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RICARDO PIRES DOS SANTOS
APROVEITAMENTO DE RESÍDUOS E MICROSCOPIA DE FORÇA
ATÔMICA EM MATERIAIS BIOLÓGICOS
FORTALEZA
2007
Tese submetida à Coordenação do Curso de Pós-
Graduação em Física, n
a Universidade Federal do
Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de
Doutor em Física.
Orientador: Prof. Dr. Valder Nogueira Freire
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RICARDO PIRES DOS SANTOS
APROVEITAMENTO DE RESÍDUOS E MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA
EM MATERIAIS BIOLÓGICOS
Aprovada em 11/ 04/ 2007
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________
Prof. Dr. Valder Nogueira Freire (Orientador)
Departamento de Física
Universidade Federal do Ceará - UFC
_____________________________________________
Prof. Dr. Benildo Sousa Cavada
Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas (BioMol-Lab)
Universidade Federal do Ceará - UFC
_____________________________________________
Prof. Dr. José Alzamir da Costa
Departamento de Física
Universidade Federal do Ceará - UFC
_____________________________________________
Prof. Dr. Jorge Luiz Martins
Instituto de Química e Geociências (IQG)
Universidade Federal de Pelotas - UFPEL
_____________________________________________
Prof. Dr. Luis Orlando Ladeira
Departamento de Física
Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG
Tese submetida à Coordenação do Curso de
Pós-
Graduação em Física, da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial para
obtenção do grau de Doutor em Física.
Orientador: Prof. Dr. Valder Nogueira Freire
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RICARDO PIRES DOS SANTOS
APROVEITAMENTO DE RESÍDUOS E MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA
EM MATERIAIS BIOLÓGICOS
Aprovada em 11/ 04/ 2007
BANCA EXAMINADORA EXTENDIDA
_____________________________________________
Prof. Dr. Edson Holanda Teixeira
Faculdade de Medicina/Sobral
Universidade Federal do Ceará - UFC
Tese submetida à Coordenação do Curso de
Pós-
Graduação em Física, da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial para
obtenção do grau de Doutor em Física.
Orientador: Prof. Dr. Valder Nogueira Freire
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DEDICATÓRIA
À minha esposa. Existem pessoas que marcam definitivamente nossas almas. A
minha esposa, Cíntia, ou minha “Florzinha” como costumo chamar, é uma delas. Na verdade
foi a única pessoa que provocou tantas mudanças maravilhosas em tão pouco tempo. Como
uma criança recém nascida, fui acolhido em seus braços ternos, após um parto difícil, cuidado
e alimentado até me tornar um homem saudável. Estar ao lado de meu amor é querer sempre
ser uma pessoa melhor. É o alicerce de minha vida, ou como naquela música: “procurei mas
encontrei você e agora o que eu faço...não suporto mais esta longa espera...porque...você é
meu amorzinho, você é meu amorzão...você é o tijolinho que faltava na minha construção”.
Tudo em relação a ela se resume em uma única frase: “Eu te amo”.
Ao meu pai Paulo e minha mãe Maria. Retidão, honestidade, compaixão e
coragem são as principais virtudes passadas por eles. Quero honrá-los em cada ato nesta vida,
pois como diz meu pai, “... um homem é julgado pelas suas atitudes”. Sem a educação e o
amor que me deram, certamente não teria terminando esta tese.
À Germaninha, cuja perda fez-me pensar na fragilidade da vida humana. Não sou
religioso, mas se anjos existem, tenho certeza que ela está entre eles agora.
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AGRADECIMENTOS
Ao CNPq, pelo apoio financeiro com a manutenção da bolsa de auxílio e pela
aprovação dos projetos “Preparação, caracterização e aplicação tecnológica de carbono poroso
preparado a partir dos resíduos da casca de arroz“ e “Rede de Nanobioestruturas“,
fundamentais no desenvolvimento de minhas atividades de pesquisa.
Ao Departamento de Física da Universidade Federal do Ceará, pela infra-estrutura
necessária à realização de minha pós-graduação.
Ao Instituto de Química e Geociências (IQG) da Universidade Federal de Pelotas;
Laboratório de Morfologia e Anatomia Vegetal da Universidade Federal do Rio Grande do
Sul; Centro de Ciências Tecnológicas da Terra e do Mar da Universidade do Vale do Itajaí
(SC); Centro de Ciências Exatas e da Natureza da Universidade Federal da Paraíba;
Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA) da Universidade Federal de
Pernambuco; Núcleo de Tecnologia do Estado do Ceará (NUTEC); Laboratórios de
Caracterização de Materiais (LACAM), Análises Térmicas Ivo Giolito, Raios-X, Moléculas
Biologicamente Ativas (BioMol-Lab), Microscopia Atômica (LMA) e Ciência e Tecnologia
de Materiais (LCTM) da Universidade Federal do Ceará, pela realização de experimentos,
disponibilidade de equipamentos e todo o apoio técnico a execução desta tese.
Ao Prof. Dr. Valder Nogueira Freire, meu orientador, pela sua paciência,
orientação e constante apoio durante todas as minhas atividades de pós-graduação e pesquisa.
Forneceu todos as condições acadêmicas e pessoais para que esta tese fosse concluída. Posso
dizer que minha vida profissional se divide em duas partes: antes e depois do Prof. Valder.
Ao Prof. Dr. Benildo Sousa Cavada, que considero meu co-orientador e no qual
tenho grande admiração.
Ao Prof. Dr. Jorge Luiz Martins pelos seus conselhos sempre importantes e por
ter me dado o privilégio de sua parceria e orientação no estudo de resíduos.
Ao Prof. Dr. José Alzamir da Costa pela cuidadosa revisão deste trabalho.
À Profa. Dra. Ana Maria do Anjos Carneiro Leão pelo constante apoio em minhas
atividades de pesquisa.
Ao Prof. Dr. Teldo Anderson da Silva Pereira pelo seu companheirismo e
estímulo em todos os momentos de minha pós-graduação.
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Agradecimentos
___________________________________________________________________________________________
vii
Ao Prof. Dr. José Marcos Sasaki pela disponibilidade da realização de medidas de
difração de raios-X em seu laboratório. Sem isto e o apoio de seus alunos de graduação,
mestrado e doutorado, parte desta tese não poderia ter sido realizada.
Aos Profs. Drs Rinaldo P. Santos, Mario L. Pessatti, Tânia L. P. Pessatti, Carlos
A. A. Gadelha, José L. L. Filho, Cibele B. M. Carvalho, Edson H. Teixeira, pelas valiosas
sugestões ao trabalho.
Aos meus professores de graduação da Universidade Federal do Rio Grande do
Sul (UFRGS) pela minha formação no Bacharelado em Física. Em especial, aos Profs. Drs
Mario N. Baibichi, João E. Schmidt e Paulo P. Neto que construíram para os alicerces da
minha formação como físico experimental, indispensável na execução deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Jorge E. A. Mariath e membros do Laboratório de Morfologia
Anatomia Vegetal do Departamento de Botânica da Universidade Federal do Rio Grande do
Sul (UFRGS) por terem sido respectivamente meu pai e meus irmãos no universo da pesquisa
acadêmica, durante meu período de graduação.
Aos pós-graduandos Alexander A. X. Santiago, Tainá M. Oliveira, Gustavo A.
Bezerra, José B. Cajazeiras, Teodora T. P. Arruda, Victor A. Carneiro, Lara Q. V. Braga,
Alexandre V. P. Albertini, Francisco F. M. Junior, Luciana M. Rebelo e Erivelton F. Costa,
pela parceria e pelas reflexões, críticas e sugestões recebidas.
Aos estudantes de iniciação científica Thiago, Marcelo e Lavor pelo auxílio
indispensável em todas as etapas dos trabalhos desenvolvidos na tese.
Aos técnicos e funcionários dos laboratórios acima citados, pela sua boa vontade e
disponibilidade de tempo para realização e orientação na realização dos experimentos
envolvidos com meu trabalho.
À minha esposa, pelo seu constante apoio em todos os momentos de minha vida.
Sem isto, nada faria sentido.
Aos meus pais, pois sem eles eu não estaria neste mundo e nem teria a estrutura
para construir a vida maravilhosa que tenho hoje.
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RESUMO
Este trabalho descreve algumas das pesquisas multidisciplinares realizadas pelo
Departamento de Física da Universidade Federal do Ceará (UFC), envolvendo o
aproveitamento de resíduos e a utilização da microscopia de força atômica (AFM) na
caracterização de estruturas biológicas. Três resíduos foram estudados: o bagaço do caju, as
cinzas de carvão mineral e as conchas de mexilhão Perna perna. No primeiro, foi feita a
caracterização das cinzas originadas da queima do pedúnculo do caju, destacando os
compostos gerados neste processo: KHCO
3
e K
2
SO
4
. Ambos são importantes na indústria
farmacêutica e na produção de adubos fosfatados. No segundo, foi demonstrado o uso das
cerâmicas produzidas a partir das cinzas volantes de carvão mineral originadas da termelétrica
Presidente Médici (RS), como substratos para a imobilização da invertase responsável pela
produção de açúcar invertido. Esta aplicação tem uso direto na produção de bebidas,
medicamentos e cosméticos. Finalmente no terceiro, foram estudadas as alterações na
composição, topografia da superfície e dureza das conchas de mexilhão Perna perna tratadas
termicamente. O nácar (ou superfície perolada) de mexilhões tem sido usado como
biomaterial na regeneração óssea, tendo que sofrer processos de esterelização (normalmente
térmicos). Por isso, a importância do estabelecimento de regiões de estabilidade mecânica,
estrutural e composicional durante estes processos.
No uso do microscópio de força atômica para estudar estruturas biológicas,
destacou-se a importância desta técnica na caracterização do desenvolvimento de biofilmes de
Enterococcus faecalis, freqüentemente encontrada em casos clínicos; e a análise
nanoestrutural da esporopolinina de grãos de pólen de Ilex Paraguarinsis St. Hill. A
esporopolinina é um dos biopolímeros mais resistente que existe, sendo do interesse crescente
dos cientistas e engenheiros de materiais.
Palavras-chave: biofilmes, cinzas voláteis de carvão mineral, compostos fosfatados,
Enterococcus faecalis, esporopolinina, Ilex Paraguarinsis, mexilhão Perna perna,
microscopia de força atômica, pedúnculo do caju, resíduos.
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ABSTRACT
This work describes some of the multidisciplinary researches accomplished in the
Department of Physics of the Universidade Federal do Ceará (UFC), involving the use of
residues involving the use of residues and atomic force microscopy (AFM) in the
characterization of biological structures. Three residues were studied: cashew bagace, coal fly
ashes, and Perna perna mussel shells. In the first, it was characterizated the ashes of the
burned cashew’s peduncle. The composition analysis resulted in the KHCO
3
and K
2
SO
4
crystal phases, both important in the pharmaceutical industry and in the production of
phosfatate fertilizers. In the second, it was used coal fly ashes ceramics from President Médici
power plant as substrate for invertase immobilization. The invertase is responsible for the
inverted sugar production. This application has direct use in the production of drinks,
medications, and cosmetics. Finally in the third, it was studied the alterations in the
composition, topography, and microhardness of the thermally treated Perna perna mussel
shells. The mussel nacre (or madrepearl surface) has been used as biomaterial in the bony
regeneration where are necessary sterilization processes (usually thermal). Like this, the
importance of the establishment of mechanical, structural, and compositional stability regions
during these processes.
In the use of the atomic force microscope for study biological structures, it was
given prominence the importance of this technique in the characterization of development
Enterococcus faecalis biofilms. This biofilms are frequently found in clinical cases. In
addition the nanostructural characterization of the sporopollenin of Ilex Paraguarinsis St. Hill
pollen grains was performed. Sporopollenin is one of the toughest known materials which is
degraded by oxidation but it is resistant to reduction.
Keywords: Atomic force microscope, biofilms, cashew’s peduncle, coal fly ashes,
Enterococcus faecalis, Ilex Paraguarinsis, Perna perna mussel shells, residues,
sporopollenin.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1. Microscópio eletrônico de varredura equipado com dispositivo para análise de
energia dispersiva de raios-X (a); Resultado típico de uma análise por EDX (b),
mostrando o espectro EDX de uma liga de níquel de alta temperatura composta por
níquel, cromo, ferro (Fe), manganês (Mn), titânio (Ti), molibdênio (Mo), silício (Si)
e alumínio (Al). O eixo horizontal representa a energia liberada pelos elétrons e o
eixo vertical, a intensidade...........................................................................................38
Figura 2.2. Difratômetro de raios-X (a); Difratograma de uma argila (b), mostrando suas
fases cristalinas: Caulinita (C), Quartzo (Q) e Ilita (I) (Albers et al., 2002)...................40
Figura 2.3. Termobalança TGA–50 (a); Curva típica de uma análise termogravimétrica
dinâmica (b), mostrando três eventos térmicos associados à perda de massa.................41
Figura 2.4. Curva típica de uma análise térmica diferencial em um material polímero..........42
Figura 2.5. Analisador térmico diferencial DSC-50 (a); Curva típica de uma calorimetria
exploratória diferencial, mostrando um pico endotérmico e outro exotérmico (b).........43
Figura 2.6. Esquema de um microscópio ótico composto.....................................................45
Figura 2.7. Microscópio metalográfico Eclipse LV100D da Nikon (a); Esquema do
sistema ótico de um microscópio metalográfico (b)......................................................47
Figura 2.8. Exemplo de um moderno microscópio de eletrônico de varredura (SEM)...........48
Figura 2.9. Esquema de funcionamento de um microscópio eletrônico de varredura
(SEM)..........................................................................................................................49
Figura 2.10. Processo de geração de elétrons retro-espalhados.............................................50
Figura 2.11. Imagem por SEM de uma liga de cobre e de alumínio formada usando
elétrons retro-espalhados. A área clara é formada principalmente de cobre e a área
escura é de alumínio.....................................................................................................50
Figura 2.12. Processo de geração de elétrons secundários....................................................50
Figura 2.13. Imagem por SEM de uma superfície fraturada de um pedaço de metal,
formada a partir de elétrons secundários.......................................................................51
Figura 2.14. Exemplo de um moderno microscópio eletrônico de transmissão (TEM)..........51
Figura 2.15. Esquema de funcionamento de um microscópio eletrônico de transmissão
(TEM)..........................................................................................................................52
Figura 2.16. Imagens de TEM: nanoporo (a) e mitocôndria (b)............................................53
Figura 2.17. Componentes básicos de um SPM....................................................................54
Figura 2.18. Componentes básicos de um STM....................................................................56
Figura 2.19. Imagem de 50 x 50 nm de uma superfície de Cu(111) a temperatura de 4 K.
São visíveis três camadas monoatômicas e numerosos defeitos pontuais. Oscilações
espaciais (ondas eletrônicas) com periodicidade de aproximadamnente 1.5 nm são
evidentes (Crommie, 1993)..........................................................................................56
Figura 2.20. Representação tridimensional da interação da sonda com a amostra em um
AFM (Antônio Siber,2003)..........................................................................................57
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Lista de figuras
__________________________________________________________________________________________
xii
Figura 2.21. Componentes básicos de um AFM...................................................................58
Figura 2.22. Detalhe da haste (seta) e sonda (asterisco) de Si
3
N
4
fabricadas
comercialmente para AFM (Weisenhorn, 1991)...........................................................58
Figura 2.23. Imagens de AFM da superfície de diferentes materiais: planos cristalinos de
um cristal do aminoácido L-Alanina, no modo de contato (a); Biofilme de salmonela,
no modo intermitente (b) Nanocristais de aragonita de uma concha de mexilhão, no
modo intermitente (c); Cristais de um filme de SnO
2
, no modo de contato (d). As
imagens foram obtidas no Laboratório de Microscopia Atômica, da Universidade
Federal do Ceará, pelo autor da presente tese...............................................................60
Figura 2.24. Gráfico de distância entre ponta e superfície versus a força de interação com
amostra e a relação com modos de operação e a curva de força/distância no AFM........60
Figura 2.25. Moderno microscópio de varredura por sonda (Laboratório de Microscopia
Atômica do Departamento de Física da Universidade Federal do Ceará)......................61
Figura 2.26 Espectrômetro FT-IR da Perkin Elmer..............................................................64
Figura 2.27 Espectro de FT-IR do fenilacetileno..................................................................64
Figura 2.28. Forma de impressão do ensaio Vickers: vista lateral (a) e vista superior (b)......65
Figura 2.29. Microdurômetro Shimadzu modelo HMV-2.....................................................66
Figura 3.1. Histograma típico de uma distribuição de freqüência..........................................78
Figura 3.2. Representação gráfica da distribuição normal.....................................................81
Figura 3.3. Fração aproximada da área sob a curva de distribuição normal entre os limites
±1σ, ±2σ e ±3σ............................................................................................................81
Figura 3.4. Área da curva normal padronizada entre a média e um valor de z.......................82
Figura 3.5. Opções de estatística descritiva no Origin..........................................................90
Figura 3.6. Opções do teste de inferência t-Student..............................................................91
Figura 3.7. Opções do teste de inferência ANOVA..............................................................91
Figura 5.1. O cajueiro. Em (a), árvore e em (b), detalhes da frutificação............................107
Figura 5.2. Ilustração da Anacardium occidentale L..........................................................107
Figura 5.3. Amostras de caju (Anacardium occidentale L.) de pedúnculo vermelho, onde
estão indicados o fruto (castanha) e o pseudofruto (pedúnculo). Barra = 2cm.............108
Figura 5.4: Pedúnculo do caju, após a extração do suco (bagaço). Barra = 2cm..................109
Figura 5.5. Esquema de preparação das cinzas do pedúnculo do caju.................................112
Figura 5.6. Pó do pedúnculo de caju, antes (a) e depois (b) da queima. Pode-se observar a
alteração na coloração e o elevado poder de agregação das cinzas. Barra = 4.5mm.....114
Figura 5.7. EDX das cinzas do pedúnculo do caju, mostrando seus principais elementos
químicos: C, O, Mg, Na, P, S e K...............................................................................115
Figura 5.8. Difratograma de raios-X do pó do pedúnculo de caju e suas cinzas, mostrando
a alteração na cristalinidade após a queima e a formação das principais fases
cristalinas: KHCO
3
, K2SO
4
e MgKPO
4
· 6H2O..........................................................116
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Lista de figuras
__________________________________________________________________________________________
xiii
Figura 5.9. Curvas de TGA e DSC mostrando as transformações térmicas das cinzas, entre
23,8 e 600ºC. Os pontos a, b e c indicam eventos térmicos. A taxa de aquecimento foi
de 10ºC/min...............................................................................................................117
Figura 5.10. Seqüência de imagens feitas por microscopia ótica mostrando o pó do
pedúnculo de caju e suas cinzas, em diferentes ampliações. (a) O pó do pedúnculo em
um aumento de 50x, evidenciando partes do pedúnculo seco; (b), (c) as cinzas do
pedúnculo em um aumento de 50x e 100x, respectivamente, mostrando cristais de
K
2
SO4, KHCO
3
(claros) e K-estruvita (rosa); (d) Detalhes de cristais de K-estruvita,
em um aumento de 200x. Bar = 250µm (a) e (b); 125µm (c) e 62,5µm (d).................119
Figura 6.1. Ação catalítica das enzimas..............................................................................125
Figura 6.2. Imobilização de enzimas em suporte sólido ou poroso. Em (a), imobilização
por adsorção física (força de van der Walls); em (b), por adsorção química (ligações
covalentes).................................................................................................................128
Figura 6.3. Imobilização de enzimas em matriz e membrana. Em (a), imobilização por
confinamento em matriz; em (b), por confinamento em membrana.............................128
Figura 6.4. Ação do γ-aminopropyltrioxysilane na imobilização de enzimas......................130
Figura 6.5. Ação do Glutaraldeído na imobilização de enzimas..........................................131
Figura 6.6. Reação mediada por suporte imobilizado por enzimas......................................131
Figura 6.7. Reação que origina uma molécula de sacarose a partir da frutose e da glicose..133
Figura 6.8. Pedra de carvão mineral (a) e suas cinzas volantes (b), após a queima em usina
termelétrica................................................................................................................135
Figura 6.9. Suporte cerâmico utilizado para a imobilização (tipo 1). Os suportes
apresentam 10mm de diâmetro e espessura variando entre 0,25 a 0,5mm...................139
Figura 6.10. Processo de silanização e imobilização da cerâmica e imobilização da
invertase.....................................................................................................................140
Figura 6.11. Ação da enzima invertase solúvel de Saccharomyces cerevisiae.....................141
Figura 6.12. Atividade na inversão da sacarose (sacarose 600g/l) da invertase imobilizada
nas cerâmicas tipo 1, 2 e 3, utilizando tampão citrato de sódio (0,1M) a pH 5,0 a 4ºC.
As cerâmicas tipo 1 são as com menor pressão de compactação.................................142
Figura 6.13. Efeito do re-uso sobre a atividade da invertase imobilizada em cerâmicas tipo
3, para uma concentração de 40% de sacarose............................................................144
Figura 6.14. Efeito do reuso sobre a atividade da invertase imobilizada em cerâmicas tipo
3, para uma concentração de 60% de sacarose............................................................144
Figura 6.15. Efeito do re-uso sobre a atividade da invertase imobilizada em cerâmicas tipo
1, para uma concentração de 80% de sacarose............................................................145
Figura 6.16. Efeito da atividade de diferentes concentrações da invertase imobilizada em
cerâmicas de cinzas UTPM com 20% de SiO
2
(tipo 4)................................................146
Figura 6.17. Efeito da atividade de diferentes concentrações da invertase imobilizada em
cerâmica de cinzas UTPM com 40% de SiO
2
(tipo 5).................................................146
Figura 6.18. Efeito da atividade de diferentes concentrações da invertase imobilizada em
cerâmica de cinzas UTPM com 60 % de SiO
2
(tipo 6)................................................147
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Lista de figuras
__________________________________________________________________________________________
xiv
Figura 6.19. Efeito da atividade de diferentes concentrações da invertase imobilizada em
cerâmica de cinzas UTPM com 80 % de SiO
2
(tipo 7)................................................147
Figura 6.20. Efeito da atividade de diferentes concentrações da invertase imobilizada em
cerâmica de cinzas UTPM com 100 % de SiO
2
(tipo 8)..............................................148
Figura 6.21. Efeito da atividade da invertase imobilizada nas cerâmicas tipo 4 – 10 (20 -
100% de SiO
2
) com 0,1 mg/ml de invertase................................................................149
Figura 6.22. Efeito da atividade da invertase imobilizada nas cerâmicas tipo 4 – 8 (20 -
100 % de SiO
2
) com 0,8 mg/ml de invertase...............................................................149
Figura 6.23. Efeito da atividade da invertase imobilizada nas cerâmicas tipo 4 – 8 (20 -
100% de SiO
2
) com 1,6 mg/ml de invertase................................................................150
Figura 6.24. Efeito da atividade da invertase imobilizada na cerâmica 4 (20% de SiO
2
)
com 5,68mg/ml de invertase, após 4 usos...................................................................150
Figura.6.25. Relação da atividade da invertase imobilizada com diferentes conteúdos de
enzima.......................................................................................................................151
Figura 7.1. Tonicella lineata, um Quíton............................................................................160
Figura 7.2. Dentalium sp , um Escafópode.........................................................................160
Figura 7.3. Caracol de jardim, um Gastrópode...................................................................161
Figura 7.4. Polvo (Octopus vulgaris), um Cefalópode........................................................161
Figura 7.5. Marisco com as conchas abertas, um Bivalve...................................................162
Figura 7.6. Vista interna da concha de um bivalve.............................................................163
Figura 7.7. Vista externa da concha de um bivalve.............................................................163
Figura 7.8. Representação esquemática da estrutura típica da concha de um bivalve. Em
(a), vista tridimensional; e em (b), o corte transversal (vista de perfil). Os elementos
do esquema não estão em proporção...........................................................................164
Figura 7.9. Conchas de mexilhão Perna perna...................................................................167
Figura 7.10. Experimentos com AFM. Análise da superfície do nácar de conchas in natura
e tratadas termicamente (a) e análise do corte transversal do nácar e da camada
prismática (b). Os elementos mostrados na figura não estão em proporção.................171
Figura 7.11. Padrão de difração para o pó da concha de mexilhão Perna perna in natura,
indicando a presença de aragonita (A) e calcita (C)....................................................173
Figura 7.12. Padrão de difração para o pó da concha de mexilhão Perna perna tratada a
temperatura de 350
º
C, indicando a presença de aragonita (A) e calcita (C).................173
Figura 7.13. Padrão de difração para o pó da concha de mexilhão Perna perna tratada a
temperatura de 450
º
C, indicando somente a presença de calcita (C)............................174
Figura 7.14. Padrão de difração para o pó da concha de mexilhão Perna perna tratada a
temperatura de 600
º
C, indicando somente a presença de calcita (C)............................174
Figura 7.15. Padrão de difração para o pó da concha de mexilhão Perna perna tratada a
temperatura de 700
º
C, indicando a presença de calcita (C) e hidróxido de cálcio
(HC)...........................................................................................................................175
Figura 7.16. Padrão de difração para o pó da concha de mexilhão Perna perna tratada a
temperatura de 800
º
C, indicando somente a presença de hidróxido de cálcio (HC).....176
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xv
Figura 7.17. Espectro FT-IR do pó da concha de mexilhão Perna perna in natura e tratado
em diferentes temperaturas.........................................................................................177
Figura 7.18. Gráfico de microdureza média em função da temperatura de tratamento. Os
retângulos pontilhados representam a ausência de diferenças significativas entre os
valores médios de microdureza..................................................................................181
Figura 7.19. Microscopia ótica de campo claro da superfície da seção transversal da
concha do mexilhão in natura. Nela estão indicados o periostracum e os lados
externo e interno da concha (Aumento de 20x). Barra = 1 mm...................................182
Figura 7.20. Microscopia ótica de campo claro da superfície do nácar, in natura (a) e
tratada a 400
º
C. Aumento de 200x..............................................................................182
Figura 7.21. Microscopia ótica de campo claro da superfície do nácar tratada a 450
º
C.
Estruturas cristalinas em forma de agulhas (algumas assinaladas por setas) podem ser
observadas imersas no nácar. A dimensão de uma destas agulhas está indicada.
Aumento de 200x.......................................................................................................183
Figura 7.22. Microscopia ótica de campo claro da superfície do nácar tratada a 500
º
C.
Observa-se o início da projeção de agulhas para fora da superfície do nácar. Aumento
de 200x......................................................................................................................183
Figura 7.23. Microscopia ótica de campo claro da superfície do nácar tratada a 550
º
C. É
possível observar a projeção de agulhas para fora da superfície, na lateral da concha
(setas). Aumento de 100x...........................................................................................184
Figura 7.24. Microscopia ótica de campo claro da superfície do nácar tratada a 600
º
C,
mostrando detalhes das agulhas. Aumento de 1000x..................................................184
Figure 7.25. Imagens de AFM sobre a matriz orgânica da superfície do nácar in natura,
mostrando as placas de aragonita (a), e detalhes da camada de
proteínas/polissacarídeos (b) com estruturas globulares de 120 nm (setas). Varreduras
de 5 x 5 µm (a) e 1 x 1 µm (b)....................................................................................185
Figure 7.26. Seqüência de imagens de AFM mostrando a superfície orgânica do nácar
aquecida em diferentes temperaturas: (a) 350, (b) 400, (c) 450 e (d) 600°C.
Intumescimento da camada orgânica, desaparecimento dos contornos das placas de
aragonita e formação de grãos (setas) são observados sobre a superfície. A estrutura
cristalina de calcita em forma de agulhas (asterisco) também é observada em 600°C
(d). Varredura de 5 x 5 μm.........................................................................................186
Figure 7.27. Imagens de AFM mostrando detalhes do nácar da superfície aquecida a
600°C. Em (a), observamos grãos (setas) com 200 nm sobre placas (asteriscos); e em
(b), agulhas. Varredura de 1 x 1 μm............................................................................187
Figure 7.28. Imagem de AFM da seção transversal do nácar de conchas in natura,
mostrando a estrutura de placas de aragonita (destacada por meio de retângulos
brancos desenhados sobre a imagem). Varredura de 45 x 45 µm................................188
Figure 7.29. Ampliação da imagem da Figura 7.28, mostrando maiores detalhes da
estrutura de placas de aragonita (destacada por meio de retângulos brancos
desenhados sobre a imagem). Varredura de 20 x 20 µm.............................................188
Figura 8.1. Aprisionamento em meio poroso......................................................................199
Figura 8.2. Anexação de células em agar............................................................................199
Figura 8.3. Crescimento de monocamadas confluentes de células......................................200
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Lista de figuras
__________________________________________________________________________________________
xvi
Figura 8.4. Célula em meio líquido....................................................................................200
Figura 8.5. Célula seca em ar.............................................................................................201
Figura 8.6. Estudo de tecidos em AFM. Tecido (a); Tecido fixado (b); Corte do tecido
fixado (c) e Corte analisado com AFM (d).................................................................201
Figura 9.1. Algumas formas típicas de bactérias.................................................................214
Figura 9.2. Arranjos mais comuns das bactérias: diplococo (a), estreptococos (b), tétrade
(c), sarcinas (d) e estafilococos (e).............................................................................215
Figura. 9.3. Estrutura típica de uma célula bacteriana.........................................................215
Figura 9.4. Parede celular de uma bactéria Gram-positiva..................................................217
Figura 9.5. Parede celular de uma bactéria Gram-negativa.................................................217
Figura 9.6. Esquema de formação de um biofilme sobre um substrato sólido.....................220
Figura 9.7. Membrana de nitrocelulose..............................................................................223
Figura 9.8. Esquema de medição da superfície da membrana de nitrocelulose por AFM.
Os elementos não estão em escala..............................................................................224
Figura 9.9. Imagens de AFM sobre amostras de MN com varreduras de 30 x 30 µm (a) e
10 x 10 µm (b). O gráfico de seção (c) mostra um corte transversal de 30 µm da
membrana. Escala de altura: 1408 nm (a), 1324 nm (b) e 1500 nm (c)........................226
Figura 9.10. Imagens de AFM sobre amostras de MN-ICC com varreduras de 30 x 30 µm
(a) e 10 x 10 µm (b). A setas em (b) indicam algumas estruturas globulares oriundas
do meio de cultura. No gráfico de seção (c) pode ser observada a alteração na
topografia da membrana devido à presença da ICC. Escala de altura: 1687 nm (a),
1457 nm (b) e 1500 nm..............................................................................................227
Figura 9.11. Imagens de AFM sobre amostras de M24, com varreduras de 30 x 30 µm (a)
e 10 x 10 µm (b). Os asteriscos em (b) indicam algumas células bacterianas enquanto
que as setas, septos transversais. No gráfico de seção (c) pode ser observada a
alteração na topografia da membrana devido à presença de células bacterianas. Escala
de altura: 837,7 nm (a), 510,9 nm (b) e 1500 nm (c)...................................................228
Figura 9.12. Imagens de AFM sobre amostras de M36, com varreduras de 30 x 30 µm (a)
e 10 x 10 µm (b). Um círculo em (a) indica a presença de uma microcolônia. No
gráfico de seção (c), pode ser observada uma clara redução da rugosidade da
superfície. Escala de altura: 900,2 nm (a), 461,9 nm (b) e 1500 nm............................229
Figura 9.13. Imagens de AFM sobre amostras de M72, com varreduras de 30 x 30 µm (a)
e 10 x 10 µm (b). As setas, sinais de soma e asteriscos (b) indicam, respectivamente,
a presença de canais, espaços intersticiais e batérias. O gráfico de seção (c), indica o
perfil desta superfície. Escala de altura: 2585 nm (a), 1416 nm (b) e 1500 nm............230
Figura 9.14. Imagens de AFM sobre amostras de M192, com varreduras de 30 x 30 µm (a)
e 10 x 10 µm (b). Um círculo em (a) indica a presença de uma das “ilhas” de
microcolônias presentes na superfície e as setas, a presença da rede polimérica. O
perfil da superfície é mostrado no gráfico de seção (c). Escala de altura: 2268 nm (a),
1234,3 nm (b) e 1500 nm...........................................................................................231
Figura 9.15. Imagens de AFM sobre amostras de M360, com varreduras de 30 x 30 µm (a)
e 10 x 10 µm (b). As setas em (b) indicam algumas espículas presentes na superfície.
No gráfico de seção (c), pode ser observada um aumento significativo da
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Lista de figuras
__________________________________________________________________________________________
xvii
irregularidade da superfície. Escala de altura: 5159,6 nm (a), 2732,8 nm (b) e 1500
nm..............................................................................................................................232
Figura 9.16. Imagens de AFM sobre MN-ICC (a) e M24 (b), M36 (c), M72 (d), M192 (e),
e M360 (f). As medidas foram realizadas com varredura de 15 x 15 µm. Diferenças
topográficas com a idade do biofilme são facilmente observadas. Escala de altura:
3,300 (a), 0,981 (b), 0,950 (c), 2,103 (d), 2,190 (e), e 3,469 µm (f).............................233
Figura 9.17. Imagens de AFM e gráficos de seção sobre MNI-ICC de 24 (a, c) e 36 horas
(b, d) realizadas em uma varredura de of 5 x 5 µm. É possível identificar a presença
de EPS devido a formação de um filme sobre a superfície bacteriana (obscurecimento
da imagem das células) e redução da diferença entre picos e depressões no gráfico de
seção de 36 horas. Escala de altura: 600 nm...............................................................234
Figura 9.18. Gráfico de freqüência para os valores de rugosidade R
a
da superfície da
membrana MN...........................................................................................................235
Figura 9.19. Gráfico de freqüência para os valores de rugosidade R
a
da superfície da
membrana MN-ICC...................................................................................................235
Figura 9.20. Gráfico de freqüência para os valores de rugosidade R
a
da superfície da
membrana M24..........................................................................................................236
Figura 9.21. Gráfico de freqüência para os valores de rugosidade R
a
da superfície da
membrana M36..........................................................................................................236
Figura 9.22. Gráfico de freqüência para os valores de rugosidade R
a
da superfície da
membrana M72..........................................................................................................237
Figura 9.23. Gráfico de freqüência para os valores de rugosidade R
a
da superfície da
membrana M192........................................................................................................237
Figura 9.24. Gráfico de freqüência para os valores de rugosidade R
a
da superfície da
membrana M360........................................................................................................238
Figura 9.25. Valor médio de R
a
(±e) da superfície de amostras da membrana MN-ICC e
M24-M360. As medidas de rugosidade distinguiram as diferentes alterações na
topografia da superfície da membrana de nitrocelulose: Adesão de glóbulos de ICC
(a); adesão de bactérias (b); formação de EPS (c); rede de EPS (d); crescimento
bacteriano sobre a rede de EPS (e), crescimento do biofilme (f).................................240
Figura 9.26. Imagens de AFM com realce de contornos sobre M24 (a), M36 (b) e M192
(c) realizadas em uma varredura de of 5 x 5 µm. As alterações da rugosidade da
parede celular bacteriana devido a presença de EPS são evidentes. Podem-se observar
detalhes da estrutura polimérica. Escala de altura: 500 nm.........................................241
Figura 10.1. As partes de uma flor completa (www.herbario.com.br).................................248
Figura 10.2. As partes de um estame (www.herbario.com.br).............................................249
Figura 10.3. As partes de um carpelo (www.herbario.com.br)............................................249
Figura 10.4. Diferentes tipos de grãos de pólen (www.pt.Wikipedia.org)...........................250
Figura 10.5. Seção de um grão de pólen, mostrando seus constituintes...............................251
Figura 10.6. Árvore e detalhes das folhas de Ilex paraguariensis (Lorenzi, 1980)..............251
Figura 10.7. Ilustração de Ilex paraguariensis, mostrando detalhes da flor e do fruto
(www.illustratedgardem.org)......................................................................................252
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Lista de figuras
__________________________________________________________________________________________
xviii
Figura 10.8. Imagens de microscopia ótica de grãos de pólen de Ilex paraguariensis, nas
vistas polar (a) e equatorial (b). Barra = 10 µm (Alvez, 1999)....................................253
Figura 10.9. Imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de grão de grãos de
pólen de Ilex paraguariensis (Santos e Mariath, 1999)...............................................253
Figura 10.10. Representação esquemática do experimento de microscopia de força
atômica com polens. Os elementos do desenho não estão em proporção.....................255
Figura 10.11. Imagens de microscopia eletrônica de varredura de grãos de pólen de Ilex
paraguariensis previamente tratados com KMnO
4
por 24 h. Muitas clavas (setas)
podem ser observadas na exina, exceto na região das aberturas (asterisco) (a);
Detalhes da clava na superfície da exina, mostrando sua irregularidade após
tratamento químico (b)...............................................................................................257
Figura 10.13. Imagem de AFM de seções semifinas de grãos de polens não tratado, em
varredura de 70 x 70 µm. Nela está indicando a clava, a parede e a fovina retraída.....258
Figura 10.14. Imagem de AFM da seção semifina de um único grão de pólen, em
varredura de 30 x 30 µm............................................................................................259
Figura 10.15. Imagem de AFM de seções semifina de um único grão de pólen, em
varredura de 15 x 15 µm. Podemos observar algumas camadas formadoras da exina,
sobre a parede............................................................................................................259
Figura 10.16. Detalhe da clava de uma seção semifina de um único grão de pólen, em
varredura de 1 x 1 µm. A superfície não revela nenhum detalhamento da
nanoestrutura da exina................................................................................................260
Figura 10.17. Imagem de AFM de seções semifinas de grãos de pólen tratados com
KMnO
4
, na varredura de 70 x 70 µm.........................................................................261
Figura 10.18. Imagem de AFM da seção semifina de um único grão de pólen tratado com
KMnO
4
, na varredura de 30 x 30 µm..........................................................................261
Figura 10.19. Imagem de AFM da seção semifina de um único grão de pólen tratado com
KMnO
4
, na varredura de 15 x 15 µm..........................................................................262
Figura 10.20. Imagem de AFM da clava de uma seção semifina de um único grão de pólen
tratado com KMnO
4
, na varredura de 1 x 1 µm. Estruturas paralelas, semelhante a
helicóides, são visíveis sobre a superfície (setas). A região retangular é ampliada na
Figura 10.21...............................................................................................................262
Figura 10.21. Imagem de AFM da clava de uma seção semifina de um único grão de pólen
tratado com KMnO
4
, na varredura de 600 x 600 nm. Observa-se com mais detalhes
as estruturas helicoidais (setas). A região retangular é ampliada por “zoom” de
software na Figura 10.22............................................................................................263
Figura 10.22. Detalhe de uma estrutura helicoidal em uma clava da seção semifina de um
grão de pólen com “zoom” por software de 125 x 125 nm..........................................263
Figura 10.23. Modelo para a nanoestrutura da esporopolinina de Ilex paraguariensis:
representação pictográfica (a) e modelo físico (b). Dois parâmetros característicos da
estrutura (a e b), aparecem indicados na Figura..........................................................264
Figura 10.24. Gráficos de seção para a medida de a de uma estrutura helicoidal feito sobre
o “zoom” de 125 x 125 nm de uma imagem com varredura de 600 x 600 nm.............265
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Lista de figuras
__________________________________________________________________________________________
xix
Figura 10.25. Gráficos de seção para a medida de b de uma estrutura helicoidal feito sobre
o “zoom” de 125 x 125 nm de uma imagem com varredura de 600 x 600 nm.............265
Figura 10.26. Histograma de freqüência para os valores de a para a amostra de pólen 1.....266
Figura 10.27. Histograma de freqüência para os valores de a para a amostra de pólen 2.....266
Figura 10.28. Histograma de freqüência para os valores de a para a amostra de pólen 3.....267
Figura 10.29. Histograma de freqüência para os valores de a para a amostra de pólen 4.....267
Figura 10.30. Histograma de freqüência para os valores de a para a amostra de pólen 5.....268
Figura 10.31. Histograma de freqüência para os valores de b para a amostra de pólen 1.....268
Figura 10.32. Histograma de freqüência para os valores de b para a amostra de pólen 2.....269
Figura 10.33. Histograma de freqüência para os valores de b para a amostra de pólen 3.....269
Figura 10.34. Histograma de freqüência para os valores de b para a amostra de pólen 4.....270
Figura 10.35. Histograma de freqüência para os valores de b para a amostra de pólen 5.....270
Figura D.1. Prensa Sky para compactação uniaxial (a) e estufa Ícamo para secagem e
esterilização de materiais (b)......................................................................................300
Figura D.2. Forno tubular para queima em atmosfera controlada (a) e detalhe interno do
forno tubular mostrando o tubo de alumina (b)...........................................................300
Figura D.3. Muflas para tratamento térmico em atmosfera de ar. (a) e Forno de
microondas adaptado para tratamento em atmosfera de ar (b).....................................301
Figura D.4. Forno tubular, microondas adapatado e os elementos da linha de gases (a). Em
(b), detalhe da tubulação das duas linhas da instalação de gases.................................301
Figura D.5. Medidor de área superficial e porosidade AUTOSORB-1-MP (a) e balança
analítica Bioprecisa (b) para a medição da massa de materiais....................................302
Figura D.6. Espectrômetro UV-VIS-IR TIDAS para análise de sólidos e soluções (a) e
microscópio ótico metalográfico LV 100D para o estudo de superfícies (b)................302
Figura D.7. Microcomputadores para a análise de dados e controle de equipamentos.........303
Figura E.1. O MultiMode SPM do LMA. MP = mesa pneumática; M = micrsocópio; LC =
sistema lupa mais câmera de vídeo; TV = monitor de TV; V = vídeo de imagem; C =
controlador Nanoscope IIIa; F = fonte de iluminação episcópica para a lupa..............305
Figura E.2. O Microscópio. Ca = cabeçote; Es = scanner; Ba = base..................................306
Figura E.3. Detalhe do cabeçote.........................................................................................306
Figura E.4. Um dos porta sondas de AFM do SPM............................................................307
Figura E.5. Caixa com sondas para AFM no modo intermitente.........................................307
Figura E.6. As partes de uma sonda de AFM......................................................................308
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LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1. Principais métodos experimentais e as propriedades físico-químicas
envolvidas.....................................................................................................................37
Tabela 4.1: Índices de reciclagem (%) de alguns materiais no Brasil. Fonte: Cempre/PBR,
1999............................................................................................................................101
Tabela 4.2 Vantagens e desvantagens da reciclagem dos resíduos sólidos...........................101
Tabela 5.1. Principais componentes do pedúnculo fresco do caju........................................108
Tabela 6.1. Identificação dos suportes cerâmicos, conforme a pressão de compactação e
composição da massa pré-cerâmica.............................................................................138
Tabela 7.1. Resultados das medidas de microdureza (em HV) e sua estatística descritiva. S
= média amostral, σ = desvio padrão e e = erro de estimação (t = 2,262, para α =
0,05)...........................................................................................................................178
Tabela 7.2. Tabela simplificada dos resultados do teste ANOVA com comparações
múltiplas (procedimento Tukey) para as medidas de microdureza nas conchas de
mexilhão in natura e tratadas termicamente (α = 0,05)................................................179
Tabela 9.1. O valor médio, desvio padrão (σ) e erro de estimação (e) de R
a
para a
superfície da membrana de nitrocelulose MN, MN-ICC e MNI-ICC em 24-360 horas.
Varredura de 30 x 30 µm e escala de altura de 2000 nm..............................................238
Tabela 9.2. Tabela simplificada dos resultados do teste ANOVA........................................239
Tabela 10.1. O valor médio, desvio padrão (σ) e erro de estimação (e) de a para estruturas
helicoidais presentes na superfície de grãos de polén tratados quimicamente com
KMnO
4
. Nível de significância (α) = 0,05 e (t = 2,045)...............................................268
Tabela 10.2. O valor médio, desvio padrão (σ) e erro de estimação (e) de b para estruturas
helicoidais presentes na superfície de grãos de polens tratados quimicamente com
KMnO
4
. Nível de significância (α) = 0,05 e (t = 2,045)...............................................271
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SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS........................................................................................................XI
LISTA DE TABELAS......................................................................................................XX
1. INTRODUÇÃO..............................................................................................................29
SEÇÃO I - FUNDAMENTOS DE MÉTODOS ANALÍTICOS.......................................35
2. MÉTODOS ANALÍTICOS...........................................................................................36
2.1 INTRODUÇÃO...........................................................................................36
2.2 ESPECTROSCOPIA DE ENERGIA DISPERSIVA DE RAIOS-X (EDX)..38
2.3 DIFRAÇÃO DE RAIOS-X (XRD)..............................................................39
2.4 ANÁLISES TÉRMICAS .............................................................................41
2.5 TÉCNICAS MICROSCÓPICAS .................................................................44
2.5.1 MICROSCOPIA ÓTICA........................................................44
2.5.2 MICROSCOPIA ELETRÔNICA............................................48
2.5.3 MICROSCOPIA DE VARREDURA POR SONDA (SPM)....53
2.6 ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NO INFRAVERMELHO COM
TRANSFORMADA DE FOURIER (FT-IR) .....................................................62
2.7 DUREZA.....................................................................................................64
2.8 ETAPAS GERAIS DE PROCESSOS ANALÍTICOS..................................66
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...............................................................69
3. TRATAMENTO DE DADOS ANALÍTICOS..............................................................73
3.1 INTRODUÇÃO...........................................................................................73
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Sumário
__________________________________________________________________________________________
xxii
3.2 CONFIABILIDADE....................................................................................74
3.3 PRINCÍPIOS DE ESTATÍSTICA................................................................75
3.3.1 RESUMO DE DADOS ESTATÍSTICOS...............................76
3.3.2 DISTRIBUIÇÕES DE PROBABILIDADE............................78
3.3.3 DISTRIBUIÇÃO NORMAL..................................................80
3.3.4 AMOSTRAGEM....................................................................82
3.3.5 DISTRIBUIÇÕES AMOSTRAIS...........................................83
3.3.6 TEOREMA DO LIMITE CENTRAL.....................................84
3.3.7 ESTIMAÇÃO.........................................................................84
3.3.8 TESTES DE SIGNIFICÂNCIA..............................................86
3.3.9 TESTE DE NORMALIDADE................................................88
3.4 REJEIÇÃO DE RESULTADOS..................................................................89
3.5 ROTEIRO PARA O TRATAMENTO DE DADOS ANALÍTICOS.............89
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...............................................................92
SEÇÃO II - PROVEITAMENTO DE RESÍDUOS..........................................................93
4. LIXO – O QUE FAZER COM ELE?...........................................................................94
4.1 INTRODUÇÃO...........................................................................................94
4.2 CLASSIFICAÇÃO DOS RESÍDUOS SÓLIDOS ........................................95
4.3 RESÍDUOS E MEIO AMBIENTE ..............................................................97
4.4 CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS DO LIXO...............................99
4.5 RECICLAGEM...........................................................................................99
4.6 EXPERIÊNCIAS COM RECICLAGEM...................................................102
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................104
5. PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS CINZAS DO BAGAÇO DO
PEDÚNCULO DE CAJU................................................................................................106
5.1 INTRODUÇÃO.........................................................................................106
5.1.1 O CAJUEIRO.......................................................................106
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Sumário
__________________________________________________________________________________________
xxiii
5.1.2 O CAJU................................................................................107
5.1.2 O BAGAÇO DO CAJU........................................................109
5.1.3 INCINERAÇÃO...................................................................109
5.1.4 OBJETIVOS.........................................................................111
5.2 MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................112
5.2.1 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS.....................................112
5.2.2 DETERMINAÇÃO DA PERDA DE MASSA......................112
5.2.3 DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA POR EDX
......................................................................................................113
5.2.4 ANÁLISE MINERALÓGICA POR XRD............................113
5.2.5 ANÁLISES TÉRMICAS POR TGA E DSC.........................113
5.2.6 PRESENÇA DE BICABORNATOS....................................114
5.2.7 ANÁLISE POR MICROSCOPIA ÓTICA DE CAMPO CLARO
......................................................................................................114
5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................114
5.3.1 PREPRARAÇÃO DAS AMOSTRAS E VARIAÇÃO DE
MASSA.........................................................................................114
5.3.2 DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA POR EDX
......................................................................................................115
5.3.3 ANÁLISE MINERALÓGICA POR XRD E PRESENÇA DE
BICARBONATOS........................................................................115
5.3.4 ANÁLISES TÉRMICAS POR TGA E DSC.........................117
5.3.5 ANÁLISE POR MICROSCOPIA ÓTICA DE CAMPO CLARO
......................................................................................................118
5.4 CONCLUSÕES.........................................................................................119
COLABORADORES......................................................................................121
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................122
6. IMOBILIZAÇÃO DE INVERTASE EM CERÂMICAS DE CINZAS VOLANTES
DE CARVÃO MINERAL...............................................................................................125
6.1 INTRODUÇÃO.........................................................................................125
6.1.1 ENZIMAS............................................................................125
6.1.2 ENZIMAS E BIOTECNOLOGIA........................................126
6.1.3 IMOBILIZAÇÃO.................................................................127
6.1.4 AÇÚCAR INVERTIDO.......................................................132
6.1.5 IMOBILIZAÇÃO DA INVERTASE....................................134
6.1.6 CINZAS DE CARVÃO MINERAL.....................................134
6.1.7 OBJETIVOS.........................................................................137
6.2 MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................137
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Sumário
__________________________________________________________________________________________
xxiv
6.2.1 MATERIAIS........................................................................137
6.2.2 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS.....................................138
6.2.3 SILANIZAÇÃO DAS CERÂMICAS E IMOBILIZAÇÃO DA
INVERTASE................................................................................139
6.2.4 ENSAIO ENZIMÁTICO......................................................139
6.2.5 HIDRÓLISE DA SACAROSE.............................................140
6.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................141
6.3.1 CINÉTICA DA HIDRÓLISE DA SACAROSE COM A
INVERTASE SOLÚVEL (5,39MG/ML).......................................141
6.3.2 CINÉTICA DA HIDRÓLISE DA SACAROSE COM A
INVERTASE IMOBILIZADA EM CERÂMICA TIPO 1, 2, E 3..142
6.3.3 DETERMINAÇÃO DO MELHOR SISTEMA INVERTASE
IMOBILIZADA APÓS O RE-USO...............................................143
6.3.4 RE-USO DAS CERÂMICAS TIPO 3 SUBMETIDAS A
DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE.................143
6.3.5 EFEITO DA ATIVIDADE DA INVERTASE IMOBILIZADA
EM CERÂMICAS COM DIFERENTES CONTEÚDOS DE ÓXIDO
DE SILÍCIO..................................................................................145
6.3.6 EFEITO DA ATIVIDADE DA INVERTASE IMOBILIZADA
NAS CERÂMICAS TIPO 4 - 8 COM DIFERENTES CONTEÚDOS
DE ENZIMA.................................................................................148
6.3.7 RELAÇÃO DA ATIVIDADE DA INVERTASE
IMOBILIZADA NAS CERAMICAS TIPO 1 (127,32 MPA) COM
DIFERENTES CONTEUDOS DE ENZIMA................................151
6.4 CONCLUSÕES.........................................................................................152
COLABORADORES......................................................................................153
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................154
7. CARACTERIZAÇÃO DE CONCHAS DE MEXILHÃO PERNA PERNA
TRATADAS TERMICAMENTE...................................................................................159
7.1 INTRODUÇÃO.........................................................................................159
7.1.1 MOLUSCOS........................................................................159
7.1.2 A CONCHA DOS BIVALVES.............................................162
7.1.3 APLICAÇÕES TECNOLÓGICAS DAS CONCHAS...........165
7.1.4 COMPORTAMENTO TÉRMICO DA CONCHA................166
7.1.5 MEXILHÕES.......................................................................166
7.1.6 OBJETIVOS.........................................................................167
7.2 MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................168
7.2.1 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS.....................................168
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Sumário
__________________________________________________________________________________________
xxv
7.2.2 ANÁLISE MINERALÓGICA POR XRD............................168
7.2.3 ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO COM
TRANSFORMADA DE FOURIER (FT-IR).................................169
7.2.4 MEDIDAS DE MICRODUREZA........................................169
7.2.5 ANÁLISE POR MICROSCOPIA ÓTICA DE CAMPO CLARO
......................................................................................................170
7.2.6 ANÁLISE POR MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA
(AFM)...........................................................................................170
7.2.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA...................................................172
7.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................172
7.3.1 ANÁLISE MINERALÓGICA POR XRD............................172
7.3.2 ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO COM
TRANSFORMADA DE FOURIER (FT-IR).................................176
7.3.3 MEDIDAS DE MICRODUREZA........................................178
7.3.4 ANÁLISE POR MICROSCOPIA ÓTICA DE CAMPO CLARO
......................................................................................................181
7.3.5 ANÁLISE POR MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA
(AFM)...........................................................................................185
7.4 CONCLUSÕES.........................................................................................189
COLABORADORES......................................................................................190
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................192
SEÇÃO III - MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA EM MATERIAIS
BIOLÓGICOS.................................................................................................................196
8. AFM EM CÉLULAS, TECIDOS E BIOMATERIAIS..............................................197
8.1 INTRODUÇÃO.........................................................................................197
8.2 PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS ....................................198
8.3 AFM EM CÉLULAS.................................................................................202
8.4 AFM EM MONOCAMADAS E BIOFILMES BACTERIANOS...............205
8.5 AFM EM TECIDOS..................................................................................206
8.6 AFM EM BIOMATERIAIS.......................................................................206
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................208
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Sumário
__________________________________________________________________________________________
xxvi
9. ESTUDO TOPOGRÁFICO DA FORMAÇÃO DE BIOFILMES DE
ENTEROCOCCUS FAECALIS POR AFM.....................................................................213
9.1 INTRODUÇÃO.........................................................................................213
9.1.1 CÉLULAS PROCARIÓTICAS E EUCARIÓTICAS............213
9.1.2 BACTÉRIAS........................................................................213
9.1.3 ENTEROCOCOS.................................................................218
9.1.4 BIOFILMES.........................................................................219
9.1.5 CARACTERIZAÇÃO DE BIOFILMES...............................220
9.1.6 OBJETIVOS.........................................................................222
9.2 MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................222
9.2.1 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS.....................................222
9.2.2 ANÁLISE POR MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA
(AFM)...........................................................................................223
9.2.3 GRÁFICO DE SEÇÃO.........................................................224
9.2.4 REALCE DE CONTORNOS................................................224
9.2.5 ANÁLISE DE RUGOSIDADE.............................................225
9.2.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA...................................................225
9.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................225
9.3.1 IMAGENS DE AFM E GRÁFICOS DE SEÇÃO.................225
9.3.2 ANÁLISE DE RUGOSIDADE.............................................234
9.3.3 REALCE DE CONTORNOS................................................241
9.4 CONCLUSÕES.........................................................................................242
COLABORADORES......................................................................................242
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................244
10.NANOESTRUTURA DA ESPOROPOLININA DE GRÃOS DE POLÉN DE ILEX
PARAGUARIENSIS ST. HIL..........................................................................................247
10.1 INTRODUÇÃO.......................................................................................247
10.1.1 ESPERMATÓFITAS..........................................................247
10.1.2 A FLOR..............................................................................247
10.1.3 O PÓLEN...........................................................................250
10.1.4 ILEX PARAGUARIENSIS ST. HIL.....................................251
10.1.5 A ESPOROPOLENINA.....................................................254
10.1.6 OBJETIVOS.......................................................................254
10.2 MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................254
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Sumário
__________________________________________________________________________________________
xxvii
10.2.1 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS...................................254
10.2.2 ANÁLISE POR MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA
(AFM)...........................................................................................255
10.2.3 GRÁFICO DE SEÇÃO.......................................................256
10.2.4 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (SEM)
......................................................................................................256
10.2.5 MICROSCOPIA ÓTICA DE CAMPO CLARO.................256
10.2.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................256
10.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................257
10.3.1 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (SEM)
......................................................................................................257
10.3.2 MICROSCOPIA ÓTICA DE CAMPO CLARO.................257
10.3.3 ANÁLISE POR MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA258
10.3.4 GRÁFICOS DE SEÇÃO.....................................................264
10.4 CONCLUSÕES.......................................................................................271
COLABORADORES......................................................................................272
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................273
11. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS........................................................................275
ANEXOS..........................................................................................................................280
A. ARTIGOS PUBLICADOS.........................................................................................281
A.1 SPOROPOLLENIN NANOSTRUCTURE OF ILEX PARAGUARIENSIS
A.ST.HIL POLLEN GRAINS (2005)..............................................................281
A.2 EVALUATION OF RED BLOOD CELLS OF HEALTHY SUBJECTS AND
PATIENTS WITH MYELODYSPLASTIC SYNDROME (2005)...................282
A.3 PRODUCTION AND CHARACTERIZATION OF THE CASHEW
(ANACARDIUM OCCIDENTALE L.) PEDUNCLE BAGASSE ASHES (2007)
........................................................................................................................283
A.4 AFM AND HYDRODYNAMIC ELECTROCHEMICAL
CHARACTERIZATION OF THE SELF-ASSEMBLED 1,4-DITHIANE ON
GOLD SURFACE (2007)................................................................................285
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Sumário
__________________________________________________________________________________________
xxviii
B. ARTIGOS SUBMETIDOS.........................................................................................287
B.1 TOPOGRAPHICAL ALTERATIONS AND ANTIMICROBIAL EFFECT
OF LIPPIA SIDOIDES ESSENCIAL OIL AGAINST ENTEROCOCCUS
FAECALIS BIOFILMS (2006) .......................................................................287
B.2 AGING OF ENTEROCOCCUS FAECALIS BIOFILMS: OBSERVATION
OF TOPOGRAPHICAL CHANGES BY ATOMIC FORCE MICROSCOPY
(2007)..............................................................................................................289
B.3 DEFORMATION INDUCED MARTENSITE IN AN AISI 301LN
STAINLESS STEEL: CHARACTERIZATION AND INFLUENCE ON
PITTING CORROSION RESISTANCE (2007) ..............................................291
B.4 OPTICAL ABSORPTION AN ELECTRONIC BAND STRUCTURE FIRST-
PRINCIPLES CALCULATIONS OF α-GLYCINE CRYSTALS (2007).........292
B.5 DETERMINATION OF THE FRACTAL DIMENSION OF LEAF
VASCULAR SYSTEM SPECIES OF GENUS RELBUNIUM (ENDL.) HOOK.
F. (RUBIACEAE) (2007)................................................................................294
C. RTIGOS À SUBMETER............................................................................................295
C.1 IMMOBILIZATION OF INVERTASE INTO SINTERIZED COAL FLY
ASHES FOR HYDROLYSIS OF SUCROSE: STABILITY, PROPERTIES AND
APPLICATION IN BIOREACTORS (2007)...................................................295
C.2 X-RAY DIFFRACTION, FOURIER TRANSFORM INFRARED,
MICROHARDNESS, AND ATOMIC FORCE MICROSCOCOPY ANALYSES
OF THE OF THE PERNA PERNA MUSSEL SHELLS THERMALLY
TREATED (2007) ...........................................................................................297
D. LABORATÓRIO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE MATERIAS (LCTM)......299
E. O MICROSCÓPIO DE VARREDURA POR SONDA DO LMA.............................304
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INTRODUÇÃO
Quando comecei a minha pós-graduação em Física da Matéria Condensada no
Departamento de Física da Universidade Federal do Ceará (UFC), em 2001, com o Prof. Dr.
Valder Nogueira Freire, não imaginava a quantidade de temas que o Grupo de
Semicondutores, no qual ingressei, estaria envolvido. Meu mestrado começou com um
trabalho teórico, na área de Física Estatística, a simulação da quebra da rigidez dielétrica de
dispositivos MOS (do inglês, “Metal Oxide Semiconductor”) por meio da percolação em
sistemas tridimensionais. Este trabalho resultou na publicação: “A multi-defect initialization-
based percolation model: a successful scheme to explain dielectric breakdown in MOS
devices. Physica E 17 (2003) 645-647”. Juntamente com a continuidade deste trabalho,
através de modelos com redes de Voronoy, ingressamos na área experimental (parte
importante de minha formação na graduação), que inicialmente ficou concentrada na
preparação e caracterização de cerâmicas de AlN. Devido à ausência de um forno com
atmosfera controlada no Departamento de Física, indispensável à produção das referidas
cerâmicas e a um contato com os profs. Jorge L. Martins do Instituto de Química e
Geociências (IQG) da Universidade Federal de Pelotas (UFPEL) e Benildo Souza Cavada, do
Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas (BioMol-Lab), da Universidade Federal do
Ceará (UFC), optamos por alterar o tópico de pesquisa. Iniciamos a preparação e
caracterização de cerâmicas das cinzas volantes de carvão mineral, um resíduo originado da
geração de energia elétrica pela Usina Termelétrica Presidente Médici, Candiota (RS). Este
tema culminou na defesa de minha dissertação de Mestrado, no início de 2003. Foi a primeira
vez que o grupo de semicondutores produziu um trabalho totalmente experimental. O curioso
desta dissertação, é que foi produzida sem a infra-estrutura necessária para tal, pois o Grupo
de Semicondutores desenvolvia apenas trabalhos teóricos. Então, como o trabalho foi
realizado? A resposta foi interação. Obtivemos apoio tanto na parte de infraestrutura como de
conhecimento técnico do Núcleo de Tecnologia do Ceará (NUTEC); dos Laboratórios de
Ótica Não-Linear e Ciência de Materiais; BioMol-Lab e Raios-X do Departamento de Física
da UFC; do Laboratório de Análises Térmicas do Departamento de Química da UFC; da
UFPEL e do Laboratório de Imunopatologia Keizo Assami (LIKA) da Universidade Federal
1
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1. Introdução
__________________________________________________________________________________________
30
de Pernambuco (UFPE). Fornos, estufas, difratômetro, microscópio eletrônico de varredura,
analisadores térmicos (DTA/TGA/DSC), balança analítica, reagentes e vidrarias são alguns
dos recursos colocados a nossa disposição pelas parcerias feitas. O resultado não poderia ter
sido outro: uma dissertação experimental produzida por um grupo teórico. Este fato acabou
por direcionar toda a nossa pesquisa futura (e minha vida também...).
Entretanto, isto seria apenas a ponta do iceberg. Os resultados promissores obtidos
com as cinzas de carvão mineral, que levaram a confecção de três patentes, abriram os
horizontes para o estudo de outros resíduos. Para tal, por intermédio do Prof. Valder e das
recentes interações feitas, ampliamos ainda mais as parcerias com laboratórios e
departamentos dentro e fora de nossa universidade. Também surgiu uma nova necessidade: a
montarmos um laboratório para preparação e caracterização de materiais. Para tal, projetos
necessitariam serem escritos visando à aquisição de recursos.
Como resultado de um projeto em conjunto, meu orientador e os professores José
Alzamir da Costa, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) e Eronides F. da
Silva Jr., da UFPE implementaram o Laboratório de Microscopia Atômica (LMA) no
Departamento de Física da UFC (Anexo E). Nele, sob a chefia do Prof. Dr. José Alexander
King Freire, foi instalado um microscópio de varredura por sonda (SPM). Através do uso da
microscopia de força atômica (AFM) diversas pesquisas se iniciaram:
• Caracterização de polímeros com o Departamento de Energia Nuclear (DEN) da UFPE;
• Estudo da nano estrutura de grãos de pólen com o BioMol-Lab, IQG e o Laboratório de
Anatomia e Morfologia Vegetal do Departamento de Botânica da Universidade Federal do
Rio Grande do Sul (UFRGS);
• Análise de formação de martensita em aços com o Laboratório de Caracterização de
Materiais (LACAM) do Departamento de Engenharia e Ciência de Materiais da UFC;
• Estudo da superfície de ouro modificada por filmes finos de 1,4-dithiane com o
Laboratório de Eletroquímica do Departamento de Química da UFC;
• Caracterização topográfica de biofilmes bacterianos com o Laboratório de Microbiologia
do Departamento de Patologia e Medicina Legal da UFC, BioMol-Lab e Faculdade de
Medicina/Sobral da UFC;
• Estudo de conchas de mexilhão com o Centro de Ciências Tecnológicas da Terra da
Universidade do Vale do Itajaí (Santa Catarina), BioMol-Lab, IQG e Departamento de
Biologia Molecular da Universidade Federal da Paraíba (UFPA);
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1. Introdução
__________________________________________________________________________________________
31
• Caracterização de resíduos de caju com o BioMol-Lab, IQG, Departamento de Biologia
Molecular da Universidade Federal da Paraíba (UFPA) e Laboratório de Anatomia e
Morfologia Vegetal (UFRGS);
• Análise topográfica de lectinas e cristais e aminoácidos com o BioMol-Lab;
• Análise topográfica de polissacarídeos sulfatados com o BioMol-Lab e Departamento de
Engenharia de Pesca da UFC; dentre outros.
Estas pesquisas, muitas ainda em andamento, tiveram como resultado a confecção
de patentes, a publicação/submissão de diversos artigos e ainda, apresentações em congressos
nacionais e internacionais.
Com a aprovação dos projetos “Caracterização e aplicações tecnológicas de
carvão poroso a partir de cascas de arroz”, “Preparação e caracterização de cerâmicas de AlN”
e a criação da Rede de Nanobioestruturas, foi possível disponibilizar recursos suficientes para
começar a montar a infra-estrutura necessária a preparação e caracterização de materiais.
Estruturar e equipar um laboratório não são atividades fáceis. Envolvem contatos
com fornecedores, levantamento de cotações, confecção de projetos de equipamentos/infra-
estrutura e uma série de tarefas que consomem tempo e esforço para que os erros sejam
minimizados, dentro de um orçamento apertado e de uso restrito como o fornecido por órgãos
públicos. Aos poucos, conseguimos. Montamos o Laboratório de Ciência e Tecnologia de
Materiais (LCTM-UFC), dividido em dois laboratórios: um de preparação de amostras e outra
de caracterização de materiais (Anexo D).
Com uma infra-estrutura mínima montada, diversos tópicos de pesquisa
experimental surgiram, somando-se aqueles envolvidos com o AFM. Também houve a
necessidade de treinamento em diferentes técnicas experimentais, tanto de preparação como
de caracterização de materiais. Surgiu assim um dilema com relação a minha tese: escolher
um tema restrito a determinada área de pesquisa explorando-o ao máximo, dentro do tempo
disponível (o que normalmente é praticado nos trabalhos de pós-graduação); ou desenvolver
vários temas envolvendo diferentes técnicas e áreas de conhecimento (prática não usual da
pós-graduação). A necessidade de execução dos projetos aprovados, operacionalização do
laboratório recém criado e treinamento em diferentes técnicas de preparação e caracterização
de materiais (inorgânicos e orgânicos), aliado à desejos pessoais de orientado/orientador,
levaram-me a escolher o último caminho. Confesso que esta escolha pareceu, a princípio,
“exótica” e mostrou-se, muitas vezes, até tortuosa. Entretanto, jamais aprendi tantas coisas e
interagi com tantas pessoas, em tão pouco tempo. E assim nasceu esta tese. É o resultado dos
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1. Introdução
__________________________________________________________________________________________
32
esforços conjuntos de diversos pesquisadores e grupos de trabalho. Apresenta algumas das
atividades de pesquisa que realizei, sob a orientação do Prof. Dr. Valder Nogueira Freire, em
meu período de doutorado em Física da Matéria Condensada no Departamento de Física da
Universidade Federal do Ceará.
Na Seção 1, introdutória, são abordados conceitos essenciais que envolvem os
métodos analíticos. Julguei importante incluir uma seção exclusivamente sobre este tema, já
que é tão utilizado no presente trabalho e fundamental em qualquer pesquisa científica. Além
disto, torna mais compreensível os temas abordados nesta tese, principalmente aos estudantes
de gradução que estão iniciando atividades de pesquisa. O Capítulo 2 trata dos principais
métodos analíticos utilizados em análise quantitativa. XRD, EDX, análises térmicas e
microscopia estão entre os temas abordados; enquanto que o Capítulo 3 apresenta os
principais tópicos envolvendo tratamento de dados, tais como confiabilidade e métodos
estatísticos. Optei pelo idioma inglês na abreviatura dos principais métodos analíticos, tanto
nesta seção como nas posteriores, já que é prática consagrada no meio científico. Entretanto,
coloquei sua tradução na língua pátria.
Na Seção 2 são abordados temas envolvendo o aproveitamento de resíduos. No
Capítulo 4 é feita uma breve introdução ao tema. Três resíduos foram estudados neste
trabalho: o bagaço do pedúnculo de caju do Estado do Ceará; as cinzas volantes de carvão
mineral do Estado do Rio Grande do Sul e as conchas de mexilhão do Estado de Santa
Catarina.
A cultura do caju é uma das principais atividades agropecuárias do nordeste
Brasileiro. Seus produtos mais conhecidos são a castanha, o suco e o líquido contido no
mesocarpo da castanha, o LCC. A maior parte do pedúnculo produzido (pseudofruto) é
desperdiçada, sendo seu uso concentrado na extração do suco. O Capítulo 5 apresentada os
resultados obtidos com a preparação e caracterização das cinzas originadas da queima de um
dos principais resíduos gerados pela extração de suco: o bagaço do pedúnculo de caju.
No Capítulo 6 é explorado o potencial da utilização das cerâmicas feitas com as
cinzas volantes da Usina Termelétrica Presidente Médici, Candiota (RS) como suportes para a
imobilização de enzimas, em particular, a invertase. A invertase é usada no processo de
fabricação de açúcar invertido, resultado da decomposição da sacarose em frutose e glicose.
No Capítulo 7, foi investigado por medidas de XRD, FT-IR, microdureza,
microscopia ótica e AFM o comportamento das conchas de mexilhão Perna perna, quando
submetidas a um tratamento térmico. O estudo do comportamento térmico e mecânico da
superfície perolada (conhecida como nácar) é importante, pois este material tem aplicações
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1. Introdução
__________________________________________________________________________________________
33
em implantes e na regeneração óssea, onde processos de esterilização são necessários.
Na Seção 3 é apresentado o resultado de algumas das pesquisas feitas utilizando a
microscopia de força atômica (AFM) na caracterização de materiais biológicos. Decidi abrir
uma seção sobre este tema já que os materiais envolvidos não faziam parte da categoria de
resíduos, sendo os resultados obtidos associados à área da biologia estrutural. O Capítulo 8,
introdutório, é destinado mostrar o AFM como técnica poderosa para análise de materiais
biológicos. Biofilmes e grãos de pólen foram os materiais escolhidos nesta tese.
No Capítulo 9, foi investigada por microscopia de força atômica, a alteração
topográfica nas superfícies de biofilmes de Enterococcus faecalis após 24, 36, 72, 192, 360
horas de crescimento. Imagens de altura, gráficos de seção e análise de rugosidade foram
realizadas sobre biofilmes crescidos em membranas estéreis de nitrocelulose. O estudo de
biofilmes é importante na moderna medicina devido a sua influência no tratamento de
doenças infecciosas com antibióticos.
No Capítulo 10 foi usado o AFM para estudar a nanoestrutura da exina de grãos
de pólen de Ilex paraguariensis (a popularmente denominada erva-mate). Pesquisas
utilizando-se AFM têm demonstrado que determinados parâmetros estruturiais da estrutura da
esporopolinina (biopolímero formador da exina) são característicos da espécie. Convém
ressaltar que a esporopolinina é considerada um dos biopolímeros mais resistentes, tendo
chamado a atenção de cientistas e engenheiros de materiais.
Por fim, no Capítulo 11, são feitas as conclusões gerais e perspectivas dos temas
apresentados nesta tese.
Nos ANEXOS A-C, estão cópias parciais (título, autores, resumo, periódico) dos
artigos publicados, submetidos e à submeter; associados não apenas ao presente trabalho, mas
a pesquisas diversas que realizei durante meu doutorado. Este procedimento foi realizado
segundo recomendação de meu orientador, como um registro de minha produção científica no
doutorado. O Laboratório de Ciência e Tecnologia de Materiais (LCTM-UFC) é apresentado
no Anexo D. Meu orientador e eu achamos importante este registro, pois a montagem do
LCTM-UFC sob a supervisão do Prof. Valder, fez parte de uma das minhas atividades como
estudante de doutorado aqui no Departamento de Física. Também julguei importante
apresentar algumas características do microscópio de varredura por sonda (SPM) existente em
nosso departamento, já que seu uso esteve diretamente envolvido em dois temas abordados na
seção III. Deste assunto trata o Anexo E.
Por ser uma tese realizada em um departamento de Física, envolvendo materiais
na sua maioria de origem biológica, achei prudente fazer uma descrição mais detalhada do
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1. Introdução
__________________________________________________________________________________________
34
contexto no qual estes materiais se inserem. Por exemplo, para falar da nanoestrutura da exina
de grãos de pólen de Ilex paraguariensis (Capítulo 10), comecei com conceitos como
espermatófitas (que significa plantas com semente), flor, grãos de pólen, exina, etc. até chegar
a estrutura alvo do estudo. Acredito que este procedimento tornou o texto mais rico,
possibilitando uma melhor compreensão ao leitor, que na sua maioria deve estar associado a
área da Física. Também mostra parte do trabalho que tive quando da realização desta tese.
Afinal, não tenho o custume de estudar algo sem pelo menos saber o que seja este algo
(mesmo que de uma maneira mais genérica). Este procedimento foi realizado em diversos
capítulos deste trabalho.
Nenhum trabalho é perfeito. É claro que falhas ocorreram. Entretanto, como uma
frase dita por um produtor de uvas no filme “Um bom ano”, de Ridley Scott, “...aprendemos
com nossos erros e não com os acertos. Então, errar é bom. O problema é quando isto se torna
um hábito...”. Desta forma, espero que esta tese, dentro de suas limitações, consiga expressar
pelo menos em parte, as pesquisas que foram realizadas por mim, sobre a orientação do Prof.
Valder Nogueira Freire, no período de meu doutorado no Departamento de Física da
Universidade Federal do Ceará.
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MÉTODOS ANALÍTICOS
2.1 INTRODUÇÃO
Pesquisadores da área da física, química, biologia e engenharia dispõem de um
impressionante conjunto de poderosas e elegantes ferramentas para reunir informações
qualitativas e quantitativas sobre a composição e estrutura da matéria. Estas ferramentas são
reunidas no que denominamos métodos analíticos. Um método analítico qualitativo fornece
informações sobre a identidade das espécies atômicas ou moleculares da matéria; um método
quantitativo, em contraste, fornece informações numéricas, tais como as quantidades relativas
de um ou mais destes componentes. Normalmente estes métodos são utilizados em conjunto,
para completa caracterização de um material a ser analisado (Blaedel, 1970; Skoog, 2002).
Os métodos analíticos são normalmente classificados, por razões históricas, como
clássicos e instrumentais. Os métodos clássicos (ou de via úmida) são aqueles realizados por
separação dos componentes focos da análise (os analitos), em uma amostra, por meio de
técnicas de precipitação, extração ou destilação. Os componentes separados são submetidos à
ação de certos reagentes resultando em produtos reconhecíveis por suas cores, solubilidade,
pontos de ebulição e fusão, seus odores ou atividades óticas (análise qualitativa). Para uma
análise quantitativa, a massa do analito e dos compostos originados deste é determinada por
meio de gravimetria ou por procedimentos titulométricos, onde é medido o volume ou a
massa de um reagente padrão para reagir completamente com o analito. Os métodos
instrumentais são aqueles que utilizam fenômenos distintos dos clássicos para explorar a
composição e estrutura de materiais. Propriedades associadas aos fenômenos de emissão,
absorção, espalhamento, refração e difração da radiação; bem como medidas do potencial
elétrico, carga e resistência elétrica, massa, relação massa/carga, velocidade da reação,
características térmicas e de radiatividade, interação da luz visível, elétrons e de sondas com a
superfície são utilizadas para a análise quantitativa. A cada uma destas propriedades está
associado um método instrumental (Tab. 2.1), que fazem uso normalmente de equipamentos
sofisticados. Também são utilizadas técnicas eficientes de cromatografia e de eletroforese, em
substituição a destilação, extração e precipitação na separação de componentes de misturas
2
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2. Métodos analíticos
__________________________________________________________________________________________
37
complexas, utilizadas nos métodos clássicos. Os métodos analíticos instrumentais vêm
dominando os laboratórios, como técnica padrão para o estudo da composição e estrutura de
materiais (Baccan et al., 1979; Skoog, 2002; Harris, 2005).
Tabela 2.1. Principais métodos experimentais e as propriedades físico-químicas envolvidas.
Método instrumental Propriedade
Espectroscopia de emissão (raios-X, UV, VIS);
fluorescência, fosforescência e luminescência
Emissão de radiação
Espectroscopia e fotometria (raios-X, UV, VIS, IV);
espectroscopia fotoacústica; ressonância magnética
nuclear e de spin eletrônico
Absorção da radiação
Turbidimetria; nefelometria; espectroscopia Raman Espalhamento da radiação
Refratometria; interferometria Refração da radiação
Métodos de difração de raios-X e elétrons Difração da radiação
Polarimetria; dispersão óptica rotatória; dicroísmo
circular
Rotação da radiação
Potenciometria; cronopotenciometria Potencial elétrico
Coulometria Carga elétrica
Amperometria; polarometria Corrente elétrica
Condutimetria Resistência elétrica
Massa
Gravimetria (balança e microbalança de cristal de
quartzo)
Espetcrometria de massa Relação massa/carga
Métodos cinéticos Velocidade da reação
Gravimetria e titulometria térmica; calorimetria
diferencial exploratória; análise térmica diferencial e
métodos de condutimetria térmica
Características térmicas
Métodos de ativação e diluição de isótopos Radiatividade
Microscopia ótica Interação da luz visível com a matéria
Microscopia eletrônica Interação de elétrons com a matéria
Microscopia de tunelamento Tunelamento de elétrons de uma superfície
Microscopia de força atômica
Interação de uma sonda com a superfície (forças de
atração, adesão, de van der Waals)
Dureza/microdureza Propriedades mecânicas da superfície
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2. Métodos analíticos
__________________________________________________________________________________________
38
2.2 ESPECTROSCOPIA DE ENERGIA DISPERSIVA DE RAIOS-X
(EDX)
A análise por energia dispersiva de raios-X (em inglês, “Energy Dispersive X-
ray” ou EDX, como é mais conhecida) é uma técnica essencial no estudo de caracterização
microscópica de materiais. Quando o feixe de elétrons incide sobre um material, os elétrons
mais externos dos átomos e os íons constituintes são excitados, mudando de níveis
energéticos. Ao retornarem para sua posição inicial, liberam a energia adquirida a qual é
emitida em comprimento de onda no espectro de raios-X. Um detector instalado na câmara de
vácuo de um microscópio eletrônico de varredura mede a energia associada a esse elétron.
Como os elétrons de um determinado átomo possuem energias distintas, é possível, no ponto
de incidência do feixe, determinar quais os elementos químicos estão presentes naquele local
e assim identificar que material está sendo observado. O diâmetro reduzido do feixe permite a
determinação da composição mineral em amostras de tamanhos muito reduzidos (< 5 µm),
permitindo uma análise quase que pontual. O uso em conjunto do EDX com o microscópio
eletrônico de varredura (Fig. 2.1a) é de grande importância na caracterização estrutural de
superfícies. Enquanto este microscópio proporciona imagens da superfície, o EDX permite
sua imediata identificação. O resultado mais freqüente de uma análise por EDX é o espectro
de energia liberada pelos elétrons e sua respectiva intensidade (Fig. 2.1b). Além da
identificação mineral, a técnica ainda permite o mapeamento da distribuição de elementos
químicos, gerando mapas composicionais de elementos desejados em um material
(Richardson e Bradshaw, 1981; Butler e Hale, 1981; Skoog, 2002).
Figura 2.1. Microscópio eletrônico de varredura equipado com dispositivo para análise de energia
dispersiva de raios-X (a); Resultado típico de uma análise por EDX (b), mostrando o espectro EDX de
uma liga de níquel de alta temperatura composta por níquel (Ni), cromo (Cr), ferro (Fe), manganês
(Mn), titânio (Ti), molibdênio (Mo), silício (Si) e alumínio (Al). O eixo horizontal representa a energia
liberada pelos elétrons e o eixo vertical, a intensidade.
(a)
(
b
)
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2. Métodos analíticos
__________________________________________________________________________________________
39
2.3 DIFRAÇÃO DE RAIOS-X (XRD)
A difração de raios-X (em inglês, “X-Ray Diffraction” ou XRD, como é mais
conhecida), é realizada através de um equipamento chamado difratômetro (Fig. 2.2a) é uma
técnica que nos permite obter informações sobre as estruturas cristalinas presentes numa
amostra, através do uso de um tipo de radiação eletromagnética: os raios-X. Os raios-X têm
comprimento de onda da ordem do diâmetro atômico (10
-10
m) ou do espaçamento entre os
átomos/íons em sólidos. Quando os raios-X são direcionados para um sólido com uma
estrutura cristalina, suas ondas são espalhadas pelo ambiente ordenado do cristal, ocorrendo a
interferência entre os raios espalhados (tanto construtiva como destrutiva) porque as
distâncias entre os centros espalhadores são da mesma ordem de grandeza que o comprimento
de onda da radiação. O resultado é a difração. (Azaroff, 1968; Skoog, 2002).
Desde a sua descoberta em 1912, por Von Laue, a difração de raios-X tem sido
uma importante fonte de informação para a ciência e a indústria. A maior parte do que é
conhecido sobre o espaçamento e arranjo dos átomos em materiais cristalinos foi determinada
diretamente por estudos de difração. Além disso, esses estudos levaram ao entendimento das
propriedades físicas dos metais, materiais poliméricos e de outros sólidos. A difração de raios-
X é, atualmente, o método de maior importância na elucidação de estruturas cristalinas
complexas. A difração de raios-X também fornece um meio conveniente e prático para a
identificação qualitativa e quantitativa de compostos cristalinos. O método de difração de
raios-X, usando uma amostra policristalina (método do pó), é capaz de fornecer informação
qualitativa e quantitativa sobre os compostos presentes na amostra sólida. Os métodos de
difração de raios-X de pó estão baseados no fato de que o padrão de difração (chamado de
difratograma) (Fig. 2.2b) é único para cada substância cristalina. Assim, se é encontrada uma
concordância exata entre o padrão produzido pela amostra desconhecida e o de uma amostra
conhecida, então a identidade química da amostra desconhecida pode ser atribuída. A
identificação de uma espécie a partir de seu difratograma de pó está baseada na posição das
linhas em termos do ângulo entre a onda incidente e a onda espalhada (2θ) e suas intensidades
relativas. O ângulo 2θ é função do espaçamento de um conjunto particular de planos. Estas
linhas formam-se picos com intensidades e distâncias entre si que variam de substância para
substância. Diferentes materiais (ou fases) possuem diferentes arranjos espaciais de átomos ou
íons, e a interação com a radiação incidente resultam numa "assinatura" muito própria. Pela
medida da intensidade das linhas de difração e sua comparação com difratogramas de padrões
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2. Métodos analíticos
__________________________________________________________________________________________
40
feitos com quantidades conhecidas, torna-se possível a análise quantitativa de misturas
cristalinas (Jacobs, 1997, Cullity, 1998; Skoog, 2002,) .
Figura 2.2. Difratômetro de raios-X (a); Difratograma de uma argila (b), mostrando suas fases
cristalinas: Caulinita (C), Quartzo (Q) e Ilita (I) (Albers et al., 2002).
Atualmente, a comparação com padrões de difração, para identificação das fases
cristalinas de um composto (análise qualitativa) é feita por intermédio de softwares
especialmente desenvolvidos para tal fim. Estes softwares são compostos por um extenso
banco de dados cristalográfico (padrões de difração) e utilizam os arquivos de dados gerados
pelo próprio difratômetro. Como exemplo, temos o X´Pert HigthScore da Philips. Já para a
análise quantitativa, o procedimento mais usado é a simulação do perfil difratométrico a partir
das estruturas das fases componentes de uma amostra através do método Rietveld. Este
método é baseado na construção de um padrão de difração calculado, de acordo com o
modelo estrutural. O padrão calculado é obtido pela introdução direta dos dados
cristalográficos, como: simetria do grupo espacial, posições atômicas, posições de ocupação e
parâmetros de rede. O padrão calculado ao se ajustar ao padrão observado fornece dados dos
parâmetros estruturais do material e parâmetros do perfil de difração. O termo refinamento no
método de Rietveld refere-se ao processo de ajuste do modelo de parâmetros utilizados no
cálculo de um padrão de difração, que seja o mais próximo do observado. O refinamento é
conduzido pela minimização da soma das diferenças entre as intensidades calculadas e
observadas (método dos mínimos quadrados), a cada passo angular do padrão de difração. O
método de Rietveld permite o refinamento de estruturas cristalinas complexas, sendo aplicado
(b)
(a)
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2. Métodos analíticos
__________________________________________________________________________________________
41
ao fornecimento de dados quantitativos (percentual de cada fase na amostra) com precisão
reconhecida (Bish e Howard, 1988; Lutterotil, 1990; Young, 1994; Young, 1995; Fancio,
1999). Os principais sofwares utilizados para o refinamento de difratogramas de pó são o
DBWS e o Rietica, ambos de livre distribuição.
2.4 ANÁLISES TÉRMICAS
A termogravimetria ou análise termogravimétrica (em inglês, “Thermogravimetric
analysis” ou TGA, como é mais conhecida) baseia-se no estudo da variação de massa de uma
amostra, resultante de uma transformação física (sublimação, evaporação, condensação) ou
química (degradação, decomposição, oxidação) em função do tempo ou da temperatura. Em
outras palavras, pode ser definida como um processo contínuo que mede a variação de massa
(perda ou ganho) de uma substância ou material como uma função da temperatura e/ou tempo.
Os equipamentos responsáveis por esta análise são chamados de termobalanças (Fig. 2.3a).
Existem três tipos básicos de técnicas termogravimétricas: termogravimetria isotérmica, que
permite medir a variação da amostra a ser analisada como uma função do tempo à temperatura
constante; termogravimetria semi-isotérmica, onde a amostra é aquecida a uma massa
constante a cada série de aumento de temperatura; e termogravimetria dinâmica, onde a
amostra é aquecida em um ambiente no qual a variação de temperatura está programada ou
pré-determinada, preferencialmente em velocidade linear. A última é a mais usada (Fig. 2.3b).
Às vezes é vantajoso poder acompanhar um termograma com sua primeira derivada. A isto
chamamos de análise termogravimétrica derivada (em inglês, “Derived Thermogravimetric”
ou DTG, como é mais conhecida). Várias termobalanças comerciais são munidas com
circuitos eletrônicos para obter a derivada automaticamente (Wendlandt, 1986; Mothé e
Azevedo, 2002).
Figura 2.3. Termobalança TGA–50 (a); Curva típica de uma análise termogravimétrica dinâmica (b),
mostrando três eventos térmicos associados à perda de massa.
Temperatura
Variação de
massa(Δm)
(a)
(
b
)
evento 1
evento 2
evento 3
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2. Métodos analíticos
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42
Variação de
temperatura (ΔT)
Temperatura
Transição vítrea
Cristalização (Exo)
Fusão (Endo)
Oxidação (Exo)
A análise térmica diferencial (em inglês, “Differential thermal analysis” ou DTA,
como é mais conhecida) é uma técnica térmica em que se mede a diferença de temperatura
entre a amostra e uma substância inerte (referência), quando ambas são submetidas ao
aquecimento ou ao resfriamento. Mudanças da temperatura da amostra são ocasionadas pelas
transições ou reações endotérmica ou exotérmica devido à mudança de fase, fusão, inversões
da estrutura cristalina, sublimação, vaporização, reações de desidratação, reações de
dissociação ou decomposição, oxidação, reações de redução e outras reações químicas. Um
gráfico típico de DTA é mostrado na Figura 2.4 (Mackenzie, 1978; Mothé e Azevedo, 2002).
Figura 2.4. Curva típica de uma análise térmica diferencial em um material polímero.
Os picos da análise térmica diferencial resultam tanto de modificações físicas
como de reações químicas induzidas por variações de temperatura da amostra. Os processos
físicos endotérmicos incluem fusão, vaporização, absorção e dessorção. A adsorção e
cristalização geralmente são exotérmicas. As reações químicas podem ser também
exotérmicas ou endotérmicas. As reações endotérmicas incluem desidratação, redução em
atmosfera gasosa e decomposição. As reações exotérmicas incluem oxidação no ar ou na
presença de oxigênio, polimerização e reações catalíticas. As áreas sob os picos nos
termogramas diferenciais dependem da massa da amostra, da entalpia do processo físico ou
químico e de certos fatores geométricos da condutividade térmica. Normalmente o
equipamento de DTA vem acoplado com o de TGA, formando um sistema TGA/DTA
(Haines, 1995; Smothers e Chiang, 1974, Skoog, 2002).
A calorimetria exploratória diferencial (em inglês, “Differential Scanning
Calorimetry” ou DSC, como é mais conhecida) pode ser definida como uma técnica que mede
temperaturas e fluxos de calor associado com transições dos materiais em função da
temperatura e do tempo. Tais medidas fornecem informações qualitativas e quantitativas
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2. Métodos analíticos
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43
sobre mudanças físicas e químicas que envolvem processos endotérmicos (absorção de calor),
exotérmicos (liberação de calor) ou mudanças na capacidade calorífica. O DSC pode
proporcionar informações específicas tais como: transição vítrea, temperatura e tempo de
cristalização, ponto de fusão, calor específico, oxidação, pureza, etabilidade térmica, ponto de
ebulição, grau de velocidade de cura, cinética de reação e outros. Um equipamento de DSC
uma curva de típica de análise são mostrados na Figura 2.5 (Hemminger e Hohme, 1984;
Mothé e Azevedo, 2002).
Figura 2.5. Analisador térmico diferencial DSC-50 (a); Curva típica de uma calorimetria exploratória
diferencial, mostrando um pico endotérmico e outro exotérmico (b).
A diferença básica entre a caloria exploratória diferencial (DSC) e a análise
térmica diferencial (DTA) é que a primeira é um método calorimétrico no qual são medidas
diferenças de energia; no segundo, são medidas as diferenças de temperatura. As curvas
térmicas para os dois métodos são similares (Speyer, 1994).
As análises térmicas são utilizadas para diversas aplicações. Entre as aplicações
para a termogravimetria incluem: adsorção e curvas de dessorção; calcinação e sinterização de
minerais; corrosão de metais em atmosfera variada; decomposição de materiais explosivos;
decomposição térmica de pirólise de materiais orgânicos, inorgânicos e biológicos;
degradação térmica oxidativa de substâncias poliméricas; desenvolvimento de procedimentos
analíticos gravimétricos (peso constante); destilação e evaporação de líquidos; determinação
de umidade, substâncias voláteis e conteúdo de cinzas; diagrama de fase e não
estequiométrico envolvendo atmosfera; estudo de cinética de reação envolvendo espécies
voláteis; estudo de desidratação e higroscopicidade; identificação de polímeros e
intermediários; taxas de evaporação e sublimação; reações no estado sólido que desprendem
voláteis; propriedades magnéticas, isto é, temperatura de cura, susceptibilidade magnética.
Temperatura
Fluxo de
calor
Endo
Exo
(a)
(b)
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2. Métodos analíticos
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44
Para o DTA/DSC, temos as aplicações para os seguintes estudos: catálise; reações de
dessolvatação; perigo de radiação; calor de reação; reações de decomposição; reações de
desidratação; estabilidade térmica; estabilidade de oxidação; determinação de transição vítrea;
calor de sublimação; determinação de pureza; diagrama de fase; reações sólido-gás; reações
de estado sólido; cinética de reação; calor de transição; calor de adsorção; determinação do
ponto de Curie; dentre outras (Ford e Timmins, 1989; Charles e Warrington, 1992;
Hatakeyama e Quinn, 1994; Mothé e Azevedo, 2002).
2.5 TÉCNICAS MICROSCÓPICAS
O menor objeto que pode ser visualizado a olho nu (resolução) é de
aproximadamente 0,2 mm (200 µm), a uma distância mínima de 25 cm (ponto próximo da
vista). A distância separando dois objetos deve ser tal que permita que sejam distinguidos um
do outro; se eles estão muito próximos (< 200 µm), aparecem como uma única mancha. Os
microscópios são instrumentos analíticos usados para aumentar a resolução e,
conseqüentemente, estruturas abaixo de 200 µm podem ser visualizadas. Existem basicamente
três tipos de microscópios, classificados conforme a natureza do elemento de interação com o
objeto a ser analisado: ótico (luz), eletrônico (elétrons) e de varredura por sonda (sonda)
(Rose, 1973).
2.5.1 MICROSCOPIA ÓTICA
A microscopia ótica se refere ao uso de qualquer microscópio que utiliza a luz
visível para tornar espécimes observáveis. O microscópio ótico usa lentes de vidro e luz
visível para formar uma imagem aumentada de um objeto. O poder de resolução de um
microscópio óptico pode ser definido tecnicamente como a menor distância entre dois pontos
que permite sua separação e conseqüente distinção. Depende do comprimento de onda de luz
e das propriedades da lente. O poder de resolução é definido como
AN
R
λ
61,0
=
onde λ é o comprimento de onda da luz e AN é a abertura numérica da lente, sendo definida
como:
α
sinnAN
=
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2. Métodos analíticos
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45
com n igual ao índice de refração médio entre a lente e a amostra e α o ângulo entre o eixo da
objetiva e o raio de luz mais oblíquo que atravessa a lente, sendo uma função das dimensões
desta. Como o sistema ótico está imerso em ar, então n = 1. Os valores de AN das lentes
diferem de acordo com o poder de aumento e com outras propriedades. O valor de AN é
gravado nas laterais de cada lente objetiva (a lente mais próxima ao objeto) de um
microscópio ótico. Os valores mais comuns para as lentes objetivas, encontradas com
freqüência em microscópios óticos modernos, são 0,25 para baixo poder de resolução, 0,65
para alto poder de resolução e 1,25 para lentes de imersão. Para um comprimento de onda
típico da luz de 550 nm e para as dimensões das objetivas atualmente fabricadas, a resolução
máxima de um microscópio ótico será da ordem de 0,22 µm, que representa mil vezes a
capacidade do olho humano. A qualidade da imagem microscópica é determinada pela
ampliação, grau de difração, distorção devido a aberrações das lentes e contraste. Para
melhorar a resolução, os microscopistas utilizam comprimentos de onda de radiação
eletromagnética cada vez menores. A luz visível não é capaz de separar distâncias inferiores a
220 nm. A luz ultravioleta, de comprimento de onda de 100 a 400 nm, pode separar distâncias
tão pequenas quanto 110 nm. Assim, o microscópio que usa luz ultravioleta ao invés de
visível possui maior resolução, permitindo a observação de mais detalhes das estruturas
analisadas (Black, 2002).
O microscópio ótico moderno não descende da lente única de Leeuwenhoek, mas
sim, do microscópio composto de Hooke (um microscópio com mais de uma lente). As lentes
únicas geram dois problemas: não podem focalizar o campo inteiro simultaneamente e
acrescentam anéis coloridos ao redor dos objetos no campo. Ambos os problemas são hoje
resolvidos através do uso de múltiplas lentes de correção colocadas próximo à lente de
aumento principal. Utilizadas em objetivas e oculares de microscópios compostos modernos,
as lentes corretivas proporcionam imagens praticamente isentas de correção (Pluta, 1988;
Black, 2002).
O microscópio ótico composto é aquele que tem duas lentes, uma objetiva e a
outra ocular, possibilitando dois estágios de amplificação (Fig. 3.7).
Figura 2.6. Esquema de um microscópio ótico composto.
Objeto
Objetiva
o
Ocular
Imagem
Olho
foco
foco
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2. Métodos analíticos
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46
Um microscópio composto com uma única ocular é chamado monocular; aquele com duas
oculares, de binocular. A luz penetra o microscópio através de uma fonte de luz na base e,
freqüentemente, passa através de um filtro azul, que filtra seus maiores comprimentos de
onda, deixando passar os menores, melhorando a resolução. Então, ela passa por um
condensador, que converge os raios luminosos para que possam passar através do objeto. O
diafragma íris controla a quantidade de luz que passa através do objeto e que vai para a lente
objetiva. Quanto maior o aumento, maior a quantidade de luz necessária para ver claramente o
objeto. A lente objetiva aumenta a imagem antes que a mesma atravesse o tubo ou canhão
para a lente ocular. A lente ocular aumenta mais ainda a imagem. Uma mesa mecânica
permite o controle preciso do movimento da lâmina, que é especialmente útil em estudos mais
detalhados de objetos. O aumento total de um microscópio composto é dado pelo produto do
aumento da objetiva pela ocular, variando de 30 a 1000 vezes (Herman, 1990).
O condensador utilizado em um microscópio ótico comum faz com que a luz seja
concentrada e transmitida diretamente através do objeto. Isto confere uma iluminação de
campo claro. Contudo, em alguns casos, é melhor examinar objetos que exibem pouco
contraste em um campo claro, sob outra iluminação. Neste caso, utiliza-se a iluminação de
campo escuro. Um microscópio ótico adaptado para a iluminação de campo escuro possui um
condensador que impede a luz de ser transmitida através do objeto. Em vez disto, leva a luz a
refletir do objeto de modo oblíquo. Quando estes raios são coletados e focalizados em uma
imagem, um objeto claro é visto em um fundo escuro (Black, 2002).
Um microscópio ótico de contraste de fase possui um condensador especial e
lentes objetivas que acentuam pequenas diferenças no índice de refração de várias estruturas
localizadas no objeto. A luz que passa através dos objetos de diferentes índices de refração é
reduzida e difratada. As modificações na velocidade da luz são visualizadas como diferentes
gradações de claridade (Zernike, 1942, Black, 2002).
O microscópio ótico Nomarski, do mesmo modo que o microscópio de contraste
de fase, usa os diferentes índices de difração para visualizar detalhes no objeto. Contudo, o
microscópio Nomarski (também chamado de contraste de interferência diferencial),
proporciona resolução bastante superior ao microscópio padrão de contraste de fase. Ele
possui uma profundidade de campo (a espessura do objeto que está em foco a qualquer
momento) extremamente curta e pode proporcionar uma imagem próxima a tridimensional
(Zernike, 1942, Black, 2002).
A microscopia ótica de fluorescência utiliza-se do fato que certas substâncias,
quando sob a ação de irradiações de comprimento de onda curtos, começam a emitir radiação
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2. Métodos analíticos
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47
própria, composta por ondas de comprimento mais longo, luminosas e visíveis, ou seja,
fluorescem. Certas substâncias quando ativadas por luz ultravioleta, violeta ou azul,
apresentarão fluorescência no azul, verde, amarelo ou vermelho, segundo sua natureza. A
simplicidade e exatidão colocaram desde logo a microscopia de fluorescência no controle de
alimentos, mineralogia e botânica. Nos primórdios desta microscopia, só era usada a chamada
fluorescência “própria” ou primária. Entretanto, descobriu-se que se poderiam tratar
substâncias ou mesmo tecidos animais e vegetais com diluições de certos corantes orgânicos e
obter assim uma florescência secundária. O tratamento com fluorocromos abriu a modalidade
de microscopia de fluorescência também em células e tecidos animais, na citologia,
histologia, patologia, hematologia, bacteriologia, etc. Corantes florescentes existem vários,
como por exemplo: amarelo de acridina, auromina, aurofosfina, sulfato de berberina, extrato
de clorofila, fluoresceína, rodamina, tioflavina e tripaflavina (Bucherl, 1972).
O microscópio de polarização se diferencia de um microscópio comum por
possuir um equipamento para a produção de luz linearmente polarizada. A utilização da luz
polarizada tem produzido resultados bem interessantes; corpos isotrópicos são facilmente
diferenciados de anisotrópicos ou birrefringentes (Bucherl, 1972).
O microscópio metalográfico (Fig. 2.7a) é um microscópio ótico composto que
utiliza a luz refletida sobre o material a ser observado (Fig. 2.7b) para registrar imagens de
amostras sólidas. Amostras opacas, como amostras metalográficas, são tipicamente
observadas por estes microscópios (Jacobs e Kilduff, 1994).
Figura 2.7. Microscópio metalográfico Eclipse LV100D da Nikon (a); Esquema do sistema ótico de
um microscópio metalográfico (b).
(a)
(
b
)
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2. Métodos analíticos
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48
2.5.2 MICROSCOPIA ELETRÔNICA
Em vez de raios de luz, a microscopia eletrônica utiliza feixes de elétrons e, em
vez de lentes de vidro, eletromagnetos são usados para focalizar o feixe. Os elétrons devem
viajar através do vácuo, pois as colisões com as moléculas de ar dispersariam os elétrons e
resultariam em uma imagem distorcida. Com o microscópio eletrônico, o poder de resolução é
aumentado 1000 vezes em relação ao óptico. Nas melhores condições, a microscopia
eletrônica prevê um poder de resolução próximo de 2 Å. As fotografias tiradas de qualquer
microscópio são chamadas de micrografia; aquelas tiradas de microscópios eletrônicos, são
chamadas de micrografias eletrônicas. Os dois tipos mais comuns de microscópios eletrônicos
são o de varredura e o de transmissão (Black, 2002).
No microscópio eletrônico de varredura (em inglês, “Scanning Electron
Microscope” ou SEM como é mais conhecido), os elétrons cujos sinais são registrados
provêm da superfície do material observado. O SEM (Fig. 2.8) pode resolver objetos de até 20
nm, proporcionando ampliações de até 50.000X.
Figura 2.8. Exemplo de um moderno microscópio de eletrônico de varredura (SEM).
O feixe eletrônico bombardeia o material, rastreando-o. Em conseqüência disto o
espécime emite elétrons secundários de baixa energia. Variações na superfície alteram o
número de elétrons emitidos. Buracos e fissuras aparecem escuros. Protuberâncias e cristas
aparecem brilhantes. Os elétrons refletidos pela superfície, juntamente com os secundários
formam uma imagem da superfície da amostra. Um feixe de elétrons é produzido no topo do
microscópio pelo aquecimento de um filamento metálico. O feixe de elétrons segue um
caminho vertical pela coluna do microscópio. Faz seu caminho por lentes eletromagnéticas
que focam e dirigem o feixe para abaixo, na amostra. Uma vez que o feixe choca-se com a
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2. Métodos analíticos
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49
amostra, outros elétrons (retro-espalhados e secundários) são lançados da amostra. Detectores
coletam os elétrons secundários e os retro-espalhados, convertendo-os em um sinal que é
enviado a uma tela similar a uma tela de TV produzindo assim uma imagem (Fig.2.9).
Elétrons retro-espalhados são elétrons do feixe incidente que emergem da amostra, devido a
interação com as forças nucleares dos átomos da amostra (Fig.2.10). As imagens formadas
pelos elétrons retro-espalhados mostram contraste nas regiões da amostra com composição
química diferente, bem como nas irregularidades (Fig.2.11). Os elétrons secundários são
aqueles arrancados da amostra, devido a interação do feixe incidente com os átomos da
amostra (Fig.2.12). São responsáveis pelo efeito 3D na imagem (Fig.2.13). A maior parte da
imagem clássica de SEM é formada pelos elétrons secundários (Reimer, 1998).
Figura 2.9. Esquema de funcionamento de um microscópio eletrônico de varredura (SEM).
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2. Métodos analíticos
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50
Figura 2.10. Processo de geração de elétrons retro-espalhados.
Figura 2.11. Imagem por SEM de uma liga de cobre e de alumínio formada usando elétrons retro-
espalhados. A área clara é formada principalmente de cobre e a área escura é de alumínio.
Figura 2.12. Processo de geração de elétrons secundários.
Elétrons secundários
Elétron
Núcleo
Feixe de e
létrons
secundários
Elétrons retro-espalhados
Elétron
Núcleo
Feixe de elétrons
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2. Métodos analíticos
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51
Figura 2.13. Imagem por SEM de uma superfície fraturada de um pedaço de metal, formada a partir de
elétrons secundários.
Para a visualização no microscópio eletrônico de varredura, a amostra deve passar
pelos seguintes processos (Cantor e Schimmel, 1980):
1) Desidratação - retirada de água;
2) Metalização - como o SEM usa elétrons para produzir a imagem, as amostras devem ser
eletricamente condutoras. Materiais não condutores devem ser cobertos por uma fina camada
condutora (ouro), processo este chamado metalização. Isto é feito através de um dispositivo
chamado Sputter.
3) Vácuo - A amostra assim preparada é colocada em vácuo, no SEM, para que o feixe de
elétrons possa mover-se sem interferência (com outras partículas).
O microscópio eletrônico de transmissão (em inglês, “Transmission Electron
Microscope” ou TEM como é mais conhecido) proporciona melhor visualização da estrutura
interna de objetos do que os outros microscópios (Fig. 2.14).
Figura 2.14. Exemplo de um moderno microscópio eletrônico de transmissão (TEM).
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2. Métodos analíticos
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52
Devido ao comprimento de onda extremamente curto da iluminação (elétrons) no
qual o TEM opera, ele pode resolver objetos de até 1 nm, ampliando-os até 500.000 vezes. A
microscopia de transmissão utiliza os elétrons que atravessam uma amostra, para formar
imagens (Fig. 2.15). Sendo assim, tais amostras (biológicas ou não) devem ser muito finas
(em torno de 0,1 µm). Para ser examinada através da microscopia eletrônica de transmissão, a
matéria viva precisa ser fixada, desidratada, impregnada com materiais duros e cortada com
instrumentos especiais (micrótomo). Além disto, por serem transparentes aos elétrons, a
maioria dos espécimes precisam ser impregnados com metais pesados, que se ligam
diferencialmente a distintos componentes subcelulares. As áreas do material que permitem
melhor transmissão dos elétrons aparecem brilhantes; as que absorvem ou defletem (regiões
densas), são escuras, gerando imagens de TEM (Fig.2.16) (Reimer, 1993; Williams e Carter,
1996; Black, 2002).
Figura 2.15. Esquema de funcionamento de um microscópio eletrônico de transmissão (TEM).
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2. Métodos analíticos
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53
Figura 2.16. Imagens de TEM: nanoporo (a) e mitocôndria (b).
2.5.3 MICROSCOPIA DE VARREDURA POR SONDA (SPM)
Os microscópios de varredura por sonda mecânica (em inglês, “Scanning Probe
Microscope” ou SPM, como são mais conhecidos) são uma família de microscópios utilizados
para observar localmente diversas propriedades da superfície de uma amostra. Dessa família,
os mais utilizados são o microscópio de força atômica (em inglês, “Atomic Force
Microscope” ou AFM, como é mais conhecido) e o microscópio de tunelamento (em inglês,
“Scanning Tunneling Microscope” ou STM, como é mais conhecido). O princípio básico de
funcionamento dos SPM’s é a detecção da interação entre uma ponta de prova e a superfície
de uma amostra. Com eles, podem-se caracterizar as superfícies estudadas com resolução que
varia da escala micrométrica à atômica. A idéia dos SPM’s surgiu como conseqüência da
observação do tunelamento de elétrons entre uma ponta de tungstênio (W), atomicamente
afilada, e a superfície de uma amostra de platina (Pt), feita por Gerd Binnig e Heinrich Rohrer
em 1981 no laboratório de pesquisas da IBM de Zürich. Motivados por essa observação,
Binnig e Rohrer, desenvolveram um equipamento com a capacidade de, simultaneamente,
varrer a superfície de uma amostra sob uma ponta de prova condutora, atomicamente afilada,
e medir a corrente de tunelamento entre a ponta e a superfície. Surgia assim, o microscópio de
tunelamento (Binning, 1982). Pelo desenvolvimento do STM, Binnig e Rohrer receberam em
1986 o Prêmio Nobel de Física e tornaram a vida de muitos pesquisadores mais interessantes,
(a)
(b)
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2. Métodos analíticos
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54
trazendo-lhes uma visão fabulosa do mundo atômico (Binning, 1987). A situação, sob certo
aspecto, limitada do STM, onde somente superfícies condutoras e semicondutoras podem ser
analisadas, levou G. Binnig, C. F. Quate e Ch. Gerber a desenvolver, em 1986, o microscópio
de força atômica (Binning, 1986). Durante a operação do AFM, monitora-se a força de
interação entre a ponta de prova e a superfície da amostra. Essa força, de magnitude
semelhante à das forças interatômicas em sólidos é da ordem de 10
-9
N. Com o AFM,
amostras tanto condutoras quanto isolantes, podem ser estudadas. A Figura 2.17 apresenta um
esquema geral da composição de um SPM (Wiesendanger, 1994; Nanoscope Command
Reference Manual, 1997; Multimode TM SPM Instruction Manual, 1996, Lindsay, 2000).
Figura 2.17. Componentes básicos de um SPM.
Desde a proposta do STM, foram desenvolvidos inúmeros SPM’s. Entre 1981 a
1991, 20 tipos diferentes foram desenvolvidos. Assim, pelo menos 20 tipos diferentes de
interações entre a ponta de prova e a superfície da amostra podem ser monitoradas. Essa
versatilidade permite que os SPM’s sejam utilizados nas mais diversas áreas do
conhecimento, como por exemplo, ciência de materiais, biologia, física, química, metrologia
etc. Um ponto adicional notável é que esses microscópios podem ser operados nos mais
diversos meios ambientes: em vácuo, em atmosfera ambiente, em líquidos, como por
exemplo, em análises biológicas, em estudos in situ de reações eletroquímicas, etc. Ao
contrário dos microscópios eletrônicos, capazes de realizar somente medidas no plano da
superfície da amostra, os SPM’s são capazes, também, de realizar medidas na direção
perpendicular ao plano da superfície (relevo da superfície). A resolução de imagens,
adquiridas com SPM’s, varia tipicamente de 0,1 a 10 nm no plano da superfície e pode ser
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2. Métodos analíticos
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menor que 0,1 nm na direção perpendicular a esse plano. São várias as aplicações do SPM,
dentre elas destacam-se (Colton, 1998):
• Investigação da estrutura de moléculas agregadas em superfícies, incluindo moléculas
biológicas tais como DNA e proteínas;
• Exploração das propriedades superficiais de reações químicas in situ em superfícies,
em líquidos, polímeros, e dentro de células vivas;
• Delineamento e medição das dimensões de domínios elétricos de dispositivos
semicondutores, tais como junções p-n, portas MOS e regiões de depleção,
monitorando capacitância ou força eletrostática;
• Arranjo de átomos em estruturas tridimensionais e fabricação de fios de nanocristais
de silício;
• Medição da fricção interna e o módulo dinâmico de volumes nanométricos em função
da temperatura para derivar uma nova compreensão de transições de fase em materiais
multifásicos tais como blendas poliméricas e compósitos;
• Investigação de materiais funcionais de filmes finos orgânicos tais como
heterojunções orgânicas utilizadas em células solares.
Um microscópio de tunelamento (STM) é capaz de resolver detalhas em
superfícies de sólidos condutores em escala atômica. A superfície é varrida com um padrão de
rastreamento por uma ponta metálica muito fina. A ponta é mantida afastada a uma distância
constante d da superfície por toda a varredura. O movimento para cima e para baixo da ponta
reflete a topografia da superfície. Para se manter a ponta a uma distância constante da
amostra, a corrente de tunelamento entre a ponta e a amostra é monitorada e mantida
constante. A corrente de tunelamento é gerada pela tensão V aplicada entre a ponta e a
amostra. A corrente de tunelamento é uma corrente que passa através de um meio que não
contém elétrons. Exemplos de tais meios incluem vácuo, um líquido não-polar ou mesmo uma
solução aquosa de eletrólito. O mecanismo do fluxo de corrente por um meio isolante pode
ser racionalizado pela mecânica quântica. As correntes de tunelamento tornam-se
significativas quanto dois condutores tem a forma de uma ponta aguda. No caso da ponta do
microscópio de tunelamento, a magnitude da corrente de tunelamento I
t
é dada
aproximadamente por
It = Ve
-Cd
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2. Métodos analíticos
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56
onde V é a tensão estática entre os condutores, C é uma constante característica da
composição dos condutores e d é o espaçamento entre o átomo inferior da ponta e o átomo
superior da amostra. Em um microscópio de tunelamento, a corrente de tunelamento é
mantida constante por um mecanismo de realimentação que move a ponta para cima e para
baixo de modo que d permaneça constante (Fig.2.18). O movimento da ponta é controlado por
um transdutor piezelétrico. A corrente de tunelamento decresce exponencialmente com a
separação entre a ponta e a amostra. Este decréscimo rápido na corrente com a distância faz
com que a corrente de tunelamento seja significativa apenas para a separação ponta-amostra
muito pequena e é responsável pela alta resolução conseguida na direção z. A Figura 2.19
mostra uma imagem gerada pelo STM (Bonnell, 1993; Tersoff, 1993; Skoog, 2002).
Figura 2.18. Componentes básicos de um STM.
Figura 2.19. Imagem de 50 x 50 nm de uma superfície de Cu(111) a temperatura de 4 K. São visíveis
três camadas monoatômicas e numerosos defeitos pontuais. Oscilações espaciais (ondas eletrônicas)
com periodicidade de aproximadamnente 1.5 nm são evidentes (Crommie, 1993).
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2. Métodos analíticos
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57
O Microscópio de Força Atômico (AFM), um dos tipos de SPM, inventado em
1986, permite resolução de átomos individuais tanto em superfícies condutoras como em
isolantes. Nesse método, uma alavanca flexível (haste) e sensível à força, munida de uma
ponta (sonda) muito fina é deslocada com um padrão de rastreamento sobre a superfície da
amostra. A força que age entre a alavanca e a superfície da amostra causa flexões diminutas
da haste, que são detectadas por meios óticos (feixe de laser) (Fig.2.20) (Fukui, 1992; Skoog,
2002).
Figura 2.20. Representação tridimensional da interação da sonda com a amostra em um AFM (Antônio
Siber,2003)
Como na microscopia de tunelamento, a movimentação da ponta, ou às vezes a
amostra, é conseguida com um tubo piezelétrico. Durante uma varredura, a força na ponta é
mantida constante pela movimentação para cima e para baixo da ponta, o que fornece a
informação topográfica. Um feixe de laser é refletido de um ponto na haste para um fotodiodo
segmentado que detecta o movimento da sonda. A saída do fotodiodo então controla a força
aplicada à ponta, de modo que ela fica constante. Em outras palavras, o sistema de controle
ótico é análogo ao controle de corrente de tunelamento no STM. O sistema de movimento é
um dispositivo piezelétrico tubular que move as amostras nas direções x, y e z sob a ponta. O
sinal do detector de feixe de laser é então realimentado ao transdutor piezelétrico da amostra,
o que faz a amostra se mover para cima e para baixo para manter uma força constante entre a
ponta e a amostra (Fig.2.21) (Binnig et al., 1986; Hansma, 1988; Baselt et al., 1993).
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2. Métodos analíticos
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58
Figura 2.21. Componentes básicos de um AFM.
O desempenho de um microscópio de força atômica depende das características
físicas da haste e da sonda ponta (sonda). O conjunto haste/sonda é produzido por corrosão de
placas de silício (Si), óxido de silício (SiO
2
) ou nitreto de silício (Si
3
N
4
). Tipicamente, as
hastes têm poucas dezenas de micrometros de comprimento, menos de dez micrometros de
largura e cerca de um micrometro de espessura. As pontas, com formatos de pirâmide ou cone
têm uns poucos micrometros de altura e largura na base (Fig.2.22) (Albrecht, et al., 1990;
Skoog, 2002).
Figura 2.22. Detalhe da haste (seta) e sonda (asterisco) de Si
3
N
4
fabricadas comercialmente para AFM
(Weisenhorn, 1991).
Os modos de fazer as imagens, também chamados modos de varredura ou de
operação, referem-se fundamentalmente à distância mantida entre a sonda (ponteira) e a
*
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2. Métodos analíticos
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amostra, no momento da varredura, e às formas de movimentar a ponteira sobre a superfície a
ser estudada. Estes modos de fazer imagens podem ser classificados em dois tipos: modo
contato e modo não-contato, dependendo das forças líquidas que atuam entre a ponteira e a
amostra. Quando o aparelho é operado na região atrativa, o método chama-se não-contato.
Nesta região, a haste de AFM se enverga na direção da amostra. A operação na região
repulsiva chama-se contato e a haste se dobra, afastando-se da amostra. No modo de não
contato a haste é atraída pelas forças de capilaridade da camada de contaminação ou pelas
forças de van der Waals (Eisenschitz, 1930), quando a amostra é limpa. No modo de contato,
a deflexão do “cantilever” é na direção oposta à da amostra. Os efeitos de uma variedade de
forças atuando entre ponta-amostra podem ser analisados, essas forças incluem as forças
atrativas de van der Waals, forças magnéticas, e forças Coulombianas, de média para grandes
distâncias, tipicamente ≥ 100 Å (Esaki, 1999; Duarte, 2000).
Uma das desvantagens da varredura no modo de contato é que a sonda está em
contato constante com a superfície da amostra e a força para baixo da ponta pode não ser
pequeno o suficiente para evitar danos à superfície da amostra e distorção da imagem como
conseqüência. Este é um problema importante para amostras macias, como biológica,
polímeros e mesmo alguns materiais aparentemente duros, como placas de silício. O problema
de dano da superfície pode ser evitado por um processo no qual a ponta entra em contato com
a superfície por apenas um curto intervalo de tempo, periodicamente, e então é removida da
superfície. Neste método de operação, chamado modo intermitente (em inglês, “Tapping
mode”), a haste oscila em uma freqüência de algumas centenas de quilohertz. A oscilação é
obtida por uma força constante e a amplitude é monitorada continuamente. A haste é
posicionada de modo que a sonda toque a superfície apenas na parte inferior de cada ciclo de
operação. Esta técnica permite a obtenção de imagens de materiais que são inviáveis no modo
de contato. A Figura 2.23 apresenta alguns exemplos de imagens feita no modo de contato e
intermitente (Strausser, 1994).
Além de gerar imagens (análise topográfica), o AFM permite obter informações a
partir da dependência com a distância das forças de interação medidas (análise não
topográfica). O estudo da relação entre força e distância chama-se espectroscopia de força.
Basicamente, determina-se a curva de força em função da distância em um local determinado
sobre a superfície da amostra. A partir das curvas de deflexão da haste em função da
aproximação da amostra, podem-se determinar as curvas de força em função da distância
entre a ponta e a superfície da amostra, para cada ponto. Então, querendo estudar uma
propriedade física em particular, extraída das curvas de forças locais, os dados podem ser
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2. Métodos analíticos
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60
representados graficamente em função da localização na superfície, fornecendo assim um
mapa resolvido espacialmente para tal propriedade. A Figura 2.24 mostra a relação entre a
curva força/distância e os modos de operação de AFM (Hartmann, 1991; Tansock e Williams,
1992; Cross, et al., 1998; Gotsmann, 1999).
Figura 2.23. Imagens de AFM da superfície de diferentes materiais: planos cristalinos de um cristal do
aminoácido L-Alanina, no modo de contato (a); Biofilme de salmonela, no modo intermitente (b)
Nanocristais de aragonita de uma concha de mexilhão, no modo intermitente (c); Cristais de um filme
de SnO
2
, no modo de contato (d). As imagens foram obtidas no Laboratório de Microscopia Atômica,
da Universidade Federal do Ceará, pelo autor da presente tese.
Figura 2.24. Gráfico de distância entre ponta e superfície versus a força de interação com amostra e a
relação com modos de operação e a curva de força/distância no AFM.
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2. Métodos analíticos
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61
Os microscópios de varredura por sonda (Fig.2.25) têm uso em uma série de áreas. No campo
dos semicondutores, têm sido usados para caracterização de superfícies de silício e defeitos
nessas superfícies, bem como na obtenção de imagens de domínios magnéticos em matérias
magnéticos; na biotecnologia, para imagens de materiais como DNA, cromatina, interações
proteína/enzima, membrana de vírus e bactérias, ação de antimicrobianos sobre a superfície
de biofilmes, dentre outras. Permite o estudo da superfície de amostras biológicas em meio
líquido (como água e solução tampão), reduzindo sensivelmente a influência da técnica de
preparação de amostras na caracterização da superfície. Também possibilita a identificação da
posição de grupos funcionais na superfície de substratos por meio da imobilização na sonda,
de compostos com capacidade de interação com estes substratos (funcionalização da ponta)
(Morris et al., 2001; Skoog, 2002).
Figura 2.25. Moderno microscópio de varredura por sonda (Laboratório de Microscopia Atômica do
Departamento de Física da Universidade Federal do Ceará).
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2. Métodos analíticos
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62
2.6 ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NO INFRAVERMELHO COM
TRANSFORMADA DE FOURIER (FT-IR)
A espectroscopia no infravermelho é uma técnica muito utilizada para a análise de
compostos orgânicos. A região do infravermelho do espectro eletromagnético cobre a faixa
logo após o visível (7,8 x 10
-7
m) até aproximadamente 10
-4
m, mas apenas a porção média de
2,5 x 10
-6
m a 2,5 x 10
-5
m é mais utilizada em química orgânica. Os comprimentos de onda
dentro da região do infravermelho são geralmente dados em micrometros, e as freqüências são
dadas em números de onda preferencialmente em hertz. O número de onda é o recíproco do
comprimento de onda em centímetros e, portanto, expresso em unidades de cm
-1
. Assim, a
região útil do infravermelho é a partir de 4000 até 400 cm
-1
. Por que uma molécula orgânica
absorve em alguns comprimentos de onda de radiação infravermelho, mas outras não? Todas
as moléculas têm uma certa quantidade de energia distribuída por toda a sua estrutura,
provocando o estiramento e contrações das ligações, ou provocando a movimentação dos
átomos para trás e para frente, entre outras vibrações moleculares. A quantidade de energia
que uma molécula contém não é continuamente variável, mas ela é quantizada. Isto é, a
molécula pode se estirar ou se deformar apenas a uma freqüência específica, correspondendo
a um nível de energia específico. Quando uma molécula é irradiada com radiação
eletromagnética, a energia é absorvida se a freqüência da radiação corresponde à freqüência
da vibração. O resultado dessa absorção de energia é um aumento da amplitude para a
vibração. Com cada freqüência absorvida pela molécula corresponde a um movimento
molecular específico, podemos conhecer os tipos de movimentos que uma molécula possui
pela medida de seu espectro na região do infravermelho. Pela interpretação desses
movimentos, podem-se descobrir quais tipos de ligação (grupos funcionais) estão presentes na
molécula (McMurray, 2005).
A interpretação completa de um espectro na região do infravermelho é difícil por
que a maioria das moléculas são tão grandes que possuem dezenas de movimentos diferentes
de estiramento e deformações angulares das ligações. Assim, um espectro da região do
infravermelho contém dezenas de absorções. Em um certo sentido, essa complexidade é
válida por que um espectro na região do infravermelho serve como uma impressão digital rara
de um composto específico. Na verdade, a região complexa do espectro no infravermelho a
partir de 1500 cm
-1
até próximo de 400 cm
-1
é chamada região de impressão digital. Se dois
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2. Métodos analíticos
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compostos possuem espectros no infravermelho idênticos, são quase certamente idênticos
(McMurray, 2005).
Felizmente, não se necessita interpretar por completo um espectro na região do
infravermelho para obter informações estruturais úteis. A maioria dos grupos funcionais
possui bandas de absorção características no infravermelho, que não mudam de um composto
para outro. A absorção C=O de uma cetona está quase sempre na faixa de 1680 a 1750 cm
-1
; a
aborção O-H de um álcool está quase sempre na faixa de 3400 a 3650 cm
-1
; a absorção C=C
de um alceno esta quase sempre na faixa de 1640 a 1680 cm
-1
; e assim por diante.
Aprendendo onde as absorções dos grupos funcionais característicos ocorrem, é possível obter
informação estrutural e composicional a partir do espectro no infravermelho (McMurray,
2005).
Três tipos de instrumentos para medidas de absorção infravermelha estão
disponíveis por fornecedores comerciais: (1) espectrômetros dispersivos de rede, que são
usados principalmente para trabalho qualitativo; (2) instrumentos multiplexados, empregando
transformada de Fourier, que são apropriados tanto para medidas qualitativas como para
quantitativas; e (3) fotômetros não-dispersivos que foram desenvolvidos para determinações
quantitativas de uma variedade de espécies orgânicas na atmosfera por espectroscopia de
absorção, emissão e reflectância (Skoog, 2002).
A espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (em inglês,
“Fourier Transform Infrared” ou FT-IR, como é mais conhecida) foi desenvolvida
inicialmente por astrônomos no início dos anos 50, para estudar os espectros infravermelhos
de estrelas distantes; somente com o uso da técnica Fourier os sinais muito fracos dessas
fontes podiam ser isolados do ruído ambiental. As primeiras aplicações químicas da FT-IF
eram para as radiações de baixa energia do infravermelho distante; no final dos anos 60, já
estavam disponíveis comercialmente instrumentos para estudos químicos tanto na região
infravermelho distante (10 a 400 cm
-1
) quanto na região infravermelho próximo e médio
(Skoog, 2002).
Existem várias vantagens no uso de instrumentos para FT-IR (Fig. 2.26). A
primeira é a eficiência de transporte, que é obtida porque os instrumentos com transformada
de Fourier possuem poucos elementos ópticos e nenhuma fenda para atenuar a radiação.
Como conseqüência, a potência da radiação que incide no detector é muito maior que em
instrumentos dispersivos, e são observadas relações sinal-ruído muito melhores. A segunda
vantagem é seu alto poder de resolução e reprodutibilidade do comprimento de onda, que
torna possível a análise de espectros complexos nos quais o número de linhas estreitas e a
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2. Métodos analíticos
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superposição espectral tornam difícil a interpretação dos espectros individuais. A terceira
vantagem vem do fato de que todos os elementos da fonte atingem o detector
simultaneamente. Essa catacterística possibilita a obtenção de dados para um espectro inteiro
em um segundo ou menos (Skoog, 2002). A Figura 2.27 mostra um espectro típico produzido
por uma análise por FT-IR.
Figura 2.26 Espectrômetro FT-IR da Perkin Elmer
Figura 2.27 Espectro de FT-IR do fenilacetileno
2.7 DUREZA
Uma propriedade que pode ser importante considerar é a dureza, que é a medida
da resistência de um material a uma deformação mecânica localizada (por exemplo, uma
pequena impressão ou risco). Os primeiros ensaios de dureza eram baseados em minerais
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2. Métodos analíticos
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65
naturais, com uma escala construída unicamente em função da habilidade de uma material em
riscar um outro mais macio. Foi desenvolvido um sistema qualitativo, e um tanto arbitrário, de
indexação da dureza conhecido por escala de Mohrs, que varia entre 1, na extremidade macia
da escala, para o talco, até 10, para o diamante. Técnicas quantitativas para a determinação da
dureza foram desenvolvidas ao longo dos anos, nas quais um pequeno penetrador é forçado
contra a superfície de um material a ser testado, sob condições controladas de carga e taxa de
aplicação. Faz-se a medida da profundidade ou do tamanho da profundidade da impressão
resultante, a qual por sua vez é relacionada a um número índice de dureza; quanto mais macio
o material, maior e mais profunda é a impressão e menor é o número índice de dureza. As
durezas medidas são apenas relativas (ao invés de absolutas), e deve-se tomar cuidado ao se
comparar valores determinados segundo técnicas diferentes. Os ensaios de dureza são
realizados com mais freqüência do que qualquer outro ensaio mecânico por diversas razões:
são simples e baratos; são não destrutivos; e outras propriedades mecânicas podem, com
freqüência, ser estimadas a partir de dados obtidos para ensaios de dureza, tais como o limite
de resistência a tração.
Existem diversas técnicas para a análise de dureza (também denominado ensaio),
conforme o tipo de penetrador utilizado. As principais são: Brinell, cujo penetrador é uma
esfera de 10 mm em aço ou carbeto de tungstênio; Vickers e Knoop, com penetrador
piramidal de diamante e Rockwell/Rockwell superficial, com o penetrador sendo esferas de
aço com 1/16, 1/8, 1/4 e ½ polegada de diâmetro. Os ensaios Knoop e Vickers são chamados
de ensaios de microdureza, já que normalmente as cargas aplicadas são na ordem de mN e o
penetrador (piramidal) é muito pequeno, de modo que a impressão resultante precisa ser
observada sob um microscópio. No caso da microdureza Vickers, o índice de dureza (dado em
HV) é determinado pela seguinte relação:
2
1
8541
d
P
,HV =
onde P é a carga aplicada (Kg) e d
1
é a medida da diagonal da forma da impressão, em mm
(Fig.2.28). A Figura 2.29 mostra um moderno equipamento para medidas de microdureza.
Figura 2.28. Forma de impressão do ensaio Vickers: vista lateral (a) e vista superior (b).
P
136°
d
1
d
1
(a)
(b)
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2. Métodos analíticos
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66
Figura 2.29. Microdurômetro Shimadzu modelo HMV-2.
2.8 ETAPAS GERAIS DE PROCESSOS ANALÍTICOS
Muitos problemas analíticos começam com perguntas que não são apropriadas
para um experimento de laboratório. Por exemplo, “Esta água é própria para o consumo?”, “O
teste de emissões em automóveis diminui a poluição do ar?” Ou ainda, “O que fazer com
tanto lixo jogado fora?”. Todas estas perguntas passam pela utilização de métodos que
permitam a caracterização dos materiais envolvidos. Um cientista traduz estas questões em
termos de determinadas medições. Deve-se então escolher, ou mesmo desenvolver, um
procedimento capaz de realizar estas medições (Harris, 2005).
Quando uma análise está completa, deve-se traduzir os resultados em termos que
possam ser compreendidos por outras pessoas, preferencialmente o público em geral. Um
aspecto muito importante de qualquer resultado está em suas limitações. Qual é a incerteza
dos resultados apresentados? Se as amostras forem feitas de maneiras diferentes, os resultados
serão os mesmos? Somente após a interpretação dos resultados e de suas limitações podem-se
tirar conclusões e tomar decisões (Fresenius, 2000; Skoog, 2002; Harris, 2005).
As etapas gerais de um processo analítico podem ser resumidas como (Horwitz,
2000; Harris, 2005;):
FORMULANDO A QUESTÃO: Traduzir questões gerais em questões específicas
acessíveis para serem respondidas por meio de métodos analíticos;
SELECIONANDO OS PROCEDIMENTOS ANALÍTICOS: Pesquisar na literatura para
encontrar procedimentos apropriados ou, se necessário, desenvolver novos procedimentos
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2. Métodos analíticos
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para fazer as medições necessárias. Para selecionar o método analítico de forma inteligente, é
essencial definir claramente a natureza do problema analítico. Tal definição requer respostas
para as seguintes questões:
1) Que exatidão é necessária?
2) Qual é a quantidade de amostra disponível?
3) Qual é o intervalo de concentração do analito?
4) Que componentes da amostra causarão interferência?
5) Quais são as propriedades físicas e químicas da matriz da amostra?
6) Quantas amostras serão analisadas?
A resposta a questão 1 é de vital importância por que ela determina quanto tempo será
necessário para realizar a análise. As questões 2 e 3 determinam quão sensível deve ser o
método e a amplitude do intervalo de concentrações que deve ser usado. A resposta a questão
4 determina a seletividade requerida do método. As respostas à questão 5 são importantes
porque alguns métodos analíticos são aplicáveis a soluções, outros a amostras gasosas
enquanto outros a sólidos. O número de amostras a serem analisadas (questão 6) é também
uma consideração importante do ponto de vista econômico. Além disto, se o número de
amostras for grande, o método escolhido deverá requerer um tempo mínimo do operador por
amostra. Por outro lado, se o que se pretende é analisar apenas umas poucas amostras, um
método mais simples, mas que pode consumir mais tempo e que requeira pouco ou nenhum
trabalho preliminar é freqüentemente a escolha adequada.
AMOSTRAGEM: Amostragem é o processo segundo o qual o material representativo é
selecionado para ser analisado. Se começarmos com uma amostra mal escolhida, ou se
ocorrem modificações na amostra durante o intervalo de tempo entre a coleta e a análise, os
resultados ficam sem significado.
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA: A preparação da amostra é o processo em que a amostra
representativa é convertida em uma forma apropriada para o método analítico. Neste processo
devem ser levadas em conta as possíveis impurezas presentes, bem como fatores ambientais
como temperatura e umidade relativa, que podem afetar as características da amostra.
ANÁLISE: Utilizar a técnica analítica em várias porções idênticas. O objetivo das medidas
repetidas é avaliar a incerteza na análise e se proteger contra um erro grosseiro na análise de
uma única porção. A incerteza de uma medida é tão importante quanto a medida em si, pois
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2. Métodos analíticos
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nos diz o quanto a medida é confiável. Se necessário, usam-se diferentes métodos analíticos,
em amostras semelhantes, para ter certeza de que todos os métodos conduzem ao mesmo
resultado e que a escolha de um método não influencia o resultado. Pode-se querer também
preparar e analisar várias amostras brutas diferentes para verificar que variações surgem no
procedimento de amostragem.
RELATÓRIO E INTERPRETAÇÃO: Produzir um relatório dos resultados que seja
completo e claramente escrito, realçando quaisquer limitações especiais associadas a eles.
CONCLUSÕES: Uma vez escrito o relatório, o analista poderá ou não se envolver no que é
feito com a informação. Quanto mais clara for a redação de um relatório, menor a
probabilidade de que ele venha a se mal interpretado por aqueles que o usam. Boas
conclusões só são tiradas de análises e interpretações bem feitas.
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2. Métodos analíticos
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69
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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2. Métodos analíticos
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72
Zernike, F. (1942). Phase contrast, a new method for the microscopic observation of
transparent objects II. Physica, 9, 974.
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TRATAMENTO DE DADOS ANALÍTICOS
3.1 INTRODUÇÃO
Todos os métodos analíticos geram dados como resultados das medidas
realizadas. Se estes dados representam ou não uma informação relevante dependerá de sua
confiabilidade. Confiabilidade é a credibilidade apresentada pelos dados coletados. Conceitos
como precisão, exatidão e erro são importantes na avaliação desta confiabilidade. A repetição
de um método de medida várias vezes indica a reprodutibilidade da medida. Quando uma
mesma grandeza é medida através de métodos diferentes e os resultados concordam entre si,
então a exatidão dos resultados passa a ser digna de confiança. Isto significa que os resultados
estão próximos do real. Em todas as medidas estão associados erros (uns mais óbvios do que
outros). Não é possível medir o valor “real” do que quer que seja, sendo assim, o melhor que
se pode fazer é aplicar a técnica que a experiência indica ser a mais confiável. O
conhecimento dos tipos de erros possíveis em um experimento pode auxiliar na escolha da
técnica analítica mais adequada.
Uma vez garantida a confiabilidade dos dados, precisamos organizá-los, descrevê-
los, analisá-los e interpretá-los de forma a utilizá-los como parâmetros de caracterização e
comparação. Para esta tarefa, dispomos de métodos estatísticos. Em termos gerais, a
estatística é um ramo do conhecimento científico que consiste num conjunto de processos que
tem por objeto estudar um determinado fenômeno a partir das informações extraídas de dados
referentes ao mesmo. Há três principais ramos na estatística: a descritiva, que envolve a
organização e a sumarização de dados; a teoria da probabilidade, que proporciona uma base
racional para lidar com situações influenciadas por fatores relacionados com o acaso; e por
último, a teoria da inferência, que envolve análise e interpretação de amostras, possibilitando
uma comparação sobre possíveis diferenças. A característica importante da estatística é o uso
de modelos. Estes são versões simplificadas (abstrações) de algum problema ou situações
reais. A característica fundamental de um modelo é o fato de reduzir uma situação complexa a
uma forma mais simples e compreensível, focalizando a atenção apenas em alguns detalhes de
uma dada situação e ignorando (talvez temporariamente) outros aspectos ou diminuindo-lhes
3
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3. Tratamento de dados analíticos
___________________________________________________________________________
74
a ênfase. Os modelos se representam sob muitas formas diferentes. Há modelos verbais
(palavras e sentenças), modelos gráficos, modelos numéricos (números e equações) e modelos
físicos (tridimensionais) (Stevenson, 1981; Skoog et al., 2002; Harris, 2005).
3.2 CONFIABILIDADE
Os termos mais utilizados na análise de confiabilidade dos dados analíticos são a:
precisão e exatidão.
PRECISÃO: é a medida da reprodutibilidade de um resultado. Representa a concordância
entre os valores numéricos de duas ou mais repetições das medidas, ou medidas que tenham
sido feitas exatamente do mesmo modo. Os termos estatísticos valor médio, desvio padrão,
variância e coeficiente de variação são normalmente associados à precisão. Se uma grandeza
for medida várias vezes e os valores forem muito próximos, a medida é precisa. Se os valores
variarem muito, a medida não é muito precisa;
EXATIDÃO: refere-se ao quanto o valor de uma medida se aproxima de seu valor “real”. Na
verdade, o único tipo de medida completamente exato é o da contagem de objetos. Todas as
outras contêm erros e são apenas aproximações da verdade. A exatidão é um termo relativo,
pois depende muito da necessidade e da dificuldade de um problema analítico. A exatidão é
expressa pelo erro absoluto ou pelo relativo. O erro absoluto (e
a
) da média é dado pela
expressão
aceitomédioa
xxe −=
onde x
médio
é o valor médio das medidas e x
aceito
é o valor aceito para grandeza que está sendo
medida. Já o erro relativo (e
r
) é o valor percentual de e
a
, em relação a x
aceito
, ou seja:
100x
x
)x(x
e
aceito
aceitomédio
r
−
=
O erro absoluto é ainda composto pela soma de dois tipos de erro: o aleatório (ou
indeterminado) e o sistemático (ou determinado).
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3. Tratamento de dados analíticos
___________________________________________________________________________
75
ERROS ALEATÓRIOS: resultam dos efeitos de variáveis que não estão controladas (e que
talvez não possam ser controladas) nas medidas. A possibilidade de um erro aleatório ser
positivo (para mais) ou negativo (para menos) é sempre a mesma. Ele está sempre presente e
não podendo ser eliminado, apenas diminuído em um experimento realizado de forma
adequada.
ERROS SISTEMÁTICOS: são erros que surgem devido a uma falha no projeto de um
experimento ou a uma falha do equipamento ou operador. Têm um valor definido, uma causa
determinável e são de mesmo sinal e magnitude para cada repetição de uma medida realizada
do mesmo modo. Os erros sistemáticos podem ser instrumentais, pessoais e metodológicos.
Nos erros instrumentais, as fontes típicas são circuitos problemas em circuitos eletrônicos,
vazamentos em sistemas de vácuo, efeitos da temperatura em detectores, correntes induzidas
nos circuitos oriundas de linhas de tensão 110/220V, calibração nos equipamentos de
medidas, etc. São facilmente detectados e corrigidos por calibração com padrões adequados.
A calibração e manutenção periódica dos equipamentos é uma forma de se evitar este tipo de
erro. Os erros pessoais são aqueles introduzidos nas medidas pelo operador de um
equipamento. Envolvem a apreciação do experimentador e das decisões que ele precisa tomar,
além da operação inadequada de um equipamento ou execução incorreta de um procedimento.
A maioria dos erros pessoais pode ser eliminada através de treinamento e do hábito de seguir
os protocolos corretos para determinada técnica. Finalmente, os erros metodológicos são
freqüentemente induzidos pelo comportamento não-ideal, físico e químico, dos reagentes e
das reações nas quais a análise está baseada. Fontes possíveis deste tipo de erro incluem
lentidão ou não-efetivação completa de reações químicas, perdas por volatilização, adsorção
do analito em sólidos, instabilidade dos reagentes, contaminantes e interferências químicas
(Skoog et al., 2002; Harris, 2005).
3.3 PRINCÍPIOS DE ESTATÍSTICA
Erros aleatórios fazem com que os resultados de medidas analíticas sejam
distribuídos aleatoriamente. Sendo assim, são convenientemente tratados por meio de
métodos estatísticos. Para a aplicação correta dos métodos estatísticos, o conhecimento de
alguns princípios de estatística fazem-se necessários.
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3. Tratamento de dados analíticos
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76
3.3.1 RESUMO DE DADOS ESTATÍSTICOS
Os métodos estatísticos envolvem a análise e a interpretação de números. Estes
números são designados por dados. Em sua forma não processada, os dados podem quase não
ter sentido. O processamento de dados reduz a quantidade de detalhes, enfatizando os
aspectos importantes dos dados. Ou seja, os dados se transformam em informações.
Os dados estatísticos se obtêm mediante um processo que envolve a observação
ou a outra mensuração de itens. Tais itens chamam-se variáveis, porque originam valores que
tendem a exibir certo grau de variabilidade quando se fazem mensurações sucessivas.
Os dados (ou variáveis) podem ser classificados em 4 tipos:
DADOS CONTÍNUOS: podem assumir qualquer valor num intervalo contínuo. Estes são os
dados típicos gerados pelos métodos estatísticos;
DADOS DISCRETOS: assumem valores inteiros. É o resultado da contagem do número de
itens;
DADOS NOMINAIS: surgem quando se definem categorias e se conta o número de
observações pertencentes a cada categoria;
DADOS POR POSTOS: consistem de valores relativos atribuídos para denotar ordem.
As medidas de tendência central são usadas para indicar um valor que tende a
tipificar, ou a representar melhor, um conjunto de números. As medidas mais usadas são:
MÉDIA ARITMÉTICA (OU SIMPLESMENTE MÉDIA): definida pela seguinte
expressão:
n
X
X
n
i
i
m
∑
=
=
1
onde X
m
é o valor médio de um conjunto de medidas, X
i
o valor da i’ésima medida e n o
número total de medidas. Esta medida de tendência central supõe que cada medida tem a
mesma importância. A média é influenciada por cada valor de um conjunto de medidas,
inclusive os extremos.
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3. Tratamento de dados analíticos
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MÉDIA PONDERADA: média na qual são atribuídos “pesos” ou importâncias diferentes
para cada medida. É definida pela seguinte expressão:
∑
∑
=
=
=
n
i
i
n
i
ii
m
w
Xw
X
1
1
onde w
i
é o “peso” da i’ésima medida;
MEDIANA: é uma medida cuja característica principal é dividir um conjunto ordenado de
dados em dois grupos iguais; a metade terá valores inferiores à mediana, a outra metade terá
valores superiores à mediana. A mediana é relativamente insensível aos valores extremos;
MODA: é o valor que ocorre com maior freqüência em um conjunto de medidas;
As medidas de dispersão de um conjunto de medidas indicam se os valores estão
relativamente próximos ou afastados uns dos outros. Existem quatro medidas básicas de
dispersão:
INTERVALO: é expresso como a diferença entre o maior e o menor valor de um conjunto de
medidas ou pela identificação destes números;
DESVIO MÉDIO ABSOLUTO: mede o desvio médio dos valores em relação à média do
conjunto, ignorando o sinal do desvio. Sua expressão é a seguinte:
n
XX
DMA
n
i
mi
∑
=
−
=
1
onde DMA é o desvio médio absoluto de um conjunto de medidas.
VARIÂNCIA AMOSTRAL: é a média dos quadrados dos desvios dos valores a contar da
média, utilizando-se n-1 ao invés de n. Sua expressão é:
1
1
2
2
−
−
=
∑
=
n
)XX(
s
n
i
mi
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3. Tratamento de dados analíticos
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78
onde s
2
é a variância de um conjunto de medidas.
DESVIO PADRÃO AMOSTRAL: é a raiz quadrada positiva da variância, ou seja:
2
ss =
Os dados estatísticos podem ser apresentados de diversas formas. A representação
mais utilizada é a distribuição de freqüência. Uma distribuição de freqüência é um
grupamento de dados em classes (arranjo ou disposição de itens em subconjuntos que
apresentam características similares), exibindo o número ou percentagem de observações em
cada classe (freqüência). A forma gráfica de representação de uma distribuição de freqüência
é denominada histograma (Fig.3.1) (Afifi e Azen, 1971; Stevenson, 1981; Mendenhall et al.,
1990; Freund, 1998).
Figura 3.1. Histograma típico de uma distribuição de freqüência.
3.3.2 DISTRIBUIÇÕES DE PROBABILIDADE
Quando executamos a repetição das medidas de um experimento, se admitirmos
que os mesmos fatores atuem de forma análoga, constatamos que existe uma possibilidade de
predição “em longo prazo”. Ou seja, certos resultados podem ser mais prováveis que outros,
para um grande número de repetições.
Uma variável aleatória é uma função com valores numéricos determinados por
fatores do acaso. As variáveis aleatórias podem ser discretas ou contínuas. São discretas se
tomam valores que podem ser contados, como por exemplo, número de lâmpadas defeituosas
1
2
3
4
5
7
6
Freqüência (%)
Classes
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3. Tratamento de dados analíticos
___________________________________________________________________________
79
em um dia de produção, número de defeitos em camisas, número de terremotos, etc...São
contínuas quando podem assumir qualquer valor em determinado intervalo, como por
exemplo, pesos de caixas de maças, o diâmetros de hemácias, tempos de quebra da rigidez
dielétrica de capacitores, alturas da população de Fortaleza, etc.
O valor esperado de uma variável aleatória em um experimento é uma média,
determinada pela seguinte relação:
∑
=
=
n
i
ii
Xp)X(E
1
onde E(X) representa o valor esperado da variável aleatória X e p
i
a probabilidade
correspondente ao valor X
i
da variável aleatória X.
Uma distribuição de probabilidade é uma distribuição de freqüências relativas (ou
probabilidades) para os resultados possíveis para uma variável aleatória (espaço amostral). As
distribuições de probabilidade proporcionam um método simples para a determinação de
certas probabilidades além dos tipos de distribuição poderem ser considerados como modelos
para descrever situações que envolvem resultados gerados pelo acaso. A essência da análise
estatística é confrontar as hipóteses de uma distribuição de probabilidades com as
especificações de determinado problema. As distribuições de probabilidade podem ser
classificadas como discretas e contínuas. Nas distribuições contínuas, as variáveis aleatórias
envolvidas são aquelas associadas a dados que podem ser contados. Já as distribuições
contínuas de probabilidade são usadas tanto para descrever variáveis aleatórias contínuas
como para aproximar variáveis discretas em certos casos.
Para as distribuições discretas, podemos definir uma função (de massa) de
probabilidade P(X
i
) de uma variável aleatória X, que assume valores num conjunto discreto
{X
1
, X
2
, …}. P(X
i
) é uma função que associa a cada X
i
a sua probabilidade de ocorrência.
No caso de distribuições contínuas, como uma variável aleatória contínua pode
assumir (teoricamente) infinitos valores, a “massa” de probabilidade em cada ponto é zero.
Por isso, a definição utilizada para função distribuição para distribuições discretas precisa ser
adaptada a esta situação. Para isto define-se a função distribuição de probabilidade F(x) = P(
X ≤ x ) com as seguintes propriedades:
• 0 ≤ F(x) ≤ 1, para todo x Є ℜ;
• F(x) é uma função contínua não-decrescente em x;
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3. Tratamento de dados analíticos
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80
•
∫
∞−
=
x
f(u)duF(x)
onde f(x) é chamada função densidade de probabilidade. f(x) tem as seguintes propriedades:
• f(x) ≥ 0;
•
1=
∫
+∞
∞−
f(u)du
A função distribuição será contínua em todo número real contrastando com a
forma “em escada” característica para variáveis discretas. A ausência de descontinuidades
indica que a “massa” de probabilidade é zero para todo x. Portanto, no caso de distribuições
contínuas de variáveis aleatórias, o cálculo de probabilidades somente terá sentido para
intervalos em ℜ em contraste com probabilidades pontuais do caso discreto. Isto significa que
o cálculo de áreas sob a função densidade f(x) resulta em probabilidades:
F(a)F(b)f(x)dub)XP(a
b
a
−==≤<
∫
Existem diversos tipos de distribuições de probabilidade, tanto discretas como
contínuas. Entretanto, a que ocupa um papel de destaque na análise estatística de dados é a
distribuição contínua normal ou Gaussiana, pois ela representa uma boa aproximação às
distribuições de freqüência encontrada em fenômenos físicos. Admite-se que os erros
indeterminados em medidas seguem a lei da distribuição normal (Fletes e Campos, 1985;
Mendenhall et al., 1990; Freund, 1998; Magalhães, 2001).
3.3.3 DISTRIBUIÇÃO NORMAL
A curva de distribuição normal apresenta determinadas características bem
definidas. Tem a forma de sino; é simétrica em relação à média; estenda-se de -∞ à +∞; fica
completamente determinada pelo seu valor médio (µ) e desvio padrão (σ) da população; sua
área total é considerada 100%; a área sob a curva entre dois pontos é a probabilidade de uma
variável normalmente distribuída tomar valores entre estes dois pontos; as probabilidades se
referem sempre a intervalos de valores e não a um único valor; a área sob a curva entre a
média e um ponto arbitrário é uma função do número de desvios padrões entre a média e
aquele ponto (Fig.3.2). Sua função densidade de probabilidade é:
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3. Tratamento de dados analíticos
___________________________________________________________________________
81
Figura 3.2. Representação gráfica da distribuição normal.
A integração da f(x) entre limites especificados fornece a probabilidade entre estes
limites. Em particular, se os limites forem de -∞ à +∞, tem-se a probabilidade total igual a 1
(100%). Se uma variável tem distribuição normal, cerca de 68% de seus valores estarão no
intervalo de um desvio padrão a contar de cada lado da média; cerca de 95,5% no intervalo de
dois desvios padrões a contar da média, e cerca de 99,7% dentro de três desvios padrões a
contar da média. Isto á válido para todas as distribuições normais (Fig.3.3)
Figura 3.3. Fração aproximada da área sob a curva de distribuição normal entre os limites ±1σ, ±2σ e
±3σ.
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3. Tratamento de dados analíticos
___________________________________________________________________________
82
Entretanto, é mais conveniente o uso do número de desvios padrões a contar da
média (z):
σ
µ
=
-x
z
onde x é um valor arbitrário, µ a média da distribuição normal e σ o desvio padrão. Valores
de z positivo significam que os valores de x estão acima da média; se negativos, abaixo da
média. As áreas da curva normal, a contar da média, para dados valores de z (Fig.3.4) são
normalmente tabelados e facilmente encontrados em qualquer livro de estatística.
Figura 3.4. Área da curva normal padronizada entre a média e um valor de z.
Por exemplo, para z=1 (um desvio padrão a contar da média, no sentido de valores maiores
que µ), a área da curva normal entre µ e σ, será de aproximadamente 0,34 (34%) e 0,68 (68%)
entre –z e +z.
A distribuição normal é um modelo teórico, sendo assim, nenhum conjunto de
dados oriundos de medidas se adequará completamente a este modelo. Entretanto têm se
constituído como uma excelente aproximação dos dados experimentais (Youmans, 1973,
Stevenson, 1981).
3.3.4 AMOSTRAGEM
Em estatística, população representa a totalidade ou universo de elementos em
estudo. Amostra é uma parcela representativa deste grupo. A finalidade da amostragem é
permitir fazer inferências sobre uma população a partir da amostra, já que na maioria dos
casos, torna-se inviável um estudo completo da população. Evidentemente supõe-se que a
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3. Tratamento de dados analíticos
___________________________________________________________________________
83
amostra represente a população de que foi extraída. Este objetivo é atingido quando a
amostragem é aleatória. Para populações discretas (aquelas que envolvem varáveis discretas),
uma amostra aleatória é aquela em que cada item da população tem a mesma probabilidade de
ser incluído na amostra. Para populações contínuas (aquelas que envolvem variáveis
contínuas), uma amostra aleatória é aquela em que a probabilidade de incluir na amostra
qualquer intervalo de valores é igual à percentagem da população que está naquele intervalo.
No tratamento estatístico dos dados analíticos, assume-se que a quantidade de
repetições dos resultados experimentais obtidos no laboratório (amostra) é uma fração
diminuta do número infinito de resultados que, em princípio, poderiam ser obtidos se
houvesse um tempo infinito e uma quantidade infinita de amostras (população). As leis
estatísticas aplicam-se somente a populações; quando estas leis são aplicadas a dados
analíticos obtidos em laboratório estamos assumindo que estes dados representam a
população. Como não se pode afirmar com certeza que esta suposição é verdadeira, então as
afirmações sobre erros aleatórios devem ser tratadas em termos de probabilidades (Stevenson,
1981; Soares et al., 1991).
3.3.5 DISTRIBUIÇÕES AMOSTRAIS
A finalidade da amostragem é obter uma indicação do valor de um ou mais
parâmetros de uma população, como a média e o desvio padrão populacional que possuem
determinada característica. As estatísticas amostrais que correspondem a esses parâmetros
populacionais são usadas para aproximar os valores desconhecidos daqueles parâmetros.
Desta forma, a média amostral é usada para estimar a média da população e o desvio padrão
amostral para estimar o desvio padrão da população.
Quando se extraem várias amostras da mesma população, no caso de uma
amostragem aleatória, há uma tendência de a estatística amostral variar de amostra para
amostra e também em relação ao verdadeiro valor do parâmetro, em razão de fatores
aleatórios associados a amostragem. Esta tendência é denominada de variabilidade amostral.
Entretanto, pode-se demonstrar que para uma amostragem aleatória a variabilidade amostral
pode ser descrita por distribuições de probabilidades, em particular a normal. Uma
distribuição amostral é uma distribuição de probabilidades que indica até que ponto uma
estatística amostral tende a variar devido a variações na amostragem aleatória. Quando a
amostragem é aleatória, há uma elevada probabilidade de que a estatística amostral se
aproxime do parâmetro populacional.
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3. Tratamento de dados analíticos
___________________________________________________________________________
84
Uma distribuição amostral de médias é uma distribuição de probabilidade que
indica quão prováveis são diversas médias amostrais. É uma função da média e do desvio
padrão da população e do tamanho da amostra. Duas características importantes das
distribuições amostrais devem ser consideras. A primeira, é que a média de uma distribuição
amostral é sempre igual à média da população e a segunda, é que o desvio padrão amostral
decresce com o aumento no número de amostras.
Quando uma população é muito grande ou infinita, o desvio padrão da
distribuição amostral da média (σ
m
) é dado por:
n
m
σ
=σ
onde σ é o desvio padrão da população e n o tamanho da amostra (Stevenson, 1981; Skoog et
al., 2002).
3.3.6 TEOREMA DO LIMITE CENTRAL
• Se uma população sob amostragem tem distribuição normal, a distribuição das médias
amostrais também será normal para todos os tamanhos de amostra;
• Se a população básica é não normal, a distribuição de médias amostrais será
aproximadamente normal para grandes amostras.
A capacidade de se fazer inferências em relação a uma população depende do
conhecimento de sua distribuição amostral. O Teorema do Limite Central diz que não é
necessário conhecer a distribuição de uma população para se fazer inferências sobre ela a
partir de dados amostrais, desde que a amostra seja grande. Na prática, a amostra deve ter um
tamanho de 30 ou mais observações (Freund, 1998).
3.3.7 ESTIMAÇÃO
Estimação é o processo que consiste em utilizar dados amostrais para estimar
parâmetros populacionais desconhecidos. Qualquer característica de uma população pode ser
estimada a partir de uma amostra aleatória. As estimativas podem ser pontuais, quando
originam uma única estimativa do parâmetro; ou intervalares quando se especifica um
intervalo de valores possíveis em se julga que o parâmetro populacional deva estar.
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3. Tratamento de dados analíticos
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A capacidade de estimar parâmetros populacionais por meio de dados amostrais
está associada diretamente ao conhecimento da distribuição amostral usada na estimativa. A
distribuição de médias amostrais é normal ou aproximadamente normal quando se consideram
erros não determinados em medidas analíticas. Sendo assim, ao fazer-se uma afirmativa de
que a média está a menos de 1,96 desvio padrões a contar da média verdadeira, pode-se
esperar estar certo 95% das vezes (área entre -1,96σ
m
e +1,96σ
m
na curva de distribuição
normal), e errado 5%. Ou seja, esta afirmativa tem um nível de confiança de 95% (5% de erro
ou 95% de certeza). Independente do nível de confiança adotado, não se pode dizer se
determinada média amostral é menor, ou maior do que o valor desconhecido da média da
população. Sendo assim, é utilizada uma atribuição probabilística do intervalo em que o valor
verdadeiro possa estar. Denomina-se intervalo de confiança a um intervalo de valores,
centrado na estatística amostral, no qual julga-se, com certa incerteza estatística determinada
pelo nível de significância adotado, estar o parâmetro da população. No exemplo acima, o
intervalo de confiança para o nível de confiança de 95% é de -1,96σ
m
à +1,96σ
m
.
A estimativa intervalar da média populacional se baseia na hipótese de que a
distribuição das médias é normal. O método para se estimar a média de uma população
depende de o desvio padrão ser conhecido ou não. Se o desvio padrão é conhecido, então a
estimativa pontual da média será µ = X
m
e a estimativa intervalar será µ = X
m
± zσ
m
. O valor
zσ
m
é normalmente denominado erro de estimação. Entretanto, para medidas onde está se
considerando erros indeterminados, o desvio padrão da população não é conhecido. Sendo
assim, algumas alterações devem ser feitas no cálculo do desvio padrão e do erro de
estimação. Ao invés de se utilizar o desvio padrão da população σ
m
deve-se utilizar o da
amostra s (que pode ser obtido experimentalmente) e substituir o parâmetro z pelo t definido
como:
s
µ
=
-x
t
O parâmetro t normalmente é chamado t de student e está associado a distribuição t, que é a
distribuição mais adequada quando se usa s. Na verdade, para grandes amostras, é razoável
usar valores de z para aproximar valores t, muito embora a distribuição t seja sempre
teoricamente correta quando não se conhece o desvio padrão da população,
independentemente do tamanho da amostra. Também é importante salientar que a distribuição
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3. Tratamento de dados analíticos
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t só é teoricamente adequada quando a distribuição é normal. O desvio padrão das médias das
amostras, neste caso, é mais conhecido como erro padrão da média (EP), dado por
n
s
EP =
Assim, a estimativa pontual da média será µ = X
m
e a estimativa intervalar será µ = X
m
± tEP.
O valor tEP é o erro de estimação (Stevenson, 1981; Harris, 2005).
3.3.8 TESTES DE SIGNIFICÂNCIA
Os testes de significância são testes estatísticos utilizados para avaliar uma
afirmação sobre parâmetros populacionais. Em relação à afirmação, estabelecem-se duas
hipóteses: a hipótese nula ou de nulidade (H
0
), onde a afirmação que o parâmetro
populacional é tal como especificado é verdadeira; e a hipótese alternativa (H
1
), onde a
afirmação é falsa. O nível de significância (α) de um teste é a probabilidade de uma hipótese
nula ser rejeitada, quando verdadeira. O nível de confiança é igual a (1 - α). A escolha de um
nível de significância implica em particionar a distribuição amostral adequada em regiões de
aceitação (variação provavelmente casual) e de rejeição (variações provavelmente não
casuais), em função de um valor z quando σ é conhecido e t quando σ é desconhecido (a
maioria dos casos). Os valores de z ou t são chamados valores críticos. Calcula-se uma
estatística de teste (um parâmetro determinado conforme o teste de significância adotado)
com base nos dados amostrais e no valor alegado (esperado) que é então comparado com o
valor crítico. Uma estatística de teste que exceda o valor crítico sugere a rejeição de H
0
, não é
a variabilidade amostral que corresponde à estatística observada; um teste inferior sugere que
se aceite H
0
. Assim, o teste de significância envolve:
• Formular a hipótese nula ou de nulidade;
• Escolher a distribuição amostral adequada. A maioria dos testes envolve a distribuição t
(testes t de Student), pois não se conhece o desvio padrão da população e sim da amostra;
• Escolher o nível de significância e conseqüentemente o valor crítico;
• Rejeitar a hipótese de nulidade se a estatística teste excede o valor crítico; caso contrário,
aceitá-la;
É muito importante que em todo o processo exista uma distribuição amostral
baseada na premissa de que a afirmação é verdadeira. Indica até onde os resultados amostrais
podem variar simplesmente em conseqüência de variação casual na amostra.
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3. Tratamento de dados analíticos
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87
Normalmente em testes de significância de dados analíticos deseja-se responder a
pergunta: dois ou mais conjuntos de dados apresentam a mesma média populacional? Ou seja,
as diferenças são ou não devido à variabilidade amostral? A hipótese de nulidade (H
0
) é que
as médias de duas ou mais populações são iguais (não existem diferenças significativas). Para
responder a estas perguntas, normalmente usam-se os testes t-student e o ANOVA. Cada um
delas gera uma estatística de teste que é comparada com o valor crítico. Também partem da
suposição de uma distribuição normal para os dados amostrais.
O teste t-Student é um teste para médias e tem como objetivo avaliar informações
sobre médias de populações. Emprega-se um teste de uma amostra se a afirmação diz respeito
a uma única população; e um teste de duas amostras, quando a afirmação envolve duas
populações. Se os grupos são independentes, usa-se o t-Student simples, caso contrário, o
pareado. A afirmação é avaliada supondo que seja verdadeira e construindo uma distribuição
amostral baseada naquela afirmação, que pode ser usada para avaliar determinado resultado
amostral. As médias amostrais que resultam em pequenos desvios do valor esperado
(alegado) são consideradas como devidas à variação casual na amostragem; grandes
diferenças são consideradas indícios de que a afirmação não é verdadeira. O desvio padrão da
distribuição amostral é usado como medida do desvio em relação ao valor esperado, e o nível
de significância serve para determinar valores críticos que separam os resultados casuais dos
não-casuais.
O teste ANOVA é um teste que utiliza a análise de variância para determinar se as
médias de duas ou mais populações são iguais. Se os grupos são independentes, usa-se o
ANOVA simples, caso contrário, ANOVA para medidas repetidas. O teste tem como base na
extração de uma amostra de cada população. A hipótese de nulidade é que as médias das
populações são todas iguais e a hipótese alternativa, é que as médias não são iguais. Se o teste
estatístico (análise de variância) leva a aceitar a hipótese de nulidade, conclui-se que as
diferenças observadas entre as médias amostrais são devidas as variações aleatórias na
amostra e assim, que as médias amostrais são iguais (dentro do nível de significância
adotado). No caso de rejeição da hipótese de nulidade, conclui-se que as diferenças entre as
médias amostrais são demasiadamente grandes para serem devidas apenas à chance e assim,
que as médias populacionais não são iguais. Quando as hipóteses básicas da análise de
variância são satisfeitas, isto é, amostras independentes extraídas de populações normais com
variâncias iguais, esta técnica é extremamente poderosa para testar a igualdade de médias
amostrais. Se as variâncias populacionais são aproximadamente iguais, a hipótese das
variâncias iguais é razoavelmente satisfeita. Entretanto, a análise de variância não testa a
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3. Tratamento de dados analíticos
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hipótese de igualdade entre variâncias populacionais. Assim, quando as variâncias amostrais
parecem diferir consideravelmente, deve-se fazer um teste diferente para a sua igualdade.
Uma regra prática é que a maior variância amostral não exceda a dez vezes a menor variância
amostral.
O teste ANOVA fornece a resposta a questão da existência ou não de diferenças
significativas entre as médias de grupos amostrais. Entretanto, na maioria das vezes,
precisamos saber em que amostras estas diferenças ocorrem. Para responder a esta nova
pergunta, realizamos os testes para comparações múltiplas entre dois grupos (dois a dois),
também conhecidos como testes pós ANOVA. Estes testes nos permitem identificar onde
estão estas diferenças. Os principais testes de comparações múltiplas são o Fisher,
Bonferroni, Sheffe e Tukey. O mais usado, por ser mais sensível, é o Tukey. Entretanto ele
exige uma igualdade nos tamanhos amostrais (ou com pequena diferença). No caso das
amostras diferirem muito em tamanho, utiliza-se o Sheffe.
Testes de significância como os t-Student e ANOVA pertencem à categoria dos
chamados testes paramétricos. Testes paramétricos são os testes conduzidos em situações
onde sabemos ou assumimos que uma teoria particular de distribuição é apropriada para
representar os dados e/ou o teste estatístico. Na realidade, o termo paramétrico pode ser
interpretado como sinônimo para “teórico” com respeito às distribuições de probabilidade.
Em contraste, os testes não-paramétricos são conduzidos sem assumirmos qualquer particular
forma teórica para aquela dada situação. Os mais conhecidos são Wilcoxon, Mann-Whitney,
Friedman e Kruskal-Wallis (Scheffe, 1959; Stevenson, 1981; Pereira, 1999).
3.3.9 TESTE DE NORMALIDADE
A distribuição normal é uma das distribuições mais importantes na estatística. Os
testes mais poderosos utilizados na inferência de dados analíticos, como o ANOVA, partem
da suposição que a distribuição amostral é normal. Apesar do Teorema do Limite Central
garantir a normalidade para um conjunto grande de amostras, nem sempre é possível seguir
este critério em experimentos analíticos. Sendo assim, é importante o emprego de
procedimentos que possibilitem testar se um conjunto de dados segue ou não uma distribuição
normal, dentro de um nível de significância adotado. Os principais testes de normalidade (ou
de aderência, como também são conhecidos) são o de Kolmogorov-Smirnov e o "W" de
Shapiro-Wilk (IDL Statistical Library, 1992).
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3. Tratamento de dados analíticos
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3.4 REJEIÇÃO DE RESULTADOS
Quando são feitas várias medidas de uma mesma grandeza, um resultado pode
diferir consideravelmente dos demais. A questão é saber se este resultado deve ser rejeitado
ou não, pois ele afetará a média. Quando um erro pode ser atribuído a algum acidente
ocorrido durante a análise o resultado deve ser rejeitado, mas quando o resultado discrepante
não pode ser atribuído a nenhuma causa definida de erro, a sua rejeição deve ser decidida por
critérios estatísticos. O teste Q pode ser utilizado para ajudar a decidir se o dado questionado
deve ser mantido ou descartado. O teste Q utiliza o seguinte procedimento:
• Colocar os valores amostrais em ordem crescente;
• Determinar a diferença entre o maior e o menor valor da amostra (intervalo);
• Determinar a diferença entre o valor questionado e o mais próximo (variação);
• O coeficiente Q (Q
calculado
) será a razão (em módulo) entre a variação e o intervalo;
• Comparar o Q
calculado
com o Q
tabelado
. Se Q
calculado
> Q
tabelado
então o valor deve ser
descartado.
O teste Q é utilizado somente quando o número de resultados é inferior a 10 (Baccan et
al., 1979; Harris, 2005)
3.5 ROTEIRO PARA O TRATAMENTO DE DADOS ANALÍTICOS
Uma vez feitas medidas analíticas e observando-se os cuidados com a
confiabilidade dos resultados, os dados devem ser tratados para fornecerem informações
relevantes em processos de caracterização ou comparação em um determinado estudo.
Inicialmente, verificam-se possíveis discrepâncias nos dados que podem levar a testes Q (para
a rejeição ou não de dados duvidosos) ou a repetição da medida nas condições em que os
dados suspeitos ocorreram. A partir daí, os dados são tratados estatisticamente. Para a análise
estatística utilizando ferramentas computacionais, deve-se elaborar uma planilha eletrônica
para que os dados sejam analisados utilizando-se um programa estatístico (EXCELL,
ORIGIN, IDL, STATDISK, etc). Inicialmente, processa-se a estatística descritiva e, em
seguida, a estatística inferencial. A partir da estatística descritiva obtém-se: freqüência, média
(X
m
), desvio padrão (s), erro padrão (EP), dentre outros. Com estes dados pode-se construir
um histograma, que representa a distribuição amostral. Verificar o tipo de distribuição por
meio do teste de normalidade. Normalmente o mais utilizado é o Shapiro-Wilk. Em caso de
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3. Tratamento de dados analíticos
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90
distribuição normal, os resultados são expressos em X
m
± tEP. O parâmetro t de Student
normalmente deve ser utilizado, já que não se conhece o desvio padrão da população (σ). Nos
casos de distribuição "Não-normal", os resultados são expressos em mediana e valores
mínimo e máximo. Na estatística inferencial, nos casos de distribuição normal com variância
semelhante, são utilizados os testes paramétricos. Na comparação entre dois grupos
independentes, o teste t-Student; e entre dependentes, o teste t-Student pareado. Na
comparação entre três ou mais grupos independentes, utiliza-se a análise de Variância
(ANOVA); e entre dependentes, ANOVA para medidas repetidas. Se na análise de variância
houver diferença significativa, seguem-se os testes para comparações múltiplas entre dois
grupos (dois a dois), para localizar entre quais grupos existe(m) a(s) diferença(s). Os testes
para comparações múltiplas após ANOVA mais freqüentemente utilizados são: Tukey,
Bonferroni, Dunnett e Student-Newman-Keuls. O mais sensível é o de Tukey. Nos casos de
distribuição "Normal" em que não se observam variâncias semelhantes ou nos de distribuição
não-Normal se utilizam os testes não-paramétricos. Na comparação entre dois grupos
dependentes aplica-se o teste de Wilcoxon e para os grupos independentes utiliza-se o teste de
Mann-Whitney. Na comparação entre três ou mais grupos, quando dependentes, o teste de
Friedman; e quando independentes, utiliza-se o teste de Kruskal-Wallis. Os testes para
comparações múltiplas após Friedman ou Kruskal-Wallis, mais freqüentemente utilizados
são: Dunn, Tukey, Dunnett e Student-Newman-Keuls. Para toda a análise estatística (teste de
normalidade e estatística inferencial) um nível de significância (α) deve ser escolhido.
Normalmente adota-se α = 0,05.
Programas muito utilizados em processamento de dados, como o ORIGIN
(OriginLab Corporation), proporcionam a realização de estatística descritiva (Fig.3.5) e testes
de hipótese t-Student (Fig.3.6) e ANOVA (Fig.3.7).
Figura 3.5. Opções de estatística descritiva no Origin.
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3. Tratamento de dados analíticos
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Afifi, A. A.;Azen, S. P. (1971). Statistical Analysis, A Computer Aided Approach. London:
Academic Press.
Baccan, N., Andrade, J. C., Godinho, O. E. S.; Barone, J. S. (1979). Química Analítica
Quantitativa Elementar. São Paulo: Edgard Blucher.
Fletes, J. F.; Campos, E. F. (1985). Apostila de estatística. Santa Catarina: UFSC.
Freund, J. E. (1998). Mathematical Statistical. 2
nd
ed. New Jersey: Prentice-Hall.
Harris, D. C. (2005). Análise Química Quantitativa. 6 ed. Rio de Janeiro: LTC.
IDL Statistical Library (1992). Research Systems, Inc.
Magalhães, M. N.; Lima, A. C. P. (2001). Noções de Probabilidade e Estatística. São Paulo:
IME-USP.
Mendenhall, W., Wackerly, D. D.; Scheaffer, R.L. (1990). Mathematical Statistics with
Applications. Boston: PWS-Kent.
Pereira, J C. R. (1999). Análise de dados qualitativos: estratégias metodológicas para as
ciências da saúde, humanas e sociais. São Paulo: Edusp.
Scheffe, H. (1959). The Analysis of Variance. Neu York: John Wiley & Sons.
Skoog, D. A, Holler, F. J.; Nieman, T. A. (2002). Princípios da Análise Instrumental. Porto
Alegre: Bookman.
Soares, I. J., Farias, A. A., Cesar, C. C. (1991). Introdução à estatística. Rio de Janeiro:
Quanabara-Kooganc.
Stevenson, W. J. (1981). Estatística Aplicada à administração. São Paulo: Harper e Row do
Brasil.
Youmans, H. L. (1973). Statistical for chemistry. New York: Charles E. Merril Publishing.
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LIXO – O QUE FAZER COM ELE?
4.1 INTRODUÇÃO
A palavra lixo, derivada do termo latim lix, significa cinza. No dicionário
(Larousse, 2004), ela é definida como: substantivo masculino. 1. Restos domésticos ou
industriais; despejos, resíduos inaproveitáveis. 2. Tudo o que não presta e se joga fora. 3.
Sujeira, imundície. 4. Coisa ou coisas inúteis, sem valor. Já a Associação Brasileira de
Normas Técnicas (ABNT) define o lixo como os “restos das atividades humanas,
considerados pelos geradores como inúteis, indesejáveis ou descartáveis, podendo se
apresentar no estado sólido, semi-sólido (todos aqueles com teor de umidade inferior a 85%)
ou líquido, desde que não seja passível de tratamento convencional”. Lixo, na linguagem
técnica, tem sido utilizado como sinônimo de resíduos sólidos e compreende materiais
descartados pelas atividades humanas. Entretanto, este é um conceito relativo, já que o fato de
algo ser descartado não o impossibilita de se tornar matéria-prima para um novo produto ou
processo.
Desde os tempos mais remotos até meados do século XVIII, quando surgiram as
primeiras indústrias na Europa, o lixo era produzido em pequena quantidade e constituído
essencialmente de sobras de alimentos. A partir da Revolução Industrial, as fábricas
começaram a produzir objetos de consumo em larga escala e a introduzir novas embalagens
no mercado, aumentando consideravelmente o volume e a diversidade de resíduos. Vidros,
plásticos, papéis e metais são apenas alguns exemplos da infinidade de materiais formadores
de resíduos. Entretanto, não só as fábricas e os consumidores atuam como fontes de dejetos. O
aumento da industrialização também trouxe uma elevação no consumo de energia e
conseqüente necessidade de ampliar sua produção. Uma das alternativas para a geração de
energia está nas termoelétricas a carvão, ainda muito utilizadas no mundo. Porém, estas atuam
também como fonte de resíduos, não só na forma de gases, mas também de resíduos sólidos,
através das cinzas resultantes da combustão do carvão (mineral ou vegetal). Também se
destacam os resíduos gerados pela agroindústria, na forma de bagaços (p. ex. cana-de-açúcar e
caju) e cascas (p. ex. arroz), dentre outros.
4
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4. Lixo: O que fazer com ele?
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O fato mais preocupante é que a população mundial está crescendo em ritmo
acelerado, esperando-se que duplique nos próximos vinte ou trinta anos. Isso implica na
expansão automática da industrialização, o que irá gerar inevitavelmente consideráveis
volumes de lixo. O não tratamento desta massa pode contribuir significativamente para a
degradação da biosfera, em detrimento da qualidade de vida (Lima, 2004).
Podemos deduzir então o conceito da inesgotabilidade do lixo, ou seja, podemos
afirmar que o lixo é inesgotável em vista de sua origem. Também podemos traduzir o
conceito de inesgotabilidade como irreversibilidade, pois os mecanismos de origem e
produção dos resíduos advêm de processos irreversíveis. Podemos finalmente concluir que os
problemas gerados pelo lixo no meio ambiente são irreversíveis, se nada fizermos para contê-
los (Lima, 2004).
Temos assim um grande problema gerado com a sociedade industrial: o que fazer
com tanto lixo? A resposta mais fácil é: livrar-se dele. O meio ambiente já sofre há muito
tempo com as conseqüências desta atitude. Os chamados “lixões” e a crescente poluição de
nossos recursos naturais formam um retrato de uma sociedade baseada no “livrar-se”.
Reduzir o consumo e reprojetar os produtos que fabricamos são as melhores
formas de diminuir a produção de resíduos e promover a sustentabilidade.
A reciclagem surge como outra resposta. É uma das melhores alternativas para a
minimização do lixo, além de gerar economias para o país. Reciclagem é um processo de
transformação de materiais que possibilita o seu reaproveitamento pela indústria ou pela
agricultura. Pode-se observar este processo na natureza: numa floresta, por exemplo, isso
funciona em um perfeito esquema de reciclagem - as folhas caem, os animais morrem,
apodrecem e se transformam em adubo para as plantas que reiniciam um novo ciclo
(Rodrigues, 2000).
4.2 CLASSIFICAÇÃO DOS RESÍDUOS SÓLIDOS
Para determinar a melhor tecnologia para tratamento, aproveitamento ou
destinação final dos resíduos é necessário conhecer a sua classificação. Os resíduos sólidos
podem ser classificados de várias maneiras. As mais comuns são quanto aos riscos potenciais
de contaminação do meio ambiente e quanto à natureza ou origem.
Conforme a NBR 10.004 da ABNT quanto aos riscos potenciais de contaminação
do meio ambiente, os resíduos sólidos podem ser classificados (Monteiro, 2001) em:
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4. Lixo: O que fazer com ele?
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• Classe I (perigosos): São aqueles que, por serem inflamáveis, corrosivos, reativos, tóxicos
ou patogênicos, apresentam riscos à saúde pública através do aumento da mortalidade ou
da morbidade, ou ainda provocam efeitos adversos ao meio ambiente quando manuseados
ou dispostos de forma inadequada;
• Classe II (inertes): São resíduos biodegradáveis ou solúveis, com possibilidade de
acarretar riscos à saúde ou ao meio ambiente, não se enquadrando nas classificações de
resíduos Classe I e Classe III;
• Classe III (inertes): São aqueles que não oferecem riscos à saúde e ao meio ambiente, e
que, quando amostrados de forma representativa, segundo a norma NBR 10.007, e
submetidos a um contato estático ou dinâmico com água destilada ou deionizada, à
temperatura ambiente, conforme teste de solubilização segundo a norma NBR 10.006, não
tiverem nenhum de seus constituintes solubilizados a concentrações superiores aos
padrões de potabilidade da água, conforme listagem nº 8 (Anexo H da NBR 10.004),
excetuando-se os padrões de aspecto, cor, turgidez e sabor.
Já quanto à origem, os resíduos sólidos podem ser classificados (Menin, 1999 e
Monteiro, 2001) como:
• Resíduo urbano: Formado por resíduos sólidos em áreas urbanas. Incluem os resíduos
domésticos, os efluentes industriais domiciliares (pequenas indústrias de fundo de quintal)
e resíduos comerciais;
• Resíduo domiciliar: Formado pelos resíduos sólidos de atividades residenciais. Contém
muita quantidade de matéria orgânica, plástico, lata, vidro;
• Resíduo comercial: Formado pelos resíduos sólidos das áreas comerciais. Composto por
matéria orgânica, papéis, plástico de vários grupos;
• Resíduo público: Formado por resíduos sólidos oriundos da limpeza pública (areia, papéis,
folhagem, poda de árvores);
• Resíduo especial: Formado por resíduos geralmente industriais. Merece tratamento,
manipulação e transporte especial, são eles, pilhas, baterias, embalagens de agrotóxicos,
embalagens de combustíveis, de remédios ou venenos;
• Resíduo industrial: Nem todos os resíduos produzidos pela indústria, podem ser
designados como resíduo industrial. Algumas indústrias do meio urbano produzem
resíduos semelhantes ao doméstico. Exemplo disto são as padarias; os demais poderão ser
enquadrados em lixo especial e ter o mesmo destino. São resíduos muito variados que
apresentam características diversificadas, pois estas dependem do tipo de produto
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4. Lixo: O que fazer com ele?
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manufaturado. Devem, portanto, ser estudados caso a caso. Adota-se a NBR 10.004 da
ABNT para se classificar os resíduos industriais: Classe I, Classe II e Classe III;
• Resíduo do serviço de saúde (RSS): Os serviços hospitalares, ambulatoriais, farmácias,
são geradores dos mais variados tipos de resíduos sépticos, resultantes de curativos,
aplicação de medicamentos que em contato com o meio ambiente ou misturado ao lixo
doméstico poderão ser patógenos ou vetores de doenças, devem ser destinados à
incineração. Segundo a NBR 12.808 da ABNT, os resíduos de serviços de saúde seguem a
seguinte classificação: Classe A - Resíduos Infectantes (biológicos, sangue e
hemoderivados, cirúrgicos anatomopatológicose exsudato, perfurantes e cortantes,
animais contaminados e assistência a pacientes); Classe B - Resíduos Especiais (rejeitos
radioativos, resíduos farmacêuticos e resíduos químicos perigosos); Classe C - Resíduos
Comuns (aqueles que não se enquadram nos tipos A e B e que, por sua semelhança aos
resíduos domésticos, não oferecem risco adicional à saúde pública)
• Resíduo espacial: Restos provenientes dos objetos lançados pelo homem no espaço, que
circulam ao redor da Terra com a velocidade de cerca de 28 mil quilômetros por hora. São
estágios completos de foguetes, satélites desativados, tanques de combustível e
fragmentos de aparelhos que explodiram normalmente por acidente ou foram destruídos
pela ação das armas anti-satélites;
• Resíduo radioativo: Resíduo tóxico e venenoso formado por substâncias radioativas
resultantes do funcionamento de reatores nucleares. Como não há um lugar seguro para
armazenar esse lixo radioativo, a alternativa recomendada pelos cientistas foi colocá-lo
em tambores ou recipientes de concreto impermeáveis e a prova de radiação, e enterrados
em terrenos estáveis, no subsolo.
4.3 RESÍDUOS E MEIO AMBIENTE
Qualquer resíduo sólido decorrente das atividades produtivas humanas, conforme
a sua quantidade, apresenta algum tipo de efeito ao meio ambiente. Entretanto, alguns
merecem atenção especial (Monteiro, 2001).
• As pilhas e baterias têm como princípio básico converter energia química em energia
elétrica utilizando um metal como combustível. Apresentando-se sob várias formas
(cilíndricas, retangulares, botões), podem conter um ou mais dos seguintes metais:
chumbo (Pb), cádmio (Cd), mercúrio (Hg), níquel (Ni), prata (Ag), lítio (Li), zinco (Zn),
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4. Lixo: O que fazer com ele?
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manganês (Mn) e seus compostos. As substâncias das pilhas que contêm esses metais
possuem características de corrosividade, reatividade e toxicidade e são classificadas
como "Resíduos Perigosos Classe I". As substâncias contendo cádmio, chumbo,
mercúrio, prata e níquel causam impactos negativos sobre o meio ambiente e, em especial,
sobre o homem. Outras substâncias presentes nas pilhas e baterias, como o zinco, o
manganês e o lítio, embora não estejam limitadas pela NBR 10.004, também causam
problemas ao meio ambiente;
• O pó que se torna luminoso encontrado no interior das lâmpadas fluorescentes contém
mercúrio. Isso não está restrito apenas às lâmpadas fluorescentes comuns de forma
tubular, mas encontra-se também nas lâmpadas fluorescentes compactas. As lâmpadas
fluorescentes liberam mercúrio quando são quebradas, queimadas ou enterradas em
aterros sanitários, o que as transforma resíduos Classe I (perigosos), uma vez que o
mercúrio é tóxico para o sistema nervoso humano e, quando inalado ou ingerido, pode
causar uma enorme variedade de problemas fisiológicos. Uma vez lançado ao meio
ambiente, o mercúrio sofre uma "bioacumulação", isto é, ele tem suas concentrações
aumentadas nos tecidos dos peixes, tornando-os perigosos para a alimentação humana. As
mulheres grávidas que se alimentam de peixe contaminado transferem o mercúrio para os
fetos, que são particularmente sensíveis aos seus efeitos tóxicos. A acumulação do
mercúrio nos tecidos também pode contaminar outras espécies selvagens, como marrecos,
aves aquáticas e outros animais (Monteiro, 2001);
• São muitos os problemas ambientais gerados pela destinação inadequada dos pneus. Se
deixados em ambiente aberto, sujeito a chuvas, os pneus acumulam água, servindo como
local para a proliferação de mosquitos. Se encaminhados para aterros de lixo
convencionais, provocam "ocos" na massa de resíduos, causando a instabilidade do aterro.
Se destinados em unidades de incineração, a queima da borracha gera enormes
quantidades de material particulado e gases tóxicos, necessitando de um sistema de
tratamento dos gases extremamente eficiente e caro. Por todas estas razões, o descarte de
pneus é hoje um problema ambiental grave ainda sem uma destinação realmente eficaz,
apesar de serem utilizados na pavimentação de estradas (Monteiro, 2001);
Outros resíduos também merecem destaque, pela sua quantidade e/ou potencial
risco ao meio ambiente. As cinzas de carvão mineral gerada por termelétricas sul-brasileiras
(milhões de megagramas são produzidas todo o ano), sendo constituída totalmente de material
inorgânico; a casca de arroz, resíduo originado do beneficiamento do arroz; a casca do coco,
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4. Lixo: O que fazer com ele?
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resultado do consumo da chamada “água de coco”, bebida popular no nordeste brasileiro; o
bagaço do “fruto” de caju, resíduo gerado pela agroindústria cajueira, também no nordeste;
conchas de mexilhão, produzidas pelo consumo humano deste molusco; dente outros.
4.4 CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS DO LIXO
É muito importante conhecer as características físicas e químicas do lixo, assim
como suas tendências futuras, pois tais parâmetros possibilitam calcular a capacidade e tipo
dos equipamentos de coleta e tratamento, e o destino final. Propriedades como o volume, por
exemplo, determinam as dimensões dos locais de descarga ou estações de transbordo, além de
tempo de vida. A composição seve para mostrar as potencialidades econômicas do lixo,
subsidiando informações para escolha do melhor e mais adequado sistema de tratamento e
disposição final. Podemos dizer ainda que a eficiência dos sistemas de coleta e disposição
final está fundamentada numa análise criteriosa das características físicas e químicas dos
resíduos. Algumas determinações importantes são (Lima, 2004):
• Teor de umidade e resíduos seco;
• Teor de substâncias voláteis e não-voláteis;
• Teor de carbono fixo;
• Teores de hidrogênio e nitrogênio;
• Teores de cálcio, sódio e potássio;
• pH;
• Poder calorífico
4.5 RECICLAGEM
Reciclagem (do francês, “recyclage”) é um conjunto de técnicas que têm por
finalidade aproveitar os detritos, reintroduzindo-os no ciclo produtivo ou transformando-os
em produtos úteis (Larousse, 2004).
Os materiais coletados para a reciclagem podem ser reprocessados de suas formas.
A reciclagem primária ou em circuito fechado ocorre quando o resíduo é transformado em
novos produtos do mesmo tipo – jornais usados em jornais novos e latas de alumínio em
novas latas de alumínio, por exemplo. Na reciclagem secundária, também chamada
“downcycling”, os materiais residuais são convertidos em produtos diferentes. Por exemplo,
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4. Lixo: O que fazer com ele?
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pneus usados podem ser fragmentados e transformados em revestimento emborrachado para
estradas; jornais podem ser re-processados em isolamento de celulose (Miller Jr, 2007).
Há dois tipos de resíduos que podem ser reciclados. O resíduo pré-consumo ou
interno é gerado em um processo de fabricação e reciclado em vez de ser descartado. O
resíduo pós-consumo ou externo é gerado pelo consumo dos produtos. Existe cerca de 25
vezes mais resíduos pré-consumo do que pós-consumo. Entretanto é importante reciclar
ambos (Miller Jr, 2007).
Em teoria, quase tudo pode ser reciclado, mas apenas duas questões importam.
Primeira, o item será realmente reciclado? Por vezes, os resíduos separados coletados para
reciclagem são misturados com outros resíduos e enviados para aterros ou incineradores, isso
pode acontecer quando os preços de matérias-primas recicladas caem muito. Segunda, as
empresas e os indivíduos completarão o ciclo da reciclagem comprando os produtos feitos de
material reciclado? Se não comprarmos tais produtos, a reciclagem não funciona (Miller Jr,
2007).
Em geral considera-se a reciclagem como a solução para todos os resíduos
gerados. Entretanto, a tecnologia da reciclagem ainda está em desenvolvimento. Há uma
grande discrepância entre a quantidade de resíduos coletados para a reciclagem e a quantidade
que atualmente é reciclada ou reusada. Reciclar não é uma tarefa simples. São necessárias
atividades de coleta e separação. Alguns produtos compostos não podem ser reciclados, sendo
desejável a separação de diferentes tipos de resíduos. Talvez a maior dificuldade na
reciclagem seja a falta de mercado para os itens reutilizados. Fatores como transporte, acesso,
integridade, limpeza, compactação e armazenagem dos resíduos geram complicações as
tentativas de reciclagem. Tendo estes fatores em mente, freqüentemente conclui-se que a
reciclagem não é necessariamente um empreendimento lucrativo. Entretanto, alguns negócios
tem tido sucesso no uso de materiais reciclados (Khan, 1996).
A Suíça e o Japão reciclam cerca de metade de seus resíduos sólidos urbanos. Os
Estados Unidos reciclam perto de 30% desse material – acima dos 6,4% de 1960. Estudos
indicam que, com incentivos econômicos e melhor projeto dos sistemas de gerenciamento de
resíduos, os Estados Unidos e outros países desenvolvidos poderiam reciclar de 60% a 80%
de seus resíduos sólidos urbanos (Miller Jr, 2007).
Segundo dados divulgados no jornal Folha de São Paulo, o Brasil perde cerca de
R$ 4,6 bilhões, por ano, por não reciclar os resíduos. A economia de energia e de recursos
naturais não-renováveis são algumas vantagens da reciclagem, além é claro, de reduzir a
quantidade de dejetos que resultarão em agentes poluentes. O governo federal lançou um
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4. Lixo: O que fazer com ele?
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101
programa para incentivar a reciclagem de resíduos. Pretende, com isso, reduzir a carga
tributária dos reciclados, criar linhas de crédito específicas e fomentar cooperativas de
catadores de lixo. Elaborado em conjunto por líderes empresariais, oito ministérios e
instituições de pesquisa, ele está sendo coordenado pelo Ministério do Desenvolvimento, da
Indústria e do Comércio. Nos últimos anos, a reciclagem de vidro declinou, a de papel
estabilizou-se, mas as de plástico e alumínio cresceram significativamente. O índice brasileiro
de recuperação de alumínio, produtos siderúrgicos e papel ondulado já é próximo do
registrado em países ricos (Scharf, 1999).
Tabela 4.1: Índices de reciclagem (%) de alguns materiais no Brasil. Fonte: Cempre/PBR, 1999.
Alumínio 61
Vidro 28
Papel de escritório 37
Papel ondulado 60
Plástico – filme 15
Plástico rígido 15
PET 21
Ferro e aço 70
Se a reciclagem compensa economicamente depende de como você percebe seus
custos e benefícios ambientais. A Tabela 4.2 mostra as principais vantagens e desvantagens da
reciclagem dos resíduos sólidos. Podemos observar que as vantagens são maiores que as
desvantagens. Além disto, mesmo que a reciclagem, de uma maneira geral, não fosse
economicamente lucrativa, seus benefícios para a preservação de nosso planeta são
inquestionáveis. O que seria melhor: arcarmos com alguns possíveis prejuízos financeiros ou
evitarmos uma situação que seria catastrófica para toda a vida na Terra? Acredito que a
pergunta já contem a resposta (Ricklefs, 2003).
Tabela 4.2 Vantagens e desvantagens da reciclagem dos resíduos sólidos.
Vantagens Desvantagens
Reduz a poluição do ar e da água
Economia de energia
Não economiza espaço em aterros em
áreas com vastas terras
Reduz a demanda de minerais
Reduz as emissões de gases causadores do efeito
estufa
Possível perda de dinheiro no caso do
vidro e da maioria dos plásticos
Reduz o descarte de resíduos sólidos
Ajuda a proteger a biodiversidade
Reduz os lucros de aterros sanitários e
incineradores
Pode economizar dinheiro para itens como papel,
metais e alguns plásticos.
Importante parte da economia
A separação na fonte é um inconveniente
para algumas pessoas.
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4. Lixo: O que fazer com ele?
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4.6 EXPERIÊNCIAS COM RECICLAGEM
Em torno de 20% dos resíduos sólidos municipais são formados por plásticos.
Como apenas 2% dos plásticos são reciclados, há a necessidade de se achar usos alternativos
para os 16 milhões de megagramas de plásticos gerados anualmente nos Estados Unidos.
Devido à demanda de seus produtos recicláveis, as embalagens PET (polyethylene
terephthalate) são os plásticos mais recicláveis. PET´s têm sido reaproveitados como fibras de
vidro residenciais e comerciais, banheiras, chuveiros, etc. Madeiras feitas de resíduos
plásticos são fortes e isentas de manutenção; são usadas para fazer piers, cercas e conveses.
Timbrex, Petra, Well-Spring, Cloverfill, Syntal são alguns dos novos produtos desenvolvidos
a partir de resíduos plásticos, por empresas como a Advanced Recycling Technology, Inc;
Mobil Chemical, Co; Allied Signal e Rising Star Futon Company. A Texaco, Inc tem
patenteado tecnologias que envolvem o uso de plásticos e borrachas para a produção de
energia. Uma empresa do Texas chamada Envirothec, Inc. está utilizando pedaços de pneu em
sistemas de irrigação (O’Sullivan, 1982; Martin, 1991; U. S. Environmental Protection
Agency, 1992, Steuteville, 1994; Riggle, 1994).
Os resíduos sólidos municipais contem 37,5% em peso de resíduos de papel.
Aproximadamente 10% do total é formado por jornais. Para uma casa média americana isto
equivale a 12,6 kg por mês sendo 35% agora reciclado. Resíduos de alimentos e grama de
jardim somam aproximadamente 25% dos resíduos sólidos municipais. Resíduos de madeira
como tábuas e itens de construção podem ser recompostas, utilizada como combustível ou
misturada com outros resíduos para produzir itens recicláveis como madeira e sinais de
trânsito. Hon Industries; Wood Fibers Internation; Community Environmental Services, Inc.;
Forest Products Laboratory; Champion Recycling Corporation, Gardenville; Green Mountais
Tecnologies; Ceres Environmental, Inc.; são exemplos de empresas que trabalham com a
reciclagem de madeira, papel e resíduos compostos (Brewer, 1987; Comello, 1993; Raftery,
1993; Farcasiu e Smith, 1993; Swanekamp, 1994; Pieper, 1994)
A caracterização e o aproveitamento das cinzas geradas como subprodutos de
processos industriais ou a partir da queima de resíduos oriundos de atividades produtivas tem
sido tema de diversas pesquisas resultando, inclusive, em patentes de novos produtos (Steven,
1995; U.S. Pat. No. 4,043,831). Cinzas resultantes da queima do carvão mineral e vegetal de
indústrias termelétricas (cinzas volantes) vêm sendo utilizadas como aditivos na preparação
de cimento (Erel, 1988) e, ainda, na confecção de materiais cerâmicos (Queralt, 1997;
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4. Lixo: O que fazer com ele?
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Koizumi, 1998; Demir, 2001). Em ambos os casos, os materiais produzidos apresentam
propriedades mecânicas de maior interesse que seus similares. Fertilizantes eficientes têm
sido desenvolvidos baseados em uma combinação de fertilizantes inorgânicos, adubo e cinzas
do lixo urbano de incineradores municipais de zonas agrícolas (Pasquini, 2004). O grande
atrativo das cinzas está no seu baixo valor agregado, composição química inorgânica e, em
alguns casos, a geometria de suas partículas.
A compostagem é definida como o ato ou ação de transformar os resíduos
orgânicos, através de processos físicos, químicos e biológicos, em uma matéria biogênica
mais estável e resistente à ação das espécies consumidoras. A compostagem não representa,
necessariamente, uma solução final para os problemas de escassez de alimentos ou do
saneamento ambiental, mas pode contribuir significativamente como elemento redutor dos
danos provocados pela disposição desordenada do lixo, além de propiciar a recuperação de
solos agrícolas exauridos pela ação de fertilizantes químicos aplicados indevidamente (Lima,
2004). A Cargill Dow está fabricando recipientes plásticos recicláveis e biodegradáveis feitos
de um polímero chamado polilácticos (PLA), fabricados com açúcar de xarope de milho. Em
vez de serem enviados para aterros sanitários, esses recipientes de bioplásticos poderiam ser
compostados para produzir um condicionador de solo. A Toyota, segunda maior fabricante de
automóveis do mundo, está investindo US$ 38 bilhões em um processo que utiliza plantas
para produzir plástico. Até 2020, a empresa espera controlar dois terços do fornecimento de
tais bioplásticos (Miller Jr, 2007).
A conversão biológica do lixo, com fins energéticos, vem a cada dia tornando-se
mais interessante uma vez que os resíduos urbanos passaram a serem considerados como
fonte inesgotável de energia alternativa. Os métodos biológicos para a produção de
combustíveis a partir do lixo baseiam-se no rendimento da atividade microbiana,
principalmente de bactérias anaeróbicas que, através de seu metabolismo, transformam a
matéria orgânica em produtos combustíveis, como gás metano e o hidrogênio. Os atuais
processos em desenvolvimento visam intensificar a produção destes elementos, na expectativa
de reduzir os custos derivados do petróleo (Lima, 2004).
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4. Lixo: O que fazer com ele?
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS CINZAS DO
BAGAÇO DO PEDÚNCULO DE CAJU
5.1 INTRODUÇÃO
5.1.1 O CAJUEIRO
O cajueiro ocupa um lugar importante entre as plantas frutíferas, devido a
crescente comercialização dos seus principais produtos: a amêndoa e o líquido contido no
mesocarpo da castanha, o LCC. A planta está presente na América Central, África e Ásia,
destacando-se a Índia, Vietnã e Brasil como maiores produtores de castanha (70% da
produção mundial). O cultivo do cajueiro é uma das principais atividades agropecuárias do
nordeste brasileiro, sendo que quase a totalidade da produção de castanha concentra-se nos
estados do Ceará, Piauí e Rio Grande do Norte. A maior parte da produção de castanha e do
LCC destina-se à exportação (EMBRAPA/CNPAD, 1992). O LCC (Líquido da Casca da
Castanha de Caju) é utilizado na fabricação de resinas fenólicas e pós de fricção para a
indústria automotiva além de apresentar propriedades medicinais anticépticas, vermífugas e
vesicantes (Mothé, 1994). Já a castanha, é usada na alimentação humana.
O cajueiro (Fig. 5.1) pertence à família Anacardiaceae, gênero Anacardium,
espécies Anacardium occidentale L. (cajueiro comum) (Fig. 5.2) e Anacardium occidentale
L. var. nanum (cajueiro anão precoce). É uma planta perene tipicamente tropical, com
crescimento contínuo, podendo atingir até 20 m de altura. Desenvolve-se preferencialmente
em regiões de alta temperatura e elevadas precipitações. A temperatura média ideal é de 27ºC,
com mínimas superiores a 22ºC. É sensível ao frio e a geadas, principalmente quando jovem;
plantas adultas apresentam redução de floração/frutificação nessas condições. É favorecido
por precipitações anuais de 800 a 1500 mm, distribuídos de 5 a 7 meses, mais uma estação
seca para florescimento. O vento é prejudicial; mesmo sendo o principal agente polinizador,
quando intenso, causa queda de flores. Os solos mais indicados são os leves, profundos e bem
drenados. A produtividade normal do cajueiro comum é de 900 kg/ha de castanha e 9 Mg/ha
5
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5. Produção e caracterização das cinzas do bagaço do pedúnculo de caju
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de frutos; enquanto que a do cajueiro anão é de 1.300 kg/ha de castanha e 13 Mg/ha de frutos,
ambos após estabilização da produção. O início da produção é do 3º ao 5º ano para o cajueiro
comum e 10 a 18 meses para cajueiro anão precoce.
Figura 5.1. O cajueiro. Em (a), árvore e em (b), detalhes da frutificação.
Figura 5.2. Ilustração da Anacardium occidentale L.
5.1.2 O CAJU
O caju é um pseudofruto, sendo a castanha o verdadeiro fruto comestível. O que
chamamos de polpa ou fruto (Fig.5.3) é na verdade o pedúnculo (Vaughan, 1997). O caju é
normalmente classificado conforme a cor de seu pedúnculo, com muitas gradações entre
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5. Produção e caracterização das cinzas do bagaço do pedúnculo de caju
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vermelho e amarelo (Johnson, 1973; Sondhi, 1980). A composição de seu pedúnculo é
bastante complexa (Tab. 5.1), apresentando vitaminas, taninos, sais minerais, ácidos
orgânicos e carboidratos, transformando-o em um importante alimento (FAO, 1986).
Entretanto, esta riqueza nutricional é responsável por sua alta perecibilidade, exigindo
cuidados especiais para estocagem, transporte, limpeza e processamento (Conceição, 1991;
Crisóstomo, 1991).
Figura 5.3. Amostras de caju (Anacardium occidentale L.) de pedúnculo vermelho, onde estão
indicados o fruto (castanha) e o pseudofruto (pedúnculo). Barra = 2cm
Tabela 5.1. Principais componentes do pedúnculo fresco do caju.
Umidade (%) 86,0
Proteínas (%) 0,70
Taninos (%) 0,37
Açúcar total (%) 8,35
Ácido ascórbico (mg/100g) 200
Fósforo (mg/100g) 33,40
Cálcio (mg/100g.) 14,50
Ferro (mg/100g.) 0,35
Vitamina A (U.I.) 10,8
No Brasil, a produção de pedúnculo de caju, praticamente concentrado na Região
Nordeste, está em torno de 1,5 milhões de megagramas por ano, com desperdício de 90 a
94%. A indústria de processamento do pedúnculo possui segmentos na produção de bebidas,
doces, geléias, néctares, farinhas, fermentados e rações, sendo que seu aproveitamento não
atinge 6% da produção (EMBRAPA, 1993; Moura, 1998). Uma das causas para este baixo
aproveitamento está associada à rápida deterioração, ocasionando elevadas perdas no campo e
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5. Produção e caracterização das cinzas do bagaço do pedúnculo de caju
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109
nas indústrias. O principal produto do pedúnculo continua sendo o suco. Existem poucas
empresas de grande porte com capacidade operacional para processarem 80 mil megagramas
de suco por ano (França, 1992). As demais formas de aproveitamento são realizadas por
estabelecimentos classificados como micro e pequenas produções caseiras, cooperativas e
associações de produtores.
5.1.2 O BAGAÇO DO CAJU
O bagaço do caju (Fig.5.4), como é chamado o subproduto do pedúnculo após a
extração do suco, representa aproximadamente 20% em peso do pedúnculo (AGRIANUAL,
2000). É uma das grandes fontes de resíduos produzidos pela agroindústria cajueira. Seu
aproveitamento, quando existe, é restrito ao uso como complemento alimentar na forma de
ração animal. Entretanto, esta utilização é limitada, devido a sua rápida degradação, tornando
inviável o armazenamento.
Figura 5.4: Pedúnculo do caju, após a extração do suco (bagaço). Barra = 2cm
Uma alternativa a reciclagem destes resíduos agroindustriais é a queima em
temperaturas acima de 600ºC (médias e altas temperaturas) na presença de oxigênio, ou seja, a
incineração. Neste processo, os compostos biológicos são destruídos, sendo reduzidos a
sólidos inorgânicos inertes (cinzas), não sujeitos aos efeitos da degradação.
5.1.3 INCINERAÇÃO
A incineração como forma de destino final dos resíduos agroindustriais é uma
prática muito antiga, e os métodos empregados, apesar de rudimentares, consistem em sua
grande maioria em empilhar resíduos e atear fogo. A cinza resultante era espalhada no solo ou
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5. Produção e caracterização das cinzas do bagaço do pedúnculo de caju
__________________________________________________________________________________________
110
incorparada como elemento auxiliar na agricultura. Com o passar do tempo, novos métodos e
tecnologias se incorporaram a este procedimento, sendo exaustivamente estudados (Lima,
2004). Para incineração de resíduos agroindustriais de pequeno e médio porte, o fogo é
substituído por muflas (fornos aquecidos por elementos resistivos).
A incineração é definida como o processo de redução de peso e volume dos
resíduos através de combustão controlada. Os remanescentes da incineração são, geralmente,
gases como dióxido de carbono (CO
2
); dióxido de enxofre (SO
2
); nitrogênio (N
2
); gás inerte
proveniente do ar utilizado como fonte de oxigênio e do próprio resíduo; oxigênio (O
2
)
proveniente do ar em excesso que não consegue ser completamente queimado; água (H
2
O);
cinza e escórias que se constituem de metais ferrosos e inertes (Lima, 2004).
Quando a combustão é incompleta pode aparecer monóxido de carbono (CO) e
particulados que consistem de carbono finamente dividido lançado na atmosfera como
fuligem e negro de fumo. Quando a combustão é realizada em temperaturas elevadas pode
haver dissociação de nitrogênio, surgindo ainda compostos resultantes da combinação deste
com o oxigênio, como NO e N
2
O
5
(Lima, 2004).
O conceito teórico da incineração consiste de uma reação química entre o
combustível e o comburente. Entretanto, para que este conceito seja válido, se faz necessário
considerar o resíduo agroindustrial como um combustível, e isso somente é possível quando
seus componentes liberam energia térmica à medida que são queimados. Esta energia química
latente, quando liberada na forma de calor, pode ser denominada calor de combustão. Os
resíduos agroindustriais em sua maioria são combustíveis. Os principais produtos da
combustão, como já mencionado, são na maioria gases como SO
x
, NO
x
, HCl e materiais
particulados. Os NO
x
, embora relativamente abundante nos resíduos, são encontrados em
quantidades bem inferiores nestes, quando comparados com os combustíveis convencionais.
A formação de NO
x
a partir da combustão de resíduos depende mais da temperatura do
processo e do nitrogênio contido no ar do que sua quantidade relativa no próprio resíduo.
Também é importante salientar que os resíduos agroindustriais contêm pouco enxofre, e em
sua combustão os compostos formados (SO
x
) normalmente são precipitados com as cinzas ou
ainda na formação de SO
2
. As equações de combustão do carbono, hidrogênio e enxofre são,
respectivamente:
C + ½O
2
→ CO + 28880 kcal
CO + ½O
2
→ CO
2
+ 68320 kcal
C + O
2
→ CO
2
+ 97200 kcal
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5. Produção e caracterização das cinzas do bagaço do pedúnculo de caju
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111
Na combustão de resíduos agroindustriais podem ocorrer situações em que as
variações de temperatura e pressão podem atingir um estado de equilíbrio químico capaz de
inibir ou mesmo interromper a reação por completo. Este fato está relacionado principalmente
ao poder calorífico do resíduo. O rendimento da combustão de resíduos está fundamentado
em dois princípios básicos (Lima, 2004):
• Regular a quantidade de ar de modo que seja mantida a mistura ar-combustível nos níveis
desejados;
• Transferir o máximo de calor gerado na combustão para o material a ser incinerado.
O Japão e alguns países europeus incineram a maior parte de seus resíduos
urbanos, mas essa prática perdeu popularidade nos Estados Unidos e na maioria dos países da
Europa. Desde 1985, mais de 280 novos projetos de incineradores para queima de grandes
quantidades de resíduos foram adiados ou cancelados nos Estados Unidos em função dos altos
custos, da preocupação com a poluição do ar e da forte oposição dos cidadãos (Miller Jr,
2007). Entretanto, a utilização dos resíduos da queima para produção de novos produtos para
diferentes aplicações tecnológicas tem estimulado recentes estudos na área de ciência de
materiais. Cerâmicas, carvões ativados e compostos luminescentes estão entre estes produtos.
Os resíduos agroindustriais são caracterizados por um elevado conteúdo de
matéria volátil, o que torna sua queima rápida (Werther, 1995; Ogada, 1996). Devido à
presença de enxofre, nitrogênio, etc., gases poluentes como o SO
2
, NO
x
, N
2
O e o HCl podem
se formar durante a sua combustão. As cinzas destes resíduos geralmente apresentam um
elevado conteúdo de potássio (Bapat, 1997; Grubor, 1995).
5.1.4 OBJETIVOS
Neste capítulo, são apresentados os resultados da preparação e caracterização das
cinzas formadas a partir da queima do bagaço de caju, com o objetivo de buscar alternativas
para o aproveitamento da grande quantidade de resíduos agroindustriais formados pela
extração do suco, através de processos que envolvam a conversão a compostos inorgânicos.
2H
2
+ O
2
→ 2H
2
O + 136400 kcal
S + O
2
→ SO
2
+ 71040 kcal
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5. Produção e caracterização das cinzas do bagaço do pedúnculo de caju
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112
5.2 MATERIAIS E MÉTODOS
5.2.1 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS
Foram utilizadas amostras de caju, da variedade de pedúnculo vermelho, obtidas
de plantações do estado do Ceará, Brasil, entre os meses de setembro de 2003 e janeiro de
2004. Após a extração da castanha, os pedúnculos foram prensados para a retirada do suco,
formando o chamado “bagaço de caju”. O bagaço foi secado em estufa a 36ºC durante 48h e
triturado em moinho analítico. O pó do bagaço foi queimado, em forno tipo mufla, em
atmosfera de ar, a (650 ± 5)ºC durante 4h, conforme procedimento para a formação de cinzas,
descrito por Gadelha (1995). A taxa de aquecimento foi de 50ºC/min e a de resfriamento de
aproximadamente 1ºC/min. A Figura 5.5. mostra a representação esquemática do processo de
preparação das cinzas, realizada no Departamento de Física da Universidade Federal do Ceará
(UFC).
Figura 5.5. Esquema de preparação das cinzas do pedúnculo do caju.
5.2.2 DETERMINAÇÃO DA PERDA DE MASSA
A perda de massa provocada pela queima foi determinada por meio da pesagem do pó
do bagaço seco e das cinzas secas, em balança analítica Bioprecisa FA2104N, conforme a
relação:
100x
pp
cpp
m
mm
Δm
−
=
Pedúnculo do
caju
Bagaço
úmido
Extração do suco
Secagem
em
estufa 36ºC/48h
Bagaço
seco
P
ó
Cinzas
Moagem em
moinho analítico
48h
Queima (640ºC/4h)
em forno tipo mufla,
em atmosfera de ar.
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5. Produção e caracterização das cinzas do bagaço do pedúnculo de caju
__________________________________________________________________________________________
113
onde Δm = perda percentual de massa, m
pp
= massa do pó do pedúnculo seco e m
c
= massa das
cinzas secas. Foi realizado este procedimento em 20 amostras, obtendo-se a perda de massa
média e o intervalo de confiança, com nível de significância de 5%. A determinação da perda
de massa foi realizada no Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas (BioMol-Lab) da
Universidade Federal do Ceará.
5.2.3 DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA POR EDX
A determinação dos elementos químicos presentes nas cinzas foi realizada por
meio de análise de energia dispersiva de raios-X (EDX) em EDX Philips Model New XL-30,
no Laboratório de Caracterização de Materiais (LACAM) da Universidade Federal do Ceará
(UFC).
5.2.4 ANÁLISE MINERALÓGICA POR XRD
Os padrões de difração de raios-X (XRD), para a análise mineralógica das cinzas
foram obtidos pelo método do pó, na temperatura ambiente (300K) em difratômetro de pó
Philips, modelo X’Pert PRO, no Laboratório de Raios-X do Departamento de Física da
Universidade Federal do Ceará (UFC). Usou-se a geometria Bragg-Bretando com radiação
Cu-kα. O tubo foi operado com 40kV e 40mA. Os dados de difração foram coletados em um
intervalo de varredura de 10º ≤ 2θ ≤ 60º com passos de 0,02º e tempo de integração de 2s por
ponto. Foi utilizado o programa X´Pert HigthScore para identificação de fases cristalinas e o
método de Rietveld, através do programa Rietica – versão 1.7.7 (C.J. Howard and B.A.
Hunter, 1997 - Lucas Heights Research Laboratories), para o refinamento do difratograma e
conseqüente análise quantitativa.
5.2.5 ANÁLISES TÉRMICAS POR TGA E DSC
As análises térmicas de termogravimetria (TGA) e calorimetria exploratória
diferencial (DSC) nas cinzas foram realizadas em atmosfera de nitrogênio, com razão de
aquecimento de 10ºC/min, de 23,8 a 600
o
C em equipamentos Shimadzu TGA/DSC, no
Laboratório de Análises Térmicas Ivo Giolito do Departamento de Química da Universidade
Federal do Ceará (UFC). O TGA realizado foi o dinâmico.
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5. Produção e caracterização das cinzas do bagaço do pedúnculo de caju
__________________________________________________________________________________________
114
5.2.6 PRESENÇA DE BICABORNATOS
A presença de bicarbonatos foi testada por meio da liberação de CO
2
em reação de
neutralização com ácido, mediante adição de 100mg de cinzas em solução padrão de 50mL de
HCl 0,5M (Merck), no Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas (BioMol-Lab),
Departamento de Bioquímica, Universidade Federal do Ceará (UFC).
5.2.7 ANÁLISE POR MICROSCOPIA ÓTICA DE CAMPO CLARO
Imagens de microscopia ótica de campo claro do pó do bagaço e das cinzas foram
obtidas em microscópio metalográfico Olympus Model BX51RF, do Laboratório de
Caracterização de Materiais (LACAM) da Universidade Federal do Ceará (UFC).
5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.3.1 PREPRARAÇÃO DAS AMOSTRAS E VARIAÇÃO DE MASSA
O bagaço de caju, após secagem e moagem, deu origem a um pó de coloração
avermelhada (Fig.5.6a) e forte odor, característico do caju. A queima em mufla gerou cinzas
de coloração amarelada (Fig.5.6b), inodoras e altamente susceptíveis a formação de
agregados. A diferença de massa entre o pó do bagaço e as cinzas demonstrou uma perda de
97%, devido à decomposição dos compostos orgânicos e evaporação dos constituintes
voláteis presentes no pedúnculo, durante a queima (Maia, 2000; Bicalho, 2001).
Figura 5.6. Pó do pedúnculo de caju, antes (a) e depois (b) da queima. Pode-se observar a alteração na
coloração e o elevado poder de agregação das cinzas. Barra = 4.5mm.
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5. Produção e caracterização das cinzas do bagaço do pedúnculo de caju
__________________________________________________________________________________________
115
5.3.2 DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA POR EDX
As medidas de EDX indicaram a presença de C, O, P, K, Mg, S, Na, Al e Si nas
cinzas (Fig.5.7). O carbono e oxigênio permaneceram como resíduos dos compostos
orgânicos, após a combustão. Os demais elementos originaram-se dos sais minerais contidos
no pedúnculo (Smith, 1992; Azoubel, 2005) e do silício e alumínio absorvidos da solução do
solo na forma de ácido monossilísico Si(OH)
4
(Tisdale, 1993; Shimizu, 2001; Mauad, 2003) e
hidróxido de alumínio Al(OH)
3
(Radojevic, 1999; Reeve, 1994;Williams, 2005). A não
detecção de cálcio e ferro demonstrou a baixa concentração destes elementos no bagaço,
estando presentes em maior quantidade no suco (Taylor, 1998; Azam-Ali, 2001).
Figura 5.7. EDX das cinzas do pedúnculo do caju, mostrando seus principais elementos químicos: C,
O, Mg, Na, P, S e K.
5.3.3 ANÁLISE MINERALÓGICA POR XRD E PRESENÇA DE BICARBONATOS
A Figura 5.8 apresenta os difratogramas de raios-X antes e depois da queima,
mostrando a transformação de um material orgânico caracteristicamente amorfo (resíduos do
bagaço seco) para um cristalino (cinzas). A análise cristalográfica das cinzas indicou, como
principais fases cristalinas, os seguintes compostos: KHCO
3
(54,17%), K
2
SO
4
(34,08%) e
MgKPO
4
·6H
2
O (10,06%). As fases restantes (1,69%) foram Mg
3
(Si
2
O
5
)(OH)
4
e
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5. Produção e caracterização das cinzas do bagaço do pedúnculo de caju
__________________________________________________________________________________________
116
NaAl(HPO
4
)
2
. Os resíduos R
WP
, R
EXP
e o grau de qualidade do refinamento (χ
2
) foram
respectivamente iguais a 5,67, 4,12 e 1,90. O grupo espacial identificado para o carbonato
ácido (ou bicarbonato) de potássio (KHCO
3
) foi o monoclínico C/2m, representando a fase
desordenada de alta temperatura (Ali, 1999). A presença de KHCO
3
foi confirmada pela
dissolução das cinzas em solução padrão de HCl 0,5M, com liberação de CO
2
(efervescência)
e formação do cloreto de potássio (KCl), conforme a reação de neutralização
KHCO
3
+ HCl → KCl + H
2
O + CO
2
(g)
Devido à baixa temperatura de decomposição (100-200ºC), sua formação deve ter ocorrido
após a queima (durante o resfriamento), da reação do K
2
CO
3
com o CO
2
e H
2
O do ar. Este
tipo de síntese é relatado por Stern (2004), sendo seu mecanismo ainda não bem
compreendido. Os grupos espaciais identificados para o sulfato de potássio (K
2
SO
4
) foram o
ortorrômbico Pmcn (α-K
2
SO
4
), com 16,97% e o Pman (β-K
2
SO
4
), com 17,11%. O MgKPO
4
hexahidratado presente nas cinzas é um composto fosfatado análogo a estruvita
(NH
4
MgPO
4
·6H
2
O), sendo denominado K-estruvita. Através dos resultados das análises de
raios-X e de cálculos estequiométricos, determinou-se o percentual em peso dos principais
elementos químicos presentes nas cinzas: K (37,92%), S (6,27%), P (1,34%), Mg (1,18%), Si
(0,20%) e Al (0,076%).
Figura 5.8. Difratograma de raios-X do pó do pedúnculo de caju e suas cinzas, mostrando a alteração
na cristalinidade após a queima e a formação das principais fases cristalinas: KHCO
3
, K
2
SO
4
e
MgKPO
4
· 6H
2
O.
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5. Produção e caracterização das cinzas do bagaço do pedúnculo de caju
__________________________________________________________________________________________
117
5.3.4 ANÁLISES TÉRMICAS POR TGA E DSC
As curvas termais de TGA e DSC (Fig.5.9), indicaram a ocorrência de dois picos
próximos, em 95,15 e 105,5ºC (entre 23,8 e 134,6ºC), correspondendo a uma perda de massa
de 26%; e outro, em 170,5ºC (entre 134,6 e 207,5ºC), com perda de massa de 4,63%.
A perda de água de hidratação do MgKPO
4
·6H
2
O deve seguir a seguinte
seqüência de reações (Borchardt, 1957):
MgKPO
4
·6H
2
O → MgKPO
4
·2H
2
O + 4(H
2
O)(l)
4H
2
O(l) → 4H
2
O(g)
MgKPO
4
·2H
2
O → MgKPO
4
·H
2
O + H
2
O(g)
MgKPO
4
·H
2
O → MgKPO
4
+ H
2
O(g)
correspondendo a uma perda teórica de água de 40,56% (4% nas cinzas). A água que ocorre
em sólidos hidratados (água essencial de hidratação) está ligada mediante ligações de
coordenação covalentes, que são normalmente mais fracas que as eletrostáticas. Por esta
razão, a água de hidratação é facilmente eliminada destes compostos pela ação do calor,
iniciando-se em temperaturas abaixo dos 100ºC (Baccan, 1979; Christian, 1977).
Figura 5.9. Curvas de TGA e DSC mostrando as transformações térmicas das cinzas, entre 23,8 e
600ºC. Os pontos a, b e c indicam eventos térmicos. A taxa de aquecimento foi de 10ºC/min.
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5. Produção e caracterização das cinzas do bagaço do pedúnculo de caju
__________________________________________________________________________________________
118
A decomposição térmica do KHCO
3
até K
2
CO
3
deve seguir a seguinte seqüência
de reações (Lee, 1996):
2KHCO
3
→ K
2
CO
3
+ H
2
O(l) + CO
2
(g)
H
2
O(l) → H
2
O(g)
correspondendo a uma perda teórica de massa de 22% de CO
2
(11,9% nas cinzas) e 9% de
água essencial de constituição (4,8% nas cinzas). A liberação de CO
2
em compostos
bicarbonatos ocorre em temperaturas próximas a 100°C (Lee, 1996). Já a água (água essencial
de constituição), só é eliminada por meio de temperaturas relativamente altas (Baccan, 1979;
Blaedel, 1970). Os eventos térmicos ocorridos entre 23,8 e 134,6ºC correspondem as perdas
de CO
2
do KHCO
3
, da água de hidratação do MgKPO
4
·6H
2
O (Kaloustian, 2002; Ravikumar,
2002) e de umidade (água de adsorção, absorção e oclusão). O percentual de umidade foi
estimado pela diferença entre a perda de massa medida nos dois primeiros eventos térmicos
(26%) e as perdas teóricas de CO
2
(11,9%) e de H
2
O do MgKPO
4
·6H
2
O (4%), resultando em
10,1%. Este elevado conteúdo de umidade é previsto em cinzas originadas da queima do
bagaço de resíduos agroindustriais (Werther, 2000) e justifica o alto poder de agregação do
material. É claro que este valor não é exato, devido a desvios na análise quantitativa por XRD,
provocado pelo próprio refinamento. A proximidade dos dois primeiros picos é explicada pela
perda de umidade das amostras (Borchardt, 1957; Newkirk, 1960) durante as medidas
térmicas. O terceiro evento térmico corresponde à perda de água essencial de constituição do
KHCO
3
, com valor percentual menor (4,63%) com relação aquele estimado de cálculos
estequimétricos e análise quantitativa a partir do refinamento do difratograma (4,8%). Esta
diferença pode estar associada às características da técnica de difração de raios-X, que em
alguns casos, exige fatores de correção. As principais causas podem ser: orientação
preferencial, extinção, microabsorção e rugosidade superficial da amostra. A não observação
de quatro eventos associados à decomposição do MgKPO
4
·6H
2
O deve-se a elevada taxa de
aquecimento (10°C/min) utilizada nas análises térmicas, como demonstrado por Frost et al
(2004). Taxas de aquecimento acima de 1°C/min reduzem o número de eventos observados.
5.3.5 ANÁLISE POR MICROSCOPIA ÓTICA DE CAMPO CLARO
A Figura 5.10 mostra imagens de microscopia ótica de campo claro feitas no pó
do bagaço e nas cinzas, em diferentes aumentos. Fica evidente a formação de cristais, após a
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5. Produção e caracterização das cinzas do bagaço do pedúnculo de caju
__________________________________________________________________________________________
119
queima. Os cristais de coloração laranja são de K-estruvita. Os demais (brancos), são de
bicarbonato e sulfato de potássio.
Figura 5.10. Seqüência de imagens feitas por microscopia ótica mostrando o pó do pedúnculo de caju
e suas cinzas, em diferentes ampliações. (a) O pó do pedúnculo em um aumento de 50x, evidenciando
partes do pedúnculo seco; (b), (c) as cinzas do pedúnculo em um aumento de 50x e 100x,
respectivamente, mostrando cristais de K
2
SO4, KHCO
3
(claros) e K-estruvita (rosa); (d) Detalhes de
cristais de K-estruvita, em um aumento de 200x. Bar = 250µm (a) e (b); 125µm (c) e 62,5µm (d).
5.4 CONCLUSÕES
Foram produzidas e caracterizadas as cinzas originadas da queima do bagaço do
pedúnculo de caju. Medidas de perda de massa mostraram que as cinzas formadas
representam apenas 3% da massa do bagaço. Análises de EDX indicaram a presença dos
seguintes elementos químicos: C, O, P, K, Mg, S, Na, Al e Si. Medidas de difração de raios-X
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5. Produção e caracterização das cinzas do bagaço do pedúnculo de caju
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120
e análises térmicas indicaram, como principais fases cristalinas: KHCO
3
(54,17%), K
2
SO
4
(34,08%) e MgKPO
4
·6H
2
O (10,06%). As fases restantes (1,69%) foram Mg
3
(Si
2
O
5
)(OH)
4
e
NaAl(HPO
4
)
2
. A estimativa de umidade ficou em torno de 10%. A elevada quantidade de
compostos de potássio é característica de resíduos agroindustriais. O carbonato ácido de
potássio (KHCO
3
) é um sólido cristalino, solúvel em água, produzido pela conversão química
do carbonato de potássio com o dióxido de carbono, via eletrólise. Não é considerado tóxico e
nem listado como carcinogênico. É usado na fabricação de cristais, vidros especiais,
cerâmicas, esmaltes, silicatos de potássio, fertilizantes, extintores de incêndio; na redução da
perda de cátions em solos ácidos e neutros; na síntese farmacêutica (vitaminas e penicilina) e
na indústria de alimentos (NOSN, 1999). Também é usado como antiácido e fungicida (Orme
2004, KHCO
3
Handbook, 2004). O sulfato de potássio (K
2
SO
4
) é freqüentemente incluído
como parte de misturas, ligantes e compostos fertilizantes. Têm um custo de fabricação maior
do que o KCl, outro composto largamente utilizado na produção de fertilizantes potássicos
(FAO, 1984). Bridger et. al. (1962) confirmaram as excelentes propriedades agronômicas da
estruvita (MgNH
4
PO
4
·6H
2
O) como fonte de fósforo, nitrogênio e magnésio, sendo de
aplicação direta nas folhas e no solo. Em particular, a K-estruvita (MgKPO
4
·6H
2
O) fornece
potássio, ao invés do nitrogênio, sendo considerado um “premium quality slow-release
fertiliser” (Liberti, 1989). Entretanto, o uso das estruvitas é limitado pelos custos envolvidos
em sua produção. A presença destes compostos nas cinzas do pedúnculo de caju transforma
este resíduo agroindustrial em uma promissora fonte não perecível de potássio, enxofre,
fósforo e magnésio em fertilizantes e na ração animal, além das diversas aplicações
abrangidas pelo carbonato ácido de potássio.
Este trabalho resultou no artigo publicado em 2007 (Anexo A.3): Ricardo P.
Santos, A.A. X. Santiago , C. A. A. Gadelha , J. B. Cajazeiras , B. S. Cavada , J. L. Martins ,
T. M. Oliveira , G. A. Bezerra , Rinaldo. P. Santos, V. N. Freire. Production and
characterization of the cashew (Anacardium occidentale l.) peduncle bagasse ashes. Journal
of Food Engineering 79 (2007).
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__________________________________________________________________________________________
121
COLABORADORES
A.A. X. SANTIAGO
a
, C. A. A. GADELHA
b
, J. B. CAJAZEIRAS
c
, B. S. CAVADA
c
, J. L. MARTINS
d
,
T. M. OLIVEIRA
c
, G. A. BEZERRA
c
, RINALDO. P. SANTOS
e
, V. N. FREIRE
a*
a
Departamento de Física, Universidade Federal do Ceará, Caixa Postal 6030, Campus do
Pici, 60455-900, Fortaleza, Ceará, Brasil.
b
Departamento de Biologia Molecular, Universidade Federal da Paraíba, Campus Castelo
Branco, 58059-000, João Pessoa, Paraíba, Brasil.
c
Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas (BioMol-Lab), Universidade Federal do
Ceará, Caixa Postal 6020, Campus do Pici, Fortaleza, Ceará, 60455-900, Brasil.
d
Instituto de Química e Geociências (IQG), Universidade Federal de Pelotas, Campus do
Capão do Leão, 96160-000, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil
e
Laboratório de Anatomia Vegetal, Departamento de Botânica, Instituto de Biociências,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 9500, Avenida Bento Gonçalves, 91501-970,
Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil.
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__________________________________________________________________________________________
122
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IMOBILIZAÇÃO DE INVERTASE EM CERÂMICAS
DE CINZAS VOLANTES DE CARVÃO MINERAL
6.1 INTRODUÇÃO
6.1.1 ENZIMAS
O termo enzima é derivado de "en" = dentro e "zima" = levedura. As enzimas são
moléculas de proteína bastante grandes e complexas formadas dentro das células de todos os
seres vivos, plantas, fungos, bactérias e organismos microscópicos unicelulares, que agem
como catalisadoras em reações bioquímicas. Um catalizador é uma substância que altera a
velocidade da reação sem ser consumida nem produzida nela. Esta alteração pode ser no
sentido da aceleração, no caso dos catalizadores positivos, ou do retardamento, no caso dos
catalizadores negativos ou estabilizadores (Bender, 1964). A generalidade das catálises
biológicas decorre no sentido da aceleração. Uma enzima é tipicamente uma proteína de
dimensões elevadas que contém um ou mais centros ativos. É nesses centros que ocorrem as
interações com as moléculas do substrato. Estes centros ativos têm estruturas compatíveis
apenas com certas moléculas com uma relação topológica semelhante à que existe entre a
chave e a respectiva fechadura. A estrutura enzimática rígida só se liga a moléculas cuja
forma corresponda exatamente a um encaixe do centro ativo. A enzima e a substância sobre a
qual vai agir (chamada substrato) formam um composto intermediário que, posteriormente,
sofre um desdobramento, regenerando a enzima (Fig.6.1) (Cornish e Bowden, 1976).
Figura 6.1. Ação catalítica das enzimas.
6
enzima
substrato
sítio
ativo
Complexo
enzima/substrato
enzim
a
su
substrato
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6. Imobilização de invertase em cerâmicas de cinzas volantes de carvão mineral
__________________________________________________________________________________________
126
Existem três métodos para nomenclatura enzimática (Fersht, 1985):
• Nome Recomendado: Mais curto e utilizado no dia a dia de quem trabalha com enzimas.
Utiliza o sufixo "ase" para caracterizar a enzima. Exs: Urease, Hexoquinase, Peptidase,
etc.
• Nome Sistemático: Mais complexo e nos dá informações precisas sobre a função
metabólica da enzima. Ex: ATP-Glicose-Fosfo-Transferase
• Nome Usual: Consagrados pelo uso; Exs: Tripsina, Pepsina, Ptialina.
As enzimas são classificadas segundo os compostos nos quais elas agem:
• Lipases: atuam nas gorduras decompondo-as em glicerol e ácidos graxos;
• Catalases: decompõem a água oxigenada;
• Amilases: decompõem os amidos em açúcares mais simples;
• Proteases: decompõem as proteínas;
• Celulases: decompõem a celulose;
• Pectinases: decompõem a pectina;
• Xilanases: decompõem a xilana;
• Isomerases: catalizam a conversão da glicose em frutose;
• Beta-glucanases: decompõem a beta-glucana; outras.
• Invertases: decompõem a sacarose.
6.1.2 ENZIMAS E BIOTECNOLOGIA
As enzimas, como mediadores de reações de síntese e degradação, são
catalisadores muito mais eficientes que as técnicas de catálise química convencionais, sendo
por isso, atualmente, muito exploradas pela biotecnologia. Sua utilização tem gerado grandes
investimentos, incluindo uma grande diversidade de processos industriais, produtos de
consumo e no campo dos biosensores (Bender et al, 1964; Cornish-Bowden, 1976; Ferst,
1985). Um importante fator determinante da utilização das enzimas em processos
tecnológicos é o seu custo. Várias enzimas que estão comercialmente disponíveis no mercado
apresentam preços variando desde muito baixos até extremamente altos. As enzimas são
moléculas catalisadoras, usadas como mediadores e não como o produto final dos processos
químicos que participam, não sendo gastas diretamente nestes processos. Seu alto custo inicial
deveria ser, então, secundário a sua utilização. Porém devido à desnaturação, as enzimas
perdem a atividade catalizadora com o tempo. Elas deveriam ser estabilizadas contra a
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6. Imobilização de invertase em cerâmicas de cinzas volantes de carvão mineral
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127
desnaturação para serem utilizadas de uma maneira eficiente. Quando são usadas em uma
forma solúvel, retêm alguma atividade depois da reação; entretanto, nesta forma, não podem
ser recuperadas para posterior reutilização sendo perdidas na forma de resíduos. Estes
resíduos permanecem como contaminante no produto e sua remoção pode envolver custos de
purificação extras. Para eliminar esta perda e aumentar a produtividade devem ser usados
métodos simples e econômicos que habilitem a separação da enzima, do produto da reação.
6.1.3 IMOBILIZAÇÃO
O modo mais fácil de alcançar isto é separando a enzima e o produto durante a
reação, formando um sistema polifásico: uma fase que contém a enzima e a outra fase que
contém o produto. A enzima é “aprisionada” dentro de sua fase, tornando-se insolúvel,
permitindo a reutilização sem contaminação do produto. Outras moléculas, inclusive os
reagentes, podem mover-se livremente entre as duas fases. Isto é conhecido como
imobilização e pode ser feita fixando-se a enzima em outro material, conhecido como suporte
de fixação. O termo imobilização não significa, necessariamente, que a enzima não pode
mover-se livremente dentro de sua fase, embora este seja o caso mais freqüentemente. Uma
variedade de materiais insolúveis pode ser usada para a imobilização, tais como matrizes
polímeras ou materiais inorgânicos normalmente inertes (Chaplin e Bucke, 1990). A elevada
eficiência apresentada por moléculas biológicas na seleção de reagentes e na especificidade da
interação com seus sítios de reação tem levado a um crescente interesse na pesquisa de
suportes imobilizados com enzimas (Mansur, 1999).
A imobilização de enzimas acarreta freqüentemente uma despesa adicional e só é
levada a cabo se representa vantagens econômicas e técnicas em relação a sua utilização em
solução. O benefício mais importante é a separação fácil da enzima dos produtos da reação
catalisada, evitando sua contaminação, particularmente se a enzima é notoriamente tóxica.
Também permite que processos contínuos sejam praticáveis, com uma economia considerável
de enzimas. A imobilização afeta freqüentemente a estabilidade e atividade da enzima, porém,
as variáveis envolvidas no processo de imobilização são normalmente controláveis, fazendo
com que as propriedades catalíticas sejam pouco alteradas (Kennedy e Cabral, 1987; Engasser
e Horvath, 1976).
Existem quatro métodos principais de imobilização de enzimas (Chaplin, 1990;
Martinek et al, 1977; Woodward, 1985): adsorção física, adsorção química, confinamento em
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128
matriz e confinamento em membrana. Na adsorção física, moléculas de enzimas são
imobilizadas no suporte por meio de forças de atração eletrostáticas, a força de van der Walls
(Fig.6.2a), enquanto que na química, esta imobilização se dá por ligações covalentes
(Fig.6.2b).
Figura 6.2. Imobilização de enzimas em suporte sólido ou poroso. Em (a), imobilização por adsorção
física (força de van der Walls); em (b), por adsorção química (ligações covalentes).
No confinamento em matriz, as enzimas são imobilizadas por retenção em uma
matriz polímera fibrosa (Fig.6.3a), enquanto que no confinamento em membrana, em uma
membrana semipermeável (Fig.6.3b). A adsorção química por ligações covalentes é o método
mais utilizado em processos industriais.
Figura 6.3. Imobilização de enzimas em matriz e membrana. Em (a), imobilização por confinamento
em matriz; em (b), por confinamento em membrana.
A escolha do método de imobilização e do tipo de suporte dependerá,
essencialmente, de dois fatores: a) das características peculiares da enzima; b) das condições
de uso da enzima imobilizada. Dado a variabilidade desses fatores, pode-se afirmar que não
existe um método geral e nem um suporte universal. Geralmente as condições de imobilização
para cada enzima só poderão se estabelecidas empiricamente. O procedimento consiste em se
(a)
(b)
Molécula
de enzima
Suporte sólido ou
poroso
Matriz polímera fibrosa
Membrana
semipermeável
Enzima
(a)
(b)
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129
imobilizar a enzima em vários suportes por meio de diferentes métodos, avaliando-se, a
seguir, a atividade do sistema imobilizado. Logicamente o binômio suporte-método mais
adequado será aquele que propiciar mais atividade após imobilização (Picher, 1975; Lima,
2001).
Todos os métodos de imobilização de enzimas envolvem um conjunto de técnicas
físicas e químicas, descritas por um protocolo desenvolvido para tal fim. Este protocolo inclui
uma série de compostos químicos que preparam o suporte para que a imobilização se realize.
Por exemplo, os trialcoxysilanes como a γ-aminopropyltriethoxysilane permitem que
materiais inertes como vidros sejam imobilizados (Fig.6.4). O Glutaraldeído é outro composto
que pode ser usado para unir enzimas entre si ou a suportes (Fig.6.5). É particularmente útil
para produzir membranas de enzimas imobilizadas; para uso em biosensores e ainda para a
união de enzimas a proteínas específicas (Chaplin e Bucke, 1990).
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130
Figura 6.4. Ação do γ-aminopropyltrioxysilane na imobilização de enzimas.
Vidro
γ-aminopropyltriethoxysilane
Thiophosgene
H
2
N - Enzima
Enzima
Enzima
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131
Figura 6.5. Ação do Glutaraldeído na imobilização de enzimas.
Uma vez imobilizada, a enzima pode ser utilizada na reação de catálise dos
reagentes para a formação do produto, sem que ocorra sua perda na forma de resíduos
(Fig.6.6).
Figura 6.6. Reação mediada por suporte imobilizado por enzimas.
Substrato de fixação
Enzimas imobilizadas
Glutaraldeído
Oligoglutaraldeído
Enzima
Enzima
Enzima
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132
O comportamento cinético de uma enzima imobilizada pode diferir
significativamente daquele quando em solução. As propriedades de uma enzima podem ser
modificadas por escolha do protocolo de imobilização adequado, considerando que o mesmo
método pode ter efeitos apreciavelmente diferentes em enzimas diferentes. Estas modificações
podem ser ocasionadas por alterações na conformação da enzima devido ao procedimento de
imobilização ou a presença e natureza do suporte de fixação (Chaplin, 1990; Martinek et al.,
1977).
Na literatura existem inúmeros materiais inertes que podem ser usados para
imobilizar enzimas. A natureza física desses suportes pode variar, desde materiais geliformes
até superfícies sólidas (lâminas de aço, pérolas de vidro, por ex.), recobertas com alguma
substância capaz de interagir com a enzima. Os suportes inertes podem ser classificados como
não poroso (vidro, sílica, aço), microencapsulado (triecetado de celolose), entrelaçado
(policrilamida, PVA) e macroporoso (alumina, sílica). O primeiro apresenta alta estabilidade
das ligações suporte-enzima frente ao pH de utilização do sistema imobilizado; o segundo,
com porosidade em torno de 35 Å, estabilidade moderada; o terceiro com porosidade variada,
possui estabilidade baixa e o último, porosidade entre 200-1000Å, apresenta elevada
estabilidade (Illanes, 1994; Lima et al., 2001). Os suportes porosos devem possuir poros com
dimensões um pouco maiores que a das partículas da enzima a ser imobilizada (Zheng, 2002).
Com o advento da técnica de imobilização foi possível diversificar as aplicações,
podendo-se citar: a adaptação de reatores químicos convencionais a processo enzimáticos
contínuos; em eletrodos enzimáticos (Guilbault et al., 1991), dispositivos formados
basicamente de um sensor e da enzima imobilizada; a técnica para diagnóstico clínico
chamada enzimaimunoensaio (Porstamnn e Kiessig, 1992), a qual explora a já conhecida
reação antígeno-anticorpo e usando a enzima como marcador; a latenciação de fármacos
através do aprisionamento de enzimas em lipossomas e microcápsulas ou em dispositivos
extracorpóreos. Uma aplicação importante que será destacada neste capítulo é a da hidrólise
(inversão) da sacarose, muito utilizada na indústria alimentícia, cosmética e farmacêutica.
6.1.4 AÇÚCAR INVERTIDO
A sacarose é um dissacarídeo, de fórmula C
12
H
22
O
11
, encontrado principalmente
na cana de açúcar e na beterraba. Estruturalmente, a sacarose resulta da união de uma
molécula de glicose e uma molécula de frutose, com a eliminação de uma molécula de água
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6. Imobilização de invertase em cerâmicas de cinzas volantes de carvão mineral
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133
(Fig.6.7) (Nelson e Griffin, 1975; Vitolo e Carreira, 1992; Lehninger, 1994). Produtos feitos a
base deste dissacarídeo apresentam o inconveniente da cristalização sobre determinadas
condições (concentração, temperatura, etc).
Figura 6.7. Reação que origina uma molécula de sacarose a partir da frutose e da glicose.
A sacarose pode ser hidrolisada por ácidos diluídos ou pela ação da enzima
invertase, liberando a glicose e a frutose que existem em sua estrutura. Essa reação é
denominada inversão da sacarose, pois durante a sua realização, o plano da luz polarizada
desvia-se da direita (+66,5º) para a esquerda (-39,6º). O chamado açúcar invertido é uma
mistura de glicose e frutose. O mel, por exemplo, é formado principalmente de açúcar
invertido. Os produtos da hidrólise completa ou parcial da sacarose produzidos pela invertase
(β-fructofuranosidase – E.C.3.2.1.2.6) são largamente utilizados na produção de cremes,
geléias, mel artificial, adoçantes, açúcar líquido, etc. devido ao sua baixa cristalização,
comparado com a sacarose. A invertase, quando imobilizada em suportes apropriados e
utilizada na hidrólise da sacarose, representa vantagens técnicas e econômicas, já que evita a
perda da enzima durante o processo, além da contaminação (resíduos de enzima) do produto
resultante (açucar invertido) (Vitolo, 1989). A inversão da sacarose pode ser obtida através da
imobilização da invertase em suportes insolúveis.
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134
6.1.5 IMOBILIZAÇÃO DA INVERTASE
A imobilização da invertase em suportes orgânicos tais como, palha de milho e
bagaço de cana-de-açúcar tem sido utilizada, porém possui como desvantagens a
possibilidade de liberação de partículas do suporte durante o processo de hidrólise. Suportes
inorgânicos têm sido utilizados como método de substituição, destacando o vidro poroso.
Entretanto, a utilização de compostos cerâmicos tem demonstrado ser muito promissor
comparando em qualidade ao vidro, além de ser bastante econômico. As cinzas resultantes da
queima de carvão mineral de termelétricas, além do baixo valor agregado (são resíduos),
apresentam grande quantidade de fases amorfas (vítreas) de silicatos e alumino silicatos
importantes em processos de imobilização, tornando-se fortes candidatas a material para a
preparação de suportes cerâmicos (Weetall e Havewala, 1972).
6.1.6 CINZAS DE CARVÃO MINERAL
O carvão mineral (Fig 6.8a) é originado do processo de eliminação do CO
2
, CH
4
,
e H
2
O (fossilização) da madeira e outros fósseis, há milhões de anos. Ocorre em associação
com uma variedade de minerais inorgânicos, entre eles os alumino silicatos (argilas minerais),
carbonatos (calcita – CaCO
3
e dolomita - CaMg(CO
3
)
2
), sulfetos (pirita – FeS
2
), cloritas
((Mg,Al,Fe)
12
(Si, Al)
8
O
20
(OH)
16
), sílica (quartzo – SiO
2
), dentre outros; e uma variedade de
óxidos, como óxido de Ferro (Fe
2
O
3
), óxido de Alumínio (Al
2
O
3
), óxido de Titânio (TiO
2
),
óxido de Cálcio (CaO), óxido de Magnésio (MgO), óxido de Fósforo (P
2
O
5
), óxido de Sódio
(Na
2
O), óxido de Potássio (K
2
O), óxidos de Enxofre (SO
2
e SO
3
). Apresenta ainda elementos
traços (metais pesados), tais como o Manganês (Mn), Lítio (Li), Escândio (Sc), Vanádio (V),
Cromo (Cr), Cobalto (Co), Níquel (Ni), Cobre (Cu), Zinco (Zn), Gálio (Ga), Estrôncio (Sr),
Ítrio (Y), Zircônio (Zr), Nióbio (Nb), Molibdênio (Mo), Cádmio (Cd), Estanho (Sn),
Antimônio (Sb), Bário (Ba), Lantânio (La), Tungtênio (W), Chumbo (Pb) e Arsênio (As).
Elementos traços são elementos que ocorrem em sistemas naturais em pequenas
concentrações e apresentam densidade igual ou acima 5g/cm
3
(Victor, 1988; Lutgens, 2001;
Skinner et al, 1999).
Quando queimado nas usinas termelétricas, para geração de energia, o carvão
mineral origina uma grande quantidade de resíduos industriais, na forma de escórias, cinzas
de fundo (do inglês, “botton ash”) e cinzas volantes (do inglês, “fly ash”) (Fig.6.8b) Sua
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135
composição está associada a do carvão de origem e as condições em que a combustão foi
realizada, podendo apresentar novas substâncias, a partir de diferentes combinações de seus
elementos constituintes, alteração de fases ou ainda, manter outros compostos inalterados,
principalmente aqueles com altos pontos de fusão (Smoot e Smith, 1985; Poop, 1988). Por
exemplo, o quartzo e o coríndon são tipicamente encontrados, mesmo após a combustão,
devido aos seus altos pontos de fusão e o curto intervalo de tempo que as partículas ficam
submetidas a altas temperaturas. Contudo, os minerais argilosos podem entrar em fusão,
formando alumino silicatos cristalinos e vítreos. Elementos como Fe, Ca e Mg podem
combinar-se com o oxigênio do ar para formar óxidos, como a magnetita (Fe
3
O
4
), hematita
(Fe
2
O
3
), cal (CaO) e o periclásio (MgO) (Tishmack, 1996). Os vários minerais que foram
identificados por difração de raios-X em cinzas volantes e de fundo, incluíram: quartzo
(SiO
2
), mulita (Al
6
Si
2
0
13
), aluminato de tricálcio (Ca
3
A
12
O
6
), melilita (Ca
2
(Mg,Al)(AlSi)
2
O
7
),
merwinita (Ca
3
Mg(SiO
4
)
2
), C
2
S (Ca
2
SiO
3
), ferrite spinel ((Mg,Fe)(Fe.A1)
2
O
4
), magnetita
(Fe
3
O
4
), hematita (Fe
2
O
3
), cal (CaO), anidrida (CaSO
4
), periclásio ou magnesita (MgO) e
sulfatos alcalinos ((Na,K)
2
S0
4
) (Helmuth, 1987; Hemmings e Berry, 1988; McCarthy, 1988;
McCarthy et al, 1993; Stout, et al, 1988; Thompson et al, 1988).
Figura 6.8. Pedra de carvão mineral (a) e suas cinzas volantes (b), após a queima em usina
termelétrica.
As cinzas de carvão mineral possuem uma quantidade excessiva de enxofre e
ferro que são tóxicas para as plantas, além de apresentarem muita resistência a
decomposições, o que acarreta problemas ecológicos se forem simplesmente devolvidas ao
meio ambiente (Sartori e Assini, 2001; Kress et al, 1998; Stewart e Konetsky, 1998; Reash et
al, 1988). Devido a questões ambientais, baixo valor agregado e diversidade em sua
composição química, têm-se, nos últimos anos, buscado aplicações para estes resíduos. A
reciclagem tem sido feita por intermédio da construção civil, usando-os como aditivo na
(a)
(b)
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136
fabricação de cimento e concreto. Além disto, também se tem pesquisado o uso de cinzas
resultantes da queima de carvão para fabricação de materiais cerâmicos (Karmanski e
Deregowski, 1995; Parras et al, 1996; Queralt, 1997; Wei e Hung, 2001; Santos, 2001; Jung,
2002), tais como: vitrocerâmicos (Cioffi, 1995; Barbieri et al, 2000; Romero et al, 2001; Park
e Heo, 2002), filtros (Pila e Loeffler, 1996; Jo, 1997; Berbner, 1997; Park et al, 2001; Lime et
al, 2001), refratários e materiais de construção (Hughes, 1996; Wiesbusch e Seyfried, 1997;
Sevelius, 1997). Entretanto, foi questionada a utilização das cinzas de carvão mineral na
fabricação de cerâmicas devido à presença de elementos traço e conseqüente radioatividade
natural (Beretka, 1995). É bem conhecido que vários elementos traços estão presentes no
carvão mineral. Uma avaliação da concentração destes elementos em cinzas foi levada a cabo,
em 1990, por Eary et al (1990). De acordo com estes estudos, algumas cinzas têm altas
concentrações de As, B, Pb, Ni, Se, V e Zn. Após a combustão do carvão, alguns destes
elementos podem permanecer nas cinzas enquanto outros podem escapar para a atmosfera nos
gases formados durante a combustão. Porém, estudos de Wyszomirski e Brylska (1996)
demonstraram que as quantidades de radioatividade produzidas pelas cinzas estão em níveis
perfeitamente seguros no que se refere à saúde humana. Também salienta que sua utilização,
na fabricação de materiais cerâmicos, representa uma solução pró-ecológica.
Estatísticas mostram que somente nos Estados Unidos, mais de 80 milhões de
megagramas de cinzas de carvão mineral são produzidas anualmente (Gupta, 1996). Estima-se
que a quantidade de cinzas geradas pelas termelétricas do sul do Brasil representam
disponibilidade de três milhões de megagramas por ano de cinzas originadas da queima de
carvão mineral, compostas de 65 à 85% de cinzas secas ou volantes e 15 à 35% de cinzas
úmidas ou pesadas. Em geral de cada 100 megagramas de carvão mineral consumido pelas
termelétricas são geradas 42 megagramas de cinzas, das quais 70% são extraídas a seco
(cinzas secas ou volantes) e 30% por via úmida (cinzas úmidas ou pesadas). Devido às suas
características físico-químicas, a cinza seca gerada é vendida a cimenteiras e concreteiras que
as empregam no cimento Portland ou como adições minerais ao concreto; já as cinzas pesadas
não alcançam o mesmo mercado constituindo assim um grande problema de ordem ambiental
(Rocha, 1999).
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137
6.1.7 OBJETIVOS
Neste capítulo, estudou-se o potencial de imobilização de inversase (β-
fructofuranosidase-E.C.3.2.1.2.6) em cerâmicas produzidas com as cinzas volantes de carvão
mineral da Usina Termelétrica Presidente Médici (UTPM), Candiota, Rio Grande do Sul e sua
aplicação na hidrólise da sacarose, tanto em batelada (processos onde, terminada a reação, a
enzima imobilizada pode ser separada da mistura final com relativa facilidade) como em
reatores enzimáticos (recipiente ou série de recipientes que executam determinada conversão
desejada através de meios de enzimáticos).
6.2 MATERIAIS E MÉTODOS
6.2.1 MATERIAIS
Foram utilizadas as cinzas volantes originadas da queima do carvão mineral da
Usina Termelétrica Presidente Médici (cinzas UTPM), Candiota, Rio grande do Sul, Brasil.
Apresentam os seguintes elementos químicos: Si (27%), Al (11,3%), Fe (3,7%), K (0,64%),
Ti (0,50%), C (0,42%), Ca (0,38%), Na (0,11%), Mg (0,03%), P (0,01%), N (<0.01%), S
(0,006%), Mn (368 mg/kg), Zn (70 mg/kg), Ni (62 mg/kg), Cr (48 mg/kg), B (24 mg/kg), Mo
(<30 mg/kg), Cu (20 mg/kg), Pb (<10 mg/kg), Cd (<3 mg/kg); sendo o mais abundante o
silício, seguido pelo alumínio. São formadas, basicamente, pelas fases cristalinas mulita,
quartzo, anidrita e calcita, possuindo também, em quantidades menores, coríndon, hematita e
outros, imersos em uma matriz vítrea cenosférica (fase amorfa). Os compostos de maior
proporção em massa dentre as fases cristalinas são a mulita e o quartzo. Sua granulometria
média é de 43,98 μm, sendo detectados partículas com 0,30 e 400 μm. Apresentam densidade
média aparente de 2,50 g/cm
3
. Em torno de 40 % de sua massa se concentra em um tamanho
de particulado maior ou igual a 63 µm; 51 % entre 63 e 45 µm; 7 % entre 45 e 25 µm e 2 %
menores que 25 µm. Partículas na forma de cenosferas correspondem a no mínimo 60 % da
massa e do volume totais das cinzas. A calcita e a anidrita concentram-se em uma
granulometria menor que 63 µm. A transformação termogravimétrica significativa ocorre em
torno de 720ºC por ocasião da queima da calcita com liberação de CO
2.
(Santos, 2001).
Como agente ligante para preparação de cerâmicas, foi utilizado glicerina P.A. da
Sigma Chemical Co.
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6. Imobilização de invertase em cerâmicas de cinzas volantes de carvão mineral
__________________________________________________________________________________________
138
Para a imobilização, foi utiliza a invertase de levedura (Saccharomyces cerevisiae
355 U/mg sólida) da Novo Nordisk (Brasil); glutaraldeído e sacarose da Sigma Chemical Co.
e diversos reagentes complementares de grau analítico.
6.2.2 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS
Foram utilizados como suporte para a imobilização de enzimas, pastilhas
cerâmicas produzidas com as cinzas UTPM, fornecidas pelo Instituto de Química e
Geoquímica (IQG) da Universidade Federal de Pelotas (UFPEL) e com sílica em pó (SiO
2
)
fornecida pelo Departamento de Física da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(UFRN). As cerâmicas foram preparadas no Departamento de Física da Universidade Federal
do Ceará (UFC), conforme a metodologia de Santos (2001): preparação da massa cerâmica
com 5% de glicerina (agente ligante), cinzas UTPM e SiO
2
nas concetrações de 0, 20, 40, 60,
80 e 100%; compactação uniaxial de ação simples durante 15s, com as pressões de 127,38,
254,76 e 318,45 MPa, em prensa hidráulica Sky; e sinterização na temperatura de 1200˚C,
durante 4 horas em forno tipo mufla, com taxa de aquecimento de 50ºC/min e de resfriamento
de aproximadamente 1ºC/min. Os tipos de suportes preparados e suas características estão
indicados na Tabela 6.1. Foram preparadas 10 amostras de cada tipo de suporte cerâmica. A
Figura 6.9 mostra a fotografia de uma cerâmica tipo 1.
Tabela 6.1. Identificação dos suportes cerâmicos, conforme a pressão de compactação e composição
da massa pré-cerâmica.
Tipo Pressão (MPa) Composição da massa pré-cerâmica
1 127,38 Cinzas UTPM
2 254,76 Cinzas UTPM
3 318,45 Cinzas UTPM
4 127,38 Cinzas UTPM+ 20% de SiO
2
5 127,38 Cinzas UTPM + 40% de SiO
2
6 127,38 Cinzas UTPM + 60% de SiO
2
7 127,38 Cinzas UTPM + 80% de SiO
2
8 127,38 100% de SiO
2
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6. Imobilização de invertase em cerâmicas de cinzas volantes de carvão mineral
__________________________________________________________________________________________
139
Figura 6.9. Suporte cerâmico utilizado para a imobilização (tipo 1). Os suportes apresentam 10mm de
diâmetro e espessura variando entre 0,25 a 0,5mm.
6.2.3 SILANIZAÇÃO DAS CERÂMICAS E IMOBILIZAÇÃO DA INVERTASE
Para cada cerâmica (com massa variando entre 0,05 e 0,08g) foi adicionado 2ml
de uma solução de γ-aminopropyltriethoxysilane (APTS) a 3% em acetona (v/v) e
posteriormente aquecida a 80ºC “overnight”. Após este período os suportes foram lavados
com acetona e água destilada. A seguir, foi adicionado o glutaraldeído como agente
bifuncional, o qual irá ligar-se ao suporte e a enzima. Foi utilizado um volume de 2ml a 2,5%
em 0,2 M de tampão fosfato a pH 7,0, por um período de 12h a 4ºC. Os suportes foram
posteriormente lavados exaustivamente com água destilada e tampão citrato de sódio a pH
5,0. A enzima em uma concentração desejada foi adicionada ao suporte por 4h a 4ºC. Em
seguida o suporte já com a enzima imobilizada foi novamente lavado exaustivamente com
água destilado e solução tampão de citrato de sódio. O processo de sinalização e imobilização
é esquematizado na Figura 6.10. A Silanização e imobilização da invertase foram realizadas
no Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA) da Universidade Federal de
Pernambuco (UFPE).
6.2.4 ENSAIO ENZIMÁTICO
A invertase imobilizada nas cerâmicas foi incubada em diferentes concentrações
de sacarose sob agitação constante a pH 5,0, a 50 ºC em tampão citrato de sódio a 0,1M por
64min. Os açúcares redutores foram determinados pelo método do ácido dinitrosalicilico
(DNSA) descrito por Miller (1959). Uma unidade de atividade enzimática é definida como
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6. Imobilização de invertase em cerâmicas de cinzas volantes de carvão mineral
__________________________________________________________________________________________
140
sendo a quantidade de enzima suficiente para converter um mol de sacarose/min em pH 5,5 a
50 ºC. O ensaio enzimático foi realizado no Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami
(LIKA) da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE).
Figura 6.10. Processo de silanização e imobilização da cerâmica e imobilização da invertase.
6.2.5 HIDRÓLISE DA SACAROSE
Os experimentos em batelada tanto para a enzima solúvel quanto para a
imobilizada foram realizados em tubos de 10ml com 4mL de solução a concentrações
variáveis de sacarose, respectivamente 20, 40, 60 and 80% (w/v), preparadas em tampão
citrato de sódio 0,1 M a pH 5,0 em 50ºC. Os experimentos com o reator “up-flow” foram
realizados em colunas de 7,5 cm x 14 mm, contendo a cerâmica de material imobilizado
preparado. A solução de sacarose (100ml) em uma concentração de 60% foi preparada em
tampão citrato de sódio 0,1M pH 5,0. Os experimentos foram realizados a 52ºC com uma
30 ml de APTS à
3% de acetona
2ml à 2,5% de
glutaraldeído em 0,2
M de tampão fosfato
à pH 7
80 ºC “overnight
Suporte cerâmico
Lavagem com acetona e
água destilada
12h à 4ºC
Lavagem com água destilada
e tampão citrato de sódio pH
5,0
Invertase
4h à 4 ºC
Lavagem com água destilada
e solução tampão citrato de
sódio pH 5,0.
Cerâmica com invertase
imobilizada.
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6. Imobilização de invertase em cerâmicas de cinzas volantes de carvão mineral
__________________________________________________________________________________________
141
velocidade de fluxo de 10mL/55 seg e uma pressão de 40,5 cm of H
2
O. A hidrólise da
sacarose foi realizada no Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA) da
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE).
6.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.3.1 CINÉTICA DA HIDRÓLISE DA SACAROSE COM A INVERTASE SOLÚVEL
(5,39MG/ML)
Nos experimentos com a enzima solúvel foi utilizada uma concentração de 5,39
mg/ml de enzima ou 1913U (cada unidade de enzima hidrolisa 0,0036mg/mL min) em um
volume final de 13mL, ou seja, cerca de 68,9mg de enzima (24459,5U). Foram utilizadas três
concentrações de sacarose preparadas em tampão citrato de sódio para a manutenção
constante do pH. As concentrações foram escolhidas baseadas nos substratos normalmente
encontrados nas indústrias alimentícias. Nas três concentrações estudadas, verificamos
(Fig.6.11) a hidrólise em torno de 100% nas concentrações de 400 e 600mg/mL de sacarose
após 20 minutos de reações e cerca de 85% para a concentração de 800 mg/mL. A não
conversão total da sacarose na concentração de 800 mg/mL possivelmente se deve a alta
concentração de açúcar presente e o baixo teor de água, o qual é substrato necessário para a
reação.
Figura 6.11. Ação da enzima invertase solúvel de Saccharomyces cerevisiae.
0 10 20 30 40 50 60 70
0
100
200
300
400
500
600
700
400 mg/ml
600 mg/ml
800 mg/ml
ART (mg/ml)
Tempo (min)
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6. Imobilização de invertase em cerâmicas de cinzas volantes de carvão mineral
__________________________________________________________________________________________
142
6.3.2 CINÉTICA DA HIDRÓLISE DA SACAROSE COM A INVERTASE
IMOBILIZADA EM CERÂMICA TIPO 1, 2, E 3
Inicialmente foram realizados todos os experimentos utilizando soluções de
sacarose de 60% , nas condições descritas anteriormente, por um período de 64min. Os
resultados (Fig.6.12) demonstraram que houve uma hidrólise de cerca de 58 e 45% utilizando
as cerâmicas tipos 2 e 3, respectivamente. Entretanto com as cerâmicas tipo 1 (menor pressão
de compactação) a atividade foi muito inferior.
Figura 6.12. Atividade na inversão da sacarose (sacarose 600g/l) da invertase imobilizada nas
cerâmicas tipo 1, 2 e 3, utilizando tampão citrato de sódio (0,1M) a pH 5,0 a 4ºC. As cerâmicas tipo 1
são as com menor pressão de compactação.
Com o objetivo de determinar a estabilidade do material imobilizado
determinamos a atividade da enzima imobilizada nas cerâmicas tipos 2 e 3 a cada 10 dias por
um período de 30 dias. Constatou-se que a perda de atividade nos primeiros 20 dias não foi
significativa. O sistema enzimático foi armazenado em tampão citrato de sódio a pH 5,0 a
4ºC.
0 10 20 30 40 50 60
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Sacarose invertida (g/l)
Tempo (min)
Tipo 1
Tipo 2
Tipo 3
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6. Imobilização de invertase em cerâmicas de cinzas volantes de carvão mineral
__________________________________________________________________________________________
143
6.3.3 DETERMINAÇÃO DO MELHOR SISTEMA INVERTASE IMOBILIZADA
APÓS O RE-USO
Foram realizados experimentos de re-uso dos sistemas imobilizados para verificar
a durabilidade do material imobilizado, utilizando a solução de sacarose a 60% (600mg/mL),
nas condições descritas anteriormente. Verificamos que em todos os experimentos houve
variações em termos da reprodutibilidade dos re-usos com todos os suportes cerâmicos. Este
comportamento se deve a maneira como o experimento foi conduzido, uma vez que por conta
da limitação de material o volume do substrato para cada 26 mg de suporte foi cerca de 3ml,
daí a dificuldade na coleta da amostra. Entretanto, verificamos que para as cerâmicas tipo 3,
com o terceiro re-uso, ainda tínhamos cerca de 90% de conversão após 60 minutos de
experimentação.
6.3.4 RE-USO DAS CERÂMICAS TIPO 3 SUBMETIDAS A DIFERENTES
CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE
Utilizou-se cerâmicas tipo 3 para realizar experimentos com diferentes
concentrações de sacarose, devido a sua alta eficiência na inversão. Foram realizados
inicialmente três grupos de experimentos com as mesmas concentrações utilizadas com a
enzima solúvel. O processo de imobilização seguiu a descrição feita anteriormente, onde uma
solução de 5,68mg/mL de proteína ficou em contato com o suporte cerâmico. Após os
processos de lavagem verificamos que a atividade retida foi de 694,9U o que corresponde à
cerca de 1,96mg de proteína. As cerâmicas tipo 3, foram incubadas com 3mL de solução de
sacarose nas seguintes concentrações: 40, 60 e 80% a pH 5,0 a 50ºC. Em seguida alíquotas
foram retidas em intervalos de tempo e analisadas pelo método do DNSA. Foi observado que
após um período de 64min cerca de 81% de inversão já havia ocorrido utilizando a solução de
60% de sacarose (Figs.6.13 – 6.15).
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6. Imobilização de invertase em cerâmicas de cinzas volantes de carvão mineral
__________________________________________________________________________________________
144
-10 0 10 20 30 40 50 60 70
0
50
100
150
200
250
Primeiro uso
Segundo uso
Terceiro uso
Quarto uso
Sacarose invertida (g/l)
Tempo (min)
Figura 6.13. Efeito do re-uso sobre a atividade da invertase imobilizada em cerâmicas tipo 3, para uma
concentração de 40% de sacarose.
0 10 20 30 40 50 60 70
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
Primeiro uso
Segundo uso
Terceiro uso
Quarto uso
Sacarose invertida (g/l)
Tempo (min)
Figura 6.14. Efeito do reuso sobre a atividade da invertase imobilizada em cerâmicas tipo 3, para uma
concentração de 60% de sacarose.
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6. Imobilização de invertase em cerâmicas de cinzas volantes de carvão mineral
__________________________________________________________________________________________
145
0 10 20 30 40 50 60 70
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Primeiro uso
Segundo uso
Terceiro uso
Quarto uso
Sacarose invertida (g/l)
Tempo (min)
Figura 6.15. Efeito do re-uso sobre a atividade da invertase imobilizada em cerâmicas tipo 1, para uma
concentração de 80% de sacarose.
6.3.5 EFEITO DA ATIVIDADE DA INVERTASE IMOBILIZADA EM CERÂMICAS
COM DIFERENTES CONTEÚDOS DE ÓXIDO DE SILÍCIO
Foram realizados testes com diversas concentrações de invertase (0,1 – 1,6
mg/mL) nas cerâmicas preparadas com a mistura de cinzas UTPM e sílica, em diversas
concentrações (tipos 4, 5, 6, 7 e 8) e com pressão de compactação de 127,38MPa. O objetivo
aqui foi verificar alguma alteração nas cerâmicas de baixa atividade enzimática, com o
acréscimo de sílica. Entretanto, as cerâmicas mistas (cinzas + sílica) continuaram
apresentando baixa inversão de sacarose. O conteúdo de sílica não interferiu na atividade
enzimática (Figs 6.16 – 6.20).
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6. Imobilização de invertase em cerâmicas de cinzas volantes de carvão mineral
__________________________________________________________________________________________
146
0 10 20 30 40 50 60 70
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
0,1 mg/ml de invertase
0,8 mg/ml de invertase
1,6 mg/ml de invertase
Sacarose invertida (g/l)
Tempo (min)
Figura 6.16. Efeito da atividade de diferentes concentrações da invertase imobilizada em cerâmicas de
cinzas UTPM com 20% de SiO
2
(tipo 4).
0 10 20 30 40 50 60 70
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
0,1 mg/ml de invertase
0,8 mg/ml de invertase
1,6 mg/ml de invertase
Sacarose invertida (g/l)
Tempo (min)
Figura 6.17. Efeito da atividade de diferentes concentrações da invertase imobilizada em cerâmica de
cinzas UTPM com 40% de SiO
2
(tipo 5).
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6. Imobilização de invertase em cerâmicas de cinzas volantes de carvão mineral
__________________________________________________________________________________________
147
0 10 20 30 40 50 60 70
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
0,1 mg/ml de invertase
0,8 mg/ml de invertase
1,6 mg/ml de invertase
Sacarose invertida (g/l)
Tempo (min)
Figura 6.18. Efeito da atividade de diferentes concentrações da invertase imobilizada em cerâmica de
cinzas UTPM com 60 % de SiO
2
(tipo 6).
0 10 20 30 40 50 60 70
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
0,1 mg/ml de invertase
0,8 mg/ml de invertase
1,6 mg/ml de invertase
Sacarose invertida (g/l)
Tempo (min)
Figura 6.19. Efeito da atividade de diferentes concentrações da invertase imobilizada em cerâmica de
cinzas UTPM com 80 % de SiO
2
(tipo 7).
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6. Imobilização de invertase em cerâmicas de cinzas volantes de carvão mineral
__________________________________________________________________________________________
148
0 10 20 30 40 50 60 70
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
0,1 mg/ml de invertase
0,8 mg/ml de invertase
1,6 mg/ml de invertase
Sacarose invertida (g/l)
Tempo (min)
Figura 6.20. Efeito da atividade de diferentes concentrações da invertase imobilizada em cerâmica de
cinzas UTPM com 100 % de SiO
2
(tipo 8).
6.3.6 EFEITO DA ATIVIDADE DA INVERTASE IMOBILIZADA NAS CERÂMICAS
TIPO 4 - 8 COM DIFERENTES CONTEÚDOS DE ENZIMA
Com o objetivo de verificar a relação do teor de enzima imobilizada em cerâmicas
com conteúdos diferentes de silício, foram realizados alguns experimentos, onde foram
utilizadas cerâmicas de teores de silício que variaram de 20 a 100%, com resultados já
discutidos anteriormente. Em relação aos teores de enzima, esta variou de 0,1 a 1,6 mg/mL
(Figs.6.21 – 6.23). Como controle utilizamos o experimento realizado inicialmente, que foi a
cerâmica com teor de silício abaixo de 20%, mas com o teor de enzima utilizado para a
imobilização de 5,68mg/mL (Fig.6.24).
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6. Imobilização de invertase em cerâmicas de cinzas volantes de carvão mineral
__________________________________________________________________________________________
149
Figura 6.21. Efeito da atividade da invertase imobilizada nas cerâmicas tipo 4 – 10 (20 - 100% de
SiO
2
) com 0,1 mg/ml de invertase.
Figura 6.22. Efeito da atividade da invertase imobilizada nas cerâmicas tipo 4 – 8 (20 - 100 % de SiO
2
)
com 0,8 mg/ml de invertase.
-10 0 10 20 30 40 50 60 70
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
20% de SiO
2
40% de SiO
2
60% de SiO
2
80% de SiO
2
100% de SiO
2
Sacarose Invertida (g/l)
Tempo (min)
0 10 20 30 40 50 60 70
0
1
2
3
4
5
6
7
20% de SiO
2
40% de SiO
2
60% de SiO
2
80% de SiO
2
100% de SiO
2
Sacarose Invertida (g/l)
Tempo (min)
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6. Imobilização de invertase em cerâmicas de cinzas volantes de carvão mineral
__________________________________________________________________________________________
150
Figura 6.23. Efeito da atividade da invertase imobilizada nas cerâmicas tipo 4 – 8 (20 - 100% de SiO
2
)
com 1,6 mg/ml de invertase.
Figura 6.24. Efeito da atividade da invertase imobilizada na cerâmica 4 (20% de SiO
2
) com 5,68mg/ml
de invertase, após 4 usos.
0 10 20 30 40 50 60 70
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
20% de SiO
2
40% de SiO
2
60% de SiO
2
80% de SiO
2
100% de SiO
2
Sacarose Invertida (g/l)
Tempo (min)
0 10 20 30 40 50 60 70
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Primeiro uso
Segundo uso
Terceiro uso
Quarto uso
Sacarose Invertida (g/l)
Tempo (min)
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__________________________________________________________________________________________
151
Não houve diferença significativa em relação a quantidade de material protéico
disponível para a imobilização e o conteúdo do sílica presente na cerâmica, havendo uma
estabilidade em torno de 10g/L de inversão de sacarose. Entretanto, quando comparamos com
5,68 g/L de enzima disponível verificamos um aumento significativo de atividade. Estes
resultados nos indicam que poderemos aumentar a atividade do material enzimático quando
aumentamos a quantidade de enzima disponível.
6.3.7 RELAÇÃO DA ATIVIDADE DA INVERTASE IMOBILIZADA NAS
CERÂMICAS TIPO 1 (127,32 MPA) COM DIFERENTES CONTEUDOS DE ENZIMA
Com o objetivo de otimizar a quantidade de enzima imobilizada para obter a
maior taxa de inversão, foi relacionada a quantidade de enzima disponível para imobilização e
a atividade enzimática representada pela quantidade de sacarose invertida (Fig.6.25).
Figura.6.25. Relação da atividade da invertase imobilizada com diferentes conteúdos de enzima.
As cerâmicas preparadas com pressão de compactação de 318,3 MPa
apresentaram eficiência 10 vezes maior na inversão da sacarose do que aquelas compactadas
com 63,66 MPa. A influência da pressão de compactação na inversão da sacarose exige ainda
maiores estudos, entretanto, sabemos que a atividade enzimática está associada a área
superficial disponível a imobilização da enzima e que as dimensões dos poros do suporte
devem ser um pouco maiores que as da enzima a ser imobilizada. Quando aumentamos a
0 1 2 3 4 5 6
0
10
20
30
40
50
Invertase (g/l)
Sacarose invertida (g/l)
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6. Imobilização de invertase em cerâmicas de cinzas volantes de carvão mineral
__________________________________________________________________________________________
152
pressão de compactação, o tamanho dos poros também se reduz. Se esta redução fosse
significativa, cerâmicas compactadas a 318,3 MPa (amostras 2, 3A e 3B) deveriam imobilizar
uma quantidade menor de enzimas e conseqüentemente apresentariam menor eficiência
enzimática que as compactadas a 63,66 e 127,32 MPa (1A, 1B, 4 – 10). Entretanto, o que se
observou foi um aumento da atividade enzimática com o aumento da pressão de compactação.
Ou seja, o tamanho de poro não teve papel relevante nos experimentos realizados. As
cerâmicas compactadas tanto a baixas quanto a altas pressões apresentaram dimensões de
poros suficientes para a imobilização. Porém, quando maior a porosidade, menor será a
densidade aparente, ou seja, menos material por centímetro cúbico estará disponível para a
interação enzimática. As cerâmicas com maior pressão de compactação ainda apresentaram
90% de atividade enzimática com o terceiro re-uso, após 60 min de experimentação.
O acréscimo de sílica, de 20 a 100%, no material cerâmico durante a preparação
não resultou em melhorias significativas na atividade enzimática das amostras compactadas
na pressão de 127,32 MPa. Ou seja, a sílica utilizada não apresentou silanização no protocolo
de imobilização. Isso é um indicativo de baixa amorfização ou alta cristalinidade da sílica
usada na preparação das cerâmicas mistas.
6.4 CONCLUSÕES
Foram imobilizadas cerâmicas com a enzima invertase (β-fructofuranosidase –
E.C.3.2.1.2.6) de levedura (Saccharomyces cerevisiae 355 U/mg sólida). As cerâmicas foram
preparadas com as cinzas de carvão mineral da Usina Termelétrica Presidente Médici,
Candiota, RS, Brasil, com diferentes pressões de compactação e temperaturas/tempo de
sinterização, apresentando dimensões de 10 mm de diâmetro e espessura variando entre 0,25 e
0,5 mm. Os resultados se mostraram promissores, sugerindo a utilização de suportes para
imobilização da invertase em escala industrial, com a construção de reatores enzimáticos para
produção de açúcar invertido. O baixo valor agregado do material utilizado na fabricação dos
suportes cerâmicos e sua elevada capacidade de imobilização justificam plenamente a
continuidade nas pesquisas com as cerâmicas das cinzas de carvão mineral da Usina
Termelétrica Presidente Médici.
Este trabalho contribuiu para a preparação do artigo a ser submetido em 2007
(Anexo C.1): Albertini, A. V. P.; Reis, A. L S.; Teles, F. R. R.; Souza, J. C.; Rolim Filho, J.
L.; Martins, D. B. G.; Salinas, C. R. M.; Nogueira, V. N.; Santos, R. P.; Gadelha, C. A. A.;
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6. Imobilização de invertase em cerâmicas de cinzas volantes de carvão mineral
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153
Martins, J. L.; Cavada, B. S.; Lima Filho, J.L. Immobilization of invertase into sinterized coal
fly ashes for hydrolysis of sucrose: stability, properties and application in bioreactors.
Também está associado à dissertação de mestrado de Alessandro Victor Patrício de Albertini
do Curso de Pós-Graduação em Bioquímica da UPPE, intitulado “Imobilização de invertase
em cinzas de carvão sinterizadas para hidrólise de sacarose: propriedades e aplicação em
biorreatores”, defendida em 2006; e ao pedido de patente “Suporte cerâmico para
imobilização de invertase”.
COLABORADORES
C. A. A. GADELHA
b
, B. S. CAVADA
c
, J. L. MARTINS
d
, A.V. P. ALBERTINI
e
, A. L. S REIS
e
,
F.R.R.
TELES
e
, J. L. LIMA FILHO
e
, V. N. FREIRE
a
a
Departamento de Física, Universidade Federal do Ceará, Caixa Postal 6030, Campus do
Pici, 60455-900, Fortaleza, Ceará, Brasil.
b
Centro de Ciências Exatas e da Natureza, Departamento de Biologia Molecular,
Universidade Federal da Paraíba, Campus Castelo Branco, 58059-000, João Pessoa, Paraíba,
Brasil.
c
Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas (BioMol-Lab), Universidade Federal do
Ceará, Caixa Postal 6020, Campus do Pici, Fortaleza, Ceará, 60455-900, Brasil.
d
Instituto de Química e Geociências (IQG), Universidade Federal de Pelotas, Campus do
Capão do Leão, 96160-000, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil.
e
Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami, Universidade Federal de Pernambuco.
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6. Imobilização de invertase em cerâmicas de cinzas volantes de carvão mineral
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CARACTERIZAÇÃO DE CONCHAS DE MEXILHÃO PERNA
PERNA TRATADAS TERMICAMENTE
7.1 INTRODUÇÃO
7.1.1 MOLUSCOS
Moluscos, da palavra latina mollis – mole, é aplicado a um grande grupo de
animais cujos representantes possuem corpo mole, invertebrados, simetria bilateral. Formam o
segundo maior grupo de animais em número de espécies, sendo superados apenas pelos
artrópodes. Apresentam uma disparidade morfológica sem comparação dentre os demais filos
de animais, reunindo os familiares caracóis (reptantes), ostras e mariscos (sésseis) e lulas e
polvos (livre-nadantes), assim como formas pouco conhecidas, como os quítons, conchas
dente-de-elefante (Scaphopoda) e espécies vermiformes (Caudofoveata e Solenogastres).
Geralmente possuem conchas calcáreas duras que protegem seus corpos, embora algumas
espécies, como lesmas e polvos, não a possuam. Compreendem caramujos, lesmas, búzios,
ostras, mexilhões, lulas e outros menos conhecidos. São predominantemente marinhos,
embora existam espécies de água doce e terrestre, podendo ter vida livre, viver fixos ou
enterrados. Podem apresentar poucos centímetros de comprimento ou atingir grandes
dimensões, como a lula gigante de águas profundas de 15 metros de comprimento. Muitos são
usados na alimentação humana, sendo algumas espécies de ostras utilizadas na produção de
pérolas. Os moluscos planorbídeos (Biomphalaria glabrata) têm importância médica, pois
servem de hospedeiros intermediários para as larvas do verme causador da esquistossomose
(Marcondes, 1994; Purges et al., 2002).
O corpo é revestido por um epitélio simples, ciliado e com glândulas mucosas. O
sistema digestivo é completo. À exceção dos bivalves (ostras, mexilhões e outros), todos
possuem rádula, uma estrutura dotada de dentes quitinosos com função de ralar o alimento. Õ
sistema respiratório é aberto ou lacunar, havendo um coração dorsal. A respiração pode ser
cutânea, branquial ou pulmonar. A excreção é feita por nefrídios. O sistema nervoso é
centralizado. Há estruturas sensoriais tácteis, visuais, receptores químicos e de equilíbrio. A
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
__________________________________________________________________________________________
160
reprodução é exclusivamente sexuada, podendo haver espécies hermafroditas. A fecundação é
externa ou interna e o desenvolvimento é direto ou indireto (Marcondes, 1994; Purges et al.,
2002).
O filo Mollusca (moluscos) inclui cerca de 100 mil espécies viventes, sendo
conhecidas cerca de 35 mil espécies fósseis. Compreende seis classes principais (Marcondes,
1994; Purges et al., 2002):
Monoplacophora (Monoplacoforados): eram os moluscos mais abundantes durante o
período Cambriano, mas hoje existem apenas algumas espécies. Diferentemente de todos os
outros moluscos atuais, os monoplacoforados existentes possuem um grande número de
brânquias, músculos e estruturas excretoras que se repetem ao longo do corpo.
Polyplacophora (Quítons): São moluscos pouco conhecidos, marinhos, encontrados no
fundo do mar. Possuem múltiplas brânquias e conchas segmentadas (oito placas calcárias
sobrepostas como telhas), mas as outras partes do corpo não são segmentadas. São todos
marinhos (Fig.7.1)
Figura 7.1. Tonicella lineata, um Quíton.
Scaphopoda (Escafópodes): Possuem concha tubular e recurvada, semelhante a um grande
canino, medindo cerca de 6 cm e aberta em uma de suas extremidades. Possuem finos
tentáculos que rodeiam a sua boca. Vivem freqüentemente enterrados na areia das águas rasas,
mas também podem ser encontrados em profundidades de até 4500 metros (Fig.7.2).
Figura 7.2. Dentalium sp , um Escafópode.
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
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161
Gastropoda (Gastrópodes): Do latim gastro = barriga e podos = pé. São os caramujos,
lesmas, etc. Divisão do corpo nítida em cabeça, pé (órgão musculoso) e massa visceral
coberta por uma concha (na maioria das espécies). Pé em forma de palmilha. Alguns são
marinhos, outros de água doce e outros terrestres (Fig.7.3).
Figura 7.3. Caracol de jardim, um Gastrópode.
Cephalopoda (Cefalópodes): De cephalo = cabeça e podos = pé. São as lulas (que possuem
10 tentáculos) e polvos (que possuem 8 tentáculos). O corpo possui massa visceral coberta
pelo manto (tipo de saco pendente da cabeça), cabeça, e pés em forma de tentáculos que ficam
ligados diretamente à cabeça. Não há concha externa, mas as lulas podem possuir uma concha
interna e reduzida (as chamadas penas). As lulas podem usar seu sifão para se deslocar por
jato-propulsão (Fig.7.4).
Figura 7.4. Polvo (Octopus vulgaris), um Cefalópode.
Bivalvia (Bivalves): Os bivalves são um grupo extremamente bem sucedido e diversificado.
São animais exclusivamente aquáticos, mas podem ocorrer em ambientes de salinidade
diversa como água salgada, doce ou salobra. A maioria das espécies vive junto ao fundo.
Alguns bivalves são organismos sésseis que se fixam ao substrato através do bisso, uma
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
__________________________________________________________________________________________
162
segregação fibrosa, enquanto que outras espécies vivem enterradas nos fundos arenosos. As
espécies que vivem soltas podem deslocar-se através de propulsão conseguida por expulsão
de água sob pressão. Estes organismos caracterizam-se pela presença de uma concha
carbonatada formada por duas valvas. O grupo surgiu no Câmbrico e é atualmente muito
diversificado, com cerca de 15000 espécies. A separação das diferentes sub-classes faz-se
pelo tipo e estrutura das guelras nos organismos vivos, e pelas características das valvas nos
bivalves fósseis. Os mexilhões, mariscos e ostras são exemplos populares de bivalves que
servem como alimento ao Homem (Fig.7.5). As ostras são também a origem das pérolas.
Figura 7.5. Marisco com as conchas abertas, um Bivalve.
7.1.2 A CONCHA DOS BIVALVES
A concha dos bivalves é em primeira análise semelhante à dos braquiópodes, uma
vez que é constituída por duas valvas. A principal diferença reside no fato de, nos
braquiópodes, as duas valvas serem desiguais (inequivalves), mas simétricas em relação a um
plano médio imaginário. Pelo contrário, nos bivalves, as valvas são iguais, mas inequilaterais,
estando o plano de simetria paralelo à charneira. As duas valvas são unidas por ligamentos e
músculos aductores. O ligamento, composto pelo resílio e tensílio, controla a abertura das
valvas que se dá quando esta estrutura está em repouso. O bivalve fecha a concha através da
contração dos músculos adutores, que podem ser um ou dois, conforme a espécie. A
geometria e distribuição das cicatrizes dos músculos adutores no interior da valva é um
critério importante na classificação dos bivalves atuais e fósseis. A zona mais antiga da valva
é o umbo, uma saliência localizada na zona antero-dorsal de cada valva, em torno da qual se
dispõem linhas de crescimento radiais. As valvas unem-se pela charneira, através de um
conjunto de dentes cardinais e/ou laterais, que são expansões carbonatadas, e respectivas
fossetas, onde encaixam na valva oposta. O manto característico dos moluscos está nos
bivalves, totalmente confinado e fixo à concha. A linha paleal das valvas soltas mostra o
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
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163
limite de extensão do corpo mole do organismo. A face externa da valva pode ou não ser
ornamentada para além das linhas de crescimento. A concha pode também apresentar várias
cores (Figs.7.6 e 7.7).
Figura 7.6. Vista interna da concha de um bivalve.
Figura 7.7. Vista externa da concha de um bivalve.
A estrutura e mineralogia das conchas dos moluscos bivalves e gastrópodes têm
sido exaustivamente estudadas (Taylor et al., 1968; Multivei, 1977; 1978). Estas conchas são
materiais bem estruturados, formados por cristais de calcita e aragonita (polimorfos do
CaCO
3
) “colados” por uma matriz orgânica (Feng et al., 2000; Warren et al., 1993). A fase
mineral representa cerca de 99% da massa da concha (Mann et al., 1993; Marsh et al., 1980).
O lado externo da concha, o periostracum, é formado principalmente por proteínas
esclerotizadas. O lado interno é dividido em duas regiões: uma, em contato com periostracum,
composta de colunas prismáticas de calcita (região prismática) e outra, entre a região
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
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164
prismática e o organismo, chamada de nácar ou região perolada. O nácar é formado por placas
poligonais de aragonita organizados em camadas entre 400 e 500 nm de altura, separadas por
filmes finos de 20 a 30 nm de um adesivo orgânico, que também forma a camada mais
externa da superfície perolada (Nakara et al., 1983; Weiss et al., 2000) (Fig. 7.8). Esta cola
orgânica, que está presente em pequena quantidade (em torno de 1%), é composta por
proteínas, glicoproteínas e quitina (Katti et al., 2005; Zentz et al., 2001; Weiss et al., 2002).
Ela tem uma importante função no controle espacial e temporal da nucleação e crescimento da
aragonita (biomineralização). A espessura do nácar e da camada prismática (e consequente
concentração de aragonita e calcita) pode variar com a espécie (Watabe et al., 1976; Addadi
and Weiner, 1985; Mann et al., 1992; Liu et al., 1992; Berman et al., 1993; Albeck et al.,
1993).
Figura 7.8. Representação esquemática da estrutura típica da concha de um bivalve. Em (a), vista
tridimensional; e em (b), o corte transversal (vista de perfil). Os elementos do esquema não estão em
proporção.
Microscopias eletrônicas de transmissão (TEM) e varredura (SEM) e,
recentemente, a microscopia eletrônica de força atômica (AFM) têm sido usadas para fazer
observações diretas da superfície do nácar (Bining et al., 1986; Rugar et al., 1990; Schaffer et
al., 1997; Song et al., 2002). O AFM tem a vantagem de ser uma técnica não destrutiva,
importante na análise de materiais orgânicos (Song et al., 2003). Imagens de AFM em alta
Placas de
aragonita
Colunas de calcita
“Cola” orgânica
Em direção ao corpo do organismo
Em direção ao periostracum (lado externo)
(a)
(b)
Nácar
Região prismática
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
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165
resolução da superfície perolada do caracol marinho Haliotis laevigata revelaram padrões de
moléculas globulares fortemente compactadas (Blank et al., 2003). AFM equipado com
indentador ultrafino também tem sido usado no estudo das propriedades mecânicas de
nanocompostos (Oliver et al., 1992; Li et al., 2004). Medidas do modulo de elasticidade
(modulo de Yung) dos constituintes do nácar resultou em valores entre 20 MPa (camada
orgânica) e 100 GPa (camada inorgânica) (Katti et al., 2001).
7.1.3 APLICAÇÕES TECNOLÓGICAS DAS CONCHAS
A biomimética é uma nova ciência que estuda os modelos da natureza e depois os
imita ou inspira-se neles ou em seus processos para resolver os problemas humanos. Afinal de
contas, após 3,8 bilhões de anos de evolução, a antureza aprendeu: o que funciona, o que é
apropriado e o que dura. Diversos pesquisadores têm se inspirado na natureza para projetar
novos materiais. Na revolução provocada pela biomimética, eles estão desvendando os
segredos de materiais naturais e aplicando-os como auxiliar na produção de substâncias feitas
pelo homem que são mais fortes, resistentes e viáveis comercialmente do que os materiais
convencionais; além de serem facilmente assimilados pelo ambiente (biodegradáveis)
(Sarikaya et al., 1995). Por exemplo, a estrutura das conchas em geral é 30 vezes mais
resistente do que o carbonato de cálcio produzido em laboratório e 300 vezes mais forte do
que o óxido de cálcio utilizado no giz comum. Estudos prévios mostraram que os principais
mecanismos de fortalecimento da concha são governados por sua micro-arquitetura sem igual
(Jackson et al., 1988; Wang et al., 1995). Muitos moluscos bivalves produzem uma concha
tão resistente que até mesmo um caminhão pode passar por cima dela, sem quebrá-la.
Além de suas interessantes propriedades mecânicas, o nácar tem sido utilizado
como um material natural para a reposição de ossos e na regeneração de defeitos
mandibulares (Atlan et al., 1997; Delattre et al., 1997). O nácar é um material biocompatível
com propriedades osteogênicas e osteoinditivas que pode iniciar a formação óssea por
osteoplastos humanos in vitro (Silve et al., 1992; Lopez et al., 1992; Lopez et al., 1995). Ele
tem também sido implantado na coluna de ratos (Liao et al., 1997). Este é um fenômeno
completamente novo. Bobbio relatou que os índios maias de Honduras usaram conchas para
implante dental há 2000 anos atrás (Bobbio, 1972). Recentes estudos mostram que a adição de
conchas de ostras aquecidas na dieta de pacientes idosos (65-96 anos) parece proporcionar um
aumento na densidade da parte mineral do osso da espinha lombar (Fugita et al., 1996).
Diversos materiais têm sido usados em ortopedia e cirurgias maxilofaciais desde a
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
__________________________________________________________________________________________
166
década passada (Nizard et al., 1996; Sedel e Rey, 1997). Muitos destes são metálicos,
entretanto, tem crescido o uso de polímeros, cerâmicos e compostos baseados em carbono
(Sedel e Rey, 1997). Existem poucos materiais de origem biológica, utilizados para este fim.
Dentre eles, incluem-se os corais, uma cerâmica porosa natura e o nácar, a região madrepérola
da concha. A principal estrutura cristalina em ambas as estruturas é a aragonita (Guillemin et
al., 1981; Guillemin et al., 1989; Patar et al., 1990; Irigaray et al., 1996; Fricain et al., 1997).
Existe uma considerável necessidade do entendimento de como o nácar pode estar
ativamente envolvido na regeneração de tecidos duros tanto em ósseos como em outras
aplicações. Sendo assim, o primeiro passo é o estudo de suas propriedades físico-químicas.
7.1.4 COMPORTAMENTO TÉRMICO DA CONCHA
O estudo do comportamento térmico da concha é importante para a compreensão
das interações entre as fases orgânicas e inorgânicas e ainda, devido ao seu uso em implantes,
para sua esterilização através de processos térmicos. Análises de espectroscopia no
infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) e difração de raios-X (XRD) realizadas
por Balmain et al. (1999) em pós de nácar tratados termicamente de conchas da ostra
Pinctada máxima, mostraram que a matriz orgânica permanece termicamente estável até
300°C; sofre alterações detectáveis entre 300 e 500°C (degradação de grupos amido e
presença de bandas devido a grupos amino); e é decomposta em aproximadamente 600°C
(com o desaparecimento de ligações C-H). Os difratogramas da matriz mineral mostraram
transformações da aragonite para a calcita entre 300 e 400°C, e da calcita para CaO entre 500
e 600°C (pequena ou nenhuma quantidade de calcita foi detectada em 600°C).
7.1.5 MEXILHÕES
Mexilhão é a denominação de várias espécies de bivalves com elevados valores
nutricionais, pertencentes à família Mytilidae, utilizados na alimentação humana. As espécies
desta família de maior importância comercial pertencem aos seguintes gêneros:
• Mytilus: presente em todos os oceanos;
• Perna: tropical, presente nos oceanos Atlântico (costa da América do Sul e África) e
Índico (África, Ásia e Oceania), além do Mar Mediterrâneo (costa africana);
• Choromytilus: sub-tropical, presente nos oceanos Pacífico (costa do Chile) e Índico
(África do Sul e Oceania);
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
__________________________________________________________________________________________
167
• Aulacomya: distribuição semelhante ao Choromytilus;
• Mytella: tropical de águas salobras, presente nas Américas do Sul e Central;
• Crenomytilus: de clima temperado, com distribuição limitada ao Mar Negro e Mar
Báltico;
• Semimytilus: tropical, restrito à costa do Pacífico, desde a Venezuela até o Peru;
• Perumytilus: possui a mesma distribuição de Semimytilus.
Os mexilhões de maior interesse econômico no Brasil são o Mytilus edulis
platensis (Rio Grande do Sul), Mytella guyanensis e Mytella falcata (Amapá até Santa
Catarina) e Perna perna (entre Rio de Janeiro e Santa Catarina). (Klappenbach, 1965; Carmo
et al., 1984; 1988; Henrriques, 2004).
O estado de Santa Catarina, no sul do Brasil, é o maior produtor nacional de
mexilhão Perna perna. Seu uso é restrito ao consumo humano, sendo suas conchas (Fig.7.9),
formadora de uma grande quantidade de resíduos. Estes resíduos geram um grande problema
ambiental para quais soluções são necessárias. Entretanto, a busca por aplicações tecnológicas
de qualquer material envolve o estudo e sua estrutura e composição.
Figura 7.9. Conchas de mexilhão Perna perna.
7.1.6 OBJETIVOS
No contexto do estudo das propriedades físico-químicas das conchas, aliado ao
fato de que o nácar está sendo usado na substituição e regeneração óssea (o que necessita, em
geral, tratamento térmico para a sua esterilização), foram utilizadas as técnicas de difração de
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
__________________________________________________________________________________________
168
raios-X (XRD), espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR),
microscopia ótica e de força atômica (AFM) para caracterizar as transformações térmicas nas
conchas do mexilhão Perna perna. Objetiva-se assim, caracterizar este resíduo para o uso
como material biocompatível.
7.2 MATERIAIS E MÉTODOS
7.2.1 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS
Espécimes adultos de mexilhões Perna perna foram coletados no estado de Santa
Catarina. As cascas de mexilhão foram lavadas em água corrente, limpas para retirada de
cracas e outros organismos macroscópicos fixados, e secas à temperatura de
aproximadamente 35
o
C sob ventilação. De algumas conchas, foram cortadas amostras
quadradas de 4 e 2 mm da região central da concha, por meio de serra circular. Parte das
conchas e das amostras quadradas foram tratadas termicamente em forno tipo mufla, em
atmosfera de ar nas temperaturas 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700 e
800
º
C (±5
º
C) durante 2 horas (grupo tratado). A taxa de aquecimento foi de 50
º
C/min e a de
resfriamento de aproximadamente 1
º
C/min. O restante não sofreu qualquer tipo de tratamento
(grupo não tratado). Algumas conchas dos grupos tratados e não tratados também foram
transformadas em pó, por meio de maceração com pistilo em cadinho de porcelana. As
amostras foram preparadas no Centro de Ciências Tecnológicas da Terra e do Mar da
Universidade do Vale do Itajaí, Santa Catarina e no LCTM-UFC.
7.2.2 ANÁLISE MINERALÓGICA POR XRD
Os padrões de difração de raios-X (XRD), para a análise mineralógica do pó das
conchas in natura e tratadas nas temperaturas de 350, 450, 600, 700 e 800
º
C foram obtidos na
temperatura ambiente (300K) em difratômetro de pó Philips, modelo X’Pert PRO, no
Laboratório de Raios-X do Departamento de Física da UFC. Usou-se a geometria Bragg-
Bretando com radiação Cu-kα. O tubo foi operado com 40KV e 40mA. Os dados de difração
foram coletados em um intervalo de varredura de 10º ≤ 2θ ≤ 80º com passos de 0,02º e tempo
de integração de 1s por ponto. Foi utilizado o programa X´Pert HigthScore para identificação
de fases cristalinas e o método de Rietveld, através do programa Rietica – versão 1.7.7 (C.J.
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
__________________________________________________________________________________________
169
Howard and B.A. Hunter, 1997 - Lucas Heights Research Laboratories), para o refinamento
do difratograma e conseqüente análise quantitativa.
7.2.3 ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO COM TRANSFORMADA DE
FOURIER (FT-IR)
Foi realizada a espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier
(FT-IR) de amostras de conchas in natura e tratadas nas temperaturas de 100, 200, 300, 400,
500, 600, 700 e 800
º
C. Para cada tratamento, inclusive in natura, foi realizado o procedimento
a seguir. Um gral de pistilo de ágata foram umedecidos e limpos com auxílio de papel
absorvente umedecido em acetona. No gral foram triturados 1 mg de amostras de mexilhão
previamente dessecadas e adicionado 100 mg de brometo de potássio (KBr) seco e finamente
pulverizado. O triturado (pó) foi espalhado uniformemente no molde da pastilha e
comprimida em prensa uniaxial a uma pressão de 800 MPa, por 1,5 a 2 minutos. A pastilha
foi colocada numa célula, coberta com o imã. A pastilha foi então introduzida no equipamento
previamente calibrado e zerado com KBr e procedidas as leituras na resolução de 4 cm
-1
, de
400 a 4000 cm
-1
com 64 varreduras. As medidas foram realizadas em Espectrofotômetro da
IV BOMEN Hartmann & Braun - MB Series com método referência: PHARMACOPEIA 24
ed. (1999), no Centro de Ciências Tecnológicas da Terra e do Mar da Universidade do Vale
do Itajaí, Santa Catarina.
7.2.4 MEDIDAS DE MICRODUREZA
Foram feitas medidas de microdureza Vikers sobre a superfície do nácar em
amostras de conchas in natura e tratada nas temperaturas de 100, 150, 200, 250, 300, 350,
400, 450, 500, 550
º
C. As medidas foram realizadas sobre o centro de 10 amostras dos cortes
quadrados de 4 mm de 10 conchas (uma amostra/concha) para cada tratamento (in natura e
nas diferentes temperaturas), totalizando 10 medidas por tratamento. Foi utilizado um
microdurômetro Shimadzu Micro Hardness Test ajustado para uma carga de 490,3 mN
durante 15 s, no Laboratório de Caracterização de Materiais (LACAM) da UFC.
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
__________________________________________________________________________________________
170
7.2.5 ANÁLISE POR MICROSCOPIA ÓTICA DE CAMPO CLARO
Imagens de microscopia ótica de campo claro com luz refletida foram realizadas
sobre a superfície do nácar de amostras dos cortes quadrados de 4 mm de conchas in natura e
tratadas nas temperaturas de 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500 e 600
º
C, em diferentes
aumentos. Também foi realizada microscopia ótica de campo claro com luz refletida na região
lateral (seção transversal) de amostras dos cortes quadrados de 2 mm de conchas in natura.
Foi utilizado um microscópio ótico metalográfico Nikon Elipse LV 100D equipado com
câmera digital, no LCTM-UFC e uma lupa Nikon FMZ800 equipada com câmera digital, no
BioMol-Lab da UFC.
7.2.6 ANÁLISE POR MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA (AFM)
Para a obtenção de imagens topográficas da superfície do nácar in natura e
tratados nas temperaturas de 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500 e 600
º
C, foram utilizadas
amostras dos cortes quadrados de 2 mm de conchas. Estas amostras foram fixadas com o
nácar voltado para cima, sobre discos de aço cobertos com fita adesiva dupla face (Fig.
7.10a). Foram realizadas varreduras de 5 x 5 e 1 x 1 μm, em regiões centrais das amostras.
Para a obtenção de imagens topográficas de seções transversais do nácar e da
camada prismárica, foram utilizadas amostras dos cortes quadrados de 2 mm das conchas in
natura. Estas amostras foram fixadas lateralmente, por meio de adesivo epóxi, em suportes
metálicos presos a discos de aço cobertos com fita adesiva dupla face de modo que a
superfície do nácar permanecesse perpendicular ao disco de aço. O sentido de varredura de
AFM foi da extremidade interna (nácar) à externa (camada prismática) da concha, em direção
ao periostracum. (Fig. 7.10b). Foram realizadas varreduras de 45 x 45 e 20 x 20 μm.
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
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171
Figura 7.10. Experimentos com AFM. Análise da superfície do nácar de conchas in natura e tratadas
termicamente (a) e análise do corte transversal do nácar e da camada prismática (b). Os elementos
mostrados na figura não estão em proporção.
Superfície do nácar
(a)
Periostracum
Disco de aço
(porta amostras AFM)
dupla face
Haste
Sonda
nácar
Periostracum
Haste
Sonda
Provável região de
nácar
concha
Sentido da varredura
(b)
Disco de aço
(porta amostras AFM)
dupla face
Provável região
prismática
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
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172
As amostras tiveram suas superfícies tratadas com jatos de N
2
(99.999% de
pureza) para a remoção de partículas livres e poeira. As amostras foram analisadas em ar, com
um Nanoscope IIIa (Digital Instruments, Santa Barbara, CA, U.S.A.) no modo de contato e
com velocidade de varredura em torno de 0.700Hz. Foram utilizadas hastes de constante
elástica média igual a 0.15 N/m, com sondas de Si
3
N
4
de raio médio de 15 nm (Digital
Instruments). Os controles de varredura foram apropriadamente ajustados (força de contato
adequada e elevados ganhos) para evitar artefatos provocados pela sonda durante a varredura.
Para as visualizações em duas e três dimensões e captura dos dados de altura (imagem), foi
utilizado o software Nanoscope versão 5.12 r3 da Digital Instruments.
7.2.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística dos dados foi baseada em estatística descritiva (tendência
central e dispersão), teste de Shapiro-Wilk (para determinar se uma amostra aleatória segue
ou não uma distribuição normal) e teste de hipótese (para verificar a existência ou não de
diferenças significativas entre grupos amostrais) (Lindman, 1974; Lehman, 1975;
Mendenhall, 1990). O nível de significância usado foi de 5%. Todo o tratamento estatístico
foi realizado usando os softwares Excel 2002 e Origin 7.0.
7.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
7.3.1 ANÁLISE MINERALÓGICA POR XRD
A Figuras 7.11-7.16 apresentam uma seqüência de difratogramas de raios-X para
os pós da concha in natura e tratada nas temperaturas de 350, 450, 600, 700 e 800
º
C,
mostrando o efeito do aquecimento em sua composição cristalográfica. O padrão de difração
de raios-X do pó da concha de Perna perna in natura (Fig. 7.11) apresentou as linhas de
difração características da aragonita (JSPDS 41-1475) e da calcita (JSPDS 86-2334), dois
polimorfos do CaCO
3
, na proporção de aproximadamente 90% de aragonita e 10% de calcita.
Os resíduos R
WP
, R
EXP
e o grau de qualidade do refinamento (χ
2
) foram respectivamente
iguais a 6,55, 5,00 e 1,71. Este resultado indicou que a estrutura em forma de placas, formada
por aragonita (nácar), predomina significativamente sobre a prismática, formada por calcita.
Já o padrão de difração do pó tratado a 350
º
C (Fig.7.12), indicou a presença de aragonita e
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
__________________________________________________________________________________________
173
calcita nas proporções de 81 e 19% (R
WP =
6,43
;
R
EXP
= 4,73 e χ
2
= 1,85), representada por um
pequeno aumento de intensidade nos picos da calcita e conseqüente redução dos de aragonita.
Este é um indicativo das transformações de aragonita para calcita com o tratamento térmico.
Figura 7.11. Padrão de difração para o pó da concha de mexilhão Perna perna in natura, indicando a
presença de aragonita (A) e calcita (C).
Figura 7.12. Padrão de difração para o pó da concha de mexilhão Perna perna tratada a temperatura de
350
º
C, indicando a presença de aragonita (A) e calcita (C).
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
__________________________________________________________________________________________
174
Entretanto, em 450
º
C, o padrão de difração (Fig.7.13) indicou somente a presença
de calcita, originada da transformação completa aragonita-calcita nesta temperatura (R
WP =
8,06
;
R
EXP
= 6,40 e χ
2
= 1,60). Padrão de difração semelhante foi encontrado para as conchas
tratadas a 600
º
C (Fig.7.14), indicando a mesma composição cristalográfica (R
WP
= 7,05
;
R
EXP
= 5,30 e χ
2
= 1,78).
Figura 7.13. Padrão de difração para o pó da concha de mexilhão Perna perna tratada a temperatura de
450
º
C, indicando somente a presença de calcita (C).
Figura 7.14. Padrão de difração para o pó da concha de mexilhão Perna perna tratada a temperatura de
600
º
C, indicando somente a presença de calcita (C).
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
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175
O padrão de difração de raios-X do pó da concha tratada a 700
º
C (Fig. 7.15)
apresentou as linhas de difração características da calcita e do hidróxido de cálcio - Ca(OH)
2
(JSPDS 81-2040), na proporção de aproximadamente 53% de calcita e 47% de Ca(OH)
2
(R
WP
=
4,86
;
R
EXP
= 3,80 e χ
2
= 1,65)
Figura 7.15. Padrão de difração para o pó da concha de mexilhão Perna perna tratada a temperatura de
700
º
C, indicando a presença de calcita (C) e hidróxido de cálcio (HC).
O hidróxido de cálcio se formou durante o resfriamento a partir da hidratação do
óxido de cálcio (CaO) originado da decomposição térmica da calcita, conforme a seqüência
de reações:
CaCO
3
→ CaO + CO
2
↑(decomposição térmica da calcita)
CaO + H
2
O → Ca(OH)
2
(hidratação do CaO)
Em 800
º
C, o padrão de difração (Fig.7.16) indicou a presença Ca(OH)
2
(98%)
originada da transformação praticamente completa da calcita em óxido de cálcio em
temperaturas acima de 700
º
C. Ainda é detectada alguma calcita residual (2%) (R
WP =
5,56
;
R
EXP
= 7,00 e χ
2
= 1,61).
Δ
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
__________________________________________________________________________________________
176
Figura 7.16. Padrão de difração para o pó da concha de mexilhão Perna perna tratada a temperatura de
800
º
C, indicando somente a presença de hidróxido de cálcio (HC).
7.3.2 ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO COM TRANSFORMADA DE
FOURIER (FT-IR)
Os espectros de FT-IR para conchas in natura e tratadas termicamente em 100,
200, 300, 400, 500, 600, 700 e 800
º
C são mostrados na Figura 7.17. Verificou-se a presença
de inúmeras bandas entre 4000 e 400 cm
-1
. Nas conchas in natura foi possível observar a
presença de modos vibracionais internos dos íons carbonatos (CO
3
-2
), υ
4
: 713, 700; υ
2
: 864;
υ
1
: 1090 e υ
3
: 1490 cm
-1
. A banda registrada 1792 cm
-1
pode também ser atribuída aos grupos
C=O dos íons carbonato. A divisão de υ
4
é característica da estrutura aragonítica. A região
entre 3000 e 3500 cm
-1
corresponde aos modos de estiramento dos grupos OH e NH dos
compostos da matriz orgânica, enquanto que a região entre 2800 e 3000 cm
-1
aos modos de
estiramento C-H. A banda 1656 cm
-1
pode ser associada aos grupos amida I (ligação C-O)
e/ou amida II (ligação C-N) da matriz orgânica protéica. Outras áreas de absorção podem ser
atribuídas a matriz orgânica. Estas bandas estão no intervalo entre 2520 e 2650 cm
-1
, estando
associadas aos grupos OH de ácidos carboxílicos.
Com relação à composição mineral, os espectros FT-IR das conchas tratadas
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
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177
termicamente entre 100 e 300
º
C não apresentaram alterações significativas quando
comparados com a concha in natura. Entretando, modificações foram observadas entre 400 e
800
º
C. A redução de υ
3
(1490 cm
-1
) e 1792 cm
-1
, a quase ausência de υ
1
(1090 cm
-1
), o
deslocamento da banda υ
2
de 864 para 880 cm
-1
e a degenerescência das bandas de υ
4
(para
713 cm
-1
) em 400
º
C indicaram a predominância da fase calcita, com relação a aragonita
devido a conversão aragonita-calcita. O desaparecimento completo de υ
1
(1090 cm
-
1) em 500
e 600
º
C apontou para uma transformação total para calcita. Isto está em acordo com os
resultados da difração de raios-X, que mostraram a existência de uma única fase, a calcita, em
450 e 600
º
C. O desaparecimento das bandas de 1792 e 713 cm
-1
e decréscimo de υ
2
(880 cm
-1
)
em 700 e 800
º
C decorre da formação de hidróxido de cálcio - Ca(OH)
2
a partir da hidratação
do CaO, conforme também detectado nos difratogramas nestas temperaturas.
Figura 7.17. Espectro FT-IR do pó da concha de mexilhão Perna perna in natura e tratado em
diferentes temperaturas.
O melhor indicador da presença da matriz orgânica está nas bandas entre 2800 e
3000 cm
-1
, característica das ligações C-H. Estas bandas foram pouco modificadas com o
aumento da temperatura, estando presentes em 300
º
C. Sofrem uma redução drástica em 400 e
500
º
C (quebra das ligações C-H) e desaparecem completamente em 600
º
C, representando a
total decomposição da matriz orgânica. O mesmo acontece com os modos associados aos
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178
grupos OH dos ácidos carboxílicos. O surgimento das bandas características do CO
2
(2360 e
2335 cm
-1
), em 400-800
º
C, pode ser atribuído à absorção de CO
2
do ambiente pelo pó das
conchas devido à decomposição da matriz orgânica com liberação de dióxido de carbono
durante a queima. A redução gradual da banda de 1656 cm
-1
até seu desaparecimento em
300
º
C representa a degradação de grupos amida. A banda larga entre 3000 e 3500 cm
-1
se
altera da concha in natura até 800
º
C, sofrendo uma redução quando comparada com o
material in natura; mantendo-se pouco alteradas entre 200 e 300
º
C; diminuindo fortemente a
partir de 400
º
C e desaparecendo em 800
º
C. Este comportamento representa os efeitos da
temperatura sobre os modos de estiramento OH e NH dos compostos da matriz orgânica.
7.3.3 MEDIDAS DE MICRODUREZA
A Tabela 7.1 mostra a estatística descritiva para as medidas de microdureza
realizadas nas amostras quadradas de 4 mm de conchas in natura e tratadas a 100, 150, 200,
250, 300, 350, 400, 450, 500, 550
º
C. O teste de normalidade de Shapiro-Wilk resultou em
uma distribuição normal para todos os grupos (conchas in natura e tratadas termicamente), o
que levou a utilização do teste de significância ANOVA com comparações múltiplas –
procedimento Tukey (Tabela 7.2).
Tabela 7.1. Resultados das medidas de microdureza (em HV) e sua estatística descritiva. S = média
amostral, σ = desvio padrão e e = erro de estimação (t = 2,262, para α = 0,05).
In natura 100
º
C 150
º
C 200
º
C 250
º
C 300
º
C 350
º
C 400
º
C 450
º
C 500
º
C 550
º
C
229 331
351 342
393
378 256
208
144 120
102
222 342
335 360
395
371 242
197
137 132
94
240 332
345 352
389
382 227
215
137 112
107
231 334
338 367
382
373 241
211
153 125
102
236 335
341 343
402
372 235
227
138 113
88
247 340
339 357
385
389 235
216
144 103
103
239 327
352 352
397
398 236
211
139 117
94
249 329
333 362
377
376 235
205
143 121
84
232 332
333 348
385
369 247
201
146 112
98
251 313
335 348
390
376 249
206
141 122
96
S
237,6
331,5 340,2 353,1 389,5 378,4 240,3 209,7 142,2 117,7 96,8
σ
9,43
7,96 7,02 8,26 7,51 9,03 8,49 8,47 4,96 8,13 7,11
e
6,74
5,67 5,02 5,90 5,37 6,46 6,07 6,06 3,55 5,81 5,08
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
__________________________________________________________________________________________
179
Tabela 7.2. Tabela simplificada dos resultados do teste ANOVA com comparações múltiplas
(procedimento Tukey) para as medidas de microdureza nas conchas de mexilhão in natura e
tratadas termicamente (α = 0,05).
In natura Diferenças significativas
100
º
C Sim
150
º
C Sim
200
º
C Sim
250
º
C Sim
300
º
C Sim
350
º
C Não
400
º
C Sim
450
º
C Sim
500
º
C Sim
550
º
C Sim
100
º
C Diferenças significativas
150
º
C Não
200
º
C Sim
250
º
C Sim
300
º
C Sim
350
º
C Sim
400
º
C Sim
450
º
C Sim
500
º
C Sim
550
º
C Sim
150
º
C Diferenças significativas
200
º
C Sim
250
º
C Sim
300
º
C Sim
350
º
C Sim
400
º
C Sim
450
º
C Sim
500
º
C Sim
550
º
C Sim
200
º
C Diferenças significativas
250
º
C Sim
300
º
C Sim
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
__________________________________________________________________________________________
180
350
º
C Sim
400
º
C Sim
450
º
C Sim
500
º
C Sim
550
º
C Sim
250
º
C Diferenças significativas
300
º
C Não
350
º
C Sim
400
º
C Sim
450
º
C Sim
500
º
C Sim
550
º
C Sim
300
º
C Diferenças significativas
350
º
C Sim
400
º
C Sim
450
º
C Sim
500
º
C Sim
550
º
C Sim
350
º
C Diferenças significativas
400
º
C Sim
450
º
C Sim
500
º
C Sim
550
º
C Sim
400
º
C Diferenças significativas
450
º
C Sim
500
º
C Sim
550
º
C Sim
450
º
C Diferenças significativas
500
º
C Sim
550
º
C Sim
500
º
C Diferenças significativas
550
º
C Sim
Não foram encontradas diferenças significativas entre as amostras de conchas in
natura e tratadas termicamente na temperatura de 350
º
C o que implica que, nesta temperatura,
as conchas apresentam estatisticamente a mesma microdureza média que as in natura. Não
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
__________________________________________________________________________________________
181
foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre 100 e 150
º
C e entre 250 e
300
º
C. O gráfico da Figura 7.18, resume os resultados da análise de microdureza. Foi possível
observar dois comportamentos mecânicos diferentes: aumento (até 300
º
C) e redução (entre
350 e 550
º
C) da microdureza da concha. O primeiro, provavelmente associado aos efeitos da
temperatura sobre os modos de estiramento OH e NH e sobre os grupos amida; o segundo,
principalmente as quebras das ligações C-H e degradação dos grupos OH de ácidos
carboxílicos.
Figura 7.18. Gráfico de microdureza média em função da temperatura de tratamento. Os retângulos
pontilhados representam a ausência de diferenças significativas entre os valores médios de
microdureza.
7.3.4 ANÁLISE POR MICROSCOPIA ÓTICA DE CAMPO CLARO
A Figura 7.19 mostra a imagem da seção transversal (no plano da espessura), feita
com uma lupa, de uma concha de mexilhão in natura. Não foi possível distinguir visualmente,
nesta ampliação (20x) ou em 1000x, o nácar e a camada prismática. O periostracum é visível,
como indicado na figura.
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
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182
Figura 7.19. Microscopia ótica de campo claro da superfície da seção transversal da concha do
mexilhão in natura. Nela estão indicados o periostracum e os lados externo e interno da concha
(Aumento de 20x). Barra = 1 mm.
As Figuras 7.20-7.24 representam imagens de microscopia ótica de campo claro
da superfície do nácar de conchas in natura e tratadas termicamente até 600
º
C. Observou-se
uma alteração na coloração, com escurecimento gradual da superfície, somente em 350-600
º
C
certamente associado à alterações da matéria orgânica. Entre conchas in natura e tratadas até
400
º
C, nenhuma alteração topográfica (além do escurecimento, em 350 e 400
º
C) foi detectada
até o aumento máximo de 200x (Fig.7.20a, b).
Figura 7.20. Microscopia ótica de campo claro da superfície do nácar, in natura (a) e tratada a 400
º
C.
Aumento de 200x.
Entretanto, em 450
º
C, diversas estruturas cristalinas em forma de agulhas
puderam ser observadas imersas na superfície do nácar como resultado do aquecimento
(Fig.7.21). Em 500, 550 e 600
º
C, estas agulhas começaram a se projetar para fora da
superfície, com o aumento da temperatura (Figs. 7.22, 7.23 e 7.24).
(a)
(
b
)
Periostracum
Lado externo
Lado interno
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
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183
Figura 7.21. Microscopia ótica de campo claro da superfície do nácar tratada a 450
º
C. Estruturas
cristalinas em forma de agulhas (algumas assinaladas por setas) podem ser observadas imersas no
nácar. A dimensão de uma destas agulhas está indicada. Aumento de 200x.
Figura 7.22. Microscopia ótica de campo claro da superfície do nácar tratada a 500
º
C. Observa-se o
início da projeção de agulhas para fora da superfície do nácar. Aumento de 200x.
74
µ
m
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184
Figura 7.23. Microscopia ótica de campo claro da superfície do nácar tratada a 550
º
C. É possível
observar a projeção de agulhas para fora da superfície, na lateral da concha (setas). Aumento de 100x.
Figura 7.24. Microscopia ótica de campo claro da superfície do nácar tratada a 600
º
C, mostrando
detalhes das agulhas. Aumento de 1000x.
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
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185
Acima de 600
º
C não foi possível a obtenção de imagens de microscopia ótica da
superfície, devido a fragmentação das conchas durante seu processo de manipulação.
Pelos resultados da difração de raios-X, a única fase cristalina presente em 450-
600
º
C é a calcita, o que leva a conclusão de que as agulhas são provavelmente cristais de
calcita formados na transição de fase aragonita/calcita. A microscopia ótica evidenciou
alterações na matrix orgânica por meio do escurecimento da superfície do nácar e na matrix
inorgânica através da formação das agulhas de calcita.
7.3.5 ANÁLISE POR MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA (AFM)
A Figura 7.25 mostra imagens de altura feitas sobre a superfície do nácar da
concha in natura. Podem ser observadas as placas de aragonita (Fig.25a) cobertas por um
filme orgânico de estruturas globulares com dimensões em torno de 120 nm (Fig.25b).
Análises de localização histoquímica da distribuição dos componentes da matriz orgânica
realizadas em diversos tipos de conchas mostraram a existência de 4 zonas com diferentes
composições sobre as placas de aragonita (Nudelman et al., 2006). Entretanto, as imagens de
AFM obtidas não revelaram diferenças topográficas entre regiões sobre a camada orgânica
das placas de aragonita das conchas de Perna perna, indicando similaridades topográficas
entre estas zonas ou diferente organização dos componentes da matriz orgânica para esta
espécie. Análises histoquímicas deverão se realizadas para confirmar esta hipótese.
Figure 7.25. Imagens de AFM sobre a matriz orgânica da superfície do nácar in natura, mostrando as
placas de aragonita (a), e detalhes da camada de proteínas/polissacarídeos (b) com estruturas
globulares de 120 nm (setas). Varreduras de 5 x 5 µm (a) e 1 x 1 µm (b).
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
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186
Nas conchas tratadas termicamente até 300°C, a superfície do nácar não exibiu
mudanças topográficas significativas. A Figura 7.26 mostra imagens de AFM feitas sobre a
superfície do nácar tratada termicamente entre 350 e 600°C. Foram detectadas transformações
progressivas na camada orgânica com o aumento da temperatura. Intumescimento progressivo
da camada, desaparecimento dos contornos das placas de aragonita e formação de grãos foram
os principais efeitos observados (Figs.7.26a-c). A Figura 7.26d mostra estruturas inorgânicas
sobre a superfície, após a destruição da matriz orgânica em torno de 600°C, conforme
resultados das análises de FT-IR. Os grãos observados acima de 350°C continuam presentes
nesta temperatura, caracterizando sua natureza inorgânica.
Figure 7.26. Seqüência de imagens de AFM mostrando a superfície orgânica do nácar aquecida em
diferentes temperaturas: (a) 350, (b) 400, (c) 450 e (d) 600°C. Intumescimento da camada orgânica,
desaparecimento dos contornos das placas de aragonita e formação de grãos (setas) são observados
sobre a superfície. A estrutura cristalina de calcita em forma de agulhas (asterisco) também é
observada em 600°C (d). Varredura de 5 x 5 μm.
*
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
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187
Em 600°C, a maior parte da superfície inorgânica consiste de placas cobertas por
grãos com dimensões de 200 nm (Fig.7.27a), visualizados também em 350°C; e de estruturas
cristalinas em forma de agulhas (Fig.7.27b), as agulhas de calcita, já visualizadas na
microscopia ótica.
Figure 7.27. Imagens de AFM mostrando detalhes do nácar da superfície aquecida a 600°C. Em (a),
observamos grãos (setas) com 200 nm sobre placas (asteriscos); e em (b), agulhas. Varredura de 1 x 1
μm.
Com os resultados da análise de raios-X, FT-IR, microdureza e da microscopia
ótica pode-se interpretar as modificações topográficas na camada orgânica da superfície do
nácar, registradas por AFM. Nas temperaturas entre 100-300°C, foram detectados efeitos da
temperatura sobre os modos de estiramento OH/NH e sobre os grupos amida sem, contudo,
ocorrerem alterações significativas nas ligações C-H e dos grupos OH dos ácidos
carboxílicos. Na análise por AFM, isto foi representado pela inexistência de modificações
topográficas na superfície. Nas temperaturas de 350, 400 e 450°C, as alterações
principalmente das ligações C-H e dos grupos OH dos ácidos carboxílicos foram detectadas
por meio de modificações na camada orgânica do nácar. Ou seja, as alterações topográficas da
camada orgânica do nácar estiveram associadas fundamentalmente ao comportamento das
ligações C-H e OH dos ácidos carboxílicos, com a temperatura. Em 600°C, além da
destruição completa da matéria orgânica, existe a presença de uma única fase cristalina: a
calcita. Os grãos, por também estarem presentes em 350°C, devem representam os primeiros
estágios da conversão de aragonita em calcita Assim, a calcita está presente nesta temperatura
em diferentes arranjos: placas, grãos e agulhas.
*
*
*
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188
As Figuras 7.28 e 7.29 mostram imagens de AFM feitas sobre a superfície lateral
de conchas in natura. Pode ser observada, em meio a impurezas, a seção transversal do nácar
com sua estrutura na forma de placas de aragonita.
Figure 7.28. Imagem de AFM da seção transversal do nácar de conchas in natura, mostrando a
estrutura de placas de aragonita (destacada por meio de retângulos brancos desenhados sobre a
imagem). Varredura de 45 x 45 µm.
Figure 7.29. Ampliação da imagem da Figura 7.28, mostrando maiores detalhes da estrutura de placas
de aragonita (destacada por meio de retângulos brancos desenhados sobre a imagem). Varredura de 20
x 20 µm.
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189
Observou-se que a topografia da superfície da região transversal das conchas in
natura, revelada pelas imagens de AFM, permaneceu semelhante aquela das Figuras 7.28 e
7.29 (nácar), em praticamente toda a extensão da área analisada, no sentido de varredura lado
interno para lado externo da concha. Este resultado corrobora com o obtido por difração de
raios-X, no qual a aragonita representa 90% da composição cristalográfica da concha. Ou
seja, o nácar é a camada predominante. Em regiões muito próximas ao lado externo, antes do
periostracum, não foi possível a obtenção de imagens devido a extrapolação do limite de
altura permitido para varredura em z pelo piezelétrico do equipamento. Certamente, por
exclusão, estas regiões correspondem à camada prismática que por ocasião do corte das
conchas, talvez tenha projetado suas colunas de calcita acima do valor tolerado pelo
piezelétrico, gerando uma topografia que impossibilitou a obtenção de imagens por AFM.
7.4 CONCLUSÕES
Neste capítulo, foi investigado por medidas de XRD, FT-IR, microdureza,
microscopia ótica e AFM o comportamento das conchas de mexilhão Perna perna, quando
submetidas a um tratamento térmico. Observou-se uma estabilidade na composição
cristalográfica da concha e na topografia do nácar até a temperatura de 300°C, associada a
ausências de alterações significativas nos modos de estiramento do C-H, nas bandas dos
grupos OH de ácidos carboxílicos e de transições aragonita/calcita. Entretanto, alterações
sobre os modos de estiramento OH/NH e sobre os grupos amida da matriz orgânica, até esta
temperatura, foram detectadas através do aumento da microdureza da concha. Apesar disto, a
degradação da matéria orgânica ainda é reduzida. Acima de 300°C, as alterações na
composição cristalográfica, topográfica e na redução da microdureza das conchas, estiveram
associadas principalmente a modificações nos modos de estiramento do C-H e nas bandas do
grupos OH de ácidos carboxílicos da matriz orgânica (degradação) e a transições
aragonita/calcita/óxido de cálcio da fase mineral. Somente em torno de 600°C, a matriz
orgânica sofre uma completa decomposição. Também pode ser observada a transformação da
aragonita em calcita, iniciando-se em torno de 350°C e estando completa em torno 450°C.
Estes resultados concordam com os reportados nas análises por FT-IR e XRD nos pós de
conchas de Pinctada máxima (Balmain et al., 1999).
O estudo do comportamento térmico e mecânico da superfície perolada é
importante, pois estes materiais têm aplicações em implantes e na regeneração óssea, onde
processos de esterilização são necessários. A matriz óssea começa a ser destruída por volta de
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7. Caracterização de conchas de mexilhão Perna perna tratadas termicamente
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190
200°C e é decomposta em 500°C (Legros et al., 1987). A matriz orgânica da concha do
mexilhão Perna perna só sofre alterações significativas (degradação acentuada) em sua
composição e topografia acima de 300°C sendo completamente destruída somente em
temperaturas em torno de 600°C, facilitando os processos de esterilização e
conseqüentemente seu uso em implantes. Estudos de regeneração óssea ainda deverão ser
realizados com conchas tratadas termicamente para associar aos resultados obtidos neste
trabalho e verificar os efeitos das alterações nos modos de estiramento OH/NH e grupos
amida da matriz orgânica nas propriedades osteogênicas e osteoinditivas do nácar. Também
deverão ser feitas extrações do nácar para posterior caracterização.
Além da caracterização do comportamento térmico das conchas, também se
obteve uma informação muito importante: a de que o nácar é a camada mais espessa nas
conchas in natura desta espécie de mexilhão. Este fato não é evidente já que a espessura do
nácar varia conforme o molusco. Como, é nesta camada que reside o maior interesse nas
aplicações que envolvem implantes e regeneração óssea, a sua predominância transforma o
mexilhão Perna perna em uma excelente fonte de nácar.
Este trabalho resultou no artigo a ser submetido em 2007 (Anexo C.2): R. P.
Santos, M. L. Pessatti, T. L. P. Pessatti, J. L. Martins, C. A. A. Gadelha, J. B. cajazeiras, B. S.
Cavada, T. M. Oliveira, G. A. Bezerra, J. A. K. Freire, V. N. Freire. X-ray diffraction, Fourier
Transform Infrared, Microhardness, and Atomico Force Microscocopy analysis of the Perna
perna mussel shells thermally treated. Também está associado ao pedido da patente
“Composto Luminescente Nanoestruturado a partir da Concha de Mexilhão Perna Perna”.
COLABORADORES
V. N. FREIRE
a
, M. L. PESSATTI
b
, T. L. P. PESSATTI
b
, J. L. MARTINS
c
, C. A. A. GADELHA
d
, J. B.
CAJAZEIRAS
e
, B. S. CAVADA
e
, T. M. OLIVEIRA
e
, G. A. BEZERRA
e
.
a
Departamento de Física, Universidade Federal do Ceará, Caixa Postal 6030, Campus do Pici,
60455-900, Fortaleza, Ceará, Brasil.
b
Universidade do Vale do Itajaí, Centro de Ciências Tecnológicas da Terra e do Mar, Curso
de Ciências Biológicas Ênfase Em Biotecnologia. Rua Uruguai 458 Centro 88302202 - Itajai,
SC, Brasil.
c
Instituto de Química e Geociências (IQG), Universidade Federal de Pelotas, Campus do
Capão do Leão, 96160-000, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil.
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191
d
Universidade Federal da Paraíba, Centro de Ciências Exatas e da Natureza - Campus I,
Departamento de Biologia Molecular. Cidade Universitária, Campus Castelo Branco,
58059000 - João Pessoa, PB, Brasil.
e
Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas(BIOMOL), Universidade Federal do
Ceará, Caixa Postal 6020, Campus do Pici, 60455-900, Fortaleza, Ceará, Brasil.
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AFM EM CÉLULAS, TECIDOS E BIOMATERIAIS
8.1 INTRODUÇÃO
O microscópio de força atômica (AFM), como já explicado no capítulo 2, é um
dos membros mais versáteis de uma família de microscópios conhecidos como microscópio
de varredura por sonda (SPM). Estes instrumentos geram imagens por meio da interação de
uma sonda com a amostra. Seu potencial para gerar imagens de sistemas biológicos de forma
não destrutiva e em tempo real, sob condições “naturais” (como no microscópio ótico) é
claramente de interesse para os pesquisadores de áreas biológicas. Desde os primeiros estudos
no início dos anos 80, publicações descrevendo aplicações biológicas do SPM têm crescido
rapidamente.
Os SPM’s não são estritamente microscópios. Eles obtêm imagens da superfície
varrendo-a com uma sonda muito fina. Os microscópios convencionais (microscópios óticos)
formam uma imagem pela coleta da radiação transmitida através, ou refletida da amostra. A
resolução é limitada pela difração e depende do comprimento de onda da radiação. Assim, os
microscópios óticos têm resolução limitada por aproximadamente 200 nm. Imagens de altas
resoluções de materiais biológicos podem ser obtidas usando elétrons de alta energia em
microscópios eletrônicos. Apesar do desenvolvimento de novas técnicas de microscopia
eletrônica que levaram ao desenvolvimento de muitos métodos elegantes para a preservação
da estrutura original dos materiais biológicos, altas resoluções envolvem o uso de alto vácuo
no exame de amostras. Pelo fato dos SPM’s formarem imagens por um princípio diferente dos
microscópios eletrônicos, possíveis alterações estruturais na amostra devido às condições
experimentais necessárias as técnicas eletrônicas são evitadas.
Os primeiros estudos biológicos com SPM foram feitos com o microscópio de
tunelamento (STM). Como a corrente de tunelamento decai rapidamente com a distância à
superfície, materiais isolantes muito finos como interfases e biopolímeros necessitariam serem
metalizados para que a corrente de tunelamento fosse detectável. O AFM e seus refinamentos
como o crio-AFM (microscopia de força atômica em baixa temperatura) elimina estas
restrições, sendo os métodos de SPM preferenciais na biologia. Originalmente acreditava-se
8
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8. AFM em células, tecidos e biomateriais
___________________________________________________________________________________________
198
que os SPM’s fossem técnicas não evasivas. Na prática, a amostra sofre danos que, no
entanto, podem ser minimizados com ajustes apropriados das variáveis envolvidas na
aplicação da técnica.
Outros tipos de SPM estão também crescendo em importância na biologia. Um
candidato, agora disponível comercialmente, é o microscópio ótico de varredura de campo
próximo (em inglês, Scanning Near-Field Optical Microscope – SNOM, como é mais
conhecido). É uma combinação de microscopia de varredura por sonda com microscopia ótica
convencional e que surgiu como uma modificação de um microscópio de tunelamento (apesar
de que a teoria do seu funcionamento já era conhecida há muito tempo) supera o limite de
difração. O SNOM melhora a resolução da ótica convencional em pelo menos uma ordem de
grandeza. Ele pode alcançar uma resolução espacial de até 25 nm, o que é bem menor que a
resolução de um microscópio de força atômica ou de um de tunelamento, mas acrescenta
informação que só é acessível com contraste ótico. É por isso que esta técnica se utiliza como
complementar ao AFM. O princípio é simples. A amostra a ser resolvida é varrida com uma
fibra ótica, que tem uma abertura muito estreita (de algumas centenas de ângstroms de
diâmetro na sua extremidade) e que está recoberta por uma película metálica opaca. Pela fibra
passa luz visível, que é refletida pela amostra, ou passa através dela para um detector. A
intensidade do sinal ótico detectado em cada ponto da varredura constitui um conjunto de
dados que irão reproduzir uma imagem da superfície da amostra com resolução entre 25 e 50
nm, com a única condição de que a distância entre a fonte de luz e a amostra seja da ordem de
50Å. Há também um crescimento no desenvolvimento de combinações de AFM’s ou
SNOM’s com microscópios óticos convencionais e confocais, ou seu uso em conjunção com
técnicas de superfícies como a ressonância plasmônica de superfície (Morri set al., 2001).
8.2 PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS
O AFM é projetado para produzir imagens de alta resolução sobre superfícies
duras e planas. Poucos sistemas biológicos aproximam-se deste ideal. Biominerais como
dentes, ossos e conchas são duros e freqüentemente parcialmente cristalinos. Entretanto, o
maior problema está no preparo de amostras com superfícies suficientemente planas. Isto
pode ser freqüentemente obtido através de cortes e polimentos.
Células são normalmente largas em relação ao tamanho da sonda, além de serem
altamente deformáveis. Sendo assim, existe uma variedade de métodos de preparação e
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8. AFM em células, tecidos e biomateriais
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199
análise de deformação e indentação de células. Tecidos apresentam problemas únicos. Em
geral, podem ser examinados usando procedimentos modificados desenvolvidos para a
microscopia ótica e eletrônica sendo o principal problema a produção de superfícies
suficientemente planas para serem analisadas com o AFM.
Diversos métodos têm sido desenvolvidos para imobilizar células. Cada método
deveria proporcionar a realização de imagens de células vivas sobre condições fisiológicas.
Claro que nem sempre isto é possível. Normalmente a célula será imobilizada em algum tipo
de substrato (normalmente mica ou lamínula) para que possa ser varrida pela sonda do AFM.
Esta varredura poderá ser feita em solução (normalmente um meio fisiológico) ou em ar. A
primeira opção é sempre preferível, já que mantém as condições originais da célula, sem
provocar qualquer tipo de alteração em sua estrutura. Para tal é utilizado um dispositivo
especial acoplado ao AFM que permite a realização de varreduras em meio líquido.
Entretanto, o estudo de estruturas biológicas também podem ser feito em ar.
Diversas dificuldades surgem na realização de imagens de células imobilizadas
em substratos. Se as células são rígidas e mantêm sua forma quando imobilizadas, a superfície
poderá ter uma rugosidade que impossibilite a obtenção de imagens, devido às células
excederem os limites do deslocamento vertical do dispositivo de varredura piezelétrico
(“scanner”). A solução para este problema é fazer com que as células “penetrem” a superfície,
diminuído assim sua altura. Duas técnicas têm sido utilizadas: o aprisionamento em meio
poroso, como mostrado na Figura 8.1 (Holstein et al, 1994; Kasas e Ikai, 1996) e a completa
anexação das células em um meio como agar, como na Figura 8.2 (Gad e Ikai, 1996).
Figura 8.1. Aprisionamento em meio poroso.
Figura 8.2. Anexação de células em agar.
Haste
Sonda
Célula
Filtro
Substrato
Haste
Sonda
Célula
Agar
Substrato
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8. AFM em células, tecidos e biomateriais
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O crescimento de monocamadas confluentes providencia também uma redução da
rugosidade da superfície da amostra permitindo assim a realização de imagens sobre as
células (Fig.8.3).
Figura 8.3. Crescimento de monocamadas confluentes de células.
Para células individuais, é possível imobilizá-las por secagem em ar sobre o
substrato através do uso de camadas superficiais não específicas como poly-L-lysine (Butt et
al., 1990) ou específicas como anticorpos ligantes (Prater et al, 1990).
Muitas células são facilmente imobilizadas pela simples secagem sobre um
substrato como, por exemplo, vidro. Durante a secagem, a célula crena (perde água),
diminuindo consideravelmente seu volume e conseqüentemente, sua altura. Assim, podem
atingir os limites de deslocamento vertical do “scanner”, possibilitando a realização das
medidas de AFM.
Células são materiais “macios”, sendo facilmente deformáveis durante o contato
da sonda com a amostra, principalmente quando as medidas são feitas em solução (meio
fisiológico), onde as características elásticas da membrana permanecem intactas. Sendo assim,
é necessário reduzir ao máximo a força de contato entre a superfície da célula e a sonda para a
formação de imagens sem artefato. Em solução, detalhes da estrutura interna da célula não são
acessíveis (Fig.8.4).
Meio líquido
Figura 8.4. Célula em meio líquido.
Haste
Sonda
Camadas de
células
Substrato
Haste
Sonda
Organelas
Substrato
Superfície celular
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8. AFM em células, tecidos e biomateriais
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201
Entretanto, quando a análise de AFM é feita em ar, a perda de água e conseqüente
redução do volume celular aliada a alta elasticidade da membrana (que também vai
diminuindo com a desidratação) resulta em um efeito interessante: a superfície celular passa a
ser “moldada” pelas organelas celulares, revelando assim detalhes da estrutura interna
(Fig.8.5).
Figura 8.5. Célula seca em ar.
É claro que este efeito depende muito da elasticidade da superfície. Em baterias, por exemplo,
onde há a presença de uma parede celular resistente, este efeito não é muito significativo.
Tecidos intactos são muito grandes, macios e rugosos para serrem vistos
diretamente com o AFM. Além disto, o AFM mostrará apenas a estrutura externa da amostra.
Portanto, técnicas histológicas e citológicas deverão ser utilizadas para converter materiais
grandes, moles e rugosos em pequenos, rígidos e planos para serem analisados pela sonda do
AFM. A técnica mais utilizada é a secção ultrafina de tecidos em meios de inclusão como
parafina, metacrilato dentre outros. Além desta técnica já ser utilizada em microscopia ótica e
eletrônica de transmissão, proporciona condições favoráveis à obtenção de imagens de
microscopia de força atômica tanto da superfície externa como interna de tecidos (Fig.8.6).
Figura 8.6. Estudo de tecidos em AFM. Tecido (a); Tecido fixado (b); Corte do tecido fixado (c) e
Corte analisado com AFM (d).
Haste
Sonda
Organelas
Substrato
Superfície celular
(a)
(b)
(c)
(d)
Tecido
Bloco de fixação
Corte
Haste
Sonda
Corte e
substrato
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8. AFM em células, tecidos e biomateriais
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202
8.3 AFM EM CÉLULAS
Bactérias isoladas, depositadas sobre substratos, também podem ser analisadas em
ar ou solução aquosa por AFM. As estruturas da parede celular são rígidas, possibilitando
uma análise de sua rugosidade (Gunning et al, 1996). Imagens dos flagelos de bactérias
podem ser obtidas, sendo observada sua subestrutura (Jaschke et al, 1994). A ação de
antibióticos sobre bactérias tem sido investigada por AFM. Estes estudos incluem a
observação da ação da penicilina sobre Bacillus subtilis (Kasas et al 1994) e o uso do AFM
para examinar alterações na estrutura da superfície de E. coli devido à exposição ao
antibiótico cefodixime (Braga e Ricci, 1998). A maior vantagem do AFM neste tipo de estudo
é a possibilidade de obter imagens em condições naturais e com uma preparação de amostras
simples, quando comparado com os métodos de microscopia eletrônica.
Poucos estudos têm sido realizados sobre fungos, sendo estes concentrados no
Saccharomyces cerviceae (Henderson, 1994; Kasas e Ikai, 1996; Gad e Ikai, 1996). Células
de fungos são grandes e macias, tornando difícil o estudo dinâmico de células vivas em
ambientes naturais: as células são facilmente deformáveis e as amostras normalmente
apresentam elevada rugosidade, dificultando a análise de AFM devido as limitações do
movimento vertical da sonda. Fungos secos em ar, imobilizados sobre substratos de vidro,
têm sido preparados para o estudo da morfologia de sua superfície. Algumas características
principais podem ser reconhecidas e utilizadas para demonstrar diferenças na morfologia da
superfície para diferentes espécies (Henderson, 1994). Vários métodos têm sido
desenvolvidos para o estudo in vivo de fungos em condições naturais, por AFM. O principal
deles envolve a imobilização dos fungos em filtros Millipore com dimensões de poros
similares aos das células (Kasas e Ikai, 1996). Isto reduz a rugosidade da amostra na ambiente
natural: o meio líquido de cultura. Um refinamento deste método é a imobilização em agar
gel, permitindo também a obtenção de imagens em meio de cultura líquido (Gad e Akai,
1996).
Microscópios de forma atômica são originalmente projetados para estudos de
superfícies com alta resolução. Assim, os primeiros AFM’s (que possuíam apenas faixas de
varredura sub-micrométrica) não permitiam estudos de células intactas. Somente com o
desenvolvimento de novas faixas de varredura, sistemas celulares começaram a serem
estudados e as células sanguíneas foram as primeiras amostras investigadas.
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8. AFM em células, tecidos e biomateriais
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203
Células vermelhas são de fácil obtenção e identificação sendo ideais para as
primeiras aplicações de AFM ao estudo de sistemas celulares. Os estudos iniciais estavam
centralizados com a realização de imagens de células intactas e na determinação do nível de
resolução no qual a morfologia da superfície poderia ser estuda. A forma das células
vermelhas é uma característica particular de doenças e há um interesse crescente na
identificação ultra-estrutural destas características associadas com doenças ou infecções de
eritrócitos por parasitas. As primeiras imagens de células vermelhas foram feitas por meio de
fixação em ar (Gould et al., 1990) ou solução tampão (Butt et al, 1990). A fixação evita a
deformação da célula pela sonda, evidenciando sua forma côncava. Imagens de alta resolução
com AFM têm revelado detalhes da estrutura da membrana que antes permaneciam ocultos
por outras técnicas, como a organização nanoestrutural do citoesqueleto e das proteínas na
superfície da membrana (Almqvist et al., 1994; Zhang et al., 1995; Han et al., 1995; Zhang et
al., 1996). Marcadores estão sendo usados, juntamente com a microscopia de força atômica,
para localizar e identificar sítios específicos sobre a superfície das células vermelhas. Neagu
et al. (1994) usaram partículas superparamagnéticas acopladas a anticorpos para localizar os
receptores da transferrina sobre a superfície de eritrócitos. O AFM tem sido usado para
comparar as estruturas de células vermelhas normais e com alguma patologia (Zachee et al.,
1992; 1994; 1996) e também as diferenças no citoesqueleto de membranas não infectadas e
infectadas com o Plasmodium falciparum (Garcia et al., 1997). Alterações como formação de
espículas, diminuição da cavidade central, alterações nas dimensionais, aumento da
rugosidade, alterações na forma e até na elasticidade da membrana são indicativos de
patologias e da presença de parasitas (Garcia et al., 1997).
Leucócitos (células brancas) também podem ser analisados por AFM,
apresentando uma forma mais variada e uma superfície mais irregular que os eritrócitos. O
uso combinado de microscópios óticos e de força atômica (Putman et al., 1992) e/ou métodos
de marcação imunológiva (Putman et al., 1993) são de evidente importância na identificação
dos tipos de células e no uso subseqüente do AFM para estudos de alta resolução em
condições naturais. Imagens comparativas de células antes e depois da marcação fornecem um
meio de identificação das características específicas da superfície. Marcadores específicos
podem ser utilizados para isolar e ligar tipos específicos de células. Anticorpos fixados em
lamínulas de vidro têm sido usados para ligar preferencialmente linfócitos B para a realização
de imagens em AFM (Prater et al., 1990).
Megacariócitos são células grandes que permanecem na medula óssea e partem-se
continuamente em fragmentos de célula denominadas plaquetas. A plaqueta é somente uma
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8. AFM em células, tecidos e biomateriais
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minúscula porção de uma célula, mas está carregada com as enzimas e substâncias químicas
necessárias para a sua função: vedar vazamentos em vasos sanguíneos e iniciar a coagulação
sanguínea. A lesão a um vaso sanguíneo expõe fibras de colágenas. Quando uma plaqueta
encontra fibras colágenas ela é ativada. Ela incha, assume um formato irregular, torna-se
viscosa e libera substâncias químicas que ativam outras plaquetas e iniciam a coagulação
sanguínea. As plaquetas viscosas formam um tampão no local danificado e a coagulação
subseqüente produz uma rede mais forte no vaso. O AFM tem permitido a obtenção de
imagens em tempo real da ativação de plaquetas aderidas a superfícies de vidro em condições
fisiológicas (Fritz et al., 1993; 1994). Detalhes do citoesqueleto e mudanças durante a
ativação podem ser visualizadas no AFM.
Existem dois tipos principais de células no tecido nervoso: neurônios e células
gliais. As primeiras, que apresentam variações em forma e tamanho, geram e conduzem sinais
eletroquímicos; as segundas, não produzem nem conduzem sinais elétricos, mas realizam o
suporte físico dos neurônios e desenvolvem muitas funções de manutenção. Há um grande
interesse no crescimento e desenvolvimento destas células e suas interações com superfícies e
neurônios. A microscopia de força atômica é uma técnica para a investigação da estrutura de
superfícies, entretanto, estudos recentes sobre células gliais demonstraram a possibilidade de
obtenção de imagens de seus componentes intracelulares (Henderson et al., 1994; Papura et
al., 1993; Vinckier et al., 1995). Em estudos de culturas misturadas de células gliais e
neurônios, foi possível observar as interações entre estas duas células (Papura et al., 1993).
Também o AFM tem sido utilizado para investigar a localização de canais de cálcio sobre a
fase de um terminal nervoso pré-sináptico (Haydon, et al., 1994) e ainda, através de alterações
na elasticidade da membrana de neurônios, seu comportamento durante processos de geração
de sinais eletroquímicos (Laney et al., 1997).
A capacidade do AFM em gerar imagens de células vivas, com resolução
molecular, aliado a possibilidade de mapeamento de propriedades mecânicas de células com
elevada resolução espacial e temporal fornece um meio para o estudo dos mecanismos de
batimento em células contráteis. Por meio de imagens de AFM e das curvas de força (força
versus deformação da superfície) de células cardíacas é possível monitorar a atividade
localizada de sua contração com uma resolução espacial entre 1-3 nm e temporal entre 60-100
µs e as mudanças de sua elasticidade durante esta contração (Hofmann et al., 1997). Usando
um modelo geométrico simples (Hertz, 1982) para a indentação da sonda na célula, a
interpretação das curvas de força versus distância têm fornecido um mapa do módulo de
Young da superfície de células cardíacas, durante o batimento.
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8. AFM em células, tecidos e biomateriais
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As células de plantas foram um dos primeiros sistemas vivos a serem analisados
por AFM (Butt et al, 1990). Estudos do corte de folhas têm revelado a ultraestrutra da parede
de células vegetais (Butt et al., 1990; Canet et al., 1996). Há poucos estudos de AFM com
grãos de pólen (Rowley et al., 1995; van der Wel et al, 1996; Demanet and Sankar, 1996),
sendo a maioria deles feitos com microscopia eletrônica de varredura ou de transmissão.
Entretanto, o AFM tem-se demonstrado uma alternativa interessante, já que possui uma
metodologia de preparação de amostras mais simples e a capacidade de revelar detalhes da
subestrutura da superfície da exima não atingida pelo SEM.
8.4 AFM EM MONOCAMADAS E BIOFILMES BACTERIANOS
Um grande número de superfícies formadas por monocamadas bacterianas tem
sido estudado por meio da microscopia de força atômica. Estas estruturas são geralmente
rígidas, bem ordenadas e podem ser isoladas na forma de grades folhas. Exemplos incluem a
camada HPI de Deinococcus radiodurans (Schabert et al., 1992), a membrana roxa de
Halobacterium (Muller et al, 1995), camadas S de Bacillus coagulans e Bacillus sphaericus
(Ohnesorge et al., 1992). Outras estruturas mais complexas incluem espículas, aros e
projeções cilíndricas da estrutura superficial de Methanospirillum hungatei (Southam et al,
1996) e as vesículas da cyanobacterium Anabaena flo-aquae (McMaster et al., 1996).
Em adição a realização de imagens de bactérias depositadas em suportes sólidos, é
também possível usar o AFM para investigar a formação e estrutura de biofilmes formados
sobre interfaces ou superfícies sólidas. Há diversos métodos microscópicos que podem ser
aplicados ao estudo de biofilmes (Surman et al., 1996; Beech et al., 1996) e o AFM
complementa o uso das microscopias ótica e eletrônica. A maior vantagem no uso do AFM é
a capacidade de cobrir a faixa de ampliação tanto do microscópio ótico como do eletrônico e a
produção de imagens tridimensionais de superfícies. A maior limitação é a curvatura ou
rugosidade dos substratos e dos biofilmes formados sobre eles. Normalmente o AFM tem sido
usado no estudo de biofilmes formados sobre vidro (Surman et al., 1996), superfícies
metálicas (Bremer et al, 1992; Steele et al, 1994; Beech, 1996; Beech et al., 1996), óxidos de
ferro (Maurice et al., 1996) e sobre interfaces óleo-água (Gunning et al., 1996). Estudos de
biofilmes bacterianos hidratados formados sobre superfícies de cobre têm mostrado que as
bactérias são observadas ligadas a cavidades metálicas adjacentes por meio de polímeros
extracelulares estendendo-se até estas cavidades (Bremer er al., 1992). Este fato é importante
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8. AFM em células, tecidos e biomateriais
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na explicação do papel dos polissacarídeos extracelulares na formação de “buracos” por
biocorrosão em superfícies metálicas.
8.5 AFM EM TECIDOS
Com uma preparação adequada das amostras, tecidos também podem ser
estudados por AFM. Imagens no modo intermitente de seções ultrafinas de tecidos coletados
de ratos revelaram detalhes de organelas citoplasmáticas (mitocôndrias e demais grânulos),
componentes nucleares (nucléolo e cromatina), o retículo endoplasmático rugoso e
ribossomos associados, microvilosidades e cílios, etc...(Yamashino e Shigeno, 1995).
Similarmente, imagens no modo de contato de secções ultrafinas de fibras da madeira
revelaram detalhes de sua composição celular (Titcombe et al., 1997). Cortes de tecidos do
intestino e do pâncreas de ratos têm mostrado detalhes de sua superfície inacessíveis por
outras técnicas (Ushiki et al., 1994). As microvilosidades foram claramente identificadas no
intestino e imagens de alta resolução evidenciaram a presença de estruturas globulares,
possivelmente glicoproteínas, sobre a superfície das microvilosidades.
Um dos benefícios adicionais do uso do AFM é possibilidade de realização de
amostras em seu estado natural. Um exemplo do uso de cortes frescos e úmidos é o estudo da
córnea bovina, onde foi possível visualizar a rede de colágeno e detalhes da periodicidade de
suas fibras (Fullwood et al., 1994).
8.6 AFM EM BIOMATERIAIS
Biomateriais são provavelmente os materiais biológicos menos estudados por
AFM. Estes materiais são geralmente complexos, mas seus componentes minerais formam um
meio rígido e provavelmente bem ordenado, possibilitando assim a obtenção de imagens de
AFM.
A estrutura final do osso é baseada na interação entre colágeno e a apatita
depositada. Estudos combinados de TEM e AFM sobre tendões mineralisados e
desmineralisados têm sido usados para refinar os modelos de composição para tendões das
patas de peru. Estudos de TEM e AFM complementam ou ao outro, um revelando a estrutura
interna e outro, aspectos da superfície (Lee et al., 1994). Alterações topográficas na estrutura
de ossos devido à osteoporose também podem ser analisas por AFM, que com sua
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8. AFM em células, tecidos e biomateriais
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207
sensibilidade é capaz de detectar flutuações nas propriedades elásticas a distâncias na ordem
de 50 nm (Tao et al., 1992).
Existem inúmeros trabalhos demonstrando o uso do AFM para estudar a dentina
(Kinney et al., 1993; 1996; Cassinelli e Morra, 1994; Marshall Jnr. et al., 1993; 1995) e o
esmalte dentário (Sollbohmer et al., 1995). A dentina é protegida da abrasão e corrosão
durante a alimentação, de ataques químicos oriundos dos ácidos dos alimentos ou de
metabólicos bacterianos, por uma camada externa de esmalte composta de 86% de cristais de
hidroxiapatita. Foram verificadas alterações na rugosidade de superfícies dentárias, medida
por AFM, em experimentos envolvendo a desmineralização da dentina por ação de ácidos
(Marshall et al., 1995). Outros experimentos envolvem a ação de substâncias clareadoras e de
enxágüe bucal na topografia da superfície dentária.
Conchas, cascos e carapaças são um dos poucos exemplos de materiais biológicos
sobre o qual é possível observar detalhes com resolução atômica (Friedbacher et al., 1991;
Manne et al., 1994). Resoluções em escala atômica têm sido obtidas sobre a carapaça do
ouriço do mar Stronglyocentrotus purpuratus, após redução a pó e compactação em discos de
KBr antes da análise de AFM. (Friedbacher et al., 1991). Diatomáceas são algas unicelulares
freqüentemente utilizadas no teste da resolução de objetivas de microscópios óticos. Suas
carapaças são basicamente de silício, coberto por filmes de polissacarídeos e lipídeos. A
investigação de várias espécies de diatomáceas, por meio de AFM, mostrou poros e
ondulações em seus nodos centrais (Linder et al., 1992). O nácar, a camada perolada das
conchas de moluscos, consiste de camadas de placas de aragonita cristalina, aderidas por uma
“cola” biológica. O AFM tem sido usado para examinar as diferentes distribuições das placas
de aragonita em um bivalve (Atina sp.) e um gastrópode (Haliotis rufescens) (Manne et al.,
1994).
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8. AFM em células, tecidos e biomateriais
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ESTUDO TOPOGRÁFICO DA FORMAÇÃO DE
BIOFILMES DE ENTEROCOCCUS FAECALIS POR
AFM
9.1 INTRODUÇÃO
9.1.1 CÉLULAS PROCARIÓTICAS E EUCARIÓTICAS
Todos as células vivas podem ser classificadas como procarióticas, da palavra
grega pro (antes) e karyon (núcleo), ou eucarióticas, de eu (verdadeiro) e karyon (núcleo). As
células procarióticas não possuem núcleo e outras estruturas contidas em membrana, ao passo
que as eucarióticas possuem tais estruturas. Todos os grandes organismos procariontes são
unicelulares, como exemplificado pelas bactérias. Os seres eucariontes incluem todos os
vegetais, animais, fungos e protistas (organismos como a Amoeba, o Paramecium e o parasita
da malária). Tanto as células procaróticas quanto eucarióticas possuem membranas que
definem as fronteiras da célula viva, e ambas contêm informações genéticas armazenadas no
DNA. Entretando, as procarióticas se diferenciam por não possuírem núcleo definido e
organelas envolvidas por membrana (exceto alguns corpos simples cobertos por membrana
em certos tipos de procariontes) (Black, 2002).
9.1.2 BACTÉRIAS
Os seres procariontes podem ser classificados em dois grandes grupos (ou
domínios): Archaea (arqueobactérias) e Bacteria (eubactéria). Todos os membros dos grupos
Archaea e Bacteria são tradicionalmente denominados bactérias. As diferenças são mais
moleculares do que estruturais. A maioria das bactérias deste planeta pertence ao domínio
Bacteria (Borzani et al., 2001).
Os procariontes estão entre os menores organismos. A maioria mede entre 0,2 e
5,0 micrometros. As bactérias geralmente apresentam as seguintes formas: esféricas (coco),
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9. Estudo topográfico da formação de biofilmes de Enterococcus faecalis por AFM
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214
em bastão (bacilo), ondulados (espirilos), em forma de vírgula (vibriões) e de espiral
(espiroquetas) (Fig.9.1). Algumas bactérias, chamadas cocobacilos, são pequenos bastonetes
com tamanho intermediário entre cocos e os bacilos. Outras bactérias não se encaixam em
nenhuma destas categorias, mas possuem um formato fino, comprido ou lobado e irregular.
Também já foram observadas bactérias quadradas (Purges et al., 2002).
Figura 9.1. Algumas formas típicas de bactérias.
Além de serem encontradas em suas formas características, muitas bactérias
formam grupos ou arranjos de células. Tais grupos se formam quando as células se dividem
sem separar. Nos cocos, estes arranjos incluem grupamentos como pares (indicado pelo
prefixo diplo), quatro células dispostas em um cubo (tédrade), oito células dispostas em cubo
(sarcina), grupos em forma de cacho de uva (estafilo) e em cadeias longas (estrepto)
(Fig.9.2). Os bacilos produzem células conectas pelas extremidades (como trens), ou lado a
lado; enquanto que as baterias espirais geralmente não são agrupadas (Blach, 2002).
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9. Estudo topográfico da formação de biofilmes de Enterococcus faecalis por AFM
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215
Figura 9.2. Arranjos mais comuns das bactérias: diplococo (a), estreptococos (b), tétrade (c), sarcinas
(d) e estafilococos (e).
Estruturalmente, as células bacterianas consistem de uma membrana celular,
geralmente envolta pela parede celular e às vezes por uma camada exterior adicional; de
citoplasma interno com ribossomos, região nuclear e alguns casos grânulos e/ou visículas; e
uma variedade de estruturas externas, tais como cápsulas, flagelos e pêlos (Fig.9.3).
Figura. 9.3. Estrutura típica de uma célula bacteriana.
A parede celular é uma estrutura presente na maioria das bactérias conhecidas,
exceto em micoplasmas e algumas Archaea, que não a possuem. Corresponde a uma das
estruturas mais importantes nas células bacterianas, estando localizada na porção mais
externa, acima da membrana citoplasmática. É composta principalmente pelo polímero
peptidoglicano. A dureza da parede celular é responsável por manter a forma do
microrganismo. Como o ambiente intracelular é bastante concentrado em relação ao meio
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
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9. Estudo topográfico da formação de biofilmes de Enterococcus faecalis por AFM
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externo, a parede atua como uma barreira física rígida mantendo a forma celular e impedindo
o rompimento da célula em decorrência do turgor. Além disso, a parede celular atua como
uma barreira de proteção contra determinados agentes físicos e químicos externos, tais como
o choque osmótico. A parede pode ainda desempenhar importante papel em microrganismos
patogênicos, em decorrência da presença de componentes que favorecem sua patogenicidade,
tais como antígenos ou moléculas envolvidas no reconhecimento celular (Blach, 2002; Purges
et al., 2002).
Christian Gram desenvolveu em 1884 um método de coloração de bactérias que
permitia sua separação em dois grupos distintos, as Gram-positivas (coloração roxa) e as
Gram-negativas (coloração vermelha). Este método continua sendo um dos mais úteis para
classificar bactérias. Neste método, as bactérias são submetidas primeiramente à ação de um
corante violeta, seguido de fixação com iodo e depois um agente de descoloração, como o
metanol. Logo em seguida, são novamente coradas com safranina. As bactérias Gram-
positivas fixam o primeiro corante, devido à maior espessura da parede celular, e ficam
coradas de azul ou violeta; enquanto que as bactérias Gram-negativas, após a descoloração
pelo metanol, são coradas pela safranina e ficam vermelhas. As bactérias que retêm a
coloração violeta são designadas por Gram-positivas. As bactérias que perdem a coloração
violeta depois de descoloradas e que adquirem um corante de contraste (ficando com um tom
cor-de-rosa) são Gram-negativas. A partir do advento da microscopia eletrônica e do
aperfeiçoamento das técnicas de análise bioquímica dos diferentes componentes celulares,
verificou-se que esta diferença era devido às diferenças de estrutura e composição das paredes
celulares (Borzani et al., 2001; Black, 2002).
As bactérias Gram-positivas apresentam uma parede celular espessa (de 20 a 80
nm), de aspecto homogêneo e superfície lisa, composta de peptidoglicano (formando até 20
camadas) e ácido teicóico. Cerca de 90% da parede celular é composta pelo peptidoglicano
(Fig.9.4). O restante da parede é composto essencialmente por ácido teicóico. Já as células
Gram-negativas exibem uma parede mais delgada (de 9 a 20 nm) de aspecto bastante
complexo e superfície mais rugosa, composta de peptidoglicano (uma ou duas camadas),
separada pelo espaço periplasmático (espaço entre a membrana celular e a parede celular) e
envolta por uma membrana externa composta de lipopolissacarídeo, ou endotoxina (Fig.9.5).
Apenas 10% da parede corresponde ao peptidoglicano (Purges et al., 2002).
A membrana celular ou plasmática é uma membrana viva que estabelece a
fronteira entre a célula e o meio. Possui uma estrutura em mosaico fluido com fosfolipídios
formando uma dupla camada e proteínas espalhadas em forma de mosaico. A principal função
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9. Estudo topográfico da formação de biofilmes de Enterococcus faecalis por AFM
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da membrana celular é regular o movimento de materiais para dentro e para fora da célula. As
membranas das células bacterianas também exercem funções geralmente realizadas por
organelas de células eucarióticas.
Figura 9.4. Parede celular de uma bactéria Gram-positiva.
Figura 9.5. Parede celular de uma bactéria Gram-negativa.
São exemplos de bactérias Gram-positivas várias espécies de: estreptococos,
estafilococos, enterococos. São exemplos de bactérias Gram-negativas: vibrão colérico,
colibacilo, salmonelas (Purges et al., 2002; Borzani et al., 2001).
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9.1.3 ENTEROCOCOS
Os Enterococos (gênero Enterococcus) são cocos, antes classificados como
estreptococos do Grupo D, que ocorrem como cocos individuais, aos pares e em cadeias
curtas. São anaeróbios facultativos, que podem crescer em condições extremas e numa grande
variedade de meios, incluindo solo, alimentos, água e em muitos animais. O seu principal
habitat natural parece ser o tubo digestivo dos animais, incluindo o do homem, onde
representam uma porção significativa da flora normal. Podem também estar presente, em
menor número, nas secreções orofaríngeas e vaginais. Por viver mais tempo na água do mar
do que os coliformes, o enterococos é considerado pela Agência de Proteção ao Meio
Ambiente dos Estados Unidos como um indicador mais adequado de doenças transmitidas
pelo contato com a água (www.portalambiental.com.br; Black, 2002).
As infecções por enterococos ocorrem em doentes internados, freqüentemente
após cirurgia ou instrumentação (por exemplo, algaliação). Os enterococos podem causar
superinfecções em doentes internados, sob terapêutica antibiótica. A superinfecção pode
ocorrer quando os antibióticos alteram o equilíbrio bacteriano no organismo, permitindo o
crescimento dos agentes oportunistas, como o enterococos. A superinfecção pode ser muito
difícil de tratar, porque é necessário optar por antibióticos eficazes contra todos os agentes
que podem causá-la. As infecções por enterococos incluem: infecções urinárias; infecções de
queimaduras e feridas cirúrgicas, bacteremia, endocardite, infecções intra-abdominais e
pélvicas (estas infecções são habitualmente mistas, causadas por enterococos e outros agentes
patogênicos), infecções de feridas e dos tecidos moles, sépsis neonatal e Meningite (raro)
(www.portalambiental.com.br, Black, 2002).
Da grande quantidade de espécies do gênero Enterococcus descritas até agora, o
Enterococcus faecalis é a mais freqüentemente encontrada em casos clínicos humanos.
Inúmeras infecções causadas por E. faecalis têm-se demonstrado resistentes ao tratamento
com as terapias antibióticas correntes, em parte devido a sua resistência intrínseca a
antibióticos e sua capacidade de formação de biofilmes (O’Toole et al., 2000). Em estudos
clínicos, biofilmes de E. faecalis têm sido implicados como agentes etiológicos de infecções
crônicas. Biofilmes de E. faecalis foram observados sobre cateteres uretais e válvulas
cardíacas (Carniol e Gilmore, 2004; Mohamed et al, 2004).
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9. Estudo topográfico da formação de biofilmes de Enterococcus faecalis por AFM
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219
9.1.4 BIOFILMES
Procariontes crescendo como células individuais de maneira planctônica (livres,
em suspensão) raramente são encontrados na natureza. Sabe-se atualmente que, quando em
seu habitat natural, as bactérias são encontradas em comunidades de diferentes graus de
complexidade, associadas a superfícies diversas, geralmente compondo um biofilme, isto é,
um ecossistema estruturado altamente dinâmico, que atua de maneira coordenada (Donlan e
Costerton, 2002).
Os biofilmes (Fig. 9.6), complexos ecossistemas microbianos, podem ser
formados por populações desenvolvidas a partir de uma única, ou de múltiplas espécies,
podendo ser encontrados em uma variedade de superfícies bióticas e/ou abióticas. Desta
maneira, muitos autores definem biofilmes como associações de microrganismos e de seus
produtos extracelulares, que se encontram aderidos a superfícies bióticas ou abióticas.
Geralmente, a dinâmica de formação de um biofilme ocorre em etapas distintas. Inicialmente
temos os organismos denominados colonizadores primários, que se aderem a uma superfície,
geralmente contendo proteínas ou outros compostos orgânicos. As células aderidas passam a
se desenvolver, originando microcolônias que sintetizam uma matriz exopolissacarídica
(EPS), que passam a atuar como substratos para a aderência de microrganismos denominados
colonizadores secundários. Estes colonizadores secundários podem se aderir diretamente aos
primários, ou promoverem a formação de coagregados com outros microrganismos e então se
aderirem aos primários. Assim, o biofilme corresponde a uma "entidade" dinâmica, pois, de
acordo com os microrganismos que o compõem, teremos estruturas físicas, químicas e
biológicas distintas. Estas alterações fazem com que cada biofilme seja único, de acordo com
os microrganismos presentes. Neste sentido, ao longo do tempo a composição microbiana dos
biofilmes geralmente sofre alterações significativas (Beveridge e Grahan, 1991).
Diversos estudos têm sido feitos sobre o processo de formação de biofilmes de
uma única espécie. Este processo, em geral, pode ser subdivido nas seguintes etapas: a)
Aderência inicial à superfície, b) Formação das microcolônias, c) Maturação das
microcolônias em um biofilme contendo a matriz de EPS, d) Crescimento do biofilme
(Fig.9.6).
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9. Estudo topográfico da formação de biofilmes de Enterococcus faecalis por AFM
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220
Figura 9.6. Esquema de formação de um biofilme sobre um substrato sólido.
A formação de microcolônias está normalmente relacionada à produção de EPS.
A maior parte dos biofilmes exibe uma certa heterogeneidade, existindo conjuntos de
agregados celulares distribuídos ao longo da matriz exopolissacarídica, que exibem
densidades variáveis, originando aberturas e canais por onde a água pode trafegar. Os espaços
intersticiais (canais) também são componentes importantes do biofilme, pois permitem a
circulação de nutrientes e a troca de metabólicos (Dufrêne, 2004).
Os microrganismos do biofilme são difíceis de erradicar com antibióticos e levam
à infecção crônica. Métodos preventivos e terapêuticos devem ser desenvolvidos, para
monitorar os biofilmes relacionados às infecções (Gilbert et al., 1997).
9.1.5 CARACTERIZAÇÃO DE BIOFILMES
A caracterização de biofilmes, entre 1978 e 1990, foi baseada em técnicas de
observações diretas, como as de microscopia ótica e microscopia eletrônica de varredura.
Entretanto, estas técnicas apresentam algumas dificuldades. Na primeira, ocorrem problemas
de perda de foco devido às diferenças topográficas na superfície do biofilme; e na segunda, a
necessidade da desidratação de uma matriz altamente hidratada, o biofilme, necessária a
realização da técnica. É uma técnica destrutiva. A microscopia confocal de varredura a laser
(MCVL), inventada em 1950, produz cortes óticos de estruturas complexas de modo que os
efeitos da perda de foco quase não ocorrem. Esta técnica não necessita de uma preparação de
amostras complexa, tal que organismos vivos podem ser observados se fluorescência for
Bactéria
Microcolônia
EPS
Aderência
Formação de
microcolônias
Maturação
das
microcolônias
Crescimento
do biofilme
Substrato sólido
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9. Estudo topográfico da formação de biofilmes de Enterococcus faecalis por AFM
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221
utilizada para visualizar células. O primeiro estudo de biofilmes vivos realizados por MCVL
produziu uma série de revelações que formam à base dos conceitos atuais de biofilmes
(Donlan e Costerton, 2002). Parsek e Fuqua (2003) salientaram a importância de observações
microscópicas no campo da microbiologia de biofilmes.
Kristich et al. (2004) analisaram por microscopia eletrônica de varredura o
biofilme desenvolvido por um E. faecalis esp-negativo, descrevendo suas características em 4,
8 e 24 horas. Os resultados mostraram que o processo de formação de um biofilme de E.
faecalis, nas condições realizadas, seguiu os seguintes estágios: adesão inicial de células
individuais (2,4 horas); formação de microcolônias (2,8 horas); e desenvolvimento de um
biofilme maduro com arquitetura complexa contendo espaços vazios correspondendo
presumivelmente a canais de água (20 horas).
Atualmente, a microscopia de força atômica (AFM) tem sido usada por diversos
pesquisadores para visualizar a arquitetura de células bacterianas (Morris et al, 1999).
Imagens de AFM são geradas pela interação de uma ponta fina (sonda) com a superfície da
amostra, revelando informações morfológicas e físicas de uma forma não destrutiva
(Bustamante e Keller, 1995; Hansma e Pietrasanta, 1998; Dufrêne, 2002). Duas principais
técnicas de AFM são utilizadas para a formação de imagens de uma superfície bacteriana:
modos de contato e intermitente. O modo de contato mede a topografia pelo deslizamento da
sonda através da superfície da amostra. O modo intermitente mede a topografia pelo
deslizamento de uma sonda presa em uma haste oscilante. Este é o modo mais usado para o
estudo de superficies biológicas, pois elimina as forças de contato, que pode danificar
amostras macias (Binnig et al., 1986; Jena e Horber, 2002). O uso do AFM para o estudo da
formação de biofilmes é novo (Ahimou et al., 2002). Tem-se demonstrado uma poderosa
ferramenta para caracterizar quantitativa e qualitativamente diversos aspectos das interações
do biofiles/substrato (Beveridge and Grahan, 1991; Beech et al., 2002; Dufrêne, 2004).
Razatos et al. (1998) mostraram que medidas de força de adesão por AFM na
superfície de células de E. coli são afetadas pelas dimensões das moléculas de lipídeos e
polissacarídeos sobre a superfície da célula. Medidas de rugosidade para descrever a
superfície de biofilmes têm sido relatadas na literatura (Gibbs and Bishop, 1995; Murga et al.,
1995; Bishop et al., 1997). Auerbach et al. (2000) estudaram, por AFM, a morfologia e as
propriedades da superfície de biofilms de Pseudomonas putida, determinando a rugosidade e
as forças de adesão nas camadas de células de biofilmes frescos e dissecados. Camesano e
Abu-Lail (2002) analisaram a heterogeneidade de macromoléculas da superfície bacteriana de
Pseudomonas putida KT2442 via espectroscopia de força molecular, usando AFM. Junior e
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9. Estudo topográfico da formação de biofilmes de Enterococcus faecalis por AFM
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222
Teschke (2005) monitoraram a dinâmica da ação do poliptídeo antimicronial PGLa sobre
Escherichia coli através de medidas de rugosidade, curvas de força e imagens de AFM.
Para fazer imagens de AFM em biofilmes, métodos variados têm sido usados para
preparar células, incluindo aprisionamento de células vivas em filtros, captura do crescimento
de células em ágar ou permitir que células colonizem uma superfície como cobre ou mica
(Casemano et al., 2000). A diferença entre bactérias fixadas em uma lamínula e depositadas
sobre um filtro é que os exopolissacarídeos celulares (EPS) não estão aderidos à lamínula na
reação de fixação, mas o EPS é freqüentemente visível com as bactérias sobre o filtro. A
deposição de bactérias sobre filtros é o método mais viável para o estudo de EPS celular,
contanto que a sonda não seja contaminada pelo EPS (Camesano et al., 2002).
9.1.6 OBJETIVOS
Neste capítulo, foi investigada por microscopia de força atômica, a alteração
topográfica nas superfícies de biofilmes de Enterococcus faecalis após 24, 36, 72, 192, 360
horas de crescimento. Imagens de altura, gráficos de seção e análise de rugosidade foram
realizadas sobre biofilmes crescidos sobre membranas esterilizadas de nitrocelulose, buscando
parâmetro topográficos qualitativos e quantitativos que caracterizem as diferentes etapas de
desenvolvimento do biofilme estudado.
9.2 MATERIAIS E MÉTODOS
9.2.1 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS
Amostras de Enterococcus faecalis (ATCC 29212 / Culti-loops-OXOID) foram
inoculadas em um meio de cultura complexo formado pela infusão de cérebro e coração (ICC)
estocada a 2-8°C e incubada a 37°C. Os biofilmes foram gerados em membrana estéril de
nitrocelulose (MN) com porosidade média de 0,22 µm (Millipore) (Fig. 9.7). O inóculo foi
preparado em meio líquido conforme descrição a seguir. Um volume de 50 µl de caldo de
ICC fresco com bactérias na turbidimetria de 6 MacFarland foi inoculado sobre amostras de
membranas de nitrocelulose colocadas sobre um meio sólido de aga e ICC. As amostras foram
incubadas aerobicamente durante 24 horas (Abdullah et al., 2005). Para o estudo topográfico
da idade dos biofilmes de 24, 36, 72, 192, 360 horas, as amostras de membrana inoculadas
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9. Estudo topográfico da formação de biofilmes de Enterococcus faecalis por AFM
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(MNI) foram colocadas em meio sólido de aga e ICC e incubadas aerobicamente até o
momento das análises de microscopia de força atômica (AFM), conforme os períodos
estabelecidos para este estudo.
Figura 9.7. Membrana de nitrocelulose.
9.2.2 ANÁLISE POR MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA (AFM)
Para a realização das medidas de microscopia de força atômica da superfície da
membrana de nitrocelulose em diferentes condições experimentais, amostras de MN, MN em
meio sólido de aga e ICC (MN-ICC) e MN inoculadas em meio sólido de aga e ICC por 24,
36, 72, 192 e 360 horas (M24, M36, M72, M192 e M360 respectivamente) foram retiradas do
meio, secas em ar durante 5 min, cortadas com bisturi e colocadas sobre discos metálicos
(porta amostras do AFM) cobertos com fita adesiva dupla face. A superfície das amostras
sofreram uma varredura em ar com um Nanoscope IIIa Multimode AFM (Digital Instruments,
Santa Bárbara, CA, U.S.A.) no modo intermitente com uma taxa de varredura de 0,400 Hz e
freqüência de ressonância variando entre 200 e 380 kHz. Foram utilizadas hastes de constante
elástica média igual a 40 N/m, com sondas de cristal de silício de raio médio de 15 nm
(Digital Instruments). Foram realizadas varreduras de 30 x 30, 15 x 15, 10 x 10 e 5 x 5 μm.
Os controles de varredura foram apropriadamente ajustados (força de contato adequada e
elevados ganhos) para evitar artefatos provocados pela sonda durante a varredura. Para as
visualizações em duas e três dimensões dos dados de altura (imagem), foi utilizado o software
Nanoscope versão 5.12 r3 da Digital Instruments. A representação esquemática da medição
realizada por AFM é mostrada na Figura 9.8.
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224
Figura 9.8. Esquema de medição da superfície da membrana de nitrocelulose por AFM. Os elementos
não estão em escala.
9.2.3 GRÁFICO DE SEÇÃO
Foi utilizado o software Nanoscope para construir gráficos de seção das imagens
de altura bidimensionais, nas varreduras de 30 x 30 μm e 5 x 5 μm. No gráfico de seção, um
“corte” por meio de uma linha reta pode ser realizado sobre qualquer parte da imagem e o
perfil de altura ao longo deste “corte” pode ser visualizado (Digital Instruments, 2001). O
limite de altura da imagem foi ajustado para 1500 nm e as seções foram feitas na região
central da imagem, paralelo ao eixo horizontal (eixo x).
9.2.4 REALCE DE CONTORNOS
Foi utilizado o software Nanoscope, para acentuar os contornos ou bordas entre
áreas diferentes de imagens com varredura de 5 x 5 μm. Este procedimento é eficaz para a
detecção de estruturas na superfície analisada. A rotina para realce de contornos detecta os
contornos em imagens por meio da aplicação de um filtro Sobel em células de 3 x 3 pixels.
Este é um tipo especial de filtro “passa altas” (filtros que eliminam as feições de baixa
freqüência, deixando apenas as de alta freqüência, expressas por bordas ou limites entre áreas
de diferentes valores de cor).
haste
sonda
Bactéria
EPS
Membrana de nitrocelulose
Suporte de aço do AFM
Fita dupla-face
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225
9.2.5 ANÁLISE DE RUGOSIDADE
Foi utilizado o software Nanoscope para calcular a rugosidade da superfície para
as imagens de altura na varredura de 30 x 30 μm. As imagens foram suavizadas por meio do
software para a análise. Trinta regiões por amostra foram aleatoriamente escolhidas para a
determinação do valor médio da rugosidade média (R
a
). R
a
é a média aritmética dos valores
de altura (Z), em relação ao plano central de referência, em uma dada região, conforme a
seguinte relação (Digital Instruments, 2001; Sayles, 1992):
N
zz
R
N
i
refi
a
∑
=
−
=
1
,
onde Z
ref
é o valor Z do plano de referência, Z
i
é o valor pontual de Z e N é o número de
pontos dentro de uma dada área.
9.2.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística das medidas de rugosidade foi baseada em estatística
descritiva (tendência central e dispersão), teste de Shapiro-Wilk (para determinar se uma
amostra aleatória segue ou não uma distribuição normal) e teste de hipótese (para verificar a
existência ou não de diferenças significativas entre grupos amostrais) (Lindman, 1974;
Lehman, 1975; Mendenhall, 1990). O nível de significância usado foi de 5%. Todo o
tratamento estatístico foi realizado usando os softwares Excel 2002 e Origin 7.0.
9.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
9.3.1 IMAGENS DE AFM E GRÁFICOS DE SEÇÃO
Nas Figuras 9.9a e 9.9b são apresentadas imagens de AFM feitas sobre a
superfície da MN, em duas diferentes resoluções, mostrando sua topografia rugosa formada
por projeções semelhantes a pólipos de material polímero. O gráfico de seção (Fig. 9.9c)
evidencia a estrutura porosa da membrana.
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226
Figura 9.9. Imagens de AFM sobre amostras de MN com varreduras de 30 x 30 µm (a) e 10 x 10 µm
(b). O gráfico de seção (c) mostra um corte transversal de 30 µm da membrana. Escala de altura: 1408
nm (a), 1324 nm (b) e 1500 nm (c).
A solução utilizada como meio de cultura (ICC) pode ser observada sobre a
superfície da MN-ICC nas Figuras 9.10a e 9.10b na forma de estruturas globulares com
diâmetro médio de 500 nm (setas na Fig. 9.10b), aderidas sobre a MN. O gráfico de seção na
Figura 9.10c mostra a alteração transversal sofrida pela membrana, devido à presença da ICC.
Estas alterações podem ser vistas como um aumento da altura dos picos no corte transversal.
O ICC formou uma rede complexa e organizada pela estrutura de poros da membrana,
responsáveis pela difusão da solução nutritiva para as regiões superficiais.
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227
Figura 9.10. Imagens de AFM sobre amostras de MN-ICC com varreduras de 30 x 30 µm (a) e 10 x 10
µm (b). A setas em (b) indicam algumas estruturas globulares oriundas do meio de cultura. No gráfico
de seção (c) pode ser observada a alteração na topografia da membrana devido à presença da ICC.
Escala de altura: 1687 nm (a), 1457 nm (b) e 1500 nm.
Após 24 horas de crescimento bacteriano (M24), inúmeras células de
Enterococcus faecalis cobriram a superfície da membrana inoculada (Fig. 9.11a).
Observaram-se células bacterianas esferoidais (indicadas por asteriscos na Fig. 9.11b) em
vários estágios de crescimento e a presença de alguns septos transversais (setas, na Fig.
9.11b), característicos da divisão celular. O aspecto homogêneo e liso da parede bacteriana
(característico do peptidoglicano de bactérias Gram-positivas), a clara distinção dos contornos
celulares e dos septos transversais foi um indicativo da reduzida quantidade de substâncias
extracelulares (EPS) sobre a superfície, representando possivelmente, a fase de adesão na
formação do biofilme. Foi evidente a redução dos picos no corte transversal (Fig. 9.11c)
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quando comparada com a MN-ICC, provocada pela presença de células. Entretanto, a
irregularidade da superfície ainda é fortemente determinada pela porosidade da MN-ICC.
Figura 9.11. Imagens de AFM sobre amostras de M24, com varreduras de 30 x 30 µm (a) e 10 x 10
µm (b). Os asteriscos em (b) indicam algumas células bacterianas enquanto que as setas, septos
transversais. No gráfico de seção (c) pode ser observada a alteração na topografia da membrana devido
à presença de células bacterianas. Escala de altura: 837,7 nm (a), 510,9 nm (b) e 1500 nm (c).
Após 36 horas de crescimento (M36), as imagens de AFM da membrana
inoculada (Figs. 9.12a e 9.12b) foram parcial e uniformemente obscurecidas pela presença de
EPS, consolidando a formação do biofilme. Foram observadas depressões associadas à
presença de microcolônias. A redução da rugosidade da superfície (quando comparado com
24 horas de crescimento), como mostrado no gráfico de seção (Fig. 9.12c), é o indicativo de
um biofilme jovem e de uma influência reduzida da porosidade na irregularidade da
*
*
*
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229
superfície do biofilme. Provavelmente esta fase corresponde a de maturação das
microcolônias, com produção de EPS.
Figura 9.12. Imagens de AFM sobre amostras de M36, com varreduras de 30 x 30 µm (a) e 10 x 10
µm (b). Um círculo em (a) indica a presença de uma microcolônia. No gráfico de seção (c), pode ser
observada uma clara redução da rugosidade da superfície. Escala de altura: 900,2 nm (a), 461,9 nm (b)
e 1500 nm.
Após 72 horas de crescimento (M72), observou-se a formação de uma rede de
EPS (Fig. 9.13a) encobrindo células de estágios anteriores (< 72 horas). Poucas bactérias
foram observadas sobre a superfície. A presença de canais (setas na Fig. 9.13b) e espaços
intersticiais (sinais de soma na Fig. 9.13b) são evidentes como estruturas integrantes do
biofilme. A superfície não obscurecida e os contornos bem definidos das poucas bactérias
presentes na superfície da rede extracelular (asteriscos na Fig. 9.13b) indicaram a pequena
quantidade (ou ausência) de EPS sobre sua parede celular (peptidoglicano). Isto é uma
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230
característica de células jovens provavelmente originadas daquelas abaixo da rede
extracelular. O gráfico de seção mostra o perfil deste estágio de desenvolvimento do biofilme
(Fig. 9.13c), com aumento da irregularidade com relação a 36 horas de crescimento, devido
aos espaços intersticiais presentes na rede de EPS. Esta fase deve representar os estágios
iniciais de crescimento do biofilme.
Figura 9.13. Imagens de AFM sobre amostras de M72, com varreduras de 30 x 30 µm (a) e 10 x 10
µm (b). As setas, sinais de soma e asteriscos (b) indicam, respectivamente, a presença de canais,
espaços intersticiais e batérias. O gráfico de seção (c), indica o perfil desta superfície. Escala de altura:
2585 nm (a), 1416 nm (b) e 1500 nm.
Após 192 horas de crescimento (M192), “ilhas” de agregados bacterianos
(microcolônias) e depressões são observadas sobre a superfície. Muitas células estão
presentes sobre a rede de EPS, que apresenta algumas regiões ainda visíveis (setas na Fig.
9.14a). A aparência de “bolas de algodão” das células bacterianas dá-se devido à presença de
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grande quantidade de material extracelular sobre sua superfície (Fig. 9.14b). O gráfico de
seção (Fig. 9.14c) mostra pequenas diferenças no perfil da superfície quando comparado com
72 horas de crescimento.
Figura 9.14. Imagens de AFM sobre amostras de M192, com varreduras de 30 x 30 µm (a) e 10 x 10
µm (b). Um círculo em (a) indica a presença de uma das “ilhas” de microcolônias presentes na
superfície e as setas, a presença da rede polimérica. O perfil da superfície é mostrado no gráfico de
seção (c). Escala de altura: 2268 nm (a), 1234,3 nm (b) e 1500 nm.
Após 360 horas de crescimento (M360), um biofilme altamente complexo
formou-se sobre a superfície (Fig. 9.15a). As células bacterianas não são distinguíveis,
estando encobertas pela grande quantidade de EPS. Estruturas semelhantes a espículas podem
ser vistas (Fig. 9.15b), dificultando a captura de dados de altura. A irregularidade da
superfície aumenta significativamente, conforme gráfico de seção (Fig. 9.15c), com relação a
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192 horas de crescimento. Temos aqui um biofilme totalmente desenvolvido e em pleno
crescimento.
Figura 9.15. Imagens de AFM sobre amostras de M360, com varreduras de 30 x 30 µm (a) e 10 x 10
µm (b). As setas em (b) indicam algumas espículas presentes na superfície. No gráfico de seção (c),
pode ser observada um aumento significativo da irregularidade da superfície. Escala de altura: 5159,6
nm (a), 2732,8 nm (b) e 1500 nm.
A Figura 9.16 mostra uma seqüência de imagens em três dimensões da MN-ICC e
M24-360 horas, feitas na varredura de 15 x 15 µm, mostrando a formação e evolução do biofilme
com o tempo nos experimentos realizados.
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233
Figura 9.16. Imagens de AFM sobre MN-ICC (a) e M24 (b), M36 (c), M72 (d), M192 (e), e M360 (f).
As medidas foram realizadas com varredura de 15 x 15 µm. Diferenças topográficas com a idade do
biofilme são facilmente observadas. Escala de altura: 3,300 (a), 0,981 (b), 0,950 (c), 2,103 (d), 2,190
(e), e 3,469 µm (f)
Uma comparação mais detalhada entre as membranas de nitrocelulose inoculadas
de 24 e 36 horas (M24 e M36, respectivamente) é feita nas Figuras 9.17, em 5 x 5 µm. Nesta
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varredura, poucas células bacterianas ficaram dentro da área analisada. Na Figura 9.17a e
9.17b, são mostradas imagens de AFM em três dimensões e gráficos de seção (Fig.9.17c e
9.17d). Os picos e depressões no gráfico de seção representam, respectivamente, o limite
superior das superfícies celulares e as regiões de contato entre as bactérias. Foi possível
identificar mais claramente a presença de EPS devido à formação de um filme sobre a
superfície das bactérias.
Figura 9.17. Imagens de AFM e gráficos de seção sobre MNI-ICC de 24 (a, c) e 36 horas (b, d)
realizadas em uma varredura de of 5 x 5 µm. É possível identificar a presença de EPS devido a
formação de um filme sobre a superfície bacteriana (obscurecimento da imagem das células) e redução
da diferença entre picos e depressões no gráfico de seção de 36 horas. Escala de altura: 600 nm.
9.3.2 ANÁLISE DE RUGOSIDADE
As Figuras 9.18-9.24 mostram gráficos de distribuição de freqüência dos valores
de R
a
para a superfície da membrana de nitrocelulose MN, MN-ICC e M24-360, com
varreduras de 30 x 30 µm. O valor médio, desvio padrão (σ) e erro de estimação (e) de R
a
são
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235
230 240 250 260 270
0
5
10
15
20
25
30
35
Frequência (%)
R
a
(nm)
175 180 185 190 195 200 205
0
5
10
15
20
25
30
Frequência (%)
R
a
(nm)
apresentados na Tabela 9.1. O teste de Shapiro Wilk resultou em uma distribuição normal
para cada um dos grupos.
Figura 9.18. Gráfico de freqüência para os valores de rugosidade R
a
da superfície da membrana MN.
Figura 9.19. Gráfico de freqüência para os valores de rugosidade R
a
da superfície da membrana MN-
ICC.
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9. Estudo topográfico da formação de biofilmes de Enterococcus faecalis por AFM
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236
75 80 85 90 95 100 105
0
5
10
15
20
Frequência (%)
R
a
(nm)
50 60 70 80 90 100 110
0
5
10
15
20
25
Frequência (%)
R
a
(nm)
Figura 9.20. Gráfico de freqüência para os valores de rugosidade R
a
da superfície da membrana M24.
Figura 9.21. Gráfico de freqüência para os valores de rugosidade R
a
da superfície da membrana M36.
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9. Estudo topográfico da formação de biofilmes de Enterococcus faecalis por AFM
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237
155160165170175180185190195200205210215
0
5
10
15
20
Frequência (%)
R
a
(nm)
Figura 9.22. Gráfico de freqüência para os valores de rugosidade R
a
da superfície da membrana M72.
140 150 160 170 180 190 200
0
5
10
15
20
25
Frequência (%)
R
a
(nm)
Figura 9.23. Gráfico de freqüência para os valores de rugosidade R
a
da superfície da membrana M192.
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9. Estudo topográfico da formação de biofilmes de Enterococcus faecalis por AFM
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238
450 475 500 525 550 575 600 625 650
0
5
10
15
20
25
30
Frequência (%)
R
a
(nm)
Figura 9.24. Gráfico de freqüência para os valores de rugosidade R
a
da superfície da membrana M360.
Tabela 9.1. O valor médio, desvio padrão (σ) e erro de estimação (e) de R
a
para a superfície da
membrana de nitrocelulose MN, MN-ICC e M24-360 horas. Varredura de 30 x 30 µm e escala de
altura de 2000 nm.
MN MN-ICC
M24 M36 M72 M192 M360
R
a
médio
188,77 254,68 88,23 76,28 186,57 166,83 541,14
σ
4.24 6,57 5,63 9,99 10,38 10,41 35,60
e
1.58 2,45 2,10 3,73 3,85 3,88 13,27
Como todos os grupos seguiram distribuições normais, dentro do nível de
significância adotado (5%), utilizou-se o teste ANOVA com o procedimento Tukey, para a
verificação da existência de diferenças estatisticamente significativas entre os valores médios
de R
a
. A Tabela 9.2 apresenta os resultados resumidos do teste ANOVA. Com exceção dos
grupos MN e M72, todos apresentaram diferenças significativas em suas médias.
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239
Tabela 9.2. Tabela simplificada dos resultados do teste ANOVA.
MN Diferenças significativas
MN-ICC Sim
MN-ICC de 24 horas Sim
MN-ICC de 36 horas Sim
MN-ICC de 72 horas Não
MN-ICC de 193 horas Sim
MN-ICC de 360 horas Sim
MN-ICC Diferenças significativas
MN-ICC de 24 horas Sim
MN-ICC de 36 horas Sim
MN-ICC de 72 horas Sim
MN-ICC de 193 horas Sim
MN-ICC de 360 horas Sim
MN-ICC de 24 horas Diferenças significativas
MN-ICC de 36 horas Sim
MN-ICC de 72 horas Sim
MN-ICC de 193 horas Sim
MN-ICC de 360 horas Sim
MN-ICC de 36 horas Diferenças significativas
MN-ICC de 72 horas Sim
MN-ICC de 193 horas Sim
MN-ICC de 360 horas Sim
MN-ICC de 72 horas Diferenças significativas
MN-ICC de 193 horas Sim
MN-ICC de 360 horas Sim
MN-ICC de 193 horas Diferenças significativas
MN-ICC de 360 horas Sim
O aumento de 65,91 nm no valor médio de R
a
entre CNM e CNM-BHI foi devido
à presença dos glóbulos da solução de crescimento (ICC); a redução de 165,77 nm entre MN-
ICC e M24, à presença de células bacterianas sobre a superfície; a redução de 11,95 nm entre
M24 e M36, à formação do EPS; o aumento de 110,29 nm entre M36 e M72, à presença da
rede de EPS, com seus interstícios e canais; a redução de 19,74 nm entre M72 e M192, ao
crescimento bacteriano sobre a rede de EPS; e finalmente, o aumento de 374,31 nm na
rugosidade entre M192 e M360, ao crescimento do biofilme. A igualdade estatística entre os
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9. Estudo topográfico da formação de biofilmes de Enterococcus faecalis por AFM
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240
valores médios de R
a
entre MN e M72 não foi relevante já que são estados qualitativamente
diferentes (sem e com bactérias). A superfície modificada foi a da membrana de nitrocelulose
com ICC (MN-ICC) e as alterações sobre a sua topografia é que são consideradas
importantes para efeitos de comparação.
A Figura 9.25 mostra o gráfico de barras de R
a
médio para MN-ICC e M24-360.
As medidas de rugosidade da superfície puderam caracterizar inequivocamente os vários
estágios de formação e estrutura do biofilme:
• 24 horas – pouco ou nenhum EPS. Contornos das células e septos distinguíveis
(rugosidade determinada pela disposição das bactérias sobre a superfície). Fase de adesão;
• 36 horas – Biofilme jovem consolidado. Células bacterianas parcialmente obscurecidas
(pequena diminuição da rugosidade devido à formação de EPS).
• 72 horas – Rede de EPS, com poucas bactérias na superfície (aumento da rugosidade
provocada pela grande quantidade de espaços intersticiais da rede);
• 192 horas – Formação de ilhas de microcolônias bacterianas, por cima da rede de EPS.
Células com aparência de “bolas de algodão”, devido ao EPS sobre sua superfície
(diminuição da rugosidade devido ao recobrimento dos espaços intersticiais);
• 360 horas – Biofilme com grande quantidade de EPS, formando espículas.
Impossibilidade de distinção de células bacterianas (aumento expressivo da rugosidade).
Biofilme em pleno crescimento.
Figura 9.25. Valor médio de R
a
(±e) da superfície de amostras da membrana MN-ICC e M24-M360.
As medidas de rugosidade distinguiram as diferentes alterações na topografia da superfície da
membrana de nitrocelulose: Adesão de glóbulos de ICC (a); adesão de bactérias (b); formação de EPS
(c); rede de EPS (d); crescimento bacteriano sobre a rede de EPS (e), crescimento do biofilme (f).
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241
9.3.3 REALCE DE CONTORNOS
Detalhes da superfície da parede bacteriana (peptidoglicano) com o tempo podem
ser vistos na Figura 9.26. Foi aplicado uma rotina de realce de contornos nas imagens de 5 x
5 µm de membranas inoculadas M24, M36 e M192 horas. Após 24 horas (M24), a superfície
da parede bacteriana apresentou um aspecto homogêneo e liso, característico do
peptidoglicano de bactérias Gram-positivas. Observou-se a presença de material polimérico
(EPS) sobre a superfície da parede após 36 e 192 horas de crescimento (M36 e M192)
(Fig.9.26b e 9.26c), inexistente após 24 horas (Fig.9.26a).
Figura 9.26. Imagens de AFM com realce de contornos sobre M24 (a), M36 (b) e M192 (c) realizadas
em uma varredura de of 5 x 5 µm. As alterações da rugosidade da parede celular bacteriana devido a
presença de EPS são evidentes. Podem-se observar detalhes da estrutura polimérica. Escala de altura:
500 nm.
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242
9.4 CONCLUSÕES
O estudo de biofilmes é importante na moderna medicina devido a sua influência
no tratamento de doenças infecciosas com antibióticos. Bactérias patogênicas raramente
existem na natureza como uma cultura planctônica pura. Elas persistem aderidas a superfícies
dentro do ecossistema de um complexo e estruturado biofilme no organismo infectado.
Biofimes bacterianos podem ser mais resistentes ao tratamento com antibióticos do que uma
cultura pura (Gilbert et al., 1997). Assim, em qualquer estudo de infecções clínicas causadas
por bactérias deve-se considerar a formação do biofilme. A compreensão da ação do biofilme
requer o conhecimento de sua estrutura e propriedades físicas. Neste capítulo, foi
demonstrado que a microscopia de força atômica é uma poderosa técnica não destrutiva para
o estudo qualitativo e quantitativo da evolução da superfície de um biofilme, possibilitando
diferenciar diferentes estágios de desenvolvimento e estruturas topográficas. Este fato abre
perspectivas para o estudo dos efeitos de agentes antibacterianos na topografia do biofilme,
fornecendo importantes informações para o tratamento deste tipo de infecção.
Este trabalho está associado a um artigo submetido em 2006 (Anexo C.1): Cibele
Barreto Mano de Carvalho, Teodora T P Arruda, Marco Antonio Botelho, Benildo Souza
Cavada, Edson H. Teixeira, Ricardo P Santos. Topographical alterations and antimicrobial
effect of Lippia sidoides essencial oil against Enterococcus faecalis biofilms. Journal of
Ethnopharmacology, 2006; e resultou em outro, submetido em 2007 (Anexo C.2): Ricardo
P. Santos, Theodora T. P. Arruda, Cibele B. M. Carvalho, Victor A. Carneiro, Lara Q. V.
Braga, Edson H. Teixeira, Francisco V. S. Arruda, Benildo S. Cavada, Alexandre Havt,
Taianá M. de Oliveira, Gustavo A. Bezerra, Valder N. Freire. Aging of Enterococcus faecalis
biofilms: observation of topographical changes by Atomic Force Microscopy. Microscopy
and Microanalysis, 2007.
COLABORADORES
T. T. P. ARRUDA
b
, C. B. M. CARVALHO
b
, V. A. CARNEIRO
c
, L. Q. V. BRAGA
c
, E. H. TEIXEIRA
c
, B. S. CAVADA
d
, A. HAVT
d
, V. N. FREIRE
a*
a
Departamento de Física, Universidade Federal do Ceará, Caixa Postal 6030, Campus do Pici
60455-900, Fortaleza, Ceará, Brazil
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9. Estudo topográfico da formação de biofilmes de Enterococcus faecalis por AFM
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243
b
Departamento de Patologia e Medicina Legal, Universidade Federal do Ceará, Caixa Postal
6030, Campus do Pici 60455-900 Fortaleza, Ceará, Brazil
c
Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas (BIOMOL), Universidade Federal do
Ceará, Caixa Postal 6020, Campus do Pici 60455-900, Fortaleza, Ceará, Brazil
d
Faculdade de Medicina/Sobral, Universidade Federal do Ceará, Av. Gerardo Rangel s/n,
Campus do Derby 62041-180, Sobral, Ceará Brazil
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244
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NANOESTRUTURA DA ESPOROPOLENINA DE GRÃOS DE
POLÉN DE ILEX PARAGUARIENSIS ST. HIL
10.1 INTRODUÇÃO
10.1.1 ESPERMATÓFITAS
Espermatófitas (que significa plantas com semente) são plantas superiores
caracterizadas por apresentarem raiz, caule, folhas, flores e sementes. Também são chamadas
de fanerógamas (por possuírem flor) ou ainda embriófitas sifonógamas, por formarem tubo
polínico. As espermatófitas podem ser classificadas como angiospermas (em que as sementes
estão no interior dos frutos) e giminospermas (no qual não há fruto, isto é, a semente é nua).
Como exemplos de angiospermas podemos citar as plantas frutíferas em geral (macieira,
laranjeira, goiabeira, etc...); de giminospermas, o pinheiro e o cipreste (Schultz, 1990;
Redondo e Theófilo, 1997).
10.1.2 A FLOR
A flor pode ser considerada como um ramo modificado para a função de
reprodução, em que os entre-nós se encontram reduzidos e em cujos nós se encontram
estruturas que se podem considerar como folhas modificadas (Eames, 1961). É o aparelho
reprodutor das Espermatófitas. Nas gimnospermas, que surgiram primeiro, as flores são
incompletas, ou seja, possuem sépalas e pétalas que formam o revestimento externo e não
produzem os óvulos dentro de um ovário. Não formam, assim, frutos. Já as angiospermas, por
outro lado, surgiram mais tarde e suas flores são completas. Isto significa que os óvulos, que
irão produzir as sementes, formam-se dentro de uma estrutura fechada, o ovário, que irá se
transformar no fruto (Esaú, 1965).
A flor completa, ou seja, das angiospermas (Fig.10.1) é constituída das seguintes
partes (Rosique, 1978; www.herbario.com.br):
10
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10. Nanoestrutura da esporopolenina de grãos de polén de Ilex paraguariensis St. Hil
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248
• Pedúnculo: é ramo de caule em cuja extremidade a flor se forma, sendo sua haste de
sustentação;
• Receptáculo: é a extremidade superior dilatada do pedúnculo onde as peças da flor se
fixam;
• Sépalas: são folhas modificadas, geralmente verdes, cuja função é de proteção. As sépalas
fecham botão floral antes que este se abra. Seu conjunto denomina-se cálice. Quando as
sépalas não são verdes e possuem a mesma cor das pétalas, o cálice recebe o nome de
petalóide e a flor é dita homoclamídea;
• Pétalas: são folhas profundamente modificadas, geralmente de diversas cores (raramente
verdes), cuja função é proteger os órgãos reprodutores e atrair animais, que irão
transportar os grãos de pólen de uma flor a outra. Seu conjunto forma a corola;
• Estames: São folhas modificadas, formando os órgãos reprodutores masculinos do vegetal
e cuja função é produzir os grãos de pólen. O conjunto de estames é chamado de
androceu;
• Carpelos: São folhas modificadas, formando os órgãos reprodutores femininos do vegetal.
Apresentam um ovário onde serão produzidos os óvulos. O conjunto dos carpelos forma o
gineceu ou pistilo.
Figura 10.1. As partes de uma flor completa (www.herbario.com.br).
O cálice, a corola, o androceu e o gineceu formam juntos, o que se denomina
verticilos florais.
Cada estame (Fig.10.2) é constituído de três partes (Rosique, 1978;
www.herbario.com.br):
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10. Nanoestrutura da esporopolenina de grãos de polén de Ilex paraguariensis St. Hil
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249
• Antera: é a parte superior do estame com forma globulosa e cuja função é de produzir os
grãos de pólen;
• Conetivo: é o local por onde o filete se fixa na parte superior do estame que é a antera;
• Filete: é a haste que liga o estame ao receptáculo da flor;
Figura 10.2. As partes de um estame (www.herbario.com.br).
O carpelo (Fig.10.3) é constituído de três partes (Rosique, 1978;
www.herbario.com.br):
• Estigma: é a parte superior do carpelo, geralmente achatada, suja finalidade é receber o
grão de pólen (elementos masculinos de reprodução). Contém formações glandulares que
segregam uma substância viscosa que fixa melhor o grão de pólen.
• Estilete: é a haste que se estende desde o estigma até o ovário, estando cheio de uma
substância gelatinosa. É pelo estilete que o tubo polínico do grão de pólen atinge o ovário;
• Ovário: é a porção do carpelo, dilatada e que está ligada ao receptáculo. É no seu interior
que se encontram os óvulos.
Figura 10.3. As partes de um carpelo (www.herbario.com.br).
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10. Nanoestrutura da esporopolenina de grãos de polén de Ilex paraguariensis St. Hil
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250
A flor das gimnospermas (flor incompleta) é conhecida com o nome de estróbilo e
é sempre unissexuada, isto é, existe uma flor com o aparelho reprodutor masculino e outra
com o aparelho reprodutor feminino. O aparelho reprodutor feminino é representado por um
óvulo destituído de ovário e que guarda no seu interior o arquegônio (órgão que dá origem a
gametas femininos) (Raven, 2001).
10.1.3 O PÓLEN
O pólen (do grego “pales” = “farinha” ou “pó”) é o conjunto dos minúsculos grãos
produzidos pelas flores das plantas espermatófitas. São normalmente arredondados, embora
os dos pinheiros sejam alados, e podem ser muito pequenos, apenas alguns micrômetros. O
menor grão de pólen conhecido é o do Myosotis, com cerca de 6 μm (0.006 mm) de diâmetro.
A forma e ornamentação dos grãos de pólen são típicas de cada família ou mesmo espécies de
plantas (Fig.10.4).
Figura 10.4. Diferentes tipos de grãos de pólen (www.pt.Wikipedia.org).
Como uma célula que é, o grão de pólen apresenta membrana (em número de
duas: exina e intina), citoplasma (chamado de fovila) e núcleo (em número de dois: gerador e
vegetativo) (Fig.10.5). A exina é a mais externa, constituída por uma substância resistente e
quebradiça, chamada esporopolenina. A intina, localizada abaixo da exina, possui natureza
celulósica e é bem mais elástica que a anterior (Vidal, 2000; Esaú, 1965).
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10. Nanoestrutura da esporopolenina de grãos de polén de Ilex paraguariensis St. Hil
___________________________________________________________________________________________
251
Figura 10.5. Seção de um grão de pólen, mostrando seus constituintes.
O pólen contém uma grande proporção de proteínas (16 a 40 %) contendo todos
os aminoácidos conhecidos, assim como numerosas vitaminas, principalmente as vitaminas C
e PP, sendo a principal fonte de alimentação das abelhas. Outro importante produto fabricado
com pólen é a geléia real. Esta composição do pólen pode ser responsável pelas alergias que
lhe são atribuídas. O estudo do pólen é a palinologia (Appezato e Carmelo, 2003).
10.1.4 ILEX PARAGUARIENSIS ST. HIL.
O Ilex paraguariensis St. Hil. conhecida como erva-mate (Fig.10.6), é uma planta
da família Aquifoliaceae. Tem altura de 4-8 m, com tronco curto de 30-40cm de diâmetro e
folhas coráceas, de 8-10cm de comprimento por 3-4cm de largura (Lorenzi, 1980).
Figura 10.6. Árvore e detalhes das folhas de Ilex paraguariensis (Lorenzi, 1980).
Floresce durante os meses de outubro-dezembro. Os frutos amadurecem em janeiro-março
(Fig.10.7).
Intina
Exina
Núcleo vegetativo
Núcleo gerador
Fovila
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10. Nanoestrutura da esporopolenina de grãos de polén de Ilex paraguariensis St. Hil
___________________________________________________________________________________________
252
Figura 10.7. Ilustração de Ilex paraguariensis, mostrando detalhes da flor e do fruto
(www.illustratedgardem.org).
Sua madeira pode ser empregada na confecção de lenha. Suas folhas são utilizadas
na preparação do "mate", o mais popular dos chás consumidos no país e exportado para todo o
mundo. Por essa razão é muito cultivada no sul do país; entretanto, a maior parte da produção
ainda provém da exploração de ervais nativos. A árvore é ornamental e pode ser empregada
no paisagismo. Seus frutos são muito consumidos por várias espécies de pássaros. Pode ser
utilizada no plantio de áreas degradadas destinadas à recomposição da vegetação.
O cultivo da erva-mate abrange cerca de 180000 propriedades dos estados do
Paraná, Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Mato Grosso do Sul. As propriedades em que ela
é cultivada são, na maioria, pequenas e médias. Isto assegura sua importância social
expressiva. Assim sendo, foi escolhida para dar início a uma série de Sistemas de Produção
publicados em forma eletrônica e que servirão de base para uma agência de informação sobre
os principais produtos de origem florestal (Lorenzi, 1980).
Em relação ao comportamento das flores, a erva-mate é unissexual em árvores
diferentes (espécie dióica). As flores, que são pequenas, pedunculadas, agrupadas em cimeiras
fasciculadas nas axilas das folhas, possuem uma característica especial, pois, embora em todas
elas se encontrem estames e pistilos, ocorre que, nas femininas, os estames não funcionam e,
nas masculinas, o pistilo aborta. Em função disso, ocorre certa dificuldade na polinização
natural (Ferreira Filho, 1957; Ferreira et al., 1982).
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253
O grão de pólen de Ilex paraguariensis (Figs.10.8 e 10.9) é tricolporado,
circulaperturado, subprolato (subesferoidal), com relação entre o eixo polar e equatorial (P/E)
igual a 1,31. Apresenta tamanho pequeno. A exina é relativamente espessa.. O pólen
apresenta-se clavado (Takeda et al., 2000).
Figura 10.8. Imagens de microscopia ótica de grãos de pólen de Ilex paraguariensis, nas vistas polar
(a) e equatorial (b). Barra = 10 µm (Alvez, 1999).
Figura 10.9. Imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de grão de grãos de pólen de
Ilex paraguariensis (Santos e Mariath, 1999).
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254
10.1.5 A ESPOROPOLENINA
Os grãos de pólen têm atraído a atenção da ciência de materiais, pois o
biopolímero formador da exina, a esporopolenina, é um dos materiais conhecidos como mais
resistentes a processos físicos, químicos e biológicos de degradação não-oxidativa, incluindo
a acetólise. Esta propriedade permite que a esporopolenina mantenha-se intacta em
sedimentos muito antigos, como do período Ortoviciano, 400 milhões de anos atrás (Erdtman,
1960).
A esporopolenina é uma mistura de ácidos graxos, fenóicos derivados como o
ácido p-coumárico e carotenos (Scott, 1994). Sua subestrutura ainda não foi completamente
revelada e muitos estudos ainda estão sendo feitos. Vários modelos têm sido propostos para a
nanoestrutura da esporopolenina de esporos e grãos de polén (Wittborn, 1998). Rowley
(Rowley, 1981) interpretou a estrutura da exina como sendo formada por subunidades
helicoidais, baseado em estudos com microscópios eletrônicos de transmissão e varredura
(TEM e SEM). Entretanto, a microscopia de força atômica (AFM) tem-se mostrado o método
ideal para o estudo deste tipo de estrutura (Xing, 2000), já que a organização de seus
componentes não é visualizada facilmente por meio de outras técnicas microscópicas.
10.1.6 OBJETIVOS
No presente capítulo, foi utilizado o microscópio de força atômica para estudar a
nanoestrutura da exina (esporopolenina) de grãos de pólen de Ilex paraguariensis St. Hil,
visando caracterizá-la qualitativamente e quantitativamente.
10.2 MATERIAIS E MÉTODOS
10.2.1 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS
Grãos de pólen maduros e frescos de Ilex paraguariensis St. Hil. foram pré-
tratados em uma mistura de ácido acético anidro e ácido sulfúrico (solução de acetólise) por
10 min, lavados em água destilada, desidratados em acetona e embebidos em resina Spurr de
baixa viscosidade (Erdtman, 1960, Spurr, 1969). Foram realizadas seções semifinas de grãos
de pólen (1 µm) em um ultramicrótomo Leica Ultracut equipado com navalha de vidro e
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255
depositadas em lamínulas para corte histológico. Parte das lamínulas com seções semifinas
foram tratados com uma solução aquosa de 1% de permanganato de potássio (KMnO
4
) por 24
horas (Claugher, 1986) e outra parte não foi tratada. A acetólise remove a intina (camada de
polissacarídeos da parede) e o KMnO
4
ataca a exina, tornando exposta a subestrutura da
esporopolinina.
10.2.2 ANÁLISE POR MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA (AFM)
Para a realização das medidas de microscopia de força atômica da superfície dos
polens, as lamínulas com as seções semifinas foram retiradas da solução de KMnO
4
, lavadas
em água destilada por 5 min, secas em estufa à 36ºC por 48 horas e montadas sobre discos
metálicos (porta amostras do AFM) cobertos com fita adesiva dupla face. Também foram
montadas as lamínulas com seções semifinas não tratadas com KMnO
4
. A superfície das
amostras sofreu uma varredura em ar com um Nanoscope IIIa Multimode AFM (Digital
Instruments, Santa Bárbara, CA, U.S.A.) no modo intermitente com uma taxa de varredura de
0,400 Hz e freqüência de ressonância variando entre 200 e 380 kHz. Utilizou-se hastes de
constante elástica média igual a 40 N/m, com sondas de cristal de silício de raio médio de 15
nm (Digital Instruments). Foram realizadas varreduras de 70 x 70 μm , 30 x 30 μm, 15 x 15
μm , 1 x 1 μm e 0,600 x 0,600 μm. Os controles de varredura foram apropriadamente
ajustados (força de contato adequada e elevados ganhos) para evitar artefatos provocados pela
sonda durante a varredura. Para as visualizações em duas e três dimensões de dados de altura
(imagem), foi utilizado o software Nanoscope versão 5.12 r3 da Digital Instruments. A
representação esquemática do experimento é mostrada na Figura 10.10.
Figura 10.10. Representação esquemática do experimento de microscopia de força atômica com
polens. Os elementos do desenho não estão em proporção.
Haste
Sonda
Pólen seccionado
Lamínula
Porta amostras do
AFM
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256
10.2.3 GRÁFICO DE SEÇÃO
Foi utilizado o software Nanoscope para construir gráficos de seção das imagens
de altura bidimensionais, em varreduras apropriadas, para a obtenção de medidas lineares. No
gráfico de seção, um “corte” por meio de uma linha reta pode ser realizado sobre qualquer
parte da imagem e o perfil de altura, ao longo deste, “corte” pode ser visualizado (Digital
Instruments, 2001).
10.2.4 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (SEM)
Amostras de grãos de pólen intactas foram tratadas com 1% de KMnO
4
durante 24
horas, desidratados em acetona, montados sobre discos de Al e cobertos com uma camada de
20 nm de Au (metalização). As amostras foram observadas em um microscópio eletrônico de
varredura JEOL JSM-5800 com a tensão de 20 kV.
10.2.5 MICROSCOPIA ÓTICA DE CAMPO CLARO
As seções semifinas não tratadas/tratadas com KMnO
4
e montadas sobre
lamínulas histológicas foram observadas em um microscópio ótico metalográfico Olympus
BX51RF.
10.2.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística das medidas lineares feitas no gráfico de seção foi baseada
em estatística descritiva (tendência central e dispersão), teste de Shapiro-Wilk (para
determinar se uma amostra aleatória segue ou não uma distribuição normal) e teste de
significância (para verificar a existência ou não de diferenças significativas entre grupos
amostrais). O nível de significância (α) usado foi de 0,05. Todo o tratamento estatístico foi
realizado usando os softwares Excel 2002 e Origin 7.0.
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257
10.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
10.3.1 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (SEM)
Após o tratamento com KMnO4 os grãos de pólen não seccionados ainda
apresentaram um aspecto normal quando observada de baixa ampliação por meio da
microscopia de varredura. Nenhuma modificação aparente foi detectada (Fig.10.11a).
Entretanto, quando a clava foi examinada em alta ampliação, a superfície da exina revelou um
aspecto granular (Fig.10.11b), resultado típico de um ataque químico por KMnO
4
(Rowley,
198; Wittborn, 1998).
Figura 10.11. Imagens de microscopia eletrônica de varredura de grãos de pólen de Ilex
paraguariensis previamente tratados com KMnO
4
por 24 h. Muitas clavas (setas) podem ser
observadas na exina, exceto na região das aberturas (asterisco) (a); Detalhes da clava na superfície da
exina, mostrando sua irregularidade após tratamento químico (b).
10.3.2 MICROSCOPIA ÓTICA DE CAMPO CLARO
A Figura 10.12 mostra imagens de microscopia ótica de seções semifinas de
polens tratados com KMnO
4
por 24 horas sobre uma lamínula histológica, montados sobre o
porta amostras do AFM. As imagens de polens não tratados apresentam o mesmo aspecto.
Podemos observar as clavas sobre as paredes dos polens. É sobre a superfície destas estruturas
que a microscopia de força atômica foi realizada.
*
*
*
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258
Fovila
Parede
Clava
Figura 10.12. Imagem de microscopia ótica (1000x) de seções semifinas de grãos de pólen
previamente tratados com KMnO
4
por 24 horas. Nela aparecem indicados a parede e as
clavas.
10.3.3 ANÁLISE POR MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA
As Figuras 10.13-10.16 mostram uma seqüência de imagens de AFM sobre as
superfícies das seções semifinas de grãos de polens não tratados com KMnO
4
, em diferentes
ampliações. A parede observada é formada apenas por exina, devido a acetólise (que degrada
a intina). Podemos observar na imagem sobre a clava (Fig.10.16) que nenhum detalhe da
nanoestrutura da esporopolenina é revelado, devido à ausência do ataque com KMnO
4
. A
clava e o restante da exina é formada por esporopolenina.
Figura 10.13. Imagem de AFM de seções semifinas de grãos de polens não tratado, em varredura de
70 x 70 µm. Nela está indicando a clava, a parede e a fovina retraída.
Parede
Clava
Fovila
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259
Figura 10.14. Imagem de AFM da seção semifina de um único grão de pólen, em varredura de 30 x 30
µm.
Figura 10.15. Imagem de AFM de seções semifina de um único grão de pólen, em varredura de 15 x
15 µm. Podemos observar algumas camadas formadoras da exina, sobre a parede.
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260
Figura 10.16. Detalhe da clava de uma seção semifina de um único grão de pólen, em varredura de 1 x
1 µm. A superfície não revela nenhum detalhamento da nanoestrutura da exina.
As Figuras 10.17-10.22 mostram imagens de AFM sobre a superfície das seções
semifinas de grãos de polens tratados quimicamente com KMnO
4
por 24 horas. Podem-se
perceber alterações na qualidade das imagens, devido à presença de resíduos resultantes da
decomposição de partes da exina e do citoplasma. Nas Figuras 10.17-10.19 (baixas
ampliações), as clavas e as paredes são distinguíveis, mas não é possível mais diferenciar os
as diferentes camadas da exina. Alguma fovina ainda está presente. Nestas ampliações,
nenhum detalhe da sub estrutura da superfície da exina aparece.
Entretanto, em altas ampliações (Figs.10.20-10.22), as imagens de AFM da exina
tratada indicam a presença de estruturas paralelas semelhante a helicóides (algumas indicadas
por setas na Fig.10.20) na clava da sexina (exina esculpida), conforme o modelo de estrutura
helicoidal de Rowley (1981). Uma destas estruturas (região retangular na Fig.10.20) é
ampliada sucessivamente por meio da varredura de 600 x 600 nm na Figura 10.21 e por
“zoom” de software na Figura 10.22 (em três dimensões).
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261
Figura 10.17. Imagem de AFM de seções semifinas de grãos de pólen tratados com KMnO
4
, na
varredura de 70 x 70 µm.
Figura 10.18. Imagem de AFM da seção semifina de um único grão de pólen tratado com KMnO
4
, na
varredura de 30 x 30 µm.
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262
Figura 10.19. Imagem de AFM da seção semifina de um único grão de pólen tratado com KMnO
4
, na
varredura de 15 x 15 µm.
Figura 10.20. Imagem de AFM da clava de uma seção semifina de um único grão de pólen tratado
com KMnO
4
, na varredura de 1 x 1 µm. Estruturas paralelas, semelhante a helicóides, são visíveis
sobre a superfície (setas). A região retangular é ampliada na Figura 10.21.
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263
Figura 10.21. Imagem de AFM da clava de uma seção semifina de um único grão de pólen tratado
com KMnO
4
, na varredura de 600 x 600 nm. Observa-se com mais detalhes as estruturas helicoidais
(setas). A região retangular é ampliada por “zoom” de software na Figura 10.22.
Figura 10.22. Detalhe de uma estrutura helicoidal em uma clava da seção semifina de um grão de
pólen com “zoom” por software de 125 x 125 nm.
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O pré-tratamento (acetólise) removeu a intina (camada de polissacarídeos da
parede do pólen) e parte do citoplasma enquanto que a exina permaneceu intacta devido a sua
resistência a oxidação, nos polens que sofreram apenas acetólise. O tratamento com KMnO4 ,
que tem sido relatado como um meio de degradar a exina e revelar detalhes de sua
nanoestrutura (Gabarayeva, 2003) mostrou-se eficiente neste processo. O modelo para a
nanoestrutura da esporopolenina de Ilex paraguariensis sugerido pelos dados experimentais
obtidos é mostrado na Figura 10.23.
Figura 10.23. Modelo para a nanoestrutura da esporopolinina de Ilex paraguariensis: representação
pictográfica (a) e modelo físico (b). Dois parâmetros característicos da estrutura (a e b), aparecem
indicados na Figura.
10.3.4 GRÁFICOS DE SEÇÃO
Foram medidos os parâmetros a (largura da helicóide) e b (espessura do braço da
helicóide) (Fig. 10.23) por meio de gráficos de seção. Realizou-se duas medidas de cada
parâmetro em gráficos de seção de 15 estruturas helicoidais de seções semifinas de 5 grãos de
pólen tratados com KMnO
4
, resultando assim, em 30 medidas de a e b por pólen (5 polens ao
todo). A análise de seção foi feita sobre o “zoom” de 125 x 125 nm de imagens com
varreduras de 600 x 600 nm (Figs.10.24 e 10.25).
a
b
(a)
(
b
)
a
b
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265
Figura 10.24. Gráficos de seção para a medida de a de uma estrutura helicoidal feito sobre o “zoom”
de 125 x 125 nm de uma imagem com varredura de 600 x 600 nm.
Figura 10.25. Gráficos de seção para a medida de b de uma estrutura helicoidal feito sobre o “zoom”
de 125 x 125 nm de uma imagem com varredura de 600 x 600 nm.
As Figuras 10.26-10.35 mostram gráficos de distribuição de freqüência dos
valores de a e b para estruturas helicoidais dos 5 polens analisados (polens 1, 2, 3, 4 e 5). O
valor médio, desvio padrão (σ) e erro de estimação (e) para a e b são apresentados nas Tabelas
10.1 e 10.2. O teste de Shapiro-Wilk resultou em uma distribuição normal para os parâmetros
a e b de cada um dos grupos (polens) e o teste ANOVA indicou a inexistência de diferenças
significativas entre as médias destes parâmetros. Sendo assim, os valores médios de a e b
a
b
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266
considerando 150 medidas para cada parâmetro (30 medidas em 5 polens) com nível de
significância (α) = 0,05 e t = 1,96 foram a = (34,27 ± 0,60) nm e b = (24,86 ± 0,46) nm.
Figura 10.26. Histograma de freqüência para os valores de a para a amostra de pólen 1.
Figura 10.27. Histograma de freqüência para os valores de a para a amostra de pólen 2.
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267
Figura 10.28. Histograma de freqüência para os valores de a para a amostra de pólen 3.
Figura 10.29. Histograma de freqüência para os valores de a para a amostra de pólen 4.
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268
Figura 10.30. Histograma de freqüência para os valores de a para a amostra de pólen 5.
Tabela 10.1. O valor médio, desvio padrão (σ) e erro de estimação (e) de a para estruturas helicoidais
presentes na superfície de grãos de pólen tratados quimicamente com KMnO
4
. Nível de significância
(α) = 0,05 e (t = 2,045).
Pólen 1
Pólen 2
Pólen 3 Pólen 4 Pólen 5
a médio
34,18 33,75 35,06 34,24 34,07
σ
3,04 2,75 4,11 4,09 3,33
e
1,13 1,03 1,54 1,53 1,24
Figura 10.31. Histograma de freqüência para os valores de b para a amostra de pólen 1.
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269
Figura 10.32. Histograma de freqüência para os valores de b para a amostra de pólen 2.
Figura 10.33. Histograma de freqüência para os valores de b para a amostra de pólen 3.
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270
Figura 10.34. Histograma de freqüência para os valores de b para a amostra de pólen 4.
Figura 10.35. Histograma de freqüência para os valores de b para a amostra de pólen 5.
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271
Tabela 10.2. O valor médio, desvio padrão (σ) e erro de estimação (e) de b para estruturas helicoidais
presentes na superfície de grãos de polens tratados quimicamente com KMnO
4
. Nível de significância
(α) = 0,05 e (t = 2,045).
Pólen 1
Pólen 2
Pólen 3 Pólen 4 Pólen 5
b médio
24,83 24,92 24,77 24,73 25,03
σ
2,88 2,93 2,34 3,26 2,24
e
1,08 1,10 0,87 1,21 0,84
Estudos recentes da nanoestrutura da esporopolenina da exina de polens de
Cedrus e Metasequoia mostraram subunidades esféricas arranjadas de forma aleatória, sem
formar estruturas helicoidais paralelas (Xing, 2000). Entretanto, os resultados apresentados
neste capítulo estão de acordo com o modelo da estrutura helicoidal (modelo de Rowley). É
possível que exista mais de um modo de polimerização para a organização da estrutura da
exina em grãos de pólen, explicando as diferenças nos resultados para diferentes espécies.
Também os recentes estudos de Rowley (1981) têm mostrado que os parâmetros a (largura do
helicóide) e b (largura da espira) são característicos da espécie analisada, sugerindo que o tipo
de polimerização pode estar associado a fatores específicos do grupo taxonômico.
10.4 CONCLUSÕES
Foi utilizada a microscopia de força atômica (AFM) para estudar a nanoestrutura
da exina de Ilex paraguariensis. As imagens revelaram estruturas paralelas supostamente
helicoidais, com parâmetros métricos a (largura da helicóide) e b (espessura do braço da
helicóide) característicos. Estes resultados concordam com o modelo da estrutura helicoidal
de Rowley (1981), e que os parâmetros a e b podem ser característicos da espécie. Novos
experimentos deverão ser realizados, aumentando o tempo de ataque químico e a resolução
das análises por AFM (scanner de maior resolução e sondas com raio menor que 15 nm) para
visualizar, mais detalhadamente, a estrutura das unidades helicoidais. Também outras espécies
deverão ser analisadas, visando a comparação dos parâmetros a e b.
Este trabalho resultou no artigo publicado em 2005 (Anexo A.1): R. P. Santos, L.
M. Rebelo, E. F. Costa, A. A. X. Santiago, V. N. Freire, J.A.K. Freire, G.A. Farias, T. M.
Oliveira, G. A. Bezerra, and B. S. Cavada. Sporopollenin Nanostructure of Ilex
paraguariensis A.St.Hil Pollen Grains. Microsc Microanal 11 (supp 3) (2005).
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272
COLABORADORES
A.A. X. SANTIAGO
a
, C. A. A. GADELHA
b
, J. B. CAJAZEIRAS
c
, B. S. CAVADA
c
, T. M. OLIVEIRA
c
, G. A. BEZERRA
c
, RINALDO. P. SANTOS
e
, J.A.K. Freire
a
, L. M. Rebelo
a
, E. F. Costa
a
, V. N.
FREIRE
a
a
Departamento de Física, Universidade Federal do Ceará, Caixa Postal 6030, Campus do
Pici, 60455-900, Fortaleza, Ceará, Brasil.
b
Departamento de Biologia Molecular, Universidade Federal da Paraíba, Campus Castelo
Branco, 58059-000, João Pessoa, Paraíba, Brasil.
c
Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas (BioMol-Lab), Universidade Federal do
Ceará, Caixa Postal 6020, Campus do Pici, Fortaleza, Ceará, 60455-900, Brasil.
e
Laboratório de Anatomia Vegetal, Departamento de Botânica, Instituto de Biociências,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 9500, Avenida Bento Gonçalves, 91501-970,
Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil.
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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10. Nanoestrutura da esporopolenina de grãos de polén de Ilex paraguariensis St. Hil
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274
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CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Esta tese apresentou os resultados de pesquisas envolvendo a transformação,
caracterização e o aproveitamento de resíduos bem como a utilização da microscopia de força
atômica (AFM) no estudo da topografia de superfícies de algumas estruturas biológicas.
Três resíduos foram estudados: o bagaço do pedúnculo de caju da agroindústria
cajueira do Estado do Ceará; as cinzas volantes originadas da queima de carvão mineral para a
geração de energia elétrica da termelétrica Presidente Médici do Estado do Rio Grande do Sul
e conchas de mexilhão Perna perna da indústria pesqueira do Estado de Santa Catarina. Estes
três resíduos se destacam pela sua elevada produção, perigo potencial ao meio ambiente e
associação a diferentes atividades econômicas importantes nos estados citados.
O bagaço do pedúnculo de caju, depois de queimado, transformou-se
predominantemente nos seguintes compostos inorgânicos: KHCO
3
(54,17%), K
2
SO
4
(34,08%) e MgKPO
4
·6H
2
O (10,06%). A presença destes compostos transformou este resíduo
agroindustrial em uma promissora fonte não perecível de potássio, enxofre, fósforo e
magnésio em fertilizantes e na ração animal, além das diversas aplicações abrangidas pelo
bicarbonato de potássio. Devido ao elevado conteúdo de carbono do bagaço, novas pesquisas
estão sendo realizadas através do tratamento térmico em atmosfera inerte (pirólise ou
carbonização), para a síntese de carvão ativado.
As cinzas volantes de carvão mineral demonstraram-se uma excelente matéria-
prima para a preparação de suportes cerâmicos de baixo custo para serem utilizados na
imobilização da enzima invertase, proporcionando um elevado rendimento no processo de
produção de açúcar invertido. Reatores para a inversão da sacarose, tendo como substratos
estas cerâmicas, já estão sendo construídos, em parceria com a indústria e com os laboratórios
de Ciência e Tecnologia de Materiais (LCTM-UFC), Keizo Assami (LIKA) e de Moléculas
Biologicamente Ativas (BioMol-Lab).
As conchas de mexilhão Perna perna, quando submetidas a um tratamento
térmico, apresentaram estabilidade na composição da matriz orgânica com aumento da
microdureza até a temperatura de 300°C. Acima desta temperatura, a matriz orgânica sofreu
modificações composicionais, mecânicas e topográficas. Somente em torno de 600°C, ocorre
11
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11. Conclusões e Perspectivas
___________________________________________________________________________________________
276
a completa decomposição da matriz orgânica. Também pode ser observada a transformação
da aragonita em calcita, iniciando-se em tono de 350°C e finalizando acima de 400°C. O
estudo do comportamento térmico e mecânico da superfície perolada é importante, pois estes
materiais têm aplicações em implantes e na regeneração óssea, onde processos de
esterilização são necessários. A matriz orgânica da concha do mexilhão Perna perna só sofreu
alterações significativas (composicionais, estruturais e mecânicas) acima de 300°C sendo
destruída somente em temperaturas acima de 500°C (em contraste com a matriz óssea),
facilitando os processos de esterilização e conseqüentemente seu uso em implantes. Além
disto, verificou-se a predominância do nácar sobre a camada prismática nas conchas do
mexilhão Perna perna, sendo este um resultado muito importante para a valorização deste
resíduo, visto que o nácar é a camada de maior interesse nos processos de regeneração óssea e
implantes. As propriedades óticas e eletrônicas do nácar também estão em fase final de
investigação, com resultados promissores na aplicação de dispositivos optoeletrônicos.
Na utilização da microscopia eletrônica em materiais biológicos, dois estudos
foram feitos: as alterações topográficas da superfície de biofilmes de Enterococcus faecalis
durante seu desenvolvimento e a nanoestrutura da exina de grãos de pólen de Ilex
paraguariensis.
Foi mostrado que a microscopia de força atômica é uma poderosa técnica não
destrutiva para o estudo qualitativo e quantitativo da evolução da superfície de um biofilme,
possibilitando diferenciar seus estágios de desenvolvimento e estruturas topográficas. Este
fato abre perspectivas para o estudo dos efeitos de agentes antibacterianos na topografia do
biofilme, fornecendo importantes informações para o tratamento deste tipo de infecção.
Análises por AFM da nanoestrutura da exina dos grãos de pólen de Ilex
paraguariensis revelaram estruturas paralelas supostamente helicoidais, com parâmetros
métricos a (largura da helicóide) e b (espessura do braço da helicóide) característicos dos
pólens analisados. Novos experimentos deverão ser realizados, aumentando-se o tempo de
ataque químico e a resolução das análises por AFM (scanner de maior resolução e sondas com
raio menor que 15 nm) para visualizar, mais detalhadamente, a estrutura das unidades
helicoidais. Também outras espécies deverão ser analisadas para comparação taxonômica.
Novos resíduos estão sendo estudados pelo LCTM-UFC e seus colaboradores, tais
como: Mesocarpo do coco, bagaço da cana-de-açúcar, resíduos da parbolização do arroz,
cinzas resultantes da incineração do lixo hospitalar, etc...A lista cresce a cada reunião (formal
e informal) de nosso grupo de pesquisa e colaboradores. É surpreendente o fato de que ainda
faltam pesquisas mais detalhadas sobre a caracterização dos resíduos oriundos de processos
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11. Conclusões e Perspectivas
___________________________________________________________________________________________
277
agroindustriais, domésticos e hospitalares, fundamentais no desenvolvimento de uma ciência
e engenharia de materiais voltadas ao aproveitamento destes resíduos. Isto limita as opções
para a sua reciclagem, já que o desempenho de qualquer material passa pelo conhecimento de
suas propriedades, associadas diretamente com sua estrutura e processamento. Processamento,
estrutura, propriedades e desempenho são quatro componentes básicos da ciência e
engenharia de materiais. Sem isto, como aumentar o valor agregado do que não se conhece?
Também crescem os trabalhos com microscopia de força atômica em materiais
biológicos. Estudos como a ação de medicamentos na parede celular, crescimento de fungos,
resolução da estrutura de cristais de proteínas, interação lectina/açúcar, efeito de doenças
sobre tecidos e células, nanoestrutura de compostos orgânicos, estudo conformacional de
polissacarídeos, espectroscopia de força em macromoléculas, etc. são algumas das pesquisas
em pleno andamento. Como diz o Prof. Benildo Cavada, “o céu é o limite” ou ainda meu
orientador, Prof. Valder Freire, “podemos tirar muito leite”.
De uma forma geral, esta tese mostrou mais do que o aproveitamento de resíduos
e a utilização da microscopia de força atômica em materiais biológicos. Mostrou a
importância da interdisciplinaridade por meio da interação com laboratórios e especialistas de
diversas áreas do conhecimento. De simples conversas na “mesa de um bar”, encontros em
congressos ou até mesmo no saguão de um aeroporto podem nascer grandes parcerias. Foi o
que aconteceu com muitos dos trabalhos apresentados aqui. E destas interações, laboratórios
foram construídos e grupos de pesquisas consolidados. E assim a ciência deve caminhar. Ela é
uma só. Divisões acadêmicas como Física, Química, Matemática, Medicina, Biologia, etc.
foram criadas pelo ser humano. O conhecimento não reconhece essas divisões e lamenta a
formação de “tribos” que muitas vezes criam barreiras ao desenvolvimento em todos os
níveis.
Segundo alguns filósofos da ciência, existem cinco concepções de
desenvolvimento: econômica, biológica, cultural, política e integral. A concepção biológica
está associada a uma melhoria das condições que procuram satisfazer as necessidades básicas
do ser humano (saúde, alimentação, moradia, etc.). Na concepção econômica, temos o
desenvolvimento identificado com o crescimento econômico. Na política, o desenvolvimento
está associado ao crescimento dos direitos políticos e humanos. A concepção cultural
considera o desenvolvimento como uma conseqüência de atividades relacionadas às áreas da
cultura e educação.
A sociedade não é um sistema estático. Não podemos isolar suas variáveis
políticas, culturais, econômicas ou biológicas, construindo um sistema com grau de resposta
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11. Conclusões e Perspectivas
___________________________________________________________________________________________
278
dependente unicamente de uma destas variáveis. Por exemplo, não podemos esperar que a
liberdade política, propiciada pelo voto, seja utilizada de uma forma efetiva em uma
coletividade com um nível cultural precário, que por sua vez influencia e é influenciada pela
política econômica e social. Ou seja, temos um sistema não linear, realimentado, que
apresenta sensibilidade as condições de suas variáveis sociais. Na verdade, os aspectos
políticos, econômicos, biológicos e culturais estão interligados, formando uma rede de
interações. Desta forma, o grau de desenvolvimento não pode ser avaliado sob qualquer uma
destas concepções isoladamente. Ao invés disto se procurarmos promover o desenvolvimento
simultâneo destes aspectos estaremos mais próximos de um desenvolvimento real, pleno.
Assim, chegamos na concepção integral de desenvolvimento. Nesta, as variáveis que
interagem no sistema social são vistas de uma forma global, tendo igual importância na
resposta do meio (desenvolvimento ou subdesenvolvimento).
Então, qual o papel da ciência no desenvolvimento? Assim como a arte e a
religião, a ciência entra como uma das ferramentas para o desenvolvimento. Entretanto, a
ciência encontrou a possibilidade de uma abordagem mais eficaz da realidade uma vez que
permite uma maior previsibilidade dos fenômenos e, com isto, maior poder para provocar
transformações na natureza. Aliada a tecnologia, que é a técnica aprimorada pelo saber
científico, conseguiu alterar nossas vidas com grande velocidade a partir do século 20. O
poder da ciência e da tecnologia provocou maravilhas jamais sonhadas pelos nossos
antepassados. Contudo, este poder é ambíguo, pois também tem levado o homem a uma
sociedade voltada ao consumo e o nosso planeta, a um destino nada animador. O que então
está errado com a ciência? O erro está na sua concepção. A ciência deve ter uma concepção
integral, onde cada parte contribui igualmente para a visão geral do todo. Uma área não é
mais importante que outra. Um grupo não é, em tese, melhor que outro. Nada de “tribos”. No
desenvolvimento integral só há lugar para uma ciência integral. Isto deveria ser ainda mais
evidente no meio público acadêmico, onde as verbas para o investimento em pesquisa
originam-se do Estado e, consequentemente, do povo. E a ele devemos satisfação.
O que foi descrito nesta tese representa apenas uma parte de todo o trabalho que
foi realizado durante meu período de pós-graduação. Não tenho a pretensão de que este texto
sirva como um “caminho das pedras”, mas espero que o material contido aqui possa servir
como uma orientação principalmente aos estudantes de iniciação científica, que representam o
futuro de nossa pós-graduação. Como esta tese nasceu de questionamentos, a estes estudantes
dou um conselho: questionem seus professores e seus orientadores. Nem sempre eles estão
certos. Não sejam meros espectadores do mundo ao seu redor. Como disse David Copperfield
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11. Conclusões e Perspectivas
___________________________________________________________________________________________
279
em David Copperfield de Charles Dickens: ”Serei eu o herói de minha própria história ou
alguém me substituirá?”. Portanto, sejam vocês os heróis das suas próprias histórias.
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Anexo A: Artigos publicados
__________________________________________________________________________________________
282
A.2 EVALUATION OF RED BLOOD CELLS OF HEALTHY SUBJECTS
AND PATIENTS WITH MYELODYSPLASTIC SYNDROME (2005)
Periódico: Microscopy and Microanalysis 11 (supp 3), 2005
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Anexo A: Artigos publicados
__________________________________________________________________________________________
283
A.3 PRODUCTION AND CHARACTERIZATION OF THE CASHEW
(ANACARDIUM OCCIDENTALE L.) PEDUNCLE BAGASSE ASHES
(2007)
Periódico: Journal of Food Engineering 79 (2007) 1432-1437
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Anexo A: Artigos publicados
__________________________________________________________________________________________
285
A.4 AFM AND HYDRODYNAMIC ELECTROCHEMICAL
CHARACTERIZATION OF THE SELF-ASSEMBLED 1,4-DITHIANE ON
GOLD SURFACE (2007)
Periódico: Journal of Eletroanalytical Chemistry 603 (2007) 21-26
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Anexo B: Artigos submetidos
__________________________________________________________________________________________
289
B.2 AGING OF ENTEROCOCCUS FAECALIS BIOFILMS:
OBSERVATION OF TOPOGRAPHICAL CHANGES BY ATOMIC
FORCE MICROSCOPY (2007)
Periódico: Microscopy and Microanalysis
Aging of Enterococcus faecalis biofilms: observation of topographical
changes by atomic force microscopy
Ricardo P. Santos
a,∗
, Theodora T. P. Arruda
b
, Cibele B. M. Carvalho
b
, Victor A. Carneiro
c
,
Lara Q. V. Braga
c
, Edson H. Teixeira
d
, Francisco V. S. Arruda
d
, Benildo S. Cavada
c
,
Alexandre Havt
c
, Taianá M. de Oliveira
c
, Gustavo A. Bezerra
c
, Valder N. Freire
a,*
a
Departamento de Física, Universidade Federal do Ceará, Caixa Postal 6030, Campus do Pici,
60455-900 Fortaleza, Ceará, Brazil
b
Departamento de Patologia e Medicina Legal, Universidade Federal do Ceará, Caixa Postal
6030, Campus do Pici, 60455-900 Fortaleza, Ceará, Brazil
c
Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas (Biomol-Lab), Universidade Federal do
Ceará, Caixa Postal 6020, Campus do Pici, 60455-900 Fortaleza, Ceará, Brazil
d
Faculdade de Medicina/Sobral, Universidade Federal do Ceará, Av. Gerardo Rangel s/n,
Campus do Derby, 62041-180 Sobral, Ceará, Brazil
∗
Corresponding author: Tel.: +55-85-3217-1551; Fax: +55-85-4008-9450
E-mail address: rpsantos2000@yahoo.com (Ricardo P. Santos) or valder@fisica.ufc.br (Valder N. Freire)
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Anexo B: Artigos submetidos
__________________________________________________________________________________________
290
ABSTRACT
Biofilms are assemblages of microorganisms and their associated extracellular products at an
interface and typically with an abiotic or biotic surface. The study of the morphology of
biofilms is important because they are associated with processes of biofouling, corrosion,
catalysis, pollutant transformation, dental caries, drug resistance, etc. Biofilms have been
examined by atomic force microscopy (AFM), which was proven to be a potent tool to
characterize, qualitatively and quantitatively, the aspects of biofilm/substratum interactions.
In this work, we used AFM to investigate topographical changes during the aging process of
Enterococcus faecalis biofilms, which were generated on sterile cellulose nitrate membrane
(CNM) filters in brain heart infusion (BHI) broth agar blood plates, after 24, 36, 72, 192, and
360 h. AFM height images showed topographical changes due to biofilm aging, which were
used to characterize several aspects of the bacterial surface such as the presence of
extracellular polymeric substance, and the biofilm age. The mean roughness (R
a
) was shown
to quantify the general topographical changes in the biofilm surface due to its aging,
highlighting the technical power of AFM in the quantitative and qualitative, non-destructive
study of the Enterococcus faecalis biofilm surface.
Keywords: AFM, biofilm, cellulose nitrate membrane, Enterococcus faecalis, EPS, Mean
roughness, topographical behavior.
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Anexo B: Artigos submetidos
__________________________________________________________________________________________
291
B.3 DEFORMATION INDUCED MARTENSITE IN AN AISI 301LN
STAINLESS STEEL: CHARACTERIZATION AND INFLUENCE ON
PITTING CORROSION RESISTANCE (2007)
Periódico: Materials Research Bulletin
Deformation induced martensite in an AISI 301LN stainless steel: characterization and
influence on pitting corrosion resistance
Abreu, H.F.G.
1,*
; Carvalho, S.S.
1
; Lima-Neto
1
, P; L.
1
; Santos, R.P
1
.; Freire, V.N.
1
;Silva, P.O.
2
.
Tavares, S.S.M.
3
.
1
Universidade Federal do Ceará, Brazil, e-mail: hamilton@ufc.br
2
Petrobras- Lubnor – Fortaleza –CE, Brazil.
3
Universidade Federal Fluminense, Brazil
Abstract
In austenitic stainless steels, plastic deformation can induce martensite formation. The
induced martensite is related to the austenite (γ) instability at temperatures close or below
ambient temperature. The deformation process can induce the formation of two types of
martensite: ε and α’. In this work, the deformation induced martensite was analyzed by X-ray
diffraction, electron back scatter diffraction (EBSD), magnetic methods and atomic force
microscope (AFM) in samples of austenitic stainless steel AISI 301LN. Results did not show
the presence of ε martensite. Both techniques, x-ray diffraction and ebsd, presented similar
quantities for the α’-martensite. Texture results indicate that the crystallographic orientation
of the formed α’-martensite is {001}<110> and {103}<110> and the parent austenite is
{hkl}<111>. The morphology of α’-martensite was analyzed by AFM. Corrosion tests
showed that deformation reduces pitting corrosion resistance. All results were compared with
AISI 316L stainless steel.
Key words: Stainless steel, induced martensite, corrosion.
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Anexo B: Artigos submetidos
__________________________________________________________________________________________
292
B.4 OPTICAL ABSORPTION AN ELECTRONIC BAND STRUCTURE
FIRST-PRINCIPLES CALCULATIONS OF α-GLYCINE CRYSTALS
(2007)
Periódico: Physical Review B
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Anexo B: Artigos submetidos
__________________________________________________________________________________________
294
B.5 DETERMINATION OF THE FRACTAL DIMENSION OF LEAF
VASCULAR SYSTEM SPECIES OF GENUS RELBUNIUM (ENDL.)
HOOK. F. (RUBIACEAE) (2007)
Periódico: Journal Theoretical Biology
Determination of the fractal dimension of leaf vascular system species of
genus Relbunium (Endl.) Hook. F. (RUBIACEAE)
RICARDO P. SANTOS
∗1
, RINALDO P. SANTOS
*2
, B. S. CAVADA
3
, J. L. MARTINS
4
, T. M.
OLIVEIRA
3
, G. A. BEZERRA
3
, J. E. A. MARIATH
2
1
Departamento de Física, Universidade Federal do Ceará, Caixa Postal 6030, Campus do Pici,
60455-900, Fortaleza, Ceará, Brazil.
2
Laboratório de Anatomia Vegetal, Departamento de Botânica, Instituto de Biociências,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Campus do Vale, 91501-970, Porto Alegre, Rio
Grande do Sul, Brazil.
3
Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas(BIOMOL), Universidade Federal do
Ceará, Caixa Postal 6020, Campus do Pici, 60455-900, Fortaleza, Ceará, Brazil
4
Instituto de Química e Geociências (IQG), Universidade Federal de Pelotas, Campus do
Capão do Leão, 96160-000, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brazil.
The fractal analysis has been used as a powerful tool to characterize the complexity of plant
structures. Trees ramification, root systems and vascular process are some examples of
patterns studied by this geometry. The fractal dimension quantifies the complexity of these
structures. In this paper, the fractal dimension of leaf vascular system was determined in three
species of genus Relbunium (Endl.) Hook. F.: R. megapotamicum (Spreng.) Ehreng., R.
hirtum (lam.) K. Schum, and R. hypocarpium Hemsl. The results showed significant
differences among the fractal dimension of these species: 1.387 (R. megapotamicum), 1.561
(R. hirtum) and 1.763 (R. hypocarpium), indicating that this parameter can to be used as
taxonomic attribute to distinguish species, and as numerical expression of the venation
density.
Key words: Biometry, fractal dimension, leaf, Relbunium, vascularization, venation density.
∗
Corresponding authors. E-mail: rpsantos2000@yahoo.com and rinaldo.santos@ufrgs.br
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ARTIGOS À SUBMETER
C.1 IMMOBILIZATION OF INVERTASE INTO SINTERIZED COAL
FLY ASHES FOR HYDROLYSIS OF SUCROSE: STABILITY,
PROPERTIES AND APPLICATION IN BIOREACTORS (2007)
Periódico: a definir
Immobilization of invertase into sinterized coal fly ashes for hydrolysis of sucrose:
stability, properties and application in bioreactors
Albertini, A. V. P.
1
; Reis, A. L S.
1
; Teles, F. R. R.
1
; Souza, J. C.
2
; Rolim Filho, J. L.
2
;
Martins, D. B. G.
1
; Salinas, C. R. M.
3
; Nogueira, V. N.
4
; Santos, R. P.
4
; Gadelha, C. A. A.
5
;
Martins, J. L.
6
; Cavada, B. S.
5
; Lima Filho, J.L.
1
1. Departamento de Bioquímica and Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami
Universidade Federal de Pernambuco.
4. Departamento de Física, Universidade Federal do Ceará, Caixa Postal 6030, Campus do
Pici, 60455-900 Fortaleza, Ceará, Brazil.
5. Universidade Federal da Paraíba, Centro de Ciências Exatas e da Natureza - Campus I,
Departamento de Biologia Molecular, Cidade Universitária, Campus Castelo Branco,
58059000 João Pessoa, Paraíba, Brazil
6. Instituto de Química e Geociências (IQG), Universidade Federal de Pelotas, Campus do
Capão do Leão, 96160-000 Pelotas, Rio Grande do Sul, Brazil
7. Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas (BIOMOL-Lab), Universidade Federal
do Ceará, Caixa Postal 6020, Campus do Pici, 60455-900 Fortaleza, Ceará, Brazil
Author’s address E-mail: alessandro.albertini@gmail.com
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________
C
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Anexo C: Artigos à submeter
__________________________________________________________________________________________
296
Abstract
Ceramics prepared with coal fly ashes added to non-porous glass beads were used as a support
for immobilization of invertase. The silanization of glass was gone with 2% 3-
aminopropyltriethoxysilane solution in toluene, through covalent binding immobilization of
the alkyl amine to glutaraldehyde and subsequent attachment of the enzyme molecule to
glutaraldehyde via Schiff’s base linkage. The protein amount and specific activity of the
immobilized enzyme on 0.438 M sucrose (pH 5.0 at 45ºC) were 1.37 mg/ 0.25g of particles
and 0.67 U/mg protein (19.89 %) of that estimated for the free enzyme, respectively. The
apparent K
m
for immobilized invertase was approximately 10-fold lower than free enzyme.
Moreover, the results in bioreactor the effect of continuous flow injection (inffluent, effluent
and alternated) showed obtained 100% of inversion at 16h of reaction with alternated flow
injection.
Key words: immobilization; invertase; coal fly ashes; ceramics; glass; biorectors.
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Anexo C: Artigos à submeter
__________________________________________________________________________________________
297
C.2 X-RAY DIFFRACTION, FOURIER TRANSFORM INFRARED,
MICROHARDNESS, AND ATOMIC FORCE MICROSCOCOPY
ANALYSES OF THE OF THE PERNA PERNA MUSSEL SHELLS
THERMALLY TREATED (2007)
Periódico: a definir
X-ray diffraction, Fourier Transform Infrared, Microhardness, and Atomic Force
Microscocopy analyses of the of the Perna perna mussel shells thermally treated
R. P. SANTOS
a*
, M. L. PESSATTI
b
, T. L. P. PESSATTI
b
, J. L. MARTINS
c
, C. A. A. GADELHA
d
, J. B.
CAJAZEIRAS
e
, B. S. CAVADA
e
, T. M. OLIVEIRA
e
, G. A. BEZERRA
e
, V. N. FREIRE
a*
a
Departamento de Física, Universidade Federal do Ceará, Caixa Postal 6030, Campus do Pici,
60455-900 Fortaleza, Ceará, Brazil
b
Universidade do Vale do Itajaí, Centro de Ciências Tecnológicas da Terra e do Mar, Curso
de Ciências Biológicas, Rua Uruguai, 458, Centro, 88302-202 Itajaí, Santa Catarina, Brazil
c
Instituto de Química e Geociências (IQG), Universidade Federal de Pelotas, Campus do
Capão do Leão, 96160-000 Pelotas, Rio Grande do Sul, Brazil
d
Universidade Federal da Paraíba, Centro de Ciências Exatas e da Natureza - Campus I,
Departamento de Biologia Molecular, Cidade Universitária, Campus Castelo Branco,
58059000 João Pessoa, Paraíba, Brazil
e
Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas (BIOMOL-Lab), Universidade Federal do
Ceará, Caixa Postal 6020, Campus do Pici, 60455-900 Fortaleza, Ceará, Brazil
Corresponding author. Tel.: +55-85-4008-9915; Fax: +55 (85) 4008-9450
E-mail address: rpsantos2000@yahoo.com (R. P. SANTOS) or valder@fisica.ufc.br (V. N. FREIRE)
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Anexo C: Artigos à submeter
__________________________________________________________________________________________
298
Abstract: Mussel shells are extraordinarily tough natural nano-composites with crack- and
shatter-resistant properties due to their complex nano-architeture, inspiring material scientists
and having applications as biomaterial for implants and ceramics. They are formed by well
structured calcite (CaCO
3
) and aragonite (CaCO
3
polymorph) platelets glued by organic
matrix components. The nacre (mother pearl side) is formed of polygonal shaped aragonitic
platelet layers, separated by a thin layer of biological organic adhesive. Their nanostructure
can be strongly modified by heat, which acts inducing crystal structure and chemical
transformations, as well as protein denaturation. In this work, we used X-ray diffraction,
fourier transform infrared, microhardness, and atomic force microscopy in the study of Perna
perna mussel shells in natura and thermally treated in the 100–600
º
C range. Analysis
revealed physical and chemical changes in the shell associated to organic/inorganic phase
transformations, and degradation material organic.
Key words: AFM, FT-IR, microhardness, nacre, Perna perna mussel shells, XRD,
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LABORATÓRIO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE
MATERIAS (LCTM)
O Laboratório de Ciência e Tecnologia de Materiais (LCTM-UFC) do
Departamento de Física da Universidade Federal do Ceará nasceu de um sonho do Prof. Dr.
Valder Nogueira Freire. Até o momento da defesa desta tese (11/04/2007), o LCTM-UFC está
divido em dois laboratórios: um de preparação de amostras e outro de caracterização de
materiais.
O laboratório de preparação de amostras foi montado com a seguinte
infraestrutura:
• Pia;
• Exaustor para saída de gases e ventilação do meio;
• Instalação de gases (duas linhas);
• Cilindro de N
2
para uso comercial;
• Dois desumidificadores;
• Uma estufa para secarem e esterilização;
• Dois fornos tipo mufla até 1200
o
C;
• Um forno tubular para queima em atmosfera controlada até 1200
o
C;
• Um forno tubular para queima em atmosfera controlada até 1800
o
C (a ser adquirido, já
aprovado em projeto);
• Dois fornos de microondas adaptados para queima (temperatura estimada de 2000
o
C);
• Dois tubos (reatores) de mulita para queima em atmosfera controlada;
• Um peneirador automático (a ser adquirido, já aprovado em projeto);
• Peneiras com malhas de 22, 45 e 65 µm;
• Uma capela para exaustão de gases (a ser adquirido, já aprovado em projeto);
• Uma prensa para compactação uniaxial;
• Um moinho de bolas (a ser aquirido, já aprovado em projeto);
• Vidrarias diversas (Becker, pipeta, placa de Petri, etc...);
• Reagentes diversos;
As Figuras D.1-D.4, mostram detalhes de alguns equipamentos do laboratório de
preparação de amsotras.
D
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Anexo D: Laboratório de Ciência e Tecnologia de Materiais (LCTM)
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300
Figura D.1. Prensa Sky para compactação uniaxial (a) e estufa Ícamo para secagem e esterilização de
materiais (b)
Figura D.2. Forno tubular para queima em atmosfera controlada (a) e detalhe interno do forno tubular
mostrando o tubo de alumina (b)
(a)
(b)
(a)
(b)
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Anexo D: Laboratório de Ciência e Tecnologia de Materiais (LCTM)
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301
Figura D.3. Muflas para tratamento térmico em atmosfera de ar. (a) e Forno de microondas adaptado
para tratamento em atmosfera de ar (b).
Figura D.4. Forno tubular, microondas adapatado e os elementos da linha de gases (a). Em (b), detalhe
da tubulação das duas linhas da instalação de gases.
O laboratório de caracterização de materiais foi montado com a seguinte
infraestrutura:
• Split de 18000 Btu’s;
• Rede com 8 pontos para conexão com a Internet;
• Três microcomputadores IBM-PC para captura de dados e controle de equipamentos;
• Uma balança analítica;
• Um espectrômetro UV-VIS-IV TIDAS;
• Um medidor de área superficial e porosidade AUTOSORB-1MP;
• Um analisador térmico TGA/DTA-60 (a ser adquirido, já aprovado em projeto);
• Um microscópio ótico metalográfico Nikon LV 100D com câmera de captura de imagens.
(a)
(b)
(a)
(b)
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Anexo D: Laboratório de Ciência e Tecnologia de Materiais (LCTM)
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302
As Figuras D.5-D.7, mostram detalhes de alguns equipamentos do laboratório de
caracterização de materiais.
Figura D.5. Medidor de área superficial e porosidade AUTOSORB-1-MP (a) e balança analítica
Bioprecisa (b) para a medição da massa de materiais.
Figura D.6. Espectrômetro UV-VIS-IR TIDAS para análise de sólidos e soluções (a) e microscópio
ótico metalográfico LV 100D para o estudo de superfícies (b).
(a)
(b)
(a)
(b)
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Anexo D: Laboratório de Ciência e Tecnologia de Materiais (LCTM)
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303
Figura D.7. Microcomputadores para a análise de dados e controle de equipamentos.
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O MICROSCÓPIO DE VARREDURA POR SONDA
DO LMA
O Laboratório de Microscopia Atômica (LMA) do Departamento de Física da
Universidade Federal do Ceará está equipado com um microscópio de varredura por sonda
MultiMode SPM Nanoscope IIIa, fabricado pela Digital Instruments Co., atualmente
pertencente ao grupo Veeco Instruments Inc. Sua aquisição deve-se aos esforços do Prof. Dr.
Valder Nogueira Freire, juntamente com pesquisadores associados. Este equipamento
representou uma grande conquista para o grupo de semicondutores, pois permitiu a interação
através de pesquisas experimentais com diferentes áreas do conhecimento (Medicina,
Microbiologia, Odontologia, Bioquímica, Zoologia, Veterinária, dentre outras).
O MultiMode SPM é um microscópio de varredura por sonda capaz de realizar
vários modos de análise de superfície, dentre eles:
• Contato – Mede a topografia da superfície de uma amostra através da varredura de uma
sonda mantida em contato com a superfície. Opera em ar e em fluidos;
• Intermitente – Mede a topografia da superfície de uma amostra através da varredura de
uma sonda que toca a superfície de forma oscilatória. Neste modo, a força de atrito entre a
sonda e a superfície são eliminadas, reduzindo assim seu dano sobre amostras macias.
Tipicamente usado em amostras biológicas. Opera em ar e em fluidos;
• Fase – Permite obter imagens contrastadas pelas diferenças na adesão e na
viscoelasticidade da superfície;
• Não contato – Mede a topografia através das forças de Van der Waals entre a superfície e
a sonda, acima da superfície;
• Microscopia de força magnética – Mede a distribuição do gradiente do campoe elétrico
em cima da superfíce da amostra;
• Microscopia de força elétrica - Mede a distribuição do gradiente da força magnética em
cima da superfíce da amostra;
• LiftMode
TM
– É uma combinação de duas técnicas, que mede separadamente a topografia
e uma outra propriedade selecionada (magnética ou elétrica);
• Modulação de força – Mede a elasticidade relativa da superfície;
• Microscopia de força lateral – Mede as forças de atrito entre a sonda e a superfície da
amostra;
E
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Anexo E: O microscópio de varredura por sonda do LMA
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305
• Microscopia de tunelamento – Mede a topografia da duperfície através da corrente de
tunelamento que depende da distância de separação entre a sonda e a superfície da
amostra condutora.
• Microscopia eletroquímica – Mede a estrutura da superfície e propriedades de condução
de materiais imersos em soluções eletrólitas com ou sem controle de potencial.
O MultiMode SPM (Fig. E.1) consiste de um computador para o controle e
análise, um vídeo para a imagem, um vídeo para o controle via programa, um controlador
Nanoscope IIIa e o microscópio propriamente dito. Ele está montado sobre uma mesa
peneumática, em cima e arreia, para evitar os efeitos de vibração. Também possui uma lupa
com câmara digital acoplada ao microscópio, conectada a um monitor de TV, para a
visualização da haste, durante sua a proximação da superfície. A lupa possui uma fonte de
alimentação para iluminação episcópica.
Figura E.1. O MultiMode SPM do LMA. MP = mesa pneumática; M = micrsocópio; LC = sistema
lupa mais câmera de vídeo; TV = monitor de TV; V = vídeo de imagem; C = controlador Nanoscope
IIIa; F = fonte de iluminação episcópica para a lupa.
LC
M
M
M
MP
TV
C
M
V
M
F
M
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Anexo E: O microscópio de varredura por sonda do LMA
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306
O microscópio é a parte principal do sistema (Fig. E.2). Nele, a sonda interage
com a amostra colhendo as informações sobre a topografia e outras propriedades da
superfície. O micreoscópio é composto pelo cabeçote, scanner e a base.
Figura E.2. O Microscópio. Ca = cabeçote; Es = scanner; Ba = base
É no cabeçote (Fig. E.3) que estão localizados o arranjo de fotodiodos, o laser e o
porta sonda (tipholder) (Fig. E.4), onde a sonda é instalada. O cabeçote está fixado sobre um
posicionador X-Y que facilita um posicionamento macrocópico da sonda sobre a superfície.
Para que a deflexão da haste seja percebida, o feixe de um laser incide sobre a mesma, de
modo que é refletido para o arranjo de fotodiodos onde a diferença de potencial gerada dá a
medida desta deflexão.
A sonda (Fig. E.5) é instalada no porta sonda para permitir a colocação correta da
haste com a ponta na cavidade do cabeçote, no feixe do laser. Este suporte fixa a sonda em
relação ao cabeçote permitindo a operação em diferentes modos de microscopia.
Figura E.3. Detalhe do cabeçote
Ca
M
Es
M
Ba
M
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Anexo E: O microscópio de varredura por sonda do LMA
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307
Figura E.4. Um dos porta sondas de AFM do SPM
Figura E.5. Caixa com sondas para AFM no modo intermitente
O scanner é a parte responsável pela varredura da superfície. Quem se movimenta
é o controlador e não a amostra. O controlador é responsável pelos movimentos nos eixos X,
Y e Z.
A base, além de sustentar o scanner e o cabeçote, possui mostratores que indicam
as voltagens no arranjo de fotodiodos dependendo do modo de operação do microscópio.
Estas voltagens contêm informações sobre o comportamento da haste na superfície da
amostra. Em modo STM, os mostradores ficam deslicados.
Existem diversos tipos de sondas sendo cada uma para um tipo específico de
interação sobre a superfície. As sondas são compostas por substrato, haste e ponta (Fig. E.6).
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Anexo E: O microscópio de varredura por sonda do LMA
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308
Figura E.6. As partes de uma sonda de AFM
Na microscopia de força atômica (AFM) são utilizados dois tipos de sondas: uma
com quatro hastes em “V” e outra com apenas uma haste. A sonda com haste única é usada no
modo intermitente (“tapping mode”). Apresentam diversos tipos de constantes de elasticidade,
desde 0,2 a 42 N/m. São utilizadas, em geral, no estudo de materiais biológico ou macios. Já
as sondas com haste em “V”, utilizadas no modo de contato (“contact mode”), são menos
susceptíveis a movimentos de torção durante a varredura. Apresentam constantes de
elasticidade normalmente entre 0,06 e 0,58 N/m. São indicadas no estudo de superfícies duras,
onde a quebra da ponta pode ocorrer facilmente.
haste
substrato
haste
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