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ASPECTOS IMUNOLÓGICOS E MORFOLOGIA DO CANAL ALIMENTAR DE
OPERÁRIOS DE Nasutitermes coxipoensis (HOLMGREN) (ISOPTERA: TERMITIDAE)
por
FRANKLIN MAGLIANO DA CUNHA
(Sob Orientação da Professora Valéria Wanderley Teixeira)
RESUMO
Cerca de 10% das espécies de cupins têm sido apontadas como agente de algum tipo de dano às
plantas. Devido ao hábito alimentar variado desses insetos, as características do tubo digestivo dos
operários e pseudo-operários são normalmente utilizadas em sistemática e filogenia. Uma
alternativa para o controle desses insetos é a utilização de fungos entomopatogênicos. No entanto,
os aspectos ligados às reações imunológicas dos insetos promovidas pelas interações com esses
patógenos, permanecem ainda bastante escassos, principalmente ao que tange as reações imunes
deflagrada pelos hemócitos. Assim a presente pesquisa teve os seguintes objetivos: 1. identificar e
caracterizar a morfologia e ultra-estrutura dos hemócitos de operários do cupim Nasutitermes
coxipoensis (Holmgren); 2. ampliar as informações sobre as reações imunológicas dos hemócitos
quando desafiados imunológicamente por Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin. e 3.
descrever a histologia do canal alimentar, visando contribuir com informações que possam ser
utilizadas na sistemática desse inseto. A análise em microscopia de luz e eletrônica dos hemócitos
revelou os seguintes tipos celulares: Plasmatócitos (PL), Granulócitos (GR), Esferulócitos (ES),
Prohemócitos (PR), Adipohemócitos (AD) e Oenocitóides (OE). Entre as concentrações de 1x10
3
a
1x10
7
conídios/mL de M. anisopliae, a concentração mais elevada de 1x10
7
conídios/mL foi a mais
eficiente com TL
50
de 1,62 dias. Verificou-se que as células mais freqüentes na hemolinfa foram os
i
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Plasmatócitos e os Granulócitos para os tratamentos nos diferentes intervalos de tempo. Analisando
a dinâmica hemocitária nos intervalos de 24h, 48h, e 72h, notou-se que os Plasmatócitos reduziram
significativamente, enquanto que os Granulócitos aumentaram, após 72h da inoculação. Os
Prohemócitos não diferiram estatisticamente nos intervalos de tempos, bem como entre os
tratamentos. Durante a contagem diferencial não foram evidenciadas alterações na morfologia
dessas células. Assim, a utilização do método de inoculação por pulverização na concentração de
1x10
7
conídios/mL, em laboratório, mostrou-se eficiente contra os mecanismos de defesa de N.
coxipoensis. As características histológicas do canal alimentar dos operários, de modo geral, foram
semelhantes as observadas em várias espécies de cupins, porém foram evidenciadas diferenças na
morfologia das células epiteliais e tipos de dobras na região do estomodeu, na disposição e número
dos ninhos, bem como a presença da membrana peritrófica na região do mesêntero. Assim essas
características podem ser utilizadas como critérios para a diferenciação entre as espécies de cupins
do gênero Nasutitermes.
PALAVRAS-CHAVE: Dinâmica hemocitária, canal alimentar, histologia, Metarhizium
anisopliae, sistemática, Nasutitermes coxipoensis
ii
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IMMUNOLOGIC ASPECTS AND MORFOLOGY OF TERMITES’ ALIMENTARY CANAL
OF Nasutitermes coxipoensis (HOLMGREN) (ISOPTERA: TERMITIDAE)
by
FRANKLIN MAGLIANO DA CUNHA
(Under The Direction of Valéria Wanderley Teixeira)
About 10% of the termites’ species have been pointed as agent of some type of damage to the
plants. Due to the diversity of food utilization of termites, the characteristics of the digestive tract
of the workers and pseudo-workers can be used in systematics and filogenia of these insectes. A
control methods of termites is the use of entomopathogenic fungi. Aspects regarding the
immunologic response of termites triggered by pathogens invasions, however, remain scarce
especially related to the immune reactions deflagrated by the hemocytes. Thus this research
focused the following objectives: 1. to identify and to characterize the hemocytes morphology of
Nasutitermes coxipoensis (Holmgren) worker´s cast; 2. to generate information about the
immunologic reactions of hemocytes when challenged by Metarhizium anisopliae (Metsch.)
Sorokin in N. coxipoensis workers and, 3. to describe the histology of workers digestive tract
aiming to contribute with support information for systematics of termites. Analysis in light and
electronics microscopy of the hemocytes typified the presence of the following cells:
Plamatocytes (PL), Granulocytes (GR), Spherulocytes (ES), Prohemocytes (PR), Adipohemocytes
(AD) and, Eonocytoids (OE). Among the concentrations from 1x10
?
to 1x10
7
conidia/mL of M.
anisopliae, the highest concentration 10
7
conidia/mL was the most efficient with LT
50
of 1.62
days. Under this concentration verified greatest frequency of Plamatocytes and Granulocytes in
the hemolymph collected during the intervals of from 24 to 72h after application. The hemocitary
iii
dynamics during the intervals of 24h, 48h, and 72h after application exhibited significant
reduction in Plamatocytes and increasing in Granulocytes. Despite of variation on cell counting
was not notified any morphological alterations in the cells. The use of termites spraying as
treatment method with 1x10
7
conidia/mL, in laboratory, triggered the defense mechanisms of N.
coxipoensis. The histology of the digestive tract of the workers, in general, exhibited similar
characteristics to those observed in other species of termites. Exceptions, however, were identified
in the morphology of the epithelial cells regarding the types, number and displaying of these cells
in the region of stomodeum as well as the existence of the peritrophic membrane in the region of
midgut. Thus these characteristics can be used as criteria for the differentiation among the species
of termites of the genus Nasutitermes.
Key words: Hemocytary dynamic, digestive tract, histology, Metarhizium anisopliae, termites
systematic, Nasutitermes coxipoensis.
iv
ASPECTOS IMUNOLÓGICOS E MORFOLOGIA DO CANAL ALIMENTAR DE
OPERÁRIOS DE Nasutitermes coxipoensis (HOLMGREN) (ISOPTERA: TERMITIDAE)
por
FRANKLIN MAGLIANO DA CUNHA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Entomologia Agrícola, da
Universidade Federal Rural de Pernambuco, como parte dos requisitos para obtenção do grau de
Mestre em Entomologia Agrícola.
RECIFE - PE
Fevereiro – 2007
v
ASPECTOS IMUNOLÓGICOS E MORFOLOGIA DO CANAL ALIMENTAR DE
OPERÁRIOS DE Nasutitermes coxipoensis (HOLMGREN) (ISOPTERA: TERMITIDAE)
por
FRANKLIN MAGLIANO DA CUNHA
Orientadora:
Valéria Wanderley Teixeira – UFRPE
Co-orientador:
Álvaro Aguiar Coelho Teixeira – UFRPE
Examinadores:
Luiz Carlos Alves – CPqAM-FIOCRUZ
Jorge Braz Torres – UFRPE
vi
A minha orientadora Valéria Wanderley Teixeira,
que através dos anos de convívio, sempre me incentivou
a crescer profissionalmente e pessoalmente, como uma
verdadeira grande amiga.
DEDICO.
Aos meus pais José Luiz da Cunha (in memoriam)
e Aurora Magliano da Cunha, minha irmã Bianca Simonetti,
meu sobrinho Eduardo Jorge e minha amada namorada Lídia Alencar.
OFEREÇO.
vii
AGRADECIMENTOS
A inteligência suprema causa primária de todas as coisas, Deus, pela inspiração e força na
realização de mais uma etapa em minha jornada de vida.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão
de bolsa de estudo.
A Universidade Federal Rural de Pernambuco e ao Programa de Pós-graduação de
Entomologia Agrícola pela realização deste curso.
Ao Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães/FIOCRUZ e Laboratório de Pesquisa Keizo
Asami (LIKA/UFPE), por abrirem suas portas para o desenvolvimento de parte da minha
pesquisa.
Aos meus pais José Luiz da Cunha (in memoriam) e Aurora Magliano da Cunha por todos
os esforços que sempre empregaram em suas existências para proporcionar-me uma vida com
amor, dignidade, carinho e respeito.
A minha irmã Bianca Simonetti Magliano pelo carinho e auxílio dispensados a mim.
A Lídia Alencar, namorada que tanto amo, por partilhar comigo todos os momentos
vivenciados nesses últimos tempos, o meu muito obrigado.
Aos meus parentes por todo o carinho e incentivo.
Aos meus orientadores Álvaro Aguiar Coelho Teixeira, Valéria Wanderley Teixeira e
Auristela Correia de Albuquerque por todo respeito, carinho, amizade e profissionalismo
compartilhados comigo durante os nossos seis anos de convivência.
Aos amigos Marco Aurélio Paes e Laurici Pires pela sincera amizade e constante disposição
em colaborar comigo.
viii
A todos os amigos do Laboratório de Histologia que sempre demonstraram um espírito de
colaboração e fraternidade, mantendo um ambiente salutar e alegre para a realização dos nossos
trabalhos.
Meus agradecimentos especiais aos estagiários Paulo Estevão (Sr. Burns), Andresa Cristina,
Lílian Maria e Ana Janaína, pela grandiosa ajuda na realização desde trabalho.
Aos pesquisadores Fábio Brayner e Luiz Carlos Alves por toda atenção, respeito e
principalmente amizade, construídas ao longo do desenvolvimento da pesquisa. As mestrandas
Helena Rocha e Marília Gabriela, aos estagiários Fernando Caldeira, Fabiana Lira, Gabriela Brito,
Sílvia Cabral aos técnicos Rafael Padilha, Sérgio Santos, Raimundo Pimentel, Fábia Melo e
Rodrigo Martins, pela colaboração no preparo das amostras para a microscopia eletrônica, bem
como todo conhecimento compartilhado, além da amizade desenvolvida.
Ao professor Jorge Braz Torres pela consultoria estatística e amizade desenvolvida.
Ao professor Antônio F. de Souza Leão Veiga pela ajuda na coleta e manutenção dos
insetos.
A todos os colegas de turma e professores do programa de pós-graduação o meu muitíssimo
obrigado por toda a experiência profissional e de vida adquirida ao longo do curso.
ix
SUMÁRIO
Páginas
AGRADECIMENTOS...................................................................................................................viii
CAPÍTULOS
1 INTRODUÇÃO.............................................................................................................01
LITERATURA CITADA....................................,,,,,,,,,,................................................05
2 CARACTERIZAÇÃO DOS HEMÓCITOS DE OPERÁRIOS DE Nasutitermes
coxipoensis (HOLMGREN) E AVALIAÇÃO HEMOCITÁRIA APÓS
PARASITISMO POR Metarhizium anisopliae (METSCH.) SOROKIN
....................................................................................................................................09
RESUMO....................................................................................................................10
ABSTRACT...............................................................................................................11
INTRODUÇÃO..........................................................................................................12
MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................14
RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................16
AGRADECIMENTOS...............................................................................................20
LITERATURA CITADA...........................................................................................20
3 HISTOLOGIA DO CANAL ALIMENTAR DE OPERÁRIOS DE Nasutitermes
coxipoensis (HOLMGREN) (ISOPTERA:TERMITIDAE).......................................30
RESUMO....................................................................................................................31
ABSTRACT...............................................................................................................32
INTRODUÇÃO..........................................................................................................33
MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................35
RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................36
x
AGRADECIMENTOS...............................................................................................39
LITERATURA CITADA...........................................................................................39
xi
CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO
Os cupins são insetos que apresentam uma ampla distribuição geográfica com grande
diversidade e abundância de indivíduos, que os tornam importantes para os ecossistemas, pois
devido ao seu hábito alimentar, participam ativamente, junto às formigas, na decomposição da
matéria orgânica vegetal e como consumidores primários (Donovan et al. 2000).
Na América do Sul foram registradas cerca de 400 espécies de cupins, as quais estão
distribuídas nas seguintes famílias: Kalotermitidae, Rhinotermitidae, Serritermitidae,
Termopsidae e Termitidae. Os Termitidae perfazem cerca de 54% e são dominantes em
abundância e diversidade (Constantino 1999).
Devido ao hábito alimentar variado dos cupins, as características do tubo digestivo dos
operários e pseudo-operários são normalmente utilizadas em sistemática e filogenia, e podem ser
detectáveis em nível de microscopia óptica de luz e eletrônica (Oliveira et al. 1988, Godoy 2004).
Segundo Gonçalves (1979) e Noirot (1995), a anatomia do tubo digestivo dos cupins da família
Termitidae apresenta-se bastante variada quando comparada aos chamados cupins inferiores.
O forte impacto causado pelas constantes expansões das fronteiras agrícolas e a facilidade de
transporte de produtos entre muitas áreas tem favorecido o aumento do número de espécies de
cupins que passam ao status de pragas, tanto urbanas quanto agrícolas (Fontes 1995, Vasconcellos
et al. 2002). Assim, cerca de 10% das espécies de cupins tem sido apontada como agente de
algum tipo de dano às plantas (Edwards & Mill 1986, Constantino 2002).
Segundo Novaretti & Fontes (1998), as culturas da cana de açúcar, arroz e eucalipto são as
mais atingidas pelos cupins na América do Sul. Esses autores registram ainda que plantios de
1
café, milho, algodão e fruteiras podem ser atacadas por esses insetos. No Brasil, os cupins têm
sido responsáveis pela redução da produção canavieira, algo em torno de 10 t/ha ao ano. Deste
modo, os cupins representam uma das mais sérias pragas da cana-de-açúcar no país (Constantino
2002).
Como conseqüências diretas da ação dos cupins à cana-de-açúcar, podemos relacionar danos
aos novos toletes utilizados no plantio, no tecido parenquimatoso e nas gemas (Pizano 1995).
Nesta cultura, Miranda et al. (2004) identificaram a ocorrência das espécies Armintermes
nordestinus Melo & Fontes, Cylindrotermes nordenskioeldi Holmgren, Nasutitermes coxipoensis
(Holmgren) e Syntermes nanus Constantino.
A espécie N. coxipoensis pertence à Família Termitidae. O gênero Nasutitermes caracteriza-
se por apresentar soldados com cápsula cefálica arredondada com coloração marrom-escuro e
tubo frontal (nasu) cônico, largo na base e mandíbulas atrofiadas. O tórax apresenta seu primeiro
segmento com uma protuberância em forma de cela. O abdome compõe-se de 10 segmentos.
Outras duas castas são encontradas na composição dos ninhos dessa espécie: os reprodutores de
primeira ordem, representada pelo rei e rainha, os reprodutores de segunda ordem ou neotênicos,
os quais serão responsáveis pela formação de novas colônias, e os operários. Esses últimos
desempenhando papel na ampliação e manutenção do cupinzeiro, além de exercer cuidados com
as ninfas, promovendo a alimentação das demais castas e os processos de assepsia (Fontes 1995,
Constantino 1999).
O uso de inseticidas químicos como fipronil (Regent
®
) e imidacloprid (Confidor 700
GrDA), por exemplo, apresentam-se como um recurso eficiente no controle dos cupins, no
entanto, essas moléculas ainda deixam resíduos no solo (Campos et al. 1998). Esse fato induz
uma busca constante e de forma global, por agentes de controle ou técnicas de manejo alternativo,
2
com efeitos mais específicos e menos nocivos ao ambiente para o uso nos agrossistemas (Martius
1998).
A utilização de agentes entomopatogênicos como os fungos são de grande viabilidade, pois
seu alto potencial de controle em diversas ordens de insetos é mundialmente conhecido e mesmo
utilizado em altas concentrações, ainda assim, evitam desequilíbrios biológicos de importância
nos sistemas ecológicos, mantendo as populações de parasitóides, predadores e polinizadores
nesses ambientes, colocando-os deste modo como importante estratégia de Manejo Integrado de
Pragas (MIP) (Pereira et al. 1998, Alves 1992, Neves et al. 2001).
Em Isoptera, o primeiro registro de parasitismo por fungos foi feito por Tate (1928) que
observou e descreveu os gêneros dos fungos Ectomyces e Termitaria e segundo Alves & Pereira
(1998) os fungos entomopatogênicos causam distúrbios fisiológicos, que refletem alterações no
tegumento, sistema circulatório, sistema reprodutor, sistema respiratório, sistema digestivo e
sistema nervoso. Dentre os fungos utilizados no controle biológico de insetos podemos destacar
Metarhizium anisopliae (Metsc.) Sorokin que pertence ao grupo dos Anamorfo, e que segundo
Kendrik (1992) é de onde derivam à maioria dos entomopatógenos.
No que se refere à patogenicidade nos cupins, Albuquerque et al. (2005) demonstraram que a
ação de M. anisopliae var. anisopliae e M. anisopliae var. acridum sobre N. coxipoensis em
laboratório é eficiente, com mortalidade de 95,7% (0,5 x 10
6
conídios/mL) e 88,8% (1,8 x 10
6
conídios/mL), respectivamente, demonstrando que M. anisopliae var. anisopliae possui maior
potencial para controle deste cupim. Sun et al. (2002), analisando a esporulação de M. anisopliae
sobre Coptotermes formosanus Shiraki em laboratório, concluíram que este fungo apresentou uma
rápida esporulação, o que é vantajoso devido ao comportamento social destes insetos, que segundo
Neves & Alves (1999) promovem um eficiente processo asséptico dos indivíduos.
3
A constante competição dos insetos com uma grande variedade de patógenos, favoreceu o
desenvolvimento de um complexo e eficiente sistema imunológico inato, o qual difere
aparentemente do sistema imunológico adaptativo dos vertebrados por não haver evidência para
mecanismos de memória imunológica (Hoffmann et al. 1996, Medzhitov & Janeway Jr 1997).
Sabe-se que a primeira linha de defesa dos insetos contra a ação de patógenos é representada pela
cutícula e o mesêntero que formam uma barreira bastante eficiente contra a invasão dos
microrganismos. Ocorrendo a quebra dessas barreiras, reações imunológicas começam a ser
desencadeadas (Søndergaard 1993, Gallo et al. 2002).
A literatura cita ainda que em alguns casos a baixa velocidade de mortalidade promovida
por alguns isolados ou pela baixa concentração do fungo, torna-se um inconveniente para uso no
controle biológico, pois nas relações entre patógeno/hospedeiro os primeiros distúrbios detectados
na hemolinfa disparam reações de defesa dos hemócitos, na tentativa de eliminar o agente invasor
ou limitar seu desenvolvimento. Estudos sobre esses mecanismos podem sugerir o
desenvolvimento de estratégias mais eficientes para o controle de pragas (Gunnarsson & Lackie
1985, Alves & Pereira 1998).
Os aspectos ligados às reações imunológicas dos insetos promovidos pelas interações com
fungos entomopatogênicos, permanecem ainda bastantes escassos, principalmente ao que tange as
reações imunes deflagradas pelos hemócitos, células que circulam livremente pela hemolinfa dos
insetos, responsáveis pelos processos de fagocitose, formação de nódulos, encapsulamento,
coagulação e citotoxidade (Vey & Götz 1986). Deste modo, o conhecimento dos mecanismos
imunes apresenta uma importância muito grande, pois os distúrbios causados nesses podem ser
sugeridos para o controle biológico de insetos vetores e pragas (Brunham et al. 1993).
Assim, a presente pesquisa visou: 1. identificar e caracterizar a morfologia e ultra-estrutura
dos hemócitos de operários do cupim N. coxipoensis; 2. ampliar as informações sobre as reações
4
imunológicas dos hemócitos quando desafiados imunológicamente por M. anisopliae e 3. descrever
a histologia do canal alimentar, visando contribuir com informações que possam ser utilizadas na
sistemática desse inseto.
Literatura Citada
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Gupta (Ed.) Hemocytic and humoral immunity in arthropods. John Wiley & Sons, Inc, 550p.
8
CAPÍTULO 2
CARACTERIZAÇÃO DOS HEMÓCITOS DE OPERÁRIOS DE Nasutitermes coxipoensis
(HOLMGREN) E AVALIAÇÃO HEMOCITÁRIA APÓS PARASITISMO POR Metarhizium
anisopliae (METSCH.) SOROKIN
F
RANKLIN M. CUNHA¹, VALÉRIA WANDERLEY-TEIXEIRA¹, ÁLVARO A.C. TEIXEIRA²,
AURISTELA C. ALBUQUERQUE¹, LUIZ C. ALVES³ E ELZA A. LUNA-ALVES LIMA
4
.
¹ Programa de Pós-Graduação em Entomologia Agrícola, UFRPE, Av. Dom Manoel de
Medeiros s/n, Dois Irmãos , 52171-900, Recife, PE.
² Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, UFRPE, Av. Dom Manoel de Medeiros
s/n, Dois Irmãos , 52171-900, Recife, PE.
³ Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA) – UFPE, Av. Moraes Rego s/n, 50670-
420, Recife, PE.
4
Laboratório de Controle Biológico, Departamento de Micologia/CCB, UFPE, Av. Prof.
Nelson Chaves Cidade Universitária, s/n, 50670-420, Recife, PE.
Cunha, F. M.; V. Wanderley-Teixeira, A. A. C. Teixeira, A. C. Albuquerque, L. C. Alves & E. A.
Luna-Alves Lima. Caracterização dos hemócitos de operários de Nasutitermes coxipoensis
(Holmgren) e avaliação hemocitária após parasitismo por Metarhizium anisopliae (Metsch.)
Sorokin. Micron.
9
RESUMO – Os insetos estão constantemente competindo com diferentes patógenos, o que
favoreceu o desenvolvimento de um complexo e eficiente sistema imunológico inato. Esses
mecanismos apresentam grande importância, pois os distúrbios causados podem ser utilizados para
o controle biológico de insetos. Esta pesquisa teve como objetivos identificar e caracterizar a
morfologia e ultra-estrutura dos hemócitos de operários de Nasutitermes coxipoensis (Holmgren)
(i); determinar os tempos letais de Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin sobre N. coxpoensis
nas concentrações de 10³ a 10
7
conídios/mL (ii) e; analisar a dinâmica hemocitária quando
imunologicamente desafiados pelo fungo em condições de laboratório, nos intervalos de 24h, 48h e
72h (iii). A análise em microscopia de luz e eletrônica revelou a presença dos seguintes tipos
celulares: Plasmatócitos (PL), Granulócitos (GR), Esferulócitos (ES), Prohemócitos (PR),
Adipohemócitos (AD) e Oenocitóides (OE). A concentração de 1x10
7
conídios/mL causou
mortalidade mais rápida dos cupins com TL
50
de 1,62 dias. As células mais freqüentes foram os
Plasmatócitos e os Granulócitos para os tratamentos nos diferentes intervalos de tempo. Em relação
à dinâmica hemocitária notou-se redução significativa dos Plasmatócitos e aumento dos
Granulócitos após 72h do tratamento. Durante a contagem diferencial não foram evidenciadas
alterações na morfologia dessas células. Assim, a utilização do método de aplicação por
pulverização na concentração de 1x10
7
conídios/mL, em laboratório, mostrou-se eficiente contra os
mecanismos de defesa de N. coxipoensis.
PALAVRAS-CHAVE: Isoptera, Nasutitermes coxipoensis, dinâmica hemocitária, ultra-estrutura,
Metarhizium anisopliae
10
CHARACTERIZATION OF HEMOCYTES IN Nasutitermes coxipoensis (Holmgren)
WORKERS AND HEMOCYTERY DYNAMICS AFTER PARASITISM BY Metarhizium
anisopliae (METSCH.) SOROKIN
ABSTRACT - The insects are constantly competing with a great variety of pathogens, what
favored the development of a complex and efficient innate immunologic system. These
mechanisms are of great importance to the insects; therefore any disorder caused can be explored
into biological control purpose. Thus, this research had three major objective: to identify and to
characterize the morphology and ultrastructure of hemocytes of Nasutitermes nasutitermes
(Holmgren) workers (i); to determine the lethal times of Metarhizium anisopliae (Metsch.)
Sorokin on N. coxpoensis using concentrations from 10
3
to 10
7
conidia/mL (ii) and; to analyze the
hemocytary dynamics when imunological challenged by fungus in conditions of laboratory during
the intervals of 24h, 48h and 72h (iii). Analysis using light and electronics microscopy typified
the existence of the following cells: Plamatocytes (PL), Granulocytes (GR.), Spherulocytes (ES),
Prohemocytes (PR), Adipohemocytes (AD) and Eonocytoids (OE). The concentration of 1x10
7
conidia/mL caused the fastest mortality with 1.6 dyas for LT
50
. The cells Plasmatocytes and
Granulocytes were most frequent during the evaluation intervals from 24 to 72h. The hemocytary
dynamics showed significant reduction of Plasmatocytes and increase of Granulocytes at 72h after
application. During cells counting no alterations in the morphology of these cells were evidenced.
The use of spraying as the method of application of M. anisopliae in the concentration of 1x10
7
conidia/mL, in laboratory, triggered the defense’s mechanisms of N. coxipoensis.
KEY WORDS: Isoptera, Nasutitermes coxipoensis, hemocytary dynamic, ultrastructure,
Metarhizium anisopliae
11
Introdução
Os insetos estão constantemente competindo com uma grande variedade de patógenos. Este
contato favoreceu o desenvolvimento de um complexo e eficiente sistema imunológico inato, o
qual difere aparentemente do sistema imunológico adaptativo dos vertebrados por não haver
evidência para mecanismos de memória imunológica (Hoffmann et al. 1996, Medzhitov &
Janeway Jr 1997). De acordo Søndergaard (1993) e Gallo et al. (2002), a primeira linha de defesa
dos insetos contra a ação de patógenos é representada pela cutícula e o mesêntero que formam
uma barreira bastante eficiente contra a invasão dos microrganismos. Ocorrendo a quebra dessas
barreiras, reações imunológicas começam a ser desencadeadas.
O sistema imunológico dos insetos caracteriza-se por mediar dois tipos de reações contra
agentes estranhos. A primeira é responsável pela realização dos processos de coagulação da
hemolinfa, melanização e produção de peptídeos antimicrobianos, ocorrendo sem a participação
direta dos hemócitos, células que circulam livremente na hemolinfa dos insetos, sendo
denominada de reação humoral (Vilmos & Kurucz 1998). O segundo meio de defesa são as
reações mediadas pelos hemócitos, sendo conhecidas como reação celular (Silva 2002). Essas
células apresentam morfologia e função variada, desempenhando ações como fagocitose,
formação de nódulos e encapsulação (Barracco & Menezes 1984, Lavine & Strand 2002).
Nos últimos anos, o desenvolvimento de pesquisas sobre o funcionamento das respostas
imunes tem sido focado com maior ênfase nos aspectos humorais, deixando àquelas mediadas
pelos hemócitos com uma lacuna muito ampla dificultando um melhor entendimento dos
mecanismos de defesa nos insetos (Lavine & Strand 2002). Como reflexo, as dificuldades de
padronização na nomenclatura e identificação dos tipos de hemócitos ainda são visíveis, pois
ferramentas como marcadores moleculares e microscopia eletrônica não eram empregados com
freqüência nesses processos (Gupta 1985, Willot et al. 1994).
12
O cupim Nasutitermes coxipoensis (Holmgren) (Isoptera:Termitidae), é de distribuição
generalizada, ocorrendo em cana-de-açúcar na região Nordeste do Brasil (Melo Filho 1996 e
Miranda et al. 2004). Esta cultura é de grande importância para a economia do Estado de
Pernambuco e do país. Os danos causados por esses insetos podem ser observados nos toletes
utilizados para o replantio do canavial, no tecido parenquimatoso ou sistema radicular das plantas
adultas, causando desta forma perdas quantitativa e qualitativa nessa cultura. Constantino (2002)
relata ainda que esses insetos podem causar danos a outras culturas tais como arroz, café, milho,
algodão e fruteiras.
Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin é um dos fungos mais utilizados em programas
de manejo integrado de pragas (MIP) como uma alternativa ao uso de inseticidas químicos, e tem
demonstrado grande eficiência para a Ordem Isoptera (Alves 1998, Pereira et al. 1998, Neves &
Alves 1999, Sun
et al. 2002, Albuquerque et al. 2005). Entretanto, em alguns casos a baixa
velocidade de mortalidade promovida por alguns isolados ou pela baixa concentração do fungo,
torna-se um inconveniente para seu uso, pois nas relações entre patógeno/hospedeiro os primeiros
distúrbios detectados na hemolinfa disparam reações de defesa dos hemócitos, na tentativa de
eliminar o agente invasor ou limitar seu desenvolvimento. Estudos sobre esses mecanismos
podem sugerir o desenvolvimento de estratégias mais eficientes para o controle de pragas
(Gunnarsson & Lackie 1985, Alves & Pereira 1998).
O presente trabalho objetivou: 1. identificar e caracterizar a morfologia e ultra-estrutura dos
hemócitos de operários de N. coxipoensis; 2. determinar os tempos letais de M. anisopliae sobre
esses operários nas concentrações de 10³, 10
4
, 10
5
, 10
6
e 10
7
conídios/mL e 3. analisar a dinâmica
hemocitária quando imunologicamente desafiados pelo fungo em condições de laboratório, nos
intervalos de 24h, 48h e 72h.
13
Material e Métodos
Obtenção dos Insetos. Os cupinzeiros foram coletados em canavial no município de Itambé, PE e
transportados para o Departamento de Agronomia da Universidade Federal Rural de Pernambuco,
onde foram mantidos em sementeiras contendo plantios de cana-de-açúcar.
Obtenção do Isolado. O fungo M. anisopliae PL
43
, isolado de Mahanarva posticata (Stal), com
número de acesso URM-3185 foi obtido da micoteca da Universidade Federal de Pernambuco.
Teste de Patogenicidade. O fungo foi multiplicado em placas de Petri contendo meio de cultura
Batata-Dextrose-Ágar (BDA) no Laboratório de Controle Biológico do Departamento de
Micologia da UFPE. Para a obtenção das suspensões, fungos com 12 dias de crescimento em
placa de Petri foram acrescidos com 15 mL de água destilada esterilizada mais Tween 80 a 0,01%,
posteriormente filtrada em gaze esterilizada e as concentrações ajustadas em 10
3
, 10
4
, 10
5
, 10
6
e
10
7
, utilizando-se câmara de Neubauer. No tratamento controle, foi aplicado água destilada
esterilizada mais Tween 80. Para cada tratamento foram utilizados 120 insetos, acondicionados
em número de 20 indivíduos por parcela, em uma proporção de 16 operários e quatro soldados de
acordo com confinamento feito por Vasconcellos (1999) em placa de Petri de 10 cm de diâmetro e
forrada com papel filtro umedecido com água destilada para a manutenção da umidade. Seis
repetições foram utilizadas por tratamento. A aplicação das suspensões fúngicas foi realizada
através de pulverização. Diariamente a mortalidade foi avaliada e os insetos mortos transferidos
para câmara incubadora BOD a 26 ± 1ºC e 12h de fotofase para confirmação da morte dos insetos
pelo fungo. Os dados de mortalidade obtidos foram submetidos à análise de Probit e as médias
comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade utilizando-se o programa estatístico SAS
(SAS Institute 1999-2001).
Coleta da Hemolinfa para Identificação dos Hemócitos em Microscopia de Luz. Foi realizada
no Laboratório de Histologia do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal da UFRPE.
14
Para essa metodologia utilizou-se a técnica de perfusão descrita por Brayner et al. (2005). Esta
consiste na utilização de um pequeno capilar de vidro contendo solução anticoagulante II (Mead
et al. 1986) para insetos. Esse capilar foi introduzido na região abdominal de 100 operários e em
seguida a hemolinfa aspirada foi depositada diretamente em lâminas de vidro, deixadas para secar
em temperatura ambiente por 20 minutos, sendo a fixação das células realizada em metanol
durante cinco minutos e coradas com Giemsa por quatro minutos. Posteriormente, realizou-se uma
lavagem rápida das lâminas com água destilada para a retirada do excesso de corante, deixando-as
secar em temperatura ambiente para posterior montagem com Entellan. A análise morfológica foi
realizada utilizando-se microscópio OLYMPUS BX-49, e fotografados em fotomicroscópio
OLYMPUS BX-51.
Contagem Diferencial dos Hemócitos. Utilizou-se a metodologia de Falleiros et al. (2003)
modificada. 300 operários foram pulverizados com M. anisopliae na concentração de 10
7
conídios/mL, por ter apresentado menor TL
50
. A hemolinfa foi coletada nos intervalos de 24h,
48h e 72h, também foram coletadas nos mesmo intervalos de tempo hemolinfa de 300 operários
pulverizados com água esterilizada mais Tween 80 (testemunha). Os insetos estavam confinados
em número de 20 por placa de Petri com dimensões de 10 cm de diâmetro forrada com papel
filtro. Para cada tratamento foi realizada a avaliação de 10 lâminas, as quais continham a
hemolinfa de 10 indivíduos distribuídas em pequenos poços, onde cada lâmina representou uma
repetição. Em cada repetição foram contadas 300 células. A percentagem dos tipos celulares
obtidos em cada repetição de todos os tratamentos foi submetido à análise de variância e as
médias comparadas através do teste de Tukey a 5% de probabilidade. O programa estatístico
utilizado foi o ASSIST (Versão 7.3).
Descrição Ultra-estrutural dos Hemócitos. No Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami
(LIKA/UFPE), a hemolinfa de 300 insetos não pulverizados foi coletada por perfusão na região
15
abdominal, para análise em microscopia eletrônica de transmissão (MET). Assim, a hemolinfa
coletada foi fixada em solução de glutaraldeído a 2,5% (tampão fosfato 0,1M, pH 7,2),
posteriormente o material coletado foi depositado em “ependorffs” contendo fixador durante 2h.
O material foi submetido a três lavagens de 10 minutos cada com o mesmo tampão e pós-fixado
em tetróxido de ósmio (OsO
4
) a 2% em tampão fosfato 0,1 M pH 7,2 por 1h. Em seguida, foram
efetuadas três lavagens de 10 minutos com o mesmo tampão e submetido à centrifugação a 2000
rpm por 1 minuto, no final de cada lavagem. A desidratação com acetona ocorreu em banhos
crescentes de 10 minutos. Após o processo de desidratação as células foram embebidas em resina
EMBED812/Araldite (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA). Os cortes ultrafinos
foram obtidos em ultramicrótomo (UReichert Ultracut), contrastados em acetato de uranila e
citrato de chumbo e analisado em microscópio Zeiss EM109.
Resultados
A eficiência de M. anisopliae sobre os operários de N. coxipoensis pelo método de
pulverização foi mais evidente na concentração de 1x10
7
conídios/mL, o que pode ser verificada
através dos tempos letais onde estes apresentaram uma redução em seus valores à medida que as
concentrações aumentaram (Tabela 1).
A análise em microscopia de luz e eletrônica dos hemócitos de operários de N. coxipoensis
revelou a presença dos seguintes tipos de hemócitos: Plasmatócitos (PL), Granulócitos (GR),
Esferulócitos (ES), Prohemócitos (PR), Adipohemócitos (AD) e Oenocitóides (OE).
Os Plasmatócitos exibiram um polimorfismo que se caracteriza pelas formas esférica, oval
ou alongada, sendo esta última à forma predominante. O núcleo apresentou-se volumoso com
poucas áreas heterocromáticas e o citoplasma contendo numerosas vesículas. Foi possível
visualizar nessas células prolongamentos citoplasmáticos (Figs. 1A e 2A).
16
Os Granulócitos apresentaram forma esférica ou oval. No seu citoplasma foram visualizados
grânulos pequenos, basófilos e geralmente esféricos, os quais encobriram o núcleo tornando difícil
a sua visualização. Analisando ultra-estruturalmente verificou-se que os grânulos são bastante
elétron-densos e núcleo apresenta morfologia irregular (Figs. 1B e 2B).
Os Esferulócitos exibiram morfologia esférica com núcleo central, e se caracterizaram por
apresentarem no seu citoplasma várias vesículas claras uniformemente distribuídas. A ultra-
estrutura revelou que essas vesículas são pouco elétron-densas e que o núcleo apresenta grande
área de eucromatina (Figs. 1C e 2C).
Os Prohemócitos foram bem caracterizadas por exibirem núcleos bastante volumosos,
ocupando quase todo o citoplasma. No núcleo foram evidenciadas regiões com grande quantidade
de heterocromatina. A morfologia dessa célula variou de esférica a oval (Figs. 1D e 2D).
Os Adipohemócitos chamaram a atenção por apresentarem numerosas gotículas lipídicas de
tamanho e forma variadas ocupando quase todo o citoplasma, além de algumas mitocôndrias. O
núcleo é excêntrico, com nucléolo evidente (Figs. 1E e 2E).
Os Oenocitóides foram são células de fácil identificação por serem os maiores hemócitos,
apresentando morfologia esférica bastante uniforme, núcleo central e pequeno em relação ao
tamanho da célula. No citoplasma os ribossomos livres foram os mais abundantes, sendo
observado ainda várias vesículas e alguns grânulos (Figs. 1F e 2F).
Discussão
Os seis tipos de hemócitos encontrados em N. coxipoensis, são reportados na literatura como
as células mais freqüentes na hemolinfa dos insetos, podendo ser encontradas em diferentes
17
ordens tais como: Lepidoptera, Diptera, Orthoptera, Blattodea, Coleoptera, Hymenoptera e
Hemiptera (Fenoglio et al. 1993, Hernandez et al. 1999, De Silva et al. 2000, Silva et al. 2000,
Hillyer & Christensen 2002,
Silva et al. 2002). As características morfológicas e ultra-estruturais
dos hemócitos de N. coxipoensis são similares às descritas em larvas de Diatraea saccharalis
(Lepidoptera: Pyralidae) (Falleiros et al. 2003), adultos de Culex quinquefasciatus (Diptera:
Culicidae) (Brayner et al. 2005) e em Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae) (Ling et al.
2003). Esses achados contribuem para uniformização dos tipos de hemócitos entre as ordens de
insetos, pois segundo Hillyer & Christensen (2002) estudos morfológicos dos hemócitos são
tentativas para achar um sistema de classificação que seja aplicado a todos os organismos do Filo
Arthropoda ou da Classe Insecta.
Os resultados da contagem diferencial dos hemócitos de operários de N. coxipoensis constam
na Tabela 2. Verificou-se que as células mais freqüentes na hemolinfa foram os Plasmatócitos e os
Granulócitos para os tratamentos nos diferentes intervalos de tempo. Analisando a dinâmica
hemocitária nos intervalos de tempo notou-se que os Plasmatócitos reduziram significativamente,
enquanto que os Granulócitos aumentaram, após 72h da pulverização. Os Prohemócitos não
diferiram estatisticamente nos intervalos de tempos, bem como entre os tratamentos. Já com
relação aos Esferulócitos, Adipohemócitos e Oenocitóides apresentaram uma redução significativa
entre os tratamentos para todos os intervalos de tempo. Devemos ressaltar ainda que na
testemunha, os Plasmatócitos, Prohemócitos, Adipohemócitos e oenocitóides mostraram uma
redução significativa apenas no intervalo de 48h em relação ao de 24h. Durante a contagem
diferencial não foram evidenciadas alterações na morfologia dessas células.
O fato dos Plasmatócitos e Granulócitos terem sido os tipos celulares mais freqüentes,
confirmam as pesquisas realizadas por Lackie (1988), Ratcliffe (1993), Strand & Pech (1995),
Lavine & Strand (2002), os quais relataram que nos insetos normalmente as células Granulares e
18
os Plasmatócitos compreendem mais de 50% dos hemócitos circulantes, tendo a capacidade de
adesão na superfície de corpos estranhos. Segundo Chain & Anderson (1983), Gunnarsson (1988),
Pech & Strand (1996) e Fuguet & Vey (2004) a redução dos plasmatócitos pode está relacionada
ao envolvimento dessas células no processo inicial de nodulação, enquanto que os granulócitos só
participam dos estágios finais desse processo, o que justificaria o seu aumento. Esses mesmos
autores sugerem ainda que o declínio dos plasmatócitos, em infecções com fungos, pode estar
relacionado à sua suscetibilidade aos metabólicos secundários tóxicos produzidos por estes.
M. anisopliae mostrou-se bastante eficaz na diminuição dos Esferulócitos, Adipohemócitos
e Oenocitóides, este fato pode ser justificado visto que essas células não têm função específica na
defesa celular (Sass et al. 1994, Jiang et al. 1997, Lanot et al. 2001, Lavine & Strand 2002).
Moino Jr. et al. (2002) e Neves & Alves (2004), também, mostraram eficiência desse fungo
em laboratório sobre cupins, porém utilizando concentrações de 1x10
9
conídios/mL e 1x10
8
conídios/mL, respectivamente. A ação desse fungo sobre operários e soldados de N. coxipoensis
foi verificada por Albuquerque et al. (2005) utilizando M. anisipliae var. anisopliae isolado PL
43
na concentração de 0,5 x 10
6
conídios/mL e M. anisopliae var. acridum isolado CG291 na
concentração de 1,8 x 10
6
conídios/mL, porém esses autores utilizaram o método de aplicação por
contato direto dos cupins em placas contendo as culturas fúngicas. Assim sendo, os resultados
mostraram que a pulverização do isolado utilizado na concentração de 1x10
7
conídios/mL é um
método eficiente em laboratório para o cupim estudado.
Assim, a utilização do método de pulverização na concentração de 1x10
7
conídios/mL, em
laboratório, mostrou-se eficiente contra os mecanismos de defesa celular de N. coxipoensis.
19
Agradecimentos
À CAPES pela concessão da bolsa ao primeiro autor, possibilitando a realização deste
trabalho e a Jorge Braz Torres (UFRPE) pela ajuda nas análises estatísticas e apreciação do artigo.
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25
Tabela 1. Avaliação da patogenicidade de M. Anisopliae sobre operários de N. coxipoensis,
em laboratório a 25 ± 1
o
C e fotoperído de 12h.
Fungo/
Concentração
1
CL
50
2
TL
50
(Dias)
3
I.C. a 95% Equação Gl
χ²
P
M. anisopliae PL
43
2x10
4
(1,3x10
4
; 3x10
4
)
4
Y=-3,454+0,801Log
dose
3 2,30 0,5120
1 x 10
3
36,29 (22,47; 94,66)
5
Y=-2,427+1,556 Log
tempo
8 2,12 0,9770
1 x 10
4
12,79 (10,95; 16,03)
5
Y=-2,581+2,331 Log
tempo
8 1.19 0,9967
1 x 10
5
5,90 (5,41; 6,47)
5
Y=-1,759+2,280 Log
tempo
8 1.31 0,9953
1 x 10
6
3,48 (3,18; 3,77)
5
Y=-1,429+2,638 Log
tempo
8 2.50 0,9613
1 x 10
7
1,62 (1,50; 1,75)
5
Y=-1,146+5,413 Log
tempo
8 2.85 0,9430
1
Concentração Letal;
2
Tempo Letal;
3
Intervalo de Confiança a 95% de probabilidade;
4
Valores
expressos em concentrações de conídios/mL;
5
Valores em dias para TL
50.
26
Tabela 2. Médias (± desvio padrão) da contagem diferencial dos hemócitos de operários de
N. coxipoensis, desafiados imunologicamente por M. anisopliae a 10
7
conídios/mL.
Tempo após tratamento (horas)
Tratamento
24h 48h 72h
Estatística
1
F
P
Plasmatócitos
Testemunha
71,46 ± 4,28 a A 55,40 ± 2,72 b A 64,43 ± 4,06 ab A 4,59
0,0192
M. anisopliae
75,27 ± 1,37 a A 77,20 ± 3,18 a B 64,26 ± 3,50 b A 6,02
0,0069
F
P
- 27,07
0,0005
-
Granulócitos
Testemunha
14,00 ± 2,32 a A 20,80 ± 1,53 a A 17,40 ± 2,28 a A -
2
M. anisopliae
13,47 ± 1,77 a A 11,73 ± 2,56 a B 24,66 ± 3.72 b A 6,25
0,0059
F
P
- 9,20
0,0072
-
Prohemócitos
Testemunha
8,13 ± 1,34 a A 12,33 ± 0,79 b A 9,76 ± 1,01 ab A 3,87
0334
M. anisopliae
10,60 ± 1,08 a A 11,00 ± 1,86 a A 11,23 ± 1,46 a A -
F
P
- - -
Esferulócitos
Testemunha
3,86 ± 1,22 a A 5,50 ± 0,93 a A 4,00 ± 0,66 a A -
M. anisopliae
0,20 ± 0,20 a B 0,00 a B 0,00 a B -
F
P
8,73
0,0085
34,84
0,0001
36,17
0001
Adipohemócitos
Testemunha
1,83 ± 0,45 a A 3,90 ± 0,36 b A 3,10 ± 0,61 ab A 4,56
0,0197
M. anisopliae
0,03 ± 0,03 a B 0,00 a B 0,00 a B -
F; P
15,62
0,0009
114,15
3,1958
25,57
0,0008
Oenocitóides
Testemunha
0,70 ± 0,17 a A 2,16 ± 0,37 b A 1,56 ± 0,34 ab A 5,73
0,0084
M. anisopliae
0,03 ± 0,33 a B 0,00 a B 0,00 a B -
F
P
15,04
0,0011
33,79
0,0001
20,62
0,0003
¹Médias seguidas pela mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem
significativamente entre si pelo teste de Tukey (P>0,05).
²Resultados não significativos pela ANOVA.
27
Fig. 1. Hemócitos de N. coxipoensis. Plasmatócito (A) exibindo um citoplasma hialino (seta) com núcleo
(N) grande e pouco heterocromático. Granulócito (B) grande quantidade de grânulos irregulares no
citoplasma (setas) chegando a encobrir quase todo o núcleo (N). Esferulócito (C) com várias vesículas
(setas) dispostas em torno do núcleo (N). Prohemócito (D) apresentando núcleo volumoso (N) e escasso
citoplasma. Adipohemócito (E) exibindo várias gotículas de lipídios dispostas irregularmente no
citoplasma (setas) próximas ao núcleo (N). Oenocitóide (F) caracterizado pelo seu tamanho volumoso e
forma esférica com núcleo pequeno e excêntrico (N). Barras =10µm.
28
N
N
N
Fig. 2. Ultra-estrutura dos hemócitos de N. coxipoensis. Plasmatócito (A) célula com prologamentos
citoplasmáticos (setas longas) e numerosas vesículas (setas curtas). Granulócito (B) grânulos elétron-
densos (setas) e núcleo de morfologia irregular (N). Esferulócito (C) vesículas pouco elétron-densas
(setas) e núcleo eucromático (N). Prohemócito (D) núcleo apresentando regiões com grande quantidade de
heterocromatina (setas). Adipohemócito (E) gotículas lipídicas no citoplasma (setas longas), mitocôndrias
(seta curta) e núcleo com nucléolo evidente (ponta de seta). Oenocitóide (F) citoplasma com numerosos
ribossomos livres (setas longas), várias vesículas (setas curtas), alguns grânulos pouco-elétron-densos
(ponta de setas) e núcleo pequeno (N). Barras =1µm.
29
CAPÍTULO 3
HISTOLOGIA DO CANAL ALIMENTAR DE OPERÁRIOS DE Nasutitermes coxipoensis
(HOLMGREN) (ISOPTERA: TERMITIDAE)
F
RANKLIN M. CUNHA¹, VALÉRIA WANDERLEY-TEIXEIRA¹, ÁLVARO A.C. TEIXEIRA²,
AURISTELA C. ALBUQUERQUE¹, LUIZ C. ALVES³ E FÁBIO A. BRAYNER³
¹ Programa de Pós-Graduação em Entomologia Agrícola, UFRPE, Av. Dom Manoel de
Medeiros s/n, Dois Irmãos , 52171-900, Recife, PE.
² Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, UFRPE, Av. Dom Manoel de Medeiros
s/n, Dois Irmãos , 52171-900, Recife, PE.
³ Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA) – UFPE, Av. Moraes Rego s/n, 50670-
420, Recife, PE.
Cunha, F. M.; V. Wanderley-Teixeira, A. A. C. Teixeira, A. C. Albuquerque, L. C. Alves & F. A.
B. Santos. Histologia do canal alimentar de operários de Nasutitermes coxipoensis (Holmgren)
(Isoptera: Termitidae). Arquivos do Instituto Biológico.
30
RESUMO – Em Isoptera as características do tubo digestivo dos operários e pseudo-operários são
normalmente utilizadas em sistemática e filogenia. Pesquisas têm confirmado o valor do modelo
espiral e morfologia do tubo digestivo dos operários para a sistemática em cupins superiores,
principalmente na família Termitidae. Assim, a presente pesquisa teve o objetivo de realizar a
descrição histológica do canal alimentar de operários de Nasutitermes coxipoensis (Holmgren) por
meio da microscopia de luz, visando obter informações que contribuam para sistemática desse
gênero. Operários de N. coxipoensis foram imobilizados a baixa temperatura (-4
o
C) para a retirada
do canal alimentar, o qual foi fixado em Boüin aquoso por 24h, incluído em “paraplast”, e os
cortes corados pela Hematoxilina-Eosina (H-E) e Tricrômico de Mallory. Os resultados
mostraram que as características histológicas do canal alimentar de operários de N. coxipoensis,
de modo geral, foram semelhantes as observadas em várias espécies de cupins, porém foram
evidenciadas diferenças na morfologia das células epiteliais e tipos de dobras na região do
estomodeu, na disposição e número dos ninhos, bem como a presença da membrana peritrófica na
região do mesêntero. Assim essas características podem ser utilizadas como critérios para a
diferenciação entre as espécies de cupins do gênero Nasutitermes.
PALAVRAS-CHAVE: Sistemática, cupins, morfologia, operários
31
HISTOLOGY OF THE WORKERS DIGESTIVE TRACT IN Nasutitermes coxipoensis
(HOLMGREN) (ISOPTERA: TERMITIDAE)
ABSTRACT – Histological characteristics of the termites workers and pseudo-workers digestive
tract are used for systematic and phylogeny studies. Research has confirmed the value of the
workers spiral digestive tract model and its morphology for systematic in higher termite, mainly
in Termitidae. Thus, this research was carried out describing Nasutitermes coxipoensis workers
digestive tract through light microscopy. Workers of N. coxipoensis were immobilized at low
temperature (-4ºC) to the extraction the food channel, which was fixed in liquid Boüin for 24h,
embedding in “ paraplast”, and the cuts were staining by Hematoxilin – Eosin (H-E) and
trichrome of Mallory. Overall, the histological characteristics found for N. coxipoensis digestive
tract were consistent with those described in several species of termites endorsing the method
applied. However, this study found differences on morphollogy of epitelials cells and on the types
of epithelium folds in the region of stomodeum regarding the displaying and the numbers of nests,
as well as the presence of peritrophic membrane in the mesenterum region. Therefore, these
characteristics may be used as characters to diferentiate species among termites of the genus
Nasutitermes.
KEY WORDS: Systematic, termites, morphology, workers
32
Introdução
A maioria dos cupins apresenta hábito alimentar herbívoro, em especial de material
vegetal em vários estágios de decomposição (Fontes 1987, Oliveira et al. 1988). Porém, cerca de
10% das espécies de cupins tem sido apontada como agente de algum tipo de dano às plantas
(Edwards & Mill 1986, Constantino 2002). Segundo Pizano (1995), Martius (1998), Culliney &
Grace (2000), Su & Scheffrahn (2000) aproximadamente das 2.500 espécies são conhecidas no
mundo e em torno de 300 são notoriamente pragas de lavouras e estruturas de madeira. Dentre
estas, já foram identificados mais de 12 espécies que atacam a cana-de-açúcar, sendo para o
Nordeste os gêneros Amintermes, Cylindrotermes e Nasutitermes os mais importantes.
No Brasil, os cupins têm sido responsáveis pela redução da produção canavieira, algo em
torno de 10t/ha ao ano, assim, isso os coloca como uma das piores pragas da cana-de-açúcar ,
principalmente no Nordeste (Albuquerque et al. 2005). Nesta cultura, Miranda et al. (2004)
identificaram a ocorrência das espécies Armintermes nordestinus Melo & Fontes, Cylindrotermes
nordenskioeldi Holmgren, Nasutitermes coxipoensis (Holmgren) e Syntermes nanus Constantino.
Costa-Leonardo (1995) menciona que o tubo digestivo dos cupins é geralmente bastante
desenvolvido, ocupando grande parte do abdome, e de acordo com Oliveira et al. (1988) a
preferência alimentar desses insetos se reflete em diferenças morfológicas no tubo digestivo que
podem ser detectáveis em nível de microscopia óptica de luz e eletrônica, sendo de grande
importância na sistemática, além de ser um valioso auxílio na interpretação ecológica.
Na Ordem Isoptera as características do tubo digestivo dos operários e pseudo-operários
são normalmente utilizadas em sistemáticas e filogenia, e várias pesquisas têm confirmado o valor
do modelo espiral e morfologia do tubo digestivo dos operários para a sistemática em cupins
superiores, principalmente na família Termitidae quando comparado aos cupins inferiores como,
33
por exemplo, os da família Kalotermitidae, onde a anatomia é mais uniforme (Gonçalves 1979,
Johnson 1979, Fontes 1992, Noirot 1995, Constantino 1998, Godoy 2004).
Fontes (1987), analisando a morfologia e configuração do tubo digestivo de cupins
operários de oito gêneros (Convexitermes, Atlantitermes, Araujotermes, Coatitermes,
Subulitermes, Agnathotermes, Cyranotermes e Angularitermes) da família Termitidae, observou
modificações na moela, no proctodeu, na válvula entérica, na pança, no cólon e segmento
mesêntero-proctodeu. No entanto, não há relatos sobre os aspectos morfológicos do tubo digestivo
de cupins do gênero Nasutitermes.
Assim, a presente pesquisa teve o objetivo de descrever a histologia do canal alimentar de
operários de N. coxipoensis, por meio da microscopia de luz, visando obter informações que
contribuam para sistemática desse gênero.
Material e Métodos
A presente pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Histologia do Departamento de
Morfologia e Fisiologia Animal da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE).
Obtenção dos Insetos. Os cupinzeiros foram coletados em canavial no município de Itambé-PE e
transportados para o Departamento de Agronomia da UFRPE, onde foram mantidos em
sementeiras contendo plantios de cana-de-açúcar.
Coleta do Canal Alimentar para Análise em Microscopia de Luz. Operários de N. coxipoensis
foram imobilizados a baixa temperatura (-4
o
C) de acordo com Gonçalves (1979) e posteriormente
colocados em lâminas de vidro contendo solução fixadora de Boüin aquoso (75 mL de solução
saturada de ácido pícrico, 25 mL de formaldeído, e 5 mL ácido acético). Utilizando-se pinça,
lâminas de bisturi e esteromicroscópio (QUIMIS – modelo 1069), a cabeça do cupim foi
decapitada, tomando-se cuidado para preservação da faringe. Em seguida, foi feita a remoção dos
34
dois últimos segmentos abdominais para facilitar a extração do canal alimentar que foi puxado
cuidadosamente pela abertura feita no abdome. Após distender o canal alimentar o mesmo foi
imerso para fixação em liquido de Boüin por um período de 24h. Para a inclusão das regiões
(estomodeu, mesêntero e proctodeu) do canal alimentar, estas foram desidratadas em banhos de
álcool etílico 70% (30 minutos), 90% e 100% por 10 minutos cada e diafanizadas em xilol por 10
minutos. Em seguida foram impregnados em banhos de “paraplast” diluído em xilol na proporção
de 50% e 100%, durante uma hora cada, e incluídos, após o último banho. A seguir, os blocos
foram cortados em micrótomo do tipo Minot (LEICA RM 2035) ajustado para 6 µm. Os cortes
assim obtidos foram submetidos às técnicas de colorações pela Hematoxilina – Eosina (H-E) e
Tricrômico de Mallory, empregando-se a metodologia descrita por Behmer et al. (1976),
Junqueira & Junqueira (1983) e Michalany (1990). A análise histológica foi realizada utilizando-
se um microscópio de luz, da marca OLYMPUS BX-49, e fotografado em fotomicroscópico
OLYMPUS BX-51.
Resultados
Histologicamente o canal alimentar dos operários de N. coxipoensis apresenta as seguintes
características:
Faringe. É revestida internamente por tecido epitelial constituído por uma única camada de
células que variam de pavimentosa a colunar alta. Na superfície dessas células foi evidenciada
íntima bem desenvolvida com áreas contendo espinhos ou espículas, a qual junto com o epitélio
formam pequenas projeções para a luz do órgão. A faringe é envolvida por tecido muscular
estriado disposto em duas camadas, onde a mais interna apresenta-se em pequenos feixes
descontínuos entre si e dispostos longitudinalmente, enquanto que a camada mais externa é
contínua e disposta circularmente (Fig. 1A).
35
Inglúvio. Essa região caracteriza-se por ser revestida por uma camada de epitélio simples com
células colunares com núcleo elíptico, localizado na região basal e nucléolo bem evidente. A
lâmina epitelial que também contém uma íntima, porém sem espícula, projeta-se para a luz do
órgão formando dobras bem mais definidas em relação à faringe. Essas projeções são em torno de
13. Externamente esse órgão é revestido por uma delgada camada de tecido muscular disposta
circularmente. Na base de algumas projeções nota-se a presença de fibras musculares arranjadas
longitudinalmente (Fig. 1B).
Proventrículo. Lâmina epitelial formada por numerosas dobras longitudinais as quais variam de
forma e tamanho de acordo com a região desse órgão. Nota-se na região anterior, 12 dobras
maiores, intercaladas por dobras menores totalizando 24 dobras (Fig. 1C). A lâmina epitelial
dessas dobras apresenta-se do tipo simples colunar, sendo revestida por uma íntima sem espícula e
bastante espessa (Fig. 1D). Já na região posterior evidenciou-se apenas 12 dobras, sendo seis
maiores com morfologia foliar e seis menores com morfologia piramidal (Figs. 1E e 1F). Nessas
dobras é possível observar uma íntima espessa revestindo a lâmina epitelial que é do tipo simples
colunar apoiado numa delgada lâmina própria. Essa lâmina própria também foi evidenciada entre
as fibras musculares que reveste externamente esse órgão (Fig. 2A).
Mesêntero. Apresenta uma parede bastante espessa sendo constituída internamente por tecido
epitelial do tipo simples, constituído por dois tipos de células: células regenerativas, agrupadas na
base da lâmina epitelial e células colunares altas com microvilos (Fig. 2B). Envolvendo o material
digerido verificou-se a presença da membrana peritrófica. Externamente esse órgão apresenta uma
fina camada de tecido muscular disposto circularmente. Não foi evidenciada lâmina própria neste
órgão (Fig. 2C). Próximo ao mesêntero observou-se tubos de Malpighi constituídos por uma
camada simples de tecido epitelial (Fig. 2D).
36
Proctodeu. Na região do cólon o epitélio é recoberto por uma espessa íntima e constituído por
células colunares com núcleo esférico, basal e volumoso. A lâmina epitelial apresenta evaginações
digitiformes que preenche grande parte da cavidade intestinal. Externamente evidencia-se uma
espessa camada muscular disposta circularmente (Fig. 2E). O reto, de forma geral, apresentou as
mesmas características histológicas do cólon, exceto pela ausência de evaginações e pela presença
de uma delgada camada de tecido muscular (Fig. 2F). No proctodeu não foi evidenciada lâmina
própria.
Discussão
De um modo geral a estrutura histológica do estomodeu de N. coxipoensis é bastante
simples, sendo constituído por uma camada externa de músculo circular, algumas fibras
musculares longitudinais e uma camada de tecido epitelial simples coberto pela íntima. A
histologia da faringe apresentou-se semelhante às características observadas por Gonçalves (1980)
para a espécie Rugitermes niger (Oliveira) (Isoptera: Kalotermitidae), porém diferindo com
relação à morfologia das células epiteliais, onde este autor relata uma variação de achatada a
cúbica para esta espécie. As características histológicas das dobras observadas no inglúvio são
semelhantes às descritas por Noirot (1995) para as seguintes famílias de cupins inferiores:
Termopsidae, Hodotermitidae, Mastotermitidae, Kalotermitidae, Rhinotermitidae, Serritermitinae.
No entanto, N. coxipoensis apresenta uma delgada camada de tecido muscular envolvendo todo o
órgão, característica esta comum nos cupins superiores (Noirot 2001). Embora, tenham sido
observadas 13 dobras da lâmina epitelial nessa região, essa característica não é considerada de
importância para a sistemática ou hábito alimentar desses insetos, pois vários autores relatam que
essas dobras diminuem de número e se tornam menos elevadas de acordo com o volume do
conteúdo alimentar ingerido (Gonçalves 1980, Noirot 2001).
37
No proventrículo, tanto na região anterior como na posterior, só foram evidencia dobras de
primeira e segunda ordem, as quais modificam de forma e tamanho ao longo do órgão. Estes
achados são semelhantes aos observados por Czolij et al. (1984) em Mastotermes darwiniensis
(Froggatt) (Isoptera: Mastotermitidae) e por Costa-Leonardo (1995) em Serritermes serrifer
(Hagen) (Isoptera: Serritermitidae). A estrutura apresentada pelo proventrículo está relacionada
com a função e consequentemente com os hábitos alimentares dos cupins, assim, as espécies que
se alimentam de madeira, por exemplo, necessitam de um proventrículo mais complexo que
aqueles cuja alimentação baseia-se em húmus (Brune & Kühl 1996). Apesar de ser observada
dobras de primeira e segunda ordem, Gonçalves (1980) relatou a presença de dobras de terceira e
quarta ordem ocorrendo no proventrículo de cupins inferiores.
As descrições histológicas do mesêntero de N. coxipoensis são similares aos encontrados por
Oliveira et al. (1988) ao analisarem ultra-estruturalmente o mesêntero das espécies Rugitermes
niger (Oliveira), Armintermes euamignathus (Silvestri) e Cornitermes cumulan (Kollar). As
células regenerativas encontradas agrupadas são denominadas por Snodgrass (1993), Costa-
Leonardo (1995) e Chapman (1998), de ninhos. De acordo com Gonçalves (1980) e Noirot (1995)
esses ninhos em cupins inferiores são numerosos e estão bem próximos uns dos outros. No
entanto, em N. coxipoensis os ninhos encontram-se mais afastados e em menor número. Este fato
pode está relacionado com a presença da membrana peritrófica, pois de acordo com as
observações de Oliveira et al. (1988) essa estrutura, juntamente com secreções mucosas, pode
atenuar os danos mecânicos nas células digestivas causado pelo atrito com o alimento ingerido,
resultando assim numa menor taxa de renovação dessas células.
As descrições feitas para a região do proctodeu são similares às relatadas para os cupins de
um modo geral (Gonçalves 1980, Costa-Leonardo 1995, Noirot 1995). Assim, a morfologia das
células epiteliais e os tipos de dobras presentes na região do estomodeu, a disposição e número
38
dos ninhos, bem como a presença da membrana peritrófica na região do mesêntero em operários
de N. coxipoensis podem ser utilizados como um recurso a mais para a diferenciação entre as
espécies de cupins do gênero Nasutitermes.
Agradecimentos
À CAPES pela concessão de bolsa ao primeiro autor, possibilitando a realização deste
trabalho e ao Profº. Antônio Fernando de Souza Leão Veiga pelo auxílio nas coletas dos
cupinzeiros.
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42
B
A
D
F
C
E
Fig. 1. (A) Faringe: epitélio com células variando de pavimentosa (seta curta) a colunar alto (seta longa),
íntima com espícula (ponta de seta) e pequenos feixes de fibras musculares longitudinais na base do
epitélio (seta branca). Barra 10µm. (B) Inglúvio: projeções do epitélio (setas longas), fibras musculares
longitudinais (ponta de seta) e circulares (seta curta) Barra 400µm. (C) Proventrículo região anterior:
dobras maiores (seta) e menores (ponta de seta) do epitélio. Barra 400µm. (D) Proventrículo região
anterior: células colunares altas revestidas por espessa íntima (seta longa) apoiada no tecido muscular (seta
curta). Barra 10µm. (E) Proventrículo região posterior: dobras de tamanho e forma variadas. Barra 400µm.
(F) Proventrículo região posterior: dobras de primeira ordem (seta curta) e segunda ordem (ponta de seta).
Barra 10µm. Coloração H-E.
43
B
A
C D
F
Fig. 2. (A) Proventrículo região posterior: lâmina própria delgada apoiando o epitélio (seta longa) e entre
as fibras musculares (seta curta). Barra 10µm. Tricrômico de Mallory. (B) Mesêntero: tecido epitelial
simples, com células colunares altas (seta) e células regenerativas agrupadas na base da lâmina epitelial
(ponta de seta) nota-se ainda na luz do órgão presença do conteúdo alimentar (*). Barra 400µm. H-E. (C)
Mesêntero: membrana peritrófica (ponta de seta) e delgada camada de tecido muscular (seta). Barra
400µm. Tricrômico de Mallory. (D) Tubos de Malpighi associados ao mesêntero (setas). Barra 400µm. H-
E. (E) Proctodeu região anterior: lâmina epitelial formando evaginações (pontas de seta), e espessa camada
de tecido muscular estriado (seta). Barra 10µm. Tricrômico de Mallory. (F) Proctodeu região posterior:
epitélio simples colunar (seta longa) com íntima (ponta de seta), e delgada camada muscular (seta curta).
Barra 10µm. H-E.
E
44
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