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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS:
FISIOLOGIA
AMÍGDALA MEDIAL PÓSTERO-VENTRAL:
CARACTERIZAÇÃO
ULTRA-ESTRUTURAL E VOLUME SOMÁTICO
NEURONAL EM RATOS MACHOS E FÊMEAS AO
LONGO DO CICLO ESTRAL
Maria Izabel de Ugalde Marques da Rocha
Porto Alegre
2006
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS:
FISIOLOGIA
AMÍGDALA MEDIAL PÓSTERO-VENTRAL: CARACTERIZAÇÃO
ULTRA-ESTRUTURAL E VOLUME SOMÁTICO NEURONAL EM RATOS
MACHOS E FÊMEAS AO LONGO DO CICLO ESTRAL.
Maria Izabel de Ugalde Marques da Rocha
Orientadora: Profa. Dra. Matilde Achaval Elena
Co-orientador: Prof. Dr. Alberto Rasia-Filho
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia
da Universidade Federal do Rio Grande do Sul como
requisito parcial para obtenção do título de doutora.
Porto Alegre
2006
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III
“Quando você acha que sabe todas as
respostas, vem a vida e muda todas as
perguntas
”
Bob Marley
Tente outra vez
Veja
Não diga que a canção está perdida
Tenha fé em Deus, tenha fé na vida
Tente outra vez
Beba
Pois a água viva ainda está na fonte
Você tem dois pés para cruzar a ponte
Nada acabou, não não não não
Tente
Levante sua mão sedenta e recomece
a andar
Não pense que a cabeça agüenta se
você parar,
Há uma voz que canta, uma voz que
dança, uma voz que gira
Bailando no ar
Queira
Basta ser sincero e desejar profundo
Você será capaz de sacudir o mundo,
vai
Tente outra vez
Tente
E não diga que a vitória está perdida
Se é de batalhas que se vive a vida
Tente outra vez
Raul Seixas/Paulo Coelho/Marcelo Motta
IV
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Maria Flávia Marques Ribeiro pela confiança em mim depositada no início
deste crescimento, pelo profissionalismo, orientação, incentivo e amizade.
À Profa. Dra. Matilde Achaval pela orientação construtiva, atenção, dedicação e estímulo
na preparação deste trabalho tão importante na minha formação profissional.
Ao Prof. Dr. Alberto Antônio Rasia Filho pelas sugestões e contribuições.
À Profa. Dra Maria Cristina Faccioni-Heuser pela contribuição e auxílio.
À Cristiane Lopes e a Moema Queirós pelo profissionalismo e disponibilidade.
Em especial ao Ernesto e aos meus filhos, Felipe e Gabriel pelo carinho, paciência,
compreensão, apoio nas horas difíceis, por entenderem a minha ausência durante a realização
deste trabalho e por acreditarem em mim.
À minha mãe, pela confiança em mim e pelo incentivo em todos os momentos.
Às minhas irmãs e sobrinhos pela assistência aos meus filhos na minha ausência.
À Aline Pagnussat pela amizade, afinidade, cumplicidade, estímulo, desprendimento,
integridade e auxílio valioso nos momentos difíceis.
À Susie Andrade pela convivência preciosa e amizade.
À Cláudia Puperi pelo incentivo, amizade e pela alegria que sempre transmite.
Às minhas amigas Lauren, Dircinha, Márcia, Martha, Marta, Gizele, Vania, Vera Lúcia,
Clarice, Leonor e Beatriz pelo interesse e pela força quando o desânimo me superava.
Às amizades criadas durante a convivência enriquecedora no laboratório de
Histofisiologia Comparada do Departamento de Ciências Morfológicas da UFRGS: Cláudia
Forti, Jocemar Ilha, Paula Rigon, Juliana de Castilhos, Erica Hermel, Rafaela Araújo, Gustavo
Mânica, Simone Marcuzzo, Pedro Kalil Gaspar
, Flávia Martinez, Régis Mestriner, Taís
Sarzenski, Marina Marchi, Alessandra Swarowsky, Giordano Viola, Aline Dall’Oglio, Nice Artemi,
Patrícia Nascimento, Eudira da Silva, Antônio Severino, Günther Gehlen e Léder Xavier.
Aos colegas do Departamento de Morfologia da UFSM pela disponibilidade e apoio
durante a minha ausência.
Ao CCS e ao Dep. Morfologia pelo auxílio nas minhas viagens.
À UFSM, à CAPES, à UFRGS e ao Programa de Pós Graduação em Fisiologia pela
oportunidade.
A todos, que contribuíram para minha formação e para que este trabalho se tornasse
realidade.
V
SUMÁRIO
ABREVIATURAS............................................................................................................VII
LISTA DE FIGURAS......................................................................................................VIII
LISTA DE TABELAS........................................................................................................X
RESUMO.........................................................................................................................XI
ABSTRACT...................................................................................................................XIII
1. INTRODUÇÃO..............................................................................................................1
1.1 Considerações gerais..................................................................................................2
1.2 Amígdala.....................................................................................................................2
1.2.1 Amígdala medial.......................................................................................................5
1.2.1.1 Localização, divisão e função................................................................................5
1.2.1.2 Conexões da amígdala medial……………………......……………….........……..…8
1.2.1.3 Citoarquitetura da amígdala medial.....................................................................13
1.2.2 Dimorfismo sexual, hormônios, ciclo estral, neurotransmissores...........................20
1.3 Lateralidade..............................................................................................................23
2. OBJETIVOS................................................................................................................25
3. MATERIAL e MÉTODOS............................................................................................27
3.1 Animais......................................................................................................................28
3.2 Identificação das fases do ciclo estral.......................................................................28
3.3 Experimentos ...........................................................................................................29
3.3.1 Experimento 1 - Avaliação do volume somático de neurônios da MePV de ratos
machos e fêmeas ao longo do ciclo estral......................................................................29
3.3.2 Experimento 2 - Estudo das características ultra-estruturais dos neurônios e dos
seus contatos sinápticos da MePV de ratos machos e fêmeas em diestro ..................32
3.3.2.1. Microscopia eletrônica.......................................................................................32
4. RESULTADOS...........................................................................................................33
VI
4.1 Experimento 1: Volume somático neuronal de células da amígdala medial póstero-
ventral de ratos machos e fêmeas no ciclo estral...........................................................34
4.1.1 Análise histológica..................................................................................................34
4.1.2 Análise estatística do volume somático neural......................................................34
4.2 Experimento 2: Características ultra-estruturais dos neurônios e contatos sinápticos
na amígdala medial póstero-ventral de ratos machos adultos e fêmeas em
diestro..............................................................................................................................38
4.2.1 Análise ultra-estrutural...........................................................................................38
5. DISCUSSÃO...............................................................................................................54
6. CONCLUSÕES...........................................................................................................67
7. PERSPECTIVAS.........................................................................................................69
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................71
9. ANEXOS.....................................................................................................................86
VII
ABREVIATURAS
AMPA
α-Amino-3-hydroxy-5-Methylisoxazolepropionoc Acid
BNST Núcleo próprio da estrial terminal
IP
3
Inositol trifosfato
GABA
Ácido γ-aminobutírico
GFAP Proteína ácida fibrilar glial
GnRH Hormônio liberador de gonadotrofinas
5-HT 5-Hidroxitriptamina
MeA Núcleo medial da amígdala
MeAD Subnúcleo ântero-dorsal da amígdala medial
MeAV Subnúcleo ântero-ventral da amígdala medial
MePD Subnúcleo póstero-dorsal da amígdala medial
MePV Subnúcleo ântero-ventral da amígdala medial
NMDA N-metil-D-aspartato
PB Tampão fosfato
PBS Tampão fosfato salino
REL Retículo endoplasmático liso
RER Retículo endoplasmático rugoso
SNC Sistema nervoso central
VMN Núcleo ventro-medial do hipotálamo
VMNvl Porção ventro-lateral do núcleo ventro-medial do hipotálamo
VIII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Divisão esquemática da amígdala do rato com suas subdivisões
anatômicas e seus componentes principais................................................4
Figura 2 Representação esquemática de cortes coronais do encéfalo de rato onde
se observam os quatro subnúcleos da Amígdala Medial............................7
Figura 3 Fotomicrografias de neurônios impregnados pela técnica de Golgi
modificada..................................................................................................15
Figura 4 Representação esquemática das diferentes morfologias dos espinhos
dendríticos, como se observam na microscopia óptica.............................18
Figura 5 Fotomicrografias monstrando a clássica citologia vaginal de ratas nas
diferentes fases do ciclo estral...................................................................29
Figura 6 Fotomicrografia de cortes semifinos seriados mostrando secções em
diferentes níveis do soma neuronal da amígdala medial póstero-ventral
de ratas fêmeas em diestro.......................................................................36
Figura 7 Médias do volume somático neuronal da amígdala medial póstero-ventral
de machos e fêmeas em diestro, proestro e estro.....................................37
Figura 8 Eletromicrografias da amígdala medial póstero-ventral de ratos machos,
mostrando soma neuronal.........................................................................42
Figura 9 Eletromicrografias da amígdala medial póstero-ventral de ratos machos,
mostrando diferentes tipos de sinapses ...................................................44
Figura 10 Eletromicrografias da amígdala medial póstero-ventral de ratos machos
mostrando diferentes tipos de espinhos ...................................................46
Figure 11 Eletromicrografias da amígdala medial póstero-ventral de ratas em diestro,
mostrando soma neuronal.........................................................................48
Figura 12 Eletromicrografias da amígdala medial póstero-ventral de ratas em diestro
mostrando diferentes tipos de sinapses....................................................50
Figura 13 Eletromicrografias da amígdala medial póstero-ventral de ratas em diestro
mostrando diferentes tipos de espinhos ...................................................52
IX
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Aferências intra- e extra-amigdalianas para os diferentes subnúcleos da
amígdala medial...........................................................................................9
Tabela 2 Eferências intra- e extra-amigdalianas dos diferentes subnúcleos da
amígdala medial de ratos...........................................................................10
X
RESUMO
A amígdala medial póstero-ventral (MePV) é uma estrutura encefálica onde os
hormônios gonadais têm um efeito neurotrófico nos ratos. Os objetivos deste trabalho
foram: 1) estimar e comparar o volume somático neuronal da MePV de machos (n=5) e
fêmeas nas fases de diestro, proestro e estro (n=5 em cada fase) do ciclo ovariano,
além de avaliar o possível efeito na lateralidade em ambos os hemisférios cerebrais.
Para tanto utilizou-se a reconstrução estereológica de cortes seriados. 2) Caracterizar
os aspectos ultra-estruturais neuronais e descrever a ultra-estrutura dos contatos
sinápticos nas diferentes porções de tais células (dendritos, espinhos dendríticos, soma
e axônio) da mesma região de ratos machos (n=8) e fêmeas em diestro (n=8). Todos os
animais foram manipulados de acordo com os procedimentos éticos, anestesiados e
perfundidos por via transcardíaca, tendo seus encéfalos sido removidos, pós-fixados e
processados para a microscopia eletrônica. No primeiro experimento, as estimativas do
volume somático médio de neurônios da MePV esquerda e direita foram realizadas
usando-se o método de Cavalieri associado à técnica de contagem de pontos. Os
dados foram comparados entre os grupos usando-se o teste de análise de variância
(ANOVA) de duas vias para medidas repetidas e pelo teste post-hoc das mínimas
diferenças significativas. O nível de significância estatística foi estabelecido em p <
0,05. A análise estatística dos dados mostrou que houve uma diferença no volume
somático da MePV entre os grupos experimentais, machos, fêmeas em diestro, proestro
e estro [F(3,16) = 3,42; p = 0,043], mas não houve diferença quanto à lateralidade
[F(1,16) = 0,19; p = 0,668] nem na interação entre grupos e lateralidade [F(3,16) = 0,99;
p = 0,421]. As comparações post-hoc mostraram que a média do volume dos machos
não diferem quando comparados com fêmeas em diestro (p > 0,05), mas foi
significativamente maior do que em fêmeas em proestro e em estro (p < 0,05 em ambos
os casos). Quando foram comparadas as médias do volume somático da MePV nas
diferentes fases do ciclo estral das fêmeas, não houve diferença significativa entre
esses todos (p > 0,05). No segundo experimento, secções ultrafinas (70-80 nm) foram
analisadas e a ultra-estrutura da MePV descrita. No neuropilo da MePV de machos e
fêmeas em diestro, neurônios e suas organelas, dendritos com e sem espinho,
processos axonais, feixes axônicos não-mielinizados e poucos axônios mielinizados,
XI
processos gliais e vasos sangüíneos foram identificados. Além disso, foram observadas
sinapses axo-dendríticas supostamente excitatórias com suas regiões pré-sinápticas
contendo vesículas claras arredondadas com algumas achatadas e outras de centro
denso. Os dendritos algumas vezes recebem vários terminais axonais sobre um mesmo
ramo e axônios contatando com mais de uma estrutura pós-sináptica também foram
observados. Os espinhos dendríticos apresentavam diferentes morfologias e
geralmente recebiam um único contato sináptico, ainda que se tenha observado
espinhos com mais de um terminal em aposição a sua membrana. Sinapses simétricas
supostamente inibitórias também foram observadas e geralmente no soma neuronal.
Os presentes resultados demonstram que: 1) o volume somático neuronal é um
parâmetro sexualmente dimórfico na MePV, sendo maior em machos do que em
fêmeas em proestro e estro, mas não em fêmeas em diestro. 2) para evidenciar
portanto, os efeitos dos hormônios gonadais nos neurônios da MePV é relevante
considerar os estágios do ciclo estral das ratas. 3) o volume somático neuronal não
mostrou lateralidade nem interação entre os grupos e lateralidade. 4) as peculiaridades
nucleares e citoplasmáticas dos neurônios da MePV de ratos machos e fêmeas em
diestro não diferem entre si e são semelhantes àquelas de outras áreas encefálicas. 5)
espinhos dendríticos formam somente sinapses assimétricas (tipo I), aparentemente
excitatórias, e podem ter mais de um contato sináptico. 6) sinapses simétricas (tipo II),
aparentemente inibitórias, ocorrem somente sobre ramos dendríticos proximais e somas
neuronais. 7) os terminais axonais formando sinapses foram observadas vesículas
claras arredondadas e algumas achatadas e ocasionalmente algumas de centro denso.
8) aparentemente as fêmeas apresentaram maior quantidade de vesículas de centro
denso do que em machos. O presente trabalho acrescenta novos achados que são
importantes para o estudo da organização celular e sináptica da MePV e que podem se
associar a outros dados morfológicos previamente descritos na literatura de modo a
aumentar a compreensão que se tem a respeito da atividade funcional dessa área do
encéfalo de ratos machos e fêmeas, ainda pouco explorada.
XII
ABSTRACT
The posteroventral medial amygdala (MePV) is a brain structure in which gonadal
hormones have a neurotrophic effect on rats. The aims of this study were: a) to estimate
and compare the neuronal somatic volume of the MePV of males (n=5) and females in
the diestrus, proestrus and estrus phases (n=5 in each phase) of the ovarian cycle,
besides evaluating the possible effect on laterality in both brain hemispheres. For this
purpose the stereological reconstruction of serial sections was used. 2) to characterize
the ultrastructural aspects of the neuronal cell bodies and describe the ultrastructure of
the synaptic contacts in the different portions of those cells (dendrites, dendritic spines,
soma and axon) in the same region of male rats (n=8) and females in diestrus (n=8). All
the animals were manipulated according to ethical procedures, anesthetized and
transcardially perfused, their brains were removed, post-fixed and processed for electron
microscopy. In the first experiment, the estimates of the mean somatic volume of the
neurons of the left and right MePV were performed using the Cavalieri method combined
with the point counting technique. The data were compared among the groups using a
two-way analysis of variance test (ANOVA) for repeated measures, followed by the least
significance difference post-hoc test. The statistical level of significance was established
as p < 0.05. The statistical analysis of the data showed that there was a difference in the
somatic volume of the MePV among the experimental groups [F(3.16) = 3.42; p =
0.043], but there was no difference as to laterality [F(1.16) = 0.19; p = 0.668], nor in the
interaction between groups and laterality [F(3.16) = 0.99; p = 0.421]. The post-hoc
comparisons showed that the data on the males are not different when compared with
females in diestrus (p > 0.05), but were significantly higher than in females in proestrus
and in estrus (p < 0.05 in both cases). When the means of the somatic volumes of the
MePV in the different phases of the estrous cycle of females were compared, no
significant difference was found between all of them (p > 0.05). In the second
experiment, ultrafine sections (70-80 nm) were analyzed and the ultra-structure of the
MePV was described. In the neuropile of the MePV of males and females in diestrus,
neurons and their organelles, dentrites with and without a spine, axonal processes, non-
myelinizated axonal bundles and a few myelinizated axons, glial processes and blood
vessels were identified. Besides this, probably excitatory axo-dentritic synapses were
XIII
observed with their pre-synaptic regions containing clear, rounded vesicles, a few of
them flattened and others with a dense center. The dendrites sometimes receive several
axonal terminals on a same branch and axons contacting more than one post-synaptic
structure were also observed. The dendritic spines presented different morphologies and
generally received a single synaptic contact, although spines were observed with more
than one terminal opposing the membrane. Apparently inhibitory symmetrical synapses
were also detected and generally in the neuronal soma.
The present results show that: 1) the neuronal somatic volume is a sexually dimorphic
parameter in MePV, and it is larger in males than in females in proestrus and estrus, but
not in females in diestrus. 2) therefore, in order to show the effects of gonadal hormones
on the neurons of MePV, it is relevant to consider the stages of the estrous cycle in the
female rats. 3) the neuronal somatic volume did not present laterality nor interaction
between the groups and laterality. 4) the nuclear and cytoplasmatic features of the
MePV neurons of male rats and females in diestrus are not different from each other and
are similar to those in other areas of the brain. 5) dendritic spines form only apparently
excitatory asymmetrical synapses and many have more than one synaptic contact. 6)
apparently inhibitory symmetrical synapses (type II) occur only on proximal dendritic
branches and neuronal soma. 7) in the axonal terminals forming synapses clear,
rounded and some flattened vesicles were observed, and occasionally a few with a
dense center. 8) apparently, females presented a greater quantity of vesicles with a
dense center than males. The present study provides important new findings to the
study of cellular and synaptic organization of the MePV, which may be associated with
other morphological data previously described in the literature, in a way that increases
the understanding of the functional activity of this so far little explored area of the male
and female rat brains.
1. INTRODUÇÃO
2
1.1 Considerações gerais
O prosencéfalo é uma confluência de sistemas que são cruciais para o
entendimento de muitas funções importantes do encéfalo, incluindo punição e
recompensa, aprendizado e cognição, alimentação e reprodução. A base para o
entendimento deste amplo aspecto é desvendar o sistema funcional do prosencéfalo e
uma das estruturas envolvidas neste contexto é a amígdala (ALHEID, 2003).
1.2 Amígdala
Em primatas, a amígdala é caracterizada como uma massa ovóide de substância
cinzenta localizada na porção terminal e rostral da formação hipocampal, tendo como
limite anterior o corno temporal do ventrículo lateral (ALHEID; de OLMOS;
BELTRAMINO, 1995). Ela recebe esta denominação devida sua semelhança com uma
amêndoa (SWANSON; PETROVICH, 1998). Embora o termo amígdala tenha sido
originalmente usado por Burdach (1819), mais tarde Johnston (1923) a definiu como
complexo amigdalar.
Em ratos a amígdala não é nem uma unidade anatômica nem unidade funcional,
pois é uma coleção de grupos de células não homogêneas relativamente agrupadas
(SWANSON, 2003).
Para Swanson e Petrovich (1998) a amígdala não compõe uma unidade
anatômica ou funcional única, formando, de fato, diferentes sistemas funcionais. Eles
consideraram a amígdala como sendo um grupo de células que parecem ser partes
diferenciadas do córtex cerebral tradicional, do claustro e do estriado, e pertencendo a
quatro sistemas funcionais: vegetativo (núcleo central), cortical frontotemporal (núcleos
3
basolateral anterior e lateral), olfativo acessório [amígdala medial (MeA)] e olfativo
principal (demais núcleos da amígdala).
Aos núcleos amigdalianos são atribuídos diferentes funções associadas com a
atenção, medo condicionado, ansiedade e a modulação de comportamentos como o
reprodutivo, defensivo e social (MEGA et al., 1997, WALKER; TOUFEXIS; DAVIS,
2003, ARGIOLAS; MELIS, 2003, BAUMAN; KEMPER, 2003; RASIA-FILHO;
LONDERO; ACHAVAL, 2000; AMARAL; CORBETT, 2003; AMARAL, 2002, BAAS;
ALEMAN; KAHN, 2004). Para a realização destas funções, as diferentes partes da
amígdala recebem vários tipos de informações interoceptivas e exteroceptivas,
modificando sua própria atividade ao analisar a informação recebida e estimulando
outras regiões do sistema nervoso central (SNC) para que se inicie a resposta ao
estímulo inicial (QUIRK; REPA; LeDOUX,1995; KNUEPFER et al., 1995; RASIA-FILHO;
LONDERO; ACHAVAL, 2000).
No rato, a amígdala pode ser dividida em 4 grandes porções: 1) amígdala
"expandida”, que é composta por uma divisão central e outra medial, onde está a
amígdala medial (MeA) e seus subnúcleos, objeto de estudo desta tese; 2) amígdala
com aspecto cortical e que se divide em complexo basolateral e nas porções que se
conectam com as vias olfativa e vomeronasal; 3) região de transição, localizada entre a
porção ventral dos núcleos da base e a amígdala expandida; e 4) núcleos ainda não
classificados (ALHEID; de OLMOS; BELTRAMINO,1995, Figura 1). Estes núcleos e
subnúcleos formam uma complexa rede estrutural inter-relacionada e multifuncional,
uma vez que está envolvida na modulação de diversos comportamentos e ajustes
homeostáticos ou alostáticos (ALHEID; de OLMOS; BELTRAMINO, 1995; RASIA-
FILHO; LONDERO; ACHAVAL, 2000; RASIA-FILHO et al., 2004).
4
Figura 1. Divisão esquemática da amígdala do rato com suas subdivisões anatômicas e seus
componentes principais, descrito por Alheid e colaboradores (1995), modificado de Rasia-Filho e
colaboradores (2000).
5
1.2.1 Amígdala medial
1.2.1.1 Localização, divisão e função
A MeA é um dos núcleos superficiais do complexo amigdalóide. De função
preponderante participa na adequação do animal a seu ambiente, modulando
comportamentos social e sexual e o aprendizado onde o componente emocional está
envolvido (ALHEID; de OLMOS; BELTRAMINO, 1995).
A MeA surge caudalmente e medialmente ao núcleo do trato olfativo lateral e se
estende caudalmente até o surgimento do corno temporal do ventrículo lateral. Neste
nível ela localiza-se dorso-medialmente ao pólo cefálico da área de transição amígdalo-
hipocampal e forma o aspecto medial da parede anterior da porção do ventrículo. Ao
longo de sua extensão, a MeA acompanha o lado ventro-lateral do trato óptico. Os
limites rostral e lateral não estão claramente definidos. Existe uma zona pobre em
células que separa a MeA da porção medial do núcleo central no sentido dorso-lateral.
Em porções médio-caudais fibras axonais ascendem pela estria terminal em direção
dorsal superior as quais se interpõem entre a MeA e outros núcleos amigdalóides
(ALHEID; de OLMOS; BELTRAMINO, 1995).
A MeA tem sido dividida em subnúcleos de diversas maneiras, segundo critérios
de vários autores. Pitkänen (2000) divide-a em três regiões denominadas: rostral,
central (porção dorsal e ventral) e caudal. Alheid e cols (1995), Paxinos e Watson
(1998) e de Olmos e cols (2004) dividem-na nos subnúcleos ântero-dorsal (MeAD),
ântero-ventral (MeAV), póstero-dorsal (MePD) e póstero-ventral (MePV; Figura 2). Para
se descrever as subdivisões dessas diferentes áreas tem sido utilizado a coloração de
Nissl, a reação de Timm para metais pesados, a reação histoquímica para
6
acetilcolinesterase e o procedimento imunoistoquímico para detecção da angiotensina
II, substância P, tirosina hidroxilase, bem como glutamato descarboxilase, dopamina-β-
hidroxilase e neurotensina (ALHEID; de OLMOS; BELTRAMINO,1995).
Em relação a suas conexões, ela pode estar organizada em uma região anterior,
da qual fazem parte a MeAD, a MeAV e a MePV, e uma região posterior, formada
basicamente pela MePD (CANTERAS; SIMERLY; SWANSON, 1995).
Os subnúcleos da MeA tem diferentes funções (CANTERAS; SIMERLY;
SWANSON, 1995, PAXINOS; WATSON, 1988). Por exemplo, a MePD parece
influenciar as atividades neuroendócrinas e o controle dos sistemas simpático e
parassimpático que o hipotálamo regula, enquanto as regiões MeAD, MeAV e MePV
podem estar relacionados com a modulação hipotalâmica dos comportamentos
reprodutivo e defensivo (CANTERAS; SIMERLY; SWANSON, 1995).
7
Figura 2. Representação esquemática de cortes coronais do encéfalo de rato onde se observam os
quatro subnúcleos da amígdala medial: amígdala medial ântero-dorsal (em amarelo), amígdala medial
ântero-ventral (em verde), amígdala medial póstero-dorsal (em azul) e amígdala medial póstero-ventral
(em vermelho). Os valores em mm colocados no lado direito das imagens referem-se à distância posterior
ao bregma. Figuras e abreviaturas baseadas no atlas do encéfalo do rato de Paxinos e Watson (1997),
equivale às figuras 26 a 31 deste.
8
1.2.1.2 Conexões da amígdala medial
A MeA recebe projeções intra-amigdalóides como do núcleo cortical posterior,
acessório basal e lateral bem como da área amigdalo-hipocampal. A MeA recebe
projeções de outras regiões encefálicas como o córtex parietal, córtex frontal
(principalmente infralímbico), formação hipocampal (parte distal e proximal do
subiculum temporal), do sistema olfativo, tálamo, hipotálamo (núcleos premamilar e
ventromedial, área pré-óptica medial e lateral, etc) e núcleo próprio da estria terminal
(BNST; CANTERAS; SWANSON, 1992).
A MeA estabelece conexões (vide Tabelas 1 e 2), muitas delas recíprocas, com
varias regiões dentro da própria amígdala, como é o caso do núcleo central e cortical e
póstero-medial, e com regiões fora da amígdala tais como o bulbo olfativo, órgão
vomeronasal, hipocampo, estriado e globo pálido ventral, núcleo próprio da estria
terminal, diversos núcleos do hipotálamo e tálamo, substância cinzenta periaquedutal
do mesencéfalo e núcleos da rafe mesencefálicos (CANTERAS; SIMERLY; SWANSON,
1995).
9
Tabela 1. Aferências intra- e extra-amigdalóides para os diferentes subnúcleos da amígdala medial, de
acordo com Pitkänen (2000).
INTRA-AMIGDALIANAS
Área amígalo-hipocampal
Córtex periamigdalóide
Núcleo basal
Núcleo basal acessório
Núcleo cortical anterior e posterior
Núcleo lateral
Subnúcleos componentes do núcleo medial
INTER-AMIGDALIANAS
(contralaterais)
Córtex periamigdalóide
Núcleo basal acessório
Núcleo cortical posterior
Núcleo do trato olfativo lateral
SISTEMA OLFATIVO
Córtex piriforme
Bulbo olfativo
Bulbo olfativo acessório
Bulbo olfativo anterior
Núcleo endopiriforme
HIPOTALÂMICAS
Área hipotalâmica anterior
Área pré-óptica medial e lateral
Área retroquiasmática
Núcleo arqueado
Núcleo dorsomedial
Núcleo hipotalâmico posterior
Núcleo lateral
Núcleo pré-mamilar
Núcleo supramamilar
Núcleo supra-óptico
Núcleo tuberal
Núcleo ventromedial
Tuber cinereum
CORTICAIS
Área pré-límbica
Córtex entorrinal
Córtex infralímbico
Córtex perirrinal dorsal
Ínsula agranular posterior
Ínsula agranular ventral
Subiculum temporal distal e proximal
TALÂMICAS
Núcleo centromediano
Núcleo medial
Núcleo parafascicular
Núcleo paratenial
Núcleo paraventricular
Núcleo posterior
Núcleo reuniens
Núcleo subparafascicular
Núcleo talâmico póstero-ventral
TRONCO ENCEFÁLICAS
Área retrorubral A8
Área tegmental ventral
Grupo celular adrenérgico C1 e noradrenégico
A1 no bulbo ventrolateral
Núcleo central superior
Núcleo dorsal da rafe
Núcleo dorsal do lemnisco lateral
Núcleo parabraquial
Núcleo peripeduncular
Núcleo tegmental pedúnculo-pontino
OUTRAS
Núcleo da banda diagonal de Broca
Núcleo próprio da estria terminal
Substantia innominata
10
Tabela 2. Eferências intra- e extra-amigdalianas dos diferentes subnúcleos da amígdala medial de ratos machos
adultos, adaptado de Canteras e colaboradores (1995) adaptado por HERMEL (2005).
As projeções foram
classificadas em: +++ densas; ++ moderadas; + fracas; - ausentes
PROJEÇÕES: MeAD MePD MePV
INTRA-NUCLEARES:
Núcleo medial ântero-dorsal
ântero-ventral
póstero-dorsal
póstero-ventral
+++
++
+++
++
++
++
+++
+++
++
INTRA-AMIGDALÓIDES:
Área amígdalo-piriforme
+++ + +++
Área amigdalóide anterior
+++ + +++
Núcleo basolateral anterior
posterior
+
+
-
+
+
+
Núcleo basomedial anterior
posterior
+++
+++
+
+
+++
+++
Núcleo central medial
central
lateral
++
+++
+
+
++
-
+
++
+
Núcleo cortical anterior
póstero-lateral
póstero-medial
+++
++
++
+
+++
+++
++
++
++
Núcleo lateral
++ + ++
Núcleo posterior
++ ++ +++
Núcleo próprio do trato olfativo acessório
+++ + +++
CORTICAIS:
Área de transição pós-piriforme
+++ ++ +
Área insular agranular
+- +
Área piriforme
++ + +
Área entorrinal lateral
medial
ventromedial
+++
+
+
++
+
+
++
+
-
Área infralímbica
++ +
Área pré-límbica
+- +
Bulbo olfativo acessório - camada mitral
+++ - -
CA1 hipocampal
++ +
Claustro
+- +
Estriado
++ - +
Núcleo do trato olfativo lateral
+- +
Núcleo endopiriforme dorsal
ventral
+
++
+
+
+
++
Núcleo olfativo anterior dorsal
externo
lateral
medial
póstero-ventral
+
+
+
+
++
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Parasubiculum
+- +
Subiculum
++ +
Tênia tecta dorsal
ventral
+
+
-
-
-
+
Tubérculo olfativo ++ - +
HIPOTALÂMICAS:
Nível pré-optico:
Área pré-óptica lateral + - -
Área pré-óptica medial +++ - +++
Núcleo periventricular ântero-ventral + +++ -
Núcleo pré-óptico medial medial
central
lateral
+++
+
+++
+++
+++
++
+
+
+
Nível hipotalâmico anterior:
Núcleo anterior anterior
central
dorsal
posterior
+
++
++
++
+
++
-
++
+++
+++
+
+++
Núcleo paraventricular magnocelular anterior
magnocelularpóstero-medial
parvocelular anterior
parvocelular dorsal
parvocelular dorsomedial
periventricular
+
+
++
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
11
Tabela 2. (Continuação)
PROJEÇÕES: MeAD MePD MePV
HIPOTALÂMICAS (continuação):
Núcleo periventricular anterior
intermediário
pré-óptico
+
++
+
-
+
-
++
+++
++
Núcleo supraquiasmático
++ - +++
Zona subparaventricular
+++ - +++
Nível tuberal:
Área hipotalâmica anterior
++ - +
Núcleo arqueado
++ + +
Núcleo dorsomedial anterior
posterior
ventral
++
+
+
+
+
+
+
+
+
Núcleo ventromedial anterior
central
dorsomedial
ventrolateral
+++
+++
+++
+++
-
+
-
+
+++
+++
+++
+
Nível mamilar:
Núcleo mamilar medial
+ + +
Núcleo periventricular posterior
+++ + +
Núcleo posterior
+++ +++ +++
Núcleo supra-mamilar
+ + +
Núcleo pré-mamilar ventral
+++ +++ +++
TALÂMICAS:
Habênula lateral
+- -
Núcleo dorsomedial medial
central
lateral
++
-
-
-
-
-
-
-
-
Núcleo paratenial
+- -
Núcleo reuniens medial
+++ - ++
Núcleo subparafascicular magnocelular
parvocelular
-
+
-
-
-
-
TRONCO ENCEFÁLICO:
Área tegmental ventral
++ +
Núcleos da rafe dorsal
interfascicular
rostral linear
central linear
+++
+
+
+
-
-
-
-
+
+
+
+
Substância cinzenta periaqueductal
++ +
OUTRAS:
Núcleo accumbens
+ - -
Núcleo próprio da estria terminal
Anterior ântero-dorsal
ântero-lateral
ântero-ventral
dorsolateral
dorsomedial
fusiforme
justacapsular
magnocelular
oval
rombóide
subcomissural
Posterior interfascicular
principal
transverso
+++
++
+++
++
+++
+
+
++
+
++
++
+++
+
+++
+++
+
+
+
+
-
-
-
+
-
+
+
+++
+
+++
++
+
++
+++
_
_
++
+
+
+
+++
+
+++
Núcleo septal lateral dorsal
intermediário
ventral
+
+++
+++
-
+
+
-
+
+
Núcleo septal medial
+ + +
Núcleo septofimbrial
+ + +
Substantia innominata
+++ +++ +++
Zona incerta
++ - +
12
Notavelmente, a MePV recebe densas projeções do sistema olfativo (bulbo
olfativo acessório), de núcleos corticais (córtex infralímbico, área pré-límbica e ínsula
agranular ventral), da formação hipocampal (córtex entorrinal e partes proximal e distal
do subiculum temporal), de núcleos hipotalâmicos (área pré-óptica medial; regiões
dorsal e medial ao núcleo paraventricular; núcleos ventromedial, pré-mamilar ventral e
dorsal, arqueado, lateral), de núcleos talâmicos (núcleos paraventricular e divisão
medial do complexo geniculado medial), do tronco encefálico, da divisão medial do
BNST e do núcleo da divisão horizontal da faixa diagonal de Broca, dentre outras
(OTTERSEN; BEN-ARI, 1979; OTTERSEN, 1980; McDONALD et al., 1999; PITKÄNEN,
2000; de OLMOS; BELTRAMINO; ALHEID, 2004, DONG; PETROVICH; SWANSON,
2001).
Como mostra a Tabela 2, a MePV envia densas projeções intra-amigdalianas,
principalmente para a MeAD e a MeAV, supostamente para outras regiões tais como as
áreas amígdalo-piriforme e amigdalóide anterior, núcleo basomedial, núcleo posterior e
núcleo próprio do trato olfativo acessório. Também envia projeções extra-amigdalianas
para diversas regiões como para diferentes partes do córtex cerebral, tálamo, núcleos
do hipotálamo, principalmente para a área pré-óptica medial, os núcleos anterior,
periventricular e supraquiasmático, a área sub-paraventricular, as regiões anterior,
central e dorsomedial do núcleo ventro medial, os núcleos posterior e pré-mamilar
ventral deste. E ainda conecta com outras áreas como as regiões anterior e posterior do
núcleo próprio da estria terminal e a substantia innominata (CANTERAS; SIMERLY;
SWANSON, 1995), com isso a MePV envia projeções para componentes relacionados
aos comportamentos reprodutivos e defensivos, também para o hipotálamo que contém
neurônios que liberam homônio liberador das gonadotrofinas (GnRH) e somatostatina e
13
ainda para regulação neuroendócrina como no caso da secreção da dopamina e
hormônio de crescimento regulado pelo núcleo arqueado (PETROVICH; CANTERAS;
SWANSON, 2001).
A distribuição de receptores para hormônios sexuais na MeA não é homogênea.
Neurônios com receptores para andrógenos estão presentes em todos seus
subnúcleos, porém sua concentração maior é observada da parte média à posterior da
MeA (SHERIDAN, 1979). Neurônios que possuem receptores dos tipos α e β para
estrógenos encontram-se preferentemente na MePD (SIMERLY et al., 1990; LI;
SCHWARTZ; RISSMAN, 1997; ÖSTERLUND, 1998), mas eles também foram
detectados na MePV (LI; SCHWARTZ; RISSMAN, 1997; SHUGHRUE; LANE;
MERCHENTHALER, 1997; ÖSTERLUND, 1998). Receptores de progesterona também
foram detectados na MeA (McEWEN, 1983; SIMERLY, 2002). Isto deve servir de base
para que se entenda as ações dos hormônios gonadais nesta região de ratos, como
será descrito em detalhes mais adiante.
1.2.1.3 Citoarquitetura da amígdala medial
De forma geral, quase a totalidade da MeA é constituída por neurônios de
tamanho médio e de formas variadas. Os neurônios de maior tamanho são mais
abundantes na região rostro-dorsal deste núcleo, principalmente a MePD e a MePV que
são regiões constituídas de células de tamanho médio morfologicamente semelhantes
(de OLMOS; BELTRAMINO; ALHEID, 2004)
Um neurônio pode apresentar atividade específica de acordo com a sua
morfologia, as conexões sinápticas que estabelece e as propriedades de membrana
14
que possui (PETERS; PALAY; WEBSTER, 1991). A morfologia dos neurônios da MeA
tem sido estudada pelo método de Golgi que pode impregnar até 10% dos neurônios de
uma determindada área. Na MeA encontram-se neurônios multipolares com somas de
morfologia variada tais como ovóide, fusiforme, redondo, estrelado ou piriforme,
apresentando dendritos de extensão variável, pouco ramificados, retilíneos ou tortuosos
(RIGOTI, 2002). Estes neurônios são classificados como bipenachado, com dois
dendritos simétricos, ou neurônios estrelados com três ou mais dendritos primários
(RASIA-FILHO; LONDERO; ACHAVAL,1999; 2004; Figura 3).
15
Figura 3. Fotomicrografias de neurônios, impregnados pela técnica de Golgi modificada, de tipo estrelado
(A) ou bipenachado (B) do subnúcleo póstero-dorsal da amígdala medial de rata adulta. S, soma. Barra:
50 μm. (conforme de CASTILHOS, 2005).
As células bipenachadas originam dois ramos dendríticos primários de
comprimento variado em cada extremo do corpo celular e que se dirigem ventralmente
e dorsalmente no interior dos subnúcleos do MeA ao qual pertencem. Tais dendritos,
quando curtos, quase sempre se ramificam próximo ao soma em dois dendritos
secundários longos, sendo que muitos deles mantêm a mesma orientação do dendrito
16
de origem. É comum encontrar os dendritos ventrais, tanto os primários quanto os
secundários, descendo obliquamente em direção ao trato óptico ou paralelamente a ele
em direção à superfície pial. Além disso, também são observados dendritos
secundários e terciários difusamente distribuídos (RASIA-FILHO; LONDERO;
ACHAVAL,1999; RASIA-FILHO et al., 2004; RIGOTI, 2002).
As células estreladas geralmente apresentam três ou quatro dendritos primários
de diferentes comprimentos. Esses dendritos dispõem-se radialmente no interior dos
subnúcleos do MeA, mas podem seguir ventralmente e, nesse trajeto, colocam-se
obliquamente ao trato óptico, dirigindo-se ao mesmo, ou posicionam-se de forma
paralela a este, até a superfície pial. Freqüentemente, os dendritos secundários e
terciários seguem de forma perpendicular em direção ao trato óptico (RASIA-FILHO;
LONDERO; ACHAVAL, 1999; RASIA-FILHO et al.; 2004; RIGOTI, 2002).
Os dendritos são considerados o principal sítio receptivo do neurônio, são
formados em diferentes períodos durante o desenvolvimento (VAN PELT; DITYATEV;
UYLINGS, 1997) e recebem aferências sinápticas que se transformam em potenciais de
membrana (SEGEV; RALL, 1998). Na MeA os dendritos são de comprimento e
diâmetro variáveis (RASIA-FILHO; LONDERO; ACHAVAL, 1999). Quando presentes os
espinhos são protusões nos ramos dendríticos e são o sítio de um grande número de
contatos sinápticos, aumentado substancialmente a superfície receptiva da arborização
dendrítica (HOF et al., 1999).
Os espinhos, todavia podem se originar do soma, dos dendritos ou do cone
axonal. São encontrados em várias populações neuronais, em todos os vertebrados e
em alguns invertebrados (NIMCHINSKY; SABATINI; SVOBODA, 2002). O espinho tem
a forma determinada pela presença de uma “cabeça” (volume de aproximadamente
17
0,001 a 1 µm
3
) conectada ao neurônio por um “pescoço” (diâmetro menor que 0,1 µm;
HARRIS; KATER, 1994). A cabeça do espinho contém uma densidade pós-sináptica e
algumas estruturas especializadas, como filamentos de actina (PETERS; PALAY;
WEBSTER, 1991). Embora mitocôndrias e microtúbulos estejam ausentes, os espinhos
contêm retículo endoplasmático liso (REL) e que pode formar uma estrutura chamada
“aparelho do espinho” (PETERS; PALAY; WEBSTER, 1991). A função desta estrutura
poderia ser de manutenção da concentração de cálcio intracelular em níveis não
patológicos, o que está associado com o processo de neuroproteção (BURGOYNE;
GRAY; BARRON, 1983). Os polirribossomos e os elementos da via lisossomal-
endossomal também estão presentes em alguns espinhos dendríticos, perto de sua
base, sugerindo que pode ocorrer síntese protéica local, bem como existir proteínas
para degradação de elementos citoplasmáticos ou de membrana celular (STEWARD;
SCHUMAN, 2001). Alguns espinhos podem modificar sua morfologia e esse processo
reflete o rearranjo rápido do citoesqueleto de actina em seu interior, podendo levar a
mudanças no tamanho e no número de espinhos (OERTNER; MATUS, 2005; TADA;
SHENG, 2006).
Em geral, os espinhos são classificados de acordo com sua morfologia em:
“filopódio”, que não apresenta uma cabeça definida e é fino e comprido e acredita-se
que seja a forma precursora dos espinhos definitivos; “fino”, o qual apresenta pescoço
fino e pode não ter uma cabeça muito volumosa; “achatado”, que não apresenta
pescoço diferenciado, e se mostra como uma elevação maior do contorno dendrítico;
em forma de “cogumelo”, que parece ser o espinho mais estável (em termos de
mudanças numéricas e contatos sinápticos duradouros); e, “ramificado”, onde um
pescoço pode dar origem a mais de uma cabeça de espinho (PETERS; KAISERMAN-
18
ABRAMOF, 1970; PETERS; PALAY; WEBSTER, 1991; HERING; SHENG, 2001;
GONZÁLEZ-BURGOS, 2004; Figura 4). Os espinhos na MeA são pleomórficos e são
encontrados ao longo dos dendritos, mas também foram visualizados no soma e,
algumas vezes, no segmento inicial de axônios (de CASTILHOS et al., 2006; HERMEL
et al., 2006a).
Figura 4. Representação esquemática das diferentes morfologias dos espinhos dendríticos, como se
observam na microscopia óptica, surgindo a partir de uma linha de base que representa o tronco
dendrítico (conforme MARCUZZO, 2006; adaptado de HERING; SHENG, 2001).
Espinhos dendríticos recebem a maioria dos sinais excitatórios, apresentam
uma morfologia dinâmica trocando sua forma rapidamente em resposta a mudanças
impostas sinapticamente e em diferentes condições hormonais. Este comportamento
dinâmico é fundamental para a eficácia e plasticidade da transmissão sináptica
(WOOLLEY, 1997). Há uma densa rede de proteínas responsáveis por este dinamismo,
mas principalmente espinofilina, que é uma proteína fosfatase 1 e proteína ligadora de
actina, que modula a transmissão sináptica excitatória (HSIEH-WILSON, et al., 2003).
É clássico que, as sinapses químicas interneuronais são constituídas de um
elemento pré-sináptico que contém vesículas sinápticas e um outro elemento oposto
dito pós-sináptico, o qual é separado pela fenda sináptica. Sinapses, com proeminente
FILOPÓDIO FINO ACHATADO COGUMELO RAMIFICADO
19
densidade pós-sináptica são chamadas de tipo I (GRAY, 1959), assimétricas e
apresentam também uma nítida fenda sináptica. Há várias exceções a esta organização
geral (PETERS; PALAY; WEBSTER, 1991). Um outro tipo de sinapse, a do tipo II, é
simétrica, tem pouca densidade pós-sináptica e a fenda sináptica é estreita (PETERS;
PALAY; WEBSTER, 1991). A análise ultra-estrutural de neurônios da MePD mostrou
que as sinapses axodendríticas são as mais freqüentemente encontradas e parecem
ser principalmente excitatórias. Suas regiões pré-sinápticas apresentam vesículas
claras arredondadas sozinhas ou mescladas com algumas vesículas de centro denso
(HERMEL et al., 2006a). Até a presente tese, não haviam dados descritos sobre a ultra-
estrutura das sinapses da MePV de ratos.
Em princípio as vesículas claras arredondadas contêm neurotransmissores de
tipo excitatórios. Por exemplo, os terminais axônios que fazem contatos sinápticos do
tipo assimétricos nos ramos dendríticos e espinhos parecem conter neurotransmissores
excitatórios como o glutamato (PETERS; PALAY; WEBSTER, 1991). De acordo com
estes mesmos autores, os axônios podem conter GABA nas vesículas claras
achatadas. As vesículas de centro denso contêm neuropeptídeos (PETERS; PALAY;
WEBSTER, 1991) e também foram encontradas tais estruturas na MePD, embora em
menor número (HERMEL et al., 2006a). Não obstante, a MeA parece ser alvo de fibras
GABAérgicas, que se originam, pelo menos em parte, de neurônios GABAérgicos do
núcleo dorsal basal da amígdala (NITECKA; FROTSCHER, 1989) e do núcleo
amigdalóide intercalado (MEREDITH; WESTBERRY, 2004).
Os axônios dos subnúcleos da região posterior da MeA (MePD e MePV)
preferentemente dirigem-se medialmente ao núcleo basal ou à porção principal do
20
BNST, enquanto os da MeAD forma parte da ansa peduncularis, também chamada de
via amígdalo-fugal ventral (KAMAL; TÖMBÖL, 1975; COOKE; SIMERLY, 2005).
Especificamente, os astrócitos da MePV estão organizadas em três camadas
distintas; a borda medial da MePV, que acompanha o tracto óptico, parece ter uma
camada de processos que possuem a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) orientados
radialmente e onde os corpos celulares de astrócitos não são facilmente distinguidos.
Mais internamente há uma camada intermediária com poucos astrócitos, mas com
abundantes processos reativos à GFAP seguindo em direção ventral. Mais ao centro da
MePV há uma terceira camada com corpos celulares de forma estrelada ou alongada
(RASIA-FILHO et al., 2002, MARTINEZ et al., 2006).
1.2.2 Dimorfismo sexual, hormônios, ciclo estral, neurotransmissores
A reprodução sexuada depende de uma variedade de comportamentos
individuais e sociais, diferentes entre machos e fêmeas. Os esteróides gonadais atuam
no sistema nervoso promovendo mudanças que persistem durante toda a vida do
animal, como no caso das áreas ditas sexualmente dimórficas, que se diferenciam entre
os sexos quanto a sua estrutura e organização. A produção hormonal, cíclica em
fêmeas e tônicas em machos, provocam mudanças estruturais e comportamentos
específicos de cada sexo, que espelham as funções endócrinas (NAFTOLIN, 1981).
Alguns mecanismos celulares que geram tais diferenças estão relacionados com a
sensibilidade dada pelos tipos de receptores a estes hormônios, o número de células
responsivas e a conectividade sináptica entre estruturas com a mesma possibilidade de
modulação de função exercida pelos esteróides sexuais (KELLEY, 1988). A exposição
do sistema nervoso a hormônios influencia permanentemente uma variedade de
21
características como o tamanho e o número de neurônios, ramos dendríticos e
conexões sinápticas em diferentes áreas não somente no desenvolvimento, mas
também em adultos (GOMEZ; NEWMAN, 1991). Por exemplo, o estradiol induz novas
sinapses e espinhos dendríticos nas células piramidais de CA1 do hipocampo
(WOLLEY et al., 1997). O mesmo ocorre na porção ventro-lateral do núcleo ventro
medial (VMNvl) do hipotálamo, onde a ação do estradiol também é capaz de causar
hipertrofia somática (ERSKINE; MILLER 1995). No VMNvl durante o proestro, quando o
nível de estrogênio em circulação sangüínea está em seu valor mais alto, a aborização
dendrítica apresenta-se alongada e com maior densidade de espinhos dendríticos
(MADEIRA et al., 2001). Estrogênio administrado em ratas ovarioectomizadas causa um
aumento das sinapses axodendríticas na VMNvl (NISHIZUKA; PFAFF, 1989). Variações
morfológicas mediadas por hormônios gonadais também foram encontradas nos
neurônios da MeA de ratas, onde foi observado que o tamanho deste núcleo, o número
de espinhos dendríticos e a quantidade de receptores nicotínicos para acetilcolina é
maior em machos do que em fêmeas (HINES; ALLEN; GORSKI, 1992; RASIA-FILHO et
al.,1999; RASIA-FILHO et al., 2004; de CASTILHOS et al., 2006). Ratos adultos
gonadectomizados tratados com testosterona apresentam um aumento da MePD
quando comparados a ratos castrados sem reposição hormonal (COOKE; TABIBNIA;
BREEDLOVE, 1999). SHIMA e cols (2003) mostraram que na MeA, o RNAm para o
receptor β do estradiol apresenta uma diminuição dada pelo nível fisiológico do
estrogênio em ratas.
Muito do conhecimento que há sobre o controle do ciclo ovariano de vários
mamíferos que possuem ovulação espontânea é baseado em estudos sobre o controle
22
do ciclo estral da rata. Esse ciclo é composto por quatro fases – diestro, proestro, estro
e metaestro – que, além de expressarem mudanças no epitélio vaginal como a
presença de células epiteliais nucleadas, leucócitos e células queratinizadas em cada
período, exibem variações nas concentrações de gonadotrofinas e conseqüentemente
de esteróides gonadais (MATTHEWS; KENYON, 1984).
É interessante que a variação do nível de estrogênio e progesterona durante o
ciclo estral altera o número dos espinhos dendríticos nos diferentes núcleos da
amígdala medial (RASIA-FILHO; LONDERO; ACHAVAL, 1999). Em outros estudos
houve aumento dos espinhos e das sinapses nos espinhos dos neurônios piramidais da
região CA1 do hipocampo durante o pró-estro, momento em que há maior receptividade
da fêmea. (McEWEN; WOOLEY, 1994)
O volume total da MePD de ratos machos é significativamente maior do que o de
fêmeas (HINES; ALLEN; GORSKI, 1992; KERCHNER et al., 1995) No núcleo
ventromedial do hipotálamo, o volume do neuropilo é significativamente maior em
machos do que em fêmeas, sem apresentar modificação durante o ciclo estral
(MADEIRA et al., 2001). Além disso, em outros estudos, o volume somático do núcleo
pré-óptico medial é maior em machos do que em fêmeas (MADEIRA et al., 1999).
Parece com isso, que um padrão de dimorfismo sexual pode ser encontrado nas
estruturas nervosas que apresentam uma conexão direta com a MeA, tais como as
duas regiões acima mencionadas (SANCHEZ; DOMINGUES, 1994). Ademais o núcleo
próprio da estria terminal é sexualmente dimórfico e parece enviar as maiores
eferências para tais regiões também que contém uma grande quantidade de neurônios
que expressam receptores para hormônios esteróides, em um padrão semelhante ao
detectado na MeA (GU; CORNEA; SIMERLY, 2003).
23
Os núcleos central e medial da amígdala são um importante alvo de fibras
GABAérgicas na amígdala (DAVIS; MYERS, 2000). Na MeA de ratos e hamsters, há
neurônios que sintetizam substância P (MICEVYCH; MATT; GO, 1988), arginina-
vasopressina (De VRIES, 1995), colecistoquinina (FRANKFURT et al, 1985; ORO;
SIMERLY;SWANSON, 1988), somatostatina (Mc DONALD, 1989), ocitocina
(VEINANTE et al., 1997), angiotensina II (LIND; SWANSON; GANTEN, 1985), hormônio
liberador de corticotrofina e GnRH (SWANSON et al, 1983), neuropeptídeo Y
(GUSTAFSON; CARD; MOORE, 1986), peptídeo intestinal vasoativo (McDONALD,
1989), peptídeo liberador de gastrina/bombesina e peptídeo relacionado ao gene de
calcitonina (MARCOS et al., 1999). Além disso a MeA apresenta imunorreatividade à
serotonina e RNAm para o receptor 5HT
1A
em ratos (ÖSTERNLUND; HURD, 1998). É
interessante salientar que na MePV foram identificados os seguintes neuropeptídeos:
peptídeo natriurético atrial, colecistoquinina, neuropeptídeo Y e somatostatina (de
OLMOS; BELTRAMINO; ALHEID, 2004), embora o papel funcional de
neurotransmissores clássicos e de neuropeptídeos neste subnúcleo não esteja nada
claro ainda. Há, no entanto, diferenças neuroquímicas nos subnúcleos da MeA o que
sugere que possa haver distintas inter-relação entre eles, e deles com outras regiões do
SNC (CANTERAS; SIMERLY; SWANSON, 1995; PITKÄNEN, 2000).
1.5 Lateralidade
A assimetria no cérebro tem sido observada em animais e em seres humanos na
sua estrutura, função e no comportamento. Esta lateralidade se reflete na evolução,
hereditariedade, desenvolvimento e em condições patológicos (TOGA et al, 2003). Há
24
vários achados relacionados com diferenças entre os lados direito e esquerdo na
morfologia e funcionamento de diversas estruturas nervosas em mamíferos.
O padrão de lateralidade difere entre os sexos, sendo isto evidenciado no
cérebro de seres humanos e em outros animais. Em ovelhas parece haver um
envolvimento do hemisfério direito cerebral no controle das experiências emocionais
negativas (da COSTA et al., 2004). Em seres humanos a amígdala esquerda é mais
freqüentemente ativada do que a amígdala direita no processamento neural da
percepção de fácies do medo (BAAS; ALEMAN; KAHN, 2004). Na aquisição e retenção
do medo condicionado, a amígdala direita de ratos está mais envolvida do que à
esquerda (BAKER et al., 2004).
Ratos e camundongos também possuem diversas funções encefálicas
lateralizadas, bem como assimetrias neuroquímicas e morfológicas (PALESTINI et al,
1997; DLUZEN; KREUTZBERG, 1996, CROWNE et al., 1992; CARLSON; GLICK,
1989; GLICK; SHAPIRO, 1985; GLICK; ROSS, 1981a, GLICK; ROSS, 1981b) que
talvez causem as diferenças no conteúdo de dopamina, serotonina e noradrenalina
presentes no tecido nervoso (ROSEN et al. 1984; SLOPSEMA; VAN DER GUGTEN;
BRUIN, 1982, ANDERSEN; TEICHER, 1999; DLUZEN; KREUTZBERG, 1996). Em
ratos a amígdala esquerda e direita podem ter uma contribuição diferente na
consolidação da memória, sendo que a direita parece ser mais importante para a
memória com treinamento motivado aversivo (COLEMAN-MESCHES; McGAUGH,
1995).
Isso indica que pode haver diferença na estrutura da MePV de acordo com o
lado em que se encontra e suas conexões. Não há dados na literatura sobre tal assunto
até o momento.
2. OBJETIVOS
26
O objetivo deste trabalho foi estudar a morfologia ultra-estrutural das conexões
sinápticas em neurônios localizados na MePV, região envolvida na modulação
neuroendócrina hipotalâmica em ratos machos e fêmeas (ALHEID; de OLMOS;
BELTRAMINO, 1995). Buscou-se também identificar possíveis diferenças no volume
neuronal neste núcleo em machos e fêmeas adultas, a possibilidade de que o volume
neuronal das fêmeas pudesse modificar durante o ciclo estral e se ocorre ou não
diferenças neste parâmetro quanto ao hemisfério (direito ou esquerdo) estudado.
Assim pretendeu-se:
1. Estimar e comparar o volume somático neuronal da MePV de machos e fêmeas nas
fases de diestro, proestro e estro do ciclo estral, além de avaliar o possível efeito da
lateralidade, usando-se a reconstrução estereológica de cortes seriados (CRUZ-ORIVE;
WEIBEL 1990; LEDDA et al., 2000) e o método de Cavalieri em associação com a
técnica de contagem de pontos (GUNDERSEN; JENSEN, 1978; HERMEL et al.,
2006b). Com isso, esperava-se encontrar dados sexualmente dimórficos e efeito das
variações cíclicas dos esteróides sexuais neste parâmetro morfológico.
2. Descrever a ultra-estrutura dos neurônios e seus contatos sinápticos nas diferentes
porções de neurônios (dendritos, espinhos dendríticos, soma e axônio) da MePV de
ratos machos e de fêmeas em diestro. Com isso, esperava-se apresentar dados
relevantes para futuras investigações juntando morfologia e funções dos neurônios da
MePV de ratos machos e fêmeas. Todos os dados aqui apresentados são ainda
inéditos e contribuem para a área do conhecimento que, embora relevante, ainda é
pouco estudada.
3. MATERIAL E MÉTODOS
28
3.1 Animais
Foram utilizados ratos Wistar adultos de ambos os sexos (3 meses de idade, 13
machos e 23 fêmeas) provenientes do biotério do Instituto de Ciências Básicas da
Saúde da UFRGS. Todos os animais foram mantidos sob temperatura ambiente (22˚ C),
ciclo claro-escuro de 12:12 horas e com água e comida ad libitum.
Todos os ratos foram manipulados de acordo com as normas internacionais de
cuidados éticos e uso de animais em laboratório (Conselho Diretivo da Comunidade
Européia de 24 de novembro de 1986, 86/609/EEC) e as normas brasileiras para o uso
ético de animais em experimentação científica.
3.2 Identificação das fases do ciclo estral
A verificação da citologia vaginal foi realizada nas ratas por duas semanas antes
do início do experimento para determinar a regularidade do ciclo estral. Apenas as ratas
que apresentaram dois ciclos estrais normais e consecutivos foram utilizadas nos
experimentos relatados a seguir. Para identificar as fases do ciclo estral foi utilizada
uma pequena pipeta com solução salina para a coleta. O conteúdo foi colocado sobre
uma lâmina histológica e observado sob microscópio óptico para a identificação da fase
do ciclo estral pela análise dos tipos celulares presentes (Fig. 5). Em diestro identificou-
se a predominância de leucócitos; proestro, de células epiteliais nucleadas; em estro,
células queratinizadas; e, em metaestro, uma mescla desses tipos celulares, conforme
classicamente descrito. Não utilizamos fêmeas em diestro por ser uma fase rápida, de
difícil detecção e com nível hormonal intermediário entre estro e proestro.
29
Figura 5. Fotomicrografias mostrando a clássica citologia vaginal de ratas nas diferentes fases do ciclo
estral. Diestro: predominância de leucócitos; Proestro: predominância de células epiteliais nucleadas;
Estro: predominância de células queratinizadas; Metaestro: presença de todos os tipos celulares
anteriores. Barra: 20 μm (HERMEL, 2005).
3.3 Experimentos
3.3.1 Experimento 1 - Avaliação do volume somático de neurônios da MePV
de ratos machos e fêmeas ao longo do ciclo estral.
Os animais (n = 5 machos, 5 fêmeas em diestro, 5 fêmeas em proestro e 5
fêmeas em estro) foram anestesiados com tiopental sódico (50 mg/Kg, i.p.; Cristalia,
Brasil), injetados com 1000 UI de heparina (Cristalia, Brasil) no ventrículo esquerdo e
perfundidos com o auxílio de uma bomba peristáltica (Control Company, Brasil, 20
ml/min) com 200 ml de solução salina, seguida por 100 ml de paraformaldeído 4 %
(Reagen, Brasil) e glutaraldeído 0,5 % (Sigma, EUA) diluídos em tampão fosfato 0,1M e
30
pH 7,4. Os encéfalos foram removidos, seccionados coronalmente em vibrátomo (100
µm; Leica, Alemanha) e as áreas contendo a MePV (–3,30 mm posteriormente à sutura
bregmática) foram selecionadas e identificadas segundo o atlas para encéfalo de rato
de Paxinos e Watson (1998). A seguir foram pós-fixadas na mesma solução durante a
noite.
As secções foram lavadas em tampão fosfato salino (PBS, 3 vezes de 30 min),
pós-fixadas por 1 h em tetróxido de ósmio 1% (Sigma, EUA), em seguida o material foi
novamente lavado em PBS (3 vezes de 15 min) e desidratado em uma série de
concentrações crescentes de álcool e óxido de propileno (Electron Microscopy
Sciences, EUA). Posteriormente foi feita a inclusão em resina (Durcupan, ACM-Fluka,
Suíça). Para isso, o material foi submetido ao seguinte protocolo: álcool 50% 2 vezes de
5 min; álcool 70% 2 vezes de 10 min; álcool 96% 2 vezes de 20 min; álcool 100% 2
vezes de 20 min. Posteriormente as secções foram embebidas em óxido de propileno,
durante 5 min; depois foi feita uma mistura 1:1 com resina (Durcupan ACM-Fluka,
Suiça) e óxido de propileno onde as secções ficaram durante 10 min; finalmente, as
secções foram colocadas em resina pura a vácuo durante 24 h a temperatura ambiente.
Após isso, as secções ainda com resina foram colocadas lâminas de vidro e cobertas
com lâminas de acetato a 60ºC por 48 h (RODRIGO et al., 1996). Com ajuda de um
estereomicroscópio (Wild, Suíça) a MePV foi identificada, e novamente seccionada,
colada sobre um bloco de resina e novamente polimerizado por 48 h a 60ºC. Secções
semifinas (1µm) foram obtidas em um ultramicrótomo (MT 6000-XL, RMC, Tucson,
EUA) usando-se navalhas de vidro e analisadas sob microscópio óptico após coloração
com azul de toluidina 1% diluída em tetraborato de sódio 1% (Merck, Alemanha).
31
Para a avaliação do volume somático neuronal foi utilizada a técnica de
reconstrução de secções seriadas (CRUZ-ORIVE; WEIBEL 1990; LEDDA et al., 2000;
HERMEL et al., 2006b), ou seja, imagens seriadas contendo a MePV foram obtidas e
digitalizadas usando-se um microscópio Nikon Eclipse E-600 (Japão) acoplado a uma
câmera CCD Pro-Series “High Performance” com o auxílio do programa “Image Pro
Plus Software 4.1” (Media Cybernetics, EUA). Um mínimo de 9 secções e 42
áreas/ponto por soma neuronal foram analisadas. As MePV direita e esquerda foram
analisadas separadamente (10 neurônios foram mensurados em cada hemisfério,
somando um total de 20 neurônios para cada animal de cada um dos grupos
experimentais). Somente os corpos celulares contidos completamente na série de
secções foram utilizados na avaliação quantitativa (Fig.6). A estimativa do volume
somático neuronal da MePV direita e esquerda de todos os animais foi obtida com o
método de Cavalieri associado com a técnica de contagem de pontos. O valor médio do
volume somático neuronal foi calculado com a equação:
V= ΣP . A/P . T
onde V= volume, ΣP= total de áreas/ponto contadas, a/p= área/ponto (16,415 μm
2
), T=
espessura da secção (1 μm).
Para a análise estatística dos dados obtidos, compararam-se os valores obtidos
nos diferentes grupos experimentais e os obtidos na MePV direita e esquerda de cada
um deles utilizando-se o teste da análise da variância (ANOVA) de duas vias para
32
medidas repetidas seguido do teste das mínimas diferenças significativas (LSD). O nível
estatístico foi estabelecido em P < 0.05.
3.3.2. Experimento 2- Caracterização ultra-estrutural dos neurônios e dos seus
contatos sinápticos da MPV de ratos machos e fêmeas em diestro
3.3.2.1. Microscopia eletrônica
Os animais (n = 8 machos e 8 fêmeas em diestro) foram anestesiados,
perfundidos e os tecidos preparados conforme protocolo do experimento 1. Após
confecção dos blocos de resina contendo o material exatamente conforme
anteriormente detalhado, foi feita a identificação da área de interesse nas secções
semi-finas. Os blocos foram trimados e a área a ser seccionada foi diminuída, para
serem obtidas secções ultrafinas (70-80 nm) no mesmo ultra-micrótomo e montadas em
grades de cobre (200 Mesh). Posteriormente, as secções foram contrastadas com
acetato de uranila 2% (Merck, Alemanha) por 30 min e citrato de chumbo 1% (Merck,
Alemanha) por 20 min (REYNOLDS, 1963), observadas e fotografadas no microscópio
eletrônico JEM 1200 EX II (Centro de Microscopia Eletrônica, UFRGS).
4. RESULTADOS
34
4.1 Experimento 1
Avaliação do volume somático neuronal de neurônios da MePV de ratos machos
e fêmeas ao longo do ciclo estral.
4.1.1 Análise histológica
Nos cortes semi-finos da MePV observaram-se neurônios multipolares, células
neurogliais, capilares sangüíneos e numerosos neuritos. Os neurônios tinham
tamanhos variados, exibiram um núcleo grande pálido com escassos grânulos de
heterocromatina contra a membrana nuclear e um denso nucléolo, envolto pelo
citoplasma (Fig.6). Também identificaram-se diferentes processos, embora foram
observados apenas os segmentos proximais de seus neuritos. O neuropilo mostrou
numerosos processos dendríticos e ocasionalmente feixes axonais compostos tanto por
axônios amielínicos como por alguns axônios finos mielinizados. Maiores detalhes
serão descritos no experimento 2. Alguns pequenos núcleos observados no neuropilo
revelou a existência de diferentes tipos de células gliais.
4.1.2 Análise estatística do volume somático neuronal
A análise estatística dos dados mostrou que houve uma diferença no volume
somático da MePV entre os grupos analisados [F(3,16) = 3,42; p = 0,043], mas não
houve diferença na lateralidade [F(1,16) = 0,19; p = 0,668] nem na interação entre os
grupos e lateralidade [F(3,16) = 0,99; p = 0,421].
As análises post-hoc mostraram que não houve diferença no volume somático na
MePV entre machos quando comparados com fêmeas em diestro (p > 0,05), mas o
volume somático dos neurônios dos machos foi significativamente maior do que o
35
obtido em fêmeas em proestro e em estro (p < 0,05 em ambos os casos). Quando
foram comparadas as médias do volume somático da MePV de fêmeas nas diferentes
fases do ciclo, não houve diferença estatisticamente significativa entre elas (p > 0,05,
em todos os casos; Fig. 7).
36
Figure 6. Fotomicrografia de cortes semifinos seriados mostrando secções em diferentes níveis (1-12) do
soma neuronal (*) da amígdala medial póstero-ventral de ratas em diestro. A numeração de cada
fotomicrografia indica as secções correspondentes na série. A estimativa do volume somático foi
determinada pela borda do corpo celular de cada neurônio usando o método Cavalieri. Coloração azul de
toluidina Barra = 5 μm
37
0
500
1000
1500
2000
2500
Machos Diestro Proestro Estro
Volume somático (µm
3
)
*
*
Figura 7. Médias (± erro padrão da média) do volume somático neuronal (em μm
3
) amígdala medial
póstero-ventral de machos e fêmeas em diestro, proestro e estro, estimada de acordo com a técnica de
Cavalieri e a técnica de contagem de pontos.
* P<0,05 quando comparados com machos.
38
4.2 Experimento 2
Estudo das características ultra-estruturais dos neurônios e dos seus contatos
sinápticos MePV de ratos machos e fêmeas em diestro.
4.2.1 Análise Ultra-estrutural
Os resultados mostraram que tanto em machos como em fêmeas, os corpos
celulares dos neurônios da MePV são arredondados ou ovais apresentam núcleo de
forma similar situado no centro do soma, e com o carioplasma homogeneamente
disperso, e um grande nucléolo situado excentricamente (Figs. 8A, D; 11C). O
carioplasma consistiu em uma matriz difusa com heterocromatina localizada contra o
envelope nuclear, e em pequenos acúmulos dispersos no carioplasma. Uma profunda
indentação pode ser vista no envelope nuclear tanto em machos como em fêmeas
(Figs. 8D, E).
O citoplasma da região do soma continha aparelho de Golgi desenvolvido (Fig.
8A, E), um retículo endoplasmático rugoso bem desenvolvido (Fig. 8E) ribossomos e
polissomos livres ou formando grânulos de Nissl (Figs. 8A; 11B), mitocôndrias de
diversos tamanhos e formas (Figs. 8A; 11A) e numerosos lisossomos (Fig. 11A).
Quanto ao neuropilo, este exibiu axônios amielínicos entre um pequeno número
de axônios mielinizados (Figs. 12E; 13A, E) seccionados transversalmente, ramos
dendríticos isolados (Figs. 10A, C e 13A) e vários contatos sinápticos. Também foram
observados vasos sangüíneos assim como células gliais e seus processos (não
mostrado).
39
No citoplasma da região inicial dos dendritos ocorriam muitos lisossomos,
algumas mitocôndrias, aparelho de Golgi e ribossomos (11A). Ao longo do citoplasma
dos dendritos notou-se principalmente microtúbulos, mitocôndrias e retículo
endoplasmático liso (Fig. 10A, E). Nos dendritos maiores houve uma predominância de
microtúbulos alinhados paralelamente ao eixo dos dendritos (Fig. 10A), estando
regularmente distribuídos nas secções transversais (Fig. 9A). Os microtúbulos nos
dendritos estavam em arranjos paralelos entre mitocôndrias e o retículo endoplasmático
liso. Ainda identificaram-se uma pequena quantidade de ribossomos e um pequeno
número de neurofilamentos (Fig. 11A). Quando os dendritos passavam a ter menor
diâmetro, as mitocôndrias se apresentavam mais centrais (Fig. 13B).
Os espinhos foram observados em dendritos embora também ocorram no soma
neuronal (Fig. 8B). Os espinhos formavam sinapses do tipo assimétricas. De acordo
com a classificação de Peters e Kaiserman-Abramof (1970) foram observados três tipos
de espinhos: os finos (Figs. 10B, D, E1; 13B, D), com finas hastes delgadas, e que
podem ter um pequeno bulbo terminal. O mais comum foi o em forma de cogumelo
(Figs. 10E, F; 13C, F), com uma haste curta e um grande bulbo terminal; e, finalmente o
achatado (Figs. 10A, C, G; 13E) com uma pequena protusão a partir do ramo dendrítico
de base.
No citoplasma dos espinhos encontraram-se retículo endoplasmático liso,
filamentos finos de actina e em sua base alguns ribossomos livres, não sendo
observados microtúbulos (Fig. 10A) e neurofilamentos. Em alguns espinhos em formato
de cogumelo puderam ser detectados polirribossomos em sua base e retículo
endoplasmático liso que se estendeu pelo seu interior formando o aparelho do espinho
(10F e E). Foram detectadas vesículas lisas entre o aparelho do espinho e a membrana
40
pré-sináptica (Fig. 13A), além de filamentos de actina que formavam o citoesqueleto do
espinho (Fig. 13C; F). A membrana pós-sináptica das sinapses assimétricas
mostravam–se eletron-densas contra sua face citoplasmática (como por exemplo, Fig. 9
C, D; E).
No restante do neuropilo da MePV, tanto em machos como em fêmeas,
identificaram-se processos neuronais seccionados tranversalmente, tangencialmente e
longitudinalmente, entre númerosos processos de células gliais e vasos sangüíneos. As
porções proximais dos dendritos continham algumas organelas também encontradas no
soma neuronal, tais como RER, lisossomos, mitocôndrias e grânulos de Nissl,
permitindo distinguir axônios de dendritos (Fig.11A). Os dendritos se desprendem do
soma e apresentavam um contorno irregular com protuberâncias, projetando-se de
diversas formas de apêndices, como os espinhos em sua superfície. Ademais, os
dendritos bifurcavam-se em ângulos agudos e diminuíam de calibre à medida que se
afastavam do soma neuronal (Fig. 11C). Pelo contrário, os axônios apresentavam um
contorno liso, de forma cilíndrica e com um calibre constante, apesar das ramificações.
Os dendritos continham RER, ribossomos e microtúbulos, em contraste com os axônios
onde predominaram neurofilamentos e não eram observados ribossomos, exceto na
sua porção proximal ao soma (Fig. 11A).
Nos dendritos observaram-se sinapses com proeminente densidade pós
sináptica, classificadas como sinapse de tipo I (GRAY, 1959). Essas sinapses
assimétricas foram as predominantes (Figs. 9A, D, E, F ; 12F), sendo a maioria delas
axo-dendríticas. O bulbo terminal dos axônios continha vesículas claras arredondadas e
ocasionalmente mitocôndrias na porção mais afastada do contato sináptico, enquanto o
axônio terminal que forma sinapses simétricas, classificadas como de tipo II (GRAY,
41
1959) apresentam vesículas claras achatadas (Fig 9B). As sinapses simétricas foram
geralmente encontradas nos espinhos somáticos (Fig. 8C) e axônios. Nesses caso em
alguns botões sinápticos identificaram-se vesículas claras arredondadas e algumas de
centro denso (Fig. 12G, H, I). Tais vesículas de centro denso sempre se localizavam
afastadas da membrana pré-sináptica (Fig. 12G, H) e foram mais visualizadas nas
fêmeas em diestro do que nos machos. Também foram observadas algumas sinapses
perfuradas (Fig 12 I) tanto em machos como em fêmeas em diestro.
42
Figura 8. Eletromicrografias da amígdala medial póstero-ventral de ratos machos. A.
Observar um soma neuronal com núcleo claro (N), com grânulos de heterocromatina
dispersos e um grande nucléolo (ncl) excêntrico. No citoplasma notar lisossomos (Lys),
complexo de Golgi (G), corpos de Nissl (Nb) e mitocôndrias (m). B. No quadro superior
da figura A, contem espinho somático (seta) com um contato axônico lateral (s). Notar
na base do espinho ribossomos livres (r). C. No quadro inferior da figura A observar em
maior aumento sinapse axo-somática simétrica, com vesículas claras arredondadas
(asterisco duplo) e mitocôndrias (m). D. Observar dois somas neuronais ovais com
núcleo (N) elíptico e mitocôndrias (m) no citoplasma. E. Soma neuronal exibindo núcleo
(N) com eucromatina dispersa, nucléolo (ncl) e uma invaginação da membrana nuclear
(seta). No citoplasma observar mitocôndria (m), ribossomos (r), retículo endoplasmático
rugoso (rer), cisternas de complexo de Golgi (G). Notar axônio com vesículas claras
fazendo sinapse com o soma neuronal (asterisco duplo) Barras = 1 μm (A), 300 nm (B e
C), 2 μm (D) e 500 nm (E).
.
43
44
Figura 9. Eletromicrografias da amígdala medial póstero-ventral de ratos machos
mostrando diferentes tipos de sinapses assimétricas. A. Notar sinapses assimétricas
(seta dupla) com axônios terminais contendo vesículas claras arredondadas (asterisco)
e poucas vesículas de centro denso (cabeça de seta), microtúbulos (mt), mitocôndrias
(m), dendrito (d). B. Observar terminal axonal contendo vesículas claras achatadas
(asterisco duplo) e, no dendrito, notar retículo endoplasmático liso (ser). C, D e E.
Sinapses assimétricas. Notar densidades pré- sinápticas (C e E, seta dupla) e pós-
sinápticas (D, seta dupla) assimetricamente distribuídas, vesículas claras arredondadas
(asterisco) e aumento do espaço sináptico. F. Observar dois terminais axônicos
contatando (setas duplas) com um único dendrito. Terminais axônicos com numerosas
vesículas claras arredondadas (asterisco) e algumas achatadas (asterisco duplo).
Barras = 250 nm (A), 160 nm (B), 200 nm (C, D e F), 100 nm (E).
45
46
Figura 10. Eletromicrografias da amígdala medial póstero-ventral de ratos machos
mostrando diferentes tipos de espinhos (setas): achatados (A, C e G), finos (B, D, E1),
em formato de cogumelo (E2 e F). A. Processo dendrítico (d) emitindo um espinho do
tipo achatado (seta) com mitocôndrias alongadas (m) e microtúbulos (mt). Um terminal
axônico com vesículas claras arredondadas (asterisco) e achatadas (asterisco duplo)
está fazendo contato com o espinho achatado assinalado. B. Terminal axônico com
vesículas claras arredondadas (asterisco) e algumas vesículas de centro denso (cabeça
de seta) contatando com espinho somático (seta). C. Sinapse axodendrítica assimétrica
com vesículas claras arredondadas (asterisco) e dendrito (d). D. Três botões sinápticos
(1, 2 e 3) contatando com espinho contendo vesículas claras arredondadas (asterisco)
e dendrito (d), densidade pós-sináptica (cabeça de seta) aparelho do espinho (cabeça
de seta dupla). E. Dendrito de onde se desprende um espinho fino (seta 1) e na parte
inferior, um espinho com formato de cogumelo (seta 2), neste último observar o
aparelho do espinho (sa). A região pré-sináptica contém vesículas claras arredondadas
(asterisco) e de centro denso (cabeça de seta). F. Sinapse axo-espinhosa. Região pré-
sináptica com vesículas claras arredondadas (asterisco) fazendo contato com espinho
dendrítico com formato de cogumelo. Neste há cisternas de retículo endoplasmático liso
(ser) formando o aparelho do espinho, densidade pós-sináptica (cabeça de seta dupla).
G. Dendrito com espinho de tipo achatado (seta), dendrito (d). Retículo endoplasmático
rugoso (rer), núcleo (N), mitocôndria (m) Barras = 500 nm (A, B e G), 200 nm (C, F e E)
e 250 nm (D).
47
48
Figura 11. Eletromicrografias da amígdala medial póstero-ventral de ratas em diestro.
A. Notar núcleo neuronal eucromático (N) no neuropilo uma fibra mielinizada (x). No
citoplasma, observar lisossomos (Lys), mitocôndrias (m), complexo do Golgi (G) e
ribossomos livres (r). A porção proximal do dendrito mostra microtúbulos (mt),
neurofilamentos (nf), retículo endoplasmático liso (ser) e lisossomos (Lys). B. Detalhe
de um neurônio com identação nuclear (seta), o pericário tem algumas cisternas de
retículo endoplasmático rugoso (rer), e grânulos de Nissl (Nb). Notar no neuropilo uma
fibra mielinizada (x). C. Neurônio estrelado mostrando núcleo eucromatínico esférico (N)
e com nucléolo periférico (ncl) observar dois processos dendriticos (d), grânulos de
Nissl (Nb). Barras 1 μm (A e C), 400 nm (B).
49
50
Figura 12. Eletromicrografias da amígdala medial póstero-ventral de ratas em diestro
mostrando diferentes tipos de sinapses. A. Sinapse axo-dendrítica, notar vesículas
claras arredondadas (asterisco) no terminal axonal contatando com o dendrito (d). B.
Dois terminais axônicos (1, 2) contatando com o mesmo processo dendrítico (d), notar
vesículas sinápticas claras arredondadas (asterisco). C.Terminal axônico contendo
numerosas vesículas claras arredondadas (asterisco) contatando com um dendrito (d).
D. Sinapse axo-dendrítica. Observar numerosas vesículas claras arredondadas
(asterisco). E. Sinapse axo-dendrítica. Notar na região pré-sináptica vesículas claras
arredondadas (asterisco), espaço sináptico aumentado e na região pós-sináptica
retículo endoplasmático liso (ser). Fibra mielínica (x). F. Sinapse assimétrica com
vesículas claras arredondadas (asterisco) e uma mitocôndria alongada (m) na região
pré-sináptica. G. Dois terminais axônicos com vesículas claras arredondadas
(asteriscos) e uma delas com algumas vesículas de centro denso (seta) contatando
com um processo dendrítico (d) com microtúbulo (mt). H. Sinapse assimétrica com
axônio com vesículas claras arredondadas (asterisco) e algumas vesículas de centro
denso (seta). I. Notar sinapse assimétrica perfurada (seta dupla) e em outra sinapse
axo-dendrítica notar vesículas claras (asterisco) e de centro denso (seta), mitocôndria
(m). Barras 200 nm (A, D, F, G e H); 300 nm (B e C), 320 nm (E) e 160 nm (I).
51
52
Figura 13. Eletromicrografias da amígdala medial póstero-ventral de ratas em diestro
mostrando diferentes tipos de espinhos (seta): formato de cogumelo (A, C e F), finos (B
e D) e achatado (E). A. Processo dendrítico (d) com mitocôndria (m), microtúbulos (mt),
retículo endoplasmático liso (ser), onde se observa um espinho formato de cogumelo
(seta) com aparelho do espinho (sa), entre este e a densidade pós-sináptica observar
vesículas lisas (cabeça de seta). A porção distal do espinho recebe um terminal axônico
com vesículas claras arredondadas (asterisco). Axônios claros mielinizados (x) também
estão na proximidade do dendrito mostrado. B. Processo dendrítico com mitocôndrias
alongadas (m) mais centrais, microtúbulos (mt) e um espinho fino (seta). C. Processo
dendrítico cortado transversalmente de onde emerge um espinho com formato de
cogumelo (seta) com filamentos de actina (af) próximo à área sináptica com marcada
densidade pós-sináptica, mitocôndrias (m), sinapse (s). D. Notar espinho do tipo fino
(seta) emergindo do dendrito cortado tranversalmente, mitocôndria (m). E. Processo
dendrítico com numerosos microtúbulos (mt), observar um espinho achatado (seta). F.
Espinho do tipo formato de cogumelo (seta), com filamentos de actina (af), ampla fenda
sináptica e na região pré-sináptica vesículas claras arredondadas (asterisco). Barras =
500 nm (A), 200 nm (C, D e F), 400 nm (B) e 600 nm (E).
53
5. DISCUSSÃO
55
A MeA faz parte da circuitaria neuronal envolvida com os comportamentos
reprodutivos e mostra algumas características sexualmente dimórficas incluindo
diferença de volume nuclear, na morfologia de seus componentes, na
conectividade sináptica e na quantidade de neurotransmissores e neuropeptídeos
(MADEIRA; LEAL; PAULA-BARBOSA, 1999; WILSON; MASCAGNI; McDONALD,
2002). Os subnúcleos na MeA contêm altas concentrações de receptores para
estradiol, progesterona e testosterona. O que muito bem pode significar que
neurônios responsivos a esteróides sexuais geram a base das diferenças entre
machos e fêmeas encontrados localmente.
Durante o ciclo estral os hormônios sexuais apresentam variações em
circulação sangüínea onde, no diestro o nível de estrogênio começa a aumentar e
a progesterona está baixa; na próxima fase, no proestro, estes hormônios
circulantes alcançarão seu pico máximo e no estro, os níveis de estrogênio e
progesterona declinam. Durante o metaestro são observados valores
intermediários entre estro e diestro (RASIA-FILHO et al., 2004).
No experimento 1 analisou-se o volume somático neuronal da MePV,
comparando-se machos e fêmeas em diestro, proestro e estro. Este procedimento
mostrou uma diferença significativa relacionada ao sexo, sendo maior em machos
do que em fêmeas no proestro e estro. Estes dados concordam com estudo prévio
do volume do soma neuronal da MePD, utilizando o mesmo procedimento deste
trabalho, onde a diferença significativa foi observada entre machos e fêmeas em
proestro e estro (HERMEL et al., 2006b). Por outro lado, em nosso estudo,
56
também observamos que não houve diferença significativa entre machos e fêmeas
em diestro, assim como ocorreu na MePD (HERMEL et al., 2006b). É interessante
que esses dados são similares ao estudo da área somática de neurônios,
impregnados pela técnica de Golgi, da MePV e da MePD estudadas
conjuntamente, onde a MeA posterior não apresentou diferença significativa entre
machos e fêmeas em diestro (RASIA-FILHO; LONDERO; ACHAVAL, 1999). Por
outro lado convém salientar que os neurônios da MePD e a MePV diferem na
expressão de receptores dos hormônios esteróides, maiores na primeira região do
que na outra (SIMERLY et al., 1990; ÖSTERLUND et al., 1998). De fato, embora a
testosterona pareça ter um efeito neurotrófico na expressão de substância P em
ratos machos na MePD e na MePV (MALSBURY; McKAY, 1994), esses dois
subnúcleos da MeA não compartilham a mesma organização funcional e
hodológica (CANTERAS; SIMERLY; SWANSON, 1995; PETROVICH;
CANTERAS; SWANSON, 2001). Isto pode significar que, apesar da menor
quantidade de receptores para esteróides sexuais na MePV, o dimorfismo sexual
identificado na MePD ocorre ainda assim. Ainda que as implicações fisiológica
disto possam ser diferentes, pois estes dois subnúcleos posteriores tem conexões
sinápticas distintas.
Em outras estruturas encefálicas, o volume somático do núcleo pré-
óptico medial (MADEIRA et al., 1999) e o volume do soma das células piramidais
das regiões CA1 e CA3 do hipocampo (ISGOR; SENGELAUBT, 1998) são
maiores em machos do que nas fêmeas, embora não tenham sido correlacionadas
com as fases do ciclo estral. Fêmeas ovarioectomizadas tratadas com estrogênio
57
e progesterona têm o volume de neurônios da área pré-óptica medial aumentados
em comparação com fêmeas adultas em diestro ou ovariectomizadas sem terapia
hormonal substitutiva (KEISER-MARCUS et al., 2001). Machos e fêmeas em
proestro têm a área somática de neurônios do núcleo ventro-medial hipotalâmico
semelhantes entre si, embora maiores em comparação com fêmeas em metaestro
(MADEIRA et al., 2001). Existem evidências que mostram claras conexões
sinápticas diretas ou indiretas, entre a MePV e essas áreas descritas acima
(CANTERAS; SIMERLY; SWANSON, 1995), o que permite supor que essas
estruturas entrariam em um circuito neural sensível à ação dos esteróides sexuais,
e onde tais hormônios poderiam afetar de forma semelhante componentes do
soma neuronal.
Os androgênios parecem também estar envolvidos na regulação da
expressão de algumas proteínas estruturais tais como a actina e a tubulina
(MATSUMOTO, 1997). A testosterona parece favorecer a polimerização e a
organização dos microtúbulos ao mesmo tempo em que diminui a
despolimerização destes. O estradiol tem efeito oposto (KIPP; RAMIREZ, 2003),
isto poderia explicar o aumento do volume somático neuronal na MePV dos
machos, envolvendo a reorganização dos microtúbulos induzida pela testosterona
normalmente presente na circulação. Além disso, o estrogênio ou a progesterona
estariam inibindo este processo durante o proestro das fêmeas e
subseqüentemente no estro. Este tipo de efeito também foi encontrado nas
densidades dos espinhos na MePV, isto é, as fêmeas tem mais espinhos no
diestro e o número destes sítios diminui no proestro, permanecendo baixo no estro
58
e no metaestro (RASIA-FILHO et al., 2004). Esta modificação cíclica e
relativamente rápida (na ordem de horas para dia) implica numa plasticidade
estrutural de neurônios da MePV de fêmeas vinculada ao nível de estradiol e
progesterona em circulação e na duração de efeitos gênicos iniciados pelos
esteróides.
Na MePV a morfologia completa do soma neuronal em cada célula
selecionada foi estudada com secções seriadas para obtenção de estimativa
tridimensional. Embora os neurônios da MePV tenham forma do corpo celular
variada e estão em diferentes orientações neste subnúcleo, esta variação não
afeta o resultado deste estudo, dada a metodologia empregada. Ademais, não foi
encontrada diferença entre os hemisférios nos grupos examinados no parâmetro
estimado, ou seja, em nossos dados não foram encontradas evidências que
mostrem que o volume celular seja lateralizado na MePV. Tampouco foram
encontradas modificações do volume neuronal em relação à lateralidade na MePD
de ratos (HERMEL, et al., 2006b). No entanto, outros autores como Cooke e cols
(2003) mostraram que o tamanho neuronal (bidimensional), é lateralizado na
MePD de ratos adultos, com neurônios maiores no hemisfério esquerdo do que no
direito. Embora tal efeito de lateralidade não foi encontrado em ratos prepubertais
(COOKE; WOOLLEY, 2005). Isto sugere que a diferença entre nosso dados e de
Cooke e cols (2003) possa ser devido a diferença de espécies de ratos, entre
metodologias distintas ou discretas diferenças regionais dentro da MePD possam
ser responsáveis pelos achados diferentes relatados.
59
Nesta tese o volume somático neuronal é um parâmetro sexualmente
dimórfico na MePV, que não está ainda descrito na literatura, para o que é
relevante observar as diferentes fases do ciclo estral a fim de se detectar a ação
dos hormônios gonadais na plasticidade estrutural desta estrutura nervosa. Há
necessidade, a partir de agora de investigar a densidade dos receptores
específicos para estrógenos e progesterona na MePV nas diferentes fases do ciclo
estral a fim de elucidar essas interações. Assim como identificar os transmissores
químicos e suas possíveis variações neste subnúcleo durante o ciclo estral. E são
candidatos para isso a síntese e expressão de colecistoquinina, vasopressina,
substância P e opióides, todos sexualmente dimórficos e presentes em alguns dos
subnúcleos da MeA (De VRIES; MILLER, 1998; MALSBURY; McKAY, 1994).
No experimento 2 analisou-se a ultra-estrutura dos neurônios da MePV bem
como a distribuição dos contatos sinápticos nos seus diferentes componentes
neuronais em ratos adultos machos e em fêmeas em diestro.
As características citoplasmáticas e nucleares dos neurônios da MePV de
machos e de fêmeas se assemelham a outras áreas do encéfalo de ratos
(PETERS; PALAY; WEBSTER, 1991) e são muito similares aos encontrados nos
neurônios da MePD em ratos adultos machos (HERMEL et al., 2006a; HERMEL,
2005). Na MePV foram identificados diferentes tipos de botões sinápticos com
numerosas vesículas sinápticas claras e arredondadas que, por vezes, continham
também vesículas com centro denso, chamadas ao conjunto de vesículas
pleiomórficas (PETERS; PALAY; WEBSTER, 1991). Outros botões sinápticos
mostravam tanto vesículas claras e achatadas como arredondadas. Os dois
60
primeiros tipos de botões sinápticos contatavam com ramos dendríticos e
espinhos, o terceiro tipo com somas neuronais. Isto é semelhante ao encontrado
nos neurônios do MePD (HERMEL, et al., 2006a). Ocorreram tais características
na MePV em ambos os sexos. Adicionalmente, parece haver um maior número
de vesículas sinápticas de centro denso em fêmeas em diestro, porém isto
necessita ser avaliado quantitativamente (HERMEL, et al., 2006a). Ainda que a
dinâmica funcional dos circuitos neurais no qual a MePV está inserida não está
completamente elucidada, mas relações entre a morfologia e a fisiologia podem
representar uma forma de explicar a dinâmica destes processos.
As vesículas claras arredondadas têm sido descritas como contendo
neurotransmissores do tipo excitatórios. Nos terminais axônios que fazem contatos
sinápticos do tipo assimétricos nos ramos dendríticos e espinhos parecem conter
neurotransmissores excitatórios como o glutamato (PETERS; PALAY; WEBSTER,
1991). Por outro lado, a MeA parece formar parte do circuito córtico-estriadopalidal
envolvido no sistema motor e recebe aferências glutamatérgicas do córtex olfativo
acessório, do córtex olfativo principal, da área pré-frontal e insular agranular
(DONG; PETROVICH; SWANSON, 2001). Outra fonte de vesículas claras
arredondadas poderiam corresponder à presença de acetilcolina e, provavelmente
tais aferências colinérgicas, procederiam da substantia innonimata (CANTERAS
et. al., 1992).
Vesículas claras achatadas também foram encontradas nos contatos
sinápticos simétricos da MePV. De acordo com Peters, Palay, Webster (1991), os
axônios podem conter GABA. A MeA é um importante alvo de fibras GABAérgicas
advindas da própria amígdala. A MeA parece ser alvo de fibras GABAérgicas, que
61
se originam, pelo menos em parte, de neurônios do núcleo dorsal basal da
amígdala (NITECKA; FROTSCHER, 1989) e do núcleo amigdalóide intercalado
(MEREDITH; WESTBERRY, 2004). Isto sugere que axônios terminais formando
sinapses simétricas na MePV podem ter uma ação inibitória no soma neuronal.
Estudos mostraram ocorrer imunorreatividade GABAérgica na MeA de gatos
(PARÉ; SMITH, 1993), gerbilos (SIMONS; YAHR, 2003) e ratos (NITECKA; BEN-
ARI, 1987; STENOVA, 1998; STENOVA; OVTSCHAROFF, 2000). Em estudo
imunoistoquímico microscopia óptica e com análise ultra-estrutural em gatos
mostrou que, embora a MeA possua escassos neurônios imunorreativos, está
ricamente inervada, por fibras GABAérgicas. Essas fibras contactariam com
somas neuronais e dendritos primários (PARÉ; SMITH, 1993). Também foram
encontrados na MeA de camundongos numerosos neurônios GABAérgicos e um
neuropilo com imunorreatividade difusa. A análise por microscopia confocal
mostrou coexistência em neurônios de terminais GABA e neuropeptídeo Y. Mais
detalhadamente axônios contendo neuropeptídeo Y faziam sinapse com neurônios
GABAérgicos (OBERTO; PANZICA; ALTRUDA, 2001). Isto pode sugerir que
alguns destes axônios terminais formam sinapses assimétricas na MePV dos
ratos, tendo uma atividade inibitória nos ramos dendríticos e soma neuronal. Isto
nos permite afirmar que os contatos simétricos detectados em somas e dendritos
primários no MePV corresponderiam a fibras possivelmente GABAérgicas.
A presença de vesículas de centro denso na MePV poderia estar
relacionada a existência de neuropeptídeos tais como: o peptídeo natriurético
atrial, a colecistoquinina, o neuropeptídeo Y, a somatostatina, a angiotensina II e a
substância P (de OLMOS; BELTRAMINO; ALHEID, 2004; BREIGERON et al.,
62
2002, EBNER et al., 2004). A ação fisiológica desses neuropeptídeos na MePV
ainda não está nada clara. Sabe-se que a angiotensina II administrada na MeA
inibe o comportamento sexual de ratos machos (BREIGERON et al., 2002) e o
estresse induz a liberação de substância P na MeA (EBNER et al., 2004), mas o
quanto esses efeitos localizam-se especificamente na MePV ainda não foi
estudado. Ao se estudar a relação dos contatos sinápticos com estruturas pós-
sinápticas o procedimento de Golgi permitiu determinar que os espinhos da MePV
têm diferentes morfologias (RASIA-FILHO et al., 1999; RASIA-FILHO; LONDERO;
ACHAVAL, 2004) assim como ocorre no córtex cerebral de ratos (PETERS;
KEISERMAN-ABRAMOF, 1970) e em diversas regiões do hipocampo (SORRA;
HARRIS, 2000). Em nosso estudo observaram-se três tipos de espinhos, o fino, o
achatado e o com formato de cogumelo. O conteúdo dos espinhos é variável,
encontrando-se polirribossomos, relacionados à síntese protéica do espinho; REL,
que está envolvido na regulação do cálcio intracelular inerente ao processo
sináptico; e, filamentos de actina. Na MePV alguns espinhos contêm cisternas
amplas de REL que constituem o aparelho do espinho (GRAY 1959, SPACEK;
HARRIS, 1997; SABATINI; MARAVALL; SVOBODA, 2001; REID, 2002). Estudos
ultra-estruturais mostraram uma densidade sináptica proporcional ao seu volume
do espinho. A densidade pós-sináptica é constituída de uma placa densa que
pode apresentar uma ou mais perfurações (PETERS; KAISERMAN-ABRAMOF,
1969) e esta densidade pode se modificar de acordo com o nível da atividade
sináptica (HARRIS; STEVENS, 1989). Como foi encontrado nos diferentes
subnúcleos da MeA (RASIA-FILHO; LONDERO; ACHAVAL, 1999; RASIA-FILHO;
LONDERO; ACHAVAL, 2004), aparentemente os espinhos menores, com cabeça
63
pouco proeminente como ocorre nos classificados como finos, são considerados
morfologicamente instáveis e têm pouca contribuição nas conexões sinápticas
mais estáveis (HERING; SHENG, 2001). Ao contrário, os espinhos que têm
cabeças maiores, como os classificados como achatados e com formato de
cogumelo são mais estáveis, expressam grande número de receptores para
glutamato de tipo AMPA e cooperam nas conexões sinápticas de longa duração
(KASAI et al., 2003). Pequenos espinhos mudam sua forma rapidamente e novos
espinhos são formados ou eliminados de acordo com a atividade neuronal.
Espinhos grandes são mais estáveis e podem persistem até meses ou anos
(KASAI et al., 2003). Os espinhos chamam a atenção por refletiram a plasticidade
sináptica. O tamanho do espinho está relacionado com o tamanho da sinapse
excitatória; a superfície, o volume e o número de vesículas pré-sinápticas estão
relacionados com a área sináptica; o comprimento do espinho e o diâmetro do
pescoço, são independentes do tamanho da sinapse (HARRIS; SULTAN, 1995).
Os espinhos podem modificar suas estruturas em poucos minutos a horas,
alterando o comprimento do pescoço, embora o significado funcional destas
mudanças ainda permaneça obscuro (KORKOTIAN; SEGAL, 2000). Os espinhos
dendríticos geralmente recebem uma sinapse excitatória na cabeça, mas alguns
podem receber uma segunda sinapse também em seu pescoço (SPACEK;
HARTMANN, 1983). Isto também foi identificado por nós na MePV de machos.
Os espinhos têm diferentes funções como de conectividade,
compartimentalizam o cálcio e outros componentes sinalizadores como inositol
trifosfato (IP
3
) e sódio (HARRIS; KATER 1994, ROSE et al., 1999). Recentemente,
foi descrito que o REL dos espinhos também tem um papel na secreção de
64
lipídios/proteínas na superfície do espinho. O retículo organizado no aparelho do
espinho encontra-se predominantemente em espinhos dendríticos maduros. Em
sua porção mais distal, observam-se vesículas de diâmetro pequeno claras, que
se desprenderiam do REL, e contribuiriam para o crescimento do espinho ou para
um possível trânsito de proteínas sinápticas, tais como receptores NMDA e AMPA
já presentes no aparelho do espinho (KENNEDY; EHLERS, 2006).
No hipocampo, a estimulação sináptica causa a liberação de glutamato na
fenda sináptica, provocando ativação dos receptores pós-sinápticos NMDA que
são também dependente de voltagem, localizados nos espinhos dendríticos, e isto
pode ativar o influxo de cálcio neste território (KOVALCHUK et al, 2000). O cálcio
entra por canais ativados mediante ligantes ou sensíveis à voltagem (ROSE, et al.,
2000). Desta forma, observar os espinhos em diferentes condições pode ajudar a
entender a importância dessas funções celulares. Tanto em machos como em
fêmeas em diestro, foram identificados todos os tipos de espinhos na MePV e não
foi detectada a predominância de algum tipo. Não obstante, esta afirmação requer
que seja realizado um estudo quantitativo. Um estudo ultra-estrutural posterior
permitirá verificar se ocorre variações na morfologia dos espinhos durante o ciclo
estral para correlacionar com modificações numéricas já identificadas com o
procedimento de Golgi (RASIA-FILHO et al., 2004), e se isso pode decorrer de
variações na forma no conteúdo dos mesmo como, por exemplo, no REL,
poliribossomos, filamentos de actina.
Nos espinhos dendríticos da MePV, sobretudo no formato de cogumelo,
foram observados numerosos filamentos de actina. O citoesqueleto de actina
65
presente nos espinhos dendríticos têm uma natureza dinâmica, mudando de forma
continuamente, espontaneamente ou em resposta a estímulos como da atividade
sináptica (FISHER et al., 1998; MATUS, 2000). Dentro dos espinhos dendríticos a
actina parece estar concentrada perto da densidade pós-sináptica. A rápida
regulação do arranjo e desarranjo do citoesqueleto de actina é importante para a
formação, manutenção e morfologia dos espinhos. Esta actina está relacionada
com a espinofilina, que é uma proteína fosfatase 1 que se liga a actina, envolvida
na transmissão sináptica excitatória (HSIEH-WILSON, et al., 2003). A espinofilina
possui características de andaime, unindo diretamente membranas ao
citoesqueleto e pode formar o eixo de um complexo macromolecular coordenando
e integrando a um complexo de sinais extra- e intracelulares com filamentos de
actina. Assim a espinofilina é um bom candidato para servir de ligação entre a
transmissão sináptica excitatória e a alteração de morfologia e na densidade dos
espinhos.
Ainda que não tenha sido realizado um estudo quantitativo ultra-estrutural
dos diferentes tipos de sinapses, sabe-se que em outras áreas nervosas, como no
córtex cerebral, 84% das sinapses são assimétricas e destas, 79% são em
espinhos dendríticos, 21% em ramos dendríticos e somente 0,1% no soma
neuronal. As sinapses simétricas ocorrem em 16% e, destas, 31% são em
espinhos dendríticos, 62% em ramos dendríticos e 7% no soma neuronal. Estas
sinapses simétricas são mais comuns na base dos ramos dendríticos e no soma
neuronal. Ademais à medida que a distância do soma neuronal aumentava nos
neurônios estudados a proporção de sinapses assimétricas aumentam igualmente
66
(PETERS, PALAY, WEBSTER,1991). O mesmo observou-se na MePV de machos
em neurônios estudados (RASIA-FILHO; LONDERO; ACHAVAL, 1999; RASIA-
FILHO et al., 2004). Para finalidade comparativa futura na MePD 67,5% das
sinapses foram em ramos dendríticos, sendo 92,1% excitatórias e 7,9% inibitórias;
23,1% foram em espinhos dendríticos, sendo 100% excitatórias; 8,2% foram no
soma neuronal, com 65% delas excitatórias e 35% inibitórias e apenas 1,2% foram
em axônios mas 100% excitatórias (HERMEL et al., 2006a).
A obtenção desses dados nos permitirá obter achados relevantes que
contribuam para definir a organização celular da MePV, resultados esses, que
combinados com outros dados morfológicos esclarecerão a atividade funcional
desta área em ratos.
6. CONCLUSÕES
68
1. O volume somático neuronal é um parâmetro sexualmente dimórfico na MePV,
sendo maior em machos do que em fêmeas em proestro e estro, mas não em
fêmeas em diestro. Além disso, o volume somático neuronal apresenta uma
tendência de diminuição, embora não alcance significância estatística ao longo do
ciclo estral. Para evidenciar os efeitos dos hormônios gonadais nos neurônios da
MePV é fundamental e de extrema relevância considerar as fases do ciclo estral
das ratas;
2. Apesar de outros autores acharem lateralidade na MePD, o volume somático
neuronal na MePV não mostrou diferença entre os hemisférios cerebrais nos
grupos experimentais estudados, nem interação entre estes grupos.
3. Características morfológicas nucleares e citoplasmáticas dos neurônios da
MePV de ratos machos e fêmeas em diestro não diferem entre si e são
semelhantes àquelas de outras áreas encefálicas já descritos na literatura;
4. Sinapses simétricas (tipo II), aparentemente inibitórias, ocorrem somente sobre
ramos dendríticos proximais e somas neuronais; sugerindo uma importante
modulação GABAérgica na atividade funcional da MePV em ratos adultos;
5. Espinhos dendríticos na MePV apresentam somente sinapses assimétricas
(tipo I), aparentemente excitatórias, e podem ter mais de um contato sináptico
sobre si ao mesmo tempo. As vesículas claras e arredondadas destas sinapses
parecem conter neurotransmissores excitatórios tais como o glutamato e
acetilcolina;
6. Apesar de diversos trabalhos demonstrarem a presença de peptídeos em
somas e fibras neuronais da MePV do rato, o presente estudo mostrou que as
vesículas com centro denso foram ocasionalmente observadas na MePV do rato e
sempre em terminais sinápticos contendo numerosas vesículas claras
arredondadas. Além disso, aparentemente as fêmeas apresentaram uma maior
quantidade de vesículas de centro denso, o que precisa ser confirmado com
dados quantitativos em experimentos futuros.
7. PERSPECTIVAS
70
1. Estudar as distribuições de cada tipo de sinapse e de suas vesículas sinápticas
na MePV de ratos machos e fêmeas em diestro utilizando uma análise semi-
quantitativa das vesículas sinápticas em eletromicrografias com aumentada
magnificação, da mesma forma que Hermel e cols, 2006a;
2. Descrever a ultra-estrutura da MePV de fêmeas nas outras fases do ciclo estral
e analisar os contatos sinápticos sobre ramos dendríticos, somas neuronais e
axônios comparando-os com os presentes resultados com machos e fêmeas em
diestro;
3. Com a técnica de imunoistoquímica associada à microscopia óptica e
eletrônica, detectar quais neurotransmissores estão presentes nas aferências
sinápticas nos neurônios da MePV;
4. Investigar um possível efeito da manipulação dos hormônios gonadais sobre o
volume somático neuronal da MePV de ratas fêmeas gonadectomizadas e
submetidas à terapia hormonal substitutiva com estradiol, progesterona ou
estradiol e progesterona, para identificar quais esteróides ovarianos apresentam
ação na ultra-estrutura da MePV.
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WOOLEY, C.S.; WEILAND, N.; McEWEN, B.S.; SCHWARTZKRON, P.A. Estradiol
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increases the sensitivity of hippocampal CA1 pyramidal cells to NMDA receptor-
mediated synaptic input: correlation with dendritic spine density. Journal of
Neuroscience, v.17, p.1848-1859, 1997.
ZAR, J.H. Biostatistical analysis. Upper Saddle, N.J.: Prentice Hall, 1999.
9. ANEXOS
86
TRABALHOS APRESENTADOS E PUBLICAÇÕES RESULTANTES
A presente tese de doutorado resultou em trabalhos apresentados em
congressos nacionais e internacionais, em resumos publicados, trabalhos no prelo
e em redação.
1. Trabalhos apresentados
ROCHA, M.I.U.M.; XAVIER, L.L.; RASIA-FILHO, A; ACHAVAL, M. Amígdala
medial póstero-ventral: estereologia e lateralidade. In I MOSTRA UFRGS, 2005.
ROCHA, M.I.U.M.; XAVIER, L.L.; RASIA-FILHO, A; ACHAVAL, M. Postero-ventral
medial amygdala: neuronal somatic volume and laterality in rats. In: XX
CONGRESSO DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE MICROSCOPIA E
MICROANÁLISE, Águas de Lindóia, v. 1, suppl 222-223, 2005.
2. Trabalhos enviados ou em fase de redação
ROCHA, M.I.U.M.; MESTRINER, R.G.; HERMEL, E.E.S; XAVIER, L.L.; RASIA-
FILHO, A; ACHAVAL, M.
Neuronal somatic volume of posteroventral medial
amygdala cells from male and female rats across the estrous cycle. Neuroscience
Letters, enviado.
ROCHA, M.I.U.M.; RASIA-FILHO, A; ACHAVAL, M. The posteroventral medial
amygdala: an ultrastructural analysis, em fase de redação.
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