( PDF ) Estudo das vias de sinalização celular induzidas pelo fator de ativação de plaquetas (PAF) em trypanosoma cruzi

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Marta Teixeira Gomes

“Estudo das Vias de Sinalização Celular Induzidas pelo

Fator de Ativação de Plaquetas (PAF) em

Trypanosoma cruzi ”

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências (Microbiologia), Instituto de

Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade

Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos

necessários à obtenção do título de Doutor em

Ciências (Microbiologia).

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Rio de Janeiro

2007

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FICHA CATALOGRÁFICA

GOMES

, Marta Teixeira

Estudo das vias de sinalização celular induzidas pelo fator de ativação de

plaquetas (PAF) em Trypanosoma cruzi. Instituto de Microbiologia Prof. Paulo

de Góes, UFRJ, Rio de Janeiro, 2007.

xi, 98p.

Tese: Doutor em Ciências (Microbiologia).

1. Trypanosoma cruzi

2. Fator de ativação de plaquetas

3. Diferenciação celular

4. Proteínas Cinases

I. Universidade Federal do Rio de Janeiro - IMPPG

II. Título

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Este trabalho foi desenvolvido sob orientação da Profª Angela Hampshire C. S.

Lopes, do Departamento de Microbiologia Geral, do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo

de Góes (IMPPG) e da Prof ª Narcisa Leal Cunha e Silva, do Instituto de Biofísica Carlos

Chagas Filho (IBCCF), Centro de Ciências da Saúde (CCS), Universidade Federal do Rio

de Janeiro (UFRJ).

Agradecimentos

Primeiramente, à Deus, sem Ele nada seria possível.

Aos meus Pais, pelo Amor, pelo incentivo, pela compreensão, por todos os esforços

para me ajudar. Obrigada por ter abdicado tantos sonhos em função dos seus filhos. Espero

nunca decepcioná-los.

Aos meus irmãos (Daniel, Hilda, Rosário, Alcina, David, Andréa, Telma), incluindo

minhas cunhadas Maria Alice e Luíza, obrigada pelo carinho, pelo estímulo, pelo incentivo

e por sempre apostarem em mim.

Aos meus sobrinhos, pelo incentivo, por transformar minha vida mais alegre e

principalmente, pela ajuda. Não posso esquecer que Rafael, Victor, Stephanie e Dayane me

cederam o computador “pacientemente” nos últimos dias de suas férias.

Ao Roberto (conhecido como Luiz Augusto) pela preocupação, pela companhia,

pela compreensão e por me fazer feliz.

À minha orientadora Angela, muito obrigada, pela oportunidade, pela competência,

pelo compromisso, pela paciência, pela amizade e por ser muito mais que orientadora.

À minha segunda orientadora Narcisa, muito obrigada pela sua simpatia, pela

oportunidade, pelo incentivo, pela competência e pelos conhecimentos transmitidos.

À Prof. Rosângela obrigada pelos ensinamentos, pela sua competência, pela

confiança, e pelo auxílio em todas as minhas etapas acadêmicas.

Aos professores André, Márcio e Leonardo pelo incentivo e pelos ensinamentos. Eu

não posso deixar de agradecer suas alunas (em especial Fabiane, Fernanda Fonseca, Patrícia

Tavares, Mariana, Débora, Bianca, Camila, Fernanda Machado, Lys) pela ajuda, pela

companhia e pelos divertidos churrascos que foram ótimos momentos de descontração.

Ao Prof. Antônio, pela sua competência, pelos ensinamentos e pelo auxílio nos

experimentos com o fluorímetro. Obrigada aos seus alunos Aline, Patrícia e Marcos pela

convivência e pelos momentos de descontração e, em especial a Luciana Rangel pela

amizade.

Ao Prof. Fernando Mello, pelas sugestões, discussões dos resultados e pela acolhida

no seu laboratório para os experimentos de dosagem de AMPc, obrigada também a Isabela

e Regina pela atenção e pelos auxílio nos experimentos.

Ao pessoal do laboratório: Cirilo, Fernando, Maria Fernanda, Milena, Marcelo e

Carolina pela ajuda, companhia e amizade. E principalmente, ao Felipe e minhas

“irmãzinhas” Danielle e Luciana, que compartilharam comigo as alegrias e dificuldades dos

experimentos, obrigada pela amizade, pela ajuda, pelos momentos de descontração e

incentivo constante. Não posso deixar de agradecer o Henrique pelo auxílio em várias

etapas desta tese e ao Fernando pela ajudar nas contagens das lâminas na reta final.

Obrigada!

À Maristela, por ter se tornado uma grande amiga, obrigada pela sua simpatia, pelo

seu otimismo, pela ajuda (que não foi pouca!) e por estar sempre à disposição mesmo nos

feriados ou fins de semana. Também tenho que agradecer a Glauce pelo auxílio no preparo

nos géis de protease.

Aos ex-amigos de laboratório Socorro, Alan e Igor pelo auxílio, pela amizade e

pelos momentos de descontração.

Ao meu “irmão” Celso e a Daniella, pela simpatia, pelas dicas e por sempre me

cederam reagentes.

À minhas amigas de turma, Renata Martins, Danielle, Cláudia (Lele), Elize e Geisy,

obrigada pela amizade, pelas palavras de ânimo e pelos momentos de descontração.

Ao Paulo e Geralda pelos momentos de descontração e, principalmente, pela ajuda e

pela competência no preparo do material.

Ao Prof. André pelas sugestões e revisão desta tese em um curto período de tempo.

Ao financiamento concedido pelas agências: Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do

Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) e

Conselho de Ensino para Graduados e Pesquisa (CEPEG) da Universidade Federal do Rio

de Janeiro.

A todos que de alguma forma contribuíram positivamente para a realização deste

trabalho. Muito obrigada.

ÍNDICE

Resumo.............................................................................................................09

Abstract............................................................................................................10

Abreviaturas.....................................................................................................11

I.- Introdução.................................................................................................. 12

I.1- Os tripanossomatídeos......................................................................... 12

I.2- O gênero Trypanosoma....................................................................... 13

I.3- A Metaciclogênese.............................................................................. 16

I.4- As Proteases....................................................................................... 19

I.5- A Sinalização Celular......................................................................... 22

I.5.1- As Proteínas Cinases…………………………………………...24

I.5.2- A Proteína Cinase A (PKA)........................................................26

I.5.3- A Proteína Cinase C (PKC).........................................................30

I.5.4- A Proteína Caseína cinase 2 (CK2).............................................32

I.6 O Cálcio.................................................................................................34

I.7- O Fator de Ativação de Plaquetas (PAF)............................................ 36

II. Objetivos.................................................................................................... 44

III. Material e Métodos................................................................................... 46

III.1- Reagentes químicos.......................................................................... 46

III.2- Microrganismo................................................................................. 46

III.3- Cultivo do microrganismo................................................................ 46

III.4- Localização do receptor para PAF....................................................47

III.5- Determinação dos níveis de AMPc intracelular............................... 47

III.6- Efeito de PAF e de moduladores de proteínas cinases e inibidores

de proteolíticos na diferenciação celular de T. cruzi ...................... 48

III.7- Obtenção do extrato celular dos parasitos para determinação do

perfil de expressão de proteases .................................................. 48

III.8- Efeito direto do PAF na atividade proteolítica..................................49

III.9- Obtenção de conteúdo citoplasmático dos parasitos para o perfil

de fosforilação de proteínas ..................................................... 49

III.10- Determinação dos níveis de cálcio intracelular.............................. 50

III.11- Dosagem de proteínas.....................................................................50

III.12- Análise estatística............................................................................50

IV. Resultados................................................................................................. 51

V.Discussão..................................................................................................... 75

VI.Conclusões................................................................................................. 87

VII.Referências Bibliográficas........................................................................ 89

RESUMO

Trypanosoma cruzi é um protozoário parasito que é transmitido por insetos

triatomíneos. Estes insetos se infectam ingerindo tripomastigotas do sangue dos

hospedeiros mamíferos; os parasitos, então, se multiplicam como epimastigotas e se

diferenciam em tripomastigotas no intestino do inseto. Os tripomastigotas infectam células

de mamíferos, onde se transformam em amastigotas e depois novamente em

tripomastigotas, sendo então liberados no sangue periférico. Os mecanismos que norteiam

as várias etapas de diferenciação dos parasitos são pouco conhecidos. Sabe-se, entretanto,

que o fator de ativação de plaquetas (PAF) estimula o processo de diferenciação de

epimastigotas para tripomastigotas “in vitro”. PAF é um fosfolipídio que age como potente

mediador de várias funções celulares, em diversos processos biológicos e patofisiológicos.

T. cruzi, como outros eucariotos, apresenta funções celulares mediadas por vias

sinalizadoras, envolvendo proteínas cinases e fosfatases, proteínas G e mensageiros

secundários. No presente trabalho, investigamos o efeito do PAF sobre os níveis de AMP

cíclico (AMPc) e a participação das proteínas cinases A (PKA), C (PKC) e proteína cinase

CK2, durante a diferenciação induzida por PAF, de formas epimastigotas em

tripomastigotas metacíclicas de T. cruzi. Inicialmente, detectamos, através do método de

imunofluorescência, a presença do receptor para PAF em formas epimastigotas, sugerindo

que a ligação desta molécula ao seu receptor é capaz de induzir diversos eventos

sinalizadores, durante a diferenciação celular deste parasito, uma vez que todos os eventos

desencadeados por este agente foram revertidos pelo antagonista de receptor de PAF, WEB

2086. Dentre esses eventos, sugerimos que PAF seja capaz de induzir um aumento na

concentração de AMPc intracelular, enquanto que AMPc exógeno e PKA tiveram suas

ações moduladas por PAF, durante a diferenciação celular deste parasito. A diferenciação

estimulada por PAF foi revertida pelo uso de inibidores de PKC (BIS) e CK2 (DRB e

TBB), sugerindo a participação destas enzimas na diferenciação. PAF também foi capaz de

modular a expressão de uma metaloprotease de 65 kDa e de uma cisteína protease de 40

kDa, com participação de AMPc, PKA, PKC e CK2. De maneira similar, a fosforilação de

diversas proteínas foi modulada por PAF, AMPc e pelos inibidores de PKA, PKC e CK2.

Nossos dados também sugerem que os eventos de sinalização desencadeados por PAF em

T. cruzi não dependem do aumento da concentração de cálcio intracelular.

ABSTRACT

Trypanosoma cruzi is a protozoan parasite transmitted by triatomine insects. These

insects get infected when they ingest contaminated blood from the mammalian hosts; the

parasites then multiply as epimastigotes and differentiate into trypomastigotes in the gut of

the insect. The trypomastigotes infect mammalian cells, where they differentiate into

amastigotes and then back into trypomastigotes, being released into the peripheral blood.

Nevertheless it is known that platelet-activating factor (PAF) triggers the “in vitro”

differentiation of T. cruzi, from epimastigote into trypomastigote form. PAF is a

phospholipid that acts as a potent mediator in diverse cell functions, in several biological

and pathophysiological processes. T. cruzi, like other eukaryotic cells, has their cell

functions mediated by signal transduction pathways, involving protein kinases and

phosphatases, G proteins and secondary messengers. In the present study, we have

investigated PAF effects on the cAMP levels, as well as the role of protein kinases A

(PKA), C (PKC) and protein kinase CK2, during the PAF-induced differentiation of

epimastigote into trypomastigote stage in T. cruzi. Initially, we have detected, by

immunofluorescence method, the presence of PAF receptor in the epimastigote form,

suggesting that PAF binding to its receptor leads to several signaling events, during cell

differentiation of T. cruzi, as all PAF effects were reversed by PAF-receptor antagonist,

WEB 2086. Among these events, we suggest that PAF enhances the amounts of

intracellular cAMP, while exogenous cAMP and PKA presented their activities modulated

by PAF, during cell differentiation of this parasite. The differentiation triggered by PAF

was reversed by inhibitors of PKC (BIS) and CK2 (DRB and TBB), suggesting a role for

these protein kinases in T. cruzi cell differentiation. PAF has also modulated the expression

of a metalloprotease of 65 kDa and a cysteine protease of 40 kDa, with the contribution of

cAMP, PKA, PKC and CK2. Likewise, total protein phosphorylation in T. cruzi was

modulated by PAF, cAMP, and by the protein kinase inhibitors of PKA, PKC and CK2.

The results presented in this study also suggest that the signaling pathways triggered by

PAF do not depend upon a raise on the concentrations of intracellular calcium.

ABREVIATURAS

AC Adenilato Ciclase

AMPc Adenosina Monofosfato Cíclica

ATP

Adenosina Trifosfa Adenosina Trifosfato

A23187 Ionóforo para Cálcio

Íon Cálcio

BIS Bisindolilmaleimida

CK2 Caseína cinase 2

DAG Diacilglicerol

DMSO Dimetilsulfóxido

DRB

5,6-dicloro-1-(β-D-ribofuranoil) benzimidazole

E-64 L-trans-epoxisuccinil leucilamido-(4-guanidino)butano

FBS Soro Fetal Bovino

GMPc Guanosina Monofosfato Cíclica

GDT Guanosina difosfato

GTP Guanosina trifosfato

Inositol Trifosfato

kDa Kilodalton

kDNA DNA do cinetoplasto

LIT Infusão de Fígado

MAPK Proteína Cinase Ativada por Mitógeno

Nitrogênio molecular

PAF Fator de Ativação de Plaquetas

PBS Tampão Salina Fosfato

PDE Fosfodiesterase

PIP

Fosfatidilinositol Bifosfato

PKA Proteína Cinase A

PKC Proteína Cinase C

PLA

Fosfolipase A

PLC Fosfolipase C

PI3K Fosfatidilinositol 3 cinase

PMA Forbol-12-miristato-13-acetato

PMSF Fluoreto de Fenilmetanosulfonil

SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS

TBB 4,5,6,7, tetrabromobenzotriazol

WEB 2086

3-[4-(2-clorofenil)-9-metil-6H-tieno-[3,2-f][1,2,4]triazolo-[4,3,α-

][1,4]diazepina-2-γ1-1-(4-morfina-γ1)-1-propanona

μCi Micro Curie

Introdução

I.1. Os Tripanossomatídeos

O sub-reino Protozoa possui membros de grande importância médica, veterinária e

agropecuária. Pertencem a este grupo protozoários causadores de doenças humanas, de

gado e animais domésticos, além de algumas espécies patogênicas para os vegetais. Este

grupo constitui a família Trypanosomatidae, da ordem Kinetoplastida, sendo esta última

caracterizada por protozoários que apresentam cinetoplasto, uma estrutura que

compreende o DNA mitocondrial (Shapiro & Englund, 1995), localizado no interior da

única mitocôndria, junto à base do flagelo (Vickerman, 1976). Duas outras famílias são

reconhecidas como pertencentes a esta ordem: Bodonidae, constituída de biflagelados de

vida livre ou comensais e Cryptobiidae, constituída de parasitas de peixes e

invertebrados (Schmidt & Roberts, 1996).

A família Trypanosomatidae apresenta, além das organelas típicas da maioria das

células eucarióticas, algumas estruturas peculiares como um cinetoplasto relativamente

pequeno e compacto, e um único flagelo locomotor, que pode estar livre ou aderido ao

corpo celular. O glicossoma é uma estrutura que compartimentaliza enzimas da via

glicolítica, enzimas da β-oxidação de ácidos graxos, síntese de éter-lipídios, esteróis,

pirimidinas e enzimas da via de recuperação de purinas (revisto por Michels, Hannaert

& Bringaud, 2000). O acidocalcisoma, outra estrutura peculiar é caracterizado por sua

alta eletrodensidade, presença de fósforo, magnésio, sódio e zinco e uma alta

concentração de cálcio no seu interior. Esta organela possivelmente é responsável pelo

armazenamento de cálcio para adaptação dos tripanossomatídeos a condições de estresse

ambiental, armazenamento de energia e regulação da homeostase do pH intracelular

(revisto por Docampo et al., 2005). A forma celular é conferida por um citoesqueleto

formado por microtúbulos subpeliculares. Estes se encontram distribuídos por todo o

corpo do protozoário, exceto na região de ligação do flagelo ao corpo celular e na região

da bolsa flagelar. Os microtúbulos subpeliculares formam ligações cruzadas entre si e

com a membrana plasmática, conferindo estabilidade e resistência à ruptura por efeitos

mecânicos (De Souza, 2002).

Os critérios usados para classificação em gêneros desses parasitos, depende da(s)

forma(s) apresentada(s) em seus ciclos evolutivos. Entretanto, a morfologia não tem sido

considerada critério taxonômico suficiente para classificação (Wallace et al., 1983).

Estudos a respeito de análise do DNA do cinetoplasto (kDNA) e do DNA genômico, além

da análise de padrões de isoenzimas, entre outros, têm sido utilizados para uma melhor

identificação e classificação dos tripanossomatídeos (Camargo et al., 1982, 1992; Nunes et

al., 1994, 1995; Marché et al., 1995, Santos et al, 2005 a). No entanto, estes critérios de

classificação ainda são falhos e necessitam ser revisto.

Atualmente nove gêneros de tripanossomatídeos são reconhecidos: Leptomonas,

Rhynchoidomonas, Blastocrithidia, Herpetomonas e Crithidia, parasitos monoxênicos e

classicamente não patogênicos para humanos; os parasitos de invertebrados e vertebrados

Endotrypanum, Leishmania e Trypanosoma e o gênero Phytomonas, constituído por

parasitos de invertebrados e plantas. Os gêneros Leishmania e Trypanosoma apresentam

espécies de grande importância médica, veterinária e econômica; e o gênero Phytomonas

também apresenta espécies de grande importância econômica (McGree & Cosgrove, 1980;

Vickerman, 1994; Camargo, 1999).

I.2. O Gênero Trypanosoma

Os membros do gênero Trypanosoma parasitam todas as classes de vertebrados, ou

seja, peixes, anfíbios, répteis, aves e mamíferos. A grande maioria vive no sangue e outros

fluidos corpóreos do hospedeiro, mas algumas espécies, como o Trypanosoma cruzi,

podem invadir e se replicar no interior de células. Em alguns casos, a infecção não

necessariamente gera doença, a qual ocorre dependendo de vários fatores, como

susceptibilidade do hospedeiro e patogenicidade do parasito (Marquardt & Demarre, 1985).

As tripanossomíases são doenças de humanos e animais domésticos, resultantes da

infecção por protozoários parasitos do gênero Trypanosoma. Dois tipos de

tripanossomíases humanas são conhecidos: a tripanossomíase americana ou doença de

Chagas (Chagas, 1909) e a tripanossomíase africana ou doença do sono. A doença de

Chagas ocorre nas Américas Central e do Sul sendo transmitida, na maior parte dos casos,

por insetos hematófagos da família Reduviidae por contaminação fecal, após a picada.

Entretanto, a transmissão congênita, por via oral ou por transfusão de sangue também pode

ocorrer, porém com menor freqüência (Rey, 2002). Segundo dados estatísticos, existem 16-

18 milhões de casos de infecção por doenças de Chagas, e outras 120 milhões de pessoas

apresentam riscos de contraí-la (WHO, 2002). O T. cruzi, agente etiológico da doença de

Chagas, apresenta um complexo ciclo biológico, caracterizado por 3 estágios evolutivos

observados nos hospedeiros vertebrados e invertebrados (Figura 1).

Figura 1: Formas evolutivas do Trypanosoma cruzi. (A) amastigota, (B)

epimastigota e (C) tripomastigota (De Souza, 2002).

A) Forma amastigota: caracterizada por apresentar pequenas dimensões, corpo

arredondado, praticamente imóvel, localizada no interior da célula hospedeira, possui um

núcleo relativamente grande, redondo e excêntrico e um flagelo curto, visível apenas por

microscopia eletrônica.

B) Forma epimastigota: apresenta cinetoplasto localizado antero-lateral ao núcleo e o

flagelo emerge lateralmente ao corpo celular.

C) Forma tripomastigota: característica das formas sanguícolas (hospedeiro vertebrado) e

metacíclicas (hospedeiro invertebrado). Possui cinetoplasto localizado na região posterior

ao núcleo, por onde emerge o flagelo, que se encontra ligado ao corpo celular, por quase

A B C

todo o corpo do parasito. Com movimento do flagelo, esta membrana é puxada, dando a

impressão de uma “membrana ondulante”.

Estudos recentes, utilizando análise de isoenzimas, ribotipagem, atividade do RNA

promotor, genes da seqüência de mini-exon e marcação dos microsatélites, evidenciaram

que T. cruzi não é uma espécie única, mas corresponde a dois subgrupos, com alta

divergência genética, designada como linhagens 1 e 2. A linhagem 1 é predominante no

ciclo doméstico, enquanto a linhagem 2 ocorre principalmente no ciclo silvestre, sendo

ambas as linhagens potencialmente patogênicas para o homem (Briones et al., 1999).

O ciclo biológico no hospedeiro invertebrado inicia-se quando os triatomíneos

vetores alimentam-se do sangue do hospedeiro vertebrado (Figura 2). Neste processo,

formas tripomastigotas presentes na corrente circulatória do hospedeiro vertebrado são

ingeridas pelo inseto. Chegando ao estômago do inseto, as formas tripomastigotas

transformam-se em formas epimastigotas e em algumas formas arredondadas. As formas

epimastigotas vão para o intestino, onde se multiplicam repetidamente por divisão binária,

podendo se ligar às células intestinais por hemidesmosomas (Zeledon, Alvarenga &

Schosinsky, 1997). No reto, uma certa proporção de epimastigotas diferencia-se em

tripomastigotas metacíclicos, que são eliminados pelas fezes e urina, durante o

hematofagismo no vertebrado, incluindo o homem. Os parasitos depositados na pele do

hospedeiro vertebrado podem ter acesso às células do sangue e posteriormente aos demais

tecidos do hospedeiro, através de lesão preexistente na pele ou de lesão ocorrida durante a

picada do inseto (revisto por Kolien & Schaub, 2000; De Souza, 2002).

Quando as formas tripomastigotas metacíclicas atingem as células do sistema

fagocitário mononuclear (SFM) da pele ou mucosas do hospedeiro vertebrado, elas são

ingeridas por um típico processo fagocítico ou induzem uma atividade endocítica na célula

hospedeira, que envolve liberação de cálcio, fosforilação de proteínas e migração

lisossomal (revisto por Andrews, 2002 e Yoshida, 2006). Ambos os processos culminam

com a formação do vacúolo parasitóforo. As formas tripomastigotas são transformadas em

amastigotas e concomitantemente escapam do vacúolo parasitóforo, devido à liberação de

enzimas; as formas amastigotas então se multiplicam por divisão binária simples. Os

parasitos entram, então, em contato direto com as estruturas citoplasmáticas do hospedeiro,

interagindo com os elementos do citoesqueleto (microtúbulos e microfilamentos) (revisto

por De Souza, 2002).

Figura 2: Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi nos hospedeiros vertebrado (homem) e

invertebrado (inseto vetor) (adaptado do “Control of Disease Center”, EUA).

I.3- A Metaciclogênese

O processo de diferenciação das formas epimastigotas reprodutivas em

tripomastigotas infectantes ocorre no tubo digestivo do inseto vetor (Figura 2, etapas 5-8).

Muito se tem discutido sobre os fatores bioquímicos que estabelecem a infecção do T. cruzi

no vetor (Kollien, Schmidt & Schaub, 1998). Entretanto, pouco é conhecido sobre os

diferentes fatores intrínsecos ao tubo digestivo que influenciam no ciclo evolutivo do T.

cruzi. Sabe-se que as propriedades físico-químicas das superfícies celulares, a tensão

superficial e as interações eletrostáticas entre as moléculas celulares podem facilitar o

disparo de cascatas de sinalização celular, influenciando a virulência e o processo de

interação celular (revisto por Schaub et al., 1998).

É conhecido que a adesão das formas epimastigotas à superfície do epitélio do

intestino médio e posterior, bem como à camada cuticular do epitélio da glândula e do saco

retal é uma etapa importante do processo de interação do T. cruzi com o hospedeiro

invertebrado. A adesão ocorre via interações hidrofóbicas entre os componentes de

superfície da forma epimastigota e as moléculas presentes na cutícula, sendo o

lipopeptidofosfoglicano (LPPG) da superfície de epimastigota e as membranas que

revestem a superfície das células intestinais (membranas perimicrovilares ou extracelulares)

os componentes de superfície envolvidos nesta adesão (Schaub, 1989; Kollien & Schaub,

2000).

Nas membranas celulares, os carboidratos ligados a proteínas ou a lipídios, formam

respectivamente glicoproteínas e glicolipídios, que são denominados genericamente de

glicoconjugados. Reconhecidamente, esses glicoconjugados de superfície exercem função

primordial na interação entre diferentes tipos de parasitas e seus hospedeiros (Almeida &

Grazzinelli, 2001).

Em T. cruzi, a expressão diferencial de glicoconjugados na superfície celular, em

diversas cepas parece estar relacionada com a infectividade desses parasitos. Acredita-se

que uma glicoproteína de 82 kDa, presente na forma tripomastigota metacíclica, seja um

ligante para receptores em células de mamíferos (Ramirez et al., 1993; Manque et al.,

2003). Receptores para formas tripomastigotas em macrófagos e mioblastos provavelmente

são os glicoconjugados, contendo resíduos de manose e N-acetilglicosamina, e estes

resíduos parecem ser importantes para a associação dos parasitos a estas células

hospedeiras, uma vez que o tratamento de macrófagos e mioblastos, com manosidase e N-

acetilglucosaminidase, inibe a adesão dos parasitos (Villalta & Kierszebaum, 1985).

Pereira, Andrade e Ribeiro, em 1981, observaram a presença de lectinas com

diferentes atividades no estômago, intestino e hemolinfa de Rhodnius prolixus. Os açúcares

ligantes para essas lectinas foram detectados em formas epimastigotas, mas não em

tripomastigotas de T. cruzi, sugerindo que esses açúcares distintos no tubo digestivo do

vetor e suas reações seletivas com o parasita podem representar mecanismo regulatório na

interação entre o parasito e o vetor. Estes autores observaram que os parasitos se ligam as

lectinas do tubo digestivo dos triatomíneos, enquanto sob a forma de epimastigotas e que,

quando um novo resíduo de açúcar é adicionado à molécula original, ligante para a lectina

do parasito, este “desliga” do tubo digestivo do barbeiro, sendo essa etapa um dos

processos que culminam na metaciclogênese.

Contreras e colaboradores (1985, 1988) mostraram que um clone específico de T.

cruzi, Dm28c pode ser induzido ao processo de metaciclogênese ao ser submetido à

incubação em um meio de cultura pobre, que reproduz parcialmente a urina do triatomíneo

vetor, o meio TAUP. Posteriormente, Rondinelli e colaboradores (1988), utilizando o meio

LIT ligeiramente modificado (M16) transformaram formas epimastigotas da cepa CL em

tripomastigotas. Estas células posteriormente tratadas com soro humano fresco e

transferidas novamente para o meio LIT deram origem a agregados de formas

arredondadas, com características de formas amastigotas ou esferomastigotas. Estas formas

são resistentes à lise por complemento e quando mantidas em meio contendo alta

concentração de soro (55%) a 37°C, se transformam em tripomastigotas, parecidas

morfologicamente com as formas sangüíneas. Os processos de amastigogênese, em que

tripomastigotas metacíclicos se transformam em amastigotas, também têm sido mimetizado

in vitro (Contreras et al., 2002).

Embora vários estudos tenham sido realizados sobre a diferenciação celular nos

tripanossomatídeos, principalmente nos gêneros Trypanosoma e Leishmania, inúmeros

aspectos desse processo, incluindo seu mecanismo e seus efeitos finais, continuam

obscuros. Uma das bases essenciais para os estudos sobre a diferenciação celular tem como

objetivo a identificação e a caracterização de marcadores bioquímicos e moleculares

correspondentes à expressão gênica, que acarreta em um fenótipo diferenciado (Williams,

1985; Derynck & Wagner, 1995).

Ávila e colaboradores (2001) descreveram em T. cruzi a metaciclogenin, um gene

detectado em epimastigotas durante seu processo de diferenciação para tripomastigotas. As

funções biológicas da proteína codificada por este gene precisam ser mais bem elucidadas,

mas especula-se que ele pode estar envolvido com a adesão de epimastigotas ao tubo

digestivo do inseto, durante o processo de metaciclogênese, já que o produto deste gene foi

detectado somente em epimastigotas em diferenciação. Recentemente, mais outros dois

genes foram identificados como “up regulated” em tripomastigotas metacíclicos:

metaciclogen II (Met II) e metacicligenin III (Met III). Esses genes como o anterior, não

estão presentes em formas epimastigotas. Análises por western blot e imunocitoquímica

demonstraram que Met II apresenta uma massa molecular, aproximada, de 16 kDa sendo

localizado no cinetoplasto desses parasitos, enquanto, Met II apresenta uma massa

aproximada de 24 kDa, localizado no núcleo. Como característica esses genes são

expressos em uma única cópia em diferentes cromossomas de T. cruzi (Yamada-Ogatta et

al. , 2004).

Bonaldo e colaboradores (1991) estudando as atividades de proteases durante a

transformação de epimastigota para tripomastigota metacíclico em T. cruzi identificaram

três componentes de massas moleculares de 65, 52 e 45 KDa. Essas enzimas foram

caracterizadas como: uma metaloprotease tripomastigota estágio-específica (65 kDa), a 52

kDa uma metaloprotease constitutivamente expressa em ambas as formas e a outra de 45

kDa uma cisteína protease expressa em maior quantidade em formas epimastigotas que em

tripomastigotas. O fato de 65 e 40 kDa serem reguladas durante os estágios de

desenvolvimento, sugere-se que estas são essenciais para a diferenciação, uma vez que

inibidores de cisteína- e metaloproteases foram capazes de bloquear a metaciclogênese.

A utilização de várias abordagens para o estudo do processo de metaciclogênese

mostra que este é um processo que ocorre gradualmente, envolvendo mudanças

morfológicas, metabólicas e genéticas do parasito. Muitas vezes, as mudanças fisiológicas,

como, por exemplo, infectividade, precedem as completas transformações morfológicas,

surgindo, consequentemente, o que podemos considerar como formas intermediárias que,

muitas vezes, já apresentam características típicas da forma tripomastigota. Algumas

modificações ocorrem na superfície, o que proporciona ferramentas para separar as formas

epimastigotas das tripomastigotas para estudos (Ávila et al., 2001).

I.4- As Proteases

As proteases, peptidases ou peptídeo hidrolases são enzimas hidrolíticas capazes de

clivar ligações peptídicas em peptídeos e proteínas, sendo encontrada em vários tipos de

organismos, como fungos, bactérias e protozoários. Essas enzimas catalisam importantes

reações biológicas essenciais, incluindo metabolismo protéico, reações imunes e

coagulação sanguínea (McKerrow et al., 1989). Por classificação, as proteases que

degradam os terminais de uma cadeia polipeptídica são denominadas de exopeptidades

(E.C. 3.4.11-19) ou mais especificamente de amino e carboxipeptidases, dependendo do

final que é liberado da cadeia de aminoácidos do substrato, enquanto, as enzimas que

catalisam a clivagem de ligações peptídicas internas são denominadas de endopeptidases ou

proteinases (E.C. 3.4.21-99) (Mc Donald, 1985).

A partir da análise de suas propriedades in vitro, as proteases são classificadas de

acordo com suas propriedades físico-químicas: (1) quanto ao pH ótimo de atividade

(protease ácida, neutra ou alcalina), (2) pela habilidade em degradar proteínas específicas

(como elastase, colágeno, gelatinase) e (3) em relação evolutiva, isto é, sua similaridade

estrutural e funcional com outras proteases já caracterizadas (como por exemplo, proteases

semelhantes à tripsina, semelhantes à pepsina). Entretanto, a classificação mais satisfatória

tem como base o grupo químico presente em seu sítio ativo: serina (E.C. 3.4.21), cisteína

(tiol) (E.C. 3.4.22), aspártico (E.C. 3.4.23) e metalo (E.C. 3.4.24). As enzimas cujo

mecanismo de ação não se encaixam ou não está totalmente conhecido foram classificadas

no subgrupo 3.4.99. Recentemente, duas novas classes foram propostas, treonina e

glutâmico proteases (Barret, Rawlings & O’Brien, 2001).

Nos tripanossomatídeos, estas enzimas têm demonstrado funções importantes na

interação parasito-hospedeiro, uma vez que estão envolvidas na nutrição do parasita,

invasão da célula hospedeira, no “turnover” de aminoácidos, e na inativação de proteínas

do sistema complemento do hospedeiro (Cazzulo, 2002; Yao, Donelson & Wilson, 2003;

Santos, Branquinha & D’Avila-Levy, 2006). Em T. cruzi três classes de enzimas

proteolíticas já foram detectadas: metalo, cisteína e serina proteases (Cazzulo, 2002).

Em formas epimastigotas e tripomastigotas metacíclicos foi detectado a expressão

uma metaloprotease de 60 kDa, associada provavelmente com o “turnover” dos

aminoácidos para serem usados na síntese de novas proteínas e para a geração de energia.

Sendo também necessárias para o processamento de proteínas do parasito requeridas no

processo de metaciclogênese (Greig & Ashall, 1990; Bonaldo et al., 1991). Recentemente,

foram descritas duas metalopeptidases em T. cruzi pertencente à família M32. Essa família

de peptidases é limitada sendo restrita a bactérias, archaea, e tripanossomatídeos (incluindo

T. cruzi, Trypanosoma brucei, Trypanosoma vivax e Leishmania major), e por não estar

presente em outras células eucarióticas, essas peptidases podem se tornar alvos promissores

para quimioterapia (Niemirowicz et al., 2006).

Entretanto, a principal atividade proteolítica de T. cruzi é a cruzipaína, cruzaína ou

gp 57/51, uma glicoproteína monomérica de 60 kDa com atividade de cisteína-protease,

que apresenta seqüência N-terminal homóloga a das proteases da família papaína,

particularmente à catepsina L, e que está presente em todas as cepas e clones do T. cruzi,

assim como em todas as formas evolutivas (Murta et al., 1990). Em formas epimastigotas

de T. cruzi esta enzima encontra-se em organelas pré-lisossomais denominadas

reservossomas (Soares, Souto-Padrón & De Souza, 1992; Sant’anna, De Souza & Cunha-e-

Silva, 2004), em formas amastigotas e em formas de transição tripomastigota-amastigota

esta proteína pode estar presente na superfície celular (Tomas, Milles & Kelly, 1997).

Embora níveis comparáveis de RNA mensageiro de cruzipaína seja detectado em todos os

estágios evolutivos do parasito, os níveis de protease e da sua atividade é 10 vezes maior

em epimastigota, sugerindo uma regulação aos níveis transcricional e pós-transcricional

(Tomas & Kelly, 1996). Sugere-se que a cruzipaína está envolvida no aumento da

metaciclogênese in vivo (Bonaldo et al., 1991; Tomas, Miles & Kelly, 1997), invasão

celular (Santos et al., 2005b), e multiplicação do parasito nas células do hospedeiro

(Stempin et al., 2004). Além disso, também tem sido proposto que a enzima exerça um

papel no escape do sistema imune do hospedeiro (Giodanengo et al., 2002).

Alguns trabalhos especulam se a cruzipaína é um dos componentes liberados pelas

formas tripomastigotas do T. cruzi, sendo um dos antígenos do parasito detectado na

superfície celular do hospedeiro e, conseqüentemente, expondo epítopos antes escondidos,

tornando-os alvos para respostas autoimunes, além de ajudar na invasão da célula

hospedeira (Di Noia et al., 2002).

Por sua ação direta na infectividade de T. cruzi, vários novos inibidores de cisteína

proteases têm sido descritos, alguns são homólogos com a região pró-peptídica da protease

e outros não têm nenhuma homologia com os inibidores previamente descritos (Yamamoto

et al., 1999). Os inibidores clássicos das cisteínas proteases incluem os componentes à base

de “organomercúrio”, peptídeos como o E-64, leupeptina e antipaína, e proteínas da

superfamília das cistatinas, como a cistatina C humana, cistatina de galinha e a cininogênio

(revisto por Cazzulo, 2002).

Estudos envolvendo inibidores endógenos de cruzipaína, como a chagasina, também

têm sido bastante explorados. A chagasina é um peptídeo de 12 kDa e que também

apresenta atividade efetiva contra papaína, é capaz de regular o processamento de

zimogenos de cruzipaína (procruzipaína) assim como o tráfego das cisteínas proteases em

compartimentos secretórios em T. cruzi (Santos et al., 2005b). Trabalhos envolvendo

tratamento de epimastigotas com vinil fenil sulfona, conhecidos por serem inibidores

irreversíveis, demonstraram que esses inibidores são capazes de impedir o processamento

autocatalítico da cruzipaína, resultando no seu acúmulo no complexo de golgi, além de

provocar alterações ultraestruturais no retículo endoplasmático, mitocôndria e membrana

nuclear (Engel et al., 1998). Bonaldo e colaboradores (1991) utilizando inibidores para

cisteína e metaloproteases bloquearam o processo de metaciclogênese em T. cruzi. Outras

atividades proteolíticas do T. cruzi, como as metaloproteases (Lowndes et al., 1996) e as

serina prolil oligopeptidases (Joyeau et al., 2000) também têm sido investigadas como

possíveis agentes quimioterápicos para a doença de Chagas.

Atualmente, avanços no conhecimento das classes de enzimas e, conseqüentemente,

no seu potencial alvo de ação foram aprimorados pelo uso do sistema MEROPS (http://

merops.sanger.ac.uk). Esse sistema tem como objetivo agrupar enzimas em famílias de

acordo com a homologia na seqüência de aminoácido. As famílias de mesma origem

ancestral são agrupadas em clãs e este tipo de informação é determinado pela estrutura

terciária das proteases, pesquisas nesse sentido permitem o conhecimento para o uso de

novos tipos de terapias.

I.5- A Sinalização Celular

As modificações morfológicas e fisiológicas induzidas pelo ambiente, no qual o

parasito se encontra, exige uma rápida adaptação das células a cada situação. O estudo de

como uma célula se comporta em cada caso pode fornecer ferramentas úteis para o

conhecimento do ciclo celular de um organismo. O modo específico como uma célula reage

aos sinais externos varia em função do grupo de proteínas receptoras que a célula possui e

através do qual ela é ajustada a detectar um subgrupo específico de sinais, assim como de

acordo com a maquinaria celular, através da qual a célula integra e interpreta a informação

recebida. Para estes eventos, há participação de receptores de superfície celular, proteínas

ligadoras do nucleotídeo guanílico (proteínas G) ou proteínas cinases, e elementos

reguladores transcricionais (Parsons & Ruben, 2000). Os resultados finais deste processo

irão definir que tipos de mecanismos a célula pode seguir (proliferar, diferenciar ou

morrer).

Durante as etapas de sinalização celular, os receptores de superfície estimulam

enzimas intracelulares alvos, que terão como função propagar e amplificar o sinal disparado

pela ligação de uma determinada molécula ao seu receptor. Os eventos que induzem a

sinalização transmembranar são feitos por duas vias principais: uma emprega a adenosina

monofosfato cíclica (AMPc) e a outra usa a combinação de mensageiros secundários, que

inclui íons cálcio e duas substâncias: inositol trifosfato (IP

) e diacilglicerol (DAG). Na

transdução de sinais disparada por estas vias, o componente inicial, o receptor, transmite a

informação através da membrana plasmática para o interior da célula, por intermédio de

uma família de proteínas de membrana, que só se tornam ativadas quando se ligam a

guanosina trifosfato (GTP), conhecidas como proteínas G. Estas proteínas ativam uma

enzima amplificadora na face interna da membrana, que converte moléculas precursoras em

mensageiros secundários. A transdução de sinais na regulação da função celular envolve

uma rápida modificação covalente reversível de proteínas celulares, pela adição de grupos

fosfato a resíduos de serina, treonina ou tirosina dessas proteínas (Berridge, 1985, como

revisão Robbins & Hollenberg, 1999).

Nas células animais, os efeitos finais da transdução de sinais são comumente

mediados por proteínas cinases e/ou fosfatases. As proteínas cinases catalisam a

transferência do fosfato terminal de ATP para um resíduo de serina ou de treonina em uma

proteína, com a formação de uma ligação fosfoéster covalente, enquanto que as fosfatases

catalisam a remoção de grupos fosfato (Hunter, 1995). Assim, a fosforilação de proteínas

desempenha um papel central nos processos de transformação e diferenciação celular de

eucarióticos superiores (Hunter & Cooper, 1981).

I.5.1- As Proteínas Cinases

Em sua grande maioria, os estudos sobre sinalização intracelular envolvendo

tripanossomatídeos, abordam as vias disparadas nas células hospedeiras de mamíferos, em

resposta à presença desses parasitos. Desta maneira, pouco se sabe sobre a transdução de

sinais que ocorre nesses parasitos, a partir de estímulos externos a eles, inclusive durante a

interação com seus hospedeiros (Parsons & Ruben, 2000). Entretanto, foram observadas

inúmeras diferenças marcantes entre o conjunto das proteínas cinases de humanos e as de

tripanossomatídeos (Naula, Parsons & Motram, 2005). Assim, o estudo sobre as vias de

sinalização intracelular de tripanossomatídeos, em especial no que diz respeito à

participação das proteínas cinases, é de suma importância, porque as descobertas que se

seguirem a esses estudos poderá levar ao desenvolvimento de novas drogas quimioterápicas

contra esses parasitos. De maneira interessante, inibidores de proteínas cinases têm gerado

muito interesse, devido ao grande sucesso no uso dos mesmos para tratamento de câncer

(revisto por Naula, Parsons & Motram, 2005).

É conhecido que a interação de tripanossomatídeos com vertebrados pode levar a

ativação de sinalização intracelular, tanto nos parasitos quanto nas células hospedeiras, e

que esta sinalização pode ser importante para o estabelecimento da infecção. Durante a

interação de formas tripomastigotas metacíclicas de T. cruzi com células de mamíferos,

ocorre à ativação de vias de sinalização que leva ao rearranjo de microfilamentos

(Rodriguez et al., 1995), recrutamento de lisossomas ao sítio de adesão (Tardieux et al.,

1992) e a internalização dos parasitos (Andrews, 2000). Em relação ao parasito, as

informações a cerca dos eventos ativados durante a interação de T. cruzi com as células

hospedeiras ainda são incipientes. No entanto, já se sabe que ocorre ativação de proteína

tirosina cinase e mobilização intracelular de Ca

, com envolvimento de fosfolipase C e IP

no parasito (Yoshida et al., 2000).

Proteínas cinases estão criticamente envolvidas em vários processos regulatórios

(Hunter, 1995; Manning et al., 2002). De acordo com as similaridades das seqüências de

aminoácidos de seus sítios catalíticos, as proteínas cinases eucarióticas são classificadas em

cinco grandes grupos: AGC, CaMK, CMGC, PTK e “outras”. O grupo AGC é representado

pelas cinases dependentes de nucleotídeos (proteínas cinase dependente de AMP cíclico

(PKA) e proteínas cinases dependente de GMP cíclico (PKG)), as cinases dependentes de

cálcio e fosfolipídios (PKC), além das cinases relacionadas à proteína S6 ribossomal. O

grupo das CaMK é representado por proteínas cinases dependentes de cálcio e calmodulina

e o grupo das PTK é representado pelas tirosina cinases. O grupo coletivamente chamado

CMGc é representado pelas proteínas cinases dependentes de ciclinas (CDKs), cinases

ativadas por mitógenos (MAPKs), cinases associadas à glicogênio sintase (GSKs) e as

cinases semelhantes às CDKs (CLKs). Dentre as cinases encontradas no grupo chamado de

“outras”, temos as do grupo Ste (de estéril). As Ste20 serina/treonina cinases regulam

processos celulares fundamentais, tais como o ciclo celular, apoptose e resposta a estresse

(Strange, Denton & Nehrke, 2006).

O sequenciamento dos genomas de três tripanossomatídeos patogênios para o

homem: Leishmania major, T. brucei e T. cruzi, foi recentemente completado, o que

permitiu a análise do conjunto de proteínas cinases (“kinoma”) de cada parasito (Parsons et

al., 2005). Tal análise revelou que cada espécie possui 179, 156 e 171 proteínas cinases de

eucariotos, respectivamente, o que representa cerca de um terço do “kinoma” humano. A

análise revelou que os tripanossomatídeos não possuem membros das famílias de tirosina

cinases citossólicas ou ligadas a receptores. Entretanto, esses parasitos apresentam

membros das famílias de proteínas cinases STE e CMGC em abundância, que parecem

estar envolvidos com a regulação do ciclo celular, diferenciação celular e resposta ao

estresse, durante seus complexos ciclos de vida (Parsons et al., 2005; Naula, Parsons &

Mottram, 2005).

Inibidores de proteínas cinases têm gerado grande interesse, devido ao grande

sucesso de drogas como Gleevec e outros inibidores de tirosina cinases (TKs) em oncologia

clínica (Naula, Parson & Mottram, 2005). De maneira interessante, parasitos da espécie T.

cruzi possuem um grande número de diferenças gênicas entre suas proteínas cinases e a de

mamíferos, que podem ser utilizadas para o desenvolvimento de novas drogas

quimioterápicas contra esse parasito (Naula, Parsons & Mottram, 2005).

I.5.2- A Proteína Cinase A (PKA)

Vários trabalhos têm demonstrado que a adenosina monofosfato cíclica (AMPc)

exerce um importante papel como mensageiro secundário, no controle do ciclo celular dos

tripanossomatídeos. O AMPc é formado a partir do ATP, pela ação da adenilato ciclase, e

degradado à AMP pela AMPc fosfodiesterase. Em células animais, os efeitos do AMPc são

mediados pela ação de uma proteína cinase dependente de AMPc, ou PKA. Na sua forma

inativa, a PKA é tetramérica, consistindo de 2 subunidades catalíticas e 2 subunidades

regulatórias. Quando ativada, AMPc liga-se à subunidade regulatória, permitindo sua

dissociação da subunidade catalítica; esta subunidade livre é capaz de fosforilar resíduos de

serina na proteína alvo. Em muitas células, o aumento da concentração de AMPc ativa a

transcrição de genes alvo-específicos, que contém uma sequência regulatória chamada

elemento de resposta ao AMPc, ou CRE. Neste caso, o sinal é transportado do citoplasma

para o núcleo, pela subunidade catalítica da PKA. No núcleo, a PKA fosforila um fator de

transcrição CREB (CRE-binding protein), permitindo a ativação de genes induzidos por

AMPc. A regulação da expressão dos genes por AMPc exerce um importante papel no

controle da proliferação, sobrevivência e diferenciação de uma grande variedade de células

(Alberts et al., 2004) (Figura 3).

Figura 3. Mecanismo de ativação da adenilato ciclase através da

ligação de um hormônio (H) ao seu receptor (adaptado de Alberts et

al., 2004).

Membrana plasmática

Rec

PtnG

GDP

Aden.

Cicla.

GTP GDP

PtnG

GTP

ATP

AMPc

PKA

Fosforilaçãode

diversasproteínas

PDE

AMP-5´

Expressãogênica

Enzimas

metabólicas

Membrana plasmática

Receptor

PtnG

GDP

Adenilil

Ciclase.

GTP GDP

PtnG

GTP

ATP

AMPc

PKA

Fosforilaçãode

diversasproteínas

PDE

AMP-5´

Expressãogênica

Enzimas

metabólicas

Membrana plasmática

Rec

PtnG

GDP

Aden.

Cicla.

GTP GDP

PtnG

GTP

ATP

AMPc

PKA

Fosforilaçãode

diversasproteínas

PDE

AMP-5´

Expressãogênica

Enzimas

metabólicas

Membrana plasmática

Receptor

PtnG

GDP

Adenilil

Ciclase.

GTP GDP

PtnG

GTP

ATP

AMPc

PKA

Fosforilaçãode

diversasproteínas

PDE

AMP-5´

Expressãogênica

Enzimas

metabólicas

A atividade da enzima adenilato ciclase já foi detectada na membrana plasmática de

todos os três estágios de desenvolvimento de T. cruzi (Castro, de Souza & Meirelles, 1991),

sendo as subunidades regulatórias e catalíticas de PKA purificadas de epimastigotas.

Nesses estudos foi possível demonstrar uma similariedade da subunidade catalítica de T.

cruzi com a subunidade catalítica da enzima presente no coração bovino, já que esta reage

cruzadamente com anticorpos contra a enzima bovina. Sendo a subunidade regulatória,

capaz de inibir a subunidade catalitica de coração bovino e esta inibição pode ser revertida

por AMPc. Experimentos de reconstituição com 2 proteínas purificadas resultaram em uma

holoenzima, com atividade similar com a holoenzima de PKA de coração bovino. A massa

molecular da holoenzima reconstituída sugere uma estrutura tetramérica para a PKA de T.

cruzi (revisto por Naula & Seebeck, 2000; Seebeck, Schaub & Johner, 2004).

Taylor e colaboradores, em 1999, caracterizaram a família gênica da adenilato ciclase

de T. cruzi e propuseram que níveis de variabilidade encontrada no domínio extracelular de

adenilato ciclase de T. cruzi pode exercer um papel na evasão da resposta imune ou pode

refletir diferenças funcionais entre isoformas, como especificidade de ligação ao ligante.

Ambas hipóteses, possivelmente contribuíram durante a evolução, para gerar a diversidade

nos repertórios dos genes de adenilato ciclase com as limitações necessárias para manter o

receptor funcional.

De maneira interessante, a estrutura da adenilato ciclase tripanossomal é distinta da

sua contraparte em mamíferos. Contudo, apesar das diferentes estruturas e todos os resíduos

estratégicos, os domínios catalíticos são conservados entre as ciclases tripanossomal e de

mamíferos. A arquitetura da adenilil ciclase tripanossomal consiste de um grande domínio

N-terminal, que presumidamente é extracelular, acompanhado por uma simples hélice

transmembrana e um domínio catalítico intracelular, uma estrutura que se assemelha aos

receptores de guanilil ciclase. Foi sugerido que o domínio extracelular pode atuar como um

receptor. Em células de mamíferos, as adenilato ciclase não têm um receptor funcional

conhecido. A adenilato ciclase de mamíferos tem dois domínios catalíticos

pseudossimétricos intracelulares C1 e C2, separados por seis hélices transmembranares,

com mais seis hélices transmembranares localizadas na direção do amino-terminal. Ambos

os domínios são requeridos para atividade máxima, embora o resíduo catalítico seja

confinado no domínio C2 (Naula & Seebeck, 2000; Seebeck, Schaub & Johner, 2004)

(Figura 4).

Figura 4. Estrutura da adenilato ciclase de mamífero (A) e de Trypanosoma

(B), em (C) Estrutura de receptores de guanilil ciclase (extraído de Seebeck et

al., 2001).

Recentemente, D`Angelo e colaboradores (2002) detectaram um novo membro da

família da adenilato ciclase de T. cruzi (TczAC). Esta proteína tem duas novas

características: é a primeira adenilato ciclase ativada por cálcio descrita para este parasito,

podendo interagir com a estrutura paraflagelar do fagelo. Esta interação pode ser

interessante, já que a proteína paraflagelar é a principal componente de uma única estrutura

fibrosa de tripanossomatídeo, chamada “paraflagellar rod”. Esta estrutura percorre

paralelamente à estrutura do axonema, ao longo de toda a extensão do flagelo. Sabe-se que

o flagelo dos tripanossomatídeos tem como função motilidade e ligação à célula

hospedeira. Deste modo, a interação do TczAC com proteína paraflagelar pode indicar uma

inter-relação entre as vias de sinalização AMPc e cálcio, podendo ser localizada no flagelo

e a regulação de cálcio de TczAC, podendo ser mediada pela proteína paraflagelar. Outros

trabalhos já tinham indicado que as ciclases tripanossomais não são reguladas por via de

proteínas G heterotriméricas e que a atividade de adenilato ciclase em formas sanguíneas de

T. brucei pode ser transientemente ativada por cálcio, embora o cálcio não tenha efeito nas

formas procíclicas. Estas observações foram baseadas no fato de que a atividade adenilato

(A) (B) (C)(A) (B) (C)

ciclase em T. brucei parece ser insensível a agentes ativadores conhecidos de adenilato

ciclase, como GTP ou análogos de GTP, foscolina e toxinas colérica e pertussis (Rollin et

al., 1996).

Várias evidências sugerem que as vias adenilato ciclase/AMPc podem estar

envolvidas no controle da diferenciação celular deste parasito, em resposta a ligantes

exógenos (Naula & Seebeck, 2000). Oliveira e colaboradores (1993), observaram que

adição de soro fetal bovino, que é um agente mitogênico em T. cruzi, causa um decréscimo

nos níveis de AMPc intracelular, sugerindo ser o AMPc um regulador negativo da

proliferação celular, já que altos níveis de AMPc inibe a síntese de DNA, RNA e proteínas.

Estudos apontam que antes da diferenciação de epimastigotas a tripomastigotas

metacíclicos, os níveis são aumentados de três a quatro vezes. Em acordo com estes dados,

AMPc e análogos de AMPc, bem como papaverina, um inibidor de fosfodiesterase, induz

diferenciação in vitro em T. cruzi (Rangel-Aldao et al., 1988, Gonzales-Perdomo, Romero

& Goldenberg, 1988).

Fraidenraich e colaboradores (1993) sugeriram que o processo de metaciclogênese

pode ser disparado por um fator derivado da globina (GDF), um pequeno peptídeo

resultado da clivagem proteolítica da α

-globina com o intestino do inseto vetor, o qual é

capaz de ativar a adenilato ciclase, presente na membrana de formas epimastigotas.

Surpreendentemente, quando o inseto infectado era alimentado com plasma, ao contrário de

sangue, a diferenciação era inibida, a menos que o peptídeo GDF fosse incluído (Garcia et

al., 1995). Em concondância com estes resultados, Heath, Hieny & Sher (1990) clonaram

um DNAc (Tc26), correspondente a um AMPc transcrito induzido, que é expresso em

tripomastigota, mas não em epimastigota.

Ouaissi e colaboradores (1992) demonstraram que, durante adesão de T. cruzi com a

célula do hospedeiro, ocorre a clivagem de fibronectina por proteases parasito-especificas,

e os fragmentos resultantes desta clivagem aceleram a diferenciação de formas

tripomastigotos metacíclicos em amastigotas proliferativas in vitro. Concomitantemente

com o aumento da concentração de AMPc intracelular, além da estimulação da síntese de

proteínas e fosforilação de diversas proteínas do parasito. Não surpreendentemente, a urina

do inseto vetor, que é descarregada na ampola retal, via túbulos de Malpighi, também

apresenta AMPc (Fraidenraich et al., 1993).

Embora nos últimos anos, extensivas pesquisas tenham auxiliado na caracterização

de moléculas ligadoras de AMPc (Diaz-Benjumea et al., 2006; Alonso et al., 2006), a

participação do AMPc nos eventos de sinalização celular presente nestes parasitos, tenham

ainda muita informação a ser explorada. O desenvolvimento de métodos que permitam

mimetizar in vitro o ciclo do T. cruzi, que ocorre tanto no hospedeiro vertebrado, como no

invertebrado, pode ser considerado uma das maiores contribuições para o estudo da

biologia deste parasito.

I.5.3- A Proteína Cinase C (PKC)

A proteína cinase C (PKC) é uma enzima serina/treonina cinase dependente de

cálcio e fosfolípideo, que é ativada por DAG. Embora também pode existir casos de

ativação de PKC independente da presença de cálcio (Chaudhary & Kasaian, 2006). O

DAG está normalmente ausente nas membranas, mas é transitoriamente produzido, a partir

da hidrólise de fosfatidilinositol 4-5-bifosfato (PIP

), presente na membrana da célula, pela

ação da fosfolipase C, em resposta a sinais extracelulares. Uma vez ativada, PKC catalisa a

fosforilação, dependente de ATP, de várias proteínas, levando à produção de algumas

reações celulares, tais como alterações na expressão de receptores de superfície,

proliferação e diferenciação celular, comunicação intercelular, fosforilação de fatores de

transcrição, entre outros (Alberts et al., 2004).

Figura 5. Mecanismo de ativação da PKC através da ligação de

um hormônio (H) ao seu receptor. H= hormônio; Rec= receptor;

PTN G = proteína G; PLC = fosfolipase C; PIP2 = fosfoinositol

difosfato; DAG = diacilglicerol; PKC = proteína cinase C;

= inositol trifosfato; PTN = proteína; P = fosfato (adaptado de

Alberts et al., 2004).

A PKC é amplamente distribuída em tecidos e órgãos de mamíferos e outros

organismos. Sua estrutura parece ser composta de uma cadeia polipeptídica única, contendo

dois domínios funcionalmente distintos: um domínio hidrofóbico, que pode se ligar à

membrana e um outro domínio, onde está o centro catalítico. Em condições de repouso, na

maioria dos tecidos, a PKC está presente numa forma solúvel inativa, mas quando a

proteína é ativada, a mesma é encontrada numa forma fortemente associada à membrana

celular, participando de vários eventos celulares (Corbalan-Garcia & Gómez-Fernandez,

2006). Muitas das atividades atribuídas a PKC em diversas células têm sido identificadas

com o auxílio de substâncias sabidamente conhecidas como indutoras de crescimento de

tumores. Estas substâncias conhecidas como os ésteres de forbol, por serem análogas ao

diacilglicerol são capazes de ativar a PKC e fornecer informações úteis em relação à ação

da PKC nos diversos tipos celulares (Chang & Lee, 2006).

Várias funções relacionadas ao crescimento, diferenciação celular e infectividade de

tripanossomatídeos têm sido atribuídas à via de transdução de sinais envolvendo PKC. Em

adição, uma PKC já foi caracterizada em formas epimastigotas de T. cruzi (Gomez et al.,

1989). A PKC identificada em T. cruzi foi associada com as frações microssomal e

Membrana plasmática

PtnG

PLC

PIP2

DAG

PKC

IP3

Reservatórios de Ca

P-PTN

Rec

Funções celulares

Expressão gênica

Membrana plasmática

PtnG

PLC

PIP2

DAG

PKC

IP3

Reservatórios de Ca

P-PTN

Rec

Funções celulares

Expressão gênica

citossólica, requerendo cálcio para sua atividade e, estimulada por fosfatidilserina, DAG ou

éster de forbol. Evidências indicam a existência de mais de uma isoforma desta proteína

nestes parasitos, sendo que a mais abundante está presente no citosol e foi identificada

como pertencente ao tipo α (Flawiá, Tellez-Iñón & Torres, 1997). No entanto, o papel desta

proteína no T. cruzi não é bem conhecido. Rodrigues e colaboradores (1999) sugeriram que

a secreção de uma fosfatase intracelular e a liberação de uma ecto-fosfatase da membrana

de T. cruzi, induzida pelo fator de ativação de plaquetas (PAF), ocorre via transdução de

sinais envolvendo PKC, correlacionando, possivelmente, este mecanismo com a

infectividade do parasito. A participação da PKC modulando a infecção de camundongos

por Leishmania amazonensis, utilizando um ativador, o forbol-12-misristato-13-acetato

(PMA) e um inibidor (esfingosina) de PKC foi observada por Rosa e colaboradores (2001).

Também foi sugerido o envolvimento da PKC na via de transdução de sinais, interferindo

na via da caseína cinase 2, estimulada pelo PAF, no processo de diferenciação celular de

Herpetomonas muscarum muscarum, através do uso de um ativador (PMA) e de um

inibidor (BIS-bisindolilmaleimida I) de PKC (Silva-Neto et al., 2002). Estes estudos

demonstram que a PKC exerce um papel importante na diferenciação celular destes

tripanossomatídeos.

I.5.4- A Proteína Cinase 2 (CK2)

A proteína cinase CK2 é uma enzima presente em quase todas as células

eucarióticas, sendo capaz de fosforilar diversas proteínas envolvidas no controle do

crescimento e na diferenciação celular, assim como na transcrição de genes e na

transdução de sinais em eucariotos superiores e inferiores (Guerra & Issinger, 1999). A

atividade da proteína CK2 pode ser evidenciada no núcleo, no citoplasma ou na

superfície de células de mamíferos (Walter, Kinzel & Kubler, 1994), onde esta enzima

fosforila proteínas contendo resíduos de serina e treonina, preferencialmente, ou tirosina

na sua porção C-terminal (Allende & Allende, 1995, revisto por Litchfield, 2003). Em

células humanas, CK2 tem sido encontrada superexpressa em algumas leucemias e

tumores, sugerindo um papel potencial na tumorigênese (Guerra & Issinger, 1999).

A proteína CK2 apresenta uma estrutura quaternária, com massa molecular de

aproximadamente 130 kDa, composta de dois tipos de subunidades catalíticas (α) e

regulatórias (β) com estrutura geral α

ou αα’β

. As subunidades α e α’ são

cataliticamente ativas por si só e apresentam massa molecular aproximada entre 42 e 44

kDa (α) ou 38 kDa (α’). Sendo estas estruturalmente análogas, mas codificadas por

diferentes genes e com funções distintas. A subunidade regulatória β (com massa

aproximada de 26 kDa em células de animais) encontra-se naturalmente inativa, mas

estimula a atividade catalítica da subunidade α de 5 a 10 vezes, podendo interagir com

outras proteínas (revisto por Litchfield, 2003).

Enzimas com atividade semelhante a CK2 em tripanossomatídeos já foram

descritas. Recentemente, Calabokis e colaboradores (2002), identificaram 2 atividades

semelhantes a caseína cinase em formas epimastigotas de T. cruzi: uma, Q-I, pertencente à

família CK1, enquanto que a outra, Q-II, parece conter uma mistura de CK1 e CK2, ou

cinase com ambas atividades. Uma proteína com atividade semelhante a CK2 foi

identificada em T. brucei brucei, sugerindo que a fosforilação de dois polipeptídios

substratos, p37 e p42, aumenta quando o parasito diferencia-se da forma longa e delgada

em formas pequenas e largas (Aboagye-Kwarteng, Ole-Moiyoi & Lonsdale-Ecles, 1991).

Em adição, os genes que codificam a subunidade α de CK2 de Leishmania chagasi e T.

brucei já foram clonados (Bhatia et al., 1998, Park et al., 2002).

A ação da CK2 no processo de morfologia e diferenciação celular parece estar

relacionada com a interação da CK2 com os elementos do citoesqueleto. Vários trabalhos

têm demonstrado proteínas associadas a serina/treonina cinases, que fosforilam tubulina in

vitro e in vivo, dentre as quais inclui-se CK2. Em particular, a CK2 tem sido descrita por

fosforilar tubulina cerebral in vitro e in vivo (Serrano et al., 1987, 1989), e especificamente

por ligar tubulina ou microtúbulos (Faust & Montenarh, 1999; Risnik et al., 1988). Em

tripanossomatídeos, os microtúbulos são os principais componentes do citoesqueleto, onde

exercem um importante papel nas mudanças morfológicas associadas com seu ciclo de

vida.

Maignon e colaboradores (1988) e González, Rangel-Aldao & Slezynger (1997)

analisando a sequência de aminoácidos da proteína dos genes α e β da tubulina em T. cruzi,

identificaram vários sítios potenciais para fosforilação da proteína CK2. Provavelmente, a

fosforilação da tubulina pela enzima semelhante a CK2 em T. cruzi exerce um importante

papel no rearranjo dos microtúbulos durante o crescimento e a diferenciação deste parasito

(Casas et al., 2002).

Em Leishmania major e Leishmania amazonensis a CK2 parece estar envolvida

com crescimento celular, morfologia e infectividade de promastigotas para macrófagos

peritoneais de camundongos in vitro e in vivo (Becker & Jaffe, 1997). Recentemente, foi

demonstrado que a diferenciação celular de Herpetomonas muscarum muscarum

estimulada pelo PAF envolve uma complexa via de sinalização envolvendo a CK2 (Silva-

Neto et al., 2002).

1.6 O Cálcio

O cálcio é conhecido como uma molécula sinalizadora universal. Em geral, sua

concentração no citosol é muito baixa (na ordem de 0.1 µM), enquanto é alta (em ordem de

1,0 mM) no meio extracelular e no lúmen do retículo endoplasmático (RE). Nas

membranas plasmáticas e do retículo endoplasmático as concentrações de cálcio são

mantidas ideais através de um gradiente que tende a conduzir o íon para o citosol. Assim,

quando um sinal abre temporariamente os canais de cálcio em ambas as membranas, o íon

migra para o citosol, aumentando de 10 a 20 vezes sua concentração local, estimulando

proteínas celulares que respondem ao mesmo (Alberts et al., 2004).

Em estado normal, as concentrações de cálcio são mantidas baixas por mecanismos,

como: (1) bomba de cálcio na membrana plasmática, que utiliza energia da hidrólise do

ATP para bombear o íon para fora da célula; (2) as proteínas transportadoras de cálcio que

acopla o efluxo de cálcio ao influxo de sódio na membrana plasmática; (3) bombas de

cálcio na membrana do RE e (4) a importação ativa de cálcio para a mitocôndria durante a

transferência de elétrons na fosforilação oxidativa (Alberts et al., 2004).

Em T. cruzi existem três mecanismos, principais, de entrada de cálcio intracelular

descritos: a mitocôndria, a membrana plasmática e os acidocalcisomas (Parsons & Ruben,

2000). Parece que em tripanossomatídeos a liberação de cálcio do RE não é bem

compreendida, uma vez que ativadores fisiológicos capazes de liberar cálcio do RE não são

encontrados nesses parasitos. Entretanto, o transporte de cálcio no RE foi deduzida pela

clonagem de genes que codificam Ca

-ATPases tipo P do RE.

A importância do cálcio durante a invasão de T. cruzi nas células de mamíferos é

reportada por diversos autores (Yoshida et al., 2000; Neira, Ferreira, Yoshida, 2002;

Manque et al., 2003). A ligação de formas tripomastigotas infectivas na célula alvo induz à

ativação de uma complexa via de sinalização tanto na célula hospedeira quanto no parasita,

com ativação da proteína G sensível à toxina pertussis e ativação da PLC, gerando IP

que

participa da liberação de cálcio de estoques intracelulares sensíveis a IP

Esses eventos

promovem, na célula hospedeira, o rearranjo de microfilamentos, recrutamento de

lisossomas para o sítio de entrada do T. cruzi e internalização do parasito (Yoshida et al.,

2000).

Burleigh e colaboradores (1997) sugerem a participação de uma serina peptidase de

120 kDa presente em tripomastigotas como responsável por induzir o aumento nos níveis

de cálcio nas células de mamíferos durante a invasão.

Neira, Fereira e Yoshida (2002) estudando dois isolados de T. cruzi, um altamente

invasivo (cepa CL) e um com pouca infectividade (cepa G), observaram a expressão

diferencial de glicoproteínas de superfície desses parasitos, sugerindo que essa expressão

diferente, permite que moléculas distintas se associem com rotas de sinalização diferentes

após a interação com a célula-alvo, promovendo, assim uma sinalização de cálcio

diferenciada. Corroborando com esses achados, Manque e colaboradores (2003) deduziram

que por formas epimastigotas não expressarem níveis detectáveis de gp82, elas são

incapazes de induzir resposta ao cálcio, entretanto, quando formas epimastigotas foram

transfectadas com gp82 (uma molécula de superfície metacíclica estágio-específica), essas

se tornam capazes de induzir uma resposta ao cálcio em células HeLa.

DoCampo e colaboradores (1995) compararam a quantidade de cálcio estocado nos

acidocalcisomas nos 3 estágios evolutivos de T. cruzi observando uma maior concentração

de cálcio em epimastigota (~50 nM) que em tripomastigota ou amastigota (~20 nM). Essas

variações na concentração de cálcio intracelular foram discutidas por Lammel e

colaboradores (1996) nos processos de multiplicação e diferenciação de T. cruzi.

Trabalhos descrevem o envolvimento do PAF na entrada de cálcio em

Dictyostelium, parece que dois sinais existem na entrada de cálcio, um é independente da

subunidade Gα2 da proteína G e atua por meio de AMPc, sem a participação do PAF e sem

ocorrer diferenciação celular, o outro depende de subunidade Gα2 da proteína G e é

elicidado pela presença de PAF e induz a diferenciação (Schaloske et al., 1995).

A resposta ao cálcio pelas células é determinada por proteínas que complementam

sua atividade, as proteínas ligadoras de cálcio (CaBPs). Em tripanossomatideos, várias

CaBPs já foram identificadas, dentre as quais a calmodulina (CaM) (Parsons & Ruben,

2000). A calmodulina é composta de uma única cadeia polipeptídica, com 4 sítios de

ligação ao cálcio, que são ativados pela ligação do complexo Ca

/calmodulina a outras

proteínas-alvo. Nesses parasitos, a dependência de CaM ocorre em um número limitado de

proteínas, que incluem nucleotídeos cíclicos, CaM cinase II, óxido nítrico sintase e Ca

ATPase de membrana plasmática (Flawiá, Téllez-Iñón & Torres, 1997).

Para estudos envolvendo oscilações nos níveis de cálcio citosólico são usados

indicadores fluorescentes sensíveis ao cálcio, como o fura-2. Fura-2 é um indicador de

cálcio que fica fluorescente quando excitado por luz UV. Quando se liga a cálcio, o Fura-2

atinge um máximo de excitação fluorescente de seu indicador, que passa por uma mudança

de emissão de 363 nm (quando está livre de cálcio) para 335 nm (quando está saturado

com cálcio), enquanto o máximo de emissão de fluorescência é relativamente imutada a

~510 nm. Medidas de concentração de cálcio usando este método previnem a interferência

devida à distribuição não uniforme de corantes e perda de cor devido à exposição por luz

(Bright et al., 1989).

I.7. O Fator de Ativação de Plaquetas (PAF)

O PAF (1-O-alquil-2-acetil-glicero-3-fosfocolina) (Figura 6) é um fosfolipídio

derivado de fosfatidilcolina, descoberto em 1970 por Henson, quando este demonstrou um

fator solúvel liberado por leucócitos, que era capaz de promover a agregação plaquetária de

coelhos imunizados (revisto por Chao & Olson, 1993). O PAF possui um resíduo éter-

alquila na posição sn-1 e um resíduo acila na posição sn-2 (grupo acetil) e a posição sn-3 é

ocupada pela O-fosfocolina (Kulikov & Muzya, 1997, Prescott et al., 2000).

Figura 6: Estrutura química do PAF (extraído de Chao & Olson, 1993).

Embora, o papel do PAF seja bastante estudado em sistemas de mamíferos,

incluindo coelhos, cobaios e o homem (Chao & Olson, 1993), a presença de PAF já foi

observada em outros organismos, como peixes (Turner & Lumb, 1989), vários

invertebrados (Sugiura et al., 1991, 1992), em Dictyostelium (Bussolino et al., 1991),

plantas (Mangold et al., 1991; Calligerou et al., 1996) e até mesmo em microrganismos,

como cianobactérias (Antonopoulou et al., 2002), Tetrahymena (Tsoukatos et al., 1993) e

Saccharomyces cerevisae (Nakayama et al., 1994 a, b). Recentemente, nosso grupo

identificou uma molécula com característica semelhante ao PAF em T. cruzi (Gomes et al.,

2006).

Em mamíferos, entre as células capazes de sintetizar e liberar PAF podemos citar

plaquetas, neutrófilos, macrófagos, basófilos, eosinófilos e células endoteliais, as quais

estão amplamente distribuídas no organismo. Isso permite a ação do PAF em quase todos

os tecidos e órgãos do corpo, exercendo numerosas atividades biológicas, relacionadas às

respostas imune, inflamatórias, alérgicas, respiratórias e cardiovasculares. Com

característica semelhante aos eicosanoídes, o PAF não é estocado nas células, sendo

sintetizado em resposta a estímulos provenientes de um grande número de moléculas,

incluindo ATP, histamina, trombina, fator de necrose tumoral, interleucinas, peptídeos

quimiotáticos, colágeno, outros autacóides, entre outros, além da interação antígeno-

anticorpo (Chao & Olson, 1993, Kulikov & Muzya, 1998).

Nas células do útero, do coração, do estômago e do cérebro (Yasuda 1986;

Nakayama, Yasuda & Saito, 1987; Tokumura et al., 1987; Nakayama & Saito,, Satouchi &

Saito, 1989; Sugatani et al., 1989), sugere-se que PAF esteja envolvido em estímulos de

proliferação e de diferenciação celular. Squinto e colaboradores (1989), demonstraram que

PAF está envolvido com a expressão de oncogenes (c-fos/c-jun) relacionados ao

crescimento de células de neuroblastoma SH-SY5Y.

Aliberti e colaboradores (1999) sugeriram que o PAF produzido durante o processo

de infeção de macrófagos murinos por T. cruzi, juntamente com a produção de citocinas

pró-infamatórias (TNF α, IFN γ e IL-12), estariam mediando resistência dos animais à

infecção.

Os eventos desencadeados por PAF nos diferentes tipos de células ainda não estão

bem esclarecidos. O seu processo de síntese pode ocorrer através de duas vias enzimáticas:

a primeira é definida como via de remodelagem, em que um resíduo de acil em uma cadeia

longa de ácido graxo é substituído por um resíduo acetil dos fosfolipídios celulares. Outra

ocorre pela via “de novo”, na qual a produção de PAF ocorre paralelamente à síntese de

fosfolipídios, neste processo, uma fosfocolina é transferido para alquil acetil glicerol

(revisto por Prescott et al., 1999, 2000).

Quando as células são estimuladas, a síntese de PAF ocorre pela via de

remodelagem, através da ativação de uma fosfolipase, que hidrolisa fosfatidilcolina a liso-

fosfatidilcolina. Esta enzima, a fosfolipase A

, é regulada por cálcio e pela fosforilação de

MAP cinase (Leslie, 1997), atuando no precursor do PAF (1-O-alquil-2-araquidonil-

glicero-3-fosfocolina), produzindo simultaneamente um ácido graxo livre (geralmente

ácido araquidônico) e liso-PAF (1-O-alquil-2-liso-glicerofosfocolina). O ácido

araquidônico é convertido em vários tipos de prostaglandinas e leucotrienos (eicosanóides),

enquanto o liso-PAF é convertido a PAF, na presença da acetil-CoA-liso-PAF

acetiltransferase, dependente de Ca

/calmodulina, como um passo seguinte à síntese

(Chilton et al., 1984). (Figura 7)

Figura 7. Síntese do PAF (adaptado de Prescott et al., 2000).

Via de Remodela

gem

alquil -

acila

–

glicero

–

fosfocolina

(precursor de PAF de membrana)

Fosfolipase A

liberação de ácidos

graxos poliinsaturados livres

Coenzima A

independente de transacilase

alquil

liso

glicero

–

fosfocolina

(liso PAF)

Adição de acetato via acetil- -

CoA: liso PAF

acetiltransferase

alquil

acetil

glicero

- 3

fosfocolina

(PAF)

Adição de fosfocolina

Defosforilação por

fosfohidrolase

alquil

–

acetil

–

glicero

–

fosfato

Acetilação por uma

acetiltransferase

alquil

–

liso

–sn

glicero

–

fosfato

(um intermediário na síntese de éter lipídio)

Via DE NOVO

Após a síntese, os efeitos desencadeados por PAF são rapidamente processados e os

níveis de PAF no plasma e tecidos voltam aos níveis basais. Estes níveis são controlados

por enzimas denominadas PAF-acetil-hidrolases (EC 3.1.1.47), enzimas capazes de

remover o grupo acetil da sn-2 posição da molécula de PAF, gerando liso-PAF e acetato.

As enzimas PAF-acetil-hidrolases possuem duas isoformas, uma secretada e outra

intracelular. Ambas as formas exibem especificidades com propriedades intrínsecas ao seu

substrato, além de não requererem cálcio para sua atividade (Prescott et al., 2000).

Quando disparada, a ação intracelular do PAF é mediada por receptores associados a

proteínas G (incluindo as proteínas Gq, Gs e Gi/o), expressas na superfície de uma

grande variedade de células. A ligação do PAF ao seu sítio específico desencadeia

diversos efeitos bioquímicos, que incluem ativação da fosfolipase A

, Cβ e D, hidrólise

de fosfoinositídeos, liberação de ácido araquidônico, aumento da concentração de cálcio,

inibição de adenilato ciclase, ativação da PKC, tirosina cinase, proteína cinase mitógeno

ativada (MAP cinases) e fosfatidilinositol 3-cinase (Ishii & Shimizu, 2000) (Figura 8).

Figura 8: Transdução de sinais disparada pela ligação do PAF ao seu receptor

específico. PTN G = proteína G; PLA2 = fosfolipase A

; PLC = fosfolipase C; DAG =

diacilglicerol; PIP2 = fosfoinositol difosfato; PKC = proteína cinase C; IP3 = inositol

trifosfato; PTN = proteína; P = fosfato; AA = ácido araquidônico; Eico = eicosanóides;

Lyso-PAF = liso PAF; PAF = fator de ativação de plaquetas; MAPKK = MAP cinase

cinase (MAP = cinase ativada por mitógeno); MAPK = MAP cinase (adaptado de

Prescott et al., 2000).

Receptor de PAF

PLA

PTN G PLC

PIP

DAG PKC

Reservatórios de Ca

MAPKK

MAPK

Eico

Lyso-PAF

PAF

PTN

Membrana Plasmática

Receptor de PAF

PLA

PTN G PLC

PIP

DAG PKC

Reservatórios de Ca

MAPKK

MAPK

Eico

Lyso-PAF

PAF

PTN

Membrana Plasmática

A transdução de sinais disparada pela ligação do PAF ao seu receptor leva à

ativação de diferentes fatores de transcrição, que controlam a expressão de genes, que estão

relacionados aos diferentes processos de ativação e diferenciação celular. Fatores de

transcrição, como a família Fos e Jun e a família Rel (NF-kB), também podem ser ativados

por PAF, levando ao desencadeamento da expressão de diferentes genes (Bazan & Allan,

1996; Liu et al., 1997; Lukiw et al., 1998). Este estudo mostra o quão complexo é a

sinalização intracelular promovida por PAF.

Como ferramenta para o estudo das vias sinalizadoras disparadas por PAF,

antagonistas do receptor de membrana do PAF têm sido bastante utilizados, entre eles, o

WEB 2086 (3-[4-(2-clofenil)-9-metil-6H-tieno-[3,2-f][1,2,4]triazolo-[4,3,α-[1,4]diazepina-

2γ1-1-(4-morfolina-γ1)-1-propanona) (Barnes, 1991) e a Yangambina, um furofurano

lignana isolado de folhas de Rolinia pickelli (Ishii & Shimizu, 2000; Ishii, Nagase &

Shimizu, 2002). Estas duas substâncias, por serem capazes de se ligar ao receptor de PAF,

impedindo sua ação, ajudam a elucidar vários mecanismos de atuação do PAF em células

inflamatórias.

Honda e colaboradores, em 1991, clonaram e seqüenciaram o gene do receptor de PAF

em células pulmonares de cobaio, mostrando que o mesmo é composto por 7 segmentos

transmembrana e uma porção terminal citoplasmática, composto por 4 resíduos de serina

e 5 de treonina, sugerindo serem estes os possíveis sítios de fosforilação (Figura 9).

Atualmente, um trabalho multidiciplinar, demonstrou elegantemente a presença de sítios

intracelulares de ligação ao PAF no envelope nuclear e no interior do núcleo (Zhu et al.,

2006), as vias metabólicas envolvendo esta molécula têm sido feitas com camundongos

deficientes para o receptor de PAF (PAFR-KO) (Shindou et al., 2000; Ohshima et al.,

2002).

Figura 9: Estrutura do receptor do PAF

( http://www.biochem2.m.u-tokyo.ac.jp/web/contents/PAFR.html)

Durante o seu o ciclo de vida, os parasitos de um modo geral e em especial os

tripanossomatídeos sanguícolas, sofrem a influência de um número vasto de moléculas do

meio, que interagem com sua superfície e exercem ações determinantes em processos

intracelulares. É o conjunto dessas interações e seus efeitos, que irá ditar o sucesso da

infecção. O efeito de alguns componentes do plasma, em processos intracelulares do

parasito, já foi demonstrado para algumas moléculas [citocinas, fator de crescimento da

epiderme (EGF), IFN γ, fator estimulatório de crescimento de granulócitos/ macrófagos

(GM-CSF), etc (Barcinski & Costa-Moreira, 1994)]. No entanto, todos esses estudos têm

sido feitos com ligantes de natureza peptídica, enquanto lipídios presentes normalmente no

sangue do hospedeiro não têm recebido tanta atenção.

O PAF produzido por mamíferos, comercialmente disponível, tem sido utilizado

para diversos estudos de metabolismo e transdução de sinais em invertebrados e em

Tetrahymena (Lekka, Tsoukatos & Kapoulas, 1990; Sordano et al., 1993), em estudos de

embriologia de ouriço do mar (Berdyshev, Vaskovsky & Vasckenko, 1995) e na ativação

de proteínas cinase de plantas (Martiny-Baron & Scherer, 1989).

Resultados anteriores demonstraram que PAF é capaz de induzir um aumento de

cerca de 40 % no número de formas diferenciadas de T. cruzi e de Hepetomonas muscarum

muscarum (Rodrigues et al., 1996; Lopes et al., 1997). A molécula semelhante ao PAF

produzida por T. cruzi é capaz de estimular a diferenciação do próprio parasito e sua

interação com macrófagos peritoneias de camundongos (Gomes et al., 2006). Esses efeitos

parecem ocorrer via receptor de superfície e acoplado à transdução de sinais, já que foi

revertido na presença de antagonistas de PAF (WEB 2086, entre outros). Em H. m.

muscarum a ação do PAF parece envolver a modulação de atividades de enzimas ecto-

fosfatases e fosfatases secretadas destes parasitos, já que o efeito desta molécula é sensível

à ação de moduladores destas enzimas (Dutra et al., 1998, 2000; Rodrigues et al., 1999).

Além disso, PAF foi capaz de estimular a atividade da enzima CK2 de H. m. muscarum,

através de complexa via de transdução de sinais, com participação de proteínas

serina/treonina e tirosina fosfatases, PLC, PKC e MAP cinases (Silva-Neto et al., 2002).

No entanto, os mecanismos intracelulares, que são disparados a partir da interação da célula

com o PAF, são ainda pouco conhecidos no nosso sistema.

II. Objetivos

Os parasitos sofrem a influencia de um vasto número de moléculas do meio externo

durante seu ciclo de vida. Estas moléculas interagem com estes parasitos e exercem papel

importante nos processos intracelulares, sendo responsáveis tanto por mudanças

morfológicas, quanto bioquímicas (Flawiá, Téllez-Iñón, Torres, 1997). Essas mudanças são

mediadas pela ligação de moléculas a seus receptores, iniciando uma série de reações

dentro da célula, através de vias de transdução de sinais, que podem regular diferentes

eventos, como expressão de fatores de virulência cruciais para a infectividade do parasito,

proliferação, diferenciação e morte celular.

No presente trabalho, procuramos determinar as vias de transdução de sinais

envolvidas na diferenciação celular de T. cruzi, clone Dm 28c, estimulada por PAF,

utilizando as seguintes abordagens:

II.1. Localizar o possível receptor para PAF em T. cruzi;

II.2. Determinar o envolvimento de AMP cíclico na diferenciação celular estimulada por

PAF em T. cruzi:

a) Determinar a ação do PAF sobre os níveis de AMPc intracelular em T. cruzi;

b) Determinar o envolvimento de AMPc e da PKA na diferenciação celular

estimulada pelo PAF em T. cruzi;

II.3. Determinar o envolvimento das proteínas cinases PKC e CK2 na diferenciação celular

estimulada pelo PAF em T. cruzi;

II.4. Analisar as possíveis mudanças, estimuladas pelo PAF, na expressão de proteases em

T. cruzi.

a) Determinar o envolvimento das proteases na diferenciação celular estimulada por

PAF em T. cruzi.

b) Determinar o envolvimento dessas proteases na sinalização celular, estimulada por

PAF em T. cruzi.

II.5. Analisar as possíveis mudanças, estimuladas pelo PAF, no perfil de fosforilação de

proteínas em T. cruzi.

II.6. Analisar os níveis intracelulares de cálcio modulados por PAF em T. cruzi.

III. Material e Métodos

III.1. Reagentes químicos

O fator de ativação de plaquetas, 1-O-alquil-2-acetil-sn-glicero-fosfatidilcolina

(PAF), dibutiril AMPc, 5,6-dichloro-1-((-D-ribofuranosil) benzimidazole (DRB),

bisindolilmaleimida I (BIS) e H89 foram obtidos de Calbiochem, San Diego, CA, USA. A

antipaína, 1,10 fenantrolina, L-trans-epoxisucinil leucilamodo-(4-guanidino) butano (E-64),

3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) e dimetil sulfóxido (DMSO) foram obtidos de Sigma

Chemical, St. Louis, MO. USA. O (3-[4-(2-clorfenil)-9-metil-6H-tieno-[3,2-f]

[1,2,4]triazolo-[4,3,(-] [1,4] diazepina-2-(1-1-(4-morfolina-(1)-1-propanona) (WEB 2086)

foi gentilmente cedido pelo Dr. H. Heurer (Boehringer Ingelheim, Alemanha). Todos os

outros reagentes utilizados foram de grau analítico.

Abaixo segue a tabela com os inibidores usados e suas enzimas alvo:

Droga Enzima alvo

H89 Inibidor de PKA

BIS Inibidor de PKC

DRB Inibidor de CK2

antipaína Inibidor de cisteína protease

E-64 Inibidor de cisteína protease

1,10 Fenantrolina Inibidor de metalo protease

III.2. Microrganismo

Neste trabalho utilizamos protozoários da espécie T. cruzi (clone Dm28c),

gentilmente cedidos pela Profa. Marcela Lopes, do Instituto de Biofísica Carlos Chagas

Filho, UFRJ.

III.3. Cultivo do microrganismo

As formas epimastigotas de T. cruzi foram mantidas por repiques semanais em meio

LIT (0,4g KCl/L; 4g NaCl/L; 8g Na

HPO

/L; 2g/L glicose; 5g/L triptona; 5g/L infusão de

fígado; 10mg/L hemina; 15g/L extrato de levedura) acrescido de 10% de soro fetal bovino

(SFB), durante 6 dias a 28ºC.

As formas tripomastigotas metacíclicas foram obtidas, através do cultivo de formas

epimastigotas, em meio quimicamente definido (meio TAUP [190 mM NaCl, 8 mM

tampão fosfato, pH 6,0, 17 mM KCl, 2 mM CaCl

, 2 mM MgCl

, 10 mM glicose, 10 mM

L-prolina]), na ausência de soro, durante 6 dias a 28ºC, condição que desencadeia a

diferenciação dos parasitos para formas tripomastigotas metacíclicas (Contreras et al.,

1985).

III. 4. Localização do Receptor para PAF

Para localização do receptor de PAF em T. cruzi foram utilizados ensaios de

imunofluorescência indireta, na qual os parasitos previamente fixados com formaldeído 4%

foram aderidos em lamínulas contendo poli-L-lisina. Algumas parasitas foram

permeabilizadas com 1% Triton X-100 por 5 minutos, à temperatura ambiente. Os aldeídos

livres foram bloqueados por cloreto de amônio 300mM, assim como outras ligações

inespecíficas também foram bloqueadas por tampão de bloqueio (PBS, pH 7.2 + gelatina de

peixe 3%). Foi utilizado um anticorpo contra receptor de PAF (α-cabra PAFR de origem de

camundongo, Santa Cruz) diluído 1: 10 em tampão de bloqueio por 2 horas, a temperatura

ambiente e um anticorpo secundário Alexa 546 burro anti- cabra IgG 1: 400 (Molecular

Probes, USA) por 1 hora, a temperatura ambiente. As lamínulas foram montadas em 0.2M de

n-propilgalato em glicerol: PBS (9:1) e observadas em microscópio ótico confocal Axioplan

2 (Zeiss).

III.5. Determinação dos níveis de AMPc intracelular

T. cruzi (5 x 10

células/ ml) foi incubado em meio TAU contendo 0,5 mM IBMX,

inibidor de fosfodiesterase, por 20 minutos. Após o tempo de incubação foi adicionado

PAF 10

-9

M, PAF 10

-6

M e/ ou WEB 10

-6

M e mantidos por 2, 4, 6 e 12 horas em garrafas

de cultura em meio TAUP. A reação foi paralisada pela adição de tricloroacético 10%. As

amostras foram congeladas, descongeladas, adicionadas de

H-AMPc (20 nCi/ 50 µl) e

centrifugadas por 4000 rpm, por 10 minutos. O sedimento foi dissolvido em NaOH 1N para

dosagem de proteínas e sobrenadante foi eluído em colunas trocadoras de íons (Dowex

AG50W-X4). O AMPc foi isolado pela recuperação das amostras em cintilador líquido, de

acordo com o método descrito por Matsuzama & Nirenberg (1975). A concentração de

AMPc produzido foi determinado por dosagem enzimática contendo uma concentração de

AMPc padrão (200 nM/ ml),

H-AMPc (2 pmoles/ 20µl) e proteína cinase. A reação

ocorreu a 0°C por 100 minutos. Após esse sistema foi filtrado em membrana de éster-

celulose e contado em cintilador líquido, como descrito por Gilman (1970).

III.6. Efeito de PAF, dos moduladores de proteínas cinases e dos inibidores de

proteolíticos na diferenciação celular de T. cruzi

Os microrganismos crescidos em meio LIT, foram centrifugados a 4000 rpm por 10

minutos e lavados 2 vezes em tampão salina fosfato (PBS), pH 7,2 e incubados em meio

TAU por 2 horas. Após, as células foram cultivadas em meio quimicamente definido (meio

TAUP), na ausência de SFB, durante 6 dias a 28°C (Contreras et al., 1985), na presença de

PAF 10

-6

M combinadas com moduladores de proteínas cinases (dibutiril AMPc 1 mM,

H89 50 µM, BIS 10 nM, DRB 100 µM) (Gonzáles-Perdomo, Romero & Goldenberg, 1988;

Silva-Neto et al., 2002) e inibidores proteolíticos (antipaína 1 µg/ ml e 1,10 fenantrolina 1

µM) (Bonaldo et al., 1991). O efeito do PAF e dos moduladores na diferenciação de T.

cruzi foi determinado por esfregaços diários corados pelo corante de Giemsa. A

porcentagem de formas diferenciadas foi determinada contando pelo menos 200 parasitos

por preparação (Rodrigues et al., 1996).

III.7. Obtenção do extrato celular dos parasitos para determinação do perfil de

proteases

Amostras de T. cruzi foram incubadas por 6 horas em meio TAUP na presença ou

ausência de PAF 10

-6

M e/ ou WEB 2086 e/ ou moduladores de proteínas cinases (dibutiril

AMPc 1 mM, H89 50 µM, BIS 10 nM, DRB 100 µM). Após o tempo de incubação, as

amostras foram centrifugadas 4000 rpm por 10 minutos, ressuspendidas em PBS contendo

1% SDS e lisadas por agitação em vortex. As proteases foram evidenciadas por SDS-

PAGE a 10% contendo 0,1% de gelatina, como substrato co-polimerizado ao gel (Henssen

& Dowdle, 1980). Foram aplicados 2 x 10

parasitos/ slot. Ao término da corrida, os géis

foram incubados em 1% Triton X-100, por 1 hora, à temperatura ambiente, sob agitação.

Os géis foram então, lavados com água destilada e incubados por 48 horas, a 37°C em

0,5M tampão fosfato, pH 5,5, suplementado com 2 mM de ditiotreitol (DTT) ou em 0,2 M

de tampão glicina-NaOH, pH 10. Após a digestão enzimática, a revelação das bandas foi

feita por coloração do gel com Coomassie Brilliant Blue R-250 e, descoloração com

solução contendo 7% de metanol e 5% de ácido acético em água, à temperatura ambiente,

sob agitação, por aproximadamente 16 horas (Branquinha et al., 1996). Para análise

densitométrica das bandas de degradação foi utilizado o programa Scion Image.

III. 8. Efeito direto do PAF na atividade proteolítica

Para determinação da atividade proteolítica, após a corrida do gel SDS-PAGE-

gelatina, os géis foram incubados na presença ou na ausência dos inibidores 10 mM 1,10-

fenantrolina e 10 µM de E-64 e, também na presença ou ausência de PAF 10

-6

WEB2086 10

-6

M ou ambos, em 0,5M de tampão fosfato pH 5,5, suplementado com 2 mM

de DTT ou em 0,2 M de tampão glicina-NaOH, pH 10 por 48 horas, a 37°C.

III.9. Obtenção de conteúdo citoplasmático dos parasitos para o perfil de fosforilação

de proteínas

Amostras de T. cruzi foram incubadas por 6 horas em meio TAUP na presença ou

ausência de PAF 10

-6

M e/ ou moduladores de proteínas cinases (dibutiril AMPc 1 mM,

H89 50 µM, BIS 10 nM, DRB 100 µM). Após o tempo de incubação, as amostras foram

centrifugadas 4000 rpm por 10 minutos, ressuspendidas em tampão de lise (Tris-HCl 20

mM, NaCl 15 mM, ortovanadato de sódio 1 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1mM, NaF 10 mM,

azida sódica 0,02 g%, pH 8,0) acrescido de coquetel de inibidores de protease (Sigma). Os

parasitos foram congelados em nitrogênio líquido e a lise foi feita por ciclos de

congelamento e descongelamento em nitrogênio. As amostras foram centrifugadas, por 10

minutos a 10000 rpm. O sedimento foi descartado e o conteúdo citoplasmático de T. cruzi

foi usado para o gel. Em seguida foi feito o meio de reação que consistiu de tampão de

reação (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, MgCl

10 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM), extrato

celular de T. cruzi com uma concentração correspondente a 80 µg de proteínas/ µl e

mistura de ATP (ATP frio e ATP

- 5.0 x 10

cpm/ ml), esse meio foi incubado por 1 hora a

30°C. Foi realizado um SDS-PAGE a 10% (Laemmili, 1970). Depois, o gel foi corado,

seco e exposto a um filme de raios-X a -70°C (Fialho, Masuda & Silva-Neto, 1999).

III.10. Determinação dos níveis de cálcio intracelular

Parasitos foram cultivados por 6 dias em meio LIT contendo 10% SFB, lavados 2

vezes, por centrifugação em meio LIT, ressupendidos no próprio meio ausente de soro e

incubados por 12 horas, na presença ou ausência de PAF 10

-6

M. Após, os parasitos foram

lavados, por centrifugação e incubados por 3 horas em meio Tyrode (137 mM NaCl, 2.7

mM KCl, 12 mM NaHCO

, 0,36 mM NaH

, 0,53 mM MgCl

, 1,36 mM CaCl

e 5,5

mM glicose) contendo 5 µM fura-2/ AM à temperatura ambiente. O fura-2 não incorporado

foi retirado por centrifugação.

Para determinação dos níveis de cálcio foram utilizados 5x10

células/ml. A

dosagem foi feita no aparelho espectrofluorímetro (Jasco FP6300) com comprimento de

onda de excitação de 340 nm e de emissão 505 nm. Para determinar a saturação de Ca

foi

adicionado 50 µM digitonina.

III. 11. Dosagem de proteínas

As proteínas foram quantificadas de acordo com o método descrito por Lowry e

colaboradores (1951), utilizando a soro albumina bovina (BSA) como padrão.

III. 12. Análise estatística

Os resultados do efeito do PAF e de moduladores de proteínas cinases e proteases

na diferenciação celular de T. cruzi foram analisados estatisticamente pelo teste de análise

de variância (ANOVA). Valores de P < 0.05 foram considerados significativos.

Os asteristícos encontrados nos resultados referem-se: (*) significativamente

diferente do controle; (**) significativamente diferente em relação ao PAF ou (***)

significativamente diferente em relação ao controle e ao PAF.

IV. Resultados

IV.1. Localização do receptor para PAF

Vários trabalhos envolvendo os efeitos do PAF em células de mamíferos

demonstram que todos os efeitos desencadeados por PAF ocorrem através da sua ligação

ao seu receptor específico de membrana. Então, como primeiro objetivo procuramos

identificar um possível receptor na superfície das células de T. cruzi. Para tal, utilizamos a

técnica de imunofluorescência indireta na qual formas epimastigotas foram fixadas em

formaldeído 4% e incubadas frente a um anticorpo policlonal contra o receptor de PAF

produzido em camundongos. A Figura 10 mostra os resultados deste ensaio, onde

demonstramos células permeabilizadas (a-d) ou não (e, f) marcadas com IgG Alexa 546 (a,

c, e) e em contraste de fase (b, d, f). De acordo com resultado demonstrado na figura,

podemos sugerir que este anticorpo foi capaz de se ligar em toda a superfície do parasito,

incluindo o corpo celular (a, c). Parasitas permeabilizados apresentaram marcação no

interior das células, entretanto, células não permeabilizadas (e) também apresentaram

marcação.

Figura 10. Imunolocalização do receptor do PAF em T. cruzi. Imunofluorescência

para o receptor do PAF em contraste de fase (b, d e f). As figuras (a-d) mostram

formas epimastigotas permeabilizadas com 1% Triton X-100 e as figuras (e- f) são

formas não permeabilizadas. Barra = 5µm.

IV.2. Determinação dos níveis de AMPc intracelular de T. cruzi.

Para estudar que vias de sinalização celular estariam envolvidas no processo de

diferenciação celular desencadeada por PAF, a partir da sua ligação ao seu receptor de

membrana, investigamos os níveis de AMPc intracelulares produzido por T. cruzi durante

o processo de metaciclogênese, em presença deste agente.

Para este ensaio, os parasitos foram incubados com inibidor de fosfodiesterase,

IBMX 0,5 mM por 20 minutos em meio TAU. O estimulo de diferenciação foi feito por

incubação em meio pobre (meio TAUP), utilizando duas concentrações de PAF (PAF 10

-9

M e PAF 10

-6

M), por diferentes intervalos de tempo. Como mostrado na figura 11, PAF

-6

M foi capaz de aumentar, em aproximadamente 2 vezes, os níveis de AMPc

produzidos por T. cruzi, comparando com o sistema controle, após 6 horas de incubação.

Neste mesmo período de tempo, PAF 10

-9

M também foi capaz de aumenta a concentração

de AMPc celular, embora em 12 horas de incubação as células apresentaram concentrações

semelhante ao sistema controle. De maneira intrigante, incubações mais prolongadas, como

por 24 horas, PAF 10

-9

M causou um aumento de 4 vezes a concentração de AMPc, como

mostrado na Figura 12.

Figura 11. Concentração de AMPc intracelular produzida por T. cruzi. 5 x 10

parasitos/ ml foram incubados em intervalos de 2, 4, 6 e 12 horas na presença ou ausência

de PAF. Os símbolos correspondem: (●) controle, (●) PAF 10

-6

M e (●) PAF 10

-9

Figura 12. Porcentagem da atividade de AMPc intracelular produzido por T. cruzi. 5

x 10

parasitos/ ml foram incubados por 24 horas na presença ou ausência de PAF 10

-6

M e

PAF 10

-9

M. Os resultados foram obtidos pelas médias de pelo menos 3 experimentos

independentes. Os asteriscos (*) referem-se: significativamente diferente do controle

Atividade intracelular

de AMP cíclico (%)

100

200

300

400

500

Controle PAF 10

-6

PAF 10

-9

Atividade intracelular

de AMP cíclico (%)

100

200

300

400

500

Controle PAF 10

-6

PAF 10

-9

Tempo (horas)

2 4 6 12

pMoles de cAMP/mg ptn

500

1000

1500

2000

Tempo (horas)

2 4 6 12

pMoles de cAMP/mg ptn

500

1000

1500

2000

Estudos anteriores reportam que após 6 horas de incubação em meio TAUP, formas

epimastigotas se aderem ao frasco de cultura e, possivelmente, ao epitélio intestinal do

hospedeiro invertebrado, para iniciar a diferenciação celular (Bonaldo et al., 1988).

Curiosamente, observamos que neste mesmo período de tempo de incubação no meio

TAUP, PAF 10

-6

M foi capaz de dobrar o concentração de AMPc intracelular. Devido a

estes resultados, suspeitamos que eventos de sinalização induzindo a diferenciação celular

de T. cruzi poderiam estar ocorrendo durante esta etapa. Assim, resolvemos utilizar este

período de tempo de incubação para os outros experimentos subseqüentes.

Objetivando investigar se o aumento na concentração de AMPc ocorre por um

mecanismo de sinalização celular disparada pela ligação do PAF ao seu receptor de

membrana, incubamos os parasitos com WEB 2086 10

-6

M, um inibidor específico do

receptor do PAF, na ausência e/ou presença de PAF 10

-6

M, nos mesmos intervalos de

tempo utilizados anteriormente (Figura 13). Nossos resultados indicam, justamente, que o

efeito promovido pelo PAF ocorre em resposta à ligação desta molécula ao seu receptor

específico de membrana, uma vez que o tratamento dos parasitos com WEB 2086 foi capaz

de reverter totalmente o efeito causado por PAF.

Figura 13. Concentração de AMPc intracelular produzido por T. cruzi. 5 x 10

parasitos/ml foram incubados em intervalos de 2, 4, 6 e 12 horas na presença ou

ausência de 10

-6

M PAF, 10

-6

M WEB ou ambos. Os símbolos correspondem: (●)

controle, (●) PAF 10

-6

M, (●)WEB 10

-6

M e (●) PAF 10

-6

M + WEB 10

-6

Tempo (horas)

2 4 6 12

pMoles de cAMP/mg ptn

500

1000

1500

2000

Tempo (horas)

2 4 6 12

pMoles de cAMP/mg ptn

500

1000

1500

2000

IV.3. Efeito de AMPc e H89 na diferenciação celular induzida PAF em T. cruzi.

Para verificar o efeito do AMPc e a participação da proteína cinase A na

diferenciação celular promovida por PAF, foram utilizadas duas drogas que são

permeáveis às membranas celulares: o dibutiril-AMPc (ativador de PKA) e H89 (inibidor

de PKA). A Figura 14 mostra a porcentagem de formas diferenciadas (tripomastigostas

metacíclicos) de T. cruzi durante 6 dias de cultivo em meio TAUP na ausência (controle)

ou na presença de PAF 10

-6

M, dibutiril-AMPc 1 mM e/ou H89 50µM.

Como resultados, observamos que a adição de dibutiril-AMPc é capaz de estimular

a diferenciação celular, desde o primeiro dia de incubação, onde as células apresentam

30% de formas tripomastigotas metacíclicas, enquanto que parasitas controle apresentam

20% de formas tripomastigotas. Este aumento corresponde a 50% a mais de células

diferenciadas em presença de AMPc, logo no primeiro dia de incubação. Parasitos

incubados com AMPc + H89 ou só com H89 apresentaram 35% de formas tripomastigotas,

o que representa um estímulo de aproximadamente 75% em relação ao controle.

Provavelmente, a inibição de PKA deve favorecer uma outra via de sinalização que

estimula a diferenciação celular de T. cruzi. De maneira interessante, a combinação de PAF

com H89 mostra um estímulo da diferenciação, com 52% de formas tripomastigotas, a

partir do 2° dia de cultivo; já no 4° e 5° dias de incubação, a adição de H89 não altera o

efeito promovido por PAF. O sistema contendo PAF mais AMPc e mais H89 não

apresentou alteração na diferenciação promovida por PAF, uma vez que este sistema

apresentou 48% de formas tripomastigotas no 2° dia de cultivo.

Por esses resultados, observamos que a incubação dos parasitos com as drogas foi

capaz de modular a diferenciação de T. cruzi. Entretanto, após o 3° dia de cultivo, a

diferenciação é observada, sem que haja diferenças expressivas quanto ao tratamento

usado.

Figura 14. Porcentagem de formas diferenciadas (tripomastigostas metacíclicos) de T. cruzi. Os

parasitos foram cultivados por 6 dias em meio TAUP na ausência (controle) e/ ou na presença das

seguintes drogas: PAF 10

-6

M, H89 50 µM e AMPc 1 mM. Os asterísticos (*) referem-se:

significativamente diferente do controle.

IV.4. Participação de PKC e CK2 na diferenciação celular induzida por PAF em

T. cruzi.

Como demonstrado no resultado anterior, a inibição da PKA induz um aumento na

diferenciação celular de T. cruzi. Então, procuramos investigar a participação da PKC e da

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 1

Controle PAFcAMP

PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 3

Controle PAFcAMP PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

Tripomastigotas (%)

100

Dia 4

Controle PAFcAMP PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

Tripomastigotas (%)

100

Dia 5

Controle PAFcAMP PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

Tripomastigotas (%)

100

Dia 6

Controle PAFcAMP PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 2

Controle PAFcAMP PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 1

Controle PAFcAMP

PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 3

Controle PAFcAMP PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

Tripomastigotas (%)

100

Dia 4

Controle PAFcAMP PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

Tripomastigotas (%)

100

Dia 5

Controle PAFcAMP PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

Tripomastigotas (%)

100

Dia 6

Controle PAFcAMP PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 2

Controle PAFcAMP PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 1

Controle PAFcAMP

PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 3

Controle PAFcAMP PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

Tripomastigotas (%)

100

Dia 4

Controle PAFcAMP PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

Tripomastigotas (%)

100

Dia 5

Controle PAFcAMP PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

Tripomastigotas (%)

100

Dia 6

Controle PAFcAMP PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 2

Controle PAFcAMP PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 1

Controle PAFcAMP

PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 3

Controle PAFcAMP PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

Tripomastigotas (%)

100

Dia 4

Controle PAFcAMP PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

Tripomastigotas (%)

100

Dia 5

Controle PAFcAMP PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

Tripomastigotas (%)

100

Dia 6

Controle PAFcAMP PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 2

Controle PAFcAMP PAF

cAMP

H89 cAMP

H89

PAF

H89

PAF

cAMP

H89

CK2 na diferenciação estimulada por PAF. Nesses experimentos, utilizamos o inibidor de

PKC (BIS I) e dois inibidores da CK2 (DRB e TBB), na ausência ou na presença de PAF.

A figura 15 mostra a porcentagem de formas diferenciadas de T. cruzi na ausência

(controle) ou na presença de BIS I a 10 nM, DRB a 100 µM, TBB a 20 nM e/ou PAF a 10

-6

Figura 15. Porcentagem de formas diferenciadas (tripomastigostas metacíclicos) de T. cruzi. Os

parasitos foram cultivados por 6 dias em meio TAUP na ausência (controle) e/ ou na presença das

seguintes drogas: BIS I a10 nM, DRB a 100 µM, TBB a 20 nM e/ou PAF a 10

-6

M. Os asterísticos

referem-se: * significativamente diferente do controle; ** significativamente diferente em relação ao

PAF; *** significativamente diferente em relação ao controle e ao PAF.

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 1

Controle PAFBIS PAF

BIS

TBB DRB PAF

TBB

PAF

DRB

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 2

Controle PAFBIS PAF

BIS

TBB DRB PAF

TBB

PAF

DRB

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 3

Controle PAFBIS PAF

BIS

TBB DRB PAF

TBB

PAF

DRB

Tripomastigotas (%)

100

Dia 4

Controle PAFBIS PAF

BIS

TBB DRB PAF

TBB

PAF

DRB

Tripomastigotas (%)

100

Dia 5

Controle PAFBIS PAF

BIS

TBB DRB PAF

TBB

PAF

DRB

Tripomastigotas (%)

100

Dia 6

Controle PAFBIS PAF

BIS

TBB DRB PAF

TBB

PAF

DRB

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 1

Controle PAFBIS PAF

BIS

TBB DRB PAF

TBB

PAF

DRB

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 2

Controle PAFBIS PAF

BIS

TBB DRB PAF

TBB

PAF

DRB

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 3

Controle PAFBIS PAF

BIS

TBB DRB PAF

TBB

PAF

DRB

Tripomastigotas (%)

100

Dia 4

Controle PAFBIS PAF

BIS

TBB DRB PAF

TBB

PAF

DRB

Tripomastigotas (%)

100

Dia 5

Controle PAFBIS PAF

BIS

TBB DRB PAF

TBB

PAF

DRB

Tripomastigotas (%)

100

Dia 6

Controle PAFBIS PAF

BIS

TBB DRB PAF

TBB

PAF

DRB

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 1

Controle PAFBIS PAF

BIS

TBB DRB PAF

TBB

PAF

DRB

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 2

Controle PAFBIS PAF

BIS

TBB DRB PAF

TBB

PAF

DRB

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 3

Controle PAFBIS PAF

BIS

TBB DRB PAF

TBB

PAF

DRB

Tripomastigotas (%)

100

Dia 4

Controle PAFBIS PAF

BIS

TBB DRB PAF

TBB

PAF

DRB

Tripomastigotas (%)

100

Dia 5

Controle PAFBIS PAF

BIS

TBB DRB PAF

TBB

PAF

DRB

Tripomastigotas (%)

100

Dia 6

Controle PAFBIS PAF

BIS

TBB DRB PAF

TBB

PAF

DRB

Observamos que a inibição da PKC, por BIS, ou da CK2, por TBB ou DRB, é

capaz de inibir a diferenciação celular de T. cruzi, de formas epimastigotas para

tripomastigotas metacíclicos, em meio TAUP. A partir do primeiro dia de cultivo, parasitos

cultivados em meio contendo BIS apresentaram 15% de formas tripomastigotas, enquanto

os cultivados em TBB e DRB apresentavam 12% e 14% de forma tripomastigotas, o que

representa um decréscimo de aproximadamente 25% em relação ao controle. A

porcentagem de formas tripomastigotas presentes em meio contendo PAF foi de 35%,

embora esse estímulo tenha sido revertido quando PAF foi adicionado em combinação com

BIS, TBB ou DRB. Na presença conjunta destes agentes com PAF, a diferenciação foi de

15%, 18% e 16%, respectivamente. Isso corresponde um decréscimo de 57% (PAF + BIS),

51% (PAF + TBB) e 54% (PAF + DRB) nos efeitos desencadeados por PAF. O conjunto

destes resultados sugere que a via de sinalização envolvendo PKC e CK2 é fundamental

para a diferenciação de T. cruzi, de formas epimastigotas para tripomastigotas metacíclicas

em meio TAUP, tanto na presença, quanto na ausência de PAF.

IV.5. Caracterização das proteases moduladas por PAF

Bonaldo e colaboradores (1991) discutiram a expressão de proteases de T. cruzi

durante o processo de metaciclogênese. Especificamente, as duas proteases diretamente

relacionadas a este processo são uma metaloprotease, possivelmente zinco dependente (de

65 kDa), uma vez que sua atividade foi totalmente inibida pela 1,10- fenantrolina em pH

10, e a outra foi classificada como uma cisteína protease (de 40 kDa), que apresenta total

inibição por E-64 em pH 5.5.

A Figura 16 mostra dados que confirmam a presença das supracitadas proteases,

nas condições utilizadas neste trabalho.

IV.6. Perfil de expressão de proteases moduladas por PAF

Com o intuito de verificar se PAF era capaz de modular a expressão dessas

proteases durante a metaciclogênese (Figura 17A) ou durante a proliferação celular

(Figura 17D), induzimos formas epimastigotas a entrarem em processo de diferenciação,

através da incubação das células em meio TAUP por 6 horas a 28°C ou incubamos os

parasitos durante 6 dias em meio LIT com 10% de soro (para analisar o crescimento

celular), na presença ou ausência de PAF 10

-6

M, WEB 2086 10

-6

M ou ambos.

Figura 16. Determinação das classes de proteases em T. cruzi. Os slots dos géis

contendo 2 x 10

parasitos/ slot foram incubados a 37°C por 48 horas em tampão 50 mM

fosfato de sódio, pH 5,5, suplementado com 2 mM DTT na presença de 10 µM E-64 ou

em tampão 50 mM glicina-NaOH, pH 10 na presença de 1 mM 1,10-fenantrolina (Phe).

As proteases foram reveladas pela presença das áreas descoradas indicativas de

degradação da gelatina. A atividade inibitória foi observada comparando-se com o

sistema controle (C).

A expressão das proteases, quando submetidas ao tratamento com PAF 10

-6

WEB 2086 10

-6

M ou ambos em meio TAUP, pobre em nutrientes, é observado na Figura

17A. Como resultados, demonstramos que PAF é capaz de reduzir a atividade das duas

proteases, com massas moleculares de aproximadamente 65 e 40 kDa. Por análise

densitométrica das bandas, obtivemos uma atividade de 40% para a protease de 65 kDa e

60% para a protease de 40 kDa, em relação ao controle. WEB 2086 foi capaz de estimular

a atividade de ambas as enzimas, em relação ao controle, que apresentaram atividades de

160% (65 kDa) e 105% (40 kDa), respectivamente. Com o tratamento com ambas as

C E-64 C Phe

pH 5,5 pH 10

65 kDa

40 kDa

C E-64 C Phe

pH 5,5 pH 10

65 kDa

40 kDa

C E-64 C Phe

pH 5,5 pH 10

65 kDa

40 kDa

drogas, a expressão destas proteases foi de 30% (65 kDa ) e 30% (40 kDa) em relação ao

controle.

Já nos sistemas onde o parasito foi incubado em meio LIT, rico em nutrientes

(Figura 17D), há um estímulo na expressão dessas proteases em presença de PAF. Nestes

sistemas, a atividade da protease de 65 kDa é de 180% e na protease de 40 kDa é de 125%,

em relação ao controle. Nesse meio de cultivo, WEB induziu um efeito inibitório de ambas

as atividades proteásicas, apresentando 80% da atividade da protease de 65 kDa e 50% da

atividade de 40 kDa, em relação ao controle. Em meio contendo PAF com WEB, a

expressão da protease de 65 kDa foi quase totalmente inibida, sua atividade foi de 10%,

enquanto a enzima de 40 kDa teve uma expressão de 25%, em relação ao controle. Neste

caso, WEB 2086 foi capaz de reverter totalmente o efeito produzido por PAF.

Figura 17 (A) SDS-PAGE-Gelatina mostrando a expressão de enzimas proteolíticas detectadas em parasitos de

T. cruzi cultivados por 6 horas em meio TAUP (A) ou em meio LIT contendo 10% de soro (D), na ausência

(controle) ou na presença de PAF 10

-6

M, WEB 2086 10

-6

M ou PAF + WEB 2086, respectivamente. O gel

contendo extratos de células foi incubado a 37°C por 48 horas em tampão 50 mM fosfato de sódio, pH 5.5,

suplementado com 2 mM DTT. Em (A e D) os números à esquerda referem-se a massa molecular das

proteases. Em (B e E) Análise densitométrica da protease de 65 kDa. Em (C e F) Análise densitométrica da

Controle PAF WEB WEB

PAF

65 kDa

40 kDa

Controle PAF WEB WEB

PAF

65 kDa

40 kDa

65 kDa

40 kDa

Densitometria (%)

120

160

200

65 kDa

ControlePAF WEB

PAF

WEB

65 kDa

40 kDa

Densitometria (%)

100

125

150

40 kDa

Controle

PAF WEB

PAF

WEB

65 kDa

40 kDa

Densitometria (%)

120

160

200

65 kDa

Controle

PAF

WEB

PAF

WEB

65 kDa

40 kDa

Densitometria (%)

105

40 kDa

Controle

PAF

WEB

PAF

WEB

Controle PAF WEB WEB

PAF

65 kDa

40 kDa

Controle PAF WEB WEB

PAF

65 kDa

40 kDa

65 kDa

40 kDa

Densitometria (%)

120

160

200

65 kDa

ControlePAF WEB

PAF

WEB

65 kDa

40 kDa

Densitometria (%)

100

125

150

40 kDa

Controle

PAF WEB

PAF

WEB

65 kDa

40 kDa

Densitometria (%)

120

160

200

65 kDa

Controle

PAF

WEB

PAF

WEB

65 kDa

40 kDa

Densitometria (%)

105

40 kDa

Controle

PAF

WEB

PAF

WEB

Controle PAF WEB WEB

PAF

65 kDa

40 kDa

Controle PAF WEB WEB

PAF

65 kDa

40 kDa

65 kDa

40 kDa

Densitometria (%)

120

160

200

65 kDa

ControlePAF WEB

PAF

WEB

65 kDa

40 kDa

Densitometria (%)

100

125

150

40 kDa

Controle

PAF WEB

PAF

WEB

65 kDa

40 kDa

Densitometria (%)

120

160

200

65 kDa

Controle

PAF

WEB

PAF

WEB

65 kDa

40 kDa

Densitometria (%)

105

40 kDa

Controle

PAF

WEB

PAF

WEB

protease de 40 kDa. Os resultados de densitometria foram feitos utilizando o programa Scion Image. Os

asterísticos referem-se: * significativamente diferente do controle; ** significativamente diferente em relação

ao PAF; *** significativamente diferente em relação ao controle e ao PAF.

IV.7. Análise da atividade proteolítica na presença de PAF e WEB 2086

Para observar se o efeito causado por PAF está relacionado a uma cascata de

sinalização, a partir da sua ligação ao seu receptor de membrana, incubamos os slots dos

géis contendo extratos do parasito em tampão fosfato de sódio, pH 5.5, suplementado com

2 mM de DTT, na presença de PAF 10

-6

M, WEB 2086 10

-6

M ou ambos, por 48 horas a

37°C (Figura 18). Como resultado, observamos que a incubação de extratos celulares com

PAF ou WEB não é capaz de alterar a atividade das proteases em T. cruzi. Estes resultados

corroboram com os descritos anteriormente, que sugerem que os eventos desencadeados

por PAF necessitam da presença de células vivas e de receptor de membrana, associado a

cascatas de sinalização intracelular.

Figura 18. SDS-PAGE-Gelatina mostra a atividade proteolítica de T. cruzi

cultivado por 6 dias em meio LIT. Os slots dos géis contendo 2 x 10

parasitos/ slot

foram incubados a 37°C por 48 horas em tampão fosfato de sódio, pH 5,5,

suplementado com 2 mM DTT na ausência (C) ou na presença de PAF 10

-6

M (P),

WEB 2086 10

-6

M (W) ou ambos (PW). As proteases do gel foram reveladas pela

presença de áreas descoradas indicativas de degradação da gelatina. Os números à

esquerda referem-se a massa molecular das proteases.

C P W PW

65 kDa

40 kDa

C P W PW

65 kDa

40 kDa

IV. 8. Diferenciação Celular induzida por PAF na presença de inibidores de proteases

Ainda investigando o envolvimento do PAF na expressão de proteases durante a

metaciclogênese, incubamos T. cruzi em meio indutor de diferenciação (meio TAUP)

durante 6 dias na presença de PAF 10

-6

M e/ ou inibidores de proteases permeáveis as

células, sem afetar a viabilidade das células, como o inibidor de metaloprotease 1,10-

fenantrolina na concentração de 1 µM e antipaína 1 µg/ mg como inibidor de cisteína

protease, como mostrado no Figura 19.

Figura 19. Porcentagem de formas diferenciadas (tripomastigostas metacíclicos) de

T. cruzi. Formas epimastigotas foram cultivados por 3 dias em meio TAUP na ausência

(controle) e/ou na presença das seguintes drogas: PAF a 10

-6

M, 1,10- fenantrolina a 1

µM e antipaína a 1µg/ ml. Os asterísticos referem-se: * significativamente diferente do

controle; ** significativamente diferente em relação ao PAF; *** significativamente

diferente em relação ao controle e ao PAF.

A figura 19 mostra a diferenciação celular após 3 dias de cultivo em meio TAUP.

O tratamento com ambas as drogas é capaz de inibir a diferenciação celular de T. cruzi,

onde verificamos 30,7% de tripomastigotas metacíclicos com o tratamento com 1 µM 1,10-

fenantrolina e 16% de tripomastigotas metacíclicos com o tratamento com 1 µg/ml de

antipaína. Parasitos incubados em meio contendo PAF em combinação com 1,10-

fenantrolina ou antipaína tiveram o efeito do PAF revertido na presença destes agentes,

produzindo de 43,65% e 18% de formas tripomastigotas, respectivamente. Curiosamente, o

tratamento com antipaína é capaz de reverter totalmente o efeito desencadeado por PAF.

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 3

Controle PAFPhen PAF

Phen

Anti PAF

Anti

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 3

Controle PAFPhen PAF

Phen

Anti PAF

Anti

IV. 9. Expressão de Proteases na Sinalização Celular desencadeada por PAF

Baseados nos resultados anteriores objetivamos, então, analisar se a expressão de

proteases estaria relacionada com as vias de sinalização desencadeadas por PAF. Para tal,

incubamos os parasitos por 6 horas em meio TAUP, na ausência ou na presença de PAF a

-6

M e/ou os moduladores das vias de sinalização celular (AMPc, H89, BIS e DRB).

a) Efeito do AMPc e H89 na expressão de proteases moduladas por PAF

A Figura 20 mostra a modulação da expressão das proteases de parasitos incubados

na presença ou ausência de PAF a 10

-6

M, AMPc a 1 mM, H89 a 50 µM ou com a

combinação desta substâncias.

Figura 20. SDS-PAGE-Gelatina mostrando a expressão de enzimas proteolíticas detectadas em T. cruzi

cultivada por 6 horas em meio TAUP, na ausência ou na presença de 10

-6

M PAF, 1mM AMPc, 50 µM

H89. O gel contendo extratos de células foi incubado a 37°C por 48 horas em tampão 50 mM fosfato de

sódio, pH 5,5, suplementado com 2 mM DTT. Em (B e C) Análise densitométrica da protease de 65 kDa.

(B) e de 40 kDa (C). Em (A) Os números à esquerda referem-se a massa molecular das proteases. Os

resultados de densitometria foram feitos utilizando o programa Scion Image. Os asterísticos referem-se: *

significativamente diferente do controle.

Formas epimastigotas de T. cruzi incubadas na presença de dibutiril-AMPc tiveram

um aumento na expressão de suas proteases; com este agente, as atividades destas enzimas

foram de 180% (65 kDa) e 160% (40 kDa), quando comparadas ao controle. Em presença

do inibidor de PKA, H89, a expressão de ambas as proteases também foi estimulada, sendo

65 kDa

40 kDa

Densitometria (%)

120

160

200

240

280

65 kDa

Controle PAF PAF

H89

PAF

cAMP

H89

cAMP H89 cAMP

H89

PAF

cAMP

Controle cAMP H89 cAMP PAF PAF PAF PAF

H89 cAMP H89 cAMP

H89

65 kDa

40 kDa

65 kDa

40 kDa

Densitometria (%)

120

150

180

40 kDa

Controle PAF PAF

H89

PAF

cAMP

H89

cAMP H89 cAMP

H89

PAF

cAMP

65 kDa

40 kDa

Densitometria (%)

120

160

200

240

280

65 kDa

Controle PAF PAF

H89

PAF

cAMP

H89

cAMP H89 cAMP

H89

PAF

cAMP

Controle cAMP H89 cAMP PAF PAF PAF PAF

H89 cAMP H89 cAMP

H89

65 kDa

40 kDa

65 kDa

40 kDa

Densitometria (%)

120

150

180

40 kDa

Controle PAF PAF

H89

PAF

cAMP

H89

cAMP H89 cAMP

H89

PAF

cAMP

65 kDa

40 kDa

Densitometria (%)

120

160

200

240

280

65 kDa

Controle PAF PAF

H89

PAF

cAMP

H89

cAMP H89 cAMP

H89

PAF

cAMP

Controle cAMP H89 cAMP PAF PAF PAF PAF

H89 cAMP H89 cAMP

H89

65 kDa

40 kDa

65 kDa

40 kDa

Densitometria (%)

120

150

180

40 kDa

Controle PAF PAF

H89

PAF

cAMP

H89

cAMP H89 cAMP

H89

PAF

cAMP

de 230% para a de 65 kDa e de 110% para a de 40 kDa, em relação ao controle. Em

sistemas contendo AMPc mais H89, a expressão das proteases foi de 200% (65 kDa) e

120% (40 kDa), em relação ao controle. Quando do tratamento dos parasitos com PAF

mais AMPc, PAF foi capaz de reverter o efeito produzido pelo AMPc na expressão de

proteases de 60 kDa (60%, em relação ao controle). Já a cisteína protease (40 kDa) teve

sua expressão aumentada em combinação a ambos os agentes, com expressão de 120% em

relação ao controle. Entretanto, a expressão destas duas enzimas na presença de PAF foi de

80% (65 kDa) e 70% (40 kDa), em relação ao controle. No sistema PAF mais H89, as

atividades destas duas proteases foram de 40% (65 kDa) e 90% (40 kDa), em relação ao

controle. Parasitos incubados em meio contendo PAF mais AMPc e H89, a metaloprotease

(65 kDa) apresentou uma expressão de 120%, em relação ao controle e a cisteína protease

(40 kDa) apresentou uma expressão igual ao controle. Curiosamente, estas proteases

tiveram o aumento de suas atividades sempre revertido na presença do PAF.

b) Efeito do BIS e DRB na expressão de proteases moduladas por PAF

O envolvimento de PKC e CK2 na expressão de proteases foi investigado na

Figura 21. A incubação de formas epimastigotas por 6 horas em meio TAUP em presença

dos inibidores de PKC (BIS) ou CK2 (DRB) foi capaz inibir a expressão das proteases,

como mostrado na figura abaixo (Figura 21).

Verificamos em meio contendo BIS ou DRB, que a expressão da metaloprotease

(65 kDa) foi de 60% e 50%, respectivamente (Figura 21B). Observamos que em meio

TAUP, em presença de PAF essa enzima é pouco expressa (10%). E em meio contendo

PAF em adição a BIS ou DRB sua expressão foi de 20%.

As cisteínas proteases também têm sua expressão modulada em presença de BIS e

DRB. O tratamento dos parasitos com BIS, na concentração de 10 nM, foi capaz de inibir a

expressão desta protease, em 20% (Figura 21C). O mesmo foi observado com DRB

(100µM), onde sua expressão em presença deste agente foi de 75% em relação ao controle.

Em presença do PAF, a expressão desta enzima foi de 50% e em sistemas onde PAF foi

combinado a BIS ou PAF foi combinado a DRB, apresentam expressão de 70% e 60%,

respectivamente.

Figura 21. (A) SDS-PAGE-Gelatina mostrando a expressão de enzimas proteolíticas detectadas em

parasitos de T. cruzi, cultivados por 6 horas em meio TAUP, na ausência (controle) ou na presença de

PAF a 10

-6

M e/ou inibidores de proteínas cinases, BIS (inibidor de PKC) e DRB (inibidor de CK2). O

gel contendo extratos de células foi incubado a 37°C por 48 horas em tampão fosfato de sódio a 50 mM,

pH 5,5, suplementado com DTT a 2 mM. As proteases foram reveladas pela presença das áreas

descoradas indicativas de degradação da gelatina. Em (B e C) Análise densitométrica da protease de 65

kDa. (B) e de 40 kDa (C). Os números à esquerda referem-se a massa molecular das proteases. Os

resultados de densitometria foram feitos utilizando o programa Scion Image. Os asterísticos referem-se:

* significativamente diferente do controle.

Controle BIS DRB PAF PAF PAF

BIS DRB

65 kDa

40 kDa

65 kDa

40 kDa

Densitometria (%)

100

110

40 kDa

Controle PAFBIS PAF

BIS

DRB PAF

DRB

65 kDa

40 kDa

Densitometria (%)

100

65 kDa

Controle PAFBIS PAF

BIS

DRB PAF

DRB

Controle BIS DRB PAF PAF PAF

BIS DRB

65 kDa

40 kDa

65 kDa

40 kDa

65 kDa

40 kDa

Densitometria (%)

100

110

40 kDa

Controle PAFBIS PAF

BIS

DRB PAF

DRB

65 kDa

40 kDa

Densitometria (%)

100

65 kDa

Controle PAFBIS PAF

BIS

DRB PAF

DRB

IV. 10. Perfis de expressão e fosforilação de proteínas induzidas por PAF na presença

de AMPc e H89

No intuito de verificar as possíveis proteínas fosforiladas durante a sinalização

celular disparada por PAF via AMPc, incubamos os parasitos por 6 horas em meio TAUP,

na ausência ou presença de PAF, AMPc, H89 ou ambos. Após o tratamento, extraímos as

proteínas do conteúdo citoplasmático e incubamos este extrato com

ATP por 1 hora a

30°C.

A Figura 22 mostra o gel com a expressão de proteínas (A) e sua radioautografia

(B). Embora nenhuma diferença significativa na expressão de proteínas seja observada

com os tratamentos submetidos, observamos maiores níveis de fosforilação em proteínas

oriundas de parasitos tratados com PAF, em relação ao controle (como indicado nas setas

pretas). Estas proteínas apresentam massas moleculares aproximadas de 60, 50, 35, 25 e 10

kDa. A incubação dos parasitos com AMPc foi capaz de estimular a fosforilação de uma

proteína de 35 kDa, enquanto que o tratamento com H89 estimulou a fosforilação de três

proteínas de 35, 25 e 10 kDa. Na combinação de AMPc mais H89, o AMPc reverteu o

efeito estimulatório de fosforilação de proteínas de 35, 25 e 10 kDa, além de inibir a

fosforilação de outras proteínas de 100, 60, 50, 20 e 15 kDa. Com exceção de uma proteína

de 60 kDa, que teve seu nível de fosforilação aumentado na presença de PAF mais AMPc,

a adição de AMPc ou AMPc mais H89 ao sistema contendo PAF foi capaz de reverter a

fosforilação estimulada pelo PAF, em proteínas de 50, 25, 20 e 10 kDa, respectivamente

(como indicado por setas vermelhas).

Figura 22. Perfis de expressão e de fosforilação de proteínas de T. cruzi na ausência ou presença de PAF

e/ou AMPc e H89. Os parasitos foram cultivados em meio TAUP por 6 horas, na ausência ou presença de PAF

-6

M e tratados ou não com AMPc (1 mM) e H89 (50 µM). Após o tratamento, o extrato protéico contendo 80

µg de proteínas foi incubado em meio de reação (250 mM de Tris-HCl pH 7,5; 750 mM de NaCl; 5 mM de

EDTA; 5 mM de EGTA; 62,5 mM de MgCl2) contendo

ATP (5x 10

cpm/ml) a 30°C por 1 hora. (A) Gel de

SDS-PAGE contendo o extrato protéico de T. cruzi. (B) Radioautografia deste gel. Os números à esquerda

referem-se às massas moleculares das proteínas. As setas pretas indicam aumento da fosforilação e as setas

vermelhas, redução da fosforilação.

IV.11. Perfil de expressão e fosforilação de proteínas induzidas por PAF na presença

de BIS e DRB

Objetivando avaliar se a diferenciação celular estimulada por PAF envolve a

fosforilação de proteínas, através de ativação das proteínas PKC e CK2, observamos o

perfil de fosforilação de parasitos tratados com 10 mM BIS e 100 µM DRB na presença ou

ausência de PAF (Figura 23). Por este método, visualizamos que o tratamento com BIS,

C cAMPH89 cAMP PAF PAF PAF PAF

H89 cAMPH89 cAMP

H89

C cAMPH89 cAMP PAF PAF PAF PAF

H89 cAMPH89 cAMP

H89

(B)

150

120

100

(A)

C cAMPH89 cAMP PAF PAF PAF PAF

H89 cAMPH89 cAMP

H89

C cAMPH89 cAMP PAF PAF PAF PAF

H89 cAMPH89 cAMP

H89

C cAMPH89 cAMP PAF PAF PAF PAF

H89 cAMPH89 cAMP

H89

C cAMPH89 cAMP PAF PAF PAF PAF

H89 cAMPH89 cAMP

H89

(B)

150

120

100

(A)

150

120

100

150

120

100

(A)

DRB e PAF foram capazes de modular a fosforilação de diversas proteínas (representado

por setas pretas). As proteínas que apresentaram um estímulo de sua fosforilação com o

tratamento com BIS apresentam massas moleculares aparentes de 50, 40, 25 e 10 kDa.

DRB foi capaz de estimular a fosforilação de 8 proteínas de massas moleculares de 100,

70, 50, 40, 33, 25, 15 e 10 kDa. O tratamento com PAF induziu o estimulo de fosforilação

de proteínas com peso molecular de 105, 100, 70, 50, 40, 33, 25, 15, 10 kDa. Em sistemas

contendo PAF mais BIS, este agente reverteu o efeito promovido por PAF, inibindo a

foção de proteínas de massa molecular aproximada de 105, 100, 70, 40, 33, 15, 10 kDa

(como mostrado com setas vermelhas). Quando DRB foi adicionado ao sistema contendo

PAF, quatro proteínas tiveram sua fosforilação reduzida (105, 33, 25 e 10 kDa, como

mostrado na Figura 23).

Figura 23. Perfil de fosforilação de proteínas de T. cruzi na ausência ou presença de PAF e/ou BIS ou

DRB. Os parasitos foram cultivados em meio TAUP por 6 horas, na ausência ou presença de PAF 10-6 M, e

tratados ou não com BIS (10 nM) e DRB (100 µM). Após o tratamento, o extrato protéico contendo 80 µg de

proteínas foi incubado em meio de reação (250 mM de Tris-HCl pH 7,5; 750 mM de NaCl; 5 mM de EDTA;

5 mM de EGTA; 62,5 mM de MgCl2) contendo

ATP (5x 10

cpm/ml) a 30°C por 1 hora. (A) Gel de SDS-

C BIS DRB PAF PAF PAF

+ BIS +DRB

C BIS DRB PAF PAF PAF

+ BIS + DRB

100

150

120

(A) (B)

C BIS DRB PAF PAF PAF

+ BIS +DRB

C BIS DRB PAF PAF PAF

+ BIS +DRB

C BIS DRB PAF PAF PAF

+ BIS + DRB

100

150

120

(A) (B)

PAGE contendo o extrato protéico de T. cruzi. (B) Radioautografia deste gel. Os números à esquerda

referem-se às massas moleculares das proteínas. As setas pretas indicam aumento da fosforilação e as setas

vermelhas, redução da fosforilação.

IV.12. Determinação dos níveis intracelulares de cálcio induzidos por PAF

Para investigar se os níveis de cálcio intracelulares eram afetados com o tratamento

com PAF, incubamos os parasitos em presença de PAF 10

-6

M em meio LIT sem soro por 6

ou 12 horas (Figura 24). As possíveis alterações na concentração de cálcio intracelular

foram visualizadas pela incubação dos parasitos com fura-2 por 3 horas.

Verificamos que tanto células controle como aquelas tratadas com PAF

apresentavam a mesma intensidade de fluorescência emitida, demonstrando que o cálcio

presente no meio extracelular não foi alterado com o tratamento. A permeabilização das

células pela adição de 50 µM de digitonina demonstrou que 300s após a adição de

digitonina as células controle atingiram 100% de elevação da intensidade de fluorescência

por cálcio. Parasitos incubados por 6 horas em LIT, na presença de PAF, quando

permeabilizados tiveram uma elevação mais lenta. Após 350 segundos, eles atingiram 90%

de liberação de cálcio, atingindo a estabilidade de forma semelhante ao que ocorreu com o

sistema controle. A adição de digitonina em parasitos incubados com PAF por 12 horas

permitiu gerar uma elevação de fluorescência máxima de 70%, após 350 segundos da sua

adição (Figura 24).

Figura 24. Determinação dos níveis intracelulares de cálcio de T. cruzi. Parasitos foram

cultivados em meio LIT sem soro, na ausência (controle) ou na presença de PAF 10

-6

M, por 6 e

12 horas, incubados em tampão Tyrode (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO

, 0,36 mM

NaH

, 0,53 mM MgCl

, 1,36 mM CaCl

e 5,5 mM glicose) contendo 5 µM de Fura-2.

VI.13. Sequência da cascata de sinalização induzida por PAF em T. cruzi

(Combinação de inibidores de proteína cinases)

Para verificar uma possível seqüência nas vias de sinalização durante a

diferenciação de T. cruzi, utilizamos a combinação de inibidores das proteínas cinases A, C

e CK2. Para esses experimentos, incubamos os parasitos por 1 hora com o inibidor a ser

testado e após esse período os parasitos foram centrifugados e lavados com PBS por 10

minutos a 4000 rpm e ressuspendidos em meio TAUP contendo um outro inibidor na

presença ou não de PAF, durante 6 dias a 28° C.

a) Efeito do H89 na diferenciação induzida por PAF em T. cruzi

A Figura 25 mostra a porcentagem de formas diferenciadas de T. cruzi quando os

parasitos foram submetidos ao tratamento prévio com H89 (50 µM) por 1 hora e após,

colocados em meio contendo a combinação de outros inibidores na presença ou não de

PAF 10

-6

M por 72 horas. Observamos que parasitos cultivados em presença de H89

apresentam 60% de formas diferenciadas de T. cruzi, porém esses efeitos são revertidos

quando H89 é combinado com BIS ou DRB, estes voltam a apresentar percentagem de

diferenciação semelhante ao sistema controle, 38% e 40% de formas tripomastigotas,

respectivamente. A combinação de H89 + PAF, H89 + BIS + PAF e H89 + DRB+ PAF são

Tempo (s)

0 200 300 400 500 600

Intensidade de Fluorescência

100

120

Controle

PAF (6 hrs)

PAF (12hrs)

Digitonina

Tempo (s)

0 200 300 400 500 600

Intensidade de Fluorescência

100

120

Controle

PAF (6 hrs)

PAF (12hrs)

Digitonina

Tempo (s)

0 200 300 400 500 600

Intensidade de Fluorescência

100

120

Controle

PAF (6 hrs)

PAF (12hrs)

Digitonina

capazes de reverter a ação do PAF. Nesses sistemas, a diferenciação foi de 40%, 40% e

42%, respectivamente. Enquanto, parasitos cultivados em meio contendo PAF tiveram

58% de formas tripomastigotas.

Figura 25. Porcentagem de formas diferenciadas (tripomastigostas metacíclicos) de T. cruzi

cultivados por 72 horas em meio TAUP. Os parasitos foram incubados por 1 hora na presença

de H89 (50 µM) sendo posteriormente, lavados, centrifugados e incubados em meio “fresco” na

ausência (controle) e/ ou na presença das seguintes drogas: PAF 10

-6

M, H89 50 µM e DRB 100

µM. Os asterísticos referem-se: * significativamente diferente do controle.

b) Efeito do BIS na diferenciação induzida por PAF em T. cruzi

A porcentagem de formas diferenciadas de T. cruzi quando os parasitos são

submetidos ao tratamento prévio com BIS (10 nM) por 1 hora e depois colocados em meio

contendo a combinação de inibidores de PKA ou CK2, na presença ou ausência de PAF

por 72 horas é observada na Figura 26. A figura mostra que parasitos cultivados em

presença de BIS somente, apresenta 42% de formas tripomastigotas semelhante ao sistema

controle, já a combinação de BIS + H89 ou BIS + DRB, a diferenciação é reduzida e a

procentagem de formas tripomastigotas encontradas foi de 27% e 30%, respectivamente. A

combinação de BIS + PAF, BIS + H89 + PAF e BIS + DRB+ PAF foram capazes de

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 3

Controle PAF H89

PAF

H89 H89

DRB

H89

BIS

PAF

H89

DRB

PAF

H89

BIS

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 3

Controle PAF H89

PAF

H89 H89

DRB

H89

BIS

PAF

H89

DRB

PAF

H89

BIS

reverter à ação do PAF, sendo as porcentagens de formas tripomastigotas de 35%, 35% e

25%, respectivamente.

Figura 26. Porcentagem de formas diferenciadas (tripomastigostas metacíclicos) de T.

cruzi cultivados por 72 horas em meio TAUP. Os parasitos foram incubados por 1 hora na

presença de BIS I (10 nM) sendo posteriormente, lavados, centrifugados e incubados em

meio “fresco” na ausência (controle) e/ ou na presença das seguintes drogas: PAF 10

-6

M ,

H89 50 µM e DRB 100 µM. Os asterísticos referem-se: * significativamente diferente do

controle.

c) Efeito do DRB na diferenciação induzida por PAF em T. cruzi

Células previamente tratadas com DRB são mostradas na Figura 27. Podemos

observar que em todos os sistemas usados houve inibição da diferenciação celular, os

sistemas contendo DRB + H89 ou DRB + BIS encontramos, respectivamente, 38% e 25%

de formas tripomastigotas. Na combinação de DRB + PAF, DRB + H89 + PAF e DRB +

BIS + PAF a porcentagem de formas diferenciadas de 28%, 28% e 30%, respectivamente.

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 3

Controle

PAF BIS

PAF

BIS BIS

DRB

BIS

H89

PAF

BIS

DRB

PAF

BIS

H89

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 3

Controle

PAF BIS

PAF

BIS BIS

DRB

BIS

H89

PAF

BIS

DRB

PAF

BIS

H89

Figura 27. Porcentagem de formas diferenciadas (tripomastigostas metacíclicos) de T. cruzi

cultivados por 72 horas em meio TAUP. Os parasitos foram incubados por 1 hora na presença

de DRB (100 µM) sendo posteriormente, lavados, centrifugados, incubados em meio “fresco” na

ausência (controle) e/ ou na presença das seguintes drogas: PAF 10

-6

M , H89 50 µM e DRB 100

µM. Os asterísticos referem-se: * significativamente diferente do controle.

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 3

Controle PAF DRB

PAF

DRB DRB

BIS

DRB

H89

PAF

DRB

BIS

PAF

DRB

H89

* *

Tripomastigotas metacíclicos (%)

100

Dia 3

Controle PAF DRB

PAF

DRB DRB

BIS

DRB

H89

PAF

DRB

BIS

PAF

DRB

H89

* *

V. Discussão

Parasitos da espécie T. cruzi atravessam muitos estágios durante seu ciclo de vida,

com diferentes morfologias e propriedades proliferativas, cada qual adaptada a um

determinado compartimento dentro de cada hospedeiro vertebrado ou invertebrado. Estes

estágios de desenvolvimento são finamente regulados por mecanismos complexos de

controle, que asseguram que seu ciclo de vida seja completado. Neste, há estágios

proliferativos para a colonização e o estabelecimento da infecção, além de estágios onde

houve paralisação do ciclo e os parasitos estão pré-adaptados à transmissão para o próximo

hospedeiro. Os tripomastigotas metacíclicos paralisados em seu ciclo dentro do intestino do

barbeiro são transmitidos a um hospedeiro mamífero, onde invadem uma grande variedade

de células e se transformam nas formas amastigotas replicantes. Estas, então, se

diferenciam em tripomastigotas, que são liberadas no sangue, invadindo novas células e

sendo transmitidas para o inseto vetor. No vetor, estes tripomastigotas se diferenciam em

epimastigotas no intestino médio do inseto, onde estabelecem a infecção. Os epimastigotas

migram para a glândula retal do inseto, onde se diferenciam novamente para formas

tripomastigotas metacíclicos. Todas estas modificações ocorrem às expensas de transdução

de sinais, que culminam em expressão de genes específicos, que conferirão os caracteres

morfológicos e fisiológicos de cada estágio evolutivo (Naula, Parsons & Mottram, 2005).

Entretanto, pouco se sabe sobre a sinalização intracelular envolvida em cada uma dessas

etapas.

PAF é o nome comum para 1-O-alquil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfocolina, que é um

fosfolipídio com ações fisiológicas diversas e potentes, particularmente como mediador de

inflamação. A síntese, transporte e degradação do PAF são finamente regulados e as bases

bioquímicas desses processos foram elucidados recentemente (Prescott et al., 2000). Muitos

mediadores lipídicos são derivados de fosfolipídios, mas o PAF foi o primeiro a mostrar

funções autacóides, ou seja, de mensageiro. Todas as ações descritas do PAF são resultado

da ligação deste lipídio a seu receptor específico e não efeitos físico-químicos na membrana

citoplasmática das células alvo. A ligação do PAF a seu receptor resulta em sinalização

intracelular complexa e variada, dependendo de diversos fatores, dentre os quais o tipo

celular envolvido (Prescott et al., 2000).

O receptor clonado do PAF possui uma estrutura típica dos receptores ligados à

proteína G (GPCRs), com sete hélices transmembranares e provavelmente transmitem os

sinais através de Gq, Gs e Gi/o. Não foram identificados subtipos de receptores de PAF até

o momento e camundongos nocauteados para este receptor aparentemente sobrevivem

normalmente. Seus fenótipos revelaram que o receptor para o PAF desempenham papel

fundamental nas respostas inflamatórias, mas seus papéis em outras funções biológicas

ainda precisam ser melhor estudados (Ishii, Nagase & Shimizu, 2002).

Recentemente demonstramos que um receptor putativo para PAF em T. cruzi está

localizado na superfície de células epimastigotas, incluindo a região flagelar. Além disso, a

microscopia de fluorescência também revelou forte marcação para este receptor no interior

dos epimastigotas (Gomes et al., 2006). Este resultado está também ilustrado no presente

trabalho (Figura 10). De Melo e colaboradores (2004) e Araripe e colaboradores (2004)

localizaram as proteínas TcRho1 e TcRAB7 em formas epimastigotas de T. cruzi numa

região intracelular, similar a que obtivemos, e caracterizaram esta região como pertencente

ao complexo de Golgi. Embora seja preciso mais estudos para se estabelecer a localização

interna deste receptor em T. cruzi, podemos especular que esta localização intracelular

possivelmente está relacionada com as vias de processamento ou reciclagem desta molécula

por vesículas envolvidas no transporte intracelular. É importante ressaltar que a existência

de receptores intracelulares nesses parasitos não pode ser descartada, em especial porque tal

localização tem sido reportada em células de mamíferos (Zhu et al., 2006).

Infecções virais têm sido descritas em vários protozóarios parasitos, que podem

explicar a aquisição de genes de mamíferos, incluindo aqueles que codificam para

receptores de membrana (Yu et al., 1996). Alguns receptores para ligantes de mamíferos já

foram descritos em tripanossomatídeos, como Leishmania (Wanderley et al., 2006).

Bussolino e colaboradores (1991) sugeriram que o PAF produzido por Dictyostelium

discoideum, em contraste com a maioria das células de vertebrados, não seja liberado para o

meio extracelular, havendo evidências da presença de receptores internos neste organismo,

a partir do qual há transdução de sinais intracelulares (Sordano et al., 1993).

A sinalização intracelular induzida pela ligação do PAF ao seu receptor leva à

ativação de fatores de transcrição e expressão de genes específicos. O cálcio, o AMPc, o

IP3 e o DAG foram comprovadamente identificados como mensageiros secundários da

sinalização mediada por PAF. Além disso, o PAF induz a ativação de fosfolipases, como a

fosfolipase A2 citossólica (cPLA

), e de cinases, tais como as MAPK, PKC, fosfatidil

inositol 3-cinase (PI3K), proteína tirosina cinases e cinase de receptor de proteína G. Além

disso, a supressão da atividade de adenilato ciclase também é considerada um exemplo de

sinal intracelular induzido por PAF (Ishii, Nagase & Shimizu, 2002).

Estudos anteriores do nosso grupo demonstraram alguns efeitos desencadeados por

PAF em tripanossomatídeos (Rodrigues et al., 1996; Rodrigues et al., 1999; Silva-Neto et

al., 2002). Recentemente, identificamos uma molécula semelhante a PAF em T. cruzi (Tc-

PAF), produzido em resposta ao estímulo dos parasitos com o ionóforo de cálcio A23187.

Tc-PAF é capaz de estimular a diferenciação celular do próprio parasito, além de aumentar

a infectividade de T. cruzi a macrófagos peritoneais de camundongo, quando estes

protozoários são pré-tratados com Tc-PAF (Gomes et al., 2006). Todos os efeitos do PAF

em tripanossomatídeos, assim como os do Tc-PAF, parecem ocorrer via receptor de

superfície, já que foram revertidos pelo antagonista de receptor de PAF (WEB 2086).

Assim como em células de mamíferos, em protozoários a resposta à ativação

externa por vias de sinalização envolve receptores de superfície, hidrólise de lipídios

ligados à membrana, mensageiros secundários, proteínas cinases e fosfatases (Parsons &

Ruben, 2000). O AMPc é um importante mensageiro secundário que, entre as suas várias

funções, participa da regulação do desenvolvimento de parasitos (diferenciação e

proliferação celular) e muitos dos efeitos são mediados pela PKA, tanto em células de

mamíferos (Smith & Scott, 2006), quanto em protozoários da família Trypanosomatidae

(Parsons & Ruben, 2000; Naula & Seebeck, 2000; Seebeck et al., 2001).

No presente trabalho, formas epimastigotas de T. cruzi, quando incubadas em um

meio pobre, que mimetiza a urina do barbeiro (meio TAUP), em presença de PAF por 6

horas, produzem o dobro de AMPc em relação às células não tratadas (Figura 11).

Oliveira, Antunes e Melo (1984) utilizando isoproterenol, um ativador de receptores β-

adrenérgicos, sugeriram que também em T. cruzi há um balanço entre proliferação e

diferenciação, o aumento nos níveis de AMPc intracelulares inibem proliferação celular e

este aumento é mais pronunciado na fase de fase de adaptação, que antecede o crescimento

celular. Parece que AMPc induz um decréscimo da proliferação celular em T. cruzi e que

em altas concentrações de AMPc há uma inibição da síntese de DNA, RNA e proteínas.

Curiosamente, Krieger e colaboradores (1999) descreveram que parasitos em 6 e 24 horas

de diferenciação já possuem genes diferencialmente expressos.

Rangel-Aldao e colaboradores (1988) observaram que formas tripomastigotas

apresentam níveis de AMPc quatro vezes maior que formas epimastigotas. Embora nosso

estudo envolva somente formas epimastigotas em processo diferenciação (epimastigotas

incubados em meio TAUP, que estimula o processo de metaciclogênese), observamos que

parasitos incubados em meio TAUP por 24 horas, na presença de PAF a 10

-9

apresentaram os mesmos níveis de AMPc encontrado por esses autores (Figura 12). Já na

Figura 13, demonstramos que o aumento na concentração de AMPc está diretamente

relacionado com a ligação do PAF ao seu receptor específico, uma vez que um antagonista

específico para o receptor de PAF, WEB 2086, foi capaz de reverter totalmente o efeito

desencadeado pelo PAF.

Castro & Meirelles (1987) e Gonzáles-Perdomo, Romero & Goldenberg (1988)

estudando o papel do AMPc no processo de metaciclogênese de T. cruzi, demonstraram

que o AMPc exógeno estimula a diferenciação de T. cruzi, tanto de epimastigotas para

tripomastigotas, como de amastigotas para epimastigotas. Em D. discoideum, o tratamento

com PAF exógeno induz a produção de AMPc e GMPc, levando a oscilações espontâneas

nos níveis de AMPc, que ocorre durante a diferenciação deste organismo, de células

amebóides a um agregado multicelular (Schaloske et al., 1995, Alvarez-Curto et al., 2007).

De forma semelhante, observamos que o dibutiril-AMPc é capaz de aumentar a

diferenciação de formas epimastigotas para formas tripomastigotas (Figura 14). Quando

comparado ao sistema controle, há um aumento correspondente a 50% de formas

tripomastigotas em presença de AMPc, logo no primeiro dia de incubação. Alguns autores

discutem que a indução da metaciclogênese depende da cinética do análogo de AMPc

usado (Gonzáles-Perdomo, Romero & Goldenberg, 1988). Isso ocorre provavelmente

devido à permeabilidade diferencial da membrana do parasito. Assim, quando esses autores

usaram um análogo que atravessa membranas biológicas com maior facilidade, o 8-bromo-

deoxiadenosina (8-Br-cAMP), um maior rendimento de formas metacíclicas foi obtido.

Sabe-se que a estrutura da adenilato ciclase em tripanossomatídeos é similar a

estrutura dos receptores de guanilato ciclase encontrados em células de mamíferos. Este

contém um domínio extracelular de ligação ao ligante e um domínio citoplasmático para a

adenilato ciclase. Evidências sugerem que a ativação da adenilato ciclase em

tripanossomatídeos não envolva a proteína G (Naula & Seebeck, 2000). Alguns autores

sugerem que o domínio do receptor extracelular possa ativar diretamente os componentes

intracelulares da adenilato ciclase de T. cruzi (Naula & Seebeck, 2000). Além destas

diferenças, nossos dados sugerem que a modulação dos níveis de AMPc intracelulares

possam ser independentes da atividade de PKA. No presente trabalho, demonstramos que a

incubação dos parasitos com o inibidor de PKA, H89, ou de PAF mais H89, induz um

estímulo da diferenciação de T. cruzi. Não podemos descartar, entretanto, a possibilidade de

que a diferenciação celular de T. cruzi seja preferencialmente sinalizada através de outra

via, provavelmente com o envolvimento de PKC e CK2, como veremos a seguir. Assim,

tanto na presença, quanto na ausência de PAF, a inibição da atividade PKA parece

favorecer esta via alternativa. De maneira semelhante, Rolin e colaboradores (1996),

descreveram que em T. brucei, a atividade da adenilato ciclase pode ser estimulada através

da inibição de PKC, e isso ocorre concomitantemente com o aumento da liberação das

glicoproteínas super-variáveis de superfície celular, as VSG.

Uma outra molécula sinalizadora intracelular bastante conhecida é a PKC, que é

uma serina/treonina cinase ativada por DAG em resposta à hidrólise de fosfolipídeos de

membrana por ação da fosfolipase C, estimulada pela proteína G. A PKC de T. cruzi foi

purificada e caracterizada em 1989 e, a partir disso, muitos autores passaram a discutir sua

participação em eventos de proliferação, diferenciação e infectividade (Gomez et al., 1989).

No presente trabalho, observamos que epimastigotas de T. cruzi, incubados em meio

TAUP, na presença de um inibidor de PKC, BIS I, ou em meio contendo BIS I mais PAF,

apresentaram um número significativamente menor de formas tripomastigotas, em relação

ao sistema controle ou de parasitos tratados apenas com PAF (Figura 15). Desta maneira,

sugerimos o envolvimento da PKC em uma das vias principais de sinalização que leva à

metaciclogênese em T. cruzi. Sugerimos também que o estímulo à diferenciação celular

promovido por PAF atue também através desta via, uma vez que o BIS I reverteu

totalmente o efeito induzido por PAF. De maneira semelhante, resultados de nosso grupo

sugerem que em H. m. muscarum, a diferenciação celular estimulada por PAF ocorre

através de uma complexa via de sinalização, envolvendo fosfolipase C, PKC, CK2, tirosina

e serina/treonina fosfatases, e MAP cinases (Silva-Neto et al., 2002). Nosso grupo também

demonstrou que em T. cruzi, a modulação da secreção de uma fosfatase ácida está

relacionada com a ativação de PCK por PAF (Rodrigues et al., 1999). Este último resultado

sugere que a fosfatase secretada possa estar envolvida na infectividade de T. cruzi, já que o

PAF estimula o processo de metaciclogênese deste parasito (Rodrigues et al., 1996), sendo

as formas tripomastigotas as infectivas para mamíferos.

PAF também é capaz de induzir um aumento na atividade de CK2 em H. m.

muscarum. Além disso, a participação inequívoca de CK2 na diferenciação celular deste

parasito foi demonstrada no mesmo estudo (Silva-Neto et al., 2002). No presente trabalho,

inibidores de CK2 capazes de atravessar membranas celulares, TBB e DRB, foram capazes

de inibir a metaciclogênese de T. cruzi (Figura 15). Na presença destes agentes, a

diferenciação foi reduzida em 25%, em relação ao controle, logo no primeiro dia de cultivo.

De forma semelhantes aos outros sistemas, PAF teve seus efeitos revertidos na presença de

TBB e DRB. Nossos resultados estão de acordo com os descritos para H. m. muscarum,

onde foi demonstrada a redução da diferenciação celular estimulada por PAF, quando na

presença de concentrações crescentes (5-200 µM) de DRB (Silva-Netto et al., 2002).

Sabidamente, as proteases são enzimas amplamente distribuídas na natureza,

possuindo funções relevantes na adesão, penetração, nutrição, sobrevivência intracelular,

multiplicação e diferenciação celular (Cazzulo, 2002; Yao, Donelson & Wilson, 2003;

Stempin et al., 2004). A atividade de proteases durante a transformação de epimastigotas

para tripomastigotas de T. cruzi foi investigada por Bonaldo e colaboradores (1991). Três

proteases foram descritas, de 40, 52 e 65 kDa. A protease de 40 kDa parece ser a

cruzipaína (a cisteína protease mais importante em T. cruzi) e a 65kDa é uma

metaloproteases dependente de zinco, visto que sua atividade é inibida por 1-10-

fenantrolina. A protease de 52 kDa também é uma metaloprotease e está presente em todos

os estágios de desenvolvimento do parasito. No presente trabalho, também observamos

uma metaloprotease de 65 kDa e uma cisteína protease de 40 kDa (Figura 16).

No presente trabalho, sugerimos que essas proteases possam ter suas expressões

moduladas por PAF, durante o ciclo celular de T. cruzi (Figura 17). Este evento foi

demonstrado, quando parasitos foram incubados em meio TAUP, na presença de PAF.

Neste sistema, as atividades dessas proteases foram reduzidas, suas expressões foram de

40%, para a protease de 65 kDa, e em 60%, para a de 40 kDa. Entretanto, em meio LIT,

rico em nutrientes, PAF induz o aumento de expressão dessas enzimas em 180% (65 kDa) e

125% (40 kDa). Como em outros sistemas, o efeito desencadeado por PAF ocorre através

da sua ligação ao receptor, uma vez que WEB 2086 foi capaz de reverter estes efeitos. Em

concordância com estes dados, verificamos que as atividades proteásicas não foram

alteradas quando os géis, contendo extratos dos parasitos, foram incubadas na presença de

PAF a 10

-6

M, WEB 2086 a 10

-6

M, ou ambos (Figura 18). Estes últimos resultados

sugerem a necessidade da presença de células vivas para a ligação do PAF ao seu receptor e

que, após essa ligação, há uma ativação de uma cascata de sinalização.

Cazzulo e colaboradores (1994) estudaram o efeito de inibidores de cisteína

protease [peptidil aciloximetil cetona (AMK) e diazometil cetona (DMKs)] durante o

crescimento e diferenciação de T. cruzi. Estes autores sugeriam que AMK, em baixa

concentração, interfere muito pouco no crescimento, porém reduz a metaciclogênese. De

maneira similar, DMKs não causam efeito algum no crescimento, inibindo, porém, a

metaciclogênese. De modo comparável, no presente trabalho observamos que a

diferenciação celular de formas epimastigotas para tripomastigotas, estimulada por PAF em

T. cruzi, foi inibida na presença de inibidores de metaloprotease e de cisteína protease (Fig.

19). Curiosamente, no sistema composto por PAF mais antipaína, que é um inibidor de

cisteína protease, PAF teve seu efeito totalmente revertido.

A principal cisteína protease de T. cruzi é a cruzipaína, que está presente em

diferentes quantidades em todos os estágios de desenvolvimento dos parasitos. Muitas

funções têm sido atribuídas a essa enzima, em especial, sua relação com a metaciclogênese e

escape do sistema imune do hospedeiro pelo parasita (Cazzulo, Stoka & Turk, 2001). Alguns

autores discutem a participação da cruzipaína como moduladora da ativação de receptores

celulares para bradicinina, durante a invasão por T. cruzi (Marcic & Erdos, 2000; Scharfstein

et al., 2000). A ativação destes receptores desencadeia uma cascata de sinalização,

envolvendo PKC, cálcio, liberação de ácido araquidônico e fosfatases. De maneira similar,

os resultados apresentados no presente trabalho demonstram que a diferenciação estimulada

por PAF envolve algumas vias de sinalização, que modulam a expressão das proteases de 65

e de 40 kDa. Na Figura 20, verificamos a expressão de proteases em resposta a incubação

com AMPc e o inibidor de PKA (H89). De modo semelhante ao que ocorre com a

diferenciação celular, parasitos incubados com AMPc ou H89 foram capazes de estimular a

expressão destas duas proteases. Entretanto, a combinação de PAF com estas substâncias

induziu a reversão dos efeitos isolados.

Além da participação de AMPc e PKA na modulação da expressão das proteases de

65 e de 40 kDa, observamos o possível envolvimento de PKC e de CK2 nesta modulação.

De maneira similar ao que ocorre durante a diferenciação, inibidores de PKC (BIS I) e CK2

(DRB) também foram capazes de reduzir a expressão de ambas as atividades proteolíticas

(Fig. 21). Assim, podemos sugerir a participação das proteases de 65 e de 40 kDa na

cascata de sinalização desencadeada por PAF em T. cruzi, importante para o processo de

metaciclogênese desses parasitos.

Recentemente, uma outra cisteína protease de peso molecular entre 97 e 116 kDa,

chamada de TcCPmet, foi descrita em T. cruzi, sendo expressa durante a metaciclogênese.

Esta nova protease parece ser secretada pelas formas metacíclicas, sendo inibida por E-64 e

TLCK e não é reconhecida por soro anti-cruzipaína, parecendo ter uma natureza diferente

(Duschak et al., 2006). As variações na massa molecular podem ser explicadas pela

diferença do protocolo usado, como substrato (fibrinogênio x gelatina), temperatura de

eletroforese, processamento da amostra ou a cepa de T. cruzi. Além disso, a participação de

uma serina peptidase (oligopeptidase B) também foi sugerida na ativação de sinalização

celular desencadeada durante a invasão de células de mamíferos por T. cruzi (revisto por

Yoshida, 2006). Estas proteases não foram observadas em nosso trabalho. Entretanto, como

ambas são características de formas metacíclicas e o tempo de incubação, em meio TAUP,

utilizado em nosso estudo não seria suficiente para que as formas epimastigotas se

transformassem em tripomastigotas, este resultado negativo não é surpreendente.

O sequenciamento dos genomas de três tripanossomatídeos patogênicos para o

homem, L. major, T. brucei e T. cruzi, foi recentemente completado, o que permitiu a

análise do conjunto de proteínas cinases (“kinoma”) de cada parasito (Parsons et al., 2005).

Tal análise revelou que cada espécie possui 179, 156 e 151 proteínas cinases de eucariotos,

respectivamente, o que representa cerca de um terço do “kinoma” humano. Através desta

análise, conclui-se que os tripanossomatídeos não possuem membros das famílias de

tirosina cinases citossólicas ou ligadas a receptores. Entretanto, esses parasitos apresentam

membros das famílias de proteínas cinases STE e CMGC em abundância, que parecem

estar envolvidas com a regulação do ciclo celular, diferenciação celular e resposta à

estresse, durante seus complexos ciclos de vida (Parsons et al., 2005; Naula, Parsons &

Mottram, 2005).

A fosforilação de proteínas constitui um importante mecanismo para a transdução

de sinais envolvidos em processos fundamentais, tais como o crescimento e a diferenciação

de protozoários parasitos, uma vez que a atividade e a expressão de diversas proteínas

cinases podem ser reguladas durante o ciclo celular desses parasitos (Parsons, Valentine &

Carter, 1993).

No presente trabalho, não identificamos mudanças qualitativas ou quantitativas

significativas na expressão de proteínas. Entretanto, várias proteínas tiveram seu perfil de

fosforilação alterado, especialmente na presença do PAF (Figuras 22 e 23).

A Figura 22 mostra os perfis de fosforilação de parasitos incubados com AMPc, H89

(inibidor de PKA) e PAF, enquanto os perfis de fosforilação de proteínas de parasitos

incubados com inibidores de PKC e de CK2 é mostrado na Figura 23.

Em T. evanis, a capacidade de fosforilar proteínas de 20 a 205 kDa foi atribuída pela

presença de CK1, CK2 e proteína cinase dependente de AMPc nesses organismos (Galan-

Caridad et al., 2004). No presente trabalho, o fato de algumas proteínas terem sido

fortemente fosforiladas em presença de inibidor de PKA, PKCe CK2 pode significar que

estas enzimas modulam negativamente alguma proteína com atividade cinásica, ou ainda que

module positivamente alguma proteína fosfatase, participando de uma intrincada rede de

transdução de sinais. Como exemplo, podemos citar a proteína fosfatase CDC25 de

humanos, que possui importante papel no ciclo celular. Esta fosfatase é substrato da CK2,

sendo positivamente modulada por sua fosforilação (Theis-Febvre et al., 2003).

A autofosforilação de algumas proteínas cinases, como a PKC, já foi descrita em

células de mamíferos (Huang et al., 1986), assim como em T. cruzi (Gómez et al., 1999). A

autofosforilação de tirosina da própria CK2 já foi detectado por Donella-Deana e

colaboradores (2001). Além da autofosforilação, a fosforilação de outras moléculas presentes

no parasito, como proteínas por ele secretadas, também pode fazer parte do complexo

sistema de sinalização deste protozoário.

Recentemente, foi descrita uma proteína transmembrana em formas tripomastigotas

de T. cruzi, chamada Tc-1. Especula-se que Tc-1 funcione como substrato para CK2. Foi

visto que esta proteína apresenta dois sítios de fosforilação para AMPc e três sítios para

PKC, que estão envolvidos na mobilização de cálcio durante a infecção (Augustine et al.,

2006).

Krassner e colaboradores (1993), após submeter epimastigotas de T. cruzi ao

estresse metabólico, usando o meio TAU modificado (PBS, 10 mM prolina, 10 mM acetato

de sódio, 0,035% NaHCO

), não detectaram mudanças na concentração de cálcio

citossólico de epimastigotas. É interessante observar que os mesmos componentes que

modulam a metaciclogênese em T. cruzi, como os aminoácidos prolina e glutamato, ou o

uso de ionóforos ou catecolaminas (neurotransmissores em células eucarióticas), não são

capazes de alterar os níveis cálcio nestes parasitos (Krassner et al., 1993). De maneira

comparável, no presente trabalho demonstramos que parasitos incubados na presença de

PAF 10

-6

M por 6 ou 12 horas não apresentaram aumento na concentração de cálcio

intracelular (Figura 24).

Diferentemente, Bollo e colaboradores (2001) demonstraram mudança na

concentração de cálcio intracelular em epimastigotas de T. cruzi incubados com nicotina.

Lammel e colaboradores (1996) verificaram um aumento nos níveis de cálcio de formas

epimastigotas, em reposta ao homogenato intestinal de Triatoma infestans, um conhecido

indutor de diferenciação celular em T. cruzi.

Do Campo e colaboradores (1991) demonstraram a participação da via do inositol

fosfato/DAG em epimastigotas de T. cruzi, estimulados por cálcio e permeabilizados com

digitonina. Entretanto, esses autores não detectaram liberação de cálcio em estoques

sensíveis a IP

em formas amastigotas e epimastigotas (Benain et al., 1991; Moreno et al.,

1991) ou em formas procíclicas e sanguíneas de T. brucei (Moreno, Do Campo & Vercesi,

1992). Estes resultados sugerem que, diferentemente do que ocorre em outras células

eucarióticas, tripanossomatídeos não usam IP

como mensageiro secundário e que a via do

pode funcionar como fonte de DAG para estimular PKC (Moreno, Do Campo &

Vercesi, 1992).

Krassner e colaboradores (1993), utilizando um agente ativador de PKC (TPA),

observaram um aumento na metaciclogênese em T. cruzi. Entretanto, o TPA não promoveu

alteração nos níveis de cálcio citossólico, sugerindo que possivelmente este evento ocorre

por ação da PKC, de maneira Ca

-independente. No presente trabalho, sugerimos que a

ativação da diferenciação de T. cruzi promovida por PAF envolve ativação da PKC;

entretanto, mais estudos serão necessários para concluir se realmente não há envolvimento

de cálcio neste evento.

Muito se discute sobre o papel do cálcio do parasito na ativação de vias

sinalizadoras durante a infecção. Yoshida e colaboradores (2000), estudando as vias de

sinalização desencadeadas pela invasão de células de mamíferos por T. cruzi, observaram a

fosforilação de uma proteína 175 kDa (p175) e mobilização de cálcio, quando extratos de

células HeLa foram colocados em contato com o parasito; tal fato não foi observado,

quando foram adicionadas células resistentes (K562). Estes dados sugerem a participação

de uma proteína tirosina cinase, de PLC, IP

e mobilização de cálcio, no parasito.

A mobilização de cálcio nos parasitos, durante a invasão das células do hospedeiro

por T. cruzi, depende da infectividade da cepa. Cepas mais virulentas, como a CL, se ligam

à superfície das células do hospedeiro pela gp82, induzindo ativação da tirosina cinase,

foforilação da p175, ativação da PLC, geração de IP

e mobilização de cálcio

possivelmente do RE, enquanto cepas menos virulentas (cepa G) se aderem à superfície das

células do hospedeiro pela gp35/50 e induz a geração de AMPc, por ativar a adenilato

ciclase e geração de cálcio, a partir dos acidocalcissomas (Yoshida, 2006).

Para tentar elucidar as vias de sinalização desencadeadas por PAF durante a

metaciclogênese, avaliamos a diferenciação celular em resposta à combinação de inibidores

de proteínas cinases, sugerindo assim uma seqüência de eventos (Figuras 25-27). A partir

destes resultados, podemos sugerir que a inibição de PKA favorece à ativação de outra(s)

via(s) de sinalização, onde a PKC parece ser essencial para a metaciclogênese, uma vez que

sua inibição, ou sua inibição seguida da inibição de CK2, reduz a diferenciação. Podemos

também sugerir a participação da PKC na diferenciação de epimastigotas para

tripomastigotas de T. cruzi, estimulada por PAF. Provavelmente, a ativação da PKC estimula

a atividade da CK2, o que irá induzir o aumento da diferenciação.

Kosuge, Sawano e Ohtsuki (2003) sugeriram que CK2 é capaz de ativar a

subunidade regulatória (RIIα) da PKA in vitro, independente da presença de AMPc. White

e McHowat (2006) observaram a ativação de fosfolipase A

cálcio- independente, por

proteases, no recrutamento de neutrófilos por células endoliais. Estes são exemplos onde

várias rotas diferentes de sinalização formam redes complexas de ativação.

Atualmente, os estudos sobre sinalização celular envolvendo tripanossomatídeos,

em sua grande maioria, abordam as vias disparadas pelas células hospedeiras de mamíferos,

em resposta à presença desses parasitos (Burleigh & Andrews, 1998). Pouco se sabe sobre a

transdução de sinais que ocorre nos parasitos, a partir de estímulos externos a ele, inclusive

durante a interação com seus hospedeiros (Parsons & Ruben, 2000). Assim, o estudo sobre

as vias de sinalização intracelular de tripanossomatídeos, em especial no que diz respeito à

participação das proteínas cinases, é de suma importância, porque as descobertas que se

seguirem a esses estudos poderá levar ao desenvolvimento de novas drogas quimioterápicas

contra esses parasitos. De fato, parasitos da espécie T. cruzi possuem um grande número de

diferenças gênicas entre suas proteínas cinases e de mamíferos, que podem ser utilizadas

para o desenvolvimento de novas drogas quimioterápicas contra esse parasito (Naula,

Parsons & Mottram, 2005). Em adição a isso, inibidores de proteínas cinases têm gerado

grande interesse, devido ao grande sucesso de drogas como Gleevec e outros inibidores de

tirosina cinases em oncologia clínica (Li et al., 2006).

Nesta tese demonstramos as possíveis vias de sinalização disparadas por PAF

durante a transformação de formas não infectivas (formas epimastigotas) em formas

infectivas (tripomastigotas) modulando as concentração de AMPc, fosforilação de proteínas

e a expressão de proteases. Esses resultados ajudam a elucidar o ciclo celular do T. cruzi

permitindo o auxílio no desenvolvimento de agentes terapêuticos.

VI. Conclusões

1. O receptor para PAF em T. cruzi foi localizado, através de imunofluorescência, na

superfície de células epimastigotas, incluindo a região flagelar e também no interior do

parasito.

2. PAF 10

-6

M foi capaz de aumentar, em aproximadamente 2 vezes, os níveis de

AMPc produzidos por T. cruzi, após 6 horas de incubação em meio TAUP. Enquanto, PAF

a 10

-9

M aumentou, em cerca de 4 vezes, os níveis de AMPc em 24 horas de incubação.

3. O aumento na concentração de AMPc, induzido por PAF, parece estar diretamente

relacionado à ligação do PAF ao seu receptor específico, uma vez que WEB 2086 foi capaz

de reverter totalmente o efeito desencadeado pelo PAF.

4. AMPc exógeno e PKA tiveram suas ações moduladas por PAF durante a

diferenciação celular deste parasito. Sugerimos que a inibição de PKA favorece à ativação de

outra(s) via(s) de sinalização, onde a PKC parece ser essencial para a metaciclogênese, uma

vez que sua inibição, ou sua inibição seguida da inibição de CK2, reduziu os índices de

diferenciação de epimastigotas para tripomastigotas em T. cruzi, estimulada por PAF.

Podemos também sugerir a participação da PKC nesta diferenciação. Provavelmente, a

ativação da PKC estimula à atividade da CK2, o que irá induzir o aumento da diferenciação.

5. PAF também foi capaz de modular a expressão de uma metaloprotease de 65 kDa e

de uma cisteína protease de 40 kDa, com participação de AMPc, PKA, PKC e CK2.

Sugerimos que os eventos desencadeados por PAF na expressão dessas proteases

necessitam da presença de células vivas e de receptor de membrana, associado a cascatas de

sinalização intracelular.

6. Inibidores de proteases de 65 e de 40 kDa reverteram o efeito desencadeado por

PAF na diferenciação celular, sem alterar a viabilidade celular.

7. A fosforilação de diversas proteínas foi modulada por PAF, AMPc e pelos

inibidores de PKA, PKC e CK2.

8. Os eventos de sinalização desencadeados por PAF em T. cruzi não dependem do

aumento da concentração de cálcio intracelular.

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