) (SUAREZ & MONACHE, 1991).

OOH

H4 H5 H6 H3

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0

Determinação Estrutural

5.1.1- Determinação Estrutural da Substância 1

A substância 1 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico das

folhas de Rauia sp.

O espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 1 (FIGURA 5.2)

apresenta quatro dubletos na região aromática, característicos de esqueleto

cumarínico substituído nas posições 7 e 8 (MURRAY et al., 1982) como discutido no

item 5.1. Observa-se um singleto integrando para três hidrogênios em δ 3,87 que

pode ser atribuído a uma metoxila na posição 7.

O espectro apresenta ainda dois dubletos em δ 5,90 e δ 4,24 (1H, J= 4,9Hz).

No espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

+ D

O) da substância 1 (FIGURA 5.3) o

sinal em δ 4,24 não é observado indicando a presença de um grupo hidroxila, e

observa-se um singleto em δ 5,90 sugerindo que o hidrogênio hidroxílico acopla com

o carbinólico.

Observa-se ainda um septupleto em δ 2,61 (1H J=7,0 Hz) e dois dubletos

integrando para 3 hidrogênios cada, em δ 1,12 (J=7,0 Hz) e δ 0,99 (J=7,0 Hz),

sugerindo a presença de duas metilas ligadas a um CH.

O espectro de RMN

C (100 MHz, CDCl

) (FIGURA 5.4) mostra sinais

referentes a 15 carbonos. Observa-se os sinais característicos do esqueleto

cumarínico substituído nas posições 7 e 8. Observa-se ainda um sinal em δ 212,5

que sugere a presença de uma carbonila no grupo ligado ao carbono 2’, um sinal em

δ 68,5 confirma a presença carbono carbinólico e os sinais em δ 19,7 e δ 17,9 são

atribuídos às metilas.

A análise dos dados e a comparação com dados da literatura indicam a

seguinte estrutura para a substância 1

substância 1

OOCH

Determinação Estrutural

ITO e colaboradores em 1987 isolaram esta substância que foi chamada de

murranganona e apresentou atividade ótica ([α]

=+105,8 em clorofórmio). Porém em

1989 IMAI e colaboradores isolaram uma substância supostamente idêntica à

murranganona, para a qual não foi observada atividade ótica sendo a substância

chamada de murpaniculol. A atividade óptica da substância 1 foi medida em

diclorometano e o valor encontrado foi de [α]

=+5,5, portanto a substância 1 possui

atividade ótica.

A análise dos dados e a comparação com dados da literatura indicam que a

substância 1 é a cumarina conhecida como murranganona isolada anteriormente de

Murraya exotica (ITO et al., 1987). Os dados RMN de

H (ITO et al., 1987) e de

(IMAI et al., 1987), da substância 1, assim como os dados da literatura estão

representados na TABELA 5.1.

FIGURA 5.2- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da murranganona.

Acquisition Time (sec)

18.4812

Comment

A37N5811

Date

01 Sep 1971 11:15:44

Date Stamp

01 Sep 1971 11:15:44

File Name

C:\DOCUMENTS AND SETTINGS\USER\MEUS DOCUMENTOS\TATINHA\ESPECTROS REL3\A37N5811.DX

Frequency (MHz)

200.13

Nucleus

Number of Transients

Origin

tatiane

Original Points Count

65536

Owner

tatiane

Points Count

65536

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

3546.10

Temperature (degree C)

27.000

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

ppm

3.473.33 3.142.931.061.02 1.01 0.970.95 0.920.89

7.6774

7.6295

7.4873

7.4441

7.2624

6.8877

6.8441

6.3185

6.2709

5.9141

5.8897

4.2599

4.2351

3.8744

3.4921

2.7037

2.6758

2.6415

2.6064

2.5726

2.5388

2.5036

1.5744

1.1502

1.1150

1.0006

0.9674

0.0000

Determinação Estrutural

FIGURA 5.3- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

+ D

O) da murranganona

FIGURA 5.4- Espectro de RMN

C (100 MHz, CDCl

) da murranganona.

Acquisition Time (sec)

18.4812

Comment

A385811H

Date

06 Sep 1971 12:00:48

Date Stamp

06 Sep 1971 12:00:48

File Name

C:\DOCUMENTS AND SETTINGS\USER\MEUS DOCUMENTOS\TATINHA\BACK UP RMN\TATI\RMN\2004\A385811H.DX

Frequency (MHz)

200.13

Nucleus

Number of Transients

Origin

tatiane

Original Points Count

65536

Owner

tatiane

Points Count

65536

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

3546.10

Temperature (degree C)

27.000

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

ppm

3.53 3.193.091.13 1.131.05 1.020.98 0.89

TMS

7.6806

7.6331

7.4900

7.4468

7.2640

6.8906

6.8474

6.3201

6.2723

5.8973

5.3019

4.7690

3.8774

3.4780

2.7086

2.6780

2.6434

2.6088

2.5745

2.5390

2.5063

1.2553

1.1510

1.1155

0.9998

0.9666

0.0000

Determinação Estrutural

TABELA 5.1- Dados de RMN de

H e

C da murranganona

H/C δ

(a)

(b)

(lit.) δ

(c)

(lit)

2 160,6 ou 160,1 160,4 ou 159,9

3 6,29 (d, 9,6 Hz) 6,29 (d, 9,4 Hz) 113,7 113,1 ou 113,3

4 7,65 (d, 9,6 Hz) 7,65 (d, 9,4 Hz) 143,5 143,5

4a 113,2 113,1 ou 113,3

5 7,47 (d, 8,6 Hz) 7,46 (d, 8,7 Hz) 129,6 129,5

6 6,87 (d, 8,6 Hz) 6,86 (d, 8,7 Hz) 107,9 107,8

7 160,6 ou 160,1 160,4 ou 159,9

8 n.o. 114,3

8a 153,5 153,2

1’ 5,90 (d, 4,9Hz) 5,90 (d, 5,7Hz) 68,5 68,3

2’ 212,5 212,4

3’ 2,61(sep, 7,0Hz)

2,61 (quint,

6,7Hz)

35,9 35,7

4’ 1,12 (d, 7,0 Hz)  1,13 (d, 6,7 Hz) 18,0 ou 19,7 17,8 ou 19,4

5’ 0,99 (d, 7,0 Hz) 0,98 (d, 6,7 Hz) 18,0 ou 19,7 17,8 ou 19,4

OCH

3,87 (s) 3,87 (s) 56,2 56,1

4,24 (d, 4,9Hz) 5,23 (d, 5,7Hz)

(a) CDCl

, 200MHz; (b) CDCl

, 270MHz; (c) CDCl

, 100MHz; n.o.=não observado

5.1.2- Determinação Estrutural da Substância 2

A substância 2 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico das

folhas de Rauia sp.

O espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 2 (FIGURA 5.5)

apresenta os quatro dubletos na região aromática, característicos de esqueleto

cumarínico substituídos nas posições 7 e 8 (MURRAY et al., 1982), como discutido

no item 5.1. Observa-se um singleto integrando para três hidrogênios em δ 3,88 que

pode ser atribuído a uma metoxila na posição 7.

O espectro apresenta ainda três singletos, que integram para três hidrogênios

cada, em δ 2,27, δ 1,85 e δ 1,81 o que sugere a presença de metilas sobre dupla

ligação e/ou metila de grupo acetato.

O espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) (FIGURA 5.6) mostra sinais

referentes a 17 carbonos. Além dos sinais característicos do esqueleto cumarínico

substituído nas posições 7 e 8, observa-se um sinal em δ 186,2 que sugere a

Determinação Estrutural

presença de uma carbonila e um sinal em δ 168,6 que sugere a presença de uma

carbonila de éster.

FIGURA 5.5- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 2.

FIGURA 5.6- Espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) da substância 2.

Acquisition Time (sec)

18.4812

Comment

A213D66.15

Date

14 May 1971 13:18:59

Date Stamp

14 May 1971 13:18:59

File Name

Frequency (MHz)

200.13

Nucleus

Number of Transients

Origin

tatiane

Original Points Count

65536

Owner

tatiane

Points Count

65536

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

3546.10

Temperature (degree C)

27.000

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

ppm

6.123.11 2.991.031.00 0.990.99

TMS

0.0000

1.6265

1.8136

1.8464

2.2795

3.8833

3.9639

6.2401

6.2877

6.8430

6.8866

7.2643

7.4322

7.4757

7.5966

7.6441

1.9 1.8

2.972.77

1.8464

1.8136

Acquisition Time (sec)

2.4248

Comment

A243D6N13

Date

05 Jun 1971 21:20:21

Date Stamp

05 Jun 1971 21:20:21

File Name

Frequency (MHz)

50.33

Nucleus

13C

Number of Transients

36112

Origin

tatiane

Original Points Count

32768

Owner

tatiane

Points Count

32768

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

13513.51

Temperature (degree C)

27.000

190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20

ppm

Chloroform-d

186.2546

168.6204

159.7542

159.4674

151.7812

143.0133

142.7592

140.7434

129.5910

117.8076

113.9891

112.5633

107.8515

77.6392

77.0000

76.3690

56.5306

21.6147

20.3528

19.9923

Determinação Estrutural

O mapa de contorno de HMBC (FIGURAS 5.7, 5.8 e 5.9) mostra as

correlações dos hidrogênios com os carbonos a uma, duas e três ligações.

FIGURA 5.7-Mapa de contorno de HMBC (100 MHz, CDCl

) da substância 2.

A análise da expansão da região aromática no mapa de contorno de HMBC

(FIGURA 5.8) mostra as correlações do esqueleto cumarínico.

Determinação Estrutural

FIGURA 5.8- Expansão do mapa de contorno de HMBC da substância 2.

A análise da expansão da região das metilas no mapa de contorno de HMBC

(FIGURA 5.9) mostra a correlação dos hidrogênios das metilas com carbonos com

sinais entre δ

145 e δ

190. Através da correlação entre o hidrogênio em δ

1,81 e o

carbono em δ

168,6 foi possível atribuir esta metila ao grupo acetato. Foi observada

uma correlação fraca entre o sinal da metila em δ

2,28 e a carbonila do éster (δ

168,6), indicando que esta metila está na posição trans em relação ao grupo

acetato. Tanto o sinal em δ

2,28 quanto em δ

1,85 mostraram correlação com os

sinais em δ

140,7 e δ

143,0 e com a carbonila em δ

186,2, portanto a metila com

112,6

151,8

159,5

159,8

OOH

6,26

7,49

116

142,8

3,88

117,8

6,87

7,62

OOH

159,8

159,5

151,8

112,6

114,0

56,5

3,88

114,0

142,8

129,6

107,9

OOCO

6,26

7,62

6,87

7,46

Determinação Estrutural

sinal em δ

2,28 se encontra na posição cis com relação à carbonila. A presença da

carbonila faz com que o sinal da metila na posição cis seja mais desblindado (δ

2,28) em que a metila na posição trans (δ

1,85), isso ocorre porque os elétrons π da

ligação C=O blindam as zonas cônicas acima e abaixo do plano e desblindam as

zonas laterais (SILVERSTEIN & WEBSTER, 2000).

FIGURA 5.9- Expansão do mapa de contorno de HMBC da substância 2.

A análise da expansão da região das metilas no mapa de contorno de HMBC

(FIGURA 5.10) mostra a correlação dos hidrogênios das metilas com carbonos com

sinais entre δ

10 e δ

30. Observam-se as correlações a uma ligação entre o sinal

em δ

1,82 e δ

20,0; δ

1,85 e δ

21,6 e δ

2,28 e δ

20,4. Observam-se ainda as

correlações a três ligações entre os sinais em δ

1,82 e δ

20,4 e entre os sinais em

2,28 e δ

21,6 o que confirma que as metilas são geminais.

168.6

140,7

143,3

OCH

2,28

1,85

OCH

143,3

140,7

168.6

1,85

2,28

1,85

2,28

168.6

140,7

143,3

OCH

1,81

Determinação Estrutural

FIGURA 5.10- Expansão do mapa de contorno de HMBC da substância 2.

A análise dos dados e a comparação com dados da literatura indicam que a

substância 2 é a cumarina conhecida como 7-metoxi-8-(2-acetoxi-3-metil-1-oxobut-2-

enil)-cumarina, isolada anteriormente de Phebalium ralstonii (BEVALOTI et al.,

1988). Através dos dados de HSQC, HMBC e RMN

C foi possível atribuir

inequivocamente os deslocamentos químicos de todos os carbonos da molécula,

uma vez que nos dados da literatura os carbonos com deslocamento químico muito

próximos não foram diferenciados. Os dados RMN de

H e

da substância 2

assim como os dados descritos na literatura estão descritos na TABELA 5.2.

2,28 1,85

1,8

20,0

20,4

21,6

Determinação Estrutural

TABELA 5.2- Dados de RMN

H e de

C da 7-metoxi-8-(2-acetoxi-3-metil-1-oxobut-

2-enil)-cumarina.

H/C δ

(a)

(b)

(lit.) δ

(c)

(lit.)

2 159,8

159,7 ou

159,3

3 6,26 (d, 9,5 Hz) 6,26 (d, 9,5 Hz) 114,0 107,9

4 7,62 (d, 9,5 Hz) 7,62 (d, 9,5 Hz) 142,8 142,8

4a 112,6 112,5

5 7,46 (d, 8,7 Hz) 7,45 (d, 8,6 Hz) 129,6 129,6

6 6,87 (d, 8,7 Hz) 6,87 (d, 8,6 Hz) 107,9 113,4

7 159,5

159,7 ou

159,3

8 117,8 117,6

8a 151,8 151,6

1’ 186,2 186,2

2’ 143,0

142,9 ou

140,7

3’ 140,7

142,9 ou

140,7

4’ 1,85 s 1,85 ou 2,27 s 21,6

21,5; 20,2

ou 19,9

5’ 2,28 s 1,85 ou 2,27 s 20,4

21,5; 20,2

ou 19,9

OCH

3,88 s 3,88 s 56,5 56,4

COO 1,82 s 1,81 s 20,0

21,5; 20,2

ou 19,9

COO 168,6 168,5

(a) CDCl

, 200MHz; (b) CDCl

, 250MHz; (c) CDCl

, 50MHz; (d) CDCl

, 90,56MHz

7-metoxi-8-(2-acetoxi-3-metil-

1-oxobut-2-enil)-cumarina

OOCH

Determinação Estrutural

5.1.3- Determinação Estrutural da Substância 3

A substância 3 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico das

folhas de Rauia sp.

O espectro de RMN

H (400 MHz, CDCl

) da substância 3 (FIGURA 5.11)

apresenta os quatro dubletos na região aromática, característicos de esqueleto

cumarínico substituídos nas posições 7 e 8 (MURRAY et al., 1982) como discutido

no item 5.1. Observa-se um singleto integrando para três hidrogênios em δ 3,90 que

pode ser atribuído a uma metoxila na posição 7.

Foi observado ainda um dubleto em δ 5,75 (1H, J=3,3 Hz), um duplo

septupleto em δ 2,38 (1H, J= 6,8 e 3,3 Hz), um singleto em δ 2,07 (3H), que sugere a

presença de uma metila sobre dupla ligação ou metila de grupo acetato e um

dubleto em 1,03 (6H, J=6,8 Hz) que sugere a presença de duas metilas ligadas a um

carbono terciário (CH).

FIGURA 5.11- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 3.

5 Oct 2005

Acquisition Time (sec)

15.8336

Date

File Name

C:\USUÁRIOS\Tatiane\RMN 400MHz\D193D693\1\espec.dx

Frequency (MHz)

400.13

Nucleus

Origin

SpinWorks 2.1, Kirk Marat, U of Manitoba

Original Points Count

65536

Owner

undefined

Points Count

65536

Sweep Width (Hz)

4139.05

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

ppm

6.293.40 3.251.401.05 1.050.98 0.96

0.0000

0.0707

1.0193

1.0364

1.2536

2.0739

2.3519

2.3597

2.3686

2.3765

2.3858

2.3937

2.4030

2.4114

3.9088

5.7519

5.7598

6.2646

6.2885

6.8619

6.8837

7.2674

7.4780

7.4997

7.6086

7.6326

Determinação Estrutural

O espectro de RMN

C (100 MHz, CDCl

) (FIGURA 5.12) mostra sinais

referentes a 9 carbonos, porém não foram observados os sinais referentes a

carbonos quaternários já que a substância foi isolada em pequena quantidade e o

tempo de aquisição de espectro não foi suficiente para que os sinais referentes aos

carbonos quaternários fossem adquiridos.

FIGURA 5.12- Espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) da substância 3.

A análise do mapa de contorno de HSQC (100 MHz, CDCl

) (FIGURA 5.13)

permitiram que fossem atribuídos os deslocamentos químicos dos carbonos

hidrogenados.

Acquisition Time (sec)

2.4248

Comment

A12N493C

Date

11 Mar 1972 04:37:25

Date Stamp

11 Mar 1972 04:37:25

File Name

C:\DOCUMENTS AND SETTINGS\USER\MEUS DOCUMENTOS\TATINHA\RELATÓRIO II A MISSãO\SUBST C\A12N493C.DX

Frequency (MHz)

50.33

Nucleus

13C

Number of Transients

28139

Origin

tatiane

Original Points Count

32768

Owner

tatiane

Points Count

32768

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

13513.51

Temperature (degree C)

27.000

145 140 135 130 125 120 115 110 105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15

ppm

16.5589

19.8202

20.5577

29.5141

56.4077

76.3608

77.0000

77.6310

82.5803

107.5975

114.2185

130.3613

142.7019

Determinação Estrutural

FIGURA 5.13- Mapa de contorno de HSQC da substância 3

Através das projeções dos deslocamentos químicos do espectro de carbono

no mapa de contorno de HMBC (FIGURA 5.14), que mostra as correlações dos

hidrogênios com carbonos a duas e três ligações, foi possível estimar os

deslocamentos químicos dos carbonos quaternários.

142,7

130,3

107,5 114,2

OOO

56,4

6,28

7,62

3,90

6,87

7,49

16,56

1,03

19,82

20,56

1,03

82,6

5,75

29,5

2,38

(

)

Determinação Estrutural

FIGURA 5.14- Mapa de contorno de HMBC da substância 3

Através da análise da expansão da região de δ

8,0-3,5 do mapa de contorno

de HMBC (FIGURA 5.15) é possível atribuir os deslocamentos químicos dos

carbonos do esqueleto cumarínico.

(

)

(

Determinação Estrutural

FIGURA 5.15- Expansão do mapa de contorno de HMBC da substância 3.

Através da análise da expansão da região de δ

2,50-0 do mapa de contorno

de HMBC (FIGURA 5.16) é possível atribuir os deslocamentos químicos do carbonos

do grupo substituinte na posição 8.

112

152

159

OOH

6,28

7,49

116

142,7

116

6,87

7,62

OOH

159

152

112

114,2

(

)

(

Determinação Estrutural

FIGURA 5.16- Expansão do mapa de contorno de HMBC da substância 3.

O espectro de massas obtido através de CG-EM (FIGURA 5.17) não

apresenta o pico do íon molecular. O pico base m/z 203 (100%) é característico de

cumarinas substituídas na posição 8, onde a cadeia lateral apresenta uma carbonila

na posição 1’ e um grupo acetoxi na posição 2’ (QUADER et al., 1992) A proposta

de fragmentação está descrita na FIGURA 5.18.

2,07

1,03

OCH

82,6

29,5

170

OCH

29,5

170

197

16,56

19,82

(

)

1.0

1.5

2.0

2.5

(

Determinação Estrutural

FIGURA 5.17-espectro de massas da substância 3.

FIGURA 5.18- Proposta de fragmentação para a substância 3.

A análise dos dados indica que a substância 3 é uma cumarina conhecida

como isomurranganona, isolada anteriormente de plantas da espécie Phebalium

(Rutaceae) (QUADER et al., 1992). Os dados espectroscópicos da isomurranganona

não foram encontrados na literatura. A atividade óptica da substância

isomurranganona foi medida e o valor encontrado foi de [α]

=+33,3 em

diclorometano.

Os dados RMN de

H da isomurranganona estão apresentados na TABELA

4.3.

OOCH

m/z 203

OOCH

isomurranganona

Determinação Estrutural

TABELA 5.3- Dados de RMN de

H e

C da isomurranganona

(a) CDCl

, 400MHz; (b) CDCl

, 50MHz

*valores obtidos através da projeção de carbono do HMBC

5.1.4- Determinação Estrutural da Substância 4

A substância 4 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico das

folhas de Rauia sp1 e da fração diclorometano do extrato metanólico do caule de

Rauia sp.

O espectro de RMN

H (400 MHz, CDCl

) da substância 4 (FIGURA 5.19)

apresenta os quatro dubletos na região aromática, característicos de esqueleto

cumarínico substituídos nas posições 7 e 8 (MURRAY et al., 1982), como discutido

no item 5.1. Observa-se um singleto integrando para três hidrogênios em δ 3,85 que

pode ser atribuído a uma metoxila.

Observam-se ainda dois singletos em δ 2,43 (3H) e δ1,79 (3H) que podem ser

atribuídos a duas metilas ligadas a carbono sp

e um sinal em δ 10,22 (s, 1H) que

pode ser atribuído a um hidrogênio de aldeído.

H/C δ

(a)

(b)

2 159*

3 6,28 (d, 9,6 Hz) 114,2

4 7,62 (d, 9,6 Hz) 142,7

4a 112*

5 7,49 (d, 8,6 Hz) 130,3

6 6,87 (d, 8,6 Hz) 107,5

7 159*

8 116*

8a 152*

1’ 197*

2’ 5,75 (d, 3,3 Hz) 82,6

3’ 2,38 (dsept, 3,3 Hz) 29,5

4’ 1,03 16.5

5’ 1,03 19,8

COO 2,07 (s) 20,5

COO 170*

OCH

3,90 (s) 54,4

Determinação Estrutural

O espectro de RMN

C (50MHz, CDCl

) (FIGURA 5.20) mostra sinais

referentes a 15 carbonos. Além dos sinais característicos do esqueleto cumarínico,

observa-se um sinal em δ 188,8 que pode ser atribuído a uma carbonila de aldeído e

um sinal em δ 56,2 atribuído ao carbono da metoxila na posição 7.

FIGURA 5.19- Espectro de RMN

H (400 MHz, CDCl

) da substância 4.

FIGURA 5.20- Espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) da substância 4.

190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20

19.852

24.891

56.243

76.376

77.015

77.646

107.670

113.054

113.275

128.574

129.254

143.602

159.646

160.122

161.105

188.826

Determinação Estrutural

A análise do mapa de contorno de HSQC (FIGURA 5.21) mostra as

correlações entre os hidrogênios e os carbonos diretamente ligados. Além dos sinais

característicos do esqueleto cumarínico, foi observada a correlação entre o sinal em

10,22 e δ

188,8 confirmando a presença de um grupo aldeído, e as correlações

dos hidrogênios das metilas em δ

1,79 com o carbono em δ

24,9 e em δ

2,43 com

o carbono em δ

19,8.

FIGURA 5.21- Mapa de contorno de HSBC (100 MHz, CDCl

) da substância 4.

188,2

10,22

24,9

1,79

19,8

2,43

56,2

6,91

7,66

OOCO

107,7

143,6

128,5

113,3

6,24

7,45

3,83

Determinação Estrutural

A análise do mapa de contorno do HMBC (FIGURA 5.22) mostra as

correlações entre os hidrogênios e os carbonos ligados a duas e três ligações.

FIGURA 5.22- Mapa de contorno de HMBC (100 MHz, CDCl

) da substância 4.

A expansão da região a δ

10-6 do mapa de contorno do HMBC (FIGURA

5.23), além das correlações dos hidrogênios do esqueleto cumarínico, mostra a

correlação do hidrogênio do grupo aldeído em δ

10,22 com os carbonos em δ

129,2 e δ

113,0.

Determinação Estrutural

FIGURA 5.23- Expansão do mapa de contorno de HMBC (100 MHz, CDCl

) da

substância 4.

A expansão da região de δ

4-1 (FIGURAS 5.24 e 5.25) mostra as

correlações dos hidrogênios da metila em δ 1,79 com o carbono em δ

129,2 a duas

ligações e com os carbonos em δ

159,6 e 19,8 a três ligações, e as correlações da

metila em δ

2,43 com o carbono em δ

129,2 a duas ligações e com os carbonos

em δ

159,6 e 24,9 a três ligações. A presença da carbonila faz com que o sinal da

metila na posição cis seja mais desblindado (δ

2,28) em que a metila na posição

trans (δ

1,85), isso ocorre porque os elétrons π da ligação C=O blinda as zonas

cônicas acima e abaixo do plano e desblinda as zonas laterais (SILVERSTEIN &

WEBSTER, 2000).

10,22

129,2

159,6

OOCH

113,0

6,24

113,0

153,0

160,1

161,1

OOH

7,45

113,0

143,6

6,91

128,5

113,0

7,66

161,1

160,1

153,0

113,0

113,3

OOH

Determinação Estrutural

FIGURA 5.24- Expansão do mapa de contorno de HMBC (100 MHz, CDCl

) da

substância 4.

FIGURA 5.25- Expansão do mapa de contorno de HMBC (100 MHz, CDCl

) da

substância 4.

129,2

159,6

HOC

1,79

19,8

129,2

159,6

HOC

2,43

24,9

Determinação Estrutural

A análise dos dados e a comparação com dados da literatura indicam que a

substância 4 é a cumarina conhecida como murralongina isolada anteriormente de

Murraya paniculata (KINOSHITA et al., 1996) (FURUKAUA et al., 1990) Os dados

RMN de

H (FURUKAUA et al., 1990) e de

C (KINOSHITA et al., 1996) da

substância 4 assim como os dados da literatura estão representados na TABELA

5.4.

TABELA 5.4- Dados de RMN de

H e

C da murralongina.

H/C δ

(a)

(lit.)

(b)

(c)

(lit.)

(c)

2 161,1 160,9

3 6,24 (d, 9,5 Hz) 6,23 (d, 9,4 Hz) 113,3 112,7

4 7,66 (d, 9,5 Hz) 7,65 (d, 9,4 Hz) 143,6 143,6

4a 113,0 112,7

5 7,45 (d, 8,6 Hz) 7,45 (d, 8,7 Hz) 128,5 128,5

6 6,91 (d, 8,6 Hz) 6,90 (d, 8,7 Hz) 107,7 107,5

7 160,1 159,8

8 113.0 112,7

8a 153 152,2

1’ 10,22 s 10,22 s 188,2 188,7

2’ 159,6 159,7

3’ 129,2 128,9

4’ 1,79 s 1,79 s 24,9 24,6

5’ 2.43 s 2.43 s 19,8 19,5

O-CH

3,83 s 3,83 s 56,2 56,0

(a) CDCl

, 400MHz; (b) CDCl

, 270MHz; (c) CDCl

, 100MHz

OOH

murralongina

Determinação Estrutural

5.1.5- Determinação Estrutural da Substância 5

A substância 5 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico das

folhas de Rauia sp e da fração diclorometano do extrato metanólico do caule de

Rauia sp.

O espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 5 (FIGURA 5.26)

apresenta os quatro dubletos na região aromática, característicos de esqueleto

cumarínico substituídos nas posições 7 e 8 (MURRAY et al., 1982) como discutido

no item 5.1. Observa-se um singleto integrando para três hidrogênios em δ 3,97 que

pode ser atribuído a uma metoxila na posição 7.

O espectro apresenta ainda dois dubletos em δ 5,31 e δ 4,53 (1H, J= 8,4Hz),

um multipleto em δ 4,62 (2H), que sugere a presença de um grupo metilenico

terminal e um singleto em δ 1,77 (3H), que sugere a presença de uma metila sobre

dupla ligação.

O espectro de RMN

C (FIGURA 5.27) mostra sinais referentes a 15

carbonos. Além dos sinais característicos de esqueleto cumarínico substituídos nas

posições 7 e 8, o espectro mostra sinas em δ 78,3 e δ 68,6 que sugerem a presença

de dois carbonos carbinólicos e o sinal em δ 17,4 é atribuído a uma metila.

A análise dos dados e a comparação com dados da literatura indicam que a

substância 5 é a cumarina conhecida como murrangatina isolada anteriormente de

Murraya paniculata (IMAI et al., 1989; KINOSHITA et al., 1996; ITO et al., 1990),

Murraya exotica (SUAREZ & MONACHE, 1991) e Rauia resinosa (VELOSO, 1995).

Os dados RMN de

H e de

C da substância 5 assim como os dados de

(KINOSHITA et al. 1989) e de

C (KINOSHITA et al., 1996) da literatura estão

representados na TABELA 5.5.

murrangatina

OOCH

Determinação Estrutural

FIGURA 5.26- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da murrangatina.

FIGURA 5.27- Espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) da murrangatina.

Acquisition Time (sec)

18.4812

Comment

A293D673

Date

07 Jul 1971 09:51:41

Date Stamp

07 Jul 1971 09:51:41

File Name

C:\DOCUMENTS AND SETTINGS\USER\MEUS DOCUMENTOS\TATINHA\ESPECTROS REL3\MURRANGATINA\A293D673.DX

Frequency (MHz)

200.13

Nucleus

Number of Transients

Origin

tatiane

Original Points Count

65536

Owner

tatiane

Points Count

65536

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

3546.10

Temperature (degree C)

27.000

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

ppm

3.293.072.001.010.950.95 0.94 0.94

TMS

7.6536

7.6060

7.4187

7.3754

7.2718

6.9006

6.8571

6.2826

6.2350

5.3290

5.3025

5.2879

4.6612

4.6533

4.6455

4.5941

4.5901

4.5484

4.5057

4.0580

3.9685

3.8793

1.7734

0.0000

Acquisition Time (sec)

2.4248

Comment

A31N7.3C

Date

21 Jul 1971 04:12:39

Date Stamp

21 Jul 1971 04:12:39

File Name

C:\DOCUMENTS AND SETTINGS\USER\MEUS DOCUMENTOS\TATINHA\ESPECTROS REL3\A31N7.3C.DX

Frequency (MHz)

50.33

Nucleus

13C

Number of Transients

3653

Origin

tatiane

Original Points Count

32768

Owner

tatiane

Points Count

32768

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

13513.51

Temperature (degree C)

27.000

160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20

ppm

Chloroform-d

160.1230

160.0820

152.8628

143.8327

143.6770

128.5339

116.0376

113.6285

113.4073

113.0631

107.7860

78.3521

77.6310

77.0000

76.3608

69.5678

56.2438

17.3947

Determinação Estrutural

TABELA 5.5- Dados de RMN de

H e

C da murrangatina.

H/C δ

(a)

(b)

(lit.) δ

(c)

(lit.)

2 160,1 160,2

3 6,26 (d, 9,5 Hz) 6,24 (d, 9,5 Hz) 113,4 113,4

4 7,63 (d, 9,5 Hz) 7,63 (d, 9,5 Hz) 143,7 143,8

4a 113,1 113,1

5 7,40 (d, 8,7 Hz) 7,40 (d, 8,5 Hz) 128,5 128,6

6 6,88 (d, 8,7 Hz) 6,88 (d, 8,5 Hz) 107,8 107,9

7 160,1 160,2

8 116,0 116,1

8a 152,9 152,9

1’ 5,31 (d, 8,4 Hz) 5,30 (d, 8,5 Hz) 69,6 69,6

2’ 4,53 (d, 8,4 Hz) 4,57(d, 8,5 Hz) 78,4 78,4

3’ 143,8 143,9

4’ 4,63 m  4,60 m 113,6 113,7

5’ 1,77 s 1,77 s 17,4 17,4

OCH

3,97 s 3,97 s 56,2 56,3

(a) CDCl

, 200MHz; (b) CDCl

, 100MHz; (c) CDCl

, 50MHz; (d) CDCl

, 100MHz

A configuração relativa dos carbonos 1’ e 2’ da murrangatina foi proposta pela

primeira vez por Talapata e colaboradores em 1973 que descreveram a abertura do

anel oxirano com acido clorídrico e dioxano com a obtenção do racemato da

murrangatina como único produto da reação. Como o valor da constante de

acoplamento dos hidrogênios vicinais do anel oxirano da phebalosina é pequeno

(

J=2Hz) concluiu-se que a estereoquímica relativa da função α-glicol da

murrangatina seria

eritro.

Porém em 1990 ITO e colaboradores publicaram a revisão da proposta

estrutural da cadeia lateral da murrangatina. Neste trabalho o tratamento da

murrangatina isolada com acetona na presença de acido

p-tolueno sulfônico levou a

eritro-murrangatina

OOCH

phebalosina

OOCH

Determinação Estrutural

obtenção do acetonídeo correspondente. Experimentos de NOE deste acetonídeo

através da irradiação dos hidrogênios H1´ou H2´ não causa efeito no sinal vizinho

indicando que estes hidrogênios ocupam planos opostos. Neste caso a estrutura

correta para a murrangatina seria aquela em que a estereoquímica da cadeia lateral

treo, 1’R 2’R.

5.1.6- Determinação Estrutural da Substância 6

A substância

6 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico das

folhas de

Rauia sp e da fração diclorometano do extrato metanólico do caule de

Rauia sp.

O espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 6 (FIGURA 5.28)

apresenta os quatro dubletos na região aromática, característicos de esqueleto

cumarínico substituídos nas posições 7 e 8 (MURRAY

et al., 1982), como discutido

no item 5.1. Observa-se um singleto integrando para três hidrogênios em

δ 3,98 que

pode ser atribuído a uma metoxila.

Foram observados ainda dois dubletos em

δ 5,43 (J= 7,5 Hz) e 4,54 (J= 7,5

Hz), um singleto largo em 4,99 

e um singleto em 1,91 integrando para três

hidrogênios.

A análise dos dados e a comparação com dados da literatura indicam que a

substância

6 é um diasteroisomero da murrangatina, a cumarina conhecida como

munomicrolina isolada anteriormente de

Murraya paniculata (ITO et al., 1990),

Murraya exotica (SUAREZ & MONACHE, 1991), Micromelum minutum (DIAS et al.,

1984) e

Rauia resinosa (VELOSO, 1995). Os dados RMN de

H da substância 6

assim como os dados da literatura (DIAS et al., 1984) estão representados na

TABELA 5.6.

murrangatina

OOCH

Determinação Estrutural

FIGURA 5.28- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da munomicrolina.

TABELA 5.6- Dados de RMN de

H munomicrolina.

H/C δ

(a)

(b)

(lit.)

3 6,28 (d, 9,5 Hz) 6,26 (d, 10 Hz)

4 7,65 (d, 9,5 Hz) 7,64 (d, 10 Hz)

5 7,42 (d, 8,7 Hz) 7,41 (d, 8 Hz)

6 6,91 (d, 8,7 Hz) 6,90 (d, 8 Hz)

1’ 5,43 (d, 7,5 Hz) 5,42 (d, 9 Hz)

2’ 4,54(d, 7,5 Hz) 4,53 (dl, 9 Hz)

4’ 4,99  sl 4,99 sl

5’ 1,91 s 1,90 s

OCH

3,98 s 3,98 s

(a) CDCl

, 200MHz; (b) CDCl

, 270MHz

Acquisition Time (sec)

18.4812

Comment

A13364641

Date

15 Mar 1972 03:39:46

Date Stamp

15 Mar 1972 03:39:46

File Name

C:\DOCUMENTS AND SETTINGS\USER\MEUS DOCUMENTOS\TATINHA\ESPECTROS REL3\MURRANGATINA\A13364641.DX

Frequency (MHz)

200.13

Nucleus

Number of Transients

Origin

tatiane

Original Points Count

65536

Owner

tatiane

Points Count

65536

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

3546.10

Temperature (degree C)

27.000

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

ppm

3.28 3.271.231.14 1.06 0.98 0.96 0.88 0.72

Chloroform-d

7.6693

7.6217

7.4374

7.3941

7.2700

6.9326

6.8893

6.3023

6.2548

5.4526

5.4145

4.9986

4.5560

4.5190

4.0277

3.9818

1.9059

1.6739

1.2627

OOCH

munomicrolina

Determinação Estrutural

ITO e colaboradores em 1990 também trataram a munomicrolina isolada com

acetona na presença de acido

p-tolueno sulfônico levando a obtenção do acetonídeo

correspondente. Experimentos de NOE deste acetonídeo através da irradiação do

hidrogênio H1´ causa o aumento de 15,7% no sinal de H2’ enquanto a irradiação do

hidrogênio H2´ causa o aumento de 20% no sinal de H1’ demonstrando que estes

hidrogênios ocupam o mesmo plano. Neste caso a estrutura correta para a

munomicrolina seria aquela em que a estereoquímica da cadeia lateral é

eritro.

1’

R2’S.

5.1.7- Determinação Estrutural da Substância 7

A substância

7 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico do

caule de

Rauia sp, diclorometano do extrato metanólico das folhas de Rauia sp.

O espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 7 (FIGURA 5.29)

apresenta os quatro dubletos na região aromática, característicos de esqueleto

cumarínico substituídos nas posições 7 e 8 (MURRAY

et al., 1982) como discutido

no item 5.1. Observa-se um singleto integrando para três hidrogênios em

δ 3,96 que

pode ser atribuído a uma metoxila na posição 7.

Observam-se ainda dois dubletos em

δ 6,69 e 6,09 (J= 8,8 Hz), um singleto

largo em

δ 4,91 (1H) e um tripleto em δ 4,74 (1H, J=1,5) e dois singletos em δ 2,08 e

δ 2,05 integrando para três hidrogênios cada, que sugerem a presença de metilas de

grupo acetato.

A análise dos dados e a comparação com dados da literatura indicam que a

substância

7 é o derivado acetilado da murrangatina, a cumarina conhecida como

acetato de murrangatina isolada anteriormente de

Phebalium coxii (QUADER et al.,

1992) e

Rauia resinosa (VELOSO, 1995). Os dados RMN de

H da substância 7

assim como os dados da literatura (DAS

et al., 1984) estão representados na

TABELA 5.7.

Determinação Estrutural

FIGURA 5.29- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) do acetato de murrangatina.

TABELA 5.7- Dados de RMN

H do acetato de murrangatina

H/C δ

(a)

(b)

(lit.)

3 6,26 (d, J= 9,5 Hz) 6,25 (d, J= 9,5 Hz)

4 7,59 (d, J= 9,5 Hz) 7,58 (d, J= 9,5 Hz)

5 7,40 (d, J= 8,7 Hz) 7,39 (d, J= 8,2 Hz)

6 6,84 (d, = 8,7 Hz) 6,83 (d, J= 8,2 Hz)

1’ 6,69 (d, J= 8,8 Hz) 6,68 s

2’ 6,09 (d, J= 8,8 Hz) 6,08 s

4’

4,91(sl)

4,74 (

t, 1,5Hz)

4,92

4,79 

5’ 1,64 s 1,64 s

OCH

3,97 s 3,97 s

COO 2,08 s 2,07 s

COO 2,05 s 2,04 s

(a) CDCl

, 200MHz; (b) CDCl

, 270MHz

OOCH

acetato de murrangatina

Acquisition Time (sec)

18.4812

Comment

A12AcMur

Date

06 Mar 1972 03:34:15

Date Stamp

06 Mar 1972 03:34:15

File Name

C:\DOCUMENTS AND SETTINGS\USER\MEUS DOCUMENTOS\TATINHA\ESPECTROS REL3\ACETATO DE MURRANGATINA\A12ACMUR.DX

Frequency (MHz)

200.13

Nucleus

Number of Transients

Origin

tatiane

Original Points Count

65536

Owner

tatiane

Points Count

65536

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

3546.10

Temperature (degree C)

27.000

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

ppm

6.463.011.041.03 1.01 1.011.000.990.96 0.96

TMS

7.6112

7.5636

7.4168

7.3732

7.2637

6.8603

6.8168

6.7065

6.6624

6.2823

6.2347

6.1076

6.0638

4.9161

4.7488

4.7412

4.7336

3.9623

2.0759

2.0459

1.6425

1.2551

0.0000

.00 4.95 4.90 4.85 4.80 4.75 4.70 4.65

1.011.00

4.9161

4.7488

4.7412

4.7336

Determinação Estrutural

5.1.8- Determinação Estrutural da Substância 8

A substância

8 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico das

folhas de

Rauia sp e do extrato metanólico do caule de Rauia sp.

O espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 8 (FIGURA 5.30)

apresenta os quatro dubletos na região aromática, característicos de esqueleto

cumarínico substituídos nas posições 7 e 8 (MURRAY

et al., 1982) como discutido

no item 5.1.

Foram observados ainda sinais referentes a 6 hidrogênios em

δ 5,12 (1H,

ddq,

J= 11,8; 6,0 e 1,7 Hz), δ 4,86 (1H, dd, J= 10,2 e 6,0 Hz), δ 3,95 (1H, dd, J= 11,8

e 10,2 Hz) e um dubleto em

δ 2,34 (3H, J= 1,7Hz). Estes dados e a ausência de

sinal em aproximadamente

δ 3,96 referente a uma metoxila sugerem que houve

ciclização entre os substituintes dos carbonos 7 e 8.

O espectro de RMN

C (FIGURA 5.31) mostra 15 sinais e o experimento de

DEPT 135 (FIGURA 5.32) mostra a presença de um carbono primário, um carbono

secundário, cinco carbonos terciários e oito quaternários. Além dos sinais

característicos de esqueleto cumarínico substituídos nas posições 7 e 8 (item 5.1) foi

observado um sinal em

δ 173,9 que indica a presença de uma carbonila na cadeia

carbônica dos substituintes do núcleo cumarínico.

A análise dos dados e a comparação com dados da literatura (VELOSO

et al.,

1997) indicam que a substância

8 é a cumarina conhecida como rauianina isolada

anteriormente de

Rauia resinosa (VELOSO et al., 1997). Os dados RMN de

H e

da substância

8 assim como os dados da literatura estão representados na TABELA

5.8.

rauianina

OOO

Determinação Estrutural

FIGURA 5.30- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da rauianina.

FIGURA 5.31- Espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) da rauianina.

Determinação Estrutural

FIGURA 5.32- Espectro de DEPT 135

da rauianina.

TABELA 5.8- Dados de RMN de

H e

C da rauianina.

H/C δ

(a)

(lit.) δ

(b)

(lit.)

2 159,4 159,5

3 6,35 (d, 9,6 Hz) 6,35 (d, 9,6 Hz) 113,7 113,6

4 7,68 (d, 9,6 Hz) 7,73 (d, 9,6 Hz) 143,4 143,5

4a 113,1 113,0

5 7,45 (d, 8,6 Hz) 7,50 (d, 8,6 Hz) 131,1 131,2

6 6,89 (d, 8,6 Hz) 6,92 (d, 8,6 Hz) 113,9 113,9

7 157,3 157,3

8 105,7 105,6

8a 151,3 151,7

2’ 173,9 174,0

3’ 145,3 145,3

4’ 123,1 122,9

5’

5,12 (ddq, 11,8; 6,0 e 1,7

Hz)

5,15 (ddq, 11,8; 6,0; 1,7

Hz)

71,0 71,0

6’

4,86 (dd, 10,2; 6,0 Hz)

3,95 (dd, 11,8 ; 10,2Hz)

4,85 (dd, 10,3; 6,0 Hz)

3,95 (dd, 11,8; 10,3 Hz)

69,5 69,5

7’ 2,34 (d, J= 1,7Hz) 2,32 (d, 1,7) 12,5 12,5

(a) CDCl

, 200MHz; (b) CDCl

, 50MHz

Determinação Estrutural

5.1.9- Determinação Estrutural da Substância 9

A substância

9 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico do

caule de

Rauia sp.

O espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 9 (FIGURA 5.33)

mostra várias semelhanças com o espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) ) da

cumarina rauianina (FIGURA 5.30). Assim como no espectro de RMN

H da

rauianina o espectro de RMN

H da substância 9 apresenta 4 sinais referentes a 6

hidrogênios, um duplo duplo quadrupleto em

δ 5,11 (1H, J= 11,8; 6,0 e 1,6 Hz), um

duplo dubleto em

δ 4,83 (1H, J= 10,1 e 6,0 Hz), um duplo dubleto em δ 3,95 (1H, J=

11,8 e 10,3 Hz) e um dubleto em

δ 2,34 (3H, J= 1,6Hz). Estes dados sugerem que

houve ciclização entre os substituintes dos carbonos 7 e 8, assim como no caso da

rauianina. Observam-se ainda dois dubletos em

δ 7,41 e δ 6,87 (1H, J= 8,6 Hz) que

podem ser atribuídos aos hidrogênios nas posições 5 e 6 respectivamente.

FIGURA 5.33- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 9.

Os dados de RMN

H da substância 9 difere dos dados da rauianina devido à

ausência de dois dubletos em

δ 6,25 e em δ 7,73 e a presença de um singleto em

δ 7,44, sugerindo que a substância 4 é um derivado da rauianina contendo um

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

10.273.462.432.32 1.461.10 1.040.99

0.000

0.849

0.880

0.918

1.225

1.262

1.299

1.658

2.340

2.349

2.538

2.543

2.574

2.580

2.611

2.618

2.649

2.655

3.939

3.948

3.998

4.796

4.825

4.847

4.876

5.064

5.073

5.094

5.124

5.132

5.162

5.303

6.843

6.886

7.264

7.386

7.429

7.442

Determinação Estrutural

substituinte adicional no carbono 3. Observa-se ainda a presença de um quadrupleto

δ 2,60 (J=7,5Hz) integrando para dois hidrogênios e de um tripleto em δ 1,26

(

J=7,5Hz) integrando para três hidrogênios sugerindo a presença de um grupamento

etila.

O espectro de RMN

C (100 MHz, CDCl

) (FIGURA 5.34) mostra sinais

referentes a 12 carbonos, porém não foram observados os sinais referentes a

carbonos quaternários já que a substância foi isolada em pequena quantidade e o

tempo de aquisição de espectro não foi suficiente para que os sinais referentes aos

carbonos quaternários fossem adquiridos.

FIGURA 5.34- Espectro de RMN

H (50 MHz, CDCl

) da substância 9.

A análise do mapa de contorno de HSQC (FIGURA 5.35) mostra as

correlações entre os hidrogênios e os carbonos diretamente ligados. Além dos sinais

característicos do esqueleto cumarínico, foi observada a correlação entre o sinal em

5,11 e δ

71,1, dos sinais em δ

4,83 e δ

3,95 com o sinal em δ

69,5 e do sinal

2,34 com o sinal em e δ

12,6. Foram observadas ainda as correlações entre

o sinal em

2,60 e sinal em δ

23, 7 e entre o sinal em δ

1,26 e sinal em δ

12,2.

Determinação Estrutural

FIGURA 5.35- Mapa de contorno de HSQC da substância

Através das projeções dos deslocamentos químicos do espectro de carbono

no mapa de contorno de HMBC (FIGURA 5.36), que mostra as correlações dos

hidrogênios com carbonos a duas e três ligações, foi possível obter os

deslocamentos químicos dos carbonos quaternários.

OOO

7,44

7,41

6,87

137,4

69,5

130,4

113,6

71,1

4,83

3,95

2,34

12,6

5,11

1,26

2,60

12,2

23,7

Determinação Estrutural

FIGURA 5.36- Mapa de contorno de HMBC da substância

113,8

161

159

1,26

152

6,87

OOO

128,7

69,5

173

2,34

147

123

5,11

23,7

161

159

152

6,87

7,41

7,44

OOO

Determinação Estrutural

O espectro de massas de alta resolução da substância 9 (FIGURA 5.37)

mostra o pico do íon molecular com

m/z 298,08450 (100%) que está de acordo com

a fórmula molecular C

, o valor calculado é m/z 298,08412.

FIGURA 5.37- Espectro de massas de alta resolução da substância

A análise dos dados de RMN

H da substância 9 e a comparação com os

dados da rauianina (VELOSO

et al., 1997) indicam que a substância 9 é a cumarina

3-etilrauianina inédita na literatura. Os dados RMN de

H da rauianina e da 3-

etilrauianina estão representados na TABELA 5.9.

3-etilrauianina

OOO

Determinação Estrutural

TABELA 5.9- Dados RMN

H e RMN

C da rauianina e da 3-etilrauianina

(a) CDCl

, 200MHz; (b) CDCl

, 50MHz

*valores obtidos através da projeção de carbono do HMBC

5.1.10- Determinação Estrutural da Substância 10

A substância 10 foi isolada da fração diclorometanica do extrato metanólico

das folhas de

Rauia sp.

O espectro de RMN

H (400 MHz, CDCl

) da substância 10 (FIGURA 5.38)

mostra várias semelhanças com o espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da

cumarina rauianina (FIGURA 5.30). Assim como no espectro de RMN

H da

rauianina o espectro de RMN

H da substância 10 apresenta 4 sinais referentes a 6

hidrogênios em

δ 5,00 (1H, ddq, J= 11,9; 6,0 e 1,3 Hz), δ 4,75 (1H, dd, J= 10,0 e 6,0

Hz),

δ 3,87 (1H, dd, J= 11,9 e 10,0 Hz) e um dubleto em δ 2,24 (3H, J= 1,3Hz). Estes

dados sugerem que houve ciclização entre os substituintes dos carbonos 7 e 8,

assim como no caso da rauianina. Observam-se ainda dois dubletos em

δ 7,94 e δ

rauianina 3-etil rauianina

(a)

(b)

(a)

(b)

2 159,5 161*

3 6,35 (d, 9,6 Hz) 113,6 - 128,7

4 7,73 (d, 9,6 Hz) 143,5 7,44 (1H, s) 137,4

4a 113,0 113,8

5 7,50 (d, 8,6 Hz) 131,2 7,41(d, 8,6 Hz) 130,4

6 6,92 (d, 8,6 Hz) 113,9 6,87 (d, 8,6 Hz) 113,6

7 157,3 158*

8 105,6

8a 151,7 152*

2’ 174,0 173*

3’ 145,3 147*

4’ 122,9 123*

5’ 5,15 (ddq, 11,8; 6,0; 1,7 Hz) 71,0 5,11(ddq, 11,8; 6,0; 1,6 Hz) 71,1

6’

4,85 (dd, 10,3; 6,0 Hz)

3,95 (dd, 11,8; 10,3 Hz)

69,5

4.83 (dd, 10,1; 6,0 Hz)

3,95 (dd, 11,8; 10,1 Hz)

69,5

7’ 2,32 (d, 1,7 Hz) 12,5 2.34 (d, 1,6 Hz) 12,6

1’’ - - 2,60(q, 7,0 Hz) 23,7

2’’ - - 1,26 (t, 7,0 Hz) 12,2

Determinação Estrutural

6,19 (1H, J= 9,6 Hz) que podem ser atribuídos aos hidrogênios nas posições 4 e 3

respectivamente.

O espectro de RMN

H da substância 10 difere dos dados da rauianina devido

a ausência dois dubletos em

δ 7,50 e em δ 6,92 e a presença de um singleto em

singleto em

δ 6,26 (1H) que sugere a presença de um substituinte na posição 5.

Observa-se ainda um singleto em

δ 3,87 (3H) sugerindo a presença de um grupo

metoxila.

FIGURA 5.38- Espectro de RMN

H (400 MHz, CDCl

) da substância 10

A análise dos dados de RMN

H da substância 10 e a comparação com os

dados da rauianina (VELOSO

et al., 1997) indicam que a substância 10 é a

cumarina 5-metoxi rauianina inédita na literatura. Os dados RMN de

H da rauianina

e da 5-metoxi rauianina estão representados na TABELA 5.10.

Acquisition Time (sec)

13.0548

Date

File Name

C:\Documents and Settings\User\Meus documentos\Tatinha\RELATÓRIO II a missão\RMN 400MHz\D353D6N49\1\ESPEC.dx

Frequency (MHz)

400.13

Nucleus

Origin

SpinW orks 2.1, Kirk Marat, U of Manitoba

Original Points Count

65536

Owner

undefined

Points Count

65536

Sweep Width (Hz)

5020.05

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

ppm

5.05 3.201.28 1.221.021.00

7.9541

7.9296

7.1939

6.2639

6.2009

6.1766

5.0197

5.0159

5.0046

4.9853

4.9721

4.7737

4.7588

4.7485

4.7335

3.9817

3.9611

3.8985

3.8744

3.8437

2.2410

2.2377

1.5698

1.1835

0.8106

0.0000

5.05 5.00 4.95 4.90 4.85 4.80 4.75 4.70

1.271.24

5.0197

5.0159

5.0046

5.0008

4.9901

4.9876

4.9853

4.9746

4.9721

4.7737

4.7588

4.7485

4.7335

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0

1.041.00

7.9541

7.9296

7.1939

6.2639

6.2009

6.1766

5-metoxirauianina

OOO

OCH

Determinação Estrutural

TABELA 5.10- Dados de RMN de

H da rauianina e da 5-metoxi rauianina

rauianina

(a)

5-metoxirauianina

(b)

3 6,35 (d, 9,6 Hz) 6,19 (d, 9,7 Hz)

4 7,73 (d, 9,6 Hz) 7,94 (d, 9,7 Hz)

5 7,50 (d, 8,6 Hz) -

6 6,92 (d, 8,6 Hz) 6,26 (1H, s)

5’ 5,15 (ddq, 11,8; 6,0; 1,7 Hz) 5,00(ddq, 11,9; 6,0; 1,3 Hz)

6’

4,85 (dd, 10,3; 6,0 Hz)

3,95 (dd, 11,8; 10,3 Hz)

4,75 (dd, 10,0; 6,0 Hz)

3,87 (dd, 11,9; 10,0 Hz)

7’ 2,32 (d, 1,7) 2.24 (d, 1,3)

OCH

- 3,87

(a) CDCl

, 200MHz

5.1.11- Determinação Estrutural da Substância 11

A substância

11 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico das

folhas de

Rauia sp1.

O espectro de RMN

H (200 MHz, MeOD) da substância 11 (FIGURA 5.39)

apresenta os dois dubletos na região dos hidrogênios aromáticos em

δ 6,17 e δ 7,84

(1H,

J= 9,5 Hz) característicos dos hidrogênios 3 e 4 de esqueleto cumarínico

(MURRAY

et al., 1982). O espectro apresenta ainda um dubleto em δ 7,44 (1H, J=

8,5 Hz), um duplo dubleto em

δ 6,78 (1H, J= 8,5 e 2,3 Hz) e um dubleto em δ 6,70

(1H,

J= 2,3 Hz) indicando benzênico 1,2,4-substituido. A ausência de um singleto em

aproximadamente

δ 3,96 indica a ausência da metoxila na posição 7 e sugere a

presença de um grupo hidroxila nesta posição.

A análise dos dados e a comparação com dados da literatura indicam que a

substância

11 é a 7-hidroxicumarina, comumente conhecida como umbeliferona,

amplamente encontrada em plantas da família Rutaceae. Os dados RMN de

H da

substância

11 assim como os dados descritos na literatura (KONG et al., 1996)

estão descritos na TABELA 5.11.

umbeliferona

OOHO

Determinação Estrutural

FIGURA 5.39- Espectro de RMN

H (200 MHz, MeOD) da umbeliferona.

TABELA 5.11- Dados de RMN

H da umbeliferona.

H/C δ

(a)

(b)

(lit.)

3 6,17(d, 9,5 Hz) 6,10 (d, 9,5 Hz)

4 7,84 (d, 9,5 Hz) 7,79 (d, 9,5 Hz)

5 7,44 (d, 8,5 Hz) 7,42 (d, 8,4 Hz)

6 6,78 (dd, 8,5 e 2,3 Hz) 6,77 (dd, 8,4 e 2,2 Hz)

8 6,70 (d, 2,3Hz) 6,71 (d, 2,2Hz)

(a) MeOD, 200MHz; (b) DMSO, 400MHz

5.1.12- Determinação Estrutural da Substância 12

A substância

12 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico das

folhas de

Rauia sp1.

O espectro de RMN

H (200 MHz,CDCl

) da substância 12 (FIGURA 5.40)

apresenta dois dubletos na região dos hidrogênios aromáticos em

δ 6,27 e δ 7,60

(1H,

J= 9,5 Hz) característicos dos hidrogênios 3 e 4 de esqueleto cumarínico

(MURRAY

et al., 1982). O espectro apresenta ainda dois singletos em δ 6,92 (1H) e

δ 6,25 1H) sugerindo um anel aromático 1,2,4,5 substituído. A presença de apenas

um singleto em

δ 3,96 indica a presença de uma metoxila, sugerindo que uma das

Acquisition Time (sec)

18.4811

Comment

A13331

Date

13 Mar 1972 03:54:51

Date Stamp

13 Mar 1972 03:54:51

File Name

C:\DOCUMENTS AND SETTINGS\USER\MEUS DOCUMENTOS\TATINHA\FAPESP2005\ESPECTROS REL3\UMBELIFERONA\A13331.DX

Frequency (MHz)

200.13

Nucleus

Number of Transients

Origin

tatiane

Original Points Count

65536

Owner

tatiane

Points Count

65536

Sweep Width (Hz)

3546.10

Temperature (degree C)

27.000

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5

ppm

1.00 0.980.97 0.97

Methanol-d4

1.2749

3.2838

3.2919

3.3000

3.3081

3.3165

6.1456

6.1929

6.6929

6.7039

6.7537

6.7653

6.7961

6.8075

7.4202

7.4626

7.8127

7.8600

7.5 7.0 6.5 6.0

1.00 0.980.97 0.970.97

7.8600

7.8127

7.4626

7.4202

6.8075

6.7961

6.7653

6.7537

6.7039

6.6929

6.1929

6.1456

Determinação Estrutural

posições tem uma hidroxila como substituinte. Deste modo duas estruturas podem

ser propostas a 7-hidroxi-6-metoxicumarina vulgarmente denominada escopoletina

ou o seu isômero a 6-hidroxi-7-metoxicumarina vulgarmente denominada

isoescopoletina.

FIGURA 5.40- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 12.

A distinção dos isômeros foi feita com base na análise do espectro de massas

da substância

12 (FIGURA 5.41), onde a escopoletina apresenta um sinal m/z=177,

cuja abundância relativa é em torno de 70%, ao passo que seu isômero pode

apresentar o mesmo pico, no entanto com uma intensidade não tão alta. Isso ocorre

pelo fato de que o íon formado pela escopoletina pode ser mais estabilizado do que

o formado pela isoescopoletina (SALLES, 1995).

OOH

escopoletina

isoescopoletina

Acquisition Time (sec)

18.4812

Comment

A37N5812

Date

01 Sep 1971 11:21:22

Date Stamp

01 Sep 1971 11:21:22

File Name

Frequency (MHz)

200.13

Nucleus

Number of Transients

Origin

tatiane

Original Points Count

65536

Owner

tatiane

Points Count

65536

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

3546.10

Temperature (degree C)

27.000

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

ppm

3.111.05 0.900.79

TMS

7.6217

7.5747

7.2618

6.9231

6.8474

6.2958

6.2482

5.3009

3.9574

3.4929

1.5611

1.2548

0.9198

0.0000

Determinação Estrutural

100

- CH

HO O O

- CH

escopoletina

isoescopoletina

m/z 192

m/z 177

A análise do espectro de massas obtido mostra o pico

m/z=177 com

intensidade de 16% o que indica que a substância

12 é a isoescopoletina,

amplamente encontrada em plantas da família Rutaceae. Os dados RMN de

H da

substância 15 assim como os dados descritos na literatura (RAZDAN

et al., 1987)

estão descritos na TABELA 5.12.

FIGURA 5.41- Espectro de massas da isoescopoletina.

TABELA 5.12- Dados de RMN

H da isoescopoletina.

H/C δ

(a)

(b)

(lit.)

3 6,27 (d, 9,5 Hz) 6,11 (d, 9,3 Hz)

4 7,60 (d, 9,5 Hz) 7,82 (d, 9,3 Hz)

5 6,92 (s) 7,12 (s)

8 6,25 (s) 6,72 (s)

OCH

3,96 (s) 3,18 (s)

(a) CDCl

, 200MHz; (b) C

, 60MHz

Determinação Estrutural

101

5.1.13- Biogênese das cumarinas

As cumarinas têm sua origem biossintética no ácido p-hidroxi-cinâmico (p-

cumárico). Inicialmente ocorre a glicosilação da hidroxila em

para com posterior

oxidação na posição

orto a cadeia lateral, seguida da glicosilação da hidroxila nesta

posição. Ocorre então a isomerização da dupla ligação da cadeia lateral e uma

lactonização levando a formação da umbeliferona (

11). A oxidação com posterior

metilação na posição 6 da umbeliferona leva a formação da isoescopoletina (

12).

ESQUEMA 5.1- Proposta biogenética para as substâncias

11 e 12.

O esqueleto mais simples é o da umbeliferona, sendo que a maior

característica de diversificação das cumarinas simples nas famílias Rutaceae e

Umbelliferae envolve a incorporação de unidades de prenila. As prenilações nas

posições 6 e 8 são comuns devido a presença da hidroxila na posição 7, que é um

grupo orientador

orto. Uma vez incorporado ao esqueleto cumarínico o grupo prenila

pode sofrer um grande número de modificações secundárias, geralmente iniciadas

com a epoxidação da dupla ligação (GRAY & WATERMAN,1978).

GliO

GliO OH

ac. p-hidroxi cinâmico

GliO OGli

GliO

COOH

OGli

OOGliO

[O]

OOHO

SAM

umbeliferona (11)

OOHO OOH

isoescopoletina (12)

Determinação Estrutural

102

ESQUEMA 5.2- Proposta biogenética para as substâncias

1, 2 e 3.

OOHO

OPP

OOHO

NADH

OOHO

NADH

OOHO

equilibrio

ceto-enólico

7-metoxi-8-(2-acetoxi-3-metil-

1-oxobut-2-enil)-cumarina (2)

OOCH

OOHO

murpaniculol (1)

OOHO

SAM

OOCH

isomurranganona (3)

OOHO

SAM

[O]

acetilação

Determinação Estrutural

103

ESQUEMA 5.3- Proposta biogenética para as substâncias

4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10.

OOHO

-H

OOH

NADH

OOHO

SAM

OOH

munomicrolina (6)

murralongina (4)

OOH

OOO

rauianina (8)

OOO

3-etilrauianina (9)

5-metoxirauianina (10)

OOO

OCH

OOO

[O]

SAM

murrangatina (5)

OOH

OOCH

acetato de murrangatina (7)

Determinação Estrutural

104

5.2- Alcalóides

Os alcalóides constituem um vasto grupo de metabólitos com grande

diversidade estrutural, representando cerca de 20% das substâncias naturais

descritas (HENRIQUES

et al., 2001). Devido à diversidade estrutural dos alcalóides

a classificação mais pratica para estas substâncias é de acordo com a biossíntese.

Os alcalóides relatados na ordem Rutales são derivados do ácido antranílico,

triptofano, fenilalanina, histidina, ácido nicotínico, ornitina ou lisina e em alguns

casos, eles são derivados de dois precursores (WATERMAN & GRUNDON, 1983).

Há mais de 470 alcalóides estruturalmente conhecidos isolados de espécies

pertencentes a ordem Rutales (WATERMAN & GRUNDON, 1983). Os alcalóides

derivados do ácido antranílico têm distribuição restrita fora da família Rutaceae,

atuando como marcador quimiotaxonômico desta família (WATERMAN, 1975).

Neste trabalho foram isolados 13 alcalóides derivados do ácido antranílico.

5.2.1- Determinação Estrutural da Substância 13

A substância

13 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico do

caule de

Rauia sp.

O espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 13 (FIGURA 5.42)

mostra um singleto

δ 6,12 característico de alcalóides quinolínicos. O espectro

mostra também um duplo dubleto em

δ 7,80 (1H, J= 8,0 e 1,2 Hz), um duplo duplo

dubleto em

δ 7,60 (1H, J= 8,2; 7,1 e 1,2 Hz), um dubleto largo em δ 7,37(1H, J=8,2

Hz), e um duplo duplo dubleto em

δ 7,25 (1H, J= 8,0; 7,1 e 1,2 Hz) sugerindo a

presença de um anel aromático

orto dissubstituído. O singleto em δ 3,70 (3H) é

característico de uma metoxila na posição 4 de alcalóides quinolínicos e singletos

δ 3,97 pode ser atribuído a uma metila ligada a um nitrogênio.

O espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) (FIGURA 5.43) mostra sinais

referentes a 11 carbonos os sinais em

δ 55,8 e δ 29,0 confirmam a presença de uma

metoxila e de uma metila ligada a um nitrogênio, respectivamente.

A análise dos dados e a comparação com dados da literatura indicam que a

substância

13 é o alcalóide quinolínico conhecido como N-metil-4-metoxi-2-

quinolona, que é amplamente distribuído em plantas da família Rutaceae. Os dados

Determinação Estrutural

105

RMN

H e de RMN

C da substância 13 assim como os dados da literatura

(MAFEZOLI, 2001) estão representados na TABELA 5.13.

FIGURA 5.42- Espectro de RMN de

H (200 MHz, CDCl

) da N-metil 4-metoxi-2

quinolona.

Acquisition Time (sec)

18.4812

Comment

A13364643

Date

15 Mar 1972 03:51:49

Date Stamp

15 Mar 1972 03:51:49

File Name

Frequency (MHz)

200.13

Nucleus

Number of Transients

Origin

tatiane

Original Points Count

65536

Owner

tatiane

Points Count

65536

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

3546.10

Temperature (degree C)

27.000

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5

ppm

3.33 3.201.871.091.01 1.00

Chloroform-d

1.9202

3.6957

3.9693

6.1220

7.2465

7.2508

7.2549

7.2700

7.2908

7.3425

7.3833

7.5698

7.5977

7.6053

7.6126

7.6404

7.9686

7.9759

8.0086

8.0157

8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1

1.871.101.091.01

Chloroform-d

8.0157

8.0086

7.9759

7.9686

7.6482

7.6404

7.6126

7.6053

7.5977

7.5698

7.5620

7.3833

7.3425

7.2908

7.2860

7.2700

7.2549

7.2508

7.2465

7.2154

7.2102

OCH

N-metil-4-metoxi-

2-quinolona

Determinação Estrutural

106

FIGURA 5.43- Espectro de RMN de

H (50 MHz, CDCl

) da N-metil 4-metoxi-2

quinolona.

TABELA 5.13- Dados de RMN de

H da N-metil 4-metoxi-2 quinolona.

H/C δ

(a)

(b)

(lit.) δ

(c)

(d)

(lit)

2 163,8 163,8

6,12 s 6,05 s

96,5 96,5

4 162,7 162,7

4a 116,5 116,5

7,98(dd, 8,0 e 1,2 Hz) 7,97 (dd, 8,0 e 1,5 Hz)

123,3 123,4

7,25 (ddd, 8,0; 7,1 e 1,2

Hz)

7,22 (ddd, 8,0; 7,1 e 1,0

Hz)

121,6 121,7

7,60 (ddd, 8,2; 7,1 e 1,2

Hz)

7,57 (ddd, 8,6; 7,1 e 1,5

Hz)

131,2 131,2

7,37( dl, 8,2 Hz) 7,33 ( dl, 8,6 Hz)

114,0 114,1

8a 139,8 139,8

NCH

3,97 s 3,95 s

29,0 29,1

OCH

3,70 s 3,68 s

55,7 55,8

(a) CDCl

, 200MHz; (b) CDCl

, 400MHz; (c) CDCl

, 50MHz; (d) CDCl

, 100MHz

Determinação Estrutural

107

5.2.2- Determinação Estrutural da Substância 14

A substância

14 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico do

caule de

Rauia sp.

O espectro de RMN

H (400 MHz, CDCl

+ gotas de CD

OD) da substância 14

(FIGURA 5.44) apresenta dois dubletos em δ 5,60 e δ 4,41 (J=2,8 Hz) que sugerem

a presença de um anel furano reduzido e com substituintes nas posições 2´e 3´. A

presença de um singleto em

δ 4,48 (3H) sugere a presença de uma metoxila. O

espectro mostra também um dubleto largo em

δ 8,06 (1H, J= 8,0 Hz), um dubleto

largo em

δ 7,62 (1H, J=8,0 Hz), um duplo duplo dubleto em δ 7,57 (1H, J= 8,0; 6,7 e

1,3 Hz) e um duplo duplo dubleto em

δ 7,30 (1H, J= 8,0; 6,7 e 1,3 Hz) sugerindo a

presença de um anel aromático

orto dissubstituído.

Observam-se ainda dois singletos em

δ 1,31 e δ 1,30 que integram para três

hidrogênios cada e sugerem a presença de duas metilas

O espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

+ gotas de CD

OD) (FIGURA 5.45)

mostra sinais referentes a 15 carbonos.

FIGURA 5.44- Espectro de RMN de

H (400 MHz, CDCl

+ gotas de MeOD) da

substância

14.

Determinação Estrutural

108

FIGURA 5.45- Espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

+ gotas de MeOD) da

substância

14.

A análise do mapa de contorno do HSQC (FIGURA 5.46) mostra as

correlações dos sinais dos hidrogênios com os sinais dos carbonos diretamente

ligados a eles, porém as correlações dos hidrogênios das metilas com os carbonos

correspondentes não foram conclusivas.

2 Apr 2004

Acquisition Time (sec)

2.4248

Comment

A03-HPLC1C

Date

21 Jan 1971 16:57:21

Date Stamp

21 Jan 1971 16:57:21

File Name

C:\USUARIOS\TATIANE\RMN 2004\A03-HPLC1C.DX

Frequency (MHz)

50.33

Nucleus

13C

Number of Transients

36648

Origin

tatiane

Original Points Count

32768

Owner

tatiane

Points Count

32768

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

13513.51

Temperature (degree C)

27.000

170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30

ppm

168.350

161.909

146.201

130.894

124.961

123.617

123.011

119.602

104.107

95.527

77.639

77.197

77.000

76.361

70.740

70.051

58.366

50.246

49.820

49.393

48.967

48.541

48.115

47.689

24.671

24.450

Determinação Estrutural

109

FIGURA 5.46- Mapa de contorno de HSQC (100 MHz, CDCl

+ gotas de MeOD) da

substância

14.

A análise do mapa de contorno de HMBC (FIGURA 5.47) mostra as

correlações entre os hidrogênios e os carbonos a três ligações e com estas

informações foi possível atribuir os deslocamentos químicos dos carbonos do anel

furano reduzido.

5,60

95,5

70,7

130,9

8,06

7,57

123,6

7,61

124,9

7,30

123,0

4,48

58,3

4,41

24,6 e 24,4

1,30 e 1,31

Determinação Estrutural

110

FIGURA 5.47- Mapa de contorno de HMBC (100 MHz, CDCl

+ gotas de MeOD) da

substância

14.

Através da análise da ampliação da região aromática no mapa de contorno de

HMBC (FIGURA 5.48) foram atribuídos os valores do deslocamento químico para os

carbonos do anel aromático.

104,1

168,3

5,60

4,41

168,3

70,7

1,31

1,30

70,0

95,5

(CH

)

161,9

OCH

4,48

Determinação Estrutural

111

FIGURA 5.48- Extensão do mapa de contorno de HMBC (100 MHz, CDCl

+ gotas

de MeOD) da substância

14.

A análise dos dados indica que a substância

14 é o alcalóide conhecido como

mirtopsina, isolado anteriormente de

Myrtopsis macrocarpa (HIFNAWY et al., 1977)

e de

Dutaillyea baudouinii (MUYARD et al., 1992). Os dados espectroscópicos da

mirtopsina não foram encontrados na literatura. Os dados RMN de

H e da

substância

7 estão representados na TABELA 5.17.

OCH

mirtopsina

7,61

123,0

123,6

7,57

8,06

130,0

146,2

119,6

124,9

7,30

Determinação Estrutural

112

TABELA 5.14- Dados de RMN de

H e

C da mirtopsina.

H/C δ

(a)

(b)

2 168,3

3 104,1

4 161,9

4a 119,6

5 8,06 (dl, 8,0Hz) 123,0

6 7,30 (ddd, 8,0; 6,7;1,3Hz) 123,3

7 7,57 (ddd, 8,0; 6,7;1,3Hz) 130,0

8 7,62 (dl, 8,0Hz) 124,9

8a 146,2

2’ 4,41(d, 2,8Hz) 95,5

3’ 5,60 (d, 2,8Hz) 70,7

4’ 70,0

1,31 (s)

1,30 (

24,6

24,4

OCH

4,48 (s) 58,3

(a) CDCl

+ gotas de MeOD, 400MHz; (b) CDCl

+ gotas de MeOD, 50MHz

5.2.3- Determinação Estrutural da Substância 15

A substância

15 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico do

caule de

Rauia sp.

O espectro de RMN H

(200 MHz, CDCl

) da substância 15 (FIGURA 5.49)

apresenta dois dubletos em

δ 7,59 e δ 7,05 (J=2,8 Hz) que sugerem a presença de

um anel furano, a presença de um singleto em

δ 4,47 (3H) é característico de uma

metoxila na posição 4 de alcalóides furoquinolínicos . O espectro mostra também um

duplo dubleto em

δ 8,29 (1H, J= 8,5 e 1,2 Hz), um dubleto largo em δ 8,01 (1H, J=8,5

Hz), um duplo duplo dubleto em

δ 7,69 (1H, J= 8,5; 6,8 e 1,2 Hz) e um duplo duplo

dubleto em

δ 7,69 (1H, J= 8,5; 6,8 e 1,2 Hz) sugerindo a presença de um anel

aromático

orto dissubstituído.

A análise dos dados e a comparação com dados da literatura (PUSSET

et al.,

1991) indicam que a substância

15 é o alcalóide furoquinolínico conhecido como

dictamina que é amplamente distribuído em plantas da família Rutaceae. Os dados

Determinação Estrutural

113

RMN de

H e da substância 15 assim como os dados da literatura (PUSSET et al.,

1991) estão representados na TABELA 5.15.

FIGURA 5.49- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da dictamina.

TABELA 5.15- Dados de RMN de

H da dictamina.

H δ

(a)

(lit.)

8,29 (dd, 8,5 e 1,2 Hz) 8,27 (dd, 8,4 e 1,7 Hz)

7,45 (ddd, 8,5; 6,8 e 1,2 Hz) 7,45 (ddd, 8,4; 8,4 e 1,7 Hz)

7,69 (

ddd, 8,5; 6,8 e 1,2 Hz) 7,68 (ddd, 8,4; 8,4 e 1,4 Hz)

8,01(

dl, 2,8 Hz) 8,01(dd, 8,4 e 1,4 Hz)

2’

7,64 (d, 2,8 Hz) 7,69 (d, 2,8 Hz)

3’

7,10( d, 2,8 Hz) 7,08( d, 2,8 Hz)

4-OCH

4,47 s 4,45 s

(a) CDCl

, 200MHz

OCH

dictamina

Acquisition Time (sec)

18.4812

Comment

A34N232

Date

12 Aug 1971 11:18:39

Date Stamp

12 Aug 1971 11:18:39

File Name

Frequency (MHz)

200.13

Nucleus

Number of Transients

Origin

tatiane

Original Points Count

65536

Owner

tatiane

Points Count

65536

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

3546.10

Temperature (degree C)

27.000

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5

ppm

3.131.401.041.000.98 0.92

TMS

8.3090

8.2641

8.0359

7.9932

7.7344

7.7004

7.6925

7.6847

7.6533

7.6390

7.4973

7.4906

7.4635

7.4549

7.2624

7.1104

7.0964

4.4722

1.5979

0.0000

8.4 8.3 8.2 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0

1.401.041.041.000.98 0.92

8.3144

8.3090

8.2714

8.2641

8.0359

7.9932

7.7344

7.7269

7.7004

7.6925

7.6847

7.6533

7.6390

7.4973

7.4906

7.4635

7.4549

7.4489

7.4206

7.4146

7.2624

7.1104

7.0964

Determinação Estrutural

114

5.2.4-Determinação Estrutural da Substância 16

A substância

16 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico do

caule de

Rauia sp.

O espectro de RMN H

(200 MHz, CDCl

) da substância 16 (FIGURA 5.50)

apresenta dois dubletos em

δ 7,65 e δ 7,09 (J=2,8 Hz) que sugerem a presença de

um anel furano, a presença de um singleto em

δ 4,46 (3H) é característico de uma

metoxila na posição 4 de alcalóides furoquinolínicos .

O espectro mostra também um duplo dubleto em

δ 7,86 (1H, J= 8,5 e 1,2 Hz),

um tripleto em

δ 7,37 (1H, J=8,5 Hz) e um duplo dubleto em δ 7,07 (1H, J= 8,5 e 1,2

Hz) sugerindo a presença de um anel aromático trisubstituído. Observa-se ainda um

singleto em

δ 4,09 (3H) sugerindo a presença de uma metoxila.

A análise dos dados e a comparação com dados da literatura (CUCA

et al.,

1998) indicam que a substância

16 é o alcalóide furoquinolínico conhecido como γ-

fagarina que é amplamente distribuído em plantas da família Rutaceae. Os dados

RMN de

H e da substância 16 assim como os dados da literatura (CUCA et al.,

1998) estão representados na TABELA 5.16.

OCH

γ-fagarina

Determinação Estrutural

115

FIGURA 5.50- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da γ-fagarina.

TABELA 5.16- Dados de RMN de

H da γ-fagarina.

H δ

(a)

(b)

(lit.)

7,86 (dd, 8,5 e 1,2 Hz) 7,85 (dl, 8,5 Hz)

7,37 (t, 8,5) 7,34 (ddd, 8,5; 7,8 e 0,9 Hz)

7,07 (

dd, 8,5 e 1,2 Hz) 7,07 (dl, 7,8 Hz)

2’

7,65 (d, 2,8 Hz) 7,65 (d, 2,8 Hz)

3’

7,09( d, 2,8 Hz) 7,09( d, 2,8 Hz)

4-OCH

4,46 s 4,44 s

OCH

4,09 s 4,07 s

(a) CDCl

, 200MHz; (b) CDCl

, 300MHz

5.2.5- Determinação Estrutural da Substância 17

A substância

17 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico do

caule de

Rauia sp.

O espectro de RMN H

(200 MHz, CDCl

) da substância 17 (FIGURA 5.51)

apresenta quatro dubletos na região aromática. Dois deles em δ 7,59 e δ 7,05 (

J=2,8

Hz) que sugere a presença de um anel furano. Os dubletos em δ 8,03 e δ 7,24

(

J=9,4 Hz) sugerem a presença de dois hidrogênios aromáticos em relação orto. O

singleto em δ 4,44 (3H) é característico de uma metoxila na posição 4 de alcalóides

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0

ppm

3.063.052.061.161.00 0.98

Chloroform-d

4.0907

4.4603

7.0467

7.0521

7.0853

7.0991

7.3268

7.3692

7.4079

7.6515

7.6655

7.8343

7.8402

7.8770

7.8829

7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0

ppm

2.061.161.00 0.98

Chloroform-d

7.0467

7.0521

7.0853

7.0991

7.3268

7.3692

7.4079

7.6515

7.6655

7.8343

7.8402

7.8770

7.8829

Determinação Estrutural

116

furoquinolínicos. O espectro mostra também dois singletos em δ 4,12 e δ 4,03

integrando para três hidrogênios cada indicando a presença de duas metoxilas.

A análise dos dados e a comparação com dados da literatura (ROBERTSON,

1963) indicam que a substância

17 é o alcalóide furoquinolínico conhecido como

esquimianina, que é amplamente distribuído em plantas da família Rutaceae. Os

dados RMN de

H e da substância 14 assim como os dados da literatura (AHOND et

al., 1978) estão representados na TABELA 5.17.

FIGURA 5.51- Espectro de RMN de

H (200 MHz, CDCl

) da esquimianina

OCH

esquimianina

8.2 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9

1.871.021.02 0.98

8.0486

8.0016

7.5957

7.5817

7.2643

7.2162

7.0556

7.0415

4.5 4.0

3.413.403.30

4.4397

4.1156

4.0350

Acquisition Time (sec)

18.4812

Comment

A12esqui

Date

06 Mar 1972 04:12:41

Date Stamp

06 Mar 1972 04:12:41

File Name

C:\DOCUMENTS AND SETTINGS\USER\MEUS DOCUMENTOS\TATINHA\ESPECTROS REL3\ESQUIMIANINA\A12ESQUI.DX

Frequency (MHz)

200.13

Nucleus

Number of Transients

Origin

tatiane

Original Points Count

65536

Owner

tatiane

Points Count

65536

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

3546.10

Temperature (degree C)

27.000

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

ppm

3.413.301.871.021.02 0.98

TMS

0.0000

1.2548

1.6682

2.0078

4.0350

4.1156

4.4397

7.0415

7.0556

7.2162

7.2643

7.5817

7.5957

8.0016

8.0486

Determinação Estrutural

117

TABELA 5.17- Dados de RMN de

H da esquimianina.

H δ

(a)

(b)

(lit.)

8,03 (d, 9,4 Hz) 8,03 (d, 9,0 Hz)

7,24 (d, 9,4 Hz) 7,23 (d, 9,0 Hz)

2’

7,59 (d, 2,8 Hz) 7,58 (d, 2,5 Hz)

3’

7,05( d, 2,8 Hz) 7,05( d, 2,5 Hz)

4-OCH

4,44 s 4,46 s

7-OCH

4,04

s 4,07 s

8-OCH

4,12

s 4,16 s

(a) CDCl

, 200MHz; (b) CDCl

, 60MHz

5.2.6- Determinação Estrutural da Substância 18

A substância

18 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico do

caule de

Rauia sp.

O espectro de RMN H

(200 MHz, CDCl

) da substância 18 (FIGURA 5.52)

apresenta quatro dubletos na região aromática. Dois deles em

δ 7,72 e δ 7,03 (J=2,6

Hz) sugerem a presença de um anel furano. Os dubletos em

δ 7,26 e δ 6,16 (J=11,8

Hz) sugerem a presença de uma dupla ligação conjugada a uma carbonila, e a

constante de acoplamento 11,8 Hz sugere a estereoquímica

Z para a dupla ligação.

Na região alifática observam-se três singletos integrando para três hidrogênios em

4,24;

δ 3,94 e δ 3,57 que sugerem a presença de três metoxilas.

A análise dos dados e a comparação com dados da literatura (ARRUDA

et al.,

1992) indicam que a substância

18 é o alcalóide secofuroquinolínico, conhecido

como

Z-rhoifolinato de dimetila, isolado anteriormente de Zanthoxylum rhoifolium

(ARRUDA

et al., 1992) e Metrodorea nigra (MÜLLER et al., 1995). Os dados RMN

H da substância 18 assim como os dados da literatura (ARRUDA et al., 1992)

estão representados na TABELA 5.18.

OCH

Z-rhoifolinato de dimetila

Determinação Estrutural

118

FIGURA 5.52- Espectro de RMN de

H Z-rhoifolinato de dimetila

TABELA 5.18- Dados de RMN de

H do Z-rhoifolinato de dimetila

(a) CDCl

, 200MHz

H δ

(a)

(lit.)

5 7,26 (1H, 11,8 Hz) 7,26 (1H, 11,8 Hz)

6 6,16 (1H, 11,8 Hz) 6,16 (1H, 11,8 Hz)

2’ 7,72 (1H, 2,6 Hz) 7,72 (1H, 2,6 Hz)

3’ 7,03 (1H, 2,6 Hz) 7,03 (1H, 2,6 Hz)

4-OCH

4,24 4,24

7-CO

3,57 3,57

8-CO

3,94 3,94

Acquisition Time (sec)

18.4812

Comment

A213D6EH1

Date

14 May 1971 13:32:43

Date Stamp

14 May 1971 13:32:43

File Name

C:\DOCUMENTS AND SETTINGS\USER\MEUS DOCUMENTOS\TATINHA\ESPECTROS REL3\RHOIFOLINATO\A213D6EH1.DX

Frequency (MHz)

200.13

Nucleus

Number of Transients

Origin

tatiane

Original Points Count

65536

Owner

tatiane

Points Count

65536

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

3546.10

Temperature (degree C)

27.000

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

ppm

7.23 3.18 3.15 3.061.060.990.96

TMS

0.0000

1.6528

2.0978

2.1740

3.5745

3.9452

4.2386

6.1298

6.1890

7.0266

7.0399

7.2324

7.2645

7.2916

7.7209

7.7339

7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7

7.23 0.990.96

7.7339

7.7209

7.2916

7.2645

7.2324

7.0399

7.0266

Determinação Estrutural

119

5.2.7- Determinação Estrutural da Substância 19

A substância 19 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico do

caule de

Rauia sp.

O espectro de RMN

H (200MHz, CDCl

) da substância 19 (FIGURA 5.53)

apresenta dois dubletos em

δ 6,74 e δ 5,53 (H, J=9,9Hz) e um singleto em δ 1,50

(6H) que sugerem a presença de um anel 2,2 dimetilcromeno. A região aromática do

espectro mostra ainda um duplo dubleto em

δ 7,52 (1H, J= 7,6 e 1,7 Hz), um tripleto

δ 7,05 (1H, J= 7,6 Hz) e um duplo dubleto em δ 7,13 (1H, J= 7,6 e 1,7Hz),

sugerindo a presença da um anel aromático trissubstituído. Um singleto em

δ 4,0

(3H) sugere a presença de uma metila ligada a heteroátomo (N ou O).

FIGURA 5.53- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da 8-hidroxi-N-metil

flindersina.

O espectro de massas de alta resolução da substância

19 (FIGURA 5.54)

mostra o pico do íon molecular com m/z 257,10107 (30,01%), que está de acordo

com a formula molecular C

o valor calculado é m/z 259,12084. O pico base

tem

m/z 242 (100%) e é gerado através da perda de uma metila.

4.5.4.2.2.1

Acquisition Time (sec)

18.4812

Comment

4.5.4.2.2.1

Date

15 Mar 1999 19:38:57

Date Stamp

15 Mar 1999 19:38:57

File Name

C:\200 MHZ\TATI\ESPECTROS\4.5.4.2.2.1\1\4.5.4.2.2.1.DX

Frequency (MHz)

200.13

Nucleus

Number of Transients

Origin

tatial

Original Points Count

65536

Owner

tatial

Points Count

65536

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

3546.10

Temperature (degree C)

27.000

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

ppm

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

5.813.132.03 1.031.01 0.93

7.5514

7.5428

7.5133

7.5052

7.2632

7.1467

7.1161

7.0899

7.0515

7.0131

6.7846

6.7352

5.5574

5.5080

4.0528

1.5019

0.0000

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5

Determinação Estrutural

120

FIGURA 5.54- Espectro de massas de alta resolução da 8-hidroxi-N-metil flindersina.

O espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) (FIGURA 5.55) mostra um sinal em

δ 162,6 referente a um carbono carbonílico, além de um sinal de carbono carbinólico

δ 78,8 e um sinal em δ 28,2 referente às metilas geminais do cromeno. A

ausência de um sinal próximo a

δ 56,0 descarta a possibilidade da presença de uma

metoxila na estrutura e o sinal em

δ 35,3 confirma a existência de uma metila ligada

a nitrogênio.

FIGURA 5.55- Espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) da 8-hidroxi-N-metil

flindersina.

4.5.4.1.5.A

Acquisition Time (sec)

2.4248

Comment

4.5.4.1.5.A

Date

24 May 1999 14:41:14

Date Stamp

24 May 1999 14:41:14

File Name

C:\200 MHZ\TATI\ESPECTROS\4.5.4.1.5.A\2\45415A-2.DX

Frequency (MHz)

50.33

Nucleus

13C

Number of Transients

32768

Origin

tatial

Original Points Count

32768

Owner

tatial

Points Count

32768

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

13513.51

Temperature (degree C)

27.000

160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30

ppm

-0.01

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09

0.10

0.11

0.12

0.13

0.14

0.15

162.3108

155.3948

144.9799

129.4107

126.6165

122.5275

118.8565

118.3730

117.8895

115.1363

105.8193

78.7618

77.6392

77.0000

76.3690

35.0206

28.2112

Determinação Estrutural

121

A análise dos dados e as comparações com os dados da literatura da 8

metoxiflindersina (HOHLEMWERGER, 2002) indicam que a substância 5 é o

alcalóide piranoquinolônico 8-hidroxi-

N-metilflindersina. Na literatura há relato da

síntese desta substância, porém este alcalóide não foi isolado de fontes naturais. Os

dados de RMN

H e de RMN

C da substância 19 e da 8-metoxiflindersina (19A)

estão representas na TABELA 5.19.

TABELA 5.19- Dados de RMN

H e de

C da substância 19 e da 8-metoxiflindersina

(

19A)

(a) CDCl

, 200MHz; (b) CDCl

, 300MHz; (c) CDCl

, 50MHz

H/C δ

(a)

(19) δ

(b)

(19A)

(c)

(19)

(c)

(19A)

2 162,3 160,4

3 105,8 106,7

4 155,4 157,4

4a 118,8 115,9

5 7,52 (dd, 7,8 e 1,7Hz) 7,47 (dd, 8,1 e 1,0Hz) 118,4 114,5

6 7,05 (t, 7,8 Hz) 7,11 (t, 8,1) 122,5 121,6

7 7,05 (dd, 7,8 e 1,7Hz) 6,95 (dd, 8,1 e 1,0Hz) 115,7 110,2

8 145,0 145,5

8a 129,4 128,1

2’ 78,7 79,0

3’ 5,54 (d, 9,9 Hz) 5,53 (d, 10,0 Hz) 126,6 126,2

4’ 6,75 (d, 9,9 Hz) 6,70 (d, 10,0 Hz) 117,9 117,1

2’(CH

)

1,50 (s) 1,52 (s) 28,2 28,2

O-CH

- 3,96 (s) - 56,0

N-CH

4,05 (s) - 35,3

N-H - 8,88 (s)

OCH

substância 19

8-metoxiflindersina (19A)

Determinação Estrutural

122

5.2.8- Determinação Estrutural da Substância 20

A substância 20 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico do

caule de

Rauia sp.

O espectro de RMN

H (200MHz, CDCl

) da substância 20 (FIGURA 5.56)

mostra várias semelhanças com o espectro de RMN

H (200MHz, CDCl

) da

substância

19 (FIGURA 5.53).

Assim como no espectro de RMN

H da substância 19 foram observados dois

dubletos em

δ 6,75 e δ 5,54 (H, J=9,9Hz) e um singleto em δ 1,50 (6H) que sugerem

a presença de um anel 2,2 dimetilcromeno e na região aromática dois duplos

dubletos em

δ 7,60 (1H, J=7,8 e 1,7Hz) e δ 7,05 (1H, J=7,8 e 1,7Hz) e um tripleto em

δ 7,15 (1H, J=7,8Hz) sugerindo a presença de um anel tri substituído. Porém o

espectro de RMN

H da substância 20 apresenta também dois singletos em δ 3,92

(3H) e

δ 3,89 (3H) que podem ser atribuídos a metilas ligadas a heteroátomos

enquanto que para a substância

19 apenas um singleto é observado em δ 4,0 (3H).

FIGURA 5.56- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da zantobumgeanina.

Acquisition Time (sec)

18.4812

Comment

A483E810A

Date

03 Nov 1998 11:41:50

Date Stamp

03 Nov 1998 11:41:50

File Name

Frequency (MHz)

200.13

Nucleus

Number of Transients

Origin

tatial

Original Points Count

65536

Owner

tatial

Points Count

65536

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

3546.10

Temperature (degree C)

27.000

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

ppm

7.273.801.571.25 1.171.00

TMS

7.6263

7.6176

7.5874

7.5790

7.2635

7.1853

7.1459

7.1067

7.0734

7.0650

7.0337

6.7722

6.7227

5.5577

5.5082

3.9274

3.8906

1.6579

1.5022

1.2548

0.0719

0.0000

1.571.25 1.22

7.6263

7.6176

7.5874

7.5790

7.2635

7.1853

7.1459

7.1067

7.0734

7.0650

7.0337

3.803.48

3.9274

3.8906

Determinação Estrutural

123

A análise dos dados da substância 20 e a comparação com os dados

substância

19 e da literatura indicam (CAMPBELL et al., 1990) que a substância 20

é o alcalóide conhecido como zantobungeanina, isolado anteriormente de plantas do

gênero

Agathosma (Rutaceae) (CAMPBELL et al., 1990), de Zanthoxylum

bungeanum e de Zanthoxylum simulans (WATERMAN & GRUNDON, 1983). Os

dados de RMN

H da substância 20 assim como os dados da literatura (CAMPBELL

et al., 1990) estão apresentados na TABELA 5.20.

TABELA 5.20 - Dados de RMN de

H da zantobungeanina.

(a) CDCl

, 200MHz

(a)

(lit.)

5 7,60 (dd, 7,8 e 1,7Hz) 7,59 (dd, 9,0 e 2,8Hz)

6 7,15 (t, 7,8 Hz) 7,12 (dd, 9,0 e 2,8Hz)

7 7,05 (dd, 7,8 e 1,7 Hz) 6,97 (dd, 9,0 e 2,8Hz)

3’ 5,54 (d, 9,9 Hz) 5,55 (d, 11,0 Hz)

4’ 6,75 (d, 9,9 Hz) 6,76 (d, 11,0 Hz)

1’(CH

)

1,50 (s) 1,52 (s)

O-CH

3,93 (s) 3,90 (s)

N-CH

3,89 (s) 3,68 (s)

OCH

zantobungeanina

Determinação Estrutural

124

5.2.9- Determinação Estrutural da Substância 21

A substância

21 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico do

caule de

Rauia sp.

O espectro de RMN

H (400 MHz, CDCl

+ gotas MeOD) da substância 21

(FIGURA 5.57) apresenta dois dubletos, em

δ 7,61 e δ 7,09 (1H, J= 7,9 Hz) e um

tripleto em

δ 7,20 (1H, J= 7,9Hz) na região aromática sugerindo a presença de um

anel aromático 1, 2, 3-substituído. Observa-se a presença de dois dubletos em

4,74 e

δ 3,82 (1H, J= 7,5 Hz), além de dois singletos em δ 3,92 e δ 3,90 (3H) que

indicam dois grupos metilas ligados a heteroátomos (N ou O). Dois singletos em

1,61 e

δ 1,30 (3H) podem ser atribuídos a dois grupos metilas. A análise do espectro

de RMN

H sugere que a substância 21 é um alcalóide piranoquinolônico com anel

pirano reduzido.

FIGURA 5.57- Espectro de RMN

H (400 MHz, CDCl

+ gotas MeOD) da substância

21.

O espectro de RMN

C (100 MHz, CDCl

+ gotas MeOD) (FIGURA 5.58)

mostra os sinais referentes a 16 carbonos, sendo os sinais em

δ 34,8 e δ 56,5

característicos de metila ligada a N e a O, respectivamente e o sinal em

δ164,6

Determinação Estrutural

125

característico da carbonila na posição 2. Observam-se ainda os sinais em δ 24,8 e δ

19,2 que podem ser atribuídos a duas metilas.

5.58- Espectro de RMN

H (100 MHz, CDCl

+ gotas MeOD) da substância 21.

A análise do mapa de contorno de HSQC (100 MHz, CDCl

+ gotas MeOD)

(FIGURA 5.59) mostra a correlações dos hidrogênios com os carbonos diretamente

ligados o que possibilitou atribuir corretamente os valores das metila ligada ao O e a

metila ligada ao N.

Determinação Estrutural

126

FIGURA 5.59- Mapa de contorno de HSQC (100 MHz, CDCl

+ gotas MeOD) da

substância

Através da análise da expansão do mapa de contorno de HMBC (FIGURA

5.60) que mostra as correlações dos hidrogênios com carbonos a duas e três

ligações, foi possível elucidar a estrutura da molécula e determinar as posições

exatas dos substituintes.

7,20

7,61

122,7

116,1

7,09

114,2

4,74

67,8

3,82

74,9

1,2919,2

26,0 1,61

56,5

3,90

OCH

3,92

34,8

NCH

Determinação Estrutural

127

FIGURA 5.60- Expansão do mapa de contorno de HMBC (100 MHz, CDCl

) da

substância

7,20

116,1

7,09

118,1

OCH

130,7

148,7

74,9

4,74

154,8

105,9

3,82

19,2

67,8

80,9

26,0

1,29

26,0

74,9

80,9

114,2

7,61

154,0

164,6

130,7

148,7

80,9

74,9

1,61

19,2

Determinação Estrutural

128

A constante de acoplamento J=7,5Hz entre os hidrogênios nas posições 3’ (δ

3,82) e 4’ (

δ 4,74) sugere a configuração relativa trans para o sistema diol.

A análise dos dados e a comparação com dados de RMN de

H da literatura

indicam que a substância

21 é o alcalóide conhecido como zantodiolina isolada

anteriormente de

Zanthoxylum simulanus (Rutaceae) (CHEN et al., 1997). Os dados

RMN de

H da substância 21 assim como os dados da literatura (CHEN et al., 1997)

estão representados na TABELA 5.21.

TABELA 5.21- Dados de RMN de

H e

C da zantodiolina

H/C δ

(a)

(b)

(lit.) δ

(c)

164,6

105,9

154,8

118,1

7,61 (d, 7,9 Hz) 7,62 (dd, 8,0 e 1,4 Hz)

116,1

7,20 (t, 7,9 Hz) 7,19 (t, 8,0 Hz)

122,7

7,09 (d, 7,9 Hz) 7,09 (dd, 8,0 e 1,4 Hz)

114,2

148,0

130,7

2’(CH

)

80,9

3’

3,82 (d, 7,5Hz) 3,83 (d, 7,8Hz)

74,9

4’

4,74 (d, 7,5Hz) 4,73 (d, 7,8Hz)

67,8

2’ 1,61 1,62 26,0

6’ 1,29 1,30 19,2

NCH

3,92 3,93 34,8

OCH

3,90 3,90 56,6

(a) CDCl

+ gotas MeOD, 200MHz; (b) CDCl

, 400MHz; (c) CDCl

+ gotas MeOD, 50MHz

HOCH

zantodiolina

Determinação Estrutural

129

5.2.10- Determinação Estrutural da Substância 22

A substância 22 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico do

caule de

Rauia sp.

O espectro de RMN

H (200MHz, CDCl

) da substância 22 (FIGURA 5.61)

apresenta dois dubletos em

δ 6,72 e 5,49 (H, J=9,9Hz) e um singleto em δ 1,50 (6H)

que sugerem a presença de um anel 2,2-dimetilcromeno. O espectro apresenta

também dois singletos em

δ 3,90 (3H) e 3,74 (3H) que podem ser atribuídos a

metilas ligadas a heteroátomos (N ou O).

A região aromática do espectro apresenta dois dubletos em

δ 7,69 e 6,91 (1H,

J= 8,7Hz) que sugerem a presença de dois hidrogênios aromáticos em relação orto.

FIGURA 5.61- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 22.

O espectro de massas de alta resolução da substância

22 (FIGURA 5.61)

mostra o pico do íon molecular com m/z 287,11464 (31,11%), que está de acordo

com a formula molecular C

. O pico base tem m/z 272 (100%) e é gerado

através da perda de uma metila.

3.6.4.6.2

Acquisition Time (sec)

18.4812

Comment

3.6.4.6.2

Date

12 May 1999 03:08:19

Date Stamp

12 May 1999 03:08:19

File Name

C:\200 MHZ\TATI\ESPECTROS\3.6.4.6.2\1\3.6.4.6.2.DX

Frequency (MHz)

200.13

Nucleus

Number of Transients

Origin

tatial

Original Points Count

65536

Owner

tatial

Points Count

65536

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

3546.10

Temperature (degree C)

27.000

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

ppm

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

6.162.722.651.221.091.04 1.02

7.7058

7.6620

7.2697

6.9450

6.9012

6.7435

6.6941

5.5126

5.4631

3.9087

3.7381

1.4946

0.0000

Determinação Estrutural

130

FIGURA 5.62- Espectro de massas de alta resolução da substância

22.

O espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) (FIGURA 5.63) mostra um sinal em

δ162,3 referente a um carbono carbonílico, além de um sinal de carbono carbinólico

δ 78,7 e um sinal em δ 28,2 referente as metilas geminais do cromeno. Os sinais

δ 62,2 e em δ 35,3 indicam a presença de uma metoxila de uma metila ligada a

nitrogênio respectivamente. O deslocamento químico do carbono da metoxila

(

δ 62,2) indica a presença de grupos substituintes nas posições orto.

FIGURA 5.63- Espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) da substância 22.

Determinação Estrutural

131

A análise do mapa de contorno de HSQC (100 MHz, CDCl

) (FIGURA 5.64)

mostra as correlações dos hidrogênios com os carbonos diretamente ligados desse

modo foi possível atribuir corretamente os valores das metila ligada ao O e a metila

ligada ao N.

FIGURA 5.64- Mapa de contorno de HSQC (100 MHz, CDCl

) da substância 22

3,73

OC H

62,2

6,91

3,90

6,71

5,49

33,2

117,8

125,5

111,1

120,1

7,69

28,2

1,50

28,2

Determinação Estrutural

132

O mapa de contorno de HMBC (FIGURA 5.65) mostra as correlações dos

hidrogênios com carbonos a duas e três ligações, foi possível observar as

correlações entre das metilas com os carbonos a duas e três ligações.

FIGURA 5.65- Mapa de contorno de HMBC (100 MHz, CDCl

) da substância 22.

3,90

134,4

117,8

125,5

162,6

28,2

1,50

OCH

CCH

3,73

134,1

78,8

Determinação Estrutural

133

A análise da expansão da região aromática do mapa de contorno de HMBC

(FIGURA 5.66) foi possível atribuir os deslocamentos químicos dos carbonos do anel

aromático e do anel cromeno e determinar as posições exatas dos substituintes.

FIGURA 5.66- Expansão do mapa de contorno de HMBC (100 MHz, CDCl

) da

substância

22.

5,49

103,5

152,5

134,1

OCH

7,69

162,6

78,8

6,91

155,6

6,71

134,4

162,6

OCH

111,5

78,8

Determinação Estrutural

134

A análise dos dados indica que a substância 22 é o alcalóide

piranoquinolônico 7-hidroxi-8-metoxi-

N-metilflindersina inédito na literatura. Os

dados RMN de

H da substância 22 estão representados na TABELA 5.22.

5.22- Dados de RMN

H e de RMN

C da 7-hidroxi-8-metoxi-N-metilflindersina

(a) CDCl

, 200MHz; (b) CDCl

, 50MHz

H/C δ

(a)

(19) δ

(c)

2 162,6

3 103,5

4 155,6

4a 111,5

5 7,69 (d, 8,8 Hz) 111,1

6 6,91 (d, 8,8 Hz) 120,1

7 152,5

8 134,4

8a 134,1

2’ 78,8

3’ 5,49 (d, 9,9 Hz) 125,5

4’ 6,71 (d, 9,9 Hz) 117,8

2’(CH

)

1,50 (s) 28,2

O-CH

3,73 (s) 62,2

N-CH

3,90 (s) 33,2

OCH

7-hidroxi-8-metoxi-N-metilflindersin

Determinação Estrutural

135

5.2.11- Determinação Estrutural da Substância 23

A substância

23 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico do

caule de

Rauia sp.

O espectro de RMN

H (200MHz, CDCl

) da substância 23 (FIGURA 5.67)

mostra várias semelhanças com o espectro de RMN

H (200MHz, CDCl

) da

substância

22 (FIGURA 5.66).

Assim como no espectro de RMN

H da substância 22 foram observados dois

dubletos em

δ 6,73 e δ 5,49 (H, J=9,9Hz) e um singleto em δ 1,49 (6H) que sugerem

a presença de um anel 2,2 dimetilcromeno e na região aromática dois dubletos em

7,71 (1H,

J=8,9Hz) e δ 6,88 (1H, J=8,9Hz) que sugerem a presença de dois

hidrogênios aromáticos em relação

orto. Porém o espectro de RMN

H da substância

23 apresenta também três singletos em δ 3,97 (3H), 3,92 (3H) e 3,78 (3H) que

podem ser atribuídos a metilas ligadas a heteroátomos enquanto que para a

substância

22 apenas dois singletos em δ 3,90 (3H) e 3,73 (3H) são observados.

FIGURA 5.67- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 23.

Acquisition Time (sec)

18.4812

Comment

A483E810B

Date

03 Nov 1998 11:52:20

Date Stamp

03 Nov 1998 11:52:20

File Name

Frequency (MHz)

200.13

Nucleus

Number of Transients

Origin

tatial

Original Points Count

65536

Owner

tatial

Points Count

65536

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

3546.10

Temperature (degree C)

27.000

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

ppm

7.277.16 3.411.041.03 0.880.84

7.7366

7.6920

7.2643

6.9009

6.8563

6.7473

6.6981

5.5144

5.4647

3.9687

3.9255

3.7781

1.6463

1.4954

1.2548

0.8803

0.0716

0.0000

Determinação Estrutural

136

A análise dos dados da substância 23 e a comparação com os dados

substância

22 e da literatura indicam (CAMPBELL et al., 1990) que a substância 23

é o alcalóide conhecido como veprissina isolado anteriormente

Vepris louisii

(Rutaceae) (AYAFOR et al., 1980) e de Oricia gabonenses (Rutaceae) (KALID &

WATERMAN, 1981). Os dados de RMN

H da substância 23 assim como os dados

da literatura (AYAFOR

et al., 1980) estão apresentados na TABELA 5.23.

TABELA 5.23- Dados de RMN de

H da veprissina

(a) CDCl

, 200MHz; (b) CDCl

, 90MHz

5.2.12- Determinação Estrutural da Substância 24

A substância

24 foi isolada do extrato diclorometano do caule de

Conchocarpus macrophyllus.

O espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 24 (FIGURA 5.68)

mostra um singleto em

δ 14,7 integrando para um hidrogênio, o que sugere a

presença de uma hidroxila quelada. Na região aromática foram observados sinais

H δ

(a)

(lit.)

5 7,71 (d, 8,9Hz) 7,69 (d, 8Hz)

6 6,88 (d, 8,9Hz) 6,85 (d, 8Hz)

2’ 5,49 (d, 9,9Hz) 5,46 (d, 10Hz)

3’ 6,73 (d, 9,9Hz) 6,73 (d, 10Hz)

1’(CH

)

1,49 (s) 1,52 (s)

7-O-CH

3,92 (s) 3,92 (s)

8-O-CH

3,97 (s) 3,95 (s)

N-CH

3,78 (s) 3,76 (s)

OCH

veprissina

Determinação Estrutural

137

referentes a cinco hidrogênios. Um duplo dubleto em 8,42 δ (1H, J= 8,0 e 1,6 Hz),

um duplo duplo dubleto em

δ 7,68 (1H, J= 8,6; 7,0 e 1,6 Hz), um dubleto largo em δ

7,46 (1H,

J= 8,6Hz) e em δ 7,25 um duplo duplo dubleto (1H, J= 8,0; 7,0 e 0.8 Hz)

sugerem um anel aromático

orto dissubstituído. Um singleto em δ 6,29 sugere um

anel aromático pentasubstituído. Os singletos em

δ 3,97, δ 3,87 e δ 3,80, todos

integrando para três hidrogênios, sugerem a presença de três metilas ligadas a

heteroátomos (N ou O). Estes sinais são característicos de esqueleto acridônico

(MAFEZOLI, 2001).

FIGURA 5.68- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) substância 24.

Determinação Estrutural

138

O espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) (FIGURA 5.69) mostra 15 sinais, o

sinal em 180,9

δ pode ser atribuído a uma carbonila. O espectro mostra também dois

sinais referentes a metoxilas em

δ 60,8 e δ 56,0 sendo que os sinais entre δ 59,6 e δ

62.1 são característicos de metoxilas com grupos adjacentes nas posições

orto

(FURUKAWA

et al., 1983). O sinal em δ 34,1 é atribuído a uma metila ligada a

nitrogênio.

FIGURA 5.69- Espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) da substância 24.

A análise dos dados e as comparações com a literatura indicam que a

substância

24 é o alcalóide acridônico conhecido como arborinina isolado

anteriormente de

Glycosmis binocularis (Rutaceae) (BOWEN et al.,1978), Glycosmis

mauritiana (Rutaceae) (RASTOR et al.,1980), Ruta graveolens (Rutaceae)

(BERGENTHAL

et al., 1979) e Almeidea rubra (Rutaceae) (AMBROZIN et al., 2005).

Os dados de RMN

H e

C da substância 24, assim como os dados de RMN

Determinação Estrutural

139

(MAFEZOLI, 2001) RMN

C (BERGENTHAL et al., 1979) da literatura estão

representados na TABELA 5.24.

TABELA 5.24- Dados de RMN

H e

C da arborinina.

H/C δ

(a)

(lit.)

(a)

(b)

(lit.)

(b)

1 156,2 155,7

2 129,9 129,9

3 159,3 159,1

4 6,29 s 6,18 s 86,7 86,7

5 7,46 (dl, 8,6 Hz) 7,45 (dl, 8,7 Hz) 114,5 114,5

7,68 (

ddd, 8,6; 7,0 e

1,6 Hz)

7,68 (ddd, 8,7; 7,0 e 1,7

Hz)

133,9 133,7

7,25 (

ddd, 8,0; 7,0 e

0,8 Hz)

7,24 (ddd, 8,0; 7,0 e 0,8

Hz)

121,4 121,2

8,42 (

dd, 8,0 e 1,6

Hz)

8,34 (

dd, 8,0 e 1,7 Hz) 126,7 126,0

9 180,9 180,4

11 140,6 140,1

12 105,3 105,3

13 120,8 120,3

14 142,0 141,6

2-O-CH

3,87 s 3,91 s 60,8 60,6

3-O-CH

3,97 s 3,99 s 56,0 55,8

N-CH

3,80 s 3,77 s 34,1 33,8

OH 14,72 s 14,75 s

(a) CDCl

, 200MHz; (b) CDCl

, 50MHz

arborinina

OCH

Determinação Estrutural

140

5.2.13- Determinação Estrutural da Substância 25

A substância 25 foi isolada do extrato diclorometano do caule de

Conchocarpus macrophyllus.

O espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 25 (FIGURA 5.70)

apresenta muitas semelhanças com o com o espectro de RMN

H da arborinina

(FIGURA 5.68).

Na região aromática um duplo dubleto em δ 8,51 (1H, J= 8,0 e 1,6 Hz), um

duplo duplo dubleto em

δ 7,76 (1H, J= 8,6; 7,0 e 1,6 Hz), um dubleto largo em δ 7,55

(1H,

J= 8,6Hz) e em δ 7,35 um duplo duplo dubleto (1H, J= 8,0; 7,0 e 0.8 Hz) ,

sugerem um anel aromático

orto dissubstituído. Um singleto em δ 6,33 sugere um

anel aromático pentasubstituído.

Porém, a ausência do singleto em

δ 14,7 e a presença de quatro singletos em

δ 4,05, δ 3,95, δ 3,89 e δ 3,50, todos integrando para três hidrogênios sugerem a

presença de quatro metilas ligadas a heteroátomos (N ou O), ou se

Ja, o hidrogênio

da hidroxila na posição 1 da arborinina foi substituído por uma metila.

FIGURA 5.70- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da metilarborinina

2 Apr 2004

Acquisition Time (sec)

18.4812

Comment

A433D694

Date

23 Oct 1970 14:11:38

Date Stamp

23 Oct 1970 14:11:38

File Name

C:\USUARIOS\TATIANE\RMN\A433D694.DX

Frequency (MHz)

200.13

Nucleus

Number of Transients

Origin

tatiane

Original Points Count

65536

Owner

tatiane

Points Count

65536

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

3546.10

Temperature (degree C)

27.000

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0

ppm

3.02 2.751.70 1.691.00 0.87

8.534

8.526

8.495

8.485

7.568

7.524

7.373

7.335

7.270

6.335

5.309

4.047

3.951

3.888

3.500

1.594

1.262

Determinação Estrutural

141

Portanto os dados sugerem que a substância 25 é o alcalóide acridônico

conhecido como metilarborinina.

A análise dos dados e as comparações com os dados da arborinina sugerem

que a substância

25 é o alcalóide acridônico conhecido como metilarborinina isolado

anteriormente de

Conchocarpus inopinatus (MAFEZOLI, 2001) e Conchocarpus

macrophyllus (Rutaceae) (VELOSO, 1995) Os dados de RMN

H da substância 24,

assim como os dados da literatura (MAFEZOLI, 2001) estão representados na

TABELA 5.25.

TABELA 5.25- Dados de RMN

H e

C da metilarborinina

H/C δ

(a)

(lit.)

(b)

4 6,29 s 6,18 s

5 7,55 (dl, 8,6 Hz) 7,31 (dl, 8,6 Hz)

6 7,76 (ddd, 8,6; 7,0 e 1,6 Hz) 7,56 (ddd, 8,7; 7,0 e 1,7 Hz)

7 7,35 (ddd, 8,0; 7,0 e 0,8 Hz) 7,19 (ddd, 8,0; 7,0 e 0,9 Hz)

8 8,51 (dd, 8,0 e 1,6 Hz) 8,44 (ddd, 8,0 e 1,7 e 0,4 Hz)

1-O-CH

4,05 s 4,03 s

2-O-CH

3,95 s 3,98s

3-O-CH

3,89 s 3,90 s

N-CH

3,50 s 3,70 s

(a) CDCl

, 200MHz; (b) CDCl

, 400MHz

metilarborinina

OCH

Determinação Estrutural

142

5.2.14- A Biogênese dos Alcalóides

Os alcalóides isolados têm sua origem biossintética no ácido antranílico.

Inicialmente ocorre a condensação da acido antranílico com unidades do malonil-

CoA.

A incorporação de duas unidades de malonil-CoA leva a formação do

esqueleto quinolínico normalmente em forma de 2 quinolona. Os esqueletos tipo 2

quinolona podem incorporar unidades de prenila através de adição nucleofílica na

posição 3. A molécula formada pode sofrer ciclização com o oxigênio na posição 2

levando a formação dos alcalóides diiidrofuroquinolínicos e através da perda da

cadeia isopropil leva a formação dos alcalóides furoquinolínicos (WATERMAN,

1975; DEWICK, 2004) (ESQUEMA 5.4).

A ciclização da prenila incorporada na posição 3 com o oxigênio na posição 4

leva a formação dos alcalóides piranoquinolônicos (WATERMAN, 1975) (ESQUEMA

5.4).

A incorporação de três unidades de malonil-CoA ao ácido antranílico com

posterior reação de Claisen e ataque do par de elétrons do nitrogênio a carbonila

levando a formação do núcleo acridônico (WATERMAN, 1975; DEWICK, 2004)

(ESQUEMA 5.5).

Determinação Estrutural

143

ESQUEMA 5.4- Proposta biogenética para as substâncias

13, 14, 15, 16, 17 e 18.

COSCoA

SCoA

OCH

Nmetil-4-metoxi-

2-quinolona (13)

SAM

OCH

mirtopsina (14)

OCH

dictamina (15)

γ-fagarina (16)

esquimianina (17)

OCH

Z-dimetilrhoifolinato (18)

OCH

2 Malonil-CoA

Determinação Estrutural

144

ESQUEMA 5.5- Proposta biogenética para as substâncias

19, 20, 21, 22 e 23.

ESQUEMA 5.6- Proposta biogenética para as substâncias

24 e 25.

[O]

OCH

zantodiolina (21)

OCH

zantobungeanina (20)

8-hidroxi-N-metilflindersina (19)

SAM

OCH

veprissina (23)

7-hidroxi-8-metoxi

N-metilflindersina(22)

OCH

OOH

CoAS

metilarborinina (25)

OCH

arborinina (24)

OCH

3 Malonil-CoA

SAM

Determinação Estrutural

145

5.3- Amidas

5.3.1- Determinação Estrutural da Substância 26

A substância 26 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico das

folhas de

Rauia sp.

O espectro de RMN

H (200 MHz, (CD

)

CO) da substância 26 (FIGURA

5.71) mostra dois dubletos

em δ 7,58 e δ 6,49 (1H, J= 15,6 Hz), característico de

hidrogênios olefínicos em relação

trans, quatro dubletos em δ 7,84 e δ 6,87 (2H, J=

8,4 Hz) e em

δ 7,18 e δ 6,97 (2H, J= 8,6 Hz) que sugerem a presença de dois anéis

aromáticos

para substituídos em sistemas de acoplamento de spins AA’XX’.

Observa-se ainda um quadrupleto em

δ 3,46 (2H, J= 7,5 Hz) e um tripleto em δ 2,77

(2H,

J= 7,5 Hz) sugerindo a presença de hidrogênios metilênicos vicinais.

FIGURA 5.71- Espectro de RMN

H (200 MHz, (CD

)

CO) substância 26.

Determinação Estrutural

146

O espectro de RMN

C (50 MHz, (CD

)

CO) (FIGURA 5.72) mostra 13 sinais

sendo que os sinais em

δ 130,50; δ 130,07; δ 116,56 e δ 116,07 são referentes a

dois carbonos equivalentes cada. Observa-se também um sinal em

δ 166,34 que

sugere a presença de uma carbonila.

FIGURA 5.72.- Espectro de RMN

H (50 MHz, (CD

)

CO) substância 26.

A análise dos dados e a comparação com dados da literatura indicam que a

substância

26 é uma amida conhecida como paprazina, isolada anteriormente de

Fumaria indica

(Fumariaceae) (RAHMAN et al., 1992), Ravenia infelix (Rutaceae)

(ANDRADE, 2003) e

Almeidea coerulea (AMBROZIN, 2004). Os dados RMN de

da substância

26 assim como os dados da literatura (AMBROZIN, 2004) estão

representados na TABELA 5.26.

paprazina

Determinação Estrutural

147

TABELA 5.26-Dados de RMN de

H e de

C da paprazina

H/C δ

(a)

(lit.) δ

(b)

(lit.)

1´ 127,8 125,89

2´/6´ 7,54 (d, 8,4 Hz) 7,38 (d, 8,3 Hz) 130,50 129,10

3´/5´ 6,87 (d,8,4 Hz) 6,69 (d, 8,3 Hz) 116,56 115,68

4´ 159,66 158,73

7´ 7,58 (d, 15,6 Hz) 7,31 (d, 15,7 Hz) 139,97 138,49

8´ 6,59 d (d, 15,6 Hz) 6,39 (d, 15,7 Hz) 118,72

9´ 166,34 165,23

1 132,8 129,49

2/6 7,18 (d, 8,4 Hz) 7,01 (d, 8,1 Hz) 130,07 129,40

3/5 6,97 (d, 8,4 Hz) 6,68 (d, 8,1 Hz) 116,07 115,06

4 156,70 155,57

7 2,88 (t, 7,5 Hz) 2,64 (t, 7,1 Hz) 35,77 34,41

8 3,58 (t, 7,5 Hz) 3,31 (t, 7,1 Hz) 41,90 40,75

(a) (CD

)

CO, 200MHz; (b) DMSO, 400MHz; (c) (CD

)

CO, 50MHz; DMSO, 100MHz

5.3.2- Determinação Estrutural da Substância 27

A substância

27 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico das

folhas de

Rauia sp.

O espectro de RMN

H (200 MHz, (CD

)

CO) da substância 27 (FIGURA

5.73) assim como o espectro de RMN

H (200 MHz, (CD

)

CO) da paprazina

(FIGURA 5.71) mostra dois dubletos característico de hidrogênios olefínicos em

relação

trans em δ 7,45 e δ 6,50 (1H, J= 15,6 Hz), um quadrupleto em δ 3,46 (2H, J=

7,5 Hz) e um tripleto em

δ 2,77 (2H, J= 7,5 Hz) sugerindo a presença de hidrogênios

metilênicos vicinais.

Observam-se ainda dois dubletos em

δ 7,08 e δ 6,76 (1H, J= 8,4 Hz) que

sugerem a presença de um anel aromático

para substituído. O espectro mostra

também um dubleto em

δ 7,16 (2H, J= 1,8 Hz), um duplo dubleto δ 6,50 (1H, J= 8,1 e

1,8 Hz) e um dubleto em

δ 6,83 (1H, J= 8,1 Hz) que sugere a presença de um anel

aromático 1,3,4-trissubstituído. Observa-se ainda um singleto em

δ 3,84 (3H)

indicando a presença de um grupo metila ligado a N ou O.

Determinação Estrutural

148

FIGURA 5.73- Espectro de RMN

H (200 MHz, (CD

)

CO) da substância 27.

O espectro de RMN

C (50 MHz, (CD

)

CO) (FIGURA 5.74) mostra 15

sinais sendo que os sinais em

δ 129,7 e δ 115,48 são referentes a dois carbonos

equivalentes cada. Observa-se também um sinal em

δ 166,6, que sugere a presença

e uma carbonila Um sinal em

δ 55,87 que confirma a presença de um grupo metila

ligada a O.

FIGURA 5.74- Espectro de RMN

C (50 MHz, (CD

)

CO) da substância 27.

Determinação Estrutural

149

A análise dos dados e a comparação com dados da literatura indicam que a

substância

27 é uma amida conhecida como N-trans feruloiltiramina isolada

anteriormente de

Balanites aegyptiaca (Zygophylaceae) (SARKER et al., 2000),

Ravenia infelix (Rutaceae) (ANDRADE, 2003) e Almeidea coerulea (AMBROZIN,

2004). Os dados RMN de

H e

C da substância 27 assim como os dados da

literatura (AMBROZIN, 2004) estão representados na TABELA 5.27.

TABELA 5.27- Dados de RMN de

H e

C da N-trans feruloiltiramina

H/C δ

(a)

(lit.) δ

(b)

(lit.)

1´ 127,17 126,46

2´ 7,16 (d,1,8 Hz) 7,10 sl 109,96 110,80

3´ 146,94 147,85

4´ 147,53 148,27

5´ 6,83 (d, 8,1 Hz) 6,79 d (J=8,1 Hz) 114,85 115,69

6´

7,04 (

dd, 8,1 e 1,8

Hz)

6,98 (dd, 8,1 e 1,8

Hz)

122,02 121,56

7´ 7,45 (d, 15,6 Hz) 7,30 (d, 15,7 Hz) 141,05 138,95

8´ 6,50 (d, 15,6 Hz) 6,42 (d, 15,7 Hz) 117,89 119,04

9´ 166,65 165,40

1 - 129,56

2/6 7,08 (d, 8,4 Hz) 7,01 (d, 8,5 Hz) 129,71 129,50

3/5 6,76 (d, 8,4 Hz) 6,68 (d, 8,5 Hz) 115,44 115,15

4 155,21 155,66

7 2,77 (t, 7,5 Hz) 2,64 (t, 7,5 Hz) 34,60 34,46

8 3,48 (q, 7,5 Hz) 3,32 (tl, 7,5 Hz) 40,83 40,72

OMe 3,79 s 55,87 55,56

(a) (CD

)

CO, 200MHz; (b) DMSO, 400MHz; (c) (CD

)

CO, 50MHz; DMSO, 100MHz

N-trans-feruloiltiramina

Determinação Estrutural

150

5.4- Flavonóide

5.4.1- Determinação Estrutural da Substância 28

A substância

28 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico das

folhas de

Rauia sp1.

O espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 28 (FIGURA 5.75)

mostra um singleto em

δ 12,66 que integra para um hidrogênio sugerindo a presença

de uma hidroxila fenólica quelada. Na região dos hidrogênios aromáticos observa-se

dois dubletos, em

δ 8,08 (2H, J= 9,1 Hz), δ 7,03 (2H, J= 9,1 Hz), indicando a

presença de hidrogênios equivalentes e conseqüentemente simetria na molécula.

Observa-se também dois dubletos em

δ 6,45 e δ 6,36 (1H, J= 2,2 Hz),indicando que

estes hidrogênios se encontram na posição

meta. Observam-se ainda a presença de

três sinais integrando para três hidrogênios cada em

δ 3,90; δ 3,88 e δ 3,86

indicando a presença de três grupos metoxila.

Considerando que a substância

28 apresenta estrutura do tipo flavona ou

flavonol a ausência de um singleto na região entre

δ 6,30 e δ 6,60 sugere a presença

de um substituinte na posição 3, portanto a hidroxila pode estar ligada na posição 3

ou 5, o que possibilita a proposta de duas estruturas.

Quando a hidroxila está ligada a C3 (II) o deslocamento químico do

hidrogênio quelado e de aproximadamente

δ 10 enquanto o deslocamento químico

do hidrogênio da hidroxila ligada a C5 é maior que

δ 10 (RAMACHANDRAN &

SIVAKUMAR, 1992; ROSSI

et al., 1997), portanto a substância 28 tem a hidroxila

ligada a C5.

3, 7, 4'-trimetoxi-5-hidroxiflavona

OCH

5, 7, 4'-trimetoxi-3-hidroxiflavona

OCH

(I) (II)

Determinação Estrutural

151

FIGURA 5.75- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 28.

A análise dos dados obtidos e a comparação com dados da literatura indicam

que a substância

28 é a flavona conhecida como 5-hidroxi-3,7,4’-trimetioxiflavona

isolada anteriormente de

Aniba sp (Bignoniaceae) (ROSSI et al., 1997), Dodonaea

viscosa (Sapindaceae) (DREYER, 1968) e Rauia resinosa (OLIVEIRA, 1996). Os

dados RMN de

H da substância 28 assim como os dados descritos na literatura

estão descritos na TABELA 5.28.

Acquisition Time (sec)

18.4812

Comment

A10N22

Date

24 Feb 1972 03:53:24

Date Stamp

24 Feb 1972 03:53:24

File Name

C:\DOCUMENTS AND SETTINGS\USER\MEUS DOCUMENTOS\TATINHA\ESPECTROS REL3\FLAVONA\A10N22.DX

Frequency (MHz)

200.13

Nucleus

Number of Transients

Origin

tatiane

Original Points Count

65536

Owner

tatiane

Points Count

65536

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

3546.10

Temperature (degree C)

27.000

13.0 12.5 12.0 11.5 11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

ppm

2.992.03 2.00 0.980.96

TMS

0.0000

1.2542

1.6109

3.8606

3.8768

3.9006

6.3545

6.3656

6.4442

7.0039

7.0493

7.2621

8.0586

8.1040

12.6576

8.0 7.5 7.0 6.5

2.03 2.00 0.98 0.90

8.104

8.068

8.058

7.2621

7.049

7.003

6.455

6.444

6.365

6.354

3.95 3.90 3.85

2.99 2.75 2.68

3.9006

3.8768

3.8606

3, 7, 4'-trimetoxi-5-hidroxiflavona

OCH

Determinação Estrutural

152

TABELA 5.28- Dados de RMN

H da 5-hidroxi-3,7,4’-trimetioxiflavona

H δ

(a)

(lit.)

6 6,36 (d, J= 2,2 Hz) 6,33 (d, J= 2,2 Hz)

8 6,45 (d, J= 2,2 Hz) 6,45 (d, J= 2,2 Hz)

2’ 8,08 (d, J= 9,1 Hz) 8,07 (d, J= 9,1 Hz)

3’ 7,03 (d, J= 9,1 Hz) 7,00 (d, J= 9,1 Hz)

5’ 7,03 (d, J= 9,1 Hz) 7,00 (d, J= 9,1 Hz)

6’ 8,08 (d, J= 9,1 Hz) 8,07 (d, J= 9,1 Hz)

OH 12,66 s 12,60 s

OMe

3,90 s

3,88

3,86

3,84

(a) CDCl

, 200MHz

5.5- Lignana

5.5.1- Determinação Estrutural da Substância 29

A substância 29 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico das

folhas de

Rauia sp1.

O espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 29 (FIGURA 5.76

mostra um singleto em

δ 6,59 que integra para quatro hidrogênios, um singleto largo

δ 5,51 que integra para dois hidrogênios sugerindo a presença de duas hidroxilas

ligadas a anel aromático e um dubleto em

δ 4,73 (2H, J=4,3 Hz). Observam-se

também um multipleto em

δ 4,28 (2H), um singleto em δ 3,90 integrando para 12

hidrogênios indicando a presença de quatro metoxilas, um multipleto entre

δ 4,0 e δ

3,8 (2H) e um multipleto em

δ 3,07 (2H).

O espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) (FIGURA 5.77) indicou a presença

de 10 sinais. Esta informação associada aos valores das integrais no espectro de

RMN

H indica que a molécula possui um plano de simetria.

Os dados obtidos indicam que a substância

29 é uma lignana furofuranica. As

lignanas furofurânicas apresentam três diasteroisômeros possíveis: diequatorial (I),

diaxial (II) e axial/equatorial (III) (DIKEY, 1958).

O diasteroisômero axial/equatorial (III) pode ser diferenciado dos outros dois (I

e II). Em I e II os hidrogênios benzílicos (H2 e H6) são equivalentes portanto

Determinação Estrutural

153

observa-se normalmente um único dubleto entre δ 4,98 e δ 4,67 enquanto em III

observa-se um sinal próximo a

δ 4,85 e outro próximo a δ 4,4.

A distinção entre os diasteroisômeros I e II pode ser feita através dos

deslocamentos químicos dos hidrogênios 4 e 8. Nos compostos com configuração

diequatorial (I) os sinais de H4 e H8 são observados entre

δ 3,75 e δ 4,70 enquanto

que na série diaxial (II) os sinais de H4 e H8 são observados entre

δ 4,18 e δ 4,43 e

entre

δ 3,80 e δ 4,08 (GARNIER et al., 1975; PELTER et al., 1976; DICKEY , 1975 e

AHAMED

et al., 2002).

A análise dos dados obtidos e a comparação com dados da literatura indicam

que a substância

29 é lignana furofurânica conhecida como siringaresinol ou

lirioresinol B isolada anteriormente de

Bulbophyllum vaginatum (Orchidaceae)

(LEONG

et al., 1999), Vinca minor (Apocynaceae) (GARNIER et al., 1975) e

Pilocarpus grandiflorus (SOUZA, 2003). Os dados RMN de

H e de

C da

substância

29 assim como os dados descritos na literatura (LEONG et al., 1999)

estão descritos na TABELA 5.29.

FIGURA 5.76- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) substância 29.

(I) (II) (III)

Acquisition Time (sec)

18.4812

Comment

A32N8.5

Date

28 Jul 1971 06:50:22

Date Stamp

28 Jul 1971 06:50:22

File Name

Frequency (MHz)

200.13

Nucleus

Number of Transients

Origin

tatiane

Original Points Count

65536

Owner

tatiane

Points Count

65536

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

3546.10

Temperature (degree C)

27.000

7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

ppm

14.694.12 2.30 1.991.971.33

TMS

7.2648

6.5873

5.5099

5.3009

4.7452

4.7236

4.3273

4.2929

4.2818

4.2475

4.0028

3.9390

3.9047

3.8452

3.1252

3.1068

3.0944

3.0706

2.1735

1.6119

1.2537

0.0000

Determinação Estrutural

154

FIGURA 5.77- Espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) substância 29.

TABELA 5.29- Dados de RMN

H e de

C do siringaresinol.

H/C δ

(a)

(b)

(lit.) δ

(c)

(d)

(lit.)

1/5 3,07(m) 3,09(2H, m) 54,3 54,4

2/6 4,73 (d, 4,3 Hz) 4,73 (d, 4,2 Hz) 86,1 86,1

4e/8e 4,28 (2H, m) 4,28 (dd, 9,0 e 6,8 Hz)

4a/8a 4,0-3,7 (2H, m) 4,28 (dd, 9,0 e 3,8 Hz)

71,8 71,8

1’/1’’ 132,1 132,1

2’/2’’ e

6’/6’’

6,59 (s) 6,58 (s) 102,7 102,8

3’/3’’ 147,1 147,2

4’/4’’ 134,3 134,4

5’/5’’ 147,2 147,2

OCH

3,90 (s) 3,90 (s) 56,4 56,4

(a) CDCl

, 200MHz; (b) CDCl

, 300MHz; (c) CDCl

, 50MHz; (d) CDCl

, 75MHz

Acquisition Time (sec) 2.4248 Comment A46N8.5C Date 04 Nov 1971 00:13:08

Date Stamp 04 Nov 1971 00:13:08

File Name

Frequency (MHz) 50.33 Nucleus 13C Number of Transients 29200 Origin tatiane

Original Points Count 32768 Owner tatiane Points Count 32768 Solvent CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz) 13513.51 Temperature (degree C) 27.000

150 145 140 135 130 125 120 115 110 105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25

ppm

Chloroform-d

147.1841

134.3765

132.1066

102.7956

86.0711

77.6310

77.0000

76.3690

71.7966

56.3995

54.3510

29.6697

OCH

siringaresinol

1''

2''

3''

4''

5''

6''

Determinação Estrutural

155

5.6- Composto fenólico

5.6.1- Determinação Estrutural da Substância 30

A substância 30 foi isolada da fração diclorometano do extrato metanólico das

folhas de

Rauia sp1.

O espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da substância 30 (FIGURA 5.78)

mostra tres sinais integrando para um hidrogênio cada na região aromática. Um

duplo dubleto em

δ 7,65 (J= 8,2 e 1,6 Hz), um dubleto em δ 7,57 (J= 1,6 Hz) e um

dubleto em

δ 6,92 (J= 8,2 Hz). Observa-se também um singleto integrando para três

hidrogênios em

δ 3,87 que pode ser atribuído a uma metoxila.

O espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) (FIGURA 5.79) mostra sinais

referentes a 8 carbonos. O sinal em

δ 168,9 sugere a presença de uma carbonila.

A análise dos dados e a comparação com dados da literatura (SAKUSHIMA

al., 1995 e SOUZA, 2003) indicam que a substância 30 é um composto fenólico

conhecido como acido vanílico, que é amplamente distribuído no reino vegetal. Os

dados RMN de

H e

C da substância 30 assim como os dados de RMN de

(SOUZA, 2003) e

C (SAKUSHIMA et al., 1995) da literatura estão representados

na TABELA 5.30.

OCH

OHO

ácido vanílico

Determinação Estrutural

156

FIGURA 5.78- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) substância 30.

FIGURA 5.79- Espectro de RMN

C (50 MHz, CDCl

) da substância 30.

8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8

1.08 0.960.95

7.6731

7.6647

7.6320

7.6233

7.5706

7.5625

7.3005

6.9401

6.8990

Acquisition Time (sec)

18.4812

Comment

A38N935

Date

09 Sep 1971 08:51:44

Date Stamp

09 Sep 1971 08:51:44

File Name

C:\DOCUMENTS AND SETTINGS\USER\MEUS DOCUMENTOS\TATINHA\BACK UP RMN\TATI\RMN\2004\A38N935.DX

Frequency (MHz)

200.13

Nucleus

Number of Transients

Origin

tatiane

Original Points Count

65536

Owner

tatiane

Points Count

65536

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

3546.08

Temperature (degree C)

27.000

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

ppm

3.171.08 0.96

TMS

0.0000

1.2572

3.4094

3.4469

3.9409

4.9321

5.3122

6.8990

6.9401

7.3005

7.5625

7.5706

7.6233

7.6320

7.6647

7.6731

Acquisition Time (sec)

2.4248

Comment

A41N943C

Date

27 Sep 1971 11:15:48

Date Stamp

27 Sep 1971 11:15:48

File Name

C:\DOCUMENTS AND SETTINGS\USER\MEUS DOCUMENTOS\TATINHA\BACK UP RMN\TATI\RMN\2004\A41N943C.DX

Frequency (MHz)

50.33

Nucleus

13C

Number of Transients

32635

Origin

tatiane

Original Points Count

32768

Owner

tatiane

Points Count

32768

Solvent

CHLOROFORM-D

Sweep Width (Hz)

13513.51

Temperature (degree C)

27.000

170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30

ppm

Methanol-d4

Chloroform-d

48.4920

48.9181

49.3524

49.7785

50.2046

55.9570

76.3608

77.0000

77.6310

112.2765

114.2103

122.0932

124.5187

146.3893

150.3308

168.8908

Determinação Estrutural

157

TABELA 5.30-Dados de RMN de

H e

C do ácido vanílico.

(a) CDCl

, 200MHz; (b) CDCl

, 50MHz; (c) CDCl

, 100MHz

5.6- Esteróides

5.6.1- Determinação Estrutural da Substância 31 e 32

A mistura das substâncias 31 e 32 foi isolada da fração hexano do extrato

metanólico das folhas de

Rauia sp1 e do e extrato diclorometano do caule de

Conchocarpus macrophyllus.

O espectro de RMN

H (200MHz, CDCl3) da mistura das substâncias 31 e 32

(FIGURA 5.80), apresenta um dubleto largo em

δ 5,35 (J=4,5Hz) referente ao H-6 e

um multipleto em

δ 3,52 referente ao hidrogênio H-3. O espectro apresentou também

dois duplos dubletos em

δ 5,16 (J=8,1 e 15,6Hz) e δ 5,02 (J=8,1 e 15,6Hz) indicou a

presença do estigmasterol. Foram observados ainda onze sinais entre

δ 0,68 e 1,00

sugeriu a presença de mais um esteróide na mistura. Para a confirmação dos

compostos presentes na mistura na mistura foi realizado o experimento de CG/MS.

H/C

(a)

(lit.) δ

(b)

(C)

(lit.)

122,1 123,1

7,57 (d, 1,8Hz) 7,58 ( d, 1,8Hz) 112,2 113,9

146,3 148,6

150,3 152,6

6,92 (d, 8,2Hz) 6,96 ( d, 8,3Hz) 114,2 115,9

7,65(dd, 8,2; 1,8Hz) 7,70 (dd, 8,3; 1,8Hz) 124,5 125,3

168,9 170,0

OCH

3,96 (s) 3,94 (s) 55,9 56,4

Determinação Estrutural

158

FIGURA 5.80- Espectro de RMN

H (200 MHz, CDCl

) da mistura das substâncias

31 e 32

Nos espectros de massas observa-se os picos dos íons moleculares com m/z

414 e 412 Daltons que são compatíveis com as formulas moleculares C

O e

O, referentes ao β-sitosterol e ao estigmasterol respectivamente.

FIGURA 5.81- Espectro de massas do β-sitosterol

Determinação Estrutural

159

FIGURA 5.82- Espectro de massas do estigmasterol.

estigmasterol (32)

β−sitosterol (31)

Atividades Biológicas

161

6- Atividades Biológicas

6.1- Atividades Biológicas dos Extratos Brutos

Para o estudo foram escolhidas seis plantas da família Rutaceae. Foram

utilizados os extratos de caule e folhas num total de 16 extratos brutos. Os extratos

foram identificados por códigos que estão representados na TABELA 6.1.

TABELA 6.1- Códigos dos extratos.

código do

extrato Planta Parte da planta Extrato

CAFD Folhas Diclorometano

CAFM

Cusparia anã

Folhas Metanol

CGCH Caule Hexano

CGCM Caule Metanol

CGCD Caule Diclorometano

CGFE

Cusparia Est.

Grosso

Folhas Éter de Petróleo

CMCD Caule Diclorometano

CMCF Caule Éter de Petróleo

CMFM Folhas Metanol

CMFE

Conchocarpus

macrophyllus

Folhas Éter de Petróleo

CJCH Caule Hexano

CJFD Folhas Diclorometano

CJFE

Cusparia João

Grandão

Folhas Éter de Petróleo

RCM Caule Metanol

RFM

Rauia sp

Folhas Metanol

RF1M Rauia sp 1 Folhas Metanol

Atividades Biológicas

162

Os extratos das plantas escolhidas foram testados nas formas tripomastigotas

de T. cruzi e nas enzimas gGAPDH de T. cruzi e APRT de Leishmania tarentolae.

Os extratos que mostraram atividade satisfatória (lise parasitária ou inibição superior

a 70%) em um ou mais ensaios foram particionados.

6.1.1- Ensaio tripanocida “in vitro” sobre a forma tripomastigota de T. cruzi

Os extratos brutos foram testados sobre a forma tripomastigota de T. cruzi de

acordo com o procedimento descrito no item 3.4.1 na página 39 e os resultados

obtidos estão representados no GRÁFICO 6.1. Foram considerados ativos os

extratos com porcentagem de lise parasitária superior a 70%.

GRÁFICO 6.1- Resultados dos testes “in vitro” sobre a forma tripomastigota de T.

cruzi.

Os resultados dos ensaios mostram que dos 16 extratos avaliados apenas o

extrato éter de petróleo do caule de Conchocarpus macrophyllus (CMCE) e o extrato

metanólico das folhas de Rauia sp (RFM), que apresentaram 94,6% e 75,3% de lise

parasitária foram considerados ativos sobre as forma tripomastigotas de T. cruzi.

15.66

12.65

9.03

28.91

55.43

50.6

7.22

94.57

1.21

27.2

31.32

36.14

15.66

75.31

42.16

100

% de lise

CAFD

CAFM

CGCH

CGCM

CGCD

CGFE

CMCD

CMCF

CMFM

CMFE

CJCH

CJFD

CJFE

RCM

RFM

RF1M

Atividades Biológicas

163

6.1.2- Ensaio de inibição da atividade da enzima gliceraldeído-3-fosfato

desidrogenase de T. cruzi (gGAPDH)

Os extratos brutos foram testados na enzima gGAPDH de acordo com o

procedimento descrito no item 3.4.2 nas páginas 39, 40 e 41 e os resultados obtidos

estão representados no GRÁFICO 6.2. Foram considerados ativos os extratos com

porcentagem de lise parasitária superior a 70%.

GRÁFICO 6.2- Resultados de inibição da atividade da enzima gGAPDH

Os resultados dos ensaios mostram que dos 16 extratos avaliados apenas o

extrato metanólico das folhas de Rauia sp1 (RF1M) apresentou inibição satisfatória

(74,6% de inibição). As porcentagens de inibição da atividade enzimática referentes

aos extratos CAFD, CGCH, CGFE, CJCH e CJFE não puderam ser calculados,

estes extratos apresentaram turvação durante os ensaios e/ou apresentaram

absorção no comprimento de onda utilizado no ensaio impossibilitando assim o

cálculo da atividade inibitória.

100

% de inibição

CAFD

CAFM

CGCH

CGCM

CGCD

CGFE

CMCD

CMCF

CMFM

CMFE

CJCH

CJFD

CJFE

RCM

RFM

RF1M

Atividades Biológicas

164

6.1.3- Ensaio de inibição da atividade de APRT Adenina Fosforibosiltransferase

de Leishmania tarentolae

Os extratos brutos foram testados frente à enzima APRT de Leishmania

tarentolae de acordo com o procedimento descrito no item 3.4.5 na página 42 e os

resultados obtidos estão representados no GRÁFICO 6.3. Foram considerados

ativos os extratos com porcentagem de lise parasitária superior a 70%.

GRAFICO 6.3- Resultados de inibição da atividade de APRT para os extratos.

Os resultados dos ensaios mostram que dos 16 extratos avaliados apenas o

extrato diclorometânico do caule de Conchocarpus macrophyllus (CMCD)

apresentou porcentagem de inibição satisfatória (77,1%), porém o extrato éter de

petróleo das folhas de Cusparia est. grosso (CGFE) e o extrato metanólico das

folhas de Rauia sp1 (RF1M) apresentaram resultados próximos ao considerado

satisfatório (64,3% e 67,9% respectivamente).

6.2- Atividades Biológicas das Frações do extrato diclorometânico do caule de

Conchocarpus macrophyllus

O fracionamento do extrato diclorometânico do caule de Conchocarpus

macrophyllus (CMCD) que apresentou 77% de inibição sobre a enzima APRT de

46.4

10.7

25.7

19.3

46.4

64.3

77.1

35.7

27.9

37.1

42.8 42.9

35.7

42.9

67.9

100

% de inibição

CAFD

CAFM

CGCH

CGCM

CGCD

CGFE

CMCD

CMCF

CMFM

CMFE

CJCH

CJFD

CJFE

RCM

RFM

RF1M

Atividades Biológicas

165

acordo com o procedimento descrito no item 3.3.1.5 nas páginas 38 e 39 levou a

obtenção de 10 frações. As frações obtidas foram submetidas ao ensaio sobre a

enzima APRT e os resultados obtidos estão representados no GRÁFICO 6.4.

GRAFICO 6.4- Resultados de inibição da atividade de APRT para frações.

Os resultados dos ensaios mostram que frações apresentaram aumento da

porcentagem de inibição quando comparado com o extrato de origem. As frações

CMCD 4, CMCD 7 e CMCD 9 apresentaram inibição maior que 90%

A porcentagem de inibição da atividade enzimática referente à fração CMCD

10 não pode ser calculada uma vez que esta fração apresentou turvação durante o

ensaio.

6.3- Atividades Biológicas das Substâncias puras

6.3.1- Ensaio tripanocida “in vitro” sobre a forma tripomastigota de T. cruzi

As substâncias isoladas foram submetidas a ensaio sobre a forma

tripomastigota de T. cruzi de acordo com o procedimento descrito no item 3.4.1 na

página 39. As concentrações utilizadas para o ensaio foram 100, 250 e 500 µM e os

resultados obtidos estão representados TABELA 6.2.

95,7

100

% de inibição

Frações

Atividades Biológicas

166

TABELA 6.2- Resultados dos testes sobre a forma tripomastigota de T. cruzi.

substância

Isolada do

extrato

Conc.

(µg/ml)

% de lise

parasitária

murrangatina (5) RCM e RF1M

100

250

500

18,0

26,1

44,4

rauianina (8)

RCM, RFM e

RF1M

100

250

500

25,4

32,5

47,8

N-metil-4-metoxi-2-quinolona (13) RCM

100

250

500

21,7

20,5

dictamina (15)* RCM

100

250

500

16,7

17,6

28,7

γ-fagarina (16)* RCM

100

250

500

26,3

33,5

75,0

esquimianina (17) RCM

100

250

500

17,9

34,3

arborinina (24)* CMCD

100

250

500

24,0

42,4

58,0

metilarborinina (25)* CMCD

100

250

500

35,6

46,4

63,2

paprazina (26)** RF1M

100

250

500

24,5

37,9

45,1

N-trans-feruloiltiramina (27)** RF1M

100

250

500

9,4

28,1

69,2

sitosterol e estigmasterol (31 + 32)* CMCD e RCM

100

250

500

19,1

20,9

40,0

* substâncias testadas por MAFEZOLI (2001)

** substâncias testadas por AMBROZIN (2004)

Atividades Biológicas

167

A comparação dos resultados representados na TABELA 6.2 mostra que as

substâncias com maiores atividades são a rauianina (8) que apresentou 47,8% de

lise parasitária a uma concentração de 1,8 mM, a γ-fagarina (16) apresentou 75,0%

de lise parasitária na concentração de 2,2 mM, a arborinina (24) apresentou 58% de

lise parasitária a uma concentração de 1,8 mM e a N-trans-feruloiltiramina (27)

apresentou 69,2% de lise parasitária a uma concentração de 1,6mM. Porém as

substâncias apresentaram resultados pouco significativos frente as formas

tripomastigotas, principalmente quando comparadas ao controle positivo, a violeta

genciana que apresenta IC

de 0,083 mM e o (-)-metilpluviatolídeo que apresentou

99% de lise parasitária na concentração de 67,5 µM (BASTOS et al. , 1999).

6.3.2- Ensaio de inibição da atividade da enzima gGAPDH gliceraldeído-3-

fosfato desidrogenase de T. cruzi

As substâncias isoladas foram submetidas a ensaio sobre a enzima gGAPDH

de acordo com o procedimento descrito no item 3.4.3 pagina 41.

Como citado no item 3.4.3, no ensaio sobre a enzima gGAPDH a avaliação da

inibição da enzima utiliza NAD

como cofator é acompanhada através da formação

de NADH, que absorve no comprimento de onda 340 nm. Porém, várias substâncias

apresentam absorção no mesmo comprimento de onda ocorrendo interferência na

análise. As amostras que apresentam mais de 30% de absorção molecular relativo

ao NADH (λ=340 nm) não puderam ser avaliadas neste comprimento de onda. Uma

alternativa é ensaiar estas substâncias utilizando Tio- NAD

como cofator, como

descrito no item 3.4.4 páginas 41 e 42 e acompanhando a formação do Tio-NADH

no comprimento de onda de 400 nm.

Das substâncias analisadas, apenas a mirtopsina (14), a dictamina (15) e a γ-

fagarina (16) utilizaram NAD

como cofator, de acordo com o procedimento descrito

no item 3.4.3, as demais substâncias foram analisadas utilizando Tio- NAD

como

cofator de acordo com o procedimento descrito no item 3.4.4 . Os resultados obtidos

estão representados na TABELA 6.3. As substâncias foram testadas na

concentração de 200 µM.

Atividades Biológicas

168

TABELA 6.3- Resultados de inibição da atividade da enzima gGAPDH

substância Isolada do extrato

Conc.

(µM)

inibição

murranganona (1) RF1M 200 7

7-metoxi-8-(2-acetoxi-3-metil-1-oxobut-2-

enil)-cumarina (2)

RF1M

200 7

isomurranganona (3) RF1M 200 3

murralongina (4) RCM e RF1M 200 1

murrangatina (5) RCM e RF1M 200 0

munomicrolina (6) RCM e RF1M 200 1

acetato de murrangatina (7) RCM 200 2

rauianina (8) RCM, RFM e RF1M 200 8

umbeliferona (11) RCM, RFM e RF1M 200 3

N-metil-4-metoxi-2-quinolona (13) RCM 200 0

mirtopsina (14) RCM 200 0

dictamina (15) RCM 200 4

γ-fagarina (16)

RCM

200 10

esquimianina (17) RCM 200 16

Z-rhoifolinato de dimetila (18) RCM 200 5

8-hidroxi-N-metilflindersina (19) RCM 200 4

7-hidroxi-8-metoxi-N-metilflindersina (22) RCM 200 0

3,7,4’-trimetoxi-5-hidroxiflavona (28) RF1M 200 9

siringaresinol (29) RF1M 200 6

ácido vanílico (30) RF1M 200 0

Os resultados apresentados na TABELA 6.3 mostram que todas as

substâncias ensaiadas mostraram porcentagem de inibição menor ou igual a 16% ou

seja, nenhuma das substâncias testadas apresentou atividade significativa frente

gGAPDH, mesmo as substâncias provenientes extrato metanólico das folhas de

Rauia sp1 (16) que apresentou 74, 5% de inibição na enzima gGAPDH.

Atividades Biológicas

169

6.3.3- Ensaio de inibição da atividade de APRT Adenina Fosforibosiltransferase

de Leishmania tarentolae

As substâncias isoladas foram submetidas a ensaio sobre a enzima APRT de

Leishmania tarentolae de acordo com o procedimento descrito no item 3.4.5 nas

páginas 42 e 43 e os resultados obtidos estão representados na TABELA 6.4. As

substâncias foram testadas em concentrações variadas.

TABELA 6.4- Resultados de inibição da atividade de APRT.

substância

Isolada do

extrato

Conc. (µM)

% inibição

murralongina (4) RCM e RF1M 100 45,8

murrangatina (5) RCM e RF1M 181 12

munomicrolina (6) RCM e RF1M 181 12

rauianina (8)

RCM, RFM e

RF1M

185 28,0

N-metil-4-metoxi-2-quinolona (13) RCM 264 20,4

dictamina (15)** RCM 251 1,6

γ-fagarina (16)

RCM

100 0

esquimianina (17) RCM 193 32,1

zantobungeanina (20) RCM 92 25,7

7-hidroxi-8-metoxi-N-

metilflindersina (22)

RCM

174 18,8

veprissina (23) RCM 166 23,4

arborinina (24)** CMCD 35,1 16,6

paprazina (26)** RF1M 177 19,8

N-trans-feruloiltiramina (27)** RF1M 158 9,9

Os resultados representados na TABELA 6.4 mostram que dentre as

substâncias testadas a murralongina (4) foi a que apresentou maior atividade 45,8%

na concentração de 100 µM. A arborinina (24) isolada da fração 9 extrato

diclorometano do caule de Conchocarpus macrophyllus (CMCD 9) que apresentou

92% de inibição frente a enzima APRT apresentou 16,6% de inibição na

concentração de 35,1 µM

Atividades Biológicas

170

6.3.2- Ensaio de inibição da atividade da enzima PNP purina nucleosídeo

fosforilase de Schistosoma mansoni

As substâncias isoladas foram submetidas a ensaio na enzima PNP de

Schistosoma mansoni de acordo com o procedimento descrito no item 3.4.6 na

página 43 e os resultados obtidos estão representados na TABELA 6.5. As

substâncias foram testadas a 200 µM.

TABELA 6.5- Resultados de inibição da atividade de PNP.

substância

Isolada do

extrato

Conc. (µM)

inibição

murranganona (1) 16 200 38,1

7-metoxi-8-(2-acetoxi-3-metil-1-oxobut-2-

enil)-cumarina (2)

200 39,1

isomurranganona (3) 16 200 49,8

murralongina (4) 14 e 16 200 36,1

murrangatina (5) 14 e 16 200 38,1

munomicrolina (6) 14 e 16 200 46,4

acetato de murrangatina (7) 14 200 31,0

rauianina (8) 14, 15 e 16 200 abs

umbeliferona (11) 14, 15 e 16 200 81,5

N-metil-4-metoxi-2-quinolona (13) 14 200 37,6

mirtopsina (14) 14 200 32,8

dictamina (15) 14 200 abs

γ-fagarina (16)

200 32,7

esquimianina (17) 14 200 59,7

Z-rhoifolinato de dimetila (18) 14 200 34,6

8-hidroxi-N-metilflindersina (19) 14 200 34,6

7-hidroxi-8-metoxi-N-metilflindersina (22) 14 200 30,1

3,7,4’-trimetoxi-5-hidroxi flavona (28) 16 200 29,9

siringaresinol (29) 16 200 abs

ácido vanílico (30) 16 200 abs

Atividades Biológicas

171

Os resultados dos ensaios (TABELA 6.4) mostram que dentre as substâncias

testadas a umbeliferona (11) foi a que apresentou maior atividade de inibição

(81,5%). A cumarina isomurranganona apresentou 49,8% de inibição na enzima

PNP.

A cumarina murrangatina (5) inibiu a atividade enzimática de PNP em 38,1%,

enquanto que seu diasteroisômero munomicrolina (6) apresentou 46,4% de inibição.

Dentre os alcalóides furoquinolínicos a γ-fagarina (16) apresentou 32,7 % de inibição

enquanto que a esquimianina (17), que possui uma metoxila a mais em sua

estrutura, apresentou 59,7% de inibição. Embora os resultados acima tenham sido

apresentados em uma única concentração, já é possível ter uma idéia do

comportamento inibitório dessas substâncias frente à enzima PNP.

As substâncias rauianina (8), dictamina (15), siringaresinol (29) e ácido

vanílico (30) apresentaram absorção no comprimento de onda do ensaio (293nm).

Atividades Biológicas

173

7- Conclusões

O estudo fitoquímico de Rauia sp e Conchocarpus macrophyllus resultou no

isolamento de 32 substâncias pertencentes a diversas classes de metabólitos

secundários como cumarinas, alcalóides, amidas, lignana, flavonóide e composto

fenólico.

Das 30 substâncias isoladas de Rauia sp, são inéditas na literatura as

cumarinas 3-etilrauianina (9) e 5-metoxirauianina (10) e os alcalóides 8-hidroxi-N-

metilflindersina (19) e 7-hidroxi-8-metoxi-N-metilflindersina (22), o que contribui para

o conhecimento do perfil químico do gênero. O estudo do caule desta planta mostrou

que o mesmo é rico em cumarinas preniladas na posição 8 onde a prenila sofreu

diversas modificações estruturais. Dentre estas cumarinas destaca-se a rauianina

(8), que possui um esqueleto incomum com um anel dihidropirano e uma γ-lactona

condensados. Além disso, o caule se mostrou rico em alcalóides derivados do ácido

antranílico, como os alcalóides tipo quinolona, furoquinolínicos,

dihidrofuroquinolínico, piranoquinolonicos, dihidropiranoquinolonico. O estudo das

folhas mostrou uma maior diversidade das classes de metabólitos encontrados.

Além das cumarinas e alcalóides foram encontradas duas amidas, uma flavona, uma

lignana e um composto fenólico.

O estudo fitoquímico de Conchocarpus macrophyllus levou ao isolamento do

alcalóide acridônico metilarborinina (25) e da mistura dos esteróides sitosterol (31) e

estigmasterol (32), além da arborinina (24) única substância descrita anteriormente

nesta espécie.

O estudo fitoquímico de Rauia sp e Conchocarpus macrophyllus,

biomonitorado por

Dos 16 extratos testados frente aos ensaios bioquímicos sobre as enzimas

GAPDH de T. cruzi e APRT de L. tarentolae e ensaio biológico sobre formas

tripomastigotas de T. cruzi, apenas quatro apresentaram atividades satisfatórias em

pelo menos um dos ensaios a que foram submetidos. O extrato éter de petróleo do

caule de Conchocarpus macrophyllus (CMCF) e o extrato metanólico das folhas de

Rauia sp (RFM) apresentaram 94% e 75% de lise sobre as formas tripomastigotas

de T. cruzi. O extrato metanólico das folhas de Rauia sp1 (RF1M) apresentou 74%

de inibição na enzima GAPDH e o extrato diclorometânico do caule de

Atividades Biológicas

174

Conchocarpus macrophyllus (CMCD) apresentou 77% de inibição na enzima APRT.

O extrato metanólico das folhas de Rauia sp-nova (RF1M) apresentou resultados

próximos ao considerado satisfatórios (67,9% de inibição) na a enzima APRT.

Do extrato metanólico das folhas de Rauia sp que apresentou 74,5% de lise

parasitária frente forma tripomastigota de T. cruzi foi isolada a cumarina rauianina

que apresentou lise parasitária de 47,76% a 500 µg/ml.

O fracionamento do extrato metanólico das folhas de Rauia sp1 que

apresentou 74,5% de inibição na enzima GAPDH não levou ao isolamento de

substâncias com atividade inibitória significativa nesta enzima.

O fracionamento do extrato diclorometano do caule de Conchocarpus

macrophyllus (CMCD) que apresentou 77% de inibição frente a enzima APRT levou

ao isolamento de dois alcalóides acridônicos destes apenas a arborinina (24) foi

testada e não apresentou atividade significativa frente a APRT (16,6% na

concentração de 35,1µM).

Comparando-se os resultados das atividades dos extratos brutos com os

obtidos para as substâncias puras pode-se concluir que ou algumas substâncias

mais ativas não foram isoladas neste estudo ou a atividade depende de uma

combinação de efeitos entre estas substâncias.

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