( PDF ) Anticorpos neutralizantes contra o vírus da cinosmose e parainfluenza caninosem cães e felinos silvestres em cativeiro

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

ANTICORPOS NEUTRALIZANTES CONTRA OS VÍRUS DA CINOMOSE E

PARAINFLUENZA CANINOS EM CÃES E FELINOS SILVESTRES EM

CATIVEIRO

Tamahine Larronda Schmidt Hartmann

Porto Alegre

2006

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

ANTICORPOS NEUTRALIZANTES CONTRA OS VÍRUS DA CINOMOSE E

PARAINFLUENZA CANINOS EM CÃES E FELINOS SILVESTRES EM

CATIVEIRO

Tamahine Larronda Schmidt Hartmann*

Dissertação apresentada como requisito

para obtenção do grau de Mestre em

Ciências Veterinárias na área de Medicina

Preventiva Veterinária – VirologiaVeterinária

Orientador: Prof. Dr. Paulo Michel Roehe

Co-orientador: Profa. Dra. Ana Cláudia Franco

Porto Alegre

2006

* Médica Veterinária, ULBRA 2000/1

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AVALIAÇÃO DE ANTICORPOS NEUTRALIZANTES CONTRA OS VÍRUS

DA CINOMOSE E PARAINFLUENZA CANINOS EM CÃES E FELINOS

SILVESTRES EM CATIVEIRO

APROVADO POR:

Prof. Dr. PAULO MICHEL ROEHE

Orientador e Presidente da Comissão

Prof. Dr. AMAURI SIMONETTI

Membro da Banca.

Prof. Dr. CLÁUDIO WAGECK CANAL

Membro da Banca.

Profa. Dra. VIRGÍNIA MINGHELLI SCHMITT

Membro da Banca.

AGRADECIMENTOS

À minha família: meus pais João Roberto e Joyce, meu irmão Christian; sogros

Círio e Ivany, vô Ruy e tia Zoraide (sei que torcem por mim de onde estão); vó Suely,

tios (Elida, Paulo, Jeane), cunhados e cunhadas (Priscilla, Stella Maris, Augusto,

Alexandre e Fernanda) e sobrinhos (Júlia, Leonardo, Catharina, Isadora, Theodoro). Ao

meu amado Cícero, muito obrigado por sempre me apoiar em tudo que faço, por estar

ao meu lado em todos os momentos com muito carinho e dedicação. Obrigada por todo

apoio, amor, carinho, amizade e compreensão, vocês todos são muito especiais e um

grande incentivo para mim, amo vocês.

Ao Lucki e a minha grande amiga Fernanda (Fefa), obrigada pelo apoio moral.

Ao meu orientador Paulo Michel Roehe, pela oportunidade, ensinamentos,

confiança, paciência, amizade, exemplo de entusiasmo e dedicação à pesquisa. À minha

co-orientadora Ana Cláudia e ao Frans, obrigada pela amizade, ensinamentos e

disposição em ajudar. Todos vocês são exemplos a serem seguidos.

A todos os meus amigos e colegas: Paulinho e Alessandra, Helena (Dada),

Fernando Spilki, Sílvia, Anna Paula, Cíntia, Diógenes e Thaís. Muito obrigado por

estarem presentes nesta fase de minha vida, tornando-a muito mais alegre e

principalmente pelo aprendizado, opiniões, apoio e amizade. Cada um de vocês ajudou-

me do seu jeito, em momentos diferentes e espero que no futuro possamos continuar nos

encontrando.

Agradeço ao Programa de Pós-Graduação da Faculdade de Veterinária da

UFRGS e todos os professores, pelos ensinamentos e oportunidade.

A FAPERGS e CNPq, por terem financiado este projeto.

A direção e todos os integrantes da FEPAGRO Saúde Animal - Instituto de

Pesquisas Veterinárias Desidério Finamor (IPVDF), em especial ao Eng. Agr. Eduardo

Schmidt.

A todos vocês que me ajudaram em vários momentos e foram muito importantes

durante este trabalho.

A Deus, por ter colocado vocês em meu caminho.

ANTICORPOS NEUTRALIZANTES CONTRA OS VÍRUS DA CINOMOSE E

PARAINFLUENZA CANINOS EM CÃES E FELINOS SILVESTRES EM

CATIVEIRO

RESUMO

O vírus da cinomose canina (CDV) e o vírus parainfluenza canino (CPIV)

afetam uma ampla variedade de hospedeiros e encontram-se distribuídos mundialmente.

O CDV é considerado um dos mais importantes agentes infecciosos dentro das

populações caninas. Este vírus é o agente causal da cinomose, uma doença

potencialmente letal em membros das famílias Canidae, Mustelidae e Procionidae,

sendo recentemente detectado como causa de morbidade e mortalidade em carnívoros

aquáticos e grandes felinos. O CPIV, por sua vez, é altamente contagioso entre cães,

podendo infectar roedores e gatos em infecções experimentais. Geralmente, o CPIV

produz uma traqueobronquite aguda auto-limitante, porém pode atuar sinergicamente

com outros agentes infecciosos, como o CDV, causando sinais clínicos mais graves.

Como em nosso meio são escassas as informações sobre estes vírus, o presente estudo

visou aprofundar os conhecimentos sobre a prevalência de CDV e CPIV em cães e

felinos silvestres mantidos em cativeiro. Para tanto, soros destes animais foram testados

em busca de anticorpos neutralizantes contra amostras padrão do CDV (Rockborn e

Snyder Hill) e do CPIV (V660). Inicialmente, foram testados soros de 173 cães de rua

mantidos em canis municipais em Novo Hamburgo e Porto Alegre, RS. A prevalência

de anticorpos neutralizantes anti-CDV frente às amostras de vírus da cinomose

Rockborn e Snyder Hill, foi de 9,3 % e 4,1 %, respectivamente. Somente dois cães

apresentaram títulos de anticorpos considerados protetores contra CDV Rockborn (igual

ou maior que 100) e nenhum soro apresentou título de anticorpos neutralizantes

considerado protetor para a amostra Snyder Hill (igual ou maior que 100). Contra a

amostra de parainfluenza canino V660, a prevalência de anticorpos neutralizantes

encontrada foi de 51,4 %. Conclui-se, portanto, que a população de cães de rua

amostrada apresenta poucos indícios de contato prévio com CDV, sugerindo grande

susceptibilidade à cinomose. Por outro lado, o CPIV parece circular amplamente nesta

população. Na segunda parte do presente estudo, como no Brasil não existem relatos

sobre CDV e CPIV em felinos silvestres, buscou-se verificar a possibilidade da

ocorrência dessas infecções em felinos silvestres brasileiros. Para tanto, foram testados

soros de 84 felinos silvestres de seis diferentes espécies nativas do Brasil (Leopardus

tigrinus, Puma concolor, Leopardus wiedii, Herpailurus yaguarondi, Panthera onca),

todos mantidos em cativeiro em criatórios de distintas regiões do País. Todos os felinos

amostrados apresentaram-se soronegativos frente às amostras de CDV e CPIV

utilizadas. Estes resultados indicam que CDV e CPIV parecem não circular nas

populações de felinos silvestres amostradas.

Palavras-chave: vírus da cinomose; vírus parainfluenza canino; cães; felinos silvestres;

soroneutralização; prevalência.

NEUTRALIZING ANTIBODIES TO DISTEMPER AND PARAINFLUENZA

VIRUSES IN DOGS AND CAPTIVE WILD FELIDS.

ABSTRACT

Canine distemper virus (CDV) and canine parainfluenza virus (CPIV) infect a

great variety of hosts ranges and are distributed worldwide. CDV is one of the most

important infectious agents in dogs. This virus may cause potentially lethal disease

among members of the Canidae, Mustelidae and Procionidae families. It has also

caused diseases of significant morbidity and mortality in aquatic carnivores and large

felids. CPIV, on its turn, is highly contagious among dogs, whilst rodents and cats are

susceptible to experimental infections. CPIV is usually associated with an acute self-

limiting tracheobronchitis. However, it can act sinergistically with other infectious

agents, such as CDV, and cause clinical signs of variable severity. As information on

CDV and CPIV infections in our millieu are scarce, this study was carried out aiming to

increase knowledge on the prevalence of CDV and CPIV in stray dogs as well as in

captive Brazilian wild felids. In order to have an estimate on such prevalences, sera

from these animals were tested for neutralizing antibodies to CDV strains Rockborn and

Snyder Hill, and to CPIV strain V660. Initially, 173 sera from stray dogs kept in

kennels from the municipalities of Novo Hamburgo and Porto Alegre, RS, were

examined. The prevalences of neutralizing antibodies to CDV strains Rockborn and

Snyder Hill were 9.3 % and 4.1 %, respectively. Only two dogs had antibody levels

which could be correlated to protection (that is, titre ≥ 100) to CDV Rockborn whereas

no sera presented antibody titres high enough to be considered protective to CDV strain

Snyder Hill (that is, titre ≥ 100). Regarding CPIV, the prevalence of anti-V660

neutralizing antibodies was 51.4 %. It can be concluded that the stray dog populations

under study shows few serological evidence of previous contact with CDV and seem

largely susceptible to CDV infections. On the other hand, CPIV seems to circulate

widely in the examined population. In the second part of this study, as there are no

reports on CDV and CPIV infections in wild felids in Brazil, it was aimed to determine

whether there would be any evidence of such infections among some of such species.

For that, 84 sera from wild felids of six different Brazilian native species (Leopardus

tigrinus, Puma concolor, Leopardus wiedii, Herpailurus yaguarondi, Panthera onca),

all kept in captivity in different regions of the country, were tested for neutralizing

antibodies to both CDV and CPIV. All wild felid sera tested were negative for

antibodies to the two strains of CDV as well as to CPIV. These results indicate that

CDV and CPIV do not seem to circulate among the wild felid populations examined.

Key words: canine distemper virus; canine parainfluenza virus; dogs; wild felids; sero

neutralization; prevalence.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Rerpresentação esquemática de um membro da família 13

Paramyxoviridae.

Figura 2 - Esquema da estratégia de replicação viral dos membros da 15

família Paramyxoviridae.

Figura 3 - Foto de um paramixovírus ao microscópio eletrônico. 24

SUMÁRIO

RESUMO 5

LISTA DE FIGURAS 9

1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 12

1.1 Vírus da Cinomose 12

1.1.1 Introdução 12

1.1.2 Descrição do agente 12

1.1.2.1 Multiplicação Viral 13

1.1.3 Epidemiologia 15

1.1.4 Transmissão 16

1.1.5 Patogenia 16

1.1.6 Manifestações clínicas de infecções por CDV 17

1.1.7 Imunidade em infecções por CDV 18

1.1.8 Diagnóstico 19

1.1.8.1 Isolamento Viral 21

1.1.9 Prevenção 21

1.2 Vírus Parainfluenza Canino 23

1.2.1 Introdução 23

1.2.2 Descrição do agente 23

1.2.2.1 Multiplicação Viral 25

1.2.3 Epidemiologia 25

1.2.4 Transmissão 25

1.2.5 Patogenia 26

1.2.6 Manifestações clínicas de infecções por CPIV 26

1.2.7 Imunidade em infecções por CPIV 27

1.2.8 Diagnóstico 28

1.2.8.1. Isolamento Viral 28

1.2.9 Prevenção 29

2. OBJETIVOS 30

Capítulo 1- Anticorpos neutralizantes contra os vírus da cinomose e 31

parainfluenza em cães.

Capítulo 2- Ausência de anticorpos neutralizantes contra os vírus da 48

cinomose e parainfluenza canino em felinos silvestres em cativeiro.

3. DISCUSSÃO E CONCLUSÕES GERAIS 60

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 64

1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1 Vírus da Cinomose

1.1.1 Introdução

O vírus da cinomose canina (“canine distemper virus”, ou CDV), causa uma

doença infecciosa sistêmica contagiosa aguda, subaguda ou crônica que pode causar

significativa mortalidade em cães e muitos outros carnívoros. A cinomose é a moléstia

viral mais prevalente em cães. Em todo o mundo, apenas a raiva tem percentagem de

fatalidades em cães mais elevada do que a cinomose (SWANGO, 1997). Além dos cães,

o CDV pode infectar uma ampla variedade de hospedeiros, incluindo muitas espécies de

felinos silvestres ameaçadas de extinção (BLYTHE et al., 1983; TIMONEY et

al..,1992; APPEL et al., 1994; SUMMERS et al., 1994; MAMAEV et al.,1995;

LEDNICKY et al., 2004).

1.1.2 Descrição do agente

O CDV pertence ao gênero Morbillivirus da família Paramyxoviridae

(POSTOM e ENGLAND, 1992; LEDNICKY et al., 2004). O CDV, como os demais

membros da família Paramyxoviridae, é um vírus pleomórfico, envelopado, com

simetria helicoidal e fita simples de RNA com polaridade negativa e diâmetro de 150 a

300 nm (APPEL e SUMMERS, 1995; BÜCHEN-OSMOND, 2003; LEDNICKY et al.,

2004). O nucleocapsídeo contém três das seis proteínas virais estruturais denominadas

NP, P e L (APPEL, 1987; LEDNICKY et al., 2004). Estas são circundadas por um

envelope lipoprotéico com uma proteína de membrana denominada proteína matriz (M)

no lado interno do vírion e duas glicoproteínas denominadas hemaglutinina e proteína

de fusão (H e F) no lado externo (SHAPSHAK et al., 1982; RIMA, 1983). A proteína M

estabiliza o envelope. A proteína H é responsável pela ligação com o receptor celular. A

proteína F é responsável pela fusão viral com a célula hospedeira (ANDREWES et al.,

1989; BÜCHEN-OSMOND, 2003). A nucleoproteína (NP) e hemaglutinina (H)

induzem resposta imune humoral específica e celular contra CDV (SIXT et al, 1998;

MESSLING et al. 2001) (Figura 1). Estes agentes virais são relativamente lábeis e sua

infectividade é destruída pelo calor, dessecamento, detergentes, solventes de lipídios e

desinfetantes (GREENE, 1984; BÜCHEN-OSMOND, 2003).

Figura 1: Rerpresentação esquemática de um membro da família

Paramyxoviridae.

1.1.2.1 Multiplicação Viral

Os mecanismos de replicação dos membros da família Paramyxoviridae são

similares (ANDREWES et al., 1989; BÜCHEN-OSMOND, 2003). A adsorção viral nas

células hospedeiras resulta da combinação da glicoproteína H do envelope do vírion

com os receptores da membrana celular, seguida por fusão deste envelope com a

membrana celular (BÜCHEN-OSMOND, 2003; MESSLING et al. 2001). A fusão

celular e a infectividade viral são acentuadas por clivagem proteolítica da proteína F e a

inibição destas atividades é realizada por inibidores enzimáticos. A fusão dos vírions na

membrana celular resulta na liberação do nucleocapsídeo dentro do citoplasma onde é

feita a síntese macromolecular viral. O nucleocapsídeo atua como um complexo

transcripcional contendo o genoma viral e as proteínas NP, P e L, com a capacidade

para sintetizar, metilar, restringir e poliadenilar o RNAm viral. A transcrição do RNAm

e a síntese de proteínas virais são seguidas por replicação do RNA viral contendo cópias

complementares do genoma viral. Este processo é dependente da síntese de proteínas e é

Glico

roteína F

Glico

roteína H

Proteína L

Proteína M

Proteína NP

Genoma RNA

Proteína P

catalisado, em parte, por uma replicase recém sintetizada. A fita de RNA de sentido

positivo obtida serve como modelo para a progênie de genomas que são

secundariamente transcritos e replicados, amplificando os componentes virais no

citoplasma celular (ANDREWES et al., 1989; BÜCHEN-OSMOND, 2003). As

glicoproteínas H e F são sintetizadas no retículo endoplasmático rugoso sendo, então,

associadas ao retículo endoplasmático liso de onde migram para a membrana

plasmática, onde ocorre a maturação viral. A proteína NP que é maior proteína do

nucleocapsídeo, parece ser sintetizada em polissomos livres e transportada direto para a

membrana plasmática. A proteína M é incorporada na membrana plasmática

rapidamente após sua síntese. Esta proteína tem um importante papel na montagem viral

por interagir com as glicoproteínas do envelope e com a proteína N do nucleocapsídeo.

Estas interações formam ligações entre os componentes virais internos e externos em

áreas localizadas da membrana celular, onde os vírions amadurecem e são liberados por

brotamento (ANDREWES et al., 1989; BÜCHEN-OSMOND, 2003) (Figura 2).

O CDV replica melhor em linfócitos e macrófagos dos animais infectados

(FRIENLANDER et al., 1985). Pode replicar-se, também, em culturas de células de

cérebro e fibroblastos de cães e furões. O isolamento em células de linhagem pode ser

alcançado pelo uso de suspensões de células de animais infectados de forma aguda

(APPEL, 1987). Uma vez adaptado, o CDV replica-se em um grande número de células

de linhagem de diferentes espécies. As células de linhagem renais caninas (MDCK) e

células VERO têm sido mais comumente usadas (APPEL e GILLESPIE, 1972;

SUMMERS et al, 1984). A formação de células gigantes multinucleadas (sincícios) é

freqüentemente encontrada em infecções por CDV. Formas arredondadas e estreladas

podem ser encontradas também. Corpúsculos de inclusão intracitoplasmáticos e

intranucleares também são achados comuns. O efeito citopático (ECP) pode aparecer de

um a dez dias após a infecção celular (FRIENLANDER et al., 1985).

Figura 2: Esquema da estratégia de replicação viral dos membros da família

Paramyxoviridae.

1.1.3 Epidemiologia

O CDV está distribuído mundialmente, sendo um dos mais importantes agentes

infecciosos das populações caninas, jovens e adultos, tanto não imunizadas como

imunizadas (DUNGWOTH,1993; BLIXENKRONE-MØLLER et al.,1993; KAI et

al.,1993; ALEX & DHANAPALAN, 1994; JOHSON et al., 1995; GEMMA et al.,

1996; GOUVEIA et al., 1996; EK-KOMMONEN et al., 1997; FRISK et al. 1999).

Conhecido por causar uma doença potencialmente letal em membros das famílias

Canidae, Mustelidae e Procionidae, o CDV foi recentemente detectado como causa de

morbilidade e mortalidade em grandes felinos (Felidae), carnívoros aquáticos e vários

outros animais (BLYTHE et al., 1983; GOULD & FENNER, 1983; TIMONEY et

al.,,1992; APPEL et al., 1994; SUMMERS et al., 1994; MAMAEV et al., 1995;

LEDNICKY et al., 2004). No Brasil, existem poucas informações disponíveis a respeito

da prevalência do CDV nas populações caninas (GOUVEIA et al., 1987; HEADLEY e

GRAÇA, 2000). Em um estudo realizado em Santa Maria, RS, foram detectados

anticorpos específicos contra CDV em 17,4% da população canina amostrada, com

histórico de vacinação desconhecido (DEZENGRINI, 2005). Em outro estudo, realizado

5’ RNA (-)

3’

Trasnscrição

Primária

Trasnscrição

Secundária

RNAm

Tradu

ão

Proteínas

Virais

lica

ão

Replicação

3’ Intermediária (+)

5’

5’ Vírus

RNA (-)

3’

Vírions

em Belo Horizonte, MG, foi encontrada uma soropositividade para cinomose de 6,1%

em cães vacinados (GOUVEIA et al., 1987).

1.1.4 Transmissão

O CDV é transmitido predominantemente por aerossóis ou por contato direto

entre animais. Não obstante, o vírus pode ser isolado da maioria dos tecidos, secreções e

até mesmo da urina de animais infectados (APPEL, 1987; APPEL e SUMMERS, 1995).

O vírus pode ser excretado por sessenta a noventa dias após a infecção, porém, períodos

curtos de liberação viral são mais típicos. O contato entre animais infectados mantém o

vírus na população. Embora a imunidade contra o vírus da cinomose seja prolongada,

ela não é necessariamente sólida ou duradoura. Cães que não recebem imunizações

periódicas podem perder sua imunidade e infectar-se após estresse, imunossupressão ou

contato com indivíduos doentes (GREENE e APPEL, 1998). A prevalência de cinomose

em cães cosmopolitas é maior entre três e seis meses de idade, o que está correlacionado

com a gradativa redução no nível de anticorpos maternos passivamente adquiridos com

ausência de imunidade ativa (ADELUS-NEVEU et al., 1991; GREENE e APPEL,

1998).

1.1.5 Patogenia

A infecção natural se dá usualmente através da inalação do vírus em aerossóis

(APPEL e SUMMERS, 1995). A replicação viral ocorre primeiramente em células do

tecido linfático do trato respiratório. O vírus multiplica-se em macrófagos teciduais,

sendo transportado para outros tecidos linfóides. Após replicação em macrófagos e

linfócitos T e B, o CDV é carreado por migração celular para todos os tecidos linfáticos

do animal, incluindo baço, timo, linfonodos, medula óssea, lâmina própria do estômago

e intestino e células de Küpfer do fígado (SUMMERS et al.1978; APPEL, 1987).

Aproximadamente sete dias pós-infecção (p.i.), o CDV pode ser isolado de todos os

tecidos linfáticos e dos linfócitos do sangue. Durante este período, a primeira elevação

de temperatura corporal é detectada, normalmente três a quatro dias p.i.. Ao mesmo

tempo, interferon (IFN) se torna detectável no soro (TSAI et al., 1982).

Entre sete a quatorze dias p.i. aproximadamente, dependendo da amostra viral,

inicia-se uma vigorosa resposta imune humoral e celular. Dependendo de fatores

individuais e de suas interações com outras variáveis relacionadas à amostra de vírus

infectante, o animal pode seguir caminhos distintos após a infecção: desenvolver uma

resposta imune vigorosa e recuperar-se, ou apresentar algum tipo de falha em sua

resposta imune que poderá resultar no desenvolvimento da doença aguda ou subaguda,

em morte ou ainda levar a uma infecção persistente (crônica). Os cães que se recuperam

são capazes de eliminar o vírus de seus tecidos. Em cães onde a recuperação não ocorre

prontamente, o vírus se espalha pela superfície epitelial dos tratos digestivo, respiratório

e urogenital, nas glândulas endócrinas e exócrinas e para o sistema nervoso central

(SNC; APPEL et al., 1982, 1984; TSAI et al., 1982). No SNC, o CDV aparece

inicialmente em linfócitos perivasculares oito a dez dias p.i., logo depois em

macrófagos meningeais e células ependimais e mais tarde em células gliais e neurônios.

Muitos cães com infecção disseminada sucumbem três a quatro semanas p.i. Como

mencionado acima, em alguns cães o início da resposta imune é tardio. Tais cães

sucumbem a uma doença subaguda, frequentemente cursando com encefalite, ou

apresentam uma infecção crônica persistente por três a quatro meses (APPEL et al.,

1982, 1984; TSAI et al., 1982). Com o início tardio da resposta imune em animais

infectados por CDV, o vírus gradualmente desaparece dos tecidos linfáticos e muitos

órgãos, exceto o SNC, olhos, algumas vezes os pulmões e certas áreas da pele

(almofadas plantares). IFN é liberado dentro do SNC destes cães enquanto se mantiver a

infecção viral persistente. Em contraste, não há IFN mensurável no soro

aproximadamente por duas semanas p.i. (TSAI et al., 1982; SUMMERS et al., 1983). A

patogênese da encefalomielite na cinomose está relacionada com a distribuição do vírus.

Encefalite aguda e morte são freqüentes quando há infecção da massa cinzenta, ao passo

que encefalite subaguda ou crônica ocorre quando a desmielinização predomina

(APPEL, 1987). Diferentes amostras de vírus têm afinidade distinta quanto à massa

branca ou cinzenta do cérebro (SUMMERS et al., 1984). O vírus infeccioso pode ser

isolado do cérebro infectado com CDV (APPEL, 1987; LEDNICKY et al. 2004).

1.1.6 Manifestações clínicas de infecções por CDV

A duração e severidade da doença clínica parecem depender da amostra viral,

condições ambientais, idade do animal, da resistência individual do hospedeiro e

infecções secundárias bacterianas e virais. Mais de 50 a 70% das infecções por CDV

são provavelmente subclínicas (GREENE e APPEL, 1998). O nível de mortalidade é

maior em cães jovens do que em cães adultos (KRAKOWKA e KOESTNER, 1976;

ADELUS-NEVEU et al., 1991). O CDV frequentemente contribui para o complexo das

doenças respiratórias caninas (“tosse dos canis”) (FORD e VADEM, 1998; DAMIÁN et

al., 2005).

O período de incubação da doença causada pelo CDV pode ser de uma a quatro

semanas ou mais. Nos casos de resposta imune tardia à infecção com CDV, sinais

neurológicos podem aparecer sem sintomas sistêmicos prévios (GREENE e APPEL,

1998). A primeira febre pode passar despercebida (três a seis dias p.i.). O segundo pico

febril ocorre vários dias mais tarde, normalmente associado a descargas nasais,

conjuntivite e anorexia. Leucopenia, especialmente linfopenia, e trombocitopenia estão

sempre presentes no início da infecção (AXTHELM e KRAKOWKA, 1987). Sinais

respiratórios e gastrointestinais podem aparecer, frequentemente acompanhados de

infecções secundárias. Pústulas na pele e queratoconjuntivite também são achados

freqüentes (CORNWELL et al., 1965; APPEL, 1987; GREENE e APPEL, 1998).

Alguns animais desenvolvem sinais nervosos, frequentemente associados à

infecção sistêmica ou subseqüente a esta. Os sinais nervosos podem ainda seguir uma

infecção sistêmica subclínica. Dependendo da amostra viral, os sinais podem estar

relacionados com a infecção da massa branca ou da massa cinzenta do cérebro

(SUMMERS et al., 1984). Incoordenações e convulsões ocorrem com maior freqüência.

Mioclonias, tremores, paresia, nistagmo, sinais meningeais de hiperestesia e rigidez

cervical, ou sinais neurológicos envolvendo o nervo óptico e lesões retinianas podem

ser notadas (GELATT et al. 1985; APPEL, 1987). Animais com sinais neurológicos

usualmente morrem. Porém, alguns se recuperam ocasionalmente apresentando sinais

residuais, como mioclonias persistentes em diferentes grupos musculares (APPEL,

1987). Hiperqueratose plantar e nasal e hipoplasia de esmalte dentário em cães em

crescimento podem ser observadas ocasionalmente (GREENE e APPEL, 1998).

1.1.7 Imunidade em infecções por CDV

A resposta imune em cães após a infecção com CDV depende da amostra viral e

do hospedeiro. Cães que se recuperam no início da infecção respondem com vigorosa

reação imune humoral e celular. Anticorpos neutralizantes aparecem dentro de dez a

vinte dias p.i. e atingem níveis máximos logo depois (KRAKOWKA et al., 1980;

GRIOT-WENK et al., 2001). A resposta citotóxica humoral dependente de

complemento segue um mesmo padrão (APPEL et al, 1987). Ambas IgG e IgM vírus-

específicas aparecem no início da infecção, sendo que a IgM vírus-específica só pode

ser mensurada entre cinco semanas a três meses p.i. A IgG vírus-específica parece ser

mais importante para a imunidade (WINTERS et al., 1984; APPEL et al., 1987;

GRIOT-WENK et al., 2001).

A resposta imune mediada por células, que é mensurada por células T

citotóxicas vírus-específicas circulantes, aparece em dez a quatorze dias p.i. e atinge o

máximo em quatorze a vinte dias p.i. Enquanto a resposta imune humoral persiste por

vários anos em cães recuperados, a resposta imune mediada por células é de curta

duração (APPEL et al. 1982; HIRAMA et al. 2002).

Cães que sucumbem à cinomose aguda entre duas a quatro semanas p.i.,

dependendo da amostra viral, têm pouco ou nenhum anticorpo neutralizante em seu soro

e a resposta imune mediada por células está ausente. Grandes variações na resposta

imune são observadas em cães com cinomose subaguda e cães que sobrevivem com

infecção persistente no SNC. Os cães que morrem da doença, normalmente, têm

formação tardia de anticorpos neutralizantes e da resposta imune celular

(KRAKOWKA, 1982; SIXT et al. 1998).

O fluído cerebroespinhal de cães que se recuperam precocemente é normalmente

livre de anticorpos contra CDV e IFN. Entretanto, cães que morrem de cinomose aguda

ou persistentemente infectados apresentam anticorpos neutralizantes e IFN no SNC.

Além disso, anticorpos neutralizantes séricos podem ser encontrados em alguns cães,

mas não todos, com infecção persistente por CDV (TSAI et al., 1982; APPEL et

al.,1984a; SIXT et al. 1998).

Imunidade de longa duração pode ser induzida com vacinas de CDV vivo

atenuado, enquanto que a imunidade induzida por vacinas com CDV inativado é de

curta duração (SHEK et al., 1980; NORRBY et al., 1986). O fluído cerebrospinal

permanece livre de anticorpos neutralizantes e IFN em cães vacinados (APPEL et al,

1987).

1.1.8 Diagnóstico

O diagnóstico de cinomose nas suas formas aguda ou subaguda deve levar em

consideração a história e os sinais clínicos. Uma combinação de febre, sinais

respiratórios, corrimentos oculonasais mucopurulentos, diarréia, hiperqueratose plantar

e sinais neurológicos é altamente indicativo de cinomose, especialmente em cães jovens

não vacinados ou cães adultos com histórico de vacinação inadequado. O exame

oftalmoscópico pode detectar lesões retinianas e podem estar presentes também,

irregularidades na superfície dos dentes, em decorrência da hipoplasia do esmalte.

Porém, os testes laboratoriais são importantes para diferenciar de outras moléstias que

também acometem os sistemas nervoso, digestivo e respiratório (GREENE, 1984).

A soroneutralização (SN) é um método diagnóstico simples que visa a detecção

de anticorpos neutralizantes no soro (GREENE e APPEL, 1998). A imunoperoxidase

(IPX) pode ser utilizada na demonstração de IgM anti-CDV, que pode ser um indício de

uma infecção recente por CDV, e de IgG. Em animais expostos a CDV de campo,

anticorpos IgM podem persistir por mais de três meses. Porém, após a vacinação, cães

têm IgM anti-CDV no soro por mais de três semanas, o que pode confundir o

diagnóstico. Além disso, os testes sorológicos podem não ser conclusivos no

diagnóstico da cinomose aguda, porque os cães infectados podem ainda não ter gerado

uma resposta imune detectável. De qualquer modo, são métodos importantes para a

determinação da prevalência de um vírus em uma população (WINTERS et al., 1984;

SOMA et al. 2001; JOZWIK et Al. 2004).

O diagnóstico definitivo pode ser firmado pela detecção do CDV nas células

epiteliais, por meio de exame de anticorpos fluorescentes, ou por isolamento do vírus

(WINTERS, 1984). As técnicas de imunofluorescência podem facilitar o diagnóstico

específico de CDV, contudo estes testes requerem equipamento especial, assim como o

ensaio imuno-enzimático (ELISA). O ELISA pode ser usado para detectar antígenos

virais ou anticorpos no soro e SNC de cães infectados (MESSLING et al., 1999). A

demonstração de antígenos de CDV através da técnica de imunohistoquímica é a mais

indicada para revelar corpúsculos de inclusão no tecido cerebral para confirmar

encefalites por cinomose, porém, são alterações pouco freqüentes (JONES et al., 2000).

Técnicas de PCR foram desenvolvidas para detectar o CDV em culturas de tecido,

secções histológicas e urina, tendo como vantagem a rapidez na obtenção dos

resultados, sensibilidade e especificidade, porém têm custos mais elevados que outros

métodos e nem sempre estão disponíveis (FRISK et al., 1999; MORITZ et al., 2000;

GEBARA et al. 2004).

1.1.8.1. Isolamento Viral

O isolamento viral de CDV virulento tem sido difícil em células de cultura de

rotina. A maioria das replicações virais com sucesso ocorre durante o cultivo direto de

tecidos-alvo do hospedeiro infectado. Culturas de macrófagos alveolares detectam o

vírus em vinte e quatro a quarenta e oito horas. A formação de sincícios é um efeito

citopático (ECP) característico do CDV em diversos tipos de cultivos celulares,

podendo ser detectado de dois a cinco dias. O crescimento em macrófagos pulmonares

ou linfócitos era considerado uma característica essencial de isolados de CDV virulento,

porém, algumas amostras de CDV virulento têm sido isoladas em células VERO ou

MDCK (APPEL, 1987; GREENE e APPEL, 1998; LEDNICKY et al., 2004).

1.1.9 Prevenção

A erradicação do CDV tem sido buscada através da vacinação. Durante as

últimas décadas a incidência de cinomose tem diminuído consideravelmente, podendo

ser devida à vacinação regular de cães (JOZWIK e FRYMUS, 2002). Contudo, muitos

surtos de cinomose foram documentados, inclusive em animais vacinados

(BLIXENKRONE- MØLLER et al., 1993; APPEL et al., 1994; GEMMA et al., 1996;

HASS et al., 1997; EK-KOMMONEN et al., 1997; JOZWIK e FRYMUS, 2002).

Muitas espécies de carnívoros selvagens são suscetíveis ao CDV e representam uma

constante fonte de infecção para cães não devidamente vacinados (APPEL, 1987).

As vacinas de CDV inativadas não são capazes de controlar a doença. Elas

induzem uma resposta imune pobre, que pode proteger os cães por muitos meses da

doença, mas não contra a infecção com CDV (APPEL et al., 1984b). Em espécies

selvagens ou exóticas, a imunização contra cinomose só pode ser realizada com vacinas

de CDV inativadas (GREENE e APPEL, 1998). Em raposas cinzentas as vacinas de

CDV atenuado são virulentas, sendo que apenas as amostras adaptadas às células de

aves não são virulentas. Porém, o início da resposta imune é retardado em relação a

vacinas adaptadas em células caninas e nem todas as espécies selvagens ficam

imunizadas com as mesmas (HALBROOKS et al., 1981; APPEL, 1987).

As vacinas de vírus vivo modificado (VVM) existentes atualmente para o CDV

induzem imunidade efetiva contra cinomose. Geralmente uma única dose de vacina

VVM para cinomose imuniza cães que estejam sem anticorpos. A imunidade materna

interfere com a imunização dos filhotes (APPEL, 1987). A idade na qual filhotes

tornam-se suscetíveis à cinomose é proporcional ao título de anticorpos de sua mãe e

varia de acordo com a transferência dos anticorpos pelo colostro aos filhotes

(SWANGO, 1997; GREENE e APPEL, 1998). Aproximadamente 50% dos filhotes são

imunizáveis para a cinomose por volta de seis semanas de idade, cerca de 75% por volta

de nove semanas de idade e mais de 95% por volta de treze semanas de idade. Devido à

idade variável em que os filhotes tornam-se imunizáveis à cinomose e de acordo com

histórico de vacinação das mães, é aplicada uma série de vacinações aos filhotes,

seguindo esquemas que sejam práticos, mas que maximizem a probabilidade da indução

da imunidade. A revacinação anual é recomendável, porque o título de anticorpos

poderá declinar até níveis não mais protetores dentro de um ano, em até um terço dos

cães jovens. Os títulos perduram por mais tempo após o reforço (SWANGO, 1997;

BIAZONO et al. 2001). Com poucas exceções, as vacinas VVM disponíveis hoje são

multiplicadas em células de aves ou ovos, como as amostras Onderstpoort (HAIG,

1956) ou Lederle (HAIG, 1956) ou de adaptações em culturas de células caninas com as

amostras Rockborn (ROCKBORN, 1960) ou Snyder Hill (CABASSO et al., 1962).

Ambos os caminhos de adaptação resultam em vacinas muito efetivas as quais induzem

imunidade em cães suscetíveis que ficam protegidos por, no mínimo, um ano e

provavelmente por vários anos na maioria dos cães (APPEL e GILLESPIE, 1972;

SWANGO, 1997; GORE et al., 2005).

Vacinas com vírus heterólogo podem ser uma alternativa para driblar a

interferência de anticorpos maternos. As vacinas de sarampo não são neutralizadas por

anticorpos contra CDV. Como as vacinas de CDV inativadas, a vacina contra sarampo

induz uma imunidade limitada que protege os cães contra a doença, mas não contra a

infecção (APPEL et al., 1984b). A imunidade estimulada pelo vírus do sarampo em

filhotes é basicamente do tipo mediada por células, com baixos títulos de anticorpos,

proporcionando proteção temporária contra o CDV (SWANGO, 1997).

Vacinas recombinantes baseadas em vetores canaripox e adenovírus, bem como

diferentes vacinas de DNA, vem sendo avaliadas (DE VRIES et al., 1988; PARDO et

al., 1997; CHERPPILOD et al., 2000; FISHER et al. 2002; FISHER et al., 2003).

Alguns autores demonstraram completa proteção em filhotes com estas vacinas (SIXT

et al., 1998; FISHER et al., 2003). Normalmente, estas vacinas são muito seguras, pois

não causam infecções nos animais vacinados, além de poder provocar uma vigorosa

resposta imune celular em recém-nascidos sem interferir com anticorpos maternos

(DONELLY et al., 1997; MOCHIZUKI et al., 1999). Contudo, os níveis de anticorpos

neutralizantes e de proteção são geralmente inadequados se estas vacinas não forem

aplicadas várias vezes e em altas doses (DE VRIES, 1988; LAYOR et al, 1999).

Além da imunização, o isolamento de cães doentes é importante para o controle

da disseminação da cinomose para outros animais. A desinfecção de um ambiente

contaminado com CDV pode ser alcançada com detergentes e solventes de gorduras

comuns, pois o envelope viral é facilmente solubilizado, inativando o agente (APPEL,

1997).

1.2 Vírus Parainfluenza canino

1.2.1 Introdução

O vírus parainfluenza canino (CPIV) é um de vários patógenos envolvidos no

quadro denominado “tosse dos canis”, uma importante enfermidade dos cães (BINN et

al., 1967; ROSEMBRG et al., 1971; WAGNER et al.,1984). A infecção natural pelo

CPIV produz uma traqueobronquite aguda auto-limitante (WAGNER et al., 1983).

Contudo, este vírus pode atuar sinergicamente com CDV, Bordetella bronchiseptica,

entre outros agentes, afetando primariamente as vias aéreas, podendo ocasionar doença

sistêmica (EVERMAN et al., 1980; FORD & VADEM, 1998; DAMIÁN et al., 2005).

O CPIV também já foi descrito como causa de encefalite em cães (EVERMAN et al.,

1981; BAUMGÄRTNER et al.,1981). Encontra-se distribuído mundialmente e atinge

uma ampla variedade de hospedeiros incluindo vários roedores, sendo altamente

contagioso entre cães (BINN & LAZAR, 1970; HSIUNG, 1972; ANDREWES et al.,

1989). A doença pode ser controlada por vacinas de vírus vivo atenuado (SWANGO,

1997; EDIMBORO et al., 2004).

1.2.2 Descrição do agente

O vírus parainfluenza canino (CPIV) pertence à família Paramyxoviridae,

classificado presentemente como do gênero Paramyxovirus (KINGSBURY, 1973;

SWANGO, 1997; BÜCHEN-OSMOND, 2003), (Figura 3). Os vírions pertencentes à

família Paramyxoviridae possuem a mesma morfologia (APPEL e SUMMERS, 1995;

BÜCHEN-OSMOND, 2003). O genoma do CPIV codifica oito proteínas virais

denominadas nucleoproteína (NP), fosfoproteína (P), proteína V, proteína matriz (M),

proteína de fusão (F), pequena proteína hidrofóbica (SH), hemaglutinina-neuraminidase

(HN) e grande proteína (L). As proteínas HN e F são glicosiladas e formam espículas

que projetam-se através do envelope viral. A proteína M está localizada na superfície

interna do envelope viral e a NP, P, L e V estão associadas ao RNA genômico para

formar um complexo ribonucleoprotéico chamado de nucleocapsídeo (BUETTI e

CHOPPIN, 1977; ANDREWES et al., 1989; BÜCHEN-OSMOND, 2003). As proteínas

HN e F estão envolvidas na indução de imunidade, sendo que a HN é responsável pela

adesão e liberação do vírion e F pela penetração e disseminação do vírus célula a célula

(ANDREWES et al., 1989; BÜCHEN-OSMOND, 2003). As funções das proteínas L e

SH não são bem conhecidas (COLLINS et al. 1996). As proteínas NP, P, L e,

provavelmente, V estão envolvidas na transcrição e replicação viral (SOUTHERN et al.

1990; BÜCHEN-OSMOND, 2003). Este vírus é relativamente lábil, não sobrevive por

muito tempo no ambiente e é facilmente inativado por desinfetantes químicos

(SWANGO, 1997).

O CPIV é antigenicamente similar ao vírus parainfluenza símio (SV5), ao

parainfluenza humano tipo 2 e aos parainfluenza bovino, ovino, suíno e felino (AIJIKI

et al., 1982; RANDALL et al., 1987).

Figura 3: Foto de um paramixovírus ao microscópio eletrônico. (aumento

de x 250000; obtida de McNulty, S. Veterinary Sciences, Queen’s

University, Belfast).

1.2.2.1 Multiplicação Viral

Como visto anteriormente, os mecanismos de replicação dos membros da família

Paramyxoviridae são similares (ANDREWES et al., 1989; BÜCHEN-OSMOND,

2003). Tanto a replicação viral como a multiplicação in vitro do CPIV seguem os

mesmos princípios descritos anteriormente (capítulo 1.1.2.1) para o CDV, exceto pela

presença de ácido neuramínico em receptores de membrana nos membros do gênero

Paramixovirus e não no gênero Morbillivirus (ANDREWES et al., 1989; BÜCHEN-

OSMOND, 2003).

1.2.3 Epidemiologia

O CPIV foi primeiramente isolado de cães com doença respiratória em 1967

(BINN et al., 1967). O vírus encontra-se amplamente distribuído geograficamente,

atingindo uma ampla variedade de hospedeiros, incluindo roedores (BINN e LAZAR,

1970; ADREWES et al., 1989; COLLINS et al. 1996). Gatos e furões são suscetíveis à

infecção experimental com CPIV (SAONA-BLACK e LEE, 1970; DURCHEFELD et

al., 1991). Este vírus é altamente contagioso entre cães (BINN e LAZAR, 1970;

HSIUNG, 1972). Estudos soroepidemiológicos revelaram alta prevalência de anticorpos

contra CPIV na população canina, por volta de 30 a 70 % (BIBRACK e BENARY,

1975; THOMPSON et al. 1975; BAUMGÄRTNER, 1985). Infecções pelo CPIV, sem

associações com outros agentes, são geralmente inaparentes e a morbidade varia de 10 a

50 %, sendo a mortalidade rara (SWANGO, 1997). Em todo o mundo, assim como no

Brasil, existem poucas informações disponíveis sobre prevalência de infecções virais

em felinos silvestres ou praticamente inexistem como no caso do CPIV (CATROXO et

al, 2004; BATISTA et al., 2005).

1.2.4 Transmissão

O CPIV é extremamente infeccioso, sendo transmitido por aerossóis ou contato

direto entre animais, porém, não persiste por muito tempo no ambiente (COLLINS et al.

1996; SWANGO, 1997). O vírus geralmente causa infecção limitada ao trato

respiratório, porém, podem ocorrer doença sistêmica e encefalite (BINN, 1970;

EVERMAN et al., 1980; MACARTNAY et al, 1985; SWANGO, 1997).

A síndrome “tosse dos canis”, onde o CPIV geralmente é um dos vários

patógenos envolvidos, ocorre mais frequentemente em cães que vivem em grupos, como

canis, centros de recolhimento de animais de rua e hospitais veterinários (APPEL e

BINN, 1987; UELAND, 1990). A infecção pelo CPIV ocorre mais frequentemente na

segunda semana após a entrada de cães novos em um canil, podendo predispor o

epitélio respiratório à entrada de outros agentes (ERLES et al., 2004).

Randall et al. (1987), revelaram pequenas diferenças antigênicas, usando

anticorpos monoclonais, entre isolados de parainfluenza canino, humano e símio.

Entretanto, ainda não está claro se estas diferenças são suficientes para restringir a

transmissão do vírus entre as espécies ou se o vírus pode atravessar barreiras entre

espécies (DURCHEFELD et al., 1991).

1.2.5 Patogenia

O CPIV causa infecção do trato respiratório, replicando-se tanto nas vias aéreas

superiores como inferiores e são expelidos nas secreções respiratórias, propagando a

infecção. O CPIV tem maior afinidade pelos macrófagos alveolares, causando

pneumonia intersticial. A infecção natural com CPIV em cães em geral é auto-limitante

e restrita ao trato respiratório (SWANGO, 1997; LÓPEZ, 2001). Contudo, o CPIV já

foi isolado de outros órgãos, como intestino, baço, fígado, cérebro e fluído cérebro-

spinhal de cães, podendo causar doença sistêmica e encefalite (BINN, 1970;

EVERMAN et al., 1980; MACARTNAY et al, 1985). Uma amostra neurotrópica de

CPIV, denominada CPI+, já foi isolada do fluído cerebroespinhal de um cão com

paralisia posterior temporária (EVERMANN et al. 1981; BAUMGÄRTNER et al.

1981). Infecções intracerebrais de cães gnotobióticos com este mesmo isolado de CPIV,

resultaram em encefalite aguda com necrose cortical laminar e aparecimento de

antígenos virais em célula ependimais e neurônios (BAUMGÄRTNER et al., 1982).

Análises mais detalhadas a respeito da patogenia da infecção por CPIV não estão

disponíveis (COLLINS et al. 1996; LÓPEZ, 2001).

1.2.6 Manifestações clínicas de infecções por CPIV

Em cães, o CPIV produz uma traqueobronquite aguda auto-limitante com

mínimos sinais clínicos e alterações histológicas. Sinais clínicos e lesões mais aparentes

ocorrem com infecções concomitantes com outros patógenos, resultando na síndrome

clínica denominada “tosse dos canis” (WAGNER et al., 1983; BAUMGÄRTNER,

1985; APPEL e BINN, 1987; FORD e VADEM 1998). A principal manifestação da

infecção é a tosse paroxística de freqüência e intensidade variáveis. A febre também é

variável. A tosse resulta da irritação traqueobrônquico-bronquiolar do trato respiratório

(SWANGO, 1997; FORD e VADEM 1998, LÓPEZ 2001). Geralmente os cães

recuperam-se da traqueobronquite induzida pelo vírus dentro de três a sete dias após o

surgimento dos sinais clínicos. A tosse pode ser induzida pela palpação ou manipulação

da traquéia por período de tempo mais prolongado. Experimentalmente, tem sido difícil

a reprodução da moléstia respiratória com o vírus CPIV (SWANGO, 1997).

Como visto anteriormente, o CPIV tem manifestado-se como uma infecção

geralmente restrita ao trato respiratório. Porém, em 1978, um agente viral foi isolado do

fluído cerebroespinhal de um cão com disfunção neurológica (EVERMANN et al. 1980;

BAUMGÄRTNER et al. 1982). Este isolado (78-238), foi caracterizado através de suas

propriedades biológicas como um parainfluenza canino (BAUMGÄRTNER et al.

1981). Além disso, o vírus já foi isolado de outros órgãos, além do sistema respiratório,

causando doença sistêmica (BINN, 1970; EVERMAN et al., 1980; MACARTNAY et

al, 1985).

1.2.7 Imunidade em infecções por CPIV

Nas infecções por CPIV, em sua maioria, os animais recuperam-se

espontaneamente dentro de três a sete dias após o início dos sinais clínicos. A

recuperação corresponde ao desenvolvimento da imunidade à infecção viral. A resposta

imune faz com que a multiplicação viral fique sob controle, ocorrendo após a

eliminação viral (SWANGO, 1997). A proteção imunológica do trato respiratório contra

a infecção depende da presença de anticorpos nas secreções respiratórias. Anticorpos da

classe IgG estão presentes em secreções do trato respiratório inferior, em concentração

proporcional ao título de anticorpos humorais. Mecanismos específicos para transportar

a IgG do soro para o lúmen do trato respiratório inexistem. O transporte ocorre por

transudação inespecífica, dirigida por altos títulos no soro. Uma quantidade mínima de

anticorpos está presente em secreções do trato respiratório superior, a menos que tenha

ocorrido infecção e estimulação dos anticorpos secretores da classe IgA (S-IgA)

(COLLINS et al. 1996; SWANGO, 1997). Em situações naturais, a IgA tem a vantagem

de ser transportada especificamente através do epitélio da superfície do lúmen, bem

como ser capaz de neutralizar o vírus dentro das células epiteliais (RENEGAR e

SMALL, 1991; MAZANEC et al., 1992). A recuperação da infecção confere imunidade

de longa duração. Células de memória efetuam a resposta anamnéstica à exposição e

reinfecção, que estende a duração da imunidade (SWANGO, 1997).

1.2.8 Diagnóstico

Devido ao fato que os vários agentes associados a doenças respiratórias em cães

podem causar sinais similares, não é possível firmar diagnóstico etiológico com base

apenas no exame clínico. Além disso, no caso de infecção pelo CPIV, geralmente não

ocorrem alterações clinico-patológicas consistentes que permitam o estabelecimento

definitivo da causa (SWANGO, 1997). Assim, o diagnóstico etiológico depende da

identificação do vírus nos animais enfermos, seja por isolamento do vírus a partir de

espécimes apropriados retirados do trato respiratório, seja pela identificação de

antígenos virais em secreções do trato respiratório por imunofluorescência ou outros

ensaios imuno-enzimáticos, ou ainda, mais modernamente, pela identificação de ácidos

nucléicos virais nas secreções e tecidos de animais infectados. Os testes sorológicos

podem ainda auxiliar no diagnóstico pela demonstração de títulos ascendentes de

anticorpos vírus-específicos em soros pareados. Este último pode ser feito através de

testes de fixação do complemento, inibição da hemaglutinação, neutralização e ensaios

imuno-enzimáticos pareados (ANDREWES et al., 1989; COLLINS et al., 1996;

SWANGO, 1997).

1.2.8.1 Isolamento viral

O vírus é isolado usualmente em células VERO. O isolamento não fornece

usualmente resultados rápidos, sendo necessárias várias passagens ou subcultivos do

vírus, antes que as células infectadas manifestem qualquer efeito citopático (ECP)

visível. Os tipos de ECP que podem ser observados em células infectadas com CDV de

campo podem incluir arredondamento ou fusão de células formando sincícios,

eventualmente revelando células com inclusões citoplasmáticas eosinofílicas. O ECP,

muitas vezes, pode ser leve ou ausente. Os isolados podem ser identificados por testes

de inibição da hemadsorção, inibição da hemaglutinação, neutralização,

imunoperoxidase ou fixação do complemento (ANDREWES et al., 1989).

1.2.9 Prevenção

A prevenção da doença é buscada através da vacinação. Atualmente apenas

vacinas inativadas e vacinas VVM contra CPIV estão disponíveis comercialmente e são

de administração intramuscular, subcutânea ou intranasal (VVM). Estas vacinas estão

combinadas com outros vírus caninos atenuados e geralmente induzem imunidade que

ajuda na prevenção da doença (SWANGO, 1997). Vacinas contra o CPIV existem em

combinação com Bordetella bronchiseptica e também adenovirus canino, para uso pelas

vias intranasal, intramuscular e subcutânea. A vacina contra o CPIV de administração

intranasal, induz imunidade mais efetiva que a vacina VVM administrada por via intra-

muscular ou subcutânea (KONTOR et al., 1981; SWANGO, 1997; EDIMBORO et al.,

2004). As vacinas de uso intranasal produzem uma proteção rápida e localizada

(estimulação de IgA na mucosa) e a imunidade protetora pode ser alcançada dentro de

quatro dias, após uma segunda dose (KONTOR et al., 1981; BEY et al., 1981). Quando

a “tosse dos canis” endêmica torna-se seriamente problemática em um canil, é

recomendado o uso de vacinas intranasais em filhotes de até três a quatro semanas de

idade. Geralmente as vacinas de uso intramuscular e subcutâneo contra CPIV são

administradas em combinação com outros vírus caninos (polivalentes), sendo

recomendadas em filhotes a partir de seis semanas de idade, três doses com intervalos

de vinte e um a trinta dias, mais um reforço anual (SWANGO, 1997).

Além da vacinação, a prevenção da infecção por CPIV inclui quarentena dos

animais antes de introduzi-los em um grupo, isolamento de animais doentes, adequada

sanidade e ventilação do ambiente (FORD e VADEN, 1990).

2. OBJETIVOS

O presente estudo teve como objetivos:

- avaliar a ocorrência de infecções por CDV e CPIV em duas populações de

cães de rua mantidos em centros de recolhimento de animais dos municípios de Novo

Hamburgo e de Porto Alegre, RS, através da pesquisa de anticorpos neutralizantes nos

soros destes animais.

- avaliar a ocorrência de infecções por CDV e CPIV em seis espécies de

felinos silvestres brasileiros, de diferentes regiões do Brasil, mantidos em cativeiro,

através da pesquisa de anticorpos neutralizantes nos soros destes animais.

Capítulo 1

Anticorpos neutralizantes contra os vírus da cinomose e parainfluenza em cães.

Neutralizing antibodies to distemper and parainfluenza viruses in dogs.

Autores:

Tamahine Larronda Schmidt Hartmann,

Helena Beatriz de Carvalho Ruthner Batista,

Diógenes Dezen,

Fernando Rosado Spilki, Ana Cláudia Franco,

Paulo Michel Roehe

Submetida à Revista Ciência Rural

Resumo

No presente estudo, foi realizada uma enquete sorológica para determinar a

presença de anticorpos neutralizantes contra os vírus da cinomose (CDV) e

parainfluenza caninos (CPIV) em soros de duas populações de cães de rua dos

municípios de Novo Hamburgo e de Porto Alegre, RS. Foram coletados soros de 173

cães de rua (82 soros de Novo Hamburgo e 91 soros de Porto Alegre) mantidos em

canis municipais destas regiões. A prevalência de anticorpos neutralizantes,

determinada através da técnica de soroneutralização frente às amostras de CDV

Rockborn e Snyder Hill foi de 9,3 % e 4,1 %, respectivamente. Contra a amostra de

CPIV V660, a prevalência de anticorpos neutralizantes encontrada foi de 51,4 %. Estes

resultados indicam que o CDV aparentemente não circula ou tem circulação limitada na

população amostrada, sugerindo susceptibilidade à eventuais infecções por este vírus. Já

o CPIV parece circular amplamente nestas populações.

Palavras-chave: cinomose; parainfluenza canino; cães; soroneutralização;

prevalência.

Abstract

In this study a serological survey was carried out to determine the prevalence of

antibodies to canine distemper virus (CDV) and canine parainfluenza virus (CPIV) in

sera from stray dogs from the cities of Novo Hamburgo and Porto Alegre, RS, Brazil.

Samples were taken from 173 stray dogs (82 samples from Novo Hamburgo and 91

samples from Porto Alegre) kept in municipal kennels. Prevalence of neutralizing

antibodies against two strains of canine distemper virus (Rockborn and Snyder Hill) and

one strain of CPIV (V660) was evaluated. Neutralizing antibodies to CDV Rockborn

were detected in 9.3 % of the samples, whereas 4.1 % of those had neutralizing

antibodies to CDV Snyder Hill. Neutralizing antibodies to CPIV V2660 were detected

in 51.4 % of samples. The rather limited frequency distribution of antibodies to CDV

suggest that the sampled populations could be largely susceptible to this virus. On the

other hand, CPIV seems to circulate widely within the stray dogs populations evaluated.

Key words: canine distemper virus; canine parainfluenza virus; dogs; sero

neutralization; prevalence

Introdução

O vírus da cinomose canina (“canine distemper virus”, ou CDV) pertence ao

gênero Morbillivirus da família Paramyxoviridae (APPEL & SUMMERS, 1999). O

CDV está distribuído mundialmente, sendo um dos mais importantes agentes

infecciosos dentro das populações caninas, tanto não-imunizadas quanto imunizadas

(GOUVEIA et al., 1987; BLIXENKRONE-MØLLER et al.,1993; GEMMA et al.,

1996; EK-KOMMONEN et al., 1997). O CDV causa uma doença sistêmica

disseminando-se por todo o organismo do hospedeiro através de células linfóides,

podendo infectar o sistema nervoso central e, ocasionalmente, produzindo uma

encefalite aguda ou crônica desmielinizante (SUMMERS & APPEL, 1994). Sinais

respiratórios, digestivos e neurológicos podem, isoladamente ou em associação, ser

encontrados em várias outras doenças infecciosas, dificultando o diagnóstico clínico

de cinomose (TIPOLD, 1995). A encefalite causada pelo CDV já foi identificada em

várias espécies, incluindo membros das famílias Canidae, Procyonidae, Mustelidae,

Felidae e muitos outros carnívoros (APPEL, 1987; TIMONEY et al., 1992; APPEL et

al., 1994) .

Outro importante agente que acomete a população canina é o vírus

parainfluenza. O vírus parainfluenza canino (CPIV) pertence ao gênero

Paramyxovirus da família Paramyxoviridae (SOUTHERN et al., 1991). O CPIV é um

de vários patógenos envolvidos no quadro denominado “tosse dos canis”, uma

síndrome que ocorre com maior freqüência em cães que vivem em grupos,

clinicamente caracterizada por uma traqueobronquite aguda auto-limitante

(WAGNER et al., 1984; APPEL & BINN, 1987). O CPIV tem uma ampla variedade

de hospedeiros, incluindo vários roedores (HSIUNG, 1972), sendo altamente

contagioso entre cães (BINN & LAZAR, 1970), usualmente incidindo nas populações

caninas com prevalências reportadas entre 30 % e 70 % (THOMPSON et al., 1975;

BAUMGÄRTNER, 1985). CDV e CPIV podem estar associados e causar doenças

respiratórias caninas (FORD & VADEM, 1998; DAMIÁN et al., 2005). Em nosso

meio são escassas as informações sobre prevalência de infecções pelo CDV

(HEADLEY & GRAÇA, 2000). Menos abundantes ainda são as informações sobre

infecções pelo CPIV (GOUVEIA et al., 1987). O objetivo do presente estudo foi

verificar a presença de anticorpos neutralizantes contra CDV e CPIV em cães de rua

mantidos em canis municipais dos municípios de Novo Hamburgo e de Porto Alegre,

RS. Para tanto, os soros dos animais foram testados em provas de soroneutralização

frente a duas amostras vacinais de CDV e frente a uma amostra de CPIV.

Materiais e métodos

Células

Células da linhagem VERO (ATCC CCL-81) foram cultivadas em meio

mínimo essencial de Eagle (E-MEM) suplementado com 5 % de soro fetal bovino

(SFB; Nutricell) e 0,1 mL/L de enrofloxacina a 10 % (Baytril). As células foram

multiplicadas segundo procedimentos usuais, em intervalos de dois a cinco dias

(BUTLER e DAWSON, 1992).

Soros

Foram coletadas amostras de soro de 173 cães sem raça definida (SRD) de

diferentes faixas etárias e com histórico de vacinação desconhecido. Destas, 82 (47,4

%) amostras eram de cães provenientes do Canil Municipal de Novo Hamburgo (RS).

Outras 91 (52,6 %) amostras foram coletadas de cães pertencentes a canis da região

metropolitana de Porto Alegre (RS).

Amostras de Vírus

As amostras de vírus utilizadas neste trabalho foram amostras de CDV

denominadas Rockborn (ROCKBORN, 1958; CORNWELL & THOMPSON, 1982) e

Snyder Hill (TIZARD, 1990). Ambas foram multiplicadas em células VERO, de

acordo com procedimentos usuais. Os títulos infecciosos dos estoques preparados

situavam-se em torno de 10

5,5

doses infectantes para 50 % dos cultivos celulares

(DICC

). A amostra de CPIV V660 (RIJSEWIJK et al., 1998) foi igualmente

multiplicada em células VERO. O estoque de vírus assim produzido atingiu títulos de

aproximadamente 10

4,5

DICC

Soroneutralização (SN)

As amostras de soros de cães foram testadas pela técnica de soroneutralização

(SN) frente às amostras de CDV Rockborn e Snyder Hill e a amostra de CPIV V660.

Brevemente, cada soro diluído (1:4 a 1:128) em E-MEM e colocado em microplacas

de cultivo celular, foi misturado com 100 DICC

de cada um dos vírus em estudo.

Após incubação por 1 hora em estufa a 37 °C, foi adicionada uma suspensão de

células VERO (10

5,8

a 10

células/mL) e incubados novamente a 37 °C. As células

foram observadas por até 7 dias em busca do ECP característico (CDV) ou coradas

por imunoperoxidase (CPIV), como descrito previamente (KRAMPS et al. 1994),

exceto que o anticorpo primário utilizado foi um soro canino policlonal anti-CPIV e o

anticorpo secundário utilizado foi um conjugado peroxidase/anti-IgG canina (Serotec).

Os títulos de anticorpos neutralizantes foram expressos como a recíproca da maior

diluição do soro capaz de inibir completamente o ECP (CDV) ou inibir a coloração

associada à presença do vírus nas células (CPIV).

Soros com títulos de anticorpos neutralizantes ≥ 4 foram considerados positivos.

Resultados

Dos 173 soros caninos titulados por SN para CDV, a maioria apresentou-se

negativo frente às duas amostras de CDV testadas, sendo 157 (90,7 %) negativos para

CDV Rockborn e 166 (95,9%) negativos para CDV Snyder Hill (Fig.1). Dos 173 cães

apenas 20 cães (16,7%) apresentaram anticorpos neutralizantes contra CDV sendo que

apenas três cães (2,5 %) apresentaram anticorpos neutralizantes contra as duas

amostras de CDV testadas (Fig.2).

Frente ao CPIV, dos 173 soros caninos testados, 84 (48,6 %) apresentaram-se

negativos para a amostra V660, sendo 89 (51,4 %) positivos (Fig. 3).

9,3

90,7

4,1

95,9

100

CDV ROCKBORN CDV SNYDER HILL

% POSITIVOS ANTI-CDV % NEGATIVOS ANTI-CDV

Figura 1 - Resultados dos testes de soroneutralização (SN) frente ao vírus da

cinomose (CDV; amostras Rockborn e Snyder Hill). n= 173

100

120

140

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920

nº do cão

Título de anticorpos

Rockborn Snyder Hill

Figura 2: Títulos de anticorpos neutralizantes contra as amostras

Rockborn e Snyder Hill do vírus da cinomose (CDV) em cães

soropositivos (n= 20).

51,4

48,6

100

CPIV V660

% POSITIVOS ANTI-CPIV % NEGATIVOS ANTI-CPIV

Figura 3: Resultados dos testes de soroneutralização (SN) frente ao vírus

parainfluenza canino (CPIV; amostra V660). n= 173

Discussão

A tomada de amostras em populações de cães de rua, constituída

essencialmente por cães não vacinados, pode servir como um indicativo da evolução

da infecção em ambiente urbano (MURPHY et al., 1999). No presente estudo, os

elevados títulos de anticorpos detectados em alguns soros contra a amostra de CDV

Rockborn sugerem que alguns cães provavelmente foram vacinados (Fig. 2).

Entretanto, estes mesmos soros frente à amostra Snyder Hill apresentaram títulos de

anticorpos baixos ou eram negativos para anticorpos neutralizantes, sugerindo que

estes cães só estariam protegidos frente a amostras antigenicamente mais parecidas

com a amostra Rockborn do que à Snyder Hill. Na verdade, somente dois cães

apresentaram títulos de anticorpos considerados protetores frente a uma agressão com

CDV virulento (≥100; APPEL, 1996) e, ainda assim, frente apenas à amostra

Rockborn (Fig.2). Apenas 2,46 % (3) dos animais possuiam anticorpos neutralizantes

contra as duas amostras de CDV, o que é um indício de pouca reatividade cruzada

entre as mesmas. Esta baixa reatividade cruzada pode ser um reflexo de diferenças

antigênicas nos epítopos protetores entre amostras de CDV (GEMMA et al., 1996;

HAAS et al., 1997), embora as implicações dessas variações na vacinação sejam ainda

desconhecidas. Variações na glicosilação da hemaglutinina podem causar

significativas diferenças no perfil antigênico do CDV (IWATSUKI et al., 1997).

Todavia, vacinas produzidas com amostras para CDV, são tidas como capazes de

induzir imunidade protetora nos animais vacinados (CORNWELL & THOMPSON,

1982; GREENE, 1990). Assim, permanece obscuro o significado das diferenças

antigênicas aqui detectadas, assim como seus reflexos na suscetibilidade dos animais

soropositivos a infecções por CDV.

Por outro lado, um grande número de animais (Fig.1) não apresentou

anticorpos neutralizantes contra as amostras utilizadas (90,7 % para Rockborn e 95,9

% para Snyder Hill). Uma vez que a população estudada era formada por cães de rua,

isto sugere que a maioria dos cães não havia sido vacinada ou não havia tido contato

prévio com o CDV. É possível que a mortalidade associada ao CDV possa ter

eliminado os animais que tenham tido contato prévio com o agente, com isso,

diminuindo sua transmissão entre a população canina de rua e, consequentemente,

levando à baixa prevalência detectada. Em um estudo já havia sido reportado

resultados similares, onde 81 % de cães com histórico de vacinação desconhecido,

eram soronegativos (JÓZWIK et al. 2004). Os resultados encontrados neste estudo

deixam claro que a população amostrada não está protegida contra a doença. Portanto,

em cães adotados, tal fato pode ser relevante à primeira imunização de filhotes se não

estiverem disponíveis dados sobre o histórico de vacinação dos mesmos. É freqüente

em nosso meio a recomendação de evitar a vacinação de filhotes de menos de dois

meses de idade (APPEL & SUMMERS, 1999), visando evitar a interferência de

anticorpos maternos no desenvolvimento de imunidade ativa do filhote. Na população

amostrada, esse risco seria negligenciável, uma vez que a maioria dos animais,

incluindo cadelas, apresentou-se soronegativa. Dessa forma, a ausência de anticorpos

passivamente adquiridos poderia dar origem a populações de cães neonatos totalmente

sensíveis ao vírus. Essa exposição nas primeiras semanas de vida poderia levar à

morte os animais que tivessem contato com o vírus, levando às altas taxas de

soronegatividade aqui detectadas.

Em relação ao CPIV, mais da metade dos cães testados (51,4 %) apresentou-se

soropositiva para anticorpos neutralizantes anti-CPIV. Em outros estudos, a

prevalência de anticorpos anti-CPIV tmabém tem sido elevada, situando-se entre 30 %

e 70 % (THOMPSON et al., 1975; BAUMGÄRTNER, 1985). O CPIV é facilmente

transmissível entre as populações caninas e, além disso, os títulos de anticorpos

neutralizantes estão pobremente relacionados com a proteção contra o desafio com o

mesmo (BINN & LAZAR, 1970; BAUMGÄRTNER, 1985; ERLES et al., 2004).

No presente estudo, foi possível detectar que o CPIV parece circular entre a

população de cães não-vacinados com prevalência muito superior ao CDV. Isto pode

ser conseqüente ao fato de que o CDV possa induzir alta mortalidade entre os cães, de

certa forma auto-limitando sua disseminação nas populações caninas. Outra

possibilidade seria que os cães de rua de fato não tenham contato com o vírus, talvez

pela vacinação de grande número de cães domiciliados, o que poderia levar a uma

baixa ou insignificante circulação do vírus no ambiente. Estas possibilidades são

ambas muito interessantes, pois revelam distintas possibilidades de evolução desta

infecção nas regiões amostradas. Ainda existe a possibilidade de que o teste

diagnóstico aqui utilizado (SN) não detecte estas amostras circulantes. Claro está que

estudos futuros serão necessários para determinar com precisão o comportamento

dessa virose em nosso meio. Por outro lado, a ampla disseminação do CPIV entre a

população canina sugere que este agente dissemina-se de forma extremamente eficaz

entre estes animais. Questionamentos podem ser, portanto, levantados em relação à

necessidade de vacinação contra CPIV na região amostrada. Esse tema igualmente

permanece como uma interessante questão a ser abordada em estudos futuros.

Conclusão

O baixo índice de soropositividade detectado frente ao CDV sugere que este

agente não tem uma circulação significativa entre as populações de cães de rua

amostradas. O CPIV apresentou prevalência significativa na população amostrada dos

municípios de Novo Hamburgo e Porto Alegre, indicando que esse agente circula

amplamente em populações caninas não domiciliadas.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado por CNPq e FAPERGS. P.M. Roehe é um pesquisador

do CNPq. Agradecemos ao Dr. Frans Rijsewijk (Animal Sciences Group, Lelystad,

The Netherlands), pela amostra de CPIV V660 e à Dra. Daisy Heck (veterinária

responsável do Canil Municipal de Novo Hamburgo), por facilitar as coletas de soro

dos cães.

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Capítulo 2

Ausência de anticorpos neutralizantes contra os vírus da cinomose e parainfluenza

canino em felinos silvestres em cativeiro.

Absence of neutralizing antibodies to distemper and parainfluenza viruses in captive

wild felids.

Autores:

Tamahine Larronda Schmidt Hartmann; Helena Beatriz de Carvalho Ruthner Batista;

Ana Cláudia Franco; Franco Kindlein Vicentini; Cristina Harumi Adania; Paulo Michel

Roehe

Manuscrito em preparação

Resumo

O vírus da cinomose canina (CDV) e o vírus parainfluenza canino (CPIV)

podem infectar uma ampla variedade de hospedeiros. O CDV foi recentemente

detectado como causa de morbidade e mortalidade em grandes felinos na África,

América do Norte e Ásia, porém no Brasil não existem relatos disponíveis sobre sua

ocorrência em felinos silvestres. Em relação ao CPIV, não existem referências sobre a

sua presença em felinos silvestres. No presente estudo, foi realizado um levantamento

sorológico em busca de anticorpos neutralizantes contra o CDV e CPIV em soros de 84

felinos silvestres mantidos em cativeiro, de seis diferentes espécies nativas brasileiras

(Leopardus tigrinus, Puma concolor, Leopardus wiedii, Herpailurus yaguarondi,

Panthera onça), coletados em diferentes regiões do Brasil. Todos as amostras

examinadas foram negativas para anticorpos neutralizantes contra as amostras de CDV

e CPIV utilizadas. Estes resultados indicam que o CDV e o CPIV aparentemente não

circulam entre as populações de felinos silvestres amostradas.

Palavras-chave: cinomose; parainfluenza canino; felinos silvestres;

soroneutralização; prevalência.

Abstract

Canine distemper virus (CDV) and canine parainfluenza virus (CPIV), are

paramyxoviruses with broad host ranges. CDV has recently been detected as a cause of

morbidity and mortality in large felids in Africa, North America and Asia. However, no

information is available on the occurrence of CDV infections in Brazilian wild felids.

Regarding CPIV, no records have been made to date on evidences of infection in wild

felids. In this study, a serological survey was carried out aiming to determine the

prevalence of antibodies to CDV and CPIV in sera of 84 captive felids of six native

species of Brazilian captive wild felids (Leopardus tigrinus, Puma concolor, Leopardus

wiedii, Herpailurus yaguarondi, Panthera onca), from different regions of Brazil. All

examined samples were negative for neutralizing antibodies to CDV and CPIV. These

results indicate that CDV and CPIV seem not to circulate within the examined

populations of wild felids.

Key words: canine distemper virus; canine parainfluenza virus; wild felids; sero

neutralization; prevalence

Introdução

O vírus da cinomose canina (CDV) pertence à família Paramyxoviridae, gênero

Morbillivirus, é altamente contagioso, sendo transmitido predominantemente por

aerossóis (APPEL & SUMMERS, 1995). Conhecido por causar uma doença

potencialmente letal em membros das famílias Canidae, Mustelidae e Procionidae, o

CDV foi recentemente detectado como causa de morbilidade e mortalidade em

membros da família Felidae, como leões e tigres (APPEL et al., 1994) e vários outros

animais (HARDER & OSTERHAUS, 1997; LEDNICKY et al., 2004). Muitos autores

têm reportado a ocorrência de infecções por CDV em grandes felinos, como leões,

tigres, leopardos e onças na África e em diferentes zoológicos nos Estados Unidos,

causando doença neurológica e muitas vezes fatal (BLYTHE et al., 1983; APPEL et al.,

1994; ROELKE-PARKER et al., 1996). Em 1994, uma epidemia causada pelo CDV

matou um terço dos leões (Panthera leo) do Seringeti, na África (MORELL, 1994;

ROELKE-PARKER et al., 1996). Logo em seguida, o CDV foi novamente implicado

como causador de mortalidade de grandes felinos em cativeiro na América do Norte

(APPEL et al., 1994; HADER et al., 1996). Em outro estudo, foi revelado que pequenos

felinos asiáticos, domésticos e silvestres, eram suscetíveis ao CDV, sendo que a

prevalência de anticorpos anti-CDV era variável de acordo com a região e, em alguns

casos, com a potencial exposição a cães (IKEDA et al., 2001). Estes surtos de cinomose

demonstraram que o vírus circulante em carnívoros não-felinos domésticos e silvestres

pode atravessar barreiras entre espécies para hospedeiros felinos (HARDER et al.,

1995). Porém, o CDV não é uniformemente letal nas distintas espécies. Ao contrário da

situação com leões, gatos domésticos (Felis sylvestris catus) podem ser infectados por

CDV e apresentar apenas um aumento da temperatura corporal, sendo a patogênese

ainda pouco clara (APPEL et al., 1974; HARDER et al.,1995; IKEDA et al., 2001).

O outro agente abordado no presente estudo, o vírus parainfluenza canino

(CPIV), pertence ao gênero Paramyxovirus da família Paramyxoviridae (KINGSBURY,

1973; SOUTHERN et al., 1991). O CPIV atinge uma enorme variedade de hospedeiros,

incluindo vários roedores (HSIUNG, 1972), sendo altamente contagioso entre cães

(BINN & LAZAR, 1970). Os gatos apresentaram-se suscetíveis em infecção

experimental por CPIV (SAONA-BLACK & LEE, 1970). Os principais sinais clínicos

causada pelo CPIV são bronquite e pneumonia intersticial (FORD & VADEN, 1998).

Nenhuma referência, entretanto, foi encontrada na literatura com relação à ocorrência de

CPIV em felinos silvestres.

No Brasil, embora haja apenas oito espécies diferentes de felinos silvestres

reconhecidas, são escassas as informações sobre prevalência de infecções virais nestes

animais, tanto nos de vida livre como nos que vivem em cativeiro (CATROXO et al,

2004; BATISTA et al., 2005). Da mesma forma, não existem referências disponíveis

sobre ocorrência de CDV e CPIV em felinos silvestres brasileiros. O objetivo do

presente estudo foi verificar a presença de anticorpos neutralizantes contra CDV e CPIV

em soros de seis espécies de felinos silvestres brasileiros mantidos em cativeiro.

Materiais e métodos

Células

Células da linhagem VERO (ATCC CCL-81) foram cultivadas em meio mínimo

essencial de Eagle (E-MEM) suplementado com 5 % de soro fetal bovino (SFB;

Nutricell). As células foram multiplicadas segundo procedimentos usuais, em intervalos

de 2 a 5 dias (BUTLER & DAWSON, 1992). Tais células foram utilizadas nos

procedimentos de cultivo das amostras de vírus vacinais e testes de soroneutralização.

Soros

Foram coletados soros de 84 felinos silvestres de cativeiro de seis diferentes

espécies nativas do Brasil em quatorze diferentes Estados pela Associação Mata Ciliar

(AMC, Jundiaí, São Paulo, Brasil). As espécies de felinos silvestres das quais as

amostras de soro foram coletadas foram: gato-do-mato-pequeno (Leopardus tigrinus, 6

amostras), onça-parda (Puma concolor, 33 amostras), gato-maracajá (Leopardus wiedii,

5 amostras), jaguatirica (Leopardus pardalis, 11 amostras), jaguarundi (Herpailurus

yaguarondi, 7 amostras) e onça-pintada/onça-preta (Panthera onca, 22 amostras). Os

soros obtidos foram devidamente armazenados, identificados e conservados a -20 °C até

o momento da realização dos testes.

Amostras de Vírus

A amostra de CDV utilizada neste trabalho, denominada Rockborn

(ROCKBORN, 1958; CORNWELL & THOMPSON, 1982), foi originalmente isolada

de casos naturais de CDV e atenuada por inúmeras passagens em células de linhagem de

mamíferos (ROCKBORN, 1958; STEWART et al., 1968; HAMBURGER et al., 1991).

A amostra de CDV Rockborn foi multiplicada em células VERO seguindo-se

procedimentos usuais. Quando o efeito citopático (ECP) tornava-se evidente em 90 a

100 % do tapete celular (em torno de 3 a 5 dias após a inoculação), os cultivos eram

congelados a -70 °C, descongelados, clarificados por centrifugação e o sobrenadante

armazenado. Após 7 a 8 passagens, o título infeccioso obtido situava-se usualmente na

faixa de 10

5,5

doses infectantes para 50 % dos cultivos celulares (DICC

A amostra de CPIV V660 foi obtida de um surto de “tosse dos canis”

(RIJSEWIJK et al., 1998). A mesma foi inoculada em células VERO e os cultivos

incubados por sete dias. Após este período, mesmo sem visualização de ECP, os

cultivos eram congelados -70

C e processados como a amostra de CDV Rockborn

acima. Os estoques de vírus assim produzidos, após seis passagens, atingiram títulos de

aproximadamente 10

4,5

DICC

Soroneutralização (SN)

As amostras de soros de felinos silvestres foram testadas pela técnica de

soroneutralização (SN) frente à amostra CDV Rockborn e à amostra CPIV V660.

Cada soro diluído de 1:16 a 1:2048 em E-MEM (os soros testados em diluições

menores que 1:16 foram tóxicos para as células) e colocado em microplacas de cultivo

celular, foi misturado com 100 DICC

de cada um dos vírus em estudo. Após

incubados por 1 hora em estufa a 37 °C, foi adicionada uma suspensão de células

VERO (10

5,8

a 10

células/mL) e incubados novamemte a 37 °C. As células foram

observadas por até 7 dias em busca do ECP característico (CDV), ou coradas por

imunoperoxidase (CPIV), como descrito previamente (KRAMPS et al. 1994), exceto

que o anticorpo primário utilizado foi um soro canino policlonal anti-CPIV, e o

anticorpo secundário utilizado foi um conjugado peroxidase/anti-IgG canina (Serotec).

Os títulos de anticorpos neutralizantes foram expressos como a recíproca da maior

diluição do soro capaz de inibir completamente o ECP (CDV) ou inibir a coloração

associada à presença do vírus nas células (CPIV). Soros com títulos de anticorpos

neutralizantes ≥ 16 foram considerados positivos.

Resultados

Todos as 84 amostras de soros das seis espécies de felinos silvestres (Leopardus

tigrinus, Puma concolor, Leopardus wiedii, Leopardus pardalis, Herpailurus

yaguarondi, Panthera onça) apresentaram-se negativas quanto à presença de anticorpos

neutralizantes frente à amostra de CDV Rockborn (Tabela1).

Igualmente, os mesmos 84 soros foram tituladas por SN para CPIV. Os mesmos

resultados foram encontrados, ou seja, todos apresentaram-se negativos (Tabela 1).

Tabela 1. Anticorpos neutralizantes contra CDV e CPIV em soros de diferentes

espécies de felinos silvestres brasileiros mantidos em cativeiro.

Espécies Número de soros (n)

Títulos de anticorpos

neutralizantes

Espécies CDV CPIV

Leopardus tigrinus

6 ≤ 16* ≤ 16

Puma concolor

33 ≤ 16 ≤ 16

Leopardus wiedii

22 ≤ 16 ≤ 16

Leopardus pardalis

11 ≤ 16 ≤ 16

Herpailurus yaguarondi

7 ≤ 16 ≤ 16

Panthera onca

5 ≤ 16 ≤ 16

Total

*Títulos de anticorpos ≤ 16 foram considerados negativos (vide Material e Métodos).

Discussão

Os resultados negativos obtidos pela pesquisa de anticorpos neutralizantes contra

CDV e CPIV nos soros de felinos silvestres brasileiros examinados no presente estudo

indicam que estes vírus aparentemente não circulam nas populações de felinos silvestres

aqui estudadas. É possível que tais espécies não sejam suscetíveis a infecções por estes

agentes. Entretanto, em função da reportada ocorrência de CDV em felinos silvestres de

vida livre ou cativos na África, Ásia e América do Norte (BLYTHE et al., 1983;

APPEL et al., 1994; ROELKE-PARKER et al., 1996; IKEDA et al., 2001), assim como

relatos indicando a possibilidade de infecção de gatos domésticos com CDV (APPEL et

al., 1974; HARDER et al.,1995; IKEDA et al., 2001), havia uma razoável probabilidade

de que felinos silvestres brasileiros fossem igualmente susceptíveis a infecção por CDV.

Os surtos de cinomose que atingiram leões do Seringeti na África, foram atribuídos a

contatos com cães domésticos infectados pelo CDV (CLEAVELAND et al., 2000). Em

outro estudo, guaxinins (Procyon lotor), foram responsabilizados por epizootias de

CDV em carnívoros de cativeiro em zoológicos e reservas animais (SEDGWICK &

YOUNG, 1968; APPEL et al, 1974; LEDNICKI et al., 2004). Assim, é provável que a

população de felinos de cativeiro amostrada neste estudo seja sensível ao CDV, embora

ainda não tenha entrado em contato com o vírus. Provavelmente, isto se deve ao fato de

os animais potenciais transmissores destas infecções não circulrem nos zoológicos de

onde foram coletadas as amostras.

Gatos podem ser infectados experimentalmente por CPIV e cães e roedores

podem transmití-los (SAONA-BLACK & LEE, 1970; HISIUNG, 1972; UELAND,

1990). Assim, embora até o presente não existam relatos de infecções por CPIV em

felinos silvestres, não obstante é muito provável que estes animais sejam também

suscetíveis ao CPIV, podendo ser infectados com este agente, desde que em contato

com transmissores contaminados. Os resultados negativos encontrados neste estudo

revelam que tal infecção não ocorreu nas populações amostradas. É importante salientar

que estes felinos são de hábitos solitários, de certa forma limitando as possibilidades de

transmissão de infecções (LEUTENEGGER et al, 1999; BATISTA et al., 2005).

Animais que vivem em grupo, como os leões, podem difundir a infecções virais com

maior facilidade em função do contato próximo com outros indivíduos potencialmente

contaminados (LEUTENEGGER et al, 1999).

No presente estudo, quanto aos resultados encontrados pela pesquisa de

anticorpos neutralizantes anti-CDV e anti-CPIV, não é possível precisar se a

inexistência de evidências de infecção se deu em função da não susceptibilidade destas

espécies ao vírus ou em função da inexistência de uma espécie transmissora

contaminada. A confirmação da sensibilidade dessas espécies ao vírus implicaria em

experimentos envolvendo inoculação experimental de animais silvestres, o que traria

outras implicações que fogem ao objetivo do trabalho aqui apresentado. Não obstante, é

interessante o fato de que tais felinos mostraram-se soronegativos a este agente.

As enfermidades podem ser fatores decisivos na extinção ou não de determinada

espécie (BATISTA et al, 2005). Recentes epizootias virais têm demonstrado que

pequenas populações de espécies altamente ameaçadas podem ficar sob risco de

extinção quando afetadas (HARDER & OSTERHAUS, 1997). Estudos visando a

determinação da ocorrência de infecções em animais silvestres devem ser ampliados a

fim de se evitar possíveis perdas, principalmente pelo fato de que muitas espécies se

encontram incluídas na lista oficial de espécies da fauna brasileira ameaçada de

extinção, instituída pelo IBAMA, como é o caso da onça-parda (CATROXO et al.,

2004). Desta forma, mesmo com os resultados sorológicos negativos obtidos, mais

estudos devem ser realizados a respeito da prevalência destas infecções, assim como das

patologias a elas associadas, com mais amostras de soros de felinos silvestres brasileiros

de cativeiro e, se possível, de vida livre.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado por CNPq e FAPERGS. P.M. Roehe é um pesquisador

do CNPq. Agradecemos ao Dr. Frans Rijsewijk (Animal Sciences Group, Lelystad,

The Netherlands) pela amostra de CPIV V660.

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3. DISCUSSÃO E CONCLUSÕES GERAIS

Presença de anticorpos neutralizantes contra CDV e CPIV em soros de cães

O presente estudo foi desenvolvido visando aprofundar os conhecimentos sobre

a prevalência de CDV e CPIV em soros de cães. Isto porque o CDV e o CPIV

encontram-se distribuídos mundialmente, sendo importantes agentes infecciosos dentro

das populações caninas (GOUVEIA et al., 1996; HEADLEY e GRAÇA, 2000). Além

disso, em nosso meio, são escassas as informações sobre prevalência de infecções pelo

CDV e, particularmente, pelo CPIV (GOUVEIA et al., 1987; HEADLEY e GRAÇA,

2000). O CDV causa uma doença infecciosa sistêmica que pode ser letal em cães. Este

vírus causa grave imunossupressão, que pode facilitar a entrada de outros agentes

(SUMMERS e APPEL, 1994). Já o CPIV, produz uma traqueobronquite limitante, com

sinais clínicos mais discretos (APPEL e BINN, 1987). Entretanto, doença clinicamente

evidente com lesões mais severa, pode ocorrer nas infecções concomitantes com outros

patógenos, sendo freqüente o sinergismo com CDV (APPEL e BINN, 1987; FORD e

VADEN, 1998). Estes relatos reforçam a importância do conhecimento da prevalência

destes dois agentes, nas populações caninas amostradas.

Os animais estudados eram cães de rua, com histórico de vacinação

desconhecido, mantidos em centros de recolhimento de animais dos municípios de

Porto Alegre e Novo Hamburgo. Os soros dos cães foram testados frente a duas

amostras vacinais de CDV e frente a uma amostra de CPIV, através da técnica de

soroneutralização. Os resultados revelaram que apenas 16,7 % (20 de 173 cães) dos

animais apresentaram anticorpos neutralizantes contra alguma das duas amostras de

CDV utilizadas nos testes (Rockborn e Snyder Hill). Também, foi encontrado que

apenas 2,46 % (3) dos animais tinham anticorpos neutralizantes contra as duas

amostras, o que é um indício de pouca reatividade cruzada entre as mesmas. Esta

variabilidade antigênica aqui evidenciada pode ser um reflexo de diferenças antigênicas

entre amostras de CDV (GEMMA et al., 1996; HAAS et al., 1997). Segundo alguns

autores, vacinas produzidas com amostras de CDV, como Rockborn e Snyder Hill,

adequadamente atenuadas, seriam capazes de induzir imunidade protetora nos animais

vacinados (CORNWELL e THOMPSON, 1982; GREENE, 1990). Contudo, estudos

têm questionado sobre a ocorrência de variantes de CDV que teriam permitido sua

expansão para novos hospedeiros e desafiado a proteção por vacinas usuais contra CDV

(BLIXENKRONE-MØELLER et al., 1993; ROELKE-PARKER et al., 1996; HARDER

e OSTERHAUS, 1997).

Por outro lado, um grande número de animais, não apresentou anticorpos

neutralizantes contra nenhuma das amostras utilizadas. Estes achados, levando-se em

conta o método utilizado, indicam que estes cães de rua não foram vacinados ou não

tiveram contato prévio com o CDV, talvez devido à alta taxa de mortalidade causada

por este vírus, diminuindo sua transmissão entre as populações caninas. JÓZWIK et al.

(2004) já haviam encontrado resultados similares em que somente 19 % dos cães com

histórico de vacinação desconhecido, possuíam títulos de anticorpos significativos (ou

seja, ≥ 100) contra cinomose, enquanto a maioria (81 %) não apresentou anticorpos

detectáveis por SN. Outra possibilidade é que o método diagnóstico utilizado no

presente estudo talvez não detecte outros tipos de anticorpos circulantes.

Quanto ao CPIV, mais da metade dos cães testados (51,4%) apresentaram-se

positivos quanto à presença de anticorpos neutralizantes para CPIV, corroborando com

estudos prévios que evidenciaram altas prevalências de anticorpos contra o CPIV em

populações caninas (THOMPSON et al., 1975; BAUMGÄRTNER, 1985). Segundo

alguns autores, em estudos sobre vacinação, parece não haver uma correlação entre os

títulos de anticorpos neutralizantes e proteção frente a infecções com o CPIV, pois

observaram que mesmo após a vacinação as infecções continuaram ocorrendo (PAIUL

et al., 2003; ERLES et al., 2004). Este fato pode ser explicado devido à forma de

vacinação utilizada. As vacinas de administração intra-muscular ou subcutânea

precisam ser capazes de provocar uma resposta imune humoral exacerbada para que

anticorpos neutralizantes cheguem à mucosa respiratória, enquanto as vacinas de

administração intranasal induzem imunidade mais rápida e localizada (mucosa) através

da estimulação de IgA (KONTOR et al., 1981; SWANGO, 1997; EDIMBORO et al.,

2004). Baseado nestes estudos pode-se concluir que a presença de anticorpos

neutralizantes circulantes evidenciada na maior parte da população estudada, não é um

indicativo de que estes animais estejam agora protegidos contra a infecção com o CPIV,

mas sim que este vírus encontra-se circulando entre estes grupos.

Este estudo revelou que o CPIV parece circular entre as populações de cães de

rua amostradas nos municípios de Novo Hamburgo e Porto Alegre, com maior

prevalência que o CDV. Com estes resultados obtidos, fica evidente que mais estudos

devem ser realizados a respeito da prevalência destas infecções, para que medidas mais

direcionadas de prevenção e controle, possam ser tomadas por profissionais da área.

Ausência de anticorpos neutralizantes contra CDV e CPIV em soros de felinos

silvestres em cativeiro

Devido ao CDV e CPIV afetarem uma ampla variedade de hospedeiros, o

presente estudo foi desenvolvido visando aprofundar os conhecimentos sobre a

prevalência destes vírus em soros de felinos silvestres brasileiros. O CDV foi

recentemente detectado como causa de morbidade e mortalidade em grandes felinos na

África, América do Norte e Ásia (APPEL et al., 1994; ROELKE-PARKER et al., 1996;

IKEDA et al., 2001; LEDNICKY et al., 2004). No Brasil, não existem relatos

disponíveis sobre a ocorrência de CDV e CPIV em felinos silvestres. Em relação ao

CPIV, não existem referências sobre a sua presença em felinos silvestres, todavia, como

gatos podem ser infectados experimentalmente por CPIV (SAONA-BLACK e LEE,

1970), é possível que estes animais possam também ser suscetíveis ao CPIV e, portanto,

possam ser infectados com este agente. Entretanto, todas as amostras de soros das seis

espécies de felinos silvestres brasileiros, mantidos em cativeiro, testados pela técnica de

soroneutralização contra CDV e CPIV, apresentaram-se negativas.

Os resultados encontrados no presente estudo, levando-se em conta o método

diagnóstico utilizado, indicam que estes vírus não circulam nas espécies estudadas.

Outra possibilidade, é que tais espécies não sejam sensíveis a infecções com estes

agentes. Entretanto, como existem relatos da ocorrência de CDV em felinos silvestres

de vida livre ou cativos, assim como relatos indicando a possibilidade de infecção de

gatos domésticos com CDV, havia uma probabilidade de que felinos silvestres

brasileiros fossem, da mesma forma, susceptíveis a infecção por CDV (BLYTHE et al.,

1983; APPEL et al., 1994; HARDER et al.,1995; IKEDA et al., 2001). Cães domésticos

e guaxinins (Procyon lotor), foram responsabilizados por epizootias de CDV em

carnívoros de cativeiro em zoológicos e reservas animais (SEDGWICK & YOUNG,

1968; APPEL et al, 1974; CLEAVELAND et al, 2000; LEDNICKI et al., 2004). Assim,

é possível que a população de felinos de cativeiro amostrada neste estudo ainda não

tenha entrado em contato com o CDV, provavelmente devido ao fato de que os animais

potenciais transmissores destas infecções não circulem nos zoológicos de onde foram

coletadas as amostras. Quanto ao CPIV, da mesma forma não é impossível precisar se a

ausência de evidências de infecção se deu em função de que estas espécies não sejam

susceptíveis ao vírus, ou em função da inexistência de uma espécie transmissora

contaminada.

Muitas espécies de felinos silvestres, aqui estudadas, encontram-se incluídas na

lista oficial de espécies da fauna brasileira ameaçada de extinção, instituída pelo

IBAMA, como é o caso da onça-parda (CATROXO et al., 2004). Devido a este fato,

mesmo que os resultados sorológicos encontrados no presente estudo tenham revelado

que o CDV e o CPIV não circulam na população amostrada, estudos com felinos cativos

e, se possível de vida livre, visando à determinação da ocorrência destas e de outras

infecções, devem ser ampliados a fim de evitar possíveis perdas.

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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