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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA - UFSC
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - CCB
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS - PGN
AÇÃO DA HOMOCISTEÍNA E DO ÁCIDO FÓLICO SOBRE O
PADRÃO MORFOLÓGICO E ESTRUTURA ORGANIZACIONAL DO
TELENCÉFALO E MEDULA ESPINHAL DE EMBRIÕES DE GALLUS
DOMESTICUS
KAROLINE KOBUS
F
LORIANÓPOLIS
/ Fevereiro / 2007
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AÇÃO DA HOMOCISTEÍNA E DO ÁCIDO FÓLICO SOBRE O
PADRÃO MORFOLÓGICO E ESTRUTURA ORGANIZACIONAL DO
TELENCÉFALO E MEDULA ESPINHAL DE EMBRIÕES DE GALLUS
DOMESTICUS
Dissertação de mestrado apresentada à
Coordenação do Curso de Pós-graduação em
Neurociências – PGN, do Centro de Ciências
Biológicas – CCB, da Universidade Federal de
Santa Catarina – UFSC, como requisito parcial
para obtenção do grau de Mestre em
Neurociências.
F
LORIANÓPOLIS
/ Fevereiro / 2007
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AÇÃO DA HOMOCISTEÍNA E DO ÁCIDO FÓLICO SOBRE O
PADRÃO MORFOLÓGICO E ESTRUTURA ORGANIZACIONAL DO
TELENCÉFALO E MEDULA ESPINHAL DE EMBRIÕES DE GALLUS
DOMESTICUS
ELABORADA POR
Karoline Kobus
COMISSÃO EXAMINADORA:
Prof. Dra. Yara Maria Rauh Müller (UFSC)
Orientadora / Presidente
Prof. Dra. Andréa Gonçalves Trentin (UFSC)
Membro
Prof. Dra. Eliane Maria Goldfeder (UFSC)
Membro
Prof. Dr. Rodrigo Bainy Leal (UFSC)
Suplente
F
LORIANÓPOLIS
/ Fevereiro / 2007
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida, pela graça da fé, pelo eterno amor e por fazer de
mim uma pessoa melhor a cada dia.
Aos meus pais, pelo exemplo de amor, respeito e trabalho, e pelo apoio
incondicional em todos os instantes. Aos meus irmãos, Junior e Fabio, pelo
companheirismo e amizade, e por tornar minha vida mais alegre. Agradeço
sempre por existirem...E a toda minha família, que sempre se fez presente, nas
vitórias ou derrotas.
Às amizades que foram capazes de sobreviver aos anos, encontros e
desencontros e continuam por perto, compartilhando comigo momentos
inesquecíveis: Mel, Nanda, Miri, Nadi, Pri, Marina, Amanda, Jackson e Kátia. Às
amizades de pessoas especiais, que apesar da distância, guardo no coração:
Jacque, Toni, Sil e Ricardo. E também às novas amizades e à alegria de nossos
encontros: Cris, Nay, Sury, Marcel, Lúcio, Pena, Murilo e Totó.
À professora Yara, pela dedicação, exemplo e amizade durante todo o
período de mestrado, em que muito acrescentei a minha formação não só
acadêmica, mas também pessoal. Aos muitos amigos do LAB: Eve e Dib, pela
companhia, amizade e disponibilidade sempre...Lizia e Márcia, companheiras de
estudo e também amigas que jamais esquecerei...E os pequenos: Helo, Fran e
Kauê, que sempre estiveram por perto dando uma mãozinha e também alegrando
as tardes no laboratório.
Às amizades que conquistei durante o mestrado: Liliana, Patrícia, Mah,
Manu e Dani, pessoas muito especiais com as quais dividi momentos alegres
durante esta fase da minha vida...
E finalmente, aos mestres, coordenadores e servidores, que fazem a PGN
existir.
Muito Obrigada!
RESUMO
O objetivo do estudo foi verificar a ação da homocisteína (HC) e do ácido fólico (AF), isoladamente
e em conjunto, no desenvolvimento embrionário, com ênfase no padrão morfológico, neurulação e
estrutura organizacional do telencéfalo (TEL) e medula espinhal embrionária (ME); para tanto,
utilizamos o modelo de Gallus domesticus. Foram constituídos 5 grupos experimentais: 2 controles
– Controle Fechado (GC1) e Controle Salina (GC2) – e 3 tratados – HC (G3), HC e AF (G4) e AF
(G5), cada um com N=10. Ovos fertilizados foram numerados, pesados e incubados em estufa
apropriada (38°C e 65% de umidade). Após 32 horas (8-9HH), foram retirados da estufa e efetuou-
se uma abertura na face superior mediana do ovo (1,5cm de diâmetro). Esta permitiu a
visualização do embrião e o tratamento: 25µl de salina (GC2), 10µmol de D,L-HC/25µl de salina
(G3), 0,5µg de AF+10µmol de D,L-HC/25µl de salina (G4) e 0,5µg de AF/25µl de salina (G5).
Concluída a manipulação, a abertura era fechada com filme PVC atóxico e o ovo recolocado na
estufa. O GC1 não foi submetido aos procedimentos de abertura e tratamento. Após 96 horas (23-
25HH), os embriões foram dessensibilizados à 4°C e posteriormente analisados ao
estereomicroscópio, para detecção de alterações do padrão morfológico, determinação do estágio
de desenvolvimento (HH) e mensuração cefálica e corporal (14, 20 e 30X). Em seguida, foram
fixados em formol 10% (24h) e conservados em etanol 70%, tendo a massa corporal aferida após 5
dias. A região cefálica e truncal dos embriões foi preparada para microscopia, e os cortes (8µm)
foram submetidos às técnicas de hematoxilina-eosina (HE), para descrição geral e posterior
morfometria das camadas celulares do TEL e ME, e quantificação celular da notocorda e
mesoderma apical à ME; técnica de Hoescht (33258), para evidenciar células em apoptose; e
técnicas imuno-histoquímicas, para localizar dos filamentos intermediários vimentina e GFAP. A
partir da análise estereomicroscópica, foi possível identificar que a porcentagem de embriões que
apresentaram padrão morfológico normal foi de 100% em GC1 e GC2, e de 70% em G5. Já em G3
e G4 a porcentagem foi de 20 e 30%, respectivamente, e a diferença significativa entre estes dois
e os demais grupos. Através da análise morfométrica realizada nos embriões, observamos que os
grupos GC1 e GC2, geralmente, apresentaram valores médios superiores aos demais grupos
tratados, com exceção de G5, que exibiu médias semelhantes a dos grupos controle. Em
contrapartida, G3 exibiu quase sempre as menores médias, embora as diferenças não fossem
significativas. Comportamento semelhante foi apresentado, quanto à morfometria das camadas
celulares – ventricular e do manto –, tanto do TEL, quanto da ME. A espessura média destas
camadas, foi, quase sempre, significativamente superior nos grupos controle em comparação aos
grupos G3 e G4. Os cortes da região truncal exibiram abertura da região apical da ME – G4 –
acompanhada de falha na fusão do mesoderma apical à ME – G3. Através das técnicas imuno-
histoquímicas, foi possível identificar diferenças na intensidade e localização dos filamentos
intermediários vimentina e GFAP, tanto no TEL quanto na ME e adjacências, entre os grupos
controle (GC1 e GC2) e tratados (G3, G4 e G5). Com relação à apoptose, foi possível evidenciá-la,
no TEL e ME, somente em G4. Portanto, o tratamento com HC (G3) foi o que mais interferiu, tanto
no padrão morfológico, quanto na estrutura organizacional do TEL e ME. Já o tratamento com AF
(G5) não interferiu, de forma significativa, nestes mesmos parâmetros. E o AF, administrado
concomitantemente com a HC (G4), não foi capaz de anular os efeitos nocivos desta substância,
provavelmente, em decorrência da imaturidade metabólica dos embriões.
Palavras-chave: homocisteína, ácido fólico, embriões de Gallus domesticus, padrão morfológico,
telencéfalo, medula espinhal.
ABSTRACT
The objective of the study was to verify the action of homocysteine (HC) and folic acid (AF),
separately and in set, in the embryonic development, with emphasis in morphologic pattern,
neurulation and organization of telencephalon (TEL) and embryonic spinal cord (SP); for this, we
used the model of Gallus domesticus. Five experimental groups had been constituted: 2 controls –
Closed Control (CG1) and Saline Control (CG2) - and 3 treated - HC (G3), HC + FA (G4) and FA
(G5), each one with N=10. Fertilized eggs had been numbered, weighed and incubated at 38°C and
65% humidity. After 32h in stove (8-9HH), a window was opened on the egg´s surface (1.5 cm
diameter), that allowed the visualization of embryo and the treatment: 25µl saline (CG2), 10µmol D,
L-HC/25µl saline (G3), 0,5µg FA + 10µmol D, L-HC/25µl saline (G4) and 0,5µg AF/25µl saline (G5).
After egg window was closed with film atoxic PVC and the eggs returned for the incubator. The CG1
was not submitted to the procedures of opening and treatment. After 96 hours (23-25HH) embryos
were dessensibilized at 4°C, removed from egg and analyzed to stereomicroscope (20X), for
detention of alterations of morphologic pattern, determination of development stage (HH) and
morphometrical analysis (14, 20 and 30X). After the embryos were fixed in formaldehyde 10% (24h)
and maintained in ethanol 70%. After the corporal mass was measuared and embryos were
prepared for microscopy. The serial sections (8µm)
were submitted to techniques of Hematoxylin-
eosin (HE), for general description, morphometrical analysis of the cellular layers of the TEL and
SC, and cellular quantification of notochord and apical mesoderm; Hoescht (33258) to evidence
cells in apoptose; and immunohistochemistry techniques to locate of intermediate filaments
vimentin and GFAP. From the stereomicroscopical analysis it was possible to identify that the
percentage of embryos that had showed normal morphologic pattern in GC1 and GC2 (100%) and
in G5 (70%). Already in G3 and G4 the percentage was respectively of 20 and 30% with significant
difference between these two and too much groups. In morphometrical analysis of the embryos we
observe that CG1 and CG2 generally had showed superior average values when compared with
too much groups, with exception of G5, that showed similar averages to control groups. On the
other hand, G3 almost always showed the average inferiors even so the differences were not
significant. Similar behavior was presented also in the morphometrical analysis of the cellular layers
- ventricular and of the mantle -, as much of the TEL how much of SC. The average thickness of
these layers was almost always significantly superior in the control groups when compared with
groups G3 and G4. The slices of the trunk region had shown opening of the apical region of SC -
G4 – and also failure in the fusion of the apical mesoderm - G3. Through immunohistochemistry
techniques it was possible to identify differences in the intensity and localization of intermediate
filaments vimentin and GFAP between the control groups (GC1 and GC2) and treated groups (G3,
G4 and G5), as much in the TEL how much in SC and surroundings. Apoptosis had been
evidenced only in the TEL and SC of G4. The treatment with HC (G3) interfered more, as much in
morphologic pattern how much in organization of TEL and SC. Although treatment with FA (G5) did
not interfere of significant form in these same parameters, when managed in set with HC (G4), it
was not capable to annul the harmful effect of this substance, probably due to metabolic immaturity
of embryos.
Key-words: homocysteine, folic acid, embryos of Gallus domesticus, morphologic pattern,
telencephalon, spinal cord.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS...................................................................................................
viii
LISTA DE TABELAS..................................................................................................
xii
LISTA DE ABREVIATURAS...................................................................................... xiii
1 INTRODUÇÃO.........................................................................................................
14
1.1 A Origem do Sistema Nervoso..............................................................................
14
1.1.1 Organização e Diferenciação do Tubo Neural...................................................
16
1.2 Os Filamentos Intermediários Vimentina e GFAP.................................................
20
1.3 A Morte Celular e o Desenvolvimento do Sistema Nervoso.................................
22
1.4 O Modelo Biológico Experimental.........................................................................
23
1.5 Defeitos do Tubo Neural – Conceito e Incidência.................................................
24
1.6 Ácido Fólico, Homocisteína e Malformações Congênitas.....................................
26
2 OBJETIVOS.............................................................................................................
31
2.1 Objetivo Geral.......................................................................................................
31
2.2 Objetivos Específicos............................................................................................
31
3 METODOLOGIA......................................................................................................
32
3.1 O Modelo Biológico Experimental.........................................................................
32
3.2 Condições de Incubação.......................................................................................
32
3.3 Procedimentos Realizados com os Ovos..............................................................
33
3.4 Análise dos Embriões: Morfologia e Morfometria..................................................
35
3.5 Procedimentos e Análise Microscópica.................................................................
37
3.6 Análise dos Resultados.........................................................................................
39
3.6.1 Morfologia e Morfometria dos Embriões............................................................
39
3.6.2 Morfometria do Telencéfalo e Medula Espinhal................................................
40
3.6.3 Quantificação das Células da Notocorda e Mesoderma....................................
41
3.6.4 Tratamento Estatístico.......................................................................................
41
4 RESULTADOS.........................................................................................................
42
4.1 Análise dos Embriões: Padrão Morfológico Externo e Morfometria......................
42
4.2 Estudo do Telencéfalo...........................................................................................
48
4.2.1 Microscopia e Morfometria.................................................................................
48
4.2.2 Imuno-localização da Vimentina e GFAP...........................................................
52
4.3 Estudo da Medula Espinhal, Notocorda e Mesoderma Adjacente........................
53
4.3.1 Microscopia, Morfometria e Quantificação Celular.............................................
53
4.3.2 Imuno-localização da Vimentina e GFAP...........................................................
58
4.4 Detecção de Apoptose no Telencéfalo, Medula Espinhal e Mesoderma..............
59
5 DISCUSSÃO............................................................................................................
62
6 CONCLUSÕES........................................................................................................
74
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................
75
ANEXO........................................................................................................................
84
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: (A–
D) Microscopia eletrônica de varredura mostrando o
processo de neurulação primária em embrião de ave............15
FIGURA 2:
Representação esquemática das vesículas encefálicas
primárias e secundárias...........................................................18
FIGURA 3:
(A) Esquema mostrando a organização do córtex encefálico
durante o processo de desenvolvimento. (B)
Esquema da
medula espinhal de embrião de galinha em E4.......................19
FIGURA 4:
Embrião de Gallus domesticus
com 96 horas de
desenvolvimento........................................................................25
FIGURA 5:
Ciclo de re-metilação e trans-sulfuração da homocisteína.......28
FIGURA 6:
Esquema didático de ovo de Gallus domesticus
no momento da
postura......................................................................................34
FIGURA 7: Estágio em que se encontra o embrião com 26-
29 horas de
desenvolvimento (estágio 8HH) ..............................................35
FIGURA 8:
Ilustração e denominação das medidas estabelecidas e
determinadas nos embriões com auxílio de gratícula
milimetrada acoplada ao estereomicroscópio..........................37
FIGURA 9: Visualização das mensurações das
camadas celulares
realizadas nos cortes histológicos do telencéfalo e da medula
espinhal....................................................................................40
FIGURA 10:
Cortes histológicos da medula espinhal mostrando delimitação
da re
gião onde foi realizada a contagem de células do
mesoderma apical (A) e visualização da notocorda indicando
as células quantificadas (B)......................................................41
FIGURA 11:
(A–
G) Fotos dos embriões dos diferentes grupos
ex
perimentais, mostrando o padrão
morfológico...............................................................................44
FIGURA 12:
Média (
x
) e desvio padrão (sd
) das medidas da região cefálica
dos embriões dos diferentes grupos experimentais.................46
FIGURA 13:
Média (
x
) e desvio padrão (sd
) das medidas corporais dos
embriões dos diferentes grupos experimentais........................47
FIGURA 14:
(A–H) Cortes frontais do telencéfalo dos em
briões dos
diferentes grupos experimentais (HE)......................................49
FIGURA 15:
Média (
x
) e desvio padrão (sd
) das medidas da espessura das
camadas ventricular e do manto e das razões camada do
manto/camada ventr
icular, das regiões dorsal e lateral do
telencéfalo, dos cortes histológicos dos embriões dos diferentes
grupos experimentais...............................................................50
FIGURA 16:
Medida da espessura da camada ventricular da região
dorsal
do telencéfalo...........................................................................51
FIGURA 17:
(A–
C) Cortes frontais do telencéfalo de embriões de diferentes
grupos experimentais submetidos à técnica de imuno-
histoquímica para vimentina.....................................................52
FIGURA 18:
(A–
F) Cortes histológicos frontais do telencéfalo de embriões
de diferentes grupos experimentais submetidos à técnica de
imuno-histoquímica com GFAP................................................54
FIGURA 19:
(A–
G) Cortes transversais da região truncal dos embriões dos
diferentes grupos experimentais corados com HE...................55
FIGURA 20:
Média (
x
) e desvio padrão (sd
) das medidas da espessura das
camadas v
entricular e do manto e da razão camada do
manto/camada ventricular da região basal da medula espinhal
dos cortes histológicos dos embriões dos diferentes grupos
experimentais...........................................................................56
FIGURA 21:
Medida da espessura da camada ventricular da região basal da
medula espinhal.......................................................................57
FIGURA 22:
(A–B) Média (
x
) e desvio padrão (sd
) do número absoluto de
c
élulas presentes no interior da notocorda dos embriões dos
diferentes grupos experimentais. Média (
x
) e desvio padrão
(sd
) do número absoluto de células presentes na região do
mesoderma apical da medula espinhal dos embriões dos
diferentes grupos experimentais..............................................58
FIGURA 23:
(A–
D) Cortes transversais da região truncal de embriões de
diferentes grupos experimentais submetidos à técnica de
imuno-histoquímica para vimentina..........................................58
FIGURA 24:
(A–
F) Cortes transversais da região truncal de embriões de
diferentes grupos experimentais submetidos à técnica de
imuno-histoquímica para GFAP...............................................59
FIGURA 25:
(A–D) Corte
s frontais do telencéfalo dos embriões de diferentes
grupos experimentais submetidos à técnica de
Hoescht
33258........................................................................................60
FIGURA 26:
(A–D) Cortes transversais da medula espin
hal dos embriões de
diferentes grupos experimentais submetidos à técnica de
Hoescht 33258.........................................................................61
LISTA DE TABELAS
TABELA 1: Padrão morfológico externo
normal e alterado exibido pelos
embriões dos diferentes grupos experimentais......................43
TABELA 2:
Valores de média (
x
) e desvio padrão (sd
) da massa corporal
(g) e do estágio de desenvolvimento (HH) dos embriões.
Número de embriões
com alteração (s) do padrão morfológico
e freqüência absoluta das alterações exibidas pelos embriões
dos diferentes grupos experimentais.....................................45
TABELA 3: Quantificação da marcação imuno-histoquímica para GFA
P
no telencéfalo dos embriões dos diferentes grupos
experimentais.........................................................................53
TABELA 4: Quantificação da marcação imuno-
histoquímica para
vimentina e GFAP na medula espinhal e estruturas próx
imas
dos embriões dos diferentes grupos experimentais...............60
LISTA DE ABREVIATURAS
AF: Ácido Fólico
AP: Ântero-posterior
D,L-HC:
D,L-homocisteína
DTN: Defeito do tubo neural (s)
GC1: Grupo Controle Fechado
GC2: Grupo Controle Salina
G3: Grupo Homocisteína
G4: Grupo Homocisteína e Ácido Fólico
G5: Grupo Ácido Fólico
GFAP: Proteína glial fibrilar ácida
HC: Homocisteína
HE: Hematoxilina-eosina
HH: Hamburguer e Hamilton
L-HC: L-homocisteína
ME: Medula espinhal
shh: sonic hedgehog
SN: Sistema nervoso
SNC: Sistema Nervoso Central
SNP: Sistema Nervoso Periférico
TEL: Telencéfalo
TN: Tubo neural
1 INTRODUÇÃO
1.1 A Origem do Sistema Nervoso
O desenvolvimento do sistema nervoso (SN) ocorre em seis etapas, a
saber: a determinação da identidade neural do ectoderma; a proliferação celular
controlada; a migração das células precursoras, resultando na formação das
diferentes regiões do sistema nervoso; a diferenciação celular, com a aquisição da
forma e das propriedades das células maduras; a formação dos circuitos neurais e
a eliminação programada de células e circuitos extranumerários (Lent, 2002). A
primeira estrutura do sistema nervoso presente nos vertebrados é a placa neural,
uma área espessada do ectoderma dorsal localizada em frente à linha primitiva
(Sadler, 1997; Wolpert et al., 1998).
No processo de neurulação há o direcionamento da expressão gênica das
células ectodérmicas para a síntese de proteínas específicas do tecido nervoso,
resultando na gradativa transformação destas em células neurais. Moléculas de
sinalização presentes no nó de Hensen, linha primitiva, notocorda e mesoderma
adjacente, induzem a formação da placa neural, pois inibem os fatores de
crescimento essenciais à formação da epiderme. Algumas dessas moléculas já
foram identificadas, como a folistatina, noguina e cordina (Lent, 2002).
O processo de neurulação é constituído por duas fases: a primária, pela
qual o encéfalo e grande parte da medula espinhal são constituídos e a
secundária, em que a partir de uma estrutura denominada cordão medular é
formada a porção caudal da medula espinhal (Catala, 2003). Em aves, as porções
mais rostrais do tubo neural tem origem através da neurulação primária, e a
porção caudal ao 27
o
par de somitos (na altura dos brotos dos membros
posteriores) é originada a partir da neurulação secundária (Lawson et al., 2001).
A neurulação primária é subdividida em quatro etapas bem definidas:
estabelecimento da placa neural, formação do sulco e pregas neurais, dobramento
da placa neural e fechamento da goteira neural através da fusão das pregas na
linha média (Smith e Schoenwolf, 1997) (figura 1). Estas envolvem uma série de
movimentos coordenados, tanto da placa neural quanto do ectoderma adjacente e,
embora sejam descritas separadamente, constituem um processo contínuo,
essencial à formação adequada do sistema nervoso ao longo do eixo rostro-
caudal do embrião (Lawson et al., 2001).
A crista neural é uma estrutura embrionária formada durante a fusão das
pregas neurais e é constituída por células localizadas na região de transição entre
o ectoderma superficial e a placa neural. Estas células migram para fora do tubo
neural e dão origem a tipos celulares variados, como os melanócitos da epiderme
e a cartilagem da região cefálica, além de serem responsáveis pela formação dos
neurônios e células da glia no sistema nervoso periférico (SNP) (Aybar e Mayor,
2002).
Figura 1: (A) Corte transversal de embrião de
ave em estágio 6HH, mostrando a formação do
sulco neural na região cefálica. (B) Corte
transversal de embrião de ave em estágio 7HH,
mostrando a formação das pregas neurais na
mesma região. (C) Corte transversal de embrião
de ave, mostrando a convergência das pregas
neurais na linha média. (D) Corte transversal de
embrião de ave mostrando o TN fechado e
separado da ectoderme (A e B modificado de
Lawson et al., 2001; C e D modificado de
Gilbert, 2000).
Em embriões humanos, a fusão das pregas neurais inicia na região do 4º
ao 6º par de somitos (Moore e Persaud, 2004),
em embriões de ave, o processo
inicia na região do mesencéfalo, por volta do estágio 8HH (26 a 29 horas) e
avança em direção cefálica e caudal, até que em ambas as extremidades,
somente pequenas áreas permaneçam abertas, os neuróporos. No embrião de
Gallus domesticus, o neuróporo rostral fecha-se entre 45 e 49 horas de
desenvolvimento e o caudal em torno de 55 horas (Sanes, 1992).
O tubo neural (TN) está localizado na região dorsal do embrião, abaixo do
ectoderma superficial, acima da notocorda e entre os pares de somitos (figura 1D).
Sua separação definitiva do ectoderma superficial é mediada pela expressão de
moléculas de adesão celular (CAM), como as caderinas. Embora as células do
ectoderma que darão origem ao TN expressem inicialmente E-caderina, durante a
A
D
B
C
neurulação elas cessam a produção desta proteína e passam a sintetizar N-
caderina, enquanto o ectoderma superficial prospectivo mantém a produção de E-
caderina. O não reconhecimento destas estruturas entre si leva a separação
definitiva entre a epiderme e o TN e alterações na expressão dessas moléculas
podem interferir neste processo (Wolpert et al., 1998).
Os mecanismos envolvidos na morfogênese do TN são complexos e ainda
não foram totalmente elucidados. As razões para isso incluem o fato de que em
diferentes níveis rostro-caudais, os movimentos morfogenéticos são diferenciados
ao mesmo estágio de desenvolvimento (Schoenwolf e Smith, 1990). Entretanto, é
atualmente aceito que a formação das pregas neurais é coordenada por uma
combinação de forças intrínsecas e extrínsecas ao neuroepitélio (Smith e
Schoenwolf, 1997). Enquanto as forças intrínsecas são geradas por
comportamentos celulares, como mudanças na forma, posição e número,
responsáveis pelo controle na formação do sulco e pregas neurais, forças
extrínsecas, geradas pelo ectoderma, mesoderma e endoderma e sua associação
com a matriz extracelular, também são capazes de interferir no dobramento da
placa neural (Lawson et al., 2001).
Existe também uma conexão direta entre citoesqueleto e diferenciação
celular. Até o momento não há um modelo de diferenciação único, mas o modelo
de diferenciação do tecido nervoso proposto por Björklund e Gordon (2006), que
postula que a combinação de actina, microtúbulos e filamentos intermediários,
vistos na região apical das células da placa neural, forma uma organela bi-estável
– “the cell state splitter” –, responsável por propagar a onda de contração ou
expansão no epitélio presumidamente neural, tem sido bastante aceita.
1.1.1 Organização e Diferenciação do Tubo Neural
O tubo neural é polarizado ao longo do eixo dorso-ventral, sendo sua
especificação mediada por componentes externos a ele. Um agente ventralizante,
a proteína sonic hedgehog (shh), que tem origem na notocorda (Gilbert e Raunio,
1997) – estrutura embrionária característica de cordados e derivada de células
que invaginam da região do nó de Hensen durante a gastrulação (Schoenwolf,
1999) – estabelece um gradiente ao longo do eixo rostro-caudal, de forma que
diferentes níveis desta proteína geram diferentes tipos celulares (Wilson e Maden,
2005). Assim, o tubo neural apresenta dois eixos de diferenciação, o dorso-ventral
e o rostro-caudal. Também duas regiões especializadas se formam no TN: a placa
do teto, na parte mais dorsal do tubo, e a placa do assoalho, localizada
ventralmente (Lent, 2002). A regionalização também ocorre como resultado de
mudanças na forma do tubo. Na região cefálica, a parede é espessa e uma série
de curvaturas e dobramentos definem as vesículas encefálicas, enquanto
caudalmente, o TN constitui uma estrutura cilíndrica que originará a medula
espinhal.
Devido à regionalização do TN, são formadas subdivisões rostro-caudais e
cada uma delas dá origem a diferentes partes do SNC (Schoenwolf, 1999). Três
dilatações constituem as vesículas encefálicas primárias: o prosencéfalo, o
mesencéfalo e o rombencéfalo. Estas formam a flexura cervical, na junção do
rombencéfalo com a medula espinhal, e a flexura cefálica, na região
mesencefálica. O prosencéfalo divide-se posteriormente nas duas vesículas
telencefálicas, que constituem os hemisférios cerebrais primitivos, e no diencéfalo,
caracterizado pelo desenvolvimento das vesículas ópticas. O mesencéfalo não se
divide, e sua cavidade é posteriormente denominada aqueduto cerebral. O
rombencéfalo se divide em metencéfalo, que dá origem à ponte e ao cerebelo, e
em mielencéfalo, que dá origem ao bulbo (Sadler, 1997) (figura 2).
O crescimento diferencial é um processo essencial à mudança na forma do
tubo e formação das flexuras. Contudo, existem outros fatores determinantes,
como a orientação dos fusos mitóticos, a mudança na forma das células, que pode
envolver funções de microfilamentos e microtúbulos, e o rearranjo localizado das
posições celulares (Goodrum e Jacobson, 1981).
Inicialmente, o tubo neural é constituído por células neuroepiteliais, que
formam um epitélio pseudo-estratificado organizando a parede do tubo. Estas
células se dividem rapidamente, constituindo a camada neuroepitelial ou
neuroepitélio, que através do processo de neurogênese, dá origem às células
presentes no SNC
(Sadler, 1997).
Figura 2: Representação esquemática das vesículas encefálicas primárias e secundárias (modificado de Moore e Persaud,
2004).
Nas vesículas telencefálicas, após cessarem as mitoses no neuroepitélio,
muitas células migram e se diferenciam (Gilbert, 2000), e as que permanecem,
constituem a camada ventricular. As células que se originam precocemente
migram distâncias menores e as que surgem mais tarde migram até regiões mais
superficiais – camada do manto. A diferenciação dessas células depende da
posição que as mesmas passam a ocupar fora do neuroepitélio (Hatten, 1999).
Como as primeiras células migram para fora da camada ventricular, surge,
entre esta e a camada do manto, constituída por células pós-mitóticas, a região
denominada intermediária ou subventricular (Hatten, 1999).
Após, se identifica
uma segunda camada, a pré-placa cortical. Em seguida, surge uma nova camada
de neurônios inserida entre a pré-placa e a camada do manto: a placa cortical,
esta última se subdivide sucessivamente, constituindo o neocórtex e dando origem
às camadas do córtex cerebral maduro (Götz et al., 2002) (figura 3A).
Na medula espinhal, o processo inicial de organização de camadas é
semelhante, com a presença das camadas ventricular e do manto. As células da
camada do manto se diferenciam em neurônios e células da glia (Sadler, 1997),
fazem conexões entre si e emitem seus prolongamentos, originando a camada
marginal (Moore e Persaud, 2004) (figura 3B).
As interações célula-célula são fundamentais no processo de migração
celular (Nadarajah e Parnavelas, 2002). Na camada ventricular do encéfalo e da
medula espinhal, as células pós-mitóticas migram ao longo das fibras da glia radial
a fim de estabelecer as camadas corticais (Hatten, 1999). Este é o modelo
clássico de migração neural, embora exista também a migração tangencial.
Este
tipo de migração caracteriza-se pelo movimento de neurônios paralelamente à
superfície encefálica, e sua importância no desenvolvimento do córtex já foi
demonstrada por traçadores retrovirais, em cortes e em
culturas de regiões
encefálicas. As células que seguem essa rota de migração, em mamíferos,
geralmente originam interneurônios e oligodendrócitos (Wong et al., 2002).
Figura 3: (A) Esquema mostrando a organização do córtex encefálico durante o processo de desenvolvimento. (ZV) zona
ventricular; (PP) pré-placa cortical; (ZSV) zona subventricular; (SP) sub-placa cortical; (PC) placa cortical; (ZM) zona do
manto (modificado de Götz et al., 2002). (B) Esquema da medula espinhal de embrião de galinha em E4 (modificado de
Wolpert et al., 1998).
A glia radial constitui um tipo celular especializado que participa da
diferenciação do SNC em vertebrados (Hatten, 1999; Götz et al., 2002). As células
da glia radial expandem seus processos radialmente ao longo de toda a parede
das vesículas encefálicas e da medula espinhal (Bentivoglio e Mazzarello, 1999).
Estas células pertencem à linhagem astroglial, e enquanto persistem em grande
parte dos vertebrados (peixes, anfíbios, répteis e aves), em mamíferos, originam
os astrócitos na maioria das regiões do SNC adulto (Margotta e Morelli, 1997).
Estas células foram visualizadas inicialmente pelo método de Golgi, mas
suas propriedades astrogliais só foram descritas por meio da imuno-histoquímica,
que revelou a expressão da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) nos processos
radiais das células presentes no córtex cerebral em desenvolvimento de primatas
(Bentivoglio e Mazzarello, 1999).
1.2 Os Filamentos Intermediários – Vimentina e GFAP
A manutenção e a regulação dinâmica da forma das células, e a
organização de compartimentos citoplasmáticos são funções de proteínas
intracelulares constituintes do citoesqueleto (Pollard & Earnshaw, 2006). Este é
composto por três classes de proteínas com propriedades físicas e funções
distintas: filamentos intermediários (10-12 nm de diâmetro), microtúbulos (cerca de
25 nm de diâmetro) e os filamentos de actina (cerca de 7-9 nm de diâmetro) (Arias
e Stewart, 2002).
Os filamentos intermediários são polímeros flexíves, mas resistentes, que
dão suporte mecânico às células, especialmente para evitar estiramento excessivo
nos tecidos de organismos mais complexos. São compostos quimicamente
estáveis, resistindo à solubilização por extremos de temperatura e também a altas
concentrações de detergentes (Pollard e Earnshaw, 2006).
Há vários tipos de filamentos intermediários e cada um é especializado para
exercer variadas funções em diferentes tipos celulares. Os primeiros relatos
encontrados na literatura descreviam 5 tipos de filamentos intermediários nos
vertebrados, distribuídos nos seguintes tecidos: citoqueratinas (tecido epitelial),
vimentina (tecido mesenquimal), desmina (tecido muscular), proteína glial fibrilar
ácida (astrócitos) e neurofilamentos (neurônios) (Machado e Figueiredo, 1996).
Estudos recentes revelaram que os vertebrados dispõem de mais de 50 genes
codificando 6 subclasses de proteínas de filamento intermediário, onde mais de
uma classe pode ser encontrada na mesma célula e o mesmo filamento pode
conter mais de um tipo de subunidade protéica. As similaridades de seqüência
para cada classe são maiores entre as espécies do que entre diferentes classes.
Isto é um indicativo de que as demandas funcionais de cada classe surgiram no
início da evolução e conferiram forte pressão seletiva sobre os genes para cada
proteína (Pollard e Earnshaw, 2006).
No tecido nervoso, as células expressam uma sucessão de isoformas de
filamentos intermediários à medida que amadurecem e se diferenciam (Pollard e
Earnshaw, 2006). A vimentina é considerada o maior componente do
citoesqueleto em astrócitos imaturos e as fibras da glia radial imuno-reativas à
vimentina contribuem para a migração dos neuroblastos na camada do manto
encefálica e também estão envolvidas no desenvolvimento da medula espinhal em
mamíferos (Oudega e Marani, 1991).
Em estágios iniciais do desenvolvimento do SNC de vertebrados, a glia
radial e astrócitos imaturos expressam vimentina como filamento intermediário.
Esta proteína, com peso molecular entre 50-54 kDa, é também característica de
células mesenquimais, constituindo o maior componente das células com esta
origem, como os fibroblastos e células endoteliais.
Os anticorpos anti-vimentina
apresentam reação cruzada com células de mamíferos, aves e anfíbios, indicando
que esta proteína foi bem conservada durante a evolução. O alto grau de
insolubilidade da vimentina sugere a sua função estrutural no citoplasma
(Machado e Figueiredo, 1996). A expressão de vimentina cessa na maioria dos
astrócitos e é substituída por GFAP nas células maduras em mamíferos (Galou et
al 1996; Cole e Lee 1997).
Os filamentos de GFAP foram isolados primeiramente a partir de placas de
esclerose múltipla (Machado e Figueiredo, 1996). Seu peso molecular está entre
47–53 kDa e ela parece ser restrita aos astrócitos no SNC de vertebrados,
portanto, é bastante utilizada como marcador exclusivo destas células (Pixley e
Vellis, 1984), estando presente em astrócitos normais e neoplásicos (Machado e
Figueiredo, 1996).
A GFAP foi encontrada em muitos vertebrados, incluindo mamíferos, aves e
peixes (Machado e Figueiredo, 1996). Além de fazer parte da constituição do
citoesqueleto maduro em astrócitos, a GFAP também contribui com a migração
dos neuroblastos, embora de maneira limitada e em período mais tardio do
desenvolvimento. Os processos radiais positivos à GFAP estão envolvidos
também no crescimento pós-natal das fibras nervosas (Oudega e Marani, 1991).
Os filamentos de GFAP foram também identificados em células de Schwann,
células da pineal e em células da neuro-hipófise (Machado e Figueiredo, 1996).
Além disso, a GFAP também pode ser expressa por células ependimárias durante
algumas fases do desenvolvimento (Roessmann, 1980) e também em processos
inflamatórios (Machado e Figueiredo, 1996).
Em embriões de galinha doméstica, segundo estudo realizado por Tapscott
et al. (1981),
os astrócitos maduros não são revelados, através de imuno-
histoquímica para GFAP, até E12, enquanto as fibras da glia radial podem ser
visualizadas através do método de Golgi já em E4 (estágios 23–25HH). A imuno-
positividade à GFAP é bastante expressiva, entre E11 e E19, na substância
branca da medula espinhal. Entretanto, em estudo mais recente, Cole e Lee
(1997) encontraram, nesta mesma espécie, já em E7, leve marcação para GFAP
em astrócitos nas substâncias branca e cinzenta, e também nas células da
camada ependimária da medula espinhal.
1.3 A Morte Celular e o Desenvolvimento do Sistema Nervoso
O controle do número de células é um mecanismo morfogenético
importante no desenvolvimento normal do SNC e responsável por determinar os
diferentes níveis de citoarquitetura deste sistema, de modo que o crescimento e a
maturação do SNC é resultado do equilíbrio entre dois processos fundamentais, a
proliferação e a morte celular (Simonati et al., 1997). Desta forma, a morte celular
elimina o excesso de células e permite a formação de estruturas especializadas
como núcleos, gânglios e camadas corticais (Anlar et al., 2003).
O processo de morte celular no sistema nervoso em desenvolvimento tem
sido bastante documentado em aves e mamíferos. Ele ocorre tanto nos neurônios
quanto nas células gliais, em várias regiões do SNC e SNP e envolve todos os
tipos celulares – motores, sensoriais, autonômicos, entéricos, receptores
sensoriais e interneurônios, células de Schwann, astrócitos e oligodendrócitos
(Buss et al., 2006). Está presente tanto nos estágios mais iniciais, envolvendo
progenitores ou células indiferenciadas, quanto durante a sinaptogênese, quando
os neurônios se diferenciam e atingem seus alvos (Oppenhein, 1991).
A morte celular que ocorre durante o desenvolvimento é um tipo de morte
celular programada por apoptose (Buss et al., 2006). Esta é uma forma de morte
celular que não é homeostática e nem acidental, mas sim uma morte celular ativa,
geneticamente programada, regulada por genes pró e anti-apoptóticos, que se
perturbados, podem resultar numa variedade de doenças e patologias (Yuan e
Yankner, 2000; Kaufmann e Hengarther, 2001).
A apoptose é um processo rápido, que possui características morfológicas
próprias, como a condensação da cromatina, fragmentação do DNA, núcleo
picnótico e eventualmente, a formação de corpos apoptóticos que são fagocitados
(Ferrer et al.,1990), não ocorrendo reação celular do tecido adjacente, sendo,
portanto, diferente do processo de morte celular por necrose.
Especula-se que a apoptose nas camadas germinativas tenha a função
básica de regular o número de progenitores neurogliais (Kuan et al., 2000).
Entretanto, existem evidências de que ela regule também o destino e fenótipo dos
neurônios em vertebrados (Yeo e Gautier, 2003). Além disso, ela pode ser
necessária para excluir células com genoma instável, com aneuploidia por
exemplo (Rehen et al., 2001).
A apoptose é também importante ao desenvolvimento do sistema nervoso
porque os neurônios são produzidos em excesso, e, então, competem por
contatos celulares até o estabelecimento de seus alvos, levando ao ajuste de seu
número, a fim de prover as conexões neurais efetivamente necessárias (Pettman
e Henderson, 1998).
1.4 O Modelo Biológico Experimental
Embriões de ave são bastante utilizados como modelo experimental para
estudo de desenvolvimento devido à similaridade entre estes e embriões de
mamíferos, principalmente na sua complexidade morfológica inicial (Sanes, 1992;
Wolpert et al., 1998). Além disso, permitem a incubação artificial e o
acompanhamento do desenvolvimento embrionário diário, porque, diferentemente
dos mamíferos, os embriões de ave se desenvolvem fora do útero, o que provém
um fácil acesso desde a postura até a eclosão. Outras vantagens da utilização de
aves como modelo experimental, em especial galinhas, é que os ovos podem ser
obtidos facilmente em grande número e também toleram bem a manipulação
experimental (Gilbert e Raunio, 1997). Por todas essas razões, embriões de
galinha doméstica tem servido à embriologia e a biologia do desenvolvimento
desde a época de Aristóteles, servindo como um modelo usual de estudo do
desenvolvimento, tanto descritivo quanto experimental (Schoenwolf, 1999).
Uma série de eventos ocorre durante a embriogênese, antes da postura do
ovo pela galinha. O ovo é envolto por membranas acelulares (vitelínicas) e após a
fertilização, é coberto por albúmen e membranas calcificadas (casca). Ainda no
oviduto, o zigoto sofre clivagem formando o blastoderma e é então estabelecido o
eixo rostro-caudal. No momento da postura, o embrião de galinha encontra-se na
gastrulação, tendo o hipoblasto já formado. Após a postura, para o
desenvolvimento ter continuidade, é necessário incubar os ovos a temperatura de
38°C (Schoenwolf, 1999).
Os estudos de embriologia realizados com Gallus domesticus adotam o
trabalho de Hamburguer e Hamilton (1951) como modelo descritivo que
estabelece os estágios de desenvolvimento (HH) do embrião desde a fertilização
até a eclosão.
Baseado neste estudo, até o estágio 14HH (50-53 horas), o número
de pares de somitos é utilizado para definir a idade do embrião, após este estágio,
os critérios incluem o desenvolvimento das membranas extra-embrionárias, a
presença de flexuras e áreas de rotação corporal, o tamanho e forma dos brotos
dos membros e o desenvolvimento dos arcos faríngeos (Sanes, 1992).
Com 53 horas de incubação, as flexuras cefálica, cervical, dorsal e caudal
já estão formadas, e, após 96 horas (23-25HH), o embrião apresenta as 5
vesículas encefálicas bem definidas, todos os pares de somitos já estão
presentes, as vesículas ópticas apresentam pigmentação e os membros anteriores
e posteriores exibem igual tamanho (Hamburguer e Hamilton, 1951) (figura 4).
1.5 Defeitos do Tubo Neural – Conceito e Incidência
Durante o desenvolvimento embrionário, os sistemas orgânicos estão
sujeitos a ação de fatores exógenos e endógenos que podem interferir na
expressão do padrão estrutural e funcional do organismo. A interferência de
fatores exógenos – agentes tóxicos ou mesmo deficiências nutricionais – pode
levar ao surgimento de malformações congênitas (Moore e Persaud, 2004).
Figura 4: Embrião de Gallus domesticus com 96 horas de desenvolvimento (23-25HH). (mes) mesencéfalo; (Bma) broto do
membro anterior; (Bmp) broto do membro posterior; (FxC) flexura cervical; (FxCa) flexura caudal; (FxD) flexura dorsal; (tel)
telencéfalo; (VO) vesícula óptica.
Os defeitos do tubo neural (DTN) constituem alterações no processo da
neurulação e/ou defeitos no invólucro esquelético do TN. Alterações na sutura
média, neural e/ou esquelética, podem afetar a região do encéfalo, medula
espinhal ou ambas. A falha em qualquer etapa do processo de neurulação, desde
a indução neural primária até o fechamento do TN, pode resultar em DTN
(Björklund e Gordon, 2006).
Estes defeitos são mais freqüentes em embriões do
que em neonatos, isso porque a maioria dos embriões afetados – 90% – são
espontaneamente eliminados (Sadler, 1997; O’Rahilly e Müller, 2005).
A anencefalia é o tipo mais grave de DTN e consiste na ausência parcial do
encéfalo e da abóbada craniana, que ocorre devido a defeitos no fechamento do
neuróporo rostral. Geralmente as partes ausentes são o prosencéfalo,
mesencéfalo e a parte craniana do rombencéfalo (O’Rahilly e Müller, 2005). Em
neonatos vivos, sempre estão presentes um tronco encefálico rudimentar e tecido
nervoso funcional (Sadler, 1997),
por esse motivo, meroanencefalia é um nome
mais adequado para esta anomalia (Moore e Persaud, 2000).
Esta malformação é
incompatível com a vida e em humanos, ocorre em 1 a cada 1.000 nascimentos
(Moore e Persaud, 2004).
Quando o DTN afeta a medula espinhal e os tecidos
sobrejacentes – meninges, arcos vertebrais, músculos e tecido epitelial – é
denominado de espinha bífida (Moore e Persaud, 2000).
As malformações do SNC constituem cerca de 10% de todas as
malformações congênitas e os DTN figuram entre as mais freqüentemente
relacionadas à mortalidade infantil e ao comprometimento funcional. A incidência
de DTN varia de 1:1.000 a 5:1.000 nascidos vivos, e sua reincidência é de
aproximadamente 3% (O’Rahilly e Müller, 2005).
Enquanto a anencefalia é uma
malformação incompatível com a vida, os neonatos com espinha bífida
sobrevivem, entretanto, os graus de acometimento são variados, e não raro a
criança é portadora de sérios comprometimentos físicos (Bruin et al., 2003).
Dados do ECLAMC/SC (Estudo Colaborativo Latino–Americano de
Malformações Congênitas em Santa Catarina), referentes aos neonatos com
malformações congênitas nascidos nas Maternidades Carmela Dutra e do Hospital
Universitário (HU-UFSC), ambas localizadas na grande Florianópolis, durante o
período de 1999 a 2004, a taxa de neonatos portadores de anencefalia foi de 3,7 e
de espinha bífida foi de 13,6 para cada 10.000 nascimentos. No mesmo período, a
taxa brasileira de ocorrência de
espinha bífida foi de 8,62, o que reflete uma
incidência expressiva desse DTN no estado de Santa Catarina (Souza, 2006).
1.6 Ácido Fólico, Homocisteína e Malformações Congênitas
Os DTN possuem uma etiologia multifatorial em que há a combinação de
fatores tanto genéticos quanto ambientais, como a nutrição, por exemplo. Sabe-se
que a ingestão de ácido fólico antes e durante o início da gestação previne a
ocorrência desses defeitos em 50 a 70% dos casos. Evidência suportada por
estudos epidemiológicos realizados nos últimos 20 anos (Molloy, 2005), que
demonstraram que as taxas de crianças que apresentam DTN vêm diminuindo nos
países desenvolvidos, não existindo dúvidas de que fatores nutricionais e
ambientais desempenham um papel importante na etiologia destes defeitos.
Estudos epidemiológicos evidenciaram a eficácia do ácido fólico na
prevenção desses defeitos congênitos. Daly et al. (1997) demonstraram que uma
dose diária de 200 µg de ácido fólico é capaz de reduzir a ocorrência dos DTN em
cerca de 39 a 41%. Segundo Finnel et al. (2004), a suplementação
periconcepcional com ácido fólico reduz em 70% a ocorrência de DTN, além de ter
ação protetora aos defeitos craniofaciais e cardíacos.
A partir da década de 90, políticas públicas têm tomado medidas para
adequar a ingestão de ácido fólico à população, principalmente entre as mulheres
em idade fértil (Cornel e Erickson, 1997; Oakley e Johnston, 2004). A fortificação
de alimentos com ácido fólico teve início nos EUA em 1998, desde então, a
prevalência de DTN caiu para 5 a cada 10.000 nascimentos (Olney e Mulinare,
2002). Entretanto, no Brasil, somente a partir de junho de 2004, o Ministério da
Saúde determinou que todas as farinhas de trigo e milho fabricadas no país ou
importadas fossem enriquecidas com ferro e ácido fólico, segundo resolução nº
344 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA).
A oferta e o metabolismo adequado do ácido fólico são necessários ao
desenvolvimento embrionário normal, bem como à maturação do sistema nervoso
(Ramaekers e Blau, 2004), tendo em vista que o mesmo desempenha papel
importante na regulação de processos como neurogênese e morte celular
programada (Mattsom e Shea, 2003).
O ácido fólico obtido na alimentação encontra-se na forma inativa, pois
apenas suas formas reduzidas funcionam como co-fatores ativos no metabolismo
celular (Ramaekers e Blau, 2004). Entretanto, ele é convertido em derivados
metabolicamente ativos, como o 5,10-metileno-tetrahidrofolato (Björklund e
Gordon, 2006). A função desses folatos é a síntese de purinas e timina, metilação
do DNA, conversão da homocisteína à metionina e a formação de grupos
doadores de metil como a S-adenosil-metionina (SAM) (Ramaekers e Blau, 2004).
O folato (5,10-metileno-tetrahidrofolato) provém o grupo metil para a conversão da
metionina à SAM, utilizada na síntese de aminoácidos, proteínas, RNA, DNA e
lipídios. Quando há baixos níveis de folato, diminuem também os níveis de SAM,
levando a uma redução na metilação da citosina do DNA (Mattsom e Shea, 2003).
A geração de novas células na embriogênese é um processo bastante
rápido, portanto, embriões são sensíveis a níveis reduzidos de folato. O ectoderma
e o neuroepitélio podem ser os mais sensíveis de todos os tecidos embrionários,
idéia suportada pela observação de que a placa neural expressa altos níveis de
RNA mensageiro para receptores de folato, quando comparada a outros tecidos
embrionários, como, por exemplo, o coração (Rosenquist e Finnel, 2001).
A deficiência de ácido fólico tem como conseqüência direta o aumento dos
níveis plasmáticos de homocisteína (Calle et al., 2003). A homocisteína é um
aminoácido sulfurado derivado da des-metilação e re-metilação da metionina, e é
metabolizado através de reações de re-metilação e trans-sulfuração (Limpach et
al., 2000). A reação de re-metilação, catabolizada pela enzima metionina
sintetase, que requer a presença de ácido fólico, converte a homocisteína à
metionina (Brauer e Tierney, 2004; Mattson e Shea, 2003).
Pela ação da cistationa
ß-sintetase, uma enzima dependente de vitamina B
6
, a homocisteína é convertida
ao aminoácido cisteína, numa reação de trans-sulfuração (Calle et al., 2003)
(figura 5). Estas duas reações permitem que o organismo mantenha os níveis
normais de homocisteína, que em humanos, estão em torno de 5 – 15 µM no
plasma sangüíneo (Ueland et al., 1993), e entre 0,5 e 10 µM no líquor e tecido
nervoso (Welch e Loscalzo, 1998). As desordens nutricionais que levam ao
aumento de homocisteína podem ser deficiência de vitaminas B
12
e B
6
e de ácido
fólico (Brauer e Tierney, 2004).
Figura 5: Ciclo de re-metilação e trans-sulfuração da
homocisteína. (MAT) metionina adenosil-transferase; (SAM)
s-adenosil-metionina; (MS) metionina-sintetase; (THF)
tetrahidrofolato; (MTHFR) metileno-tetrahidrofolato redutase;
(SAH) s-adenosil-homocisteína; (SAHH) s-adenosil-
homocisteína-hidrolase; (CBS) cistationa ß-sintetase.
A homocisteína é um metabólito normal, porém, em indivíduos com
deficiência de ácido fólico ou com alterações na atividade enzimática da 5,10-
metileno-tetrahidrofolato redutase, metionina sintetase ou cistationa ß-sintetase
METIONINA SAM
HOMOCISTEÍNA
MS
B
12
5,10-metileno THF
MTHFR
5-metil THF
THF
SAH
SAHH
MAT
CBS
B
6
CISTEÍNA
METIONINA SAM
HOMOCISTEÍNA
MS
B
12
B
12
5,10-metileno THF
MTHFR
5-metil THF
THF
SAH
SAHH
MAT
CBS
B
6
B
6
CISTEÍNA
ela se acumula intracelularmente (Limpach et al., 2000). Segundo Mattsom e Shea
(2003), níveis elevados de homocisteína podem induzir a quebra do DNA,
estresse oxidativo e apoptose no sistema nervoso.
E o aumento dos níveis séricos
da homocisteína está relacionado a condições neurodegenerativas como acidente
vascular cerebral (AVC), doença de Alzheimer e Parkinson, e também com
doenças psiquiátricas (Mattsom e Shea, 2003).
Tanto a deficiência de ácido fólico, quanto o aumento da homocisteína
promovem danos ao DNA neuronal por impedir seu reparo. Entretanto, essa morte
neural promovida pela deficiência de doadores de metil pode ser atenuada através
da suplementação com purina e timina (Krumann et al., 2002). Os efeitos adversos
provocados pela deficiência do ácido fólico ou aumento dos níveis intracelulares
de homocisteína atingem as células do sistema nervoso em mitose, incluindo
células da glia e progenitores neurais (Choi e Mason, 2000), o que pode ser
bastante relevante em se tratando de um sistema em desenvolvimento.
Rosenquist et al. (1999) demonstraram, durante o desenvolvimento de
embriões de ave, que a homocisteína atua como inibidor dos receptores NMDA.
Desta forma, ela pode interferir em funções importantes durante o
desenvolvimento, tendo em vista que estes receptores regulam processos como a
migração e adesão celulares, o influxo intracelular de cálcio e a morte celular
programada (Lipton et al., 1997).
Estudos evidenciam o papel da alteração do metabolismo homocisteína/
metionina na etiologia de malformações cardíacas (Rosenquist et al., 1996;
Limpach et al., 2000, Boot et al., 2004), defeitos do tubo neural (Afman et al.,
2005; Limpach et al., 2000; Zhu et al., 2003) e doenças cardiovasculares (Meleady
et al., 2003). Níveis elevados de homocisteína no sangue da mãe aumentam os
riscos de malformações ao nascimento, principalmente os DTN. Em casos de
hiperhomocisteinemia maternal, a suplementação com ácido fólico diminui a
incidência desses defeitos. Entretanto, os mecanismos responsáveis pelo efeito
protetor do ácido fólico são desconhecidos, bem como os mecanismos celulares
pelos quais o nível elevado de homocisteína aumenta o risco de ocorrência de
DTN e de que forma essa relação é causal ou secundária ao metabolismo anormal
do folato (Brauer e Tierney, 2004).
Fatores genéticos também podem estar envolvidos na gênese de
malformações congênitas. Foram descobertas alterações em genes que codificam
enzimas envolvidas nas cadeias de reação do folato, enzimas que participam da
re-metilação da homocisteína (Hansen et al., 2001). As malformações em que há
fortes indícios de que tanto fatores genéticos quanto nutricionais possam interagir
para determinar a expressão do fenótipo incluem os DTN, malformações
cardíacas e craniofaciais (Finnel et al., 2004).
O papel do aumento dos níveis de homocisteína na etiologia dos DTN tem
sido estudado em muitos modelos animais (Afman et al., 2005). A homocisteína
demonstrou ser teratogênica em embriões de ave induzindo defeitos congênitos
do tubo neural (Rosenquist et al., 1996, Epeldegui et al., 2002), coração
(Rosenquist et al. 1996), membros (Limpach et al., 2000) e olhos (Maestro de las
Casas et al., 2003). A administração de doses que variavam de 0,5-7,5 µmol de
D,L-homocisteína (D,L-HC) provocou poucos defeitos, já a dose de 20 µmol foi
letal. Defeitos grosseiros do TN foram observados em embriões tratados com 5-15
µmol de D,L- HC (Rosenquist, et al.,1996).
Portanto, o objetivo do nosso estudo foi analisar o padrão morfológico
externo e a organização do telencéfalo e da medula espinhal de embriões de
Gallus domesticus tratados com homocisteína e/ou ácido fólico, durante o período
inicial de desenvolvimento (96 hr).
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Investigar a interferência da homocisteína e do ácido fólico no processo de
desenvolvimento embrionário inicial (96 horas) de Gallus domesticus, com ênfase
no processo de neurulação, no padrão morfológico externo e na estrutura
organizacional do telencéfalo e medula espinhal.
2.2 Objetivos Específicos
• Reconhecer e descrever as alterações no padrão morfológico externo nos
grupos tratados;
• Aferir a massa corporal dos embriões controle e tratados;
• Avaliar o efeito isolado da homocisteína e do ácido fólico sobre a estrutura
organizacional do telencéfalo e medula espinhal dos embriões de ave;
• Caracterizar o efeito do ácido fólico sobre a estrutura organizacional do
telencéfalo e medula espinhal dos embriões de ave tratados com
homocisteína.
3 MATERIAL E MÉTODOS
Os procedimentos utilizados nesta pesquisa foram aprovados pela
Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA/UFSC, sob os números
00006/CEUA e 23080.032216/2005-18/UFSC. Todos os experimentos foram
realizados no Laboratório de Reprodução e Desenvolvimento Animal, do
Departamento de Biologia, Embriologia e Genética, do Centro de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Santa Catarina.
3.1 O Modelo Biológico Experimental
Ovos fertilizados da espécie Gallus domesticus foram doados pela Empresa
Macedo-Koerich S/A - São José/SC e transportados ao Laboratório de
Reprodução e Desenvolvimento Animal/BEG/CCB em bandejas apropriadas,
confeccionadas com papel reciclável, que possuíam acomodações individuais, o
que dificultava a movimentação dos ovos durante o trajeto. Estes foram limpos,
numerados e tiveram a massa aferida em balança de precisão (0,01g).
A amostra
consistiu de ovos homogêneos, de forma ovalada e coloração bege, e média de
massa de 65,64g
(± 5,36)
.
3.2 Condições de Incubação
Os ovos doados pela empresa são fertilizados e os embriões estão na fase
de blástula (figura 6), sendo a estrutura embrionária reconhecida como
blastoderma. Isso porque desde a fecundação até o momento da postura, o
embrião de galinha já inicia seu desenvolvimento. Após a postura, se a
temperatura não estiver próxima dos 38°C, o desenvolvimento é interrompido
(Magaldi, 1974, Romboli et al., 1984). Portanto, os ovos eram estocados a um
intervalo de temperatura entre 10 e 15°C, por um período médio de 96 horas,
sendo o período máximo recomendado de 168 horas (7 dias) (Magaldi, 1974,
Romboli et al., 1984).
Para retomar o processo de desenvolvimento dos embriões, e então dar
início aos experimentos, os ovos eram primeiramente dispostos em posição
horizontal, em incubadora apropriada e a uma temperatura constante de 37,5°C a
38°C e umidade de 65% (Dias e Müller, 1998). Iniciada a incubação, estabeleceu-
se um período de cerca de 2 horas, para que os embriões retomassem o
desenvolvimento, sendo determinados a partir daí, os estágios de
desenvolvimento embrionário (HH) de acordo com o descrito por (Hamburguer e
Hamilton, 1951) para a espécie Gallus domesticus.
3.3 Procedimentos Realizados com os Ovos
Após 32 horas de incubação (estágio 8HH) os ovos foram retirados da
incubadora e a câmara de ar percutida com um estilete de extremidade rombóide,
a fim de se efetuar um orifício para permitir a saída de ar. Procedeu-se então, com
uma seringa de insulina de agulha ultra-fina (12 mm), a retirada de cerca de 50 a
200µl de albúmem, o que viabilizava o rebaixamento do embrião. Esses
procedimentos facilitavam a realização de uma segunda abertura, efetuada na
face superior mediana do ovo, onde a casca era expandida com o auxílio de um
alfinete e pinças, gerando uma abertura de aproximadamente 1,5 cm de diâmetro,
que permitia a visualização e o manuseio do embrião (figura 6).
Excetuando-se os grupos controle, os demais embriões foram tratados com
homocisteína e/ou ácido fólico. O veículo para as duas substâncias foi salina e a
quantidade de solução injetada foi de 25 µl
por embrião. O local da injeção foi a
região do vitelo próxima à área opaca – futura área vasculosa do embrião. Na
figura 7, vê-se o desenho de um ovo de um embrião de ave com 26-29 horas de
desenvolvimento (estágio 8 HH), correspondente à idade de manuseio. Os
embriões eram manipulados nesta idade, devido ao fato do processo de
neurulação ainda não ter se completado neste estágio, permanecendo ambos os
neuróporos, anterior e posterior, abertos.
casca
albúmen
Blastoderme (embrião)
vitelo
câmara de ar
membranas da casca
membrana vitelínica
chalaza
Figura 6: Esquema didático de ovo de Gallus domesticus no momento da postura. A seta vermelha () indica o local onde
será efetuada a abertura que permite o rebaixamento do embrião. A seta azul (
) indica o local onde será efetuada a
abertura, que permite o manuseio e a visualização do embrião (Modificado de Wolpert et al., 1998).
Para atingir aos objetivos propostos, foram constituídos 5 grupos
experimentais, cada qual com n=10, totalizando 50 embriões. Foram utilizados
dois grupos como controle – Grupo Controle 1 (GC1): ovos intactos; e Grupo
Controle 2 (GC2): 25µl de solução salina. O uso de dois controles justifica-se pelo
fato de que a manipulação do embrião, principalmente neste estágio tão inicial
(26-29 horas), pode por si só interferir no processo de desenvolvimento, por isso
foi utilizado um Grupo Controle Fechado (GC1), neste, não houve nenhuma
manipulação até a retirada do embrião do ovo, realizada após 96 horas de
incubação (23-25HH). O Grupo Controle Salina (GC2), foi constituído a fim de
verificar se houve interferência do veículo administrado em conjunto com os
demais tipos de agentes utilizados, como segue:
– Grupo 3 (G3) : 10 µmol de D,L-Homocisteína em 25 µl de solução
salina (400mM);
– Grupo 4 (G4) : 10 µmol D,L-Homocisteína e 0,5 µg de ácido fólico
em 25 µl de solução salina;
– Grupo 5 (G5) : 0,5 µg de ácido fólico em 25 µl de solução salina.
Concluída a manipulação, a abertura localizada na face superior mediana
do ovo era fechada com filme PVC transparente atóxico e o ovo recolocado na
estufa. Diariamente, o desenvolvimento dos embriões foi acompanhado, sendo
observadas, in ovo, as seguintes características gerais (Dias, 1996; Schatz, 2003):
1) Aspecto da vesícula vitelínica e área vasculosa;
2) Padrão normal de desenvolvimento do embrião:
- Desenvolvimento das vesículas cerebrais e
vesículas ópticas,
- Organização do eixo corporal
- Diferenciação das estruturas faciais,
- Fechamento adequado da região torácica e abdominal.
Figura 7: Embrião de Gallus domesticus com 26-29 horas de desenvolvimento (estágio 8-9HH). A seta preta () indica o
neuróporo anterior aberto, a seta vermelha (
) aponta à formação dos somitos e a seta azul () a região caudal do
embrião (modificado de Hamburguer e Hamilton, 1951).
3.4 Análise dos Embriões: Morfologia e Morfometria
Após 96 horas de incubação (23-25HH), os embriões tiveram seu
desenvolvimento interrompido sendo retirados da estufa e colocados a
temperatura de 4°C por 15 minutos. Com o uso de uma colher de café e tesoura
cirúrgica, o embrião foi separado do saco vitelínico e colocado em placa de Petri
contendo solução salina, onde através da agitação suave foram retirados os
remanescentes das membranas extra-embrionárias. Após, os embriões foram
fixados em formaldeído a 10% por até 24 horas e conservados em solução de
etanol 70%, onde permaneceram por 5 dias até que tivessem sua massa corporal
aferida em balança de precisão (0,0001g) e fossem posteriormente analisados ao
estereomicroscópio (20X), a fim de se determinar o estágio de desenvolvimento
embrionário conforme Hamburguer e Hamilton (1951) e de se detectar a presença
de alterações visíveis no padrão morfológico externo.
A fim de realizar uma análise mais detalhada do padrão morfológico dos
embriões e verificar se o ácido fólico e a homocisteína interferiram no crescimento
das estruturas embrionárias, foram estabelecidas algumas mensurações feitas
com auxílio de gratícula milimetrada acoplada ao estereomicroscópio (14, 20 e
30X), sendo obtidas as seguintes medidas de comprimento (figura 8):
- altura cefálica (1): distância medida do ápice (topo do mesencéfalo) até a
altura do IV arco faríngeo, passando pela vesícula óptica (14X);
- distância cefálica ântero-posterior (2):
medida desde a extremidade
anterior do telencéfalo à extremidade posterior do mielencéfalo passando
pela vesícula óptica (14X);
- diagonal cefálica (3): medida desde a extremidade anterior do telencéfalo
ao ápice (topo do mesencéfalo) (20X);
- distância ântero-posterior na base do mesencéfalo (4): medida horizontal
ântero-posterior na base do mesencéfalo (30X);
- altura do mesencéfalo (5): medida perpendicular à 4 (30X);
- diâmetro da vesícula óptica (6): medida horizontal no centro da vesícula
óptica (30X);
- comprimento do ápice ao vértice (7): distância do ápice ao vértice do
embrião, passando pelo centro da vesícula óptica até a região dorsal do
embrião na altura do brotamento do membro anterior (14X);
- comprimento do vértice à cauda (8): distância medida a partir do vértice
até à extremidade caudal do embrião passando pelo brotamento do
membro posterior (14X);
- distância entre os brotos dos membros (9): medida horizontal entre o
brotamento de cada membro (anterior e posterior) (14X);
- distância ântero-posterior na altura do coração (10): medida horizontal
medida desde a região ventral à dorsal do embrião na altura do coração
(14X);
- comprimento total (11): corresponde ao somatório das medidas 7 e 8.
Figura 8: Ilustração e denominação das medidas estabelecidas e determinadas nos embriões com auxílio de gratícula
milimetrada acoplada ao estereomicroscópio (14,20 e 30X).
3.5 Procedimentos e Análise Microscópica
As regiões cefálica e truncal dos embriões previamente fixadas foram
preparadas para microscopia de luz e fluorescência, de acordo com as seguintes
etapas:
- Desidratação: realizada em série etanólica crescente (70 até 100%);
- Diafanização: as peças forma colocadas em álcool/xilol e transferidas para
xilol, até a peça tornar-se translúcida;
- Inclusão: três banhos de parafina a 57ºC por 45 minutos cada, sendo que
após o último banho, as peças foram orientadas em blocos e deixadas à
temperatura ambiente;
- Confecção dos Cortes: os cortes, frontais para a região cefálica e
transversais para a região truncal, foram confeccionados em micrótomo rotativo
(espessura de 8µm) e colocados sobre lâminas histológicas.
- Desparafinização: as lâminas foram desparafinizadas em xilol, seguido de
álcool / xilol e hidratação em série alcoólica decrescente, de álcool absoluto até
álcool 70% e em água destilada.
a) Coloração Hematoxilina-Eosina (HE) - Após desparafinização, as lâminas
foram coradas com Hematoxilina de Harris, lavadas em água corrente e imersas
em eosina aquosa (1%). Posteriormente seguiu-se a desidratação e montagem
das lâminas com bálsamo do Canadá (Beçak e Paulet, 1976).
Técnica utilizada como controle histológico, para realização de morfometria
das camadas celulares das regiões do telencéfalo e medula espinhal e de
quantificação das células da notocorda e do mesoderma apical da medula
espinhal dos embriões.
b) Método de Hoescht (33258) – Após desparafinização, as lâminas foram
banhadas em solução de tampão Mc Ivaine (0,4M de fosfato de sódio e 0,1M de
ácido cítrico, pH 5,5) por 5 minutos. Em seguida, foram coradas durante 10
minutos em Hoechst 33258 (Sigma) diluído em tampão Mc Ivaine na concentração
de 0,5 µg/ml. Após esse procedimento, as lâminas foram lavadas em água
destilada (3 banhos de 5 minutos cada), montadas com tampão Mc Ivaine,
vedadas com esmalte e armazenadas a 4°C.
Técnica
utilizada para visualizar os núcleos celulares e principalmente
identificar células apoptóticas (Verma e Babu, 1995).
c) Técnicas Imuno-Histoquímicas – Alguns cortes histológicos foram
destinados a reações imuno-histoquímicas para localização dos filamentos
intermediários vimentina e GFAP (proteína ácida fibrilar da glia) nas regiões
cefálica e truncal dos embriões. Para tal, foram utilizados independentemente dois
tipos de anticorpos primários, anti-vimentina e anti-GFAP, como segue abaixo:
- Bloqueio da atividade das peroxidases endógenas: 1 banho de peróxido
de hidrogênio (0,3%) em metanol por 15 minutos; em seguida as lâminas foram
lavadas por 15 minutos em tampão fosfato (PBS - 0,1M, pH de 7,4) + Triton X-
100% (0,3%). Após, as lâminas foram lavadas duas vezes por 10 minutos em
tampão PBS.
- Bloqueio de sítios inespecíficos: as lâminas foram incubadas com soro
fetal bovino 5% por 1 hora. Em seguida, os cortes foram lavados em PBS por 10
minutos em agitação.
- Incubação com anticorpo primário: o conjunto de lâminas foi subdividido
para incubação independente com os anticorpos anti-vimentina V9 (1:50) e anti-
GFAP (1:50)
em PBS por 12 horas a 4°C. Após a incubação, as secções foram
lavadas com PBS em agitação 3 vezes por 10 minutos.
- Incubação com anticorpo secundário: as secções incubadas com anti-
GFAP foram incubadas com anti-coelho conjugado à peroxidase (1:100), e as
secções incubadas com anti-vimentina V9 foram incubadas com anti-camundongo
conjugado à peroxidase (1:100). Ambos em PBS por 1 hora e trinta minutos, em
temperatura ambiente. Em seguida, os cortes foram lavados 3 vezes em PBS por
10 minutos em agitação.
- Revelação: as secções foram tratadas com solução de 3-3’-
Diaminobenzidine (DAB) por tempo suficiente até que os cortes apresentassem
tonalidade marrom; em seguida, a reação foi bloqueada com água destilada.
O controle negativo consistiu na realização dos procedimentos acima
descritos, suprimindo-se a incubação com o anticorpo primário.
3.6 Análise dos Resultados
3.6.1 Morfologia e Morfometria dos Embriões
A partir da observação dos embriões com auxílio do estereomicroscópio
(20X) e detectada a presença de alterações do padrão morfológico, estas foram
organizadas em categorias. Foram obtidas as médias das freqüências de
ocorrência de cada categoria para cada grupo experimental.
Após a mensuração de massa corporal, determinação do estágio de
desenvolvimento (HH) e da realização das mensurações corporais e da região
cefálica dos embriões, com auxílio de gratícula milimetrada acoplada ao
estereomicroscópio (14, 20 e 30X), foram obtidas e registradas as médias (
x
) e
desvio padrão (sd) destas variáveis para todos os grupos.
Para as medidas da região cefálica, todos os grupos possuíam n=10, com
exceção do Grupo Homocisteína (G3), que possuía n=09. Para as medidas
corporais, os Grupos Controle Fechado (GC1) e Controle Salina (GC2)
apresentaram n=10 para todas as mensurações. Para a medida 7, os grupos G3 e
G5 apresentaram n=09; para as medidas 8 e 11, os grupos G3, G4 e G5
apresentaram n=09; para as medidas 9 e 10, o Grupo G5 apresentou n=09. Em
todas as situações em que os grupos apresentaram n inferior a 10 foi devido à
impossibilidade de mensuração por motivo de haver alterações no padrão
morfológico externo dos embriões.
3.6.2 Morfometria
do Telencéfalo e Medula Espinhal
Com auxílio de ocular micrométrica acoplada ao microscópio de luz (400X),
foi realizada morfometria do telencéfalo e da medula espinhal dos embriões.
Foram mensuradas a espessura das camadas ventricular e do manto, e após,
foram calculadas as razões camada do manto/camada ventricular.
Para as medidas das camadas celulares do telencéfalo, foram utilizados 6
cortes para cada grupo e foi mensurada a espessura das camadas nas regiões
dorsal e lateral (n=06 para cada camada em cada região).
Para a região da medula espinhal, foram utilizados também 6 cortes, sendo
mensuradas a espessura das camadas celulares na região basal (direita e
esquerda) da medula espinhal (n=12 para cada camada) (figura 9).
Figura 9: Visualização das mensurações das camadas celulares realizadas nos cortes histológicos do telencéfalo (8µm) (A
– 40X e B - 400X) e da medula espinhal (8µm) (C – 200X e D - 400X). (TD) telencéfalo dorsal, (TL) telencéfalo lateral, (CV)
camada ventricular, (CM) camada do manto, (D) direita, (E) esquerda.
D
TD
D
TL
A
D E
C
CV CM
B
CV
CM
3.6.3 Quantificação das Células da Notocorda e Mesoderma
A gratícula de Weibel acoplada ao microscópio de luz (400X) foi utilizada
para delimitar a área de contagem direta, realizada com auxílio de contador
manual, das células do mesoderma localizado imediatamente acima da região
apical da medula espinhal (n=6 cortes histológicos por grupo). O mesmo
procedimento foi adotado para realizar a contagem das células do interior da
notocorda (n=06 cortes histológicos por grupo) (figura 10).
Figura 10: Cortes histológicos da medula espinhal (8µm) (A - 200X e B - 100X). (A) Delimitação da região onde foi realizada
a contagem de células do mesoderma apical. (B) Visualização da notocorda, a seta preta (→) indica as células que foram
contadas diretamente em aumento de 400X.
3.6.4
Tratamento Estatístico
Os dados referentes ao padrão morfológico e morfométrico dos embriões,
medidas de espessura das camadas do telencéfalo e da medula, bem como os
resultados obtidos a partir da contagem das células da notocorda e do mesoderma
apical da medula espinhal, foram analisados no programa estatístico Statistica
®
versão 6.0
para Windows. Para verificar a existência de diferenças significativas
entre os grupos, foi utilizado o teste de análise de variância de uma via (One-Way
ANOVA), p ≤ 0,05, seguido de teste post hoc de Duncan, quando n=10 para todos
os grupos, e teste de Tukey quando n=09 para alguns grupos.
A B
4 RESULTADOS
Este capítulo contém o conjunto de dados obtidos através da análise
estereomicroscópica e morfométrica do padrão morfológico externo, e também da
análise microscópica do sistema nervoso central – telencéfalo e medula espinhal –
, notocorda e mesoderma adjacente ao telencéfalo e à medula espinhal dos
embriões dos diferentes grupos experimentais. São apresentados, acerca da
morfologia dos embriões, variáveis de massa corporal (g), estágio de
desenvolvimento (HH), características do padrão morfológico externo, bem como
medidas morfométricas cefálicas e corporais previamente estabelecidas na
metodologia.
Quanto à análise microscópica dos tecidos embrionários, são apresentadas
diferentes técnicas histológicas realizadas no SNC destes embriões, como a
coloração com Hematoxilina-eosina, que permitiu a descrição geral dos tecidos e
posterior morfometria das camadas celulares do telencéfalo e medula espinhal em
desenvolvimento, bem como a quantificação das células da notocorda e do
mesoderma apical à medula espinhal; a técnica de Hoescht (33258), que
possibilitou a detecção de células apoptóticas nos tecidos neural e mesodérmico;
e as técnicas imuno-histoquímicas, que permitiram identificar a presença dos
filamentos intermediários vimentina e GFAP nas estruturas embrionárias
analisadas, e verificar a existência de diferenças na intensidade e localização
destes entre os grupos, evidenciando a presença de alterações no padrão de
diferenciação celular dos tecidos em questão.
4.1 Análise dos Embriões: Padrão Morfológico Externo e Morfometria
Os embriões de Gallus domesticus tratados com homocisteína e/ou ácido fólico
exibiram várias alterações na morfologia externa, em contrapartida, nos grupos
Controle Fechado (GC1) e Controle Salina (GC2), todos os embriõesexibiram
padrão morfológico externo considerado normal para o desenvolvimento da
espécie (tabela 1). As alterações encontradas nos grupos tratados consistiram em
modificações nas flexuras e curvaturas corporais, hipoplasia do mesencéfalo,
assimetria de vesículas ópticas e extrusão visceral (figura 11).
A porcentagem de embriões que apresentaram padrão morfológico normal
foi de 20%, 30% e 70% nos grupos tratados com Homocisteína (G3),
Homocisteína e Ácido Fólico (G4) e Ácido Fólico (G5), respectivamente, sendo a
diferença significativa entre os grupos Controle (GC1 e GC2) e os grupos G3 e G4
(p < 0,001). Houve também diferença significativa quanto à porcentagem de
embriões que exibiram padrão morfológico normal do Grupo Ácido Fólico (G5) em
comparação com os grupos Homocisteína (G3) (p < 0,01) e Homocisteína e Ácido
Fólico (G4) (p < 0,05)
(tabela 1).
Tabela 1: Padrão morfológico externo normal e alterado exibido pelos embriões dos diferentes grupos experimentais.
Grupos Experimentais
PADRÃO MORFOLÓGICO EXTERNO
GC1
(N=10)
GC2
(N=10)
G3
(N=10)
G4
(N=10)
G5
(N=10)
Normal
100%
a
100%
a
20%
b
30%
b
70%
a
Alterado
– Assimetria de Vesículas Ópticas
0%
0%
0%
10%
0%
– Extrusão Visceral
0%
0%
10%
10%
0%
– Hipoplasia do Mesencéfalo
0%
0%
0%
10%
10%
Flexura Cervical
0%
0%
10%
20%
20%
Flexura Dorsal
0%
a
0%
a
50%
b
50%
b
10%
a
– Modificações nas Flexuras
e Curvaturas Corporais
Torção Tóraco-lombar
0%
0%
20%
0%
10%
Dentre as alterações morfológicas observadas, a mais freqüente foi a
modificação no padrão da flexura dorsal, totalizando 50% dos embriões no grupo
G3 e também em G4, sendo a diferença significativa em relação aos grupos GC1
e GC2 (p < 0,01). Os embriões do Grupo Ácido Fólico (G5) também exibiram essa
alteração na flexura dorsal, porém com freqüência significativamente inferior aos
outros dois grupos (G3 e G4) (p < 0,05) (tabela 1).
Os embriões tratados com homocisteína e/ou ácido fólico também exibiram,
entre outras anormalidades, modificação no padrão da flexura cervical – 10% (G3)
e
20% (G4 e G5) – e torção do eixo corporal na região tóraco-lombar – 20% (G3) e
10% (G5). Porém, para estas alterações, bem como para as demais, as diferenças
entre os grupos não foram significativas.
Figura 11: (A) Embrião do Grupo Controle Fechado (GC1) apresentando padrão morfológico externo normal (14X). (B)
Embrião do Grupo Ácido Fólico (G5) apresentando hipoplasia do mesencéfalo e modificação no padrão da flexura cervical
(20X). (C) Embrião do Grupo Homocisteína (G3) apresentando extrusão visceral e modificação no padrão da flexura dorsal
(10X). (D) Embrião do Grupo Homocisteína (G3) apresentando torção tóraco-lombar (7X). (E) Embrião do Grupo
Homocisteína (G3) apresentando modificação no padrão da flexura cervical (7X). (F) Embrião do Grupo Homocisteína e
Ácido Fólico (G4) apresentando hipoplasia do mesencéfalo e modificação no padrão da flexura cervical (20X). (G) Embrião
do Grupo Homocisteína e Ácido Fólico (G4) apresentando assimetria de vesículas ópticas (10X) (hipoplasia da vesícula
óptica no antímero esquerdo).
Quanto à variável de massa corporal (g) dos embriões, os valores médios
não revelaram diferença significativa entre os grupos. Já com relação ao estágio
de desenvolvimento (HH), os valores médios, de modo geral, também foram
semelhantes entre os grupos, com exceção do Grupo Controle Fechado (GC1),
que exibiu média significativamente superior aos demais (tabela 2).
Com relação à análise morfométrica dos embriões, quanto às medidas da
região cefálica, os grupos Controle Fechado (GC1) e Controle Salina (GC2),
exibiram valores médios superiores aos demais grupos que receberam tratamento,
com exceção do Grupo Ácido Fólico (G5), que em alguns casos exibiu média
superior ou bastante similar a dos grupos controle (figura 2). A média da medida
da altura cefálica (1) foi superior nos grupos Controle Fechado (GC1), Controle
Salina (GC2) e Ácido Fólico (G5): 3,85mm
(± 0,32)
; 3,55mm
(± 0,3)
e 3,64mm
(±
0,52)
, respectivamente. Entre os outros dois grupos as médias foram semelhantes
– 3,43mm
(± 0,62)
e 3,4mm
(± 0,58)
– G3 e G4, respectivamente. Com relação à
média da distância cefálica AP (2), esta foi inferior no Grupo Homocisteína (G3),
em relação aos demais – 3,57mm
(± 0,51)
– sendo a diferença significativa entre
este grupo e o Grupo Controle Fechado (GC1), que obteve o maior valor médio –
4,31mm
(± 0,5)
. A média da medida da diagonal cefálica (3) foi superior no Grupo
Controle Fechado (GC1) – 4,32 mm
(± 0,32)
– em relação aos demais, que
obtiveram médias semelhantes, tendo, entretanto, o Grupo Ácido Fólico (G5),
apresentado a maior média entre os demais – 3,87mm
(± 0,52)
(figura 12).
Tabela 2: Valores de média (
x
) e desvio padrão (sd) da massa corporal (g) e do estágio de desenvolvimento (HH) dos
embriões.
Número de embriões com alteração (s) do padrão morfológico e freqüência absoluta das alterações exibidas
pelos embriões dos diferentes grupos experimentais (n=10 por grupo).
Grupos Experimentais (n=50) Massa Corporal (g)
Estágio de
Desenvolvimento
(HH)
Alterações no Padrão
Morfológico
N° de
embriões
Freqüência
Controle Fechado (GC1) 0,056 (±0,031) 24,8 (±0,42) * 0 0
Controle Salina (GC2) 0,046 (±0,024) 24,1 (±0,32) 0 0
Homocisteína (G3) 0,054 (±0,025) 24,1 (±0,88) 8 9
Homocisteína e Ácido Fólico (G4) 0,044 (±0,024) 24,1 (±0,74) 7 10
Ácido Fólico (G5) 0,056 (±0,041) 24,2 (±0,63) 3 5
Duncan test * p < 0,05
Embora os valores médios das medidas mesencefálicas tenham
demonstrado bastante linearidade entre os grupos, a média da medida da
distância AP na base do mesencéfalo (3) foi inferior no Grupo Homocisteína (G3)
– 2,69mm
(± 0,42)
. Já a média da altura do mesencéfalo (4), neste mesmo grupo,
foi superior aos demais – 1,45mm (±
0,29)
(figura 12). Para o diâmetro da vesícula
óptica (5) os grupos demonstraram também linearidade entre as médias, embora o
Grupo Controle Fechado (GC1) tenha apresentado novamente valor médio
superior em relação aos demais – 1,3mm
(± 0,2)
(figura 12).
Figura 12: Média (
x
) e desvio padrão (sd) das medidas da região cefálica dos embriões dos diferentes grupos
experimentais (Tukey test
a
p < 0,01).
Com relação à morfometria corporal dos embriões, pode-se dizer que as
médias obedeceram a um padrão linear. A média da medida do comprimento do
ápice ao vértice (7) foi superior no Grupo Controle Fechado (GC1) em
comparação aos demais – 6,92mm
(± 0,84)
. O Grupo Homocisteína e Ácido Fólico
Altura Cefálica
2
2,5
3
3,5
4
4,5
mm
GC1 GC2 G3 G4 G5
Distância AP na Base do Mesencéfalo
1,5
2
2,5
3
3,5
4
mm
GC1 GC2 G3 G4 G5
Altura do Mesencéfalo
0,5
0,85
1,2
1,55
1,9
mm
CG1 GC2 G3 G4 G5
Distância Cefálica AP
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
mm
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
Diâmetro da Vesícula Óptica
0,5
0,85
1,2
1,55
1,9
mm
GC1 GC2 G3 G4 G5
Diagonal Cefálica
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
mm
CG1 GC2 G3 G4 G5
Altura Cefálica
2
2,5
3
3,5
4
4,5
mm
GC1 GC2 G3 G4 G5
Distância AP na Base do Mesencéfalo
1,5
2
2,5
3
3,5
4
mm
GC1 GC2 G3 G4 G5
Altura do Mesencéfalo
0,5
0,85
1,2
1,55
1,9
mm
CG1 GC2 G3 G4 G5
Distância Cefálica AP
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
mm
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
Distância Cefálica AP
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
mm
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
Diâmetro da Vesícula Óptica
0,5
0,85
1,2
1,55
1,9
mm
GC1 GC2 G3 G4 G5
Diagonal Cefálica
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
mm
CG1 GC2 G3 G4 G5
(G4) apresentou o menor valor médio – 6,38mm
(± 1,03)
. Quanto à medida do
comprimento do vértice à cauda (8), o Grupo Controle Salina (GC2) apresentou a
maior média – 4,0mm
(± 0,43)
– seguido do Grupo Ácido Fólico (G5) – 3,97mm
(±
0,82)
– Grupo Controle Fechado (GC1) – 3,83mm
(± 0,45)
– Grupo Homocisteína e
Ácido Fólico (G4) – 3,77 mm
(± 0,53)
– e do Grupo Homocisteína (G3), que o
obteve a menor média – 3,44mm
(± 0,54)
(figura 13).
Figura 13: Média (
x
) e desvio padrão (sd) das medidas corporais dos embriões dos diferentes grupos experimentais (Tukey test
p > 0,05).
A média da medida da distância entre os brotos dos membros (9) foi
superior no Grupo Ácido Fólico (G5) – 2,96mm
(± 0,42)
– seguido dos grupos
Controle Salina (GC2) e Controle Fechado (GC1), que apresentaram médias
semelhantes – 2,84mm
(± 0,34)
e 2,83mm
(± 0,17)
, respectivamente. Novamente o
menor valor médio foi apresentado pelo Grupo Homocisteína (G3) – 2,62mm
(±
0,34)
(figura 13).
Distância AP na Altura do Coração
1,5
2
2,5
3
3,5
4
mm
CG1 GC2 G3 G4 G5
Comprimento Total
8
8,5
9
9,5
10
10,5
11
11,5
12
mm
CG1 GC2 G3 G4 G5
Comprimento do Ápice ao Vértice
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
8
mm
GC1 GC2 G3 G4 G5
Comprimento do Vértice à Cauda
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
mm
CG1 GC2 G3 G4 G5
Distância entre os Brotos dos Membros
1,5
2
2,5
3
3,5
4
mm
CG1 GC2 G3 G4 G5
Distância AP na Altura do Coração
1,5
2
2,5
3
3,5
4
mm
CG1 GC2 G3 G4 G5
Comprimento Total
8
8,5
9
9,5
10
10,5
11
11,5
12
mm
CG1 GC2 G3 G4 G5
Comprimento do Ápice ao Vértice
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
8
mm
GC1 GC2 G3 G4 G5
Comprimento do Vértice à Cauda
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
mm
CG1 GC2 G3 G4 G5
Distância entre os Brotos dos Membros
1,5
2
2,5
3
3,5
4
mm
CG1 GC2 G3 G4 G5
Embora os valores médios da distância AP na altura do coração (10)
tenham demonstrado bastante linearidade, novamente o Grupo Homocisteína (G3)
registrou o menor valor médio – 3,00mm
(± 0,41)
– seguido dos grupos Controle
Salina (GC2) e Controle Fechado (GC1), que apresentaram novamente valores
médios bastante próximos – 3,07mm
(± 0,4)
e 3,09mm
(± 0,42)
, respectivamente.
Para esta medida, os maiores valores foram registrados pelos grupos G4 e G5 –
3,50
21mm
(± 0,62)
e 3,16mm
(± 0,34)
, respectivamente (figura 13).
A medida do comprimento total (11), que corresponde ao somatório das
medidas do comprimento do ápice ao vértice (7) e do comprimento do vértice à
cauda (8), foi inferior no Grupo Homocisteína (G3) – 9,06mm
(± 1,47)
– seguido dos
grupos G4, G5, GC2 e GC1, respectivamente. Para as medidas corporais,
nenhuma das diferenças nos valores médios entre os grupos foi significativa
(figura 13).
4.2 Estudo do Telencéfalo
4.2.1 Microscopia e Morfometria
Através da observação das lâminas histológicas, da região cefálica dos
embriões, verificou-se a existência de diferenças na organização tecidual do
telencéfalo dos embriões dos diferentes grupos experimentais. Em todos os
grupos experimentais, a espessura média das camadas ventricular e do manto era
sempre maior na região lateral do que na região dorsal do telencéfalo, que
possuía menor densidade celular.
No Grupo Controle Fechado (GC1) e Controle Salina (GC2) a zona de
migração dos neuroblastos e glioblastos, correspondente à camada do manto, era
mais espessa e melhor organizada em comparação aos demais grupos, tanto na
região dorsal quanto lateral do telencéfalo (figura 14). Ao microscópio de luz
(1000X), nem sempre era nítida a distinção entre as camadas celulares nos cortes
histológicos do telencéfalo dos embriões dos grupos Homocisteína (G3) e
Homocisteína e Ácido Fólico (G4).
A partir da análise morfométrica realizada nestas camadas, esses dados se
confirmaram, e na maioria das vezes, os grupos Controle Fechado (GC1) e
Controle Salina (GC2) apresentaram espessura média, de ambas as camadas
celulares telencefálicas, significativamente superiores aos demais grupos,
independente do tratamento.
Figura 14: Cortes frontais do telencéfalo (8µm) dos embriões dos diferentes grupos experimentais corados com
Hematoxilina-eosina (HE). (A) Vista geral do telencéfalo de embrião do Grupo Controle Fechado (GC1) (40X), mostrando as
duas vesículas telencefálicas e os ventrículos laterais. (B) Detalhe da região lateral do telencéfalo de embrião do Grupo
Controle Salina (GC2) (400X). (C) Detalhe da região dorsal do telencéfalo de embrião do GC1 (200X). (D) Detalhe da região
lateral do telencéfalo de embrião do GC2 (1000X). (E) Detalhe da região lateral do telencéfalo de embrião do Grupo
Homocisteína (G3) (400X). (F) Detalhe da região lateral do telencéfalo de embrião do Grupo Homocisteína e Ácido Fólico
(G4) (200X). (G) Detalhe da mesma região visualizada em F (1000X). (H) Detalhe da região dorso-lateral do telencéfalo de
embrião do Grupo Ácido Fólico (G5) (200X). (VL) ventrículo lateral; (CV) camada ventricular; (CM) camada do manto; (TD)
telencéfalo dorsal; (TL) telencéfalo lateral.
A espessura média da camada ventricular mensurada na região dorsal do
telencéfalo foi significativamente superior no Grupo Controle Fechado (GC1) em
comparação aos demais grupos tratados com homocisteína e/ou ácido fólico –
56,64µm
(± 8,24)
– seguido do Grupo Ácido Fólico (G5) e Homocisteína e Ácido
C
E
F
B
CV
CM
A
VL
VL
D
CM
CV
G
CM
CV
H
TD
TL
_____
347µm
52µm
_____
_____
67µm
_____
21µm
48µm
_____
66µm
_____
28µm
_____
_____
111µm
Fólico (G4) - 36,61µm
(± 3,94)
e 36,08µm
(± 5,88)
, respectivamente (p < 0,0001). O
Grupo Controle Salina (GC2) também obteve média superior aos demais grupos
tratados, sendo significativamente superior a média do Grupo Homocisteína (G3),
que apresentou a menor média de espessura da camada ventricular nesta região
do telencéfalo – 23,39µm
(± 2,52)
(p < 0,0001) (figura 15 e 16).
Figura 15:
M
édia (
x
) e desvio padrão (
sd
) das medidas da espessura das camadas ventricular e do manto e das razões
camada do manto/camada ventricular, das regiões dorsal e lateral do telencéfalo, dos cortes histológicos dos embriões dos
diferentes grupos experimentais (n═06 para todas as mensurações).
Para a medida da espessura da camada ventricular na região lateral do
telencéfalo, o Grupo Controle Fechado (GC1) apresentou média significativamente
superior em relação aos demais grupos que receberam tratamento com
homocisteína e/ou ácido fólico – 70,45µm
(± 6,5)
(p < 0,05) – seguido pelo Grupo
Ácido Fólico (G5), Controle Salina (GC2), Homocisteína e Ácido Fólico (G4) e
Homocisteína (G3), que apresentou o menor valor médio para a camada
Camada Ventricular Dorsal
10
20
30
40
50
60
micrometros
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
b
b
b
c
Camada Ventricular Lateral
30
40
50
60
70
80
micrometros
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
bc
c
bcd
bd
Camada do Manto Dorsal
0
10
20
30
40
50
60
micrometros
CG1 CG2 G3 G4 G5
a
ab
b
ab
ab
Camada do Manto Lateral
10
30
50
70
micrometros
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
Razão Camada do Manto/Ventricular Dorsal
0,10
0,35
0,60
0,85
1,10
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
a
a
ab
b
Razão Camada do Manto/Ventricular Lateral
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
Camada Ventricular Dorsal
10
20
30
40
50
60
micrometros
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
b
b
b
c
Camada Ventricular Dorsal
10
20
30
40
50
60
micrometros
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
b
b
b
c
Camada Ventricular Lateral
30
40
50
60
70
80
micrometros
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
bc
c
bcd
bd
Camada Ventricular Lateral
30
40
50
60
70
80
micrometros
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
bc
c
bcd
bd
Camada do Manto Dorsal
0
10
20
30
40
50
60
micrometros
CG1 CG2 G3 G4 G5
a
ab
b
ab
ab
Camada do Manto Dorsal
0
10
20
30
40
50
60
micrometros
CG1 CG2 G3 G4 G5
a
ab
b
ab
ab
Camada do Manto Lateral
10
30
50
70
micrometros
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
Camada do Manto Lateral
10
30
50
70
micrometros
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
Razão Camada do Manto/Ventricular Dorsal
0,10
0,35
0,60
0,85
1,10
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
a
a
ab
b
Razão Camada do Manto/Ventricular Dorsal
0,10
0,35
0,60
0,85
1,10
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
a
a
ab
b
Razão Camada do Manto/Ventricular Lateral
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
Razão Camada do Manto/Ventricular Lateral
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
ventricular também nesta região do telencéfalo – 53,04µm
(± 8,43)
(p < 0,0005).
A
média desta medida no Grupo Ácido Fólico (G5) – 62,44µm
(± 6,52)
–, embora
inferior a do grupo GC1, também foi significativamente superior em relação à
média do Grupo Homocisteína (G3) (p < 0,05) (figura 15).
Com relação ao valor médio da espessura da camada do manto na região
dorsal do telencéfalo, o Grupo Controle Fechado (GC1) obteve também maior
média em comparação aos demais grupos – 24,06µm
(± 3,50)
– seguido dos
grupos Controle Salina (GC2), Homocisteína e Ácido Fólico (G4) e Ácido Fólico
(G5), respectivamente. O Grupo Homocisteína (G3) novamente apresentou o
menor valor médio – 16,01µm
(± 1,57)
, sendo significativa a diferença entre este
último e o GC1 (p < 0,005).
Já para a mesma camada, porém agora mensurada na região lateral do
telencéfalo, o Grupo Controle Salina (GC2) apresentou média significativamente
maior aos demais grupos – 56,64µm
(± 9,01)
(p < 0,0005) – seguido dos grupos
Controle Fechado (GC1), Ácido Fólico (G5), Homocisteína (G3) e Homocisteína e
Ácido Fólico (G4), respectivamente (figura 15).
Camada Ventricular Dorsal
Figura 16:
Medida da
espessura da camada
ventricular da região dorsal do
telencéfalo. Os dois primeiros
grupos (1 e 2) correspondem
aos grupos GC1 GC2; e os
grupos 3, 4 e 5,
correspondem
aos grupos G3, G4 e G5,
respectivamente.
Quanto aos valores das razões camada do manto/camada ventricular nas
duas regiões telencefálicas – dorsal e lateral – os grupos exibiram um perfil
diferente. A maior razão média da região dorsal do telencéfalo, calculada a partir
das medidas de espessura das camadas celulares aí localizadas, foi obtida pelo
Grupo Homocisteína (G3) – 0,69
(± 0,11)
– sendo a diferença significativa entre
este grupo e os grupos Controle Fechado (GC1), Controle Salina (GC2) e Ácido
Fólico (G5) (p < 0,05). Para esta razão, o menor valor médio foi apresentado pelo
grupo GC1 – 0,43
(±0,07)
. Já para os valores médios das razões calculadas a partir
das morfometria realizada na região lateral do telencéfalo, o Grupo Controle Salina
(GC2) obteve média significativamente superior aos demais grupos – 0,99
(± 0,16)
(p < 0,0005) – que apresentaram valores médios lineares para estas razões,
embora a menor média, para esta razão, tenha sido obtida pelo Grupo
Homocisteína e Ácido Fólico (G4) 0,42
(± 0,09)
(figura 15).
4.2.2 Imuno-localização da Vimentina e GFAP
A partir da análise imuno-histoquímica do telencéfalo, foi possível observar,
em todos os grupos experimentais, ausência de marcação para vimentina, tanto
nas regiões das camadas ventricular e do manto, quanto no mesoderma adjacente
à vesícula encefálica (figura 17 e tabela 3).
Figura 17: Cortes frontais do
telencéfalo (8µm) de embriões
de diferentes grupos
experimentais submetidos à
técnica de imuno-histoquímica
para vimentina. (A) Região
lateral do telencéfalo de
embrião do Grupo Controle
Fechado (GC1) (200X). (B)
Região dorsal do telencéfalo
de embrião do Grupo
Homocisteína (G3) (200X).
(C) Região dorso-lateral do
telencéfalo de embrião do
Grupo Ácido Fólico (G5)
(200X). (VL)
ventrículo lateral;
(CV)
camada ventricular;
(CM)
camada do manto;
(TD)
telencéfalo dorsal;
(TL)
telencéfalo lateral
.
A
VL
CV
CM
74 µm
_____
B
VL
56 µm
_____
C
VL
TD
TL
70 µm
_____
A
VL
CV
CM
74 µm
_____
A
VL
CV
CM
74 µm
_____
A
VL
CV
CM
74 µm
_____
B
VL
56 µm
_____
B
VL
56 µm
_____
C
VL
TD
TL
70 µm
_____
C
VL
TD
TL
70 µm
_____
Em contrapartida, os cortes submetidos à técnica de imuno-histoquímica
para GFAP revelaram marcação positiva nas regiões das camadas ventricular
e/ou do manto, e também no mesoderma adjacente ao telencéfalo, embora
houvesse diferenças na localização das marcações entre os grupos (figura 18 e
tabela 3). O Grupo Controle Salina (GC2) revelou forte marcação positiva para
GFAP nas regiões das camadas ventricular e do manto e também no mesoderma
adjacente à camada ventricular em todo o telencéfalo. O Grupo Controle Fechado
(GC1) também revelou marcação positiva para a região da camada ventricular no
telencéfalo dorsal e lateral. O Grupo Homocisteína (G3) revelou marcação
negativa para GFAP em todo o telencéfalo, com exceção apenas de algumas
células isoladas localizadas na camada ventricular da região dorsal do telencéfalo.
Também o Grupo Homocisteína e Ácido Fólico (G4) revelou marcação negativa
para GFAP em todas as regiões do telencéfalo. O Grupo Ácido Fólico (G5) revelou
marcação positiva na camada ventricular nas regiões dorsal e lateral do
telencéfalo (figura 18 e tabela 3).
Tabela 3: Quantificação da marcação imuno-histoquímica para GFAP no telencéfalo dos embriões dos diferentes grupos
experimentais. (TD)
telencéfalo dorsal
; (TL)
telencéfalo lateral
; (-)
ausência de marcação;
(+)
marcação leve;
(++)
marcação
moderada;
(+++)
marcação intensa.
GC1
GC2
G3
G4
G5
Telencéfalo
TD TL TD TL TD TL TD TL TD TL
Camada do Manto
- - +++ +++ - - - - - -
Camada Ventricular
++ ++ +++ +++ + - - - ++ ++
Mesoderma Adjacente
+ + +++ +++ - - - - - -
4.3 Estudo da Medula Espinhal, Notocorda e Mesoderma Adjacente
4.3.1 Microscopia, Morfometria e Quantificação Celular
Através da observação das lâminas histológicas da região truncal dos
embriões, verificou-se a existência de diferenças na organização celular das
camadas da medula espinhal e do mesoderma apical adjacente à medula espinhal
nos diferentes grupos experimentais (figura 19). O Grupo Controle Fechado (GC1)
e o Grupo Controle Salina (GC2) exibiram padrão adequado de fechamento do
tubo neural (TN) e mesoderma apical na maioria dos cortes. Já o Grupo
Homocisteína (G3) exibiu, em todos os cortes, falha na fusão do TN e também do
mesoderma adjacente ao ápice da medula espinhal.
A partir da análise dos cortes do Grupo Homocisteína e Ácido Fólico (G4),
foi possível observar também a existência de falha no fechamento do TN na região
apical da medula espinhal, mas não do mesoderma adjacente, onde identificamos
apenas a existência de uma densidade celular menor em comparação com os
Grupos Controle (GC1 e GC2) (figura 22). Já o Grupo Ácido Fólico (G5) exibiu
organização tecidual semelhante aos grupos controle, embora em alguns cortes
não houvesse fusão total do mesoderma apical. Nos cortes histológicos de todos
os grupos, fez-se facilmente a distinção entre as zonas ventricular e do manto na
medula espinhal, e em alguns cortes dos grupos controle, foi possível observar
também o início da formação da camada marginal (figura 19).
Figura 18: Cortes frontais do telencéfalo (8µm) de embriões de diferentes grupos experimentais submetidos à técnica de
imuno-histoquímica com GFAP. (A) Vista da região dorsal do telencéfalo de embrião do Grupo Controle Fechado (GC1)
(200X). (B) Detalhe da região lateral do telencéfalo de embrião do GC1 (400X). (C) Detalhe da região do telencéfalo lateral
de embrião do Grupo Controle Salina (GC2) (400X). (D) Vista da região dorsal do telencéfalo de embrião do Grupo
Homocisteína e Ácido Fólico (G4) (400X). (E) Vista da região dorsal do telencéfalo de embrião do Grupo Homocisteína (G3)
(400X). (F) Vista da região dorsal do telencéfalo de embrião do Grupo Ácido Fólico(G5) (400X). (VL)
ventrículo lateral;
(CV)
camada ventricular;
(CM)
camada do manto
.
A
VL
Mes
_____
101
µ
m
B
VL
CV
28
µ
m
_____
C
Mes
CV
CM
_____
48
µ
m
D
VL
38
µ
m
_____
_____
E
VL
CV
39
µ
m
_____
F
VL
CV
28
µ
m
A
VL
Mes
_____
101
µ
m
A
VL
Mes
_____
101
µ
m
B
VL
CV
28
µ
m
_____
B
VL
CV
28
µ
m
_____
C
Mes
CV
CM
_____
48
µ
m
C
Mes
CV
CM
C
Mes
CV
CM
_____
48
µ
m
D
VL
38
µ
m
_____
D
VL
D
VL
38
µ
m
_____
_____
E
VL
CV
39
µ
m
_____
E
VL
CV
E
VL
CV
39
µ
m
_____
F
VL
CV
28
µ
m
_____
F
VL
CV
F
VL
CV
28
µ
m
Figura 19:
Cortes transversais da região truncal (8µm) dos embriões dos diferentes grupos experimentais corados com
Hematoxilina-eosina (HE).
(A)
Vista geral da medula espinhal de embrião do Grupo Controle Fechado (GC1) (100X).
(B)
Vista geral da medula espinhal de embrião do Grupo Homocisteína (G3) (100X).
(C)
Detalhe da medula espinhal de
embrião do Grupo Ácido Fólico (G5) (200X).
(D)
Detalhe da região basal da medula espinhal de embrião do GC1 (400X).
(E)
Detalhe da mesma região da medula espinhal em embrião do Grupo Controle Salina (GC2) (1000X).
(F)
Detalhe da
medula espinhal de embrião do Grupo Homocisteína e Ácido Fólico (G4) (200X)
. (G)
Detalhe de F (400X).
(CV)
camada
ventricular
;
(CM)
camada do manto
;
(CMa)
camada marginal
.
As diferenças observadas na organização celular das camadas medulares
foram confirmadas através da mensuração destas, realizada na região basal da
medula espinhal. Com relação à espessura da camada ventricular, o Grupo
Controle Fechado (GC1) apresentou os maiores valores médios – 32,95µm
(± 3,79)
– essa diferença foi significativa em relação aos grupos G3 e G4 (p < 0,05), e o
menor valor médio para esta camada celular foi apresentado pelo Grupo
A
B
C
F
G
D
CV
CM
CMa
E
CM
CMa
______
129 µm
______
134 µm
______
41 µm
46 µm
______
27 µm
______
82 µm
______
______
41 µm
A
B
C
F
G
D
CV
CM
CMa
E
CM
CMa
______
129 µm
______
134 µm
______
41 µm
46 µm
______
27 µm
______
82 µm
______
______
41 µm
Homocisteína (G3) – 28,13µm
(± 4,27)
(figura 20 e 21). A média de espessura da
camada do manto na medula espinhal, também foi significativamente superior no
Grupo Controle Fechado (GC1) – 83,03µm
(± 4,32)
(p < 0,0005) – e o menor valor,
de 45,21µm
(± 3,77)
, foi exibido desta vez pelo Grupo Homocisteína e Ácido Fólico
(G4). Os grupos Controle Salina (GC2) e Ácido Fólico (G5) também obtiveram
médias significativamente superiores ao grupo G4 (p < 0,0005 e p < 0,005,
respectivamente) (figura 20).
Figura 20
: Média (
x
) e desvio padrão (
sd
) das medidas da espessura das camadas ventricular e do manto e da razão
camada do manto/camada ventricular da região basal da medula espinhal dos cortes histológicos dos embriões dos
diferentes grupos experimentais (n═12 para todas as mensurações).
Quanto aos valores das razões camada do manto/camada ventricular, a
maior média, calculada a partir dos valores das camadas celulares mensuradas na
região basal da medula espinhal, foi obtida novamente pelo Grupo Controle
Fechado (GC1) – 2,55
(± 0,32)
– sendo a diferença significativa entre este grupo e
os grupos GC2 (p < 0,05), G4 (p < 0,0001) e G5 (p < 0,005), mas não em
comparação ao grupo Homocisteína (G3), que obteve, para esta razão, a segunda
maior média – 2,44
(± 0,64)
–, seguido do Grupo Controle Salina (GC2), cuja média
foi também significativamente superior a do Grupo Homocisteína e Ácido Fólico
(G4) – 2,07
(± 0,48)
(p < 0,05) (figura 20).
Camada Ventricular
20
25
30
35
40
micrometros
GC1 GC2 G3 G4 G5
b
b
Camada do Manto
30
40
50
60
70
80
90
micrometros
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
bc
c
d
b
Razão Camada do Manto / Ventricular
1
1,5
2
2,5
3
3,5
micrometros
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
b
a
bd
cd
Camada Ventricular
20
25
30
35
40
micrometros
GC1 GC2 G3 G4 G5
b
b
Camada Ventricular
20
25
30
35
40
micrometros
GC1 GC2 G3 G4 G5
b
b
Camada do Manto
30
40
50
60
70
80
90
micrometros
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
bc
c
d
b
Camada do Manto
30
40
50
60
70
80
90
micrometros
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
bc
c
d
b
Razão Camada do Manto / Ventricular
1
1,5
2
2,5
3
3,5
micrometros
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
b
a
bd
cd
Razão Camada do Manto / Ventricular
1
1,5
2
2,5
3
3,5
micrometros
GC1 GC2 G3 G4 G5
a
b
a
bd
cd
Camada Ventricular
Analisando a notocorda dos embriões, por meio da contagem direta das
células localizadas no interior desta estrutura, pode-se constatar que não houve
diferenças significativas no número absoluto de células entre os grupos. Embora
os Grupos Controle Fechado (GC1), Homocisteína (G3) e Ácido Fólico (G5)
tenham apresentado os maiores valores médios, enquanto os Grupos Controle
Salina (GC2) e o Grupo Homocisteína e Ácido Fólico (G4) obtiveram as menores
médias para esta variável (figura 22).
Analisando o mesoderma apical à medula espinhal, verificou-se, após
realização de contagem direta das células, a existência de diferenças significativas
no número absoluto destas células entre os grupos. A média de células do
mesoderma presentes nesta região foi significativamente superior nos grupos
Controle Fechado (GC1) e Controle Salina (GC2) – 175,67
(±14,98)
e 166,83
(±25,04)
, respectivamente (p < 0,05). O menor valor médio foi exibido pelo Grupo
Homocisteína (G3) – 115,17
(± 20,23)
(p < 0,005) (figura 22).
Figura 21:
Medida da
espessura da camada
ventricular da região basal da
medula espinhal. Os dois
primeiros grupos (1 e 2)
correspondem aos grupos
GC1 GC2; e os grupos 3, 4 e
5, correspondem aos grup
os
G3, G4 e G5, respectivamente.
Figura 22:
(A) Média (
x
) e desvio padrão (
sd
) do número absoluto de células presentes no interior da notocorda dos
embriões dos diferentes grupos experimentais.
(B) Média (
x
) e desvio padrão (
sd
) do número absoluto de células
presentes na região do mesoderma apical da medula espinhal dos embriões dos diferentes grupos experimentais.
4.3.2 Imuno-localização da Vimentina e GFAP
A análise dos cortes submetidos á técnica de imuno-histoquímica para
vimentina revelou marcação positiva, em regiões bem definidas, somente no
Grupo Controle Fechado (GC1). Este mostrou marcação positiva em algumas
células das camadas ventricular e do manto da medula espinhal e em células
localizadas no interior da notocorda. Nos demais grupos experimentais não houve
marcação imuno-histoquímica para vimentina (figura 23 e tabela 4).
Figura 23:
Cortes transversais da região truncal
(8µm) de embriões de diferentes grupos
experimentais submetidos à técnica de imuno-
histoquímica para vimentina.
(A) Detalhe da
medula espinhal de embrião do Grupo Controle
Fechado (GC1) (400X). A seta vermeha indica
marcação positiva na região apical da camada do
manto e a seta azul indica a marcação positiva na
região de transição entre as camadas ventricular e
do manto.
(B) Detalhe da notocorda de embrião
do GC1 (400X).
(C) Vista geral da medula
espinhal de embrião do Grupo Homocisteína (G3)
(100X).
(D) Vista geral da medula espinhal de
embrião do Grupo Ácido Fólico (G5) (100X).
(CC)
canal central
; (CV)
camada ventricular
; (CM)
camada do manto;
(n)
notocorda.
Já os cortes submetidos à técnica de imuno-histoquímica para GFAP,
revelaram extensa marcação positiva em todos os grupos experimentais, em
diferentes regiões, com exceção do Grupo Homocisteína (G3), em que a
marcação foi positiva somente na região do mesoderma apical e ectoderma
A
CC
CV
CM
37 µm
_____
B
33 µm
_____
C
118 µm
_____
D
108 µm
_____
A
CC
CV
CM
37 µm
_____
A
CC
CV
CM
37 µm
_____
B
33 µm
_____
B
33 µm
_____
C
118 µm
_____
C
118 µm
_____
D
108 µm
_____
D
108 µm
_____
Células da Notocorda
5
30
55
80
105
130
155
GC1 GC2 G3 G4 G5
A
Células Mesenquimais
55
80
105
130
155
180
205
GC1 GC2 G3 G4 G5
a a
b
b
b
B
Células da Notocorda
5
30
55
80
105
130
155
GC1 GC2 G3 G4 G5
A
Células da Notocorda
5
30
55
80
105
130
155
GC1 GC2 G3 G4 G5
A
Células Mesenquimais
55
80
105
130
155
180
205
GC1 GC2 G3 G4 G5
a a
b
b
b
B
Células Mesenquimais
55
80
105
130
155
180
205
GC1 GC2 G3 G4 G5
a a
b
b
b
Células Mesenquimais
55
80
105
130
155
180
205
GC1 GC2 G3 G4 G5
a a
b
b
b
B
superficial (epiderme). No Grupo Controle Fechado (GC1) observou-se marcação
positiva na região do mesoderma apical, gânglios espinhais e no mesoderma
ventral adjacente à notocorda. O Grupo Homocisteína e Ácido Fólico (G4) foi
reativo ao GFAP em algumas células das camadas ventricular e do manto da
medula espinhal. O Grupo Ácido Fólico (G5) revelou marcação positiva em
algumas células da camada ventricular da medula espinhal e no mesoderma
adjacente à notocorda (figura 24 e tabela 4).
Figura 24: Cortes transversais
da região truncal (8µm) de
embriões de diferentes grupos
experimentais submetidos à
técnica de imuno-histoquímica
para GFAP.
(A) Vista geral da
medula espinhal de embrião do
Grupo Controle Fechado (GC1)
(100X).
(B) Vista geral da
medula espinhal de embrião do
Grupo Homocisteína (G3)
(100X), a seta indica a marcação
positiva na epiderme.
(C)
Detalhe da medula espinhal de
embrião do Grupo Homocisteína
e Ácido Fólico (G4) (200X).
(D)
Mesma imagem de C, as setas
indicam marcação positiva em
células da medula espinhal.
(E)
Detalhe da região basal da
medula espinhal de embrião do
Grupo Ácido Fólico (G4) (400X),
as setas indicam marcação
positiva na região da camada
ventricular da medula espinhal.
(F) Mesma imagem de E (200X),
mostrando o mesoderma ventral
em torno da notocorda
(me)
medula espinhal
; (n)
notocorda
;
(ge)
gânglio espinhal
.
4.4 Detecção de Apoptose no Telencéfalo, Medula Espinhal e Mesoderma
Através da observação dos cortes da região cefálica dos embriões, que
foram submetidos à técnica de Hoescht 33258, foi possível observar que no Grupo
Controle Salina, tanto na camada do manto, quanto na região do mesoderma
adjacente à região dorsal do telencéfalo, não foi evidenciada a presença de
células apoptóticas. O contrário foi observado no Grupo Homocisteína e Ácido
Fólico (G4), onde tanto na região do mesoderma, quanto na camada do manto, foi
possível identificar a presença de células apoptóticas em estágio de condensação
da cromatina. Em contrapartida, neste mesmo grupo, foi possível observar
A
n
ge
me
166 µm
_____
C
92 µm
_____
E
37 µm
_____
B
134 µm
_____
D
74 µm
_____
F
67 µm
_____
A
n
ge
me
166 µm
_____
A
n
ge
me
166 µm
_____
C
92 µm
_____
C
92 µm
_____
E
37 µm
_____
E
37 µm
_____
B
134 µm
_____
B
134 µm
_____
D
74 µm
_____
D
74 µm
_____
F
67 µm
_____
F
67 µm
_____
também intensa atividade proliferativa
na região ventricular do telencéfalo dorsal
(figura 25).
Tabela 4:
Quantificação da marcação imuno-histoquímica para vimentina e GFAP na medula espinhal e estruturas
próximas dos embriões dos diferentes grupos experimentais.
(-)
ausência de marcação;
(+)
marcação leve;
(++)
marcação
moderada;
(+++)
marcação intensa.
Medula Espinhal e
Adjacências
Imuno-
marcação
GC1
GC2
G3
G4
G5
Camada do Manto
+ - - - -
Camada Ventricular
+ - - - -
Ectoderma Superficial
- - - - -
Gânglio Espinhal
- - - - -
Mesoderma Apical
- - - - -
Mesoderma Ventral
- - - - -
Notocorda
Vimentina
++ - - - -
Camada do Manto
- + - + -
Camada Ventricular
- + - + +
Ectoderma Superficial
+ + + + -
Gânglio Espinhal
++ + - ++ -
Mesoderma Apical
+++ ++ + +++ -
Mesoderma Ventral
+++ - - ++ ++
Notocorda
GFAP
- - - - -
Figura 25:
Cortes frontais do telencéfalo (8µm) dos embriões de diferentes grupos experimentais submetidos à técnica de
Hoescht 33258.
(A) Vista geral do telencéfalo de embrião do Grupo Controle Salina (GC2) (100X). (B) Detalhe da camada
do manto do telencéfalo dorsal (seta vermelha), de algumas células do mesoderma adjacente (seta azul) e do limite entre a
camada do manto e o mesoderma (seta amarela) de embrião do Grupo Controle Fechado (GC1) (1000X).
(C) Detalhe do
limite entre a região do mesoderma adjacente à camada do manto do telencéfalo dorsal de embrião do Grupo Homocisteína
e Ácido Fólico (G4) (1000X), as setas indicam células apoptóticas em estágio de cromatina condensada na camada do
manto (setas cor-de-rosa) e de degradação da cromatina (seta amarela)
. (D) Detalhe das camadas ventricular (seta laranja)
e migratória (seta vermelha) do telencéfalo dorsal de embrião do mesmo Grupo G4 (1000X), a seta azul indica células em
divisão celular.
A
B
C
D
228µm
______
23µm
______
11
µm
______
11µm
______
Através da observação dos cortes histológicos da região truncal dos
embriões, que foram submetidos à técnica de Hoescht 33258, não foi possível
observar a presença de células apoptóticas no Grupo Controle Fechado (GC1),
tanto na região da das camadas ventricular e do manto, quanto no mesoderma
adjacente ao ápice da medula espinhal. Em contrapartida, no Grupo Homocisteína
e Ácido Fólico (G4), na região da camada do manto, foi possível evidenciar a
presença de células apoptóticas em diferentes estágios: degradação da cromatina
e corpos apoptóticos. No Grupo Controle Salina (GC2) foram encontradas células
apoptóticas na região do mesoderma apical da medula espinhal (figura 26).
Figura 26:
Cortes transversais da medula espinhal (8µm) dos embriões de diferentes grupos experimentais submetidos à
técnica de Hoescht 33258.
(A) Vista geral da medula espinhal de embrião do Grupo Controle Fechado (GC1) (100X), a seta
vermelha indica o correto fechamento do TN e do mesoderma apical adjacente.
(B) Detalhe da região do mesoderma apical
da medula espinhal de embrião do Grupo Controle Salina (GC2) (1000X), a seta cor-de-rosa indica célula apoptótica em
estágio de cromatina condensada.
(C) Detalhe da medula espinhal de embrião do Grupo Homocisteína e Ácido Fólico (G4)
(200X), a seta vermelha indica o não fechamento do TN.
(D) Detalhe da região basal da medula espinhal do corte anterior
(1000X), as setas indicam células em diferentes estágios de apoptose na camada do manto, corpos apoptóticos (setas cor-
de-rosa) e degradação da cromatina (seta amarela).
A
B
C
D
145
µm
______
11
µm
______
74
µm
______
15
µm
______
5 DISCUSSÃO
Nosso objetivo com este trabalho foi avaliar a interferência da homocisteína
e do ácido fólico, isoladamente e em conjunto, no processo de desenvolvimento
embrionário inicial, com ênfase na neurulação,
no padrão morfológico externo e na
estrutura organizacional do telencéfalo e medula espinhal; para tanto, utilizamos
como modelo animal embriões de Gallus domesticus. Estes são utilizados há mais
de 100 anos por embriologistas e constituem um excelente modelo para o estudo
de desenvolvimento, tanto descritivo quanto experimental, de vertebrados
superiores – aves e mamíferos –, animais cujo desenvolvimento apresenta graus
de complexidade crescentes que levam a um aumento de volume exponencial
(Schoenwolf, 1999).
Ao analisar nossos resultados, encontramos, nos embriões submetidos aos
tratamentos com homocisteína e/ou ácido fólico, tanto alterações do padrão
morfológico externo, como modificações nas flexuras corporais e hipoplasia
mesencefálica, quanto alterações nos processos de proliferação, migração e
diferenciação celulares, verificadas através da análise morfométrica e imuno-
histoquímica do telencéfalo e medula espinhal. Observamos diferenças
significativas na espessura média das camadas ventricular e do manto destas
estruturas do SNC, e também modificações na localização de elementos do
citoesqueleto – filamentos intermediários vimentina e GFAP –, demonstrando que
os agentes utilizados interferiram no desenvolvimento do SNC – telencéfalo e
medula espinhal embrionária – e também em estruturas adjacentes, como o
mesoderma apical e cranial e notocorda.
Com relação ao padrão morfológico externo, foi possível constatar que o
tratamento com homocisteína e/ou ácido fólico, interferiu no processo de
morfogênese inicial dos embriões de Gallus domesticus (96 horas), por ser capaz
de modificar, de diferentes maneiras e proporções, as características externas dos
embriões. Inclusive, algumas das alterações encontradas estão relacionadas à
ocorrência de defeitos do tubo neural (DTNs), como por exemplo, as modificações
no padrão das flexuras do eixo corporal, exibidas por alguns embriões.
Jacobson e Tam (1982) apud Brook et al. (1991) demonstraram, que em
embriões de camundongo, há uma considerável redução da flexura cefálica no
momento do fechamento do TN na região do mesencéfalo, devido à existência de
uma pausa temporária no dobramento axial, que é responsável pela formação
desta flexura. Straaten et al. (1993) observaram também uma relação direta entre
a falha no fechamento do neuróporo posterior e o ângulo de curvatura presente na
região caudal de embriões de galinha analisados em culturas, sugerindo que a
curvatura do eixo corporal pode ser um mecanismo que regula a neurulação
nestes animais.
Partindo do princípio que a neurulação envolve tanto forças intrínsecas –
geradas por comportamentos celulares como mudanças na forma, posição e
número de células, controle da formação da placa neural e das pregas neurais –
quanto extrínsecas ao neuroepitélio – geradas pela ectoderme superficial,
mesoderme e endoderme e sua associação com a matriz extracelular (Schoenwolf
e Smith, 1990; Lawson et al., 2001), um possível mecanismo, que pode ser
considerado durante a regulação deste processo, é o papel da curvatura do eixo
corporal (Straaten, et al., 1993).
Uma das hipóteses
levantadas para acentuar a curvatura do eixo corporal
e, assim, impedir o fechamento do neuróporo posterior, seria a aplicação de um
estresse mecânico sobre o neuroepitélio, ou seja, o dobramento na direção ventral
faria oposição à elevação e conseqüente fusão das pregas neurais (Brook et al.,
1991). Essa relação causa-efeito pôde ser observada em nosso estudo, tendo em
vista que a modificação no padrão da flexura dorsal dos embriões apresentou-se
com freqüência expressiva (50%), tanto nos embriões do Grupo Homocisteína
(G3), quanto nos embriões do Grupo Homocisteína e Ácido Fólico (G4). E após
análise histológica da medula espinhal, estes embriões exibiram, em 100% dos
cortes, abertura da medula espinhal na região apical – Grupo G4 – acompanhada
de falha na fusão do mesoderma adjacente – Grupo G3 – revelando que houve
erro no processo de neurulação na região da medula espinhal. Desta forma, se o
desenvolvimento não tivesse sido interrompido após 96 horas de incubação (23-25
HH), mas prosseguisse até a eclosão (21 dias), os pintos provavelmente
apresentariam DTNs ao nascimento.
Estudos realizados por Epeldegui et al. (2002), encontraram, em 46% dos
embriões tratados com uma dose de 20µmol de L-homocisteína, a ocorrência de
DTNs. Rosenquist et al. (1996) observaram também, após tratamento com
homocisteína, em doses de 10 e 15µmol (100 de L-homcisteína e 200mM de D,L-
homocisteína), em embriões de galinha doméstica com até 48 horas de
desenvolvimento, a taxa de ocorrência de DTN de 27%. Neste estudo, os autores
observaram, que
na maioria dos casos em que havia fechamento anormal do TN,
a medula espinhal e o encéfalo apresentavam maior número de células, porém,
estas se organizam de maneira irregular. Além desses defeitos, a duplicação da
notocorda também era comum nos embriões tratados com homocisteína.
O Grupo Homocisteína (G3) apresentou, em 20% dos embriões, a
modificação no padrão de curvatura do eixo corporal denominada de torção
tóraco-lombar. Esta alteração foi relatada também por Rosenquist et al. (1999).
Neste estudo, 6,4% dos embriões tratados com L-homocisteína (5µmol ou
100mM) exibiram torção corporal severa nesta região, acompanhada ou não de
DTN. No Grupo Homocisteína e Ácido Fólico (G4), 10% dos embriões
apresentaram assimetria de vesículas ópticas, modificação do padrão morfológico
registrada também por Maestro de las Casas et al. (2003), em que a dose de
20µmol de L-homocisteína demonstrou ser teratogênica ao desenvolvimento das
estruturas ópticas, levando ao surgimento de malformações como microftalmia e
defeitos na formação do cristalino. Rosenquist et al. (1999) também encontraram,
em embriões tratados com homocisteína, alterações denominadas em seus
resultados de defeitos orofaciais, entre estas, encontrava-se desde a ausência até
hipoplasia de vesícula óptica.
Embriões do Grupo G4 (10%) e G5 (10%) apresentaram hipoplasia do
mesencéfalo, que pode ter como causa diferenças regionais na atividade
proliferativa do tubo neural, notocorda, mesoderme e endoderme, tendo em vista
que estas podem gerar mudanças no padrão externo do embrião, bem como na
morfologia do encéfalo (Takamatsu e Fujita, 1987). Miller et al. (2003) também
encontraram, em seus embriões de Gallus gallus tratados com D,L-homocisteína
(0,5 a
20µmol ou 500 a 750mM), uma redução da massa encefálica.
Embora os embriões tratados com ácido fólico tenham apresentado
algumas alterações no padrão morfológico, o que não era esperado, já que
extensa literatura relata seus efeitos benéficos no processo de desenvolvimento, a
freqüência dessas alterações foi menor, se comparada aos grupos Homocisteína
(G3) e Homocisteína e Ácido Fólico (G4). Tanto que, a porcentagem de embriões
que exibiram padrão morfológico normal no Grupo Ácido Fólico (G5) foi bastante
similar a dos grupos Controle – 70% – enquanto nos grupos G3 e G4 foi
significativamente inferior – 20 e 30%, respectivamente. Há de se considerar, em
modelos de desenvolvimento, que embriões são organismos extremamente
delicados e complexos, e podem, portanto, ser perturbados durante o curso do
desenvolvimento de maneiras inespecíficas, o que por vezes pode comprometer e
dificultar a interpretação dos resultados experimentais (Schoenwolf, 2001). Desta
forma, apenas a manipulação e injeção de uma substância, embora se espere que
esta seja benéfica aos embriões, pode interferir no seu desenvolvimento. O
mesmo se aplica para justificar a diferença não significativa das médias de massa
corporal entre os grupos, e a diferença significativa, com relação ao estágio de
desenvolvimento (HH), somente do Grupo Controle Fechado (GC1) em relação
aos demais grupos, tendo em vista que o GC1 não sofreu interferência no seu
processo de desenvolvimento até a análise de sua morfologia após 96 horas de
incubação.
Entretanto, após análise mais detalhada dos embriões, através da
morfometria das regiões cefálica e corporal como um todo, foi possível verificar
diferenças no padrão de crescimento das estruturas embrionárias entre os grupos,
embora nem sempre estas fossem significativas. Quanto às medidas da região
cefálica, por exemplo, os grupos Controle Fechado (GC1) e Controle Salina (GC2)
sempre exibiram, com exceção da medida da altura do mesencéfalo, valores
médios superiores em relação aos demais grupos que receberam tratamento, com
exceção do Grupo Ácido Fólico (G5), que na maioria dos casos exibiu média
bastante similar a dos grupos Controle (GC1 e GC2). Este resultado era esperado,
tendo em vista que não localizamos na literatura estudos relatando os efeitos
nocivos desta substância ao padrão de crescimento e desenvolvimento de
estruturas embrionárias. Pelo contrário, existem estudos epidemiológicos (Daly et
al., 1997; Bruin et al., 2003) e experimentais (Rosenquist et al., 1996; Rosenquist
et al., 1999;
Hansen et al., 2001) que embora recentes, demonstram que o ácido
fólico é indispensável ao desenvolvimento embrionário normal, principalmente em
estágios iniciais, tendo em vista sua interferência no processo de neurulação
(Rosenquist e Finnel, 2001; Calle et al., 2003; Finnel et al., 2004; Molloy, 2005;
Björklund e Gordon, 2006).
Em contrapartida, o Grupo Homocisteína (G3) exibiu os menores valores
médios em quase todas as medidas cefálicas, sendo a diferença significativa,
entre este e o grupo GC1, para a medida da distância cefálica ântero-posterior. O
que concorda com os resultados de Greene et al. (2003), que demonstraram, que
nas doses de 0,5mM ou acima, a exposição de embriões de camundongo em
cultura à homocisteína, causa um aumento, dose-dependente, no retardo do
crescimento e na letalidade, além de causar anormalidades nos embriões.
Analisando os valores médios apresentados acerca das medidas corporais,
foi possível constatar também que a homocisteína foi a substância testada que
mais interferiu no padrão de crescimento dos embriões, tendo em vista que os
valores médios das medidas de comprimento do vértice à cauda e comprimento
total se apresentaram inferiores neste grupo em relação aos demais, embora a
diferença não tenha sido significativa.
A análise morfométrica do telencéfalo dos embriões possibilitou identificar a
existência de diferenças significativas entre os grupos com relação à organização
das camadas celulares desta vesícula encefálica. Os grupos tratados com
Homocisteína (G3) e com Homocisteína e Ácido Fólico (G4) exibiram quase
sempre os menores valores médios de espessura de ambas as camadas celulares
– ventricular e do manto –, tanto na região dorsal quanto lateral do telencéfalo. E
após comparar os valores médios do Grupo Homocisteína (G3) com os valores
médios dos grupos Controle (GC1 e GC2) e também do Grupo Ácido Fólico (G5),
essa diferenças foram, de maneira geral, significativas. Isto demonstra, que a
maior interferência nos processos tanto de proliferação – camada ventricular –
quanto de migração e diferenciação celulares – camada do manto – foram
provocadas pela homocisteína (Grupo G3). O que era esperado, tendo em vista o
fato de que estudos já demonstraram que o efeito da homocisteína sobre a
proliferação celular implica que ela exibe características freqüentemente
associadas com fatores de crescimento e citocinas. Além disso, sabe-se que a
homocisteína funciona como inibidor do
receptor NMDA (Rosenquist et al., 1999;
Rosenquist e Finnell, 2001), que é o principal regulador da migração neuronal,
adesão celular, influxo de Ca
++
na célula e apoptose; além de atuar como fator de
crescimento durante o desenvolvimento neuronal (Medina et al., 2001). Desta
forma, níveis elevados de homocisteína tem potencial para alterar os padrões
normais de diferenciação e proliferação celulares durante o desenvolvimento
(Brauer e Tierney, 2004).
Pelos dados apresentados, percebe-se que a homocisteína alterou de
forma significativa dois passos essenciais ao desenvolvimento do telencéfalo, que
são a geração e diferenciação das células neurais, que tem início com o
surgimento dos neuroblastos e glioblastos em zonas proliferativas adjacentes aos
ventrículos, e depois prossegue com a migração dessas células para uma
localização mais superficial, quando aí originam as células pós-mitóticas e após
diferenciam-se em neurônios ou células gliais (Blaschke et al., 1996).
Este fato pôde ser observado também através da análise das médias das
razões camada do manto/ventricular na região dorsal do telencéfalo, visto que a
diferença entre o Grupo Homocisteína (G3) e os Grupos Controle (GC1 e GC2) e
Ácido Fólico (G5) foi significativa. O Grupo Homocisteína (G3) obteve a razão
média mais próxima de um (0,69), isso mostra que a espessura média da camada
ventricular era bastante próxima à espessura média da camada do manto.
Somando-se ao fato da espessura média da camada do manto também ter sido
significativamente inferior neste grupo, conclui-se que houve, especificamente
nesta região, menor diferenciação dos neuroblastos no telencéfalo dos embriões
tratados com homocisteína, tendo em vista que, com o curso do desenvolvimento,
a fração das células que migram a partir da camada ventricular para se diferenciar
aumenta, levando à conseqüente diminuição da população de células progenitoras
seguida da cessação da neurogênese (Hanashima et al., 2002).
Observando os mesmos padrões morfométricos, porém analisados na
medula espinhal dos embriões, as médias de espessura da camada ventricular
foram significativamente superiores no Grupo Controle Fechado (GC1) em
comparação com os grupos Homocisteína (G3) e Homocisteína e Ácido Fólico
(G4), o que denota novamente a interferência da homocisteína no processo de
proliferação celular também nesta região do SNC em desenvolvimento. Já quanto
aos processos de migração e diferenciação celular, os resultados foram pouco
elucidativos, porque embora a diferença da média de espessura da camada do
manto na ME tenha sido significativa entre o Grupo Controle Fechado (GC1) e o
Grupo Homocisteína (G3), este último apresentou um valor bastante próximo à
média do Grupo Controle Salina (GC2) e superior aos demais, o que interferiu nos
valores das razões, obtendo o Grupo Homocisteína (G3) valor bastante próximo
ao Grupo Controle Fechado (GC1) e superior aos demais grupos.
Através da análise quantitativa dos cortes da medula espinhal, observamos
diferença significativa no número absoluto de células presentes na região do
mesoderma apical dos Grupos Controle (GC1 e GC2) em relação aos demais,
apresentando novamente o Grupo Homocisteína (G3) a menor média entre eles.
Estes dados constituem um resultado bastante interessante, considerando que
todos os cortes do Grupo G3 exibiram DTN, com falha na fusão do tecido neural
(ME) e da região do mesoderma apical, e levando em conta que estudos recentes
demonstraram que a fusão da epiderme e das pregas neurais requer um equilíbrio
entre proliferação, sobrevivência celular e apoptose e que perturbações nesse
sistema podem levar a falhas nesse processo (Brauer e Tierney, 2004).
Há
estudos que relacionam a ocorrência de anencefalia – o mais grave DTN – à
redução na densidade celular na região do mesoderma cranial, demonstrando que
ele potencialmente contribui para o desenvolvimento deste defeito, por ter um
papel importante na facilitação da neurulação, contribuindo para a elevação das
pregas neurais
(Dunlevy et al., 2006; Coop, 2005). Morris e Solursh (1978) apud
Coop (2005) relataram esta influência em embriões de mamíferos, demonstrando
que a elevação das pregas neurais tem uma fase inicial que consiste na
expressiva expansão do mesoderma cranial, com proliferação celular e um
considerável aumento no espaço extracelular.
A análise da notocorda, através da contagem direta das células presentes
no interior desta estrutura, não revelou diferenças significativas, o que nos faz
concluir que as substâncias utilizadas neste trabalho não interferem na formação
e/ou regressão da notocorda, e portanto, provavelmente os DTNs causados pela
homocisteína não interferem na sinalização feita por esta estrutura durante a
neurulação. A notocorda é muito importante durante o processo de
desenvolvimento de embriões de cordados, uma vez que as células que a
compõem têm origem a partir do nó e/ou linha primitiva durante a gastrulação, o
que a torna responsável, em parte, pela padronização do TN e dos somitos
através de duas ações: supressão da atividade de fatores de crescimento
necessários à dorsalização, e secreção de sinais ventralizantes como o sonic
hedgehog (Schoenwolf, 1999).
Por meio da análise imuno-histoquímica do telencéfalo dos embriões, foi
demonstrada marcação negativa para o filamento intermediário vimentina em
todos os grupos experimentais, tanto na região das camadas celulares, quanto no
mesoderma adjacente ao telencéfalo dorsal e lateral. Resultado este que não era
esperado, tendo em vista que a presença de fibras radiais positivas à vimentina no
telencéfalo de embriões de galinha doméstica foi descrita por Striedter e Beydler
(1997) e devido ao fato já estabelecido de que o desenvolvimento do sistema glial
em vertebrados é determinado por dois eventos: a substituição de vimentina por
GFAP, e a transformação da glia radial em astrócitos (Kálman et al., 1998). Sendo
assim, esperava-se que houvesse marcação positiva, para este elemento do
citoesqueleto, ao menos nos grupos controle, neste estágio inicial do
desenvolvimento (23-25HH). Além disso, sabe-se que as células da glia radial,
que orientam a migração dos neuroblastos na camada do manto, expressam
vimentina e GFAP (Oudega & Marani, 1991) e já foram reveladas, através do
método de Golgi, em embriões de galinha, no 4° dia embrionário (estágio 23–
25HH) (Tapscott et al., 1981).
Entretanto, podemos afirmar que este resultado não decorreu de falhas nos
procedimentos imuno-histoquímicos, porque realizamos a técnica utilizando duas
concentrações diferentes dos anticorpos primário e secundário, e adotamos um
controle positivo (cortes de encéfalo de pinto de 7 dias). Neste, houve marcação
positiva para vimentina no cerebelo (foto em anexo), o que era esperado, tendo
em vista que as células da glia de Bergmann coexpressam vimentina e GFAP
(Lazarides, 1982 apud Noack et al., 2003). Todavia, enquanto para mamíferos
(Bentivoglio e Mazzarello, 1999)
está bem documentado que o desaparecimento
da glia radial ocorre concomitantemente ao surgimento de astrócitos reativos à
GFAP, em aves, principalmente em galinha doméstica, já foi demonstrado que
esta interação é menos evidente. A
natureza de algumas fibras positivas à GFAP
e negativas à vimentina sugere que estas representam processos astrocíticos
formados a partir de um mecanismo secundário ao da glia radial
(Kálman et al.,
1998), o que poderia explicar a ausência de marcação positiva à vimentina no
telencéfalo dos embriões em nossos grupos experimentais. Além disso, apesar da
intensa investigação já realizada, as funções da vimentina não foram ainda
claramente definidas; e já se sabe, que a perda desta abundante proteína é
compatível com a vida e não causa alterações evidentes no fenótipo do organismo
– camundongo – nem mesmo em culturas celulares (Eckes et al.,1998).
Ao contrário da técnica de imuno-histoquímica para vimentina, quando
utilizamos, nos cortes do telencéfalo, o anticorpo para o filamento intermediário
GFAP, observamos marcação positiva em diferentes regiões, embora não
estivesse presente no telencéfalo de todos os grupos experimentais. O Grupo
Controle Salina (GC2) foi o que apresentou marcação mais intensa, tanto nas
camadas celulares quanto no mesoderma adjacente à vesícula encefálica. Com
base em nossos resultados, e considerando
a conexão existente entre
citoesqueleto e diferenciação no tecido neural (Björklund e Gordon, 2006) e a
contribuição do GFAP na migração dos neuroblastos, embora de forma limitada e
mais tardia (Oudega e Marani, 1991), pode-se dizer que os grupos Homocisteína
(G3) e Homocisteína e Ácido Fólico (G4) foram os que sofreram maior
interferência no processo de diferenciação e maturação celular no telencéfalo, por
apresentar, respectivamente, leve marcação apenas na região da camada
ventricular do telencéfalo dorsal e marcação negativa em toda a vesícula
encefálica. Por outro lado, o Grupo Ácido Fólico (G5) apresentou marcação
semelhante ao Grupo Controle Fechado (GC1), não revelando GFAP na camada
do manto e mesoderma adjacente à vesícula encefálica. Em primatas, incluindo o
homem, o GFAP foi encontrado, durante o período pré-natal, nas fibras da glia
radial (Kálman e Ajtai, 2001).
Partindo para análise da região da medula espinhal e estruturas adjacentes,
é difícil tirar conclusões sobre a interferência da homocisteína e/ou ácido fólico,
quanto à localização do filamento intermediário vimentina, tendo em vista que
houve marcação positiva somente no Grupo Controle Fechado (GC1), em ambas
as camadas celulares da ME e também em células localizadas no interior da
notocorda. Entretanto, a presença de vimentina na medula espinhal, em embriões
de galinha, nos estágios iniciais do desenvolvimento (8–12HH) já está
documentada na literatura (Page et al., 1989), bem como em torno da notocorda,
nos somitos e nervos espinhais, em estágio 25HH (Noack et al., 2003).
Considerando que, no nosso resultado, encontramos células da notocorda com
marcação positiva à vimentina e que estas, e também as localizadas em torno
desta estrutura, são de origem mesodérmica, a imuno-reatividade nesta região é
pertinente (Machado e Figueiredo, 1996).
Já a marcação para GFAP foi bastante intensa e se estendeu por diversas
regiões, embora com intensidade e localização diferentes entre os grupos
experimentais. Houve marcação para GFAP em células das camadas ventricular e
do manto da medula espinhal, o que se contrapõe aos dados de Tapscott et al.
(1981), pois segundo este estudo, em embriões de galinha doméstica, a imuno-
positividade para GFAP foi encontrada entre E11 e E9 na medula espinhal, e
nossos embriões encontravam-se em E4 no momento da análise. Entretanto, Cole
e Lee (1997) encontraram, nesta mesma espécie, em E7, leve marcação para
GFAP em astrócitos nas substâncias branca e cinzenta, e também nas células da
camada ependimária da medula espinhal. Os grupos experimentais e controles
apresentaram também marcação positiva à GFAP nos gânglios espinhais,
provavelmente devido à presença de astrócitos, porém, apresentaram também
marcação positiva no ectoderma e mesoderma apical e ventral (adjacente à
notocorda), onde não há a presença de astrócitos. Entretanto, a presença do
filamento intermediário GFAP já foi descrita em células não-neurais, o que indica
que possivelmente ele possua outras funções que ainda não foram descritas, além
de participar do processo de diferenciação neural (Hansen, et al., 1989 apud
Oudega e Marani, 1991).
Em se tratando da questão da ocorrência de morte celular programada,
através da aplicação da técnica de Hoescht 33258, foi possível observar somente
a presença expressiva de apoptose, tanto no telencéfalo, quanto na medula
espinhal e mesoderma adjacente aos mesmos, no Grupo Homocisteína e Ácido
Fólico (G4). Provavelmente este efeito ocorreu devido à ação da homocisteína,
tendo em vista evidências de que ela esteja envolvida no aumento de quebra do
DNA ocasionado por falha na sua metilação, o que conseqüentemente leva à
apoptose (Sachdev, 2005).
As análises de Kruman et al. (2002) demonstraram que a deficiência de
folato e o acúmulo de homocisteína intracelular promovem danos ao DNA
neuronal por impedir seu reparo, devido à deficiência de doadores de metil nestas
situações. Sabe-se que o sistema nervoso é altamente sensível a esses efeitos,
porque a homocisteína é rapidamente captada pelos neurônios por um
transportador específico presente na membrana, o que leva rapidamente a altos
níveis intracelulares (Grieve et al., 1992).
Em nosso estudo, observamos, na
camada do manto do telencéfalo dorsal e da medula espinhal de embriões do
Grupo Homocisteína e Ácido Fólico (G4), várias células em diferentes estágios de
apoptose.
A partir de nossos resultados, evidenciamos a presença de alterações,
tanto morfológicas, quanto histológicas e imuno-histoquímicas nos embriões
tratados com homocisteína e ácido fólico (Grupo G4). Ou seja, o ácido fólico não
pôde reverter, ao menos de forma significativa, o efeito teratogênico da
homocisteína. Entretanto, sabe-se que embriões e fetos humanos possuem
menos habilidade e eficiência na trans-sulfuração e re-metilação quando
comparados a adultos (Björklund e Gordon, 2006) e em ratos, o tecido neural
embrionário tem uma demanda elevada de S-adenosil-metionina (SAM) durante o
período crítico de fechamento do TN. É aceitável, portanto, que os embriões, no
estágio de desenvolvimento em que as substâncias foram administradas (8-9HH),
não tivessem ainda eficiência metabólica suficiente, e, por esse motivo, o ácido
fólico pode não ter sido capaz de reverter, de forma significativa, os efeitos
nocivos da homocisteína ao desenvolvimento.
Dunlevy et al. (2006) encontraram DTNs em embriões de camundongo em
cultura, após tratamento com metionina, o que também não era esperado, tendo
em vista que a falta de doadores de metil é um dos mecanismos especulados
como causa da ocorrênica de DTNs (Matson e Shea, 2003; Brauer e Tierney,
2004; Kruman et al., 2002). Para elucidar a questão, eles quantificaram os níveis
de SAM e s-adenosil-homocisteína (SAH) em suas culturas de embriões de
camundongo (E8,5), e verificaram que houve aumento dos níveis de SAM,
provavelmente devido à oferta de metionina, mas também de SAH; e concluíram
que a elevação nos níveis de SAH ocorreu devido a um “feedback negativo”, que
suprimiu a conversão da homocisteína à metionina, devido à grande oferta desta
última. Desta forma, o conseqüente aumento nos níveis de homocisteína levou ao
aumento nos níveis de SAH, uma vez que o equilíbrio da reação neste caso
favorece à sua formação. E, como para todos os efeitos, sabe-se que a redução
na razão SAM/SAH inibe as reações de trans-metilação (Matson e Shea, 2003;
Brauer e Tierney, 2004), isto explicaria a ocorrência dos DTNs em seus embriões.
O estudo de Dunlevy et al. (2006) demonstrou que o excesso de metionina
foi capaz de suprimir o ciclo de metilação, sugerindo que a mesma pode ser
contra-indicada como agente protetor, e que, portanto, a regulação do processo é
muito tênue, o que pode explicar também a interferência da homocisteína em
conjunto com o ácido fólico no processo de desenvolvimento dos nossos
embriões, bem como as alterações encontradas nos embriões tratados com ácido
fólico.
6 CONCLUSÕES
O
tratamento com homocisteína (Grupo G3) foi o que interferiu de maneira
mais significativa, tanto no padrão morfológico externo dos embriões, quanto na
estrutura organizacional do telencéfalo e medula espinhal embrionária. Tendo em
vista que o mesmo exibiu, quase sempre, comportamento significativamente
diferente ao dos grupos controle (GC1 e GC2).
O tratamento com ácido fólico (Grupo G5), de maneira geral, não foi capaz
de interferir significativamente no padrão morfológico externo e na estrutura
organizacional do telencéfalo e medula espinhal embrionária. Tendo em vista que
este grupo exibiu, quase sempre, comportamento bastante similar ao dos grupos
controle (GC1 e GC2).
Quando utilizamos a homocisteína e o ácido fólico em conjunto (Grupo G4),
observamos interferência significativa destes agentes no processo de
desenvolvimento dos embriões de Gallus domesticus, quando comparado aos
grupos controle (GC1 e GC2) e ácido fólico (Grupo G5). Estas diferenças dizem
respeito tanto ao padrão morfológico, quanto à estrutura organizacional do
telencéfalo e medula espinhal embrionária.
O ácido fólico não foi capaz de reverter, ao menos de forma eficaz, a ação
nociva da homocisteína (Grupo G4), tanto sobre o padrão morfológico quanto
sobre a estrutura organizacional do telencéfalo e medula espinhal embrionária.
Provavelmente, as modificações encontradas, tanto morfológicas, quanto
organizacionais, ocorreram devido à imaturidade metabólica dos embriões neste
estágio inicial do desenvolvimento (96 horas), desta forma, talvez estes não
tenham sido capazes de utilizar o ácido fólico como agente protetor, não anulando,
portanto, os efeitos adversos provocados pela homocisteína.
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polymorphisms and increased risks for neural tube defects
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ANEXO
Corte sagital de cerebelo de pinto de 7 dias submetido à marcação imuno-histoquímica para
vimentina (40X).
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