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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
Faculdade de Medicina
AVALIAÇÃO DA TÉCNICA DO IRMA PARA
DOSAGEM DOS PEPTÍDEOS VASOATIVOS
(ANP E BNP) EM SANGUE FETAL
Erika Milhomens Brescia
Belo Horizonte-MG
2006
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Erika Milhomens Brescia
AVALIAÇÃO DA TÉCNICA DO IRMA PARA
DOSAGEM DOS PEPTÍDEOS VASOATIVOS
(ANP E BNP) EM SANGUE FETAL
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-
Graduação da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal de Minas Gerais, como
requisito parcial para a obtenção do título de
Mestre.
Área de concentração: Saúde da Mulher.
Orientador: Prof. Dr. Antônio Carlos Vieira
Cabral.
Faculdade de Medicina da UFMG
Belo Horizonte-MG
2006
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Aos meus pais, com muito amor,
por tudo o que eles representam na minha vida.
AGRADECIMENTOS
Meus eternos agradecimentos ao meu orientador Prof. Dr. Antônio Carlos Vieira
Cabral, pela oportunidade, pelo exemplo e por todo o conhecimento passado.
Ao Prof. Dr. Henrique Vitor Leite, que realizou junto com o Prof. Dr. Antônio
Carlos Vieira Cabral a coleta de todas amostras e pela sua disponibilidade
sempre.
À Dra. Zilma Nogueira Reis, pela enorme paciência e ajuda em vários momentos,
principalmente com a estatística, e por fornecer o banco de dados.
À mestranda Jacqueline Braga Pereira Dantas, pelo carinho, amizade e por
realizar a dosagem dos peptídeos.
À Prof. Dra. Adelina Martha dos Reis, que cedeu o laboratório para a realização
das dosagens.
À Dra. Eura Martins Lage, pelo exemplo de dedicação e pela atenção a mim
dispensada.
A todos os membros do CEMEFE que direta ou indiretamente colaboraram para a
realização deste estudo.
À Cris, pelo incentivo, Tony, pelo amor e compreensão, amigos e familiares, pelo
apoio sempre.
Ao CNPq, cuja bolsa possibilitou chegar até o final.
“O que sabemos é uma gota.
O que ignoramos é um oceano.”
Isaac Newton (1643-1727)
RESUMO
Para avaliar a técnica do IRMA (ensaio imunorradiométrico) na dosagem dos
peptídeos vasoativos - ANP e BNP - em sangue fetal, realizou-se um estudo descritivo
transversal, no qual foram incluídas 17 gestantes com idade gestacional entre 23 e 33
semanas. Todas haviam sido encaminhadas ao Centro de Medicina Fetal (CEMEFE) do
Hospital das Clínicas (HC) da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) em 2002,
com indicação de cordocentese para realização de exames tradicionais, como
hematimetria (em mães isoimunizadas) e cariótipos de fetos malformados, além de
transfusão intra-uterina. As gestantes assinaram o termo de concordância em participar
do estudo antes de serem incluídas. A coleta da amostra sanguínea fetal foi realizada
pela equipe do CEMEFE por meio de cordocentese, e obtida da veia do cordão umbilical
dos fetos. O volume de sangue retirado, variando entre 1 e 2ml, foi colocado em tubos
Vacutainer® contendo EDTA (ácido etilenodiaminotetracético). A amostra de sangue fetal
foi encaminhada ao Laboratório de Medicina Fetal do CEMEFE para ser centrifugada (10
minutos a 4.000 rpm, a 4ºC). O plasma obtido foi acondicionado em tubo de eppendorf de
2ml e em seguida armazenado em nitrogênio líquido a -196ºC. Para realizar as dosagens
do ANP e do BNP, foram utilizados kits da marca SHIONOGI & Co. Ltd., Osaka-Japan.
As dosagens foram realizadas no Laboratório de Endocrinologia e Metabolismo do
Instituto de Ciências Biológicas (ICB) da UFMG. O valor mínimo de ANP encontrado foi
26pg/ml e o máximo 655,2pg/ml. Já as concentrações do BNP variaram entre 11,9pg/ml e
284,9pg/ml. Nos fetos que apresentaram níveis de hemoglobina (Hb) menor que 10g/dl,
considerados anêmicos, a média da Hb fetal foi 6,56g/dl, enquanto nos fetos não
anêmicos (Hb ≥ 10g/dl) o valor médio de Hb fetal encontrado foi 12,56g/dl. Não se
verificou associação entre os níveis de Hb pré transfusão intra-uterina (TIU) e o ANP
(p=0,491). Já o BNP mostrou correlação positiva com os valores de Hb fetais (p=0,010).
Os resultados encontrados mostraram que a técnica do IRMA é confiável para dosar os
peptídeos vasoativos (ANP e BNP) em sangue fetal.
Palavras-chave: Peptídeos vasoativos ANP e BNP. Sangue fetal. IRMA.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACTH Hormônio adreno-corticotrófico
ANF Atrial natriuretic factor (fator atrial natriurético)
ANP Atrial natriuretic peptide (peptídeo atrial natriurético)
BNP Brain natriuretic peptide (peptídeo natriurético tipo-B ou peptídeo
cerebral natriurético)
CEMEFE Centro de Medicina Fetal
CNH Hormônio natriurético cardíaco
CNP C-type natriuretic peptide (peptídeo natriurético tipo-C)
COEP Comitê Ético de Pesquisa em Humanos
ECL Eletroquimiluminescência
ECLIA Imunoensaio por eletroquimiluminescência
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
GC Guanilato ciclase
GMPc Cyclic ganosina monophosphate (Guanosina 3’, 5’-monofosfato
cíclica)
HAC Hipertensão arterial crônica
Hb Hemoglobina
HC Hospital das Clínicas
ICB Instituto de Ciências Biológicas
I
125
Radioisótopo iodo 125
IG Idade gestacional
IRMA Ensaio imunorradiométrico
MEIA Ensaio imunoenzimático por micropartículas
NPR Natriuretic peptide receptor (Receptor de peptídeo natriurético)
proANP Pro-atrial natriuretic peptide (Pro-peptídeo atrial natriurético)
proBNP Pro-brain natriuretic peptide (Pró-peptídeo natriurético tipo B ou
Pro-peptídeo cerebral natriurético)
PROBRAL Programa Brasil-Alemanha
Rh Rhesus
RNAm Messenger ribonucleic acid (RNA mensageiro)
RIE Radioimunoensaio
rpm Rotações por minuto
SISNEP Sistema Nacional de Ética em Pesquisa
SNC Sistema nervoso central
TIU Transfusão intra-uterina
UFMG Universidade Federal de Minas Gerais
VCM Volume corpuscular médio
α-hANP α-polipeptídeo atrial natriurético humano
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figuras
Figura 1 – Estrutura molecular dos peptídeos natriuréticos humanos..... 20
Figura 2 – Síntese do ANP humano........................................................ 22
Figura 3 – Síntese do BNP humano........................................................ 23
Figura 4 – Seletividade dos receptores do sistema de peptídeos
natriuréticos........................................................................................ 29
Figura 5 – Ações do ANP nas células-alvo.............................................. 30
Figura 6 – Comparação entre o sistema de peptídeos em embriões
(esquerda) e em adultos (direita)........................................................ 41
Figura 7 – Princípio do método do radioimunoensaio de duplo
anticorpo............................................................................................. 50
Figura 8 – Foto tirada pelo aparelho de ultra-som durante a
cordocentese ..................................................................................... 63
Figura 9 – Desenho da técnica IRMA..................................................... 65
Gráficos
Gráfico 1 – Distribuição das gestantes de acordo com a idade
gestacional (em semanas).................................................................. 58
Gráfico 2 – Distribuição das gestantes de acordo com a paridade.......... 59
Gráfico 3 – Distribuição das gestantes por idade (em anos)................... 60
Gráfico 4 – Distribuição dos níveis sanguíneos fetais do ANP (pg/ml).... 70
Gráfico 5 – Distribuição dos níveis sanguíneos fetais do BNP (pg/ml).... 71
Gráfico 6 – Descrição dos fetos quanto à presença ou ausência de
anemia fetal (Hb <10 g/dl)................................................................... 72
Gráfico 7 – Correlação entre níveis de Hb pré-TIU e ANP no sangue
fetal (p=0,491).................................................................................... 73
Gráfico 8 – Correlação entre níveis de Hb pré-TIU e BNP no sangue
fetal (p=0,010)..................................................................................... 74
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadros
Quadro 1 – Situações em que ocorre a liberação de ANP.......................... 25
Quadro 2 – Vantagens relativas de ensaios de ANB / BNP e NT-proANP/
NT-proBNP............................................................................................. 47
Tabelas
Tabela 1 – Distribuição das gestantes por idade gestacional (em
semanas).............................................................................................. 57
Tabela 2 – Caracterização das gestantes de acordo com a idade
gestacional (em semanas).................................................................... 58
Tabela 3 – Distribuição das gestantes de acordo com a paridade.............. 59
Tabela 4 – Caracterização das gestantes de acordo com a paridade......... 59
Tabela 5 – Distribuição das gestantes de acordo com a idade (em anos)... 60
Tabela 6 – Caracterização das gestantes de acordo com a idade (em
anos)...................................................................................................... 60
Tabela 7 – Descrição das pacientes e fetos de acordo com a idade,
paridade, Idade gestacional e hemoglobina pré-TIU............................. 61
Tabela 8 – Descrição das dosagens sanguíneas fetais de ANP (pg/ml)..... 70
Tabela 9 – Descrição das dosagens sanguíneas fetais de BNP (pg/ml).... 71
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO……………………………………………………………… 13
2 REVISÃO DA LITERATURA………………………………………..……. 16
2.1 Os peptídeos natriuréticos ANP e BNP..……………………………… 17
2.1.1 Histórico………………………………………………………………… 17
2.1.2 Bioquímica e fisiologia dos peptídeos natriuréticos........................ 18
2.1.2.1 Estrutura dos peptídeos e forma circulante................................... 18
2.1.2.2 Síntese........................................................................................... 20
2.1.2.3 Secreção........................................................................................ 23
2.1.2.4 Distribuição tecidual e expressão gênica...................................... 26
2.1.2.5 Receptores.................................................................................... 27
2.1.2.6 Ações biológicas dos peptídeos natriuréticos................................ 32
2.2 Peptídeos natriuréticos no plasma fetal.............................................. 35
2.2.1 Concentrações fetais dos peptídeos natriuréticos........................... 37
2.2.2 Secreção e clearance dos peptídeos natriuréticos no feto.............. 40
2.2.3 Expressão dos peptídeos natriuréticos no coração fetal................. 43
2.3 Métodos laboratoriais de dosagem dos peptídeos natriuréticos:
ANP, BNP................................................................................................. 44
2.3.1 Princípio das técnicas de dosagem dos peptídeos natriuréticos..... 49
3 OBJETIVOS............................................................................................ 53
4 PACIENTES E MÉTODOS.................................................................... 55
4.1 Pacientes............................................................................................. 56
4.1.1 Caracterização das gestantes estudadas......................................... 57
4.1.2 Critérios de inclusão......................................................................... 61
4.1.3 Critérios de exclusão........................................................................ 61
4.2 Métodos............................................................................................... 62
4.2.1 Cordocentese - técnica de coleta do sangue fetal........................... 62
4.2.2 Técnica de processamento e armazenamento do sangue fetal....... 64
4.2.3 Técnica de dosagem dos peptídeos ANP e BNP pelo método
IRMA (ensaio imunoradiométrico)............................................................. 64
4.3 Metodologia Estatística.......................................................................
4.3.1 Tipo de estudo................................................................................
4.3.2 Análise estatística...........................................................................
64
64
64
5 RESULTADOS....................................................................................... 68
5.1 Grupo de estudo................................................................................. 69
5.2 Descrição das dosagens sanguíneas fetais de ANP........................... 69
5.3 Descrição das dosagens sanguíneas fetais de BNP........................... 71
5.4 Descrição dos fetos segundo presença ou ausência de anemia fetal
(Hb <10g/dl)............................................................................................... 72
5.5 Correlação entre níveis de Hb e ANP no sangue fetal........................ 73
5.6 Correlação entre níveis de Hb e BNP no sangue fetal........................ 74
6 COMENTÁRIOS..................................................................................... 75
7 CONCLUSÃO......................................................................................... 80
REFERÊNCIAS......................................................................................... 82
APÊNDICE E ANEXO............................................................................... 91
1 INTRODUÇÃO
Na década de 80, um trabalho apresentou grande avanço no entendimento dos
fluidos corporais. De Bold et al. (1981) verificaram atividade diurética, natriurética
e vasodepressora induzidas pela infusão de extratos de tecido atrial em ratos. Em
1984, o peptídeo atrial natriurético (ANP) foi apontado como o primeiro peptídeo
da família dos hormônios natriuréticos cardíacos e em 1988 o peptídeo
natriurético tipo-B (BNP) foi isolado no cérebro de porcos. Desde então, eles têm
sido muito estudados.
O ANP e o BNP são peptídeos vasoativos encontrados em animais e humanos
adultos. Após a verificação de que essas substâncias estão presentes também
durante o desenvolvimento dos indivíduos, cresceu na comunidade científica o
interesse pelos peptídeos vasoativos fetais, visando ao melhor entendimento da
fisiologia fetal. Esse conhecimento auxilia na compreensão de doenças que
apresentam alterações nas concentrações dos mesmos.
Compartilhando desse interesse universal em torno dos peptídeos vasoativos, o
CEMEFE (Centro de Medicina Fetal) do Hospital das Clínicas da UFMG e o curso
de Pós-Graduação em Ginecologia e Obstetrícia da UFMG iniciaram, em 1999,
uma linha de pesquisa para estudo dos peptídeos vasoativos (ANP e BNP)
durante gestações complicadas por pré-eclampsia. Os primeiros trabalhos foram
realizados junto com um grupo de pesquisadores da Alemanha – Programa
Brasil-Alemanha (projeto PROBRAL). A partir daí, várias teses e dissertações
foram desenvolvidas no serviço.
13
O primeiro trabalho do curso de Pós-graduação realizado dentro dessa nova linha
de pesquisa foi a tese da Dra Zilma Silveira Nogueira Reis em 2001. Em seguida,
vieram a tese da Dra. Aurora Silva Oliveira (2002), a dissertação da Dra. Juliana
Barra (2002) e a tese da Dra Gláucia Menezes (2002). Nesse mesmo ano, 2002,
em dissertação de mestrado, o Dr. Mário Dias Corrêa Júnior foi o primeiro a
avaliar as concentrações de ANP e BNP em fetos. Todas as dosagens do ANP e
do BNP realizadas até então, utilizaram a técnica do radioimunoensaio (RIE).
Devido à necessidade de um volume relativamente grande, aproximadamente
10ml de sangue para realizar o RIE, constatou-se a importância de um novo
método de dosagem que apresentasse a mesma confiabilidade no resultado,
porém que utilizasse menor quantidade de sangue fetal, já que esse volume é
muito representativo em relação à volemia total do feto.
Assim surgiu o interesse em avaliar o método IRMA (ensaio imunorradiométrico),
técnica já conhecida para dosagem dos peptídeos vasoativos em adultos, para
dosar os peptídeos vasoativos fetais.
14
2 REVISÃO DA
LITERATURA
15
2.1 Os peptídeos natriuréticos
2.1.1 Histórico
Na década de 50, era conhecida a presença de grânulos nos cardiomiócitos de
átrios e ventrículos e sabia-se que eles eram diferentes entre as espécies. Em
1956, Kisch mostrou existir diferença em grânulos presentes em átrios e
ventrículos do mesmo coração, sugerindo que as variações na forma e no
tamanho significariam diferenças em suas funções (KISCH, 1956). Entretanto,
apenas muitos anos depois foi possível compreender a função desses grânulos,
quando DE BOLD et al., a partir da infusão de extratos de tecido atrial em ratos,
verificaram efeito natriurético, diurético e vasodepressor causado pela infusão.
Assim, foi dado o primeiro passo para o entendimento da fisiologia dos nossos
fluidos corporais (DE BOLD et al., 1981).
Somente três anos após a descoberta de De Bold et al.. foi isolado o primeiro
membro da família de peptídeos natriuréticos, o ANP, inicialmente conhecido
como fator atrial natriurético (ANF) - (SEIDMAN et al., 1984). Seidman et al.
verificaram na molécula precursora do ANF características típicas de hormônios
sugerindo que se tratava de um hormônio cardíaco. Uma nova função atrial foi
então postulada (endócrina). Nesse mesmo ano o ANF foi purificado,
seqüenciado e nomeado α-polipeptídeo atrial natriurético humano (α-hANP) -
(KANGAWA; MATSUO, 1984). Em 1988, Sudoh et al. identificaram no cérebro de
porcos um novo peptídeo da família de peptídeos natriuréticos que, por esta
razão, passou a se chamar peptídeo natriurético cerebral ou peptídeo natriurético
16
tipo-B (BNP). E em 1990 o terceiro membro da família foi então identificado e
nomeado peptídeo natriurético tipo-C (CNP) - (SUDOH et al., 1990).
Desde então a família dos peptídeos natriuréticos tem sido muito estudada, pois
eles suprem uma função vital na regulação cardiovascular, atuando como
reguladores da pressão sanguínea e homeostases de fluidos corporais através de
seus efeitos diurético, natriurético e vasodilatador (ESPINER et al., 1995;
RUBATTU; VOLPE, 2001).
2.1.2 Bioquímica e fisiologia dos peptídeos natriuréticos
2.1.2.1 Estrutura dos peptídeos e forma circulante
O peptídeo atrial natriurético (ANP), o peptídeo natriurético tipo-B (BNP), o
peptídeo natriurético tipo-C (CNP) e outros peptídeos derivados da porção N-
terminal da cadeia peptídica do proANP e proBNP são hormônios natriuréticos
cardíacos (CNHs) e fazem parte da família de peptídeos natriuréticos (CLÉRICO;
DEL RY; GIANNESSI, 2000).
Esse grupo de peptídeos é estruturalmente semelhante, mas geneticamente
distintos. O ANP e o BNP são de origem cardíaca e o CNP de origem endotelial
(RUSKOAHO, 2003). Os três conservam alguns aminoácidos através dos
membros da família, como mostrado em destaque, na parte escura, na FIG. 1.
Diferem em apenas seis dos 17 aminoácidos que formam a estrutura em forma de
17
anel presente em cada um deles. São diferentes também no tamanho, sendo 28,
32 e 22 aminoácidos em cada um, respectivamente (RUSKOHAO, 1992;
YANDLE, 1994).
A principal forma biologicamente ativa do peptídeo atrial natriurético em humanos
é composta de 28 aminoácidos, ANP (99-126). Outros nomes comumente usados
na literatura são: ANP; α-ANP; ANP (1-28). Sua base estrutural é formada por
uma porção carboxiterminal, outra aminoterminal e um anel com 17 aminoácidos
fechado por uma ponte dissulfito entre dois resíduos de cisteína. A seqüência de
aminoácidos é altamente conservada entre as espécies. O ANP de humanos,
porcinos, caninos, bovinos e ovinos possui resíduo metionina na posição 110,
enquanto o dos coelhos, ratos e camundongos possuem resíduo leucina na
mesma posição (YANDLE, 1994).
O peptídeo natriurético tipo-B, em sua forma circulante, é composto de 32
aminoácidos, BNP (77-108), conhecido como BNP-32 e, assim como o ANP, é
estruturalmente formado por uma porção carboxiterminal, outra aminoterminal e
um anel com 17 aminoácidos fechado por uma ponte dissulfito entre dois resíduos
de cisteína (RUSKOAHO, 1992; YANDLE, 1994). Já a variabilidade da seqüência
de aminoácidos pode ser grande entre as espécies (YANDLE, 1994). Foi
inicialmente identificado no cérebro de porco (SUDOH et al., 1988), mas outros
estudos já mostraram que os níveis de BNP no coração são muito maiores
(HOSODA et al., 1991).
O peptídeo natriurético tipo-C, composto de 22 aminoácidos, CNP (82-103), é
conhecido como CNP-22 e possui o mesmo anel com 17 aminoácidos presente
18
nos outros dois membros da família. Difere-se do ANP e do BNP por não possuir
uma porção carboxiterminal. Assim como no ANP, sua seqüência de aminoácidos
é altamente conservada entre as espécies. O CNP-22 é idêntico em porcos, ratos
e humanos. Dos três peptídeos, é o mais prevalente no sistema nervoso central e
o menos presente no coração (ESPINER et al., 1995; YANDLE, 1994).
Somente serão detalhados o ANP e o BNP, pois o CNP não foi objetivo do
presente estudo.
FIGURA 1 - Estrutura molecular dos peptídeos natriuréticos humanos.
FONTE: Espiner et al. (1995).
2.1.2.2 Síntese
Embora múltiplas formas de ANPs sejam produzidas, há evidências da existência
de um único gene, o qual é altamente conservado nos genomas dos humanos,
camundongos e ratos. Em humanos, esse gene responsável pela síntese do ANP
é localizado no braço curto do cromossomo 1, banda p36,21. É composto de três
exons e dois introns (YANG-FENG et al., 1985), como pode ser visto na FIG. 2.
19
O ANP é sintetizado a partir de um grande precursor, um peptídeo de 151
aminoácidos, conhecido como prepro-ANP. Esse precursor, que contém uma
seqüência sinal de 25 aminoácidos, é clivado e passa a ser composto de 126
aminoácidos. Essa nova seqüência é chamada de proANP e é a principal forma
de ANP armazenada no átrio humano normal. Na maioria dos hormônios, a forma
armazenada é a madura e não o pró-hormônio, como no ANP (YANDLE, 1994). O
proANP permanece dentro de grânulos nos cardiócitos atriais até que receba
algum estímulo e ocorra sua clivagem (ESPINER, 1994; RUSKOAHO, 2003).
A clivagem do proANP ocorre durante ou logo após a sua liberação (RUSKOAHO,
1992). Após ser clivado, libera um fragmento carboxi-terminal de 28 aminoácidos
(ANP 99-126), que é sua principal forma ativa, e um outro fragmento de 98
aminoácidos (ANP 1-98) da porção aminoterminal em quantidades iguais
(ESPINER, 1994; RUSKOAHO, 2003). Por essa razão, a dosagem do fragmento
de ANP com 98 aminoácidos pode ser usada como estimativa da liberação de
ANP pelo coração, já que o ANP (1-98) tem meia-vida aproximadamente 10 vezes
maior no plasma que o ANP (2-5 minutos) e, conseqüentemente, tem 10-50 vezes
a concentração plasmática do ANP. O ANP (1-98) também é mais estável em
condições laboratoriais que o ANP (forma biologicamente ativa) - (RUSKOAHO,
2003).
20
FIGURA 2 - Síntese do ANP humano.
NOTA: O exon 1 codifica a seqüência sinal de peptídeos (25 aminoácidos) e os primeiros 20
aminoácidos do proANP. O segundo exon codifica a maior parte do preproANP, com exceção da
tirosina terminal, a qual é codificada pelo exon 3.
FONTE: Adaptado de Yandle (1994).
Semelhantemente ao ANP, o gene responsável pela síntese do BNP possui três
exons e dois introns (FIG.3) e também está localizado no braço curto do
cromossomo 1, banda p36,21.
O BNP também é sintetizado inicialmente como preproBNP, um precursor de 134
aminoácidos. Este é clivado e o sinal peptídico com 26 aminoácidos é removido,
dando origem ao proBNP com 108 aminoácidos (YANDLE, 1994). Finalmente, o
proBNP é clivado e libera o BNP, uma molécula com 32 aminoácidos (BNP-32) -
(LEVIN; GARDNER; SAMSON, 1998; NAKAO et al., 1992a). Diferentemente do
21
ANP, o BNP em humanos não é armazenado na forma de pró-hormônio e sim em
sua forma madura, o BNP-32 (ESPINER, et al; 1995).
FIGURA 3 - Síntese do BNP humano.
FONTE: Adaptado de Yandle (1994).
2.1.2.3 Secreção
A função secretora do átrio cardíaco foi a primeira a ser descoberta, mas hoje já
se sabe que ambos, átrios e ventrículos, sintetizam e secretam alguns hormônios
peptídeos natriuréticos (MUKOYAMA et al., 1991). Estudos in vitro também
mostraram que o ANP, assim como o BNP, são secretados do tecido ventricular e
que essa fonte contribui amplamente para os níveis circulantes dos mesmos. Em
resposta ao estiramento induzido (pressão ventricular esquerda), o ANP
22
aumentou 81% e o BNP 150%, mostrando que também podem ser secretados em
resposta a estiramento (KINNUNEM; VUOLTEENAHO; RUSKOAHO, 1993).
O ANP e o BNP são secretados normalmente em algumas situações fisiológicas e
também em situações patogênicas, onde os níveis plasmáticos aparecem muito
aumentados (ESPINER, 1994).
O ANP é produzido principalmente no átrio cardíaco (HOSODA et al., 1991;
SEIDMAN et al,. 1984) e armazenado em grânulos eletrodensos nos cardiócitos
atriais (KISCH, 1956; JAMIESON; PALADE, 1964). Ao receber algum estímulo
inicia-se então a sua clivagem (ESPINER, 1994; RUSKOAHO, 2003).
Os grânulos que armazenam o ANP, juntamente com o complexo de Golgi
altamente desenvolvido, são a diferença morfológica mais evidente entre o
volume de fenótipos de cardiócitos atrial e ventricular em mamíferos. O grânulo
atrial específico armazena ambos, ANP e BNP (McGRATH; DeBOLD, 2005).
A liberação do ANP pode ser devida a causas mecânicas e humorais (BRENNER
et al., 1990). O aumento na tensão da parede atrial reflete-se no aumento do
volume intravascular e é o principal estímulo para sua liberação (LEVIN;
GARDNER; SAMSON, 1998). Outro forte estímulo para a secreção de ANP é a
taquicardia, principalmente atrial (ESPINER, 1994). Alguns hormônios e
neurotransmissores, como endotelinas, vasopressina e catecolaminas, também
estimulam diretamente sua secreção (LEVIN; GARDNER; SAMSON, 1998).
23
O QUADRO 1 mostra algumas das situações fisiológicas e patogênicas em que o
ANP pode ser secretado. Estudos in vitro indicam alguns fatores químicos que
influenciam na liberação desses peptídeos (ESPINER, 1994; RUBATTU; VOLPE,
2001).
O ANP pode ser secretado também pelo ventrículo (KINNUNEM;
VUOLTEENAHO; RUSKOAHO, 1993; RUSKOAHO, 1992) e pelo sistema nervoso
central (SNC) (ANTUNES-RODRIGUES et al., 1992).
QUADRO1
Situações em que ocorre a liberação de ANP
Fonte: adaptado de Espiner (1994).
24
Fisiológicas:
Expansão do volume
Ingestão de líquido
Aumento da ingestão de sódio
Imersão em água
Posição supina
Exercício físico
Patogênicas:
Hipóxia
Isquemia miocárdica
Taquicardia
Hipertensão arterial
Insuficiência cardíaca congestiva
Insuficiência renal crônica
Químicas:
Fatores neurohumorais
Angiotensina II, endotelina I, catecolaminas, vasopressina, prostaglandina e
glucocorticóides
O BNP foi inicialmente identificado em cérebro de porcos (SUDOH et al., 1988).
Em humanos, está presente também no cérebro, mas principalmente no coração
(LEVIN; GARDNER; SAMSON, 1998), sendo o ventrículo a maior fonte de BNP
cardíaco (77%) (HOSODA et al., 1991).
O nível plasmático de BNP humano é marcadamente aumentado em distúrbios
como insuficiência cardíaca, infarto agudo do miocárdio, insuficiência renal
crônica, hipertensão arterial (HOSODA et al., 1991; YANDLE, 1994). Assim como
em idosos, após dietas com maior ingestão de sódio e pacientes com cirrose com
ascite (ESPINER, 1994).
Enquanto os níveis plasmáticos de BNP em humanos normais são
consideravelmente menores que os de ANP, em pacientes com insuficiência
cardíaca congestiva eles aparecem muito aumentados e sempre superam os
níveis de ANP (MUCOYAMA et al., 1991). Neste caso o BNP é o principal
peptídeo natriurético encontrado no plasma sanguíneo (HOSODA et al., 1991).
Sugerindo que o BNP, diferente do ANP, tem um potente papel patofisiológico na
disfunção ventricular esquerda aguda (NAKAO et al., 1992a).
2.1.2 4 Distribuição tecidual e expressão gênica
O pró-hôrmonio precursor para cada um dos peptídeos é codificado por um gene
diferente. A distribuição tecido-específica e a regulação de cada peptídeo também
são únicas (LEVIN; GARDNER; SAMSON, 1998).
25
A distribuição de ácido ribonucléico mensageiro (RNAm) do BNP e RNAm do ANP
é claramente diferente no coração humano, especialmente entre átrio e ventrículo.
Em corações normais, o nível de BNP RNAm encontrado no átrio direito > átrio
esquerdo > ventrículo direito = ventrículo esquerdo. O nível de ANP RNAm no
átrio direito = átrio esquerdo >> ventrículo direito = ventrículo esquerdo (HOSODA
et al., 1991).
Além do coração, a expressão gênica do ANP também acontece em tecidos
extracardíacos como em células do arco aórtico, pulmão, cérebro, olho, adrenal,
rim, trato gastrointestinal, timo, plexo coróide e corpos ciliares (RUSKOAHO,
1992), tuba uterina, útero, testículos, ovários (DOS REIS et al., 1995; GUTKOSKA
et al., 1993; KIM et al., 1997). Entretanto, sua expressão nesses tecidos é muito
baixa, <2% do ANP atrial transcrito (ESPINER et al., 1995).
A expressão extracardíaca do BNP ocorre na medula adrenal em bovinos e no
cérebro de porcos (ESPINER et al., 1995). Em humanos, o gene é expresso no
cérebro e nas células amnióticas (ITOH et al., 1993).
2.1.2.5 Receptores
Os efeitos biológicos dos peptídeos natriuréticos são mediados por ligações dos
peptídeos com receptores de membrana específicos (ESPINER et al., 1995),
localizados na superfície de células-alvo (LEVIN; GARDNER; SAMSON, 1998). O
anel presente na estrutura dos peptídeos natriuréticos (ANP, BNP, CNP) possui
26
grande homologia na seqüência de aminoácidos e é fundamental para a ligação
dos peptídeos aos seus receptores (NAKAYAMA, 2005).
Três tipos de receptores dos peptídeos natriuréticos foram identificados em
tecidos de mamíferos, NPR-A, NPR-B e NPR-C (receptor de clearance) -
(KOOLER; GOEDDEL, 1992). Os receptores A e B possuem atividade guanilato
ciclase e são mediadores das atividades biológicas dos peptídeos natriuréticos. O
NPR-C não possui atividade guanilato cilcase e sua função é a remoção dos
peptídeos natriuréticos da circulação (YANDLE, 1994).
A seletividade dos receptores para cada um dos peptídeos natriuréticos foi
avaliada em culturas celulares e mostrou que o NPR-C apresenta afinidade com
os três peptídeos, maior com o ANP > CNP >BNP em humanos e ratos (FIG. 4).
O receptor C permite também a ligação com vários outros análogos dos peptídeos
natriuréticos. O NPR-A tem grande afinidade com o ANP e o BNP e pequena com
o CNP. O NPR-B é mais seletivo para o CNP e este tem pouca afinidade com o
ANP e o BNP (SUGA et al., 1992). Nenhum receptor específico foi identificado
para o BNP, sugerindo que o ANP e o BNP atuam através do receptor A,
enquanto o CNP age via receptor B (ESPINER et al., 1995). Em humanos, o BNP
tem menos afinidade com o NPR-C que o ANP, o que pode explicar sua maior
meia-vida na circulação (WILKINS; REDONDO; BROWN, 1997). A descoberta
sobre a seletividade dos NPRs facilitou o entendimento do sistema de peptídeos
natriuréticos (SUGA et al., 1992).
27
FIGURA 4 - Seletividade dos receptores do sistema de peptídeos natriuréticos.
FONTE: Adaptado de Nakayama (2005).
Os receptores A e B, que possuem atividade guanilato ciclase (GC), são
compostos de uma parte extracelular, uma parte intracelular e uma
transmembrana única. A ligação entre as regiões intracelular e extracelular é feita
através do segmento de membrana (FIG. 5) (WILKINS; REDONDO; BROWN,
1997). O receptor C também possui transmembrana separando o sítio extracelular
do sítio citoplasmático (NAKAO et al., 1992b), mas falta a parte intracelular
(WILKINS; REDONDO; BROWN, 1997). A interação dos peptídeos natriuréticos
aos seus receptores ativa a guanilato ciclase, conduzindo ao aumento de GMPc
(guanosina 3', 5'-monofosfato cíclica) - (LEVIN; GARDNER; SAMSON, 1998).
28
Entre os receptores de peptídeos natriuréticos A e B existe uma semelhança
estrutural com aproximadamente 44% de homologia no sítio de ligação
extracelular. O sítio extracelular do NPR-C assemelha-se aproximadamente em
30% ao NPR-A e NPR-B (HOLCBERG et al., 1995; KOLLER; GOEDDEL, 1992).
FIGURA 5 - Ações do ANP nas células-alvo.
FONTE: Adaptado de Levin, Gardner e Samson (1998).
O NPR-C está envolvido na eliminação dos peptídeos natriuréticos, que se ligam
aos receptores, são internalizados e enzimaticamente degradados. Depois o
receptor C retorna à superfície celular (MAACK et al., 1987).
29
Endopeptidases neutras também são responsáveis por inativar os três peptídeos
natriuréticos. A afinidade das endopeptidases é maior pelo CNP comparado ao
ANP, já pelo BNP é bem menor do que pelos outros dois (KENNY et al., 1993). As
endopeptidases estão presentes nas células tubulares renais e células vasculares
(LEVIN; GARDNER/ SAMSON, 1998). A combinação do NPR-C com as
endopeptidases neutras na inativação do ANP resulta em um efeito muito maior
que cada um separadamente (WILKINS; REDONDO; BROWN, 1997).
O NPR-A pode ser encontrado no pulmão, rim, adrenal, coração, tecido adiposo e
olho (NAKAO et al., 1992b), útero e tubas uterinas (DOS REIS et al., 1995)
sobrepondo em alguns a distribuição tecidual do NPR-B. O receptor B está
presente no pulmão, rim e cérebro. O NPR-C se expressa vastamente no pulmão,
rim, placenta e coração (NAKAO et al., 1992b). Um estudo feito com macacos
rhesus mostrou que o RNAm para o NPR-A é abundantemente expresso nos
glomérulos renais, zona glomerulosa da adrenal, hipófise, cerebelo e coração,
enquanto o RNAm do NPR-B foi identificado na medula adrenal, hipófise e
cerebelo. O RNAm do NPR-C foi amplamente distribuído no rim, adrenal, coração
cérebro (WILCOX et al., 1991) e tubas uerinas (DOS REIS et al., 1995).
Assim como os hormônios maduros, uma forte homologia dos três receptores de
peptídeos natriuréticos existe entre as espécies - mais de 95% na seqüência de
NPR-C em humanos, ratos e bovinos (ESPINER et al., 1995; NAKAO et al.,
1992b).
30
2.1.2.6 Ações biológicas dos peptídeos natriuréticos
O ANP e o BNP apresentam grande homologia estrutural e funcional (YANDLE,
1994), mas geneticamente são distintos (RUSKOAHO, 2003). O pró-hôrmonio
precursor para cada um deles é codificado por um gene diferente. A distribuição
tecido-específica e a regulação de cada peptídeo também são únicas (LEVIN;
GARDNER; SAMSON, 1998). A distribuição de RNAm do ANP e RNAm do BNP
é diferente no coração humano (HOSODA et al., 1991).
Os efeitos biológicos dos peptídeos natriuréticos são mediados por ligações dos
peptídeos com receptores de membrana específicos (ESPINER et al., 1995). Já
foram isolados receptores específicos dos peptídeos natriuréticos em vários
tecidos, incluindo o coração, árvore vascular, rins, adrenais, pulmões e áreas
específicas do sistema nervoso central (ESPINER, 1994).
As propriedades dos peptídeos natriuréticos são predominantemente mediadas
pelo aumento direto da GMPc produzida pela ativação dos receptores guanilato
ciclase (McGRATH; De BOLD, 2005).
As ações biológicas são influenciadas por algumas variáveis fisiológicas, como
pressão arterial em repouso, status do sódio, postura e idade (ESPINER, 1994).
Os peptídeos natriuréticos ANP e BNP mostraram ser importantes reguladores
dos sistemas renina-angiotensina-aldosterona e nervoso simpático, como
hormônios que contrabalançam o aumento da pressão e do volume sanguíneos
(McGRATH; De BOLD, 2005).
31
Entre os maiores efeitos do ANP em humanos estão a natriurese, aumento no
hematócrito (como resultado de filtração capilar aumentada) e a inibição da
secreção e/ou ação de outros sistemas hormonais, incluindo sistema renina-
angiotensina-aldosterona, vasopressina e catecolaminas. Outros efeitos são:
hipotensão e vasodilatação, entretanto, observados apenas em grandes infusões
ou em casos de insuficiência cardíaca (ESPINER, 1994; WOODS, 2004).
As ações do ANP e do BNP na pressão sanguínea são muitas vezes mal
compreendidas. Apesar de serem conhecidos como hormônios vasodilatadores,
essa ação não é predominante em animais normais in vivo. Apenas em altas
doses de infusão dos peptídeos ou em casos de falência cardíaca (WOODS,
2004).
Os mecanismos por meio dos quais o ANP reduz a pressão sanguínea são a
diminuição do débito cardíaco, reduções na resistência vascular periférica e
diminuição do volume intravascular (BRENNER et al., 1990).
Nos rins, uma infusão de ANP induz a natriurese e diurese, acompanhada de
aumentos de fosfato, cálcio, magnésio, cloreto, e excreção de GMPc (BRENNER
et al., 1990).
Uma variedade de ações hemodinâmicas atribuídas ao ANP já foi documentada
em experimentos com animais e humanos. Esses efeitos vão desde ações na
microcirculação até efeitos cardíacos centrais (diminuição do débito cardíaco),
vasorrelaxamento arteriolar e efeitos no SNC autônomo (inibição de
baroreceptores) - (ESPINER, 1994).
32
Em humanos normotensos e animais de experimentos, uma dose alta e única de
ANP causa pequena e sustentada queda na pressão arterial média e pequeno
aumento da taxa cardíaca (RICHARDS et al., 1985). Esse efeito é provavelmente
devido à ação direta no tônus vascular (vasorrelaxamento), também observado
durante infusões intra-arteriais locais diretas do hormônio (BOLLI 1987).
Infusões contínuas com doses muito baixas de ANP apresentaram aumento de
excreção de sódio e diminuição das pressões sanguíneas em humanos
hipertensos, além de elevação da freqüência cardíaca e do hematócrito,
mostrando, assim, que o ANP em pequenas concentrações está intimamente
envolvido na regulação do equilíbrio de sódio e na pressão sanguínea em
humanos (JANSSEN et al., 1989). Esses achados sugerem que variações
fisiológicas do ANP têm importantes ações vasodepressoras in vivo se agirem por
tempo prolongado (ESPINER, 1994).
Em humanos normais, a infusão de pequenas doses de ANP em curtos períodos
leva à queda de renina e aldosterona (RICHARDS et al., 1988), sem afetar os
níveis de cortisol. A supressão da renina e aldosterona pode ser superada por
grandes aumentos do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH), ou angiotensina, ou
por estimulação neurohumoral, como induzido por hipotensão ou hemorragia
(ESPINER; RICHARD, 1989).
Infusões de ANP que inibem aldosterona também causam queda proporcional de
renina e angiotensina. As respostas destas duas substâncias podem ser
separadas; por exemplo, na insuficiência cardíaca congestiva, a aldosterona é
mais inibida que a renina (SATIO, 1987).
33
Estudos em animais mostraram forte evidência de neurossecreção do ANP
agindo via receptores específicos (NPR-A e possivelmente NPR-C), sugerindo
sua participação na regulação cerebral de pressão sanguínea e homeostase de
sódio (ESPINER, 1994).
Uma ação parácrina importante do ANP é a inibição da proliferação celular, como,
por exemplo, nas células endoteliais, mesangiais e da musculatura lisa vascular.
Isso sugere que o ANP regula o crescimento celular do sistema vascular (APELL,
1992).
A variabilidade da seqüência de aminoácidos do BNP é maior entre as espécies
do que o ANP (YANDLE, 1994). Por essa razão, a interpretação de dados
cruzados entre as espécies exige mais cuidados (ESPINER, 1994).
Holmes et al. (1993) verificaram que em homens normais, duas horas de infusão
de BNP (alcançando níveis semelhantes a leve insuficiência cardíaca) ativam a
guanilato ciclase e têm efeito natriurético, inibem renina e adolterona e reduzem o
volume plasmático. E sugeriram que o BNP e o ANP devem participar do controle
homeostático de sódio e regulação da pressão sanguínea em humanos.
2.2 Peptídeos natriuréticos no plasma fetal
Em 1986, Yamaji et al. relataram a presença de ANP circulante em fetos
humanos. O ANP encontrado no sangue de cordão umbilical e os maiores níveis
34
plasmáticos verificados no plasma arterial comparado ao plasma venoso
sugeriram a secreção do ANP pelo tecido atrial fetal humano (ou outro tecido).
O ANP foi identificado a partir da nona semana de gestação. Durante o
desenvolvimento do coração, aparece em maiores quantidades no átrio esquerdo
e decresce no átrio direito, ventrículo direito e ventrículo esquerdo,
respectivamente (TSUCHIMOCHI et al., 1988). O BNP foi detectado no coração
de fetos normais com 10 semanas de idade gestacional (HYETT et al., 1996).
O sistema de peptídeos natriuréticos nos fetos tem sido descrito como um sistema
endócrino duplo. Dois componentes, ANP e BNP, são especificamente regulados
em condições patofisiológicas (WALTER; STEPAN; FABER, 2001; WALTER et
al., 2002).
Fetos de ratos responderam a aumentos na pressão intracardíaca com elevados
níveis de ANP plasmático, assim como animais adultos, indicando um sistema
funcional de peptídeos natriuréticos durante a vida fetal (WEI et al., 1987).
A expressão de BNP e CNP foi demonstrada na decídua da placenta de
camundongos (CAMERON et al., 1996) e a expressão de ANP foi demonstrada
na placenta humana, particularmente por células citotrofoblásticas (GRAHAM et
al., 1996).
Em sua tese de doutorado, Menezes (2002) determinou a presença de BNP na
placenta humana utilizando a técnica de radioimunoensaio.
35
2.2.1 Concentrações fetais dos peptídeos natriuréticos
Alguns estudos mostraram que as concentrações de ANP em fetos de animais e
humanos são maiores do que as maternas (MAKIKALLIO et al., 2001; PANOS et
al., 1989; WALTER; STEPAN; FABER, 2001; WEI et al., 1987).
As concentrações de BNP fetais encontradas também são maiores que as
maternas (BAJORIA; WARD; CHATTERJEE, 2002; WALTER; STEPAN; FABER,
2001; WEI et al., 1987). Um estudo realizado por LAURIA et al. (1996) mostrou o
contrário, níveis de BNP materno maiores que os fetais.
A concentração de ANP no plasma fetal é maior que no plasma adulto. Como tem
meia-vida curta no plasma, a concentração do peptídeo na circulação é mantida
devido à alta taxa de produção endógena do ANP, o que revela a grande
capacidade de produção e secreção de ANP pelo coração fetal (CHEUNG, 1995).
Desse modo, altas concentrações de peptídeos natriuréticos em fetos
comparados aos adultos indicam que o sistema de peptídeos natriuréticos é
importante no controle do volume cardíaco em fetos (WALTER; STEPAN; FABER,
2001).
Os níveis de ANP na circulação fetal não variam ao longo da gestação (BAJORIA;
WARD; SOORANNA, 2001; KINGDON et al., 1992; PANOS et al., 1989; VILLE et
al., 1994;). No entanto outros dois estudos mostraram que os níveis de ANP se
elevam ao longo da gestação em fetos de ovelhas. Esse fato está associado
36
provavelmente ao progressivo aumento da taxa cardíaca nos fetos, como em
fetos maduros (BRACE; CHEUNG, 1987; CHEUNG; BRACE, 1988).
Em fetos normais, a expressão cardíaca do RNA mensageiro do ANP diminuiu
com o avanço da gestação, enquanto no RNA mensageiro do BNP nenhuma
mudança significativa foi percebida. Nos fetos trissômicos, a expressão de ambos,
RNAm do ANP e do BNP, apresentou significante aumento (HYETT et al., 1996).
A concentração de ANP fetal dosado antes e imediatamente após uma transfusão
sanguínea mostrou aumento significante em resposta à expansão de volume
sanguíneo, sugerindo que a liberação de ANP nos fetos exerce papel importante
na homeostase de volume sanguíneo fetal (PANOS et al., 1989).
Um outro resultado foi encontrado por Walter, Stepan e Faber (2001) em fetos
isoimunizados, caracterizados por circulação hiperdinâmica, com velocidade de
fluxo sanguíneo aumentado em veias e artérias, onde a concentração do ANP
apareceu elevada, enquanto a do BNP não se alterou, quando comparados a
fetos controles. No entanto, esses mesmos fetos isoimunizados, ao receberem
transfusão intravascular (aumento agudo do volume cardíaco), levaram aumento
significativo aos níveis plasmáticos de BNP e não de ANP, mostrando que os dois
peptídeos respondem diferentemente a aumentos agudos ou constantes na
sobrecarga de volume cardíaco.
As concentrações plasmáticas da porção aminoterminal de ANP e BNP (NT-
proANP e NT-proBNP) em recém nascidos saudáveis mostraram forte aumento
nos primeiros dias de vida, sugerindo que o ANP e o BNP desenvolvem papéis
37
fisiológicos na mudança da circulação fetal para neonatal. Os níveis desses
peptídeos abaixam e se tornam estáveis após quatro e dois dias de vida,
respectivamente (MIR et al., 2003).
Em sua dissertação de mestrado, Corrêa Júnior (2002) verificou que as
concentrações séricas do ANP não variam entre recém-nascidos de mães
hipertensas e normotensas. E as concentrações séricas do BNP são maiores em
recém-nascidos de mães hipertensas apenas quando fetos com crescimento
intra-uterino restrito são incluídos na análise. Observou, ainda, que as
concentrações séricas do ANP e do BNP fetais só são influenciadas
significantemente pelo aumento da pressão arterial materna, quando esta leva à
lesão placentária e ao desenvolvimento de crescimento intra-uterino restrito.
As concentrações do ANP na circulação fetal e em doenças fetais apresentam
algumas contradições. Ville et al. (1994) mostraram níveis aumentados de ANP
em fetos anêmicos, acidêmicos e hidrópicos. Já Kingdom et al. (1989)
referenciaram níveis aumentados de ANP após transfusão intravascular e Fisk et
al. (1990) relataram níveis aumentados de ANP em fetos não hidrópicos e níveis
diminuídos de ANP em fetos hidrópicos após transfusão.
Em um estudo realizado em 2002, Tsukahara et al. registraram, pela primeira vez, a
interação existente entre os mediadores vasoativos e natriuréticos no cordão umbilical.
Foram correlacionados os níveis de arginina vasopressina, endotelina I, adrenomedulina,
ANP, BNP e óxido nítrico, dosados em sangue da veia do cordão na hora do parto e
comparados aos níveis de adultos normais.
38
2.2.2 Secreção e clearance dos peptídeos natriuréticos no feto
Os peptídeos natriuréticos cardíacos são secretados durante o desenvolvimento
em resposta a estímulos fisiológicos similares aos que os levam a ser secretados
em adultos (CAMERON; ELLMERS, 2003). Alguns estudos em fetos de ovelhas
mostraram que a secreção do ANP é estimulada em resposta ao aumento de
volume, hiperosmolaridade (CHEUNG, 1995), hipóxia (CHEUNG, 1995;
JOHNSON et al., 1997) e por vasoconstritores como angiotensina II e fenilefrina
(CAMERON; ELLMERS, 2003), vasopressina (WEI et al., 1987) e endotelina
(CHEUNG, 1995).
Altos níveis de ANP e BNP observados no coração fetal e a capacidade de
responderem a estímulos de volume indicam que esse é um sistema de peptídeos
funcional durante a gestação e deve ser importante na regulação da pressão
sanguínea e equilíbrio (sódio/água) durante o desenvolvimento de embriões,
assim como em adultos (FIG. 6) - (CAMERON; ELLEMRS, 2003).
39
FIGURA 6 - Comparação entre o sistema de peptídeos em embriões (esquerda) e
em adultos (direita).
FONTE: adaptado de Cameron e Ellmers (2003).
Semelhante à circulação em adultos, ANP e BNP respondem diferentemente a
sobrecargas de volume cardíaco de curto (induzido por transfusão intra-uterina) e
longo período (fetos com isoimunização rhesus - Rh) na circulação fetal. Os fetos
com isoimunização Rh apresentam aumentados níveis de ANP; e o BNP não se
40
altera. Já na transfusão intravascular, apenas os níveis de BNP elevam-se
significantemente, sugerindo que o ANP e o BNP constituem um sistema de
peptídeos natriuréticos responsável pelas mudanças na pressão cardíaca
(WALTER; STEPAN; FABER, 2001).
Durante o desenvolvimento, os peptídeos natriuréticos participam da regulação da
pressão sanguínea e homeostase de fluidos corporais e modificam o crescimento
e desenvolvimento de tecidos cardiovascular e ósseo (CAMERON; RICHARDS,
2002).
A remoção dos peptídeos natriuréticos da circulação ocorre através de ligação
com o NPR-C. Eles são internalizados e enzimaticamente degradados. Uma outra
forma de eliminação é pela ação de endopeptidases neutras (MAACK et al.,
1987). A inativação dos peptídeos se dá após a abertura da estrutura em forma
de anel que os compõe (KENNY et al., 1993).
WALTER et al. (2004) foram os primeiros a determinar concentrações de
fragmentos aminoterminais de ANP e BNP e a atividade de endopeptidases em
fetos humanos. As concentrações de NT-proANP no plasma fetal foram 11,7
vezes maiores que no plasma materno, enquanto as concentrações de ANP no
feto foram apenas 1,8 vez maior que as maternas, indicando maior degradação
do ANP na circulação fetal. Já o NT-proBNP e o BNP apresentaram
concentrações duas vezes maiores nos fetos que no sangue materno. Os fetos
com isoimunização Rh tiveram concentrações plasmáticas de NT-proBNP
maiores que os controles, enquanto o BNP praticamente não se alterou,
41
revelando maior degradação do BNP que do NT-proBNP. Essa degradação não
parece estar associada ao aumento na atividade de endopeptidases neutras.
2.2.3 Expressão dos peptídeos natriuréticos no coração fetal
No coração adulto, o átrio é o principal local de expressão do RNA mensageiro do
ANP (HOSODA et al., 1991; RUSKOAHO, 1992). No coração de fetos humanos,
o nível de RNAm do ANP ventricular encontrado foi maior que no ventrículo do
coração de controles adultos (GARDNER et al., 1989). Os níveis de RNAm do
ANP ventricular são um quinto dos níveis encontrados no átrio, comparados com
ventrículos de adultos normais, nos quais os níveis de RNAm do ANP são 1% dos
níveis encontrados nos átrios (ESPINER et al., 1995). O ANP atrial é
significantemente mais alto que o ANP ventricular durante o desenvolvimento
fetal, indicando que, em fetos de mamíferos, o átrio é o tecido predominante de
produção do ANP (WALTER et al., 2002).
Entretanto, durante o desenvolvimento de roedores, foram encontrados níveis
mais altos de expressão do ANP e do BNP nos ventrículos (WEI et al., 1987;
CAMERON et al., 1996). Já em fetos de ovelhas, semelhantemente aos fetos
humanos, houve maior expressão no átrio que no ventrículo durante a gestação
(CHEUNG; ROBERTS, 1993). Os níveis de ANP e BNP em ventrículos fetais
também são maiores que em ventrículos adultos (WEI et al., 1987).
Nenhuma expressão de CNP foi detectada durante o desenvolvimento do coração
em ratos e humanos (CAMERON et al., 1996).
42
Esses estudos mostram que a contribuição de ANP do ventrículo de embriões é
significantemente maior que a do ventrículo de adultos em todas as espécies
estudadas. E em algumas o ventrículo é o local predominante de expressão do
ANP e do BNP durante o desenvolvimento (CAMERON; RICHARDS, 2002).
Foi descrito, em fetos de ratos com 20 dias de gestação, nível muito alto de ANP
circulante (WEI et al., 1987), possivelmente associado a expandido volume de
água no feto (CAMERON et al., 1996).
Observações diárias da expressão de peptídeos natriuréticos durante a
embriogênese em camundongos mostraram que o RNA mensageiro do ANP e do
BNP aparecem por volta do oitavo/nono dias de gestação, apresentam grande
pico nos níveis de RNAm no dia 12,5 e picos menores nos dias 14,5 e 16,5 pós-
coito (CAMERON et al., 1996). Isso significa que o ANP e o BNP influenciam na
formação do coração (CAMERON; ELLMERS, 2003).
2.3 Métodos laboratoriais de dosagem dos peptídeos natriuréticos: ANP, BNP
Em 1985, Yamaji, Ishibashi e Takaku utilizaram um radioimunoensaio adequado
para verificar se o ANF era um hormônio circulante em humanos. O resultado
demonstrou que o ANF é um hormônio circulante e que é secretado em resposta
à expansão do volume.
43
A primeira evidência de peptídeo natriurético fetal também foi verificada a partir da
dosagem pelo método do radioimunoensaio (YAMAJI et al., 1986).
Através de radioimunoensaio, verificou-se que durante o desenvolvimento do
coração maior quantidade de ANP é encontrada no átrio esquerdo, seguido do
átrio direito, ventrículo direito e ventrículo esquerdo, respectivamente
(TSUCHIMOCHI et al., 1988).
Mucoyama et al. (1991) usaram radioimunoensaio específico para BNP humano
(hBNP), com anticorpo monoclonal e investigaram síntese, secreção e clearance,
comparando o ANP em pacientes normais e com insuficiência cardíaca
congestiva crônica.
O ANP é comumente dosado por radioimunoensaios (RIE). Entretanto, esse
método apresenta alguns problemas, principalmente com o limite de detecção e
precisão (CLERICO et al., 1990; GUTKOWSKA et al., 1987;). Um método de
dosagem ideal para o ANP deve detectar apenas sua forma biologicamente ativa
(ANP
99-126
) e não os precursores (proANP
1-126
, ) ou metabólitos (ANP
124-126
, ANP
107-126
, ANP
112-126
, etc.) ou outros peptídeos relatados da família (BNP, CNP)
(ESPINER et al., 1995; RUSKOAHO, 1992).
Dosagens do ANP plasmático realizadas através de ensaios imunorradiométricos
(IRMA) mostraram melhor sensibilidade e precisão que os RIEs já relatados
(LEWIS et al., 1989; TATTERSAL et al., 1990). Um dos motivos é que o IRMA
não requer extração prévia ou purificação da amostra do plasma e, por esta
razão, torna-se mais adequado que RIEs em ensaios de rotina das concentrações
44
plasmáticas fetais do ANP e BNP (CLERICO et al., 1996, CLERICO; LEVARSI;
MARIANI, 1999). Além disso, o IRMA não utiliza o ANP (ou BNP) marcado
radioativamente como traçador e sim um anticorpo radioativo mais estável, o que
reduz muito a instabilidade do traçador (problema já relatado em alguns RIEs) -
(CLERICO; LEVARSI; MARIANI, 1999).
Em 1996, Clerico et al. avaliaram um kit de dosagem do ANP que utiliza a técnica
do IRMA. Por meio do kit IRMA foram realizadas as dosagens das concentrações
plasmáticas de ANP em pacientes saudáveis (n=59) e com insuficiência cardíaca
(n=77). Os resultados foram similares aos relatados em outros ensaios
imunorradiométricos e foram muito melhores que os conseguidos através de
radioimunoensaios.
Teoricamente, seria mais fácil um método de imunoensaio para NT-proANP e NT-
proBNP devido às suas maiores concentrações plasmáticas, quando comparadas
às do ANP e BNP, respectivamente (CLERICO; DEL RY; GIANNESSI, 2000; WEI
et al., 1993). Baseados nessas informações, em 1998 Numata desenvolveu um
método mais sensível e rápido para dosagem do NT-proANP em plasma, o IRMA.
Essa nova técnica, além de consumir menos tempo para dosagem comparada
aos radioimunoensaios previamente descritos, apresentou também mais
sensibilidade e, diferentemente do ANP, não exigiu condições especiais para
coleta e armazenamento das amostras.
Por outro lado, um imunoensaio para NT-proANP ou NT-proBNP pode sofrer a
interferência de alguns problemas analíticos, principalmente relativos a variações
das especificidades dos ensaios. Por esta razão, resultados diferentes são
45
produzidos por métodos diferentes (CLERICO; DEL RY; GIANNESSI, 2000). As
divergências encontradas nos resultados dos métodos utilizados afetam a
precisão de diagnóstico dos ensaios, o que dificulta a distinção entre as pessoas
com e sem doenças cardíacas (CLERICO; DEL RY; GIANNESSI, 2000;
HAMMERER-LERCHER et al., 2001; PRONTERA et al., 2003). O QUADRO 2
apresenta as vantagens de dosarem-se o ANP e o BNP ou NT-proANP e NT-
proBNP.
QUADRO 2
Vantagens relativas de ensaios de ANB / BNP e NT-proANP / NT-proBNP
ANP / BNP NT-proANP / NT-proBNP
Correlação próxima entre
atividades hormonais e
imunológicas.
Concentrações circulantes maiores
e mais estáveis.
Melhor correlação com condições
clínicas ou fisiológicas após agudas
alterações hemodinâmicas.
Menor degradação in vivo e in vitro.
Fonte: Clerico e Emdin (2004).
Alguns trabalhos foram realizados com o objetivo de comparar diferentes técnicas
de dosagem dos peptídeos natriuréticos.
Em 2005, Clerico et al. compararam quatro diferentes métodos de dosagem do
BNP: o IRMA (ensaio imunorradiométrico), dois sistemas de imunoensaios
automatizados; o MEIA (ensaio imunoenzimático por micropartículas) e o ADVIA
(quimioluminescência) e o Triage BNP Test (imunoensaio de fluorescência).
Avaliaram também um método totalmente automatizado que utiliza a tecnologia
46
de detecção por eletroquimiluminescência (ECL) para o NT-proBNP, ELECSYS
®
2010. Os resultados obtidos a partir do MEIA foram significantemente diferentes
dos outros. Os métodos que apresentaram melhor concordância nos resultados
foram o IRMA e o ADVIA. Os quatro foram capazes de diferenciar pessoas
saudáveis dos pacientes com diferentes graus de falência cardíaca, assim como
classificá-los (leves e graves). A eletroquimioluminescência para NT-proBNP
mostrou melhor resultado quando comparada aos outros imunoensaios.
Um outro estudo comparou os resultados do método ECLIA (imunoensaio por
eletroquimiluminescência) para NT-proBNP com os resultados do IRMA para ANP
e BNP em pessoas saudáveis e em pacientes com doença cardíaca. O ensaio
com o NT-proBNP apresentou melhor performance em diferenciar indivíduos
saudáveis de pacientes doentes do que os ensaios de ANP e BNP e o melhor
desempenho foi mais evidente nas que apresentaram apenas insuficiência
cardíaca branda (PRONTERA et al., 2003). Já em outro trabalho, onde foi usado
um imunoensaio diferente para o NT-proBNP e NT-proANP e um ensaio
imunorradiométrico para o BNP, não sendo verificada diferença nos resultados
clínicos obtidos com os ensaios de NT-proBNP e BNP. Isso evidenciou que a
performance do imunoensaio escolhido é um ponto importante na determinação
dos resultados de uma comparação entre diferentes ensaios para CNH
(HAMMERER-LERCHER et al., 2001).
O BNP e o NT-proBNP são ferramentas que ajudam como marcadores da função
cardíaca, principalmente de alterações da função ventricular esquerda. Os dois
são secretados na circulação em iguais quantidades, mas existe diferença entre
seus níveis circulantes devido a distintos receptores e mecanismos de clearance.
47
O NT-proBNP tem concentração quatro a seis vezes maior que o BNP. Nenhum
deles apresenta vantagem clínica relevante. Ambos os peptídeos mostraram valor
equivalente como marcadores prognósticos e diagnósticos, apesar da experiência
clínica ser maior com o BNP (PFISTER; SCHNEIDER, 2004).
2.3.1 Princípio das técnicas de dosagem dos peptídeos natriuréticos
Em 1960, Berson e Yallow introduziram os sistemas de análise por saturação
utilizando a medida radioativa, o que tornou possível a dosagem de substâncias
com baixíssimas concentrações (nano e picogramas). Surgiu, assim, a
possibilidade de determinar qualquer tipo de molécula biológica, desde que se
consiga obter um receptor específico e que a molécula biológica possa, de algum
modo, ser marcada. Dependendo do tipo de receptor, a técnica de saturação
pode ser imunoensaio, quando o receptor específico é um anticorpo ou
competição protéica, quando o receptor é uma proteína transportadora específica.
E dependendo do tipo de marcação que a molécula biológica receber, os
imunoensaios podem ser radioimunoensaio (RIE), quando a marcação é feita com
isótopos radioativos ou enzimaimunoensaio, quando a marcação é feita com
enzimas (apud MOURA et al., 1998).
O RIE consiste na introdução do hormônio marcado com um traçador
(radioisótopo) em uma reação imunológica que se dá com o hormônio natural,
sem o isótopo em sua molécula, que nessa reação é tido como antígeno. O
princípio do método é uma reação imunológica in vitro entre antígeno e anticorpo.
Com a introdução do hormônio marcado com o isótopo radioativo, este irá
48
competir com o mesmo anticorpo, em igualdade de condições com o hormônio
natural (objeto de dosagem) - (FERREIRA, 1983).
O que ocorre é uma reação de competição entre a substância a ser determinada
e a mesma substância marcada (radioisotopicamente) por um receptor específico
comum a elas (MOURA et al., 1998). Durante um período de incubação, formam-
se os imunocomplexos. Após centrifugação, as parte não ligadas são aspiradas e
a parte ligada passa pela leitura em um contador gama. A FIG. 7 ilustra um RIE
de duplo anticorpo.
amostra + anticorpo anti-ANP
125
I-ANP
separação do imuno complexo:
segundo anticorpo
Centrifugar
Contador gama (LKB)
RIE de duplo anticorpo
+
+
FIGURA 7 - Princípio do método do radioimunoensaio de duplo anticorpo.
O IRMA - Shionoria BNP (ou ANP), Shionogi & Co. Ltd., Osaka-Japan, é um kit de
dosagem para o peptídeo natriurético tipo-B (ou ANP). A técnica é um ensaio
49
imunorradiométrico, realizado sem a necessidade de extração prévia da amostra.
Consiste em uma prática conhecida como "sanduíche" (DEL RY et al., 2000), na
qual são utilizados dois anticorpos monoclonais que reconhecem duas regiões
distintas do peptídeo. Um deles já vem marcado com o iodo 125, usado como
traçador. Apresenta uma fase sólida, em que um dos dois anticorpos é fixado a
uma "pérola" previamente preparada para interagir com o peptídeo. Em um tubo
de ensaio, é colocado o primeiro anticorpo monoclonal antiBNP (ou antiANP)
humano fixado à pérola. No mesmo tubo de ensaio são adicionadas a amostra de
plasma e uma solução contendo o segundo anticorpo monoclonal antiBNP (ou
antiANP) humano marcado com o iodo 125. Após um período de incubação, uma
solução de lavagem é utilizada para remover o que não se ligou e a leitura do
conjugado formado (amostra + dois anticorpos) é feita no aparelho Minigama
Radiometer. A quantidade de radioatividade emitida (na fase sólida) é
proporcional à quantidade de peptídeo, ANP ou BNP, da amostra.
O método de imunoensaio Bayer ADVIA Centaur BNP
®
- Bayer Diagnostics
Division, desenvolvido em 2002 (BLUESTEIN et al., 2002), é o primeiro ensaio
comercialmente disponível para BNP que utiliza uma plataforma imunoquímica. É
uma técnica de imunoensaio por quimioluminescência, que utiliza dois anticorpos
(monoclonal-duplo) para duas regiões (sítios) do peptídeo (WU et al., 2004).
Triage BNP Test
®
- Biosite
®
Diagnostics é um método automatizado para
detrminação quantitativa do BNP e utiliza imunoensaio de fluorescência. O
método é baseado em um cartucho de teste de aproximadamente 2 X 5 X 1cm,
onde é introduzida uma amostra de 250μl de sangue total ou plasma, com o
auxílio de uma micropipeta. O plasma é transferido por capilares para uma
50
câmara de reações. Após um período de incubação, o cartucho de teste deve ser
introduzido em um aparelho, Triage Meter, onde a leitura é feita por fluorescência
(FISCHER et al., 2001; VOGESER; JACOB, 2001).
Abbott AxSYM (Abbott Laboratories Diagnostic Division), ensaio imunoenzimático
por micropartículas (MEIA), disponível desde 2002 (KELLY et al., 2002), possui
dois sítios de ligação e utiliza um anticorpo monoclonal antiBNP, quantificando o
peptídeo por meio de fluorescência (CHIEN; CHEN; KAO, 2006).
Roche Elecsys 2010 (Roche Diagnostics, Indianapolis, In) para NT-proBNP utiliza
o método da eletroquimiluminescência. Ocorre uma interação simultânea entre a
amostra e um anticorpo policlonal com biotina e um segundo anticorpo policlonal
marcado com rutênio, formando um imunocomplexo. O sistema Elecsys consiste
de micropartículas magnetizadas revestidas de streptavidina onde se ligam os
imunocomplexos pela porção biotina de um dos conjugados. Essa ligação ocorre
na estação do eletrodo. Assim, basta uma lavagem para a retirada das moléculas
não ligadas e pode ser iniciada a reação de quimiluminescência por excitação
elétrica e leitura em fotomultiplicador (CHIEN; CHEN; KAO, 2006).
51
3 OBJETIVOS
Objetivo Primário
Verificar se a concentração dos peptídeos vasoativos ANP e BNP em sangue fetal
é perveptível através da dosagem pelo método de ensaio imunorradiométrico do
IRMA, devido à pequena quantidade de peptídeo em circulação no feto e ao
pequeno volume de sangue possível de ser obtido.
Objetivo Secundário
Verificar se o método tem sensibilidade suficiente para perceber variações
induzidas por doença fetal (no caso a anemia por isoimunização materna).
53
4 PACIENTES E
MÉTODOS
56
4.1 Pacientes
Para a realização do estudo de avaliação da técnica do IRMA para dosagem de
ANP e BNP em fetos, foram incluídas 17 gestantes. Todas haviam sido
encaminhadas ao Centro de Medicina Fetal do Hospital das clínicas - UFMG (no
ano de 2002), para submeterem-se à cordocentese para realização de exames
tradicionais, como hematimetria (em mães isoimunizadas) e cariótipos de fetos
malformados, além de tranfusão intra-uterina.
As gestantes foram consultadas quanto ao interesse de participarem desta
pesquisa. Aquelas que consentiram em participar assinaram um termo de
concordância, o consentimento informado (APÊNDICE A) e posteriormente foram
incluídas no estudo.
A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Humanos
(COEP-UFMG) e encontra-se registrada no Sistema Nacional de Ética em
Pesquisa (SISNEP) sob o nº ETIC 089/05 (ANEXO A).
57
4.1.1 Caracterização das gestantes estudadas
As gestantes estudadas foram caracterizadas em relação à idade gestacional,
paridade e idade, conforme mostram as TAB. 1, 2, 3, 4, 5 e 6 e os GRAF. 1, 2 e 3.
TABELA 1
Distribuição das gestantes por idade gestacional (em semanas)
Idade Gestacional Freqüência Percentual (%)
≤ 24 3 17
25 a 26 4 23
27 a 28 3 18
29 a 30 2 12
31 a 32 3 18
33 2 12
Total 17 100
58
TABELA 2
Caracterização das gestantes de acordo com a idade gestacional (em semanas)
Características Média Mínimo - Máximo Mediana
Idade gestacional 28 23 - 33 28
n= 17
GRÁFICO 1 - Distribuição das gestantes de acordo com a idade gestacional
(em semanas).
<=24
17%
25 a 26
23%
27 a 28
18%
29 a 30
12%
31 a 32
18%
33
12%
59
TABELA 3
Distribuição das gestantes de acordo com a paridade
Paridade Freqüência Percentual (%)
2 7 41
3 1 6
4 8 47
6 1 6
Total 17 100
TABELA 4
Caracterização das gestantes de acordo com a paridade
Características Média Mínimo - Máximo Mediana
Paridade 3,24 2 - 6 4
n= 17
GRÁFICO 2 - Distribuição das gestantes de acordo com a paridade.
2
41%
3
6%
4
47%
6
6%
60
TABELA 5
Distribuição das gestantes de acordo com a idade (em anos)
Idade Freqüência Percentual (%)
≤ 21 5 28
22 a 24 4 24
25 a 27 1 6
28 a 30 2 12
31 a 33 4 24
≥ 34 1 6
Total 17 100
TABELA 6
Caracterização das gestantes de acordo com a idade (em anos)
Características Média Mínimo - Máximo Mediana
Idade 25,29 19 - 34 23
n= 17
GRÁFICO 3 - Distribuição das gestantes por idade (em anos).
<=21
28%
22 a 24
24%
25 a 27
6%
28 a 30
12%
31 a 33
24%
>=34
6%
61
TABELA 7
Descrição dos fetos de acordo com o valor da hemoglobina pré-TIU
Variável N Média
Desvio-
padrão
Mínimo Mediana Máximo
Hb-pré
TIU
17 9,735 3,564 3,600 10,000 15,500
Hb Pré-TIU: hemoglobina pré-transfusão intra-uterina; N: número de casos.
Os fetos que apresentaram hemoglobina < 10g/dl foram considerados anêmicos.
4.1.2 Critérios de inclusão
• Gestante, do Centro de Medicina Fetal do HC - UFMG, com indicação para
realizar cordocentese (hematimetria ou cariótipo) e posteriormente
transfusão intra-uterina.
• Concordância em participar do estudo - consentimento informado.
• Confirmação da punção da veia umbilical certificando a pureza do sangue fetal
(volume corpuscular médio - VCM >106 fL).
4.1.3 Critérios de exclusão
• Cardiopatia fetal.
• Malformações congênitas
• Uso de fármacos com ação no coração fetal (exemplo: dicitalicot,
propanolol).
• Pré-eclampsia e/ou hipertensão arterial crônica (HAC).
• Diabetes materno.
62
4.2 Métodos
4.2.1 Cordocentese - técnica de coleta do sangue fetal
A coleta do sangue fetal para posterior dosagem pela técnica do IRMA foi
realizada pela equipe do Centro de Medicina Fetal da UFMG, através de
cordocentese, seguindo-se o protocolo do serviço.
O sangue fetal foi obtido da veia do cordão umbilical das gestantes cujos fetos
eram submetidos à transfusão intra-uterina. Sempre que se realiza uma
transfusão desse tipo, é necessária a retirada de certa quantidade de sangue do
feto para exame hematimétrico antes que ele receba o novo sangue. Era desse
volume retirado de sangue fetal que se obtinha a amostra para a dosagem dos
peptídeos vasoativos.
Guiados pelo aparelho de ultra-som Siemens SONOLINE Prima, dois
profissionais do CEMEFE-HC/UFMG (sempre os mesmos) iniciavam o
procedimento com anti-sepsia abdominal materna em local previamente
selecionado para punção. Em seguida, era aplicado um anestésico local
(xylocaína 1% sem adrenalina) para anestesia no abdome materno. Para
obtenção do sangue, uma agulha longa (BD 20 Gauge) era introduzida através do
abdome materno e puncionava a veia umbilical, em local próximo à inserção
placentária ou em alça livre no cordão umbilical.
63
FIGURA 8 – Foto tirada pelo aparelho de ultra-som durante a cordocentese
A quantidade aspirada variou entre 5 e 7ml de sangue fetal. Desse volume:
• 1ml foi utilizado para determinação do grupo sanguíneo, fator Rh e valor de
hemoglobina fetais. Uma pequena parte foi usada para determinação
rápida quantitativa da hemoglobina no sangue fetal, no aparelho
HEMOCUE® (B-Hemoglobin Photometer HEMOCUE AB; ANGELHOLM
SWEDEN) previamente calibrado, o que permite imediato conhecimento do
valor de hemoglobina e, desta forma, possibilita prever o grau de anemia
fetal a fim de fazer a programação do volume a ser transfundido (nos casos
indicados). O restante foi encaminhado ao Laboratório Central do
HC/UFMG para confirmação da hemoglobina dosada no HEMOCUE® e
avaliação do VCM para certificação de que o sangue foi colhido da veia
umbilical e não da circulação materna.
• 1ml recolhido em seringa pré-heparinizada foi usado para a gasometria.
• 1 a 2ml, obtido e repassado para tubos tipo Vacutainer ® contendo EDTA,
foi utilizado para dosagem dos peptídeos natriuréticos (ANP e BNP). Esse
64
volume de sangue fetal foi encaminhado ao Laboratório de Medicina Fetal
do CEMEFE-HC/UFMG para ser centrifugado e armazenado.
4.2.2 Técnica de processamento e armazenamento do sangue fetal
Inicialmente, cada uma das amostras de mais ou menos 1,0ml de sangue fetal foi
centrifugada por 10 minutos a 4000 rpm, a 4°C, em um aparelho Eppendorf
Centrífuga 5403, para que fosse retirado o plasma sanguíneo com micropipeta. O
plasma separado foi acondicionado em tubo de eppendorf de 2ml, os tubos foram
identificados, conforme registro do caso, no banco de dados do estudo e
armazenado em nitrogênio líquido a -196°C. As amostras congeladas foram
posteriormente usadas para a dosagem dos peptídeos natriuréticos vasoativos
pela técnica do IRMA.
4.2.3 Técnica de dosagem dos peptídeos ANP e BNP pelo método IRMA (ensaio
imunorradiométrico)
Para dosar os peptídeos vasoativos fetais - ANP e BNP - pela técnica do IRMA,
foi utilizado um kit de ANP e outro de BNP marca SHIONOGI & Co.Ltd.Osaka-
Japan.
65
A técnica IRMA é conhecida como “sanduíche”. Utiliza dois anticorpos
monoclonais que reconhecem a região carboxiterminal e a estrutura
intramolecular em forma de anel do peptídeo, respectivamente.
O SHIONOGI ANP e o SHIONOGI BNP são kits de ensaio imunorradiométrico
para a determinação quantitativa desses peptídeos natriuréticos e apresentam
como princípio imunorradiométrico uma fase sólida em que um dos dois
anticorpos monoclonais é fixado a uma "pérola" que deve ser previamente
preparada para interagir com o sítio específico do peptídeo. O segundo anticorpo
é marcado com o radioisótopo iodo 125 (I
125
), usado como traçador, como mostra
a FIG. 9.
.
FIGURA 9 - Desenho da técnica IRMA.
Para a dosagem dos peptídeos, o primeiro anticorpo monoclonal antiANP ou
antiBNP humano foi colocado em um tubo de ensaio de polietileno fixado à
66
"pérola" (fase sólida). A ele foram adicionados 100μl da amostra de plasma fetal e
200μl de solução contendo o segundo anticorpo monoclonal antiANP ou antiBNP
humano marcado com o I
125
.
A curva foi preparada a partir da reconstituição dos padrões com 0,5ml de água
destilada em cada um dos seis tubos contendo concentrações crescentes, fixas e
definidas de ANP ou BNP sintético humano liofilizado (tubos de A a H nas
seguintes concentrações: 4, 10, 40, 150, 600, 2000pg/ml). Dois controles com
concentração de 20 e 300pg/ml fornecidos pelo kit foram usados no ensaio após
reconstituição com 0,5ml de água destilada. Esse conjugado (amostra + dois
anticorpos) foi levemente misturado (em agitador vortex) e os tubos foram
incubados overnight (22 horas / 2-8°C).
O conteúdo líquido dos tubos foi aspirado cuidadosamente o máximo possível.
Adicionaram-se 2ml de solução de lavagem (previamente reconstituída com
1.000ml de água destilada) em cada tubo, o que foi posteriormente aspirado.
Esse processo de lavagem e aspiração foi repetido uma vez.
A leitura da reação foi feita no aparelho Minigama Radiometer. A quantidade de
radioatividade emitida (na fase sólida) é proporcional à quantidade de peptídeo,
ANP ou BNP, da amostra.
A dosagem dos peptídeos vasoativos fetais pela técnica do IRMA foi feita no
Laboratório de Endocrinologia e Metabolismo do Departamento de Fisiologia do
ICB da UFMG, coordenado pela Professora Adelina Martha dos Reis. As
67
amostras foram transportadas até o laboratório em recipiente de isopor com gelo
seco, sendo descongeladas apenas na hora da realização das dosagens.
4.3 Metodologia Estatística
4.3.1 Tipo de estudo
Trata-se de estudo descritivo, transversal. O resultado considerado tem avaliação
qualitativa (percepção dos peptídeos pelo método testado).
4.3.2 Análise estatística
Foram utilizadas tabelas para a descrição das dosagens sanguíneas fetais do
ANP e do BNP (pg/ml) e gráficos de distribuição para as distribuições dos níveis
sanguíneos fetais do ANP e do BNP (pg/ml). E um outro gráfico para descrição
dos fetos quanto à presença ou ausência de anemia fetal (Hb ,10g/dl).
A correlação entre níveis de hemoglobina pré-TIU e as concentrações de ANP e
BNP no sangue fetal, foram verificadas através da análise por regressão.
Para realizar o estudo foi utilizado o programa MINITAB Inc® versão 11.12 de
1996.
O nível de significância considerado foi de p<0,05.
68
69
5 RESULTADOS
5.1 Grupo de estudo
Neste estudo foram analisados os resultados das dosagens de ANP e BNP dos
fetos de 17 gestantes, seguindo-se os critérios de inclusão descritos no capítulo 4
deste estudo.
Em uma das 17 amostras de sangue fetal foi obtida apenas a dosagem de ANP e
em uma outra apenas a dosagem de BNP. Já que eram duas amostras com
menor quantidade. Sendo assim, dos 17 fetos incluídos no estudo, obtivemos 16
dosagens de ANP e 16 dosagens de BNP.
5.2 Descrição das dosagens sanguíneas fetais de ANP
Pela TAB. 8 é possível verificar que em 16 dosagens de ANP fetal realizadas, o
valor mínimo encontrado foi de 26pg/ml e o máximo de 655,2pg/ml. Isso
mostrando que o teste foi sensível à variação dos valores. A mediana foi
89,7pg/ml e a média 144,8pg/ml. O GRAF. 4 representa a distribuição dos
valores sanguíneos fetais do ANP.
69
TABELA 8
Descrição das dosagens sanguíneas fetais de ANP (pg/ml)
Variável N Média
Média
SE
Desvio-
Padrão
Mínimo Q1 Mediana Q3 Máximo
ANP
(pg/ml)
16 144,8 39,0 155,9 26,0 55,4 89,7 212,0 655,2
ANP: peptídeo atrial natriurético; N: número de casos
Níveis sanguíneos fetais do ANP (pg/ml)
63054045036027018090
GRÁFICO 4 - Distribuição dos níveis sanguíneos fetais do ANP (pg/ml).
70
5.3 Descrição das dosagens sanguíneas fetais de BNP
A TAB. 9 mostra que os valores de BNP fetais das 16 amostras analisadas
variaram de 11,9pg/ml a 284,9pg/ml. O GRAF. 5 representa a distribuição dos
valores sanguíneos fetais do BNP.
TABELA 9
Descrição das dosagens sanguíneas fetais de BNP (pg/ml)
Variáve
l
N
Média
Média
SE
Desvio-
padrão
Mínimo Q1 Mediana Q3 Máximo
BNP
(pg/ml)
16 67,7 17,4 69,6 11,9 19,0 46,2 92,0 284,9
BNP - peptídeo natriurético tipo-B; N - número de casos
Níveis sanguíneos fetais do BNP (pg/ml)
2802402001601208040
GRÁFICO 5 - Distribuição dos níveis sanguíneos fetais do BNP (pg/ml).
71
5.4 Descrição dos fetos segundo presença ou ausência de anemia fetal -
(Hb <10g/dl)
No grupo dos fetos não anêmicos (Hb ≥10g/dl), o valor médio da hemoglobina
encontrado foi de 12,56g/dl. Já no grupo dos fetos com anemia (Hb <10 g/dl), a
média da hemoglobina foi de 6,56g/dl. Essa comparação pode ser visualizada no
GRAF. 6.
Anemia ausente
Hemoglobina fetal (g/dl)
10
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Anemia presente
Média 6,56
Média 12,56
GRÁFICO 6 - Descrição dos fetos quanto à presença ou ausência de anemia fetal
(Hb <10 g/dl).
72
5.5 Correlação entre níveis de Hb e ANP no sangue fetal
Na análise por regressão a associação entre os valores sanguíneos fetais de ANP
(pg/ml) e valores fetais de Hb-pré-TIU (g/dl), não mostrou correlação entre eles
(p=0,491), como mostra o GRÁF. 7.
Hb-Pré TIU
ANP pg/ml
15,012,510,07,55,0
700
600
500
400
300
200
100
0
S 158,522
R-Sq 3,5%
R-Sq (ad j) 0,0%
Fitted Line Plot
ANP pg/ml = 67,0 + 8,19 Hb-Pré TIU
GRÁFICO 7 - Correlação entre níveis de Hb pré-TIU e ANP no sangue fetal
(p=0,491).
73
5.6 Correlação entre níveis de Hb e BNP no sangue fetal
A partir da análise por regressão que associou os níveis de BNP (pg/ml) com os
valores da Hb-pré-TIU no sangue dos fetos, registrou-se correlação positiva
(p=0,010), verificando-se que o BNP diminui à medida que aumenta o valor da
hemoglobina.
Hb-Pré TIU
BNP pg/ml
15,012,510,07,55,0
300
250
200
150
100
50
0
S 56,2469
R-Sq 39,0%
R-Sq (ad j) 34,6%
Fitted Line Plot
BNP pg/ml = 187,3 - 12,06 Hb-Pré TIU
GRÁFICO 8 - Correlação entre níveis de Hb pré-TIU e BNP no sangue fetal
(p=0,010).
74
6 COMENTÁRIOS
O presente estudo se propôs a verificar a possibilidade de dosagem dos
peptídeos ANP e BNP no sangue fetal. O motivo dessa dúvida se refere ao fato de
saber-se que o feto sintetiza diversos hormônios e peptídeos vasoativos em
pequena quantidade, compatível com seu nível de complexidade tecidual, ainda
em crescimento e elaboração.
A importância de se dispor de uma técnica capaz de dosar substâncias fetais
(sensibilidade do método) a partir de pequeno volume de amostras sanguíneas é
imensurável. A partir desses métodos, pode-se estudar a fisiologia do feto
humano e a evolução natural de algumas doenças que sabidamente alteram as
concentrações dessas substâncias a serem dosadas.
Tradicionalmente, a dosagem dos peptídeos vasoativos ANP e BNP se realizava
por radioimunoensaio (RIE) que, para sua completa realização (calibração das
colunas e dosagem), necessita de amostra superior a 5ml, idealmente superior a
10ml de sangue total. Esse volume em fetos no segundo trimestre corresponde à
quantidade próxima de 4% da sua volemia total, tendo o potencial de promover
repercussões hemodinâmicas fetais (CABRAL, 2005).
O teste de dosagem dos peptídeos vasoativos pela técnica do IRMA testado em
1996 (CLERICO et al., 1996) caracteriza-se por utilizar amostras de pequeno
volume, mantendo a mesma confiabilidade dos resultados do RIE (CLERICO;
LEVARSI; MARIANI, 1999), tornando o método potencialmente de grande
utilização no feto humano, principalmente com idade gestacional distante do
termo. Por esta razão, escolhemos o Kit IRMA para dosar o ANP e o BNP em
76
nosso estudo. Pela primeira vez esse método foi utilizado para dosagem dos
peptídeos vaoativos em sangue fetal.
Os resultados do presente estudo foram conclusivos em mostrar dosagem do
ANP e do BNP em fetos na faixa gestacional entre 23 e 33 semanas. Em média,
as dosagens foram realizadas em amostras de sangue fetal com volume médio de
1,5ml.
Outro aspecto que também se tentou mostrar neste trabalho é que fatores
sabidamente determinantes de elevação dos peptídeos vasoativos, a partir de sua
ocorrência, mostram variações de resultados quanto à especificidade do método
IRMA. Assim sendo, mostrou-se de forma definitiva que fetos anêmicos,
sabidamente uma condição que altera a concentração dos peptídeos vasoativos,
apresentam concentrações diferentes conforme o grau diferenciado de sua
anemia.
A isoimunização (Rh) é caracterizada por uma circulação hiperdinâmica com
velocidade de fluxo sanguíneo aumentada nas artérias e veias. Além disso a
anemia fetal é compensada por uma aumentada carga cardíaca. Ville et al. (1994)
encontraram níveis aumentados de ANP em fetos anêmicos, acidêmicos e
hidrópicos. Já Kingdom et al. (1989) referenciaram níveis aumentados de ANP
após transfusão intravascular, diferente do relato feito por Walter; Stepan; Faber
(2001), que encontraram níveis aumentados de BNP após transfusão
intravascular mas verificaram que o ANP não se alterou. Fisk et al. (1990)
relataram níveis aumentados de ANP em fetos não hidrópicos e níveis diminuídos
de ANP em fetos hidrópicos após transfusão. Pode-se perceber facilmente como
77
são conflitantes os resultados encontrados com relação as concentrações do ANP
na circulação fetal e em doenças fetais.
Walter; Stepan; Faber (2001), em trabalho realizado com 9 fetos isoimunizados e
9 fetos sem isoimunização (controles), verificaram que o ANP mostrou-se
aumentado na presença da isoimunização (Rh) e o BNP não apresentou aumento
significativo. Em nosso estudo econtramos resultado divergente. Utilizando uma
amostragem maior, 17 fetos com isoimunização, verificamos ao efetuar a análise
de regressão, que a diminuição no valor da hemoglobina pré-TIU (maior grau de
anemia) está associada a um aumento no nível do BNP (GRÁFICO 8), mostrando
correlação entre o peptídeo e a anemia fetal.
A partir dos resultados aqui encontrados a técnica do IRMA passa a ser
plenamente validada para estudar condições clínicas e doenças fetais que, sem
dúvida, interferem na produção e secreção desses peptídeos.
No CEMEFE do HC-MG os estudos a respeito do diagnóstico da insuficiência
cardíaca fetal, do ponto de vista bioquímico, passarão a utilizar o BNP como
marcador da contratilidade do músculo cardíaco do coração fetal.
Outras situações capazes de alterar os peptídeos vasoativos, como o ANP na
transfusão feto-fetal (no feto pletórico), poderão, a partir de agora, ter as
dosagens realizadas por esse método descrito e validado neste estudo.
78
Desta forma, esperamos ter contribuído com pequeno avanço no conhecimento
do feto humano, com resultados futuros de melhor condução em situações de
risco à saúde fetal.
79
7 CONCLUSÃO
Em face dos resultados obtidos, pode-se concluir que a técnica de dosagem dos
peptídeos vasoativos pelo método do IRMA é viável e confiável quando realizada
em sangue fetal.
81
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Automated B-Type Natriuretic Peptide Assay in Patients with Heart Failure: A
Multisite Study. Clinical Chemistry, Washington DC, v. 50, n.5, p. 867-873, May,
2004.
YAMAJI, T.; ISHIBASHI, M. TAKAKU, F.; Atrial Natriuretic Factor in Human Blood.
The Journal of Clinical Investigations, Ann Arbor MI, v. 76, n. 4, p. 1705-1709,
Oct., 1985.
YAMAJI, T. et al. Atrial natriuretic peptide in umbilical cord blood: evidence for a
circulating hormone in human fetus. The Journal of Clinical Endocrinology and
Metabolism, Springfield, v. 63, n. 6, p. 1414-1417, Dec., 1986.
YANDLE, T.G. Minisymposium: the natriuretic peptides hormones. Biochemistry of
natriuretic peptides. Journal of Internal Medicine, Oxford, v. 235, n. 6, p. 561-
576, June, 1994.
YANG-FENG, T. L. et al. The prodilatin gene is located on the distal short arm of
human chromosome 1 and on mouse chromosome 4. American Journal of
Human Genetics, Baltimore, v. 37, n. 6, p. 1117-1128, Nov., 1985.
90
APÊNDICE E ANEXO
APÊNDICE A
Avaliação da técnica do IRMA para dosagem de peptídeos vasoativos
(ANP e BNP) em sangue fetal
Consentimento pós-informado
Estamos realizando no Hospital das Clínicas da UFMG a pesquisa intitulada Avaliação da técnica do
IRMA para dosagem de peptídeos vasoativos (ANP e BNP) em sangue fetal.
O sangue fetal possui substâncias chamadas peptídeos vasoativos que são capazes de informar sobre a
gravidade de algumas doenças do feto, principalmente as mal formações cardíacas e os casos de anemia.
Estas informações são importantes para escolher o melhor tratamento a ser feito quando o feto tem
anemia.
A técnica do IRMA é um exame de laboratório que possibilita a realização de exames com pequena
quantidade de sangue ou tecido cardíaco.
Como existe indicação para coleta de sangue do seu feto por causa da anemia, gostaríamos de solicitar a
sua autorização para que a parte do sangue que foi retirado e que vai ser jogado fora possa ser usado para
realizar a dosagem dos peptídeos vasoativos ANP e BNP.
Caso você não concorde em autorizar este exame não haverá nenhum prejuízo quanto ao seu tratamento
ou do seu filho no Hospital das Clínicas.
Os resultados dos exames estarão arquivados e caso você queira ser informada dos mesmo em qualquer
momento basta solicitar.
Eu, ........................................................................................., portadora de documento de identidade n°
.........................................., expedido pela ............................................, estou ciente do que foi exposto
acima e autorizo a retirada de amostra de sangue fetal, durante a transfusão intra-uterina realizada para
tratamento desta doença, para esta pesquisa. participo de forma voluntária deste estudo e estou ainda
ciente de que a amostra colhida não trará risco à minha saúde ou a de meu bebê, além daqueles próprios
da doença e da transfusão intra-uterina, dos quais já estou ciente.
Belo Horizonte, ............. de ...................................... de .............
__________________________________________________
assinatura da paciente
Telefone para contato: 031 32489422
Maternidade Hospital das Clínicas da UFMG
Erika - Bióloga 031 99433979
Comitê de ética em pesquisa da UFMG - 031 34994592
92
ANEXO A
93
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