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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO
DE CIÊNCIAS RURAIS
PROGRAMA
DE PÓS-GRADUAÇÃO CIÊNCIA DO SOLO
CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIA FIXADORA DE
NITROGÊNIO EM LUPINUS ALBESCENS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Marcos Roberto Dobler Stroschein
Santa Maria, RS, Brasil
2007
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2
CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIA FIXADORA DE
NITROGÊNIO EM Lupinus albescens
por
Marcos Roberto Dobler Stroschein
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de Pós-
Graduação em Ciência do Solo, Área de Concentração em Biodinâmica
e Manejo do Solo, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS),
como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Ciência do Solo
Orientador: Prof. PhD Flávio Luiz Foletto Eltz
Santa Maria, RS, Brasil
2007
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Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Rurais
Programa de Pós-Graduação em Ciência do Solo
A Comissão Examinadora, abaixo assinada,
aprova a Dissertação de Mestrado
CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIA FIXADORA DE
NITROGÊNIO EM Lupinus albescens
elaborada por
Marcos Roberto Dobler Stroschein
como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Ciência do Solo
COMISSÃO EXAMINADORA:
Flávio Luiz Foletto Eltz, PhD
(Presidente/Orientador)
Zaida Inês Antoniolli, Dr. (UFSM)
Luciano Kayser Vargas, Dr. (Fepagro)
Santa Maria, 22 de fevereiro de 2007.
4
À minha família
EU DEDICO
5
AGRADECIMENTOS
A Universidade Federal de Santa Maria e ao Programa de Pós-Graduação em
Ciência do Solo, pelo conhecimento e formação.
Aos professores Flávio Luiz Foletto Eltz e Zaida Inês Antoniolli, pela atenção
dispensada e pelo conhecimento compartilhado durante a realização deste trabalho.
Aos bolsistas Manoeli Lupatini, Matheus Pontelli e Marta R. da Rocha, pelo
auxílio responsável nos trabalhos de laboratório,
Aos colegas de laboratório de Biologia e Microbiologia do Solo e do Ambiente,
pela convivência e amizade.
A Adriana Giongo e o Dr. Luciano Kayser Vargas, pelos conselhos dados
durante toda a execução do projeto.
Aos funcionários Antônio Bassaco, Flávio Vieira da Silva, Gladis Uberti e
Tarcísio Uberti, pelo auxílio sempre prestado.
A minha namorada Cardine Martins dos Reis, pelo seu apoio e compreensão.
Aos amigos, André Paulo Hübner, Janete Baumgardt e Stefen Barbosa Pujol,
“membros do Grupo das Diazotróficas”, pela amizade durante todos estes anos.
A todos os colegas do Programa de Pós-Graduação em Ciência do Solo da
UFSM, pelos dois anos de amizade e convivência.
6
“Se tiveres de empreender uma luta, cuida-te para que, vencendo a ti mesmo, não
haja vencidos em tua caminhada. Luta sem fazer inimigos e persevera na lição
que a vida te concede, pois lutar não significa guerrear.”
Alex Zarthú, psicografado por Robson Pinheiro
7
RESUMO
Dissertação de Mestrado
Programa de Pós-Graduação em Ciência do Solo
Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil
CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIA FIXADORA DE
NITROGÊNIO EM Lupinus albescens
AUTOR: Marcos Roberto Dobler Stroschein
ORIENTADOR: Flávio Luiz Foletto Eltz
Data e Local de Defesa: Santa Maria, 22 de fevereiro de 2007.
O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar populações promissoras de rizóbio de L.
albescens na fixação biológica de nitrogênio. Duzentos e quatro isolados foram obtidos a
partir de três espécies de tremoço (L. albescens, L. lanatus e Lupinus sp.). Trinta e oito
isolados escolhidos após a purificação foram caracterizados fenotipicamente e submetidos a
um teste de autenticação, realizado em casa de vegetação. Estes testes objetivaram
selecionar estirpes simbiontes formadoras de leghemoglobina. Os isolados promissores
foram identificados com base nas características fenotípicas através da comparação com
vinte e duas estirpes de rizóbio. Determinou-se as características fisiológicas dos isolados
promissores, sendo avaliado a capacidade de crescer em: diferentes temperaturas,
concentrações de NaCl e pH, e a uma caracterização molecular com base em reação de
polimerase em cadeia (PCR) utilizando o oligonucleotídeo BOX A1-R. Foi realizada a
determinação da eficiência simbiôntica com base no teor de nitrogênio total da parte aérea,
a massa seca da parte aérea e das raízes, e número de nódulos. A caracterização
fenotípica dos trinta e oito isolados possibilitou a formação de 11 grupos com características
distintas. O isolado UFSM L1.3 formou nódulos e leghemoglobina quando associado a L.
albescens, tendo sido identificado no gênero Bradyrhizobium. A estirpe UFSM L1.3
apresentou crescimento em temperatura de 28 e 32°C, na concentração de NaCl de 0,1% e
na faixa de pH 4,0 a 8,0. O padrão de polimorfismo gerado pelo primer BOX-PCR permitiu
diferenciar o isolado UFSM L1.3 dos demais estudados. A eficiência simbiôntica do isolado
de rizóbio UFSM L1.3 foi de 94,2% em comparação com a testemunha nitrogenada.
Palavras-chave: tremoço, rizóbio, Bradyrhizobium
8
ABSTRACT
Master Dissertation in Soil Science
Graduate Programme in Soil Science
Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brazil
CHARACTERIZATION OF BACTERIUM THAT
FIXES NITROGEN IN Lupinus albescens
Author: Marcos Roberto Dobler Stroschein
Advisor: Flávio Luiz Foletto Eltz
Date and Place of Defense: Santa Maria, February 22
th
,2007.
The objective of this work was to characterize promising isolated rhizobium of L. albescens in
the nitrogen biological fixation. Two hundred and four isolates were obtained from three
species of lupine (L. albescens, L. lanatos e Lupinus sp.). Thirty-eight isolates chosen
randomly were characterized through their phenotype and submitted to an authenticity test
done in the greenhouse. In order to select symbiotic strains that synthesizes
leghaemoglobin. The promising isolates were identified by their phenotypic characteristics by
comparing twenty-one strains of rhizobium. The physiological characteristics of the promising
isolated were determined and evaluated about the growing capacity in different
temperatures, NaCl concentrations and pH, and a molecular characterization by polymerase
chain reaction (PCR) using the primer BOX. An experiment, in the greenhouse, was made to
determine the symbiosis efficiency by the total nitrogen, and the dried mass in the aerial part
and in the roots, and the number of nodules. The phenotypic characterization of the thirty-
eight isolated enabled the development of 11 groups with distinct characteristics. The UFSM
L1.3 strain developed nodules and leghaemoglobin when associated to L. Albescens and
was identified in the genus Bradyrhizobium. The UFSM L1.3 strain presented growing in the
temperature from 28 to 32°C, in a NaCl concentration of 0,1% and in a pH from 4,0 to 8,0.
The standard of polymorphism generated by the primer BOX-PCR enabled to distinguish the
UFSM L1.3 isolated from the others. The symbiosis efficiency of the UFSM L1.3 isolated was
of 94,2% when compared to the without nitrogen.
Key-words: lupine, rhizobium, Bradyrhizobium.
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Ocorrência de areais no sudoeste do Rio Grande do Sul
(SUERTEGARAY et al., 2001). .................................................................................. 19
Figura 2 – Espécie de Lupinus albescens em área de arenização. Santa Maria,
2007.
.......................................................................................................................... 20
Figura 3 – Etapas da execução do trabalho com rizóbio em Lupinus. Santa
Maria, 2007.
............................................................................................................... 35
Figura 4 – Isolamento de bactérias a partir de nódulos de Lupinus albescens:
a) amostragem de material do interior do nódulo; b) inoculação em meio LMA.
........ 37
Figura 5 – Meio de cultura LMA com vermelho congo (a) e azul de bromotimol
(b), utilizados na caracterização cultural dos isolados. Santa Maria, 2007.
............... 40
Figura 6 – Padrões utilizados na caracterização fisiológica dos rizóbio. a)
UFSM L1.3; b) SEMIA 938; c) Sem inoculação. Santa Maria, 2007.
......................... 44
Figura 7 – Dendograma de similaridade baseado nas características culturais
de 38 isolados de Lupinus (UFSM L1.1, UFSM L1.2, UFSM L1.3, UFSM L1.4,
UFSM L1.5, UFSM L1.6, UFSM L1.7, UFSM L1.8, UFSM L 1.9, UFSM L1.10,
UFSM L1.11, UFSM L1.12, UFSM L1.13, UFSM L1.14, UFSM L2.1, UFSM
L2.2, UFSM L2.3, UFSM L2.4, UFSM L2.5, UFSM L2.6, UFSM L2.7, UFSM
L2.8, UFSM L2.9, UFSM L2.10, UFSM L2.11, UFSM L2.12, UFSM L3.1, UFSM
L3.2, UFSM L3.3, UFSM L3.4, UFSM L3.5, UFSM L3.6, UFSM L3.8, UFSM
L4.1, UFSM L4.2, UFSM L4.3, UFSM L4.4) e estirpe recomendada para
Lupinus (SEMIA 938). Santa Maria, 2007.
................................................................. 51
Figura 8 – Nódulo em Lupinus albescens (isolado UFSM L1.3) aos 60 dias. a)
Nodulação positiva; b) Produção de leghemoglobina.
............................................... 55
10
Figura 9 – Dendograma de similaridade baseado em características culturais
entre um isolado de Lupinus albescens (UFSM L1.3), uma estirpe
recomendada para Lupinus (SEMIA 938) e 21 estirpes-tipo de rizóbio (Tabela
6).
............................................................................................................................... 57
Figura 10 – Padrão de polimorfismo gerado por BOX-PCR. 1. Bradyrhizobium
sp. (SEMIA 938). 2. Bradyrhizobium sp. (SEMIA 928). 3. UFSM L1. 3. 4. 1p. 5.
2p. 6. Rhizobium sp. 7. Sem DNA. M. Marcador: DNA de Lambda clivado com
EcoRI + HindIII.
.......................................................................................................... 62
Figura 11 – Dendograma genético de três isolados de Lupinus albescens
comparados a duas estirpes de Bradyrhizobium sp recomendadas para
tremoço e uma estirpe de Rhizobium sp., após análise de agrupamento dos
fragmentos obtidos pela amplificação do DNA por PCR com o oligonucleotídeo
específico BOX-A1R. Análise realizada com o algoritmo UPGMA e o
coeficiente de Pearson. Santa Maria, 2007.
............................................................... 63
Figura 12 – Eficiência simbiótica relativa de isolado de rizóbio de Lupinus
albescens (UFSM L1.3) e de estirpe comercial recomendada para Lupinus
(SEMIA 938). Santa Maria, 2007.
............................................................................... 65
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Diferentes famílias e gêneros de rizóbio fixadores de nitrogênio
descritos..................................................................................................................... 26
Tabela 2 – Locais de coleta de três espécies de tremoço nos municípios de
Alegrete, Maçambará e São Francisco de Assis. Santa Maria, 2007......................... 36
Tabela 3 – Valores relativos às características culturais dos isolados utilizados
na construção do dendograma. Santa Maria, 2007.................................................... 42
Tabela 4 – Espécies e estirpes tipo de rizóbio utilizadas na comparação dos
isolados de
Lupinus.................................................................................................... 46
Tabela 5 – Relação do número de isolados nos quatro locais e nas três
espécies de
Lupinus estudadas. Santa Maria, 2007.................................................. 50
Tabela 6 – Características culturais fenotípicas dos isolados bacterianos
pertencentes aos grupos formados a partir de cinco características básicas.
Santa Maria, 2007. ..................................................................................................... 53
Tabela 7 – Características culturais de um isolado de
Lupinus albescens e de
22 estirpes de rizóbio, Santa Maria, 2007. ................................................................. 58
Tabela 8 – Crescimento de duas estirpes de rizóbio em diferentes pH,
concentrações de NaCl e temperatura em meio líquido LMA. Santa Maria,
2007. .......................................................................................................................... 60
Tabela 9 – Massa seca da parte aérea (MSPA), nitrogênio na parte aérea
(NPA), eficiência simbiôntica (Efra), massa seca das raízes (MSR) e número
de nódulos (NN) do isolado UFSM L1.3 e da estirpe SEMIA 938. Santa Maria,
2007. .......................................................................................................................... 65
12
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
g
grama (s)
°C
grau (s) Celsius
h
hora (s)
kg
quilograma (s)
Kg ha
-
1
quilograma (s) por hectare
L
litro (s)
M
Molar
m
metro (s)
mg
miligrama (s)
mL
mililitro (s)
mg L
-
1
miligrama (s) por litro
mm
milímetro (s)
min
minuto (s)
µL
microlitro
%
percentagem
seg
segundo (s)
rcf
força centrifuga relativa
V
volts
13
LISTA DE ANEXOS
ANEXO A – Meios de cultura e soluções utilizados para o estudo da população
bacteriana oriunda de Lupinus albescens..................................................................82
14
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...................................................................................................16
2 REVISÃO DE LITERATURA.............................................................................18
2.1 Áreas arenizadas.............................................................................................18
2.2 Gênero Lupinus: ocorrência e simbiose com rizóbio..................................20
2.3 Fixação biológica de nitrogênio (FBN)..........................................................23
2.4 Grupo rizóbio...................................................................................................24
2.5 Taxonomia de rizóbio .....................................................................................27
2.5.1 Caracterização fenotípica de rizóbio ................................................................28
2.5.1.1 Métodos fenotípicos tradicionais ...................................................................28
2.5.1.2 Métodos quimiotaxonômicos.........................................................................30
2.5.2 Caracterização genética de rizóbio ..................................................................31
2.5.2.1 Hibridização do DNA .....................................................................................32
2.5.2.2 Polimorfismo dos tamanhos dos fragmentos de restrição (RFLP) ................32
2.5.2.3 Análises baseadas na reação em cadeia de polimerase...............................33
3 MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................35
3.1 Coleta das raízes das plantas de Lupinus ....................................................36
3.2 Isolamento de rizóbio .....................................................................................37
3.3 Autenticação dos isolados.............................................................................38
3.4 Caracterização fenotípica...............................................................................39
3.4.1 Características culturais ...................................................................................39
3.4.1.1 Coloração de Gram .......................................................................................39
3.4.1.2 Tempo de crescimento para a visualização das colônias..............................39
3.4.1.3 Diâmetro das colônias...................................................................................40
3.4.1.4 Produção de goma ........................................................................................41
3.4.1.5 Coloração das colônias .................................................................................41
15
3.4.1.6 Alteração do pH do meio...............................................................................41
3.4.1.7 Agrupamento dos isolados............................................................................42
3.4.2 Caracterização fisiológica.................................................................................43
3.4.2.1 Crescimento em diferentes temperaturas......................................................43
3.4.2.2 Crescimento em diferentes pH ......................................................................44
3.4.2.3 Crescimento em diferentes concentrações de NaCl .....................................45
3.5 Identificação dos isolados..............................................................................45
3.6 Caracterização molecular...............................................................................46
3.7 Teste de eficiência na Fixação Biológica de Nitrogênio..............................48
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.........................................................................50
4.1 Isolamento e caracterização...........................................................................50
4.2 Autenticação dos isolados bacterianos nativos ..........................................54
4.3 Caracterização do gênero de uma estirpe de rizóbio isolada de Lupinus
albescens.................................................................................................................55
4.4 Caracterização fisiológica..............................................................................59
4.5 Caracterização molecular...............................................................................61
4.6 Avaliação da eficiência simbiótica relativa...................................................63
5 CONCLUSÕES..................................................................................................66
6 SUGESTÕES PARA O DESENVOLVIMENTO DE NOVAS PESQUISAS........67
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................68
16
1 INTRODUÇÃO
A região sudoeste do Rio Grande do Sul apresenta 0,26 % de sua área
sujeitos ao processo de arenização (SUERTEGARAY et al., 2001). Nesta região, a
formação de pradarias mistas sobre o substrato arenítico constitui um dos ambientes
mais frágeis da América do Sul (AB’SABER, 1995). O processo de degradação
desses solos pode estar associado à sua formação geológica e ao uso intensivo
destas áreas com cultivo agricola e pecuária (SUERTEGARAY, 1998).
Em função do aumento da degradação do solo no sudoeste do Rio Grande do
Sul proporcionado pela intensificação da agricultura, a partir da década de 70, vários
sistemas conservacionistas foram propostos, no entanto não atingiam os principais
fatores do processo de arenização: a chuva e o vento. Desta maneira o uso de
plantas de coberturas apresenta-se como uma alternativa para a recuperação de
áreas degradadas, por diminuir os efeitos do impacto da gota da chuva e da erosão
eólica.
A recuperação das áreas em processo de arenização vem sendo estudada, e
uma das alternativas pode ser a utilização de alguma leguminosa nativa como planta
de cobertura. Lupinus albescens está sendo pesquisada devido à sua alta
rusticidade, adaptabilidade a solos arenosos, capacidade de redução do processo
de erosão eólica, potencial produtivo de matéria seca, cobertura do solo e fixação
biológica de nitrogênio. No entanto poucos estudos vêm dado atenção a
identificação e seleção de estirpes de rizóbio em associação com L. albescens.
O estudo de plantas nativas de Lupinus albescens pode proporcionar o
isolamento de novas estirpes de rizóbio que apresentam características importantes
de adaptação ecológica e maior eficiência na fixação biológica de nitrogênio. Isto é
essencial para a compreensão da diversidade de espécies e aproveitamento deste
recurso biológico. O conhecimento das características fenotípicas e genéticas vem
sendo utilizados na distinção de estirpes de rizóbio e no processo de identificação
dos isolados de espécies nativas de leguminosas.
O objetivo deste trabalho foi caracterizar isolados promissores de rizóbio de L.
albescens na fixação biológica de nitrogênio. Os objetivos específicos do estudo
17
foram: a) caracterizar por métodos fenotípicos estirpes bacterianas isoladas a partir
de nódulos de L. albescens; b) avaliar a capacidade de formação de nódulos e
produção de leghemoglobina; c) identificar o gênero dos rizóbios promissores por
métodos fenotípicos; d) analisar as características genéticas, fisiológicas e eficiência
simbiótica dos rizóbios promissores na fixação biológica de nitrogênio.
18
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Áreas arenizadas
No estado do Rio Grande do Sul as áreas arenizadas ocorrem entre as
latitudes 29º00’ S e 31°00' S e longitudes 54º30’ W Gr e 58º45’ W Gr, sendo
caracterizadas por apresentar regiões arenosas desprovidas de vegetação
(SUERTEGARAY, 1998). Estes areais podem ser encontrados nos municípios de
Alegrete, Cacequi, Itaquí, Maçambará, Manuel Viana, Quaraí, Rosário do Sul, São
Borja, São Francisco de Assis e Unistalda, ocupando 0,26% da região sudoeste do
estado (Figura 1) (SUERTEGARAY, 1998; SUERTEGARAY, 2001).
O termo arenização foi proposto por Suertegaray (1987), para diferenciar o
fenômeno de degradação e perda da produtividade que ocorre no sudoeste gaúcho,
definindo-o como o processo de retrabalhamento de depósitos areníticos não
consolidados, conferindo mobilidade aos sedimentos não protegidos pela vegetação,
e distinguindo-o do fenômeno de desertificação. Embora o termo desertificação seja
ainda utilizado de forma abrangente, há uma tendência mundial de restringir este
conceito aos processos de degradação do solo relacionados às condições climáticas
de regiões áridas e semi-áridas.
A ocorrência destes areais tem como base a Formação Botucatu (datada do
período Mesozóico) sob o qual se assentaram depósitos arenosos hídricos e eólicos
durante o período Pleistoceno e Holoceno (SUERTEGARAY, 1998), originando
solos extremamente arenosos e de baixa agregação e alta friabilidade. Aliam-se a
isso chuvas que podem chegar a 1.400 mm por ano
1
, que fornecem energia
necessária para formação de sulcos que resultam em ravinas e, ao longo do tempo,
essas ravinas se expandirão pela ação do escoamento superficial concentrado,
formando voçorocas. Os sedimentos transportados durante as chuvas torrenciais
são depositados à jusante das ravinas e voçorocas, dando origem à formação de
1
O clima desta região é classificado por Köppen como Cfa, subtropical úmido, sem estação seca, com uma
precipitação média anual de 1400 mm (SOUTO, 1984).
19
depósitos arenosos e que, com o tempo e a ação da erosão eólica, irão formar os
areais (SUERTEGARAY, 1998).
Segundo Ab’Saber (1995) a ação dos ventos é mais intensa nesta região
porque se alternam ventos gerais sul-norte, muito fortes no inverno, com ações de
turbilhonamento, ocorrendo associação entre erosão hídrica e eólica. Desta maneira,
o material movimentado altera a vegetação ao redor do núcleo de degradação
através do efeito abrasivo e do soterramento, quando da deposição das partículas
Como o ecossistema nativo desta região apresenta-se extremamente frágil, devido à
própria natureza dos solos sobre os quais se desenvolveu, reduzindo a capacidade
de resilência destes solos, com a continuidade do processo de transporte,
deposição, morte e soterramento da vegetação, há a intensificação do processo de
degradação do solo, com a expansão da área alterada (ROVEDDER et al., 2003).
Desta maneira a arenização é considerado um processo natural, no entanto, a
degradação destas áreas é acelerada pela atividade antrópica. Ou seja, podem ser
resultado do pisoteio do gado, revolvimento do solo e do uso de maquinaria pesada
na atividade agrícola, originando sulcos e desencadeando condições de escoamento
concentrado.
Figura 1 – Ocorrência de areais no sudoeste do Rio Grande do Sul
(SUERTEGARAY et al., 2001).
20
2.2 Gênero Lupinus: ocorrência e simbiose com rizóbio
O gênero Lupinus pertence à subfamília Papilionoideae da família
Leguminoseae, apresentando entre 300 a 500 espécies e estando estas espécies
distribuídas no Continente Americano e algumas regiões da África e Mediterrâneo
(CONTERATO, 2004). Nos trabalhos publicados por Santos (2000) e Pinheiro &
Miotto (2001), estes autores relatam a existência de 13 espécies de Lupinus,
ocupando diferentes regiões fisiográficas do Rio Grande do Sul. O uso de algumas
espécies de Lupinus como adubação verde vem sendo preconizada em várias
regiões do mundo, principalmente na melhoria dos solos devido à sua habilidade de
crescer em solos pobres e sob condições adversas (WOLKO & WEEDEN, 1990).
A espécie Lupinus albescens H. et Arn. (Figura 2) foi descrita ocorrendo no
noroeste da Argentina, Uruguai, Paraguai e Brasil (PLANCHUELO & DUNN, 1984).
No sudoeste do Rio Grande do Sul esta espécie ocorre naturalmente, tendo evoluído
paralelamente aos processos pedogenéticos e climáticos que formaram a paisagem
atual da Campanha Gaúcha (ROVEDDER et al., 2005).
Figura 2 – Espécie de Lupinus albescens em área de arenização. Santa Maria,
2007.
21
O L. albescens é uma planta herbácea, de crescimento ereto, com hábito
anual. As folhas apresentam forma digitada, inflorescências racemosas com flores
arroxeadas ou lilases terminais e frutos na forma de vagens, com até seis ou sete
sementes. A semente desta espécie pode levar de 10 a 20 dias para germinar,
contudo, a germinação é abundante, formando banco de plântulas com alta
densidade. Em teste de germinação realizado no Laboratório de Sementes da
UFSM, com um tratamento prévio de escarificação em cilindro rotativo, a espécie
apresentou 100 % de germinação (ROVEDDER et al., 2004).
A espécie apresenta folíolos e ramos muito pilosos, além de apresentar
substâncias resiníferas, o que pode ser um mecanismo de adaptação às condições
edafoclimáticas da região, comprovando a sua evolução paralela a um
paleoambiente xeromórfico. Estas características, além de atribuírem alta rusticidade
à espécie, possuem efeitos benéficos quando do uso da espécie em estratégias de
recuperação e a tornam inadequada ao consumo animal. Esta elevada pilosidade
atua diminuindo a transpiração, fator importante em solos de baixa retenção hídrica
(ROVEDDER et al., 2004).
Outra característica adaptativa desta espécie, relacionada às condições
hídricas do solo, é a formação de um vigoroso sistema radicular pivotante, com
presença de raízes em até 1,50 m de profundidade, proporcionando uma
capacidade de buscar água e nutrientes a elevadas profundidades. Além disto, a
espécie apresenta associação simbiótica com bactérias fixadoras de nitrogênio, com
nódulos ativos no colo da raiz e próximo à coifa (ROVEDDER et al., 2004).
A capacidade de redução do processo de transporte e deposição de areia foi
estudado em L. albescens em consórcio com aveia preta, evidenciando uma
redução de 93 % de areia movimentada pela erosão eólica em núcleo de arenização
quando comparada com uma área não revegetada (ROVEDDER et al., 2003).
Hickmann et al. (2005) compararam o L. albescens com Secale cereale L.
(centeio) na eficiência como planta de cobertura do solo, constatando uma maior
produção de massa seca e de ciclagem de nutrientes para o tremoço. Isto pode ser
pelo fato desta espécie ser nativa da região sudoeste e, portanto, tenha
desenvolvido mecanismos genéticos de adaptação, como capacidade de absorção
de nutrientes em baixas concentrações e resistência a déficit hídrico.
Segundo Rovedder et al. (2005), esta espécie de tremoço apresentou um
acúmulo de massa seca de 6,42 Mg ha
-1
e de nitrogênio na parte aérea de até 158,3
22
Kg ha
-1
quando cultivado em área degradada. Estes resultados são superiores aos
3,2 Mg ha
-1
de massa seca e 81,38 Kg ha
-1
de nitrogênio encontrados para tremoço
branco (Lupinus albus) (GOLVEIA & ALMEIDA, 1997), 3,0 Mg ha
-1
de massa seca e
88 Kg ha
-1
de nitrogênio para nabo forrageiro (Raphanus sativus L.) (WIETHÖLTER,
2003) e aos 5,3 Mg ha
-1
de massa seca e 65,4 Kg ha
-1
de nitrogênio para aveia preta
(Avena strigosa Schieb.) (ROSSATO, 2004). Estes dados indicam que Lupinus
albescens apresenta-se como uma espécie promissora ao uso como adubo verde,
tendo elevado potencial para cobertura.
Rovedder et al. (2005) também relacionou os acúmulos de nitrogênio
encontrados na parte aérea das plantas de L. albescens à eficiência dos
microssimbiontes fixadores de nitrogênio. No entanto ainda não se conhece o
gênero de rizóbio associado a esta espécie de tremoço.
Uma das primeiras descrições feitas de uma bactéria isolada a partir de
nódulos de uma espécie de Lupinus foi realizada por Eckhardt et al. (1930). Estes
autores relatam a presença de bactérias de crescimento lento que não se
enquadravam em outros grupos de nodulação cruzada, classificando-os com
Rhizobium lupini. Após a publicação de Jordan (1982), esta espécie foi alocada
dentro de Bradyrhizobium japonicum por apresentar características culturais
semelhantes. No entanto, estudos mais detalhados mostraram que as bactérias
isoladas de Lupinus mostravam-se diferentes de B. japonicum, sendo então
alocadas em um novo taxa, Bradyrhizobium sp. (Lupinus) (WANG et al., 2006).
Para o cultivo de tremoço no Brasil, existem duas estirpes de Bradyrhizobium
sp. recomendadas, SEMIA 928 e 938, as quais podem ser obtidas na coleção de
cultura da Fepagro (Brasil, 2006). Menna et al. (2006) avaliaram a filogenia das
principais estirpes utilizadas em inoculantes comerciais e demonstraram que SEMIA
938 apresenta alta relação filogenética com Bradyrhizobium elkanii. Outra espécie
descrita simbionte a Lupinus albus foi caracterizada por Trujillo et al. (2005). Os
isolados apresentavam características culturais que se distinguem de
Bradyrhizobium sp., e relação filogenética com Ochrobactrum, sugerindo uma nova
espécie: Ochrobactrum lupini. No entanto ainda não se sabe da capacidade de
nodulação e fixação biológica de nitrogênio das estirpes de Bradyrhizobium sp.
recomendadas para tremoços em associação com L. albescens.
23
2.3 Fixação biológica de nitrogênio (FBN)
A fixação biológica de nitrogênio é caracterizada pela utilização do nitrogênio
gasoso da atmosfera (N
2
) como fonte de nitrogênio para o metabolismo de um grupo
seleto de seres vivos, que inclui algumas espécies de microrganismos procarióticos.
Estes microrganismos possuem o complexo enzimático chamado nitrogenase,
necessário para transformar o N
2
em amônia, subseqüentemente assimilada em
aminoácidos e proteínas (NEVES & RUMJANEK, 1998).
A capacidade diazotrófica está restrita a Bacteria e Archaea, incluindo
cianobactérias e bactérias Gram positivas e Gram negativas (MOREIRA &
SIQUEIRA, 2006). A observação de uma árvore filogenética contendo espécies
procarióticas mostra que os microrganismos diazotróficos ocorrem em um grande
número de taxa e sua distribuição não obedece nenhum padrão lógico. Esta
característica pode ser explicada por três hipóteses. A primeira é que a capacidade
diazotrófica teve origens múltiplas. A segunda é que este caráter diazotrófico estava
presente num ancestral comum a todas as espécies, mas foi perdido durante o
processo evolutivo que deu origem a diferentes ramos filogenéticos. A terceira é que
o potencial diazotrófico teve uma única origem, mas se estendeu à outros ramos
filogenéticos por transferência lateral de plasmídeos (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006).
As bactérias denominadas rizóbio são consideradas o principal grupo de
diazotróficos, por sua importânica agronômica e pela fixação de nitrogênio. O
segundo grupo economicamente mais importante é composto pelas cianobactérias,
que têm sido encontradas como fixadoras de vida-livre e em associações com várias
plantas, dentre estas, a planta aquática Azolla. O manejo desta espécie vegetal vem
sendo estimulado junto ao sistema de arroz irrigado na China e Vietnam.
Cianobactérias podem formar ainda associações com vários outros organismos,
como fungos e algas (formando liquens) e angiospermas do gênero Gunnera. O
terceiro grupo de organismos fixadores de N é representado pela associação
simbiótica entre actinomicetos (Frankia, Nostoc) e plantas de várias famílias,
principalmente plantas arbóreas pertencentes aos gêneros Alnus e Casuarina
(SPRENT & SPRENT, 1990).
24
Outro grupo de diazotróficos apresenta uma associação menos profunda com
plantas, não caracterizando uma interação simbiótica. Este grupo inclui bactérias
que colonizam o interior de plantas superiores. O quinto grupo de bactérias que
contribui para o balanço de N nos ecossistemas é constituído por bactérias de vida-
livre. Organismos como Klebsiella sp. e Azotobacter sp. vivem no solo e fixam
nitrogênio quando outras formas de N não estão disponíveis. Esta grande
diversidade de espécies de procariotos que apresentam a capacidade de fixação
biológica de nitrogênio demonstram a necessidade de estudos de novos
microrganismos.
Nos últimos 10 anos, técnicas de análise molecular do DNA têm sido aplicadas
para detectar e analisar bactérias sem a necessidade de nenhum procedimento de
cultivo ou isolamento. Estas técnicas confirmam, através da variabilidade genética
obtida de amostras ambientais, a existência de um grande número de
microrganismos do solo nunca antes detectado pelas técnicas de cultivo
(HUGENHOLTZ et al., 1998). Dessa forma, muitas espécies de organismos
diazotróficos podem estar contribuindo no processo de fixação de N sem ainda
terem sido isolados.
2.4 Grupo rizóbio
As plantas da família Leguminoseae, composta por aproximadamente 750
gêneros, destes 250 cultiváveis (FREIRE, 1992), possuem uma interação
simbiôntica com bactérias da ordem Rhizobiales, que se caracterizam pela formação
de estruturas hipertróficas, nas raízes e, excepcionalmente, no caule, denominadas
nódulos. A capacidade de fixação biológica de nitrogênio destes microrganismos
ocorre devido ao complexo enzimático nitrogenase, que converte o N
2
em amônia e
assim disponibiliza nitrogênio para as plantas (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006).
Estes microrganismos são bactérias Gram negativas, aeróbicas não
esporulantes, pertencentes ao filo alpha-Proteobacteria, os quais são genericamente
identificados como rizóbio (ZAKHIA & LAUJUDIE, 2001). A classificação destes
25
microrganismos, nos últimos vinte anos, esteve em constante alteração, sendo
descobertos novos gêneros, alterando a taxonomia (WANG et al., 2006).
No estudo taxonômico inicial de rizóbio, todas as bactérias formadoras de
nódulos em leguminosas eram classificadas no gênero Rhizobium (FRANK, 1889
apud WANG et al., 2006), apresentando seis espécies: R. leguminosarum, R.
meliloti, R. trifolii, R. phaseoli, R. lupini e R. japonicum. Nesta classificação, o círculo
de hospedeiros era o fator mais importante na definição destas espécies, embora
tenham sido descritas também características morfológicas e fisiológicas (FRED et
al., 1932). Com o prosseguimento das pesquisas, o uso da especificidade do
hospedeiro como principal critério de classificação de rizóbio foi abandonado por
apresentar um grande número de exceções dentro destes grupos (Wilson, 1944).
Em seu trabalho, Jordan (1982) modificou a taxonomia de rizóbio, dividindo-os
em dois gêneros: Bradyrhizobium e Rhizobium. O primeiro gênero correspondia às
cepas de crescimento lento, de reação básica em meio de cultura LMA (Levedura
Manitol Ágar) (VINCENT, 1970), com diâmetro menor ou igual a 1 mm e crescimento
em 5 a 7 dias, designando somente uma espécie Bradyrhizobium japonicum, que
incluiu também a espécie R. lupini por apresentar características semelhantes. No
gênero Rhizobium alocaram-se três espécies: R. leguminosarum, R. meliloti e R. loti.
Na primeira espécie foram considerados três biovares: R. leguminosarum bv. viciae,
bv. trifolli e bv. phaseoli. Os três biovares constituíram o mesmo grupo na taxonomia
numérica e na hibridização DNA-DNA, mas corresponderam a diferentes grupos de
nodulação cruzada (WANG et al., 2006).
Em estudos posteriores, outro grupo de bactérias de crescimento rápido foi
coletado em solos na China e identificado, tanto a partir do solo como de nódulos de
soja, cujas características fisiológicas e bioquímicas indicavam uma posição
taxonômica intermediária entre Rhizobium e Bradyrhizobium (KEYSER et al., 1982,
XU & GE, 1984). Desta maneira, se propôs a criação de uma nova espécie,
Rhizobium fredii, baseados principalmente em experimentos de hibridização de DNA
(SCHOLLA & ELKAN, 1984).
Atualmente, a taxonomia do grupo rizóbio vem sendo modificada. A principal
alteração ocorreu no gênero
Rhizobium, ao qual foram incluídas todas as espécies
de Agrobacterium (CONN, 1942) e Allorhizobium undicola (de LAJUDIE, 1998a),
combinando as novas espécies: Rhizobium radiobacter, R. rhizogenes, R. rubi, R.
undicola e R. vitis (YOUNG et al., 2001). Outra mudança aconteceu ao gênero
26
Sinorhizobium, de acordo com Young (2003), os gêneros Sinorhizobium e Ensifer
são similares e segundo o “Bacteriological Code” o gênero Sinorhizobium deve ser
transferido para Ensifer por ter sido descrito posteriormente. Assim, hoje são
consideradas quatro famílias (Rhizobiaceae, Bradyrhizobiaceae, Phylobacteraceae e
Xanthobacteraceae), cinco gêneros (Rhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium,
Sinorhizobium/ Ensifer
2
e Azorhizobium) e 46 espécies validadas pelo IJSEM
3
(Tabela 1).
Tabela 1 – Diferentes famílias e gêneros de rizóbio fixadores de nitrogênio
descritos.
Família Gênero
Número
de Espécies
Autor(es) e ano
Rhizobiaceae
Rhizobium
16 Frank (1889)
Sinorhizobium/ Ensifer
13 Chen et al. (1988);
de Lajudie et al.
(1994)
Bradyrhizobiaceae
Bradyrhizobium
5 Jordan (1984)
Phylobacteraceae
Mesorhizobium
10 Jarvis et al. (1997)
Xanthobacteraceae
Azorhizobium
2 Dreyfus et al. (1988)
Outras espécies que apresentam a capacidade de formar nódulos e fixar
nitrogênio, não pertencentes ao grupo rizóbio, vêm sendo isoladas de diferentes
leguminosas. Dentro do Filo α-Proteobacteria foram descritos o gênero Blastobacter
(B. denitrificants) isolado a partir de nódulos de Aeschynomene indica (van BERKUN
et al., 2002), Methylobacterium (M. nodulans) de Crotalaria spp. (JOURAND et al.,
2004), Devosia (D. neptuniea) de Neptunia natans (RIVAS et al., 2002) e
Ochrobactrum (O. lupini) de Lupinus onoratus (TRUJILLO et al., 2005).
2
Neste trabalho, o autor convencionou em utilizar somente Sinorhizobium para designação do gênero.
3
IJSEM, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. A validação de um novo taxon
deve vir acompanhada de uma publicação neste periódico ou que passe a integrar a lista de publicações validas,
aprovadas pelo ICSP (International Committee on Systematics of Prokaryotes).
27
No Filo β-Proteobacteria foi isolado o gênero Ralstonia (R. taiwanensis) a partir
de nódulos de Mimosa spp. por Chen et al. (2001), enquanto Vandamme et al.
(2002) reportaram o gênero Burkholderia, abrangendo quatro espécies (B. tuberum,
B. phymatum, B. caribensis, B. cepacia) isoladas de cinco leguminosas tropicais.
Essas descobertas indicam que a diversidade de procariotos capazes de
estabelecer simbiose com leguminosas pode ser muito mais ampla que o previsto e
certamente conduzirão a avanços significativos no conhecimento da origem e
evolução da fixação biológica de nitrogênio, assim como sua manipulação pelo
homem.
2.5 Taxonomia de rizóbio
A sistemática bacteriana é definida com sendo o processo de caracterização e
arranjo da diversidade em uma maneira ordenada, reconhecendo grupos de
organismos similares em uma hierarquia, cuja entidade básica é a espécie
(DELLAGLIO et al., 2004). De acordo com Cowan (1968), a sistemática inclui a
taxonomia e aspectos da ecologia, bioquímica, genética, patologia, biologia
molecular e microscopia. No entanto, o termo sistemática é comumente utilizado
como sinônimo de taxonomia.
Segundo Vandamme et al. (1996), a taxonomia bacteriana é tradicionalmente
dividida em: a) classificação, isto é, o arranjo ordenado dos organismos em grupos
taxonômicos com base em sua similaridade; b) nomenclatura, ou seja, identificação
das unidades definidas na classificação; c) identificação de organismos
desconhecidos, que é o processo de definir se um determinado organismo pertence
a uma das unidades definidas na nomenclatura.
De acordo com Holt et al. (1994, p. 03) “Esquemas de identificação não são
esquemas de classificação, apesar de poder existir certa similaridade”. O processo
de identificação envolve um numero reduzido de caracteres, facilmente determinado,
que permitam uma alocação correta à espécie, enquanto que na classificação
busca-se uma ampla coleção de dados, envolvendo vários aspectos fenotípicos e do
genótipo, permitindo descrever as propriedades do microrganismo.
28
A identificação de uma bactéria se inicia na caracterização fenotípica e
genética dos isolados e posterior alocação deste isolado caracterizado a uma
espécie conhecida, após a verificação de certo grau de similaridade.
2.5.1 Caracterização fenotípica de rizóbio
Estão incluídos nos métodos fenotípicos todos aqueles não direcionados às
moléculas de DNA ou RNA, consequentemente incluem as técnicas
quimiotaxonômicas
4
(VANDAMME et al., 1996). Desta maneira os principais
métodos fenotípicos são denominados de tradicionais e quimiotaxonômicos.
2.5.1.1 Métodos fenotípicos tradicionais
Os métodos fenotípicos tradicionais são usados nos protocolos de
identificação da maioria dos Laboratórios de Microbiologia, compreendem dados
morfológicos, fisiológicos e bioquímicos que permitem a distinção de diferentes taxa.
Os gêneros de rizóbio descritos até o momento podem ser diferenciados com
base em características culturais e morfológicas em meio LMA (VINCENT, 1970).
Segundo Martins et al. (1997), os principais parâmetros utilizados são: tempo de
crescimento em meio de cultura LMA, reação ácida ou básica em meio de cultura,
diâmetro de colônia, produção de polissacarídeos extracelulares (goma) e coloração
da colônia. Com relação ao tempo de crescimento podem, ser formados cinco
grupos: muito rápido, para aquelas colônias que podem ser visualizadas após 1 dia
de incubação; rápido, para aquelas que são visualizadas de 2 a 3 dias de incubação,
intermediárias; com 4 a 5 dias; lentas, com 6 a 10 dias e muito lentas, são
visualizadas após 10 dias de incubação (MELLONI et al., 2006)
4
O termo quimiotaxonomia refere-se à aplicação de métodos analíticos para a coleta de informações sobre os
vários constituintes da célula visando à classificação bacteriana (Vandamme et al., 1996)
29
A alteração do pH do meio de cultura pode ser usada para dividir os isolados
em três classes: estirpes que apresentam reação ácida, reação básica ou reação
neutra em meio de cultura. Placas com meio LMA recém preparadas com azul de
bromotimol, possuem pH próximo a 6,8 e cor verde. Rizóbios de crescimento lento
tendem a alcalinizar, modificando a cor para azul, enquanto os rizóbios de
crescimento rápido tendem a acidificar o meio, alterando a cor para amarelo
(MARTINS et al., 1997). Tan & Broughton (1981) sugerem que as mudanças de pH
promovidas pelo rizóbio no meio de cultura são devido à utilização preferencial de
açúcares pelas estirpes de crescimento rápido, seguida da excreção de ácidos
orgânicos, e de compostos nitrogenados pelas estirpes de crescimento lento e
conseqüente liberação de cátions.
O diâmetro das colônias dos isolados que nodulam leguminosas é um
parâmetro que apresenta correlação com outras características culturais. Colônias
com diâmetro menor que 1 mm possuem superfície seca ou pouca produção de
polissacarídeos, e colônias maiores tendem a produzir mais goma (Martins et al.,
1997).
A produção de polissacarídeos extracelulares, também denominada de muco
ou goma, é outra característica utilizada na caracterização de rizóbio. As estirpes
podem ser agrupadas em secas, quando não produzem goma, e quando ocorre
formação de goma são classificadas quanto à quantidade produzida em: alta, média
e baixa. Estirpes de crescimento rápido tendem a produzir mais goma, ao contrário
de rizóbios de crescimento lento que formam colônias secas ou com baixa produção
de muco (MARTINS et al., 1997).
A coloração da colônia varia dentro das diferentes estirpes de rizóbio, sendo
uma importante característica no agrupamento de taxa. A coloração pode variar de
incolor, branco a creme, sendo mais incomum a cor amarela (ARAÚJO, 1994).
A avaliação das características culturais e morfológicas é o primeiro passo para
a identificação de grupos taxonômicos de microrganismos, podendo prever uma boa
aproximação em nível de gênero. Estes descritores podem indicar diferenças
fisiológicas importantes entre microrganismos, que podem ser detectadas
posteriormente mediante estudos mais refinados (PELCZAR et al., 1997). Um
exemplo é o gênero Mesorhizobium, no qual foram incluídos isolados que
apresentavam algumas características fenotípicas diferenciadas do gênero
30
Rhizobium, inclusive algumas estirpes que apresentam crescimento intermediário,
sugerindo a existência de diferenças metabólicas importantes (MOREIRA et al.,
1993; JARVIS et al., 1997; de LAJUDIE et al., 1998b).
Alguns descritores fenotípicos tradicionais avaliados têm como objetivo não
somente a caracterização, mas verificar a provável adaptabilidade ecológica dos
diferentes isolados às condições ambientais predominantes no ecossistema para o
qual se procede a seleção do rizóbio. A capacidade de crescimento em diferentes
pH, concentrações de sais, temperatura e antibiótico são utilizados na
caracterização “in vitro” como também na correlação com condições ambientais
(SWELLIM et al., 1997; SÁ et al., 1993; XAVIER et al., 1998).
A habilidade em utilizar diferentes fontes de carboidratos pode ser usada
também na diferenciação das espécies de rizóbio (GRAHAM et al., 1991). Esta
caracterização pode ser feita através do uso de kits para estudo de descritores
bioquímicos, como o sistema API, Staph-Ident, Rapid E, Enterotubos, Oxi-ferm,
Micro ID System e Biolog Nutritional System (HÜBNER et al., 2004).
2.5.1.2 Métodos quimiotaxonômicos
As técnicas quimiotaxonômicas visam avaliar a composição química de alguns
constituintes da célula procariótica, sendo os principais métodos SDS PAGE, análise
de isoenzima, sorologia e pirólese (avaliação do conteúdo de ácidos graxos)
(VANDAMME et al., 1996).
A análise de proteínas totais por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio
(SDS PAGE – sodium dodecyl sulfato polyacrylamide gel electrophoresis) é utilizada
na caracterização bacteriana por apresentar uma alta confiabilidade na distinção de
estirpes muito proximamente relacionadas (VANDAMME et al., 1996). Este método
foi empregado por Lima et al. (2005) no estudo da diversidade de estirpes de
Bradyrhizobium spp. isoladas de diferentes solos da Amazônia. Este método foi
também utilizado na determinação das relações filogenéticas entre Mesorhizobium
tianshanense e outros rizóbios (TAN et al., 1997), e na caracterização da espécie
Methylobacterium nodulans (JOURAND et al., 2004).
31
Outra técnica que utiliza eletroforese é a analise de isoenzima, que se baseia
no diagnóstico das múltiplas formas moleculares da mesma enzima que ocorre em
uma determinada espécie, como resultado da presença de um ou mais genes
codificando para cada uma destas formas (VANDAMME et al., 1996). Este método
foi utilizado por Barrera et al. (1997) na caracterização de uma população do gênero
Bradyrhizobium.
Os métodos sorológicos vêm sendo empregados a mais de 70 anos na
taxonomia de rizóbio. O principio desta técnica está baseada na presença de
variabilidade nos constituintes antigênicos das células bacterianas (NISCHI, 1994),
sendo o método de ELISA (Enzyme-Linked Imuno Sorbent Assay) considerado a
principal prática. No entanto, o seu uso no processo de identificação bacteriana é
limitado, uma vez que estirpes de rizóbio que possuem propriedades antigênicas
similares podem ser bastante diversas com respeito a outras características
fenotípicas e genotípicas.
A análise do teor de ácidos graxos celulares constitui-se em um método rápido
e reproduzível, quando realizada em condições controladas (JARVIS & TIGHE,
1994). Este método foi utilizado para a discriminação entre estirpes de
Bradyrhizobium e R. meliloti isoladas de diferentes solos da Itália (KAY et al., 1994).
2.5.2 Caracterização genética de rizóbio
Os métodos genotípicos de taxonomia, direcionados para moléculas de DNA
ou RNA, são uma conseqüência do progresso tecnológico experimentado pela
biologia molecular nas décadas recentes e atualmente dominam os estudos
taxonômicos modernos (VANDAMME et al., 1996). A caracterização genética de
procariotos pode ser baseada na quantidade total do DNA, pelas técnicas de
hibridização de DNA e RFLP (Restrictions Fragment Length Polymorfhism), e por
amplificação de seqüências do DNA e RNA, pelas diferentes metodologias de PCR
(Polymerase Chain Reaction).
32
2.5.2.1 Hibridização do DNA
A definição de uma espécie bacteriana é feita pela hibridização DNA-DNA
(VANDAMME et al., 1996). Este método é baseado na capacidade do DNA se
desnaturar a altas temperaturas e recombinar-se em baixas temperaturas. Quando o
percentual de recombinação DNA-DNA é igual ou superior a 70% sugere ser a
mesma espécie. Estirpes que possuem uma hibridização variando entre 25 e 60%
são consideradas espécies diferentes pertencentes ao mesmo gênero e percentuais
inferiores a 10% compreendem gêneros diferentes (WANG et al., 2006).
A maior parte das espécies de rizóbio hoje definidas obedece este critério. No
entanto Martinez-Romero (1994) relata alguns casos de muito baixa homologia de
DNA dentro das espécies Sinorhizobium fredii, Rhizobium tropici, Mesorhizobium
plurifarium. Nestes casos métodos fenotípicos podem auxiliar na correta distinção
das estirpes.
2.5.2.2 Polimorfismo dos tamanhos dos fragmentos de restrição (RFLP)
A determinação do polimorfismo dos tamanhos de fragmentos de restrição
(RFLP – Restrictions Fragment Length Polymorfhism) é um método empregado em
taxonomia de procariotos e nos estudos de diversidade para comparação de estirpes
(WANG et al., 2006).
A distinção dos grupos bacterianos e feitos através do polimorfismo gerado no
DNA total pela ação de enzimas de restrição. Esta análise inclui a digestão do DNA
total com o uso de enzimas específicas, sua separação por eletroforese e a
hibridização com fragmentos de seqüência homologa de DNA marcadas com
radioatividade ou compostos que desencadeiam uma reação de luminescência
(FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1995). Outra metodologia pode ser realizada pela
clivagem do produto oriundo da reação de PCR com enzimas de restrição e
visualizada em gel de agarose, na técnica denominada PCR-RFLP.
33
As análises de RFLP e PCR-RFLP vêm sendo muito utilizadas na
caracterização da diversidade entre diferentes populações de rizóbio, principalmente
avaliado as regiões 16S do RNAr e da região intergênica 16S e 23S RNAr
(FERNANDES et al..2003; TAN et al., 2001; CHUEIRE et al., 2000a; DOIGNON-
BOURCIER et al., 2000).
2.5.2.3 Análises baseadas na reação em cadeia de polimerase
As técnicas de PCR permitem a amplificação de seqüências definidas da
molécula de DNA, diferenciando e identificando as estirpes de bactérias. Esta prática
contribuiu para os recentes avanços obtidos na taxonomia de rizóbio.
O uso de oligonucleotídeos específicos que amplificam seqüências repetidas
do DNA, pela técnica de PCR, proporcionando a formação de perfis eletroforéticos
que promovem a chamada impressão digital do organismo (fingerprinting). Os
oligonucletídeos mais comumente utilizados são BOX, ERIC (Enterobacterial
Repetitive Intergenic Consensus) e REP (Repetitive Extragenic Palindromic
Sequences) que amplificam seqüências repetidas no genoma bacteriano
(VERSALOVIC et al., 1994). Estes métodos têm sido empregados no estudo da
diversidade intra-específica de rizóbio, fazendo a distinção de estirpes muito
proximamente relacionadas (FERNANDES et al., 2003; CHUEIRE et al., 2000b).
Para a distinção de estirpes recomendadas para o cultivo de diferentes
espécies de leguminosas vêm sendo empregados os métodos que utilizam os
oligonucleotídeos ERIC, REP e BOX (CHUEIRE et al., 2000a; CHUEIRE et al.,
2000b; BANGEL, 2000). Segundo Selenska-Pobell et al. (1996), a técnica de BOX-
PCR foi eficiente para distinguir diferentes espécies de Rhizobium e as informações
geradas for auxiliaram na caracterização realizada pela técnica de RFLP do DNA. O
estudo da diversidade de 29 isolados bacterianos de três espécies arbóreas de
regiões temperadas da China foi realizada pela técnica de BOX-PCR e permitiram
alocar estas estirpes no gênero Bradyrhizobium (LIU et al., 2005).
34
Outra ferramenta de uso crescente na prática de identificação de bactérias é a
amplificação de regiões específicas do genoma e posterior seqüenciamento de
bases. A identificação é determinada pela comparação das seqüências obtidas com
a de outros organismos disponíveis no banco de dados da National Center for
Biotechnology Information (NCBI). As moléculas de RNA 16S e 23S presentes no
ribossomo são comumente empregadas na taxonomia de procariotos por serem
regiões conservadas e se enquadram nos conceitos que definem um marcador
filogenético relatado por Piaza et al. (2006). A região 23S é bem maior do que a 16S,
contendo mais informações genéticas úteis em estudos de filogenia (LUDWING et
al. 1992), no entanto o número de seqüências presentes nos bancos de dados é
pouco, limitando a comparação de novas seqüências
5
.
5
A comparação do numero de seqüências de 16S e 23S, disponíveis para alinhamento, pode ser feita no banco
de dados da NCBI (http//:www.ncbi.nlm.nih.gov/).
35
3 MATERIAL E MÉTODOS
Para a execução do trabalho foram coletadas amostras de raízes em Alegrete,
Maçambará e São Francisco de Assis (Tabela 1) e o material foi analisado nos
Laboratórios de Biologia e Microbiologia do Solo e do Ambiente do Departamento de
Solos da Universidade Federal de Santa Maria/RS e no Núcleo de Microbiologia
Agrícola do Departamento de Genética da Universidade Federal do Rio Grande do
Sul/RS (Figura 3).
Isolamento e autenticação dos rizóbios
Laboratório e casa de vegetação do
Departamento de Solos, UFSM
Caracterização Fenotípica:
− Características culturais.
− Crescimento em diferentes
temperaturas.
− Crescimento em diferentes
concentrações de NaCl.
− Crescimento em diferentes
pH.
Laboratório de Biologia e
Microbiologia do Solo e do
Ambiente, UFSM
Eficiência simbiótica na FBN:
− Nitrogênio total da parte
aérea.
− Massa seca da parte
aérea.
− Massa seca das raízes.
− Número de nódulos
Casa de vegetação do
Departamento de Solos,
UFSM.
Caracterização Molecular:
− Extração de DNA.
− BOX – PCR.
− Eletroforese em Gel de
Agarose.
Departamento de Genética,
UFRGS.
Coleta de raízes de L.
albescens;
L. lanatus e Lupinus sp.
Municípios:
- Alegrete
- Maçambará
- São Francisco de Assis
Figura 3 – Etapas da execução do trabalho com rizóbio em Lupinus. Santa
Maria, 2007.
36
3.1 Coleta das raízes das plantas de Lupinus
Para escolha dos locais a serem coletadas as raízes de Lupinus, foram
selecionadas duas áreas de ocorrência natual de Lupinus albescens, no local
denominado “Ponte de Pedra” e na Fazenda Santa Zélia, localizados nos municípios
de Alegrete e Maçambará. Foi escolhida também uma área de arenização onde as
plantas de L. albescens estão sendo cultivadas aproximadamente a 5 anos,
localizado na Fazenda Santo Antão no município de Alegrete. As raízes das
espécies L. lanatus e Lupinus sp. foram coletadas em uma voçoroca no município de
São Francisco de Assis (Tabela 2).
O procedimento de coleta foi realizado de acordo com metodologia
modificada proposta por Hungria (1994). Em cada local foram amostradas plantas
em plena floração, tendo sido escolhidas de forma aleatória. Cavou-se ao redor da
raiz para a retirada intacta do sistema radicular. Removeu-se o excesso de solo e foi
retirada a parte aérea com auxilio de uma tesoura de poda. As raízes foram
colocadas em sacos plásticos e acondicionadas em uma caixa térmica.
Tabela 2 – Locais de coleta de três espécies de tremoço nos municípios de
Alegrete, Maçambará e São Francisco de Assis. Santa Maria, 2007.
Local de
Coleta
Número de
Plantas
Espécie Coordenadas Geográficas Município
“Ponte de
Pedra”
10 Lupinus albescens 29°39’58”S e 55°23’43”W Alegrete
Fazenda
Santo
Antão
10 Lupinus albescens 29°40’58”S e 55°19’40”W Alegrete
Fazenda
Santa Zélia
10 Lupinus albescens 28°53’07”S e 56°17”01”W Maçambará
Voçoroca
10 Lupinus sp. 29°31’23”S e 55°14’40”W
São Francisco
de Assis
2 Lupinus lanatus 29°31’23”S e 55°14’40”W
São Francisco
de Assis
37
3.2 Isolamento de rizóbio
O isolamento das bactérias foi realizado no Laboratório de Biologia e
Microbiologia do Solo e do Ambiente da Universidade Federal de Santa Maria. As
raízes coletadas foram lavadas com auxílio de uma peneira. As raízes com os
nódulos foram secos em papel toalha e as raízes fragmentadas em pedaços
menores com auxílio de uma tesoura de poda para facilitar a retirada do material do
interior do nódulo. Para cada sistema radicular foram retirados de um a três nódulos.
Após esta limpeza, os nódulos foram acondicionados em placas de Petri.
A desinfestação dos nódulos foi feita de acordo com metodologia proposta por
Hungria (1994). Cada nódulo foi submerso em álcool 95% por dez segundos,
posteriormente em solução de hipoclorito a 5% e seguido de oito lavagens em água
destilada e esterilizada. Os nódulos foram cortados ao meio com auxílio de bisturi e
pinça para raspagem do seu interior e posterior inoculação em meio de cultura LMA
(Levedura Manitol Agar) (VINCENT, 1970). O material amostrado foi incubado no
escuro a 28°C por 10 dias (Figura 4).
a)
b
)
Figura 4 – Isolamento de bactérias a partir de nódulos de Lupinus albescens:
a) amostragem de material do interior do nódulo; b) inoculação em meio LMA.
38
Após a inoculação, as colônias isoladas que apresentavam crescimento entre
2 a 10 dias e não absorviam o vermelho congo, eram marcadas e inoculadas
novamente em meio de cultura LMA para purificação. A pureza do isolado foi
determinada mediante teste de Coloração de Gram. Os trinta e oito isolados
bacterianos inicialmente purificados foram utilizados para a realização da
autenticação e caracterização fenotípica.
3.3 Autenticação dos isolados
A capacidade de nodulação e formação de leghemoglobina foi verificada pela
autenticação dos isolados. O experimento foi realizado em casa de vegetação do
Departamento de Solos da Universidade Federal de Santa Maria durante 60 dias.
O experimento foi realizado em copos de plástico com capacidade de 500 mL,
contendo uma mistura composta de vermiculita e areia na proporção 2:1, a qual foi
acondicionada em sacos plásticos de polipropileno e esterilizada por uma hora em
autoclave a 120°C por três dias consecutivos. Em cada recipiente foram colocados
cinco sementes de L. albescens previamente escarificadas e desinfestadas em
solução de hipoclorito 5 % por 5 min. O inóculo consistiu de caldo LM (VICENT,
1970), onde foram inoculados os tratamentos e incubado a 28°C por seis dias sob
agitação de 120 rpm.
O experimento constou de 41 tratamentos com duas repetições, sendo 38
isolados, duas estirpes de Bradyrhizobium sp. recomendadas para Lupinus (SEMIA
928 e 938), um tratamento sem inoculação. A cada cinco dias era adicionado 10 mL
de solução nutritiva (SOMASEGARAN & HOBEN, 1985). A avaliação da presença
dos nódulos foi feita em lupa esteroscópica no Laboratório de Microbiologia e
Biologia do Solo e do Ambiente.
39
3.4 Caracterização fenotípica
3.4.1 Características culturais
3.4.1.1 Coloração de Gram
As culturas foram crescidas a 28ºC, por seis dias, em placas de Petri com
meio de cultura LMA. Pequena amostra do crescimento foi então transferida e
esparramada em uma gota de água em lâmina de microscopia. O esfregaço foi
fixado na chama de lamparina e então submetido ao método de coloração de Gram
de Hucker, de acordo com procedimento descrito por Murray et al. (1994) modificado
pela substituição de etanol 95% por solução alcoólica de acetona a 5% como agente
de descoloração.
As soluções de Gram estão descritas no Anexo A. A lâmina preparada foi
analisada sob objetiva de 100 x sob óleo de imersão em microscópio óptico com
aumento de 2.000 vezes. Culturas que apresentaram células de cor azul-violáceo
foram assumidas como sendo Gram positivas e aquelas de coloração vermelho-
róseo como Gram negativas.
3.4.1.2 Tempo de crescimento para a visualização das colônias
Os isolados foram crescidos em placas de Petri contendo meio LMA
(VINCENT, 1970) modificado pela a adição de 5 mL L
-1
de solução de Vermelho
Congo (Figura 5). Foi considerado crescimento muito rápido, para aquelas colônias
que podem ser visualizadas após um dia de incubação; rápido, para aquelas que
são visualizadas de dois a três dias de incubação, intermediárias; com quatro a
40
cinco dias; lentas, com seis a dez dias e muito lentas, são visualizadas após dez
dias de incubação (MELLONI et al., 2006).
b
)
a)
Figura 5 – Meio de cultura LMA com vermelho congo (a) e azul de bromotimol
(b), utilizados na caracterização cultural dos isolados. Santa Maria, 2007.
3.4.1.3 Diâmetro das colônias
O diâmetro das colônias foi determinado juntamente com o tempo de
crescimento. Após sete dias de incubação, o diâmetro das colônias foi medido com
auxílio de um paquímetro, sendo o tamanho determinado em milímetro. Em cada
uma das placas, foram medidas 10 colônias isoladas e os resultados obtidos foram
submetidos à média aritmética e expressos em valores absolutos.
41
3.4.1.4 Produção de goma
A produção de goma (polissacarídeos) foi determinada juntamente com o
diâmetro das colônias, após sete dias de incubação. Esta característica foi
determinada visualmente em: sem produção de goma (s/goma), baixa, média e alta
produção de goma (MELLONI et al., 2006).
3.4.1.5 Coloração das colônias
A coloração das colônias foi determinada visualmente durante a determinação
do diâmetro das colônias. Foram consideradas as cores: branca, creme, amarela e
incolor (MELLONI et al., 2006).
3.4.1.6 Alteração do pH do meio
Os isolados foram inoculados em meio LMA (VINCENT, 1970) modificado
pela a adição 10 mL L
-1
de Azul de Bromotimol (Figura 5). A coloração azul do meio
de cultura foi considerada alcalina, coloração amarela ácido e a não alteração da cor
original do meio neutro. Os isolados foram comparados com placas sem inoculação
e inoculada com a estirpe de Bradyrhizobium sp. SEMIA 938.
42
3.4.1.7 Agrupamento dos isolados
Após a caracterização cultural dos isolados, foi construído um dendograma de
similaridade pelos métodos Complete Linkage e Distância Euclidiana (Everitt, 1993
apud Melloni et al., 2006) por meio do programa STATISTICA 4.5 (1993). Os valores
obtidos na caracterização foram estipulados de acordo com Melloni et al. (2006)
(Tabela 3).
Tabela 3 – Valores relativos às características culturais dos isolados
utilizados na construção do dendograma. Santa Maria, 2007.
Característica cultural
Intervalo de
observação
Valor atribuído para
a construção do
dendogramas
(1)
A. Tempo, em dias para visualização 1 dia (muito rápido) 1
das colônias 2 a 3 dias (rápido) 2
4 a 5 dias
(intermediário)
3
6 a 10 dias (lento) 4
10 dias (muito lento) 5
B. Diâmetro da colônia < 1 mm 1
1 a 2 mm 2
> 2 mm 3
C. Alteração do pH do meio Acido 1
Neutro 2
Básico 3
D. Produção de goma s/goma 1
Baixa 2
Média 3
Alta 4
E. Coloração da colônia Branca 1
Creme 2
Amarela 3
Incolor 4
(1)
Os valores foram ponderados de acordo com a importância atribuída às características culturais
na construção do dendograma, sendo 100, 75, 100, 25 e 75% para as características A, B, C, D e
E (MELLONI et al., 2006).
43
Os valores obtidos na caracterização fenotípica foram ponderados de acordo
com a importância atribuída às características fenotípicas na construção do
dendograma, sendo 100, 75, 100, 25 e 75% para as características tempo, em dias
para visualização das colônias; diâmetro médio das colônias; modificação do pH do
meio LMA com Azul de Bromotimol; produção de goma e coloração das colônias,
respectivamente, de acordo com Melloni et al. (2006) e Moreira et al. (1993).
3.4.2 Caracterização fisiológica
Os isolados que apresentaram formação de nódulos e produção de
leghemoglobina e a estirpe SEMIA 938, foram submetidos aos testes de crescimento
em diferentes temperaturas, concentrações de NaCl e pH.
3.4.2.1 Crescimento em diferentes temperaturas
A capacidade de crescimento em diferentes temperaturas foi determinada
pela inoculação em tubos de ensaio contendo meio LM (Levedura Manitol)
(VINCENT, 1970), onde os isolados foram incubados a temperatura de 28; 32; 37 e
40°C. Tubos que apresentavam turbidez no caldo foram considerados como
resultado positivo e não turvos foram considerados negativos. Foi utilizado na
comparação um tratamento sem inoculação para confirmar a ausência de
crescimento (Figura 6).
44
3.4.2.2 Crescimento em diferentes pH
Para avaliar a capacidade de crescimento em diferentes pH, tubos de ensaio
contendo 5 mL de caldo LM (VINCENT, 1970), tendo valores de pH de 4; 5; 6; 7; 8; 9
e 10, ajustados com NaOH e HCl 1M, foram incubados e crescidos a uma
temperatura de 28°C sob agitação de 120 rpm. A análise de crescimento foi
determinada sete dias após a incubação. Tubos que apresentavam turbidez no caldo
foram considerados como resultado positivo e não turvos foram considerados
negativos. Foram inoculadas duas testemunhas que cresceram em caldo LM
(VINCENT, 1970) com pH 6,8 e temperatura de 28°C sob agitação de 120 rpm. Foi
utilizado na comparação um tratamento sem inoculação para confirmar a ausência
de crescimento (Figura 6).
a) b) c)
Figura 6 – Padrões utilizados na caracterização fisiológica dos rizóbio. a)
UFSM L1.3; b) SEMIA 938; c) Sem inoculação. Santa Maria, 2007.
45
3.4.2.3 Crescimento em diferentes concentrações de NaCl
A habilidade de crescer em diferentes concentrações de NaCl foi determinada
pela incubação dos isolados em tubos de ensaio contendo 5 mL de caldo LM
(VINCENT, 1970) acrescidos com 0,1; 0,5; 1,0; 5,0 e 10,0 % (m/v) de NaCl,
incubados a 28°C sob agitação de 120 rpm durante sete dias. Tubos com turbidez
no caldo foram considerados com crescimento positivo e não turvos negativos. Duas
testemunhas foram utilizadas na comparação, crescidas a pH 6.8 em temperatura de
28°C sob agitação de 120 rpm no mesmo período de tempo. Um tratamento sem
inoculação foi utilizado na comparação dos resultados negativos (Figura 6).
Para o desenvolvimento dos testes de crescimento em diferentes pH e
concentrações de NaCl, foram considerados duas repetições por tratamento, caso
houvesse discordância de resultado em cada repetição, os tratamentos seriam
inoculados novamente.
3.5 Identificação dos isolados
A partir das características culturais dos isolados, foi realizada a identificação
do gênero, comparando os dados obtidos dos isolados que apresentaram resultado
positivo para formação de nódulos e leghemoglobina pelo teste de autenticação,
com dados obtidos da literatura de 21 estirpes tipo de rizóbio (Tabela 4). O
agrupamento foi realizado mediante a construção de um dendograma de
similaridade pelos métodos Complete Linkage e Distância Euclidiana (EVERITT,
1993) por meio do programa STATISTICA 4.5 (1993). Os valores obtidos na
caracterização e da literatura para construção do dendograma foram ponderados de
maneira semelhante ao item 3.4.1.7 (Tabela 3).
46
Tabela 4 – Espécies e estirpes tipo de rizóbio utilizadas na comparação dos
isolados de Lupinus.
Espécie Estirpe-tipo Referência
Azorhizobium caulinodans
ORS 571 Dreyfus et al. (1988)
Azorhizobium dobereinerae
UFLA 1-100 Moreira et al. (2006)
Bradyrhizobium japonicum
ATCC10324 Jordan et al. (1984)
Bradyrhizobium liaoningense
2281 Xu et al. (1995)
Bradyrhizobium yuanmingense
CCBAU 10071 Yao et al. (2002)
Mesorhizobium amorphae
ACCC 19665 Wang et al. (1999)
Mesorhizobium chacoense
CECT 5336 Velazquez et al. (2001)
Mesorhizobium loti
NZP2213 Jarvis et al. (1997)
Mesorhizobium plurifarum
ORS 1032 de Lajudie et al. (1998b)
Mesorhizobium septentrionale
SDW014 Gao et al. (2004)
Rhizobium huautlense
SO2 Wang et al. (1998)
Rhizobium mongolense
USDA 1844 van Berkun et al. (1998)
Rhizobium gallicum
R602sp Armager et al. (1997)
Rhizobium giardinii
H152 Armager et al. (1997)
Rhizobium hainanese
I66 Chen et al. (1997)
Rhizobium lossense
CCBAU7190B Wei et al. (2003)
Rhizobium undicula
ORS 992 de Lajudie et al. (1998a)
Rhizobium yanglingense
CCBAU71623 Tan et al. (2001)
Sinorhizobium arboris
HAMBI 1552 Nick et al. (1999)
Sinorhizobium kummerowiae
CCBAU71042 Wei et al. (2002)
Sinorhizobium morelense
Lc57 Wang et al. (2002)
3.6 Caracterização molecular
A caracterização por BOX - PCR foi realizada no Núcleo de Microbiologia
Agrícola, do Departamento de Genética da UFRGS. Foi utilizado na comparação o
isolado de Lupinus L123B, SEMIA 938 e 928 e dois isolados de Lupinus descritos
por Rovedder et al. (2005) de crescimento rápido e uma espécie de Rhizobium sp.
47
Para a extração de DNA foi seguido o protocolo modificado de Sambrook et al.
(1998), onde as estirpes foram crescidas em meio líquido por sete dias. Uma
alíquota de 1,5 mL de cultura foi transferidas para microtubos de 2 mL e
centrifugados por 3 minutos a 16099 rcf por duas vezes. Descartou-se o
sobrenadante e adicionou-se 500 µL de TE1, homogeneizando em vortex até que
todo pellet tenha sido ressuspendido. Foram adicionadas 25 µL de Lizoenzima e
incubados a 37°C por 1 hora. Posteriormente, as amostras foram mantidas a
temperatura ambiente por cinco minutos e adicionou-se 200 µL de acetato de
amônia 7,5 M e mantidas em gelo por 15 min. Centrifugou-se por 10 min a 16099 rcf
e o sobrenadante foi vertido para outro microtubo de 1,5 mL. A quantidade de 1
volume de fenol-clorofórmio foi adicionada e agitou-se por 10 minutos. O material foi
centrifugado por 5 min a 2795 rcf após foi adicionado 8 µL de NaCl 5M e 0,6
volumes de isopropanol, e mantidas as amostras no gelo por 10 min. Centrifugou-se
por 15 minutos a 12.000 rpm e o sobrenadante descartado. O pellet de DNA foi
lavado com 500 µL de Etanol 70% e centrifugado por 2 minutos a 12.000 rpm. O
pellet foi ressuspendido em 30 µL de TE.
O DNA das bactérias foi amplificado pela técnica de PCR (Polymerase Chain
Reaction) com o oligonucleotídeo BOX A1-R (5’-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-
3’), que amplifica regiões conservadas e repetitivas do DNA cromossômico. A
amplificação foi realizada utilizando os seguintes ciclos: um ciclo de desnaturação
inicial a 95°C por 6 mim, 35 ciclos de desnaturação (30 seg a 90 °C), anelamento (1
min a 52°C) e extensão (8 min a 65°C), um ciclo de extensão final a 65°C por 16 min
(MARTIN et al., 1992). Os fragmentos amplificados foram separados por eletroforese
a 80 V durante três horas em gel de agarose a 1,5% e corado com brometo de
etídeo e fotografado.
O perfil de bandas no gel foi transformado em uma matriz binária
bidimensional, onde 0 indicava a ausência de banda e 1 a presença e o
agrupamento realizado pelo programa STATISTICA 4.5 (1993) usando o algoritmo
UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with arithmetic mean) e o coeficiente de
Pearson.
48
3.7 Teste de eficiência na Fixação Biológica de Nitrogênio
Neste experimento foram estudados os isolados que apresentaram resultado
positivo para formação de nódulos e leghemoglobina pelo teste de autenticação e a
estirpe SEMIA 938, recomendada para Lupinus sp., obtida da coleção de culturas da
FEPAGRO (Fundação Estadual de Pesquisa Agropecuária).
O experimento foi realizado em vasos de plástico com capacidade de 500g de
substrato, contendo uma mistura composta de vermiculita e areia na proporção 2:1,
a qual foi acondicionada em sacos plásticos de polipropileno e esterilizada por uma
hora em autoclave a 120°C por três dias consecutivos. Em cada vaso foram
semeados quatro plantas de Lupinus albescens previamente escarificadas e
desinfestadas em solução de hipoclorito 5 % (v/v) por 5 minutos. O inóculo consistiu
de caldo LM (Vicent, 1970), onde foram inoculados os isolados e incubado a 28°C
por seis dias sob agitação de 120 rpm. O numero de células foi determinado em
Câmara de Neubauer e expressos em células mL
-1
.
A cada sete dias era adicionado 10 mL de solução nutritiva livre de nitrogênio
(SOMASEGARAN & HOBEN, 1985). Os tratamentos consistiram do isolado UFSM
L1.3, SEMIA 938, um tratamento sem adição de nitrogênio e outro com a adição de
400 mg de N, aplicados 50 mg na semeadura e por mais sete vezes via solução
nutritiva. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com quatro
repetições. O experimento foi conduzido por 45 dias, na casa de vegetação do
Departamento de Solos da Universidade Federal de Santa Maria.
Na colheita, a parte aérea da planta foi separada do sistema radicular, sendo
acondicionados em sacos de papel e secados em estufa a 65°C com ventilação
forçada durante três dias. As avaliações realizadas foram: a produção de matéria
seca da parte aérea, o acúmulo de nitrogênio na parte aérea, segundo metodologia
descrita em Tedesco et al. (1995) número de nódulos e massa seca das raízes. Os
dados foram submetidos ao teste de Scott-Knott, a 5% de probabilidade de erro,
realizados pelo programa Sisvar 4.6 (FERREIRA, 2000).
49
A eficiência simbiôntica (Efra) foi determinada segundo a equação (1)
proposta por Brockwell et al. (1966), apud Sá (2001):
Efra% =
N total fixado – N total S/N x 100 (1)
N total C/N – N total S/N
Onde:
N total fixado: nitrogênio total do tratamento;
N total S/N: nitrogênio total da testemunha sem nitrogênio;
N total C/N: nitrogênio total da testemunha com nitrogênio.
50
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Isolamento e caracterização
O isolamento proporcionou a obtenção de 204 isolados puros. Nas áreas
“Ponte de Pedra” e Fazenda Santa Zélia foram isolados os maiores números de
bactérias a partir de nódulos de Lupinus albescens (76 e 50 isolados,
respectivamente). Na área de arenização foram obtidos 39 isolados bacterianos a
partir de nódulos de Lupinus albescens. Estes resultados demonstram que os
maiores números de isolados foram encontrados nas áreas de ocorrência natural de
L. albescens, em comparação a área em processo de arenização, onde foi
introduzida esta espécie de tremoço. Na voçoroca, a partir de duas plantas de
Lupinus lanatus obtiveram-se seis isolados e 32 isolados de Lupinus sp. (Tabela 5).
Tabela 5 – Relação do número de isolados nos quatro locais e nas três
espécies de Lupinus estudadas. Santa Maria, 2007.
Local de Coleta Numero de Plantas Espécie
Número de
isolados
“Ponte de Pedra”
10
Lupinus albescens
76
Fazenda Santo Antão
10
Lupinus albescens
39
Fazenda Santa Zélia
10
Lupinus albescens
50
Voçoroca
10 Lupinus sp. 32
Voçoroca
2
Lupinus lanatus
6
Total 204
51
A caracterização fenotípica dos isolados bacterianos possibilitou a formação
de dois grupos com características culturais distintas (I e II). O grupo I se diferenciou
por apresentar o maior número de isolados bacterianos, com 81,5% do total de
organismos caracterizados e o grupo II com 18,5% (Figura 7), sendo que todas as
estirpes apresentaram reação de Gram negativa. O grupo rizóbio é encontrado nas
α-Proteobactérias, tendo estes microrganismos reação de Gram negativa
(MOREIRA & SIQUEIRA, 2006).
Similaridade (%)
UFSM L4.1
UFSM L4.3
SEMIA 938
UFSM L3.6
UFSM L3.5
UFSM L3.3
UFSM L1.4
UFSM L1.3
UFSM L2.11
UFSM L2.10
UFSM L2.1
UFSM L3.7
UFSM L3.2
UFSM L3.4
UFSM L1.14
UFSM L1.13
UFSM L3.1
UFSM L2.12
UFSM L4.4
UFSM L4.2
UFSM L3.8
UFSM L2.9
UFSM L2.8
UFSM L2.7
UFSM L2.6
UFSM L2.5
UFSM L2.4
UFSM L2.3
UFSM L2.2
UFSM L1.12
UFSM L1.11
UFSM L1.10
UFSM L1.9
UFSM L1.8
UFSM L1.7
UFSM L1.6
UFSM L1.5
UFSM L1.2
UFSM L1.1
100 80 60 40 20 0
II = 54%
I = 20%
A
B
C
E
D
F
G
H
I
J
L
Figura 7 – Dendograma de similaridade baseado nas características culturais
de 38 isolados de Lupinus (UFSM L1.1, UFSM L1.2, UFSM L1.3, UFSM L1.4,
UFSM L1.5, UFSM L1.6, UFSM L1.7, UFSM L1.8, UFSM L 1.9, UFSM L1.10,
UFSM L1.11, UFSM L1.12, UFSM L1.13, UFSM L1.14, UFSM L2.1, UFSM L2.2,
UFSM L2.3, UFSM L2.4, UFSM L2.5, UFSM L2.6, UFSM L2.7, UFSM L2.8, UFSM
L2.9, UFSM L2.10, UFSM L2.11, UFSM L2.12, UFSM L3.1, UFSM L3.2, UFSM
L3.3, UFSM L3.4, UFSM L3.5, UFSM L3.6, UFSM L3.8, UFSM L4.1, UFSM L4.2,
UFSM L4.3, UFSM L4.4) e estirpe recomendada para Lupinus (SEMIA 938).
Santa Maria, 2007.
52
Dos 38 isolados bacterianos avaliados, 28 apresentaram uma similaridade de
aproximadamente 50%, os quais obtiveram crescimento rápido e intermediário
(Grupos A, B, C, D e E) e reação ácida, com exceção do grupo C que teve reação
neutra em meio de cultura (Tabela 5). Também dentro destes isolados bacterianos,
o grupo E apresentou coloração de colônia branca, diferindo-se dos demais grupos
que mostraram coloração incolor. Estes grupos variaram na intensidade de produção
de goma, de baixa para o Grupo E, média para os grupos B, C e D e alta para o
Grupo A (Tabela 6).
A alta produção de goma, pela maioria dos isolados de crescimento rápido,
pode ter influenciado a variação no diâmetro de colônias encontradas no grupo A,
possivelmente devido à alta concentração de nutrientes e de fontes de carbono do
meio LMA. Por serem produtos extracelulares, os exopolissacarídeos se acumulam
na superfície das células (CORONADO et al., 1996) e podem estar associados ao
acúmulo de nutrientes, adesão superficial e proteção a estresses ambientais. O
baixo pH e presença de alumínio são fatores de estresse ambiental evidenciado nas
áreas em processo de arenização (ROVEDDER, 2003), o que torna a produção de
exopolissacarídeos uma característica importante na seleção de bactérias fixadoras
de nitrogênio em áreas arenizadas.
Com aproximadamente 55% de similaridade, sete isolados apresentaram
crescimento lento (grupos H, I, L) e intermediário (grupo J), variando o diâmetro das
colônias de 1 a 2 mm. Os grupos H e I apresentaram reação básica em meio de
cultura, baixa produção de goma, variando na coloração da colônia, creme para o
grupo H e branca para o grupo I. A estirpe SEMIA 938 apresentou 100% de
similaridade com os isolados do grupo I e 74% com o isolado do grupo H (Figura 7 e
Tabela 6).
Oito isolados bacterianos apresentaram crescimento lento e reação básica em
meio de cultura. Estas características são comuns em isolados de Lupinus
(BARRERA et al., 1997), entretanto, Miller & Pepper (1988) relatam o isolamento de
bactérias de crescimento rápido em tremoço.
53
Tabela 6 – Características culturais fenotípicas dos isolados bacterianos
pertencentes aos grupos formados a partir de cinco características básicas.
Santa Maria, 2007.
Características
Grupo
1 2 3 4 5
Número de
Isolados
A 3 3-5 Ácida Alta Incolor
21
B 4 3 Ácida Média
Incolor 2
C 3 2 Neutra Média
Incolor 2
D 3 2 Ácida Média
Incolor 1
E 3 2 Ácida Baixa Branca
2
F 1 1 Ácida Média Branca
1
G 3 1 Ácida Sem goma Amarela
2
H 6 1 Básica Baixa Creme
1
I 6 1 Básica Baixa
Branca 5
J 5 1 Neutra Baixa
Incolor 1
L 6 2 Neutra Média Branca
1
1: Tempo, em dias, para a visualização das colônias; 2: Diâmetro da colônia; 3: Alteração do pH do
meio; 4: Produção de goma; 5: Coloração das colônias.
Os grupos F e G demonstraram ter características únicas, sendo F de
crescimento muito rápido, com diâmetro de 1 mm, reação ácida em meio de cultura
e coloração branca. Rovedder et al. (2005) relatam o isolamento de três isolados
bacterianos com crescimento muito rápido e características culturais semelhantes a
este grupo. Os dois isolados do grupo G tiveram as características mais divergentes,
por apresentar colônias sem goma e amarelas, com diâmetro de 1 mm e
apresentando tempo de crescimento rápido, diferenciando dos outros de
crescimento rápido e lento.
54
4.2 Autenticação dos isolados bacterianos nativos
A capacidade de formação de nódulos e produção de leghemoglobina é pré-
requisito para definir o grupo rizóbio. Desta maneira, em trabalhos de rizobiologia,
este conhecimento é importante para reduzir o número de organismos a serem
estudados e selecionar estirpes mais eficientes.
Dos trinta e oito isolados bacterianos submetidos à caracterização cultural,
foram testadas a capacidade de formação de nódulos e produção de
leghemoglobina. Trinta e sete isolados bacterianos não apresentaram formação de
nódulos e somente com o isolado UFSM L1.3 foram observados nódulos vermelhos,
tendo formado 5 nódulos grandes próximos ao colo das raízes, com tamanho
variado entre 3 a 4 mm (Figura 6). A coloração vermelha no interior do nódulo
formado por UFSM L1.3, em L. albescens, indica a produção de leghemoglobina
(Figura 8). Esta substância é responsável pelo transporte de oxigênio no interior do
nódulo, impedindo a inativação da nitrogenase (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006). As
estirpes SEMIA 938 e SEMIA 928 não foram simbiontes a L. albescens,
demonstrando a necessidade de se isolar estirpes de rizóbios nativos que sejam
eficientes para esta espécie vegetal.
Relatos encontrados na literatura correlacionam o tamanho do nódulo com a
sua eficiência na fixação biológica de nitrogênio. Anyango et al. (1995), avaliaram a
capacidade de formação de nódulos de isolados obtidos a partir de feijoeiro no
Quênia. Estes autores constataram que os nódulos ineficientes eram brancos,
pequenos, com aproximadamente 1mm de diâmetro e em grande quantidade,
enquanto que os isolados eficientes eram os que formavam nódulos vermelhos,
maiores, em torno de 3 mm e em menor número.
Em trabalho com a variedade de feijoeiro “Limburgse vroege”, em solos
tropicais brasileiros, os nódulos grandes, esféricos e pigmentados apresentaram
maior capacidade de fixação biológica de nitrogênio em comparação com nódulos
brancos que variaram em tamanho e forma (Michiels et al. 1998).
Os isolados UFSM L3.3, UFSM L3.5 e UFSM L3.6 foram obtidos a partir de
Lupinus sp. e sua inoculação em Lupinus albescens não proporcionou a formação
55
de nódulos. Este resultado pode indicar uma especificidade entre os isolados
bacterianos e Lupinus sp. No entanto testes de inoculação são necessários para
confirmar a simbiose entre os isolados UFSM L3.3, UFSM L3.5 e UFSM L3.6 e esta
espécie de tremoço.
Os demais isolados que não foram simbiontes a L. albescens devem ser
inodulados em outras espécies de leguminosas e estudos taxonômicos mais
aprofundados.
a)
b)
Figura 8 – Nódulo em Lupinus albescens (isolado UFSM L1.3) aos 60 dias. a)
Nodulação positiva; b) Produção de leghemoglobina.
4.3 Caracterização do gênero de uma estirpe de rizóbio isolada de Lupinus
albescens
A caracterização cultural apresenta informações relevantes para a alocação
de uma estirpe em determinado gênero de rizóbio (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006).
Para uma aproximação do gênero, as características culturais do isolado UFSM L1.3
e SEMIA 938 foram comparadas com 21 estirpes tipo de rizóbio através de análise
de similaridade (Figura 9).
O isolado de rizóbio UFSM L1.3 apresentou aproximadamente 95% de
similaridade com o grupo formado por estirpes de Bradyrhizobium (Bradyrhizobium
japonicum ATCC10324, Bradyrhizobium liaoningense 2281, Bradyrhizobium
56
yuanmingense CCBAU 10071 e Bradyrhizobium sp. 938), tendo a coloração de
colônia creme como sendo a característica que divergiu deste grupo (Tabela 7). As
duas estirpes tipo de Azorhizobium (Azorhizobium caulinodans ORS 571 e
Azorhizobium dobereinerae UFLA 1-100) apresentaram 78% de similaridade com o
grupo formado por Bradyrhizobium e UFSM L1.3, tendo como diferença o tempo de
crescimento rápido a intermediário (3 a 4 dias). As estirpes de Rhizobium e
Sinorhizobium apresentaram agrupamento distintos com o grupo Bradyrhizobium e
UFSM L1.3, tendo muito baixa similaridade.
O comportamento das estirpes de Mesorhizobium foi intermediária aos grupos
de estirpes tipo Bradyrhizobium (considerando UFSM L1.3) e Rhizobium, onde
Mesorhizobium amorphae ACCC 19665,
Mesorhizobium septentrionale SDW 014,
Mesorhizobium loti NZP 2213 e Mesorhizobium chacoense CECT 5336 foram mais
similares aos grupos de Bradyrhizobium e Azorhizobium, e Mesorhizobium
plurifarum ORS 1032 apresentou maior similaridade com Rhizobium e Sinorhizobium
(Figura 8). O gênero Mesorhizobium foi proposto para agrupar bactérias que
apresentavam características que eram comuns aos gêneros Rhizobium e
Bradyrhizobium (YOUNG, 1996).
Todas as estirpes tipo do gênero Rhizobium apresentaram 95% de
similaridade com Sinorhizobium, com exceção de
Rhizobium undicula ORS 992. A
distinção destes dois gêneros só é possível com testes de taxonomia polifásica,
como os realizados por Chen et al. (1988) e por de Lajudie et al. (1994).
A coloração creme apresentada pelo isolado de rizóbio UFSM L1.3 não é
característico do gênero Bradyrhizobium. Segundo o Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology, o gênero Bradyrhizobium apresenta colônias opacas,
eventualmente translúcidas ou brancas (HOLT et al., 1994). No entanto, esta
coloração já foi descrita para estirpes de Bradyrhizobium isoladas de Sitrato na
Amazônia e de Acácia no Kenia (LIMA et al., 2005; ODEE et al., 1997).
O gênero Bradyrhizobium vem sendo relatado como sendo simbionte a
Lupinus. Barrera et al. (1997), estudando a diversidade de 41 bactérias que nodulam
quatro espécies de Lupinus, encontraram alta relação filogenética com
Bradyrhizobium elkanii. Vielma et al. (1999) caracterizaram fenotipicamente e a
capacidade de nodulação e determinaram a produção de matéria seca de 5 estirpes
nativas de Bradyrhizobium sp. (Lupinus), isoladas de L. mutabilis e L. meridanus.
57
Bottomley et al. (1994) estudaram a composição da população de rizóbio em
pastagens nos Estados Unidos, avaliaram duas espécies de Lupinus. Estes autores
encontraram três grupos que apresentaram relação filogenética com B. japonicum e
B. elkanii. Desta maneira, a estirpe de rizóbio UFSM L1.3 pode ser alocada em
Bradyrhizobium, por apresentar características culturais semelhantes a este gênero.
CCBAU71623
USDA 1844
R602sp
H152
CCBAU7190B
100 80 60 40 20 0
I66
CCBAU71042
HAMBI 1552
Lc57
ORS 1032
ORS 992
CECT 5336
NZP2213
SDW014
ACCC 19665
ORS 571
UFLA 1-100
2281
ATCC10324
Semia 938
UFSM L1.3
CCBAU 10071
SO2
Similaridade (%)
Figura 9 – Dendograma de similaridade baseado em características culturais
entre um isolado de Lupinus albescens (UFSM L1.3), uma estirpe
recomendada para Lupinus (SEMIA 938) e 21 estirpes-tipo de rizóbio (Tabela
4).
58
Tabela 7 – Características culturais de um isolado de Lupinus albescens e de
22 estirpes de rizóbio, Santa Maria, 2007.
Características Culturais
Espécie
1 2 3 4 5
UFSM L1.3 6 Básico 1 Creme Baixa
Bradyrhizobium sp. (SEMIA 938) 6 Básico 1 Branca Baixa
Azorhizobium caulinodans
3 a 4 Básico 0,5 Creme Baixa
Azorhizobium dobereinerae
3 a 4 Básico 1 Incolor Baixa
Bradyrhizobium japonicum
7 Básico < 1,0 Branca Baixa/Seca
Bradyrhizobium liaoningense
7 a 10 Básico < 1,0 Branca Baixa
Bradyrhizobium yuanmingense
7 Básico < 1,0 Branca Baixa
Mesorhizobium amorphae
7 Ácido 1 Incolor Média
Mesorhizobium chacoense
7 Ácido 1 a 3 Branca Média
Mesorhizobium loti
3 a 5 Ácido 2 a 4 Branca Média
Mesorhizobium plurifarum
2 a 3 Ácido 0,5 a 2 Branca Média
Mesorhizobium septentrionale
7 a 10 Ácido 1 Incolor Média
Rhizobium huautlense
2 a 4 Ácido 3 Creme Alta
Rhizobium gallicum
2 a 3 Ácido 3 Branca Alta
Rhizobium giardinii
2 a 3 Ácido 3 Branca Alta
Rhizobium hainanese
3 Ácido 2,5 Creme Alta
Rhizobium lossense
3 Ácido 2,5 Creme Alta
Rhizobium mongolense
3 Ácido 2,5 Branca Alta
Rhizobium undicula
1 a 2 Ácido 0,5 - 3 Creme Alta
Rhizobium yanglingense
3 Ácido 2,5 Branca Alta
Sinorhizobium arboris
2 a 4 Ácido 3 Creme Alta
Sinorhizobium kostiense
2 a 4 Ácido 3 Creme Alta
Sinorhizobium kummerowiae
2 Ácido 2,5 Creme Alta
Sinorhizobium morelense
3 Ácido 2 Creme Alta
1: Tempo, em dias, para a visualização das colônias; 2: Alteração do pH do meio; 3: Diâmetro da
colônia (mm); 4: Coloração das colônias; 5: Produção de goma. ORS 571: Azorhizobium caulinodans
(DREYFUS et al.; 1988); UFLA 1-100: Azorhizobium dobereinerae (MOREIRA et al.; 2006);
ATCC10324: Bradyrhizobium japonicum (JORDAN et al.; 1984); 2281: Bradyrhizobium liaoningense (
XU et al.; 1995); CCBAU 10071: Bradyrhizobium yuanmingense (YAO et al.; 2002); ACCC 19665:
Mesorhizobium amorphae (WANG et al.; 1999); CECT 5336: Mesorhizobium chacoense
(VELAZQUEZ et al.; 2001); NZP2213: Mesorhizobium loti (JARVIS et al.; 1997); ORS 1032:
Mesorhizobium plurifarum (de LAJUDIE et al.; 1998b); SDW014: Mesorhizobium septentrionale
(GAO et al.; 2004); R602sp: Rhizobium gallicum (ARMAGER et al.; 1997); H152: Rhizobium giardinii
(ARMAGER et al.; 1997); I66: Rhizobium hainanese (CHEN et al.; 1997); CCBAU7190B: Rhizobium
lossense (WEI et al.; 2003); CCBAU71623: Rhizobium yanglingense (TAN et al.; 2001); SO2:
Rhizoibum huautlense (WANG et al.; 1998); USDA 1844: Rhizoibum mongolense (van BERKUN et
al.; 1998); ORS 992: Rhizobium undicula (de LAJUDIE et al.; 1998);HAMBI 1552: Sinorhizobium
arboris (NICK et al.; 1999); CCBAU71042: Sinorhizobium kummerowiae (WEI et al.; 2002); LC57:
Sinorhizobium morelense (WANG et al.; 2002).
59
4.4 Caracterização fisiológica
A capacidade de crescer em diferentes pH, concentrações de NaCl e
temperatura permitiu a diferenciação das estirpe de rizóbio UFSM L1.3 e SEMIA 938
(Tabela 8).
As duas estirpes avaliadas apresentaram crescimento em meio líquido entre
os pH 4,0 a 8,0, no entanto, uma menor turbidez no meio de cultura foi observado
para UFSM L1.3 quando inoculado em meio mais ácido (pH 4,0) e mais alcalino (pH
8,0), não ocorrendo crescimento em pH 9,0 e 10,0. Segundo Moreira et al. (1994),
estirpes isoladas de solos ácidos mostram-se mais adaptadas a condições de pH
mais baixo em meio de cultura do que isolados de solos mais básicos. No entanto,
alguns autores vêm relatando que a concentração de Alumínio nos solos pode ser
um fator mais significante na sobrevivência dos rizóbios em solos ácidos (HARA &
OLIVEIRA, 2004). Os solos em processo de arenização apresentam pH próximo a
5,0 tendo teores de alumínio de até 0,5 cmol
c
L
-1
e
com uma saturação por Al de
70% (ROVEDDER, 2003). Desta maneira, é indicado que as estirpes de rizóbio
selecionadas sejam adaptadas a esta condição de meio.
As duas estirpes diferiram na capacidade de crescer em diferentes
concentrações de NaCl, onde UFSM L1.3 apresentou resultado positivo somente na
concentração de 0,1%. A capacidade de crescer em concentrações mais altas de
NaCl é observada geralmente para estirpes de crescimento rápido, devido a maior
produção de polissacarídeos extracelulares que envolvem as células bacterianas,
diminuindo o contato com o meio e proporcionando maior resistência da célula ao
efeito osmótico (El SHEIKH, 1988; ODEE et al, 1997). O efeito de salinidade não é
relatado nos núcleos de arenização, sendo esta provavelmente uma característica
não limitante para o uso de UFSM L1.3 na inoculação de L. albescens.
60
Tabela 8 – Crescimento de duas estirpes de rizóbio em diferentes pH,
concentrações de NaCl e temperatura em meio líquido LMA. Santa Maria,
2007.
Característica Fisiológica UFSM L1.3 SEMIA 938
pH
4 +/- +
5 + +
6 + +
7 + +
8 +/- +/-
9 - -
10 - -
NaCl (%)
0,1 + +
0,5 - +
1,0 - -
5,0 - -
10,00 - -
Temperatura (C°)
28 + +
32 + +
37 - -
40 - -
+: crescimento positivo; -: crescimento negativo; +/-: pouca turbidez
Rovedder (2003), avaliou a temperatura do solo em diferentes profundidades
em áreas com ocorrência de areal, registrando temperaturas de 22°C de 0 a 3 cm de
profundidade no mês de maio de 2002. A temperatura pode afetar estádios
importantes da infecção, formação e função dos nódulos, no entanto, estes efeitos
podem variar de acordo com a espécie hospedeira e microsimbionte (MOREIRA &
SIQUEIRA, 2006). Desta maneira, a estirpe de rizóbio UFSM L1.3, que apresentou
crescimento entre 28 e 32°C, pode ser inoculada em sementes de Lupinus
albescens. Para um melhor entendimento deste mecanismo nesta espécie vegetal,
são necessários mais estudos relacionados com a estirpe isolada e as condições de
campo.
61
4.5 Caracterização molecular
Diversos estudos de determinação das relações genéticas entre estirpes de
rizóbio têm empregado a amplificação do DNA pela técnica de PCR com
oligonucleotídeos específicos, como as seqüências REP, ERIC e BOX, que
codificam as regiões altamente conservadas, normalmente no espaço intergênico
(LAGUERRE et al., 1997; HUNGRIA et al., 2000; SANTOS et al., 1999; MostaSso et
al., 2002). A principal vantagem no uso destes oligonucleotídeos específicos, é de
que em uma única reação, pode se obter um número elevado de bandas, permitindo
a detecção de polimorfismo para a caracterização molecular dos isolados (CHUEIRE
et al., 2000b).
Pela análise de BOX-PCR, constatou-se que os isolados apresentaram perfis
únicos de bandas, ocorrendo a maior semelhança para as estirpes SEMIA 938 e 928
recomendadas para o cultivo de tremoço (Figura 10 e 11). As estirpes
recomendadas para o cultivo de tremoço, pelo baixo grau de polimorfismo
constatado, podem representar a mesma estirpe, conforme relatado quanto a
estirpes de soja pertencentes a sorogrupos norte-americanos (JUDD et al., 1993), a
estirpes de rizóbios isoladas do cerrado brasileiro (HUNGRIA et al., 1998; SANTOS
et al., 1999) e estirpes de rizóbio nativo dos tabuleiros costeiros de Sergipe
(FERNANDES et al., 2003).
O BOX-PCR realizado com os seis isolados bacterianos de Lupinus spp.,
permitiu uma diferenciação no padrão do polimorfismo gerado em gel de agarose
(Figura 10). A região do espaço intergênico do isolado bacteriano UFSM L1.3
apresenta três bandas distintas com tamanho aproximado de 3000, 1455 e 600
pares de bases. Este padrão não foi verificado em nenhum dos outros isolados
bacterianos estudados. O isolado bacteriano UFSM 1p apresenta duas bandas
características com 3000 e 600 pares de base (Figura 10), e UFSM 2p gerou várias
bandas com tamanhos variando de 4200 a 564 pares de base. A estirpe de
Rhizobium sp apresenta um padrão de quatro bandas bem características com o
tamanho aproximado de 4200, 1900, 1455 e 1264 pares de base. O polimorfismo
62
gerado pela técnica de BOX-PCR permite a caracterização molecular entre os
isolados.
M 7 6 5 2 4 1 3 M
p
b
24756
4973
2027
947
831
564
Figura 10 – Padrão de polimorfismo gerado por BOX-PCR. 1. Bradyrhizobium
sp. (SEMIA 938). 2. Bradyrhizobium sp. (SEMIA 928). 3. UFSM L1. 3. 4. 1p. 5.
2p. 6. Rhizobium sp. 7. Sem DNA. M. Marcador: DNA de Lambda clivado com
EcoRI + HindIII.
Por meio da análise que utilizou o agrupamento de UPGMA, dois grandes
grupos foram formados com baixa similaridade genética, mas não houve relação
entre os agrupamentos obtidos e as espécies de Bradyrhizobium e Rhizobium
(Figura 11). Os resultados deste estudo demonstram que a análise de BOX-PCR foi
eficiente para discriminá-las, embora nem sempre sejam adequadas nas avaliações
filogenéticas (LAGUERRE et al., 1997; BANGEL, 2000; FERNANDES et al., 2003;
CHUEIRE et al., 2000b).
Para uma melhor caracterização e identificação do isolado UFSM L1.3, está
sendo realizada a etapa de seqüenciamento da região 16S do DNA ribossômico.
63
11
Distancia genética
Semia 938
Semia 928
I = 15%
Rhizobium sp.
2p
Distância Genética
Figura 11 – Dendograma genético de três isolados de Lupinus albescens
comparados a duas estirpes de Bradyrhizobium sp recomendadas para
tremoço e uma estirpe de Rhizobium sp., após análise de agrupamento dos
fragmentos obtidos pela amplificação do DNA por PCR com o
oligonucleotídeo específico BOX-A1R. Análise realizada com o algoritmo
UPGMA e o coeficiente de Pearson. Santa Maria, 2007.
4.6 Avaliação da eficiência simbiótica relativa
O estudo da eficiência na fixação biológica de nitrogênio vem sendo realizado
em diversos trabalhos, para selecionar estirpes potenciais para o desenvolvimento
de inoculantes (CARVALHO et al., 2005; ZILLI et al., 2006; MELLONI et al., 2006). A
relação das médias obtidas de massa seca da parte aérea, nitrogênio na parte
1p
UFSM L1.3
100 80 60 40 20 0
II = 54%
UFSM
UFSM
64
aérea, eficiência simbiótica, massa seca das raízes e número de nódulos permitiu
caracterizar as estirpes bacterianas UFSM L1.3 e SEMIA 938 (Tabela 9 e Figura 11)
A massa seca da parte aérea foi maior para o isolado UFSM L1.3, não
diferindo estatisticamente do tratamento nitrogenado, apresentando
aproximadamente 40% a mais de massa seca em comparação com SEMIA 938
(Tabela 9). A estirpe recomendada para Lupinus (SEMIA 938) não diferiu do
tratamento sem nitrogênio (Tabela 8).
A avaliação do teor de nitrogênio total na parte aérea de L. albescens
demonstrou que o isolado UFSM L1.3 foi semelhante ao tratamento com nitrogênio,
tendo uma concentração de 3,19 %, apresentando uma eficiência simbiótica relativa
de 94,2%. No entanto, SEMIA 938 apresentou médias semelhantes ao tratamento
sem nitrogênio, com uma concentração de 2,42%, representando que esta estirpe
não é capaz de fixar nitrogênio quando em simbiose com Lupinus albescens (Figura
11). Concentrações de nitrogênio superiores a 3,0% na parte aérea vem sendo
relatada para estirpes eficientes de Bradyrhizobium. Segundo Lima et al. (2005),
isolados de Bradyrhizobium de diferentes solos da Amazônia que apresentaram uma
eficiência simbiótica próxima a 100%, obtiveram uma concentração de nitrogênio
superior a 3,0%.
A estirpe isolada de L. albescens apresentou a maior produção de matéria
seca nas raízes, sendo que SEMIA 938 foi semelhante ao tratamento sem adição de
nitrogênio. Este resultado pode ser explicado pela formação dos nódulos, somente
encontrados em UFSM L1.3 e o maior desenvolvimento das raízes de L. albescens
(Tabela 9).
Segundo Rovedder et al. (2005), a espécie de tremoço evoluiu paralelamente
aos processos pedogenéticos e climáticos que formaram a paisagem atual da
Campanha Gaúcha. As etapas para formação dos nódulos dependem e variam em
função dos genótipos da planta e das estirpes envolvidas, assim como fatores
ambientais (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006). Desta maneira, as condições
edafoclimáticas encontradas na Campanha Gaúcha, poderiam ter contribuído para a
seleção de estirpes de rizóbio simbiontes a espécie L. albescens. A não formação de
nódulos e consequentemente a baixa eficiência na fixação biológica de nitrogênio de
SEMIA 938 em L. albescens pode estar relacionada a sua origem, sendo que esta
estirpe foi isolada de L. albus nos Estados Unidos (MENNA et al., 2006).
65
Tabela 9 – Massa seca da parte aérea (MSPA), nitrogênio na parte aérea (NPA),
eficiência simbiôntica (Efra), massa seca das raízes (MSR) e número de
nódulos (NN) do isolado UFSM L1.3 e da estirpe SEMIA 938. Santa Maria, 2007.
Tratamento
MSPA
-- mg planta
-1
--
NPA
-- % --
MSR
-- mg planta
-1
--
NN
UFSM L1.3 135 a
1
b 3,19 ab 70 abc 4
SEMIA 938 80 b1 2,42 b 33 c 0
C/N 118 ab1 3,24 ab 44 bc 0
S/N 95 b1 2,38 b 37 c 0
C.V. (%) 12,45aaaaa 11,19aaa 0 8,71 alaaa
1 Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre pelo teste de Scott-Knott a 5% de
probabilidade de erro. C/N – com nitrogênio. S/N – sem nitrogênio.
0
20
40
60
80
100
UFSM L1.3 SEMIA 938
Eficiência Simbiótica (%)
4,6%
94,2%
Figura 12 – Eficiência simbiótica relativa de isolado de rizóbio de Lupinus
albescens (UFSM L1.3) e de estirpe comercial recomendada para Lupinus
(SEMIA 938). Santa Maria, 2007.
66
5 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos nesse trabalho permitem concluir que:
a) Onze grupos com características fenotípicas semelhantes foram
encontrados de 38 isolados bacterianos da região sudoeste do Estado
do Rio Grande do Sul.
b) O isolado UFSM L1.3 produziu nódulos e leghemoglobina em Lupinus
albescens, apresentou a capacidade de crescer em temperatura de 28 e
32°C, na concentração de NaCl de 0,1% e na faixa de pH 4,0 a 8,0.
c) O padrão de polimorfismo gerado pelo oligonucleotídeo BOX-PCR
permitiu diferenciar o isolado UFSM L1.3 dos demais estudados.
d) Lupinus albescens não formou associação simbiótica com a estirpe
comercial SEMIA 938.
e) A estirpe UFSM L1.3 apresentou uma eficiência simbiótica relativa de
94,2% na fixação biológica de nitrogênio.
67
6 SUGESTÕES PARA O DESENVOLVIMENTO DE NOVAS
PESQUISAS
Os resultados alcançados nesta pesquisa, em conformidade com o estado
atual do conhecimento, permitem fazer as seguintes sugestões à continuidade do
trabalho:
a) Identificar os isolados de três espécies de Lupinus ainda não
caracterizados a fim de selecionar estirpes promissoras para produção de
inoculante a nível comercial.
b) Seqüenciar a região 16S do RNAr do isolado de rizóbio UFSM L1.3 para
estudos de filogenia.
c) Seqüenciar as regiões nif e nod do isolado UFSM L1.3 para possibilidade
de entendimento das relações entre bactéria e planta.
d) Obter maior número de isolamentos a fim de aumentar o banco de rizóbio
associado a Lupinus albescens, Lupinus lanatus e Lupinus sp.
e) Caracterizar a variabilidade ecológica de rizóbio encontrados em solo e
plantas de Lupinus albescens, Lupinus lanatus e Lupinus sp. em áreas
degradadas da região sudoeste do Estado do Rio Grande do Sul.
68
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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and Evolutionary Bacteriology, v. 53, n. 5, p. 1575-1583, 2003.
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YOUNG, J. M. et al. A revision of Rhizobium Frank 1889, with an emended
description of the genus, and the inclusion of all species of Agrobacterium Conn
1942 and Allorhizobium undicola de Lajudie et al. 1998 as new combinations:
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81
Journal of Systematic and Evolutionary Bacteriology, v. 51, n. 1, p. 89-103,
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YOUNG, J. M. The genus name Ensifer Casida 1982 takes priority over
Sinorhizobium Chen et al. 1988, and Sinorhizobium morelense Wang et al. 2002 is a
later synonym of Ensifer adhaerens Casida 1982. Is the combination 'Sinorhizobium
adhaerens' (Casida 1982) Willems et al. 2003 legitimate? Request for an Opinion.
International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology, v 53, n. 6, 2107-
2110, 2003.
YOUNG, J.P.W.; HAUKKA, K.E. Diversity and phylogeny of rhizobia. New
Phytologist, v. 133, n. 1, p. 87-94, 1996.
ZAKHIA, F.; LAJUDIE, P. Taxonomy of Rhizobia. Agronomie, v. 21. n. 6, p. 569-
576. 2001.
ZILLI, J. E. et al. Eficiência simbiótica de estirpes de Bradyrhizobium isoladas de
solo do Cerrado em caupi. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 41, n. 5, p. 811-
818, 2006
82
ANEXOS
ANEXO A – Meios de cultura e soluções utilizados para o estudo da população
bacteriana oriunda de Lupinus albescens.
Meio de cultura LMA (Vincent, 1970)
Manitol 10,0gA
K
2
HPO
4
0,5g0
MgSO
4
.7H
2
O 0,2g0
NaCl 0,1g0
Extrato de Levedura 0,5g0
Agar 16,00 g
Água destilada 1000 mL
Ajuste do pH para 6,8
Meio de cultura LM (Vincent, 1970)
Manitol 10,0gA
K
2
HPO
4
0,5g0
MgSO
4
.7H
2
O 0,2g0
NaCl 0,1g0
Extrato de Levedura 0,5g0
Água destilada 1000 mL
Ajuste do pH para 6,8
Azul de Bromotimol (Hungria, 1994)
Solução estoque 0,5g L
-1
Água destilada 1000 mL
Vermelho Congo (Hungria, 1994)
Solução estoque 2,5 g L
-1
Água destilada 1000 mL
83
Solução Nutritiva (Somasegaran & Hoben, 1985)
CaCl
2
.H
2
O 294,1 g L
-1
KH
2
PO
4
136,1 g L
-1
FeEDTA 4,5 g L
-1
Citrato-Fe 6,70 g L
-1
MgSO
4
.7H
2
O 123,3 g L
-1
K
2
SO
4
87,0 g L
-1
MnSO
4
.H
2
O 338 mg L
-1
H
3
BO
3
247 mg L
-1
ZnSO
4
.7H
2
O 288 mg L
-1
CuSO
4
.7H
2
O 100 mg L
-1
CoSO
4
.7H
2
O 056 mg L
-1
NaMoO
2
.2H
2
O 048 mg L
-1
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