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Avaliação do tratamento a curto prazo com
ouabaína na reatividade vascular de rato.
Alessandra Simão Padilha
Tese de Doutorado em Ciências Fisiológicas
Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas
Universidade Federal do Espírito Santo
Vitória, Abril de 2007
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Avaliação do tratamento a curto prazo com
ouabaína na reatividade vascular de rato.
Alessandra Simão Padilha
Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da
Universidade Federal do Espírito Santo como requisito parcial para a obtenção do
grau de Doutora em Ciências Fisiológicas.
Aprovada em __________, por:
___________________________________________________
Prof. Dr. Dalton Valentim Vassallo – Orientador, UFES.
___________________________________________________
Prof
a
. Dr
a
. Ivanita Stefanon - PPGCF, UFES.
___________________________________________________
Prof. Dr. José Geraldo Mill - PPGCF, UFES.
___________________________________________________
Prof
a
. Dr
a
. Cleci Menezes Moreira – CCS-U, UNIPAMPA
___________________________________________________
Prof
a
. Dr
a
. Luciana Venturini Rossoni – ICB, USP.
Coordenador da PPGCF:
________________________________________________
Prof. Dr. José Geraldo Mill
Universidade Federal do Espírito Santo
Vitória, Abril de 2007
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Vivendo, se aprende; mas o que se aprende, mais, é só a
fazer outras maiores perguntas.
(Guimarães Rosa, Grande sertão: veredas)
Dedico este trabalho à minha mãe, ao meu pai
e aos meus irmãos, Fabíola, Júnior e Maroun.
Em especial, à pequena Beatriz – já tão amada
e esperada por nós.
Ao Prof. Dr. Dalton Valentim Vassallo, meu particular agradecimento, por toda
orientação e ensinamentos preciosos. Acima de tudo, pela grande amizade
construída ao longo desses anos. Muito obrigada por ter me despertado para o
fantástico mundo da pesquisa, apoiando-me e ensinando-me – tal como um pai – a
trilhar os caminhos dessa longa jornada.
Agradecimentos
A Deus, por todas as graças e bênçãos que tenho recebido ao longo da minha vida,
em especial a maior de todas: Beatriz!
Quero agradecer, especialmente, à minha família, meu porto seguro: à minha mãe
Zarria, ao meu pai Sérgio, que mesmo não presente neste plano, vela por mim; e
aos meus irmãos Fabíola, Maroun e Júnior. É no apoio e amor incondicional de
vocês por mim que eu crio forças para sempre dar um passo mais adiante. Obrigada
também aos meus cunhados Helder, Elizangela e Ivone, e aos meus amados
sobrinhos Gabriela, Juliana, Luisa e Vitor.
Aos Professores Doutores Victoria Cachofeiro e Vicente Lahera, por terem me
acolhido tão gentilmente e amorosamente em Madrid e em seu laboratório na
Faculdad de Medicina da Universidad Complutense de Madrid. Meus sinceros
agradecimentos pela atenção especial nos meus momentos de dificuldade. Não
poderia deixar de agradecer, ainda, à pequena Ana e à Olga, por toda a
hospitalidade.
À Profa. Dra. Mercedes Salaices, pelo carinho, confiança e amizade com que me
recebeu e me orientou em seu laboratório na Faculdad de Medicina da Universidad
Autônoma de Madrid. Agradeço, também, à Profa. Dra. Maria Jesus Alonso, por
todos os conselhos que foram de grande valor neste trabalho.
À Profa. Dra. Ivanita Stefanon, pela amizade, confiança e pela ajuda concedida
durante esses anos.
Á Profa. Dra. Cleci, grande parceira de trabalho e amiga em todas as horas, pelo
incentivo e ensinamentos, dentre os quais, dois muito valiosos: a serenidade e a
persistência. Não poderia deixar de agradecer aqui, também, ao Luiz, pela ajuda que
prestou enquanto esteve conosco, e ao “Pablito”, por tornar o ambiente do
laboratório ainda mais alegre.
Aos meus grandes amigos, Fabiana & Eduardo e Ágata, que estiveram ao meu lado,
mesmo quando a distância era grande. É nas horas mais difíceis que reconhecemos
os nossos amigos!
A Giulia e ao Franck, que se tornaram excelentes amigos, especialmente após
nossa convivência em Madrid. Muito obrigada pela paciência, carinho, compreensão
e, sobretudo, pelo apoio nos momentos mais difíceis por que passei. Serei
eternamente grata por isso!
Ao Élio, pela presença carinhosa ao meu lado, tornando mais branda essa longa
jornada.
Aos amigos e companheiros do LEMC, que partiram para outros rumos e deixarão
sempre saudades: Válber, Carlos, Carmem, Matheus, Fabíola, Diego, Rosemberg,
Patrícia, Rita, Fabiano, Silvio, Ana Paula, Leonardo, Flávia, Adriana.
Aos amigos e companheiros do LEMC, novos e antigos, com os quais tenho
aprendido e ainda vou aprender muito: Karina, Juliana, Luciana, Edna, Aurélia,
Fernanda, Saulo, Miriam, Lorena, Thaís, Gabriel, Altemar, Kelly, Vivi, Lili, Guilherme,
Priscila, Patrick, Rogério, Núbia, Nelson, Aaron, Lélia.
Á todas “las chicas guapas de L4”, que me prestaram grande ajuda experimental e
técnica e tornaram a minha passagem por Madrid mais alegre e inesquecível: Ana
Briones, Yoli, Ana Garcia, Amada, Raquel, Marta e Mayte. Muito obrigada pelo
carinho e amizade com que me receberam. Las echaré de menos!
À “las chicas de la UCM”: Natália, Maria e Bea. Obrigada pela acolhida em Madrid e
por toda a amizade dispensada!
A todos os demais amigos do PPGCF, pela amizade e pelos ótimos momentos:
Diego, Marcelo, Mário, Rodrigo, Pedro & Daniel, e a tantos outros que torna o nosso
programa de pós-graduação mais alegre! Em especial, nossos happys de sexta à
tardinha, depois de um dia inteiro de experimento. Que ainda possamos brindar
muitas outras sextas!
Aos professores do PPGCF, pelos ensinamentos, pela ajuda desinteressada e pela
amizade!
Ao secretário Fonseca, por ter muitas vezes disponibilizado seu tempo, sempre
corrido, e me ajudado com as questões burocráticas. À Cláudia, à Maria, à equipe
do biotério e a todos os demais funcionários do PPGCF, muito obrigada pela
inestimável ajuda técnica.
Á CAPES e à FAPES/FUNCITEC, pelo apoio financeiro.
SUMÁRIO
Sumário
9
Lista de Esquemas, Tabelas e Figuras............................................................. 12
Resumo ............................................................................................................... 19
Abstract............................................................................................................... 21
1. Introdução....................................................................................................... 23
1.1. Disfunção endotelial na hipertensão ...................................................... 24
1.2. A bomba de sódio e sua relação na hipertensão................................... 29
1.3. Ouabaína endógena ................................................................................. 32
1.3.1. Hipertensão induzida pelo tratamento crônico com ouabaína............ 39
2. Objetivos......................................................................................................... 44
2.1. Objetivo Geral ........................................................................................... 44
2.2. Objetivos Específicos .............................................................................. 44
3. Materiais e Métodos ....................................................................................... 46
3.1. Experimentos agudos .............................................................................. 46
3.1.1. Animais experimentais ....................................................................... 46
3.1.2. Experimentos agudos in vivo.............................................................. 46
3.1.2.1. Metodologia para as preparações in vivo................................... 46
3.1.2.2. Protocolos experimentais para as preparações in vivo.............. 46
3.1.3. Experimentos agudos in vitro ............................................................. 47
3.1.3.1. Avaliação dos valores pressóricos............................................. 47
3.1.3.2. Metodologia empregada para estudos de reatividade vascular
no leito vascular caudal .......................................................................... 48
3.1.3.3. Protocolos experimentais para as preparações in vitro.............. 48
3.2. Experimentos crônicos ............................................................................ 50
3.2.1. Animais experimentais ....................................................................... 50
3.2.2. Medidas de pressão arterial ............................................................... 50
3.2.3.Metodologia empregada para estudo de reatividade vascular em
artérias mesentéricas de resistência............................................................50
3.2.4. Protocolos experimentais ................................................................... 52
3.2.5. Western Blot....................................................................................... 55
3.2.5.1. Expressão protéica da isoforma endotelial da sintase de óxido
nítrico e da ciclooxigenase-2................................................................... 55
3.2.5.1.1. Eletroforese e transferência das amostras.............................. 55
Sumário
10
3.2.5.1.2. Incubação com os anticorpos e detecção das isoformas........ 56
3.3. Expressão dos resultados e análises estatísticas................................. 57
3.4. Fármacos e reagentes utilizados ............................................................ 58
4. Resultados...................................................................................................... 61
4.1. Experimentos agudos in vivo .................................................................. 61
4.1.1. Dados ponderais, valores pressóricos e de freqüência cardíaca
em animais anestesiados. ........................................................................... 61
4.1.2. Efeito da ouabaína na pressão arterial de ratos anestesiados........... 62
4.1.3. Efeito do bloqueio dos receptores AT1 para angiotensina II sobre
as ações da ouabaína na pressão arterial ................................................... 66
4.2. Experimentos agudos in vitro ................................................................. 70
4.2.1. Dados ponderais, valores pressóricos e de freqüência cardíaca
em animais acordados. ............................................................................... 70
4.2.2. Resposta vasoconstritora à fenilefrina e resposta vasodilatadora
induzida pela acetilcolina ............................................................................. 70
4.2.3. Efeito da administração aguda de 1µM ouabaína sobre a resposta
pressora à fenilefrina no leito vascular caudal .............................................72
4.2.4. Modulação do endotélio no efeito da ouabaína sobre a resposta
pressora à fenilefrina ................................................................................... 75
4.2.5. Análise da participação da angiotensina II nos efeitos da ouabaína
sobre a resposta pressora à fenilefrina ....................................................... 81
4.3. Experimentos crônicos ............................................................................ 86
4.3.1. Valores pressóricos, de freqüência cardíaca e de massa corporal .... 86
4.3.2. Respostas vasculares ao KCl, a acetilcolina e à fenilefrina................ 88
4.3.3. Modulação do endotélio sobre a resposta vasoconstritora à
fenilefrina. ....................................................................................................91
4.3.4. Efeito da inibição da enzima conversora de angiotensina e dos
receptores AT1 sobre a resposta vasoconstritora à fenilefrina. ..................92
4.3.5. Efeito da inibição da NOS sobre a resposta vasoconstritora à
fenilefrina...................................................................................................... 95
4.3.6. Efeito da inibição da COX sobre a resposta vasoconstritora à
fenilefrina. .................................................................................................... 97
Sumário
11
4.3.7. Efeito temporal da resposta vasoconstritora induzida por fenilefrina . 99
4.3.8. Efeito do tratamento crônico com ouabaína sobre a atividade
funcional da Na
+
K
+
, ATPase sensível à ouabaína........................................ 101
4.3.9. Expressão protéica da isoforma endotelial da sintase de óxido
nítrico e da COX-2........................................................................................ 103
5. Discussão ....................................................................................................... 105
5.1. Estudos agudos........................................................................................ 105
5.1.1. Efeito da ouabaína na pressão arterial de ratos anestesiados........... 106
5.1.2. Efeito da ouabaína na reatividade vascular in vitro............................ 109
5.2. Estudos crônicos...................................................................................... 114
6. Conclusão....................................................................................................... 123
6.1. Estudos agudos........................................................................................ 123
6.1.1. Estudos agudos in vivo....................................................................... 123
6.1.2. Estudos agudos in vitro. ..................................................................... 123
6.2. Crônicos .................................................................................................... 124
7. Referências Bibliográficas ............................................................................ 126
LISTA DE ESQUEMAS, TABELAS E FIGURAS
Lista de Esquemas, Tabelas e Figuras.
12
Lista de Esquemas, Tabelas e Figuras
Página
Esquema 1. Geração de espécies reativas de oxigênio
(ROS). 27
Esquema 2. Modelo do plasmerosoma (PRS) e o
mecanismo envolvido no aumento de cálcio (Ca
2+
)
transiente induzido por baixas doses de ouabaína em
células musculares lisas (CML). 37
Esquema 3. Esquema demonstrando os principais
componentes da preparação para o estudo de vasos de
resistência isolados, desenvolvido por Mulvany & Halpern
(1977). 51
Tabela 1. Valores de pressão arterial sistólica, pressão
arterial diastólica e freqüência cardíaca de ratos Wistar,
WKY e SHR, anestesiados. 61
Tabela 2. Valores de pressão arterial sistólica, pressão
arterial diastólica e freqüência cardíaca de ratos Wistar,
WKY e SHR, acordados. 70
Tabela 3. Valores de EC50 e resposta máxima (Rmáx)
obtidos através de curvas concentração-resposta à
fenilefrina em artérias caudal de ratos Wistar, WKY e SHR. 73
Lista de Esquemas, Tabelas e Figuras.
13
Tabela 4. Valores de EC50 e resposta máxima (Rmáx)
obtidos através de curvas concentração-resposta à
fenilefrina em artérias caudal de ratos Wistar (n = 9), WKY
(n = 5) e SHR (n = 8) antes e após perfusão com 1 µM de
ouabaína. 74
Tabela 5. Valores de EC50 e resposta máxima (Rmáx,
mmHg) obtidos através de curvas concentração-resposta à
fenilefrina em artérias caudal de ratos Wistar (n = 9), WKY
(n = 5) e SHR (n = 8) antes (E+) e após lesão endotelial (E-
). 75
Tabela 6. Efeito da remoção do endotélio (E-) e dos
tratamentos com Captopril (CAP), Losartan (LOS) e L-
NAME (LNA) na Rmax (%) e EC50 à fenilefrina em artéria
mesentérica de ratos controle (CT) e tratados por 15 dias
com ouabaína (OUA). 90
Tabela 7. Efeito da incubação com tetraetilamônio (TEA, 2
mM) sobre os valores de EC50 e R
max
à fenilefrina em
artérias mesentéricas previamente incubadas com L-NAME
(LNA, 100 µM) + indometacina (Indo, 10 µM), de ratos
controle (CT) e tratados com ouabaína (OUA). 99
Tabela 8. Valores de resposta máxima (R
max
) e
sensibilidade (pD
2
) à noradrenalina uma e duas horas após
realização da primeira curva concentração-resposta a este
agonista alfa-adrenérgico em artérias mesentéricas de
resistência de ratos Controle, Ouabaína, Losartan e
Ouabaína + Losartan. 101
Lista de Esquemas, Tabelas e Figuras.
14
Figura 1. Valores de pressão arterial sistólica (PAS) em
ratos Wistar (A, N=5), WKY (B, N=7) e SHR (C, N=6)
anestesiados com uretana, antes (barras claras) e após
(barras pontilhadas) 60 minutos da administração de 18
µg/Kg de ouabaína. 63
Figura 2. Valores de pressão arterial diastólica (PAD) em
ratos Wistar (A, N=5), WKY (B, N=7) e SHR (C, N=6)
anestesiados com uretana, antes (barras claras) e após
(barras pontilhadas) 60 minutos da administração de 18
µg/Kg de ouabaína. 64
Figura 3. Valores de freqüência cardíaca (FC) em ratos
Wistar (A, N=5), WKY (B, N=7) e SHR (C, N=6)
anestesiados com uretana, antes (barras claras) e após
(barras pontilhadas) 60 minutos da administração de 18
µg/Kg de ouabaína. 65
Figura 4. Valores de pressão arterial sistólica (PAS) em
ratos Wistar (A, N=4), WKY (B, N=4) e SHR (C, N=5)
anestesiados com uretana, antes (barras claras) e após
(barras pontilhadas) 30 minutos da administração de
losartan e após (barras pontilhadas) após 60 minutos da
administração de 18 µg/Kg de ouabaína. 68
Lista de Esquemas, Tabelas e Figuras.
15
Figura 5. Valores de pressão arterial diastólica (PAD) em
ratos Wistar (A, N=4), WKY (B, N=4) e SHR (C, N=5)
anestesiados com uretana, antes (barras claras) e após
(barras pontilhadas) 30 minutos da administração de
losartan e após (barras pontilhadas) após 60 minutos da
administração de 18 µg/Kg de ouabaína. 69
Figura 6. Mudanças na pressão de perfusão média (∆MPP;
mmHg), induzidas por doses crescentes de fenilefrina, no
leito vascular caudal de animais Wistar (n=26, quadrados
cheios), WKY (n=14, círculos cheios) e SHR (n=26,
triângulos cheios). 71
Figura 7. Mudanças na média da pressão de perfusão
(∆MPP; mmHg), induzidas por doses crescentes de
fenilefrina, no leito vascular caudal de animais Wistar (A, n =
9), WKY (B, n = 5) e SHR (C, n = 8) antes (símbolos cheios)
e após (símbolos vazio) perfusão por 60 minutos com
ouabaína. 74
Figura 8. Mudanças na média da pressão de perfusão
(∆MPP; mmHg) induzidas por doses crescentes de
fenilefrina no leito vascular caudal de ratos Wistar (A, n = 9 -
7), WKY (B, n = 5 - 5) e SHR (B, n = 7 - 5), nas condições
com endotélio (símbolos cheios) e após lesão endotelial
com CHAPS (símbolos vazios). 78
Lista de Esquemas, Tabelas e Figuras.
16
Figura 9. Mudanças na média da pressão de perfusão
(∆MPP; mmHg) induzidas por doses crescentes de
fenilefrina após lesão endotelial com CHAPS no leito
vascular caudal de ratos Wistar (A, n = 7), WKY (B, n = 5) e
SHR (B, n = 5), antes (símbolos cheios) e após (símbolos
vazios) perfusão por 60 minutos com 1 µM de ouabaína. 80
Figura 10. Mudanças na média da pressão de perfusão
(∆MPP; mmHg) induzidas por doses crescentes de
fenilefrina no leito vascular caudal de ratos Wistar (A, n = 6)
e WKY (B, n = 4) antes (símbolos cheios) e após (símbolos
vazios) perfusão por 60 minutos com losartan (10
-4
M). 83
Figura 11. Mudanças na média da pressão de perfusão
(∆MPP; mmHg) induzidas por doses crescentes de
fenilefrina no leito vascular caudal de ratos Wistar (A, n = 7),
WKY (B, n = 6) e SHR (C, n = 12) antes (símbolos cheios) e
após (símbolos vazios) co-perfusão por 60 minutos com
losartan (10
-4
M) e ouabaína (1 µM). 85
Figura 12. Valores de pressão arterial sistólica (PAS,
mmHg), pressão arterial diastólica (PAD, mmHg) e
freqüência cardíaca (FC, bpm) de ratos Wistar controle (CT,
n = 10) e tratados por 15 dias com ouabaína (OUA, n = 10). 87
Figura 13. Relaxamento dependente do endotélio induzido
por acetilcolina (10
-10
-10
-5
M) em artérias mesentéricas de
resistência pré-contraídas com fenilefrina em ratos controle
(CT, n = 11) e tratados com ouabaína (OUA, n = 9). 89
Lista de Esquemas, Tabelas e Figuras.
17
Figura 14. Respostas contráteis induzidas por fenilefrina,
em artérias mesentéricas de resistência de ratos controle
(CT, n = 8) e Ouabaína (OUA, n = 7). 89
Figura 15. Efeito da remoção mecânica do endotélio (E-)
sobre a resposta contrátil induzida por fenilefrina em artérias
mesentéricas de resistência de ratos controle (CT, n = 8 - 7)
e tratados por 15 dias com ouabaína (OUA, n = 7 - 7). 92
Figura 16. Resposta contrátil induzida por fenilefrina em
artérias mesentéricas de resistência de ratos controle (CT, n
= 6) e tratados por 15 dias com ouabaína (OUA, n = 7)
antes e após incubação com captopril (Cap, 10 µM). 93
Figura 17. Resposta contrátil induzida por fenilefrina em
artérias mesentéricas de resistência de ratos controle (CT, n
= 7) e tratados por 15 dias com ouabaína (OUA, n = 7)
antes e após incubação com Losartan (Los, 10 µM). 94
Figura 18. Resposta contrátil induzida por fenilefrina em
artérias mesentéricas de resistência de ratos controle (CT, n
= 9) e tratados por 15 dias com ouabaína (OUA, n = 7)
antes e após incubação com L-NAME (LNA, 100 µM). 96
Figura 19. Efeito da pré-incubação com L-NAME (LNA,
100µM) e Indometacina (Indo, 10µM) e com L-NAME (LNA,
100µM), Indometacina (Indo, 10µM) e TEA (2mM) nas
curvas concentração-resposta à fenilefrina em artéria
mesentérica de ratos controle (CT, n = 6 ) e tratados por 15
dias com ouabaína (OUA, n = 6). 98
Lista de Esquemas, Tabelas e Figuras.
18
Figura 20. Controle temporal das curvas concentração-
resposta à fenilefrina artérias mesentéricas de resistência
de ratos controle (CT, n = 8) e ouabaína (OUA, n = 7). 100
Figura 21. A. Curva de relaxamento ao KCl na ausência e
na presença de ouabaína (OUA 100 µM) em artérias
mesentéricas de resistência de ratos controle (CT, n = 5) e
ouabaína (OUA, n = 5). Figura C representa a diferença de
área abaixo da curva (dAUC) do relaxamento ao KCl na
ausência e presença de ouabaína. 103
Figura 22. (A) Análise densitométrica de Western blot para
expressão protéica da isoforma endotelial da sintase de
óxido nítrico (eNOS) e (B) Análise densitométrica de
Western blot para expressão protéica da COX-2 em artérias
mesentéricas de resistência de ratos controle e ouabaína.
Painel superior mostra as bandas de Western blots
representativas da expressão da eNOS e α-actina, e da
COX-2 e α-actina em artérias mesentéricas de ratos
controle e ouabaína. 104
RESUMO
A ouabaína (OUA), um inibidor da Na
+
K
+
-ATPase, está presente em
concentrações nanomolares (nM) no plasma de vários mamíferos. Em ratos
hipertensos, concentrações nM dessa substância, de forma aguda, são capazes de
aumentar a pressão arterial (PA) e a sensibilidade do músculo liso vascular à
agonistas α-adrenérgicos, via liberação de angiotensina II (Ang II). No entanto, não
se sabe se o efeito de concentrações maiores de OUA já conhecidas por aumentar a
PA e amplificar a reatividade vascular a esses agonistas, tanto em ratos
normotensos quanto em hipertensos, também são dependentes da liberação de Ang
II. Por outro lado, os efeitos agudos da OUA parecem ser distintos dos seus efeitos
crônicos. A hipertensão induzida por administração crônica de OUA por 5 semanas é
acompanhada de alterações compensatórias dos fatores endoteliais sobre a
reatividade vascular. Porém, ainda não se sabe se essas alterações já se iniciam em
estágios mais precoces dessa hipertensão.
Neste estudo avaliamos as ações agudas de 18 µg/Kg (i.v.) de OUA na PA de
ratos hipertensos (SHR) e normotensos (Wistar e WKY), bem como os efeitos de 1
µM de OUA na reatividade vascular à fenilefrina (FE) no leito vascular caudal desses
animais. Também investigamos, em ratos Wistar, o efeito do tratamento crônico por
15 dias com OUA (25 µg/Kg) sobre a resposta a contrátil à FE em artérias
mesentéricas de resistência (AMR).
A administração de 18 µg/Kg de OUA elevou a pressão arterial diastólica
(PAD) e a pressão arterial sistólica (PAS) em ratos Wistar e SHR, mas não em WKY.
A administração de losartan preveniu o efeito pressor da OUA sobre a PAD de ratos
Wistar, mas não alterou os demais parâmetros. No leito vascular caudal dos ratos
Wistar, WKY e SHR, 1µM de OUA foi capaz de aumentar a resposta à FE. Esse
aumento foi atribuído à liberação local de Ang II, já que a co-perfusão com Losartan
e OUA, não modificou a resposta à FE. Nos SHR, somente parte dessa resposta foi
abolida pela administração de losartan. Esses dados sugerem que a OUA amplifica
a resposta à FE em ratos normotensos, via liberação de Ang II. Já nos hipertensos,
outras vias endoteliais, além da Ang II parecem estare envolvidas.
O tratamento crônico com OUA por 15 dias elevou a PAS, PAD e freqüência
cardíaca em ratos Wistar. No entanto, a reatividade vascular à FE em AMR foi
similar em ratos tratados e não tratados. A incubação das AMR com L-NAME
aumentou a resposta a FE nos dois grupos, embora esse efeito tenha sido maior nos
ratos tratados. Essa resposta não foi acompanhada de aumento na expressão
protéica da eNOS, nem de alterações no relaxamento à acetilcolina. A co-incubação
de Indometacina e L-NAME deslocou a curva concentração-resposta à FE para a
esquerda nos ratos não tratados similar àquele obtido somente com L-NAME,
sugerindo a ausência da participação dos prostanóides em resposta à FE. Já em
ratos tratados, a incubação dos dois fármacos não desviou a curva concentração-
resposta à FE, indicando a participação de prostanóides vasoconstritores. Nos ratos
tratados esse resultado foi acompanhado de aumento na expressão protéica de
COX-2. A pré-incubação das artérias com Indometacina, L-NAME e TEA, promoveu
um desvio adicional da curva concentração-resposta a FE somente em AMR de
ratos não tratados. Esses dados sugerem que estágios iniciais da hipertensão
induzida por OUA são acompanhados de aumento da liberação de NO e
prostanóides vasoconstritores, e redução de EDHF, que em conjunto, apesar de não
modificar a reatividade vascular à FE, podem contribuir para a manutenção da
hipertensão induzida por OUA.
ABSTRACT
Abstract
21
Ouabain (OUA), an inhibitor of the Na
+
K
+
ATPase (NKA), is an endogenous
compound present in namolar concentration in the plasma of several mammalians. In
several models of hypertension plasma OUA concentration is increased suggesting
an association to the genesis and/or maintenance of hypertension. In this study
pressor changes resulting from the acute administration of OUA 18µg/Kg (i.v.) (~30
nmol/Kg) were evaluated in normotensive (Wistar and WKY) and spontaneously
hypertensive rats (SHR). At the same time, were evaluated the effects of 1µM OUA
in the reactivity of the tail vascular bed to phenylephrine (PHE) in Wistar, WKY and
SHR. On the order hand, the vascular reactivity and the role of endothelial factors in
mesenteric resistance arteries (MRA) in 15 day chronic oubain treated rats were also
investigated.
The systolic (SBP) and diastolic (DBP) blood pressure were increased by the
acute administration of 18µg/Kg of OUA in Wistar and SHR, but not in WKY. The
pretreatment with losartan (10 mg/kg), an inhibitor of AT1 receptors, only blocked the
effects of OUA in the DBP in Wistar, without altering the other parameters.
In the tail vascular bed, the perfusion with OUA in the presence of endothelium
(E+) increased the vascular reactivity of PHE in the all groups. In the absence of
functional endothelium, the effects of OUA were abolished. However, in E+, after
perfusion with losartan (10
-4
M) plus OUA, the increase of response to PHE by OUA
was totally abolished in Wistar and WKY, and partially in SHR.
The chronic ouabain treatment for 15 days increased SBP, DBP and heart
rate. However, this treatment did not change the pressor response to PHE. The
endothelium removal or the nitric oxide synthase (NOS) inhibitor (L-NAME, 10
-5
M)
increased the responses to α-adrenergic agonists. The endothelial modulation was
similar in treated and untreated rats, but the L-NAME effects were more increased in
MRA in treated rats. Endothelial NOS expression and relaxation of acetilcholine
remained unaltered after ouabain treatment.
To evaluated the prostanoids participation in the response to PHE, the MRA
were incubated with Indometacin (10
-4
M), an inhibitor of cyclooxigenase, plus L-
LNAME. In the same protocol, EDHF participation was investigated, after incubation
of MRA with Indometacin and L-NAME plus TEA (2mM), an inhibitor of calcium
activated potassium channels.
Indometacin plus L-NAME, shifted leftward the concentration-response curves
to PHE in MRA from untreated rats and this response was similar when compared
Abstract
22
the leftward shift after incubation only L-NAME. However, in MRA of the treated rats,
the co-incubation with Indometacin plus L-NAME did not altered concentration-
response curves to PHE. This result was accompanied by increase in the COX-2
expression. TEA shifted the PHE curves further leftward only in MRA from untreated
rats.
In conclusion, these results suggest that the increase in the DBP in Wistar
after 18µg/Kg OUA depends of angiotensin II. In the tail vascular bed of
normotensive and hypertensive rats, the acute administration of 1µM OUA, increased
of PHE pressor response. The endothelium modulates this response by releasing
angiontensin II in normotensive rats, but in hypertensive rats, other factors seem to
be involved besides the angiotensina II.
The chronic ouabain treatment for 15 days modified the participation of
endothelial factors in response to PHE in MRA, by the increase liberation of NO and
prostanoids, and impairment of EDHF release. This was accompanied by an
increased COX-2 expression. Although this balance avoids changes in the PHE
concentration-response curves these vascular changes might contribute to maintain
the ouabain-induced hypertension.
INTRODUÇÃO
Introdução
23
1. Introdução
A hipertensão arterial constitui-se num dos principais fatores de risco para
doenças cardiovasculares, cerebrovasculares e renais, sendo que essas doenças
atualmente são responsáveis por um grande percentual de morbi-mortalidade em
países industrializados. Estima-se que 20% da população mundial apresente
hipertensão arterial, sendo que no Brasil esse percentual pode chegar em torno de
40% em algumas regiões do país (V Diretrizes Brasileiras de Hipertensão Arterial).
De acordo com os níveis tensionais em indivíduos adultos, são considerados
normais aqueles valores de pressão arterial sistólica abaixo de 130 mmHg, e de
pressão arterial diastólica aqueles abaixo de 85 mmHg. Valores tensionais acima
desses mencionados são classificados como hipertensão. No entanto, o diagnóstico
de hipertensão deve ser cauteloso e outros fatores considerados de risco, além dos
níveis tensionais altos, devem ser levados em consideração, como lesão de órgãos-
alvo e doenças associadas, visto que a hipertensão arterial é uma doença
multifatorial.
Dentre os diversos fatores que contribuem para a gênese e/ou manutenção
da hipertensão arterial essencial incluem-se as alterações nos parâmetros
hemodinâmicos com modificações no débito cardíaco e resistência vascular
periférica; alterações funcionais como aumento da atividade simpática e do sistema
renina-angiotensina; resistência à insulina; a hereditariedade e a raça (Freis et al,
1973; Folkow, 1982; Harrap, 1994). Também se inclui a obesidade, o tabagismo, o
sedentarismo e o alto consumo de sal (Bakris & Mensah, 2002). Todos esses fatores
podem contribuir para desencadear e/ou agravar o processo hipertensivo.
A pressão arterial é uma entidade física e depende, portanto, de fatores
físicos como volume sanguíneo e capacitância da circulação, sendo assim,
determinada pelo produto do débito cardíaco e da resistência vascular periférica. No
entanto, são alterações na resistência vascular os principais responsáveis por
modificações da pressão arterial (Folkow, 1982).
Grande parte da resistência vascular periférica é atribuída às pequenas
artérias de resistência. Essas artérias contribuem passivamente e ativamente para a
manutenção da resistência basal e para o controle do fluxo sanguíneo durante
alterações hemodinâmicas (Mulvany, 2002; 2003). Pelo menos, três importantes
Introdução
24
componentes modificam claramente a resistência vascular: a estrutura, a mecânica e
a função dos vasos sangüíneos (Intengan & Schiffrin, 2000). Alterações estruturais,
como redução do diâmetro luminal e espessamento de parede arterial, alterações
mecânicas, como redução da elasticidade, bem como modificações nas respostas
vasoconstritora e vasodilatadora, dependentes do endotélio, podem repercutir em
aumento da resistência e conseqüentemente, hipertensão arterial (Intengan &
Schiffrin, 2000; Mulvany, 2002; 2003).
1.1. Disfunção endotelial na hipertensão
O endotélio vascular, por ser capaz de produzir e liberar substâncias
vasodilatadoras e vasoconstritoras interfere diretamente no tônus vascular e,
portanto, na resistência vascular (Rubanyi, 1993). Dentre as substâncias que
promovem o relaxamento do músculo liso vascular incluem-se a prostaciclina (PGI
2
),
o óxido nítrico (NO) e o fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF)
(Moncada et al, 1977; Furchgott & Zawadski, 1980; Palmer et al, 1987; Félétou &
Vanhoutte, 1988). Já entre aquelas capazes de promover contração do músculo liso
vascular podemos citar a angiotensina II, endotelina-1 e os metabólitos derivados da
via do ácido araquidônico como tromboxano A
2
(TXA
2
), prostaglandinas H
2
(PGH
2
) e
F
2α
(PGF
2α
), além dos ânions superoxido (O
2
-
) (Rubanyi & Vanhoutte, 1986; Kifor &
Dzau, 1987; Yanagiswa et al, 1988; Frolich & Forstermann, 1989; Vanhoutte, 1993).
Muitas dessas substâncias regulam o crescimento e apoptose das células
musculares lisas, além de interferirem também na agregação plaquetária e a adesão
de leucócitos (Moncada et al, 1977; Kubes et al, 1991; Moncada et al, 1991;
Rubanyi, 1993). Deste modo, o endotélio possui uma participação essencial e ativa
no controle e manutenção da pressão arterial. Nesse sentido, é fácil compreender
que modificações na sua função, como, por exemplo, aumento da síntese e/ou
liberação de fatores vasoconstritores ou fatores de crescimento podem promover
aumento de resistência vascular e conseqüentemente, da pressão arterial.
Modificações desse tipo já foram observadas por muitos pesquisadores nos
processos hipertensivos levando à denominação de disfunção endotelial (Panza et
al, 1990; Taddei et al, 1993; Rizzoni et al, 1996; Rossi et al, 1997).
Dentre as alterações funcionais do endotélio observadas na hipertensão,
incluem-se modificações da síntese de NO. Alguns trabalhos demonstram uma
Introdução
25
redução da síntese de NO na hipertensão, enquanto outros demonstram um
aumento desse vasodilatador como um mecanismo compensatório (Dohi et al, 1990;
Alexander et al, 1999; Briones et al, 1999, 2002; Rossoni et al, 2002b; Chang et al,
2002). No entanto, há pesquisadores que relatam que a síntese e liberação de NO
parecem não estar alteradas na hipertensão, porém sua biodisponibilidade está
reduzida devido ao aumento da formação de ânions superóxidos, que inativam o
NO, reduzindo sua ação vasorelaxante e promovendo vasoconstricção (Gryglewski
et al, 1986; Suzuki et al, 1995).
Outras alterações ainda relacionadas ao NO, dizem respeito à expressão e
atividade das isoformas da sintase do óxido nítrico (NOS) que também poderiam
contribuir para a disfunção endotelial observada na hipertensão. Porém, Briones e
colaboradores (2002) demonstraram que em artérias cerebrais de ratos
espontaneamente hipertensos (SHR) não havia um prejuízo na produção endotelial
de NO pela ativação da NOS, no entanto, a hipertensão induzia uma up-regulation
da expressão basal da isoforma induzível da sintase do óxido nítrico (iNOS).
Já estudos de Nava e colaboradores (1995 e 1998) demonstraram, em
células endoteliais cardíacas e em artéria mesentérica de resistência de SHR, que
tanto a expressão como a atividade da isoforma constitutiva da NOS estavam
elevadas nesses animais quando comparados aos seus controles normotensos. No
entanto, os níveis de monofosfato cíclico de guanosina (GMPc) nos animais
hipertensos não foram diferentes em comparação aos normotensos, indicando que,
mesmo havendo um maior produção de NO, pelo aumento da expressão e atividade
da NOS constitutiva, este não é biologicamente ativo suficiente para estimular a
formação de GMPc e manter um adequado tônus vasodilatador dependente de NO.
Esses dados corroboram a teoria de que, nesse modelo de hipertensão, a síntese de
NO está normal ou até mesmo incrementada, embora sua degradação esteja
elevada devido ao aumento na produção de radicais livres como será descrito a
seguir.
Um outro fator quem têm ganhado relevância na literatura e parece estar
implicado na hipertensão arterial é a presença de um inibidor endógeno da isoforma
endotelial da sintase do óxido nítrico (eNOS) produzido pelas células endoteliais, o
N(G), N(G`)-dimetilarginina (ADMA). Seus níveis plasmáticos correlacionam-se
positivamente com os níveis pressóricos e inversamente com o relaxamento
Introdução
26
endotélio-dependente, constituindo-se também como fator de risco cardiovascular
(Boger et al, 1998; Achan et al, 2003; Dayoub et al, 2003; Kielstein et al, 2004).
A disfunção endotelial resulta também de outras alterações além daquelas
apresentadas na via do NO. O aumento do estresse oxidativo já está bem
estabelecido como um fator presente na hipertensão arterial.
Durante o metabolismo celular aeróbico, normalmente são produzidas várias
substâncias eletricamente instáveis, potencialmente reativas com moléculas
biológicas capazes de causar oxidação e dano irreversível à célula. Estas
substâncias são denominadas espécies reativas de oxigênio (ERO) e apresentam
um elétron não pareado na última camada (ou seja, elétrons que ocupam sozinhos a
última órbita atômica). A produção normal de ERO no metabolismo celular é
proveniente da geração oxidativa de energia pela cadeia mitocondrial, de radicais
livres pelo citocromo P-450, do mecanismo de defesa dos fagócitos que produzem
radical superóxido para causar morte em microorganismos, entre outros
mecanismos associados. Apesar de o organismo gerar grandes quantidades de
ERO, em contrapartida também sintetiza substâncias antioxidantes que inativam as
ERO, havendo, portanto, um equilíbrio desse sistema. Um dos antioxidantes mais
predominantes no sistema vascular é a enzima denominada superóxido dismutase
(SOD), que inativa os ânions superóxidos gerados (Fridovich, 1978). O estresse
oxidativo, por conseguinte, é um desbalanço do estado redox, na qual substâncias
pró-oxidantes se sobrepõem à capacidade antioxidante, resultando em aumento da
produção de ERO.
Na hipertensão arterial, o estresse oxidativo é caracterizado, principalmente,
por aumento de ânions superóxidos (
O
2
-
), originados a partir de NAD(P)H oxidases
que catalizam a redução de 1 elétron do oxigênio usando NADH ou NAD(P)H como
doadores de elétrons, além dos radicais hidroxila (OH
·
), peroxinitrito (ONOO
-
), dentre
outros, associado com redução das defesas antioxidantes (esquema 1) (Suzuki et
al, 1995; Wu et al, 2001; Hamilton et al, 2001). Os ânions superóxidos ao se
combinarem com o NO, formam o peroxinitrito (esquema 1), que tem alta
capacidade oxidativa (Beckman et al, 1990; Goldstein & Czapski, 1995). Portanto,
esse aumento de ERO poderia reduzir a biodisponibilidade de NO, contribuindo para
a disfunção endotelial. Outros trabalhos que sustentam esse mecanismo são
aqueles desenvolvidos com ratos hipertensos tratados com antioxidantes. Nesses
Introdução
27
ratos, o tratamento com análogos da SOD, tempol e vitaminas C e E, promovem
redução da pressão arterial e melhora do relaxamento endotélio dependente
(Schnackenberg et al, 1998; Chen et al, 2001; Yanes et al, 2005; de Richelieu et al,
2005).
Há ainda estudos que demonstram uma redução dos “varredores” ou
scanvengers de ERO, como a SOD e a catalase, na hipertensão arterial, embora
outros relatem um aumento compensatório dessas enzimas (Rathaus & Bernheim;
2002; Zhan et al, 2004; Wu et al, 2005). O aumento da expressão e atividade da
NADPH oxidase e o desacoplamento da eNOS, que contribui para a formação de
ânions superóxidos, também têm sido descritos na hipertensão, consequentemente,
contribuindo para o aumento do estresse oxidativo e disfunção endotelial (Zalba et
al, 2000; Beswick et al, 2001; Wu et al, 2005; Fortuño et al, 2005).
Esquema 1. Geração de espécies reativas de oxigênio (ERO). Um aumento na produção de ânions
superóxidos (
O
2
-
), principalmente devido à ativação da NAD(P)H oxidase, está envolvido na
disfunção endotelial por redução da biodisponibilidade de óxido nítrico (NO) e aumento de
peroxinitrito (ONOO
-
). Adaptado de Fortuño et al, 2005.
NADPH oxidase
Citocromo P-450
Xantina oxidase
Ciclooxigenase
Lipooxigenase
Desacoplamento da eNOS
O
2
-
SOD
H
2
O
2
+
NO
OONO
-
Redução da
biodisponibilidade de NO
Disfunção endotelial
Catalase
H
2
O
Glutationa
peroxidase
Peroxidação lipídica e
nitrosilação de proteínas
Dano celular
Introdução
28
As alterações na via da ciclooxigenase também estão presentes na
hipertensão arterial. Artérias de resistência de ratos hipertensos (SHR) possuem
menor relaxamento endotélio-dependente devido a maior liberação de fatores
vasoconstritores dependentes da enzima ciclooxigenase (COX) (Diederich et al,
1990; Luscher et al, 1990). Ao mesmo tempo, a amplificação de respostas contráteis
à agonistas, presentes na hipertensão, também parece envolver produtos da COX
(Zerrouk et al, 1997; Rapoport & Williams, 1996; Alvarez et al, 2005). Em artéria
muscular de ratos hipertensos, por exemplo, ocorre uma maior liberação de
tromboxano A2 (TXA2) que, por sua vez, aumenta a vasoconstricção miogênica
(Ungvari & Koller, 2000).
Respostas ao shear stress também estão alteradas e parte dessas
modificações podem ser atribuídas aos prostanóides. Em arteríolas de músculo
cremaster de ratos hipertensos, o shear stress promove vasoconstricção
dependente da via da COX e PGH2, ao passo que nos ratos normotensos, resulta
em vasodilatação (Huang et al, 2000).
Grande parte dessas alterações mencionadas acima, por outro lado,
poderiam ser justificadas por modificações na expressão da enzima ciclooxigenase-
1 (COX-1) ou ciclooxigenase-2 (COX-2). De fato, aortas de ratos SHR possuem
maior expressão de COX-1 e maior liberação de PGH2, quando comparado aos
seus controles normotensos (WKY) (Ge et al, 1995). Modificações na expressão da
COX-2 também foram descritas em aorta de ratos hipertensos. Nesse estudo
desenvolvido por Alvarez e colaboradores (2005), anéis de aorta de animais SHR
apresentaram maior resposta contrátil à fenilefrina, por maior liberação de PGF2α e,
provavelmente, devido à maior expressão de COX-2. Finalmente, o aumento da
expressão da COX-2 está envolvido no aumento do estresse oxidativo, o que
poderia contribuir para a disfunção endotelial presente na hipertensão (Feng et al,
1995; Virdis et al, 2005).
Como dito anteriormente, o aumento da produção de ERO está presente na
hipertensão arterial, e isso contribui para o desenvolvimento e/ou manutenção do
quadro hipertensivo. Vários estudos demonstram que a angiotensina II participa
desse processo porque aumenta o estresse oxidativo na hipertensão (Romero &
Reckelhoff, 1999; Touyz & Schiffrin, 2001; Nickenig & Harrison, 2002).
Introdução
29
Trabalhos demonstram que a angiotensina II, via receptores AT1, leva a
produção de ERO na parede vascular em parte devido à ativação da NAD(P)H
oxidase (Rajagopalan et al, 1996; Zhang et al, 1999; Touyz & Schiffrin, 2001).
Somado a isso, tanto as ERO quanto a angiotensina estimulam a produção de
fatores de crescimento e outros agentes pró-inflamatórios que, em conjunto,
promovem disfunção endotelial. Estudos demonstram que a inibição dos receptores
AT1 para angiotensina II reverte a disfunção endotelial em indivíduos hipertensos
(Dohi et al, 2003). Além do mais, esse bloqueio diminui o estresse oxidativo em ratos
SHR, além de reduzir os níveis de marcadores de inflamação plasmáticos e estresse
oxidativo em pacientes hipertensos (Welch & Wilcox et al, 2001; Dohi et al, 2003).
Por fim, estudos clínicos e experimentais demonstram que tanto o bloqueio da ECA
quanto dos receptores AT1, não somente reduzem a pressão arterial, mas também
regridem o remodelamento cardíaco e arterial, confirmando assim, o papel
fundamental da angiotensina II nas alterações cardiovasculares presentes na
hipertensão arterial (Ennis et al, 1998; Rizzoni et al, 1997; Yokoyama et al, 2005).
Além da disfunção endotelial, que pode modificar o tônus vascular e, dessa
forma, contribuir para o desenvolvimento e/ou manutenção da hipertensão,
alterações na atividade e/ou expressão da bomba de sódio também podem estar
implicadas nesse processo (Webb & Bhor, 1979; Blaustein, 1993; Marín & Redondo,
1999).
1.2. A bomba de sódio e sua relação na hipertensão
A bomba de sódio pertence a família das P-ATPases, um grupo de proteínas
integrais de membrana caracterizadas pela sua função de hidrólise de ATP e pela
presença de vários domínios hidrofóbicos que formam α-hélices transmembrânicas
(Horisberger, 2004). A Na
+
K
+
-ATPase é composta por duas grandes subunidades, α
e β, e uma pequena subunidade γ.
A subunidade α- catalítica, com peso molecular de aproximadamente 113kDa,
possui até 10 domínios transmembrânicos e é responsável pelo transporte de
cátions, hidrólise do ATP, além de atuar como receptor para glicosídeos cardíacos
(Blanco & Mercer, 1998). Já foram identificados 4 isoformas desta subunidade,
Introdução
30
sendo que a isoforma α
1
é amplamente distribuída pelas diferentes células do
organismo, ao passo que a α
2
é encontrada no músculo esquelético, no cérebro, no
coração, adipócitos, músculo liso vascular, bem como em vários outros tecidos; a α
3
é essencialmente encontrada no tecido neural, cardíaco e ovários; e por fim, a
isoforma α
4
foi identificada somente em espermatozóides de ratos (Lingrel, 1992;
Marín & Redondo, 1999).
A subunidade β possui um peso molecular de 55kDa apresentando um único
domínio transmembrana hidrofóbico e é altamente glicosilada. Além de ser essencial
para o ancoramento e estabilização do complexo protéico à membrana, essa
subunidade também modula a afinidade da enzima ao Na
+
e K
+
(Blanco & Mercer,
1998). De maneira similar a subunidade α, existem 4 isoformas da subunidade β
tecido-dependente. A isoforma β
1
é largamente distribuída no organismo, mas
predominante no tecido renal; já a isoforma β
2
é expressa no cérebro, músculo
esquelético e glândula pineal; a isoforma β
3
está presente em testículos, retina,
fígado e pulmão; e finalmente, uma isoforma β
4
relacionada a H
+
K
+
-ATPase, foi
isolada e clonada em Xenopus, ratos e coelhos (Sweadner, 1989; Blanco & Mercer,
1998).
A terceira subunidade γ, de peso molecular de aproximadamente 14kDa,
pertence a um grupo de sete proteínas recentemente descobertas, chamadas de
“FXYD” (Sweadner & Rael, 2000; Geering, 2006). Esta subunidade, ou FXYD2, não
produz mudanças na expressão da Na
+
K
+
-ATPase, mas parece modificar as
propriedades de transporte da bomba (Mercer et al, 1993; Geering, 2006).
Provavelmente, essa expressão tecido-dependente das isoformas das
subunidades α e β indicam que cada uma desempenha uma função particular
associada ao tecido no qual se expressa. Por exemplo, camundongos que não
expressam o gene para a isoforma α
2
exibem aumento da força de contração
muscular esquelética e cardíaca, ao passo que em camundongos que não
expressam a isoforma α
1
têm redução da força de contração muscular (James et al,
1999; He et al, 2001). Há diferenças também em relação à sensibilidade aos
glicosídeos cardíacos. Em ratos as isoformas α
2
, α
3
e α
4
possuem maior afinidade à
ouabaína ao passo que a isoforma α
1
possui baixa afinidade à ouabaína, porém
maior afinidade aos íons Na
+
e K
+
(Marín & Redondo, 1999). Portanto, dependendo
Introdução
31
do tecido na qual se expressam, funções distintas podem ser reguladas pela
atividade de uma determinada isoforma.
A bomba de sódio é imprescindível para a regulação da homeostasia do
sódio, potássio e cálcio, dentre outros íons, participando ativamente da regulação do
tônus vascular (Webb & Bohr, 1978; Haddy, 1983; Vassalle, 1987). Diversas
substâncias podem promover sua inibição ou ativação. Hormônios ou outros fatores
que produzem a ativação da via da ciclooxigenase induzem a formação de PGE
2
,
potente inibidor da bomba de sódio (Marín & Redondo, 1999). Glicosídeos
cardíacos, como a ouabaína, ou solução livre de K
+
, também produzem inibição da
bomba de sódio e, consequentemente, aumento do tônus vascular (Toda, 1980;
Marín et al, 1988; Sato & Aoki, 1988).
A inibição da bomba, em nível de musculatura lisa vascular, acarreta aumento
de resistência vascular. Dentre os mecanismos envolvidos nesse aumento da
resistência incluem a despolarização, que termina por ativar canais para cálcio
dependentes de voltagem e influxo de cálcio e redução da atividade do trocador
Na
+
/Ca
2+
(Ozaki et al, 1978; Fleming, 1980; Casteels et al, 1985; Vassalle, 1987;
Marín et al, 1991; Blaustein, 1993). Além disso, o aumento de cálcio intracelular
ocasionado pela inibição da bomba de sódio, pode promover maior liberação de
norepinefrina das terminações nervosas perivasculares resultando em aumento da
resistência vascular (Karaki & Urakawa, 1977; Rodríguez-Mañas et al, 1994).
Outras substâncias derivadas do endotélio também podem interferir no
funcionamento da bomba de sódio, ativando-a, como é o caso da angiotensina II,
endotelina-1 e prostaciclina (Marín & Redondo, 1999). O óxido nítrico também é um
estimulante da atividade da Na
+
K
+
-ATPase, sendo que este efeito constitui-se num
dos seus mecanismos de ação vasorelaxante (Gupta et al, 1994; Gupta et al, 1996).
Levando-se em conta que a atividade da bomba de sódio está relacionada à
manutenção da homeostasia do sódio e a regulação do tônus vascular, alterações
na atividade e/ou expressão desta enzima podem modificar de forma expressiva a
resistência vascular e assim, estar envolvidas na hipertensão arterial.
De fato, alguns estudos demonstram que em alguns modelos de hipertensão
a atividade e/ou expressão da bomba de sódio está alterada (Webb & Bohr, 1979;
David-Dufilho et al, 1984; Hopp et al, 1986; Rossoni et al, 2002a). Muitos desses
estudos sugeriram, então, a possibilidade de que haveria, no plasma de animais
Introdução
32
hipertensos, um fator circulante capaz de inibir a Na
+
K
+
-ATPase, uma vez que a
subunidade α da Na
+
K
+
-ATPase possui um sítio de ligação para glicosídeos
cardíacos.
1.3. Ouabaína endógena
A ouabaína, um glicosídeo cardiotônico, foi reconhecido como um composto
ativo primário do veneno de flexas da tribo Maasai, na África, há mais de cem anos
atrás por um antropologista francês chamado Arnaud. É originária da semente de
plantas africanas como a Strophantus gratus (ou Ouabaio) e Acokanthera schimpert.
Assim como a Digitalis purpurea, a ação da ouabaína ocorre através de sua
capacidade de inibir a bomba de sódio. Nos seres humanos, a Na
+
K
+
-ATPase possui
em sua subunidade α um sítio de ligação para digitálicos. No entanto, a função exata
desse “receptor” para ouabaína ainda não foi totalmente esclarecida e é objetivo de
muitos estudos que se iniciaram no início da década de 60.
A primeira pesquisa que sugeriu a existência de uma substância de origem
endógena inibidora da Na
+
K
+
-ATPase foi desenvolvida por de Wardener e
colaboradores (1961). Nesse estudo, cães foram submetidos a uma sobrecarga
salina e o sangue desses cães foi doado para outro animal receptor. Os cães
receptores, então, apresentaram aumento da natriurese, sugerindo, portanto, que
aqueles animais submetidos à expansão aguda de volume liberavam um hormônio
natriurético circulante que participava da excreção de sódio pelos rins.
Após esse estudo, vários pesquisadores sugeriram que o hormônio
natriurético circulante liberado em resposta às expansões de volume extracelular,
poderia ser um inibidor da Na
+
K
+
-ATPase (Kramer et al, 1969; Buckalew et al, 1970;
Pamnani et al, 1981). Mais tarde, outros estudos verificaram que esse mesmo
hormônio participava da gênese de hipertensões dependentes de volume, já que
nesses casos, a atividade da Na
+
K
+
-ATPase encontrava-se reduzida (Overbeck et
al, 1976; Haddy & Overbeck, 1976; Clough et al, 1983; Songu-Mize et al, 1987).
No entanto, a confirmação do envolvimento desse hormônio na hipertensão
arterial foi realizada nos estudos que correlacionaram positivamente os níveis
plasmáticos dessa substância com os níveis pressóricos de indivíduos normotensos
Introdução
33
e hipertensos (Pamnani et al, 1981; Hamlym et al, 1982). Os níveis plasmáticos
desse inibidor são aumentados pela ingestão de sódio em pacientes com
hipertensão essencial, e esse nível também se correlaciona positivamente com a
pressão arterial (de Wardener et al, 1981; Hasegawa et al, 1987).
Entretanto, a natureza química dessa substância ainda permanecia
desconhecida. O termo digitalis-like apareceu na literatura quando Gruber e
colaboradores (1980) mostraram que esse inibidor plasmático da Na
+
K
+
-ATPase
fazia reação cruzada com anticorpos anti-digoxina. Porém, somente mais tarde, é
que a estrutura química do fator endógeno circulante inibidor da Na
+
K
+
-ATPase foi
estabelecida. Assim, em 1991, diversos pesquisadores demonstraram que o
composto endógeno tinha uma composição química similar à ouabaína (C
29
H
44
O
12
),
bem como a atividade bioquímica e fisiológica semelhantes, além de possuir 100%
de reatividade cruzada com anticorpos policlonais para ouabaína (Hamlyn et al,
1991; Mathews et al, 1991; Ludens et al, 1991; Bova et al, 1991). A partir de então, o
composto passava a se chamar ouabain-like ou ouabaína endógena.
Em relação à origem endógena da substância ouabain-like, alguns estudos
que identificaram alguns sítios de produção e liberação foram desenvolvidos antes
mesmo da caracterização desse hormônio. Pelo menos três importantes origens
foram identificadas: o hipotálamo, a região anteroventral do terceiro ventrículo e a
zona glomerulosa do córtex adrenal (Haupert & Sancho, 1979; Pamnani et al, 1981;
Songu-Mize et al, 1982; Bealer et al, 1983; de Wardener & Clarkson, 1985; Morgan
et al, 1985; Tamura et al, 1987; Ludens et al, 1992). Hoje, sabe-se também, que a
ouabaína endógena pode ser liberada por miócitos ventriculares (D`Urso et al,
2004).
A ouabaína endógena pode ser secretada em resposta a diversos estímulos.
Sem dúvida, o principal deles é o aumento da concentração plasmática de sódio
seguido por expansão aguda de volume (de Wardener et al, 1961; Blaustein, 1993;
Yamada et al, 1997). No entanto, a secreção de ouabaína também ocorre em
resposta à estimulação β-adrenérgica, bem como pelo hormônio
adrenocorticotrópico (ACTH) e angiotensina II, via receptores AT2 (Laredo et al,
1994; Laredo et al, 1995; Laredo et al, 1997; Shah et al, 1999; Bauer et al, 2005).
O aumento dos níveis plasmáticos de ouabaína tem sido associado a diversos
estados patológicos como hipertensão essencial, insuficiência cardíaca congestiva,
Introdução
34
hiperaldosteronismo primário, insuficiência renal crônica, pré-eclampsia, síndrome
de Cushing, dentre outras (Hamlyn et al, 1982; Gottlieb et al, 1992; Naruse et al,
1994; Rossi et al, 1995; Hamlyn et al, 1996). Em indivíduos hipertensos, os níveis
plasmáticos de ouabaína podem variar entre 0,08 à 25 nmol/l, enquanto que em
normotensos ocorre uma variação entre 0,07 à 0,77 nmol/l (Rossi et al, 1995).
A ouabaína endógena poderia estar envolvida na gênese e/ou manutenção da
hipertensão arterial pelo fato de poder se ligar a Na
+
K
+
-ATPase, inibindo-a. De
acordo com o mecanismo de ação dos digitálicos, essa substância ao se fixar na
subunidade α, promoveria inibição do transporte de íons e, conseqüentemente,
acúmulo de sódio intracelular. O aumento da [Na
+
] citosólico, por sua vez, reduz ou
inibe a atividade do trocador Na
+
/Ca
++
, aumentando as concentrações de cálcio
intracelular (Blaustein, 1988; Marín et al, 1988). Com isso a membrana é
despolarizada aumentando a probabilidade de abertura de canais para cálcio
dependentes de voltagem, com posterior influxo de cálcio para dentro da célula
(Vassalle, 1987; Marin et al, 1988). Com o aumento das concentrações
intracelulares de cálcio há maior recaptação desse íon para o retículo
sarcoplasmático, aumentando seus estoques intracelulares (Fleming, 1980;
Mulvany, 1992; Blaustein, 1993). Dessa forma, isso resultaria em amplificação das
respostas contráteis a agentes vasoativos pela ouabaína. Por fim, a inibição da
bomba de sódio nas terminações perivasculares simpáticas, poderia promover a
liberação de noradrenalina e redução da recaptação da mesma, induzindo, assim,
contração do músculo liso vascular (Vanhoutte & Lorenz, 1984; Marin et al, 1988).
Essas ações em conjunto, aumentam a resistência vascular periférica e produzem
efeito inotrópico positivo, consequentemente, elevando a pressão arterial.
Todas essas ações foram baseadas em pesquisas experimentais com doses
terapêuticas de ouabaína. Assim, um desses estudos verificou que em artérias
cerebrais de rato a ouabaína poderia agir diretamente no músculo liso vascular, ao
passo que em artérias femorais promovia liberação de noradrenalina pelas
terminações perivasculares, em ambas as situações resultando em contração das
artérias (Marin et al, 1988). No entanto, alguns trabalhos demonstraram que
algumas ações da ouabaína poderiam ser negativamente moduladas pelo endotélio,
através da liberação de um fator vasodiltador (Sánchez-Ferrer et al, 1992;
Rodríguez-Mañas et al, 1992; Rodríguez-Mañas et al, 1994). A modulação do
Introdução
35
endotélio nas respostas da ouabaína, no entanto, poderiam variar quando se
tratasse de um animal hipertenso. Ponte e colaboradores (1996a; b) demonstraram
que em aorta de ratos normotensos (WKY), as contrações da ouabaína eram
moduladas negativamente pelo endotélio, ao passo que em ratos hipertensos (SHR),
o endotélio liberava um fator vasoconstrictor. Entretanto, a natureza química desses
fatores endoteliais ainda não era conhecida. Alguns estudos realizados em cultura
de células endoteliais verificaram que a ouabaína poderia promover a liberação de
prostaciclina, endotelina e NO (Nakagawa et al, 1987; Yamada et al, 1990; Xie et al,
1993).
No entanto, esses mecanismos acima são descritos somente para
concentrações de ouabaína na ordem de µM, ou seja, concentrações
farmacológicas. Já os mecanismos de ação da ouabaína em concentrações
nanomolares, próximas às fisiológicas ou patológicas, são distintas das citadas
acima.
A ouabaína endógena, em concentrações nanomolares, parece atuar num
microdomínio celular denominado de plasmerosome (Blaustein et al, 1998). Neste
microdomínio, a isoforma α
1
da Na
+
K
+
-ATPase estaria distribuída uniformemente
pelas células atuando como uma varredora de sódio intracelular, sendo responsável
pela manutenção do gradiente eletroquímico do sódio e do potássio. Esta isoforma
possui alta afinidade ao sódio e baixíssima afinidade a ouabaína. Já as isoformas α
2
e α
3
, que possuem alta afinidade à ouabaína e baixa afinidade ao sódio, estariam
co-localizadas com o trocador Na
+
/Ca
++
e próximas do retículo sarcoplasmático
juncional numa microrregião da célula denominada de plasmerosome (Juhaszova et
al, 1996; Golovia & Blaustein, 1997; Blaustein et al, 1998). Assim, mesmo
concentrações nanomolares de ouabaína poderiam inibir a Na
+
K
+
-ATPase,
ocasionando um aumento das concentrações de sódio na região do plasmerosome,
que por sua vez, inibiria a troca Na
+
/Ca
++
, com conseqüente aumento das
concentrações de cálcio, também somente nessa microrregião, o que levaria ao
acúmulo de cálcio no retículo sarcoplasmático (esquema 2). De fato, a inibição da
Na
+
K
+
-ATPase por concentrações nanomolares de ouabaína não elevam o cálcio
citosólico (Arnon et al, 2000). Esse poderia ser um mecanismo adicional que poderia
explicar como concentrações nanomolares de ouabaína poderiam contribuir para o
processo hipertensivo.
Introdução
36
Ca
2+
Na
+
Na
+
K
+
Na
+
Ca
2+
α
αα
α1-R
SOC
α
αα
α2/α
αα
α3 NKA
NCE
PRS
RS
SERCA
Ca
2+
Ca
2+
ATP ATP
ATP
IP3-RIP3
RYR
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Na
+
Na
+
K
+
Na
+
Ca
2+
α
αα
α1-R
SOC
α
αα
α2/α
αα
α3 NKA
NCE
PRS
RS
SERCA
Ca
2+
Ca
2+
ATP ATP
ATP
IP3-RIP3
RYR
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Na
+
Na
+
K
+
Na
+
Ca
2+
α
αα
α
1
-R
SOC
α
αα
α
2
/α
αα
α
3
NKA
OUBAINA
NCE
PRS
RS
SERCA
Ca
2+
Ca
2+
ATP ATP
ATP
IP3-RIP3
RYR
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Na
+
Na
+
K
+
Na
+
Ca
2+
α
αα
α
1
-R
SOC
α
αα
α
2
/α
αα
α
3
NKA
OUBAINA
NCE
PRS
RS
SERCA
Ca
2+
Ca
2+
ATP ATP
ATP
IP3-RIP3
RYR
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Ca
2+
Esquema 2. Modelo do plasmerosoma (PRS) e o mecanismo envolvido no aumento de cálcio (Ca
2+
)
transiente induzido por baixas doses de ouabaína em células musculares lisas (CML). O esquema
mostra o retículo sarcoplasmático (RS) juncional com suas Ca
2+
-ATPases na membrana (SERCA), o
microdomínio entre a membrana do RS e a membrana plasmática adjacente com os canais de cálcio
operados por estoques (SOC), as isoformas α
2
e α
3
da Na
+
, K
+
-ATPase (NKA) e o trocador Na
+
/Ca
2+
(NCE). Painel superior: Sob condições normais. Painel inferior: Após administração de baixas doses
de ouabaína. α1-R; receptor alfa-adrenérgico; IP
3
, trifosfato de inositol; IP
3
-R, receptor de IP
3
; RYR,
receptor de rianodina. Modificado de Arnon et al (2000).
Introdução
37
Diversos pesquisadores, utilizando concentrações nanomolares de ouabaína
verificaram que essa substância, agudamente, além de aumentar a pressão arterial
de ratos hipertensos, potencializa as respostas vasoconstritoras a agonistas α-
adrenérgicos (Songu-Mize
et al
, 1995; Vassallo
et al
, 1997; Rossoni
et al
, 2001,
Padilha
et al
, 2004). Trabalho desenvolvido por Rossoni e colaboradores (1999)
mostrou que em artéria caudal de ratos normotensos, 10 nM de ouabaína, além de
promover aumento de reatividade vascular à fenilefrina, estimula a liberação de um
fator endotelial que é capaz de modular negativamente o endotélio. Por outro lado,
Padilha e colaboradores (2004), estudando a reatividade vascular na artéria caudal
de ratos hipertensos, demonstraram que o aumento da responsividade à fenilefrina
após incubação com ouabaína, era atribuído à estimulação da ECA e liberação de
angiotensina II local. Esses dados sugerem que os efeitos de baixas concentrações
de ouabaína são distintos em presença de hipertensão arterial, e poderiam colaborar
para a gênese e/ou manutenção da mesma. Ao mesmo tempo, o modelo de
hipertensão estudado parece, também, influenciar nas ações da ouabaína.
Em ratos tratados cronicamente com L-NAME, a administração aguda de
10nM de ouabaína foi capaz de elevar a pressão arterial nesses animais, porém
esse efeito não foi atribuído a uma ação vascular direta isolada desse digitálico, mas
sugere alterações centrais no tônus simpático (Rossoni
et al
, 2003). Além do mais,
nesse mesmo estudo, a reatividade vascular à fenilefrina foi reduzida após a
administração aguda de ouabaína, sugerindo a liberação de um fator vasodilatador
dependente do endotélio. Por outro lado, em ratos hipertensos DOCA-sal, a mesma
concentração de ouabaína aumenta a reatividade vascular è fenilefrina no leito
vascular caudal desses animais (Rossoni
et al
, 2001). Já em SHR, um modelo
animal que mimetiza a hipertensão essencial humana, como mencionado
anteriormente, 1nM de ouabaína eleva a pressão arterial e a reatividade vascular à
fenilefrina por um mecanismo periférico dependente da liberação de angiotensina
(Padilha
et al
, 2004). Portanto, parece que os efeitos da ouabaína sobre a
reatividade vascular dependem, em parte, do modelo de hipertensão estudado e das
concentrações de ouabaína utilizadas.
Além das ações periféricas da ouabaína, ações centrais também já foram
descritas. Diversos trabalhos, utilizando concentrações nanomolares de ouabaína,
verificaram que a administração subcutânea ou intracerebroventricular crônica de
ouabaína em ratos Wistar induz aumento da pressão arterial via aumento da
Introdução
38
atividade simpatoexcitatória e redução da simpatoinibitória, já que o bloqueio
ganglionar com hexametônio normaliza a pressão arterial (Leenen
et al
, 1994;
Huang & Leenen, 1994). Esse mesmo grupo de pesquisadores demonstrou que
ratos SHR e Dahl-sensíveis submetidos a dieta rica em sódio, liberam ouabaína, de
origem “central”, responsável pelo aumento da via simpatoexcitatória e redução da
simpatoinibitória, ocasionando exacerbação da hipertensão nesses animais (Huang
& Leenen, 1996a). Esses efeitos centrais da ouabaína parecem envolver a ativação
do sistema renina-angiotensina, já suas ações pressoras são inibidas por
administração de losartan, um bloqueador de receptores AT
1
para angiotensina II
(Huang & Leenen, 1996b; Huang
et al
, 1998).
Portanto, os efeitos periféricos da ouabaína sobre o músculo liso vascular
modificando a resistência vascular periférica, associados aos seus efeitos
simpatoexcitatórios centrais, podem contribuir para a gênese e/ou manutenção dos
processos hipertensivos.
1.3.1. Hipertensão induzida pelo tratamento crônico com ouabaína
A ouabaína, quando administrada cronicamente, é capaz de induzir
hipertensão. Yuan e colaboradores (1993) foram os primeiros pesquisadores a
demonstrar este fato. Logo em seguida, Manunta e colaboradores
(1994),
verificaram que a hipertensão provocada por administração crônica de ouabaína era
dose-dependente.
Essa hipertensão induzida pela ouabaína parece depender de um
componente central, já que a administração de hexametônio abole o aumento dos
níveis pressóricos em ratos tratados com ouabaína, tanto por via periférica
(subcutaneamente) como central (intracerobroventricularmente) (Huang
et al
, 1994).
Ao mesmo tempo, esse mesmo grupo de pesquisadores, verificou que o
desenvolvimento dessa hipertensão é acompanhado de um aumento da atividade
simpática e um prejuízo do baroreflexo (Huang & Leenen, 1999). Esse efeito
hipertensinogênico envolve a ativação do sistema renina-angiotensina central uma
vez que a hipertensão induzida pela ouabaína pode ser prevenida em presença de
losartan ou embusartan (Zhang & Leenen, 2001). Além disso, promove também
aumento do conteúdo de angiotensina II no hipotálamo (Cheung
et al
, 2006).
Introdução
39
Além dos efeitos hipertensinogênicos da ouabaína envolverem a ativação do
sistema renina-angiotensina, pesquisas recentes também demonstram a
participação da via da endotelina 1. Nessas pesquisas, o tratamento crônico com
ouabaína aumenta a liberação de endotelina 1 pela área cinzenta periaquedutal que,
via receptores ETa, nessa mesma área, promovem aumento da resistência vascular
renal e redução do fluxo sangüíneo, indicando hiperrreatividade simpática (Di Filippo
et al
, 2003; D`Amico
et al
, 2003).
No entanto, a hipertensão induzida pela ouabaína também promove
alterações periféricas de grande relevância. Rossoni e colaboradores (2002a; b)
verificaram que, perifericamente, a administração crônica de ouabaína em ratos
promove alterações regionais na reatividade vascular à fenilefrina. Esses
pesquisadores verificaram uma redução na resposta vasoconstritora à fenilefrina em
anéis de aorta torácica e mesentérica superior sem promover, no entanto, alterações
em anéis de artéria caudal. Outros dados corroboram as mudanças regionais de
reatividade vascular induzida pela ouabaína crônica. Em anéis de artéria renal de
ratos tratados, tanto a resposta constritora ao cloreto de potássio quanto à resposta
à fenilefrina foram aumentadas em relação aos respectivos controles (Kimura
et al
,
2000). Já em segmentos de artéria mesentérica de resistência, o tratamento com
ouabaína não promove modificações na reatividade vascular à noradrenalina (Xavier
et al
, 2004b).
Assim como os estudos desenvolvidos com administração aguda de
ouabaína, o tratamento crônico também altera a expressão e a liberação de fatores
endoteliais e esse mecanismo também varia de acordo com a artéria estudada. No
trabalho desenvolvido por Rossoni e colaboradores (2002b), citado acima, a redução
na reatividade vascular à fenilefrina em aorta e mesentérica superior de animais
tratados com ouabaína, parece depender da liberação de NO. Ao mesmo tempo,
essas artérias apresentaram aumento da expressão protéica para a eNOS e nNOS.
Corroborando esses dados, Xavier e colaboradores (2004b) também verificaram que
a redução da resposta à fenilefrina em artéria mesentérica superior dependia da
liberação de NO e redução dos prostanóides pelo endotélio. No entanto, em
segmentos de artéria mesentérica de resistência de ratos tratados, o aumento da
modulação via NO e redução do EDHF, justificava a ausência de alterações na
reatividade à noradrenalina nessas artérias (Xavier
et al
, 2004b). A liberação de NO
Introdução
40
pelas terminações nitrérgicas de artérias mesentéricas superiores também parece
estar aumentada em resposta à estímulos elétricos, após tratamento crônico com
ouabaína (Xavier
et al
, 2004a). Essa maior liberação de óxido nítrico neuronal,
parece dever-se ao aumento da expressão da nNOS (Xavier
et al
, 2004a).
No entanto, além da via do NO, outros sistemas endoteliais estão envolvidos
nas ações da ouabaína crônica. Xavier e colaboradores (2004c), verificaram que a
redução na reatividade vascular à fenilefrina em aorta de ratos tratados
cronicamente com ouabaína eram dependentes de endotelina 1, via receptores ETA,
uma vez que o bloqueio desses receptores abolia a modulação endotelial negativa.
Todos esses dados sustentam a hipótese de que as alterações vasculares
periféricas induzidas pelo tratamento crônico com ouabaína constituem-se, não um
mecanismo que poderia contribuir para um efeito hipertensinogênico dessa
substância, mas sim, mecanismos compensatórios a essa hipertensão. No entanto,
esses estudos foram desenvolvidos em estágios tardios da hipertensão ouabaína e
muitos deles, utilizando artérias de condutância.
Uma das propostas desse estudo foi determinar, em artérias mesentéricas de
resistência, se em estágios mais recentes dessa hipertensão, a ouabaína é capaz de
produzir alterações na reatividade vascular que poderiam ser favoráveis ou então, se
contraporem à manutenção da hipertensão. Portanto, poderíamos realizar um
estudo comparativo das ações temporais da ouabaína, através da análise de suas
ações em estágios precoces da hipertensão desenvolvida pelo tratamento com esse
digitálico, e ao mesmo tempo, comparar essas respostas com as obtidas de estudos
anteriores, desenvolvidos em estágios mais tardios dessa hipertensão.
Como já mencionado, trabalhos prévios do nosso grupo (Padilha
et al
, 2004)
verificaram que a administração aguda de concentrações nanomolares de ouabaína,
próximas àquelas encontradas no plasma de indivíduos normotensos, aumentam a
reatividade vascular à fenilefrina em ratos SHR, mas não em ratos normotensos.
Esse aumento é dependente da estimulação da ECA e da liberação local de
angiotensina II. No entanto, estudos que utilizaram concentrações de ouabaína na
ordem de 10nM verificaram que ratos normotensos, além exibirem um aumento da
reatividade vascular à fenilefrina, liberam um fator endotelial que é capaz de modular
negativamente o endotélio, possivelmente um fator que estimula a abertura de
canais de potássio (Rossoni
et al
, 1999). Já em ratos hipertensos L-NAME,
Introdução
41
diferentemente de ratos DOCA-sal, essa mesma concentração de ouabaína produz
redução da reatividade vascular à fenilefrina, sugerindo a liberação de um fator
vasodilatador em resposta a ouabaína (Rossoni
et
al, 2001, 2003). Portanto, parece
que os efeitos agudos da ouabaína sobre a reatividade vascular dependem, em
parte, do modelo de hipertensão em estudo e da concentração do digitálico utilizada.
A maior parte dos casos de hipertensão arterial desenvolvida na população
são do tipo essencial, ou seja, não apresentam uma causa específica. Ao contrário,
são decorrentes de processos multifatoriais que incluem aumento da resistência
vascular periférica, da atividade simpática, do sistema renina-angiotensina além de
possuir um forte componente genético e poder ser influenciada por fatores
ambientais, como tabagismo e obesidade (Folkow
et al
, 1982; Wyss, 1993; Kaplan,
1998). Um modelo de hipertensão animal que possui muita dessas características
são os ratos SHR, pois assim como a hipertensão essencial humana, este modelo é
uma expressão de doença hipertensora determinada geneticamente, de origem
poligênica e influenciada por fatores ambientais (Okamoto & Aoki, 1963). Além do
mais, como já exposto, esses animais parecem ser mais sensíveis às ações da
ouabaína.
Trabalhos anteriores do nosso grupo já demonstram que esses animais
exibem um aumento de reatividade vascular à fenilefrina com concentrações de
ouabaína na ordem de 1nM, 10nM e 100µM (Vassallo
et al
, 1997; Padilha
et al
,
2004). No entanto, os mecanismos envolvidos nesse aumento de reatividade com as
concentrações de ouabaína acima de 10nM ainda não foram esclarecidos. Uma vez
que já está estabelecido o envolvimento do sistema renina-angiotensina em resposta
à 1nM de ouabaína, permaneceu uma dúvida: Esse mecanismo de ação se manteria
em concentrações mais elevadas desse digitálico? Uma outra questão relevante é
que a reatividade vascular de ratos normotensos não é modificada por baixas
concentrações de ouabaína. No entanto, elevando-se a concentração para 10nM,
esses animais exibem aumento de reatividade vascular, ao mesmo tempo em que
liberam um fator endotelial capaz de modular negativamente a resposta à fenilefrina
(Rossoni
et al
, 1999). Portanto, esses mecanismos também estariam mantidos se
elevássemos a concentração de ouabaína?
Introdução
42
Dessa forma, uma outra proposta desse estudo foi verificar se concentrações
mais elevadas de ouabaína, como por exemplo 1µM, conhecida por aumentar a
reatividade vascular tanto de ratos hipertensos como de normotensos, poderiam
promover alterações vasculares similares àquelas encontradas com concentrações
nanomolares.
OBJETIVOS
Objetivos
44
2. Objetivos
2.1. Objetivo geral
Estudar, de forma aguda, os efeitos da administração de 18µg/Kg (
i.v.
) e 1µM
de ouabaína na pressão arterial e reatividade vascular à fenilefrina no leito
vascular caudal, respectivamente, de ratos normotensos e hipertensos. Ao
mesmo tempo, avaliar o possível envolvimento da angiotensina II nessas
respostas, uma vez que já está estabelecido o seu envolvimento nos efeitos de
concentrações nanomolares de ouabaína.
Também objetivamos analisar as possíveis alterações na reatividade vascular
à fenilefrina em artérias mesentéricas de resistência de ratos tratados por 15 dias
com ouabaína e a participação dos diferentes fatores endoteliais nesta resposta.
2.2. Objetivos específicos
Estudos dos efeitos agudos da ouabaína
-
Avaliar os efeitos da administração aguda de 18µg/Kg de ouabaína (~30
nmol/Kg) na pressão arterial sistólica, diastólica e freqüência cardíaca de ratos
normotensos (Wistar e WKY) e hipertensos (SHR).
-
Verificar a participação da angiotensina II nos efeitos pressores produzidos pela
ouabaína sobre a pressão arterial sistólica e diastólica, bem como da freqüência
cardíaca em ratos normotensos e hipertensos.
-
Avaliar o efeito de 1µM de ouabaína sobre a resposta pressora à fenilefrina, no
leito vascular caudal de ratos normotensos (Wistar e WKY) e hipertensos (SHR).
-
Estudar uma possível modulação endotelial sobre os efeitos da ouabaína no leito
vascular caudal desses animais.
-
Investigar a possível participação da angiotensina II nos efeitos da ouabaína
sobre a resposta pressora à fenilefrina, no leito vascular caudal de ratos Wistar,
WKY e SHR.
Objetivos
45
Estudo dos efeitos crônicos da ouabaína
-
Avaliar a pressão arterial sistólica, diastólica e freqüência cardíaca em ratos
tratados por 15 dias com ouabaína.
-
Verificar se o tratamento com ouabaína altera a reatividade vascular à fenilefrina
em artérias mesentéricas de resistência.
-
Estudar uma possível modulação endotelial sobre os efeitos crônicos da
ouabaína nestas artérias, bem como estudar que possíveis fatores endoteliais
poderiam estar envolvidos.
-
Avaliar se o tratamento crônico com a ouabaína altera, em artérias mesentéricas
de resistência, a expressão protéica da isoforma endotelial da sintase de óxido
nítrico e da ciclooxigenase-2.
-
Investigar se o tratamento crônico com a ouabaína altera a atividade da
Na
+
K
+
ATPase sensível à ouabaína nas artérias mesentéricas de resistência.
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais e Métodos
46
3. Materiais e Métodos
3.1. Experimentos agudos
3.1.1. Animais Experimentais
Neste estudo, foram utilizados ratos normotensos Wistar e Wistar Kyoto
(WKY), e ratos espontaneamente hipertensos (SHR); machos, com idade
aproximada de 12 semanas. Esses animais foram cedidos pelo biotério do Programa
de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal do Espírito
Santo. Os animais foram mantidos em gaiolas, sob condições controle de
temperatura e ciclo claro-escuro de 12 horas, tendo livre acesso a água e
alimentação.
3.1.2. Experimentos agudos “in vivo”
3.1.2.1. Metodologia para as preparações “in vivo”
Ratos Wistar, WKY e SHR foram anestesiados com uretana (1,2 g/ Kg,
i.p.)
e
submetidos à canulação da artéria carótida e veia jugular, para medida de pressão
arterial e administração de drogas, respectivamente. As canulações foram realizadas
com um cateter de polietileno (PE-50, Clay-Adams) preenchido com salina
heparinizada (100 U/ml). A cânula arterial foi conectada a um transdutor de pressão
(modelo 1050BP) que por sua vez estava conectado a um pré-amplificador, e este,
por sua vez, conectado a um sistema Biopac de aquisição de dados (MP100 Biopac
Systems, Inc; CA). Foram feitos registros contínuos da pressão arterial sistólica
(PAS), pressão arterial diastólica (PAD) e freqüência cardíaca (FC).
3.1.2.2. Protocolos experimentais para as preparações “in vivo”
•
Avaliação da pressão arterial antes e após administração de ouabaína
Estudos prévios do nosso laboratório (Vassallo
et al
, 1997; Padilha
et al
,
2004) sugerem que o tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína leva a concentrações
plasmáticas nanomolares (0,3 nmol/Kg) deste digitálico, caso se assuma que este
fármaco foi diluído em 40 ml de volume extracelular por cada 100 gramas de rato.
Materiais e Métodos
47
Seguindo o mesmo raciocínio, utilizamos a dose de 18 µg/Kg, para alcançarmos,
dessa forma, uma concentração plasmática aproximada de 30 nmol de ouabaína.
Após 30 minutos de estabilização, foi feito o registro controle de pressão
arterial sistólica e diastólica e, em seguida, ouabaína (18 µg/Kg,
i.v.
) foi
administrada. Uma hora depois, os valores de pressão arterial foram novamente
registrados.
Foram analisadas as mudanças de pressão arterial sistólica e diastólica, bem
como de freqüência cardíaca, antes e após uma hora da administração de ouabaína,
comparando possíveis alterações sobre estas variáveis, entre os animais
normotensos e hipertensos.
•
Efeito do bloqueio dos receptores AT1 para angiotensina II sobre a
resposta pressora induzida pela ouabaína
Com a finalidade de avaliar uma possível participação do sistema renina-
angiotensina nas ações da ouabaína, foi utilizado Losartan (10 mg/kg,
i.v.
), um
bloqueador dos receptores AT1 para angiotensina II. Após 30 minutos de
estabilização, foi feito o registro controle de pressão arterial sistólica, pressão arterial
diastólica e freqüência cardíaca e, em seguida, foi administrado losartan. Após 30
minutos da administração deste fármaco, foram realizados, novamente, registros de
pressão arterial e freqüência cardíaca, e em seguida, ouabaína (18 µg/Kg,
i.v.
) foi
administrada. Após 1 hora, os valores de pressão arterial e freqüência cardíaca
foram novamente avaliados.
3.1.3. Experimentos agudos “in vitro”
3.1.3.1. Avaliação dos valores pressóricos
Um dia antes da realização dos experimentos “
in vitro
”, os ratos SHR, WKY e
Wistar foram anestesiados com éter etílico e submetidos à cateterização da artéria
carótida direita com cateter de polietileno (PE 50, Clay-Adams), o qual foi
exteriorizado para o dorso do animal, subcutaneamente. Os ratos foram colocados
em gaiolas individuais e, no dia seguinte, a cânula foi conectada a um transdutor de
pressão (modelo 1050BP) conectado a um pré-amplificador o qual estava conectado
a um sistema Biopac de aquisição de dados (MP100 Biopac Systems, Inc; CA).
Materiais e Métodos
48
Foram feitos registros contínuos da pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial
diastólica (PAD) e freqüência cardíaca (FC) durante 30 minutos.
3.1.3.2. Metodologia empregada para estudos de reatividade vascular no
leito vascular caudal de rato
Para a realização dos estudos
in
vitro
foi utilizada a técnica de perfusão do
leito vascular caudal, descrita por França e colaboradores (1997). Após a realização
dos registros de pressão arterial e freqüência cardíaca, os ratos foram anestesiados
com pentobarbital sódico (65 mg/Kg,
ip
) e heparinizados (500 UI,
ip
). A seguir, a
artéria caudal foi dissecada e canulada próximo à sua base com um intracate
(Safelet intracate 24G X ¾, NIPRO) preenchido por solução nutridora. A cauda foi
seccionada, isolada e conectada a um sistema de perfusão (Anexo 1). As artérias
caudais foram perfundidas com solução de Krebs-Henseleit, composta por (em mM):
NaHCO
3
27,2; NaCl 119; NaH
2
PO
4
1; MgSO
4
1,2; KCl 5,0; CaCl
2
1,25; glicose 11;
EDTA 0,03. Esta solução foi mantida à temperatura de 36°C ± 0,5°C, aerada pelo
borbulhamento de mistura carbogênica contendo 95% de O
2
e 5% de CO
2
,
mantendo o pH estável em 7,4. A perfusão do leito vascular caudal foi mantida sob
fluxo constante de 2,5 ml/min por meio de uma bomba peristáltica (Milan, Colombo,
Paraná, Brasil) e o sistema de perfusão foi conectado a um transdutor de pressão
Nihon-Kohden TP-200T (conectado a um pré-amplificador FUNBEC MP-100) que
por sua vez estava conectado a um sistema de aquisição de dados (MP100 Biopac
System, Inc; CA), o qual era ligado a um computador (PC Pentium), para registros
contínuos de pressão de perfusão neste leito vascular. Após a montagem, a
preparação foi submetida a um período de estabilização de 45 minutos e, em
seguida, foram iniciados os protocolos experimentais. Baseando-se na relação:
Pressão = Fluxo x Resistência, e sendo o fluxo constante, as variações de pressão
refletiam variações na resistência vascular.
3.1.3.3. Protocolos experimentais para as preparações “in vitro”
•
Efeito da ouabaína 1 µM sobre a resposta pressora à fenilefrina no leito
vascular caudal
Para a realização deste protocolo, após o período de estabilização, doses
crescentes de fenilefrina (0,01 - 100 µg,
in
bolus, em um volume de 100µl), foram
Materiais e Métodos
49
administradas antes e após uma hora de infusão contínua com ouabaína (1 µM), em
presença do endotélio vascular.
Ao final desses experimentos, a integridade funcional do endotélio foi
avaliada. Para isso, o leito vascular caudal foi previamente contraído através da
infusão contínua de fenilefrina (10
-7
M) e após o estabelecimento de um platô,
5µg/100µl de acetilcolina (
in
bolus
) foi administrada.
•
Modulação do endotélio no efeito da ouabaína 1 µM sobre a resposta
pressora à fenilefrina
Com a finalidade de avaliar uma possível modulação do endotélio no efeito da
ouabaína (1 µM) sobre a resposta pressora à fenilefrina, em animais normotensos e
hipertensos, foi realizada a lesão química do endotélio. Ao mesmo tempo, também
foi avaliada a modulação endotelial sobre a resposta pressora a esse agonista α-
adrenérgico nos animais normotensos e hipertensos.
A lesão do endotélio foi feita através da administração de CHAPS, {3-[(3-
cloroamidopropil) dimetilamônio]-I-propanosulfonato} (8mg,
in bolus
, em volume de
80 µl). Após o restabelecimento da situação basal, as preparações foram
submetidas a doses crescentes de fenilefrina (0,01 - 100 µg,
in
bolus, em um volume
de 100µl) antes e após infusão contínua, por uma hora, de ouabaína (1 µM).
A lesão endotelial foi confirmada pela ausência de relaxamento a acetilcolina
(5µg/100µl) em preparações pré-contraídas com fenilefrina (10
-7
M). A administração
de dose única de nitroprussiato de sódio (5µg/100µl), um agente vasodilatador
independente do endotélio, também foi realizada para avaliar a integridade do
relaxamento do músculo liso vascular induzido pelo óxido nítrico.
•
Envolvimento da angiotensina II sobre o efeito da ouabaína 1 µM na
resposta pressora à fenilefrina
A participação do sistema renina-angiotensina nas curvas concentração-
resposta à fenilefrina e no efeito produzido pela ouabaína sobre a resposta pressora
à fenilefrina foi avaliado através da infusão de losartan (10
-4
M), um inibidor de
receptores AT
1
para angiotensina II. Assim, curvas dose-resposta à fenilefrina (0,01 -
100 µg,
in
bolus, em um volume de 100µl) foram desenvolvidas antes a após a co-
infusão desse fármaco e/ou ouabaína.
Materiais e Métodos
50
3.2. Experimentos crônicos
3.2.1. Animais experimentais
Nesse estudo foram utilizados ratos Wistar, machos, normotensos, com 45
dias de vida. Esses animais foram fornecidos pelo biotério da Faculdade de
Medicina da
Universidad Autónoma de Madrid
. Durante o tratamento, os animais
foram mantidos em gaiolas com livre acesso à ração e água, sob um ciclo claro-
escuro de 12 horas e temperatura ambiente.
Os ratos foram aleatoriamente divididos em dois grupos experimentais: (1)
animais tratados com ouabaína durante 15 dias (25 µg/Kg/dia
s.c
. dissolvida em óleo
de soja) e (2) animais controle tratados somente com veículo.
3.2.
2.
Medida da pressão arterial
Ao final do tratamento, os ratos foram anestesiados com uretana (1,2 g/kg,
i.p.
) e um cateter de polietileno (PE50), preenchido com salina heparinizada (100
U/ml), foi introduzido na artéria carótida. A pressão arterial sistólica e diastólica, e
freqüência cardíaca, foram registradas continuamente durante 30 minutos com um
transdutor de pressão (modelo 1050BP, UFI, Inc., Morro Bay, CA) e registradas
usando uma interface e um software de aquisição de dados para computador
(modelo MP100A, BIOPAC System, Inc. Santa Barbara, CA).
3.2.3. Metodologia empregada para estudo de reatividade vascular em
artérias mesentéricas de resistência
Para estudar a reatividade vascular em artérias mesentéricas de resistência,
foi utilizado o método descrito por Mulvany & Halpern (1977). Assim, após o término
do tratamento e posteriormente, das medidas pressóricas, os ratos foram
decapitados e o leito mesentérico removido e posto em uma placa de Petri contendo
solução de Krebs-Henseleit a 4º C (composição em mM: NaCl 118; KCl 4,7;
NaHCO
3
25; CaCl
2
.2H
2
O 2,5; KH
2
PO
4
1,2; MgSO
4
.7H
2
O 1,2; EDTA 0,01 e glicose
11). Ramos de terceira ordem da artéria mesentérica superior foram dissecados e
cortados em segmentos de 1,5 - 2,0 mm de comprimento com o auxílio de um
microscópio de dissecção. Dois fios de tungstênio (40 µm de diâmetro) foram
inseridos no lúmen das artérias e montados em um miógrafo para vasos resistência
(Danish Myo Tech, Modelo 410A e 610M, JP-Trading I/S, Aarhus, Dinamarca) para
Materiais e Métodos
51
estudos de tensão isométrica. Um dos fios estava acoplado a um transdutor de
tensão e o outro a um micrômetro que permitia o estiramento das artérias (Esquema
3). Esse miógrafo estava conectado um sistema para aquisição de dados
(Powerlab/800 ADInstruments Pty Ltd, Castle Hill, Austrália) e este a um computador
(Macintosh).
d
Esquema 3. Esquema demonstrando os principais componentes da preparação para o estudo de
vasos de resistência isolados, desenvolvido por Mulvany & Halpern (1977). (A) Leito mesentérico e
seus ramos, (B) diagrama mostrando como a parte terminal da artéria é montada entre dois fios de
tungstênio de 32 µm de diâmetro cada, (C) diagrama mostrando a as placas de aço, entre as quais
está montada uma artéria de até 2mm de comprimento e uma das placas está conectada a um
transdutor de força de alta sensibilidade enquanto a segunda está conectada a um micrômetro, e
(D) foto ilustrativa do aparelho. Modificado de Mulvany & Halpern (1977).
Materiais e Métodos
52
Depois das artérias de resistência terem sido devidamente montadas, foram
estabilizadas por um período de 30 minutos em solução de Krebs-Henseleit,
gaseificada com mistura carbogênica (95% de O
2
e 5% de CO
2
, pH 7,4) e mantida à
temperatura de 37° C. Transcorrida a estabilização, as artérias foram estiradas a
uma tensão de repouso considerada ótima em relação ao seu diâmetro interno. Para
isso, em cada segmento arterial a relação tensão:diâmetro interno foi calculado e a
circunferência interna correspondente a uma pressão transmural de 100 mmHg para
um vaso relaxado in situ (L
100
) foi determinada (Mulvany & Halpern, 1977). Para a
realização dos experimentos, as artérias foram mantidas com uma circunferência
interna L
1
, calculado como L
1
= 0,90 x L
100
, circunferência na qual o desenvolvimento
de força é máximo (Mulvany & Halpern, 1977). O diâmetro luminar efetivo (l
1
) foi
determinado de acordo com a equação l
1
= L
1
/π.
Após as artérias terem sido normalizadas, foram submetidas a um período de
estabilização de 30 minutos e em seguida, contraídas com cloreto de potássio (KCl
120 mM), para avaliar sua integridade funcional.
3.2.4. Protocolos experimentais
•
Efeito do tratamento com ouabaína sobre a resposta de relaxamento
dependente do endotélio e sobre a resposta vasoconstritora à fenilefrina
Após a avaliação da integridade funcional das artérias com KCl (120 mM), as
mesmas foram mantidas por um período de estabilização de 30 minutos e, então
foram pré-contraídas com fenilefrina até aproximadamente 50 % da contração
máxima produzida por KCl (120 mM). Após formação de um platô de contração,
curvas concentração-resposta à acetilcolina (10
-10
-10
-5
M) foram realizadas.
Transcorridos um período de aproximadamente 40 minutos, foram realizadas as
curvas concentração-resposta à fenilefrina (10
-8
- 3x10
-5
M).
•
Modulação do endotélio sobre a resposta vasoconstritora à fenilefrina
Para avaliar a modulação endotelial sobre a resposta vasoconstritora à
fenilefrina, o endotélio de algumas artérias mesentéricas de resistência foi removido
Materiais e Métodos
53
de acordo com a metodologia descrita por Osol e colaboradores (1989). Para isso,
um pelo de cavalo foi lavado com etanol e posteriormente em solução de Krebs.
Previamente à normalização da tensão de repouso dos segmentos arteriais, o
pelo de cavalo foi introduzido no lúmen das mesmas e foram realizados pequenos
movimentos delicados de fricção contra a parede arterial. Somente após esse
procedimento é que as artérias foram normalizadas para sua tensão de repouso e
em seguida, submetidas a um período de estabilização de 30 minutos. A integridade
das preparações foi avaliada através da capacidade de contração das artérias ao
KCl (120 mM).
Depois de submetidas à contração ao KCl, as artérias foram novamente
estabilizadas por 30 min, e então, as preparações foram pré-contraídas com
fenilefrina a uma concentração capaz de produzir aproximadamente 50 % da
contração máxima ao KCl 120 mM. A remoção do endotélio foi confirmada pela
ausência de relaxamento à acetilcolina (10
-6
M). Seguidos esses procedimentos, as
preparações foram lavadas para retirada das drogas e após 40 minutos de
estabilização, curvas concentração-resposta à fenilefrina (10
-8
- 3x10
-5
M) foram
realizadas.
•
Avaliação da participação enzima conversora de angiotensina e da
angiotensina II sobre a resposta vasoconstritora à fenilefrina.
A participação da enzima conversora de angiotensina e da angiotensina II
sobre a resposta contrátil induzida pela fenilefrina foi avaliada através da utilização
de captopril (10 µM), um inibidor da enzima conversora de angiotensina, e losartan
(10 µM), um bloqueador dos receptores AT1 para angiotensina II, respectivamente.
Para isso, curvas concentração-resposta a esse agente α-adrenérgico foram
desenvolvidas antes e após incubação por 40 minutos com esses fármacos.
•
Avaliação da participação do óxido nítrico sobre a resposta
vasoconstritora à fenilefrina.
Para demonstrar a participação do óxido nítrico na resposta constritora à
fenilefrina, curvas concentração-resposta a esse agente contrátil foram
Materiais e Métodos
54
desenvolvidas antes e após incubação por 40 minutos com L-NAME (100 µM), um
inibidor não seletivo da sintase de óxido nítrico.
•
Avaliação da participação dos prostanóides e do fator hiperpolarizante
derivado do endotélio sobre a resposta vasoconstritora à fenilefrina.
Para estudar a influência dos prostanóides da via do ácido-araquidônico-
ciclooxigenase, curvas concentração-resposta à fenilefrina foram realizadas antes e
após 40 minutos da pré-incubação das artérias com indometacina (10 µM), um
inibidor da ciclooxigenase, e L-NAME (100 µM). Nesse mesmo protocolo, foi
avaliada a influência do fator hiperpolarizante derivado do endotélio através da
realização de uma terceira curva concentração-resposta à fenilefrina após 40
minutos da pré-incubação com tetraetilamônio (TEA, 2 mM), um bloqueador de
canais para o potássio ativados por cálcio, indometacina e L-NAME.
•
Avaliação temporal da resposta vasoconstritora induzida por fenilefrina
Com o intuito de verificar a estabilidade das preparações, foram realizadas
curvas concentração-resposta à fenilefrina em artérias mesentéricas uma e duas
horas após realização da primeira curva à fenilefrina (0h).
•
Avaliação da atividade funcional da Na
+
, K
+
-ATPase sensível à ouabaína
A atividade da Na
+
, K
+
-ATPase foi analisada utilizando-se a técnica de
relaxamento induzido por potássio, descrita por Webb & Bohr (1978) e modificada
por Rossoni e colaboradores
(1999).
Após a realização da curva de relaxamento à acetilcolina, para confirmação
da viabilidade endotelial, os segmentos arteriais foram estabilizados por 30 minutos
em solução normal de Krebs-Henseileit, e em seguida, foram estabilizados por mais
30 minutos em solução sem potássio. Após esse período, as artérias foram pré-
contraídas com fenilefrina, e, após atingir um platô, KCl (1, 2, 4 e 6 mM) foi
adicionado de maneira cumulativa em intervalos de 2 minutos e 30 segundos (Ponte
et al
, 1999a; Rossoni
et al
, 2002a). Após esse procedimento, as preparações foram
incubadas com ouabaína (100 µM) durante 30 minutos, e a curva de relaxamento ao
potássio foi novamente repetida.
Materiais e Métodos
55
3.2.5. Western Blot
3.2.5.1. Expressão protéica da isoforma endotelial da sintase de óxido
nítrico e da ciclooxigenase-2
A expressão da isoforma endotelial da sintase de óxido nítrico (eNOS) e da
ciclooxigenase-2 (COX-2) foi determinada através da técnica de
Western Blot.
Amostras de artérias mesentéricas, que estavam congeladas a -80
o
C foram
homogeneizadas em solução tampão composta de: Tris (10 mM, pH=7,4), Lauril
sulfato de sódio (SDS, 1%) e Metavanadato de sódio (1 mM). Os homogeneizados
foram centrifugados a 6000 rpm por 10 minutos à 4ºC e a concentração de proteína
foi medida no sobrenadante pelo método de Bradford (1976).
3.2.5.1.1. Eletroforese e transferência das amostras
Alíquotas do homogeneizado (60 µg de proteína) foram diluídas em solução
de Laemmli (Uréia 0,5 mM; SDS 0,17 mM; DTT 39 µM; Tris-HCl pH=8 0,01 M e Azul
de bromofenol 0,5 %) e após isso mantidas à temperatura de 99° C durante 4
minutos. Em seguida, foi novamente centrifugada e então, aplicada no gel com SDS
a 0,1% (Lauril Sulfato Sódico-poliacrilamida - SDS-PAGE). As amostras foram
submetidas a uma eletroforese com 7,5 % SDS-PAGE em um sistema Mini-Protean
II (BioRad) durante 2 horas, aplicando uma corrente constante de 80 V (Power Pac
200, BioRad). O gel era composto de dois níveis, Gel1 (7,5% de acrilamida) e Gel 2
(3% de acrilamida). Em um mesmo gel foram aplicadas amostras de células
endoteliais humanas como controle positivo para a eNOS (Transduction
Laboratories, KY) ou macrófagos para como controle positivo para COX-2
(Transduction Laboratories, KY).
Após a eletroforese, as proteínas foram transferidas para uma membrana de
polivinil difluorida (PVDF, Transfer Membrane, Hybond P, Amersham Life Science),
previamente ativada com metanol. Para a transferência, o gel, a membrana e papel
Whatman foram colocados em um sistema de sanduíche e imersos em uma cuba
(Mini-Protean II, Módulo de Transferência, BioRad) contendo a solução de
transferência (Tris 25 mM; Glicina 190 mM; SDS 0,05 % e Metanol 20 %). O sistema
foi submetido a uma corrente de 230 mA durante 20 horas.
Materiais e Métodos
56
3.2.5.1.2. Incubação com os anticorpos e detecção das isoformas
As membranas foram incubadas durante 120 minutos, à temperatura
ambiente e sob agitação, com uma solução bloqueante (leite desnatado 5 %,
soroalbumina bovina 5 %, Tris- 25 mM, NaCl 137 mM e Tween 20 0,2 %) para evitar
a união não específica com reativos não imunológicos. Em seguida estas mesmas
membranas foram incubadas durante 18 horas (
overnight
), com solução bloqueante
contendo o anticorpo primário para a eNOS (diluição 1:2000) ou COX-2 (diluição
1:100). O anticorpo primário era monoclonal contra a isoforma eNOS (Transduction
Laboratories, KY) ou COX-2 (Cayman Chemical, US). Depois disto, as membranas
foram lavadas com solução de TBS-T (Tris 10 mM, NaCl 100 mM e Tween 20 0,1 %)
por 40 minutos, sob agitação. Posteriormente, foram incubadas com anticorpo
secundário, Imunoglobulina IgG Anti-camundongo unida a peroxidase de coelho
para a eNOS (Transduction Laboratories, UK. Diluição em solução bloqueante:
1:5000) ou IgG Anti-coelho unida a peroxidase de coelho para a COX-2
(Transduction Laboratories, UK. Diluição em solução bloqueante: 1:2000), por 90
minutos, à temperatura ambiente e sob agitação. A proteína correspondente a eNOS
ou a COX-2 foi detectada por uma reação de quimiluminescência, utilizando um
sistema de detecção (ECL Plus, Amersham Life Science) incubando as membranas
por 8 minutos. As membranas foram colocadas em contato com um filme fotográfico
(Hyperfilm, Amersham Life Science), e as bandas impregnadas posteriormente
reveladas. As bandas das proteínas foram quantificadas mediante análise
densitométrica. Para tal, os filmes com as bandas protéicas impregnadas foram
gravados por um scanner conectado a um computador. Para análise das bandas e a
quantificação da área e da densidade das bandas foi utilizado um programa de
análise de imagens (Image J).
As mesmas membranas utilizadas para detecção da expressão protéica para
eNOS ou COX-2 foram utilizadas para detecção de α-actina (Transduction
Laboratories, UK. Diluição em solução bloqueante: 1:5000 no caso do anticorpo
monoclonal e 1:5000, no caso do IgG Anti-coelho unida a peroxidase de coelho),
visto que a densidade óptica para eNOS e COX-2 foram normalizadas em relação à
α-actina.
Materiais e Métodos
57
3.3. Expressão dos resultados e análises estatísticas
Os resultados estão apresentados como média ± erro padrão da média. Os
valores de “n” representam o número de animais utilizados em cada protocolo
experimental.
As respostas vasopressoras induzidas pela fenilefrina, na perfusão do leito
arterial caudal, são expressas como mudanças na pressão de perfusão, subtraindo o
pico de resposta pressora à fenilefrina pela pressão de perfusão basal.
Os resultados das respostas de relaxamento induzido pela acetilcolina e pelo
nitroprussiato de sódio, no leito arterial caudal, são expressos como porcentagem de
relaxamento induzido por estes fármacos.
Os resultados das respostas contráteis obtidos em artérias mesentéricas de
resistência foram normalizados em função da resposta máxima obtida com KCl (120
mM), considerada como 100% da resposta contrátil do músculo. Já as respostas de
relaxamento, foram expressas como porcentagem de relaxamento das contrações
induzidas por agonistas.
Para a determinação dos valores de resposta máxima (Rmáx) e EC
50
para
fenilefrina ou a acetilcolina, foi realizada uma análise de regressão não-linear, obtido
através da análise das curvas concentração-resposta utilizando o programa
GraphPad Prism Software (San Diego, CA, USA). A sensibilidade dos agonistas
foram expressas como EC50. Alguns resultados foram expressos como diferenças
da área sob a curva de concentração-resposta (dAUC) à fenilefrina em situações
controle e experimentais. A AUC foi calculada para cada curva concentração-
resposta e a diferença está expressa como porcentagem da diferença da AUC
(dAUC) da curva controle correspondente (GraphPad Prism Software, San Diego,
CA, E.U.A). Outros resultados também foram expressos como produto da razão
entre as sensibilidades obtidas através das curvas concentração-resposta à
fenillefrina em determinadas condições experimentais.
Resultados da expressão da eNOS e COX-2 foram expressos como a relação
entre a densidade óptica para eNOS e COX-2 em relação à α-actina.
A análise dos resultados foi realizada utilizando-se teste
T
, pareado e/ ou não
pareado, e análise de variância (ANOVA), uma e/ou duas vias, medidas repetidas ou
completamente randomizada. Quando a ANOVA apresentava significância
estatística o teste
post-hoc
de Bonferroni era realizado (GraphPad Prism Software,
Materiais e Métodos
58
San Diego, CA, E.U.A). Os resultados foram considerados estatisticamente
significantes para valores de P<0,05.
3.4. Fármacos e reagentes a utilizados
-2-Hidroxietilmercaptano (β-mercaptoetanol) (Sigma)
-3`, 3”, 5`, 5”-Tetrabromofenolsulfoneftaleína, sal sódico (Azul de Bromofenol)
(Sigma)
-Acetilcolina, cloridrato (Sigma)
-Ácido acético glacial (Probus)
-Ácido aminoacético (Glicina) (Sigma)
-Ácido Etilenodiaminotetracético (EDTA) (Sigma)
-Ácido hidroxietilpiperazina etanosulfônico (HEPES) (Sigma)
-Albumina bovina (Sigma)
-Anticorpo de camundongo anti-eNOS (Anti-eNOS) (Transduction Laboratories)
-Anticorpo de camundongo anti-COX-2 (Anti-COX-2) (Cayman Chemical)
-Anti-imunoglobulina G de camundongo (Transduction Laboratories)
-Anti-imunoglobulina G de coelho (Transduction Laboratories)
-Bicarbonato de sódio (Pancreac)
-Captopril (Sigma)
-Cloreto de cálcio (Pancreac)
-Cloreto de potássio (Pancreac)
-Cloreto de sódio (Pancreac)
-Controle positivo para eNOS (Células endoteliais) (Transduction Laboratories)
-Controle positivo para COX-2 (macrófagos) (Transduction Laboratories)
-CHAPS,(3-[(3-Colamidopropil)-dimetilamônio]-1-propanosulfonato) (Sigma)
-DL-Ditiotreitol (DTT) (Sigma)
Materiais e Métodos
59
-Etanol absoluto (Probus)
-Éter sulfúrico (Pancreac)
-Fosfato de potássio (Pancreac)
-Fosfato de sódio (Merck)
-Glicerol (Sigma)
-Glicose (Merck)
-Indometecina (Sigma)
-Lauril sulfato sódico (SDS) (BioRad)
-Leite desnatado Sveltesse (Nestlé)
-l-Fenilefrina, hidrocloridrato (Sigma)
-Losartan (Merck)
-Metanol (Merck)
-N, N, N`, N`-Tetrametil-etilenodiamina (Temed) (Sigma)
-N, N`-Metilenbisacrilamida 40% Solução 37, 5:1 (Acrilamida) (BioRad)
-N(W)-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), dicloridrato (Sigma)
-Nitroprussiato de sódio, dihidratado (Sigma)
-Ouabaína, octahidrato (Sigma)
-Persulfato Amônico (APS) (Sigma)
-Polioxietileno sorbitam monolaurato (Tween 20) (BioRad)
-Reagente para detecção de Western Blot (ECL plus) (Amersham Life Science,
Pharmacia biotech)
-Sulfato de magnésio heptahidratado (Merck)
-Tetraetilamônio, cloridrato (Sigma)
-Tris (hidroximetil)-aminometano (Tris) (BioRad)
-Uréia (Sigma)
- Uretana (Sigma)
Materiais e Métodos
60
Todas as soluções concentradas (10
-1
e 10
-2
M) foram dissolvidas em água
bidestilada e mantidas no congelador a –20
0
C. Somente a indometacina foi
dissolvida em uma solução de bicarbonato de sódio 1,5 mM. As diluições
necessárias eram preparadas recentemente, em cada dia de experimento. As
soluções utilizadas para os experimentos
“in vivo”
foram dissolvidas em solução
salina (NaCl 0,9%).
RESULTADOS
Resultados
61
4. Resultados
4.1. Experimentos agudos “in vivo”
4.1.1. Dados ponderais, valores pressóricos e de freqüência cardíaca em
animais anestesiados.
Os animais normotensos (Wistar e WKY) e hipertensos (SHR) não apresentaram
diferenças nos valores de massa corporal (Wistar: 298 ± 6 g; WKY: 289 ± 5 g; SHR: 294
± 8 g. ANOVA -1 via, P > 0,05).
Em relação aos níveis pressóricos em animais anestesiados, os ratos SHR
apresentaram níveis de pressão arterial sistólica e diastólica aumentados quando
comparados tanto aos ratos WKY quanto aos Wistar (Tabela 1). Os valores de
freqüência cardíaca não diferiram entre os animais Wistar e SHR, embora tenham sido
estatisticamente diferentes quando comparados os animais WKY e SHR (Tabela 1).
Tabela 1. Valores de pressão arterial sistólica, pressão arterial diastólica e freqüência cardíaca de ratos
Wistar, WKY e SHR, anestesiados.
Wistar
WKY SHR
PAS (mmHg)
102 ± 5 (N=9) 112 ± 2 (N=11) 133 ± 4
*+
(N=10)
PAD (mmHg)
70 ± 5 (N=9) 68 ± 3 (N=11) 91 ± 3
*+
(N=10)
FC (bpm)
314 ± 15 (N=9) 285 ± 10 (N=11) 338 ± 16
+
(N=10)
PAS – Pressão Arterial Sistólica; PAD – Pressão Arterial Diastólica e FC – Freqüência Cardíaca.
Os valores representam a média ± EPM.
ANOVA (uma via),
*
P < 0,05 vs SHR.
+
P < 0,05 WKY vs SHR.
Resultados
62
4.1.2. Efeito da ouabaína na pressão arterial de ratos anestesiados
Todos os ratos utilizados nos estudos in vivo foram anestesiados com uretana.
Esse anestésico, de maneira similar, reduziu a pressão arterial sistólica e diastólica nos
3 grupos estudados (comparar tabela 1 e tabela 2), conforme já descrito na literatura
(Vassallo et al, 1997; Rossoni et al, 2001; Rossoni et al, 2003).
Após um período de estabilização de 30 minutos, foi administrada ouabaína e ao
final de 60 minutos após essa administração, os animais Wistar e SHR (Figura 1A e 1C)
apresentaram um aumento significativo da pressão arterial sistólica (Wistar: 102 ± 6
mmHg vs Wistar/OUA: 128 ± 3 mmHg; SHR: 131 ± 6 mmHg vs SHR/OUA: 153 ± 3
mmHg. Teste t, P < 0,05). No entanto, nos animais WKY (Figura 1B), a administração
de ouabaína não produziu nenhuma alteração na PAS (WKY: 111 ± 3 mmHg vs
WKY/OUA: 111 ± 4 mmHg. Teste t, P > 0,05).
De maneira similar, a ouabaína também foi capaz de elevar a pressão arterial
diastólica (Figura 2A e 2C) nos animais Wistar e SHR (Wistar: 73 ± 9 mmHg vs
Wistar/OUA: 111 ± 8 mmHg; SHR: 95 ± 3 mmHg vs SHR/OUA: 127 ± 4 mmHg. Teste t,
P < 0,05). Porém, nos animais WKY (Figura 2B), a administração desse glicosídeo
reduziu a pressão arterial diastólica (WKY: 66 ± 4 mmHg vs WKY/OUA: 56 ± 3 mmHg.
Teste t, P < 0,05).
A freqüência cardíaca (Figura 3) não foi modificada pela administração de
ouabaína em nenhum dos 3 grupos estudados (Wistar: 311 ± 26 bpm vs Wistar/OUA:
384 ± 9 bpm; WKY: 287 ± 11 bpm vs WKY/OUA: 310 ± 17 bpm; SHR: 359 ± 24 bpm vs
SHR/OUA: 386 ± 13 bpm. Teste t, P > 0,05).
Resultados
63
A)
Wistar Wistar/OUA
0
100
200
*
PAS (mmHg)
B)
WKY WKY/OUA
0
100
200
PAS (mmHg)
C)
SHR SHR/OUA
0
100
200
*
PAS (mmHg)
Figura 1. Valores de pressão arterial sistólica (PAS) em ratos Wistar (A, N=5), WKY (B, N=7) e SHR (C,
N=6) anestesiados com uretana, antes (barras claras) e após (barras pontilhadas) 60 minutos da
administração de 18 µg/Kg de ouabaína. Os resultados estão expressos como média ± erro padrão da
média. Teste T: * P < 0,05 vs antes da administração de ouabaína.
Resultados
64
A)
Wistar Wistar/OUA
0
50
100
150
*
PAD (mmHg)
B)
WKY WKY/OUA
0
50
100
150
*
PAD (mmHg)
C
SHR SHR/OUA
0
50
100
150
*
PAD (mmHg)
Figura 2. Valores de pressão arterial diastólica (PAD) em ratos Wistar (A, N=5), WKY (B, N=7) e SHR (C,
N=6) anestesiados com uretana, antes (barras claras) e após (barras pontilhadas) 60 minutos da
administração de 18 µg/Kg de ouabaína. Os resultados estão expressos como média ± erro padrão da
média. Teste T: * P < 0,05 vs antes da administração de ouabaína.
Resultados
65
A)
Wistar Wistar/OUA
0
100
200
300
400
FC (bpm)
B)
WKY WKY/OUA
0
100
200
300
400
FC (bpm)
C)
SHR SHR/OUA
0
100
200
300
400
FC (bpm)
Figura 3. Valores de freqüência cardíaca (FC) em ratos Wistar (A, N=5), WKY (B, N=7) e SHR (C, N=6)
anestesiados com uretana, antes (barras claras) e após (barras pontilhadas) 60 minutos da administração
de 18 µg/Kg de ouabaína. Os resultados estão expressos como média ± erro padrão da média. Teste T:
P > 0,05.
Resultados
66
4.1.3. Efeito do bloqueio dos receptores AT1 para angiotensina II sobre as ações
da ouabaína na pressão arterial
Para analisar a participação da angiotensina II nos efeitos da ouabaína, foi
administrado losartan, um bloqueador dos receptores AT1 para angiotensina II, depois
de transcorridos um período de estabilização de 30 minutos e antes da administração
de ouabaína.
A administração de losartan (Figura 4) per se reduziu significativamente a
pressão arterial sistólica nos 3 grupos de animais estudados (Wistar: 101 ± 6 mmHg vs
Wistar/LOS: 76 ± 3 mmHg; WKY: 114 ± 0,6 mmHg vs WKY/LOS: 94 ± 3 mmHg; SHR:
133 ± 6 mmHg vs SHR/LOS: 106 ± 5 mmHg. ANOVA 1 via, P < 0,05). No entanto, como
é possível observar na Figura 4A e 4C, esse fármaco não foi capaz de bloquear os
efeitos pressores da ouabaína nos animais Wistar e SHR (Wistar/LOS: 76 ± 3 mmHg vs
Wistar/LOS+OUA: 103 ± 4 mmHg; SHR/LOS: 106 ± 5 mmHg vs SHR/LOS+OUA: 150 ±
5 mmHg. ANOVA 1 via, P < 0,05). Já nos animais WKY (Figura 4B), a pressão arterial
sistólica em presença de losartan não foi modificada após a administração de ouabaína
(WKY/LOS: 94 ± 3 mmHg vs WKY/LOS+OUA: 101 ± 3 mmHg. ANOVA 1 via, P > 0,05).
Lembrar que a administração de ouabaína não produzia efeitos sobre a pressão arterial
sistólica (Figura 1B) nesses animais.
A pressão arterial diastólica (Figura 5) foi reduzida significativamente após a
administração de losartan em todos os grupos estudados (Wistar: 67 ± 6 mmHg vs
Wistar/LOS: 38 ± 0,4 mmHg; WKY: 71 ± 3 mmHg vs WKY/LOS: 38 ± 4 mmHg; SHR: 87
± 6 mmHg vs SHR/LOS: 62 ± 4 mmHg. ANOVA 1 via, P < 0,05). Nos ratos Wistar, esse
fármaco bloqueou os efeitos pressores da ouabaína sobre a pressão arterial diastólica
(comparar Figuras 2A e 5A) (Wistar/LOS: 38 ± 0,4 mmHg vs Wistar/LOS+OUA: 54 ± 5
mmHg. ANOVA 1 via, P > 0,05). Entretanto, esse efeito não foi observado nos animais
SHR (SHR/LOS: 62 ± 4 mmHg vs SHR/LOS+OUA: 81 ± 5. ANOVA 1 via, P < 0,05), ou
seja, a ouabaína incrementou a pressão arterial diastólica mesmo em presença de
losartan, similar ao que ocorreu na pressão arterial sistólica. Já nos animais WKY
(Figura 5B), a administração de ouabaína não promoveu efeito adicional sobre as
respostas encontradas com losartan (WKY/LOS: 38 ± 4 mmHg vs WKY/LOS+OUA: 35
± 3 mmHg. ANOVA 1 via, P > 0,05).
Resultados
67
A freqüência cardíaca não foi modificada pela presença de losartan ou losartan +
ouabaína em todos os grupos estudados (Wistar: 318 ± 6 bpm vs Wistar/LOS: 311 ± 10
bpm vs Wistar/LOS+OUA: 356 ± 23 bpm; WKY: 280 ± 22 bpm vs WKY/LOS: 268 ± 25
bpm vs WKY/LOS+OUA: 292 ± 18 bpm; SHR: 312 ± 13 bpm vs SHR/LOS: 293 ± 27
bpm vs SHR/LOS+OUA: 341 ± 16 bpm. ANOVA 1 via, P < 0,05).
A)
Wistar Wistar/LOS Wistar/LOS+OUA
0
100
200
*
+
PAS (mmHg)
B)
WKY WKY/LOS WKY/LOS+OUA
0
100
200
*
PAS (mmHg)
Resultados
68
C)
SHR SHR/LOS SHR/LOS+OUA
0
100
200
*
+
PAS (mmHg)
Figura 4. Valores de pressão arterial sistólica (PAS) em ratos Wistar (A, N=4), WKY (B, N=4) e SHR (C,
N=5) anestesiados com uretana, antes (barras claras) e após (barras pontilhadas) 30 minutos da
administração de losartan e após (barras pontilhadas) após 60 minutos da administração de 18 µg/Kg de
ouabaína. Os resultados estão expressos como média ± erro padrão da média. ANOVA 1 Via: * P < 0,05
vs antes da administração de losartan;
+
P < 0,05 vs após a administração de losartan.
Resultados
69
A)
Wistar Wistar/LOS Wistar/LOS+OUA
0
50
100
150
*
PAD (mmHg)
B)
WKY WKY/LOS WKY/LOS+OUA
0
50
100
150
*
*
PAD (mmHg)
C)
SHR SHR/LOS SHR/LOS+OUA
0
50
100
150
*
+
PAD (mmHg)
Figura 5. Valores de pressão arterial diastólica (PAD) em ratos Wistar (A, N=4), WKY (B, N=4) e SHR (C,
N=5) anestesiados com uretana, antes (barras claras) e após (barras pontilhadas) 30 minutos da
administração de losartan e após (barras pontilhadas) após 60 minutos da administração de 18 µg/Kg de
ouabaína. Os resultados estão expressos como média ± erro padrão da média. ANOVA 1 Via: * P < 0,05
vs antes da administração de losartan;
+
P < 0,05 vs após a administração de losartan.
Resultados
70
4.2. Experimentos agudos “in vitro”
4.2.1. Dados ponderais, valores pressóricos e de freqüência cardíaca em
animais acordados.
O peso corporal dos 3 grupos de animais estudados não diferiram entre si
(Wistar: 286 ± 6 g; WKY: 271 ± 7 g; SHR: 268 ± 5 g. ANOVA 1 via, P > 0,05).
Os animais SHR apresentaram níveis de pressão arterial sistólica e diastólica
aumentados quando comparados aos animais Wistar ou aos WKY (Tabela 2). Os
valores de freqüência cardíaca, da mesma forma como ocorreu nos ratos anestesiados
(Tabela 1), não diferiram entre os animais Wistar e SHR, embora tenham sido
estatisticamente diferentes entre os animais WKY e SHR (Tabela 2).
Tabela 2. Valores de pressão arterial sistólica, pressão arterial diastólica e freqüência cardíaca de ratos
Wistar, WKY e SHR, acordados.
WKY
Wistar SHR
PAS (mmHg)
122 ± 3 (N=21) 123 ± 2 (N=26) 205 ± 2* (N=30)
PAD (mmHg)
92 ± 3 (N=21) 94 ± 3 (N=26) 160 ± 3* (N=30)
FC (bpm)
343 ± 7 (N=21) 356 ± 4 (N=26) 364 ± 5
+
(N=30)
PAS – Pressão Arterial Sistólica; PAD – Pressão Arterial Diastólica e FC – Freqüência Cardíaca. Os
valores representam a média ± EPM.
ANOVA (1 via), *P < 0,05 SHR vs Wistar e WKY;
+
P < 0,05 WKY vs SHR.
4.2.2. Resposta vasoconstritora à fenilefrina e resposta vasodilatadora induzida
pela acetilcolina
A resposta de relaxamento mediada pelo endotélio foi avaliada através da
administração de uma única dose in bolus de acetilcolina (5µg), em artérias
previamente contraídas com fenilefrina. A magnitude da resposta de relaxamento à
acetilcolina foi similar nos 3 grupos estudados (Wistar: -68,5 ± 2,5 mmHg; WKY: -67,8 ±
2,7 mmHg; SHR: -72,5 ± 2,2 mmHg. ANOVA 1 via, P > 0,05).
Resultados
71
A fenilefrina aumentou, de maneira dose-dependente, a média da pressão de
perfusão do leito vascular caudal nos três grupos estudados. Não houve diferenças na
sensibilidade (EC50) e resposta máxima (Rmáx) à fenilefrina entre os ratos Wistar e
SHR (Figura 6; tabela 3). No entanto, ao se avaliar a resposta pressora à fenilefrina nos
animais WKY, observou-se que os mesmos apresentavam uma redução na resposta
máxima à fenilefrina quando comparados aos animais Wistar e SHR (Figura 6; tabela
3).
-6 -5 -4 -3 -2 -1 0
0
100
200
300
400
Wistar
WKY
SHR
*
*
* *
Fenilefrina (log M)
∆
∆
∆
∆
MPP (mmHg)
Figura 6. Mudanças na média da pressão de perfusão (∆MPP; mmHg), induzidas por doses crescentes
de fenilefrina, no leito vascular caudal de animais Wistar (n=26, quadrados cheios), WKY (n=14, círculos
cheios) e SHR (n=26, triângulos cheios). Os resultados estão expressos como média ± erro padrão a
média.
ANOVA (duas vias): * P < 0,05 vs Wistar e SHR.
Resultados
72
Tabela 3: Valores de EC50 e resposta máxima (Rmáx, mmHg) obtidos através de curvas concentração-
resposta à fenilefrina em artérias caudal de ratos Wistar, WKY e SHR.
Wistar WKY SHR
EC50
0,004 ± 0,0006 0,003 ± 0,0004 0,005 ± 0,0005
Rmáx
267 ± 12,0 215 ± 8* 288 ± 11
EC50 – Sensibilidade; Rmáx – Resposta máxima. Valores são expressos como média ± EPM.
ANOVA (uma via): * P < 0,05 vs. Wistar e SHR.
4.2.3. Efeito da administração aguda de 1 µM de ouabaína sobre a resposta
pressora à fenilefrina no leito vascular caudal de ratos
Dados anteriores do nosso laboratório (Padilha et al, 2004) já demonstraram que
a infusão contínua com solução de Krebs-Henseleit por 60 minutos não modifica a
reatividade à fenilefrina nem a média da pressão de perfusão basal nos animais Wistar,
WKY e SHR. Devido a isso, não foi realizado o protocolo temporal de reatividade à
fenilefrina no presente estudo.
A perfusão por 60 minutos com 1 µM de ouabaína não foi capaz de alterar a
média da pressão de perfusão basal nos animais normotensos (Wistar: 96,4 ± 3,9
mmHg vs Wistar/OUA: 100,1 ± 3,5 mmHg ; WKY: 85,4 ± 4,3 mmHg vs WKY/OUA: 80,1
± 9 mmHg. Teste T, P > 0,05). No entanto, nos animais SHR, a perfusão com ouabaína
elevou a média da pressão de perfusão basal de forma significativa (SHR: 87,8 ± 4,9
mmHg vs SHR/OUA: 95,5 ± 5,2 mmHg. Teste T, P < 0,05).
A administração de fenilefrina aumentou, de maneira concentração-dependente,
a média da pressão de perfusão nas artérias de animais normotensos e hipertensos
(Figura 7). Nos animais Wistar, a sensibilidade a este agonista alfa-1 adrenérgico foi
elevada após perfusão por 60 minutos com ouabaína (Figura 7A e Tabela 4). Já nos
Resultados
73
animais WKY e SHR, tanto a sensibilidade quanto a resposta máxima foram
aumentadas por esse glicosídeo (Figura 7B e 7C, Tabela 4).
A)
-6 -5 -4 -3 -2 -1 0
0
100
200
300
400
Wistar
Wistar/Oua
*
*
Fenilefrina (log M)
∆
∆
∆
∆
MPP (mmHg)
B)
-6 -5 -4 -3 -2 -1 0
0
100
200
300
400
WKY
WKY/Oua
*
*
*
*
* *
Fenilefrina (Log, M)
∆
∆
∆
∆
MPP (mmHg)
Resultados
74
C)
-6 -5 -4 -3 -2 -1 0
0
100
200
300
400
SHR
SHR/Oua
*
*
*
*
*
*
Fenilefrina (log, M)
∆
∆
∆
∆
MPP (mmHg)
Figura 7. Mudanças na média da pressão de perfusão (∆MPP; mmHg), induzidas por doses crescentes
de fenilefrina, no leito vascular caudal de animais Wistar (A, n = 9), WKY (B, n = 5) e SHR (C, n = 8)
antes (símbolos cheios) e após (símbolos vazio) perfusão por 60 minutos com ouabaína. Os resultados
estão expressos como média ± erro padrão a média.
ANOVA (duas vias): * P < 0,05 vs antes da perfusão com ouabaína.
Tabela 4. Valores de EC50 e resposta máxima (Rmáx, mmHg) obtidos através de curvas concentração-
resposta à fenilefrina em artérias caudal de ratos Wistar (n = 9), WKY (n = 5) e SHR (n = 8) antes e após
perfusão com 1 µM de ouabaína.
EC50 Rmáx
Antes Depois Antes Depois
Wistar
0,004 ± 0,0006 0,002 ± 0,0005* 301,3 ± 19,8
295,1 ± 23,0
WKY
0,003 ± 0,0007 0,002 ± 0,0004* 195,2 ± 11,3
234,8 ± 10,1*
SHR
0,006 ± 0,001 0,004 ± 0,001* 258,4 ± 20,4
288,4 ± 20,1*
EC50 – Sensibilidade; Rmáx – Resposta máxima. Valores são expressos como média ± EPM.
Teste T: * P < 0,05 vs antes da perfusão com ouabaína.
Resultados
75
Tabela 5. Valores de EC50 e resposta máxima (Rmáx, mmHg) obtidos através de curvas concentração-
resposta à fenilefrina em artérias caudal de ratos Wistar (n = 9-7), WKY (n = 5-5) e SHR (n = 7-5) antes
(E+) e após lesão endotelial (E-).
EC50 Rmáx
E+ E- E+ E-
Wistar
0,004 ± 0,0006 0,001 ± 0,0004* 301,3 ± 19,8
347,5 ± 29,3
WKY
0,003 ± 0,0007 0,0005 ± 0,0001* 195 ± 11,34 279,0 ± 32,5*
SHR
0,006 ± 0,001 0,001 ± 0,0002* 258,4 ± 20,4
391,2 ± 44,7*
EC50 – Sensibilidade; Rmáx – Resposta máxima. Valores são expressos como média ± EPM.
Teste T: * P < 0,05 vs após lesão endotelial (E-).
4.2.4. Modulação do endotélio no efeito da ouabaína sobre a resposta pressora à
fenilefrina
Recente trabalho do nosso laboratório (Padilha et al, 2004) demonstrou que a
lesão endotelial provocada por CHAPS em artérias caudais, tanto de Wistar como de
WKY e SHR, promove aumento da média da pressão de perfusão basal comparada às
artérias de animais com endotélio intacto. Outro dado relevante desse mesmo trabalho,
é que a infusão com solução de Krebs-Henseleit por 60 minutos não modifica a média
da pressão de perfusão nessas artérias com endotélio lesado nem a reatividade
vascular à fenilefrina. Assim sendo, não realizamos os protocolos temporais acima
mencionados.
Após lesão endotelial, a sensibilidade à fenilefrina foi aumentada nos ratos
Wistar, sem modificar, no entanto, a resposta máxima (Tabela 5). Já nos animais WKY
e SHR, tanto a sensibilidade quanto à resposta máxima (Tabela 5) foram elevadas pela
lesão endotelial.
Para analisar se o grau de deslocamento da sensibilidade à fenilefrina obtida
através das curvas concentração-resposta a esse fármaco antes e após lesão
endotelial entre os três grupos estudados era diferente, foi utilizado o cálculo da razão
dessa sensibilidade nas condições com e sem endotélio. Dessa forma, observou-se que
Resultados
76
o efeito da remoção do endotélio não foi diferente entre os grupos estudados (Razão
EC50 - Wistar E+/E: 0,409 ± 0,121; WKY E+/E-: 0,244 ± 0,094; SHR E+/E-: 0,146 ±
0,031. Teste T, P > 0,05).
Para averiguar se os efeitos pressores da ouabaína eram dependentes do
endotélio, foram realizadas curvas concentração-resposta à fenilefrina, na ausência do
endotélio funcional, antes e após perfusão por 60 minutos com ouabaína.
A perfusão por 60 minutos com 1 µM de ouabaína não foi capaz de alterar a
média da pressão de perfusão basal na ausência do endotélio funcional nos 3 grupos
estudados (Wistar: 106,1 ± 5,6 mmHg vs Wistar/OUA: 98,7 ± 4,3 mmHg; WKY: 125,6 ±
5,8 mmHg vs WKY/OUA: 104,3 ± 5,9 mmHg; SHR: 124,0 ± 6,5 mmHg vs SHR/OUA:
104,5 ± 6,5 mmHg. Teste T, P > 0,05).
Tanto nos animais Wistar (Figura 9A) como nos animais WKY (Figura 9B), a
perfusão com ouabaína não alterou nem a sensibilidade nem a resposta máxima à
fenilefrina (EC50 – Wistar E-: 0,001 ± 0,0004 vs Wistar E-/OUA: 0,0009 ± 0,0002; WKY
E-: 0,0005 ± 0,0001 vs WKY E-/OUA: 0,0005 ± 0,0002. Rmáx – Wistar E-: 347,5 ± 29,3
mmHg vs Wistar E-/OUA: 323,3 ± 32,5 mmHg; WKY E-: 279,0 ± 32,5 mmHg vs WKY E-
/OUA: 259,9 ± 15,9 mmHg. Teste T, P > 0,05). Da mesma forma, nos animais SHR
(Figura 9B) a ouabaína não produziu nenhuma modificação nos parâmetros de
sensibilidade e resposta máxima à fenilefrina (EC50 – SHR E-: 0,001 ± 0,0002 vs SHR
E-/OUA: 0,001 ± 0,0003. Rmáx – SHR E-: 391,2 ± 44,7 mmHg vs SHR E-/OUA: 406,0 ±
41,2 mmHg. Teste T, P > 0,05). Desse modo, pode-se sugerir que os efeitos da
ouabaína sobre a reatividade vascular à fenilefrina observada nos animais normotensos
e hipertensos são dependentes do endotélio.
A lesão endotelial foi confirmada nos três grupos estudados através da resposta
de relaxamento induzida pela acetilcolina, praticamente abolida após administração de
CHAPS (Wistar E+: -72,2 ± 4,1 vs Wistar E-: -3,2 ± 1,5%; WKY E+: -74,4 ± 4,5 vs WKY
E-: -7,2 ± 1,1%; SHR E+: -68,7 ± 5,4 vs SHR E-: -6,8 ± 2,1%. Teste T, P < 0,05). Para
descartar qualquer possibilidade de lesão muscular após a lesão endotelial, foi
Resultados
77
administrado nitroprussiato de sódio, um vasodilatador independente do endotélio. Não
foi observada modificação na resposta de relaxamento induzida por esse fármaco antes
a após a lesão endotelial (Wistar E+: -75,6 ± 2,9 % vs Wistar E-: -71,0 ± 5,1 %; WKY
E+: -77,0 ± 3,1 % vs WKY E-: -74,4 ± 4,0 %; SHR E+: -72,5 ± 2,6 % vs SHR E-: -70,5 ±
1,5 %. Teste T, P > 0,05).
A)
-6 -5 -4 -3 -2 -1 0
0
100
200
300
400
Wistar E-
Wistar E+
Fenilefrina (Log M)
∆
∆
∆
∆
MPP (mmHg)
*
*
*
*
B)
-6 -5 -4 -3 -2 -1 0
0
100
200
300
400
WKY E+
WKY E-
*
*
*
*
*
* *
Fenilefrina (Log M)
∆
∆
∆
∆
MPP (mmHg)
Resultados
78
C)
-6 -5 -4 -3 -2 -1 0
0
100
200
300
400
SHR E-
SHR E+
*
*
*
*
*
* *
Fenilefrina (Log M)
∆
∆
∆
∆
MPP (mmHg)
Figura 8. Mudanças na média da pressão de perfusão (∆MPP; mmHg) induzidas por doses crescentes
de fenilefrina no leito vascular caudal de ratos Wistar (A, n = 9 - 7), WKY (B, n = 5 - 5) e SHR (B, n = 7 -
5), nas condições com endotélio (símbolos cheios) e após lesão endotelial com CHAPS (símbolos
vazios). ANOVA (duas vias): * P < 0,05 vs em condições com endotélio.
Resultados
79
A)
-6 -5 -4 -3 -2 -1 0
0
100
200
300
400
Wistar E-
Wistar E-/Oua
Fenilefrina (Log M)
∆
∆
∆
∆
MPP (mmHg)
B)
-6 -5 -4 -3 -2 -1 0
0
100
200
300
400
WKY E-
WKY E-/Oua
Fenilefrina(Log M)
∆
∆
∆
∆
MPP (mmHg)
Resultados
80
C)
-6 -5 -4 -3 -2 -1 0
0
100
200
300
400
SHR E-
SHR E-/Oua
Fenilefrina (Log M)
∆
∆
∆
∆
MPP (mmHg)
Figura 9. Mudanças na média da pressão de perfusão (∆MPP; mmHg) induzidas por doses crescentes
de fenilefrina após lesão endotelial com CHAPS no leito vascular caudal de ratos Wistar (A, n = 7), WKY
(B, n = 5) e SHR (B, n = 5), antes (símbolos cheios) e após (símbolos vazios) perfusão por 60 minutos
com 1 µM de ouabaína.
ANOVA (duas vias): P > 0,05.
Resultados
81
4.2.5. Análise da participação da Angiotensina II nos efeitos da ouabaína sobre a
resposta pressora à fenilefrina
Resultados anteriores demonstraram que 1 µM de ouabaína foi capaz de
aumentar a reatividade vascular à fenilefrina e que essa resposta é dependente da
presença do endotélio funcional. Ao mesmo tempo, dados prévios do nosso laboratório
(Padilha et al, 2004) demonstraram que pequenas doses de ouabaína (1 nM) aumenta
a reatividade à fenilefrina em ratos SHR, no mesmo segmento arterial utilizado no
presente estudo, e que essa resposta é dependente de angiotensina II endotelial.
Dessa forma, analisamos se esse mesmo mecanismo poderia estar implicado nos
efeitos de concentrações maiores de ouabaína sobre a reatividade vascular de ratos
hipertensos e normotensos, utilizando, para isso, losartan, um inibidor dos receptores
AT1 para angiotensina II.
Inicialmente, avaliamos se o losartan per se modificava a reatividade vascular à
fenilefrina em ratos Wistar e WKY. Uma vez que dados prévios do nosso laboratório
(Padilha et al, 2004) demonstraram que a resposta vasoconstritora a esse agonista α-
adrenérgico não se alterava em ratos SHR, esse protocolo não foi realizado no
presente estudo. Dessa forma, como é possível observar nas figuras 10A e 10 B, o
losartan não produziu nenhuma alteração na reatividade vascular è fenilefrina e nos
valores de sensibilidade (Wistar: 0,003 ± 0,001 vs Wistar/Los: 0,002 ± 0,0004; WKY:
0,003 ± 0,001 vs WKY/Los: 0,002 ± 0,0003. Teste T, P > 0,05) e resposta máxima
(Wistar: 231,2 ± 21,9 mmHg vs Wistar/Los: 233,5 ± 25,6 mmHg; WKY: 217,6 ± 11,6
mmHg vs WKY/Los: 229,7 ± 16,9 mmHg. Teste T, P > 0,05) a esse agente
vasoconstritor.
Nos animais normotensos, a co-infusão por 60 minutos com ouabaína e losartan
(Figura 11), não modificou a sensibilidade (Wistar: 0,004 ± 0,002 vs Wistar Oua/Los:
0,002 ± 0,0002; WKY: 0,002 ± 0,0003 vs WKY Oua/Los: 0,001 ± 0,0003. Teste T, P >
0,05) e a resposta máxima (Wistar: 259,8 ± 15,9 mmHg vs Wistar Oua/Los: 252,8 ± 13,2
mmHg; WKY: 227,0 ± 13,2 mmHg vs WKY Oua/Los: 250,1 ± 16,1 mmHg. Teste T, P >
Resultados
82
0,05) a fenilefrina, sugerindo que os efeitos desse glicosídeo sobre a reatividade
vascular (ver figuras 7A e 7B) são mediados pela angiotensina II.
Já nos SHR, como demonstrado na figura 11C, a perfusão com losartan aboliu
somente os efeitos pressores da ouabaína (ver figura 7C) sobre a resposta máxima à
fenilefrina (SHR: 295,5 ± 11,3 mmHg vs SHR Oua/Los: 303,7 ± 11,2 mmHg. Teste T, P
> 0,05), mantendo seus efeitos sobre a sensibilidade a esse agente vasoconstritor
(SHR: 0,005 ± 0,001 vs SHR Oua/Los: 0,002 ± 0,0004. Teste T, P < 0,05).
Resultados
83
A)
-6 -5 -4 -3 -2 -1 0
0
100
200
300
400
Wistar
Wistar/Los
Fenilefrina (Log M)
∆
∆
∆
∆
MPP (mmHg)
B)
-6 -5 -4 -3 -2 -1 0
0
100
200
300
400
WKY
WKY/Los
Fenilefrina (Log M)
∆
∆
∆
∆
MPP (mmHg)
Figura 10. Mudanças na média da pressão de perfusão (∆MPP; mmHg) induzidas por doses crescentes
de fenilefrina no leito vascular caudal de ratos Wistar (A, n = 6) e WKY (B, n = 4) antes (símbolos cheios)
e após (símbolos vazios) perfusão por 60 minutos com losartan (10
-4
M).
ANOVA (duas vias): P > 0,05.
Resultados
84
A)
-6 -5 -4 -3 -2 -1 0
0
100
200
300
400
Wistar
Wistar Oua/Los
Fenilefrina (Log M)
∆
∆
∆
∆
MPP (mmHg)
B)
-6 -5 -4 -3 -2 -1 0
0
100
200
300
400
WKY
WKY Oua/Los
Fenilefrina (Log M)
∆
∆
∆
∆
MPP (mmHg)
Resultados
85
C)
-6 -5 -4 -3 -2 -1 0
0
100
200
300
400
SHR
SHR Oua/Los
Fenilefrina (Log M)
∆
∆
∆
∆
PPM (mmHg)
*
*
Figura 11. Mudanças na média da pressão de perfusão (∆MPP; mmHg) induzidas por doses crescentes
de fenilefrina no leito vascular caudal de ratos Wistar (A, n = 7), WKY (B, n = 6) e SHR (C, n = 12) antes
(símbolos cheios) e após (símbolos vazios) co-perfusão por 60 minutos com losartan (10
-4
M) e ouabaína
(1 µM).
ANOVA (duas vias): * P < 0,05 vs após co-perfusão com losartan e ouabaína.
Resultados
86
4.3. Experimentos crônicos
4.3.1. Valores pressóricos, de freqüência cardíaca e de massa corporal
O tratamento por 15 dias com ouabaína induziu aumento significativo da pressão
arterial sistólica, diastólica e freqüência cardíaca quando comparado aos animais
controle (Figura 12). Ao final dos 15 dias de tratamento os valores de massa corporal
foram similares nos dois grupos estudados (CT: 351,8 ± 7,4 g; OUA15d 352,3 ± 4,71 g.
Teste T, P > 0,05).
A)
CT OUA
0
25
50
75
100
125
150
*
PAS (mmHg)
Resultados
87
B)
CT OUA
0
25
50
75
100
125
150
*
PAD (mmHg)
C)
CT OUA
0
100
200
300
400
500
*
FC (bpm)
Figura 12. Valores de pressão arterial sistólica (PAS, mmHg), pressão arterial diastólica (PAD, mmHg) e
freqüência cardíaca (FC, bpm) de ratos Wistar controle (CT, n = 10) e tratados por 15 dias com ouabaína
(OUA, n = 10). Teste T: * P < 0,05 vs CT.
Resultados
88
4.3.2. Respostas vasculares ao KCl, a acetilcolina e à fenilefrina
O diâmetro luminar efetivo das artérias mesentéricas de terceira ordem de ratos
tratados com ouabaína não diferiram quando comparado ao grupo controle (CT: 218 ±
6,3 µm vs OUA: 212 ± 6,7 µm, Teste T, P > 0,05).
As contrações induzidas por KCl (120 mM) foram similares em artérias
mesentéricas de ratos tratados com ouabaína e ratos controle (CT: 6,83 ± 0,71 mN/mm
vs OUA: 5,26 ± 0,36 mN/mm; Teste T, P > 0,05 ). A retirada mecânica do endotélio não
alterou a resposta contrátil induzida pelo KCl tanto nos ratos controle (CT/E+: 6,83 ±
0,71 mN/mm vs CT/E-: 5,4 ± 0,79 mN/mm, Teste T, P > 0,05) como nos ratos ouabaína
(OUA/E+: 5,26 ± 0,36 mN/mm vs OUA/E-: 4,3 ± 0,8 mN/mm, Teste T, P > 0,05). Da
mesma forma, nos segmentos sem endotélio, a resposta ao KCl não diferiu entre os
grupos experimentais (CT/E-: 5,4 ± 0,79 mN/mm vs OUA/E-: 4,3 ± 0,8 mN/mm, Teste T,
P > 0,05).
Como observado na figura 13, a acetilcolina induziu relaxamento concentração-
dependente em artérias mesentéricas de ratos controle e ouabaína, previamente
contraídas com fenilefrina. Tanto a resposta máxima como a sensibilidade a esse
agente vasodilatador não foram alteradas pelo tratamento com ouabaína (EC50: CT:
2,35x10
-8
± 4,89x10
-9
; OUA: 5,7x10
-8
± 2,12 x10
-8
. Rmax: CT: -84,90 ± 2,1; OUA: -86,92
± 2,70. P>0,05).
A administração de fenilefrina promoveu, de maneira concentração-dependente,
aumento do tônus basal de artérias mesentéricas de animais controle e ouabaína
(Figura 14). Nestes grupos, tanto a resposta máxima como a sensibilidade a este
agonista alfa-1 adrenérgico foram de similar magnitude (Figura 14 e Tabela 6).
Resultados
89
-10 -9 -8 -7 -6 -5
-100
-75
-50
-25
0
OUA
CT
Acetilcolina (Log M)
Relaxamento (%)
Figura 13. Relaxamento dependente do endotélio induzido por acetilcolina (10
-10
-10
-5
M) em artérias
mesentéricas de resistência pré-contraídas com fenilefrina em ratos controle (CT, n = 11) e tratados com
ouabaína (OUA, n = 9). Os resultados (média ± erro padrão da média) estão expressos como
porcentagem da contração induzida por fenilefrina. ANOVA (duas vias): P > 0,05.
-9 -8 -7 -6 -5 -4
0
25
50
75
100
125
150
OUA
CT
Fenilefrina (Log M)
Contração (%)
Figura 14. Respostas contráteis induzidas por fenilefrina, em artérias mesentéricas de resistência de
ratos controle (CT, n = 8) e Ouabaína (OUA, n = 7). Os resultados (média ± erro padrão da média) estão
expressos como porcentagem da contração induzida por 120 mM de KCl. ANOVA (duas vias): P > 0,05.
Resultados
90
Tabela 6. Efeito da remoção do endotélio (E-) e dos tratamentos com Captopril (CAP), Losartan (LOS) e
L-NAME (LNA) na Rmax (%) e EC50 à fenilefrina em artéria mesentérica de ratos controle (CT) e
tratados por 15 dias com ouabaína (OUA).
EC50 R
max
(%)
E+
CT (8)
7,97x10
-7
± 9,72x10
-8
113,3 ± 4,95
OUA (7)
7,03x10
-7
± 6,37x10
-8
114,79 ± 4,85
E-
CT (7)
4,34,10
-7
± 7,44x10
-8
* 126,64 ± 7.45
OUA (7)
4,61x10
-7
± 3,46x10
-8
* 129,45 ± 3,68*
CAP
CT (6)
1,09x10
-6
± 3,45x10
-7
109,89 ± 3,82
CT/CAP (6)
1,11x10
-6
± 2,32x10
-7
112,77 ± 3,70
OUA (7)
4,91x10
-7
± 8,19x10
-8
130,56 ± 4,16
OUA/CAP (7)
3,80x10
-7
± 4,84x10
-8
132,03 ± 3,97
LOS
CT (7)
7,20x10
-7
± 1,30x10
-7
113,24 ± 4,13
CT/LOS (7)
6,46x10
-7
± 1,10x10
-7
117,46 ± 4,22
OUA (7)
4,49x10
-7
± 9,57x10
-8
132,69 ± 5,48
OUA/LOS (7)
3,97 x10
-7
± 1,18x10
-7
132,62 ± 3,21
LNA
CT (9)
1,00x10
-6
± 1,61x10
-7
118,76 ± 4,46
CT/LNA (9)
5,52x10
-7
± 1,36x10
-7
+ 119,36 ± 3,10
OUA (7)
6,56x10
-7
± 2,11x10
-7
136,67 ± 2,67
OUA/LNA (7)
1,63x10
-7
± 8,14x10
-8
+ 137,54 ± 1,86
Os valores estão expressos como média ± epm. Teste T.
* P < 0,05 vs E+. + P < 0,05 CT/LNA e OUA/LNA vs CT e OUA, respectivamente.
Resultados
91
4.3.3. Modulação do endotélio sobre a resposta vasoconstritora à fenilefrina
Tanto nos ratos controle como nos ratos tratados com a ouabaína, a remoção do
endotélio aumentou à sensibilidade da resposta contrátil à fenilefrina, embora o
aumento da resposta máxima só tenha sido evidenciada nos ratos ouabaína (Figura
15A e 15B, tabela 6). Através do cálculo da razão entre a sensibilidade à fenilefrina em
condições com endotélio e sem endotélio no grupo controle e entre as mesmas
condições no grupo ouabaína, observou-se que o efeito da remoção do endotélio não
foi diferente entre um grupo ou outro (CTE+/E-: 0,69 ± 0,23 vs OUA E+/E-: 0,71 ± 0,09.
Teste T, P > 0,05).
A)
-9 -8 -7 -6 -5 -4
0
25
50
75
100
125
150
CT/E+
CT/E-
*
*
Fenilefrina (Log M)
Contração (%)
Resultados
92
B)
-9 -8 -7 -6 -5 -4
0
25
50
75
100
125
150
OUA/E-
OUA/E+
*
*
*
*
Fenilefrina (Log M)
Contração (%)
Figura 15. Efeito da remoção mecânica do endotélio (E-) sobre a resposta contrátil induzida por
fenilefrina em artérias mesentéricas de resistência de ratos controle (CT, n = 8 - 7) e tratados por 15 dias
com ouabaína (OUA, n = 7 - 7). Os resultados (média ± epm) são expressos como porcentagem da
resposta máxima ao KCl. ANOVA (duas vias). * P < 0,05.
4.3.4. Efeito da inibição da enzima conversora de angiotensina e dos receptores
AT1 na resposta vasoconstritora à fenilefrina
Para avaliar a contribuição da angiotensina II nas respostas alfa adrenérgicas,
curvas concentração-resposta à fenilefrina foram construídas antes e após incubação
dos segmentos arteriais com captopril (10
-4
M), um inibidor da enzima conversora de
angiotensina, e losartan (10
-4
M), um inibidor dos receptores AT1 para angiotensina II.
Tanto nos ratos controle, como nos ratos ouabaína, a incubação com essas drogas não
modificou a sensibilidade e a resposta máxima à fenilefrina (Figura 16 e 17, tabela 6).
Resultados
93
A)
-9 -8 -7 -6 -5 -4
0
25
50
75
100
125
150
CT
CT/Cap
Fenilefrina (Log M)
Contração (%)
B)
-9 -8 -7 -6 -5 -4
0
25
50
75
100
125
150
OUA
OUA/Cap
Fenilefrina (Log M)
Contração (%)
Figura 16. Resposta contrátil induzida por fenilefrina em artérias mesentéricas de resistência de ratos
controle (CT, n = 6) e tratados por 15 dias com ouabaína (OUA, n = 7) antes e após incubação com
captopril (Cap, 10 µM). Os resultados (média ± epm) são expressos como porcentagem da resposta
máxima ao KCl. ANOVA (duas vias). P > 0,05.
Resultados
94
A)
-9 -8 -7 -6 -5 -4
0
25
50
75
100
125
150
CT
CT/Los
Fenilefrina (Log M)
Contração (%)
B)
-9 -8 -7 -6 -5 -4
0
25
50
75
100
125
150
OUA
OUA/Los
Fenilefrina (Log M)
Contração (%)
Figura 17. Resposta contrátil induzida por fenilefrina em artérias mesentéricas de resistência de ratos
controle (CT, n = 7) e tratados por 15 dias com ouabaína (OUA, n = 7) antes e após incubação com
Losartan (Los, 10 µM). Os resultados (média ± epm) são expressos como porcentagem da resposta
máxima ao KCl. ANOVA (duas vias). P > 0,05.
Resultados
95
4.3.5. Efeito da inibição da NOS na resposta vasoconstritora à fenilefrina
Com o objetivo de avaliar o papel do óxido nítrico sobre as curvas concentração-
resposta à fenilefrina, artérias mesentéricas de resistência de ratos controle e ouabaína
foram pré-incubadas com um inibidor não-seletivo da sintase de óxido nítrico, o L-
NAME (10
-5
M).
Como demonstrado na Figura 18 e tabela 6, o L-NAME potencializou a resposta
vasoconstritora à fenilefrina nos dois grupos estudados. No entanto, a potencialização
da resposta α-adrenérgica induzida por esse fármaco, avaliada através da razão entre a
sensibilidade à fenilefrina na presença e ausência da droga nos dois grupos, foi maior
nos animais tratados com ouabaína (CT-CT/LNA: 0,63 ± 0,16; OUA-OUA/LNA: 0,22 ±
0,04. Teste T, P < 0,05).
Ao compararmos o efeito da remoção do endotélio com o efeito obtido pela pré-
incubação com L-NAME sobre as curvas concentração-resposta à fenilefrina, através
da razão da sensibilidade a esse fármaco obtida nos dois casos acima, observamos
que em segmentos de ratos controle a potencialização da resposta à fenilefrina após
remoção endotelial ou tratamento com L-NAME (CT E+/E-: 0,69 ± 0,23 vs CT-CT/LNA:
0,63 ± 0,16. Teste T, P > 0,05) foi similar. Já nos animais ouabaína, a razão da
sensibilidade à fenilefrina obtida antes e após a remoção do endotélio foi maior
comparada àquela obtida antes e após incubação com L-NAME (OUA E+/E-: 0,71 ±
0,09 vs OUA-OUA/LNA: 0,22 ± 0,04. Teste T, P < 0,05).
Resultados
96
A)
-9 -8 -7 -6 -5 -4
0
25
50
75
100
125
150
CT
CT/LNA
*
*
Fenilefrina (Log M)
Contração (%)
B)
-9 -8 -7 -6 -5 -4
0
25
50
75
100
125
150
OUA
OUA/LNA
*
*
*
Fenilefrina (Log M)
Contração (%)
Figura 18. Resposta contrátil induzida por fenilefrina em artérias mesentéricas de resistência de ratos
controle (CT, n = 9) e tratados por 15 dias com ouabaína (OUA, n = 7) antes e após incubação com L-
NAME (LNA, 100 µM). Os resultados (média ± epm) são expressos como porcentagem da resposta
máxima ao KCl. ANOVA (duas vias). * P < 0,05 vs após incubação com LNA.
Resultados
97
4.3.6. Efeito da inibição da COX na resposta vasoconstritora à fenilefrina
Para avaliar a participação dos prostanóides na resposta vasoconstritora à
fenilefrina, foram realizadas curvas concentração-resposta à fenilefrina antes e após
incubação com L-NAME (10
-5
M) e Indometacina (10
-4
M). No mesmo protocolo,
averiguamos a participação do fator hiperpolarizante derivado do endotélio através da
realização de uma terceira curva concentração-resposta à fenilefrina previamente
incubada com L-NAME (10
-5
M), Indometacina (10
-4
M) e TEA (2mM).
A incubação das artérias com L-NAME e Indometacina aumentou a sensibilidade
à fenilefrina nos ratos controle (Figura 19A e tabela 7). Entretanto, nos animais
ouabaína (Figura 19B e tabela 7), nenhum efeito foi observado.
A adição de TEA (2mM), juntamente com L-NAME e Indometacina, produziu um
desvio adicional à esquerda nas curvas de fenilefrina nos ratos controle (Figura 19A e
tabela 7). Novamente, nos ratos tratados com ouabaína não foi observado mudanças
após incubação com esses fármacos (Figura 19B e tabela 7).
Para demonstrar a participação dos prostanóides nas curvas concentração-
resposta à fenilefrina, foi calculada a razão da sensibilidade obtida através das curvas
de fenilefrina na ausência e presença de L-NAME (Figura 18, tabela 6) e foi comparada
essa razão com aquela obtida nas curvas de fenilefrina na ausência e presença de L-
NAME e Indometacina (Figura 19, tabela 7). De acordo com essa análise, a presença
de indometacina não modificou a sensibilidade nas curvas de fenilefrina nos animais
controle (CT-CT/LNA: 0,63 ± 0,16 vs CT-CT/LNA+INDO: 0,70 ± 0,05. Teste T, P >
0,05). No entanto, nos animais ouabaína, a presença de indometacina juntamente com
L-NAME, reduziu consideravelmente a sensibilidade a fenilefrina obtida das curvas
apenas com L-NAME sugerindo a participação dos prostanóides nesse grupo de
animais (OUA-OUA/LNA: 0,22 ± 0,04 vs OUA-OUA/LNA+INDO: 0,74 ± 0,08. Teste T, P
< 0,05).
Resultados
98
A)
-9 -8 -7 -6 -5 -4
0
25
50
75
100
125
150
CT
CT/LNA+Indo
CT/LNA+Indo+TEA
*
*
*
*
*
*
*
#
#
#
Fenilefrina (Log M)
Contração (%)
B)
-9 -8 -7 -6 -5 -4
0
25
50
75
100
125
150
OUA
OUA/LNA+Indo
OUA/LNA+Indo+TEA
*
#
Fenilefrina (Log M)
Contração (%)
Figura 19. Efeito da pré-incubação com L-NAME (LNA, 100µM) e Indometacina (Indo, 10µM) e com L-
NAME (LNA, 100µM), Indometacina (Indo, 10µM) e TEA (2mM) nas curvas concentração-resposta à
fenilefrina em artéria mesentérica de ratos controle (CT, n = 6 ) e tratados por 15 dias com ouabaína
(OUA, n = 6). Os resultados (média ± epm) são expressos como porcentagem da resposta máxima ao
KCl. ANOVA (duas vias). * P < 0,05 vs incubação com LNA e Indo. # P < 0,05 vs incubação com LNA,
Indo e TEA.
Resultados
99
Tabela 7. Efeito da incubação com tetraetilamônio (TEA, 2 mM) sobre os valores de EC50 e R
max
à
fenilefrina em artérias mesentéricas previamente incubadas com L-NAME (LNA, 100 µM) + indometacina
(Indo, 10 µM), de ratos controle (CT) e tratados com ouabaína (OUA).
CT L-NAME + Indo L-NAME+Indo+TEA
EC50 R
max
EC50 R
max
EC50 R
max
CT
8,93x10
-7
±
7,72x10
-8
116,17 ± 5,28
6,10x10
-7
±
2,05x10
-8
*
122,17 ± 3,84
3,46x10
-7
±
5,45x10
-8
*+
127,41 ± 2,32
OUA
3,88x10
-7
±
9,41x10
-8
128,24 ± 4,60
2,76x10
-7
±
7,26x10
-8
127,34 ± 4,21
1,04x10
-6
±
7,95x10
-7
128,18 ± 3,43
Valores representam média ± erro padrão da média.
ANOVA: * P < 0,05 vs CT; +P < 0,05 vs L-NAME + Indo.
4.3.7. Efeito temporal da resposta vasoconstritora induzida por fenilefrina
Para verificar a estabilidade das preparações foram realizadas curvas
concentração-resposta à fenilefrina em artérias mesentéricas de ratos controle e
ouabaína, uma e duas horas após realização da primeira curva à fenilefrina (0h). Sendo
assim, como observado na figura 20 e tabela 8, tanto nos animais controle como nos
animais ouabaína, a sensibilidade e a resposta máxima a este agonista alfa-
adrenérgico não sofreram modificações ao longo do protocolo experimental.
Resultados
100
A)
-9 -8 -7 -6 -5 -4
0
25
50
75
100
125
150
CT (0 h)
CT (1 h)
CT (2 h)
Fenilefrina (Log M)
Contração (%)
B)
-9 -8 -7 -6 -5 -4
0
25
50
75
100
125
150
OUA (0 h)
OUA (1 h)
OUA (2 h)
Fenilefrina (Log M)
Contração (%)
Figura 20. Controle temporal das curvas concentração-resposta à fenilefrina artérias mesentéricas de
resistência de ratos controle (CT, n = 8) e ouabaína (OUA, n = 7). Os resultados (média ± erro padrão da
média) estão expressos como porcentagem da contração induzida por 120 mM de KCl.
ANOVA: P > 0,05.
Resultados
101
Tabela 8. Valores de resposta máxima (R
max
) e sensibilidade (pD
2
) à noradrenalina uma e duas horas
após realização da primeira curva concentração-resposta a este agonista alfa-adrenérgico em artérias
mesentéricas de resistência de ratos Controle, Ouabaína, Losartan e Ouabaína + Losartan.
0 Hora 1 Hora 2 Horas
EC50 R
max
EC50 R
max
EC50 R
max
CT
7,97x10
-7
±
9,72x10
-8
113,3 ± 4,95
7,53x10
-7
±
7,45x10
-8
*
111,8 ± 2,52
9,12x10
-7
±
1,13x10
-8
*+
110,0 ± 2,66
OUA
7,22x10
-7
±
7,19x10
-8
114,8 ± 4,85
5,93x10
-7
±
5,42x10
-8
126,3 ± 5,39
7,04x10
-6
±
1,90x10
-8
123,4 ± 2,16
Valores representam média ± erro padrão da média.
ANOVA: P > 0,05.
4.3.8. Efeito do tratamento crônico com ouabaína sobre a atividade funcional da
Na
+
, K
+
-ATPase sensível à ouabaína
A atividade funcional da Na
+
K
+
ATPase foi estudada indiretamente através da
técnica de relaxamento induzido pelo potássio descrita por Webb & Bohr (1978) e
modificada por Rossoni e colaboradores (1999).
Como observado na figura 21, o potássio administrado às preparações foi capaz
de reduzir de maneira concentração-dependente a contração induzida por fenilefrina
(10
-6
M) em artéria mesentérica de ratos controle (Figura 21A) e tratados com ouabaína
(Figura 21B). A administração de ouabaína 100 µM inibiu de maneira significativa o
relaxamento induzido pelo potássio nos dois grupos de animais estudados.
Comparando-se a dAUC da curva de relaxamento ao KCl na presença e na
ausência de ouabaína (100 µM) (Figura 21C), é possível observar que essa diferença
foi similar nos dois grupos, sugerindo que a atividade funcional da Na
+
, K
+
-ATPase
sensível à ouabaína não difere pelo tratamento por 15 dias com ouabaína.
Resultados
102
A)
0 1 2 3 4 5 6
-100
-75
-50
-25
0
CT
CT/OUA (100 µ
µµ
µM)
*
*
*
*
KCl, mM
Contração (%)
B)
0 1 2 3 4 5 6
-100
-75
-50
-25
0
OUA
OUA/OUA (100 µ
µµ
µM)
*
*
*
*
KCl, mM
Contração (%)
Resultados
103
C)
-100
-75
-50
-25
0
CT
OUA
dAUC (%)
Figura 21. A. Curva de relaxamento ao KCl na ausência e na presença de ouabaína (OUA 100 µM) em
artérias mesentéricas de resistência de ratos controle (CT, n = 5) e ouabaína (OUA, n = 5).
ANOVA: * P < 0,05 CT ou OUA vs após incubação com ouabaína 100 µM.
Figura C representa a diferença de área abaixo da curva (dAUC) do relaxamento ao KCl na ausência e
presença de ouabaína.
Teste T: P > 0,05.
4.3.9. Expressão protéica da isoforma endotelial da sintase de óxido nítrico e da
COX-2
A Figura 22 mostra a expressão da isoforma eNOS (Figura 22A) e COX-2 (Figura
22B) detectadas pelo método de Western blot em artérias mesentéricas de ratos
controle e ouabaína. A expressão protéica para a isoforma eNOS não foi alterada pelo
tratamento com ouabaína. No entanto, o tratamento com ouabaína foi capaz de
aumentar a expressão de COX-2, quando comparado às artérias de animais controle.
Resultados
104
A)
CT OUA
eNOS
α- Actina
0.0
0.5
1.0
1.5
CT
OUA
eNOS/
α
α
α
α
-actina
B)
CT OUA
COX-2
α-Actina
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
CT
OUA
*
COX-2/
α
α
α
α
-actina
Figura 22. (A) Análise densitométrica de Western blot para expressão protéica da isoforma endotelial da
sintase de óxido nítrico (eNOS) e (B) Análise densitométrica de Western blot para expressão protéica da
COX-2 em artérias mesentéricas de resistência de ratos controle e ouabaína. Painel superior mostra as
bandas de Western blots representativas da expressão da eNOS e α-actina, e da COX-2 e α-actina em
artérias mesentéricas de ratos controle e ouabaína. Os resultados (média ± erro padrão da média) estão
expressos como expressão da eNOS em relação a α-actina. Teste T: * P < 0,05 vs CT.
DISCUSSÃO
Discussão
105
5. Discussão
A ouabaína é um composto endógeno presente em concentrações nanomolares
no plasma de diversos mamíferos, incluindo o homem (Hamlyn et al, 1996). Os níveis
plasmáticos dessa substância estão elevados em algumas condições patológicas, tais
como hipertensão arterial, podendo contribuir para a gênese e/ou manutenção das
mesmas (Hamlyn et al, 1982; Gottlieb et al, 1992). O envolvimento da ouabaína nos
processos hipertensivos vem sendo sugerido desde a década de 70 por Haddy &
Overbeck (1976). Esses pesquisadores demonstraram que esse hormônio inibidor da
atividade da Na
+
K
+
ATPase participava da gênese de hipertensões dependentes de
volume.
Este composto, inicialmente foi denominado de fator digitalis-like (Haddy et al,
1978). No entanto, por possuir características semelhantes à ouabaína foi denominado
posteriormente de fator ouabain-like (Mathews et al, 1991; Bova et al, 1991). Hoje, esse
fator já é conhecido como ouabaína endógena e sua produção e secreção são feitas
por regiões específicas do organismo, como o hipotálamo, região anteroventral do
terceiro ventrículo, córtex adrenal e miócitos cardíacos (Haupert & Sancho, 1979;
Songu-Mize et al,1982; Tamura et al, 1988; D`Urso et al, 2004).
Diversos estudos experimentais, tanto crônicos como agudos, têm sido
desenvolvidos no intuito de elucidar os mecanismos de ação da ouabaína devidos,
principalmente, ao seu efeito hipertensinogênico. Assim, a proposta deste trabalho foi o
de desenvolver dois estudos paralelos, um agudo e outro crônico, de forma a contribuir
para o conhecimento dos efeitos hipertensores desse hormônio.
5.1. Estudos agudos
Trabalhos anteriores do nosso grupo, utilizando concentrações nanomolares de
ouabaína, demonstraram que essa substância, além de aumentar a pressão arterial de
ratos hipertensos, potencializa as respostas vasoconstritoras a agonistas α-
adrenérgicos (Songu-Mize et al, 1995; Vassallo et al, 1997; Rossoni et al, 2001; Padilha
et al, 2004). Além disso, Rossoni e colaboradores (1999) verificaram que em artéria
Discussão
106
caudal de ratos normotensos, 10 nM de ouabaína além de promover aumento de
reatividade vascular à fenilefrina, estimulava a liberação de um fator endotelial que era
capaz de modular negativamente o endotélio. No entanto, recentemente outro trabalho
do nosso grupo (Padilha et al, 2004), utilizando concentrações ainda mais baixas de
ouabaína, verificou um aumento de reatividade vascular à fenilefrina apenas em artéria
caudal de ratos espontaneamente hipertensos, demonstrando que ratos hipertensos
são mais sensíveis às ações da ouabaína do que àqueles normotensos. Nesse mesmo
trabalho, foi demonstrado que o aumento da responsividade ao agonista α-adrenérgico
pela ouabaína era atribuído à estimulação da ECA e liberação de angiotensina II local.
Esses dados sugerem que os efeitos de baixas concentrações de ouabaína são
distintos em presença de hipertensão arterial, e poderiam colaborar para a gênese e/ou
manutenção da mesma.
No presente trabalho, buscamos verificar se concentrações maiores de ouabaína
poderiam alterar a reatividade vascular e a pressão arterial de ratos hipertensos (SHR)
e normotensos (Wistar e WKY) pelos mesmos mecanismos encontrados no trabalho de
Padilha e colaboradores (2004).
5.1.1. Efeito da ouabaína na pressão arterial de ratos anestesiados
Neste estudo, foram utilizados ratos hipertensos SHR, e normotensos WKY e
Wistar. Todos os animais tinham, aproximadamente, três meses de idade e não
apresentaram diferenças na massa corporal.
Com relação à freqüência cardíaca de animais anestesiados, os valores não
diferiram entre os ratos Wistar e SHR, embora tenham sido diferentes quando
comparados os ratos WKY e SHR. De acordo com Dickhout & Lee (1998), a freqüência
cardíaca pode se apresentar mais elevada em SHR quando comparado ao WKY,
embora Smith & Hutchins (1979), verificaram que apenas nas primeiras semanas de
vida é que a freqüência cardíaca se torna diferente entre esses animais. No entanto,
vale ressaltar que os ratos do presente estudo encontravam-se sob condições
anestésicas, que poderia interferir sobre esse parâmetro.
Discussão
107
Quanto aos níveis pressóricos, como era de se esperar, apresentaram-se mais
elevados em ratos SHR quando comparados tanto aos ratos WKY como aos Wistar.
Entretanto, o anestésico reduziu de maneira similar, a pressão arterial sistólica e
diastólica nos 3 grupos estudados (comparar tabela 1 e tabela 2), conforme já descrito
na literatura (Vassallo et al, 1997; Rossoni et al, 2001; Rossoni et al, 2003).
A hipertensão arterial nos ratos SHR começa a se desenvolver a partir da quinta
semana de vida (Lais et al, 1977). O desenvolvimento dessa hipertensão depende em
parte de alterações estruturais na parede dos vasos sangüíneos que precedem ao
desenvolvimento da mesma (Lee 1985; Smeda et al, 1988; Rizzoni et al, 1994; van
Gorp et al, 2000). Além disso, alguns trabalhos na literatura têm demonstrado que na
fase pré-hipertensiva, a atividade simpática já se encontra aumentada, sendo este um
fator que, adicionado às alterações estruturais dos vasos sangüíneos, podem constituir-
se nas alterações básicas predisponentes à hipertensão arterial nos SHR (Tucker &
Johnson, 1984; Brock et al, 1996).
Para avaliar os efeitos da ouabaína sobre a pressão arterial de ratos
normotensos e hipertensos, 18 µg/Kg (~30 nmol/Kg) dessa substância foi administrada
após um período de estabilização de 30 minutos. Como era de se esperar, essa
substância elevou a pressão arterial sistólica e diastólica dos ratos Wistar e SHR,
confirmando o seu efeito hipertensor (Vassalo et al, 1997; Rossoni et al, 2001). No
entanto, esse mesmo efeito não foi observado nos animais WKY. Ao contrário, nesses
ratos a pressão arterial diastólica foi reduzida pela administração aguda de ouabaína.
Trabalhos do nosso grupo ainda não publicados (Siman et al, 2007) também verificaram
essa mesma resposta, porém utilizando concentrações menores de ouabaína (0,18
µg/Kg).
O incremento da pressão arterial encontrado nos animais Wistar e SHR pode ser
explicado por diversos mecanismos, incluindo mecanismos vasculares. Como já
mencionado, alterações na resistência vascular periférica podem interferir diretamente
na pressão arterial. Trabalhos anteriores já demonstraram que concentrações elevadas
de ouabaína podem sensibilizar a resposta vascular a agentes α-adrenérgicos e ao KCl
(Overbeck, 1984; Ceron & Bendhack, 1997; Vassallo et al, 1997; Rossoni et al, 2001).
Discussão
108
Isso poderia explicar, principalmente, o efeito da ouabaína sobre o aumento da pressão
diastólica.
A isoforma α da Na
+
K
+
, ATPase consiste de 4 diferentes isoformas, com
diferentes afinidades para digitálicos (Sweadner, 1989; Marin & Redondo, 1999).
Blautein e colaboradores (1998) descreveram um microdomínio celular, denominado de
plasmerosome, onde as isoformas α
2
e α
3
, que possuem alta afinidade a ouabaína
estariam co-localizadas ao trocador Na
+
/Ca
++
e próximas do retículo sarcoplasmático
juncional. Nessa região, concentrações nanomolares de ouabaína, inibindo a
Na
+
K
+
ATPase, promoveriam aumento das concentrações de sódio, que por sua vez,
inibiria a troca Na
+
/Ca
++
, com conseqüente aumento das concentrações de cálcio, e
posterior acúmulo de cálcio no retículo sarcoplasmático. Seguindo esse raciocínio, a
concentração utilizada nesse estudo (~30 nmol/Kg) poderia promover aumento da
resistência vascular, e assim, aumento da pressão arterial nos ratos Wistar e SHR.
A capacidade da ouabaína de elevar a pressão arterial também resulta de ações
centrais. A ouabaína ativa o sistema nervoso simpático e reduz a eficiência do
baroreflexo, contribuindo para o aumento da pressão arterial (Leenen et al, 1994). Esse
efeito está relacionado à capacidade da ouabaína de ativar os sistemas renina-
angiotensina e endotelina centrais (Huang & Leenen, 1996b; Huang et al, 1998; Di
Filippo et al, 2003; D`Amico et al, 2003). Recentemente, também demonstramos que
baixas concentrações de ouabaína promovem liberação local de angiotensina II,
aumentando, assim, a sensibilidade do leito vascular caudal à fenilefrina (Padilha et al,
2004).
Portanto, para investigar se os efeitos hipertensinogênicos da ouabaína
encontrados com a dose utilizada nesse estudo poderiam envolver a angiotensina II, foi
realizado o pré-tratamento com losartan, um bloqueador dos receptores AT1 para
angiotensina. Nos ratos WKY, a administração de losartan não promoveu efeitos
adicionais àqueles observados na presença de ouabaína. No entanto, nos ratos Wistar,
esse bloqueador inibiu os efeitos pressores da ouabaína somente sobre a pressão
arterial diastólica, sem modificar a pressão arterial sistólica. Provavelmente, nesse
caso, o sistema renina-angiotensina periférico parece estar mais envolvido do que o
sistema central, já que não observamos o bloqueio na pressão arterial sistólica. No
Discussão
109
entanto, vale ressaltar que, para comprovar essa ação protocolos adicionais como, por
exemplo, o bloqueio pré-ganglionar, deverão ser realizados futuramente.
Já nos ratos SHR, a administração de losartan não foi capaz de bloquear as
ações da ouabaína, tanto sobre a pressão arterial sistólica, quanto sobre a pressão
arterial diastólica. O fato do bloqueio dos receptores AT1 não impedirem os efeitos
pressóricos da ouabaína tanto nos ratos Wistar quanto nos ratos SHR sugerem outros
mecanismos de ação da ouabaína já descritos na literatura. O próprio aumento da
atividade simpática causado pela ouabaína poderia ser um fator presente nesses
resultados, já que essa substância aumenta a liberação de noreprinefrina pelos
terminais simpáticos (Rodríguez-Mañas et al, 1994). Outro fato é que, agindo como
digitálico, a ouabaína pode promover efeito inotrópico positivo, que também contribui
para o aumento da pressão arterial (Dostanic et al, 2005). Finalmente, não podemos
descartar a possibilidade de a ouabaína estar ativando o sistema endotelina, que por
sua vez, produz hiperrreatividade simpática e, conseqüentemente, aumento da pressão
arterial (Di Filippo et al, 2003; D`Amico et al, 2003).
Uma vez que altas concentrações de ouabaína produzem incremento da pressão
arterial diastólica, provavelmente alterações na reatividade vascular podem estar
contribuindo para esse efeito hipertensor. Portanto, a próxima etapa desse estudo foi
analisar se 1 µM de ouabaína modifica a reatividade vascular à fenilefrina no leito
vascular caudal de ratos normotensos e hipertensos. Além disso, investigar alguns
possíveis mecanismos implicados nessas respostas.
5.1.2. Efeito da ouabaína na reatividade vascular in vitro
Neste estudo, os animais SHR, como esperado, apresentaram pressão arterial
mais elevada do que os normotensos Wistar e WKY. Vale ressaltar que as medidas
foram realizadas em animais acordados e por isso, há uma diferença entre os níveis
pressóricos apresentados nos protocolos anteriores.
Antes de analisar os efeitos da ouabaína sobre a reatividade vascular à
fenilefrina, demonstramos como essa reatividade encontrava-se nos animais
Discussão
110
normotensos e hipertensos. De acordo com nossos dados, os ratos WKY apresentaram
uma redução de resposta máxima em relação aos Wistar e SHR.
Alguns trabalhos demonstram que a reatividade vascular a agonistas alfa-
adrenérgicos pode estar elevada em animais SHR quando comparados aos WKY
(Lograno et al, 1989; Vulpis et al, 1989). No entanto, não encontramos diferenças entre
os ratos Wistar e SHR. Tanto os ratos Wistar quanto os WKY, embora normotensos,
são geneticamente diferentes, e este fato poderia explicar, em parte, as diferenças na
reatividade vascular à fenilefrina.
Os resultados obtidos após a administração de ouabaína demonstram que 1 µM
desse digitálico foi capaz de potencializar a resposta vasoconstritora à fenilefrina nos
ratos Wistar, WKY e SHR, corroborando dados prévios do nosso laboratório (Vassallo
et al, 1997; Rossoni et al, 2001). Como dito anteriormente, baixas concentrações de
ouabaína podem exercer esse efeito sensibilizador através da sua ligação às isoformas
α
2
e α
3
da Na
+
K
+
,ATPAse, na região do plasmerosoma (Blaustein et al, 1998). No
entanto, diferentemente dos resultados obtidos com 10 nM, onde a perfusão com
ouabaína reduzia a pressão de perfusão média basal (Rossoni et al, 2001), a
concentração desse digitálico utilizada neste estudo não promoveu alterações nesse
parâmetro nos ratos Wistar e WKY, ao passo que nos SHR, a pressão de perfusão
média basal foi elevada. Provavelmente, esse aumento de tônus basal pode ter sido
conseqüência de alterações no potencial de repouso de membrana através da
capacidade da ouabaína de inibir a Na
+
K
+
, ATPase (Marin & Redondo, 1999). Esses
resultados sustentam a hipótese de que animais hipertensos são mais sensíveis às
ações da ouabaína do que os normotensos (Padilha et al, 2004). Como o principal
receptor para ouabaína é a Na
+
K
+
ATPase, quanto maior quantidade de sítios
receptores, maior será a ação da ouabaína. De fato, alguns estudos, como o de David-
Dufilho e colaboradores (1984) e Webb & Bohr (1979) demonstraram que a atividade da
Na
+
K
+
ATPase é maior em ratos SHR do que em relação ao seu controle WKY,
indicando que a hipertensão repercute com aumento do número de unidades da bomba
de sódio na membrana.
Discussão
111
Com o intuito de investigar a modulação endotelial na resposta pressora à
fenilefrina, o endotélio vascular desses animais foi lesado por administração de uma
única dose de CHAPS, como descrito previamente por Rossoni e colaboradores (1999)
para o leito vascular caudal. Na ausência do endotélio funcional, a resposta pressora à
fenilefrina foi amplificada em todos os grupos estudados. No entanto, nos animais WKY
e SHR, além de promover aumento da sensibilidade, houve também aumento de
resposta máxima a esse agonista α-adrenérgico, sugerindo que, nesses animais, a
modulação endotelial negativa é maior do que em ratos Wistar. A pressão de perfusão
média basal após lesão endotelial também foi aumentada significativamente nos ratos
normotensos e hipertensos, sugerindo a participação do endotélio na manutenção do
tônus basal no leito vascular caudal desses animais.
A capacidade de modulação endotelial à agentes vasoconstritores em ratos
hipertensos é um tema bastante discutido e conflitivo na literatura. Há trabalhos que
demonstram que em animais hipertensos há um aumento da modulação endotelial,
enquanto outros relatam um prejuízo da mesma (Arribas et al, 1994; Lang et al, 1995;
Dohi et al, 1996; Maeso et al, 1999; Chang et al, 2002). O fato de haver muitos dados
contraditórios pode dever-se em parte, às distintas preparações e artérias utilizadas em
cada estudo. Neste trabalho, no entanto, se compararmos somente os ratos Wistar e
SHR, podemos sugerir que nos últimos, há uma maior modulação endotelial, fato que
não ocorre se compararmos WKY e SHR.
A remoção do endotélio também comprovou que os efeitos da ouabaína sobre a
reatividade vascular à fenilefrina são dependentes do mesmo, uma vez que, na sua
ausência, essa substância não modificou a reatividade vascular. Há diversos trabalhos
na literatura demonstrando que o endotélio é capaz de modular às ações da ouabaína.
Assim, estudos como o de Ponte e colaboradores (1996a, b), Sánchez-Ferrer e
colaboradores (1992) e Rodriguez-Mañas e colaboradores (1992), realizados
respectivamente, em aorta, vasos placentários e artérias carótidas de animais e
pacientes normotensos, demonstram que a retirada do endotélio eleva a magnitude da
resposta contrátil induzida por ouabaína. Os resultados desses pesquisadores sugerem
a existência de uma modulação endotelial inibitória nas contrações induzidas pela
ouabaína e que isso ocorre, provavelmente, através da liberação de um fator difusível
Discussão
112
que poderia estimular e/ou antagonizar o efeito da ouabaína. Trabalhos do nosso grupo
também demonstraram, em ratos normotensos, que 10nM de ouabaína poderia induzir
a liberação de um fator vasodilatador derivado do endotélio, possivelmente abridor de
canais para potássio (Rossoni et al, 1999). Esse mesmo resultado, posteriormente foi
obtido em ratos tratados cronicamente com L-NAME (Rossoni et al, 2003). Mais
recentemente, outro trabalho do nosso grupo, utilizando concentrações ainda menores
de ouabaína, verificou que em animais hipertensos, mas não em normotensos, a
ouabaína estimulava a liberação local de angiotensina II no leito vascular caudal desses
animais (Padilha et al, 2004). Portanto, diversos dados sustentam o fato de que a
ouabaína exerce a maior parte de seus efeitos periféricos via endotélio. No entanto, as
vias endoteliais estimuladas pela ouabaína dependem da concentração dessa
substância, do leito arterial estudado e da presença ou não de hipertensão.
Como já havíamos demonstrado anteriormente em ratos SHR, a ouabaína é
capaz de liberar angiotensina II endotelial e assim, sensibilizar o leito vascular caudal
aumentando a resposta contrátil à fenilefrina (Padilha et al, 2004). Ao mesmo tempo,
nos estudos in vivo, verificamos que, nos ratos Wistar, o aumento da pressão diastólica
pela ouabaína foi abolido em presença de losartan. Dessa forma, o próximo passo
deste estudo foi averiguar a participação desta via nos efeitos da ouabaína sobre a
reatividade vascular à fenilefrina.
Muitos trabalhos mostram uma relação direta entre a angiotensina II e ouabaína.
Em vários modelos hipertensão experimental, ou mesmo em ratos normotensos,
submetidos à dieta com alta concentração de sódio ou administração central de salina
hipertônica, a ouabaína “cerebral” promove liberação de angiotensina II, por fim,
resultando num prejuízo do baroreflexo com aumento da atividade simpatoexcitatória e
redução da simpatoinibitória (Huang & Leenen, 1996a; Budzikowski & Leenen, 1997;
Huang & Leenen; 1998). Além disso, essas ações foram prevenidas após administração
de losartan, sugerindo, portanto, a participação do sistema renina-angiotensina nessas
ações, via receptores AT1 (Huang et al, 1999; Zhang & Leenen, 2001).
Neste estudo, a perfusão com losartan aboliu os efeitos da ouabaína sobre a
resposta pressora à fenilefrina nos animais normotensos. Nos ratos Wistar, esse dado
corrobora àqueles observados in vivo, onde o aumento de pressão diastólica induzido
Discussão
113
por ouabaína foi bloqueado em presença de losartan. Já nos ratos WKY, embora a
ouabaína não tenha produzido efeitos significativos sobre a pressão arterial, promove
aumento da reatividade vascular α-adrenérgica, via angiotensina II endotelial. No
entanto, em ratos hipertensos, outros fatores parecem estar envolvidos já que, somente
o aumento de resposta máxima à fenilefrina, produzido por esse digitálico, foi inibido.
Recentemente, foi demonstrado que a ouabaína pode estimular a liberação de
endotelina pelas células endoteliais (Saunders & Scheiner-Bobis, 2004). Além disso,
não podemos descartar uma possível inibição da bomba de sódio pela ouabaína, que
por sua vez, poderia amplificar a resposta contrátil à fenilefrina (Ponte et al, 1996a, b).
De fato Webb & Bohr (1979) verificaram que ratos SHR possuem um aumento na
atividade da bomba de sódio. Concordante com esses resultados, Pickar e
colaboradores (1994) demonstraram uma up-regulation do número de bombas de sódio
em músculo esquelético de SHR, devido ao aumento das concentrações de sódio
intracelular presentes nesse modelo de hipertensão, e, conseqüentemente, aumento da
atividade da bomba. Dessa forma, como esses animais possuem uma maior quantidade
e atividade da bomba de sódio, maiores poderão ser os efeitos da ouabaína agindo
sobre a Na
+
K
+
,ATPase.
No entanto, vale ressaltar, que existem outras vias pela qual a ouabaína poderia
estar atuando, interferindo tanto na atividade da Na
+
K
+
ATPase, como na resposta
pressora à fenilefrina, através da liberação de fatores endoteliais. Esta outra via de
ação da ouabaína poderia ocorrer através de sua ligação a uma nova classe distinta de
receptores para ouabaína, recentemente descobertos (Ward et al, 2002). Segundo
esses pesquisadores, esses receptores são saturáveis, específicos para ouabaína, e de
alta afinidade, e poderiam estar envolvidos no transporte e/ou regulação da secreção
de ouabaína.
Ainda nesse estudo agudo, não foram observadas modificações nas respostas
de relaxamento à acetilcolina entre os ratos normotensos e hipertensos. Esses
resultados contradizem os de Pourageaud & Freslon (1995) onde demonstraram que o
Discussão
114
relaxamento a acetilcolina e bradicinina, é significantemente reduzido em anéis de aorta
de ratos SHR quando comparados ao WKY. Concordante com esses resultados,
Diederich e colaboradores (1990) verificaram um prejuízo no relaxamento induzido pela
acetilcolina em ratos SHRSP (SHR stroke prone) e que parece ser devido à liberação
de fatores derivados da via da ciclooxigenase interferindo na liberação e/ou ação dos
fatores relaxantes derivados do endotélio, já que a presença de meclofenamato, um
inibidor dessa via, normalizou o relaxamento dependente do endotélio. As divergências
de resultados podem ser ocasionadas por determinadas diferenças como o leito
vascular estudado, o agonista utilizado para a liberação dos fatores endoteliais, a idade
do animal, a técnica utilizada (anéis ou leito vascular, por exemplo). Portanto, é de se
esperar encontrar trabalhos que demonstrem redução, não modificação ou mesmo um
aumento da resposta de relaxamento dependente do endotélio (Lee et al, 1987; Mantelli
et al, 1995; Briones et al, 1999; Vázquez-Pérez et al, 2001).
5.2. Estudos crônicos
Diversos trabalhos têm demonstrado que a administração crônica de ouabaína
produz hipertensão em ratos normotensos, sustentando as hipóteses de que este
hormônio endógeno está envolvido na gênese e/ ou manutenção da mesma (Huang et
al, 1994; Manunta et al, 1994; Kimura et al, 2000; Manunta et al, 2001; Rossoni et al,
2002a,b; Di Filippo et al, 2003; Xavier et al, 2004a,b,c). Neste trabalho, em
concordância com esses dados, o tratamento por 15 dias com ouabaína foi capaz de
elevar a pressão arterial sistólica e diastólica. Além disso, verificamos um aumento de
freqüência cardíaca nesses animais.
Dois mecanismos estão envolvidos na hipertensão induzida por administração
crônica de ouabaína: um mecanismo central e um mecanismo periférico. O mecanismo
central está associado a um aumento da atividade simpatoexcitatória e um prejuízo do
barorreflexo (Huang et al, 1994; Huang & Leenen, 1999). Esses efeitos são prevenidos
Discussão
115
por administração de bloqueadores de receptores AT1 para angiotensina II e ET1 para
endotelina (Zhang & Leenen, 2001; Di Filippo et al, 2003).
Os mecanismos periféricos envolvidos neste modelo de hipertensão, no entanto,
parecem refletir alterações compensatórias ou adaptativas à hipertensão. Agudamente,
como já mencionado, a ouabaína aumenta a reatividade vascular (Vassallo et al, 1997;
Rossoni et al, 2001; Padilha et al, 2004). Entretanto, após administração crônica por 5
semanas desse digitálico, observa-se uma redução da reatividade vascular à fenilefrina
e aumento da atividade e expressão da Na
+
K
+
ATPase (Rossoni et al, 2002a). Essa
redução da reatividade vascular parece se devido ao aumento da produção de óxido
nítrico e maior expressão de eNOS e iNOS (Rossoni et al, 2002b).
No entanto, os efeitos vasculares induzidos pelo tratamento crônico com
ouabaína diferem quando estudados em artérias de condutância e em artérias de
resistência. Em artéria de condutância, como aorta e mesentérica superior, o tratamento
por 5 semanas com ouabaína, além de aumentar a produção de NO, diminui a
participação dos prostanóides, reduzindo a reatividade à agonistas α-adrenérgicos
(Rossoni et al, 2002b; Xavier et al, 2004b). Já em artérias mesentéricas de resistência,
embora também haja um aumento da produção de NO, há um prejuízo da ação do
EDHF, o que mantém a resposta à noradrenalina inalterada nessas artérias (Xavier et
al, 2004b).
Além das alterações mencionadas acima, também já foi descrito o envolvimento
do sistema da endotelina nesse modelo de hipertensão. Em aorta de animais tratados
crônicamente com esse digitálico, esse sistema é ativado, além de produzir aumento da
expressão de receptores ETa para endotelina-1 (Xavier et al, 2004c).
No entanto, todos os efeitos periféricos acima citados foram estudados após o
tratamento por 5 semanas com ouabaína. Sabe-se que os aumentos pressóricos
ocasionados por esse tratamento já estão estabelecidos após 15 dias (Rossoni et al,
2002a,b; Xavier et al, 2004a,b). Além disso, as artérias de resistência possuem uma
maior contribuição na regulação da resistência periférica total e pressão arterial. Sendo
assim, a proposta desse estudo foi investigar se as mesmas mudanças observadas
anteriormente em artérias de resistência são as mesmas apresentadas em estágios
Discussão
116
iniciais neste modelo de hipertensão ou se àquelas são mecanismos adaptativos ou
compensatórios ao processo hipertensivo.
Em concordância com trabalhos anteriores que utilizaram artérias mesentéricas
de resistência de ratos tratados por 30 dias com ouabaína, o tratamento por 15 dias
também não modificou a resposta pressora à fenilefrina (Xavier et al, 2004a,b). A
remoção mecânica do endotélio amplificou, de forma similar em ratos controle e
ouabaína, a reatividade vascular à fenilefrina. Entretanto, em animais tratados, a
preincubação com L-NAME, um inibidor não-seletivo da NOS, induziu um aumento de
maior magnitude da curva concentração-resposta à fenilefrina quando comparada ao
grupo controle. Esse dado sugere que o tratamento com ouabaína por 15 dias promove
uma maior modulação negativa do óxido nítrico sobre a resposta alfa-adrenérgica em
vasos de resistência, corroborando estudos prévios (Rossoni et al, 2002b; Xavier et al,
2004a,b).
Embora esse tratamento com ouabaína tenha sido acompanhado de aumento da
liberação de NO, não modificou a expressão protéica da eNOS, ou seja, o aumento na
liberação de NO não pode ser atribuído a um aumento na expressão de eNOS,
corroborando novamente trabalhos anteriores (Xavier et al, 2004b). Esses resultados
reforçam a idéia de que existem alterações regionais na hipertensão ouabaína, já que
em aorta, o tratamento por 5 semanas, aumenta a expressão e eNOS e iNOS (Rossoni
et al, 2002a,b).
Sugerimos que o aumento da modulação endotelial nos ratos tratados com
ouabaína poderia ser devido a um aumento da atividade da NOS, embora o
relaxamento a acetilcolina não tenha diferido nos dois grupos, de acordo com trabalhos
prévios (Kimura et al, 2000; Rossoni et al, 2002a; Xavier et al, 2004b). No entanto, já foi
demonstrado que o tratamento agudo com ouabaína é acompanhado de aumento na
liberação basal de óxido nítrico e não modifica a liberação estimulada por bradicinina
(Xie et al, 1993).
Apesar do tratamento crônico por 15 dias com ouabaína ter sido acompanhado
de aumento da modulação endotelial negativa pelo NO, devemos recordar que a
remoção do endotélio amplificou de maneira similar a resposta à fenilefrina. Isso sugere
que, se por um lado há aumento de fator vasodilatador, por outro, pode haver um
Discussão
117
prejuízo de outro fator vasodilatador e/ou aumento da liberação de um vasoconstrictor
de origem endotelial.
Para investigar qual fator poderia estar envolvido, primeiramente testamos a
participação da angiotensina II local e atividade da enzima conversora de angiotensina,
uma vez que dados do nosso grupo já demonstraram que o tratamento agudo com
ouabaína promove a liberação local de angiotensina II via ativação de receptores AT1,
em artéria caudal de ratos (Padilha et al, 2004). No entanto os efeitos agudos da
ouabaína parecem ser distintos dos efeitos crônicos, já que a incubação das artérias
com losartan (bloqueador de receptores AT1 para angiotensina II) ou captopril
(bloqueador da enzima conversora de angiotensina) não modificou a resposta à
fenilefrina nos ratos controle e tratados com ouabaína.
Nakagawa e colaboradores (1987) demonstraram que a ouabaína é capaz de
induzir a liberação de prostaciclina em células endoteliais bovinas. Associado a isso, a
hipertensão arterial pode alterar a síntese e liberação de prostanóides, o que contribui
para as alterações vasculares observadas nesta patologia (Auch-Schwelk & Vanhoutte,
1991; Alvarez et al, 2005). Portanto, investigamos essa via incubando as artérias com
L-NAME + Indometacina e calculamos a razão da sensibilidade obtida através das
curvas de fenilefrina na ausência e presença de L-NAME (Figura 6) e na ausência e
presença de L-NAME + Indometacina (Figura 7). Assim, as diferenças encontradas
poderiam ser atribuídas à participação dos prostanóides. De acordo com essa análise,
nos animais controle, a razão entre a sensibilidade à fenilefrina antes e após L-NAME e
antes e após L-NAME + Indometacina não foram diferentes, sugerindo que nas artérias
desses animais não há envolvimento de prostanóides nas curvas de concentração-
resposta à fenilefrina. Em contrapartida, nos animais ouabaína, a adição de
Indometacina reduziu consideravelmente essa razão, sugerindo a liberação de
prostanóides nesses animais. Esses resultados diferem daqueles obtidos pelo nosso
grupo em artéria mesentérica superior de ratos tratados por 5 semanas com ouabaína,
onde houve uma perda da participação dos prostanóides vasoconstritores sobre a
reatividade vascular à fenilefrina (Xavier et al, 2004b). Isso sugere, mais uma vez, que a
hipertensão ouabaína cursa com modificações de reatividade vascular distintas em
artérias de condutância e de resistência. Adicionalmente, o tratamento por 15 dias com
Discussão
118
ouabaína, mas não em situações controle, foi acompanhado de aumento da expressão
protéica de COX-2.
Sabe-se que o NO pode interferir diretamente na síntese de prostanóides e
expressão de COX-2 (Salvemini et al, 1997; Mollace et al, 2005). Essa interação é
claramente visualizada em situações inflamatórias onde o NO induz a expressão de
COX-2 aumentando a formação de prostaglandinas pró-inflamatórias, elevando a
resposta inflamatória (Mollace et al, 2005). Ao mesmo tempo, sabe-se que a
hipertensão também é acompanhada de processo inflamatório vascular (Sanz-Rosa et
al, 2005). Dessa forma, uma vez que o tratamento por 15 dias com ouabaína é
acompanhado de hipertensão e aumento da liberação de NO, esses fatores, por sua
vez, poderiam ser os responsáveis pelo aumento na expressão de COX-2 e liberação
de prostanóides.
Além de alterações nas vias do NO e dos prostanóides, dados anteriores do
nosso grupo também já relataram que o tratamento crônico por 5 semanas com
ouabaína modifica a participação do EDHF na reatividade vascular (Rossoni et al,
2002b; Xavier et al, 2004b). No entanto, essas modificações dependem do leito
vascular estudado. Em artéria caudal, a ouabaína promove a liberação de EDHF, que
contribui para a redução da reatividade vascular à fenilefrina (Rossoni et al, 2002b). Já
em artéria mesentérica de resistência, o mesmo tratamento reduz a liberação de EDHF,
que somado ao aumento da participação do NO, não modifica a reatividade vascular à
noradrenlina (Xavier et al, 2004b).
Para verificar, então, a participação desse fator em estágios mais recentes da
hipertensão ouabaína, as artérias foram previamente incubadas com tetraetilamônio
(TEA), um bloqueador de canais para potássio ativados por cálcio, juntamente com L-
NAME e indometacina. O pré-tratamento com L-NAME + Indometacina +TEA produziu
um desvio adicional para a esquerda nas curvas concentração-resposta à fenilefrina em
artérias mesentéricas de ratos controle, que foi abolido pelo tratamento crônico com
ouabaína. Esses dados sugerem que em artérias mesentéricas de resistência de
animais controle, há liberação de EDHF em resposta à fenilefrina, de acordo com dados
prévios (Schiffrin, 1996). No entanto, o tratamento com ouabaína por 15 dias, em
Discussão
119
concordância com trabalhos anteriores do nosso grupo (Xavier et al, 2004b), cursa com
um prejuízo na liberação desse fator.
O EDHF é o fator vasodilatador dependente do endotélio predominante em
artérias de resistência, ao passo que em artérias de condutância, o NO possui um papel
fundamental nesta vasodilatação (Edwards et al, 1998; Brandes et al, 2000). Uma vez
que essas artérias de resistência possuem uma participação importante na regulação
da resistência vascular periférica, alterações na síntese ou liberação do EDHF podem
ser cruciais em doenças cardiovasculares como a hipertensão arterial. Ao mesmo
tempo, a hipertensão cursa com um prejuízo das ações do NO (Kojda & Harrison,
1999). Recentes estudos indicam que o EDHF pode compensar a perda do NO e
preservar o relaxamento dependente do endotélio em artérias mesentéricas de ratos
hipertensos (Sofola et al, 2002). No entanto, outros dados têm demonstrado uma
atenuação deste relaxamento na hipertensão (Sunano et al, 1999; Goto et al, 2004;
Mori et al, 2006). As diferenças nesses estudos podem dever-se a diversos fatores,
incluindo o tipo de leito vascular estudado.
Neste trabalho, observamos que o tratamento por 15 dias com ouabaína
promove uma perda da participação do EDHF e um aumento da modulação endotelial
negativa pelo NO na reatividade vascular à fenilefrina. Entretanto, não está claro se o
aumento da participação do NO seria um mecanismo compensatório à perda do EDHF.
Tem sido demonstrado que a ouabaína, em baixas concentrações, diminui a
permeabilidade das junções comunicantes das células musculares lisas de aorta de
ratos (Martin et al, 2004). Como dito anteriormente, a natureza exata do EDHF ainda é
contraditória, no entanto, alguns trabalhos sugerem que o acoplamento elétrico entre as
células endoteliais através das junções comunicantes, é fundamental para as ações
hiperpolarizantes do EDHF (Taylor et al, 1998; Harris et al, 2000). Seguindo esse
raciocínio, poderíamos sugerir que a síntese do EDHF poderia não estar prejudicada
em artérias mesentéricas de resistência de ratos tratados com ouabaína, no entanto, a
ação desse fator hiperpolarizante, através das junções comunicantes estaria sendo
dificultada pela redução da permeabilidade das mesmas provocadas por esse digitálico.
Sendo assim, a participação do EDHF nas respostas vasoconstrictoras à fenilefrina
Discussão
120
estariam reduzidas, e em contrapartida, poderia estar havendo maior liberação de NO
como um mecanismo compensatório a essa perda.
Além de modificar a síntese e liberação de fatores vasoativos derivados do
endotélio, a ouabaína interfere na atividade e expressão da Na
+
K
+
,ATPase. Essas
alterações na bomba de sódio parecem também depender do tipo de tratamento, agudo
ou crônico, e do leito vascular estudado. Trabalhos do nosso grupo (Rossoni et al,
1999), demonstraram que 10 nM de ouabaína promove, de forma aguda, inibição
parcial da atividade da Na
+
K
+
,ATPase. Já concentrações ainda mais baixas de
ouabaína (1nM) são capazes de aumentar a atividade da Na
+
K
+
,ATPase no leito
vascular caudal e em miócitos ventriculares (Gao et al, 2002; Padilha et al, 2004).
No entanto, o tratamento crônico com ouabaína por 5 semanas parece induzir
alterações regionais na atividade e expressão da Na
+
K
+
,ATPase. Dados anteriores do
nosso grupo verificaram que em aorta de ratos tratados com ouabaína ocorre aumento
da expressão e atividade das isoformas α
1
e α
2
, ao passo que em mesentérica superior
não há modificações nesses parâmetros e em artéria caudal a expressão e atividade
dessas isoformas estão reduzidas, em relação ao controle (Rossoni et al, 2002a).
Neste trabalho, a atividade funcional da Na
+
K
+
,ATPase foi avaliada através da
técnica de relaxamento induzida pelo potássio, inicialmente descrita por Webb & Bohr
(1978). A adição de potássio, em segmentos previamente contraídos com fenilefrina
induziu relaxamento concentração-dependente nos dois grupos estudados. Porém, para
se determinar à proporção deste relaxamento que é sensível à ouabaína, outra curva foi
realizada na presença de uma concentração de ouabaína já conhecida por ser capaz
de inibir a bomba de sódio. Através do cálculo da porcentagem da diferença da área
sob a curva (%dAUC) na presença e na ausência de ouabaína, podemos obter o
relaxamento atribuído à ativação da Na
+
K
+
,ATPase. Assim, após incubação com
ouabaína, o relaxamento induzido por potássio nas artérias de ambos grupos foi
significativamente reduzido. Entretanto, a %dAUC do grupo controle e do grupo
ouabaína não diferiram, demonstrando que a atividade da Na
+
,K
+
-ATPase sensível à
ouabaína não é alterada após 15 dias de tratamento com esse digitálico.
Discussão
121
Estes resultados são distintos daqueles observados com tratamento por 5
semanas com ouabaína (Rossoni et al, 2002a). Em anéis de aorta, o tratamento com
ouabaína, além de aumentar a atividade da Na
+
,K
+
-ATPase, cursa com aumento da
expressão protéica das isoformas α
1
e α
2
(Rossoni et al, 2002a). Tanto o aumento da
atividade quanto da expressão das isoformas α da Na
+
,K
+
-ATPase, poderiam estar
associadas à redução da resposta vasoconstritora à fenilefrina observado nessas
artérias (Rossoni et al, 2002a). Nesse mesmo estudo, em artéria mesentérica superior,
a expressão e atividade da Na
+
,K
+
-ATPase não se encontraram alteradas, ao passo
que em artéria caudal foram reduzidas. Todos esses dados sugerem que as alterações
provocadas pela ouabaína na atividade da bomba de sódio são dependentes do leito
vascular estudado e do tempo de tratamento, já que no presente estudo a atividade foi
similar em ratos controle e tratados.
No entanto, não podemos descartar a possibilidade de que as alterações na
síntese e liberação de fatores endoteliais vasoativos provocados pela ouabaína também
são capazes de interferir na atividade da bomba de sódio. Sabe-se que o NO é um fator
capaz de estimular a atividade Na
+
,K
+
-ATPase (Gupta et al, 1994, 1996). Ao mesmo
tempo, a PGE2, formada pela ativação da via da ciclooxigenase, é um potente inibidor
da bomba de sódio (Marín & Redondo, 1999).
Neste trabalho, o tratamento com ouabaína por 15 dias promoveu aumento da
liberação de NO e prostanóides vasoconstritores em resposta a estimulação α-
adrenérgica. Dessa forma, não podemos desconsiderar o fato de que esses fatores
também poderiam estar interferindo da atividade da bomba de sódio. O fato da
atividade da Na
+
,K
+
-ATPase não ter sido modificada pela ouabaína poderia decorrer,
em parte, das ações simultâneas dessas substâncias.
As alterações vasculares aqui observadas pelo tratamento com ouabaína por 15
dias poderiam ser decorrentes de um mecanismo compensatório à hipertensão. No
entanto, algumas alterações já descritas neste modelo de hipertensão, como o aumento
da modulação do NO e redução da resposta contrátil à fenilefrina encontradas em aorta
e em artéria mesentérica superior de ratos não foram prevenidas com o tratamento com
losartan (Xavier et al, 2004b,c). Estes estudos também demonstraram que a maior
Discussão
122
modulação endotelial pelo NO e a perda do EDHF em artérias mesentéricas de
resistência também permanecem inalteradas pelo tratamento com losartan (Xavier et al,
2004b). No entanto, o tratamento com losartan previne o desenvolvimento de
hipertensão arterial induzido pela ouabaína sugerindo que, embora a angiotesina II
esteja implicada no desenvolvimento do processo hipertensivo neste modelo, como já
previamente descrito (Huang & Lennen, 1999; Zhang & Leenen, 2001), as alterações
vasculares periféricas parecem depender de outros mecanismos.
Manunta e colaboradores (2000) verificaram que a digoxina e a digitoxina, ambos
compostos digitálicos, ao contrário da ouabaína, não produzem hipertensão em ratos
quando administrados cronicamente. Estes resultados sugerem que a hipertensão
induzida pela ouabaína pode ser independente da sua capacidade de se ligar e inibir a
Na
+
,K
+
-ATPase. Além do mais, o tratamento com ouabaína, mas não com digoxina,
promove alterações na reatividade vascular renal (Kimura et al, 2000). Recentemente,
Ward e colaboradores (2002) descreveram novos sítios de ligação para ouabaína em
células adrenocorticais. Desse modo, não podemos descartar a possibilidade de que os
efeitos hipertensivos e as alterações vasculares provocadas pelo tratamento crônico
com ouabaína poderiam ocorrer através da sua ligação a esses receptores.
CONCLUSÕES
Conclusões
123
6. Conclusão
6.1. Estudos Agudos
6.1.1. Estudos Agudos in vivo
- A administração aguda de 18µg/Kg de ouabaína (~30 nmol/Kg) é capaz de
aumentar a pressão arterial sistólica e diastólica em ratos Wistar e SHR, mas não
em ratos WKY.
- Nos ratos Wistar, somente o aumento da pressão arterial diastólica foi prevenido
por administração de losartan, sugerindo o envolvimento do sistema renina-
angiotensina.
- Nos animais hipertensos, no entanto, os efeitos pressores da ouabaína não
foram alterados por administração de losartan, diferentemente do que já havia sido
demonstrado por nosso grupo com doses mais baixas de ouabaína (Padilha et al,
2004).
Esses dados sugerem que os mecanismos pelos quais a ouabaína promove
aumento de pressão arterial de forma aguda dependem da dose utilizada e da
presença ou não de hipertensão arterial. Doses menores, como 1nM, não
modificam a pressão arterial de ratos normotensos, embora eleve em animais
hipertensos através de um mecanismo que envolve a ativação do sistema renina-
angiotensina (Padilha et al, 2004). Contudo, doses maiores, como a utilizada neste
estudo, são capazes de aumentar a pressão arterial em ratos Wistar, através de
um mecanismo que, em parte, é devido a angiotensina II. Já em SHR os efeitos
pressóricos de concentrações mais elevadas desse digitálico parecem envolver
outros mecanismos de ação.
6.1.2. Estudos Agudos in vitro
- Em animais normotensos, Wistar e WKY, 1µM de ouabaína aumentou a
reatividade vascular do leito vascular caudal à fenilefrina, corroborando dados
prévios do nosso laboratório (Vassallo et al, 1997; Rossoni et al, 2001). Essa
alteração é dependente do endotélio, uma vez que na ausência do mesmo, o
Conclusões
124
efeito da ouabaína na resposta pressora à fenilefrina foi abolido. Essa alteração
está associada à liberação de angiotensina II, já que esses efeitos foram
prevenidos na presença de losartan.
- No leito vascular caudal de ratos hipertensos (SHR), 1µM de ouabaína também
foi capaz de aumentar a reatividade vascular à fenilefrina, de acordo com dados
prévios (Vassallo et al, 1997; Rossoni et al, 2001). Esse efeito é dependente do
endotélio e parcialmente associado à liberação de angiotensina II.
Estes resultados sugerem que os efeitos produzidos por concentrações
elevadas de ouabaína na reatividade vascular de ratos normotensos,
diferentemente do que ocorre com baixas concentrações (10nM), envolvem a
liberação local de angiotensina II, que modula positivamente a resposta à
fenilefrina.
Já em ratos hipertensos, somente parte do aumento da reatividade vascular
à fenilefrina produzida pela ouabaína pode ser atribuído a liberação local de
angiotensina II, sugerindo o envolvimento de outras vias endoteliais. Isso difere
dos resultados obtidos pelo nosso grupo utilizando concentrações menores desse
digitálico (1nM) (Padilha et al, 2004). Ao mesmo tempo, sugere que o
envolvimento da angiotensina II nas ações vasculares agudas da ouabaína são
dependentes da concentração desse digitálico.
Outro dado relevante a considerar é que, ao analisarmos os efeitos de 1nM
e 1µM de ouabaína na reatividade vascular de ratos normotensos e hipertensos,
esse últimos parecem ser mais sensíveis às ações dessa substância, sugerindo
que esse hormônio poderia estar implicado na gênese e/ou manutenção da
hipertensão.
6.2. Estudos Crônicos
- O Tratamento crônico com ouabaína por 15 dias não modificou a reatividade
vascular à fenilefrina em artérias de resistência. Esses resultados diferem
daqueles encontrados com o tratamento por 5 semanas em vasos de
condutância (Rossoni et al, 2002a,b; Xavier et al, 2004b,c), no entanto,
Conclusões
125
corroboram os dados de Xavier e colaboradores (2004b) em artérias
mesentéricas de resistência.
- A reatividade se manteve inalterada provavelmente porque esse tratamento
cursou com o aumento da modulação endotelial pelo óxido nítrico, porém com
um prejuízo da resposta do fator hiperpolarizante derivado do endotélio,
corroborando novamente dados do tratamento crônico por 5 semanas de Xavier
e colaboradores (2004b). Vale ressaltar que a expressão protéica para eNOS
não foi alterada pela ouabaína, de acordo com dados prévios (Xavier et aI,
2004b). Além disso, o tratamento por 15 dias também cursa com aumento da
liberação de prostanóides vasoconstritores em resposta à fenilefrina e aumento
da expressão protéica de COX-2. Esses resultados se contrapõem àqueles
observados em vasos de condutância após tratamento por 5 semanas com
ouabaína, onde parece haver um prejuízo da liberação de prostanóides (Xavier
et al, 2004b).
- Diferente do observado em artérias mesentéricas de resistência de ratos
tratados por 5 semanas com ouabaína (Xavier et al, 2004b), 15 dias de
tratamento não foi capaz de modificar a atividade funcional da Na
+
K
+
,ATPase.
Esses dados em conjunto demonstram que em estágios mais recentes da
hipertensão ouabaína, há uma maior modulação do NO e perda do EDHF,
alterações que persistem em estágios mais tardios do tratamento crônico e que
podem ser ocasionadas pela ouabaína per se. No entanto, outras alterações como
a liberação de prostanóides e o aumento da expressão da COX-2, encontradas
somente em estágios mais recentes desta hipertensão, parecem contribuir para o
estabelecimento da mesma.
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