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UFRRJ
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
VETERINÁRIAS
TESE
Avaliação experimental e estudos a campo relacionados
a Theileria equi (Laveran, 1901) Mehlhorn & Schein,
1998 em Canis familiaris no Município de Seropédica,
Rio de Janeiro, Brasil.
Gil Vicente Oliveira da Silva
2006
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ii
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
AVALIAÇÃO EXPERIMENTAL E ESTUDOS A CAMPO
RELACIONADOS A Theileria equi (LAVERAN, 1901) MEHLHORN &
SCHEIN, 1998 EM Canis familiaris NO MUNICÍPIO DE SEROPÉDICA,
RIO DE JANEIRO, BRASIL.
GIL VICENTE OLIVEIRA DA SILVA
Sob a Orientação do Professor
Carlos Luiz Massard
e Co-orientação do Professores
Fernando Queiroz Almeida & Jairo Dias Barreira
Tese submetida como requisito parcial
para obtenção do grau de Doutor em
ciências, no Curso de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias, Área de
Concentração em Parasitologia
Veterinária
Seropédica, RJ
Abril de 2006
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iii
636.089696
S586a
T
Silva, Gil Vicente Oliveira da, 1975-
Avaliação experimental e estudos a campo relacionados a Theileria equi
(Laveran, 1901) Mehlhorn & Schein, 1998 em Canis familiaris no
município de Seropédica, Rio de Janeiro, Brasil / Gil Vicente Oliveira da
Silva. – 2006.
49f. : il.
Orientador: Carlos Luiz Massard.
Tese (doutorado) – Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Instituto
de Veterinária.
Bibliografia: f. 39-49.
1. Babesiose – Seropédica(RJ) – Teses. 2. Babesiose em cavalo –
Seropédica(RJ) – Teses. 3. Cão – Infecções – Seropédica(RJ) – Teses. 4.
Protozoologia veterinária – Teses. I. Massard. Carlos Luiz, 1947- . II.
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro.Instituto de Veterinária. III.
Título.
iv
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
GIL VICENTE OLIVEIRA DA SILVA
Tese submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências, no
Curso de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, área de Concentração em Parasitologia
Veterinária.
TESE APROVADA EM 19/04/2006
Carlos Luiz Massard, Ph.D. UFRRJ
(Orientador)
Jairo Dias Barreira, Ph.D. FIOCRUZ
Nádia Regina Pereira Almosny, Ph.D. UFF
Guido Fontgalland Coelho Linhares, Ph.D. UFG
Assinatura
Romário Cerqueira Leite, Ph.D. UFMG
v
DEDICATÓRIA
“In memoriam: Ao meu Pai, VICENTE JOÃO DA SILVA, que sempre se orgulhou e vibrou
com cada avanço e entristeceu-se com cada queda na minha vida. Devo-lhe: O Dom de ser
quem sou, com todas as alegrias e agruras inerentes a isso; meu senso de honestidade,
trabalho e respeito ao próximo. Sinto-me extremamente honrado por ser seu filho! Não
receba um adeus, mas um até breve de minha parte! E de onde o senhor estiver, Pai me
conceda sempre sua Benção...”
“As minhas Menininhas: GIULIA, EMANUELLE & MARIANA DE JESUS DA SILVA, que
tenho a honra de Deus ter me concedido à incumbência de exercer a Paternidade.Vocês são,
minhas filhas, uma grande, senão, a maior motivação para que Eu siga em frente nos meus
objetivos e proposições.”
“ A minha Super Mãezona, JORGINA FRANCISCA OLIVEIRA DA SILVA, que desde a
minha mais tenra idade, foi coruja, mas não omissa e permissiva! Esta vitória, Mãe, também,
é sua! Sou Grato a Deus por ter me concedido a senhora com Anjo-da-Guarda.” “Obrigado
por sempre acreditar em Seu Filho.”
“ A minha Amada, Confidente & Companheira, EDNA SANTOS DE JESUS DA SILVA, que
sempre com seu equilíbrio, bom senso e principalmente Amor & Carinho, ajudou-me a
galgar mais um de meus objetivos. Edna nós estamos de parabéns! Obrigado por você fazer
parte de minha história e ter me concedido a privilégio de fazer parte da Sua.”
“ Ao meu Tio-Padrinho, JORGE MATIAS DE OLIVEIRA, que desde sempre foi um forte
pilar e exemplo em meu desenvolvimento quanto pessoa! E que certamente me tem e sempre
terá como um Filho.”
vi
AGRADECIMENTOS
Ao Professor CARLOS LUIZ MASSARD, do Departamento de Parasitologia Animal,
Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de janeiro (UFRRJ), pela
orientação, amizade e estímulo não somente na vida acadêmica, mas sobre tudo me prestigiou
diversas vezes com sua Sabedoria de vida. Causa-me profundo orgulho ser contado com um
de seus discípulos e amigos, desde a ocasião da Iniciação Científica.
Ao colega, incansável, paciente e organizado, HUARRISSON AZEVEDO SANTOS,
que me emprestou grande parte de seus dons e tempo e me concedeu o prazer do convívio a
amizade. Ao não menos dedicado, e parceiro JULIO TOMOMI TAJIRI parafraseando meu
orientador: Estes rapazes são “de ouro”.
Ao Dr. JAIRO DIAS BARREIRA, pelas suas sempre pertinentes considerações com
respeito à metodologia científica e, principalmente, por sua sincera amizade.
Ao Dr. GUIDO FONTGALLAND COELHO LINHARES, Departamento de Doenças
Parasitárias da Escola de Veterinária da Universidade Federal do Goiás por sua preciosa
orientação no tocante à logística e a execução dos exames de Biologia Molecular, bem como
nas estratégias para seu melhor aproveitamento e resultados, e por sempre estar disposto a
abrir as portas de seu Departamento, sem nenhum tipo de reserva ou ressalva.
A Doutoranda, CRISTIANE DIVAN BALDANI, Curso de Pós-Graduação em
Patologia Animal / UNESP / Jaboticabal pela sua disponibilidade, competência e boa vontade,
quanto à ajuda, necessária e relevante nos exames sorológicos, em mais uma etapa.
A minha “Mãe-científica”, Dr.ª NÁDIA REGINA PEREIRA ALMOSNY, do
Departamento de Patologia e Clínica Veterinária, Faculdade de Veterinária, Universidade
Federal Fluminense (UFF), por suas considerações sempre pertinentes, sua amizade,
confiança e sempre bom exemplo de caráter, que tenho o privilégio de dispor desde a
iniciação científica.
A Drª. ROSANGELA ZACARIAS MACHADO, Departamento de Patologia Animal /
UNESP / Jaboticabal, por estar sempre disponível a esclarecimentos concernentes a este e
outros trabalhos, bem como ter subsidiado a confecção dos exames sorológicos, nos cedendo
substrato necessário para confecção dos mesmos.
Ao Professor FERNANDO QUEIROZ DE ALMEIDA, por suas considerações sempre
pertinentes a respeito da organização e metodologia deste trabalho, bem como seu competente
apoio nos momentos em que o solicitei.
vii
Aos Colegas ANSELMO AFONSO GOLINSKY & KÁTIA ROBERTA
FERNANDES, Curso de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias / Parasitologia Veterinária
/ UFRRJ, por haverem cedido gentilmente as lâminas positivas para Babesia equi
provenientes de animais de seus próprios experimentos, para utilização nos testes sorológicos.
A todos os Professores do Departamento de Parasitologia Animal da UFRRJ, que
contribuíram decisivamente para a minha maturidade profissional com seus exemplos de
austeridade e bom senso que lhes é peculiar.
Aos senhores funcionários: OSVALDO, JORGE, ANTÔNIO, ARCANJO, GILMAR
MONTEIRO, JOÃO BENTO E GILMAR SACRAMENTO, dentre outros do Departamento
de Parasitologia Animal, pela presteza e apoio constante, durante o Curso de Doutorado.
A CAPES, que atuante quanto agente financiador e mantenedor ao longo de meu curso
proporcionou os subsídios indispensáveis para confecção e elaboração deste trabalho.
viii
“Meu filho, se aceitares as minhas palavras e guardares contigo meus mandamentos dando ouvido
atento à Sabedoria e inclinando teu coração para conheceres a prudência; se invocares a Sabedoria e clamares a
prudência; se a procurares como ao dinheiro, e a esquadrinhares como a um tesouro, então compreenderás o
TEMOR DO SENHOR e alcançarás o conhecimento de Deus. Porque é o Senhor quem dá a Sabedoria, e de sua
boca procedem Conhecimento e Prudência. Ele reserva habilidade aos retos e será um escudo para os que
caminham com integridade; protegerá as veredas de quem anda na justiça e os caminhos dos Santos guardará.
Então conhecerás a Justiça e o Direito, a Equidade e todo bom caminho, porque a Sabedoria entrará no teu
coração e o Conhecimento será o teu Prazer.”
Provérbios 2, 1-10.
ix
BIOGRAFIA DO AUTOR
GIL VICENTE OLIVEIRA DA SILVA, filho de VICENTE JOÃO DA SILVA e
JORGINA FRANCISCA OLIVEIRA DA SILVA, nascido a 20 de Abril de 1975, no bairro
de Campo Grande, na cidade do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro.
Cursou o primeiro Grau no Colégio Delta, Santa Cruz, Rio de Janeiro, do período de
1979 a 1986, de onde saiu com o 6º ano concluído e na Escola Municipal João Proença,
Campo Grande, Rio de janeiro, onde concluiu o 8º ano em 1988. Posteriormente ingressou no
Colégio Estadual Professor Fernando de Almeida Raja Gabaglia, Campo Grande, Rio de
Janeiro, onde cursou e concluiu o segundo grau em 1991.
Em Agosto de 1992, ingressou no Curso de Graduação em Medicina Veterinária na
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, município de Seropédica, Rio de Janeiro. Foi
durante a graduação Bolsista de Iniciação Cientifica – PIBIC/CNPq do Instituto de Biologia,
Departamento de Parasitologia Animal, no período de Julho de 1996 à Julho de 1997, sob a
orientação do Professor DR. CARLOS LUIZ MASSARD, desenvolvendo o projeto de título:
Ocorrência de Ehrlichia spp. em animais silvestres no Estado do Rio de Janeiro, auxiliando
também a coleta de material e dados para a tese de Doutoramento da DR.ª NÁDIA REGINA
PEREIRA ALMOSNY, e sob orientação da mesma, estagiou no Laboratório de Patologia
Clínica Veterinária da Faculdade de Veterinária, Departamento de Clínica Veterinária, na
Universidade Federal Fluminense, Vital Brasil, Niterói, Rio de Janeiro, no período de 1996 a
1997.
Ingressou no Curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária – Parasitologia
Veterinária, em Março de 2000, no qual defende a dissertação de Mestrado, versando sobre o
tema: Caracterização de uma área enzoótica peri-urbana no Estado do Rio de Janeiro com
avaliação de aspectos hematológicos e bioquímicos séricos e revisão bibliográfica sobre
Babesiose Eqüina no Continente Americano, defendido em Fevereiro de 2002.
Prestou concurso e ingressou no então Curso de Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias – Parasitologia Veterinária. Foi alocado no Programa de cooperação
interconstitucional (PROCAD / CAPES), ao qual tinha como responsável o DR. CARLOS
LUIZ MASSARD.
Participou como um dos consultores para testes de eficácia de produto babesicida e
anaplasmicida, solicitados a FAPUR pelo grupo Akzo Nobel – Divisão Intervet / saúde
animal
x
Participou ainda, de convênio interinstitucional envolvendo três instituições:
Universidade Estadual Norte-Fluminense / UFRRJ; Universidade Federal do Espírito Santo /
UFRRJ, a primeira participação deu-se como palestrante para a pós-graduação da primeira
instituição; a segunda participando como docente em aulas de parasitologia para o curso de
graduação em Medicina Veterinária, no Campus Alegre.
Durante a pós-graduação participou de vários eventos científicos institucionais e
nacionais, apresentando temas de sua especialidade. Em revistas cientificas publicou três
artigos em protozoologia e acarologia, todos relacionados à área da Medicina Veterinária
Preventiva, versando sobre carrapatos e doenças transmissíveis.
xi
RESUMO
SILVA, Gil Vicente Oliveira da. Avaliação experimental e estudos a campo relacionados a
Theileria equi (Laveran, 1901) Mehlhorn & Schein, 1998 em Canis familiaris no
Município de Seropédica – Estado do Rio de Janeiro – Brasil. Seropédica: UFRRJ, 2006,
49 p. (Tese–Doutorado em Ciências Veterinárias). Instituto de Veterinária, Departamento
Parasitologia Animal, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2006.
As piroplasmoses eqüinas são doenças que variam de progressão debilitante a fatal, tendo
como agentes causais às espécies Theileria equi e Babesia caballi. A manutenção dessas
espécies na natureza, bem como a habilidade de dispersão das mesmas, são fatores limitantes
quanto ao melhoramento genético dos plantéis eqüinos tendo em vista as restrições
internacionais referentes ao trânsito de animais acometidos com estes patógenos. No Brasil,
em termos econômicos estas parasitoses assumem grande vulto tendo em vista que o plantel
nacional de eqüinos é estimado em 5.800.000 de cabeças que somado aos asininos chega-se
ao total de 8.300.000. A elucidação dos elos referentes à história natural da doença, sobretudo
os que propiciam a perpetuação da mesma em nossos plantéis, torna-se urgente e necessário.
Nota-se que algumas espécies mantêm um convívio estreito com eqüídeos dentre as quais a
Canis familiaris. Com o propósito de avaliar a possibilidade da espécie C. familiaris estar
envolvida na cadeia epizootiológica da espécie T. equi, utilizamos duas abordagens:
experimental e epizootiológica. Para a primeira, utilizando materiais procedentes de dezessete
cães adultos e filhotes os quais foram divididos em três grupos: G
1
– Cães filhotes; G
2
– Cães
adultos; G
3
– Cães adultos e filhotes imunossuprimidos, mantidos livres de ixodídeos, desde a
ocasião do nascimento até o término das avaliações experimentais referentes à possibilidade
da espécie C. familiaris ser hospedeira viável de T. equi. Para avaliar o estabelecimento da T.
equi nestes animais, foram utilizadas para isto as seguintes ferramentas diagnósticas: aspecto
parasitológico - esfregaços sanguíneos à microscopia óptica de imersão; sorológico - por meio
de pesquisa de anticorpos anti-T. equi, utilizando a reação de imunofluorescência indireta
(RIFI); e molecular, utilizando quatro diferentes protocolos de reação de polimerização em
cadeia (PCR), nos seguintes materiais: sangue total com EDTA; fragmentos de diversos
órgãos; ninfas de Boophilus microplus e adultos de Rhipicephalus sanguineus. No segundo
momento, Avaliou-se, por três vezes, doze cães provenientes de área de estabilidade enzoótica
para T. equi com estreita convivência com cavalos desde a ocasião de seus nascimentos,
utilizou-se para isto a MOI e RIFI, formando o grupo G4. Os resultados foram negativos em
todas as observações. Conclui-se que a espécie T. equi não se mostrou hábil quanto ao
estabelecimento e desenvolvimento em C. familiaris, e que esta espécie não está envolvida na
cadeia epizootiológica natural da T. equi, no Município de Seropédica, Estado do Rio de
Janeiro, Brasil.
Palavras chave: epizootiologia; equino; piroplasmose.
xii
ABSTRACT
SILVA, Gil Vicente Oliveira da. Experimental Assessment and Field studies about
Theileria equi (Laveran, 1901) Mehlhorn & Schein, 1998 in Canis familiaris in
municipality of Seropédica – State of Rio de Janeiro – Brazil. Seropédica: UFRRJ, 2006,
49 p. (Thesis Doctor Science in Veterinaries Sciences). Veterinary Institute, Animal
Parasitology Department, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ,
2006.
The equines piroplasmosis are diseases that may cause debilitating progress or fatal episodies,
its etiologic agents are the species Theileria equi and Babesia caballi. The maintenance of
these species in nature, as well as the widespread ability, are limitants factor to genetic
improvement of equines herds in view of the internationals restrictions referring the
accomited animals transit with these patogens. In Brazil, in economic terms these patogens
have a great importance because the national erd is stimated in 5,800,000 of animals, that
dropped with the asinines, arrive in 8,300,000 of animals. The eluciding of links to the natural
disease history, overall the ones that propitiate the perpetuation of it in our herds, becomes
urgent and necessary. Note that some species have a sight convivence with equines, among it
is the Canis familiaris. With purpose to evaluate the possibility of C. familiaris to be involved
on epizootiologic natural chain of T. equi, we used two boarding: experimental and
epizootiologic. For the first, using material from seventeen dogs and puppies that were
divided in three groups: G1 – Puppies; G2 – Dogs; G3 – immunossuprimitted dogs and
puppies, both ixodids-free since birth until end of experimental evaluations referring the
possibility to C. Familiaris to be a able host to T. equi. to evaluate the occurrence of T. equi in
these animals, were used some diagnostic tools, as follow: parasitologic aspect – blood smears
in immersion optical microscopy (IOM); sorology: using research of antibodies against T.
equi, with immunofluorescence indirect test (IFT); and molecular – using four differents
protocols of polimerase chain reaction (PCR), in follow material: blood with EDTA; fragment
of tissues; Boophilus microplus nymphs and Rhipicephalus sanguineus in adult stage. In the
second moment, evaluated, for three times, twelve dogs from enzootic stability area to T. equi
with a sight convivence with horses since birth occasions, using for it IMO and IFT, forming
G4 group. The results were negatives in all observations. Concluding that the T. equi specie
did not show the ability to establishment and development in C. Familiaris; and that specie do
not involved in epizootiologic natural chain of T. equi, in municipality of Seropedica, State of
Rio de Janeiro, Brazil.
Key words: epizootiology; equine, piroplasmosis.
xiii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 1
2 REVISÃO DE LITERATURA 3
2.1 Histórico dos Agentes Etiológicos de Piroplasmoses em Eqüinos e Cães 3
2.2 Posição Taxonômica 5
2.3 Vetores das Piroplasmoses Eqüinas no Mundo 6
2.4 Sinais Clínicos e Patologia Clínica das Piroplasmoses Eqüina 6
2.5 Epidemiologia das Piroplasmoses Eqüinas no Mundo 8
2.5.1 Epidemiologia nos continentes asiático, africano e europeu 8
2.5.2 Epidemiologia na América do norte e central 10
2.5.3 Epidemiologia na américa do sul 10
2.5.4 Epidemiologia no Brasil 11
2.6 Piroplasmoses Canina no Mundo 12
2.6.1 Babesia canis (PIANA & GALLI-VALÉRIO 1895) 12
2.6.2 Babesia gibsoni (PATTON, 1910) 14
2.6.3 Rangelia vitalii (PESTANA, 1910) 17
2.6.4 Theileria annae ZAHLER, RINDER, SCHEIN & GOTHE, 2000. 18
2.6.5 Theileria equi (LAVERAN, 1901) MEHLHORN & SCHEIN, 1998. 19
2.7 Diagnóstico 20
3 MATERIAL E MÉTODOS 22
3.1 Local de Execução 22
3.2 Origem do inoculo, cálculo da parasitemia e inoculação experimental de T.
equi em Canis familiaris
22
3.3 Origem, formação dos grupos e manutenção de C. familiaris 22
3.3.1 Avaliação dos aspectos clínicos dos cães 23
3.3.2 Protocolo de imunossupressão 23
3.4 Origem, obtenção e manutenção de carrapatos 24
3.4.1 Larvas de Boophilus microplus livres de Babesia spp 24
3.4.2 Obtenção ninfas de Rhipicephalus sanguineus livres de parasitos do
gênero Babesia
24
3.4.3 Procedimento de infestação nos espécimes C. familiaris adultos 25
3.5 Coleta de Amostras de Sangue 25
3.5.1 Parasitologia 25
xiv
3.5.2 Hematologia, sorologia e biologia molecular 26
3.6 Coleta de amostras de outros tecidos 26
3.6.1 Biopsia de linfonodos 26
3.6.2 Fragmentos de outros órgãos Post-morten 26
3.7 Hematologia: 27
3.8 Sorologia: 27
3.8.1 Origem do extrato antigênico 27
3.8.2 Confecção da reação de imunofluorescência indireta 27
3.9 Biologia Molecular 28
3.9.1 Escolha dos protocolos 28
3.9.2 Extração de DNA 28
3.9.3 Reações em cadeia de polimerase 29
3.9.4 Controle positivo para PCR 29
3.9.5 Confecção da eletroforese 29
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 30
4.1 Grupos G1 e G2 30
4.1.1 Aspectos clínico-parasitológicos 30
4.1.2 Aspectos sorológicos 30
4.1.3 Aspectos moleculares 30
4.2 Grupo G3 34
4.2.1 Aspectos clínico-parasitológicos 34
4.2.2 Aspectos moleculares 34
4.2.3 Aspectos biológicos 35
4.3 Grupo G4 37
4.3.1 Aspectos parasitológicos 37
4.3.2 Aspectos sorológicos 37
5 CONCLUSÕES 39
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 40
ÍNDICE DE TABELAS E FIGURAS
Tabela 1 Distribuição, utilizando ferramentas de diagnóstico sorológicos, nos continentes
asiáticos, europeu e africano das espécies Theileria equi e Babesia caballi
Tabela 2 Distribuição geográfica da espécie Babesia canis em canídeos
Tabela 3 Distribuição geográfica da espécie Babesia gibsoni em canídeos
Figura 1 Variação da temperatura dos cães filhotes Grupo 3, inoculados com Theileria
xv
equi, no período de Julho 2004 à Setembro 2004
Figura 2 Variação da temperatura dos cães adultos Grupo 2, inoculados com Theileria
equi, no período de Novembro 2004 a Janeiro 2005.
Figura 3 Variação da temperatura dos cães adultos imunossuprimidos do Grupo 3,
inoculados com Theileria equi, no período de Setembro à Outubro 2005
1
1 INTRODUÇÃO
As Piroplasmoses eqüinas são doenças anemiantes que possuem ampla distribuição
mundial. É importante lembrar que somente 10% do plantel eqüino mundial estão alocados
em áreas de instabilidade enzoótica, o que na ocasião da exposição aos agentes causais podem
apresentar diversos tipos de danos, principalmente nos quadros agudos, que não raramente
evoluem para morte. Trata-se de parasitoses que acometem preferencialmente a família
Equidae, tendo como agentes etiológicos: Babesia equi e Babesia caballi.
Recentemente, os avanços nas áreas de biologia molecular, sobretudo nas avaliações
de sequenciamento e filogenia, e das observações da ocorrência de esquizogonia pré-
eritrocítica em B. equi; houve uma variação quanto aos táxons gênero e família, na espécie B.
equi, que passando a ser designada: Theileria equi; Família Theileriidae.
Espécies de piroplasmídeos são transmitidas por carrapatos da família Ixodidae,
diferindo, entretanto, na transmissão: horizontal ou transestadial, no tocante à espécie B. equi
(=T. equi); e vertical ou transovariana, na espécie B. caballi. Existindo alguns relatos que
contrariam essas afirmativas, tais como: Hyalomma anatolicum anatolicum, na espécie B.
equi (=T. equi) (NEITZ, 1956a) e Rhipicephalus evertsi evertsi, em B. caballi (DE WAAL &
POTGIETER, 1987), respectivamente.
O estado portador assintomático dos equinos facilita a disseminação dos agentes B.
equi (=T. equi) e B. caballi, em locais de instabilidade enzoótica, motivando a comunidade
científica de modo geral, a buscar meios de diagnósticos cada vez mais exeqüíveis e sensíveis,
para a detecção destes hemoparasitos. Cabe ressaltar que, por questões ecológicas o manejo
integrado de artrópodes, sobretudo o voltado para o controle de carrapatos, torna-se urgente à
indicação de medidas sanitárias adequadas para o controle destas parasitoses, ficando os
aspectos iatrogênicos e de transmissão vertical entre os hospedeiros vertebrados, em segundo
plano.
Quanto aos métodos diagnósticos, foi consenso internacional a utilização do Teste de
Fixação de Complemento (TFC), descrito primeiramente para a espécie B. caballi por. Esta
técnica foi mais tarde adotada e padronizada pelo “United States Departament of Agriculture”
(USDA) no ano de 1969, passando a ser utilizada como de referência internacional. Desde
então, este teste é obrigatório na ocasião de importação de cavalos para os mais variados fins,
ganhando especial notoriedade no intercambio e exportação entre áreas de estabilidade para
áreas de instabilidade enzoótica. A utilização da microscopia óptica, em esfregaços
sanguíneos corados por diversos métodos, sobretudo o de Giemsa, mostra-se extremamente
conclusivo quanto à existência desses agentes etiológicos, porém não apresentem um grau de
sensibilidade seguro, havendo assim, a possibilidade de diagnósticos falsos negativos. O
desenvolvimento de novos instrumentos de diagnósticos proporciona um amplo espectro de
escolha quanto à relação sensibilidade e especificidade, tanto nos testes detecção direta, tais
como: “Single-round Polimerase Chain Reaction (PCR)” e “Nested-round PCR”; Cultivo em
eritrócitos; Teste de aglutinações em tubos capilares; Como nos de detecção indireta: Reação
de Imunofluorescência Indireta (RIFI), “Enzyme Linked Immunosorbent Assay” (ELISA),
tanto o simples quanto o de inibição competitivo.
Recentemente com a utilização da PCR a B. equi (=T. equi) pode ocorrer em Canis
familiaris, e B. canis, em Equus caballus. Os autores dessa afirmativa utilizaram marcadores
específicos para cães, para eximir o achado de qualquer suspeita de má-manipulação. A
observação desta relação não é entendida pelos mesmos, como imprópria tendo em vista a
estreita relação que estas espécies apresentam, principalmente em meios rurais e sugeram
assim a existência de uma antiga relação entre parasito-hospedeiro, nas espécies em questão.
A pesquisa direcionada ao esclarecimento dos elos epidemiológicos, principalmente
no que tange manutenção desses parasitos na natureza, assume um grande vulto do ponto de
2
vista científico e econômico. A eqüinocultura no Brasil vem destacando-se quanto à melhoria
do aspecto genético e na qualidade de nossos animais, especialmente em competições
eqüestres no âmbito mundial. A eqüinocultura é um setor de nossa economia, que gera divisas
e empregos em nosso País. O Plantel eqüino no Brasil já ultrapassa 5.700.000, que somados
aos outros solípedes chega a 8.300.000 .
Este trabalho teve por objetivo verificar se em condições naturais e experimentais, a
espécie C. familiaris esta envolvida na cadeia epidemiológica de B. equi (=T. equi),
comportando-se como reservatório para esta espécie própria de solípedes em geral, sobretudo
na espécie E. caballus.
3
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Histórico dos Agentes Etiológicos de Piroplasmoses em Eqüinos e Cães
BABÉS (1888), ao avaliar sangue proveniente de bovinos com hemoglubinúria e
febredo delta do Rio Danúbio na Romênia descreveu a ocorrência da espécie Hematococcus
bovis. Mais tarde, STARCOVICI (1893) propôs a criação do gênero Babesia em homenagem
ao pesquisador romeno, primeiro observador destes hemoparasitos.
PATTON (1895) descreveu o gênero Piroplasma, para hemoparasitos
intraeritrocíticos não pigmentados que apresentam elementos esféricos, piriformes ou ovóides,
e de grande proporção com relação aos eritrócitos que se multiplica por divisão binária, os
gametas, se existentes, eram tidos como incomuns. A sua multiplicação se efetua em
ixodídeos que os transmitem para suas proles. Em alguns casos, podendo ocorrer a
transmissão transestadial principalmente em carrapatos heteroxenos.
A descoberta em cães de caça na província de Lombardia, na Itália, de parasitos
intraeritrocíticos grandes, com relação ao diâmetro do eritrócito, piriforme e ovóide, foram
designados por PIANA & GALLI-VALÉRIO (1895), como Piroplasma canis.
DIONISI (1898), descreveu o gênero Achromaticus como parasitos não pigmentados
em hemácias e que se apresentam de forma piriforme ou arredondada, e com “grande”
dimensão se comparados com o diâmetro dos eritrócitos. Observou também que, o local de
esquizogônia era incerto, mas que ao nível dos eritrócitos, realizavam divisão do tipo binária.
Naquela época esses autores antes acreditaram ser este gênero a fase de transição evolutiva
entre os gêneros Plasmodium e Piroplasma.
A babesiose eqüina foi durante muito tempo caracterizado como “síndrome” por
veterinários na África do Sul, como citou THEILER (1901). Este autor enviou a França aos
cuidados de LAVERAN, que ao examinar amostras de sangue eqüino, caracterizou e
descreveu o agente etiológico como Piroplasma equi. Mais tarde, THEILER (1902)
comprovou a existência da diferença etiológica entre a febre biliar, causada por vírus e
piroplasmose eqüina causada por protozoários.
BETTENCOURT, FRANÇA E BORGES (1907) Apud BRUMPT (1936),
descreveram o gênero Theileria como parasitos intraeritrocíticos, que apresentam formas de
bacilos, ovóides e piriformes de “pequeno porte”, dividindo-se em dois e estes evoluindo para
4 formas, trofozoíticas. Ressaltaram que os elementos que formavam a cruz eram bem
pequenos, arredondados e quase que exclusivamente compostos de cromatina. Na descrição
da esquizogonia, observaram que a mesma ocorria em gânglios linfáticos. O gênero possui
ixodídeos como hospedeiros invertebrados, não sendo descrita, porém, a transmissão do tipo
transovariana.
Mais tarde, FRANÇA (1909), propõe a criação de um novo gênero para espécie
Piroplasma equi, passando esta a ser classificada como Nuttallia equi (LAVERAN, 1901)
FRANÇA, 1909. Isto se baseou na presença de formas em cruz, que apresentavam um
protoplasma mais abundante que o gênero Theileria. Esse gênero foi considerado impróprio
para o parasito de eqüinos por se tratar de um nome pré-ocupado por um molusco bivalvo da
América do Norte (PEIRCE, 1975 Apud LINHARES, 1994).
Posteriormente, PATTON (1910), descreveu a presença de pequenas formas
parasitárias, com diversos aspectos: anelar, ovóide (ligeiramente maior), em cães de caça em
Madras, Índia, designando a nova espécie como Piroplasma gibsoni, em homenagem ao Dr.
F. M. GIBSON, que foi o primeiro a observar este agente etiológico.
4
Ao avaliarem a etiologia da febre biliar dos eqüídeos inoculados com a cepa sul-
africana, NUTTALL & STRICKLAND (1912), encontraram além do Piroplasma equi, um
parasito intraeritrocítico maior, distinto, o qual considerou em definitivo como uma nova
espécie, demonstrando a ocorrência de uma outra espécie nas hemácias dos eqüinos. Esta
espécie foi designada Piroplasma caballi.
DE KOCK (1918) publicou um trabalho relatando o insucesso do tratamento da
nuttalliose em cavalos, com o uso de uma gama de componentes químicos como o azul de
trypan, o qual foi efetivo para B. caballi.
KELSER (1922) reportou a epizootia da doença em 17 cavalos do exército dos EUA,
que desembarcaram no Panamá. A associação do ixodídeo Anocentor (Dermacentor) nitens
(NEUMANN, 1897) com piroplasmose eqüina, incriminando-o como possível agente
transmissor da B. caballi, identificando o último como o agente etiológico da doença. NEITZ
(1956) revisou a classificação dos piroplasmídeos, colocando os gêneros Nuttallia,
Achromaticus e Piroplasma, como sinonímias do gênero Babesia STARCOVICI, 1893, da
família Babesiidae POCHE. Assim, esse autor considerou o gênero Babesia, como único da
família Babesiidae, caracterizando-o pelo tipo e local de reprodução no hospedeiro vertebrado
(divisão binária em eritrócitos) diferentemente do gênero Theileria da família Theileriidae a
qual se caracteriza por divisão esquizogônica em leucócitos e invasão de eritrócitos.
A piroplasmose eqüina tomou proporções endêmicas nos Estados Unidos da América
(EUA) em 1961, devido à importação de animais originários de Cuba, região endêmica para a
enfermidade, que chegaram Flórida, e que possivelmente disseminaram a doença para outros
estados, devido ao intenso trânsito de cavalos e presença do vetor A. nitens, transmissor de B.
caballi (ROBY & ANTHONY, 1963; BRYANT et al., 1969; THOMPSON, 1969;
BRÜNNING, 1996). Nos EUA foi verificada a presença de outras espécies de carrapatos
considerados potenciais vetores, a saber: o Rhipicephalus sanguineus LATREILLE, está
presente na maioria dos estados em maior incidência nos Estados da Flórida e Nova York e o
A. nitens na Flórida. O R. sanguineus pode transmitir por via transovariana B. caballi por
quatro gerações (MAURER, 1962).
Segundo FRIEDHOFF (1990), com a colonização americana, foram trazidas várias
espécies de carrapatos do Velho Mundo, que parasitavam os animais domésticos e que se
adaptaram muitos bem nas Américas e com o passar dos anos, principalmente devido às
contínuas exportações de animais, carrapatos das Américas, também se adaptaram muito bem
no Continente Europeu; o que demonstra a capacidade de adaptação dos vetores favorecendo
a transmissão de agentes patogênicos em vários continentes.
ZAHLER, RINDER, SCHEIN & GOETHE (2000), descreveram a ocorrência de um
pequeno piroplasmídeo, fenotipicamente idêntico a B. gibsoni, mas geneticamente mais
relacionado à espécie B. microti, sugerindo a designação Theileria annae, para este parasito.
5
2.2 Posição Taxonômica
Reino: Protista
Sub-reino: Protozoa (GOLDFUSS, 1818)
Filo: Apicomplexa LEVINE, 1970.
Classe: Sporozoea LEUCKART, 1879.
Subclasse: Piroplasmea LEVINE, 1961.
Ordem: Piroplasmida WENYON, 1926.
Família: Theileriidae DU TOIT, 1918; Babesiidae POCHE, 1913
Gênero: Theileria BETTENCOURT, FRANÇA & BORGES, 1907; Babesia STARCOVICI,
1893.
Espécie: Theileria equi (LAVERAN, 1901) MEHLHORN & SCHEIN, 1998; Babesia caballi
(NUTTALL & STRICKLAND, 1910).
A utilização de aspectos de filogenia para fins taxonômicos, indubitavelmente, traz
clarezas e dúvidas com respeito às classificações das inúmeras espécies. Torna-se urgente à
adequação dos aspectos: fenotípicos, biológicos e genéticos, a fim de se encontrar o consenso
a respeito da sistemática de eucariotes e procariotes, objetivos este que encontrasse celebrado
na taxonomia polifásica (UILENBERG et al. 2004).
A discussão sobre a posição da espécie Theileria equi, é um assunto que apresenta
discordância, no meio científico desde o inicio do século XX. A discordância reside em fatos
referentes a sua biologia, a despeito de diferenças significativas desta espécie com as demais
espécies do gênero Babesia, tais como: I - O desenvolvimento no hospedeiro vertebrado que,
ao contrário das outras espécies, apresenta formas de multiplicação em linfócitos, de acordo
com os trabalhos realizados in vitro e in vivo (SCHEIN et al., 1981; MOLTMANN et al.,
1983); II – B. equi (=T. equi) apresenta metabolismo distinto, demonstrado pela alta
resistência a ação dos compostos babesicidas (MEHLHORN & SCHEIN, 1984); III – A
presença de citóstoma e de uma estrutura alimentar tubular em trofozoítos de B. equi (=T.
equi) (SIMPSON et al., 1967; FRERICHS & HOLBROOK, 1969; SIMPSON & NEAL,
1980). Tais aspectos sugerem que a espécie Babesia equi está mais próximas ao gênero
Theileria do que ao gênero Babesia. Baseando-se nestes aspectos, e, sobretudo no uso de
instrumento da filogenia molecular, MEHLHORN & SCHEIN (1998), propuseram a mudança
taxonômica para: Theileria equi (LAVERAN, 1901) MEHLHORN & SCHEIN, 1998.
Cabe ressaltar, porém, que outros autores discordam desta grafia, tendo em vista que a
B. equi, não se apresenta como uma Theileria clássica ao nível de filogenia molecular
(KJEMTRUP et al., 2000; CRIADO-FORNÉLIO et al. 2003; NAGORE et al., 2004). No
entanto existe outra linha de pesquisa que prefere criar uma nova família para B. equi (=T.
equi), que possivelmente se denominaria Nicollidae e seu nome passaria a ser Nicollia equi,
sendo também futuros Integrantes desta família: B. microti e B. rodhaini. (COX, 1994).
Neste trabalho, adotaremos a terminologia T. equi, proposta pelos autores
MEHLHORN & SCHEIN (1998). Embora entendamos que os aspectos fenotípicos e de ciclo
de vida impulsionam a criação de um novo gênero, até então esta proposta nos parecer mais
razoável, em concordância com UILENBERG et al. (2004).
6
2.3 Vetores das Piroplasmoses Eqüinas no Mundo
ENIGK (1943, 1944) In SOULSBY (1987) revisou as espécies de ixodídeos que são
incriminados pela transmissão de B. equi (=T. equi), a saber: Dermacentor reticulatus
(Europa), Hyalomma excavatum e H. plumia (Grécia e Ásia Central), H. dromedarii (Norte da
África), Rhipicephalus bursa e R. turanicus ( Antiga União das Repúblicas Socialistas
Soviética), R. evertsi (África do Sul), Rhipicephalus sanguineus (LATREILLE, 1806) (Ásia
Central e África do Norte). O mesmo autor sugere que as espécies B. equi (=T. equi) e B.
caballi, são antagônicas e que a B. equi (=T. equi) apresenta-se mais freqüente, minimizando
a ocorrência de B. caballi. Trabalhos recentes desenvolvidos na Mongólia por BATTSETSEG
et al., (2001) demonstram que ao nível do hospedeiro intermediário Dermacentor nuttalli,
observou-se através de aspectos biomoleculares a ocorrência de 10 e 12,9% para B. equi (=T.
equi) e B. caballi, de ocorrência, nos ixodídeos estudados.
NEITZ (1956a) verificou que alguns vetores de B. caballi permanecem com o poder
de infectividade por duas gerações, sem se alimentar em animal infectado, enquanto que
outros, mantêm a infecção por somente dois estágios sucessivos, do ciclo de vida de uma
geração. Para este autor, os vetores de B. caballi seriam três espécies do gênero Dermacentor:
D. marginalus (= D. reticulatus), D. pictus e D. silvarum; quatro do gênero Hyalomma: H.
volgense, H. anatolicum (= H. excavatum), H. marginatum e H. dromedarii;que fora recém
introduzida em nossa plataforma continental (Massard et al., 2001) e duas do gênero
Rhipicephalus: R. sanguineus e R. bursa. Os vetores de B. equi (=T. equi) seriam duas
espécies do gênero Dermacentor: D. marginatus e D. pictus, quatro espécies do gênero
Hyalomma: H. anatolicum anatolicum, H. marginatum detritum, H. excavatum e H. uralense
detritum, e três espécies do gênero Rhipicephalus: R. bursa, R. sanguineus e R. evertsi. B.
equi (=T. equi) é transmitida predominantemente pela via transestadial, exceto aespécie H.
anatolicum anatolicum, que faz transmissão transovariana. (NEITZ, 1956b).
ERSHOV (1956) In: SOULSBY (1987) sugeriu a existência de antagonismo quanto a
ocorrência no hospedeiro vertebrado, entre as duas babesias, que as infecções por B. equi (=T.
equi) são mais freqüentes do que as produzidas por B. caballi.
O vetor de B. equi (=T. equi), ainda é desconhecido na França, suspeitando-se ser o
Rhipicephalus bursa (MOREL, 1981).
No Marrocos, B. equi (=T. equi) foi isolada de carrapatos adultos naturalmente
infectados da espécie H. marginatum (MOLTMANN et al., 1983).
Dentre as espécies que acometem eqüídeos de modo geral, as principais são:
Anocentor nitens e Amblyomma cajennense, porém demonstraram-se incapazes de transmitir a
espécie B. equi (=T. equi) experimentalmente (STILLER & COAN, 1995).
Trabalhos recentes reportam a transmissão experimental de B. equi (=T. equi) por
Boophilus microplus (CANESTRINI, 1887) que demonstraram através da microscopia
eletrônica de transmissão, que B. equi (=T. equi) é capaz de se multiplicar em glândulas
salivares de B. microplus na fase adulta, demonstrando a capacidade de transmissão biológica
transmissão transestadial desse hemoparasito. Este fato sugere que o B. microplus
possivelmente possa ser um transmissor natural da B. equi (=T. equi), esta espécie possa se
tratar do provável vetor onde se observa que não existe nenhuma outra espécie de vetor
possível, concomitantemente, constitua a única espécie ou a espécie predominante encontrada
em eqüídeos (CUNHA, 1993; GUIMARÃES et al., 1998ab), justificando sua presença em
partes da América Latina, dentre as quais o Brasil.
2.4 Sinais Clínicos e Patologia Clínica das Piroplasmoses Eqüinas
Os parasitos Babesia equi e B. caballi são agentes etiológicos distintos, que se diferem
morfologicamente, biologicamente, pelo modo de transmissão nos vetores e no período de
7
incubação das enfermidades por elas causadas, que variam de 10 a 30 dias para B. caballi (DE
WAAL, 1990) e 12 a 19 dias para B. equi (=T. equi) (DE WAAL, 1992).
A piroplasmose clínica ocorre principalmente em duas circunstâncias: a primeira
quando movimento de cavalos susceptíveis para áreas endêmicas, a segunda quando cavalos
portadores são movidos para áreas não endêmicas, mas que contêm vetores, capazes de
transmitir as espécies de Babesia a cavalos susceptíveis (KNOWLES, 1988).
A severidade das infecções por B. equi (=T. equi) e B. caballi está intimamente ligada
ao número de parasitos que induzem a primo-infecção e das taxa de reprodução da amostra
dos parasitos envolvidos. Observou-se que existem diferenças notórias, no que tange a
apresentação geral da infecção grave por B. caballi em comparação com a B. equi (=T. equi)
(MASSARD, 1993).
Em geral as infecções graves de B. caballi resultam em disfunções de diversos órgãos
devido às aglomerações dos parasitos desta espécie nos capilares viscerais, resultando em
fragilidade capilar com rompimento e escape de eritrócitos (hemorragias). No fígado observa-
se atrofia e degeneração da veia centrolobular e necrose. Nos casos agudos de infecção por B.
caballi, os sintomas são freqüentemente caracterizados por: inapetência, febre com
temperatura acima de 40ºC, mucosas congestas, taquicardia e taquipnéia. A infecção por B.
equi (=T. equi), resulta principalmente na destruição de eritrócitos, devido à intensa
multiplicação intraeritrocitária sobrevindo à morte por anemia (HOLBROOK, 1969).
Nos casos agudos de infecções por B. equi (=T. equi), o sintoma característico é a
febre, muitas vezes de natureza intermitente, com temperatura variando de 39,5º a 42,3ºC
(TAYLOR et al., 1969) em casos mais graves, pode ocorrer hemoglobinúria (SIPPEL et al.,
1962; RETIEF, 1964; RUDOLPH et al., 1975). É comum observar-se mucosas pálidas ou
ictéricas, com petéquias, equimoses e edemas de membros. Há casos em que sintomas
digestivos podem estar associados, tais como: cólica, constipação, fezes mucoídes
freqüentemente seguidas de diarréia ou fezes ressecadas, principalmente em casos de infecção
por B. equi (=T. equi) (LITTLEJOHN, 1963 In: BONE et al., 1963).
As enfermidades causadas por B. equi (=T. equi) ou B. caballi, apresentam algumas
sintomas semelhantes, que podem ocorrer em maior ou menor grau de intensidade,
dependendo do parasitismo e da resistência individual do hospedeiro (SOULE et al. 1984),
vale ressaltar, que eqüinos adultos, importados de áreas indenes e introduzidos em regiões
endêmicas, são consideravelmente mais susceptíveis ao desenvolvimento de um quadro mais
severo da doença (SIPPEL et al., 1962). Estudos recentes desenvolvidos por MUJICA et al.
(2002), no Estado do Rio de Janeiro-Brasil, demonstrou um quadro clínico de infecção aguda,
por B. caballi, em eqüino sensível destacando a presença de anemia, icterícia, balanopustite e
fezes com secreção do tipo mucoíde.
Em infecções agudas por B. equi (=T. equi), o hemograma demonstra na série
vermelha, anemia do tipo microcítica hipocrômica ou anemia normocítica normocrômica
(SCHEIN, 1988). Em 53 casos agudos a campo no Chile, observou-se anemia normocítica
normocrômica (RUDOLPH, 1971). Na série branca geralmente se encontra neutropenia,
linfopenia, eosinopenia e aumento significativo do número de monócitos (RUDOLPH et al.,
1975), além de decréscimo do fibrinogênio e elevadas concentrações de bilirrubina plasmática
(RISTIC, 1985).
Embora, em outras localidades, autores citaram que os casos clínicos de B. caballi são
clinicamente inaparentes e raramente responsáveis por anemias severas entre outros sintomas
(DE WAAL, 1992).
A parasitemia, raramente excede a 1% em infecções por B. caballi e geralmente em
infecções por B. equi (=T. equi) se encontram na faixa de 1 a 7%, mas em alguns casos
podem chegar a 80% (FRIEDHOFF et al., 1990).
8
Os animais portadores crônicos, principalmente de B. equi (=T. equi), são os que
causam maior preocupação e prejuízos.
2.5 Epidemiologia das Piroplasmoses Eqüinas no Mundo
2.5.1 Epidemiologia nos continentes asiático, africano e europeu
As espécies que provocam as piroplasmoses eqüinas são de ampla distribuição
mundial, sendo consideradas limitantes quanto a pecuária eqüina bem com no
desenvolvimento genético de raças nativas. Podemos listar dentre os países nos diferentes
continentes (Asiático, Europeu e Africano), em cujos plantéis eqüinos, são acometidos por
estes agentes etiológicos, conforme listado na Tabela 1.
9
Tabela 1: Distribuição, utilizando ferramentas de diagnósticos sorológicos, nos continentes
Asiáticos, Europeu e Africano das espécies de Theileria equi e Babesia caballi.
Autor País
Método de
Diagnóstico
T.equi
%
B.caballi
%
Ambas
%
DONELLY et al. (1980) Kuwait RIFI 77,1 11,4 ---
CAMACHO et al. (2005) Espanha RIFI 40 28 20
XUAN et al. (2002) China (Xinjianj)
Elisa
Recombinante
40 24,3 15,7
BOLDBAATAR et al. (2005) Mongolia Elisa 72,8 40,1 30,7
XU et al. (2003) China (Jilin) Elisa 34 32 12
IKADAI et al. (2002) Japão Elisa 2,2 5,4 ---
RHALEM (2001) Marrocos Elisa
SHKAP et al. (1998) Israel
RIFI e Elisa
Competitivo
95,7 --- ---
AVARZED et al. (1997) Mongolia RIFI 88,2 84,5 ---
GUMMOW et al. (1996)
Províncias do Sul da
África
RIFI
61 40 ---
BOCH (1985) Alemanha RIFI 5,6 1,25
DONNELLY et al. (1980) Oman RIFI e TFC
75 (TFC) e
97,7 (RIFI)
40,9
(TFC) e
40,9
(RIFI)
---
MALHOTRA et al. (1978) Índia (Rajasthan) TCA 96,4 --- ---
POTGIETER et al. (1992) África do Sul RIFI 70,6 37
TENTER et al. (1986) Sudão TFC e RIFI
68,1(TFC) e
94,5(RIFI)
--- ---
10
2.5.2 Epidemiologia nas Américas do norte e central
Com o advento da padronização do TFC, atenuaram-se as eventuais discordâncias de
dados no “National Veterinary Service Laboratories” (USDA) entre os anos de 1986-1990
que revelaram: em 65.911 soros de eqüinos de várias raças que passaram pelas estações de
quarentena, e de 67.517soros testados para infecção por B. equi (=T. equi), 5.246 (7,8%)
foram soropositivos (ZAUGG & LANE, 1992).
Observa-se um quadro díspar do anterior quando se trata da América central. Nestes
animais, cerca de 1/3 do plantel destinado às importações para os EUA, eram soropositivos
para uma ou ambas as babesias. Em Porto Rico, 89% dos cavalos examinados eram
soropositivos para B. caballi e 25% para B. equi (=T. equi) (HOLBROOK et al., 1969).
2.5.3 Epidemiologia na América do Sul
No Chile e na Argentina no período de 1970 a 1972, cavalos de corrida e de salto
foram vendidos para os EUA, sendo rejeitados na estação de quarentena de Miami e
devolvidos aos países de origem, à custa de seus proprietários. Este fato causou grande
impacto no comércio internacional de cavalos, por serem os animais portadores
assintomáticos de Babesia sp. Inquéritos epidemiológicos posteriores, demonstraram que
havia animais portadores assintomáticos nesses países sul-americanos. A espécie de carrapato
mais encontrada parasitando cavalos no Chile foi o Otobius megnini (DUGÉS, 1883 Apud
PEREIRA, 1999), mas não foi comprovado ser esta espécie a veiculadora de Babesia sp. aos
eqüinos chilenos (RUDOLPH, 1971).
Exames sorológicos em haras de criação e "studs" na Província de Santiago no Chile
revelaram que de um total de 24 haras, foram selecionados 18 correspondentes àqueles que
tinham mais 10 animais por plantel. A população foi de 912 animais, dos quais 605 eram
adultos (com seis a 19 anos) e 307 eram potros (com menos de um ano). Por limitação
quantitativa de antígeno para o teste TFC, foram escolhidos 118 adultos e 62 potros, num total
de 180 animais, que correspondem a 20% da população. 30% dos cavalos adultos e 22,6% dos
potros mostraram a variação de decréscimo de títulos de anticorpos ao TFC, contra os
antígenos de B. equi (=T. equi) e B. caballi no decorrer da idade. Num total de 50 animais,
96% foram soropositivos para B. equi (=T. equi), 2% para B. caballi e 2% para ambas. Dos
18 haras, 14 (77,8%) apresentou animais soropositivos para as duas espécies, tanto em adultos
quanto em potros; concluindo que a enfermidade se encontra em áreas de cavalos PSI, com
nível similar aos hipódromos da Província de Santiago, fato relacionado ao intercâmbio entre
haras e hipódromos. Foi também observado que B. equi (=T. equi), não foi considerada tão
patogênica nesta região, como quanto já foi relatada em outros países, onde causa
enfermidade e alta mortalidade (URCELAY et al., 1973).
Um estudo da prevalência da piroplasmose em eqüinos da raça Criolla, da província de
Córdoba na Colômbia, mostrou que de 82 soros de eqüinos pertencentes a 13 fazendas,
situadas na região nordeste da Colômbia, testados pelo TFC e pela Reação de
Imunofluorescência Indireta (RIFI), ambas as Babesia foram encontradas em todas as
fazendas. O TFC detectou anticorpos para B. caballi em 41% e para B. equi (=T. equi) em
65% animais. A RIFI indicou a prevalência de 90% para B. caballi e 94% para B. equi (=T.
equi) prevalência de animais soros-reagentes em diferentes grupos de idade, revelou um
significante declínio, de anticorpos para B. caballi ao TFC em animais acima de três anos de
idade. Os títulos do TFC para ambas as babesias declinaram gradualmente com o aumento da
idade dos animais para B. caballi, mas ainda presente em animais com idade superior a nove
anos para B. equi (=T. equi). Os carrapatos encontrados foram: Anocentor nitens, em todas as
fazendas e Amblyomma cajennense em apenas duas fazendas (TENTER et al., 1988).
11
2.5.4 Epidemiologia no Brasil
No Brasil, a piroplasmose eqüina por Nuttallia equi (=T. equi) foi descrita pela
primeira vez por CARINI (1910) através do diagnóstico clínico e laboratorial em cavalos no
Estado de São Paulo. Esta mesma espécie foi novamente reportada em animais de corrida com
quadro agudo de piroplasmose no mesmo estado (GUIMARÃES et al., 1950). DUPONT &
BARREIROS TERRA (1952) formulam um histórico a respeito da patologia citando a
ocorrência no Estado do Rio de Janeiro, através do uso da microscopia óptica.
As babesioses são relativamente freqüentes, sendo a maioria quase sempre causada
pela B. equi (=T. equi) (HIPÓLITO et al., 1965; BARBOSA et al., 1993, 1995; LINHARES,
1994; BITTENCOURT et al., 1997).
TENTER & FRIEDHOFF (1986), analisando soros provenientes do Rio de Janeiro e
Espírito Santo, encontraram prevalência de 72% para portadores de infecção por B. equi (=T.
equi) e 64% para B. caballi em 20 amostras examinadas pela Reação de Imunofluorescência
Indireta (RIFI).
RIBEIRO & LIMA (1989) em Minas Gerais, observaram uma prevalência de 72%
para portadores de infecção por B. equi (=T. equi), examinados através da RIFI.
No Estado do Rio Grande do Sul, CUNHA (1993) observou a prevalência de Infecção
por B. equi (=T. equi) de 57,9%, pela RIFI, na avaliação realizada em 133 animais do Jockey
Club de Pelotas e dois haras na zona sul do Rio Grande do Sul, e verificou a presença de B.
microplus parasitando cavalos.
LINHARES (1994), no centro-oeste, na microrregião de Goiânia, registrou
prevalências de 94,7% para B. equi (=T. equi) e 90,8% para B. caballi, utilizando-se a RIFI,
caracterizando área como de estabilidade enzoótica e trabalhou com eqüinos criados em
regime extensivo e semi-intensivo.
PFEIFER BARBOSA (1993, 1995) verificou elevada prevalência de babesioses, no
setor de eqüinocultura da Fazenda do Instituto de Zootecnia (FAIZ), da Universidade Federal
Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), observando que a soropositividade ao TFC em 60 eqüinos,
era de 96,7% para B. equi (=T. equi) e 61,7% para B. caballi, em diagnóstico realizado no
Laboratório do Instituto de Parasitologia da Universidade de Hannover, Alemanha.
No Brasil a prevalência de babesiose ‚ bastante distinta nas diferentes regiões do país,
como por exemplo: estudos realizados no Rio de Janeiro e em Minas Gerais demonstraram
que 85% a 100% dos eqüinos examinados pelo TFC, são portadores de Babesia sp.; enquanto
que no Rio Grande do Sul, o percentual de soropositivos fica em torno de 30 a 50% (ANPC,
1996).
BOTTEON (2002) observou que em 121 amostras em regime extensivo, semi-
intensivo, os 27 animais criados em regime de estabulação permanente, apresentavam títulos
menores ao RIFI (mais freqüente 1:40), sendo que estes animais apresentavam maior
susceptibilidade à enfermidade, devido à Instabilidade enzoótica a que estavam expostos. A
pesquisa foi realizada nos municípios de Seropédica, Japeri, Paracambi, Miguel Pereira, Nova
Iguaçu, Itaguaí e Rio de Janeiro.
"Aspectos Epidemiológicos da babesiose eqüina na Microrregião Fluminense do
Grande Rio - Itaguaí, Estado do Rio de Janeiro" foi o tema do trabalho de BITTENCOURT et
al. (1997), em que 78 eqüinos, criados em regime extensivo (FAIZ-UFRRJ) e propriedades
vizinhas, na Região Fluminense de Itaguaí, RJ, foram testados pelo TFC (Universidade de
Hannover), no período de abril a agosto de 1985. A maioria era portadora de anticorpos
circulantes anti-B. equi (=T. equi) (84,6%) e anti-B. caballi (93,6%), o que caracterizou ser
uma área fortemente enzoótica e potencialmente de risco para animais procedentes de áreas
livres de carrapatos, vetores biológicos da enfermidade.
12
No Brasil, a piroplasmose‚ considerada como uma endemia, especialmente, nos
rebanhos criados soltos a campo. Segundo a experiência do Laboratório de Análises Clínicas
Veterinárias Paddock, Jockey Club de São Paulo (referência para o diagnóstico de
piroplasmose Eqüina), 90% dos animais são soropositivos para as babesioses, nas regiões,
centro-oeste e sudeste. Em estudos realizados por (KERBER, 1997) com 720 eqüinos de
várias raças originárias de 28 fazendas de diferentes regiões do país: Mato Grosso, São Paulo,
Minas Gerais, Paraná e Rio Grande do Sul, demonstrou a existência de B. equi (=T. equi) e B.
caballi, em todas as regiões diagnosticadas pelo TFC e presença das espécies de carrapatos:
A. nitens, A. cajennense e B. microplus, parasitando os cavalos. Foram observadas baixas
prevalências de B. caballi e B. equi (=T. equi) em áreas subtropicais, provavelmente isto
ocorra, por um maior desenvolvimento de várias espécies de carrapatos em regiões tropicais.
O controle de carrapato indicado neste trabalho‚ o "spray", contendo deltametrina (piretróide),
à diluição de 25 mg/1 a cada três semanas, durante um ano, em áreas tropicais, tentando com
isto reduzir a infestação no pasto. Em áreas subtropicais, é suficiente utilizar o produto a cada
três semanas, nas estações de primavera e verão. Os assuntos acima mencionados foi tema de
trabalho apresentando no Congresso da Associação Mundial de Veterinária Eqüina, realizado
em Padova, na Itália. Em fazendas onde há associação de eqüinocultura com bovinocultura, e
não há controle de carrapatos, foi encontrada alta prevalência, especialmente de infecções por
B. equi (=T. equi) (KERBER, 1997, SIQUEIRA, 1997).
DA COSTA PEREIRA et al. (2004) descreveu que a ocorrência de B. equi (=T. equi),
a qual teve oportunidade de avaliar, era superior a B. caballi em todas as situações. Também
notou que as condições de criação e os métodos ineficazes no controle de vetores são fatores
predisponentes à ocorrência da infecção pelos agentes causadores de babesiose eqüina em
estabelecimentos que possuam portadores ditos assintomáticos.
Estudos Desenvolvidos na mesorregião da Baixada Litorânea Fluminense, com
avaliação de 49 animais oriundos do Curral de apreensão da Universidade Federal
Fluminense, indicou que aquela Mesorregião é de estabilidade enzoótica para espécie T. equi,
com prevalência de 100%, nas amostras analisada na RIFI (SILVA, 2002).
2.6 Piroplasmoses Canina no Mundo
2.6.1 Babesia canis (PIANA & GALLI-VALÉRIO 1895)
Após a descrição de B. canis por PIANNA & GALLI-VALÉRIO (1895), foi seguida,
por estudos posteriores, de distribuição e também da possibilidade da existência de parasitos
relacionados a membros da ordem carnívora. Até 1938, era amplamente aceito que esta
espécie só acometia Canis familiaris, quando SCHOOP & DIDIÉ (1938), foram bem
sucedidos na infecção experimental em Vulpes vulpes (raposa) na Alemanha. Posteriormente,
NEITZ & STEYN (1947), transmitiram para Canis mesomelas mesomelas (Chacal de dorso
preto) esplenectomizado e não esplenectomizado e mostraram que havia provas suficientes
para afirmar que B. canis alem de não ser especifico de Canis familiaris, era sinonímia de
Babesia rossi descrito por NUTTALL (1910) em Canis adustus (Cahcal de flanco listrado),
conforme Tabela 2.
Atualmente, são reconhecidos três subespécies de B. canis, com seus correspondentes
vetores: B. canis canis, encontrada na Europa, sendo o vetor a espécie Dermacentor
reticulatus; B. canis vogeli encontrada no Norte Africano; na América do Norte tendo como
principal vetor o ixodídeo Rhipicephalus sanguineus; B. canis rossi encontrada na África do
Sul, tendo como vetor a espécie Haemaphysalis leachi (UILENBERG et al. 1989;
TABOADA & MERCHANT, 1991; SCHETTERS et al., 1997; LOBETTI, 1998; CARRET et
al., 1999).
13
Tabela 2*: Distribuição geográfica da espécie Babesia canis em canídeos silvestres.
*MASSARD et al., (2006) dados não publicados.
Hospedeiro Parasito
Espécies Nome vulgar Babesia canis
(Microscopia óptica).
Distribuição Autores das
Citações
Canis
Familiaris
Cão Presente Cosmopolita PIANA &GALLI-
VALÉRIO (1895) e
muitos outros
autores
C. adustus
(Thos
adustus)
Chacal flanco listrado Presente Oeste africano NUTTALL (1910);
NEITZ & STEYN
(1947)
C. vulpes Raposa vermelha Presente Alemanha SCHOOP & DEDIÉ
(1938)
T. mesonelas Chacal de dorso preto Presente África do Sul NEITZ & STEYN
(1947)
C. latraus Coiote Presente Estados Unidos
da América
EWING et al.
(1965)
C. lupaster Lobo Presente Argélia GAYOT (1946)
C. lupus Lobo Presente Rússia YAKIMOFF &
SCHOKHOV(1917)
Cerdocyon
thous
Cachorro do mato Presente Brasil MASSARD et al.
(1975).
Lycaon
Pictus
Cão caçador do Cabo Presente Africa do Sul NEITZ (1965).
14
Apesar de ambas as espécies apresentarem-se ao nível de aspecto fenotípico idênticas,
suas patogenias são diferentes, bem como seu caráter antigênico, sendo a espécie B. canis
rossi, a mais patogênica dentre elas, por apresentar uma capacidade de multiplicação
acentuadamente superior as outras, induzindo doença fulminante entre os cães na África do
Sul (SCHETTERS et al, 1997).
No Brasil, trabalhos para elucidar qual a subespécie ou a ocorrência das mesmas na
população canina têm atualmente gerado publicações acerca de caracterização e transmissão.
Recentemente, PASSOS et al. (2005) caracterizaram genotipicamente a ocorrência de Babesia
vogeli, em cães naturalmente infectados provenientes dos Estados de Minas Gerais e São
Paulo. SÁ (2005) identificou este subespécie como sendo a que acomete os cães no Estado do
Rio de Janeiro.
Estudos desenvolvidos no Brasil, incriminam a espécie R. sanguineus como a
responsável pela transmissão tanto em nível cidade como ao nível rural (O`DWYER, 2000).
Esta espécie tem hábitos nidícolas, em sua fase de vida livre, podendo ser encontrada dentro
de canis, no interior das residências e nos quintais das casas, escondendo-se em frestas e
buscando abrigo em buracos das próprias instalações (LABRUNA & PEREIRA, 2000).
Com relação à sintomatologia e respeitando as diferenças quanto à progressão clinica
de cada subespécie temos: febre, anorexia, apatia, vômito, icterícia, esplenomegalia e
hiperplasia de linfonodos, hemoglobinúria. Na patologia clínica, caracteriza-se por anemia
hemolítica, inicialmente normocítica normocrômica, evoluindo para macrocítica hipocrômica
e regenerativa, sendo observado não raramente, reticulocitose, anisocitose e policromasia,
nota-se em alguns casos a presença de trombocitopenia, hemoglobinemia e bilirrubinemia
(FELDMAN et al., 1982; LOBETTI et al., 1996).
2.6.2 Babesia gibsoni (PATTON, 1910)
Esta espécie foi descrita originalmente em Canis familiaris na Índia, sendo
classificada entre os pequenos Piroplasma spp., devido seu tamanho diminuto (1 – 2µm). Na
ocasião da descrição da espécie, PATTON (1910). Este autor também determinou que as
raças autóctones da Índia, bem como a espécie Canis aureus (chacal dourado) podendo atuar
como reservatório.
Trata-se de um piroplasmídeo que acomete tanto canídeos domésticos como silvestres.
Sua sintomatologia apresenta-se da seguinte forma: febre, anemia marcada com icterícia e
hemoglobinúria, inapetência, prostração, espleno e hepatomegalia, progredindo para o êxito
letal (LEVINE, 1985; BOOZER & MACINTIRE, 2003). É uma patologia que acomete tanto
animais jovens quanto adultos; na fase jovem os animais desenvolvam quadro mais severo em
comparação aos adultos, quando esse agente patogênico é transmitido por carrapatos (BOSE
et al. 1995; DE WAAL, 2000; MUHLNICKEL et al. 2002). A infecção por B. gibsoni é
endêmica em muitas partes da Ásia, Austrália, África, Oriente Médio e América do Norte
(BIRKENHEUER et al. 2003 b; BOOZER & MACINTIRE, 2003), existindo relato da sua
ocorrência também no Brasil (BRACCINI et al., 1992). A sua ampla distribuição mundial
pode ser atribuída principalmente à facilidade de mobilidade dos cães e a presença de vários
vetores ixodídeos em potencial. A eliminação desta parasitose é dificultada pelo amplo
número de espécies de ixodídeo com potencial vetor biológico para B. gibsoni, como também
pelo fato desses ixodídeos realizarem repasto sanguíneo em um amplo grupo de mamíferos
(SHAW et al., 2001; CACCIO et al. 2002).
Diversas espécies de ixodídeos estão envolvidas em sua transmissão, tais como:
Haemaphisalis bispinosa, sendo a primeira observada na ocasião da descrição da espécie por
15
PATTON (1910); Haemaphysalis longicornis (HIGUCHI et al., 1991), R. sanguineus
(HIGUCHI et al., 1999).
Com o advento das ferramentas moleculares, muitas ocorrências que, baseando-se
somente no aspecto fenotípico, eram imputadas a B. gibsoni, têm sido reavaliadas e re-
escritas. Neste sentido, recentes avanços são observados também quanto à presença e
identificação de pequenos piroplasmídeos de cães. KJEMTRUP et al. (2000), descreveram a
ocorrência de três genogrupos distintos de pequenas babesias em cães. Outros relatos neste
sentido têm surgido na literatura, como por exemplo, na Alemanha (ZAHLER et al., 2000) e
na Espanha (CAMACHO et al., 2001).
16
Tabela 3*: Distribuição geográfica da espécie Babesia gibsoni em canídeos silvestres:
*MASSARD et al.( 2006), dados não publicados.
Hospedeiro Parasito
Espécies Nome vulgar Babesia gibsoni
(Microscopia óptica).
Distribuição Autores das
Citações
Canis
Familiaris
Cão Presente Índia, Europa,
Estados Unidos
da América,
Brasil.
PATTON, 1910; e
muitos outros
autores
C. aureus Chacal dourado Presente Índia PATTON, 1910
C. lupus Lobo Presente Russia YAKIMOFF &
SCHOKHOV, 1917
Cyon
duklunensis
Cão selvagem da Índia Presente India PLIMMER, 1915.
Vulpes
dorsalis
Raposa Presente Mali & Egito LÉGER & BEDIES,
1922; MARONPOT
& GUINDY, 1970
17
2.6.3 Rangelia vitalii (PESTANA, 1910)
O estudo desta parasitose iniciou-se em 1908, quando CARINI observou uma doença
de cães no Brasil, com sintomatologia hemorrágica, conhecida como “Nambyuvú” (orelha
que sangra – idioma Guarani) levantou a suspeita de tratar-se de uma piroplasmose pela
semelhança apresentada com a icterícia maligna dos cães, provocada pela B. canis.
PESTANA (1910), em nota preliminar comunicada à Sociedade Científica de São
Paulo, que relacionou o fato de haver encontrado um piroplasma no sangue de cães com a
doença conhecida vulgarmente como “Nambyuvú” ou peste de sangue. Estudou a doença
espontânea e através de inoculações experimentais, reproduziu a infecção em cães jovens.
Posteriormente, ainda em 1910, PESTANA em trabalho mais apurado identificou o agente
etiológico desta doença, denominando-se Piroplasma vitalii, em homenagem ao eminente
Diretor do Instituo Butantan, Dr. VITAL BRAZIL. Tal parasito diferia da espécie B canis,
baseando-se em aspectos morfológicos e biológicos, além da sintomatologia e achados
macroscópicos.
Segundo PESTANA (1910) esta parasitose apresenta-se em três formas clínicas
características, a saber: I – Benigna: febre intermitente, com a presença no sangue circulante
de formas intraeritrocitárias; II – Hemorrágica: o animal desenvolve apatia, anorexia e
emaciação. Observa-se a hiperplasia de linfonodos e a febre torna-se constante, com mucosas
evoluindo de pálidas a ictéricas (que também se acentuam no tegumento), fraqueza muscular,
com dificuldade de deambulação e com respiração ofegante. As hemorragias manifestam-se
externamente na boca, nariz, olhos, pele e nas bordas das orelhas, sintoma patognômonico que
dá o nome à doença entre os populares; III – Grave: presença de desenvolvimento rápido, não
havendo tempo para o desenvolvimento de hemorragias externas, havendo, porém,
hemorragias internas, sobretudo as enterorragias. Talvez por isso designada, pelos caçadores
como “Nambyuvú das tripas”.
CARINI & MACIEL (1914) re-avaliando a doença, observaram aspectos relacionados
com a patogenia e lesões patológicas, confirmando os resultados de Pestana e propuseram a
criação de um novo gênero que denominaram Rangelia, homenageando o Dr. RANGEL
PESTANA que estudou e descreveu minuciosamente esta espécie. Baseou-se principalmente
na presença de esquizogonia exo-eritrocítica em células endoteliais que foram descritas
detalhadamente. Ensaiaram ainda (1914) os primeiros testes no sentido do tratamento com
“Tripan Blue”, com resultados animadores para época.
CARINI (1916) no idioma alemão publicou praticamente o mesmo trabalho que já
havia sido publicado em 1914 juntamente com Maciel. Este trabalho foi apenas enriquecido
com novas ilustrações sobre aspectos da morfologia do parasito.
MOREIRA (1938), em desacordo com os autores anteriores, não encontrou diferenças
no quadro sintomatológico entre nambyuvú e a clássica babesiose canina, causada pela
Babesia canis e admitiu de acordo com WENYON (1926) a possibilidade de infecção mista
intercorrente de Toxoplasma gondii e B. canis para as formas de esquizogonia descritas por
PESTANA (1910) e CARINI & MACIEL (1914).
MOREIRA (1939) testou a eficiência de “Tripan Blue” e da acaprina no tratamento da
babesiose canina, utilizando grande número de animais.
CARINI (1948) novamente publicou sobre o assunto, confirmando a existência das
formas de Rangelia encontradas nos tecidos (esquizontes) e refutando a possibilidade de
tratar-se de Toxoplasma ou Hepatozoon. Discute apresentando com maiores detalhes a
multiplicação do parasito nas células retículo-endoteliais. Neste trabalho cita o fato de
BRUMPT acreditar serem válidos seus achados, tendo inclusive incluído o novo gênero em
seu livro publicado em 1936.
18
PARAENSE (1949) sugeriu a possibilidade da existência de uma fase negativa no
sangue no período prepatente da babesiose canina transmitida por carrapatos, contudo sem
encontrar quaisquer formas de desenvolvimento exo-eritrocítico, neste mesmo trabalho, o
autor tentou também reproduzir a doença no sentido de verificar os estágios de esquizogonia
sem alcançar êxito.
REZENDE (1976) descreveu a ocorrência desta parasitose em cães provenientes de
áreas rurais no Rio de Janeiro com proposta de revalidação do grupo Rangelia, relatando a
ocorrência de baixa parasitemia e de infestação dos ixodídeos: Amblyomma aureolatum, A.
cajennense, A. ovale, A. tigrinum e R. sanguineus em C. familiaris provenientes destas áreas.
MASSARD (1979) citou que neste tipo de nicho ecológico, nota-se a maior prevalência da
espécie A. aureolatum, infestando C. familiaris. Posteriormente, observou-se a relação destes
ixodídeos com a presença da espécie Hepatozoon canis em áreas rurais (O´DWYER et al.,
2001), embora a caracterização do esporocisto deu-se na espécie A. ovale (FORLANO et al.,
2005).
Recentemente, LORETTI & BARROS (2005) em uma revisão desta parasitose na
Região Sul do Brasil, sobretudo Rio Grande do Sul, citam que neste estado, os cães de áreas
rurais que apresentam manifestações clínicas compatíveis com a infecção por Rangelia vitalii,
estão predominantemente infestados com o carrapato A. aureolatum.
2.6.4 Theileria annae ZAHLER, RINDER, SCHEIN & GOTHE, 2000
Recentemente, ZAHLER et al. (2000) descreveram a ocorrência de um pequeno
babesídeo, isolado de um cão procedente da Alemanha que adquiriu a infecção em sua estada
na região dos Pirineus, na Espanha em 1994. Na ocasião utilizou-se a porção 18S rRNA para
amplificação e notou-se que o agente em questão tinha 89,5% de similaridade com a B.
gibsoni asiática; 86,6% de identidade com a B. canis e uma acentuada similaridade com
parasito de outra espécie animal, apresentando alto grau de relação filogenética com a espécie
B. microti (96,7%), porém distante o suficiente para a sugestão da criação da espécie, a qual
foi sugerida como Theileria annae.
Durante o ano 1996 foi observada a presença, no exame de esfregaços sanguíneos de
157 C. familiaris procedentes do Norte da Espanha, pequeno piroplasmídeo, anelado.
Nenhum deles havia estado em áreas endêmicas para B. gibsoni, até então o único pequeno
piroplasmídeo atribuído à espécie C. familiaris. A hematologia e a bioquímica sérica mostrou
que quase todos os espécimes tinham uma intensa anemia hemolítica regenerativa e que em
alguns casos havia evidencias de insuficiência renal. O estudo molecular foi procedido em
amostras obtidas em junho de 2000. A analise filogenética mostrou 99% com a B. microti e
100% de identidade com o novo piroplasmídeo recém descrito (ZAHLER et al., 2000), que
provisoriamente foi denominado T. annae, sugerindo tratar-se o Norte da Espanha de uma
área endêmica para este piroplasmídeos (CAMACHO et al., 2001). Mais tarde, estudos
desenvolvidos por CAMACHO et al. (2003) sugerem que exista a associação da transmissão
desta parasitose com o ixodídeo Ixodes hexagunus.
19
2.6.5 Theileria equi (LAVERAN, 1901) MEHLHORN & SCHEIN, 1998
As observações morfológicas por si só, não são suficientemente convincentes quanto à
distinção entre os babesídeos (ZAHLER et al, 2000). A existência do acentuado
pleomorfismo da B. gibsoni esta intimamente correlacionada com a B. equi (=T. equi), em
contrapartida a distinção entre esta espécie e a B. microti é impossível, adotando métodos
fenotípicos (PURNELL, 1981; KJEMTRUP et al., 2000).
O advento de métodos diagnósticos que elucidem a identificação, sobretudo de
pequenos piroplasmídeos, tornou-se urgente e relevante. Segundo UILENBERG et al. (2004)
e MASSARD (comunicação pessoal, 2006), o aspecto fenotípico, isoladamente, não
proporciona subsídios suficientes para identificação de uma espécie, embora o uso do aspecto
genotípico por si só não proporciona, em definitivo, as identificações específicas, surgindo à
necessidade da formulação de um consenso ente estes aspectos, bem como o aspecto
biológico das espécies em questão. CRIADO-FORNÉLIO et al. (2003a), citaram que muitas
vezes direcionam-se as ferramentas diagnósticas disponíveis para a identificação de espécies
clinicamente relevantes, desconsiderando a ocorrência de quadros incomuns de relação
parasito-hospedeiro. Utilizando-se a metodologia de abordagem diagnóstica molecular,
CRIADO-FORNÉLIO et al. (2003b) demonstraram com o uso de iniciadores universais e a
técnica de sequenciamento, a presença de infecções mistas e isoladas de T. annae e B. canis
em Felix catus, provenientes de Portugal e Espanha.
Recentemente, CRIADO-FORNÉLIO et al. (2003a) demonstraram, utilizando a
abordagem molecular, a presença incomum da espécie B. equi (=T. equi) em C. familiaris. A
presença desta relação parece estar amplamente distribuída em diversas províncias espanholas
(Madrid, Sevilla e Alicante), e está intimamente correlacionada ao habitat rural. Vale ressaltar
que, a ocorrência em cães assintomáticos denota baixo grau de patogenicidade deste parasito
neste hospedeiro. A presença do sequenciamento de amostras provenientes de diversas
espécies, a principio, levou os autores a suspeitar de má-manipulação das amostras, porém tal
questionamento foi suprimido com o uso de iniciadores específicos para C. familiaris (CAN-F
e CAN-R / amplificam produto do gen mitosina canina com 290 pares de base). E a presença
de infecções cruzadas em ambas as espécies, B. equi (=T. equi) em C. familiaris e B. canis em
E. caballus, não é algo improvável, tendo em vista a estreita relação existente entre estas
espécies, principalmente no que tange o nicho ecológico rural.
20
2.7 Diagnóstico
Com o advento da microscopia óptica, muitas parasitoses que até então não havia sido
diagnosticadas as suas etiologias, seja causada por um agente etiológico potencial ou mesmo
metabólica, como as que ocorrem em inúmeras enfermidades. Esta ferramenta é utilizada
desde então em inúmeras áreas do conhecimento dentre as quais a parasitologia Lato sensu, e
em diversas espécies de microrganismos, pode citar como exemplos: as piroplasmoses, as
tripanosomatíases, as malarias, as espiroquetoses entre outros.
Certamente, a observação a “olhos armados” é bastante conclusiva, porém nem sempre
isto é possível de ser feito, sendo especialmente verdade nos casos crônicos e assintomáticos
(YAMANE et al. 1993 a,b). Em algumas áreas da parasitologia, desenvolveu-se desde os
primórdios métodos de diagnósticos alternativos, que visavam refutar esta dificuldade. Dentre
as inúmeras técnicas utilizadas, destacam-se o uso de animais de laboratório (inoculação in
vivo) e o diagnóstico utilizando vetores potenciais sobre o hospedeiro vertebrado
(Xenodiagnóstico).
Neste particular, a espécie B. equi, para sua perpetuação, por tratar-se de um parasito
obrigatório, necessita de vetores que possuam habilidade de adquirir, desenvolver e replicar
em seu interior formas evolutivas de B. equi, para posteriormente migrarem para as glândulas
salivares e serem inoculadas na forma de esporozoíta em hospedeiros vertebrados. UETI et al.
(2005), basearam-se nesta presunção, que os carrapatos adquiram tal infecção em baixos
níveis parasitêmicos, utilizaram ninfas de B. microplus, que é uma espécie na qual a B. equi
desenvolve-se biologicamente, e observou-se a transmissão ao infestarem potros.
HIRATO et al., (1945), foi quem primeiro reportou a possibilidade de aplicação do
Teste de Fixação de Complemento (TFC) para o diagnóstico das babesioses eqüinas,
primeiramente envolvendo B. caballi. Em março de 1969 o TFC foi aceito como teste oficial
para piroplasmoses eqüinas pelo USDA, sendo desde então reconhecido e utilizado
mundialmente (FRIEDHOFF, 1982). As amostras de B. equi (=T. equi) e B. caballi (USDA)
utilizadas no TFC foram isoladas de cavalos naturalmente infectados da Flórida
criopreservadas e mantidas por várias passagens em pôneis e vetores. No caso de B. caballi,
se utilizaram passagens em A. nitens e para B. equi (=T. equi) passagens em Hyalomma
anatolicum anatolicum e Rhipicephalus turanicus (KLINCKMANN, 1981; TENTER, 1984).
O TFC detecta títulos de anticorpos, a partir de oito dias do início da infecção,
declinando entre dois e três meses pós-infecção, por eliminação espontânea ou terapêutica
com drogas babesicidas em caso de infecção por B. caballi. A partir daí, as reações
imunológicas diagnosticadas através do TFC, podem se tomar negativas num intervalo de 3 a
15 meses para B. caballi, e para B. equi (=T. equi) o animal se mantêm por toda a vida como
portador (FRIEDHOFF, 1982; BRÜNNING, 1996).
Em casos de exportação de cavalos de áreas endêmicas para os Estados Unidos,
Canadá, Japão e Austrália, utilizado o TFC com o "screening", e em casos contraditórios,
pode-se associar a imunofluorescência indireta e futuramente o ELISA, que se encontra em
fase de pesquisa (BOSE & PEYMANN, 1994).
Atualmente as pesquisas têm avançado para o desenvolvimento de novos testes de
diagnóstico, que na maioria das vezes são mais sensíveis na detecção de portadores
assintomáticos “Enzyme Linked immunosorbent Assay” - ELISA, mas o TFC ainda ‚ o teste
mais específico para o diagnóstico das babesioses eqüinas (BRÜNNING, 1996).
Uma razão primária para que ocorram resultados falsos negativos no TFC é a presença
da imunoglobulina da classe das IgG (T) que não fixa complemento e é bastante encontrada
no soro de eqüinos (MCGUIRE et al., 1971). As imunoglobulinas do grupo das Ig G que tem
hábil poder de fixação de complemento são IgG1 e IgG3 (ROITT, 1998).
O teste de imunofluorescência indireta é o método mais utilizado atualmente, sendo
empregado no diagnóstico de todas as espécies do Gênero Babesia (BÖSE et al., 1995). Foi
21
utilizada pela primeira vez por RISTIC & SIBINOVIC (1964) para o diagnóstico de
babesiose. Comparada com o TFC, apresenta maior sensibilidade e especificidade
(DONNELLY et al., 1980). Este método pode detectar anticorpos já a partir do sexto dia pós-
infecção (DE WAAL et al., 1987) e mesmo com uma única infecção, os anticorpos podem ser
detectados um ano e meio após a inoculação (WEILAND, 1986; KUTTLER et al., 1988). O
Custo por teste é baixo e a maioria dos reagentes necessários é prontamente disponível ou de
preparação local. Normalmente não mais que 70-90 amostras podem ser examinadas por dia
(BÖSE et al., 1995).
O método sorológico mais sensível é o teste ELISA, embora exista necessidade de
adaptação para um protocolo mais simples, o que quando alcançado, proporcionará a
facilidade da automação possibilitando o manejo de grandes amostras em períodos
relativamente mais curtos dos que observados em testes atuais. Foi adaptado para pesquisa de
anticorpos anti-Babesia divergens por PURNELL et al. (1976). Comparado ao TFC e a RIFI,
apresenta sensibilidade maior, no entanto, tem se verificado reações cruzadas entre as diversas
espécies de Babesia, entre elas Babesia equi e Babesia caballi (AICHER, 1984; SOULE et
al., 1984). Atualmente Ensaios Imunoenzimáticos do tipo competitivo com a utilização de
anticorpos monoclonais, vêm sendo desenvolvidos e demonstrados um alto grau de
sensibilidade e especificidade, embora ainda pouco exeqüível ao nível de diagnóstico de
rotina por tratar-se de uma técnica laboriosa (KNOWLES et al., 1998).
Devido ao pleomorfismo dos parasitos, as observações morfológicas por si só, não são
suficientes para distinção entre B. gibsoni, B. equi (=T. equi) e B. microti, ao nível de
microscopia óptica (PURNELL, 1981; ZAHLER et al., 2000 ab; KJEMTRUP et al., 2000).
A amplificação molecular de DNA de Babesia utilizando a Reação de Cadeia de
Polimerase demonstra ser um método de detecção direta acentuadamente mais sensível que a
microscopia óptica. (BOSE et al. 1995; BIRKENHEUER et al., 2003 a).
A utilização das técnicas moleculares, sobretudo a utilização de mais de uma técnica
em conjunto, tais como: PCR + RFLP, (CACCIO et al. 2002); PCR + Clonagem e
sequenciamento (CRIADO-FORNÉLIO et al. 2003; SCOFIELD, 2006) tem se mostrado
promissora tanto fins diagnósticos quanto epizoológicos.
Entende-se que após a ocorrência desta relação atípica entre B. equi (=T. equi) e C.
familiaris, salienta-se a importância do desenvolvimento de modelos diagnósticos que
avaliem ao mesmo tempo a ocorrência destes dois parasitismos, tais como existente para B.
gibsoni e B. canis (BIRKENHEUER et al., 2003). Embora se apresentando incipiente e ainda
sem a devida avaliação quanto à importância na cadeia epidemiológica, acentuasse a
intimidade que tanto cães quanto eqüinos têm entre si e a tendência a cronicidade presente nas
infecções por B. equi (=T. equi) e sua importância em sanidade animal e econômica.
22
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Local de Execução
Os experimentos foram realizados em três diferentes locais, que foram:
• Estação para Pesquisa Parasitológica W.O. NEITZ, pertencente ao Departamento
de Parasitologia Animal/ Instituto de Veterinária da Universidade Federal Rural
do Rio de Janeiro (UFRRJ). A UFRRJ está situada entre os paralelos 22°41’
22°45’ de latitude sul e os meridianos 43°38’ 43°42’ de longitude oeste de
Greenwich a uma altitude de 33 metros do nível do mar, apresentando um clima
tipicamente tropical, localizada no Município de Seropédica, Rio de Janeiro.
• Laboratório de Biologia Molecular, Embrapa Agrobiologia – Seropédica – RJ –
Brasil.
• Laboratório de Diagnóstico de Doenças Parasitárias da Escola de Veterinária da
Universidade Federal de Goiás, Brasil. Sob a supervisão do Dr. Guido
Fontgalland Coelho Linhares.
3.2 Origem do Inóculo, Cálculo de Parasitemia e Inoculação Experimental de T. equi em
Canis familiaris
Utilizou-se nestes experimentos a cepa Jaboticabal criopreservada de T. equi. Esta
cepa demonstrou ser viável na produção da doença clínica e alto nível parasitêmicos em
cavalos jovens sensíveis ou adultos imunossuprimidos.
O descongelamento foi realizado em banho-maria
1
, a 37ºC durante 30 minutos, a fim
de proporcionar as condições mais próximas às observadas in vivo. O grau de parasitemia do
inóculo foi calculado conforme preconizado pelo “Instituto Interamericano de Cooperación
para la Agricultura” (IICA, 1985), para o cálculo de Babesiose e anaplasmose bovina. Para
tanto, avaliou-se à microscopia óptica de imersão, 29 campos uniformes em esfregaços
sanguíneos, com aproximadamente 350 hemácias, em movimento borda grega na lâmina,
escolhidos na porção do terço final dos esfregaços sanguíneos, obtendo ao final da avaliação
grau de parasitemia de 60%.
Após isto, inoculou-se por via subcutânea sobre a região escapular, volume que
variaram conforme a faixa etária dos espécimes, a saber: 2 ml em espécimes jovens e 3 ml em
espécimes adultos. O mesmo procedimento foi adotado com os animais testemunhas
(controle), sendo que o inóculo utilizado, por via subcutânea, para este grupo era composto
por NaCl a 0,9% (solução fisiológica).
3.3 Origem, Formação dos grupos e Manutenção de Canis familiaris
Os animais utilizados nos experimentos foram obtidos do produto de duas gestações
de fêmeas sem raça definida (SRD), totalizando 17 cães, sendo 05 fêmeas e 12 machos.
Formou-se 03 grupos distintos: G1–04 cães jovens (02 filhotes; 02 filhotes-controle); G2–08
cães adultos (06 adultos; 02 adultos-controles); No intuito de esclarecer a susceptibilidade da
espécie C. familiaris ocorre em condições normais, condições de aumento fisiológico de
corticosteróide (esforço físico) ou mesmo em algum tipo de imunodeficiência, introduzimos o
G3 composto de: 02 cães filhotes e 03 adultos (01 filhotes e 02 adultos imunossuprimidos; 01
filhote e 01 adulto-controle).
1
Banho-maria Fanem Mod. 102/8
23
Os animais foram mantidos, vermifugados, vacinados e alimentados com ração
comercial
2
e água ad libitum desde Março de 2003 até Novembro de 2005. Os canis eram
isentos de carrapatos, previamente e durante todo o experimento tratado da seguinte forma:
utilizaram-se produtos carrapaticidas à base de deltametrina e amitraz, nas diluições
recomendadas pelos fabricantes, em intervalos regulares de 21 dias; e como métodos físicos à
varredura de fogo, e distribuição de vaselina em volta das paredes e assoalhos em intervalos
de 15 dias. A inspeção quanto à presença de carrapatos nos cães foram feitas diariamente.
Utilizou-se para fins de estudos epizootiológicos, 12 espécimes de cães (SRD), de
idade e sexos distintos, que conviviam em estreita relação com cavalos em nichos rurais desde
o nascimento, dando origem à formação do último grupo avaliado: G4. Todos os animais
estudados conviviam com eqüinos desde o nascimento e apresentavam-se infestados com
carrapatos do gênero Amblyomma. Estes animais pertenciam a 05 propriedades rurais,
localizadas no Município de Seropédica, Rio de Janeiro dispersas no raio de 20 km, tendo por
referência a Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro.
3.3.1 Avaliação dos aspectos clínicos dos cães
Para verificar o estado de higidez dos espécimes C. familiaris, antes e durante os
experimentos, adotou-se o seguinte protocolo de avaliação clínica: I - Temperatura retal,
aferida a cada 24 horas a partir do dia zero da inoculação; II - Tempo de preenchimento
capilar, realizado no momento da aferição da temperatura; III - hematócritos, com intervalos
regulares de 07 dias, a fim de avaliar se ocorreria algum tipo de anormalidade sanguínea.
3.3.2 – Protocolo de imunossupressão
Para a imunossupressão química utilizou-se Dexametasona
3
na dose de 0,5mg/kg de
peso vivo, administrado pela via intramuscular a cada 12 horas. Os cães foram previamente
imunossuprimidos e continuaram até o 27º dia de imunossupressão. A inoculação dos animais
com sangue total contendo T. equi, deu-se no 7º dia de imunossupressão.
Adotou-se este protocolo de FORLANO (2005), que naquela ocasião avaliava o ciclo
biológico de Hepatozoon canis em condições experimentais. Adaptou-se, principalmente o
tempo de imunossupressão ao ciclo biológico de T. equi, cerca de 10 dias e prolongou-se sete
dias por com o intuito de proporcionar manifestações clínicas ou parasitológicas da possível
interação entre as espécies T. equi e C. familiaris.
2
Ração Bummer®
3
Azium®
24
3.4 Origem, Obtenção e Manutenção de Carrapatos
3.4.1 Larvas de Boophilus microplus livres de Babesia sp.
A metodologia utilizada para criação e manutenção da colônia de carrapato B.
microplus foi baseada no trabalho de NEITZ et al. (1971) e BARREIRA (1988).
Foram utilizadas 125 teleóginas de Boophilus microplus coletadas de bovinos mestiços
mantidos na Estação para Pesquisas Parasitológicas W. O. NEITZ na Universidade Federal
Rural do Rio de Janeiro.
No laboratório, as teleóginas foram lavadas em água corrente, secadas, pesadas,
selecionadas segundo o seu peso, em seguida foram identificadas e fixadas em placas de Petri
as quais foram acondicionadas em câmara climatizada do tipo BOD, à temperatura de 28±2ºC
e 80±5% de Umidade Relativa (UR).
Os ovos do segundo dia de postura das teleóginas foram separados e pesados em
balança analítica de quatro casas decimais. Durante a pesagem parte dos ovos foram
separados em seringas cada uma com 0,5g de ovos. As seringas contendo os ovos foram
identificadas e acondicionadas em câmara climatizada, à temperatura e UR igual à utilizada
para manutenção das teleóginas.
Quinze dias pós-eclosão, as larvas de Boophilus microplus foram utilizadas para uma
segunda infestação de bezerros sensíveis, livres de Babesia spp. Cada bezerro foi infestado
com aproximadamente 10.000 larvas viáveis. A finalidade dessa infestação foi verificar,
através do exame da hemolinfa das teleóginas recuperadas (5, 7 e 10º dia pós-início de
postura) a confirmação de nenhum tipo de hemoparasito. Assim sendo, seguiu-se o protocolo
exposto referente a ovos do 2º dia de postura.
3.4.2 Obtenção de ninfas Rhipicephalus sanguineus livres de parasitos de Babesia sp.
Utilizou-se 60 fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus sanguineus obtidas de cães
naturalmente infestados. Depois de coletadas, os exemplares foram lavados em água corrente,
secos em papel toalha, pesados em balança analítica e acondicionadas em placas de Petri,
devidamente identificadas, e transferidas para câmara climatizada do tipo BOD regulada a
28±2ºC, Umidade Relativa de 80±5%.
Utilizou-se o mesmo protocolo adotado para espécie B. microplus quanto à postura do
2º dia. Estes foram pesados em alíquotas de 0,1g e acondicionados em seringas plásticas
descartáveis com a extremidade distal cortada e vedada com algodão hidrofílico. Estas
seringas foram mantidas nas mesmas condições controladas descritas para as fêmeas
ingurgitadas. Foram feitos exames da hemolinfa nos dias 5, 7 e 10 após o inicio da postura de
cada teleógina, para verificar a possibilidade dessas teleóginas estarem infectadas com
hemoparasitos do gênero Babesia, utilizando-se somente as posturas das teleóginas negativas.
Quinze dias após a eclosão das larvas, foram feitas infestações artificiais em coelhos
mestiços (Nova Zelândia X Califórnia). Utilizou-se a técnica do saco de pano aderido à orelha
(NEITZ et al., 1971) com larvas de 15-20 dias de idade, na razão de 1500 larvas por coelho.
As larvas ingurgitadas naturalmente desprendidas foram divididas em seringas,
contento em cada cerca de 100 larvas ingurgitadas, as quais foram transferidas para a câmara
climatizada regulada nas mesmas condições descritas anteriormente. Após 15 dias da ecdise
as ninfas foram utilizadas para infestação artificial em coelhos, na razão de 200 ninfas por
coelho, para obtenção de teleóginas.
25
Após o desprendimento natural, as teleóginas foram acondicionadas em seringas 20ml,
mantidas câmara climatizada do tipo BOD e foi feito exame da hemolinfa das teleóginas nos
dias 5, 7 e 10 após o início da postura sendo separados os ovos dos dois primeiros dias, para a
obtenção de forma mais segura, larvas livres de parasitos do gênero Babesia As larvas obtidas
após a eclosão foram utilizadas para infestação artificial em coelhos, conforme descrito
anteriormente. As ninfas livres de parasitos do gênero Babesia, obtidas dessas infestações,
posteriormente foram utilizadas para infestação artificial em cão SRD, utilizando a técnica do
saco de pano aderido às orelhas.
3.4.3 Procedimento de infestação nos espécimes C. familiaris adultos
Foram utilizados dois cães do grupo G3, ambos machos e com aproximadamente 1
ano de idade, imunossuprimidos e experimentalmente inoculados com T. equi. As infestações
foram realizadas utilizando a técnica do saco de pano aderido às orelhas (NEITZ et al., 1971;
CUNHA, 1978). Quinze dias após a eclosão das larvas de B. microplus, procedemos à
infestação artificial no cão (C
1
) na razão de 10000 larvas, distribuídas uniformemente em
ambas orelhas. O cão C
2
foi infestado com ninfas de Rhipicephalus sanguineus na razão de
200 ninfas distribuídas uniformemente em cada orelha. Ao final de cada infestação foram
colocados em cada cão (C
1
e C
2
) colares especiais, designados de elisabetano, para impedir a
retirada dos sacos de pano pelos cães.
3.5 Coleta de Amostras de Sangue
3.5.1 Parasitologia
Foram realizados diariamente punções de vasos periféricos do pavilhão auricular dos
animais inoculados com B. equi, utilizando as primeiras gotas de sangue para realizar os
esfregaços sanguíneos, sendo procedidas tricotomias prévias e utilizando para punção agulhas
estéreis (25X7 mm), individualizadas para cada animal. Após a coleta e distensão do sangue
em lâminas de vidro apropriadas para hematoscopia, estas foram identificadas, secas em
temperatura ambiente, fixadas nos locais de coleta com a utilização do álcool metílico puro
para análise, durante 3 minutos. Em seguida foram coradas pelo método de Giemsa
4
(1:10)
por 45 minutos em temperatura ambiente, e avaliados à microscopia óptica de imersão
5
com
amplitude de 1000X.
4
Azur-Eosin-Methylene blue solution – Lab. Merck – Part 7442592;
5
Microscópio binocular Wild Mod. 31977;
26
3.5.2 Hematologia, sorologia e biologia molecular
Nos grupos G1, G2 e G3, os animais tiveram amostras coletadas antes da inoculação,
as demais coletas foram realizadas após a inoculação com intervalo de 07 dias entre as elas.
As amostras de sangue foram coletadas utilizando-se o sistema Vaccutainer® em tubos com e
sem anticoagulante, através da venipunção braquial.
Os tubos com anticoagulante foram colocados em temperatura ambiente até a
formação do coágulo no interior dos mesmos; colocados em seguida em centrifuga específica
6
e após a centrifugação a 1500 rpm (rotações por minuto), durante 10 minutos, os soros
sanguíneos foram obtidos. Após isto, foram colocados em frascos do tipo Eppendorf®, com
auxílio de pipetas do tipo Pasteur e acondicionados a -20ºC.
Os tubos contendo EDTA, destinados a hematologia, forma extraídos com auxílio de
pipetas de 25 µl para os diferentes fins diagnósticos, bem como retiradas amostras destes para
os tubos de microhematócritos, por capilaridade. O material restante, era acondicionado em
freezer à -20ºC, para utilização em biologia molecular.
3.6 Coleta de Amostras de Outros Tecidos
3.6.1 Biopsia de linfonodos
Nas ocasiões de coleta de sangue, adotou-se o procedimento da punção do linfonodo
poplíteo, nos seguintes dias pós-inoculação: 0, 5 e 7; a fim de verificar a ocorrência de macro
ou microesquizontes de T. equi nestas amostras. Adotou-se o seguinte protocolo para este fim:
localizava-se por meio de palpação o linfonodo-alvo; procedia-se à tricotomia com o uso de
lâmina de aço no local; utilizavam-se agulhas e seringas estéreis, sendo as primeiras (25 x
7mm) e as seringas de 20ml, por meio de pressão negativa (puxando-se o êmbulo da seringa),
com a agulha dentro do linfonodo; retirava-se o equipamento e colocava-se o produto da
coleta sobre lâmina de vidro; confeccionava-se o esfregaço do tecido e após isto, fixou-se em
metanol o material para, posteriormente, adotar o método de coloração de Giemsa e proceder-
se à observação no microscópio óptico com magnitude de 1000 X.
3.6.2 Coleta de fragmentos de órgãos post-mortem
No decorrer do experimento, alguns dos animais do grupo (G3) desenvolveram
quadro clínico de dermatite do tipo úmida. Utilizou-se antibioticoterapia
7
e fluidoterapia para
os animais, mas os mesmos não responderam, evoluindo para quadros septicêmicos e,
posteriormente, óbito. A necrópsia foi procedida tão logo confirmou-se os respectivos
episódios. Foram coletados fragmentos de: pulmão, rins, fígado, coração, baço e linfonodos
mesentéricos. Deste material, procedemos à técnica de “imprint” dos mesmos, que consistiu
no toque dos respectivos fragmentos sobre lâmina de vidro e o uso da pressão física com o
uso de pinça do tipo “dente-de-rato”, adotando o mesmo tratamento para coloração por
Giemsa. Os fragmentos restantes, foram acondicionados em recipientes estéreis e conservados
sob congelamento até a ocasião de seu uso em pesquisas moleculares.
6
Centrifugador Excelsa 2 – Fanem LTDA – Modelo 205N.
7
Flotril® 10%
27
3.7 Hematologia
Seguiram os critérios adotados por SILVA (2002). Os hemogramas compunham-se da
avaliação do volume globular, hematimetria, hemoglobinometria, leucometria global,
específica, hematoscopia e leucocitoscopia.
O volume globular era efetuado em centrífuga para microhematócrito
8
, utilizando-se
tubos capilares. A hematimetria e leucometria global foram realizadas em câmara de
específicas
9
utilizando-se, respectivamente, soro fisiológico (Hematimetria) e líquido de
Tuerk (Leucometria) (COLES, 1986).
A coloração dos esfregaços sanguíneos para a leucometria específica, hematoscopia,
leucocitoscopia e pesquisa de parasitos foram efetuada através da coloração de Giemsa (JAIN,
1993)
As leucometrias específicas foram realizadas com esfregaços sanguíneos obtidos na
ocasião da venipunção braquial, sendo os esfregaços corados pelo Giemsa e avaliados a luz da
microscopia óptica com a utilização do aumento de 1000X. (COLES, 1986).
3.8 Sorologia
3.8.1 Origem do extrato antigênico
O extrato antigênico utilizado para realizar a RIFI foi preparado nos laboratório de
Hemoparasitoses e vetores, do Departamento de Parasitologia Animal. Procedimento
desenvolvido pelos doutorandos Kátia Roberta Fernandes e Anselmo Afonso Golynski, sob a
responsabilidade e supervisão do Prof. Carlos Luiz Massard.
Objetivando a eliminação de Babesia caballi, iniciou-se o protocolo de
quimioesterilização para a mesma com Diproprionato de imidocarb
10
em três aplicações (em
doses 2x superiores a preconizada pelos fabricantes, com intervalos de 72 horas entre as
mesmas). O equino foi mantido nas dependências da UFRRJ, onde este foi submetido a
esplenectomia, foram procedidos exames clínicos e parasitológicos diários e
aproximadamente no 10º dia pós-operatório verificou-se pico parasitêmico superior a 80%.
Coletou-se sangue para confecção das lâminas, que posteriormente foram mantidas à -20ºC,
até o momento da reação.
3.8.2 Confecção da reação de imunofluorescência indireta
A técnica foi procedida segundo critérios adotados por BALDANI (2004), com
modificações referentes à espécie testada e a composição dos controles negativos e positivos
(E. caballus), em todas as repetições. As laminas de antígenos confeccionados com sangue de
eqüino com alto grau de parasitemia para T. equi, foram descongeladas à temperatura
ambiente e, em seguida, marcadas com pequenos círculos com esmalte de coloração
vermelha. Em cada cavidade foram pipetados 10µl dos soros teste (1:40 e 1:80). As lâminas
foram incubadas em câmara úmida a 37ºC por 45 minutos e, a seguir, submetidas a três
lavagens por imersão de cinco minutos cada em solução salina tamponada (PBS). Após
secagem à temperatura ambiente, as cavidades das lâminas foram recobertas com
aproximadamente 2µl de conjugado de isotiocianato de fluoresceína anti-IgG canina, diluído
em 1:700 em solução de PBS, contendo azul de Evans 1mg%. Foram utilizados como
8
Centrifugador para Micro-hematócrito Fanen Mod. 207N
9
Neubauer
Improved
10
Imizol®
28
controles negativo e positivo, soros negativos e positivos de eqüino para cada lâmina, com
conjugado de isotiocianato de fluoresceína anti-IgG eqüino, diluído em 1:1000 em solução
PBS, contendo Azul de Evans 1mg%. Após adição do conjugado, as lâminas foram
novamente incubadas conforme descrito acima e submetidas a duas lavagens por imersão, de
cinco minutos cada em PBS, e uma terceira lavagem de 30 segundos em água tridestilada. As
lâminas, após secagem, foram montadas com lamínulas, utilizando-se glicerina tamponada a
uma reação 9:1 de glicerina/tampão carbonato-bicarbonato 0,5M pH 9,6 e, posteriormente,
observadas em microscópio equipado para fluorescência (Olympus, BX-FLA).
3.9 Biologia Molecular
3.9.1 Escolha dos protocolos
Com o propósito de avaliar a presença de T. equi nas amostras de: sangue, fragmentos
de órgãos (Linfonodos, pulmões, baço e fígado) e carrapatos (ninfas de Boophilus microplus e
adultos de Rhipicephalus sanguineus) de C. familiaris experimentalmente infectados com T.
equi, foram utilizados quatro diferentes protocolos espécie-específicos para detecção de T.
equi, a saber: três ensaios de PCR, a saber: LINHARES, 2003; ALLSOPP et al., 1994;
BASHIRUDDIN et al., 1999; e um ensaio de “nested PCR” (NICOLAIEWSKY et al., 2001).
Os protocolos escolhidos para os ensaios de PCR (iniciadores) amplificam
fragmentos-alvo do DNA de T. equi de diferentes tamanhos, a saber: ALLSOPP et al. (1994)
e BASHIRUDDIN et al. (1999) - produtos do gene 18 S RNA r de, respectivamente, 816 e
664 pares de base (pb); o emprego do protocolo descrito por NICOLAIEWSKY et al. (2001)
para nested-PCR, que gera produto interno de 102 pb, referente ao gene EMA 1.
3.9.2 Extração de DNA
Utilizaram-se diferentes materiais, com o objetivo de extração do DNA, tais como:
sangue total conservado em EDTA; fragmentos de órgãos; ninfas de B. microplus e adultos de
R. sanguineus. Previamente à extração de DNA, as amostras de sangue, passaram pelo
processo de refrigeração (-8 à -2ºC), para posteriormente, serem utilizadas.
O preparo do material de natureza sólida, tanto fragmentos de órgãos como os
carrapatos, utilizamos o processo de maceração com graau e pistilo. Adicionou-se água
ultrapura para facilitar o processo de coleta de células e líquidos tissulares provenientes do
processo de maceração, com o auxílio de pipetas e ponteira estéreis.
As extrações do DNA foram realizadas empregando-se o "Kit” Comercial
11
, conforme
indicado pelo fabricante.
11
Amersham pharmacia Biotech GFX.
29
3.9.3 Reações em cadeia de polimerase
As misturas de reagentes ("mix") para os ensaios de PCR foram preparadas conforme
descrito originalmente pelos seus respectivos autores.
As amostras de DNA total forma testadas sem diluição e nas diluições de 1:10, 1:100 e
1:1000. Com relação às programações adotadas para cada grupo de iniciadores, temos:
1. LINHARES, (2003): “hot start” à 94ºC por 2 minutos, seguidos de 40 ciclos
sucessivos nas temperaturas de 94ºC por 30 segundos; 53ºC por 30 segundos;
72ºC por 1 minuto e um tempo de extensão extra à 72ºC por 5 minutos
(LINHARES, 2003);
2. ALLSOPP et al.,(1994):A desnaturação em 94 / 5 min.; 30 ciclos de 94 / 30s;
64 /30s e 72 / 30s; extensão final de 72 / 5 minutos;
3. BASHIRUDDIN et al. (1999): Utilizou-se para o “Single PCR”, descrito por, a
seguinte programação: 5 min a 94ºC, 30 ciclos: 94ºC por 30 s, 64ºC por 30 s,
72ºC por 30 s e tempo de extensão final a 72◦C de 5 min; e
4. NICOLAIEWSKY et al. (2001): primeira etapa com iniciadores: Externos
EMAE-1 e EMAE-2; e Internos EMAI-1 e EMAI-2. Ciclo a primeira etapa:
hot start 94◦C por 4 min; seguidos de 40ciclos: 94◦C por 40 s, 60◦C por 1 min,
72◦C por 1 min, tempo de extensão final a 72◦C de 4 min; na segunda etapa:
Hot start a 94◦C por 4 min 35ciclos: 94◦C por 1 min, 60◦C por 45 s, 72◦C por
45;
3.9.4 Controle positivo para PCR
Utilizou-se, como controle positivo para as reações em cadeia de polimerase, DNA
total extraído de sangue de cavalo inoculado experimentalmente com amostra pura de T. equi,
colhida na fase de pico de parasitemia. Estas amostras de sangue foram gentilmente cedidas
pela Dra. ROSÂNGELA ZACARIAS MACHADO - FCAV/UNESP- Jaboticabal - Estado de
São Paulo, Brasil.
3.9.5 Confecção da eletroforese
Os produtos de PCR foram inoculados no gel de Agarose a 1,2%, no volume de 10µl,
misturados previamente em corante de corrida e submetidos a 90 volts durante 55 minutos,
em tampão TBE 1x.
Para cada corrida de eletroforese eram inoculados os controles (negativo e positivo) e
o marcador molecular (100bp DNA - Ladder - Invitrogen®) ao lado das amostras.
Após a corrida os géis forma corados em brometo de etídio por imersão em solução na
concentração de 1%.
30
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Grupos G1 e G2:
4.1.1 Aspectos clínico-parasitológicos
Na microscopia óptica de imersão, após a avaliação dos esfregaços sanguíneos e de
punções de linfonodos dos espécimes C. familiaris imunocompetentes, não foram observadas
formas evolutivas compatíveis com a presença de T. equi. E estes animais não apresentaram
variações clínicas, característica de processo patológico, conforme FIGURA 1 e 2.
Estes resultados sugerem que mesmo em animais jovens, que possuem o sistema
imunológico imaturo, portanto mais susceptíveis que os adultos, não foram capazes de
desenvolver infecção por T. equi detectável a microscopia óptica.
As considerações referentes ao diagnóstico diferencial de pequenos piroplasmídeos na
microscopia óptica, tais como: Babesia gibsoni, B. microti e T. annae (ZAHLER et al.,
2000b; KJEMTRUP et al., 2000), é plausível, tendo em vista a não diferenciação destes à
microscopia. Embora os resultados observados indiquem que colocar a espécie T. equi no
grupo de espécies de protozoários que acometem C. familiaris, mereça uma certa reserva, até
que todas as possibilidades de transmissão sejam avaliadas.
Observa-se que as diferenças de compatibilidade espécie-específica entre parasito-
hospedeiro, demonstraram ser decisivas quanto ao estabelecimento de infecção deste T. equi
em C. familiaris, contrapondo-se ao descrito na literatura sobre os piroplasmídeos (ZAHLER
et al., 2000; CRIADO-FORNÉLIO et al., 2003ab).
4.1.2 Aspectos sorológicos
As amostras de soro avaliadas pela RIFI para pesquisa de anticorpos anti-Theileria
equi, foram negativas em ambas as titulações adotadas.
Tais resultados são comuns em quadros em que não exista de interação parasito-
hospedeiro. O que sugere a existência de barreiras imunológicas, que podem ter contribuído
para o resultado observado, tais como: a resposta imune do tipo celular, promovida pelo
sistema mononuclear fagocitário, por meio da fagocitose, pode ter limitado a instalação do
agente etiológico em questão; a ausência de receptores específicos nas células das espécies C.
familiaris impedindo penetração de T. equi.
4.1.3. Aspectos moleculares
Os resultados das PCRs para amostras de sangue total de C. familiaris
experimentalmente infectados com T. equi, conservadas em EDTA, foram negativos nos
protocolos utilizados.
Tais resultados se contrapõem aos da literatura (CRIADO-FORNÉLIO et al., 2003a).
Os autores responsáveis pela citação da ocorrência desta relação parasito-hospedeiro,
utilizaram abordagem direcionada a biologia molecular (sequenciamento e filogenia), não
utilizando porém, como contraprova, protocolo bio-molecular específica para T. equi.
Diferenças genotípicas pequenas têm sido motivações para reavaliações, redescrições ou
mesmo a criação de novas espécies (ZAHLER et al., 2000a), sem a adoção de critérios mais
amplos que acomodem não somente o aspecto molecular, como também o fenotípico e ,
principalmente, o biológico (UILENBERG et al. 2004)
31
37
37,5
38
38,5
39
39,5
40
40,5
41
1 3 5 7 9 111315171921232527293133353739414345474951
Tempo (dias)
Temperatura (ºC)
Filhote 1
Filhote 2
Figura 1. Variação da temperatura de Cães filhotes (Grupo 1) inoculados com Theileria equi,
no período de julho a setembro de 2004.
32
37
38
39
40
41
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51
Tempo (dias)
Temperatura (ºC)
Adulto 1
Adulto 2
Adulto 3
Adulto 4
Adulto 5
Adulto 6
Figura 2. Variação da temperatura de cães adultos (Grupo 2) inoculados com Theileria equi,
no período de novembro de 2004 a janeiro de 2005.
33
4.2 Grupo G3
4.2.1 Aspectos clínico-parasitológicos
Os resultados a microscopia óptica de imersão, referentes aos grupos de C. familiaris
imunossuprimidos e infectados experimentalmente com T. equi, avaliando tanto esfregaços
sanguíneos de sangue sistêmico e periférico, quanto os provenientes de punções de linfonodos
dos espécimes estudados, não foram observadas formas evolutivas compatíveis com a
presença de T. equi. Observaram-se anormalidades clínicas decorrentes da sensibilidade à
imunossupressão química, em função de infecções secundárias, sobretudo no sistema
tegumentar de dois espécimes que evoluíram a óbito: um cão-testemunha e um adulto
avaliado, conforme Figura 3.
A leucopenia inicial induzida pelo uso de corticosteróide sintético, tende a diminuir a
resposta celular nos capilares sanguíneos e mais ainda a diminuição da migração dos
monócitos circulantes para resposta imunológica do tipo celular. Este fato foi levado em
consideração quando se preconizou a inclusão deste grupo. Os autores da descrição da relação
entre T. equi e C. familiaris, citam de modo pouco pormenorizado os critérios adotados pelos
clínicos daquelas localidades para a coleta e envio do material a pesquisa laboratorial
(CRIADO-FORNÉLIO et al., 2003a). Embora não fosse motivo deste trabalho a indução de
quadro infeccioso, mesmo frente à situação mais grave, aonde os animais que vieram a falecer
estavam com prognóstico reservado, e sabidamente inoculados com T. equi, não houve a
observação da parasitemia.
Fundamentando-se deste modo, a hipótese da incapacidade da cepa utilizada causar
quaisquer anormalidades ou mesmo de estabelecer-se na espécie C. familiaris.
4.2.2. Aspectos moleculares
Os resultados das PCRs, do DNA extraído de: sangue total com EDTA conservado à -
20ºC e fragmentos de linfonodos, pulmões, baço, e fígado conservados pelo congelamento,
provenientes de C. familiaris experimentalmente infectados com T. equi e imunossuprimidos,
foram negativos nos protocolos adotados neste estudo.
No concernente a observação na confecção da reação de cadeia de polimerase,
utilizou-se “amplicon” obtido sem diluições prévias, procedendo ao protocolo de LINHARES
(2004). Nesta oportunidade, nos deparamos com o resultado negativo e uma faixa de
amplificação inespecífica e significativa.
Em um dos espécimes imunossuprimidos, precisamente no 18º dia pós-inoculação, ao
avaliarmos o material proveniente do linfonodos poplíteos observou-se à presença de
estruturas compatíveis com Corpos Azuis de Koch, descritas na espécie Theileria parva.
Porém a luz da biologia molecular, não houve a confirmação desta suspeita, cabendo ressaltar
que as amostras utilizadas para exame foram coletadas, exatas 48 horas antes do óbito.
34
4.2.3. Aspectos biológicos
Não houve, em nenhum dos protocolos utilizados, amplificação de DNA nas reações
de PCR, referentes a pesquisa de T. equi em adultos de R. sanguineus e ninfas de Boophilus
microplus, provenientes de animais imunossuprimidos e experimentalmente inoculados com
T. equi.
No meio científico, existe um consenso a respeito da existência de um complexode
espécie, denominado complexo R. sanguineus, que tem como espécies: R. camicasi; R.
turanicus; R. sanguineus stricto sensu; R. sulcatus.. No entanto, alguns trabalhos ainda
sugerem que a espécie R. sanguineus, possua um amplo espectro de hospedeiros susceptíveis,
estas afirmações carecem de revisão profunda quanto a classificação específica (PEGRAM et
al., 1987ab). Avaliando-se o ponto-de-vista morfológico, sem adoção de métodos mais
acurados para fins taxonômicos, existe uma real dificuldade na distinção destas espécies, fato
este que justificou a criação do complexo. Assim sendo, , ao observarmos tais resultados na
pesquisa bio-molecular de T. equi, entendemos que: o animal não desenvolveu a infecção por
T. equi; ou provavelmente o R. sanguineus que havia sido citado por ENIGK (1943) da
espécie R. turanicus, devido sua localização, sendo também notório o fato de não haver mais
citações neste sentido na literatura científica desde então sobre esta relação T. equi e R.
sanguineus.
Nota-se que a utilização da espécie B. microplus para fins de xenodiagnóstico, é tanto
plausível quanto exeqüível (GUIMARÃES et al., (1998); UETI et al. (2005)) do ponto-de-
vista biológico. Não existindo outro motivo a ser ponderado, neste caso, que não a
incapacidade da cepa T. equi, inoculada experimentalmente em animal previamente
imunossuprimido, de estabelecer e desenvolver-se neste hospedeiro vertebrado.
35
37
37,5
38
38,5
39
39,5
40
40,5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
Tempo (dias)
Temperatura (ºC)
Filhote imunossuprimido
Adulto 1 imunossuprimido
Adulto 2 imunossuprimido
Figura 3. Variação da temperatura de cão jovem e adulto imunossuprimidos (Grupo 3)
inoculados com Theileria equi, no período de setembro a outubro de 2005.
36
4.3 Grupo G4
4.3.1 Aspectos parasitológicos
Ao nível da microscopia óptica de imersão, não foram observadas formas evolutivas,
em nenhum elemento figurado do sangue, compatíveis com T. equi, ou quaisquer outros
hematozoários que acometa a espécie C. familiaris. Embora, aspectos epidemiológicos,
sobretudo a questões referentes à teoria dos focos naturais (REIS, 2001): a superposição das
áreas habitadas pelos hospedeiros e potenciais vetores e a presenças do parasito e sua
prevalência estão contempladas, tendo em vista que a área em questão é citada como área de
estabilidade enzoótica para T. equi (PFIFFER, 1994).
Este aspecto não serve em absoluto de base para refutar a ocorrência da relação entre
T. equi e C. familiaris, devido à baixa sensibilidade em níveis parasitêmicos baixos
(YAMAME et al., 1987ab). O que é também reportado no estudo desenvolvido por LORETTI
& BARROS, 2005, com relação à ocorrência em sangue circulante de outros pequenos
piroplasmídeos de caninos de procedência rural, como a espécie Rangelia vitalii.
As ocorrências de pequenos babesídeos em C. familiaris têm estado incipientes, se
comparado à ocorrência de B. canis e B. vogeli (PASSOS et al., 2005; SÁ, 2005). Apenas no
Estado do Rio Grande do Sul, se tem notícia através de publicação científica da ocorrência de
pequeno babesídeo (BRACCINI et al., 1992), que poderia ser atribuída a T. equi, por ser de
consenso comum que esta espécie, fenotipicamente, é indistinta da B. gibsoni, apresentando,
porém um único aspecto que poderia ser utilizado em diagnóstico diferencial, entre elas: a
presença de divisões com aspecto de cruz, o que não foi reportado em outra espécie, que não
as pertencentes ao gênero Equus.
Porém adotou-se a inclusão do G4 no intuito de se observar em condições tão
próximas quanto possíveis, respeitando-se objetivamente a adaptação e evolução da espécie
C. familiaris reportada no continente americano em detrimento ao europeu, o comportamento
destas espécies, T. equi e C. familiaris, conforme descrito pelos autores europeus (CRIADO-
FORNÉLIO et al. 2003a) em um nicho rural considerado enzoótico para T. equi.
4.3.2 Aspectos sorológicos
As pesquisas referentes à presença de anticorpos da classe Ig G anti-T. equi, nas
amostras de soro oriundas de três repetições em doze espécimes C. familiaris, foram negativas
nas diluições 1:40 e 1:80, na reação de imunofluorescência indireta. A não produção de
resposta imune detectável pela RIFI, em particular para pesquisa desta classe de
imunoglobulina (Ig G), que apresenta maiores graus de concentração sérica em detrimento as
da classe Ig M (TIZARD, 2000; ROITT et al., 1999).
Estes resultados não corroboram com a hipótese de que a co-habitação de um mesmo
nicho ecológico proporciona a ocorrência da relação parasito-hospedeiro incomum
(CRIADO-FORNÉLIO et al., 2003 ab). Porém, no âmbito densidade populacional do
hospedeiro vertebrado e vetores biológicos, bem como os fatores limitantes à transmissão, tais
como uso de produtos carrapaticidas ou mesmo o grau nutricional dos indivíduos,
provavelmente corroboraram para observação do resultado negativo em C. familiaris, na
região estudada.
37
Considera-se que a interação entre as espécies T. equi e C. familiaris incomum
ocorrida em outros países, tanto envolvendo C. familiaris (CRIADO-FORNÉLIO et al.,
2003a), quanto Felis catus (CRIADO-FORNÉLIO et al., 2003b) e as espécies T. equi e B.
canis canis, respectivamente, são plausíveis com as cepas ocorrentes naquelas localidades.
Em alguns casos, existem diferenças genotípicas estritas a poucos pares de bases em espécies
seqüenciadas e depositadas no banco de dados genéticos, mundialmente acessíveis, como por
exemplo, o que ocorre com as cepas de T. equi (Spain 1 e Spain 2), que possuem diferença de
apenas 04 Pares de bases, fato este que segundo os autores CRIADO-FORNÉLIO et al.
(2003a), inviabiliza a infecção de uma possível espécie hospedeira alternativa, no caso a C.
familiaris.
Tais diferenças, como já abordado em tópicos anteriores, não podem por si só servir de
apoio para redescrições, revalidações ou mesmo criações de espécies; outros parâmetros são
de notória importância quanto à taxonomia, não somente do grupo dos piroplasmídeos, mas
em todas as espécies de modo geral (UILENBERG et al., 2004).
38
5 CONCLUSÕES
1. A inoculação experimental em cães domésticos (C. familiaris) imunocompetentes e
imunossuprimidos com amostra viável criopreservada da cepa Jaboticabal de T. equi
não reproduziu infecção detectável clinicamente ou pelos métodos: microscopia
óptica, RIFI, biologia molecular e xenodiagnóstico;
2. C. familiaris imunocompetentes e imunossuprimidos foram refratários à infecção
experimental com a cepa Jaboticabal de T. equi; e
3. Em condições naturais, cães domésticos como estreita relação com eqüinos em áreas
enzoóticas para T. equi, na microrregião de Seropédica, Estado do Rio de Janeiro,
Brasil, não apresentaram anticorpos anti-T. equi, não estando, portando, envolvidos na
epizootiologia de T. equi nesta localidade.
39
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