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Ministério da Saúde
Fundação Oswaldo Cruz
Centro de Pesquisas René Rachou
Curso de Pós-Graduação em Ciências da Saúde
Avaliação do efeito de drogas esquistossomicidas sobre a fase intramolusco do
Schistosoma mansoni
Ana Carolina Alves de Mattos
Dissertação apresentada com vistas à obtenção do Título de Mestre em Ciências
da Saúde na área de Doenças Infecciosas e Parasitárias.
Orientador: Dr. Paulo Marcos Zech Coelho
Março
2006
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Milhares de livros grátis para download.
Fundação Oswaldo Cruz
Centro de Pesquisas René Rachou
Curso de Pós-Graduação em Ciências da Saúde
Esta Dissertação intitulada:
Avaliação do efeito de drogas esquistossomicidas sobre a fase intramolusco do
Schistosoma mansoni
apresentada por
Ana Carolina Alves de Mattos
Foi avaliada pela banca examinadora composta pelos seguintes membros:
Prof. Dr.____________________________________
Paulo Marcos Zech Coelho
Prof. Dr. __________________________________
Zilton de Araújo Andrade
Prof. Dr. ____________________________________
Marcos Pezzi Guimarães
Dissertação defendida em 31 de março 2006
2
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Catalogação-na-fonte
Rede de Bibliotecas da FIOCRUZ
Biblioteca do CPqRR
Segemar Oliveira Magalhães CRB/6 1975
M435a
2006
Mattos, Ana Carolina Alves de.
Avaliação do efeito de drogas esquistossomicidas sobre a
fase intramolusco do Schistosoma mansoni / Ana Carolina Alves
de Mattos. – Belo Horizonte, 2006.
xviii, 91 f.: il; 29,7 x 21,0 cm.
Bibliografia: f. 81-91
Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Fundação
Oswaldo Cruz/Centro de Pesquisas René Rachou/Área de
concentração: Doenças Infecciosas e Parasitárias
Schistosoma mansoni 2. Fase intramolusco 3. drogas
esquistossomicidas I. Título. II. Coelho, Paulo Marcos Zech
(Orientador).
CDD – 22. ed. – 616.963
3
Agradecimentos
4
Dedico este trabalho aos meus queridos pais,
Sérgio e Nilza, exemplos de carinho e dedicação,
pelo incentivo. Ao Bruno, meu incentivador e
companheiro, pelo amor e paciência.
Ao meu orientador, Dr. Paulo Marcos, pelos ensinamentos, atenção, paciência e confiança em
mim depositada. Obrigada pelos ótimos momentos de conversa.
Ao querido Dr. John Kusel, pela oportunidade de trabalhar ao seu lado. Obrigada pelos
ensinamentos, amizade e incentivo, e pelos ótimos momentos de convivência. Você é uma
pessoal especial.
Ao Dr. Paulo Filemom Pimenta e à Dra. Nágila Secundino, pela colaboração imprescindível
na reta final deste trabalho.
Ao Dr. Naftale Katz, pela oportunidade de aprender e trabalhar no Laboratório de
Esquistossomose.
À Delza, Dílcia, Sueleny e Liana, pelos ensinamentos e pelas agradáveis horas de trabalho e
convivência. Vocês foram fundamentais na execução deste trabalho.
Ao Dr. Luciano Andrade Moreira, pelos inúmeros empréstimos da máquina fotográfica.
À Dra. Diana Bahia e à estudante Lívia das Graças Avelar, pelos ensinamentos no cultivo dos
esporocistos.
À Neusa Araújo, pela amizade, pelas conversas e enorme ajuda na perfusão dos
camundongos.
Aos amigos do Laboratório de Esquistossomose: Ana Karine, Áureo, Daniela, Fábio,
Gardênia, Luís André, Priscila, Rodrigo, Symone, Vandinha, Vanessa Borges e D. Vera, pela
ótima convivência durante estes anos, pela amizade e ajuda.
À Vanessa Lopes, pela dedicação e presteza, pronta a ajudar sempre que necessário.
A todos do Laboratório de Entomologia Médica do CPqRR, em especial a Cris e a Tati, pela
ajuda nas análises de microscopia laser confocal. Ao Gustavo, pela paciência e ajuda na
formatação das imagens.
5
À estatística Anna Carolina Lustosa, pela paciência e boa vontade.
À Fabrícia Alvisi, minha grande amiga, pelo companheirismo e pelos momentos agradáveis
de convivência. Obrigada pela ajuda, correções e sugestões. Você faz muita falta.
Aos amigos do Laboratório de Pesquisas Clínicas, em especial à Fernanda, pela ajuda na
formatação deste trabalho, pela amizade e pelos ótimos momentos de descontração.
Às amigas: Ana Bahia, Ana Thereza, Luciene, Paola e Pollanah, pela amizade, incentivo e
pelos importantes e agradáveis momentos de conversa.
A todos os amigos do Curso de Pós-Graduação do CPqRR/FIOCRUZ.
Aos Coordenadores e funcionários do Programa de Pós-Graduação, pela acessibilidade e
presteza.
À Equipe do Biotério, Central de Esterilização e ao Segemar, pela ajuda e colaboração sempre
que necessário.
À minha irmã Antonietta e ao meu cunhado Sérgio, pelos momentos de descontração.
A Deus, afinal, sem Ele nada é possível.
A vocês que, de alguma forma, estiveram ao meu lado, obrigada pelo incentivo, torcida,
carinho e contribuição neste momento de realização em minha vida.
6
7
“Não existem erros, apenas lições. O crescimento é um
processo de tentativa e erro: experimentação. As experiências que
não deram certo fazem parte do processo, assim como as bem-
sucedidas. As respostas estão dentro de você. Tudo o que tem a
fazer é analisar, ouvir e acreditar.”
(Albert Einstein)
"Nunca ande pelo caminho traçado, pois ele conduz somente
até onde os outros já foram.”
(Alexandre Graham Bell)
Sumário
1 Introdução .............................................................................................................................. 20
1.1. Esquistossomose .................................................................................................... 20
1.2. Oxamniquina .......................................................................................................... 24
1.3. Praziquantel ............................................................................................................ 25
1.4. Ação de diferentes drogas sobre a fase intramolusco do parasito .......................... 27
1.5. Associação oxamniquina e praziquantel ................................................................ 30
1.6. Resistência ao praziquantel .................................................................................... 31
2 Objetivo .................................................................................................................................. 33
2.1. Objetivo geral ......................................................................................................... 33
2.2. Objetivos específicos ............................................................................................. 33
3 Materiais e Métodos ............................................................................................................... 34
3.1. Avaliação do efeito das drogas PZQ e OXA na fase intramolusco do parasito ..... 34
3.1.1. Caramujos e parasitos ......................................................................................... 34
3.1.2. Infecção dos caramujos ....................................................................................... 34
3.1.3. Tratamento experimental .................................................................................... 34
3.1.4. Avaliação da eliminação de cercárias ................................................................. 36
3.2. Experimentos “in vitro” ......................................................................................... 37
3.2.1. Obtenção e transformação “in vitro” de miracídios em esporocistos primários . 37
3.2.2. Marcação dos parasitos com sondas fluorescentes ............................................. 38
3.2.3. Experimento 1 – Avaliação da ação do PZQ sobre esporocistos transformados
“in vitro” ....................................................................................................................... 39
3.2.4. Experimento 2 – Avaliação do efeito do PZQ sobre a membrana de esporocistos
transformados “in vitro” ............................................................................................... 40
3.2.5. Experimento 3 – Avaliação da presença de lisossomos em esporocistos e da
ação do PZQ sobre essas organelas ácidas .................................................................... 40
3.2.6. Fluorescência (Microscopia de Fluorescência e Laser Confocal) ....................... 41
3.2.7. Preparo e leitura das lâminas ............................................................................... 41
3.2.8. Imagens fotográficas ........................................................................................... 42
3.3. Avaliação da suscetibilidade do S. mansoni ao PZQ após vários tratamentos na
fase intramolusco .......................................................................................................... 42
3.3.1. Primeira Etapa ..................................................................................................... 42
3.3.2. Segunda Etapa ..................................................................................................... 43
3.4. Análise Estatística ................................................................................................. 45
8
4 Resultados .............................................................................................................................. 47
4.1. Avaliação do efeito das drogas PZQ e OXA na fase intramolusco do parasito ..... 47
4.2. Experimentos “in vitro” ......................................................................................... 58
4.2.1. Experimento 1 – Avaliação da ação do PZQ sobre esporocistos transformados
“in vitro” ....................................................................................................................... 58
4.2.2. Experimento 2 – Avaliação do efeito do PZQ sobre a membrana de esporocistos
transformados “in vitro” ............................................................................................... 58
4.2.3. Experimento 3 – Avaliação da presença de vesículas ácidas semelhantes a
lisossomos em esporocistos e do efeito do PZQ sobre essas organelas ácidas ............. 61
4.3. Avaliação da suscetibilidade do S. mansoni ao PZQ após vários tratamentos na
fase intramolusco .......................................................................................................... 62
4.3.1. Reprodutibilidade dos experimentos ................................................................... 66
5 Discussão ............................................................................................................................... 70
6 Conclusões ............................................................................................................................. 79
7 Referências bibliográficas ...................................................................................................... 81
9
Lista de Quadros
Quadro 1 - Grupos experimentais e tratamentos.......................................................................36
Quadro 2 - Esquemas terapêuticos............................................................................................44
10
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Número de vermes vivos recuperados após perfusão das veias mesentéricas e do
fígado de camundongos infectados com 25 cercárias das cepas LE e LE – PZQ de S. mansoni
e tratados com diferentes dosagens de PZQ, trinta dias após o tratamento.............................. 63
Tabela 2 - Número de vermes vivos recuperados após perfusão das veias mesentéricas e do
fígado de camundongos infectados com 25 cercárias das cepas LE e LE – PZQ de S. mansoni
e tratados com diferentes dosagens de PZQ, trinta dias após o tratamento.............................. 65
Tabela 3 - Número de vermes vivos recuperados após perfusão das veias mesentéricas e do
figado de camundongos infectados com 25 cercárias das cepas LE e LE – PZQ de S. mansoni
e tratados com diferentes dosagens de PZQ, trinta dias após o tratamento.............................. 68
11
Lista de Figuras
Figura 1 - Desenvolvimento do S. mansoni-fase intramolusco (Jannotti-Passos, 1998) ........23
Figura 2 - Ciclo evolutivo do S. mansoni................................................................................. 23
Figura 3 - Avaliação da ação do PZQ sobre os esporocistos transformados "in vitro". (A)
esporocisto não exposto ao PZQ; morfologia normal. A seta indica a perda da placa ciliar. (B)
esporocisto exposto a 5µg/mL de PZQ. (C) esporocisto exposto a 10µg/mL de PZQ; nítida
contração e alteração no formato do parasito. Imagens visualizadas em microscopia óptica
comum. Barras = 20µm............................................................................................................ 58
Figura 4 - Avaliação da ação do PZQ sobre a membrana de esporocistos
transformados "in vitro". (A – C) parasitos marcados com Hoechst 33258. Imagens
visualizadas por microscopia de fluorescência. (A) esporocisto controle; (B e C) esporocistos
expostos a 5µg/mL e 10µg/mL de PZQ, respectivamente. É possível verificar leve marcação
no controle e um aumento na fluorescência naqueles expostos à droga. (D - I) esporocistos
marcados com lectina de Glicine max. (D e E) parasitos controles; (F e G) esporocistos
expostos a 5µg/mL de PZQ; (H e I) esporocistos expostos a 10µg/mL de PZQ. A marcação
com a sonda só é visível nos esporocistos expostos à droga. Imagens geradas por microscopia
laser confocal. Barras = 20µm.................................................................................................. 60
Figura 5 - Avaliação da presença de organelas ácidas semelhantes a lisossomos em
esporocistos transformados “in vitro” e do efeito do PZQ sobre essas organelas. (A e B)
esporocistos marcados com 5µL de LysoTracker Red e não expostos ao PZQ; presença de
algumas vesículas ácidas; (C e D) esporocistos marcados com LysoTracker Red e expostos a
5µg/mL de PZQ; (E e F) esporocistos marcados com LysoTracker Red e expostos a 10µg/mL
de PZQ. Presença de uma maior área marcada. Imagens geradas por microscopia laser
confocal. Barras: A, C, E e F = 20µm; B e D = 10µm............................................................ 62
Figura 6 - Gráficos representativos da reprodutibilidade dos experimentos 1 e 2. Comparação
do número de vermes recuperados entre os grupos controles infectados com cercárias LE (A);
grupos controles infectados com cercárias LE – PZQ (B); grupos infectados com cercárias LE
tratados com 200mg/Kg de PZQ (C); grupos infectados com cercárias LE - PZQ tratados
com 200mg/Kg de PZQ (D); grupos infectados com cercárias LE tratados com 400mg/Kg de
PZQ (E); grupos infectados com cercárias LE - PZQ tratados com 400mg/Kg de PZQ (F);
grupos infectados com cercárias LE tratados com 800mg/Kg de PZQ (G); grupos infectados
com cercárias LE - PZQ tratados com 800mg/Kg de PZQ (H)................................................ 67
12
Lista de Gráficos
Gráfico 1 - Gráfico referente às médias de cercárias eliminadas e ao desvio padrão nos nove
exames realizados no 1º experimento (período pré-patente) para avaliação do efeito das
drogas na fase intramolusco do parasito. I: caramujos infectados e não tratados; IOR:
caramujos infectados e tratados com 500mg/Kg de OXA; IPR: caramujos infectados e
tratados com 1000mg/Kg de PZQ. ...........................................................................................48
Gráfico 2 - Cinética da mortalidade dos caramujos pertencentes ao 1º experimento. I:
caramujos infectados e não tratados; IOR: caramujos infectados e tratados com 500mg/Kg de
OXA; IPR: caramujos infectados e tratados com 1000mg/Kg de PZQ; N: caramujos não
infectados e não tratados; NOR: caramujos não infectados e tratados com 500mg/Kg de OXA;
NPR: caramujos não infectados e tratados com 1000mg/Kg de PZQ..................................... 49
Gráfico 3 - Gráfico referente às médias de cercárias eliminadas e ao desvio padrão nos seis
exames realizados no 2º experimento (período pré-patente) para avaliação do efeito das
drogas na fase intramolusco do parasito. I: caramujos infectados e não tratados; IT: caramujos
infectados e tratados uma vez com 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de PZQ. ...................... 50
Gráfico 4 - Cinética da mortalidade dos caramujos pertencentes ao 2º experimento. I:
caramujos infectados e não tratados; IT: caramujos infectados e tratados com 250mg/Kg de
OXA + 500mg/Kg de PZQ; N: caramujos não infectados e não tratados; NT: caramujos não
infectados e tratados com 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de PZQ.......................................51
Gráfico 5 - Gráfico referente às médias de cercárias eliminadas e ao desvio padrão nos nove
exames realizados no 3º experimento (período pré-patente) para avaliação do efeito das
drogas na fase intramolusco do parasito. I: caramujos infectados e não tratados; IT: caramujos
infectados e tratados duas vezes com 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de PZQ. .................. 51
Gráfico 6 - Cinética da mortalidade dos caramujos pertencentes ao 3º experimento. I:
caramujos infectados e não tratados; IT: caramujos infectados e tratados com 250mg/Kg de
OXA + 500mg/Kg de PZQ; N: caramujos não infectados e não tratados; NT: caramujos não
infectados e tratados com 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de PZQ.......................................52
Gráfico 7 - Gráfico referente às médias de cercárias eliminadas e ao desvio padrão nos quatro
exames realizados no 4º experimento (período patente) para avaliação do efeito das drogas na
fase intramolusco do parasito. I: caramujos infectados e não tratados; IOR: caramujos
infectados e tratados com 500mg/Kg de OXA; IPR: caramujos infectados e tratados com
1000mg/Kg de PZQ. ................................................................................................................ 53
Gráfico 8 - Cinética da mortalidade dos caramujos pertencentes ao 4º experimento. I:
caramujos infectados e não tratados; IOR: caramujos infectados e tratados com 500mg/Kg de
13
OXA; IPR: caramujos infectados e tratados com 1000mg/Kg de PZQ; N: caramujos não
infectados e não tratados; NOR: caramujos não infectados e tratados com 500mg/Kg de OXA;
NPR: caramujos não infectados e tratados com 1000mg/Kg de PZQ..................................... 54
Gráfico 9 - Gráfico referente às médias de cercárias eliminadas e ao desvio padrão nos cinco
exames realizados no 5º experimento (período patente) para avaliação do efeito das drogas na
fase intramolusco do parasito. I: caramujos infectados e não tratados; IT: caramujos
infectados e tratados uma vez com 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de PZQ. ...................... 55
Gráfico 10 - Cinética da mortalidade dos caramujos pertencentes ao 5º experimento. I:
caramujos infectados e não tratados; IT: caramujos infectados e tratados com 250mg/Kg de
OXA + 500mg/Kg de PZQ; N: caramujos não infectados e não tratados; NT: caramujos não
infectados e tratados com 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de PZQ.......................................56
Gráfico 11 - Gráfico referente às médias de cercárias eliminadas e ao desvio padrão nos cinco
exames realizados no 6º experimento (período patente) para avaliação do efeito das drogas na
fase intramolusco do parasito. I: caramujos infectados e não tratados; IT: caramujos
infectados e tratados duas vezes com 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de PZQ. .................. 57
Gráfico 12 - Cinética da mortalidade dos caramujos pertencentes ao 6º experimento. I:
caramujos infectados e não tratados; IT: caramujos infectados e tratados com 250mg/Kg de
OXA + 500mg/Kg de PZQ; N: caramujos não infectados e não tratados; NT: caramujos não
infectados e tratados com 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de PZQ.......................................58
Gráfico 13 - Gráfico de dispersão do número total de vermes vivos recuperados por animal
dos grupos controles e experimentais e suas respectivas medianas ( ) referentes ao
experimento1.............................................................................................................................64
Gráfico 14 - Gráfico de dispersão do número total de vermes vivos recuperados por animal
dos grupos controles e experimentais e suas respectivas medianas ( ) referentes ao
experimento 2............................................................................................................................66
Gráfico 15 - Gráfico de dispersão do número total de vermes vivos recuperados por animal
dos grupos controles e experimentais e suas respectivas medianas ( ) referentes ao
experimento passagem 1. * p<0,005 estatisticamente diferente do grupo 1 (LE – controle/
400mg/Kg)................................................................................................................................ 69
14
Lista de Abreviaturas
OXA – oxamniquina
PZQ – praziquantel
ED
50
–
dose efetiva para matar 50% dos vermes
IOR – caramujos infectados e tratados com OXA
IPR – caramujos infectados e tratados com PZQ
NOR – caramujos não expostos aos miracídios e tratados com OXA
NPR – caramujos não expostos aos miracídios e tratados com PZQ
IT – caramujos infectados e tratados com associação de OXA + PZQ
NT – caramujos nãos exspostos aos miracídios e tratados com associação de OXA + PZQ
N – caramujos não expostos aos miracídios e não tratados
I – caramujos infectados e não tratados
SFB – soro fetal bovino
MLC – Microcópio Laser Confocal
LE-PZQ – cepa LE de S. mansoni submetida a três tratamentos com PZQ na fase
intramolusco
15
Resumo
O presente trabalho avaliou a ação da oxamniquina (OXA), do praziquantel (PZQ) e
da associação OXA/ PZQ sobre a fase intramolusco do Schistosoma mansoni. Nos estudos
“in vivo”, caramujos Biomphalaria glabrata infectados com S. mansoni foram tratados com
500mg/Kg de OXA ou 1000mg/Kg de PZQ ou 250mg/Kg de OXA+ 500mg/Kg de PZQ, na
fase pré-patente e patente da infecção. Nos experimentos “in vitro”, esporocistos primários
transformados “in vitro” foram expostos a 5µg/mL e 10µg/mL de PZQ. Avaliou-se, através de
marcadores fluorescentes específicos, a ação do PZQ sobre o tegumento e sobre as vesículas
ácidas, descritas pela primeira vez em esporocistos primários em nosso trabalho. Nossos
resultados mostraram que tanto o tratamento com OXA quanto com PZQ, isoladamente, no
período pré-patente, retardam o desenvolvimento do parasito, aumentando em
aproximadamente dez dias o período pré-patente. Já o tratamento com a associação
OXA/PZQ, neste mesmo período, retardou ainda mais o desenvolvimento do parasito,
aumentando em até 56 dias o período pré-patente. O tratamento, no período patente, com
OXA ou PZQ, isoladamente, interrompeu a eliminação de cercárias. A eliminação de
cercárias foi restabelecida aproximadamente 15 dias após o tratamento, porém em
quantidades bem menores às anteriores ao tratamento, quando os caramujos foram tratados
com 1000mg/Kg de PZQ. O mesmo resultado não foi observado quando os caramujos foram
tratados com 500mg/Kg de OXA. A associação OXA/PZQ, no período patente, não só
interrompeu a eliminação de cercárias, como levou à “cura” dos caramujos. Esses resultados
sugerem um efeito sinérgico dessas drogas quando administradas associadas. Em relação aos
experimentos “in vitro”, foi possível verificar que o PZQ causa uma nítida contração na
musculatura do esporocisto, alterando o formato do parasito. O PZQ gera, ainda, dano no
tegumento do S. mansoni, evidenciado pela marcação com as sondas Hoechst 33258 e Lectina
de Glicine max. Além disso, verificou-se um aumento da área marcada pela sonda
LysoTracker Red, após o contato dos esporocistos com a droga, sugerindo maior atividade
das vesículas ácidas presentes. A partir dos resultados obtidos, nos quais caramujos infectados
e tratados com 1000mg/Kg de PZQ param de eliminar cercárias e retornam a eliminá-las, em
números bem menores aos encontrados antes do tratamento, 15 dias após o término do
tratamento, avaliamos se cercárias provenientes destes caramujos tratados poderiam gerar
vermes adultos menos susceptíveis ao PZQ. Os resultados mostram que não foram
encontradas diferenças estatisticamente significativas entre o número de vermes recuperados
de camundongos infectados com a cepa LE (controle) e LE submetida a três tratamentos com
PZQ na fase intramolusco (LE-PZQ), independente da dose de PZQ administrada (200, 400
16
ou 800mg/Kg). No entanto, quando os camundongos foram infectados com cercárias
provenientes de caramujos previamente tratados, porém, submetidos a uma passagem para
manutenção do ciclo de vida do parasito, sem novo tratamento, foi possível verificar que os
vermes adultos, provenientes de cercárias da LE – PZQ, mostraram-se estatisticamente menos
susceptíveis à droga do que os vermes adultos provenientes da cepa LE controle, quando
ambos os grupos foram tratados com 400mg/Kg de PZQ. Nossos resultados, utilizando o
modelo B. glabrata/ S. mansoni, abrem perspectivas interessantes para estudos de
mecanismos de ação de drogas, para verificar se caramujos tratados e “curados” apresentam
resistência à reinfecção pelo S. mansoni, além da possibilidade de ser útil na seleção de
parasitos resistentes a drogas esquistossomicidas.
17
Abstract
The aim of the present study was to evaluate the activity of oxamniquine (OXA),
praziquantel (PZQ), and OXA/PZQ association on the intramolluscan phase of Schistosoma
mansoni. In vivo studies were carried out using Biomphalaria glabrata snails, infected with
S. mansoni, and treated with 500 mg/Kg OXA or 1000 mg/Kg PZQ or 250 mg/Kg OXA +
500 mg/Kg PZQ, at the pre-patent and patent phases of infection. In vitro studies were also
performed with in vitro transformed primary sporocysts, exposed to 5µg/mL and 10µg/mL
PZQ. By means of specific fluorescent labels, it was possible to evaluate the activity of
praziquantel on the tegument and acidic vesicles in primary sporocysts, described for the first
time in our study. Our results showed that treatments administered either with OXA or with
PZQ, separately, retarded the parasite´s development at the pre-patent phase, and raised up
this period for 10 days as well. On the other hand, treatment performed with the association
OXA/PZQ delayed even more the parasite´s development, increasing up to 56 days the pre-
patent period. Treatment carried out with OXA or PZQ, separately, interrupted cercarial
shedding. Approximately 15 days after treatment, cercarial shedding was restablished, but in
smaller quantities than those observed before treatment, when the snails were treated with
1000 mg/Kg PZQ. The same result could not be obtained when the snails were treated with
500 mg/Kg PZQ. OXA/PZQ association administered at the pre-patent period, not only
interrupted cercarial shedding, but provided also a “cure” for the snails. These results
suggested a synergistic effect of these drugs, when they are associately administered. In
relation to the in vitro experiments, it was possible to observe that PZQ caused an evident
contraction of the sporocyst musculature, changing the parasite´s structure. PZQ caused
damage to the tegument of S. mansoni, as it could be seen by labelling using the probes
Hoechst 33258 and Lectin of Glycine max. Also, it was verified a large delimited area
labelled by the probe LysoTracker Red, after contact of the sporocyst with the drug,
suggesting a more intense activity of acidic organelles. Taking into account the results, i.e.,
that infected snails treated with 1000 mg/Kg discontinued cercarial shedding, which after 15
days post-treatment is restablished, but in lower numbers than those observed before
treatment, we evaluated the cercariae proceeding from those treated snails, aiming at verifying
whether they could generate adult worms less susceptible to PZQ. The results obtained
showed that there were not statistically significant differences between the number of
recovered worms from snails infected with the LE strain (control) and the same strain
submitted to three treatments with PZQ, at the intramolluscan phase (LE-PZQ), irrespective
of the PZQ doses administered (200, 400 or 800 mg/Kg). Nevertheless, when mice were
18
infected with cercariae obtained from previously treated snails, but submitted to a passage
without treatment, in order to maintain the parasite´s life cycle, it was possible to observe that
adult worms proceeding from LE strain/PZQ were less susceptible to the drug than adult
worms obtained from the LE strain/control, when both groups were treated with 400 mg/Kg
PZQ. Our study, using the model B. glabrata/S. mansoni showed results that could lead to
interesting perspectives related to further studies on the mechanisms of drug action, aiming at
observing whether treated and “cured” snails could present resistance to S. mansoni
reinfection. Also, these results may be possibly useful for selecting resistant parasites to
schistosomicidal drug compounds.
19
1 Introdução
As infecções por helmintos são consideradas prioridade na saúde pública em diversas
partes do mundo (Urbani & Albonico, 2003). De acordo com Harder (2002), a
esquistossomose continua sendo a helmintose de principal significância médica em grande
parte do planeta.
1.1. Esquistossomose
A esquistossomose é uma das doenças parasitárias de maior prevalência, sendo
endêmica em mais de 76 países e territórios distribuídos pela África, Ásia e Américas (Engels
et al., 2002). Está associada à pobreza, ocorrendo principalmente em áreas sem condições
sócio – econômicas e sanitárias adequadas e sem acesso a outras medidas de prevenção
efetivas.
Estima-se que mais de 200 milhões de pessoas estejam infectadas e aproximadamente
600 milhões expostas ao risco de contrair a doença (Chitsulo et al., 2000). Além disso,
aproximadamente 280 mil mortes por ano são atribuídas às esquistossomoses (Van der Werf
et al., 2003). Nos últimos 50 anos, houve uma mudança na distribuição da esquistossomose,
no entanto, mesmo com programas de controle bem sucedidos, o número de pessoas
infectadas ou sob risco de contrair a doença não foi reduzido (Engels et al., 2002).
As esquistossomoses são causadas por trematódeos digenéicos, pertencentes ao
gênero Schistosoma. Das cinco espécies de Schistosoma que parasitam o homem, as de maior
relevância são: Schistosoma mansoni (Sambon, 1907), Schistosoma haematobium (Bilharz,
1852) e Schistosoma japonicum (Katsurada, 1904), causadores, respectivamente, da
esquistossomose mansoni, esquistossomose hematóbica e esquistossomose japônica.
A esquistossomose mansoni é endêmica em 54 países e territórios distribuídos pela
América do Sul, Caribe e África (WHO, 2002), enquanto as esquistossomoses hematóbica e
japônica estão restritas ao continente africano e asiático, respectivamente.
No Brasil, a esquistossomose é um grave problema de saúde pública, abrangendo 19
estados. Nas regiões sudeste e nordeste, existem focos de transmissão desde o Maranhão até o
Espírito Santo e Minas Gerais, enquanto nas regiões norte e sul, existem apenas áreas de
média extensão e focos isolados (Teles, 2005; Coura & Amaral, 2004). Segundo Katz e
Peixoto (2000), mais de 8 milhões de pessoas estão infectadas, enquanto outras 30 milhões
estão expostas ao risco de infecção.
O S. mansoni possui um ciclo evolutivo que envolve uma reprodução assexuada que
ocorre no molusco (hospedeiro intermediário) e uma reprodução sexuada que ocorre no
20
hospedeiro vertebrado. Os hospedeiros invertebrados do S. mansoni são moluscos do gênero
Biomphalaria. No Brasil, existem dez espécies e uma sub-espécie pertencentes a esse gênero,
mas somente três já foram encontradas eliminando cercárias em condições naturais. São elas:
B. glabrata (Say, 1818), B. tenagophila (Orbigny, 1835), B. straminea (Dunker, 1848)
(Paraense, 1975).
O ciclo de vida do S. mansoni inicia-se quando ovos são eliminados nas fezes de
hospedeiros definitivos (geralmente o homem). Na água, os miracídios eclodem, nadam e
penetram nos moluscos através da parte externa do corpo. Após a penetração dos miracídios,
ocorre a perda do epitélio ciliar e a degeneração do terebratorium (extremidade anterior do
parasito, onde se encontram as terminações das glândulas adesivas e de penetração). Ocorre,
ainda, uma série de transformações morfológicas, a larva se torna imóvel e passa a ser
chamada de esporocisto primário. Na 2ª semana após a penetração, transformam-se em
esporocistos secundários. Ocorre, então, uma migração transtecidual dos esporocistos, até
alcançarem a glândula digestiva ou hepatopâncreas. Esses esporocistos secundários sofrem
modificações anatômicas, dando início à proliferação das células germinativas e formação das
cercárias. A formação completa das cercárias, até a sua emergência, ocorre de 27 a 30 dias
após a penetração dos miracídios (Pan, 1965). Essas cercárias são eliminadas pelo molusco,
permanecendo na água. Ao encontrar um hospedeiro definitivo, penetram através da pele,
perdendo a cauda. Transformam-se em esquistossômulos, que migram em direção aos vasos
sangüíneos, e são levados pela circulação periférica aos pulmões. Posteriormente, migram
para o fígado, via circulação sangüínea, onde ocorre a maturação dos vermes para posterior
acasalamento. Em seguida, os vermes migram para as veias mesentéricas inferiores onde
ocorre a postura de ovos. Parte desses ovos ganha a circulação e depositam-se no fígado.
Inicia-se, então, uma reação inflamatória ao redor desses ovos, levando à formação de
granulomas, o evento patogênico mais grave na esquistossomose. Outros ovos podem
depositar-se nas paredes intestinais, produzindo granulomas, enquanto outros podem alcançar
a luz intestinal, sendo, então, eliminados pelas fezes, reiniciando o ciclo (Coles, 1973) (Figura
1 e Figura 2).
21
Miracídios
esporocisto I
esporocisto II
18 dias após a penetração
glândulas digestivas ou hepatopâncreas
epitélio do manto e pseudobrânquias
Período Pré-Patente
-------------------------------------------------------------------------------------------------
eliminação de cercárias Período Patente
22
Figura 1 - Desenvolvimento do S. mansoni-fase intramolusco (Jannotti-Passos, 1998)
Figura 2 - Ciclo evolutivo do S. mansoni
O controle da esquistossomose baseia-se, principalmente, nas seguintes medidas:
emprego da quimioterapia em larga escala, educação em saúde e engenharia sanitária,
combate ao molusco através do uso de moluscicidas, controle biológico e alterações no
ambiente aquático. A quimioterapia é a principal alternativa para reduzir a morbidade da
doença em áreas endêmicas, bem como tratar casos isolados da doença (WHO, 1993).
As duas principais drogas utilizadas no tratamento da esquistossomose são a
oxamniquina (OXA) (Mansil - Pfizer S.A) e o praziquantel (PZQ) (Farmanguinhos -
Fundação Oswaldo Cruz/ FIOCRUZ).
23
Uma vez que a quimioterapia constitui uma das principais medidas para o controle da
esquistossomose, estudos visando conhecer os mecanismos de ação de drogas, com
envolvimento da relação parasito/hospedeiro, são de grande relevância. A ação de drogas nas
diferentes fases evolutivas do Schistosoma, tanto nos hospedeiros vertebrados como nos
invertebrados, poderá propiciar ferramentas importantes no conhecimento de mecanismos de
ação de drogas, seleção de linhagens resistentes em laboratório e representar um novo modelo
de triagem de drogas esquistossomicidas com resultados mais rápidos e econômicos.
1.2. Oxamniquina
A OXA tornou-se disponível para o tratamento da esquistossomose nos anos 70,
sendo, em passado recente, muito utilizada no tratamento em massa, com aproximadamente
13 milhões de pessoas tratadas na América do Sul e África (Fenwick, 2003).
Essa droga é um metabólito da série das tetrahidroquinoleínas (Richard & Foster,
1969), eficaz somente contra os vermes da espécie S. mansoni. É rapidamente metabolizada e
excretada, em sua maior parte, pela urina.
O principal mecanismo de ação da OXA é a inibição da síntese de ácidos nucléicos. A
enzima sulfotransferase esterifica a droga, e os produtos dessa esterificação são capazes de
alquilar o DNA e outras macromoléculas do parasito (Cioli et al., 1993). De acordo com Cioli
et al. (1989), essa inibição da síntese de ácidos nucléicos é um processo reversível em vermes
resistentes, porém irreversível em parasitos sensíveis. Além disso, os vermes machos são mais
sensíveis à droga do que os parasitos fêmeas (Cioli et al., 1995).
Segundo a Organização Mundial da Saúde (WHO, 1990), a OXA é eficaz em dose
única de 20mg/Kg na América do Sul, ilhas do Caribe e oeste da África. No entanto, doses
mais elevadas são necessárias em outras partes do continente Africano.
De acordo com Foster et al. (1971), todas as fases evolutivas do S. mansoni podem ser
tratadas com a droga, porém cercárias e vermes adultos são significativamente mais afetados
pela droga. Coelho et al. (1988) demonstraram a ação da OXA na fase intramolusco do
parasito.
Atualmente, a produção da OXA vem sendo diminuída e essa droga vem sendo
substituída no Brasil pelo PZQ para o tratamento da esquistossomose, tanto em campanhas de
saúde pública como na clínica.
24
1.3. Praziquantel
Atualmente, o PZQ é o medicamento de escolha, segundo a Organização Mundial da
Saúde, para o tratamento, em larga escala, da esquistossomose, sendo efetivo contra as cinco
espécies de Schistosoma (Doenhoff et al., 2002).
O PZQ tem atividade contra uma grande variedade de platelmintos, mas geralmente
não é eficaz contra nematódeos (Andrews et al., 1983). Possui baixa toxicidade, sendo
eliminado completamente do organismo após 24 horas, principalmente através das fezes e da
urina (Cioli & Pica-Mattocci, 2003).
A dose recomendada para o tratamento da esquistossomose mansoni e hematóbica é de
40-60mg/Kg; doses mais elevadas são utilizadas nos casos de esquistossomose japônica
(WHO, 2002).
As preparações comerciais da droga são compostas por uma mistura de partes iguais
dos isômeros levo (-) e dextro (+). Porém, o enantiômero levo (-) é a forma ativa “in vivo”
(Andrews et al., 1983; Liu et al., 1986; Xiao et al., 1999) e “in vitro” (Xiao & Catto, 1989;
Staudt et al., 1992).
Apesar dos inúmeros trabalhos realizados na tentativa de esclarecer o modo de ação do
PZQ, existem muitas perguntas a elucidar (Day et al., 1992; Redman et al., 1996; Cioli &
Picca-Mattocci, 2003). No entanto, alguns efeitos desta droga sobre o parasito já estão bem
esclarecidos, como contração muscular, dano tegumentar e alterações metabólicas.
Pax et al. (1978) e Fetterer et al. (1980) demonstraram que, após exposição do parasito
à droga, “in vivo” ou “in vitro”, observa-se uma rápida e sustentável contração da
musculatura. Essa contração tem grande influência na eliminação do parasito, uma vez que,
como conseqüência dessa contração, o verme perde seu poder de fixação nas veias
mesentéricas, sendo levado para o fígado e, conjuntamente com outras lesões, decorrentes da
ação da droga, será morto, desencadeando uma reação inflamatória, que resultará na
reabsorção do parasito e, geralmente, restará uma área fibrosada no local da reação.
Quanto aos danos no tegumento, após o contato com o PZQ, é descrito o aparecimento
de bolhas na superfície do verme e conseqüente vacuolização do tegumento (Becker et al.,
1980; Mehlhorn et al.; 1981). Entretanto, este fenômeno sempre ocorre após a morte do
parasito, independente da droga utilizada, não constituindo, assim, um mecanismo específico
de ação do PZQ no tegumento do Schistosoma. Além disso, o PZQ gera alteração na fluidez
da membrana do verme e desestabilização do tegumento (Lima et al., 1994a). Essas alterações
no tegmento levam à exposição de antígenos do parasito na superfície do verme (Harnett &
Kusel, 1986) e conseqüente ação do sistema imune do hospedeiro sobre o parasito. Vários
25
trabalhos descreveram que a eficácia do tratamento com PZQ é dependente de uma resposta
imune específica do hospedeiro contra o S. mansoni (Brindley & Sher, 1987; Fallon et al.,
1992; Ribeiro et al., 2004).
Acredita-se, ainda, que a maioria desses mecanismos de ação do PZQ sejam processos
dependentes de Ca++ (Cioli et al., 1995), uma vez que foi demonstrado, em experimentos “in
vitro”, realizados em meio de cultura livre de Ca++, o bloqueio dessas respostas (Pax et al.,
1978; Wolde Mussie et al., 1982; Xiao et al., 1984). Sugere-se que o PZQ tenha ação sobre
proteínas de membrana presentes nos canais de cálcio, e que alterações nessas proteínas
levariam à abertura desses canais e ao conseqüente aumento do nível de Ca++ nos tecidos do
parasito (Kohn et al., 2001).
O PZQ gera, também, uma depleção do conteúdo de glutationa. A glutationa é uma
tripeptídeo fundamental para a sobrevivência das células; ela está envolvida em processos que
previnem a acumulação de compostos tóxicos na célula (Ishikawa, 1992). Assim, é possível
que a quantidade dessa proteína esteja relacionada à suscetibilidade/ resistência do parasito.
Em experimentos “in vitro”, utilizando esquistossômulos, Ribeiro et al. (1998) observaram
uma redução no conteúdo de glutationa após a exposição à droga.
Alguns fatores podem influenciar na eficácia terapêutica do PZQ. A fase de
desenvolvimento do parasito foi descrita como fator relevante na eficácia da droga. Muitos
trabalhos foram realizados, visando avaliar a ação do PZQ sobre as diferentes fases evolutivas
do parasito (Gönnert & Andrews, 1977; Xiao et al., 1985; Ribeiro et al., 1998, 2004;
Carneiro-Santos et al., 2001; Liang et al., 2001, 2003; Pica-Mattoccia & Cioli, 2004). Gönnert
e Andrews (1977) realizaram os primeiros trabalhos, nos quais as diversas fases de
desenvolvimento do parasito (cercárias, esquistossômulos, vermes jovens e adultos) foram
expostas ao PZQ, em experimentos “in vivo” e “in vitro”. De acordo com os resultados, todas
as fases evolutivas do parasito são sensíveis à droga, no entanto, o PZQ foi mais eficaz contra
cercárias e vermes adultos.
Vários traballhos também descreveram a ação do PZQ frente aos miracídios
(Andrews, 1978; Coles, 1979; Liang et al., 2001, 2003) e esporocistos intramolusco (Coles,
1979; Touassem & Combes, 1986; Yi & Combes, 1987; Coelho et al., 1988; Riley &
Chappell, 1990). Nestes estudos, foi possível verificar que tanto os miracídios quanto os
esporocistos são afetados pelo PZQ. Nos estudos de Liang et al. (2001, 2003), observou-se
que os miracídios, expostos “in vitro” ao PZQ, apresentaram uma rápida e marcante alteração
em sua morfologia. Além disso, já foi descrito que os miracídios perdem a motilidade e o
poder infectante após o contato com o PZQ (Coles, 1979).
26
A ação do PZQ nas diferentes fases do ciclo de vida do Schistosoma vem sendo
ultimamente estudada, utilizando-se como ferramenta sondas fluorescentes. Além disso, estas
sondas também já foram usadas para demonstrar aspectos morfológicos e fisiológicos do
parasito. Lima et al. (1994a,b) demonstraram a presença de dano no tegumento de vermes
adultos, após a exposição ao PZQ, utilizando marcadores fluorescentes específicos para
componentes da membrana celular. No estudo realizado por Ribeiro et al. (1998), no qual se
avaliou o efeito do PZQ sobre o nível de glutationa, em esquistossômulos, foi utilizada a
técnica de microscopia de fluorescência. Oliveira et al. (2006) demonstraram a ação do PZQ
sobre o sistema excretor e o tegumento de vermes adultos, utilizando marcadores
fluorescentes. Al-Adhami et al. (2003, 2005) demonstraram a presença de compartimentos
ácidos em miracídios, esquistossômulos e vermes adultos, utilizando um marcador
fluorescente específico para corar lisossomos. Além disso, Carneiro-Santos et al. (2001)
descreveram a ausência desses compartimentos em cercárias e, ainda, verificaram a ação do
PZQ sobre essas vesículas ácidas em esquistossômulos transformados. A presença de diversas
lectinas em esporocistos transformados “in vitro” ou presentes em cortes histológicos de
tecidos de caramujos também já foi descrita, utilizando-se marcadores fluorescentes
específicos (Yoshino et al., 1977; Zelck & Becker, 1990; Uchikawa & Loker, 1991; Johnston
& Yoshino, 1996). Dessa forma, esses marcadores fluorescentes são de grande valia no estudo
da biologia e do comportamento do parasito nas diferentes fases do seu ciclo de vida, bem
como no esclarecimento de alguns aspectos do mecanismo de ação de drogas
esquistossomicidas sobre o S. mansoni.
1.4. Ação de diferentes drogas sobre a fase intramolusco do parasito
Diversos estudos já demonstraram que drogas que atuam contra vermes adultos e
imaturos do Schistosoma, no hospedeiro vertebrado, incluindo o PZQ, também atuam na fase
intramolusco do parasito, levando à interrupção na eliminação de cercárias (Warren &
Weisberg, 1966; Warren, 1967; Coles, 1979; Touassem & Combes, 1986; Yi & Combes,
1987; Coles & Bruce, 1987; Coelho et al., 1988; Riley & Chappell, 1990). Além disso, de
acordo com Coles (1973), enzimas presentes em esporocistos migram de maneira semelhante
às de vermes adultos em eletroforese. Esses dados apontam para uma similaridade entre as
vias metabólicas destas duas diferentes fases do ciclo de vida do Schistosoma (Coelho et al.,
1988).
Warren & Weisberg (1966) realizaram um estudo em caramujos expostos a
miracídios, utilizando o cloranfenicol, um antibiótico inibidor de síntese de proteína. Nesse
trabalho, caramujos foram expostos por 24 horas aos miracídios de S. mansoni e, em seguida,
27
colocados em contato com o antibiótico, na concentração de 312 ppm, por 5 semanas.
Observou-se que os caramujos permaneceram sem eliminar cercárias por 6 semanas após o
término do tratamento. Além disso, caramujos positivos (eliminando cercárias) também foram
expostos ao cloranfenicol sob as mesmas condições. Foi possível observar uma supressão na
eliminação de cercárias, que se manteve até 4 semanas após o término do tratamento.
A ação do hycanthone, uma droga do mesmo grupo químico da OXA e já usada no
tratamento clínico da esquistossomose, foi avaliada por Warren (1967). Nesse estudo, os
caramujos, após 24 horas de exposição aos miracídios, foram expostos à droga na
concentração de 0.4 ppm, por 5 semanas. Os resultados obtidos foram os mesmos encontrados
com o cloranfenicol, uma supressão na eliminação de cercárias por até 6 semanas após o
término do tratamento.
Agentes mutagênicos também já foram avaliados na fase intramolusco do parasito. No
estudo realizado por Coles & Bruce (1987), caramujos infectados com S. mansoni foram
expostos ao sulfonato etil metano (ESM), e, posteriormente, cercárias eliminadas de
caramujos expostos e não expostos ao ESM foram transformadas em esquistossômulos. Esses
esquistossômulos foram, então, expostos ao metrifonato, um agente esquistossomicida. Após
3 dias de contato com o metrifonato, foi possível observar que os esquistossômulos,
provenientes de cercárias eliminadas por caramujos previamente expostos ao ESM, possuíam
maior atividade do que aqueles provenientes de cercárias de caramujos não expostos ao ESM,
23/14000 e 12/ 14000, respectivamente.
Segundo Coelho et al. (1988), a OXA também possui ação sobre a fase intramolusco
do S. mansoni. Caramujos B. glabrata infectados, submetidos ao tratamento com a droga na
concentração de 10 ppm, incorporada a 500mg de ração, tiveram a eliminação de cercárias
suprimida por 1 semana após o tratamento. Vários outros compostos (esquistossomicidas ou
não) foram testados nesse trabalho e verificou-se que algumas drogas efetivas contra vermes
adultos e imaturos também agiam na forma intramolusco do parasito.
Utilizando o PZQ, Coles (1979) encontrou resultados interessantes. Em seu estudo,
caramujos infectados foram mantidos em contato com o PZQ, diluído em água, nas
concentrações de 3x10
-5
, 10
-6
durante 24 horas. Após esse período, foram expostos à luz para
verificar a eliminação de cercárias e fixados para análise histopatológica. Observou-se a
ausência de cercárias nos caramujos expostos à droga. Nas análises histopatológicas,
verificou-se a presença de esporocistos jovens intactos e de cercárias em desenvolvimento,
porém poucas possuíam cauda.
Touassem & Combes (1986) submeteram caramujos B. glabrata infectados com S.
mansoni ao tratamento com PZQ por 48 horas. A droga, na concentração de 0,1%, foi
28
incorporada à alimentação dos moluscos e, após o tratamento, a eliminação de cercárias foi
avaliada semanalmente. Os resultados mostraram uma supressão imediata da eliminação de
cercárias, porém, esse período perdurou apenas alguns dias após o tratamento. No entanto, o
número de cercárias eliminadas permaneceu bem inferior aos números encontrados antes do
tratamento. Análises histopatológicas também foram realizadas. Para esse objetivo, caramujos
foram fixados durante e após o tratamento. Foi possível observar uma destruição total de
cercárias maduras e recém-formadas. O tegumento de esporocistos jovens e de embriões de
cercárias permaneceu intacto. Observou-se, ainda, que, durante o tratamento, os esporocistos
secundários não produziam cercárias, porém, ao final do tratamento, ocorria uma proliferação
intensa de esporocistos, bem como a formação de embriões de cercárias, o que explicaria o
reestabelecimento da eliminação de cercárias.
Em outro estudo, realizado por Riley & Chappell (1990), os caramujos foram tratados
com PZQ por 72 horas. A droga foi incorporada à ração dos moluscos, em diferentes
dosagens: 20, 29, 37µg/g. A avaliação da eliminação de cercárias foi realizada por até 8
semanas. Para a análise histopatológica, os caramujos foram fixados pós-tratamento e
observados à luz do microscópio óptico e eletrônico. Os resultados mostraram uma redução
de, aproximadamente, 90% no número de cercárias eliminadas. Essa redução ocorreu
imediatamente após o tratamento com a droga, permanecendo até a 8ª semana. Na análise
histopatológica, foi possível verificar a presença de várias cercárias desintegradas, embora
algumas permanecessem intactas. Não foi possível observar o processo de desintegração das
cercárias, fato esse que sugere uma ação rápida do PZQ sobre elas. Já os esporocistos
permaneceram com o tegumento intacto, o que favoreceu o reestabelecimento da eliminação
das cercárias.
Estudos avaliando a atividade do PZQ frente aos esporocistos de S. japonicum também
foram realizados. Yi & Combes (1987) submeteram moluscos Oncomelania hupensis,
infectados com 10 miracídios do parasito, ao tratamento com PZQ diluído em água, nas
concentrações 3x10
-5
, 10
-6
e 10
-7
por 24 horas, nos períodos pré-patente e patente da infecção.
Os resultados referentes ao tratamento no período pré-patente (18 dias p.i.) demonstraram um
desenvolvimento normal do parasito, mantendo-se o mesmo período pré-patente nos grupos
controles e tratados. Na análise histopatológica, observou-se a presença de embriões de
esporocistos jovens se desenvolvendo, sugerindo que os esporocistos primários não são
afetados pelo PZQ. Já o tratamento realizado no período patente da infecção gerou resultados
um pouco diferentes. Ocorreu uma supressão da eliminação de cercárias, que permaneceu por
aproximadamente 25 dias após o tratamento, sendo reestabelecida, em níveis baixos, após
esse período. Nos resultados da histopatologia, durante o tratamento, foi possível observar
29
algumas cercárias maduras mortas e esporocistos com tegumento intacto. Nesse estudo, os
autores sugerem que o “tratamento” de caramujos infectados com drogas esquistossomicidas
possa ser um método alternativo e barato para triagem de drogas, e ainda ser uma técnica útil
na comparação da sensibilidade de cepas de diferentes áreas geográficas.
1.5. Associação oxamniquina e praziquantel
A OXA e o PZQ possuem mecanismos de ação distintos. Dessa forma, a combinação
dessas duas drogas pode gerar um efeito sinérgico. De acordo com Delgado et al. (1992), a
associação de drogas em baixas dosagens pode ser a alternativa para melhorar a terapêutica de
algumas doenças. Essas associações, além de favorecerem a redução dos efeitos tóxicos
causados pela droga, podem dificultar o aparecimento de resistência, uma vez que essas serão
administradas em dosagens reduzidas.
Resultados distintos já foram obtidos, utilizando a associação OXA/PZQ. Alguns
estudos mostraram uma nítida ação sinérgica desta associação tanto em modelo experimental
quanto no homem (Shaw & Brammer, 1983; Campos et al., 1985; Zwingenberger et al., 1987;
Botros et al., 1989; Campos et al., 1989; Delgado et al., 1992), enquanto outros trabalhos não
obtiveram esta mesma resposta (Pugh & Teesdale, 1983; Creasy et al., 1986; Dietze & Prata,
1986; Gryscheck et al., 2004). Metodologias distintas, bem como a época do tratamento são
fatores que podem ter levado a resultados tão diferentes.
Oliveira (2005) realizou um estudo “in vitro”, utilizando a associação dessas duas
drogas. As lesões presentes do tegumento de vermes adultos expostos à associação OXA/
PZQ foram comparadas com as causadas pela exposição de vermes adultos à OXA e PZQ,
isoladamente. Por meio do uso de marcadores fluorescentes específicos, ficou claro que a
associação OXA/ PZQ foi muito mais eficaz em causar dano no tegumento dos parasitos do
que as drogas utilizadas isoladamente, o que demonstra, mais uma vez, a ação sinérgica
dessas drogas quando utilizadas em associação.
Outro ponto interessante envolvendo a ação sinérgica da associação OXA/ PZQ é o
fato do PZQ, segundo Cioli et al. (1995) e Pica Mattoccia & Cioli (2004), ser mais eficaz em
eliminar parasitos fêmeas, enquanto a OXA possui maior ação sobre os vermes machos.
Dessa forma, a associação dessas duas drogas teria um efeito complementar, levando à
redução de ambos os sexos do parasito.
30
1.6. Resistência ao praziquantel
A disponibilidade de uma droga com baixa toxicidade, administrada oralmente, em
dose única e com alta eficácia, possibilita o tratamento da população em larga escala. Porém,
o uso da quimioterapia em massa, como principal método de controle da esquistossomose em
áreas endêmicas, pode gerar o surgimento de cepas resistentes, através do mecanismo de
pressão seletiva (Coelho et al., 1997).
De acordo com Kinotti (1987), o S. mansoni possui a capacidade de desenvolver
resistência a doses terapêuticas de drogas, principalmente quando submetido a constante
pressão desses esquistossomicidas.
Diversos estudos já demonstraram a existência de cepas de S. mansoni resistentes ou
tolerantes ao PZQ, tanto no campo quanto em laboratório (Fallon et al., 1994, 1995; Stelma et
al., 1995; Ismail et al., 1996, 1999; Araújo et al., 1996; Bonesso-Sabadini & Dias, 2000).
A redução na eficácia do tratamento com PZQ envolve diversos fatores. As altas taxas
de infecção e re-infecção, o elevado número de vermes e a grande quantidade de vermes
imaturos no momento do tratamento podem levar a uma redução da sensibilidade às drogas
(Cioli, 2000; Doenhoff et al., 2002).
Vários parâmetros têm sido utilizados para definir a existência de cepas resistentes.
Recentemente, Cioli et al. (2004) avaliaram os valores de ED
50
(dose efetiva para matar 50%
dos vermes) para cepas sensíveis e resistentes ao PZQ. Os autores observaram que as cepas
resistentes possuem ED
50
três vezes maior do que as cepas sensíveis à droga. Além disso, a
taxa de eclosão de miracídios, o tempo necessário para que o PZQ altere a morfologia do
miracídio, bem como a taxa de cercárias que perdem a cauda em contato com PZQ, durante
um determinado tempo, já foram sugeridos como parâmetros para se definir a presença ou não
de resistência (Liang et al., 2000, 2001). No entanto, devido a diferenças na suscetibilidade ao
PZQ entre as espécies e linhagens de Schistosoma, esses ensaios devem ser melhor avaliados,
comparando-se as respostas das várias espécies e cepas (Liang et al., 2001).
Várias medidas têm sido sugeridas para se tentar reduzir o impacto da resistência a
drogas esquistossomicidas: (1) educação sanitária para evitar a reinfecção após o tratamento;
(2) aumento da vigilância pelos órgãos oficiais de saúde pública, para monitorar o
aparecimento de resistência; (3) desenvolvimento de técnicas simples e factíveis para a
detecção de cepas resistentes no campo; (4) desenvolvimento de novas drogas
esquistossomicidas; (5) associação de drogas (Bennett et al., 1997).
De acordo com Ross et al. (1993) e Liang et al. (2003), o processo de pressão
quimioterápica para seleção de resistência, utilizado em laboratório, é um processo importante
31
a ser utilizado, uma vez que esses parasitos resistentes podem ser a chave para elucidar os
mecanismos de ação de drogas. No entanto, segundo Fallon et al. (1996), os diversos
experimentos de indução de resistência, realizados em laboratório, utilizando sucessivas
passagens e tratamentos em camundongos, já publicados, são longos e utilizam metodologias
distintas, o que dificulta a comparação entre eles, impedindo, assim, uma análise mais
aprofundada dos resultados obtidos.
Em função das dificuldades de encontrar um método rápido e confiável para selecionar
linhagens de Schistosoma resistentes às drogas esquistossomicidas em laboratório e também
estabelecer novos modelos para triagem de novos compostos e combinações de drogas
esquistossomicidas, bem como, novos procedimentos para esclarecer os mecanismos de ação
dessas drogas, o presente trabalho foi conduzido, empregando as duas drogas mais utilizadas
na clínica para o tratamento da esquistossomose na fase intramolusco do S. mansoni. Dentro
das abordagens mencionadas, administramos as drogas, isoladamente ou em associação
utilizando caramujos experimentalmente infectados e esporocistos transformados “in vitro”.
32
2 Objetivo
2.1. Objetivo geral
O presente trabalho tem como objetivo estudar o efeito de drogas esquistossomicidas
na fase intramolusco do S. mansoni.
2.2. Objetivos específicos
1. Verificar o efeito do PZQ e da OXA sobre S. mansoni na fase intramolusco;
2. Verificar se existe efeito sinérgico da associação entre PZQ e OXA sobre a fase
inatramolusco do S. mansoni;
3. Descrever as possíveis alterações morfológicas e metabólicas causadas nos
esporocistos, quando expostos ao praziquantel, “in vitro”, utilizando microscopia óptica
comum, de fluorescência e laser confocal;
4. Verificar uma possível alteração na suscetibilidade da cepa LE ao PZQ, após
exposição prévia desta cepa à droga, na fase intramolusco do parasito.
33
3 Materiais e Métodos
3.1. Avaliação do efeito das drogas PZQ e OXA na fase intramolusco do parasito
Para verificar a ação do PZQ, da OXA, bem como da associação dessas duas drogas
na fase intramolusco do S. mansoni, seis experimentos distintos foram realizados, sendo três
no período pré-patente e outros três no período patente da infecção. No primeiro experimento,
realizado no período pré-patente e patente, utilizou-se PZQ e OXA, isoladamente, e nos
demais experimentos, as duas drogas em associação.
3.1.1. Caramujos e parasitos
Foram utilizados caramujos da espécie B. glabrata, linhagem Barreiro de Cima,
mantida rotineiramente por mais de 30 anos no Moluscário do Centro de Pesquisa René
Rachou (FIOCRUZ). Os parasitos utilizados foram S. mansoni da cepa LE, mantida por mais
de 35 anos no Moluscário/ Laboratório de Esquistossomose do Centro de Pesquisa René
Rachou (FIOCRUZ).
3.1.2. Infecção dos caramujos
Os caramujos foram expostos, individualmente, a 10 miracídios de S. mansoni (cepa
LE), segundo a técnica descrita por Souza (1993). Nos experimentos realizados no período
patente da infecção, trinta dias após a exposição aos miracídios, os caramujos foram expostos
à luz artificial, por 1 hora, para verificar a positividade. Os caramujos que eliminavam
cercárias foram selecionados para os experimentos. Já nos experimentos realizados no período
pré-patente, os caramujos foram tratados 18 dias após exposição aos miracídios.
3.1.3. Tratamento experimental
Neste estudo foram realizados seis experimentos, sendo que para cada experimento o
tratamento correspondia a cinco dias consecutivos de exposição dos caramujos à droga. As
drogas utilizadas foram incorporadas à ração da marca Nuvital - Nuvilab (composição: milho
integral, farelo de soja, farelo de trigo, carbonato de cálcio, fosfato bicálcio, cloreto de sódio,
premix vitamínico, aminoácidos) e fornecida como alimento para os moluscos, diariamente.
Essa ração foi autoclavada, triturada e a ela incorporados 10% de carbonato de cálcio. Para o
tratamento foi adicionada água, até que a ração adquirisse uma consistência pastosa e
possibilitasse a adição/ mistura da droga. Após a adição da droga, a mistura foi
34
homogeneizada e separada em porções de 100mg de ração, quantidade esta que corresponde à
alimentação diária de cada caramujo. Os caramujos foram pesados e a partir do peso obtido,
calculada a dosagem em mg/Kg. No primeiro e quarto experimentos, nos quais as drogas
foram utilizadas isoladamente, a dosagem fornecida foi de 500mg/Kg de OXA (Mansil -
Pfiser S.A) e 1000mg/Kg de PZQ (Cestox - MERCK). Nos experimentos restantes, as drogas
foram administradas em associação nas concentrações de 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de
PZQ. O número de caramujos por grupo e o número de tratamentos variou entre os seis
experimentos. No primeiro experimento foram formados grupos com 15 caramujos cada e
estes caramujos foram tratados no período pré-patente da infecção uma única vez. No
segundo e terceiro experimentos foram formados grupos com 30 caramujos cada, e as drogas
foram administradas em associação, no período pré-patente. Porém, no segundo experimento,
os caramujos foram tratados uma vez, enquanto, no terceiro, os grupos foram tratados duas
vezes. No quarto experimento, os caramujos foram tratados apenas uma vez no período
patente da infecção e os grupos possuíam 15 caramujos cada. No quinto experimento, os
caramujos foram tratados uma vez no período patente e os grupos foram formados contendo
30 caramujos cada. No sexto e último experimento, os grupos possuíam 50 caramujos cada e
os caramujos foram tratados no período patente por duas vezes. No primeiro e quarto
experimentos, chamamos de IOR e IPR os caramujos infectados e tratados com OXA e PZQ,
respectivamente. Havia também caramujos não infectados e tratados com OXA (NOR) e
tratados com PZQ (NPR). Nos demais experimentos, chamamos de IT o grupo de caramujos
infectados e tratados e de NT caramujos não infectados e tratados. Para todos os
experimentos, foram formados grupos controles, não tratados, de caramujos infectados (I) e
não infectados (N). Estes foram mantidos sob as mesmas condições dos grupos tratados,
porém, sem exposição à droga. Nos experimentos realizados no período pré-patente, os
caramujos foram tratados no 18º dia após a exposição aos miracídios (primeiro e segundo
experimentos) e também no 32º dia após a infecção (terceiro experimento). Os caramujos dos
experimentos do período patente foram tratados aos 32 dias após a exposição aos miracídios
(quarto e quinto experimentos) e também aos 42 dias após a infecção, no sexto experimento.
Durante todo o experimento, os caramujos foram mantidos individualmente em copos
plásticos. Os grupos experimentais e os tratamentos utilizados estão descritos no Quadro 1.
35
Quadro 1 - Grupos experimentais e tratamentos
1º Experimento
Pré-Patente
Grupo/ n
n° de
tratamentos
Tratamento
IOR/ 15 1 500mg/Kg de OXA
NOR/ 15 1 500mg/Kg de OXA
IPR/ 15 1 1000mg/Kg de PZQ
NPR/ 15 1 1000mg/Kg de PZQ
I/ 15 _ Controle
N/ 15 _ Controle
2º Experimento
Pré-Patente
IT/ 30 1 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de PZQ
NT/ 30 1 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de PZQ
I/ 30 _ Controle
N/ 30 _ Controle
3º Experimento
Pré-Patente
IT/ 30 2 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de PZQ
NT/ 30 2 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de PZQ
I/ 30 _ Controle
N/ 30 _ Controle
4º Experimento
Patente
IOR/ 15 1 500mg/Kg de OXA
NOR/ 15 1 500mg/Kg de OXA
IPR/ 15 1 1000mg/Kg de PZQ
NPR/ 15 1 1000mg/Kg de PZQ
I/ 15 _ Controle
N/ 15 _ Controle
5º Experimento
Patente
IT/ 30 1 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de PZQ
NT/ 30 1 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de PZQ
I/ 30 _ Controle
N/ 30 _ Controle
6º Experimento
Patente
IT/ 50 2 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de PZQ
NT/ 50 2 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de PZQ
I/ 50 _ Controle
N/ 50 _ Controle
IOR: caramujos expostos aos miracídios e tratados com OXA; NOR: caramujos não expostos aos miracídios e
tratados com OXA; IPR: caramujos expostos aos miracídios e tratados com PZQ; NPR: caramujos não expostos aos
miracídios e tratados com PZQ; IT: caramujos expostos aos miracídios e tratados com OXA + PZQ; NT: caramujos
não expostos aos miracídios e tratados com OXA + PZQ; N: caramujos não expostos aos miracídios e não tratados;
I: caramujos expostos aos miracídios e não tratados.
3.1.4. Avaliação da eliminação de cercárias
Os caramujos foram examinados, para verificar a eliminação de cercárias, antes do
tratamento e semanalmente, após o tratamento. A quantificação das cercárias foi realizada por
amostragem. Os caramujos foram colocados, individualmente, em beckers pequenos,
contendo 4 mL de água sem cloro e expostos à luz artificial por uma hora. O líquido contendo
36
cercárias foi transferido para tubos cônicos de 10mL e mantidos a 5ºC por, aproximadamente,
3 horas. Após esse período, o sobrenadante foi descartado e acrescentados 3mL de formol a
10%. No momento da quantificação, a solução de formol contendo cercárias foi
homogeneizada, e 1mL de cada tubo foi transferido para uma placa escavada e contado,
utilizando-se microscópio estereoscópio. O número final de cercárias foi multiplicado por 3
(total de mililitros contidos em cada tubo).
3.2. Experimentos “in vitro”
Os experimentos “in vitro” foram realizados visando verificar a ação do PZQ sobre
esporocistos de S. mansoni transformados “in vitro”, por meio do uso de sondas fluorescentes.
3.2.1. Obtenção e transformação “in vitro” de miracídios em esporocistos primários
Dez camundongos infectados com 100 cercárias da cepa LE de S. mansoni foram
sacrificados, aos 50 dias de infecção, por deslocamento cervical. Com auxílio de pinça e
tesoura, tiveram as vísceras expostas e o fígado retirado. O fígado foi mantido em salina
0,85%, contendo 10% de antibiótico penicilina/estreptomicina (Sigma Chemical Co. St.
Louis, MO, USA; 10.000 unidades de penicilina e 10mg de estreptomicina/ml) por 30
minutos, à temperatura ambiente, em capela de fluxo laminar. Após esse período, os fígados
foram triturados e lavados, seguindo-se a técnica descrita por Pelegrino & Katz (1968),
resumidamente: os fígados, em salina 0,85%, foram triturados por aproximadamente 5
minutos em liquidificador, previamente esterilizado com álcool 70% e luz UV por 20
minutos. O líquido, contendo os fígados já triturados, foi “filtrado” com ajuda de uma gaze,
colocado em um cálice e o volume completado com salina 0,85%, para 1litro. O líquido foi
deixado no escuro, à temperatura ambiente, por 30 minutos, para sedimentar. Após a
sedimentação, o sobrenadante foi retirado, com auxílio de bomba de vácuo e o volume
novamente completado para 1L, agora com água desclorada. O líquido foi deixado sob as
mesmas condições da lavagem anterior, no entanto, por 20 minutos. Este último procedimento
foi realizado duas vezes. Após as três lavagens, o sedimento restante foi colocado em balão
volumétrico e coberto com papel alumínio, de maneira que apenas uma pequena parte da
abertura do balão permanecesse descoberta. O balão foi exposto à luz artificial, favorecendo,
assim, a eclosão e a visualização dos miracídios, devido ao fototropismo positivo.
Os miracídios foram coletados em tubos Falcon de 50mL (aproximadamente 8 tubos)
e mantidos no gelo por aproximadamente 30 minutos. Após esse tempo, o sobrenadante foi
retirado e mantidos 5mL do líquido em cada tubo. Os líquidos contendo os miracídios foram
37
então transferidos para um único tubo e mantidos novamente por 30 minutos no gelo. Parte do
sobrenadante foi retirada, restando, mais uma vez, 5mL de líquido contendo os miracídios.
O cultivo/transformação dos miracídios foi realizado em meio de cultura RPMI – 1640
pH 7,4 (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA) suplementado com 5%(v/v) de soro
bovino fetal inativado (SBF) (Gibco Limited, Paisley, Scotland) e 20µg/mL de antibiótico
gentamicina (Garamox – 80mg/ Hipolabor). Em garrafas de 25cm
2
(Sarstedt), próprias para
cultura de células, foi adicionado 1mL do líquido contendo os miracídios para 15mL do meio
de cultura já suplementado. As garrafas foram mantidas fechadas, em estufa incubadora
B.O.D., a 26°C, por 24 horas. Passado esse período, as garrafas foram retiradas da B.O.D.,
observadas em microscópio invertido (Zeiss), para verificar a liberação da placa ciliar
miracidiana, o que caracteriza a transformação.
O conteúdo das garrafas foi transferido para dois tubos Falcon de 50mL e estes,
mantidos à temperatura ambiente por 30 minutos. Após esse período, retirou-se o
sobrenadante, mantendo-se, aproximadamente, 5mL em cada tubo. Todo o líquido foi
transferido para um único tubo e o volume completado para 50mL, com meio de cultura
RPMI – 1640 (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA) não suplementado, em temperatura
ambiente. O tubo foi mantido por mais 30 minutos sob as mesmas condições anteriores. Após
os 30 minutos, o sobrenadante foi retirado, permanecendo apenas 5mL do líquido contendo os
esporocistos. Ao final desse procedimento, os esporocistos foram utilizados em experimentos
distintos.
Alguns materiais utilizados nesse procedimento foram adquiridos estéreis, enquanto
outros foram esterilizados em autoclave, incluindo a salina e a água desclorada.
3.2.2. Marcação dos parasitos com sondas fluorescentes
Experimentos distintos, utilizando tipos diferentes de sonda, foram realizados, visando
verficar a presença de compartimentos ácidos, semelhantes a lisossomos, bem como avaliar a
ação do PZQ sobre esses compartimentos e sobre a superfície da membrana dos esporocistos.
a) Hoechst 33258
A sonda Hoechst 33258, (bis benzamida) (2,4 hidroxifenil 5, 4 metil, 1 piperazina 2,5
bi H-benzimidazol), é um marcador que possui afinidade por DNA, só se tornando
fluorescente quando se liga a este. Posssui, ainda, um carater hidrofílico e, devido a isso, não
consegue se difundir para o interior das células. Essas características o tornam um indicador
de integridade de membrana, uma vez que só se ligará ao DNA da célula quando houver
algum tipo de lesão. Esta sonda absorve luz no comprimento de onda de 455nm e emite luz no
38
comprimento de onda 352nm, espectro visível, azul. A Hoechst 33258, utlizada neste estudo,
foi obtida da Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA, sob a forma de pó e diluída em água
destilada, obtendo-se uma solução estoque com concentração final de 10mg/mL.
b) Lectina de Glicine max (soybean) (SBA) conjugada a tetrametil rodamina
isotiocianato (TRITC)
A lectina de Glicine max se liga a carboidratos de membrana, mais especificamente a
N-acetilgalactosamina (fração glicídica de glicolipídeos e glicoproteínas), composto
abundante nas membranas celulares. A lesão da membrana celular pode levar à exposição de
N-acetilgalactosamina, a qual irá se ligar à lectina de Glicine max que, por sua vez, está ligada
ao fluoróforo TRITC (tetrametil rodamina isotiocianato). Assim, esta sonda absorve luz no
comprimento de onda de 543nm e emite luz no comprimento de onda 571nm, espectro
visível, vermelho. A fluorescência proveniente da TRITC, determina o local no qual ocorreu a
exposição de N-acetilgalactosamina. A lectina de Glicine max foi obtida da Sigma Chemical
Co. St. Louis, MO, USA, sob a forma de pó e diluída em meio de cultura RPMI-1640 (Sigma
Chemical Co. St. Louis, MO, USA), obtendo-se uma solução estoque com concentração de
1mg/mL.
c) LysoTracker Red DND 99
A sonda LysoTracker Red (C
20
H
24
BF
2
N
5
O) é um marcador acidotrópico, específico
para lisossomos e compartimentos ácidos em células vivas. A sonda absorve luz no
comprimento de onda de 450nm e emite luz no comprimento de onda 590nm, espectro
visível, vermelho. A LysoTracker Red, utilizada neste trabalho, foi obtida da Molecular
Probes, Eugene, Ore, sob a forma líquida (1mM), sendo diluídos 10μL em 1mL meio de
cultura RPMI – 1640 (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA), perfazendo a concentração
final de 0,001mM.
3.2.3. Experimento 1 – Avaliação da ação do PZQ sobre esporocistos transformados
“in vitro”
Após a transformação dos miracídios “in vitro” para obtenção dos esporocistos, 1mL
de meio RPMI – 1640 (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA), contendo os parasitos, foi
distribuído em cada um dos três tubos Falcon de 15mL. Em dois dos três tubos foram
adicionados, respectivamente, 10μL de uma solução estoque de PZQ 0,1mg/mL
(concentração final 1μg/mL) e 10μL de PZQ a 0,5 mg/mL (concentração final 5μg/mL). No
tubo controle foram adicionados 10μL de metanol, uma vez que o PZQ foi diluído em
39
metanol. Os esporocistos foram incubados em estufa a 37°C e 5% de CO
2
, por 15 minutos.
Após esse período, foram confecionadas lâminas e, em seguida, observadas em microscópio
óptico comum.
3.2.4. Experimento 2 – Avaliação do efeito do PZQ sobre a membrana de esporocistos
transformados “in vitro”
Para realização deste experimento, 1mL de meio RPMI – 1640 (Sigma Chemical Co.
St. Louis, MO, USA), contendo esporocistos, foi transferido para cada um dos três tubos
Falcon de 15mL. Dois experimentos foram realizados em paralelo, nos quais se empregaram
marcadores distintos. Para a sonda Hoechst 33258 (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO,
USA), 5µL do marcador (solução estoque 10mg/mL) foram adicionados a cada tubo. Os
parasitos foram incubados por 30 minutos, em estufa a 37°C e 5% de CO
2
. Após a incubação,
foram adicionados ao primeiro tubo 10µL de solução estoque de PZQ a 0,5mg/mL, e no
segundo 10µL de solução estoque de PZQ a 1mg/mL, perfazendo uma concentração final de
5µg/mL e 10µg/mL, respectivamente. Ao terceiro tubo, controle do experimento, foram
acrescentados 10µL de metanol. Os esporocistos foram, então, incubados novamente, agora
por 15 minutos, sob as mesmas condições anteriores. Após a incubação, foram preparadas
lâminas e examinadas em microscópio de fluorescência. No caso do marcador lectina Glicine
max (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA), adicionaram-se 5µL do marcador (solução
estoque 1mg/ml). A partir dessa etapa, o mesmo protocolo foi empregado. No entanto, após a
incubação, foram preparadas lâminas e estas foram examinadas em microscópio laser
confocal.
3.2.5. Experimento 3 – Avaliação da presença de lisossomos em esporocistos e da ação
do PZQ sobre essas organelas ácidas
Neste experimento, 1mL de meio RPMI-1640 (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO,
USA), contendo esporocistos primários, foi transferido para cada um dos três tubos Falcon de
15mL. Esses esporocistos foram marcados com 20µL de uma solução estoque de 0,001mM da
sonda Lysotracker Red (Molecular Probes, Eugene, Ore) e incubados em estufa a 37° C e 5%
de CO
2,
por 30 minutos. Após esse período, a um dos tubos foram adicionados 10µL de
solução estoque de PZQ a 0,5mg/mL, e a um outro, 10µL de solução estoque de PZQ a
1mg/mL, perfazendo uma concentração final de 5µg/mL e 10µg/mL, respectivamente. Ao
terceiro tubo, foram adicionados 10µL de metanol, utilizado como controle do experimento.
40
Os esporocistos foram incubados por 15 minutos, em estufa a 37°C e 5% de CO
2.
Após esse
período, foram confeccionadas lâminas e examinadas em microscópio laser confocal.
3.2.6. Fluorescência (Microscopia de Fluorescência e Laser Confocal)
O fenômeno da fluorescência pode ser descrito, resumidamente, como um tipo de
emissão de luz (luminescência) em que um corpo (sonda fluorescente ou fluoróforo) absorve
luz e logo depois a emite. A absorção de luz ocorre de uma fonte de energia, que, no caso da
microscopia de fluorescência, provém de fótons emitidos de uma radiação luminosa (lâmpada
incandecente de mercúrio, UV). A imagem gerada pode ser visualizada diretamente através
das lentes oculares do microscópio ou capturada em máquina fotográfica acoplada a este. Na
microscopia laser confocal, a formação da imagem ocorre de forma diferente. A luz emitida
pelo corpo fluorescente será absorvida por um ou mais feixes de luz (lasers) que captam
intervalos de comprimento de ondas específicos. O Microscópio Laser Confocal (MLC)
utilizado possui três lasers: o Argônio, que emite freqüências de quatro comprimentos de onda
diferentes - 458, 477, 488 e 514nm; o Hélio/Neônio 1 - 543nm e o Hélio/Neônio 2 - 633nm.
O MLC gera uma imagem que é digitalizada e visualizada na tela do computador. A principal
vantagem do MLC sobre a microscopia de fluorescência é o fato de o MLC ter a capacidade
de excluir a fluorescência emitida por pontos que estejam fora do foco desejado, permitindo a
formação de imagens de melhor qualidade, sem a interferência de regiões que não possuem
interesse no estudo. No entanto, as duas técnicas são complementares, permitem detectar
componentes particulares de um complexo biomolecular, inclusive de células vivas, ajudando
na visualização de estruturas, compostos ou processos em curso em um determinado material
em estudo.
3.2.7. Preparo e leitura das lâminas
Ao final de cada experimento, foram confeccionadas lâminas para análise. Porém, as
preparações foram realizadas de maneiras distintas, em conformidade com a técnica de
microscopia utilizada. Para análise em microscópio óptico comum e de fluorescência, as
lâminas foram preparadas da seguinte forma: duzentos microlitros do líquido contendo os
esporocistos foram transferidos para lâminas delimitadas por pequenas quantidades de
vaselina, a fim de se evitar o extravasamento dos parasitos da lâmina e o achatamento deles,
após a colocação da lamínula. Para análise em microscópio laser cofocal, as lâminas foram
preparadas de outra maneira. Por se tratar de um microscópio invertido, no qual, para leitura,
a lamínula deve estar voltada para baixo, em contado com as objetivas, apenas 40µL do
41
líquido contendo os esporocistos foram transferidos para lâmina. As lâminas também foram
delimitadas com vaselina e montadas com lamínula. Após essa etapa, a lamínula foi selada
com esmalte, para assegurar o não extravasamento do líquido da lâmina, fato que poderia
danificar as objetivas no momento da análise. As lâminas foram observadas em microscópio
óptico de fluorescência (K - Zeiss), utilizando filtro DAPI para Hoechst 33258. O exame do
material no microscópio laser confocal foi realizado, utilizando o modelo Zeiss LSM 510
(Laboratório de Entomologia Médica/ CPqRR). O laser empregado foi o Hélio/Neônio 1
(543nm) com filtro Rodamina para lectina de Glicine max TRITC e LysoTracker Red. A
sonda Hoechst 33258 não foi analisada em microscopia confocal, uma vez que não há filtro
adequado para leitura deste marcador no microscópio usado.
3.2.8. Imagens fotográficas
As imagens deste estudo, geradas pela análise em microscópio óptico comum e de
fluorescência, foram obtidas com máquina fotográfica digital Nikon 4.0 megapixel,
gentilmente cedida pelo Dr. Luciano Andrade Moreira (Laboratório de Malária/ CPqRR).
3.3. Avaliação da suscetibilidade do S. mansoni ao PZQ após vários tratamentos na
fase intramolusco
Para verficar se o PZQ é capaz de gerar alguma alteração na suscetibilidade do S.
mansoni, caso caramujos infectados sejam submetidos a sucessivos tratamentos com esta
mesma droga, o seguinte esquema experimental foi desenvolvido.
3.3.1. Primeira Etapa
3.3.1.1.Caramujos e parasitos
Caramujos da espécie B. glabrata, mantidos rotineiramente pelo Moluscário do Centro
de Pequisa René Rachou/ FIOCRUZ foram utilizados. Os parasitos usados foram S. mansoni,
da cepa LE, mantida no Centro de Pesquisa René Rachou/ FIOCRUZ.
3.3.1.2.Infecção dos caramujos
Os caramujos foram expostos a 10 miracídios de S. mansoni (cepa LE), segundo a
técnica descrita por Souza (1993). Trinta dias após a exposição aos miracídios, os caramujos
foram expostos à luz artificial, por 1 hora, para verificar a presença de cercárias.
42
3.3.1.3.Tratamento experimental
Os caramujos que eliminavam cercárias foram separados em grupos contendo 50
exemplares cada. Foram formados os seguintes grupos: caramujos infectados e tratados com
PZQ (IT) e caramujos infectados e não tratados (I). Para cada um desses grupos, foram
formados grupos controles contendo 30 caramujos cada: caramujos não expostos aos
miracídios e tratados com PZQ (NT) e caramujos não expostos aos miracídios e não tratados
(N). Os caramujos foram pesados e com a média do peso encontrada foi realizado o cálculo
de 500mg/Kg (1° experimento) e 100mg/Kg (2° experimento) de PZQ, que foi incorporada à
100mg de ração, para cada caramujo. Esses caramujos foram mantidos individualmente, em
copos plásticos com 200mL de água desclorada e tratados três vezes durante 5 dias
consecutivos. No 5º dia, após o término do tratamento, os caramujos foram examinados e no
dia seguinte (6º dia após o término do tratamento), iniciado o tratamento subseqüente. Ao
final do terceiro tratamento, os caramujos passaram a ser examinados semanalmente.
A ração utilizada para a incorporação da droga/ alimentação dos caramujos foi ração
para camundongo da marca Novital (COMPOSIÇÂO). Essa ração foi autoclavada, triturada e
a ela incorporados 10% de carbonato de cálcio. Para o tratamento foi adicionado água, até que
a ração adquirisse uma consistência pastosa e possibilitasse a adição/ mistura da droga. Após
a adição da droga, a mistura foi homogeneizada e separada em porções de 100mg de ração,
quantidade esta que corresponde à alimentação diária de cada caramujo. Os caramujos não
tratados foram mantidos nas mesmas condições, porém alimentados com alface.
Para avaliação da eliminação de cercárias, os caramujos foram expostos à luz artificial
por 1 hora, individualmente. Os moluscos foram examinados semanalmente, após o término
do terceiro e último tratamento. Os camundongos foram infectados, para a continuidade dos
estudos, na semana em que os caramujos voltaram a eliminar cercárias em número suficiente
para o inóculo individual.
3.3.2. Segunda Etapa
3.3.2.1.Animais e parasitos
Camundongos suíços, fêmeas, com aproximadamente 20g foram utilizados como
modelo experimental nesta segunda fase do experimento. Para a infecção desses
camundongos, foram utilizadas cercárias da cepa LE de S. mansoni, submetida a 3
tratamentos prévios com PZQ na fase intramolusco, esta chamada de LE-PZQ, e cercárias da
cepa LE não submetida ao tratamento com PZQ, que serviu como base de comparação.
43
3.3.2.2.Infecção dos camundongos
Caramujos B. glabrata infectados com a cepa chamada LE-PZQ e LE (controle) foram
expostos à luz artificial, individualmente, por 2 horas. Após esse período, o líquido contendo
as cercárias foi transferido para um único recipiente, obtendo um “pool” de cercárias LE-PZQ
e outro LE. De cada becker, foi retirada uma alíquota de aproximadamente 0,3mL e
distribuída em uma placa escavada. As cercárias foram mortas com lugol e contadas com o
auxílio de lupa. As alíquotas foram ajustadas, a fim de se obter uma concentração equivalente
a 25 ±5 cercárias, em um volume de 0,3mL.
Os camundongos foram inoculados no dorso, individualmente, por via subcutânea,
segundo a técnica de Pellegrino e Katz (1968). A infecção foi realizada utilizando uma
seringa de aço-inox com volume ajustável. Cinqüenta camundongos foram infectados com 25
±5 cercárias LE-PZQ e outros cinqüenta com 25 ±5 cercárias da cepa LE, em um volume final
de inoculo de 0,3mL por animal.
3.3.2.3. Tratamento experimental
Aos 45 dias de infecção, os animais foram divididos em 8 grupos, 4 com
camundongos infectados com cepa LE e outros 4 com LE-PZQ, cada grupo contendo 12
animais. Os camundongos foram pesados individualmente e os cálculos da dose da droga
realizados também individualmente. Os camundongos foram tratados com PZQ (Cestox -
MERCK) nas dosagens de 200, 400 e 800mg/kg, e grupos controles, não tratados, também
foram mantidos nas mesmas condições. Os comprimidos foram pesados e, posteriormente,
realizado o cálculo do fator de correção (considerando-se apenas o princípio ativo, excluindo-
se o excipiente). Com ajuda de pistilo, os comprimidos foram macerados e diluídos em água.
A droga foi administrada com auxílio de seringa de gavagem por via oral, em dose única.
Dois experimentos, seguindo o mesmo protocolo, foram realizados, em tempos distintos, para
verificar a reprodutibilidade dos resultados. Os grupos e os esquemas terapêuticos utilizados
estão descritos no Quadro 2.
Quadro 2 - Esquemas terapêuticos
Grupos Infecção Dosagem (PZQ)
1 LE 200mg/Kg
2 LE-PZQ 200mg/Kg
3 LE 400mg/Kg
4 LE-PZQ 400mg/Kg
5 LE 800mg/Kg
6 LE-PZQ 800mg/Kg
7 LE Controle
8 LE-PZQ Controle
44
LE-PZQ: cepa LE de S. mansoni submetida a três tratamentos na fase intramolusco do
parasito; LE: cepa de S. mansoni não submetida a tratamento com PZQ (controle).
3.3.2.4.Recuperação de vermes
Trinta dias após o tratamento, os grupos tratados foram sacrificados por fratura
cervical (exceto os grupos controles, que foram sacrificados 45 dias após a infecção). A
perfusão foi realizada seguindo-se em linhas gerais a técnica descrita por Pellegrino e
Siqueira (1956), resumidamente: conteúdo visceral foi exposto; fígado e mesentério separados
pela ligadura da veia renal e a veia porta seccionada. Com o auxílio de uma agulha, acoplada
a um pipetador automático (Brewer), injetou-se solução salina 0,85% heparinizada, na aorta
descendente, permitindo, assim, a perfusão do sistema porta e das veias mesentéricas,
recuperando-se os vermes presentes. Adicionalmente foi realizada a perfusão do fígado
através da injeção de salina 0,85%, heparinizada, no hilo hepático. Os vermes foram, então,
coletados em beckers de 200mL, contados e separados em macho e fêmea com auxílio de
lupa.
Como mencionado acima, quarenta e cinco dias após a infecção, os camundongos dos
grupos controle LE e LE-PZQ foram sacrificados e perfundidos. O fígado desses
camundongos foi processado de acordo com Pelegrino & Katz (1968) para obtenção de
miracídios e posterior infecção de caramujos. Seguindo o mesmo protocolo dos experimentos
anteriores, trinta dias após a infecção, os caramujos foram examinados para verificar a
presença de cercárias. No entanto, os caramujos não foram tratados; as cercárias, sem passar
por um novo tratamento, foram utilizadas para infectar 50 camundongos com 25±5 cercárias
da cepa LE e outros 50 camundongos com 25±5 cercárias da cepa LE-PZQ. Esses
camundongos foram separados em grupo e tratados seguindo, o mesmo protocolo dos
experimentos anteriores, com exceção do tratamento com 200mg/Kg, que não foi realizado
devido ao número insuficiente de camundongos. Esse experimento foi chamado de
experimento passagem 1.
3.4. Análise Estatística
A análise do efeito das drogas esquistossomicidas, OXA e PZQ, na fase intramolusco
do parasito, foi realizada empregando-se o Teste de Kruskal-Wallis seguido das comparações
múltiplas de Dunn’s ou Tukey (1º e 4º experimentos) e Mann-Whitney (nos demais
experimentos). No 5º experimento foi, ainda, realizada uma análise complementar utilizando-
se o teste Kruskal-Wallis seguido das comparações múltiplas de Tukey, para comparar o
45
mesmo grupo nos vários exames. Com esses testes, foi possível verificar a ação das drogas
nos diferentes tempos examinados, em um mesmo grupo, podendo-se obter, ao final da
análise, uma cinética da eliminação de cercárias para cada um dos grupos. Para realizar a
avaliação do efeito das drogas, levando em consideração o grupo controle, foi utilizado, em
todos os experimentos, o teste de Kruskal-Wallis, seguido das comparações múltiplas de
Dunn’s, que permitem comparar simultaneamente os grupos tratados e não tratado (controle)
nos diferentes períodos considerados.
Para verificar uma possível alteração na suscetibilidade da cepa LE-PZQ, em função
da pré-exposição de caramujos infectados ao PZQ, testes analíticos comparando-se o número
de vermes recuperados foram realizados. Uma comparação entre a média de vermes
recuperados dos camundongos infectados com a cepa LE e LE-PZQ tratados com dosagem
específica de PZQ (200, 400 ou 800mg/Kg) foi realizada. Para isso, utilizou-se o teste de
Mann-Whitney, no caso de dados não paramétricos, e o Teste t de Student, se paramétricos,
isto é, ajustando-se à curva normal de Gauss. Avaliou-se, ainda, o efeito das diferentes
dosagens de PZQ (200, 400 e 800mg/Kg) sobre os vermes da cepa LE e LE-PZQ,
separadamente. Utilizou-se como padrão de comparação a média de vermes recuperados dos
grupos controles LE e LE-PZQ, não submetidos ao tratamento com PZQ. O teste utilizado foi
o não paramétrico de Kruskal -Wallis, seguido das comparações múltiplas de Dunn’s.
A reprodutibilidade dos experimentos 1 e 2 foi verificada, comparando-se o número de
vermes recuperados nos grupos infectados com a mesma cepa e tratados com a mesma
dosagem de PZQ, porém realizados em épocas diferentes. Utilizou-se, então, Teste t, quando
os dados ajustavam-se à distribuição normal de Gauss, e o teste não paramétrico de Mann-
Whitney, quando isso não ocorria.
Todas as análises deste estudo foram realizadas com 5% de significância, utilizando-se
os programas estatísticos MINITAB 13 e PRISMA 3.
46
4 Resultados
4.1. Avaliação do efeito das drogas PZQ e OXA na fase intramolusco do parasito
Caramujos positivos (eliminando cercárias) foram tratados na fase pré-patente ou
patente com 500mg/Kg de OXA, 1000mg/Kg de PZQ ou 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de
PZQ. A ação dessas drogas na fase intramolusco do parasito foi avaliada mediante a
comparação entre a média de cercárias eliminadas pelos grupos tratados e não tratados, nos
diferentes exames realizados. Seis experimentos distintos foram realizados e analisados
separadamente. Esses experimentos foram divididos em Período Pré-Patente (1º, 2º e 3º
experimentos) e Período Patente (4º, 5º e 6º experimentos).
Período Pré-Patente
1º Experimento
Neste primeiro experimento, o tratamento dos caramujos ocorreu aos 18 dias após a
exposição aos miracídios. Nove exames pós-tratamento foram realizados, sendo estes 14, 21,
28, 35, 42, 49, 56, 63 e 70 dias pós-tratamento. Quatorze dias após o tratamento, observou-se
que 100% caramujos pertencentes aos grupos tratados com OXA (IOR) e com PZQ (IPR)
encontravam-se negativos, sendo estatisticamente diferentes (p = 0,03) da média de cercárias
eliminadas pelos caramujos do grupo controle não tratado (I). Vinte e um dias após o término
do tratamento, 50% dos caramujos do grupo IOR e IPR permaneciam sem eliminar cercárias.
No entanto, não foi encontrada diferença estatisticamente significativa (p>0,05), neste
segundo exame, quando comparamos o número de cercárias eliminadas pelos grupos IOR e
controle. Entretanto, a comparação entre o grupo IPR e controle revelou uma diferença
estatisticamente significativa entre esses dois grupos (p = 0,026). Isso é possível já que a
média de cercárias eliminadas pelo grupo IPR foi menor do que a média do grupo IOR. No
terceiro exame realizado, ainda foi possível encontrar diferença estatisticamente significativa
entre o grupo IPR e controle (I) (p<0,05). A partir do quarto exame, não foram encontradas
diferenças estatisticamente significativas entre o número de cercárias eliminadas pelos grupos
IOR e IPR quando comparados com o controle, embora, em ambos os grupos tratados,
houvesse caramujos negativos (Gráfico 1). Ao final do experimento, apenas 2 dos 8
caramujos vivos do grupo IOR, permaneciam negativos, enquanto, no grupo IPR, 100% dos
caramujos voltaram a eliminar cercárias.
47
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
1º exam e 2º exame 3º exame 4º exame 5º exam e 6º exam e 7º exame 8º exame 9º exam e
média de cercárias eliminadas
I
IOR
IPR
Gráfico 1 - Gráfico referente às médias de cercárias eliminadas e ao desvio padrão nos nove exames realizados
no 1º experimento (período pré-patente) para avaliação do efeito das drogas na fase intramolusco do parasito. I:
caramujos infectados e não tratados; IOR: caramujos infectados e tratados com 500mg/Kg de OXA; IPR:
caramujos infectados e tratados com 1000mg/Kg de PZQ.
Ambas as drogas retardaram o desenvolvimento do parasito em, aproximadamente, 10
dias. O tratamento com PZQ manteve uma redução da eliminação de cercárias por um período
maior do que o tratamento com OXA. Observou-se que o tratamento, independente da droga
utilizada, não levou à morte dos caramujos, uma vez que o número de caramujos vivos ao
final do experimento, nos grupos de caramujos não expostos aos miracídios tratados com
OXA (NOR) e tratados com PZQ (NPR), foi o mesmo no grupo de caramujos não expostos
aos miracídios não tratados (N), 15. Já a infecção, independente da presença ou não do
tratamento, causou a mortalidade de, aproximadamente, 50% dos grupos IOR, IPR e I
(Gráfico 2).
48
0
2
4
6
8
10
12
14
16
1º
exame
2º
exame
3º
exame
4º
exame
5º
exame
6º
exame
7º
exame
8º
exame
9º
exame
nº de caramujos vivos
I
IOR
IPR
N
NOR
NPR
Gráfico 2 - Cinética da mortalidade dos caramujos pertencentes ao 1º experimento. I: caramujos infectados e não
tratados; IOR: caramujos infectados e tratados com 500mg/Kg de OXA; IPR: caramujos infectados e tratados
com 1000mg/Kg de PZQ; N: caramujos não infectados e não tratados; NOR: caramujos não infectados e tratados
com 500mg/Kg de OXA; NPR: caramujos não infectados e tratados com 1000mg/Kg de PZQ.
2º Experimento
Seis exames foram realizados neste segundo experimento, sendo estes 14, 21, 28, 35,
42 e 49 dias após o tratamento. Demonstrou-se que o tratamento, aos 18 dias de infecção com
a associação de 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de PZQ, gerou, até o 4º exame (35 dias pós-
tratamento), uma diferença estatisticamente significativa (p<0,002) na média de cercárias
eliminadas pelo grupo tratado (IT) em relação ao grupo não tratado (I) (Gráfico 3). No
primeiro exame realizado, todos os caramujos do grupo IT permaneciam negativos, enquanto
os caramujos do grupo controle (I) estavam eliminando uma média de 1240 cercárias por
caramujo.
49
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
1º exam e 2º exame 3º exame 4º exame 5º exam e 6º exam e
média de cercárias eliminadas
I
IT
Gráfico 3 - Gráfico referente às médias de cercárias eliminadas e ao desvio padrão nos seis exames realizados no
2º experimento (período pré-patente) para avaliação do efeito das drogas na fase intramolusco do parasito. I:
caramujos infectados e não tratados; IT: caramujos infectados e tratados uma vez com 250mg/Kg de OXA +
500mg/Kg de PZQ.
O tratamento com a associação das drogas retardou o desenvolvimento do parasito
sendo, o período pré-patente do grupo tratado maior do que o do grupo controle. Quatorze
caramujos do grupo I, 22 caramujos do grupo IT e 28 caramujos não expostos aos miracídios
e tratados (NT) e não tratados (N) permaneceram vivos até o final do experimento (Gráfico
4), mostrando que um tratamento com a associação OXA/PZQ não é responsável pela morte
dos caramujos, já que os caramujos IT sobreviveram mais do que os caramujos infectados e
não tratados (I) e os caramujos do grupo NT sobreviveram em mesmo número que os
caramujos do grupo N.
0
5
10
15
20
25
30
35
1º exame 2º exame 3º exame 4º exame 5º exame 6º exame
nº de caramujos vivos
I
IT
N
NT
50
Gráfico 4 - Cinética da mortalidade dos caramujos pertencentes ao 2º experimento. I: caramujos infectados e não
tratados; IT: caramujos infectados e tratados com 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de PZQ; N: caramujos não
infectados e não tratados; NT: caramujos não infectados e tratados com 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de
PZQ.
3º Experimento
Dois tratamentos foram realizados no terceiro experimento, sendo estes aos 18 e 32
dias após a infecção. Nove exames foram realizados pós-tratamento, 14 dias após o 1º
tratamento, 3, 10, 17, 24, 31, 38, 52, 60 dias pós 2º tratamento. Observou-se uma diferença
estatisticamente significativa (p<0,02) na média de cercárias eliminadas pelos caramujos
infectados e tratados (IT) em relação à média de cercárias eliminadas pelo grupo de caramujos
infectados e não tratados (I) até o 6º exame (31 dias após o 2º tratamento). Neste 6º exame,
95,8% dos caramujos do grupo IT permaneciam sem eliminar cercárias. A partir do 7º exame
(38 dias pós-tratamento), não foi possível observar uma diferença estatisticamente
significativa entre a média de cercárias eliminadas pelo grupo IT e I (Gráfico 5). No entanto,
ao final do experimento, 61,5% dos caramujos do grupo IT permaneceram negativos.
0
500
1000
1500
2000
2500
1º exam e 2º exam e 3º exam e 4º exam e 5º exame 6º exame 7º exam e 8º exame 9º exame
média de cercárias eliminadas
I
IT
Gráfico 5 - Gráfico referente às médias de cercárias eliminadas e ao desvio padrão nos nove exames realizados
no 3º experimento (período pré-patente) para avaliação do efeito das drogas na fase intramolusco do parasito. I:
caramujos infectados e não tratados; IT: caramujos infectados e tratados duas vezes com 250mg/Kg de OXA +
500mg/Kg de PZQ.
Dois tratamentos, com a associação das drogas, retardaram ainda mais o
desenvolvimento do parasito quando comparamos esses resultados com os obtidos no
experimento anterior. Porém não foi suficiente para abortar a infecção. Apenas 2 caramujos I
51
permaneceram vivos ao final do experimento, enquanto 13 caramujos IT, 25 caramujos não
expostos aos miracídios e tratados (NT) e 28 caramujos não expostos aos miracídios e não
tratados (N) sobreviveram (Gráfico 6). Esse resultado mostra que dois tratamentos, com a
associação OXA/PZQ, na fase pré-patente da infecção, aumentaram a sobrevivência dos
caramujos do grupo IT, quando comparados com os caramujos do grupo I.
0
5
10
15
20
25
30
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1º
exame
2º
exame
3º
exame
4º
exame
5º
exame
6º
exame
7º
exame
8º
exame
9º
exame
nº de caramujos vivos
I
IT
N
NT
Gráfico 6 - Cinética da mortalidade dos caramujos pertencentes ao 3º experimento. I: caramujos infectados e não
tratados; IT: caramujos infectados e tratados com 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de PZQ; N: caramujos não
infectados e não tratados; NT: caramujos não infectados e tratados com 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de
PZQ.
4º Experimento
No quarto experimento, os caramujos foram tratados aos 32 dias após a exposição à
miracídios. Quatro exames foram realizados sendo estes aos 5, 12, 19 e 26 dias após o
término do tratamento. Cinco dias após o término do tratamento, foi possível observar uma
redução estatisticamente significativa (p<0,05) na média de cercárias eliminadas pelos
caramujos pertencentes aos grupos tratados (IOR e IPR), quando comparados com o grupo
controle não tratado (I). No primeiro exame, 69,2% dos exemplares do grupo de caramujos
infectados e tratados com OXA (IOR) estavam negativos, enquanto que 100% dos caramujos
infectados e tratados com PZQ (IPR) permaneceram sem eliminar cercárias. No 12º, 19º e 26º
dia, após o término do tratamento, ocorreu um aumento na porcentagem de caramujos
eliminando cercárias e conseqüente aumento na média de cercárias eliminadas pelos
caramujos pertencentes aos grupos IOR e IPR. No entanto, essa média permaneceu
estatisticamente menor (p<0,05) quando comparada com o grupo não tratado (Gráfico 7).
52
Além disso, foi possível verificar, para o grupo IOR, que não há diferença estatisticamente
significativa, entre a média de cercárias eliminadas no último exame pós-tratamento e a média
eliminada antes do tratamento (p>0,05), mostrando que os caramujos voltaram a eliminar
cercárias em números semelhantes aos anteriores ao tratamento. Por outro lado, foi possível
observar que a média de cercárias eliminadas pelos caramujos do grupo IPR, no quarto
exame, é estatisticamente menor do que a média eliminada pelos caramujos deste mesmo
grupo, antes do tratamento (p<0,01). Demonstrou-se que, após o tratamento com PZQ, os
caramujos voltaram a eliminar cercárias, porém em números bem menores do que os
observados antes do tratamento.
0
500
1000
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2000
2500
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4500
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ant es 1º exame 2º exame 3º exam e 4º exam e
média de cercárias eliminadas
I
IOR
IPR
Gráfico 7 - Gráfico referente às médias de cercárias eliminadas e ao desvio padrão nos quatro exames realizados
no 4º experimento (período patente) para avaliação do efeito das drogas na fase intramolusco do parasito. I:
caramujos infectados e não tratados; IOR: caramujos infectados e tratados com 500mg/Kg de OXA; IPR:
caramujos infectados e tratados com 1000mg/Kg de PZQ.
O tratamento com ambas as drogas foi efetivo na redução da eliminação de cercárias
quando comparadas com o controle. Além disso, os caramujos tratados com PZQ não
voltaram a eliminar cercárias em números semelhantes aos anteriores ao tratamento. O
mesmo não foi observado para o tratamento com OXA. A mortalidade foi elevada no grupo
IPR: apenas 4 caramujos permaneceram vivos ao final do experimento. Nos grupos IOR e I a
taxa de sobrevivência foi maior, sendo encontrados vivos, ao término do experimento, 10 e 9
caramujos, respectivamente. Cem por cento dos grupos controles não expostos aos miracídios
e não tratados (N), não expostos aos miracídios e tratados com OXA (NOR) e 13 caramujos
não expostos aos miracídios e tratados com PZQ (NPR) permaneceram vivos ao final do
experimento (Gráfico 8). Embora grande parte dos caramujos pertencentes ao grupo IPR
tenha morrido, observa-se que não foi o tratamento com PZQ o resposnsável pela morte
53
destes caramujos, uma vez que mais de 85% dos caramujos do grupo NPR permaneceram
vivos.
0
2
4
6
8
10
12
14
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antes 1º exame 2º exame 3º exame 4º exame
nº de caramujos vivos
I
IOR
IPR
N
NOR
NPR
Gráfico 8 - Cinética da mortalidade dos caramujos pertencentes ao 4º experimento. I: caramujos infectados e não
tratados; IOR: caramujos infectados e tratados com 500mg/Kg de OXA; IPR: caramujos infectados e tratados
com 1000mg/Kg de PZQ; N: caramujos não infectados e não tratados; NOR: caramujos não infectados e tratados
com 500mg/Kg de OXA; NPR: caramujos não infectados e tratados com 1000mg/Kg de PZQ.
5º Experimento
No 32º dia após a exposição aos miracídios, os caramujos do segundo experimento
foram tratados com 250mg/Kg de OXA + 500mg/kg de PZQ. Seis exames foram realizados,
sendo um antes do tratamento e cinco pós-tratamento: 5, 12, 19, 26 e 33 dias após o término
do tratamento. Foi possível observar que, em todos os períodos analisados, houve uma
redução estatisticamente significativa (p<0,05) na média de cercárias eliminadas pelo grupo
de caramujos infectados e tratados (IT), quando comparado com a média do grupo controle
(caramujos infectados não tratados – I). No 1º exame realizado pós-tratamento, todos os
caramujos do grupo IT encontravam-se negativos. Ao final do experimento, 50% dos
caramujos vivos do grupo IT permaneceram sem eliminar cercárias (Gráfico 9). Quando
comparamos a média de cercárias eliminadas pelos caramujos de grupo IT, antes e após o
tratamento, verificamos que, ao final do experimento, os caramujos eliminaram uma média de
cercárias estatisticamente menor (p<0,01) do que a média eliminada antes do tratamento.
54
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
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4000
antes 1º exam e. 2º exam e. 3º exame. 4º exame. 5º exam e.
média de cercárias elim inadas
I
IT
Gráfico 9 - Gráfico referente às médias de cercárias eliminadas e ao desvio padrão nos cinco exames realizados
no 5º experimento (período patente) para avaliação do efeito das drogas na fase intramolusco do parasito. I:
caramujos infectados e não tratados; IT: caramujos infectados e tratados uma vez com 250mg/Kg de OXA +
500mg/Kg de PZQ.
O tratamento com a associação das drogas foi efetivo na supressão da eliminação de
cercarias, levando à “cura” de quatro dos oito caramujos do grupo IT, vivos ao final do
experimento. Uma alta mortalidade foi observada nos grupos I e IT. Apenas 9 caramujos do
grupo I e 8 caramujos do grupo IT permaneceram vivos ao final do experimento. Acredita-se
que a infecção associada ao tratamento tenha sido responsável pela morte dos caramujos, já
que nos grupos de caramujos não expostos aos miracídios e tratados (NT) e caramujos não
expostos aos miracídios não tratados (N) 100% dos caramujos permaneceram vivos (Gráfico
10).
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0
5
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antes 1º exame 2º exame 3º exame 4º exame 5º exame
nº de caramujos vivos
I
IT
N
NT
Gráfico 10 - Cinética da mortalidade dos caramujos pertencentes ao 5º experimento. I: caramujos infectados e
não tratados; IT: caramujos infectados e tratados com 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de PZQ; N: caramujos
não infectados e não tratados; NT: caramujos não infectados e tratados com 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de
PZQ.
6º Experimento
No sexto experimento, os caramujos foram tratados com 250mg/Kg de OXA +
500mg/Kg de PZQ aos 32 e 42 dias após a exposição aos miracídios. Os caramujos forma
submetidos a cinco exames, sendo estes aos 5 dias após o 1º tratamento e aos 5, 12, 19 e 21
dias após o 2º tratamento. Observou-se uma redução estatisticamente significativa (p<0,05) da
média de cercárias eliminadas pelo grupo de caramujos infectados e tratados (IT) em relação à
média de cercárias eliminadas pelo grupo de caramujos infectados não tratados (I) até o 2º
exame realizado após o tratamento (5 dias após o 2º tratamento). Devido à alta mortalidade
observada no grupo de caramujos infectados e não tratados (I) (a partir do 4º exame pós-
tratamento não havia caramujos vivos), não foi possível dar continuidade à análise estatística,
utilizando este grupo. No entanto, ao final do experimento, sete caramujos do grupo IT
permaneciam vivos e sem eliminar cercárias (Gráfico 11). Dessa forma, há uma diferença
estatisticamente significativa (p<0,05) entre a média de cercárias eliminadas pelos caramujos
do grupo IT, antes e após o tratamento.
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0
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1500
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antes 1º exame 2º exame 3º exame 4º exame 5º exame
média de cercárias eliminadas
I
IT
Gráfico 11 - Gráfico referente às médias de cercárias eliminadas e ao desvio padrão nos cinco exames realizados
no 6º experimento (período patente) para avaliação do efeito das drogas na fase intramolusco do parasito. I:
caramujos infectados e não tratados; IT: caramujos infectados e tratados duas vezes com 250mg/Kg de OXA +
500mg/Kg de PZQ.
Dois tratamentos com a associação das drogas foram efetivos na redução da
eliminação de cercárias, levando à “cura” de todos os sete caramujos do grupo IT vivos, ao
final de experimento. Ao final do experimento, 100% dos exemplares dos grupos de
caramujos não expostos aos miracídios e tratados (NT) e não expostos aos miracídios e não
tratados (N) encontravam-se vivos. Embora uma alta mortalidade tenha sido observada no
grupo de caramujos infectados e tratados (IT), acredita-se, mais uma vez, que o tratamento foi
responsável por aumentar a sobrevivência dos caramujos do grupo IT, já que, ao final do
experimento, não havia caramujos do grupo I vivos (Gráfico 12).
0
10
20
30
40
50
60
antes 1º exame 2º exame 3º exame 4º exame 5º exame
nº de caramujos vivos
I
IT
N
NT
57
Gráfico 12 - Cinética da mortalidade dos caramujos pertencentes ao 6º experimento. I: caramujos infectados e
não tratados; IT: caramujos infectados e tratados com 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de PZQ; N: caramujos
não infectados e não tratados; NT: caramujos não infectados e tratados com 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de
PZQ.
4.2. Experimentos “in vitro”
4.2.1. Experimento 1 – Avaliação da ação do PZQ sobre esporocistos transformados
“in vitro”
Observou-se que o PZQ, independentemente da concentração utilizada (5µg/mL ou
10µg/mL), gera uma nítida contração no esporocisto, facilmente visível à microscopia óptica
convencional. É interessante observar que essa contração parece ser diretamente proporcional
à concentração da droga, ou seja, em maiores concentrações, a contração se torna mais
evidente. (Figura 3). Além disso, é importante salientar que, mesmo apresentando essa
alteração morfológica, os esporocistos permaneciam vivos e se movendo.
Figura 3 - Avaliação da ação do PZQ sobre os esporocistos transformados "in vitro". (A) esporocisto não
exposto ao PZQ; morfologia normal. A seta indica a perda da placa ciliar. (B) esporocisto exposto a 5µg/mL de
PZQ. (C) esporocisto exposto a 10µg/mL de PZQ; nítida contração e alteração no formato do parasito. Imagens
visualizadas em microscopia óptica comum. Barras = 20µm.
4.2.2. Experimento 2 – Avaliação do efeito do PZQ sobre a membrana de esporocistos
transformados “in vitro”
Para avaliar o efeito do PZQ sobre a membrana de esporocistos, dois experimentos em
paralelo foram realizados. Em um dos experimentos, foi utilizada a sonda Hoechst 33258 e
58
em outro, o marcador lectina de Glicine max. Os esporocistos foram marcados e,
posteriormente, expostos à diferentes concentrações da droga. No que diz respeito à sonda
Hoechst 33258, foi possível verificar uma leve marcação no grupo controle (Figura 4A). No
entanto, nos grupos, nos quais o PZQ foi adicionado, observou-se que essa marcação foi mais
intensa. Dessa forma, além da alteração no formato do esporocisto, foi possível visualizar um
aumento na fluorescência naqueles esporocistos submetidos ao contato com a droga (Figura
4B e C), fato esse que sugere a presença de dano na membrana. Em relação à lectina Glicine
max, os esporocistos controle (não expostos à droga) não apresentaram nenhuma marcação,
podendo chamá-los de negativos (Figura 4D e E). Porém, os esporocistos colocados em
contato com a droga apresentaram forte marcação, independentemente da concentração de
droga utilizada. Ocorreu uma nítida marcação da membrana, ao redor de todo o parasito
(Figura 4F – G e 4H-I).
59
Figura 4 - Avaliação da ação do PZQ sobre a membrana de esporocistos transformados "in vitro". (A – C) parasitos
marcados com Hoechst 33258. Imagens visualizadas por microscopia de fluorescência. (A) esporocisto controle; (B
e C) esporocistos expostos a 5µg/mL e 10µg/mL de PZQ, respectivamente. É possível verificar leve marcação no
controle e um aumento na fluorescência naqueles expostos à droga. (D - I) esporocistos marcados com lectina de
60
Glicine max. (D e E) parasitos controles; (F e G) esporocistos expostos a 5µg/mL de PZQ; (H e I) esporocistos
expostos a 10µg/mL de PZQ. A marcação com a sonda só é visível nos esporocistos expostos à droga. Imagens
geradas por microscopia laser confocal. Barras = 20µm.
4.2.3. Experimento 3 – Avaliação da presença de vesículas ácidas semelhantes a
lisossomos em esporocistos e do efeito do PZQ sobre essas organelas ácidas
Os resultados dos esporocistos expostos à sonda LysoTracker Red mostram uma nítida
marcação de vesículas ácidas (lisossomos), demonstrando, pela primeira vez, a presença
dessas organelas nesse estágio do ciclo de vida do S. mansoni. Além da presença dessas
organelas, foi possível verificar que o PZQ interfere na formação desses lisossomos. Os
esporocistos expostos ao PZQ nas concentrações de 5µg/mL e 10µg/mL (Figura 5C-D e 5E-F,
respectivamente), além de terem o seu formato alterado, também possuem uma maior área
marcada pela sonda do que os esporocistos controle (Figura 5A e B), não expostos à droga.
61
Figura 5 - Avaliação da presença de organelas ácidas semelhantes a lisossomos em esporocistos transformados
“in vitro” e do efeito do PZQ sobre essas organelas. (A e B) esporocistos marcados com 5µL de LysoTracker
Red e não expostos ao PZQ; presença de algumas vesículas ácidas; (C e D) esporocistos marcados com
LysoTracker Red e expostos a 5µg/mL de PZQ; (E e F) esporocistos marcados com LysoTracker Red e
expostos a 10µg/mL de PZQ. Presença de uma maior área marcada. Imagens geradas por microscopia laser
confocal. Barras: A, C, E e F = 20µm; B e D = 10µm.
4.3. Avaliação da suscetibilidade do S. mansoni ao PZQ após vários tratamentos na
fase intramolusco
Os resultados do experimento “in vivo” da ação do PZQ sobre a fase intramolusco do
parasito mostraram que o PZQ gera uma interrupção imediata da eliminação de cercárias e
que essas voltam a ser eliminadas em números bem menores aos encontrados antes do
62
tratamento. Diante disso, decidiu-se avaliar se essas cercárias, provenientes de caramujos
tratados, poderiam gerar vermes adultos menos susceptíveis à droga do que as cercárias
provenientes de caramujos não tratados, em função de uma pressão seletiva quimioterápica.
Para isso, dois esquemas terapêuticos diferentes foram utilizados.
O esquema terapêutico utilizado no 1º experimento, no qual os caramujos foram
submetidos a três tratamentos, durante cinco dias consecutivos, com 500mg/Kg de PZQ, foi
considerado excessivo, uma vez que trinta dias após o último tratamento, os caramujos não
haviam voltado a eliminar cercárias, não sendo possível continuar os estudos.
Um segundo experimento, com esquema terapêutico diferente foi, então, realizado.
Nesse experimento, os caramujos foram tratados três vezes com 100mg/Kg de PZQ, durante
cinco dias consecutivos. Vinte e cinco dias após o último tratamento, os caramujos voltaram a
eliminar cercárias. Aos quarenta dias após o último tratamento, os caramujos já estavam
eliminando cercárias em quantidade suficiente para infectar o número de camundongos
necessários para dar continuidade aos estudos. Dois experimentos, seguindo o mesmo
protocolo e esquema terapêutico, foram realizados. Os resultados desses experimentos foram
analisados separadamente.
Experimento 1
Tabela 1 - Número de vermes vivos recuperados após perfusão das veias mesentéricas e do fígado de
camundongos infectados com 25 cercárias das cepas LE e LE – PZQ de S. mansoni e tratados com
diferentes dosagens de PZQ, trinta dias após o tratamento.
Distribuição de
Vermes (%)
Tratamento/ Cepa
nº de
camundongos
vivos ao final
do
experimento
Mesentério Fígado
Média de
vermes
recuperados
Desvio
Padrão
(DP)
LE 12
53,0 47,0
3,83 2,368
200mg/Kg
LE - PZQ 10
35,83
64,17
3,9 2,514
LE 12
16,98
83,01
1,5 1,243
400mg/Kg
LE - PZQ 10
10,81
89,19
1,2 1,476
LE 12
5,26
94,73
0,75 1,215
800mg/Kg
LE - PZQ 10
8,23
91,76
1,0 1,155
LE 12
88,68
11,32
4,416 4,166
controle
LE - PZQ 11
75,27
24,73
8,4 5,492
Para avaliar o efeito das diferentes dosagens de PZQ sobre a cepa LE e LE – PZQ, foi
utilizado o teste de Kruskal – Wallis, seguido das comparações múltiplas de Dunn’s. No que
diz respeito à cepa LE, o tratamento com 800mg/Kg levou a uma redução da carga parasitária,
estatisticamente significativa (p< 0,05), quando comparado com o grupo controle. Porém, os
63
tratamentos com 200mg/Kg e 400mg/Kg de PZQ se mostraram estatisticamente semelhantes
ao controle, e ainda geraram resultados estatisticamente similares, quando comparados entre
si. Além disso, o tratamento com 800mg/Kg se mostrou, estatisticamente, mais eficiente do
que 200mg/Kg (p< 0,01), mas semelhante ao de 400mg/Kg. Em relação à média de vermes
recuperados dos camundongos infectados com cercárias previamente expostas ao PZQ (LE –
PZQ), os tratamentos com 400mg/Kg e 800mg/Kg se mostraram efetivos na redução da carga
parasitária, sendo estatisticamente diferentes do grupo controle (p<0,01). Apenas o tratamento
com 200mg/Kg foi semelhante ao grupo controle. Em ambas as “cepas”, o tratamento com
800mg/Kg não foi capaz de eliminar todos os parasitos. Quando comparamos, através do teste
de Mann – Whitney, a média de vermes recuperados dos camundongos tratados com mesmo
esquema terapêutico, porém infectados com cercárias “diferentes” (proveniente de caramujos
não tratados – LE (controle) ou provenientes de caramujos tratados - LE – PZQ) não foram
encontradas diferenças estatisticamente significativas entre elas (p>0,05) (Tabela 1, Gráfico
13).
1 2 3 4 5 6 7 8
0
10
20
Grupos
Nº total de vermes vivos
Gráfico 13 - Gráfico de dispersão do número total de vermes vivos recuperados por animal dos grupos controles
e experimentais e suas respectivas medianas ( ) referentes ao experimento1.
64
1- LE/ 200mg/Kg
2- LE – PZQ/ 200mg/Kg
3- LE/ 400mg/Kg
4- LE – PZQ/ 400mg/Kg
5- LE/ 800mg/Kg
6- LE – PZQ/ 800mg/Kg
7- LE/ Controle
8- LE – PZQ/ Controle
Experimento 2
Tabela 2 - Número de vermes vivos recuperados após perfusão das veias mesentéricas e do fígado de
camundongos infectados com 25 cercárias das cepas LE e LE – PZQ de S. mansoni e tratados com
diferentes dosagens de PZQ, trinta dias após o tratamento.
Distribuição de
Vermes (%)
Tratamento/ Cepa
nº de
camundongos
vivos ao final
do
experimento
Mesentério Fígado
Média de
vermes
recuperados
Desvio
Padrão
(DP)
LE 10
51,02 48,98
3,4 2,675
200mg/Kg
LE - PZQ 12
35,85 64,15
2,25 2,137
LE 12
12,16
83,84
1,5 1,446
400mg/Kg
LE - PZQ 12
5,41
94,59
0,58 0,7930
LE 12
1,33
98,67
0,416 0,9962
800mg/Kg
LE - PZQ 11
3,70
96,30
0,54 0,6876
LE 12
61,0
39,0
5,3 4,119
controle
LE - PZQ 12
80,0
20,0
9,58 6,208
Neste segundo experimento, foram analisados os mesmos aspectos do experimento 1.
Os mesmos esquemas terapêuticos foram utilizados e através do teste de Kruskal – Wallis,
seguido das comparações múltiplas de Dunn’s, foi possível verificar, no que diz respeito à
cepa LE, que, como no experimento 1, os tratamentos com 200mg/Kg e 400mg/Kg de PZQ
não se mostraram estatisticamente diferentes do controle. Apenas o tratamento com
800mg/Kg de PZQ gerou uma redução da carga parasitária estatisticamente diferente do
grupo controle (p< 0,001). Da mesma forma, o tratamento com 200mg/Kg de PZQ se mostrou
estatisticamente diferente do tratamento com 800mg/Kg (p< 0,05). Já os tratamentos com
400mg/Kg e 800mg/Kg de PZQ geraram resultados estatisticamente semelhantes na redução
da carga parasitária. Na análise da “cepa” LE - PZQ, mais uma vez, os tratamentos com
400mg/Kg e 800mg/Kg de PZQ foram efetivos na redução da carga parasitária, sendo
diferentes estatisticamente do grupo controle (P< 0,001). O tratamento com 200mg/Kg gerou
resultados estatisticamente semelhantes ao grupo controle. E da mesma forma que o
experimento anterior, a dose de 800mg/Kg de PZQ não foi suficiente para eliminar todos os
parasitos, independente da infecção. No que diz respeito à suscetibilidade, o mesmo resultado
do experimento 1 foi encontrado. O teste de Mann – Whitney mostrou que os dois tipos de
cercárias (LE e LE – PZQ) responderam da mesma forma quando tratadas com a mesma
dosagem de PZQ, não sendo, então, encontradas diferenças estatisticamente significativas
quando comparadas entre si (p> 0,05) (Tabela 2, Gráfico 14).
65
1 2 3 4 5 6 7 8
0
10
20
Grupos
Nº total de vermes vivos
Gráfico 14 - Gráfico de dispersão do número total de vermes vivos recuperados por animal dos grupos controles
e experimentais e suas respectivas medianas ( ) referentes ao experimento 2.
4.3.1. Reprodutibilidade dos experimentos
A reprodutibilidade dos experimentos 1 e 2 foi avaliada. Os grupos infectados com a
mesma cepa e tratados com o mesmo esquema terapêutico, porém, pertencentes a
experimentos distintos, foram comparados entre si. A análise revelou que nenhuma diferença
estatística foi encontrada entre os gupos controle, tanto da cepa LE (p = 0,59), quanto LE –
PZQ (p = 0,69). Esse resultado comprova a homogeneidade, tanto da infecção dos animais,
quanto da perfusão, realizada para recuperação dos vermes. Além disso, para nenhum outro
grupo, submetido a tratamento, foi encontrada diferença estatísticamente significativa,
demonstrando, também, a homogeneidade no tratamento experimental realizado nos
diferentes experimentos (Figura 6).
Exp 1 Exp 2
0
10
20
LE (controle)
Nº total de vermes vivos
Exp 1 Exp 2
0
10
20
LE - PZQ (controle)
Nº total de vermes vivos
66
1- LE/ 200mg/Kg
2- LE – PZQ/ 200mg/Kg
3- LE/ 400mg/Kg
4- LE – PZQ/ 400mg/Kg
5- LE/ 800mg/Kg
6- LE – PZQ/ 800mg/Kg
7- LE/ Controle
8- LE – PZQ/ Controle
(A)
(B)
Exp 1 Exp 2
0
5
10
LE (200mg/Kg)
Nº total de vermes vivos
Exp 1 Exp 2
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
LE - PZQ (200mg/Kg)
Nº total de vermes vivos
Exp 1 Exp 2
0.0
2.5
5.0
LE (400mg/Kg)
Nº total de vermes vivos
Exp 1 Exp 2
0
1
2
3
4
LE - PZQ (400mg/Kg)
Nº total de vermes vivos
Exp 1 Exp 2
0
1
2
3
4
LE (800mg/Kg)
Nº total de vermes vivos
Exp 1 Exp 2
0
1
2
3
LE - PZQ (800mg/Kg)
Nº total de vermes vivos
Figura 6 - Gráficos representativos da reprodutibilidade dos experimentos 1 e 2. Comparação do número de
vermes recuperados entre os grupos controles infectados com cercárias LE (A); grupos controles infectados com
cercárias LE – PZQ (B); grupos infectados com cercárias LE tratados com 200mg/Kg de PZQ (C); grupos
infectados com cercárias LE - PZQ tratados com 200mg/Kg de PZQ (D); grupos infectados com cercárias LE
tratados com 400mg/Kg de PZQ (E); grupos infectados com cercárias LE - PZQ tratados com 400mg/Kg de
67
p = 0,69
(C)
p = 0,11
(D)
p = 1,0
(E)
p = 0,25
(F)
p = 0,37
(G)
p = 0,28
(H)
PZQ (F); grupos infectados com cercárias LE tratados com 800mg/Kg de PZQ (G); grupos infectados com
cercárias LE - PZQ tratados com 800mg/Kg de PZQ (H).
Experimento Passagem 1
Tabela 3 - Número de vermes vivos recuperados após perfusão das veias mesentéricas e do figado de
camundongos infectados com 25 cercárias das cepas LE e LE – PZQ de S. mansoni e tratados com
diferentes dosagens de PZQ, trinta dias após o tratamento.
Distribuição de
Vermes (%)
Tratamento/ Cepa
nº de
camundongos
vivos ao final
do
experimento
Mesentério Fígado
Média de
vermes
recuperados
Desvio
Padrão
(DP)
LE 12
6,25
93,75
0,416
*
0,7930
400mg/Kg
LE - PZQ 12
13,2
86,8
1,92
*
1,443
LE 12
2,47
97,5
0,25 0,6216
800mg/Kg
LE - PZQ 12
3,0
97,0
0,25 0,4523
LE 12
85,7
14,3
2,92 2,937
controle
LE - PZQ 12
70,0
30,0
3,33 3,114
* P<0,01
O teste de Kruskal – Wallis, seguido das comparações múltiplas de Dunn’s, mais uma
vez foi utilizado para comparar os esquemas terapêuticos empregados. Para a cepa LE, o
tratamento com 400mg/Kg de PZQ se mostrou estatisticamente semelhante ao controle.
Apenas a dosagem de 800mg/Kg se mostrou eficaz na redução da carga parasitária, quando
comparado com o grupo controle (p< 0,05). Neste experimento, o tratamento com 400mg/Kg
de PZQ gerou resultados semelhantes aos do tratamento com 800mg/Kg. Em relação à “cepa”
LE – PZQ, apenas o tratamento com 800mg/Kg se mostrou estatisticamente diferente do
controle, com p< 0,01. O grupo tratado com 400mg/Kg não foi efetivo na redução da carga
parasitária, sendo estatisticamente semelhante ao controle. Além disso, os tratamentos com
400mg/Kg e 800mg/Kg se mostraram estatisticamente distintos, quando comparados entre si
(p< 0,01). Neste experimento foi ainda encontrada uma redução na suscetibilidade ao PZQ no
grupo infectado com cercárias provenientes de caramujos pré-expostos à droga (LE – PZQ) e
tratados com 400mg/Kg de PZQ. Verificou-se que a média de vermes recuperados neste
grupo (1,92) é estatisticamente maior (p< 0,005) do que a do grupo infectado com a cepa LE e
tratado com o mesmo esquema terapêutico (0,416) (Tabela 3, Gráfico 15)
68
1 2 3 4 5 6
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
Grupos
Nº total de vermes vivos
Gráfico 15 - Gráfico de dispersão do número total de vermes vivos recuperados por animal dos grupos controles
e experimentais e suas respectivas medianas ( ) referentes ao experimento passagem 1. * p<0,005
estatisticamente diferente do grupo 1 (LE – controle/ 400mg/Kg).
69
1- LE/ 400mg/Kg
2- LE – PZQ/ 400mg/Kg
3- LE/ 800mg/Kg
4- LE – PZQ/ 800mg/Kg
5- LE/ Controle 6-
LE – PZQ/ Controle
*
5 Discussão
A oxaminiquina e o praziquantel são, atualmente, as duas drogas disponíveis no
mercado para o tratamento da esquistossomose. Segundo Foster et al. (1971), todas as fases
evolutivas do S. mansoni podem ser tratadas com OXA, enquanto o PZQ apresenta efeito
diferenciado em função das fases evolutivas do ciclo de vida do parasito (Gönnert &
Andrews, 1977; Coles, 1979; Riley & Chappell, 1990; Carneiro – Santos et al., 2001; Liang et
al., 2001, 2003).
Vários autores já demonstraram a ação de diversas drogas, incluindo OXA e PZQ, na
fase intramolusco do Schistosoma. Essas drogas levam à interrupção na eliminação de
cercárias (Warren & Weisberg, 1966; Warren, 1967; Andrews, 1977; Coles, 1979; Touassem
& Combes, 1986; Yi & Combes, 1987; Coles & Bruce, 1987; Coelho et al., 1988; Riley &
Chappell, 1990). Yi & Combes (1987) e Coelho et al. (1988) após verificarem o efeito do
PZQ sobre a fase evolutiva intramolusco do parasito, sugeriram a utilização de caramujos
infectados como modelo experimental para triagem de drogas esquistossomicidas e ainda,
propuseram que este modelo poderia servir como um teste rápido e fácil para detecção de
resistência/ suscetibilidade a drogas.
Em nosso trabalho, utilizamos caramujos na fase pré-patente e patente da infecção
para verificar o efeito do PZQ, da OXA e da associação dessas duas drogas sobre a fase
intramolusco do parasito. Nossos resultados demonstraram que o PZQ, a OXA e a associação
dessas duas drogas possuem ação nesta fase do ciclo evolutivo do S. mansoni. Quando o
tratamento ocorreu no período pré-patente da infecção, utilizando as drogas isoladamente, foi
possível observar um atraso de, aproximadamente, 10 dias, no perídodo pré-patente. Os
caramujos tratados, tanto com OXA (500mg/Kg) quanto com PZQ (1000mg/Kg),
isoladamente, começaram a eliminar cercárias 39 e 46 dias após a infecção, respectivamente,
enquanto os caramujos não tratados eliminaram uma média de 128 cercárias/caramujo 30 dias
após a exposição aos miracídios (Gráfico 1). Já foi descrito por Souza, Cunha & Andrade
(1995) que os caramujos começam a eliminar cercárias de 27 a 30 dias após o contato com
miracídios. Yi & Combes (1987) realizaram um estudo no qual caramujos infectados com
Schistosoma japonicum foram tratados com PZQ no período de desenvolvimento de
esporocistos primários. Observou-se que o período pré-patente dos caramujos tratados foi
exatamente o mesmo dos caramujos controles. Além disso, por meio de análise
histopatológica, verificou-se que os esporocistos primários permaneciam intactos, contendo
inúmeros embriões de esporocistos secundários que se desenvolviam normalmente. No
entanto, em nosso trabalho, os caramujos foram infectados com S. mansoni, que possui um
70
período pré-patente de, aproximadamente, 30 dias, enquanto o S. japonicum tem um período
pré-patente de, aproximadamente, 60 dias e ainda, em nosso estudo, os caramujos foram
tratados 18 dias após a infecção, período em que são encontrados, nos moluscos, esporocistos
secundários recém-formados e alguns esporocistos primários, sendo esperados resultados
semelhantes aos obtidos no período patente. Foi possível verificar ainda, em nossos
experimentos, no período pré-patente, que os caramujos tratados com PZQ voltaram a
eliminar cercárias mais lentamente e em menor quantidade do que os caramujos tratados com
OXA (46 dias após infecção - média de 2,7 cercárias/caramujo e 39 dias pós-infecção – média
de 62,4 cercárias/caramujo, respectivamente), sugerindo que os esporocitos sejam mais
sensíveis ao PZQ do que à OXA. O tratamento na fase patente da infecção, tanto com OXA
quanto com PZQ, isoladamente, gerou uma interrupção imediata da eliminação de cercárias.
No entanto, independentemente da droga utilizada, esses caramujos voltaram a eliminar
cercárias, aproximadamente, 15 dias após o tratamento (Gráfico 7). Porém, os caramujos
tratados com PZQ voltaram a eliminar cercárias em números estatisticamente menores do que
os encontrados antes do tratamento. Já os tratados com OXA eliminavam no último exame
(26 dias pós-tratamento) uma média estatisticamente semelhante à anterior ao tratamento.
Esses resultados, do período patente, corroboram com os encontrados por Yi & Combes
(1987), que, utilizando PZQ e S. japonicum, observaram que os caramujos tratados
permaneceram sem eliminar cercárias por, aproximadamente, 20 dias pós-tratamento,
voltando a eliminá-las em números bem menores aos anteriores ao tratamento. Porém, no
estudo de Touassem & Combes (1986), utilizando PZQ e S. mansoni/B. glabrata, os
caramujos permaneceram sem eliminar cercárias apenas 4 dias após o tratamento, voltando a
eliminá-las em números semelhantes aos de antes do tratamento. Da mesma forma, Riley &
Chappell (1990), estudando a ação do PZQ em B. glabrata infectada com S. mansoni,
verificaram uma redução e não uma supressão na eliminação de cercárias e, ao final de oito
semanas, estes caramujos tratados eliminavam cercárias em nível semelhante aos anteriores
ao tratamento. Acreditamos que essas diferenças, no período de supressão da eliminação de
cercárias, tenham ocorrido devido ao uso de metodologias distintas. Embora em ambos os
estudos a droga tenha sido adicionada à ração, o tempo de exposição dos caramujos à droga e
as dosagens utilizadas foram menores do que as utilizadas em nosso trabalho (2 dias e 0,1%
de PZQ e 3 dias e 37mg/Kg de PZQ, respectivamente). As análises histopatológicas
realizadas, ainda, por Touassem & Combes (1986) e Riley & Chappell (1990) mostraram a
presença de cercárias completamente destruídas e alguns esporocistos secundários intactos,
logo após o tratamento. Passados quatro a oito dias, a histopatologia revelou a presença de
esporocistos se multiplicando e novas cercárias começando a se desenvolver. Esses dados
71
explicariam o restabelecimento da eliminação das cercárias pelos caramujos algum tempo
após o término do tratamento. Em relação ao tratamento com OXA, isoladamente, nossos
resultados vão além dos encontrados por Coelho et al. (1988), que demonstraram que a OXA
gera a supressão total da eliminação de cercárias, uma semana após o tratamento.
De acordo com Delgado et al. (1992), como a OXA e o PZQ possuem mecanismos de
ação distintos, espera-se da combinação de ambos um efeito complementar. Esse efeito
sinérgico, observado por diversos autores (Shaw & Brammer, 1983; Campos et al., 1985;
Zwingenberger et al., 1987; Botros et al., 1989; Campos et al., 1989; Delgado et al., 1992),
em hospedeiros vertebrados (modelo experimental e homem), também foi verificado em
nossos estudos na fase intramolusco do parasito. Delgado et al. (1992) sugerem que, quando
fármacos são associados, para um mesmo fim, suas dosagens podem ser reduzidas,
diminuindo também os efeitos tóxicos. Dessa forma, os caramujos, na fase pré-patente e
patente da infecção pelo S. mansoni, foram tratados com a associação das metades da
dosagem de OXA e PZQ isoladamente. Quando os caramujos, no período pré-patente da
infecção, foram tratados uma vez com 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de PZQ, observou-se
um atraso de, aproximadamente, 10 dias no período pré-patente (2º exame). Os caramujos só
começaram a eliminar cercárias, em números semelhantes ao do grupo controle, 60 dias após
a exposição aos miracídios (5° exame), sugerindo um efeito residual maior desta associação
do que das drogas administradas isoladamente (Gráfico 3). Este efeito residual se mostra
ainda maior quando os caramujos são submetidos a dois tratamentos com esta mesma
associação OXA/PZQ. Um atraso de, aproximadamente, 30 dias (5º exame) no período pré-
patente dos caramujos submetidos ao tratamento foi observado, ou seja, os caramujos só
voltaram a eliminar cercárias 60 dias após a exposição aos miracídios. Além disso, esses
caramujos só eliminaram cercárias, em números semelhantes ao do controle, 74 dias após a
exposição aos miracídios (7º exame) (Gráfico 5). É importante ressaltar que não houve um
aumento na taxa de mortalidade quando utilizamos a associação OXA/ PZQ, independente de
um ou dois tratamentos.
O efeito sinérgico da associação OXA/ PZQ também foi observado em caramujos
submetidos a tratamentos com 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de PZQ, no período patente
da infecção. Um único tratamento com esta associação gerou uma supressão total da
eliminação de cercárias no 1º exame, sendo ainda observada uma redução na eliminação de
cercárias de quase 98% nos demais exames realizados, quando comparado com os números
anteriores aos do tratamento (Gráfico 9). Quando os caramujos foram submetidos a dois
tratamentos com esta mesma associação, observou-se uma supressão total da eliminação de
cercárias que se manteve até o 5º e último exame, ou seja, os caramujos que antes do
72
tratamento eliminavam em média 1284 cercárias, após o tratamento se “curaram”, não
voltando a eliminar cercárias (Gráfico 11). Acredita-se que a associação OXA/ PZQ possa
levar à destruição das cercárias e dos esporocistos, não permitindo, assim, a sua recuperação/
multiplicação e conseqüente restabelecimento da eliminação de cercárias. A partir desses
experimentos, foi possível verificar que os esporocistos secundários são parcialmente
sensíveis à OXA e ao PZQ quando estes são administrados isoladamente e fortemente
afetados pela associação dessas drogas, principalmente se o tratamento ocorrer no período
patente da infecção.
De acordo com Coles (1973), os esporocistos utilizam oxigênio e produzem ácido
lático assim como os vermes adultos e, ainda, enzimas presentes em esporocistos migram de
modo similar às dos vermes adultos, em eletroforese. Coelho et al. (1988) afirmam que esses
achados podem sugerir que vias metabólicas semelhantes podem estar presentes no estágio
intramolusco do S. mansoni e em vermes adultos no hospedeiro vertebrado. Estes relatos
explicariam o porquê de drogas que agem sobre os vermes adultos também serem efetivas na
fase intramolusco do parasito.
Tendo em vista os nossos resultados e os dados presentes na literatura, que sugerem a
resistência de esporocistos primários e secundários ao PZQ e a suscetibilidade das cercárias
em desenvolvimento, na fase intramolusco do parasito, nosso trabalho avaliou a ação do PZQ
sobre esporocistos primários transformados “in vitro”. Após a penetração do miracídio no
hospedeiro invertebrado, ocorre uma série de mudanças estruturais e metabólicas, que levam à
transformação dos miracídios em esporocistos (Pan, 1965). Por meio do cultivo de miracídios,
essas mudanças podem ser acompanhadas e a transformação dos miracídios em esporocistos
realizada “in vitro”. De acordo com Basch & DiConza (1974), a primeira e principal alteração
observada é a perda da camada ciliar presente nos miracídios e ausente nos esporocistos. Essa
camada é sustentada por uma camada muscular, que não é perdida durante essa
transformação. Após três horas de cultivo, é possível verificar a perda desta camada ciliar e a
formação de um novo tegumento, mais fino e com microvilosidades, bem característico de
esporocistos. Vinte horas após o cultivo, essas microvilosidades estão bem maiores e o
tegumento se assemelha ao de esporocistos primários presentes em caramujos infectados há
vários dias.
Apesar de os estudos citados anteriormente demonstrarem, por meio de histologia, que
esporocistos, tanto primários quanto secundários, permanecem intactos após contato com o
PZQ, uma alteração no formato e uma nítida contração, nos esporocistos primários
transformados “in vitro”, após a exposição a 5 e 10µg/mL de PZQ, foi observada em nosso
trabalho (Figura 3A e B). Embora essa contração da camada muscular seja evidente, a
73
movimentação dos parasitos também foi nítida, ou seja, o PZQ agiu sobre esses esporocistos,
mas não foi capaz de matá-los. Um dos mecanismos de ação do PZQ, já descrito por alguns
autores (Pax et al., 1978; Fetterer et al., 1980), é a contração muscular. O contato de vermes
adultos com a droga, tanto “in vivo” quanto “in vitro”, gera uma imediata e sustentável
contração da musculatura. Liang et al. (2001, 2003) descreveram essa mesma contração
observada em nosso trabalho nos esporocistos primários, em miracídios expostos ao PZQ “in
vitro”.
Segundo Melhorn et al. (1981), o PZQ é capaz de gerar dano no tegumento do
Schistosoma. Como observado em nossos resultados, o PZQ foi capaz de gerar uma contração
evidente nos esporocistos. Dessa forma, avaliamos, através do uso de marcadores
fluorescentes, a influência do PZQ sobre o tegumento de esporocistos. Os marcadores
utilizados foram Hoechst 33258 e lectina de Glicine max, que se ligam, respectivamente, ao
DNA da célula e a carboidratos de membrana (N-acetilgalactosamina). No que diz respeito a
Hoechst 33258, foi possível observar uma leve fluorescência nos esporocistos expostos à
sonda, mas não à droga (controles) (Figura 4A). Esta marcação se tornou mais evidente após
o contato dos esporocistos com a droga, independentemente da dosagem (Figura 4B e C),
sugerindo, então, que o PZQ é capaz de gerar dano no tegumento de esporocistos. Porém,
devido à presença de uma leve marcação nos esporocistos controles, um segundo marcador
foi testado: lectina de Glicine max. A presença de N-acetilgalactosamina em esporocistos já
foi demonstrada em alguns trabalhos, porém utilizando metodologias bem distintas (Yoshino
et al., 1977; Zelck & Becker, 1990; Uchikawa & Loker, 1991; Johnston & Yoshino, 1996).
Nossos resultados mostraram uma nítida marcação da membrana dos parasitos expostos ao
PZQ, sugerindo que neste local houve a exposição de N-acetilgalactosamina (Figuras 4F, G,
H, I). Além disso, não se observou marcação alguma nos esporocistos não expostos à droga
(Figura 4D e E). Oliveira et al. (2006) observaram que os danos causados pelo PZQ em
vermes adultos expostos à droga “in vitro” não são intensos o suficiente para serem marcados
pela sonda lectina Glicine max. Esse resultado não está de acordo com os obtidos em nosso
trabalho, utilizando esporocistos. No entanto, a explicação para tal fato seria a diferença
existente entre o tegumento dessas duas diferentes fases evolutivas do parasito. Os vermes
adultos possuem um tegumento composto por uma espessa camada acelular e seguida de uma
camada celular bi-lipídica (McLaren, 1980); o mesmo não é observado em esporocistos que
possuem uma fina camada celular de, aproximadamente, 0,5µm (Smith & Chernin, 1974),
possívelmente mais frágil e mais permeável, quando comparado com a dos vermes adultos.
Em outro trabalho realizado por Oliveira (2005), sugere-se que a sonda Hoechst 33258 seja
muito sensível na marcação de danos no tegumento de vermes adultos, de modo que qualquer
74
lesão no tegumento, por menor que seja, pode ser marcada por esta sonda. Isso poderia
explicar a leve marcação presente nos esporocistos antes do contato com a droga, que, durante
o cultivo, podem ter tido sua membrana danificada. Nesse mesmo trabalho, Oliveira
demonstrou que essa mesma sensibilidade não foi observada com lectina Glicine max. Em
seus estudos, utilizando vermes adultos, as lesões marcadas por esta sonda eram maiores do
que as marcadas pela Hoechst 33258. Dessa forma, os possíveis danos causados no tegumento
dos esporocistos, mantidos em cultura, não foram marcados pela lectina Glicine max; em
compensação, as lesões causadas pelo PZQ, por serem mais intensas, tornaram-se nítidas. Al-
Adhami et al. (2003) demonstraram que cercárias sem lesão aparente no tegumento
apresentaram uma leve marcação quando em contato com a sonda Hoechst 33258.
Em nosso trabalho, avaliamos também a presença de organelas ácidas nos
esporocistos. Para isso nós utilizamos o marcador fluorescente LysoTracker Red. Esta sonda é
um marcador específico para lisossomos de células de mamíferos (Dietl et al., 1996). Os
resultados mostraram uma marcação de várias vesículas no interior dos esporocistos primários
expostos à sonda (Figura 5A e B). Assim, foi demonstrada, pela primeira vez, a presença de
organelas semelhantes a lisossomos neste estágio do ciclo vital do S. mansoni. Essas
vesículas, segundo Carneiro-Santos et al. (2001), possuem características funcionais
semelhantes às de lisossomos e acidocalcinomas. Os acidocalcinomas são organelas
conservadas desde bactérias até o homem. Possuem função de armazenamento e são
responsáveis pela manutenção do pH intracelular (Do Campo et al., 2005). No entanto, Al-
Adhami et al. (2005), utilizando compostos inibidores da formação de vesículas ácidas,
semelhantes a lisossomos, demonstraram a inibição da formação dessas vesículas em
esquistossômulos. Além disso, nesse mesmo trabalho, definiram a presença de proteínas,
presentes em lisossomos de células de mamíferos, em extratos de esquistossômulos. Diversos
trabalhos já utilizaram o marcador LysoTracker Red para demonstrar a presença e a ausência
desses compartimentos ácidos nas diferentes fases evolutivas do parasito. Carneiro-Santos et
al. (2001) demonstraram a presença dessas organelas em esquistossômulos e a ausência delas
em cercárias. A presença dessas vesículas em esquistossômulos e a ausência em cercárias
foram confirmadas por Al-Adhami et al. (2003, 2005). Neste último trabalho foi mostrado,
ainda, que os miracídios não revelam a presença de vesículas quando expostos ao
LysoTracker Red, demonstrando que nesta fase do ciclo do parasito essas vesículas também
não estão presentes. Os autores sugerem que os lisossomos estejam envolvidos em processos
de sobrevivência e adaptação dos esquistossômulos ao seu novo ambiente (hospedeiro
vertebrado), o que explicaria o desenvolvimento dessas organelas imediatamente após a
transformação das cercárias em esquistossômulos. O mesmo pode ocorrer durante a
75
transformação miracídio/ esporocistos. Durante esta transformação ocorrem mudanças
metabólicas que podem levar ao surgimento dessas vesículas ácidas. Provavelmente estas
estruturas exercem um papel fundamental na sobrevivência e na adaptação dos esporocistos
no seu novo ambiente (hospedeiro invertebrado). Outro evento que pode ocorrer durante essas
transformações é a autofagia. A autofagia é um processo utilizado pelas células para eliminar
componentes celulares desnecessários, durante a diferenciação celular (De Duve & Wattiaux,
1966). Sabe-se que esses componentes celulares sem função são capturados e degradados
pelos lisossomos para posterior eliminação (Jans et al. 2004). Dessa forma, sugere-se que,
durante a transformação, tanto de cercárias para esquistossômulo quanto de miracídio para
esporocisto, ocorra um estímulo do processo de autofagia, levando ao desenvolvimento dessas
vesículas ácidas.
Após a descoberta de lisossomos nos esporocistos, nós verificamos a influência do
PZQ sobre estas organelas. Foi possível verificar um aumento na área marcada pelo
LysoTracker Red após a exposição dos parasitos à droga (Figura 5C, D, E, F), sugerindo uma
maior atividade dos lisossomos. Isso poderia explicar nossos resultados, “in vivo” e “in vitro”,
da ação do PZQ sobre a fase intramolusco do S. mansoni, que mostram que os esporocistos
são afetados pelo PZQ, mas que a droga não é capaz de destruí-los. Afinal, segundo Carneiro-
Santos et al. (2001), esses lisossomos funcionam como depósitos intracelulares para
desintoxicação do parasito. Logo, essas vesículas ácidas poderiam ser capazes de eliminar a
droga do parasito, antes de esta destruir o esporocisto. Essa hipótese é sustentada também
pelos estudos de Al-Adhami et al. (2005), que revelaram a presença desses compartimentos
ácidos em vermes imaturos (estágio do pulmão, naturalmente resistente ao PZQ) e ausentes
em vermes adultos, naturalmente sensíveis ao PZQ. Além disso, já foi descrita a ocorrência de
autofagia em vermes adultos de S. mansoni após o tratamento com drogas (Clarkson &
Erasmus, 1984).
Diversos trabalhos já relataram a existência de cepas resistentes ao PZQ, tanto em
campo quanto em laboratório (Fallon et al., 1994, 1995; Stelma et al., 1995; Ismail et al.,
1996, 1999; Araújo et al., 1996; Bonesso-Sabadini & Dias, 2000). De acordo com Coelho et
al. (1997), o uso da quimioterapia em massa, como principal método de controle da
esquistossomose em áreas endêmicas, pode gerar o surgimento de cepas resistentes, através
do mecanismo de pressão seletiva devido a tratamentos sucessivos. Esse processo de seleção
de resistência é um problema que deve ser tratado como prioritário, uma vez que o PZQ é a
única droga efetiva disponível contra as três espécies causadoras da esquistossomose de maior
importância médica: S. mansoni, S. haematobium e S. japonicum. Dessa forma, é de grande
importância a elaboração de testes simples e rápidos para triagem de drogas
76
esquistossomicidas e, ainda, testes baratos, factíveis e simples para detecção de cepas
resistentes.
O processo de pressão seletiva de drogas, utilizado para selecionar linhagens de S.
mansoni resistentes, é um mecanismo importante a ser utilizado, uma vez que esses parasitos
resistentes podem ser a chave para elucidar os mecanismos de ação de drogas (Ross et al.,
1993; Liang et al., 2003). Além disso, segundo Coles & Bruce (1987), parasitos resistentes
podem ser de grande importância no desenvolvimento de novas drogas esquistossomicidas,
bem como de novas combinações terapêuticas.
Nossos resultados, discutidos acima, demonstraram a ação do PZQ sobre a fase
intramolusco do Schistosoma, tanto “in vivo” quanto “in vitro”. Nos experimentos “in vivo”,
ficou claro que o PZQ gera uma interrupção da eliminação de cercárias e que essas voltam a
ser eliminadas em números bem menores aos anteriores ao tratamento. Tendo em vista esses
resultados, nós avaliamos se cercárias, provenientes de caramujos tratados, poderiam gerar
vermes adultos menos susceptíveis a esta droga em relação às cercárias provenientes de
caramujos não tratados, em função de uma pressão seletiva quimioterápica. Observou-se que
três tratamentos de cinco dias, com 100mg/Kg/ dia de PZQ, na fase intramolusco, não foram
suficientes para alterar a suscetibilidade dos vermes adultos recuperados de camundongos,
independente da dose de PZQ utilizada (200, 400 e 800mg/Kg) (Tabela 1 e Gráfico 13;
Tabela 2 e Gráfico 14). Nos dois experimentos realizados, os resultados obtidos foram
estatisticamente semelhantes, demonstrando o rigor com que esses experimentos foram
conduzidos. Acredita-se que mais tratamentos e/ou passagens sejam necessários para que essa
alteração de suscetibilidade à droga possa ser verificada nos vermes adultos, considerando-se
que em cada uma delas os caramujos seriam novamente tratados. No experimento chamado de
passagem 1, os camundongos foram infectados com cercárias provenientes de caramujos
previamente tratados, porém submetidas a uma passagem para manutenção do ciclo de vida
do parasito, sem que os caramujos fossem tratados novamente. Foi possível verificar que os
vermes adultos, provenientes de cercárias da cepa LE submetida a três tratamentos na fase
intramolusco (LE – PZQ), mostraram-se menos susceptíveis à droga do que os vermes
adultos, provenientes da cepa LE não submetida aos tratamentos na fase intramolusco, quando
ambos foram tratados com 400mg/Kg de PZQ (Tabela 3 e Gráfico 15). Para a dose de
800mg/Kg, nenhuma alteração na suscetibilidade foi observada. A dose de 800mg/Kg de
PZQ, neste caso, foi excessiva, resultando na eliminação de quase todos os parasitos. No
entanto, por se tratar de um único experimento, a repetição do experimento é necessária para
confirmar estes resultados.
77
Nosso trabalho, mostrando a ação do PZQ e OXA sobre a fase intramolusco do
parasito, tanto “in vivo” quanto “in vitro”, bem como a “cura” dos moluscos gerada pelo
tratamento com a associação das duas drogas, abre perspectivas interessantes para estudos de
mecanismos de ação de drogas, para verificar se caramujos tratados e “curados” apresentam
resistência à reinfecção pelo S. mansoni, além da possibilidade de ser útil na seleção de
parasitos resistentes a drogas esquistossomicidas.
78
6 Conclusões
Os resultados obtidos neste trabalho nos levam a concluir que:
• Os tratamentos, tanto no período pré-patente quanto patente da infecção, com
OXA ou com PZQ, isoladamente, agem na fase intramolusco do parasito,
interrompendo a eliminação de cercárias;
• Após o tratamento com PZQ, isoladamente, na fase patente da infecção, os
caramujos voltam a eliminar cercárias em números inferiores aos encontrados
antes do tratamento. Esse fato não ocorre com os caramujos tratados com
OXA, isoladamente, que voltam a eliminar cercárias em números semelhantes
aos encontrados antes do tratamento;
• Os tratamentos, tanto com OXA quanto com PZQ, na fase pré-patente da
infecção, geram um atraso no período pré-patente;
• Um ou dois tratamentos com a associação de 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg
de PZQ, no período pré-patente da infecção, levam a um atraso no período pré-
patente, mas não eliminam totalmente a infecção;
• No período patente, um único tratamento com a associação de 250mg/Kg de
OXA + 500mg/Kg de PZQ gera uma significativa interrupção/ redução na
eliminação de cercárias, mas não é suficiente para eliminar os parasitos dos
caramujos;
• Dois tratamentos, com a associação de 250mg/Kg de OXA + 500mg/Kg de
PZQ, no período patente da infecção, levam à erradicação do S. mansoni
intramolusco;
• Os esporocistos primários transformados “in vitro” apresentam uma nítida
contração, após o contato com 5 e 10µg/mL de PZQ, alterando o formato do
parasito;
• O PZQ causa dano no tegumento dos esporocistos primários, sendo estes
marcados pelas sondas Hoechst 33258 e lectina de Glicine max;
• Os esporocistos primários possuem organelas ácidas, semelhantes a
lisossomos;
• O PZQ influencia na formação dessas organelas ácidas, aumentando a área
marcada pela sonda LysoTracker Red, após o contato dos esporocistos com a
droga;
79
• Três tratamentos de cinco dias consecutivos, com 100mg/Kg/ dia de PZQ, na
fase intramolusco, não foram suficientes para alterar a suscetibilidade dos
vermes adultos, independente da dose de PZQ utilizada (200, 400 e
800mg/Kg);
• Os vermes adultos recuperados de camundongos infectados com cercárias
provenientes de caramujos previamente tratados com PZQ, porém, submetidos
a uma passagem para manutenção do ciclo de vida do parasito, sem que os
caramujos fossem tratados novamente, são menos susceptíveis ao PZQ do que
vermes adultos da cepa LE (controle), na dose de 400mg/Kg de PZQ.
80
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