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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Centro de Pesquisa René Rachou
Mestrado em Biologia Celular e Molecular
ASSOCIAÇÕES ENTRE ASPECTOS CLÍNICO-LABORATORIAIS E
PARÂMETROS FENOTÍPICOS CELULARES
DA IMUNIDADE INATA E ADAPTATIVA NA LEISHMANIOSE
TEGUMENTAR AMERICANA
PATRICIA MONTEIRO DE FREITAS TEIXEIRA
Belo Horizonte
Maio de 2005
TESE MBCM - CPqRR
P.M.F. TEIXEIRA 2005
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
Ministério da Saúde
Fundação Oswaldo Cruz
Centro de Pesquisas René Rachou
Curso de Pós-graduação em Ciências da Saúde
“ASSOCIAÇÕES ENTRE ASPECTOS CLÍNICO-
LABORATORIAIS E PARÂMETROS FENOTÍPICOS
CELULARES DA IMUNIDADE INATA E ADAPTATIVA NA
LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA”
por
Patrícia Monteiro de Freitas Teixeira
Dissertação apresentada com vistas à obtenção do Título de Mestre em
Ciências na área de Biologia Celular e Molecular.
Orientador: Dr. Olindo Assis Martins Filho
Maio, 2005
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Ministério da Saúde
Fundação Oswaldo Cruz
Centro de Pesquisas René Rachou
Curso de Pós-graduação em Ciências da Saúde
Esta Dissertação intitulada:
“ASSOCIAÇÕES ENTRE ASPECTOS CLÍNICO-
LABORATORIAIS E PARÂMETROS FENOTÍPICOS
CELULARES DA IMUNIDADE INATA E ADAPTATIVA NA
LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA”
apresentada por
Patrícia Monteiro de Freitas Teixeira
foi avaliada pela banca examinadora composta pelos seguintes membros:
Prof. Dr. Olindo Assis Martins Filho
Profa. Dra. Andréa Teixeira de Carvalho
Profa. Dra. Débora d’Avila Reis
Dissertação defendida e aprovada em 19 de maio de 2005
Dedico este trabalho a Deus, pela presença
constante em minha vida.
Aos meus pais, por colaborarem pelo meu
crescimento pessoal e profissional e por lutarem pela
realização dos meus sonhos.
Ao Olindo, por seus ensinamentos e por toda sua
dedicação.
Agradecimentos
Ao meu Pai do Céu, “não tenho palavras para agradecer Tua bondade, dia após dia,
me cercas com fidelidade, nunca me deixes esquecer que tudo que tenho, tudo que
sou, o que vier a ser, vem de Ti Senhor. Tudo, entrego a Ti.”
À minha querida mãe, a força transmitida e o enorme amor que me manteve
perseverante e confiante. E por ser minha amiga do coração, compartilhou comigo
todos esses momentos. E ao meu pai, que mesmo ausente, lutou para a realização dos
meus sonhos. Muito obrigada!
Ao Luiz, pelo carinho, apoio e ajuda nessa caminhada. E pela forte presença em todos
os momentos.
Aos meus queridos irmãos, a Bel, pelos conselhos, a Sissi, por sua luz, pela paciência
em me ouvir, ao Arnaldo, pelo carinho e a Cláudia pelo incentivo. Obrigada a vocês
pela amizade e por nossa cumplicidade.
Ao meu tio Arnaldo, exemplo de pai.
À minha querida e eterna amiga Denise. Obrigada por ter me ajudado a chegar aqui,
sem você nada disso seria possível. Obrigada pela sua amizade. Obrigada por me
ouvir. Obrigada por me compreender. Obrigada por toda ajuda. Obrigada pela pessoa
que é. Obrigada por fazer parte da minha vida e da minha família. Muito obrigada.
À Thalita, pelas palavras tão sábias, tão esclarecedoras, sempre me ajudando na busca
da consciência.
Ao ejC, minha família do coração. Obrigada pelo carinho e preocupação.
Ao Dr. Olindo, pelo exemplo de competência. Obrigada por todos ensinamentos, pelo
crescimento profissional e pessoal. Pelo carinho, pela atenção e dedicação. Obrigada
por ter permitido realizar esse trabalho com você.
À Dra. Silvana, pela doce presença, pelas sugestões e por todo apoio.
À Ariane, por toda ajuda, por todos os ensinamentos. Por ter cooperado para o meu
crescimento, pela sua enorme e preciosa colaboração para a realização desse trabalho.
À Vanessa Pascoal, Roberta Dias e Jordana por todo o apoio. Pela amizade, pela
preocupação com o meu trabalho. Obrigada por serem tão especiais.
À Dani e ao Renato, obrigada por terem feito parte de um momento tão importante da
minha vida. Obrigada por todo carinho, por todo cuidado com o meu trabalho e por
todos os ensinamentos. Obrigada por cada momento que estive com vocês. Foi um
imenso prazer. Adoro vocês!
À Eliandra, pela amizade, pelo carinho com que me recebeu. Pelas conversas, por
tornar a vida mais alegre, por ter me proporcionado dias tão agradáveis. Obrigada por
toda ajuda.
À Roberta Félix, pelos conselhos e atenção. Por estar sempre disposta a nos atender.
À Bia, por todo o apoio técnico.
Ao Márcio, pela atenção e pela disposição em solucionar as minhas dúvidas.
A Léia, por sua cumplicidade e por ter compartilhado comigo momentos de
descobertas. Obrigada pela sua Presença significativa.
Aos meus queridos e inesquecíveis amigos do laboratório, obrigada por ter pessoas
como vocês ao meu lado: Xênia, Simone, Renata, Ana Marciano, Ana Wendling,
Izabelle, Paula, Júlia, Rodrigo, Natália, Luíza, Marina e Jaqueline.
Aos amigos do laboratório de Imunologia, pelo carinho com que sempre me receberam.
Aos meus amigos da Pós – graduação, pela amizade. Em especial à Marcela, Fabrícia,
Fernanda e Marília pelas conversas, e pelos momentos de partilha.
Ao Paulo, pela atenção e por ajudar a solucionar os meus problemas.
A Comissão de Pós-Graduação – CPG, por nos receber com atenção, estando sempre
disponíveis para nos ajudar.
À Carol, por todo auxílio na estatística.
Ao Segemar, pelas constantes e imprescindíveis buscas para a concretude deste.
Ao Edmar pela assistência na informática.
À Carla por tornar o ambiente adequado e propício para a realização do trabalho.
À Cíntia por facilitar o trabalho na lavagem dos materiais.
Aos funcionários, pelo carinho e pela inesquecível acolhida.
Aos pacientes, pela oportunidade de aprendizado.
“O conhecimento pode pôr o homem em contato com
pequenas porções de felicidade que a vida lhe
oferece; e, uma vez conseguidas, já não as poderá
perder, pois se haverão integrado a sua vida.”
(da Logosofia)
INDICE
LISTA DE TABELAS.........................................................................................................i
LISTA DE FIGURAS.........................................................................................................ii
LISTA DE ABREVIATURAS..........................................................................................viii
RESUMO..........................................................................................................................xi
ABSTRACT.....................................................................................................................xii
INTRODUÇÃO..................................................................................................................1
OBJETIVOS....................................................................................................................13
PACIENTES, MATERIAL E MÉTODOS.........................................................................16
I – PACIENTES...............................................................................................................17
II – MATERIAL E MÉTODOS..........................................................................................20
1 - Material biológico...................................................................................................20
2 - Imunofenotipagem dos leucócitos do sangue periférico por citometria de
fluxo.................................................................................................................................20
3 - Análises estatísticas...............................................................................................33
RESULTADOS................................................................................................................34
PARTE 1 - Aspectos fenotípicos de células envolvidas na imunidade inata: ênfase em
monócitos e neutrófilos....................................................................................................35
1 - Aspectos fenotípicos de monócitos circulantes......................................................36
2 - Aspectos fenotípicos de neutrófilos circulantes.....................................................39
PARTE 2 - Aspectos fenotípicos de células envolvidas na imunidade adaptativa: ênfase
em subpopulações linfocitárias.......................................................................................43
1 - Aspectos fenotípicos de linfócitos T circulantes....................................................44
2 - Aspectos fenotípicos de linfócitos B circulantes....................................................49
PARTE 3 - Associações entre aspectos clínico-laboratoriais e parâmetros fenotípicos
celulares da imunidade inata e adapatativa: ênfase no número e tempo das lesões e na
positividade da intradermorreação de Montenegro.........................................................55
1 - Aspectos fenotípicos de monócitos circulantes.....................................................56
2 - Aspectos fenotípicos de neutrófilos circulantes....................................................62
3 - Aspectos fenotípicos de linfócitos T circulantes....................................................70
4 - Aspectos fenotípicos de linfócitos B circulantes....................................................84
SINTESE DOS RESULTADOS.....................................................................................100
DISCUSSÃO.................................................................................................................105
CONCLUSÃO...............................................................................................................118
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................120
i
LISTA DE TABELAS
TABELA I: População estudada......................................................................................19
TABELA II: Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para análise
de populações, subpopulações celulares e moléculas de superfície..............................22
ii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de monócitos
CD16+ no sangue periférico........................................................................................................23
Figura 2: Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de monócitos
pro-inflamatórios (CD4low+HLA-DR++) no sangue periférico.....................................................24
Figura 3: Seqüência de procedimentos utilizados para avaliar a expressão da molécula CD23
em monócitos no sangue periférico.............................................................................................25
Figura 4: Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de neutrófilos
CD28+, HLA-DR+ e CD23+ no sangue periférico........................................................................26
Figura 5: Seqüência de procedimentos utilizados para avaliar a expressão da molécula CD16
em neutrófilos no sangue periférico.............................................................................................27
Figura 6: Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de subpopulação
de linfócitos T e subpopulação de linfócitos B no sangue periférico............................................29
Figura 7: Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de subpopulação
de linfócitos T ativados no sangue periférico...............................................................................30
Figura 8:
Seqüência de procedimentos utilizados para avaliar a expressão da molécula HLA-DR
em linfócitos B no sangue periférico............................................................................................32
Figura 9: Percentual de monócitos CD16+ no sangue periférico de indivíduos com
Leishmaniose Cutânea Localizada LCL ( ) e de indivíduos não infectados NI ( )....................36
Figura 10: Percentual médio de monócitos pró inflamatórios (HLA-DR++) no sangue periférico
de indivíduos com Leishmaniose Cutânea Localizada LCL ( ) e de indivíduos não infectados NI
( )...............................................................................................................................................37
iii
Figura 11: Análise da expressão da molécula CD23 em monócitos do sangue periférico de
indivíduos com Leishmaniose Cutânea Localizada LCL ( ) e de indivíduos não infectados NI
( )..............................................................................................................................................38
Figura 12: Percentual de neutrófilos CD28+ no sangue periférico de indivíduos com
Leishmaniose Cutânea Localizada LCL ( ) e de indivíduos não infectados NI ( )....................39
Figura 13: Percentual de neutrófilos HLA-DR+ no sangue periférico de indivíduos com
Leishmaniose Cutânea Localizada LCL ( ) e de indivíduos não infectados NI ( )....................40
Figura 14: Análise da expressão de CD16 em neutrófilos no sangue periférico de indivíduos
com Leishmaniose Cutânea Localizada LCL ( ) e de indivíduos não infectados NI ( )............41
Figura 15: Percentual de neutrófilos CD23+ no sangue periférico de indivíduos com
Leishmaniose Cutânea Localizada LCL ( ) e de indivíduos não infectados NI ( )....................42
Figura 16: Percentual médio de linfócitos T (A), linfócitos T CD4+ (B) e linfócitos T CD8+ (C)
circulantes no sangue periférico de indivíduos com Leishmaniose Cutânea Localizada LCL ( ) e
de indivíduos não infectados NI ( )............................................................................................45
Figura 17: Percentual de linfócitos T totais HLA-DR+ (A), linfócitos T CD4+HLA-DR+ (B) e
linfócitos T CD8+HLA-DR+ (C) circulantes no sangue periférico de indivíduos com
Leishmaniose Cutânea Localizada LCL ( ) e de indivíduos não infectados NI
( )...............................................................................................................................................47
Figura 18: Razão de linfócitos T CD8+HLA-DR+/CD4+HLA-DR+ circulantes no sangue
periférico de indivíduos com Leishmaniose Cutânea Localizada LCL ( ) e de indivíduos não
infectados NI ( ).........................................................................................................................48
Figura 19: Percentual médio de linfócitos B totais CD19+ (A), B convencionais CD19+CD5- (B)
e linfócitos B1 CD19+CD5+ (C) no sangue periférico de indivíduos com Leishmaniose Cutânea
Localizada LCL ( ) e de indivíduos não infectados NI ( )..........................................................50
iv
Figura 20: Análise da expressão da molécula HLA-DR em linfócitos B circulantes do sangue
periférico de indivíduos com Leishmaniose Cutânea Localizada LCL ( ) e de indivíduos não
infectados NI ( ).........................................................................................................................51
Figura 21: Percentual de linfócitos CD19+CD23+ no sangue periférico de indivíduos com
Leishmaniose Cutânea Localizada ( ) e de indivíduos não infectados NI ( )............................52
Figura 22: Percentual da razão de Monócitos HLA-DR+/Linfócitos T CD8+CD23+ (A),
Monócitos HLA-DR+/Linfócitos T CD8+HLA-DR+ (B) e Linfócitos T HLA-DR+/ Linfócito B total
(C) circulantes no sangue periférico de indivíduos com Leishmaniose Cutânea Localizada LCL
( ) e de indivíduos não infectados NI ( )....................................................................................54
Figura 23: Percentual de monócitos CD16+ no sangue periférico de pacientes portadores de
Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-laboratorias
como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+
( ) e de indivíduos não infectados NI ( )...................................................................................57
Figura 24: Percentual de monócitos pró-inflamatórios HLA-DR++ no sangue periférico de
pacientes portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de
aspectos clínico-laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias (
), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( )....................................59
Figura 25: Análise da expressão da molécula CD23 em monócitos no sangue periférico de
pacientes portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de
aspectos clínico-laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias (
), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( )....................................61
Figura 26: Percentual de neutrófilos CD28+ no sangue periférico de pacientes portadores de
Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-laboratorias
como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+
( ) e de indivíduos não infectados NI ( )...................................................................................63
Figura 27: Percentual de neutrófilos HLA-DR+ no sangue periférico de pacientes portadores de
Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-laboratorias
como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+
( ) e de indivíduos não infectados NI ( )...................................................................................65
v
Figura 28: Análise da expressão de CD16 em neutrófilos no sangue periférico de pacientes
portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-
laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM-
( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( )............................................................67
Figura 29: Percentual de neutrófilos CD23+ no sangue periférico de pacientes portadores de
Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-laboratorias
como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+
( ) e de indivíduos não infectados NI ( )...................................................................................69
Figura 30: Percentual médio de linfócitos T circulantes no sangue periférico de pacientes
portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-
laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM-
( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( )...........................................................71
Figura 31: Percentual médio de linfócitos T CD4+ circulantes no sangue periférico de pacientes
portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-
laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM-
( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( )............................................................73
Figura 32: Percentual médio de linfócitos T CD8+ circulantes no sangue periférico de pacientes
portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-
laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM-
( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( )............................................................75
Figura 33: Percentual médio de linfócitos T totais HLA-DR+ circulantes no sangue periférico de
pacientes portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de
aspectos clínico-laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias (
), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( )....................................77
Figura 34:
Percentual médio de linfócitos T CD4+HLA-DR+ circulantes no sangue periférico de
pacientes portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de
aspectos clínico-laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias (
), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( )....................................79
vi
Figura 35: Percentual médio de linfócitos T CD8+HLA-DR+ circulantes no sangue periférico de
pacientes portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de
aspectos clínico-laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias (
), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( )....................................81
Figura 36: Razão de linfócitos T CD8+HLA-DR+/CD4+HLA-DR+ circulantes no sangue
periférico de pacientes portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em
função de aspectos clínico-laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ),
LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI (
)..........83
Figura 37: Percentual médio de linfócitos B totais CD19+ circulantes no sangue periférico de
pacientes portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de
aspectos clínico-laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias (
), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( )....................................85
Figura 38: Percentual médio de linfócitos B convencionais CD19+CD5- circulantes no sangue
periférico de pacientes portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em
função de aspectos clínico-laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ),
LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI (
)...........87
Figura 39: Percentual médio de linfócitos B1, CD19+CD5+ circulantes no sangue periférico de
pacientes portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de
aspectos clínico-laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias (
), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( )....................................89
Figura 40: Análise da expressão da molécula HLA-DR em linfócitos B circulantes no sangue
periférico de pacientes portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em
função de aspectos clínico-laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ),
LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI (
)...........91
Figura 41: Percentual médio de linfócitos CD19+CD23+ no sangue periférico de pacientes
portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-
vii
laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM-
( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( )............................................................93
Figura 42: Razão em valores absolutos de Monócitos HLA-DR+/CD19+CD23+ circulantes no
sangue periférico de pacientes portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados
em função de aspectos clínico-laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ),
LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( )........95
Figura 43: Razão em valores absolutos de Monócitos HLA-DR+/CD8+HLA-DR+ circulantes no
sangue periférico de pacientes portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados
em função de aspectos clínico-laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ),
LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI (
).........97
Figura 44: Razão entre Linfócitos T HLA-DR+/CD19+ circulantes no sangue periférico de
pacientes portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de
aspectos clínico-laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias
( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( )...............................99
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
ADCC - Citotoxicidade celular dependente de anticorpos
APCs - Células apresentadoras de antígenos
BSA - Albumina bovina sérica
C5 - C9 - Proteínas do complemento
CD -“Cluster of differentiation”
CD4 - Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos T auxiliares
CD8 - Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos T citotóxicos
CD14 - Marcador de superfície celular da população de monócitos
CD16 - Marcador de superfície celular da população de células NK
CD19 - Marcador de superfície celular da população de linfócitos B
DTH - Reação de Hipersensibilidade do tipo tardia
EDTA - Àcido Etilenodiaminotetracético
ELISA - Enzyme linked immu
FACScan - Fluorecence Activated Cell Sorter
Fc - Fração cristalizável de imunoglobulinas
FcRII - Receptor Fc de baixa afinidade para imunoglobulina E, também denominado
CD23
FcRIII - Receptor Fc de baixa afinidade para imunoglobulina G, também denominado
CD16
FITC - Isotiocianato de fluoresceína
FL - Fluorescência
FSC - Forward Angle Light Scatter (Tamanho celular)
FNS - Fundação Nacional de Saúde
ix
GM - CSF - Fator estimulador de colônia de macrófagos e granulócitos
HLA-DR - Antígeno Leucocitário Humano
Ig - Imunoglobulina
IgE - Imunoglobulina E
IgG - Imunoglobulina G
IL - Interleucina
IMF - Intensidade Média de Fluorescência
INF-γ - Interferon gama
LC - Leishmaniose Cutânea
LCF – Fator quimiotático de Leishmania
LCL - Leishmaniose Cutânea Localizada
LMC - Leishmaniose Mucocutânea
LCD - Leishmaniose Cutânea Difusa
LD - Leishmaniose Disseminada
LPG - Lipofosfoglicano
LTA - Leishmaniose Tegumentar Americana
MFF - Solução fixadora
MHC - Complexo Principal de Histocompatibilidade
MIP-1 - proteína inflamatória de macrófago 1alfa
MIP-1 - proteína inflamatória de macrófago 1beta
NI - Grupo não infectado
NK – Natural Killer
NO - Óxido Nítrico
PBMC - Células mononucleares do sangue periférico
PBS-P - Tampão Fosfato Salínico Permeabilizante
x
PBS-W - Tampão Fosfato Salínico de Lavagem
PE – Ficoeritrina
pH - Potencial hidrogeniônico
PMA - Acetato mirístico de forbol
RPMI - Meio de cultivo celular
rpm - rotação por minuto
SSC - Side Angle Light Scatter (Granulosidade celular)
TGF- – Fator de crescimento tumoral beta
Th1 - Células T CD4
+
secretoras do padrão 1 de citocinas
Th2 - Células T CD4
+
secretoras do padrão 2 de citocinas
TNF-α - Fator de necrose tumoral alfa
WHO - Organização Mundial de Saúde
xi
RESUMO
Os estudos que avaliam a participação de eventos imunológicos associados à
progressão e resistência nas Leishmanioses chamam a atenção para a necessidade de
maiores investigações a fim de identificar a influência de variáveis chaves no processo
de categorização dos pacientes. Nesse trabalho analisamos características
imunofenotípicas de leucócitos do sangue periférico de indivíduos portadores de LCL,
categorizados em função de aspectos clínico-laboratoriais, incluindo: o número de
lesões (LCL-1 e LCL-2-4), o tempo de lesão (LCL60 e LCL>60) e a positividade no
teste de Montenegro (LCL-TM- e LCL-TM+), com ênfase em células envolvidas na
imunidade inata e adaptativa. Nossos resultados mostraram que os mecanismos
imunológicos que acompanham a infecção humana por Leishmania são constituídos de
eventos complexos, multifatoriais que envolvem o estabelecimento concomitante de
ativação e imunorregulação do compartimento da imunidade inata bem como aspectos
fenotípicos sugestivos da ativação paralela da imunidade celular e humoral. Esse perfil
complexo foi parcialmente esclarecido, quando consideramos a associação de aspectos
clínico-laboratoriais com os parâmetros fenotípicos avaliados. Observamos um
predomínio de alterações associados à imunidade celular no grupo LCL-1, enquanto
uma maior freqüência de aspectos da imunidade humoral foi detectada no grupo LCL-2-
4. Observamos uma dinâmica típica nos eventos da imunidade inata, mais freqüente no
grupo LCL60 e adaptativa, preferencialmente detectadas no grupo LCL>60.
Associados ao grupo LCL-TM+, foram os aspectos imunofenotípicos da imunidade inata
e adaptativa associados à atividade protetora leishmanicida. Em conjunto, nossos
resultados demonstram a importância de se considerar esses parâmetros clínico-
laboratoriais para a categorização de pacientes portadores de LCL nos estudos de
aspectos imunológicos associados à leishmaniose tegumentar americana.
xii
ABSTRACT
Several studies focusing attention on the immunological events associated with
resistance and susceptibility in Leishmaniasis aware for the need of additional
investigation to identify the influence of key parameters to be used in order to better
classify the patients. Herein we have analyzed immunophenotypic features of peripheral
blood leukocytes from Leishmania patients, categorized base don their clinic-laboratorial
status, including: number of lesions (LCL-1 e LCL-2-4), time of lesion evolution (LCL60
e LCL>60) and the positivity on Montenegro skin test (LCL-TM- e LCL-TM+), focusing
attention on cell involved on the innate and adaptive immunity. Our results demonstrated
that the immunological mechanisms triggered by Leishmania infection in humans are
constituted by multifactorial and complex events that involve the concomitant
establishment of activation and immunoregulation within the innate immunity
compartment as well as phenotypic features suggestive of parallel activation of cellular
and humoral adaptive immune response. This complex profile was partially clarified
when we considered the association between clinical-laboratorial findings and the
phenotypic features evaluated. We observed a predominance of phenotypic alterations
linked to cellular immunity in the LCL-1 group, whereas a higher frequency of aspects
related to humoral immune response was typical of LCL-2-4 group. We have noticed a
classic dynamic of innate immunity events, more frequently observed within the LCL60
group and those of adaptive immune response, preferentially detected for the LCL>60
group. Associated with the LCL-TM+ group we found immunophenotypic features
related with the innate and adaptive leishmanicide protective activity. Taken together,
our findings demonstrated the importance of considering these clinic-laboratorial
parameters to better categorize the Leishmania patients in studies of immunological
aspects associated with the American Cutaneous Leishmaniasis
Associações entre aspectos clínico-laboratoriais e parâmetros fenotípicos celulares da imunidade inata e
adaptativa na Leishmaniose Tegumentar Americana
INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO
2
As leishmanioses são um complexo grupo de doenças causadas por parasitos da
família Trypanosomatidae, do gênero Leishmania (ROSS, 1903). A taxonomia do
gênero Leishmania é bastante complexa. Após extensa revisão, LAINSON & SHAW
(1987) sugeriram a organização das espécies que parasitam o homem em dois
subgêneros: Leishmania e Viannia, levando-se em consideração o local em que os
parasitos multiplicam-se no tubo digestivo do flebotomíneo. O subgênero Viannia
engloba os parasitos do complexo “braziliensis” e o subgênero Leishmania compreende
os parasitos do complexo “mexicana”. No Brasil, as principais espécies que causam
leishmanioses humanas são L. (Viannia) braziliensis, L. (V.) guyanensis, L (Leishmania)
amazonensis , L. (V.) lainsoni, L. (V.) naiffi, L. (V.) shawi e L. (L.) chagasi, sendo as seis
primeiras dermotrópicas e a última apresentando um caráter viscerotrópico (GRIMALDI
et al., 1989).
As leishmanioses apresentam um amplo espectro de formas clínicas que
dependem das espécies de Leishmania envolvidas e da relação parasito-hospedeiro
(SARAIVA et al., 1989). Em função do caráter espectral das manifestações clínicas das
leishmanioses, diversos autores têm proposto diferentes classificações clínicas.
MARZOCHI (1992) propõe a classificação das Leishmanioses sob quatro formas
clínicas: a leishmaniose cutânea localizada (LCL), leishmaniose mucocutânea (LMC),
leishmaniose cutânea difusa (LCD) e leishmaniose visceral (LV). A Leishmaniose
Tegumentar Americana (LTA), objeto de estudo nessa investigação, engloba as três
primeiras formas clínicas. A LCL caracteriza-se por apresentar lesões únicas ou
múltiplas confinadas na pele, observando-se poucos parasitos nas lesões, tendendo à
cura espontânea. As lesões se caracterizam por úlceras com bordas elevadas com o
fundo granuloso, com ou sem exsudação (MARZOCHI, 1992). A LMC acomete,
principalmente a mucosa nasal e oral, sendo na maioria das vezes secundária à lesão
cutânea em atividade ou anos após ter sido cicatrizada. Essa forma clínica é causada,
na maioria das vezes, pela L. braziliensis, apresentando os níveis de anticorpos mais
elevados que a LCL e uma resposta celular bastante aumentada. A LCD apresenta
menor incidência, sendo caracterizada por nódulos não ulcerados disseminados por
todo o corpo do paciente. Essa manifestação clínica apresenta aspectos bem diferentes
das outras formas de LTA. Os casos de LCD no Brasil devem-se, principalmente, à
infecção por L. amazonensis (MARSDEN, 1986).
INTRODUÇÃO
3
Segundo estimativas da Organização Mundial de Saúde (WHO, 2004), a LTA
ocorre em 88 países sendo sua notificação compulsória em apenas 30 deles. Do total
de casos de LTA no mundo, cerca de 90% ocorreram em apenas seis países: o Irã, a
Arábia Saudita, a Síria e o Afeganistão no Velho Mundo, e o Brasil e o Peru na América
do Sul. No continente americano, há uma grande diversidade na casuística dos
diferentes países. No Brasil, o número de casos da LTA vem aumentando
consideravelmente, havendo uma média anual de 35 mil novos casos.
A incidência da
doença no Brasil aumentou de 21.800 casos em 1998 para 60.000 casos em 2003.
Segundo a Secretaria de Estado da Saúde (SES/MG) em Minas Gerais, pelo menos
401 dos 856 municípios já registraram a ocorrência de transmissão de LTA. Foram
notificados 1074 casos de leishmaniose até o final de 1998 (FNS, 1999).
A LTA é mais comum em trabalhadores que entram em contato com a mata onde
ocorre transmissão. Entretanto, ao lado desse aspecto associado à floresta, a doença,
foi descrita em áreas de colonizações antigas há muito tempo desmatadas e destinadas
à agropecuária, como por exemplo, o Vale do Rio Doce, no Estado de Minas Gerais
(MAYRINK et al., 1979). Dessa forma, acredita-se que a alta freqüência da doença em
todos os estados brasileiros, principalmente nas regiões norte e nordeste, devem-se
principalmente a dois fatores epidemiológicos: 1) a ação antrópica invasiva, resultando
na maior exposição à doença, e 2) o processo migratório, na ocupação das periferias
dos centros urbanos, fazendo com que vários mamíferos passem a ser novos
reservatórios do parasito (FNS, 1999). Nesse contexto, os principais reservatórios da
LTA são pequenos roedores silvestres, e em menor proporção animais domésticos.
Os vetores envolvidos na transmissão da leishmaniose são dípteros
pertencentes à família Phlebotominae, ao gênero Lutzomyia (SHAW, 1999). A
transmissão do parasito ocorre através da picada da fêmea infectada para exercer o
repasto sanguíneo no hospedeiro vertebrado, sendo inoculadas as formas
promastigotas infectantes (metacíclicas) juntamente com a saliva do flebotomíneo. Ao
serem introduzidas no corpo do hospedeiro vertebrado os parasitos inoculados, são
inicialmente opsonizados por moléculas do sistema do complemento, e penetram nos
macrófagos via receptores CR1 e CR3, onde se transformam em amastigotas. Neste
microambiente intracelular, as moléculas de superfície das formas amastigotas,
principalmente o Lipofosfoglicano (LPG) e a glicoproteína gp63, protegem o parasito da
lise no interior do fagolissosoma, inibindo mecanismos oxidativos e enzimas
INTRODUÇÃO
4
lisossomais, promovendo assim condições favoráveis para a multiplicação do parasito.
Eventualmente, os macrófagos infectados se rompem e liberam as formas amastigotas,
que infectam macrófagos adjacentes, contribuindo assim para a instalação do quadro
infeccioso. Ao exercer novo repasto, o inseto ingere juntamente com o sangue,
macrófagos parasitados por formas amastigotas. No interior do trato digestivo do vetor,
os macrófagos se rompem liberando as formas amastigotas que se transformam em
formas promastigotas, que se multiplicam ainda no sangue ingerido, envolto por uma
matriz peritrófica secretada pelas células do estômago do inseto, a qual se rompe após
alguns dias do repasto. Após a desintegração da matriz peritrófica, as formas
promastigotas migram para o intestino do vetor, onde ocorre nova multiplicação e
diferenciação. As Leishmanias na forma promastigota metacíclica migram para a região
anterior do tubo digestivo prontas para infectarem um novo hospedeiro (SHORTT et al.,
1931; SACKS, 1989).
A prevenção da LTA é difícil, já que seus vetores e reservatórios são
predominantemente silvestres, dificultando, dessa forma, a eliminação de animais
infectados, bem como o uso de inseticidas. Apesar da LTA se caracterizar por um
padrão epidemiológico silvestre, existem áreas periurbanas onde houve adaptação do
vetor no ambiente peridomiciliar, aumentando assim, a freqüência de cães com LTA no
nordeste e sudeste do Brasil (MARZOCHI & MARZOCHI, 1997). Além disso, o controle
da LTA apresenta restrições, devido aos aspectos múltiplos inerentes ao parasito, aos
vetores, reservatórios e hospedeiros. Várias são as tentativas de desenvolvimento de
métodos capazes de controlar a doença. Atualmente, medidas profiláticas anti-LTA
estão baseadas no controle vetorial (MARZOCHI & MARZOCHI, 1997), associado ao
tratamento de casos humanos (TOLEDO et al., 2001).
Atualmente, o tratamento da LTA está baseado principalmente na quimioterapia
com antimoniais pentavalentes. A utilização de Interferon-gama (IFN-γ) recombinante
associado ao antimonial no tratamento da LCD tem apresentado resultados
promissores (BADARO et al., 1993). Numa outra abordagem terapêutica, recentemente,
a vacina contra LTA desenvolvida por MAYRINK et al. (1979) tem sido empregada em
associação com antimoniais, com bons resultados em casos onde o antimônio
apresenta-se ineficaz ou induz efeitos colaterais graves (MAYRINK et al., 1979;
MAYRINK et al., 1985). Essa associação da imunoterapia ao antimônio, denominada
INTRODUÇÃO
5
imunoquimioterapia vem demonstrando-se eficaz no tratamento de pacientes co-
infectados com HIV-Leishmania, resistentes à terapia com as drogas convencionais (Da
CRUZ et al., 1999). Este novo enfoque da terapêutica da LTA chama a atenção para a
necessidade de estudos no campo da imunologia, que possam dar suporte na
interpretação dos resultados, bem como auxiliar na elaboração de novos esquemas
terapêuticos aplicáveis em situações especiais.
Os mecanismos imunológicos que protagonizam a leishmaniose vêm sendo
investigados, a fim de elucidar os aspectos associados aos eventos de proteção e
imunopatologia durante a progressão da doença. Grande parte dos conhecimentos
sobre os aspectos imunológicos na LTA foi consolidada a partir de estudos realizados
através de infecções experimentais em modelo murino (HOWARD et al., 1980;
LOCKSLEY et al., 1987). Esses estudos permitiram a elaboração de uma proposta
geral de que a recuperação e resistência à leishmaniose devem-se principalmente ao
componente celular da resposta imunológica, relegando a participação humoral a um
segundo plano (LOCKSLEY et al., 1987).
O estudo da leishmaniose em modelo murino permitiu uma melhor compreensão
acerca dos mecanismos imunorreguladores e imunopatológicos na LTA. A resistência à
infecção observada em camundongos C57BL/6 infectados com L. major, está
relacionada à ativação e diferenciação de células T CD4+ do Tipo 1, secretoras de IFN-
γ (LOCKSLEY et al., 1987), que é a principal citocina associada à resistência, que em
sinergia com o TNF-α, promove a ativação de macrófagos e, conseqüentemente,
favorece a eliminação das Leishmanias (GREEN et al., 1990). Dentre os mecanismos
da resposta imune celular efetora já descritos, acredita-se que a destruição da
Leishmania seja mediada por macrófagos ativados principalmente através da produção
de óxido nítrico (NO) (WEI et al., 1995). Por outro lado, outras linhagens de
camundongos (BALB/c) desenvolvem uma resposta imune predominantemente do Tipo
2 após a infecção com L. major (LOCKSLEY et al., 1987). Nestes animais, células T
CD4+ produzem IL-4 em resposta a antígenos de Leishmania. A IL-4 regula
negativamente a produção de IFN-γ e NO, impedindo a destruição dos parasitos pelos
macrófagos. Além disso, a IL-4 promove a diferenciação de células T CD4+ do Tipo 2
com secreção de IL-4, IL-5 e IL-10, entre outras citocinas, bem como a produção de
anticorpos específicos (HEINZEL et al., 1989). Os mecanismos que levam
INTRODUÇÃO
6
preferencialmente à ativação e expansão de diferentes tipos de células T CD4+ ainda
não estão completamente esclarecidos. Evidências sugerem que vários fatores possam
afetar este processo durante a infecção por Leishmania: 1) a interação do parasito com
células apresentadoras de antígenos com habilidades distintas de apresentar diferentes
classes de moléculas antigênicas, 2) a influência de sinais co-estimuladores, 3) os
mecanismos de transdução de sinais utilizados pelas subclasses das células T CD4+ e
4) o perfil de citocinas presente durante os eventos iniciais da diferenciação celular
(GRIMALDI & TESH, 1993).
Recentemente grande importância tem sido dada aos eventos iniciais da
resposta imune na LTA experimental, com ênfase no papel da imunidade inata no
direcionamento da imunidade adaptativa. Existem evidências de que o desenvolvimento
da LTA murina é criticamente dependente dos eventos iniciais que ocorrem logo após o
encontro dos parasitos com neutrófilos que parecem ser as primeiras células
hospedeiras do parasito, enquanto aguardam a chegada de macrófagos ao foco de
infecção (WOODMAN et al., 1998; PEARSON & STEIGBIGEL, 1981). Neste contexto,
células da imunidade inata, como os granulócitos, macrófagos e células dendríticas
secretam citocinas e quimiocinas, resultando em um microambiente favorável ao
direcionamento da diferenciação das células T presentes nos linfonodos proximais, para
células do Tipo 1, com papel protetor, ou Tipo 2 associados ao fenótipo de
susceptibilidade (STENGER & RÖLLINGHOFF, 2001). Em suma, os dados obtidos em
modelo experimental murino para LTA, sugerem que uma resposta imune celular
efetora contra a Leishmania promove a síntese de IL-12 e a diferenciação de células T
CD4+ do Tipo 1, com produção de IFN-γ e TNF-α, culminando na ativação de
macrófagos, produção de NO, eliminação dos parasitos e resolução da infecção.
Entretanto, os mecanismos protetores e imunopatológicos demonstrados no
modelo murino de infecção com L. major, devem ser analisados com cautela,
considerando a necessidade de validação para o contexto da infecção humana.
Acredita-se que outros fatores contribuem no desenvolvimento e na resolução da
Leishmaniose humana, onde a resposta imune humana não tem sido tão bem
caracterizada como em modelos experimentais (MELBY et al., 1994).
Como observado em modelo experimental, vários autores mostram o
envolvimento da resposta imune celular na resolução da infecção humana (CARVALHO
et al., 1985; Da CRUZ et al., 1994). Entretanto, a contribuição das diferentes
INTRODUÇÃO
7
populações celulares e citocinas ainda não estão bem esclarecidas. Dados
relacionados ao perfil fenotípico celular do infiltrado inflamatório no foco das lesões
cutâneas, bem como os estudos da expressão de citocinas e quimiocinas realizados
através da análise de biópsias da lesão têm demonstrado resultados bastante
controversos, principalmente quando consideramos a espécie de Leishmania infectante
e o tempo de lesão.
Estudos realizados em camundongos infectados com L. major, avaliaram a
participação das células da imunidade inata no curso da infecção. Foi observado que os
granulócitos são as primeiras populações leucocitárias a serem recrutadas ao local de
infecção, em seguida os macrófagos passam a ser predominante na lesão na fase
inicial (MULLER et al., 2001). GUTIERREZ et al. (1991) mostraram haver uma
correlação inversa entre a presença de amastigotas e a presença de eosinófilos nas
biópsias de lesões de pacientes portadores da LTA. Com relação às células NK, essas
têm sido implicadas como mediadoras da interface da resposta imune inata e adquirida
(BACKSTROM et al., 2003). MAASHO et al. (1998) sugeriram que as células NK
estariam envolvidas no processo de proteção e cura de pacientes com LCL. Além das
células da imunidade inata contribuírem para a contenção do parasito na fase inicial da
infecção, há evidências da participação dessas células na síntese de citocinas com
propriedades imunorregulatórias, podendo influenciar na diferenciação das células T
(TACCHINE-COTTIER et al., 2000).
Alguns estudos que avaliam a freqüência de subpopulações de linfócitos T no
infiltrado inflamatório das lesões cutâneas de pacientes portadores de LCL relatam um
predomínio de linfócitos T CD4+ (BARRAL et al., 1987; PIRMEZ et al., 1990; ESTERRE
et al., 1992), enquanto outros demonstram um envolvimento maior de linfócitos T CD8+
nas lesões (MODLIN et al., 1985; MARTÍNEZ-ARENDS et al., 1991; VIEIRA et al.,
2002; SILVEIRA et al., 2004). Nesse contexto, foi observado que as lesões de
pacientes portadores de LCL com menos de 1 ano de evolução, apresentam
freqüências semelhantes de células T CD4+ e T CD8+, bem como a presença de
células T CD25+, expressando o marcador de ativação HLA-DR (MARTÍNEZ-ARENDS
et al., 1991). Num estudo que avaliou a relação entre tempo de evolução da doença e o
fenótipo celular presente na lesão, LIMA et al. (1994) não observaram variações no
percentual de macrófagos, células B e linfócitos T CD4+ e T CD8+. Entretanto, foi
observado que lesões recentes apresentavam um aumento no percentual de células
INTRODUÇÃO
8
Tγδ+, quando comparadas com lesões mais antigas. A análise das lesões de pacientes
infectados com L. major, no momento do diagnóstico e durante o processo de cura,
mostrou a presença de grande número de células expressando o marcador de ativação
celular HLA-DR no momento do diagnóstico, e uma diminuição no percentual de células
T CD8+ na lesão durante a cura (GAAFAR et al., 1999). Estudos que avaliam a
expressão de citocinas na lesão de indivíduos portadores de LCL demonstram um
predomínio de IFN-γ sobre IL-4 e baixa expressão de IL-5 e IL-10 (CÁCERES-
DITTMAR et al., 1993). MELBY et al. (1994) avaliando a expressão de citocinas na
lesão de pacientes infectados com L. mexicana, observaram um aumento significativo
na expressão de IL-1, TNF-α, IL-10 e TGF-β nas lesões antigas (≥ 4 meses de
evolução), quando comparado a lesões mais recentes (< 2 meses de evolução).
Estudos realizados por VIEIRA et al. (2002) demonstram que na lesão há um
predomínio paralelo de células T CD8+, com presença de células IFN-γ e TNF-α
positivas.
Em conjunto, os estudos imunofenotípicos mais recentes têm confirmado o papel
de células T CD8+ na resposta imune com um perfil mais balanceado na LCL,
sugerindo a importância dessas células no processo de cura da infecção (SILVEIRA et
al., 2004). Cabe ressaltar que o estudo do perfil imunofenotípico em células das lesões
da LTA humana apresenta restrições, já que freqüentemente, as lesões são múltiplas,
dessa forma, como instrumento alternativo de investigação, vários autores têm proposto
a avaliação dos elementos e eventos da resposta imune, através da análise de
leucócitos do sangue periférico, como perspectiva de retratar o perfil imunológico de
todas as lesões, sumariando a resposta imune (GAAFAR et al., 1999).
Os estudos dos aspectos imunofenotípicos de leucócitos do sangue periférico
humano têm sido realizados tanto no contexto ex vivo, quanto após intervenções
antígeno-específicas in vitro em estudos realizados com células mononucleares do
sangue periférico (PBMC) em culturas convencionais in vitro ou amostras de sangue
total empregadas em técnicas de cultura rápida in vitro. A maioria desses estudos
aborda aspectos gerais de associação entre o perfil fenotípico celular e aspectos
clínico-laboratoriais dos pacientes, visando associar um determinado perfil fenotípico
com os eventos de resistência e susceptibilidade na LTA. Nesse contexto, os
parâmetros de resistência e susceptibilidade têm sido estudados considerando-se como
INTRODUÇÃO
9
“susceptível” o grupo de indivíduos infectados, portadores de lesão recente e doença
ativa. Já a “resistência” tem sido considerada como uma característica observada em
indivíduos portadores de lesão crônica, em processo de resolução, em indivíduos
curados após quimioterapia ou imunoquimioterapia, em indivíduos vacinados e aqueles
naturalmente resistentes residentes em áreas endêmicas para a LTA. Do ponto de vista
laboratorial, a resistência à infecção na LTA tem sido associada à positividade na
intradermorreação de Montenegro (TM) (BOURREAU et al., 2003; MAYRINK et al.,
1979).
Considerando o exposto, estudos realizados por ADJARY et al. (2000)
demonstraram que PBMC de pacientes com lesões ativas e indivíduos curados
produzem altos níveis de IFN-γ, paralelos à ausência ou baixos níveis de IL-4 em
culturas estimuladas in vitro com antígenos de L. major. Por outro lado, a ausência ou
baixos níveis de IFN-γ, paralelo à uma alta produção de IL-4 foram encontrados em
pacientes portadores de lesões crônicas. Na maioria dos indivíduos avaliados as
células que expressavam citocinas intracelulares após a incubação com antígeno, eram
linfócitos T CD4+. Não foram encontradas diferenças significativas no percentual de
linfócitos T CD8+ produtores de citocinas, quando avaliados em culturas-controle ou
estimulados com antígenos do parasito. Entretanto, vários trabalhos reforçam a
hipótese de que os linfócitos T CD8+ estejam envolvidos nos mecanismos
imunoprotetores na LTA e que o estabelecimento de um padrão de resposta do Tipo 1,
com produção de IFN-γ seja importante para o processo de resistência na LTA. A
análise da resposta celular in vitro, empregando-se PBMC estimuladas com L. major
mostrou um menor percentual de linfócitos T CD8+ nos pacientes ao diagnóstico,
quando comparado aos valores observados no processo de cura pós-terapêutica
(GAAFAR et al., 1999). Estudos desenvolvidos por DA CRUZ et al. (1994) e
COUTINHO et al. (1998) também utilizando culturas de PBMC estimuladas in vitro com
antígenos de L. braziliensis, mostraram um maior percentual de linfócitos T CD8+ nas
culturas de células de indivíduos curados, em relação aos indivíduos avaliados antes do
tratamento, os quais apresentam um predomínio de linfócitos T CD4+. Esses autores
acreditam que no processo de cura pós-terapêutica específica na LTA mais importante
que apenas o predomínio de linfócitos T CD8+ seria o balanço entre as células T CD4+
INTRODUÇÃO
10
e T CD8+, em que as primeiras teriam sua proporção diminuída durante o processo de
cura.
Ainda no contexto da resistência na LTA, MENDONÇA et al. (1995) observaram
uma expansão de linfócitos T CD8+ em culturas de PBMC de indivíduos vacinados,
após estimulação in vitro com antígenos de L. braziliensis, contrastando com um
predomínio de linfócitos T CD4+ em culturas de PBMC obtidas de pacientes infectados.
Estudos mais recentes, empregando uma nova abordagem de culturas in vitro,
utilizando culturas de sangue total de curta duração, têm demonstrado maior correlação
com os achados imunofenotípicos que apontam o papel importante de linfócitos T CD8+
nos eventos de resistência na LTA (MASINI, A.B. 2005, comunicação pessoal). Esse
estudo demonstra um maior envolvimento de citocinas do Tipo 1 (IFN-γ e TNF-α) em
indivíduos portadores de lesão crônica, em processo de resolução e em indivíduos
curados, e maior envolvimento de citocinas do Tipo 2 em portadores de lesões recentes
e indivíduos não infectados de área endêmica para LTA.
Entretanto, também foi demonstrado que os linfócitos T CD4+ apresentam um
aumento na síntese de IFN-γ tanto no grupo com lesões recentes quanto no grupo com
lesões tardias, e um aumento da síntese de TNF-α pelos linfócitos T CD4+, nos eventos
mais tardios (MASINI, A.B. 2005, comunicação pessoal).
Tomados em conjunto, estes resultados, embora ainda um pouco controversos,
sugerem que em humanos, as células T CD8+, a síntese de IFN-γ com ausência ou
produção reduzida de IL-4 estejam envolvidas nos mecanismos de imunidade protetora
na LTA. Por outro lado, um predomínio de linfócitos T CD4+ sobre CD8+ e maior
produção de IL-4 estão associados aos eventos de susceptibilidade na LTA. Assim,
podemos postular que a resolução da infecção humana está associada ao componente
celular da resposta imunológica e que as células T CD8+ e a citocina IFN-γ parecem
participar dos mecanismos de resistência e recuperação na leishmaniose tegumentar.
Cabe ressaltar, entretanto, que a resposta imune do hospedeiro portador de LTA
a antígenos derivados de Leishmania, não deve ser avaliada de forma dirigida, restrita a
aspectos fenotípicos associados aos eventos de imunidade celular. Nesse contexto, a
resposta imune deve ser considerada como um somatório de interações entre
moléculas sinalizadoras sob a forma de fatores solúveis, receptores de superfície
celular e imunoglobulinas. Existem evidências obtidas em modelo experimental murino
INTRODUÇÃO
11
que demonstram a participação de padrões distintos de resposta imune humoral nos
eventos protetores e imunopatológicos na LTA experimental, onde se observa uma
associação entre os eventos protetores da resposta do Tipo 1 e o predomínio de IgG2a
enquanto, maior produção de IgG1 e IgE, tem sido associado à resposta do Tipo 2 e
maior susceptibilidade dos animais (STEVENS et al., 1988). Em humanos, LABRADA et
al. (1989) demonstraram o predomínio de níveis de IgM anti-Leishmania nos soros de
pacientes com lesões recentes e o aumento dos níveis de IgG anti-Leishmania nos
soros de pacientes com lesões tardias. Alguns estudos tentam associar os níveis
séricos de anticorpos com aspectos clínico-laboratoriais da LTA. O’NEIL et al. (1993)
demonstraram que pacientes com maior tempo de lesão e com acometimento das
mucosas apresentam maiores níveis de IgE e IgA específicas para Leishmania,
respectivamente. Alguns estudos tentam associar o aumento dos níveis séricos de IgG
com a gravidade da infecção (SCHURR et al., 1986). Entretanto, os estudos da
resposta imune humoral na LTA ainda apresentam lacunas importantes e resultados
controversos. Por exemplo, num estudo realizado por SOUZA-ATTA et al. (2002) foi
demonstrada a existência de uma correlação positiva entre os níveis séricos de IgE e o
tamanho da intradermorreação de Montenegro, que está geralmente associada à
capacidade do paciente em montar uma resposta celular. Por outro lado, os autores
mostram uma correlação negativa entre o nível de IgE e o número de lesões, esse
geralmente associado a um padrão de resposta do Tipo 2. Além disso, outro estudo
demonstra uma correlação positiva significativa entre CD23s e IgE anti-Leishmania, em
pacientes portadores da LCL, que poderiam estar contribuindo para a morte do parasito
(CABRERA et al., 2003).
O papel de subpopulações de linfócitos B na LTA ainda encontra-se obscuro e
requer maiores esclarecimentos. Estudos em modelo experimental mostraram que
camundongos BALB/c depletados de células B1 (CD5+) são capazes de montar uma
resposta imune do Tipo 1 associada a uma menor gravidade da doença, conferindo
assim uma maior resistência à infecção por L. major (HOERAUF et al., 1994).
Entretanto, BABAI et al. (1999) observaram que a infecção progride de forma mais
grave nos camundongos BALB/c com depleção sistêmica das células B1, sugerindo
que essas células não contribuem para a suscetibilidade dos camundongos BALB/c
infectados com L. major. VIEIRA et al. (2002), avaliando o perfil imunofenotípico de
linfócitos presentes nas lesões de pacientes portadores de LTA, observaram uma maior
INTRODUÇÃO
12
freqüência de células B associada à alta produção de IFN-γ nas lesões de pacientes
portadores de LCL, quando comparado aos pacientes portadores de leishmaniose
disseminada, sugerindo que tal associação poderia estar relacionada à contenção dos
parasitos e os eventos de proteção na LTA. Os autores propõem que nas lesões, a
elevada expressão de IFN-γ estaria estimulando células B a secretarem anticorpos da
subclasse IgG1 que poderiam estar envolvidos no processo de opsonização,
promovendo uma fagocitose mais eficiente, levando ao controle do parasitismo. Por
outro lado, os parasitos poderiam usar dessa via para ganharem acesso aos fagócitos,
promovendo a sua multiplicação no interior dessas células.
A participação de eventos imunológicos associados à progressão e resistência à
doença tem sido investigada em diversos trabalhos. Em modelo experimental, a
polarização da resposta imune do Tipo 1 e Tipo 2 está bem caracterizada, entretanto os
mecanismos imunológicos na infecção humana necessitam de maiores investigações.
COUTINHO et al. (1996) demonstraram que a infecção humana não apresenta uma
resposta polarizada do Tipo 1 ou do Tipo 2, como demonstrado nos trabalhos
experimentais com camundongos. Nesse contexto, observa-se ainda a necessidade de
maiores investigações da resposta imune na LTA, para a identificação de variáveis
chaves no processo de categorização dos pacientes avaliados, considerando que além
dos aspectos inerentes ao parasito infectante e a sincronicidade do processo
infeccioso, variáveis outras, como os aspectos clínico-laboratoriais do paciente podem
ter um impacto diferencial no perfil de resposta imune observado. A fim de contribuir
para o entendimento dos mecanismos imunológicos associados à LTA humana,
propusemos para esse estudo, uma investigação detalhada de características
imunofenotípicas de leucócitos do sangue periférico de indivíduos portadores de LCL,
com ênfase em células envolvidas na resposta imune inata e adaptativa. O estudo
dessas populações celulares será focalizado considerando-se uma proposta de
categorização dos pacientes em função de aspectos clínico-laboratoriais relevantes no
contexto da LTA.
Associações entre aspectos clínico-laboratoriais e parâmetros fenotípicos celulares da imunidade
inata e adaptativa na Leishmaniose Tegumentar Americana
OBJETIVOS
OBJETIVOS
14
Objetivo Geral
Estudar aspectos fenotípicos celulares da imunidade inata e adaptativa no
sangue periférico de pacientes com Leishmaniose Tegumentar Americana
Objetivos específicos
1) Caracterizar aspectos fenotípicos de células envolvidas na imunidade inata: ênfase
em monócitos e neutrófilos;
2) Analisar aspectos fenotípicos de células envolvidas na imunidade adaptativa: ênfase
em subpopulações linfocitárias;
3) Investigar possíveis associações entre aspectos clínico-laboratoriais e parâmetros
fenotípicos celulares da imunidade inata e adaptativa: ênfase no número e tempo das
lesões e na positividade da intradermorreação de Montenegro.
OBJETIVOS
15
Para alcançar os objetivos específicos propostos nesse estudo, foram abordados os
seguintes tópicos de investigação:
Aspectos da Imunidade Inata:
I - Aspectos fenotípicos de monócitos circulantes:
A - Freqüência de “macrófagos - like” (CD16+)
B - Freqüência de monócitos pró-inflamatórios (HLA-DR++)
C - Expressão do receptor CD23 por monócitos
II – Aspectos fenotípicos de neutrófilos circulantes:
A - Freqüência de neutrófilos CD28+
B - Freqüência de neutrófilos HLA-DR+
C - Densidade de expressão do receptor CD16 por neutrófilos
D - Freqüência de neutrófilos CD23+
Aspectos da Imunidade Adaptativa:
I - Aspectos fenotípicos de linfócitos T circulantes:
A - Freqüência de subpopulações de linfócitos T (CD4+ e CD8+)
B - Freqüência de subpopulações de linfócitos T ativados (HLA-DR+)
II - Aspectos fenotípicos de linfócitos B circulantes:
A - Freqüência de subpopulações de linfócitos B (CD5- e CD5+)
B - Densidade de expressão de HLA-DR em linfócitos B
C - Freqüência de linfócitos B CD23+
Balanço da resposta imune:
A - Razão entre Monócitos HLA-DR+/Linfócitos CD19+CD23+
B - Razão entre Monócitos HLA-DR+/Linfócitos T CD8+HLA-DR+
C - Razão entre Linfócitos T HLA-DR+/Linfócitos CD19+
Associações entre aspectos clínico-laboratoriais e parâmetros fenotípicos celulares da imunidade
inata e adaptativa na Leishmaniose Tegumentar Americana
PACIENTES, MATERIAL E MÉTODOS
PACIENTES, MATERIAL E MÉTODOS
17
I – PACIENTES
Neste estudo foram incluídos 27 indivíduos portadores de Leishmaniose Cutânea
Localizada (LCL) e 24 indivíduos não infectados (NI). Todos os indivíduos analisados
foram voluntários residentes em uma área endêmica para a leishmaniose, na cidade de
Caratinga, Vale do Rio Doce – Estado de Minas Gerais. A equipe do Departamento de
Parasitologia da UFMG, sob a coordenação do Dr. Wilson Mayrink, vem atuando nesta
área endêmica desde 1965, fornecendo assistência médica ambulatorial para mais de
10.000 pacientes. Os pacientes foram avaliados clinicamente por um médico
dermatologista e o diagnóstico da LCL realizado através do teste parasitológico por
pesquisa direta do parasito (PAR) em material de biópsia das bordas das úlceras e
através de teste imunológico de hipersensibilidade tardia pela intradermorreação de
Montenegro (TM). A seleção e o recrutamento dos voluntários, bem como a coleta do
material biológico foram realizadas no Centro de Tratamento de Leishmaniose (CTL)
em Caratinga - MG. Todo procedimento diagnóstico foi realizado por um técnico em
patologia clínica, funcionário da Fundação Nacional de Saúde (FNS).
Após a avaliação clínica, os indivíduos selecionados foram inicialmente
agrupados como portadores da LCL, por apresentarem resultado positivo em pelo
menos um dos testes diagnósticos empregados (PAR-/TM+, PAR+/TM-, PAR+/TM+).
Posteriormente, os pacientes portadores de LCL foram categorizados em função de
aspectos clínico-laboratoriais em diferentes subgrupos, como descrito a seguir:
PACIENTES, MATERIAL E MÉTODOS
18
LCL-1 – Pacientes portadores de LCL caracterizada pela presença de uma lesão;
LCL-2-4 – Pacientes portadores de LCL caracterizada pela presença de duas a quatro
lesões;
LCL60 – Pacientes portadores de LCL caracterizada por lesão recente, com tempo de
evolução inferior ou igual a 60 dias;
LCL>60 – Pacientes portadores de LCL caracterizada por lesão tardia, com tempo de
evolução superior a 60 dias;
LCL-TM- – Pacientes portadores de LCL com intradermorreação de Montenegro
negativa;
LCL-TM+ – Pacientes portadores de LCL com intradermorreação de Montenegro
positiva.
O grupo controle foi constituído por indivíduos saudáveis, residentes na mesma
área endêmica, consistindo de indivíduos TM-.
Esse estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ètica da Fundação
Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), sob o número de protocolo 0070/99 – CEP/FIOCRUZ.
A TABELA I apresenta os dados demográficos dos grupos de indivíduos
estudados.
PACIENTES, MATERIAL E MÉTODOS
19
TABELA I - População estudada
Grupos Sigla Idade Sexo M/F Total
Não Infectados NI 08-64 12/12 24
LCL 05-83 17/10 27
LCL-1 14-83 14/6 20
LCL-2-4 05-37 4/3 7
LCL60 05-58 11/7 18
LCL>60 11-83 7/2 9
LCL-TM- 07-47 4/1 5
Leishmaniose Cutânea Localizada
LCL-TM+
05-83 14/8 22
PACIENTES, MATERIAL E MÉTODOS
20
II – MATERIAL E MÉTODOS
1 – Material biológico
No presente estudo, foram avaliadas amostras de sangue periférico de
indivíduos residentes em área endêmica de LCL, que apresentavam lesão cutânea e
com resultado positivo em pelo menos um dos testes diagnósticos empregados.
Também foram avaliadas amostras de indivíduos que não apresentavam lesão ativa
e/ou cicatriz compatível com LCL. O sangue periférico foi coletado a vácuo em tubos de
5 mL, contendo anticoagulante EDTA e foi utilizado para a realização do hemograma e
para os ensaios de imunofenotipagem de leucócitos no contexto ex vivo.
2 – Imunofenotipagem dos leucócitos do sangue periférico por citometria de fluxo
Procedimento experimental
Os ensaios de imunofenotipagem dos leucócitos do sangue periférico foram
feitos segundo o protocolo proposto pelo fabricante Becton Dickinson, modificado
conforme descrito a seguir.
Alíquotas de 100 µl de sangue periférico total, coletados em EDTA foram
transferidas para tubos de poliestireno 12 x 75 cm (Falcon), contendo coquetel de
anticorpos monoclonais específicos para marcadores de superfície celular de interesse,
marcados com fluorocromos distintos (TAB. II). As combinações de anticorpos
monoclonais foram estabelecidas em função dos imunofenótipos de interesse e
incluíram: IgG1/IgG1; CD4/CD3; CD8/CD3; CD19/CD3; CD16/CD3; CD4/HLA-DR;
CD8/HLA-DR; CD4/CD28; CD19/CD5; CD19/CD23. As misturas de anticorpos foram
diluídas previamente em PBS 0,015M, pH 7,4 contendo 2% de BSA (reagentes SIGMA,
E.U.A.), empregando diluições previamente estabelecidas através de ensaios de
titulação de cada anticorpo empregado. Após homogeneização em vórtex, a mistura
reacional foi incubada por 30 minutos, à temperatura ambiente e ao abrigo da luz.
Posteriormente, as amostras foram submetidas à lise dos eritrócitos, utilizando 2 mL de
solução de lise comercial (FACS
TM
Lysing Solution – Becton Dickinson) diluída 10 vezes
em água destilada. As amostras foram homogeneizadas e incubadas por 10 minutos à
temperatura ambiente. Em seguida, as amostras foram submetidas à centrifugação a
PACIENTES, MATERIAL E MÉTODOS
21
400G por 10 minutos a 18ºC. O sobrenadante foi descartado, as amostras lavadas com
2ml de PBS (0,015M pH 7,4), sendo novamente submetidas às mesmas condições de
centrifugação. Posteriormente, as amostras foram fixadas com 300 µl de solução
fixadora - MFF (10g/l de paraformaldeído, 1% de cacodilato de sódio, 6,67 g/l de cloreto
de sódio, pH 7,2). Após um período adicional de 15 minutos a 4ºC, a análise dos
parâmetros morfométricos e imunofenotípicos das células presentes em cada tubo foi
determinada com o auxílio de um citômetro de fluxo (FACScan – Becton Dickinson),
utilizando o programa CELLQuest
TM
para aquisição e análise dos dados. Para cada
imunofenotipagem, foram coletadas informações relativas aos aspectos morfométricos
de tamanho e granulosidade, bem como aspectos imunofenotípicos de 10.000 eventos.
As informações foram armazenadas em arquivos com extensão FCS, empregando a
modalidade de arquivamento de resolução de 1024 canais e na modalidade “List Mode”
para posterior geração dos dados, empregando diferentes estratégias de análise.
PACIENTES, MATERIAL E MÉTODOS
22
TABELA II - Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para
análise de populações, subpopulações celulares e moléculas de superfície.
Anticorpos
Fluorocromo
Células-Alvo
Anti-IgG1
Anti-CD3
Anti-CD4
Anti-CD5
Anti-CD8
Anti-CD16
Anti-CD19
Anti-CD23
Anti-CD28
Anti-HLA-DR
FITC, PE
FITC
FITC, PE
FITC
FITC, PE
PE
FITC, PE
PE
PE
PE
-
Linfócitos T
Linfócitos T auxiliar
Linfócitos B1
Linfócitos T citotóxicos
Neutrófilos, Monócitos
Linfócitos B
Linfócitos B, Neutrófilos, Monócitos
Linfócitos T, Neutrófilos
Linfócitos T, B e Neutrófilos
2 - Estratégias de análise imunofenotípica celular por citometria de fluxo
Os dados obtidos através da imunofenotipagem dos leucócitos do sangue
periférico dos pacientes portadores de LCL e dos indivíduos não infectados foram
analisados utilizando-se de estratégias específicas dependendo do fenótipo celular de
interesse. Assim, empregando os recursos múltiplos de análise de dados disponíveis no
programa CellQuest
TM
, foram adotadas diferentes estratégias para análise fenotípica de
células envolvidas na imunidade inata e adaptativa, baseada em oito modalidades
disponíveis, denominadas aqui em função do fenótipo celular de interesse como
descrito a seguir:
PACIENTES, MATERIAL E MÉTODOS
23
A – Análise da freqüência de “macrófagos - like” (CD16+)
A análise de monócitos CD16+ (macrófagos-like”) foi feita segundo protocolo
proposto por ZIEGLER-HEITBROCK (1996), modificado conforme descrito a seguir:
após a seleção da região de interesse (R1), baseado em aspectos morfométricos em
gráficos de distribuição puntual de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC), foram
construídos gráficos de tamanho versus FL2/CD16 para quantificar o percentual de
células CD16+ dentro da população de monócitos previamente selecionada em R1
(FIG. 1).
A B
Granulosidade
Tamanho
R1
FL2/CD16
Tamanho
21,51
78,49
0,00
0,00
Figura 1: Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de monócitos CD16+ no
sangue periférico. (A) Gráfico de distribuição puntual FSC versus SSC utilizado para a seleção da
população celular de interesse – R1. (B) Gráfico de distribuição puntual FSC versus FL2/CD16, contendo
as células selecionadas na região R1, empregado para quantificar o percentual de monócitos CD16+.
B – Análise da freqüência de monócitos pró-inflamatórios (HLA-DR++)
A análise de monócitos pró-inflamatórios (HLA-DR++) foi feita segundo protocolo
proposto por BELGE et al. (2002), modificado conforme descrito a seguir: após a
seleção da região de interesse (R1), baseado em aspectos morfométricos e
imunofenotípicos em gráficos de distribuição puntual de FL1/CD4 versus granulosidade
(SSC) para a identificação da população de monócitos como células CD4low+ e de
PACIENTES, MATERIAL E MÉTODOS
24
granulosidade intermediária entre linfócitos e neutrófilos, foram construídos gráficos de
tamanho versus FL2/HLA-DR para quantificar o percentual de células HLA-DR++ dentro
da população de monócitos previamente selecionada em R1 (FIG. 2). O limiar de
expressão de HLA-DR++ foi determinado através da análise paralela da expressão de
HLA-DR por linfócitos B, considerando o perfil da expressão de HLA-DR por linfócitos.
A B
R1
Granulosidade
FL1/CD4
76,56
23,44
0,00
0,00
Tamanho
FL2/HLA-DR
Figura 2: Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de monócitos pro-
inflamatórios (CD4low+HLA-DR++) no sangue periférico. (A) Gráfico de distribuição puntual FL2/CD4
versus SSC utilizado para a seleção da população celular de interesse – R1. (B) Gráfico de distribuição
puntual FSC versus FL2/HLA-DR, contendo as células selecionadas na região R1, empregado para
quantificar o percentual de monócitos pró-inflamatórios.
C – Análise da expressão do receptor CD23 por monócitos
A expressão da molécula CD23 na população de monócitos foi determinada
através da análise semi-quantitativa por intensidade média de fluorescência (IMF)
conforme descrito a seguir: após a seleção da região de interesse (R1), baseado em
aspectos morfométricos em gráficos de distribuição puntual de tamanho (FSC) versus
granulosidade (SSC), foram construídos histogramas unidimensionais de intensidade
de fluorescência FL2/CD23 versus número de células para determinar a intensidade
PACIENTES, MATERIAL E MÉTODOS
25
média de fluorescência da expressão do CD23 pela população de monócitos
previamente selecionada em R1 (FIG.3).
A
Granulosidade
Tamanho
R1
B
Nº Células
FL2/CD23
M1 = 6,29
Figura 3: Seqüência de procedimentos utilizados para avaliar a expressão da molécula CD23 em
monócitos no sangue periférico. (A) Gráfico de distribuição puntual FSC versus SSC utilizado para a
seleção da população celular de interesse – R1. (B) Histograma unidimensional de fluorescência
FL2/CD23, contendo as células selecionadas na região R1, utilizado para determinar a intensidade média
de fluorescência (IMF) da expressão de CD23 por monócitos.
D - Análise da freqüência de neutrófilos CD28+, HLA-DR+ e CD23+
As análises de neutrófilos CD28+, HLA-DR+ e CD23+ foram feitas conforme
descrito a seguir: a seleção da região de interesse (R1) foi baseada em aspectos
morfométricos e imunofenotípicos em gráficos de distribuição puntual de FL1/CD4
versus granulosidade (SSC), para a identificação da população de neutrófilos como
células CD4- e de granulosidade elevada, minimizando assim a contaminação da região
PACIENTES, MATERIAL E MÉTODOS
26
selecionada por monócitos e linfócitos. Em seguida foram construídos gráficos de
tamanho versus FL2/CD28, FL2/HLA-DR ou FL2/CD23 para quantificar o percentual de
células CD28+, HLA-DR+ e CD23+ dentro da população de neutrófilos previamente
selecionada em R1 (FIG. 4). A contaminação da região de neutrófilos por eosinófilos foi
minimizada através da exclusão de células autofluorescentes em gráficos de
distribuição puntual de FL1/CD4 versus fluorescência não relacionada (FL3).
A B
Granulosidade
FL1/CD4
R1
Granulosidade
FL1/CD19
R1
C D E
FL2/CD28
Tamanho
8,80
91,20
0,00
0,00
FL2/HLA-DR
Tamanho
7,31
92,69
0,00
0,00
FL2/CD23
Tamanho
2,94
97,06
0,00
0,00
Figura 4: Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de neutrófilos CD28+ no
sangue periférico. (A) Gráfico de distribuição puntual FL1/CD4 versus SSC utilizado para a seleção da
população celular de interesse – R1. (B) Gráfico de distribuição puntual FL1/CD19 versus SSC utilizado
para a seleção da população celular de interesse – R1. Gráfico de distribuição puntual FSC versus
FL2/CD28 (C), FSC versus FL2/HLA-DR (D) e FSC versus FL2/CD23 (E), contendo as células
selecionadas na região R1, empregados para quantificar o percentual de neutrófilos CD28+, HLA-DR+ e
CD23+.
PACIENTES, MATERIAL E MÉTODOS
27
E - Análise da densidade de expressão do receptor CD16 por neutrófilos
A expressão da molécula CD16 na população de neutrófilos foi determinada
através da análise semi-quantitativa por intensidade média de fluorescência (IMF)
conforme descrito a seguir: após a seleção da região de interesse (R1), baseado em
aspectos morfométricos em gráficos de distribuição puntual de tamanho (FSC) versus
granulosidade (SSC), foram construídos histogramas unidimensionais de intensidade
de fluorescência FL2/CD16 versus número de células para determinar a intensidade
média de fluorescência da expressão do CD16 pela população de neutrófilos
previamente selecionada em R1 (FIG.5).
A
Tamanho
Granulosidade
Tamanho
R1
B
Nº Células
FL2/CD16
M1 = 135,71
Figura 5: Seqüência de procedimentos utilizados para avaliar a expressão da molécula CD16 em
neutrófilos no sangue periférico. (A) Gráfico de distribuição puntual FSC versus SSC utilizado para a
seleção da população celular de interesse – R1. (B) Histograma unidimensional de fluorescência
FL2/CD16, contendo as células selecionadas na região R1, utilizado para determinar a intensidade média
de fluorescência (IMF) da expressão de CD16 por neutrófilos.
PACIENTES, MATERIAL E MÉTODOS
28
F – Análise da freqüência das populações de linfócitos T (CD3+), B (CD19+) e das
subpopulações de células T (CD4+ e CD8+) e B (CD5-, CD5+ e CD23+)
As análises das freqüências de populações de linfócitos T (CD3+), B (CD19+) e
das subpopulações de células T (CD4+ e CD8+) e B (CD5-, CD5+ e CD23+) foram
realizadas utilizando-se da estratégia de análise convencional. Esse tipo de análise
consistiu na seleção da população celular de interesse, baseada em aspectos
morfométricos, através de gráficos de distribuição puntual de tamanho (FSC) versus
granulosidade (SSC). Após a seleção da região de interesse (R1), o percentual de
subpopulações celulares fluorescentes, dentro da população selecionada, foi obtido em
gráficos bidimensionais de distribuição puntual da fluorescência (FIG. 6).
O percentual de linfócitos T totais (CD3+) foi calculado como a média dos valores
de células CD3+ obtidos em análises paralelas, empregando as combinações de
anticorpos monoclonais anti-CD3/anti-CD4, anti-CD3/anti-CD8, anti-CD3/anti-CD19 e
anti-CD3/anti-CD16.
PACIENTES, MATERIAL E MÉTODOS
29
A
Granulosidade
Tamanho
R1
B C
FL2/CD4
FL1/CD3
29,81
22,21
0,64
47,33
FL1/CD5
FL2/CD19
4,68
51,78
17,10
26,44
Figura 6: Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de subpopulação de
linfócitos T e subpopulação de linfócitos B no sangue periférico. (A) Gráfico de distribuição puntual FSC
versus SSC utilizado para a seleção da população celular de interesse – R1. (B) Gráfico de distribuição
puntual FL1/CD3 versus FL2/CD4, contendo as células selecionadas na região R1, empregado para
quantificar o percentual de subpopulações de linfócitos T. (C) Gráfico de distribuição puntual FL1/CD5
versus FL2/CD19, contendo as células selecionadas na região R1, empregado para quantificar o
percentual de subpopulações de linfócitos B.
PACIENTES, MATERIAL E MÉTODOS
30
G– Análise da freqüência de subpopulações de linfócitos T ativados (HLA-DR+)
A análise da freqüência de subpopulações de linfócitos T ativados (HLA-DR+) foi
realizada utilizando-se da estratégia de análise convencional, seguida por cálculos
adicionais para determinar a fração de células T ativadas dentro de uma subpopulação
específica. Esse tipo de análise consistiu na seleção da população celular de interesse,
baseada em aspectos morfométricos, através de gráficos de distribuição puntual de
tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC). Após a seleção da região de interesse
(R1), o percentual de subpopulações celulares fluorescentes, dentro da população
selecionada, foi obtido em gráficos bidimensionais de distribuição puntual da
fluorescência FL1/CD4 ou FL1/CD8 e FL2/HLA-DR (FIG. 7). As frações de células T
ativadas dentro das subpopulações CD4+ e CD8+ foram calculadas através das
fórmulas: [% de células CD4+HLA-DR+/(%CD4+HLA-DR- + %CD4+HLA-DR+) X 100] e
[% de células CD8+HLA-DR+/(%CD8+HLA-DR- + %CD84+HLA-DR+) X 100].
O percentual de linfócitos T totais ativados foi calculado como o somatório das
freqüências das subpopulações de células T ativadas (Σ % de células CD4+HLA-DR+ +
CD8+HLA-DR+).
A B
Granulosidade
Tamanho
R1
FL2/HLA-DR
FL1/CD4
6,05
25,84
37,21
30,90
Figura 7: Seqüência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de subpopulação de
linfócitos T ativados no sangue periférico. (A) Gráfico de distribuição puntual FSC versus SSC utilizado
para a seleção da população celular de interesse – R1. (B) Gráfico de distribuição puntual FL1/CD4
versus FL2/HLA-DR, contendo as células selecionadas na região R1, empregado para quantificar o
percentual de subpopulações de linfócitos T CD4+ ativados.
PACIENTES, MATERIAL E MÉTODOS
31
H - Análise da densidade de expressão de HLA-DR em linfócitos B
A expressão da molécula HLA-DR na população de linfócitos B foi determinada
através da análise semi-quantitativa por intensidade média de fluorescência (IMF)
conforme descrito a seguir: após a seleção da região de interesse (R1), baseado em
aspectos morfométricos em gráficos de distribuição puntual de tamanho (FSC) versus
granulosidade (SSC), foram construídos gráficos de distribuição puntual de
fluorescência FL1/CD4 e FL1/CD8 versus FL2/HLA-DR, contendo as células
selecionadas em R1, onde foram selecionadas as células CD4- ou CD8- (R2) para
excluir a contaminação com linfócitos T CD4+ e CD8+ ativados em cada análise,
respectivamente. Em seguida foram construídos gráficos de distribuição puntual de
tamanho (FSC) versus FL2/HLA-DR, contendo apenas as células presentes
simultaneamente em “R1 and R2”, para a seleção da população HLA-DR++
correspondente aos linfócitos B. Numa análise final, após a combinação das regiões
“R1 and R2 and R3”, foram criados histogramas unidimensionais de intensidade de
fluorescência FL2/HLA-DR versus número de células para determinar a intensidade
média de fluorescência da expressão do HLA-DR pela população de linfócitos B
previamente selecionada (FIG. 8).
PACIENTES, MATERIAL E MÉTODOS
32
A
Granulosidade
Tamanho
R1
B C
FL2/HLA-DR
FL1/CD4
R2
FL2/HLA-DR
R3
Tamanho
D
Figura 8: Seqüência de procedimentos utilizados para avaliar a expressão da molécula HLA-DR em
linfócitos B no sangue periférico. (A) Gráfico de distribuição puntual FSC versus SSC utilizado para a
seleção da população celular de interesse – R1. (B) Gráfico de distribuição puntual FL1/CD4 versus
FL2/HLA-DR, contendo as células selecionadas na região R1, empregado para selecionar as células
CD4- e eliminar a contaminação com subpopulações de linfócitos T ativados (R2). (C) Gráfico de
distribuição puntual tamanho (FSC) versus FL2/HLA-DR, contendo as células selecionadas
simultaneamente nas regiões “R1 and R2” para a seleção da população HLA-DR++, correspondente aos
linfócitos B. (D) Histograma unidimensional de fluorescência FL2/HLA-DR, contendo as células
selecionadas simultaneamente nas regiões “R1 and R2 and R3”, utilizado para determinar a intensidade
média de fluorescência (IMF) da expressão de HLA-DR por linfócitos B.
PACIENTES, MATERIAL E MÉTODOS
33
3 - Análises Estatísticas
O Teste t de Student foi utilizado para a comparação das médias de dois grupos
de indivíduos, quando as variáveis estudadas apresentavam distribuições
gaussianas ou normais, denominados dados paramétricos com desvios-padrões
semelhantes. Em situações em que as variáveis de interesse apresentavam um
comportamento não gaussiano, ou distribuição não-normal, denominados de dados
não paramétricos, o teste de Mann-Whitney foi empregado para a comparação das
medianas. A determinação da normalidade da distribuição dos valores individuais
para cada variável bem como as análises estatísticas foram realizadas através do
programa GraphPadPrism (GraphPad Software Inc.), versão 3.0.
Para a análise comparativa entre três grupos, empregou-se a análise de variância
(ANOVA), seguida da comparação múltipla pelo teste de Tukey para dados que
apresentavam distribuições gaussianas ou normais, denominados dados
paramétricos com desvios-padrões semelhantes. O teste Kruskal-Wallis seguido pelo
teste de comparações múltiplas de Dunn’s foi utilizado para análises de dados que
apresentavam um comportamento não gaussiano, ou distribuição não-normal,
denominados de dados não paramétricos.
As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p≤ 0,05.
Associações entre aspectos clínico-laboratoriais e parâmetros fenotípicos celulares da imunidade
inata e adaptativa na Leishmaniose Tegumentar Americana
RESULTADOS
RESULTADOS
35
1-
Aspectos fenotípicos de células envolvidas na imunidade inata: ênfase em
monócitos e neutrófilos
RESULTADOS
36
I - Aspectos fenotípicos de monócitos circulantes:
A - Freqüência de “macrófagos - like” (CD16+)
A avaliação do percentual de monócitos CD16+ no sangue periférico foi feita
através de uma estratégia de análise fenotípica específica baseada em parâmetros
morfométricos e imunofenotípicos como ilustrado em Material e Métodos.
Os resultados do percentual de monócitos CD16+ na população de monócitos
totais do sangue periférico de pacientes com LCL e de indivíduos não infectados estão
representados na FIG. 9.
A análise dos dados não mostrou diferença estatística significativa entre o grupo
LCL e o grupo NI (NI=23,70%; LCL=24,06%).
% de monócitos CD16+
0
30
60
Figura 9: Percentual de monócitos CD16+ no sangue periférico de indivíduos com Leishmaniose
Cutânea Localizada LCL ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ). A população de monócitos
circulantes foi identificada através de aspectos morfométricos e imunofenotípicos utilizando-se anticorpo
monoclonal anti-CD16 marcado com PE, segundo protocolo de imunofenotipagem descrito em Material e
Métodos. Os resultados estão expressos como dispersão dos valores individuais (símbolos) e percentual
médio (barras) de monócitos CD16+ na população de monócitos.
RESULTADOS
37
B - Freqüência de monócitos pró-inflamatórios (HLA-DR++)
A avaliação do percentual de monócitos HLA-DR++ na população de monócitos
do sangue periférico foi feita através de uma estratégia de análise fenotípica específica
baseada em parâmetros morfométricos e imunofenotípicos como ilustrado em Material
e Métodos.
O percentual de monócitos pró-inflamatórios (HLA-DR++) na população de
monócitos do sangue periférico de pacientes com LCL e de indivíduos não infectados
está representado na FIG. 10.
A análise dos dados não demonstrou nenhuma diferença estatística significativa
entre o grupo LCL e o grupo NI (NI=81,43%; LCL=83,62%).
0
50
100
% de monócitos HLA-DR++
Figura 10: Percentual médio de monócitos pró inflamatórios (HLA-DR++) no sangue periférico de
indivíduos com Leishmaniose Cutânea Localizada LCL ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ). A
população de monócitos circulantes foi identificada através de aspectos morfométricos e
imunofenotípicos utilizando-se anticorpo monoclonal anti-HLA-DR marcado com PE, segundo protocolo
de imunofenotipagem descrito em Material e Métodos. Os resultados estão representados como
dispersão (símbolos) e a média (barras) de monócitos HLA-DR++ na população de monócitos.
RESULTADOS
38
C - Expressão do receptor CD23 por monócitos
A expressão da molécula CD23 em monócitos do sangue periférico foi feita
através de uma estratégia de análise fenotípica semi-quantitativa como ilustrado em
Material e Métodos. Os monócitos foram inicialmente identificados através de aspectos
morfométricos seguida pela análise imunofenotípica semi-quantitativa.
A FIG. 11 mostra os resultados da intensidade média de fluorescência da
expressão da molécula CD23 em monócitos do sangue periférico de pacientes com
LCL e de indivíduos não infectados. A análise dos dados revelou que o grupo LCL
apresentou uma expressão maior (p<0,05) da molécula CD23, quando comparado ao
grupo NI (NI=4,19; LCL=10,23).
Esses dados enfatizam a implicação da expressão do receptor CD23 por
monócitos, e suscitam a importância de avaliar esse aspecto fenotípico no contexto de
diferentes aspectos clínico-laboratoriais na LCL.
0.1
1
10
100
a
Expressão de CD23 em
monócitos (IMF)
Figura 11: Análise da expressão da molécula CD23 em monócitos do sangue periférico de indivíduos
com Leishmaniose Cutânea Localizada LCL ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ). A população de
monócitos circulantes foi identificada através de aspectos morfométricos e imunofenotípicos utilizando-se
anticorpo monoclonal anti-CD23 marcado com PE, segundo protocolo de imunofenotipagem descrito em
Material e Métodos. Os dados estão expressos sob forma de dispersão (símbolos) e a média (barras) dos
valores de intensidade média de fluorescência (IMF) da expressão da molécula CD23 em monócitos. A
diferença estatística (p<0,05) está identificada pela letra “a” em comparação com o grupo NI.
RESULTADOS
39
II – Aspectos fenotípicos de neutrófilos circulantes:
A - Freqüência de neutrófilos CD28+
A população de neutrófilos do sangue periférico foi avaliada através de uma
estratégia de análise fenotípica específica baseada em parâmetros morfométricos e
imunofenotípicos como ilustrado em Material e Métodos.
A FIG.12 apresenta o percentual de neutrófilos CD28+ na população de
neutrófilos do sangue periférico de pacientes com LCL e de indivíduos não infectados.
A análise dos dados permitiu observar um percentual menor (p<0,05) de
neutrófilos CD28+ no grupo LCL, quando comparado ao grupo NI (NI=6,74%;
LCL=3,84%).
0
11
22
a
%
de neutrófilos CD28+
Figura 12: Percentual de neutrófilos CD28+ no sangue periférico de indivíduos com Leishmaniose
Cutânea Localizada LCL ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ). A população de neutrófilos
circulantes foi identificada através de aspectos morfométricos e imunofenotípicos utilizando-se anticorpo
monoclonal anti-CD28 marcado com PE, segundo protocolo de imunofenotipagem descrito em Material e
Métodos. Os resultados estão expressos como dispersão dos valores individuais (símbolos) e percentual
médio (barras) de neutrófilos CD28+ na população de neutrófilos. A diferença estatística (p<0,05) está
identificada pela letra “a” em comparação com o grupo NI.
RESULTADOS
40
B - Freqüência de neutrófilos HLA-DR+
A população de neutrófilos do sangue periférico foi avaliada através de uma
estratégia de análise fenotípica específica baseada em parâmetros morfométricos e
imunofenotípicos como ilustrado em Material e Métodos.
A FIG. 13 apresenta o percentual de neutrófilos HLA-DR+ na população de
neutrófilos do sangue periférico de pacientes com LCL e de indivíduos não infectados.
A análise dos dados mostrou que o grupo LCL apresentou um valor percentual
de neutrófilos HLA-DR+ significativamente maior (p
<0,05)
que o grupo NI (NI=3,16%;
LCL=4,98%).
0
7.5
15
a
% de neutrófilos HLA-DR+
Figura 13:
Percentual de neutrófilos HLA-DR+ no sangue periférico de indivíduos com Leishmaniose
Cutânea Localizada LCL ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ). A população de neutrófilos
circulantes foi identificada através de aspectos morfométricos e imunofenotípicos utilizando-se anticorpo
monoclonal anti-HLA-DR marcado com PE, segundo protocolo de imunofenotipagem descrito em Material
e Métodos. Os resultados estão expressos como dispersão dos valores individuais (símbolos) e
percentual médio (barras) de neutrófilos HLA-DR+ na população de neutrófilos. A diferença estatística
(p<0,05) está identificada pela letra “a” em comparação com o grupo NI.
RESULTADOS
41
C - Densidade de expressão do receptor CD16 por neutrófilos
A avaliação da expressão da molécula CD16 em neutrófilos do sangue periférico
foi feita através de uma estratégia de análise fenotípica semi-quantitativa como ilustrado
em Material e Métodos. Os neutrófilos foram inicialmente identificados através de
aspectos morfométricos seguida pela análise imunofenotípica semi-quantitativa.
A FIG. 14 mostra os resultados da expressão da molécula CD16 por neutrófilos
do sangue periférico de pacientes com LCL e de indivíduos não infectados.
A análise dos resultados mostrou que os pacientes com LCL apresentaram uma
expressão menor (p<0,05) dessa população, quando comparado ao grupo NI
(NI=441,26; LCL=185,37).
1
100
10000
a
Expressão de CD16 em
neutrófilos (IMF)
Figura 14:
Análise da expressão de CD16 em neutrófilos no sangue periférico de indivíduos com
Leishmaniose Cutânea Localizada LCL ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ). A população de
neutrófilos circulantes foi identificada através de aspectos morfométricos e imunofenotípicos utilizando-se
anticorpo monoclonal anti-CD16 marcado com PE, segundo protocolo de imunofenotipagem descrito em
Material e Métodos. Os resultados estão expressos como dispersão e a média dos valores de intensidade
média de fluorescência (IMF) da expressão de CD16 por neutrófilos. A diferença estatística (p<0,05) está
identificada pela letra “a” em comparação com o grupo NI.
RESULTADOS
42
D - Freqüência de neutrófilos CD23+
A avaliação do percentual de neutrófilos CD23+ no sangue periférico foi feita
através de uma estratégia de análise fenotípica específica baseada em parâmetros
morfométricos e imunofenotípicos como ilustrado em Material e Métodos.
A FIG. 15 mostra os resultados do percentual de neutrófilos CD23+ na população
de neutrófilos do sangue periférico, em pacientes com LCL e de indivíduos não
infectados.
A análise dos dados mostrou um percentual maior (p<0,05) de neutrófilos CD23+
no grupo LCL, em relação ao grupo NI (NI=1,35%; LCL=2,40%).
Em conjunto, nossos resultados mostram pela primeira vez, a importância de se
avaliar a expressão de receptores por neutrófilos circulantes no contexto da LCL,
incluindo os marcadores HLA-DR, CD28, CD23 e CD16, e sugerem a participação de
células envolvidas na imunidade inata no âmbito da resposta imune durante a infecção
por parasitos do sub-gênero Viannia. Nesse contexto, os resultados chamam a atenção
para a importância de avaliar esse aspecto fenotípico no contexto de diferentes
aspectos clínico-laboratoriais na LCL.
0
3
6
% de neutrófilos CD23+
a
Figura 15:
Percentual de neutrófilos CD23+ no sangue periférico de indivíduos com Leishmaniose
Cutânea Localizada LCL ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ). A população de neutrófilos circulantes
foi identificada através de aspectos morfométricos e imunofenotípicos utilizando-se anticorpo monoclonal
anti-CD23 marcado com PE, segundo protocolo de imunofenotipagem descrito em Material e Métodos.
Os resultados estão expressos através de dispersão dos valores individuais (símbolos) e percentual
médio (barras) de neutrófilos CD23+ na população de neutrófilos. A diferença estatística (p<0,05) está
identificada pela letra “a” em comparação com o grupo NI.
RESULTADOS
43
2 - Aspectos fenotípicos de células envolvidas na imunidade adaptativa: ênfase
em subpopulações linfocitárias
RESULTADOS
44
I - Aspectos fenotípicos de linfócitos T circulantes:
A - Freqüência de subpopulações de linfócitos T (CD4+ e CD8+)
Para avaliar o percentual de linfócitos T totais (CD3+) do sangue periférico foi
calculado a média dos valores de células CD3+ obtidos em análises paralelas, como
descrito em Material e Métodos. A avaliação do percentual das subpopulações de
linfócitos T (CD4+ e CD8+) na população de linfócitos totais do sangue periférico foi
realizada através de ensaios de dupla marcação e os resultados obtidos através da
análise convencional como ilustrado em Material e Métodos.
Os resultados do percentual de linfócitos T totais (CD3+) do sangue periférico de
pacientes com LCL e de indivíduos não infectados estão representados na FIG. 16A.
A análise dos resultados demonstrou que os indivíduos infectados apresentaram
um percentual de linfócitos T CD3+ circulantes, significativamente maior (p<0,05),
quando comparado ao grupo NI (NI=57,91%; LCL=65,98%).
As FIGs. 16B e 16C apresentam os resultados dos percentuais de linfócitos T
CD4+ e CD8+ na população de linfócitos totais do sangue periférico de pacientes com
LCL e de indivíduos não infectados.
A análise dos resultados demonstrou que os indivíduos infectados apresentaram
um percentual de linfócitos T CD4+ (NI=31,60%; LCL=35,62%) e T CD8+ (NI=23,34%;
LCL=27,70%) significativamente maior (p<0,05), quando comparado ao grupo NI.
RESULTADOS
45
A
0
50
100
a
% de Linfócitos T em
Linfócitos Totais
B C
0
25
50
a
% de Linfócitos CD4+ em
Linfócitos Totais
0
25
50
a
% de Linfócitos CD8+ em
Linfócitos Totais
Figura 16:
Percentual médio de linfócitos T (A), linfócitos T CD4+ (B) e linfócitos T CD8+ (C) circulantes
no sangue periférico de indivíduos com Leishmaniose Cutânea Localizada LCL ( ) e de indivíduos não
infectados NI ( ).O percentual de linfócitos T totais foi calculado como a média dos valores de células
CD3+ obtidos em análises paralelas. A população de linfócitos T CD4+ e T CD8+ foi, inicialmente,
identificada através de aspectos morfométricos seguida pela análise imunofenotípica utilizando-se
anticorpos monoclonais anti-CD4 e anti-CD8 marcados com FITC e anti-CD3 marcado com PE, segundo
protocolo de imunofenotipagem descrito em Material e Métodos. Os resultados estão apresentados como
dispersão dos valores individuais (símbolos) e a média (barras) do percentual das células T (A) e T CD4+
(B) e linfócitos T CD8+ (C) na população de linfócitos totais. As diferenças estatísticas (p<0,05) estão
identificadas pela letra “a” em comparação com o grupo NI.
RESULTADOS
46
B - Freqüência de subpopulações de linfócitos T ativados (HLA-DR+)
A avaliação do percentual das células T totais ativadas (HLA-DR+) no sangue
periférico foi estimada através do somatório de linfócitos T CD4+ e T CD8+ ativados. A
avaliação do percentual das subpopulações de linfócitos T CD4+ e T CD8+ ativadas
(HLA-DR+) do sangue periférico foi feita através de ensaios de dupla marcação, como
ilustrado em Material e Métodos.
A FIG. 17A mostra o percentual de linfócitos T totais ativados no sangue
periférico de pacientes com LCL e de indivíduos não infectados.
A análise dos dados demonstrou que os indivíduos infectados apresentaram um
percentual de linfócitos T HLA-DR+ significativamente maior (p<0,05), quando
comparado com os indivíduos não infectados (NI=3,75; LCL=20,34).
Os percentuais de linfócitos T CD4+ HLA-DR+ e T CD8+ HLA-DR+ na população
de linfócitos totais do sangue periférico de pacientes com LCL e de indivíduos não
infectados estão representados nas FIGs. 17B e 17C.
A análise dos dados demonstrou que os indivíduos infectados apresentaram um
percentual de linfócitos T CD4+ HLA-DR+ (NI=1,97%; LCL=8,15%) e linfócitos T CD8+
HLA-DR+ (NI=1,78%; LCL=12,19%) significativamente maior (p<0,05), quando
comparado com os indivíduos não infectados.
RESULTADOS
47
A
0.0
20.5
41.0
a
% de Linfócitos T HLA-DR+
B C
% de Linfócitos T CD8+ HLA-DR+
em Linfócitos Totais
0
16
32
a
0.0
10.5
21.0
% de Linfócitos T CD4+ HLA-DR+
em Linfócitos Totais
a
Figura 17:
:
Percentual de linfócitos T totais HLA-DR+ (A), linfócitos T CD4+HLA-DR+ (B) e linfócitos T
CD8+HLA-DR+ (C) circulantes no sangue periférico de indivíduos com Leishmaniose Cutânea Localizada
LCL ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ). O percentual de linfócitos T totais ativados foi estimado
através do somatório de linfócitos CD4+ e CD8+ co-expressando o marcador HLA-DR. A população de
linfócitos T CD4+ e T CD8+ ativados foi inicialmente identificada através de aspectos morfométricos
seguida pela análise imunofenotípica, utilizando-se anticorpos monoclonais anti-CD4 e anti-CD8
marcados com FITC e anti-HLA-DR marcado com PE, segundo protocolo de imunofenotipagem descrito
em Material e Métodos. Os resultados estão expressos sob forma de dispersão dos valores individuais
(símbolos) e percentual médio (barras) de linfócitos T totais HLA-DR+ na população de linfócitos totais e
das subpopulações de linfócitos T CD4+ e T CD8+ ativados nas populações de linfócitos totais. As
diferenças estatísticas (p<0,05) estão identificadas pela letra “a” em comparação com o grupo NI.
RESULTADOS
48
Visando investigar o balanço da ativação de linfócitos T CD4+ e CD8+ durante a
infecção por Leishmania, realizamos uma análise adicional da razão entre os valores
percentuais de células CD8+HLA-DR+/CD4+HLA-DR+.
Os resultados da razão entre os linfócitos T CD8+ HLA-DR+ e T CD4+ HLA-DR+
no sangue periférico de pacientes com LCL e de indivíduos não infectados estão
representados na FIG. 18.
A análise dos dados demonstrou que os indivíduos infectados apresentaram uma
razão CD8+HLA-DR+/CD4HLA-DR+ (NI=1,31%; LCL=1,55%) significativamente maior
(p<0,05) quando comparado com os indivíduos não infectados.
Razão de Linfócitos T CD8+
HLA-DR+/CD4+HLA-DR+
0.0
2.5
5.0
a
Figura 18:
:
Razão entre linfócitos T CD8+HLA-DR+/CD4+HLA-DR+ circulantes no sangue periférico de
indivíduos com Leishmaniose Cutânea Localizada LCL ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ). Os
resultados estão expressos sob forma de dispersão dos valores individuais (símbolos) e da razão de
linfócitos T CD8+HLA-DR+/CD4+HLA-DR+ (barras). A diferença estatística (p<0,05) está identificada pela
letra “a” em comparação com o grupo NI.
RESULTADOS
49
II - Aspectos fenotípicos de linfócitos B circulantes:
A - Freqüência de subpopulações de linfócitos B (CD5- e CD5+)
Para avaliar o percentual de linfócitos B e subpopulações de linfócitos B
convencionais (CD19+CD5-) e linfócitos B1 (CD19+CD5+) na população de linfócitos
totais do sangue periférico foram realizados ensaios de dupla marcação e os resultados
foram obtidos através da análise convencional, como ilustrado em Material e Métodos.
O percentual de linfócitos B (CD19+) na população de linfócitos totais do sangue
periférico está representado na FIG. 19A.
A análise dos dados não demonstrou diferença significativa na comparação de
pacientes com LCL e de indivíduos não infectados (NI=11,39%; LCL=13,78%).
Os resultados do percentual de linfócitos B convencionais (CD19+CD5-) na
população de linfócitos totais do sangue periférico estão apresentados na FIG. 19B.
A análise dos dados demonstrou que não houve diferença estatisticamente
significativa entre o grupo de pacientes com LCL e o grupo NI (NI=10,59%;
LCL=10,93%).
A FIG. 19C apresenta os resultados do percentual de linfócitos B1 (CD19+CD5+)
na população de linfócitos totais do sangue periférico.
A análise dos resultados não mostrou diferença estatisticamente significativa
entre o grupo de pacientes com Leishmaniose Cutânea e o grupo NI (NI=2,57%;
LCL=2,69%).
RESULTADOS
50
A
0
17
34
% de Linf
ó
citos B em
Linfócitos Totais
B C
0
15
30
% de Linfócitos CD19+ CD5-
em Linfócitos Totais
% de Linfócitos CD19+ CD5+
em Linfócitos Totais
0
5
10
Figura 19: Percentual médio de linfócitos B totais CD19+ (A), B convencionais CD19+CD5- (B) e
linfócitos B1 CD19+CD5+ (C) no sangue periférico de indivíduos com Leishmaniose Cutânea Localizada
LCL ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ). A população de linfócitos foi inicialmente identificada
através de aspectos morfométricos seguida pela análise imunofenotípica utilizando-se anticorpos
monoclonais anti-CD5 marcados com FITC e anti-CD19 marcado com PE, segundo protocolo de
imunofenotipagem descrito em Material e Métodos. Os resultados estão expressos como dispersão dos
valores individuais (símbolos) e percentual médio (barras) dos linfócitos B totais, B convencionais e
linfócitos B1 na população de linfócitos totais.
RESULTADOS
51
B - Densidade de expressão de HLA-DR em linfócitos B
A avaliação da expressão da molécula HLA-DR em linfócitos B na população de
linfócitos totais do sangue periférico foi feita através de uma estratégia de análise
fenotípica semi-quantitativa, como ilustrado em Material e Métodos. Os linfócitos foram
inicialmente identificados através de aspectos morfométricos, seguida pela análise
imunofenotípica semi-quantitativa.
A FIG.20 mostra os resultados da expressão da molécula HLA-DR em linfócitos
B do sangue periférico de pacientes com LCL e de indivíduos não infectados.
A análise dos dados demonstrou uma expressão maior de HLA-DR+ em
linfócitos B no grupo LCL (p<0,05), quando comparado com o grupo NI (NI=306,00;
LCL=3782,71).
1
100
10000
Expressão de HLA-DR em
Linfócitos B (IMF)
a
Figura 20: Análise da expressão da molécula HLA-DR em linfócitos B circulantes do sangue periférico de
indivíduos com Leishmaniose Cutânea Localizada LCL ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ). A
população de linfócitos foi inicialmente identificada através de aspectos morfométricos seguida pela
análise imunofenotípica utilizando-se anticorpo monoclonal anti-HLA-DR marcado com PE, segundo
protocolo de imunofenotipagem descrito em Material e Métodos. Os resultados estão expressos sob
forma de dispersão (símbolos) e a média (barras) dos valores de intensidade média de fluorescência
(IMF) da expressão de HLA-DR. A diferença estatística (p<0,05) está identificada pela letra “a” em
comparação com o grupo NI.
RESULTADOS
52
C - Freqüência de linfócitos B CD23+
Para avaliar a expressão da molécula CD23 em linfócitos B na população de
linfócitos totais do sangue periférico foram feitos ensaios de dupla marcação, como
descrito em Material e Métodos.
A FIG. 21 demonstra o percentual de linfócitos CD19+CD23+ na população de
linfócitos totais do sangue periférico de pacientes com LCL e de indivíduos não
infectados.
A análise dos dados revelou que o grupo LCL apresentou um percentual maior
(p<0,05) de linfócitos B CD23+, em relação ao grupo NI (NI=2,16%; LCL=9,99%).
Em suma, nossos dados referentes aos aspectos imunfenotípicos de linfócitos T
e B reforçam os relatos do estabelecimento de mecanismos de imunidade celular e
humoral durante a infecção por Leishmania. Dessa forma, torna-se relevante avaliar a
participação seletiva de subpopulações celulares nesse contexto, considerando
diferentes aspectos clínico-laboratoriais dos pacientes portadores de LCL.
a
0.0
10.5
21.0
% de Linfócitos B CD23+
em Linfócitos Totais
Figura 21: Percentual de linfócitos CD19+CD23+ no sangue periférico de indivíduos com Leishmaniose
Cutânea Localizada ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ). As populações celulares foram marcadas
utilizando-se anticorpos monoclonais anti-CD19 marcados com FITC e anti-CD23 marcado com PE,
segundo protocolo de imunofenotipagem descrito em Material e Métodos. Os resultados estão expressos
através de dispersão dos valores individuais (símbolos) e média percentual (barras) de linfócitos
CD19+CD23+ na população de linfócitos totais. A diferença estatística (p<0,05) está identificada pela
letra “a” em comparação com o grupo NI.
RESULTADOS
53
Balanço da resposta imune na LCL:
Visando investigar o balanço do envolvimento da resposta imune inata e
adaptativa durante a infecção por Leishmania, realizamos uma análise adicional da
razão entre os valores absolutos de monócitos pró-inflamatórios (HLA-DR++) e células
CD19+CD23+ por mm
3
de sangue (DECKER et al., 2003).
Os resultados da razão entre os valores absolutos de monócitos pró-
inflamatórios (HLA-DR++) e células B CD23+ no sangue periférico de pacientes com
LCL e de indivíduos não infectados estão representados na FIG. 22A.
A análise dos dados demonstrou que os indivíduos infectados apresentaram uma
razão entre monócitos pró-inflamatórios (HLA-DR++) e células B CD23+
significativamente menor (p<0,05), quando comparados com os indivíduos não
infectados (NI=22,96; LCL=3,46).
Numa outra abordagem, calculamos a razão entre os valores absolutos de
monócitos pró-inflamatórios (HLA-DR++) e células CD8+HLA-DR+ por mm
3
de sangue.
Os resultados dessa razão estão representados na FIG. 22B.
A análise dos dados demonstrou que os indivíduos infectados apresentaram uma
razão entre monócitos pró-inflamatórios (HLA-DR++) e CD8+HLA-DR+
significativamente menor (p<0,05), quando comparados com os indivíduos não
infectados (NI=23,65; LCL=2,96).
A fim de avaliar o balanço da resposta imune celular e humoral, calculamos a
razão entre linfócitos T totais ativados e linfócitos B totais no sangue periférico de
pacientes com LCL e de indivíduos não infectados. A FIG. 22C apresenta os resultados
dessa razão.
A análise dos resultados revelou que os indivíduos infectados apresentam uma
razão entre linfócitos T totais ativados e linfócitos B totais, significativamente maior
(p<0,05), quando comparados com os indivíduos não infectados (NI=0,37%;
LCL=2,07%).
Em conjunto, esses dados relativos ao balanço da resposta imune inata em
relação à imunidade adaptativa celular e humoral sugerem um papel importante da
imunidade adaptativa na LCL. Entretanto, considerando os achados referentes aos
aspectos imunofenotípicos de linfócitos T e Linfócitos B, demonstrados nesse estudo,
acreditamos na importância de uma avaliação mais detalhada da participação seletiva
RESULTADOS
54
de subpopulações celulares nesse contexto, considerando diferentes aspectos clínico-
laboratoriais do pacientes portadores de LCL.
A B
0
28
56
Monócitos HLA-RD++/
CD19+CD23+
a
0
21
42
Monócitos HLA-RD++/
CD8+HLA-DR+
a
C
0.0
2.5
5.0
7.5
a
Linfócitos T HLA-DR+/CD19+
Figura 22: Razão entre Monócitos HLA-DR+/Linfócitos T CD19+CD23+ (A), Monócitos HLA-
DR+/Linfócitos T CD8+HLA-DR+ (B) e Linfócitos T HLA-DR+/CD19+ circulantes (C) no sangue periférico
de indivíduos com Leishmaniose Cutânea Localizada LCL ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ). Os
resultados das razões entre a resposta imune inata e adaptativa (A e B) foram calculados empregando-se
os valores absolutos de células/mm3 de sangue enquanto os resultados da razão entre a resposta imune
celular e humoral foram calculados empregando-se os valores percentuais de células na população de
linfócitos totais. Os resultados estão expressos sob forma de dispersão dos valores individuais (símbolos)
e percentual médio (barras) da razão de Monócitos HLA-DR+/Linfócitos T CD19+CD23+, Monócitos HLA-
DR+/Linfócitos T CD8+HLA-DR+ e Linfócitos T CD3+HLA-DR+/ Linfócito B total. As diferenças
estatísticas (p<0,05) estão identificadas pela letra “a” em comparação com o grupo NI.
RESULTADOS
55
3 - Associações entre aspectos clínico-laboratoriais e parâmetros fenotípicos
celulares da imunidade inata e adapatativa: ênfase no número e tempo das lesões
e na positividade da intradermorreação de Montenegro
RESULTADOS
56
Durante a infecção por parasitos do sub-gênero Viannia, diversos aspectos
clínico-laboratoriais tornam-se evidentes e sugerem sua possível utilização como
indicadores importantes de aspectos inerentes à patogenia e à morbidade na LCL.
Nesse contexto, selecionamos dois parâmetros clínicos e um parâmetro laboratorial que
consideramos de interesse e com impacto importante nos aspectos imunológicos da
LCL, como relatados a seguir, incluindo: número e tempo das lesões e a positividade da
intradermorreação de Montenegro. Dessa forma, os pacientes portadores de LCL
incluídos nesse estudo foram categorizados em função desses aspectos clínico-
laboratoriais e procedemos a análises subseqüentes dos imunofenótipos previamente
relatados em nosso estudo.
I - Aspectos fenotípicos de monócitos circulantes:
A - Freqüência de “macrófagos - like” (CD16+)
A avaliação do percentual de monócitos CD16+ no sangue periférico foi feita
através de uma estratégia de análise fenotípica específica baseada em parâmetros
morfométricos e imunofenotípicos, como ilustrado em Material e Métodos.
Os resultados do percentual de monócitos CD16+ na população de monócitos
totais do sangue periférico de pacientes com LCL, categorizados em função de
aspectos clínico-laboratoriais, estão representados na FIG. 23.
A análise dos dados não mostrou diferença estatística significativa entre os
subgrupos de pacientes portadores de LCL em relação ao grupo NI (NI=23,70%; LCL-
1=24,38%; LCL-2-4=22,87%; LCL60=25,75%; LCL>60=20,68%; LCL-TM-=23,64%;
LCL-TM+=24,06%).
RESULTADOS
57
A B
0
30
60
% de monócitos CD16+
0
25
50
% de monócitos CD16+
C
30
60
% de monócitos CD16+
Figura 23: Percentual de monócitos CD16+ no sangue periférico de pacientes portadores de
Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-laboratorias como: (A)
LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos
não infectados NI ( ). A população de monócitos circulantes foi identificada através de aspectos
morfométricos e imunofenotípicos utilizando-se anticorpo monoclonal anti-CD16 marcado com PE,
segundo protocolo de imunofenotipagem descrito em Material e Métodos. Os resultados estão expressos
como dispersão dos valores individuais (símbolos) e percentual médio (barras) de monócitos CD16+ na
população de monócitos.
RESULTADOS
58
B - Freqüência de monócitos pró-inflamatórios (HLA-DR++)
A avaliação do percentual de monócitos HLA-DR++ na população de monócitos
do sangue periférico foi feita através de uma estratégia de análise fenotípica específica
baseada em parâmetros morfométricos e imunofenotípicos, como ilustrado em Material
e Métodos.
O percentual de monócitos pró-inflamatórios (HLA-DR++) na população de
monócitos do sangue periférico de pacientes com LCL, categorizados em função de
aspectos clínico-laboratoriais, estão representados na FIG. 24
A análise dos dados não mostrou diferença estatística significativa entre os
subgrupos de pacientes portadores de LCL em relação ao grupo NI (NI=81,43%; LCL-
1=84,01%; LCL-2-4=82,49%; LCL60=85,85%; LCL>60=79,15%; LCL-TM-=87,85%;
LCL-TM+=82,65%).
RESULTADOS
59
A B
% de monócitos HLA-DR++
0
50
100
0
50
100
% de monócitos HLA-DR++
C
0
50
100
% de monócitos HLA-DR++
Figura 24: Percentual de monócitos pró-inflamatórios HLA-DR++ no sangue periférico de pacientes
portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-
laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-
TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ). A população de monócitos circulantes foi identificada
através de aspectos morfométricos e imunofenotípicos utilizando-se anticorpo monoclonal anti-HLA-DR
marcado com PE, segundo protocolo de imunofenotipagem descrito em Material e Métodos. Os
resultados estão representados como dispersão (símbolos) e a média (barras) de monócitos HLA-DR++
na população de monócitos.
RESULTADOS
60
C - Expressão do receptor CD23 por monócitos
A expressão de CD23 em monócitos na população de monócitos do sangue
periférico foi feita através de uma estratégia de análise fenotípica semi-quantitativa,
como ilustrado em Material e Métodos. Os monócitos foram inicialmente identificados
através de aspectos morfométricos, seguida pela análise imunofenotípica semi-
quantitativa.
Os resultados da intensidade média de fluorescência da expressão da molécula
CD23 em monócitos do sangue periférico de pacientes, categorizados em função de
aspectos clínico-laboratoriais, estão representados na FIG. 25.
A análise dos dados revelou que os grupos LCL-1, LCL- 2-4, LCL60 e LCL >60
apresentaram uma expressão maior (p<0,05) da molécula CD23 em monócitos, quando
comparado ao grupo NI (NI=4,19; LCL-1=10,95; LCL-2-4=8,20; LCL60=9,20; LCL>60=
12,31).
A análise dos resultados mostrou ainda que apenas grupo LCL-TM+ apresentou
uma maior (p<0,05) expressão de CD23 em relação ao grupo NI (NI=4,19; LCL-TM-
=7,58; LCL-TM+=10,84).
Esses achados enfatizam a implicação da expressão do receptor CD23 por
monócitos, inerente ao contexto da LCL, independente dos aspectos clínico-
laboratoriais do paciente, com exceção da positividade no TM.
RESULTADOS
61
A B
0.1
1
10
100
Expressão de CD23 em
monócitos (IMF)
a
a
Expressão de CD23 em
monócitos (IMF)
0.1
1
10
100
a
a
C
0.1
1
10
100
Expressão de CD23 em
monócitos (IMF)
a
Figura 25: Análise da expressão da molécula CD23 em monócitos no sangue periférico de pacientes
portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-
laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-
TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ). A população de monócitos circulantes foi identificada
através de aspectos morfométricos e imunofenotípicos utilizando-se anticorpo monoclonal anti-CD23
marcado com PE, segundo protocolo de imunofenotipagem descrito em Material e Métodos. Os dados
estão expressos sob forma de dispersão (símbolos) e a média (barras) dos valores de intensidade média
de fluorescência (IMF) da expressão da molécula CD23 em monócitos. As diferenças estatísticas
(p<0,05) estão identificadas pela letra “a” em comparação com o grupo NI.
RESULTADOS
62
II – Aspectos fenotípicos de neutrófilos circulantes:
A - Freqüência de neutrófilos CD28+
A avaliação do percentual de neutrófilos CD28+ no sangue periférico foi feita
através de uma estratégia de análise fenotípica específica baseada em parâmetros
morfométricos e imunofenotípicos, como ilustrado em Material e Métodos.
Os resultados do percentual de neutrófilos CD28+ na população de neutrófilos do
sangue periférico de pacientes com LCL, categorizados em função de aspectos clínico-
laboratoriais, estão representados na FIG. 26.
A análise dos dados mostrou que apenas os grupos LCL-1, LCL60 e LCL-TM+
apresentam um percentual menor (p<0,05) de neutrófilos CD28+, quando comparados
ao grupo NI (NI=6,74%; LCL-1=3,18%; LCL-2-4=5,74%; LCL60=3,06%;
LCL>60=5,41%; LCL-TM-=3,59%; LCL-TM+=3,90%).
Esses achados sugerem a participação precoce de células envolvidas na
imunidade inata no âmbito da resposta imune durante a infecção por parasitos do sub-
gênero Viannia, quando analisamos os subgrupos LCL60 e LCL>60.
RESULTADOS
63
A B
a
0
11
22
%
de neutrófilos CD28
+
%
de neutrófilos CD28
+
0
11
22
a
C
%
de neutrófilos CD28
+
0
11
22
a
Figura 26: Percentual de neutrófilos CD28+ no sangue periférico de pacientes portadores de
Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-laboratorias como: (A)
LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos
não infectados NI ( ). A população de neutrófilos circulantes foi identificada através de aspectos
morfométricos e imunofenotípicos utilizando-se anticorpo monoclonal anti-CD28 marcado com PE,
segundo protocolo de imunofenotipagem descrito em Material e Métodos. Os dados estão expressos sob
forma de dispersão (símbolos) e a média (barras) de neutrófilos CD28+ na população de neutrófilos. As
diferenças estatísticas (p<0,05) estão identificadas pela letra “a” em comparação com o grupo NI.
RESULTADOS
64
B - Freqüência de neutrófilos HLA-DR+
A população de neutrófilos do sangue periférico foi avaliada através de uma
estratégia de análise fenotípica específica baseada em parâmetros morfométricos e
imunofenotípicos, como ilustrado em Material e Métodos.
Os resultados do percentual de neutrófilos HLA-DR+ na população de neutrófilos
do sangue periférico de pacientes com LCL, categorizados em função de aspectos
clínico-laboratoriais, estão representados na FIG. 27.
A análise dos resultados revelou que apenas o grupo LCL60 dias apresenta um
valor percentual de neutrófilos HLA-DR+ significativamente maior (p<0,05), em relação
ao grupo NI (NI=3,16%; LCL60=5,11%; LCL>60=4,72%).
A análise dos resultados não demonstrou diferença estatística na análise dos
resultados entre os grupos LCL-1, LCL-2-4, LCL-TM- e LCL-TM+, em relação ao grupo
NI (NI=3,16%; LCL-1=4,92%; LCL-2-4=5,14%; LCL-TM-=4,87%; LCL-TM+=5,00%).
Esses resultados reforçam o envolvimento precoce de células associadas à
imunidade inata no âmbito da resposta imune durante a infecção por parasitos do sub-
gênero Viannia, quando analisamos os subgrupos LCL60 e LCL>60.
RESULTADOS
65
A B
0.0
7.5
15.0
% de neutrófilos HLA-DR+
0.0
7.5
15.0
% de neutrófilos HLA-DR+
a
C
0.0
7.5
15.0
% de neutrófilos HLA-DR
+
Figura 27: Percentual de neutrófilos HLA-DR+ no sangue periférico de pacientes portadores de
Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-laboratorias como: (A)
LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos
não infectados NI ( ). A população de neutrófilos circulantes foi identificada através de aspectos
morfométricos e imunofenotípicos utilizando-se anticorpo monoclonal anti-HLA-DR marcado com PE,
segundo protocolo de imunofenotipagem descrito em Material e Métodos. Os dados estão expressos sob
forma de dispersão (símbolos) e a média (barras) de neutrófilos HLA-DR+ na população de neutrófilos. A
diferença estatística (p<0,05) está identificada pela letra “a” em comparação com o grupo NI.
RESULTADOS
66
C - Densidade de expressão do receptor CD16 por neutrófilos
A avaliação da expressão da molécula CD16 em neutrófilos do sangue periférico
foi feita através de uma estratégia de análise fenotípica semi-quantitativa, como
ilustrado em Material e Métodos. Os neutrófilos foram inicialmente identificados através
de aspectos morfométricos, seguida pela análise imunofenotípica semi-quantitativa.
A FIG. 28 mostra os resultados da expressão de CD16 por neutrófilos na
população de neutrófilos do sangue periférico de pacientes com LCL, categorizados em
função de aspectos clínico-laboratoriais.
Foi demonstrada através das análises dos dados uma menor expressão de
CD16 nos neutrófilos (p<0,05) nos grupos LCL-1, LCL60, LCL>60 e LCL-TM+, quando
comparado ao grupo NI (NI=441,26; LCL-1=181,56; LCL-2-4=195,72; LCL60=198,83;
LCL>60=159,95; LCL-TM-=184,83; LCL-TM+=185,50).
Esses dados sugerem o envolvimento da interface entre a resposta imune celular
inata e a resposta imune adaptativa via imunocomplexos no contexto da resposta imune
durante a infecção por parasitos do sub-gênero Viannia, preferencialmente nos eventos
mais tardios, quando analisamos os subgrupos LCL60 e LCL>60.
RESULTADOS
67
A B
1
100
10000
a
a
1
100
10000
a
Expressão de CD16 em
neutrófilos (IMF)
Expressão de CD16 em
neutrófilos (IMF)
C
a
1
100
10000
Expressão de CD16 em
neutrófilos (IMF)
Figura 28: Análise da expressão de CD16 em neutrófilos no sangue periférico de pacientes portadores
de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-laboratorias como:
(A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+ ( ) e de
indivíduos não infectados NI ( ). A população de neutrófilos circulantes foi identificada através de
aspectos morfométricos e imunofenotípicos utilizando-se anticorpo monoclonal anti-CD16 marcado com
PE, segundo protocolo de imunofenotipagem descrito em Material e Métodos. Os resultados estão
expressos como dispersão e a média dos valores de intensidade média de fluorescência (IMF) da
expressão de CD16 por neutrófilos. As diferenças estatísticas (p<0,05) estão identificadas pela letra “a”
em comparação com o grupo NI.
RESULTADOS
68
D - Freqüência de neutrófilos CD23+
A avaliação do percentual de neutrófilos CD23+ no sangue periférico foi feita
através de uma estratégia de análise fenotípica específica baseada em parâmetros
morfométricos e imunofenotípicos, como ilustrado em Material e Métodos.
A FIG. 29 mostra os resultados do percentual de CD23 por neutrófilos na
população de neutrófilos do sangue periférico de pacientes com LCL, categorizados em
função de aspectos clínico-laboratoriais.
Foi observado, através das análises dos resultados, um maior percentual de
neutrófilos CD23+ (p<0,05) nos grupos LCL-2-4, LCL60 e LCL-TM+, quando
comparado ao grupo NI (NI=1,35%; LCL-1=2,17%; LCL-2-4=3,09%; LCL60=2,44%;
LCL>60=2,33%; LCL-TM-=3,59%; LCL-TM+=3,90%).
Novamente, os resultados confirmam a presença precoce de células
relacionadas à imunidade inata no âmbito da resposta imune durante a infecção,
sugerindo uma queda na participação dos neutrófilos nos eventos mais tardios, quando
analisamos os subgrupos LCL60 e LCL>60.
RESULTADOS
69
A B
0
3
6
% de neutrófilos CD23+
a
% de neutrófilos CD23+
a
0
3
6
C
% de neutrófilos CD23
+
a
0
3
6
Figura 29: Percentual de neutrófilos CD23+ no sangue periférico de pacientes portadores de
Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-laboratorias como: (A)
LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos
não infectados NI ( ). A população de neutrtófilos circulantes foi identificada através de aspectos
morfométricos e imunofenotípicos utilizando-se anticorpo monoclonal anti-CD23 marcado com PE,
segundo protocolo de imunofenotipagem descrito em Material e Métodos. Os resultados estão expressos
como dispersão dos valores individuais (símbolos) e percentual médio de neutrófilos CD23+. As
diferenças estatísticas (p<0,05) estão identificadas pela letra “a” em comparação coms os grupos NI.
RESULTADOS
70
III - Aspectos fenotípicos de linfócitos T circulantes:
A - Freqüência de subpopulações de linfócitos T (CD4+ e CD8+)
O percentual de linfócitos T totais (CD3+) do sangue periférico foi calculado
como a média dos valores de células CD3+ obtidos em análises paralelas, como
descrito em Material e Métodos.
A FIG. 30 mostra os resultados do percentual de linfócitos T totais (CD3+) do
sangue periférico de pacientes com LCL, categorizados em função de aspectos clínico-
laboratoriais.
A análise dos resultados demonstrou que os grupos LCL-1, LCL60 e LCL-TM+
apresentam maior (p<0,05) percentual de linfócitos T CD3+ circulantes quando
comparado ao grupo NI (NI=57,91%; LCL-1=66,97%; LCL-2-4=63,13%;
LCL60=65,87%; LCL>60=66,19%; LCL-TM-=64,99%; LCL-TM+=66,20%).
RESULTADOS
71
A B
0
50
100
% de Linfócitos T em
Linfócitos Totais
a
a
0
50
100
% de Linfócitos T em
Linfócitos Totais
C
0
50
100
a
% de Linfócitos T em
Linfócitos Totais
Figura 30: Percentual médio de linfócitos T circulantes no sangue periférico de pacientes portadores de
Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-laboratorias como: (A)
LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos
não infectados NI ( ).O percentual de linfócitos T totais foi calculado como a média dos valores de
células CD3+ obtidos em análises paralelas. Os resultados estão apresentados como dispersão dos
valores individuais (símbolos) e a média (barras) do percentual das células T. As diferenças estatísticas
(p<0,05) estão identificadas pela letra “a” em comparação com o grupo NI.
RESULTADOS
72
Para avaliar o percentual das subpopulações de linfócitos T CD4+ na população
de linfócitos totais do sangue periférico foram realizados ensaios de dupla marcação e
os resultados obtidos através da análise convencional, como ilustrado em Material e
Métodos.
A FIG. 31 apresenta os resultados dos percentuais de linfócitos T CD4+ na
população de linfócitos totais do sangue periférico de pacientes com LCL,
categorizados em função de aspectos clínico-laboratoriais.
A análise dos resultados não revelou diferença estatística significativa para o
percentual de linfócitos T CD4+, entre os subgrupos de pacientes portadores de LCL,
em relação ao grupo NI (NI=31,60%; LCL-1=36,06%; LCL-2-4=34,38%;
LCL60=36,50%; LCL>60=33,88%; LCL-TM-=36,94%; LCL-TM+=35,33%).
RESULTADOS
73
A B
25
50
% de Linfócitos T CD4
+
em
Linfócitos Totais
25
50
% de Linfócitos T CD4
+
em
Linfócitos Totais
0
0
C
25
50
% de Linfócitos T CD4
+
em
Linfócitos Totais
0
Figura 31: Percentual médio de linfócitos T CD4+ circulantes no sangue periférico de pacientes
portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-
laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-
TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ). A população de linfócitos foi inicialmente identificada
através de aspectos morfométricos seguida pela análise imunofenotípica utilizando-se anticorpo
monoclonal anti-CD4 marcado com FITC e anti-CD3 marcado com PE, segundo protocolo de
imunofenotipagem descrito em Material e Métodos. Os resultados estão apresentados como dispersão
dos valores individuais (símbolos) e a média (barras) do percentual das células T CD4+ na população de
linfócitos totais.
RESULTADOS
74
Para avaliar o percentual das subpopulações de linfócitos T CD8+ na população
de linfócitos totais do sangue periférico foram realizados ensaios de dupla marcação e
os resultados obtidos através da análise convencional, como ilustrado em Material e
Métodos.
A FIG. 32 apresenta os resultados dos percentuais de linfócitos T CD8+ na
população de linfócitos totais do sangue periférico de pacientes com LCL,
categorizados em função de aspectos clínico-laboratoriais.
A análise dos dados mostrou ausência de diferença estatística significativa para
o percentual de linfócitos T CD8+, entre os subgrupos de pacientes portadores de LCL,
em relação ao grupo NI (NI=23,34%; LCL-1=28,52%; LCL-2-4=25,35%;
LCL60=26,65%; LCL>60=29,80%; LCL-TM-=25,42%; LCL-TM+=28,22%).
RESULTADOS
75
A B
0
25
50
% de Linfócitos T CD8
+
em Linfócitos Totais
0
25
50
% de Linfócitos T CD8
+
em Linfócitos Totais
C
0
25
50
% de Linfócitos T CD8
+
em Linfócitos Totais
Figura 32: Percentual médio de linfócitos T CD8+ circulantes no sangue periférico de pacientes
portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-
laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-
TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ). A população de linfócitos foi inicialmente identificada
através de aspectos morfométricos seguida pela análise imunofenotípica utilizando-se anticorpo
monoclonal anti-CD8 marcado com FITC e anti-CD3 marcado com PE, segundo protocolo de
imunofenotipagem descrito em Material e Métodos. Os resultados estão apresentados como dispersão
dos valores individuais (símbolos) e a média (barras) do percentual das células T CD8+ na população de
linfócitos totais.
RESULTADOS
76
B - Freqüência de subpopulações de linfócitos T ativados (HLA-DR+)
A avaliação do percentual das células T totais ativadas (HLA-DR+) no sangue
periférico foi estimada através do somatório de linfócitos T CD4+ e T CD8+ ativados.
A FIG. 33 mostra os percentuais de linfócitos T totais ativados no sangue
periférico de pacientes com LCL, categorizados em função de aspectos clínico-
laboratoriais.
A análise dos dados demonstrou que todos os subgrupos de pacientes
portadores de LCL apresentam um percentual de linfócitos T HLA-DR+
significativamente maior (p<0,05), quando comparados com os indivíduos não
infectados (NI=3,75%; LCL-1=21,20%; LCL-2-4=17,87%; LCL60=20,16%;
LCL>60=20,69%; LCL-TM-=23,26%; LCL-TM+=19,67%).
Esses dados reforçam os relatos do estabelecimento de mecanismos de
imunidade celular durante a infecção Leishmania, independente dos aspectos clínico-
laboratoriais do paciente. Dessa forma, torna-se relevante avaliar a participação seletiva
de subpopulações celulares nesse contexto.
RESULTADOS
77
A B
0.0
20.5
41.0
a
a
% de Linfócitos T HLA-DR
+
0.0
20.5
41.0
a
a
% de Linfócitos T H LA-DR
+
C
% de Linfócitos T H LA-DR+
0.0
20.5
41.0
a
a
Figura 33: Percentual médio de linfócitos T totais HLA-DR+ circulantes no sangue periférico de pacientes
portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-
laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-
TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ).O percentual de linfócitos T totais ativados foi estimado
através do somatório de linfócitos CD4+ e CD8+ co-expressando o marcador HLA-DR. Os resultados
estão apresentados como dispersão dos valores individuais (símbolos) e a média (barras) do percentual
das células T CD8+ na população de linfócitos totais. As diferenças estatísticas (p<0,05) estão
identificadas pela letra “a” em comparação com o grupo NI.
RESULTADOS
78
A avaliação do percentual das subpopulações de linfócitos T CD4+ ativados
(HLA-DR+) do sangue periférico foi feita através de ensaios de dupla marcação, como
ilustrado em Material e Métodos.
Os resultados dos percentuais de linfócitos T CD4+ HLA-DR+ no sangue
periférico de pacientes com LCL, categorizados em função de aspectos clínico-
laboratoriais, estão apresentados na FIG. 34.
A análise dos dados demonstrou que todos os subgrupos de pacientes LCL
apresentam um percentual de linfócitos T CD4+ HLA-DR+ significativamente maior
(p<0,05), quando comparados com os indivíduos não infectados (NI=1,97%; LCL-
1=8,32%; LCL-2-4=7,64%; LCL60=8,78%; LCL>60=6,89%;LCL-TM-=10.54%; LCL-
TM+=7,60%). De forma interessante, observa-se que os grupos LCL60 e LCL-TM-
apresentam os valores mais elevados de ativação de células T CD4+.
RESULTADOS
79
A B
% de Linfócitos T CD4+ HLA-DR+
em Linfócitos Totais
0.0
10.5
21.0
0.0
10.5
21.0
a
a
a
a
% de Linfócitos T CD4+ HLA-
DR+
em Linfócitos Totais
C
0.0
10.5
21.0
a
a
% de Linfócitos T CD4+ HLA-
DR+
em Linfócitos Totais
Figura 34: Percentual médio de linfócitos T CD4+HLA-DR+ circulantes no sangue periférico de pacientes
portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-
laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-
TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ).A população de linfócitos T CD4+ ativados foi inicialmente
identificada através de aspectos morfométricos seguida pela análise imunofenotípica, utilizando-se
anticorpo monoclonal anti-CD4 marcado com FITC e anti-HLA-DR marcado com PE, segundo protocolo
de imunofenotipagem descrito em Material e Métodos. Os resultados estão apresentados como dispersão
dos valores individuais (símbolos) e a média (barras) do percentual das células T CD4+ ativadas na
população de linfócitos totais. As diferenças estatísticas (p<0,05) estão identificadas pela letra “a” em
comparação com o grupo NI.
RESULTADOS
80
A avaliação do percentual das subpopulações de linfócitos T CD8+ ativados
(HLA-DR+) do sangue periférico foi feita através de ensaios de dupla marcação, como
ilustrado em Material e Métodos.
A FIG. 35 mostra os resultados dos percentuais de linfócitos T CD8+ HLA-DR+
no sangue periférico de pacientes com LCL, categorizados em função de aspectos
clínico-laboratoriais.
A análise dos resultados revelou que todos os subgrupos de pacientes LCL
apresentaram um percentual de linfócitos T CD8+ HLA-DR+ significativamente maior
(p<0,05), quando comparados com os indivíduos não infectados (NI=1,78%; LCL-
1=12,88%; LCL-2-4=10,23%; LCL60=11,39%; LCL>60=13,80%; LCL-TM-=12,72%;
LCL-TM+=12,07%), sendo que os subgrupos LCL-1 e LCL>60 apresentaram os
maiores valores percentuais de linfócitos T CD8+ ativados.
Em conjunto, os dados de ativação de subpopulações de linfócitos T
demonstram o envolvimento dessas subpopulações nos mecanismos de imunidade
celular durante a infecção Leishmania, independente dos aspectos clínico-laboratoriais
do paciente. Entretanto, torna-se ainda importante identificar o balanço da participação
dessas subpopulações celulares no âmbito dos diferentes aspectos clínico-laboratoriais
avaliados nesse estudo.
RESULTADOS
81
A B
0
16
32
0
16
32
a
a
a
a
% de Linfócitos T CD8+ HLA-DR+
em Linfócitos Totais
% de Linfócitos T CD8+ HLA-DR+
em Linfócitos Totais
C
0
16
32
a a
% de Linfócitos T CD8+ HLA-
DR+
em Linfócitos Totais
Figura 35: Percentual médio de linfócitos T CD8+HLA-DR+ circulantes no sangue periférico de pacientes
portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-
laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-
TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ). A população de linfócitos T CD8+ ativados foi inicialmente
identificada através de aspectos morfométricos seguida pela análise imunofenotípica, utilizando-se
anticorpo monoclonal anti-CD8 marcado com FITC e anti-HLA-DR marcado com PE, segundo protocolo
de imunofenotipagem descrito em Material e Métodos. Os resultados estão apresentados como dispersão
dos valores individuais (símbolos) e a média (barras) do percentual das células T CD8+ ativadas na
população de linfócitos totais. As diferenças estatísticas (p<0,05) estão identificadas pela letra “a” em
comparação com o grupo NI.
RESULTADOS
82
Visando investigar o balanço da ativação de linfócitos T CD4+ e CD8+ durante a
infecção por Leishmania, realizamos uma análise adicional da razão entre os valores
percentuais de células CD8+HLA-DR+/CD4+HLA-DR+ de pacientes com LCL,
categorizados em função de aspectos clínico-laboratoriais e que está representado na
FIG. 36.
A análise dos dados demonstrou que LCL-1 apresenta uma razão entre linfócitos
T CD8+HLA-DR+/CD4+HLA-DR+ significativamente maior (p<0,05), quando comparado
com os grupos NI (NI=1,31; LCL-1=1,60; LCL-2-4=1,38).
A análise dos dados demonstrou que LCL>60 apresenta uma razão entre
linfócitos T CD8+HLA-DR+/CD4+HLA-DR+ significativamente maior (p<0,05), quando
comparado com o grupo NI (NI=1,31; LCL60=1,23; LCL>60=1,93).
A análise dos dados demonstrou que LCL-TM+ apresenta uma razão entre
linfócitos T CD8+HLA-DR+/CD4+HLA-DR+ significativamente maior (p<0,05), quando
comparado com os grupos NI (NI=1,31; LCL-TM-=1,25; LCL-TM+=1,61).
Esses achados reforçam a hipótese da ativação precoce de células T CD4+
seguida pela expansão da população de linfócitos T CD8+ nos eventos mais tardios na
LCL, quando analisamos os subgrupos LCL60 e LCL>60. Ainda, é interessante
observar que os grupos LCL-1 e LCL-TM+ apresentam valores mais elevados da razão
CD8+HLA-DR+/CD4+HLA-DR+, reforçando o papel protetor da imunidade celular
mediada por linfócitos T CD8+ no contexto da LCL.
RESULTADOS
83
A B
0.0
2.5
5.0
0.0
2.5
5.0
Linfócitos T CD8HLA-DR+/
T CD4+HLA-DR+
Linfócitos T CD8HLA-DR+/
T CD4+HLA-DR+
a a
C
0.0
2.5
5.0
Linfócitos T CD8HLA-DR+/
T CD4+HLA-DR+
a
Figura 36: Razão entre linfócitos T CD8+HLA-DR+/CD4+HLA-DR+ circulantes no sangue periférico de
pacientes portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos
clínico-laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ),
LCL-TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ).Os resultados estão expressos sob forma de
dispersão dos valores individuais (símbolos) e percentual médio (barras) da razão de linfócitos T
CD8+HLA-DR+/CD4+HLA-DR+. As diferenças estatísticas (p<0,05) estão identificadas pela letra “a” em
comparação com o grupo NI.
RESULTADOS
84
IV - Aspectos fenotípicos de linfócitos B circulantes:
A - Freqüência de subpopulações de linfócitos B (CD5- e CD5+)
Para avaliar o percentual de linfócitos B na população de linfócitos totais do
sangue periférico foram realizados ensaios de dupla marcação e os resultados foram
obtidos através da análise convencional, como ilustrado em Material e Métodos.
O percentual de linfócitos B (CD19+) na população de linfócitos totais do sangue
periférico de pacientes com LCL, categorizados em função de aspectos clínico-
laboratoriais está representado na FIG. 37.
A análise dos dados revelou que apenas o grupo LCL-2-4 apresentou um
percentual de linfócitos B totais, significativamente maior (p<0,05), quando comparado
ao grupo NI e LCL-1(NI=11,39%; LCL-1=12,34%; LCL-2-4=17,88%).
Nenhuma diferença significativa foi observada entre os grupos LCL-1, LCL60,
LCL>60, LCL-TM- e LCL-TM+ e o grupo NI (NI=11,39%; LCL60=14,56%;
LCL>60=12,21%; LCL-TM-=14,77%; LCL-TM+=13,55%).
Esses resultados re-enfatizam o envolvimento de mecanismos de imunidade
humoral nos aspectos de morbidade durante a infecção Leishmania, quando
analisamos os grupos LCL-1 e LCL-2-4.
RESULTADOS
85
A B
0
17
34
% de Linfócitos B em
Linfócitos Totais
% de Linf
ó
citos B em
Linfócitos Totais
0
17
34
a,b
C
% de Linf
ó
citos B em
Linfócitos Totais
0
17
34
Figura 37:
Percentual médio de linfócitos B totais CD19+ circulantes no sangue periférico de pacientes
portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-
laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL
60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-
TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ).A população de linfócitos B totais foi inicialmente
identificada através de aspectos morfométricos seguida pela análise imunofenotípica, utilizando-se
anticorpo monoclonal anti-CD19 marcado com PE, segundo protocolo de imunofenotipagem descrito em
Material e Métodos. Os resultados estão apresentados como dispersão dos valores individuais (símbolos)
e a média (barras) do percentual das células B na população de linfócitos totais. As diferenças
estatísticas do grupo LCL número de lesões (p<0,05) estão identificadas pela letra “a”, “b” em
comparação com o grupo NI, LCL-1, respectivamente.
RESULTADOS
86
Para avaliar o percentual das subpopulações de linfócitos B convencionais
(CD19+CD5-) na população de linfócitos totais do sangue periférico foram realizados
ensaios de dupla marcação e os resultados foram obtidos através da análise
convencional como ilustrado em Material e Métodos.
O percentual de linfócitos B convencionais na população de linfócitos totais do
sangue periférico de pacientes com LCL, categorizados em função de aspectos clínico-
laboratoriais está representado na FIG. 38.
A análise dos dados revelou que o grupo LCL-2-4 apresenta um percentual de
linfócitos B convencionais, significativamente maior (p<0,05), quando comparado ao
grupo LCL-1, não apresentando diferença significativa em relação ao grupo NI
(NI=10,59%; LCL-1=9,53%; LCL-2-4=14,95%).
Os grupos LCL60, LCL>60, LCL-TM- e LCL-TM+ não apresentaram diferença
significativa para o percentual de linfócitos B convencionais, quando comparados ao
grupo NI (NI=10,59%; LCL60=11,52%; LCL>60=9,76%; LCL-TM-=10,92%; LCL-
TM+=10,93%).
Esses resultados reforçam a hipótese previamente apresentada do envolvimento
dos mecanismos de imunidade humoral nos aspectos de morbidade durante a infecção
Leishmania, quando analisamos os grupos LCL-1 e LCL-2-4.
RESULTADOS
87
A B
0
15
30
b
% de Linfócitos CD19+ CD5-
em Linfócitos Totais
0
15
30
% de Linfócitos CD19+ CD5-
em Linfócitos Totais
C
0
15
30
% de Linfócitos CD19+ CD5-
em Linfócitos Totais
Figura 38:
Percentual médio de linfócitos B convencionais CD19+CD5- circulantes no sangue periférico
de pacientes portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos
clínico-laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL
60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ),
LCL-TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ). A população de linfócitos B convencionais foi
inicialmente identificada através de aspectos morfométricos seguida pela análise imunofenotípica,
utilizando-se anticorpos monoclonais anti-CD5 marcados com FITC e anti-CD19 marcado com PE,
segundo protocolo de imunofenotipagem descrito em Material e Métodos. Os resultados estão
apresentados como dispersão dos valores individuais (símbolos) e a média (barras) do percentual das
células B convencionais na população de linfócitos totais. A diferença estatística do grupo LCL número de
lesões (p<0,05) está identificada pela letra “b” em comparação com o grupo LCL-1.
RESULTADOS
88
Para avaliar o percentual das subpopulações de linfócitos B1 (CD19+CD5+) na
população de linfócitos totais do sangue periférico foram realizados ensaios de dupla
marcação e os resultados foram obtidos através da análise convencional, como
ilustrado em Material e Métodos.
O percentual de linfócitos B1 (CD19+CD5+) na população de linfócitos totais do
sangue periférico de pacientes com LCL, categorizados em função de aspectos clínico-
laboratoriais está representado na FIG. 39.
A análise dos dados de linfócitos B1 mostrou que não houve diferença estatística
entre os subgrupos de pacientes portadores de LCL, em relação ao grupo NI
(NI=2,57%; LCL-1=2,55%; LCL-2-4=3,09%; LCL60=2,70%; LCL>60=2,67%; LCL-TM-
=3,23%; LCL-TM+=2,57%).
RESULTADOS
89
A B
0
5
10
% de Linfócitos CD19+ CD5+
em Linfócitos Totais
0
5
10
% de Linfócitos CD19+ CD5+
em Linfócitos Totais
C
0
5
10
% de Linfócitos CD19+ CD5+
em Linfócitos Totais
Figura 39: Percentual médio de linfócitos B1, CD19+CD5+ circulantes no sangue periférico de pacientes
portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-
laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-
TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ).A população de linfócitos B convencionais foi inicialmente
identificada através de aspectos morfométricos seguida pela análise imunofenotípica, utilizando-se
anticorpos monoclonais anti-CD5 marcados com FITC e anti-CD19 marcado com PE, segundo protocolo
de imunofenotipagem descrito em Material e Métodos. Os resultados estão apresentados como dispersão
dos valores individuais (símbolos) e a média (barras) do percentual das células B1 na população de
linfócitos totais
RESULTADOS
90
B - Densidade de expressão de HLA-DR em linfócitos B
A avaliação da expressão da molécula HLA-DR em linfócitos B na população de
linfócitos totais do sangue periférico foi feita através de uma estratégia de análise
fenotípica semi-quantitativa como ilustrado em Material e Métodos.
A FIG.40 mostra os resultados da expressão da molécula HLA-DR em linfócitos
B do sangue periférico de pacientes com LCL, categorizados em função de aspectos
clínico-laboratoriais.
A análise dos dados demonstrou que os subgrupos de pacientes portadores de
LCL apresentam uma maior expressão de HLA-DR+ em linfócitos B (p<0,05), quando
comparado com o grupo NI. O grupo LCL>60 também apresentou uma maior expressão
dessa molécula em relação ao grupo LCL60 (NI=306; LCL-1=3800,11; LCL-2-
4=3733,02; LCL60=3546,53; LCL>60=4255,08; LCL-TM-=3539,24; LCL-
TM+=3838,05).
RESULTADOS
91
A B
1
100
10000
a,b
a
Expressão de HLA-DR em
Linfócitos B (IMF)
1
100
10000
Expressão de HLA-DR em
Linfócitos B (IMF)
a
a
C
Expressão de HLA-DR em
Linfócitos B (IMF)
1
100
10000
a
a
Figura 40: Análise da expressão da molécula HLA-DR em linfócitos B circulantes no sangue periférico de
pacientes portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos
clínico-laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ),
LCL-TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ).A população de linfócitos foi inicialmente identificada
através de aspectos morfométricos seguida pela análise imunofenotípica utilizando-se anticorpo
monoclonal anti-HLA-DR marcado com PE, segundo protocolo de imunofenotipagem descrito em Material
e Métodos. . Os resultados estão expressos sob forma de dispersão (símbolos) e a média (barras) dos
valores de intensidade média de fluorescência (IMF) da expressão de HLA-DR. As diferenças estatísticas
(p<0,05) estão identificadas pela letra “a” em comparação com o grupo NI. A diferença estatística do
grupo LCL tempo de lesão (p<0,05) está identificada pela letra “b” em comparação com o grupo LCL60.
RESULTADOS
92
C - Freqüência de linfócitos B CD23+
Para avaliar o percentual de linfócitos B CD23+ na população de linfócitos totais
do sangue periférico foram feitos ensaios de dupla marcação, como descrito em
Material e Métodos.
A FIG. 41 demonstra o percentual de linfócitos CD19+CD23+ na população de
linfócitos totais do sangue periférico de pacientes com LCL, categorizados em função
de aspectos clínico-laboratoriais.
A análise dos dados revelou que os grupos LCL-1 e LCL-2-4 apresentam um
percentual de linfócitos B CD23+, significativamente maior (p<0,05), quando comparado
ao grupo NI. O grupo LCL-2-4 também apresentou um maior percentual de linfócitos B
CD23+ em relação ao grupo LCL-1 (NI=2,16%; LCL-1=8,90%; LCL-2-4=13,10%).
A análise dos dados mostrou que os grupos LCL60, LCL>60, LCL-TM- e LCL-
TM+ apresentam um percentual maior (p<0,05) de linfócitos B CD23+, em relação ao
grupo NI. (NI=2,16%, LCL60=10,22%; LCL>60=9,53%; LCL-TM-=10,56%; LCL-
TM+=9,86%).
Em conjunto, os dados referentes aos aspectos imunofenotípicos de linfócitos B
sugerem a importância da avaliação do balanço de aspectos fenotípicos associados à
imunidade celular e humoral na LCL, sugerindo maior envolvimento da imunidade
humoral nos eventos tardios na LCL, quando analisamos a expressão de HLA-DR em
linfócitos B nos subgrupos LCL60 e LCL>60. Ainda, salienta a importância da
imunidade humoral como elemento relevante nos relatos de maior morbidade na LCL,
quando analisamos a freqüência de linfócitos B totais, convencionais e CD23+ nos
subgrupos LCL-1 e LCL-2-4.
RESULTADOS
93
A B
0.0
10.5
21.0
0.0
10.5
21.0
% de Linfócitos B CD23
+
em Linfócitos Totais
a
a,b
a
a
% de Linfócitos B CD23
+
em Linfócitos Totais
C
0.0
10.5
21.0
a
a
% de Linfócitos B CD23
+
em Linfócitos Totais
Figura 41: Percentual médio de linfócitos CD19+CD23+ no sangue periférico de pacientes portadores de
Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-laboratorias como: (A)
LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-TM+ ( ) e de indivíduos
não infectados NI ( ).A população de linfócitos foi inicialmente identificada através de aspectos
morfométricos seguida pela análise imunofenotípica utilizando-se anticorpos monoclonais anti-CD19
marcados com FITC e anti-CD23 marcado com PE, segundo protocolo de imunofenotipagem descrito em
Material e Métodos. Os resultados estão expressos através de dispersão dos valores individuais
(símbolos) e média percentual (barras) de linfócitos CD19+CD23+ na população de linfócitos totais. As
diferenças estatísticas (p<0,05) estão identificadas pela letra “a” em comparação com o grupo NI. A
diferença estatística do grupo LCL número de lesões (p<0,05) está identificada pela letra “b” em
comparação com o grupo LCL-1.
RESULTADOS
94
Balanço da resposta imune na LCL, em função de parâmetros clínico-
laboratoriais:
Visando investigar o balanço do envolvimento da resposta imune inata e
adaptativa durante a infecção por Leishmania, realizamos uma análise adicional da
razão entre os valores absolutos de monócitos pró-inflamatórios (HLA-DR++) e células
CD19+CD23+ por mm
3
de sangue em pacientes portadores de LCL, categorizados em
função de aspectos clínico-laboratoriais.
Os resultados da razão entre os valores absolutos de monócitos pró-
inflamatórios (HLA-DR++) e células B CD23+ no sangue periférico de pacientes com
LCL e de indivíduos não infectados estão representados na FIG. 42.
A análise dos dados demonstrou que os indivíduos LCL-1 e LCL-2-4 apresentam
uma razão entre monócitos pró-inflamatórios (HLA-DR++) e células B CD23+
significativamente menor (p<0,05) quando comparado com os indivíduos não infectados
(NI=22,96; LCL-1=3,98; LCL-2-4=1,98).
A análise dos dados demonstrou que os grupos LCL60 e LCL>60 apresentam
uma razão entre monócitos pró-inflamatórios (HLA-DR++) e células B CD23+
significativamente menor (p<0,05) quando comparado com os indivíduos não
infectados. Entretanto os indivíduos LCL60 apresentam uma razão maior em relação
ao grupo LCL>60 (NI=22,96; LCL60=4,02; LCL>60=2,34).
A análise dos dados demonstrou que os indivíduos LCL-TM- e LCL-TM+
apresentam uma razão entre monócitos pró-inflamatórios (HLA-DR++) e células B
CD23+ significativamente menor (p<0,05), quando comparados com os indivíduos não
infectados (NI=22,96; LCL-TM-=3,26; LCL-TM+=3,51).
Esses achados sugerem o predomínio da ativação de células envolvidas na
imunidade adaptativa com a expansão da população de linfócitos CD19+CD23+ em
todos os grupos avaliados.
RESULTADOS
95
A B
0
28
56
a
a
Monócitos HLA-DR++/
CD19+CD23+
0
28
56
a
a
Monócitos HLA-DR++/
CD19+CD23+
C
Monócitos HLA-DR++/
CD19+CD23+
0
28
56
a
a
Figura 42: Razão entre Monócitos HLA-DR+/CD19+CD23+ circulantes no sangue periférico de pacientes
portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-
laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-
TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ).Os resultados foram calculados empregando-se os valores
absolutos de células/mm
3
de sangue e estão expressos sob forma de dispersão dos valores individuais
(símbolos) e valor médio (barras) da razão de Monócitos HLA-DR+/CD19+CD23+ As diferenças
estatísticas (p<0,05) estão identificadas pela letra “a” em comparação com o grupo NI.
RESULTADOS
96
Numa outra abordagem, calculamos a razão entre os valores absolutos de
monócitos pró-inflamatórios (HLA-DR++) e células CD8+HLA-DR+ por mm
3
de sangue
em indivíduos portadores de LCL, categorizados em função de aspectos clínico-
laboratoriais. Os resultados dessa razão estão representados na FIG. 43.
A análise dos dados demonstrou que todos os subgrupos de indivíduos
infectados apresentam uma razão entre monócitos pró-inflamatórios (HLA-DR++) e
CD8+HLA-DR+ significativamente menor (p<0,05), quando comparados com os
indivíduos não infectados (NI=23,65; LCL-1=3,25; LCL-2-4=2,12, LCL60=3,12;
LCL>60=2,63; LCL-TM-=2,48; LCL-TM+=3,07).
Em suma, esses resultados salientam novamente o predomínio da ativação
precoce de células envolvidas na imunidade inata, seguida pelo envolvimento da
imunidade adaptativa com a expansão da população de linfócitos T CD8+HLA-DR+ nos
eventos mais tardios na LCL, quando analisamos os subgrupos LCL60 e LCL>60.
RESULTADOS
97
A B
0
21
42
a
a
Monócitos HLA-DR++/
CD8+ HLA-DR+
0
21
42
a
a
Monócitos HLA-DR++/
CD8+ HLA-DR+
C
0
21
42
a
a
Monócitos HLA-DR++/
CD8+ HLA-DR+
Figura 43: Razão entre Monócitos HLA-DR+/CD8+HLA-DR+ circulantes no sangue periférico de
pacientes portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos
clínico-laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ),
LCL-TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ). Os resultados foram calculados empregando-se os
valores absolutos de células/mm
3
de sangue e estão expressos sob forma de dispersão dos valores
individuais (símbolos) e valor médio (barras) da razão de Monócitos HLA-DR+/CD8+HLA-DR+. As
diferenças estatísticas (p<0,05) estão identificadas pela letra “a” em comparação com o grupo NI.
RESULTADOS
98
Numa abordagem final, analisamos o balanço entre a resposta imune celular e
humoral através do cálculo da razão entre linfócitos T totais ativados/linfócitos B totais
presentes no sangue periférico de portadores de LCL, categorizados em função de
aspectos clínico-laboratoriais. Os resultados dessa razão estão representados na FIG.
44.
A análise dos dados demonstrou que os subgrupos LCL-1, LCL60, LCL>60 e
LCL-TM+ apresentam uma razão de Linfócitos T totais ativados (HLA-DR+) /Linfócitos B
totais (CD19+) significativamente maior (p<0,05), quando comparados com os
indivíduos não infectados (NI=0,37%; LCL-1=2,38%; LCL-2-4=1,19%, LCL60=1,89%;
LCL>60=2,35%; LCL-TM-=1,79%; LCL-TM+=2,13%). Entretanto, é interessante
observar que o grupo LCL>60 apresenta a maior razão entre os aspectos
imunofenotípicos da imunidade celular em relação a humoral.
Esses achados reforçam mais uma vez a importância de um predomínio da
imunidade celular sobre a humoral nos eventos protetores na LCL quando analisamos
os subgrupos LCL-1 e LCL-2-4, bem como os subgrupos LCL-TM- e LCL-TM+. Além
disso, os dados dos subgrupos LCL60 e LCL>60 sugerem maior envolvimento da
resposta celular nos eventos tardios.
RESULTADOS
99
A B
0.0
2.5
5.0
7.5
a
a
0.0
2.5
5.0
7.5
Linfócitos T HLA-DR+/CD19+
a
Linfócitos T HLA-DR+/CD19+
C
0.0
2.5
5.0
7.5
a
Linfócitos T HLA-DR+/CD19+
Figura 44: Razão entre Linfócitos T HLA-DR+/CD19+ circulantes no sangue periférico de pacientes
portadores de Leishmaniose Cutânea Localizada, categorizados em função de aspectos clínico-
laboratorias como: (A) LCL-1 ( ), LCL-2-4 ( ); (B) LCL60 ( ), LCL>60 dias ( ), (C) LCL-TM- ( ), LCL-
TM+ ( ) e de indivíduos não infectados NI ( ). Os resultados foram calculados empregando-se os
valores percentuais de células na população de linfócitos totais e estão expressos sob forma de
dispersão dos valores individuais (símbolos) e valor médio (barras) da razão de Linfócitos T CD3+HLA-
DR+/CD19+. As diferenças estatísticas (p<0,05) estão identificadas pela letra “a” em comparação com o
grupo NI.
Associações entre aspectos clínico-laboratoriais e parâmetros fenotípicos celulares da imunidade
inata e adaptativa na Leishmaniose Tegumentar Americana
SÍNTESE DOS RESULTADOS
SÍNTESE DOS RESULTADOS
101
Considerando o grande número de alterações significativas observadas para os
diversos parâmetros fenotípicos celulares e moleculares empregados nesse estudo,
elaboramos a seguir, um diagrama com a síntese dos resultados (FIG. 45). Inicialmente,
foram consideradas as diferenças significativas observadas entre o grupo LCL e o
grupo NI (FIG. 45A). Em seguida, foram realizadas análises das interseções entre os
subgrupos de pacientes LCL, categorizados em função de parâmetros clínico-
laboratoriais. Esse tipo de abordagem visou distinguir alterações intrínsecas da LCL
daquelas capazes de ser associadas com o número de lesões (FIG. 45B), tempo de
lesão (FIG. 45C) e a positividade no teste de Montenegro (FIG. 45D), sendo específicas
de uma determinada categoria clínica. Para tal, com o objetivo de facilitar a
interpretação e discussão dos resultados, bem como a elaboração de conclusões
baseadas nas evidências de perfil fenotípico diferencial, a FIG. 45 apresenta um
diagrama ilustrativo com a síntese dos resultados.
A análise das informações contidas na FIG. 45 permitiu a verificação que
pacientes portadores de LCL, quando analisados em conjunto em relação ao grupo NI
apresentam um perfil de resposta imune misto, com alterações tanto em aspectos
fenotípicos associados à imunidade inata (Monócitos e Neutrófilos), quanto adaptativa
(Linfócitos T e B), bem como da resposta imune adaptativa celular e humoral, sugerindo
o envolvimento complexo de mecanismos imunológicos. Além disso, na análise do
compartimento da imunidade inata, observam-se tanto eventos fenotípicos sugestivos
de ativação ( Monócitos CD23+, Neutrófilos HLA-DR+, Neutrófilos CD23+) bem
como mecanismos reguladores ( Neutrófilos CD28+, Neutrófilos CD16+), No âmbito
da imunidade adaptativa, observam-se também um perfil misto, com envolvimento de
aspectos fenotípicos sugestivos da ativação simultânea da imunidade celular e humoral
( LTHLADR+, LTCD4+HLADR+, LTCD8+HLADR+, LBHLADR+,
CD19+CD23+).
Considerando a complexidade da resposta imune durante a infecção por
Leishmania, a ausência de sincronicidade/perfil preferencial dos eventos imunológicos
observados nos portadores de LCL, e o perfil misto de resposta identificado em nosso
estudo, tivemos o interesse de avaliar a possível associação desses achados
fenotípicos com diferentes aspectos clínico-laboratoriais. Nesse contexto, selecionamos
três importantes aspectos mais relevantes no âmbito da infecção humana por
Leishmania, os quais estão diretamente associados com características de morbidade e
SÍNTESE DOS RESULTADOS
102
os eventos de proteção já descritos na literatura, incluindo: número de lesões cutâneas,
tempo de lesão e a positividade no teste de Montenegro. Embora, também tenhamos
avaliado a associação entre aspectos demográficos, tais como sexo e idade, apenas os
parâmetros clínico-laboratoriais apresentaram alterações estatísticas distintas das
observadas previamente na análise conjunta dos portadores de LCL. Esse tipo de
abordagem, previamente realizada em nosso laboratório (MASINI, A.B., 2005), já havia
sugerido o impacto importante dessas variáveis clínico-laboratoriais no estudo do perfil
de citocinas intracitoplasmáticas no contexto da LCL e a ausência de associação
daquele perfil com aspectos demográficos da população em estudo.
No âmbito das alterações imunológicas específicas de um determinado grupo
clínico-laboratorial, observamos um predomínio de alterações em aspectos fenotípicos
associados á imunidade celular no grupo LCL-1 ( LTCD8+HLADR+/CD4+HLA-DR+,
LTHLADR+/LB). Por outro lado, observamos um predomínio de aspectos da
imunidade humoral no grupo LCL-2-4 ( LB, CD19+CD5-, CD19+CD23+). Em
conjunto, esses resultados reforçam o papel protetor da imunidade celular mediada por
linfócitos T CD8+ no contexto da LCL. Ainda, esses resultados re-enfatizam o
envolvimento de mecanismos de imunidade humoral nos aspectos de morbidade
durante a infecção pela Leishmania, quando analisamos os grupos LCL-1 e LCL-2-4
(FIG. 45B).
A análise dos dados fenotípicos à luz da categorização do grupo LCL em função
do tempo de lesão, permitiu observar uma dinâmica dos eventos da imunidade inata,
mais freqüente em portadores de lesão recente LCL60 (
Neutrófilos CD28+,
Neutrófilos HLA-DR+, Neutrófilos CD23+) e adaptativa, preferencialmente detectadas
em portadores de lesão crônica LCL>60 (
LTCD8+HLADR+/CD4+HLA-DR+, HLADR
em LB) (FIG. 45C).
Aspectos imunofenotípicos característicos do grupo LCL-TM+ foram aqueles da
imunidade inata e adaptativa diretamente associados à imunidade celular leishmanicida
(
CD23 em Monócitos, LTCD8+HLADR+/CD4+HLA-DR+, LTHLA-DR+/LB). Esses
dados reforçam os relatos prévios de que a positividade no teste de Montenegro é um
importante indicador laboratorial da habilidade de montar uma resposta imune celular
protetora anti-Leishmania (FIG. 45D).
Considerando as características imunofenotípicas intrínsecas da LCL,
independentes dos aspectos clínico-laboratoriais avaliados, destacam-se a participação
SÍNTESE DOS RESULTADOS
103
simultânea da imunidade adaptativa celular e humoral com uma elevação significativa
da ativação de linfócitos T (LT HLA-DR+, LTCD4+HLA-DR+ e LTCD8+HLA-DR+) e
células B (LB CD23+). Além disso, observa-se um predomínio da imunidade adaptativa,
pela presença constante da reduzida taxa de monócitos pró-inflamatórios em relação
aos eventos da imunidade celular e humoral (Monócitos HLA-R++/CD8+HLA-DR+ e
Monócitos HLA-R++/LBCD23+), independente da categorização dos portadores de
LCL.
Como característica imunofenotípica associada aos eventos de proteção,
observa-se nos grupos LCL-1, LCL>60 e LCL-TM+ uma ativação preferencial da
resposta imune mediada por linfócitos T CD8+, sobressaindo à ativação de linfócitos T
CD4+, dada a maior taxa da expressão de HLA-DR por células citotóxicas, em relação
às células auxiliares (LTCD8+HLA-DR+/CD4+HLA-DR+). Além disso, no âmbito da
positividade do teste de Montenegro, realça-se a indução na expressão de CD23 por
monócitos como evento acoplado à detecção laboratorial da imunidade celular. Em
contrapartida, no grupo que representa maior grau de morbidade na LCL (LCL-2-4),
observa-se maior comprometimento do compartimento humoral com alterações mais
significativas em aspectos fenotípicos de linfócitos B.
No estudo simulador da dinâmica dos eventos imunológicos durante a LCL,
observa-se o envolvimento precoce de neutrófilos na infecção por Leishmania, com o
estabelecimento mais tardio da imunidade celular mediada por linfócitos T CD8+.
SÍNTESE DOS RESULTADOS
104
A
B
C
D
CD16 em Neutrófilos
CD23 em Monócitos
% Neutrófilos HLA-DR
+
% LT CD3
+
% Neutrófilos CD23
+
% Neutrófilos CD28
+
% LT CD4
+
% LT CD8
+
% LT HLA-DR
+
% LT CD4
+
HLA-DR
+
% LT CD8
+
HLA-DR
+
% LT CD8
+
HLA-DR
+
/ CD4
+
HLA-DR
+
HLA-DR em LB
% LB CD23
+
Monócitos HLA-DR
++
/ LT CD8
+
HLA-DR
+
LT HLA-DR
+
/ LB
Monócitos HLA-DR
++
/ LB CD23
+
LCL-2-4LCL-1
CD23 em Monócitos
a
CD23 em Monócitos
a
% LT HLA-DR
+a
% LT HLA-DR
+a
% LT CD4
+
HLA-DR
+ a
% LT CD4
+
HLA-DR
+ a
% LT CD8
+
HLA-DR
+ a
% LT CD8
+
HLA-DR
+ a
HLA-DR em LB
a
HLA-DR em LB
a
% LB CD23
+ a
% LB CD23
+ a
Monócitos HLA-DR
++
/
LB CD23
+a
Monócitos HLA-DR
++
/
LB CD23
+a
Monócitos HLA-DR
++
/
LT CD8
+
HLA-DR
+a
Monócitos HLA-DR
++
/
LT CD8
+
HLA-DR
+a
% Neutrófilo CD28
+a
CD16 em Neutrófilos
a
% LT CD3
+ a
% LT CD8
+
HLA-DR
+
/
CD4
+
HLA-DR
+a
LT HLA-DR
+
/ LB
a
% Neutrófilos CD23
+a
% Neutrófilos CD23
+a
% LB
a,b
% LB
a,b
LB CD19
+
CD5
- b
LB CD19
+
CD5
- b
% LB CD23
+ b
% LB CD23
+ b
LCLTM+LCLTM-
% LT HLA-DR
+a
% LT CD4
+
HLA-DR
+ a
% LT CD8
+
HLA-DR
+ a
HLA-DR em LB
a
% LB CD23
+a
Monócitos HLA-DR
++
/
LB CD23
+a
Monócitos HLA-DR
++
/
LT CD8
+
HLA-DR
+a
CD23 em Monócitos
a
% Neutrófilos CD28
+a
% Neutrófilos CD23
+a
% LT CD3
+a
LT HLA-DR
+
/ LB
a
CD16 em Neutrófilos
LT CD8
+
HLA-DR
+
/
CD4
+
HLA-DR
+
LCL>60LCL<60
% NeutrófilosCD28
+a
% NeutrófilosCD28
+a
% Neutrófilos CD23
+a
% Neutrófilos CD23
+a
% LT CD3
+a
% LT CD3
+a
% Neutrófilos HLA-DR
+ a
% Neutrófilos HLA-DR
+ a
CD23 em Monócitos
a
CD23 em Monócitos
a
CD16 em Neutrófilos
a
CD16 em Neutrófilos
a
% LT HLA-DR
+a
% LT CD4
+
HLA-DR
+ a
% LT CD4
+
HLA-DR
+ a
% LT CD8
+
HLA-DR
+ a
% LT CD8
+
HLA-DR
+ a
HLA-DR em LB
a
HLA-DR em LB
a
% LB CD23
Monócitos HLA-DR
++
/
LB CD23
+a
LT HLA-DR
+
/ LB
a
LT HLA-DR
+
/ LB
a
Monócitos HLA-DR
++
/
LB CD8
+
DR
+a
LT CD8
+
HLA-DR
+
/
CD4
+
HLA-DR
+a
HLA-DR em LB
b
HLA-DR em LB
b
+a
Figura 45: Análise cross-seccional do perfil fenotíopico de células envolvidas na resposta imune inata e
adaptativa, bem como em eventos da imunidade celular e humoral, no sangue periférico de pacientes
portadores da LCL analisados em conjunto (A), ou categorizados em função de aspectos clínico-
laboratoriais, incluindo número de lesões (B), tempo de lesão (C) e positividade no teste de Montenegro
(D). A orientação das setas representa elevação ou diminuição estatisticamente significativa entre os
parâmetros avaliados. As letras “a” e “b” representam diferenças significativas em relação ao grupo NI e
ao outro subgrupo de paciente portador de LCL em cada análise.
Associações entre aspectos clínico-laboratoriais e parâmetros fenotípicos celulares da imunidade inata e
adaptativa na Leishmaniose Tegumentar Americana
DISCUSSÃO
DISCUSSÃO
106
Diversos estudos que avaliam aspectos inerentes ao complexo grupo de
doenças denominado “Leishmanioses”, chamam a atenção para a natureza multifatorial
dos eventos associados ao estabelecimento/manutenção de diferentes formas clínicas,
dando suporte a hipóteses de que mecanismos complexos estão envolvidos na indução
e/ou regulação da patogenia das leishmanioses. Nesse contexto, a LCL apresenta
diferentes aspectos que podem ser atribuídos a fatores ligados ao parasito, como por
exemplo, a virulência dependente da espécie envolvida no processo infeccioso.
ROMERO et al. (2001), observaram que pacientes infectados com L. braziliensis
apresentam um menor número de lesões, que, entretanto, apresentam-se maiores que
aquelas observadas em pacientes infectados com L. guyanensis. SILVEIRA et al.
(2004) demonstram que indivíduos portadores de LCL infectados por L. amazonensis
apresentam uma capacidade maior em montar uma resposta imune do Tipo 2, quando
comparados aos indivíduos infectados com L. braziliensis, o que proporcionaria o
estabelecimento de manifestações clínicas mais graves, como por exemplo, a LCD.
Ainda, no contexto dos aspectos que interferem na patogênese da LTA, diversos
estudos têm focalizado atenção em fatores ligados ao hospedeiro, incluindo o
polimorfismo de expressão gênica de produtos do complexo maior de
histocompatibilidade (LARA et al., 1991; OLIVO-DIAZ et al., 2004), a presença de co-
infecções (De LIMA BARROS et al., 2005; ROMERO et al., 2004; RABELLO et al.,
2003) bem como o estado imunológico do indivíduo, no que se refere à capacidade de
montar uma resposta imune com maior caráter protetor ou indutor de morbidade
(POMPEU et al., 2001). No âmbito da imunogenética, os trabalhos chamam a atenção
para a importância da influência da expressão de genes específicos do HLA de classe I
(HLA-A,B,C) e classe II (HLA-DP, HLA-DQ e HLA-DR) (LARA et al., 1991; OLIVO-DIAZ
et al., 2004). Os resultados desses estudos indicam que os genes do HLA de classe I
parecem não apresentar um impacto relevante na susceptibilidade a LCL. Por outro
lado, os genes do HLA de classe II parecem ser relevantes para a expressão clínica de
LCL, como o HLA-DRB1*0407 (OLIVO-DIAZ et al., 2004) e HLA-DQw3 (LARA et al.,
1991), relacionados à susceptibilidade, e o HLA-DP*0401 (OLIVO-DIAZ et al., 2004),
relacionado à resistência na LCL. Os estudos que avaliam o impacto das co-infecções
nas manifestações clínicas a LTA chamam a atenção para um relato de 2000 casos de
pacientes co-infectados por Leishmania-HIV, apresentando LCL ou LMC causada por L.
braziliensis e L. amazonensis (ROMERO et al., 2004).
DISCUSSÃO
107
Dentre os principais tópicos abordados nos estudos que avaliam a resposta
imune na infecção humana por parasitos do gênero Leishamania, vários aspectos são
amplamente investigados. Alguns estudos visam compreender melhor, os mecanismos
imunológicos envolvidos na resistência/susceptibilidade desse complexo de doenças,
enquanto outros focalizam na participação diferenciada dos compartimentos celular e
humoral da resposta imune, com ênfase em aspectos imunofenotípicos de células da
imunidade inata e da resposta adaptativa. Ainda, no âmbito da resposta imune, diversos
trabalhos demonstram que no decurso da infecção, a expressão diferencial de citocinas
é um fator que controla a imunopatogenia da LCL (MELBY et al., 1994; ROCHA et al.,
1999).
Embora alguns dos elementos envolvidos no desenvolvimento das diferentes
manifestações clínicas das leishmanioses já tenham sido descritos, estudos adicionais
fazem-se ainda necessários para a compreensão da dinâmica desse processo. O
estudo da participação de diferentes populações celulares nos eventos de resistência e
susceptibilidade chama a atenção para o envolvimento tanto da resposta imune celular,
como humoral. Nesse contexto, a detecção de moléculas expressas na superfície de
células tem permitido um grande avanço na pesquisa científica aplicada ao estudo de
doenças infecto-parasitárias humanas. Empregando sistemas de análises
imunofenotípicas mais elaborados e protocolos experimentais mais atuais, torna-se
possível ainda, a análise simultânea de um maior número de moléculas por superfície
celular, possibilitando a identificação e/ou caracterização de novas subpopulações
celulares. Esse tipo de abordagem oferece assim, informações adicionais que podem
enriquecer os conhecimentos acerca das diferentes manifestações clínicas da LTA.
Nesse trabalho, desenvolvemos um estudo de aspectos imunofenotípicos de
leucócitos do sangue periférico de pacientes portadores de LCL numa abordagem
“cross-seccional” que permitiu avaliar o impacto de diferentes aspectos clínico-
laboratoriais relevantes no contexto da LCL, aqui denominados “número de lesões”,
“tempo de lesão” e “positividade no teste de Montenegro”. A partir dos resultados
obtidos, elaboramos 4 diagramas (FIG. 45A, B, C e D) com o objetivo de permitir uma
análise mais detalhada das diferenças observadas entre os grupos avaliados.
Para facilitar o entendimento das considerações propostas a partir dos resultados
obtidos nesse estudo, apresentaremos a seguir uma discussão dirigida para cada
objetivo específico proposto nesta investigação. Assim, inicialmente serão avaliados os
DISCUSSÃO
108
aspectos inerentes a LCL quando avaliamos o grupo de pacientes infectados em
relação ao grupo controle (FIG. 45A). A seguir, serão abordados os aspectos
imunofenotípicos especificamente identificados para cada subgrupo de pacientes
portadores de LCL, categorizados em função dos aspectos clínico-laboratoriais
avaliados (FIG. 45B, C e D).
Considerando as alterações fenotípicas observadas no grupo LCL para as
células envolvidas na imunidade inata (FIG. 45A), nossos resultados sugerem o
estabelecimento de um perfil complexo de eventos, com a presença simultânea de
mecanismos relacionados à ativação – aumento na expressão de CD23 por monócitos
(FIG. 11), uma elevada freqüência de neutrófilos HLA-DR+ (FIG. 13) e CD23+ (FIG. 15)
e mecanismos relacionados à modulação da resposta imune - diminuição no percentual
de neutrófilos CD28+ (FIG. 12), além de uma queda na expressão de CD16 por
neutrófilos (FIG. 14). A participação de células envolvidas na imunidade inata durante a
infecção por parasitos do gênero Leishmania tem sido descrita por diversos autores. O
papel protetor de monócitos através da atividade fagocítica e leishmanicida pela
produção de TNF-α e NO tem sido amplamente investigada (VOULDOUKIS et al.,
1995). Por outro lado, o papel de neutrófilos no contexto de LTA, tem sido
recentemente descrito em modelo experimental murino de infecção com L. major,
sugerindo a participação importante desses fagócitos nos eventos iniciais de instalação
do processo infeccioso, sendo essas células as primeiras a chegarem no foco de
infecção e o primeiro “habitat” das formas infectantes de Leishmania até o momento da
chegada de macrófagos ao local da inoculação do parasito (AGA et al., 2002). Esse
perfil misto de ativação/modulação de neutrófilos, paralelo com a hiperexpressão de
CD23 por monócitos sugere que esses eventos heterogêneos poderiam não estar
ocorrendo simultaneamente e que, na verdade a existência de outros fatores, como por
exemplo, a ausência de sincronicidade de infecção no grupo de pacientes LCL ou
diferenças em aspectos clinico-laboratoriais poderiam ser variáveis relevantes capazes
de interferir no perfil imunofenotípico observado no grupo LCL. Essa hipótese será
abordada oportunamente ao longo dessa discussão.
No compartimento de células envolvidas na imunidade adaptativa, ao avaliar no
grupo LCL a freqüência de células T ativadas, através da análise do marcador de
ativação HLA-DR (KO et al., 1979), observamos uma elevação significativa em relação
ao grupo controle (FIG. 17A), consistente com o envolvimento da imunidade celular nos
DISCUSSÃO
109
eventos imunológicos desencadeados pela infecção por Leishmania (LIEW &
O’DONNELL, 1993). A resposta imune celular apresenta um papel importante nas
infecções associadas à patógenos intracelulares (KAUFMANN, 1993). A LCL apresenta
uma relevante resposta mediada por células T, caracterizada por uma alta proliferação
linfocitária frente a antígenos de Leishmania (CASTES et al., 1983; CARVALHO et al.,
1985). Da CRUZ et al. (1994) associaram o envolvimento da resposta imune celular aos
mecanismos de resistência na LCL. Estudos de GAAFAR et al. (1999), demonstraram a
existência de um menor percentual de linfócitos T CD8+ ao diagnóstico, quando
comparado aos valores observados em pacientes portadores de LCL durante o
processo de cura pós-terapêutica, avaliando o PBMC desses pacientes. Estudos
desenvolvidos por Da CRUZ et al. (1994) e COUTINHO et al. (1998) também chamam a
atenção para presença de um maior percentual de linfócitos T CD8+ nas culturas de
células de indivíduos curados, em relação aos indivíduos avaliados antes do
tratamento, os quais apresentam um predomínio de linfócitos T CD4+. Esses autores
acreditam que no processo de cura pós-terapêutica, mais importante que o predomínio
de linfócitos T CD8+ seria o balanço entre as células T CD4+ e T CD8+, em que as
primeiras teriam sua proporção diminuída durante o processo de cura. Em nosso
estudo, a análise de subpopulações de células T ativadas no grupo LCL demonstrou
um aumento significativo tanto de células T CD4+ (FIG. 17B), quanto de células T CD8+
ativadas (FIG. 17C). Essas alterações fenotípicas observadas reforçam a idéia que um
perfil misto de ativação celular poderia ser conseqüência da ausência de sincronicidade
na infecção dos pacientes incluídos no grupo LCL e chamam a atenção para a
necessidade de subcategorização dos pacientes portadores de LCL, a fim de avaliar se
o aumento seletivo na freqüência dessas células poderia ser um reflexo de fatores
clínico-laboratoriais distintos. Ainda, nesse contexto, a análise do balanço entre a
ativação celular de linfócitos T CD4+/CD8+ seria um aspecto relevante a ser
considerado como proposto por Da CRUZ et al. (1994) e COUTINHO et al. (1998).
A participação da resposta imune humoral na infecção por Leishmania ainda
apresenta lacunas importantes e os resultados já apresentados parecem ainda
controversos, visto que a maioria dos estudos chama a atenção para o papel protetor
conferido pela resposta imune celular (LIEW & O’DONNELL 1993). Cabe salientar que
nossos dados mostraram um aumento significativo na expressão de HLA-DR por
células B circulantes (FIG. 20), além de uma elevação na freqüência de linfócitos B
DISCUSSÃO
110
ativados CD23+ (De MIGUEL et al., 2003) em indivíduos portadores da LCL (FIG. 21),
confirmando o estado de ativação dessa população celular nos pacientes portadores de
LCL.
Ao considerarmos os aspectos clínicos da LTA, diversos estudos chamam a
atenção para a importância da análise de características consideradas relevantes, tais
como: manifestação clínica da LTA (LCL, LMC ou LCD) (ROMERO et al., 2001),
tamanho da intradermorreação de Montenegro (SOUZA-ATTA et al., 2002), número das
lesões (ULRICH et al., 1988; MENDONÇA et al., 1988; SOUZA-ATTA et al., 2002), e
tempo de evolução das lesões (ULRICH et al., 1988; MENDONÇA et al. 1988). Nesse
contexto, nos propusemos avaliar o impacto do número de lesões no perfil
imunofenotípico dos leucócitos circulantes em indivíduos portadores de LCL, como
indicador clínico de morbidade da infecção. Para tal sub-categorizamos o grupo LCL em
LCL-1 e LCL-2-4. Nossos dados demonstram de forma interessante, que existe uma
alteração preferencial na população de linfócitos B no grupo LCL 2-4, com aumento
significativo na freqüência de linfócitos B circulantes (FIG. 37A), na subpopulação de
células B convencionais (CD19+CD5-) (FIG. 38A) e de linfócitos B ativados
(CD19+CD23+) (FIG. 41A). Esses aspectos imunofenotípicos celulares podem ser
associados com os resultados descritos por MENDONÇA et al. (1988) que
demonstraram níveis de IgG significativamente maiores em pacientes portadores de
lesões múltiplas, quando comparados com pacientes apresentando lesão única. A
presença de altos títulos de anticorpos específicos reflete a característica invasiva da
infecção. Os resultados mostram que o predomínio de linfócitos B direciona a uma
forma mais grave da infecção, como demonstrado por SCHURR et al. (1986) onde o
elevado nível de anticorpos está associado às formas mais graves da leishmaniose,
como por exemplo, a LCD. Essas observações são reforçadas por estudos
desenvolvidos por PALANIVEL et al. (1996), que demonstraram o envolvimento das
células B na manutenção da resposta do Tipo 2, através da produção de IL-10. Em
conjunto, nossos dados confirmam através do perfil imunofenotípico, os achados
sorológicos do maior envolvimento da resposta imune humoral em pacientes portadores
de lesões múltiplas (MENDONÇA et al. 1988; MOSLEH et al., 1995).
Nossos dados referentes aos aspectos imunofenotípicos de células da imunidade
inata, demonstraram um aumento seletivo de neutrófilos CD23+ no grupo de indivíduos
portadores de lesões múltiplas. Estudos desenvolvidos por VELLA et al. (1999)
DISCUSSÃO
111
demonstraram que a expressão de CD23 por neutrófilos é regulada por IFN-γ,
reforçando a hipótese de que portadores de lesões múltiplas apresentam um
predomínio de uma resposta imune do Tipo 2.
Na análise dos pacientes portadores de lesão única, torna-se evidente o
predomínio de uma imunidade celular adaptativa, com um aumento de linfócitos T,
paralelo a um aumento da razão entre linfócitos T CD8+ HLA-DR+/T CD4+ HLA-DR+
(FIG. 36A) e um aumento da razão entre linfócitos T HLA-DR+/CD19+ (FIG. 44A).
Esses achados reforçam o envolvimento de células T CD8+ nos aspectos de proteção
na infecção por Leishmania (Da CRUZ et al., 1994; COUTINHO et al., 1998; GAFFAR
et al., 1999).
Ainda considerando os aspectos clínicos relevantes na LTA, existem relatos
acerca da influência do tempo de evolução da lesão sobre o perfil imunológico
associado aos fatores inerentes aos eventos de instalação do processo infeccioso, bem
como no controle ou progressão da infecção (SOUZA-ATTA et al., 2002). Nesse
sentido, nos propusemos avaliar impacto do tempo de evolução das lesões cutâneas no
perfil imunofenotípico dos leucócitos circulantes de indivíduos portadores de LCL,
classificando-os em função do tempo de lesão em dois grupos distintos: portadores de
lesão recente (LCL60) e portadores de lesões crônicas (LCL>60), segundo proposto
por CARVALHO et al. (1985).
Nossos resultados demonstraram de forma interessante, que pacientes
portadores de lesões recentes (LCL60) apresentaram alterações no perfil
imunofenotípico de neutrófilos circulantes com aspectos tipicamente relacionados com a
ativação/modulação de eventos da imunidade inata, incluindo um aumento significativo
no percentual de neutrófilos HLA-DR+ (FIG.27B), neutrófilos CD23+ (FIG. 29B) e queda
na freqüência de neutrófilos CD28+ (FIG. 26B). Esses resultados sugerem a existência
de uma possível dualidade no papel de neutrófilos nos eventos imunológicos
desencadeados pela infecção por Leishmania.
Os estudos acerca dos neutrófilos têm mostrado sua grande importância em
eventos iniciais da infecção por Leishmania, participando ativamente do processo
complexo de atividades que podem determinar o estabelecimento da doença ou
controle do processo infeccioso (SANDILANDS et al., 2003). Na verdade, a literatura
carece de uma melhor elucidação sobre o papel dos neutrófilos nas infecções por
Leishmania, uma vez que há trabalhos que relatam uma atividade protetora (RIBEIRO-
DISCUSSÃO
112
GOMES et al., 2004) e outros uma atividade facilitadora em relação ao
estabelecimento da infecção (TACCHINI-COTTIER et al., 2000). RIBEIRO-GOMES et
al. (2004) através de estudos em modelo experimental, demonstraram que a depleção
de PMN em camundongos BALB/c reduz a carga parasitária, enquanto que, em
camundongos B6 observa-se uma exacerbação da infecção. TACCHINI-COTTIER et
al., (2000) demonstraram que os neutrófilos contribuem para o desenvolvimento de
lesões em camundongos BALB/c infectados com L. major, além de influenciar no
desenvolvimento da resposta do Tipo 2.
Ressaltando essa dualidade do papel de neutrófilos no processo infeccioso, van
ZANDBERGEN et al. (2002) demonstraram que, em camundongos, após a infecção
com L. major, os parasitos secretam um fator quimiotático para neutrófilos – Leishmania
chemotactic factor (LCF), sendo interiorizados por essas células que migram para o
local da infecção. Além disso, nos neutrófilos em que se encontram as Leishmanias
interiorizadas, ocorre a liberação de IL-8, promovendo seu próprio recrutamento.
Os neutrófilos funcionam então, como um reservatório para a Leishmania, e são
estimulados a secretarem fatores quimiotáticos também para macrófagos, como CCL-3
(MIP-1) e CCL-4 (MIP-1) (proteína inflamatória de macrófago 1 e 1,
respectivamente). Após 2-3 dias da infecção, os neutrófilos sofrem apoptose, os
macrófagos recrutados fagocitam os neutrófilos, agora como corpos apoptóticos
(SAVILL et al., 1989; van ZANDBERGEN et al., 2004), identificados através da
fosfatidilserina, molécula expressa na superfície das células que sofreram apoptose
(FADOK et al., 1992). Essas células apoptóticas funcionam como um mecanismo
indireto de transmissão da Leishmania, uma vez que são fagocitadas pelos macrófagos.
O tempo de vida dos neutrófilos na circulação é de 6-10 horas, após esse período
sofrem apoptose. Essas células podem ter o período de vida prolongado, quando
incubadas in vitro com citocinas pró-inflamatórias, como fator estimulador de colônia de
macrófagos e granulócitos (GM-CSF), fator estimulador de colônia de granulócitos (G-
CSF), IL-8, IL-1, glicocorticóides e produtos bacterianos (COLLOTA et al., 1992). AGA
et al. (2002), têm mostrado que as Leishmanias também podem estender o período de
vida dos neutrófilos, interferindo na via da caspase-3, impedindo, por certo tempo, que
essas células sofram apoptose. O tempo do efeito anti-apoptótico é o necessário para
manter as Leishmanias vivas até o momento da chegada dos macrófagos, ocorrendo,
então a apoptose dos neutrófilos infectados, sendo fagocitados pelos macrófagos. Essa
DISCUSSÃO
113
pode ser uma via silenciosa que os parasitos utilizam para entrar nos macrófagos. Após
a ingestão dos corpos apoptóticos dos PMN infectados, os macrófagos liberam
citocinas anti-inflamatórias, como TGF-. As Leishmanias internalizadas por essa via
indireta sobrevivem e multiplicam-se nos macrófagos (van ZANDBERGEN et al., 2004).
Entretanto, os neutrófilos podem destruir as Leishmanias por enzimas
proteolíticas e por oxigênio reativo (REMALEY et al., 1984), sendo assim, além da
capacidade migratória e atividade microbicida, os neutrófilos podem também funcionar
com um reservatório para a Leishmania como mencionado anteriormente.
Os estudos que avaliam os eventos de alterações fenotípicas dos neutrófilos
demonstram que a ligação cruzada de CD28 nos neutrófilos do sangue periférico
humano resulta no aumento inicial da expressão do receptor A de IL-8 (IL-8RA ou
CXCR-1), havendo um aumento da quimiotaxia induzida por IL-8. Foi demonstrado,
portanto, o importante papel da molécula CD28 na regulação da expressão de CXCR-1
e na migração de neutrófilos em resposta ao IL-8 (VENUPRASAD et al., 2001). Ainda,
com base nas mudanças do fenótipo celular envolvido no processo migratório, JOLLY
et al. (2004) observaram que o receptor para IgE de alta afinidade, FcRI, está
envolvido no processo de recrutamento das células ao foco inflamatório. De acordo com
MONTESEIRIN et al. (2005), o bloqueio do receptor para IgE de baixa afinidade,
FcRII, induz uma baixa modulação na expressão de CD62L (L-selectina – molécula de
adesão) na superfície dos neutrófilos. Esses dados corroboram com os nossos
achados, uma vez que encontramos uma diminuição do percentual de neutrófilos
CD28+ (FIG. 26B) e um aumento na freqüência de neutrófilos CD23+ (FIG. 29B) no
grupo de pacientes portadores de lesões recentes (LCL60), indicando que a
diminuição de CD28 e o aumento de CD23 nos neutrófilos são indicadores do aumento
da migração dessas células ao foco inflamatório. Além disso, encontramos um aumento
no percentual de neutrófilos HLA-DR+ nos pacientes com lesões recentes (FIG. 27B),
reforçando o processo de migração dessas células ao local da injúria, visto que LEI et
al. (2001) observaram que a ligação cruzada do MHC II com antígenos induz a
produção de IL-8 por neutrófilos humanos.
Ainda avaliando a expressão de marcadores de superfície nos neutrófilos
circulantes, observamos de maneira interessante, uma diminuição da expressão de
CD16 (FcRIII) em neutrófilos nos indivíduos com lesão recente e tardia (FIG. 28B),
com uma queda mais acentuada no grupo LCL>60. RAVETCH & PERUSSIA (1991)
DISCUSSÃO
114
mostraram que neutrófilos expressam constitutivamente o receptor de baixa afinidade
para IgG (FcRIIIb/CD16). A estimulação celular através dos FcRs pode resultar na
modulação da expressão desse receptor na superfície celular bem como na indução de
várias funções efetoras, estando envolvidas na geração de produtos oxidativos, na
fagocitose, na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) (HULETT &
HOGARTH, 1994). A diminuição da expressão de CD16 resulta da interação desses
receptores com imunocomplexos (FOSSATI et al., 2002). Esse resultado mostra o
envolvimento da resposta imune humoral nos pacientes com LCL, principalmente na
fase tardia de infecção.
Embora LAUFS et al. (2002) tenham demonstrado que a fagocitose de
Leishmanias por neutrófilos possa ocorrer tanto na presença quanto na ausência de
opsoninas, os parasitos fagocitados na ausência de opsoninas sobrevivem no interior
dos neutrófilos por até um dia. Em conjunto, esses dados associados aos nossos
achados imunofenotípicos, reforçam a hipótese para um papel duplo de neutrófilos
durante a infecção por Leishmania, podendo contribuir tanto para a manutenção dos
parasitos no seu interior nos eventos mais precoces (LCL60), quanto para a
eliminação do parasito nos eventos tardios dependendo de outros fatores gerados no
microambiente da infecção.
Dando suporte a essa hipótese, nossos resultados mostram um aumento na
expressão de HLA-DR em linfócitos B como um indicador imunofenotípico de maior
envolvimento da imunidade humoral nos eventos tardios da LCL. Avaliando a
expressão de HLA-DR+ por linfócitos B (CD19+HLA-DR+), observamos um aumento
significativo no grupo LCL>60, em relação ao grupo LCL60 (FIG. 40B). Essa
informação é consistente com os relatos de baixos níveis de reatividade sérica de IgG
anti-Leishmania encontrados em pacientes portadores da LTA com lesões cutâneas
únicas ou recentes (ULRICH et al., 1988; MENDONÇA et al., 1988). CONVIT et al.
(1993) mostraram que anticorpos específicos anti-Leishmania apresentam baixos níveis
de reatividade sérica nos casos de lesão recente, enquanto CHIARI et al. (1973)
relatam, inclusive, observações de negatividade sorológica em pacientes com lesões
recentes. Além disso, dados obtidos, recentemente, em nosso laboratório, avaliando
especificamente os grupos de pacientes incluídos nesse estudo, demonstram que o
grupo LCL60 apresenta, geralmente, níveis menores de reatividade de IgG anti-formas
promastigotas vivas de L. braziliensis, avaliados através da citometria de fluxo
DISCUSSÃO
115
(ROCHA, R.D. 2005, comunicação pessoal). Ainda, nesse contexto, VIEIRA et al.
(2002) sugerem que a produção de anticorpos, preferencialmente IgG1, poderia estar
envolvida nos eventos de opsonização mais efetiva, havendo, dessa forma, uma melhor
contenção da infecção.
Assim, partindo dessas informações, em associação com os nossos resultados,
observamos uma maior participação da resposta imune humoral na fase tardia da LCL.
Considerando ainda que a expressão de CD16 por neutrófilos pode estar associada aos
mecanismos efetores de IgG, nossos dados imunofenotípicos de linfócitos B, pareados
com relatos prévios de ROCHA, R.D. (2005, comunicação pessoal) sobre a reatividade
sorológica de IgG anti-Leishmania desses indivíduos, reforçam a hipótese de que a
diminuição da expressão de CD16 por neutrófilos na fase tardia de infecção, evidencia
a participação mais efetiva de mecanismos de interface da resposta imune celular inata
e humoral adaptativa nos eventos tardios na LCL.
Em contraposição aos achados imunofenotípicos observados em pacientes do
grupo LCL60, nossos resultados demonstraram que pacientes portadores de lesões
tardias (LCL>60) apresentam um perfil imunológico mais relacionado com uma possível
polarização da resposta imune para um padrão de reatividade da imunidade adaptativa,
destacando-se, além das alterações fenotípicas em linfócitos B, previamente abordadas
nessa seção, um típico balanço relacionado à imunidade protetora anti-Leishmania
dado pelo aumento da razão entre linfócitos T CD8+HLA-DR+/CD4+HLA-DR+ (FIG.
36B).
Embora, nesse estudo, não tenha sido contemplado a análise do perfil de
citocinas produzido por essas células, MASINI, A.B. (2005, comunicação pessoal)
demonstraram que indivíduos portadores de lesão crônica apresentam um predomínio
de uma resposta imune do Tipo 1, gerando assim um microambiente favorável ao
desencadeamento de mecanismos celulares de imunidade adaptativa imunoprotetores
que participariam efetivamente no processo de resolução da infecção, através de
mecanismos leishmanicidas múltiplos. Consistente com essas observações, MASINI,
A.B. (2005, comunicação pessoal) observou um número maior de células T CD4+ IFN-γ
positivas no grupo de pacientes com lesão recente. No entanto, a produção de IFN-γ
por células T CD8+ foi significativamente maior no grupo de pacientes portadores de
lesão tardia. Esses relatos em conjunto com o predomínio de linfócitos T CD8+/CD4+
DISCUSSÃO
116
ativados no grupo LCL>60 (FIG. 36B) reforçam as hipóteses da importância de
linfócitos T CD8+ nos eventos protetores na LCL (Da CRUZ et al., 1994; MENDONÇA
et al., 1995).
Ao considerar os aspectos laboratoriais na LTA, as principais investigações
demonstram a importância da análise de características relevantes, tais como:
reatividade sorológica e, principalmente a positividade no teste de Montenegro. Nesse
estudo, avaliamos o impacto da positividade do teste de Montenegro, como indicador
laboratorial da presença de eventos imunoprotetores em indivíduos portadores de LCL,
sub-categorizados com LCL-TM- e LCL-TM+. O teste de intradermorreação de
Montenegro detecta a presença da hipersensibilidade tardia, revelando a capacidade do
paciente em elaborar uma resposta imune celular frente a antígenos do parasito, sendo
um procedimento amplamente utilizado no diagnóstico laboratorial de LTA. A reação
positiva manifesta-se através do desenvolvimento de uma enduração local cerca de 48
a 72 horas após a inoculação do antígeno. Normalmente, a positividade do teste ocorre
por volta de alguns meses após início da lesão cutânea, e dessa forma, é bastante
freqüente o fato de pacientes com lesões recentes apresentarem resultados negativos
no teste (MONTENEGRO, 1926). Nossos resultados demonstraram que o grupo LCL-
TM+ apresentou um conjunto de alterações fenotípicas indicadoras de maior
envolvimento de eventos da imunidade celular inata e adaptativa, incluindo um aumento
na expressão de CD23 por monócitos circulantes (FIG. 25C), uma elevação na
freqüência de linfócitos T CD8+ circulantes com maior razão entre células T
CD8+/CD4+ ativadas (FIG. 36C).
Os estudos que avaliam o papel da imunidade celular no contexto da LTA
demonstram que a resposta imune inata é muito importante como um mecanismo de
defesa, contendo a disseminação da infecção, bem como, secretando citocinas que
contribuem para a manutenção do microambiente, no qual as células T serão primadas,
promovendo o estabelecimento de uma imunidade adquirida efetiva contra os parasitos.
Nesse contexto, VOULDOUKIS et al. (1995) observaram que a ligação do receptor
CD23 (FcRII) por IgE resulta na produção de NO, promovendo a morte da Leishmania
no interior dos macrófagos, mesmo na ausência de TNF-. Acreditamos que o aumento
na expressão de CD23 em monócitos observado no grupo LCL-TM+ (FIG. 25C),
poderia refletir um aspecto imunofenotípico da imunidade inata, estando diretamente
associado à imunidade celular leishmanicida. Os dados encontrados na análise dos
DISCUSSÃO
117
linfócitos T e subpopulações ativadas nos permitem especular que a resposta imune
inata estaria criando um microambiente com predomínio das citocinas do Tipo 1,
favorecendo o desenvolvimento da resposta imune adaptativa, efetiva para a ativação
dos mecanismos leishmanicidas pela interação dos eventos da imunidade inata e
adaptativa.
Em suma, nossos resultados mostraram que os mecanismos imunológicos que
acompanham a infecção humana por Leishmania são constituídos de eventos
complexos, multifatoriais que envolvem o estabelecimento concomitante de ativação e
imunorregulação do compartimento da imunidade inata bem como aspectos fenotípicos
sugestivos da ativação paralela da imunidade celular e humoral. Esse perfil complexo e,
a princípio controverso de alterações fenotípicas pode ser parcialmente esclarecido,
quando consideramos a importância do impacto diferencial de aspectos clínico-
laboratoriais nos parâmetros fenotípico da resposta imune de indivíduos portadores de
LCL. Nesse contexto, observamos um predomínio de alterações fenotípicas associadas
à imunidade celular em indivíduos portadores de lesão única e um maior envolvimento
da imunidade humoral em portadores de lesões múltiplas. Foi possível também
identificar uma dinâmica nos eventos imunológicos na LCL, com alterações em
parâmetros da imunidade inata, mais freqüentemente observados em portadores de
lesão recente, enquanto o envolvimento da resposta imune adaptativa foi
preferencialmente detectado em portadores de lesão crônica. Ainda, os aspectos
imunofenotípicos da imunidade inata e adaptativa, diretamente associados à imunidade
celular leishmanicida, foram seletivamente identificados em associação com a
positividade no teste de Montenegro.
Associações entre aspectos clínico-laboratoriais e parâmetros fenotípicos celulares da imunidade
inata e adaptativa na Leishmaniose Tegumentar Americana
CONCLUSÕES
CONCLUSÕES
119
1. Pacientes portadores de LCL apresentam alterações no perfil fenotípico de leucócitos
circulantes, sugestivas do estabelecimento concomitante de ativação ( Monócitos
CD23+, Neutrófilos HLA-DR+, Neutrófilos CD23+) e imunorregulação ( Neutrófilos
CD28+, Neutrófilos CD16+) do compartimento da imunidade inata;
2. No âmbito da imunidade adapatativa, observa-se um perfil misto, com envolvimento
de aspectos fenotípicos sugestivos da ativação paralela da imunidade celular e humoral
( LTHLADR+, LTCD4+HLADR+, LTCD8+HLADR+, LBHLADR+,
CD19+CD23+).
3 a. Há um predomínio de alterações fenotípicas associados á imunidade celular no
grupo LCL-1 ( LTCD8+HLADR+/CD4+HLA-DR+, LTHLADR+/LB), com maior
prevalência de alterações em aspectos da imunidade humoral no grupo LCL-2-4 ( LB,
CD19+CD5-, CD19+CD23+), o que reforça o envolvimento da imunidade celular
mediada por linfócitos T CD8+ nos eventos protetores e dos mecanismos de imunidade
humoral nos aspectos de morbidade durante a infecção pela Leishmania.
3 b. A categorização do grupo LCL em função do tempo de lesão, permitiu identificar
uma dinâmica nos eventos da imunidade inata, mais freqüente em portadores de lesão
recente LCL60 (
Neutrófilos CD28+, Neutrófilos HLA-DR+, Neutrófilos CD23+) e
adaptativa, preferencialmente detectadas em portadores de lesão crônica LCL>60 (
LTCD8+HLADR+/CD4+HLA-DR+, HLADR em LB), mantendo-se um perfil misto de
imunidade celular e humoral em portadores de lesão crônica.
3 c. Seletivos do grupo LCL-TM+, foram os aspectos imunofenotípicos da imunidade
inata e adaptativa diretamente associados à imunidade celular leishmanicida (
CD23
em Monócitos, LTCD8+HLADR+/CD4+HLA-DR+, LTHLA-DR+/LB).
Associações entre aspectos clínico-laboratoriais e parâmetros fenotípicos celulares da imunidade inata e
adaptativa na Leishmaniose Tegumentar Americana
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