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UNIVESIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
TESE DE DOUTORADO
3-ALCOXI-4-HIDROXI PIRROLIDIN-2-ONAS, 2-METILSULFANIL
PIRIMIDINA, ENOILCARBAMATOS E 3-DIALCOXI FOSFORILOXI
TRIALOMETILADOS: SÍNTESE E POTENCIAL INIBITÓRIO SOBRE
A ATIVIDADE DA ENZIMA ACETILCOLINESTERASE
ADRIANA DORNELLES CARPES OBREGON
PPGQ
SANTA MARIA, RS, BRASIL.
2006
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3-ALCOXI-4-HIDROXI PIRROLIDIN-2-ONAS, 2-
METILSULFANIL PIRIMIDINA, ENOILCARBAMATOS E 3-
DIALCOXI FOSFORILOXI TRIALOMETILADOS: SÍNTESE E
POTENCIAL INIBITÓRIO SOBRE A ATIVIDADE DA ENZIMA
ACETILCOLINESTERASE
Por
ADRIANA DORNELLES CARPES OBREGON
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química – área de
concentração em Química Orgânica – da Universidade Federal de Santa Maria (RS),
como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Química.
Santa Maria, RS – Brasil
2006
ii
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iii
Dedico esta tese a todos os meus colegas
de pesquisa que de uma forma ou outra
colaboraram para a realização deste
trabalho. Tenho na maioria deles mais que
meros colegas, mas queridos amigos dos
quais guardarei agradável lembrança.
iv
Dedico também a minha família que durante
o trabalho, soube compreender e estimular
nas horas de desânimo.
Ao Mauro meu reconhecimento pelo
exemplo de força de vontade.
A Lauriane pela presença sempre amiga e
leal.
Ao Marcus Vinícius pela alegria contagiante.
Aos meus pais, familiares e amigos que
estiveram ao meu lado quando necessitei.
Meu amor e agradecimento a vocês.
v
Ao prof. Dr. Nilo Zanatta serei sempre
grata pela oportunidade que me concedeu
em trabalhar no seu grupo.
Além disso, agradeço a orientação e
principalmente a paciência, o carinho e o
respeito com que sempre fui tratada.
Obrigada.
vi
A profa. Dra. Maria Rosa Schetinger pela
orientação, amizade e carinho que sempre
pude contar.
Agradeço principalmente pelo incentivo
que me destes nos momentos difíceis, me
mostrando o valor do trabalho e
acreditando nele.
Obrigada.
vii
AGRADECIMENTOS
Inicialmente, agradeço a Universidade Federal de Santa Maria, a qual já
proporcionou minha formação em Farmácia e Bioquímica e que novamente me
proporciona crescimento.
A todos os meus colegas de laboratório de química e de bioquímica. Não quero
citar nomes porque são muitos e temo esquecer alguém. Isso seria imperdoável, pois
todos foram importantes.
Aos professores que ministraram as disciplinas e contribuíram para o acréscimo
de novos conhecimentos, inclusive aos que causavam terror nas farmacêuticas.
Especialmente aos professores Nilo Zanatta, Marcos Martins, Hélio Bonacorso e
Ademir Morel, os quais sempre tiveram paciência redobrada nos esclarecimentos
prestados.
Aos professores que gentilmente aceitaram compor minha banca de qualificação:
Marcos Martins, Ionara Dalcol e Carla Bonan; pela contribuição positiva que trouxeram
ao trabalho.
Aos funcionários do departamento de química, Valéria Velásquez e Ademir
Sartori pela eficiência, presteza e educação com que sempre tratam os alunos.
Ao setor de bioquímica que sempre cedeu espaço e oportunidade para que meu
trabalho pudesse ser realizado, em especial às professoras Maria Rosa Schetinger e Vera
Morsch.
À Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Química e órgãos fomentadores
CNPq, CAPES, FAPERGS e FATEC.
viii
RESUMO
3-ALCOXI-4-HIDROXI PIRROLIDIN-2-ONAS, 2-METILSULFANIL
PIRIMIDINA, ENOILCARBAMATOS E 3-DIALCOXI FOSFORILOXI
TRIALOMETILADOS: SÍNTESE E POTENCIAL INIBITÓRIO SOBRE A
ATIVIDADE DA ENZIMA ACETILCOLINESTERASE
Autora: Adriana Dornelles Carpes Obregon
Orientador: Prof. Dr. Nilo Zanatta
Co-orientadora: Profa. Dra. Maria Rosa Schetinger
Este trabalho apresenta um estudo de várias classes de compostos orgânicos:
enamino compostos, γ-aminoálcoois, oxazinonas, oxazinas, diidrofuranonas, pirrolidin-
2-onas, 2-metilsulfanil pirimidina, enoilcarbamatos e 3-dialcoxi fosforiloxi
trialometilados sobre a atividade da enzima acetilcolinesterase. Também demonstra o
efeito per se de solventes orgânicos sobre a atividade da AChE em diferentes estruturas
cerebrais de rato. As 3-alcoxi-5-hidroxi-5-trifluormetil pirrolidin-2-onas N-alquiladas e
N-O-alquiladas e os enoilcarbamatos trifluormetilados mostraram efeito inibitório
significativo (p<0,05) sobre a atividade in vitro da AChE de estriado cerebral de rato, na
concentração de 1,0 mM. A dimetil-(2-metilsulfanil-4-triclorometil-6-pirimidinilme-
toxi)etil] amina mostrou efeito inibitório significativo (p<0,001) sobre a atividade in
vitro da AChE de estriado cerebral de rato na concentração de 0,1mM. O efeito in vivo
dessa pirimidina foi significativo (p<0,001) na concentração de 10 mg/Kg sobre a
atividade da AChE em estriado cerebral e membrana de eritrócitos de rato. Finalmente,
as 3-dietoxi-fosforiloxi carbamatos de etila trifluormetilados mostraram efeito inibitório
significativo (p<0.001) sobre a atividade da AChE purificada em concentrações a partir
de 0.001 mM.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Autora: Adriana Dornelles Carpes Obregon
Orientador: Prof. Dr. Nilo Zanatta
Co-orientadora: Profa. Dra. Maria Rosa Schetinger
Tese de Doutorado em Química
Santa Maria, 20 de outubro de 2006.
ix
ABSTRACT
TRIHALOMETHYLATED 3-ALKOXY-4-HYDROXY PYRROLIDIN-2-ONES,
2-METHYLSULFANYL PYRIMIDINE, ENOYLCARBAMATES AND 3-
DIALKOXY PHOSPHORYLOXY: SYNTHESIS AND POTENTIAL
INHIBITORY ACTIVITY ON THE ACETYLCHOLINESTERASE ENZYME
Author: Adriana Dornelles Carpes Obregon
Advisor: Prof. Dr. Nilo Zanatta
Co-advisor: Profa. Dra. Maria Rosa Schetinger
This work presents a study of the several organic compounds such as
trihalomethylated enaminones, γ-amino alcohols, oxazinones, oxazines,
dihydrofuranones, pyrrolidin-2-ones, 2-methylsulfanyl pyrimidine, enoylcarbamates
and 3-dialkoxy phosphoryloxy on the acetylcholinesterase enzyme activity. Also, this
work shows the effect per se of organic solvents on the AChE of different cerebral
structures of rats. The N- and N-O-alkylated 3-alkoxy-5-hydroxy-trifluormethyl-
pyrrolidin-2-ones and trifluoromethylated enoylcarbamates showed in vitro inhibitory
effect of the AChE activity in the striatum cerebral of rat, at the concentration 1.0 mM.
The dimethyl-[(2-methylsulfanyl-4-trichloromethyl-6-pyrimidin-ylmethoxy)-ethyl]
amine showed significant inhibitory effect (p<0.001) in vitro on AChE activity of the
striatum cerebral of rat, in the concentration 0.1mM. The in vivo effect of this
pyrimidine was significant (p<0.001) in the concentration of 10mg/Kg in the AChE
activity in striatum and erythrocyte of rat. Finally, the trifluoromethylated 3-diethoxy-
phosphoryloxy ethyl carbamates show significant inhibitory effect (p<0.001) on the
purified AChE activity at the concentration of 0.001 mM.
FEDERAL UNIVERSITY OF SANTA MARIA
GRADUATE COURSE OF CHEMISTRY
AUTHOR: Adriana Dornelles Carpes Obregon
ADVISOR: Prof. Dr. Nilo Zanatta
CO-ADVISOR: Profa. Dra. Maria Rosa Schetinger
Doctoral Thesis in Chemistry
Santa Maria, 20
th
October 2006.
x
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO E OBJETIVOS..............................................................................1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.................................................................................6
2.1. Sistema Colinérgico....................................................................................................7
2.2. A Acetilcolinesterase .................................................................................................9
2.3. Mecanismo de hidrólise da AChE............................................................................12
2.4. Inibidores clássicos da AChE...................................................................................15
2.4.1. Organofosforados................................................................................................16
2.4.1.1.Gases neurotóxicos..............................................................................................16
2.4.1.2. Inseticidas...........................................................................................................17
2.4.1.3. Uso terapêutico...................................................................................................18
2.4.2. Carbamatos..........................................................................................................20
2.4.2.1.Inseticidas............................................................................................................20
2.4.2.2. Uso terapêutico...................................................................................................21
2.5. Análogos da Acetilcolina.........................................................................................22
2.6. Anticolinesterásicos de uso clínico..........................................................................23
2.7. Efeito das pirrolidinonas sobre o sistema colinérgico..............................................26
3. APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS QUÍMICOS............28
3.1. Síntese de enaminonas, aminoálcoois, oxazinona e oxazinas...................................29
3.2. Síntese de 3-N-alquil-aminometilenodiidrofuran-2-onas..........................................31
3.3. Síntese das 3-alcoxi- 5-hidroxi- 5-trifluormetil pirrolidin-2-onas.............................31
3.4. Síntese das 3-alcoxi- 5-hidroxi- 5-trifluormetil pirrolidin-2-onas N-alquiladas e N-O-
alquiladas...................................................................................................................33
3.5. Síntese da (3,3-dietoxi-5-hidroxi-5-trifluormetil-4,5-dihidropirrolidin-2-ona)
acetamida...................................................................................................................34
3.6. Síntese da dimetil-[(2-metilsulfanil-4-triclorometil-6-pirimidinilmetoxi)etil]
amina..........................................................................................................................36
3.7. Síntese de enoilcarbamatos trifluormetilados............................................................37
3.8. Síntese dos 3-dialcoxi fosforiloxi trifluormetilados..................................................39
xi
4. APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS BIOLÓGICOS.......41
4.1. Ensaio de atividade da enzima AChE.......................................................................42
4.2. Efeito per se dos solventes orgânicos sobre a atividade da AChE em diferentes
estruturas cerebrais de rato........................................................................................43
4.3. Avaliação in vitro de enaminonas, aminoálcoois, oxazinona, oxazinas e
diidrofuranonas sobre a atividade da AChE em estriado e hipocampo cerebral de
ratos............................................................................................................................47
4.4. Avaliação in vitro de 3-alcoxi-5-hidroxi-5-trifluormetil pirrolidin-2-onas sobre a
atividade da AChE em estriado cerebral de ratos......................................................51
4.5. Avaliação in vitro de 3-etóxi- 5-hidroxi- 5-trifluormetil pirrolidin-2-onas N-
alquiladas e N-O-alquiladas sobre a atividade da AChE em estriado cerebral de
ratos............................................................................................................................52
4.6. Avaliação in vitro e in vivo da dimetil-(2-metilsulfanil-4-triclorometil-6-
pirimidinilmetoxi)etil] amina sobre a atividade da enzima AChE............................57
4.7. Avaliação in vitro de enoilcarbamatos trifluormetilados sobre a atividade da enzima
AChE em estriado cerebral de ratos..........................................................................62
4.8. Avaliação in vitro de 3-dialcoxi fosforiloxi trifluormetilados sobre a atividade da
enzima AChE purificada............................................................................................65
5. CONCLUSÕES.........................................................................................................73
6. SUGESTÕES PARA CONTINUIDADE DO TRABALHO.................................76
7. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS..............................................................78
7.1. Secção de Procedimentos Biológicos......................................................................79
7.1.1. Reagentes..............................................................................................................79
7.1.2. Equipamentos........................................................................................................79
7.1.3. Amostra.................................................................................................................80
7.1.3.1. Animais experimentais........................................................................................80
7.1.4. Preparações teciduais............................................................................................80
7.1.4.1.Dissecação de tecido cerebral e determinação da atividade da AChE.................80
7.1.4.2. Preparo das frações de membrana de eritrócitos (Ghost) e determinação da
atividade da AChE................................................................................................81
xii
7.1.4.3. Preparo da enzima AChE purificada e determinação de sua atividade
específica..............................................................................................................82
7.1.4.4. Protocolo para o ensaio in vivo com dimetil-(2-metilsulfanil-4-triclorometil-6-
pirimidinilmetoxi)etil] amina................................................................................83
7.1.4.5. Análise Estatística ...............................................................................................84
7.2. Secção de Procedimentos Químicos.......................................................................85
7.2.1. Reagentes e solventes purificados .......................................................................85
7.2.2. Equipamentos .......................................................................................................86
7.2.3. Procedimento para síntese de compostos..............................................................86
7.2.3.1.Reação de O-proteção da 5-hidroxi-5-trifluormetil-3-dietoxi pirrolidin-2-ona com
2,3-diidropirano....................................................................................................86
7.2.3.2. Reação de O-proteção da 5-hidroxi-5-trifluormetil-3-dietoxi pirrolidin-2-ona
com cloro trimetilsilano........................................................................................86
7.2.3.3. Reação de alquilação da 5-hidroxi-5-trifluormetil-3-dietoxi pirrolidin-2-ona O-
protegida com cloroacetamida..............................................................................87
7.2.3.4. Síntese de 6-bromometil-2-metilsulfanil-4-triclorometil pirimidina...................87
7.2.3.5. Síntese de dimetil-[(2-metilsulfanil-4-triclorometil-6-pirimidinilmetoxi)etil]
amina.....................................................................................................................88
7.2.3.6. Síntese dos (4,4,4-trifluor-1-alquil-3-oxo-1-but-1-enil)-carbamato de etila...... 88
7.2.3.7. Síntese dos [3-(álcoxi-fosforilóxi)-4,4,4-trifluor-1-alquil-butil) carbamato de
etila........................................................................................................................88
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................90
9. ANEXO I.................................................................................................................103
10. ANEXO II................................................................................................................114
xiii
LISTA DE TABELAS
TABELA 3.1. Nomenclatura dos enamino compostos, aminoálcoois, oxazinona, oxazinas
................................................................................................................................................30
TABELA 3.2. Nomenclatura 3-N-alquil-aminometilenodiidrofuran-2-onas........................31
TABELA 3.3. Nomenclatura das 3-alcoxi-5-hidroxi-5-trifluormetil pirrolidin-2-onas........32
TABELA 3.4.1. Proporção das 3-alcoxi- 5-hidroxi- 5-trifluormetil pirrolidin-2-onas N-
alquiladas e N-O-alquiladas....................................................................................................33
TABELA 3.4.2. Nomenclatura das 3-alcoxi- 5-hidroxi- 5-trifluormetil pirrolidin-2-onas N-
alquiladas e N-O-alquiladas....................................................................................................34
TABELA 3.7. Nomenclatura dos Enoilcarbamatos trifluormetilados ..................................38
TABELA 3.8. Nomenclatura dos 3-dialcoxi fosforiloxi trifluormetilados............................39
TABELA 4.3.1. Efeito sobre a atividade da AChE em estriado de ratos...............................49
TABELA 4.3.2. Efeito sobre a atividade da AChE em hipocampo de ratos.........................50
TABELA 4.4. Efeito das 3-alcoxi-5-hidroxi-5-trifluormetil pirrolidin-2-onas sobre a
atividade da AChE em estriado cerebral de ratos...................................................................51
TABELA 4.5. Efeito das pirrolidinonas 10a-d sobre a atividade da AChE em estriado
cerebral de ratos......................................................................................................................53
TABELA 4.6. Efeito sobre a atividade da AChE em estriado cerebral de ratos....................57
xiv
LISTA DE ESQUEMAS E FIGURAS
ESQUEMA 3.1. .....................................................................................................................29
ESQUEMA 3.2. .....................................................................................................................31
ESQUEMA 3.3. .....................................................................................................................31
ESQUEMA 3.4. .....................................................................................................................33
ESQUEMA 3.5.1. ..................................................................................................................34
ESQUEMA 3.5.2. ..................................................................................................................35
ESQUEMA 3.5.3. ..................................................................................................................35
ESQUEMA 3.6.1. ..................................................................................................................36
ESQUEMA 3.6.2. ..................................................................................................................37
ESQUEMA 3.7. .....................................................................................................................38
ESQUEMA 3.8. .....................................................................................................................39
FIGURA 4.3. Estrutura química dos enamino compostos, aminoálcoois, oxazinona, oxazinas
................................................................................................................................................48
FIGURA 4.4.Estrutura química das 3-alcoxi-5-hidroxi-5-trifluormetil pirrolidin-2-
onas.........................................................................................................................................51
FIGURA 4.5. Estrutura química das 3-alcoxi- 5-hidroxi- 5-trifluormetil pirrolidin-2-onas N-
alquiladas e N-O-alquiladas....................................................................................................52
FIGURA 4.7.1. Estrutura química dos Enoilcarbamatos trifluormetilados...........................62
FIGURA 4.7.2. Estrutura química dos Enoilcarbamatos trifluormetilados reduzidos .........62
FIGURA 4.7.3. Estrutura química dos Enoilcarbamatos heterocíclicos trifluormetilados ou
oxazinanas...............................................................................................................................62
FIGURA 4.8. Derivados 3-dialcoxi fosforiloxi trifluormetilados .........................................65
xv
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 4.2.1. Efeito do Álcool Metílico sobre a atividade da AChE em estriado cerebral
de ratos....................................................................................................................................44
GRÁFICO 4.2.2. Efeito do Álcool Etílico sobre a atividade da AChE em estriado cerebral
de ratos....................................................................................................................................44
GRÁFICO 4.2.3. Efeito do Álcool Isopropílico sobre a atividade da AChE em estriado
cerebral de ratos......................................................................................................................45
GRÁFICO 4.2.4. Efeito do Álcool t-Butílico sobre a atividade da AChE em estriado cerebral
de ratos....................................................................................................................................45
GRÁFICO 4.2.5. Efeito da Acetona sobre a atividade da AChE em estriado cerebral de ratos
................................................................................................................................................46
GRÁFICO 4.2.6. Efeito da Acetonitrila sobre a atividade da AChE em estriado cerebral de
ratos.........................................................................................................................................46
GRÁFICO 4.2.7. Efeito do DMSO sobre a atividade da AChE em estriado cerebral de
ratos.........................................................................................................................................47
GRÁFICO 4.5.1. Efeito das pirrolidinonas 10a sobre a atividade da AChE.........................54
GRÁFICO 4.5.2. Efeito das pirrolidinonas 10b sobre a atividade da AChE.........................54
GRÁFICO 4.5.3. Efeito das pirrolidinonas 10c sobre a atividade da AChE..........................55
GRÁFICO 4.5.4. Efeito das pirrolidinonas 10d sobre a atividade da AChE.........................56
GRÁFICO 4.6.1. Efeito in vitro da dimetil- [(2-metilsulfanil-4-triclorometil-6-pirimidinil
metoxi) etil] amina sobre a atividade da AChE estriatal de ratos...........................................58
GRÁFICO 4.6.2. Efeito in vivo da dimetil-[(2-metilsulfanil-4-triclorometil-6-pirimidinil
metoxi)etil] amina sobre a atividade da AChE estriatal de ratos............................................59
GRÁFICO 4.6.3. Efeito in vivo da dimetil-[(2-metilsulfanil-4-triclorometil-6-pirimidinil
xvi
metoxi)etil] amina sobre a atividade da AChE eritrocítica de ratos.......................................60
GRÁFICO 4.7.1. Efeito do composto 22a sobre a atividade da AChE estriatal....................63
GRÁFICO 4.7.2. Efeito do composto 22b sobre a atividade da AChE estriatal....................64
GRÁFICO 4.7.3. Efeito do composto 22c sobre a atividade da AChE estriatal....................64
GRÁFICO 4.8.1. Efeito do composto 25a sobre a atividade da AChE purificada................67
GRÁFICO 4.8.2. Efeito do composto 25b sobre a atividade da AChE purificada................67
GRÁFICO 4.8.3. Efeito do composto 25c sobre a atividade da AChE purificada.................68
GRÁFICO 4.8.4. Efeito do composto 25d sobre a atividade da AChE purificada................68
GRÁFICO 4.8.5. Efeito do composto 25e sobre a atividade da AChE purificada.................69
GRÁFICO 4.8.6. Efeito do composto 25f sobre a atividade da AChE purificada.................69
GRÁFICO 4.8.7. Efeito do composto 25g sobre a atividade da AChE purificada................70
GRÁFICO 4.8.8. Efeito do composto 25h sobre a atividade da AChE purificada................70
GRÁFICO 4.8.9. Efeito do composto 25i sobre a atividade da AChE purificada.................71
xvii
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS
1
1. INTRODUÇÃO
A acetilcolina (ACh) é um dos maiores moduladores da função cerebral e é o
principal neurotransmissor do sistema nervoso periférico.
N
OM
O
e
M
e
Me
M
e
OH
Acetilcolina (ACh)
A regulação na liberação da ACh é crucial para a função do sistema nervoso. Além
disso, a disfunção da transmissão colinérgica tem sido ligada a um amplo número de
condições patológicas
1,2,3
. A enzima colina acetiltransferase (ChAT) sintetiza a ACh, a
qual é armazenada em vesículas sinápticas sendo liberada para transmitir o impulso
colinérgico.
SCoAMe
O
+
Colina
Acetiltransferase
(ChAT)
+
HSCoA
N
OH
Me
Me
Me
OH
N
OMe
O
Me
Me
Me
OH
Colina (Ch) Acetil
-
CoA Acetilcolina (ACh) S-CoA
Esse impulso colinérgico é estreitamente regulado pela enzima acetilcolinesterase
(AChE), a qual hidrolisa o neurotransmissor ACh em colina (Ch) e acetato, restaurando
assim a polarização original da membrana pós-sináptica, tornando possível novamente o
impulso nervoso
4
.
Acetilcolina Colina Acetato
Acetilcolinesterase
(AChE)
+
MeO
O
N
OH
Me
Me
Me
N
OMe
O
Me
Me
Me
OH
A enzima AChE foi classificada em diferentes formas moleculares: formas
globulares e assimétricas. A forma globular existe como um monômero (G1), dímero
(G2), e tetrâmero (G4) enquanto que as formas assimétricas são agregados de
tetrâmeros
5,6,7
. As formas globulares de AChE estão presentes no cérebro e tem sido
2
relatado que essas formas isoméricas da enzima estão distribuídas de forma distinta nos
neurônios
8,9,10
.
A AChE é um importante alvo terapêutico e atualmente inibidores reversíveis dessa
enzima têm sido usado para o tratamento de desordens cognitivas como na Doença de
Alzheimer (D.A.) e outras demências
11,12,13
. Recentemente, com a ajuda de tomografia
ou PET (positron emission tomography), alguns pesquisadores têm demonstrado um
déficit colinérgico significativo nos pacientes com a D.A. e um nível diminuído da
enzima AChE
14,15
. Além disso, existe um envolvimento diferencial das isoformas
moleculares da AChE no estresse e cognição
16
. Novos inibidores da AChE (AChEi) têm
sido sintetizados e testados frente as diferentes isoformas da enzima, com o objetivo de
descobrir drogas com maior afinidade e seletividade na ação farmacológica
17,18
. Os
AChEi também são empregados para combater desordens neuromusculares, tais como a
miastenia gravis e o glaucoma
19
.
Assim como os inibidores reversíveis da AChE são amplamente utilizados na
clínica para tratamento de várias patologias, os inibidores irreversíveis também possuem
aplicação comercial como inseticidas e herbicidas
20,21,22,23
. A AChE de insetos é o alvo
primário de pesticidas organofosforados (OPs), os quais inibem irreversivelmente a
enzima devido a uma ligação estável estabelecida entre um grupo hidroxila do sítio
ativo da enzima com o átomo de fósforo desses compostos. A fosforilação da serina
presente no sítio ativo leva a um acúmulo de acetilcolina, causando uma
hiperestimulação colinérgica nos insetos com conseqüente hiperexcitabilidade,
tremores, paralisia e morte
24
.
Os carbamatos também podem ser empregados como pesticidas, porém inibem a
enzima AChE de forma reversível e por isso são considerados menos tóxicos que os
OPs. Os compostos derivados do ácido carbâmico são provavelmente os inseticidas com
mais ampla atividade biocida. Eles interagem com a hidroxila do aminoácido serina
presente no sítio ativo da enzima AChE levando a carbamilação desse grupo de forma
reversível, sendo que a descarbamilação desse resíduo de aminoácido leva de 30 a 40
minutos para ocorrer
25
.
Como os carbamatos são inibidores reversíveis da AChE e apresentam um alto
grau de afinidade na ligação com a enzima, várias moléculas com o grupo carbamato
foram sintetizadas nos últimos anos
26,27,28
. A Rivastigmina (Exelon®) é o protótipo mais
promissor dessa classe, produzido pelo laboratório farmacêutico Novartis e amplamente
utilizado na clínica para tratamento da D.A.
29
.
3
N
Me
Me
Me
O
N
O
Me
Me
Rivastigmina
A Doença de Alzheimer é uma desordem neurodegenerativa caracterizada por
deterioração dos neurônios colinérgicos, o que resulta em notável déficit do
neurotransmissor ACh
30
. Uma das primeiras tentativas de corrigir o déficit colinérgico
presente na doença foi a produção de análogos da ACh. A intenção das pesquisas
realizadas com compostos estruturalmente relacionados a ACh seria a de produzir
candidatos capazes de aumentar os níveis cerebrais de colina (Ch) melhorando assim a
biosíntese do neurotransmissor
31
. Porém, os resultados obtidos não foram satisfatórios
devido à presença de efeitos colaterais indesejáveis.
No entanto, a terapia atual para melhorar a transmissão colinérgica ainda está
baseada no uso de inibidores da AChE, pois esse caminho consagrou os melhores
resultados nos testes clínicos, recuperando parcialmente os pacientes da perda de
memória e déficit cognitivo
32,33
.
Uma outra classe de compostos empregados no tratamento de déficit cognitivo
são as pirrolidinonas. Estudo extensivo do modo de ação das pirrolidinonas tem
revelado vários efeitos farmacológicos, sendo que a maioria delas influencia a função
colinérgica
34,35,36
. O Piracetam (2-(2-oxopirrolidin-1-il)acetamida), foi a primeira
pirrolidinona a despertar atenção dos clínicos no início da década de 70
37
e desde então
foi crescente o interesse da indústria farmacêutica na síntese de novos derivados
pirrolidínicos
38,39
para testes biológicos sobre a melhora da função cognitiva.
N
O
NH
2
O
Piracetam
Recentemente, o grupo Bayer patenteou uma série de pirrolidinonas
trifluormetiladas
40
como melhoradores cognitivos, o que comprova a importância
biológica dessa classe de heterociclos.
4
Considerando que carbamatos e organofosforados são clássicos inibidores da
enzima AChE e que derivados pirrolidínicos apresentam ação sobre receptores
colinérgicos; compostos dessas classes obtidos pelo grupo tornaram-se objetos de
interesse para testes sobre a atividade da AChE. Sendo que a presença de grupos
trialometilados é um fator importante para melhorar a lipossolubilidade de compostos e
com isso o perfil farmacocinético. Quanto a dimetil-[(2-metilsulfanil-4-triclorometil-6-
pirimidinilmetoxi) etil] amina (20), previamente obtida pelo grupo, a presença de um
substituinte análogo à colina ligado na posição 6 do anel pirimidínico, a torna um
possível bioisóstero da acetilcolina. Considerando também que uma ampla variedade de
compostos são anualmente sintetizados pelo NUQUIME (Núcleo de Química de
Heterociclos) e uma mínima percentagem deles são avaliados em testes de atividade
biológica, o presente trabalho tem por objetivos:
♦ Descobrir as melhores condições de teste sobre a enzima AChE considerando as
características físico-químicas de compostos sintetizados pelo grupo e suas
solubilidades em diferentes solventes orgânicos .
♦ Avaliar o efeito de compostos heterocíclicos ou não-heterocíclicos, previamente
sintetizados, sobre a atividade da enzima AChE.
♦ Obter um análogo sintético do 2-(2-oxopirrolidin-1-il) acetamida – Piracetam; e
avaliar seu efeito sobre a atividade da enzima AChE, bem como sobre a
memória em ratos.
♦ Obter da dimetil-[(2-metilsulfanil-4-triclorometil-6-pirimidinilmetoxi) etil]
amina (20) e avaliar seu efeito in vitro e in vivo sobre a atividade da enzima
AChE.
♦ Avaliar o efeito in vitro de derivados enoilcarbamatos trifluormetilados (22a-c)
sobre a atividade da enzima AChE.
♦ Avaliar o efeito in vitro de 3-dialcoxi fosforiloxi trifluormetilados (25a-i) como
inibidores da enzima AChE purificada.
5
REVISÃO DA BIBLIOGRAFIA
6
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 O SISTEMA COLINÉRGICO
Os terminais nervosos colinérgicos sintetizam e liberam o neurotransmissor
acetilcolina (ACh). No neurônio pré-sináptico, a enzima colina acetiltransferase (ChAT)
biossintetisa o neurotransmissor ACh, a partir de uma molécula de colina e acetil-
CoenzimaA ou acetil-CoA – (esquema 2.1.1).
ESQUEMA 2.1.1.
SCoAMe
O
+
Colina
Acetiltransferase
(ChAT)
+
HSCoA
N
OH
Me
Me
Me
OH
N
OMe
O
Me
Me
Me
OH
Colina (Ch) Acetil
-
CoA Acetilcolina (ACh) S-CoA
O neurotransmissor assim sintetizado é armazenado em vesículas sinápticas via
transporte vesicular de ACh. Frente a um potencial de ação a ACh é liberada na fenda
sináptica e exerce seus efeitos mediados pela ativação de receptores específicos,
designados como receptores colinérgicos, e subdivididos, conforme o alcalóide
estimulante, em dois subgrupos: nicotínicos e muscarínicos
41
. Até o momento cinco
subtipos de receptores muscarínicos foram identificados (M1 - M5), sendo que os
receptores M1 e M2 estão presentes em neurônios do SNC e periférico, além de outros
tecidos glanglionares
42
. Os receptores M2 estão localizados nos terminais de neurônios
pré-sinápticos e parecem estar envolvidos no processo de recaptação de colina. São
designados como nicotínicos os receptores estimulados pelo alcalóide nicotina, e
localizam-se predominantemente nas sinapses ganglionares. São compostos por cinco
subunidades conhecidas como: α
1
, α
2
, β, γ e δ
43
.
Quando o neurotransmissor é liberado, liga-se aos receptores colinérgicos
nicotínicos e/ou muscarínicos propagando assim o impulso nervoso colinérgico (figura
2.1.1).
7
FIGURA 2.1.1. Sistema colinérgico: Acetilcolina (ACh), receptor muscarínico do tipo
1 (M1), receptor muscarínico do tipo 2 (M2), acetilcolinesterase sináptica (AChE-S),
colina acetiltransferase (ChAT), transporte vesicular de ACh (vAChT)
55
. (Reproduzido
de Soreq H., Seidman S. Neuroscience, 2001, 2, 8).
As colinesterases são as enzimas que regulam o efeito desse neurotransmissor,
pois se a ACh permanecesse ligada por longo tempo aos receptores causaria uma
superestimulação do sistema colinérgico, levando a sinais como: agitação, fraqueza
muscular, miose, hipersalivação, sudorese, insuficiência respiratória, inconsciência,
confusão mental, convulsão e morte
44
.
8
As colinesterases estão amplamente difundidas em tecidos colinérgicos e não-
colinérgicos, bem como no plasma e outros fluidos biológicos
45,46,47
. Elas estão
divididas em duas classes de acordo com a especificidade do substrato, comportamento
na presença de excesso de substrato e a suscetibilidade a inibidores: a acetilcolinesterase
(AChE) ou “colinesterase verdadeira” e a butirilcolinesterase (BuChE), também
conhecida como “pseudocolinesterase”, colinesterase não-específica ou simplesmente
colinesterase. A AChE hidrolisa ACh mais rápido do que outros ésteres de colina, pois é
mais específica para esse substrato. Por outro lado, a butirilcolinesterase age
preferencialmente sobre a butirilcolina (BuCh), mas também hidrolisa a ACh
46,47,48
. A
inibição da AChE pelo excesso de substrato é uma das principais características que a
distingue da BuChE. Esta última exibe ativação na presença de excesso de substrato
49,50
.
A AChE é inibida seletivamente pelo brometo de 1,5-bis (4-alildimetilaminopropil)
pentan-3-ona (BW 264C51), enquanto que a BuChE é seletivamente inibida pelo 10-[2-
dietilaminopropil]-fenotiazida (etopropazina)
51
. A distribuição em tecidos específicos é
também diferente entre essas duas enzimas: a AChE é abundante no cérebro, músculos e
membrana de eritrócitos, enquanto que a BuChE tem maior atividade no fígado,
intestino, coração, rins e pulmão
52
. Muitas espécies tais como o humano, o cavalo e o
camundongo exibem atividade elevada da BuChE em seu plasma, enquanto que o rato
tem maior atividade da AChE em seu plasma quando comparada a atividade da
BuChE
46
.
A AChE e a BuChE mostram 65% de homologia na seqüência de aminoácidos e
apresentam formas moleculares similares e a estrutura do centro ativo é determinada por
diferentes genes no cromossomo humano 7 (especificamente 7q22) e 3 (especificamente
3q22), respectivamente
53
. A principal função da AChE é a hidrólise rápida do
neurotransmissor ACh e ela é uma das enzimas de atividade catalítica mais rápida que
se conhece
54
.
A neurotransmissão mediada por ACh é fundamental para a função do sistema
nervoso
55
. Seu bloqueio total é letal e sua perda gradual, como na doença de
Alzheimer
56
, Atrofia Múltipla
57
e outras condições
58
estão associadas à deterioração
progressiva das funções cognitivas, autonômicas e neuromusculares.
2.2. A ACETILCOLINESTERASE
A acetilcolinesterase (AChE, EC 3.1.1.7), é uma importante enzima regulatória que
controla a transmissão do impulso nervoso colinérgico por hidrolisar o neurotransmissor
9
excitatório ACh, tanto nas sinapses colinérgicas cerebrais quanto nas
neuromusculares
59
. No entanto, o papel biológico da AChE não está limitado à
transmissão colinérgica, já que essa proteína foi encontrada em níveis elevados em
outros tecidos. Uma evidência adicional para o papel não-colinérgico dessa proteína, foi
a comparação dos níveis de AChE e ChAT em neurônios não-colinérgicos que
continham somente AChE
60,61
.
Atualmente, existe o interesse no meio científico pelo papel não-catalítico dessa
proteína, e alguns trabalhos têm demonstrado que variantes estruturais da AChE estão
amplamente distribuídas pelos tecidos humanos participando de funções no crescimento
e adesão celular
62
, neurogênese
63
, sinaptogênese
64
, hematopoiese
65
, osteogênese
66
; além
de processos patológicos associados ao estresse
67,68
e deterioração de neurônios
colinérgicos
69,70
.
Vários estudos sobre as propriedades catalíticas da AChE possibilitaram o
conhecimento detalhado do sítio ativo dessa enzima
71,72,73
. Um grande passo na
compreensão do mecanismo catalítico da AChE e modo de ação dos inibidores, ocorreu
em 1991 com a determinação da estrutura tridimensional da AChE dimérica de Torpedo
californica
74
. Mais tarde, a estrutura cristal da AChE de rato,
75
Drosophila
76
e do
homem
77
foram obtidas e mostraram ser similares.
O sítio ativo da AChE situa-se na parte inferior de um estreitamento semelhante
a uma garganta (gorge), a 20 Å de profundidade, alinhado com resíduos hidrofóbicos,
os quais parecem ser importantes na orientação do substrato ao sítio ativo
74
. O sítio
compreende um subsítio esterásico, o qual contém a tríade catalítica (Ser-His-Glu) e um
subsítio aniônico que liga o grupo amônio quaternário da ACh. Na borda ou superfície
do “gorge”, cerca de 14 Å do sítio ativo, situa-se um segundo sítio ligante de grupo
amônio quaternário, o sítio aniônico periférico (Peripheral Anionic Sites- PAS), o qual é
responsável pela inibição por substrato
72,73
.
A AChE tem numerosos inibidores: alguns como os organofosforados ligam-se
exclusivamente no sítio esterásico; outros contendo grupo amônio quaternário similar a
acetilcolina ligam-se no sítio aniônico. Já os compostos bis ou tris-quaternários com
mais de uma porção amônio, pode ligar-se em ambos os sítios. Outros ainda, como o
propidium ou a fasciculina, ligam exclusivamente no sítio aniônico periférico – PAS
78.
Há um consenso que os inibidores do sítio ativo não afetam as funções
secundárias da AChE
79,80,81
. No entanto, vários autores têm observado que o
BW284C51, um composto bis-quaternário ligante do PAS, inibe a diferenciação de
10
neurônios embriônicos em aves
80
, a regeneração neuronal em Aplysia
82
e a deposição
amilóide na Doença de Alzheimer
83,84
.
A determinação do sítio ativo da AChE demonstrou a presença de uma tríade
catalítica (fig. 2.2.1 - a) com os seguintes aminoácidos: histidina, serina e glutamato ou
aspartato. O nucleófilo foi identificado como sendo um resíduo de serina, vizinho a esta
está um resíduo de histidina aumentando a nucleofilicidade da serina
85
. A figura 2.2.1
(b) ilustra a interação do substrato natural (acetilcolina – ACh) com o sítio esterásico da
enzima AChE. É possível observar que existe uma interação eletrostática com o subsítio
aniônico, o qual apresenta um aspartato ou glutamato, sendo que tanto um como o outro
aminoácido apresenta átomos de oxigênio com pares de elétrons livres para interagiram
com a carga positiva presente no grupo amônio quaternário da ACh. Essa interação
eletrostática parece fundamental na orientação da porção éster da ACh para o sítio
catalítico da enzima
44,54,78
.
11
FIGURA 2.2.1. a) Ilustração do sítio esterásico contendo a tríade catalítica,
externamente o sítio periférico aniônico (PAS)
55
(Reproduzido de Soreq H., Seidman S.
Neuroscience, 2001, 2, 8). b) Interação do substrato (ACh) com o sítio esterásico da
AChE
44
. (Reproduzido de Patrick GL. An Introduction to Medicinal Chemistry. Second
Edition, Oxford, 2001. Chap. 15, pp 470).
2.3 MECANISMO DE HIDRÓLISE DA AChE
Os aminoácidos serina e histidina estão inteiramente envolvidos no mecanismo
de hidrólise do substrato Acetilcolina, como será ilustrado detalhadamente nas figuras
2.3.1 a 2.3.7. O processo enzimático é extraordinariamente eficiente por causa da
proximidade do nucleófilo serina e a catálise ácido/básica da histidina, sendo que uma
molécula de ACh é hidrolisada em 100 microsegundos
44
.
Quando uma molécula de acetilcolina aproxima-se do sítio ativo da AChE a
serina age como um nucleófilo atacando o carbono eletrofílico da carbonila do estér.
Essa adição nucleofílica abre o grupo carbonila (fig. 2.3.1).
H
3
CO
O
N(CH
3
)
3
O
H
NH
N
Serina
Histidina
FIGURA 2.3.1
12
Para estabilizar a carga positiva do oxigênio da serina, a histidina age como uma
base capturando o próton desse oxigênio, com isso se estabelece a ligação do éster a
serina (fig. 2.3.2);
(Catálise Básica)
NH
N
O
H
C
O
H
3
C
O
R
Histidina
Serina
NH
HN
O
C
H
3
C
O
O
R
Histidina
Serina
FIGURA 2.3.2
Logo em seguida a histidina exerce uma catálise ácida, protonando a função
éster do intermediário, tornando-o um bom grupo abandonador (fig. 2.3.3);
NH
N
O
CH
3
C
O
OR
H
Histidina
Serina
NH
NH
O
CH
3
C
O
OR
Histidina
Serina
(Catálise Ácida)
FIGURA 2.3.3
O grupo carbonila é recuperado e a porção álcool do éster (colina) é liberada.
Nesse estágio da reação, uma molécula de água age como nucleófilo atacando o carbono
eletrofílico do grupamento acetila (fig. 2.3.4). A colina liberada já pode ser recapturada
e reutilizada na biossíntese de novas moléculas de ACh (fig. 2.1.1).
13
NH
N
O
CH
3
C
O
Histidina
Serina
O
H
H
NH
N
O
CH
3
C
O
Histidina
Serina
H
2
O
ROH
FIGURA 2.3.4
No passo subseqüente, a histidina, por catálise básica, deprotona a água,
aumentando o seu poder nucleofílico. Com isso estabiliza a ligação do oxigênio ao
carbono do grupo acila, recuperando o grupo acetila (fig. 2.3.5).
NH
N
O
CH
3
C
O
OH
H
Histidina
Serina
FIGURA 2.3.5
A histidina então, novamente, exerce uma catálise ácida protonando o
intermediário (oxigênio da serina) recuperando, em seguida, o grupo hidroxila do
resíduo de serina (fig. 2.3.6);
NH
NH
O
CH
3
COH
O
Histidina
Serina
NH
N
O
CH
3
COH
O
H
Histidina
Serina
FIGURA 2.3.6
Após a protonação do oxigênio da serina, a carbonila é recuperada e o grupo acetila
torna-se um bom grupo abandonador. Com isso, o acetato deixa o sítio ativo e libera a
enzima para o novo ciclo catalítico (fig. 2.3.7).
14
NH
N
OH
Histidina
Serina
C
O
H
3
COH
FIGURA 2.3.7
2.4. INIBIDORES CLÁSSICOS DA AChE
Os compostos organofosforados e carbamatos são considerados inibidores clássicos
da AChE com grau variado de toxicidade para o ser humano. Estas substâncias vêm
sendo amplamente utilizadas como inseticidas, fungicidas e parasiticidas na agricultura,
desde a II Guerra Mundial
86
. Atualmente, são os inseticidas mais utilizados na
agricultura e nos ambientes domésticos
87
. Além do amplo emprego como pesticidas,
alguns organofosforados têm potencial medicamentoso, com ações que os tornariam
passíveis de serem utilizados no tratamento do glaucoma e da
miastenia gravis, embora
sejam subutilizados, por serem medicamentos de risco, tendo sua dose tóxica próxima à
dose terapêutica. Estes compostos são ainda utilizados em saúde pública no controle de
vetores, como o da malária
88
e vetores de outras doenças, como a dengue.
Até o final da década de cinqüenta os organoclorados eram os compostos mais
usados como pesticidas. Entretanto, a partir deste ano, levando-se em consideração a
persistência ambiental dos organoclorados, o reconhecido potencial inseticida e a menor
persistência ambiental dos organofosforados; os organoclorados foram sendo
substituídos pelos organofosforados e posteriormente, em parte pelos carbamatos
89
.
Atualmente, mais de 200 organofosforados diferentes e mais de 25 carbamatos são
produzidos
86,87,88,89,90
e comercializados, sendo a principal classe de pesticidas utilizada
nos Estados Unidos e em todo o mundo, movimentando anualmente bilhões de
dólares
91
.
15
2.4.1. ORGANOFOSFORADOS
2.4.1.1. GASES NEUROTÓXICOS
Em 1820, Lassaigne sintetizou o primeiro éster fosforado. Posteriormente, na
Alemanha, o químico Michaelis evoluiu bastante a pesquisa destes compostos
91
.
Embora um grande número de organofosforados tenham sido descobertos no início do
século, o conhecimento de seus efeitos deletérios só foram relatados em 1932, quando
Lang e Kreuger observaram efeitos tóxicos em ratos
90
. A descoberta resultou em um
grande número de novos usos potenciais para os compostos organofosforados, incluindo
o seu uso como gases neurotóxicos, chamados de "
gases dos nervos", os conhecidos
gases de guerra
sarin, soman e tabun, que foram usados na II Guerra Mundial. Na
Guerra do Golfo, houve rumores sobre a ameaça da utilização destas armas químicas, o
que motivou a distribuição de máscaras contra gases e atropina, para a população
civil
90,91,92
e os militares, por sua vez, portavam auto-injetores contendo atropina e
Pralidoxima, para tratar a eventual exposição aos gases neurotóxicos
91,92
. Recentemente,
estes gases tornaram-se notórios, pelo seu uso como agentes de ataques terroristas,
como o que ocorreu em 19 de março de 1995, no metrô de Tókio, no Japão, envolvendo
o gás
sarin. Esses agentes nervosos são inibidores irreversíveis da enzima
acetilcolinesterase e seus efeitos letais são devido a hiperatividade do sistema
colinérgico
92,93
.
O Sarin (isopropil metilfosfofluoridato –
I), Tabun (etil N,N-dimetil
fosforamidocianidato –
II), Soman (pinacolil metilfosfofluoridato – III) e o
Ciclosarian (cicloexil metilfosfofluoridato –
IV) são os exemplos mais importantes
de agentes nervosos utilizados como armas químicas
92
.
P
O
Me
O
F
Me Me
P
O
Me
O
F
P
O
N
O
CN
Me
Me
Me
P
O
Me
O
F
Me
terc-butil
I II III IV
16
2.4.1.2. INSETICIDAS
Os inseticidas organofosforados de maior interesse toxicológico e comercial são
ésteres ou tióis derivados de ácido fosfórico, fosfônico, fosfínico ou fosforamídico.
O sistema de classificação adotado para os pesticidas organofosforados mais usado
comumente, baseia-se na identidade dos átomos ligados diretamente ao átomo de
fósforo. O fósforo dos organofosforados é pentavalente e tetracoordenado. Três dos
substituintes são ligados ao fósforo por ligações simples, sendo que a ligação entre o
fósforo e o quarto substituinte é usualmente representada por uma dupla ligação
94
.
Na estrutura química básica (
V), quando R
1
e R
2
são grupos aril ou alquil ligados
diretamente ao átomo de fósforo, formam os fosfinatos; porém se esses mesmos
grupos ligam-se ao átomo de fósforo através de oxigênio ou enxofre, formam-se os
fosfatos ou tiofosfatos, respectivamente. Em outros casos, R
1
está diretamente
ligado ao átomo de fósforo e R
2
a um oxigênio ou enxofre, formando os fosfonatos
ou tiofosfonatos. Quando pelo menos desses grupos for amina (-NH
2
), formam-se as
fosforamidas. O átomo da dupla ligação com o fósforo é sempre oxigênio ou
enxofre. Finalmente, o grupo X pode ser representado por diversos grupos:
halogênio, alifático, aromático ou heterociclo. Independente de qual seja o grupo X,
está ligado ao fósforo por oxigênio ou enxofre
95
.
P
O(S)
R
1
X
R
2
V
Os organofosfatos apresentam quatro oxigênios ligados ao fósforo; exemplo de
fosfatos pesticidas inclui o Mevinfós® ou 2-metoxicarbonil-1-metilvinil dimetil fosfato;
o Naled® ou 1,2-dibromo-2,2-dicloroetil dimetil fosfato; e o Paraoxon® ou dietil-
p-
nitrofenil fosfato (
VI, VII e VIII, respectivamente).
17
P
EtO O
EtO O NO
2
P
OMe
MeO O
OMe
MeO
O
P
O
B
r
Cl
ClO
MeO
OMe Br
VI
VII
VIII
Os organofosforados que apresentam enxofre fazendo dupla ligação com o
fósforo possuem melhor ação inseticida, já que os insetos, diferente dos humanos,
são capazes de metabolizar essas drogas por desulfurização oxidativa, ou seja;
apresentam uma enzima que catalisa a substituição do enxofre por oxigênio
44
.
O Parathion® ou O,O-dietil O-(4-nitrofenil) fosforotioato e o Malathion® ou
O,O-dimetil ditiofosfoato de dietil mercaptosuccinato (IX e X, respectivamente),
são dois exemplos de pró-drogas com ação inseticida e toxicidade relativamente
baixa para humanos.
P
E
tO S
E
tO O NO
2
P
MeO S
MeO S
OE
t
O
O
OE
t
IX X
2.4.1.3. USO TERAPÊUTICO
O conhecimento do mecanismo de ação dos organofosforados sobre a enzima AChE
permitiu a modificação sintética de moléculas já conhecidas a fim de se obter novas
moléculas com efeito menos tóxico. Esse planejamento sintético levou a obtenção de
um composto conhecido como Ecotiopato ou Iodeto de fosfolina ou iodeto de (2-
dietoxifosfoniltioetil) trimetilamônio (XI). Esse fármaco apresenta ação miótica que
inicia dentro de 10 a 30 minutos de sua aplicação oftálmica e pode persistir de 1 a 4
18
semanas, causando a redução da pressão intraocular. O uso clínico do Ecotiopato é feito
quando corticóides ou β-bloqueadores não mostram sucesso terapêutico no tratamento
da doença. O emprego prolongado deste fármaco pode levar a efeitos adversos
indesejáveis devido a inibição sistêmica da AChE
96
.
P
O
OE
t
S
OEt
M
e
3
N
I
XI
O Metrifonato é um organofosforado produzido pela Bayer (XII), que inicialmente
foi empregado como inseticida e anti-helmíntico; recentemente foi descrito a eficiência
dessa droga no tratamento do déficit cognitivo da Doença de Alzheimer
97
.
P
OMe
O
M
eO
CCl
3
HO
XII
O metrifonato foi bem tolerado pelos pacientes (91% completaram as 30 semanas de
tratamento), sendo que os principais efeitos colaterais observados foram: diarréia, dores
abdominais e náuseas
98
. Morris e cols.
99
revelaram que além dos efeitos benéficos sobre
a cognição, o metrifonato também contribuiu para melhorar o comportamento dos
pacientes de Alzheimer. Esses resultados indicam que o Metrifonato tem um perfil de
eficácia e tolerabilidade semelhante ao Donepezil, o qual é atualmente considerado um
dos melhores fármacos para o tratamento da doença de Alzheimer
100
. No entanto, sabe-
se que o metrifonato tem como princípio ativo o 2,2,2-tricloro-1-hidroetildimetil
fosfonato (
Dichlorvos), e que este é usado como inseticida em vários tipos de cultura e é
suspeito de causar neuropatia tardia, após intoxicação aguda grave
101
.
19
2.4.2. CARBAMATOS
2.4.2.1. INSETICIDAS
Os compostos derivados do ácido carbâmico são provavelmente os compostos com
a faixa mais ampla de atividades biocidas
25
. Na estrutura básica (XIII), X pode ser um
átomo de oxigênio ou enxofre, R
1
e R
2
são usualmente substituintes orgânicos, mas
podem ser também hidrogênio. Quando R
1
é metila e R
2
é hidrogênio, o carbamato
exibe atividade inseticida, se R
1
é um grupo aromático os compostos são usados como
herbicida, enquanto que atividade fungicida está presente se R
1
for imidazol. Já o
substituinte em R
3
é quase sempre um radical orgânico ou um metal
95
.
NX
X
R
1
R
2
R
3
XIII
Os compostos Aldicarb® ou 2-metil-2-(metiltio)propionaldeido
O-
metilcarbamoiloxima -
XIV; Sevin®, carbaril ou 1-naftil N-metilcarbamato – XV;
Carbofuran® ou 2,3-diidro-2,2-dimetilbenzofuran-7-il metilcarbamato –
XVI; e
Primicarb® ou 2-dimetil-5,6-dimetilpirimidin-4-il
N,N-dimetilcarbamato – XVII, são
exemplos de carbamatos inseticidas.
CNHCH
3
O
O
CNHCH
3
O
NOCH
3
SCCH
CH
3
CH
3
XIV
XV
CNHCH
3
O
O
O
Me
Me
XVI
XVII
NN
N
Me Me
Me
Me O CNHCH
3
O
20
2.4.2.2. USO TERAPÊUTICO
Em 1864 foi descoberto um alcalóide natural, encontrado em sementes de uma
planta venenosa no oeste da África. Mas, somente em 1925, a estrutura química desse
alcalóide foi estabelecida e pode-se evidenciar a presença de um carbamato ligado a um
sistema de anéis (
XVIII), esse composto natural foi designado de fisostigmina ou
eserina.
N
N
Me
Me
O
H
N
O
Me
Me
XVIII
A fisostigmina tem uso limitado na medicina tanto pela ação inibitória rápida e
fugaz sobre a atividade da AChE como pelos efeitos colaterais que apresenta.
Atualmente, ela é empregada no tratamento do glaucoma e como antídoto em
intoxicações por atropina (antagonista muscarínico). A importância da fisostigmina, é
que esse composto serviu de protótipo para o planejamento e a síntese de análogos mais
eficientes e menos tóxicos.
A neostigmina e a piridostigmina (
XIX e XX, respectivamente), são análogos do
alcalóide natural fisostigmina, os quais apresentam ação mais prolongada e eficiente que
seu protótipo estrutural. Tanto a neostigmina como a piridostigmina são empregadas no
tratamento da
miatenia gravis, uma doença neuromuscular progressiva caracterizada por
uma debilidade e fraqueza muscular generalizadas
102
. Essas drogas também são de
utilidade clínica para reverter os efeitos de bloqueadores neuromusculares após
processos cirúrgicos
103
.
NON
O
M
e
M
e
Me
Me
Me
N
Me
ON
O
Me
M
e
XIX
XX
Br
B
r
21
O primeiro carbamato sintético a encontrar aplicação clínica foi a miotina (XXI),
assim denominado devido a sua atividade miótica
104
. Atualmente esse composto está em
desuso, mas serviu de protótipo para síntese de novas moléculas de interesse
farmacêutico.
N
Me
Me
Me
O
NHMe
O
XXI
Weinstock e cols.
105
sintetizaram uma série de análogos da miotina com variações
nos grupos alquil-substituintes ligados ao carbamato. Alguns desse compostos
mostraram-se menos tóxicos que a fisostigmina. Além disso, os derivados disubstituídos
mostraram um tempo de ação mais prolongado, sendo testados como candidatos
potenciais para o tratamento da doença de Alzheimer. O derivado (+)S-N-etil-3-[(1-
dimetilamino)etil]-n-metil fenilcarbamato, conhecido genericamente como rivastigmina
(XXII) e comercializado pelo laboratório Novartis com o nome de Exelon®, mostrou
afinidade 10 vezes maior pela forma G1 da AChE cerebral sobre as outras formas
periféricas da enzima
106,107,108,109
.
N
Me
Me
Me
O
NE
t
O
Me
XXII
2.5. ANÁLOGOS DA ACETILCOLINA
Os análagos da acetilcolina são principalmente agonistas dos receptores
colinérgicos, muscarínicos ou nicotínicos. Esses compostos mimetizam a ação da
acetilcolina por interagirem com os receptores e produzirem efeito colinérgico. Porém a
maioria deles apresentou efeitos colaterais indesejáveis, o que impossibilitou seu uso
como fármacos. Alguns exemplos estão ilustrados abaixo; a metacolina ou cloreto de 2-
(acetiloxi)-
N,N,N-trimetil-1- propanamínio - XXIII, o carbacol ou cloreto de 2-
22
[(aminocarbonil)oxi]-
N,N,N-trimetiletanamínio - XXIV, o betanecol ou cloreto de 2-
[(aminocarbonil)oxi]-
N,N,N-trimetil-1-propanamínio – XXV e o edrofônio – XXVI, são
alguns dos exemplos de análogos da neurotransmissor natural.
Cl
Cl
H
3
CO
NMe
3
OCH
3
H
2
NO
NMe
3
O
XXIII
XXIV
Cl
Cl
H
2
NO
NMe
3
OCH
3
NHO
Et
Me
Me
XXV
XXVI
Desses quatro compostos mostrados, apenas o edrofônio continua tendo aplicação
farmacológica para o tratamento da
miastenia gravis
109
.
2.6. ANTICOLINESTERÁSICOS DE USO CLÍNICO
O uso clínico crescente de inibidores da enzima AChE como terapia de uma
variedade de desordens do sistema nervoso central (SNC), como a Doença de
Alzheimer
110
, Síndrome de Down
111
, Injúria Traumática Cerebral
112
ou Delirium
113
tornam cada vez maior o interesse das indústrias farmacêuticas na obtenção de
moléculas que apresentem essa atividade
114
.
O primeiro inibidor da AChE (AChEi) aprovado pelo
United States Food and
Drug Administration (FDA) em 1993, foi o tetrahidroaminoacridine (THA),
genericamente chamado de Tacrina (XXVII), o qual foi liberado para a comercialização
com o nome de Cognex®
115
. Esse fármaco mostrou-se inconveniente por ter de ser
administrado quatro vezes ao dia e estar associado a hepatotoxicidade e incidências de
efeitos colaterais
116,117
.
23
N
NH
2
XXVII
Usando tacrina como modelo estrutural, várias tentativas de síntese de análogos
desse composto foram realizadas, com a intenção de produzir novas moléculas mais
potentes e com reduzidos efeitos colaterais
118,119,120,121
.
O mais potente inibidor, o ((
R,S)-1-benzil-4-[(5,6-dimetoxi-1-indanon)2-il]metil
piperidina (XXVIII), conhecido pelo nome trivial de Donepezil e comercializado como
Aricept®, foi aprovado pelo FDA em 1996
122
. Esse composto é membro de uma família
de inibidores da AChE baseados na estrutura N-benzilpiperidina, que foram
desenvolvidos a partir de estudos de QSAR
123
, sintetizados e testados, pela Eisai
company, no Japão
124
. Esse fármaco resultou do estudo e planejamento racional de
drogas a partir do conhecimento do sítio ativo da enzima AChE e de suas interações
químicas com os ligantes. Além disso, ele representa uma nova geração de AChEi que
oferece a conveniência de ser administrado somente uma vez ao dia e com poucos
efeitos colaterais
125
.
MeO
MeO
O
N
XXVIII
No ano de 2000, o Hidrogênio tartarato de (+)-(
S)-N-etil-3-[(1-dimetilamino)
etil]-N-metil-fenilcarbamato (XXII), conhecido pelo nome genérico de Rivastigmina e
comercializada como Exelon®, foi mais um fármaco AChEi aprovado pelo FDA para o
tratamento de patologias com desordem cognitiva
29
. Sendo que em maio de 2006, o
FDA ampliou as indicações da rivastigmina para ser usada também no tratamento da
Doença de Parkinson
126,127
. Atualmente, outros inibidores da AChE também estão sendo
avaliados em pacientes com Doença de Parkinson.
24
O último composto aprovado pelo FDA para o tratamento da doença de
Alzheimer foi a galantamina (XXIX), em fevereiro de 2001; denominado
comercialmente como Remynil® e produzido pelo laboratório Janssen Pharmaceutica.
O alcalóide galantamina ou (4aS,6R,8aS)-4a,5,9,10,11,12-hexaidro-3-metoxi-11-metil-
6H-benzofuro[3a,3,2,-ef] [2] benzazepin-6-ol foi inicialmente isolado de flores e bulbo
da
Galanthus woronowii, sendo posteriormente sintetizado
128,129
.
O
NMe
H
Me
MeO
XXIX
Além dos compostos mostrados acima, os quais já foram aprovados para serem
comercializados; o Huperzine A (
XXX), um alcalóide isolado de uma erva chinesa
conhecida como
Huperzia serrata, é um potente e seletivo inibidor da enzima AChE.
Embora esse alcalóide não tenha sido aprovado para comercialização pelo FDA, é muito
utilizado na medicina tradicional chinesa como fitoterápico e induz a uma significante
melhora na memória dos pacientes de Alzheimer, sem nenhum efeito colateral
noticiável até o momento
130
. Uma observação importante é que o Huperzine A inibe
preferencialmente a isoforma G4 da enzima
131
.
NH
O
H
2
N
Me
Me
XXX
25
Devido ao interesse biológico sobre os compostos AChEi, seja para a aplicação
na saúde humana, ou na agricultura como pesticidas; muitos pesquisadores continuam
estudando, planejando, sintetizando e avaliando biologicamente novos compostos em
diferentes países
118,119,120,124,130,131
.
2.7. EFEITO DAS PIRROLIDINONAS SOBRE O SISTEMA COLINÉRGICO
As pirrolidinonas ou 2-oxopirrolidinas constituem uma classe de compostos que têm
sido objeto de pesquisas por mais de três décadas. Os primeiros trabalhos clínicos e
experimentais investigaram o efeito nootrópico, sendo posteriormente estudado como
agentes neuroprotetores e anticonvulsivantes
38
.
A primeira pirrolidinona a chamar a atenção dos clínicos foi o piracetam (XXXI) ou
2-(2-oxopirrolidin-1-il) acetamida, no início da década de 70, e desde então tem sido
grande o interesse farmacêutico para essa classe de compostos
37
. Extensivos estudos do
modo de ação das pirrolidinonas
132,133
têm revelado vários efeitos farmacológicos, com
notáveis diferenças entre as drogas. A maioria, no entanto, influencia a função
colinérgica estimulando a produção e recaptação de acetilcolina. Esses efeitos
colinérgicos das pirrolidinonas parece ser devida a interações tanto com receptores
nicotínicos quanto muscarínicos
39,134
. Devido a grande homologia entre os receptores
colinérgicos e a enzima AChE, é possível que esses compostos interajam com esta
última.
N
O
NH
2
O
XXXI
Recentemente, o grupo Bayer registrou uma patente
40
da preparação de novas
pirrolidinonas trifluormetiladas (
XXXII) com comprovada atividade como
melhoradores cognitivos.
N
OF
3
C
R
1
AR
2
XXXII
26
Para o composto acima R
1
= H, alquila ou CF
3
, A= alquileno ou alquenileno e R
2
=
alcoxila, aminas ou sulfonila. A demonstração de que esses compostos melhoram a
cognição encoraja a pesquisa na sua interação com a enzima AChE, já que inibidores da
AChE são empregados na clínica para o tratamento do déficit cognitivo.
27
APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
QUÍMICOS
28
3. APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS QUÍMICOS
3.1. SÍNTESE DE ENAMINONAS (2a-c), AMINOÁLCOOIS (3a-d),
OXAZINONA (4a), OXAZINAS (5a-b)
ESQUEMA 3.1.
F
3
COEt
OH
H
RNH
2
, CH
2
Cl
2
ou NaOH, 25°C
60 - 90%
F
3
C NHR
OH
H
70 - 80%
H2-Pd/C
MeOH
F
3
C NHR
OH
H
H
HCHO, EtOH
(CCl
3
)
2
CO
(CH
2
)Cl
2
, Et
3
N
55 - 75%
70%
N
O
CF
3
R
N
O
CF
3
R
O
1 2a-c
3a-d
4a
5a-b
COMPOSTO
R
2a
-CH-CH
2
-(CO
2
CH
3
)
2b
-CH-(CO
2
CH
3
)-CH
2
-CH(CH
3
)
2
2c
-CH-(CO
2
CH
3
)-CH(CH
3
)-CH
2
CH
3
3a
-CH-CH
2
-(CO
2
CH
3
)
3b
-CH-(CO
2
CH
3
)-CH
2
-CH(CH
3
)
2
3c
-CH-(CO
2
CH
3
)-CH(CH
3
)-CH
2
CH
3
3d
-CH-(CO
2
CH
3
)-CH
2
Ph
4a
-CH-(CO
2
CH
3
)-CH
2
-CH(CH
3
)
2
5a
-CH-(CO
2
CH
3
)-CH(CH
3
)-CH
2
CH
3
5b
-CH-(CO
2
CH
3
)-CH
2
Ph
A síntese dos enamino compostos 2a-c, baseou-se em reações de substituição
nucleofílica no carbono β das 4-etoxi-1,1,1-trifluor-3-alquen-2-ona, tendo com agente
nucleofílico aminoácidos esterificados.
Os aminoálcoois 3a-d foram obtidos pela redução dos enamino compostos
empregando metodologia de hidrogenação catalítica com paládio/carbono 10%. A
oxazinona 4a foi obtida pela reação de ciclização do γ-aminoálcool 3b com trifosgênio
sob refluxo.
29
E finalmente as oxazinas 5a e 5b resultaram da reação de ciclização dos γ-
aminoálcoois 3c e 3d com
p-formaldeído, respectivamente, conforme esquema 3.1.
Todos os procedimentos descritos sucintamente acima estão detalhadamente
apresentados e discutidos em tese de doutorado da doutora Adriana Squizani
135
, além
disso, a metodologia para a obtenção de alguns desses compostos foi publicada por
Zanatta e cols
136,137
. Os dados espectroscópicos desses compostos encontram-se no
anexo I desta tese.
TABELA 3.1. Nomenclatura dos enamino compostos, aminoálcoois, oxazinona,
oxazinas
COMPOSTO NOMENCLATURA
2a
2-[(E)-4,4,4-trifluor-3-oxo-1-butenilamino] acetato de metila
2b
4-metil-2-[(E)-4,4,4-trifluor-3-oxo-1-butenilamino] pentanoato
de metila
2c
3-metil-2-[(E)-4,4,4-trifluor-3-oxo-1-butenilamino] pentanoato
de metila
3a
2-(4,4,4-trifluor-3-hidroxibutilamino) acetato de metila
3b
4-metil-2-(4,4,4-trifluor-3-hidroxibutilamino) pentanoato de
metila
3c
3-metil-2-(4,4,4-trifluor-3-hidroxibutilamino) pentanoato de
metila
3d
3-fenil-2-(4,4,4-trifluor-3-hidroxibutilamino) propanoato de
metila
4a
4-metil-2-(2-oxo-6-trifluormetil-1,3-oxazinan-3-il) pentanoato
de metila
5a
3-metil-2-(6-trifluormetil-1,3-oxazinan-3-il) pentanoato de
metila
5b
3-fenil-2-(6-trifluormetil-1,3-oxazinan-3-il) propanoato de
metila
30
3.2. SÍNTESE DE 3-
N-ALQUIL-AMINOMETILENODIIDROFURAN-2-
ONAS (7a-b)
As 3-
N-alquil-aminometilenodiidrofuran-2-onas
138
7a-b foi obtidas por reação
de adição nucleofílica; tendo como precursor o 3-tricloroacetil-4,5-diidrofurano (6) e as
aminas pirrolidina (C
4
H
9
N) e piperidina (C
5
H
11
N) como respectivos agentes
nucleofílicos (Esquema 3.2.). Os dados espectroscópicos desses compostos encontram-
se no anexo I desta tese.
ESQUEMA 3.2.
O
CCl
3
O
C
4
H
9
N
CH
2
Cl
2
, 25°, 1h
CH
2
Cl
2
, 25°, 1h
C
5
H
11
N
92%
91%
O
O
N
O
O
N
6
7a
7b
TABELA 3.2. Nomenclatura 3-N-alquil-aminometilenodiidrofuran-2-onas
COMPOSTO NOMENCLATURA
7a
3-Pirrolidin-1-ilmetileno-dihidro-furan-2-ona
7b
3-Piperidin-1-ilmetileno-dihidro-furan-2-ona
3.3. SÍNTESE DAS 3-ALCOXI- 5-HIDROXI- 5-TRIFLUORMETIL
PIRROLIDIN-2-ONAS (9a-d)
ESQUEMA 3.3.
F
3
COR
O
R
2
R
1
NaCN, EtOH ou MeOH/H
2
O
Refluxo, 24h
65-75%
N
R
1
HO
F
3
C
O
H
OR
R
2
8a-d 9a-d
R R
1
R
2
a
Et H H
b
Me H Me
c
(CH
2
)
2
d
Et H OEt
31
Uma série de 3-alcoxi-5-hidroxi-5-trifluormetil pirrolidin-2-onas
(9a-d)
139
com
diferentes substituintes na posição 3 foi sintetizada. Esses compostos foram obtidos a
partir de reações de β-alcóxivinil trifluormetil cetonas
(8a-d) dissolvidas em metanol ou
etanol, onde foi adicionada uma solução aquosa de cianeto de sódio.
Os produtos foram formados devido, inicialmente, à adição de Michael do
cianeto ao carbono β das cetonas, formando como intermediário não isolável β-ciano
cetonas, seguido de hidrólise do grupo ciano para amina e do ataque intramolecular do
nitrogênio da amida à carbonila das cetonas, formando os compostos
9a-d em
rendimentos moderados à bons. Os dados espectroscópicos desses compostos
encontram-se no anexo I desta tese.
TABELA 3.3. Nomenclatura das 3-alcoxi-5-hidroxi-5-trifluormetil pirrolidin-2-
onas
COMPOSTO NOMENCLATURA
9a
5-hidroxi-5-trifluormetil-3-etoxi pirrolidin-2-ona
9b
5-hidroxi-5-trifluormetil-3,3-dimetoxi pirrolidin-2-ona
9c
6-hidroxi-6-trifluormetil-hexahidro-furo[2,3-c] pirrol-4-ona
9d
5-hidroxi-5-trifluormetil-3,3-dietoxi pirrolidin-2-ona
O composto
9a, obtido pela ciclização da 4-etoxi-1,1,1-trifluor-3-alquen-2-ona com
cianeto de sódio
141
, apresenta um inconveniente: a formação de um par de enantiômeros
e seus diasteroisômeros, portanto, quatro isômeros. Por isso, a alquilação da
pirrolidinona
9d ao invés da 9a, resolveria em parte esse problema; já que resultaria em
apenas um par de enantiômeros.
Além disso, a realização de uma síntese mais seletiva, a fim de produzir somente o
produto
N-alquilado permitiria a comparação dos efeitos obtidos com os produtos
dialquilado e monolaquilado.
O procedimento para obtenção da 3,3-dietoxi-5-hidroxi-5-trifluormetil-4,5-
dihidropirrolidin-2-ona (
9d) já é conhecido
142
. A tentativa de alquilar seletivamente o
nitrogênio do anel seria o passo subseqüente.
32
3.4. SÍNTESE DAS 3-ALCOXI- 5-HIDROXI- 5-TRIFLUORMETIL
PIRROLIDIN-2-ONAS
N-ALQUILADAS E N-O-ALQUILADAS (10a-d)
A alquilação da 3-etoxi-5-hidroxi-5-trifluormetil-4,5-dihidropirrolidin-2-ona, 9a
foi realizada em acetonitrila, hidróxido de potássio e empregando como agentes
alquilantes: iodeto de metila, brometo de etila, brometo de
n-butila e cloreto de benzila.
Essas reações de alquilação resultaram uma mistura de produtos
N-alquilados e N,O-
alquilados conforme mostra o esquema 3.4.1., exceto para a alquilação com iodeto de
metila, a qual forneceu somente o produto
N,O-alquilado. Com os demais agentes
alquilantes, obteve-se o produto
N,O-alquilado em maior proporção (tabela 3.4.1.). Os
procedimentos empregados nessas reações são detalhadamente apresentados e
discutidos em tese de doutorado da doutora Luciana S. Rosa
140
. Os dados
espectroscópicos desses compostos encontram-se no anexo I desta tese.
ESQUEMA 3.4.
N
HO
CF
3
O
H
OEt
CH
3
CN, KOH
YR, Refluxo, 24h
N
HO
CF
3
O
R
OEt
N
RO
CF
3
O
R
OEt
+
9a
10
10'
10,10’ Y R
a
I Me
b
Br Et
c
Br n-Bu
d
Cl Bn
TABELA 3.4.1. Proporção das 3-alcoxi- 5-hidroxi- 5-trifluormetil pirrolidin-2-
onas
N-alquiladas e N-O-alquiladas
Produto Haleto de
Alquila
Proporção
dos Produtos
Rendimento (%)
10a
MeI
70
10b + 10b’
C
2
H
5
Br 3:1 52/23
10c + 10c’
n-C
4
H
9
Br 3,5:1 51/17
10d + 10d’
C
6
H
5
CH
2
Br 5,5:1 41/10
33
TABELA 3.4.2. Nomenclatura das 3-alcoxi- 5-hidroxi- 5-trifluormetil pirrolidin-2-
onas
N-alquiladas e N-O-alquiladas
COMPOSTO NOMENCLATURA
10a
3-etoxi-1-metil-5-meiose-5-trifluormetil-2-pirrolidinona
10b
1-etil-3-etoxi-5-etoxi-5-trifluormetil-2-pirrolidinona
10b’
3-etoxi-5-hidroxi-1-etil-5-trifluormetil-2-pirrolidinona
10c
1-n-butil-5-butoxi-3-etoxi-5-trifluormetil-2-pirrolidinona
10c’
1-n-butil-3-etoxi-5-hidroxi-5-trifluormetil-2-pirrolidinona
10d
1-benzil-5-benziloxi-3-etoxi-5-trifluormetil-2-pirrolidinona
10d’
1-benzil-3-etoxi-5-hidroxi-5-trifluormetil-2-pirrolidinona
3.5. SÍNTESE DA (3,3-DIETOXI-5-HIDROXI-5-TRIFLUORMETIL-4,5-
DIHIDROPIRROLIDIN-2-ONA) ACETAMIDA (15)
A
N-alquilação de 3,3-dietoxi-5-hidroxi-trifluormetil-4,5-dihidropirrolidin-2-ona
com cloro acetamida resultaria em um análogo sintético do Piracetam®. Um análogo
desse fármaco poderia ser testado para uma ampla faixa de atividades biológicas.
A fim de obter o produto
N-alquilado a partir do precursor 9d; dois métodos de
proteção da função álcool na posição 5 do anel foram testados. O primeiro utilizando
2,3-diidropirano e o segundo cloro trimetilsilano, conforme mostra o esquema 3.5.1 e
3.5.2, respectivamente.
ESQUEMA 3.5.1
N
H
O
F
3
C
HO
OEt
EtO
+
O
N
H
O
F
3
C
O
O
OEt
EtO
9d 11 12
THF an.
HCl, KOH
34
ESQUEMA 3.5.2
N
H
O
F
3
C
HO
OEt
EtO
+(CH
3
)
3
SiCl
N
H
O
F
3
C
(CH
3
)
3
SiO
OEt
EtO
9d
13
14
Et
3
N, DMAP
THF an.
75-85%
Embora o método de proteção de álcoois com diidropirano seja bem
conhecido,
143
nossa tentativa de proteção por essa metodologia não foi bem sucedida.
Os espectros de RMN de
1
H e
13
C, não mostraram o sinal do próton ligado ao carbono
do cetal que deveria ser formado após a proteção da hidroxila no composto
12. No
entanto, o segundo método de proteção da função álcool das pirrolidinonas empregando
o cloro trimetilsilano
144
como agente de proteção, foi bem sucedida e rendeu o produto
14 O-protegido com bons rendimentos. O sinal dos prótons das metilas do trimetilsilano
ligado ao oxigênio é visto no espectro de RMN de
1
H como um sinal vizinho ao
tetrametilsilano. Além disso, o sinal do próton ligado ao oxigênio da hidroxila
desaparece após a reação de proteção.
O emprego das pirrolidinonas protegidas nas reações de alquilação pelo método
já conhecido, o qual empregava acetonitrila , KOH e refluxo (mostrado no esquema
3.4.1.) resultou em quatro produtos finais: pirrolidinona protegida não alquilada,
pirrolidinona protegida alquilada, pirrolidinona desprotegida alquilada e pirrolidinona
desprotegida não-alquilada. É possível que o refluxo tenha contribuído para a perda da
proteção pelo trimetilsilano.
Na tentativa de melhorar esses resultados empregou-se uma nova metodologia
para as reações de alquilação,
145
desta vez empregando BuLi como base a temperatura
de -78°C , conforme esquema 3.5.3.
ESQUEMA 3.5.3
35
N
OF
3
C
(CH
3
)
3
SiO
H
BuLi/THF/-78°C,2h
ClCH
2
CONH
2
N
OF
3
C
(CH
3
)
3
SiO
NH
2
O
14
15
16%
A reação mostrada no esquema 3.5.3 também resultou em mistura de produtos
alquilados e não alquilados, com proporção inferior de produto
N-alquilado (15). Nos
espectros de RMN de
1
H os sinais dos prótons ligados ao carbono da acetamina
apareceram como dois dubletos em 4,88 e 4,86 ppm.
Como o procedimento do esquema acima era realizado em duas horas,
resolvemos aumentar o tempo de reação a fim de obter somente o produto
15. Testamos
tempos de 6, 16, 24 e 48 horas e o resultado não modificou. Então, foi realizada a
purificação do produto em coluna de fluorisil com lavagem de solventes em graus
crescentes de polaridade. Após a limpeza do cartucho e a aplicação do produto, foi
eluído 2 ml de cada solvente na seguinte ordem; hexano, diclorometano, acetonitrila e
metanol. As frações de cada solvente foram coletadas e evaporadas, amostras de RMN
de
1
H de cada uma foram feitas; porém em nenhuma das frações coletadas foi
encontrado o produto.
3.6. SÍNTESE DA DIMETIL-[(2-METILSULFANIL-4-TRICLOROMETIL-6-
PIRIMIDINILMETOXI)ETIL] AMINA (20)
A síntese da dimetil-(2-metilsulfanil-4-triclorometil-6-pirimidinilmetoxi)etil] amina
(
17) foi realizada conforme procedimento adotado pela doutora Darlene Flores em seu
trabalho de doutorado.
146
O esquema 3.6.1 apresenta o primeiro passo reacional para a obtenção do anel
pirimidínico precursor da dimetil-[(2-metilsulfanil- 4-triclorometil-6-pirimidinilmetoxi)
etil] amina -
20, contendo metilsulfanil na posição 2 e bromo metil na posição 6 do anel
pirimidínico. Após o tratamento da reação, o produto
18 (6-bromometil-2-metilsulfanil-
4-triclorometil pirimidina) foi obtido como um óleo amarelo com bom rendimento.
ESQUEMA 3.6.1
36
16 17 18
Cl
3
CCH
2
Br
OOCH
3
+ [CH
3
SC(=NH)NH
2
]
2
. H
2
SO
4
MeOH/H
2
O
HCl, refl.,48h
N
N
CCl
3
SMe
Br
65%
O esquema 3.6.2 apresenta a reação de substituição do bromo na posição 6 do anel
pirimidínico pelo 2-dimetilamino etanol. O produto
20 é obtido facilmente como um
sólido amarelo claro em ótimo rendimento.
ESQUEMA 3.6.2
92%
18 19 20
N
N
CCl
3
SMe
Br
+
N
OH
Me
Me
ACETONA an.
25°C, 16h
N
N
CCl
3
SMe
O
N
Me
Me
Os detalhes experimentais a cerca das reações mostradas nos esquemas acima,
estão na secção experimental.
3.7. SÍNTESE DE ENOILCARBAMATOS TRIFLUORMETILADOS
Os carbamatos 22a-c foram obtidos a partir da reação de 4-alcoxi-1,1,1-trifluor-
alqu-3-en-2-onas
147
com etil carbamato conforme demonstrado por Zanatta e col.
148
Os
derivados
23a-c foram obtidos pela redução da dupla da carbonila com boro hidreto de
sódio em etanol. A reação de ciclização desses compostos reduzidos com trifosgênio
levou a formação das oxazinonas correspondentes
24a-c.
ESQUEMA 3.7.
37
OEtF
3
C
OR
H
NH
2
COOEt, CH
2
CL
2
, TsOH
Refluxo, 24-48h
41-80%
NHCOOEtF
3
C
OR
H
NaBH
4
, EtOH
Refl., 24hs
38-82%
NHCOOEtF
3
C
R
H
OH
(CCl
3
O)
2
CO
(CH
2
)
2
Cl
2
Et
3
N, 5hs
25-54%
N
O
CF
3
O
COOEt
R
21
22
23
24
22,23,24 R
a
H
b
Me
c
Ph
TABELA 3.7. Nomenclatura dos Enoilcarbamatos trifluormetilados
COMPOSTO NOMENCLATURA
22a
(4,4,4-trifluor-3-oxo-1-but-1-enil) carbamato de etila
22b
(4,4,4-trifluor-1-metil-3-oxo-1-but-1-enil) carbamato de etila
22c
(4,4,4-trifluor-1- fenil-3-oxo-1-but-1-enil) carbamato de etila
23a
(4,4,4-trifluor-3-hidroxi-butil) carbamato de etila
23b
(4,4,4-trifluor-3-hidroxi-1-metil-butil) carbamato de etila
23c
(4,4,4-trifluor-3-hidroxi-1-fenil-butil) carbamato de etila
24a
2-oxo-6-trifluormetil-[1,3]oxazinana-3- carbamato de etila
24b
2-oxo-4-metil-6-trifluormetil-[1,3]oxazinana-3- carbamato de etila
24c
2-oxo-4-fenil-6-trifluormetil-[1,3]oxazinana-3- carbamato de etila
38
3.8. SÍNTESE DOS 3-DIALCOXI FOSFORILOXI TRIFLUORMETILADOS
Os compostos organofosforados ou derivados fosforiloxi 25a-i foram obtidos a
partir de reação dos aminoálcoois (4,4,4-trifluor-3-hidroxi-but-1-il) etil carbamato (
23a-
c)
com oxicloreto de fósforo em tolueno, na presença de piridina ou trietilamina, em
atmosfera inerte, por 5 horas a temperatua ambiente. Os procedimento de síntese desses
compostos fazem parte do trabalho de doutorado realizado pela colega Deise
Borchhardt. Os dados espectroscópicos dos compostos
25a-i estão no anexo I desta tese.
ESQUEMA 3.8.
23
POCl
3
, Tolueno
Et
3
N, 5hs
NHCOOEtF
3
C
R
H
OH
NHCOOEtF
3
C
R
H
O
PCl Cl
O
MeOH,
EtOH ou
AlOH
NHCOOEtF
3
C
R
H
O
P
R
1
R
1
O
25
25 R
R
1
a
H MeO
b
Me MeO
c
Ph MeO
d
H EtO
e
Me EtO
f
Ph
EtO
g
H Alil
h
Me Alil
i
Ph Alil
TABELA 3.8. Nomenclatura dos 3-dialcoxi fosforiloxi trifluormetilados
COMPOSTO NOMENCLATURA
25a
[3-(dimetoxi-fosforiloxi)-4,4,4-trifluor-butil] carbamato de etila
25b
[3-(dimetoxi-fosforiloxi)-4,4,4-trifluor-1-metil-butil] carbamato de
etila
25c
[3-(dimetoxi-fosforiloxi)-4,4,4-trifluor-1-fenil-butil] carbamato de
39
etila
25d
[3-(dietoxi-fosforiloxi)-4,4,4-trifluor-butil] carbamato de etila
25e
[3-(dietoxi-fosforiloxi)-4,4,4-trifluor-1-metil-butil] carbamato de
etila
25f
[3-( dietoxi-fosforiloxi)-4,4,4-trifluor-1-fenil-butil] carbamato de
etila
25g
[3-(Bis-aliloxi-fosofriloxi)-4,4,4-trifluor-butil] carbamato de etila
25h
[3-(Bis-aliloxi-fosforiloxi)-4,4,4-trifluor-1-metil-butil] carbamato
de etila
25i
[3-(Bis-aliloxi-fosofriloxi)-4,4,4-trifluor-1-fenil-butil] carbamato
de etila
40
APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
BIOLÓGICOS
41
4. APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS BIOLÓGICOS
4.1. ENSAIO DE ATIVIDADE DA ENZIMA AChE
Os ensaios de atividade biológica sobre a enzima AChE, dos compostos sintetizados
pelo grupo, foi marcado por questões como: qual a solubilidade desses compostos em
água? Os não solúveis em água, em que solvente seriam preparados? Qual a influência
dos solventes orgânicos sobre a atividade enzimática? Qual a concentração ideal dos
compostos para um ensaio
in vitro? Que estruturas cerebrais seriam usadas como fonte
de enzima? Quais as moléculas mais prováveis de apresentarem atividade sobre a
AChE?
A partir disso, foram realizados vários testes de solubilidade em solventes orgânicos
e testados a influência desses solventes sobre a atividade da enzima em diferentes
estruturas cerebrais.
As enaminonas
2a-c e os aminoálcoois 3a-d foram os primeiros compostos
candidatos ao ensaio de atividade. Esses compostos foram testados em quatro
concentrações (1, 10, 100, 1000
μM). Desse ensaio preliminar ficou determinado que a
maior concentração (1000
μM) seria a escolhida para as futuras triagens de atividade
dos compostos.
Além disso, inicialmente cinco estruturas cerebrais de rato foram utilizadas:
hipocampo, estriado, hipotálamo, cerebelo e córtex cerebral. Como o estriado é a
estrutura cerebral que apresenta a maior atividade da enzima AChE, ficou estabelecido
que essa seria a estrutura preferencial para a realização dos testes biológicos.
A atividade da AChE foi determinada pelo método de Elmann e col. (1961)
148
modificado por Rocha e col. (1993)
149
. Tendo as estruturas cerebrais de ratos como
fonte de enzima, acetiltiocolina (0,8 mM) como substrato, e um sistema contendo ácido
5,5’-ditiobis-2-nitrobenzóico (DTNB) como indicador da hidrólise da acetiltiocolina. O
DTNB é usado para determinação colorimétrica de grupos tióis em amostras biológicas.
A solução de DTNB é levemente amarelada, porém na presença de grupos tióis é
convertido a ácido 5-mercapto-2-nitrobenzóico, de coloração amarela, o qual tem
absorção máxima em 412 nm, sendo que o espectro de absorção do DTNB (420), não
interfere com a detecção dos grupos tióis. A atividade específica da AChE nas estruturas
cerebrais foi expressa como µmol ACSCh/H/mg proteína, em eritrócitos como
mU/µmol Hb e na enzima purificada como U/ml/minuto.
42
O esquema abaixo mostra a reação entre o DTNB e as moléculas de tiocolina (RSH)
resultantes da hidrólise produzida pela AChE.
HOOC
O
2
N
S
S COOH
NO
2
RSH
2
NO
2
COOH
-
S
+
RSSR
DTNB Ácido 5-mercapto
2-nitrobenzóico
4.2. EFEITO per se DOS SOLVENTES ORGÂNICOS SOBRE A ATIVIDADE
DA AChE EM DIFERENTES ESTRUTURAS CEREBRAIS DE RATO
Um dado importante, foi a observação que alguns dos solventes empregados na
solubilização dos compostos inibiam de forma significativa a atividade da AChE. Com
isso surgiu a idéia de testar diferentes solventes sobre a atividade dessa enzima.
Os resultados ilustrados nos gráficos a seguir representam o efeito
per se dos
solventes sobre a atividade da AChE em estriado cerebral de ratos. Os solventes
testados foram álcool metílico (CH
4
O), álcool etílico (C
2
H
6
O), álcool isopropílico
(C
3
H
8
O), álcool terc-Butílico (C
4
H
10
O), acetona (C
3
H
6
O), acetonitrila (C
2
H
3
N), e
dimetil sulfóxido (DMSO; C
2
H
6
OS).
Além do estriado cerebral, o hipocampo, hipotálamo, cerebelo e córtex cerebral
também foram usados como fonte de enzima AChE. No entanto, ilustramos somente os
resultados do estriado cerebral, pois o trabalho resultante desse ensaio encontra-se na
integra no anexo II desta tese.
150
Para todos os compostos solubilizados em solvente orgânico nos ensaios com a
AChE e apresentados nesta tese, a concentração de tais solventes no meio de reação
com a enzima foi sempre de 2.5%, já que adicionava-se sempre 50
μL da solução
contendo o composto para uma volume final de 2000
μL de mistura reacional.
43
GRÁFICO 4.2.1. Efeito do Álcool Metílico sobre a atividade da AChE em estriado
cerebral de ratos
Contr 0.6 1.2 1.8 2.5 5 10%
Concentração
0
7
14
21
28
Atividade AChE
Resultados mostrados como média ± desvio padrão na tabela V do anexo II. Não houve
diferença significativa entre as várias concentrações e o controle.
GRÁFICO 4.2.2. Efeito do Álcool Etílico sobre a atividade da AChE em estriado
cerebral de ratos
Contr 0.6 1.2 1.8 2.5 5 10%
Concentração
0
7
14
21
28
Atividade AChE
Resultados mostrados como média ± desvio padrão na tabela V do anexo II. Não houve
diferença significativa entre as várias concentrações e o controle.
44
GRÁFICO 4.2.3. Efeito do Álcool Isopropílico sobre a atividade da AChE em
estriado cerebral de ratos
Contr 0.6 1.2 1.8 2.5 5 10%
Concentração
0
7
14
21
28
Atividade AChE
**
**
Resultados mostrados como média ± desvio padrão na tabela V do anexo II. Somente as
concentrações de 5 e 10% diferiram significativamente de controle **(p< 0.01).
GRÁFICO 4.2.4. Efeito do Álcool
t-Butílico sobre a atividade da AChE em
estriado cerebral de ratos
Contr 0.6 1.2 1.8 2.5 5 10%
Concentração
0
6
12
18
24
30
Atividade AChE
**
**
*
*
Resultados mostrados como média ± desvio padrão na tabela V do anexo II. As
concentrações de 1.2, 1.8, 2.5 e 10% diferiram significativamente de controle *(p<
0.05) e **(p< 0.01).
45
GRÁFICO 4.2.5. Efeito da Acetona sobre a atividade da AChE em estriado
cerebral de ratos
Contr 0.6 1.2 1.8 2.5 5 10%
Concentração
0
6
12
18
24
Atividade AChE
**
***
*
**
***
Resultados mostrados como média ± desvio padrão na tabela V do anexo II. As
concentrações de 1.2, 1.8, 2.5, 5 e 10% diferiram significativamente de controle *(p<
0.05), **(p< 0.01) e ***(p< 0.001).
GRÁFICO 4.2.6. Efeito da Acetonitrila sobre a atividade da AChE em estriado
cerebral de ratos
Contr 0.6 1.2 1.8 2.5 5 10%
Concentração
0
6
12
18
24
Atividade AChE
**
***
*
**
***
Resultados mostrados como média ± desvio padrão na tabela V do anexo II. As
concentrações de 1.2, 1.8, 2.5, 5 e 10% diferiram significativamente de controle *(p<
0.05), **(p< 0.01) e ***(p< 0.001).
46
GRÁFICO 4.2.7. Efeito do DMSO sobre a atividade da AChE em estriado cerebral
de ratos
Contr 0.6 1.2 1.8 2.5 5 10%
Concentração
0
5
10
15
20
Atividade AChE
**
***
*
***
***
Resultados mostrados como média ± desvio padrão na tabela V do anexo II. As
concentrações de 1.2, 1.8, 2.5, 5 e 10% diferiram significativamente de controle *(p<
0.05), **(p< 0.01) e ***(p< 0.001).
4.3. AVALIAÇÃO
in vitro DE ENAMINONAS, AMINOÁLCOOIS,
OXAZINONA, OXAZINAS e DIIDROFURANONAS SOBRE A ATIVIDADE
DA AChE EM ESTRIADO E HIPOCAMPO CEREBRAL DE RATOS
Os primeiros compostos testados frente à enzima AChE foram sintetizados pela
doutora Adriana Squizani.
135,136,137
. Como esses compostos não foram solúveis em água,
optamos por solubilizá-los em DMSO 50% (dimetil sulfóxido/água – 1:1), sendo que a
mesma concentração e volume desse solvente foi adicionado ao controle, a fim de
desconsiderar seu efeito sobre a AChE. Como o DMSO foi diluído em água (50%), a
concentração final desse solvente no meio de reação com a enzima foi de 1,25%.
As enaminonas
2a-c e os aminoálcoois 3a-d foram testados em hipotálamo,
estriado, hipocampo, cerebelo e córtex cerebral. No entanto, para as diferentes
estruturas cerebrais, observou-se o mesmo padrão de inibição enzimática. A partir
dessas observações, foi possível definir um protocolo de ensaio ou
screening dos
futuros testes, o qual empregaria uma ou duas estruturas cerebrais: estriado ou estriado e
hipocampo; e a concentração de 1000
μM do composto a ser testado.
47
As 3-
N-alquil-aminometilenodiidrofuran-2-onas
138
7a-b foram sintetizaas pelo
doutor Rosemário Barichello.
141
FIGURA 4.3. Estrutura química dos enamino compostos, aminoálcoois,
oxazinona, oxazinas testados sobre estriado carebral e hipocampo de ratos
4.3.1. ENAMINONAS
F
3
CNH
O
O
OMe
Me
Me
F
3
CNH
O
O
OMe
2b
2a
F
3
CNH
O
O
OMe
Me
Me
2c
4.3.2. AMINOÁLCOOIS
NH
F
3
C
OMe
O
HO
3a 3b
NHF
3
C
OMe
O
Me
Me
HO
NH
F
3
C
OMe
O
Me
Me
HO
3c 3d
NHF
3
C
OH
OMe
O
Ph
4.3.3. OXAZINONA
48
N
O
OMe
F
3
C
O
Me
Me
O
4a
4.3.4. OXAZINAS
N
O
OMe
F
3
C
O
Me
Me
5b
5a
O
N
F
3
C
O
OMe
Ph
4.3.5. DIIDROFURANONAS
7a
N
O
O
N
O
O
7b
Nos resultados mostrados nas tabelas 4.3.1 e 4.3.2 somente estriado e hipocampo
foram considerados. Essas tabelas apresentam o grau de inibição da AChE como média
± desvio padrão quando 1000
µM dos diferentes compostos foram adicionados ao meio
de reação contendo a enzima.
TABELA 4.3.1. Efeito sobre a atividade da AChE em estriado de ratos
COMPOSTO Atividade AChE
Controle Solvente
Atividade AChE
1 mM Composto
2a
21.65±0.61 20.66±0.66
2b
21.65±0.61 21.02±0.53
49
2c
21.65±0.61 20.85±0.51
3a
19.36±0.91 16.42±2.026
3b
19.59±0.96 19.95±1.101
3c
20.12±1.17 19.94±1.36
3d
21.73±1.84 20.55±2.32
4a
21.65±0.61 21.16±0.52
5a
21.65±0.61 20.71±0.55
5b
21.03±1.06 21.06±0.88
7a
22.61±0.33 22.48±0.405
7b
23.91±2.26 23.74±3.307
Solvente para compostos 2a-c, 3a-d, 4a e 5a-b = DMSO 50%; para compostos 7a-b =
EtOH. Resultados mostrados como média ± desvio padrão, (n = 4).
TABELA 4.3.2. Efeito sobre a atividade da AChE em hipocampo de ratos
COMPOSTO Atividade AChE
Controle Solvente
Atividade AChE
1 mM Composto
2a
4.08±0.205 4.46±0.16
2b
4.08±0.205 4.30±0.32
2c
4.08±0.205 4.34±0.46
3a
3.95±0.62 3.10±1.11
3b
3.01±0.23 3.07±0.28
3c
3.89±0.35 3.81±0.44
3d
4.83±0.64 4.26±0.29
4a
4.08±0.205 4.11±0.33
5a
4.08±0.205 4.41±0.38
5b
3.96±0.71 4.05±0.73
7a
6.903±0.68 6.30±0.81
7b
6.45±0.36 5.78±0.17
Solvente para compostos 2a-c, 3a-d, 4a e 5a-b = DMSO 50%; para compostos 7a-b =
EtOH. Resultados mostrados como média ± desvio padrão, (n = 4).
Nenhum dos compostos acima mostrou resultado significativo quando
comparado à atividade enzimática do controle.
50
4.4. AVALIAÇÃO
in vitro DE 3-ALCOXI-5-HIDROXI-5-TRIFLUORMETIL
PIRROLIDIN-2-ONAS SOBRE A ATIVIDADE DA AChE EM ESTRIADO
CEREBRAL DE RATOS
Na segunda fase de testes realizados sobre a atividade da enzima AChE, uma série
de pirrolidinonas
139,140
com diferentes substituintes na posição 3 foram testadas (figura
4.4.1).
FIGURA 4.4. Estrutura química das 3-alcoxi-5-hidroxi-5-trifluormetil pirrolidin-
2-onas (9a-d)
N
HO
CF
3
O
H
OEt
9a 9b
N
HO
CF
3
O
H
OMe
OMe
N
HO
CF
3
O
H
OEt
OEt
O
N
O
HO
CF
3
H
9c 9d
A tabela 4.4.1 mostra os resultados obtidos quando 1000
µM dos compostos 9a-d
foram adicionados ao meio de reação.
TABELA 4.4. Efeito das 3-alcoxi-5-hidroxi-5-trifluormetil pirrolidin-2-onas sobre
a atividade da AChE em estriado cerebral de ratos
COMPOSTO Atividade AChE
Controle EtOH
Atividade AChE
1 mM Composto
9a
19.42±1.15
18.84±0.34
51
9b
19.42±1.15 19.84±1.44
9c
19.42±1.15 19.38±1.10
9d
19.42±1.15 18.83±1.06
Resultados mostrados como média ± desvio padrão, (n = 4).
As pirrolidinonas 9a-d não mostraram efeito inibitório significativo sobre a
enzima AChE.
4.5. AVALIAÇÃO
in vitro DE 3-ETÓXI- 5-HIDROXI- 5-TRIFLUORMETIL
PIRROLIDIN-2-ONAS
N-ALQUILADAS E N-O-ALQUILADAS SOBRE A
ATIVIDADE DA AChE EM ESTRIADO CEREBRAL DE RATOS
Juntamente com as 3-alcoxi-5-hidroxi-5-trifluormetil pirrolidin-2-onas, realizou-se
um
screening para pirrolidinonas alquiladas derivadas de 9a
140
. Os derivados alquilados
continham mistura de produtos
N-alquilado e N-O-alquilado. Contudo existia um
excesso das pirrolidinonas
N-O-alquiladas e por isso o produto N-alquilado foi
considerado como impureza. Os ensaios
in vitro sobre a atividade da enzima AChE de
estriado cerebral de ratos com as pirrolidinonas
N-O-alquiladas foram realizados a fim
de fazer uma comparação com o resultado obtido para a 3-etoxi-5-hidroxi-5-
trifluormetil-4,5-dihidropirrolidin-2-ona, 9a.
A tabela 4.5.1 mostra os resultados obtidos quando 1000
µM das pirrolidinonas
alquiladas; foram adicionadas ao meio de reação.
Todas as pirrolidinonas
N-O-alquiladas, mas especialmente a 10b e 10d,
mostraram efeito inibitório significativo sobre a atividade da AChE
[F(1,6)=383.25,p<0.0001] e [F(1,6)=130.58,p<0.0001], respectivamente. O teste F para
as amostras que continham os compostos mostrou diferença significante quando
comparado ao controle.
FIGURA 4.5. Estrutura química das 3-alcoxi- 5-hidroxi- 5-trifluormetil pirrolidin-
2-onas
N-alquiladas e N-O-alquiladas
52
N
O
F
3
C
MeO
OEt
Me
10a
N
O
F
3
C
HO
OEt
Et
N
O
F
3
C
EtO
OEt
Et
10b 10b'
+
N
O
F
3
C
HO
OEt
Bu
N
O
F
3
C
BuO
OEt
Bu
10c 10c'
+
10d 10d'
+
N
O
F
3
C
Bn
OEt
Bn
N
O
F
3
C
HO
OEt
Bn
TABELA 4.5. Efeito das pirrolidinonas 10a-d sobre a atividade da AChE em
estriado cerebral de ratos
COMPOSTO Atividade AChE
Controle EtOH
Atividade AChE
1 mM Composto
10a
19.85±0.75
16.88±0.82**
10b + 10b’
19.74±0.62 8.37±0.98***
10c + 10c’
19.74±0.62 16.09±0.79**
10d + 10d’
21.52±0.78 14.82±0.87***
Resultados mostrados como média ± desvio padrão; ** p<0.01 e *** p<0.001, (n = 5).
A atividade da AChE é expressa como µmolACSCh/H/mg proteina.
53
Considerando os resultados preliminares obtidos, decidimos repetí-lo
empregando concentrações de 0.01, 0.1, 1, 2, 5 e 10 mM sobre a AChE estriatal.
GRÁFICO 4.5.1. Efeito das pirrolidinonas 10a sobre a atividade da AChE estriatal
EtOH 0.01 0.1 1 2 5 10mM
Concentração
0
5
10
15
20
Atividade AChE
**
*
*
**
Resultados mostrados como média ± desvio padrão, [EtOH = 17.36±1.65], [0.01mM =
15.56±1.67], [0.1mM = 16.44±1.38], [1mM = 14.76±1.49], [2mM = 13.88±1.44], [5mM =
11.82±0.89], [10mM = 7.75±1.04]; * p<0.05. Para 10a [F(6,21)=21.883; p<0.05]
GRÁFICO 4.5.2. Efeito das pirrolidinonas 10b sobre a atividade da AChE estriatal
54
EtOH 0.01 0.1 1 2 5 10mM
Concentração
0
5
10
15
20
Atividade AChE
***
***
***
***
Resultados mostrados como média ± desvio padrão, [EtOH = 17.26±1.51], [0.01mM =
16.92±1.53], [0.1mM = 16.03±1.49], [1mM = 7.34±1.27], [2mM = 0.51±0.21], [5mM =
0.45±0.11], [10mM = 0.06±0.069]; ***p<0.001. Para 10b [F(6,21)=220.317; p<0.001].
GRÁFICO 4.5.3. Efeito das pirrolidinonas 10c sobre a atividade da AChE estriatal
EtOH 0.01 0.1 1 2 5 10mM
Concentração
0
5
10
15
20
Atividade AChE
*
**
***
***
Resultados mostrados como média ± desvio padrão, [EtOH = 17.26±1.51], [0.01mM =
17.44±1.16], [0.1mM = 17.05±1.75], [1mM = 14.06±1.21], [2mM = 12.64±0.87], [5mM =
10.15±1.12], [10mM = 9.08±1.66]; *p<0.05, **p<0.01 e ***p<0.001. Para 10c
[F(6,21)=26.168; p<0.001]
55
GRÁFICO 4.5.4. Efeito das pirrolidinonas 10d sobre a atividade da AChE estriatal
EtOH 0.01 0.1 1 2 5 10mM
Concentração
0
5
10
15
20
25
Atividade AChE
***
**
***
***
Resultados mostrados como média ± desvio padrão, [EtOH = 21.05±1.67], [0.01mM =
20.50±1.38], [0.1mM = 19.66±1.45], [1mM = 14.16±0.87], [2mM = 11.20±0.72], [5mM =
1.63±0.56], [10mM = 0.00±0.00]; **p<0.01 e ***p<0.001. Para 10d [F(6,21)=258.605;
p<0.001].
Apesar das pirrolidinonas alquiladas apresentarem o inconveniente da mistura de
produtos, pode-se considerar que os resultados obtidos para esses compostos da série
10a-d foram animadores.
Acreditamos que esses resultados possam ser atribuídos as pirrolidinonas
N-O-
alquiladas, já que essas mostravam excesso quando comparado ao produto
monoalquilado. Porém o efeito discreto do composto 10a sobre a atividade da enzima
AChE, o qual continha somente o produto dialquilado, nos instiga a questionar se o
efeito observado para as pirrolidinonas 10b-b’ e 10d-d’ não seria garantido mais pela
forma monoalquilada que pela forma dialquilada. De qualquer maneira a separação
desses produtos ou uma
N-alquilação seletiva é imprescindível para testarmos
novamente e respondermos com convicção essa questão. Além disso, a alquilação da
pirrolidinona 9d ao invés da 9a, levaria a um número reduzido de isômeros o que seria
desejável para melhorar os ensaios.
56
4.6. AVALIAÇÃO
in vitro E in vivo DA DIMETIL-[(2-METILSULFANIL-4-
TRICLOROMETIL-6-PIRIMIDINILMETOXI)ETIL] AMINA (20) SOBRE A
ATIVIDADE DA ENZIMA AChE
O último composto a ser testado foi a dimetil-[(2-metilsulfanil-4-triclorometil-6-
pirimidinilmetoxi)etil] amina.
146
Esse composto despertou interesse para teste de
atividade anticolinesterásica, porque o substituinte na posição 6 do anel pirimidínico é
um análogo estrutural da colina, a qual faz parte da estrutura do substrato natural da
enzima AChE.
A tabela 4.6.1 mostra que o derivado pirimidínico, em concentração 2 vezes menor
que utilizada nos
screening anteriores, inibiu em 50% a atividade da enzima AChE
[F(1,6)=95.88,p<0.0001]. O teste F mostrou diferença significativa entre o composto
(500 µM) quando comparado ao controle (MeOH).
TABELA 4.6. Efeito sobre a atividade da AChE em estriado cerebral de ratos
COMPOSTO
20
Atividade AChE
Controle MeOH
Atividade AChE
0,5 mM Composto
N
N
CCl
3
SCH
3
ON
20.56±1.93
10.06±0.92***
Resultados mostrados como média ± desvio padrão; *** p<0.001, (n = 5).
O interesse biológico sobre essa molécula deve-se principalmente à similaridade
estrutural com a colina presente na acetilcolina. Além dessa particularidade que torna o
composto 20 uma molécula interessante para avaliação sobre a atividade da AChE; ele
também apresenta uma proximidade estrutural com um inseticida comercializado com o
nome de Primicarb® ou 2-dimetil-5,6-dimetilpirimidin-4-il
N,N-dimetilcarbamato. Esse
último composto é constituído de um anel pirimidínico e apresenta substituintes nas
posições 2 e 6 do heterociclo que possuem propriedades químicas similares aos
substituintes do composto 20, nas mesmas posições.
A partir desses dados prévios, definiu-se um protocolo de ensaio
in vitro que
empregaria 10, 100 e 500
μM do composto em estriado cerebral de ratos.
Os resultados
in vitro sobre a AChE de estriado cerebral de ratos mostrou efeito
inibitório significativo nas duas maiores concentrações utilizadas [F(4,15)=25.22;
57
p<0.001]. O Post Hoc de Duncan mostrou diferença significativa entre as concentrações
de 100 e 500
μM quando comparadas com o controle.
GRÁFICO 4.6.1. Efeito
in vitro da dimetil-[(2-metilsulfanil-4-triclorometil-6-
pirimidinilmetoxi)etil] amina sobre a atividade da AChE estriatal de ratos
Contr MeOH 0.01 0.1 0.5 mM
Concentração
0
6
12
18
24
Atividade AChE
**
***
Resultados mostrados como média ± desvio padrão, [Controle = 20.06±1.71], [MeOH =
20.56±1.93], [0.01mM = 18.56±1.96], [0.1mM = 15.28±1.78], [0.5mM = 10.06±0.92];
**p<0.01 e ***p<0.001
, (n = 5).
A dimetil- [(2-metilsulfanil- 4-triclorometil-6-pirimidinilmetoxi) etil] amina 20,
foi o único composto testado sobre a AChE que mostrou solubilidade em água, sendo
portanto o primeiro candidato a testes
in vivo sobre a AChE.
A partir desses resultados foram calculadas as concentrações ideais a serem
empregadas no ensaio
in vivo.
O ensaio utilizou quatro grupos de animais, com sete animais em cada grupo. O
grupo 1 era o grupo controle, onde os animais receberam água destilada diariamente
por 10 dias. Os outros três grupos: grupo 2, grupo 3 e grupo 4, receberam diariamente
soluções aquosas com dimetil- [(2-metilsulfanil- 4-triclorometil-6-pirimidinilmetoxi)
etil] amina, nas concentrações de 1, 10 e 100 mg/Kg, respectivamente. Assim como o
58
grupo controle, os grupos tratados também continham sete ratos e foram gavados no
mesmo período do dia (meio da tarde).
Após 10 dias de tratamento esses animais foram decapitados, seus cérebros
foram retirados e cuidadosamente dissecados em estriado, hipocampo e córtex cerebral.
Além disso, amostras de fígado e rim foram coletadas para análise histológica, a fim de
verificar dano tecidual pela droga.
GRÁFICO 4.6.2. Efeito
in vivo da dimetil-[(2-metilsulfanil-4-triclorometil-6-
pirimidinilmetoxi)etil] amina sobre a atividade da AChE estriatal de ratos
Controle 1 10 100 mg/Kg
Concentração
0
6
12
18
24
Atividade AChE
***
***
Resultados mostrados como média ± desvio padrão, [Controle = 19.88±2.18], [1mg/Kg =
18.60±2.30], [10mg/Kg = 11.61±2.28], [100mg/Kg = 11.65±1.32]; ***p<0.001, (n = 7).
O gráfico 4.6..2 mostra o efeito inibitório do composto 20 sobre a atividade da
AChE de estriado cerebral de rato. É possível notar que a concentração de 1 mg/Kg já
mostrou tendência à inibição da enzima, porém quando 10 e 100 mg/Kg da dimetil- [(2-
metilsulfanil- 4-triclorometil-6-pirimidinilmetoxi) etil] amina foram administrados por
via oral por 10 dias, um efeito inibitório significativo sobre a atividade da AChE foi
observado, [F(3,24)=12.93; P<0.0001]. O post hoc de Duncan mostrou diferença
significativa entre as concentrações de 10 e 100mg/Kg e o controle.
59
O gráfico 4.6.3 mostra o efeito do composto 20 sobre a atividade da enzima AChE
em membrana de eritrócitos de rato. É interessante notar, que ao contrário do efeito
observado em estriado, neste caso houve ativação na atividade da enzima AChE. Na
concentração de 100mg/Kg [F(3,24)=6.50; p<0.0044]. O Post Hoc de Duncan mostrou
diferença significativa entre a concentração de 100mg/Kg e todos os demais grupos,
porém as concentrações de 1 e 10 mg/Kg não mostraram diferença significativa quando
comparadas ao controle.
GRÁFICO 4.6.3. Efeito
in vivo da dimetil-[(2-metilsulfanil-4-triclorometil-6-
pirimidinilmetoxi)etil] amina sobre a atividade da AChE eritrocítica de ratos
Controle 1 10 100 mg/Kg
Concentração
0
25
50
75
100
125
150
Atividade AChE
***
Resultados mostrados como média ± desvio padrão, [Controle = 92.91±5.76], [1mg/Kg =
112.09±8.07], [10mg/Kg = 105.98±6.71], [100mg/Kg = 135.06±8.69]; ***p<0.001, (n = 7).
Amostras sanguíneas de todos os animais foram coletadas e testes laboratoriais
como dosagem de transaminases séricas, uréia e creatinina, foram realizados a fim de
evidenciar hepato e nefrotoxicidade. O hemograma dos animais controle e tratados,
também foi feito a fim de verificar possíveis discrasias sanguíneas determinadas pela
presença da droga. Os resultados encontrados não mostraram diferença entre os grupos
tratados e o controle, indicando assim que esse composto foi bem tolerado pelo
organismo dos animais.
60
A análise das atividades cerebrais da enzima AChE, inicialmente nos provou
algumas propriedades farmacocinéticas importantes: 1º) o composto administrado por
via oral foi absorvido; 2º) foi distribuído, e principalmente; 3º) passou a barreira
hematoencefálica, já que exerceu efeito inibitório significante sobre a AChE de estriado
cerebral dos animais tratados quando comparado aos animais controle. Os parâmetros
farmacocinéticos de absorção, distribuição e biodisponibilidade são fundamentais para
que uma droga seja viável como um fármaco.
Sabe-se que compostos muito polares dificilmente exercem efeito sobre o
sistema nervoso, justamente porque apresentam baixa lipossolubilidade dificultando o
transporte e passagem através da membrana hematoencefálica. Com isso, a droga não
chega ao local de ação que deveria para exercer o efeito farmacológico.
O resultado encontrado nos testes
in vivo com a dimetil- [(2-metilsulfanil- 4-
triclorometil-6-pirimidinilmetoxi) etil] amina foram muito animadores e nos incentivam
a investigar novas atividades biológicas para esse composto.
Além disso, a análise de amostras sangüíneas por HPLC permitiria evidenciar a
integridade da molécula e/ou seus metabólitos, a fim de avaliar se o efeito é garantido
pela molécula que é administrada ou algum metabólito produzido no metabolismo de
primeira passagem no fígado.
É inquestionável que o composto 20 apresenta efeito sobre a atividade da enzima
AChE. Quanto ao fato de apresentar efeito contrário em estriado cerebral e membrana
de eritrócito, é coerente pensar que, trata-se de isoformas diferentes da enzima AChE;
determinando com isso atividade igualmente diferente. Sabe-se que as isoformas de
AChE prevalentes no cérebro são as do tipo G1 e G4, já a forma encontrada nos
eritrócitos é principalmente, G2.
8-10
Outro fator relevante a ser considerado é que, normalmente os efeitos colaterais
dos inibidores da AChE empregados no tratamento em diversas patologias cognitivas, é
determinado pela inibição de todas as formas da enzima. Portanto o efeito da dimetil-
[(2-metilsulfanil- 4-triclorometil-6-pirimidinilmetoxi) etil] amina sobre membrana de
eritrócitos possivelmente represente a possibilidade de atenuação de efeitos colaterais
periféricos, já que na concentração de 10 mg/Kg, o composto inibe significativamente a
AChE estriatal e não apresenta efeito significativo sobre a AChE de membrana
eritrocítica.
Futuros testes deste composto sobre a atividade da enzima butirilcolinesterase
devem ser investigados, já que a inibição conjunta da acetilcolinesterase e
61
butirilcolinesterase parece contribuir para a manifestação clínica de efeitos colaterais
indesejáveis.
4.7. AVALIAÇÃO
in vitro DE ENOILCARBAMATOS
TRIFLUORMETILADOS SOBRE A ATIVIDADE DA ENZIMA AChE EM
ESTRIADO CEREBRAL DE RATOS
FIGURA 4.7.1. Estrutura química dos Enoilcarbamatos trifluormetilados
Composto R
22a
H
22b
Me
F
3
CNH
2
ECO
t
OR
22c
Ph
FIGURA 4.7.2. Estrutura química dos Enoilcarbamatos trifluormetilados
reduzidos
Composto R
23a
H
23b
Me
F
3
C NHCO
2
E
t
OH
R
23c
Ph
FIGURA 4.7.3. Estrutura química dos Enoilcarbamatos heterocíclicos
trifluormetilados ou oxazinonas
Composto R
24a
H
24b
Me
N
O
RO
CF
3
OEtO
24c
Ph
62
O ensaio biológico dos compostos 22a-c para testar a inibição da enzima AChE, foi
realizado em estriado cerebral de ratos empregando concentrações de 0.1, 1, 2, 5 e 10
mM; usando etanol como solvente no preparo das soluções.
Considerando a concentração de 1000 µM, a qual foi empregada nos
screenings
inicias dos demais compostos, pode-se observar um efeito inibitório significativo pra os
três compostos, sendo que esse efeito é dependente da concentração.
Para o composto 22a [F(5,18)= 35.35; p<0.001], 22b [F(5,18)= 117.67; p< 0.001] e
22c [F(5,18)= 31.81; p< 0.001]. Sendo que para todos eles, o Post Hoc de Duncan
mostrou diferença significatica entre os grupos 1, 2, 5 e 10 mM e o controle. Para o
composto 22a, a concentração de 0.1 mM também mostrou diferença significativa
quando comparado ao controle.
Os gráficos 4.7.1., 4.7.2 e 4.7.3 mostram os resultados obtidos para os
compostos 22a-c.
GRÁFICO 4.7.1. Efeito do composto 22a sobre a atividade da AChE estriatal
Controle 0.1 1 2 5 10 mM
Concentração
0
7
14
21
28
Atividade AChE
**
*
***
**
***
Resultados mostrados como média ± desvio padrão, [EtOH = 23.07±1.84], [0.1mM =
20.21±1.85], [1mM = 17.51±1.57], [2mM = 15.83±1.27], [5mM = 12.57±1.38], [10mM =
9.22±0.13]; *p<0.05, **p<0.01 e ***p<0.001, (n = 4).
63
GRÁFICO 4.7.2. Efeito do composto 22b sobre a atividade da AChE estriatal
Controle 0.1 1 2 5 10 mM
Concentração
0
8
16
24
32
Atividade AChE
**
***
**
***
Resultados mostrados como média ± desvio padrão, [EtOH = 27.74±1.18], [0.1mM =
27.29±1.30], [1mM = 23.34±0.72], [2mM = 22.77±0.62], [5mM = 19.52±1.13], [10mM =
6.49±1.83]; **p<0.01 e ***p<0.001, (n = 4).
GRÁFICO 4.7.3. Efeito do composto 22c sobre a atividade da AChE estriatal
Controle 0.1 1 2 5 10 mM
Concentração
0
7
14
21
28
Atividade AChE
***
**
***
***
64
Resultados mostrados como média ± desvio padrão, [EtOH = 22.26±2.72], [0.1mM =
21.31±2.26], [1mM = 16.89±1.98], [2mM = 14.43±1.75], [5mM = 9.55±1.07], [10mM =
6.37±1.40]; **p<0.01 e ***p<0.001, (n = 4).
A tentativa de testes com os produtos reduzidos 23a-c, derivados dos compostos
22a-c mostrados na figura 3.7.2 não obteve êxito, pois os mesmos apresentaram
turvação no meio de reação resultando em leituras de absorbâncias irregulares. Por essa
razão não puderam ser considerados. O mesmo impedimento ocorreu para os derivados
heterocíclicos 24a-c, mostrados na figura 3.7.3.
Os enoilcarbamatos 22a-c assim como as pirrolidinonas alquiladas, apresentaram
efeito significativo somente em concentrações elevadas (1 mM), exceto para o 22a que
mostrou efeito inibitório significativo na concentração de 0.1 mM. Essas concentrações
ainda são consideradas elevadas para o efeito produzido.
4.8. AVALIAÇÃO
in vitro DE 3-DIALCOXI FOSFORILOXI
TRIFLUORMETILADOS SOBRE A ATIVIDADE DA ENZIMA AChE
PURIFICADA
Semelhante aos carbamatos, os compostos organofosforados também representam
moléculas de interesse para testes de atividade sobre a enzima AChE. Os
organofosforados inseticidas são inibidores clássicos dessa enzima. Sabe-se que os
organofosforados ligam-se de forma irreversível ao sítio ativo das colinesterases,
enquanto que os carbamatos ligam-se de forma reversível. O mecanismo de ação de
organofosforados e carbamatos é bem estabelecido e tanto um como o outro liga-se ao
sítio ativo, interagindo com a tríade catalítica da enzima. Além disso, alguns
carbamatos, por apresentarem alta afinidade de ligação ao sítio ativo da AChE, são
capazes de reverter a neuropatia tóxica induzida por organofosforado, reativando a
propriedade catalítica da enzima.
90
Compostos organofosforados derivados dos carbamatos 22a-c foram obtidos a partir
de derivatização da hidroxila ligada no carbono α ao grupo trifluormetil. A estrutura
química dos derivados 25a-i são apresentadas na figura 4.8.1.
FIGURA 4.8. Derivados 3-dialcoxi fosforiloxi trifluormetilados
65
25 R
R
1
a
H MeO
b
Me MeO
c
Ph MeO
d
H EtO
e
Me EtO
f
Ph
EtO
g
H Alil
h
Me Alil
i
Ph Alil
F
3
CNHO
OO
P
O
R
1
R
1
R
25
Esses compostos constituem uma classe muito interessante para testes sobre
colinesterases, pois existe a associação das funções: carbamato e organofosforado na
mesma molécula. A expectativa em conhecer o efeito desses compostos é muito grande,
já que não temos como mensurar o comportamento que moléculas dessa natureza
podem obter frente a enzima. Um estudo preciso do mecanismo de ação de compostos
que agrupem as funções carbamato e organofosforado na mesma molécula desperta
grande interesse e representa uma área ampla de estudo a serem realizados.
O ensaio preliminar para esses compostos utilizou enzima AChE de estriado
cerebral de ratos e a concentração de 10 mM dos compostos, porém não foi obtida
leitura de absorbância porque nessa concentração os compostos inibiram 100% da
atividade da enzima nessa estrutura. Como tínhamos pouca quantidade dos compostos
para realizar o ensaio, decidimos realizá-los em enzima purificada e em várias
concentrações dos organofosforados.
Dessa forma, investigamos o efeito dos organofosforados trifluormetilados sobre a
atividade da enzima AChE purificada, empregando concentrações de 0.001, 0.01, 0.1, 1
e 10 mM para os nove compostos; a enzima foi utilizada na concentração de 0.025
unidades/ml.
Os resultados mostrados nos gráficos apresentam dois controles: o primeiro sem
solvente e o segundo com a presença do solvente usado na preparação da solução dos
compostos. Optamos por usar dois controles para saber o efeito do solvente sobre a
atividade da enzima purificada, pois no trabalho anterior realizado para avaliar o efeito
dos solventes orgânicos a enzima era de estrutura cerebral de ratos. Além disso, aquele
trabalho não avaliou o efeito do álcool alílico o qual foi utilizado na preparação dos
compostos 25g-i. Porém o resultado dos compostos foi comparado somente ao resultado
do segundo controle na presença de solvente.
66
GRÁFICO 4.8.1. Efeito do composto 25a sobre a atividade da AChE purificada
Contr MeOH 0.001 0.01 0.1 1 10 mM
Concentração
0
7
14
21
28
Atividade AChE
***
*
Resultados mostrados como média ± desvio padrão, [Controle = 24.77±2.27], [MeOH =
24.66±2.02], [0.001mM = 24.30±1.71], [0.01mM = 24.85±1.98], [0.1mM = 24.34±2.39], [1mM
= 19.24±2.89], [10mM = 5.01±1.25]; *p<0.05 e ***p<0.001. Para composto 25a
[F(6,21)=36.89; p<0.0001] , (n = 4).
GRÁFICO 4.8.2. Efeito do composto 25b sobre a atividade da AChE purificada
Contr MeOH 0.001 0.01 0.1 1 10 mM
Concentração
0
7
14
21
28
Atividade AChE
**
Resultados mostrados como média ± desvio padrão, [Controle = 24.26±3.50], [MeOH =
24.93±1.94], [0.001mM = 24.57±2.01], [0.01mM = 24.42±2.17], [0.1mM = 24.69±3.06], [1mM
67
= 22.46±2.46], [10mM = 14.46±2.47]; ** p<0.01. Para composto 25b [F(6,21)=4.98; p<0.0063]
, (n = 4).
GRÁFICO 4.8.3. Efeito do composto 25c sobre a atividade da AChE purificada
Contr MeOH 0.001 0.01 0.1 1 10 mM
Concentração
0
6
12
18
24
Atividade AChE
**
***
Resultados mostrados como média ± desvio padrão, [Controle = 20.69±1.58], [MeOH =
21.20±1.80], [0.001mM = 20.88±1.72], [0.01mM = 21.04±1.22], [0.1mM = 18.89±2.91], [1mM
= 12.54±1.36], [10mM = 0.00±0.00]; **p<0.01 e ***p<0.001. Para composto 25c
[F(6,21)=63.36; p<0.0001] , (n = 4).
GRÁFICO 4.8.4. Efeito do composto 25d sobre a atividade da AChE purificada
Contr. EtOH 0.001 0.01 0.1 1 10 mM
Concentração
0
6
12
18
24
Atividade AChE
***
***
***
***
***
68
Resultados mostrados como média ± desvio padrão, [Controle = 20.03±0.37], [EtOH =
18.14±0.17], [0.001mM = 15.12±0.48], [0.01mM = 10.81±0.91], [0.1mM = 14.42±0.34], [1mM
= 14.03±0.47], [10mM = 6.26±0.13]; ***p<0.001. Para composto 25d [F(6,21)=273.13;
p<0.0001] , (n = 4).
GRÁFICO 4.8.5. Efeito do composto 25e sobre a atividade da AChE purificada
Contr EtOH 0.001 0.01 0.1 1 10 mM
Concentração
0
6
12
18
24
Atividade AChE
***
***
Resultados mostrados como média ± desvio padrão, [Controle = 19.59±0.55], [EtOH =
17.87±0.53], [0.001mM = 17.24±0.48], [0.01mM = 17.83±1.36], [0.1mM = 18.38±0.31], [1mM
= 15.36±0.13], [10mM = 9.40±0.20]; ***p<0.001. Para composto 25e [F(6,21)=84.96;
p<0.0001] , (n = 4).
GRÁFICO 4.8.6. Efeito do composto 25f sobre a atividade da AChE purificada
Contr EtOH 0.001 0.01 0.1 1 10 mM
Concentração
0
5
10
15
20
Atividade AChE
***
***
***
***
***
69
Resultados mostrados como média ± desvio padrão, [Controle = 17.99±0.35], [EtOH =
16.61±0.41], [0.001mM = 13.94±0.698], [0.01mM = 13.60±1.16], [0.1mM = 13.36±0.66],
[1mM = 11.60±0.68], [10mM = 0.95±0.16]; ***p<0.001. Para composto 25f [F(6,21)=211.55;
p<0.0001] , (n = 4).
GRÁFICO 4.8.7. Efeito do composto 25g sobre a atividade da AChE purificada
Contr AlOH 0.001 0.01 0.1 1 10 mM
Concentração
0
6
12
18
24
Atividade AChE
***
***
Resultados mostrados como média ± desvio padrão, [Controle = 21.56±1.56], [AlOH =
19.60±4.19], [0.001mM = 19.02±1.94], [0.01mM = 18.19±1.29], [0.1mM = 17.68±1.26], [1mM
= 10.85±1.53], [10mM = 0.76±0.10]; ***p<0.001. Para composto 25g [F(6,21)=33.02;
p<0.0001] , (n = 4).
GRÁFICO 4.8.8. Efeito do composto 25h sobre a atividade da AChE purificada
Contr AlOH 0.001 0.01 0.1 1 10 mM
Concentração
0
6
12
18
24
Atividade AChE
***
70
Resultados mostrados como média ± desvio padrão, [Controle = 21.56±2.19], [AlOH =
17.79±2.86], [0.001mM = 17.32±2.24], [0.01mM = 16.49±2.17], [0.1mM = 16.02±2.48], [1mM
= 15.01±2.75], [10mM = 6.74±1.28]; ***p<0.001. Para composto 25h [F(6,21)=10.68;
p<0.0001] , (n = 4).
GRÁFICO 4.8.9. Efeito do composto 25i sobre a atividade da AChE purificada
Contr AlOH 0.001 0.01 0.1 1 10 mM
Concentração
0
6
12
18
24
Atividade AChE
***
***
Resultados mostrados como média ± desvio padrão, [Controle = 20.73±1.30], [AlOH =
17.32±0.69], [0.001mM = 17.91±0.69], [0.01mM = 17.75±1.81], [0.1mM = 17.44±0.83], [1mM
= 12.58±0.27], [10mM = 1.84±0.65]; ***p<0.001. Para composto 25i [F(6,21)=124.80;
p<0.0001] , (n = 4).
Analisando os resultados encontrados para os 3-dialcoxi fosforiloxi
trifluormetilados, é possível notar que os grupos R
1
ligados diretamente ao átomo de
fósforo parecem interferir mais no efeito dos compostos sobre a atividade da AChE, que
o grupo R vizinho à amina do carbamato. No entanto, quando R é metila os compostos
exercem apenas um discreto efeito sobre a atividade da AChE, demonstrando que o
grupo metila nessa posição desfavorece a atividade inibitória do composto.
Quanto à natureza de R
1
, é possível notar que a presença do grupo etoxila ligado
diretamente ao fósforo, mostrou os melhores efeitos inibitórios sobre a atividade da
AChE, compostos 25d-f. Sendo que quando R
1
são metoxila (25a-c), o efeito inibitório
sobre a atividade da enzima AChE só é significativo em presença de alta concentração
do composto. Para os compostos 25g-i os efeitos sobre a atividade da enzima AChE
foram similares aos encontrados para os compostos 25a-c, com a diferença que nos
71
primeiros o solvente (álcool alílico) exerceu efeito inibitório significativo sobre a
atividade da enzima.
Outro dado importante observado no ensaio dos 3-dialcoxi fosforiloxi
trifluormetilados é que o etanol usado no segundo controle para os compostos 25d-f,
mostrou efeito inibitório sobre a atividade da enzima purificada, diferindo um pouco do
observado no trabalho que testou o efeito
per se dos solventes sobre a enzima cerebral
de ratos. Porém com o metanol o efeito inibitório foi inexistente, conforme já havíamos
constatado anteriormente. Para o álcool alílico, o qual foi empregado pela primeira vez
nos ensaios, observou-se um efeito inibitório significativo (p<0.05) quando comparado
ao controle sem solvente.
A apreciação de todos esses dados de atividade biológica tornam mais relevante
a interação entre a síntese de compostos orgânicos e a avaliação dessas moléculas,
abrindo uma nova possibilidade no desenvolvimento de pesquisa que interligue as áreas
do conhecimento químico e biológico.
72
CONCLUSÕES
73
5.
CONCLUSÕES
Após a realização, apresentação e discussão dos resultados e tendo como parâmetros
os objetivos inicialmente propostos para o desenvolvimento deste trabalho,
concluímos que:
♦ Foi possível determinar uma padronização dos ensaios para a enzima AChE
devido a necessidade de avaliar compostos orgânicos pouco solúveis em água.
Com isso, descobrimos quais os solventes que interferem significativamente
sobre a atividade da enzima podendo definir agora aqueles mais apropriados
para o emprego nos ensaios biológicos.
♦ Os primeiros grupos de compostos testados não demonstraram efeito sobre a
atividade da AChE. Porém, os aminoálcoois 3a-d poderiam ser avaliados sobre
os receptores colinérgicos, pois alguns aminoálcoois já são conhecidos como
antagonistas muscarínicos.
♦ Os resultados encontrados para as pirrolidinonas N-alquiladas derivadas de 9a
sustentam o interesse biológico em compostos dessa classe. A
N-alquilação de
9d com cloro acetamida, teria o conveniente de produzir um produto com
reduzido número de isômeros e potencial atividade anticonvulsivante,
anticolinesterásica e/ou nootrópica.
♦ A avaliação in vitro e in vivo do composto 20 sobre a atividade da enzima AChE
tornou essa molécula alvo de interesse para testes de atividade em outros
sistemas biológicos. Além disso, esse composto apresenta uma rota sintética
simples, originando o produto com bom grau de pureza e rendimento.
♦ Os enoilcarbamatos trifluormetilados 22a-c inibiram significativamente a
atividade da enzima AChE, porém as concentrações usadas são ainda elevadas.
♦ Dos 3-dialcoxi fosforiloxi trifluormetilados, o composto 25d e 25f mostraram
efeito inibitório altamente significativo sobre a atividade da AChE, mesmo em
baixas concentrações. Com isso concluímos que o grupo alcóxi ligado
74
diretamente ao átomo de fósforo é importante na determinação desse efeito e o
substituinte alquil vizinho à amina do carbamato também interfere, porém de
forma menos significativa. Para esses compostos torna-se importante a
realização de ensaio cinético, a fim de demonstrar o tipo de inibição exercida
sobre a atividade da AChE.
♦ Os resultados apresentados direcionam os estudos futuros para obtenção de
novos compostos similares a dimetil-[(2-metilsulfanil-4-triclorometil-6-
pirimidinilmetoxi)etil] amina 20, já que esta mostrou resultados promissores
como inibidor da AChE
in vitro e in vivo. Além disso, novos testes de atividade
com a enzima butirilcolinesterase devem ser realizados para esses compostos.
75
SUGESTÕES PARA CONTINUIDADE DO TRABALHO
76
6.
SUGESTÕES PARA CONTINUIDADE DOTRABALHO
♦ Separação das pirrolidinonas 10b e 10d a fim de identificar qual dos produtos,
se
N- ou N,O-alquiladas, é o responsável pelo efeito sobre a atividade da AChE.
♦ Ensaio cinético com as pirrolidinonas 10b e 10d a fim de identificar o tipo de
inibição sobre a atividade da enzima AChE (ensaio preliminar indicou tipo de
inibição mista) completando assim o trabalho dessa classe.
♦ Obtenção de outros heterociclos análogos ao composto 20, a fim de investigar o
efeito do anel na atividade da enzima.
♦ Além disso, variações do agente nucleofílico (pseudotioúréia) a fim de produzir
derivados de 20, com diferentes substituintes na posição 2 do anel pirimidínico.
♦ A síntese de análogos de 20, porém na forma de sal de amônio quaternário, o
que apresentaria maior similaridade ao substrato natural da enzima AChE.
♦ Ensaio cinético com as 3-dialcoxi fosforiloxi trifluormetilados 25d e 25f com o
objetivo de investigar o tipo de inibição sobre a atividade da enzima AChE, já
que essas moléculas apresentam tanto a função fosfato como a carbamato. Sendo
que, quando em moléculas separadas, ambas funções interagem com a tríade
catalítica da enzima.
♦ Avaliação do efeito inibitório sobre a atividade da enzima AChE para uma nova
série de 14 compostos piridínicos, os quais foram sintetizados e devidamente
purificados pela colega Liana S. Fernandes em seu trabalho de mestrado.
77
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
78
7. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
7.1. SECÇÃO DE PROCEDIMENTOS BIOLÓGICOS
7.1.1. Reagentes
♦ Albumina bovina – Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo, USA)
♦ Comassie Azul Brilhante - Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo, USA)
♦ ácido orto fosfórico 85% - Synth (Labsynth – São Paulo)
♦ Álcool etílico - C
2
H
6
O - Synth (Labsynth – São Paulo)
♦ Álcool metílico - CH
4
O - Synth (Labsynth – São Paulo)
♦ Álcool alílico - C
3
H
8
O - Synth (Labsynth – São Paulo)
♦ Álcool terc-butila - C
4
H
10
O - Synth (Labsynth – São Paulo)
♦ Dimetilsulfóxido - C
2
H
6
OS ou DMSO – Vetec do Brasil
♦ Acetonitrila - C
2
H
3
N - Vetec do Brasil
♦ Acetona - C
3
H
6
O - Vetec do Brasil
♦ Acetilcolina acetil hidrolase ou Acetilcolinesterase - AChE – E.C.3.1.1.7 -
Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo, USA)
♦ Iodeto de Acetitiolcolina – C
7
H
16
NOS.I ou ACSCh - Sigma Chemical Co. (St.
Louis, Mo, USA)
♦ Ácido-5-5’-ditio-bis-2-dinitrobenzóico – DTNB - Sigma Chemical Co. (St.
Louis, Mo, USA)
♦ Fosfato de Potássio Monobásico - KH
2
PO
4
♦ Fosfato de Potássio Dibásico - K
2
HPO
4
Todos os reagentes utilizados foram de pureza analítica e o preparo das soluções
foi realizado com água destilada.
7.1.2. Equipamentos
♦ Balança Ohaus AS 200
♦ Centrífuga
♦ Homogeneizador de tecidos – Heidolph
79
♦ Espectrofotômetro U 2001 – Hitachi
♦ Espectrofotômetro 800XI – Femto
♦ Pipetas automáticas – Socorex
♦ Vidraria volumétricas
♦ Cronômetros
♦ Banho-maria NT 248 – Nova Técnica
7.1.3. AMOSTRA
7.1.3.1. Animais Experimentais
Os animais utilizados nos estudos experimentais, foram provenientes do Biotério
Central da Universidade Federal de Santa Maria. Trata-se de ratos da raça Wistar,
adultos machos, pesando entre de 200-300g, mantidos no Biotério do Departamento de
Química, setor de Bioquímica, acondicionados sob ciclo claro-escuro (12h), com
temperatura ambiente controlada (± 21°C). Os animais foram alimentados com ração
apropriada a fase de crescimeto (Guabi) e água
ad libitum, respectivamente.
7.1.4. PREPARAÇÕES TECIDUAIS
7.1.4.1. Dissecação de Tecido Cerebral e determinação da atividade da AChE
Os animais foram levemente anestesiados com éter em recipiente fechado, e
decapitados por guilhotinamento. A caixa craniana foi aberta com instrumentação
adequada e o cérebro exposto sobre placa de Petry refrigerada, sendo permeabilizado
externamente com meio isosmótico – Médium I (sacarose 0.32 M; Tris 1.0 M; EDTA
0.1 mM em pH 7.5), para o procedimento de dissecação das estruturas anatômicas
desejadas.
Cada estrutura cerebral devidamente separada foi homogeneizada na proporção
de um grama de tecido para 10 ml de solução isosmótica.
A atividade da enzima acetilcolinesterase nos tecidos cerebrais, foi determinada
de acordo com o método de Ellman et al (1961) modificado por Rocha et al. (1993). O
método é baseado na mensuração da absorbância a 412 nm a 25°C, decorrentes da
80
formaç
A atividade específica da AChE nas estruturas cerebrais foi calculada conforme
fórmula a seguir e os res µmol ACSCh/h/mg proteina.
∆ x Vol. reagentes
ε x Vol. Enz. x [prot.]
ão de um íon amarelo originado a partir do ácido 5,5’-Ditiobis-2-nitrobenzóico –
DTNB.
ultados expressos como
Sendo que:
∆ = diferença de absorbância por minuto
Volume reagentes = volume total da mistura no tubo de reação (2 ml)
n (13.6 mM
-1
cm
-1
)
olume de enzima = 0.1 ml
rot.] = Concentração de proteína no tecido em mg
A atividade da AChE em eritrócitos foi determinada por Elmann et al (1961)
modificado por Worek et al. (1999). Amostras de sangue total dos animais tratados com
dimetil- (2-metilsulfanil- 4-triclorometil-6-pirimidinilmetoxi) etil] amina foram
coletadas e preparadas adicionando 100 ul de sangue à 10 ml de tampão fosfato (0.1
mM), pH 7.4 contendo Triton X-100 (0.03%). A solução tampão com Triton X-100
promove a hemólise dos eritrócitos após cuidadosa agitação. Essas amostras
hemolisadas foram separadas em alíquotas de 2 ml e congeladas imediatamente e assim
conservadas até o ensaio de atividade da AChE. O ensaio empregou 500 ul do
hemolisado preparado anteriormente, 1 ml de tampão fosfato (0.1 mM) pH 7.4, 50 ul de
solução de DTNB (10 mM) e 10 ul de solução de etopropazine (6 mM), um inibidor
seletivo da butirilcolinesterase. Após a pré-incubação dessa mistura à 37°C por 10
minutos, a reação foi iniciada pela adição de 25 ul de ACSCh (14 mM) e o
desenvolvimento da cor foi medido pela leitura da absorbância em 436 nm. O
ε = coeficiente de extinção da AChE segundo Elman
V
[p
7.1.4.2. Preparo das frações de Membrana de Eritrócitos (Ghost) e determinação
da atividade da AChE
81
comprimento de onda de 436 nm reduz em 25% a interferência da hemoglobina
presente no meio. A atividade da enzima foi corrigida da hidrólise espontânea do
substrato e degradação de DTNB. A absorção do coeficiente de TNB
-
(ácido 5-
mercapto-2-nitrobenzóico) em 436 nm (ε = 10.6 mM
-1
cm
-1
) derivou do coeficiente de
extinção
em 412 nm (ε = 13.6 mM
-1
cm
-1
), como originalmente apresentado por Elmann
ChE e o conteúdo de hemoglobina e os resultados são expressos como
U/µm
cálculos para a atividade da AChE em eritrócitos obedeceu as seguintes
fórmulas:
∆ x Vol. reagentes
AChE’ =
ε
(1961).
A atividade específica da AChE em eritrócitos foi calculada do quociente entre a
atividade da A
m ol Hb.
Os
AChE’ x 1.58 x Vol. reagentes
AChE =
[Hb]
Sendo que:
∆ = diferença de absorbância por minuto
Volume reagentes = volume total da mistura no tubo de reação (1000 µl)
ε = coeficiente de extinção da AChE segundo Elmann (10.6 mM
-1
cm
-1
)
Hb] = Concentração de hemoglobina no sangue total
eparo da enzima AChE purificada e determinação de sua atividade
luir com 903 µl de solução tampão
[
7.1.4.3. Pr
específica
A enzima Acetylcholine acetyl hydrolase (E.C.3.1.1.7) apresentava 301
unidades/mg sólido. Com isso ao pesar 3 mg e di
fosfato pH 7.4, obteve-se uma solução com 1U/µl.
82
por Rocha et al. (1993), conforme
escrito no item 1.4.1, sendo mudado apenas a temperatura de pré-incubação para 37°C.
A atividade específica da AChE purificada foi calculada conforme fórmula a
seguir e os resultados ex uto
∆ x Vol. reagentes
enz.
Essa solução de enzima purificada de 1U/µl foi diluída 1000 vezes, obtendo-se
uma solução de 0.001 U/µl. Porém somente 50 µl dessa solução foi incubada no meio
de reação resultando uma concentração final de 0.025 unidades de AChE/ml.
A atividade específica da enzima AChE purificada foi determinada de acordo
com o método de Ellman et al (1961) modificado
d
pressos como U/ml/min
ε x Vol. Enz. x U
Sendo que:
∆ = diferença de absorbância por minuto
tal da mistura no tubo de reação (2 ml)
= coeficiente de extinção da AChE segundo Elmann (13.6 mM
-1
cm
-1
)
olume de enzima = 0.05 µl
7.1.4.4
etil-6-pirimidinilmetoxi)etil] amina
in vivo, obedeceu ao procedimento descrito
g/mol
ltos
ia de administração: Oral por gavagem
oses:
olume administrado: aproximadamente 500 ul de solução
Volume reagentes = volume to
ε
V
Unidade de enzima = 0.05 U
. Protocolo para o ensaio
in vivo com dimetil-[(2-metilsulfanil-4-
triclorom
O modelo de protocolo para o ensaio
abaixo:
Peso molecular do composto: 342,5
Solvente: Água destilada
Modelo: Ratos machos adu
Tratamento: 10 dias (sub-crônico)
V
D 1, 10 e 100 mg/kg
V
83
PREPARO DAS SO
g
LUÇÕES:
TRATAMENTO 1 – 1 mg/K
Pesado 10 mg composto _____________ 20 ml de água
1 mg ______________ 2 ml / 1000g
Se o rato 200 g 2 ml _____ 1000g
Então: 0.4 ml _____ 200 g
g
TRATAMENTO 2 – 10 mg/K
Pesado 100 mg composto _____________ 20 ml de água
10 mg ______________ 2 ml / 1000g
Se o rato 200 g 2 ml _____ 1000g
Então: 0.4 ml _____ 200 g
TRATAMENTO 3 – 100 mg/Kg
Pesado 1000 mg composto _____________ 20 ml de água
100 mg ______________ 2 ml / 1000g
Se o rato 200 g 2 ml _____ 1000g
Então: 0.4 ml _____ 200 g
Para calcular o volume a ser administrado pegar o peso do rato multiplicar por 2 e
ividir por 1000, já que se o rato tivesse 1000g receberia sempre 2 mL dos compostos.
7.1.5.
uncan, com o programa estatístico
SPSS/P
sideradas significativas quando p<0.05.
grandeza F representa um índice de significância da diferença entre os grupos
testados:
d
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram analisados através da análise da variância (MANOVA) e (ONE-
WAY) seguido pelo teste de Raio Múltiplo de D
C 11.0 (Statistical Package for Social Sciences). As diferenças entre os grupos
foram con
A
84
F =
Variância média aritmética das amostras (ao acaso)
Variância entre as amostras de grupos diferentes
Quanto maior o valor de F significa que a variância entre as amostras de grupos
diferentes foi maior que a variância das amostras dentro do mesmo grupo; portanto
quanto maior o val
or de F mais significativo é o resultado obtido para o efeito testado.
Na representação:
F(X,Y) = N, p<Z
al de dados (n) usados na análise menos o número de
a acima para F).
= Para que seja significativo deve ser menor que 0.05.
.2. SECÇÃO DE PROCEDIMENTOS QUÍMICOS
.2.1. Reagentes e Solventes purificados
♦ refluxado por 3 horas sobre
♦ efluxado por 3 horas sobre
♦ stilada uma vez e apó refluxada com P
2
O
5
e coletada sobre
♦ , refluxado por 3 horas sobre P
2
O
5
♦ euterados empregados para realização
X = Refere-se ao número de grupos analisados menos um (X = g – 1).
Y = Refere-se ao número tot
grupos (g), ou seja, Y = n – g.
N = Valor encontrado no cálculo de F (fórmula apresentad
p = Índice de significância da diferença entre os grupos.
Z
7
7
♦ Piridina: Merck. Destilado sobre KOH
Diclometano: Synth. Seco em CaCl
2
over nigth,
P
2
O
5
destilado e coletado sobre peneira molecular.
Clorofórmio: Synth. Seco em CaCl
2
over nigth, r
P
2
O
5
destilado e coletado sobre peneira molecular.
Acetona: Synth. De
peneira molecular.
Acetonitrila: Synth. Seco em CaCl
2
over nigth
destilado e coletado sobre peneira molecular.
CDCl
3
e DMSO-d
6
foram os solventes d
da análise espectroscópica das amostras
85
OBS: Os reagentes e solventes purificados e secos obedeceram normas usuais.
150
.2.2. Equipamentos
♦ DPX 200 OU DPX 400 (freqüências de 200 e 400
♦ com filme de poliestireno
♦ s VARIO EL Elementar Analysensysteme GmbH (análise
♦
less autosampler, coluna capilar cross-
♦ EICHERT – THERMOVAR com termômetro não aferido (ponto de
fusão).
.2.3. Procedimento para síntese de compostos
da 5-hidroxi-5-trifluormetil-3-dietoxi pirrolidin-2-
álise. Porém, os espectros de RMN de
1
H e
13
C revelaram a
resença do composto 9d.
5-hidroxi-5-trifluormetil-3-dietoxi pirrolidin-2-
ona co
7
Espectrômetro BRUKER
MHz, respectivamente)
Espectrômetro BRUKER IFS 28 com FT (calibrado
de 0,05 mm de espessura com absorção a 1601cm
-1
)
Foss Heraeu
elementar).
Cromatógrafo gasoso HP 6890 acoplado a um detector de massa seletivo HP
5973 equipado com injetor split-split
linked HP5 (espectroscopia de massa).
Kofler R
7
7.2.3.1. Reação de
O-proteção
ona com 2,3-diidropirano (12)
A 5-hidroxi-5-trifluormetil-3-dietoxi pirrolidin-2-ona 9d (9 mmoles) e THF
tratado (10 mL) foram colocados em um balão de 25 mL e submetido a agitação. O 2,3-
diidropirano (9.2 mmoles) foi então adicionado. Logo em seguida foi adicionado 0.09
mL de ácido clorídrico concentrado e foi mantido sob agitação a 25°C por
aproximadamente 18 horas. Após esse tempo foi adicionado 0.02 g de hidróxido de
potássio e agitado por mais 30 minutos. A mistura foi filtrada e o THF evaporado,
houve a formação de um sólido branco. Esse sólido foi solubilizado em éter e extraído.
Após a extração com éter e água destilada, a fase orgânica foi seca e evaporada. A
amostra foi enviada para an
p
7.2.3.2. Reação de
O-proteção da
m cloro trimetilsilano (14)
86
A 5-hidroxi-5-trifluormetil-3-dietoxi pirrolidin-2-ona 9d (2.5 mmoles),
trietilamina tratada (3.0 mmoles), dimetilamino piridina – DMAP (0.25 mmoles) e THF
tratado (10 mL) foram colocados em um balão de 50 mL (duas bocas) e submetido a
agitação sob banho de gelo. Uma das bocas do balão continha um funil de adição e a
outra estava conectada à linha de argônio. Por meio de um funil de adição, foi
adicionado o cloro trimetilsilano (2.75 mmoles) lentamente. Após a adição, o banho de
gelo foi retirado e a mistura permaneceu sob agitação a 25°C, overnight. Uma solução
saturada de cloreto de sódio (15 mL) foi adicionada ao balão e extraída com éter etílico.
A fase orgânica foi seca com sulfato de sódio, filtrada e
evaporada. O produto foi obtido
como um sólido amarelo claro parecido com o material de partida 9d. Os espectros de
ras; 2º) Após adição do alquilante, elevação da temperatura a
5°C por 6, 16 ou 24 horas e 3°) refluxo após adição do alquilante. Porém nenhuma das
RMN de
1
H e
13
C revelaram a presença do produto 14.
7.2.1.3. Reação de alquilação da 5-hidroxi-5-trifluormetil-3-dietoxi pirrolidin-2-
ona
O-protegida com cloroacetamida (15)
Um balão de duas bocas de 50 mL foi ligado em uma das entradas à linha de
argônio, sendo que a outra entrada foi fechada com um septo de silicone. Este sistema
foi devidamente flambado. Após resfriamento do sistema com banho de gelo seco, o
composto 14 (2.0 mmoles) foi solubilizado em THF seco (5 mL) e rapidamente
adicionado ao balão por meio de uma seringa. Essa mistura foi submetida à agitação e
resfriada até -78°C. Então 3.0 mmoles de butil lítio, previamente titulado; foi
adicionado com uma seringa. A adição da base escureceu a solução. Essa mistura
permaneceu sob agitação por uma hora. A cloro acetamida (3 mmoles) foi solubilizada
em THF seco (10 mL), adicionada ao balão com uma seringa e foi mantida agitação a -
78°C por duas horas. Após esse tempo, uma solução saturada de cloreto de amônio (15
mL) foi colocada no balão e a extração foi realizada com éter etílico. A fase orgânica foi
seca, filtrada e evaporada. A amostra foi devidamente analisada por os espectros de
RMN de
1
H e
13
C e MS, os dados mostraram apenas 16% da presença do produto 15.
Várias tentativas de otimização dessa reação foram feitas: 1º) testes com maior tempo
de reação a -78°C até 6 ho
2
tentativas foi promissora.
7.2.1.4. Síntese de 6-bromometil-2-metilsulfanil-4-triclorometil pirimidina (18).
87
O composto 16 (10 mmoles), sulfato de 2-metil-2-tiopseudouréia 17 (20
mmoles), água destilada (10 mL) e metanol (25mL) foram adicionados a um balão de
100 ml sob vigorosa agitação. Após solubilização parcial do sólido (17), ácido
clorídrico concentrado (3.5 ml) foi adicionado à mistura do balão, a qual foi mantida
sob agitação e refluxo por 48 horas. Após esse tempo, o metanol foi evaporado e foi
realizada uma extração utilizando clorofórmio e solução de carbonato de sódio 1M. A
fase orgânica foi seca com sulfato de sódio, filtrada e evaporada. Foi obtido um óleo
marrom escuro, o qual foi solubilizado em uma mistura de hexano/cloro
fórmio 2:1 e
ltrado em sílica sob vácuo. Após a evaporação do solvente obteve-se um óleo amarelo
os dados espectrais confirmaram a estrutura do produto 18.
ada análise da amostra com espectros de RMN de
1
H e
13
C. Os
ados espectrais coincidiram com os dados já conhecidos para esse composto. A
da.
etil
teres
s a partir da reação de 4-alcoxi-1,1,1-trifluor-
lqu-3-en-2-onas
144
com etil carbamato conforme demonstrado por Zanatta e col.
145
abalho de mestrado.
fi
claro com rendimento de 65%. A análise da amostra com espectros de RMN de
1
H e
13
C
foi realizada e
7.2.1.5. Síntese de dimetil-[(2-metilsulfanil-4-triclorometil-6-pirimidinilmetoxi)etil]
amina (20).
O 6-bromometil-2-metilsulfanil-4-triclorometil pirimidina 18 (3 mmoles) e
N,N-
dimetil-etanolamina 19 (6 mmoles) foram agitados em acetona tratada (10ml) por 16
horas a 25°C. O produto 20 precipitou na forma de um sólido amarelado, o qual foi
filtrado sob vácuo (lavado com acetona gelada) e seco em dessecador sob pressão
reduzida. O rendimento do produto obtido foi de 92%. Após secagem adequada do
sólido obtido, foi realiz
d
solubilidade do composto 20 foi testada e o mesmo mostrou boa solubilidade em álcoois
e em água destila
7.2.1.6. Síntese dos (4,4,4-trifluor-1-alquil-3-oxo-1-but-1-enil)-carbâmico ácido
és (22a-c)
Os carbamatos 18a-c foram obtido
a
O procedimento para síntese desses compostos foi realizado pela colega Deise
Borchhardt em seu tr
7.2.1.7. Síntese dos [3-(álcoxi-fosforilóxi)-4,4,4-trifluor-1-alquil-butil) etil
carbamatos (25a-i)
88
Os compostos organofosforados ou derivados fosforiloxi 25a-i foram obtidos a
partir de reaç
ão dos aminoálcoois (4,4,4-trifluor-3-hidroxi-but-1-il) etil carbamato (23a-
) com oxicloreto de fósforo em tolueno, na presença de piridina ou trietilamina, em
tmosfera inerte, por 5 horas a temperatua ambiente. Os procedimento de síntese desses
ompostos fazem parte do trabalho de doutorado realizado pela colega Deise
orchhardt.
c
a
c
B
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Zanatta, N.; Squizani, A.M.C.; Fantinel, L.; Nachtingall, F.M.;
Bonacorso, H.G.; Martins, M.A.P.
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Zanatta, N.; Squizani, A.M.C.; Fantinel, L.; Nachtingall, F.M.;
Borchhardt, D.M.; Bonacorso,
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Zanatta, N.; Barichello, R.; Pauletto, M.M.; Bonacorso, H.G.; Martins,
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Zanatta, N.; Rosa, L.S.; Loro, E.; Bonacorso, H.G.; Martins, M.A.P. J.
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sódio e sua aplicação na síntese de 2-pirrolidinonas.. Tese de doutorado, PPGQ,
Depto
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Zanatta, N.; Rosa, L.S.; Cortelini, F.M.; Beux, S.; Santos, A.P.D.;
Bonacorso, H.G.
142.
Martins, M.A.P.; Pereira, C.M.P.; Zimmermann, N.E.K.; Cunico, W.;
Moura, S.; Beck,
.
Bernardy, K.F.; Floyd, M
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Corey, E.J.; Pan, B.C.; Hua, D.H.; Deardorff, D
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Obregon, A.D.C.; Schetinger, M.R.C.; Correa, M.M.; Morsch, V.M.;
Silva, J.E.P.; Martins, M.A.P.; Bonacorso, H. G.; Zanatta, N.
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Marchi, T.; Bonacorso, H.G.; Martins, M.A.P.
Bioorg. Med. Chem. 2006.
102
ANEXO I
9. Dados Espectroscópicos
103
9.
DADOS ESPECTROSCÓPICOS
2-[4,4,4-trifluor-3-oxo-1-butenilamino] acetato de metila – (2a)
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
) δ = 3,78 (s, 3H, -OCH
3
); 4,09 (d, 2H,
3
J
H6H5
= 6,0 Hz, H-
6); 5,44 (d, 1H,
3
J
H3H4
= 7,2 Hz, H-3); 7,06 (d/d, 1H,
3
J
H4H3
= 13,4 Hz;
3
J
H4H5
= 7,2 Hz,
-4); 10,13 (sl, 1H, H-5);
13
C NMR (50 MHz, CDCl
3
) δ = 49,7 (C6); 52,6 (C8); 88,4
z, C2);
sl, 1H, H-5);
13
C NMR (100 MHz, CDCl
3
) δ = 21,3 (C9’); 22,3 (C9); 24,3
7); 41,6 (C8); 52,7 (C6); 60,0 (C11); 87,8 (C3); 117,1 (
1
J
C-F
= 288,2 Hz, C1); 156,2
25 (N-
, H-5);
13
C NMR (100 MHz, CDCl
3
) δ = 11,3 (C9’);
4,8 (C9); 24,7 (C8); 38,4 (C7); 52,6 (C6); 67,2 (C11); 88,0 (C3); 117,2 (
1
J
C-F
= 288,5
(Filme, cm
-1
), 1744
H
(C3); 117,0 (
1
J
C-F
= 289,0 Hz, C1); 157,9 (C4); 168,6 (C7); 174,2 (
2
J
C-F
= 33,5 H
ν (KBr, cm
-1
), 1748 (C=O) 3234 (N-H); Fórmula Molecular = C
7
H
8
F
3
NO
3
, Massa
Molecular = 211,14; Análise Elementar Calc: C = 39,82 %; H = 3,82, N = 6,63 %;
Experimental: C = 39,89 %; H = 3,75 %; N = 6,38 %.
4-metil-2-[4,4,4-trifluor-3-oxo-1-butenilamino] pentanoato de metila – (2b)
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
) δ = 0,94 (d, 3H,
3
J
H9H8
= 3,8 Hz, H-9); 0,97 (d, 3H,
3
J
H9H8
=
3,8 Hz, H-9’); 1,74
a
(m, 3H, H-8, H-7); 3,77 (s, 3H, -OCH
3
); 3,99 – 4,10 (m, 1H, H-6);
5,43 (d, 1H,
3
J
H3H4
= 7,2 Hz, H-3); 7,14 (d/d, 1H,
3
J
H4H3
= 13,4 Hz;
3
J
H4H5
= 7,2 Hz, H-
4); 10,24 (
(C
(C4); 171,7 (C10); 178,6 (
2
J
C-F
= 33,6 Hz, C2); ν (Filme, cm
-1
), 1746 (C=O), 33
H); Fórmula Molecular = C
11
H
16
F
3
NO
3
, Massa Molecular = 267,24; Análise Elementar
Calc: C = 49,44 %; H = 6,03%, N = 5,24 %; Experimental: C = 49,05 %; H = 5,92 %; N
= 5,07 %.
3-metil-2-[4,4,4-trifluor-3-oxo-1-butenilamino] pentanoato de metila – (2c)
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
) δ = 0,89 - 0,99
a
(m, 6H, H-9, H-9’); 1,18 – 1,26 (m, 1H,
H-8); 1,43 – 1,49 (m, 1H, H-8); 1,97 – 2,00 (m, 1H, H-7); 3,78 (s, 3H, -OCH
3
); 3,78 –
3,88
a
(m, 1H, H-6); 5,42 (d, 1H,
3
J
H3H4
= 7,2 Hz, H-3); 7,08 (d/d, 1H,
3
J
H4H3
= 13,4 Hz;
3
J
H4H5
= 7,2 Hz, H-4); 10,38 (sl, 1H
1
Hz, C1); 157,2 (C4); 170,4 (C10); 178,6 (
2
J
C-F
= 33,6 Hz, C2); ν
(C=O), 3329 (N-H); Fórmula Molecular = C
11
H
16
F
3
NO
3
, Massa Molecular = 267,24;
Análise Elementar Calc: C = 49,44 %; H = 6,03%, N = 5,24 %; Experimental: C =
49,05 %; H = 5,92 %; N = 5,07 %.
104
2-(4,4,4-trifluor-3-hidroxibutilamino) acetato de metila – (3a)
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
) δ = 1,76 – 1,95 (m, 2H, H-3); 2,80 – 3,33 (m, 2H, H-4);
3,44 (s, 2H, H
-6); 3,74 ( 3, 3H, -OCH
3
); 4,19 (ws, 3H, H-2, OH, NH);
13
C NMR (100
Hz, CDCl
3
) δ = 27,4 (C8); 46,0 (C3); 49,6 (C4); 51,9 (C6); 70,5 (
2
J
C – F
= 31,0Hz,
325 (O-
7,5 (C3); 42,0; 42,3 (C8); 44,8; 45,7 (C4); 51,9; 51,9 (C6); 59,0; 59,0
11); 71,0, 71,1 (
2
J
C – F
= 31,0Hz;
2
J
C – F
= 31,3Hz, C2); 125,0, 125,1 (
1
J
C – F
=281,0 Hz;
9 (O-H);
7,6 (C3); 37,9; 38,1 (C7); 45,4; 46,7 (C4); 51,7; 52,0 (C6); 65,3;
6,3 (C11); 72,0, 72,2 (
2
J
C – F
= 31,1Hz;
2
J
C – F
= 31,3Hz, C2); 124,6, 124,8 (
1
J
C – F
-O),
M
C2); 125,0 (
1
J
C – F
= 281,5Hz, C1); 171,7 (C7); ν (Filme, cm
-1
), 1266 (=C-O), 3
H); Fórmula Molecular = C
7
H
12
F
3
NO
3
, Massa Molecular = 215,17; Análise Elementar
Calc: C = 39,07 %; H = 5,62 %; N = 6,51 %; Experimental: C = 38,78 %; H = 5,12 %;
N = 6,64 %.
4-metil-2-(4,4,4-trifluor-3-hidroxibutilamino) pentanoato de metila – (3b)
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
) δ = 0,90 (s, 3H, H-9), 0,93 (s, 3H, H-9); 1,45 – 1,53 (m,
2H, 2H-8); 1,64-1,85 (m, 8H, 2H-3, 2H-7); 2,51-3,25 ( m, 4H, 2H-4); 3,33-3,39 (m,
2H, 2H-6); 3,74 (s, 6H, 2 –OCH
3
); 4,14-4,24 (m, 2H, 2H-2); 4,33 (ws, 6H, 2H-2, 2-OH,
2-NH);
13
C NMR (100 MHz, CDCl
3
) δ = 21,7; 21,8 (C9’); 22,5; 22,6 (C9); 24,7; 24,7
(C7); 26,8; 2
(C
1
J
C – F
= 282,0Hz, C1); 174,9; 174,9 (C10); ν (Filme, cm
-1
), 1265 (=C-O), 330
Fórmula Molecular = C
11
H
20
F
3
NO
3
, Massa Molecular = 271,27; Análise Elementar
Calc: C = 48,70 %; H = 7,43 %; N = 5,16 %; Experimental: C = 48,43 %; H = 7,00 %;
N = 5,13 %.
3-metil-2-(4,4,4-trifluor-3-hidroxibutilamino) pentanoato de metila – (3c)
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
) δ = 0,90 (s, 3H, H-9), 0,93 (s, 3H, H-9’); 1,07 – 1,54 (m,
4H, 2H-8); 1,71-1,87 (m, 6H, 2H-7, 2H-3); 2,51-3,03 (m, 4H, 2H-4); 3,14 (d,1H,
3
J
H6H7
= 5,7Hz, H-6); 3,21 (d,1H,
3
J
H6H7
= 5,4Hz, H-6); 3,74 (s, 6H, 2-OCH
3
); 4,22 (ws, 6H,
2H-2, 2OH, 2NH);
13
C NMR (100 MHz, CDCl
3
) δ = 11,2; 11,5 (C9’); 15,6; 15,7 (C9);
25,2; 25,3 (C8); 27,5; 2
6
=280,0 Hz;
1
J
C – F
=281,0 Hz, C1); 173,2; 174,2 (C10); ν (Filme, cm
-1
), 1265 (=C
3398 (O-H); Fórmula Molecular = C
11
H
20
F
3
NO
3
, Massa Molecular = 271,27; Análise
Elementar Calc: C = 48,70 %; H = 7,43 %; N = 5,16 %; Experimental: C = 48,40 %; H
= 7,12 %; N = 5,00 %.
105
4-metil-2-(2-oxo-6-trifluormetil-1,3-oxazinan-3-il) pentanoato de metila – (4a)
1
H NMR (400 MHz, CDCl
3
) δ = 0,96 (s, 3H, H-10); 0,99 (s, 3H, H-10’); 1,49 - 1,56 (m,
1H, H-9); 1,75 (t, 2H,
3
JH
7
H
8
H
9
= 6,7 Hz, H-8); 2,11 – 2,37 (m, 2H, H-3); 3,32 – 3,54
(m, 2H, H-4); 3,73 (s, 3H, -OCH
3
); 4,64 – 4,74 (m, 1H, H-2); 5,05 (t, 1H,
3
JH
7
H
8
H
8’
=
7,8 Hz, H-7);
13
C NMR (100 MHz, CDCl
3
) δ = 20,9 (C3); 21,1 (C10); 23,1 (C10’); 24,8
9); 36,8 (C8); 38,7 (C4); 52,3 (C12); 57,0 (C7); 73,4 (
2
J
C – F
= 34,3 Hz, C2); 123,0
-O), 1716
(C11); 21,6; 22,4 (C3); 25,0; 25,1 (C9); 32,8; 33,5 (C8); 45,6;
6,3 (C4); 51,3 (C12); 68,3; 69,1 (C7); 74,6; 74,7 (
2
J
C – F
= 32,2 Hz, C2); 82,5; 82,7
66 (=C-O),
(C
(
1
J
C – F
= 280,0 Hz, C1); 151,4 (C6); 171,7 (C11); ν (Filme, cm
-1
), 1265 (=C
(C=O); Fórmula Molecular = C
12
H
18
F
3
NO
4
, Massa Molecular = 297,27; Análise
Elementar Calc: C = 48,48 %; H = 6,10 %; N = 4,71 %; Experimental: C = 48,89 %; H
= 6,49 %; N = 5,37 %.
3-metil-2-(6-trifluormetil-1,3-oxazinan-3-il) pentanoato de metila – (5a)
1
H NMR (400 MHz, CDCl
3
) δ = 0,84 (2d, 6H,
3
JH
11
H
8
= 6,6 Hz, 2H-11); 0,88 (2t, 6H,
3
JH
10
H
9
= 7,4 Hz, 2H-10); 1,06 – 1,18 (m, 2H, 2H-9); 1,47 (d/d, 1H, J
H – H
= 2,3 Hz;
3
JH
3
H
4
= 13,0 Hz, H-3); 1,55 (d/d, 1H, J
H – H
= 2,4 Hz;
3
JH
3
H
4
= 13,0 Hz, H-3); 1,63 –
1,69 (m, 2H, 2H-9); 1,82 – 2,02 (m, 4H, 2H-3, 2H-8); 2,85 – 2,93 (m, 2H, 2H-4); 3,02
(d, 1H, J
H – H
= 10,2 Hz, H-7); 3,11 (d, 1H, J
H – H
= 9,8 Hz, H-7); 3,15 – 3,18 (m, 2H,
2H-4); 3,70 (s, 3H, OCH
3
); 3,71 (s, 3H, -OCH
3
); 3,82 – 3,88 (m, 2H, 2H-2); 4,20 (d,
1H, J
H – H
= 9,6 Hz, H-6); 4,33 (d, 1H, J
H – H
= 10,0 Hz, H-6); 4,64 (d, 1H, J
H – H
= 9,6
Hz, H-6); 4,70 (d, 1H, J
H – H
= 10,0 Hz, H-6);
13
C NMR (100 MHz, CDCl
3
) δ = 10,4;
10,5 (C10); 15,1; 15,2
4
(C6); 123,6 (
1
J
C – F
= 279,0 Hz, C1); 172,5; 173,2 (C11); ν(Filme, cm
-1
), 12
1718 (C=O); Fórmula Molecular = C
12
H
20
F
3
NO
3
, Massa Molecular = 283,29; Análise
Elementar Calc: C = 50,88 %; H = 7,12 %; N = 4,94 %; Experimental: C = 49,83 %; H
= 6,85 %; N = 4,39 %.
3-fenil-2-(6-trifluormetil-1,3-oxazinan-3-il) propanoato de metila – (5b)
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
) δ = 1,55-1,59(m, 2H, 2H-3); 1,93 – 2,00 (m, 2H, 2H-3);
2,89 – 3,01
a
(m, 6H, 2H-4, 4H-10); 2,89 – 3,28
a
(m, 2H, 2H-4); 3,55 (s, 3H, -OCH
3
);
3,59 (s, 3H, -OCH
3
); 3,62 – 3,71 (m, 2H, 2H-7); 3,80 – 3,90 (m, 2H, 2H-2); 4,28 (d, 1H,
2
JH
6
H
6
= 9,8 Hz, H-6); 4,35 (d, 1H,
2
JH
6
H
6
= 10,3 Hz, H-6); 4,73 (d, 1H,
2
JH
6
H
6
= 9,8
Hz, H-6); 4,80 (d, 1H,
2
JH
6
H
6
= 10,3 Hz, H-6); 7,14 – 7,30 (m, 10H, 2Ph);
13
C NMR
106
(50 MHz, CDCl
3
) δ = 21,3; 22,2 (C3); 36,4; 36,8 (C10); 46,0; 46,1 (C4); 51,3; 51,4
(C9); 65,3; 6
5,6 (C7); 74,0; 74,5 (
2
J
C – F
= 32,0 Hz, C2); 82,0; 82,4 (C6); 123,2; 123,6
J
C – F
= 286,5 Hz, C1); 126,5; 126,6 (C13); 128,0; 128,3 (C12); 128,9; 129,0 (C14);
-1
), 1265 (=C-O), 1733 (C=O);
(200 MHz, CDCl
3
): δ = 1,92 (t, J = 6,4 Hz, 4H, H-8); 3,15 (t, J = 7,6 Hz, 2H, H-
4); 3,56 (t,
J = 6,4 Hz, 4H, H-7); 4,24 (t, J = 7,6 Hz, 2H, H-5); 7,37 (s, 1H,
H-6).
13
C
N 49,9 (C-7); 64,6 (C-5); 87,4 (C-3);
1
M
5
, 6H, H-9, H-8); 3,03 (t,
J = 7,6 Hz, 2H, H-4);
,38 (t,
J = 6,4 Hz, 4H, H-7); 4,25 (t, J = 7,6 Hz, 2H, H-5); 7,13 (s, 1H,
H-6).
13
C NMR
-5); 85,6
-3); 145,5 (C-6); 175,9 (C-2). Fórmula Molecular = C
10
H
15
NO
2;
Massa Molecular =
08
3); 94 (26); 80 (34); 67 (25); 55 (32)..
roxi-5-trifluormetil-3-etoxi pirrolidin-2-ona (9a) – Ver referência 139
9c) – Ver referência
(
1
137,0; 137,2 (C11); 172,1; 172,6 (C8);
ν(Filme, cm
Fórmula Molecular = C
15
H
18
F
3
NO
3
, Massa Molecular = 317,30; Análise Elementar
Calc: C = 56,78 %; H = 5,72 %; N = 4,41 %; Experimental: C = 55,53 %; H = 5,47 %;
N = 4,54 %.
3-Pirrolidin-1-ilmetileno-dihidro-furan-2-ona (7a)
1
H NMR
MR (50 MHz, CDCl
3
): δ = 25,2 (C-4); 25,6 (C-8);
43,2 (C-6); 175,3 (C-2). Fórmula Molecular = C
9
H
13
NO
2;
Massa Molecular = 167,20.;
S EI (70ev):
m/z (%)= 167 (M
+
, 86); 139 (23); 122 (100); 108 (25); 94 (29); 81 (39);
4 (21).
3-Piperidin-1-ilmetileno-dihidro-furan-2-ona (7b)
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
): δ = 1,64 (m
3
(50 MHz, CDCl
3
): δ = 23,8 (C-9); 25,9 (C-4); 26,1 (C-8); 50,9 (C-7); 64,4 (C
(C
181,23.; MS EI (70ev):
m/z (%)= 181 (M
+
, 60); 153 (21); 136 (100); 122 (35); 1
(2
5-hid
5-hidroxi-5-trifluormetil-3,3-dimetoxi pirrolidin-2-ona (9b) – Ver referência 139
6-hidróxi-6-trifluormetil-hexahidro-furo[2,3-
c] pirrol-4-ona (
139
5-hidroxi-5-trifluormetil-3,3-dietoxi pirrolidin-2-ona (9d) – Ver referência 142
107
3-etóxi-1-metil-5-metóxi-5-trifluormetil-2-pirrolidinona (10a)
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
): δ = 1,16 (t, 3H,
3
J
H8-H7
= 6,8 H-8); 2,05; 2,58 (d/d, 1H,
2
J
H4’-
H4
= 15,4,
3
J
H4’-H3
= 5,9, H-4, H-4’); 2,76 (s, 3H, N-CH
3
); 3,19 (s, 3H, O-CH
3
); 3,60-3,65
(m, 2H, H-7); 4,00 (t, 1H,
3
J
H3-H4(4’)
= 5,9; H-3
).
13
C NMR (100 MHz, CDCl
3
): δ = 14,6
( 3,5 (C-3); 90,82 (q,
2
J
CF
=
3,30-3,50 (m, 2H, H-9); 3,50-3,70 (m, 2H, H-7); 3,80-4,00 (m, 2H,
H-12); 4,05 (t, 1H,
3
J
H3-H4(4’)
= 7,8; H-3)
13
C NMR (100 MHz, CDCl
3
): δ = 12,1 (C-10);
1 0,5 (q,
2
J
C-F
= 32,5, C-
5
M
1
H-8; H-10); 2,00, 3,00 (m, 2H,
-4 e H-4’); 3,30-3,50 (m, 2H, H-9); 3,50-3,70 (m, 2H, H-7); 4,29 (t, 1H,
3
J
H3-H4(4’)
=
-8); 35,2 (C-4); 58,0
3,80 (m, 2H, H-7); 3,99 (t,
H,
3
J
H3-H4
= 5,6 H-3
).
13
C NMR (100 MHz, CDCl
3
): δ = 13,4 (C-11); 15,0 (C-17);
4 (C-4); 61,7 (C-9);
64,9 (C-14); 65,3 (C-7); 74,8 (C-3); 90,0 (q,
2
J
C-F
= 30,8, C-5); 124,38 (q,
1
J
C-F
= 297,0,
C-8); 37,0 (C-4); 49,3 (N-CH
3
); 65,8 (O-CH
3
); 66,4 (C-7); 7
32,0, C-5); 122,9 (q,
1
J
C-F
= 284,2; CF
3
); 173,27 (C-2). Fórmula Molecular =
C
9
H
14
F
3
NO
3;
Massa Molecular = 241,21.; MS EI (70ev): m/z (%)= 197 (31); 167 (23);
128(100).
1-etil-3-etóxi-5-etóxi-5-trifluormetil-2-pirrolidinona (10b)
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
): δ = 1,21 (t, 9H,
3
J
H-H
= 6,8; H-8; H-10; H-13); 2,00; 3,00
(m, 2H, H-4, H-4’);
5,1 (C-8, C-13); 35,0 (C-4); 58,3 (C-9); 66,7 (C-7); 73,6 (C-3); 9
); 123;3 (q,
1
J
C-F
= 284,0, CF
3
); 173.2 (C-2). Fórmula Molecular = C
11
H
18
F
3
NO
3;
Massa
olecular = 269,26
;
MS EI (70ev): m/z (%)= 225 (56); 196(24); 181(87); 156 (100);
28 (77); 112 (67).
3-etóxi-5-hidróxi-1-etil-5-trifluormetil-2-pirrolidinona (10b’)
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
): δ = 1,21 (t, 9H,
3
J
H-H
= 6,8
H
7,8 H-3
).
13
C NMR (100 MHz, CDCl
3
): δ = 12,6 (C-10); 14,7 (C
(C-9); 66,3 (C-7); 73,6 (C-3); 91,0 (q,
2
J
C-F
= 32,5 C-5); 122,6 (q,
1
J
C-F
= 284,0 CF
3
);
173,6 (C-2). Fórmula Molecular = C
9
H
14
F
3
NO
3 ;
Massa Molecular = 241,21; MS EI
(70ev):
m/z (%)= 171 (100), 110(35),82 (81), 69 (37).
1-n-butil-5-butóxi-3-etóxi-5-trifluormetil-2-pirrolidinona (10c)
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
): δ = 0,86-0,88 (m, 6H, H-12 e H-17); 1,00; 1,15 (m, 7H,
H-
8, H-11, H-16); 1,20-1,40 (m, 2H, H-10); 1,40-1,60 (m, 2H, H-15); 1,90-2,90 (m, 2H, H-
4
); 3,10-3,30 (m, 2H, H-9); 3,40-3,50 (m, 2H, H-14); 3,50-
1
15,1 (C-8); 18,6 (C-11); 19,6 (C-16); 28,6 (C-10); 30,61 (C-15); 37,
108
CF
3
); 173,44 (C-2). Fórmula Molecular = C
15
H
26
F
3
NO
3;
Massa Molecular = 325,37; MS
EI (70ev):
m/z (%)= 281 (17); 167 (57); 156 (100); 57 (43).
1-n-butil-3-etóxi-5-hidróxi-5-trifluormetil-2-pirrolidinona (10c’)
5,6 H-3).
13
C NMR (100 MHz, CDCl
3
): δ = 13,5
-11); 15,1 (C-8); 18,6 (C-11); 28,6 (C-10); 36,5 (C-4); 61,5 (C-9); 65,1 (C-7); 72,7
,7 (C-2). Fórmula
1H, H-3); 4,50-4,70 (s, 4H, H-9); 7,20-7,50 (m,
H, Ph).
13
C NMR (100 MHz, CDCl
3
): δ = 15,2 (C-8); 31,8 (C-4); 42,2 (C-9); 64,8 (C-
3,8 (C-2). Fórmula
(m, 2H, H-7); 4,10-4,30 (m, 1H, H-3); 4,50-4,70 (s, 4H, H-9); 7,20-7,50 (m,
5H, Ph).
13
C NMR (100 MHz, CDCl
3
): δ = 15,1 (C-8); 36,3 (C-4); 43,8 (C-9); 66,9 (C-7);
7 lar
= C
14
H
16
F
3
NO
3;
Massa Molecular =
303,28; MS EI (70ev): m/z (%)= 258 (1); 189 (99);
9
-bromometil-2-metilsulfanil-4-triclorometil pirimidina (18) – Ver referência 146
imetil-(2-metilsulfanil-4-triclorometil-6-pirimidinilmetoxi)etil] amina (20) – Ver
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
): δ = 0,86-0,88 (m, 3H, H-12); 1,00-1,15 (m, 5H,
H-8, H-
11); 1,20-1,40 (m, 2H, H-9); 1,90-2,90 (m, 2H, H-4
); 2,80-3,10 (m, 2H, H-9); 3,50-3,60
(m, 2H, H-7); 4,12 (t, 1H,
3
J
H3-H4
=
(C
(C-3); 83,4 (q,
2
J
C-F
= 32,6; C-5); 123,9 (q,
1
J
C-F
= 284,0; CF
3
); 172
Molecular = C
11
H
18
F
3
NO
3;
Massa Molecular = 269,26; MS EI (70ev): m/z (%)= 225
(100); 182 (51); 168 (9); 156 (89).
1-benzil-5-benzilóxi-3-etóxi-5-trifluormetil-2-pirrolidinona (10d)
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
): δ = 1,20-1,30 (m, 3H, H-8); 2,00-3,.00 (m, 2H, H-4, H4’);
3,60-4,10 (m, 2H, H-7); 4,10-4,30 (m,
5
7, C-11); 73,4 (C-3); 123,2 (
1
J
C-F
= 284,0, CF
3
); 126-130 (Ph); 17
Molecular = C
21
H
22
F
3
NO
3;
Massa Molecular = 393,41; MS EI (70ev): m/z (%)=349 (4);
243 (22); 152 (12); 106 (19); 91 (100).
1-benzil-3-etóxi-5-hidróxi-5-trifluormetil-2-pirrolidinona (10d’)
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
): δ = 1,20-1,30 (m, 3H, H-8); 2,00-3,00 (m, 2H, H-4, H4’);
3,60-4,10
3,3 (C-3); 122,8 (
1
J
C-F
= 270,0; CF
3
); 126,0-130,0 (Ph); 174,3 (C-2). Fórmula Molecu
1 (100).
6
d
referência 146
109
(4,4,4-trifluor-3-oxo-1-but-1-enil) carbamato de etila (22a) – Ver referência 148
-trifluor-1-metil-3-oxo-1-but-1-enil) carbamato de etila (22b) – Ver referência
48
z, CF
3
); 156,60 (C-
).
19
F NMR (100 MHz, CDCl
3
): δ = -77,78.
31
P NMR (100 MHz, CDCl
3
): δ = 0,92.
entar
MHz,
DCl
3
): δ = -77,94.
31
P NMR (100 MHz, CDCl
3
): δ = -0,22. Fórmula Molecular =
; H =
(4,4,4
1
(4,4,4-trifluor-1- fenil-3-oxo-1-but-1-enil) carbamato de etila (22c) – Ver referência
148
[3-(dimetoxi-fosforiloxi)-4,4,4-trifluor-butil] carbamato de etila (25a)
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
): δ = 1,23 (t, 3H, J
H8-H7
= 7,0 Hz, H-8); 1,84 – 1,91 (m, 1H,
H-3); 2,08 – 2,10 (m, 1H, H-3); 3,17 – 3,20 (m, 1H, H-4); 3,55 – 3,63 (m, 1H, H-4);
3,81 (d, 3H,
J
H9-P
= 11,6 Hz, H-9); 3,83 (d, 3H, J
H9-P
= 11,2 Hz, H-9’); 4,11 (q, 2H, J
H7-
H8
= 7,0 Hz, H-7); 4,71 – 4,76 (m, 1H, H-2); 5,66 (sl, 1H, NH).
13
C NMR (100 MHz,
CDCl
3
): δ = 14,25 (C-8); 29,31 (C-3); 35,42 (C-4); 54,66 (C-9); 60,54 (C-7); 72,42 (J
C-F
= 32,7 Hz,
J
C-P
= 3,6 Hz, C-2); 123,34 (J
C-F
= 278,7 Hz, J
C-P
= 6,4 H
6
Fórmula Molecular = C
9
H
17
F
3
NO
6
P; Massa Molecular = 323,21; Análise Elem
Calc: C = 33,45 %; H = 3,30 %; N = 4,33 %;. Experimental: C = 33,45 %; H = 3,50 %;
N = 4,33 %. MS EI (70ev):
m/z (%)= 278 (7); 127 (100); 109 (18).
[3-(dimetoxi-fosforiloxi)-4,4,4-trifluor-1-metil-butil] carbamato de etila (25b)
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
): δ = 1,23 (t, 3H, J
H8-H7
= 7,4 Hz, H-8); 1,26 (d, 3H, J
CH3-H4
= 6,2 Hz, CH
3
); 1,83 – 1,92 (m, 1H, H-3); 2,04 – 2,11 (m, 1H, H-3); 3,77 (d, 3H, J
H9-P
=
11,0 Hz, H-9); 3,79 (d, 3H,
J
H9’-P
= 10,8 Hz, H-9’); 3,85 – 3,97 (m, 1H, H-4); 4,10 (q,
2H,
J
H7-H8
= 7,0 Hz, H-7); 4,71 – 4,79 (m, 1H, H-2); 5,00 (sl, 1H, NH).
13
C NMR (100
MHz, CDCl
3
): δ = 14,36 (C-8); 19,97 (CH
3
); 36,26 (C-3); 43,14 (C-4); 54,12 (J
C-P
= 5,5
Hz, C-9); 54,59 (
J
C-P
= 6,3 Hz, C-9); 60,51 (C-7); 72,54 (J
C-F
= 33,0 Hz, J
C-P
= 5,0 Hz,
C-2); 123,39 (
J
C-F
= 279,3 Hz, J
C-P
= 5,9 Hz, CF
3
); 155,80 (C-6).
19
F NMR (100
C
C
10
H
19
F
3
NO
6
P; Massa Molecular = 337,23 Análise Elementar Calc: C = 35,62 %
5,68 %; N = 4,15 %;. Experimental: C = 35,63 %; H = 5,71 %; N = 4,06 %. MS EI
(70ev):
m/z (%)= 292 (7); 249 (2); 211 (5); 127 (100); 109 (21); 96 (15); 70 (26).
110
[3-(dimetoxi-fosforiloxi)-4,4,4-trifluor-1-fenil-butil] carbamato de etila (25c)
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
): δ = 120 (t, 3H, J
H8-H7
= 7,0 Hz, H-8); 2,28 – 2,48 (m, 2H,
H-3); 3,77 (d, 3H,
J
H9-P
= 11,2 Hz, H-9); 3,84 (d, 3H, J
H9’-P
= 11,2 Hz, H-9’); 4,08 (q,
2H,
J
H7-H8
= 7,0 Hz, H-7); 4,46 – 4,60 (m, 1H, H-2); 4,88 (q, 1H, J
H4-NH
= 7,6 Hz, H-4);
5,63 (d, 1H,
J
NH-H4
= 7,2 Hz, NH); 7,28 – 7,36 (m, 5H, Ph).
13
C NMR (100 MHz,
CDCl
3
): δ = 14,38 (C-8); 36,33 (C-3); 51,67 (C-4); 54,64 (J
C-P
= 6,4 Hz, C-9); 54,80
(
J
C-P
= 5,6 Hz, C-9’); 60,82 (C-7); 72,46 (J
C-F
= 33,0 Hz, J
C-P
= 4,8 Hz, C-2); 126,66;
128,07; 128,92; 140,10 (6C, Ph); 123,4 (
J
C-F
= 280,0 Hz, J
C-P
= 5,7 Hz, CF
3
); 155,72
(C-6).
19
F NMR (100 MHz, CDCl
3
): δ = -77,98.
31
P NMR (100 MHz, CDCl
3
): δ = -
,19. Fórmula Molecular = C
19
H
25
F
3
NO
6
P; Massa Molecular = 451,38; Análise
C = 45,14 %; H
6).
19
F NMR (100 MHz, CDCl
3
): δ = -77,68.
31
P NMR (100
Hz, CDCl
3
): δ = -1,16. Fórmula Molecular = C
11
H
21
F
3
NO
6
P; Massa Molecular =
mental:
0
Elementar Calc: C = 45,12 %; H = 5,30 %; N = 3,51 %;. Experimental:
= 5,33 %; N = 3,39 %. MS EI (70ev):
m/z (%)= 399 (M
+
, 2); 273 (16); 244 (100); 200
(68); 77 (29).
[3-(dietoxi-fosforiloxi)-4,4,4-trifluor-butil] carbamato de etila (25d)
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
): δ = 1,23 (t, 3H, J
H8-H7
= 7,2 Hz, H-8); 1,37 (dt, 3H, J
H10-H9
= 7,0 Hz,
J
H10-P
= 1,2 Hz, H-10); 1,39 (dt, 3H, J
H10’-H9’
= 7,0 Hz, J
H10’-P
= 1,2 Hz, H-
10’); 1,84 – 1,93 (m, 1H, H-3); 2,05 – 2,18 (m, 1H, H-3); 3,15 – 3,22 (m, 1H, H-4);
3,60 – 3,66 (m, 1H, H-4); 4,09 – 4,25 (m, 6H, H-7, H-9, H-9’); 4,63 – 4,82 (m, 1H, H-
2); 5,80 (sl, 1H, NH).
13
C NMR (100 MHz, CDCl
3
): δ = 15,60 (C-8); 15,95 (J
C-P
= 7,1
Hz, C-10); 29,20 (C-3); 35,48 (C-4); 60,71 (C-7); 63,52 (
J
C-P
= 5,6 Hz, C-9); 64,73 (J
C-P
= 6,6 Hz, C-9’); 72,27 (
J
C-F
= 32,4 Hz, J
C-P
= 4,9 Hz, C-2); 123,52 (J
C-F
= 278,8 Hz, J
C-P
= 6,3 Hz, CF
3
); 156,66 (C-
M
351,26; Análise Elementar Calc: C = 37,61 %; H = 6,03 %; N = 3,99 %;. Experi
C = 37,81 %; H = 6,01 %; N = 3,74 %. MS EI (70ev):
m/z (%)= 306 (10); 278 (5); 250
(17); 155 (100); 127 (57).
[3-(dietoxi-fosforiloxi)-4,4,4-trifluor-1-metil-butil] carbamato de etila (25e)
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
): δ = 1,23 (t, 3H, J
H8-H7
= 6,8 Hz, H-8); 1,26 (d, 3H, J
CH3-H4
= 6,4 Hz, CH
3
); 1,34 (dt, 3H, J
H10-H9
= 7,2 Hz, J
H10-P
= 0,8 Hz, H-10); 1,37 (dt, 3H,
J
H10’-H9’
= 7,2 Hz, J
H10’-P
= 0,8 Hz, H-10’); 1,86 – 1,90 (m, 1H, H-3); 2,05 – 2,12 (m,
1H, H-3); 3,90 – 3,93 (m, 1H, H-4); 4,10 (q, 2H,
J
H7-H8
= 6,8 Hz, H-7); 4,07 – 4,22 (m,
111
6H, H-7, H-9, H-9’); 4,70 – 4,75 (m, 1H, H-2); 5,01 (sl, 1H, NH).
13
C NMR (100 MHz,
CDCl
3
): δ = 14,49 (C-8); 15,91 (J
C-P
= 7,8 Hz, C-10); 16,03 (J
C-P
= 6,1 Hz, C-10); 20,43
(CH
3
); 36,39 (C-3); 43,42 (C-4); 60,66 (C-7); 63,56 (J
C-P
= 5,7 Hz, C-9); 64,57 (J
C-P
=
6,7 Hz, C-9’); 72,31 (
J
C-F
= 33,0 Hz, J
C-P
= 4,8 Hz, C-2); 123,55 (J
C-F
= 278,8 Hz, J
C-P
=
6,3 Hz, CF
3
); 155,82 (C-6).
19
F NMR (100 MHz, CDCl
3
): δ = -77,86.
31
P NMR (100
Hz, CDCl
3
): δ = -1,76. Fórmula Molecular = C
12
H
23
F
3
NO
6
P; Massa Molecular =
imental:
δ = -
7,89.
31
P NMR (100 MHz, CDCl
3
): δ = -0,99. Fórmula Molecular = C
17
H
25
F
3
NO
6
P;
,90 %; N =
, H-4);
,06 – 4,16 (m, 2H, H-7); 4,47 – 4,63 (m, 4H, H-9); 4,66 – 4,76 (m, 1H, H-2); 5,16 –
6
P;
M
365,28; Análise Elementar Calc: C = 39,46 %; H = 6,35 %; N = 3,83 %;. Exper
C = 39,46 %; H = 6,35 %; N = 3,83 %. MS EI (70ev):
m/z (%)= 320 (10); 292 (3); 250
(14); 155 (100); 127 (42); 70 (25).
[3-( dietoxi-fosforiloxi)-4,4,4-trifluor-1-fenil-butil] carbamato de etila (25f)
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
): δ = 1,20 (t, 3H, J
H8-H7
= 7,0 Hz, H-8); 1,33 (t, 3H, J
H10-H9
= 7,0 Hz); 1,37 (t, 3H,
J
H10’-H9’
= 7,0 Hz); 2,28 – 2,39 (m, 2H, H-3); 4,03 – 4,23 (m, 6H,
H-7, H-9, H-9’); 4,48 – 4,62 (m, 1H, H-2); 4,90 (q, 1H,
J
H4-NH
= 7,6 Hz, H-4); 5,71 (d,
1H,
J
NH-H4
= 7,2 Hz, NH); 7,28 – 7,41 (m, 5H, Ph).
13
C NMR (100 MHz, CDCl
3
): δ =
14,42 (C-8); 15,81 (
J
C-P
= 7,2 Hz, C-10); 15,99 (J
C-P
= 6,4 Hz, C-10’); 36,52 (C-3);
51,75 (C-4); 60,85 (C-7); 63,55 (
J
C-P
= 5,5 Hz, C-9); 64,61 (J
C-P
= 6,4 Hz, C-9’); 72,20
(
J
C-F
= 32,5 Hz, J
C-P
= 4,8 Hz, C-2); 126,39 (J
C-F
= 230,9 Hz, J
C-P
= Hz, CF
3
); 126,59;
127,99; 128,88; 140,44 (6C, Ph); 155,76 (C-6).
19
F NMR (100 MHz, CDCl
3
):
7
Massa Molecular = 427,35; Análise Elementar Calc: C = 47,78 %; H = 5
3,28 %;. Experimental: C = 47,40 %; H = 5,22 %; N = 3,87 %. MS EI (70ev):
m/z (%)=
427 (M
+
, 4); 382 (2); 272 (16); 244 (100); 200 (66); 155 (97); 127 (36); 77 (22).
[3-(Bis-aliloxi-fosofriloxi)-4,4,4-trifluor-butil] carbamato de etila (25g)
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
): δ = 1,20 (t, 3H, J
H8-H7
= 6,6 Hz, H-8); 1,74 – 1,88 (m,
1H, H-3); 1,97 – 2,10 (m, 1H, H-3); 3,16 – 3,29 (m, 1H, H-4); 3,46 – 3,57 (m, 1H
4
5,43 (m, 4H, H-11); 5,84 – 6,02 (m, 2H, H-10). Fórmula Molecular = C
13
H
21
F
3
N
3
O
Massa Molecular = 375,28; Análise Elementar Calc: C = 41,61 %; H = 5,64 %; N =
3,73 %. MS EI (70ev):
m/z (%)= 330 (6); 318 (6); 179 (100); 124 (22); 110 (10).
[3-(Bis-aliloxi-fosforiloxi)-4,4,4-trifluor-1-metil-butil] carbamato de etila (25h)
112
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
): δ = 1,23 (t, 6H, J
H8-H7
= 7,0 Hz, H-8, CH
3
); 1,83 – 1,94
(m, 1H, H-3); 2,02 – 2,17 (m, 1H, H-3); 3,89 – 3,92 (m, 1H, H-4); 4,10 (q, 2H,
J
H7-H8
=
7,0 Hz, H-7); 4,53 – 4,64 (m, 4H, H-9); 4,69 – 4,81 (m, 1H, H-2), 5,23 – 5,44 (m, 4H,
H-11); 5,86 – 6,03 (m, 2H, H-10).
13
C NMR (100 MHz, CDCl
3
): δ = 14,20 (C-8); 19,90
(CH
3
); 36,08 (C-3); 43,09 (C-4); 60,22 (C-7); 67,93 (J
C-P
= 4,9 Hz, C-9); 68,58 (J
C-P
=
6,3 Hz, C-9’); 72,65 (
J
C-F
= 33,7 Hz, J
C-P
= 5,1 Hz, C-2); 117,15 (J
C-P
= 4,2 Hz, C-11);
118,42 (
J
C-P
= 6,9 Hz, C-11); 123,29 (J
C-F
= 278,2 Hz, J
C-P
= 6,0 Hz, CF
3
); 131,63 (J
C-P
lar =
26,58; 128,05; 128,93 (Ph); 131,85 (
J
C-P
= 7,0 Hz, C-
0); 132,29 (
J
C-P
= 6,2 Hz, C-10’); 140,36 (Ph); 155,83 (C-6). Fórmula Molecular =
19
H
25
F
3
NO
6
P; Massa Molecular = 451,38; Análise Elementar Calc: C = 50,56 %; H =
,58 %; N = 3,10 %. MS EI (70ev):
m/z (%)= 451 (M
+
, 3); 272 (29); 244 (100); 200
6); 179 (63); 79 (32); 57 (12).
= 4,0 Hz, C-10); 132,06 (
J
C-P
= 6,9 Hz, C-10); 155,80 (C-6). Fórmula Molecu
C
14
H
23
F
3
NO
6
P; Massa Molecular = 389,31; Análise Elementar Calc: C = 43,19 %; H =
5,95 %; N = 3,60 %. MS EI (70ev):
m/z (%)= 344 (6); 179 (100); 211 (15); 139 (36);
124 (39).
[3-(Bis-aliloxi-fosofriloxi)-4,4,4-trifluor-1-fenil-butil] carbamato de etila (25i)
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
): δ = 1,12 (t, 3H, J
H8-H7
= 7,2 Hz, H-8); 2,16 – 2,37 (m, 2H,
H-3); 4,01 (q, 2H,
J
H7-H8
= 7,2 Hz, H-7); 4,09 – 4,16 (m, 1H, H-4); 4,36 – 4,63 (m, 5H,
H-9, H-2); 5,13 – 5,44 (m, 4H, H-11); 5,81 – 6,00 (m, 2H, H-10); 7,19 – 7,63 (5H, Ph).
13
C NMR (100 MHz, CDCl
3
): δ = 14,40 (C-8); 36,44 (C-3); 44,51 (C-4); 60,97 (C-7);
68,15 (
J
C-P
= 3,4 Hz, C-9); 68,87 (J
C-P
= 5,6 Hz, C-9’); 72,47 (J
C-F
= 33,10 Hz, J
C-P
=
4,8 Hz, C-2); 118,25 (
J
C-P
= Hz, C-11); 118,78 (J
C-P
= 7.0 Hz, C-11’); 123,40 (J
C-F
=
280,00 Hz,
J
C-P
= 6,2 Hz, CF
3
); 1
1
C
5
(7
113
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