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Universidade de São Paulo
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Departamento de Química
Programa de Pós-Graduação em Química
“Ação de corantes fotossensíveis em meio homogêneo
e micro heterogêneo de lipossomos no controle do
crescimento de Streptococcus mutans”
Tony de Paiva Paulino
Tese apresentada à Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo,
como parte das exigências para a
obtenção do título de Doutor em
Ciências. Área: Química.
Ribeirão Preto - SP
2006
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Universidade de São Paulo
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Departamento de Química
Programa de Pós-Graduação em Química
“Ação de corantes fotossensíveis em meio homogêneo
e micro heterogêneo de lipossomos no controle do
crescimento de Streptococcus mutans”
Tony de Paiva Paulino
Orientador: Prof. Dr. Pietro Ciancaglini
Co-orientador: Prof. Dr. Antônio Cláudio Tedesco
Tese apresentada à Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo,
como parte das exigências para a
obtenção do título de Doutor em
Ciências. Área: Química.
Ribeirão Preto - SP
2006
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FICHA CATALOGRÁFICA
Paulino, Tony de Paiva
“Ação de corantes fotossensíveis em meio homogêneo e
micro heterogêneo de lipossomos no controle do crescimento de
Streptococcus mutans”. Ribeirão Preto, 2006.
p. 115p: il; 30cm
Tese apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de
Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo, Área de
Concentração: Química
Orientador: Ciancaglini, Pietro
1- Stre
p
tococcus mutans 2- Tera
p
ia fotodinâmica 3 Li
p
ossomos
DEDICATÓRIA
A meus pais ANÍSIO e PERPÉTUA, que nunca mediram esforços para
que meu objetivo fosse alcançado, investindo em mim apoio, carinho,
atenção e AMOR INCONDICIONAL.
À minha irmã MARCELA pelo incentivo, carinho e compreensão.
À FERNANDA pelo carinho e presença em momentos difíceis, pelo
apoio e auxílio constante.
Às vovós GERALDAS que sempre estiveram junto a mim, amparando e
guiando meus passos.
DEDICO
AGRADECIMENTOS
Obrigado Pietro,
Pietro Ciancaglini, meu amigo e orientador, que muito me
ENSINOU, fornecendo condições para crescer e produzir
ciência. Foi assim que posso dizer que nos tornamos AMIGOS.
Obrigado pelas instruções durante esta etapa, pela orientação
no dia-a-dia com paciência e preocupação. Obrigado pela sua
enriquecedora colaboração sempre presente e por você ser
esta pessoa tão importante para mim.
O obrigado é pouco!!!
AGRADECIMENTOS
Ao amigo, companheiro e eterno mestre, Professor Dr. Pietro Ciancaglini,
filho da Dona Elisa, pela paciência e apoio em momentos difíceis e desafiadores,
pelo amparo amigo e por sua participação em minha vida acadêmica.
Ao amigo, Professor Dr. Geraldo Thedei Júnior, da Universidade de
Uberaba, pelo apoio teórico, pessoal e profissional. Seus conselhos e idéias foram e
serão ponderantes em toda minha carreira. Suas geniosas idéias sobre PDT fizeram
muita diferença neste trabalho.
Ao amigo, Professor Dr. Antonio Cláudio Tedesco, do Departamento de
Química da F.F.C.L.R.P – USP - Grupo de Fotoquímica e Fotobiologia, pela co-
orientação, constante atenção, suporte técnico e sincera empatia.
Ao amigo Geraldo B. Londe, professor da Universidade Federal do Triângulo
Mineiro – UFTM, pela atenção, amizade, exclusividade e apoio.
Aos amigos da pós-graduação: Ana Maria, Carol, Fernanda, Hérica, Kátia,
Marcelle, Rosângela e Prislaine.
Maytê, obrigado pelo apoio técnico e principalmente pela amizade.
Aos amigos do laboratório de Sistemas Miméticos de Membrana: Rodrigo
(Diguinho), Luis Eduardo (Dudu), Leonardo (Tchau), Roberto (Pub’s), Maytê,
Ricardo, Mariana, Juliana, Imaculada, Ricardo (Torrone).
Niltinho (Guaraldo) e Ivana...... o que seríamos de nós sem vocês!!!
Karina, Adriana e Vânia pela ajuda nos experimentos com os fibroblastos e
nas análises fotoquímicas.
Aos professores Richard John Ward e Elisabete Zaniquelli pelos
equipamentos e atenção empregados em meu trabalho.
Aos amigos da Universidade de Uberaba, minha progenitora, em especial aos
amigos da Educação Física e a todos que participaram de minha formação
acadêmica.
A todos os professores e funcionários do Departamento de química,
principalmente Lâmia, Bel (Pessoa), André, Sônia, Maria e Losane.
Priscila Cerviglieri, pelas traduções e correções da língua inglesa.
Alcides, Geraldo, Marquinho pela assistência aos problemas hidráulicos e
elétricos.
Tuca e Zé, da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, pelas microscopias.
A CAPES e FAPESP pelo apoio técnico e financeiro
“Meu andar é firme; meu anseio é forte;
ou eu encanto a vida ou desencanto a morte”.
Paulo Diniz
As invenções são, sobretudo,
o resultado de um trabalho teimoso.
Alberto Santos Dumont
SUMÁRIO
Resumo
i
Abstract
iii
Lista de Abreviaturas e siglas
v
Lista de tabelas
vi
Lista de Figuras
vii
1. INTRODUÇÃO 1
1.1. Aspectos históricos da bactéria Streptococcus mutans 1
1.2. Taxonomia do Streptococcus mutans 2
1.3. Aquisição primária e transmissão de S. mutans 3
1.4. S. mutans e a cárie: 4
1.5. Terapia fotodinâmica (TFD) 8
1.5.1. Mecanismo de ação da TFD 9
1.5.2. Os processos fotofísicos e fotoquímicos que ocorrem durante a
TFD
11
1.6. Agentes fotossensíveis 15
1.7. A fonte de luz 18
1.8. Efeitos da TFD 18
1.8.1. Mecanismos da TFD em microrganismos 21
1.9. Lipossomos
22
2. OBJETIVOS
24
3. MATERIAL E MÉTODOS 26
3.1. Equipamentos utilizados 26
3.2. Material utilizado 27
3.3. Streptococcus mutans 28
3.3.1. Padronização das condições de crescimento de
Streptococcus mutans em meio líquido
28
3.3.2. Avaliação do consumo de carboidratos durante o
crescimento de S. mutans
28
3.3.3. Determinação do número de Unidades Formadoras de
Colônias (UFC’s)
29
3.3.4. Avaliação do pH e densidade óptica do meio de cultivo
durante o crescimento de S. mutans
30
3.3.5. Padronização do crescimento do biofilme de S. mutans 30
3.3.5.1. Padronização das condições de crescimento de S.
mutans na placa de 24 poços (formação do
biofilme)
31
3.4. Fibroblastos 31
3.4.1. Condições de crescimento dos Fibroblastos 31
3.5. Preparação da solução estoque dos Agentes Fotossensíveis
Utilizados na TFD
32
3.5.1. Preparação da solução estoque de Rose bengal 32
3.5.2. Preparação da solução estoque de Protoprofirina IX 32
3.5.3. Preparação da solução estoque de Zinco Ftalocianina
(ZnPc)
32
3.6. Preparação dos Lipossomos e ZnPc-lipossomos 32
3.6.1. Determinação do diâmetro médio dos lipossomos 33
3.6.2. Preparação do gradiente isopícnico de densidade de
sacarose
33
3.7. Caracterização fotoquímica e fotofísica dos agentes
fotossensíveis estudados 34
3.7.1. Determinação espectroscópica de absorção no estado
estacionário dos compostos fotossensíveis Protoporfirina
IX e Zinco ftalocianina
34
3.7.2. Determinação dos espectros de emissão de fluorescência
no estado estacionário dos compostos fotossensíveis
estudados
35
3.7.3. Determinação do rendimento quântico de fluorescência (Φ
F
)
dos compostos estudados
36
3.7.4. Determinação do espectro de absorção resolvido no tempo 37
3.7.5. Determinação do rendimento quântico de produção de
oxigênio singlete (
)
39
3.8. Constituição, descrição e montagem do fotopolimerizador de
resina odontológica e caracterização espectral da luz emitida
40
3.9. Aplicação da Terapia fotodinâmica (TFD) 41
3.9.1. Avaliação dos efeitos citotóxicos da TFD aplicada ao S.
mutans na presença ou ausência de diferentes agentes
fotossensíveis
41
3.9.2. Avaliação da formação de biofilme após TFD 42
3.9.3. Avaliação dos efeitos citotóxicos da TFD aplicada nos
fibroblastos na presença ou ausência de diferentes agentes
fotossensíveis
42
3.9.4. Determinação da viabilidade celular 43
3.9.4.1. Ensaios com Azul Tripan 43
3.9.4.2. Ensaios com MTT 43
3.9.5. Pulso de carboidratos para avaliação da capacidade
acidogênica de S. mutans
44
3.9.6. Pulso de glicose para avaliação da capacidade acidogênica
de S. mutans após TFD
45
3.10. Obtenção das frações microssomais de membrana de
Streptococcus mutans
46
3.11. Quantificação da proteína 47
3.12. Influência da TFD sobre a atividade ATPase total de fração
microssomal de membrana de S. mutans
47
3.13. Expressão e análise de proteínas de estresse (Heat Shock
Protein – HSP) em S. mutans após TFD
48
3.13.1. Cultivo e tratamento das células 48
3.13.2. Lise bacteriana para obtenção de proteínas de estresse (Heat
Shock Protein – HSP) de S. mutans
49
3.14. Análise por SDS-PAGE e “Western Blotting” 49
3.15. Estudos de peroxidação lipídica em S. mutans: ação sobre a
fração de membrana e em bactérias em meio planctônico
50
3.15.1 Fração de membrana 50
3.15.2. Bactérias em meio planctônico 51
3.16. Efeito da terapia fotodinâmica sobre o DNA de S. mutans 51
3.16.1. Emprego da TFD sobre as células 51
3.16.2. Extração de DNA genômico bacteriano 52
3.17. Microscopia Eletrônica de Transmissão do S. mutans 53
3.18. Descarte das células
53
4- RESULTADOS e DISCUSSÃO: 54
4.1. Otimização das condições de crescimento de S. mutans 54
4.1.1. Avaliação da capacidade acidogênica de S. mutans em
meio planctônico após adição de diferentes carboidratos –
pulso de carboidratos.
60
4.2. Caracterização fotoquímica dos agentes fotossensíveis e seu
emprego na TFD sobre S. mutans e fibroblastos
63
4.2.1. Rose bengal 65
4.2.1.1. Caracterização fotoquímica do Rose bengal 65
4.2.1.2. Efeito da TFD sobre S. mutans e fibroblastos utilizando-se
o Rose bengal
66
4.2.2. Protoporfirina IX 66
4.2.2.1 Caracterização fotoquímica e fotofísica da Protoporfirina IX
e seu emprego na TFD sobre S. mutans e fibroblastos
66
4.2.2.2. Efeito da TFD sobre S. mutans e fibroblastos utilizando-se
a Protoporfirina IX
74
4.2.3. Zinco ftalocianina 74
4.2.3.1. Avaliação da incorporação de ZnPc aos lipossomos:
construção, quantificação e localização do corante
76
4.2.3.2. Caracterização fotoquímica e fotofísica do Zinco
ftalocianina
80
4.2.3.3. Efeito da TFD sobre S. mutans e fibroblastos
utilizando-se a zinco ftalocianina
82
4.2.4. Avaliação da formação de biofilme após TFD
88
4.2.5. Localização dos agentes fotossensíveis em S. mutans 90
4.2.6. Avaliação da capacidade acidogenica de S. mutans após TFD
com os diferentes agentes fotossensíveis
93
4.2.7. Avaliação da atividade ATPase total de fração de membrana de
S. mutans após emprego da TFD
94
4.2.8. Avaliação do perfil eletroforético de proteínas do lisado
bacteriano
95
4.2.9. Avaliação da expressão de proteínas de choque térmico em S.
mutans após TFD com Rose bengal
97
4.2.10. Avaliação do perfil eletroforético de DNA de S. mutans após
emprego de TFD na presença de diferentes agentes
fotossensíveis
97
5- CONCLUSÃO
102
6- BIBLIOGRAFIA
105
7- ANEXOS 115
i
RESUMO
Desequilíbrios no desenvolvimento da microbiota bucal podem gerar algumas
patologias e, entre elas, está a cárie dental, uma doença crônica - contagiosa, de
etiologia multifatorial, mas extremamente relacionada à bactéria Streptococcus
mutans, que através de seu metabolismo fermentativo destrói estruturas
mineralizadas do dente.
Além disso, o aumento da resistência à antibioticoterapia, devido à existência
do biofilme (também formado pelo S. mutans) e aos tratamentos bactericidas mal
sucedidos, faz do desenvolvimento de técnicas antimicrobianas alternativas um
importante foco nesta área de pesquisa. Assim, na busca de novas metodologias
contra microrganismos, estudos usando a Terapia fotodinâmica (TFD) têm sido
empregados para se obter a inativação de bactérias como o S. mutans.
A TFD é uma modalidade terapêutica em que há a integração de uma luz
visível, um corante e oxigênio que quando interagem, levam à produção de diferentes
espécies reativas de oxigênio (ERO’s) que irão desencadear uma seqüência de
eventos biológicos, resultando numa possível morte ou inativação celular, inclusive
de microrganismos como o S. mutans.
O objetivo deste trabalho foi avaliar a ação da TFD sobre a bactéria S. mutans
em meio planctônico ou formando biofilme. Assim, a metodologia padronizada
possibilitou o cultivo da bactéria em meio líquido (planctônico) ou na forma de
biofilme, tornando-se possível a realização de testes com a aplicação da terapia
fotodinâmica. Uma análise das curvas de crescimento possibilitou avaliar o
metabolismo anaeróbico de S. mutans que consome açúcares fermentáveis (glicose,
frutose, sacarose e maltose), mostrando-se hábil na produção de ácidos.
Conforme proposto, um fotopolimerizador de resina odontológica foi
empregado como fonte de luz na TFD. Esta luz é emitida em comprimentos de onda
variáveis (possível graças à troca do filtro de luz do equipamento) que fotoativam os
diferentes corantes empregados tais como: Rose bengal, a Protoporfirina IX (PPIX) e
a Zinco ftalocianina. Estes agentes fotossensíveis, depois de irradiados, produzem
espécies reativas de oxigênio, principalmente o oxigênio singlete, que leva à
inativação bacteriana observada nos experimentos realizados. Em contrapartida, as
concentrações de luz e corantes empregados na inativação bacteriana apresentaram
valores de baixa toxicidade para culturas de fibroblastos.
ii
Além disso, a grande diferença entre as concentrações de corante que causa
a morte da bactéria na presença e na ausência de luz, indica que os compostos
produzidos pela fotoativação são os responsáveis pela morte bacteriana em meio
planctônico. Quanto ao biofilme formado por S. mutans, é possível promover uma
diminuição da sua formação tanto com a TFD quanto com o emprego de flúor.
Células irradiadas imediatamente após a adição do corante foram
semelhantemente inativadas após TFD, podendo ser desconsiderada uma incubação
prévia para que agente fotossensível fosse homogeneamente distribuído.
Aparentemente a TFD não acarretou em mudanças na atividade ATPase total
extraída da membrana da bactéria. Os experimentos para a determinação da
localização dos corantes na célula ou para a avaliação de sua capacidade
acidogênica não foram conclusivos em relação à possibilidade das espécies reativas
estarem causando danos à parede, membrana plasmática ou ainda em alguma
biomolécula citoplasmática da bactéria. Em adição, os estudos da peroxidação
lipídica, de análise do DNA e de proteínas de stress após a TFD não trouxeram
nenhuma informação adicional conclusiva sobre o alvo específico das ERO’s que
causam a inativação bacteriana.
Esta metodologia, apesar de ainda não poder ser aplicada na clínica, poderá
complementar as técnicas antimicrobianas convencionais, por ser uma metodologia
simples, de fácil emprego e baixo custo, podendo inclusive ser associada à
possibilidade do uso de diferentes agentes fotossensíveis e adequada às
necessidades da prática odontológica.
Palavras chave: Streptococcus mutans, Terapia Fotodinâmica, Fotopolimerizador de
Resina odontológica, Biofilme.
iii
ABSTRACT
Unbalance in the development of the mouth microbiota can originate some
pathologies, dental cavity being among them - a chronic disease - contagious, of
multifactorial etiology, but extremely related to the Streptococcus mutans bacteria,
which, through its fermentative metabolism, destroys tooth mineralized structures.
Besides that, the increase in resistance to antibiotic therapy, due to the
existence of biofilm (also formed by S. mutans) and to non successful bactericide
treatments, makes alternative antimicrobial techniques development an important
focus in this research area.
So, in search of new methodologies against microorganisms studies using the
Photodynamic Therapy (PDT) have been employed to achieve inactivation of
bacteria such as S. mutans.
PDT is a therapeutical modality in which there is an integration of a visible
light, a dye and oxygen, when they interact, there is the production of different
reactive oxygen species (ROS’s) which will lead to a sequence of biological events,
resulting in a possible cellular death or inactivation, including microorganisms such
as S. mutans.
The aim of this work was to evaluate the action of PDT on S. mutans in
planktonic medium or forming biofilm. So, the standardized methodology allowed the
cultivation of bacteria in liquid media (planktonic) or in the biofilm form, making it
possible to do tests with the application of the photodynamic therapy. The analysis of
the growth curves allowed the evaluation of the anaerobic metabolism of S. mutans,
which consumes fermentable sugars (glucose, fructose, sucrose and maltose), and is
apt in acid production.
According to what is was proposed, a Hand Held Photopolymerizer was used
as light source in PDT. This light is sent in variable wave lengths (made possible
thanks to the change of the light filter in the equipment) which photoactivate the
different dyes used, such as Rose bengal, Protoporphyrin IX (PPIX) and the Zinc
Phtalocyanine. These photosensitive agents, after being irradiated, produce reactive
oxygen species, specially the singlet oxygen, which leads to the bacterial inactivation
observed in the experiments done. Nonetheless, the light concentrations and dyes
used in the bacterial inactivation have shown low toxicity values for fibroblasts
cultures.
iv
Besides that, the high difference between the dye concentrations which causes
the death of bacteria in the presence and absence of light indicates that the
compounds produced by the photoactivation are the responsible for the bacterial
inactivation in planktonic media.
As for the biofilm formed by S. mutans, it is possible to have a decrease in its
formation with PDT as much as with the use of fluoride.
Cells irradiated immediately after the dye addition were similarly inactivated
after PDT, so a previous incubation for the homogeneous distribution of the
photosensitive agent can be discarded.
Apparently, the PDT did not cause changes in the total APTase activity
extracted from bacteria membrane. The experiments for the determination of dye
location in the cell or for the evaluation of its acidogenic capacity were not conclusive
in relation to the possibility of reactive species to be causing damage to the cell wall,
plasmatic membrane or still in some cytoplasmatic biomolecule of the bacteria.
In addition, the studies of lipidic peroxidation, DNA analysis and stress proteins
after PDT did not bring any conclusive additional information about the specific target
of ROS’s that cause bacterial inactivation.
This methodology, although can’t be applied in clinic yet, can complement the
conventional antimicrobial techniques, being a simple methodology, of easy used and
low cost, which can also possibly be associated to the use of different photosensitive
agents and adjusted to the needs of odontological practice.
Keywords: Streptococcus mutans, Photodynamic Therapy, Hand Held
Photopolymerizer, Biofilm.
v
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Anti-GroEL: Anticorpo anti HSP70
BSA: Albumina bovina
DAB: (3,3’-Diaminobenzidina)
DMEM-F12: Meio Dulbecco's Modified Eagle /Medium F-12 Nutrient medium
DMF: Dimetilformamida
DMSO: Dimetilsulfóxido
DPPC: Dipalmitoil fostatidil colina
DTT: Ditiotreitol
FBS: Soro bovino fetal
GAR: anticorpo de cabra anti-IgG
HBSS: Hank's Balanced Salt Solution
HSP70: Heat Shock Protein 70 KDa (proteína de choque térmico)
LPC: Lisofosfatidil colina
MES: Ácido 2-[N-Morfolino]etanosulfônico
MOPS: Ácido 3-[N-Morfolino]propanosulfonico
MTT: 3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazolina
PPIX: Protoporfirina IX
RB: Rose bengal
SDS: Dodecil sulfato de sódio
TCA: Ácido tricloroacético
TLC: Cromatografia de camada delgada
Tris: Tris(hidroximetil)aminometano
TSA: Tryptic Soy Agar, TSA-Soybean-casein digest agar
TSB: Triptic Soy Broth, Soybean-casein digest medium
UFC: Unidades formadoras de colônia
ZnPc: Zinco ftalocianina
vi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Diferenciação bioquímica de estreptococos do grupo mutans. () -
11-89% das cepas são positivas; (+) - 90 % ou mais das cepas
são positivas; (-) - 90 % ou mais das cepas são positivas; ND -
Não determinado.
04
Tabela 2: Valores dos picos de absorção máxima do corante PPIX (0,2
µmol/L), dissolvido em diferentes solventes, determinada conforme
descrito em Material e Métodos.
70
Tabela 3: Valores de rendimento quântico de oxigênio singlete para a PPIX
em tampão PBS (pH 7,4), baseado na comparação com
Feoforbide-a, conforme descrito em Material e Métodos.
72
Tabela 4: ZnPc-Lipossomo formado a partir de diferentes concentrações de
ZnPc conforme descrito em Material e Métodos, item 3.6.
Disposição dos resultados obtidos no espalhamento dinâmico de
luz: polidispersão e diâmetro médio e o desvio é referente a média
de 3 medidas realizadas com preparações distintas.
78
Tabela 5: Valores de rendimento quântico de oxigênio singlete determinados
para o composto ZnPc-lipossomo, baseado no agente
fotossensível padrão (Feoforbide-a), conforme descrito no item
3.7.5 de Material e Métodos.
83
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura1: Microscopia eletrônica de transmissão de S. mutans.
Cepas crescidas em meio completo, suplementado com glicose
(50 mMol/L). Aumento de 25.000 x
3
Figura 2: A etiologia multifatorial da cárie: a dieta, o estado imunológico e a
higiene bucal do hospedeiro e a microbiota bucal são fatores que,
persistindo, poderão levar ao desenvolvimento da cárie desde que
prevaleçam por um determinado período de tempo associados
(KATZ et al., 1979).
6
Figura 3: Esquema representativo da aplicação da TFD em paciente com
tumor: após a aplicação da droga (A), a mesma irá
preferencialmente concentrar-se no órgão ou tecido doente (B)
para que posteriormente seja realizada localmente a irradiação
com luz (C), levando as células doentes à morte e conseqüente
cura da doença (D).
9
Figura 4: Reação do oxigênio singlete com grupos de moléculas importantes. 14
Figura 5: Estrutura química do Rose bengal (A), Protoporfirina IX (B) e Zinco
Ftalocianina (C).
16
Figura 6: Lipossomo: representação de uma vesícula unilamelar cuja fase
aquosa é inteiramente cercada por uma membrana formada por
moléculas de fosfolipídeos, constituindo uma bicamada lipídica.
22
Figura 7: Fotopolimerizador de resina odontológica conforme descrito no
Depósito de Patente nº: PI 0404223-9 (PAULINO et al., 2004b):
Fotopolimerizador manual de resina odontológica com ponteira
autoclavável (D), vista lateral do suporte filtro luz (C1), vista frontal
do suporte filtro de luz (C2), compartimento lâmpada halógena
(A), filtro de luz (B) e setup de alimentação (E).
40
Figura 8: Fluxograma de eventos da metodologia aplicada para o emprego
da TFD em S. mutans.
42
Figura 9. Curvas de crescimento de S. mutans mostrando a variação da
densidade óptica em 600nm (A) e pH (B) em função do tempo de
cultivo em meio TSB (
______
) ou meio completo (- - - -): sem fonte
de carbono (Ì); na presença de 13 mmol/L de glicose ({); 13
mmol/L xilose () ou mistura de 13 mmol/L glicose com 13 mmol/L
xilose (). Cada ponto é a média de três experimentos com uma
variação inferior a 5%.
58
Figura 10. Concentração da glicose em função do tempo de crescimento de
S. mutans em meio TSB suplementado () ou não ({) com 13
mmol/L xilose. Inserção: curva padrão de calibração usando um
Kit de ensaio de glicose (PAULINO et al., 2003). Cada ponto é a
média de três experimentos com uma variação inferior a 5%.
59
Figura 11. TLC dos carboidratos utilizados como referência (xilose e glicose)
e do meio de cultura de S. mutans após crescimento em meio
suplementado com 13 mmol/L glicose (linhas 1-4) por 4, 8, 12 e 24
horas, respectivamente ou com mistura de 13 mmol/L glicose e 13
mmol/L xilose (linhas 5-8), por 4, 8, 12 e 24 horas,
respectivamente. Linhas 9, 10 e 11 contêm padrões de glicose,
xilose e mistura de glicose com xilose, respectivamente.
60
Figura 12. Placa de cultura (24 poços) após 12 horas de crescimento de S.
mutans em meio completo suplementado com 1% (p/v) de
carboidrato. Coluna 1, maltose; 2, xilose; 3, glicose; 4, frutose; 5,
sacarose e 6, controle (sem fonte de carbono). Linha A, sem flúor;
B, C e D com 1, 3 e 5 mmol/L de NaF, respectivamente.
62
Figura 13: Fotomicrografia do biofilme formado por S. mutans após
crescimento durante 12 horas em meio completo suplementado
viii
com 1% de carboidrato (p/v) e/ou NaF (1, 3 e 5 mmol/L ) como
indicado. O controle refere-se ao biofilme formado em meio
completo não suplementado com carboidrato (aumento de 100 X).
63
Figura 14: pH da suspensão celular de S. mutans suplementado com
diferentes fontes de carbono. A suspensão celular foi
suplementada com: (z) Glicose; () Frutose; () Xilose; ()
Maltose; (|) Sacarose e () sem nenhuma fonte de carbono. Os
dados representam a média de valores (n=3) e as barras de erros
representam o desvio padrão.
65
Figura 15: (_____)Espectro de absorção do Rose Bengal 4.0 µmol/L em
tampão salino pH 7.4 (PBS) e (------) espectro de transmitância do
filtro original do fotopolimerizador de resina odontoógica.
68
Figura 16: Viabilidade de S. mutans na presença de variáveis concentrações
de Rose bengal. A bactéria (10
3
UFC) foi incubada com Rose
bengal durante 10 minutos e incubada em meio de cultivo TSA
durante 36 horas a 37ºC na ausência de luz com () ou sem ()
irradiação de luz pelo fotopolimerizador. Inserção: viabilidade dos
fibroblastos na presença de variáveis concentrações de Rose
Bengal. As células (10
6
) foram incubadas com o corante durante
10 minutos e crescidas em DEMEN/F-12 por 24 horas no escuro
com () ou sem () irradiação com o fotopolimerizador.
69
Figura 17: Espectros de absorção do corante PPIX na concentração de 3,0
µmol/L e de emissão (Transmitância) da luz emitida pelo
fotopolimerizador, realizado conforme descrito em Material e
Métodos, item 3.7.1. Uma amostra de tampão fosfato (pH 7,4),
DMSO, Diclorometano e Acetona, todos sem o corante foi
utilizada para calibração do equipamento (branco).
71
Figura 18: Espectro de emissão de fluorescência do corante PPIX. Excitação
fixa em 452 nm com leitura a partir de 600 a até 800 nm, conforme
descrito em Material e Métodos.
73
Figura 19: Espectro de absorção do transiente do corante PPIX (0,2 µmol/L),
0,21 µs após a excitação por pulso de laser em 355 nm,
mostrando a absorção máxima do triplete e o fotobranqueamento
do estado fundamental, centrado em 350 nm.
74
Figura 20: Viabilidade de S. mutans na presença de variáveis concentrações
de Protoporfirina IX. A bactéria (10
3
UFC) foi incubada com PPIX
durante 10 minutos e incubada em meio de cultivo TSA durante 36
horas a 37ºC na ausência de luz com () ou sem () irradiação de
luz pelo fotopolimerizador. Inserção: viabilidade dos fibroblastos na
presença de variáveis concentrações de PPIX. As células (10
6
)
foram incubadas com o corante durante 10 minutos e crescidas
em DEMEN/F-12 por 24 horas no escuro com () ou sem ()
irradiação com o fotopolimerizador.
76
Figura 21: Centrifugação em gradiente de densidade de sacarose: (A)
Lipossomo DPPC:LPC (10:1); (B) Zinco ftalocianina em meio
orgânico; (C) ZnPc-Lipossomo 3,72 µmol/L. (
) Fluorescência
ZnPc: λ
ex
= 640, λ
em
= 680 nm (•) lipídeos: absorbância em 820 nm,
referente ao fosfato inorgânico obtido pela hidrólise ácida dos
fosfolipídios e (
) % sacarose determinada por refratometria.
80
Figura 22: Espectros de absorção normalizados do corante ZnPC em meio
etanólico e lipossomal. Faixa de varredura empregada: 400 a 800
nm.
84
Figura 23: Espectro de emissão de fluorescência de ZnPC em meio
lipossomal (3,78 µmol/L). Excitação fixa em 610 nm, com faixa de
varredura de 630 a 750 nm, conforme descrito em Material e
ix
Métodos. 85
Figura 24: Espectro de absorção do transiente do corante ZnPC incorporado
em lipossomos (3,78 µmol/L), 0,21 µs após a excitação por pulso
de laser em 355 nm, com faixa de varredura de 300 a 800 nm,
mostrando a absorção máxima do triplete e o fotobranqueamento
do estado fundamental.
86
Figura 25: Espectro de absorção da ZnPc-Lipossomo 3,78 µmol/L em
tampão salino pH 7.4 (PBS) e (------) espectro de transmitância do
filtro de luz (600 – 700 nm) adaptado ao fotopolimerizador de
resina odontológica.
87
Figura 26: Viabilidade de S. mutans na presença de variáveis concentrações
de ZnPc-Lipossomo. A bactéria (10
3
UFC) foi incubada com ZnPc-
Lipossomo durante 10 minutos e incubada em meio de cultivo TSA
durante 36 horas a 37ºC na ausência de luz com () ou sem ()
irradiação de luz pelo fotopolimerizador. Inserção: viabilidade dos
fibroblastos na presença de variáveis concentrações de ZnPc-
Lipossomo. As células (10
6
) foram incubadas com o corante
durante 10 minutos e crescidas em DEMEN/F-12 por 24 horas no
escuro com () ou sem () irradiação com o fotopolimerizador.
90
Figura 27. Fotomicrografia do biofilme formado por S. mutans após
crescimento durante 2 horas em meio completo suplementado
com 1% de sacarose (p/v): RB, PPIX e ZnPc são respectivamente
as células tratadas com os agentes fotossensíveis Rose bengal,
Protoporfirina IX e ZnPc-lipossomo. O controle refere-se ao
biofilme formado e não tratado com a TFD. O poço limpo refere-se
à micrografia do poço sem nenhum biofilme crescido (aumento de
100 X).
92
Figura 28: Variação do pH observado em suspensão de S. mutans na
presença de glicose (50 mmol/L) após terapia fotodinâmica: (•)
Grupo Controle, () Rose bengal, () Protoporfirina IX e () ZnPc-
lipossomo. Durante 10 minutos foi avaliado o pH da suspensão.
Valores expressos em pH conforme descrito em Materiais e
Métodos.
97
Figura 29:
Eletroforese de gel de poliacrilamdia para o li8sado pretéico de S.
mutans. A bactéria foi cultivada e posteriormente lisada com
tampão de lise. As proteínas (50 µg por linha) separadas em SDS-
PAGE 7,5%, PM: peso molecular padrão; 1: S. mutans estressado
com NaCl; 2: S. mutans não estressado (controle negativo).
Tratamentos conforme descrito em Material e Métodos.
100
Figura 30. Imunoblot de proteínas (Heat Shock Protein 70). S. mutans foi
cultivado e posteriormente lisados com tampão de lise. As
proteínas (50µg por linha) separadas em SDS-PAGE 10%, foram
transferidas para uma membrana de nitrocelulose, à qual foi
incubada com anticorpo anti-GROEL (1:100) e anticorpo
monovalente conjugado com peroxidase. 1: S. mutans submetido
a TFD; 2: S. mutans irradiado com Luz proveniente do
fotopolimerizador de resina odontológica; 3: S. mutans estressado
com NaCl 4: S. mutans não estressado (controle negativo); 5: S.
mutans tratado com Rose bengal. Tratamentos conforme descrito
em Material e Métodos.
101
Figura 31. Gel de agarose das amostras de DNA obtidas de S. mutans. 1: S.
mutans não submetido a TFD; 2: S. mutans submetido a TFD com
Rose bengal; 3: S. mutans submetido a TFD com PPIX e 4: S.
mutans submetido a TFD com ZnPc-lipossomos.
102
_______________________________________________________________Introdução
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos históricos da bactéria Streptococcus mutans
Em 1890, após estudos com lactobacilos provenientes de lesões cariogênicas,
Miller propôs que o ácido lático fosse o produto final da fermentação dos carboidratos.
Ele considerou que a cárie ocorria devido à dissolução da porção orgânica, através de
um ataque ácido ao esmalte e dentina. Estes ácidos eram provenientes da
fermentação lática, causada por bactérias a partir de alimentos que ficavam na boca
após a alimentação (HARTLES & McDONALD, 1950).
Dentre as bactérias existentes nestas lesões, destacam-se os estreptococus
(Bactérias Gram positivas, ovóides e em cadeia) que, além de serem as bactérias
mais comuns na boca, são também produtoras deste ácido e conseqüentemente
cariogênicas. Assim, o termo cariogênico é aplicado apenas em algumas cepas de
estreptococus capazes de produzir cáries em animais e ou seres humanos (WILLIANS
& ELLIOTT, 1979).
Uma característica comum às cepas cariogênicas é também a capacidade de
armazenar polissacarídeos intracelulares semelhantes ao glicogênio. Estas reservas
intracelulares podem ser metabolizadas a ácido lático quando os carboidratos
exógenos são exauridos, estendendo o período durante o qual as cepas irão produzir
ácidos. Portanto, no contexto da cárie dental, as cepas que não armazenam estes
polissacarídeos somente irão produzir ácidos enquanto houverem açucares
disponíveis na boca. Em contrapartida, cepas capazes de armazenar os
polissacarídeos durante uma refeição do hospedeiro, poderão utilizá-los para o
metabolismo energético após uma limpeza bucal.
Willians e Elliott (WILLIANS & ELLIOT, 1979) listam ainda significantes
aspectos relativos às bactérias cariogênicas:
• A capacidade de fermentar carboidratos e conseqüentemente reduzir o pH
para aproximadamente 4 – 5 (este pH é o valor no qual ocorre
desmineralização do esmalte dental).
• A capacidade de produzir uma reserva de polissacarídeos a partir de
açucares da dieta do hospedeiro. Esta reserva é usada como substrato de
_______________________________________________________________Introdução
2
fermentação quando os carboidratos exógenos (da dieta do hospedeiro)
não estão mais disponíveis. Cepas capazes de armazenar estes
polissacarídeos são capazes de produzir ácidos por maiores períodos que
cepas incapazes.
• A capacidade de produzir polissacarídeos extracelulares que permitem às
células aderirem entre si e inclusive na superfície da parede dos dentes.
Alguns polissacarídeos são formados principalmente a partir da sacarose
(dextranos).
Dentre os estreptococus, o Streptococcus mutans aparenta-se a mais
cariogênica espécie em evidência, apesar de algumas cepas de S. sanguis e S. oralis
serem também causadores da cárie (MARSH, 1993).
Em 1924 o microbiologista Kilian Clarke desenvolveu seus estudos envolvendo
a cárie dental, encontrando em lesões cariogênicas da dentina pequenos cocobacilos
em cadeia, os quais apresentavam um formato mais oval do que esférico. Ele então
sugeriu que estas células eram mutantes de estreptococus e as chamou de
Streptococcus mutans (CLARKE, 1924). Clarke tentou provar a associação destes
estreptococus com a doença cárie dental, mas infelizmente sua hipótese não foi aceita
por outros. Na década de 60, o método de pesquisa gnobiótica animal estimulou
novos estudos na microbiologia da cárie dental e só então a bactéria S. mutans foi
convincentemente associada a esta doença (HAMADA, 1986).
1.2 Taxonomia do Streptococcus mutans
De acordo com a classificação do Bergey’s Manual of Determinative
Bacteriology (HOLT et al., 1994), o gênero Streptococcus inclui os grupos pyogenico,
oral e anaeróbico dos estreptococus, assim como o grupo de outros estreptococus. As
células são esféricas ou ovóides, com diâmetro médio de 0,5 – 2,0 µm, ocorrendo em
pares ou cadeia quando crescidas em meio líquido e corando-se Gram positivas.
Estreptococus normalmente necessitam de meios enriquecidos para seu crescimento,
seu metabolismo é fermentativo, produzindo principalmente lactato (não produzem
gás). Os estreptococus são catalase negativa e comumente atacam células vermelhas
(hemácias), apresentando uma coloração esverdeada (-hemólise) ou um completo
_______________________________________________________________Introdução
3
clareamento (-hemólise). Sua temperatura ótima de crescimento é 37ºC sendo
limitado a 25-45ºC. Estreptococus constituem a maior população presente na
cavidade oral com várias espécies diferentes colonizando vários nichos ecológicos da
boca. A diferenciação entre os grupos pyogenicos, orais e anaeróbicos pode ser
trabalhosa e por esta razão, uma combinação entre informações é necessária para
uma correta classificação (HOLT et al., 1994).
Especificamente para o S. mutans, as células possuem cerca de 0,5-0,75 µm
de diâmetro, ocorrem em pares, cadeia curta ou média, sem cápsulas
(Figura 1). Sob condições ácidas em meio líquido ou sólido estas cadeias podem
atingir comprimentos de 1,5 a 3,0 µm.
Figura 1: Microscopia eletrônica de transmissão de S. mutans.
Cepas crescidas em meio completo, suplementado com glicose (50 mMol/L). Aumento de
25.000 x.
A diferenciação dentro do grupo dos estreptococos do grupo mutans é baseada
em diferenças de reações bioquímicas (Tabela 1), por propriedades físico-químicas da
superfície (van der MEI et al., 1991) ou até mesmo por técnicas moleculares (WHILEY
& BEIGHTON, 1998).
1.3. Aquisição primária e transmissão de S. mutans
_______________________________________________________________Introdução
4
Normalmente, antes do nascimento o feto humano é estéril. A contaminação da
cavidade oral começa no primeiro contato táctil com a mãe e outras pessoas
presentes no parto, inclusive o contato com o ar e outros equipamentos.
Tabela 1: Diferenciação bioquímica de estreptococos do grupo mutans. (∆) - 11-89% das
cepas são positivas; (+) - 90 % ou mais das cepas são positivas; (-) - 90 % ou mais das
cepas são positivas; ND - Não determinado.
Espécies
Característica
s
S. mutans S. ratus S. sobrinus S. cricetus S. downe
i
S. ferus
Fermentação de
Manitol + + + + + +
Sorbitol + + + - +
Rafinose + + + + - -
Inulina + + + + +
Melobiose + - ND ND ND
Trealose + + + + ND
Hidrólise de:
Arginina - + - - - -
Esculina + + - +
Resistência à
bacitracina
+ + + - - -
A cavidade oral sem dentes de crianças, contém apenas superfície epitelial e
as primeiras espécies colonizadoras não requerem uma superfície hospedeira. Dentre
os primeiros colonizadores, incluem-se alguns estreptococus, Veillonella,
Actinomyces, Fusobacterium e alguns bastonetes Gram negativos (KÖNÖNEM et al.,
1994, 1999). Streptococcus salivarius está entre os primeiros colonizadores primários,
ocupando o dorso da língua da criança (SOCRANSKY & MANGANIELLO, 1971). Nos
primeiros meses, a maioria das cepas detectadas são colonizadores transientes.
Streptococcus sanguis e os estreptococus do grupo mutans são colonizadores
permanentes apenas depois da primeira erupção dentária (BERKOWITZ et al., 1975).
1.4. S. mutans e a cárie:
_______________________________________________________________Introdução
5
É estimado que o corpo humano contem cerca de 10
14
células, dentre as quais
90% não são do próprio hospedeiro. Dentre estas células, estão compreendidos os
microrganismos pertencentes à microflora residente, os quais não são meramente
passivos, mas contribuem direta e indiretamente para o desenvolvimento normal dos
sistemas fisiológicos, de nutrição e defesa do hospedeiro. Muitas doenças são
causadas por microrganismos diferentes da microbiota normal ou até mesmo por um
desequilíbrio da microflora residente (MARSH, 2003).
Um exemplo deste desequilíbrio ocorre durante o desenvolvimento da cárie
dental, visto que o Streptococcus mutans, uma bactéria Gram positiva, compõe uma
parte substancial da microbiota presente na placa dental sujeita ao desenvolvimento
desta doença. Esta bactéria usa os carboidratos presentes na dieta como fonte de
energia para realização de um processo anaeróbico (principalmente fermentação
lática), resultando na produção de ácidos orgânicos (PAULINO et al., 2003). Estes
ácidos, baixam o pH para valores em torno de 5 na superfície do dente, induzindo
assim sua desmineralização e causando a cárie (RADCLIFFE et al., 2002).
A cárie dental está inserida entre as mais significantes doenças crônicas
contagiosas, as quais afetam principalmente países subdesenvolvidos, populações de
baixa renda e/ou pacientes imuno comprometidos (KRASSE, 1988; MARSH, 2003). Já
a existência da doença, se baseia na interação de fatores que produzirão a destruição
irreversível de estruturas mineralizadas do dente, podendo chegar a proporções de
comprometimento da vitalidade dental e da fixação do elemento dental no complexo
maxilo-mandibular (MENAKER, 1980; CHARLOTTE et al., 2002; RADCLIFFE et al.,
2002).
A cárie dental é uma doença comum, mundialmente espalhada e sua etiologia
é multifatorial, sendo que os hábitos de vida do hospedeiro e a infecção por
estreptococos do grupo mutans são os fatores mais importantes, ver esquema da
Figura 2 (JOHNSON, 1991; BRATTHALL, 1997).
No mundo ocidental, a prevalência de cáries tem diminuído, apesar de que,
cerca de 5 – 20% da população ainda permanece em grupos de risco (BOLIN, 1997;
WATT & SHEIHAM, 1999). Já em países em desenvolvimento, a taxa de cáries
dentais está em constante evolução e pelo fato de que mais de 80 % das crianças do
mundo vivem nestes países, a cárie dental é considerada como um dos maiores
_______________________________________________________________Introdução
6
problemas de saúde pública (CIRINO & SCANTLEUBURY, 1998).
Figura 2: A etiologia multifatorial da cárie: a dieta, o estado imunológico, a higiene bucal do
hospedeiro e a microbiota bucal são fatores que, persistindo, poderão levar ao
desenvolvimento da cárie desde que prevaleçam por um determinado período de tempo
associados (KATZ et al., 1979).
Na ocorrência de cárie, algumas espécies de fungos e bactérias podem
predominar (BOYAR et al., 1989; MARSH et al., 1989). Dentre estas espécies, as
bactérias Streptococcus sobrinus e o S. mutans compreendem uma parte substancial
da contagem de células presentes na placa dental sujeita ao desenvolvimento de cárie
e sua importância na etiologia da cárie dental é indiscutível (MIKKELSEN et al., 1981),
sendo o S. mutans o principal agente etiológico (Mc NEIL & HAMILTON, 2003).
Apesar disso, a dieta, o estado imunológico, a higiene bucal do paciente (hospedeiro)
e a microbiota bucal são fatores que, persistindo, poderão levar ao desenvolvimento
da cárie desde que prevaleçam por determinado período de tempo associados, sendo
variável de indivíduo para indivíduo (MENAKER, 1980).
A placa microbiana, formada por uma comunidade diversa de microrganismos,
é um biofilme composto por numerosos e distintos tipos de bactérias que vivem
próximos e justapostos à superfície do dente do hospedeiro (KOLENBRANDER,
2000). Este biofilme forma-se naturalmente no dente e sua presença é normalmente
benéfica, pois contribui para estimular as defesas inatas do hospedeiro consistindo
numa barreira contra outros microrganismos patogênicos. Assim, no biofilme sadio,
_______________________________________________________________Introdução
7
encontram-se muitas espécies bacterianas, tais como Streptococcus sanguis, S.
oralis, S. mitis, Actinomyces naeslundii, entre outros (MARSH, 1993).
É reconhecido atualmente que a formação do biofilme é um importante aspecto
dentre várias doenças, se não a sua maioria, incluindo importantes patologias como
endocardites valvulares, osteomielites, cáries dentais, infecções do ouvido médio,
infecções de âmbito médico-hospitalar, implantes oculares e até infecções pulmonares
em pacientes com fibrose cística. Este biofilme pode tolerar agentes antimicrobianos
em concentrações de 10 a 1000 vezes maiores que o necessário para eliminar
organismos planctônicos geneticamente iguais. Além disso, é normalmente mais
resistente às fagocitoses, o que o torna extremamente difícil de ser erradicado dos
tecidos vivos (JEFFERSON, 2004).
Com o objetivo de demonstrar os efeitos de diferentes fontes de carbono na
ausência ou presença de diferentes concentrações de flúor, Paulino e colaboradores
em 2004, concluíram que a bactéria S. mutans forma biofilme independente da fonte
de carbono utilizada. Entretanto, a intensidade do biofilme formado é maior com
sacarose, frutose, glicose e maltose, os quais são metabolizados pelo microrganismo.
Além disso, independentemente do açúcar empregado, crescentes concentrações de
flúor diminuem a formação deste biofilme (PAULINO et al., 2004).
Associado a estes fatores, o aumento da resistência à antibioticoterapia por
bactérias como Streptococcus sobrinus e Streptococcus mutans faz do
desenvolvimento de técnicas antimicrobianas alternativas um importante foco nesta
área de pesquisa (MALIK et al., 1992).
Assim, agentes microbianos de amplo espectro têm sido desenvolvidos e mais
especificamente tratando-se de microrganismos Gram positivos, novos compostos
estarão sendo postos a prova nos próximos anos (WISE, 1998).
Desta forma, técnicas tradicionais têm sido empregadas na redução destes
microrganismos, incluindo remoção mecânica e quimioterapia, sendo que o sucesso
do tratamento está diretamente associado à colaboração e motivação do paciente
(FEREZ et al., 1999; OLSVIK & TENOVER, 1993).
Considerando-se a dificuldade no controle de microrganismos resistentes a
antibióticos, alguns tratamentos têm sido desenvolvidos. Dentre eles, a produção de
vacinas (SMITH, 2002), a terapia com o flúor (COX et al., 1999) e a antibioticoterapia
(HIRASAWA & TAKADA, 2002).
Neste sentido, Wallman e colaboradores (WALLMAN et al., 1998) comentam a
_______________________________________________________________Introdução
8
dificuldade de se obter um decaimento longo e significativo da contagem de S. mutans
após tratamento com clorexidina, havendo a necessidade de se combinar ao
tratamento antimicrobiano convencional uma restrição dos níveis de sacarose da dieta
do paciente, o que vem reforçar ainda mais a idéia de que o que se pode observar é o
surgimento de diferentes formas de resistência aos tratamentos antimicrobianos
convencionais.
Além disso, a penetração dos agentes quimioterápicos no biofilme bacteriano
resulta em uma reduzida susceptibilidade dos microrganismos a este tipo de
tratamento (MARSH & BRADHAW, 1993).
Na busca de novas alternativas contra microrganismos, estudos usando a
Terapia fotodinâmica (TFD) têm sido empregados para obter a inativação de bactérias
(PAULINO et al., 2005), leveduras (BERTOLONI et al., 1984) e virus (SKILES et al.,
1985), inclusive o HIV (MATTHEWS et al., 1988).
1.5. Terapia fotodinâmica (TFD)
Os organismos vivos foram evolutivamente se adaptando à radiação solar
presente sobre a superfície terrestre e sob estas condições eles permanecem ilesos
sob a luz visível. Entretanto, a presença simultânea de um corante fotossensibilizador
e oxigênio, convertem esta inócua radiação em um potente agente de injúria sobre as
células destes organismos. Raab, um estudante alemão, há dois séculos atrás,
descreve na literatura o primeiro fenômeno científico destes efeitos (ROSENTHAL,
1989).
Assim, Oscar Raab no ano de 1899 em Munique, observou que o Paramecium
podia ser eliminado na presença do corante acridina e luz, sendo que a luz ou a
acridina quando empregadas separadamente eram inertes a este organismo. Além
disso, ele demonstrou a dependência deste fenômeno com a presença do oxigênio e
relatou o uso clínico da eosina como um fotossensibilizador para o tratamento do
câncer de pele, Condyloma lata e Cutaneous lupus (SMITH, 1984). Desta forma,
também próximo ao século 20, von Tappeiner e Jodlbauer conduziram uma longa
série de experimentos com a reação ocorrida entre a luz e os corantes, criando o
termo “photodynamic erscheinung” (ação fotodinâmica) e demonstraram que uma
grande variedade de corantes eram capazes de fotossensibilizar uma série de
microrganismos (JARRATT et al., 1982).
_______________________________________________________________Introdução
9
Além disso, nos últimos anos tem sido investigada a potencialidade do uso de
corantes fotossensibilizáveis como agentes no tratamento fotoquimioterápico de
tecidos tumorais, definindo-se uma nova linha de ação nesta área denominada terapia
fotodinâmica (TFD).
1.5.1. Mecanismo de ação da TFD
TFD é uma modalidade terapêutica em que há a integração de uma luz visível,
uma droga (chamada de fotossensibilizador ou corante) e oxigênio que normalmente
está presente nos tecidos e meio reacional (Figura 3).
Este agente fotossensível pode ser normalmente uma molécula presente no
meio (células ou tecidos), mas no caso específico da TFD é administrada uma droga
ou uma pré-droga (Figura 3-A e 3-B), tornando-se esta, a primeira etapa da terapia.
Em uma segunda etapa do tratamento, o tecido ou as células doentes, são expostos a
uma luz visível (com um comprimento de onda específico) a qual é absorvida pelo
agente fotossensível (Figura 3-C). Separadamente, o corante (em concentrações
terapêuticas) ou a luz (em doses terapêuticas) não apresentam citotoxicidade.
Assim, a interação destes dois agentes na presença de oxigênio leva à
produção de diferentes espécies reativas de oxigênio (ERO’s) como, por exemplo, o
oxigênio singlete entre os quais irão desencadear uma seqüência de eventos
biológicos, resultando numa possível morte celular (Figura 3-D) (GOMER et
al.,1989;HENDERSON & DOUGHERTY, 1992; SHARMAN et al., 1999).
Microrganismos têm sido empregados em uma ampla variedade de ensaios
para determinar o mecanismo da ação fotodinâmica induzida por numerosos agentes
fotossensíveis. Devido ao baixo alcance, por causa da vida curta dos intermediários
reativos gerados, a localização do corante na célula alvo tem sido motivo de dúvidas.
Desta forma, Dahl e colaboradores em 1988, sugerem que a penetração em células
tem sido considerada essencial para a ação fotodinâmica de alguns corantes,
enquanto que para outros, a ação fotodinâmica tem sido observada sem penetração
(DAHL et al., 1988).
_______________________________________________________________Introdução
10
Figura 3: Esquema representativo da aplicação da TFD em paciente com tumor: após
a aplicação da droga (A), a mesma irá preferencialmente concentrar-se no órgão ou tecido
doente (B) para que posteriormente seja realizada (localmente) a irradiação (C), levando as
células doentes à morte e conseqüentemente à cura da doença (D).
Em relação ao emprego da terapia para o controle de microrganismos, estudos
usando luz laser indicam que certas bactérias podem ser eficientemente inativadas
após a TFD com o emprego de azul de toluidina ou azul de metileno (USACHEVA et
al., 2001) e até mesmo com moléculas mais complexas como a alumínio ftalocianina
dissulfonada (BURNS et al., 1995) ou a Zinco Ftalocianina (MINNOCK et al., 1996).
Alguns estudos específicos indicam que certas bactérias orais incluindo S.
mutans e S. sobrinus, entre outras, podem ser inativadas após TFD com azul de
toluidina e azul de metileno (WILSON et al., 1993), alumínio ftalocianina dissulfonada
(BURNS et al., 1995) após irradiação com luz laser, ou com o uso de Rose Bengal
(PAULINO et al., 2005) fotossensibilizado por uma luz halógena.
A luz tem sido utilizada no tratamento de doenças desde a antiguidade. Muitas
civilizações antigas utilizaram fototerapia, mas apenas neste último século ela foi
utilizada como terapia reparadora. Segundo as recentes descobertas científicas dos
A droga é injetada
no organis mo
A drog a se c oncentr a nas
célul as d oent es
A droga é ativada
pel a l uz
As célul as são
inativadas seletivamente
LUZ
A
B
CD
_______________________________________________________________Introdução
11
pioneiros Finsen, Raab e Von Tappeiner, a combinação de luz e a administração de
uma droga levam a uma fotoquimioterapia, agindo como uma ferramenta terapêutica
(ACKROYD, 2001).
Alguns grupos têm descoberto que laseres de argônio ou hélio-neônio (He-Ne)
podem diminuir as contagens microbianas de agentes patógenos, podendo
descontaminar regiões de tecido inflamado (MATEVSKI, 2003). Assim, como pode se
observar, a maioria das aplicações de TFD está associada a uma luz laser, apesar de
que, fontes de luz não laser também têm sido utilizadas (BRANCALEON &
MOSELEY, 2002).
Estudos desenvolvidos na última década indicam que o uso dos
fotopolimerizadores manuais (fontes de luz não laser) não apresenta nenhum dano
térmico ou fotoquímico (luz azul) à retina (SATROM et al., 1987; THACH, 1999) e
completa ausência de qualquer dano visual ao paciente ou ao clínico por irradiações
UV-A ou UV-B (COOK, 1986). Comparado à manutenção das fontes laser, seu custo
é bastante inferior (ZOEPF, 2001).
Além disso, a possibilidade de contaminações por infecções bucais entre
pacientes através da utilização do fotopolimerizador foi descartada, visto que estudos
demonstraram que a desinfecção do equipamento, propositalmente contaminado com
S. mutans, se dá facilmente após tratamento com agentes fenólicos (CAUGHMAN et
al., 1989), além do que, há a possibilidade de se promover uma eficiente esterilização
através de um processo de pasteurização ou autoclavagem.
1.5.2. Os processos fotofísicos e fotoquímicos que ocorrem durante a TFD
No diagrama de Jablonski (BONNETT, 1988), ilustrado no Esquema 1, estão
representados os processos fotofísicos e fotoquímicos que um agente fotossensível
pode sofrer após a absorção de radiação.
Após a absorção de um fóton de luz, o agente fotossensível passa a popular
um estado excitado singlete mais energético (S
n
), de onde pode retornar para o seu
estado fundamental pelo processo de relaxação física conhecido como conversão
interna (ic) ou através do processo radioativo de emissão de fluorescência. As
propriedades fluorescentes dos agentes fotossensíveis têm sido úteis para a
visualização, localização e delineação da lesão maligna. Contudo, a ação
fotodinâmica é dependente do processo de cruzamento intersistemas (isc),
_______________________________________________________________Introdução
12
caracterizado pela inversão do spin eletrônico. Através deste processo, a molécula do
agente fotossensível passa a popular os estados excitados tripletos (T
1
). A partir do
estado tripleto, a droga fotossensibilizadora pode retornar para o estado fundamental
pelo processo de conversão interna ou pelo processo de emissão de fosforescência
(k
p
) (LAKOWICZ, 1984).
S
n
S
1
S
0
T
1
T
n
Φ
i s c
λ
1
λ
3
Φ
i c
Φ
ic
k
f
k
p
R
* ,
X
* ,
R
+
*
R
*,
X
*,
R
+
*
O
2
O
2
1
Fo t o s s e n s i b i l i z a ção
E
R O s
C e l u l a r
h
ν
hν - absorção de luz
S
0
- estado singlete fundamental
Sn - estado excitado singlete superior
Tn - estado excitado tripleto superior
k
f
– fluorescência
k
p
- fosforescência
ic - conversão interna
isc - cruzamento intersistema
R- produto de uma reação
fotoquímica
Esquema 1: Diagrama de Jablonski para um sistema fotoluminescente (LAKOWICZ, 1984).
De maior importância que os processos fotofísicos, entretanto, são as reações
que a droga fotossensibilizadora pode sofrer neste estado excitado. A maioria dos
dados disponíveis sobre a TFD sugerem um mecanismo comum de ação, onde o
agente fotossensível tripleto na presença do oxigênio molecular presente no meio
induz a produção de espécies reativas de oxigênio, (EROs) (
1
O
2
,
•
O
2
−
,
•
OH
, H
2
O
2
) que
atacam centros específicos dentro dos sistemas celulares, levando à apoptose celular
(KESSEL et al., 1999). Os mecanismos de produção destas espécies reativas são
descritos a seguir:
O mecanismo do Tipo I (FOOTE, 1991) parte do princípio de que o agente
fotossensibilizante (
0
F), ao absorver energia luminosa, sofrerá mudança de nível
energético para
1
F (estado singleto) e possivelmente para
3
F (estado tripleto)
(Equação 1.1). Esta espécie formada (no estado tripleto), na presença de
_______________________________________________________________Introdução
13
macromoléculas (Sub), sofrerá uma abstração de um átomo de hidrogênio ou uma
reação de transferência de elétrons para estas diferentes macromoléculas biológicas
(Sub), levando à produção de radicais livres e íons radicais (Equação 1.2). A espécie
reduzida do agente fotossensível pode transferir um elétron ao oxigênio molecular
presente no meio formando espécies reativas de oxigênio como peróxidos, ânion
superóxido, etc (Equação 1.3). Este tipo de mecanismo de fotossensibilização,
esquematizado abaixo:
0
F
1
F
3
F (Equação 1.1)
3
F + Sub → Sub
+•
+ F
• -
(Equação 1.2)
F
•
-
+
3
O
2
→
F + O
2
- •
(Equação 1.3)
Substrato: semioxidado; Sensibilizador: semi-reduzido.
0
F
1
F
3
F (Equação 1.1)
3
F + SubH → F H
•
+ SubH
•
(Equação 1.2)
FH
•-
+
3
O
2
→ F+ HO
2
- •
(ácido conjugado) (Equação 1.3)
Outro caminho possível para a droga em seu estado excitado tripleto (
3
F) é o
de transferência de energia para o oxigênio molecular (
3
O
2
) com formação de oxigênio
singlete (
1
O
2
; Equação 1.4), generalizando assim a produção dos EROs. Esta espécie
ativa de oxigênio reage rápida e indiscriminadamente com os mais variados materiais
biológicos (Sub) como lipídios insaturados, aminoácidos, proteínas e ácidos nucléicos
(Equação 1.5 e Figura 4), sendo apontado como o principal responsável pela
inativação da célula tumoral ou pela morte de alguns microrganismos. Este tipo de
reação de fotossensibilização é conhecido como do Tipo II (FOOTE, 1991).
3
F +
3
O
2
→
0
F +
1
O
2
(Equação 1.4)
1
O
2
+ Sub → Sub–OO (Equação 1.5)
_______________________________________________________________Introdução
14
CH
3
CH
3
C
8
H
17
H
O
Colesterol
1
O
2
CH
3
CH
3
HO
O
O
C
8
H
17
HN
NHR
CO
2
R
Triptofano
1
O
2
HN
NHR
CO
2
RO
O
HN
N
NH
N
O
H
2
N
Guanina
1
O
2
HN
N
NH
N
O
H
2
N
O
O
Figura 4: Reação do oxigênio singlete com grupos de moléculas importantes.
Em solução homogênea, a probabilidade e a eficiência do processo de
fotossensibilização, dependem de vários parâmetros fotofísicos, tais como o
rendimento quântico de produção do estado excitado tripleto e sua velocidade de
decaimento para o estado fundamental. Contudo, em meio micro-heterogêneo tais
como células e tecidos, os parâmetros estruturais e funcionais também estão
envolvidos na determinação da eficiência do processo de fotossensibilização. Estes
parâmetros regulam a incorporação, localização e a ligação/interação das moléculas
do agente fotossensível com as moléculas alvo (REGAN & PARRISH; 1982,
BONNETT, 2000).
O primeiro passo no processo de fotossensibilização de uma célula é a ligação
do agente fotossensível às membranas plasmáticas ou sua permeação através das
mesmas para o citosol. Em princípio, a permeação pode ocorrer por difusão, por um
_______________________________________________________________Introdução
15
sistema de transporte ativo ou por endocitose. Os processos passivos, tais como a
difusão e a osmose, resultam das diferenças de concentração das substâncias dentro
e fora das células, isto é, o movimento de uma substância para um gradiente de
menor concentração. Os processos de transporte ativo envolvem o movimento de
substâncias através de uma membrana celular contra um gradiente de potencial. Este
processo usualmente envolve o uso de sistemas carreadores de drogas (BONNETT,
2000; REGAN & PARRISH, 1982).
1.6. Agentes fotossensíveis
A importância da localização dos agentes fotossensíveis numa célula ou tecido
se deve ao efeito produzido pela TFD nestas células. Para facilitar o desenvolvimento
de novas drogas é extremamente necessário conhecer o alvo a ser destruído. Assim,
um estudo sistemático da relação estrutura/atividade pode trazer melhoramentos nos
procedimentos terapêuticos, visto a possibilidade de se desenvolver fármacos com
afinidades por diferentes células, tecidos ou órgãos. À medida que novas drogas vêm
surgindo, estudos de localização em tecidos ou a nível subcelular podem ocorrer.
Alguns agentes fotossensíveis têm sido criados para emprego na sua forma pura, não
em misturas. Neste sentido, mitocôndrias, lisossomos, membranas plasmáticas,
ácidos nucléicos de células tumorais têm se tornado alvo potencial para a TFD
(DOUGHERTY et al., 1998).
Em 1913, Meyer-Betz (MEYER-BETZ, 1913) desenvolveu testes cutâneos de
fototoxicidade injetando hematoporfirina em si mesmo a fim de avaliar o efeito
fotosensibilizante em humanos. A autofluorescência tumoral, devido ao acúmulo de
porfirina endógena em tumores experimentais foi demonstrado por Policard, em 1924,
ao utilizar uma lâmpada de Wood. A Lâmpada de Wood é uma lâmpada com uma luz
azulada que auxilia no diagnóstico das micoses superficiais. Quando há a presença
de tinha, a luz azulada torna-se esverdeada; na presença de pitiríase versicolor, pode-
se visualizar uma coloração róseo-dourada. A porfiria apresenta urina avermelhada,
que com a lâmpada de Wood evidencia-se cor alaranjada, sendo esta lâmpada capaz
de fotoestimular corantes biológicos, evidenciando algumas patologias (POLICARD,
1924).
Auler e Banzer (AULER & BANZER, 1942) usaram a hematoporfirina para
_______________________________________________________________Introdução
16
destruição seletiva de tumores em animais. O derivado da hematoporfirina foi isolado
por Schwartz ao reagir ácido acético glacial e ácido sulfúrico com hematoporfirina e
posterior solubilização álcali diluído. O derivado da hematoporfirina, para a localização
tumoral, apresentou melhores propriedades que a hematoporfirina e foi utilizado com
sucesso por Lipson em 1961 (DANIEL, 1991). Dougherty e colaboradores
(DOUGHERTY et al., 1975) usaram o termo terapia de fotorradiação para descrever o
tratamento de tumores em animais, usando luz visível filtrada e um derivado da
hematoporfirina.
A primeira grande série de pacientes que passou pela terapia fotodinâmica
usando-se um derivado da hematoporfirina foi relatada por Dougherty e seus
colaboradores no ano de 1977, onde 111 dos 113 casos de tumores malignos em 25
pacientes, sofreram uma redução volumétrica parcial ou completa do tumor
(DOUGHERTY, 1998).
Até meados de 1994, quase todas as aplicações clínicas de TFD utilizavam
alguma substância química derivada da hematoporfirina (HpD), como agente
fotossensível (JORI, 1994). Atualmente, dentre as várias classes de agentes
fotossensíveis disponíveis, destacam-se também os derivados de xantenos e as
ftalocianinas (SHARMAN et al., 1999). No presente trabalho foram utilizados corantes
representantes destas três diferentes classes, conforme mostrado na Figura 5,
respectivamente.
Figura 5: Estrutura química do Rose bengal (A), Protoporfirina IX (B) e Zinco Ftalocianina (C).
Os derivados de xanteno são comumente utilizados como marcadores
auxiliares de trauma corneano (BOWYER et al., 2001), apesar de não serem
utilizados na TFD clínica e apenas empregados como modelos experimentais
comparativos. Apresentam excelentes propriedades fotofísicas e uma boa produção
de oxigênio singlete (KOCHEVAR et al., 1996). Dentre estes derivados, o Rose bengal
A B C
_______________________________________________________________Introdução
17
(RB), Figura 5 A, revelou ser um bom produtor de oxigênio singlete quando utilizado
como agente fotossensível apresentando uma absorção de luz na região de 500 nm
(PACZKOWSKI et al., 1985). Além disso, estudos pré-clinicos já demonstraram que,
em doses adequadas de droga e luz, o Rose bengal pode ser utilizado com segurança
no tratamento de desordens da pele (WATCHTER et al., 2003).
Um outro agente fotossensível endógeno, a Protoporfirina IX (PPIX) (Figura 5
B) (MACDONALD et al., 2001), penúltimo produto da biosíntese do grupo Heme, é um
composto aromático planar, derivado da porfirina, constituída por quatro unidades
pirrólicas arranjadas simetricamente e ligadas umas as outras por pontes metina. São
completamente conjugadas, garantindo assim uma forte banda de absorção no
espectro do visível, em aproximadamente 400 nm, denominada Banda Soret. Além
disso, as porfirinas e seus derivados têm sido efetivos na inativação de bactérias
Gram positivas como Streptococcus faecalis e Staphylococcus aureus (SZOCS et al.,
1999).
A Protoporfirina IX em seu estado basal é uma molécula no estado singlete (S
o
)
que quando irradiada pode dependendo da quantidade de energia absorvida, passar
por um cruzamento intersistemas (ISC), produzindo uma molécula de Protoporfirina IX
no estado triplete. O oxigênio molecular, estando em seu estado triplete basal (
3
O
2
),
serve como um bom receptor de energia de moléculas no estado triplete (como é o
caso da Protoporfirina IX). Assim, esta transferência de energia é favorável,
permitindo a formação de uma nova espécie reativa, o oxigênio singlete (
1
O
2
)
(ERICSON et al., 2003).
As propriedades fotofísicas das ftalocianinas são fortemente dependentes do
íon do metal central e, entre as ftalocianinas metálicas, a zinco (II) (complexo zinco
ftalocianina) (ZnPc) e o Alumínio (III) (complexo de cloroalumínio ftalocianina)
apresentam favoráveis propriedades fotofísicas para aplicações em TFD, com estado
singleto excitado de uma relativa longa vida (3 – 8 ns) e estado tripleto, também com
um tempo de vida longo, são formados (NUNES et al., 2004). A coloração intensa das
ftalocianinas, juntamente com sua estabilidade térmica, levaram esta classe de
compostos a serem utilizados em diversas áreas, como o seu emprego como corantes
na pigmentação de plásticos, o uso em fotografia colorida, além de poderem ser
utilizadas como sondas de diagnóstico para tumores.
A Zinco Ftalocianina (Figura 5C) é um promissor agente fotossensibilizador de
segunda geração muito utilizado na TFD, visto sua aumentada eficiência na produção
_______________________________________________________________Introdução
18
de oxigênio singlete (SIBATA et al., 2004; OLIVEIRA et al., 2005). Este corante,
insolúvel em meio aquoso, exibe um forte espectro na região do vermelho com um
comprimento de onda máximo em 671 nm.
Alguns derivados de ftalocianinas apresentam baixa solubilidade em solução
aquosa, necessitando de técnicas alternativas, como a sua incorporação a sistemas
carreadores de drogas, para que a disponibilidade destas drogas a sistemas celulares
seja realizada (SIBATA et al., 2004; OLIVEIRA et al., 2005).
1.7. A fonte de luz
Segundo Tomé, a terapia fotodinâmica tem aplicação moderadamente
complexa porque requer não só a dose certa da substância fotossensibilizadora como
também a dose certa de luz para a sua ativação (TOMÉ, 2002). De acordo com
Jacques e colaboradores, cada mol de um determinado tipo de porfirina deve receber
uma determinada quantidade de fótons para que possa transferir energia para o
oxigênio tripleto e iniciar o efeito citotóxico. Portanto é necessário um fornecimento de
luz adequado para o sucesso da terapia (JACQUES et al., 1992).
Assim, a fonte luminosa precisa ter a capacidade de gerar luz com
comprimento de onda adequado e com suficiente intensidade para ativar o
fotossensibilizador, além do que esta fonte precisa ser móvel e dirigível para que
apenas a área alvo seja iluminada.
Embora a maioria das aplicações da TFD esteja associada à luz laser, fontes
de luz não laser têm sido empregadas. (BRANCALEON & MOSELEY, 2002). Além
disso, estudos desenvolvidos na última década indicam claramente que o uso de luz
visível isolada de um fotopolimerizador de resina odontológica não induz nenhum
dano térmico ou fotoquímico à retina (SATROM et al., 1987). Quanto ao operador ou
ao paciente, não há nenhum tipo de dano aos olhos devido à irradiação UV-A ou UV-B
provenientes do próprio equipamento, pelo fato destas potências neste comprimento
de onda serem baixas. Quanto ao custo dos fotopolimerizadores de resina
odontológica, estes apresentam ser inferiores aos laseres disponíveis no mercado
(COOK, 1986).
1.8. Efeitos da TFD
_______________________________________________________________Introdução
19
Os efeitos da TFD são conseguidos através de uma série de eventos fotofísicos
oriundos da excitação do agente fotossensível pela luz, os quais levam à produção de
espécies reativas de oxigênio (basicamente oxigênio singlete), que iniciam uma série
de eventos citotóxicos, induzindo danos a todos os componentes celulares com a
conseqüente morte da célula (COHEN et al., 1974; ROSS et al., 1977; BRASSEUR et
al., 1988; PENNING & DUBBELMAN, 1994).
Devido à limitada migração do oxigênio singlete de seu local de origem ao sítio
de ação, as regiões de localização dos agentes fotossensíveis estão proximamente
relacionadas com a região de ação da TFD. Até 1998, os agentes fotossensíveis mais
seletivos eram, para lisossomas, a Lisil-clorina-p6, para membranas celulares as
porfirinas monocatiônicas e para as mitocôndiras os monômeros de porficeno.
Agentes fotossensíveis que não eram captados pelas células como a uroporfirina são
extremamente ineficientes. Apesar disso, estes compostos apresentam alta produção
de oxigênio singlete. O fato da maioria dos agentes fotossensíveis não se acumularem
no núcleo das células faz com que a TFD tenha geralmente um baixo potencial
causador de danos no DNA que leve a célula a mecanismos de mutação e/ou
carcinogênese. Agentes fotossensíveis que se localizam na mitocôndria (ex.: ácido
aminolevulínico – ALA, precursor da protoporfirina IX), são extremamente capazes de
induzir a apoptose, enquanto que outros agentes localizados na membrana plasmática
facilmente causam necrose após durante a exposição à luz (DOUGHERTY et al.,
1998).
Foi determinado através de estudos bioquímicos que enzimas (monoamino
oxidase e adenilato quinase) podem ser inativadas de maneira dose dependente e luz
dependente de forma temporária ou definitiva pela TFD, utilizando como agente
fotossensível o Photofrin, que é um derivado porfirínico de 1ª geração (MURANT et
al., 1987).
O estudo da inativação de outras enzimas pela TFD, associado a outros
métodos terapêuticos como a hipertermia, mostra uma situação bastante curiosa,
onde certas enzimas são mais facilmente desnaturadas pela hipertermia após TFD
(como a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, uma enzima chave da via glicolítica),
outras são insensíveis (como a amilase) e outras ainda são protegidas da
desnaturação pela hipertermia pós TFD como a mioglobina (PRINSZE et al., 1991).
_______________________________________________________________Introdução
20
Em se tratando de estudos da TFD sobre microrganismos, Shawar e Cooper
(1990) relataram a importância da concentração da droga, sua absorção e sua relação
com a fotossensibilidade de Bacillus subtilis e Streptococcus faecalis, empregando um
derivado de hematoporfirina como agente fotossensível e irradiando as células com
luz visível no espectro do vermelho (λ=630 nm). Os estudos cinéticos conduzidos por
esses autores mostram que a quantidade de droga ligada às células aumenta na
medida em que sua concentração se eleva na mistura de incubação, provavelmente
devido à saturação dos sítios de ligação da droga (SHAWAR & COOPER, 1990).
As respostas celulares de procariotos à fotossensibilização são também
importantes, particularmente, pelo fato do emprego da fotossensibilização no
tratamento de infecções microbianas. Estudos específicos indicam que certas
bactérias orais incluindo Streptococcus mutans e Streptococcus sobrinus, entre
outras, podem ser inativadas após TFD com azul de toluidina e azul de metileno
(WILSON et al., 1993), alumínio ftalocianina dissulfonada (BURNS et al., 1995) ou
Rose Bengal (PAULINO et al., 2005).
Soukos e colaboradores mostraram que o azul de toluidina é citotóxico para S.
sobrinus em concentrações ao redor de 5,0 µg/mL após irradiação com luz lazer de
baixa energia (7,3 mW em laser de Hélio-Neônio), enquanto que o tratamento similar
não afetou a viabilidade de queratinócitos orais, sugerindo que o sistema de TFD pode
ser empregado eficazmente no combate a bactérias causadoras de doenças
periodontais (SOUKOS et al., 1996). Também nesse sentido, Wood e colaboradores
elaboraram um estudo in vitro para testar a TFD (com luz laser) não em uma bactéria
isolada, mas no ecossistema representado pelo biofilme dental, empregando para isso
um sistema removível implantado no dente de voluntários, que permitiu o
estabelecimento de um biofilme. Após um tempo determinado, esse sistema era
removido e submetido à TFD com ftalocianina. Os resultados mostrados por esses
autores incluem a ocorrência de danos à membrana das bactérias e vacuolação do
citoplasma, indicando que a TFD causou sérios danos para a estrutura bacteriana,
sendo um potencial agente no combate a esses microrganismos (WOOD et al., 1999).
O’Neil e colaboradores (2003), a fim de estabelecer comparativamente a
eficácia entre agentes fotossensibilizadores atualmente empregados, investigaram a
ação fotodinâmica de seis diferentes corantes contra S. sanguis, usando um laser de
Hélio-neônio (632,8 nm).
_______________________________________________________________Introdução
21
O uso de corantes derivados de porfirinas (SHAWAR & COOPER, 1990;
MEULEN et al., 1997; ROVALDI et al., 2000) e ftalocianinas (WOOD et al., 1999) tem
sido comprovadamente eficiente no controle de microrganismos Gram positivos,
dentre os quais está incluso o S. mutans.
O desenvolvimento da TFD voltado para a inativação de bactérias tem sido
motivado pela observação do surgimento nos últimos anos, de linhagens de bactérias
altamente resistentes a antibióticos. Diversas investigações têm estabelecido que
bactérias Gram positivas sejam sensíveis à ação fotossensibilizante de uma ampla
variedade de porfirinas e ftalocianinas. Por outro lado, bactérias Gram negativas
possuem uma considerável resistência à fotossensitização, a não ser que seja
aumentada a permeabilidade de sua membrana externa pelo tratamento anterior com
agentes químicos ou biológicos tais como CaCl
2
ou Tris-EDTA (VENEZIO et al., 1985;
SHAWAR & COOPER, 1990).
1.8.1. Mecanismos da TFD em microrganismos
Microrganismos têm desenvolvido efetivas estratégias para otimizar suas
condições de crescimento e sobrevivência. Bactérias têm se adaptado a uma
variedade de formas de resistência ao estresse oxidativo e danos oriundos de um
mundo predominantemente aeróbico. A ocorrência quase que universal de
mecanismos de resistência contra estresse oxidativo, particularmente os provenientes
de espécies reativas de oxigênio (ERO´s), sugerem que a maioria, se não todas as
bactérias, têm que lidar com um ataque oxidativo. A fonte primária do estresse
oxidativo é o metabolismo aeróbio que leva à produção de ERO´s como o peróxido de
hidrogênio, radical superóxido, radical peridroxil, radical hidroxil e uma variedade de
outros metabólitos tóxicos, incluindo peróxidos orgânicos e outros compostos
orgânicos e inorgânicos capazes de transferir elétrons para regiões de dano oxidativo.
Microrganismos anaeróbicos, aeróbicos e inclusive os anaeróbios facultativos estão
sujeitos ao estresse oxidativo freqüentemente como resultado de seus próprios
metabólitos provenientes ou associados ao oxigênio. Dentre as maiores fontes de
estresse oxidativo atuantes contra os microrganismos, destacam-se os agentes de
esterilização e desinfecção utilizados na indústria como o hipoclorito, peróxido de
hidrogênio entre outros (MARQUIS, 2004).
_______________________________________________________________Introdução
22
Algumas proteínas necessárias à manutenção da integridade do DNA, à
fidelidade transcricional, à eficiência traducional e ao “folding” de proteínas
(Chaperoninas), são unicamente identificadas durante o crescimento ácido tolerante
de Streptococcus mutans em pH 5,0 ou quando estas células crescem em pH superior
a 7,0 (LEN et al., 2004). Estas proteínas, denominadas de Heat Shock Protein (HSP)
são conhecidas e sua expressão também se dá em organismos Gram negativos como
a Porphyromonas gingivalis (LEKE et al., 1999).
Assim, o estudo das HSP frente à TFD é importante uma vez que cepas de S.
mutans, quando submetidas à terapia, poderiam desenvolver mecanismos de
resistência ou tolerância ao contato com espécies reativas de oxigênio produzidas.
1.9. Lipossomos
Lipossomos são potenciais sistemas de liberação para uma variedade de
compostos que incluem moléculas de baixo peso molecular como fármacos (inclusive
agentes fotossensíveis), proteínas terapêuticas e agentes para diagnóstico. Eles são
espontaneamente formados quando fosfolipídeos são dispostos em meio aquoso e,
quando isto acontece, deve-se à interação hidrofílica da cabeça polar dos grupos
fosfato com a água, resultando na formação de sistemas multilamelares. Já os
sistemas unilamelares (vesículas) consistem em simples bicamadas lipídicas (Figura
6) em forma esférica, que são parecidas (mimetizam) com membranas biológicas cuja
formação se dá a partir do fornecimento de energia aos sistemas multilamelares
(como por exemplo, sonicação ou extrusão).
Uma variedade de fosfolipídios naturais e sintéticos está disponível para a
preparação de lipossomos e são considerados como bons sistemas carreadores de
drogas (VERMURI & RHODES, 1995).
_______________________________________________________________Introdução
23
Figura 6: Lipossomo: representação de uma vesícula unilamelar cuja fase aquosa é
inteiramente cercada por uma membrana formada por moléculas de fosfolipídeos,
constituindo uma bicamada lipídica.
Embora a TFD esteja sendo usada com sucesso em diversas aplicações
clínicas, seu mecanismo de ação sobre microrganismos patogênicos ainda é pouco
esclarecedor, além do que, a utilização de lipossomos como modelos que permitam
mimetizar situações específicas ocorridas in vivo ou seu uso como sistemas
carreadores é bastante promissor. Assim, os resultados destes estudos são de
importância na pesquisa de novos agentes fotossensíveis a fim de melhorar a
eficiência da TFD (inclusive utilizando-os como carreadores) e o entendimento dos
efeitos citotóxicos de algumas drogas (HOEBEKE, 1995).
________________________________________________________________Objetivos
24
2. OBJETIVOS:
O presente projeto teve como objetivo a padonização e adequação de um
método capaz de promover o controle da bactéria Streptococcus mutans, utilizada
como modelo biológico, através do emprego da terapia fotodinâmica, auxiliada pelo
emprego de uma luz não laser onde os corantes são carreados por sistemas
homogêneos ou micro heterogêneos de lipossomos.
A cárie dental hoje pode ser considerada uma doença de ocorrência mundial,
em especial nos países subdesenvolvidos, o que leva a gastos enormes com o
tratamento de suas conseqüências, fazendo com que sejam necessárias a tomada
de medidas preventivas e/ou curativas com menores gastos. Assim, no presente
projeto foi estudada a TFD associada a diferentes agentes fotossensíveis sobre o
crescimento da bactéria Streptococcus mutans, devido à sua estreita relação com a
cárie e por ser um dos principais organismos responsáveis pelo processo
cariogênico.
Apesar da utilização da TFD no tratamento antimicrobiano estar ainda em
recente estágio de desenvolvimento, esta técnica parece ser muito promissora, em
função do surgimento de microrganismos cada vez mais resistentes a antibióticos
disponíveis (MEULEN et al., 1997).
O projeto engloba estudos bioquímicos visando a utilização de corantes
fotossensíveis compreendendo os seguintes objetivos específicos:
• Padronização de condições ótimas de cultivo de Streptococcus mutans;
• Definição da luz fotoativadora e da(s) droga(s) ideal(is) para o estudo da TFD
em S. mutans;
• Caracterização fotofísica dos corantes empregados;
• Identificação do tempo ideal de incubação das drogas “in vitro”;
• Determinação da localização e quantificação do corante na célula;
• Avaliação do efeito do corante sobre o crescimento de S. mutans com e sem
irradiação;
• Avaliação do efeito do corante em sistemas de lipossomos, com e sem
irradiação;
• Otimização das condições de concentração de corante, potência e tempo de
irradiação com luz fotoativadora sobre as células e/ou sistemas de
________________________________________________________________Objetivos
25
lipossomos;
• Estudo da toxicidade dos agentes fotossensíveis em células bucais;
• Estudos da alteração da capacidade acidogênica da S. mutans após a TFD;
• Avaliação da TFD sobre o biofilme formado por S. mutans;
• Avaliação dos danos provocados pela TFD sobre o DNA bacteriano;
• Avaliação da expressão de Heat shock protein (HSP) por S. mutans após
TFD.
___________________________________________________Resultados e Discussão
26
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Equipamentos utilizados
• Analisador de espalhamento dinâmico da luz: Zetasizer 3000HS
A
, da
Malvern Instruments Ltda
• Bomba peristáltica: Pump P-1, Pharmacia Biotech
• Câmara de Neubauer
• Centrífuga: RC-5, Superspeed Refrigerated Centriguge, Sorval
• Coletor de Frações: Spectrum/Chrom – CF1 Fraction Collector
• Contador de colônias: Phoenix Ind. E Com. Equip. Científicos Ltda –
Araraquara – Brasil
• Espectrofluorímetro: Spectronic SLM 8100
• Espectrofluorímetros: modelo F-4500 da Hitachi e Fluorog 3 da SpexAs
• Espectrofotômetro: Milton Roy, Spectronic, Genesys 2
• Espectrofotômetros de absorção, modelo U-3000 da Hitachi e Lambda 20
da Perkin Elmer
• Estereomicroscópio: Leica; modelo MZ FLIII
• Estufa Microbiológica: Quimis, Modelo Q316B14
• Fotopolimerizador de Resina Odontológica: Dabi Atlante, Modelo Ultralux
(Figura 7)
• Gradiente Maker: SG 100, Hoefer
• Leitor Placa de ELISA: Labsystem
• Osmose Reversa com deionizador: Millipore, modelo Direct-Q
• pHmetro: Marte, Modelo MB10
• Sistema de detecção de luz: Power Meter da Field Master, Coherent, com
uma cabeça de detecção LM-30V
• Sistema purificador de água: Direct-Q, Millipore
• Sonicador de Ponta: Sonics & Materials, modelo Vibra Cell VC 600
• Ultracentrífuga: Hitachi, Himac 70 MX
___________________________________________________Resultados e Discussão
27
3.2. Material utilizado
Todas as soluções aquosas foram preparadas com água ultrapura, obtida
através do sistema Direct-Q (Millipore), com uma filtragem final em membrana de
0,22 µm de diâmetro.
Os reagentes com grau de pureza analítico abaixo relacionados foram
adquiridos dos respectivos fabricantes e empregados nos experimentos:
Corning Star:
Placa de cultura de 24-wells - 3524;
Difco:
Triptic Soy Broth (TSB); Tryptic Soy Agar, Difco (TSA); Doles Reagentes: Kit
para dosagem de glicose - Glucox 500;
Gibco:
Soro Bovino fetal (BSA); Hank's Balanced Salt Solution (HBSS); Meio
Dulbecco's Modified Eagle /Medium F-12 Nutrient medium (DMEN/F1); Dodecil
sulfato de sódio (SDS); Membrana de nitrocelulose; Ditiotreitol (DTT);
Merck:
Ácido clorídrico; Ácido sulfúrico; Azul Tripan; Cloreto de potássio; Cloreto de
sódio; Fluoreto de sódio; Clorofórmio, Dimetilsulfóxido (DMSO);
Dimetilformamida (DMF); Frutose; Glicose; Maltose, 3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-
difenil brometo de tetrazolina (MTT); Piridina; Xilose; Metanol; n-butanol;
Isopropanol; Sacarose; Sulfato de magnésio; Ácido tricloroacético (TCA);
Tiocianato de sódio; Uréia.
Mallinckodt:
Fosfato de potássio monobásico; Fosfato de sódio dibásico;
Millipore:
Membrana estéril de 0,22 µm;
Sigma:
Acrilamida; anticorpo de cabra anti-IgG; Anti-GroEL; Bis acrilamida; Soro
Albumina bovina (BSA); Cloranfenicol; 3,3’-Diaminobenzina (DAB); Coquetel de
inibidor de proteases P-8465; Dipalmitoilfostatidilcolina (DPPC); DNAase; Glass
Beads G8772; Glicerol; Placa de sílica para TLC código Z12,271-8; Protoporfirina
IX (PPIX); Rose bengal (RB); Igepal CA-630; Lisofosfatidil colina (LPC);
Lisozima; Ácido 2-[N-Morfolino]etanosulfônico (MES); Ácido 3-[N-
Morfolino]propanosulfonico (MOPS); Tris (hidroximetil)-aminometano (TRIS);
Tween 20; Zinco ftalocianina (ZnPc),
Synth
: Orcinol;
Os demais reagentes não mencionados foram adquiridos no mercado
nacional e são de alto grau analítico (PA).
___________________________________________________Resultados e Discussão
28
3.3. Streptococcus mutans
3.3.1. Padronização das condições de crescimento de Streptococcus mutans
em meio líquido
A cepa ATCC 25175 de Streptococcus mutans, adquirida da Fundação André
Tosello, foi armazenada (–20ºC) em uma solução 40% (v/v) de glicerol e sua pureza
checada antes do uso através de um inóculo em meio de crescimento. Para cultivar
e avaliar a pureza da bactéria foram utilizados os meios de cultivo TSB ou o TSA e
preparados de acordo com as instruções do próprio fabricante. Para os demais
testes de crescimento bacteriano na presença de diferentes fontes de carbono foi
empregado o meio completo, descrito por Dhasper e Reynolds (DHASPER &
REYNOLDS, 1991). Todos os materiais, carboidratos e meios de cultivo foram
autoclavados a 121ºC durante 20 minutos antes do uso. Os cultivos foram efetuados
em uma jarra de anaerobiose (técnica da vela), a fim de produzir um ambiente
favorável ao crescimento do microrganismo. Para o preparo do inóculo de S.
mutans, a turbidêz inicial das bactérias foi avaliada em um espectrofotômetro e
ajustada inicialmente para A
600nm
=0,5. Para a determinação da contagem dos
microrganismos viáveis em meio líquido, 15 µL de uma suspensão celular
(A
600nm
=0,5) foi inoculada em tubos contendo 4 mL do meio de cultivo (TSB ou Meio
completo) e a contagem inicial de unidades formadoras de colônia por mililitro de
suspensão celular (UFC/mL) foi estimada, após o cultivo das células, através da
contagem realizada em um contador de colônias conforme descrito por Paulino e
colaboradores (PAULINO et al., 2005).
3.3.2. Avaliação do consumo de carboidratos durante o crescimento de S.
mutans
Os carboidratos consumidos durante o crescimento de S. mutans foram
avaliados por cromatografia em camada delgada (TLC) e, especificamente a glicose,
por método enzimático.
A placa de sílica para TLC utilizada (20 x 20cm) foi ativada a 100ºC durante 2
___________________________________________________Resultados e Discussão
29
horas. 0,5 mL de TCA 30 % (p/v) foi adicionado às alíquotas (1 mL) do meio (livre de
células) onde foi realizado o cultivo e em seguida, misturado em vórtex por 1
minuto. Esta solução foi mantida a 4ºC por 12 horas, ocorrendo assim uma
preciptação das proteínas presentes no meio de cultivo. Após este período, as
amostras foram centrifugadas (3.000xg durante 15 minutos) e 50 µL do
sobrenadante foram concentrados (10 vezes) por secagem em sistema de vácuo
para posteriormente ser aplicado na placa de TLC.
Como padrão, 3 µL de glicose ou de xilose (50 mg/mL) ou de uma mistura
destes dois carboidratos (25 mg/mL de cada) foram aplicados à placa. A fase móvel
foi constituída por n-butanol:piridina:água:metanol numa proporção de 7:3:1:0,45
(v/v). Após a corrida cromatográfica, a placa foi seca à temperatura ambiente em
capela de exaustão e em seguida pulverizada com uma solução de Orcinol 0,2%
(p/v) em ácido sulfúrico/metanol (1:1, v/v). A revelação da cromatografia ocorreu em
uma estufa a 150ºC durante aproximadamente 5 a 10 minutos conforme descrito em
Paulino e colaboradores (PAULINO et al., 2003). As imagens foram posteriormente
capturadas em um scanner.
Para a dosagem enzimática de glicose, foi utilizado um kit (Glucox 500). A
glicose foi avaliada quantitativamente no meio de cultivo durante diferentes fases do
crescimento da bactéria e para isto uma curva padrão foi construída com crescentes
quantidades de glicose (0,05 – 0,5 mg/mL) e utilizada para determinar o fator de
conversão (Absorbância em 510 nm por µg de glicose) onde a presença de xilose
não afetou a determinação da glicose por este método.
3.3.3. Determinação do número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC’s)
Para a determinação do número de UFC’s da suspensão bacteriana utilizada
nos experimentos foi empregada a técnica da semeadura em placa (Spread Plate).
Assim, após a realização de cada experimento, as células foram espalhadas (50
µL/placa) com o auxílio de uma alça de Drigalski sobre a placa contendo meio de
cultivo (TSA). Posteriormente foram incubadas, a 37ºC em microanaerobiose,
durante 48 horas para determinação da contagem das UFC’s.
___________________________________________________Resultados e Discussão
30
3.3.4. Avaliação do pH e densidade óptica do meio de cultivo durante o
crescimento de S. mutans
Durante o crescimento da bactéria, para a realização de curvas de
crescimento, a densidade óptica e o pH do meio foram avaliados (a cada 2 horas)
coletando-se para análise alíquotas (2 mL) do meio de cultivo previamente
homogeneizado.
3.3.5. Padronização do crescimento do biofilme de S. mutans
Para se avaliar as melhores condições de crescimento para o biofilme
(carboidrato e inoculo), o meio completo, descrito por Dhasper e Reynolds
(DHASPER & REYNOLDS, 1991), foi previamente autoclavado e usado nos
experimentos com o biofilme.
Cada solução estoque dos açucares (glicose, xilose, sacarose (2 mol/L) e
maltose (1 mol/L)), previamente autoclavada, foi utilizada para complementar o meio
de cultivo. Todos os cultivos ocorreram numa jarra de anaerobiose a 37ºC durante
12 horas.
A bactéria estoque foi submetida a três transferências sucessivas, a cada 24
horas de intervalo em meio TSB, a fim de restabelecer o metabolismo bacteriano
normal.
A turbidêz das células utilizadas como pré-inóculo para o experimento foi
ajustada para A
600nm
=0,5. Para a formação do biofilme o meio líquido completo foi
suplementado com os carboidratos (1% p/v, concentração final) e distribuídos (1
mL/poço) em uma placa de cultura de 24-poços. Foi inoculado em cada poço 15 µL
do pré-inóculo (Abs
600nm
=0,5) para posteriormente ser incubado durante 12 horas,
conforme descrito por Paulino e colaboradores (PAULINO et al., 2003). Após este
período, o meio de crescimento foi removido e cada “poço” foi lavado com PBS
(NaCl 0,13 mol/L, KCl 2,7 mmol/L, Na
2
HPO
4
8,1 mol/L e KH
2
PO
4
1,47 mol/L pH final
de 7,5), seco a temperatura ambiente e as imagens foram capturadas através de um
estereomicroscópio.
___________________________________________________Resultados e Discussão
31
3.3.5.1. Padronização das condições de crescimento de S. mutans na placa de
24 poços (formação do biofilme)
Uma curva de crescimento do biofilme foi realizada para avaliação da melhor
condição de tempo de cultivo a ser adotado para o cultivo do biofilme de S. mutans
em meio completo, suplementado com sacarose (1%, p/v). Assim, em uma placa de
24 poço foi adicionada 1 mL em cada poço de um inoculo que continha 3,75 µL de
S. mutans (Abs
600nm
=0,5) e sacarose 1% (p/v). Este meio de cultivo, após o inóculo,
foi retirado em intervalos subseqüentes de 1 hora (4 poços/ hora). Para isso, 1 mL
do meio de cultivo contido em cada poço foi substituído por 1 mL de uma solução
fluoretada (NaF, 10mmol/L) que interrompeu o crescimento do biofilme nestes
respectivos poçoss. Desta forma, ao final de 6 horas de curva de crescimento, uma
curva, com 6 intervalos diferentes foi obtida e para cada intervalo foi obtido 4 poços
contendo o biofilme formado. Estes biofilmes formados foram levados a um
estereomicroscópio para serem avaliados quanto ao seu melhor tempo de
crescimento onde existiam células confluentes ou não nos respectivos poços.
3.4. Fibroblastos
3.4.1. Condições de crescimento dos Fibroblastos
As cepas de fibroblastos foram obtidas a partir de uma linhagem ATCC CCL-
110 (PAULINO et al., 2005) e mantidas em solução estoque congeladas em
nitrogênio líquido com soro bovino fetal (FBS) e DMSO (9:1 v/v). Após o processo de
descongelamento, os fibroblastos foram crescidos em placas de cultivo com meio
Dulbecco's Modified Eagle /Medium F-12 Nutrient medium (DMEM-F12), o qual foi
preparado de acordo com as instruções do próprio fabricante, filtrado em uma
membrana estéril de 0,22 µm. O meio obtido é ainda enriquecido com FBS 10%,
penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 µg/mL e anfotericina 0,25 µg/mL.
O meio onde foram crescidas as células foi renovado duas vezes por semana
e os fibroblastos foram utilizados quando todas as células estavam completamente
confluentes e alcançaram uma contagem aproximada de 1 x 10
6
células/mL.
___________________________________________________Resultados e Discussão
32
3.5. Preparação da solução estoque dos Agentes Fotossensíveis Utilizados na
TFD
3.5.1. Preparação da solução estoque de Rose bengal
Para os experimentos realizados foi constituída uma solução estoque de Rose
bengal em tampão fosfato salino (PBS) esterilizado em um filtro de 0,22 µm,
resultando numa concentração final de 2 mmol/L. Esta solução foi então
armazenada a uma temperatura de –20ºC até o uso.
3.5.2. Preparação da solução estoque de Protoprofirina IX
Para os experimentos realizados foi constituída uma solução estoque de
Protoporfirina IX 2 mmol/L em solução ácida (HCl 1 mol/L):metanol (1:9, v/v). Esta
solução foi então fracionada e armazenada a uma temperatura de –20ºC até o uso.
3.5.3. Preparação da solução estoque de Zinco Ftalocianina (ZnPc)
Para os experimentos realizados foi constituída uma solução estoque de ZnPc
(3,87 x 10
-4
mol/L) em dimetilformamida:dimetilsulfóxido (1:1, v/v). Esta solução foi
então fracionada e armazenada a uma temperatura de -20ºC até o uso.
3.6. Preparação dos Lipossomos e ZnPc-lipossomos
A fim de se utilizar a ZnPc em meio aquoso, foram empregados os
lipossomos. Estas vesículas foram preparadas por sonicação empregando-se 12,0
mg de DPPC e 1,2 mg de LPC os quais foram dissolvidos conjuntamente em 4 mL
de clorofórmio. A preparação do ZnPc-lipossomo ocorreu da mesma maneira sendo
o corante adicionado a fase orgânica em concentrações crescentes de até 50
µmol/L. Em seguida esta solução foi seca sob uma atmosfera de nitrogênio e após
secagem, 4 mL de PBS (pH 7,4) foram adicionados ao filme obtido, sendo
posteriormente incubado a 60ºC durante 1 hora, com intervalos de uma vigorosa
___________________________________________________Resultados e Discussão
33
agitação a cada 10 minutos. Após este período de incubação, a mistura foi sonicada
por 4 minutos com um sonicador de ponta (240 Watts) e ultra-centrifugada a 100.000
xg durante 20 minutos. O sobrenadante corresponde às vesículas unilamelares
relativamente homogêneas, as quais foram avaliadas através de medidas de
espalhamento de luz e determinação da quantidade de corante incorporado.
3.6.1. Determinação do diâmetro médio dos lipossomos
Para a caracterização dos lipossomos foram realizadas medidas de
distribuição de tamanho de partícula por espalhamento de luz dinâmico (no momento
do uso) e medidas de absorbância em 500 nanômetros para acompanhar a
estabilidade da amostra durante 30 dias.
As medidas de distribuição de tamanho dos lipossomos e ZnPc-lipossomos
foram realizadas empregando-se o equipamento da Malvern Instruments Ltda
(modelo Zetasizer 3000HS
A
) no Laboratório da Profa. Dra. Maria Elizabete
Zaniquelli, no Departamento de Química da FFCLRP-USP. Para cada experimento,
três seqüências de dez medidas foram realizadas.
A quantificação do corante incorporado nas vesículas lipossomais foi
determinada através de medidas de absorção de luz (
671nm
=2,4x10
5
Mol
-1
.cm
-1
) da
amostra, utilizando-se como branco a suspensão contendo o lipossomo sozinho.
3.6.2. Preparação do gradiente isopícnico de densidade de sacarose
Um gradiente continuo de sacarose foi construído (1 – 30% de sacarose em
tampão PBS, com a densidade variando de 1.0381 à 1.1764) utilizando-se para a
montagem do mesmo um Gradient Maker. As amostras de Zinco fitalocianina,
lipossomos e ZnPc-Lipossomos (500 µL) foram aplicadas ao gradiente e
centrifugadas em uma ultacentrífuga (Himac 70 MX) com um rotor vertical Hitachi
P65VT3 a 180.000xg durante 4 horas a 25
o
C. Os gradientes foram fracionados com
auxílio de um coletor de frações (500 µL) e analisados para fosfato inorgânico
conforme descrito por Chen (CHEEN et al., 1956) e para Zinco fitalocianina por
fluorescência (emissão em 680 nm).
___________________________________________________Resultados e Discussão
34
3.7. Caracterização fotoquímica e fotofísica dos agentes fotossensíveis
estudados
Nos estudos espectrofotométricos foram utilizados os espectrofotômetros de
absorção, modelo U-3000 da Hitachi e Lambda 20 da Perkin Elmer, além dos
espectrofluorímetros modelo F-4500 da Hitachi e Fluorog 3 da SpexAs. Todos os
equipamentos dispõem de controle de temperatura e agitação magnética.
Para realizar a análise fotoquímica e fotofísica do ZnPc, utilizou-se uma
amostra (branco) de lipossomos sem droga (lipossomo vazio), constituídos também
de DPPC:LPC, constituídos pela mesma proporção fosfolipídeos.
3.7.1. Determinação espectroscópica de absorção no estado estacionário dos
compostos fotossensíveis Protoporfirina IX e Zinco ftalocianina
Quando uma molécula interage com a radiação eletromagnética, na faixa do
ultravioleta-visível (faixa de comprimento de onda de 200-700 nm), ocorre o
fenômeno denominado absorção. A espectroscopia de absorção está relacionada
com a transição eletrônica das moléculas (Diagrama de Jablonski, Esquema 1) e a
absorção molecular depende da estrutura eletrônica da molécula. A absorção de
energia eletromagnética é quantizada e conduz à passagem de elétrons dos orbitais
do estado fundamental para o estado excitado singlete de maior energia, ou seja, a
radiação que é absorvida tem energia igual à diferença de energia entre os estados
excitado e fundamental. Como resultado da absorção de energia, átomos ou
moléculas passam de um estado de menor energia para um estado de maior energia
(Esquema 1).
Os espectros de absorção UV-Visível geralmente são registrados como
gráficos de Absorbância (A) em função do comprimento de onda (λ), da freqüência
ou número de onda da radiação incidente. Pode-se também construir um gráfico do
coeficiente de absortividade molar (ε) (ou log ε) em função de λ. As características
principais de uma banda de absorção são a sua posição e sua intensidade.
A investigação dos espectros de absorção no estado estacionário da PpIX em
meio homogêneo (tampão fosfato) e da ZnPC em meio lipossomal foram baseadas
___________________________________________________Resultados e Discussão
35
em medidas diretas dos espetros de absorção registrados de 300 a 800 nm em cela
de quartzo com 1,0 cm de caminho óptico. As referências utilizadas nesse estudo
foram tampão fosfato de sódio (pH 7,4) e lipossoma sem a presença do
fotossenssibilizador para os espectros de solução de PpIX e lipossoma de ZnPC,
respectivamente, além disso foram determinados em meios de diferentes
polaridades (Tampão pH 7,4; DMSO; Acetona e Diclorometano) e os valores de
coeficiente de absortividade molar (), na presença de tampão pH 7,4 (PBS).
3.7.2. Determinação dos espectros de emissão de fluorescência no estado
estacionário dos compostos fotossensíveis estudados
A emissão de fluorescência é um processo radioativo no qual uma molécula
excitada perde a energia absorvida sob a forma de emissão de luz após a transição
do estado excitado singlete para o estado fundamental (Diagrama de Jablonski,
Esquema 1). A espectroscopia de emissão de fluorescência pode ser usada para se
obter informações valiosas a respeito de sistemas biológicos sempre de uma
maneira não destrutiva. As técnicas de fluorescência são amplamente utilizadas nos
estudos de estruturas moleculares, interações entre moléculas, sondagem de meio
ambientes com características diversas e análise de traços de materiais. Como
vantagens, uma maior seletividade dos comprimentos de onda de excitação e
emissão, maior sensibilidade de um fóton com concentração de sub-picograma de
material e ampla variedade de métodos de amostragem (soluções concentradas e
diluídas, superfícies sólidas, suspensões, etc).
O estudo de espectroscopia resolvida no tempo foi realizado para os
compostos Protoporfirina IX e Zinco ftalocianina, nas concentrações fixas de 5
µmol/L, uma vez que nestas condições estes compostos estão na forma
monomérica em solução. Com base na análise dos dados espectrais de absorção,
foram determinados os espectros de emissão de fluorescência, usando-se o
comprimento de absorção máxima do corante PPIX (452 nm) em meio homogêneo e
para o corante ZnPC (610 nm) meio lipossomal. Os espectros de emissão de
fluorescência foram registrados dentro da faixa específica entre 600 a 800 nm para
PpIX em meio homogêneo e de 630 a 750 nm para ZnPC em meio lipossomal.
Para cada medida de decaimento foram coletadas em média 4000 contagens.
Todas as medidas foram realizadas na presença de oxigênio (solução em equilíbrio
___________________________________________________Resultados e Discussão
36
com o ar) com agitação e termostatização contínuas à 25º C.
3.7.3. Determinação do rendimento quântico de fluorescência (Φ
F
) dos
compostos estudados
Os rendimentos quânticos de fluorescência foram determinados utilizando
como padrões violeta de cresil em etanol.
O rendimento quântico de fluorescência (Φ
F
)pode ser definido como (LAKOWICZ,
1984):
volumedeunidadeportempodeunidadeporabsorvidoquantaden
volumedeunidadeporetempodeunidadepormoléculasden
o
o
=Φ
F
(Equação 3.1)
Essa quantidade nos informa a relação entre a quantidade de moléculas que
efetivamente fluorescem (nF) e de moléculas que foram eletronicamente excitadas
(N
exc
)
exc
N
nF
F =Φ
(Equação 3.2)
O número de moléculas excitadas é, em princípio, equivalente ao número de
fótons absorvidos.
Nas medidas experimentais de Φ
F
é necessário que haja uma correção prévia
do espectro de emissão do material ou o uso de um padrão que apresente
propriedades semelhantes às da espécie desconhecida (o espectro de emissão da
amostra deve estar na mesma faixa do de emissão do padrão) (DEMAS; CROSBY,
1971). Assim, este método consiste na comparação de áreas sobre os espectros de
emissão de fluorescência corrigidos de uma solução padrão e da amostra em
estudo. A área A é dada por A = Φ
F
DO, onde DO é a densidade óptica da amostra.
Deste modo, o rendimento quântico foi determinado por (Equação 3.3):
padrão
padrão
amostra
padrão
amostra
amostra
padrão
amostra
x
n
n
x
aAbsorbânci
aAbsorbânic
x
Área
Área
φφ
=
(Equação: 3.3)
___________________________________________________Resultados e Discussão
37
Os espectros foram determinados sob as mesmas condições experimentais.
As soluções do padrão e da amostra foram preparadas numa concentração que
assegurasse uma absorbância de 0,1 no comprimento de onda de excitação (λ
exc
=
600 nm para o violeta de cresil, λ
exc
= 577 nm para PPIX e λ
exc
= 610 nm para
ZnPC).
Foram utilizados como padrões solução de violeta de cresil em etanol (Φ
F
=
0,54) e solução de ZnPC em etanol (Φ
F
= 0,28). A seguir, foi traçado o espectro de
emissão corrigido de cada sistema estudado, sendo determinada a área sob as
curvas (600 a 800 para PPIX e 630 a 750 nm para ZnPC).
3.7.4. Determinação do espectro de absorção resolvido no tempo
A fotólise por pulso de laser é uma técnica muito utilizada para o estudo de
processos fotoquímicos primários. A técnica é muito utilizada para estudos de
características de emissão e absorção de espécies transientes.
O método de fotólise por pulso de laser consiste na excitação de uma amostra
por um pulso de luz de alta intensidade (luz laser) o qual é absorvido pela amostra.
Nestas condições formam-se intermediários (ou espécies transientes) de vida curta
como as espécies excitadas, os radicais e os íons em altas concentrações. A técnica
envolve a irradiação de uma amostra com um pulso de curta duração e alta energia
de uma luz laser monocromático monitorando-se as mudanças na densidade óptica
das espécies presentes de µs a ms.
Esse espectro mostra a diferença entre as absorções do transiente e do
precursor (estado estacionário) e podem ajudar na identificação de espécies
excitadas.
A técnica de fotólise por pulso de laser possui várias vantagens como a
possibilidade de ser aplicada a gases, líquidos (soluções) e sólidos, na presença ou
ausência de oxigênio. Sua alta sensibilidade permite o estudo de intermediários com
concentrações muito pequenas utilizando-se amostras diluídas e/ou volume
pequeno nas cubetas. Além disso, a identificação de intermediários pode ser feita
através do espectro se as bandas de absorção forem separadas e caracterizadas e
sua investigação pode ser feita na região de nano e picosegundos.
___________________________________________________Resultados e Discussão
38
Entretanto, a técnica de fotólise por pulso de laser apresenta algumas
limitações onde a amostra deve ser opticamente clara e transparente para o
monitoramento da luz. A presença de espalhamento de partículas deve ser evitada,
e a absorbância da solução deve ser ajustada de modo a aumentar a eficiência da
luz de monitoramento. Seu intermediário reativo não deve possuir absortividade
molar baixa. Além disso, a falta de detalhes no espectro de absorção pode tornar a
identificação quase impossível e a determinação de parâmetros cinéticos pode ser
difícil, especialmente para intermediários de vida muito curta.
Os principais componentes do espectrômetro para medidas de fotólise por
pulso de laser são: fonte de excitação (laser), fonte de análise (usualmente uma
lâmpada de Xenônio operando em modo contínuo (CW) ou pulsado), compartimento
de amostra e célula de amostra, monocromador ou filtros de análise, detector de
análise (usualmente um tubo de fotomultiplicadora ou fotodiodo de Silício), um
registrador de transiente de alta velocidade (usualmente um osciloscópio analógico
para registro dos dados) e um computador (para controle do experimento,
armazenagem do sinal e processamento dos dados).
Os estados excitados triplete dos fotossenssibilizadores PPIX em meio
homogêneo (tampão fosfato pH 7,4) e ZnPC em meio lipossomal foram gerados e
estudados por fotólise por pulso de laser. Os experimentos foram realizados
utilizando-se como fonte de excitação o terceiro harmônico (355 nm) do laser
pulsado de Nd-YAG da Continuum, modelo SURELITE I-10. Os estudos para
obtenção dos decaimentos das espécies triplete geradas e os espectros de
absorção dos transientes foram realizados numa concentração tal que a absorbância
fosse aproximadamente 0,3 num comprimento de onda de 355 nm para todas as
soluções analisadas.
Os comprimentos de onda utilizados para o monitoramento de emissão foram
de 452 nm para PPIX e 480 nm para ZnPC. Como resposta do sistema laser
computadorizado, obtêm-se um gráfico de decaimento experimental, ou seja, a
variação da densidade óptica em função do tempo, bem como a curva que simula o
decaimento observado.
___________________________________________________Resultados e Discussão
39
3.7.5. Determinação do rendimento quântico de produção de oxigênio singlete
(Φ
∆
)
Neste estudo, utilizou-se o método direto para determinar-se o tempo de vida
(τ
∆
) e o rendimento quântico de produção do oxigênio singlete (Φ
∆
) gerados pelo
fotossensibilizador PPIX em meio homogêneo e ZnPC em meio lipossomal. Os
valores de Φ
∆
foram obtidos relativamente ao feoforbide-a em etanol (Φ
∆
= 0,59).
Os experimentos foram realizados em uma fonte de excitação utilizando o
terceiro harmônico (355 nm) de um laser pulsado de Nd-YAG do Continuum, modelo
Surelite I-10. As soluções analisadas foram preparadas em seus respectivos meios
de estudo, assegurando que no comprimento de onda de 355 nm a absorbância
fosse da ordem de 0,3. As soluções foram acondicionadas em cubetas de
fluorescência adaptadas para deaeração da amostra. Todas as soluções analisadas
foram saturadas com O
2
durante 30 minutos antes da análise. Como resposta do
sistema laser computadorizado, obteve-se um gráfico da variação de intensidade de
fosforescência em 1270 nm em função do tempo, bem como a curva com ajuste
exponencial que melhor simulava o decaimento observado.
Nos estudos para determinação de produção de oxigênio singlete para os
dois corantes estudados foi utilizado o composto feoforbide-a que apresenta um alto
valor de rendimento quântico de oxigênio singlete (
= 0,59). Os tempos de vida
de oxigênio singlete foram determinados através da transferência de energia entre o
estado excitado triplete do fotossenssibilizador e o oxigênio molecular presente no
meio.
A intensidade máxima de fosforescência no tempo 0 foi determinada pela
regressão exponencial e os tempos de vida de oxigênio singlete foram determinados
pelo tratamento do ajuste da curva.
___________________________________________________Resultados e Discussão
40
3.8. Constituição, descrição e montagem do fotopolimerizador de resina
odontológica e caracterização espectral da luz emitida
O fotopolimerizador de resina odontológica (Figura 7), utilizado neste trabalho
como fonte de luz fotossensibilizante, possui uma lâmpada halógena (Figura 7A)
emissora de uma luz que, ao passar por um filtro (Figura 7B) acoplado ao suporte
(C2), se condensa a uma banda mais estreita de luz, de comprimento de onda de
400 a 500 nm (filtro original do equipamento) ou 600 a 700 nm (filtro adaptado) a
qual é conduzida através de uma ponteira (Figura 7D).
Figura 7: Fotopolimerizador de resina odontológica conforme descrito no Depósito de
Patente nº: PI 0404223-9 (PAULINO et al., 2004b): Fotopolimerizador manual de resina
odontológica com ponteira autoclavável (D), vista lateral do suporte filtro luz (C1), vista
frontal do suporte filtro de luz (C2), compartimento lâmpada halógena (A), filtro de luz (B) e
setup de alimentação (E).
Ambas as faixas de transmitância foram determinadas através de um espectro
de varredura dos filtros a qual foi realizada em um espectrofotômetro (Spectronic,
Genesys 2) utilizando-se uma faixa de varredura de 300 a 800 nm com 2 nm de
intervalo de leitura.
A potência da luz emitida pelo equipamento foi previamente estabelecida em
um comprimento de onda respectivo ao espectro máximo de absorção de cada
corante. Desta forma, a irradiação foi realizada num sistema (Power Meter - Field
Master, Coherent, com uma cabeça de detecção LM-30V) onde, para o uso do
equipamento, a ponteira do fotopolimerizador foi acoplada a um tubo de ensaio (120
x 12 mm) adaptado uma distância de 11 cm do sistema de detecção de luz. Este
tubo, quando utilizado para os experimentos de TFD, foi revestido com papel
A
C1
C2
B
E
D
___________________________________________________Resultados e Discussão
41
alumínio e posicionado de forma que a suspensão celular ficasse também a 11 cm
da ponteira do fotopolimerizador na sua extremidade inferior, assim como
posicionado para os sistemas de detecção de luz.
3.9. Aplicação da Terapia fotodinâmica (TFD)
3.9.1. Avaliação dos efeitos citotóxicos da TFD aplicada ao S. mutans na
presença ou ausência de diferentes agentes fotossensíveis
Antes da incubação com diferentes concentrações de Rose Bengal (0 a 50
µmol/L), Protoporfirina IX (0 a 50 µmol/L) e ZnPc (0 a 8,14µmol/L), a suspensão
bacteriana (10
9
UFC/mL) foi serialmente diluída em PBS para a obtenção de 10
3
UFC/mL. Após este procedimento, parte da preparação foi submetida ao controle de
toxicidade no escuro e também pela fonte de luz. A outra parte da suspensão foi
submetida ao experimento de morte celular com a adição de diferentes
concentrações dos corantes em diferentes tubos de ensaio protegidos da luz
ambiente. Assim, sob uma agitação branda, durante 10 minutos, as bactérias foram
pré-incubadas e posteriormente irradiadas (30 segundos).
Após este tempo de irradiação, 50 µL da suspensão celular (com ou sem
células tratadas com os corantes) de todas as amostras (inclusive o controle) foram
espalhados diretamente em placas de Petri contendo meio TSA; as placas foram
protegidas da luz, colocadas em uma jarra de anaerobiose e incubadas a 37ºC por
36 horas (Figura 8). Em seguida foi avaliado o número de UFC/mL.
___________________________________________________Resultados e Discussão
42
Figura 8: Fluxograma de eventos da metodologia aplicada para o emprego da TFD em S.
mutans.
3.9.2. Avaliação da formação de biofilme após TFD
A capacidade de formação do biofilme foi avaliada após a exposição das
células (constituintes de um biofilme) à TFD, em sua fase inicial de crescimento (2
horas). Assim, para a realização dos experimentos, a bactéria estoque foi submetida
a três repiques sucessivos, e inoculada em meio completo (conforme descrito no
item 3.3.5.1) enriquecido com sacarose 1 % (p/v). Para o crescimento do biofilme, a
placa contendo o inóculo (Corning Costar) foi levada à estufa (37ºC, microaerofilia)
durante 2 horas. Em seguida a placa foi retirada da estufa para a realização da troca
do meio de cultivo (onde havia crescido o biofilme inicial) por uma solução salina
(PBS) contendo separadamene Rose bengal, Protoporfirina IX ou Zinco Ftalocianina
com 0,5; 0,2 e 3,72 µmol/L, respectivamente.
Imediatamente após a adição dos corantes, foi realizada a irradiação do
biofilme (30 segundos) com o auxílio do fotopolimerizador de resina odontológica.
Após a irradiação, a solução com os corantes foi retirada e novamente substituída
por um novo meio de cultivo completo suplementado com 1 % (p/v) de sacarose.
Assim, por mais 2 horas, o biofilme foi mantido sob crescimento. Após este período,
o meio de crescimento foi removido e cada “poço” foi lavado com PBS, seco a
temperatura ambiente e as imagens foram capturadas através de um
estereomicroscópio.
3.9.3. Avaliação dos efeitos citotóxicos da TFD aplicada nos fibroblastos na
presença ou ausência de diferentes agentes fotossensíveis
S. mutans
10
3
UFC/mL
Distribuído em tubos (1 mL)
Diluído com PBS
10 minutos incuba
ç
ão
Célula + Corante
Sem irradiar
Irradiação com
fotopolimerizador
Toxicidade
“per se”
Controle de contaminantes
Controle
de células
S. mutans
10
9
UFC/mL
Abs
600
= 0,5
Avaliação da
toxicidade
Células controle
Sem corante
Sem luz
Toxicidade da
luz emitida
Toxicidade
após TFD
Células na presença do agente fotossensível
___________________________________________________Resultados e Discussão
43
Para a realização deste experimento, 1,0 x 10
6
células foram crescidas em
meio DMEM-F12 como descrito por Paulino e colaboradores (PAULINO et al., 2005).
As células foram isoladas por centrifugação e lavadas duas vezes com HBSS. A
concentração inicial de células usadas em todos os experimentos foi de 0,7 x 10
6
células/mL em HBSS. 1 mL desta suspensão de foi distribuída em tubos de ensaio
(120 x 12 mm). Após isto, parte foi separadamente submetida ao controle de
toxicidade do corante e da luz per se. Uma outra parte da suspensão celular foi
submetida ao experimento de irradiação com adição de diferentes concentrações de
Rose Bengal (0 a 50 µmol/L), Protoporfirina IX (0 a 20 µmol/L) e Zinco ftalocianina
(meio lipossomal com 0 a 8,14 µmol/L) em diferentes tubos (120 x 12 mm). Sob
suave agitação as células foram incubadas por 10 minutos, assim como feito para o
S. mutans, com subseqüente irradiação com o fotopolimerizador durante 30
segundos. Após estes procedimentos, as células foram centrifugadas e
ressuspensas em meio de cultivo DMEM/F-12.
Em seguida a cultura ressuspensa foi levada a uma incubadora de CO
2
e a
viabilidade celular foi avaliada a partir da técnica do MTT ou Azul Tripan, conforme
descrito a seguir.
3.9.4. Determinação da viabilidade celular
3.9.4.1. Ensaios com Azul Tripan
A solução azul tripan na concentração de 0,1 % (p/v) foi preparada e
posteriormente filtrada em um filtro 0,22 µm. A suspensão celular foi diluída na
proporção 1:1 (v/v) com o corante. Após 10 minutos de incubação esta suspensão
foi diluída apropriadamente em solução salina (PBS) para permitir uma fácil
contagem de células em cada campo de uma câmara de Neubauer, possibilitando-
se assim estimar a relação que há entre as células viáveis e as células lisadas.
3.9.4.2. Ensaios com MTT
A viabilidade celular foi determinada utilizando-se ensaio com 3-(4,5-dimetil
tiazol-2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazolina (MTT), (KAWADA et al., 2002). O teste é
baseado na capacidade de células viáveis a reduzirem a base de tetrazolina a um
produto azul, denominado formazam (MOSMMAN, 1983).
___________________________________________________Resultados e Discussão
44
As células, após o crescimento em estufa, foram homogeneizadas no próprio
meio de cultivo (1,0 mL). Em seguida, 1,0 mL da solução de MTT (0,5 mg/mL) foi
adicionado a cada poço e incubados a 37ºC durante 4 horas.
Ao final do período de incubação, o meio pode ser removido e o corante
formado no fundo do poço (formazam) foi dissolvido com 300 µL de isopropanol
(0,04 mol/L HCl em isopropanol absoluto). A solução foi repipetada pelo menos 3
vezes para garantir uma completa dissolução do corante em isopropanol. A
absorção (em 570 nm) da solução resultante foi medida com uma subtração de um
branco (650 nm). Para estas leituras foi utilizado um leitor de ELISA da Labsystem.
3.9.5. Pulso de carboidratos para avaliação da capacidade acidogênica de S.
mutans
Foi avaliada a capacidade de bactérias em meio planctônico de acidificar o
meio após a adição de uma fonte de carbono. As células foram crescidas em
microaerofilia no meio completo, acrescido de glicose (50 mmol/L) até que a
densidade óptica alcançasse um valor aproximado de 1. Este meio de cultivo
contendo as células foi então centrifugado (3.000 xg, 20 minutos) e lavado duas
vezes em tampão salino (NaCl 0,9 %). Finalmente, ao final das duas lavagens, as
células foram novamente centrifugadas e o pellet foi ressuspenso no mesmo
tampão, sua densidade óptica corrigida para 1,0 (Abs
600 final
=1,0) e o pH estabilizado
em aproximadamente 6 – 7 com uma solução de hidróxido de potássio 0,1 mol/L.
Em seguida estas células foram submetidas a diferentes condições experimentais:
• avaliação da variação do pH sem adição de nenhuma fonte de carbono;
• avaliação da variação do pH sem suplementação com fonte de carbono e
suplementado com fluoreto de sódio (1 mmol/L);
• avaliação da variação do pH de suspensão suplementada separadamente com
glicose, frutose, sacarose, maltose e xilose (50 mmol/L),
• avaliação da variação do pH de uma suspensão suplementada separadamente
com glicose, frutose, sacarose, maltose e xilose (50 mmol/L) e acrescido de
fluoreto de sódio (1 mmol/L)
Assim, após a prévia incubação, o pH destas suspensões celulares foi
avaliado, sob agitação constante, durante 600 segundos e, com os dados coletados
___________________________________________________Resultados e Discussão
45
foi construído um gráfico onde são representadas as variações de pH durante o
tempo em relação ao pH inicial usando a seguinte fórmula:
∆pH = pH (tempo
zero
) – pH (Tempo
600 - X
); para X ≤ 600 segundos.
3.9.6. Pulso de glicose para avaliação da capacidade acidogênica de S. mutans
após TFD
Conforme metodologia descrita, uma nova suspensão celular foi produzida
para avaliar a capacidade acidogênica do S. mutans após a TFD.
Em seguida estas células foram submetidas a diferentes condições
experimentais:
• avaliação da variação do pH sem adição de glicose, grupo controle sem
glicose;
• avaliação da variação do pH após suplementação da suspensão celular com
glicose (50 mmol/L final), grupo controle com glicose;
• avaliação da variação do pH após prévia incubação com Rose bengal (0,5
µmol/L) ou Protoporfirina IX (0,2 µmol/L) ou ZnPc-lipossomo (3,78 µmol/L),
irradiados com luz proveniente do fotopolimerizador de resina odontológica
(filtro de 400 – 500nm para o Rose Bengal e Protoporfirina IX; filtro de 600-
700nm para a ZnPc-lipossomo) e acrescidos com 50 mmol/L final de glicose,
para avaliação da TFD sobre a capacidade acidogênica;
• avaliação da variação do pH sem glicose e com uma irradiadiação de 30
segundos com luz proveniente do fotopolimerizador de resina odontológica,
(filtro de 400-500 nm ou 600-700 nm), para avaliação do efeito da luz;
• incubado com Rose bengal (0,5 µmol/L) ou Protoporfirina IX (0,2 µmol/L) ou
Zinco ftalocianina (3,78 µmol/L), incubados previamente por 10 minutos sem
uma posterior adição de carboidrato, para avaliação do efeito per se dos
agentes fotessensíveis.
Assim, cada grupo, após a prévia incubação,foi submetido a uma irradiação
(30 segundos) com luz proveniente do fotopolimerizador (exceto controles sem luz),
e acrescido de glicose (50 mmol/L final). Imediatamente, sob agitação constante, os
grupos foram monitorados quanto a sua capacidade acidogênica durante 600
segundos (avaliação da variação do pH).
___________________________________________________Resultados e Discussão
46
Desta forma foi construído um gráfico onde são representadas as variações
de pHdurante o tempo em relação ao pH inicial conforme descrito no item anterior.
3.10. Obtenção das frações microssomais de membrana de Streptococcus
mutans
As frações de membrana rica em H
+
-ATPase foram obtidas de acordo com a
metodologia descrita por Bender e colaboradores (BENDER et al., 1986) com
algumas modificações detalhadas a seguir.
Para a preparação das células, um inóculo de 4 mL de uma cultura de 12 horas
de S. mutans (meio completo suplementado com 50 mmol/L glicose) foi realizado em
1,0 litro deste mesmo meio de cultivo estéril. O crescimento bacteriano foi
monitorado até que o pH do meio de cultivo alcançasse um valor de
aproximadamente 4 (equivalente a fase estacionária de crescimento deste
microrganismo).
Ao final do crescimento, as células foram retiradas do meio por centrifugação
(9.000 xg, 10 minutos, 20ºC) em centrífuga sorval e o pellet obtido foi pesado. Cerca
de 1,0 g (peso úmido) de células de Streptococcus mutans foram lavadas duas
vezes com 15 mL de PBS e seguido por uma nova centrifugação (9.000 xg, 10
minutos, 20º C). O pellet obtido foi ressuspenso em tampão MES 25 mmol/L, pH 6,2
contendo 97 mol/L de NaSCN (Tampão de Preparação) até absorbância de 0,4 em
700 nm, homogeneizado em potter e em seguida foi adicionado 0,4 mg/mL de
lisozima. A mistura foi deixada por 3 horas a 25
o
C com suave agitação e em seguida
centrifugada a 9.000xg por 20 minutos a 4
o
C. O pellet obtido foi ressuspenso em 50
mL de Tampão MES 50 mmol/L, pH 6,2 contendo 10 mmol/L de MgSO
4
e 0,8 mol/L
de NaCl (Tampão de Choque Osmótico).
Esta solução foi sonicada por 20 minutos, com intervalos de 5 em 5 minutos
para manter a temperatura por volta de 4
o
C, utilizando-se um sonicador de ponta
Vibracell 600V, a 50% de amplitude. Em seguida foram adicionados 175 U/mL de
DNAase e 250 µL/g de célula de coquetel de inibidor de proteases e deixado por 45
minutos à temperatura ambiente com agitação suave. O material assim obtido foi
ultracentrifugado a 100.000xg por 1 hora a 4
o
C. O pellet que corresponde a fração
de membrana rica em H
+
-ATPase foi ressuspenso em tampão MES 25 mmol/L pH
6,2, a concentração de proteína foi estimada (HARTREE, 1972) e em seguida as
___________________________________________________Resultados e Discussão
47
membranas foram novamente tratadas com lisozima em uma proporção de 1:1 (p/p)
por 2 horas à temperatura ambiente com agitação suave. Essa solução foi
novamente ultracentrifugada a 100.000xg por 1 hora a 4
o
C e ressuspensa em 30 mL
de Tampão de Choque Osmótico e mantida em geladeira durante 12 horas .
Em seguida a mistura foi retirada da geladeira e colocada em banho de
ultrassom por 1 hora. Essa mistura foi então centrifugada (9.000 xg, 10 minutos,
4ºC) e o sobrenadante obtido fopi recolhido e ultracentrifugado (100.000xg por 1
hora a 4
o
C). O pellet obtido foi ressuspenso em 15 mL de tampão Tris.HCl 50
mmol/L, pH 7,5 contendo 10 mmol/L de MgSO
4
(Tampão de Estoque). As frações de
membrana foram imediatamente aliquotadas para serem utilizadas ou congeladas
em nitrogênio líquido para serem armazenadas a –20
o
C.
3.11. Quantificação da proteína
A concentração de proteína foi estimada de acordo com o método de Hartree
(HARTREE, 1972) na presença de SDS 2% (p/v) utilizando-se albumina bovina
(BSA) como padrão.
3.12. Influência da TFD sobre a atividade ATPase total de fração microssomal
de membrana de S. mutans
A atividade ATPase total da membrana de S. mutans ou a atividade ATPase da
membrana após tratamento com TFD com os diferentes corantes foi determinada
descontinuamente, a 37
o
C, em um espectrofotômetro, através da dosagem do
fosfato inorgânico liberado em meio reacional Bis.Tris 50 mmol/L, pH 6,5 (atividade
ATPase total), contendo ATP 5 mmol/L, e MgCl
2
10 mmol/L em volume final de 1,0
mL.
Para a realização da TFD, a fração microssomal de membrana foi previamente
tratada com Rose Bengal, Protoporfirina ou Zinco ftalocianina (0,05; 0,02 e 0,37
µmol/L, respectivamente) separadamente e imediatamente irradiada (90 segundos)
pela luz emitida pelo fotopolimerizador de resina odontológica.
A reação foi sempre iniciada pela adição de ATP ao meio reacional e
interrompida pela adição de solução gelada de TCA 30% (p/v), em tempos
reacionais preestabelecidos (MAGALHÃES et al., 2005).
___________________________________________________Resultados e Discussão
48
Durante a irradiação e após o término da reação, os tubos foram mantidos em
banho de gelo, diminuindo a hidrólise do ATP. Ao término da reação, os tubos foram
imediatamente centrifugados por 10 minutos e, em seguida, efetuada a dosagem de
fosfato, seguindo o método descrito por Heinonen e Lahti (HEINONEM & LATHI,
1981). Em cada experimento foram incluídos controles sem a enzima, para se
estimar a hidrólise não enzimática do substrato e das amostras contendo somente
corantes, estimando-se assim a absorção de luz por estas espécies. Tubos com
enzima, sem corante e com luz e com corante e sem luz foram avaliados também
para determinação do efeito per se da luz e da droga sozinhos. As determinações
foram sempre feitas em duplicatas e tomando-se o cuidado de não hidrolisar mais
que 5% de substrato. Uma unidade de enzima foi definida arbitrariamente como
sendo 1 nmol de fosfato liberado por minuto, nas condições padrões do teste.
3.13. Expressão e análise de proteínas de estresse (Heat Shock Protein – HSP)
em S. mutans após TFD
3.13.1. Cultivo e tratamento das células
Para o crescimento das bactérias, um inóculo (3,75 µL/mL) foi realizado em
1,0 litro de meio completo estéril, suplementado com 50 mmol/L de glicose e
tamponado com 50 mmol/L de MOPS. Este meio de cultivo foi então mantido em
estufa microbiológica (37ºC), sob agitação suave, durante 8 horas, até que o pH do
meio de cultivo alcançasse um valor aproximado de 6,7 com uma densidade ótica de
± 1.
Após o crescimento, o meio de cultivo foi fracionado em 3 frascos (200 mL
cada) para avaliação da:
• capacidade de indução ao estresse per se do corante Rose bengal (0,1
µmol/L) sem a irradiação com luz;
• capacidade de indução ao estresse per se da luz (120 segundos) sem a
adição de um agente fotossensível.
• capacidade de indução ao estresse após emprego da TFD com Rose bengal
(0,1 µmol/L) e com 120 segundos de irradiação com a luz.
Além disso, outros 2 frascos contendo 200 mL de meio de cultivo foram
utilizados como controle negativo para cepa não irradiada e sem o corante (controle
___________________________________________________Resultados e Discussão
49
de estresse negativo) e como controle positivo para uma cepa estimulada a produzir
HSP após a adição de 1 mol/L de cloreto de sódio (estresse osmótico).
Após os respectivos tratamentos citados, as células foram novamente levadas
à estufa microbiológica (37ºC, microaerofilia) por 5 minutos e posteriormente foi
adicionado cloranfenicol (1 mmol/L) afim de interromper a síntese protéica das
células tratadas.
Estas amostras foram mantidas a 4º C e centrifugadas (9.000 xg) durante 30
minutos, o pellet foi ressuspenso em PBS (suplementado com 1mmol/L de
cloranfenicol) duas vezes para lavagem.
3.13.2. Lise bacteriana para obtenção de proteínas de estresse (Heat Shock
Protein – HSP) de S. mutans
Os pellets obtidos foram pesados e ressuspensos em tampão de lise
bacteriana (Uréia 8 mol/L, DTT 62 mmol/L e Igepal 2% (v/v)) numa proporção de 5
mL de tampão de lise para cada 1 grama de célula na presença de pérolas de vidro
(p/p) (Glass Beads).
Em seguida, as células foram sonicadas (5 minutos) com sonicador de ponta
(220 Watts) em banho de gelo. Ao final do procedimento as células foram vortexadas
vigorosamente durante 10 minutos. Os tubos contendo o material lisado foram
centrifugados (20 minutos, 3.000xg) para separar células não lisadas e as pérolas de
vidro do sobrenadante. O sobrenadante foi coletado e a concentração de proteína foi
estimada conforme descrito no Item 3.11.
3.14. Análise por SDS-PAGE e “Western Blotting”
A determinação do peso molecular das proteínas foi obtida por SDS-PAGE
como descrito por LAEMMLI (1970). Resumidamente, 5% de poliacrilamida foi usada
para o gel de empacotamento e 7,5% para o gel de corrida. O gel foi corado pela
prata para visualização do perfil protéico. “Western Blotting” foi realizado por
transferência das bandas protéicas para uma membrana de nitrocelulose (2 horas,
300-400 mA). A membrana foi tratada com solução bloqueadora (PBS, contendo 5%
(p/v) de leite em pó desnatado e 0,05% (v/v) Tween 20) por 1h e sondada com
anticorpo Anti-GroEL (1:1000) em solução bloqueadora por 2 horas a 4°C. A
___________________________________________________Resultados e Discussão
50
membrana de nitrocelulose foi lavada com PBS-tween 20 (0,05%) durante 30
minutos em constante agitação e posteriormente incubada com anticorpo de cabra
anti-IgG (GAR) conjugado a peroxidase (diluição 1:1000) por 1,5 h. Novamente a
membrana de nitrocelulose foi lavada com PBS-tween 20 (0,05 % p/v) por 30
minutos em constante agitação, revelada (DAB e peróxido hidrogênio 30% (v/v)) e
bloqueada com água destilada. Em seguida a imagem foi capturada e digitalizadas
em Scanner.
3.15. Estudos de peroxidação lipídica em S. mutans: ação sobre a fração de
membrana e em bactérias em meio planctônico
3.15.1 Fração de membrana
As frações de membrana obtidas (Item 3.10) foram submetidas a um prévio
tratamento com a TFD. Assim, 100 µL da fração obtida foi tratada com os agentes
fotossensíveis Rose bengal, Protoporfirina IX e ZnPc-lipossomo nas concentrações
finais de 0,5; 0,2 e 3,78 µmol/L, respectivamente. Em seguida, as amostras foram
irradiadas (30 segundos) e a atividade enzimática foi avaliada conforme descrito no
item 3.12.
Os grupos foram preparados conforme descrito abaixo:
- Grupo experimental: suspensão celular tratada com os agentes fotossensíveis,
seguidos pela irradiação de luz.
- Grupo controle positivo: fração de membrana foi tratada com peróxido de
hidrogênio (0,5 mmol/L) e Sulfato de ferro II (1mmol/L), produzindo peróxidos
reativos (reação de Fenton, Equação 3.4)
•
+
+
⇔+
−++
HOOHFeOHFe
3
22
2
(Equação 3.4)
- Amostra branco: fração de membrana não tratada com TFD ou peróxidos (via
reação de Fenton).
Ao final do tratamento (Fenton ou TFD), adicionou-se 50 µL de uma solução
de ácido fosfórico 7% (v/v) e 100 µL de uma solução de ácido Tiobarbitúrico 1% (em
NaOH 50 mmol/L), homogenizou-se em seguida deixando durante 10 minutos. Em
seguida a solução foi aquecida (95º C durante 15 minutos). Após esfriar, os valores
de absorbância foram coletados em 532 nm.
___________________________________________________Resultados e Discussão
51
3.15.2. Bactérias em meio planctônico
Células íntegras de S. mutans, cultivadas por 12 horas em meio de cultivo
líquido (TSB) foram centrifugadas a 3.000xg para a obtenção de um pellet
bacteriano que foi posteriormente lavado em solução PBS (2 lavagens) para
novamente ser centrifugado.
O pellet obtido foi ressuspenso em um tampão PBS até concentração de 0,5
(Abs
600nm
). Estas suspensão celular foi então tratada com os agentes fotossensíveis
Rose bengal, Protoporfirina IX e ZnPz-lipossomo com as concentrações finais de
0,5; 0,2 e 3,78 µmol/L, respectivamente.
Posteriormente, estas células foram irradiadas com a luz proveniente do
fotopolimerizador de resina odontológica, com os filtros de luz respectivos aos
corantes empregados, durante 30 segundos.
Os grupos foram preparados conforme descrito abaixo:
- Grupo experimental: suspensão celular tratada com o agente fotosenssível,
seguido pela irradiação de luz.
- Grupo controle positivo: suspensão celular, tratada com peróxido de hidrogênio
(0,5 mmol/L) e Sulfato de ferro II (1 mmol/L), produzindo peróxidos reativos (reação
de Fenton)
- Amostra branco: suspensão celular, não tratada com TFD ou peróxidos (via reação
de Fenton).
Ao final do tratamento (Fenton ou TFD), adicionou-se 50 µL de uma solução
de ácido fosfórico 7% (v/v) e 100 µL de uma solução de ácido Tiobarbitúrico 1,0 %
(p/v) preparada em NaOH 50 mmol/L, homogenizou-se para em a solução foi
mantida em repouso durante 10 minutos. Em seguida, a solução foi aquecida (95ºC
durante 15 minutos). Após esfriar, os valores de absorbância foram avaliados em
532 nm.
3.16. Efeito da terapia fotodinâmica sobre o DNA de S. mutans
3.16.1. Emprego da TFD sobre as células
Uma suspensão celular (Abs
600nm
= 0,5) em PBS foi tratada com os agentes
fotosensíveis Rose bengal, Protoporfirina IX e ZnPc-lipossomo nas respectivas
concentrações de 0,5; 0,2 e 3,78 µmol/L. Posteriormente foram irradiadas (30
___________________________________________________Resultados e Discussão
52
segundos) com a luz proveniente do fotopolimerizador de resina odontológica
(utilizando-se para isso os filtros de luz correspondentes aos agentes
fotossensíveis).
Em seguida estas células foram centrifugadas (3.000xg) e o pellet foi
submetido à extração do DNA genômico.
3.16.2. Extração de DNA genômico bacteriano
O DNA genômico das amostras foi extraído pelo método descrito por Pitcher
(PITCHER, 1989). O crescido bacteriano foi incubado a 37ºC por 30 minutos em
uma solução contendo solução tamponante TE (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA) pH
8,0, contendo sacarose a 25 % (p/v) e lisozima 50 mg/mL. Após incubação a 37ºC
foram adicionados ao tubo 500 µL de tampão GES (5 mol/L de tiocianato de
guanidina, 0,1 mol/L de EDTA e 0,5 % (p/v) de sarcosil-solução a 30% (p/v) de
sarcosinato lauril sódio, promovendo-se então a lise bacteriana.
Ao lisado bacteriano, foram adicionados 250 µL de acetato de amônio 7,5
mol/L, misturados e incubados por 10 minutos no gelo. A seguir, foram adicionados
ao tubo 500 µL de clorofórmio/2-pentanol (1:1, v/v), o mesmo foi agitado
vigorosamente por 10 minutos e depois centrifugado por 10 minutos a 10.000xg.
O sobrenadante (700 µL) foi transferido para um novo tubo, ao qual foram
adicionados 875 µL de etanol absoluto armazenado a -20°C e o tubo foi mantido a –
20ºC por 18-24h.
Após esta incubação, o tubo foi centrifugado por 3 minutos a 10.000xg, o
sobrenadante foi desprezado e foram adicionados 100 µL de acetato de amônio
/etanol (1:1, v/v), seguido de uma nova centrifugação nas mesmas condições da
anterior. Desprezado o sobrenadante, o DNA contido no tubo foi precipitado com
etanol absoluto armazenado a -20°C e o tubo foi novamente centrifugado. Por
último, o sobrenadante foi desprezado e o tubo contendo o DNA deixado aberto em
câmara de fluxo laminar para secagem. Posteriormente, o DNA foi ressuspenso em
100 µL de solução tamponante TE (10 mmol/L Tris, 1 mol/L EDTA) pH 8,0 e
incubado 18-24h a 4ºC.
A quantificação do DNA para posterior aplicação no gel foi realizada no
“GeneQuant pro RNA/DNA calculator” (Amersham Pharmacia Biotech) de acordo
com os seguintes parâmetros: concentração de DNA (µg/mL), absorbância em
230nm, 260nm (quantificação de DNA e RNA, respectivamente), 280nm
(quantificação de proteínas). As amostras foram aplicadas em gel de agarose (1 %,
p/v) e reveladas na presença de brometo de etídio.
3.17. Microscopia Eletrônica de Transmissão do S. mutans
___________________________________________________Resultados e Discussão
53
Uma cultura celular, fase estacionária (12 horas de crescimento) foi
centrifugada (3.000xg, durante 15 minutos) e ressuspensa em tampão PBS para
lavagem. Esta suspensão foi novamente centrifugada e o pellet, constituído por
células livres de meio de cultivo, foi incubado com uma solução de glutaraldeído 3%
(v/v) por 1 hora. Esta suspensão foi trocada pelo mesmo volume de tampão Tris-HCl
5 mmol/L, pH 7,5. Em seguida, o material foi ressuspenso separadamente em uma
solução de ósmio 1% (p/v) preparada no mesmo tampão da incubação. Após 1 hora
de repouso, o pellet foi lavado em tampão fosfato de sódio 0,1 mol/L, pH 7,3,
centrifugado e desidratado com concentrações crescentes de acetona/água,
variando de 30 a 95% (v/v) com intervalos de 5 minutos para cada troca. A última
desidratação foi realizada com acetona 100% durante 10 minutos, por 3 vezes.
Finalmente o pellet foi infiltrado em resina de araldite a 37º C durante 48 horas e
incluso em araldite pura durante 72 horas a 60º C. Cortes de aproximadamente 0,5
µm foram realizados com o ultramicrótomo e contrastados em acetato de uranila 4%
(p/v), pH 12, por 10 minutos seguido de citrato de chumbo 0,3% (p/v), pH 12, durante
mais 10 minutos. As imagens foram capturadas em um equipamento Philips, Modelo
208, localizado no Departamento de Morfologia da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto – USP.
3.18. Descarte das células
As células, bactérias, meios de cultivo e outros materiais contaminados ou
não utilizados nos experimentos foram autoclavados a 121ºC durante 20 minutos e
posteriormente descartados.
___________________________________________________Resultados e Discussão
54
4. RESULTADOS e DISCUSSÃO:
4.1. Otimização das condições de crescimento de S. mutans
Streptococcus mutans é uma bactéria normalmente presente na microbiota
bucal e sua relação com o surgimento da cárie dental é evidente. Esta relação é em
parte devida à grande capacidade acidogênica deste organismo, principalmente
devido à formação de ácidos orgânicos como o lático, acético e o propiônico
(PAULINO et al., 2003).
A Figura 9A mostra uma curva de crescimento da bactéria S. mutans, sem
fonte de carbono ou com glicose, com xilose ou glicose e xilose associados,
suplementando o meio em condições microaerófilas. Nas primeiras 5 horas de
crescimento (fase “lag”) pode ser observado que a multiplicação celular, medida
pela densidade óptica do meio em 600 nm, é consideravelmente pequena. Nesta
fase (também denominada preparatória) as células monitoram o meio de cultivo
(analisando os possíveis nutrientes presentes) e sintetizam seu aparato enzimático
para a próxima etapa do crescimento. No meio suplementado com glicose ou com a
mistura (glicose e xilose), durante as 7 horas subseqüentes à fase “lag” a bactéria
se reproduz em escala exponencial. Isto pode ser observado, pois a turbidez do
meio aumenta rapidamente (fase “log”). Finalmente, após 12 horas de cultivo, surge
uma fase onde não há um crescimento substancial (fase estacionária), devido à
depleção de alguns nutrientes e/ou grandes quantidades de metabólitos tóxicos
gerados como produtos finais do metabolismo. A mistura de xilose ao meio de
cultivo não afeta a cinética de crescimento das células quando comparado ao meio
de cultivo suplementado somente com glicose.
No meio ao qual apenas a xilose foi adicionado como fonte de carbono, é
observado um pequeno aumento na turbidez durante 2 horas após a fase “log”,
sendo que posteriormente este se estabiliza e dá lugar a uma fase estacionária
prematura (Figura 9A). Este fato sugere que S. mutans não metaboliza a xilose, pois
um crescimento similar é obtido quando o cultivo é realizado em meio sem nenhuma
fonte de carbono. O pequeno crescimento, nestas duas condições, mostra que a
bactéria possui algumas reservas intracelulares de energia na forma de
polissacarídeos, como já descrito na literatura (PAULINO et al., 2003). Estas
reservas podem ser suficientes para iniciar o crescimento, mas insuficientes para
___________________________________________________Resultados e Discussão
55
mantê-lo, interrompendo-se assim a progressão da cultura.
Na Figura 9B pode ser observado que no meio de cultivo o decaimento mais
significativo do pH ocorre durante a fase “Log” do crescimento para o meio
suplementado com glicose ou com a mistura (glicose e xilose). Entretanto, no meio
sem nenhuma fonte de carbono ou suplementado apenas com xilose, o decaimento
é menos significativo. Em todas as situações, o decaimento do pH é devido
principalmente à produção dos ácidos orgânicos, sendo sua produção devida ao
metabolismo anaeróbico da glicose pelo S. mutans (PAULINO et al., 2003). Já para
o meio de cultivo sem a adição de carboidrato ou suplementado apenas com xilose,
a quantidade de açúcar fermentado é pequena (restrito apenas às reservas
intracelulares), sendo a acidificação conseqüentemente menor.
A quantidade de glicose presente no meio de cultura foi monitorada durante o
período de crescimento (Figura 10). Nesta figura é observado que ao decorrer o
período entre a fase “Log” e estacionária (5
a
– 12
a
hora), há um rápido decaimento
da quantidade de açúcar que alcança um mínimo no início da fase estacionária,
sendo um dos fatores que explicam a parada no crescimento durante esta fase. O
alto consumo de glicose durante a fase “Log” mostra claramente o intenso
metabolismo da bactéria, visando manutenção da atividade celular e um aumento
do número de células (Figura 9A), o que explica a grande produção de ácido (Figura
9B) durante esta fase de crescimento. Estas observações são confirmadas por uma
análise de TLC do meio de cultivo durante diferentes fases do crescimento (Figura
11). Nesta Figura é observado que a glicose é gradualmente consumida,
desaparecendo ao final da fase “Log” (Linhas 1-4), enquanto que a xilose é
detectada durante todo o período estudado (Linha 5-8). Nas Linhas 9 - 11, pode- se
observar que a mistura de glicose e xilose afeta a migração de ambos os
carboidratos. Desta forma a progressiva atenuação das manchas (5-8) reflete o
consumo de glicose, enquanto que a xilose permanece constante.
A não metabolização da xilose reflete um interessante aspecto, porque esta
pentose pode ser usada através de uma via do metabolismo denominada via “das
pentoses fosfato” cuja função principal é a produção de potencial redutor (NADPH) e
a interconversão de açúcares com um número de carbonos entre três e sete
(NELSON & COX, 2000). Entretanto, S. mutans não possui enzimas oxidativas da
via das pentoses fosfato e aparentemente usa a ribose para fornecer átomos de
carbono para a biosíntese de aminoácido (ROLLA, 1989).
___________________________________________________Resultados e Discussão
56
Desta forma, nenhum crescimento significante é apresentado na presença de
xilose (Figura 9A), isto sugere que a bactéria é incapaz de transportar este açúcar
para dentro da célula e/ou convertê-lo em algum intermediário da via das pentoses
fosfato (PAULINO et al., 2003).
Posteriormente, nossos estudos se dirigiram a uma análise da formação do
biofilme de S. mutans na presença de diferentes tipos de fonte de carbono e/ou na
presença de um clássico agente antibacteriano, o fluoreto de sódio.
Na Figura 12 é apresentada uma foto de uma placa de 24 poços após 12
horas de crescimento. O biofilme pode ser visualizado pela sua aparência opaca no
fundo do poço. Sua intensidade varia em função da fonte de carbono e da
concentração de flúor. Assim, na coluna 5 (crescimento na presença de sacarose)
um biofilme mais intenso é observado, inclusive na presença de 5 mmol/L de flúor
(coluna 5, linha D (D5), enquanto que, na coluna 3 (crescimento na presença de
glicose) um biofilme menos intenso é formado. Além disso, este biofilme é
progressivamente reduzido com o aumento da concentração de flúor (coluna 3,
(B3), (C3) e (D3). A mesma observação é feita para o crescimento na presença de
maltose (coluna 1) e frutose (coluna 4). Quando a xilose ou nenhuma fonte de
carbono é adicionada ao meio de crescimento, nenhum biofilme pode ser observado
a olho nú, (coluna 2 e 6 respectivamente).
A Figura 13 mostra a morfologia do biofilme formado por S. mutans após 12
horas de crescimento nas condições testadas. Utilizando-se glicose, frutose ou
maltose como fonte de carbono, a formação de uma camada homogênea de
biofilme, ocupando totalmente o fundo do poço, pode ser visualizada. No caso do
uso da sacarose, uma total ocupação do fundo do poço também ocorre, apesar da
aparência da superfície do biofilme formado ser irregular. Este aspecto pode ser
devido a pelo menos em parte, à produção de polissacarídeos extracelulares
quando a sacarose é utilizada como fonte de carbono, afetando a morfologia celular
(MORO et al., 1986). A xilose, assim como o meio de cultivo não suplementado por
nenhuma fonte de carbono, não promoveu uma total ocupação do fundo do poço,
reforçando a idéia sugerida por Paulino e colaboradores (PAULINO et al., 2003) de
que a bactéria não metaboliza este carboidrato.
A adição de crescentes concentrações de flúor ao meio suplementado com
glicose, frutose e maltose produziram um efeito muito similar, com uma gradual
redução da cobertura do fundo do poço (Figura 13), surgindo assim pequenas áreas
___________________________________________________Resultados e Discussão
57
0 5 10 15 20 25
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Tempo (horas)
Densidade optica
600nm
A
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
pH
B
Figura 9. Curvas de crescimento de S. mutans mostrando a variação da densidade óptica
em 600nm (A) e pH (B) em função do tempo de cultivo em meio TSB (
______
) ou meio
completo (- - - -): sem fonte de carbono (Ì); na presença de 13 mmol/L de glicose ({); 13
mmol/L xilose () ou mistura de 13 mmol/L glicose com 13 mmol/L xilose (). Cada ponto é
a média de três experimentos com uma variação inferior a 5%.
___________________________________________________Resultados e Discussão
58
0 5 10 15 20 25
0
5
10
15
0 5 10 15
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Absorvância (510 nm)
[Glicose] (mM)
[Glicose] (mM)
Tempo (horas)
Figura 10. Concentração da glicose em função do tempo de crescimento de S. mutans em
meio TSB suplementado () ou não ({) com 13 mmol/L xilose. Inserção: curva padrão de
calibração usando um Kit de ensaio de glicose (PAULINO et al., 2003). Cada ponto é a
média de três experimentos com uma variação inferior a 5%.
___________________________________________________Resultados e Discussão
59
Figura 11. TLC dos carboidratos utilizados como referência (xilose e glicose) e do meio de
cultura de S. mutans após crescimento em meio suplementado com 13 mmol/L glicose
(linhas 1-4) por 4, 8, 12 e 24 horas, respectivamente ou com mistura de 13 mmol/L glicose e
13 mmol/L xilose (linhas 5-8), por 4, 8, 12 e 24 horas, respectivamente. Linhas 9, 10 e 11
contêm padrões de glicose, xilose e mistura de glicose com xilose, respectivamente.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
___________________________________________________Resultados e Discussão
60
com um gradual desaparecimento do biofilme acompanhado por um respectivo
aumento da concentração de flúor (1, 3 e 5 mmol/L).
O efeito de flúor na formação do biofilme em presença de sacarose foi menos
intenso, visto que com 5 mmol/L de NaF, a cobertura do fundo do poço foi menos
significante, além do que, diferentemente dos outros carboidratos, não foi possível a
visualização de colônias isoladas. Aparentemente, a bactéria torna-se menos
sensível ao flúor quando seu crescimento ocorre na presença de sacarose. Quando
a xilose é usada como fonte de carbono, uma redução no crescimento pode ser
observada claramente e, embora menos significante, o crescimento na presença
deste carboidrato e flúor é menor, como já descrito anteriormente. O mesmo
resultado foi observado quando nenhuma fonte de carbono foi empregada,
favorecendo a conclusão de que o metabolismo de fontes de carbono intracelular é
prejudicado pelo flúor, possivelmente pelo bloqueio da enzima enolase, como
descrito por Cox e colaboradores (COX et al., 1999).
A condição na qual a bactéria consegue multiplicar-se na presença de flúor
se deve ao fato de que, em pH neutro (em torno de 7), a dose inibitória deste haleto
é de 10 mmol/L, ao passo que, quando o meio torna-se mais ácido, a dose
necessária para promover uma inibição no crescimento da bactéria cai cerca de 10
vezes (pH 5,5). Assim, o fato da bactéria conseguir baixar o pH do meio na medida
em que ela metaboliza os carboidratos, explica seu crescimento inicial em presença
de flúor e na medida que o pH baixa, concentrações de flúor antes pouco eficazes,
ganham um aumento de 10 vezes na sua capacidade de inibir o catabolismo das
células (FEJERSKOV et al., 1996). Esta inibição pode inclusive ser notada, haja
vista a diminuição da formação do biofilme (Figura 13).
4.1.1. Avaliação da capacidade acidogênica de S. mutans em meio planctônico
após adição de diferentes carboidratos – pulso de carboidratos.
A Figura 14 mostra o decaimento do pH após a adição de diferentes açúcares
à suspensão celular de S. mutans. Um intenso e similar decréscimo do pH pode ser
observado nos 20 minutos iniciais da incubação com glicose, frutose, maltose ou
sacarose. Após esta inicial e intensa liberação ácida, uma fase de decaimento lenta
do pH é observada, continuando até os 120 minutos do final da incubação. Este
decaimento do pH se deve a metabolização dos açúcares através da via glicolítica,
___________________________________________________Resultados e Discussão
61
Figura 12. Placa de cultura (24 poços) após 12 horas de crescimento de S. mutans em
meio completo suplementado com 1% (p/v) de carboidrato. Coluna 1, maltose; 2, xilose; 3,
glicose; 4, frutose; 5, sacarose e 6, controle (sem fonte de carbono). Linha A, sem flúor; B,
C e D com 1, 3 e 5 mmol/L de NaF, respectivamente.
___________________________________________________Resultados e Discussão
62
NaF (0 µmol/L) NaF (1µmol/L) NaF (3µmol/L) NaF (5µmol/L)
Glicose Frutose Sacarose Maltose Xilose Controle
Figura 13: Fotomicrografia do biofilme formado por S. mutans após crescimento durante 12
horas em meio completo suplementado com 1% de carboidrato (p/v) e/ou NaF (1, 3 e 5
mmol/L ) como indicado. O controle refere-se ao biofilme formado em meio completo não
suplementado com carboidrato (aumento de 100 X).
___________________________________________________Resultados e Discussão
63
com posterior produção de ácidos orgânicos que tornam o ambiente ácido, o que é
frequentemente observado em meios de cultivo deste microrganismo (PAULINO et
al., 2003).
Quando a xilose é utilizada como fonte de carbono, a acidificação é menos
intensa e alcança valores similares ao do controle (sem adição de carboidrato),
reforçando a idéia de que a xilose não promove o crescimento de S. mutans, não
sendo metabolizado por este microrganismo (PAULINO et al., 2003). A acidificação
inicial observada pode ser devida a um mecanismo alternativo de entrada de açúcar
realizado por este organismo (denominado “uptake” ou importe), que envolve um
antiporte de H
+
(HAMILTON, 1987). Visto que a xilose não é metabolizada pela
bactéria, a produção de energia diminui e a acidificação para. De fato, na ausência
de combustível metabólico, o pH diminui uniformemente e alcança valores similares
ao observado no pulso com xilose (Figura 14). Isto reforça a observação de Paulino
e colaboradores (PAULINO et al., 2003) onde o crescimento e acidificação no meio
de cultivo, sem a adição de carboidrato é insignificante, possivelmente por causa da
restrita quantidade de açúcar fermentável disponível na forma de reserva
intracelular, como já descrito anteriormente (SPATAFORA, 1995). Estas reservas
podem ser suficientes para iniciar a acidificação, mas elas são depletadas. Então a
diminuição do pH nos experimentos controle e na xilose é devida à eliminação de
ácidos produzidos através do metabolismo de reservas de combustível intracelular,
provavelmente polissacarídeos (WEGMAN et al., 1984).
Estes resultados mostram que a sacarose não é mais acidogênica que a
glicose ou frutose, visto que uma acidificação similar do ambiente extracelular
ocorre de forma semelhante a estes carboidratos. A cariogenicidade deste açúcar
está também relacionada com a indução da síntese de polissacarídeos
extracelulares insolúveis, envolvidos na adesão bacteriana à superfície do dente e
conseqüente formação de biofilme, conforme descrito por Rola (ROLA, 1989).
4.2. Caracterização fotoquímica dos agentes fotossensíveis e seu emprego na
TFD sobre S. mutans e fibroblastos
Estudos envolvendo a utilização da TFD com fins bactericidas são realizados
desde a década de 80 (VENEZIO et al., 1985) e sua aplicação tem obtido resultados
promissores (SHAWAR & COOPER 1990; WILSON et al., 1993; BURNS et al.,
___________________________________________________Resultados e Discussão
64
0 20 40 60 80 100 120
4
5
6
7
pH
Tempo de incubação (minutos)
Figura 14: pH da suspensão celular de S. mutans suplementado com diferentes fontes de
carbono. A suspensão celular foi suplementada com: (z) Glicose; () Frutose; () Xilose;
() Maltose; (|) Sacarose e () sem nenhuma fonte de carbono. Os dados representam a
média de valores (n=3) e as barras de erros representam o desvio padrão.
___________________________________________________Resultados e Discussão
65
1995; PAULINO et al., 2005). Assim, padronizadas as condições de crescimento da
bactéria, a terapia fotodinâmica passou a ser o foco principal de estudo neste
trabalho. E, a fim de se promover um efeito bacteriostático in vitro no S. mutans,
experimentos empregando-se diferentes agentes fotossensíveis foram realizados e
de forma comparativa, estes estudos foram aplicados sobre uma cultura in vitro de
fibroblastos.
Desta forma, inicialmente os agentes fotossensíveis foram avaliados quanto
aos seus aspectos fotoquímicos e fotofísicos para que posteriormente pudessem ser
empregados corretamente na inativação da bactéria S. mutans com o auxílio da
TFD.
4.2.1. Rose bengal
4.2.1.1. Caracterização fotoquímica do Rose bengal
O Rose Bengal, também chamado de Rosa de bengala é a 4,5,6,7-tetracloro-
2’,4’,5’,7’-tetraidrofluoresceína, um corante comumente utilizado como colírio, em
consultórios oftalmológicos, para identificação de células da córnea ou células com
lesões. Entretanto, devido às elevadas taxas de toxicidade apresentadas por este
corante, ele tem sido substituído pela flouresceína sódica ou indocioanina verde
especialmente nas aplicações na clínica oftalmológica (SINGH, et al., 2004).
Além disso, o Rose bengal é um agente fotossensível muito empregado
experimentalmente na TFD, este agente fotossensível possui uma grande
capacidade de se localizar na membrana plasmática de mamíferos, formando altas
quantidades de oxigênio singlete e levando estas células a morte e, por esta razão,
seu emprego na clínica com finalidade terapêutica tem sido evitada (PEDERSEN et
al., 1977; DAHL et al., 1988; KOCHEVAR et al., 1994; WACHTER et al., 2003;
PAULINO et al., 2005).
Quanto aos seus aspectos fotoquímicos, estudos já realizados demonstram
uma banda de absorção de luz na faixa de 500 a 600 nm e, de fato, na Figura 15
está mostrado o espectro de absorção do Rose Bengal (4,0 µmol/L em PBS), cuja
banda de absorção no espectro do visível (450 – 600 nm) é semelhante ao descrito
por Kochevar e colaboradores (KOCHEVAR et al., 1996) e Stiel e colaboradores
(STIEL et al., 1996).
___________________________________________________Resultados e Discussão
66
O espectro de absorção da droga é coincidente com o espectro de emissão
da luz irradiada pelo fotopolimerizador de resina odontológica (filtro original do
fabricante, 400 – 500 nm), o que permite a fotossensibilização do corante com a luz
disponível.
A caracterização fotoquímica do Rose bengal em relação ao rendimento
quântico de oxigênio singlete, emissão de fluorescência, absorção de transiente,
decaimento triplete e emissão de fosforescência não foram realizados visto que este
corante foi empregado nos experimentos com TFD somente como uma droga
modelo pois, seus rendimentos quânticos para a produção de espécies reativas de
oxigênio já são descritos na literatura (LARKIN et al., 2002; RODRIGUÉZ et al.,
2004).
4.2.1.2. Efeito da TFD sobre S. mutans e fibroblastos utilizando-se o Rose
bengal
A Figura 16 indica claramente que a partir da fotoirradiação de uma
suspensão contendo o corante, na presença de S. mutans, realizada com o
fotopolimerizador (325,1 mJ/cm
2
que corresponde a 30 segundos de irradiação com
a amostra localizada a 11,2 cm da ponteira do fotopolimerizador), deve estar
ocorrendo a produção de espécies reativas de oxigênio que irão induzir a inativação
da bactéria. Assim, pode-se observar que, no escuro (toxicidade “per se”), somente
concentrações acima de 5,0 µmol/L são tóxicas para a bactéria, ao passo que, com
uma concentração de corante 5 vezes menor e após uma dose de luz (30
segundos) é possível inativar todos os microrganismos viáveis.
Além disso, comparativamente, no inserto da Figura 16 pode ser observado
que para os fibroblastos é requerida uma concentração de aproximadamente 1
µmol/L de Rose bengal para promover uma morte celular de aproximadamente 10 %
após a irradiação da mesma dose de luz e, no escuro, concentrações deste corante
abaixo de 5 µmol/L são inertes à viabilidade celular.
4.2.2. Protoporfirina IX
4.2.2.1 Caracterização fotoquímica e fotofísica da Protoporfirina IX e seu
emprego na TFD sobre S. mutans e fibroblastos
___________________________________________________Resultados e Discussão
67
300 400 500 600 700 800
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
Absorbância
Comprimento de Onda (nm)
20
40
60
80
Transmitância
Figura 15: (_____)Espectro de absorção do Rose bengal 4.0 µmol/L em tampão salino pH
7.4 (PBS) e (------) espectro de transmitância do filtro original do fotopolimerizador de resina
odontológica.
___________________________________________________Resultados e Discussão
68
0,01 0,1 1 10
0
20
40
60
80
100
Morte Celular (%)
Log [RB](µmol/L)
Morte Bacteriana (%)
Log [RB](µmol/L)
0,01 0,1 1 10 100
0
20
40
60
80
100
Figura 16: Viabilidade de S. mutans na presença de variáveis concentrações de Rose
bengal. A bactéria (10
3
UFC) foi incubada com o corante durante 10 minutos e incubada em
meio de cultivo TSA durante 36 horas a 37ºC na ausência de luz com () ou sem ()
irradiação de luz pelo fotopolimerizador. Inserção: viabilidade dos fibroblastos na presença
de variáveis concentrações de Rose bengal. As células (10
6
) foram incubadas com o
corante durante 10 minutos e crescidas em DEMEN/F-12 por 24 horas no escuro com ()
ou sem () irradiação com o fotopolimerizador.
___________________________________________________Resultados e Discussão
69
O espectro de absorção da PPIX em meio homogêneo (tampão fosfato, pH
7,4) foi determinado utilizando uma concentração de 5,0 µmol/L. Seu espectro de
absorção apresenta-se com bandas bastante alargadas (Figura 17) devido ao fato
deste corante não ser muito solúvel em meio aquoso.
Comparado ao espectro observado pela PPIX em água, na presença de
solventes orgânicos há um grande deslocamento das bandas de absorção do
corante, o que é inclusive descrito por outros autores (BRANCALEON, et al., 2004).
Assim, um estudo para avaliar o deslocamento das bandas provocado por solventes
de diferentes polaridades foi realizado e os resultados estão mostrados na Figura
17.
Na Figura 17, pode-se observar que o pico de absorção máxima de luz pela
droga é, quando em tampão pH 7,4, igual a 384 nm, passando para uma faixa de
menor energia (396 a 420 nm) quando o corante está na presença de solventes
orgânicos (Tabela 2). Aparentemente, a variação ocorrida na banda de absorção
(406 e 420 nm), na presença de solventes orgânicos está relacionada a um
decréscimo da constante dielétrica (BONNETT, 1988).
Observa-se também que a luz emitida pelo fotopolimerizador de resina
odontológica é coincidente com a região de absorção de luz da PPIX em todos os
tampões apresentados na Figura 17.
De fato a redução da constante dielétrica pode afetar o tempo de vida das
espécies singlete e triplete que por sua vez afeta a quantidade (rendimento
quântico) de florescência e por conseqüência a quantidade de ERO’s.
Tabela 2: Valores dos picos de absorção máxima do corante PPIX (0,2 µmol/L), dissolvido
em diferentes solventes, determinada conforme descrito em Material e Métodos.
Solvente Constante Dielétrica Absorção Máxima (nm)
Tampão (pH 7,4) 80,0 384
DMSO 47,2 406
Acetona 20,8 416
Diclorometano 20,7 420
Ainda na Figura 17 é mostrado o espectro de absorção de luz, na região do
visível (300 – 800 nm), pela PPIX em diferentes sistemas tamponantes e orgânicos.
A banda de absorção observada de 370 – 420 nm é característica para este tipo de
___________________________________________________Resultados e Discussão
70
300 400 500 600 700 800
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Diclorometano
DMSO
Tampão pH 7,4
Acetona
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Transmitância
Fotopolimerizador
Figura 17: Espectros de absorção do corante PPIX na concentração de 3,0 µmol/L e de
emissão (Transmitância) da luz emitida pelo fotopolimerizador, realizado conforme descrito
em Material e Métodos, item 3.7.1. Uma amostra de tampão fosfato (pH 7,4), DMSO,
Diclorometano e Acetona, todos sem o corante foi utilizada para calibração do equipamento
(branco).
___________________________________________________Resultados e Discussão
71
composto (SCOLARO et al., 2002) e, de forma semelhante ao ocorrido com o
corante Rose bengal, a luz emitida pelo fotopolimerizador de resina odontológica
sobrepõe à região de absorção de luz deste derivado porfirínico.
O rendimento quântico de fluorescência para a PPIX foi determinado
utilizando-se como padrão a violeta de cresil em etanol (Φ
F
= 0,54) sendo o
rendimento quântico apresentado pelo corante PPIX em meio homogêneo de 0,16 e
para uma solução padrão de PPIX em acetona é de 0,12.
Quanto à emissão de fluorescência, a PPIX em meio homogêneo, apresentou
emissão máxima em 647 e 688 nm (Figura 18).
A Figura 19 mostra o espectro de absorção do transiente realizado por
fotólise por pulso de laser, onde as regiões com absorbância acima de zero
apresentam absorção triplete. Para o fotossenssibilizador PPIX, este perfil varia de
400 a 700 nm. A depleção da banda de absorção do estado fundamental da PPIX
em meio homogêneo apresenta-se em 360 nm. Já os tempos de vida do estado
excitado triplete para PPIX foi de 0,26 µs em meio homogêneo (resultado não
mostrado).
O coeficiente de absortividade molar (ε = 2,7.10
4
cm
-1
mol
-1
L) do corante
PPIX foi determinado no cumprimento de onda de 452 nm, para a droga presente
em meio tamponado (tampão PBS, pH 7,4), utilizando a Lei de Lambert-Beer. As
medidas foram feitas em cubetas de quartzo com 1,0 cm de caminho óptico,
conforme descrito em Material e Métodos.
A intensidade máxima de fosforescência no tempo 0 foi determinada pela
regressão exponencial e os tempos de vida de oxigênio singlete foram determinados
pelo tratamento do ajuste da curva (resultado não mostrado). O valor do rendimento
quântico de produção de oxigênio singlete produzido pelo corante PPIX e
feoforbide-a, determinados são apresentados na Tabela 3. O Feoforbide-a,
conforme descrito em Material e Métodos, foi empregado como corante padrão
Tabela 3: Valores de rendimento quântico de oxigênio singlete para a PPIX em tampão PBS
(pH 7,4), comparação com Feoforbide-a, conforme Material e Métodos.
Composto
Φ
∆
Feoforbide-a 0,59
PPIX em tampão 8,42
___________________________________________________Resultados e Discussão
72
600 650 700 750 800
0
50
100
150
200
Intensidade de Fluorescência
Comprimento de onda (nm)
Figura 18: Espectro de emissão de fluorescência do corante PPIX. Excitação fixa em 452
nm com leitura a partir de 600 a até 800 nm, conforme descrito em Material e Métodos.
___________________________________________________Resultados e Discussão
73
300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
∆OD
Comprimento de onda (nm)
Figura 19: Espectro de absorção do transiente do corante PPIX (0,2 µmol/L), 0,21 µs após
a excitação por pulso de laser em 355 nm, mostrando a absorção máxima do triplete e o
fotobranqueamento do estado fundamental, centrado em 350 nm.
___________________________________________________Resultados e Discussão
74
4.2.2.2. Efeito da TFD sobre S. mutans e fibroblastos utilizando-se a
Protoporfirina IX
Conforme apresentado na Figura 17, utilizando-se o filtro original do
fotopolimerizador de resina odontológica é possível emitir uma luz na qual a PPIX
possa absorver (400 – 500 nm), podendo gerar assim espécies reativas de oxigênio.
Para isto, a PPIX foi adicionada a uma suspensão celular, seguida por uma
irradiação com o fotopolimerizador.
A PPIX é uma molécula no estado singlete basal que, quando irradiada,
produz através de um cruzamento intersistemas, uma quantidade significativa de
espécies tripleto no estado basal. Já o oxigênio molecular, sempre presente em
meios biológicos, normalmente serve como bom aceptor de energia de moléculas
no estado tripleto (ERICSON et al., 2003).
Assim, fundamentado nos princípios da TFD e, conforme mostrado na Figura
20, é possível inativar a bactéria com concentrações do corante a partir de 0,2
µmol/L, utilizando-se para isto dose de energia de 325,1 mJ/cm
2
. Já a toxicidade no
escuro da droga (emprego da droga sem utilizar a luz, toxicidade “per se” do
corante) só se evidencia em concentrações superiores a 3,0 µmol/L. Esta ordem de
grandeza para a concentração tóxica de corantes é normalmente encontrada em
corantes fotossensíveis endógenos tais como a protoprofirina (TREMBLAY et al.,
2002).
Adicionalmente, os resultados apresentados no inserto da Figura 20 indicam
que os fibroblastos, quando submetidos às mesmas condições de TFD que as
bactérias, apresentam um efeito de morte celular (toxicidade após a TFD), em torno
de 30 % (para 0,5 µmol/L de Protoporfirina IX), chegando a um máximo de
aproximadamente 60 % de toxicidade quando utilizada uma concentração de 50
µmol/L de PPIX. Além disso, a toxicidade do corante para os fibroblastos quando
não irradiados (toxicidade “per se”), somente se torna significativa em
concentrações superiores à 5 µmol/L de Protoporfirina IX.
4.2.3. Zinco ftalocianina
As ftalocianinas compreendem uma das principais classes de agentes
fotossensibilizantes utilizados na TFD. A Zinco ftalocianina é uma das
___________________________________________________Resultados e Discussão
75
0,01 0,1 1 10
0
20
40
60
80
100
Morte Celular (%)
Log [PPIX](µmol/L)
Morte Bacteriana (%)
Log [PPIX](µmol/L)
110
0
20
40
60
80
100
Figura 20. Viabilidade de S. mutans na presença de variáveis concentrações de
Protoporfirina IX. A bactéria (10
3
UFC) foi incubada com PPIX durante 10 minutos e
incubada em meio de cultivo TSA durante 36 horas a 37ºC na ausência de luz com () ou
sem () irradiação de luz pelo fotopolimerizador. Inserção: viabilidade dos fibroblastos na
presença de variáveis concentrações de PPIX. As células (10
6
) foram incubadas com o
corante durante 10 minutos e crescidas em DEMEN/F-12 por 24 horas no escuro com ()
ou sem () irradiação com o fotopolimerizador.
___________________________________________________Resultados e Discussão
76
metaloftalocianinas mais empregadas na TFD e devido ao seu caráter lipofílico, ela
tem sido incorporada em sistemas de liberação de fármacos lipossolúveis como
lipossomos ou micelas (RUCK et al., 1996).
Assim, o ZnPc foi empregado em estudos como agente fotossensível,
utilizando-se como agente carreador os lipossomos, os quais foram constituídos
pela técnica de sonicação.
4.2.3.1. Avaliação da incorporação de ZnPc aos lipossomos: construção,
quantificação e localização do corante
Os lipossomos, como estruturas semelhantes às vesículas, são basicamente
constituídos por fosfolipídeos organizados como uma bicamada lipídica concêntrica
que contêm um compartimento aquoso em seu interior (OLIVEIRA et al., 2005).
Devido a suas características anfipáticas, eles podem incorporar substâncias em
seu compartimento aquoso ou na sua bicamada lipídica. Considerando esta
particularidade, os lipossomos podem ser empregados como bons e potenciais
carreadores de drogas (ANWER et al., 2000; REDDI et al., 1990), inclusive agentes
fotossensíveis como a ftalocianinas (SIBATA et al., 2004).
O coeficiente de absortividade molar do corante ZnPC em meio lipossomal
(ZnPc-lipossomo) foi obtido utilizando-se a Lei de Lambert-Beer. As medidas foram
feitas em cubetas de quartzo com 1,0 cm de caminho óptico (
672nm
=2,3.10
5
L.mol
-1
.
cm
-1
).
Os lipossomos foram construídos através do método de sonicação (conforme
descrito no item 3.6 de Material e Métodos). Já a incorporação do corante aos
lipossomos foi avaliada através de análise espectrofotométrica do corante
incorporado às vesículas (
672nm
= 2,3.10
5
L.mol
-1
.cm
-1
). Assim, a Tabela 4 mostra a
as concentrações de ZnPc-lipossomo obtidas após montagem das vesículas e
incorporação do corante, as medidas de diâmetro médio e as respectivas medidas
de polidispersão.
Observa-se que a incorporação de ZnPc aos lipossomos acontece
concomitantemente ao aumento da concentração do corante empregada na
constituição das vesículas. Além disso, o tamanho médio destas vesículas formadas
(na presença de ZnPc) é inversamente proporcional ao aumento da concentração
do corante incorporado (na faixa de concentração0 de 0 a 32,0 µmol/L), exceto para
___________________________________________________Resultados e Discussão
77
a concentração de 50,0 µmol/L de ZnPc onde o tamanho médio observado não
obedeceu esta inversão de proporcionalidade.
Tabela 4: ZnPc-Lipossomo formado a partir de diferentes concentrações de ZnPc conforme
descrito em Material e Métodos, item 3.6. Disposição dos resultados obtidos no
espalhamento dinâmico de luz: polidispersão, diâmetro médio e o desvio são referentes a
média de 3 medidas realizadas com preparações distintas.
ZnPc (µmol/L)
Adicionado ao
ensaio de
preparação
Determinado
nos
lipossomos
Diâmetro médio
(nm)
Polidispersão
- - 45,9 ± 3,67 0,364 ± 0,03
2,0 0,79 ± 0,03 260,8 ± 62,59 0,913 ± 0,07
4,0 1,15 ± 0,05 250,9 ± 60,21 0,899 ± 0,07
8,0 2,09 ±
0,10 220,0 ± 66,00 1,000 ± 0,08
16,0 4,42 ± 0,22 105,5 ± 8,44 0,356 ± 0,02
32,0 3,78 ± 0,18 93,0 ± 7,44 0,334 ± 0,02
50,0 8,14 ± 0,40 122,3 ± 24,46 0,521 ± 0,04
Assim, o tamanho médio das vesículas sofre uma alteração quando se forma
na presença do corante. Percebe-se também que os altos valores de polidispersão
(acima de 0,5), para as vesículas constituídas com 0,79; 1,15 e 2,09 µmol/L de ZnPc
indicam que a população de vesículas de diferentes tamanhos é muito grande,
diminuindo a confiabilidade das medidas de diâmetro médio obtidas.
Conforme pode ser observado, na Tabela 4, os valores de polidispersão dos
ZnPc-lipossomos de 3,78 µmol/L foram os menores obtidos (0,334). Além disso,
estabilidade destas vesículas pode ser avaliada pelo método espectrofotométrico
onde a turbidez e medidas de espalhamento de luz da suspensão foram
acompanhadas durante 30 dias (resultados não mostrados). Estes parâmetros não
variaram significativamente quando as vesículas foram mantidas sob refrigeração
(4
o
C) e foi padronizado como período máximo de uso 7 dias após sua preparação.
Neste sentido, após a padronização da metodologia para construção do
ZnPc-lipossomo, estas vesículas foram empregadas para avaliação da toxicidade da
TFD em células de S. mutans e fibroblastos.
___________________________________________________Resultados e Discussão
78
Determinada a concentração de trabalho, uma posterior etapa do processo foi
confirmar a incorporação do corante nos lipossomos. Neste sentido, foi realizada
uma centrifugação em gradiente de densidade de sacarose (Figura 21), conforme
descrito em Material e Métodos (3.6.2).
O gradiente de sacarose permite, através de uma estreita e definida faixa de
densidade, separar organelas, estruturas celulares ou pequenas vesículas (como o
ZnPc-lipossomo). Assim, uma amostra contendo somente os lipossomos (na
ausência do corante), o corante em meio orgânico e uma última contendo os ZnPc-
lipossomo (constituídos de 3,78 µmol/L do corante) foram aplicados ao gradiente
para confirmação da incorporação do corante.
Estes resultados, mostrados na Figura 21A, sugerem que os lipossomos na
ausência do corante, estão presentes numa concentração de sacarose ao redor de
18 % (p/p) (densidade de 1,071 g/mL). Por outro lado, o Zinco Ftalocianina
praticamente não entra no gradiente, permanecendo nas primeiras frações de baixa
concentração de sacarose (Figura 21B). Finalmente para o sistema de ZnPc-
Lipossomo, Figura 21C, o corante e os lipídeos migraram no gradiente de sacarose
ao redor de 17 % (p/p) com uma densidade de 1,067 g/mL, indicando que a Zinco
Ftalocianina está incorporada aos lipossomos e muito provavelmente intercalado às
regiões hidrofóbicas dos fosfolipídeos devido a sua alta hidrofobicidade, conforme
anteriormente sugerido por Sibata e colaboradores (SIBATA et al., 2004).
Quanto as características das vesículas formadas, o ZnPc-lipossomo tem
uma densidade de 1,067 g/mL com um diâmetro médio de aproximadamente 100
nm, ao passo que os lipossomos na ausência de corante (45 nm) os quais possuem
uma densidade média de 1,071 g/mL. Assim, as vesículas formadas na ausência do
corante apresentam-se com uma maior densidade, quando comparadas com as
vesículas de ZnPc-lipossomos, possivelmente por mudanças no raio de curvatura
das vesículas e sua compactação, causado pela inserção do corante à bicamada de
fosfolipídeos.
As medidas de diâmetro foram expressas como valores médios devido à alta
polidispersidade presente nas amostras obtidas, visto que os valores de
polidispersão indicam um elevado número de diferentes populações (diferentes
tamanhos de vesículas). Neste sentido, o ZnPc-lipossomo empregado nos
experimentos apresentaram-se com o menor valor de polidispersidade, reflexo de
um menor variação no tamanho das vesículas, permitindo uma maior confiabilidade
e reprodutibilidade.
___________________________________________________Resultados e Discussão
79
0 5 10 15 20 25
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Fluorescência (a.u.)
Fluorescência (a.u.)
A
595
nm
Sacarose (%)
A
595
nm
C
Frações
50
100
150
200
250
B
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
A
10
12
14
16
18
20
22
10
12
14
16
18
20
22
10
12
14
16
18
20
22
100
200
300
400
500
Figura 21: Centrifugação em gradiente de densidade de sacarose: (A) Lipossomo
DPPC:LPC (10:1); (B) Zinco ftalocianina em meio orgânico; (C) ZnPc-Lipossomo 3,72
µmol/L. (
) Fluorescência ZnPc: λ
ex
= 640, λ
em
= 680 nm (•) lipídeos: absorbância em 820 nm,
referente ao fosfato inorgânico obtido pela hidrólise ácida dos fosfolipídios e (
) % sacarose
determinada por refratometria.
___________________________________________________Resultados e Discussão
80
4.2.3.2. Caracterização fotoquímica e fotofísica do Zinco ftalocianina
Assim como apresentado para o ZnPc, num estudo com a PPIX Chartterjee e
colaboradores mostraram que há um deslocamento de bandas de absorção (
máx
)
provocado pela diferença entre a polaridade de solventes como o etanol ou uma
solução aquosa. Este deslocamento é também observado nas bandas Q do
espectro (600 a 700 nm) de porfirinas (CHARTTERJEE et al., 2000). De acordo com
a literatura, as bandas Q correspondem aos níveis vibracionais referentes ao
primeiro e segundo estado eletronicamente excitado singlete (EICHWURZEL et al.,
2000). Em nossos estudos, de forma semelhante ao observado por Chartterjee,
observa-se que além do deslocamento observado nas bandas Q, a incorporação do
corante ZnPC em lipossoma leva também a um deslocamento do pico de absorção
máxima, indo de 666 nm em etanol para 672 nm em meio lipossomal, como
mostrado na Figura 22.
O rendimento quântico de fluorescência do ZnPC em meio lipossomal (ZnPc-
lipossomo) foi determinado utilizando como padrão uma solução de ZnPC em etanol
(Φ
F
= 0,28). O rendimento quântico apresentado pelo corante em meio lipossomal foi
Φ
F
= 0,19. Esta diminuição possivelmente ocorre pelo fato do agente fotossensível
estar incorporado aos lipossomos especificamente dentro de sua bicamada lipídica,
conforme já descrito na literatura (SIBATA et al., 2004).
Através do rendimento quântico de fluorescência é possível determinar se
uma molécula tem uma boa emissão de fluorescência. Uma sonda fluorescente ou
um marcador de fluorescência precisam ter um alto rendimento de fluorescência (Φ
F
> 0,7). Entretanto, um agente fotossensível deve ter um baixo rendimento quântico
de fluorescência porque ele deve usar a energia absorvida para alcançar o estado
triplete excitado, o qual está envolvido com o processo de fotosensibilização de um
sistema biológico. Um bom agente fotossensível deve apresentar um alto valor de
rendimento quântico para a produção de estados triplete (ver Diagrama de
Jablosnki, Esquema 1)
(LAKOWICZ, 1984)
O rendimento quântico de fluorescência de uma solução padrão de ZnPc,
calculado por um método absoluto, corresponde à 0,28 (OWENS et al., 1998). Este
valor, Comparado aos valores obtidos experimentalmente para o ZnPc-lipossomo
(0,19). Em consequência disto, observa-se que para o ZnPc-lipossomo há uma
___________________________________________________Resultados e Discussão
81
maior produção de estados tripletos, haja visto que os valores de Φ
F
são menores
que os da solução padrão.
O espectro de emissão de fluorescência do fotossenssibilizador ZnPC foi
determinado e apresentou emissão máxima em 689 nm (Figura 23). Cada nível de
energia de uma molécula está associado a estados de energia vibracional e
rotacional. A molécula torna-se excitada pela absorção de uma radiação
eletromagnética de freqüência apropriada, que conduz a um nível vibracional
excitado de energia correspondente a estados eletrônicos singletes mais elevados.
O processo de relaxação térmica, assim como os processos de relaxação
vibracional, colisional e rotacional conduzem as moléculas ao mais baixo nível
vibracional do estado singlete. É a partir deste estado que pode ocorrer a emissão
de fluorescência, onde há a perda da energia absorvida e concomitante retorno do
elétron ao seu estado fundamental (BAHERA et al., 1999).
A Figura 24 mostra o espectro de absorção do transiente do ZnPC em meio
lipossomal, realizado por fotólise por pulso de laser.
As regiões com absorbância acima de zero apresentam absorção triplete.
Para o fotossenssibilizador ZnPC, o estado excitado triplete apresenta um perfil com
absorção máxima na região de 420 a 580 nm. A depleção da banda de absorção do
estado fundamental da ZnPC em meio lipossomal apresenta-se em 670 e 340 nm.
O tempo de vida do estado excitado triplete para o ZnPc em meio lipossomal foi de
3,95 µs.
Quanto ao espectro de decaimento do triplete (resultado não mostrado),
sabe-se que a eficiência fotodinâmica de um fotossensibilizador depende do seu
rendimento quântico e tempo de vida do estado excitado triplete. Assim, quanto
maior o tempo de vida do estado excitado, maior será a probabilidade de
transferência de energia do agente fotossensível para o oxigênio molecular e
consequente produção do oxigênio singlete (FOOTE, 1991).
Nos estudos para determinação de produção de oxigênio singlete para o
ZnPc-lipossomo foi utilizado o composto feoforbide-a como padrão de referência,
que apresenta um alto valor de rendimento quântico de oxigênio singlete (
=
0,59). Os tempos de vida de oxigênio singlete foram determinados através da
transferência de energia entre o estado excitado triplete do fotossenssibilizador e o
oxigênio molecular presente no meio. A intensidade máxima de fosforescência no
tempo 0 foi determinada pela regressão exponencial e os tempos de vida de
___________________________________________________Resultados e Discussão
82
oxigênio singlete foram determinados pelo tratamento do ajuste da curva (resultado
não mostrado).
Os valores dos rendimentos quânticos de produção de oxigênio singlete
produzidos pelos corantes ZnPC e feoforbide-a, determinados pela equação 1 são
apresentados na Tabela 5.
Tabela 5: Valores de rendimento quântico de oxigênio singlete determinados para o
composto ZnPc-lipossomo, baseado no agente fotossensível padrão (Feoforbide-a),
conforme descrito no item 3.7.5 de Material e Métodos.
Composto
Φ
∆
Feoforbide-a 0,59
ZnPC lipossomal 0,54
A Figura 25 mostra as características espectrais de absorção e emissão da
luz pelo Zinco ftalocianina incorporada aos lipossomos (ZnPc-Lipossomo) e pelo
fotopolimerizador de resina odontológica, respectivamente. Para o corante
incorporado às vesículas, há uma absorção de luz na faixa de 640 a 690 nm,
semelhante aos trabalhos desenvolvidos por Sibata e colaboradores que utilizaram
micelas formadas pela mistura de polietilenoglicol 5000 e diestearoil fosfatidil
etanolamina (SIBATA et al., 2004).
Em relação à fonte de luz, novamente foi empregado o fotopolimerizador de
resina odontológica. Apesar disso, a emissão de luz pelo equipamento não é
condizente com a faixa de absorção de luz do corante agora empregado (ZnPc-
lipossomo). Assim, um filtro com características para emissão de luz (600 a 700 nm)
foi instalado no equipamento, em substituição ao original, para a realização dos
próximos experimentos como o ZnPc-Lipossomos.
Assim, desta forma foi possível realizar uma avaliação dos efeitos da TFD
após o emprego de diferentes concentrações do ZnPc-lipossomo previamente
incubado com a bactéria ou com os fibroblastos.
4.2.3.3. Efeito da TFD sobre S. mutans e fibroblastos utilizando-se o Zinco
ftalocianina
Avaliadas as características fotofísicas e fotoquímicas do ZnPc-lipossomo,
___________________________________________________Resultados e Discussão
83
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Absorbância
800700600500400
Comprimento de onda (nm)
ZnPC / Etanol
ZnPC / Lipossomo
Figura 22: Espectros de absorção normalizados do corante ZnPC em meio etanólico e
lipossomal. Faixa de varredura empregada: 400 a 800 nm.
___________________________________________________Resultados e Discussão
84
2.0x10
6
1.5
1.0
0.5
Intensidade de Fluorescência
740720700680660640
Comprimento de onda (nm)
Figura 23: Espectro de emissão de fluorescência de ZnPC em meio lipossomal (3,78
µmol/L). Excitação fixa em 610 nm, com faixa de varredura de 630 a 750 nm, conforme
descrito em Material e Métodos.
___________________________________________________Resultados e Discussão
85
-4
-3
-2
-1
0
1
∆OD
800700600500400300
Comprimento de onda (nm)
Figura 24: Espectro de absorção do transiente do corante ZnPC incorporado em
lipossomos (3,78 µmol/L), 0,21 µs após a excitação por pulso de laser em 355 nm, com
faixa de varredura de 300 a 800 nm, mostrando a absorção máxima do triplete e o
fotobranqueamento do estado fundamental.
___________________________________________________Resultados e Discussão
86
400 500 600 700 800
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Transmitância
Absorbância
Comprimento de Onda (nm)
0
10
20
30
40
50
60
Figura 25: (____) Espectro de absorção da ZnPc-Lipossomo 3,78 µmol/L em tampão salino
pH 7.4 (PBS) e (------) espectro de transmitância do filtro de luz (600 – 700 nm) adaptado ao
fotopolimerizador de resina odontológica.
___________________________________________________Resultados e Discussão
87
assim como da luz empregada para sua fotoativação (fotopolimerizador com filtro
adaptado), um estudo da capacidade da TFD em inativar o Strepcotoccus mutans
foi realizado.
Como citado anteriormente, para realização da fotoirradiação com o
fotopolimerizador, foi necessário efetuar a troca do filtro do equipamento. Assim, o
filtro original (400 a 500 nm) foi substituído pelo filtro adaptado (com faixa de
emissão de 600 a 700 nm) possibilitando a fotoativação do ZnPc-lipossomo. Desta
forma, após a irradiação com o a bactéria foi plaqueada, conforme descrito em
Material e Métodos e sua taxa de inativação calculada.
Assim, a Figura 26 mostra os resultados obtidos após a contagem das células
viáveis (S. mutans e fibroblastos) que foram submetidas à TFD. Especificamente, foi
avaliado o efeito do aumento da concentração do corante incubado com as células
antes da irradiação sobre a viabilidade celular. Para isto as concentrações foram
variadas de 0 a 8,14 µmol/L de ZnPc-lipossomo. Numa concentração de 0,79
µmol/L foi observada a inativação bacteriana de 25% das células (aplicando-se uma
dose de luz de 325,1 mJ/cm
2
) que alcançou 100 % de inativação quando pré-
incubado com 3,78 µmol/L do corante. A toxicidade “per se”, apresentou-se com
valores máximos em torno de 20% quando do uso de 50 µmol/L, indicando também
que a morte bacteriana é certamente conseqüência das espécies reativas de
oxigênio produzidos, devido à diferença na concentração de droga necessária para
fotoinativar as bactérias na ausência ou presença de luz.
Para os fibroblastos a morte celular avaliada a partir dos experimentos com
MTT ou Azul Tripan (descritos em Material e Métodos), após a terapia fotodinâmica,
apresentaram uma toxicidade de aproximadamente 80% para concentrações acima
de 3,78 µmol/L, com uma toxicidade no escuro máxima de 20 % (50 µmol/L de
ZnPc-Lipossomo), sugerindo que o emprego da TFD in vivo, nestas condições, está
comprometido devido a alta toxicidade do sistema ZnPc-Lipossomo apresentada
sobre as células bucais (inserto da Figura 26).
As ftalocianinas têm sido empregadas como compostos fotossensíveis na
TFD visando a destruição de células cancerígenas, de bactérias e vírus
(STERNBERG & DOLPHIN, 1993). A principal característica fotofísica destes
corantes consiste numa forte absorção na região do vermelho do espectro de UV-
visível (banda Q) com uma sobreposição (“overlap”) na região de máxima
penetração de luz nos tecidos (JORI, 1996). Em contrapartida, para o emprego da
___________________________________________________Resultados e Discussão
88
TFD em S. mutans, a penetração em tecidos, baseado na chamada janela
terapêutica não se faz necessária, visto que normalmente esta bactéria não é uma
célula invasiva ou hospedeira de células humanas, mas sim de superfície.
De forma contrária, há uma considerável importância na permeação da luz
pelo biofilme formado pela bactéria. Assim, fica evidente que a técnica descrita pode
ser eficiente também contra bactérias tanto em meio planctônico quanto para em um
biofilme.
O emprego de lipossomos na formulação de drogas para a TFD é baseada
na observação de que a afinidade dos agentes fotossensíveis pelos tecidos
neoplásicos aumenta conforme a hidrofobicidade destes agentes (RICHELLI et al.,
1993). Apesar disso, no caso específico da TFD contra o S. mutans, é clara a
dificuldade em se manter uma droga altamente insolúvel em meio aquoso (no caso
o ZnPc) na presença das bactérias, sendo necessário um carreador.
Mesmo assim, estudos que avaliem a afinidade descrita por Richelli e
colaboradores (RICHELLI et al., 1993) devem ser realizados para a interação dos
lipossomos com as bactérias tanto em meio líquido (planctônico) ou quando
presentes na constituição de biofilmes.
4.2.4. Avaliação da formação de biofilme após TFD
A placa dental é o termo comumente empregado para o biofilme que é
formado na superfície do dente e que consiste numa complexa comunidade
microbiana presente na superfície dental. Além disso, a literatura já descreveu que
são as substâncias orgânicas, provenientes da fermentação lática de alguns
carboidratos, os responsáveis pela desmineralização da hidroxiapatida do dente
(SOUKOS et al., 2000; PAULINO et al., 2005).
Assim, o estudo da TFD sobre a viabilidade de S. mutans em meio
planctônico é somente um marco inicial dos estudos de TFD sobre este
microrganismo, permitindo a padronização da técnica e um estudo inicial sobre os
possíveis métodos de emprego da TFD contra o S. mutans.
Neste sentido, um estudo avaliando os efeitos da TFD em biofilme formado
por S. mutans foi realizado e, diferentemente do que já foi mostrado pela literatura
(ZANIN et al., 2005), este estudo emprega uma luz de baixo custo (foto-
___________________________________________________Resultados e Discussão
89
0,01 0,1 1 10
0
20
40
60
80
100
Morte Celular (%)
Log [ZnPc](µmol/L)
Morte Bacteriana (%)
Log [ZnPc](µmol/L)
110
0
20
40
60
80
Figura 26. Viabilidade de S. mutans na presença de variáveis concentrações de ZnPc-
Lipossomo. A bactéria (10
3
UFC) foi incubada com ZnPc-Lipossomo durante 10 minutos e
incubada em meio de cultivo TSA durante 36 horas a 37ºC na ausência de luz com () ou
sem () irradiação de luz pelo fotopolimerizador. Inserção: viabilidade dos fibroblastos na
presença de variáveis concentrações de ZnPc-Lipossomo. As células (10
6
) foram incubadas
com o corante durante 10 minutos e crescidas em DEMEN/F-12 por 24 horas no escuro
com () ou sem () irradiação com o fotopolimerizador.
___________________________________________________Resultados e Discussão
90
polimerizador de resina odontológica) ao invés de lasers.
Ao mesmo tempo, a proposta do trabalho está também focada no emprego
futuro deste equipamento, no tratamento de algumas doenças que envolvem
microrganismos presentes no trato bucal (PAULINO et al., 2004b)
A Figura 27 mostra as imagens do biofilme formado por S. mutans antes e
após o emprego da TFD utilizando-se Rose bengal, Protoporfirina IX e a ZnPc-
lipossomo, processadas conforme descrito em Material e Métodos (3.9.2).
A dose de luz e a concentração dos agentes fotossensíveis foram as mesmas
empregadas nos experimentos de TFD em meio planctônico. Os resultados indicam
que há uma diminuição do biofilme formado quando o mesmo é submetido à terapia.
Na verdade, as microscopias demonstram um significante decaimento da
formação do biofilme que, apesar de não ter sido quantitativamente comparado ao
grupo Controle, pode-se afirmar que os biofilmes submetidos a terapia fotodinâmica
utilizando-se 325,1 mJ/cm
2
de densidade de energia, apresentam uma menor taxa
de crescimento, quando comparado ao controle.
Este resultado também vem a reforçar a hipótese de que a diminuição da
formação do biofilme, assim como a inativação celular observada nos experimentos
anteriores, são fruto da formação de espécies reativas de oxigênio que,
possivelmente tenham afetado a viabilidade bacteriana.
Na Figura 27 pode ser observado que há uma confluência bacteriana sobre o
poço onde ocorre o crescimento bacteriano, diferentemente, nos poços onde foram
realizados os experimentos com a TFD, uma menor confluência é observada,
apresentando-se com uma intensidade intermediária ao grupo Controle e ao poço
limpo.
Estes estudos iniciais com a TFD aplicada ao biofilme podem ser
empregados no estudo do crescimento deste biofilme em outros materiais como
suportes de hidroxiapatita, dentes ou ainda sobre materiais de restauração.
4.2.5. Localização dos agentes fotossensíveis em S. mutans
Estudos realizados por Merchat e colaboradores, demonstram que a
localização celular de porfirinas meso-substituídas em bactérias Gram negativas é
gradativamente menor de acordo com o número de lavagens em tampão salino aos
quais as células são submetidas. Além disso, o tempo de incubação das células
___________________________________________________Resultados e Discussão
91
Corante
Controle PDT (30” luz) Poço limpo
RB
0,5µmol/L
PPIX
0,2µmol/L
ZnPc-Lipossomo
3,78µmol/L
Figura 27: Fotomicrografia do biofilme formado por S. mutans após crescimento durante 2
horas em meio completo suplementado com 1% de sacarose (p/v): RB, PPIX e ZnPc são
respectivamente as células tratadas com os agentes fotossensíveis Rose bengal,
Protoporfirina IX e ZnPc-lipossomo. O controle refere-se ao biofilme formado e não tratado
com a TFD. O poço limpo refere-se à micrografia do poço sem nenhum biofilme crescido
(aumento de 100 X).
___________________________________________________Resultados e Discussão
92
com o corante implica diretamente na concentração do mesmo em diferentes
compartimentos celulares (MERCHAT et al., 1996).
Assim, possivelmente, uma maior concentração do corante dentro das células
estará diretamente implicado com um maior tempo de incubação das mesmas com
a maioria dos agentes fotossensíveis.
Além disso, sabe-se que as espécies reativas produzidas pelos agentes
fotossensíveis são de vida curta e que não conseguem migrar pelos diferentes
compartimentos celulares devido a sua alta reatividade.
Neste sentido, uma melhor compreensão do local (região celular) onde o
agente fotossensível se localiza pode auxiliar numa melhor compreensão dos
mecanismos de ação da TFD sobre a bactéria, ou seja, determinando-se a
localização do corante, pode ser determinada uma possível ação do mesmo nas
respectivas regiões celulares como citoplasma, membrana, parede, algumas
organelas, etc.
Um experimento realizado neste sentido foi com irradiações feitas com o
fotopolimerizador, realizadas imediatamente após a adição dos agentes
fotossensíveis (Rose bengal, Protoporfirina e ZnPc-lipossomo) às diferentes
suspensões bacterianas. Assim, evitou-se uma possível entrada dos corantes nas
células, possibilitando que assim, o corante ligado à parede celular ou à membrana
fossem os responsáveis pela produção de ERO’s que levassem à inativação
bacteriana.
Desta forma, os resultados obtidos nestes experimentos foram
respectivamente semelhantes aos apresentados anteriormente (para todos os
agentes fotossensíveis pré-incubados por 10 minutos), sugerindo que o corante não
precisa entrar na célula para causar sua inativação. Além disso, bactérias que não
foram irradiadas não foram afetadas pelo corante mesmo com pré-incubação
(toxicidade “per se”).
Estes resultados somente sugerem a não entrada do corante na célula
(citoplasma celular), apesar do que para sua confirmação é importante uma
avaliação da presença dos agentes fotossensíveis no citoplasma bacteriano.
Possivelmente, os efeitos observados (inativação bacteriana) são
provenientes de danos causado à(s) biomolécula(s) presentes nesta bactéria
(proteína, lipídeo ou ácidos nucléicos), especificamente em sua parede ou
membrana.
___________________________________________________Resultados e Discussão
93
Assim, devido à possibilidade das espécies reativas estarem promovendo
danos à membrana bacteriana, estudos avaliando a peroxidação lipídica ou de
alteração da atividade de enzimas presentes nesta membrana seriam importantes
para esta compreensão.
4.2.6. Avaliação da capacidade acidogenica de S. mutans após TFD com os
diferentes agentes fotossensíveis
Um experimento avaliando a variação do pH de uma suspensão celular em
função do tempo é mostrado na Figura 28. Para isto, o Rose bengal, a PPIX e o
ZnPc-lipossomo foram adicionados à suspensão bacteriana para uma posterior
irradiação com o fotopolimerizador (325,1 mJ/cm
2
). Após esta irradiação, as células
em suspensão foram avaliadas durante 10 minutos quanto a sua capacidade de
produção de ácidos (avaliação do metabolismo de glicose).
Os resultados obtidos mostram que para as células que não foram
submetidas à terapia (células controle), um decaimento significativo do pH é
observado (pH ≅ 0,55), o que revela um metabolismo rápido da glicose como fonte
de carbono para a o processo fermentativo. Por outro lado, o emprego da TFD
utilizando o Rose bengal (0,5 µmol/L) e a Protoporfirina IX (0,2 µmol/L) fez com que
as bactérias diminuíssem significativamente sua capacidade acidogênica (pH ≅
0,01 e 0,05 respectivamente), sugerindo que houve uma redução do processo
metabólico responsável pela produção ou extrusão destes ácidos para o meio
extracelular. Esta diminuição da capacidade acidogênica pode ser reflexo de vários
fatores, que afetam a atividade ATPase (H+ATPase, ou outras enzimas extrusoras
de prótons), inbição de enzima(s) da via glicolítica, entre outros que porventura
estejam direta ou indiretamente implicados no metabolismo dos carboidratos.
Já a TFD utilizando o ZnPc-Lipossomo não afetou significativamente a
capacidade acidogênica da bactéria (pH ≅ 0,4) pois, este valor não expressa uma
significativa diminuição da capacidade acidogênica quando comparado ao controle
(pH ≅ 0,55). Assim, da mesma forma que os demais corantes, o ZnPc-lipossomo
também foi capaz de inativar as bactérias em meio planctônico e, mas não foi capaz
de promover uma diminuição da acidogenia da bactéria. Uma possível explicação
para este fato é que o sistema lipossomal possa interferir na inativação bacteriana
___________________________________________________Resultados e Discussão
94
de forma diferente dos demais corantes.
Além disso, quando avaliado a toxicidade “per se” de todos os corantes ou
somente da luz, resultados semelhantes aos encontrados quando aplicada a TFD
em meio planctônico também foram encontrados, indicando que a diminuição da
capacidade acidogênica de S. mutans é devido às espécies reativas de oxigênio
formadas.
Um experimento específico, avaliando a atividade ATPase total de uma
fração membrana de S. mutans foi de grande importância nesta etapa do trabalho,
haja visto a possibilidade das espécies reativas formadas estarem alterando
especificamente a atividade ATPase de algumas enzimas que realizam a extrusão
de prótons.
4.2.7. Avaliação da atividade ATPase total de fração de membrana de S.
mutans após emprego da TFD
Conforme descrito por Magalhães e colaboradores (MAGALHÃES et al.,
2003), a capacidade extrusora de prótons está ligada à atividade de enzimas
(ATPase do tipo P e F) presentes na membrana do S. mutans. Assim, os resultados
dos experimentos empregados para na avaliação da capacidade acidogênica (item
4.2.6) sugerem a possibilidade de existir uma relação entre as espécies reativas de
oxigênio com a diminuição desta capacidade.
Neste sentido uma fração de membrana de S. mutans obtida conforme
descrito em Material e Métodos, foi submetida ao tratamento com os agentes
fotossensíveis (Rose bengal, Protoporfirina e ZnPc-lipossomo) para a avaliação da
atividade ATPase total.
Para isto foram empregados 0,05; 0,02 e 0,37 µmol/L de Rose bengal, PPIX
e ZnPc-lipossomos respectivamente, para tratar as frações de membrana a serem
submetidas a TFD. A luz empregada foi a mesma utilizada nos experimentos
anteriores (325,1 mJ/cm
2
). Surpreendentemente, nenhum corante empregado, após
aplicação de luz, foi capaz de promover significativas alterações da atividade
ATPase.
A literatura descreve a ação da TFD em sistemas enzimáticos, causando
uma diminuição da atividade específica para algumas enzimas (PRINSZE et al.,
1991). Estes resultados indicam que as espécies reativas de oxigênio formadas não
___________________________________________________Resultados e Discussão
95
foram suficientes ou não alcançaram os sítios ativos das ATPases de forma a
modular suas atividades.
Neste sentido, mais estudos envolvendo uma variação tanto da concentração
dos corantes empregados quanto a dose de luz utilizada serão necessários para
uma maior avaliação da relação entre a TFD e a atividade ATPase total das frações
de membrana.
4.2.8. Avaliação do perfil eletroforético de proteínas do lisado bacteriano
A seleção natural de organismos no meio onde vivem não se dá somente
pelas suas características genotipicas. Uma nova modificação que permita a
proliferação de um organismo ocorre através da expressão de uma resposta
adaptativa à diversas condições de estresse fisiológico do ambiente. Assim, estudos
de mudanças de temperatura de crescimento, levaram ao descobrimento de
proteínas de choque térmico (HSP), ou também chamadas de proteínas de estresse
(HRIMECH et al., 2000).
As proteínas de estresse são divididas em famílias e, as mais conhecidas são
as HSP-60 (GroEL, aproximadamente de 60 KDa.) e HSP-70 (GroEL,
aproximadamente de 70 KDa) (HRIMECH, et al., 2000), que podem ser analisadas
após a indução do estresse (térmico, osmótico ou ácido) nas bactérias, seguido por
uma análise eletroforética acompanhada ou não por uma análise de “blotting”.
Na Figura 29, um gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) foi empregado na
separação eletroforética de um lisado celular obtido conforme descrito em Material e
Métodos. Na linha PM estão dispostos os padrões de peso molecular (45 – 205
KDa). As linhas 1 e 2 mostram respectivamente o perfil eletroforético de células
submetidas ao controle osmótico (cloreto de sódio 0,5 mol/L) e as células não
submetidas ao estresse (grupo controle). A marcação (retângulo) no gel refere-se a
região onde podem ser encontradas as proteínas de choque térmico expressas
(com peso molecular de 70 KDa).
Estas bandas protéicas, referentes às HSP, não foram observadas nestas
condições, o que indica a necessidade de uma melhor padronização do cultivo e
tratamento das células para a realização deste experimento.
Utilizando técnicas de proteômica, McNeill e Hamilton conseguiram
evidenciar perfeitamente uma diferença na expressão das proteínas HSP-60 e HSP-
___________________________________________________Resultados e Discussão
96
0246810
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
∆pH
Tempo (minutos)
Figura 28: Variação do pH observado em suspensão de S. mutans na presença de glicose
(50 mmol/L) após terapia fotodinâmica: (•) Grupo Controle, () Rose bengal, ()
Protoporfirina IX e () ZnPc-lipossomo. Durante 10 minutos foi avaliado o pH da
suspensão. Valores expressos em pH conforme descrito em Materiais e Métodos.
___________________________________________________Resultados e Discussão
97
70 após uma indução de estresse ácido (McNEIL & HAMILTON,2004),
diferentemente, a sensibilidade da técnica empregada neste experimento não
permitiu a visualização de bandas protéicas relacionadas às HSP.
4.2.9. Avaliação da expressão de proteínas de choque térmico em S. mutans
após TFD com Rose bengal
Conforme descrito por Len e colaboradores, há uma maior expressão de
proteínas de estresse após sua indução (estresse ácido) em Streptococcus mutans .
Inclusive, uma recente análise proteômica reforça a idéia de que ocorrem também
alterações nas vias metabólicas deste organismo quando este é exposto a
condições estressantes (LEN et al., 2004).
Assim, proteínas de choque térmico podem indicar em microrganismos a
existência de alguma condição estressante que possa comprometer a viabilidade
celular. Neste sentido, um experimento para avaliar a expressão destas proteínas
em S. mutans foi realizado.
A bactéria S. mutans foi submetida a diversas condições de estresse,
posteriormente lisada. Este lisado celular foi submetido a uma eletroforese
desnaturante (SDS-PAGE), e posteriormente transferido para uma membrana de
nitrocelulose que foi tratada com anticorpos específicos para proteínas de estresse
(HSP-70) conforme descrito em Material e Métodos.
Assim, nossos resultados indicam que S. mutans expressa esta classe de
proteína em todas as situações de estresse induzidas (inclusive no grupo controle).
A Figura 30 mostra um blotting das proteínas, em papel de nitrocelulose. Estas
proteínas podem ser confirmadas nas 5 colunas da membrana com uma
intensidades de cor que indicam semelhantes expressões protéicas para a HSP70.
Neste sentido, as condições avaliadas não foram suficientes para induzir nenhuma
diferença na expressão destas proteínas pela bactéria.
Diferentemente, Hrimech e colaboradores encontraram diferentes expressões
destas proteínas após uso de xilitol ou empregando-se mutantes de S. mutans que
não expressam estas proteínas (HRIMECH et al., 2000).
4.2.10. Avaliação do perfil eletroforético de DNA de S. mutans após emprego
de TFD na presença de diferentes agentes fotossensíveis
___________________________________________________Resultados e Discussão
98
Uma das conseqüências da acidificação intracelular é a perda de bases
púricas e/ou pirimidicas do DNA. Assim, danos a esta molécula, não reparados,
bloqueiam sua síntese ou replicação, podendo ser letal a célula (LEN et al., 2004).
Após TFD, a possível perda da atividade ATPase poderá induzir a uma
diminuição do pH citoplasmático bacteriano, causando portanto, como já descrito
anteriormente, danos ao DNA.
A Figura 31 mostra o efeito da fotosensibilização no DNA de S. mutans
inativado pela TFD. Nas linhas 1, 2, 3 e 4 estão indicadas as amostras de DNA
obtidas da extração após o emprego da terapia com Rose bengal, PPIX, ZnPc-
lipossomo e também o Grupo Controle, respectivamente. O DNA analisado não
apresentou danos, mostrando-se sem nenhuma fragmentação.
Por outro lado, Bhatti e colaboradores mostram uma degradação do DNA
após o emprego da TFD na bactéria Porphyromonas gingivalis, sugerindo que a
morte celular pode ser proveniente do dano ao material genético deste organismo
(BHATTI et al., 1998).
O emprego da TFD sobre um microrganismo Gram positivo tem como
conseqüência a inativação bacteriana, causando efeitos específicos sobre algumas
organelas e estruturas celulares, conforme mostrado para S. mutans no presente
trabalho. Entretanto, os efeitos causados pela TFD em microrganismos Gram
negativos, como a P. gingivalis, mostraram-se diferentes, sugerindo que os efeitos
deletérios sobre o S. mutans possam estar ocorrendo em microambientes diferentes
ou provenientes de efeitos menos drásticos no próprio DNA, como a formação de
adutos que impeçam uma possível síntese ou transcrição.
___________________________________________________Resultados e Discussão
99
Figura 29. Eletroforese de gel de poliacrilamdia para o li8sado pretéico de S. mutans. A
bactéria foi cultivada e posteriormente lisada com tampão de lise. As proteínas (50 µg por
linha) separadas em SDS-PAGE 7,5%, PM: peso molecular padrão; 1: S. mutans
estressado com NaCl; 2: S. mutans não estressado (controle negativo). Tratamentos
conforme descrito em Material e Métodos.
PM 1 2
205 KDa
116 KDa
97,4 KDa
66 KDa
45 KDa
HSP70
___________________________________________________Resultados e Discussão
100
Figura 30. Imunoblot de proteínas (Heat Shock Protein 70). S. mutans foi cultivado e
posteriormente lisados com tampão de lise. As proteínas (50µg por linha) separadas em
SDS-PAGE 10%, foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose, à qual foi
incubada com anticorpo anti-GROEL (1:100) e anticorpo monovalente conjugado com
peroxidase. 1: S. mutans submetido a TFD; 2: S. mutans irradiado com Luz proveniente do
fotopolimerizador de resina odontológica; 3: S. mutans estressado com NaCl 4: S. mutans
não estressado (controle negativo); 5: S. mutans tratado com Rose bengal. Tratamentos
conforme descrito em Material e Métodos.
PM 1 2 3 4 5
205 KDa
116 KDa
97,4 KDa
66 KDa
29 KDa
___________________________________________________Resultados e Discussão
101
Figura 31: Gel de agarose das amostras de DNA obtidas de S. mutans. 1: S. mutans não
submetido a TFD; 2: S. mutans submetido a TFD com Rose bengal; 3: S. mutans submetido
a TFD com PPIX e 4: S. mutans submetido a TFD com ZnPc-lipossomos.
1 2 3 4
_____________________________________________________________Conclusão
102
5. CONCLUSÃO
Conforme o proposto, a metodologia padronizada em nosso trabalho
possibilitou o cultivo de S. mutans em meio líquido (planctônico) ou na forma de
biofilme, tornando-se possível assim a realização de testes com a aplicação da
terapia fotodinâmica. As curvas de crescimento da bactéria na presença de
diferentes fontes de carbono (xilose e/ou glicose) ou diferentes meios de cultivo
(TSB ou meio completo) permitem avaliar as características de seu crescimento e
consumo de glicose.
Em meio líquido, pode-se concluir que, entre a 5ª e 10ª hora após o inóculo
(fase “Log”), há uma maior atividade metabólica da bactéria, reflexo de um aumento
significativo da densidade óptica do meio de cultivo, com um respectivo aumento da
taxa de crescimento bacteriano. Assim, as células obtidas para a realização deste
trabalho foram crescidas até a fase “Log”, garantindo-se um número maior de
células metabolicamente ativas e viáveis para o experimento.
Uma análise das curvas de crescimento possibilitou avaliar o metabolismo
anaeróbico de S. mutans que consome açúcares fermentáveis (glicose, frutose,
sacarose e maltose), mostrando-se hábil na produção de ácidos.
De acordo com os objetivos do trabalho, uma fonte de luz já disponivel em
consultórios odontológicos foi selecionada para o emprego na TFD. Desta maneira,
o fotopolimerizador de resina odontológica foi o equipamento escolhido por
apresentar baixo custo, fácil manuseio, além de não apresentar emissão de luz UV-
A ou UV-B que possa causar danos ao olho do operador e/ou do paciente no caso
de uma aplicação clínica. Quando utilizado, o equipamento emite nas condições
padronizadas, uma dose de luz de 325,1 mJ/cm
2
que corresponde a uma exposição
à luz durante 30 segundos.
Os corantes selecionados para este trabalho foram o Rose bengal, a PPIX e
a Zinco ftalocianina. O Rose bengal, um clássico agente fotossensível, possui
significativo rendimento quântico na produção de oxigênio singlete (
=0,90) e é
empregado como uma droga modelo em muitos experimentos, apesar de não ser
permitido o seu uso clínico na TFD. Quanto aos demais corantes empregados,
estes foram caracterizados fotoquimicamente e os resultados permitiram concluir
que há também uma produção de oxigênio singlete (
) pela PPIX e ZnPc-
lipossomo de 8,42 e 0,54, respectivamente.
_____________________________________________________________Conclusão
103
A diferença entre as concentrações de corante que causa a morte da bactéria
na presença e na ausência de luz, indica que os compostos produzidos pela
fotoativação são os responsáveis pela morte celular. Além disso, nas condições de
terapia fotodinâmica estudadas, as concentrações de Rose bengal (0,5 µmol/L) e
PPIX (0,2 µmol/L) foram eficientes na inativação bacteriana ao passo que nestas
mesmas condições, com os fibroblastos, não houve morte celular.
Diferentemente, para o ZnPc-lipossomo, a concentração encontrada de
corante (3,78 µmol/L) necessária para fotoinativar a bactéria, resultou em uma
toxicidade de aproximadamente 80% para os fibroblastos.
Além disso, células irradiadas imediatamente após a adição dos corantes
foram semelhantemente inativadas após TFD, podendo ser desconsiderada uma
incubação prévia com os agentes fotossensíveis e sugerindo uma possível ação
das ERO’s fora da bactéria.
Quanto à formação do biofilme, pode-se concluir que S. mutans foi capaz de
formá-lo quando crescida na presença dos carboidratos analisados (glicose, frutose,
sacarose, xilose ou maltose; 1% p/v). Há uma maior formação deste biofilme
quando as células foram crescidas na presença de sacarose. Além disso, o biofilme
que foi submetido a um cultivo na presença de flúor, foi significativamente afetado
pelo gradativo aumento deste haleto (1 a 5 mmol/L). Esta diminuição na formação
do biofilme pode ser justificada possivelmente pelo bloqueio da atividade glicolítica
e/ou diminuição do substrato de adesão.
O biofilme de S. mutans também foi submetido a TFD com as doses de
corantes empregadas e definidas em meio planctônico. Neste sentido, pode-se
concluir que as concentrações dos corantes: Rose bengal (0,5 µmol/L),
Protoporfirina IX (0,2 µmol/L) e ZnPc-lipossomo (3,78 µmol/L), foram também
capazes de diminuir significativamente a intensidade do biofilme, observado após 4
horas de crescimento.
A TFD aparentemente não apresentou interferência na atividade ATPase
total extraída da membrana da bactéria, com nenhum dos corantes estudados.
Em adição, os estudos para determinar a localização do corante na bactéria,
da peroxidação lipídica, de análise do DNA, e de proteínas de estresse após TFD,
não trouxeram nenhuma informação adicional conclusiva sobre o alvo específico
das ERO’s que causam a inativação bacteriana.
As técnicas descritas neste trabalho ainda não poderão ser utilizadas na
_____________________________________________________________Conclusão
104
clínica em substituição a técnicas existentes, mas, após maiores estudos, poderá
ser empregada como uma modalidade complementar às quimioterapias
antimicrobianas convencionais, por ser simples e de fácil emprego. O custo do
fotopolimerizador também é um fator que deve ser ponderado pois na técnica
proposta, é um equipamento barato e já disponível em consultório odontológico.
Além disso, há a possibilidade de se utilizar diferentes corantes, sintéticos ou
naturais, dada a capacidade de adaptação do equipamento a filtros de luz, tornando
o processo ainda mais barato e simples de ser adequado às características do
corante.
____________________________________________________________Bibliografia 105
6. BIBLIOGRAFIA
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__________________________________________________________Anexos 115
7. ANEXOS
__________________________________________________________Anexos 116
__________________________________________________________Anexos 117
__________________________________________________________Anexos 118
__________________________________________________________Anexos 119
__________________________________________________________Anexos 120
__________________________________________________________Anexos 121
__________________________________________________________Anexos 122
__________________________________________________________Anexos 123
__________________________________________________________Anexos 124
__________________________________________________________Anexos 125
__________________________________________________________Anexos 126
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__________________________________________________________Anexos 129
__________________________________________________________Anexos 130
__________________________________________________________Anexos 131
__________________________________________________________Anexos 132
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__________________________________________________________Anexos 148
__________________________________________________________Anexos 149
__________________________________________________________Anexos 150
__________________________________________________________Anexos 151
__________________________________________________________Anexos 152
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__________________________________________________________Anexos 154
__________________________________________________________Anexos 155
__________________________________________________________Anexos 156
__________________________________________________________Anexos 157
Artigo submetido à Biochemistry and molecuylar biology education/2006
Monitoring the acidogeny of Streptococcus mutans:
The effect of carbon source and fluoride
Tony P. Paulino
a
, Maytê Bolean
a
, Pietro Ciancaglini
a
and Geraldo Thedei Jr.
b*
a
Departamento de Química, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto,
FFCLRP–USP, 14040-901 Ribeirão Preto, SP, Brazil
b
Universidade de Uberaba, 38055-500 Uberaba, MG, Brazil
*Corresponding author
E-mail address: [email protected] (G. Thedei)
Key words: Streptococcus mutans; carbon source, fluoride, acidogenesis
__________________________________________________________Anexos 158
Abstract
The main objective of this class experiment is to show the influence of the
carbon source and fluoride on the acidogenic capability of Streptococcus mutans. Under
the experimental condition of 50 mmol/L of fermentable carbohydrate, a decrease of 3
and 2 pH units was observed in the absence or presence of 1 mmol/L fluoride,
respectively. The great acidogenic capability and the velocity of acid production by this
cariogenic bacterium allow an interesting discussion regarding the metabolic pathways
which lead to cavity development. The influence of fluoride in acidogenesis reinforces
the importance of this halogen in cavity prevention. In addition to that, the low
execution cost and the simple technical apparatus makes this experiment easy to
perform.
Key words: Streptococcus mutans; carbon source, fluoride, acidogenesis
__________________________________________________________Anexos 159
INTRODUCTION
The destruction of the mineralized structures of teeth is called “dental cavity”.
This process occurs basically by the action of acids produced by a variety of
microorganisms which are normally present on tooth surface, forming an “oral
microbiota” or “dental biofilm”. Among the organisms found on biofilm, the Gram
positive bacterium Streptococcus mutans stands out, recognized as one of the main
caries-forming organisms and is a substantial part of the mouth cell microbiota [1].
The energy production by this organism is due to the anaerobic metabolism of
carbohydrates, causing a pH drop on the dental surface and a consequent solubilization
of the hydroxyapatite present at dental enamel, leading to dental cavity development [1].
There are two hypotheses for explain the acidification process. The most used
one proposes that protons originate from glucose metabolism itself, during anaerobic
fermentation process [2, 3, 4]. An alternative hypothesis postulates that hydrolysis of
ATP without its regeneration através da oxidative phosphorilation generates the excess
of protons, whereas anaerobic fermentation of glucose produces no net acid [5].
Sucrose is considered the most cariogenic of sugars, not only because of the fact
it supplies highly fermentable monosaccharide (glucose and fructose), but also because
it is the substrate of enzymes which produce polysaccharides that favor bacterial
adhesion on dental surface forming a biofilm composed of different microorganisms
[6].
Among the action mechanisms proposed for dental cavity reduction, the use of
fluoride is prescribed due to the: inhibition of glycolitic enzyme enolase, reduction of
cellular aggregation mediated by glucan-binding proteins [7, 8], remineralization of
acid-demineralized teeth and the formation of a less soluble dental component
fluorhydroxyapatite [9].
The main objective of this experiment is to demonstrate the acid production by
S. mutans metabolizing different sugars in the presence e absence of fluoride.
BACKGROUND THEORY AND PRE-LABORATORY PREPARATION
Through the 10 biochemical reactions of glycolysis, glucose is metabolized
generating two molecules of pyruvate. This process reduces 2 moles of NAD
+
in 2
moles of NADH and generates a gain of 2 moles ATP per mol of glucose metabolized.
As more and more glucose molecules are metabolized in this pathway, the NAD
+
stock
becomes deprived and the regeneration of this molecule is necessary. To do this, the
NADH may give their electrons to the respiratory chain (in aerobic organisms), a
sequence of electron-transfer components which finally give the electron to its final
acceptor oxygen. This process generates a high ATP yield and is used by so-called
“aerobic organisms”. Alternatively, NADH may donate its electrons to the pyruvate
__________________________________________________________Anexos 160
itself, in a process called fermentation [10] which is used by the so-called “anaerobic
organisms”.
Streptococcus mutans, like other cariogenic bacteria, are not able to synthesize
cytocromes and do not carry out oxidative phosphorilation. This organism uses the
carbohydrates present in the host’s diet trough glycolytic pathway (Embden-Meyerhof-
Parnas Pathway) leading to the production of pyruvate [11].
The pyruvate receives the electrons carried by NADH (regenerating NAD
+
) in
an anaerobic process called “lactic fermentation”, since this reaction forms mainly
lactate but also acetate small amounts of formate, pyruvate, succinate and propionate
[12, 13]. All these anions formed inside the cell must be expelled to the external
medium avoiding its accumulation in the cytoplasm.
Due to its great metabolic activity and to the presence of a proton pump that
extrudes H
+
from cell interior in the direction of external medium, the environment
surrounding the bacteria becomes acidified, leading to demineralization of tooth
structures and, as a result, to cavity development [14, 15, 16].
The fermentation process is blocked in the presence of fluoride by at least two
ways, both related with the inhibition of the enzyme enolase, the 9
th
enzyme of the
glycolytic pathway: (i) enolase converts 2-phosphoglycerate and ADP into
phosphoenolpyruvate (PEP) and ATP, avoiding ATP production and (ii) the glucose
uptake is reduced because one of the systems for absorption of this sugar in streptococci
involves PEP, thus depriving the cell of glucose and, consequently, of energy. The
combination of these effects may be related to the reported beneficial effects of fluoride
in oral health [9].
The simple experiment proposed here allows the discussion of essential aspects
of S. mutans sugar metabolism and its effects over acidification of extracellular medium
and the possible consequent tooth demineralization. The effect of fluoride gives light to
the important role of this halogen in dental cavity prevention.
GENERAL NOTES
In this class experiment, we describe a methodology adapted to the use of a S. mutans
strain acquired commercially. There is a possibility of isolating a lineage of S. mutans,
inoculating a saliva sample in Mitis-Salivarius-Bacitracin-Sucrose (MSBS), a selective
culture medium [17].
EXPERIMENTAL PROCEDURE
__________________________________________________________Anexos 161
Strain: The ATCC 25175 strain of Streptococcus mutans is available from the André
Tosello Foundation, Campinas-SP (Brazil) http://www.bdt.fat.org.br/
. The lineage was
stored in –20ºC in 40% (v/v) glycerol.
Liquid medium: The complete medium described by Dhasper and Reynolds [17] was
used as described [18]. This medium was composed by 10g/L triptone; 5 g/L Yeast
extract; 60 µmol/L MgSO
4
; 1.3 µmol/L FeSO
4
; 1.5 µmol/L MnCl
2
; 0.2 mmol/L
KH
2
PO
4
; 0.3 mmol/L K
2
HPO
4
; 0.7 mmol/L KCl and autoclaved at 121ºC during 15
min.
Sugars solutions: Each stock sugar solution (glucose, xylose, sucrose, fructose), used to
complement the complete culture medium was prepared at a final concentration of 2
mol/L and autoclaved at 121ºC for 15 min. Maltose stock solution was 1 mol/L,
autoclaved under the same condition.
Growth conditions: All cultivations were done in a candle jar, at 37ºC for 24 hours, in a
micro-aerophilic atmosphere obtained after lighting a candle inside the jar and tampar a
jarra hermeticamente to consume part of the oxygen and avoid entrada de fresh air. This
is a simple way to consume part of oxygen present in the environment, creating an ideal
atmosphere to the S. mutans growth.
Pre-inoculate: Stock strain was submitted to 3 successive transferences (12 hours
incubation) in Tryptic Soy Broth (TSB) medium in order to reestablish their normal
metabolism. The turbidity of the pre-inoculate was adjusted to A
600nm
=0.5,
corresponding to ~10
9
cells/mL (for details see reference [18, 19] and the inoculate in
100 mL liquid medium supplemented with glucose as carbon source. The cells were
then submitted to overnight incubation as described above.
Carbohydrate pulse: After overnight growth, the cells were harvested by centrifugation
at room temperature and washed with 10 mL of 50 mmol/L KCl containing 1 mmol/L
MgCl
2
. The cells were suspended in the same solution and the absorbance was adjusted
to 1 and the pH to 7.3 using 0.5 mol/L KOH. To 10 mL of the cell suspension, the
volume of carbohydrate enough to 50 mmol/L final concentration was added and the pH
__________________________________________________________Anexos 162
was monitored during at least 2 hours. During this time, the incubation was kept at room
temperature and slow stirring.
Cell disposal: The cells which were not used or remained from the experiment were
autoclaved at 121ºC for 20 minutes and then discarded.
STUDENT PITFALLS
This is a very easy class experiment, but some problems, such as culture
contamination, may occur as a result of bad manipulation.
Adjusting the pH of the cell suspension to 7.3 is time consuming, since the cell
suspension can drop the pH strongly. The addition of 0.5 mol/L KOH solution should
be drop to drop, in order to avoid excessive alkalinization of the cell suspension.
RESULTS AND DISCUSSION
Figure 1 shows the decrease in pH after the addition of different sugars to a cell
suspension of S. mutans. An intense and very similar pH decrease can be observed until
the 20 initial minutes of incubation with glucose, fructose, maltose and sucrose. After
this initial and intensive acid liberation, a phase of slow pH decrease is observed,
continuing until 120 minutes of incubation. This decrease in pH is due, as described
above, to sugar metabolization through glycolytic pathway with subsequent production
of organic acids which makes the environment acidic, as already observed in culture
medium [19].
When xylose is the carbon source, the acidification is less intense and reaches a
similar value to that of the control without carbohydrate addition. Since it was already
described that xylose does not promote the growth of S mutans [19], the initial
acidification may occur due to one alternative mechanism of sugar uptake by this
organism, which involves the antiport with H
+
[20]. Since xylose may not be
metabolized by the bacterium, the energy production soon decreases and the
acidification stops. In fact, in the absence of metabolic fuel, the pH decreases uniformly
and reaches values similar to that observed in the pulse with xylose (Figure 1). This
reinforces the observation of Paulino et al. [19], where growth and acidification in
media without the addition of carbohydrate are insignificant, possibly because the
fermentable sugar is restricted to the intracellular reserves, as already described [21].
These reserves would be enough to start the acidification, but they would soon be
__________________________________________________________Anexos 163
depleted. So, the pH decrease in the control and xylose experiments is due to the
elimination of acid produced through the metabolization of intracellular reserves of fuel,
probably polysaccharides [22].
This experiment also shows us that sucrose is not more acidogenic than glucose
or fructose, since it induces a similar acidification of extacellular environment. The
cariogenicity of this sugar is related with the induction of the synthesis of extracellular
polysaccharides evolved with bacterial adhesion on tooth surface and consequent
biofilm formation, as described by Rola [6].
Figure 2 shows the results of a carbohydrate pulse in the presence of 1 mmol/L
fluoride. It may be observed that fluoride affects negatively the acidogenic capacity of
S. mutans for all metabolized sugars. This may be due, at least in part, to the known
inhibition of enolase by fluoride. The inhibition of this enzyme leads to block glycolysis
and the subsequent acid production, explaining the small acidification. Since xylose is
not metabolized by S. mutans, the fluoride has no effect on acid production when this
sugar is the carbon source. Besides that, this ion can also interfere in the use of
intracellular reserves (intracellular glycogen) since in the cell suspension supplemented
with fluoride there is a smaller acidification than the one observed in its absence.
Fluoride may also affect the glucose absorption, since glucose (and many other
sugars) is transported through the phosphoenolpyruvate (PEP)-dependent sugar
phosphotransferase system (PTS), o qual depende da presence de phosphoenolpyruvate.
Uma vez que a inhibition of enolase blocks the production of phosphoenolpyruvate, this
result in a reduction of PTS activity [9].
In addition, fluoride can inhibit the proton translocating F-type ATPase of
streptococcal cell membranes, causing a deleterious intracellular pH drop [2].
In conclusion, this class experiment shows that S. mutans is able of intensive
acid production, as long as the carbon sources are metabolized by the organism, leading
to an elevated risk of dental cavity development of the host due to the acid-induced
tooth demineralization. Opposed to common sense, this risk appears soon after
carbohydrate reaches the bacterium and not after many hours wit hout tooth hygiene,
since it was observed that the major acidification occurs after the 20 initial minutes of
incubation in the presence of metabolized sugars. In other words, the demineralization
of tooth begins soon after carbohydrate consumption, so mouth hygiene should be done
fast. Better results are expected if hygiene contains fluoride, because acidogenesis is
significantly affected by this halogen, possibly by the blockage of the glycolytic
__________________________________________________________Anexos 164
activity.
LABORATORY TIME
Our experience with different student classes shows that 1 period of 4 hours
separated by an overnight interval is adequate to carry out the experiment as described.
An assistant can prepare and autoclave the culture medium, prepare the pre-inoculate
and adjust the pH of cell suspension in advance, leaving to the students the pulse of
carbohydrates and pH measurement.
Acknowledgements
We thank Priscila Cerviglieri for revision of the manuscript. We also thank FAPESP, CNPq, CAPES and Universidade de Uberaba,
for the continuous support given to our laboratories. TPP is the recipient of a Ph.D. fellowship from CAPES.
STUDY QUESTIONS
1) Why can S. mutans induce cavity formation?
2) Why does enolase inhibition decrease the acidification of the incubation medium?
3) How is glucose transformed into lactic acid, by lactic fermentation?
4) Is sucrose more acidogenic than glucose or fructose?
5) If the previous answer is “no”, why is sucrose more cariogenic than other sugars?
6) If tooth hygiene is done 30 minutes after ingestion of a sucrose-containing food, is
there any risk of dental cavity?
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__________________________________________________________Anexos 166
0 20406080100120
4
5
6
7
pH
Incubation time (min)
Figure 1: pH of cell suspension of S. mutans supplied with different carbon sources. A
cell suspension was supplied with: (z) Glucose; (▲)Fructose; (▼) Xylose; (♦)
Maltose; (|) Sucrose and (■) without carbon source. Data represent mean values (n=3)
and error bars represent standard deviations.
__________________________________________________________Anexos 167
0 20406080100120
5
6
7
pH
Incubation time (min)
Figure 2: pH of cell suspension of S. mutans supplied with different carbon sources, in
the presence of 1 mmol/L fluoride. A cell suspension was supplied with: (z) Glucose;
(▲)Fructose; (▼) Xylose; (♦) Maltose; (|) Sucrose and (■) without carbon source.
Data represent mean values (n=3) and error bars represent standard deviations.
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