( PDF ) Estudo da susceptibilidade da linhagem celular GRX Clone-c para o isolamento de diferentes tipos de vírus

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Universidade Federal do Rio de Janeiro

Estudo da Susceptibilidade da Linhagem Celular GRX Clone-c

para o Isolamento de Diferentes Tipos de Vírus

María Liz Gamarra Ramírez

2007

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UFRJ

Estudo da Susceptibilidade da Linhagem Celular GRX

Clone-c para o Isolamento de Diferentes Tipos de Vírus

María Liz Gamarra Ramírez

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Ciências

Biológicas (Microbiologia), do Instituto de

Microbiologia Prof. Paulo de Góes, da

Universidade Federal do Rio de Janeiro, como

parte dos requisitos necessários à obtenção do

título de Mestre em Ciências Biológicas

(Microbiologia).

Orientadores: Norma Suely de Oliveira Santos

e Maria Teresa Villela Romanos.

Rio de Janeiro

Janeiro de 2007

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Estudo da Susceptibilidade da Linhagem Celular GRX Clone-c para o

Isolamento de Diferentes Tipos de Vírus

María Liz Gamarra Ramírez

Orientadores: Norma Suely de Oliveira Santos e

Maria Teresa Villela Romanos.

Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em

Ciências Biológicas (Microbiologia), do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de

Góes, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos

necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas

(Microbiologia).

Aprovada por:

____________________________________

Profa. Luciana Barros de Arruda Hinds

__________________________________

Profa. Luciana de Jesus Costa

__________________________________

Profa. Márcia Dutra Wigg

__________________________________

Prof. Davis Fernandes Ferreira

Rio de Janeiro

Janeiro de 2007

iii

Ramírez, María Liz Gamarra.

Estudo da Susceptibilidade da Linhagem Celular GRX

Clone-c para o Isolamento de Diferentes Tipos de Vírus / María

Liz Gamarra Ramírez - Rio de Janeiro: UFRJ/IMPPG, 2007.

xvi, 90p, il., 31cm.

Orientadores: Norma Suely de Oliveira Santos

Maria Teresa Villela Romanos

Dissertação (mestrado) – UFRJ / IMPPG, Programa de

Pós-graduação em Ciências Biológicas (Microbiologia), 2007.

Referências Bibliográficas: f. 64 – 90.

1. Cultura de Células. 2. GRX. 3. Isolamento viral. 4.

Susceptibilidade Celular. I – Santos, Norma Suely de Oliveira e

Romanos, Maria Teresa Villela. II – Universidade Federal do Rio

de Janeiro – Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes,

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas

(Microbiologia). III - Título

Aos meus pais Angel (in memoriam) e

Guillerma, que me proporcionaram a

oportunidade para meu permanente

crescimento.

AGRADECIMENTOS

9 A Deus, por tudo.

9 A minha mãe e minha família que desde o momento em que decidi

estudar me deram todo o apoio e incentivo.

9 As minhas orientadoras: Prof. Norma e Prof. Maria Teresa, pela

competente orientação, inesgotável paciência, amizade e incentivo

constante em todas as etapas da realização deste trabalho. Serei

sempre grata pela oportunidade de entrar em seus laboratórios.

9 Ao Prof. Radovan, que de alguma maneira tornou possível este trabalho

ao ceder gentilmente a célula GRX, e ao Anderson que muitas vezes foi

perturbado pela Maria Carolina para descongelar as células.

9 Aos meus amigos do laboratório Adriana, Caroline, Maria Carolina,

Fabrício e Ludmila que me receberam com carinho e amizade, me

ajudaram e aconselharam nos momentos de desespero. E a Soluza

pelos momentos de descontração.

9 Aos amigos do LEDAC, que de alguma forma colaboraram para que este

trabalho fosse concluído.

9 A Norma Coluchi, Claudia Candia, e Adán Sanchez pela amizade, apoio

e estímulo inicial para a realização do mestrado.

9 Aos amigos que deixei no Paraguai, que me deram o incentivo para

prosseguir na busca dos meus objetivos.

9 À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior

(CAPES), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq), e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do

Rio de Janeiro (FAPERJ) pelo apoio finaceiro;

9 Ao Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes e ao Departamento de

Virologia, representados pela Professora Tháis Souto-Padron,

Coordenadora de Pós-Graduação, Professora Agnes Marie de Sá

Figueiredo, Diretora do IMPPG e Professor Davis Fernandes Ferreira,

Chefe do Departamento de Virologia.

9 E finalmente, a todos que de alguma forma contribuíram para a

realização deste trabalho.

vii

RESUMO

Estudo da Susceptibilidade da Linhagem Celular GRX – Clone-c para o

Isolamento de Diferentes Tipos de Vírus

María Liz Gamarra Ramírez

Orientadores: Norma Suely de Oliveira Santos e Maria Teresa Villela Romanos.

Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Biológicas (Microbiologia), do Instituto de Microbiologia

Prof. Paulo de Góes, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte

dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências

Biológicas (Microbiologia).

Há cerca de duas décadas, uma linhagem celular murina (denominada

GRX), representativa das células estreladas hepáticas, foi desenvolvida e

caracterizada quanto às suas propriedades biológicas e bioquímicas.

Considerando que (i) as culturas de células constituem uma ferramenta usual e

fundamental para elaboração de modelos experimentais in vitro e, (ii) são

utilizadas como substratos para a propagação de vírus, entre outras aplicações

importantes; (iii) que a susceptibilidade da linhagem celular GRX para

propagação viral é desconhecida, o objetivo principal do presente trabalho foi

avaliar a susceptibilidade dessa linhagem celular para propagar diferentes

tipos de vírus. A linhagem GRX clone-c (GRX) foi obtida do Banco de Células

do Estado do Rio de Janeiro (UFRJ, RJ), e cultivada em meio mínimo

essencial de Eagle (MEM) suplementado com 10% de SFB. Monocamadas de

células GRX foram infectadas com cepas de vírus DNA e RNA. As culturas

inoculadas foram incubadas a 37

C em ambiente de 5% de CO

e observadas

diariamente ao microscópio óptico invertido, até o aparecimento de efeito

citopatogênico (CPE). Os sobrenadantes dessas culturas foram analisados

para determinação do título viral. Foi verificado que a linhagem GRX é

susceptível à propagação de vírus herpes simplex tipos 1 e 2 (HSV-1 e HSV-

2), vírus mayaro (MAY), vírus Sindbis (SIN), vírus da encefalite eqüina do

oeste (WEE), vírus da estomatite vesicular (VSV) e metapneumovírus humano

(hMPV), podendo ser considerada um novo substrato para estudo da

replicação viral. Além disso, foi possível realizar o isolamento primário de uma

amostra de HSV-1 a partir de secreção de vesícula labial, demonstrando que

está célula pode ser utilizada para a propagação desse vírus a partir de

material clínico.

Palavras-chave: 1. Cultura de Células; 2. GRX; 3. Isolamento viral; 4.

Susceptibilidade Celular.

Rio de Janeiro

Janeiro de 2007

viii

ABSTRACT

Analysis of the Susceptibility of the Cell Line GRX – clone C for the Isolation of

Different Types of Viruses.

María Liz Gamarra Ramírez

Advisors: Norma Suely de Oliveira Santos e Maria Teresa Villela Romanos.

Abstract da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Biológicas (Microbiologia), do Instituto de Microbiologia

Prof. Paulo de Góes, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte

dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências

Biológicas (Microbiologia).

Twenty years ago, a murine cell line (designated GRX) representative of

hepatic strellate cells was established and its biologic and biochemical

characteristics were determined. Considering that (i) cell cultures constitute an

usual and fundamental tool for in vitro experimental models; (ii) are used as

substrate for viral replication, among other important applications and, (iii) that

the susceptibility of the GRX cell line for viral propagation has never been

established, the main goal of the present study was to evaluate the

susceptibility of this cell line to replicate different types of viruses. The GRX

cells were obtained from the Banco de Células do Estado do Rio de Janeiro

(UFRJ, RJ), and grown in Minimum Essential Medium (MEM) supplemented

with FBS 10%. GRX monolayers were infected with DNA and RNA viruses. The

infected cells were incubated at 37

C with 5% CO

and observed daily for the

cytopatic effect (CPE). The supernatants of such cultures were analyzed for

viral titration. The results indicated that the GRX cell line is susceptible for

replication of herpes simplex virus types 1 and 2 (HSV-1 and HSV-2), mayaro

virus (MAY), Sindbis virus (SIN), west equine encephalitis virus (WEE),

Vesicular Stomatitis virus (VSV) and human metapneumovirus (hMPV) and can

be used as substrate for viral replication studies. Moreover, we successfully

isolated an HSV-1 strain from a labial lesion, which suggests that this cell line

could be used for propagation of virus from clinical samples.

Key words: 1. cell cultures; 2. GRX; 3. Viral isolation; 4. Cell Susceptibility.

Rio de Janeiro

January 2007

SUMÁRIO

I. INTRODUÇÃO.......................................................................................... 1

1. Histórico................................................................................................... 1

2. Tipos de Cultura de Células..................................................................... 6

3. Vantagens e Desvantagens da Cultura de Células................................. 16

4. Propagação de Vírus em Culturas de Células......................................... 17

5. Linhagem Celular GRX............................................................................

II. OBJETIVOS............................................................................................. 31

III. MATERIAL MÉTODOS........................................................................... 32

1.Culturas de células.................................................................................... 32

2. Amostras virais......................................................................................... 32

2.1.Ativação das cepas rotavírus para inoculação....................................... 35

3. Expansão e manutenção da cultura de células....................................... 35

4. Avaliação da susceptibilidade de células GRX para propagação viral.... 36

5. Avaliação da susceptibilidade da linhagem GRX para isolamento

primário de vírus herpes simplex.................................................................

6. Métodos empregados para avaliar a propagação viral em culturas de

células GRX.................................................................................................

6.1. Visualização do CPE............................................................................. 39

6.2. Determinação do título viral nas culturas de células............................. 40

6.3. Demonstração da propagação de HSV e identificação do tipo viral

em cultura de GRX e Vero a partir da amostra clínica através da

detecção do ácido nucléico viral.................................................................

6.3.1. Extração de ácido nucléico viral a partir do sobrenadante de cultura

de células inoculadas e diretamente da amostra clínica..............................

6.3.2. Detecção de Vírus Herpes Simplex através de reação em cadeia

da polimerase (PCR)....................................................................................

6.3.3. Identificação do tipo de Vírus Herpes Simplex através de reação

em cadeia da polimerase (PCR)..................................................................

IV. RESULTADOS........................................................................................ 45

1. Estabelecimento das condições de cultivo das culturas de células GRX 45

2. Susceptibilidade da linhagem GRX para a propagação viral................... 46

2.1. Vírus de RNA........................................................................................ 46

2.1. Vírus de DNA........................................................................................ 49

3. Isolamento primário de HSV-1 em GRX.................................................. 51

4. Determinação do título viral nas culturas de células................................ 53

V. DISCUSSÃO............................................................................................ 55

VI. CONCLUSÕES.

.........................................................................

VII. PERSPECTIVAS FUTURAS................................................................. 63

VIII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................... 64

ÍNDICE DE TABELAS E QUADROS

Tabela 1. Alguns vírus e células de escolha para o seu isolamento........ 20

Tabela 2. Lista de vírus utilizados neste estudo....................................... 34

Tabela 3: Resultados da propagação de vírus RNA na linhagem GRX

em diferentes passagens. ........................................................................

Tabela 4: Propagação de vírus DNA na linhagem GRX.......................... 49

Tabela 5. Títulos virais obtidos a partir dos sobrenadantes das culturas

de células infectadas................................................................................

xii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Representação diagramática da evolução de uma linhagem

celular........................................................................................................

Figura 2: Diagrama da curva de crescimento de células de linhagem

contínua......................................................................................................

Figura 3. Esquema mostrando a localização das células estreladas

hepáticas....................................................................................................

Figura 4. Monocamada confluente de células GRX não infectadas,

cultivadas em DMEM com 10%SFB..........................................................

Figura 5. Morfologia das monocamadas de culturas de células

utilizadas nesse estudo..............................................................................

Figura 6. Exemplo do diagrama da placa de 48 cavidades para

experimentos de susceptibilidade da propagação viral em células GRX..

Figura 7. Propagação de vírus na linhagem GRX. A: cultura de células

GRX não inoculadas; B: cultura de células GRX inoculadas com vírus

Mayaro 24 h pós-infecção..........................................................................

Figura 8. Propagação de vírus na linhagem GRX. A: cultura de células

GRX não inoculadas; B: cultura de células GRX inoculadas com HSV-1

24 h pós-infecção.......................................................................................

Figura 9. Detecção e identificação de HSV-1 a partir de uma amostra

clínica inoculada em GRX..........................................................................

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

2D: Bi-dimensional

3D: Tri-dimensional

A549: Cultura de células de carcinoma de pulmão humano

Adv19: Adenovírus sorotipo 19

Adv2: Adenovírus sorotipo 2

Adv40: Adenovírus sorotipo 40

C6/36: Cultura de células de Aedes albopictus

CEH: células estreladas hepáticas

: Dióxido de carbono

CPE: efeito citopático

DEN-1: Vírus Dengue tipo 1

DEN-2: Vírus Dengue tipo 2

DEN-3: Vírus Dengue tipo 3

D-MEM: Meio Mínimo Essencial de Eagle em salina de Dulbecco

DNA: Ácido desoxirribonucléico

dNTP: dideoxinucleotídeos trifosfato

EDTA: Ácido Etilenodiaminotetracético

GBM8401: Cultura de células de glioblastoma humano

GMK: Cultura de células de rim de macaco verde africano

GRX: Cultura de células de fígado de camundongo

HCoV-HKU1: Cepa de coronavírus humano

HCoV-NL63: Cepa de coronavírus humano

HCR3: Amostra de rotavírus de origem humana

HEK: Cultura de células de rim de embrião humano

HeLa: Cultura de células de carcinoma cervical humano

HEp2: Cultura de células de carcinoma laríngeo humano

HEPES: 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid

hMPV: Metapneumovírus humano

HSV-1-ACVr: Vírus Herpes Simplex tipo 1 resistente ao aciclovir

HSV-2-ACVr: Vírus Herpes Simplex tipo 2 resistente ao aciclovir

HuH7: Cultura de células de hepatocarcinoma humano

IMR-32: Cultura de células de neuroblastoma humano

xiv

KB: Cultura de células de carcinoma epidermóide humano

KCl: Cloreto de potássio

LAVIREO: Laboratório de Viroses Respiratórias, Entéricas e Oculares

LEDAC: Laboratório Experimental de Drogas Antivirais e Citotóxicas

LLC-MK2: Cultura de células de rim de macaco Rhesus

LVM II: Laboratório de Virologia Molecular II

MA-104: Cultura de células de rim de macaco verde africano

MAY: Vírus Mayaro

MDBK: Cultura de células de rim de bovino

MDCK: Cultura de células de rim de cachorro

MEM: Meio Mínimo Essencial de Eagle

MgCl

Cloreto de magnésio

MME: Master mix com Enzima

MMH-D3: Cultura de células de rim de camundongo

MRC-5: Cultura de células de pulmão de embrião humano

NIH: National Institute of Health

: Molécula de oxigênio

OMS: Organização Mundial de Saúde

pb: Pares de Bases

PCR: Reação em Cadeia da Polimerase

pH: Potencial hidrogeniônico

RNA: Ácido ribonucléico

RRV: Amostra de rotavírus de origem símia

SA-11: Amostra de rotavírus de origem símia

SARS-CoV: Coronavírus humano associado à Severe Acute Respiratory

Syndrome

SFB: Soro Fetal Bovino

SIN: Vírus Sindbis

TBE: Tampão tris-ácido bórico-EDTA

TCID

: dose infecciosa que produz CPE em 50% das culturas inoculadas

Tris-HCl: Tris[hidroximetil]aminometano – Ácido Clorídrico

Vero: Cultura de células de rim de macaco Cercopitheccus aethiops

VSV: Vírus da Estomatite Vesicular

WEE: Vírus da Encefalite Eqüina do Oeste

WI-38: Cultura de células de pulmão de embrião humano

xvi

I. INTRODUÇÃO

1. Histórico

Historicamente o cultivo de células teve a sua origem no século XIX,

como um método para o estudo do comportamento das células de origem

animal, livres das variações sistêmicas que ocorrem dentro do organismo

durante a homeostase normal. Assim, no ano de 1885, Wilhelm Roux obteve o

isolamento de uma placa neural de embrião de galinha mantendo-a viva em

uma solução salina durante alguns dias com o objetivo de estudar seu

desenvolvimento em condições in vitro. Roux demonstrou que o fechamento

da mesma era devido à multiplicação de suas células e não devido à

compressão exercida pelas estruturas adjacentes, como era sustentado pelos

cientistas da época (revisado por Romijn, 1988; Reina, 2006).

Especula-se ainda que a cultura de células de tecidos de animais

iniciou-se no século passado, com o trabalho do zoólogo americano Ross

Granviele Harrison, que demonstrou que fragmentos de tecido podiam ser

mantidos in vitro, empregando culturas de medula espinhal embrionária de

anfíbios, conseguindo assim observar o crescimento dos axônios de

neuroblastos, e estabelecendo que estes se formavam por expansão, a partir

do corpo neuronal e não por fusão de uma cadeia de células. As observações

de Harrison resolveram uma das controvérsias em neurobiologia,

demonstrando que as fibras nervosas efetivamente emergiam das células

nervosas do tubo medular (Harrison, 1907).

A primeira limitação para o estabelecimento de células em culturas era

a obtenção de um meio nutritivo adequado. Assim, Harrison e um de seus

discípulos, Burrows (1910), tiveram a idéia de incorporar plasma ou soro de

aves domésticas como nutriente para as culturas de tecidos embrionados de

galinha, o que lhes permitiu cultivar sobre lamínulas, células em coágulo de

plasma homólogo. Burrows foi o primeiro a observar e descrever a mitose em

células, in vitro, tendo sido ele o primeiro a utilizar a denominação de "cultura

de tecido" (Burrows, 1910; Burrows, 1912). Poucos anos depois, Alexis Carrel,

introduziu técnicas inovadoras, incorporando o extrato de embrião de galinha

como estimulador do crescimento celular, procedimento este que se tornou

universal. Além disso, em 1912, Carrel mostrou a possibilidade de manter em

cultura uma linhagem celular de coração de galinha, mediante subcultivos.

Grande parte do êxito na manutenção da cultura se deveu aos recipientes

inventados por ele, os denominados “frascos de Carrel”. Este pesquisador foi

laureado com o Prêmio Nobel de Medicina em 1912 (Carrel, 1912; Carrel,

1913; Carrel, 1923).

As exigências nutricionais das culturas foram também estudadas por

numerosos cientistas, que fizeram uma cuidadosa investigação sobre os

efeitos exercidos por sais, aminoácidos, carboidratos e outros nutrientes sobre

o desenvolvimento de células de animais cultivadas in vitro durante curto

espaço de tempo. Seus trabalhos constituíram, o ponto de partida para a

elaboração dos chamados “meios sintéticos”, que atualmente são utilizados

nos cultivos celulares e que em geral, são compostos de sais minerais,

aminoácidos e vitaminas, variando a composição de acordo com diferentes

tipos de necesidades nutricionais das células empregadas (Lewis & Lewis,

1911; White, 1949; Eagle, Oyama, & Levy, 1957).

A preparação de culturas foi facilitada graças ao desenvolvimento de

métodos para dissociar células sem alterar a sua viabilidade. Assim, Rous &

Jones em 1916 empregaram pela primeira vez os extratos adicionados de

tripsina para dissociar células de tecidos (Rous & Jones, 1916). Essa

propriedade foi posteriormente transferida para o campo da Virologia como

uma maneira de tornar possível o crescimento de uma variedade de culturas

de células (Rapp & Melnick, 1966; Wilmer, 1965).

A aquisição da capacidade de proliferar células indefinidamente em

meio de cultura representa uma considerável vantagem para os

pesquisadores, pois permite a repetição dos bioensaios, visto que se pode em

suspensão dispor de culturas idênticas. Assim, Wilton R. Earle, na década de

1940 obteve a primeira linhagem celular estabelecida mantida em suspensão,

a partir de fibroblastos de tecido conjuntivo de camundongo, também chamada

linhagem celular continua, consistente de células adaptadas a um crescimento

indefinido em meio de cultivo (Earle et al., 1954; Wilmer, 1965). Por outro lado,

Katherine Sanford e colaboradores (1948) isolaram células da linhagem celular

L e mostraram que aderidas a um suporte eram capazes de formar clones na

cultura de tecidos. Demonstraram que, para que uma célula chegue a se

dividir necessita ser alimentada com os nutrientes corretos (Sanford, Earle &

Likely, 1948). Mais tarde vieram os trabalhos de George O. Gey e

colaboradores (1952), que conseguiram estabelecer a primeira linhagem

celular em monocamada, a partir de um carcinoma cervical humano, as

atualmente bem conhecidas células HeLa (Gey, Coffman & Kubicek, 1952).

Na década de 1960, Hayflick e Moorhead, utilizaram pela primeira vez

antibióticos para prevenir a contaminação dos cultivos de fibroblastos e

conseguiram manter esses cultivos durante cerca de 12 passagens, porém

não conseguiram estabelecer linhagens estáveis (Hayflick & Moorhead, 1961).

Depois vieram os trabalhos de Ham (1965) que introduziu o primeiro meio

sintético quimicamente definido capaz de manter algumas células de mamífero

em cultivo indefinidamente (Ham, 1965).

Inovações no desenvolvimento de meios de cultura, o uso de

antibióticos, as técnicas de tripsinização para as passagens de células e a

suplementação do meio com soro fetal bovino, permitiram o desenvolvimento e

aplicabilidade das culturas de células (Wilmer, 1965).

Em 1958, Temim e Rubim, desenvolveram um ensaio quantitativo para

infecção de fibroblasto de embrião de galinha com o vírus do Sarcoma de

Rous demostrando que esse vírus requer divisão celular para o inicio da

síntese e a replicação do RNA viral (Temim & Rubim, 1958; Temim & Rubim,

1959). Na década seguinte, as características deste e outros tipos de

transformação celular por vírus foram estabelecidas (Wilmer, 1965).

Mais tarde foram estabelecidas as primeiras linhagens celulares

diferenciadas. Assim, em 1969, Augusti-Tocco e Sato cultivando a primeira

linhagem celular de neurônios a partir de clones isolados, obtidos a partir de

neuroblastoma de camundongos (Augusti-Tocco & Sato, 1969). Kohler e

Milstein, em 1975, estabeleceram a primeira linhagem celular produtora de

anticorpos monoclonais. O estabelecimento da tecnologia de obtenção de

anticorpos monoclonais lhes valeu o Prêmio Nobel (Kohler & Milstein, 1975).

Em 1982,

Nakabayashi e colaboradores publicaram seus trabalhos

demonstrando que o cultivo das diferentes linhagens celulares requer misturas

distintas de hormônios e fatores de crescimento para crescer em meios livres

de soro (Nakabayashi et al., 1982).

Atualmente, o uso de células em cultivo vai além do entendimento e do

estudo de processos biológicos. As culturas in vitro têm permitido grandes

avanços na compreensão dos mecanismos implicados nos processos

intracelulares e intercelulares, chegando à sua aplicação na reposição de

tecidos em indivíduos e transplantes (Wigley, 2002).

2. Tipos de Culturas de Células

É difícil fazer uma classificação das culturas de células baseada na

morfologia, porém em geral é possível separá-las como células do tipo epitelial

e células do tipo fibroblástica (Paul, 1965).

As culturas de células (ou linhagens celulares) são classificadas de

acordo com a capacidade de ancoragem (aderência) a uma superfície

determinada, podendo crescer formando monocamadas ou em suspensão. As

células aderentes dependem da fixação à base dos frascos ou placas de

cultura para se proliferarem, no qual formam uma única camada contínua sobre

uma superfície, e representam a grande maioria das linhagens em estudo. Já

as linhagens em suspensão não dependem de ancoragem e se proliferam,

como o próprio nome sugere, suspensas no meio (Martins, Boaventura & Lima,

2005).

Os tipos de culturas de células rotineiramente utilizados podem ser de

culturas de células primárias, culturas celulares diplóides, linhagens celulares

contínuas, culturas clonadas e cepas celulares, as quais podem ser derivadas

de muitas espécies de animais, e que diferem substancialmente em suas

características (Landry & Hsiung, 2000; Specter et al., 2002; McAteer & Davis,

2002). Geralmente, são culturas bi-dimensionais (2D) onde as células podem

ser crescidas tanto em suspensão quanto em monocamadas. A seguir, serão

descritos os tipos de culturas celulares mencionados.

As culturas de células primárias, também chamadas de culturas finitas,

originam-se de células desagregadas recentemente de tecidos de um

organismo e possuem tempo limitado de vida em cultura – normalmente não

mais que 5 a 20 ciclos de divisão celular. A maioria das células normais não dá

origem a linhagens celulares contínuas, e após certo período, as células em

cultura entram em senescência e morrem. Podem ser obtidas do sangue,

órgãos (rins, fígado, linfonodos, baço, timo, pâncreas) e organismos

(embriões), mediante desagregação enzimática ou mecânica do tecido ou

através de lavados. Já quando um cultivo primário é subcultivado (passagem),

as células da primeira passagem recebem o nome de

cultivo secundário

(Condit, 2001; Specter et al., 2002; McAteer & Davis, 2002; Martins,

Boaventura & Lima, 2005; Andrei, 2006).

Culturas de células primárias de diferentes origens, incluindo células de

embrião de galinha, e rim de macaco, cachorro, coelho ou hâmster, têm sido

usadas em todo o mundo para a produção de vacinas atenuadas ou inativadas

para uso humano por mais de 40 anos. O sucesso no controle de doenças

virais, tais como poliomielite, sarampo, caxumba e rubéola, tornou-se possível

através do uso de vacinas preparadas em culturas de células primárias e a

experiência tem indicado que esses produtos são seguros e eficientes (WHO,

1998). Contudo, a tendência atual é a substituição desses cultivos primários

por culturas celulares diplóides devido ao fato de que a qualidade e a

sensibilidade das culturas primárias obtidas de diferentes animais são

variáveis. Além disso, a dificuldade de obtenção de culturas derivadas de

primatas não-humanos tem aumentado principalmente devido à contaminação

por agentes infecciosos (Andrei, 2006).

culturas de células finitas (ou diplóides) são estabelecidas a partir do

subcultivo de células primárias, geralmente derivadas de tecidos animais,

consistindo de uma população homogênea de um único tipo de célula, que

pode dividir até 100 vezes antes de esta linhagem entrar em senescência, e

retém o número de cromossomas diplóide a despeito de numerosos ciclos de

divisão celular (Landry & Hsiung, 2000; Specter et al., 2002; Andrei 2006).

A principal vantagem das culturas celulares diplóides de origem humana

ou símia em comparação com as culturas de células primárias é que podem ser

bem caracterizadas e padronizadas, e a produção pode ser baseada num

sistema de banco de células. Vacinas preparadas em duas linhagens celulares

diplóides diferentes, originadas de pulmão de embrião humano (p.ex.: WI-38 e

MRC-5) têm sido usadas extensivamente nas últimas décadas sendo

consideradas seguras (Andrei, 2006).

Já as

linhagens de células ditas permanentes, contínuas ou imortais,

consistem de um único tipo celular e tệm a capacidade ilimitada de crescimento

em cultura; o estabelecimento pode ser a partir de tecidos humanos ou de

animais. Elas freqüentemente apresentam morfologia ou número de

cromossomas anormais (aneuplóides). Estas linhagens são derivadas dos

seguintes métodos: (a) subcultivo seriado ou cultivo primário de células de

tumor humano ou animal, tais como as células HeLa; (b) transformação de uma

célula normal apresentando um tempo de vida finito, com um oncogene viral,

por exemplo, linfócito B tranformado pelo vírus Epstein-Barr; (c) subcultivo

seriado de uma população de células normais gerando espontaneamente uma

nova população de células com tempo de vida infinito; (d) fusão entre uma

célula de mieloma com um linfócito B produtor de anticorpos. Linhagens de

células contínuas são agora consideradas um substrato alternativo para a

produção de muitas substâncias biológicas medicinais; um sistema de banco

de células semelhante ao utilizado para células diplóides fornecem os meios

para a produção de produtos biológicos por um período indefinido, baseado em

células bem caracterizadas e padronizadas. No entanto, muitas dessas células

expressam vírus endógenos e são tumorigênicas havendo o risco de

tumorigênese associada com DNA celular residual que pode codificar proteínas

transformantes e proteínas promotoras de crescimento (Landry & Hsiung, 2000;

Condit, 2001). A Organização Mundial de Saúde (OMS) publicou recentemente,

os requerimentos para o uso de linhagens celulares contínuas para a produção

de produtos biológicos (WHO, 1998).

culturas clonadas (clones) têm origem na seleção clonal que é o

estabelecimento de uma população de células derivadas de uma única célula.

Os clones podem ser derivados de uma linhagem de células contínuas ou de

uma cultura primária. Em ambos os casos o propósito da clonagem é o mesmo:

minimizar o grau de variação genética e fenotípica dentro da população de

células. Por outro lado, o termo cepas celulares é usado para descrever a

população de células subcultivadas selecionadas com base na expressão de

propriedades específicas, características funcionais, ou marcadores (Clarke et

al., 2002; McAteer & Davis, 2002).

Os pesquisadores têm reconhecido as limitações das culturas de células

2D dado o fato de que elas não reproduzem as características morfológicas e

bioquímicas que as células possuem no tecido original. Alternativamente, a

metodologia de culturas de células tri-dimensional (3D) oferece aos

pesquisadores os meios para crescimento e diferenciação celulares sob

condições que reproduzem o ambiente in vivo (Andrei 2006). Holtfreter (1944),

e posteriormente Moscona (1952, 1961) foram os pioneiros no campo de

culturas de células em 3D através de suas pesquisas em morfogênese usando

culturas de células malignas ou embrionárias, reagregadas em torno de

substratos esféricos (Holtfreter, 1944; Moscona, 1952; 1961). Estudos

subseqüentes aumentaram consideravelmente o âmbito das pesquisas em

células agregadas, utilizando esferóides revestidos de células tumorais como

um modelo in vitro para estudos em resposta de células tumorais à terapia

(Sutherland, McCreidie & Inch,1971; Sutherland, 1988).

Embora a importância das culturas de células tenha sido demonstrada há

muito tempo, a utilização de culturas de células em 3D somente foi introduzida

recentemente. As conseqüências de tentar extrapolar os achados em 2D para o

comportamento celular em 3D estão se tornando claras (Edelman & Keefer,

2005). Por exemplo, observações relativas às diferenças entre culturas de

células em 2D versus culturas de células em 3D foram feitas em pesquisas

oncológicas que demonstraram a reversão do fenótipo maligno de células

humanas de mama em culturas 3D e in vivo por anticorpos bloqueadores de ß1-

integrina (Weaver et al., 1997), não observada em culturas 2D. Posteriormente,

estudos demonstraram que as condições ambientais têm efeito importante nas

propriedades neoplásicas de células de tumor, e tais efeitos podem influenciar a

resposta farmacológica das células cancerosas a drogas quimioterápicas (Sahai

& Marshall, 2003).

Uma grande vantagem das culturas de células 3D é sua geometria bem

definida e em comparação com culturas tradicionais, sua semelhança mais

próxima com a situação in vivo no que diz respeito à forma e ambiente celular.

Forma e ambiente podem determinar a expressão gênica e o comportamento

biológico das células (Mueller-Klieser, 1997).

As células normais em cultura, tipicamente, mostram um padrão de

crescimento sigmoidal de atividade proliferativa que reflete a adaptação à

cultura, condicionada ao meio ambiente, e a disponibilidade física do substrato

e os nutrientes necessários para a produção de novas células (McAteer &

Davis, 2002).

Hayflick & Moorhead (1961) estudaram linhagens celulares derivadas de

vários tecidos, onde foram avaliadas as características gerais, taxas de

crescimento, concentração celular e, a partir destas informações, foi traçado um

diagrama representativo (Figura 1). É interessante observar nesta figura o ponto

em que uma cultura deixa de ser finita e passa a ser de linhagem contínua,

devido às alterações celulares que podem acontecer em qualquer ponto do

cultivo (Hayflick & Moorhead, 1961).

A fase I ou fase de cultura primária representa o estágio inicial que

termina com a formação da primeira camada confluente de células. Neste

ponto, é feito o primeiro subcultivo, ou é contada a primeira passagem; as

reservas nutritivas do meio foram exauridas e o espaço da superfície do frasco

não é mais suficiente. Começa então a fase II que se caracteriza por

crescimento intenso e necessidade de muitos repiques. Em determinado

momento, pode acontecer uma alteração que torna a cultura finita numa

linhagem celular, cujo potencial de vida passa a ser infinito. Por outro lado, as

células que não sofrem alteração entram na fase III e em senescência, onde

ocorre a morte após um período limitado de tempo (de Almeida & Boaventura,

2005).

Numa linhagem celular permanente, todas as células já são capazes de

proliferar indefinidamente. Assim, neste tipo de cultivo, precisamos considerar

apenas três fases de crescimento celular, que estão definidas pela fase lag,

fase log e fase estacionária ou plateau (Figura 2). A fase lag corresponde ao

período de adaptação à cultura, pois ocorre pouca ou ausência de divisão

celular imediatamente após adição das células a um meio de cultura. A duração

desta fase depende do estágio de crescimento em que se encontra a cultura

que lhe deu origem e da densidade celular podendo-se estender por uma hora

até alguns dias.

Por outro lado, a fase log caracteriza uma proliferação exponencial ou

logarítmica durante a qual a multiplicação é máxima e constante. Esta fase

também é o período ideal para experimentação e estudo, pois há uma maior

viabilidade e atividade metabólica da população celular, a sua duração depende

da densidade inicial das células e da taxa de crescimento celular e da

densidade de saturação da linhagem.

Na fase estacionária ou plateau ocorre uma diminuição na velocidade de

crescimento normal das células após confluência, pois o número de morte

celular tende a ser equivalente ao número de células novas, além da atuação

de alguns fatores limitantes como a redução na capacidade de dispersão das

células, diminuição da quantidade de nutrientes e de fatores de crescimento no

meio. Nesta fase a atividade metabólica também decresce e as células estão

mais susceptíveis a danos. Cada vez que estas fases se completam, é

necessário repicar a cultura, diluindo a suspensão de células ou tripsinizando a

cultura aderida para diminuir a densidade celular (Freshney, 1987b; McAteer &

Davis, 2002; Martins, Boaventura & Lima, 2005; de Almeida & Boaventura,

2005).

Figura 1: Representação diagramática da evolução de uma linhagem celular

(Adaptado de Hayflick & Moorhead, 1961, apud Freshney, 1987c)

Figura 2: Diagrama da curva de crescimento de células de linhagem contínua

(Adaptado de: Freshney, 1987b)

3. Vantagens e Desvantagens das Culturas de Células

Os vários tipos de culturas de células apresentam uma série de vantagens

(Freshney, 1987a):

1. Podem ser mantidas em um meio ambiente controlado, tais como o meio

físico-químico (pH, temperatura, pressão osmótica, nível de O

, CO

tensão superficial) e fisiológicos (hormônios, fatores de crescimento,

densidade celular, etc.).

2. Caracterização e homogeneidade das amostras: as células em cultivo

geralmente são homogêneas, com morfologia e composição uniformes,

o que permite obter com facilidade um número elevado de réplicas

idênticas, que supera o grave problema da heterogeneidade.

3. Economia: o emprego de culturas de células em microtécnica permite

uma economia no uso de reagentes ou drogas, ao serem realizados

experimentos em volumes pequenos.

4. Possibilidade de estudar fenômenos, inacessíveis em tecidos intatos.

5. Conhecimento do comportamento e função de uma população isolada

de células.

Por outro lado, os sistemas de cultura de células apresentam um certo

número de desvantagens, entre as quais podemos citar (Freshney, 1987a):

1. O crescimento das células é muito mais lento que o dos contaminantes

habituais (fungos, leveduras, bactérias, micoplasmas); isto implica

manter as condições de assepsia em todo momento.

2. Instabilidade: muitas das linhagens celulares imortais são instáveis. Para

isso é necessário periodicamente, reiniciar o cultivo a partir de um

estoque de células com um baixo número de passagens.

3. Perda das características fenotípicas.

4. Validade do modelo in vitro: quando se estabelece o cultivo celular, as

células são acrescidas de hormônios, indutores químicos, entre outros

nutrientes para estabelecer as condições ideais do estado in vivo, porém

não está claro se o estado in vitro é o equivalente ao estado de

diferenciação in vivo.

4. Propagação de Vírus em Culturas de Células

No início das pesquisas em virologia animal, os progressos na

simplificação dos sistemas experimentais ocorreram lentamente inicialmente

com os animais selvagens, passando para animais de laboratório, como

camundongos e ovos embrionados de galinha, até as culturas de células, e

finalmente o cultivo de células individualizadas (Levine, 2001). Entre 1948 e

1955, quatro eventos importantes converteram a virologia animal em uma

ciência laboratorial: (i) Sanford, Earle & Likely, no National Institute of Health

(NIH) superaram a dificuldade de cultivar células individualizadas (Sanford,

Earle & Likely, 1948), (ii) Gey, Coffman & Kubicek, no John Hopkins Hospital

cultivaram e fizeram passagens de células humanas pela primeira vez e

desenvolveram uma linhagem celular (HeLa) derivada de um carcinoma

cervical (Gey, Coffman & Kubicek, 1952), (iii) Harry Eagle no NIH desenvolveu

e optimizou meio para cultivo de células individualizadas (Eagle, 1955), e (iv)

em 1949, John Enders, Thomas Weller e Frederick Robbins demonstraram que

poliovírus replicava em células não-neuronais humanas (Enders, Weller &

Robbins, 1949). Devido a essa descoberta, os últimos autores foram laureados

com o Prêmio Nobel de Medicina em 1954 (revisado por Levine, 2001).

Entre 1798 e 1949, todas as vacinas virais em uso (varíola, raiva, febre

amarela e influenza) eram produzidas em animais ou ovos embrionados de

galinha. Assim essas idéias, avanços tecnológicos e materiais experimentais

tiveram dois efeitos imediatos em virologia. Primeiro, eles levaram ao

desenvolvimento da vacina contra a poliomieltite sendo a primeira vacina

produzida em cultura de células e posteriormente a produção de outras vacinas

virais tais como sarampo e rubéola. Segundo, a utilização de cultura de células

para o estudo de vírus permitiu estudos da bioquímica e biologia molecular da

replicação viral iniciando a era moderna da virologia molecular (revisado por

Levine, 2001 e Andrei, 2006).

A capacidade dos vírus de serem replicados nas células de origem

humana ou animal in vitro favoreceu o avanço no conhecimento da virologia,

genética e fisiologia celular (Superti et al., 1991; da Costa, 2005; Freymuth et

al., 2005). No que diz respeito à virologia, as culturas de células permitem (i) o

isolamento primário de vírus (MacFarlane & Sommerville, 1969; Rhim et al.,

1969; McSwiggan et al., 1975; Woods & Young, 1988; Superti et al., 1991;

Weingartl et al., 2002; Freymuth et al., 2005; El-Awady et al., 2006; Ingram et

al., 2006), (ii) a execução de vários ensaios de infecciosidade (Ramos et al.,

1998; Blight, Kolykhalov & Rice, 2000; Deffrasnes, Côté & Boivin, 2005), (iii)

estudos bioquímicos (Fortuna, Trugo & Borojevic, 2001; Arcanjo et al., 2002;

Cardoso et al., 2003), (iv) servem de instrumento para a produção de vacinas e

de massa viral (Hilleman, 2000; Patnayak, Tiwari & Goyal, 2005) (v) além de

estudo e desenvolvimento de substâncias com atividade antiviral (Miranda et

al., 1997; Wigg, 1997; Almeida et al., 1998; Amaral et al., 1999; Gonçalves,

1999; Santos et al., 1999; Gonçalves et al., 2001; Romanos, 2001; Miranda et

al., 2002; Romanos et al., 2002a;b; Gonçalves et al., 2005).

Os fatores fundamentais para a escolha da linhagem celular para o

isolamento viral são a susceptibilidade e a velocidade de replicação. Cada

linhagem de células mostra susceptibilidade diferenciada a cada grupo ou

membro de famílias de vírus, como pode ser observado na tabela 1 onde são

exemplificados algumas células utilizadas para o isolamento de vírus. Essa

capacidade para suportar a replicação viral é devida, muitas vezes, à presença

de fatores e de atividade celular que têm sido identificados como sendo

importantes para a replicação de certos vírus como por exemplo a presença de

receptores virais na célula, fatores que facilitam o desnudamento viral, fatores

de transcrição, proteíno-cinases, proteases, enzimas de replicação de DNA e

fatores de tradução (Olivo, 1996).

Tabela 1. Alguns vírus e células de escolha para o seu isolamento.

Vírus Célula

Referência

Enterovírus MA104, GMK Pallansch & Roos, 2001

Rotavírus MA104, Vero Franco & Greenberg,

2001; Superti et al., 1991

Adenovírus HeLa, HEp-2, A549, KB,

MRC-5

McSwiggan et al., 1975;

Ruuskanen, Meurman &

Akusjärvi, 2001; Woods &

Young, 1988

Alfavírus Vero, A549, MRC-5 Tsai, Weaver & Monath,

2001

Vírus herpes simplex Vero, HEp-2, MRC-5, HeLa, WI-38 Ustaçelebi, 2001

Vírus influenza MDCK, HuH7, IMR-32, GBM8401 Hayden & Palese, 2001;

Freymuth et al., 2005;

Chan et al., 2006.

Nota: MA104 (rim de macaco verde africano); GMK (rim de macaco verde

africano); Vero (rim de macaco Cercopitheccus aethiops); HeLa (carcinoma

cervical humano); HEp2 (carcinoma laríngeo humano); A549 (carcinoma de

pulmão humano); KB (carcinoma epidermóide humano); MRC-5 (pulmão de

embrião humano); WI-38 (pulmão de embrião humano); MDCK (rim de

cachorro); HuH7 (hepatocarcinoma humano); IMR-32 (neuroblastoma humano);

GBM8401 (glioblastoma humano).

Atualmente um crescente número de células tem se mostrado eficiente

para o isolamento de uma variedade de vírus podendo estas ser de origem

humana (HEp-2, MRC-5, HuH7, HeLa, A549) ou animal (Vero, GS [peixe

marinho tropical], MMH-D3 [rim de camundongo], MDCK) (Black, Melnick, &

Reissig, 1956; McSwiggan et al., 1975; Lieber et al., 1976; Whitaker &

Hayward, 1985; Reina et al., 1997; Specter et al., 2002; Qin et al., 2006;

Freymuth et al., 2005; Feigelstock, Thompson & Kaplan, 2005).

No que diz respeito à observação da propagação viral em cultura de

células susceptíveis, várias abordagens podem ser realizadas a fim de detectar

a presença de propagação viral nas células inoculadas tais como: observação

do efeito citopático (CPE), formação de corpúsculos de inclusão e

hemadsorção (Condit, 2001).

O CPE se refere a alterações na morfologia em células individuais ou

grupos de células induzidas pela infecção viral, as quais são observadas ao

microscópio óptico (Condit, 2001). Dependendo do vírus e do tipo de cultura de

células, o CPE observado na cultura pode ser caracterizado pelo

arredondamento celular, células refráteis, picnose, vacuolização, granulação,

formação de células gigantes, degeneração granular onde o citoplasma torna-

se refringente, formação de sincícios que resultam da fusão das células,

agregação, perda da aderência, ou lise (White & Fenner, 1994; Landry &

Hsiung, 2000; Condit, 2001; Ustaçelebi, 2001; Specter et al., 2002).

Além disso, no campo da virologia médica, os laboratórios de virologia

conseguiram identificar importantes patógenos virais humanos através do

reconhecimento de vírus que induziam efeitos citopáticos específicos nas

culturas de células. Alguns vírus como o poliovírus e coxsackievírus podem

produzir efeitos citopáticos caracterizados pela total destruição das células que

usualmente ocorrem dentro das primeiras 12-24 horas após inoculação (Landry

& Hsiung, 2000; Rotbart, 2001); outros como os adenovírus, que só se replicam

adequadamente em células de origem epitelial, em geral o efeito citopático

observado consiste em arredondamento, aumento de tamanho e agregação

das células infectadas (Smith et al., 1986; Woods & Young, 1988; Landry &

Hsiung, 2000; Ruuskanen, Meurman & Akusjarvi, 2001).

Muitos vírus, como os herpesvírus, varicella-zoster, vírus do sarampo

que comumente causam infecções em humanos, podem induzir efeitos

citopáticos em uma ampla gama de células que são consideradas susceptíveis

a estes vírus e que geralmente são caracterizados pela presença de células

arredondadas ou multinucleadas que aparecem 2-3 dias após infecção (Landry

& Hsiung, 2000; Ustaçelebi, 2001). Em geral, a presença de vírus sincicial

respiratório pode ser reconhecida pelo desenvolvimento de células gigantes e

sincícios nas culturas inoculadas após 1 semana de incubação (Piedra,

Englund & Glezen, 2001) e outros como os rotavírus são considerados agentes

exigentes, pois requerem condições especiais em termos de cultura. Em geral

o CPE é caracterizado por focos de células redondas e refringentes similares a

velas em chama (Sato et al., 1981; Franco & Greenberg, 2001; Arias et al.,

2002; Rodriguez et al., 2004).

A replicação de certos vírus em cultura de células geralmente produz

pouco ou nenhum tipo de CPE visível. A replicação desses agentes pode ser

detectada por técnicas alternativas como por exemplo a observação de

corpúsculos de inclusão, que são alterações mais discretas na arquitetura

intracelular e são discerníveis ao microscópio óptico. O efeito é altamente

específico para um vírus em particular, de forma que a presença de um tipo

específico de corpúsculo de inclusão pode fornecer o diagnóstico de um tipo

específico de infecção viral, como por exemplo o corpúsculo de Negri induzido

pela replicação do vírus rábico (Condit, 2001).

A hemadsorção, que se refere à capacidade de eritrócitos aderirem a

superfície de células infectadas por certos tipos de vírus, serve para detectar a

replicação de vírus que expressam hemaglutininas, (proteínas que se ligam a

receptores de ácido siálico na superfície de hemácias) como o vírus da

influenza (Condit, 2001)

Outros testes como ensaios de interferência viral; reações sorológicas tal

como imunofluorescência; detecção do ácido nucléico viral, também podem ser

utilizados para a demonstração da propagação viral após inoculação da cultura

(White & Fenner, 1994; Carman, 2001; Specter et al., 2002; Tsai, Weaver &

Monath, 2001; Hayden & Pasele, 2002; Park et al., 2005).

5. Linhagem Celular GRX

No fígado normal, a principal população de células é a dos hepatócitos

ou células do parênquima hepático, que estão organizados em lâminas de

dupla camada, formando os lóbulos hepáticos, separados por pequenos

canais, os sinusóides hepáticos, por onde circula o sangue. Entre os

hepatócitos e a circulação sangüínea existe uma camada de células chamadas

sinusoidais. Entre as células que delineiam o espaço sinusoidal e os

hepatócitos, existe o espaço de Disse. Estas células estão intimamente

associadas com as células endoteliais e com os hepatócitos. São em número

de quatro as populações de células sinusoidais: células endoteliais, células de

Kupffer, células “Pit” e as células estreladas hepáticas (CEH) (Wake, 1980;

Hendriks, Brouwer & Knook, 1990; Fonsenca et al., 2005). (Figura 3).

Figura 3. Esquema mostrando a localização das células estreladas hepáticas;

CE (células endoteliais); CEH (células estreladas hepáticas); CK (células de

Kupffer); CP (células do parênquima), S (sinusóides). (Adaptado de Sato,

Suzuki & Senoo, 2003).

As CEHs, também conhecidas como células de Ito, células intersticiais, células

armazenadoras de Vitamina-A, lipócitos ou lipócitos hepáticos; são residentes

do espaço parasinusoidal (espaço de Disse), sempre separadas do lúmen

sinusoidal pelas células endoteliais e podem ser identificadas pela morfologia

estrelada e pela presença de gotas de gordura características no citoplasma

(Wake, 1980; Kawada, 1997; Sato, Susuki & Senoo, 2003; Senoo, 2004)

Nas condições hepáticas normais, as CEHs possuem baixa atividade

mitótica; possuindo duas funções fisiológicas bem distintas: são o principal

local de armazenamento de vitamina A do organismo (Blomhoff & Wake, 1991;

Fortuna, 1996), e são produtoras de componentes da matriz extracelular

(Hendriks, Brouwer & Knook, 1987; Sato, Susuki & Senoo 2003).

Estas CEHs, quando isoladas de fígado normal de camundogo,

apresentam fenótipo lipocítico, mas ao serem colocadas em cultura

rapidamente diminuem seu conteúdo de lipídios e adquirem um fenótipo

fibroblastóide (Gressner & Schafer, 1989; Sato, Kato & Tyson, 1995). Mantidas

em cultura elas proliferam e produzem quantidades crescentes de

componentes de matriz extracelular (Gressner & Schafer, 1989) como

colágenos do tipo I, III, IV e laminina (Wisse et al., 1996). Já em algumas

situações patológicas, como na fibrose e diminuição dos estoques de vitamina

A em casos de depleção desta vitamina, perdem seu conteúdo lipídico in vivo

(Troen et al., 1994).

Os mecanismos bioquímicos e condições que induzem essas células a

interconversão de fenótipos miofibroblástico para o lipocítico, assim como as

mudanças na síntese e secreção de retinol, lipídios e colágeno são ainda

pouco conhecidos (Margis & Borojevic, 1989; Borojevic et al., 1990; Vicente et

al., 1998; Andrade et al., 2003).

Há cerca de duas décadas, foi estabelecida uma linhagem celular que é

responsável pela fibrogênese em reações fibrosas hepáticas e que tem sido

utilizada como um modelo experimental para o estudo da fisiologia dos lipócitos

hepáticos. Assim a partir de um modelo de reação fibro-granulomatosa no

parênquima do fígado de camundongos C3H/HeN, induzida por ovos de

Schistossoma mansoni, foi isolada a linhagem GR, que posteriormente foi

estabelecida in vitro numa linhagem celular permanente miofibroblástica

denominada GRX, representativa de lipócitos hepáticos (Borojevic et al., 1985).

Esta linhagem GRX é altamente proliferativa, com morfologia

fibroblástica, estrelada, poligonal ou alongada quando cultivada em vidro,

plástico ou colágeno. Após a confluência a proliferação diminui, mas não

cessa, levando a uma organização em “vales e montanhas” (Figura 4).

Apresentam o citoplasma rico em ribossomos, retículo endoplasmático rugoso

com cisternas dilatadas, na região perinuclear é extremamente rica em Golgi,

na região subjacente à membrana plasmática pode ser observada uma

diferenciação citoplasmática, contendo miofibrilas e densificações locais

características de miofibroblastos. Elas secretam colágeno (tipo I, III, IV),

laminina e fibronectina, possuem membrana basal e apresentam extensivos

desmossomos (Borojevic et al., 1985; Margis & Borojevic, 1989).

Nas condições normais de cultura, as células GRX expressam o fenótipo

miofibroblástico com o aspecto morfológico e bioquímico característico das

células do parênquima hepático (Guma et al., 2001; Cardoso et al., 2003).

Quando confluentes, uma fração destas células apresenta conversão

espontânea e acumula gotas de lipídios (Monteiro, Geremias & Borojevic,

1995).

Foram isolados clones com uma capacidade de passar do fenótipo

miofibroblástico (M-GRX) para o lipocítico (L-GRX), quando incubados com

retinol (Margis & Borojevic, 1989; Margis et al., 1992; Fortuna, Trugo &

Borojevic, 2001; Cardoso et al., 2003; Fortuna et al., 2003), com a

indometacina que é capaz de induzir uma completa e rápida conversão

lipocítica em cinco dias, com a insulina que tem um efeito sinergístico no

acúmulo e síntese de lipídios (Guaragna, Trugo & Borojevic, 1991) e com β-

caroteno (Martucci, 2000; Martucci et al., 2004; Albuquerque, 2005). Quando

induzidas ao fenótipo lipocítico, as colônias de GRX se tornam poligonais,

aumentam de tamanho e acumulam gotas de lipídio, que aumentam em

número e tamanho, mas não se fusionam (Margis & Borojevic, 1989; Borojevic

et al., 1990).

Esta linhagem desde seu estabelecimento tem sido considerada um

modelo para o estudo das células estreladas hepáticas por sua origem,

morfologia, padrão de proliferação e capacidade de secreção de componentes

da matriz (Borojevic et al., 1985; Margis & Borojevic, 1989; Borojevic et al.,

1990; Silva, Borojevic, & Mourão, 1992).

Figura 4. Monocamada confluente de células GRX não infectadas, cultivadas

em DMEM com 10%SFB.

II. OBJETIVOS

Considerando que (i) as culturas de células constituem uma ferramenta

usual e fundamental para elaboração de modelos experimentais e como

substratos para a propagação de vírus, entre outras aplicações importantes, (ii)

e que a susceptibilidade da linhagem celular GRX para propagação viral é

desconhecida, temos como principal objetivo:

9 Demonstrar a susceptibilidade da linhagem celular GRX Cl-c para

propagação de diferentes tipos de vírus.

Objetivos secundários:

9 Estabelecer as condições de cultivo dessa linhagem celular, tais como,

tipo de meio de cultura, freqüência de repiques, e tempo de incubação

para a propagação viral;

9 Determinar a capacidade dessa célula produzir partículas virais

infecciosas;

9 Isolar na cultura GRX Cl-c vírus a partir de amostras clínicas.

III. MATERIAL E MÉTODOS

1. Culturas de células

Foi utilizada uma linhagem de célula de camundongo, denominada GRX

CL-c (GRX), produzida e cedida gentilmente pelo Banco de Células do Estado

do Rio de Janeiro (Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ). Também

foram utilizadas culturas de células MA-104, Vero, HEp-2, MDBK e C6/36

pertencentes à coleção de culturas do Laboratório Experimental de Drogas

Antivirais e Citotóxicas (LEDAC) e do Laboratório de Viroses Respiratórias,

Entéricas e Oculares (LAVIREO), do Departamento de Virologia do Instituto de

Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro

(Figura 5).

2. Amostras virais

Neste estudo foram utilizadas amostras de vírus padrão, provenientes da

coleção de vírus do LEDAC; do Laboratório de Virologia Molecular II (LVM II); e

do LAVIREO apresentados na tabela 2.

Figura 5. Morfologia das monocamadas de culturas de células utilizadas nesse

estudo (100x).

Tabela 2. Lista de vírus utilizados neste estudo.

Vírus

Cultura de células

de origem

Laboratório de

origem

Vírus RNA

Rotavírus humano amostra HCR3 MA104 LAVIREO

Rotavírus símio amostra SA11 MA104 LAVIREO

Rotavírus símio amostra RRV MA104 LAVIREO

Vírus Dengue tipo 1 (DEN-1) C6/36 LEDAC

Vírus Dengue tipo 2 (DEN-2) C6/36 LEDAC

Vírus dengue tipo 3 (DEN-3) C6/36 LEDAC

Vírus Mayaro (MAY) Vero LVM II

Vírus Sindbis (SIN) Vero LEDAC

Vírus da Encefalite Eqüina do Oeste (WEE) Vero LEDAC

Metapneumovírus humano (hMPV) Vero LAVIREO

Vírus da Estomatite Vesicular (VSV) MDBK LEDAC

Vírus DNA

Vírus Herpes Simplex tipo 1 resistente

ao aciclovir (HSV-1 ACVr)

Vero LEDAC

Vírus Herpes Simplex tipo 2 resistente

ao aciclovir (HSV-2 ACVr)

Vero LEDAC

Adenovírus sorotipo 2 (Adv2) (respiratório) HEp-2 LAVIREO

Adenovirus sorotipo 19 (Adv19) (ocular) HEp-2 LAVIREO

Adenovírus sorotipo 40 (Adv40) (entérico) HEp-2 LAVIREO

2.1. Ativação das cepas de rotavírus para inoculação

Para a ativação das cepas de rotavírus (SA-11, RRV e HCR3), foi

necessária a adição de tripsina (Difco:1:1500) à suspensão viral para uma

concentração final de 10 µg/mL, seguida de incubação a 37

C por 30 minutos

com a finalidade de clivar as espículas virais, o que possibilitará a adsorção

das partículas virais às células.

3. Expansão e manutenção da cultura de células

Inicialmente as culturas de células GRX foram repicadas e mantidas em

três diferentes meios de cultura acrescidos de 10% soro fetal bovino (SFB),

para verificação do melhor sistema para essas culturas: Meio Mínimo Essencial

de Eagle (MEM); Meio Mínimo Essencial de Eagle em salina de Dulbecco (D-

MEM) e Meio 199 (Life Technologies, Rockville, MD). Posteriormente, essas

células, assim como as demais culturas utilizadas no estudo, foram mantidas

em MEM acrescido de 10% SFB. Exceto para a cultura C

que foi mantido

em meio L15.

As linhagens de células utilizadas neste estudo foram cultivadas em

garrafas plásticas de 25 cm

(Corning, New York, EUA) ou garrafas de vidro do

tipo xarope, e repicadas segundo a necessidade. Para isso o meio de cultura

das garrafas de células foi descartado e o tapete celular lavado com 5 mL de

meio de cultura. Em seguida, foram adicionados, aproximadamente, 5 mL de

tripsina por garrafa. As culturas foram mantidas em temperatura ambiente e as

monocamadas monitoradas ao microscópio óptico invertido até o início do

desprendimento das células, observado pelo arredondamento das células do

tapete celular. A solução de tripsina foi, então, desprezada e as garrafas de

células foram agitadas até o total desprendimento das células da monocamada.

As células foram suspensas em MEM ou L15, acrescido de gentamicina

(concentração final de 50 µg/mL), solução de bicarbonato de sódio a 0,25%,

fungizona (2,5µg/ mL), glutamina (30 µg/mL) e HEPES 10 mM e suplementado

com 10% de SFB. Depois disso foram distribuídos 5 mL da suspensão de

células por garrafa de 25 cm

ou 10 mL por garrafa xarope. Para os estudos de

avaliação da susceptibilidade das células GRX para propagação viral, 0,5

mL/poço da suspensão celular foram distribuídos em placas de plástico

contendo 48 poços. Para a titulação viral, 0,1 mL/poço de suspensão celular

foram distribuídos em placas contendo 96 poços. As suspensões foram

homogeneizadas suavemente e incubadas em estufa a 37

C em presença de 5

% de CO

4. Avaliação da susceptibilidade de células GRX para propagação viral

Para os experimentos de susceptibilidade foram utilizadas placas de 48

cavidades contendo monocamadas de células GRX com 80-90% de

confluência, aproximadamente 4,2 x 10

células/mL, inoculadas de acordo com

o diagrama em anexo (Figura 6). Antes da inoculação, o meio de crescimento

foi desprezado, as monocamadas de células lavadas. Para a propagação dos

vírus SA-11, RRV e HCR3, foi adicionado tripsina ao meio de manutenção da

cultura para uma concentração final de 5 µg/mL antes da inoculação viral e

para o hMPV a concentração final foi de 1 µg/mL. Para os demais vírus, o meio

de crescimento foi substituído pelo meio de manutenção sem tripsina. As

monocamadas foram inoculadas com 0,1 mL da suspensão viral e incubadas

durante uma hora a 37

C para permitir a adsorção dos vírus. Após esse

período, o inóculo foi removido cuidadosamente por aspiração, a monocamada

celular lavada para a remoção das partículas virais não adsorvidas e

acrescidas de 0,5 mL de meio de manutenção. As culturas foram incubadas a

C em ambiente de CO

sendo observadas diariamente em microscópio

óptico invertido. Simultaneamente, foram preparadas placas semelhantes

contendo monocamadas de células HEp2, MA-104, C6/36, MDBK ou Vero, e

processadas da mesma forma para inoculação de vírus com o objetivo de

comparar os resultados.

Figura 6. Exemplo do diagrama da placa de 48 cavidades para experimentos

de susceptibilidade da propagação viral em células GRX.

SA11

1 2 4 5 6 3 7 8

RRV

HCR3

RRV

HCR3 RRV

HCR3

RRV

HCR3

RRV

5. Avaliação da susceptibilidade da linhagem GRX para isolamento

primário de vírus herpes simplex

Uma amostra de secreção de vesícula labial, suspeita de infecção por

vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) foi inoculada simultaneamente em culturas

de células GRX e Vero para o isolamento viral. Para tal, 0,5 mL da suspensão

preparada em solução salina de Gey ABC e descontaminada com uma solução

de gentamicina/fungizona para uma concentração final de gentamicina 100

µg/mL e fungizona 20 µg/mL, foram inoculados em garrafas de 25 cm

contendo monocamadas de células previamente lavadas com meio sem SFB.

As garrafas foram mantidas na estufa a 37

C por 1 hora para permitir a

adsorção dos vírus às células. Em seguida, foi adicionado 5 mL do meio de

manutenção e incubadas a 37

C em ambiente de 5% de CO

. As culturas

foram observadas diariamente até a verificação do efeito citopatogênico (CPE).

Ao final deste período, as garrafas foram congeladas e descongeladas duas

vezes. Foram feitas alíquotas do sobrenadante das culturas que foram

congeladas a -80

C para análises posteriores.

6. Métodos empregados para avaliar a propagação viral em culturas de

células GRX

6.1. Visualização de CPE: para verificação da presença de CPE, as culturas

infectadas foram observadas diariamente em microscópio óptico invertido e

comparadas com culturas não infectadas. Para as culturas que apresentaram

CPE característico de cada vírus, o sobrenadante foi recolhido, aliquotado e

congelado a -80

C até a sua utilização em experimentos subseqüentes. As

culturas que não apresentaram CPE foram observadas por um período máximo

de sete dias. Após esse período os sobrenadantes foram recolhidos,

aliquotados e congelados para serem utilizados em passagens subseqüentes,

na tentativa de observação de CPE. Neste caso, estipulou-se realizar até três

passagens seriadas na tentativa de observação do CPE.

6.2. Determinação do título viral nas culturas de células

Uma vez demonstrada, na triagem inicial, a capacidade das células GRX

de propagar um determinado tipo de vírus, os sobrenadantes das diversas

passagens foram submetidos à titulação.

Os sobrenadantes das culturas de células HEp-2, MA-104, Vero, C6/36,

MDBK infectadas em paralelo com a avaliação da susceptibilidade da GRX,

também foram titulados e os títulos foram comparados àqueles obtidos na

GRX.

A titulação viral foi realizada para se estabelecer a TCID

/mL (dose

infecciosa que produz CPE em 50% das culturas inoculadas), de acordo com o

cálculo estabelecido por Reed & Muench (1938).

Foram realizadas diluições logarítmicas decimais (10

-1

até 10

-7

) dos

vírus, utilizando-se o meio de manutenção celular como diluente. Cada diluição

foi inoculada em monocamadas de células confluentes (microplaca com 96

poços), após a substituição do meio de crescimento pelo de manutenção. As

células inoculadas foram incubadas a 37

C em ambiente contendo 5% de CO

6.3. Demonstração da propagação de HSV e identificação do tipo viral em

culturas de GRX e Vero a partir da amostra clínica através da detecção do

ácido nucléico viral

6.3.1. Extração de ácido nucléico viral a partir do sobrenadante de cultura

de células inoculadas e diretamente da amostra clínica

Uma alíquota de 200 µL dos sobrenadantes das culturas células GRX e

Vero inoculadas com amostra clínica com suspeita de HSV, e 200 µL da

amostra clínica em Gey ABC, foram submetidos à extração do DNA viral

usando o Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI) de

acordo com as especificações do fabricante. As alíquotas de sobrenadante de

cultura foram transferidas para tubos eppendorfs de 1,5 mL contendo 0,2 mL

da solução de lise nuclear e 2 µL da solução RNAse. Os tubos foram, então,

misturados por inversão e incubados por 15-30 min em banho-maria 37°C.

Após a incubação os tubos foram deixados à temperatura ambiente por 5 min

para esfriarem e em seguida adicionados 130 µL da solução de precipitação de

proteínas. A seguir, os tubos foram agitados em vortex e incubados em gelo

por 5 min. As amostras foram centrifugadas a 12000 x g, por 4 min, e o

sobrenadante transferido para outro tubo contendo 600 µL de isopropanol. Os

tubos foram misturados por inversão e deixados à temperatura ambiente por

30 min. Decorrido esse período os tubos foram centrifugados a 12000 x g por 1

min e o sobrenadante descartado. Depois, foram adicionados 600 µL de etanol

70% e os tubos novamente centrifugados a 12000 x g por 1 min. Os

sobrenadantes foram novamente descartados e os tubos deixados abertos à

temperatura ambiente até que o precipitado estivesse seco. O sedimento foi

suspenso em 40 µL da solução de reidratação de DNA, incubado a 65°C por 1h

e os tubos estocados a -20°C até o momento do uso.

6.3.2. Detecção de Vírus Herpes Simplex através de reação em cadeia da

polimerase (PCR)

Para detecção de HSV a partir do sobrenadante das culturas de células

GRX e Vero, e da amostra original, foi utilizado o protocolo descrito por Tafreshi

e colaboradores (Tafreshi et al., 2005), que utiliza oligonucleotídeos capazes

de amplificar uma região conservada da DNA polimerase dos vírus herpes

simplex tipos 1 e 2, Epstein-Barr e citomegalovírus. No caso dos HSV-1 e 2, a

amplificação por esses oligonucleotídeos gera um fragmento de 742pb. Para tal

5 µL do DNA viral extraído foram misturados a 20 µL da Master mix com

Enzima (MME) contendo 14,6 µL de água destilada, 0,5 µL de mistura de

deoxinucleotídeos trifosfato (contendo soluções 1,25 mM de dATP, dGTP,

dCTP, dTTP cada; concentração final 0,2 mM), 2,5 µL de tampão de enzima

10x concentrado (contendo Tris-HCl 100mM, pH 9,0, KCl 500mM, e 1% de

Triton X-100), 1,5 µL da solução de MgCl

25 mM (concentração final 1,5 mM),

0,7 µL da solução de oligonucleotídeos HHV-F1/HHV-R1 (20 µM de cada;

concentração final 0,5 µM) e 0,2 U da enzima Taq polimerase. A mistura foi

então submetida a um ciclo de incubação inicial de 94˚C por 3 minutos

seguidos de uma série de 35 ciclos de PCR (94˚C/45 seg; 65˚C/1 min; 72˚C/1

min) e de uma incubação final de 72˚C/7 min. As amplificações aconteceram

em termociclador GeneAmp PCR System modelo 2400 (Applied Biosystems,

Foster City, CA), em tubos de 0,2 mL. Alíquotas de 10 µL do produto da PCR

foram aplicadas em gel de agarose 1,2% em tampão TBE (Tris bas 0,089M,

ácido bórico 0,089M e EDTA 0,002M) 0,5x acrescido de 5 µg/mL de brometo

de etídio. Posteriormente, foi realizada eletroforese em tampão TBE 0,5x a

120V por 1 hora. Foi utilizado o padrão de tamanho molecular 100pb ladder

(Fermentas, Hanover, MD). Após a eletroforese, o gel foi observado para

visualização das bandas através da transiluminação com luz ultravioleta e

fotografado com máquina Polaroid.

Posteriormente, 5 µL do produto amplificado na PCR foram misturados a

20 µL da MME descrita acima, mudando apenas os oligonucleotídeos. Nessa

segunda amplificação (nested-PCR), foram utilizados os oligonucleotídeos

HHV-F2 / HHV-R2 (Tafreshi et al., 2005), que amplificam um fragmento de

493pb dos HSV-1 e 2. A mistura foi então submetida a um ciclo de incubação

inicial de 94˚C por 3 minutos seguidos de uma série de 35 ciclos de PCR

(94˚C/45 seg; 63˚C/1 min; 72˚C/1 min) e de uma incubação final de 72˚C/7 min.

Alíquotas de 10 µL do produto da PCR foram aplicadas em gel de agarose

1,2% em tampão TBE como descrito acima.

6.3.3. Identificação do tipo de Vírus Herpes Simplex através de reação em

cadeia da polimerase (PCR)

Para a identificação do vírus herpes simplex foi utilizado o par de

oligonucleotídeos H

e H

que amplificam uma região repetitiva do

genoma dos HSV-1, gerando um fragmento de 147pb (Markoulatos et al.,

2001). Para a amplificação de vírus herpes simplex do tipo 2 foram utilizados os

oligonucleotídeos H

e H

que amplificam a região codificadora para a

DNA polimerase e geram um fragmento de 227pb (Markoulatos et al., 2001).

Em tubos de 0,2 mL, foram misturados 5 µL do DNA total e 20 µL da MME

contendo 14,5 µL de água destilada, 0,5 µL de mistura de deoxinucleotídeos

trifosfato (contendo soluções 1,25 mM de dATP, dGTP, dCTP, dTTP cada;

concentração final 0,2 mM), 2,5 µL de tampão de enzima 10x concentrado

(contendo Tris-HCl 100mM, pH 9,0, KCl 500mM, e 1% de Triton X-100), 1,5 µL

da solução de MgCl

25 mM (concentração final 1,5 mM), 1 µL da solução de

oligonucleotídeos HHV-F1/HHV-R1 (20 µM de cada; concentração final 0,5 µM)

e 0,2 U da enzima Taq polimerase. A mistura foi então submetida a um ciclo de

incubação a 94

C por 3 min seguido de uma série de 40 ciclos (94

C/30 seg;

C/40 seg; 72

C/50 seg) seguido de uma incubação final de 78

C/ 15 min.

Finalmente, alíquotas de 10 µL do produto da PCR foram analisadas em gel de

agarose 1,2% em tampão TBE, como descrito anteriormente.

IV. RESULTADOS

1. Estabelecimento das condições de cultivo das culturas de células GRX:

as culturas de GRX foram originalmente fornecidas pelo Banco de Células em

D-MEM, suplementado com 10% SFB. Foram realizadas, pelo menos 5

passagens das culturas de células GRX com diferentes tipos de meio de

culturas (MEM, D-MEM e 199) e após comparação concluímos que a

velocidade de multiplicação das células, observadas pelo tempo de formação

da monocamada, era maior quando as culturas foram mantidas em MEM. Da

mesma forma, a aparência do tapete celular, visualizado ao microscópio óptico

invertido, era mais “saudável” quando as células foram cultivadas em MEM. Por

outro lado, quando cultivadas em meio 199 as células apresentavam um

crescimento mais lento e uma aparência “sofrida”. Desta forma, concluímos que

dentre os substratos usados o MEM é o melhor meio para o crescimento e

manutenção das culturas de células GRX, nas condições testadas.

Com relação à freqüência de repiques, nós estabelecemos que as

culturas devem ser repicadas a cada 48-72h, na proporção 1:2, quando o meio

de cultura utilizado é MEM suplementado com 10% SFB e são mantidas a 37ºC

em ambiente de 5% CO

. Caso as culturas sejam mantidas em D-MEM ou

meio 199, os repiques devem ser realizados a cada 72-96h, 1:2.

2. Susceptibilidade da linhagem GRX para a propagação viral

2.1. Vírus de RNA: a linhagem GRX foi susceptível à infecção pelos vírus

MAY, SIN, WEE, VSV e hMPV; em contraste aos Rotavírus (amostra SA11,

RRV e HCR3) e dos Vírus da Dengue (tipos 1, 2 e 3) os quais não induziram

CPE visível nessa cultura (Tabela 3).

Após 24 horas de inoculação dos vírus MAY, SIN e WEE em culturas de

GRX, foi observado o CPE caracterizado inicialmente pela formação de focos

de picnose celular, seguido de lise e posterior desprendimento da

monocamada de células (Figura 7). Já quando a culturas foram inoculas com

VSV a presença do CPE, semelhante ao descrito acima, foi observado 48h

após inoculadas. Nas culturas de célula Vero (MAY, SIN e WEE) ou MDBK

(VSV) o tempo para surgimento do CPE, bem como as caraterísticas deste, são

semelhantes ao observado em GRX.

Com relação ao hMPV, o CPE foi observado após 5 dias de inoculação

e se caracterizou por arredondamento celular e desprendimento da

monocamada. Nas células Vero o CPE apresentado por esse vírus é a picnose

e desprendimento da monocamada e pode ser observado em torno do 12

dia

pós-infecção.

Tabela 3: Resultados da propagação de vírus RNA na linhagem GRX em

diferentes passagens.

Não Testado

CPE

Vírus RNA

# 1 # 2 # 3

Rotavírus símio amostra SA11 - -

Rotavírus símio amostra RRV - - -

Rotavírus humano amostra HCR3 - NT

Vírus da dengue tipo 1(DEN-1) - - NT

Vírus da dengue tipo 2(DEN-2) - - NT

Vírus da dengue tipo 3(DEN-3) - - NT

Metapneumovírus humano (hMPV) + NT NT

Vírus Mayaro (MAY) + + +

Vírus Sindbis (SIN) + + +

Vírus da Encefalite Eqüina do Oeste (WEE) + + +

Vírus da Estomatite Vesicular (VSV) + + NT

Figura 7. Propagação de vírus na linhagem GRX. A: cultura de células GRX

não inoculadas; B: cultura de células GRX inoculadas com vírus Mayaro 24h

pós-infecção (100x).

2.2. Vírus de DNA: a linhagem GRX não se mostrou susceptível para a

propagação dos adenovírus (sorotipo 2, 19 e 40). Por outro lado, ambos os

tipos de HSV inoculados na GRX induziram o arredondamento inicial das

células seguidas pela formação de sincícios, sendo muito semelhantes ao

observado nas células tradicionalmente utilizadas para seu isolamento (Vero).

Verificou-se que as células apresentaram CPE nas primeiras 24 horas, após a

inoculação com cepas de HSV-1-ACVr e as células inoculadas com HSV-2-

ACVr apresentou um CPE após as primeiras 48 horas, semelhante ao

observado nas culturas de células Vero (Tabela 4, Figura 8)

Tabela 4: Propagação de vírus DNA na linhagem GRX.

CPE

Vírus DNA

# 1 # 2 # 3

HSV-1 ACVr + + +

HSV-2 ACVr + + +

Adv 2 - - NT

Adv 19 - - NT

Adv 40 - - NT

Não Testado

Figura 8. Propagação de vírus na linhagem GRX. A: cultura de células GRX

não inoculadas; B: cultura de células GRX inoculadas com HSV-1-ACVr 24h

pós-infecção (100x).

3. Isolamento primário de HSV-1 em GRX: uma amostra clínica, coletada de

paciente que apresentava lesão labial sugestivas de infecção pelo HSV foi

inoculada nas linhagens celulares Vero e GRX. Verificou-se a presença de

CPE característico de HSV nas primeiras 24 horas após a primeira inoculação

em ambas as células. Através de PCR e nested-PCR a amostra viral isolada

tanto nas culturas quanto na amostra original foi identificada como HSV-1

(Figura 9).

Figura 9. Detecção e identificação de HSV-1 a partir de uma amostra clínica

inoculada em GRX.

742pb

500pb 493pb

A: gel de agarose demonstrando produtos amplificados por PCR para a

pesquisa de HSV; B: produtos da amplificação por nested-PCR das mesmas

amostras. M – marcador de tamanho molecular 100pb (Fermentas); linhas 1 e

2 controles positivos de HSV-1 e HSV-2, respectivamente; sobrenadantes de

cultura de células Vero (linha 3) e GRX (linha 5) inoculada com líquido de

vesicula labial positivo para HSV-1; linha 4 – HSV-1 amplificado diretamente a

partir do meio de transporte (MTV).

C: produtos da amplificação por PCR para identificação de HSV. M –

marcador de tamanho molecular 100pb (Fermentas); Linha 1: sobrenadante

de cultura de células Vero; Linha 3: sobrenadante de cultura de células

GRX inoculada com líquido de vesícula labial positivo para HSV-1; linha 5:

HSV-1 amplificado diretamente a partir do meio de transporte (MTV). linhas

8 e 10 controles positivos de HSV-1 e HSV-2, respectivamente; Linhas 2, 4,

6, 7, 9 e 11 branco

4. Determinação do título viral nas culturas de células: foram determinados

os títulos das preparações virais obtidas nas diferentes culturas de células

utilizadas no estudo. No caso das culturas de GRX foi realizada a titulação das

diferentes passagens dos vírus que apresentaram CPE visível. Foi observado

um aumento do título viral com o aumento das passagens, exceto para o HSV-

1 onde foi observada uma redução do título entre a primeira e segunda

passagem. Os sobrenadantes obtidos após inoculação com o VSV e o hMPV

serão titulados futuramente (Tabela 5).

Tabela 5. Títulos virais obtidos a partir dos sobrenadantes das culturas de

células infectadas.

Linhagem GRX Cl-c

Número de passagens

Vírus

Título na

célula de

origem *

# 1 # 2 # 3

HSV-1 ACVr 5,50 3,40

2,50

HSV-2 ACVr 5,12 2,50

3,50 NT

SIN 6,00 4,85 5,00 NT

MAY 6,25 4,15 4,84 5,00

WEE 6,31 2,50 5,40 NT

VSV NT NT

NT NT

hMPV NT NT

Os títulos estão expressos em log

TCID

/25µL;

NT: não titulado.

* Vide tabela 2.

V. DISCUSSÃO

Nos últimos anos, o desenvolvimento dos métodos rápidos de

diagnóstico virológico tem contribuído para o avanço na detecção de novos

vírus; não obstante, o isolamento viral ainda mantém-se como a técnica

“padrão-ouro” com o qual os novos métodos devem ser comparados. Por tal

motivo, laboratórios que são equipados para a realização de testes rápidos,

algumas vezes precisam recorrer à inoculação em culturas de células (Carman,

2001; Kottaridi et al., 2006; Chang et al., 2006)

Apesar de já terem sido descritas diversas linhagens celulares para

isolamento viral, ainda existe um número significativo de vírus para os quais

não existem hospedeiros laboratoriais disponíveis. Assim, o estabelecimento

da susceptibilidade de uma nova linhagem celular para propagação viral cria

uma alternativa de cultura para esses agentes. A busca por essas novas

alternativas tem sido intensificada nos últimos anos, principalmente devido ao

surgimento de novos vírus, como é o caso do metapneumovírus humano

(hMPV) e dos novos coronavírus humanos (SARS-CoV, HCoV-NL63, HCoV-

HKU1) (van der Hoogen et al., 2001; Ksiazek et al., 2003; Rota et al., 2003; van

der Hoek et al., 2004; Fouchier et al., 2004; Woo et al., 2005); ou da

necessidade do isolamento viral para realização de estudos bioquímicos e

moleculares, como por exemplo os norovírus e os vírus das hepatites B e C

(Duizer et al., 2004; Guha et al., 2004; Katayama et al., 2006; Durantel &

Zoulim, 2007). Conseqüentemente, um número significativo de estudos vem

sendo publicado, avaliando a susceptibilidade de várias linhagens celulares

para um determinado vírus ou família de vírus (Chonmaitree et al., 1988;

Superti et al., 1991; Reina et al., 1997; Kok, Pryor & Payne, 1998; Blight,

Kolykhalov & Rice, 2000; Weingartl et al., 2002; Freymuth et al., 2005; Chan et

al., 2006; El-Awady, et al., 2006; Kanda et al., 2006; Spilki et al., 2006; Hirai et

al., 2006; Ingram et al., 2006; Qin et al., 2006).

Embora a linhagem celular GRX tenha sido estabelecida em cultura há

cerca de 20 anos (Borojevic et al., 1985), esta ainda não havia sido analisada

quanto à sua susceptibilidade para isolamento viral. Por esse motivo, foi

realizado o presente trabalho onde, pela primeira vez, foi demonstrada a

capacidade dessa linhagem celular de propagar uma variedade de vírus, se

constituindo assim, numa nova ferramenta para os laboratórios de virologia.

Em trabalhos anteriores as células da linhagem GRX, foram mantidas

em cultura em D-MEM suplementado com 10% de SFB (Borojevic et al.,1985;

Martucci, 2000; Albuquerque, 2005). Entrentanto, nossos experimentos

demonstraram que o MEM é um substrato mais apropriado para a manutenção

dessas células em cultura.

A análise da susceptibilidade celular ao isolamento viral pode ser

realizada por diversas metodologias desde a observação do CPE seguido da

titulação viral, até a demonstração da propagação viral por reação de

hemaglutinação, reação de imunofluorescência e detecção do genoma viral

(MacFarlane & Sommerville, 1969; Rhim et al., 1969; Weingartl et al., 2002;

Chan et al., 2003; Freymuth et al., 2005; Chan et al., 2006; Chang et al., 2006;

Hirai et al., 2006; Ingram et al., 2006; Kanda et al., 2006; Spilki et al., 2006; Qin

et al., 2006). Neste estudo, foi utilizada apenas a observação do CPE seguido

da titulação viral como determinante da propagação viral em células GRX isto

porque, os vírus analisados já haviam sido propagados em outras culturas

celulares com apresentação de CPE e, portanto, não seria vantajosa a

utilização de uma nova cultura que requeresse metodologias alternativas para

demonstração da produção de vírus.

Os alfavírus, tais como WEE, MAY e SIN possuem uma variedade de

hospedeiros na natureza, replicando em mamíferos, aves, artrópodes e

anfíbios, e são capazes de infectar uma ampla variedade de culturas de células

(Ajello, 1979; Pant, Sudeep & Athawale, 1992; Strauss & Strauss, 1994;

Klimstra, Ryman & Johnston, 1998; Ferreira et al., 2000; Bello et al., 2001;

Weingartl et al., 2002). Nesse estudo, foi possível observar a replicação desses

vírus em culturas de células GRX a partir da primeira inoculação. Foram

obtidos títulos virais elevados, tendo sido observado um aumento progressivo

dos títulos nas diferentes passagens seriadas em GRX, demonstrando a

produção de partículas infecciosas sendo este um substrato tão eficiente para a

propagação viral quanto às culturas de células Vero regularmente usadas para

esses agentes.

Com relação ao VSV, este também pode ser propagado em uma

variedade de sistemas celulares, como por exemplo, células MDBK

(Landsberger & Compans, 1976) , 3D4 (linhagem de células monomielóides de

porcino) (Weingartl et al., 2002), NIVI-AK-453 (células de Aedes krombeini)

(Pant, Sudeep & Athwale, 1992) e PC-0199-BR (células de Psorophora

confinnis) (Bello et al., 2001). Nesse estudo o VSV induziu a formação de CPE

em culturas de células GRX nas duas passagens realizadas. Desta forma,

essas culturas oferecem uma nova alternativa de substrato para o isolamento

desse vírus.

Um resultado importante nesse trabalho foi o isolamento de hMPV em

células GRX. O hMPV foi descrito como patógeno humano em 2000, contudo

esse não é um patógeno recente, já tendo sido isolado de aspirados de

nasofaringe que estavam estocados desde 1958 (van den Hoogen et al., 2001).

Especula-se que as razões porque esse vírus foi isolado somente

recentemente seriam (i) a replicação viral pobre em culturas de células usadas

tradicionalmente para o diagnóstico de vírus respiratórios como HEK (rim de

embrião humano), HEp-2 e MDBK e (ii) o fato do isolamento primário ser

facilitado pela presença de baixa concentração de tripsina o que

freqüentemente não é usado rotineiramente em diagnóstico virológico. O

metapneumovírus humano pode ser propagado em cultura de células LLC-MK2

(rim de macaco Rhesus) e algumas linhagens da célula Vero (Deffrasnes, Côté

& Boivin, 2005). A propagação é lenta nessas culturas de células e

freqüentemente requer cerca de duas semanas ou mais para o surgimento do

CPE (Deffrasnes, Côté & Boivin, 2005). O CPE em células LLC-MK2 se

caracteriza por focos de células arredondadas e refringentes com subseqüente

desprendimento da monocamada e grupos de pequenos sincícios (Deffrasnes,

Côté & Boivin, 2005). Em contraste, o CPE em células Vero é indistinguível de

outros vírus, como por exemplo enterovírus, e consiste de células redondas e

mortas. O CPE aparece mais rapidamente em células LLC-MK2 do que em

células Vero (Deffrasnes, Côté & Boivin, 2005).

Devido à importância desse vírus como patógeno humano, e a pouca

disponibilidade de sistemas celulares eficientes para a sua propagação,

diversos estudos têm sido realizados na tentativa de estabelecer um sistema

rápido e eficiente (van den Hoogen et al., 2001; Boivin et al., 2002; Deffrasnes,

Côté & Boivin, 2005; Ingram et al., 2006; Tan et al., 2007). Nesse estudo, foi

utilizada uma amostra de hMPV adaptada a cultura de células Vero a qual foi

propagada em GRX em meio acrescido de tripsina numa concentração de 1

µg/mL. Após cinco dias de incubação foi observado o CPE que consistiu de

focos de células arredondadas e refringentes com subseqüente

desprendimento da monocamada. O CPE observado é semelhante ao descrito

para as células LLC-MK2, contudo o tempo para observação deste é menor.

Embora tenha sido feita apenas uma passagem, nossos resultados

preliminares nos permitem sugerir, que a GRX pode ser uma alternativa

interessante para a propagação desse vírus.

O isolamento viral em culturas de células tem sido considerado um dos

métodos mais sensíveis e específicos para detecção dos HSV (Moore, 1984).

Diferentes tipos de células têm sido empregados para o isolamento dos HSV, a

partir de amostras clínicas com o aparecimento de efeitos citopatogênicos

típicos nas culturas de células em 2-3 dias. As células diplóides de origem

humana como WI-38 e MRC-5 e as células da linhagem contínua Vero, HEp-2

e A549, vêm sendo frequentemente utilizadas, para o isolamento a partir de

amostras clínicas (McSwiggan et al., 1975; Smith et al., 1986; Woods & Young,

1988; Landry & Hsiung, 2000; Ustaçelebi, 2001; Varella et al., 2005). Já a

diferenciação dos tipos de HSV pode ser feita por testes convencionais como

teste de neutralização ou com o auxilio de técnicas moleculares. Na análise

feita por Aldea e colaboradores (2002), através de experimentos empregando

culturas de células para o isolamento de HSV, comparados a detecção do DNA

viral através de PCR em tempo real, os autores ressaltaram a utilidade do

método molecular em situações que exigem rapidez no diagnóstico, porém o

método tradicional de isolamento viral em cultura de células não deixou de ser

eficiente (Aldea et al., 2002). Em nosso estudo, os HSV-1 e 2 induziram CPE

em 24h pós-infecção em células GRX em todas as passagens. Embora os

títulos obtidos tenham sido mais baixos do que aqueles observados em cultura

de células Vero, os resultados demonstram que a GRX poder ser utilizada

como sistema para progação desses vírus.

Durante os nossos experimentos tivemos a oportunidade fazer o

isolamento primário de uma amostra clínica proveniente de uma lesão labial

sugestiva de infecção herpética na linhagem celular GRX. Esta amostra clínica

foi inoculada na GRX e em células Vero e em ambas linhagens apresentaram

CPE característico. Quanto ao aparecimento de CPE típico em GRX este se

caracterizou pela observação de focos de células grandes, muitas delas

multinucleadas e que apareceram num período entre 24 horas após

inoculação. Após isolamento, os sobrenadantes de ambas as células além do

material clínico colhido em salina de Gey ABC foram submetidos a técnicas

moleculares onde foi confirmada a detecção de HSV-1. Nossos resultados

sugerem que a linhagem celular GRX é suscetível à infecção pelos HSV,

podendo ser empregados para o isolamento primário desses vírus.

VI. CONCLUSÕES

9 Os experimentos demonstraram que o meio Mínimo Essencial de Eagle

(MEM) foi o melhor substrato para o crescimento e manutenção das culturas

de células GRX, nas condições utilizadas.

9 Essas culturas devem ser repicadas a cada 48h (1:2), quando o meio de

cultura utilizado é o MEM suplementado com 10% SFB a 37ºC em ambiente

de 5% CO

9 Até o momento, a linhagem GRX se mostrou susceptível à propagação dos

vírus observado pela presença de CPE: HSV-1, HSV-2, SIN, MAY, WEE,

VSV e hMPV.

9 A replicação das cepas virais inoculadas foi detectada pela presença do

CPE característico de cada vírus, semelhante àqueles observados nas

células tradicionalmente empregadas.

9 Essa linhagem celular pode ser utilizada como um novo sistema para o

isolamento primário de HSV-1, assim como para a propagação de vírus

emergentes tais como hMPV para o qual existem poucas culturas de células

disponíveis.

VII. PERSPECTIVAS FUTURAS

9 Determinação da eficiência de propagação viral em cultura de células

GRX comparando com as culturas de células tradicionalmente utilizadas

para a propagação dos vírus que apresentaram CPE em GRX, através

da quantificação das partículas virais infecciosas produzidas nas culturas

infectadas com diferentes multiplicidades de infecção.

9 Avaliação da susceptibilidade das células GRX para outros tipos de

vírus, tais como, vírus das hepatites A, B e C e vírus da febre amarela.

9 Isolamento primário de diferentes tipos de vírus a partir de material

clínico.

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