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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS
ESTUDO DO PRÉ-CONDICIONAMENTO COM N-METIL-D-
ASPARTATO (NMDA) EM CONVULSÕES INDUZIDAS POR ÁCIDO
QUINOLÍNICO EM CAMUNDONGOS
Samuel Vandresen Filho
Orientadora: Prof
a
. Dr
a
Carla Inês Tasca
Co-orientadora: Prof
a
. Drª Carina Rodrigues Boeck
Colaborador: Prof. Dr. Alcir Luiz Dafré
Florianópolis, Fevereiro de 2007.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS
ESTUDO DO PRÉ-CONDICIONAMENTO COM N-METIL-D-
ASPARTATO (NMDA) EM CONVULSÕES INDUZIDAS POR ÁCIDO
QUINOLÍNICO EM CAMUNDONGOS
Samuel Vandresen Filho
Orientadora: Prof
a
. Dr
a
Carla Inês Tasca
Co-orientadora: Prof
a
. Drª Carina Rodrigues Boeck
Colaborador: Prof. Dr. Alcir Luiz Dafré
Dissertação apresentada ao curso de Pós-graduação em Neurociências da
Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito parcial à obtenção do
título de Mestre.
Florianópolis, Fevereiro de 2007.
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“Não deixaremos de explorar, e ao
término da nossa exploração
deveremos chegar ao ponto de
partida e conhecer este lugar pela
primeira vez”
Thomas Stearns Eliot
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AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais, Samuel e Irene pelo amor, apoio e incentivo em todos os
momentos da minha vida.
Agradeço à minha orientadora Dra. Carla I. Tasca, pela oportunidade, pelos
ensinamentos científicos, pela compreensão, paciência e motivação que tanto me ajudaram
durante o mestrado.
Agradeço a minha co-orientadora Dra. Carina Rodrigues Boeck pela motivação e
ânimo, e também pelos merecidos “puxões de orelha” que me ajudaram na concretização
deste trabalho.
Ao Dr. Alcir Luiz Dafré, pois foi através da colaboração com seu laboratório que
conseguimos realizar parte importante deste trabalho.
À minha querida Elise pelo amor, apoio e dedicação em todos os momentos.
Ao povo do laboratório: Scheyla, Bruno, Tharine, Helena, Cristiane, Ellen, Dênis,
Simone, Marina, Thais, Claudia, Manuela, Denis, Wagner.
Aos meus amigos e amigas de mestrado e doutorado, especialmente ao Fábio,
Eduardo, Ana Paula, Thais e Kelson.
Agradeço ao Dr. Reynaldo Takahashi por permitir a utilização do aparelho
estereotáxico.
À Dra. Andréa Gonçalves Trentin pelo empréstimo de equipamentos.
Ao Dr. Rodrigo Bainy Leal e Dr. Nelson Gabilán, pelo auxilio técnico e amizade.
Ao Nivaldo da secretaria do PPG pela sua dedicação aos alunos.
A todos os amigos e amigas, pelos atos, sugestões e criticas que me ajudaram nesta
jornada.
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A todos os professores do curso, pela amizade e pelo prazer em ensinar.
Ao CNPq, pelo financiamento da bolsa de estudo.
Agradeço a todos que algum modo contribuíram para a realização deste trabalho.
6
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS...............................................................................................................i
LISTA DE ABREVIATURAS...............................................................................................iii
RESUMO................................................................................................................................iv
ABSTRACT............................................................................................................................vi
1. INTRODUÇÃO..................................................................................................................1
1.1. Transmissão glutamatérgica..............................................................................................1
1.2. Excitotoxicidade e Morte Celular.....................................................................................5
1.3. Pré-condicionamento.......................................................................................................10
1.4. Glutationa........................................................................................................................12
1.5. Ácido Quinolínico...........................................................................................................15
2. OBJETIVOS.....................................................................................................................18
2.1 Objetivo Geral..................................................................................................................18
2.2 Objetivos Específicos.......................................................................................................18
3. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................19
3.1. Materiais..........................................................................................................................19
3.2. Equipamentos..................................................................................................................19
3.3. Animais...........................................................................................................................20
7
3.4. Procedimento Cirúrgico .................................................................................................20
3.5. Tratamento com NMDA.................................................................................................20
3.6.. Convulsões com Ácido Quinolínico..............................................................................21
3.7. Separação de Proteínas por Eletroforese (SDS-PAGE)..................................................22
3.7.1. Separação de Proteínas por Eletroforese......................................................................22
3.7.2. Eletrotransferência e Imunodetecção de proteínas (Western blot)..............................22
3.8. Análise da Fragmentação de DNA..................................................................................23
3.9. Avaliação dos níveis de Glutationa total (GSH-t)...........................................................24
3.10. Ensaios Enzimáticos......................................................................................................25
3.10.1. Avaliação da atividade da Glutationa Peroxidase (GPx)...........................................25
3.10.2. Avaliação da atividade da Glutationa S-Transferase (GST).....................................25
3.10.3. Avaliação da atividade da Glutationa Redutase (GR)................................................26
3.10.4. Avaliação da atividade da Glicose 6-fosfato Desidrogenase (G6PDH).....................27
3.11. Dosagem de Proteína.....................................................................................................27
3.12. Análise Estatística.........................................................................................................27
4. RESULTADOS.................................................................................................................28
4.1. Análise da Fragmentação de DNA..................................................................................28
4.2. Imunodetecção da Caspase-3..........................................................................................34
4.3. Avaliação da Glutationa Total e da Atividade de suas Enzimas Relacionadas..............37
8
5. DISCUSSÃO.....................................................................................................................45
6. CONCLUSÕES................................................................................................................55
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................56
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Figura esquemática da transmissão glutamatérgica.................................................3
Figura 2. Representação esquemática da apoptose e suas vias clássicas................................6
Figura 3. Esquema ilustrativo das funções anti-oxidantes da glutationa..............................14
Figura.4. Análise da fragmentação internucleossomal do DNA do córtex cerebral de
camundongos após tratamento com ácido quinolínico i.c.v.................................................29
Figura. 5. Análise da fragmentação internucleossomal do DNA do hipocampo de
camundongos após tratamento com ácido quinolínico i.c.v.................................................30
Figura. 6. Análise da fragmentação internucleossomal do DNA do córtex cerebral de
camundongos 48 horas após tratamento com NMDA e/ou ácido quinolínico......................32
Figura. 7. Análise da fragmentação internucleossomal do DNA do hipocampo de
camundongos 48 horas após tratamento com NMDA e/ou ácido quinolínico......................33
Figura 8. Imunodetecção da proteína Caspase-3 e de seu fragmento de 17 kDa no córtex
cerebral de camundongos tratados com NMDA e/ou ácido quinolínico..............................35
10
Figura 9. Imunodetecção da proteína Caspase-3 e de seu fragmento de 17 kDa no
hipocampo de camundongos tratados com NMDA e/ou ácido quinolínico.........................36
Figura 10. Avaliação dos níveis de glutationa total (GSH-t) no pré-condicionamento com
NMDA contra as convulsões induzidas pelo AQ no córtex cerebral e hipocampo de
camundongos.........................................................................................................................38
Figura 11. Atividade da Glutationa peroxidase (GPx) no córtex cerebral e hipocampo de
camundongos após o pré-condicionamento com NMDA e a infusão de AQ.......................40
Figura 12. Atividade da Glutationa S-transferase (GST) no córtex cerebral e hipocampo de
camundongos após o pré-condicionamento com NMDA e a infusão de AQ.......................42
Figura 13. Atividade da Glutationa redutase (GR) no córtex cerebral e hipocampo de
camundongos após o pré-condicionamento com NMDA e a infusão de AQ.......................43
Figura 14. Atividade da Glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH) no córtex cerebral e
hipocampo de camundongos após o pré-condicionamento com NMDA e a infusão de
AQ.........................................................................................................................................44
11
LISTA DE ABREVIATURAS
AQ: Ácido Quinolínico
AMPA: α-Amino-3-Hidróxi-5-Metil-4-Isoxazolproprionato
DNA: Ácido desoxiribonucléico
EDTA: Ácido etileno-dinitrilo-tetra-acético
ERO: Espécies reativas de oxigênio
GABA: Ácido gama-amino-butírico
GPx: Glutationa Peroxidade
GR: Glutationa Redutase
GSH: Glutationa
GSH-t: Glutationa total
GST: Glutationa S-transferase
G6PDH: Glicose 6-fosfato desidrogenase
i.c.v. : Intra-cerebroventricular
i.p. : Intra-peritoneal
NMDA: N-Metil-D-Aspartato
NQnc: animais tratados com NMDA + QA não convulsionados
NQc: animais tratados com NMDA + QA convulsionados
SDS: duodecil sulfato de sódio
SNC: Sistema Nervoso Central
TBS: tampão tris-salina
TBS-T: tampão tris-salina com Tween-20
Tris: Tris hidroxi metil amino metano
12
RESUMO
O pré-condicionamento cerebral se refere a um estado de tolerância transitória do tecido
nervoso a um estimulo letal evocado por um insulto moderado prévio. O pré-
condicionamento pode ser evocado por estímulos físicos ou químicos, como o pré-
condicionamento com N-metil-D-aspartato (NMDA). O pré-condicionamento com NMDA
pode ser promovido in vivo pela administração de uma dose sub-convulsivante de NMDA,
com efeito neuroprotetor contra a toxicidade do cainato ou isquemia, além de prevenir
convulsões e morte neuronal induzida pelo ácido quinolínico (AQ) em camundongos. O
objetivo deste estudo foi avaliar o tipo de morte celular no hipocampo e córtex cerebral
induzida pela administração de AQ em camundongos, bem como avaliar os efeitos do pré-
condicionamento com NMDA sobre a expressão da caspase-3, fragmentação de DNA e
sobre o sistema antioxidante da glutationa (GSH). Os camundongos foram pré-
condicionados com NMDA (75 mg/kg, 10 ml/kg i.p) 24 h antes da infusão de AQ (4 µl, 9.2
mM i.c.v.). O AQ não promoveu fragmentação do DNA tanto no córtex cerebral como no
hipocampo, sugerindo morte celular por necrose. O pré-condicionamento com NMDA não
promoveu alteração na fragmentação do DNA, demonstrando que não possui efeito
neurotóxico. O pré-condicionamento com NMDA e a infusão de AQ não promoveram
alterações na expressão da pró-caspase-3 e da caspase-3. O pré-condicionamento com
NMDA e a infusão de AQ não alteraram o conteúdo de glutationa total (GSH-t), e a
atividade das enzimas glutationa redutase e da glicose 6-fosfato desidrogenase. Contudo,
um aumento na atividade da glutationa S-transferase (GST) foi observado no córtex
cerebral após o tratamento com NMDA e AQ. Além disso, o pré-condicionamento com
13
NMDA preveniu a diminuição na atividade da glutationa peroxidase (GPx) induzida pelo
AQ no hipocampo, mas não teve efeito sobre a diminuição da atividade da GPx cortical.
14
ABSTRACT
Brain preconditioning refers to a state of transient brain tissue tolerance to a lethal insult
evoked by a prior mild insult. Preconditioning can be evoked by a variety of physical or
chemical stimuli, such as chemical preconditioning with N-methyl-D-aspartate (NMDA).
NMDA preconditioning can be evoked in vivo by a non-convulsant dose of NMDA, and it
is known to be neuroprotective against kainate toxicity or ischemia and prevents seizures
and neuronal death induced by quinolinic acid (QA) in mice. This study aimed to evaluate
the kind of cellular death in cerebral cortex and hippocampus induced by the administration
of QA in mice, as well as, to evaluate the effects of NMDA preconditioning in the
expression of caspase-3, DNA fragmentation and, its effects in the gluthatione scavenger
system. Mice were preconditioned by a non-convulsant NMDA dose (75 mg/kg, 10 ml/kg
i.p.) 24h before AQ infusion (4 µl, 9.2 mM i.c.v.). QA did not promote DNA laddering
either in the cerebral cortex or in the hippocampus, suggesting cellular death by necrosis.
NMDA preconditioning did not promote DNA laddering. NMDA preconditioning and QA
infusion did not evoked any alteration in both pro-caspase-3 and capsase-3 active form
expression. NMDA preconditioning and QA infusion did not alter GSH content, GR and
G6PDH activities, however, an increase in GST activity was observed in the cerebral cortex
from mice. Moreover, NMDA pretreatment was able to prevent the QA-induced decrease in
hippocampal GPx activity, but it was not effective against the decreased cortical GPx
activity.
15
1. INTRODUÇÃO
1.1 Transmissão Glutamatérgica
O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório no Sistema Nervoso Central
(SNC) de mamíferos e está envolvido no desenvolvimento, sobrevivência neuronal,
aprendizado e memória. Os efeitos do glutamato são mediados por receptores ionotrópicos,
os quais são canais de cátions, e metabotrópicos que modulam proteínas ligantes de
nucleotídeos da guanina (proteínas G) (DINGLEDINE et al, 1999). Farmacologicamente,
os receptores ionotrópicos classificam-se em receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA),
de α-amino-3-hidróxi-5-metil-4-isoxazolproprionato (AMPA) e de cainato de acordo com a
maior seletividade por seus ligantes sintéticos específicos (AHMADIAN et al, 2004).
Evidências demonstram a existência de oito receptores metabotrópicos de glutamato
(mGluR) que são subdivididos em três grupos de acordo com dados farmacológicos,
mecanismos de transdução do sinal e similaridade na seqüência de aminoácidos. O grupo I
de mGluR (mGlu1 e mGlu5) estimulam a fosfolipase C, enquanto o grupo II (mGlu2 e
mGlu3) e o grupo III (mGlu4, mGlu6, mGlu7 e mGlu8) modulam a atividade da adenilato
ciclase (GUBELLINI et al, 2004; SWANSON et al, 2005).
Fisiologicamente, os receptores AMPA e cainato estão relacionados à transmissão
sináptica rápida no SNC e são caracterizados pelas rápidas cinéticas de ativação e
desativação (POPESCU & AUERBACH, 2004). Os receptores AMPA formam-se de
quatro subunidades GluR1, GluR2, GluR3 e GluR4 e são responsáveis pela despolarização
inicial do potencial pós-sináptico (STONE & ADDAE, 2002). Evidências demonstram que
16
a entrada de cálcio pelos receptores AMPA ativa a cálcio-calmodulina quinase II, a qual,
por sua vez, fosforila o próprio receptor, o que potencializa a corrente iônica conduzida
pelo mesmo, fenômeno esse que tem sido relacionado à potenciação de longa duração
(LTP) (XIA & STORM, 2005).
Os receptores de cainato são tetrâmeros formados a partir da associação de cinco
tipos de subunidades denominadas GluR5, GluR6, GluR7, KA1 e KA2. Encontrados no
hipocampo, córtex, estriado, cerebelo, amígdala, hipotálamo, medula espinhal e na retina,
os receptores de cainato diferenciam-se dos receptores AMPA pela menor corrente
conduzida e pela cinética de desativação mais lenta (HUETTNER, 2003). Os receptores de
cainato localizados nas células pré-sinápticas estão envolvidos na modulação da liberação
de ácido gama-amino-butírico (GABA) e do próprio glutamato em sinaptossomas
hipocampais. Os receptores de cainato pós-sinápticos são responsáveis por um componente
lento e pequeno do potencial excitatório pós-sináptico relacionado a fenômenos de
plasticidade de curta e longa duração. Além das funções fisiológicas, a ativação desses
receptores através do tratamento com cainato tem sido utilizado como modelo químico da
epilepsia do lobo temporal de humanos (LERMA, 2003; MADDEN, 2002).
Dentre os receptores glutamatérgicos, os receptores NMDA são os que possuem a
maior afinidade pelo glutamato (WAXMAN et al., 2005). Os receptores NMDA são
proteínas heteroméricas compostas da combinação de subunidades NR1 com as
subunidades NR2A-D ou NR3A-B (TAKAGI et al, 2003). As subunidades NR1 são
constitutivas e promovem a funcionalidade do receptor, enquanto que as subunidades NR2
determinam a especificidade do receptor (SCOTT et al., 2003; WAXMAN et al., 2005).
Acredita-se que duas subunidades NR1 se associem com duas subunidades NR2, de modo
17
que a glicina, um co-agonista, una-se subunidades NR1 e o glutamato as subunidades NR2
(SCHORGE et al., 2003).
Figura 1. Figura esquemática da transmissão glutamatérgica. O glutamato, estocado
em vesículas sinápticas localizadas no terminal sináptico, é liberado na fenda sináptica pela
chegada de potenciais de ação. Uma vez liberado, o glutamato pode atuar sobre seus
receptores localizados nas células pós-sinápticas ou ser recaptado por neurônios ou células
gliais através da ação de transportadores glutamatérgicos.
Durante a transmissão sináptica, a ativação dos receptores NMDA requer a ligação
simultânea de glicina e glutamato em combinação com despolarização do potencial de
membrana (WAXMAN et al., 2005). No potencial de repouso, o canal do receptor é
bloqueado pelo íon magnésio, o qual é expulso do canal após uma despolarização inicial.
Com a abertura do canal do receptor NMDA, ocorre um influxo de íons sódio, potássio e
18
principalmente de íons cálcio (WAXMAN et al., 2005). A ativação dos receptores NMDA
produz uma corrente de ascensão e decaimento lentos que superam em duração aquelas
geradas por ativação dos receptores AMPA e cainato e deste modo acarreta em um
potencial excitatório pós-sináptico mais prolongado (GIBB, 2004). A ativação dos
receptores NMDA, deste modo, está associada a processos fisiológicos como o
desenvolvimento, formação e plasticidade das sinapses, vinculados a fenômenos como a
aprendizagem e a memória (CULL-CANDY, et al., 2001).
A ação sináptica do glutamato é finalizada por sua recaptação a partir da fenda
sináptica por proteínas de membrana conhecidas como transportadores de aminoácidos
excitatórios (EAATS). Os EAATS são compostos de cinco membros: EAAT1 (GLT-1),
EAAT2 (GLAST), expressos em células gliais, EAAT3 e EAAT4, expressos
preferencialmente em neurônios e EAAT5 expresso na retina (PORCHE et al, 2003;
NAKAGAWA & SATOH, 2004). A recaptação de glutamato está acoplada ao transporte
de íons inorgânicos como o sódio, potássio e hidrogênio e utiliza a energia livre
armazenada no gradiente eletroquímico desses íons para concentrar o glutamato no interior
das células. A estequiometria do transporte sugere que a cada ciclo três íons sódio e um
próton são co-transportados com o glutamato para o meio intracelular associado ao anti-
porte de um íon potássio para fora da célula (GREWER & RAUEN, 2005). Além disso,
verificou-se que o transporte de glutamato está associado à ativação de um canal de cloreto,
o transporte do qual não é termodinamicamente acoplado a recaptação de glutamato.
Assim, o transporte de cloreto não é necessário para a translocação do substrato e parece ser
um balanço contra o efeito despolarizante gerado pela entrada de sódio e a saída de potássio
(KANAI & HEDIGER, 2004; SHIGERI et al, 2004).
19
1.2. Excitotoxicidade e Morte Celular
Newhouse e Lucas (1957) foram os primeiros a sugerir um papel neurotóxico para o
glutamato ao demonstrarem que injeções de glutamato eram capazes de destruir as camadas
internas da retina de camundongos. Esses resultados foram replicados por John W. Olney,
em 1969, que estendeu os resultados de retinotoxicidade a compostos relacionados como o
cainato e sugeriu o termo excitotoxicidade para indicar toxicidade por aminoácidos
excitatórios. Assim, excitotoxicidade se refere ao processo no qual as células nervosas
respondem inapropriadamente a concentrações elevadas de glutamato na fenda sináptica e
que culminam com a morte celular (LYNCH et al., 2002). A excitotoxicidade pode resultar
em dois tipos distintos de morte celular: a necrose e a apoptose (ANKRACRONA et al,
1995, BONFOCO et al, 1995). A necrose é o processo no qual ocorre tumefação da
mitocôndria e do reticulo endoplasmático, ruptura celular e geração de resposta
inflamatória. A apoptose é caracterizada por condensação citoplasmática e nuclear,
clivagem do ácido desoxirribonucléico (DNA) intra-nuclear e subseqüente fagocitose
(HICKEY & CHESSELET, 2003).
Durante a apoptose, ocorre a desorganização do citoesqueleto e o encolhimento
celular com perda do contato com a matriz extracelular ou com as células adjacentes
(PETTMANN & HENDERSON, 1998). As moléculas de DNA são fragmentadas por
endonucleases e a cromatina condensa-se (LEBLANC, 2003). A clivagem do DNA acarreta
a fragmentação do núcleo que, então, se dissolve no citoplasma. Esses fragmentos,
conhecidos como corpos ou vesículas apoptóticas, estão envoltos por membrana. A
superfície celular altera-se e adquire propriedades que provocam a fagocitose imediata por
20
macrófagos ou células vizinhas, antes de haver liberação do conteúdo celular (LEBLANC,
2003).
Classicamente, se divide duas vias apoptóticas: a via intrínseca, iniciada por um
desequilíbrio na homeostase intracelular e a via extrínseca desencadeada pela ativação de
receptores de morte celular localizados na membrana plasmática (Figura 2). Ambas
envolvem a ativação de enzimas proteolíticas denominadas caspases (cisteína-aspartato
proteases) por conterem um resíduo de cisteína no sítio ativo e clivarem após resíduos de
aspartato (ASHE & BERRY, 2003).
Figura 2. Representação esquemática da apoptose e suas vias clássicas. De acordo com
o insulto de origem, duas vias apoptóticas podem ser identificadas: a via extrínseca e a via
intrínseca. Estas envolvem a ativação de caspases iniciadoras distintas, mas culminam com
a ativação da caspase 3 e conseqüentemente a morte celular.
21
As caspases são sintetizadas como zimogênios, pró-caspases, que são ativadas por
processamento proteolítico em resíduos de aspartato específicos (ASHE & BERRY, 2003).
De modo geral, as caspases são formadas por heterotetrâmeros, que após a proteólise
formam dois fragmentos grandes e pequenos, formando assim dois heterodímeros
(COHEN, 1997; GRÜTTER, 2000). Dois heterodímeros, então, se associam para originar a
forma ativa da enzima (STENNICKE & SALVESEN, 1998). As caspases ativam ou
inibem, por clivagem proteolítica, inúmeros alvos intracelulares como proteínas do
citoesqueleto, da lamina nuclear, e proteínas envolvidas com o DNA e com a transdução de
sinais (ASHE & BERRY, 2003).
A via intrínseca envolve o recrutamento de membros da família de proteínas Bcl-2
com atividade pró-apoptótica, como Bax, que sofre uma alteração conformacional e
oligomeriza-se, com posterior translocação para a mitocôndria, onde induz a formação do
poro de permeabilidade transitória na membrana mitocondrial e a liberação de fatores
apoptogênicos que ativam as caspases efetoras (ORRENIUS et al, 2003). As caspases
efetoras possuem como alvos intracelulares proteínas essenciais para a manutenção da
morfologia celular, morte celular, clivagem do DNA, regulação do ciclo celular e
transdução de sinais intracelulares (PETTMANN & HENDERSON, 1998).
A via extrínseca está relacionada aos receptores de membrana chamados de
receptores de morte celular. Esses receptores fazem parte da família dos receptores de
fatores de necrose tumoral (TNF) e o processo de acoplamento entre molécula sinalizadora-
receptor de morte celular acarreta a ativação das caspases 2, 8 e 10 (ASHE & BERRY,
2003). Após a ativação dessas caspases iniciadoras, as caspases efetoras 3, 6 e 7 são
ativadas por proteólise (PETTMANN & HENDERSON, 1998). Assim, a via extrínseca é
iniciada por um insulto extracelular que acarreta a ativação da caspase-8 pelos receptores
22
de morte. A caspase-8, por sua vez, leva a ativação da caspase-3, uma caspase efetora, que
resulta na fragmentação do DNA, condensação da cromatina e morte celular (LEBLANC,
2003).
Durante o processo de excitotoxicidade, concentrações elevadas de glutamato na
fenda sináptica causam a ativação demasiada dos receptores glutamatérgicos na célula pós-
sináptica com conseqüente entrada de íons sódio e cálcio, o último, principalmente através
dos receptores NMDA (WARING, 2005). O influxo excessivo de cálcio sobrecarrega os
mecanismos reguladores como o seqüestro de íons cálcio pelas mitocôndrias e pelo reticulo
endoplasmático que mantêm a sua concentração intracelular baixa (ARUNDINE &
TYMIANSKI, 2003). Deste modo, ocorre um desequilíbrio na homeostase desse íon que
resulta na ativação inapropriada de diversos processos dependentes de cálcio (ARUNDINE
& TYMIANSKI, 2003).
O acúmulo de cálcio intracelular pode resultar na ativação de proteases, lipases,
fosfatases e endonucleases que medeiam a morte celular (HYND et al., 2004). Além disso,
a entrada de cálcio via receptores NMDA pode causar a produção de óxido nítrico (NO)
pela enzima óxido nítrico sintase neuronal (nNOS). Níveis aumentados de NO, gerados a
partir da estimulação excessiva dos receptores NMDA, podem reagir com ânions
superóxido com a resultante formação do peróxido de nitrito (MARK et al, 2001). Este, por
sua vez, é extremamente tóxico às células, e em excesso pode provocar dano no DNA e
disfunção mitocondrial e concomitantemente, morte celular (MARK et al, 2001). Além
disso, o seqüestro de cálcio livre intracelular pelas mitocôndrias após abertura excessiva
dos receptores NMDA leva a despolarização do potencial de membrana mitocondrial e
inibição da cadeia de transporte de elétrons que acarretam no bloqueio da síntese de ATP
23
com conseqüente comprometimento dos processos dependentes da hidrólise de ATP
(NICHOLLS & BUDD, 1998).
Acredita-se que morte neural excitotóxica esteja envolvida em afecções
neurológicas agudas e crônicas. Essas situações patológicas incluem as doenças de
Alzheimer, Parkinson, Huntington, esclerose lateral amiotrófica, esclerose múltipla,
isquemia cerebral, glaucoma, demência associada ao HIV e epilepsia (MARK et al, 2001;
HYND et al, 2004; WAXMAN & LYNCH, 2005). Todas essas patologias são causadas por
mecanismos distintos, mas poderiam compartilhar uma via final comum ao dano neuronal
devido à estimulação excessiva dos receptores glutamatérgicos, especialmente do subtipo
NMDA (LIPTON, 2004). Dessa forma, antagonistas de receptores NMDA poderiam,
potencialmente, proporcionar um benefício terapêutico nessas desordens neurológicas.
Contudo, apesar de antagonistas de receptores NMDA prevenirem o dano neuronal
excitotóxico em modelos in vitro e in vivo, essas drogas possuem uma aplicação clinica
limitada devido aos efeitos colaterais (LIPTON, 2004). Estes incluem náuseas, psicose,
vômito, déficits mnemônicos e morte neuronal ocasionada pelo bloqueio completo dos
receptores NMDA, visto o papel importante que estes possuem nos processos neuronais
normais (STONE & ADDAE., 2002; WAXMAN & LYNCH, 2005). Visto assim, a
identificação de outros mecanismos de neuroproteção possibilita novas oportunidades para
a geração de estratégias terapêuticas com potencial utilização clinica no tratamento de
pacientes acometidos com desordens neuronais agudas e crônicas (SCHALLER & GRAF,
2002; DIRNAGL et al, 2003).
1.3. Pré-condicionamento
24
O termo pré-condicionamento foi introduzido por Janoff (1964) no intuito de
descrever a resposta de tolerância do organismo ao estresse letal induzida pela exposição
prévia a baixas doses de agentes ou estímulos tóxicos. Praticamente, qualquer estímulo
capaz de gerar dano ao organismo ou aos tecidos pode, quando aplicado abaixo do limiar de
injúria, ativar mecanismos endógenos de proteção, assim amenizando o impacto de
estímulos deletérios posteriores (DIRNAGL et al, 2003). Assim, o princípio geral do pré-
condicionamento é a obtenção de um estado de proteção celular, tecidual ou do organismo
como um todo através da exposição a insultos subletais que conferem, deste modo, certa
tolerância a um insulto letal posterior (DIRNAGL et al, 2003; MERGENTHALER et al,
2004).
Em um experimento realizado com cães em 1984, Judith Swain e colaboradores
observaram que após a indução de um episódio curto de isquemia cardíaca por oclusão da
artéria coronária esquerda o conteúdo desses nucleotídeos após os episódios seguintes
diminuía em uma taxa mais lenta. Com um mesmo modelo experimental semelhante e com
base nesses resultados, Charles Murry e Keith Reimer (1986) realizaram oclusões breves (5
min) seguidas de oclusão prolongada da artéria circunflexa de cães (40 min) e observaram
que a área de infarto nesses animais pré-condicionados era consideravelmente menor, ou
seja, o miocárdio pré-condicionado tornava-se tolerante a um insulto posterior mais grave.
Os autores atribuíram essa proteção à diminuição da depleção de ATP ou ao possível menor
acúmulo de catabólitos tóxicos no miocárdio dos cães (REIMER et al, 1986).
A primeira descrição de pré-condicionamento no SNC foi realizada por Kitagawa e
cols (1991) que relataram a neuroproteção promovida por um breve episódio isquêmico
contra uma isquemia letal posterior em diversas áreas do cérebro, como as regiões CA1 e
CA3 do hipocampo. Como postulado pelo seu princípio, estudos posteriores demonstraram
25
que esse estado de tolerância ao dano cerebral pode ser obtido por diversos meios sejam
estes químicos, elétricos ou anóxicos, de modo que tem se demonstrado a participação dos
receptores NMDA na geração dessa neuroproteção endógena em diferentes modelos de pré-
condicionamento por meio da administração de antagonistas como o MK-801 e a
quetamina (BOND et al, 1999; REJDAK et al, 2001; SCHALLER & GRAF, 2002;
SAMOILOV et al, 2003).
Acredita-se que a os mecanismos responsáveis pela neuroproteção induzida pelo
pré-condicionamento envolva a atenuação de diferentes processos que acarretam em dano
celular como a excitotoxicidade, o desequilibrio iônico, o estresse oxidativo e nitrosativo, a
disfunção metabólica, a inflamação e processos relacionados a morte celular necrótica e
apoptótica (GIDDAY, 2006). Sugere-se que a proteção também seria obtida pelo ativação
de mecanismos envolvidos com a sobrevivência celular e pelo aumento dos processos de
reparo endógenos, os quais diminuiriam a extensão da lesão neural e, concomitantemente,
facilitariam a recuperação da função cerebral (GIDDAY, 2006).
Nesse contexto, a administração de dose subconvulsivante de NMDA via
intraperitoneal tem sido utilizada como modelo de pré-condicionamento químico frente a
diversos insultos letais posteriores (BOECK et al, 2004). Tais modelos têm demonstrado
que este tratamento protege neurônios hipocampais de insulto isquêmico (MIAO et al,
2005) e protege camundongos da convulsão induzida por ácido quinolínico (AQ) por um
periodo de tempo de 24 a 48 após o pré-condicionamento com NMDA, no entanto, sem
alterar a latência e a duração das convulsões (BOECK et al, 2004). Além disso, nesse
estudo Boeck e cols (2004) demonstraram que o pré-condicionamento com NMDA protege
neurônios hipocampais da morte celular induzida pelo AQ tanto em animais que não
convulsionam quanto naqueles que convulsionam.
26
Entretanto, o tipo de morte celular ocasionado pelas convulsões induzidas pelo AQ
e a ativação ou não de proteínas pró- ou anti-apoptóticas pelo pré-condicionamento
induzido por NMDA permanecem desconhecidos. A análise da fragmentação de DNA,
realizada 24 horas após as convulsões induzidas pelo AQ, no hipocampo e córtex de
camundongos pré-condicionados com NMDA, revelou ausência de alteração em relação ao
grupo controle (BOECK et al, 2005a). Além disso, a ativação de caspase-3 não foi
detectada na região CA1 do hipocampo após 24 horas da injeção de AQ nesses animais
(BOECK et al, 2005a).
1.4. Glutationa
A glutationa (GSH) é um tripeptídeo (L-γ-glutamil-L-cistenilglicina), contendo
cisteína e é o tiol não protéico mais abundante nas células dos mamíferos (DIRNAGL et al,
2003). A GSH participa de diversos processos celulares, tais como: a síntese de DNA,
proteínas, leucotrienos e a modulação da função protéica (SIMS et al, 2004; NJALSSON,
2005). No entanto, a GSH exerce um importante papel como antioxidante nas células
participando, assim, da proteção contra o estresse oxidativo (Dirnagl et al, 2003). O estresse
oxidativo pode ser definido como um distúrbio no estado de equilíbrio no sistema de pró-
oxidantes e antioxidantes das células intactas, ou seja, uma condição na qual exista um
desequilíbrio entre a produção e a remoção de espécies reativas de oxigênio (EMERIT et al,
2004).
A GSH pode reagir não enzimaticamente com diversos compostos oxidativos ou
servir de substrato para a ação da glutationa peroxidase (GPx) na detoxificação de
peróxidos orgânicos e de hidrogênio (Figura 3). A GSH também pode participar de outras
27
reações anti-oxidantes, tais como na detoxificação de compostos eletrofílicos, como o 4-
hidroxinonenal, pela ação da glutationa S-transferase (MAHER, 2005). A eliminação de
peróxidos mediada pela GPx conduz a formação da glutationa dissulfeto (GSSG, glutationa
oxidada), a qual pode ser reduzida novamente à GSH por meio da enzima glutationa
redutase (GR), em uma reação dependente de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
reduzida (NADPH) (WANG & BALLTORI, 1998) (Figura 3). A enzima glicose-6-fosfato
desidrogenase (G6PDH) reduz a nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADP
+
) à NADPH e
desse forma participa na proteção frente ao estresse oxidativo por manter a GSH no seu
estado reduzido (MAHER, 2005).
28
Figura 3. Esquema ilustrativo das funções antioxidantes da glutationa. Um
hidroperóxido (ROOH) é reduzido pela glutationa peroxidase (GPx) através da oxidação da
glutationa reduzida (GSH) a glutationa dissulfeto (GSSG). A GSSG é reduzida novamente
a GSH através da ação da glutationa redutase (GR) com oxidação de nicotinamida adenina
dinucleotídeo fosfato reduzida (NADPH) à nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
(NADP
+
), que é reduzido novamente pela G6PDH. A GSH também pode ser utilizada pela
glutationa S-transferase (GST) na detoxificação de compostos eletrofílicos.
Normalmente, o cérebro mantém uma proporção entre GSH/GSSG elevada como
uma defesa antioxidante (WANG & BALTTORI, 1998). Foi demonstrado que em modelos
nos quais ocorre a depleção das reservas intracelulares de GSH, observa-se a morte
neuronal por apoptose, além disso, demonstrou-se que o uso de drogas que causam
diminuição da GSH intracelular tem implicado em maior dano neuronal em resposta a
isquemia (SAVITZ & ROSENBAUM, 1998). Assim, sabe-se que o estresse oxidativo
severo diminui os níveis de GSH total (GSH-t) (TAN et al, 2001), enquanto que estresse
celular moderado pode levar a um aumento nos níveis de GSH-t, o que provavelmente está
envolvido na geração da tolerância celular a insultos posteriores letais (DICKINSON &
FORMAN, 2002; SEO et al, 2004).
1.5. Ácido Quinolínico
O ácido quinolínico (AQ), um metabólito do triptofano proveniente da via das
quinureninas, foi inicialmente estabelecido como um intermediáio na síntese do ácido
nicotínico e da nicotinamida adenina dinucleotídeo (STONE, 2001). A sua importância no
29
SNC só foi reconhecida quando o bioquímico russo Izyaslav Lapin (1978) realizou um
experimento no qual seis quinureninas: DL-quinurenina, ácido quinolínico, ácido 3-hidroxi-
antranílico, ácido xanturênico, ácido picolínico, e o ácido nicotínico foram injetadas
individualmente no ventrículo lateral de camundongos. Lapin observou que todas essas
substâncias produziram excitação motora e/ou convulsões clônicas, e que dentre estes, o
metabólito com ação mais potente era o ácido quinolínico. Logo depois, Trevor Stone e
Martin Perkins (1981) analisaram a ação excitatória do AQ e de seus análogos injetados em
diferentes regiões do SNC e foram os primeiros a levantar suspeita sobre a existência de
subtipos de receptores NMDA.
Atualmente, sabe-se que o AQ causa convulsões através da ação sobre os receptores
NMDA, particularmente, aqueles que contêm subunidades NR2B (MORONI, 1999;
SCHWARCZ & PELLICCIARI, 2002). A toxicidade do AQ tem sido implicada em
diversas condições patológicas do SNC, como as doenças de Huntington e Parkinson
(STONE, 2001), na demência associada a infecção com HIV e na etiologia da epilepsia em
humanos (HEYES et al, 1989; HEYES et al, 1990). Assim, a administração cérebro-
ventricular de AQ tem sido utilizada em modelos animais de convulsões, modelos nos
quais observa-se convulsões tônico-clônicas e morte neuronal nas diversas regiões
hipocampais (SCHMIDT et al, 2000; GANZELLA et al, 2006).
Dessa forma, a toxicidade promovida pelo AQ envolve a ativação dos receptores
NMDA, com desequilíbrio da homeostase do íon cálcio intracelular e disfunção
mitocondrial com exaustão do ATP intracelular (STONE & DARLINGTON, 2002;
NAREDO et al, 2005). Além disso, a toxicidade promovida pelo AQ envolve mecanismos
de estresse oxidativo (NAREDO et al., 2005). Alguns desses mecanismos incluem a
formação de complexos entre o AQ e o íon ferro (Fe
+2
) que medeiam a geração de EROS,
30
alteração do perfil de alguns antioxidantes endógenos, aumento da produção de espécies
reativas de nitrogênio, com conseqüente peroxidação lipídica e carbonilação protéica
(SANTAMARÍA et al, 2003; METERE et al, 2006;).
Além da atuação direta sobre os receptores NMDA, estudos mostraram que o AQ
pode sobrecarregar o sistema glutamatérgico pela modulação do transporte de glutamato.
Demonstrou-se que o AQ é um inibidor da captação de glutamato tanto em preparações de
vesículas sinápticas (TAVARES et al, 2000) quanto em astrócitos em cultura (TAVARES
et al, 2002). O tratamento in vivo com AQ não afeta a captação de glutamato por
sinaptossomas obtidos do cérebro de ratos (TAVARES et al, 2005). Entretanto,
demonstrou-se uma diminuição na captação de glutamato em fatias de hipocampo após a
administração in vivo (i.c.v.) de AQ em ratos (Oliveira et al, 2004). Essas discrepâncias
podem ser devidas aos diferentes tipos de transportadores de glutamato. O AQ também
exerce ação sobre a liberação basal de glutamato em sinaptossomas tanto in vitro
(TAVARES et al, 2002) como após o tratamento in vivo, sem afetar a liberação induzida
por altas concentrações de potássio (TAVARES et al, 2005). Estes dados sugerem que o
AQ promove excitotoxicidade ao atuar nos NMDAR, assim como, por elevar a
concentração extracelular de glutamato.
31
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Avaliar os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na proteção e morte
celular no pré-condicionamento com NMDA e nas convulsões induzidas pelo ácido
quinolínico.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1- Identificar o tipo de morte celular envolvida após o tratamento com ácido quinolínico,
avaliando a fragmentação de DNA em intervalos de 8, 24, 48, 72, 96 horas após a
administração de AQ.
32
2. Avaliar a fragmentação de DNA 48 horas após o pré-condicionamento com NMDA e
após as convulsões induzidas com AQ.
3 - Avaliar a expressão da proteína Caspase-3 em animais pré-condicionados com NMDA e
24 horas após as convulsões induzidas com AQ.
4 - Avaliar a participação de defesas antioxidantes não-protéicas (glutationa) no pré-
condicionamento com NMDA e 24 horas após convulsões induzidas com AQ.
5 - Avaliar a atividade das enzimas envolvidas no metabolismo da glutationa, GPx, GST,
GR e G6PDH, no pré-condicionamento com NMDA e 24 horas após convulsões induzidas
com AQ.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Materiais
N-metil-D-aspartato (NMDA), ácido quinolínico (AQ), nicotinamida adenina dinucleotídeo
fosfato reduzida (NADPH), nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADP
+
), glicose 6-fosfato
(G6P), tert-butilhidroperóxido (tBOOH), cloreto de magnesio, gluationa oxidada (GSSG) e
reduzida (GSH), 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB), glutationa redutase, albumina bovina
sérica, ácido 5,5’-ditio-bis-(2-nitrobenzóico) (DTNB) foram obtidos da Sigma (St. Louis,
MO, U.S.A.). Proteinase K foi obtida da Boehring Mannhein. Anticorpo anti-caspase-3 foi
obtido da ONCOGENE. β-mercaptoetanol, ácido bórico, anticorpos secundários anti-mouse
conjugados à peroxidase, brometo de etídio, glicina, Kit de extração de DNA
(GenomicPrepTm Cells and Tisssue DNA Isolation Kit), Kit ECL, membrana de
nitrocelulose, padrão de pares de bases, persulfato de amônia, duodecil sulfato de sódio
(SDS) e Tris (hidroxi-metil-amino-metano) foram obtidos da GE HealthCare. Padrão de
33
peso molecular foi obtido da BIO-RAD. Filmes fotográficos, soluções reveladora e
fixadora foram obtidos da KODAK. Tiopental sódico foi obtido da Cristalia (Itapira, SP,
Brazil).
3.2. Equipamentos
Agitador magnético, Q-221-2 – Quimis, Aparelho estereotáxico – David Kopf,
Banho-maria, dbm 120 – Benfer, Centrífuga, 5415 D – Eppendorf, Cuba de eletroforese -
Amersham Pharmacia Biotech, Cuba de eletrotransferência - Amersham Pharmacia
Biotech, Espectrofotômetro – Varian Cary 50.
3.3. Animais:
Os camundongos albinos Swiss machos (30-40 g) foram mantidos em temperatura
de 22 ± 1 °C em um ciclo de 12 horas claro (a partir das 7 horas) e 12 horas escuro, em
caixas plásticas (5 animais por caixa) com água e ração disponíveis. Os nossos protocolos
para experimentos com animais foram projetados de maneira que o animal tenha o mínimo
de sofrimento possível e com limite de animais sacrificados (conforme protocolo aprovado
pela CEUA/UFSC).
3.4. Procedimento Cirúrgico
Os animais foram anestesiados com tiopental de sódio administrado por via intra-
peritoneal (i.p.) (10 mL/Kg do animal) e uma cânula guia foi implantada para infusão intra-
34
cerebroventricular (i.c.v.) (SCHMIDT et al, 2000). Em um estereotáxico, a pele do crânio
foi removida e uma cânula guia de 30 G/7 mm foi implantada a 1 mm posterior ao bregma,
1 mm à direita da linha mediana, 1 mm abaixo do ventrículo lateral e fixada com cimento
acrílico.
3.5. Tratamento com NMDA
Após a administração de NMDA (75 mg/Kg de animal) ou salina (NaCl 0,9%) i.p.
os animais foram colocados individualmente em caixas de acrílico (20 x 20 x 20 cm) e,
então, observados por 30 min para a ocorrência de mudanças comportamentais. Os animais
retornaram para a sua respectiva caixa e permaneceram por 24 ou 48 horas.
3.6. Convulsões com Ácido Quinolínico
O ácido quinolínico (4 µL, 9,2 mM, pH 7) ou salina (NaCl 0,9%) foram
administrados i.c.v. através de uma agulha de 30 G/8 mm, introduzida pela cânula guia. Os
animais foram colocados em caixas de acrílico e observados por 10 min para a ocorrência
de mudanças comportamentais como ‘wild running’ (corrida involuntária), episódios
convulsivos tônico ou clônico e convulsão tônico-clônica, que devem ocorrer por pelo
menos 5 segundos (HALLAK et al, 1993). Os animais pré-tratados com NMDA que não
apresentaram as convulsões foram considerados protegidos. Os animais retornaram para a
sua respectiva caixa e permaneceram por 24 horas para os experimentos de imunodetecção
da caspase-3 e de avaliação do metabolsimo da GSH.
35
Nos experimentos de fragmentação de DNA, os animais foram injetados com AQ
(4µl, 9.2mM, pH 7, i.c.v.), então, colocados em caixas de acrílico e observados para a
ocorrência de episódios convulsivos tônico ou clônico e convulsão tônico-clônica.
(HALLAK et al, 1993). Os animais retornaram para sua respectiva caixa e permaneceram
por 8, 24, 48, 72 e 96 horas.
3.7. Separação de Proteínas por Eletroforese (SDS-PAGE)
3.7.1. Separação de Proteínas por Eletroforese
Os córtices cerebrais e hipocampos foram solubilizados em 100 µl de tampão de
amostra (SDS 4 %, 50 mM de Tris-HCl e 100 mM de EDTA , pH 6,8), aquecidas por
cinco minutos para permitir a homogeneização do tecido e 10 µ l de amostra foram retirados
para dosagem de proteína pelo método de Peterson (1977). Em seguida foi adicionada a
solução de diluição de amostra (glicerol 40%, 25 mM de Tris-HCl e azul de bromofenol;
pH 6,8), numa proporção solução de diluição/solução de amostra de 25:100 (v/v), e β-
mercaptoetanol 8%. As proteínas totais (60 µg/poço) foram separadas em um gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE) usando gel de separação com acrilamida 12 % e gel de
36
entrada a acrilamida 4 %. A eletroforese foi realizada com corrente fixa de 40 mA e
voltagem máxima de 140 mV (para 2 géis), por 1-2 horas em temperatura ambiente.
utilizando-se o tampão superior (190mM de glicina, 25mM de Tris e SDS 0,1%) e o
inferior (50 mM de Tris-HCl; pH 8,3). Após a corrida, os géis foram submetidos à
eletrotransferência.
3.7.2. Eletrotransferência e Imunodetecção de proteínas (Western blot)
Após a eletroforese, o gel foi lavado com tampão superior de eletroforese por 30
min. Em seguida, o gel foi equilibrado em tampão de transferência com metanol 10% (50
mM de Ácido Bórico e 4 mM de EDTA; pH 8,9) durante 30 minutos. As proteínas foram
transferidas do gel para a membrana de nitrocelulose (0,4 µm) no sentido do pólo negativo
para o positivo, utilizando um “sanduíche” compreendido de espuma de suporte, papel
filtro, gel, nitrocelulose, novamente papel filtro e espuma de suporte. A transferência foi
realizada a 4°C usando corrente de 400 mA por 1,15 h em uma cuba contendo tampão de
transferência. Após a eletrotransferência, as membranas foram coradas com solução de
Ponceau [0,5% de Ponceau (w/v) em 1% de ácido acético (v/v)] para controle da
transferência e em seguida lavadas com TBS (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5).
Após a lavagem com TBS, as membranas foram bloqueadas (1 hora) com leite
desnatado 5 % em TBS e a seguir lavadas por 3 vezes de 5 min com TBS-T (Tween-20
0,05 %, Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5). As membranas foram incubadas com
anticorpos primários (1:250) contra a proteína caspase-3 por 12-14h horas. Para a detecção
dos complexos imunes, as membranas foram novamente lavadas com TBS-T e o anticorpo
secundário (ligado à peroxidase) na diluição de 1:8000 incubado por 1 hora. Após lavagens
com TBS-T a detecção foi revelada por emissão de quimioluminescência (Kit ECL),
37
seguindo as recomendações do fabricante. As medidas de imunoconteúdo das proteínas
foram realizadas através de densitometria, utilizando o programa Scion Image – Release
Beta 4.0.2., Scion Corporation.
3.8. Análise da Fragmentação do DNA
Os córtices e hipocampos foram lisados e homogeneizadas através de incubação em
um tampão de lise (GenomicPrep
TM
-Cells and Tissue DNA Isolation Kit, GE Healthcare.) e
as proteínas e o RNA liberados das células foram hidrolizados pela adição de proteinase K
(100 µg/ml) e RNAse (20 µg/ml), respectivamente. O homogeneizado foi centrifugado a
16.000 g por 15 min a 4
o
C. Os ácidos nucléicos foram então sedimentados utilizando-se
isopropanol a 4
o
C durante um período de 12 horas e posteriormente centrifugados a 16.000
g por 30 min. Aos precipitados formados foi adicionado etanol 70 % com posterior
centrifugação a 16.000 g por 15 minutos. O sobrenadante foi cuidadosamente retirado e
então foi adicionada uma solução de reidratação (kit). O DNA obtido foi então submetido a
uma eletroforese em um gel de agarose a 2 % com 100 ug/ml de brometo de etídio e
posteriormente visualizado utilizando-se um transiluminador como fonte de luz ultravioleta
(YANG & PAUL, 1997).
3.9. Avaliação dos níveis de Glutationa total (GSH-t)
Os córtices e hipocampos foram homogeneizados em 10 volumes de acido perclórico
0,5 M e centrifugados a 15.000 g por 2 min. Para determinar os níveis de glutationa total
(glutationa reduzida + oxidada), foi utilizado o método descrito por Tietze (1969) e
38
modificado por Akerboom & Sies (1981). O meio de reação utilizado era composto por 0,1
M fosfato de potássio, 1 mM EDTA, pH 7,0, ácido 5, 5´-ditiobis-2-nitrobenzóico (DTNB)
1,67 mg/ml, NADPH 4 mg/ml em 0,5% de KHCO
3
ou NaHCO
3
e GR 0,1 U/ml. A 810-900
µL do meio de reação, adiciona-se 100-10 µl de amostra. Uma curva padrão de GSSG foi
construída para comparação com a leitura de equivalentes de GSH-t das amostras, a qual foi
realizada a 25
º
C por 3 min, a 412 nm e é expressa em ∆ABS
TNB
/min. A inibição da GR é um
fator crítico do método. Para corrigir esta inibição uma quantidade conhecida de GSSG (0,5
µM em 50 µl) foi adicionada à amostra, e serviu como um controle interno (DAFRÉ, 1996).
3.10. Ensaios Enzimáticos
Os córtices cerebrais e hipocampos foram homogeneizados em tampão HEPES 20
mM, pH 7,4. As amostras foram então centrifugadas a 20.000 g por 30 min a 4
o
C e o
sobrenadante resultante foi usado para os ensaios enzimáticos. As atividades enzimáticas
foram determinadas no sobrenadante em um espectrofotômetro Varian Cary 50.
3.10.1. Avaliação da atividade da Glutationa Peroxidase (GPx)
A GPx catalisa a redução do H
2
O
2
, bem como de peróxidos orgânicos, utilizando a
glutationa reduzida (GSH) como co-substrato para esta reação para produzir glutationa
oxidada (GSSG). A GSSG é reduzida pela glutationa redutase com o consumo de NADPH
(ε = 6.220 M
-1
cm
-1
), que pode ser acompanhado espectrofotometricamente em 340 nm
(Wendel, 1981; Flohé & Günzler, 1984). Para este ensaio, o meio de reação continha 0,1 M
de tampão fosfato pH 7,0, 1 mM de EDTA, 1 mM de GSH e 0,1 mM de NADPH.
Adicionou-se amostra neste meio para mensurar o consumo inespecífico de NADPH
39
através de uma leitura por 2 min a 340 nm. Ao adicionar o substrato t-BOOH
(hidroperóxido de tert-butila) 1 mM, a leitura foi realizada por mais 2 min. Ao decréscimo
de absorbância por minuto obtido descontou-se o consumo inespecífico de NADPH. O
valor obtido foi dividido pelo coeficiente de extinção molar do NADPH (ε = 6.220 M
-1
cm
-
1
) e multiplicado pelas diluições. O valor foi expresso como nUnidade/min/mg de proteína.
Uma Unidade corresponde a 1 µmol/ml/min.
3.10.2.
Avaliação da Atividade Glutationa S-Transferase (GST)
Durante o ensaio, a GST catalisa a conjugação da GSH com o substrato sintético 1-
cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) que produz um conjugado que é detectado em 340 nm. A
atividade enzimática é proporcional à velocidade de produção do composto conjugado
(Habig & Jakoby, 1981). Para este ensaio, o meio de reação continha 0,1M de tampão
fosfato pH 7,0, 1 mM de EDTA e 1 mM de GSH. Foram feitas leituras independentes
realizadas por 2 min para mensurar a velocidade da reação espontânea do CDNB com GSH,
neste caso, sem a presença da amostra. Depois de acrescentar a amostra e o segundo
substrato (CDNB 1 mM) ao meio de reação, realizou-se a leitura por 2 min a 340 nm a 30º
C. Ao decaimento por minuto obtido com a amostra, descontou-se a velocidade da reação
espontânea. O valor obtido pelo coeficiente de extinção molar do conjugado GSH/CDNB (ε
= 9.600 M
-1
cm
-1
) foi multiplicado pelas diluições. . O valor foi expresso como
mUnidades/mg de proteína.
3.10.3. Avaliação da atividade da Glutationa Redutase (GR)
A GR é uma enzima que catalisa a redução dependente de NADPH da glutationa
oxidada (GSSG) em glutationa reduzida (GSH). O meio de reação utilizado para a
40
avaliação desta enzima foi composto por 50 mM de tampão fosfato de potássio pH 7,0, 1
mM de EDTA, 1 mM de GSSG e 0,225 mM de NADPH. Após adicionar a amostra, o
consumo inespecífico de NADPH foi medido por 2 min a 340 nm. Ao adicionar o substrato
GSSG 1 mM, a leitura foi realizada por 2 min adicionais. Do decaimento por minuto obtido
descontou-se o consumo inespecífico de NADPH. O valor obtido foi dividido pelo
coeficiente de extinção molar do NADPH (ε = 6.220 M
-1
cm
-1
) e multiplicado pelas
diluições. O valor foi expresso como mUnidades/mg de proteína. Uma Unidade
corresponde a 1 µmol/ml/min.
3.10.4. Avaliação da atividade da Glicose 6-fosfato Desidrogenase (G6PDH)
A G6PDH catalisa a redução de NADP
+
à NADPH através da oxidação da glicose
6-fosfato. A glicose 6-fosfato é oxidada pela G6PDH com o formação de NADPH, que
pode ser acompanhado espectrofotometricamente em 340 nm (GLOCK & MCLEANC,
1953). O meio de reação utilizado para a avaliação desta enzima foi composto por 50 mM
de Tris pH 7,4, 3 mM de MgCl
2
, 0,13 mM de NADP
+
, 1,5 mM de glicose- 6-fosfato. Ao
meio de reação com a amostra foi adicionado o substrato glicose 6-fosfato 1,5 mM e a
absorbância relativa à formação do NADPH/min foi lida a 340 nm durante 2 minutos a 30
o
C. O valor foi expresso como mUnidade/mg de proteína.
3.11. Dosagem de proteína:
41
A concentração protéica foi determinada pelo método de Peterson (1977) para
proteínas que foram submetidas à eletroforese ou pelo método de Bradford (1976) nos
experimentos de dosagem da atividade enzimática. A albumina bovina sérica foi utilizada
como padrão.
3.12. Análise estatística:
A análise estatística foi realizada através da análise de variância de uma via
(ANOVA), seguida do teste de Duncan. Os dados estão expressos como a média ± erro
padrão e os experimentos foram realizados em triplicatas. Foram considerados
significativos valores com p < 0,05.
4. RESULTADOS
4.1. ANÁLISE DA FRAGMENTAÇÃO DE DNA
Boeck e cols (2004) demonstraram que a administração i.c.v. de AQ induz lesão
celular no hipocampo de camundongos. No entanto, o tipo de morte celular desencadeada
pela infusão de AQ in vivo não é bem conhecido. Sabe-se que a indução de fragmentação
do DNA tem sido considerada como um parâmetro para a caracterização de morte celular
por apoptose (ISHIMARU et al, 1999; SASTRY & RAO, 2000). Deste modo, este
parâmetro de morte celular por apoptose foi utilizado para identificar o tipo de morte
celular induzido pelo AQ in vivo.
42
Os camundongos foram tratados com AQ para a indução de convulsões e após 8,
24, 48, 72, ou 96 horas foram mortos por decapitação e os córtices cerebrais e hipocampos
removidos para a análise da fragmentação do DNA. O padrão de migração eletroforética
em gel de agarose de amostras de DNA extraídas do córtex cerebral e hipocampo pode ser
observado nas Figuras 4 e 5, respectivamente. Nestas figuras pode se observar que o
tratamento com AQ não promoveu fragmentação do DNA em nenhum dos tempos
observados tanto no córtex cerebral (Figura 4) quanto no hipocampo (Figura 5) quando
comparados com o grupo controle tratado com salina ( NaCl 0.9%, i.c.v.)
Figura.4. Análise da fragmentação internucleossomal do DNA do córtex de
camundongos após tratamento com ácido quinolínico i.c.v. Os animais foram mortos
43
por decapitação 8, 24, 48, 72 e 96 horas após a infusão de AQ (36,8 nmóis, i.c.v.). As
colunas correspondem: pb: marcador de pares de bases de DNA 100 pb; Controle: salina. A
análise da fragmentação do DNA ocorreu por eletroforese em gel de agarose, conforme
descrito em Materiais e Métodos. Figura representativa de três experimentos do gel de
agarose para amostras do córtex.
Figura. 5. Análise da fragmentação internucleossomal do DNA do hipocampo de
camundongos após tratamento com ácido quinolínico i.c.v. Os animais foram mortos
por decapitação 8, 24, 48, 72 e 96 horas após a infusão de AQ (36,8 nmóis, i.c.v.). As
colunas correspondem: pb: marcador de pares de bases de DNA 100 pb; Controle: salina. A
44
análise da fragmentação do DNA ocorreu por eletroforese em gel de agarose, conforme
descrito em Materiais e Métodos. Figura representativa de três experimentos do gel de
agarose para amostras do hipocampo.
Demonstrou-se que o pré-condicionamento com NMDA é eficiente em proteger os
animais das convulsões induzidas pelo AQ e do dano celular causado pelo mesmo durante
um intervalo de tempo de 24 a 48 horas (BOECK et al, 2004). Contudo, os mecanismos
desencadeados pelo pré-condicionamento não são bem caracterizados. A análise da
fragmentação do DNA de amostras do córtex cerebral e hipocampo de camundongos 24 h
após as convulsões induzidas pelo AQ em animais pré-condicionados com NMDA não
revelou nenhum aumento na fragmentação do DNA (BOECK et al, 2005).
Com o intuito de verificar se o pré-condicionamento com NMDA altera a fragmentação de
DNA por um período de tempo mais prolongado, este parâmetro de morte celular foi
avaliado em amostras de DNA do córtex cerebral e hipocampo de camundongos após o pré-
condicionamento com NMDA e 48 horas após as convulsões induzidas pelo AQ. Quando
comparados com o grupo controle, o pré-condicionamento com NMDA não promoveu
nenhuma alteração na fragmentação do DNA no córtex cerebral (Figura 6) e no hipocampo
(Figura 7) tanto nos animais protegidos das convulsões induzidas por AQ, como naqueles
não protegidos.
45
Figura. 6. Análise da fragmentação internucleossomal do DNA do córtex cerebral de
camundongos 48 horas após tratamento com NMDA e/ou ácido quinolínico. Os
animais foram tratados com veículo (salina, grupo controle), ou NMDA (75 mg/kg, i.p.) 24
h antes da infusão de AQ (36,8 nmóis, i.c.v) e foram observados por 10 minutos para a
ocorrência de convulsões. Os animais retornaram para suas respectivas caixas e foram
mortos após 48 h da infusão de AQ e os córtices cerebrais foram removidos. NQnc indica
os animais tratados NMDA + QA não convulsionados e NQc indica os animais tratados
com NMDA + QA convulsionados pb: marcador de pares de bases de DNA 100 pb. A
análise da fragmentação do DNA ocorreu por eletroforese em gel de agarose, conforme
descrito em Materiais e Métodos. Figura representativa de três experimentos.
46
Figura. 7. Análise da fragmentação internucleossomal do DNA do hipocampo de
camundongos 48 horas após tratamento com NMDA e/ou ácido quinolínico. Os
animais foram tratados com veículo (salina, grupo controle), ou NMDA (75 mg/kg, i.p.) 24
h antes da infusão de AQ (36,8 nmóis, i.c.v) e foram observados por 10 minutos para a
ocorrência de convulsões. Os animais retornaram para suas respectivas caixas e foram
mortos após 48 h da infusão de AQ e os hipocampos foram removidos. NQnc indica os
animais tratados NMDA + QA não convulsionados e NQc indica os animais tratados com
NMDA + QA convulsionados pb: marcador de pares de bases de DNA 100 pb. A análise da
fragmentação do DNA ocorreu por eletroforese em gel de agarose, conforme descrito em
Materiais e Métodos. Figura representativa de três experimentos.
47
4.2. IMUNODETECÇÃO DA CASPASE-3.
Diversos estudos demonstraram que as vias intrínsecas e extrínsecas da apoptose
convergem para a ativação da caspase-3, onde esta é ativada através de um processo de
proteólise (COHEN, 1997; STENNICKE & SALVESEN, 1998; GRÜTTER, 2000). Visto
que um dos mecanismos propostos para a geração da tolerância cerebral induzida pelo pré-
condicionamento envolve a atenuação das vias de morte celular, foi realizada uma
avaliação da participação da caspase-3 no pré-condicionamento com NMDA e nas
convulsões induzidas pelo AQ.
A imunomarcação da caspase-3 foi avaliada no córtex cerebral e hipocampo
de camundongos após o pré-condicionamento com NMDA e 24 horas após as convulsões
induzidas pelo AQ. A caspase-3 total (32 kDa) e o fragmento de 17 kDa foram detectados
tanto no córtex cerebral (Figura 8 A) como no hipocampo (Figura 9 A). No entanto, a
quantificação da imunodetecção da caspase-3 (Figura 8 B e Figura 9 B) não revelou
nenhuma alteração entre os tratamentos realizados independente da ocorrência ou não de
convulsões em relação ao grupo controle.
48
Figura 8. Imunodetecção da proteína Caspase-3 e de seu fragmento de 17 kDa no
córtex cerebral de camundongos tratados com NMDA e/ou ácido quinolínico. Os
animais foram tratados com veículo (salina, grupo controle) ou NMDA (75 mg/kg, i.p.) 24
h antes da infusão de AQ (36,8 nmóis, i.c.v.) e foram observados por 10 minutos para a
ocorrência de convulsões. NQnc indica os animais tratados NMDA + QA não
convulsionados e NQc indica os animais tratados com NMDA + QA convulsionados A.
Fotografia representativa de “western bloting” do córtex cerebral de camundongos, n = 6.
B. Quantificação da densidade ótica das bandas marcadas para a proteína Caspase-3 de
amostras do córtex cerebral. Os valores representam média ± erro padrão. (ANOVA
seguido do teste de Duncan).
49
Figura 9. Imunodetecção da proteína Caspase-3 e de seu fragmento de 17 kDa no
hipocampo de camundongos tratados com NMDA e/ou ácido quinolínico. Os animais
foram tratados com veículo (salina, grupo controle) ou NMDA (75 mg/kg, i.p.) 24 h antes
da infusão de AQ (36,8 nmóis, i.c.v.) e foram observados por 10 minutos para a ocorrência
de convulsões. NQnc indica os animais tratados NMDA + QA não convulsionados e NQc
indica os animais tratados com NMDA + QA convulsionados A. Fotografia representativa
de “western bloting” do hipocampo de camundongos, n = 6. B. Quantificação da densidade
ótica das bandas marcadas para a proteína Caspase-3 de amostras do hipocampo. Os
valores representam média ± erro padrão. (ANOVA seguido do teste de Duncan).
50
4.3. AVALIAÇÃO DA GLUTATIONA TOTAL E DA ATIVIDADE DE SUAS
ENZIMAS RELACIONADAS
Considerando que os níveis de GSH-t são considerados marcadores do estresse
oxidativo (MAHER, 2005), o conteúdo de GSH-t foi avaliado no córtex cerebral e
hipocampo de camundongos após o pré-condicionamento com NMDA e 24 horas após as
convulsões induzidas pelo AQ.
Na Figura 10 observa-se que o tratamento com NMDA ou a infusão de AQ não
provocaram nenhuma alteração nos níveis de GSH-t tanto no córtex como no hipocampo
em comparação com o grupo controle (salina). Adicionalmente, os níveis de GSH-t total
não estavam alterados entre os grupos não-convulsionado (NQnc) e convulsionado (NQc)
(Figura 10).
51
Controle NMDA AQ NQnc NQc
0
25
50
75
100
125
150
Córtex Cerebral
Hipocampo
Níveis de GSH-t
(% do controle)
Figura 10. Avaliação dos níveis de glutationa total (GSH-t) no pré-condicionamento
com NMDA contra as convulsões induzidas pelo AQ no córtex cerebral e hipocampo
de camundongos. Os animais foram tratados com veículo (salina, grupo controle) (n=7),
ou NMDA (n = 8) (75 mg/kg, i.p.) 24 h antes da infusão de AQ (36,8 nmóis, i.c.v.) (n = 5)
e foram observados por 10 minutos para a ocorrência de convulsões. NQnc indica os
animais tratados NMDA + QA não convulsionados (n = 9) e NQc indica os animais
tratados com NMDA + QA convulsionados (n = 9). Os valores estão apresentados como
porcentagem do controle (100%) e representam media ± erro padrão. Os níveis de GSH-t
do grupo controle são 2,28 ± 0,12 µmol/g tecido para o córtex cerebral e 2,05 ± 0,13
µmol/g tecido para o hipocampo. (ANOVA seguido do teste de Duncan).
52
Como uma atividade aumentada da GPx foi demonstrada após o pré-
condicionamento hipóxico (ARTHUR et al, 2004), a atividade da GPx foi avaliada no
córtex e hipocampo de camundongos após o pré-condicionamento com NMDA, assim
como após a infusão i.c.v. de AQ.
Como pode ser observado na Figura 11, todos os camundongos tratados com AQ
apresentaram uma diminuição significativa na atividade da GPx cortical quando
comparados com os grupos controle e NMDA. Assim, nota-se que o pré-condicionamento
com NMDA não aboliu a redução na atividade da GPx induzida pelo AQ no córtex cerebral
mesmo nos animais que não apresentaram convulsões (grupo NQnc). No hipocampo, o
grupo tratado com salina i.p. e AQ i.c.v. apresentou uma redução significativa na atividade
da GPx em relação ao grupo controle. O pré-condicionamento com NMDA preveniu a
diminuição induzida pelo AQ, o que pode ser considerado um efeito protetor.
53
Controle NMDA AQ NQnc NQc
0
20
40
60
80
100
120
Córtex Cerebral
Hipocampo
#
#
#
*
Atividade da GPx
(% do controle)
Figura 11. Atividade da Glutationa peroxidase (GPx) no córtex cerebral e hipocampo
de camundongos após o pré-condicionamento com NMDA e a infusão de AQ. Os
animais foram tratados com veículo (salina, grupo controle) (n=6), ou NMDA (n = 6) (75
mg/kg, i.p.) 24 h antes da infusão de AQ (36,8 nmóis, i.c.v.) (n = 5) e foram observados por
10 minutos para a ocorrência de convulsões. NQnc indica os animais tratados NMDA + QA
não convulsionados (n = 7) e NQc indica os animais tratados com NMDA + QA que
convulsionados (n = 6). Os valores estão apresentados como porcentagem do controle (100
%, 15,76 ± 0,38 nU/min/mg proteína para o córtex cerebral e 8,29 ± 0,18 nU/min/mg
proteína para o hipocampo) e representam media ± erro padrão.* p < 0,05 comparado com
o grupo controle. # p < 0,05 comparado com os grupos controle e NMDA. (ANOVA
seguido do teste de Duncan).
54
A partir de demonstrações prévias de que o AQ é capaz de gerar produtos da
peroxidação lipídica (YAN et al, 2005), e a GST é capaz de detoxificar tais compostos
(MAHER, 2005), seguiu-se a análise dos efeitos do pré-condicionamento com NMDA e do
AQ sobre a atividade da GST.
No córtex cerebral, observou-se que o pré-condicionamenteo com NMDA e a
administração i.c.v. de AQ resultaram em um aumento na atividade da GST quando
comparados com o grupo controle (Figura 12). Contudo, a associação do pré-
condicionamento com NMDA e a infusão de AQ preveniram este aumento tanto nos
animais convulsionados (NQc) quanto nos não convulsionados (NQnc). No hipocampo,
nenhuma alteração foi observada na atividade da GST entre os grupos apesar dos
tratamentos ou da ocorrência de convulsões (Figura 12).
55
Controle NMDA AQ NQnc NQc
0
25
50
75
100
125
150
Córtex Cerebral
Hipocampo
*
#
Atividade da GST
(% do controle)
Figura 12. Atividade da Glutationa S-transferase (GST) no córtex cerebral e
hipocampo de camundongos após o pré-condicionamento com NMDA e a infusão de
AQ. Os animais foram tratados com veículo (salina, grupo controle) (n=6), ou NMDA (n =
9) (75 mg/kg, i.p.) 24 h antes da infusão de AQ (36,8 nmóis, i.c.v.) (n = 5) e foram
observados por 10 minutos para a ocorrência de convulsões. NQnc indica os animais
tratados NMDA + QA não convulsionados (n = 10) e NQc indica os animais tratados com
NMDA + QA que convulsionados (n = 8). Os valores estão apresentados como
porcentagem do controle (100 %, 76,1 ± 0,57 nU/min/mg proteína para o córtex cerebral e
134,2 ± 1,12 nU/min/mg proteína para o hipocampo) e representam media ± erro padrão. *
p < 0,05 comparado com o grupo controle. # p < 0,05 comparado com os grupos controle e
NQnc. (ANOVA seguido do teste de Duncan).
56
A glutationa dissulfeto (GSSG), gerada a partir da atividade da GPx em resposta ao
estresse oxidativo, é reduzida novamente a GSH pela GR em uma reação dependente de
NADPH, o qual é originado pela atividade da G6PDH. O pré-condicionamento com
NMDA associado ou não com a infusão de AQ não provocou nenhuma alteração
significativa em ambas as enzimas GR (Figura 13) e G6PDH (Figura 14), tanto no córtex
como no hipocampo em comparação ao grupo controle.
Controle NMDA AQ NQnc NQc
0
20
40
60
80
100
120
Córtex Cerebral
Hipocampo
Atividade da GR
(% do controle)
Figura 13. Atividade da Glutationa redutase (GR) no córtex cerebral e hipocampo de
camundongos após o pré-condicionamento com NMDA e a infusão de AQ. Os animais
foram tratados com veículo (salina, grupo controle) (n=6), ou NMDA (n = 6) (75 mg/kg,
i.p.) 24 h antes da infusão de AQ (36,8 nmóis, i.c.v.) (n = 6) e foram observados por 10
minutos para a ocorrência de convulsões. NQnc indica os animais tratados NMDA + QA
não convulsionados (n = 7) e NQc indica os animais tratados com NMDA + QA que
convulsionados (n = 6). Os valores estão apresentados como porcentagem do controle (100
%, 28,6 ± 0,6 nU/min/mg proteína para o córtex cerebral e 34,4 ± 0,5 nU/min/mg proteína
57
para o hipocampo) e representam media ± erro padrão. (ANOVA seguido do teste de
Duncan).
Controle NMDA AQ NQnc NQc
0
20
40
60
80
100
120
Córtex Cerebral
Hipocampo
Atividade da G6PDH
(% do controle)
Figura 14. Atividade da Glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH) no córtex cerebral e
hipocampo de camundongos após o pré-condicionamento com NMDA e a infusão de
AQ. Os animais foram tratados com veículo (salina, grupo controle) (n=6), ou NMDA (n =
6) (75 mg/kg, i.p.) 24 h antes da infusão de AQ (36,8 nmóis, i.c.v.) (n = 6) e foram
observados por 10 minutos para a ocorrência de convulsões. NQnc indica os animais
tratados NMDA + QA não convulsionados (n = 8) e NQc indica os animais tratados com
NMDA + QA que convulsionados (n = 8). Os valores estão apresentados como
porcentagem do controle (100 %, 13,45 ± 0,19 nU/min/mg proteína para o córtex cerebral e
7,02 ± 0,22 nU/min/mg proteína para o hipocampo) e representam media ± erro padrão.
(ANOVA seguido do teste de Duncan).
58
5. DISCUSSÃO
O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório no SNC de mamíferos e a
ativação de seus receptores está envolvida em processos fisiológicos e patológicos. A
ativação excessiva dos NMDAR pode induzir morte celular tanto por apoptose como por
necrose (NICHOLLS & BUDD, 1998; ARUNDINE & TYMIANSKI, 2003). Demonstrou-
se que a injeção intra-hipocampal de cainato em ratos provoca morte celular com
características necróticas e apoptóticas (CHANG et al, 2005), assim como o glutamato
promove morte celular com características apoptóticas em fatias de hipocampo (MOLZ et
al, 2005).
O AQ é um agonista dos NMDAR envolvido com a toxicidade celular através da
geração de radicais livres, distúrbio da transmissão glutamatérgica e está associado a
diversas condições patológicas do SNC (STONE & DARLINGTON, 2002). Neste estudo,
avaliou-se a fragmentação do DNA, um parâmetro indicador de morte celular por apoptose,
para caracterizar o tipo de morte celular induzida pela infusão de AQ i.c.v. em
camundongos.
A curva de tempo da análise da fragmentação do DNA no córtex cerebral (Figura 1)
e hipocampo (Figura 2) após as convulsões induzidas pelo AQ não revelou fragmentação
do DNA. Em outro estudo, foi demonstrado que a injeção i.c.v. de AQ aumenta
significantemente a captação de iodeto de propídio a partir de 4h até 72 h após o insulto
com AQ (GANZELLA et al, 2006). O iodeto de propídio é um composto polar que entra
59
somente nas células com a membrana plasmática rompida (WROBEL et al, 1996). Estes
resultados de fragmentação do DNA e captação de iodeto de propídio sugerem uma morte
celular por necrose após as convulsões induzidas pelo AQ.
As proteases caspases são clivadas e ativadas quando o processo de morte por
apoptose é desencadeado. Nos experimentos de imunodetecção da caspase-3, não se
observou um aumento na detecção do fragmento de 17 kDa, que representa a forma ativada
da caspase-3, tanto no córtex cerebral (Figura 8) como no hipocampo (Figura 9) após o
tratamento com AQ em relação ao grupo controle. Além disso, o tratamento com AQ não
promoveu diminuição no conteúdo de GSH nas estruturas avaliadas (Figura 10),
considerando-se que a depleção da GSH celular está envolvida no desencadeamento de
cascatas de morte celular por apoptose (SAVITZ & ROSENBAUM, 1998). Assim, as
ausências de fragmentação de DNA e detecção do fragmento de 17 kDa, além da falta de
alterações nos níveis de GSH-t sugerem que a injeção de AQ i.c.v. promova morte celular
por um processo necrótico no córtex cerebral e hipocampo. Por outro lado, a injeção de AQ
intra-estriatal desencadeia uma cascata de morte celular apoptótica com dano ao DNA e
ativação da caspase 3 nos neurônios espinhosos médios do estriado (QIN et al, 1999;
SENATOROV et al, 2004).
Visto que a excitotoxicidade glutamatérgica está envolvida em diversos modelos de
dano cerebral, como a isquemia, tanto in vitro como in vivo, a atenuação desse processo de
injúria celular poderia estar envolvido com o estado de tolerância cerebral induzido pelo
pré-condicionamento. De fato, diversos modelos de pré-condicionamento demonstraram a
participação do sistema glutamatérgico na geração da tolerância cerebral (GIDDAY, 2006).
Em modelos de pré-condicionamento isquêmico, o tratamento com MK-801 previne
o efeito neuroprotetor de uma isquemia breve, no entanto, o tratamento com antagonistas
60
dos receptores AMPA não influenciam a neuroproteção, salientando, desse modo, o
envolvimento do sistema glutamatérgico, especialmente dos NMDAR (BOND et al, 1999).
Além disso, o pré-condicionamento isquêmico e hipóxico promovem um aumento na
expressão de GLT-1 e GLAST nas áreas cerebrais protegidas (CIMAROSTI et al, 2005;
ZHANG et al, 2007). Assim, o sistema glutamatérgico participa do pré-condicionamento
cerebral tanto na sua fase de indução, através dos NMDAR, como também na fase de
efetuação, por meio dos transportadores de glutamato que regulam os níveis extracelular de
glutamato.
Os receptores adenosinérgicos influenciam o pré-condicionamento com NMDA.
Boeck e cols (2004) demonstraram que a administração de um antagonista dos receptores
A
1
reverte a proteção promovida pelo pré-condicionamento com NMDA contra convulsões
induzidas pelo AQ. No entanto, esse antagonista de receptores A
1
não aboliuir a proteção
celular do pré-condicionamento contra o dano citotóxico no hipocampo causado pelo AQ
(BOECK et al 2004). No mesmo estudo, verificou-se que o N-ciclopentiladenosina, um
agonista de receptor de adenosina do sub-tipo A
1
, não alterou a incidência de convulsões,
como também não afetou o dano celular induzido pelo AQ.
Além disso, em cultura de neurônios granulares também se demonstrou a
participação dos receptores adenosinérgicos e receptores do fator neurotrófico derivado do
cérebro. A administração de antagonistas do receptor A
1
, mas não de antagonistas do
receptor A
2A
, reverte a neuroproteção mediada pelo pré-condicionamento com NMDA
contra a morte celular induzida por glutamato (BOECK et al 2005b). Zhu e cols. (2005)
observaram que o efeito neuroprotetor do pré-condicionamento com NMDA era atenuado
pela co-administração de um inibidor da atividade dos receptores do fator neurotrófico
61
derivado do cérebro do tipo TrkB. Esses dados sugerem uma importante interação entre o
sistema adesinérgico e as neurotrofinas com o pré-condicionamento com NMDA.
Além da atenuação de processos de lesão celular, o pré-condicionamento
promoveria proteção neural através do aprimoramento dos processos de reparo celular.
Sabe-se que a isquemia e o período de reperfusão são acompanhados de dano oxidativo ao
DNA que precede a morte celular. Assim, entre estes, os processos de reparo endógeno do
DNA poderiam ser um dos mecanismos potencializados pelo pré-condicionamento
cerebral.
No presente estudo, avaliou-se a análise da fragmentação do DNA após o pré-
condicionamento com NMDA. Os resultados não revelaram fragmentação do DNA tanto
no córtex cerebral (Figura 6) como no hipocampo (Figura 7). Assim, a dose sub-
convulsivante de NMDA utilizada não causou dano ao DNA, resultado semelhante
encontrado na análise da fragmentação 24 h após as convulsões com AQ (BOECK et al,
2005a). Estudos com pré-condicionamento isquêmico também demonstraram que o
estimulo pré-condicionante não causa dano ao DNA, e além disso, previnem a
fragmentação do mesmo induzida por uma isquemia letal (SUGAWARA et al, 2001). No
mesmo estudo, os autores demonstraram que a proteção neural após o pré-condicionamento
isquêmico estava acompanhado de um aumento na expressão da proteína Ku 70 nas áreas
protegidas. A proteína Ku 70 é uma componente da maquinaria protéica envolvida no
reparo do DNA. Esta proteína se une às fitas danificadas de DNA e iniciam, assim, o
processo de reparo do mesmo. Estes resultados sugerem que os mecanismos de reparo do
DNA podem estar envolvidos com a tolerância cerebral (SUGAWARA et al, 2001).
Os mecanismos moleculares responsáveis pela neuroproteção induzida pelo pré-
condicionamento parecem envolver também tanto o aumento na expressão e atividade de
62
moléculas envolvidas na sobrevivência celular como a redução daquelas associadas à morte
celular.
No presente estudo, avaliou-se a expressão da caspase-3 no córtex e hipocampo
após o tratamento com NMDA e com AQ. Os resultados não revelaram nenhuma alteração
na expressão da caspase-3 total (32 kDa, pró-caspase) tanto após o pré-condicionamento
com NMDA e quanto com o tratamento com AQ. A avaliação do fragmento de 17 kDa, que
representa a forma ativada da caspase-3, também não demonstrou alteração nos grupos
tratados em relação ao controle, sugerindo que a ativação da caspase-3 não é essencial no
pré-condicionamento com NMDA. No entanto, Qi e cols (2001) demonstraram uma
diminuição na ativação da caspase-3 pelo pré-condicionamento isquêmico no prosencéfalo
de camundongos. Por outro lado, em outros modelos de pré-condicionamento isquêmico,
foram demonstrada a clivagem da caspase-3 e sua subseqüente ativação durante um
intervalo de tempo coincidente com o período de tolerância isquêmica (TANAKA et al,
2004; MCLAUGHLIN et al, 2005). Dessa forma, durante a tolerância cerebral a ativação
da caspase-3 não é acompanhada de morte celular. Isso pode ser resultado da intervenção
negativa do pré-condicionamento sobre um dos alvos da caspase-3 a DNase-ativada por
caspase, uma deoxiribonuclease que cataliza a fragmentação do DNA, evitando assim a
morte celular (TANAKA et al, 2004).
Em modelos de pré-condicionamento hipóxico, a expressão de outras proteínas pró-
apoptóticas como a Bax encontra-se reduzida (RYBNIKOVA et al, 2006). A Bax, quando
ativada por um insulto isquêmico, sofre uma alteração conformacional, se oligomeriza e se
transloca para a mitocôndria, onde pode formar poros e resultar na liberação de fatores
apoptogênicos mitocondriais que ativam as caspases (LEBLANC, 2003). Do mesmo modo,
63
a proteína pró-apoptótica Bim sofre rápida degradação pelo sistema ubiquitina-proteossoma
na aquisição de tolerância isquêmica (MELLER et al, 2006).
Além disso, a expressão aumentada das proteínas de choque térmico HSP 27 e HSP
72, ambas envolvidas com a proteção celular, podem contribuir para a tolerância cerebral
induzida pelo pré-condicionamento (PLUMIER et al, 1997; MORI et al, 2000 VALENTIM
et al, 2003). Outros dados de pré-condicionamento isquêmico demonstram um aumento na
expressão das proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-xL. Neste mesmo modelo, foi
demonstrado que a ativação da proteína de união do elemento de resposta ao AMP cíclico
regula a expressão dessas proteínas durante a aquisição da tolerância cerebral (MELLER et
al, 2005).
As enzimas antioxidantes também são candidatas em potencial como moléculas
efetoras do pré-condicionamento cerebral (DANIELISOVA et al, 2005), como o
promovido pelo NMDA contra convulsões induzidas pelo AQ, desde que aquelas poderiam
combater os efeitos das ERO, as quais se sabe participar da excitoxicidade promovida pelo
AQ (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al, 2000; GANZELLA et al, 2006).
Visto que a GSH é o tiol não protéico mais abundante nas células, os níveis de
GSH-t e a razão entre a glutationa reduzida e oxidada (GSH/GSSG) são considerados
indicadores do estado redox celular e podem ser considerados como marcadores do estresse
oxidativo (MAHER, 2005). Assim neste trabalho, com o intuito de elucidar as moléculas
efetoras ativadas por uma dose sub-convulsivante de NMDA e os efeitos tóxicos do AQ,
uma avaliação do sistema antioxidante da GSH foi realizada, desde que é amplamente
demonstrado na literatura que os níveis celulares de GSH estão relacionados a
sobrevivência ou morte celular (WULLNER et al, 1999; RIZZARDINI et al, 2003; SIMS et
al, 2004).
64
Neste modelo, o pré-condicionamento com NMDA não provocou nenhuma
alteração nos níveis de GSH-t, indicando que o pré-tratamento com NMDA não promoveu
estresse oxidativo (Figura 10). De fato, este resultado não é surpreendente a partir de que
não houve alterações nas atividades da GPx e GR nos animais pré-condicionados (Figura
11 e Figura 13). Estes resultados estão em desacordo com achados prévios in vitro, nos
quais um aumento nos níveis de GSH são demonstrados (SINGH et al, 2006) após o
tratamento com uma dose sub-tóxica de NMDA, apesar de que no presente trabalho a razão
GSH/GSSG não foi avaliada. O AQ também não provocou nenhuma alteração nos níveis de
GSH-t 24 h após sua infusão. Esta ausência de efeito do AQ sobre o conteúdo cortical e
hipocampal de GSH poderia se atribuída ao fato de que os ERO gerados após a infusão de
AQ i.c.v. estão aumentados 4 h depois do tratamento, mas retornam aos valores do grupo
controle após 24 h. (GANZELLA et al, 2006).Cruz-Aguado e cols (2000) demonstraram
uma diminuição de 30% no conteúdo estriatal de GSH, no entanto, sem alterações nos
níveis de GSH no córtex e hipocampo.
Em relação às enzimas associadas a GSH, nenhuma alteração na atividade da GPx
foi induzida pelo pré-condicionamento com NMDA (Figura 11), o que está de acordo com
relatos prévios na literatura, nos quais outros estímulos pré-condiconantes foram utilizados,
tais como isquemia (PUISIEUX et al, 2004) e depressão cortical alastrante (MITCHELL et
al, 2001). Além disso, a atividade de outras enzimas antioxidantes como a Cu/Zn e Mn-
superóxido dismutase não foram alteradas pelo pré-condicionamento com isquêmia
(PUISIEUX et al, 2004) ou com depressão cortical alastrante (MITCHELL et al, 2001).
Apesar das atividades das enzimas antioxidantes não estarem alteradas no modelo de pré-
condicionamento isquêmico, o pré-tratamento com ebselen, um composto antioxidante
seleno-orgânico, ou com dimetiltiouréia, um neutralizante de radicais livres, aboliu a
65
neuroproteção, sugerindo assim a participação do estresse oxidativo no pré-
condicionamento isquêmico. Por outro lado, uma dose sub-tóxica de NMDA acarretou no
aumento da atividade da GPx e da Cu/Zn-superóxido dismutase em cultura de glioma C6
(SINGH et al, 2006) e neuroblastoma SHSY5Y (SINGH et al, 2005). O pré-
condicionamento com hipóxia também aumentou a atividade da GPx, assim como, da
Mn
+2
-superóxido dismutase em cultura de neurônios corticais (ARTHUR et al, 2004).
Foi demonstrado que nas amostras do córtex cerebral de todos os grupos que
receberam a infusão de AQ i.c.v. houve uma diminuição da atividade da GPx e que o pré-
condicionamento com NMDA não foi efetivo em prevenir esses efeito (Figura 11).
Entretanto, tal prevenção foi observada no hipocampo, onde o pré-condicionamento aboliu
a diminuição na atividade da GPx induzida pelo AQ. Estudos prévios demonstraram que
uma única injeção intra-estriatal de AQ aumenta a peroxidação lipídica, no entanto, sem
provocar alterações na atividade da GPx num período de 2 h (RODRIGUEZ-MARTINEZ
et al, 2000; SANTAMARÍA et al, 2003) e 6 semanas (CRUZ-AGUADO et al, 2000) após a
lesão com AQ.
Diferentemente das outras enzimas avaliadas, o pré-condicionamento com NMDA
induziu um aumento na atividade da GST no córtex cerebral (Figura 12). O aumento da
atividade da GST induzido pelo pré-condicionamento com NMDA poderia ser devido à
geração de peróxidos lipídicos gerados pela ativação dos NMDAR. O aumento na atividade
da GST cortical após a injeção de AQ poderia neutralizar produtos da peroxidação lipídica
(MAHER, 2005), os quais sabe-se que podem ser gerados a partir da estimulação excessiva
dos NMDAR (BABU et al, 1997). Estudos anteriores também demonstraram um aumento
na atividade da GST no estriado após o tratamento com AQ (CRUZ-AGUADO et al, 2000).
Nenhuma alteração na atividade da GST foi observada nos animais pré-tratados com
66
NMDA seguido pela infusão de AQ independentemente da ocorrência ou não de
convulsões.
A atividade da GR permaneceu inalterada no córtex cerebral e hipocampo dos
camundongos expostos ao pré-condicionamento com NMDA, assim como, daqueles
expostos ao pré-condicionamento seguida da infusão de AQ (Figura 13). Estes dados estão
em desacordo com resultados prévios em culturas de neurônios corticais expostas ao pré-
condicionamento hipóxico, onde um aumento na atividade da GR foi observado e,
adicionalmente, níveis significativamente mais baixos de íons superóxido e peróxido de
hidrogênio (ARTHUR et al, 2004). No presente trabalho, também foi demonstrado que o
AQ não exerce nenhum efeito sobre a atividade da GR (Figura 13). Cruz-Aguado e cols
(2000), do mesmo modo, não observaram alterações na atividade da GR no córtex frontal e
hipocampo após injeção intra-estriatal de AQ, apesar de que uma diminuição na atividade
da GR foi observada no estriado que recebeu a injeção de AQ.
A atividade da G6PDH não foi previamente estudada em modelos de pré-
condicionamento no SNC. No entanto, estudos com modelos de pré-condicionamento
isquêmico do miocárdio de ratos demonstraram que não ocorre alteração na atividade da
G6PDH (TURRENS et al, 1992). No presente trabalho, também foi demonstrado que a
atividade da G6PDH não foi alterada tanto pelo pré-condicionamento com NMDA como
pela infusão de AQ (Figura 14). Por outro lado, em um modelo de pré-condicionamento
com ozônio, este foi efetivo em prevenir a diminuição na atividade da G6PDH no fígado
induzida pelo CCl
4
(LEÓN et al, 1998).
Dessa forma, o presente estudo demonstra que o tratamento com dose sub-tóxica de
NMDA induz proteção contra as convulsões induzidas pelo AQ e o sistema antioxidante da
67
GSH pode não estar diretamente associado aos efetores responsáveis pela tolerância
cerebral induzida pelo pré-condicionamento com NMDA. Foi demonstrado que o pré-
condicionamento com NMDA previne a redução da atividade da GPx induzida pelo AQ,
mas somente no hipocampo. Entretanto, o pré-condicionamento com NMDA não provocou
alterações nos níveis de GSH-t, na atividade da GR e da G6PDH. Apesar de que, baseado
nestes resultados, não se pode descartar que um estresse oxidativo moderado poderia ativar
cascatas de sinalização que estariam envolvidas na indução da tolerância cerebral, o que
não foi avaliado no presente estudo. Assim, a identificação dos mecanismos intrínsecos de
proteção celular permanece crucial no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas
que parecem estar sobrepostos entre os diferentes métodos de pré-condicionamento, e
podem representar um tratamento para desordens agudas e crônicas do cérebro, como a
isquemia e a epilepsia.
68
6. CONCLUSÕES
- A infusão de AQ não promoveu a fragmentação do DNA no córtex cerebral e no
hipocampo após 8, 24, 48, 72 e 96 h, caracterizando assim morte celular necrótica.
- O pré-condicionamento com NMDA não promoveu fragmentação do DNA no córtex
cerebral e hipocampo 48 após a infusão de AQ.
- O pré-condicionamento com NMDA e a infusão de AQ não provocaram nenhuma
alteração significativa na expressão da pró-caspase-3 e na caspase-3 ativada tanto no córtex
cerebral como no hipocampo.
- O pré-condicionamento com NMDA e a infusão de AQ não alteraram o conteúdo de
glutationa total no córtex e hipocampo dos animais.
- A infusão de AQ promoveu uma diminuição significativa na atividade da GPx no córtex
cerebral e no hipocampo. No entanto, somente no hipocampo o pré-condicionamento
preveniu essa diminuição, o que pode ser considerado um efeito neuroprotetor.
- O pré-condicionamento com NMDA e a administração i.c.v. de AQ resultaram em um
aumento na atividade da GST no córtex cerebral. No entanto, a associação do pré-
condicionamento com NMDA e a infusão de AQ preveniram este aumento tanto nos
animais convulsionados quanto nos não convulsionados. Não houve alteração da atividade
da GST no hipocampo.
- O pré-condicionamento com NMDA e a infusão de AQ não provocaram nenhuma
alteração significativa na atividade da GR e da G6PDH tanto no córtex como no
hipocampo.
69
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