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CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE
MACHOS-XX DE TRUTA ARCO-ÍRIS
(
Oncorhynchus
mykiss)
RAFAEL VENÂNCIO DE ARAÚJO
2007
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RAFAEL VENÂNCIO DE ARAÚJO
CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE MACHOS-XX DE TRUTA
ARCO-ÍRIS
(Oncorhynchus mykiss)
Dissertação apresentada à Universidade Federal
de Lavras como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em Zootecnia,
área de concentração em Produção Animal,
para a obtenção do título de “Mestre”.
Orientadora
Profª. PhD Ana Tereza de Mendonça Viveiros
LAVRAS
MINAS GERAIS - BRASIL
2007
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Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca Central da UFLA
Araújo, Rafael Venâncio
Criopreservação do sêmen de machos-XX de truta arco-íris
(Oncorhynchus mykiss) / Rafael Venâncio Araújo.
– Lavras: UFLA,
2007.
124 p. : il.
Orientador: Ana Tereza de Mendonça Viveiros
.
Dissertação (Mestrado) – UFLA.
Bibliografia.
1. Truta. 2. Sêmen. 3. Criopreservação. I. Universidade Federal de
Lavras. II. Título.
CDD-639.3755
RAFAEL VENÂNCIO DE ARAÚJO
CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE MACHOS-XX DE TRUTA
ARCO-ÍRIS
(Oncorhynchus mykiss)
Dissertação apresentada à Universidade Federal
de Lavras como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em Zootecnia,
área de concentração em Produção Animal,
para a obtenção do título de “Mestre”.
APROVADA em 09 de janeiro de 2007
Profa. Dra. Yara Aiko Tabata
(APTA-SAA-SP)
Prof. Dr. Rilke Tadeu Fonseca de Freitas UFLA
Prof. Dr. José Cleto da Silva Filho UFLA
Profa. PhD Ana Tereza de Mendonça Viveiros
UFLA
(Orientadora)
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
A Deus,
pela minha vida e por seu Amor infinito.
Aos meus pais, Jair e Dilma,
por acreditarem no meu potencial, pela educação
recebida e pelo amor e carinho dedicados.
A todos aqueles que, de alguma forma, colaboraram
para a concretização deste curso e deste trabalho.
DEDICO
As duas palavras mais importantes: “MUITO OBRIGADO”. A palavra
mais importante: “NÓS”. A palavra menos importante: “EU”
“Nada façais por contenda ou por vanglória, mas por humildade;
cada um considere os outros superiores a si mesmo”.
Filipenses 2.3
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Lavras, pela excelência na educação
superior, em especial ao Departamento de Zootecnia, pelo acolhimento.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais
(FAPEMIG), pelo apoio financeiro.
À Profa. PhD. Ana Tereza de Mendonça Viveiros, pela atenção,
orientação e companheirismo durante todo este trabalho.
Ao Prof. Dr. Rilke Tadeu Fonseca Freitas, pelo direcionamento
estatístico durante a elaboração e execução do projeto.
À Profa. Dra. Priscila V. R. Logato, pelos conhecimentos transmitidos
durante todo o curso.
Aos pesquisadores científicos Yara Aiko Tabata e Marcos Guilherme
Rigolino, pela atenção, orientação, amizade e companheirismo durante todo este
trabalho.
Á equipe de apoio Rosana Aparecida da Silva, Antônio Donizeti da
Silva e Luiz Roberto da Silva, da Estação Experimental de Salmonicultura “Dr.
Ascânio de Faria”-APTA-SAA-SP, pela ajuda e por contribuírem com
informações imprescindíveis para a realização deste trabalho.
À equipe da Estação de Hidrobiologia de Furnas Centrais Elétricas, em
especial ao Sr. Dirceu e Sra. Marcília, pela valiosa colaboração e auxílio.
Aos colegas Alexandre N. Maria, Laura H. Orfão, Ziara Isaú, João
Fernando Koch, Aleximiliano V. Oliveira, Daniel Henrique B. Padrão, Ivan B.
Nakandakare, Marcos P. César, Larissa N. e Milena, pela ajuda.
Enfim, a todos que contribuíram, direta ou indiretamente, para a
realização deste trabalho, e a DEUS, que a todos observa e de todos cuida em
cada momento de nossa jornada,
agradeço
.
BIOGRAFIA
RAFAEL VENÂNCIO DE ARAÚJO
, filho de Jair Venâncio de Araújo
e Dilma Noemia Araújo, nasceu na cidade de Curitiba, estado do Paraná.
Em fevereiro de 2005, colou grau em Zootecnia, pela Universidade
Federal de Lavras.
Em março do mesmo ano, iniciou o mestrado no programa de Pós-
Graduação em Zootecnia, do Departamento de Zootecnia da Universidade
Federal de Lavras, tendo defendido dissertação em 9 de janeiro de 2007.
SUMÁRIO
RESUMO.............................................................................................................. i
ABSTRACT........................................................................................................iii
CAPÍTULO 1..................................................................................................... 01
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 02
2. OBJETIVOS .................................................................................................. 04
2.1 Objetivo geral............................................................................................... 04
2.2 Objetivos específicos ................................................................................... 04
3 REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................... 05
3.1 Truta arco-íris (
Oncorhynchus mykiss)
. ....................................................... 05
3.2 Reprodução. ................................................................................................. 08
3.3 Controle da sexualidade em peixes. ............................................................. 10
3.4 Sexualidade em peixes ................................................................................. 11
3.5 Determinação sexual.................................................................................... 13
3.6 Diferenciação sexual .................................................................................... 14
3.7 Inversão sexual............................................................................................. 15
3.8 Aspectos relevantes da biologia do sêmen de peixes................................... 21
3.8.1 Morfologia dos espermatozóides .............................................................. 22
3.8.2 Metabolismo e motilidade dos espermatozóides....................................... 23
3.8.3 Volume de sêmen...................................................................................... 27
3.8.4 Concentração espermática......................................................................... 28
3.9 Diluidores de sêmen..................................................................................... 29
3.10 Crioprotetores............................................................................................. 31
3.11 Criopreservação do sêmen de peixes ......................................................... 32
3.12 Descongelamento do sêmen de peixes....................................................... 37
3.13 Proporção espermatozóide: ovo e fertilização artificial............................. 38
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................... 41
CAPÍTULO 2..................................................................................................... 55
RESUMO........................................................................................................... 56
1 INTRODUÇÃO. ............................................................................................. 58
2 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 60
3 RESULTADOS............................................................................................... 66
4 DISCUSSÃO................................................................................................... 71
5 CONCLUSÃO ................................................................................................ 79
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................ 80
CAPÍTULO 3..................................................................................................... 87
RESUMO........................................................................................................... 88
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 90
2 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 92
3 RESULTADOS............................................................................................... 97
4 DISCUSSÃO................................................................................................ 101
5 CONCLUSÃO .............................................................................................. 104
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................... 105
CAPÍTULO 4................................................................................................... 108
2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................... 115
ANEXOS ......................................................................................................... 117
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1
TABELA 1: Estimativa de produção e número de produtores de truta nos
estados brasileiros .........................................................................08
CAPÍTULO 2
TABELA 1: Dados referentes ao número de animais, peso vivo, volume,
motilidade, concentração espermática e pH nas diferentes
etapas experimentais......................................................................66
TABELA 2: Motilidade (%; média ± desvio padrão; n=5 machos-XX)
espermática do sêmen de machos-XX de truta arco-íris,
criopreservado em diferentes diluidores e DMSO 10%................67
TABELA 3: Motilidade (%; média ± desvio padrão; n=5 peixes)
espermática pós-descongelamento do sêmen de machos-XX de
truta arco-íris, criopreservado em glicose-gema combinado a
diferentes crioprotetores (10%) e taxas de diluição ......................68
TABELA 4: Motilidade (%; média ± desvio padrão; n=5 doadores de
sêmen) espermática do sêmen de machos-XX de truta arco-íris,
criopreservado em meio contendo glicose-gema-DMSO, e
envasado em diferentes volumes de palhetas................................69
TABELA 5: Motilidade (%; média ± desvio padrão; n=5 doadores de
sêmen) espermática do sêmen de machos-XX de truta arco-íris,
criopreservado em meio contendo glicose-gema-DMSO e
descongelado em diferentes temperaturas.....................................69
TABELA 6: Taxa de ovos olhados em diferentes relações espermatozóide :
ovo para o sêmen de machos-XX de truta arco-íris,
criopreservado em glicose-gema-DMSO e descongelado a
70°C por 3 segundos .....................................................................70
CAPÍTULO 3
TABELA 1: Dados referentes ao número de animais, peso vivo, volume,
motilidade, concentração espermática, pH e índice
gonadossomático (GSI) nas diferentes etapas experimentais........97
TABELA 2: Motilidade (%; média ± desvio padrão; n=3 machos-XX)
espermática do sêmen intratesticular de machos-XX de truta
arco-íris, criopreservado em diferentes diluidores, acrescidos
de 10% de gema e 10% DMSO e descongelado em diferentes
temperaturas ..................................................................................98
TABELA 3: Motilidade (%; média ± desvio padrão; n=5 machos-XX)
espermática do sêmen intratesticular de machos-XX de truta
arco-íris, diluído em diferentes proporções sêmen: plasma
seminal, incubado ou não por 1:30h a 4°C e criopreservado em
glicose-gema-DMSO.....................................................................99
TABELA 4: Motilidade (%; média ± desvio padrão; n=5 machos-XX)
espermática do sêmen intratesticular de machos-XX de truta
arco-íris, diluído em diferentes proporções sêmen: plasma,
incubado por 1:30h a 4°C e criopreservado em diferentes
diluidores.....................................................................................100
CAPÍTULO 4
TABELA 1: Dados referentes ao número médio de animais, peso vivo,
volume, motilidade, concentração espermática, pH e índice
gonadossomático (GSI)...............................................................110
TABELA 2: Melhores resultados de motilidade espermática e taxa de ovos
olhados para machos-XX de truta arco-íris com e sem ductos
espermáticos................................................................................112
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1
FIGURA 1: Truta arco-íris
(Oncorhynchus mykiss)
.........................................05
FIGURA 2: Método indireto para obtenção de progênie 100% feminina.........16
FIGURA 3: Alterações testiculares. A. Constrição testicular e ausência de
ductos espermáticos. B. Presença simultânea de ovários e
testículos........................................................................................20
FIGURA 4: Sucessão de eventos desencadeadores da motilidade
espermática em espécies de água doce..........................................27
FIGURA 5: A. Botijão de vapor de nitrogênio líquido; B. Botijão de
nitrogênio líquido..........................................................................36
FIGURA 6: Incubadoras ...................................................................................40
FIGURA 7: Ovos olhados e eclosão de um eleuteroembriões..........................40
CAPÍTULO 2
FIGURA 1: Incubadoras de bandeja – parcelas distribuídas aleatoriamente....65
CAPÍTULO 3
FIGURA 1: Extração do sêmen intratesticular por gotejamento.......................93
i
RESUMO
ARAÚJO, Rafael Venâncio.
Criopreservação do sêmen de machos-XX de
truta arco-íris
(Oncorhynchus mykiss
).
2007. 124 p. Dissertação (Mestrado em
Produção Animal) – Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG.
1
O estudo foi conduzido entre julho e agosto de 2005 e 2006, com o objetivo de
aperfeiçoar as técnicas de criopreservação do sêmen de machos de truta arco-íris
obtidos por inversão sexual (machos-XX). Inicialmente, apenas os peixes que
liberavam sêmen por pressão abdominal foram utilizados. No experimento 1,
foram testados quatro diluidores de sêmen (glicose 5,4%, NaCl 0,9%, NaCl
1,2%-tris e BTS
®
) e o efeito da adição da gema de ovo aos diluidores. Depois, o
efeito dos crioprotetores DMSO, etileno glicol, metil glicol e metanol, taxas de
diluição de 1:3 e 1:7 (experimento 2), das palhetas de 0,25; 0,5 e 4,0 ml
(experimento 3) e do descongelamento das palhetas a temperaturas do banho-
maria de 70ºC/3s, 60ºC/8s e 50ºC/8s (experimento 4) foi avaliado quanto à
motilidade espermática. No experimento 5, o sêmen congelado foi avaliado
quanto à capacidade de fertilização (taxa de ovos olhados), em diferentes
proporções espermatozóide:ovo (15x10
6
a 60x10
6
), após 196°C dias de
incubação. Em todos os experimentos, as amostras de sêmen diluídas foram
congeladas em vapor de nitrogênio (N
2
), a -170°C, por 12-16 horas, até serem
transferidas para o N
2
líquido. Na fase seguinte, apenas o sêmen obtido
diretamente dos testículos (intratesticular) foi utilizado. No experimento 1, o
sêmen foi diluído em três diluidores (glicose 5,4%, NaCl 0,9% ou NaCl 1,2%-
tris), gema e DMSO. As amostras foram congeladas conforme descrito na fase
inicial e descongeladas a 70°C/3s ou 35°C/16s. Depois, o período de incubação
de 01h30min, antes do congelamento, foi testado no sêmen diluído (1:0, 1:6 ou
1:8, experimento 2; 1:5, 1:7 ou 1:9, experimento 3) em plasma seminal e
congelado em glicose ou NaCl como diluidores (experimento 3), gema de ovo e
DMSO. As amostras de sêmen coletadas por meio de massagem abdominal
apresentaram as maiores taxas de motilidade espermática pós-descongelamento
quando criopreservadas em meio contendo glicose, gema e DMSO, na proporção
1:3, envasadas em palhetas de 0,5 ml e descongeladas a 70ºC/3s. As maiores
taxas de ovos olhados foram produzidas com sêmen descongelado nas
proporções acima de 30x10
6
espermatozóides:ovo. Quando o sêmen
intratesticular foi congelado diretamente, sem passar pelo período de incubação,
as taxas de motilidade espermática pós-descongelamento foram baixas;
entretanto, quando diluído 1:6 em plasma, incubado e re-diluído 1:3 em glicose-
gema-DMSO, a motilidade espermática aumentou de 18% para 60%. Com base
nos resultados deste trabalho, conclui-se que o sêmen de machos-
____________________________________________
1
Comitê Orientador: Ana Tereza de Mendonça Viveiros - UFLA (Orientadora), Rilke
Tadeu Fonseca de Freitas – UFLA e Yara Aiko Tabata – APTA (co-orientadores).
ii
XX de truta arco-íris pode ser criopreservado em meio contendo glicose, gema e
DMSO, em palhetas de 0,5 ml e descongelado a 70ºC/3s. O sêmen intratesticular
pode ser criopreservado com o mesmo protocolo, mas precisa ser previamente
incubado em plasma seminal, por 01h30min.
iii
ABSTRACT
ARAÚJO, Rafael Venâncio.
Semen cryopreservation of rainbow trout XX-
males.
2007. 124 p. Dissertation (Master in Animal Production) – Federal
University of Lavras, Lavras, Minas Gerais, Brazil.
1
This study was carried out during July and August of 2005 and 2006. The aim of
this study was to improve the cryopreservation techniques for semen
cryopreservation of sex-reversed rainbow trout males (XX-males). The first
session of experiments, only semen collected under abdominal massage was
used. In experiment 1, four semen extenders (glucose 5,4%, NaCl 0,9%, NaCl
1,2%-tris and BTS
®
) and the addition of egg yolk at 0 and 5% to the freezing
media were tested. Then the effects of DMSO, ethylene glycol, methylglycol
and methanol as cryoprotectants, semen dilution ratios of 1:3 and 1:7
(experiment 2), straw volumes of 0.25; 0.5 and 4.0 ml (experiment 3) and
thawing at a water bath temperatures of 70ºC/3s, 60ºC/8s and 50ºC/8s
(experiment 4) on post-thaw sperm motility were evaluated. In experiment 5,
post-thaw semen was used at different sperm:egg ratios (15x10
6
to 60x10
6
) and
eyed-egg rate was calculated after 196°C days. In all theses five experiments,
semen was cryopreserved in nitrogen (N
2
) vapor at -170°C for 12-16 h, then
transferred to a liquid N
2
vessel. During the second session of experiments, only
intratesticular semen obtained after male sacrifice was used. In experiment 1,
semen was cryopreserved in one extender (glucose 5,4%, NaCl 0,9% or NaCl
1,2%-tris), egg yolk and DMSO according to the method described previously,
and thawed at 70°C/3s or 35°C/16s. Then the pre-freezing incubation of semen
diluted (1:0, 1:6 or 1:8, experiment 2; 1:5, 1:7 or 1:9, experiment 3) in seminal
plasma and frozen in glucose or NaCl as extender (experiment 3), egg yolk and
DMSO was tested. When semen was collected under abdominal massage, the
highest post-thaw sperm motilities were observed in those samples diluted 1:3 in
glucose, egg yolk and DMSO as freezing medium, cryopreserved in 0.5-ml
straws and thawed at 70ºC/3s. The highest eyed-egg rates were observed when
sperm:egg ratio was above 30x10
6
. When intratesticular semen was immediately
cryopreserved without the incubation period, very low post-thaw sperm motility
were observed. However, when intratesticular semen was diluted 1:6 in seminal
plasma, incubated for 1:30h and cryopreserved in glucose, egg and DMSO, post-
thaw sperm motility increased from 18% (without incubation) to 60% (after
incubation). Based in these results we can conclude that semen of rainbow trout
XX-males can be successfully cryopreserved in a freezing medium containing
glucose, egg and DMSO, in 0.5-ml straws and thawed at 70ºC/3s. If
____________________________________________
1
Comitê Orientador: Ana Tereza de Mendonça Viveiros - UFLA (Orientadora), Rilke
Tadeu Fonseca de Freitas – UFLA e Yara Aiko Tabata – APTA (co-orientadores).
intratesticular semen is used, than the pre-freezing incubation period of 1:30h in
seminal plasma is mandatory.
1
CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO
2
1 INTRODUÇÃO
A Aqüicultura é o setor de produção de alimentos que mais cresce no
mundo. Em 1999, ela foi responsável pela produção de 42,77 milhões de
toneladas, o que correspondeu a 31,3% da produção pesqueira mundial (Fish
Farming International, 2001).
Os salmonídeos estão entre os grupos de espécies de peixes mais
produzidos em confinamento, contribuindo com 1,39 milhão de toneladas, no
valor de 4,57 bilhões de dólares. As principais espécies representantes deste
grupo são o salmão-do-atlântico (
Salmo salar
) e a truta arco-íris (
Oncorhynchus
mykiss
), esta última a espécie avaliada neste estudo.
O controle da sexualidade em truta arco-íris é de grande importância
para a indústria da aqüicultura, pois as fêmeas dessa espécie apresentam taxas de
crescimento mais elevadas do que os machos. Os machos atingem a maturidade
sexual antes de alcançar o peso comercial, comprometendo a qualidade e a
rentabilidade da criação, por ser este um dos processos biológicos que mais
afetam a produtividade. Durante este período, a energia que seria utilizada para o
crescimento somático é canalizada para a produção de gametas, resultando na
diminuição do crescimento, na eficiência alimentar, na sobrevivência e na
qualidade do pescado (Bye & Lincoln, 1986).
Uma das técnicas mais utilizadas para a obtenção de lotes 100% femininos
em truta arco-íris é a inversão sexual pela via indireta, que consiste na
masculinização de fêmeas genotípicas por meio andrógenos e posterior
fertilização de óvulos normais com o sêmen dessas fêmeas masculinizadas
(machos-XX). Esse procedimento permite o crescimento dos testículos e a
produção de espermatozóides viáveis nesses indivíduos, que são geneticamente
fêmeas, e, conseqüentemente, todos os seus espermatozóides carregam o
cromossomo X. Entretanto, esse tratamento conduz a uma população masculina
3
na qual a maioria dos machos-XX apresenta os dutos espermáticos ausentes,
incompletos ou afuncionais, o que requer o sacrifício dos animais e a retirada
dos testículos para se obter o sêmen.
A necessidade do sacrifício dos animais para a retirada dos testículos e a
obtenção do sêmen requer do produtor a manutenção de um número mais
elevado de reprodutores nas pisciculturas, além de uma utilização constante de
hormônios para a manutenção dos lotes invertidos. Essas práticas acabam,
muitas vezes, onerando os custos de produção na propriedade. Dessa forma, o
sêmen desses animais poderia ser criopreservado, dispensando-se, assim, a
prática contínua do tratamento hormonal e permitindo a disponibilidade desse
material ao longo do ano, reduzindo a necessidade de um estoque muito grande
de reprodutores. Pode ainda servir como base para o desenvolvimento e a
manutenção de bancos genéticos e transporte de gametas (McAndrew et al.,
1995).
O objetivo deste estudo foi avaliar alguns fatores que interferem na
criopreservação do sêmen de machos-XX de truta arco-íris, buscando
aperfeiçoar as técnicas de criopreservação, tanto para os peixes que possuem os
dutos espermáticos completos, como para aqueles que não os possuem, na
tentativa de racionalizar a produção de lotes 100% femininos, levando em
consideração as condições de cultivo encontradas no Brasil.
4
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Este trabalho teve o objetivo geral de aperfeiçoar as técnicas de
criopreservação do sêmen de machos-XX de truta arco-íris (
Oncorhynchus
mykiss
).
2.2 Objetivos específicos
•
Avaliar a eficiência de diferentes soluções diluidoras e crioprotetoras
sobre a motilidade espermática após o congelamento.
•
Avaliar a eficiência de diferentes taxas de diluição (sêmen:criosolução)
sobre a motilidade espermática após o descongelamento.
•
Avaliar a motilidade espermática, após o descongelamento, para o
sêmen envasado em diferentes volumes de palhetas.
•
Avaliar o efeito de diferentes temperaturas de descongelamento do
sêmen sobre a motilidade espermática, após o descongelamento.
•
Avaliar o efeito de diferentes proporções de espermatozóide por ovo
sobre a taxa de fertilização, para o sêmen criopreservado.
•
Avaliar a eficiência de diferentes diluidores de sêmen e temperaturas de
descongelamento sobre a motilidade espermática, após o congelamento
do sêmen intratesticular
•
Avaliar o efeito da incubação pré-congelamento do sêmen intratesticular
em plasma seminal, em diferentes taxas de diluição.
5
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Truta arco-íris (
Oncorhynchus mykiss
)
.
Reino: Animália;
Filo: Chordata;
Classe: Actinopterygii;
Ordem: Salmoniformes;
Família: Salmonidae;
Gênero:
Oncorhynchus;
Espécie:
Oncorhynchus mykiss
, Walbaum, 1792.
Nome vulgar: truta arco-íris.
FIGURA 1:
Truta arco-íris
(Oncorhynchus mykiss)
Foto: www.fws.gov
A truta arco-íris (Figura 1) caracteriza-se pelo formato fusiforme do seu
corpo coberto por finas escamas. Sua coloração varia de acordo com o ambiente
em que vive, com o sexo, a idade e o estado de maturação sexual, entre outros
fatores. Geralmente, a coloração do seu dorso varia do castanho para o
esverdeado, os flancos são acinzentados e o ventre esbranquiçado, apresentando
pintas escuras espalhadas pelo corpo e nadadeiras (Blanco-Cachafeiro, 1995). É
um peixe carnívoro, que se alimenta na natureza de presas vivas, como insetos,
larvas, moluscos, crustáceos e pequenos peixes.
6
A truta arco-íris, a forma residente em água doce da espécie
Oncorhynchus mykiss
, é um salmonídeo originário dos rios da vertente pacífica
da América do Norte, cuja distribuição natural se estende do sul do Alasca até o
norte do México (Tabata, 1997). Por apresentar excelentes características, tanto
para a aqüicultura quanto para a pesca esportiva, encontra-se amplamente
distribuída em todas as águas frias do mundo, exceto no continente Antártico
(Hershberger, 1992). Na América do Sul é encontrada na Argentina, no Brasil,
na Bolívia, no Chile, na Colômbia, no Equador, no Peru e na Venezuela.
Além das formas anádroma (que passa uma parte de sua vida no mar e
desova em água doce, de modo semelhante aos salmões-do-atlântico ou do
pacífico) e do fato de ser residente em água doce (que passa toda sua vida em
riachos, lagos ou rios), denominadas respectivamente de steelhead e arco-íris,
esta espécie também apresenta dimorfismos quanto às formas costeira e
continental (Tabata & Ports, 2004). Essas diferenças, decorrentes de sua
adaptação a diferentes hábitats, geraram certa confusão quanto a sua
classificação taxonômica. MacCrimmon (1971) listou 20 nomes de espécies que
eram usados para identificar as várias formas encontradas, sendo os mais
citados:
Salmo gairdneri, S. irideus e S. gilberti.
Com base em análises osteológicas de DNA mitocondrial, que revelaram
que a truta apresenta maior similaridade com os salmões-do-pacífico (gênero
Oncorhynchus) do que com a truta e o salmão-do-atlântico (gênero Salmo), o
“American Fisheries Society Names of Fishes Committee”, em 1988, adotou o
uso do nome genérico
Salmo
para todas as trutas e salmões-do-atlântico. Além
disso, a constatação de que a truta arco-íris, descrita por Richardson, em 1836,
como
Salmo gairdneri,
era a mesma espécie descrita por Johann Walbaum em
1792, como
Salmo mykiss
, na região de Kamchatka,
mykiss
teve prioridade sobre
gairdneri
por ter sido descrito primeiro. Desde então, a truta arco-íris e todas as
7
suas formas passaram a ser denominadas de
Oncorhynchus mykiss
(Smith &
Stearley, 1989).
A propagação artificial da truta arco-íris teve início em 1874, pela
transferência de ovos embrionados do rio MacCloud, no norte da Califórnia,
para a Caledônia, Nova York. A primeira exportação realizada com sucesso
ocorreu em 1874, para Tóquio. Foi introduzida na França em 1879 e, daí,
disseminada por toda a Europa, onde seu cultivo, como atividade industrial,
iniciou-se na Dinamarca, em 1890. Com exceção da carpa comum, a truta arco-
íris é, provavelmente, uma das espécies mais antigas empregadas em cultivo
(Gall & Crandell, 1992).
No Brasil, a truta arco-íris foi introduzida em 26 de maio de 1949,
inicialmente na Serra da Bocaina, no município de Bananal, por meio de 5.000
ovos embrionados procedentes da Dinamarca. Em maio do ano seguinte, mais
50.000 ovos foram importados do mesmo local e incubados no recém-
organizado Posto de Biologia e Criação de Trutas, em Bananal, de onde foram
distribuídos para vários municípios do sudeste e sul do Brasil (Faria, 1953).
Posteriormente, foram realizadas várias importações de ovos
embrionados de diferentes procedências, até que, na década de 1970, iniciaram-
se os primeiros trabalhos sobre reprodução artificial desta espécie no Brasil. No
princípio daquela mesma década, foi instalada, em Campos do Jordão, SP, a
primeira truticultura comercial. Atualmente, existem cerca de 120
truticulturas
localizadas nos estados de São Paulo, Minas Gerais, Espírito Santo, Rio de
Janeiro, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul (Tabela 1).
Apesar de, anteriormente, terem ocorrido duas outras tentativas de
introdução de trutas, a primeira, em 1913, com ovos da espécie
Salmo trutta
fario
, e a segunda, com ovos de truta arco-íris, em maio do mesmo ano
(Sociedade de Amigos dos Aquários Públicos, 1996), a introdução feita em 1949
8
é considerada o marco da introdução da truta no Brasil, pois, a partir deste lote,
originaram-se populações “naturalizadas” (Porto -Foresti et al., 2002).
TABELA 1
. Estimativa de produção e número de produtores de truta nos
estados brasileiros (Proença et al., 2001).
Além de sua capacidade de adaptação a diversos sistemas aquáticos
(rios, lagos, represas, tanques, laboratórios de incubação, tanques rede, etc.), a
truta apresenta um alto grau de domesticação: ambos os sexos amadurecem em
cativeiro, os gametas podem ser facilmente coletados, a fertilização é realizada
externamente, aceita alimento artificial desde a primeira alimentação e permite
uma série de manipulações no tocante ao controle da sexualidade. Estas
características, aliadas ao elevado valor comercial, fizeram da truta arco-íris uma
das espécies mais intensamente pesquisadas e um dos salmonídeos mais
cultivados (Tabata, 1997).
3.2 Reprodução
As trutas completam a maturação sexual aos 2 anos de idade, com peso
ao redor de 1.000 gramas. Ao final do primeiro ano de vida, alguns machos se
apresentam maduros sexualmente, entretanto, esta característica é prejudicial ao
ganho de peso. No Brasil, o período de reprodução ocorre entre os meses de
maio a agosto, quando os dias são mais curtos (menor fotoperíodo) e as
Estado
Produção (t ano
-1
)
Nº de produtores
São Paulo
Minas Gerais
Santa Catarina
Rio de Janeiro
Espírito Santo
Paraná
Rio Grande do Sul
600
500
215
200
85
60
25
25
22
35
32
2
2
3
Total
1685
121
9
temperaturas mais baixas. Para se obter bons resultados no processo da
reprodução, a temperatura da água deve estar próxima dos 10
o
C.
São vários os fatores ambientais que regulam a função reprodutiva nos
peixes. Dentre eles, o fotoperíodo e a temperatura são os mais importantes,
especialmente em salmonídeos (Bromage et al., 2001). O fotoperíodo é o
principal fator determinante da maturação e do período de reprodução, atuando
no mecanismo da puberdade, gametogênese e ovulação. A temperatura da água
desempenha um papel modulador, regulando a progressão de vários estágios do
processo reprodutivo, como a liberação dos gametas, a fertilização, a
embriogênese, a diferenciação sexual, etc. (Bromage & Cumaranatunga, 1998;
Davies & Bromage, 2002).
A puberdade consiste em uma série de mecanismos fisiológicos que
promovem a primeira maturação gonadal, quando são ativados os processos de
gametogênese e a produção de hormônios sexuais, que culminam, mais tarde,
com a maturação sexual (Tabata & Ports, 2004). Esse processo envolve a
maturação dos gametas, a expressão das características sexuais secundárias e o
comportamento reprodutivo. O momento em que a puberdade é desencadeada
depende da espécie, da idade, do peso e do perfil genético do animal (Estay et
al., 1995).
Quando livres na natureza, as trutas migram para as cabeceiras dos rios
em busca de águas mais limpas e locais mais protegidos de predadores para se
reproduzirem; assim, desovam uma vez por ano, nas estações de temperaturas
mais baixas. As fêmeas escavam um ninho em zonas de fundo arenoso e pouca
corrente (normalmente margens do rio). Os ovos são depositados nessas
concavidades e, depois de fertilizados, pelo macho são cobertos com areia, onde
ficam até a eclosão (Blanco-Cachafeiro, 1995). Quando confinadas em tanques,
as trutas não se reproduzem naturalmente. Os reprodutores alcançam a
maturidade sexual e a maturação final dos ovócitos e espermatozóides, porém,
10
não os liberam naturalmente, sendo necessária a intervenção do homem para
completar o processo reprodutivo (Tabata & Portz., 2004). Essa intervenção se
dá pela extrusão manual dos ovócitos e espermatozóides por compressão
abdominal, não sendo necessária a aplicação de hormônios, como o extrato bruto
de pituitária de carpa, normalmente usado na reprodução de outras espécies de
peixes mantidas em cativeiro. Segundo Springate et al. (1984), a produtividade
máxima pode ser alcançada quando os ovos são fertilizados entre quatro e dez
dias após a ovulação, sob temperatura da água de 10°C.
3.3 Controle da sexualidade em peixes
As técnicas de controle da sexualidade em peixes apresentam um grande
potencial para aumentar a produtividade nos cultivos, pois permitem obter os
benefícios associados ao sexo que apresentam as características morfológicas,
fisiológicas ou comportamentais de interesse econômico (Tabata, 1997).
Nas criações comerciais, uma das principais vantagens obtidas pelo
cultivo monossexo, é quando um dos sexos apresenta, em relação ao outro, uma
marcada superioridade na taxa de crescimento. Contudo, dependendo da espécie,
as técnicas de controle dos sexos podem trazer outros benefícios, tais como:
supressão da reprodução, contenção de gastos energéticos com a atividade
reprodutiva, uniformidade de tamanho na colheita, redução dos efeitos da
maturação sexual na aparência e na qualidade da carne, bem como a diminuição
dos riscos de impacto ambiental decorrente do escape de peixes para os sistemas
naturais (Beardmore et al., 2001).
Em muitas espécies de peixes cultivados, as fêmeas apresentam taxas de
crescimento mais elevadas do que os machos, alcançando tamanhos maiores. Em
alguns grupos, incluindo os salmonídeos, os machos maturam antes de atingir o
peso comercial, comprometendo a qualidade e a rentabilidade da criação.
11
A maturação sexual é um dos processos biológicos que mais afetam a
produtividade, pois, durante este período, a energia para o crescimento somático
é canalizada para a produção de gametas, resultando na diminuição do
crescimento, da eficiência alimentar, da sobrevivência e da qualidade do pescado
(Bye & Lincoln, 1986). Desse modo, a truta arco-íris tem sido tradicionalmente
comercializada na forma de truta porção, com peso de, aproximadamente, 250
gramas, que pode ser alcançado antes do início da atividade reprodutiva. Nos
machos, entretanto, esses problemas são mais acentuados, pois uma considerável
proporção deles amadurece sexualmente ainda no primeiro ano de vida,
enquanto as fêmeas maturam somente aos dois anos de idade (Tabata & Ports
2004). Além disso, após atingirem a maturação sexual, os salmonídeos machos
desenvolvem algumas características sexuais secundárias que consistem,
principalmente, na projeção da mandíbula em forma de gancho e no
espessamento e escurecimento da pele, que são indesejáveis, do ponto de vista
comercial. Essas alterações, associadas à queda da resistência e ao aumento do
comportamento agressivo os predispõem a infecções por fungos e bactérias que,
além de comprometerem a comercialização, podem provocar a morte dos
animais (Brown & Roberts, 1982).
Assim, em algumas espécies, particularmente em truta arco-íris, o
cultivo de lotes femininos é vantajoso, pois se elimina o problema da maturação
sexual precoce dos machos e, ao mesmo tempo, pode-se aumentar a produção de
ovos com o mesmo custo de manutenção de reprodutores.
3.4 Sexualidade em peixes
A expressão da sexualidade em peixes é bastante diversificada,
proporcionando um excelente material para os estudos relacionados à
diferenciação e à evolução do sexo entre os animais. Os peixes podem ser
12
classificados como: gonocóricos (quando os sexos ocorrem separadamente nos
indivíduos), hermafroditas (ambos os sexos estão presentes no mesmo
indivíduo) e unissexuados (espécies onde ocorre apenas o sexo feminino). Em
razão dessa ampla variação, machos e fêmeas poderiam ser melhor definidos,
respectivamente, como produtores de sêmen e de ovos (Yamamoto, 1969).
As espécies cultivadas, em sua maioria, são do tipo gonocórico, que
podem ser divididas em indiferenciadas e diferenciadas. Nas gonocóricas
indiferenciadas, a gônada primordial primeiro se desenvolve em uma gônada
semelhante a um ovário e, depois, metade dos indivíduos torna-se macho e a
outra metade torna-se fêmea. Nas espécies diferenciadas, a gônada diferencia-se
diretamente em um testículo ou em um ovário.
Hermafroditismo é a ocorrência de tecido ovariano e testicular em um
mesmo indivíduo. Há três tipos de hermafroditas: sincrônico (em que ovos e
espermatozóides maturam ao mesmo tempo), protogínico (primeiro
desenvolvem ovário e, posteriormente, revertem para testículo) e protandrômico
(primeiro desenvolvem testículo e depois ovário). As espécies unissexuadas
apresentam reprodução natural por ginogênese, em que o espermatozóide do
macho de uma espécie bissexual contribui apenas para a ativação do
desenvolvimento do ovo, sem ocorrência da singamia (Yamazaki, 1983).
A expressão do sexo depende de dois eventos: da determinação sexual e
da diferenciação sexual. A determinação sexual é responsável pelo sexo genético
(ou genotípico), enquanto que a diferenciação sexual é responsável pelo
desenvolvimento das gônadas (sexo gonadal ou fenotípico). A interação desses
dois eventos resulta em dois fenótipos: macho ou fêmea, seja morfológica,
comportamental ou funcionalmente (Piferrer, 2001).
13
3.5 Determinação sexual
O sexo genético é determinado na fertilização, pela combinação dos
cromossomas provenientes do ovo e do espermatozóide (Yamazaki, 1983). A
determinação sexual é definida como a soma de genes responsáveis pela
formação das gônadas e de suas características. Esses genes podem estar
espalhados pelo genoma ou a maioria deles, concentrados em um par de
cromossomas que, neste caso, são chamados de cromossomas sexuais. Há três
modelos de determinação sexual que podem ser aplicados em peixes:
cromossômico, poligênico e interação genótipo-ambiente (Piferrer, 2001).
A determinação sexual cromossômica implica na presença de
cromossomas sexuais, em que um par de cromossomas (denominados de
heterocromossomas) acumula a maioria dos genes responsáveis pelo
desenvolvimento sexual. A maioria dos peixes não apresenta
heterocromossomas, não sendo morfologicamente distintos. Mas, com base em
análises citogenéticas, reversão sexual e cruzamentos controlados, oito sistemas
cromossômicos já foram descritos. Estes sistemas variam desde sistemas
simples, como XX/XY ou WZ/ZZ, até os mais complexos, envolvendo mais que
um par de cromossomas sexuais ou diferentes números de cromossomas,
dependendo do sexo.
O sexo em que os cromossomas são iguais é chamado de homogamético,
e heterogamético, quando os cromossomas são diferentes. Os sistemas
cromossômicos XX/XY e ZW/ZZ são os mais freqüentes entre as espécies
cultivadas e, neles, a proporção sexual na progênie não difere significativamente
de 1:1. No sistema XX/XY, as fêmeas são homogaméticas e os machos
heterogaméticos, enquanto que, no sistema ZW/ZZ, as fêmeas são
heterogaméticas e os machos homogaméticos. A denominação de XY ou ZW é
14
usada apenas para evitar confusões, quando se descrevem os dois sistemas
(Tave, 1993).
No sistema poligênico de determinação sexual, genes epistáticos
determinantes do sexo estão presentes tanto nos cromossomas autossômicos,
como nos heterocromossomas e o sexo do embrião será resultante da
combinação dos fatores masculinos e femininos, presentes no conjunto
cromossômico herdado de cada parental (Hunter et al., 1983). Nesse sistema, a
proporção sexual macho:fêmea será diferente de 1:1. A influência que esses
genes influenciadores ou modificadores do sexo têm sobre a determinação
sexual constitui um problema quando se objetiva a produção de lotes
monossexos.
Embora a determinação sexual ocorra, principalmente, sob controle
genético, fatores ambientais, tais como: temperatura, fotoperíodo, salinidade e
altas densidades de estocagem, podem ter influência nesse processo. A
determinação sexual pela interação genótipo-ambiente está se tornando evidente
em um número cada vez maior de espécies, mostrando que é possível controlar o
sexo pela manipulação ambiental.
3.6 Diferenciação sexual
A diferenciação sexual envolve todos os eventos que ocorrem durante o
desenvolvimento, resultando na expressão do sexo genético no sexo fenotípico.
Ela inclui os primeiros eventos que ocorrem desde a gônada primordial até a
diferenciação completa em testículos ou ovários.
Nas espécies gonocóricas diferenciadas, a diferenciação sexual ocorre
primeiro nas fêmeas e depois nos machos. Os primeiros sinais de diferenciação
sexual nas fêmeas são a entrada das oogonias na meiose e ou a proliferação das
células somáticas para formar a cavidade ovariana. Nos machos, a diferenciação
15
sexual é caracterizada pelo surgimento da espermatogônia, pelo arranjo das
células germinativas e somáticas em lóbulos e pela diferenciação do sistema
vascular do testículo, incluindo os dutos espermáticos.
A natureza do indutor endógeno da diferenciação sexual ainda não está
totalmente esclarecida, mas, muitas evidências reforçam a idéia de que os
esteróides sexuais são, de fato, indutores naturais da diferenciação sexual em
peixes. Mais recentemente, muitas pesquisas têm enfocado a importância das
enzimas esteroidogênicas, no processo da diferenciação sexual em peixes e
outros vertebrados. Salmões machos funcionais foram obtidos de fêmeas
genotípicas tratadas com inibidor específico da aromatase, evidenciando que os
estrógenos endógenos são responsáveis pela diferenciação ovariana e que a
aromatase tem um papel fundamental neste processo (Piferrer, 2001).
3.7 Inversão sexual
O controle artificial do sexo em peixes, pela administração hormonal,
iniciou-se com os trabalhos realizados no final de 1930 e princípio de 1940
(revisão em Yamamoto, 1969). Os resultados obtidos nesses estudos
proporcionaram não somente informações sobre os mecanismos genéticos da
diferenciação sexual, mas também demonstraram as potencialidades de suas
aplicações em espécies economicamente importantes, em que os cultivos
monossexos são vantajosos.
Uma vez que os esteróides sexuais estão envolvidos no processo natural
de diferenciação sexual, esse processo pode ser controlado pela administração de
hormônios sexuais, em peixes sexualmente indiferenciados, alterando o curso da
diferenciação no sentido do sexo desejado.
A feminização pela técnica hormonal pode ser conduzida, diretamente,
pelo fornecimento de estrógenos durante os estágios iniciais do
16
desenvolvimento, ou, indiretamente (Figura 2), pela masculinização de fêmeas
genotípicas com andrógenos e posterior fertilização de óvulos normais com o
sêmen dessas fêmeas masculinizadas (Piferrer & Donaldson, 1989).
FIGURA 2:
Método indireto para a obtenção de progênie 100% feminina
(Fonte: APTA-SAA-SP).
A feminização direta pode ser aplicada em qualquer espécie,
independentemente do sistema de determinação sexual, ou de qual é o sexo
homogamético ou heterogamético, enquanto que a feminização indireta é
indicada para aquelas espécies em que as fêmeas são homogaméticas no sistema
de determinação sexual. São várias as espécies em que o acasalamento de
fêmeas masculinizadas com fêmeas normais produz uma progênie totalmente
feminina, entre elas: truta arco-íris, salmão-do-atlântico, tilápia-do-nilo, medaka,
goldfish, etc. (Piferrer, 2001).
17
A utilização do método indireto é o mais indicado, pois os peixes
submetidos ao tratamento hormonal são em número reduzido e não são
destinados ao consumo humano, mas empregados como reprodutores e, ainda, a
progênie resultante é 100% feminina, pois as fêmeas invertidas, embora sejam
funcionalmente machos, são genotipicamente femininas (Piferrer & Donaldson,
1988).
Além disso, restrições, como a alta mortalidade e a redução no
crescimento, foram verificadas durante o tratamento de feminização por
estrógenos, tornando esse método impraticável, do ponto de vista econômico.
Outra desvantagem desse método consiste no fato de que os animais tratados não
podem ser utilizados como reprodutores, pois metade deles, supostamente, é de
machos genotípicos (Johnstone et al., 1979).
Por outro lado, o método indireto requer mais de uma geração para a
produção de lotes 100% femininos. Na implantação do método, é necessário
realizar a separação entre as fêmeas masculinizadas e os machos normais, por
meio do teste de progênie ou pela observação direta das gônadas (Bye &
Lincoln, 1986). Uma vez que o primeiro lote monossexo feminino tenha sido
obtido, essa identificação torna-se desnecessária, pois o tratamento de
masculinização pode ser aplicado em uma parcela totalmente feminina.
O sucesso da inversão sexual depende do tipo, da natureza e da
concentração do hormônio utilizado, bem como da via de administração, da
época de início e da duração do tratamento. A resposta à administração de
esteróides sexuais varia muito de acordo com o estágio de desenvolvimento,
portanto, o período em que o tratamento é conduzido (fase de maior
sensibilidade ao esteróide exógeno) é mais importante do que a dosagem ou a
duração do tratamento (Piferrer & Donaldson, 1993). Segundo Yamamoto
(1969), para promover uma reversão do sexo de modo eficiente, a administração
dos esteróides sexuais deve ser iniciada antes do aparecimento dos primeiros
18
sinais da diferenciação e continuar até a fase em que a diferenciação tenha se
estabelecido.
Nas espécies gonocóricas diferenciadas, a reversão do sexo obtida de
modo artificial é, provavelmente, permanente, pois a ação dos genes
determinantes do sexo gonadal é restrita ao período da diferenciação, enquanto
que, nas espécies hermafroditas, os genes ligados ao sexo podem se expressar
em estágios mais avançados do desenvolvimento gonadal (Yamazaki, 1983).
A truta arco-íris é classificada, quanto ao tipo de sexualidade, como uma
espécie do tipo gonocórico diferenciado, em que a gônada diferencia-se
diretamente em um testículo ou em um ovário (Takashima et al., 1980). Nela, o
sexo genético é determinado no momento da fertilização, pelos cromossomas
sexuais, como acontece na maioria dos peixes gonocóricos. Entretanto, a
diferenciação sexual ocorre algum tempo após a eclosão, no período final da
absorção do saco vitelínico, quando se inicia a alimentação (Yamazaki, 1983).
Os primeiros sinais da diferenciação aparecem primeiro nas fêmeas, entre 18 e
28 dias após a eclosão, a uma temperatura de incubação de 11,5°C (Van den
Hurk & Slof, 1978). Nesses estágios iniciais do desenvolvimento, a
diferenciação sexual é bastante lábil e a reversão completa e funcional dos sexos
pode ser facilmente obtida pela administração de hormônios esteroidais
(Yamamoto, 1969).
Estes tratamentos são conduzidos nas fases iniciais do desenvolvimento,
muitos meses antes da comercialização e os resíduos desses esteróides
desaparecem em menos de um mês depois de finalizado o tratamento (Piferrer,
2001).
A administração do hormônio pode ser feita por vários modos,
entretanto, sob condições comerciais, a escolha deve levar em consideração a
sua praticidade. Dentre as vias de administração, as mais recomendadas são as
que veiculam o hormônio por meio da ração ou de banhos de imersão. Em
19
salmonídeos, os banhos de imersão, aplicados próximos à eclosão, são eficientes
para veicular os esteróides, pois, essas espécies possuem um grande volume de
vitelo, que serve como reservatório para o hormônio, que é absorvido durante a
fase de diferenciação sexual (Piferrer, 2001).
Dentre os estrógenos, o 17 beta-estradiol tem sido o mais utilizado para
promover a feminização, pois, além de ser eficiente, é natural, sendo menos
impactante ao ambiente (Piferrer, 2001). Doses de 20 mg.kg
-1
de dieta, com ou
sem imersão prévia de ovos olhados e alevinos em solução aquosa de 250 µgL
-1
,
foram suficientes para induzir a feminização em truta arco-íris (Johnstone et al.,
1978).
A masculinização tem sido conduzida usando-se 17 alfa-
metiltestosterona (MT) que, por ser um esteróide sintético, é mais potente do que
os naturais e, portanto, a dose empregada é menor. Por outro lado, por demandar
maior tempo para ser degradado na natureza é mais nocivo ao ambiente (Lee &
Donaldson, 2001). A dose efetiva de MT, para se obter a inversão sexual de
fêmeas para machos funcionais, é espécie específica. Okada et al. (1981)
analisaram diferentes concentrações de MT em truta arco-íris, usando alevinos
todos fêmeas, que foram obtidos pela fertilização de ovos normais com sêmen
de fêmeas masculinizadas. Doses que variaram de 0,01 e 100 mg.kg
-1
de ração
foram administradas por 8 semanas, a partir do início da alimentação, a uma
temperatura de 10°C. A maior porcentagem (84,4%) de machos foi obtida com a
dose de 0,5 mg.kg
-1
de dieta.
As fêmeas masculinizadas (machos-XX) apresentam testículos
morfologicamente alterados e, na maioria das vezes, com dutos espermáticos
ausentes (Figura 3), sendo necessário o sacrifício dos animais e a remoção das
gônadas para a utilização do sêmen. Este sêmen coletado diretamente do
testículo apresenta uma redução na taxa de fertilização, provavelmente, em razão
da presença de grande quantidade de espermátides.
20
FIGURA 3.
Alterações testiculares.
A.
Constrição testicular e ausência
de dutos espermáticos.
B.
Presença simultânea de ovários e
testículos
(Foto: APTA-SAA-SP).
A
B
21
Para racionalizar a produção de lotes monossexos femininos, o sêmen
obtido das fêmeas masculinizadas poderia ser criopreservado, dispensando-se,
desse modo, a prática contínua do tratamento hormonal (Hunter et al., 1983;
Kavamoto et al., 1991; Silveira et al., 2000). Entretanto, para viabilizar o
emprego desta técnica, torna-se necessário produzir fêmeas masculinizadas com
dutos espermáticos funcionais, como os descritos por Tabata et al. (2000) e
Tsumura et al. (1991), uma vez que o sêmen obtido de fêmeas com dutos
mostrou-se qualitativamente semelhante ao de machos normais.
Por ser aromatizável, o MT, quando administrado em doses superiores
àquelas recomendadas para a inversão ou por períodos prolongados, produz a
chamada feminização paradoxal (Solar & Donaldson, 1985). Por outro lado,
quando administrado em doses elevadas, ao redor de 25 mg.kg
-1
de ração,
promove a esterilização das gônadas (Mellito da Silveira et al., 1995). Nos casos
em que se deseja promover a esterilidade reprodutiva, os autores recomendam a
utilização de banhos de imersão, seguidos do fornecimento do hormônio na dieta
(Mellito da Silveira et al., 1995). Embora a esterilização possa ser induzida por
tal tratamento, a necessidade da exposição a altas doses de hormônios
androgênicos limita o seu uso na produção de salmonídeos estéreis em larga
escala.
3.8 Aspectos relevantes da biologia do sêmen de peixes
Os fatores que envolvem a biologia do sêmen de peixes já foram
amplamente estudados, sendo identificadas várias características referentes à
biologia seminal de peixes, como a imobilidade dos espermatozóides no sêmen
in natura,
a curta duração do seu desenvolvimento após sua ativação e a
necessidade de diluição em um meio hiposmótico para a iniciação do
movimento espermático (Billard & Cosson, 1992). Existem várias características
22
que podem ser utilizadas como parâmetros para a avaliação da qualidade
seminal. Entre elas, podem-se citar a motilidade espermática, a taxa de
fertilização (Rana, 1995), a concentração espermática (Billard 1988; Lahnsteiner
et al., 2000; Stein 1980) e a análise morfológica do sêmen (Kavamoto et al.,
1999).
Segundo Bedore (1999), o sucesso da aplicação da tecnologia de
criopreservação do sêmen de uma determinada espécie de peixe depende,
preliminarmente, da análise de variáveis seminais, dentre as quais incluem-se
volume produzido, concentração e motilidade espermática.
3.8.1 Morfologia dos espermatozóides
Os espermatozóides podem ser morfologicamente subdivididos em
cabeça, peça intermediária e cauda (Nagahama, 1983). Na maioria dos grupos de
peixes falta o acrossoma, que ocorre em todos os outros grupos de vertebrados.
A morfologia dos espermatozóides parece refletir no seu modo de fertilização. A
carência do acrossoma é compensada pela
presença da micrópila, um orifício no
córion do ovo para a penetração do espermatozóide (Cosson et al., 1999). A
cauda, ou flagelo, pode ainda ser subdivida em colo e peça intermediária,
principal e terminal, assim como ocorre para os espermatozóides de mamíferos
domésticos. O colo, ou peça de conexão, representa a inserção do corpo basal do
flagelo à cabeça. A peça intermediária consiste de uma bainha mitocondrial
disposta em hélice, responsável pela geração de energia necessária à propulsão
mótil dos espermatozóides (Hafez, 2004).
23
3.8.2 Metabolismo e motilidade dos espermatozóides
Segundo Stoss (1983), o metabolismo basal dos espermatozóides e a
energia necessária para motilidade espermática são derivados do catabolismo de
nutrientes exógenos e endógenos, de maneira aeróbica ou anaeróbica. Os
espermatozóides de peixes que possuem fertilização interna apresentam a
capacidade de realizar glicólise em processos anaeróbios, sendo muito provável
que a manutenção do metabolismo espermático seja feita a partir dos açúcares
ovarianos (Gardiner, 1978, citado por Leung & Jamieson, 1991). Entretanto, a
atividade glicolítica de espermatozóides de peixes de fecundação externa é
muito limitada, principalmente com relação ao metabolismo oxidativo (Harvey
& Kelley, 1984).
Billard et al. (1995) concluíram que os espermatozóides de carpa
(Cyprinus carpio)
são carregados com ATP, o qual é a maior fonte de energia
durante o curto período de motilidade, porém, é hidrolisado rapidamente durante
a fase ativa da motilidade. A síntese de ATP fornece uma contribuição muito
pequena e pode ser resultado da glicólise e da respiração mitocondrial. A
motilidade é interrompida quando 50% a 80% desses ATPs são consumidos pela
hidrólise. A mitocôndria é o reservatório endógeno de fonte de energia para a
motilidade de espermatozóides em peixes marinhos e essa motilidade está
diretamente relacionada à presença das mitocôndrias na peça intermediária do
espermatozóide (Gwo 1995). Provavelmente, a exaustão do suprimento de
energia contida na mitocôndria restringe a motilidade dos espermatozóides
nestes peixes. Cosson (2004), estudando fatores que controlam a motilidade
espermática em peixes, observou que espermatozóides que perderam a
motilidade, após algum tempo, têm essa capacidade restaurada, sugerindo uma
resposta à reposição dos estoques de ATP por meio da via oxidativa do
metabolismo mitocondrial.
24
Na presença de cianeto de potássio (inibidor da oxidação do citocromo),
antimicina (inibidor da etapa catalítica entre o citocromo b e c1) e atractilosida
(inibidor da fosforilação do ADP), o período de motilidade do espermatozóide
de
Cottus gobio
é diminuído em cerca de 98%. Isso demonstra que a fosforilação
oxidativa e a oxidação de ácidos graxos são importantes para a obtenção de
recursos energéticos para a motilidade nesta espécie (Lahnsteiner et al., 1997).
Em truta arco-íris
(Oncorhynchus mykiss)
, o cianeto de potássio, a antimicina e o
atractiloside também são eficientes inibidores da motilidade espermática
(Lahnsteiner et al., 1993).
Ainda de acordo com Lahnsteiner et al. (1997), a presença de grânulos
de glicogênio nos espermatozóides de
Cottus gobio
indica que, provavelmente,
estes desempenham algum papel no suprimento de energia em ciprinídeos e
salmonídeos. Entretanto, o 2-deoxy-d-glicose, um inibidor da glicólise, não afeta
a duração da motilidade, sugerindo a utilização de outros recursos energéticos
pelo espermatozóide quando o glicogênio não está disponível (Lahnsteiner et al.,
1995). Após o término da glicólise, as células espermáticas utilizam
exclusivamente triglicerídeos para a obtenção de energia (Bedore, 1999).
Os espermatozóides de peixes são imóveis nos testículos e no plasma
seminal. A motilidade é ativada quando o meio em que os espermatozóides se
encontram se torna hiposmótico, como a água do ambiente externo (Cosson,
2004). A diferença existente entre a baixa osmolaridade da água em relação
àquela do plasma seminal é essencial para a iniciação da motilidade dos
espermatozóides em peixes de água doce. Nos peixes marinhos, a situação é
inversa – a motilidade é iniciada quando o espermatozóide entra em contato com
a água do mar, cuja osmolaridade é muito mais elevada que a do plasma seminal
(Takai & Morisawa, 1995).
A motilidade espermática tem sido freqüentemente utilizada como
critério de viabilidade do espermatozóide, porém, segundo Bedore (1999), nem
25
sempre representa um bom indicativo da capacidade de fertilização.
Espermatozóides imóveis não estão necessariamente mortos ou incapazes de
fertilização (Friborough, 1966 citado por Jamieson, 1991). A utilização de
espermatozóides de salmão-do-atlântico com baixa ou nenhuma motilidade
resultou em fertilização (Truscott & Idles, 1968 citado por Jamieson, 1991).
Entretanto, segundo Carolsfeld & Harvey (1999) e Godinho (2000), a motilidade
espermática é um dos principais parâmetros a serem considerados na análise da
qualidade do sêmen de peixes. Para tanto, deve-se levar em conta que a
motilidade espermática é influenciada por inúmeros fatores, como temperatura,
estado nutricional, estado sanitário, condições de análise, soluções ativadoras
empregadas, espécie estudada e, segundo Rana (1995), um dos principais
moderadores da motilidade espermática é o progresso da época reprodutiva em
que os machos se encontram.
Segundo Morisawa et al. (1983), a osmolaridade não é determinante
essencial da motilidade espermática em salmonídeos; nestes peixes, a motilidade
é suprimida pelo K+ seminal contido no duto espermático e é iniciada pela
redução da sua concentração na água doce onde ele é liberado. Com a
diminuição da concentração externa de íons K+, ocorre o efluxo desse cátion
para o meio extracelular, estimulando a abertura de canais de Ca++ e seu influxo
para o interior da célula espermática. O aumento da concentração intracelular de
Ca++ participa decisivamente na iniciação da motilidade (Cosson, 2004).
Fatores, como o pH ou outros íons presentes, podem polarizar a membrana
celular e estimular a motilidade dos espermatozóides dos peixes (Morisawa et
al., 1999).
A estrutura do espermatozóide de truta foi consideravelmente alterada
depois da diluição do sêmen em água, tendo ocorrido ruptura da membrana
plasmática e intumescimento das mitocôndrias (Billard, 1978). Essas alterações
não foram observadas quando o sêmen foi diluído em soluções com cerca de
26
0,7% de salinidade. Concluiu-se, então, que a água, doce ou do mar, não é o
melhor meio a ser utilizado em inseminação artificial e experimentos devem ser
conduzidos para definir qual é o melhor ativador do sêmen a ser utilizado nas
práticas de piscicultura (Billard, 1978). Gwo (1995) cita a ocorrência de ruptura
na membrana plasmática e nas mitocôndrias, confirmando resultados observados
anteriormente por Billard (1978, 1983) e Morisawa et al. (1983); afirma, ainda,
que danos osmóticos na estrutura do espermatozóide podem ser o principal fator
limitante da duração da motilidade espermática em peixes de água doce.
Na Figura 4 estão descritos os possíveis eventos ocorridos no
desencadeamento da motilidade espermática. O exemplo ilustra a ativação dos
espermatozóides de alguns peixes de água doce, quando transferidos do fluido
seminal para água doce, mostrando como a súbita diminuição da osmolaridade
externa imediatamente leva ao reajustamento da concentração iônica interna
pelo processo osmorregulativo da membrana.
A diminuição da concentração iônica interna atinge valores em que a
atividade da ATPase é ótima e, conseqüentemente, a motilidade é em alta
velocidade. Posteriormente, o conteúdo de ATP torna-se baixo porque a
renovação pela fosforilação mitocondrial é muito lenta, o que é combinado com
uma diminuição adicional da concentração iônica a valores em que a atividade
da ATPase é bloqueada; por isso, a intensidade flagelar é completamente
interrompida alguns minutos mais tarde. De acordo com Perchec-Poupard et al.
(1997), em ambiente hiposmótico, o volume citoplasmático das células
espermáticas de espécies de água doce pode aumentar em até três vezes, em
resposta ao influxo de água.
27
FIGURA 4
. Sucessão de eventos desencadeadores da motilidade espermática
em espécies de água doce. Modificado de Cosson (2004).
3.8.3 Volume de sêmen
O volume de sêmen produzido pelos peixes é muito variável. Ele vai
depender muito da espécie, da idade e do tamanho do indivíduo, da época do ano
em que ele foi obtido, se foi coletado no início ou no final do período
Tempo 0
< 1s
> 1 min
Transferência do sêmen para água doce
Diminuição da osmolaridade externa
Osmorregulação = Influxo de água
Diminuição da osmolaridade interna
Diminuição da concentração iônica interna
Ligação da atividade da ATPase
Diminuição dos estoques de ATP
Concentração iônica muito baixa para
atividade da ATPase
Término da motilidade
28
reprodutivo e da metodologia utilizada na sua obtenção (Bedore, 1999). A idade
e o tamanho do peixe estão altamente relacionados com o volume de sêmen
obtido em uma coleta. O volume obtido em truta arco-íris com 3 anos de idade é
3 vezes maior do que aquele obtido em indivíduos com 2 anos (Büyükhatipoglu
& Holtz, 1984).
Baynes & Scott (1987) registraram diminuição no volume de sêmen de
truta arco-íris a cada coleta subseqüente. Eles obtiveram 5 ml na primeira coleta,
2 ml na segunda e menos de 2 ml na terceira. Concluíram que, possivelmente, o
manejo dos peixes promove inibição da produção de sêmen. Kavamoto et al.
(1985), trabalhando com truta arco-íris de acordo com as condições climáticas
brasileiras para a reprodução da espécie, verificaram que o volume de sêmen
obtido de 79 machos distribuídos nos períodos reprodutivos de 1980, 1981 e
1983 variou de 5,01 a 12,36 ml, que foram próximos aos valores mínimo de 4
ml e máximo de 8 ml encontrados por Billard et al. (1971).
3.8.4 Concentração espermática
O conhecimento da concentração espermática do sêmen é de grande
importância para a sua adequada utilização. Os métodos utilizados para a sua
determinação são a contagem em câmara de Neubauer (Büyukhatipoglu &
Holtz, 1984) e o estabelecimento da relação entre volume celular:volume de
fluido seminal, obtida por meio do espermatócrito (Fogli da Silveira et al., 1990)
e por espectrofotometria (Billard et al., 1971; Ciereszko & Dabrowski, 1993;
Fogli da Silveira et al., 1987; Suquet et al., 1992).
O cálculo da concentração espermática é realizado em números de
células espermáticas coletadas por quilograma de peso corporal (células/kg), por
grama de testículo ou, ainda, por peixe (células/peixe). O número de
espermatozóides por ml de sêmen é mais apropriado, podendo ser
29
complementado pelo volume total de sêmen. Sêmen altamente concentrado nem
sempre oferece elevada motilidade ou altas taxas de fertilização (Geffen &
Evans, 2000; Williot et al., 2000). Este parâmetro não é uma medida específica
da capacidade de fertilização do sêmen e pode variar muito dentro de
determinadas espécies de peixes ou em um mesmo indivíduo ao longo da vida. É
importante observar que a concentração espermática torna-se uma característica
relativamente importante quando se fertilizam ovos com um volume constante
de sêmen, analisando a capacidade de fertilização de diferentes amostras de
sêmen (Rurangwa et al., 2004).
Os valores de concentração espermática para o sêmen de machos
normais de truta arco-íris podem variar de 15,3x10
6
a 20,69x10
6
espermatozóides / mm
3
(Billard et al., 1971). Kavamoto et al. (1985) avaliaram a
concentração espermática do sêmen de truta arco-íris durante três anos
consecutivos e encontraram resultados que estão dentro dos limites observados
por Billard et al. (1971).
3.9 Diluidores de sêmen
Os diluidores são soluções de sais ou de carboidratos adicionados ao
sêmen, cuja função é manter a viabilidade das células espermáticas durante a
redução da temperatura. As condições mínimas requeridas de um diluidor
adequado são: isotonicidade, para que não haja ativação prévia da motilidade
espermática; estabilidade, pois suas características físico-químicas não devem
ser alteradas durante o contato com o sêmen; condutividade térmica elevada,
permitindo a rápida transferência de temperatura do meio externo para os
espermatozóides; esterilidade, ou seja, não devem veicular microrganismos
potencialmente nocivos às células espermáticas e, finalmente, servir de
carreador de crioprotetores. É importante que a motilidade dos espermatozóides
30
não seja ativada antes do congelamento e nem durante o descongelamento, pois
ela pode exaurir a reserva energética necessária à fertilização (Legendre &
Billard, 1980).
Segundo Tan-Fermin et al. (1999), a diluição do sêmen em solução com
mesma composição do plasma seminal permite melhor aproveitamento da sua
capacidade fecundante, principalmente levando-se em conta que a quantidade de
sêmen utilizada em procedimentos rotineiros de desova induzida é maior do que
o necessário. O uso de diluidores pode estabilizar as condições físico-químicas
durante a estocagem do sêmen, prolongando a viabilidade dos espermatozóides.
Soluções contendo glicose em sua composição (McNiven et al., 1993;
Piironen 1993; Silveira et al., 2006; Stoss & Reftsie 1983) e soluções salinas
(Babiak et al., 1995; Büyükhatipoglu & Holtz, 1978; Stein 1980; Stoss & Holtz
1981) têm sido bastante empregadas como diluidores de sêmen de truta arco-íris.
A glicose desempenha um papel muito importante na motilidade espermática do
sêmen. Estudos mostraram que os espermatozóides de truta arco-íris utilizam
triglicerídeos e glicose como fontes primárias de energia (Lahnsteiner et al.,
1993). Concentrações adequadas de glicose podem atuar suprindo as
necessidades metabólicas das células espermáticas.
As soluções salinas simples também têm sido empregadas com grande
sucesso como diluidor de sêmen de diversas espécies. Soluções que possuem
como base o NaCl em sua composição, com níveis entre 100 e 200 mM,
apresentam um pequeno risco de danos hipo ou hiperosmótico para os
espermatozóides de salmonídeos (Scott & Baynes 1980).
Outras soluções diluidoras desenvolvidas para algumas espécies em
particular, muitas vezes, podem ser utilizadas com sucesso em outras espécies. O
diluidor BTS® (Beltsville Thawing Solution - Minitub®) foi originalmente
desenvolvido para o resfriamento do sêmen suíno e tem obtido bons resultados
como diluidor na criopreservação do sêmen de algumas espécies, como a
31
piracanjuba
(Brycon orbignyanus)
, (Maria, 2005), a curimba
(Prochilodus
lineatus)
, (Miliorini, 2006 e Òrfão, 2006) e a pirapitinga
(Brycon nattereri)
,
(Oliveira, 2006), entre outros.
3.10 Crioprotetores
Os crioprotetores são substâncias acrescidas ao meio diluidor do sêmen
com a finalidade de proteger os espermatozóides durante o congelamento e o
descongelamento. Os crioprotetores impedem as criolesões, mas, quando usados
em concentrações elevadas, podem se tornar tóxicos aos espermatozóides.
Dentre as características desejáveis em um crioprotetor, destacam-se a reduzida
toxicidade e a alta solubilidade em água.
Os crioprotetores podem ser divididos em dois grupos: os chamados
intracelulares ou solúveis (permeáveis) à membrana plasmática e os
extracelulares ou não solúveis. O determinante são as propriedades físico-
químicas (principalmente o peso molecular) e a interação existente entre a
substância e a membrana plasmática. No grupo dos crioprotetores solúveis, os
mais usados são: o dimetil sulfoxido (DMSO), o glicerol e o metanol. O segundo
grupo é conhecido como crioprotetores não permeáveis ou crioprotetores
externos e incluem: açúcares (ex.: sacarose, glicose), polímeros (ex.: dextran,
PVP) e proteínas (ex.: gema de ovo, leite desnatado, soro).
O papel dos crioprotetores intracelulares é evitar, ou diminuir, a
formação de microcristais de gelo intracelulares, enquanto os crioprotetores
extracelulares atuam estabilizando e reparando externamente a membrana
celular. Os alvos da proteção proporcionada pelos crioprotetores intracelulares
são as enzimas lábeis (por exemplo, a catalase) e a estabilidade das proteínas em
soluções aquosas. Segundo Chao (1991), há um grande risco, porém, na
utilização de crioprotetores internos, porque estes podem, alternativamente,
32
promover a desnaturação protéica, sobretudo sob elevadas temperaturas,
causando uma toxicidade nos sistemas enzimáticos e, por conseguinte, celulares.
Isso ocorre, principalmente, quando as concentrações de crioprotetores internos
são muito elevadas (Cruz, 2001). Os crioprotetores internos mais efetivos são
aqueles que permeiam a membrana celular rapidamente (Simeone, 1998).
Existem relatos da utilização de diversos crioprotetores intracelulares na
preservação do sêmen de salmonídeos. Entre eles, estão DMSO (Baynes &
Scott, 1987; Holtz, 1993; Legendre & Billard, 1980; Stoss & Holts, 1983),
glicerol (Pironen, 1993), DMSO e glicerol combinados (Lahnsteiner et al., 1995,
1996c), propanodiol (Lahnsteiner et al., 1996b), dimetil acetamida (McNiven et
al., 1993) e metanol (Lahnsteiner et al., 1997, 2000, 2002). O DMSO e o
metanol são os crioprotetores intracelulares mais utilizados na criopreservação
do sêmen de truta arco-íris. Em salmonídeos, de forma geral, o crioprotetor
extracelular mais usado é a gema de ovo e a utilização desse agente estabilizador
de membrana é essencial para manter a viabilidade dos espermatozóides após o
processo de congelamento e descongelamento (Baynes & Scott, 1987;
Lahnsteiner et al., 1996a).
Aparentemente, determinados crioprotetores agem melhor em algumas
espécies do que em outras, de sorte que a seleção do melhor crioprotetor a ser
testado pela primeira vez numa espécie deve ser feita por tentativa e erro
(Bedore, 1999).
3.11 Criopreservação do sêmen de peixes
A criopreservação envolve procedimentos que permitem o
armazenamento de espermatozóides em nitrogênio líquido, a uma temperatura
de, aproximadamente, -196°C, mantendo-se a viabilidade dos gametas por
tempo indefinido. Mins et al. (2000) verificaram que a percentagem de
33
espermatozóides móveis, contidos no sêmen criopreservado de esturjão, não
diminuiu ao longo de cinco anos de armazenamento.
A tecnologia para a criopreservação de gametas de peixes encontra-se
ainda em desenvolvimento e a sua utilização em produções comerciais ainda é
bastante escassa, comparada a algumas espécies de animais domésticos.
Entretanto, o progresso alcançado nos últimos anos, com relação ao
desenvolvimento de diluentes e técnicas de criopreservação, indica que a
criopreservação de gametas de peixes pode vir a ser mais utilizada no futuro.
Atualmente, sêmen de várias espécies de peixes é criopreservado com
sucesso, alcançando taxas de fertilização cada vez mais semelhantes às obtidas
com sêmen fresco (salmonídeos, por Billard et al., 1992; bagre-africano,
Clarias
gariepinus
, por Viveiros et al., 2000 e 2002; bagre-europeu,
Silurus glanis,
por
Linhart et al., 1993; tilápia,
Oreochromis niloticus
, por Rana & McAndrew,
1989), podendo ser utilizados rotineiramente em programas de produção e
hibridação. Em revisão sobre criopreservação de gametas, foram listadas mais de
50 espécies de peixes, cujos espermatozóides já foram criopreservados (Leung
& Jamieson, 1991). Os salmonídeos ocupam o primeiro lugar em número de
espécies e, dentre estas, incluem-se peixes de alta importância econômica, como
a truta arco-íris e o salmão-do-atlântico. É provável que técnicas similares
possam fornecer resultados positivos para espécies nas quais o congelamento
ainda não foi testado (Bedore, 1999).
Estudos envolvendo o congelamento do sêmen de machos normais de
truta arco-íris foram relatados por vários autores (Baynes & Scott, 1987; Cabrita
et al., 2001a, Conget et al., 1996; Fogli da Silveira et al., 1994; McNiven et al.,
1993; Stoss et al., 1978; Stoss et al., 1983; Wheeler & Thogaard, 1991), porém,
o número de trabalhos relacionados à utilização e à aplicação do sêmen obtido
de fêmeas masculinizadas ainda é bastante escasso (Feist et al., 1995; Kavamoto
et al., 1991; Robles et al., 2003; Silveira et al., 2006; Tabata & Mizuta, 1997).
34
Quando o sêmen é colocado diretamente no nitrogênio líquido, a
membrana plasmática e a peça intermediária podem desaparecer inteiramente.
Por outro lado, quando o sêmen é colocado no vapor de nitrogênio líquido, os
espermatozóides sofrem um congelamento gradual e as estruturas membranosas
não são muito alteradas, apesar de o aspecto da cromatina ser consideravelmente
modificado (Billard, 1983).
A formação de microcristais de gelo é deletéria aos espermatozóides por
duas razões principais: a osmoconcentração e a elevação da temperatura
intracitoplasmática. Com a desidratação pela retenção de água nos cristais, o
meio extracelular torna-se progressivamente mais concentrado e há uma
osmoconcentração também em regiões dentro do citoplasma. A
osmoconcentração extracelular ocasiona efluxo de água e intensificação da
concentração osmótica interna, o que promove desnaturação das
macromoléculas e crenação celular, podendo haver total colapso da membrana
celular (Mazur, 1977).
O processo de cristalização resulta, ainda, em elevação momentânea da
temperatura, o que é prejudicial às células espermáticas. Em temperaturas em
torno de 5°C, a água intra e extracelular permanece super-resfriada e não se
cristaliza. Entre -5°C e -10°C, microcristais de gelo começam a se formar no
meio extracelular e o processo de desidratação se inicia. Os maiores prejuízos
conhecidos na estrutura do espermatozóide ocorrem no intervalo crítico entre
0°C e -40°C (Leung, 1991). A finalidade do processo de congelamento em
nitrogênio líquido é fazer com que a suspensão de células espermáticas atinja
temperaturas abaixo do ponto de congelamento do meio, antes que haja a
formação de microcristais de gelo nos meios intra e extracelular.
Além da escolha de diluidores e crioprotetores adequados, o sucesso da
criopreservação de sêmen em nitrogênio líquido exige que as taxas de
resfriamento estejam situadas entre 10
o
C e 50
o
C min
-1
(Harvey & Carolsfeld,
35
1993). Esta taxa é usualmente obtida no vapor de nitrogênio. Para isso,
tradicionalmente, despeja-se nitrogênio liquido numa caixa de isopor e, após o
equilíbrio entre o vapor e o líquido, encontra-se a distância correta da superfície
do nitrogênio líquido onde o sêmen deveria ser colocado, para que taxas de
congelamento ideais fossem obtidas. Esta operação é dificultada por variações
bruscas na temperatura do ambiente onde se realiza a criopreservação, sendo
bastante difícil de ser obtida quando realizada no campo. O uso de botijões
contendo apenas vapor de nitrogênio ("dry-shipper", Taylor-Wharton) (Figura 5)
pode facilitar a realização dos procedimentos de criopreservação no campo, pois
eles são hermeticamente fechados e, por isto, mantêm a temperatura constante
(cerca de -180°C). Resultados satisfatórios com esta metodologia encontram-se
disponíveis na literatura (Aoki et al., 1997; Cruz, 2001; Serralheiro et al., 1999;
Silveira et al., 2006).
O tipo de recipiente utilizado para envasar o sêmen é um outro aspecto
importante no processo de criopreservação. Palhetas de diferentes capacidades
têm sido utilizadas (0,25 ml; 0,5 ml; 1,0 ml; 1,2 ml; 1,8 ml; 2,5 ml; 4,0 ml e 5,0
ml). A taxa de fertilização, quando o sêmen foi envasado em palheta de 1,2 ml,
foi semelhante àquela com palheta de 0,5 ml para salmonídeos e a palheta de 0,5
ml resultou em uma fertilização 40% inferior em relação ao sêmen fresco
(Lahnsteiner et al., 1997). Não foi encontrada diferença na motilidade
espermática para o sêmen de truta arco-íris, quando palhetas de 0,5; 1,8 e 5,0 ml
foram comparadas. Porém, a viabilidade das células e a taxa de fertilização
foram mais baixas para as palhetas de maior volume com relação às de 0,5 ml
(Cabrita et al., 2001b). Excelentes resultados de motilidade espermática e
fertilização também são encontrados em estudos com palhetas de 0,25 e 0,5 ml,
na criopreservação do sêmen de salmonídeos (Lahnsteiner et al., 1995). Em
geral, as palhetas de 0,5 ml são as mais utilizadas entre os pesquisadores no
congelamento de sêmen de peixes, porém, sua capacidade de fertilização se
36
restringe a um número muito pequeno de ovos, o que torna cada vez mais
freqüentes estudos com palhetas de maior volume, objetivando a fertilização em
grande escala. Quando grupos grandes de ovos (1.600-2.000 ovos) foram
fertilizados com palheta de 5,0 ml, os resultados de fertilização foram similares
aos das palhetas de 0,5 ml, demonstrando que a ligeira perda em fertilização foi
compensada pelos benefícios das palhetas de 5,0 ml (Cabrita et al., 2001b). A
grande desvantagem das palhetas muito calibrosas é que, geralmente, não
proporcionam um descongelamento uniforme, ou seja, a superfície descongela
mais rapidamente que a porção central (Carolsfeld & Harvey, 1999).
FIGURA 5. A.
Botijão de vapor de nitrogênio líquido;
B.
Botijão de nitrogênio
líquido
(Foto: DZO – UFLA)
.
A
B
37
3.12 Descongelamento do sêmen de peixes
Em geral, células congeladas rapidamente, como em palhetas de 0,5 ml,
devem ser mais rapidamente descongeladas quando comparadas com células
congeladas em velocidade mais lenta, como em criotubos ou macropalhetas
contendo um volume maior de sêmen (Viveiros, 2005). Portanto, a velocidade
de congelamento das células e o volume das palhetas que serão utilizadas devem
ser levados em conta para selecionar a temperatura ideal de descongelamento e o
tempo de exposição das palhetas a essa temperatura. O congelamento envolve a
perda de água e a desidratação celular, enquanto o descongelamento envolve
uma reidratação das células, ocorrendo influxo de água para o interior do
citoplasma (Holt, 2000).
A maioria das células suporta um descongelamento rápido, mesmo que
não se hidrate totalmente, exceto para embriões de mamíferos (Bedore, 1999). O
descongelamento rápido tem sido utilizado como medida importante na
prevenção de recristalização de gelo intracelular, letal para as células (Leung &
Jamieson, 1991). As taxas de descongelamento mais bem sucedidas são aquelas
que envolvem altas temperaturas e reduzido intervalo de tempo de exposição,
entretanto, cuidados com o superaquecimento devem ser assegurados, pois pode
ser letal aos espermatozóides (Scott & Baynes, 1980).
O descongelamento das palhetas normalmente é feito por imersão em
banho-maria. O sêmen congelado, ao ser retirado do botijão de nitrogênio
líquido, deve ser agitado em banho-maria por poucos segundos, para que
descongele uniformemente (Cruz, 2001). Com palhetas mais calibrosas, este
processo se torna mais difícil porque o descongelamento não é uniforme, ou
seja, a superfície descongela mais rápido que a porção central. Deve-se, então,
aquecer a palheta apenas o tempo suficiente para iniciar o descongelamento do
conteúdo, de modo que a temperatura da palheta continue a subir mesmo depois
38
de ter sido removida da água quente, completando, assim, o processo de
descongelamento (Carolsfeld & Harvey, 1999).
Existe uma numerosa variação com relação à taxa de descongelamento,
para o sêmen de salmonídeos (Lanhesteiner et al., 1997). Fogli da Silveira et al.
(1994) usaram, pela primeira vez, a temperatura de descongelamento de 70ºC,
por 3 segundos, para o descongelamento do sêmen de truta arco-íris, que foi
posteriormente adotado por Silveira (2002, 2006), obtendo excelentes resultados
de fertilização para o sêmen criopreservado.
As condições de criopreservação do sêmen apresentam grande variação
entre as diferentes espécies de peixes, porém, quando se trata do
descongelamento do sêmen, esse parâmetro não se mostra espécie-específico.
Em estudos com diferentes espécies de salmonídeos, não foi observada diferença
quanto à temperatura de descongelamento e os resultados eficientes de
motilidade espermática e fertilização foram obtidos com sêmen descongelado a
25ºC, por 30 segundos, para todas as espécies estudadas (Lahnsteiner et al.,
1995).
3.13 Proporção espermatozóide: ovo e fertilização artificial
A fertilização artificial de gametas de peixes representa um enorme
avanço em programas comerciais. Esta técnica apresenta várias vantagens,
dentre as quais se sobressaem o aproveitamento de gametas e o maior número de
ovos férteis e de embriões viáveis. Com isso, o sêmen extruído de um único
macho pode fertilizar até cinco fêmeas (Billard, 1990).
A qualidade espermática, em muitos casos, tem sido somente avaliada
em termos de motilidade após descongelamento. Segundo Rana & MacAndrew
(1989), a taxa de fertilização dos ovos é, sem dúvida, o mais apropriado e
prático critério nos protocolos de avaliação para a criopreservação de
39
espermatozóides. Todavia, resta a incerteza relativa ao fato de este parâmetro ser
avaliado isoladamente, uma vez que a homogeneidade das condições de
fertilização constitui requisito imprescindível a sua validação.
Outros fatores, como o número de espermatozóides por ovo, a duração
do contato entre os gametas ou o protocolo de fertilização utilizado, podem
também influenciar o sucesso da fertilização (Suquet et al., 1995; Chereguini et
al., 1999). Na produção comercial, uma relação ótima espermatozóide:ovo tem
sido recomendada; ao mesmo tempo, os trabalhos experimentais utilizam o
sucesso da fertilização como um ponto final da qualidade espermática, sugerindo
uma relação mínima espermatozóide:ovo (Suquet et al., 1995).
Existe grande variação da proporção de número de espermatozóide por
ovo que adotada nos trabalhos que envolvem fertilização a partir do sêmen
criopreservado de salmonídeos. A proporção recomendada para as culturas
comerciais de truta arco-íris é de 10x10
6
espermatozóides por ovo (Scott &
Baynes, 1980 - revisão). Proporções de 3,5x10
6
(Fogli da Silveira et al., 1994),
2,7x10
6
(Lahnsteiner et al., 2002), 20x10
6
(Silveira et al., 2002) e 16x10
6
espermatozóides por ovo (Salte et al., 2004) têm sido usadas para o sêmen
criopreservado. Para o sêmen de machos-XX, é descrita uma proporção de
20x10
6
espermatozóides por ovo (Silveira et al., 2006), para os peixes que
apresentam os dutos espermáticos funcionais e 3,8x10
6
(Geffen & Evans., 2000)
e 17x10
6
(Robles et al., 2003) para o sêmen intratesticular.
Para a truta arco-íris, o método recomendado para a fertilização é o
método “seco”, no qual os gametas são misturados na ausência de água, fazendo
com que cada ovócito fique envolvido por milhares de espermatozóides,
facilitando a sua penetração no canal micropilar antes da ativação espermática.
Esse procedimento é necessário porque o espermatozóide, uma vez ativado,
apresenta motilidade, cuja duração é de 30 segundos, no máximo, permitindo um
deslocamento de cerca de 3 mm, o que é insuficiente para percorrer um ovo de
40
diâmetro médio de 5 mm, como
é o caso do ovo de truta (Billard & Cosson,
1992). Entretanto, o excesso de espermatozóides utilizados na fertilização
encobre a qualidade dos espermatozóides criopreservados, dificultando as
comparações entre protocolos (Viveiros et al., 2000).
Após o processo de fertilização, os ovócitos são levados para as
incubadoras (Figura 6), onde permanecem por, aproximadamente 300°C dias até
a eclosão. Em salmonídeos, o tempo de incubação é dado em unidades térmicas
acumuladas (UTA) em °C dias, de modo que, conhecendo-se a temperatura
media da água, é possível prever o número de dias necessários para o
desenvolvimento de cada etapa do embrião. Aos 180°C dias decorridos da
fertilização, a organogênese está bem avançada, com os olhos dos embriões bem
pigmentados e visíveis através da casca do ovo. Nessa fase, denominada de
“ovos olhados” (Figura 7), os embriões são bem resistentes e permitem uma
série de manipulações que possibilitam a sua comercialização. Aos 500°C dias,
os eleuteroembriões já apresentam dois terços do saco vitelínico absorvido, seu
desenvolvimento já está completo e podem ser chamados de alevinos.
Fonte: APTA-SAA-SP
FIGURA 7.
Ovos olhados e
eclosão de um eleuteroembriões.
FIGURA 6.
Incubadoras
41
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55
CAPÍTULO 2
CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE MACHOS-XX DE TRUTA
ARCO-ÍRIS
(Oncorhynchus mykiss)
COM DUTOS ESPERMÁTICOS
FUNCIONAIS
56
Criopreservação do Sêmen de machos-XX de truta arco-íris
(Oncorhynchus
mykiss)
com dutos espermáticos funcionais
RESUMO
As fêmeas de truta arco-íris apresentam taxas de crescimento mais elevadas do
que os machos, sendo a inversão sexual a técnica mais utilizada para a obtenção
de lotes 100% femininos. Neste estudo, diversos fatores que interferem na
criopreservação do sêmen de machos-XX (fêmeas masculinizadas) de truta arco-
íris foram avaliados, com o objetivo de aperfeiçoar as técnicas de
criopreservação do sêmen. Foram utilizados machos-XX que apresentavam os
dutos espermáticos funcionais e o sêmen coletado por pressão abdominal. No
experimento 1, quatro diferentes diluidores (glicose 5,4%; BTS
®
6%; NaCl 0,9%
e NaCl 1,2%-tris) e a adição da gema de ovo à criosolução (diluidor +
crioprotetor) foram testados. A criosolução foi preparada com 80% de cada um
dos diluidores testados, acrescidos de 10% de gema e 10% de dimetil sulfoxido
(DMSO), ou 90% de BTS
®
e 10% de DMSO. O sêmen foi diluído 1:3
(sêmen:criosolução), envasado em palhetas de 0,5 ml e congelado em botijão de
vapor de nitrogênio (CP 100, Taylor-Wharton), a -170°C, transferido, após 12-
16 horas, para o nitrogênio líquido, a -196°C, onde permaneceu por, no mínimo,
6 horas antes de ser descongelado para avaliação da motilidade espermática e ou
fertilização. O descongelamento do sêmen foi feito em banho-maria, a 70°C, por
3 segundos. No experimento 2, diferentes crioprotetores (DMSO, etileno glicol,
metil glicol e metanol) e duas taxas de diluição do sêmen (1:3 e 1:7) foram
avaliados. No experimento 3, o sêmen foi diluído 1:3 em glicose, gema e DMSO
e criopreservado em três diferentes volumes de palhetas (0,25; 0,5 e 4,0 ml). As
palhetas de 0,25 e 0,5 ml foram descongeladas em banho-maria, a 70ºC/3s e as
de 4,0 mL, a 70ºC/15s. No experimento 4 o sêmen foi diluído 1:3 em glicose-
gema-DMSO, criopreservado em palhetas de 0,5 ml e descongelado em três
diferentes temperaturas (70ºC/3s, 60ºC/8s e 50ºC/8s). Nos experimentos 1, 2, 3
e 4, o sêmen descongelado foi avaliado quanto à motilidade. No experimento 5,
o sêmen foi diluído 1:3 em glicose-gema-DMSO e criopreservado em palhetas
de 0,5 ml. Após o descongelamento a 70ºC/3s, o sêmen foi avaliado quanto à
capacidade de fertilização (taxa de ovos olhados), em diferentes proporções
espermatozóide:ovo (15x10
6
a 60x10
6
), após 196°C dias de incubação. O
diluidor glicose-gema proporcionou maior motilidade espermática, quando
comparado aos outros diluidores testados, e o acréscimo de gema de ovo foi
fundamental para o processo de criopreservação. O crioprotetor DMSO
proporcionou maior motilidade espermática quando comparado ao etileno glicol,
57
metil glicol e metanol, e o sêmen diluído 1:3 obteve motilidade espermática
maior que o sêmen diluído 1:7. A motilidade espermática do sêmen
descongelado a 70ºC/3s foi maior quando comparado ao sêmen descongelado a
60ºC/8s e 50ºC/8s. A motilidade espermática foi maior (P<0,05) quando o
sêmen foi criopreservado em palhetas de 0,5 ml, em relação às palhetas de 0,25
e 4,0 ml e a taxa de ovos olhados para a proporção de 15x10
6
espermatozóides
por ovo foi menor (P<0,05), comparada às outras proporções testadas (30x10
6
,
45x10
6
, 60x10
6
). Com base nesses resultados, pode-se concluir que o sêmen de
truta arco-íris criopreservado em glicose-gema-DMSO, diluído 1:3, envasado em
palhetas de 0,5 ml e descongelado a 70ºC/3s, obteve as maiores taxas de
motilidade espermática após o descongelamento. A proporção de 30x10
6
espermatozóides por ovo, para o sêmen criopreservado, é suficiente para
alcançar taxas de ovos olhados de, aproximadamente, 40%.
58
1 INTRODUÇÃO
Os salmonídeos estão entre os grupos de espécies de peixes mais
produzidos em confinamento e as principais espécies representantes deste grupo
são o salmão-do-atlântico (
Salmo salar
) e a truta arco-íris (
Oncorhynchus
mykiss
).
Para que seja possível alcançar altas taxas de produtividade por área em
um menor espaço de tempo, o que tem se usado nas pisciculturas modernas são
as chamadas técnicas de controle da sexualidade em peixes. Em trutas e salmões,
as fêmeas apresentam taxas de crescimento mais elevadas do que os machos,
sendo assim, mais vantajosas para a produção comercial. Os machos alcançam a
maturidade sexual antes de atingir o peso comercial, comprometendo a
qualidade e a rentabilidade da criação, já que a maturação sexual é um dos
processos biológicos que mais afetam a produtividade. Isso porque, durante este
período, a energia que seria utilizada para o crescimento somático é canalizada
para a produção de gametas, resultando na diminuição do crescimento, eficiência
alimentar, sobrevivência e na qualidade do pescado (Bye & Lincoln, 1986).
Existem diferentes técnicas que podem ser empregadas para a obtenção de
lotes monossexos em trutas, porém, a mais utilizada comercialmente é a
inversão sexual pela via indireta. Esta técnica consiste na masculinização de
fêmeas XX pela administração de hormônios masculinizantes. O andrógeno
sintético 17 alfa-metiltestosterona é o hormônio mais utilizado para o processo
de inversão de sexos e o resultado da sua administração é a obtenção de machos
XX. Lotes 100% femininos são produzidos pelo acasalamento desses machos-
XX com fêmeas normais XX. O grande problema encontrado nesse tipo de
manipulação é o fato de que esses machos-XX, obtidos por inversão sexual,
apresentam testículos morfologicamente alterados e, na maioria das vezes, com
dutos espermáticos ausentes, incompletos ou afuncionais (Geffen & Evans,
59
2000; Tsumura et al., 1991), sendo necessário o sacrifício dos animais e a
remoção das gônadas para a utilização do sêmen intratesticular. Essa prática de
sacrifício dos animais torna necessária a manutenção de um número elevado de
reprodutores nas piscigranjas, além de uma utilização constante de hormônios
para a manutenção dos lotes invertidos, o que acaba, muitas vezes, onerando os
custos de produção na propriedade.
Com base nesses dados, torna-se necessária a adoção de técnicas que
atuem de forma eficiente na racionalização da produção de lotes 100%
femininos. Dessa forma, o sêmen de machos-XX de truta arco-íris poderia ser
criopreservado, diminuindo, assim, a prática contínua de tratamento hormonal
(Hunter et al., 1983; Kavamoto et al., 1991; Silveira et al., 2000) e permitindo a
disponibilidade desse material ao longo do ano, reduzindo a necessidade de um
estoque muito grande de machos-XX. Pode, ainda, servir como base para o
desenvolvimento e a manutenção de bancos genéticos, transporte de gametas e
facilitando a fertilização artificial. (McAndrew et al., 1995). Entretanto, o
sucesso da criopreservação do sêmen depende de vários fatores que, em
conjunto, atuam melhorando a qualidade do sêmen criopreservado. Assim, o
objetivo deste estudo foi avaliar parâmetros, como: diluidores de sêmen,
crioprotetores, taxas de diluição do sêmen, temperaturas de descongelamento
das palhetas, volumes de palhetas e relação ideal de espermatozóides por ovo, no
intuito de aperfeiçoar as técnicas de criopreservação do sêmen de machos-XX de
truta arco-íris que apresentam os dutos espermáticos funcionais, levando em
consideração as condições de cultivo encontradas no Brasil.
60
2 MATERIAL E MÉTODOS
O estudo foi realizado nos meses de julho e agosto de 2005, obedecendo
ao período reprodutivo da truta arco-íris para as condições climáticas
encontradas no Brasil. Os animais utilizados eram provenientes da Estação
Experimental de Salmonicultura “Dr. Ascânio de Faria” - APTA-SAA-SP,
localizada na cidade de Campos do Jordão, SP.
As médias de temperatura da água no período foram de 12,7°C e
12,4°C, respectivamente. Para cada experimento, foram selecionados cinco
machos-XX de truta arco-íris (
Oncorhynchus mykiss
) com, aproximadamente,
dois anos de idade e peso médio de 1,3 kg. A inversão sexual das fêmeas foi
feita conforme rotina na Estação Experimental de Campos de Jordão, por meio
da utilização do hormônio sintético 17 alpha-metil testosterona, na dose de 250
microgramas / kg de ração, ministrado durante 80 dias a uma temperatura média
de 12,8ºC, totalizando 1024 UTA (unidades térmicas acumuladas), em graus
centígrados dias (ºC dias). Nos peixes em que os dutos espermáticos se
apresentavam funcionais (cerca de 30% do total submetido ao processo de
inversão sexual), o sêmen foi coletado por meio de massagem abdominal após
os peixes serem devidamente anestesiados em solução de benzocaína na
proporção de 1:10.000. Os que não apresentavam os dutos funcionais,
impossibilitando a coleta do sêmen por massagem abdominal, não foram
utilizados. O sêmen foi coletado em tubos de ensaio graduados, após ter sido
rejeitada uma pequena parcela inicial para evitar a contaminação, seu volume
mensurado e mantido em um recipiente com gelo até ser manipulado.
Antes de iniciar cada experimento, a motilidade espermática (%
espermatozóides móveis em relação ao total observado) foi estimada
subjetivamente no microscópio de luz em aumento de 400X. A solução utilizada
como ativadora da motilidade espermática foi o NaHCO
3
1% (Fogli da Silveira
61
et al., 1994) pH 8,3,
na proporção de 40 microlitros de ativador para cada 10
microlitros de sêmen. Foi avaliada a concentração espermática do sêmen de cada
peixe utilizando-se a câmara de Neubauer. Foi mensurado o pH do sêmen de
60% dos peixes utilizados. Apenas as amostras de sêmen que apresentaram taxas
de motilidade espermática iniciais iguais ou superiores a 80% foram utilizadas.
Em todos os experimentos, as palhetas foram congeladas em botijão de vapor de
nitrogênio (CP 100, Taylor-Wharton), a -170°C. Após 12-16 horas, as amostras
foram transferidas para o nitrogênio líquido a -196°C, onde permaneceram por,
no mínimo, 6 horas antes de serem descongeladas para a avaliação da motilidade
espermática.
2.1 Experimento 1: diluidores de sêmen
O experimento 1 foi dividido em três etapas e teve como objetivo
principal avaliar o efeito de diferentes diluidores na criopreservação do sêmen.
A criosolução foi preparada com 80% ou 90% de cada um dos diluidores
testados, 10% do crioprotetor dimetil sulfoxido (DMSO) e 0% ou 10% de gema.
O sêmen foi diluído na proporção de 1:3 (sêmen: criosolução), envasado em
palhetas de 0,5 ml (n=3), descongelado em banho-maria, a 70°C, por 3 segundos
e as taxas de motilidade espermática estimadas. A etapa A foi conduzida em um
delineamento em blocos casualizados (DBC), com cinco blocos, sendo um
macho-XX doador de sêmen por bloco. Foram testados dois diferentes
diluidores: glicose 5,4% + gema de ovo (glicose-gema), de acordo com Silveira
et al. (2006) e BTS
®
6% - Beltsville Thawing Solution, Minitub
®
,
contendo
glicose monohidratada 80%, citrato de sódio 12,7%, EDTA 2,65%, sulfato de
gentamicina 0,50%, NaHCO
3
2,65% e KCl 1,59% (Maria et al., 2006).
Na etapa B, foi utilizado o delineamento inteiramente casualizado
(DIC), com cinco repetições. Foi coletado, individualmente, sêmen de cinco
62
machos-XX, de um mesmo lote, para compor um “pool”. Testaram -se, nessa
etapa, além da solução de glicose 5,4%, a solução de NaCl 1,2% + Tris 0,4%
(NaCl-tris; solução imobilizadora de Saad; Linhart et al., 1993) e a solução de
NaCl 0,9%. Nas três soluções houve o acréscimo de 10% de gema de ovo.
O objetivo da etapa C foi avaliar o efeito da gema de ovo na
criopreservação do sêmen. Foi utilizada a solução diluidora que obteve maiores
taxas de motilidade espermática nas etapas A e B (glicose 5,4%). Na metade da
solução foi acrescentado 10% de gema e a outra metade permaneceu sem gema.
O delineamento experimental utilizado, assim como na etapa A, foi o DBC com
cinco blocos, sendo um macho-XX doador de sêmen por bloco.
2.2 Experimento 2: crioprotetores
O objetivo deste experimento foi selecionar um crioprotetor que,
combinado ao diluidor glicose-gema, proporcionasse maiores taxas de
motilidade espermática pós-descongelamento. O delineamento experimental
utilizado em cada uma das etapas foi o DBC, com 5 blocos, sendo um macho-
XX doador de sêmen por bloco. Na etapa A, foram testados os seguintes
crioprotetores: DMSO, etileno glicol, metil glicol e metanol, todos na proporção
de 10% da criosolução (80% glicose 5,4% - 10% gema) diluídos 1:3.
Na etapa B foram testadas duas diferentes taxas de diluição do sêmen
(1:3 e 1:7) combinadas aos crioprotetores DMSO e etileno glicol, dispostos em
uma estrutura fatorial 2x2 (taxa de diluição x crioprotetor).
Em ambas as etapas, o sêmen foi envasado em palhetas de 0,5 ml (n=3),
descongelado em banho-maria, a 70°C, por 3 segundos e as taxas de motilidade
espermática estimadas.
63
2.3 Experimento 3: volume de palhetas
Para testar o efeito do volume das palhetas na criopreservação do sêmen,
o experimento 4 foi dividido em duas etapas. Na etapa A, o sêmen foi envasado
em palhetas de 0,25 e 0,5 ml (n=3 palhetas/ macho-XX). Na etapa B, comparou-
se a palheta de 0,5 ml com a palheta de 4,0 ml (n=5). O delineamento
experimental utilizado foi o DBC, com 5 blocos, sendo um macho-XX doador
de sêmen por bloco.
Em ambas as etapas o sêmen foi diluído em glicose-gema-DMSO, na
proporção de 1:3. A temperatura de descongelamento adotada foi a de 70ºC, por
3 segundos, com exceção das palhetas de 4,0 ml, que foram descongeladas a
70ºC, por 15 segundos. Após o descongelamento, as taxas de motilidade
espermática foram estimadas.
2.4 Experimento 4: temperatura de descongelamento
O sêmen de cinco machos-XX foi diluído em glicose-gema-DMSO, na
proporção de 1:3, envasado em palhetas de 0,5 ml (n=3) e congelado de acordo
com a metodologia adotada como padrão. O descongelamento das palhetas foi
feito em banho-maria em três diferentes temperaturas (70ºC/3s, 60ºC/8s e
50ºC/8s) e a motilidade espermática do sêmen estimada. O delineamento
utilizado foi um DBC com 5 blocos, sendo um macho-XX doador de sêmen por
bloco.
64
2.5 Experimento 5: proporção espermatozóides:ovo na taxa de fertilização
Foi coletado, individualmente, sêmen de cinco machos-XX e constituído
um “pool” com 3 ml de cada macho. O “pool” foi diluído 1:3 em glicose -gema-
DMSO, envasado em palhetas de 0,5 ml e congelado.
O sêmen foi descongelado em banho-maria a 70°C, por 3 segundos e,
antes de iniciar a fertilização, cinco palhetas foram usadas para avaliar a taxa de
motilidade espermática. Foram selecionados cinco machos-XX para compor um
outro “pool” que serviu como controle (n=3/tratamento). O “pool” foi utilizado
in natura
para fertilizar cada fêmea, respeitando-se as devidas concentrações
espermáticas para cada tratamento, com o objetivo de avaliar a viabilidade dos
ovos. Foram testados quatro diferentes tratamentos: 15x10
6
, 30x10
6
, 45x10
6
e
60x10
6
espermatozóides por ovo. Duas réplicas foram executadas para cada
tratamento em cada fêmea (3 fêmeas x 2 repetições), totalizando seis réplicas
por tratamento. Cem ovos de cada fêmea foram distribuídos em copos plásticos
de 100 ml devidamente identificados; o sêmen descongelado foi imediatamente
misturado aos ovos e a ativação dos espermatozóides feita com uma solução de
NaHCO
3
1%. Depois de 20 minutos da ativação, os ovos foram enxaguados com
água corrente e as parcelas aleatoriamente distribuídas em incubadoras de
bandeja (Figura 1). A taxa de ovos olhados foi determinada após 16 dias de
incubação com 194°C dias, etapa em que os embriões já apresentam os olhos
pigmentados. O cálculo foi feito relacionando-se a quantidade de ovos viáveis e
o número total de ovos por amostra.
O delineamento experimental utilizado foi um DBC, composto por três
blocos, sendo cada bloco constituído por uma fêmea doadora de ovos de,
aproximadamente, dois anos de idade e peso médio de 1,33 kg. Os testes de
fertilização foram realizados 24 horas após o congelamento do sêmen.
65
FIGURA 1:
Incubadoras de bandeja – parcelas distribuídas aleatoriamente
(Fonte: APTA-SAA-SP)
2.6 Análise estatística
Os dados de motilidade espermática e taxas de fertilização dos ovos
foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelos testes F e
Scott-Knott, a 5% de probabilidade, utilizando-se o pacote computacional
Sistema de Análise de Variância (Sisvar) (Ferreira, 1999).
66
3 RESULTADOS
As características do sêmen dos 25 machos-XX utilizados neste estudo
estão apresentadas na Tabela 1.
TABELA 1
: Dados referentes ao número de animais, peso vivo, volume,
motilidade, concentração espermática e pH, nas diferentes etapas experimentais.
Peixes Experimento Peso vivo Volume Motilidade
1
Sptz x 10
6
pH
(kg) (ml) inicial (%) /mm
3
1
1A e 2A
0,90
3,5
100
10
7,2
2
1A e 2A
1,10
11,0
80
10
--
3
1A e 2A
1,10
3,7
80
5
7,3
4
1A e 2A
1,10
6,1
100
11
7,3
5
1A e 2A
1,25
3,6
80
13,7
--
6
1B e 4B
1,20
3,0
90
15
7,0
7
1B e 4B
0,90
4,0
80
17
--
8
1B e 4B
1,25
5,5
90
18
7,4
9
1B e 4B
1,00
4,0
90
17
--
10
1B e 4B
1,00
3,5
80
14
7,2
11
1C e 4A
1,00
3,0
90
13
7,3
12
1C e 4A
0,90
3,5
90
15
--
13
1C e 4A
0,95
5,0
90
13
7,3
14
1C e 4A
1,10
5,0
100
20
--
15
1C e 4A
1,20
5,0
100
12
7,0
16
2B e 3
0,98
5,0
100
8
7,4
17
2B e 3
0,84
4,0
100
13
--
18
2B e 3
1,24
4,0
100
8
7,6
19
2B e 3
0,90
4,0
100
17
--
20
2B e 3
0,94
4,5
100
5
7,1
21
5
2,10
6,0
80
12
7,0
22
5
2,40
8,0
80
10
--
23
5
2,40
6,0
90
15
7,0
24
5
2,60
6,0
90
11
--
25
5
2,00
5,0
80
14
7,2
média ± DP
1,3±0,5 5,0±2,0 90±8,0 13±4,0 7,2±0,2
Sptz – espermatozóides.
67
3.1 Experimento 1: diluidores de sêmen
O diluidor glicose-gema foi o que proporcionou maiores taxas de
motilidade espermática pós-descongelamento, em todas as etapas experimentais.
Os resultados estão expressos na Tabela 2.
TABELA 2:
Motilidade (%; média ± desvio padrão; n=5 machos-XX)
espermática do sêmen de machos-XX de truta arco-íris, criopreservado em
diferentes diluidores e DMSO 10%.
Médias seguidas de letras iguais na mesma coluna e etapa não diferem entre si, pelo teste
de Scott Knott, na etapa B e pelo teste F, nas etapas A e C (P>0,05).
1
Glicose monohidratada 80%; citrato de sódio 12,7%; EDTA 2,65%; sulfato de
gentamicina 0,50%; NaHCO
3
2,65 %; KCl 1,59 %.
3.2 Experimento 2: crioprotetores
Na etapa A houve diferença significativa (P
<
0,05) entre os
crioprotetores testados. O DMSO foi o crioprotetor que apresentou maiores
taxas de motilidade espermática pós-descongelamento, seguido de etileno glicol,
metil glicol e metanol.
Na etapa B, detectou-se que o efeito dos crioprotetores e dos níveis de
diluição foi significativo (P<0,05). O crioprotetor DMSO foi o que proporcionou
maiores taxas de motilidade espermática pós-descongelamento, tanto na diluição
Etapas
Diluidores
Motilidade espermática (%)
A
Glicose 5,4% + gema
1
BTS
®
41 ± 18 a
3,0 ±2,5 b
B
Glicose 5,4% + gema
NaCl 0,9% + gema
NaCl-tris + gema
60 ± 0,0 a
50 ± 7,0 b
22 ± 8,0 c
C
Glicose 5,4% + gema
Glicose 5,4%
53 ± 7,0 a
17 ± 8,0 b
68
1:3 como na 1:7, quando comparado ao etileno glicol. Quando se avaliou a
motilidade espermática dentro de cada diluidor, observou-se que a diluição 1:3
obteve melhores resultados, tanto para o crioprotetor DMSO como para o etileno
glicol, quando comparada à diluição 1:7. Os resultados de motilidade
espermática estão expressos na Tabela 3.
TABELA 3:
Motilidade (%; média ± desvio padrão; n=5 peixes) espermática
pós-descongelamento do sêmen de machos-XX de truta arco-íris, criopreservado
em glicose-gema combinado a diferentes crioprotetores (10%) e taxas de
diluição.
Médias seguidas de letras iguais maiúsculas nas linhas e minúsculas nas colunas, dentro
da mesma etapa, não diferem entre si, pelo teste de Scott Knott (P>0,05).
1
Não testado
3.3 Experimento 3: volume de palhetas
Na etapa A, houve diferença significativa (P<0,05) para a taxa de
motilidade espermática nos diferentes volumes de palhetas testados. A palheta
de 0,5 ml apresentou maiores taxas de motilidade espermática pós-
descongelamento, quando comparada com a de 0,25 ml. Na etapa B, novamente,
as taxas de motilidade espermática foram maiores quando o sêmen foi congelado
em palhetas de 0,5 ml, comparadas com a de 4,0 ml (P<0,05). Os resultados de
motilidade espermática estão expressos na Tabela 4.
Sêmen: criosolução
Etapa
Crioprotetor (10%)
1:3
1:7
A
DMSO
Etileno glicol
Metil glicol
Metanol
41 ± 18 a
32 ± 10 b
18 ± 8,0 c
5,0 ± 3,0 d
Nt
1
Nt
Nt
Nt
B
DMSO
Etileno glicol
63 ± 3,0 a A
26 ± 3,0 b A
37 ± 10 a B
13 ± 3,0 b B
69
TABELA 4:
Motilidade (%; média ± desvio padrão; n=5 doadores de sêmen)
espermática do sêmen de machos-XX de truta arco-íris, criopreservado em meio
contendo glicose-gema-DMSO e envasado em diferentes volumes de palhetas.
Médias seguidas de letras iguais na mesma coluna e etapa não diferem entre si, pelo teste
F (P>0,05).
3.4 Experimento 4: temperaturas de descongelamento
A temperatura de descongelamento de 70°C, por 3 segundos,
proporcionou maiores taxas de motilidade espermática (P
<
0,05), quando
comparada às temperaturas de 60ºC e 50ºC, por 8 segundos (Tabela 5).
TABELA 5
: Motilidade (%; média ± desvio padrão; n=5 doadores de sêmen)
espermática do sêmen de machos-XX de truta arco-íris, criopreservado em meio
contendo glicose-gema-DMSO e descongelado em diferentes temperaturas.
Médias seguidas por letras iguais na coluna, não diferem entre si, pelo teste de Scott
Knott (P>0,05).
Etapa
Palheta (ml)
Descongelamento
(ºC)
Tempo
(segundos)
Motilidade
(%)
A
0,5
0,25
70
70
3
3
50 ± 7 a
32 ± 14 b
B
0,5
4,0
70
70
3
15
60 ± 3 a
46 ± 3 b
Descongelamento (ºC)
Tempo (segundos)
Motilidade (%)
70
60
50
3
8
8
63 ± 3,0 a
51 ± 8,0 b
48 ± 12 b
70
3.5 Experimento 5: proporção espermatozóides:ovo na taxa de fertilização
Quando se utilizou uma relação de 15x10
6
espermatozóides por ovo, a
taxa de ovos olhados foi de 30%, ou seja, significativamente menor (P<0,05)
quando comparada às outras três relações utilizadas (30x10
6
, 45x10
6
, 60x10
6
)
que apresentaram taxas de ovos olhados de 39%, 45% e 43%, respectivamente
(Tabela 6). Não houve diferença significativa (P>0,05) entre elas e a motilidade
média do sêmen pós-descongelamento foi de 52%.
TABELA 6
: Taxa de ovos olhados em diferentes relações espermatozóide:ovo
para o sêmen de machos-XX de truta arco-íris, criopreservado em glicose-gema-
DMSO e descongelado a 70°C, por 3 segundos.
Médias seguidas por letras iguais na coluna, não diferem entre si, pelo teste de Scott
Knott (P>0,05).
Nº de palhetas
Espermatozóides:ovo
Ovos olhados (%)
1
2
3
4
15 x 10
6
30 x 10
6
45 x 10
6
60 x 10
6
30 ± 3,0 a
39 ± 2,0 b
45 ± 0,0 b
43 ± 10 b
71
4 DISCUSSÃO
A utilização de andrógenos para a inversão sexual em truta arco-íris é
uma técnica muito usada, porém, na maioria das vezes, esse tratamento conduz a
uma população masculina cuja maioria dos machos-XX apresenta os dutos
espermáticos ausentes, incompletos ou afuncionais, o que requer o sacrifício dos
animais para obter o sêmen intratesticular (Geffen & Evans, 2000 Tsumura et
al., 1991). Quando compararam-se machos-XX que apresentavam os dutos
espermáticos com machos normais XY, não foi encontrada diferença com
relação às características seminais (viscosidade, coloração, motilidade e
concentração espermática) e o sêmen dos peixes com dutos teve o mesmo
comportamento que o sêmen dos machos normais XY, após a criopreservação
(Silveira et al., 2006). A criopreservação do sêmen de machos-XX que
apresentam os dutos espermáticos facilita o gerenciamento da reprodução e
reduz o número de reprodutores estocados (Feist et al., 1995; Tabata et al.,
2000).
A solução de glicose 5,4% usada como diluidor na criopreservação do
sêmen de truta arco-íris, acrescida de 10% DMSO e 10% gema de ovo, mostrou-
se eficiente, apresentando uma boa taxa de motilidade espermática após o
descongelamento. Soluções contendo glicose em sua composição têm sido
amplamente usadas por vários autores (McNiven et al., 1993; Piironen, 1993;
Silveira et al., 2006; Stoss & Reftsie, 1983) para a criopreservação do sêmen de
truta arco-íris, proporcionando excelentes resultados de motilidade espermática e
fertilização pós-descongelamento. A fosforilação oxidativa mitocondrial é
altamente requerida para produzir energia durante o batimento flagelar dos
espermatozóides e a insuficiência de ATP é uma das principais causas da
redução da motilidade espermática (Cosson et al., 1999). Estudos mostraram que
os espermatozóides de truta arco-íris utilizam triglicerídeos e glicose como
72
fontes primárias de energia (Lahnsteiner et al., 1993). Provavelme nte, a
concentração de glicose empregada neste estudo (5,4% da solução diluidora) foi
suficiente para suprir as necessidades metabólicas das células espermáticas.
O diluidor BTS
®
, rotineiramente utilizado como diluidor do sêmen de
suíno no processo de resfriamento, possui 80% de glicose na sua composição.
Não existem relatos na literatura de utilização de BTS
®
para a criopreservação
do sêmen de truta arco-íris, porém, ele tem sido altamente eficaz como diluidor
utilizado no processo de criopreservação do sêmen de espécies nativas
brasileiras, como a piracanjuba,
Brycon orbignyanus
(Maria, 2005), a curimba,
Prochilodus lineatus
(Miliorini, 2006 e Órfão, 2006) e a pirapitinga,
Brycon
nattereri
(Oliveira, 2006), entre outros.
No presente trabalho utilizou-se o BTS
®
como diluidor de sêmen na
tentativa de testar sua eficácia na preservação do sêmen de truta arco-íris, porém,
os resultados de motilidade espermática obtidos não foram satisfatórios. A
solução fisiológica de NaCl 0,9% (154 mM) utilizada neste trabalho como
diluidor de sêmen, acrescida de DMSO 10% e gema de ovo 10%, mostrou-se
eficiente no processo de criopreservação do sêmen, proporcionando boas taxas
de motilidade espermática pós-descongelamento.
Diluidores à base de soluções salinas já foram amplamente estudados por
diversos autores (Babiak et al., 1995; Borchard & Schmidt, 1979;
Büyükhatipoglu & Holtz, 1978; Stein, 1980; Stoss & Holtz, 1981). A grande
vantagem do NaCl é a simplicidade da sua formulação, tendo em vista que
soluções simples têm sido empregadas com grande sucesso como diluidor de
sêmen de diversas espécies. Além disso, soluções que têm como base o NaCl,
com níveis entre 100 e 200 mM, possuem um pequeno risco de danos hipo ou
hiperosmótico para os espermatozóides de salmonídeos (Scott & Baynes, 1980).
Outra solução salina simples que foi avaliada foi a solução de NaCl 1,2%-tris,
acrescida de 10% de gema de ovo. Esta solução foi testada pela primeira vez em
73
salmonídeos neste trabalho e não proporcionou resultados satisfatórios de
motilidade espermática com taxas abaixo de 23%. Maria (2005), testando o
mesmo diluidor para criopreservação do sêmen de piracanjuba (
Brycon
orbignyanus
), também não obteve boas taxas de motilidade espermática pós-
descongelamento. Entretanto, taxas de motilidade espermática acima de 60%
foram observadas quando se utilizou a solução de NaCl 1,2%-tris + DMSO ou
NaCl 1,2%-tris + metil glicol, na criopreservação do sêmen de dourado
(Salminus maxillosus)
(Órfão & Viveiros, 2004).
O acréscimo de gema de ovo, combinado à glicose e ao DMSO, foi
crucial para a manutenção da motilidade espermática após o descongelamento.
A gema de ovo é rotineiramente adicionada aos diluidores para criopreservação
do sêmen de mamíferos, com o objetivo de proteger as células espermáticas
contra o choque térmico. Acredita-se que sua ação seja devido à presença de
lipoproteínas de baixa densidade (LDL), as quais aderem à membrana celular
durante o processo de criopreservação, preservando, com isso, a membrana dos
espermatozóides (Moussa et al., 2002). Sua atuação se dá na superfície da
membrana plasmática, restaurando a perda de fosfolipídeos e, aparentemente,
induzindo uma alteração transitória de sua composição, conseqüentemente
prevenindo a ruptura da membrana (Farstard, 1996). Em peixes, como em
mamíferos, a gema de ovo está relacionada com a resistência da membrana
plasmática e aos danos causados pela baixa temperatura (Leung, 1991). Em
Salmonídeos, esse agente estabilizador de membrana é essencial para manter a
viabilidade dos espermatozóides após o processo de congelamento e
descongelamento (Baynes & Scott, 1987; Lahnsteiner et al., 1996a); já nos
ciprinídeos, a adição de gema de ovo provoca um efeito negativo na qualidade
do sêmen, reduzindo a motilidade espermática (Babiak & Glogowski, 1998;
Lahnsteiner et al., 2000).
74
Existem relatos da utilização de diversos crioprotetores que são
utilizados na preservação do sêmen de salmonídeos, entre eles estão o dimetil
sulfoxido (DMSO) (Baynes & Scott 1987; Holtz 1993; Legendre & Billard
1980; Stoss & Holts 1983), glicerol (Pironen 1993), combinação entre DMSO e
glicerol (Lahnsteiner et al., 1995, 1996b), propanodiol (Lahnsteiner et al.,
1996b), dimetil acetamida (McNiven et al., 1993) e metanol (Lahnsteiner et al.,
1997, 2000, 2002). Neste estudo, foram testados DMSO, metanol, metil glicol e
etileno glicol, tendo os dois últimos sido testados, pela primeira vez, na
criopreservação do sêmen de truta arco-íris. O DMSO foi o crioprotetor que
apresentou melhores resultados no decorrer dos experimentos, proporcionando
motilidade espermática entre 41% e 63% e taxa de ovos olhados de 45%. O
DMSO tem sido usado como crioprotetor de eleição por vários autores (Cabrita
et al., 2001a
e 2001b; Fogli da Silveira et al., 1994; Robles et al., 2003; Silveira
et al., 2002 e 2006) na criopreservação do sêmen de truta arco-íris,
proporcionando bons resultados de motilidade espermática e fertilização após o
descongelamento.
O crioprotetor metanol, combinado ao diluidor glicose-gema, não
proporcionou resultados satisfatórios de motilidade espermática neste estudo.
Entretanto, quando o metanol foi comparado ao DMSO, foi observada maior
capacidade de fertilização do sêmen criopreservado em metanol quando
combinado a diluidores complexos que tinham como base soluções salinas em
sua composição (Lahnsteiner et al., 1997). Talvez essa combinação explique a
melhor eficiência do metanol em relação aos resultados encontrados neste
trabalho, tendo em vista que avaliou-se o metanol associado apenas a diluidores
mais simples, tendo como base a glicose e não soluções salinas.
Dentre os crioprotetores que foram testados pela primeira vez neste
trabalho, o etileno glicol proporcionou motilidade espermática de 32%, enquanto
o metil glicol proporcionou apenas 18% de motilidade pós-descongelamento.
75
Pelo fato terem sido testados pela primeira vez em truta arco-íris, acredita-se que
ainda necessitam de mais estudos quanto à concentração ideal, diluição utilizada
e sua resposta em associação a diferentes diluidores, para que se possa inferir
com maior precisão sobre a eficácia do etileno glicol e do metil glicol na
preservação do sêmen de truta arco-íris. Na criopreservação de sêmen de tilápia
(
Sarotherodon mosssambicus
), foi observado sinergismo entre crioprotetores
(Harvey, 1983). Aparentemente, determinados crioprotetores agem melhor em
algumas espécies do que em outras, de sorte que a seleção do melhor
crioprotetor a ser testado pela primeira vez numa espécie deve ser feita em testes
de tentativa e erro (Bedore, 1999).
Quando se avaliou a taxa de diluição do sêmen, a proporção 1:3 (v/v)
proporcionou maior motilidade espermática pós-descongelamento, quando
comparada à diluição 1:7 (v/v), tanto para a criosolução glicose-gema-DMSO
quanto para a criosolução glicose-gema-elileno glicol. As taxas de diluição
utilizadas para criopreservação de sêmen de peixes têm variado de 1:1 a 1:10
(v/v). A concentração espermática também apresenta grande diferença entre as
diferentes espécies de peixes (Stein, 1980) e a relação ótima para a diluição do
sêmen é espécie-específica (Lahnsteiner et al., 1996c). Entretanto, a
concentração espermática depende muito do período em que a espécie se
encontra dentro da estação reprodutiva (Piironen & Hyvärinen 1983; Piironen
1985) e da idade dos peixes (Billard, 1988), podendo, ainda, variar entre as
diferentes populações de uma mesma espécie. Portanto, a avaliação da
concentração espermática e a adaptação das relações de diluição do sêmen
devem ser recomendadas de acordo com cada reprodutor e populações de peixes
(Lahnsteiner et al., 2000). Geralmente, a diluição recomendada para a
criopreservação do sêmen de salmonídeos varia de 1:1 a 1:3 (Babiak et al., 1995;
Legendre & Billard 1980).
76
No presente estudo, foram avaliados três diferentes volumes de palhetas
(0,5, 0,25 e 4,0 ml). A palheta de 0,5 ml, quando comparada a de 0,25 ml,
proporcionou maior taxa de motilidade espermática pós-descongelamento (50 e
32% respectivamente). O mesmo foi observado quando se comparou a palheta
de 0,5 com a de 4,0 ml (60% e 46%, respectivamente). Em estudos realizados
com o mesmo estoque de reprodutores, palhetas de 0,5 e 4,0 ml foram utilizadas
no processo de criopreservação. Não foi observada diferença entre os volumes
das palhetas quando o sêmen foi criopreservado no diluidor V2 composto por:
NaCl 0,75g, NaHCO
3
0,20g, KCl 0,038g, glicose 0,10g, água destilada 100 ml,
gema de ovo 20 ml (Stein & Bayrle, 1978) e 10 ml de DMSO. Porém, quando se
utilizou a solução modificada de Cortland para diluir o sêmen, as taxas de
fertilização foram maiores para as palhetas de 0,5 ml com relação às de 4,0 ml
(Solução modificada de Cortland: NaCl 0,725g, CaCl
3
2H
2
O 0,023g, KCl
0,038g, NaH
2
PO
4
0.041g; Mg(SO
4
).7H
2
O 0,023g; NaHCO
3
0.10g; glicose 0,10
g, água destilada 100 ml [Carosfeld et al., 1990] e 24 ml de DMSO). Em outro
estudo, não foi encontrada diferença na motilidade espermática ao comparar
palhetas de 0,5; 1,8 e 5,0 ml. Porém, a viabilidade das células e a taxa de
fertilização foram mais baixas para as palhetas de maior volume com relação às
de 0,5 ml (Cabrita et al., 2001b).
Excelentes resultados de motilidade espermática e fertilização também
foram encontrados em estudos com palhetas de 0,25 e 0,5 ml, na criopreservação
do sêmen de salmonídeos (Lahnsteiner et al., 1995). Em geral, as palhetas de 0,5
ml são mais eficientes que as palhetas de maior volume, porém, sua capacidade
de fertilização se restringe a um número muito pequeno de ovos, o que torna
cada vez mais freqüentes estudos com palhetas de maior volume, objetivando a
fertilização em grande escala. Quando grupos grandes de ovos (1.600-2000
ovos) foram fertilizados com palheta de 5,0 ml, os resultados de fertilização
foram similares aos das palhetas de 0,5 ml, demonstrando que a ligeira perda em
77
fertilização foi compensada pelos benefícios das palhetas de 5,0 ml (Cabrita et
al., 2001b).
Em geral, células congeladas rapidamente, como em palhetas de 0,5 ml,
devem ser mais rapidamente descongeladas quando comparadas com células
congeladas em velocidade mais lenta, como em criotubos ou macropalhetas
contendo um volume maior de sêmen (Viveiros, 2005). Portanto, a velocidade
de congelamento das células e o volume das palhetas que serão utilizadas devem
ser levados em conta para selecionar a temperatura ideal de descongelamento e o
tempo de exposição das palhetas a essa temperatura. Neste estudo, testou-se
apenas o descongelamento rápido para palhetas de 0,5 ml e observou-se que a
exposição das palhetas por três segundos, a uma temperatura de 70ºC, resultou
em maior taxa de motilidade espermática pós-descongelamento em relação às
temperaturas de 60ºC e 50ºC, por oito segundos. Fogli da Silveira et al. (1994)
usaram, pela primeira vez, a temperatura de descongelamento de 70ºC, por 3
segundos, que foi posteriormente adotada por Silveira (2002, 2006), obtendo
excelentes resultados de fertilização para o sêmen criopreservado.
Existem relatos de que há diferenças com relação às condições de
criopreservação do sêmen para as diversas espécies, porém, quando se trata do
descongelamento do sêmen, esse parâmetro não se mostra espécie-específico,
observando-se resultados eficientes de motilidade e fertilização para o sêmen
descongelado a 25ºC, por 30 segundos, para diferentes espécies de salmonídeos
(Lahnsteiner et al., 2000).
Existe uma grande variação da proporção de número de espermatozóide
por ovo adotada nos trabalhos que envolvem fertilização a partir do sêmen
criopreservado de salmonídeos. A proporção recomendada para as culturas
comerciais de truta arco-íris é de 10x10
6
espermatozóides por ovo (spz:ovo)
(Scott & Baynes, 1980 - revisão). Proporções de 3,5x10
6
(Fogli da Silveira et al.,
1994), 2,7x10
6
(Lahnsteiner., 2002), 20x10
6
(Silveira et al., 2002) e 16x10
6
78
spz:ovo (Salte, 2004) têm sido usadas para o sêmen criopreservado. Para o
sêmen de machos-XX, é descrita uma proporção de 20x10
6
spz:ovo (Silveira et
al., 2006) para os peixes que apresentam os dutos espermáticos funcionais e de
3,8x10
6
(Geffen & Evans. 2000) e 17x10
6
spz:ovo (Robles et al., 2003) para o
sêmen intratesticular. No presente trabalho, proporções acima de 30x10
6
spz:ovo
foram suficientes para alcançar taxas de ovos olhados de 42%, em média,
demonstrando maior eficiência quando comparadas à proporção de 15x10
6
spz:ovo.
O protocolo de criopreservação do sêmen utilizado neste experimento
foi o que obteve maiores taxas de motilidade espermática nos experimentos 1, 2,
3 e 4 (glicose-gema-DMSO, diluído 1:3, envasado em palhetas de 0,5 ml e
descongelado a 70°C por 3s). Sabe-se que o processo de criopreservação causa
diversos danos às células espermáticas, resultando em uma diminuição
significativa da motilidade espermática e do número de espermatozóides vivos,
o que afeta diretamente o número de espermatozóide que realmente estarão
aptos a fertilizar os ovos após o descongelamento do sêmen. As proporções de
espermatozóide por ovo que são relatadas na literatura, geralmente, não levam
em conta o número de espermatozóides vivos após o processo de
criopreservação. Esse fato talvez explique a grande diferença entre os protocolos
utilizados.
A truta arco-íris é uma espécie muito estudada em todo o mundo,
geralmente servindo como modelo para estudos preliminares em outras espécies.
Por ser um peixe de clima temperado, grande parte das pesquisas está
concentrada em países tradicionais no cultivo de trutas e salmões, como é o caso
do Canadá, Estados Unidos e diversos países europeus. Em países de clima
tropical, onde a espécie foi introduzida e o seu processo de adaptação ainda não
foi totalmente consolidado, a truta arco-íris ainda é pouco estudada. Na literatura
internacional, foram realizados diversos estudos que envolvem protocolos de
79
criopreservação com excelentes resultados, porém, neste estudo, procurou-se
avaliar alternativas mais simples para o processo de criopreservação, na tentativa
de adaptar um protocolo que seja eficiente para as condições de cultivo
encontradas no Brasil.
5 CONCLUSÃO
Para as condições de cultivo dos machos-XX de truta arco-íris
encontradas no Brasil, a solução composta por 80% glicose 5,4% + 10% gema
de ovo associada a 10% do crioprotetor DMSO mostrou-se eficiente no processo
de criopreservação do sêmen, quando envasado em palhetas de 0,5 ml e
descongelado a 70ºC, por 3 segundos, utilizando para o processo de fertilização,
uma proporção maior ou igual a 30x10
6
espermatozóide por ovo.
80
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87
CAPÍTULO 3
CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN INTRATESTICULAR DE
MACHOS-XX DE TRUTA ARCO-ÍRIS
(Oncorhynchus mykiss)
88
Criopreservação do Sêmen Intratesticular de machos-XX de truta arco-íris
(Oncorhynchus mykiss)
RESUMO
O controle da sexualidade em truta arco-íris é de grande importância para a
indústria da aqüicultura, pois as fêmeas dessa espécie apresentam taxas de
crescimento mais elevadas do as dos machos. Os machos atingem a maturidade
sexual antes de alcançarem o peso comercial. Essa precocidade afeta a produção,
pois está associada a alterações no metabolismo que resultam na diminuição do
ganho de peso, perda da qualidade da carne e maior suscetibilidade a doenças. A
inversão sexual pela via indireta é a técnica mais utilizada para a produção de
lotes 100% femininos e consiste na obtenção de machos-XX, a partir da
masculinização de fêmeas normais (XX) por meio da administração de
andrógenos. O resultado do cruzamento entre machos-XX e fêmeas normais é o
de indivíduos 100% fêmeas. A morfologia externa dos machos-XX é idêntica à
dos machos normais, porém, na maioria das vezes, apresentam os dutos
espermáticos incompletos, sendo necessário remover as gônadas para a obtenção
do sêmen. As características espermáticas do sêmen intratesticular exigem a
elaboração de um protocolo específico para criopreservação. Neste estudo,
alguns fatores que interferem na criopreservação do sêmen intratesticular de
machos-XX de truta arco-íris foram avaliados, na tentativa de aperfeiçoar as
técnicas de criopreservação. No experimento 1, três diluidores (glicose 5,4%;
NaCl 0,9% e NaCl 1,2%-tris) e duas temperaturas de descongelamento (70°C/3s
e 35°C/16s) foram testados. A criosolução (diluidor + crioprotetor) foi preparada
com 80% de cada um dos diluidores, 10% do crioprotetor dimetil sulfóxido
(DMSO) e 10% de gema. O sêmen foi diluído 1:3 (sêmen:criosolução),
envasado em palhetas de 0,5 ml e congelado em botijão de vapor de nitrogênio
(CP 100, Taylor-Wharton) a -170°C, transferido, após 12-16 horas, para o
nitrogênio líquido, a -196°C, onde permaneceu por 6 horas, antes de ser
descongelado para avaliação da motilidade espermática. No experimento 2,
foram testadas três taxas de diluições em plasma seminal (1:0, 1:6 e 1:8). Depois
de diluído, o sêmen foi dividido em duas partes; uma delas foi re-diluída 1:3 em
glicose-gema-DMSO e imediatamente congelada (controle) e a outra
permaneceu por 1h:30min à temperatura de 4°C (incubação) antes de ser re-
diluída 1:3 em glicose-gema-DMSO e congelada. No experimento 3, o sêmen
foi diluído em plasma seminal em três diferentes proporções (1:5, 1:7 e 1:9) e
incubado como no experimento 2. Após esse período, o sêmen foi re-diluído 1:3,
em duas diferentes criosoluções (glicose-gema-DMSO e NaCl-gema-DMSO).
89
Nos experimentos 2 e 3, o sêmen foi envasado em palhetas de 0,5 ml,
descongelado a 70°C/3s e as taxas de motilidade espermática avaliadas. Os
diluidores glicose 5,4% e NaCl 0,9% foram significativamente superiores ao
NaCl-tris, porém, a motilidade espermática foi baixa para todos os tratamentos e
não houve diferença significativa (P>0,05) entre as temperaturas de
descongelamento de 70°C/3s e 35°C/16s. A incubação pré-congelamento em
plasma seminal proporcionou maior taxa de motilidade espermática pós-
descongelamento e o sêmen diluído 1:6 obteve melhores resultados quando
comparada a 1:8 e 1:0
.
O sêmen diluído 1:5 e 1:7 em plasma proporcionou
maiores taxas de motilidade espermática com relação à diluição 1:9. O mesmo
foi observado para o diluidor glicose 5,4%, que obteve melhores resultados
quando comparado ao NaCl 0,9%. Com base nesses resultados, pode-se concluir
que a incubação pré-congelamento do sêmen em plasma seminal foi
fundamental para o aumento do potencial de motilidade do sêmen intratesticular
e que o sêmen diluído 1:6 em plasma e re-diluído 1:3 em glicose-gema-DMSO,
quando envasado em palhetas de 0,5 ml e descongelado a 70ºC/3s, pode alcançar
taxas de motilidade espermática de 60% pós-descongelamento.
90
1 INTRODUÇÃO
O controle da sexualidade em truta arco-íris é de grande importância
para a indústria da aqüicultura, pois as fêmeas dessa espécie apresentam taxas de
crescimento mais elevadas do que a dos machos. As fêmeas de truta arco-íris
alcançam a maturidade sexual mais tarde do que os machos e atingem seu peso
comercial antes de entrarem em atividade reprodutiva. Assim, a produção de
lotes 100% femininos é um dos objetivos a serem alcançados pelos piscicultores,
pois traz benefícios econômicos importantes para a produção comercial
(Panadian & Sheela, 1995).
A feminilização pode ser obtida por meio da inversão sexual pela via
indireta, que consiste na masculinização de fêmeas genotípicas com andrógenos
e posterior fertilização de óvulos normais com o sêmen dessas fêmeas
masculinizadas (Piferrer & Donldson, 1989). Dentre as vias de administração de
hormônios, as mais recomendadas são as que veiculam o hormônio por meio da
ração ou de banhos de imersão (Tabata & Portz, 2004). Esses procedimentos
permitem o crescimento dos testículos e a produção de espermatozóides viáveis
nesses indivíduos, que são geneticamente fêmeas e, conseqüentemente, todos os
seus espermatozóides carregam o cromossomo X. Entretanto, esse tratamento
conduz a uma população masculina na qual a maioria dos machos-XX apresenta
os dutos espermáticos ausentes, incompletos ou afuncionais, o que requer o
sacrifício dos animais e a retirada dos testículos para se obter o sêmen (Geffen &
Evans, 2000; Tsumura et al., 1991).
Esses espermatozóides extraídos diretamente dos testículos não sofrem
as modificações que ocorrem nos dutos espermáticos de machos normais, tais
como a nutrição e a reabsorção dos espermatozóides (Billard & Takashima,
1983) e a regulação da composição iônica do fluido seminal (Morisawa &
Morisawa, 1990), entre outros. Além disso, impedem a secreção de hormônios
91
que atuam indiretamente na motilidade espermática do sêmen (Van den Hurk et
al., 1978). Portanto, o sêmen obtido diretamente do testículo não está
completamente maduro, sua densidade é elevada e, provavelmente, diversas
células ainda se apresentam imaturas. Este fato requer uma maturação externa
prévia dos espermatozóides antes da ativação, tendo em vista que os
espermatozóides coletados diretamente dos testículos apresentam motilidade
mais baixa com relação ao sêmen dos machos normais (Robles et al., 2003).
A necessidade do sacrifício dos animais para a retirada dos testículos e
obtenção do sêmen requer, do produtor, a manutenção de um número mais
elevado de reprodutores nas pisciculturas, além da utilização constante de
hormônios para a manutenção dos lotes invertidos. Essas práticas acabam,
muitas vezes, onerando os custos de produção na propriedade. Dessa forma, o
sêmen desses animais poderia ser criopreservado, dispensando-se, assim, a
prática contínua do tratamento hormonal (Hunter et al., 1983; Kavamoto et al.,
1991; Silveira et al., 2000) e permitindo a disponibilidade desse material ao
longo do ano, reduzindo a necessidade de um estoque muito grande de
reprodutores. Pode ainda servir como base para o desenvolvimento e a
manutenção de bancos genéticos e transporte de gametas (McAndrew et al.,
1995).
As características diferenciadas do sêmen intratesticular de machos-XX de
truta arco-íris devem ser consideradas para a formulação de um protocolo
específico de criopreservação do sêmen.
O objetivo deste estudo foi avaliar alguns fatores que interferem na
criopreservação do sêmen intratesticular de machos-XX de truta arco-íris, na
tentativa de definir um protocolo eficaz de criopreservação. Foram avaliados o
efeito de diferentes diluidores de sêmen e temperaturas de descongelamento,
diferentes taxas de diluições do sêmen em plasma seminal e o efeito da
incubação pré-congelamento na motilidade dos espermatozóides.
92
2 MATERIAL E MÉTODOS
O estudo foi realizado nos meses de julho e agosto de 2006, obedecendo
ao período reprodutivo da truta arco-íris para as condições climáticas
encontradas no Brasil. Os animais utilizados eram provenientes da Estação
Experimental de Salmonicultura “Dr. Ascânio de Faria” - APTA-SAA-SP,
localizada na cidade de Campos do Jordão, SP.
As médias de temperatura da água, nos meses de julho e agosto de 2006,
foram de 11,7°C e 12,4°C, respectivamente. Para cada experimento foram
selecionados de três a cinco machos-XX de truta arco-íris (
Oncorhynchus
mykiss
) com, aproximadamente, dois anos de idade e peso médio de 1,5 kg. A
inversão sexual das fêmeas foi feita conforme rotina na Estação Experimental de
Campos de Jordão, por meio da utilização do hormônio sintético 17 alpha-metil
testosterona, na dose de 250 microgramas / kg de ração, ministrado durante 80
dias, a uma temperatura média de 12,8ºC, totalizando 1024 UTA (unidades
térmicas acumuladas), em graus centígrados dias (ºC dias). Foi utilizado sêmen
intratesticular de machos-XX que não apresentavam os dutos espermáticos,
sendo necessário o sacrifício dos peixes e a retirada dos testículos. Os peixes
foram insensibilizados em solução contendo o anestésico benzocaína, na
proporção de 1:10.000 por, aproximadamente, 30-40 segundos, até cessarem os
movimentos. As brânquias foram seccionadas para a sangria, que teve o objetivo
de diminuir o fluxo de sangue na região dos testículos e evitar, ao máximo, a
contaminação do sêmen com sangue. Os testículos foram removidos, pesados
para a determinação do índice gonadossomático e cortados, no sentido
longitudinal, para a extração do sêmen por gotejamento (Figura 1). Este método
de obtenção do sêmen diminui a contaminação com sangue e a deposição de
células espermáticas ainda imaturas (Robles et al., 2003). O sêmen foi coletado
93
em tubos de ensaio graduados, seu volume mensurado e mantido em um
recipiente com gelo até ser manipulado.
Antes de iniciar cada experimento, a motilidade espermática foi
subjetivamente estimada no microscópio de luz em aumento de 400X. A solução
utilizada como ativadora da motilidade espermática foi o NaHCO
3
1% (Fogli da
Silveira et al., 1994) pH 8,3,
na proporção de 40 microlitros de ativador para
cada 10 microlitros de sêmen. Foram avaliados também a concentração
espermática utilizando-se a câmara de Neubauer, e o pH do sêmen de cada
peixe. O sêmen, depois de diluído em criosolução (diluidor + crioprotetor), foi
envasado em palhetas de 0,5 ml e criopreservado em botijão de vapor de
nitrogênio (CP 100, Taylor-Wharton), a -170°C. Após 12-16 horas, as amostras
foram transferidas para o nitrogênio líquido a -196°C, onde permaneceram por,
no mínimo, 6 horas, até serem descongeladas para avaliação da motilidade
espermática.
FIGURA 1.
Extração do sêmen intratesticular por gotejamento
(Fonte: Rafael V.A).
94
2.1 Experimento 1: diluidores de sêmen e temperaturas de descongelamento
No experimento 1, foram testados três diferentes diluidores de sêmen:
glicose (glicose 5,4%), NaCl (NaCl 0,9%) e NaCl-tris (NaCl 1,2% + Tris 0,4% -
solução imobilizadora de Saad; Linhart et al., 1993). A criosolução foi preparada
com 80% de cada um dos diluidores testados, 10% do crioprotetor dimetil
sulfoxido (DMSO) e 10% de gema. O sêmen foi diluído na proporção de 1:3
(sêmen: criosolução), envasado em palhetas de 0,5 ml (n=6
palhetas/diluidor/macho) e congelado. O descongelamento das palhetas foi feito
em duas diferentes temperaturas (70°C/3s e 35°C/16s; n=3 palhetas/temperatura/
diluidor/macho) e a taxa de motilidade espermática subjetivamente estimada. O
delineamento experimental utilizado foi em blocos casualizados (DBC), com
três blocos (1 bloco=1 macho-XX), dispostos em uma estrutura fatorial 3x2
(diluidores x temperaturas de descongelamento).
2.2 Experimento 2: incubação pré-congelamento do sêmen em plasma
seminal
Sêmen de cinco machos-XX de um mesmo lote foi coletado e
homogeneamente misturado para compor um “pool”. O “pool” de sêmen foi
diluído em plasma seminal, em três diferentes proporções (1:0 = sem diluir; 1:6
e 1:8). Após a diluição em plasma, uma parte das amostras foi novamente
diluída 1:3 (sêmen + plasma: criosolução), em uma criosolução à base de
glicose-gema-DMSO, envasada em palhetas de 0,5 ml (n=5 palhetas/taxa de
diluição) e imediatamente congeladas. A outra parte foi acondicionada em tubos
de ensaio, recebeu uma suplementação de oxigênio e foi mantida, por 1h:30min,
à temperatura de 4°C (incubação), na tentativa de promover a maturação dos
espermatozóides. Após 1h:30min de incubação, o sêmen foi novamente diluído
95
1:3 (sêmen + plasma: criosolução) em uma criosolução a base de glicose-gema-
DMSO, envasado em palhetas de 0,5 ml (n=5 palhetas/taxa de diluição) e
congelado. As amostras foram descongeladas a 70°C/3s e a taxa de motilidade
espermática subjetivamente estimada. O plasma seminal utilizado para diluir o
sêmen intratesticular foi obtido a partir da centrifugação do sêmen de
machos
normais de truta arco-íris. O sêmen foi centrifugado a uma velocidade de 3.000
rpm durante uma hora, após esse período, o sobrenadante foi coletado e
centrifugado novamente por mais uma hora. O plasma coletado foi
acondicionado em tubos de ensaio e mantido a 4ºC até ser utilizado. O
delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado (DIC),
disposto em uma estrutura fatorial 3x2 (taxa de diluição em plasma x situações:
incubação e controle s/incubação).
2.3 Experimento 3: incubação pré-congelamento e diluidores de sêmen
.
O sêmen intratesticular de cinco machos-XX de um mesmo lote foi
coletado e misturado homogeneamente para compor um “pool”. O “pool” de
sêmen foi diluído em plasma seminal em três diferentes proporções (1:5; 1:7 e
1:9). Após a diluição, o sêmen foi acondicionado em tubos de ensaio, recebeu
uma suplementação de oxigênio e foi mantido, por 1h:30min, à temperatura de
4°C. Após 1h:30min de incubação, o sêmen foi re-diluído na proporção de 1:3
(sêmen + plasma: criosolução), em duas diferentes criosoluções (glicose-gema-
DMSO e NaCl-gema-DMSO), envasado em palhetas de 0,5 ml (n=5
palhetas/taxa de diluição em plasma/diluidor) e congelado. O descongelamento
foi feito a 70°C/3s e a taxa de motilidade espermática subjetivamente estimada.
O delineamento experimental utilizado foi um DIC, disposto em uma estrutura
fatorial 3x2 (taxa de diluição em plasma x diluidor).
96
2.6 Análise estatística
Os dados de motilidade espermática foram submetidos à análise de
variância e as médias comparadas, pelo teste de Scott-Knott, a 5% de
probabilidade, utilizando-se o pacote computacional Sistema de Análise de
Variância (Sisvar) (Ferreira, 1999).
97
3 RESULTADOS
As características do sêmen intratesticular dos 13 machos-XX utilizados
nesse estudo estão apresentados na Tabela 1.
TABELA 1
: Dados referentes ao número de animais, peso vivo, volume,
motilidade, concentração espermática, pH e índice gonadossomático (GSI), nas
diferentes etapas experimentais.
Peixe
1
Expto
Peso vivo
(kg)
Volume
(ml)
Motilidade
inicial (%)
2
Sptz x
10
6
/mm
3
pH
3
GSI
1
1
2,7
3,0
80
33
6,8
3,8
2
1
2,6
3,0
70
30
7,2
3,75
3
1
2,9
4,0
80
35
7,0
3,8
4
2
1,1
2,5
70
35
7,2
6,36
5
2
1,0
3,0
80
30
7,2
5,5
6
2
1,2
4,0
70
32
7,0
5,5
7
2
1,0
3,5
70
38
6,9
5,8
8
2
1,3
3,0
70
31
6,8
4,65
9
3
1,0
5,0
80
36
7,2
6,8
10
3
1,4
3,0
70
32
6,9
5,32
11
3
1,0
4,0
70
38
6,9
5,0
12
3
1,2
4,0
80
30
7,1
4,6
13
3
1,1
3,0
80
35
7,0
3,8
Média ± DP
1,5± 0,7
3,5± 0,7
74,6± 5,2
33,5± 2,9
7,0±0,15
5,0±1,0
1
Sptz = espermatozóides;
2
Expto = experimento
3
GSI = Índice gonadossomático (GSI = peso da gônada (g) x 100/peso vivo (g)).
98
3.1 Experimento 1: diluidores de sêmen e temperaturas de descongelamento
A interação diluidor x temperatura de descongelamento não foi
significativa (P>0,05), indicando que não houve variações nas taxas de
motilidade espermática para as diferentes combinações entre diluidores e
temperaturas de descongelamento. Em média, o sêmen criopreservado em meio
contendo glicose 5,4% e NaCl 0,9% obteve maiores taxas de motilidade
espermática, quando comparado ao sêmen criopreservado em meio contendo
NaCl-tris. Para as temperaturas de descongelamento de 70°C/3s e 35°C/16s, não
houve diferença significativa. Os resultados estão expressos na Tabela 2.
TABELA 2:
Motilidade (%; média ± desvio padrão; n=3 machos-XX)
espermática do sêmen intratesticular de machos-XX de truta arco-íris,
criopreservado em diferentes diluidores, acrescidos de 10% de gema e 10%
DMSO e descongelado em diferentes temperaturas.
Médias seguidas de letras iguais maiúsculas nas linhas e minúsculas nas colunas não
diferem entre si, pelo teste de Scott Knott (P>0,05).
1
NaCl-tris = NaCl 1,2% + Tris 0,4% - Solução imobilizadora de Saad.
3.2 Experimento 2: incubação pré-congelamento do sêmen em plasma
seminal
Os efeitos da diluição em plasma seminal e da incubação pré-
congelamento (1h:30min/4°C) foram significativos (P<0,05). Os tratamentos
Descongelamento
Motilidade (%)
Diluidores
70ºC/3s
35ºC/16s
Média ± DP
NaCl 0,9%
1
NaCl-tris
Glicose 5,4%
6,7 ± 2,9
4,5 ± 2,5
7,8 ± 2,5
6,7 ± 0,0
5,0 ± 0,0
6,7 ± 1,7
6,7 ± 0,0 a
4,7 ± 0,7 b
7,2 ± 0,8 a
Média ± DP
6,3 ± 1,7 A
6,1 ± 1,0 A
99
que passaram pelo período de incubação pré-congelamento proporcionaram
maiores taxas de motilidade espermática e, em média, o sêmen diluído 1:6
(sêmen: plasma) obteve maiores taxas de motilidade espermática, quando
comparado às proporções 1:8 e 1:0. Quando o sêmen foi submetido à incubação
pré-congelamento e diluído 1:6 em plasma, observou-se maior taxa de
motilidade espermática pós-descongelamento com relação ao sêmen diluído 1:8
e 1:0
.
Para o sêmen controle, que não passou pelo período de incubação, não
houve diferença quando o sêmen foi diluído 1:6 ou 1:8. Entretanto, essas duas
diluições proporcionaram maiores taxas de motilidade espermática com relação
ao sêmen não diluído (1:0).
Quando foi avaliado o período de incubação dentro
de cada nível de diluição em plasma seminal, o sêmen diluído 1:6 ou 1:8
proporcionou maiores taxas de motilidade espermática quando passou pelo
período de incubação pré-congelamento. Para a diluição 1:0, não houve
diferença, entre o sêmen que foi incubado ou não, quanto à motilidade
espermática (Tabela 3).
TABELA 3:
Motilidade (%; média ± desvio padrão; n=5 machos-XX)
espermática do sêmen intratesticular de machos-XX de truta arco-íris, diluído
em diferentes proporções sêmen:plasma seminal, incubado ou não por 1h:30min
a 4°C e criopreservado em glicose-gema-DMSO..
Médias seguidas de letras iguais maiúsculas nas linhas e minúsculas nas colunas não
diferem entre si, pelo teste de Scott Knott (P>0,05).
1
Controle: sêmen que não passou pelo período de incubação de
1h:30min,
a 4°C
2
1:0 : sêmen não diluído
(in natura).
Motilidade (%)
Taxa de diluição
(Sêmen:plasma)
1
Controle
Incubação
(1h:30min /4°C)
2
1:0
1:6
1:8
6,0 ± 2,2 Ab
18 ± 8,3 Ba
15 ± 5,0 Ba
0,0 ± 0,0 Ac
60 ± 7,0 Aa
50 ± 7,0 Ab
100
3.3 Experimento 3:
incubação pré-congelamento e diluidores de sêmen
Detectou-se que o efeito dos diluidores foi significativo (P<0,05),
entretanto, o mesmo não foi observado quando foram avaliadas as diferentes
taxas de diluição em plasma. Quando o sêmen foi diluído 1:5 em plasma
seminal, a solução de glicose, que foi utilizada para re-diluir o sêmen e prepará-
lo para o congelamento, proporcionou maiores taxas de motilidade espermática
pós-descongelamento, comparada à solução de NaCl. O mesmo foi observado
para o sêmen diluído 1:7 em plasma seminal. Quando o sêmen foi diluído 1:9,
não houve diferença entre a solução de glicose e NaCl, com relação à motilidade
espermática. Quando foram avaliadas as diferentes diluições em plasma, dentro
de cada solução diluidora de sêmen, não detectou-se diferença para o sêmen
diluído 1:5, 1:7 e 1:9, quando a solução de NaCl foi utilizada para re-diluir o
sêmen. Entretanto, quando a solução de glicose foi utilizada, as diluições 1:5 e
1:7, em plasma, proporcionaram maiores taxas de motilidade espermática
quando comparadas ao sêmen diluído 1:9 (Tabela 4).
TABELA 4:
Motilidade (%; média ± desvio padrão; n=5 machos-XX)
espermática do sêmen de machos-XX de truta arco-íris, diluído em diferentes
proporções sêmen: plasma, incubado por 1h:30min, a 4°C e criopreservado em
diferentes diluidores.
Médias seguidas de letras iguais maiúsculas nas linhas e minúsculas nas colunas não
diferem entre si, pelo teste de Scott Knott (P>0,05).
1
Solução diluidora: Soluções à base de glicose ou NaCl utilizadas para re-diluir o sêmen
após ser pré-diluído em plasma seminal e incubado por
1h:30min,
a 4°C.
1
Solução diluidora
Taxa de diluição
(Sêmen:plasma)
Glicose 5,4%
NaCl 0,9%
1:5
1:7
1:9
50 ± 0,0 Aa
54 ± 5,5 Aa
44 ± 5,5 Ab
36 ± 5,5 Ba
40 ± 0,0 Ba
44 ± 5,5 Aa
101
4 DISCUSSÃO
Os dutos testiculares possuem um papel importante no armazenamento e
nutrição dos espermatozóides, síntese de esteróides, composição iônica do fluido
seminal, atividade auto e heterofagocítica e na formação do plasma seminal
(Lahnsteiner et al., 1993). Conseqüentemente, o sêmen obtido diretamente do
testículo não está completamente maduro, sua densidade é elevada e,
provavelmente, diversas células ainda se apresentam imaturas. Diferenças com
relação às características seminais (motilidade espermática, concentração
espermática e de ATP) foram observadas quando o sêmen de machos-XX, que
possuíam os dutos espermáticos funcionais, foi comparado ao sêmen
intratesticular dos machos-XX sem dutos (Geffen & Evans 2000). Em outro
estudo, quando o sêmen de machos-XX que apresentavam os dutos foi
comparado ao sêmen de machos normais XY, não foi encontrada diferença com
relação às características seminais (viscosidade, coloração, motilidade e
concentração espermática), apresentando comportamento semelhante de
motilidade e fertilização após a criopreservação (Silveira et al., 2006).
No experimento 1 do presente estudo, foram testamos diferentes
diluidores de sêmen à base de glicose, NaCl e NaCl-tris, e duas temperaturas de
descongelamento (70°C/3s e 35°C/16s) no processo de criopreservação do
sêmen intratesticular. Os resultados de motilidade espermática pós-
descongelamento não foram satisfatórios, apresentando taxas abaixo de 7%,
dificultando a avaliação do efeito dos diferentes diluidores e temperaturas de
descongelamento testadas. A utilização do sêmen
in natura
, extraído
diretamente dos testículos e sem passar por nenhuma diluição prévia ou período
de incubação pré-congelamento, pode explicar as baixas taxas de motilidade
espermática encontradas, tendo em vista a elevada densidade do sêmen
intratesticular e a presença de células imaturas.
102
O efeito da incubação do sêmen em plasma seminal foi avaliado e teve
como objetivo detectar a capacidade do plasma seminal como promotor da
maturação dos espermatozóides, quando submetido a um período de incubação
por 1h:30min, a 4°C (experimento 2). Foram avaliadas também diferentes taxas
de diluição do sêmen em plasma, na tentativa de preparar os espermatozóides
para o processo criogênico. A densidade do sêmen intratesticular é bastante
elevada e foi uma das hipóteses levantadas para o insucesso da criopreservação
quando o sêmen não foi submetido a pré-diluições. Essa alta densidade poderia
estar dificultando o contato uniforme da criosolução com os espermatozóides e
impedindo a entrada dos crioprotetores de forma eficaz em todas as células. Em
operações comerciais, devido à alta viscosidade do sêmen intratesticular,
geralmente, são feitas pré-diluições em soluções que apresentam osmolaridade
semelhante à do sêmen, evitando-se, assim, a sua ativação (Geffen & Evans,
2000).
Quando o tratamento controle foi avaliado, ou seja, o sêmen que não
passou pelo período de incubação, detectou-se efeito significativo com relação à
diluição em plasma seminal. Maiores taxas de motilidade espermática foram
obtidas quando o sêmen foi diluído em plasma seminal (1:6 ou 1:8), com relação
ao sêmen não diluído (1:0), porém, os valores de motilidade espermática
encontrados (1:6 = 18% e 1:8 = 15%) não foram satisfatórios. Entretanto, as
mesmas amostras de sêmen diluídas 1:6 e 1:8, quando foram incubadas por
1h:30min, a 4°C, proporcionaram taxas de motilidade espermática pós-
descongelamento de 50% e 60%, respectivamente. Esses resultados mostram
que a diluição do sêmen intratesticular contribuiu para o aumento da motilidade
espermática, quando comparado ao sêmen não diluído, porém, para que se
alcancem resultados satisfatórios de motilidade espermática pós-
descongelamento, é necessária a incubação do sêmen em meio específico, na
tentativa de promover a maturação das células espermáticas.
103
Imediatamente após terem completado a espermiogênese, os
espermatozóides ainda não estão completamente maduros e não apresentam um
potencial para motilidade (Lahnsteiner et al., 1999; Miura et al., 1992; Morisawa
& Morisawa, 1986).
A maturação final é feita no lúmen lobular e nos dutos
espermáticos, onde existem hormônios que são responsáveis por esse processo.
Mais especificamente em salmonídeos, acredita-se que o hormônio 17 alpha, 20
beta-dihydroxy-4-pregnen-3-one (17, 20-DP) seja responsável pela maturação
final dos espermatozóides e esteja envolvido, direta ou indiretamente, na
elevação do pH do plasma seminal, causando, dessa maneira, um aumento no
índice de AMPc dentro dos espermatozóides, permitindo que sejam móveis uma
vez que entrem em contato com uma solução hipoosmótica (Miura et al., 1992;
Nagahama, 1994). Este fato talvez explique as baixas taxas de motilidade
espermática encontradas no sêmen intratesticular, que necessitam de uma
maturação exógena prévia antes da ativação (Robles et al., 2003). Além disso,
nos dutos espermáticos, grandes quantidades de triglicerídeos estão presentes no
plasma seminal (Piironen & Hyvarinen, 1983) e sabe-se que estes compostos são
usados pelos espermatozóides de machos normais para obter energia
(Lahnsteiner et al., 1993).
Os espermatozóides de truta apresentam uma única mitocôndria na base
de sua cabeça, que possui baixa habilidade para realizar a fosforilação oxidativa
(Le Lay et al., 1999). Esse fato explica o curto período de movimento dessas
células. Conseqüentemente, as deficiências em compostos responsáveis pelo
fornecimento de energia, como é o caso dos triglicerídeos e os baixos índices de
AMPc dentro das células, atuam negativamente no metabolismo energético dos
espermatozóides, diminuindo a motilidade e a viabilidade espermática do sêmen
intratesticular de machos-XX.
Quando o sêmen intratesticular de machos-XX foi incubado em plasma
seminal artificial (NaCl 7,60 g, KCl 2,98 g, CaCl2 · 2H2O 0,37 g, MgCl2 ·
104
6H2O 0,31 g, NaHCO3 0,21 g, e 1000-ml de água destilada), na proporção de
1:10 (v/v), em pH 9,9, por 2 horas, a 4ºC, a porcentagem de espermatozóides
móveis aumentou de 0,5% para 80% e a taxa de ovos olhados passou de 5,5%
para 53,8% (Kobayashi et al., 2004). Em outro estudo, o sêmen intratesticular de
machos-XX foi diluído 1:9 (v/v) em uma solução comercial de maturação
(MATURFISH
®
, IMV, França), incubado por 2 horas, a 4ºC, com
suplementação de oxigênio, re-diluído 1:3 (v/v) em um criodiluidor à base de
DMSO-gema-proteína de soja e criopreservado. As taxas de motilidade
espermática variaram entre 10% a 30% e as taxas de fertilização entre 30% e
60% (Robles et al., 2003). No experimento 3, podemos avaliar o efeito de dois
diluidores de sêmen que foram utilizados para re-diluir o sêmen incubado e o
diluidor que proporcionou maiores taxas de motilidade espermática pós-
descongelamento foi a solução à base de glicose, quando comparada ao NaCl.
Nossos melhores resultados de motilidade espermática pós-descongelamento
foram obtidos quando o sêmen foi pré-diluído 1:6 (v/v) em plasma seminal,
incubado por 1h:30min, a 4°C e re-diluído (1:3 v/v) em glicose-gema-DMSO,
antes de ser congelado.
5 CONCLUSÃO
Neste estudo, concluiu-se que a incubação pré-congelamento dos
espermatozóides em plasma seminal foi fundamental para o aumento do
potencial de motilidade do sêmen intratesticular de machos-XX e que o sêmen
diluído 1:6 em plasma seminal, incubado por 1h:30min, a 4°C e re-diluído 1:3
em glicose-gema-DMSO, foi o protocolo de criopreservação que proporcionou
os maiores taxas de motilidade espermática pós-descongelamento.
105
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108
CAPÍTULO 4
DISCUSSÃO E CONCLUSÃO GERAL
109
1. Criopreservação do sêmen de machos-XX de truta arco-íris
A truta arco-íris é uma das espécies de salmonídeos mais cultivadas e
pesquisadas em todo do o mundo, devido às suas excelentes características, tanto
para a aqüicultura quanto para a pesca esportiva, além de se adaptar muito bem a
diversos sistemas aquáticos e apresentar alto grau de domesticação.
Por ser uma espécie de clima temperado, alguns aspectos devem ser
observados para a sua implantação em países onde o clima tropical é
predominante. Nas regiões montanhosas do Brasil, onde o relevo não favorece a
agricultura convencional e os rios apresentam condições hidrobiológicas
impróprias para o desenvolvimento da aqüicultura com espécies tropicais, o
cultivo da truta arco-íris tem se tornado uma alternativa bastante viável, tanto
para os pequenos como para os grandes produtores (Tabata & Portz, 2004).
Ao contrário de outras espécies, em que pouco se conhece sobre manejo
e tecnologia de produção, na truta arco-íris alguns padrões de cultivo já estão
bem estabelecidos e foram adaptados para as condições encontradas no Brasil, o
que favorece a disponibilidade de tecnologia para os produtores. Dentre essas
tecnologias disponíveis, podemos citar a criopreservação do sêmen, que foi o
alvo de nosso estudo e que será discutida nesse breve capítulo.
O objetivo deste trabalho foi aperfeiçoar as técnicas de criopreservação
do sêmen de machos-XX de truta arco-íris, tanto para os peixes portadores de
dutos espermáticos funcionais, ou seja, naqueles em que a coleta do sêmen pode
ser feita por pressão abdominal, quanto para aqueles que não apresentavam os
dutos espermáticos e o sêmen tem que ser coletado diretamente do testículo. No
presente estudo, foram utilizados 25 machos-XX, que apresentavam os dutos
espermáticos funcionais e 13 machos que não possuíam os dutos. As
características seminais desses dois grupos estão expressas na Tabela 1.
110
TABELA 1
:
Dados referentes ao número médio de animais, peso vivo, volume,
motilidade, concentração espermática, pH e índice gonadossomático (GSI).
Machos
XX
PV (kg)
Volume
(ml)
Motilidade
inicial (%)
1
Spz x
10
6
/mm
3
PH
2
GSI
Com
ductos
n=25
1,3 ± 0,5
5,0 ± 2,0
90 ± 8,0
13 ± 4,0
7,2 ± 0,2
Sem
ductos
n=13
1,5 ± 0,7
3,5 ± 0,7
74,6 ± 5,2
33,5 ± 2,9
7,0 ± 0,15
5,0 ± 1,0
Média
total
1,4 ± 0,6
4,3 ± 1,3
82,3 ± 6,6
23,2 ± 3,4
7,1 ± 0,17
5,0 ± 1,0
1
Sptz = espermatozóides;
2
GSI = Índice gonadossomático (GSI = peso da gônada (g) x 100/peso vivo (g)).
Vários diluidores foram testados no processo de criopreservação do
sêmen (capítulos 2 e 3), porém, os que obtiveram melhores resultados, tanto para
o sêmen coletado por pressão abdominal (peixes com dutos espermáticos), como
para o sêmen intratesticular (peixes sem dutos espermáticos), foram a glicose
5,4% e o NaCl 0,9%, acrescidos de 10% de gema de ovo.
O acréscimo de gema de ovo foi crucial para a manutenção da
motilidade espermática após o descongelamento, pois ela está relacionada com a
resistência da membrana plasmática aos danos causados pela baixa temperatura
(Leung, 1991). Em Salmonídeos, esse agente estabilizador de membrana é
essencial para manter a viabilidade dos espermatozóides após o processo de
congelamento e descongelamento (Baynes & Scott, 1987; Lahnsteiner et al.,
1996a).
A taxa de diluição de 1:3 (sêmen: criosolução) foi a que proporcionou
maior motilidade espermática pós-descongelamento para o sêmen obtido por
massagem abdominal dos peixes com dutos. Quando esta mesma diluição foi
utilizada para o sêmen intratesticular, as taxas de motilidade espermática caíram
111
consideravelmente, possivelmente porque a concentração do sêmen
intratesticular é bem maior quando comparada ao sêmen coletado por pressão
abdominal (Lahnsteiner et al., 1993). As taxas de diluição utilizadas para a
criopreservação de sêmen de peixes têm variado de 1:1 a 1:10 (v/v). Para
salmonídeos, a diluição recomendada para a criopreservação do sêmen varia de
1:1 a 1:3 (Babiak et al., 1995; Legendre & Billard 1980). A concentração
espermática também apresenta grande diferença entre as diferentes espécies de
peixes (Stein, 1980) e a relação ótima para a diluição do sêmen é espécie-
específica (Lahnsteiner et al., 1996b).
Com relação aos crioprotetores, o DMSO proporcionou melhores
resultados de motilidade após o descongelamento e foi adotado como
crioprotetor padrão, devido aos bons resultados encontrados. O DMSO tem sido
usado como crioprotetor de eleição por vários autores (Cabrita et al., 2001a
e
2001b; Fogli da Silveira et al., 1994; Robles et al., 2003; Silveira et al., 2002 e
2006), na criopreservação do sêmen de truta arco-íris, proporcionando bons
resultados de motilidade espermática e fertilização após o descongelamento.
Diferentes volumes de palhetas e temperaturas de descongelamento do
sêmen também foram testadas. De maneira geral, a palheta de 0,5 ml
proporcionou maiores taxas de motilidade espermática pós-descongelamento,
porém, sua capacidade de fertilização se restringe a um número muito pequeno
de ovos, o que torna cada vez mais freqüentes estudos com palhetas de maior
volume, objetivando a fertilização em grande escala. Palhetas de 0,5 ml já foram
utilizadas por vários autores (Cabrita et al., 2001b; Lahnsteiner et al., 1995;
Silveira et al., 2002 e 2006, entre outros) na criopreservação do sêmen de truta
arco-íris. A temperatura de descongelamento que obteve melhor resposta de
motilidade espermática pós-descongelamento, para as palhetas de 0,5 ml, foi a
de 70ºC, por 3 segundos. Fogli da Silveira et al. (1994) usaram, pela primeira
vez, a temperatura de descongelamento de 70ºC, por 3 segundos, que foi
112
posteriormente adotada por Silveira et al. (2002, 2006), obtendo excelentes
resultados de fertilização para o sêmen criopreservado. A velocidade de
congelamento das células (rápida ou lenta) e o volume das palhetas que serão
utilizadas devem ser levados em conta para selecionar a temperatura ideal de
descongelamento e o tempo de exposição das palhetas a essa temperatura.
Os melhores resultados de motilidade espermática e fertilização, obtidos
a partir da análise dos diversos fatores estudados (diluidores, crioprotetores,
taxas de diluição, volume de palheta, taxa de descongelamento, etc.), estão
expressos na Tabela 2,
TABELA 2:
Melhores resultados de motilidade espermática e taxa de ovos
olhados para machos-XX de truta arco-íris com e sem ductos espermáticos.
1
Vol: volume das palhetas
2
Molil: motilidade espermática pós-descongelamento
Os dutos testiculares possuem um papel importante no armazenamento e
na nutrição dos espermatozóides, na síntese de esteróides, na composição iônica
do fluido seminal, na atividade auto e heterofagocítica e na formação do plasma
seminal (Lahnsteiner et al., 1993). Conseqüentemente, o sêmen obtido
Machos
XX
Crio-
solução
Diluição
(v/v)
1
Vol
(ml)
Descon-
gelamento
(ºC)
Incubação
(h/ºC)
2
Motil
(%)
Ovos
olhados
(%)
Com
ductos
Glicose
+
Gema
+
DMSO
1:3
0,5
70ºC/3s
------------
65
45
Sem
ductos
Glicose
+
Gema
+
DMSO
1:3
0,5
70ºC/3s
1h:30min/
4ºC
60
113
diretamente do testículo não está completamente maduro, sua densidade é
elevada e, provavelmente, diversas células ainda se apresentam imaturas. Na
tentativa de reverter essa situação, o efeito da incubação do sêmen intratesticular
em plasma seminal e diferentes diluições do sêmen em plasma foram avaliados,
na tentativa aumentar a taxa de motilidade espermática pós-descongelamento.
Maiores taxas de motilidade espermática foram obtidas quando o sêmen
foi diluído em plasma seminal (1:6 ou 1:8), com relação ao sêmen não diluído
(1:0), porém, os valores de motilidade espermática encontrados (1:6 = 18% e 1:8
= 15%) não foram satisfatórios. Entretanto, as mesmas amostras de sêmen
diluídas 1:6 e 1:8, quando foram incubadas por 1h:30min, a 4°C,
proporcionaram taxas de motilidade espermática pós-descongelamento de 60% e
50%, respectivamente. Estes resultados mostram que a diluição do sêmen
intratesticular contribuiu para o aumento da motilidade espermática quando
comparado ao sêmen não diluído, porém, para que se alcancem resultados
satisfatórios de motilidade espermática pós-descongelamento, é necessária a
incubação do sêmen em meio específico, na tentativa de promover a maturação
das células espermáticas.
O teste de fertilização para o sêmen criopreservado foi feito apenas com
o sêmen coletado por massagem abdominal dos peixes que apresentavam os
dutos espermáticos. Foram testadas diferentes proporções de espermatozóide por
ovo para o sêmen criopreservado. Proporções acima de 30x10
6
espermatozóides
por ovo foram suficientes para alcançar taxas de ovos olhados de 42%, em
média. O protocolo de criopreservação do sêmen utilizado para avaliar a taxa de
fertilização foi o que obteve maiores taxas de motilidade espermática nos
experimentos anteriores (glicose-gema-DMSO, diluído 1:3, envasado em
palhetas de 0,5 ml e descongelado a 70°C por 3s). Sabe-se que o processo de
criopreservação causa diversos danos às células espermáticas, resultando em
uma diminuição significativa da motilidade espermática e do número de
114
espermatozóides viáveis, o que afeta diretamente o número de espermatozóide
que, realmente, estarão aptos a fertilizar os ovos após o descongelamento do
sêmen. As proporções de espermatozóide por ovo que são relatadas na literatura,
geralmente, não levam em conta o número de espermatozóides vivos após o
processo de criopreservação, o que, talvez, explique a grande diferença entre os
protocolos utilizados. O teste de fertilização não foi realizado para o sêmen
intratesticular, pois, a definição de um protocolo eficiente de criopreservação do
sêmen, a partir da avaliação da motilidade espermática pós-descongelamento, só
foi alcançada no final do período reprodutivo, quando as fêmeas já haviam
encerrado seu período reprodutivo.
Conclui-se, que o sêmen de machos-XX de truta arco-íres pode ser
efetivamente criopreservado em meio contendo glicose, gema e DMSO, em
palhetas de 0,5 ml e descongelado a 70ºC/3s. O sêmen coletado por meio de
massagem abdominal e criopreservado de acordo com o protocolo descrito
permite uma taxa de 40% de ovos olhados, quando a proporção de 30x10
6
espermatozóide por ovo é utilizada. O sêmen intratesticular pode ser
criopreservado utilizando-se o mesmo protocolo descrito acima, desde que seja
previamente diluído 1:6 (v/v) em plasma seminal e incubado por 1h:30min, à
temperatura de 4°C.
115
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117
ANEXOS
ANEXO A
FIGURA 1A Temperatura máxima, mínima e média da água, para os
meses de julho (A) e agosto (B) de 2005.................................119
FIGURA 2A Temperatura máxima, mínima e média da água, para os
meses de julho (C) e agosto (D) de 2006.................................120
ANEXO B CAPÍTULO 2
TABELA 1B Análise de variância do efeito dos diluidores sobre a
motilidade espermática (experimento 1 A)..............................121
TABELA 2B Análise de variância do efeito dos diluidores sobre a
motilidade espermática (experimento 1 B) ..............................121
TABELA 3B Análise de variância do efeito da gema de ovo sobre a
motilidade espermática (experimento 1 C) ..............................121
TABELA 4B Análise de variância do efeito dos crioprotetores sobre a
motilidade espermática (experimento 2 A)..............................122
TABELA 5B Análise de variância do efeito dos crioprotetores e da taxa de
diluição sobre a motilidade espermática (experimento 2 B) ....122
TABELA 6B: Análise de variância do efeito do volume de palheta sobre a
motilidade espermática (experimento 3 A)..............................122
TABELA 7B Análise de variância do efeito do volume de palheta sobre a
motilidade espermática (experimento 3 B) ..............................123
TABELA 8B Análise de variância do efeito da temperatura de
descongelamento sobre a motilidade espermática
(experimento 4)........................................................................123
118
TABELA 9B Análise de variância do efeito do número de
espermatozóides por ovo sobre a taxa de ovos olhados
(experimento 5)........................................................................123
ANEXO C CAPÍTULO 3
TABELA 1C: Análise de variância do efeito de diluidores e temperaturas
de descongelamento sobre a motilidade espermática do
sêmen intratesticular (experimento 1)......................................124
TABELA 2C Análise de variância do efeito da diluição e da incubação do
sêmen intratesticular em plasma seminal sobre a motilidade
espermática (experimento 2)....................................................124
TABELA 3C Análise de variância do efeito da diluição do sêmen
intratesticular em plasma seminal e do diluidor sobre a
motilidade espermática (experimento 3)..................................124
119
FIGURA 1A.
Temperatura máxima, mínima e média da água, para os meses
de julho (
A
) e agosto (
B
) de 2005.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
Data
Temperatura
maxima
minima
média
0
2
4
6
8
10
12
14
16
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
Data
Temperatura
maxima
minima
média
A
B
120
FIGURA 2A.
Temperatura máxima, mínima e média da água, para os meses
de julho (
C
) e agosto (
D
) de 2005.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
Data
Temperatura
maxima
minima
média
0
2
4
6
8
10
12
14
16
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
Temperatura
maxima
minima
média
C
D
121
TABELA 1B.
Análise de variância do efeito dos diluidores sobre a motilidade
espermática (experimento 1 A).
TABELA 2B.
Análise de variância do efeito dos diluidores sobre a motilidade
espermática (experimento 1 B).
FV
GL
SQ
QM
Fc
Pr>Fc
DILUIDOR
erro
2
12
3880.000000
480.000000
1940.000000
40.000000
48.500
0.0000
Total corrig: 14
4360.000000
CV (%) = 14.37
Média geral:44.0000000 Número de observações: 15
TABELA 3B.
Análise de variância do efeito da gema de ovo sobre a motilidade
espermática (experimento 1 C)
FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
BLOCO
DILUIDOR
erro
4
1
24
2421.666667
11213.333333
2345.000000
605.416667
11213.333333
97.708333
6.196 0.0014
114.763 0.0000
Total corrig:29
15980.000000
CV (%) = 44.93
Média geral: 22.0000000 Número de observações: 30
FV
GL
SQ
QM
Fc
Pr>Fc
GEMA
BLOCO
erro
1
4
24
9720.000000
313.333333
913.333333
9720.0000
78.333333
38.055556
255.416
2.058
0.0000
0.1180
Total corrig: 29
10946.666667
CV (%) = 17.79
Média geral: 34.6666667 Número de observações: 30
122
TABELA 4B.
Análise de variância do efeito dos crioprotetores sobre a
motilidade espermática (experimento 2 A).
TABELA 5B.
Análise de variância do efeito dos crioprotetores e da taxa de
diluição sobre a motilidade espermática (experimento 2 B).
TABELA 6B
. Análise de variância do efeito do volume de palheta sobre a
motilidade espermática (experimento 3 A).
FV
GL
SQ
QM
Fc
Pr>Fc
BLOCO
CRIOPROTETOR
erro
4
3
52
2585.833333
11534.583333
6384.166667
646.45833
3844.8611
122.77243
5.266
31.317
0.0012
0.0000
Total corrig: 59
20504.583333
CV (%) = 46.33
Média geral: 23.9166667 Número de observações: 60
FV
GL
SQ
QM
Fc
Pr>Fc
BLOCO
CRIO
DILUIÇAO
CRIO*DIL
erro
4
1
1
1
52
376.666667
13801.66666
5801.666667
601.666667
2503.333333
94.166667
13801.666667
5801.666667
601.666667
48.141026
1.956
286.692
120.514
12.498
0.1150
0.0000
0.0000
0.0009
Total corrig:
59
23085.00000
CV (%) = 20.11
Média geral: 34.5000000 Número de observações: 60
FV
GL
SQ
QM
Fc
Pr>Fc
BLOCO
VOL_PALH
erro
4
1
24
1986.666667
2430.000000
2053.333333
496.666667
2430.000000
85.555556
5.805
28.403
0.0020
0.0000
Total corrig: 29
6470.000000
CV (%) = 22.56
Média geral: 41.0000000 Número de observações: 30
123
TABELA 7B
. Análise de variância do efeito do volume de palheta sobre a
motilidade espermática (experimento 3 B).
TABELA 8B
. Análise de variância do efeito da temperatura de
descongelamento sobre a motilidade espermática (experimento 4).
FV
GL
SQ
QM
Fc
Pr>Fc
BLOCO
TEMP_DESC
erro
4
2
38
1257.777778
1831.111111
3568.888889
314.444444
915.555556
93.918129
3.348
9.748
0.0192
0.0004
Total corrig:44
6657.777778
CV (%) = 18.02
Média geral: 53.7777778 Número de observações: 45
TABELA 9B
. Análise de variância do efeito do número de espermatozóides por
ovo sobre a taxa de ovos olhados (experimento 5).
FV
GL
SQ
QM
Fc
Pr>Fc
BLOCO
SPZ:OVO
erro
2
3
18
26.083333
797.458333
972.416667
13.041667
265.819444
54.023148
0.241
4.920
0.7880
0.0114
Total corrig: 23
1795.958333
CV (%) = 18.75
Média geral: 39.2083333 Número de observações: 24
FV
GL
SQ
QM
Fc
Pr>Fc
BLOCO
PALHETA
erro
4
1
44
300.000000
2178.000000
972.000000
75.000000
2178.000000
22.090909
3.395
98.593
0.0167
0.0000
Total corrig:49
3450.000000
CV (%) = 8.87
Média geral: 53.0000000 Número de observações: 50
124
TABELA 1C
. Análise de variância do efeito de diluidores e temperaturas de
descongelamento sobre a motilidade espermática do sêmen intratesticular
(experimento 1).
FV
GL
SQ
QM
Fc
Pr>Fc
BLOCO
DILUIDOR
DESCONGTO
DIL*DESC
erro
2
2
1
2
46
62.037037
62.037037
0.462963
6.481481
215.740741
31.018519
31.018519
0.462963
3.240741
4.690016
6.614
6.614
0.099
0.691
0.0030
0.0030
0.7548
0.5062
Total corrig: 53
346.759259
CV (%) = 34.91
Média geral: 6.2037037 Número de observações: 54
TABELA 2C
. Análise de variância do efeito da diluição e da incubação do
sêmen intratesticular em plasma seminal sobre a motilidade espermática
(experimento 2).
FV
GL
SQ
QM
F
Pr>Fc
DILUIÇÃO
INCUBAÇÃO
DIL*INCUB
erro
2
1
2
24
7361.666667
4200.833333
3361.666667
800.000000
3680.833333
4200.833333
1680.833333
33.333333
110.425
126.025
50.425
0.0000
0.0000
0.0000
Total corrig:29
15724.16666
CV (%) = 23.25
Média geral: 24.8333333 Número de observações: 30
TABELA 3C
. Análise de variância do efeito da diluição do sêmen
intratesticular em plasma seminal e do diluidor sobre a motilidade espermática
(experimento 3).
FV
GL
SQ
QM
Fc
Pr>Fc
DILUIDOR
DILUIÇÃO
DIL*DILUIÇÃO
erro
1
2
2
24
653.333333
86.666667
326.666667
480.000000
653.333333
43.333333
163.333333
20.000000
32.667
2.167
8.167
0.0000
0.1364
0.0020
Total corrig: 29
1546.66666
CV (%) = 10.01
Média geral: 44.6666667 Número de observações: 30
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