( PDF ) Biodiversidade de rizóbios microssimbiontes do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) em regiões produtoras do estado de Santa Catarina

PRISCILA STOCCO

BIODIVERSIDADE DE RIZÓBIOS MICROSSIMBIONTES DO

FEIJOEIRO (Phaseolus vulgaris L.) EM REGIÕES PRODUTORAS DO

ESTADO DE SANTA CATARINA

LAGES - SC

2006

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1

UNIVERSIDADE DO ESTADO DE SANTA CATARINA - UDESC

CENTRO DE CIÊNCIAS AGROVETERINÁRIAS – CAV

DEPARTAMENTO DE SOLOS

PRISCILA STOCCO

BIODIVERSIDADE DE RIZÓBIOS MICROSSIMBIONTES DO

FEIJOEIRO (Phaseolus vulgaris L.) EM REGIÕES PRODUTORAS DO

ESTADO DE SANTA CATARINA

Dissertação apresentada ao curso de Pós-Graduação em

Ciência do Solo da Universidade do Estado de Santa

Catarina, como requisito parcial para obtenção do título

de Mestre em Ciência do Solo.

Orientador: Prof. Dr. Julio Cesar Pires Santos

Co-orientador: Dr

a

. Mariangela Hungria

LAGES – SC

2006

2

PRISCILA STOCCO

BIODIVERSIDADE DE RIZÓBIOS MICROSSIMBIONTES DO

FEIJOEIRO (Phaseolus vulgaris L) EM REGIÕES PRODUTORAS DO

ESTADO DE SANTA CATARINA

Dissertação apresentada ao curso de Pós-Graduação em Ciência do Solo da Universidade do

Estado de Santa Catarina, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em

Ciência do Solo.

Banca Examinadora:

Orientador: _____________________________________________________________

Dr. Julio Cesar Pires Santos

UDESC

Co-orientador: _____________________________________________________________

Dr

a

. Mariangela Hungria

EMBRAPA - Soja

Membro: ____________________________________________________________

Dr. Fernando Gomes Barcellos

EMBRAPA - Soja

Membro: ____________________________________________________________

Dr. Osmar Klauberg Filho

UDESC

Londrina, 15/12/2006

3

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, razão de toda existência.

Ao meu orientador e amigo Prof. Dr. Julio Cesar Pires Santos que sempre me atendeu

com muita dedicação e carinho. As suas lições e a sua capacidade de doação revelaram-no um

professor e uma pessoa muito especial.

Meu especial agradecimento a Dra. Mariangela Hungria que aceitou o desafio de me

orientar, pela atenção, dedicação, amizade, compreensão, confiança e constante incentivo.

Sem a sua disponibilidade e empenho não seria possível à realização deste trabalho.

Ao CNPq, pela concessão da bolsa de estudos.

À EMBRAPA Soja, pela estrutura que me foi concedida para a realização deste

trabalho.

Aos colegas do Laboratório de Biotecnologia do Solo: Adalgisa, Alan, Daisy, Eliana,

Fabiana, Fábio Mostasso, Fábio Plotegher, Fernando, Glaciela, Jesiane, Leandro, Leny, Lígia,

Lucas, Maria, Michele, Nágila, Pâmela, Renan Oliveira, Renan Ribeiro, Rinaldo, Rosinei,

Susan e Dr. Rubens, pessoas sem as quais grande parte do meu trabalho não seria possível.

À Universidade do Estado de Santa Catarina, Centro de Ciências Agroveterinárias,

Departamento de Solos pela oportunidade de realização deste curso.

Aos professores do curso de Ciência do Solo, em especial, Jaime, Jackson e Paulo

Ernani, pelos conhecimentos compartilhados.

Ao Dr. Osmar Klauberg Filho, por ter me iniciado na pesquisa e pela amizade.

4

À Eliana, Pâmela, Alan, Fábio Mostasso e Fábio Plotegher por tudo que me ensinaram

e por estarem sempre dispostos a ajudar.

Ao Diego, pela amizade e contribuição para com este trabalho.

Ao bolsista de iniciação científica, Vitor, pela colaboração na realização deste

trabalho, meu muito obrigado.

Aos funcionários da UDESC-CAV Alcir, Fátima e Henrique pela colaboração.

Aos colegas, Alex, Alexandre, Anderson, Carlos, Dário, Denis, Fernando, Ivan,

Janaína e Maurício, pela contribuição, boa vontade e dedicação nos experimentos a campo.

Aos meus pais, em especial minha mãe, por acreditar nos meus sonhos, pela

confiança, proteção e muito amor com que sempre me envolveu.

As minhas irmãs, Camila e Caroliny pelo apoio e incentivo.

Ao meu noivo, Bruno, sempre presente com seu amor, apoio e compreensão.

A Cleusa, Brian, Michele, Daiane, Marcos e Kell pessoas importantes no conjunto que

cerca minha vida.

À Adelina e Tatiana amigas de todas as horas, pela amizade, apoio durante os

momentos difíceis, e pelos seus conselhos e ajudas frente aos problemas enfrentados.

A Glaciela pela disponibilidade em ajudar, pela paciência em me ensinar, pelo seu

incentivo e pela amizade dedicada.

À Ana Carolina de Souza, Ana Carolina Fiúza, Clara, Gabriela, Jéssica, Lígia,

Mariana Ebert, Mariana Passoni e Natália pela convivência divertida, as boas risadas e a

companhia.

5

RESUMO

No Brasil, o feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) ocupa um lugar de destaque na

agricultura, pois os grãos representam uma fonte importante de proteínas e minerais para a

população. Como ocorre com outras leguminosas, o feijoeiro apresenta a capacidade de se

associar simbioticamente com bactérias fixadoras de nitrogênio atmosférico (N

2

), a maioria

classificada no gênero Rhizobium. Em geral, os solos brasileiros apresentam uma população

abundante de rizóbios capazes de nodular e fixar N

2

quando em simbiose com o feijoeiro,

contudo, a diversidade dessas bactérias ainda é pouco conhecida. Este trabalho teve, por

objetivo, avaliar a diversidade de rizóbios associados ao feijoeiro em três regiões do Estado de

Santa Catarina, onde predomina a agricultura familiar, praticada em pequenas propriedades.

Foram obtidos 117 isolados, provenientes de 23 áreas do extremo-oeste, do meio-oeste e do

planalto sul de Santa Catarina. Com base nas propriedades morfo-fisiológicas, os isolados

foram classificados em nove grupos. Pela análise do DNA dos isolados após a amplificação

com um "primer" (BOX) que codifica regiões conservadas e repetidas do genoma, foi

possível constatar um grau elevado de diversidade genética, com a obtenção de 107 perfis

distintos; além disso, as populações de rizóbios diferiram em cada uma das três regiões de

Santa Catarina. Pela técnica de PCR-RFLP do gene ribossomal 16S, seguida pela digestão

com três enzimas de restrição, foram obtidos 13 agrupamentos, que poderiam indicar a

ocorrência de espécies distintas ou até gêneros distintos. Embora tenha ocorrido a

predominância da espécie R. etli, os resultados indicam que novas espécies ainda não

6

descritas devem estar presentes nos solos de Santa Catarina. O conhecimento dessa

diversidade é fundamental, não só para o avanço no conhecimento, como também para

delinear estratégias visando incrementar a contribuição do processo biológico para a nutrição

nitrogenada do feijoeiro.

Palavras-chave: Phaseolus vulgaris. Rhizobium. Diversidade.

7

ABSTRACT

Common bean (Phaseolus vulgaris L.) occupies a major position in Brazilian

agriculture, as the grains represent an important source of proteins and minerals for the

population. Common bean may establish a symbiotic relation with bacteria capable of fixing

atmospheric nitrogen (N

2

), the majority classified into the genus Rhizobium. In general the

Brazilian soils show an abundant population of rhizobial bacteria capable of nodulating and

fixing N

2

with common bean, however, their diversity is still poorly known. The aim of this

study was to evaluate the diversity of common bean rhizobia in three regions of the State of

Santa Catarina, southern Brazil, where there is a predominance of familiar agriculture

performed in small properties. A total of 117 isolates were obtained from 23 areas of the

extreme-west, middle-west and southern plateau of Santa Catarina. Based on morpho-

physiological properties, the isolates were classified into nine groups. The DNA analysis,

after the amplification with the BOX primer, which encodes for conserved and repetitive

8

regions of the genome, detected a high level of genetic diversity, with 107 different profiles.

Furthermore, the rhizobial population differed in each of the three regions of Santa Catarina.

When the DNA of the isolates was amplified with primers encoding for the ribosomal 16S

gene, followed by the digestion with three restriction enzymes, 13 groups were obtained that

could be related to different species or genera. Although there was a predominance of R. etli

in all three regions, the results indicate that new and still undescribed species must be present

in the soils of Santa Catarina. The study and detection of rhizobial diversity is fundamental

not only for increasing the scientific knowledge, but also to enable the establishment of new

strategies towards increasing the contribution of the biological N

2

fixation process to the

common bean nutrition.

Keywords: Phaseolus vulgaris. Rhizobium. Diversity.

9

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Localização geográfica das áreas coletadas no estado de Santa Catarina .............. 24

Figura 2 - Dendrograma obtido pela análise dos produtos de amplificação BOX A1R-PCR,

com o algoritmo UPGMA e o coeficiente de Jaccard (J) ...................................................... 37

Figura 3 - Dendrograma obtido pela análise dos produtos de amplificação BOX A1R-PCR,

com o algoritmo UPGMA e o coeficiente de Jaccard (J) de isolados de feijoeiro da região 1 do

estado de Santa Catarina ...................................................................................................... 38

Figura 4 - Dendrograma obtido pela análise dos produtos de amplificação BOX A1R-PCR,

com o algoritmo UPGMA e o coeficiente de Jaccard (J) de isolados de feijoeiro da região 2 do

estado de Santa Catarina ...................................................................................................... 37

10

Figura 5 - Dendrograma da obtido pela análise dos produtos de amplificação BOX A1R-PCR,

com o algoritmo UPGMA e o coeficiente de Jaccard (J) de isolados de feijoeiro da região 3 do

estado de Santa Catarina ...................................................................................................... 38

Figura 6 - Dendrograma obtido pela análise por RFLP-PCR da região 16S rRNA com o

algoritmo UPGMA e o coeficiente de Jaccard (J)................................................................. 42

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Distribuição geográfica e dados climáticos dos locais de coleta, no ano de 2005

a

....

......................................................................................................................................... ...25

Tabela 2 - Procedência, classificação e propriedades químicas dos solos do estado de Santa

Catarina ............................................................................................................................... 26

Tabela 3 - Procedência e número de isolados no estado de Santa Catarina............................ 33

Tabela 4 - Morfologia das colônias e de pH em meio YMA de rizóbios microssimbiontes de

feijoeiro do estado de Santa Catarina. Caracterização realizada aos três dias de crescimento..

............................................................................................................................................ 34

11

Tabela 5 - Perfis de RFLP-PCR da região 16S rRNA em isolados de rizóbios de feijoeiro do

estado de Santa Catarina ...................................................................................................... 43

12

SUMÁRIO

1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ......................................................................................... 14

1.1. A CULTURA DO FEIJOEIRO ..................................................................................... 14

1.2. FIXAÇÃO BIOLÓGICA DE NITROGÊNIO................................................................ 15

1.3. CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA DE BACTÉRIAS FIXADORAS DE N

2

COM A

CULTURA DO FEIJOEIRO................................................................................................ 17

1.4. ANÁLISES FILOGENÉTICAS PARA A DETERMINAÇÃO DA DIVERSIDADE DE

RIZÓBIOS........................................................................................................................... 19

2. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................................. 23

2.1. ESTIRPES UTILIZADAS COMO REFERÊNCIAS ..................................................... 23

2.2. ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO MORFO-FISIOLÓGICA DOS ISOLADOS

DE RIZÓBIOS .................................................................................................................... 23

2.3. CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA .............................................................................. 27

2.3.1. Extração de DNA dos isolados de rizóbio................................................................... 27

2.3.2. BOX A1R-PCR.......................................................................................................... 29

2.3.3. RFLP-PCR da região 16S rRNA ................................................................................ 30

3. RESULTADOS ............................................................................................................... 32

3.1. ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO MORFO-FISIOLÓGICA DOS RIZÓBIOS...32

3.2. CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DOS RIZÓBIOS POR REP-PCR.......................... 34

3.3. CARACTERIZAÇÃO DO GENE RIBOSSOMAL DA REGIÃO 16S .......................... 40

13

4. DISCUSSÃO................................................................................................................... 44

CONCLUSÕES.........................................................................................................................46

REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 48

14

1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1. A CULTURA DO FEIJOEIRO

O feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) é cultivado em todo o território nacional (Meireles

et al., 2000). Caracteriza-se, nutricionalmente, como uma fonte importante de proteínas para a

população brasileira, destacando-se, ainda, pela presença de aminoácidos essenciais

(Velasquez et al., 1988) e de minerais como o Ca, Mg, P, Fe e Zn (Martín-Cabrejas et al.,

1997). É uma das leguminosas mais importantes na alimentação humana, sendo o seu

consumo vantajoso por exercer efeito complementar às proteínas dos demais cereais, por

exemplo, o arroz (Lajolo et al., 1996).

A maior parte da área cultivada com feijoeiro no Brasil localiza-se em solos ácidos,

pouco férteis e cultivados com baixo nível de tecnologia, resultando nos baixos rendimentos

verificados na cultura. Nesse quadro, o fornecimento adequado de nutrientes, particularmente

o N e o P, representa um dos fatores limitantes à obtenção de maiores rendimentos no Brasil

(Araujo, 1994).

O cultivo dessa leguminosa no Brasil é difundido, principalmente, em pequenas

propriedades. Nesse contexto, a agricultura familiar no Brasil representa 85,2% do total dos

estabelecimentos, que ocupam 30,5% do território nacional e são responsáveis por 37,9% do

valor bruto da produção agropecuária nacional (INCRA/FAO, 2000). Conforme o

levantamento do INCRA/FAO (2000), do valor bruto da produção agropecuária nacional,

67% da cultura do feijão é produzido nos estabelecimentos da agricultura familiar. No estado

de Santa Catarina a agricultura é tipicamente familiar, representando 90,5% do total dos

15

estabelecimentos. Os agricultores familiares de Santa Catarina possuem 60% da área agrícola

e respondem por 71,3% do valor bruto da produção agropecuária catarinense (FETAESC,

2006).

1.2. FIXAÇÃO BIOLÓGICA DE NITROGÊNIO

O N é um dos elementos mais abundantes da Terra, constituindo quase 80% dos gases

atmosféricos. Nenhum animal ou planta, porém, é capaz de utilizá-lo como fonte protéica,

pois o N encontra-se sob a forma gasosa de N

2

, uma molécula formada por dois átomos de N

unidos por uma tripla ligação extremamente estável e que requer uma elevada energia de

ativação para que venha a reagir com outros elementos (Araujo, 2006).

As principais formas de disponibilização de nitrogênio às plantas são: 1) o solo,

através da decomposição da matéria orgânica, porém, este recurso é esgotado rapidamente

após alguns cultivos; 2) os fertilizantes nitrogenados, representando a forma de assimilação

mais fácil, mas a um elevado custo econômico e ambiental; 3) a fixação não-biológica,

resultante de processos naturais, principalmente de descargas elétricas, combustão e

vulcanismo; 4) a fixação biológica de N

2

, principal via de incorporação do N à biosfera

(Hungria et al., 2001).

A fixação biológica do N

2

(FBN) ocorre através da associação entre plantas

hospedeiras e organismos fixadores de N

2

, que transformam o N

2

em formas assimiláveis para

as plantas, através do complexo enzimático denominado de dinitrogenase, que é composto por

duas unidades protéicas, a Fe-proteína e a Mo-Fe-proteína e que, auxiliadas pela ferridoxina,

reduzem o N

2

a amônia (NH

3

) (Morgante, 2003).

A principal contribuição da FBN ocorre pela associação mais estreita entre a planta

hospedeira e bactérias fixadoras de N

2

, denominada simbiose. Essa associação é caracterizada

16

pela formação de novos órgãos, usualmente nas raízes, denominados nódulos. No interior

desses órgãos, formas diferenciadas de rizóbios fixam N

2

utilizando energia dos fotossintatos

fornecidos pela planta hospedeira e produzem amônia (NH

3

),

que é transformada em NH

4

+

e

liberada para a planta hospedeira (Schultze & Kondorosi, 1998).

A simbiose inicia-se com a troca de sinais moleculares, ativando genes dos dois

parceiros, liberando substâncias com propriedades quimiotáticas pelas raízes hospedeiras,

atraindo e estimulando a multiplicação dessas bactérias na rizosfera e induzindo à transcrição

dos genes essenciais à nodulação, nod, nol e noe (Hungria et al., 1997). Esses genes

codificam a produção dos fatores de nodulação, ou fatores Nod, que são oligossacarídeos

lipoquitínicos secretados pelas bactérias simbióticas, relacionados aos estágios iniciais de

nodulação. Os fatores Nod, mediante reconhecimento pela planta, induzem a uma intensa

divisão celular no córtex da raiz (Morgante, 2003).

As bactérias colonizam a rizosfera, multiplicando-se ao redor dos pêlos radiculares,

resultando na formação de raízes curtas e grossas, bem como no encurvamento e no aumento

no número de pêlos radiculares. Em seguida, as bactérias degradam uma porção da parede

celular na região encurvada dos pêlos radiculares e o plasmalema começa a invaginar. Com

isso, ocorre a restauração da parede celular, resultando na formação de um canal, originando o

cordão de infecção (Morgante, 2003; Hungria et al., 1997; Hungria et al., 1994). O cordão de

infecção cresce em direção às células em divisão no córtex da raiz, até atingir o primórdio do

nódulo, que se diferencia em nódulos maduros e as bactérias são liberadas dentro do

citoplasma da planta hospedeira. A seguir, as bactérias são envoltas por uma membrana, no

interior da qual param de se multiplicar, aumentam de tamanho e sofrem várias alterações

bioquímicas, sendo diferenciados em bacterióides, formas capazes de fixar N

2

(Morgante,

2003; Schultze & Kondorosi, 1998; Hungria et al., 1997).

17

Com esse mecanismo alternativo é possível economizar em fertilizantes nitrogenados,

diminuir a poluição de rios, lagos e lençóis subterrâneos, além de aumentar a produtividade de

muitas culturas (Drozdowicz, 1997; Hungria et al., 1997).

1.3. CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA DE BACTÉRIAS FIXADORAS DE N

2

COM A

CULTURA DO FEIJOEIRO

A taxonomia é, freqüentemente, usada como um sinônimo para sistemática e consiste

na classificação, nomenclatura e identificação de um organismo (Cowan, 1968).

A classificação é o arranjo dos organismos em grupos (táxons), com base em

similaridades, enquanto que a nomenclatura é a determinação de nomes para os grupos

taxonômicos, de acordo com as regras internacionais descritas pelo “International Code of

Nomenclature of Bacteria” (Sneath, 1992). Já a identificação é o uso prático da classificação,

e determina a identidade de um isolado como membro, ou não, de uma unidade. A

classificação bacteriana consiste de diversos níveis, o maior deles denominado de Domínio.

Todos os procariotos estão posicionados em dois Domínios, Archae e Bacteria. Para cada

Domínio são descritos os Filos, as Classes, as Ordens, as Famílias, os Gêneros, as Espécies e

as subespécies.

Níveis mais altos, tais como Filo, Classe, Ordem, Família e Gênero, têm sido

classificados com base nas seqüências de nucleotídeos do gene ribossomal 16S. A

determinação de espécies, entretanto, permanece incerta, sendo que análises de similaridades

entre DNA-DNA, seqüências de nucleotídeos do gene 16S RNAr e características fisiológicas

vêm sendo utilizadas a fim de caracterizar uma dada espécie. Contudo, não há, até o presente

momento, uma determinação precisa quanto à especiação em bactérias (Brenner et al., 2000).

18

No caso das bactérias simbióticas fixadoras de N

2

, existem, hoje, vários gêneros

descritos: Allorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium, Sinorizobium,

Burkholderia e Methylobacterium. Tradicionalmente, essas bactérias vêm sendo chamadas,

coletivamente, de “rizóbios”.

A classificação taxonômica dos rizóbios foi, inicialmente, baseada em sua

especificidade hospedeira. Como exemplo, as bactérias que nodulam o feijoeiro foram

classificadas como Rhizobium phaseoli. A classificação posterior para os rizóbios, proposta

por Jordan (1984), considerou as características morfo-fisiológicas, genéticas e a

especificidade hospedeira. Piñero et al. (1988) sugeriram que uma classificação

biologicamente mais representativa de Rhizobium spp. deveria ser baseada em critérios

genéticos e evolucionários que refletissem a similaridade total das estirpes e suas prováveis

linhas genealógicas de evolução.

Na classificação de Jordan (1984), o gênero Rhizobium é caracterizado como bactérias

de crescimento rápido em meio de cultura específico e todas as estirpes de rizóbios isoladas

do feijoeiro passaram a pertencer à espécie R. leguminosarum bv. phaseoli. No entanto, este

novo arranjo taxonômico não foi totalmente aceito, havendo várias evidências de que

deveriam existir novas espécies.

Foram, então, conduzidos estudos que levaram à separação das estirpes de R.

leguminosarum bv. phaseoli em dois grupos, tipo I e tipo II (Martínez et al., 1985). Logo a

seguir, as estirpes do tipo II foram definidas como R. tropici (Martínez-Romero et al., 1991),

espécie que foi subdividida em IIA e IIB, com uma estirpe de referência do subgrupo IIA, a

CFN 299 e, para o tipo IIB a estirpe tipo CIAT 899.

Em 1991, Segovia e colaboradores observaram que as estirpes americanas de sua

coleção formavam um agrupamento separado de R. leguminosarum bv. phaseoli, sugerindo,

então, que todos os isolados americanos obtidos de nódulos de feijoeiro passassem a ser

19

denominados de Rhizobium sp. tipo I. A seguir, Segovia et al. (1993) sugeriram uma nova

espécie, Rhizobium etli, tendo pelo menos um biovar, Rhizobium etli bv. phaseoli, com a

estirpe tipo CFN 42 (USDA 9032). A partir de então, ficou determinado que a espécie R.

leguminosarum bv. phaseoli deveria ser usada somente para estirpes que estivessem

estritamente relacionadas aos genes cromossomais de outros biovares desta espécie (Hungria

et al., 1997).

Posteriormente, na França, estudos de diversidade de rizóbios microssimbiontes do

feijoeiro levaram à descrição de novas espécies e biovares, R. gallicum bv. gallicum e bv.

phaseoli e R. giardinii bv. giardinii e bv. phaseoli (Amarger et al., 1997).

1.4. ANÁLISES MOLECULARES PARA A DETERMINAÇÃO DA DIVERSIDADE DE

RIZÓBIOS

Conforme discutido por Wang & Martínez-Romero (2000), uma poderosa ferramenta

para a taxonomia de um determinado organismo é o estudo da filogenia, utilizada para

determinar a relação existente entre os organismos, indicando seu possível grupo, suas

relações com outros grupos e seu lugar nas famílias e reinos, bem como auxiliando no

reconhecimento dos ancestrais. Nesse contexto, moléculas mais conservadas evolutivamente

ajudam a comparar organismos relacionados distantemente, enquanto que moléculas menos

conservadas permitem identificar mudanças pequenas e recentes.

Os genes ribossomais (RNAr) codificam moléculas de RNA ribossomal, que são

essenciais para a sobrevivência de todos os organismos e são altamente conservadas em

bactérias e outros organismos, uma vez que todos realizam síntese de proteínas. Assim, a

conservação desses genes, devido à reserva estrutural dos ribossomos, e à existência de

20

variabilidade em alguns domínios, torna as seqüências dos genes ribossomais (5S, 16S e 23S)

boas escolhas para comparar organismos e inferir filogenias (Thórsson et al., 2000).

A presença de domínios altamente conservados nas seqüências dos genes que

codificam as regiões 16S RNAr permitem a construção de “primers” (oligonucleotídeos

iniciadores) para a amplificação dos mesmos em diferentes tamanhos para a maioria dos

procariotos. Os genes da região 16S RNAr de rizóbios podem ser amplificados utilizando-se,

por exemplo, os “primers” fD1 e rD1 descritos por Weisburg et al. (1991). O seqüenciamento,

parcial ou total, associada à RFLP (‘Restriction Fragment Length Polymorphism’) do gene

16S RNAr têm sido comumente utilizado para estimar a filogenia (Thies et al., 2001).

A técnica de PCR associada ao RFLP (PCR-RFLP) possibilita que os organismos

possam ser diferenciados pela análise de um segmento de DNA ou gene específico pela

clivagem com enzimas de restrição. Assim, o segmento de DNA é fragmentado em diferentes

comprimentos, evidenciando o polimorfismo no comprimento dos fragmentos obtidos,

encontrado em organismos distintos.

Atualmente, a análise de PCR-RFLP e o seqüenciamento do gene que codifica a região

16S RNAr têm sido muito utilizados para inferir posições taxonômicas e diferenciar

organismos simbiônticos (Terefework et al., 1998). As informações contidas na seqüência do

gene 16S RNAr permitem inferira as relações evolutivas entre as bactérias simbióticas.

(Doyle, 1998; Wang & Martínez-Romero, 2000). Com base na análise desse gene, inclusive,

há indicação de várias espécies novas dentro da diversidade encontrada nos solos brasileiros

(Menna et al., 2006).

Seqüências dos genes ribossomais 5S, 23S e da região intergênica entre o 16S e o 23S

RNAr (IGS) também têm sido utilizadas para estimar relações entre espécies de rizóbios.

Como exemplo, a comparação parcial do gene 23S RNAr entre Agrobacterium vitis,

Rhizobium leguminosarum, R. etli e R. galegae indicou que estes gêneros não estão tão

21

relacionados à Agrobacterium como quando se analisam seqüências do gene 16S RNAr. Esse

fato indica que a taxa de mudanças nas seqüências do gene 23S RNAr, assim como também já

foi constatado para os genes 5S RNAr e IGS RNAr, é mais rápida que a observada para o

gene 16S RNAr, sendo assim, esses genes (23S e 5S e IGS) poderiam ser utilizados com o

propósito de identificação e tipagem entre espécies, mais do que para inferir relações

filogenéticas (Wang & Martínez-Romero, 2000).

Uma grande limitação nas análises filogenéticas das seqüências do operon RNAr (16S,

23S, 5S e IGS), porém, é o fato de que muitos gêneros de bactérias possuem múltiplas cópias

do operon RNAr, e os alelos RNAr podem divergir em cada cópia, em maior ou em menor

extensão, devido à recombinação intragênica localizada e à transferência lateral parcial, ou

total, dos operons RNAr (Yap et al., 1999). Para estirpes do gênero Bradyrhizobium, tal

problema pode ser negligenciado, devido ao fato de que, até o presente momento, foi

identificada apenas uma cópia do operon RNAr. Já para as estirpes dos gêneros Rhizobium,

Mesorhizobium, Sinorhizobium, Allorhizobium e Azorhizobium, foram identificadas múltiplas

cópias, no entanto, são cópias incompletas e possíveis de identificação em análises de gel de

eletroforese, ou, ainda, são cópias idênticas, não alterando, assim, as análises (Willems et al.,

2001).

A metodologia de rep-PCR (repetitive-sequence-based-PCR) também tem sido

utilizada para estimar diversidade e relações entre os organismos (Versalovic et al., 1991).

Essa técnica consiste no uso de “primers” específicos para amplificar elementos repetitivos e

conservados dispersos no cromossomo bacteriano. Os marcadores rep-PCR permitem

diferenciar espécies e estirpes. (Versalovic et al., 1994; Selenka-Pobell et al., 1996;

Rademaker et al., 1998).

Existem três famílias de elementos repetitivos para este tipo de análise, incluindo a

seqüência REP (“Repetitive Extragenic Palindromic”) (35-40 pb), a seqüência ERIC

22

(“Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus”) (124-127 pb) e os elementos BOX: box

A (54 pb), box B (43 pb) e box C (50 pb). Os elementos repetitivos estão localizados em

distintas posições intergênicas no genoma, em ambas as orientações e os “primers” podem ser

sintetizados a partir de repetições invertidas dos elementos REP, ERIC e da subunidade box A

dos elementos BOX. Se as repetições estão distribuídas no genoma em orientação invertida,

então um único “primer” pode ser suficiente para gerar polimorfismo de DNA (Versalovic et

al., 1994; Rademaker et al., 1998).

Apesar dos avanços nas metodologias para a avaliação da biodiversidade, ainda pouco

se conhece sobre as bactérias simbióticas fixadoras de N

2

no Brasil. Isso fica ainda mais

evidenciado no caso da associação com o feijoeiro, cultura de grande importância para o

Brasil e que pode se beneficiar fortemente pelo processo de fixação biológica de N

2

. Nesse

contexto, este trabalho teve, por objetivo, determinar a diversidade de microssimbiontes

diazotróficos da cultura do feijoeiro no Estado de Santa Catarina, contribuindo para o

conhecimento da biodiversidade brasileira.

23

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. ESTIRPES UTILIZADAS COMO REFERÊNCIAS

As estirpes utilizadas como referências foram: Rhizobium tropici tipo A CFN 299

(=USDA 9039, =LMG 9517), Rhizobium tropici tipo B CIAT 899

T

(=UMR 1899, =USDA

9030, =TAL 1797, HAMBI 1163, =SEMIA 4077, =ATCC 49672), Rhizobium etli CFN 42

T

(=USDA 9032), recebidas do Centro de Ciências Genômicas, Cuernavaca, México;

Rhizobium tropici PRF 81 (=SEMIA 4080), coleção do banco de germoplasma da Embrapa

Soja; Rhizobium giardinii bv. giardinii estirpe H152

T

, Rhizobium gallicum bv. gallicum

estirpe R602

T

, fornecidos pelo INRA, Dijon France; Rhizobium leguminosarum bv phaseoli

estirpe USDA 2671, proveniente do USDA, Beltsville, EUA.

2.2. ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO MORFO-FISIOLÓGICA DOS ISOLADOS

DE RIZÓBIOS

Em novembro e dezembro de 2005 foram coletados, ao acaso, nódulos de raízes de

feijoeiros e amostras de solo, em 33 áreas representativas do estado de Santa Catarina,

localizadas no extremo oeste, meio oeste e no planalto sul, conforme indicado na figura 1. As

características de zoneamento climático são apresentadas na Tabela 1. Os solos foram

classificados conforme o mapa de classificação dos solos de Santa Catarina (Embrapa, 2006)

24

e as propriedades químicas foram determinadas segundo os métodos propostos por Tedesco et

al. (1995). A caracterização química dos solos das áreas amostradas pode ser visualizada na

Tabela 2.

Figura 1 - Localização geográfica das áreas coletadas no estado de Santa Catarina

Região 1: Extremo Oeste – Chapecó

Região 2: Extremo Oeste – Concórdia

Região 3: Meio Oeste

Região 4: Planalto Sul

Região 5: Planalto Norte

Região 6: Nordeste

Região 7: Vale do Itajaí

Região 8: Grande Florianópolis

Região 9: Sul

4

•

Estado do Paraná

Estado do Rio Grande

do Sul

Argentina

Oceano

Atlântico

25

Tabela 1 – Distribuição geográfica e dados climáticos dos locais de coleta, no ano de 2005

a

Região Latitude Longitude Altitude (m)

Temperatura

média mínima

absoluta (ºC)

Temperatura

média máxima

absoluta (ºC)

Média da

precipitação total

mensal (mm)

Extremo Oeste – Chapecó

b

27º05’26”S 52º38’02”W 679 8,1 32,0 181,6

Extremo Oeste – Concórdia

c

27º18’47”S 51º59’32”W 585 7,2 32,5 142,8

Meio Oeste – Campos Novos

d

27º23’00”S 51º12’56”W 964 5,5 29,3 196,1

Planalto Sul – Lages

e

27º48’27”S 50º19’44”W 937 5,4 29,6 168,8

a

Dados

fornecidos pela EPAGRI

b

Áreas correspondentes : Guatambu, Caxambu do Sul, Águas de Chapecó, Palmitos, Planaltina, Pinhalzinho e BR 282 km 546

c

Áreas correspondentes: Nova Teutônia, Peritiba, Piratuba, Machadinho-Piratuba, Capinzal e Ouro

d

Áreas correspondentes: Capinzal, Ouro, Campos Novos, Brunópolis e Curitibanos

e

Áreas correspondentes: Lages, Painel, Urupema, São Joaquim, São José do Cerrito e Palmeira

26

Tabela 2 – Procedência, classificação e propriedades químicas dos solos do estado de Santa Catarina

Localização Classificação do Solo pH (H2O) pH (KCl) Ca* Mg* Al* Na** K** P** N** % MO

Extremo Oeste - Chapecó

1. Guatambu Latossolo vermelho distroférrico 7,02 6,47 14,34 2,81 0,30 18,00 244,00 288,53 8,00 3,51

2. Caxambu do Sul Nitossolo vermelho eutrófico 5,03 4,36 5,28 0,53 0,50 12,00 335,50 69,86 10,00 3,48

3. (Dom José) Caxambu do Sul Nitossolo vermelho eutrófico 6,03 5,20 6,72 2,22 0,25 16,50 800,00 464,55 185,00 3,18

4. Águas de Chapecó Nitossolo vermelho eutrófico 5,24 4,51 5,70 1,54 0,40 10,00 72,00 39,83 180,00 3,10

5. Palmitos Nitossolo vermelho eutrófico 6,53 5,65 15,30 5,57 0,10 21,50 878,50 1152,52 14,00 5,50

6. Planaltina Nitossolo vermelho eutrófico 5,29 4,64 10,80 3,05 0,40 18,00 180,00 20,16 16,00 4,40

7. Pinhalzinho Latossolo vermelho distroférrico 5,25 4,56 6,00 1,78 0,20 16,00 392,50 33,55 10,00 3,22

8. BR 282 km 546 Latossolo vermelho distroférrico 6,38 5,44 14,22 6,28 0,10 23,50 615,00 516,52 169,00 2,90

Extremo Oeste - Concórdia

9. Nova Teutônia Nitossolo vermelho eutrófico 5,61 4,65 13,38 7,14 0,10 25,00 151,00 492,05 184,00 3,17

10. Peritiba Nitossolo vermelho eutrófico 5,59 4,70 12,24 2,61 0,35 11,50 603,00 82,86 16,00 3,36

11. Piratuba Nitossolo vermelho eutrófico 5,71 5,09 7,32 1,30 0,25 17,00 169,50 46,24 321,00 5,53

12. (Usina Machadinho) Piratuba Nitossolo vermelho eutrófico 7,19 6,72 14,22 4,56 0,35 130,50 335,50 1340,05 636,00 10,94

Meio Oeste – Campos Novos

13. Capinzal Nitossolo vermelho eutrófico 5,16 4,59 7,38 2,07 0,40 9,50 498,50 128,42 537,00 9,24

14. Ouro Nitossolo vermelho eutrófico 5,89 5,87 8,10 3,26 0,20 24,50 345,50 82,29 12,00 3,16

15. Campos Novos Latossolo vermelho distroférrico 6,41 5,11 9,78 5,63 0,25 21,50 266,50 363,84 219,00 3,76

1.6. Campos Novos (Plantio direto) Latossolo vermelho distroférrico 5,83 5,10 9,66 5,04 0,25 15,00 415,50 105,65 15,00 4,62

17. BR 470 km 291 Latossolo vermelho distroférrico 5,68 5,05 6,84 2,43 0,30 21,50 292,00 144,47 288,00 4,96

18. Brunópolis Latossolo bruno distrófico 4,41 3,79 3,48 0,89 2,73 9,00 182,00 29,46 11,00 3,32

19. Curitibanos (sentido Brunópolis) Latossolo bruno distrófico 5,49 4,56 3,90 1,07 0,45 4,50 42,00 87,56 8,00 2,83

Planalto Sul - Lages

20. (Estação de Aquicultura) Lages Cambissolo húmico textura média 6,52 5,88 9,54 3,38 0,20 6,00 44,50 656,24 11,00 7,11

21. Painel Latossolo bruno distrófico 4,35 3,91 2,64 0,15 1,93 13,00 150,00 88,96 14,00 9,10

22. (Cedro) Urupema Latossolo bruno distrófico 5,42 4,98 8,88 4,18 0,40 12,00 220,50 108,16 28,00 11,03

23. Urupema Latossolo bruno distrófico 5,56 4,76 14,40 3,59 0,30 26,00 93,50 127,41 20,00 7,54

24. São Joaquim Cambissolo húmico 6,68 6,23 14,22 5,57 0,30 28,00 615,50 357,81 593,00 10,20

25. São José do Cerrito Nitossolo vermelho distrófico 5,98 5,51 6,48 3,85 0,15 11,00 121,00 24,24 25,00 8,72

26. (Sto Antonio dos Pinhos) São José do

Cerrito

Nitossolo vermelho distrófico 6,06 5,21 12,06 4,74 0,30 17,00 505,50 217,89 14,00 7,49

27. (Toca da Onça) São José do Cerrito Nitossolo vermelho distrófico 5,94 5,27 10,80 3,38 0,30 21,50 927,50 332,69 21,00 5,47

28. (Guaiabeira ) São José do Cerrito Nitossolo vermelho distrófico 5,14 4,57 7,38 3,35 0,40 15,00 451,00 25,82 21,00 5,65

29. ( Salto Rio Caveiras) Lages Latossolo bruno distrófico 5,17 4,50 5,10 2,61 0,45 15,50 310,50 35,56 20,00 5,39

30. (Urupema) 1600 m altitude Cambissolo húmico alumínico 5,25 4,53 8,16 3,73 0,99 24,00 290,50 837,46 46,00 6,51

31. (Cadeados) Lages Cambissolo húmico alumínico 5,40 3,79 4,20 1,16 5,11 11,50 294,50 131,19 20,00 5,31

32. (Bela Vista) Lages Cambissolo húmico alumínico 6,17 5,44 11,82 6,46 0,20 35,50 162,00 59,78 23,00 5,87

33. (Cerro Alto) Palmeira Cambissolo húmico alumínico 5,15 4,54 5,16 4,50 0,35 18,00 286,50 439,74 22,00 5,05

*Teores de Ca, Mg e Al no solo (cmol

c

dm

-3

)

**Teores de Na, K, P e N no solo (mg dm

-3

)

27

No laboratório, dez nódulos de plantas coletadas em cada local, em amostragem

correspondendo a uma área representativa de cada propriedade, foram retirados ao acaso,

procedendo-se ao isolamento e obtenção de culturas puras de bactérias, de acordo com

metodologia descrita por Vincent (1970). Para isso, os nódulos foram desinfestados

superficialmente durante 1 minuto em álcool (95%), 5 minutos em hipoclorito de sódio

comercial e lavados em água destilada e esterilizada por cinco vezes; em seguida, foram

macerados com uma pinça flambada e, com uma alça de platina, repicados em meio de cultura

contendo extrato de levedura e manitol (YM, Vincent, 1970) e o corante vermelho congo

(Vincent, 1970). As placas foram incubadas a 28ºC, no escuro, e verificadas diariamente.

Todas as estirpes foram caracterizadas quanto à produção de muco, transparência, cor,

tamanho, borda, elevação e crescimento, aos três e cinco dias de crescimento (Vincent, 1970).

Também foi observada, a partir do quinto dia de crescimento, a acidificação ou alcalinização

do meio YM contendo o indicador de pH azul de bromotimol. Foi formada uma coleção de

trabalho, onde as bactérias foram mantidas em meio YMA inclinado, a 4ºC e também,

procedeu-se ao armazenamento em YM com 25% de glicerol, a -80º C.

2.3. CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA

2.3.1. Extração de DNA dos isolados de rizóbio

Para a extração de DNA, as bactérias foram incubadas em 15 mL de meio YM, durante

3 dias, a 28ºC, com agitação de 80 rpm. Após a incubação, as suspensões bacterianas foram

centrifugadas a 10.000 rpm durante 15 minutos, o sobrenadante foi descartado e o precipitado

transferido para um eppendorf de 1,5mL, lavado por três vezes com solução salina (NaCl a

28

0,85%), centrifugado e o sobrenadante foi descartado. Depois da 3ª lavagem foi acrescentado 1

mL de solução salina, o precipitado foi homogeneizado e adicionado um volume de solução

salina para obter uma concentração final de 10

9

células mL

-1

. Foram transferidos 1,4 mL da

suspensão bacteriana para um outro tubo de microcentrífuga, centrifugados a 12.000 rpm

durante 5 minutos e o sobrenadante foi descartado. Em seguida, o precipitado foi ressuspenso

em 400 µL de TE 50/20 (50 mM de Tris, pH 8; 20 mM de EDTA-Na

2

pH 8), adicionando-se 50

µL de SDS a 10% (10 g de sodium dodecyl sulphate em 100 mL de água), 10 µL de proteinase

K (10 mg mL

-1

em água, mantida no congelador), 10 µL de lisozima (5 mg mL

-1

em água,

mantida no congelador), 2 µL de RNAse (10 mg mL

-1

, preparada em tampão com 10 mM de

Tris HCl pH 8 e 15 mM de NaCl) e, então, incubado a 37ºC por, aproximadamente, 1 hora (até

clarear). Na seqüência, as amostras foram homogeneizadas com ponteiras de 1 mL, por três

vezes, para retirar a viscosidade. A seguir, foram acrescentados NaCl 5 M para uma

concentração final de 250 mM (30 µL), AcONa 3 M para uma concentração final de 300 mM

(70 µL) e 28 µL de H

2

O milli Q. As amostras foram homogeneizadas e deixadas em repouso

por 1 hora a 4ºC, em seguida, foram centrifugadas a 12.000 rpm durante 15 minutos,

recolhendo-se 300 µL do sobrenadante de cada amostra e adicionados, a estes, 600 µL de

etanol absoluto gelado (aproximadamente -20ºC) a 95% armazenando-se, então, de 12-18

horas, a -20

º

C. Após este período, as amostras foram centrifugadas a 12.000 rpm durante 15

minutos, o etanol 95% descartado, e adicionados 200 µL de etanol 70% (gelado). As amostras

foram centrifugadas novamente a 12.000 rpm durante 5 minutos, o etanol foi descartado e os

precipitados colocados para secar a temperatura ambiente. Finalmente, os precipitados foram

ressuspendidos em 50 µL de TE 10:1 (10 mM Tris-HCl pH 8; 1 mM EDTA, pH 8).

Para verificar a concentração e pureza do DNA, as amostras foram submetidas à

eletroforese em gel de agarose de 10 x 11 cm a 1,5% [0,6 g de agarose em 40 mL de TBE 1X

(10,8 g de Tris-base; 5,5 g de ácido bórico; 4 mL de EDTA, 0,5 M, pH 8, para cada litro de

29

solução)], durante 40 minutos a 80 V. A concentração foi verificada por comparação com

padrão de peso molecular conhecido, Lambda

TM

(Invitrogen

TM

). A pureza do DNA foi

verificada após a coloração com brometo de etídio e a visualização em um transluminador

TFX-35-M emitindo luz ultravioleta de comprimento de onda curta.

A concentração do DNA foi ajustada por comparação em gel com o peso molecular

para 10 ng. µL

-1

, usando água milli Q esterilizada como diluente, quando necessário.

2.3.2. BOX A1R-PCR

O DNA das bactérias foi amplificado pela técnica de PCR com o “primer” BOX A1R

(5’-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’), (Versalovic et al., 1994), em um termociclador

PTC-200

TM

MT-Research. O volume final da reação de amplificação da PCR foi de 25 µL,

contendo: dNTPs 1,5 mM, MgCl

2

50 mM, tampão 10X, “primer” 50 pmol, DNA 20 ng, Taq

polimerase 5 U e água milli Q esterilizada para completar o volume. A amplificação foi

realizada utilizando os seguintes ciclos: 1 ciclo de desnaturação inicial a 95°C por 7 min; 35

ciclos de desnaturação (1 min a 94°C), anelamento (1 min a 53°C) e extensão (8 min a 65°C); 1

ciclo de extensão final a 65°C por 16 min; manutenção a 4°C.

Após a amplificação, cada tubo recebeu 6 µL de tampão de amostra (0,25% de azul de

bromofenol e 40% de sacarose ou 30% de glicerol). Foi preparado um gel de agarose de 20 X

25 cm a 1,5%, diluído em tampão TBE 1X (10,8 g de Trisma base, 5,5 g de ácido bórico e 4

mL de EDTA Na

2

0,5 M pH 8 em 1 L de água destilada), e colocado em uma cuba Horizon

R

20

x 25 cm. Nas canaletas do gel foram colocados 31 µL de cada amostra, com exceção da

primeira canaleta, da última e da central, nas quais foram colocados 5 µL, por canaleta, do

padrão de peso molecular de 1 kb plus DNA Ladder

TM

(Invitrogen

TM

). O DNA foi submetido à

30

eletroforese horizontal a 120 V por 6 horas. Após a eletroforese, o gel foi corado com brometo

de etídio e observado em um transluminador TFX-35-M com lâmpada UV e fotografado em

uma câmera Kodak Digital Science 120. Os perfis de bandas obtidos foram analisados pelo

programa Bionumerics (Applied Mathematics, Kortrijk, Bélgica versão 1.50) e para a análise

de agrupamento foi usado o algoritmo UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with

Arithmetic mean) e o coeficiente de Jaccard. A tolerância das bandas foi estabelecida em 2%,

no programa Bionumerics.

2.3.3. PCR-RFLP do gene ribossomal 16S RNAr

O gene ribossomal 16S foi amplificado com o uso dos “primers” fD1 (5’-

CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) e rD1 (5’-

CCCGGGATCCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCC-3’), descritos por Weisburg et al.,

(1991).

Para as amplificações por PCR foi preparada uma reação contendo, para cada amostra:

dNTPs 1,5 mM, tampão para PCR (10X), MgCl

2

50 mM, "primer" - fD1 e rD1 - 10 pmol,

DMSO, Taq polimerase 5 U, DNA 40 ng e completado o volume final para 50 µL com água

milli Q estéril. Os ciclos de amplificação foram os seguintes: 2 minutos a 95

o

C; 15 segundos a

94

o

C, 45 segundos a 93

o

C, 45 segundos de 55º C, 2 minutos a 72

o

C; 29 ciclos de 15 segundos

a 94º C, 2 minutos a 72

o

C, com manutenção final a 4°C. Os produtos de amplificação foram

visualizados em gel de agarose de 10 x 11 cm a 1,5% e comparados com padrão de peso

molecular conhecido, Low DNA Mass

TM

Ladder (Invitrogen

TM

).

Para o RFLP, foi utilizada a metodologia descrita por Laguerre et al. (1994). O produto

da amplificação com os “primers” fD1 e rD1 foi digerido com as seguintes enzimas de

31

restrição: HhaI (5’ – GCG/C - 3’; 3’ – C/GC – 5’), HpaII (5’ – C/CGG – 3’; 3’ – GGC/C – 5’)

e RsaI (5´- GT/AC – 3´; 3´- CA/TG – 5´) (Invitrogen

TM

). Para cada reação de restrição foram

utilizados 10 U de enzima, tampão específico para cada enzima (10X) conforme especificação

do fabricante, 6 µL do produto de PCR e completado o volume final para 10 µL com água milli

Q estéril. As reações foram incubadas a 37

o

C, por 2 horas, de acordo com instruções do

fabricante (Invitrogen).

Em cada canaleta do gel foram colocados 10 µL de cada amostra e 4 µL do tampão de

amostra, com exceção da primeira canaleta, da central e da última, nas quais foram colocados 5

µL, por canaleta, do padrão de peso molecular de 100 pb, (Invitrogen

TM

). Os fragmentos

obtidos foram analisados por eletroforese em uma cuba Horizon

R

, 20 X 25 cm em gel

horizontal (20 X 12 cm) com 3% de agarose, em TBE 0,5 X, a 120 V, durante 4 horas. Após a

eletroforese, o gel foi corado com brometo de etídio visualizado em um transluminador UV, e

fotografado conforme descrito anteriormente. Os padrões de bandas obtidos foram analisados

pelo programa Bionumerics e para o agrupamento foi usado o algoritmo UPGMA e o

coeficiente de Jaccard. A tolerância das bandas foi estabelecida em 3% no programa

Bionumerics.

32

3. RESULTADOS

3.1. ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO MORFO-FISIOLÓGICA DOS RIZÓBIOS

Os isolados foram obtidos de quatro diferentes regiões do estado de Santa Catarina,

sendo o extremo oeste representado por 6 áreas, o meio oeste por quatro e o planalto sul com

13. Obtiveram-se 117 isolados, de 23 áreas investigadas (Tabela 3). Todos os isolados

apresentaram crescimento rápido, sendo possível realizar a caracterização morfo-fisiológica

em três dias. Os grupos predominantes foram aqueles que apresentaram colônias de cor

branca opaca em YMA, borda lisa, elevação cupular e produção moderada de muco.

Aproximadamente 97% dos isolados apresentaram reação ácida em meio YMA contendo azul

de bromotimol (Tabela 4).

Os atributos morfo-fisiológicos (Tabela 4) não foram relacionados à distribuição

geográfica (Tabela 1), ou com as propriedades químicas (Tabela 2), ou climáticas (Tabela1).

33

Tabela 3 – Procedência e número de isolados no estado de Santa Catarina

Município Número de isolados

Região 1: Extremo Oeste

(Chapecó)

1. Guatambu

3

2. Caxambu do Sul

2

3. Palmitos

1

4. Planaltina

2

5. Pinhalzinho

2

(Concórdia)

6. Peritiba

2

Região 2: Meio Oeste – Campos Novos

7. Ouro

1

8. Campos Novos (plantio direto)

2

9. Brunópolis

5

10. Curitibanos (sentido Brunópolis)

5

Região 3: Planalto Sul - Lages

11. (Estação de Aqüicultura) Lages

6

12. Painel

11

13. (Cedro) Urupema

1

14. Urupema

10

15. São José do Cerrito

8

16. (Sto Antonio dos Pinhos) São José do Cerrito

7

17. (Toca da Onça) São José do Cerrito

9

18. (Guaiabeira) São José do Cerrito

6

19. (Salto Rio Caveiras) Lages

7

20. (Urupema) 1600 m altitude

6

21. (Cadeados) Lages

5

22. (Bela Vista) Lages

7

23. (Cerro Alto) Palmeira

9

Total

117

34

Tabela 4 - Morfologia das colônias e pH em meio YMA de rizóbios microssimbiontes de feijoeiro do estado de

Santa Catarina. Caracterização realizada aos três dias de crescimento

Cor Transparência Produção de Muco

Reação em meio YMA Número de isolados

Abundante Ácida 7

Moderada Ácida 79

Opaca Básica 2

Branca Ácida 14

Pouca Básica 1

Neutra 1

Translúcida Abundante Ácida 1

Moderada Ácida 9

Rosa Opaca Pouca Ácida 3

Total 117

3.2. CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DOS RIZÓBIOS POR REP-PCR

Constatou-se um grau elevado de polimorfismo de DNA entre as bactérias

investigadas, com a obtenção de 107 perfis distintos pela técnica de rep–PCR, pela

amplificação do DNA com o “primer” BOX A1R-PCR (Figura 2). A análise de agrupamento

dos produtos de amplificação por rep-PCR resultou na união de todos os isolados e estirpes de

referência em um nível de similaridade de apenas 27% (Figura 2). Vinte e quatro grupos

puderam ser observados no dendrograma, quando considerado o nível de similaridade de 70%

e, aproximadamente, 26% representando isolados únicos. Quatro grupos uniram bactérias com

perfis idênticos do mesmo solo. Como exemplos, os isolados de Cerro Alto, Palmeira 111,

113, 115 e 110 no grupo IV; no agrupamento XIV os isolados 75 e 74 da localidade Toca da

Onça no município de São José do Cerrito e de Bela Vista, Lages (102 e 103; 106 e 107).

Outros agrupamentos incluíram bactérias de perfis idênticos, mas que apresentavam origens

distintas: no grupo V (118 e 96; 95 e 87) e os isolados 63, 46 e 56 no grupo XVI (Figura 2).

Foi possível observar os agrupamentos conforme as regiões, onde a região 4, correspondente

ao planalto sul catarinense, reuniu 14 grupos em um nível de similaridade de 70%, sendo eles:

I, II, III, V, VII, X, XIV, XV, XVII, XIX, XX, XXI, XXII e XXIII. Nos agrupamentos IV,

35

VII e XVI ocorreu o predomínio da região 4 e apenas os grupos IX e XXIV como

representantes da região 3 (Figura 2).

As estirpes de referência apresentaram perfis bastante distintos em relação aos

isolados de Santa Catarina. Somente uma estirpe, a 116, isolada de Cerro Alto, Palmeira, foi

posicionada no mesmo grupo III com R. leguminosarum bv. phaseoli estirpe USDA 2671 e R.

gallicum bv. gallicum R602 em um nível de similaridade de 76% (Figura 2).

A análise também foi conduzida considerando cada uma das regiões. Na região 1,

correspondente ao extremo oeste incluindo Chapecó e Concórdia, foram agrupados doze

isolados e esses uniram-se em um nível de similaridade de 24% (Figura 3). A região 2

agrupou 13 isolados com uma similaridade de 31% (Figura 4) e, finalmente, a região 3 reuniu,

com 34% de similaridade, 92 isolados (Figura 5).

Não foi constatada correlação significativa entre nenhum dos índices de similaridade

genética (Figura 2) com os atributos químicos do solo (Tabela 2), ou climáticos (Tabela 1).

36

Similaridade (%)

Continua

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

50

45

40

35

30

28

62

94

61

104

68

32

99

44

64

USDA 2671

R602

116

93

25

111

113

115

110

118

96

58

95

87

90

21

91

01

92

60

77

12

22

18

CFN 299

19

35

59

15

23

65

H 152

06

106

107

71

82

54

70

10

09

117

66

86

02

30

03

05

51

Estação de Aquicultura - Lages

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Urupema 1600m

São José do Cerrito

Bela Vista - Lages

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Painel

Cadeados - Lages

Urupema

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Rhzizobium leguminosarum bv. phaseoli

Rhizobium gallicum bv. gallicum

Cerro Alto - Palmeira

Urupema 1600m

Curitibanos sentido Brunópolis

Cerro Alto - Palmeira

Urupema 1600m

São José do Cerrito

Urupema 1600m

Salto do Rio Caveiras - Lages

Curitibanos sentido Brunópolis

Urupema 1600m

Guatambu

Urupema 1600m

São José do Cerrito

Toca da Onça - São José do Cerrito

Peritiba

Curitibanos sentido Brunópolis

Brunópolis

Rhizobium tropici A

Brunópolis

Painel

São José do Cerrito

Campos Novos - Plantio Direto

Curitibanos sentido Brunópolis

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Rhizobium giardinii bv. giardinii

Palmitos

Bela Vista - Lages

Toca da Onça - São José do Cerrito

Guaiabeira - São José do Cerrito

São José do Cerrito

Toca da Onça - São José do Cerrito

Pinhalzinho

Cerro Alto - Palmeira

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Salto do Rio Caveiras - Lages

Guatambu

Estação de Aquicultura - Lages

Guatambu

Caxambu do Sul

Urupema

Grupo I

Grupo II

Grupo III

Grupo IV

Grupo V

Grupo VI

Grupo VII

Grupo VIII

Grupo IX

Grupo X

Grupo XI

Grupo XII

Grupo XIII

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

50

45

40

35

30

28

62

94

61

104

68

32

99

44

64

USDA 2671

R602

116

93

25

111

113

115

110

118

96

58

95

87

90

21

91

01

92

60

77

12

22

18

CFN 299

19

35

59

15

23

65

H 152

06

106

107

71

82

54

70

10

09

117

66

86

02

30

03

05

51

Estação de Aquicultura - Lages

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Urupema 1600m

São José do Cerrito

Bela Vista - Lages

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Painel

Cadeados - Lages

Urupema

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Rhzizobium leguminosarum bv. phaseoli

Rhizobium gallicum bv. gallicum

Cerro Alto - Palmeira

Urupema 1600m

Curitibanos sentido Brunópolis

Cerro Alto - Palmeira

Urupema 1600m

São José do Cerrito

Urupema 1600m

Salto do Rio Caveiras - Lages

Curitibanos sentido Brunópolis

Urupema 1600m

Guatambu

Urupema 1600m

São José do Cerrito

Toca da Onça - São José do Cerrito

Peritiba

Curitibanos sentido Brunópolis

Brunópolis

Rhizobium tropici A

Brunópolis

Painel

São José do Cerrito

Campos Novos - Plantio Direto

Curitibanos sentido Brunópolis

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Rhizobium giardinii bv. giardinii

Palmitos

Bela Vista - Lages

Toca da Onça - São José do Cerrito

Guaiabeira - São José do Cerrito

São José do Cerrito

Toca da Onça - São José do Cerrito

Pinhalzinho

Cerro Alto - Palmeira

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Salto do Rio Caveiras - Lages

Guatambu

Estação de Aquicultura - Lages

Guatambu

Caxambu do Sul

Urupema

Grupo I

Grupo II

Grupo III

Grupo IV

Grupo V

Grupo VI

Grupo VII

Grupo VIII

Grupo IX

Grupo X

Grupo XI

Grupo XII

Grupo XIII

37

Continuação

Similaridade (%)

Figura 2 - Dendrograma obtido pela análise dos produtos de amplificação BOX A1R-PCR, com o algoritmo

UPGMA e o coeficiente de Jaccard (J)

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

50

45

40

35

30

102

103

108

75

74

78

55

50

69

76

49

48

72

63

46

56

53

26

29

31

43

13

08

04

27

114

52

112

89

105

11

67

73

85

88

34

36

100

80

101

79

81

38

42

39

33

37

24

17

83

84

41

PRF 81

CFN 42

40

CIAT 899

98

97

14

16

20

57

45

47

07

Bela Vista - Lages

Toca da Onça - São José do Cerrito

Guaiabeira - São José do Cerrito

São José do Cerrito

Urupema

Toca da Onça - São José do Cerrito

Urupema

Toca da Onça - São José do Cerrito

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Urupema

São José do Cerrito

Urupema

Estação de Aquicultura - Lages

Cedro - Urupema

Ouro

Planaltina

Caxambu do Sul

Estação de Aquicultura - Lages

Cerro Alto - Palmeira

Urupema

Cerro Alto - Palmeira

Salto do Rio Caveiras - Lages

Bela Vista - Lages

Peritiba

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Toca da Onça - São José do Cerrito

Salto do Rio Caveiras - Lages

Painel

Cadeados - Lages

Guaiabeira - São José do Cerrito

Cadeados - Lages

Guaiabeira - São José do Cerrito

Painel

Curitibanos sentido Brunópolis

Brunópolis

Guaiabeira - São José do Cerrito

Salto do Rio Caveiras - Lages

Painel

Rhizobium tropici

Rhizobium etli

Painel

Rhizobium tropici B

Cadeados - Lages

Campos Novos - Plantio direto

Brunópolis

São José do Cerrito

Urupema

Planaltina

Grupo XIV

Grupo XV

Grupo XVI

Grupo XVII

Grupo XVIII

Grupo XIX

Grupo XX

Grupo XXI

Grupo XXII

Grupo XXIII

Grupo XXIV

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

50

45

40

35

30

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

50

45

40

35

30

102

103

108

75

74

78

55

50

69

76

49

48

72

63

46

56

53

26

29

31

43

13

08

04

27

114

52

112

89

105

11

67

73

85

88

34

36

100

80

101

79

81

38

42

39

33

37

24

17

83

84

41

PRF 81

CFN 42

40

CIAT 899

98

97

14

16

20

57

45

47

07

Bela Vista - Lages

Toca da Onça - São José do Cerrito

Guaiabeira - São José do Cerrito

São José do Cerrito

Urupema

Toca da Onça - São José do Cerrito

Urupema

Toca da Onça - São José do Cerrito

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Urupema

São José do Cerrito

Urupema

Estação de Aquicultura - Lages

Cedro - Urupema

Ouro

Planaltina

Caxambu do Sul

Estação de Aquicultura - Lages

Cerro Alto - Palmeira

Urupema

Cerro Alto - Palmeira

Salto do Rio Caveiras - Lages

Bela Vista - Lages

Peritiba

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Toca da Onça - São José do Cerrito

Salto do Rio Caveiras - Lages

Painel

Cadeados - Lages

Guaiabeira - São José do Cerrito

Cadeados - Lages

Guaiabeira - São José do Cerrito

Painel

Curitibanos sentido Brunópolis

Brunópolis

Guaiabeira - São José do Cerrito

Salto do Rio Caveiras - Lages

Painel

Rhizobium tropici

Rhizobium etli

Painel

Rhizobium tropici B

Cadeados - Lages

Campos Novos - Plantio direto

Brunópolis

São José do Cerrito

Urupema

Planaltina

Grupo XIV

Grupo XV

Grupo XVI

Grupo XVII

Grupo XVIII

Grupo XIX

Grupo XX

Grupo XXI

Grupo XXII

Grupo XXIII

Grupo XXIV

38

Similaridade (%)

Figura 3 – Dendrograma obtido pela análise dos produtos de amplificação BOX A1R-PCR, com o algoritmo

UPGMA e o coeficiente de Jaccard (J) de isolados de feijoeiro da região 1 do estado de Santa

Catarina

Similaridade (%)

Figura 4 – Dendrograma obtido pela análise dos produtos de amplificação BOX A1R-PCR, com o algoritmo

UPGMA e o coeficiente de Jaccard (J) de isolados de feijoeiro da região 2 do estado de Santa

Catarina

100

90

80

70

60

50

40

30

BOX

05

03

02

10

09

06

12

04

08

11

01

07

Caxambu do Sul

Guatambu

Pinhalzinho

Palmitos

Peritiba

Caxambu do Sul

Planaltina

Peritiba

Guatambu

Planaltina

100

90

80

70

60

50

40

30

100

90

80

70

60

50

40

30

BOX

05

03

02

10

09

06

12

04

08

11

01

07

Caxambu do Sul

Guatambu

Pinhalzinho

Palmitos

Peritiba

Caxambu do Sul

Planaltina

Peritiba

Guatambu

Planaltina

BOXBOX

05

03

02

10

09

06

12

04

08

11

01

07

Caxambu do Sul

Guatambu

Pinhalzinho

Palmitos

Peritiba

Caxambu do Sul

Planaltina

Peritiba

Guatambu

Planaltina

100

90

80

70

60

50

40

30

100

90

80

70

60

50

40

30

BOX

05

03

02

10

09

06

12

04

08

11

01

07

Caxambu do Sul

Guatambu

Pinhalzinho

Palmitos

Peritiba

Caxambu do Sul

Planaltina

Peritiba

Guatambu

Planaltina

BOXBOX

05

03

02

10

09

06

12

04

08

11

01

07

Caxambu do Sul

Guatambu

Pinhalzinho

Palmitos

Peritiba

Caxambu do Sul

Planaltina

Peritiba

Guatambu

Planaltina

100

90

80

70

60

50

40

30

100

90

80

70

60

50

40

30

BOXBOX

05

03

02

10

09

06

12

04

08

11

01

07

Caxambu do Sul

Guatambu

Pinhalzinho

Palmitos

Peritiba

Caxambu do Sul

Planaltina

Peritiba

Guatambu

Planaltina

BOXBOX

05

03

02

10

09

06

12

04

08

11

01

07

Caxambu do Sul

Guatambu

Pinhalzinho

Palmitos

Peritiba

Caxambu do Sul

Planaltina

Peritiba

Guatambu

Planaltina

100

90

80

70

60

50

40

BOX

100

90

80

70

60

50

40

BOX

22

25

21

16

20

19

15

23

13

18

24

17

14

Curitibanos sentido Brunópolis

Brunópolis

Campos Novos – Plantio direto

Curitibanos sentido Brunópolis

Ouro

Brunópolis

Curitibanos sentido Brunópolis

Brunópolis

Campos Novos - Plantio direto

22

25

21

16

20

19

15

23

13

18

24

17

14

Curitibanos sentido Brunópolis

Brunópolis

Campos Novos – Plantio direto

Curitibanos sentido Brunópolis

Ouro

Brunópolis

Curitibanos sentido Brunópolis

Brunópolis

Campos Novos - Plantio direto

Curitibanos sentido Brunópolis

Brunópolis

Campos Novos – Plantio direto

Curitibanos sentido Brunópolis

Ouro

Brunópolis

Curitibanos sentido Brunópolis

Brunópolis

Campos Novos - Plantio direto

39

Figura 5 – Dendrograma obtido pela análise dos produtos de amplificação BOX A1R-PCR, com o algoritmo

UPGMA e o coeficiente de Jaccard (J) de isolados de feijoeiro da região 3 do estado de Santa

Catarina

100

90

80

70

60

50

40

BOX

54

67

70

117

85

52

89

91

28

62

94

61

68

32

99

44

64

118

96

58

95

87

90

111

113

115

110

93

35

59

116

83

88

76

112

69

48

49

26

29

53

63

46

56

27

31

50

55

75

74

78

66

30

114

65

86

43

73

82

71

34

36

80

100

72

79

81

38

42

39

60

77

92

98

97

51

57

41

33

37

45

47

84

40

São José do Cerrito

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Toca da Onça - São José do Cerrito

Cerro Alto - Palmeira

Salto do Rio Caveiras - Lages

Urupema

Salto do Rio Caveiras - Lages

Urupema 1600m

Estação de Aquicultura - Lages

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Urupema 1600m

São José do Cerrito

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Painel

Cadeados - Lages

Urupema

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Cerro Alto - Palmeira

Urupema 1600m

São José do Cerrito

Urupema 1600m

Salto do Rio Caveiras - Lages

Cerro Alto - Palmeira

Urupema 1600m

Painel

São José do Cerrito

Cerro Alto - Palmeira

Guaiabeira - São José do Cerrito

Salto do Rio Caveiras - Lages

Toca da Onça - São José do Cerrito

Cerro Alto - Palmeira

Toca da Onça - São José do Cerrito

Urupema

Estação de Aquicultura - Lages

Urupema

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Urupema

São José do Cerrito

Estação de Aquicultura - Lages

Urupema

São José do Cerrito

Toca da Onça - São José do Cerrito

Guaiabeira - São José do Cerrito

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Estação de Aquicultura - Lages

Cerro Alto - Palmeira

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Salto do Rio Caveiras - Lages

Cedro - Urupema

Toca da Onça - São José do Cerrito

Guaiabeira - São José do Cerrito

Toca da Onça - São José do Cerrito

Painel

Guaiabeira - São José do Cerrito

Cadeados - Lages

Toca da Onça - São José do Cerrito

Guaiabeira - São José do Cerrito

Painel

São José do Cerrito

Toca da Onça - São José do Cerrito

Urupema 1600m

Cadeados - Lages

Urupema

São José do Cerrito

Painel

Urupema

Salto do Rio Caveiras - Lages

Painel

100

90

80

70

60

50

40

BOX

100

90

80

70

60

50

40

BOX

54

67

70

117

85

52

89

91

28

62

94

61

68

32

99

44

64

118

96

58

95

87

90

111

113

115

110

93

35

59

116

83

88

76

112

69

48

49

26

29

53

63

46

56

27

31

50

55

75

74

78

66

30

114

65

86

43

73

82

71

34

36

80

100

72

79

81

38

42

39

60

77

92

98

97

51

57

41

33

37

45

47

84

40

São José do Cerrito

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Toca da Onça - São José do Cerrito

Cerro Alto - Palmeira

Salto do Rio Caveiras - Lages

Urupema

Salto do Rio Caveiras - Lages

Urupema 1600m

Estação de Aquicultura - Lages

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Urupema 1600m

São José do Cerrito

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Painel

54

67

70

117

85

52

89

91

28

62

94

61

68

32

99

44

64

118

96

58

95

87

90

111

113

115

110

93

35

59

116

83

88

76

112

69

48

49

26

29

53

63

46

56

27

31

50

55

75

74

78

66

30

114

65

86

43

73

82

71

34

36

80

100

72

79

81

38

42

39

60

77

92

98

97

51

57

41

33

37

45

47

84

40

São José do Cerrito

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Toca da Onça - São José do Cerrito

Cerro Alto - Palmeira

Salto do Rio Caveiras - Lages

Urupema

Salto do Rio Caveiras - Lages

Urupema 1600m

Estação de Aquicultura - Lages

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Urupema 1600m

São José do Cerrito

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Painel

Cadeados - Lages

Urupema

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Cerro Alto - Palmeira

Urupema 1600m

São José do Cerrito

Urupema 1600m

Salto do Rio Caveiras - Lages

Cerro Alto - Palmeira

Urupema 1600m

Painel

São José do Cerrito

Cerro Alto - Palmeira

Guaiabeira - São José do Cerrito

Salto do Rio Caveiras - Lages

Toca da Onça - São José do Cerrito

Cerro Alto - Palmeira

Toca da Onça - São José do Cerrito

Urupema

Estação de Aquicultura - Lages

Urupema

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Urupema

São José do Cerrito

Estação de Aquicultura - Lages

Urupema

São José do Cerrito

Toca da Onça - São José do Cerrito

Guaiabeira - São José do Cerrito

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Estação de Aquicultura - Lages

Cerro Alto - Palmeira

Sto Antonio dos Pinhos - São José do Cerrito

Salto do Rio Caveiras - Lages

Cedro - Urupema

Toca da Onça - São José do Cerrito

Guaiabeira - São José do Cerrito

Toca da Onça - São José do Cerrito

Painel

Guaiabeira - São José do Cerrito

Cadeados - Lages

Toca da Onça - São José do Cerrito

Guaiabeira - São José do Cerrito

Painel

São José do Cerrito

Toca da Onça - São José do Cerrito

Urupema 1600m

Cadeados - Lages

Urupema

São José do Cerrito

Painel

Urupema

Salto do Rio Caveiras - Lages

Painel

40

3.3. PCR-RFLP DO GENE RIBOSSOMAL 16S

Os 117 isolados obtidos neste estudo também foram avaliados pela técnica PCR-RFLP

do gene ribossomal 16S (Laguerre et al., 1994). Os produtos de PCR foram digeridos com as

enzimas HhaI, HpaII e RsaI, respectivamente. No caso das restrições com a enzima RsaI, em

alguns isolados foram obtidos fragmentos que quando somados, resultaram em 2.200 a 2.400

pb, o que pode indicar a existência de mais de uma cópia do gene. A digestão com as demais

enzimas de restrição, HhaI e HpaII, resultou em fragmentos que, somados, resultaram em,

aproximadamente, 1.500 pb.

O dendrograma obtido com os produtos de restrição mostra que os isolados agruparam

em um nível final de similaridade bastante baixo, de 31% e 6 grupos principais puderam ser

definidos, em adição a 5 isolados que ocuparam posições isoladas. (Figura 6).

O grupo I incluiu dois isolados com 100% de similaridade, o isolado 92 de Urupema

(1.600m de altitude, com pastagem de inverno e, posteriormente, cultivado com feijão no

sistema de plantio convencional) e o isolado 14 de Campos Novos (plantio direto), agruparam

com a estirpe tipo R. giardinii bv. giardinii H152 em um nível de similaridade de 94% (Figura

6).

No grupo II reuniu 19 isolados e mostrou 100% de identidade com as estirpes de

referências R. tropici PRF 81, R. tropici tipo B CIAT 899

T

. Já o isolado 12, do extremo oeste,

de Peritiba, foi o único que agrupou com a estirpe R. tropici tipo A estirpe CFN 299, com uma

similaridade de 93,3%, formando o grupo III (Figura 6).

Cinco isolados foram unidos em um nível final de similaridade de 94,4% no grupo IV,

com dois subgrupos, o primeiro com dois isolados com semelhança total, 106 e 107, ambos de

Bela Vista, Lages, e o segundo com três isolados de perfis idênticos, dois do extremo oeste e

um do planalto sul catarinense (Figura 6).

41

O grupo V reuniu com 100% de similaridade entre si, 38 isolados com R.

leguminosarum bv. phaseoli USDA 2671 e, também, com R. gallicum bv. gallicum R602

T

. A

seguir, dois isolados, 116 e 105 diferiram do grupo V ocupando posições isoladas (Figura 6).

O grupo VI foi o que incluiu o maior número de isolados, 42, mostrando 100% de

similaridade com a estirpe tipo da espécie R. etli CFN 42

T

.

Nenhuma estirpe de referência foi agrupada no grupo VII, apenas dois isolados de

Pinhalzinho e um de Palmitos, unidos em um nível final de similaridade de 100%.

As estirpes 99, 23, 24, 98 e 97 apresentaram perfis bastante distintos dos demais, com

nível de similaridade inferior a 60%.

Também não houve correlação significativa entre os índices de diversidade genética

por PCR-RFLP (Figura 6) e os atributos químicos do solo (Tabela 2), ou com os dados

climáticos (Tabela1).

42

Similaridade (%)

Grupo I

Grupo II

Grupo III

Grupo VI

Grupo VIII

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

50

45

40

35

30

RFLP HhaI

RFLP HpaII

RFLP RsaI

92

14

H 152

39

79

81

80

83

84

82

101

100

38

33

41

40

PRF 81

42

22

25

34

37

36

CIAT 899

12

CFN 299

106

107

77

07

01

60

72

88

90

89

94

93

118

96

95

87

21

19

35

54

63

59

85

16

18

20

28

17

117

44

104

111

113

112

115

110

32

USDA 2671

58

62

61

67

68

70

R 602

116

105

45

73

75

76

74

CFN 42

86

78

91

05

04

11

43

66

64

52

08

15

13

26

27

30

47

46

102

103

108

48

02

114

31

50

55

51

03

56

49

57

69

65

53

29

71

10

09

06

98

97

23

99

24

Urupema 1600m (20)

Campos Novos (8)

Rhizobium giardinii bv. giardinii

Painel (12)

Guaiabeira (18)

Salto do Rio Caveiras (19)

Guaiabeira (18)

Cadeados (21)

Painel (12)

Rhizobium tropici

Painel (12)

Curitibanos (10)

Painel (12)

Rhizobium tropici B

Peritiba (6)

Rhizobium tropici A

Bela Vista (22)

Toca da Onça (17)

Planaltina (4)

Guatambu (1)

São José do Cerrito (15)

Toca da Onça (17)

Salto do Rio Caveiras (19)

Urupema 1600m (20)

Cerro Alto (23)

Urupema 1600m (20)

Salto do Rio Caveiras (19)

Curitibanos (10)

Brunópolis (9)

Painel (12)

São José do Cerrito (15)

Sto Antonio dos Pinhos (16)

São José do Cerrito (15)

Salto do Rio Caveiras (19)

Brunópolis (9)

Estação de Aquicultura (11)

Brunópolis (9)

Cerro Alto (23)

Urupema (14)

Bela Vista (22)

Cerro Alto (23)

Painel (12)

Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli

São José do Cerrito (15)

Sto Antonio dos Pinhos (16)

São José do Cerrito (15)

Sto Antonio dos Pinhos (16)

Toca da Onça (17)

Rhizobium gallicum bv. gallicum

Cerro Alto (23)

Bela Vista (22)

Urupema (14)

Toca da Onça (17)

Rhizobium etli

Salto do Rio Caveiras (19)

Guaiabeira (18)

Urupema 1600m (20)

Caxambu do Sul (2)

Peritiba (6)

Cedro (13)

Sto Antonio dos Pinhos (16)

Urupema (14)

Planaltina (4)

Campos Novos (8)

Ouro (7)

Estação de Aquicultura (11)

Urupema (14)

Bela Vista (22)

Urupema (14)

Guatambu (1)

Cerro Alto (23)

Estação de Aquicultura (11)

Urupema (14)

São José do Cerrito (15)

Urupema (14)

Guatambu (1)

São José do Cerrito (15)

Urupema (14)

São José do Cerrito (15)

Toca da Onça (17)

Sto Antonio dos Pinhos (17)

Urupema (14)

Estação de Aquicultura (11)

Toca da Onça (17)

Pinhalzinho (5)

Palmitos (3)

Cadeados (21)

Curitibanos (10)

Cadeados (21)

Curitibanos (10)

Grupo IV

Grupo VII

Grupo V

Grupo I

Grupo II

Grupo III

Grupo VI

Grupo VIII

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

50

45

40

35

30

RFLP HhaI

RFLP HpaII

RFLP RsaI

92

14

H 152

39

79

81

80

83

84

82

101

100

38

33

41

40

PRF 81

42

22

25

34

37

36

CIAT 899

12

CFN 299

106

107

77

07

01

60

72

88

90

89

94

93

118

96

95

87

21

19

35

54

63

59

85

16

18

20

28

17

117

44

104

111

113

112

115

110

32

USDA 2671

58

62

61

67

68

70

R 602

116

105

45

73

75

76

74

CFN 42

86

78

91

05

04

11

43

66

64

52

08

15

13

26

27

30

47

46

102

103

108

48

02

114

31

50

55

51

03

56

49

57

69

65

53

29

71

10

09

06

98

97

23

99

24

Urupema 1600m (20)

Campos Novos (8)

Rhizobium giardinii bv. giardinii

Painel (12)

Guaiabeira (18)

Salto do Rio Caveiras (19)

Guaiabeira (18)

Cadeados (21)

Painel (12)

Rhizobium tropici

Painel (12)

Curitibanos (10)

Painel (12)

Rhizobium tropici B

Peritiba (6)

Rhizobium tropici A

Bela Vista (22)

Toca da Onça (17)

Planaltina (4)

Guatambu (1)

São José do Cerrito (15)

Toca da Onça (17)

Salto do Rio Caveiras (19)

Urupema 1600m (20)

Cerro Alto (23)

Urupema 1600m (20)

Salto do Rio Caveiras (19)

Curitibanos (10)

Brunópolis (9)

Painel (12)

São José do Cerrito (15)

Sto Antonio dos Pinhos (16)

São José do Cerrito (15)

Salto do Rio Caveiras (19)

Brunópolis (9)

Estação de Aquicultura (11)

Brunópolis (9)

Cerro Alto (23)

Urupema (14)

Bela Vista (22)

Cerro Alto (23)

Painel (12)

Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli

São José do Cerrito (15)

Sto Antonio dos Pinhos (16)

São José do Cerrito (15)

Sto Antonio dos Pinhos (16)

Toca da Onça (17)

Rhizobium gallicum bv. gallicum

Cerro Alto (23)

Bela Vista (22)

Urupema (14)

Toca da Onça (17)

Rhizobium etli

Salto do Rio Caveiras (19)

Guaiabeira (18)

Urupema 1600m (20)

Caxambu do Sul (2)

Peritiba (6)

Cedro (13)

Sto Antonio dos Pinhos (16)

Urupema (14)

Planaltina (4)

Campos Novos (8)

Ouro (7)

Estação de Aquicultura (11)

Urupema (14)

Bela Vista (22)

Urupema (14)

Guatambu (1)

Cerro Alto (23)

Estação de Aquicultura (11)

Urupema (14)

São José do Cerrito (15)

Urupema (14)

Guatambu (1)

São José do Cerrito (15)

Urupema (14)

São José do Cerrito (15)

Toca da Onça (17)

Sto Antonio dos Pinhos (17)

Urupema (14)

Estação de Aquicultura (11)

Toca da Onça (17)

Pinhalzinho (5)

Palmitos (3)

Cadeados (21)

Curitibanos (10)

Cadeados (21)

Curitibanos (10)

Grupo IV

Grupo VII

Grupo V

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

50

45

40

35

30

RFLP HhaI

RFLP HpaII

RFLP RsaI

92

14

H 152

39

79

81

80

83

84

82

101

100

38

33

41

40

PRF 81

42

22

25

34

37

36

CIAT 899

12

CFN 299

106

107

77

07

01

60

72

88

90

89

94

93

118

96

95

87

21

19

35

54

63

59

85

16

18

20

28

17

117

44

104

111

113

112

115

110

32

USDA 2671

58

62

61

67

68

70

R 602

116

105

45

73

75

76

74

CFN 42

86

78

91

05

04

11

43

66

64

52

08

15

13

26

27

30

47

46

102

103

108

48

02

114

31

50

55

51

03

56

49

57

69

65

53

29

71

10

09

06

98

97

23

99

24

Urupema 1600m (20)

Campos Novos (8)

Rhizobium giardinii bv. giardinii

Painel (12)

Guaiabeira (18)

Salto do Rio Caveiras (19)

Guaiabeira (18)

Cadeados (21)

Painel (12)

Rhizobium tropici

Painel (12)

Curitibanos (10)

Painel (12)

Rhizobium tropici B

Peritiba (6)

Rhizobium tropici A

Bela Vista (22)

Toca da Onça (17)

Planaltina (4)

Guatambu (1)

São José do Cerrito (15)

Toca da Onça (17)

Salto do Rio Caveiras (19)

Urupema 1600m (20)

Cerro Alto (23)

Urupema 1600m (20)

Salto do Rio Caveiras (19)

Curitibanos (10)

Brunópolis (9)

Painel (12)

São José do Cerrito (15)

Sto Antonio dos Pinhos (16)

São José do Cerrito (15)

Salto do Rio Caveiras (19)

Brunópolis (9)

Estação de Aquicultura (11)

Brunópolis (9)

Cerro Alto (23)

Urupema (14)

Bela Vista (22)

Cerro Alto (23)

Painel (12)

Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli

São José do Cerrito (15)

Sto Antonio dos Pinhos (16)

São José do Cerrito (15)

Sto Antonio dos Pinhos (16)

Toca da Onça (17)

Rhizobium gallicum bv. gallicum

Cerro Alto (23)

Bela Vista (22)

Urupema (14)

Toca da Onça (17)

Rhizobium etli

Salto do Rio Caveiras (19)

Guaiabeira (18)

Urupema 1600m (20)

Caxambu do Sul (2)

Peritiba (6)

Cedro (13)

Sto Antonio dos Pinhos (16)

Urupema (14)

Planaltina (4)

Campos Novos (8)

Ouro (7)

Estação de Aquicultura (11)

Urupema (14)

Bela Vista (22)

Urupema (14)

Guatambu (1)

Cerro Alto (23)

Estação de Aquicultura (11)

Urupema (14)

São José do Cerrito (15)

Urupema (14)

Guatambu (1)

São José do Cerrito (15)

Urupema (14)

São José do Cerrito (15)

Toca da Onça (17)

Sto Antonio dos Pinhos (17)

Urupema (14)

Estação de Aquicultura (11)

Toca da Onça (17)

Pinhalzinho (5)

Palmitos (3)

Cadeados (21)

Curitibanos (10)

Cadeados (21)

Curitibanos (10)

Grupo IV

Grupo VII

Grupo V

Figura 6 – Dendrograma obtido pela análise por RFLP-PCR da região 16S rRNA com o algoritmo UPGMA e o

coeficiente de Jaccard (J)

43

O agrupamento produzido para cada enzima também foi representado por uma letra

minúscula (Tabela 5), sendo possível comparar os isolados com todas as enzimas e agrupar as

que apresentaram perfis enzimáticos semelhantes. Das três enzimas estudadas, nenhuma

conseguiu diferenciar, isoladamente, as espécies, porém, individualmente, para as enzimas

HhaI e HpaII foi possível diferenciar a espécie tipo R. tropici tipo A CFN 299 das demais. A

enzima RsaI produziu perfil semelhante com todas as espécies, exceto para R. etli CFN 42

T

.

De acordo com a Tabela 5, 35,9% dos isolados analisados apresentaram perfil semelhante à

espécie R. etli, e a ocorrência dessas bactérias foi generalizada em todos as regiões. Foram

obtidos oito perfis distintos com a enzima HhaI, dez com a enzima HpaII e sete com a RsaI.

Considerando as três enzimas de restrição, os isolados de Santa Catarina foram classificados

em 13 combinações distintas de perfis.

Tabela 5 - Perfis de PCR-RFLP da região 16S rRNA em isolados de rizóbios de feijoeiro do estado de Santa

Catarina

HhaI HpaII RsaI Estirpes % Total

a a a 01, 07, 77 2,56

a d a 14, 92 1,71

a e a 106, 107 1,71

b b a 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 32, 35, 44, 54, 58, 59, 60,

61, 62, 63, 67, 68, 70, 72, 85, 87, 88, 89, 90, 93, 94,

95, 96, 104, 105, 110, 111, 112, 113, 115, 116, 117,

118, USDA 2671, R602

32,5

b b b 02, 03, 04, 05, 08, 11, 13, 15, 26, 27, 29, 30, 31, 43,

45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 64, 65,

66, 69, 71, 73, 74, 75, 76, 78, 86, 91, 102, 103, 108,

114, CFN 42

35,9

b c a 06, 09, 10 2,56

b d a H 152 0,85

b b c 105,116 1,71

c d a 22, 25, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 79, 80, 81,

82, 83, 84, 100, 101, PRF 81, CIAT 899

16,23

c j a 12 0,85

d f d 97, 98 1,71

e g e 24 0,85

f h f 23 0,85

g j g 99 0,85

h j a CFN 299 0,85

44

4. DISCUSSÃO

É possível que os isolados de rizóbios obtidos de nódulos de feijoeiro sejam nativos,

pois nenhuma das áreas consideradas tem histórico de inoculação. Contudo, há tradição de

cultivo do feijoeiro na maioria das regiões estudadas no estado de Santa Catarina, podendo o

rizóbio ter vindo nas sementes, que podem carregar várias células viáveis, conforme relatado

por Pérez-Ramirez e colaboradores (1998).

Em relação à distribuição das espécies de rizóbios do feijoeiro no mundo, tem sido

argumentado que, nos locais onde a leguminosa foi introduzida pela região Mesoamericana,

ou do norte da Argentina, as sementes devem ter carregado R. etli; posteriormente, a

colonização européia e o comércio com Europa e África poderiam explicar a presença dessa

espécie na Espanha, Senegal e Áustria (Aguilar et al., 1998; Pérez-Ramirez et al., 1998). De

modo semelhante, R. tropici parece ser nativa da região tropical da América do Sul (Martínez-

Romero et al., 1991) e, como a espécie também tem sido encontrada em algumas regiões da

África e diversos locais da França, também pode ter sido introduzida nesses locais por vias

comerciais (Amarger et al., 1993, 1994, 1995; Anyango et al., 1995).

Das 33 coletas realizadas, em dez áreas não foi obtido nenhum isolado, o que pode

estar relacionado com os teores de N no solo superiores a 169,00 mg dm

-3

encontrados nestes

locais, indicando a aplicação de adubos nitrogenados. Apesar do feijoeiro ser uma planta com

grande capacidade de aproveitamento do N disponível no solo, sabe-se que a associação

simbiótica é muito sensível à presença do N mineral e tende a afetar negativamente o processo

de FBN (Straliotto et al., 2006).

45

Observando os grupos formados com os isolados pela técnica de PCR-RFLP do gene

ribossomal 16S no grupo I, no qual se encontram as estirpes de R. tropici PRF 81, CIAT 899

T

(tipo B) e CFN 299 (tipo A), somente isolados das regiões 3 e 4 foram agrupados, e, os solos

dessas regiões são caracterizados por valores de pH inferiores aos das demais regiões, sendo o

valor médio de pH de 4,9 ± 0,5. Anyango e colaboradores (1995) mostraram que, no Quênia,

R. tropici é a espécie dominante em pH 4,5, enquanto que, em pH alcalino, havia dominância

de R. etli. De modo semelhante, nos Cerrados brasileiros, 98% da população em solo com pH

4,8 foi constituída de R. tropici, decrescendo para 80% quando o pH foi incrementado, por

calagem, para 5,5 (Hungria et al., 1997). Além disso, houve uma tendência de predominância

de R. giardinii bv. giardinii, em pH 5,7 ± 0,1, de R. etli em pH 5,9 ± 0,5 e de R.

leguminosarum bv. phaseoli e R. gallicum bv. gallicum em pH de 5,4 ± 0,6.

A análise das estirpes pela técnica de RFLP não detectou diferenças genéticas entre as

espécies R. leguminosarum bv. phaseoli USDA 2671 e R. gallicum bv. gallicum R602. É

provável, porém, que as estirpes pertençam à espécie R. leguminosarum bv. phaseoli, que já

foi isolada de vários locais do Brasil (Mercante et al., 1998; Straliotto et al., 1999; Mostasso

et al., 2002; Giongo et al., 2006). Até o presente momento, de todas as espécies nodulantes do

feijoeiro, somente R. gallicum bv. gallicum ainda não foi encontrada nos solos brasileiros

(Mostasso et al., 2002). O fato de não ocorrer diferenciação entre estas duas espécies

comprometeu a identificação de 40 isolados nativos neste estudo. Por exemplo, os isolados

111, 113, 115 e 110, da localidade de Cerro Alto, são idênticos, tanto pela análise de RFLP,

quanto pela análise por BOX A1R-PCR. A diferenciação dessas espécies poderá ser possível

pelo uso de uma outra enzima de restrição, ou pelo seqüenciamento do gene 16S rRNA.

Por outro lado, 42 isolados nativos foram agrupados com R. etli CFN 42

T

. Embora

diversos estudos no Brasil tenham identificado R. tropici como a espécie predominante

(Mercante et al., 1998; Straliotto et al., 1999; Hungria et al., 2000; Mostasso et al., 2002), a

46

maioria dos isolados desses estudos são provenientes da região dos Cerrados. Essa região

apresenta algumas peculiaridades quando comparada às demais regiões brasileiras, como

longos períodos de seca, temperaturas freqüentemente acima de 40ºC e solos extremamente

ácidos (Hungria & Vargas, 2000). Além disso, estudos recentes mostram que R. etli pode

ocorrer de modo abundante em solos brasileiros (Grange & Hungria, 2004), quando isolado a

partir de diluições de solo. Conforme já comentado, R. etli predomina na região noroeste da

Argentina (Aguilar et al., 2006) e essa pode ter sido a via de introdução da espécie em Santa

Catarina. Os isolados identificados como R. etli foram posicionados, pela análise de BOX

A1R-PCR, nos agrupamentos XII, XIII, XIV, XV e XVI, em um nível final de similaridade

de 61%.

Os isolados 01, 06, 07, 09, 10, 23, 24, 77, 97, 98, 99, 105, 106, 107 e 116 não

formaram agrupamento com nenhuma das cinco espécies já descritas de rizóbios

microssimbiontes do feijoeiro, de modo que podem representar novas espécies de rizóbios.

47

CONCLUSÕES

Esse estudo é um dos primeiros realizados no estado de Santa Catarina e contribui para

o conhecimento da biodiversidade brasileira de rizóbios associados à cultura do feijoeiro.

Considerando a análise de RFLP-PCR do gene 16S rRNA, houve indicação de que devem

estar presentes, nos solos de Santa Catarina, 13 espécies capazes de nodular o feijoeiro. A

população nos solos das três regiões produtoras de Santa Catarina, capturada a campo com

feijoeiro e investigada neste estudo, consistiu de 17,1% de R. tropici, 35,9% de R. etli, 32,5%

de R. leguminosarum, 1,7% com R. giardinii e 12,8% dos isolados não foram classificados em

nenhuma das espécies descritas como simbiontes do feijoeiro. Como, até o presente momento,

existem apenas cinco espécies descritas como microssimbiontes dessa leguminosa, os

resultados indicam que novas espécies de rizóbios devem ser descritas a partir dos isolados

obtidos em Santa Catarina. Além disso, deve-se destacar a diversidade genética

intraespecífica elevada, que foi evidenciada pela análise por BOX A1R-PCR, uma vez que

107 perfis distintos foram obtidos na análise dos 117 isolados disponíveis. Essa diversidade

genética elevada pode representar uma fonte importante de genes para a agricultura e para o

meio ambiente, bem como de estirpes com maior capacidade de fixação biológica do N

2

.

48

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