ads:
Vanessa Marques Alvarez
BIOPROSPECÇÃO DA POPULAÇÃO BACTERIANA
HALOTOLERANTE E BIODEGRADADORA DE ÓLEO
PRESENTE EM SOLO IMPACTADO NA REGIÃO DE
PANELAS, SE
INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA PROF. PAULO DE GÓES
UNIVERSIDADE DE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
RIO DE JANEIRO
2007
Tese apresentada ao Instituto de
Microbiologia Prof. Paulo de Góes,
como requisito para a obtenção do grau
de Mestre em Microbiologia
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
2
FICHA CATALOGRÁFICA
_________________________________________________________________________
ALVAREZ, Vanessa Marques
Bioprospecção da população bacteriana halotolerante e biodegradadora
de óleo presente em solo impactado na região de Panelas, SE
Rio de Janeiro, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes/ UFRJ,
2007.
96 fls
Dissertação: Mestre em Ciências Biológicas (Microbiologia)
1. Biodegradação
2. Bactérias Halotolerantes
3. Diversidade
I. Universidade Federal do Rio de Janeiro – Tese
II. Título
_______________________________________________________________
ads:
3
Tese realizada no Laboratório de
Genética Microbiana, Departamento de
Microbiologia Geral, Instituto de
Microbiologia Prof. Paulo de Góes, da
Universidade Federal do Rio de Janeiro sob
a orientação da Profa. Lucy Seldin.
4
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer a todos que contribuíram para a realização do
meu trabalho de alguma forma.
A Deus por ter me dado o maior presente de todos: a vida.
À minha orientadora, Dra. Lucy Seldin, pela amizade, dedicação e pelo grande
exemplo como pesquisadora e professora. Muito obrigada pelo incentivo,
pelas oportunidades e pelo carinho!
Aos meus pais, Luiz Felippe e Maria Alice, por serem pessoas tão especiais!
Por me amarem muito e incondicionalmente! Sem a força que vocês me
transmitem a cada dia seria impossível realizar mais esta conquista.
Obrigada mesmo por vocês me ajudarem a superar obstáculos e por
acreditarem em mim SEMPRE! Amo vocês!
Ao meu namorado, Rafael, pelo companheirismo, cumplicidade e
compreensão. Obrigada por sempre me motivar nos momentos difíceis e
comemorar as minhas conquistas como se fossem as suas vitórias! O seu
apoio foi fundamental para a conclusão desta tese, em TODOS os
momentos. Espero conseguir retribuir à altura! Te amo muito!
À minha família, pela união e por todos os momentos maravilhosos que
passamos juntos!
Aos meus amigos do laboratório: Renata, Janinha, Silvia, Marcinha, Elisa,
Fábio, Luciano, Diogo Bastos, Diogo Jurelevicius, Joana, Natalie, Simone,
Natália (obrigada pela ajuda com os experimentos de antagonismo e
degradação) e também Irene. Obrigada por estarem sempre prontos a
ajudar e por comemorarem comigo cada resultado novo!
5
Aos meus amigos Raquel e Renato, Fernanda e Gustavo, Lívia e Daniel,
Renata e Felipe, Mariana e Adriano, Margareth, Lilian, Juliana, Débora,
Amanda e Renato, Vanessa Pio, Renata e Alexandre, Carla, Sheila e
Waleska. Obrigada pelos risos, pelas festas, pelas viagens e pelo apoio de
sempre.
À Silvia, pela atenção, por compartilhar seus conhecimentos e pela ajuda
durante os meus experimentos.
À Renata. Muito obrigada! Enfrentar os desafios do mestrado seria muito mais
difícil sem a sua amizade! Conte comigo para o que der e vier!
Ao Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes na pessoa de sua diretora,
Dra. Agnes Marie Sá Figueiredo, aos professores e ao pessoal técnico e
administrativo pelas facilidades oferecidas.
À Petrobras, pelo auxílio financeiro e pelo apoio logístico em todas as etapas
deste trabalho, permitindo a realização do mesmo.
À equipe da Petrobras/CENPES/PDEDS/Biotecnologia e Tratamentos
Ambientais (BTA), em especial, à Gina V. Sebastián, ao Ronalt Leite Vital
e à Renata Casella, que sempre se mostraram dispostos a discutir os
resultados e oferecer meios para a concretização dos objetivos propostos
neste estudo.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
pela bolsa de estudos concedida pelo Programa Taxonomia.
6
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIAÇÕES 8
RESUMO 9
SUMMARY 10
INTRODUÇÃO 11
1. O petróleo 11
2. O impacto do petróleo no meio ambiente 12
3. Microrganismos degradadores de óleo 14
4. Biorremediação 19
5. A água de produção 22
6. Biorremediação de solos contaminados com óleo e água de produção 23
7. Isolamento e detecção de bactérias degradadoras de óleo no ambiente 25
JUSTIFICATIVA 30
OBJETIVOS 32
MATERIAIS E MÉTODOS 34
1. Amostragem 34
2. Meios de cultura 36
3. Soluções 38
4. Tampões 42
5. Avaliação direta da diversidade bacteriana em ambientes
contaminados com óleo e água de produção 43
5.1. Extração de DNA total da comunidade microbiana 43
5.2. Amplificação do gene que codifica o rRNA 16S por PCR 44
5.3. Eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) 45
5.4. Análise estatística dos perfis de DGGE 46
7
5.5. Clonagem e seqüenciamento do DNA presente
nas bandas de DGGE 46
5.6. Análise das seqüências clonadas 47
6. Avaliação indireta da diversidade bacteriana em ambientes
contaminados com óleo e água de produção 48
6.1. Isolamento de bactérias halofílicas ou halotolerantes
degradadoras de hidrocarbonetos 48
6.2. Teste de degradação de hidrocarbonetos 49
6.3. Testes fenotípicos 49
6.4. ARDRA (Amplified Ribossomal DNA Restriction analysis) 50
7. Teste de antagonismo 51
8. Análise das diferentes amostras do solo 52
RESULTADOS 53
1. Análise das diferentes amostras do solo 53
2. Avaliação direta da diversidade bacteriana em ambientes
contaminados com óleo e água de produção 57
3. Avaliação indireta da diversidade bacteriana em ambientes
contaminados com óleo e água de produção 61
4. Teste de antagonismo 74
DISCUSSÃO 75
REFERÊNCIAS 82
8
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ARDRA – Análise da restrição do DNA 16S amplificado
DGGE – Eletroforese em gel de gradiente desnaturante
DNA – Ácido desoxirribonucléico
HPA – Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos
PCR – Reação da polimerase em cadeia
RAPD – DNA polimórfico amplificado randomicamente
rDNA 16S – DNA ribossomal 16S
RNA – Ácido ribonucléico
rRNA 16S – RNA ribossomal 16S
SSCP – Polimorfismo da conformação da fita simples
TGGE – Eletroforese em gel de gradiente de temperatura
TPH – Hidrocarbonetos totais do petróleo
T-RFLP – Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição terminal
q.s.p. – Quantidade Suficiente Para
9
RESUMO
Com intuito de avaliar um possível processo de biorremediação em uma
área impactada do campo petrolífero de Carmópolis denominada Panelas,
contaminada por uma mistura de óleo com água de produção (com uma
salinidade de 7%), durante o processo de recuperação secundária do petróleo,
este estudo teve como objetivos principais a avaliação de modo direto e
indireto da diversidade da comunidade bacteriana do local contaminado e de
uma área não contaminada (controle), além do isolamento de estirpes
halofílicas e/ou halotolerantes com capacidade de degradar óleo. A análise
direta da diversidade das comunidades bacterianas presentes nos locais citados
foi realizada através de técnicas moleculares como PCR, DGGE 16S,
clonagem e seqüenciamento. Devido à alta salinidade da água de produção e
ao efeito tóxico do óleo cru, a comunidade bacteriana sofreu alterações
significativas que foram visualizadas na comparação dos perfis das amostras
de solo contaminado com os perfis das amostras do solo controle na DGGE
16S. Duas bandas do gel da DGGE foram seqüenciadas e identificadas como
Paenibacillus sp. e Frankia sp. Além disso, foi realizado o isolamento de 131
estirpes bacterianas a partir de culturas de enriquecimento das amostras de
solo contaminado. Estas estirpes foram testadas quanto à capacidade de
degradar óleo cru e tolerar altas concentrações de NaCl. Os referidos testes
resultaram na seleção de 22 estirpes halotolerantes degradadoras de
hidrocarbonetos que foram submetidas ao teste de ARDRA. Quinze grupos
genotípicos foram formados e estes estão sendo avaliados quanto a sua
possível utilização na forma de consórcios para a biorremediação da área
contaminada de Panelas.
10
SUMMARY
Considering the use of a bioremediation process in an area of
Carmópolis oil field named Panelas, contaminated by a mix of oil and
production water (salinity of 7%), during the secondary recovery process, this
study aimed to determine the diversity of the bacterial community from this
contaminated compared to a non-contaminated soil area. For this purpose,
molecular methods based on PCR-DGGE followed by cloning and sequencing
were used. Furthermore, halophilic and/or halotolerant strains capable to
degrade crude oil were isolated. Significant changes in the DGGE profiles
were observed mainly because of the high salinity present in the production
water and the toxic effect from the crude oil. Two bands were extracted from
DGGE, sequenced and they were identified as Paenibacillus sp. and Frankia
sp. Moreover, 131 bacterial strains were isolated from enrichment cultures
obtained from the contaminated soil samples. These strains were further tested
for their ability to degrade crude oil and tolerate high NaCl concentrations.
Twenty-two strains showing these characteristics were submitted to ARDRA
analyses. Fifteen genotypic groups were formed and they are being evaluated
for their application in bioremediation as a consortium in the contaminated
area of Panelas.
11
INTRODUÇÃO
1. O petróleo
O petróleo é uma substância oleosa, inflamável, menos densa que a água, com
cheiro característico e de cor variando entre o negro e o castanho escuro
(www.petrobras.com.br). Este é composto de uma mistura complexa de hidrocarbonetos e
outros compostos orgânicos, incluindo alguns constituintes organometálicos como, por
exemplo, vanádio e níquel (Chang, 1994; Van Hamme, Singh & Ward, 2003).
Os hidrocarbonetos são quantitativamente os mais importantes constituintes do
petróleo, podendo ser classificados em três grupos: alifáticos, alicíclicos e aromáticos. Os
hidrocarbonetos alifáticos são compostos de cadeias abertas e estão subdivididos em
alifáticos saturados (hidrocarbonetos mais estáveis conhecidos como parafinas ou alcanos)
e alifáticos insaturados (hidrocarbonetos menos estáveis conhecidos como oleofinas ou
alcenos). Os hidrocarbonetos alicíclicos (cicloalcanos) têm alguns ou todos os átomos
arranjados em uma estrutura em anel e podem ser saturados ou insaturados. Os
hidrocarbonetos aromáticos (arenos) contêm ao menos um anel de benzeno e são chamados
de hidrocarbonetos monocíclicos, enquanto os que possuem mais de um deste tipo de anel
são chamados de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HPAs) (Leythaeuser &
Rückheim, 1989).
O petróleo também é constituído por compostos sulfurosos (ex: sulfetos,
polissulfetos, benzotiofenos), compostos nitrogenados (ex: piridinas, quinolinas, indóis),
compostos oxigenados (ex: ácidos carboxílicos, fenóis, ésteres), resinas e asfaltenos
(Leythaeuser & Rückheim, 1989; Huang et al., 2004).
12
Um reservatório de petróleo, por definição, é formado por 3 elementos: a rocha
matriz, a rocha impermeável e a rocha reservatório.
A rocha matriz é a rocha na qual o óleo cru é formado e da qual, posteriormente, o
mesmo é expulso. Alguns pesquisadores defendem que os fluidos do petróleo são
produzidos pela quebra térmica do material orgânico fóssil contido nos sedimentos e que
este processo é, provavelmente, a fonte dos depósitos mais significantes descobertos até o
momento. Além disso, acreditam também que alguns fluidos são diluídos por compostos de
origem inorgânica (Planckaert, 2005). Entretanto, Chang (1994) defende que os
reservatórios de petróleo formaram-se na crosta terrestre como resultado da decomposição
anaeróbica de matéria animal, vegetal e planctônica por bactérias.
A rocha reservatório funciona como uma esponja, pois ela pode armazenar e expelir
o fluido. Normalmente, esta rocha possui uma grande capacidade de estocar fluidos ricos
em hidrocarbonetos. Já o papel da rocha impermeável é conter a migração dos
hidrocarbonetos, permitindo assim a formação dos reservatórios de petróleo (Planckaert,
2005).
2. O impacto do petróleo no meio ambiente
O petróleo é uma das fontes de energia mais importantes no mundo industrial
moderno. Os impactos ambientais causados pela indústria do petróleo são provenientes da
exploração, transporte, refino e utilização dos seus produtos (Prince, 1993; Balba, Al-
Awandi & Al-Daher, 1998; Wei, Mather & Fotheringham, 2005). Estas atividades estão
envolvidas em 90% dos acidentes resultantes da exploração e utilização do petróleo, e
somente os 10% restantes são atribuídos às catástrofes de derrames de óleo em alto mar
13
resultando na contaminação de regiões costeiras (Balba, Al-Awandi & Al-Daher, 1998;
Prince, 1993).
Em várias operações de produção, processamento e armazenamento, grandes
volumes de resíduos são gerados sob forma de lamas oleosas (Manning & Thompson,
1995). A contaminação dos solos pelo petróleo e seus derivados pode ser distribuída pelas
três fases do solo (gasosa, líquida e sólida), devido à volatilidade, à solubilidade e à carga
iônica do contaminante gerando grande impacto ambiental (Cacciatore & McNeil, 1995).
Os hidrocarbonetos ligam-se fortemente a superfícies sólidas, incluindo os solos, e a
remediação destes materiais representa um desafio significante. Os hidrocarbonetos mais
leves, além de tóxicos, tendem a volatilizar na atmosfera, reduzindo a qualidade do ar e
prejudicando a saúde dos seres humanos e animais. Compostos com altas concentrações de
enxofre também fazem parte dos resíduos petrolíferos necessitando de tratamento
específico (Van Hamme, Singh & Ward, 2003).
Visando tornar o processo de descontaminação acessível economicamente, os
pesquisadores vêm testando estratégias tecnológicas, que incluem esquemas
biotecnológicos, para tratar locais contaminados. Nestes tratamentos, os microrganismos
podem representar uma alternativa eficaz na recuperação do ambiente atingido (Singh,
Mullin & Ward, 2001).
Atualmente, as tecnologias mais utilizadas para a remediação do solo incluem o
aterro dos resíduos, emulsificação, evaporação, solidificação, dispersão, lavagem, adsorção
térmica, nitrificação, incineração e remoção mecânica. Entretanto, muitas destas
tecnologias são caras ou não levam à decomposição completa dos contaminantes. O
tratamento biológico, conhecido como biorremediação, tem sido reconhecido como uma
tecnologia promissora para lidar com ambientes poluídos por vários contaminantes
14
orgânicos, principalmente os hidrocarbonetos do petróleo (Medina-Bellver et al., 2005;
Shuhong et al., 2005).
3. Microrganismos degradadores de óleo
Muitos microrganismos são eficientes na degradação de hidrocarbonetos (Bouwer
& Zehnder, 1993) e possuem uma maquinaria metabólica que permite a utilização do
petróleo como única fonte de carbono (Van Hamme, Singh & Ward, 2003). A explicação
para a sua gama extraordinária de capacidades degradadoras está na coexistência dos
microrganismos, por bilhões de anos, com uma variedade imensa de compostos orgânicos
muito antes da época em que os seres humanos apareceram no planeta. Esta grande
diversidade de substratos com os quais os microrganismos entraram em contato passaram a
ser utilizados no seu crescimento levando à seleção de enzimas capazes de transformar os
novos compostos naturais orgânicos (Butler & Manson, 1997; Ellis, 2000).
Uma grande quantidade de microrganismos com capacidade de degradar diversos
compostos, como benzeno, fenol e naftaleno, já foi isolada e caracterizada (Dickel, Haug &
Knackmus, 1993; Faison, 2001). Dentre eles, as bactérias são as mais estudadas para a
aplicação na biorremediação. Este fato se deve à facilidade de cultivo e manipulação
genética, capacidade de metabolizar organo-clorados, capacidade de mineralização de
diversos compostos químicos e a utilização dos mesmos como fonte de energia (Bouwer &
Zehnder, 1993). A Tabela 1 exemplifica os gêneros de bactérias que estão presentes no
solo e são capazes de degradar hidrocarbonetos do petróleo.
15
Gênero Substrato
Achromobacter Óleo combustível
Acidocella Naftaleno
Acidovorax Fenantreno
Acinetobacter Óleo combustível
Actinomyces Óleo cru
Aeromonas Óleo Diesel
Agrobacterium Aromáticos da gasolina
Alcaligenes Óleo combustível
Alcanivorax Alcanos
Alkanindiges Alcanos
Alteromonas Óleo cru
Arthrobacter Óleo combustível
Aureobacterium Óleo cru
Azoarcus Tolueno
Azospirillum Combustível de avião
Azotobacter Óleo cru
Bacillus Tolueno
Beijerinckia Fenantreno
Blastoclhoris Tolueno
Tabela 1
- Gêneros de bactérias capazes de crescer utilizando
hidrocarbonetos como única fonte de carbono e energia (Prince, 2005)
16
Gênero Substrato
Brevibacterium Alcanos
Brevundimonas Óleo combustível
Burkholderia Tolueno
Clavibacter Naftaleno
Comamonas Fenantreno
Corynebacterium Óleo combustível
Cycloclasticus Bifenil
Cytophaga Óleo cru
Dechloromonas Benzeno
Desulfatibacillum Alcanos
Desulfobacterium Xileno
Desulfobacula Tolueno
Desulfosarcina Xileno
Desulfosporosinus Gasolina
Dietzia Alcanos
Enterobacter Alcanos
Erwinia Alcanos
Flavobacterium Óleo Diesel
Geobacillus Óleo cru
Geobacter Tolueno
Gordonia Alcanos
Klebsiella Óleo cru
17
Gênero Substrato
Lactobacillus Óleo cru
Leclercia Pireno
Leucotrix Óleo cru
Lutibacterium Fenantreno
Marinobacter Óleo cru
Micrococcus Hexadecano
Moraxella Bifenil
Mycobacterium Fenantreno
Neptunomonas Naftalenos
Nocardia Alcanos
Nocardioides Fenantreno
Ochrobactrum Diesel
Oleiphilus Alcanos
Oleispira Alcanos
Paenibacillus Fenantreno
Pasteurella Fluoranteno
Peptococcus Óleo cru
Planococcus Alcanos
Polaromonas Naftaleno
Proteus Óleo cru
Pseudomonas Óleo combustível
Ralstonia Tolueno
18
Gênero Substrato
Rhodococcus Fenantreno
Sarcina Óleo cru
Serratia Óleo cru
Sphaerotilus Óleo cru
Sphingomonas Tolueno
Spirillum Óleo cru
Staphylococcus Diesel
Stenotrophomonas Pireno
Streptomyces Alcanos
Thalassolituus Alcanos
Thauera Tolueno
Thermoleophilum Alcanos
Thermus Pireno
Vibrio Fenantreno
Xanthobacter Dibenzotiofeno
Xanthomonas Fenantreno
19
4. Biorremediação
O conceito de biorremediação foi introduzido no fim da década de 80. Esta
tecnologia envolve microrganismos participando de diversas reações físicas e químicas em
solos poluídos. Os poluentes são degradados através do metabolismo microbiano (Shuhong
et al., 2005) resultando na redução da concentração e/ou a toxicidade de várias substâncias
químicas como derivados do petróleo, hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos (incluindo
hidrocarbonetos poliaromáticos), entre outros (Korda et al., 1997).
A remediação de solos contaminados com óleo através dos microrganismos
representa um caminho rápido para a degradação dos hidrocarbonetos do petróleo e
também diminui o risco da contaminação dos lençóis d’água. A degradação microbiana
natural é a primeira opção para os tratamentos do meio ambiente (Alexander, 1994).
Comparada aos métodos físico-químicos, a biorremediação oferece uma alternativa
eficiente para o tratamento da poluição pelo petróleo, já que a maioria das moléculas
encontradas no óleo cru e nos produtos refinados é biodegradável e os microrganismos
degradadores de óleo são ubiquitários (Fayad & Overton, 1995; Aislabie, McLeod &
Fraser, 1998; Chaineau et al., 2000).
Diferentes técnicas são utilizadas no processo de biorremediação, dentre elas
podemos citar: (1) a bioatenuação, que consiste em monitorar o progresso natural da
degradação para assegurar que a concentração de contaminantes diminuiu ao longo do
tempo; (2) a bioestimulação, que ocorre através do estímulo intencional das bactérias
indígenas degradadoras de xenobiontes pela adição de aceptores de elétrons, água,
nutrientes ou doadores de elétrons; ou (3) bioaumento, no qual realiza-se a adição de
20
bactérias crescidas em laboratório que possuem características apropriadas para a
degradação dos compostos poluentes (Widada, Nojiri & Omori, 2002).
A atenuação natural se concentra na capacidade de biodegradação intrínseca das
comunidades microbianas indígenas. Através dela o movimento do contaminante e o
declínio lento e progressivo da concentração do mesmo são monitorados. Este
monitoramento é válido quando não existem grandes ameaças à saúde humana e onde o
impacto não está se espalhando rapidamente (Philp & Atlas, 2005).
A bioestimulação envolve a adição de oxigênio, água e nutrientes minerais
(geralmente combinações de nitrogênio, fósforo e elementos traço) e resulta na aceleração
da reprodução dos microrganismos presentes no local em até cem vezes, necessitando de
um monitoramento ecológico constante (Orzech, Solyst & Thompson, 1991).
O bioaumento é um método que envolve a aplicação direta no solo de
microrganismos provenientes do local de contaminação, comercializados por grandes
empresas ou geneticamente modificados. Muitos microrganismos são submetidos a uma
seleção induzida com o objetivo de aumentar a sua capacidade de degradar contaminantes
específicos e melhorar a adaptação às condições do local. Entretanto, a possibilidade de
efeitos ecológicos adversos a partir da introdução de microrganismos exógenos ou
geneticamente modificados deve ser examinada e minimizada (Orzech, Solyst &
Thompson, 1991; Leavitt & Brown, 1994).
Utilizando as técnicas descritas acima, diversos métodos biológicos já foram
descritos para o processamento dos resíduos petrolíferos em solos contaminados com óleo.
Como exemplo, podemos citar o ‘landfarming’, a biopilha, a bioventilação e a utilização de
biorreatores (Ward, 1991; Prince, 1993; Atlas & Cerniglia, 1995; Korda et al., 1997).
21
Como exposto anteriormente, a contaminação por hidrocarbonetos do petróleo
ocorre como uma mistura complexa de hidrocarbonetos. Embora o potencial dos
microrganismos em degradar compostos orgânicos sob condições favoráveis seja elevado,
nenhuma espécie sozinha tem a capacidade de degradar todos os componentes de um
determinado óleo (Office of Technology Assessment, 1991), e nenhum “super organismo”
degradador de óleo foi desenvolvido pela engenharia genética. Atualmente, vários
organismos são conhecidos pela capacidade de degradar, normalmente, um ou poucos
hidrocarbonetos do petróleo de cada vez. Dessa forma, a biodegradação eficaz da
contaminação do petróleo requer uma mistura de populações compostas de diversos
gêneros, cada qual capaz de metabolizar seus respectivos compostos (Korda et al., 1997).
Algumas estirpes comerciais são utilizadas para a realização do bioaumento, como por
exemplo: Rhodococcus erythropolis BKM Ac-1339D (Anonymous, 1993a), Bacillus sp.
BKPM B-5467 (Anonymous, 1992), Pseudomonas putida CCM 4307 (Anonymous,
1993b), Candida sp. M23-2 (Anonymous, 1994a) e Trichoderma sp. AP-5 (Anonymous,
1994b).
Embora excelentes resultados tenham sido obtidos em experimentos de
biorremediação em laboratório, não existe garantia de que os microrganismos terão o
mesmo comportamento em campo. Muitos compostos que são facilmente metabolizados in
vitro não são degradados eficientemente em solos contaminados e aqüíferos. Isto pode
estar relacionado à diminuição da biodisponibilidade causada pela adsorção dos compostos
nas partículas do solo ou em soluções de fase líquida não-aquosas (Alexander, 1991) e à
distribuição das populações bacterianas no solo. Dessa forma, muitos pesquisadores vêm
ressaltando que a comunidade científica deve prestar atenção aos fatores que controlam a
biodisponibilidade dos contaminantes orgânicos e aos métodos para aumentar a viabilidade
22
e atividade microbiana, além de monitorar a biorremediação, a ecologia e o destino de
microrganismos eventualmente introduzidos no ambiente (Korda et al., 1997).
5. Água de produção
A indústria do petróleo é uma grande consumidora e produtora de água. Ao final do
tempo de vida (útil) de um campo petrolífero, os poços podem produzir mais de 95% de
água (ex.: 95m
3
de água para cada metro cúbico de fluido produzido que possui 0,05 m
3
de
óleo) (Planckaert, 2005). No Brasil, por exemplo, em 1998, um volume estimado de 9,3 x
10
6
m
3
de água de produção foi liberado no mar por 7 plataformas fixadas na Bacia de
Campos (Jerez Vegueria, Godoy & Miekeley, 2002).
A água de produção gerada durante o processo de extração, muitas vezes, é utilizada
na recuperação secundária do petróleo. Para tal, ocorre a injeção da mesma no aqüífero do
reservatório de petróleo para manter a pressão e empurrar o óleo até os poços de produção (
Planckaert, 2005).
Essa água de produção (ou água produzida) pode ser muito salina e contém
componentes tóxicos indesejáveis, além de uma grande quantidade de hidrocarbonetos. Ela
pode ser caracterizada da seguinte forma: ausência de oxigênio dissolvido, salinidade
significativa de mais de 300 g/ l (cloretos, sulfatos ou bicarbonatos), alta temperatura (40 a
90°C), pequena quantidade de partículas em suspensão, uma grande concentração e
variedade de hidrocarbonetos, alguns álcoois (fenóis), alguns metais, como zinco, chumbo
ou cobre, e alguns ácidos. Outros compostos, como compostos orgânicos e fontes de
nitrogênio e fósforo, são encontrados na água e podem servir de nutrientes para as bactérias
(Planckaert, 2005).
23
O derrame da água de produção sem tratamento no ambiente, com quantidades
variadas de sal, inibe o crescimento das plantas, leva ao aumento da erosão e perda da
superfície do solo e gera a contaminação dos lençóis d’água por sais e hidrocarbonetos
(Nicholson & Fathepure, 2004).
6. Biorremediação de solos contaminados com óleo e água de produção
Como os processos convencionais de tratamento microbiológico não funcionam em
altas concentrações de sal, a biorremediação de campos petrolíferos impactados com água
de produção somente pode ser realizada através do bioaumento utilizando-se bactérias
indígenas ou bactérias halofílicas e/ou halotolerantes (que sejam capazes de degradar os
compostos do petróleo) (Nicholson & Fathepure, 2004).
Os microrganismos halofílicos e halotolerantes – que possuem a capacidade de
crescer em ambientes salinos – são encontrados nos três domínios da vida: Archaea,
Bacteria e Eukarya (Oren, 1999). Como resultado da sua adaptação a esses ambientes, tais
microrganismos desenvolveram propriedades únicas que podem ser aplicadas em vários
campos da biotecnologia: na degradação ou transformação de poluentes orgânicos, na
produção e fermentação de alimentos e na produção de biopolímeros (como
biossurfactantes e enzimas) entre outros (Margesin & Schinner, 2001; Oren 2002; Sánchez-
Porro et al., 2003; Garcia, Ventosa & Mellado, 2005).
Os microrganismos dependentes de sal para crescer são denominados halofílicos,
enquanto os microrganismos que são capazes de crescer tanto na ausência quanto na
presença de sal são chamados de halotolerantes. Os microrganismos halotolerantes que
possuem a capacidade de crescer acima de 15% (w/v) NaCl, são considerados
24
halotolerantes extremos (Margesin & Schinner, 2001). A definição mais utilizada para os
microrganismos halofílicos é a de Kushner (1978), que classifica os microrganismos como:
ligeiramente halofílicos, quando apresentam a concentração ótima de NaCl para
crescimento em torno de 3% (0,5 M); halofílicas moderadas, quando os microrganismos
apresentam o crescimento ótimo em meio contendo de 3 – 15% (0,5 – 2,5 M) de NaCl;
halofílicas extremas, quando os microrganismos apresentam ótimo crescimento em meio
contendo de 15 – 30% (2,5 – 5,2 M) de NaCl. Estes organismos halofílicos moderados e
extremos são de grande interesse no tratamento de efluentes hipersalinos. As bactérias
halotolerantes crescem em ambientes contendo menos de 3% de NaCl, mas também podem
resistir a altas concentrações de sal, coexistindo com bactérias halofílicas em ambientes
hipersalinos (Marquez, Ventosa & Ruiz-Barraquero, 1987).
Diversos estudos indicam o envolvimento de bactérias halofílicas e halotolerantes
na degradação de poluentes. Oren e colaboradores (1992) demonstraram a capacidade de
uma arquea halofílica (estirpe EH4) em degradar um amplo espectro de n-alcanos e
hidrocarbonetos aromáticos na presença de altas quantidades de sal. Gauthier e
colaboradores (1992) descreveram a bactéria halotolerante extrema Marinobacter
hydrocarbonoclasticus, que possui a capacidade de degradar uma variedade de
hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos. Em 1992, uma estirpe de Streptomyces sp.
halotolerante foi isolada de um campo petrolífero na Rússia por Kuznetnov e
colaboradores e foi observado, no mesmo estudo, que este microrganismo degradava óleo
cru. Além disso, Plotnikova e colaboradores (2001) verificaram que bactérias isoladas de
um local impactado com altas concentrações de sal eram capazes de degradar
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HPAs).
25
7. Isolamento e detecção de bactérias degradadoras de óleo no ambiente
Ecologicamente, os microrganismos capazes de metabolizar hidrocarbonetos estão
amplamente distribuídos no ambiente. Dessa forma, muitas dificuldades foram encontradas
durante as tentativas de caracterizar as comunidades microbianas naturais impactadas com
hidrocarbonetos do petróleo. Apesar das dificuldades, muitas ferramentas estão sendo
desenvolvidas, na tentativa de melhorar os estudos que visam quantificar os
microrganismos e verificar a sua distribuição no ambiente natural, na esperança de associar
essas comunidades com funções do ecossistema (Van Hamme, Singh & Ward, 2003).
As razões para tentar realizar tais análises incluem: descrever o papel dos
microrganismos na gênese do petróleo através do tempo geológico (Omori et al., 1992;
Margot, Ollivier & Patel, 2000), avaliar os efeitos a longo-prazo da poluição pelo petróleo
(Lindstrom, Barry & Braddock, 1999), desenvolver e avaliar a remediação dos resíduos
gerados (Ka, Yu & Mohn, 2001; Siciliano et al., 2003), rastrear o enriquecimento de
microrganismos patogênicos durante a remediação (Berg, Roskot & Smalla, 1999; Foght et
al., 1996) e controlar atividades microbianas deletérias durante a produção de petróleo
(Eckford & Fedorack, 2002).
Os métodos para analisar a diversidade microbiana e a função da comunidade
podem ser divididos em métodos dependentes de cultivo e independentes de cultivo, sendo
que ambos devem incluir técnicas de caracterização genética (Van Hamme, Singh & Ward,
2003).
Os métodos tradicionais, dependentes de cultivo, são os mais comuns e estão
baseados nas diferenças morfológicas, metabólicas e fisiológicas dos microrganismos. Isto
inclui o isolamento e cultivo em meio sólido, ensaios em meio líquido como o NMP
26
(Número Mais Provável) e a utilização de substrato em placas Biolog (Van Hamme, Singh
& Ward, 2003). Entretanto, utilizando estes métodos, a enumeração e o monitoramento de
populações bacterianas degradadoras de xenobiontes em ambientes contaminados pode
levar um tempo longo e, na maioria das vezes, subestima os números como resultado da
dificuldade existente em cultivar a maioria dos microrganismos do solo (Lloyd-Jones et al.,
1999).
Atualmente, técnicas moleculares vêm sendo utilizadas para caracterizar os ácidos
nucléicos dos microrganismos contidos na comunidade microbiana das amostras
ambientais. O principal benefício dessas análises moleculares é a possibilidade de estudar
comunidades microbianas sem cultivar bactérias e fungos, enquanto as análises usando
incubação no laboratório (microbiologia clássica) são indiretas e produzem mudanças
artificiais na estrutura e na atividade metabólica da comunidade microbiana. Além disso,
métodos moleculares diretos preservam o ‘status’ metabólico in situ e a composição da
comunidade microbiana, porque as amostras são congeladas imediatamente após a coleta.
Também, a extração direta dos ácidos nucléicos de amostras ambientais conta com uma
proporção muito grande de microrganismos (90-99,9%) que não são cultiváveis em
laboratório, mas podem ser responsáveis pela maioria da atividade biodegradadora de
interesse (Brockman, 1995).
Dentre os métodos para avaliar os perfis das comunidades podemos citar a
eletroforese em gel de gradiente desnaturante ou DGGE (Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis), a eletroforese em gel de gradiente de temperatura ou TGGE (Temperature
Gradient Gel Electrophoresis), o polimorfismo da conformação da fita simples ou SSCP
(Single Strand Conformation Polymorphism), a técnica de DNA polimórfico amplificado
randomicamente ou RAPD (Random Amplified polymorphic DNA), a análise de restrição
27
do DNA ribossomal amplificado ou ARDRA (Amplified Ribossomal DNA Restriction
Analysis) (Kent & Triplett, 2002).
A separação de seqüências específicas de DNA, ou a detecção de pequenas
diferenças existentes entre elas, pode fornecer informações importantes sobre a estrutura da
comunidade e a diversidade dos microrganismos contendo o gene procurado. Geralmente
essas técnicas são acopladas com a reação de PCR para amplificar seqüências que não são
abundantes. Os produtos de PCR amplificados podem ser examinados utilizando técnicas,
como o DGGE e o TGGE, que detectam substituições únicas na seqüência de nucleotídeos
(Schneegurt-Mark & Kulpa-Chaler, 1998).
O DGGE e o TGGE são métodos pelos quais fragmentos de DNA do mesmo
tamanho, mas que apresentam seqüências diferentes, podem ser separados por eletroforese
(Muyzer, 1999). A separação é baseada no decréscimo da mobilidade eletroforética da
dupla fita desnaturada parcialmente em géis de poliacrilamida contendo um gradiente linear
de agentes desnaturantes (uma mistura de uréia e formamida) ou um gradiente linear de
temperatura (Muyzer,Waal & Uitterlinden, 1993). Estas técnicas são importantes na
separação e identificação de produtos de PCR amplificados que possam ter o mesmo
tamanho, porém pequenas diferenças nas seqüências nucleotídicas e são freqüentemente
utilizadas para avaliar a diversidade microbiana em amostras ambientais (Schneegurt-Mark
& Kulpa-Chaler, 1998).
Um estudo realizado por Watanabe e colaboradores (1998) usou uma combinação
de métodos microbiológicos e moleculares para detectar e caracterizar as bactérias
degradadoras de fenol em lodo ativado. As análises de TGGE dos produtos da PCR do gene
rrs (que codifica o rRNA 16S) e do gene que codifica a fenol hidroxilase (LmPH)
demonstraram poucas populações bacterianas dominantes após 20 dias de incubação
28
utilizando fenol como fonte de carbono. Comparações das seqüências de isolados
bacterianos diferentes e de bandas extraídas do gel de TGGE revelaram duas espécies
bacterianas dominantes responsáveis pela degradação do fenol.
A análise do polimorfismo do tamanho dos fragmentos terminais (T-RFLP) é um
método que também contribui para o rastreamento dos microrganismos degradadores de
hidrocarbonetos e muitos estudos utilizando esta técnica já foram utilizados com este
propósito. O T-RFLP mede o polimorfismo dos fragmentos de restrição terminais de um
marcador de PCR amplificado. A digestão subseqüente com endonucleases selecionadas
produz fragmentos terminais apropriados que são separados por tamanho, com uma alta
resolução (+
1 base), em géis de seqüênciamento (Marsh, 1999).
Em 2001, Watts e colaboradores fizeram uma análise comparativa de comunidades
degradadoras de PCB (bifenilas policloradas) em culturas de enriquecimento utilizando três
técnicas diferentes de ‘screening’ molecular: ARDRA, DGGE e T-RFLP. Eles concluíram
que a interpretação dos resultados apresentados pelos diferentes métodos era realizada de
modos distintos, porém todos estes métodos foram úteis para a análise qualitativa e
identificaram o mesmo microrganismo, sendo considerado o DGGE o mais rápido e
eficiente para o monitoramento dos microrganismos de uma cultura enriquecida.
Outra técnica que pode ser aplicada na investigação da comunidade degradadora de
hidrocarbonetos presente em locais que sofreram derrame de óleo é a hibridização de
sondas com genes microbianos envolvidos no catabolismo dos contaminantes. Estas sondas
são desenhadas a partir de genes específicos envolvidos nas etapas enzimáticas chave das
vias microbianas de degradação de poluentes ambientais e podem ser usadas para examinar
tanto ambientes virgens quanto ambientes contaminados (Atlas et al., 1992; Greer et al.,
2001). Margesin e colaboradores (2003) verificaram a prevalência de sete genótipos
29
(Pseudomonas putida Gpo1 alkB, Acinetobacter spp. alkM, Rhodoccocus spp. alkB1,
Rhodoccocus spp. alkB2, P. putida xylE, P. putida ndoB e Mycobacterium sp. estirpe
PYR-1nidA) envolvidos na degradação de n-alcanos, hidrocarbonetos aromáticos e HPAs
(hidrocarbonetos aromáticos policíclicos) em solos Alpinos Europeus virgens e
contaminados com óleo, através de ensaios de PCR combinados à hibridização com as
sondas específicas alkB, alkM, alkB1, alkB2, xylE, ndoB e nidA.
A análise das variações que ocorrem na população de um local contaminado pelos
métodos descritos acima, acompanhada por uma mudança na função de uma comunidade,
auxilia na identificação das populações funcionalmente dominantes (Bond et al., 1995;
Borneman & Triplett, 1997). Entretanto, os pesquisadores têm enfatizado que experimentos
de cultura pura são indispensáveis para a análise detalhada das funções de cada população e
que o isolamento das populações funcionalmente dominantes em uma comunidade
microbiana é muito importante (Watanabe et al., 1998).
Portanto, é válido ressaltar que os métodos microbiológicos clássicos combinados
aos métodos moleculares contribuem para uma melhor avaliação da comunidade
microbiana do local estudado e sua resposta aos processos de biorremediação utilizando-se
o bioaumento, a bioestimulação e/ou atenuação natural (Brockman, 1995).
30
JUSTIFICATIVA
O campo petrolífero de Carmópolis, em Sergipe, foi descoberto em 1963, e
representa a maior acumulação de óleo bruto em terra da Petrobras. Devido a sua grande
importância econômica, a Diretoria Executiva da Petrobras aprovou, em dezembro de 2006,
o investimento de US$ 314 milhões no campo de Carmópolis, visando o aumento da
produção diária atual. Os investimentos consistem em aumentar os níveis de injeção de
água, e em aumentar, centralizar e racionalizar as instalações de injeção, produção e
tratamento (www.petrobras.com.br).
Em agosto de 2004, durante o processo de recuperação secundária do petróleo no
campo de Carmópolis (SE), na área de Panelas, ocorreu um derrame acidental que
acarretou a destruição da área atingida (perda da flora/fauna original) pela contaminação do
solo com uma mistura, na proporção de 1:3, de óleo e água de produção. A presença dessa
água de produção é um problema adicional na contaminação com óleo, pois a mesma
contém uma grande quantidade de sal (em torno de 7%).
Considerando-se que a biodegradação é um processo eficiente na descontaminação
de ambientes poluídos com óleo, a prospecção de novas estirpes bacterianas provenientes
do derrame de petróleo e água de produção neste local, que sejam eficientes na degradação
de hidrocarbonetos e resistentes a elevadas concentrações de sal, é de suma importância.
Entretanto, até o início deste trabalho, não haviam sido realizados estudos (na área
destruída) para analisar as populações que apresentassem estas características.
Apesar das técnicas microbiológicas tradicionais (ex: plaqueamento, isolamento de
diferentes morfotipos coloniais e identificação dos isolados por testes bioquímicos) serem
usadas com grande sucesso na caracterização de espécies microbianas isoladas, elas não são
31
consideradas suficientes, pois apenas uma pequena fração (aproximadamente 1 a 10%) dos
microrganismos presentes no ambiente pode ser isolada e caracterizada. A grande maioria é
considerada não cultivável. Além disso, sabe-se pouco a respeito do que realmente ocorre
com a comunidade microbiana do ambiente ao longo do processo de contaminação e
degradação do óleo, e quais as populações que permanecem e/ou são selecionadas nestas
novas condições.
Sendo assim, os dados que foram gerados durante o presente estudo, combinados
com informações como: o tipo de solo, o tipo de óleo e a salinidade da água de produção
que contaminaram o local, são importantes para definir com mais precisão o melhor
processo de biorremediação a ser implementado.
32
OBJETIVOS
Este projeto teve como objetivos (i) estudar a estrutura da comunidade bacteriana
(cultivável e não cultivável) de Panelas, no campo petrolífero de Carmópolis (SE),
comparando-se as populações das áreas contaminadas pelo derrame de óleo com a área
controle (sem contaminação) através de métodos moleculares, (ii) isolar estirpes halofílicas
e/ou halotolerantes com capacidade de degradar óleo que possam apresentar uma possível
aplicação na biorremediação do solo contaminado.
Etapas do projeto
I. Avaliação direta da diversidade bacteriana em ambientes contaminados com óleo
através de métodos moleculares:
Extração mecânica do DNA total do solo (amostras de três diferentes pontos da
contaminação e amostra controle)
Amplificação via PCR da região codificadora do rRNA 16S da comunidade
bacteriana presente nas amostras coletadas na região impactada e controle
Análise, através da técnica de DGGE, da variação dos perfis das comunidades dos
diferentes locais de coleta, para verificar o impacto na diversidade bacteriana
gerado pelo derrame de óleo e água de produção
Extração, clonagem e seqüenciamento de bandas importantes do gel de DGGE
para a identificação das populações alteradas (selecionadas ou extintas) nos três
pontos analisados.
33
II. Avaliação indireta da diversidade bacteriana em ambientes contaminados com óleo
através de:
Pré-enriquecimento em meio Bushnell-Haas (preparado com água destilada ou
água de produção utilizada na extração de petróleo em Panelas-SE) contendo o
óleo extraído na região de Panelas (SE) como única fonte de carbono
Isolamento de estirpes bacterianas
Seleção de diferentes morfotipos
Teste de degradação de óleo (na presença e na ausência de água de produção
utilizada na extração de petróleo em Panelas-SE)
Identificação fenotípica das estirpes de interesse (ex: coloração de Gram e curva
de halofilia)
Identificação molecular das estirpes de interesse através da amplificação da região
codificadora do rRNA 16S via PCR, seguida da análise de restrição do DNA
ribossomal amplificado, clonagem dos produtos de PCR de cada grupo
geneticamente distinto, extração plasmidial dos transformantes e seqüenciamento
Teste de antagonismo entre as estirpes halotolerantes e degradadoras de óleo
isoladas neste estudo.
34
MATERIAIS E MÉTODOS
1.Amostragem
Como explicado anteriormente, em 2004, em Panelas (área localizada no campo
petrolífero de Carmópolis – SE), um acidente aconteceu devido ao rompimento de uma
tubulação utilizada durante a recuperação secundária do petróleo. A tubulação rompida
passava por um local apresentando um pequeno declive. Portanto, a mistura do óleo e água
de produção migrou a partir do ponto mais alto (origem da contaminação), passando pela
região de maior inclinação, e acumulou-se na região mais baixa (onde o declive diminui).
Como a região contaminada apresentava estes pontos com diferentes concentrações da
mistura de óleo e água de produção, foram coletadas três amostras de solo do local
impactado, em três pontos diferentes a partir do ponto de origem do derrame. A primeira
amostra foi retirada no ponto mais alto (Ponto 1 - início da contaminação), a segunda no
ponto intermediário (Ponto 2 - por onde os contaminantes passaram) e a terceira no ponto
mais baixo onde a mistura água de produção e óleo pôde atingir e ficar acumulada (Ponto
3). De cada ponto, foram coletadas, com o auxílio de espátulas estéreis, três amostras de
aproximadamente 150 g cada e estas foram misturadas em sacos estéreis para dar origem a
uma amostra composta de aproximadamente 500 g de solo. Estas amostras de solo foram
coletadas até 20 cm de profundidade a partir da superfície. A distância entre os pontos de
coleta estudados (pontos 1, 2, 3 e controle) variou de 10 a 20 m. As amostras de solo foram
transportadas para o Rio de Janeiro de avião em isopor contendo gelo. As amostras de solo
foram estocadas no freezer imediatamente após o seu recebimento a -20°C. O esquema do
local contaminado e os pontos de coletas das amostras de solo encontram-se na figura 1.
35
Além disso, foi feita uma amostragem do solo não contaminado (sem água de
produção e óleo), utilizado neste estudo como o controle negativo. Todas as amostras foram
recolhidas 8 meses após o incidente e tanto as amostras de solo contaminadas com óleo e
água de produção quanto a amostra de solo controle foram mantidas no freezer a -20 °C. As
figuras 2 e 3 representam, respectivamente, o local de Panelas de onde foi coletado o solo
controle e a região contaminada pela mistura de poluentes onde foi coletada a amostra de
solo do ponto 3.
Figura 1
– Migração da mistura de óleo e água de produção pela
região de declive a partir do local do derrame.
Local do
Derrame
Figura 2
– Área não contaminada. Local
onde a amostra de solo controle foi coletada
Figura 3
– Área contaminada. Local onde
a amostra de solo do ponto 3 foi coletada
36
2.Meios de cultura
2.1. Para seleção de microrganismos
2.1.1. Bushnell-Haas (Difco) pH 7,0
Sulfato de Magnésio 0,2 g
Cloreto de Cálcio 0,02 g
Fosfato de Monopotássio 1 g
Fosfato de hidrogênio diamônio 1 g
Nitrato de potássio 1 g
Cloreto Férrico 0,05 g
Água destilada / Água produzida * (q.s.p.) 1000 ml
*Água produzida utilizada na extração de petróleo em Panelas (SE)
2.2. Para isolamento de estirpes degradadoras e/ou halotolerantes
As estirpes foram semeadas em seis meios distintos: LB (‘Luria-Bertani Broth’;
Schleif & Wensink,1981), LB acrescido de 7% de NaCl, TBN (Seldin & Penido, 1986),
TBN acrescido de 7% de NaCl, TSB (‘Trypticase Soy Broth’ – Difco) e TSB acrescido de
7% de NaCl. As estirpes foram estocadas em tubos de agar inclinado contendo o meio no
qual foram isoladas.
2.2.1. Meio LB (‘Luria-Bertani Broth’) pH 7,2
37
2.2.2. Meio TBN (Tiamina/Biotina/Nitrogênio) pH 7,2
Glicose 10 g
Extrato de Levedura 1 g
MgSO
4
.7 H
2
O (10% em H
2
O) 2 ml
Tiamina (0,1% em H
2
O) 1 ml
Biotina (0,1% em H
2
O) 1 ml
Solução de Micronutrientes 1 ml
NaOH, 2N 2 ml
Azul de bromotimol (0,5% em etanol) 1 ml
Água destilada q.s.p. 1000 ml
A solução de micronutrientes foi preparada em água destilada contendo H
3
BO
3
a
0,29%, ZnSO
4
.7H
2
O a 0,022%, MnCl
2
.4H
2
O a 0,18% e CuSO
4
.5H
2
O a 0,008%. Após a
autoclavação a 121°C por 15 min, foi adicionado ao meio uma solução de K
2
HPO
4
a 8%,
pH 8,0, na proporção de 10 ml/l (1% do volume do meio).
Triptona 10 g
Extrato de levedura 5 g
NaCl 5 g
Água destilada q.s.p. 1000 ml
38
2.2.3. Meio TSB (‘Trypticase Soy Broth’ – Difco) pH 7,3
Trypticase Soy Broth 30 g
Água destilada q.s.p. 1000 ml
Para a confecção dos meios LB/ NaCl 7%, TSB/ NaCl 7% e TBN/ NaCl 7% , os
meios LB, TSB e TBN, respectivamente, foram acrescidos de 70 g de NaCl e, então,
avolumados para 1000 ml.
Para a solidificação dos meios de cultura, foram acrescentados 12 g de ágar para
cada 1000 ml de meio.
3.Soluções
3.1. Solução de Acrilamida/ Bis-acrilamida 40%
Acrilamida 38,93 g
Bis-acrilamida 1,07 g
Água Milli-Q q.s.p. 100 ml
A acrilamida foi dissolvida em 30% do volume final de água Milli-Q. A bis-
acrilamida foi acrescentada aos poucos, e o volume completado com água Milli-Q. A
39
solução foi filtrada em membrana Millipore de 0,45 µm e estocada a 4°C em frasco
âmbar.
3.2. Solução corante de corrida para eletroforese de DNA em gel de agarose
Glicerol 50 ml
EDTA, pH 7,5 20 mM
Azul de bromofenol 0,05 g
Xileno cianol 0,05 g
Água destilada q.s.p. 100 ml
3.3. Solução corante de corrida para DGGE
Glicerol 70% (v/v)
Azul de bromofenol 0,05% (p/v)
Xileno cianol 0,05% (p/v)
Água Milli-Q q.s.p. 100 ml
40
3.4. Solução corante de gradiente para DGGE
Azul de bromofenol 0,5% (p/v)
Xileno cianol 0,5% (p/v)
Tampão TAE 50x 2 ml
Água Milli-Q q.s.p. 100 ml
3.5. Solução 0% desnaturante – gel de acrilamida 6%
Solução de Acrilamida/Bis-acrilamida 40% 15 ml
Tampão TAE 50x 2 ml
Água Milli-Q q.s.p. 100 ml
A solução foi filtrada em membrana Millipore de 0,45 µm e estocada a 4°C em
frasco âmbar.
3.6. Solução 100% desnaturante– gel de acrilamida 6%
Solução de Acrilamida/Bis-acrilamida 40% 15 ml
Tampão TAE 50x 2 ml
Formamida deionizada 40 ml
Uréia 42 g
Água Milli-Q q.s.p. 100 ml
41
A solução foi filtrada em membrana Millipore de 0,45 µm e estocada a 4°C em
frasco âmbar.
3.7. Solução de persulfato de amônio
A solução de persulfato de amônio foi preparada em água Milli-Q em uma
concentração final de 100 mg/ml e estocada a -20°C.
3.8. Solução de formamida deionizada
Resina AG501-X8 da (Bio-Rad) 5 g
Formamida 100 ml
A resina foi adicionada à formamida e colocada sob agitação em placa por
aproximadamente 1 h. Em seguida, a solução foi filtrada em papel de filtro Whatman n° 4 e
estocada em frasco âmbar a temperatura ambiente.
42
4.Tampões
4.1. Tampão TAE 50x
Tris 2M
Ácido acético glacial 1M
EDTA 0,5 M pH 8,0 50 mM
pH 7,8
4.2. Tampão TEB
Tris 89 mM
EDTA 2,5 mM
H
3
BO
3
89 mM
pH 7,8
43
5.Avaliação direta da diversidade bacteriana em ambientes contaminados com óleo e
água de produção
5.1. Extração de DNA total da comunidade microbiana
Triplicatas de 0,5 g de solo dos diferentes pontos e do solo controle foram
submetidas ao método direto de extração de DNA total através de lise mecânica. Para tal,
foi utilizado o “kit” de extração de DNA para solo (FastDNA Spin Kit for Soil) da
BIO101 (Califórnia, EUA).
As triplicatas de DNA extraídas do solo de cada amostra foram aplicadas a um gel
de agarose 0,8% (p/v) em tampão TEB (Tris-EDTA-ácido bórico) para a realização de uma
eletroforese horizontal. Foi utilizada uma corrente elétrica de 8 V por cm em tampão TEB,
durante aproximadamente 2 horas, com o objetivo de analisar a pureza e qualidade das
amostras de DNA extraídas. As amostras foram misturadas a uma solução corante para
eletroforese de DNA em gel de agarose na proporção de 1:3 antes da aplicação no gel. O
marcador de peso molecular utilizado foi o “1Kb Plus DNA Ladder” (Promega ).
Ao final da corrida eletroforética, o gel foi incubado à temperatura ambiente durante
aproximadamente 20 minutos em uma solução de brometo de etídio (2 µg/ml) para ser
corado e, em seguida, observado e fotografado sob luz UV no sistema de análise de
imagens IMAGO (B &L, Holanda).
44
5.2. Amplificação do gene que codifica o rRNA 16S por PCR
Os fragmentos do DNA ribossomal 16S, amplificados a partir das amostras de DNA
total extraídas do solo, foram obtidos através da Reação da Polimerase em Cadeia (PCR)
usando um par de iniciadores baseados no gene de E. coli, sendo o U968f-GC1 (grampo
GC + 5’ ACC GCG AAG AAC CTT AC 3’) homólogo à região 968-984 do gene para
rRNA 16S e o L1401r (5’ GCG TGT GTA CAA GAC CC 3’) homólogo à região 1384-
1401 do mesmo gene (Heuer & Smalla, 1997). As reações de amplificação foram realizadas
em tubos, com o volume final de 50 µl, contendo uma mistura de tampão da enzima Taq-
polimerase 1x [10 mmol de tampão Tris-HCl (pH 8,3) e 10 mmol de KCl], 5 mM de
MgCl
2
, 200 µmol de cada desoxinucleotídeo trifosfato (dNTP), 20 ρmol de cada iniciador,
5 µg de BSA, 2,5 U da enzima Taq-polimerase, 1µl (50 a 100 ng) de DNA e água Milli-Q
estéril. O ciclo aplicado foi: um ciclo de desnaturação de 3 min a 94°C, seguido de 35
ciclos de 1 min a 94°C, 1 min e 30 s a 55°C e 1 min a 72°C e da extensão a 72°C por 10
min (Heuer & Smalla, 1997).
Para confirmar se o rDNA foi efetivamente amplificado na reação de PCR, os
fragmentos obtidos foram aplicados em gel de agarose 1,2% (p/v) em tampão TEB para a
realização de uma eletroforese horizontal. Foi utilizada uma corrente elétrica de 8V por cm
em tampão TEB durante aproximadamente 2 horas. Os produtos de PCR foram misturados
a uma solução corante para eletroforese de DNA em gel de agarose na proporção de 1:3
antes da aplicação no gel. O marcador de peso molecular utilizado foi o “1Kb Plus DNA
Ladder” (Promega).
45
Ao final da corrida eletroforética, o gel foi incubado à temperatura ambiente
durante, aproximadamente, 20 minutos em uma solução de brometo de etídio (2 µg/ml)
para ser corado e, em seguida, observado e fotografado sob luz UV no sistema de análise de
imagens IMAGO (B&L, Holanda).
5.3. Eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE)
Para estimar e avaliar a estrutura da comunidade bacteriana presente nos solos dos
pontos 1, 2, 3 e controle, foi realizada a eletroforese em gradiente de gel desnaturante
(DGGE) dos produtos do PCR- rDNA 16S obtidos.
Os fragmentos de PCR preparados com grampos GC foram separados em um gel de
poliacrilamida 6%, com um gradiente linear de 40-70% dos agentes desnaturantes uréia e
formamida (100% de desnaturantes correspondem a 7 M de uréia e 40% de formamida
deionizada). Foram aplicados 20 µl da amostra de PCR, adicionada de 10 µl de corante de
corrida para DGGE, em cada poço do gel e a corrida foi realizada a 60°C no sistema
“Dcode Universal Mutation Detection System” da Bio-Rad (Richmond, USA) a 75 V por
aproximadamente 16 h. O gel foi corado por aproximadamente 40 min com SYBR Green I
(Molecular Probes) na ausência de luz, exposto à luz UV e digitalizado em sistema IMAGO
(B&L).
46
5.4. Análise estatística dos perfis de DGGE
Os perfis de bandas obtidos nos géis de DGGE foram analisados com o auxílio do
programa “Image Quant” a partir da imagem digitalizada pelo sistema IMAGO (B&L).
Para a comparação entre as bandas presentes nas diferentes amostras, foram construídas
matrizes baseadas na presença e ausência de bandas nos perfis de DGGE. A partir destas
matrizes, foram construídos dendrogramas através do “software” NTSYS – 2.02,
utilizando-se o coeficiente de similaridade de Pearson e o método UPGA.
5.5. Clonagem e seqüênciamento do DNA presente nas bandas de DGGE
Bandas importantes do gel de DGGE foram retiradas do gel com o auxílio de
ponteiras estéreis e os DNAs presentes nas bandas foram eluídos em 50 µl de água
destilada estéril a 4°C durante uma noite. Foi realizado, posteriormente, o DGGE das
amostras dos DNAs obtidos a partir das bandas eluídas, que foram reamplificadas por PCR
nas mesmas condições descritas anteriormente. Os produtos de PCR que apresentaram
bandas individuais foram purificados com a utilização do kit de purificação comercial
“Wizard
TM
Rapid PCR Purification System” (Promega®). Posteriormente, 3 µl dos
produtos purificados foram então ligados ao vetor pGEM-T Easy, a 4ºC durante uma noite,
segundo as recomendações do fabricante do kit “pGEM-T Easy Vector Systems”
(Promega®). Em seguida, células competentes de Escherichia coli JM109 foram
transformadas de acordo com as instruções do mesmo fabricante. Após a transformação, as
células foram mantidas em meio LB por 1,5 h, a 37ºC sob agitação. Uma quantidade de 70
47
µl de cada cultura foi semeada em placas contendo meio LB com ampicilina (100 µg/ml),
nas quais foram previamente espalhados sobre a superfície 100 µL da solução de IPTG (24
µg/ml) e 20 µL da solução de X-gal (50 mg/ml). Em seguida, as placas foram incubadas a
37ºC por 24 horas. Após este período as colônias brancas (contendo os insertos de rDNA
16S) foram selecionadas. Para a confirmação da presença do inserto nos clones, foi feita
uma reação de PCR diretamente da colônia, utilizando-se os iniciadores M13f (5’ GTA
AAA CGA CGG CCA G 3’) e M13r (5’ CAG GAA ACA GCT ATG AC 3’). Após a
confirmação, os produtos da reação foram seqüenciados em um seqüenciador automático
ABI Prism 3100. O seqüenciamento foi realizado por membros da EMBRAPA/CNPMS,
Sete Lagoas, MG.
5.6. Análise das seqüências clonadas
Após o seqüenciamento dos clones, as seqüências obtidas foram comparadas com as
presentes no GenBank e foi feita a análise filogenética para a determinação dos parentes
evolucionários mais próximos das seqüências parciais do gene que codifica o rRNA 16S.
Para tal, foi realizada uma busca no Banco de Dados (GenBank) usando-se o programa
BLAST (Altschul et al., 1997).
48
6.Avaliação indireta da diversidade bacteriana em ambientes contaminados com óleo
e água de produção
6.1. Isolamento de bactérias halofílicas ou halotolerantes degradadoras de
hidrocarbonetos
Para isolar bactérias degradadoras de óleo halotolerantes ou halofílicas, 5 g de solo
das amostras dos pontos 1, 2 e 3 foram adicionados, separadamente, em Erlenmeyers
contendo 45 ml de meio Bushnell-Haas preparado com água de produção (a mesma
utilizada na recuperação secundária de petróleo na área de Panelas) ou água destilada e
suplementado com aproximadamente 500 µl de óleo extraído no campo petrolífero de
Carmópolis (SE). Esses sistemas foram incubados durante 7 dias e sob agitação a 28°C.
Ao término do período de incubação, foi feita outra cultura de enriquecimento. Para
tal, 1 ml proveniente do enriquecimento com água de produção ou água destilada de cada
local foi adicionado em diferentes Erlenmeyers contendo meio Bushnell-Haas, preparado
com água de produção ou água destilada, suplementado com 500 µl de óleo extraído na
região de Carmópolis (SE). Esses sistemas foram incubados também durante 7 dias e sob
agitação a 28°C.
Concluídas as etapas de enriquecimento, cada amostra foi plaqueada em seis
diferentes meios de cultura: TSB, TSB + 7% de NaCl, LB, LB + 7% de NaCl, TBN e TBN
+ 7% de NaCl. As amostras plaqueadas nos dois últimos meios foram pasteurizadas (a
80°C/ 10 min) para selecionar bactérias formadoras de endósporos. Todas as placas de Petri
foram incubadas a 32°C por 48-72 h.
49
Após o período de incubação, as colônias crescidas nos diferentes meios,
provenientes de cada ponto, foram testadas em relação ao potencial de degradação e
halotolerância. Aquelas que apresentaram o perfil desejado foram identificadas fenotipica e
genotipicamente.
6.2. Teste de degradação de hidrocarbonetos
Após o isolamento das colônias de cada ponto do local contaminado nos diferentes
meios foi realizado o teste de degradação de óleo em microplacas de 24 poços. Em cada
poço foram adicionados: 1800 µl de meio Bushnell-Haas (preparado em água destilada),
200 µl da cultura da amostra bacteriana a ser testada e 20 µl de óleo. Sistemas semelhantes
foram feitos utilizando 1800 µl do meio Bushnell-Haas preparado com água de produção,
200 µl da cultura da estirpe a ser testada e 20 µl de óleo a fim de testar também a
halotolerância das estirpes isoladas.
6.3. Testes fenotípicos
As estirpes isoladas com capacidade de degradar hidrocarbonetos e capazes ou não
de tolerar a salinidade da água de produção foram identificadas fenotipicamente através da
coloração de Gram e da curva de halofilia.
Para a realização da curva de halofilia foi testada a capacidade das amostras
isoladas de crescer em concentrações diferentes de NaCl. Para tal, as amostras pré-
selecionadas de acordo com a capacidade de degradar óleo foram crescidas inicialmente em
50
5 ml de meio LB, que contém 0,5% de NaCl, durante 48 h a 32°C para a obtenção do pré-
inóculo. Em seguida, 100 µl do pré-inóculo foram transferidos para tubos de ensaio
contendo 5 ml do meio LB com diferentes concentrações de NaCl ( 2; 4; 5,5; 7; 10; 12; 15 e
17 %) e incubados a 32°C/ 48h. A turvação do meio observada após o período de incubação
foi interpretada como crescimento positivo da amostra testada. Todas as amostras
selecionadas para este experimento foram comparadas com um controle negativo
representado por um tubo de ensaio contendo somente o meio LB na concentração de NaCl
a ser testada, incubado sob as mesmas condições de tempo e temperatura das amostras.
6.4. Análise da restrição do DNA ribossomal amplificado (ARDRA)
Além dos testes fenotípicos, foi realizada uma análise da diversidade entre as
estirpes selecionadas através da análise da restrição do DNA ribossomal amplificado
(ARDRA). Para isso, o DNA dessas estirpes foi extraído de acordo com Seldin & Dubnau
(1985). Em seguida, o gene que codifica o rRNA 16S (gene rrs) de cada estirpe foi
amplificado utilizando-se os iniciadores universais pA (5’AGA GTT TGA TCC TGG
CTC AG 3’) e pH (5’ AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA 3’) descritos por Massol-
Deya e colaboradores (1995).
Cada reação foi realizada em um volume final de 50 µl em tubo contendo 10 µl do
tampão de PCR 10x da Promega, 1,5 mM de MgCl
2
, 1,5 mM de cada um dos quatro
desoxinucleotídeos trifosfatados, 1 µM de cada iniciador, 2,5 U de Taq DNA polimerase,
1 µl de DNA e água bidestilada estéril q.s.p. 50 µl. O ciclo aplicado foi: 1x (2 min a
51
94°C); 35x (1 min e 10 seg a 92°C; 30 seg a 48°C; 2 min e 10 seg a 72°C); 1x (2 min a
72°C) ; 4°C.
Após a amplificação, a digestão dos produtos de PCR foi feita com as seguintes
enzimas de restrição: HinfI, HaeIII e RsaI. Os produtos foram incubados com as enzimas
por 24 h na temperatura ótima de cada enzima, conforme o protocolo do fabricante.
Transcorrido o tempo de incubação, foi realizada uma eletroforese em gel de agarose
1,4% do produto da digestão por 4 h a 80 V.
Ao final da corrida eletroforética, o gel foi incubado à temperatura ambiente
durante, aproximadamente, 20 minutos em uma solução de brometo de etídio (2 µg/ml)
para ser corado e, em seguida, observado e fotografado sob luz UV no sistema de análise de
imagens IMAGO (B&L, Holanda).
A partir do perfil de restrição das bandas foi construída uma matriz de presença e
ausência. Esta matriz deu origem a um dendrograma, através do auxílio do “software”
NTSYS – 2.02, para permitir a visualização de grupos distintos entre as amostras de cultura
pura.
7.Teste de antagonismo
Para verificar se as amostras bacterianas halotolerantes degradadoras de óleo, que
foram isoladas a partir do solo contaminado de Panelas, eram capazes de produzir
substâncias antimicrobianas que pudessem ocasionar a inibição umas das outras foi
realizado o teste de antagonismo. Para tal, ao menos uma amostra bacteriana de cada grupo
foi crescida por 48 h a 32°C em 5 ml de meio LB líquido. Em seguida, foram feitos ‘spots’
52
de 5 µl das amostras a serem testadas como produtoras de substâncias antimicrobianas em
placas de Petri de vidro contendo meio LB sólido. Então, após a incubação durante 48 h a
32°C, as bactérias foram mortas com vapor de clorofórmio colocando-se algodões
embebidos em clorofórmio durante 20 minutos na tampa das placas inoculadas. Decorridos
os 20 minutos, os algodões foram retirados e as placas ficaram abertas durante 15 minutos
para que o clorofórmio evaporasse completamente.
Na etapa seguinte, 3 ml do meio LB semi-sólido (0,6% de agar) foi adicionado de
200 µl da amostra bacteriana indicadora previamente crescida e vertido sobre as placas de
Petri contendo os ‘spots’ das bactérias mortas. Posteriormente, estas mesmas placas foram
incubadas durante 48 h a 32°C e foi observada a formação de halos de inibição quando a
estirpe indicadora foi inibida pela amostra produtora da substância antimicrobiana que se
difundiu no ágar.
8.Análise das diferentes amostras do solo
Para estabelecer uma correlação entre o nível de contaminação e a prevalência de
diferentes populações bacterianas foi realizado o teste dos hidrocarbonetos totais do
petróleo (TPH) utilizando as amostras de solo de cada um dos três pontos da região
contaminada de Panelas (Carmópolis – SE). Os testes de TPH foram realizados por
membros da EMBRAPA solos e do CENPES/ Petrobras. Além disso, testes de
caracterização do solo (classe textural, micronutrientes, fertilidade e os teores totais de
diversos elementos) foram realizados por membros do Laboratório de Análise de Solo,
Planta e Resíduos (LABFER) no Departamento de Solos da Universidade Federal Rural do
Rio de Janeiro.
53
RESULTADOS
Inicialmente, foram realizadas as análises do solo do local afetado pelos poluentes.
Esta avaliação foi importante para correlacionar a presença da mistura de óleo cru com
água de produção no solo de Panelas com as mudanças ocorridas na diversidade da
comunidade bacteriana do local.
1.Análise das diferentes amostras do solo
Para quantificar o óleo presente nas amostras de solo dos pontos 1, 2 e 3 e do solo
controle foi realizada a dosagem dos Hidrocarbonetos Totais do Petróleo (TPH) por
membros do CENPES/ Petrobras. O solo do ponto 3 foi aquele no qual a maior
concentração de hidrocarbonetos foi detectada e o controle apresentou as menores
concentrações do poluente. Os valores de TPH de cada amostra de solo podem ser
observados na Tabela 2.
Local
TPH 2 (ppm)
Controle 81,3
Ponto 1 182,0
Ponto 2 259,2
Ponto 3 285,0
Tabela 2 – TPH das amostras de solo dos diferentes pontos e controle.
54
Além disso, o solo da região de Panelas foi caracterizado, por membros da
EMBRAPA solos, quanto à sua classe textural como franco-argiloarenoso tendo como base
as porcentagens de areia, silte argila total e argila natural (Tabela 3).
Outras características analisadas foram: micronutrientes (Tabela 4), os teores totais
de diversos elementos (Tabela 5) e fertilidade (Tabela 6) do solo de Panelas (Carmópolis –
SE).
Componentes %
Areia 66
Silte 12
Argila total 22
Argila natural 7
Elementos Micronutrientes (mg/kg)
Fe 312
Cu 0,8
Zn 2
Mn 3,8
Tabela 3 – Análise dos componentes do solo
Tabela 4 – Teores trocáveis - Micronutrientes do solo de Panelas (SE)
55
Elementos g/kg
N 3,18
P
2
O
5
0,69
P 0,3
K
2
O 1,2
K 1
Ca 1,04
Mg 0,63
Fe 5,52
Cu 0,004
Zn 0,016
Mn 0,020
Tabela 5 – Teores totais dos elementos presentes no solo de Panelas (SE)
56
pH do solo: 4,6
Elementos Cmol
c
/ dm³ mg/l %
Na 0,17 - -
Ca 2,7 - -
Mg 1,2 - -
K 0,22 - -
H+Al 8,5 - -
Al 0,3 - -
S 4,29 - -
T 12,79 - -
V - - 34
P - 6 -
K - 86 -
Carbono orgânico - - 2,53
Saturação por Al - - 2,345
Saturação por Na - - 1
Tabela 6 – Fertilidade do solo de Panelas (SE)
57
2. Avaliação direta da diversidade bacteriana em ambientes contaminados com óleo e
água de produção
2.1. Avaliação da estrutura da comunidade bacteriana presente nos solos através
da técnica de DGGE
Como descrito anteriormente, foram realizadas: a extração direta de DNA dos solos
(com e sem contaminação), a amplificação do material genético obtida com iniciadores
universais para o gene que codifica o rRNA 16S e a eletroforese em gel de gradiente
desnaturante (DGGE) para a comparação da diversidade bacteriana existente entre as
comunidades das amostras de solo dos pontos 1, 2 e 3 e do solo controle (Figura 4).
58
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Figura
4
–
Eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) para avaliação das
comunidades bacterianas presentes nos solos. Solo controle [2, 3 e 4], solos dos pontos 1
[5, 6 e 7], 2 [8, 9 e 10] e 3 [11, 12 e 13]. Kb Ladder [1 e 14]. As setas indicam as bandas
que foram cortadas para posterior seqüenciamento.
1
2
3
4
5
6
59
Através da visualização dos perfis de bandas apresentados no DGGE (Figura 4) é
possível observar que as comunidades bacterianas dos solos contaminados variaram em
relação às do solo controle. Além disso, no mesmo gel, nota-se o desaparecimento de
algumas bandas, bem como a seleção de outras.
As bandas 1 e 3, apresentadas na figura 4, foram cortadas do gel de DGGE e
eluídas. Os DNAs eluídos a partir das bandas foram amplificados através de PCR utilizando
o par de iniciadores pA e pH e os produtos obtidos foram clonados em vetor pGEM-T Easy
e seqüenciados. Em seguida, as seqüências obtidas foram comparadas a seqüências pré-
existentes no GenBank e com o auxílio do programa BLAST foi realizada a análise
filogenética para identificação do parente evolucionário mais próximo.
A banda 1 apresentou uma similaridade de 98% com Paenibacillus sp. Esta banda
foi também observada no perfil de DNA amplificado das triplicatas da amostra de solo
controle, no qual não havia o impacto da mistura de óleo e água de produção. Entretanto,
esta mesma banda não foi detectada nos perfis das amostras dos solos de diferentes pontos
de contaminação.
A banda 3 apresentou similaridade de 93% com Frankia sp. sendo detectada nos
perfis das amostras de solo dos pontos 1 e 2, que apresentaram respectivamente,
concentrações de TPH (Tabela 2) equivalentes a 182 ppm e 259,2 ppm. Entretanto, a banda
3 não apareceu nos perfis das triplicatas da amostra de solo do ponto 3 e nem nos perfis da
amostra do solo controle.
As bandas 2, 4, 5 e 6 encontram-se em fase de seqüenciamento e, portanto, ainda não
foram identificadas. Apesar disso, é possível observar na Figura 2, que as bandas 2 e 4
estão presentes nos perfis das amostras do solo controle e dos solos dos pontos 1 e 2,
desaparecendo, entretanto, nos perfis das amostras do solo 3. Já a banda 5 pôde ser
60
observada nos perfis das amostras de solo dos pontos 2 e 3 e a banda 6 aparece somente nos
perfis das triplicatas da amostra de solo do ponto 3.
2.2. Análise estatística dos perfis de DGGE
Com base nos perfis de DGGE das comunidades bacterianas de cada ponto de coleta,
utilizando 21 marcadores correspondentes ao número de bandas diferentes encontradas no
gel, foi construído um dendrograma (figura 5) no qual foi possível observar que as
triplicatas de cada ponto são mais próximas entre si formando subgrupos. O ponto 3
apresentou uma comunidade menos diversa o que pôde ser observado no perfil das
amostras do ponto 3, que apresentaram um menor número de bandas e agruparam-se, no
dendrograma, separadamente das amostras do controle e do ponto 1. O ponto 2 foi aquele
que apresentou amostras com o maior número de bandas e, por tal razão foi o que ficou
mais distante dos outros perfis apresentando maior diversidade. Vale ressaltar, que o ponto
2 foi o local de coleta onde o terreno era inclinado e que, possivelmente, este ponto ficou
menos tempo sob a influência dos contaminantes. Assim, a presença de um maior numero
de bandas nos perfis da amostra do ponto 2 em relação aos demais perfis pode estar
relacionado a esta característica física do local.
61
Figura
5
–
Dendrograma construído pelo método de UPGA. A escala representa
o coeficiente de similaridade de Pearson, baseando-se na presença e na ausência
de bandas nos perfis de DGGE das comunidades bacterianas presentes no solo
controle e nos solos dos pontos 1, 2 e 3.
Tree Diagram for Variables
Unweighted pair-group average
1-Pearson r
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
Linkage Distance
P2(2)
P2(3)
P2(1)
P3(3)
P3(2)
P3(1)
P1(2)
P1(3)
P1(1)
Cont(3)
Cont(2)
Cont(1)
62
3.Avaliação indireta da diversidade bacteriana em ambientes contaminados com óleo
e água de produção
3.1. Isolamento de bactérias halofílicas ou halotolerantes degradadoras de
hidrocarbonetos
Em relação à avaliação indireta das comunidades presentes nas amostras de solo
foram isoladas 131 amostras, representadas por colônias morfologicamente distintas ou
isoladas de locais diferentes (pontos 1, 2 ou 3), que foram selecionadas em diferentes meios
(LB, LB + 7% NaCl, TSB, TSB + 7% NaCl, TBN e TBN + 7% NaCl). Estas colônias
foram obtidas após o plaqueamento das culturas de enriquecimento em meio Bushnell-Haas
preparado com água destilada ou meio Bushnell-Haas preparado com água de produção
(adicionados de óleo). Na Tabela 7, pode-se observar o número de amostras isoladas, a
partir do plaqueamento das culturas de enriquecimento das amostras de solo dos pontos de
coleta 1, 2 e 3, nos diferentes meios de cultura.
63
Tabela 7 - Amostras dos diferentes pontos de coleta
Meio de isolamento Ponto de coleta N° de amostras isoladas
1 18
2 10
TSB
3 13
1 3
2 8
TSB + 7% NaCl
3 8
1 21
2 21
LB
3 18
1 2
2 3
LB + 7% NaCl
3 2
1 2
2 1
TBN
3 1
Do total de 131 amostras bacterianas, 46, 43 e 42 foram isoladas a partir das
culturas de enriquecimento dos pontos 1, 2 e 3, respectivamente. Além disso, mais amostras
foram isoladas quando plaqueadas em meios contendo baixa concentração de NaCl. O meio
LB foi o mais eficiente no isolamento de amostras bacterianas morfologicamente
diferentes, apresentando um número de 60 isolados (45,8% do total).
64
3.2. Teste de degradação de hidrocarbonetos
Todas as 131 amostras isoladas foram submetidas ao teste de degradação do óleo de
Carmópolis em microplacas de 24 poços. Neste teste, as amostras foram inoculadas em
meio Bushnell-Haas, preparado com água destilada ou água de produção, adicionado de
óleo. Após uma semana, foi possível observar o crescimento bacteriano e a degradação do
óleo por amostras capazes de degradar hidrocarbonetos presentes no óleo cru extraído no
campo de Carmópolis. A Figura 6 exemplifica uma microplaca contendo óleo que foi
degradado por diferentes isolados.
Figura
6
-
Teste de degradação
de hidrocarbonetos presentes no óleo cru de
Carmópolis. [A1] Controle negativo; [A2] LBO 2.15; [A3] LBO 2.17; [A4] LBO a;
[A5] LBO 3.25; [A6] DLB 1.4; [B1] DLB 1.5; [B2] DLB 1.7; [B3] DLB 2.1; [B4]
DLB 2.6; [B5]DLB 3.4; [B6] DTSB 1.1; [C1] DTSB 1.2; [C2] DTSB 1.3; [C3]
DTSB 1.5; [C4] DTSB 1.6; [C5] DTSB 1.7; [C6] DTSB 2.3; [D1] DTSB 2.6; [D2]
DTSB 3.1; [D3] DTSB 3.3; [D4] DTSB 3.6; [D5] DTSB 3.8; [D6] TSBP 1.6.
1 2 3 4 5 6
A
B
C
D
65
Após os testes de degradação, concluiu-se que 22 amostras isoladas a partir dos
diferentes pontos de coleta e em diferentes meios de cultura foram capazes de degradar o
óleo na presença da água de produção (com salinidade de aproximadamente 7%) (Tabela
8). A Figura 7 resume o processo de triagem das 22 amostras capazes de degradar óleo na
presença da água de produção.
Enriquecimento usando
meio BH + água produzida
57
74
Teste de degradação
utilizando meio BH +
água produzida
7
15
Enriquecimento usando
meio BH + água destilada
Figura
7
– Esquema da triagem das 22 amostras degradadoras de óleo e tolerantes à água de
produção que foram isoladas a partir de duas culturas de enriquecimento diferentes.
22
66
3.3. Testes fenotípicos
As amostras bacterianas que apresentaram capacidade de degradar óleo na presença
da água de produção foram selecionadas para o estudo fenotípico. Estas amostras foram
nomeadas de acordo com as culturas de enriquecimento de origem (‘D’ para os isolados da
cultura em meio Bushnell-Haas preparado em água destilada e ‘P’ para os isolados da
cultura em meio Bushnell-Haas preparado em água de produção) e também de acordo com
os meios dos quais foram isoladas (TSB e LB). A numeração que segue o nome das
amostras representa o ponto de coleta do solo e a colônia isolada a partir do plaqueamento
(Ex: DLB 1.1 – colônia 1 isolada a partir da cultura de enriquecimento do solo do ponto 1
em meio Bushnell-Haas preparado com água destilada). Os testes utilizados para a análise
fenotípica foram a coloração de Gram e a curva de halofilia. Somente um bastonete Gram-
negativo, amostra DLB 1.7 (Figura 8), foi encontrado dentre as amostras isoladas. Além
disso, foram encontrados cocos, como, por exemplo, na amostra DLB 1.4 (Figura 9),
cocobacilos e bastonetes Gram-positivos. Mais detalhes sobre a classificação morfo-
tintorial das amostras degradadoras de óleo resistentes a altas concentrações de sal podem
ser encontrados na Tabela 8.
67
Figura
8
–
Bastonetes Gram-
negativos. Amostra bacteriana DLB
1.7 corada pelo método de Gram e
visualizada ao microscópio óptico
com o aumento de 100 x.
Figura 9
–
Cocos Gram-positivos.
Amostra bacteriana DLB 1.4
corada pelo método de Gram e
visualizada ao microscópio óptico
com o aumento de 100 x.
68
Crescimento em diferentes concentrações de NaCl
Degradadoras
Gram
2%
4%
5,5%
7% 10% 12% 15% 17%
DTSB 1.1 Cocos Gram + + + + + + + - -
DTSB 1.6 Cocos Gram + + + + + + w - -
DTSB 2.3 Cocos Gram + + + + + + w - -
DTSB 2.5 Bastonetes Gram +
+ + + + + w - -
DTSB 3.4 Bastonetes Gram + + + + + + + w -
DTSB 3.5 Bastonetes Gram + + + + + + + w -
DTSB 3.6 Bastonetes Gram + + + + + + w - -
DLB 1.1 Cocos Gram + + + + + + w - -
DLB 1.2 Cocos Gram + + + + + + w - -
DLB 1.4 Cocos Gram + + + + + + - - -
DLB 1.7 Bastonetes Gram - + + + + + w - -
DLB 1.8 Cocos Gram + + + + + + w - -
DLB 1.9 Cocos Gram + + + + + + w - -
DLB 1.10 Cocos Gram + + + + + + w - -
DLB 1.11 Cocos Gram + + + + + + w - -
DLB 2.6 Cocos Gram + + + + + + - - -
DLB 3.4 Cocobacilo Gram + + + + + + -
-
-
PTSB 1.6 Cocobacilo Gram + + + + + + -
-
-
PLB 1.1 Cocos Gram + + + + + + -
-
-
PLB 1.2 Cocos Gram + + + + + + - - -
PLB 3.1 Cocos Gram + + + + + + - - -
PLB 3.4 Cocos Gram + + + + + + - - -
Tabela
8
– Características fenotípicas das amostras degradadoras de óleo halotolerantes.
Quando observado o crescimento das amostras foi utilizado o símbolo [+] e a ausência de
crescimento das amostras pode ser interpretado na tabela com o símbolo [-]. O símbolo [w]
foi utilizado quando o crescimento das amostras foi observado, porém de forma mais fraca.
69
As amostras DLB 1.1, DLB 1.2, PTSB 1.6, PLB 1.1, PLB 1.2, PLB 3.1 e PLB 3.4
foram isoladas a partir do plaqueamento das culturas de enriquecimento que foram
preparadas com meio Bushnell-Haas em água de produção e adicionadas de óleo. Dentre
elas, três (PTSB 1.6, PLB 1.1 e PLB 1.2) foram isoladas a partir da cultura de
enriquecimento do solo do ponto 1, sendo que a amostra PTSB 1.6 foi obtida após o
plaqueamento em meio TSB e as outras duas em meio LB. Já as amostras PLB 3.1 e PLB
3.4 foram obtidas após o plaqueamento da cultura de enriquecimento do solo do ponto 3 em
meio LB.
As demais amostras foram todas isoladas a partir das culturas de enriquecimento
adicionadas de óleo que foram preparadas com meio Bushnell-Haas em água destilada.
Ainda observando a tabela 8, é possível verificar que a maioria das amostras foram isoladas
a partir deste tipo de cultura de enriquecimento (Bushnell-Haas + água destilada) utilizando
os solos dos três pontos (1, 2 ou 3).
Comparando o número de amostras isoladas a partir das diferentes culturas de
enriquecimento realizadas com os solos de cada ponto é possível verificar que, do total de
22 amostras, 11 foram provenientes do ponto 1, 3 do ponto 2 e 8 do ponto 3. Outro dado
importante que pode ser visualizado na Tabela 8 é a faixa de crescimento, em diferentes
concentrações de NaCl, obtida por cada amostra. A maioria das amostras (14) foi capaz de
crescer em uma faixa de concentração de NaCl que variou de 2 a 12%. Entretanto, dois
bastonetes Gram-positivos foram capazes de crescer em uma concentração de NaCl
correspondente a 15% e as demais amostras, em sua maioria cocos Gram-positivos,
cresceram em concentrações de NaCl de até 10%.
70
3.4. Testes genotípicos
Para separar as amostras bacterianas selecionadas devido a sua capacidade de
degradar óleo na presença da água de produção em grupos distintos, foi realizado um
ARDRA, como descrito anteriormente. Nas Figuras 10, 11 e 12 podem ser observados os
perfis das digestões do gene que codifica o rRNA 16S das 22 amostras. Essas digestões
foram realizadas utilizando três diferentes enzimas de restrição, HaeIII, HinfI e Rsa I, e
geraram diferentes padrões na corrida eletroforética.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Figura
10
–
ARDRA/
Hae
III
. Perfis da digestão com a endonuclease HaeIII do gene que
codifica o rRNA 16S bacteriano amplificado por PCR. [1] Kb Ladder, [2] DLB 1.1, [3]
DLB 1.2, [4] DLB 1.4, [5] DLB 1.7, [6] DLB 1.8, [7] DLB 1.9, [8] DLB 1.10, [9] DLB
1.11, [10] DLB 2.6, [11] DLB 3.4, [12] DTSB 1.1, [13] DTSB 1.6, [14] DTSB 2.3, [15]
DTSB 2.5, [16] DTSB 3.4, [17] DTSB 3.5, [18] DTSB 3.6, [19] PTSB 1.6, [20] PLB 1.1,
[21] PLB 1.2, [22] PLB 3.1, [23] PLB 3.4.
71
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Figura
11
–
ARDRA/
Hinf
I
. Perfis da digestão com a endonuclease HinfI do gene que
codifica o rRNA 16S bacteriano amplificado por PCR. [1] Kb Ladder, [2] DLB 1.1, [3]
DLB 1.2, [4] DLB 1.4, [5] DLB 1.7, [6] DLB 1.8, [7] DLB 1.9, [8] DLB 1.10, [9] DLB
1.11, [10] DLB 2.6, [11] DLB 3.4, [12] DTSB 1.1, [13] DTSB 1.6, [14] DTSB 2.3, [15]
DTSB 2.5, [16] DTSB 3.4, [17] DTSB 3.5, [18] DTSB 3.6, [19] PTSB 1.6, [20] PLB
1.1, [21] PLB 1.2, [22] PLB 3.1, [23] PLB 3.4.
72
Usando 29 marcadores, correspondentes a todas as bandas diferentes observadas
após a digestão com as três endonucleases de restrição, uma análise de similaridade foi
realizada baseada no UPGMA (‘unweighted pair group method with aritmetic mean’), com
o auxílio do programa NTSYS – 2.02. Esta análise deu origem a um dendrograma
apresentado na Figura 13. Neste dendrograma, 15 grupos genotípicos diferentes de rDNA
16S foram detectados em 100% de similaridade. O bastonete Gram-negativo (amostra DLB
1.7) foi o grupo que ficou mais afastado dos demais, separando-se em 59% similaridade.
Também em 59% de similaridade, o grupo das bactérias Gram-positivas dividiu-se em
outros dois grupos. Um destes grupos foi formado em 100% de similaridade somente por
quatro estirpes (PLB 1.1, PLB 1.2, PLB 3.1 e PLB 3.4) classificadas como cocos Gram-
positivos. Já o outro grupo, formado por cocos, cocobacilos e bastonetes Gram-positivos
Figura
12
–
ARDRA/
RSA
I
. Perfis da digestão com a endonuclease RSAI do gene que
codifica o rRNA 16S bacteriano amplificado por PCR. [1] Kb Ladder, [2] DLB 1.1, [3]
DLB 1.2, [4] DLB 1.4, [5] DLB 1.7, [6] DLB 1.8, [7] DLB 1.9, [8] DLB 1.10, [9] DLB
1.11, [10] DLB 2.6, [11] DLB 3.4, [12] DTSB 1.1, [13] DTSB 1.6, [14] DTSB 2.3, [15]
DTSB 2.5, [16] DTSB 3.4, [17] DTSB 3.5, [18] DTSB 3.6, [19] PTSB 1.6, [20] PLB 1.1,
[21] PLB 1.2, [22] PLB 3.1, [23] PLB 3.4.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
73
subdividiu-se em 65% de similaridade, formando um grupo composto por dois bacilos
Gram-positivos (DTSB 3.4 e DTSB 3.5) e um cocobacilo Gram-positivo. O grupo maior
subdividiu-se em dois subgrupos em 72% de similaridade. Nesta subdivisão, um subgrupo
foi separado em 88% de similaridade e constituído por dois cocos Gram-positivos (DLB
1.1 e DLB 1.2) e dois bacilos Gram-positivos (DTSB 2.5 e DTSB 3.6). O outro subgrupo
separado em 86% de similaridade foi formado por amostras Gram-positivas classificadas
como cocos (em sua maioria) e um cocobacilo (PTSB 1.6). Dentre os cocos do grupo
citado, as amostras DLB 1.9, DLB 1.10 e DLB 1.11 apresentaram 100% de similaridade,
assim como as amostras DTSB 1.1 e DTSB 1.6.
DLB 1.1
DLB 1.2
74
4.Teste de antagonismo
No teste de antagonismo foi escolhida uma amostra bacteriana para representar cada
grupo genotípico gerado pelo ARDRA. Portanto, como foram formados 15 grupos, 15
amostras bacterianas foram testadas quanto à produção e susceptibilidade a substâncias
antimicrobianas. Apenas três estirpes produziram substâncias antimicrobianas que foram
capazes de inibir uma ou mais amostras bacterianas dentre as 14 restantes. A amostra
DTSB 1.6 produziu uma substância antimicrobiana que foi capaz de inibir 7 amostras,
sendo elas: DLB 1.4, DLB 1.8, DLB 2.6, DLB 3.4, DTSB 2.3, DTSB 3.4 e DTSB 3.5. A
amostra DLB 1.9 foi capaz de inibir o crescimento das amostras DLB 1.4 e DLB 1.8. Já a
amostra DLB 1.4 produziu uma substância que inibiu somente a amostra DLB 1.7. A
inibição foi interpretada como um halo transparente formado ao redor da amostra
bacteriana produtora da substância antimicrobiana difundida no ágar. Na Figura 14 é
possível observar a inibição da amostra indicadora DTSB 3.5 pela amostra produtora DTSB
1.6.
Figura
14
–
Teste de antagonismo
.
Um halo transparente indicado pela seta é
observado à volta da amostra produtora de substância antimicrobiana DTSB 1.6
como resultado da inibição da amostra indicadora DTSB 3.5.
75
DISCUSSÃO
A maioria das pesquisas sobre biodegradação de hidrocarbonetos em ambientes que
possuem condições extremas, como, por exemplo, alta salinidade, tem se concentrado nos
hidrocarbonetos do petróleo. Na literatura científica já foi demonstrado que uma grande
quantidade de poluentes orgânicos é mineralizada ou transformada por microrganismos
capazes de crescer na presença de sal (Oren et al., 1992).
O uso de microrganismos capazes de degradar rejeitos orgânicos na presença de sal
poderia diminuir os gastos muitas vezes destinados aos processos de diluição para diminuir
a salinidade dos locais afetados pelo contaminante, ou à remoção do sal por osmose
reversa, troca iônica ou eletrodiálise antes do tratamento biológico (Margesin & Schinner,
2001).
Como citado anteriormente, as bactérias halotolerantes e halofílicas são
microrganismos promissores nos processos de biorremediação de ambientes contaminados
e que apresentam alta salinidade (Oren et al., 1992). Dessa forma, neste estudo, um dos
principais objetivos foi isolar bactérias capazes de degradar o óleo extraído na região de
Panelas (SE) que também apresentassem tolerância à concentração de sais de 7%. Esta
característica revelou-se importante, pois a concentração de sais presente na água de
produção resultante da atividade exploratória do local era equivalente a 7%.
O isolamento de 15 grupos de bactérias genotipicamente diferentes (do total de 22
amostras bacterianas analisadas pelo método de ARDRA) e com as características
explicitadas no parágrafo anterior gerou novas perspectivas para a recuperação biológica da
76
área de Panelas (Carmópolis – SE), que foi degradada pelo impacto do derrame da mistura
de óleo e água de produção.
De acordo com a análise dos componentes do solo, observada na Tabela 3, o solo da
área atingida foi classificado texturalmente como franco-argiloarenoso. Neste caso, a
porcentagem de areia (66%) é maior do que a de outros componentes apresentando uma
alta permeabilidade e proporcionando aos contaminantes uma mobilidade maior. Apesar
disso, o solo também apresentou um percentual de argila total significante (22%) não
permitindo a migração vertical do poluente a uma profundidade maior do que 20 cm. Dessa
forma, conclui-se que a inclinação do local influenciou na movimentação do poluente para
o ponto mais baixo.
Existem vários relatos de microrganismos que possuem a capacidade de oxidar os
hidrocarbonetos do petróleo até mesmo na presença de 30% de sal. Dentre eles podemos
citar o Streptomyces albaxialis degradador de óleo cru (Kuznetsov et al., 1992) e um
membro do grupo Halobacterium capaz de degradar n-alcanos (Kulichevskaya et al.,
1992). Além disso, Ashok, Saxena e Musarrat isolaram, em 1995, quatro estirpes
bacterianas pertencentes aos gêneros Micrococcus, Pseudomonas e Alcaligenes, que foram
capazes de degradar dois tipos de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (naftaleno e
antraceno) na presença de uma concentração de 7,5% de NaCl. Alguns pesquisadores
como, por exemplo, Nicholson e Fathepure (2004) empenharam-se no estabelecimento de
consórcios de bactérias indígenas para a biorremediação de solos com alta salinidade e que
foram contaminados por hidrocarbonetos do petróleo. Em 2004, eles demonstraram a
capacidade de um consórcio de bactérias halotolerantes e halofílicas em degradar os
compostos presentes no BTEX (benzeno, tolueno, etil-benzeno e xileno) sob condições
aeróbicas.
77
Estudos como o de Bento e colaboradores (2005), que comparam diferentes técnicas
de biorremediação como atenuação natural, bioestimulação e bioaumento, comprovam que
o bioaumento com bactérias indígenas é o mais apropriado em processos de biorremediação
de solos contaminados.
Esse dado reforça a importância do isolamento, neste trabalho, das 15 estirpes
bacterianas a partir do local onde ocorreu o derrame acidental, pois as comunidades
bacterianas presentes em solos contaminados tendem a ser dominadas por estirpes que
sejam capazes de sobreviver à toxicidade, utilizar o poluente para o seu crescimento
(Zucchi et al., 2003) e, no caso da presença de grandes quantidades de sal, resistir à
salinidade do ambiente (Margesin & Schinner, 2001).
As estirpes isoladas neste estudo foram classificadas como halotolerantes devido
aos resultados dos testes de tolerância a diferentes concentrações de NaCl. Nestes testes,
diferentes amostras foram capazes de crescer em concentrações distintas que variaram de
2% a 15% de NaCl. Todas as amostras foram capazes de crescer na concentração de 0,5%
de NaCl caracterizando-as como halotolerantes segundo a classificação de Kushner (1978).
As bactérias halofílicas dependem de uma concentração de NaCl igual ou superior a 3%
para o seu crescimento, comportamento que não foi observado em nenhuma das amostras
isoladas. Além disso, todas as amostras foram capazes de crescer, pelo menos, a uma
concentração de 10% de NaCl, que corresponde à uma concentração de sais maior do que a
presente na água de produção derivada do processo de extração de petróleo em Panelas
(SE), que foi derramada acidentalmente no solo junto ao óleo cru. Embora a concentração
exata de sais presente no solo após o acidente seja desconhecida e que fatores climáticos
(ex: períodos de chuva e seca) possam ter alterado a salinidade do local, o isolamento de
bactérias halotolerantes é de grande importância, pois derrames acidentais no ambiente
78
envolvendo água de produção contendo salinidade alta (maiores que 7%) são uma realidade
nos processos de extração e transporte do petróleo.
Diversos pesquisadores, como Ijah e Ukpe (1992), Nazina e colaboradores (2001) e
Cunha e colaboradores (2006), têm relatado a importância do gênero Bacillus, e de gêneros
relacionados, em relação à degradação de hidrocarbonetos do petróleo. Devido ao fato
destas bactérias formarem endosporos resistentes a condições ambientais adversas (ex:
aridez, temperaturas altas e pH baixo) (Nicholson, 2002) esperava-se o isolamento de um
número maior de bacilos neste estudo. Entretanto, apenas 4 bacilos Gram-positivos foram
isolados em meio TSB. Mesmo após a pasteurização (para eliminar as células vegetativas) e
plaqueamento das diferentes culturas de enriquecimento em meio TBN, somente quatro
colônias (crescidas após a germinação de esporos que resistiram à pasteurização) foram
isoladas, porém as mesmas não foram capazes de degradar o óleo cru em microplacas.
É importante ressaltar que foram isoladas, dentre as 15 estirpes bacterianas,
predominantemente bactérias Gram-positivas. Somente uma das estirpes foi classificada
como bastonete Gram-negativo, permanecendo, inclusive, separada em 59% de
similaridade das demais no dendrograma gerado pela análise estatística do perfil de
restrição obtido no teste de ARDRA (Figura 13). Estas 15 estirpes bacterianas encontram-
se ainda em fase de seqüenciamento, razão pela qual não foi possível realizar a análise
filogenética das mesmas.
Complementando o estudo, foi possível determinar também quais das amostras
bacterianas halotolerantes degradadoras de óleo que foram isoladas produziram substâncias
antimicrobianas capazes de inibir as demais. Estes dados são importantes para a obtenção
de um consórcio bacteriano estável onde estes microrganismos possam crescer e atuar em
sinergismo a favor da degradação do óleo e conseqüente descontaminação do ambiente.
79
Amostras como a DTSB 1.6, DLB 1.9 e DLB 1.4 não podem ser combinadas com algumas
das outras amostras isoladas a fim de formar um consórcio e serem utilizadas em processos
de biorremediação. As amostras bacterianas sensíveis às substâncias produzidas e liberadas
pelas amostras citadas acima podem ter o crescimento inibido durante o cultivo em
conjunto inviabilizando a sua aplicação tanto in vitro quanto no meio ambiente.
No presente estudo, foi realizada também a análise direta da comunidade bacteriana
das amostras de solo contaminadas com diferentes concentrações de hidrocarbonetos totais
do petróleo (TPHs). Técnicas microbiológicas tradicionais (ex: plaqueamento, isolamento
de diferentes morfotipos coloniais e identificação dos isolados por testes bioquímicos) têm
sido usadas com grande sucesso na caracterização de espécies microbianas isoladas, mas
não são consideradas suficientes já que apenas uma pequena fração (aproximadamente 1 a
10%) dos microrganismos presentes no ambiente pode ser isolada e caracterizada. A grande
maioria é considerada não cultivável. Além disso, sabe-se pouco a respeito do que
realmente ocorre com a comunidade microbiana do ambiente ao longo do processo de
contaminação e degradação do óleo, e quais as populações que permanecem e/ou são
selecionadas nestas novas condições (Philp et al., 2005).
Através da análise dos perfis do DGGE das comunidades do solo controle e dos
solos dos pontos 1, 2 e 3 foi possível estabelecer uma relação entre concentração de óleo e
diversidade bacteriana. A amostra do solo controle apresentou o menor teor de TPH (81,3
ppm) enquanto as amostras de solo dos pontos 1, 2 e 3 apresentaram valores crescentes de
TPH (respectivamente, 182; 259,2 e 285 ppm). Embora o percentual de óleo presente nas
amostras de solo não tenham sido altos e discrepantes entre si e uma análise estatística não
tenha sido realizada na dosagem do TPH das amostras de solo dos diferentes pontos,
coincidentemente, nos perfis do DGGE que representavam as triplicatas do DNA total do
80
solo controle amplificado através de PCR 16S, a diversidade foi, em geral, maior do que
nos locais contaminados e com teores mais altos de TPH. As triplicatas do DNA total do
solo do ponto 3, também amplificado através de PCR 16S, apresentaram a redução mais
significativa da diversidade. Além disso, a intensidade das bandas nos diferentes perfis do
DGGE foi analisada visualmente e determinadas populações foram selecionadas com o
aumento do teor de TPH do local, gerando bandas fortes nas triplicatas das amostras de
DNA amplificado dos pontos 2 e 3 (ex: bandas 5 e 6 da Figura 4). Outras bandas não
puderam ser mais visualizadas com o aumento do TPH. Acredita-se, portanto, que as
populações selecionadas foram aquelas que apresentaram a capacidade de degradar o óleo
cru, ou sobreviver na sua presença, e que também foram capazes de tolerar a alta salinidade
da água de produção que contaminou o local.
Muitos estudos que utilizaram o DGGE para monitorar a comunidade microbiana
em solos contaminados por hidrocarbonetos do petróleo revelaram resultados que não
seriam obtidos através de métodos convencionais usadas em microbiologia. Por isso, o
DGGE é considerado um método eficiente e econômico para analisar a estrutura e a
diversidade dessas comunidades. Outra vantagem do DGGE é que ele possui uma resolução
maior do que outros métodos para análise de comunidades e, além disso, possibilita o corte
das bandas do gel para fins de seqüenciamento (Philp et al., 2005).
Neste estudo, através do DGGE foi possível identificar a banda 1 do DGGE (Figura
4) e observar que a população de Paenibacillus sp. representada pela mesma apareceu
somente nos perfis das triplicatas de solo controle. Apesar do gênero Paenibacillus estar
comprovadamente relacionado à degradação de hidrocarbonetos do petróleo como, por
exemplo, o fenantreno (Meyer et al., 1999), a população de Paenibacillus sp. foi afetada
negativamente pela contaminação do solo dos pontos 1, 2 e 3 com a mistura de óleo e água
81
de produção. Inclusive não existem evidências, apesar da análise filogenética das culturas
puras não estar concluída, de isolamento de bacilos Gram-positivos que possam ser
identificados como pertencentes ao gênero Paenibacillus a partir das culturas de
enriquecimento dos pontos 1, 2 e 3.
A banda 3, presente na Figura 4 (DGGE), não pode ser identificada pois não
apresentou similaridade maior ou igual a 97% com nenhuma das seqüências presentes no
GenBank. Entretanto, o parente evolucionário mais próximo encontrado foi Frankia sp.,
apresentando 93% de similaridade. Esta banda somente foi encontrada nos perfis das
triplicatas dos solos contaminados com óleo e água de produção (pontos 1 e 2). Embora a
banda 3 não apareça na amostra do solo controle, este fato não significa a inexistência deste
actinomiceto no mesmo, pois esta população pode estar presente em quantidade pequena no
solo não contaminado impedindo a sua detecção pelo método utilizado. Entretanto, após um
estímulo, como a contaminação do solo por hidrocarbonetos que possam ser utilizados
como fonte de carbono, a mesma população passa a ser mais abundante e,
conseqüentemente, detectada pelos métodos moleculares utilizados neste trabalho.
Através dos resultados apresentados podemos concluir que os métodos
convencionais de microbiologia aliados aos métodos moleculares foram importantes tanto
na avaliação nas mudanças ocorridas na comunidade bacteriana do solo de Panelas afetado
pela mistura de óleo e água de produção, quanto no isolamento de estirpes bacterianas com
um grande potencial para o desenvolvimento de consórcios bacterianos que possam ser
utilizados na biorremediação do local contaminado.
82
REFERÊNCIAS
AISLABIE, J., McLEOD, M. & FRASER, R. 1998. Potential for biodegradation of
hydrocarbons in soil from the Ross Dependency, Antartica. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 49: 210-214.
ALEXANDER, M. 1991. Research needs in bioremediation. Environ. Sci. Technol. 25:
1972-1973.
ALEXANDER, M. 1994. Biodegradation and bioremediation. Academic Press, San Diego.
ALTSCHUL, S. F., MADDEN, T. L., SCHAEFFER, A. A., ZHANG, Z., MILLER, W. &
LIPMAN, D. J. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of
protein database search programs. Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402.
ANONYMOUS. 1992. Bacillus sp. new strain for use in phenol degradation, diesel oil
degradation, petroleum degradation, etc., in sea-water or fresh water; aquifer
decontamination and bioremediation. Patent S. U. 1,784,592.
ANONYMOUS. 1993a. Culture of Rhodococcus erythropolis for removal petroleum from
waste and soil – soil decontamination, petroleum degradation, paraffin degradation,
diesel fuel degradation and waste-disposal. Patent S.U. 1,805,097.
83
ANONYMOUS. 1993b. Natural microorganism mixed culture for hydrocarbon degradation
– Pseudomonas putida and Geotrichum candidum mixed culture application in
petroleum degradation and oil degradation for soil decontamination and
groundwater decontamination. Patent W.O. 9,321,348.
ANONYMOUS. 1994a. Candida sp. capable of petroleum degradation – and crude oil
degradation - for use in bioremediation. Patent J. P. 6,319,530.
ANONYMOUS. 1994b. Trichoderma sp. capable of petroleum degradation, for use in
bioremediation. Patent J. P. 6,319,529.
ASHOK, B.T., SAXENA, S. & MUSARRAT, J. 1995. Isolation and characterization of
four polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacteria from soil near an oil
refinery. Lett. Appl. Microbiol. 21: 246-248.
ATLAS, R. M., SAYLER, G. S., BURLAGE, R. S. & BEJ, A. K. 1992. Molecular
approaches for environmental monitoring of microorganisms. Bio Techniques 12:
706-717.
ATLAS, R. M. & CERNIGLIA, C. E. 1995. Bioremediation of petroleum pollutants:
diversity and environmental aspects of hydrocarbon biodegradation. BioSciencie 45:
332-338.
84
BALBA, M. T., AL-AWANDHI, N. & AL-DAHER, R. 1998. Bioremediation of oil-
contaminated soil: microbiological methods for feasibility assessment and field
evaluation. J. Microbiol. Methods 32: 155-164.
BENTO, F.M., CAMARGO, F.A.O., OKEKE, B.C. & FRANKENBERGER, W.T. 2005.
Comparative bioremediation of soils contaminated by natural attenuation,
biostimulation and bioaugmentation. Bioresour. Technol. 96: 1049-1055.
BERG, G., ROSKOT, N. & SMALLA K. 1999. Genotypic and phenotypic relationship
between clinical and environmental isolates of Stenotrophomonas maltophilia. J.
Clin. Microbiol. 37: 3594-3600.
BOND, P. L., HUGENHOLTZ, P., KELLER, J. & BLACKALL, L. L. 1995. Bacterial
community structure of phosphate-removing and non-phosphate-removing activated
sludge from sequencing batch reactors. Appl. Environ. Microbiol. 61: 1910-1916.
BORNEMAN, J. & TRIPLETT, E. W. 1997. Molecular microbial diversity in soils from
eastern Amazonia: evidence for unusual microorganisms and microbial population
shifts associated with deforestation. Appl. Eviron. Microbiol. 63: 2647-2653.
BOUWER, E. J. & ZEHNDER, A. J. B. 1993. Bioremediation of organic compounds –
putting microbial metabolism to work. Trends Biotechnol. 11: 360-367.
85
BROCKMAN, F. J. 1995. Nucleic-acid-based methods for monitoring the performance of
in situ bioremediation. Mol. Ecol. 4: 567-578.
BUTLER, C.S. & MANSON, J. R. 1997. Structure, function analysis of the bacterial
aromatic ring hydroxylating dioxigenases. Adv. Microb. Physiol. 38: 47-84.
CACCIATORE, D. A. & McNEIL, M.A. 1995. Principles of soil bioremediation. BioCycle
61-63.
CHAINEAU, C. H., VIDALIE, J. F., GENESTE, P., DUCREUX, J. & BALLERINI, D.
2000. Bioremediation of a crude oil-polluted clay soil in a temperature zone, p, 1-
12. In Proceedings of the SPE International Conference on Health, Safety, and the
Environment in Oil and Gas Exploration and Production. Society of Petroleum
Engineers, Houston, Texas.
CHANG, R. 1994. Química. 5ª edição. Em: McGraw-Hill (eds). Lisboa. pp. 1056-1088.
CUNHA, C. D., ROSADO, A. S., SEBASTIÁN, G. V., SELDIN, L. & VON DER WEID,
I. 2006. Oil biodegradation by Bacillus strains isolated from the rock of an oil
reservoir located in a deep-water production basin in Brazil. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 73 (4): 949-959.
86
DICKEL, O., HAUG, W. & KNACKMUS, H-J. 1993. Biodegradation of nitrobenzene by a
sequential anaerobic-aerobic process. Biodegradation 4: 187-194.
ECKFORD, R. E. & FEDORAK, P. M. 2002. Planktonic nitrate reducing bacteria and
sulfate reducing bacteria in some western Canadian oil field waters. J. Ind.
Microbiol. Biotechnol. 29: 83-92.
ELLIS, B. M. L. 2000. Environmental biotechnology informatics. Curr. Opin. Biotechnol.
11: 232- 235.
FAISON, B. D. 2001. Harzadous waste treatment. SIM News 51 : 193- 208.
FAYAD, N. M. & OVERTON, E. 1995. A unique biodegradation pattern of the oil spilled
during the 1991 Gulf War. Mar. Poll. Bull. 30: 239-246.
FOGHT, J. M., WESTLAKE, D. W., JOHNSON, W. M. & RIDGWAY, H. F. 1996.
Environmental gasoline-utilizing isolates and clinical isolates of Pseudomonas
aeruginosa are taxonomically indistinguishable by chemo taxonomic and molecular
techniques. Microbiology 142: 2333-2340.
GARCIA, M. T., VENTOSA, A. & MELLADO, E. 2005. Catabolic versatility of aromatic
compound-degrading halophilic bacteria. FEMS Microbiol Ecol. Sep 1; 54 (1): 97-
109.
87
GAUTHIER, M. J., LAFAY, B., CHRISTEN, R., FERNANDEZ, M., ACQUAVIVA, M.,
BONIN, P. & BERTRAND, J. C. 1992. Marinobacter hydrocarbonoclasticus gen.
nov., sp. nov., a new extremely halotolerant, hydrocarbon-degrading marine
bacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 42: 568-576.
GREER, C. W., WHYTE, L. G., LAWRENCE, J. R., MASSON, L. & BROUSSEAU, R.
2001. Genomics technologies for environmental science. Environ. Sci. Technol. 35:
360A-366A.
HEUER, H. & SMALLA, K. 1997. Application of denaturing gradient gel electrophoresis
and temperature gradient gel electrophoresis for studying soil microbial
communities. In: van Elsas, J. D., Wellington, E. M. H., Trevors, J. (eds) Modern
Soil Microbiology. Marcel Dekker Inc., New York. pp. 353-373.
HUANG, H., LARTER, S. R., BOWLER, B. F. J. & OLDENBURG, T. B. P. 2004. A
dynamic biodegradation model suggested by petroleum compositional gradients
within reservoir columns from the Liaohe basin, NE China. Organic Geochemistry
35: 299-316.
IJAH, U. J. J. & UKPE, L. I. 1992. Biodegradation of crude oil by Bacillus strains 28A and
61B isolated from oil spilled soil. Waste Manage. 12: 55-60.
JEREZ VEGUERIA, S. F., GODOY, J. M., & MIEKELEY, N. 2002. Environmental
impact studies of barium and radium discharges by produced waters from the
88
“Bacia de Campos” oil-field offshore platforms, Brazil. J. Eviron. Radioact. 62: 29-
38.
KA, J. O., YU, Z. & MOHN, W.W. 2001. Monitoring the size and metabolic activity of the
bacterial community during biostimulation of fuel contaminated soil with
competitive PCR and RT-PCR. Microbiol. Ecol. 42: 267-273.
KENT, A. D. & TRIPLETT, E. W. 2002. Microbial communities and their interactions in
soil and rhizosphere ecosystems. Annu. Rev. Microbiol. 56: 211-236.
KORDA, A., SANTAS, P., TENENTE, A. & SANTAS, R. 1997. Petroleum hydrocarbon
bioremediation: sampling and analytical techniques, in situ treatments and
commercial microorganisms currently used. Appl. Microbiol. Biotechnol. 48: 677-
686.
KULICHEVSKAYA, I.S., MILEKHINA, E.I., BORZENKOV, I.A., ZVYAGINTSEVA,
I.S. & BELYAEV, S.S. 1992. Oxidation of petroleum hydrocarbons by extremely
halophilic archaebacteria. Microbiology 60: 596-601.
KUSHNER, D. J. 1978. Life in high salt and solute concentrations: halophilic bacteria. In:
Kushner, D. J. (Ed.), Microbial life in extreme environments. Academic Press.
London, U.K. pp: 317-368.
89
KUZNETNOV, V. D., ZAITSEVA, T.A., VAKULENKO, L. V. & FILIPPOVA, S. N.
1992. Streptomyces abiaxialis sp. nov. – a new petroleum hydrocarbon-degrading
species of thermo- and halotolerant Streptomyces. Microbiology 61: 84-91.
LEAVITT, M. E. & BROWN, K. L. 1994. Biostimulation versus bioaugmentation: three
case studies. In: Hinchee, R. E., Alleman, B.C., Hoeppel, R. E., Miller, R. N. (eds)
Hydrocarbon bioremediation. Lewis, Bopca Raton. Fla, pp. 72-79.
LEYTHAEUSER, D. & RÜCKHEIM, J. 1989. Heterogeneity of oil composition within a
reservoir as a reflection of accumulation history. Geochim. Cosmochim. Acta 53:
2119-2123.
LINDSTROM, J. E., BARRY, R. P. & BRADDOCK, J. G. 1999. Long-term effects on
microbial communities after a subartic oil spill. Soil Biol. Biochem. 31: 1677-1689.
LLOYD-JONES, G., LAURIE, A. D., HUNTER, D. W. F. & FRASER, R. 1999. Analysis
of catabolic genes for naphtalene and phenanthrene degradation in contaminated
New Zeland soils. FEMS Microbiol. Ecol. 29: 69-79.
MANNING, F. C. & THOMPSON, R. E. 1995. Oilfield processing, vol. 2: crude oil.
PennWell, Tulsa, Okla.
90
MARQUEZ, M. C., VENTOSA, A. & RUIZ-BERRAQUERO, F. 1987. A taxonomic study
of heterotrophic halophilic and non-halophilic bacteria from a solar saltern. J. Gen.
Microbiol. 133: 45-56.
MARSH, T. L. 1999. Terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP): an
emerging method for characterizing diversity among homologous populations of
amplification products. Curr. Opin. Microbiol. 2: 323-327.
MARGESIN, R. & SCHINNER, F. 2001. Biodegradation and bioremediation of
hydrocarbons in extreme environments. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56: 650-653.
MARGESIN, R., LABBÉ, D., SCHINNER, F., GREER, C.W. 7 WHYTE, L. G. 2003.
Characterization of hydrocarbon-degrading microbial populations in contaminated
and pristine alpine soils. 2003. Appl. Environ. Microbiol. 69 (6): 3085-3092.
MARGOT, M., OLLIVIER, B. & PATEL, B. K. C. 2000. Microbiology of petroleum
reservoirs. Antonie Van Leeuwenhoek 77:103-116.
MASSOL-DEYA, A. A., ODELSON, D. A., HICHEY, R.P. & TIEDJE, J. M. 1995.
Bacterial community fingerprinting of amplified 16S and 16-23S ribosomal DNA
gene sequences and restriction endonuclease analysis (ARDRA). In: Molecular
microbial ecology manual. (Akkermans, A. D. L., van Elsas, J. D. & de Bruijn, F. J.
eds.). section 3.3.2, pp. 1-8. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands.
91
MEDINA-BELLVER, J. I., MARÍN, P., DELGADO, A., RODRÍGUEZ-SANCHES, A.,
REYES, E., RAMOS J. L. & MARQUÉS, S. 2005. Evidence for in situ crude oil
biodegradation after the Prestige oil spill. Environ. Microbiol. 7(6): 773-779.
MEYER, S., MOSER, R., NEEF, A., STAHL U. & KAMPFER, P. 1999. Differential
detection of key enzymes of polyaromatic-hidrocarbon-degrading bacteria using
PCR and gene probes. Microbiology 145: 1731-1741.
MUYZER, G., de WAAL, E. C. & UITTERLINDEN, A. G. 1993. Profiling of complex
microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of
polymerase chain reaction-amplified genes encoding for 16S rRNA. Appl. Environ.
Microbiol. 59: 695-700.
MUYZER, G. 1999. DGGE/ TGGE: a method for identifying genes from natural
ecosystems. Curr. Opin. Microbiol. 2: 317-322.
NAZINA, T.N., TOUROVA, T. P., POLTARAUS, A. B., NOVIKOVA, E. V.,
GRIGORYAN, A. A., IVANOVA, A. E., LYSENKO, A. M., PETRUNYAKA, V.
V., OSIPOV, G. A., BELYAEV, S. S. & IVANOV, M. V. 2001. Taxonomic study
of aerobic thermophilic bacilli: descriptions of Geobacillus subterraneus gen. nov. ,
sp nov. and Geobacillus uzenensis sp nov. from petroleum reservoirs and transfer of
Bacillus stearothermophilus, Bacillus thermocatenulatus, Bacillus
thermoleovorans., Bacillus kaustophilus, Bacillus thermoglucosidasius and Bacillus
thermodenitrificans to Geobacillus as the new combinations G. stearothermophilus,
92
G. thermocatenulatus, G. thermoleovorans, G. kaustophilus, G.
thermoglucosidasius and G. thermodenitrificans. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:
433-446.
NICHOLSON, C. A. & FATHEPURE, B. F. 2004. Biodegradation of benzene by
halophilic and halotolerant bacteria under aerobic conditions. Appl. Environ.
Microbiol. 70 (2): 1222-1225.
NICHOLSON, W. L. 2002. Roles of Bacillus endospores in the environment. Cell. Mol.
Life Sci. 59: 410-416.
OFFICE OF TECHNOLOGY ASSESSMENT. 1991. Bioremediation for marine oil spills –
background paper, OTA-BP-O-70. US Government Printing Office, Washington,
DC.
OMORI, T., MONNA, L., SAIKI, Y. & KODAMA, T. 1992. Desulfurization of
dibenzothiophene by Corynebacterium sp. strain SY1. Appl. Environ. Microbiol.
58: 911-915.
OREN, A., GUREVICH, P., AZACHI, M. & HENIS, Y. 1992. Microbial degradation of
pollutants at high salt concentrations. Biodegradation 3: 387-398.
OREN, A. 1999. Bioenergetic aspects of halophilism. Microbiol. Mol. Biol. Rev.
63(2):334-348.
93
OREN, A. 2002. Diversity of halophilic microorganisms: environments, phylogeny,
physiology, and applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 28(1):56-63.
ORZECH M., SOLYST, J. & THOMPSON, P. 1991. State’s use of bioremediation:
advantages, constraints, and strategies. Natural Resources Policy Research, National
Governo’s Association, USA.
PHILP, J.C & ATLAS, R.M. 2005. Bioremediation of contaminated soils and aquifers. In:
Atlas, R.M. & Philp, J.C. (Eds.). Bioremediation: Applied microbial solutions for
real-world environmental cleanup. ASM Press, Washington, D.C., pp. 139-236.
PHILP, J.C, WHITELEY, A.S., CIRIC, L. & BAILEY, M.J. 2005. Monitoring
Bioremediation. In: Atlas, R.M. & Philp, J.C. (Eds.). Bioremediation: Applied
microbial solutions for real-world environmental cleanup. ASM Press, Washington,
D.C., pp. 237-268.
PLOTNIKOVA, E. G., ALYNTSEVA, O. V., KOSHELEVA, I. A., PUNTUS, I. F.,
FILONOV, A. E., GAVRISH, E. Y. U., DEMAKOV, V. A. & BORONIN A. M.
2001. Bacterial degraders of polycyclic aromatic hydrocarbons isolated from salt-
contaminated soils and bottom sediments in salt mining areas. Microbiology 70: 51-
58.
PLANCKAERT, M. 2005. Oil reservoirs and oil production. In: Ollivier, B. & Magot, M.
(Eds.). Petroleum Microbiology. ASM Press, Washington, D.C, pp. 3-19.
94
PRINCE, R. C. 1993. Petroleum spill bioremediation in marine environments. Crit. Rev.
Microbiol. 19: 217-242.
PRINCE, R. C. 2005. The microbiology of marine oil spill bioremediation. In: Ollivier, B.
& Magot, M. (Eds.). Petroleum Microbiology. ASM Press, Washington, D. C., pp.
317-335.
SANCHEZ-PORRO, C., MARTIN, S., MELLADO, E. & VENTOSA, A. 2003. Diversity
of moderately halophilic bacteria producing extracellular hydrolytic enzymes. J
Appl Microbiol. 94(2):295-300.
SCHLEIF, R.F. & WENSINK, P.C. 1981. Pratical Methods in Molecular Biology. Spring-
Verlag. New York.
SCHNEEGURT-MARK, A. & KULPA-CHALER, F. Jr. 1998. The application of
molecular techniques in environmental biotechnology for monitoring microbial
systems. Biotechnol. Appl. Biochem. 27: 73-79.
SELDIN, L. & DUBNAU, D. 1985. DNA homology among Bacillus polymyxa, Bacillus
azotofixans and other nitrogen fixing Bacillus strains. Int. J. Syst. Bacteriol. 35:
151-154.
SELDIN, L. & PENIDO, E.G.C. 1986. Identification of Bacillus azotofixans using API tests.
Antonie van Leeuwenhoek 52: 403-409.
95
SHUHONG, Y., LEICHANG, H., LI, Y. O., MING, D.,YINGYING, H. & DEWEN, D. 2005.
Investigation on bioremediation of oil-polluted wetland at Liaodong Bay in northeast
China. Appl. Microbiol. Biotechnol.
SICILIANO, S. D., GERMIDA, J. J., BANKS, K. & GREER, C. W. 2003. Changes in
microbial community composition and function during a polyaromatic hydrocarbon
phytoremediation field trial. Appl. Environ. Microbiol. 69: 483-489.
SINGH, A., MULLIN, B. & WARD, O.P. 2001. Reactor based process for the biological
treatment of petroleum wastes. In: Petrotech (ed) Proceedings of the Middle East
Petrotech. 2001. Conference. Petrotech, Bahrain, pp: 1-13.
VAN HAMME, J. D., SINGH, A. & WARD, O. P. 2003. Recent advances in petroleum
microbiology. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67: 503-549.
WARD, O. P. 1991. Bioprocessing, p. 160. Milton Keynes Open University Press,
Chicago, Ill.
WATANABE, K, TERAMOTO, M., FUTAMATA, H. & HARAYAMA, S. 1998.
Molecular detection, isolation, and physiological characterization of functionally
dominant phenol-degrading bacteria in activated sludge. Appl. Environ. Microbiol.
64: 4396-4402.
96
WATTS, J. E. M., WU, Q., SCHREIER, S. B., MAY, H. D. & SOWERS, K. R. 2001.
Comparative analysis of polychlorinate biphenyl-dechlorinating communities in
enrichment cultures using three different molecular screening techniques. Environ.
Microbiol. 3: 710-719.
WEI, Q. F., MATHER, R.R. & FOTHERINGHAM, A. F. 2005. Oil removal from used
sorbents using a biosurfactant. Bioresour. Technol. 96: 331-334.
WIDADA, J., NOJIRI, H. & OMORI, T. 2002. Recent developments in molecular
techniques for identification and monitoring of xenobiotic-degrading bacteria and
their catabolic genes in bioremediation. Appl. Microbiol. Technol. 60: 45-59.
ZUCCHI, M., ANGIOLINI, L., BORIN, S., BRUSETTI, L., DIETRICH, N., GIGLIOTTI,
C. BARBIERI, P., SORLINI, C. & DALFFONCHIO, D. 2003. Response of
bacterial community during bioremediation of an oil-polluted soil. J. Appl.
Microbiol. 94: 248-257.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
