( PDF ) Estudo fitoquímico de Trichogonia menthaefolia Gardner (Asteraceae-Eupatorieae)

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Dissertação apresentada à Faculdade de

Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo, como parte das

exigências para a obtenção do título de Mestre

em Ciências, Área:Química

RIBEIRÃO PRETO - SP

2006

Universidade de São Paulo

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto

Departamento de Química

Programa de Pós-Graduação em Química

Estudo fitoquímico de Gardner

(Asteraceae-Eupatorieae)

Trichogonia menthaefolia

Endler Marcel Borges

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ENDLER MARCEL BORGES

Estudo Fitoquímico de Trichogonia menthaefolia Gardner

(Asteraceae-Eupatorieae)

Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de

Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP,

como parte das exigências para a obtenção do título de

Mestre em Ciências.

Área de concentração: Química.

Orientadora: Prof

. Dr

. Dionéia Camilo Rodrigues de

Oliveira

Ribeirão Preto

2006

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FICHA CATALOGRÁFICA

Borges, Endler Marcel

Estudo Fitoquímico de Trichogonia menthaefolia Gardner

(Asteraceae-Eupatorieae). Ribeirão Preto, 2006.

82 p. : il. ; 30cm

Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Filosofia

Ciências e Letras de Ribeirão Preto/USP – Área de concentração:

Química.

Orientadora: Oliveira, Dionéia Camilo Rodrigues de

1. Asteraceae. 2. Eupatorieae. 3. Trichogonia menthaefolia

Gardner.

FOLHA DE APROVAÇÃO

Endler Marcel Borges

Estudo Fitoquímico de Trichogonia menthaefolia Gardner (Asteraceae-Eupatorieae)

Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade

de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da

USP, como parte das exigências para a obtenção do

título de Mestre em Ciências.

Área de concentração: Química

Aprovado em

Banca Examinadora

Prof(a). Dr(a). __________________________________________________________

Instituição _____________________________________________________________

Assinatura: _____________________________________________________________

Prof(a). Dr(a). __________________________________________________________

Instituição _____________________________________________________________

Assinatura: _____________________________________________________________

Prof(a). Dr(a). Orientador(a)_______________________________________________

Instituição _____________________________________________________________

Assinatura: _____________________________________________________________

Agradecimentos

À Prof

. Dr

. Dionéia Camilo Rodrigues de Oliveira, pela orientação.

À Prof

. Dr

. Diones Aparecida dias pelo incentivo.

Ao Prof. Dr. Norberto Peporine Lopes pela coleta do material vegetal

Ao Prof. Dr. João Luis Callegari Lopes pela colaboração

À minha avó e pelo apoio, incentivo e compreensão.

À minha mãe e pelo apoio, incentivo e compreensão.

À funcionária Virgínia,da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto

pela obtenção dos espectros de RMN.

Ao José Carlos Tomaz, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto

pela amizade.

Aos pós-graduandos Humberto Sakamoto e Renata Takeara pelas valiosas lições.

À Mailyn por todo o carinho.

À Poly, pelo incentivo, apoio, auxílio e companheirismo.

Ao CNPq pela concessão da bolsa.

À FAPESP pelo auxílio á pesquisa concedido.

À CAPES pelo auxílio indireto.

A todos aqueles que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.

Sumário

Lista de abreviaturas i

Lista de tabelas

Lista de figuras i

Resumo i

Abstract i

Metabólitos isolados i

1. Introdução 01

1.1. Considerações gerais 01

1.2. A fitoquímica e o novo milênio 03

1.3. Família, tribo, subtribo, gênero e espécie 05

2. Objetivos 10

3. Materiais e métodos 11

3.1. Fases estacionárias para cromatografia 11

3.2. Solventes e reagentes 12

3.3. Instrumentos 12

3.4. Métodos 13

3.4.1. Metodologia utilizada nas análises por CG 13

3.4.2. Metodologia para a obtenção dos espectros massas 14

3.4.3. Metodologia para o preparo das amostras a serem cromatografadas 14

4. Procedimento experimental 15

4.1. Coleta e identificação do material vegetal 15

4.2. Preparação dos extratos brutos 15

4.3. Isolamento e purificação dos constituintes químicos do extrato em

diclorometano 17

4.3.1. Isolamento dos constituintes químicos das frações obtidas da CLV do

extrato em diclorometano

4.4. Isolamento dos constituintes químicos do extrato metanólico 21

5. Identificação estrutural 23

5.1. Identificação estrutural do sesquiterpeno 6α-angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno

(1)

5.2. Identificação estrutural do triterpeno 3α-hidroxi-olean-12-eno (2) 26

5.3. Identificação estrutural da mistura dos triterpenos presentes na fração

TmD-5 (3, 4, 5 e 6)

5.4. Identificação estrutural dos esteróides (7, 8, 9, 10 e 11) 33

5.5. Identificação estrutural do flavonóide ramnocitrina (12) 38

5.6. Identificação estrutural do flavonóide ramnocitrina

3-O-β-galactopiranosídeo (13)

6. Conclusões 44

7. Referências bibliográficas 46

Lista de Abreviaturas

Tr – tempo de retenção relativo

Rf - fator de retenção

CLV – Cromatografia Líquida a Vácuo

CCDC - Cromatografia em Camada Delgada Comparativa

CCDP - Cromatografia em Camada Delgada Preparativa

CC - Cromatografia em Coluna Clássica

CG - Cromatografia de fase Gasosa

FID – Flame Ionization Detector

EM – Espectrometria de Massas

EM-EM – Espectrometria de Massas Seqüencial

DEPT 135

– Distorsioneless Enhancement by Polarization Transfer 135

HMQC – Detected Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

PND – Proton Noise Decoupling

RMN

H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN

C – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13

AcOEt – Acetato de Etila

O – Éter Etílico

MeOH – Metanol

– Diclorometano

CHCl

– Clorofórmio

DMSO-d

- Dimetilsulfóxido Deuterado

TmD – Extrato bruto de Trichogonia menthaefolia em Diclorometano

iii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Fitoquímica de espécies de Trichogonia ...................................................

Tabela 2- CLV do extrato em diclorometano da Trichogonia menthaefolia ............

Tabela 3- CC da fração TmD-6 .................................................................................

Tabela 4- Dados de RMN

H da substância 6α-Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno

comparados com os dados da literatura (Bohlmann et al.,

1981b)..........................................................................................................

Tabela 5- Dados de RMN obtidos dos espectros de

C (PND e DEPT 135º) e nos

mapas de contorno do HMQC (δ em ppm, CDCl

) ...................................

Tabela 6-

Dados de RMN

C (δ em ppm, CDCl

) do triterpeno 3α-hidroxi-olean-

12-eno comparados com os valores da β-amirina

(Mahato et al, 1994) ...................................................................................

Tabela 7-

Dados do espectro de RMN de

C (δ em ppm, CDCl

) para β-amirina e

lupeol comparados com os dados da literatura (Mahato et al.,

1994)............................................................................................................

Tabela 8-

Dados do espectro de RMN de

C (δ em ppm, CDCl

) para

pseudotaraxasterol e taraxasterol comparados com os dados da literatura

(Mahato et al., 1994)...................................................................................

Tabela 9- Identificação das substâncias presentes em TmD-5 (Coluna HP-50).........

Tabela 10- Identificação das substâncias presentes em TmD-5 (Coluna HP-1)...........

Tabela 11-

Resultados experimentais de RMN de

C (δ em ppm, CDCl

) para os

esteróides β-sitosterol e estigmasterol comparados com a literatura

(Kojima et al., 1990)...................................................................................

Tabela 12-

Resultados experimentais de RMN de

C (δ em ppm, CDCl

) para os

esteróides estigmast-7-en-3β-ol e espinasterol comparados com a

literatura (Kojima et al., 1990)....................................................................

Tabela 13- Identificação da mistura de esteróides (coluna HP-50) ..............................

Tabela 14- Identificação da mistura de esteróides (coluna HP-1) ................................

Tabela 15- Dados do espectro de RMN

H do flavonóide ramnocitrina comparados

com a literatura (Barberá et al., 1986) e

(Harborne,1995) .........................................................................................

Tabela 16-

Dados do espectro de RMN

C (δ em ppm, DMSO-d

) do flavonóide

ramnocitrina comparados com a literatura

(Agrawal et al., 1989) ................................................................................

Tabela 17-

Dados do espectro de RMN

H do flavonóide ramnocitrina comparados

com os da ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo ....................................

Tabela 18- Valores de RMN

H do flavonóide ramnocitrina 3-O-β-

galactopiranosídeo comparados com os valores da literatura (Barberá et

al., 1986).....................................................................................................

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Esquema representativo da obtenção dos extratos brutos do pó de T.

menthaefolia.................................................................................................

Figura 2- Fluxograma do trabalho experimental realizado com o extrato

diclorometânico de T. menthaefolia.............................................................

Figura 3- Fluxograma do trabalho experimental realizado com o extrato metanólico

de T. menthaefolia........................................................................................

Figura 4- Proposta de fragmentação da ramnocitrina no modo positivo que

confirma a metoxila em C7 (March & Miao., 2004)

......................................................................................................................

Figura 5- Proposta de fragmentação para a ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo

(13) (March et al., 2006)..............................................................................

Figura 6-

Espectro de RMN

H (δ em ppm, CDCl

e 400MHz) do sesquiterpeno

6α-Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno (1).........................................................

Figura 7- Expansões de parte do espectro presente na figura 6...................................

Figura 8- Expansões de parte do espectro presente na figura 6...................................

Figura 9- Espectro de RMN

C (PND, δ em ppm; CDCl

, 100MHz) do

sesquiterpeno 6α-Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno (1)..................................

Figura 10- Espectro de RMN

C (DEPT 135º, δ em ppm; CDCl

, 100MHz) do

sesquiterpeno 6α-Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno (1)..................................

Figura 11- Mapas de contorno do HMQC.....................................................................

Figura 12- Expansão dos mapas de contorno do HMQC presente na figura 11 ...........

Figura 13-

Espectro de RMN

H (δ em ppm, CDCl

e 400MHz) do triterpeno 3α-

hidroxi-olean-eno (2)....................................................................................

Figura 14- Expansões de parte do espectro presente na figura 13.................................

Figura 15-

Espectro de RMN

C (PND,

em ppm; CDCl

, 100MHz) do triterpeno

3α-hidroxi-olean-eno (2)..............................................................................

Figura 16- Expansões de parte do espectro presente na figura 15.................................

Figura 17-

Espectro de RMN

C (DEPT 135º, δ em ppm; CDCl

, 100MHz) do

triterpeno 3α-hidroxi-olean-eno (2)..............................................................

Figura 18- Cromatograma obtido por CG da mistura de triterpenos: A- padrão de

referência, B- β-sitosterol (7), C- β-amirina (3), D- lupeol (4), E-

pseudotaraxasterol (6) e F- taraxasterol (5) (coluna HP-1) .........................

Figura 19-

Cromatograma obtido por CG da mistura de triterpenos: A- padrão de

referência, B- β-sitosterol (7), C- β-amirina (3), D- lupeol (4), E-

pseudotaraxasterol (6) e F- taraxasterol (5) (coluna HP-50)........................

Figura 20- Espectro de RMN

H (δ em ppm, CDCl

e 400MHz) da mistura dos

triterpenos (3, 4, 5 e 6).................................................................................

Figura 21- Espectro de RMN

C (PND, δ em ppm; CDCl

100MHz) da mistura dos

triterpenos (3, 4, 5 e 6).................................................................................

Figura 22- Espectro de RMN

C (DEPT 135

, δ em ppm; CDCl

, 100MHz) da

mistura dos triterpenos (3, 4, 5 e 6)..............................................................

Figura 23- Cromatograma dos padrões dos esteróides: A- padrão de referência, B-

campesterol (9), C- estigmasterol (8), D- β-sitosterol (7), E- estigmast-7-

em 3β-ol (10) e F- espinasterol (11) (coluna HP-50)...................................

Figura 24- Cromatograma dos padrões dos esteróides: A- padrão de referência, B-

campesterol (9), C- estigmasterol (8), D- β-sitosterol (7), E- estigmast-7-

em 3β-ol (10) e F- espinasterol (11) (coluna HP-1).....................................

Figura 25- Análise

por CG da mistura dos esteróides: A- padrão de referência, B-

campesterol (9), C- estigmasterol (8), D- β-sitosterol (7), E- estigmast-7-

em 3β-ol (10) e F- espinasterol (11) (coluna HP-50)...................................

Figura 26- Análise por CG da mistura dos esteróides: A- padrão de referência, B-

campesterol (9), C- estigmasterol (8), D- β-sitosterol (7), E- estigmast-7-

em 3β-ol (10) e F- espinasterol (11) (coluna HP-1).....................................

Figura 27- Enriquecimento com padrões na mistura dos esteróides: A- padrão de

referência, B- campesterol (9), C- estigmasterol (8), D- β-sitosterol (7),

E- estigmast-7-em 3β-ol (10) e F- espinasterol (11) (coluna HP-50)..........

Figura 28- Espectro de RMN

H (δ em ppm; CDCl

400MHz) da mistura dos

esteróides (7, 8, 9, 10 e 11)..........................................................................

Figura 29- Expansões de parte do espectro presente na figura 28.................................

Figura 30- Espectro de RMN

C (PND, δ em ppm; CDCl

, 100MHz) da mistura dos

esteróides (7, 8, 9, 10 e 11)..........................................................................

Figura 31- Espectro de RMN

C (DEPT 135

, δ em ppm; CDCl

, 100MHz) da

mistura dos esteróides (7, 8, 9, 10 e 11).......................................................

Figura 32-

Espectro de RMN

H (

em ppm; DMSO-d

, 400MHz) do flavonóide

ramnocitrina (12)..........................................................................................

vii

Figura 33- Expansões de parte do espectro presente na figura 32.................................

Figura 34-

Espectro de RMN

C (PND,

em ppm; DMSO-d

, 100MHz) do

flavonóide ramnocitrina (12)........................................................................

Figura 35-

Espectro de RMN

C (DEPT

135º, δ em ppm; DMSO-d

, 100MHz) do

flavonóide ramnocitrina (12)........................................................................

Figura 36- EM no modo negativo do flavonóide ramnocitrina (12)..............................

Figura 37- EM-EM no modo negativo do flavonóide ramnocitrina (12)......................

Figura 38- EM-EM no modo positivo do flavonóide ramnocitrina (12).......................

Figura 39- Espectro de RMN de

H do flavonóide ramnocitrina 3-O-β-

galactopiranosídeo (13) (δ em ppm, DMSO-d

, 400MHz)..........................

Figura 40- Expansão de parte do espectro presente na figura 39...................................

Figura 41- EM no modo negativo do flavonóide ramnocitrina 3-O-β-

galactopiranosídeo (13)................................................................................

Figura 42- EM-EM no modo negativo do flavonóide ramnocitrina 3-O-β-

galactopiranosídeo (13)................................................................................

viii

Resumo

BORGES, E.M. Estudo fitoquímico de Trichogonia menthaefolia Gardner (Asteraceae-

Eupatorieae). 2006. 82p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras

de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006.

Neste trabalho estamos apresentando o estudo fitoquímico das partes totais da espécie

Trichogonia menthaefolia Gardner (Asteraceae-Eupatorieae). O material vegetal foi coletado

em Furnas – MG e a partir do pó seco foram preparados os extratos em diclorometano e em

metanol, em seqüência. Do extrato diclorometânico foram isolados: o sesquiterpeno 6α-

angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno, o triterpeno 3α-hidroxi-olean-12-eno, os triterpenos lupeol,

taraxasterol, pseudotaraxasterol e 3β-hidroxi-olean-12-eno (identificados em mistura), os

esteróides β-sitosterol, estigmasterol, campesterol, estimast-7-en-3β-ol e espinasterol

(identificados em mistura) e o flavonóide ramnocitrina. Do extrato metanólico foi isolado o

flavonóide ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo. Estas substâncias, após isolamento e

purificação por métodos cromatográficos, foram identificadas com o auxílio de várias técnicas

espectroscópicas como: EM, EM-EM, RMN de

C (PND; DEPT 135º) e a técnica

bidimensional HMQC. Na identificação das misturas de triterpenos e esteróides a

cromatografia de fase gasosa também foi utilizada.

Abstract

BORGES, E.M. Phytochemistry study of Trichogonia menthaefolia Gardner (Asteraceae-

Eupatorieae). 2006. 82p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras

de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006.

In this study we are presenting the results of the phytochemical investigation of the

Trichogonia menthaefoli Gardner (Asteraceae-Eupatorieae). This specie was collected in

Furnas – MG. Dicholorometanic and methanolic extracts were prepared from the dried

powder plant material. These extracts were fractioned through chromatoghraphic methods.

The dichloromethanic extract furnished the: sesquiterpene 6α-angeloyloxy-eudesm-4(15)-ene;

triterpenes: 3α-hydroxy-olean-12-ene, lupeol, taraxasterol, pseudo-taraxasterol and 3β-

hydroxy-olean-12-ene (identified in mixture) and the steroids: sitosterol, stigmasterol,

stigmast-7-en-3β-ol, spinasterol and campesterol (identified in mixture) and the flavonóide

rhamnocitrin. The methanolic extract afforded the flavonoid rhamnocitrin 3-O-β-

galactopyranoside. Compound identification was performed by using a variety of

spectroscopic methods, such as: MS, MS-MS,

H and

C NMR and HMQC bidimensional

technique. The identification of mixtures (triterpenes and steroids) was also performed by gas

chromatography in addition to other spectroscopic methods.

Metabólitos Isolados

Sesquiterpeno

6α-Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno (1)

Triterpenos

lupeol (4)

-amirina (3)

taraxasterol (5)

pseudotaraxasterol (6)

-hidroxi-olean-12-eno (2).

-hidroxi-olean-12-eno (3).

epi-

-amirina (2)

Esteróides

H H

-sitosterol (7)

estigmasterol (8)

campesterol (9)

estigmast-7-en-3

-ol (10)

espinasterol (11)

Flavonóides

ramnocitrina (12)

1''

2''

3''

4''

5''

6''

ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo (13)

___________________________________________________________Introdução

1. Introdução

1.1. Considerações gerais

A importância dos produtos naturais é ilustrada por Gragg e colaboradores, em seu

trabalho eles verificaram que 157 das 520 (30%) novas drogas aprovadas pela Food and Drug

Administration nos Estados Unidos num período de 12 anos (1983-1994) eram produtos

naturais ou seus derivados. Isto é uma evidência da importância e do crescimento da

fitoterapia, seja em países pobres onde não existem outras alternativas ou em países ricos

onde programas bem direcionados buscam novas alternativas onde os métodos comumente

utilizados pelas indústrias farmacêuticas não correspondem as expectativas (Cordell, 2000).

A fitoterapia data de antes do início do cristianismo perfazendo pergaminhos, escritas

e conhecimentos transmitidos de pai para filho, que sobreviveram até os dias atuais. Mas foi

apenas em 1524 que Paracelsus atentou pela necessidade de descobrirmos o que as plantas

medicinais possuíam que era capaz de promover a cura. Foi quando ele escreveu “Archidoxa”

do “Arcanum”, o primeiro relato a respeito da procura pelos princípios ativos (Cordell, 2000).

Esta necessidade de descobrir as entidades responsáveis pela cura, as quais foram

propostas inicialmente por Paracelsus começou por volta de 1780 com o trabalho de Scheele,

onde se estudava os ácidos orgânicos de várias espécies de plantas medicinais. Os trabalhos

de Scheele e seus antecessores esbarraram em recursos experimentais extremamente limitados

(Cordell, 2000).

No final do século XIX, a química se constituiu como disciplina científica moderna,

com os trabalhos de Lavoisier, Berzelius e Liebig, sendo esta a época em que química e

medicina caminharam juntos, foi esta a época em que os mais importantes alcalóides da

___________________________________________________________Introdução

medicina convencional, tais como morfina, atropina, papaverina, codeína e efedrina foram

descobertos (Cordell, 2000).

Foi nesta época que o exemplo mais clássico de medicamento concebido através de

produtos naturais, a aspirina (Acido Acetil Salicílico) foi desenvolvido, a história da aspirina

começou a alguns milênios na Europa, Ásia e África onde se usava as cascas da Salix alba

para combater a febre e a dor, em 1898, Felix Hoffman, sintetizou um composto de caráter

menos ácido, acetilando o grupo hidroxila na posição orto, descobrindo assim a aspirina, que

hoje comemora um centenário e representa cerca de 1,2% do mercado mundial de

medicamentos (Cordell, 2000).

No entanto após a revolução industrial do século XIX, mais especificamente entre

1901 e 1970, teve início a procura de substâncias químicas de origem sintética que pudessem

ser utilizadas como medicamentos, o exemplo mais clássico disto são os trabalhos realizados

por Ehrlich e outros realizados entre 1909 e 1935 e da descoberta das Sulfas por Ernest

Foumeau (Cordell, 2000).

Este período ficou marcado pela descoberta das mais importantes substâncias

sintéticas, tais como: amilocaína, procaína, ácido-5-etil-5-fenilbarbitúrico e a famosa

penicilina advinda de experiências com fungos. Iniciando-se assim uma nova era onde as

grandes indústrias farmacêuticas estagnaram suas pesquisas com produtos naturais, e as

indústrias farmacêuticas começaram a apostar violentamente nos métodos de screening

(Cordell, 2000).

Os métodos de screening utilizando compostos de origem sintética, semi-sintética e

química combinatória se mostraram demasiadamente sedutores frente a compostos de origem

natural como os extratos de plantas, culturas de fungos e fermentações bacterianas, uma vez

que compostos de origem natural geralmente estão presentes como misturas complexas de

___________________________________________________________Introdução

difícil separação assim como na maioria dos casos, salvo raras exceções, são de difícil

elucidação estrutural (Filho & Yunes, 2001).

1.2. A fitoquímica e o novo milênio

Durante os últimos anos a atenção da indústria farmacêutica tem se voltado novamente

para os produtos naturais, em especial por causa de três novas drogas de origem vegetal;

taxol, etoposídeo e artemisinina (Phillipson, 2001).

O taxol é obtido das cascas do Taxus brevifolia, sendo sua atividade contra o câncer

conhecida desde a década de 60, o taxol teve sua estrutura elucidada em 1971 e apenas na

década de 90, que o taxol e seu análogo semi-sintético o taxotere tiveram sua eficiência

comprovada contra o câncer de ovário e seio. Cabe também ressaltar que para obter 1900g de

taxol são necessárias 27.300kg de cascas ou seja aproximadamente 6.000 árvores (Cordell,

1995). A busca por uma fonte de taxol capaz de atender as demandas do mercado, culminou

na semi-síntese e na síntese total do taxol, revolucionando a química orgânica sintética

(Viegas et al., 2006).

O etoposídeo é a principal substância presente na resina da Podophyllum peltatum,

sendo que esta substância inibe a divisão celular, sendo seu análogo semi-sintético eficiente

no combate ao câncer de pulmão e testículos (Phillipson, 2001).

A artemisinina isolada como princípio ativo da Artemisia annua, se mostrou eficaz

contra a malária, sendo que a descoberta da mesma impulsionou o desenvolvimento de novas

drogas antimaláricas como: β-arteméter, o arte-éter e o artesunato de sódio todos estes

derivados semi-sintéticos da artemisinina (Viegas et al., 2006).

As pesquisas com o taxol, etoposídeo e artemisinina impulsionaram a indústrias

farmacêuticas a investirem novamente em pesquisas com produtos naturais, sendo que a

___________________________________________________________Introdução

maior parte dos esforços com produtos naturais tem como objetivo a descoberta de novas

drogas anti-câncer, um reflexo disto é que no período de 1983-1994, 61% das novas drogas

anti-câncer provinham de produtos naturais (Cordell, 2000). No entanto o principal interesse

das pesquisas com produtos naturais, atualmente, não é produzir drogas melhores do que as

que já existem no mercado e sim fornecer novas alternativas. Dentre os milhares de

exemplos que podem ser dados existem três que convém serem destacados:

O Ginkgo biloba utilizado no controle de problemas vasculares cerebrais, de memória

e com propriedades neuroprotetoras ilustra um exemplo de fitoterápico de sucesso. A partir

dos extratos dessa planta, Nakanishi e colaboradores isolaram os ginkolídeos-A, B, C, e M

que demonstraram importantes propriedades antitrombóticas (Viegas et al., 2006).

Do extrato da erva-de-São-João (Hypericum perforatum), foi isolado a hipericina,

utilizada como antidepressivo. Aparentemente, as propriedades atribuídas a este extrato

devem-se a hiperforina, que compreende uma mistura de tautômeros. Atualmente na

Alemanha para cada 30 mil receitas de fluoxetina (Prozac) são emitidas 200 mil de

Hypericum sp. (Filho & Yunes, 2001).

O gossipol, obtido do óleo de semente do algodão (Gossypium sp.), foi amplamente

utilizado na China como contraceptivo masculino, propriedade confirmada em 1980 (Viegas

et al., 2006).

Desta maneira a fitoquímica desempenha um papel importante na medida em que com

o isolamento, purificação e identificação estrutural de substâncias químicas, implementa a

literatura com informações químicas que podem ser utilizadas, após estudos biológicos, como

fontes alternativas frente às drogas existentes no mercado além de fornecer novos modelos de

fármacos, para química medicinal (modelagem molecular).

___________________________________________________________Introdução

1.3. Família, tribo, subtribo, gênero e espécie.

A família Asteraceae (Compositae) é a maior de todas as famílias, compreendendo

1535 gêneros e mais de 23.000 espécies conhecidas, distribuídas por 3 subfamílias e 17 tribos.

Sendo o conceito de subfamília recente, tanto é que as subfamílias Asteroideae e

Cichorioideae se tornaram conhecidas por volta de 1970, e a subfamília Barnadesioideae foi

descrita apenas em 1992, por sua vez os conceitos de tribo são bem mais antigos, tendo seu

início por volta de 1900 com os trabalhos pioneiros de Henri Cassini e Carl Linnaeus

(Bremer, 1994).

As espécies da família Asteraceae são amplamente distribuídas pelo mundo, mas é

particularmente abundante no oeste dos Estados Unidos e do México, no sul do Brasil, ao

longo dos Andes, nas Áreas Mediterrâneas, Sudeste Asiático, Ásia Central, Sul da África e

Austrália (Bremer, 1994).

A tribo Eupatorieae compõe a maior parte das asteraceas nas regiões Neotropicais, a

qual também se apresenta nos Estados Unidos e Canadá, assim como por todo Hemisfério

Ocidental. Integrantes da tribo que foram introduzidos nas ilhas do pacífico acabaram se

espalhando pelo Velho Mundo. Com base nos conceitos atuais, a tribo tem 200 gêneros

conhecidos, correspondendo a aproximadamente 10% das asteraceas (King & Robinson,

1987).

Em virtude da grande diversidade da flora ao longo do mundo, esta tribo não é bem

compreendida, ocasionando erros nas identificações botânicas. Estudos mais elaborados

começaram a serem feitos em 1970. Estes novos estudos levaram os taxonomistas King e

Robinson (1987) a sugerirem um novo sistema de classificação, o qual fez com que surgissem

três novos gêneros Ageratina, Ayapana e Campuloclinium cujas espécies pertenciam ao

gênero Eupatorium (King & Robinson, 1987).

___________________________________________________________Introdução

Atualmente não é atribuída grande importância econômica a tribo, no entanto

existem exemplos bem claros de espécies importantes como por exemplo: Eupatorium

cannabinum usada na Índia no tratamento de úlceras e na Itália na medicina homeopática;

espécies de Mikania são usadas na América do Sul e na África no tratamento de mordidas de

serpentes; óleos essenciais de Trilisa odoratissima como agente fixador em perfumes e o uso

das folhas secas para adicionar sabor ao tabaco; Koanophyllon tinctorium e K. albicaule são

poderosos corantes; Stevia rebaudiana é a muito tempo conhecida pelo seu sabor doce e como

um possível substituto para o açúcar; Austroeu patorium inulaefolium foi utilizada no Uruguai

no controle de natalidade e muitas outras utilidades (King & Robinson, 1987).

Estudo mais recente a respeito da química das espécies da tribo Eupatorieae indica

que esta apresenta alcalóides pirrolizidínicos, no entanto estes alcalóides são diferentes dos

produzidos pelo seu parente próximo, a tribo Senecioneae (King & Robinson, 1987).

Quanto aos flavonóides, estão presentes em todas as inflorescências das espécies da

tribo Eupatorieae especialmente as de coloração amarela (King & Robinson, 1987).

Uma outra característica química importante do grupo é a presença em seus óleos

essenciais de benzofuranos, os quais são responsáveis por muitas das espécies da tribo

Eupatorieae serem venenosas. A característica das plantas da tribo apresentar benzofuranos é

tão marcante que a presença dos mesmos no gênero Isocarpha foi usada como argumento

para colocar este gênero dentro desta tribo (King & Robinson, 1987).

Monoterpenos na forma de derivados do timol, ocorrem esporadicamente dentro da

tribo Eupatorieae, estes ocorrem na Bishovia boliviensis, na Mikania officinalis e M.

purpurascens, duas espécies endêmicas do Brasil. Já os sesquiterpenos ocorrem largamente ao

longo da tribo (King & Robinson, 1987).

___________________________________________________________Introdução

A subtribo Gyptidinae é uma das maiores subtribos dentro da tribo Eupatorieae. Esta

subtribo atinge sua maior diversidade no Cerrado brasileiro onde a subtribo Critoniinae é rara

(King & Robinson, 1987).

Dos 27 gêneros pertencentes à subtribo Gyptidinae, 23 estão concentrados na

América do Sul, estando apenas 2 gêneros concentrados nos Estados Unidos e no México,

Conoclinium e Tamaulipa. O gênero Lourteigia é natural de grandes altitudes ocorrendo ao

longo do norte dos Andes. O gênero Neocuatrecasia só é encontrado no Peru e na Bolívia. Os

gêneros Trichogonia e Barrosoa estão concentrados no Brasil, apresentando apenas algumas

espécies distribuídas pela Venezuela e Colômbia (King & Robinson, 1987).

O gênero Trichogonia é reconhecido pelo papo plumoso que é encontrado na maioria

das espécies deste gênero. Em todo caso o gênero Helogyne também apresenta papo plumoso

o que pode causar confusão entre as espécies, este gênero é genuinamente brasileiro, sendo

uma característica das espécies brasileiras, a presença de glândulas ao longo do tubo da corola

(King & Robinson, 1987).

A espécie T. menthaefolia é endêmica do Brasil e nenhum estudo fitoquímico foi

realizado até o momento com esta espécie, assim como nenhuma avaliação biológica do

gênero foi conduzida.

Na tabela 01 estão descritas as espécies de Trichogonia que passaram por algum

estudo químico.

___________________________________________________________Introdução

Tabela 01: Fitoquímica de espécies de Trichogonia

Espécie Polaridade do extrato Parte da

planta

Classes químicas Referências

Bibliográficas

O:éter de petróleo

1:2, v:v

aéreas Sesquiterpenos,

esteróides e lactonas

sesquiterpênicas

Bohlmann et al.,

1981a

O:éter de petróleo

1:2, v:v

raízes Sesquiterpenos,

esteróides e derivados

furânicos da

acetofenona

Bohlmann et al.,

1981a

Trichogonia

prancii

O:éter de petróleo

1:2, v:v

aéreas Lactonas

sesquiterpênicas

Bohlmann et al.,

1984

O:éter de petróleo

1:2, v:v

aéreas Sesquiterpenos e

derivados da

acetofenona

Bohlmann et al.,

1981a

Trichogonia

grazielae

O:éter de petróleo

1:2, v:v

raízes Sesquiterpenos e

derivados da

acetofenona

Bohlmann et al.,

1981a

Trichogonia

scottmorii

O:éter de petróleo

1:2, v:v

aéreas Sesquiterpenos,

sesquiterpenóides,

esteróides e derivados

da acetofenona

Bohlmann et al.,

1981a

O:éter de petróleo

1:2, v:v

aéreas Sesquiterpenos,

esteróides, ácidos

graxos e lactonas

sesquiterpênicas

Bohlmann et al.,

1981a

O:éter de petróleo

1:2, v:v

raízes Sesquiterpenos e

derivados da

acetofenona

Bohlmann et al.,

1981a

Trichogonia

salviaefolia

MeOH:Et

O: éter de

petróleo

1:1:1, v:v:v

planta

total

Lactona

sesquiterpênica e

diterpeno

Baruah et al.,

1985

O:éter de petróleo

1:2, v:v

aéreas

Diterpenos e lactonas

sesquiterpênicas

Bohlmann et

al., 1984

O:éter de petróleo

1:2, v:v

aéreas Sesquiterpenos,

esteróides, derivados da

acetofenona e lactonas

sesquiterpênicas

Bohlmann et al.,

1981a

Trichogonia

villosa

O:éter de petróleo

1:2, v:v

raízes Sesquiterpenos,

derivados da

acetofenona e lactonas

sesquiterpênicas

Bohlmann et al.,

1981a

___________________________________________________________Introdução

O:éter de petróleo

1:2, v:v

aéreas Sesquiterpenos,

diterpenos e lactonas

sesquiterpênicas

Bohlmann et

al., 1984

Trichogonia

gardneri

Hexano:AcOEt 3:1, v:v aéreas Lactonas

sesquiterpênicas

Vichnewski et

al., 1985

Trichogonia

hirtifolia

O:éter de petróleo

1:2, v:v

aéreas Sesquiterpenos,

esteróides, derivados da

acetofenona, derivados

do benzofurano e

lactonas

sesquiterpênicas

Bohlmann et

al., 1984

Trichogonia

santosii

O:éter de petróleo

1:2, v:v

aéreas Sesquiterpenos,

esteróides, derivados da

acetofenona, cromenos,

derivados do

isoeugenol, triterpenos

e lactonas

sesquiterpênicas

Bohlmann et

al., 1984

Conclusivamente o perfil químico encontrado nas espécies de Trichogonia é

expresso pelos sesquiterpenos, lactonas sesquiterpênicas, derivados da acetofenona, esteróides

e triterpenos.

___________________________________________________________Objetivos

2. Objetivos

Tendo em vista a importância do estudo químico e da avaliação biológica de nossa

flora nativa, em especial de Asteraceae, em função de sua representativa participação na

mesma, considerando que o gênero Trichogonia é genuinamente brasileiro e estando bem

representado na família, com apenas oito espécies investigadas quimicamente e que a

Trichogonia menthaefolia Gardner é endêmica do Brasil e nenhum estudo fitoquímico foi

conduzido até o momento com esta espécie, parece justificado o estudo da composição

química da mesma.

Os objetivos do presente estudo são o isolamento e a identificação de componentes

químicos micromoleculares dos extratos diclorometânico e metanólico das partes totais desta

espécie vegetal coletada em seu habitat natural.

___________________________________________________Materiais e métodos

3. Materiais e métodos

3.1. Fases estacionárias para Cromatografia

Para o preparo de colunas cromatográficas clássicas foram utilizados como fases

estacionárias sílica gel 60 específica para colunas, da marca Merck, com tamanho de partícula

62-200 µm, Sephadex LH –20 da marca Sigma, com tamanho de partícula 25-100µ e sílica

gel 60 H, com tamanho de partícula de 63-200 µm. As duas primeiras fases estacionárias

foram utilizadas em CC e a última em CLV.

Para as análises por CG foram utilizadas colunas HP-1 (metilsilicone) e HP-50

(metilfenilsilicone), ambas com (30m x 0,25mm x 0,25mm).

Para o preparo das CCDC foi utilizado sílica 60GF

254

, da marca Merck, com tamanho

de partícula de 5-40 µm em uma camada de 0,25mm aplicada em placas de vidro de 5x20,

10x20 e 20x20 cm.

Para o preparo das CCDP foi utilizado como fase estacionária sílica gel 60 PF

254+366

marca Merck, em uma camada de 1mm aplicada em placas de vidro 20x20 cm.

___________________________________________________Materiais e métodos

3.2. Solventes e Reagentes

Solventes deuterados (CDCl

e DMSO-d

) das marcas Aldrich e Merck foram

utilizados para a obtenção dos espectros de RMN de

H e de

Para o fracionamento dos extratos, foram utilizados os solventes de grau comercial, os

quais foram submetidos à destilação fracionada.

Para revelar as placas cromatográficas, CCDC e CCDP, foi utilizada uma mistura de

anisaldeído/metanol/ácido acético glacial/ácido sulfúrico 1:80:20:5 e luz UV com

comprimento de onda de 254 e 366 nm (lâmpada UVGL-25), respectivamente.

3.3. Instrumentos

Os espectros de RMN

C, PND, DEPT 135

e HMQC foram registrados em

espectrômetro Brucker Avance DRX-400, operando a 400 MHz para o

H e 100MHz para o

Para as análises em CG foi utilizado o equipamento Hewlett Packard 5890 serie 2.

Os espectros de massas foram obtidos em um espectrômetro de massas modelo:

ultrOTOF

-ESI-TOF Mass Spectrometer Bruker Daltonics, Billerica, MA, EUA.

___________________________________________________Materiais e métodos

3.4. Métodos

3.4.1. Metodologia utilizada nas análises por CG

• Coluna capilar HP-50

Temperatura do injetor: 260

Temperatura FID: 330

Temperatura da coluna: Gradiente de temperatura 105

C até 200

C (13

C/mim);

200

C até 240

C (5

C/mim – 20mim); 240

C até 280

C (10

C/mim – 10mim).

Gás de arraste: Hidrogênio com Split 1:50

Velocidade Linear: 45cm/seg a 250

• Coluna capilar HP-1

Temperatura do injetor: 260

Temperatura FID: 330ºC

Temperatura da Coluna: 250

C por 12mim; 250

C até 280

C a 6

C/mim

Gás de Arraste: Hidrogênio com Split 1:50

Velocidade Linear: 46cm

/seg a 250

3.4.2. Metodologia para a obtenção dos espectros massas

Condições do experimento: Bomba de Infusão, Fluxo 180µL/h.

Fase móvel para a solubilização: MeOH:H

O (8:2)

O aparelho é de alta resolução necessitando de calibração interna e externa antes de

serem realizadas as análises. Usa-se para calibração interna uma solução do sal sódico do

___________________________________________________Materiais e métodos

ácido trifluoracético e na calibração externa uma solução de Formiato de Sódio, à 10mM, para

adquirir os espectros em alta resolução.

3.4.3. Metodologia para o preparo das amostras a serem cromatografadas

• no CG

As amostras foram adsorvidas em pequena quantidade de sílica gel 60 e aplicadas em

uma pipeta de Pasteur e eluída com 10mL de hexano e posteriormente com 15mL de

clorofórmio. A solução em hexano é descartada e a solução em clorofórmio é concentrada

para posterior análise no CG, antes da qual é solubizada em clorofórmio.

• nas CC com o uso da fase sólida silicagel 60

As amostras foram adsorvidas em pequena quantidade de sílica 60 e aplicadas no topo

das CC.

• nas CC com o uso da fase sólida Sephadex LH-20

As amostras foram solubilizadas em metanol e centrifugadas por 5 minutos,

posteriormente os precipitados foram retirados e a fase líquida foi aplicada diretamente no

topo das CC.

_____________________________________________Procedimento experimental

4. Procedimento experimental

4.1. Coleta e identificação do material vegetal

O material vegetal (partes totais) foi coletado em seu habitat natural em Furnas - MG

numa estrada de terra a 1 km do mirante da represa, na época da floração em 18/04/1998 pelo

Prof. Dr. Norberto Peporine Lopes, recebendo o n

NPL 130.

Este material vegetal foi identificado como Trichogonia menthaefolia Gardner pelo

taxonomista Dr. José L. Panero, do Departamento de Botânica da Universidade do Texas,

Estados Unidos. Uma exsicata do espécimen (n

SPFR 04958) encontra-se no Herbário do

Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto -

USP.

4.2. Preparação dos extratos brutos

Após ser estabilizada em estufa de ar circulante à temperatura de 40

C, todas as partes

do material coletado foram pulverizadas em moinho de faca.

O pó seco (500g) passou pelo processo de maceração exaustiva, à temperatura

ambiente, com solventes em ordem crescente de polaridade (primeiro diclorometano e depois

metanol). Em seguida, os solventes foram removidos (sobre pressão reduzida), obtendo-se

assim os extratos brutos de média polaridade e de alta polaridade.

_____________________________________________Procedimento experimental

Figura 01: Esquema representativo da obtenção dos extratos brutos do pó de

T. menthaefolia

Planta Total

Pó

500g

Estufa de ar circulante 40

Moinho de faca

Extrato diclorometânico

(72g)

Maceração com CH

a TA

Resíduo

Maceração com Metanol a TA

Extrato metanólico

(18g)

Resíduo

(desprezado)

_____________________________________________Procedimento experimental

4.3. Isolamento e Purificação dos constituintes químicos do extrato em diclorometano

O fracionamento do extrato bruto em diclorometano foi realizado através de uma CLV

utilizando-se 35g do mesmo, em uma coluna de vidro de dimensões compatíveis e 500g de

sílica gel 60. A coluna cromatográfica foi eluída com solventes em ordem crescente de

polaridade, sendo o volume aproximado de cada fração 500ml, exceto a fração 1 onde o

volume de solvente utilizado foi 5L, obtendo-se 144 frações que posteriormente foram

reunidas por CCDC.

Tabela 02: CLV do extrato em diclorometano da Trichogonia menthaefolia

Eluente Frações Código Massa total (g)

Hexano 100% 01 TmD-1 0,24

Hexano/AcOEt 9,5:0,5 02-16 TmD-2 6,42

Hexano/AcOEt 9:1 17-29 TmD-3 1,79

Hexano/AcOEt 8:2 30-43 TmD-4 4,27

Hexano/AcOEt 7:3 44-57 TmD-5 3,86

Hexano/AcOEt 1:1 58-73 TmD-6 4,05

Hexano/AcOEt 3:7 74-84 TmD-7 1,97

Hexano/AcOEt 2:8 85-95 TmD-8 1,23

AcOEt 100% 96-108 TmD-9 2,98

AcOEt/MeOH 9,5:0,5 109-111 TmD-10 0,78

AcOEt/MeOH 9:1 112-122 TmD-11 2,69

AcOEt/MeOH 7:3 123-138 TmD-12 3,48

Etanol 100% 137-144 TmD-13 0,52

_____________________________________________Procedimento experimental

4.3.1. Isolamento dos constituintes químicos das frações obtidas da CLV do extrato em

diclorometano

A escolha de uma fração para submetê-la às separações cromatográficas foi baseada

em três critérios:

Massa da fração: frações cujas massas eram da ordem de unidades de grama ou menor não

foram utilizadas.

Análise dos espectros de RMN

H: a observação das feições espectrais permitiu inferir sobre a

presença ou não de micromoléculas que seriam de interesse ao estudo.

Perfil da amostra em CCDC: se a amostra apresentasse poucos pontos na CCDC ela seria

submetida a uma CCDP, se a fossem vários pontos ela seria submetida a uma CC.

_____________________________________________Procedimento experimental

Figura 02: Fluxograma do trabalho experimental realizado com o extrato diclorometânico de

T. menthaefolia

Extrato

diclorometânico

(35g)

TmD-1

TmD-3

TmD-5

CLV

TmD-6

TmD-10

CCDP

Análise por

Substância

(5mg)

Substância

(6mg)

Mistura de

triterpenos

3, 4, 5, e 6

CCDP

(162mg)

Substância

(12)

(22mg)

Mistura de esteróides

(7, 8, 9, 10 e 11)

(100mg)

_____________________________________________Procedimento experimental

Isolamento dos constituintes químicos da fração TmD-1

A fração TmD-1 (237,1mg) foi submetida a uma CCDP utilizando-se clorofórmio

como fase móvel, onde o sesquiterpeno 6α-Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno (1) (5mg) foi

isolado em Rf: 0,77 apresentando coloração azul frente ao revelador químico.

Isolamento dos constituintes químicos da fração TmD-3

Uma porção da fração TmD-3 (500mg) foi submetida a uma CCDP utilizando-se

clorofórmio como fase móvel, onde o triterpeno 3α-hidroxi-olean-12-eno (2) (6mg) foi

isolada em Rf: 0,8 apresentando coloração azul frente ao revelador químico.

Isolamento dos constituintes químicos da fração TmD-5

A fração TmD-5 (3,86g) tem aparência de um sólido amorfo branco, a partir da qual

os terpenos, β-amirina (3), lupeol (4), taraxasterol (5), pseudotaraxasterol (6) e β-sitosterol

(7), foram identificados em mistura, através das análises do CG de uma pequena quantidade

da fração TmD-5 (10mg). Mais detalhes ver no item 5.3.

Isolamento dos constituintes químicos da fração TmD-6

Uma porção da fração TmD-6 (1,2g) foi submetida a uma CC utilizando-se 150g de

sílica gel como fase estacionária e eluída com solventes em ordem crescente de polaridade,

partindo de 100% de hexano até 100% diclorometano e então metanol:diclorometano 1:1 e

metanol 100%.

_____________________________________________Procedimento experimental

As frações 28 e 29 (162mg) foram reunidas e submetidas a uma CCDP em

Hexano/AcOEt 7:3 fornecendo a mistura dos esteróides β-sitosterol (7), estigmasterol (8),

campesterol (9) (100mg), estigmast-7-en-3β-ol (10) e espinasterol (11) em Rf: 0,32

apresentando absorção intensa na lâmpada de UV nos comprimentos de onda 256 e 366nm.

Esta mistura teve seus constituintes químicos identificados através das análises do CG de

uma pequena quantidade da mistura de esteróides (10mg). Mais detalhes ver no item 5.4.

Tabela 03: CC da fração TmD-6

Frações Fase móvel Volume

1-5 Hexano 100% 400ml

6-11 Hexano/CH

9,5:0,5 550ml

12-15 Hexano/CH

9:1 300ml

16 e17 Hexano/CH

7:3 400ml

18 Hexano/CH

1:1 100ml

19-25 CH

100% 800ml

26 e 27 CH

/Metanol 200ml

28-32 CH

/Metanol 500ml

33 e 34 CH

/Metanol 200ml

35-42 Metanol 100% 700ml

Isolamento dos constituintes químicos da fração TmD-10

Uma porção da fração TmD-10 (532mg) foi submetida a uma CC utilizando-se

Sephadex-LH-20 como fase estacionária e metanol como fase móvel, recolhendo-se frações

de 10mL, num total de 55 frações.

As frações 42-50 forneceram o flavonóide ramnocitrina (12) (25mg) praticamente

puro.

_____________________________________________Procedimento experimental

4.4. Isolamento dos constituintes químicos do extrato metanólico

O extrato metanólico (18,0g) foi dissolvido em 150 mL de metanol, ocorrendo a

completa solubilização do mesmo. Em seguida particionou-se com hexano, por 10 vezes

(200mL cada).

A solução metanólica resultante foi concentrada e a massa obtida foi de 8,0g, sendo

que apenas 3,23g foi submetido a uma CC utilizando-se Sephadex-LH-20 como fase

estacionária e metanol como fase móvel, recolhendo-se 62 frações de 30ml cada.

As frações 43-53 forneceram o flavonóide ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo (13)

(32mg).

Figura 03: fluxograma do trabalho experimental realizado com o extrato metanólico de T.

menthaefolia

-solubilização em metanol

-partição com hexano

Solução metanólica

concentração

Solução hexânica

Fração metanólica (8,0g)

(Sephadex LH-20)

Substância 13

(32,0mg)

Extrato metanólico (18g)

________________________________________________ Identificação estrutural

5. Identificação estrutural

5.1. Identificação estrutural do sesquiterpeno 6α-Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno (1).

O H

-Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno (1)

A substância 6α-Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno, foi identificada pela análise das

informações contidas nos espectros de RMN de

C, PND, DEPT 135

e HMQC (p. 48-

54).

Esta substância já tinha sido isolada das partes aéreas da Ageratum fastigiatum

(Eupatorieae, Asteraceae, Bohlmann et al.,1981b).

Os principais sinais observados no espectro de RMN

H (Figuras 06, 07 e 08, p. 48, 49

e 50) foram:

• dubletos em δ0,91 e δ0,89 ambos integrando para 3H cada e com J 7,1 Hz

referentes aos hidrogênios 12 e 13 do grupamento isopropil;

• o singleto em δ0,77 integrado para 3H indica que a estrutura sesquiterpênica

apresenta um grupo metil;

• os singletos largos em δ4,76 e δ4,54 integrados para 1H cada, referem-se aos

hidrogênios do grupo metileno, H-15a e H-15b;

________________________________________________ Identificação estrutural

• o dubleto largo em δ2,08 integrando para 1H e com valor de J 10,6 Hz, foi

atribuído ao H-5. Este valor de J é típico de acoplamento axial-axial, por sua

vez a posição axial deste hidrogênio define a junção trans do anel em C5;

• o duplo dubleto em δ5,14 integrando para 1H e J 10,4 e 10,1 Hz, foi atribuído

ao H-6. O valor deste δ infere em um hidrogênio oximetínico e os valores de J

são típicos de acoplamento axial-axial. Tais observações definem a posição

axial deste hidrogênio assim como a de seus vizinhos em C5 e C7;

• os hidrogênios do grupo angelato estão bem evidentes, pelo quádruplo

quadrupleto em δ5,93 integrando para 1H e J 7,2 e 1,5 Hz referente ao

hidrogênio na posição 3’, com os duplos quadrupletos em δ1,89 integrando

para 3H e J 7,2 e 1,5 Hz referente aos hidrogênios da metila na posição 4’ e

com o multipleto em δ1,83 integrando para 3H referente aos hidrogênios da

metila na posição 5’;

Tabela 04: Dados de RMN

H da substância 6α-Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno comparados

com os dados da literatura (Bohlmann et al., 1981b)*

Hidrogênio

δ, J e multiplicidade realizado

em 270 MHz (literatura)

δ, J e multiplicidade

(1)

H-3a 2,28; dl; 12,0 2,30; m

H-3b 1,95; m 1,94; m

H-5 2,08; dl; 11,0 2,08; dl; 10,6

H-6 5,15; dd; 11,0 e 10,0 5,14; dd; 10,4 e 10,1

H-11 1,95; m 1,7; m

H-12 0,93; d; 7,0 0,91; d; 7,1

H-13 0,91; d; 7,0 0,89; d; 7,1

H-14 0,79; s 0,77; s

H-15a 4,67; sl 4,76; sl

H-15b 4,54; sl 4,54; sl

H-3´ 5,93; qq; 7,0 e 1,5 5,93; qq; 7,2 e 1,5

H-4´ 1,90; dq; 7,0 e 1,5 1,89; dq; 7,2 e 1,5

H-5´ 1,83; dq; 7,0 e 1,5 1,83; m

* δ em ppm e J em Hz (obtido em CDCl

)

Posteriormente os dados constantes dos espectros de RMN

C (PND e DEPT 135º) e

HMQC (figuras 09, 10, 11 e 12, p. 51, 52, 53 e 54), corroboraram com a proposta estrutural.

________________________________________________ Identificação estrutural

Analisando os espectros de RMN

C (PND e DEPT 135º) podemos observar os

carbonos metilênicos - 1, 2, 8 e 9 - em δ40,21, δ18,30, δ38,08 e δ42,15 respectivamente,

sendo que os hidrogênios destes grupos metilênicos não podem ser observados no espectro de

RMN

H porque os mesmos aparecem na região de δ1,3-1,75. Através dos mapas de contorno

do HMQC foi possível observar correlações importantes, confirmando a atribuição dos

carbonos.

Tabela 05: Dados de RMN obtidos dos espectros de

C (PND e DEPT 135º) e nos mapas de

contorno do HMQC (δ em ppm, CDCl

Carbonos Tipos de

carbonos

Correlações retiradas do

HMQC

C-1 CH

40,21 1,30-1,75

C-2 CH

18,30 1,30-1,75

C-3 CH

24,21 1,94 e 2,30

C-4 C 146,39

C-5 CH 55,98 2,08

C-6 CH 70,92 5,14

C-7 CH 49,51 1,30-1,75

C-8 CH

38,08 1,30-1,75

C-9 CH

42,15 1,30-1,75

C-10 C 38,09

C-11 CH 26,14 1,70

C-12 CH

16,12 0,91

C-13 CH

21,39 0,89

C-14 CH

17,57 0,77

C-15 CH

106,67 4,54 e 4,76

C-1´ C 168,38

C-2´ C 128,71

C-3´ CH 135,69 5,93

C-4´ CH

15,43 1,89

C-5´ CH

20,68 1,82

Os espectros de RMN de

C (PND, DEPT 135º) e os mapas de contorno do

HMQC se encontram no anexo 01.

________________________________________________ Identificação estrutural

5.2. Identificação estrutural do triterpeno 3α-hidroxi-olean-12-eno (2).

29 30

-hidroxi-olean-12-eno (2)

O espectro de RMN

H (Figuras 13 e 14, p. 55 e 56) apresentou uma grande

quantidade de sinais na região de δ1,16-0,86 indicando a presença de substância de natureza

terpênica, sendo que na região de δ1,16-0,86 são observados oito singletos com as mesmas

integrais (δ1,16, δ1,14, δ1,09, δ1,04, δ1,00 δ0,99, δ0,95 e δ0,85), um multipleto em δ5,62

referente a hidrogênio olefinico e um multipleto em δ3,47 referente a hidrogênio oximetínico.

Os dados dos espectros de RMN

C (PND e DEPT 135

) (Figuras 15, 16 e 17, p. 57 e 58 e

59) apontaram para um triterpeno da classe olean-12-eno uma vez que os valores de

deslocamentos químicos para os carbonos C12 e C13 estão entre ~δ122 e ~δ145 e são

observados oito metilas, dez carbonos secundários, cinco carbonos terciários e sete carbonos

quaternários. O valor do deslocamento químico do carbono C3 (δ76,37) indica que este tem

uma hidroxila ligada em α (Mahato et al., 1994).

Posteriormente a amostra foi submetida a uma análise por CG em uma coluna HP-1,

adicionando à amostra padrões de triterpenos. A análise por CG mostrou que o mesmo

apresenta Tr (com relação ao colesterol) muito próximo ao da β-amirina, sendo o Tr da

amostra 1,317 e o da β-amirina 1,420.

________________________________________________ Identificação estrutural

Uma vez que os deslocamentos químicos de RMN

C e o Tr da substância em análise

são muito parecidos com os da β-amirina, concluímos tratar-se de um epímero da β-amirina,

ou seja com a hidroxila em C3 na posição axial (α). No intuito de descobrir a influência dos

deslocamentos químicos, quando a hidroxila esta em axial ou equatorial (α ou β),

comparamos os valores de RMN

C das substâncias A e B que também são da família olean-

12-eno e diferem entre si apenas na posição da hidroxila.

55,5

48,8

78,8

76,4

15,7

22,1

40,2

27,8

36,9

18,3

33,5

37,3

38,8

23,0

122,1

143,8

56,1

23,3

27,3

32,9

36,8

34,3

30,9

44,0

47,5

28,3

16,4

18,1

28,2

176,1

33,2

23,5

36,7

27,6

39,9

36,7

18,0

30,9

36,7

48,8

49,2

23,0

125,5

137,5

56,0

22,1

26,2

32,9

36,2

34,2

31,0

44,2

47,0

15,8

18,0

28,2

179,0

28,2

32,9

23,6

Comparando os valores de RMN de

C (Mahato et al., 1994) das substâncias A e B

podemos observar que os carbonos C3, C5 e C24 são os que sofrem maior influência, com a

alteração da estereoquímica da hidroxila na posição 3. Feito esta observação e estendendo esta

comparação entre a β-amirina e a substância 2, podemos concluir que as duas substâncias são

idênticas diferindo uma da outra apenas pela posição da hidroxila em C3.

________________________________________________ Identificação estrutural

A título de comparação os valores de RMN de

C da substância 2 e da β-amirina estão

apresentados na tabela 06.

Tabela 06: Dados de RMN

C (δ em ppm, CDCl

) do triterpeno 3α-hidroxi-olean-12-eno

comparados com os valores da β-amirina (Mahato et al, 1994).

Carbonos 3α-hidroxi-olean-12-eno β-amirina

1 35,06 28,7

2 29,70 27,3

3 76,37 79,0

4 39,28 38,8

5 49,66 55,3

6 18,21 18,5

7 30,34 32,8

8 39,28 38,8

9 43,04 47,7

10 37,82 37,7

11 23,63 23,6

12 122,09 121,8

13 141,57 145,5

14 40,81 41,8

15 27,80 26.2

16 27,00 27.0

17 34,60 32,5

18 47,41 47,4

19 não observado 46,9

20 30,08 31,1

21 34,83 34,8

22 36,01 37,2

23 28,94 28,8

24 19,62 15,5

25 18,42 15,6

26 16,21 16,9

27 25,45 26,6

28 32,40 28,4

29 34,52 33,3

30 25,45 23,7

Os espectros de RMN de

H e de

C (PND e DEPT 135º) se encontram no anexo 02.

________________________________________________ Identificação estrutural

5.3. Identificação estrutural da mistura de triterpenos presentes na fração TmD-5 (3, 4, 5 e 6)

lupeol (4)

-amirina (3)

taraxasterol (5)

pseudotaraxasterol (6)

A fração TmD-5 apresentou em seu espectro de RMN

H (Figura 20, p. 62) uma

grande quantidade de sinais entre δ0,76 e δ1,07, referente a grupos metílicos e um multipleto

entre δ3,17 e δ3,25 referente aos hidrogênios hidroximetínicos, sendo que todos os triterpenos

identificados na fração TmD-5 - após análise do CG - tem em comum uma hidroxila em β na

posição 3. Quanto aos hidrogênios olefinicos também são observados, aparecendo como

multipletos em δ4,62 e δ4,60.

No espectro de RMN

C (Figura 21, p.63) também há evidências da presença de

triterpenos devido a grande quantidade de sinais entre δ35,0-14,0 referentes a grupos

metílicos e o sinal em δ79,07 referente a carbono contendo uma hidroxila ligada na posição β,

como é típico da grande maioria dos triterpenos.

A análise do espectro de RMN

C na região dos carbonos olefinicos foi de grande

importância para a identificação dos triterpenos, uma vez que estes são bem evidentes neste

________________________________________________ Identificação estrutural

espectro, com os sinais: δ121,7 (C12) e δ145,2 (C13) (β-amirina); δ151,0 (C20) e δ109,3

(C29) (lupeol); δ139,2 (C20) e δ119,4 (C21) (pseudotaraxasterol) e δ154,6 (C20) e δ107,1

(C30) (taraxasterol) (Olea & Roque, 1990, Mahato et al., 1994).

A título de ilustração todos os valores de RMN

C dos triterpenos identificados em

mistura na fração TmD-5 assim como os respectivos valores da literatura seguem nas tabelas

7 e 8.

Tabela 07: Dados do espectro de RMN de

C (δ em ppm, CDCl

) para β-amirina e lupeol

comparados com os dados da literatura (Mahato et al., 1994).

Carbonos β-amirina lupeol

literatura experimental literatura experimental

1 28,7 29,4 38,7 38,9

2 27,3 27,4 27,4 27,4

3 79,0 79.0 78,9 79.0

4 38,8 39,0 38,8 38,8

5 55,3 55,4 55,3 55,4

6 18,5 18,2 18,3 18,2

7 32,8 32,8 34,2 34,5

8 38,8 39,3 40,8 40,9

9 47,7 48,6 50,4 50,4

10 37,7 38,7 37,1 38,7

11 23,6 22,6 20,9 22,6

12 121,8 121,7 25,1 28,0

13 145,5 145,2 38,8 40,9

14 41,8 42,0 42,8 50,4

15 26.2 26,2 27,4 27,4

16 27.0 27,4 35,5 34,5

17 32,5 31,9 43,0 38,9

18 47,4 47,2 48,8 48,7

19 46,9 46,8 47,9 46,8

20 31,1 31,9 150,9 151,0

21 34,8 34,5 29,8 29,4

22 37,2 37,1 40,0 39,3

23 28,8 29,4 28,8 29,4

24 15,5 15,4 15,4 15,4

25 15,6 15,4 16,1 16,3

26 16,9 16,3 15,9 16,3

27 26,6 26,7 14,5 14,1

28 28,4 28,0 18,0 18,3

29 33,3 34,0 109,3 109,3

30 23,7 23,7 19,3 19,5

________________________________________________ Identificação estrutural

Tabela 08: Dados do espectro de RMN de

C (δ em ppm, CDCl

) para pseudotaraxasterol e

taraxasterol comparados com os dados da literatura (Mahato et al., 1994)

Carbonos pseudotaraxasterol taraxasterol

literatura experimental literatura experimental

1 38,8 38,9 38,8 38,8

2 27,4 27,4 27,4 27,8

3 79,0 79,6 79,0 79,0

4 38,8 38,8 38,8 38,8

5 55,3 55,4 55,4 55,4

6 18,3 18,2 18,3 18,2

7 34,3 34,5 34,1 34,5

8 41,1 41,0 40,9 41,0

9 50,4 50,5 50,5 50,5

10 37,1 38,7 37,1 38,7

11 21,6 22,6 21,4 22,6

12 27,6 28,0 26,6 26,7

13 39,2 38,2 39,2 39,4

14 42,3 42,0 42,0 42,0

15 27,0 27,4 26,6 27,4

16 36,6 37,1 38,3 38,8

17 34,4 34,5 34,5 34,5

18 48,8 48,7 48,7 48,7

19 36,6 42,0 39,4 39,3

20 138,8 139,2 154,6 154,6

21 118,9 119,2 25,6 25,6

22 42,2 42,0 38,9 38,9

23 28,8 29,4 28,8 29,4

24 15,4 15,4 15,4 15,4

25 16,3 16,3 16,8 16,4

26 16,1 16,3 15,9 16,3

27 14,8 15,3 14,8 15,3

28 17,7 18,3 19,5 19,5

29 22,5 22,7 25,5 25,5

30 21,7 21,5 107,7 107,1

Convém destacar que o sinal de C21 do pseudotaraxasterol não pode ser observado no

espectro de DEPT 135

(Figura 22, p. 64), pelo fato da concentração do pseudotaraxasterol

em TmD-5 ser muito menor do que a concentração dos demais triterpenos.

A confirmação dos triterpenos presentes em TmD-5 foi feita por CG, através de

análises nas colunas HP-1 e HP-50. As análises foram feitas comparando os tempos de

retenções relativos dos picos presentes na mistura de triterpenos com os tempos de retenção

relativo de padrões autênticos. Através destas comparações foi possível confirmar a presença

________________________________________________ Identificação estrutural

dos terpenos β-amirina (3), lupeol (4), taraxasterol (5), pseudotaraxasterol (6) e β-sitosterol

(7), sendo que os dados referentes às análises por CG (Figuras 18 e 19 - p. 60 e 61) nas

colunas HP-50 e HP-1 se encontram nas tabelas 9 e 10.

Tabela 09: Identificação das substâncias presentes em TmD-5 (Coluna HP-50)

Compostos Tempo de retenção

(mistura de

triterpenos)

Tempo de retenção

relativo*(mistura

de triterpenos)

Tempo de

retenção relativo

(Padrões)

β-amirina 27,953 1,315 1,315

lupeol 30,456 1,432 1,432

pseudotaraxasterol 34,159 1,606 1,605

taraxasterol 34,843 1,639 1,638

β-sitosterol 25,420 1,195 1,193

*com relação ao colesterol 21,262

Tabela 10: Identificação das substâncias presentes em TmD-5 (Coluna HP-1)

Compostos Tempo de retenção

(mistura de

triterpenos)

Tempo de retenção

relativo*(mistura

de triterpenos)

Tempo de

retenção relativo

(Padrões)

β-amirina 16,543 1,269 1,295

lupeol 18,689 1,351 1,351

pseudotaraxasterol 20,555 1,486 1,484

taraxasterol 20,555 1,486 1,486

β-sitosterol 16,543 1,269 1,270

*com relação ao colesterol 13,826

Os espectros de RMN de

C (PND e DEPT 135º) e os cromatogramas se

encontram no anexo 03.

________________________________________________ Identificação estrutural

5.4. Identificação estrutural da mistura de esteróides (7, 8, 9, 10 e 11)

H H

-sitosterol (7)

estigmasterol (8)

campesterol (9)

estigmast-7-en-3

-ol (10)

espinasterol (11)

O espectro de RMN

H (Figuras 28 e 29, p. 68 e 69) da mistura em análise apresenta

vários sinais entre δ0,7 e δ1,0 correspondendo a grupos metílicos, vários sinais entre δ1,0 e

δ2,0 que podem ser atribuídos a grupos metilênicos, um multipleto em δ3,5 (H-3) referente à

hidrogênios hidroximetínicos, dois duplos dubletos em δ5,0 (H23) e δ5,1 (H22) com J 15 e

8,5Hz e um multipleto em δ5,35 referente a hidrogênios olefinicos. Todos esses sinais no

RMN evidenciam a presença de fitoesteróides (Kojima et al., 1990).

Na literatura (Kojima et al., 1990) os autores descrevem os hidrogênios olefinicos (H-

6) do β-sitosterol (7) e do estigmasterol (8) como um multipleto em δ5,35 e os hidrogênios

hidroximetínicos (H-3) como um multipleto em δ3,53. Por sua vez os hidrogênios olefinicos

________________________________________________ Identificação estrutural

(H-7) do estigmast-7-en-3β-ol (10) e do espinasterol (11) são descritos como multipletos em

δ5,16 e δ5,15 respectivamente e os hidrogênios hidroximetínicos como multipletos em δ3,60

e δ3,59 respectivamente.

No espectro de RMN

C (Figuras 30 e 31, p. 70 e 71) a presença de esteróides

também é averiguada devido aos sinais:

• δ140,8 e δ121,7: C5 e C6 do β-sitosterol (7);

• δ140,7, δ121,7, δ138,3 e δ129,2: C5, C6, C22 e C23 do estigmasterol (8);

• δ138,3 δ117,5: C7 e C8 do estigmast-7-en-3β-ol (10);

• δ117,5, δ138,3, δ138,6 e δ129,3: C7, C8, C22 e C23 do espinasterol (11);

Estes fitoesteróides tem em comum uma hidroxila em β na posição 3, sendo que os C3

do β-sitosterol (7) e do estigmasterol (8) aparecem em δ71,8 e os C3 do estigmast-7-en-3β-ol

(10) e do espinasterol (11) em δ71,0 (Kojima et al., 1990). Convém destacar que o sinal

referente ao carbono C3 dos esteróides estigmast-7-en-3β-ol e espinasterol não pode ser

observado no PND, sendo observado apenas no espectro de DEPT 135

com intensidade

muito menor que o sinal δ71,8 (veja Figura 31, p.71).

A presença de campesterol (9) não foi evidenciada por RMN

H e

C uma vez que

esta substância tem seus deslocamentos químicos referentes aos carbonos da ligação dupla

idênticos aos do β-sitosterol (7) (o contrário também poderia ser dito).

A título de ilustração todos os valores de RMN

C dos esteróides identificados em

mistura assim como os valores da literatura seguem nas tabelas 11 e 12.

________________________________________________ Identificação estrutural

Tabela 11: Resultados experimentais de RMN de

C (δ em ppm, CDCl

) para os esteróides

β-sitosterol e estigmasterol comparados com a literatura (Kojima et al., 1990).

Carbonos β-sitosterol estigmasterol

literatura experimental literatura experimental

1 37,2 37,3 37,2 37,3

2 31,6 31,9 31,6 31,9

3 71,8 71,8 71,8 71,8

4 42,3 42,3 42,3 42,3

5 140,7 140,8 140,7 140,7

6 121,7 121,7 121,7 121,7

7 31,9 31,9 31,9 31,9

8 31,9 31,9 31,9 31,9

9 50,1 50,2 50,1 50,2

10 36,6 36,5 36,6 36,5

11 21,1 21,1 21,1 21,1

12 39,9 40,5 39,7 40,5

13 42,3 42,3 42,2 42,2

14 56,6 56,9 56,6 56,9

15 24,3 24,4 24,4 24,4

16 28,8 28,9 28,9 28.9

17 56,0 56,0 55,9 56,0

18 11,9 12,1 12,0 12,1

19 19,4 19,4 19,4 19,4

20 36,1 36,5 40,5 40,5

21 18,8 19,0 21,2 21,2

22 33,9 31,9 138,3 138,3

23 26,6 25,4 129,2 129,3

24 45,5 42,3 51,2 51,2

25 29,1 28,9 31,9 31,7

26 19,9 21,1 21,1 21,1

27 19,0 19,4 19,0 19,4

28 23 24,4 25,4 25,4

29 12,0 12,1 12,3 12,3

________________________________________________ Identificação estrutural

Tabela 12: Resultados experimentais de RMN de

C (δ em ppm, CDCl

) para os esteróides

estigmast-7-en-3β-ol e espinasterol comparados com a literatura (Kojima et al., 1990).

Carbonos estigmast-7-en-3β-ol espinasterol

literatura experimental literatura experimental

1 37,1 37,3 37,1 37,3

2 31,4 31,7 31,4 31,7

3 71,0 71,1 71,0 71,1

4 37,9 37,3 38,0 37,3

5 40,2 40,5 40,2 40,5

6 29,6 28,9 29,6 28,9

7 117,4 117,5 117,4 117,5

8 139,6 138,3 139,5 138,3

9 49,4 50,1 49,4 50,1

10 34,4 36,6 34,4 36,6

11 21,5 21,2 21,5 21,2

12 39,5 40,5 39,4 40,5

13 43,4 42,3 43,3 42,3

14 55,0 56,0 55,1 56,0

15 23,0 23,0 23,0 23,0

16 27,9 28,3 28,5 28,3

17 56,0 56,0 55,8 56,0

18 11,8 12,1 12,0 12,1

19 13,0 12,3 13,0 12,3

20 36,6 36,5 40,8 40,5

21 18,9 19 21,4 21,1

22 33,8 31,9 138,8 138,3

23 26,1 25,4 129,4 129,3

24 45,8 42,3 51,2 51,2

25 29,1 28,9 31,9 31,9

26 19,8 21,1 21,1 21,1

27 19,0 19,4 19,4 19,4

28 22,9 21,2 25,4 25,4

29 11,9 12,1 12,3 12,3

Deve ser destacado que sendo as estruturas destes esteróides muito semelhantes, a

identificação dos mesmos em mistura utilizando-se apenas métodos físicos não seria possível,

desta forma a composição da mistura de esteróides foi confirmada pelas análises em CG

(Figuras 23, 24, 25 e 26 e 27, p. 65, 66 e 67) feitas nas colunas HP-50 e HP-1 utilizando-se os

tempos de retenções relativos e o método de enriquecimento com padrões. Nas tabelas 13 e 14

seguem as informações contidas nos cromatogramas.

________________________________________________ Identificação estrutural

Tabela 13: Identificação da mistura de esteróides (coluna HP-50).

Compostos Tempo de

retenção

(minutos)

Tempo de

retenção

relativo*

Padrões Mistura de

esteróides

Padrões* Mistura de

esteróides**

campesterol 24,101 24,052 1,105 1,106

estigmasterol 24,805 24,733 1,137 1,139

β-sitosterol 26,173 26,092 1,200 1,200

estigmast-7-en-3β-

26,698 26,637 1,224 1,224

espinasterol 28,146 28,046 1,291 1,291

*com relação ao colesterol 21,805

**com relação ao colesterol 21,744

Tabela 14: Identificação da mistura de esteróides (coluna HP-1)

Compostos Tempo de

retenção

(minutos)

Tempo de

retenção

relativo

Padrões Mistura de

esteróides

Padrões* Mistura de

esteróides**

campesterol 16,098 15,925 1,162 1,158

estigmasterol 16,726 16,565 1,207 1,205

β-sitosterol 17,465 17,362 1,260 1,263

estigmast-7-en-3β-

17,723 17,525 1,279 1,275

espinasterol 18,607 18,427 1,343 1,340

*com relação ao colesterol 13,855

**com relação ao colesterol 13,750

Os espectros de RMN de

C, (PND e DEPT 135º) e cromatogramas se encontram

no anexo 04.

________________________________________________ Identificação estrutural

5.5. Identificação estrutural do flavonóide ramnocitrina (12)

OOH

ramnocitrina (12)

Os sinais presentes no espectro de RMN

H da amostra em análise (Figuras 32 e 33 p.

72 e 73) indicam a presença de flavonóide, uma vez que são observados hidrogênios

aromáticos (δ8,2-6,3) e fenólicos (δ12,5-9,5). Os sinais que caracterizam o flavonóide em

análise são: dubletos em δ8,09 e δ6,94 com J 9Hz típicos de acoplamento orto no anel B

integrando para dois hidrogênios cada, os dubletos em δ6,75 e δ6,35 com J 2Hz, típico de

acoplamento meta no anel A integrando para um hidrogênio cada e o singleto em δ3,86

integrando para 3 hidrogênios o que indica a presença de uma metoxila, no entanto a

localização da mesma não pode ser feita por simples análise deste espectro, podendo estar nas

posições 3, 7 ou 4’.

A comparação entre os valores obtidos de RMN

H e

C (Figuras 32, 33, 34 e 35, p.

72-75) com os valores da literatura para o flavonóide ramnocitrina apresentam ótima

concordância, como prova disto os valores experimentais e da literatura estão apresentados

nas tabelas 15 e 16.

________________________________________________ Identificação estrutural

Tabela 15: Dados do espectro de RMN

H do flavonóide ramnocitrina comparados com a

literatura ( Barberá et al., 1986) e (Harborne,1995)*

Hidrogênios δ, J e multiplicidade

realizado em 200.13 MHz

(Barberá et al., 1986)

δ, J e multiplicidade

(Harborne et al.,

1995)

δ, J e

multiplicidade

(12)

6 6,34; (2,2); d 6,39; (2,1); d 6,35; (2,0); d

8 6,73; (2,2); d 6,75; (2,1); d 6,75; (2,0); d

2’ 8,07; (8,8); d 8,10; (8,9); d 8,09; (9,0); d

3’ 6,93; (8,8); d 6,89; (8,9); d 6,94; (9,0); d

5’ 6,93; (8,8); d 6,89; (8,9); d 6,94; (9,0); d

6’ 8,07; (8,8); d 8,10; (8,9); d 8,09; (9,0); d

OMe 3,85; s ------------- 3,86; s

5-OH 12,60; sl ------------- 12,48; sl

* δ em ppm e J em Hz (obtidos em DMSO-d

)

Tabela 16: Dados do espectro de RMN

C (δ em ppm, DMSO-d

) do flavonóide

ramnocitrina comparados com a literatura (Agrawal et al., 1989)

Carbonos Tipos de carbonos δ experimental

(12)

δ literatura (Agrawal

et al., 1989)

C-2 C 147,6 147,2

C-3 C 136,3 135,9

C-4 C 176,4 176,0

C-5 C 160,7 160,3

C-6 C-H 97,9 97,4

C-7 C 165,2 164,9

C-8 C-H 92,4 92,1

C-9 C 156,4 156,1

C-10 C 104,4 104,0

C-1’ C 121,9 121,0

C-2’ C-H 129,9 129,4

C-3’ C-H 115,8 115,4

C-4’ C 159,7 159,3

C-5’ C-H 115,8 115,4

C-6’ C-H 129,9 129,4

Embora os dados de RMN

H e

C sejam suficientes para confirmar o flavonóide

ramnocitrina, também foi o espectro de massas no modo negativo e EM-EM no modo

positivo (Figuras 36 e 38 – p. 76 e 78), onde os picos do íon molecular são condizentes com a

ramnocitrina [M-H] 299,0559 e [M+H] 301,0799, respectivamente.

A espectrometria de massas também auxiliou na confirmação da posição da metoxila,

feita por EM-EM no modo positivo (Figura 38, p. 78) onde a presença dos fragmentos m/z

________________________________________________ Identificação estrutural

121,0347, m/z 179,0430, m/z 167,0412 e m/z 151,0450, confirmam a posição da metoxila em

C-7 (estes fragmentos se encontram propostos na Figura 04). Deve ser destacado que a

utilização de EM-EM no modo positivo na determinação da posição de metoxilas no

esqueleto de flavonóides é descrita por March e Miao (2004).

A ramnocitrina também foi submetida à EM-EM (Figura 37, p. 77) no modo negativo,

mas os fragmentos presentes no espectro não foram conclusivos na determinação da posição

da metoxila.

Figura 04: Proposta de fragmentação da ramnocitrina no modo positivo que confirma a

metoxila em C7 (March & Miao., 2004).

121

179

133

167

151

Os espectros de RMN de

C (PND e DEPT 135º) e de EM se encontram no anexo

05.

________________________________________________ Identificação estrutural

5.6. Identificação estrutural do flavonóide ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo (13).

OOH

1''

2''

3''

4''

5''

6''

ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo (13)

O flavonóide ramnocitrina já tinha sido isolado e identificado no estudo do extrato de

média polaridade (diclorometano), a comparação direta dos espectros de RMN

H (Figuras 32

e 33, p. 72 e 73) do flavonóide ramnocitrina com o espectro (Figuras 39 e 40, p. 79 e 80) da

sua versão glicosilada levaram a entender que de fato os esqueletos carbônicos eram os

mesmos (veja os dados na tabela 17) e o dubleto em δ5,43 de J 7,6Hz indica que o açúcar

presente é a β-D-galactopiranose.

De acordo com Barberá et al, (1986) quando um flavonóide é glicosilado na posição 3

ocorre uma alteração nos deslocamentos químicos dos hidrogênios 2’ e 6’, no entanto estas

alterações não são previsíveis e geralmente levam a equívocos, mas por sua vez quando um

flavonóide é glicosilado na posição 4’ ocorre uma desblindagem dos hidrogênios 3’ e 5’ em

torno de 0,3 ppm. Uma vez que o glicosídeo só pode estar nas posições 3 e 4’ e não é

observada nenhuma desblindagem em torno de 0,3 ppm nos hidrogênios 3’ e 5’ em relação a

ramnocitrina podemos concluir que o açúcar está na posição 3.

A título de comparação os valores de RMN

H da ramnocitrina 3-O-β-

galactopiranosídeo são comparados com os valores da literatura (Barberá et al., 1986) e

apresentados na tabela 18.

________________________________________________ Identificação estrutural

Tabela 17: Dados do espectro de RMN

H do flavonóide ramnocitrina comparados com os da

ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo*

Hidrogênios δ, J e multiplicidade da

ramnocitrina (12)

δ, J e multiplicidade da ramnocitrina

3-O-β-galactopiranosídeo (13)

6 6,35; (2,0), d 6,39; (2,2), d

8 6,75; (2,0), d 6,75; (2,2), d

2’ 8,09; (9,0), d 8,12; (9,0), d

3’ 6,94; (9,0), d 6,88; (9,0), d

5’ 6,94; (9,0), d 6,88; (9,0), d

6’ 8,09; (9,0), d 8,12; (9,0), d

OMe 3,86; s 3,87; s

5-OH 12,48; sl 12,66, sl

* δ em ppm e J em Hz (obtidos em DMSO-d

)

Tabela 18: Valores de RMN

H do flavonóide ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo

comparados com os valores da literatura (Barberá et al., 1986)*

Hidrogênio

δ, J e multiplicidade da

literatura

δ, J e multiplicidade (13)

6 6,37; (2,1), d 6,39; (2,2), d

8 6,74; (2,1), d 6,75; (2,2), d

2’ e 6’ 8,09; (8,9), d 8,12; (9,0), d

3’ e 5’ 6,88; (8,9), d 6,88; (9,0), d

OMe 3,86; s 3,87; s

5-OH 12,60 sl 12,66, sl

H’’-1 5,40; (7,5), d 5,43; (7,6), d

* δ em ppm e J em Hz (obtidos em DMSO-d

)

A ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo também foi submetida a EM no modo

negativo (figuras 41, p. 81) onde o fragmento [M-H] m/z 461,1054 confirma a estrutura

proposta. Por sua vez o espectro de EM-EM no modo negativo (Figura 42, p. 82) não foi

conclusivo na determinação da posição do açúcar, mas ajudou a confirmar a estrutura

proposta. Os fragmentos que ajudaram na confirmação da estrutura são: m/z 298,0461,

referente à perda do açúcar e m/z 283,0239, referente à perda da metila do fragmento anterior.

Todos os fragmentos observados no espectro de EM-EM no modo negativo estão descritos na

figura 05 de acordo com March et al (2006).

________________________________________________ Identificação estrutural

Figura 05: Propostas de fragmentação para a ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo (13)

(March et al., 2006).

OOH

m/z 255

m/z 227

m/z 298

m/z 461

m/z 283

Os espectros de RMN de

H, EM e EM-EM no modo negativo se encontram no anexo

06.

__________________________________________________________Conclusões

6. Conclusões

A meta principal deste trabalho era traçar um perfil fitoquímico de Trichogonia

menthaefolia Gardner, com base no isolamento e identificação dos componentes químicos

micromoleculares dos extratos diclorometânico e metanólico das partes totais desta espécie

vegetal. Neste sentido foram isolados e identificados os compostos:

A partir do extrato diclorometânico:

- 6α-angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno (1);

- 3α-hidroxi-olean-12-eno (2);

- β-amirina (3), lupeol (4), taraxasterol (5) e pseudotaraxasterol (6) - identificados em mistura;

- β-sitosterol (7) estigmasterol (8), campesterol (9), estigmast-7-em-3β-ol (10) e espinasterol

(11) - identificados em mistura;

- ramnocitrina (12).

A partir do extrato metanólico:

- ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo (13).

Comparando o perfil fitoquímico das espécies já estudadas por (Bohlmann et al.,

1981a), (Bohlmann et al., 1984), (Baruah et al., 1985) e (Vichnewski et al., 1985) com os

resultados obtidos para a Trichogonia menthaefolia, objeto deste estudo, podemos concluir:

Dentre as espécies estudadas e já relatadas na literatura todas apresentaram lactonas

sesquiterpênicas, sendo que neste trabalho nenhuma lactona sesquiterpênica foi encontrada,

isto não quer dizer que a Trichogonia menthaefolia não tenha lactonas sesquiterpênicas, uma

maneira de confirmar se a planta tem esta classe química é fazer uma percolação com

diclorometano das folhas e realizar um estudo deste extrato, o que facilitaria o isolamento das

mesmas uma vez que as lactonas sesquiterpênicas estarão presentes em maior quantidade no

__________________________________________________________Conclusões

extrato, sendo que este procedimento não foi realizado no presente trabalho por falta de

material vegetal.

Os triterpenos, os esteróides e os sesquiterpenos são comuns nas espécies de

Trichogonia e em membros da família Asteraceae, devendo ser destacado que:

Os triterpenos taraxasterol, acetato de taraxasterol e acetato de lupeol já foram

identificados na T. prancii por sua vez o acetato de taraxasterol se mostrou bem comum no

gênero sendo identificado também nas espécies T. scottmorii, T. salviaefolia e T. villosa

(Bohlmann et al., 1981a). Os triterpenos pseudotaraxasterol, lupeol, 3β-hidroxi-olean-12-eno

e 3α-hidroxi-olean-12-eno foram identificados pela primeira vez no gênero.

A presença de sesquiterpenos são comuns nas espécies de Trichogonia, mas o 6α-

angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno é o primeiro sesquiterpeno com esqueleto do tipo eudesmano a

ser relatado no gênero.

Os esteróides β-sitosterol e estigmasterol já foram encontrados em T. hirtifolia e o

estigmasterol na T. santosii (Bohlmann et al., 1984), sendo que os esteróides campesterol,

estigmast-7-em-3β-ol e espinasterol estão sendo identificados pela primeira vez no gênero.

A presença de flavonóides, glicosilados ou não, ainda não havia sido relatada em

Trichogonia provavelmente em virtude dos estudos químicos, presentes na literatura, terem

sido realizados somente com extratos de baixa polaridade. O estudo das últimas frações da

CLV do extrato diclorometânico e do extrato metanólico permitiu a identificação dos

flavonóides ramnocitrina e ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo respectivamente.

______________________________________________ Referências bibliográficas

7. Referências bibliográficas

Agrawal, P. K. Carbon-13 NMR of Flavonoids. Elsevier, p. 152, 1989.

Barberá, O.; Sanz, J. F.; Sánches-Parareda, J.; Marco J. A. Further Flavonol Glycosides from

Anthyllis Onobrychioides. Phytochemistry, v.25, p.2361-2365, 1986

Barreiro, E. J.; Fraga, C. A. M.; Araújo Jr, J. X. O uso de matérias-primas vegetais para

síntese de fármacos. In: Simões, C. M. O.; Schenkel, E. P.; Gosmann, G.; Mello, J. C. P.;

Mentz, L. A.; Petrovick, P. R. Farmacognosia da Planta ao Medicamento. 4ª. edição,

Editora da UFSC, 149-164. 1999.

Baruah, N. R.; Zdero, C.; Bohlmann, F.; King, R. M.; Robison, H. Some Sesqui- and

Diterpenes from the Tribe Eupatorieae. Phytochemistry, v.24, p.2641-2644, 1985.

Bohlmann, F.; Zdero, C.; Pickard, J.; Robinson, H.; King, R. M. New Types of Sesquiterpene

Lactones and Other Constituents from Trichogonia Species. Phytochemistry, v. 20, p.1323-

1333, 1981a.

Bohlmann, F.; Ahmed, M.; King, R. M., Robinson, H. Labdane and Eudesmane Derivates

from Ageratum Fastigiatum. Phytochemistry, v. 20, p. 1434-1435, 1981b.

Bohlmann, F.; Zdero, C.; Jakupovic, J.; Gerke, T.; Wallmeyer, M.; King, R. M.; Robinson, H.

Neue Sesquiterpenlactone und Rosan-Derivate aus Trichogonia-Arten. Liebigs Ann. Chem,

v.1, p.162-185, 1984.

Bremer, K. Asteraceae & Classification. Timber Press, p.13, 40, 1994.

Cordell, A. G. Changing Strategies in Natural Products Chemistry. Phytochemistry, v.40, p.

1585-1612, 1995.

Cordell, A. G. Biodiversity and Drug Discovery – A Symbiotic Relationship.

Phytochemistry, v. 55, p. 462-480, 2000.

Filho, V. C. & Yunes, R. A. Estudo Químico de Plantas Medicinais Orientado para a Análise

Biológica. Obtenção, Determinação e Modificação Estrutural de Compostos Bioativos. In:

Yunes, R. A & Calixto, J. B. Plantas Medicinais sob a Ótica da Química Medicinal Argos

- Editoras Universitárias, p. 18-42, 2001.

______________________________________________ Referências bibliográficas

Harborne J. B. The Flavonoids. Chapman & Hall, p. 453, 1995.

King, R. M & Robinson, H. The genera of the Eupatorieae (Asteraceae). 21. Monographs

in Systematic Botany, p.1-30, 84-136, 1987.

Kojima, H.; Sato, N.; Hatano, A. Sterol Glucosides from Prunella Vulgaris Phytochemistry,

v.29, p. 2351-2355, 1990.

Mahato, S. B. & Kundu, A. P.

C NMR Spectra of Pentacyclic Triterpenoids—A

Compilation and Some Salient Features. Phytochemistry, v.37, p.1517-1575, 1994.

March, R. E. & Miao, Xiu-Sheng. A Fragmentation Study of Kaempferol Using Electrospray

Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry at High Mass Resolution. International

Journal of Mass Spectrometry. v.231, p. 157-167, 2004.

March, R. E.; Lewars, E. G.; Stadey, C. J.; Miao Xiu-Sheng; Zhao, X.; Metcalfe, C. D. A

Comparison of Flavonoid Glycosides by Electrospray Tandem Mass Spectrometry.

International Journal of Mass Spectrometry, v.248, p.61–85, 2006.

Olea, R. S. G. & Roque, F. N. Análise de Misturas de Triterpenos por RMN de

C, Química

Nova, v.13, p. 278-281, 1990.

Phillipson, J. D. Phytochemistry and Medical Plants. Phytochemistry. v.56, p. 237-243, 2001

Vichnewski, W.; Kulanthaivel, P.; Goedken, V. L.; Herz, W. Two Sesquiterpene Lactones

from Trichogonia Gardneri. Phytochemistry, v. 24, p. 291-296, 1985.

Viegas, C. Jr.; Bolzani, V. S.; Barreiro, E. J. Os Produtos Naturais e a Química Medicinal

Moderna. Química Nova, v.28, p.326-337, 2006.

_______________________________________________________________ Anexos

Anexo 01: Figuras 06, 07, 08, 09, 10, 11 e 12

0.9423

1.0000

1.0193

0.9774

0.9807

3.0835

2.7719

3.0004

3.0929

3.0104

2.0943

2.0678

1.9030

1.8986

1.8847

1.8809

1.8292

1.8254

1.8216

0.9181

0.9080

0.9004

0.8910

0.7779

(ppm)

0.81.21.62.02.42.83.23.64.04.44.85.25.66.0

0.9423

1.0000

1.0193

0.9774

Integral

5.9337

5.9267

5.9230

5.9192

5.9160

5.9053

5.9015

5.1716

5.1457

5.1205

4.7537

4.7511

4.5377

4.5358

(ppm)

4.44.64.85.05.25.45.65.86.0

Figura 06: Espectro de RMN

H (δ em ppm, CDCl

e 400MHz) do sesquiterpeno 6α-

Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno (1)

_______________________________________________________________ Anexos

1.0000

Integral

5.9589

5.9552

5.9514

5.9444

5.9406

5.9375

5.9337

5.9267

5.9230

5.9192

5.9160

5.9084

5.9053

5.9015

(ppm)

5.805.825.845.865.885.905.925.945.965.986.006.026.04

Integral

(ppm)

1.161.201.241.281.321.361.401.441.481.521.561.601.641.681.721.76

Figura 07: Expansões de parte do espectro presente na figura 06

_______________________________________________________________ Anexos

1.0000

3.1940

2.8349

Integral

2.0943

2.0678

1.9643

1.9491

1.9340

1.9176

1.9030

1.8986

1.8955

1.8847

1.8809

1.8772

1.8292

1.8254

1.8216

(ppm)

1.851.901.952.002.052.10

6.9797

3.2151

Integral

0.9181

0.9080

0.9004

0.8910

0.8802

0.8625

0.7779

(ppm)

0.700.750.800.850.900.951.00

Figura 08: Expansões de parte do espectro presente na figura 06

_______________________________________________________________ Anexos

168.3828

146.3941

135.6798

128.7115

106.6719

77.3367

77.0240

76.7039

70.9212

55.9809

49.5072

42.1534

40.2258

38.0946

38.0801

31.9410

29.7079

29.3733

26.1365

24.2089

22.7033

21.3940

20.6812

18.3026

17.5680

16.1205

15.4295

14.1202

0.0018

(ppm)

020406080100120140160

Figura 09: Espectro de RMN

C (PND, δ em ppm; CDCl

, 100MHz) do sesquiterpeno 6α-

Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno (1)

_______________________________________________________________ Anexos

135.6935

106.6638

70.9059

55.9582

49.4918

42.1453

40.2105

38.0720

29.7071

26.1284

24.2008

22.7024

21.3859

20.6876

18.2800

17.5599

16.1124

15.4359

(ppm)

0102030405060708090100110120130140

Figura 10: Espectro de RMN

C (DEPT 135º, δ em ppm; CDCl

, 100MHz) do sesquiterpeno

6α-Angeloiloxi-eudesm-4(15)-eno (1)

_______________________________________________________________ Anexos

Figura 11: Mapas de contorno do HMQC

_______________________________________________________________ Anexos

Figura 12: Expansão dos mapas de contorno do HMQC presente na figura 11

_______________________________________________________________ Anexos

Anexo 02: Figuras 13, 14, 15, 16 e 17

5.6393

5.6241

3.6795

3.6751

3.6675

3.4800

3.4724

3.4655

1.2525

1.1616

1.1427

1.0928

1.0442

1.0038

0.9886

0.9514

0.8491

(ppm)

0.01.02.03.04.05.06.07.08.0

Figura 13: Espectro de RMN

H (δ em ppm, CDCl

e 400MHz) do triterpeno 3α-hidroxi-

olean-eno (2)

_______________________________________________________________ Anexos

1.0000

0.4887

0.5437

1.0936

0.6373

0.7407

Integral

1.1616

1.1427

1.0928

1.0442

1.0038

0.9886

0.9514

0.8971

0.8800

0.8623

0.8491

(ppm)

0.850.900.951.001.051.101.15

0.1321

Integral

3.4800

3.4724

3.4655

(ppm)

3.403.443.483.523.56

0.1299

Integral

5.6393

5.6241

(ppm)

5.605.625.645.665.68

Figura 14: Expansões de parte do espectro presente na figura 13

_______________________________________________________________ Anexos

141.5736

122.0871

77.3388

77.2224

77.0187

76.7059

76.3713

49.6693

47.4144

43.0428

40.8170

39.2896

38.9477

37.8275

36.0091

35.0635

34.8307

34.5980

34.5252

33.0996

32.4013

32.0594

32.0376

31.9285

30.3428

30.0809

29.7100

29.4699

29.3681

29.2663

29.1790

28.9462

28.2479

27.7970

25.4548

25.1711

23.6291

22.6980

19.6212

18.4283

18.2101

16.2098

14.1368

-0.0035

(ppm)

020406080100120140160180200

Figura 15: Espectro de RMN

C (PND,

em ppm; CDCl

, 100MHz) do triterpeno 3α-

hidroxi-olean-eno (2)

_______________________________________________________________ Anexos

49.6693

47.4144

43.0428

40.8170

39.2896

38.9477

37.8275

36.0091

35.0635

34.8307

34.5980

34.5252

33.0996

32.4013

32.0594

32.0376

31.9285

(ppm)

32333435363738394041424344454647484950

30.0809

29.7100

29.4699

29.3681

29.2663

29.1790

28.9462

28.2479

27.9570

27.7970

25.4548

25.1711

23.6291

22.6980

19.6212

18.4283

18.2101

16.5735

16.2098

14.1368

(ppm)

1415161718192021222324252627282930

Figura 16: Expansões de parte do espectro presente na figura 15

_______________________________________________________________ Anexos

49.6612

47.4063

43.0275

38.9469

36.0010

35.0554

34.5971

34.5244

33.0915

32.4077

32.0586

32.0368

30.3420

29.7092

28.9381

27.7961

25.4613

23.6283

22.7045

19.6204

18.4348

18.2093

16.2090

14.1432

(ppm)

121416182022242628303234363840424446485052

122.1009

76.3705

(ppm)

768084889296100104108112116120124

Figura 17: Espectro de RMN

C (DEPT 135º, δ em ppm; CDCl

, 100MHz) do triterpeno 3α-

hidroxi-olean-eno (2)

_______________________________________________________________ Anexos

Anexo 03: Figuras 18, 19, 20, 21 e 22

Figura 18: Cromatograma obtido por CG da mistura de triterpenos: A- padrão de referência,

B- β-sitosterol (7), C- β-amirina (3), D- lupeol (4), E- pseudotaraxasterol (6) e F- taraxasterol

(5) (coluna HP-1)

_______________________________________________________________ Anexos

Figura 19: Cromatograma obtido por CG da mistura de triterpenos: A- padrão de referência,

B- β-sitosterol (7), C- β-amirina (3), D- lupeol (4), E- pseudotaraxasterol (6) e F- taraxasterol

(5) (coluna HP-50)

_______________________________________________________________ Anexos

(ppm)

0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.0

4.6190

4.6133

4.6070

4.6020

4.5673

3.6575

3.6410

3.6240

3.2281

3.2155

3.1997

3.1871

(ppm)

3.23.43.63.84.04.24.44.6

Figura 20: Espectro de RMN

H (δ em ppm, CDCl

e 400MHz) da mistura dos triterpenos (3,

4, 5 e 6)

_______________________________________________________________ Anexos

(ppm)

020406080100120140160

154.6263

150.9603

145.1922

139.1913

121.7197

119.3920

109.3324

107.1430

(ppm)

105110115120125130135140145150155160

Figura 21: Espectro de RMN

C (PND, δ em ppm; CDCl

100MHz), da mistura dos

triterpenos (3, 4, 5 e 6)

_______________________________________________________________ Anexos

121.6023

109.3314

107.1493

79.1379

(ppm)

102030405060708090100110120130

Figura 22: Espectro de RMN

C (DEPT 135

, δ em ppm; CDCl

, 100MHz) da mistura dos

triterpenos (3, 4, 5 e 6)

_______________________________________________________________ Anexos

Anexo 04: Figuras 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 e 31

A F

B D

Figura 23: Cromatograma dos padrões dos esteróides: A- padrão de referência, B-

campesterol (9), C- estigmasterol (8), D- β-sitosterol (7), E- estigmast-7-em 3β-ol (10) e F-

espinasterol (11) (coluna HP-50)

A C E

Figura 24: Cromatograma dos padrões dos esteróides: A- padrão de referência, B-

campesterol (9), C- estigmasterol (8), D- β-sitosterol (7), E- estigmast-7-em 3β-ol (10) e F-

espinasterol (11) (coluna HP-1)

_______________________________________________________________ Anexos

Figura 25: Análise

por CG da mistura dos esteróides: A- padrão de referência, B-

campesterol (9), C- estigmasterol (8), D- β-sitosterol (7), E- estigmast-7-em 3β

espinasterol (11) (coluna HP-50)

-ol (10) e F-

Figura 26: Análise por CG da mistura dos esteróides: A- padrão de referência, B-

campesterol (9), C- estigmasterol (8), D- β-sitosterol (7), E- estigmast-7-em 3β

espinasterol (11) (coluna HP-1)

_______________________________________________________________ Anexos

Figura 27: Enriquecimento com padrões na mistura dos esteróides: A- padrão de refe

B- campesterol (9), C- estigmasterol (8), D- β-sitosterol (7), E- estigmast-7-em 3β-ol (10

espinasterol (11) (coluna HP-50)

rência,

) e F-

_______________________________________________________________ Anexos

5.3555

5.3429

5.1812

5.1598

5.1433

5.1219

5.0442

5.0228

5.0063

4.9849

3.5529

3.5365

3.5251

3.5125

3.4974

3.4854

(ppm)

0.01.02.03.04.05.06.07.0

Figura 28: Espectro de RMN

H (δ em ppm; CDCl

400MHz) da mistura dos esteróides (7,

8, 9, 10 e 11)

_______________________________________________________________ Anexos

1.0000

0.9438

0.8669

Integral

5.3555

5.3429

5.1812

5.1598

5.1433

5.1219

5.0442

5.0228

5.0063

4.9849

(ppm)

4.854.904.955.005.055.105.155.205.255.305.355.405.45

1.0239

Integral

3.5529

3.5365

3.5251

3.5125

3.4974

3.4854

(ppm)

3.463.483.503.523.543.563.583.603.62

Figura 29: Expansões de parte do espectro presente na figura 28

_______________________________________________________________ Anexos

140.7492

138.3270

129.2712

121.7137

117.4658

71.8082

56.8678

55.9513

51.2452

50.1541

42.2911

42.2184

40.5091

39.6799

37.2577

36.5158

31.8969

28.9292

25.4159

24.3685

21.2262

21.0953

21.0735

19.4078

18.9859

12.2577

12.0540

(ppm)

0102030405060708090100110120130140150

Figura 30: Espectro de RMN

C (PND, δ em ppm; CDCl

, 100MHz) da mistura dos

esteróides (7, 8, 9, 10 e 11)

_______________________________________________________________ Anexos

71.8081

71.0662

56.8677

55.9512

52.2998

51.2451

50.1540

42.2911

40.5090

39.6798

37.2576

31.8895

31.6495

28.9291

25.4159

24.3684

21.2261

21.1025

21.0734

19.4077

18.9858

12.2576

(ppm)

051015202530354045505560657075

138.3269

129.2711

121.7136

(ppm)

100104108112116120124128132136140144148152

Figura 31: Espectro de RMN

C (DEPT 135

, δ em ppm; CDCl

, 100MHz) da mistura dos

esteróides (7, 8, 9, 10 e 11)

_______________________________________________________________ Anexos

Anexo 05: Figuras de 32, 33, 34, 35, 36, 37 e 38

1.0000

1.1372

0.4172

0.7678

Integral

12.4805

12.4558

10.1804

9.5596

9.3486

8.1016

8.0791

6.9510

6.9285

6.3560

(ppm)

-1.50.01.53.04.56.07.59.010.512.013.5

Figura 32: Espectro de RMN

H (

em ppm; DMSO-d

, 400MHz) do flavonóide

ramnocitrina (12)

_______________________________________________________________ Anexos

1.0000

1.1372

0.4172

0.7678

Integral

8.1016

8.0791

6.9510

6.9285

6.7554

6.7504

6.3609

6.3560

(ppm)

6.46.66.87.07.27.47.67.88.08.2

3.6883

Integral

3.8717

3.8662

3.8564

(ppm)

3.843.883.92

Figura 33: Expansões de parte do espectro presente na figura 32

_______________________________________________________________ Anexos

176.3673

165.2384

160.6850

159.6667

156.4371

147.5776

136.3251

129.9387

121.9084

115.8057

104.3713

97.8176

92.3477

56.3715

55.9569

(ppm)

60708090100110120130140150160170180

Figura 34: Espectro de RMN

C (PND,

em ppm; DMSO-d

, 100MHz) do flavonóide

ramnocitrina (12)

_______________________________________________________________ Anexos

129.9387

115.8130

97.8249

92.3550

56.3788

55.9642

40.2528

40.0419

39.8382

(ppm)

020406080100120140

Figura 35: Espectro de RMN

C (DEPT

135º, δ em ppm; DMSO-d

, 100MHz) do

flavonóide ramnocitrina (12)

_______________________________________________________________ Anexos

255.2341

299.0559

325.1837

100

200

300

400

500

600

m/z

x10

Intens.

121118.d: -MS

Figura 36: EM no modo negativo do flavonóide ramnocitrina (12)

_______________________________________________________________ Anexos

211.0432

227.0376

243.0702

255.0328

271.0629

284.0339

299.0567

100

150

200

250

300

m/z

500

1000

1500

Intens.

9554-MS-MS.d: -MS

Figura 37: EM-EM no modo negativo do flavonóide ramnocitrina (12)

_______________________________________________________________ Anexos

45.0240

55.6070

67.3062

98.9891

107.0540

121.0347

134.0431

142.5432

151.0450

167.0412

179.0430

201.0785

212.0548

227.0795

245.6824

258.0620

286.0568

301.0802

100

150

200

250

300

m/z

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

x10

Intens.

71118-MS-MS-massamenor.d: +MS, 100%=14813

Figura 38: EM-EM no modo positivo do flavonóide ramnocitrina (12)

_______________________________________________________________ Anexos

Anexo 06: Figuras 39, 40, 41 e 42

12.6259

10.2677

8.1259

8.1040

6.8882

6.8657

6.7572

6.7517

6.3896

6.3841

5.4439

5.4247

3.8664

(ppm)

0.01.53.04.56.07.59.010.512.0

Figura 39: Espectro de RMN de

H do flavonóide ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo

(13) (δ em ppm, DMSO-d

, 400MHz)

_______________________________________________________________ Anexos

2.8312

2.8134

1.0000

1.2961

8.1259

8.1040

6.8882

6.8657

6.7572

6.7517

6.3896

6.3841

(ppm)

6.46.56.66.76.86.97.07.17.27.37.47.57.67.77.87.98.08.18.2

1.2561

Integral

5.4439

5.4247

(ppm)

5.405.455.50

Figura 40: Expansão de parte do espectro presente na figura 39

_______________________________________________________________ Anexos

461.1054

497.0823

551.1371

605.1493

713.4694

100

200

300

400

500

600

700

800

900

m/z

x10

Intens.

3542.d: -MS

Figura 41: EM no modo negativo do flavonóide ramnocitrina 3-O-β- galactopiranosídeo (13)

_______________________________________________________________ Anexos

132.5602

227.0351

255.0301

283.0239

298.0461

100

150

200

250

300

m/z

500

1000

1500

2000

2500

3000

Intens.

6542-MS-MS.d: -MS

Figura 42: EM-EM no modo negativo do flavonóide ramnocitrina 3-O-β-galactopiranosídeo

(13)

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