ads:
DISSERTAÇÃO
ASSOCIAÇÃO DE MARCADORES EST-SSR À
RESISTÊNCIA AO BICHO-MINEIRO EM
CAFEEIROS
FERNANDA DE OLIVEIRA PINTO
Campinas, SP
2006
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
INSTITUTO AGRONÔMICO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA
TROPICAL E SUBTROPICAL
ASSOCIAÇÃO DE MARCADORES EST-SSR À
RESISTÊNCIA AO BICHO-MINEIRO EM CAFEEIROS
FERNANDA DE OLIVEIRA PINTO
Orientador: Oliveiro Guerreiro Filho
Co-orientadora: Mirian Perez Maluf
Dissertação submetida como requisito
parcial para obtenção do grau de
Mestre em
Agricultura Tropical e Subtropical
Área de Concentração em Melhoramento
Genético Vegetal
Campinas, SP
Maio 2006
ads:
Aos meus pais
Marlene e Luís e à minha irmã Carolina
DEDICO
Ao Marcio, pelo apoio, amor e dedicação
indispensáveis
OFEREÇO
AGRADECIMENTOS
- Primeiramente a Deus, por ter-me permitido chegar até aqui. Agradeço pela Sua força e
proteção que me permitiram alcançar os difíceis objetivos;
- Ao Instituto Agronômico, pela oportunidade de realização do Curso de Mestrado;
- A EMBRAPA - Café, pela concessão de bolsa de estudo;
- Ao CNPq, pelo financiamento deste projeto;
- Ao orientador, Dr. Oliveiro Guerreiro Filho e a co-orientadora, Drª Mirian Perez Maluf,
pelos ensinamentos importantes durante o curso e na minha vida profissional;
- Aos Professores da área de concentração Melhoramento Genético Vegetal, pelos
ensinamentos indispensáveis à minha formação;
- Aos funcionários da PG-IAC, pelo auxílio dado no decorrer do curso;
- Aos colegas da pós-graduação e a todos do Laboratório de Biologia Molecular do Centro
de Café, pela constante amizade e pelo apoio durante o desenvolvimento desta dissertação;
- A funcionária Sílvia, pela constante amizade e pela inestimável ajuda na organização
desta dissertação;
- Aos meus pais, Luís e Marlene, à minha irmã Carolina e à minha avó Maria Elisa, pelo
amor, incentivo e força que sempre me deram para que conseguisse chegar até o fim;
- Ao meu namorado, Marcio, pela força, companheirismo e apoio que sempre dedicou a
mim;
- Aos meus tios e tias, avô e primos, por sempre acreditarem e torcerem por mim;
- Às minhas amigas Paula, Michelle e Bethe pela constante amizade e companheirismo
dedicados a mim durante todo este período.
ESCLARECIMENTOS
As seqüências genômicas analisadas nesta dissertação foram obtidas no Banco de
ESTs do Genoma Café. O acesso a este Banco de Dados é restrito e condicionado à
autorização pelo Comitê Gestor do Genoma Café, cujos membros são formados pela
FAPESP, CBP&D do Café e EMBRAPA. Os dados são confidenciais e não podem ser
divulgados publicamente durante o período previsto de confidenciabilidade. Portanto, as
seqüências utilizadas não serão apresentadas neste trabalho.
SUMÁRIO
ÍNDICE DE TABELAS.......…………..…………………………………………... vi
ÍNDICE DE FIGURAS............................................................................................. vii
RESUMO................................................................................................................... viii
ABSTRACT............................................................................................................... ix
1 INTRODUÇÃO...................................................................................................... 1
2 REVISÃO DE LITERATURA................................................................................ 3
2.1 A Cultura do Café……………..…………………………………………............ 3
2.2 Melhoramento do Cafeeiro.………………………............................................... 4
2.2.1 Biologia do bicho-mineiro…………………………………………………….. 5
2.2.2 Seleção de cafeeiros resistentes ao bicho-mineiro.……………………............ 5
2.3 Mecanismos de defesa da planta........................................................................... 7
2.4 Marcadores Microssatélites…………………………………............................... 10
2.5 Importância da Busca de Microssatélites em Banco de ESTs……....…………... 12
3. MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................... 14
3.1 Local de Experimentação………………………………………………….......... 14
3.2 Material Vegetal.................................................................................................... 14
3.3 Avaliação da Resistência....................................................................................... 15
3.3.1 Técnica de criação de insetos..…......………………......................................... 15
3.3.2 Infestação das plantas e avaliação da resistência……………………………... 16
3.4 Desenvolvimento de Marcadores Microssatélites................................................. 17
3.4.1 Busca de microssatélites em banco de dados ESTs de café………...……….... 17
3.4.2 Isolamento do DNA genômico........................................................................... 17
3.4.3 Amplificação de microssatélites via PCR (reação da polimerase em cadeia).... 18
3.4.4 Eletroforese dos fragmentos…………………………………………............... 19
3.4.5 Análise dos resultados........................................................................................ 19
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................. 21
4.1 Avaliação da Resistência……………................................................................... 21
4.2 Desenvolvimento de Marcadores Microssatélites………………………………. 23
4.2.1 Tipo de repetição e função dos SSR…………………………………………... 25
4.2.2 Posição do SSR no gene……………………………………………………..... 28
4.2.3 Amplificação de microssatélites via PCR…………………………………….. 30
5 CONCLUSÕES........................................................................................................ 38
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................... 39
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Genealogia da população segregante para resistência ao bicho-
mineiro oriunda do programa de melhoramento desenvolvido pelo
Instituto Agronômico de Campinas………………..……................
15
Tabela 2.
Escala de pontos para a classificação de cafeeiros quanto ao tipo de lesão desenvolvida a partir
da infestação pelo bicho-mineiro......
17
Tabela 3. Nível de resistência ao bicho-mineiro dos 136 indivíduos da
progênie H14954-46 C1351 EP 473................................................. 21
Tabela 4.
Buscas em ESTs (Etiquetas de Seqüências Expressas) do Banco de
Dados do Genoma Café
…………......………………………............. 24
Tabela 5.
Associação das seqüências de vinte e nove microssatélites quanto à sua
função e posição no gene, obtida a partir das anotações do banco de
dados do Genoma Café........
…………………………………….........
27
Tabela 6. Caracterização dos locos SSR quanto à quantidade de alelos/loco e
quanto à variação no tamanho dos alelos……….............................. 35
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Tipos de lesões desenvolvidas por Leucoptera coffeella em folhas com
diferentes níveis de resistência avaliados numa mediante escala de 1 a
4 pontos.........................................................................
22
Figura 2.
Padrão de amplificação dos oligos SSR em bulks de DNA (A1 e A2 -
SSR 6; B1 e B2- SSR 15; C1 e C2- SSR 9). PM- Peso Molecular de 250
pb; 1 a 11- bulks de plantas resistentes ao bicho-mineiro; 12 a 21- bulks
de plantas suscetíveis ao bicho-mineiro.......................................................
31
Figura 3.
Padrão de amplificação em gel de poliacrilamida 6% do SSR 4, com dois
alelos, em bulks de plantas resistentes (1 a 11) e plantas suscetíveis (12 a
21) ao bicho-mineiro....................................................................................
32
Figura 4.
Padrão de amplificação em gel de poliacrilamida 6% do SSR 15, com
dois alelos, em bulks de plantas resistentes (1 a 11) e plantas suscetíveis
(12 a 21) ao bicho-mineiro...........................................................................
32
Figura 5.
Padrão de amplificação em gel de poliacrilamida 6% do SSR 18, com
quatro alelos, em bulks de plantas resistentes (1 a 11) e de plantas
suscetíveis (12 a 21) ao bicho-mineiro
.................................................... 33
Figura 6.
Padrão de amplificação em gel de poliacrilamida 6% do SSR 18, em
genótipos do bulk suscetível (P1-
C1195-5-6-2; P2-H13685-1; P3-
H14954-46; P4-IAC 81)
– parentais; 90, 92, 94, 95, 97 - genótipos
individuais do bulk
18).
...............................................................................................
33
PINTO, Fernanda de Oliveira. Associação de marcadores EST-SSR à resistência ao
bicho-mineiro em cafeeiros. 2006. Dissertação (Mestrado em Melhoramento Genético
Vegetal) – Pós-Graduação-IAC.
RESUMO
Um dos fatores que podem limitar o desenvolvimento de novas cultivares de cafeeiro por
programas de melhoramento é a dificuldade de seleção precoce para características
agronômicas superiores, visto que essas apresentam herança genética complexa e forte
influência ambiental. Atualmente, marcadores moleculares são utilizados, em diferentes
espécies de plantas, como uma ferramenta alternativa e eficiente para seleção de tais
características. Em café, até o momento, já foram identificados marcadores do tipo RAPD e
AFLP associados a características de interesse agronômico, tais como resistência à
ferrugem e nematóides. O objetivo deste projeto é a identificação de marcadores
moleculares do tipo microssatélite (SSR) que co-segreguem com a resistência ao bicho-
mineiro, para utilização em programas de seleção para essa praga. Foram avaliadas 136
plantas de progênie proveniente do intercruzamento entre Coffea arabica X C. racemosa
quanto ao nível de resistência ao bicho-mineiro. A estratégia proposta para a identificação
desses marcadores microssatélites de sequências expressas foi através de buscas dirigidas
aos bancos de ESTs (expressed sequence tagged) de cafeeiro. Os locos SSR avaliados
apresentaram, em sua maioria, repetições mais complexas sendo 65% das repetições de
tetranucleotídeos, 21% de trinucleotídeos e 14% de dinucleotídeos. Além do padrão
complexo de repetição, os locos avaliados estão localizados preferencialmente na região 5’-
UTR do gene (53,57%) e os genes estão envolvidos com mecanismos de defesa. Trinta e
dois oligos foram desenhados, dos quais 29 amplificaram os locos SSR com o tamanho
esperado, com um número médio de alelos/loco de 2,1. Apenas um loco SSR foi
polimórfico, porém não segregou com a resistência ao bicho-mineiro. Estes resultados
sugerem que a seleção assistida por estes marcadores no melhoramento do café devem ser
utilizados em cruzamentos iniciais, onde a variabilidade genética ainda é significante.
Palavras-chave: café, marcadores moleculares, seleção assistida.
PINTO, Fernanda de Oliveira. Analysis of EST-SSR markers in coffee progenies
segregating to leaf-miner resistance. 2006. Dissertação (Mestrado em Melhoramento
Genético Vegetal) – Pós-Graduação-IAC.
ABSTRACT
The development of new coffee cultivars has been limited by the difficulty in early of
selection desirable agronomic traits, since those characteristics exhibit complex genetic
inheritance and significant environmental influence. Currently, molecular markers have
been used as an alternative and efficient selection tool by breeding programs of several
plant species. In coffee, some RAPD and AFLP markers were already identified and co-
segregate with agronomic characteristics such as pathogen resistance. The main purpose of
this work was to identify expressed microsatellite (SSR) markers associated with resistance
to leaf-miner in coffee progenies These markers will be useful during selection for
resistance to this insect by coffee breeding programs. The identification of potential SSR
markers has been accomplished by directed search on the Brazilian Coffee ESTs Database.
EST- SSR were preferentially selected from genes expressed in leaves and stressed tissues.
Sequence analysis of 32 selected SSR loci showed that complex repeats (65%) are more
frequent than tri- (21%) and di- (14%) nucleotide repeats. Also, expressed SSR are
localized frequently in the 5’- UTR of the gene transcript. Moreover, most of the genes
containing evaluated SSR are associated with defense mechanisms. Polimorphisms were
analyzed in advanced progenies segregating for resistance to the leaf-miner. Genomic DNA
extracted from 136 plants, all corresponding to advanced generations of a Coffea arabica X
Coffea racemosa hybrid, were used for EST-SSR amplifications. Frequency of SSR alleles
was 2.1/locus, and only one locus SSR showed polymorphism, but did not cosegregat with
the resistance to leaf-miner. These results suggest that marker assisted-selection in coffee
breeding should be performed on initial crosses and selection, where the genetic variability
is still significant.
Key words: coffee, molecular markers, assisted-selection.
1 INTRODUÇÃO
O Brasil é o principal produtor e exportador do café com o equivalente a 30% do total
global e com uma produção nacional representando cerca de 25% do volume internacional.
Apresenta um parque cafeeiro com 6,0 bilhões de pés, sendo 75% em produção. Uma área
de 2,0 milhões de hectares encontra-se em franca produção e 484 mil hectares
compreendem cafezais novos, ou em formação (EMBRAPA, 2001).
Apesar da acentuada redução da área cultivada nas últimas décadas e de diversos
fatores abióticos como seca e geada e, de fatores bióticos como pragas e doenças
(GONÇALVES, 1998), têm determinado oscilações na sua produção total, o Brasil ainda
ocupa uma posição dominante no mercado mundial. A estimativa oficial de produção na
safra de 2005/2006 é de 39,272 milhões de sacas, contando com 2.222 milhões de hectares
plantados (Anuário Estatístico do Café, 2005/2006 - Companhia Nacional de
Abastecimento - CONAB).
Conhecem-se mais de cem espécies do gênero Coffea originárias da África e sul da Ásia
(CHEVALIER, 1947) apesar de somente as espécies Coffea arabica e C. canephora terem
importância econômica ativa no mercado mundial. Por outro lado, as espécies não
cultivadas do gênero Coffea apresentam uma grande importância do ponto de vista
adaptativo, sendo fontes de variabilidade genética. Tais espécies possuem características
altamente vantajosas tais como resistência a doenças e pragas, tolerância à seca e outras
alterações ambientais (FAZUOLI et al., 1999). Um exemplo da utilização destes recursos
genéticos é a variedade IAC2258 (Apoatã) de C. canephora desenvolvida pelo Instituto
Agronômico de Campinas (IAC), utilizada como porta enxerto de C. arabica devido à
resistência a nematóides (FAHL et al., 1998).
Doenças e pragas são fatores restritivos para ao alcance do máximo potencial produtivo
de uma cultivar. No Brasil a ferrugem e os nematóides, importantes pragas da cultura,
atingem todas as regiões cafeicultoras e, se não forem devidamente controladas, podem
causar uma queda drástica na produção. O controle químico desses agentes tem se mostrado
eficiente, porém, além de representar cerca de 10 a 20% do custo total da produção
(VEGRO & FERREIRA, 2000), pode promover a redução simultânea de importantes
inimigos naturais devido à baixa seletividade. Além disso, a pressão de seleção pode levar
ao surgimento de raças de patógenos resistentes aos produtos aplicados. Um dos maiores
desafios para os pesquisadores tem sido determinar métodos eficientes de controle, porém
de baixo impacto ambiental.
Um dos maiores problemas nas lavouras de C. arabica é o bicho-mineiro Leucoptera
coffeella (GUÉRIN-MÉNEVILLE, 1842) (Lepidoptera-Lyonetiidae), que constitui-se no
maior problema da cultura. Essa praga, que só ocorria no Brasil em períodos secos, passou
a atingir níveis mais elevados também em períodos chuvosos, causando perdas que podem
ultrapassar 50% (SOUZA & REIS, 1992). O controle químico, método de controle mais
utilizado, aumenta o custo de produção e causa poluição ambiental (GUERREIRO et al.,
1998; GUEDES, 1999).
O desenvolvimento da cafeicultura brasileira deve-se grandemente ao trabalho realizado
pelo programa de melhoramento do cafeeiro do Instituto Agronômico de Campinas iniciado
em 1932. Este trabalho deu origem a um grande número de cultivares recomendadas para
as variadas regiões do país.
O IAC vem desenvolvendo há cerca de 20 anos um extenso programa de melhoramento
visando à seleção de cafeeiros resistentes ao bicho-mineiro (GUERREIRO et al., 1995).
Este inseto era considerado problema apenas nos períodos de seca do ano, mas o uso
intensivo de defensivos agrícolas nas lavouras cafeeiras principalmente de produtos com
largo espectro de ação, a utilização de espaçamentos maiores visando especialmente à
mecanização para controle de ferrugem e as extensas áreas de plantio favoreceram a sua
proliferação, e atualmente, a infestação atinge níveis de danos significativos em qualquer
época do ano (PARRA, 1975). Genes de resistência presentes em C. racemosa foram
transferidos para C. arabica através de cruzamentos controlados. Atualmente, um grande
número de progênies híbridas está em processo de seleção para resistência ao bicho-
mineiro. No entanto, limitações decorrentes do ciclo de vida longo das espécies de Coffea
tornam a seleção de genótipos com características desejadas um processo lento e
dispendioso. Assim, o desenvolvimento de ferramentas que auxiliem na seleção de
progênies resistentes, tais como marcadores moleculares, representa um avanço para o
programa de melhoramento do cafeeiro.
Este trabalho teve por objetivo identificar marcadores do tipo microssatélite (SSR) que
co-segreguem com a resistência ao bicho-mineiro em híbridos de Coffea, e que possam ser
utilizados como marcadores para seleção assistida. Para isto, as análises foram realizadas
para identificar seqüências expressas de marcadores moleculares do tipo microssatélites
(SSR) no Banco de ESTs de café e avaliar o padrão de SSRs em progênies de café
segregantes para resistência e suscetibilidade ao bicho-mineiro
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A Cultura do Café
O café pertence ao gênero Coffea, família Rubiacea, formado por cerca de 100 espécies, em
sua maioria, nativas do Continente Africano e algumas endêmicas da região que vai de
Madagascar ao Oceano Índico.
As espécies mais cultivadas e de maior importância econômica são C. arabica L. (café
arábica) e C. canephora Pierre (café robusta) (CARNEIRO, 1997). Outras espécies do gênero
como C. racemosa, C. kapakata, C. liberica, apresentam importante utilização em
programas de melhoramento, como fontes de variabilidade genética (FAZUOLI et al.,
1999), uma vez que possuem características de interesse agronômico (CARVALHO &
FAZUOLI, 1993).
A espécie C. arabica é uma espécie alotetraplóide (2n = 4x = 44 cromossomos). É
predominantemente autofértil em aproximadamente 90% das flores, enquanto C. canephora e
outras espécies conhecidas do gênero Coffea são diplóides (2n = 2x = 22 cromossomos),
alógamas e autoincompatíveis (FAZUOLI et al., 1999). C. arabica é nativa de uma região
restrita, marginal às demais espécies, localizada no sudoeste da Etiópia e Sudão e norte do
Quênia (CHEVALIER, 1947; CHARRIER, 1978; BRIDSON, 1982). A diversidade genética
de cultivares de Coffea arabica L. é relativamente pequena e a sua ampliação torna-se
importante para o futuro do melhoramento do cafeeiro. Esta estreita diversidade deve-se ao fato
de serem plantas autógamas com centro de origem limitado e de terem sido utilizadas pequenas
quantidades de sementes durante o processo de dispersão do café, foram introduzidos poucos
acessos (CARVALHO et al., 1993), além de serem bastante aparentadas e em grande maioria,
derivam-se das cultivares Típica, originalmente introduzida no Brasil em 1727 e Bourbon
Vermelho, oriunda da ilha de mesmo nome (ANTHONY et al., 2001). Trata-se de uma
espécie nobre e que produz café de boa qualidade. Existem muitas variedades de C. arabica e
mais de 40 mutantes já descritos (CARVALHO et al., 1991). As características desses mutantes
são variáveis como, por exemplo, crescimento e forma da planta, tipo de ramificação, forma e
coloração das folhas, tamnho das sementes, resistência a moléstias, pragas e nematóides, dentre
outras.
Estudos baseados na análise da seqüência de DNA suportam que C. arabica é resultado da
associação de duas espécies diplóides de Coffea. Em trabalho conduzido por LASHERMES et
al. (1999), foram identificados dois grupos de cromossomos ou genomas combinados. A
organização do genoma de C. arabica foi confirmada utilizando metodologia de hibridação
(GISH). Foi utilizado como sonda DNA genômico de duas prováveis espécies doadoras e
os resultados sugeriram que C. arabica é um anfidiplóide formado pela hibridação entre C.
eugeniodes e C. canephora ou ecotipos relacionados a estas espécies diplóides. Além destes
resultados os autores indicaram a baixa divergência existente entre os dois genomas
constituintes de C arabica e sugeriram que o processo de especiação ocorreu recentemente,
com origem na África Central.
A outra espécie de interesse comercial, C. canephora, possui distribuição geográfica ampla
ocorrendo nas regiões ocidental, central tropical e subtropical do continente africano
(CHARRIER & BERTHAUD, 1985). A variabilidade existente dentro dessa espécie é muito
grande, e pode ser verificada em relação ao tamanho e forma das plantas, folhas, frutos e
sementes.
As demais espécies de Coffea não são cultivadas economicamente, mas ocorrem de forma
silvestre e possuem variabilidade elevada para algumas características tais como resistência a
pragas e doenças.
Por se tratar de uma cultura perene e de período juvenil longo, o melhoramento genético do
cafeeiro é lento, sendo necessária a implementação de técnicas que facilitem e acelerem a
obtenção, avaliação e seleção de materiais superiores. Análises genéticas em espécies de Coffea
já vêm sendo feitas para aproveitamento de características importantes para o melhoramento,
tais como tamanho e forma da planta, fruto e sementes, além da resistência a doenças, pragas e
nematóides (FAZUOLI, 1999).
2.2 Melhoramento do Cafeeiro
A crescente demanda mundial por alimentos de melhor qualidade, principalmente livres
de resíduos de defensivos agrícolas, tem promovido um avanço significativo em diversas
áreas da produção vegetal.
Recentemente, métodos avançados de melhoramento genético vegetal têm se destacado
principalmente devido à possibilidade de obtenção de resultados uniformes e direcionados
para características desejáveis. Dentre as técnicas de biotecnologia moderna que poderiam
auxiliar o programa de melhoramento do cafeeiro destacam-se a cultura de tecidos, a
transformação genética e os marcadores moleculares.
O Programa de Melhoramento do Cafeeiro do IAC além de visar o desenvolvimento de
cultivares produtivas, com resistência a ferrugem e nematóides, foca também a obtenção de
variedades de café tolerantes a insetos. Algumas espécies tais como C. canephora, C.
racemosa e C. congensis vêm sendo utilizadas como fontes importantes de variabilidade
genética neste programa (FAZUOLI et al., 1984; BERTRAND et al., 2000).
Para o desenvolvimento de cultivares resistentes ao bicho-mineiro, C. racemosa tem
sido utilizada como doadora de genes de resistência ao inseto devido à facilidade do
cruzamento com C. arabica (CARVALHO & MONACO, 1968).
Embora a seleção de plantas melhoradas esteja em nível avançado, e já tenha sido
possível relacionar a resistência ao inseto a dois genes complementares e dominantes
(GUERREIRO-FILHO et al., 1999), pouco se sabe ainda sobre a natureza e sobre os
marcadores associados a esta resistência.
2.2.1 Biologia do bicho-mineiro
O inseto bicho-mineiro Leucoptera coffeella (GUÉRIN-MÉNEVILLE, 1842), é um
micro-lepdóptero de hábito crepuscular noturno. As mariposas medem 6,5 mm de
envergadura, têm coloração branca pardacenta e as asas anteriores e posteriores franjadas.
As lagartas vivem dentro de lesões ou minas foliares por elas mesmas construídas. Quando
completamente desenvolvidas, medem cerca de 3,5 mm de comprimento. Este inseto é
considerado de metamorfose completa, passando pelas fases de ovo, lagarta, crisálida e
adulta (SOUZA et al., 1998). A postura dos ovos sempre é feita na face superior das folhas
e, após a eclosão, as lagartas penetram na folha através da epiderme pelo mesofilo foliar
dirigindo-se ao parênquima paliçádico, iniciando a alimentação e levando ao dano.
As lesões causadas pelo bicho-mineiro entre as epidermes, também denominadas
galerias ou minas, têm bordas irregulares, são de coloração amarelo-pálido e
posteriormente tornam-se pardacentas (KORONNOVA & DE LA VEJA, 1985). No
mesofilo, as minas provocadas pelo inseto estão exclusivamente no parênquima paliçádico
(CARDENAS, 1981).
2.2.2 Seleção de cafeeiros resistentes ao bicho-mineiro
Um gradiente de infestação pode ser observado entre as folhas jovens até as mais
velhas durante a infestação natural de variedades de café suscetíveis ao bicho-mineiro
(NANTES & PARRA, 1977), com lesões pequenas e irregulares sendo observadas com
maior freqüência em folhas jovens (CARDENAS-MURILLO & POSADA-OCHOA,
1984).
No gênero Coffea são identificados diferentes níveis de resistência ao bicho-mineiro
entre as espécies. GUERREIRO-FILHO et al. (1991) sugeriram o agrupamento das
espécies em altamente resistentes (C. stenophylla, C. brevipes, C. salvatrix e C. liberica),
moderadamente resistentes (C. racemosa, C. kapakata, C.devrevei e C. eugenioides),
suscetíveis (C. congensis e C. canephora) e altamente suscetíveis (C. arabica). Outras
espécies provenientes da África Continental como C. humilis, Coffea sp. Moloundou, C.
jasminoides, ou da Ilha de Madagascar, como, C. perrieri e C. resinosa, também
apresentaram níveis elevados de resistência ao inseto (GUERREIRO-FILHO, 1994). A
espécie C. racemosa vem sendo utilizada como doadora de genes de resistência ao inseto
para a espécie C. arabica (CARVALHO & MONACO, 1968).
A seleção de indivíduos resistentes é realizada em uma primeira etapa no viveiro
descartando-se plantas suscetíveis de cada progênie obtidas por cruzamentos dirigidos ou
autofecundações. Plantas não atacadas são avaliadas individualmente em laboratório
utilizando-se metodologia descrita por GUERREIRO-FILHO (1994). A avaliação da
resistência é feita pelo tipo de reação observada nas folhas.
O desenvolvimento de cultivares de C. arabica resistentes teve início a partir de
cruzamentos entre os cafeeiros C1195-5-6-1 e C1195-5-6-2 com plantas selecionadas das
cultivares Icatu Vermelho, Catimor e Híbrido de Timor, resistentes ao fungo Hemileia
vastatrix, causador da ferrugem do cafeeiro.
A combinação híbrida H11421 (RC
3
–C1195-5-6-2 x H4782-7-882 Icatu Vermelho)
destacou-se pela produtividade média e pelo maior nível de resistência das plantas ao
bicho-mineiro (GUERREIRO-FILHO et al., 1991). Uma das melhores plantas da progênie,
H11421-11 foi utilizada em retrocruzamentos com a cultivar Catuaí Vermelho IAC 81,
dando origem à progênie H13685 (RC
4
). Plantas selecionadas na geração anterior foram
retrocruzadas com a cultivar Catuaí Amarelo IAC 62. Um desses cruzamentos, realizados
com o indivíduo H13685-1 deu origem à progênie H14954 (RC
5
), que se encontra plantada
no ensaio de progênies EP473, no Centro Experimental Central do IAC, em Campinas, SP.
A progênie da planta H14954-46 foi selecionada para o estudo de associação da resistência
com microssatélites expressos.
Finalmente, plantas selecionadas deste último retrocruzamento foram utilizadas como
parentais masculinos em cruzamentos com a cultivar Catuaí Vermelho IAC 144 (H 20033;
RC
6
).
A metodologia de seleção adotada consiste em uma associação entre os métodos de
retrocruzamentos e genealógico, sendo a cultivar Catuaí utilizada nos retrocruzamentos
com o intuito de se obter plantas produtivas, resistentes ao inseto e de porte baixo (MALUF
& GUERREIRO-FILHO, 2005).
Por se tratar de uma espécie perene, de ciclo longo, uma primeira seleção de plantas
resistentes é realizada ainda na fase de mudas. Plantas jovens suscetíveis são descartadas
precocemente em viveiro a partir da análise da infestação natural por L. coffeella. As mudas
resistentes ou não atacadas no viveiro são avaliadas posteriormente em testes de laboratório
mediante utilização do método de discos de folhas (GUERREIRO-FILHO et al., 1992).
Apenas plantas consideradas resistentes são plantadas em ensaios de progênies para
avaliação de suas características agronômicas de interesse. Supõe-se que a utilização de
marcadores moleculares possa potencializar a redução dos custos financeiros e o aumento
da eficiência do programa de seleção de plantas resistentes ao inseto.
2.3 Mecanismos de Defesa da Planta
O sistema de defesa das plantas contra insetos pode atuar de duas formas. A primeira, a
resistência estática ou constitutiva, ocorre mesmo sem a ação de agentes agressores e é
definida como o efeito combinado de todas as barreiras constitutivas presentes na planta
antes do ataque. Esta resistência é recebida por herança dos ancestrais e torna as plantas
imunes (ou não-hospedeiras) à maioria dos patógenos. A segunda é a resistência ativa ou
induzida, que é desenvolvida via mecanismos de proteção ativados durante o contato com o
patógeno (GATEHOUSE, 2002).
Os mecanismos de resistência são ativados perto da área infectada para tentar prevenir a
difusão do patógeno ou deter a contínua predação por insetos. A velocidade com que a
planta reconhece a presença do agressor determina o tempo de resposta à invasão,
desencadeando uma ou mais reações de defesa. Se a resposta é mais rápida do que o
processo de infecção, a planta pode conter o agente (resistência). A interação entre um
patógeno e um vegetal é dita ‘compatível’ quando leva à doença, mas se a planta resiste à
agressão a interação é dita incompatível (MARGIS-PINHEIRO, 1993).
Os processos biossintéticos envolvidos nos mecanismos de defesa estática e ativa são
praticamente os mesmos, envolvendo os mesmos genes, porém, diferem entre si apenas na
expressão dos mesmos. Na resistência estática, a expressão gênica é o resultado do
processo normal de desenvolvimento da planta, enquanto que na resistência ativa, a
expressão é regulada por um sinal ativado durante estímulo externo (GATEHOUSE, 2002).
A resistência ativa pode ser reconhecida pela chamada reação de hipersensibilidade ou
HR, com a morte de células situadas nos locais por onde o agressor penetra. Com isso, a
planta impede o acesso do patógeno a células vizinhas, limitando a infecção. Os aspectos
fisiológicos da hipersensibilidade incluem o aumento rápido e transitório de agentes
oxidantes, a perda de íons potássio (K+) e ganho de íons hidrogênio (H+) pelas células, a
destruição de compartimentos e o espessamento das paredes celulares e da cutícula, além da
síntese de toxinas e proteínas relacionadas à defesa. Além destes compostos, a resistência
ativa pode trazer proteção a planta contra um grupo de patógenos (MARGIS-PINHEIRO,
1993).
O metabolismo secundário das plantas é o responsável pela produção de compostos
orgânicos que não apresentam função direta no crescimento e desenvolvimento da planta e
que estão presentes no mecanismo de defesa (BENNETT & WALLSGROVE, 1994).
Os compostos fenólicos produzidos pelo metabolismo secundário (APPEL, 1993)
foram identificados como integrantes de mecanismos de defesa das plantas contra diversos
patógenos (KOSUGE, 1969) e parecem influenciar os processos fisiológicos das plantas
como síntese de moléculas sinalizadoras, proteção contra estresse ambiental e constituição
da parede celular (BI et al., 1997). São exemplos de compostos fenólicos, o ácido
clorogênico, antocianinas, fitoalexinas, taninos e ligninas entre outros.
As interações entre fenólicos oxidados e proteínas da dieta são deletérias para os insetos
(FELTON et al., 1989a), pois alteram a disponibilidade de aminoácidos e são irreversíveis.
Em trabalho desenvolvido com folhas de morangueiros, LUCZYNSKI et al. (1990)
descreveram o desenvolvimento retardado do ácaro Tatranychus urticae. Em cultivares
contendo altas concentrações de compostos fenólicos o crescimento deste ácaro foi
suprimido, supostamente pela inativação de suas enzimas digestivas.
Outro exemplo de compostos que oxidam fenóis são as enzimas conhecidas como
polifenoloxidases (PPO) e peroxidases (PO) (MAYER, 1987). Nas plantas, ainda não se
sabe ao certo sobre o papel fisiológico das PPOs, embora a função mais provável seja o
envolvimento com em mecanismos de defesa contra patógenos e predadores
(CONSTABEL et al., 2000). Vários autores têm relatado a indução de atividade de PPO
como resposta a fatores bióticos e abióticos, incluindo danos causados por herbívoros,
infecções por bactérias e fungos, ferimentos aplicação de regurgitantes de insetos e
exposição ao composto sinalizador da via metabólica do jasmonato (CONSTABEL &
RYAN, 1998; KRUZMANE et al., 2002).
A PO, presente nos tecidos das plantas, catalisa a conversão de peróxidos de hidrogênio
(H
2
O
2
) em água utilizando fenóis como doadores de hidrogênio. Alterações na sua
atividade durante o desenvolvimento das doenças nas plantas tem sido correlacionadas com
a expressão de resistência em diferentes sistemas patógeno-hospedeiro (OLIVEIRA et al.,
1997). A atividade da peroxidase pode aumentar em plantas submetidas a diversos tipos de
estresse (SIEGEL, 1993) e suas funções fisiológicas nas plantas estão relacionadas ao
espessamento da parede celular e cicatrização de ferimentos, incluindo lignificação e
suberização (GOLDBERG et al., 1985; ESPELIE et al., 1986).
Em cafeeiros, poucas informações sobre ação da peroxidase foram publicadas até o
momento. SALGADO (2004) mostrou que o teor de fenóis totais não varia entre folhas de
cafeeiros com e sem produção de frutos. Porém, as concentrações de fenóis totais em folhas
jovens foram superiores àquelas observadas em folhas adultas com produção de frutos
(25%) ou sem produção de frutos (46%). O autor sugere que os compostos secundários
estariam sendo desviados para as folhas mais novas, ainda pouco lignificadas, para sua
maior proteção contra a herbivoria.
A importância da oxidação fenólica na resistência de cafeeiros ao ataque de L. coffeella,
nas espécies parentais C. arabica e C. racemosa, e em híbridos provenientes deste
cruzamento foi analisada por RAMIRO
(2003). Os autores verificaram que os fenóis não
exercem papel central na expressão da resistência ao bicho-mineiro. Foram detectadas
diferenças entre as espécies parentais quanto à concentração total de fenóis solúveis e à
atividade das enzimas oxidativas PO e PPO. Entretanto, as plantas híbridas resistentes e
suscetíveis não diferiram entre si em nenhuma das características analisadas. Somente nas
plantas da espécie C. racemosa, parental doador dos genes de resistência ao inseto, foi
detectada indução significativa da produção do ácido clorogênico e de PPO. Os resultados
indicam que a indução de atividade fenólica das enzimas PO e PPO em resposta ao ataque
de insetos pode não ser evidência concreta da participação destas em um mecanismo de
defesa direto.
2.4 Marcadores Microssatélites
A utilização da biologia molecular como ferramenta nos programas de melhoramento
genético tem propiciado extrema agilidade. Atualmente uma gama de marcadores
moleculares tem sido identificada, através de técnicas que permitem uma ampla
caracterização do polimorfismo genético existente em plantas. Esses marcadores
representam uma ferramenta importante em programas de melhoramento assistido. Um
exemplo da utilização destes marcadores foi demonstrado por PONCET et al. (2004), que
visou avaliar a distribuição geográfica de espécies de Coffea. Foram utilizados 110 oligos
microssatélites para analisar a diversidade genética de 6 espécies e as espécies C.canephora
e C. pseudozanguebariae compartilharam, porém, não houve nenhuma correlação entre
estas duas espécies.
Marcadores de DNA têm sido utilizados para análise de divergência genética
(CATTANEO, 2001); identificação de cultivares (BAUM et al., 2000), mapeamento
genético (RAFALSKI, 2002; BRESSAN-SMITH, 1998), filogenia (GEHRIG et al., 1997);
melhoramento genético visando resistência a doenças (SANTOS, 2000), sexagem
(URASAKI et al., 2002). Todos estes estudos buscam identificar variações em seqüências
genômicas que possam estar relacionadas com um fenótipo específico. Assim, a análise da
variação das seqüências é de maior importância nos estudos genéticos e os marcadores
moleculares são uma ferramenta útil para determinar e analisar essas variações. Atualmente
uma gama de marcadores como RFLP, RAPD, AFLP e Microssatélites (SSR) têm sido
utilizados para diferentes espécies (PHILIPS et al., 2001 e VARSHNEY et al., 2004).
Os Microssatélites ou SSR (Sequência Simples Repetida) têm sido muito utilizados em
programas de melhoramento. Estes marcadores são compostos de seqüências simples
repetidas de 2 a 5 nucleotídeos “in tandem” na seqüência de DNA, tais como (CA)
n
(AGAT)
n
(ATT)
n
. O polimorfismo nestes locos é resultado de variações do número de
repetições das seqüências de nucleotídeos (AKKAYA et al., 1992). A repetição pode ser
perfeita ou interrompida por muitos nucleotídeos não repetidos sendo chamada de
repetições compostas (SAGHAI-MAROOF et al., 1994).
Os marcadores SSR são úteis para uma variedade de aplicações em genética de plantas
e melhoramento pela sua reprodutibilidade, natureza multialélica, alto grau de
polimorfismo, herança co-dominante, relativa abundância e boa cobertura do genoma
(POWELL et al., 1996). Os marcadores SSR têm sido úteis para integração de mapas
genéticos e mapas físicos e tem provido os melhoristas e geneticistas com uma ferramenta
eficiente para associar variação genética e fenotípica (GUPTA & VARSHNEY, 2000).
As seqüências das regiões que flanqueiam os SSRs são conservadas em indivíduos da
mesma espécie. Dessa maneira, os SSRs são amplamente distribuídos em todo genoma de
eucariotos e podem ser amplificados por oligos específicos sintetizados a partir destas
regiões flanqueadoras (PONCET et al., 2004).
A variação encontrada nos microssatélites pode ser devida tanto ao “escorregamento”
da DNA polimerase durante a replicação ou devido a recombinação desigual, durante a
meiose, resultando em diferenças no número de cópias das sequências de nucleotídeos. Os
SSRs polimórficos aumentam a possibilidade de detecção de diferenças alélicas entre
espécies próximas, dentro de uma espécie, ou até mesmo entre indivíduos numa população
(YU et al., 1999). O polimorfismo é detectado após a amplificação do DNA via PCR e
separação dos produtos por eletroforese em gel de poliacrilamida ou agarose (WU &
TANKSLEY, 1993).
Vários trabalhos utilizando SSR foram desenvolvidos com sucesso para avaliar a
diversidade genética entre genótipos. Em trabalho desenvolvido por AKKAYA et al.
(1992) demonstraram que SSRs estavam presentes em genótipos de soja e altos níveis de
polimorfismo foram detectados entre os grupos. Foi observada uma média de 7 alelos em
cada 3 locos SSRs, permitindo assim a identificação de 43 genótipos de soja.
Outro trabalho que demonstrou a capacidade dos marcadores SSR foi desenvolvido por
KIJAS et al. (1995), mostrando que há grande variação de tamanho nos locos SSR em
espécies de citros. Neste trabalho foram avaliados acessos provenientes de um cruzamento
intergenérico entre limão cravo (Citrus limonia Osbeck) e Poncirus trifoliata. Foram
analisados dois locos SSR quanto à variação e herança alélica, a partir da amplificação e
hibridização com a sonda TAA. Demonstrou-se com este estudo que todas as plantas da
progênie avaliada apresentaram o SSR (TAA) indicando assim que a região flanqueadora é
conservada nos diferentes genomas testados.
Em trabalho semelhante, SAHA et al. (2002) avaliaram a presença de SSR em cDNA
de 11 acessos de algodão e 4 gêneros próximos. Trinta e um pares de oligos SSR, dos 120
testados, amplificaram fragmentos de cDNA. A análise das sequências mostrou que 25%
dos 24 clones de cDNA selecionados aleatoriamente amplificaram regiões contendo
repetições e mostraram que os SSR contendo cDNA foram conservados em duas diferentes
espécies de algodão (Gossypium barbadense e G. hirsutum). Este estudo revelou a
importância dos marcadores SSR para o mapeamento comparativo de genes transcritos.
2.5 Importância da Busca de Microssatélites em Bancos de EST
As pesquisas em biotecnologia estão trazendo grande impacto para a agricultura e a
indústria alimentícia em todo o mundo. Um dos requisitos primordiais para o uso das novas
ferramentas biotecnológicas é a identificação de genes. Os métodos para se analisar a
estrutura e função de genes, em larga escala, denominados coletivamente de tecnologia
genômica, têm proporcionado uma enorme produção de informações e a geração de bancos
de dados de seqüências de DNA, que possibilitam a identificação dos fatores genéticos
determinantes e ou associados com características de interesse agronômico.
O Projeto Genoma Café que resultou na construção de um banco de dados com mais de
200 mil seqüências de DNA, permitiu a identificação de mais de 30 mil genes, responsáveis
pelos diversos mecanismos fisiológicos de crescimento e desenvolvimento do cafeeiro
(EMBRAPA, 2004).
O seqüenciamento do genoma total de organismos superiores, como o cafeeiro, é uma
tarefa árdua e de custo elevado, devido à sua complexidade e tamanho. Por isso, vários
projetos de seqüenciamento de plantas vêm optando pelo seqüenciamento de Etiquetas de
Seqüências Expressas ou EST, onde apenas os genes expressos pelo organismo são
seqüenciados. Genes expressos são aqueles que se encontram ativos no momento e nas
condições da análise. O banco de dados obtido pelos pesquisadores brasileiros é o resultado
do seqüenciamento de várias bibliotecas de cDNA, ou seja, seqüências de DNA
correspondentes aos genes expressos nos vários tecidos da planta (folhas, raízes, frutos,
flores e ramos - sadios e submetidos a estresses bióticos e abióticos como pragas, doenças,
frio, calor, seca) em diversos estágios de desenvolvimento.
O método padrão para desenvolvimento de marcadores SSR envolve a criação
de uma pequena biblioteca genômica, com subseqüente hibridização com
oligonucleotídeos repetidos “in tandem”, seleção de clones contendo repetições e
o seqüênciamento de clones candidatos. Este processo, apesar de ser muito
laborioso e de consumir muito tempo e recursos (THIEL et al., 2002), tem sido
muito utilizado em diferentes espécies para o desenvolvimento de SSR (LUI et
al., 1996; STRUSS & PLIESKE, 1998).
Uma estratégia alternativa para a identificação de locos SSR utiliza a informação
disponível em Bancos de Seqüências de DNA. Os SSRs podem ser identificados nestes
bancos de dados, através de algoritmos específicos, encurtando tempo e custos requeridos
para seu desenvolvimento. Atualmente com o aumento da disponibilidade de seqüências de
genes expressos de diversas espécies vegetais, resultado de projetos de seqüênciamento em
larga escala, a busca por SSR “in silico” é uma estratégia muito atraente. Segundo RUDD
(2003), através do uso de aplicativos computacionais, seqüências correspondentes tanto a
EST (Etiquetas de Sequências Expressas), quanto a clones de cDNA, podem ser
identificadas e copiadas dos Bancos de Dados para análise e caracterização de SSRs. A
estratégia básica de obtenção de EST constitui um método rápido e eficiente de
amostragem do genoma para seqüências ativas de genes. O EST representa uma seqüência
total ou parcial de um gene que foi expresso em um tecido, em um momento determinado
(STERKY & LUNDEBERG, 2000).
Estes são chamados de EST-SSRs ou microssatélites de sequências expressas. O
desenvolvimento destes marcadores é relativamente fácil e barato por serem bioprodutos
das sequências de genes ou ESTs disponíveis publicamente nos bancos de dados. Neste
contexto, a utilização de SSR baseados em genes expressos tem sido relatada para muitas
espécies incluindo uvas (SCOTT et al., 2000), cana-de-açúcar (CORDEIRO et al., 2001),
trigo duro (EUJAYL et al., 2001) e centeio (HACKAUF & WEHLING, 2002).
Atualmente, vários estudos já utilizam a estratégia de busca de SSR em Bancos de
ESTs, como descrito por CATO et al. (2001). Os autores descrevem algumas vantagens da
utilização destas seqüências expressas com marcadores genéticos. Primeiro, se um
marcador EST estiver geneticamente associado a uma característica de interesse, é provável
que o mesmo afete diretamente a característica. Segundo, os ESTs que apresentam
homologia com genes candidatos podem ser utilizados de forma específica para
mapeamento genético.
Embora o polimorfismo dos SSRs seja uma limitação para muitas espécies, os
marcadores SSR ainda são ferramentas valiosas para a genética e melhoramento de plantas.
Transcritos de genes também contendo motivos repetidos e a abundância de ESTs faz deste
uma fonte potencial atrativa de marcadores microssatélites. A comparação de
comprimentos de repetição de SSR em clones de bibliotecas enriquecidas versus SSR
derivados de banco de dados, mostrou que repetições encontradas em bibliotecas
enriquecidas foram significantemente maiores do que aqueles encontrados em SSR
derivados de banco de dados (RAMSAY et al., 2000). Além disso, a presença de SSR em
transcritos de genes conhecidos sugere que eles podem ter importante papel na expressão e
função gênica (KANTETY et al., 2001).
Estudos mostram que os SSRs têm sido encontrados na região 5’- UTR (Região não
traduzida) de genes de plantas e animais. Em alguns organismos, estes polimorfismos estão
também correlacionados com padrões de expressão gênica como foi avaliado em ervilha
(STAFSTRAM & INGRAM, 2004). Neste estudo foram avaliados 15 acessos do gênero
Pisum e de gêneros próximos (Cicer, Lathyrus, Lens, e Vicia) com relação à seqüência do
cDNA PsSat5 que continha o SSR. Os resultados demonstraram que todas as seqüências
analisadas com a repetição TCA foram similares, com exceção do número de repetições
(expansões e contrações no número de repetições). Porém não houve uma correlação clara
entre o número de repetições TCA na região 5’- UTR e o nível de expressão do gene
PsSat5.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Local de Experimentação
As atividades experimentais foram desenvolvidas no Centro de Café "Alcides
Carvalho" do Instituto Agronômico - IAC, Campinas, São Paulo.
3.2 Material Vegetal
A genealogia do material em estudo é apresentada na tabela 1. Trata-se de população
obtida a partir de um cruzamento interespecífico inicial entre a espécie Coffea arabica (2n
= 4x = 44 cromossomos), que é suscetível ao bicho-mineiro e C. racemosa (2n = 2x = 22
cromossomos), que é resistente à praga.
Tabela 1. Genealogia da população segregante para resistência ao bicho-mineiro oriunda do
programa de melhoramento desenvolvido pelo Instituto Agronômico de Campinas.
Geração
Genealogia
Parental C. racemosa C1195 (resistente) X C. arabica Blue Montain (suscetível)
F
1
C1195-5 (resistente)
RC
1
C1195-5-6 (resistente) (C. arabica X C1195-5)
RC
2
∗C1195-5-6-2 (resistente) (C. arabica X C1195-5-6)
RC
3
H11421 (H4782-7-882 Icatu vermelho X C1195-5-6-2)
RC
4
∗H13685 (IAC81 Catuaí vermelho X H11421-11)
RC
5
H14954 (IAC62 Catuaí amarelo X H13685-1)
F
2
RC
5
∗H14954-46 (polinização livre) C1351
∗ Material vegetal avaliado neste estudo
Os genótipos utilizados no experimento constituem uma progênie de 136 plantas
obtidas por polinização livre do acesso - H14954-46 C1351 EP473 - classificado em ensaio
de campo como resistente ao bicho-mineiro e localizados no viveiro do Centro de Café do
IAC (Figura 1). Este acesso pertence à geração F
2
RC
5
do programa de melhoramento
visando resistência do cafeeiro ao bicho-mineiro desenvolvido pelo Instituto Agronômico.
Foram analisados, além da progênie, quatro genótipos como parentais: C1195-5-6-2 (C.
arabica X C1195-5-6); H13685-1 C1841 EP 369 (IAC 81 Catuaí vermelho X H12114-1);
H14954-46 C 1351-EP 473; IAC 81 (Catuaí vermelho). Os parentais do cruzamento
interespecífico original não puderam ser utilizados neste trabalho devido à eliminação
destas plantas, após quarentena realizada em 1954.
3.3 Avaliação da Resistência
3.3.1 Técnica de criação de insetos e condições ambientais
Uma população de L. coffeella foi mantida em laboratório segundo a metodologia
descrita por KATIYAR & FERRER (1968) e adaptada por PARRA (1985).
Foram utilizadas gaiolas de 60 x 60 x 60 cm constituídas por estrutura e fundo de
madeira, sendo as paredes laterais e superiores, revestidas por tecido branco de algodão. Os
pés de sustentação foram pintados com uma mistura de cal e inseticida, para impedir o
ataque de formigas.
As gaiolas foram mantidas sob temperatura de 27
o
C ± 3
o
C, umidade relativa de 70% ±
10% e fotofase de 14 horas, condições que permitem a obtenção de insetos em maior
número e ciclos mais curtos (PARRA, 1985). Os adultos foram alimentados com solução
de sacarose a 10% (NANTES & PARRA, 1977), fornecida aos insetos em papel de filtro,
depositado na parede superior das gaiolas e renovado periodicamente para evitar a
fermentação da solução açucarada e o desenvolvimento dos fungos.
Mudas de cafeeiros da cultivar Obatã IAC1669-20 foram utilizadas para a multiplicação
dos insetos, sendo o número de mudas nas gaiolas determinado em função do seu estágio de
desenvolvimento e da densidade populacional do inseto. Como as posturas são realizadas
nas folhas preferencialmente à noite, as mudas foram substituídas diariamente por novas
mudas isentas de infestação. Uma vez infestadas, as plantas foram transferidas para
prateleiras mantidas no mesmo laboratório de criação.
Entre quinze e vinte dias após a postura, folhas contendo grande número de crisálidas, eram
destacadas das mudas e introduzidas nas gaiolas para a emergência dos adultos, fechando
assim o ciclo biológico do inseto.
3.3.2 Infestação das plantas e avaliação da resistência
O nível de resistência dos 136 indivíduos da progênie H14954-46 C1351 EP473 foi avaliado em laboratório de acordo com a
metodologia descrita por GUERREIRO-FILHO (1994), que consiste na utilização de um suporte de isopor medindo 2 x 10 x 30 cm,
vasado por microtubos de 2,0 mL, distanciados 3 cm um do outro, onde o pecíolo das folhas destacadas das plantas avaliadas foi
mantido hidratado e inserido na gaiola de criação durante o período de exposição aos insetos. Após a oviposição, discos de folhas
foram retirados dos locais onde as posturas foram realizadas, os ovos excedentes foram eliminados deixando-se dois ou três ovos por
discos de folhas, mantidos em câmara úmida (caixas plásticas com espumas úmidas), até a avaliação do tipo de reação. A avaliação
foi realizada dez dias após a eclosão das lagartas, mediante escala de 1 a 4 pontos, que consiste na classificação das plantas quanto à
resistência ao bicho-mineiro em função do tipo de lesão apresentada após infestação artificial em laboratório de acordo com a tabela
2.
Tabela 2. Escala de pontos para a classificação de cafeeiros quanto ao tipo de lesão
desenvolvida a partir da infestação pelo bicho-mineiro
.
3.4 Desenvolvimento de Marcadores Microssatélites
3.4.1 Busca de microssatélites em banco de dados ESTs de café
O Banco de seqüências ESTs oriundos do Projeto Genoma Café foi submetido a buscas
para identificação de seqüências do tipo SSR potencialmente relacionados com a resistência
ao bicho-mineiro.
Para estas buscas foram utilizadas ferramentas como o algoritmo BLAST (ALTSCHUL
et al., 1990), através do programa “Tandem Repeats Finder” versão 3.01 (BENSON, 1999)
desenvolvidas pela equipe de Bioinformática do Projeto Genoma Café. Estes aplicativos
permitem a identificação de ESTs contendo SSR, e também a identificação do motivo
repetido, número de repetições e número de cópias do SSR no genoma.
As seqüências identificadas no banco serviram como base para a síntese de oligos
específicos para amplificação dos locos SSR.
3.4.2 Isolamento do DNA genômico
Folhas oriundas de plantas resistentes e suscetíveis foram coletadas e imediatamente
congeladas em nitrogênio líquido para isolamento do DNA genômico segundo método de
PAILLARD et al. (1996).
Neste protocolo, 1g de folha fresca foi lavada em etanol 70% e macerada em N
2
. O pó
obtido foi ressuspendido em 1,5 mL de Tampão de Extração (0,35 M de Sorbitol; 0,10 M
de Tris-HCl pH 8,0; 50 mM EDTA pH 8,0; 1,5% β-mercaptoetanol) e centrifugado a 1000
Pontos Classificação Descrição
1 Resistente (R)
Lesões pontuais
2 Moderadamente Resistente (MR)
Lesões filiformes pequenas
3 Moderadamente Suscetível (MS)
Lesões grandes irregulares
4 Suscetível (S)
Lesões grandes arredondadas
g, por 20 minutos à 4
o
C. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi ressuspendido
em 1,5 mL de tampão de extração. A essa solução acrescentou-se 520 μL de tampão de lise
(0,2 M Tris-HCl pH 8,0; 50 mM EDTA pH 8,0; 2 M NaCl, 2% (w/v) MATAB) e 110 μL
de SDS 10 %. Após incubação da mistura a 65
o
C por 30 minutos adicionou-se 1 mL da
solução de clorofórmio: álcool isoamílico (24:1), misturando até que ficasse homogênea.
Depois de centrifugação a 1000 g, por 15 minutos à 4
o
C foi feita a transferência da fase
aquosa superior para um novo tubo. O DNA foi precipitado adicionando-se 0,1 volume de
acetato de sódio 3 M pH 5,2 e 1 volume de etanol absoluto gelado. A solução foi
centrifugada a 10.000 g por 15 minutos e o sobrenadante descartado. Após a evaporação do
etanol do precipitado, ressuspendeu-se o DNA em 1 mL de TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0; 1
mM EDTA pH 8,0) com RNAse a 200 μg/mL. Após incubação por 30 minutos a 37
o
C,
adicionou-se 1 mL de solução fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1) e
centrifugou-se a 8.000 g, por 10 minutos a 4
o
C. A fase aquosa superior foi transferida para
novo tubo para outra precipitação do DNA (adicionando-se 0,1 volume de acetato de sódio
3 M pH 5,2 e 1 volume de etanol absoluto gelado). A solução foi centrifugada a 10.000 g
por 15 minutos, o sobrenadante descartado e o precipitado ressuspendido em 50 μL de TE,
após a evaporação do etanol.
O DNA foi quantificado em gel de agarose 1%, através de medidas da absorbância
entre 260-280 nm em espectrofotômetro. A partir da visualização e definida a concentração,
foram realizadas diluições para concentração final de 20 ng/μL. As amostras de DNA de
102 plantas, entre resistentes e suscetíveis, foram agrupadas em 21 bulks, contendo em
média cinco genótipos de cada planta, de acordo com metodologia descrita por
MICHELMORE et al. (1991). Foram formados 11 bulks de plantas resistentes e 10 de
plantas suscetíveis.
3.4.3 Amplificação de microssatélites via PCR (reação da polimerase em cadeia)
A obtenção de pares de oligos SSR foi feita mediante utilização do software Primer 3
(ROZEN, 1998). Foram priorizados oligos com tamanho entre 18 a 20 pb e conteúdo CG %
entre 50-60%.
As seqüências SSR foram amplificadas primeiramente nos genótipos parentais, C1195-
5-6-2 (C. arabica X C1195-5-6); H13685-1 C1841 EP 369 (IAC 81 Catuaí vermelho X
H12114-1); H14954-46 C 1351- EP 473; IAC 81 (Catuaí vermelho). Para otimização das
condições de reação e do padrão de amplificação de cada par de oligos, as seqüências SSR
foram amplificadas primeiramente nos 21 bulks. Após amplificação dos SSRs nos bulks, os
locos SSR polimórficos foram avaliados em todos os genótipos.
As reações de amplificação foram conduzidas em volume final de 25 μL, contendo 40
ng de DNA genômico, tampão PCR 1X (100 mM Tris-HCl, pH 8,4 e 500 mM KCl), 0,1
mM de cada dNTP, 2,0 mM de MgCl
2
, 0,2 μM de cada oligo (foward e reverse) e 0,5 U
Taq DNA polimerase (Invitrogen). As amplificações foram realizadas nas seguintes
condições: 94° C por 3 minutos; seguido de 30 ciclos de 94° C por 1 minuto; temperatura
de anelamento específica para cada par de oligo por 1 minuto (55-57ºC), 72° C por 1
minuto, e extensão final a 72°C por 2 minutos.
3.4.4 Eletroforese dos fragmentos
Inicialmente, os produtos da amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de
agarose 2%, por 3 horas a 90 volts. Foram então, corados com brometo de etídeo e
visualizados sob luz ultravioleta.
Em uma segunda etapa, os fragmentos amplificados foram separados em gel
denaturante de poliacrilamida 6% e visualizados pela coloração com prata, segundo método
de CRESTE et al. (2001). A eletroforese foi realizada a 1.200 volts durante 1hora e 40
minutos. A coloração do gel de acrilamida com prata foi realizada com o kit da Promega,
Silver Sequence DNA Staining Reagents. A coloração seguiu três passos: fixação do gel
com uma solução de ácido acético glacial (Merk) 10% por 20 minutos; coloração do gel por
uma solução de AgNO
3
acrescido de formaldeído 37 % (2g de AgNO
3
em 2 L de água
milli-Q mais 3 mL de formaldeído 37%) por 30 minutos; revelação do gel com uma
solução de Na
2
CO
3
gelado (60 g de Na
2
CO
3
em 2 L de água milli-Q com 3 mL de
formaldeído 37% e 400 μL de Na
2
O
3
S
2
10 mg/mL) por aproximadamente 10 minutos ou
até que as bandas pudessem ser visualizadas.
3.4.5 Análise dos resultados
A caracterização dos SSRs envolveu dois tipos de análises. A primeira visou uma
avaliação da possível função desempenhada por estas seqüências. Para isto realizaram-se
estudos “in silico” para identificar a posição do SSR no EST, tipo de repetição e identidade
do gene contendo o SSR. A segunda análise foi realizada a partir dos produtos amplificados
e envolveu a caracterização dos alelos com relação ao tamanho, freqüência na população
estudada e polimorfismos.
O número médio de alelos por loco (A) foi obtido pela média aritmética do número
total de alelos dividido pelo número total de locos.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Avaliação da Resistência
Das 136 plantas de cafeeiro da progênie H14954-46 C1351 EP473 avaliadas a partir da
infestação artificial do bicho-mineiro, 54 plantas receberam nota 1 sendo consideradas
resistentes ao bicho-mineiro; 48 receberam nota 4 sendo suscetíveis ao bicho-mineiro; 4
plantas receberam nota 2 sendo moderadamente resistentes e 30 receberam nota 3 sendo
moderadamente suscetíveis (Tabela 3).
Tabela 3. Nível de resistência do cafeeiro ao bicho-mineiro avaliado em 136 indivíduos da
progênie H14954-46 C1351 EP 473, medida pela escala de pontos definida em função do tipo de
lesão desenvolvida a partir da infestação deste inseto.
Planta
Tipo de reação Pontos
Total Identificação
Resistente 1 54
1, 2, 7, 10, 11, 13, 15, 17, 18, 19, 20, 24, 29, 31, 32, 33, 36,
38, 39, 41, 44, 45, 49, 51, 57, 60, 62, 65, 66, 73, 74, 77, 78,
80, 86, 88, 93, 96, 99, 100, 101, 102, 104, 106, 108, 117,
122, 124, 125, 127, 132, 134, 139, 140
Moderadamente
Resistente
2 4 9, 50, 59, 91
Moderadamente
Suscetível
3 30
6, 26, 30, 35, 37, 40, 47, 48, 61, 64, 67, 68, 69, 72, 79, 82,
84, 98, 103, 105, 107, 109, 111, 115, 116, 118, 119, 129,
130, 135
Suscetível 4 48
3, 4, 5, 8, 12, 14, 16, 21, 22, 23, 25, 27, 28, 34, 42, 43, 52,
53, 54, 55, 56, 58, 63, 70, 71, 75, 76, 81, 83, 85, 89, 90, 92,
94, 95, 97, 110, 113, 114, 120, 121, 123, 126, 128, 131,
133, 137, 138
As plantas que receberam nota 1 na escala de pontos, apresentaram lesões pontuais nas
folhas; as que receberam nota 2 apresentaram lesões filiformes; as que receberam nota 3
apresentaram lesões grandes irregulares e as com nota 4 apresentaram lesões grandes
arredondadas (Figura 1).
O tipo de lesão desenvolvida pelas plantas revelou que existe variação do nível de
resistência das plantas avaliadas. Como os discos foliares avaliados apresentaram notas 1,
2, 3 e 4, mostram que ainda há segregação para o caráter da resistência ao bicho-mineiro do
cafeeiro na progênie, pois, são de indivíduos provenientes de um cruzamento
interespecífico embora se trate de uma população avançada de retrocruzamento.
As plantas resistentes foram homogêneas quanto à expressão da resistência ao bicho-
mineiro, sendo que a maioria dos discos foliares apresentaram lesões pontuais (nota 1),
nota mínima na escala adotada. O mesmo foi observado em relação às plantas
suscetíveis que apresentaram o mesmo padrão de desenvolvimento das lesões.
De acordo com teste de χ
2
, a proporção de plantas resistentes e suscetíveis ao bicho-
mineiro na F
2
RC
5
foi similar a segregação esperada de 9 resistentes: 7 suscetíveis. Este
resultado concorda com trabalho de GUERREIRO et al. (1999), que encontraram as
mesmas proporções de plantas resistentes e suscetíveis ao bicho-mineiro em F
2
do RC
4
.
A fenotipagem precisa dos indivíduos é de fundamental importância para sua correta
associação com marcadores moleculares em plantas. Trabalhos semelhantes vêm sendo
realizados com cafeeiro em relação a outras características. RIBEIRO et al. (2005)
visou-se incorporar resistência à nematóides em cafeeiros. Foram avaliadas 50 progênies
de híbridos interespecífico de C. arabica e C. canephora provenientes do banco de
germoplasma da Universidade Federal de Viçosa, com resistência a uma população de
Meloidogyne exigua. Os autores verificaram que 31 progênies foram resistentes ao
nematóide e as demais eram suscetíveis. As progênies avaliadas apresentaram
características de imunes, altamente resistentes, moderadamente resistentes e suscetíveis
sendo a maioria pertencente ao híbrido do Timor.
A
D
C
B
Figura 1. Tipos de lesões desenvolvidas por Leucoptera coffeella em folhas com diferentes níveis
de resistência, avaliados numa escala de 1 a 4 pontos. A) Lesões pontuais – plantas resistentes; B)
Lesões filiformes pequenas – plantas moderadamente resistentes; C) Lesões grandes irregulares –
plantas moderadamente suscetíveis; D) Lesões grandes arredondadas – plantas suscetíveis
(RAMIRO et al., 2004).
1 ponto 2 pontos 4 pontos 3 pontos
10 mm
4.2 Desenvolvimento de Marcadores Microssatélites
As atividades de busca, por seqüências, realizadas neste trabalho conhecidas também
como “data-mining” incluíram buscas dirigidas no Banco de Dados do Genoma Café,
através do programa “Tandem Repeats Finder” versão 3.01 (BENSON, 1999). Nestas
buscas foram identificados 315 ESTs-SSR, dos quais foram selecionadas e analisadas 32
seqüências SSR expressas em bibliotecas de folhas, submetidas ou não a algum tipo de
“stress”, tais como inóculo de patógeno, uso de indutores químicos de defesa, entre outros.
Nesta busca foram priorizadas seqüências expressas em folhas infectadas por bicho-mineiro
e ferrugem (Hemileia vastatrix). Além disso, foram também selecionados SSR expressos
em folhas tratadas com indutores de defesa como o BION. Esta estratégia visou aumentar a
probabilidade de serem identificados marcadores associados com a resistência a patógenos
e provavelmente relacionadas à mecanismos de defesa da planta.
A partir das buscas foi realizada a caracterização “in silico” dos alelos SSR quanto ao
número e padrão de repetição, localização do SSR no gene, identidade dos genes contendo
o SSR e sua provável função. O resultado destas análises está apresentado na tabela 4.
Tabela 4. Buscas em ESTs (Etiquetas de Seqüências Expressas) do Banco de Dados do Genoma
Café.
Bibliotecas de cDNA Padrão de repetição
Freqüência de repetições
no Banco
Tamanho
esperado (pb)
Calo embriogênico TC 39,5 169
Folha CAGGGA 10,2 211
Folha + BION TCCTCCTCTTCT 3,4 244
Folha GAGAGAG 13 203
Folha; células em suspensão GAA 22 204
Folha + bicho-mineiro CAA 10 201
Folha; calo embriogênico GAT 19 173
Folha + BION CTCTT 8 296
Folha + BION GCT 10,7 291
Folha + bicho-mineiro CT 17 283
Folha + bicho-mineiro CCT 13,3 303
Folha AAGG 9,8 306
Folha
GCGTGGGCGGAC 3,6 214
Folha + ferrugem + bicho-
mineiro
CAGCAGCATCAG 3,7 205
Sementes ATTGCAGAA 7,6 186
BION plântulas; células em
suspensão
CCCACGCGTCCG 6,1 235
Folha
ATGCCC 9,0 186
Linhagem embriogênica
GAGAGAGAAAGG 5,6 216
Células + BION CAGGGA 10,2 238
Folhas
Folha + BION
TTCTTC 22 202
Folha + raiz CCA 18 205
Folha TTTGGCT 44 200
Folha + bicho-mineiro GGAGAA 7,8 208
Folha GAAGGT 6,7 205
Folha AG 30 276
Sementes TCGTCGTCATCA 5,2 201
Calo embriogênico GGAGGAGGCCAC 5,7 213
Calo embriogênico GCCCACGCGTCC 4,1 194
Calo embriogênico CT 17,5 200
4.2.1 Tipo de repetição SSR e função dos SSRs
A seleção dos EST-SSR para as análises seguiu inicialmente o critério de freqüência de
ocorrência do loco no genoma. Desta forma, foram selecionados os ESTs-SSR com o maior
número de repetições detectado. Um segundo critério para seleção foi a complexidade da
seqüência repetida. Para tal foi avaliada a freqüência dos tipos de repetições como
apresentado na tabela 4.
Os locos SSR apresentaram em sua maioria repetições mais complexas: 65% das
repetições foram de tetranucleotídeos, 21% de trinucleotídeos e 14% de dinucleotídeos.
Para as análises de segregação foram preferencialmente selecionados repetições do tipo
perfeito sem interrupções em sua seqüência. A distribuição do número de repetições dos
motivos analisados foi o maior em dinucleotídeo variando de 17 a 30 repetições no
genoma, seguida por repetições de trinucleotídeos variando de 10 a 22 repetições no
genoma, e as mais complexas de tetranucleotídeos variando de 3
a 13 repetições com única
exceção de 44 repetições no genoma.
Outro aspecto avaliado foi a possível identidade dos genes contendo os SSRs
selecionados. Esta associação foi feita a partir das análises da anotação do Banco de Dados
do Genoma Café. Os resultados destas análises são apresentados na tabela 5, e indicam que
os SSR avaliados estão associados com genes que codificam proteínas com diferentes
funções, tais como enzimas metabólicas, proteínas estruturais e fatores de transcrição. Além
disso, significativamente, parte das proteínas contendo SSR tem papel relevante em
mecanismos de defesa.
Repetições de trinucleotídeos são mais comuns, seguidas igualmente por repetições de
dinucleotídeos ou tetranucleotídeos, dependendo do estudo em questão. Por exemplo,
VARSHNEY et al. (2002), demonstraram que entre algumas espécies de cereais, repetições
de trinucleotídeos foram mais freqüentes (54-78%), seguidos por repetições de
dinucleotídeos (17,1- 40,4%) e repetições de tetranucleotídeos (3-6%).
As funções dos genes que contém SSRs e o papel dos motivos SSR na função de genes
de plantas são documentados na literatura. Repetições de trinucleotídeos em alguns genes
humanos mostraram estar associado a desordens neurológicas em humanos (SASAKI et al.,
1996; NERI et al., 1996). O gene normal contém de 6-34 repetições CAG e a doença e os
sintomas tornam-se mais severos quando a repetição CAG está presente de 36-121 vezes.
CERESINI et al. (2005) buscaram SSR em bancos de dados de Eucalipto. Neste
trabalho foram identificados 37% de repetições diméricas e 33% repetições triméricas. A
repetição dimérica AG/CT foi a mais freqüente seguida de repetições triméricas
CCG/CGG. Além disso, os autores mostraram que 48% dos EST-SSR avaliados foram
homólogos a proteínas com alguma função biológica, além das repetições estarem
localizadas nas regiões 5’ou 3’ do gene.
Tabela 5. Associação das seqüências de vinte e nove microssatélites quanto à sua função e posição
no gene, obtida a partir das anotações do banco de dados do Genoma Café.
SSR Contig Função Localização no gene
2 1687 Proteína expressa Região 5’ - UTR*
3 2074 Fator auxiliar SnRNP Região codificadora
4 2988 Proteína associada a microfibrila
Região codificadora próxima
ao domínio funcional
5 3024 Proteína ligante GAGA Região 5’ - UTR
6 3388 Proteína ligante de ácido nucléico Região 5’ - UTR
9 2452 Proteína ligante de RNA AML1 Região 5’ - UTR
11 10226 Provável proteína de resistência Região codificadora
14 987 Provável Kinase Região 5’- UTR
15 1177 Proteína desconhecida -
16 6290 Precursor da peroxidase Região 5’- UTR
17 13778 Proteína desconhecida -
18 13034 U1 ribonucleoprotein C Regiao codificadora
19 12445 Proteína desconhecida -
20 10 Fator de elongamento EF2 Região codificadora
21 945 Proteína ligante de RNA Região codificadora 5’
22 1150 Proteína desconhecida -
23 1246 Proteína desconhecida -
24 1379 Proteína desconhecida Região 5’- UTR
25 2074 Fator auxiliar de SnRNP
Região codificadora próximo
ao domínio funcional
26 3445 Proteína contendo RRM
Região codificadora próximo
ao domínio funcional
27 4446 Fator de processamento RNA Região 5’- UTR
28 9600 Pectinesterase Região 5’- UTR
29 11952 Proteína da família TraB
Região codificadora próxima
ao domínio funcional
30 13345 Proteína expressa Região 5’- UTR
31 152 Proteína expressa Região 5’- UTR
32 1458 Proteína desconhecida Região 5’- UTR
33 1704 Provável proteína regulatória de auxina Região 5’- UTR
34 2044 Proteína família da histidina ácido Região 5’- UTR
35 2131 Sucrose sintase 2 Região 5’- UTR
* UTR- “Untranslated region”
4.2.2 Posição do SSR no gene
Os SSR foram avaliados com relação à posição no transcrito. Os resultados desta
análise estão apresentados na tabela 5.
Os locos SSR avaliados encontram-se preferencialmente na região 5’- UTR do gene
(53,57%), representando mais da metade dos locos avaliados. Esta região está envolvida
com a estabilidade do transcrito e seu reconhecimento pela maquinaria de síntese protéica
(SHERAMETI et al., 2002).
Os SSR têm sido encontrados na região 5’-UTR de um grande número de genes de
plantas e animais. Em estudos conduzidos em arroz, um número variável de repetições CT
na região 5’-UTR do gene Waxy está correlacionado com o conteúdo de amilose no grão.
Embora, a maior variabilidade no conteúdo seja resultado de um SNP adjacente a este
microssatélite, as repetições CT parecem afetar o sítio de processamento do íntron (BLIGH
et al., 1995; AYRES et al., 1997; LARKIN & PARK, 1999).
A presença de SSR na região 5’-UTR não necessariamente sugere ou implica que alelos
polimórficos existirão na população. Estudo desenvolvido por KALCHEVA et al. (1999),
com gene humano MAP 2 que continha sete repetições CAG na região 5’-UTR, mostrou
que o mesmo número de repetições foi encontrado num total de 86 indivíduos, incluindo 31
controles e 55 indivíduos com uma doença neuropsiquiátrica. Neste caso, nenhuma
variabilidade ou polimorfismo nos SSR é conhecido na população.
Também CHO et al. (2000), em estudos de polimorfismos de SSR em arroz, relatou 27
genes que continham SSR em regiões de exons (8), introns (5), 5’-UTR (8) ou 3’-UTR.
SCOTT et al. (2000), em estudo com EST-SSR, também relataram que existiam
diferenças de polimorfismos entre os microssatélites derivados de 3’-UTR (mais
polimórfico ao nível de cultivar), 5’-UTR (mais polimórfico entre cultivar e espécie) e SSR
na seqüência codificadora (mais polimórfico entre espécie e gênero). Similar a este estudo,
marcadores SSR (CCG) na região 5’-UTR de genes de proteínas ribossomais de milho
parecem estar envolvidos na regulação da fertilização (DRESSELHAUS et al., 1999).
Um outro aspecto interessante é que aproximadamente 69% dos EST-SSR foram
homólogos a proteínas com alguma função biológica. Os SSRs 4, 11, 25, 26 e 29
localizam-se dentro ou perto da seqüência codificadora dos domínios conservados da
proteína. De maneira geral estes domínios são diretamente responsáveis pela função
biológica destas proteínas. Por exemplo, o grupo das peroxidases (PO) inclui enzimas
capazes de catalisar a transferência do hidrogênio de um doador para o H
2
0
2
. Em plantas, a
ação desse grupo de enzimas constitui uma proteção antioxidativa. A atividade da
peroxidase pode aumentar em plantas submetidas a diversos tipos de estresses (SIEGEL,
1993).
Um outro exemplo interessante é o domínio RRM encontrado no loco SSR 26. Este
domínio é conhecido como proteína ligante de RNA e são encontrados em uma variedade
de proteínas, e está envolvido na regulação do processamento de RNA. Sua estrutura
consiste de quatro fitas e duas hélices arranjadas em estrutura alfa e beta e são mais
presentes em sementes (BIRNEY et al., 1993).
Outro aspecto interessante no que se refere à função da proteína é o domínio da proteína
da família traB apresentada pelo loco SSR 29. Esta proteína parece estar envolvida com
sinais de respostas a feromônios em bactérias (AN & CLEWELL, 1994). Também no loco
SSR 5 a proteína ligante de GAGA desempenha papel importante no controle da expressão
gênica em animais. Esta proteína é uma proteína específica regulatória. Em trabalho
semelhante desenvolvido em soja por SANGWAN et al. (2002), demonstrou-se que a
proteína recombinante GBP que naturalmente não se liga a seqüências de dinucleotídeos
repetidas, ligou-se à região promotora do elemento GAGA. Os autores sugeriram que a
interação entre os elementos GAGA e proteínas GBP apresentam característica regulatória
em plantas.
Estes resultados sugerem que a presença de SSR em regiões transcritas do gene pode
desempenhar uma função importante durante a síntese e/ou atividade da proteína. Desta
maneira, pode-se esperar que não somente os polimorfismos de tamanho dos SSRs sejam
potenciais marcadores para seleção. Além destas, a presença ou ausência de um SSR pode
interferir com a atividade do gene, representando assim um potencial marcador para
seleção. Para que isto seja possível, no entanto, estudos de genômica funcional, visando à
caracterização da expressão de genes contendo SSR, serão fundamentais para uma
compreensão da função destas seqüências nos genes expressos durante a resposta de defesa
ao ataque pelo bicho-mineiro.
4.2.3 Amplificação de microssatélites via PCR
Para o isolamento do DNA genômico somente plantas que receberam notas extremas 1
e 4 para avaliação do nível de resistência foram utilizadas para as análises de segregação de
SSR. Foi extraído o DNA das folhas jovens, correspondente a terceira folha emitida, das
102 plantas avaliadas, sendo 54 resistentes com nota 1 e 48 suscetíveis com nota 4.
Os 102 genótipos foram agrupados em 11 bulks de plantas resistentes e 10 bulks de
plantas suscetíveis. A estratégia de agrupar os genótipos em bulk objetivou uma rápida
avaliação de possíveis polimorfismos.
Para caracterização genômica dos EST-SSR, foram avaliados 32 locos SSR. Estes
foram amplificados através de oligos específicos obtidos a partir da seqüência
correspondente à região flanqueadora de cada loco. Os SSRs foram amplificados através de
reações de PCR nos genótipos parentais e nos 21 bulks de plantas resistentes e suscetíveis.
Posteriormente, os diferentes bulks foram individualizados conduzindo-se as reações de
amplificação.
Os fragmentos amplificados nos bulks resistentes e suscetíveis foram separados
primeiramente por eletroforese em gel de agarose 2%, para verificação do padrão de
amplificação das bandas. Estes apresentaram, em sua maioria, um padrão de amplificação
de banda única, como exemplificado pelas amplificações utilizando-se os oligos 6, 15 e 9 e
mostrados na figura 2.
Figura 2. Padrão de amplificação dos oligos SSR em bulks de DNA (A1 e A2 - SSR 6; B1 e B2-
SSR 15; C1 e C2- SSR 9). PM- Peso Molecular de 250 pb; 1 a 11- bulks de plantas resistentes ao
bicho-mineiro; 12 a 21- bulks de plantas suscetíveis ao bicho-mineiro.
A1 A2
B1
C1 C2
B2
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 PM
Após a análise em gel de agarose, os fragmentos foram avaliados através de eletroforese
em gel denaturante de poliacrilamida 6%. Todos os locos amplificados apresentaram entre
dois e quatro alelos, uma possibilidade esperada, uma vez que as plantas avaliadas são
tetraplóides (Figuras 3 e 4).
Primer 6 (R e S)
Figura 3. Padrão de amplificação em gel de poliacrilamida 6% do SSR 4, com dois alelos, em bulks
de plantas resistentes (1 a 11) e plantas suscetíveis (12 a 21) ao bicho-mineiro.
Figura 4. Padrão de amplificação em gel de poliacrilamida 6% do SSR 15, com dois alelos, em
bulks de plantas resistentes (1 a 11) e plantas suscetíveis (12 a 21) ao bicho-mineiro.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Apenas um loco apresentou polimorfismo, o SSR 18 no bulk 18 de planta suscetível e
também no parental P4 suscetível (IAC 81- Catuaí Vermelho). O polimorfismo se repetiu
para o genótipo 90 do bulk 18 como mostrado nas figuras 5 e 6.
Figura 5. Padrão de amplificação em gel de poliacrilamida 6% do SSR 18, com quatro alelos, em
bulks de plantas resistentes (1 a 11) e de plantas suscetíveis (12 a 21) ao bicho-mineiro.
Figura 6. Padrão de amplificação em gel de poliacrilamida 6% do SSR 18, em genótipos do bulk
suscetível (P1-
C1195-5-6-2; P2-H13685-1; P3-H14954-46; P4-IAC 81) – parentais; 90, 92,
94, 95, 97 - genótipos individuais do bulk 18).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
P1 P2 P3 P4 90 92 94 95 97
Os resultados das amplificações dos SSRs estão apresentados na tabela 6 mostrando que
dos 32 oligos avaliados 29 amplificaram fragmentos/alelos correspondentes ao tamanho
esperado a partir da análise de “data-mining”. Os alelos apresentaram variação de tamanho
entre 140 a 300 pares de base. Alguns locos amplificados tais como os locos 3, 5, 6, 18, 25,
27 e 33 apresentaram tamanhos acima do esperado pelas análises de “data mining”, entre
700 a 900 pares de base (Tabela 6). Esta discrepância no resultado sugere a presença de
íntrons nestes produtos amplificados como observado também por JANY et al. (2003).
Neste trabalho foram selecionados EST-SSR de uma espécie de fungo ectomicorrizo
Hebeloma cylindrosporum de Pinus pinaster. De onze locos SSR avaliados, três
amplificaram locos com tamanho acima do esperado, sugerindo a presença de íntrons em
produtos genômicos.
Resultados similares foram observados por THIEL et al. (2003) e VARSHNEY et al.
(2002). Nestes estudos, comparando os SSR oriundos de ESTs e SSR genômico, mostrou-
se que é mais freqüente a amplificação de fragmentos de tamanho não esperados. Este
resultado é provavelmente devido a presença de íntrons e inserções-deleções
(aproximadamente 20 pb) no ESTs-SSR que podem alterar o tamanho do fragmento.
Tabela 6. Caracterização dos locos SSR quanto à quantidade de alelos/loco e quanto à variação no
tamanho dos alelos.
SSR Tamanho esperado (pb) Variação do tamanho
dos alelos
Alelos/loco Repetição dos SSR
2 169 198 - 200 2 (TC)
40
3 211 700 - 800 2
(CAGGGA)
10
4 244 240 - 250 2
(TCCTCCTCTTCT)
4
5 203 890 - 900 2
(GAGAGAG)
45
6 204 795 - 800 2
(GAA)
22
9 200 247 - 250 2
(CAA)
10
11 173 245 - 250 2
(GAT)
19
14 296 295 - 300 2
(CTCTT)
8
15 291 245 - 250 2
(GCT)
11
16 283 248 - 250 2 (CT)
17
17 303 292 - 300 4
(CCT)
13
18 186 700 - 706 2
(ATGCCC)
9
19 306 288 - 300 4 (AAGG)
10
20 214 200 - 212 2
(GCGTGGGCGGAC)
4
21 205 200 1
(CAGCAGCATCAG)
4
22 186 140 - 200 2
(ATTGCAGAA)
8
23 235 700 1
(CCCACGCGTCCG)
6
24 216 140 - 200 2
(GAGAGAGAAAGG)
6
25 238 794 - 800 2
(CAGGGA)
10
26 202 194 - 200 2
(TTCTTC)
22
27 205 797 - 800 2
(CCA)
18
28 200 185 - 200 2
(TTTGGCT)
5
29 208 200 1
(GGAGAA)
8
30 205 188 - 200 4
(GAAGGT)
7
31 276 250 1
(AG)
17
32 201 238 - 250 2
(TCGTCGTCATCA)
5
33 213 350 - 800 3
(GGAGGAGGCCAC)
6
34 194 208 - 220 2
(GCCCACGCGTCC)
4
35 200 398 - 400 2 (CT)
17
A síntese de oligos não é uma ciência exata, e o sucesso da taxa de 60-90 % de
amplificação para ambos os SSRs genômico e ESTs têm sido mostrados em diferentes
estudos (THIEL et al., 2003; KOTA et al., 2001). As possíveis explicações incluem: (i) 1
ou ambos oligos de SSR-ESTs estendem um sítio de processamento ou “splice”, (ii) a
presença de grandes íntrons na seqüência de DNA genômico, (iii) o uso de informação
duvidosa de seqüência para o desenvolvimento de oligos e (iv) oligos foram originados de
clones de cDNA quiméricos. Assim, a qualidade da seqüência de SSR-ESTs para a síntese
de oligos é importante.
Os locos SSR avaliados apresentaram um total de 61 alelos com um número médio de
alelo por loco de 2,1. 80% dos locos SSR apresentaram 2 alelos /loco, 10% apresentaram 4
alelos/loco e 10% 1 alelo/loco. Apesar do grande número de alelos observados neste
estudo, apenas 1 loco apresentou alelos polimórficos entre os genótipos avaliados incluindo
um parental (P4- Catuaí vermelho), porém não segregou com a resistência a o bicho-
mineiro pois foi encontrado somente em genótipos suscetíveis. De acordo com trabalhos
desenvolvidos por THIEL et al. (2003), os microssatélites derivados de ESTs são
significativamente menos polimórficos do que aqueles derivados de regiões genômicas.
Este fato explicaria o não aparecimento de polimorfismo para os locos avaliados nas
plantas de café resistentes e suscetíveis ao bicho-mineiro. Para este estudo foi selecionada
uma progênie segregante com origem em uma hibridação interespecífica entre C. arabica e
C. racemosa. Em estudos de diversidade genética realizada por RUAS et al. (2003), dentre
as espécies do gênero Coffea, C. racemosa, espécie doadora dos genes de resistência ao
bicho-mineiro, é a mais distante de C. arabica do ponto de vista genético. Assim, esperava-
se que o nível de diversidade genética dentro desta população fosse maior, apesar da já
descrita reduzida diversidade genética de C. arabica. O fato de ter sido selecionada uma
população de geração avançada (F
2
RC
5
) pode ter contribuído para a ausência de
polimorfismos. No entanto, as avaliações de genótipos parentais anteriores demonstram que
nestas gerações também não foram observados polimorfismos. Assim pode-se supor que
possíveis polimorfismos presentes nos parentais iniciais foram rapidamente diminuídos
durante os primeiros ciclos de seleção.
Uma vez que a seleção para resistência ao bicho-mineiro foi direcionada desde os
primeiros cruzamentos era esperado que os locos envolvidos em mecanismos de defesa
apresentassem baixa diversidade genética. Assim, a estratégia de selecionar EST-SSR
potencialmente associados a locos de defesa pode ter resultado na ausência de alelos
polimórficos. Uma seleção aleatória de locos SSR para avaliação poderia então revelar um
maior número de alelos polimórficos. Por outro lado, a chance destes possíveis
polimorfismos co-segregarem com a característica de resistência ao bicho-mineiro é
pequena. De fato, o único loco SSR polimórfico observado não apresentou co-segregação
com a característica de resistência, uma vez que foi detectado, apenas em alguns genótipos
suscetíveis. Tendo isto em vista, os resultados deste estudo sugerem que a utilização de
EST-SSR para seleção assistida em café é pouco eficiente para populações avançadas em
programas de melhoramento.
Apesar deste estudo não ter revelado nenhum marcador para seleção assistida, o seu
caráter exploratório é fundamental para a compreensão dos eventos genéticos envolvidos
dos cruzamentos interespecíficos. Uma hipótese para a função dos SSRs é que estes
marcadores estariam associados com algum outro mecanismo genético relacionado ao
controle da expressão de genes de interesse. Estudos recentes demonstram que espécies
poliplóides apresentam padrões particulares de expressão gênica. ADAMS et al. (2003),
fizeram análises da expressão de genes em algodão, uma espécie alopoliplóide resultado da
hibridação de Gossypium herbaceum X G. raimondii, sugerindo que a seleção de alelos
expressos nos diferentes tecidos e órgãos da planta não é aleatória. Os autores identificaram
regiões específicas de alguns genes que correspondem às seqüências dos alelos orignados
em cada uma das espécies parentais. Assim, avaliando o nível de expressão destes alelos,
foi verificado que em alguns tecidos apenas o alelo da espécie parental A era expresso,
mesmo na presença de alelos provenientes de outra espécie, sugerindo a existência de
mecanismos genéticos de escolha de alelos ativos. Estes aspectos são importantes para se
estabelecer o papel de determinados grupos de genes em um cruzamento interespecífico, e
para se prever a taxa de introgressão de cada genótipo em um híbrido. Neste contexto, a
identificação de marcadores tais como os SSR, associados a locos preferencialmente
expressos, poderá possibilitar a seleção de genes de interesse em cruzamentos iniciais. No
entanto, para que estas hipóteses sejam comprovadas é necessária uma ampla
caracterização da expressão de genes contendo SSR.
5 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos no presente trabalho permitem concluir que:
1. Os locos SSR de seqüências expressas em café apresentam alta taxa de
complexidade;
2. Os SSR expressos avaliados neste estudo estão relacionados com a estabilidade dos
transcritos gênicos, uma vez que se localizam preferencialmente na região 5’-UTR.
Este fato sugere que estes locos estão envolvidos com o controle da expressão
gênica;
3. Não há relação entre o padrão de segregação de seqüências microssatélites e a
resistência ao bicho-mineiro nas plantas de café avaliadas, uma vez que não foi
encontrado nenhum polimorfismo co-segregante com a característica de resistência;
4. Seleção assistida por EST-SSR não se mostrou eficiente em populações avançadas.
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADAMS, K. L.; CRONN, R.; WENDEL, J. F. Genes duplicated by polyploidy show
unequal contributions to the transcriptome and organ-specific reciprocal silencing.
Proceedings of the National Academy of Science, v.100, n.8, p.4649-4654, 2003.
AKKAYA, M. S.; BHAGWAT, A. A; CREGAN, P. B. Length polymorphisms of simple
sequence repeat DNA in soybean. Genetics, v.132, p.1131-1139, 1992.
ALTSCHUL, S.F.; GISH, W.; MILLER, W.; MEYERS, E. W.; LIPMAN, D. J. Basic local
alignament search tool. Journal of Molecular Biology, v.215, p.403-410, 1990.
AN, F. Y.; CLEWELL, D. B. Characterization of the determinant (traB) encoding sex
pheromone shutdown by the hemolysin/bacteriocin plasmid pAD1 in Enterococcus
faecalis. Plasmid, v.2, p.121-215, 1994.
ANTHONY, F.; BERTRAND, B.; QUIROS, O.; WILCHES, A.; LASHERMES, P.;
BERTHAUD, J.; CHARRIER, A. Genetic diversity of wild coffee (Coffea arabica L.)
using molecular markers. Euphytica, Dordrecht, v.118, n.1, p.53-65, 2001.
APPEL, H. M. Phenolics in ecological interactions : the importance of oxidation. Journal
of Chemical Ecology, New York, v.19, n.7, p.1521-1552, 1993.
AYERS, N. M.; MACCLUNG, A. M.; LARKING, P. D.; BLIGH, H. F. J.; JONHS, C. A.;
PARK, W. D. Microsatellites and a single nucleotide polymorphism diferentiate apparent
amylose classes in an extended pedigree of US rice germplasm. Theoretical and Applied
Genetics, v.94, p.773-781, 1997.
BENNETT, R.N.; WALLSGROVE, R.M. Secondary metabolites in plant defense
mechanisms. New Phytologist, Cambrige, v.127, p.617-633,1994.
BENSON, G. Tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences. Nucleic Acids
Research, v.27, p.573-580, 1999.
BERTRAND, B.; PEÑA DURÁN, M. X.; ANZUETO, F.; CILAS, C.; ETIENNE, H.;
ANTHONY, F.; ESKES, A. B. Genetic study of Coffea canephora coffee tree resistance to
Meloidogyne incognita nematodes in Guatemala and Meloidogyne sp. nematodes in El
Salvador for selection of rootstock varieties in Central America. Euphytica, v.113, n.2,
p.79 –86, 2000.
BI, J. L.; FELTON, G. W.; MURPHY, J. B.; HOWLES, P. A.; DIXON, R. A.; LAMB, C.
J. Do plant phenolics confer resistance to specialist and generalist insect herbivores?
Jounal of Agricultural and Food Chemistry, Washington, v.45, p.4500-4504, 1997.
BIRNEY, E.; KUMAR, S.; KRAINER, A. R. Analysis of the RNA-recognition motif and
RS and RGG domains: conservation in metazoan pre-mRNA splicing factors. Nucleic
Acids Research, v.21, n.25, p.5803-5581, 1993.
BLIGH, H. F. J.; TILL, R. I.; JONES, C. A. A microsatellite sequence closely linked to the
Waxy gene of Oryza sativa. Euphytica, v.86, p.83-85, 1995.
BRESSAN-SMITH, R. E. Mapeamento de locos de características quantitativas
associadas com a morfologia, a fotossíntese e o rendimento do feijão (Phaseolus
vulgaris L.). 1998. 99 f. Tese (doutorado em produção vegetal) - Universidade Estadual do
Norte Fluminense, UENF, Campos dos Goytacazes, RJ.
BRIDSON, D. M. Studies in Coffea in Psilanthus (Rubiaceae Sub fam. Cinchonoideae) for
part 2 of Flora Tropical East Africa: Rubiaceae. Kew Bulletin, v.36, n.4, p.817-859, 1982.
CARDENAS, R. M. Caracterización histo-morfológica del daño del minador de la
hoja, Leucoptera coffeella (Guérin-Méneville), en especies e híbridos de Coffea spp. y
observaciones sobre resistencia. 1981. 69 f. Tesis de Grado Magíster Scientiae —
Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia.
CARDENAS, R. M.; POSADA, O. Observaciones sobre resistencia de seis materiales de
Coffea al dano del minador de las hojas (Leucoptera coffeella G.M.). Genicafé, v. 35, n.1,
p.3-8, 1984.
CARNEIRO, M. F. Coffee biotechnology and its application in genetic transformation.
Euphytica, Dordrecht, v.96, p.167-172, 1997.
CARVALHO, A.; FAZUOLI, L.C. Café. In: FURLANI, A.M.C.; VIÉGAS, G.A. (Ed.). O
melhoramento de plantas no Instituto Agronômico. Campinas: Instituto Agronômico,
1993. Cap.2, p.29-76.
CARVALHO, A.; MEDINA-FILHO, H. P.; FAZUOLI, L. C.; GUERREIRO-FILHO, O.;
LIMA, M. M. A. Aspectos genéticos do cafeeiro (Genetics Aspects of the coffee tree).
Revista Brasileira de Genética. V.14, p.135-183, 1991.
CARVALHO, A.; MONACO, L.C. Relaciones genéticas de especies seleccionadas de
Coffea. Cafe, Lima, v.9, n.4, p.1-19, 1968.
CATO, S. A.; GARDNER, R. C.; KENT, J.; RICHARDSON, T.E. A rapid PCR- based
method for genetically mapping ESTs. Theoretical and Applied Genetics, v.102, p.296-
306, 2001.
CATTANEO, L. F. Avaliação da divergência genética e análise de gerações em
mamoeiro (Carica papaya L.). 2001. 94 f. Tese (doutorado em produção vegetal) –
Universidade Estadual do Norte Fluminense – UENF, Campos dos Goytacazes, RJ.
CERESINI, P. C.; SILVA, C. L. S. P.; MISSIO, R. F.; SOUZA, E. C.; FISCHER, C. N.;
GUILHERME, I. R.; GREGORIO, I.; SILVA, E. H. T; CICARELLI, R. M. B.; SILVA, M.
T. A.; GARCIA, J. F.; AVELAR, G. A.; NETO, L. R. P.; MARÇON, A. R.; JUNIOR, M.
B.; MARINI, D. C. Satellyptus: Analyses and database of microsatellites from ESTs of
Eucalyptus. Genetics and Molecular Biology, v.28, n.3 (suppl), p.589- 600, 2005.
CHARRIER, A. La structure génétique des caféiers spontanés de la región malgache.
Paris: Menoires ORSTOM, 1978. 223 p.
CHARRIER, A.; BERTHAUD, J. Botanical classification of coffee. In: CLIFFORD, M.N.;
WILSON, K.C. (Ed.). Coffee:Botany, biochemistry and production of beans and
beverage. Wetsport: AVI Publishing, 1985. p.13-47.
CHEVALIER, A. Les caféiers du globe III; systhématique dês caféiers et faux-
caféiers, maladies et insects nuisibles. Paris: Lechevoier, 1947. 356 p. (Encyclopédie
Biologique, 281)
CHO, T. G.; ISHII, T.; TEMNYKH, S.; CHEN, X.; LIPOVICH, L.; MCCOUGH, S. R.;
PARK, W. D.; AYER, N.; CARTINHOUR, S. Diversity of microsatellites derived from
genomic libraries and GenBank sequences in rice (Oryza sativa). Theoretical and Applied
Genetics, v.100, p.713- 722, 2000.
CONAB. Anuário Estatístico do Café, 2005-2006. Estimativa oficial. Companhia Nacional
de Abastecimento.
CONSTABEL, C. P.; RYAN, C. A. A survey of wound-and methyl jasmonate- induced
leaf polyfenol oxidase in crops plants. Phytochemistry, Oxford, v.47, n.4, p.507-511,
1998.
CONSTABEL, C. P.; YIP, L.; PATTON, J. J.; CHRISTOPHER, M. E. Polyphenol oxidase
from hybrid poplar. Cloning and expression in response to wounding and herbivory. Plant
Physiology, Sofia, v.124, p.285-295, 2000.
CORDEIRO, G. M.; CASU, R.; MCINTYRE, C. L.; MANNERS, J. M.; HENRY, R. J.
Microsatellite markers from sugarcane (Saccharum spp.) EST cross transferable to
erianthus and sirghum. Plant Science, v.160, p.1115-1123, 2001.
CRESTE, S.; TULMANN-NETO, A. FIGUEIRA, A. Detection of single repeat
polymorphisms in denaturing polyacrilamide sequencing gels by silver staining. Plant
Molecular Biology Reports, v.19, n.229-306, 2001.
DRESSELHAUS, T.; CORDTS, S.; HEUER, S.; SAUTER, M.; LOERZ, H.; KRANZ, E.
Novel ribosomal genes from maize are differentially expressed in the zygotic and somatic
cell cycles. Molecular Genetics and Genomics, v.261, n.2, p.416-27, 1999.
EMBRAPA - EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA. 2001.
http://www22.sede.embrapa.br/cafe/consorcio/home_4.htm
, (04 de abril 2006).
EMBRAPA- EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA). 2004.
http://www.cenargen.embrapa.br/biotec/genomacafe
, (12 de abril 2006).
ESPELIE, K. E.; FRANCISCHI, V. R.; KOLATTUKUDY, P. E. Immunocytochemical
localization and time course of appearance of an anionic peroxidase associated with
suberization in wound healing potato tuber tissue. Plant Physiology, Rockville, v.81, p.
487-492, 1986.
EUJAYL, I.; SORRELLS, M. E.; BAUM, M.; WOLTERS, P.; POWELL, W. Assessment
of genotypic variation among cultivated durum wheat based on EST-SSRs and genomic
SSRs. Euphytica, v.119, p.39-43, 2001.
FAHL, J. I.; CARELLI, M. L. C.; GALLO, P. B. Enxertia de Coffea arabica sobre
progênies de C. canephora e C. congensis no crescimento, nutrição mineral e produção.
Bragantia, v.57, n.2, p.297-312, 1998.
FAZUOLI, L. C.; MEDINA FILHO, H. P.; GUERREIRO-FILHO, O.; GONÇALVES, W.;
SILVAROLA, M. B.; LIMA, M. M. A. de; CARVALHO, A. Cultivares de Café.
Campinas: Instituto Agronômico, 1999. (Fôlder).
FAZUOLI, L.C.; COSTA, W. M.; GONÇALVES, M.; LIMA, M. M. A.; FERNANDES, J.
A. R. Café Icatu como fonte de resistência e/ou tolerância ao nematóide Meloidogyne
incognita, In: CONGRESSO BRASILEIRO DE PESQUISA CAFEEIRAS, 11, Londrina.
Resumos... Rio de Janeiro: IBC/GERCA, 1984. p.247-248.
FELTON, G. W.; DONATO, K.; DEL VECCHIO, R. J.; DUFFEY, S. S. Activation of
plant foliar oxidases by insect feeding reduces nutritive quality of foliage for noctuid
herbivores. Journal of Chemical Ecology , v.15, n.12 , p.2667-2694, 1989a.
GATEHOUSE, J. A. Plant resistance towards insect herbivores: a dynamic interaction.
New Phytologist, Cambridge, v.156, p.145-169, 2002.
GEHRIG, H. H.; ROSICKE, H.; KLUGE, M. Detection of DNA polymorphisms in the
genus Kalanchoe by RAPD-PCR fingerprint and its relationships to infrageneric taxonomic
position and ecophysiological photosynthetic behaviour of the species. Plant Science,
v.125, p.41- 41, 1997.
GOLDBERG, R.; LE, T.; CATESSON, A. M. Localization and properties of cell wall
enzyme activities related to the final stages of lignin biosynthesis. Journal of
Experimental Botany, Oxford, v.36, p.503-510, 1985.
GONÇALVES, W.; LIMA, M. M. A. ; SILVAROLLA, M. B.; FAZUOLI, L. C.;
GUERREIRO FILHO, O. Cultivar Icatu Vermelho Iac-925: Fonte de Resistência a
Nematóides do Gênero Meloidogyne. In: 44o. Congresso Nacional de Genética, 1998,
Águas de Lindóia. Genetics and Molecular Biology. Ribeirão Preto: Sociedade Brasileira
de Genética, v.21, p.228, 1998.
GUEDES, R. N. C. Resistência de insetos a inseticidas, p. 101-107. In L. Zambolim (ed.),
I Encontro sobre manejo de doenças e pragas. Viçosa, UFV, 1999, 146p.
GUERREIRO FILHO, O.; SILVAROLLA, M. B.; ESKES, A. B. Expressão e modo de
herança da resistência do cafeeiro ao bicho mineiro. In: 24o. Congresso Brasileiro de
Pesquisas Cafeeiras, 1998, Poços de Caldas. Resumos do 24o. Congresso Brasileiro de
Pesquisas Cafeeiras. Rio de Janeiro: MAA/PROCAFË, v.24, p.166-167, 1998.
GUERREIRO-FILHO, O. Identification de genes de résistance a Perileucoptera
coffeella em vue de I`ameliorationde Coffea arábica: Potentiel d`espéces diploi dês du
genre Coffea; genes de Bacillus thuringiensis. 1994. 173p. These (Doctorat) - ENSAM,
Montpellier.
GUERREIRO-FILHO, O.; MAZZAFERA, P.; FAZUOLI, L. C.; SILVAROLLA, M. B.;
LIMA, M. M. A.; MEDINA FILHO, H. P.; GONÇALVES, W.; RAMOS, L. C. S. Reserva
gênica primária de coffea arabica provenientes do centro de origem e diversificação. In:
Simpósio Nacional de Recursos Genéticos Vegetais, Campinas. ANAIS DO 1o.
SIMPÓSIO NACIONAL DE RECURSOS GENÉTICOS VEGETAIS. Campinas:
IAC/EMBRAPA, v.1, p.65, 1995.
GUERREIRO-FILHO, O.; MEDINA FILHO, H. P.; CARVALHO, A. Fontes de
resistência ao bicho mineiro, Perileucoptera coffeella, em Coffea spp. Bragantia,
Campinas, v.50, n.1, p.45-55, 1991.
GUERREIRO-FILHO, O.; MEDINA FILHO, H. P.; CARVALHO, A. Método para seleção
precoce de cafeeiros resistentes ao bicho mineiro Perileucoptera coffeella. Turrialba, v. 42,
n.3, p.348-358, 1992.
GUERREIRO-FILHO, O.; SILVAROLLA, M. B.; ESKES, A. B. Expression and mode of
inheritance of resistance of leaf miner Perileucoptera coffeella. Euphytica, v.105, n.1, p.7-
15, 1999.
GUPTA, P.K.; VARSHNEY, R. K. The development and use of microsatellite markers for
genetic analysis and plant breeding with emphasis on bread wheat. Euphytica, v.113,
p.163-185, 2000.
HACKAUF, B.; WEHLING, P. Identification of microsatellite polymorphisms in an
expressed portion of the ryebgenome. Plant Breeding, v.121, p.17-25, 2002.
http://www-genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html (17 de junho de
2005).
JANY, J. L.; BOUSQUET, J.; KHASA, P. Microsatellite markers for Hebeloma species
developed from expressed sequence tags in the ectomycorrhizal fungus Hebeloma
cylindrosporum. Molecular Ecology Notes, v.3, p.659-661, 2003.
KALCHEVA, N.; LACHMAN, H. M.; SHAFIT-ZAGARDO, B. Survey of CAG repeat
polymorphisms in the human MAP 2 gene. Psychiatric Genetic, v.9, p.43-46, 1999.
KATENTY, R. V.; LA ROTA, M.; MATHEUS, D. E.; SORRELLS, M. E. Dataminig for
simple sequence repeats in expressed sequence tags from barley, maize, rice, sorghum, and
wheat. Plant Molecular Biology, v.48, p.501-510, 2002.
KATIYAR, K. P.; FERRER, F. Rearing technique biology and sterilization of the coffee
leaf miner, Leucoptera coffeella (GUÉRIN-MENEVILLE, 1842) (Lepidoptera:
Lyonetiidae). In: International Atomic Energy Agency. Vienne: IAEA, 1968. p.165-175.
KIJAS, J. M.H.; FOWLER, J. C. S.; THOMAS, M. R. An evatuation of sequence tagged
microsatellite site markers for genetic analysis within Citrus and related species. Genoma,
v.38, p.349-355, 1995.
KONNOROVA, E.; DE LA VEJA, A. Nocividad de Leucoptera coffeella (Lepdoptera-
Lyonetiidae). III. Características y dimensiones de las lesiones producidas a las hojas del
cafeto. Cienc. Tec. Agric. Café y Cacao, Habana, v.7, n.1, p.25-40, 1985.
KOSUGE, T. The role of phenolics in host response to infection. Annual Review of
Phytopathology, Palo Alto, v.7, p.195-222, 1969.
KOTA, R.; VARSHNEY, R. K.; THIEL, T.; DEHMER, K. J.; GRANER, A. Generation
and comparison of EST-derived SSRs and SNPs in barley (Hordeum
vulgareL.).Hereditas,v.135,n.2-3,p.145-151,2001.
NANTES, J. F. D.; PARRA, J. R. P. Avaliações de danos causados por Perileucoptera
coffeella (GUÉRIN-MENEVILLE, 1842) (Lepidoptera: Lyonetiidae), em três variedades
de café (Coffea spp.). O solo. Piracicaba, v.69, n.2, p.26-29, 1977.
KRUZMANE, D.; JANKEVICA, L.; IEVINSH, G. Effect of regurgitantt from
Leptinotarsa decemlineata on wound responses in Solanum tuberosum and Phaseolus
vulgaris. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v.115, p.577-584, 2002.
LARKING, P. D.; PARK, W. D. Transcript accumulation and utilization of alternate and
non-consesus splice sites in rice granule-bound starch synthase are temperature-sensitive
and controlled by a single-nucleotide polymorphism. Plant Molecular Biology, v.40,
p.719-727, 1999.
LASHERMES, P.; COMBES, M-C.; ROBERT, J.; TRIUSLOT, P.; D’HONT, A.;
ANTHONY, F.; CHARRIER, A. Molecular characterisation and origin of the Coffea
arabica L. genome. Molecular Genetics and Genomics, v.261, p.259-266, 1999.
LIU, Z. W.; BIYASHEV, R. M., MAROOF, M. A. S. Development of simple sequence
repeat DNA markers and their integration into a barley linkage map. Theoretical and
Applied Genetics, v.93, p. 869-876, 1996.
LUCZYNSKY, A.; ISMAN, M.B.; RAWORTH, D. A. Strawberry foliar phenolics and
their relationship to development of two-spotted spider mite. Journal of Economic
Entomology, College Park, v.83, p.557-563, 1990.
MALUF, M. P.; GUERREIRO-FILHO, O. Melhoramento Genético do cafeeiro visando
resistência ao bicho-mineiro. In: 22° Encontro Sobre Temas de Genética e Melhoramento,
2005. Piracicaba, SP.
MARGIS-PINHEIRO, M.; MARTIN, C.; DIDIERJAN, L.; BURKARD, G. 'Differential
expression of bean chitinase genes by virus infection, chemical treatment and UV
irradiation' in Plant Molecular Biology, v.22, p.659-668, 1993.
markers for genetic analysis and plant breeding with emphasis on bread wheat. Euphytica,
v.113, p.63-185, 2000.
MAYER, A. M. Polyphenol oxidases in plants: recent progress. Phytochemistry, Oxford,
v.26, p.11-20, 1987.
MICHELMORE, R. W.; PARAN, I.; KESSELI, R. V. Identification of markers linked to
disease-resistance genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in
specific genomic regions by using segregating populations. Proceedings of the National
Academy of Sciences, v. 88, p. 9828-9832, 1991.
NERI, C.; ALBANESE, V.; LEBRE, A-S.; HOLBERT, S.; SAADA, C.;
BOUGUELERET, L.; MEIER-EWERT, S.; LE GALL, I.; MILLASSEAU, P.; BUI, H.;
GIUDICELLI, C., MASSART, C. ; GUILLOU, S. ; GEREVY, P; POULLIER, E.;
RIGAULT, P.; WEISSENBACH, J.; LENNON, G.; CHUMAKOV, I.; DAUSSET, J.;
LEHRACH, H.; COHEN, D.; CANN, H.N. Survey of CAG/CTG repeats in human cDNAs
representing new genes: candidates for inherited neurological disorders. Human
Molecular Genetics, v.5, p.1001-1009, 1996.
OLIVEIRA, R. F.; PASCHOLATI, S. F.; LEITE, B. Papilla formation and peroxidase
activity in Mimosa scabrella hipocotyls inoculated with the non-pathogen Colletotrichum
graminicola. Fitopatologia Brasileira, v.22, n.2, p.195-197, 1997.
PAILLARD, M.; LASHERMES, P.; PÉTIARD, V. Construction of a molecular linkage
map in Coffea. Theoretical and Applied Genetics, v.93, p.41-47, 1996.
PARRA, J. R. P. Bioecologia de Perileucoptera coffeella (GUÉRIN-MENEVILLE,
1842) (Lepidoptera: Lyonetiidae) em condições de campo. 1975. 114 f. Tese (Doutorado
em Entomologia Agrícola) - ESALQ/USP, Piracicaba.
PARRA, J. R. P. Biologia comparada de Perileucoptera coffeella (Guerin-Meneville, 1982)
(Lepdoptera-Lyonetiidae) visando ao seu zoneamento ecológico no Estado de São Paulo.
Revista Brasileira de Entomologia, v.29, n.1, p.45-76, 1985.
PHILIPS, R. L.; VASIL, I. K. (Ed.). DNA-Based Markers in Plants. Dordrecht: Kluwer
Academic Publishers, p.497, 2001.
PONCET, V.; HAMON, P.; MINIER, J.; CARASCO, C.; HAMON, S.; NOIROT, M. SSR
cross- amplification and variation within coffee trees (Coffea spp.). Genome, v. 47, p.1071-
1081,2004.
POWELL, W.; MACHRAY, G. C.; PROVAN, J. Polymorphism reveleaded by simple
sequence repeats. Trends Plant Science, v.1, p.215-222, 1996.
RAFALSKI, J. A. Novel genetic mapping tools in plants: SNPs and LD-based aproaches.
Plant Science , v.162, p.329- 333, 2002.
RAMIRO, D. A.; GUERREIRO-FILHO, O.; QUEIROZ-VOLTAN, R. B.; MATTHIESEN,
S. C. Caracterização anatômica de folhas de cafeeiros resistentes e suscetíveis ao bicho-
mineiro. Bragantia, Campinas, v.63, n.3, p.363-372, 2004.
RAMSAY, L.; MACAULAY, M.; IVANISSEVICH, D. S.; MACLEAN, K.; CARDLE, L.;
FULLER, J.; EDWARDS, K.J.; TUVESSON, S.; MORGANTE, M.; MASSARI, A.;
MAESTRI, E.; MARMIROLI, N.; SJAKSTE, T.; GANAL, M.; POWELL, W.; WAUGH,
R. A simple sequence repeat-based linkage map of barley. Genetics, v.156, p. 1997-2005,
2000.
RIBEIRO, R. C. F.; PEREIRA, A. A.; OLIVEIRA, C. H.; LIMA, R. D. Resistência de
Progênies de Híbridos Interespecíficos de Coffea arabica e Coffea canephora a
Meloidogyne exígua. Nematologia Brasileira, v.29, n.1, p.11-16, 2005.
ROZEN, S.; SKALETSKY, H. J. 1998. Primer 3. Code available at RUAS, P. M.; RUAS,
C. F.; RAMPIM, L. Genetic relationship in Coffea species and parentage determination of
interespecific hibrids using ISSR (Intre- Simple Sequence Repeat) markers. Genetics of
Molecular Biology, v.26, n.3, p.319-327, 2003.
RUDD, S. Expressed sequence tags: alternative or complement to whole genome
sequences?. Trends Plant Science, v.8, n.7, p.321-329, 2003.
SAGHAI MAROOF, M. A.; BIYASHEV, R. M.; YANG, G. P.; ZHANG, Q.; ALLARD,
R. W. Extraordinarily polymorphic microsatellite DNA in barley: species diversity,
chromosomal locations, and population dynamics. Proceedings of the National Academy
Science, v.91, p.5466-5470, 1994.
SAGWAN, I.; O’BRIA, M.R. Identification of a siybean protein that interacts with GAGA
element dinucleotide repeat DNA. Plant Physiology, v.4, p.1788-1794, 2002.
SAHA, S.; KARACA, M.; JENKINS, J. N.; ZIPF, A. E.; REDDY, O. U.; KANTENTY, R.
V. Simple sequence repeats as useful resources to study transcribed genes of cotton.
Euphytica, v.130, p.355-364, 2003.
SALGADO, P. R. Fenóis totais no cafeeiro em razão das fases de frutificação e do
clima. Piracicaba, ESALQ/USP, 60p. Dissertação (Mestrado), 2004.
SANTOS, A. S. Marcadores de DNA no melhoramento genético do feijoeiro
(Phaseolus vulgaris L.) visando resistência à Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli.
140p. 2000. Tese (Doutorado em Produção Vegetal) - Universidade Estadual do Norte
Fluminense, UENF, Campos dos Goytacazes.
SASAKI, T.; BILLET, E.; PETRONIS, A. ; YING, D. ; PARSONS, T. ; MACCIARDI,
F.M ; MELTZER, H. Y. ; LIEBERMAN, J. ; JOFFE, R. T.; ROSS, C. A.; MCINNIS, M.
G.; LI, S. H.; KENNEDY, J. L. Psychosis and genes with trinucleotide repeat
polymorphism. Human Genetics, v.97, p.244-246, 1996.
SCOTT, K. D.; EGGLER, P.; SEATON, G.; ROSSETO, M.; ABLETT, E. M.; LEE, L. S.;
HENRY, R. J. Analyses of SSRs derived from grape ESTs. Theoretical and Applied
Genetics, v.100, p.723-726, 2000.
SHERAMETI, I. M. N. ; YAMAMOTO, Y. Y. ; PFANNSCHMIDT, T.; OELMULLER.
Polyribosome loading of spinach mRNA for photosystem I subunits is controlled by
photosynthetic electron transport. Plant Journal, v.32, p.631-639, 2002.
SIEGEL, B.Z. Plant peroxidases: an organismic perspective. Plant Growth Regulation,
v.12, p.303-312, 1993.
SOUZA, J. C.; REIS, P. R.; RIGITANA, R.L. O bicho mineiro do cafeeiro: biologia,
danos e manejo integrado. Belo Horizonte: EPAMIG, 1998. 48p. (Boletim Técnico, 54)
SOUZA, J. C.; REIS, P.R. Bicho mineiro: Biologia, danos e manejo integrado. Belo
Horizonte, Epamig, 1992, 37. 28p.
STAFSTROM, J. P.; INGRAM P. TCA microsatellite repeats in the 5’- UTR of the Sat S
gene of wild and cultivated accessions of Pisum and of four closely related genera.
Intenational Journal Plant of Science, v.165, n.2, p.273-280, 2004.
STERKY F.; LUNDEBERG, J. Sequence analysis of genes and genomes. Journal of
Biotechnology, v.76, p.1-31, 2000.
STRUSS, P.; PLIESKE, J. The use of microsatellite markers for detection of genetic
diversity in barley populations. Theoretical and Applied Genetics, v.97, p.308-315,
1998.
THIEL, T.; MICHALEK, W.; VARSHNEY, R. K.; GRANER, A. Exploiting EST
databases for the development and characterization of gene-derived SSR-markers in barley
(Hordeum vulgare L.). Theoretical and Applied Genetics, v.106, p.411- 422, 2003.
URASAKI, N.; TOKUMOTO, M.; TORORA, K.; BAN, Y.; KAYANO, T.; TANAKA, H.;
OKU, H.; CHINEN, I.; TERAUCHI, R. A male and hermaphrodite specific RAPD markers
for papaya (Carica papaya L.). Theoretical and Applied Genetics, v.104, n.2-3, p.281-
285, 2002.
VARSHNEY, R. K.; GRANER, A.; SORRELLS, M. Genic microsatellites markers in
plants: features and applications. Trends in Biotchnology, v.23, n.1, 2005.
VARSHNEY, R. K.; KORZUN, V. BÖRNER, A. Molecular maps in cereals: met
hodology and progress. In: GUPTA, P. K.; VARSHNEY, R. K. (Ed.). Cereal Genomics.
Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, p.35-82, 2004.
VARSHNEY, R. K; THIEL, T.; STEIN, N.; LANGRIDGE, P.; GRANER, A. In silico
analysis on frequency and distribution of microsatellites in ESTs of some cereal
species. Cellular And Molecular Biology Letters, v.7, n.2, p.537-546, 2002.
VEGRO, C. L. R.; FERREIRA, C. R. R. P. T. Evolução das despesas com defensivos
agrícolas e fertilizantes para a safra de café 2000/01 nos estados de São Paulo e Paraná.
Informações Econômicas, v.30, p.53-59, 2000.
WU, K-S.; TANKSLEY, S. D.Abundance, polymorphism and genetic mapping of
microsatellites in rice. Molecular Genetics and Genomics, v.241, p.225-235, 1993.
YU, K.; PARK, S. J.; POYSA, V. Abundance and variation of microsatellite DNA
sequences in beans (Phaseolus and Vigna). Genome, v.42, p.27-34, 1999.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
