( PDF ) Clonagem e caracterização dos genes que codificam endo-xilogalacturonana hidrolase, o fator de transcrição PacC e a proteína PalA em Crinipellis perniciosa, agente causal da vassoura-se-bruxa

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GILVAN FERREIRA DA SILVA

CLONAGEM E CARACTERIZAÇÃO DOS GENES QUE CODIFICAM

ENDO-XILOGALACTURONANA HIDROLASE, O FATOR DE TRANSCRIÇÃO

PacC E A PROTEÍNA PalA EM Crinipellis perniciosa, AGENTE CAUSAL DA

VASSOURA-DE-BRUXA NO CACAUEIRO (Theobroma cacao)

Tese apresentada à Universidade

Federal de Viçosa, como parte das

exigências do Programa de Pós-

Graduação em Microbiologia Agrícola,

para obtenção do título de Doctor

Scientiae.

VIÇOSA

MINAS GERAIS - BRASIL

2007

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Ficha catalográfica preparada pela Seção de Catalogação e

Classificação da Biblioteca Central da UFV

Silva, Gilvan Ferreira da, 1974-

S586c Clonagem e caracterização dos genes que codificam

2007 endo-xilogalacturonana hidrolase, o fator de transcrição

PacC e a proteína PalA em Crinipellis perniciosa, agente

causal da vassoura-de-bruxa no cacaueiro (Theobroma

cacao) / Gilvan Ferreira da Silva. – Viçosa : UFV, 2007.

xi, 91f. : il. ; 29cm.

Orientador: Marisa Vieira de Queiroz.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Viçosa.

Inclui bibliografia.

1. Fungos - Genética. 2. Enzimas pectinolíticas.

3. Crinipellis perniciosa. 4. Vassoura-de-Bruxa

(Fitopatologia). 5. Clonagem molecular.

I. Universidade Federal de Viçosa. II.Título.

CDD 22.ed. 571.2959

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GILVAN FERREIRA DA SILVA

CLONAGEM E CARACTERIZAÇÃO DOS GENES QUE CODIFICAM

ENDO-XILOGALACTURONANA HIDROLASE, O FATOR DE TRANSCRIÇÃO

PacC E A PROTEÍNA PalA EM Crinipellis perniciosa, AGENTE CAUSAL DA

VASSOURA-DE-BRUXA NO CACAUEIRO (Theobroma cacao)

Tese apresentada à Universidade

Federal de Viçosa, como parte das

exigências do Programa de Pós-

Graduação em Microbiologia Agrícola,

para obtenção do título de Doctor

Scientiae.

APROVADO: 19 de janeiro de 2007

Prof. Júlio Cézar Mattos Cascardo

(Co-orientador)

Prof

Elza Fernandes de Araújo

(Co-orientador)

Prof

Célia Alencar de Moraes

Prof

Denise Mara Soares Bazzolli

Prof

Marisa Vieira de Queiroz

(Orientadora) - UFV

A minha querida mãe,

Dedico.

AGRADECIMENTOS

Para mim, talvez, esta seja a parte mais importante da tese. Não consigo

imaginar a realização deste trabalho sem o alicerce que tive durante toda minha

graduação e pós-graduação, onde a família, os professores e amigos foram

peças fundamentais.

Por isso agradeço:

Antes de qualquer coisa, a Deus, por não somente ter me dado

habilidades vitoriosas, mas também por ter me dado à oportunidade de

conhecer pessoas especiais que de alguma forma me ajudaram a crescer e

pular obstáculos.

À Universidade Federal de Viçosa, ao Departamento de Microbilogia e ao

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela

oportunidade e pelo apoio financeiro.

Aos meus pais, em especial a minha mãe que sempre esteve presente,

mesmo que não fisicamente, nos momentos complicados dessa história,

sempre me apoiando e confortando.

Ao meu irmão Humberto e aos meus sobrinhos.

Ao Eric pela companhia durantes esses quatro anos de Viçosa.

À professora Marisa não só pela orientação, mas também pelo exemplo

de profissionalismo e dedicação com que conduz seu trabalho.

À professora Elza pelo apoio sempre que necessitei.

À professora Célia principalmente pelo incentivo e confiança.

Aos demais professores do Departamento de Microbiologia, que

contribuíram para minha formação profissional.

Aos meus amigos funcionários do BIOAGRO Evandro, Danilo, Toninho,

Raimundo, Paulo e José Reinaldo pelos serviços prestados.

Aos “GRANDES” amigos do Laboratório de Genética, aos que se foram e

aos atuais pela boa convivência: João Batista, Jildete, Klédna, Rodrigo Barros,

Ximena, Marcos, Ireninha, Vivi, Mariana, Janaína, Leonardo, Daniel, Júnio,

Michelle, Leandro, Swiany, Maycon, Rodrigo BQI, Rafael, Guilherme e Darlene,

Em especial aos amigos Marcos Soares e Klédna, pelos bons momentos,

e pelos ensinamentos, foi muito bom trabalhar com vocês, era hilário.

Com muito carinho a Swiany sempre presente e pela amiga

incondicional.

iii

A Viviane Aline que sempre foi um anjinho, uma pessoa muito especial

que apesar da distância, o tempo não apagará os bons momentos, para você

todo sucesso do mundo.

Gostaria de agradecer ao pessoal do laboratório de Genômica e

Expressão Gênica da UESC onde fui muito bem recebido por todos no período

em que passei em Ilhéus.

Agradeço a todos os membros de minha banca de defesa pela

participação e valiosas sugestões a esse trabalho.

Agradecimento especial pela valiosa ajuda do Rafael pela formatação de

todas as figuras da tese.

Aos Amigos dos Laboratórios de Fisiologia, em especial ao Julio, Talita

e.Cássia.

Aos amigos do Petróleo, Tânia pelo apoio e descontração, Bruna sempre

alegre, e a Cynthia Canedo pela amizade sinceridade e ajuda durante o início

do meu doutorado.

Aos amigos do laboratório de Microbiologia Industrial, principalmente ao

Zé Carlos.

Ao amigo Juliano Lino pela ajuda em todos os momentos.

Ao casal Elisa e Roberto pela amizade.

BIOGRAFIA

Gilvan Ferreira da Silva, filho de Raimunda Maria da Silva e João

Ferreira da Silva, nasceu em 09 de dezembro na cidade Poço Verde, Estado de

Sergipe.

Em março de 1995, ingressou no curso de Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Sergipe, graduando-se em licenciatura em outubro de

1999.

Atuou como professor substituto de Genética e Evolução de abril de 2000

a fevereiro de 2001 na Univesidade Federal de Sergipe.

Em fevereiro de 2001 iniciou o mestrado em Genética e Melhoramento

de Plantas pela Universidade Federal de Lavras, defendendo tese em fevereiro

de 2003.

Em março de 2003 ingressou no doutorado em Microbiologia Agrícola da

Universidade Federal de Viçosa.

Defendeu a tese de doutorado em janeiro de 2007, concluindo as

exigências para a obtenção do título de Doctor Scientia em Microbiologia.

SUMÁRIO

RESUMO........................................................................................................ viii

ABSTRACT.................................................................................................... x

INTRODUÇÃO............................................................................................... 01

1. Crinipellis perniciosa........................................................................ 01

2. Fatores de patogenicidade e virulência............................................ 03

3. Pectinases em fungos fitopatogênicos............................................. 05

4. Proteínas inibidoras de poligalacturonase (PGIPs).......................... 08

5. Efeito do pH do ambiente em Fungos.............................................. 10

6. Importância do pH na patogênese em fungos................................. 13

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................... 19

CAPÍTULO 1 – Isolamento e caracterização do gene que codifica

endo-xilogalacturonana hidrolase de Crinipellis perniciosa, agente

causal da vassoura-de-bruxa no cacaueiro (Theobroma

cacao)................................................................................................... 27

1. RESUMO.......................................................................................... 28

2. INTRODUÇÃO.................................................................................. 29

3. MATERIAL E MÉTODOS................................................................. 31

3.1. Microrganismos e condições de cultivo................................... 31

3.2. Isolamento do gene que codifica a endo-xilogalacturonana

hidrolase de C. perniciosa.............................................................. 31

3.3. Sequenciamento e análise das seqüências............................ 34

3.4. Detecção do número de cópias do gene do xghCp................ 34

3.5. Extração de RNA total e análise por RT-PCR (Reverse

Transcriptase - Polymerase Chain Reaction)...................................... 35

4. RESULTADOS.................................................................................. 37

4.1. Caracterização da endo-xilogalacturonana hidrolase de C.

perniciosa....................................................................................... 37

4.2. Análise da transcrição do gene xghCp.................................... 42

4.3. Alinhamento das seqüências e análise filogenética................ 42

5. DISCUSSÃO..................................................................................... 48

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................. 51

CAPÍTULO 2 – Caracterização dos genes relacionados ao pH: pacC.

e palA de Crinipellis perniciosa, agente causal da vassoura-de-bruxa

no cacaueiro (Theobroma cacao)......................................................... 55

1. RESUMO.......................................................................................... 56

2. INTRODUÇÃO.................................................................................. 57

3. MATERIAL E MÉTODOS................................................................. 62

3.1. Microrganismo e condições de cultivo..................................... 62

3.2. Clonagem dos genes palACp e pacCCp................................. 62

3.3. Extração e caracterização dos fragmentos de DNA dos

fagos recombinantes...................................................................... 64

3.4. Sequenciamento e análise das seqüências............................ 66

3.5. Extração de RNA total e analise por RT-PCR (Reverse

Transcriptase - Polymerase Chain Reaction).......................................... 67

4. RESULTADOS.................................................................................. 69

4.1. Isolamento e caracterização do gene palACp..................................

4.2. Isolamento e caracterização do gene pacCCp................................. 74

5. DISCUSSÃO..................................................................................... 83

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................. 86

7. CONCLUSÕES................................................................................. 90

vii

RESUMO

SILVA, Gilvan Ferreira da, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, janeiro de

2007. Clonagem e caracterização dos genes que codificam endo-

xilogalacturonana hidrolase, o fator de transcrição PacC e a proteína

PalA em Crinipellis perniciosa, agente causal da vassoura-de-bruxa em

Theobroma cacao. Orientadora: Marisa Vieira de Queiroz. Co-orientadores:

Elza Fernandes de Araújo, Flávia Maria Lopes Passos e Júlio Cezar de

Mattos Cascardo.

Crinipellis perniciosa é o agente causal da vassoura-de-bruxa no

cacaueiro, e em outras espécies do gênero Theobroma, causando danos na

cultura do cacau e cupuaçu com grande impacto econômico. Neste trabalho,

descrevem-se o isolamento e a caracterização dos genes que codificam endo-

xilogalacturonana hidrolase (Xgh), PalA e PacC. O gene xghCp possui uma região

codificadora de 1.251 pares de bases, interrompida por quatro possíveis

íntrons. A proteína deduzida apresenta 417 aminoácidos, sendo codificada por

um gene cópia única. A transcrição do gene foi analisada por meio da técnica

de RT-PCR, sendo avaliados os efeitos do pH e das fontes de carbono glicose

e pectina. A transcrição do gene não foi reprimida por glicose 1%. Em presença

de pectina os transcritos do gene xghCp foram detectados em pHs variando de

4,0 a 8,0. Na análise filogenética da proteína deduzida, XghCp agrupou-se com

endo-xilogalacturonana hidrolase de Aspergillus tubingensis, Aspergillus niger e

duas enzimas similares a Xgh de Aspergillus fumigatus. O alinhamento múltiplo

revelou que XghCp apresenta, na região correspondente ao sítio de ligação ao

substrato de poligalacturonase, a seqüência GIK (Gy-Ile-Lys) que foi comum a

todas as endo-xilogalacturonanas hidrolase analisadas. Este é o primeiro relato

de endo-xilogalacturonana hidrolase em basidiomiceto. Neste trabalho também

foi realizada a clonagem e caracterização dos genes palA e pacC, relacionados

à transdução de sinal em resposta ao pH em C. perniciosa. A transcrição do

gene palACp não é regulada por pH e a proteína deduzida apresentou o

domínio conservado BRO1. A análise filogenética mostrou que esta proteína é

conservada de fungos a humanos. Foram seqüenciados 4.347 pb

viii

correspondentes ao gene pacCCp, que apresentou uma ORF de 2.472 pb

interrompida por 8 íntrons putativos. Na região promotora, foram localizados

três possíveis sítios de reconhecimento para PacCCp (5’GCCAG3’), o que

sugere um sistema de auto-indução deste gene em pH alcalino. Os transcritos

do gene pacCCp foram detectados por RT-PCR em pH 6,8 e 8,0 em 8, 18 e 32

horas após a indução. Em pH 4,0, foi observada a transcrição basal no período

de 8 a 32 horas. A seqüência deduzida apresentou 824 aminoácidos, com

domínios dedos de zinco extremamente conservados em leveduras e fungos

filamentosos. Motivos de reconhecimento proteína-proteína YPXL/I de interação

com PalA foram localizados na região C-terminal da proteína PacCCp entre os

aminoácidos 637 e 742. A identificação dos genes pacC e palA sugere que C.

perniciosa, apresenta a cascata de sinalização em resposta ao pH.

ABSTRACT

SILVA, Gilvan Ferreira da, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, January

2007. Cloning and characterization of the genes encoding endo-

xylogalacturonan hydrolase, PacC transcription factor, and PalA protein

in Crinipellis perniciosa, witches’ broom causal agent in Theobroma

cacao. Adviser: Marisa Vieira de Queiroz. Co-Advisers: Elza Fernandes de

Araújo, Flávia Maria Lopes Passos and Júlio Cézar de Mattos Cascardo.

Crinipellis perniciosa is the causal agent of witches’ broom disease in

cocoa plants as well as in other species of Theobroma, with important economic

impact in both cocoa and cupuaçu crops. We report the isolation and

characterization of the genes encoding endo-xylogalacturonan hydrolase (Xgh),

PalA and PacC. The xghCp gene contains a 1,251 base pairs coding region

interrupted by four putative introns. The deduced protein displays 417 amino

acid residues and is coded by a single-copy gene (xghCp). Gene transcription

has been analyzed by semi-quantitative RT-PCR, and the effects of either pH or

the carbon sources glucose and citric pectin have been evaluated. Gene

transcription was not repressed by 1% glucose. In the presence of pectin, xghC

transcripts were detected from pH 4,0 to pH 8,0. Phylogenetic analysis of the

deduced protein, XghCp, grouped it with endo-xylogalacturonan hydrolase of

both Aspergillus tubingensis and Aspergillus niger, as well as with two Xgh

similar enzymes of Aspergillus fumigatus. Multiple alignment revealed that

XghCp presents a GIK sequence (Gly-lle-Lys), common to all endo-

xylogalacturonan known hydrolases, in the region corresponding to the

polygalacturonase substrate binding site. This is the first report of an endo-

xylogalacturonan hydrolase in a basidiomycete. Cloning and characterization of

palA and pacC, both related to signal transduction in response to pH in C.

perniciosa, were also achieved. palACp transcription was not regulated by pH,

and the deduced protein showed a conserved BRO1 domain. The phylogenetic

analysis showed it to be a widely conserved protein, from fungi to human

beings. A total of 4,347 bp corresponding to pacCCp, which displayed an ORF

containing 2,472 bp interrupted by 8 putative introns, has been sequenced.

Three possible sites of PacC cis-elements (5’GCCAG3’) have been localized in

the promoter region, suggesting a self-induction system for this gene under

alkaline pH. Transcripts of pacCCp were detected by RT-PCR at pH 6.8 and pH

8.0 at 8, 18, and 32 hours after induction. At pH 4.0, basal transcription was

observed from 8 to 32 hours. The deduced sequence exhibited 824 amino acid

residues with zinc fingers domains highly conserved in yeasts and filamentous

fungi. YPXL/l protein-protein recognition motifs, which interact with PalA, were

localized in the C-terminal region of PacCCp between amino acid residues 637

and 742. pacC and palA identification suggests that C. perniciosa presents a

signaling cascade in response to pH, which would allow PacCCp transcription

factor to act as a regulator of environmental pH controlled virulence factors.

INTRODUÇÃO

1. Crinipellis perniciosa

O fungo Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer (Agaricales,

Tricholomataceae, Marasmeae) é o agente causal da vassoura-de-bruxa em

duas culturas economicamente importantes, o cacaueiro (Theobroma cacao L.)

e o cupuaçu (Theobroma grandiflorum Willd ex. Spreng). A doença representa,

atualmente, um dos principais fatores limitantes à produção. Este fungo tem

sido considerado o mais importante fitopatógeno do cacaueiro, tendo evoluído

concomitantemente com T. cacao, ambos endêmicos da Bacia Amazônica

(Griffith et al., 1994; Nunes et al., 2002).

Análise filogenética utilizando as seqüências de DNA correspondentes as

regiões ITS, RPB1, EF1-α, rDNA 28S e 18S, sugerem a inclusão de C.

perniciosa no gênero Moniliophthora, passando a ser denominado

Moniliophthora perniciosa Aime & Phillips-Mora com.nov. (Aime & Phillips-Mora,

2005).

O gênero Crinipellis compreende, aproximadamente, 63 espécies que

são, em sua grande maioria, saprófitas. A variabilidade de hospedeiros do

fungo C. perniciosa permite a separação dos isolados em biótipos de acordo

com hospedeiro infectado. Representantes do biótipo C infectam as espécies

do gênero Theobroma e Herrania, pertencentes à família Sterculiaceae e

atualmente classificados dentro da família Malvaceae. O gênero Theobroma

possui 22 espécies, onde as mais importantes são Theobroma cacao L e

Theobroma grandiflorum (Willd ex. Spreng). O biótipo S agrupa os isolados que

infectam as espécies da familia Solanaceae e os isolados do biótipo B causam

vassoura-de-bruxa em Bixa orellana. Isolados do biótipo L são saprófitas e

heterotálicos, cujos basidiocarpos já foram encontrados em lianas e cipós das

famílias Malpighiaceae e Bignoniaceae e em Arrabidaea verrucosa (cipó). O

biótipo H foi o último a ser descrito e abrange isolados que infectam

representantes da família Malpighiaceae (Griffith & Hedger, 1994; Resende et

al., 2000; Griffith et al., 2003).

O biótipo-C de C. perniciosa possui um ciclo de vida hemibiotrófico, com

duas fases distintas de crescimento. O fungo invade os tecidos meristemáticos

dos hospedeiros e permanece durante certo período como biotrófico, mas

depois passa para a fase necrotrófica e cresce saprofiticamente sobre os

tecidos mortos. A infecção inicia-se quando tubos germinativos dos

basidiósporos penetram em tecidos meristemáticos da planta, como brotos

apicais, flores e frutos. Os basidiósporos de C. perniciosa são capazes de

infectar o tecido meristemático e penetrar diretamente por meio das hifas

primárias no tecido da folha de T. cacao (Muse et al., 1996; Kilaru &

Hasenstein, 2005).

O controle da doença tem sido feito pela eliminação dos frutos infectados

por meio de podas fitossanitárias. No entanto, o controle biológico tem sido

usado como uma alternativa ao controle da doença. Trichoderma ssp é um

micoparasita capaz de competir por espaço e nutrientes. A CEPLAC/CEPEC

desenvolveu um biofungicida a base de Trichoderma stromaticum, com

eficiência de 90% na eliminação de C. perniciosa (Bastos, 2000). Rubini et al.,

(2005) avaliaram o uso potencial de endofíticos do cacaueiro no controle

biológico deste patógeno e verificaram que o fungo Gliocladium catenulatum é

capaz de reduzir em 70% a incidência da doença em mudas de cacaueiro.

A obtenção de clones resistentes tem sido a principal estratégia de

combate à doença, porém, a variabilidade genética do patógeno pode ser um

problema na seleção de plantas resistentes a um grande número de isolados.

Rincones et al. (2006) analisaram a variabilidade genética de isolados

pertencentes aos biótipos C, S e L, por meio do perfil de microssatélites e da

avaliação dos cariótipos obtidos por meio de eletroforese em campo pulsado.

Os resultados mostraram maior grau de variabilidade genética e cromossômica

em isolados do biótipo C da Amazônia em comparação com os isolados na

Bahia.

A possibilidade de produzir plantas geneticamente modificadas tem

surgido como uma nova perspectiva ao controle da vassoura-se-bruxa, o que

ressalta a importância do conhecimento da fisiologia da doença. Recentemente

foi desenvolvido um transgênico de Theobroma cacao L. resistente a

Colletotrichum gloesporioides (Maximova et al., 2006).

Em fevereiro de 2000, surgiu a iniciativa para realização do projeto

genoma de C. perniciosa, financiado pelo governo da Bahia e pelo CNPq. Foi

inicialmente formado um consórcio interinstitucional formado pela Universidade

Estadual de Santa Cruz (UESC), Universidade Estadual de Campinas

(UNICAMP), Centro de Pesquisa do Cacau (CEPLAC) e o Centro Nacional de

Recursos Genéticos – EMBRAPA. O projeto genoma tem auxiliado as

pesquisas e a identificação de genes com potencial papel na patogenicidade de

C. perniciosa, abrindo assim novas perspectivas no desenvolvimento de

métodos para o controle da doença.

2. Fatores de patogenicidade e virulência

A identificação de fatores de patogenicidade codificados por genes de

cópia única que atuem isoladamente no ataque do patógeno, não tem tido

resultados promissores. Possivelmente devido à complexidade dos eventos

envolvidos no desenvolvimento da doença, tornou-se necessária uma

combinação de fatores para cada hospedeiro (Rogers et al., 2000; Prusky &

Yakoby, 2003). O número de genes de patogenicidade isolados está

diretamente relacionado ao conceito de patogenicidade e às várias definições

disponíveis na literatura. Dependendo da amplitude com que se define fator de

patogenicidade esse número pode variar muito.

Genes necessários ao desenvolvimento da doença, mas não necessários

para completar o ciclo de vida do patógeno in vitro é o conceito de genes de

patogenicidade adotado por Idnurm & Howlett (2001). Essa definição é baseada

no uso de técnicas de inativação gênica para avaliação dos potenciais

candidatos a genes de patogenicidade. A inativação desses genes resulta na

perda de sintomas da doença. Portanto, a identificação desses genes é muito

importante não somente para o conhecimento do processo da doença, mas

também para detecção de alvos para controle da mesma.

Virulência é um caráter quantitativo, ou seja, uma variação positiva ou

negativa, inferior ou superior nos sintomas (Casadevall & Pirofski, 1999;

Wassenaar & Gaastra, 2001; Idnurm & Howllett, 2001). Wassenaar & Gaastra

(2001) propuseram uma definição, baseada na função durante o processo de

virulência e, assim, dividiram esses genes em três classes. Na primeira, estão

classificados os verdadeiros genes de virulência, que codificam produtos

diretamente prejudiciais ao hospedeiro, que não estão presentes em linhagens

não patogênicas e são freqüentes alvos para o desenvolvimento da resistência

pelo hospedeiro. Os fatores de virulência, codificados por genes da classe I

incluem toxinas de baixa e alta massa molecular, enzimas que comprometem a

integridade estrutural do tecido hospedeiro, assim como enzimas que degradam

a parede celular de plantas. Genes da classe II são requeridos para ativar os

verdadeiros fatores de virulência, por meio da regulação da expressão,

modificação na tradução, processamento ou secreção das proteínas codificadas

pelos genes de virulência da classe I. Genes da classe III codificam fatores

necessários ao patógeno para enfrentar efetivamente o ambiente de hostilidade

encontrado no hospedeiro, como sensores osmóticos, degradadores ou

transportadores de xenobióticos e reguladores de pH, entre outros (Wassenaar

& Gaastra, 2001; Prusky & Yakoby, 2003). Genes envolvidos no metabolismo

básico celular não são considerados como genes de virulência, a não ser que a

sua inativação resulte em atenuação dos sintomas da doença (Idnurm e

Howlett, 2001).

Neste trabalho, adotou-se a classificação de Wassenaar & Gaastra

(2001) para genes de virulência, assim como a de Idnurm & Howlett (2001) para

genes de patogenicidade.

3. Pectinases em fungos fitopatogênicos

No processo de interação planta-patógeno, os fungos fitopatogênicos

produzem várias enzimas extracelulares necessárias à penetração. A primeira

barreira à penetração é a cutícula, que é degradada pela cutinase, facilitando a

penetração. Ultrapassando a cutícula, a parede celular vegetal forma a segunda

barreira, cuja constituição é complexa, e apresenta a pectina como um dos seus

principais componentes.

A pectina é um heteropolissacarídeo complexo, que apresenta duas

regiões bem definidas: a “região lisa” que constitui a cadeia primária e consiste

de unidades de (α-1-4) ácido galacturônico, que pode ser acetilado em O-2 ou

O-3 e metilado em O-6; as regiões na estrutura-mãe, que tem muitas cadeias

laterais denominadas “regiões ramificadas”, onde duas diferentes estruturas

podem ser identificadas, a xilogalacturonana e a ramnogalacturonana (de Vries

& Visser, 2001). A degradação enzimática da pectina é considerada um

importante aspecto na infecção. O processo de degradação envolve uma ação

combinada de numerosas enzimas (Quadro 1), que são fortes candidatas a

fatores de virulência da classe I (Walton, 1994; Akimitsu et al., 2004).

De acordo com o mecanismo de ação as enzimas pectinolíticas podem

ser classificadas em dois grupos, descritos a seguir: (a) hidrolases, que

incorporam uma molécula de água, durante a clivagem das ligações

glicosídicas entre os ácidos galacturônicos, (b) liases que clivam as ligações

glicosídicas via reação de β-eliminação (Jayani et al., 2005). As esterases são

hidrolases e incluem as enzimas que atuam sobre os grupos metil e etil

presentes na pectina. A pectinametilesterase (PME) hidrolisa as ligações éster

dos grupos metil da pectina, produzindo metanol e ácido poligalacturônico, e

reduzindo, assim, o grau de esterificação. Sua atividade é considerada muito

importante para a completa degradação da pectina por poligalacturonase e

pectato liase, uma vez que estas enzimas mostram limitada degradação de

substratos metilados (Christgau et al., 1996).

Recentemente foi caracterizada uma nova enzima pectinolítica

denominda endo-xilogalacturonana hidrolase em Aspergillus tubingensis (van

der Vult-Bergmans et al., 2000). A xilogalacturonana hidrolase (Xgh) é capaz de

degradar xilogalacturonana (XGA), um polímero cujo esqueleto é constituído de

α-D-ácido galacturônico e β-D-xilose. O XGA está presente na parede celular

de várias células e em exsudatos (gomas). Embora a xilogalacturonana

hidrolase possa agir como uma endo-enzima, Zandleven et al., (2005)

mostraram que esta enzima também possui uma ação exolítica e que atua dos

finais não-redutores para os finais redutores. Xgh pertence à família glicohidro-

28, que agrupa pectinases de bactérias, fungos, plantas e insetos (Markovic,

2001).

Quadro 1 – Classificação das enzimas pectinolíticas produzidas por fungos

Enzimas pectinolíticas

Hidrolases

Endopoligalacturonase

Exopoligalacturonase

Ramnogalacturonase

Endo-xilogalacturonana hidrolase

Liases

Endopectato liase

Exopectato liase

Endopectina liase

Exopectina liase

Esterases

Pectinametilesterase

Ramnogalacturonana acetilesterase

Fonte: Lebeda et al., 2001

Para Rogers et al. (2000), o papel das enzimas extracelulares, que

degradam barreiras físicas, durante a invasão do hospedeiro, tem sido

controverso. Os resultados de diferentes tipos de análises evidenciam seu

papel na patogênese, incluindo a correlação entre o nível de cada enzima e

virulência, evidência imunoquímica da secreção da enzima durante a infecção,

presença de mecanismos de defesa do hospedeiro pela inibição da enzima com

inibidores seletivos ou aplicação de anticorpos específicos e aumento na

virulência pela transferência de genes. A incapacidade em demonstrar uma

drástica redução na virulência, em alguns casos, tem gerado dúvidas sobre a

função das enzimas extracelulares que degradam barreiras físicas do

hospedeiro. Desse modo, a inativação pode não ser capaz de revelar a

contribuição dessas enzimas na patogênese, a menos que os genes que

codificam todas as enzimas funcionalmente redundantes possam ser

inativados.

Recentemente, a importância das enzimas pectinolíticas na virulência

tem sido demonstrada. A inativação de genes, que codificam poligalacturonases

e pectato liase em diferentes fungos, tem reduzido a virulência em Aspergillus

flavus em algodão, Botrytis cinerea em tomate, Alternaria alternata em citros e

Colletotrichum gloeosporioides em abacate (Shieh et al., 1997; ten Have et al.,

1998; Prusky et al., 2001). Entretanto em Cochliobulus carbonum, o mutante

para uma endopoligalacturonase não mostrou distinção em relação à linhagem

selvagem, indicando que, neste fungo, a poligalacturonase não é requerida

como fator de virulência. Possivelmente, isto ocorreu por que existem outras

enzimas que degradam pectina, ou a degradação não é crucial para o

desenvolvimento da doença (Scott-Craig et al., 1990).

Tem sido relatado que a inativação em um único gene pode não resultar

em um efeito detectável na virulência do fungo. Em Sclerotinia sclerotiorum e B.

cinerea, as poligalacturonases formam um conjunto de isoenzimas, o que

possivelmente dificulta a determinação do papel de uma única enzima como

fator de virulência, pois, a inativação de um gene pode ser compensada pelas

demais (Wubben et al., 1999; Kasza et al., 2004). Em Chondrostereum

purpureum, as poligalacturonases também são codificadas por uma família

multigênica, cuja análise filogenética sugere a ocorrência de duplicação gênica

durante o processo evolutivo (Williams et al., 2002).

A presença de família multigênica pode proporcionar uma alta

capacidade adaptativa e eficiência em ampla gama de hospedeiros. O papel e a

especificidade das isoenzimas podem ser atribuídos a diferenças na seqüência

ou na sua rede funcional, permitindo uma reação diferencial com vários

substratos pectinolíticos em numerosas espécies (Williams et al., 2002).

A produção extracelular de pectinases é, geralmente, condicionada à

repressão catabólica por meio de carboidratos prontamente metabolizáveis e

em muitos casos, a expressão gênica das poligalacturonases tem sido

condicionada ao pH ambiental (Cotton et al., 2003; Wubben et al., 2000).

Alguns genes que codificam poligalacturonases apresentam expressão

constitutiva, como os genes pgaA e pgaB de A. niger, e Bcpg1 e Bcpg2 de B.

cinerea (Parenicova et al., 2000, Wubben et al., 2000) ou, são diferencialmente

expressos dependendo do estádio de infecção e do hospedeiro (ten Have et al.,

2001). Em outros casos, a expressão é regulada por sinais presentes durante a

interação planta-patógeno (Yang et al., 2005).

A parede celular da planta é heterogênea e, estruturalmente, dinâmica. A

composição da pectina difere entre espécies de plantas, tecidos, tipos de

células e em cada diferente região em torno da parede de uma célula individual

(Freshour et al., 1996).

Os basidiósporos de C. perniciosa são capazes de infectar o tecido

meristemático e penetrar diretamente por meio das hifas primárias no tecido da

folha de T. cacao. A penetração direta no tecido do cacaueiro e a degradação

completa de células do mesófilo ressaltam a importância das enzimas

responsáveis pela degradação da parede celular no sucesso da infecção por C.

perniciosa (Kilaru & Hasenstein, 2005).

4. Proteínas inibidoras de poligalacturonase (PGIPs)

Proteínas inibidoras de poligalacturonases (PGIPs) são proteínas

extracelulares de defesa da planta, que limitam a atividade hidrolítica das

poligalacturonases (PGs), favorecendo o acúmulo de oligogalacturonídeos

elicitores da resposta de defesa da planta (De Lorenzo et al., 2001; Federici et

al., 2006; Di Matteo et al., 2006). Os genes pgips codificam proteínas, que

apresentam um peptídeo sinal de endereçamento para o retículo

endoplasmático. O peptídeo maduro apresenta 300 a 315 aminoácidos com

vários sítios potenciais de glicosilação, sendo caracterizado pela presença de

dez repetições ricas em leucina, e cada uma é originária da modificação de um

bloco de 24 aminoácidos apresentando o consenso

GxIPxxLxxLxxLxxLxLxxNxLx, também encontrado em várias proteínas de

resistência. A interação PG-PGIP limita a atividade das PGs e favorece o

acúmulo de oligossacarídeos elicitores no apoplasto. Os oligossacarídeos são,

geralmente, elicitores de uma gama de respostas de defesa da planta, incluindo

o acúmulo de fitoalexina, síntese de lignina e produção de espécies reativas de

oxigênio (De Lorenzo et al., 2001). Estas são típicas respostas de defesa geral,

ativadas pelo reconhecimento de padrões moleculares associados ao patógeno

(PAMPs). PAMPs são moléculas do patógeno, tais como lipopolissacarídeos,

peptídeoglicanas e flagelina em bactérias, mananas em leveduras, quitina e

ergosterol de fungos que atuam como elicitores de resposta de defesa

(Nurnberger & Brunner, 2002, Nurnberger et al., 2004). Desse modo,

estritamente os oligogalacturonídeos mesmo servindo como elicitores, não são

considerados PAMPs, visto que são originados da degradação da parede

celular do próprio hospedeiro (Nümberger et al., 2004).

Em várias espécies de plantas, as PGIPs são proteínas com

características bioquímicas quase idênticas e são codificadas por uma família

multigênica. Esses genes são diferencialmente regulados e expressos, espacial

e temporalmente, durante o desenvolvimento do organismo e em resposta as

várias situações de estresse. A análise funcional de promotores tem revelado

que alguns genes, que codificam PGIPs, respondem somente à injúria,

enquanto outros são induzidos por injúria, ácido salicílico ou oligossacarídeos

(De Lorenzo et al., 2001). Tem sido observado, também, que a adição de

elicitores como oligossacarídeos funciona como indutores da expressão de

genes de defesa (Poinssot et al., 2003).

O aumento na produção de PGIPs, nos diversos estádios de

desenvolvimento, favorece a proteção contra o ataque de patógenos, o

contrário ocorre com o declínio, pois, os frutos maduros, nos quais tem sido

observada uma menor expressão de PGIPs, são mais suscetíveis ao ataque de

patógenos (De Lorenzo et al., 2001; Di et al. 2006).

Poinssot et al. (2003) verificaram que a endopoligalacturonase 1 de B.

cinerea e o oligogalacturonídeo (OGA) ativam resposta inata em videiras, o que

inclui o efluxo de cálcio, a produção de espécies reativas de oxigênio e de

fitoalexinas. Todavia, a intensidade e cinética da resposta, provocadas pelo

OGA, foram muito diferentes em comparação com os efeitos da

poligalacturonase 1 (Pg1). Os autores concluem que a atividade elicitora da Pg1

não é devida somente a liberação de oligogalacturonídeo, mas principalmente

ao reconhecimento de motivos específicos da proteína. Boudart et al. (2003),

expressando quatro diferentes construções de endopoligalacturonase de C.

lindemuthianum em plantas de tabaco, constataram que a atividade elicitora da

resposta sistêmica da planta é devido a degradação de OGAs da parede

celular.

5. Efeito do pH do ambiente em fungos

Os microrganismos possuem a capacidade de adaptar-se ao pH do

ambiente. Um dos aspectos desta adaptação, particularmente importante para

os organismos que crescem sob ampla variação de pH, é a capacidade de

expressão gênica adequada a cada pH (Arst & Peñalva, 2003; Peñalva & Arst,

2004).

O fator de transcrição PacC em fungos filamentosos e seu homólogo em

leveduras Rim101, possuem três dedos de zinco (Cys

His

) que formam um

domínio de ligação ao DNA. Em Aspergillus nidulans, a análise funcional

desses domínios mostrou que o primeiro deles não se liga ao DNA, e que é a

glicina (Gln) 155 da α-hélice no dedo de zinco 3 que está, especialmente,

envolvida no contato com o DNA. O primeiro dedo de zinco interage

crucialmente com o dedo de zinco 2, e este participa do contato com o

hexanucleotídeo 5’GCCARG3’ (Fernandez-Martinez et al., 2003).

A proteína PacC é sintetizada em sua forma inativa, denominada PacC

que sofre processamento pós-traducional por meio de dois passos proteolíticos,

ocorrendo a ativação sob condições de pH alcalino. O primeiro passo é

dependente de pH com formação do PacC

, uma forma intermediária entre a

forma ativa PacC

, que resulta do segundo passo proteolítico. O polipepitídeo

com 27kDa contém cerca de 250 resíduos da região N-terminal de PacC, que

inclui o domínio dedo de zinco. O pH do ambiente regula a sensibilidade de

PacC ao processamento pela protease. A interação do domínio C, localizado

entre os resíduos 529 e 678 com dois domínios anteriores, previne o

processamento sob condições inapropriadas do pH. Quando o meio torna-se

alcalino, ocorre uma cascata de sinalização e a proteína adquire uma

conformação aberta, a qual permite a ação da protease PalB (Arst & Peñalva,

2003; Peñalva & Arst, 2004).

Dentre os genes regulados por pH ambiental, encontram-se aqueles que

codificam para enzimas secretadas, permeases e reguladores da expressão de

genes que codificam enzimas intracelulares ligadas à síntese de produtos, que

são exportados como toxinas, antibióticos, assim como enzimas ligadas à

produção de compostos capazes de modificar o pH. Nos últimos anos, têm

surgido evidências de que a regulação de genes, envolvidos na modificação

pós-traducional das enzimas destinadas à secreção, também é regulada em

resposta ao pH (Espeso & Peñalva 1996; Penãlva & Arst, 2002; Nozawa et al.,

2003).

A proteína PacC reconhece o cis-elemento 5’-GCCAAG-3’. A substituição

de bases resultou em substancial ou completa perda de ligação, exceto a

adenina 5 (trocado por G). Um T precedente ao hexanucleotídeo aumentou a

ligação da proteína (Espeso et al., 1997).

A existência de uma cascata de sinalização, responsável pela regulação

em resposta ao pH, tem sido amplamente demonstrada na maioria dos fungos

filamentosos, bem como em leveduras (Peñalva & Arst, 2004). O fungo A.

nidulans tem sido usado, como organismo modelo, para o estudo desta cascata

e o papel funcional de cada um dos genes responsáveis pela sinalização tem

sido exaustivamente analisado. Esses sinais permitem a ativação de genes,

que respondem ao pH alcalino, bem como a repressão de genes expressos em

pH ácido de acordo com o meio (Peñalva & Arst, 2004).

O sistema de sinalização é codificado por seis genes, palA, palB, palC,

palF, palH e palI, os dois últimos codificam proteínas transmembrana capazes

de detectar o pH externo. Os produtos dos genes palC e palF ainda não

possuem papel claro na cascata de sinalização. A transdução de sinal mediada

por pH culmina na clivagem do fator de transcrição PacC para sua forma ativa,

e para que tal fato ocorra, a proteína PalA liga-se a dois motivos YPXL/I

localizados em cada lado da região de sinalização da protease. Adicionalmente,

PalA interage com Vps32/Snf7 e recruta a proteína PalB, que é uma císteina

protease (Caddick et al., 1986; Denison, 1995; Xu & Mitchell, 2001; Vincent et

al., 2003; Arst & Peñalva 2003; Herranz et al., 2005; Tilburn et al., 2005).

O fato da transdução de sinal ocorrer, apenas, em pH alcalino é bastante

intrigante, pois nenhum dos seis genes pal tem mostrado evidência de

regulação por pH. Desse modo, a resposta ao pH deve ocorrer após a

transcrição (Díez et al., 2002; Espeso & Arst, 2000; Rollins, 2003; Aréchiga-

Carvajal & Ruiz-Herrera, 2005).

No mutante constitutivo pacC Leu340Ser, a interação intramolecular que

impede o processamento é interrompida, fazendo com que ocorra

processamento independente do pH (Diez et al., 2002). Mutantes nulos, em

qualquer um dos seis genes pal e em pacC, produzem fenótipos que mimetizam

condições de crescimento em pH ácido, ou seja ocorre marcadamente ativação

dos genes expressos em pH acido e baixa ou expressão não detectável de

genes regulados por pH alcalino (Caddick et al., 1986; Denison, 2000; Negrete-

Urtasun et al., 1997; Peñalva & Arst, 2004).

Mutantes pacC

, que mimetizam condições de pH alcalino, foram obtidos

pela remoção entre 100 a 214 resíduos da porção C-terminal, incluindo a região

altamente ácida, rica em repetições de glutamina. Os mutantes que mimetizam

crescimento em condições de acidez são obtidos por meio da remoção de

resíduos entre 299 e 505 na região C-terminal. A remoção completa do gene é,

também, caracterizada pelo fenótipo semelhante ao crescimento em pH ácido,

mas leva ao baixo crescimento (Tilburn et al., 1995). Mutante pacC

inclui

mutantes com troca de fase de leitura na seqüência do gene pacC ou pontos de

terminação, que geram proteínas truncadas na posição anterior ou dentro dos

motivos dedo de zinco. Mutantes pacC

+/-

são, fenotipicamente, indistinguíveis

dos mutantes pal

, e, como a proteína não é processada em pH ácido e neutro,

a mutação leva a interferências na sinalização por pH, como aquelas que

afetam a ligação de PalA ou PalB em PacC (Espeso et al., 1997; Vincent et al.,

2003).

O mecanismo que conduz a repressão dos genes, que se expressam em

ambiente ácido, ficou mais claro com os trabalhos de Espeso e Arst (2000).

PacC

é um ativador de genes expressos em pH alcalinos pelo

reconhecimento de cis elementos na região promotora desses genes.

Entretanto, a repressão de genes que são normalmente expressos em pH

ácido, ocorre por inibição competitiva, onde PacC previne a ligação do fator de

ativação IntA pela sobreposição no sítio promotor.

6. Importância do pH na patogênese em fungos

Alguns patógenos podem, dinamicamente, alterar o pH local para

adaptar o ambiente ao seu arsenal enzimático. A amplitude na mudança de pH

depende da força de tamponamento do tecido da planta, de forma que o

patógeno produzirá diferentes efeitos em diferentes tecidos. Prusky et al.,

(2001) sugerem que muitos patógenos aumentam sua virulência pela

modulação do pH do hospedeiro. Este mecanismo asseguraria que genes, que

codificam enzimas que degradam a parede celular, sejam expressos e seus

produtos secretados em condições ótimas de pH para o seu funcionamento.

Muitos fungos modificam ativamente o pH do ambiente pela excreção de

ácidos orgânicos, como os ácidos oxálico, cítrico e glucorônico que,

efetivamente, acidificam o meio (Alkimitsu et al., 2004; Prusky & Yakoby, 2003;

Prusky et al., 2004). Enquanto outros alcalinizam o tecido do hospedeiro pela

excreção de amônia. Os resultados das pesquisas de Prusky et al. (2001)

sugerem que a excreção de amônia é um importante fator de virulência

(Kramer-Haimovich et al., 2006).

A virulência é atribuída há dois fatores importantes, a saber: o sucesso

adaptativo do patógeno às condições físicas e fisiológicas encontradas no

hospedeiro; e a resistência ou tolerância às defesas impetradas pelo organismo

parasitado (Wassenaar & Gaatra, 2001; Prusky & Yakob, 2003).

O pH ambiental é, comumente, dinâmico durante a interação planta-

patógeno. Várias espécies de Colletotrichum secretam amônia em quantidades

significantes, capazes de elevar o pH e aumentar a virulência (Prusky et al.

2001; Drori et al. 2003; Kramer-Haimovich et al., 2006).

A resistência dos frutos de abacate ao C. gloeosporioides parece estar

ligada ao pH. Estudos realizados por Yakoby et al., (2000) evidenciaram que C.

gloeosporioides, crescendo em meio indutor, foi capaz de aumentar o pH de 3,8

para 6,5. A secreção de pectato liase foi detectada, apenas, em pH acima de

5,8, enquanto a transcrição do gene pel foi inicialmente detectado em pH 5,0 e

aumentou até pH 5,7. No que diz respeito à poligalacturonase (PG), a

transcrição e a secreção foram detectadas em pH 5,0 e continuaram até pH 5,7.

Esses resultados sugerem que o hospedeiro pode regular a secreção de PL e

afetar a virulência, visto que cultivares resistentes produzem frutos com pH

menor que 5,5, inclusive durante a maturação.

Em Aternaria alternata, a expressão do gene que codifica endo-1,4-β-

glucanase é aumentada, quando o pH exógeno eleva-se (Eshel et al., 2002).

Em B. cinerea e outros fitopatógenos produtores de ácido oxálico, a diminuição

do pH está correlacionada ao aumento na transcrição de genes, que codificam

endopoligalacturonases (Wubben et al., 2000). Metarhizium anisopliae regula a

transcrição de genes que codificam enzimas proteolíticas e quitinolíticas em

resposta ao pH ambiental. Além disso, foi verificado que ele é capaz de

alcalinizar o meio pela produção de amônia, que teria função relacionada à

regulação do micro-ambiente, sendo, portanto, considerado como fator de

virulência (St. Leger et al., 1998; St. Leger et al., 1999).

Em resposta ao pH, Yarrowia lipolytica secreta protease alcalina ou ácida

(Gonzalez-Lopez et al., 2002). O pH também afetou a secreção de enzimas

como lipases, celulases, amilases, pectinases e proteases, em isolados

fitopatogênicos e endofíticos de Colletotrichum (Jr. Maccheroni et al., 2004).

A virulência de patógenos humanos como Candida albicans e bactérias

patogênicas de animais como Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae e

Escherichia coli é dependente do pH ambiental (Davis et al., 2000a; Olson,

1993; Blankenhorn et al. 1999). Do mesmo modo, fungos fitopatogênicos vêm

sendo estudados no que diz respeito ao pH ambiental e seu processo funcional

ligado à virulência (Manteau et al. 2003; Rollins & Dickman, 2001).

As primeiras evidências que o mecanismo de regulação dependente de

pH semelhante ao descrito para A. nidulans também ocorria no fitopatógeno B.

cinerea, foram apresentadas por Manteau et al., (2003). Esses autores

avaliaram se o pH do tecido hospedeiro era capaz de regular a produção de

fatores de patogenicidade, e com esta finalidade, estudaram dois isolados de B.

cinerea originários de diferentes espécies de plantas. A análise da secreção dos

elementos putativos de virulência foi realizada, em meio sintético tamponado

em pH de 2,0 a 7,0.

Múltiplos processos são afetados pelo pH ambiental em S. sclerotiorum.

A exposição a ambiente de pH alcalino aumentou o acúmulo de ácido oxálico,

dependendo da fonte de carbono presente no meio. O desenvolvimento do

esclerócio foi favorecido em pH ácido e inibido em pH neutro. Rollins e Dickman

(2001) clonaram o gene pac1, que codifica o fator de transcrição putativo

semelhante a PacC. Este fator de transcrição apresenta 3 dedos de zinco,

similares em seqüência e organização aos dedos de zinco da proteína PacC de

A. nidulans. O promotor do gene possui oito sítios consensos de ligação a

Pac1, o que sugere sua auto-regulação.

Desde 1965, está estabelecido a atividade sinérgica entre a produção de

ácido oxálico e poligalacturonase (Bateman & Beer, 1965, citado por Rollins,

2003), os quais são considerados essenciais à virulência de S. sclerotiorum e

de outros patógenos produtores de ácido oxálico. Tanto a produção de ácido

oxálico quanto à regulação de endopoligalacturonase são reguladas pelo pH

ambiental (Rollins et al., 2001; Rollins, 2003). O ácido oxálico favorece a

atividade das PGs, pela acidificação do tecido infectado e tem sido sugerido

que o oxalato estabiliza o sítio ativo da enzima, aumentando a afinidade pelo

substrato (Favaron et al., 2004). Há evidências de que a enzima que degrada o

ácido oxálico em plantas, confere aumento da resistência contra fungos

fitopatogênicos, de modo que o gene que codifica essa enzima tem sido

introduzido em várias plantas transgênicas (Kesarwani et al., 2000; Lane, 2002;

Lu, 2003).

No intuito de estudar, funcionalmente, o gene pac1 de S. sclerotiorum,

Rollins (2003) obteve, por troca gênica, mutante com perda da função. O

mutante pac1 possui crescimento micelial normal em pH ácido, entretanto, o

crescimento foi inibido com o aumento do pH. A produção de ácido oxálico

permaneceu responsiva ao pH alcalino, mas o acúmulo foi reduzido em 75%.

No que diz respeito às endopoligalacturonases, o produto da transcrição de pg1

foi modificado em pH ambiental maior, o que demonstra uma clara

desrepressão gênica e conseqüente acumulação do transcrito de pg1 em um

pH mais elevado. No entanto, o mutante pac1 teve reduzida atividade da

endopoligalacturonase, visto que o pH não foi ideal para a atividade desta

proteína. A regulação de outras enzimas, que degradam a parede celular, pode

igualmente ser alterada neste mutante. Consequentemente, a virulência foi

drasticamente reduzida, o que faz acreditar que o gene pac1 é necessário a

uma apropriada regulação dos processos fisiológicos importantes para a

patogênese (Rollins, 2003).

No fitopatógeno U. maydis, foi identificado e isolado o fator de transcrição

PacC codificado por uma ORF de 2.484 pb, gerando uma proteína de 827

aminoácidos com alta similaridade a PacC de Fusarium oxysporum e

Aspergillus niger. Testes de complementação evidenciaram a capacidade de

restaurar a atividade de protease em mutante Rim101 de Yarrowia lipolytica,

confirmando a função homóloga. A mutação não afetou a transição dimórfica

induzida in vitro pelo pH, nem a taxa de crescimento, a resistência ao sorbitol

hipertônico ou ao estresse causado pelo KCl e a patogenicidade. No entanto,

semelhantemente ao ocorrido como os mutantes pacC de outros fungos, o

mutante de U. maydis mostrou um fenótipo pleiotrópico com alteração na

morfogênese, redução na produção de protease e aumento na sensibilidade a

e Li

. Outras características fenotípicas não reportadas previamente, em

mutantes pacC, como mudanças morfológicas, aumento na sensibilidade a

enzimas líticas e aumento na secreção de polissacarídeos, foram também

reportadas nesse mutante (Aréchiga-Carvajal & Ruiz-Herrera, 2005).

A análise da virulência em resposta ao pH de Aspergillus, responsável

por doenças pulmonares, foi estudada por Bignell et al., (2005). Em mutantes

para o fator de transcrição PacC a rota de transdução de sinal foi bloqueada ou

ocorreu ausência do processamento proteolítico, atenuando, severamente, a

virulência. As infecções causadas por esse mutante foram caracterizadas pelo

crescimento limitado in vivo e redução na infiltração celular inflamatória, em

contraste com a ativação constitutiva do fator PacC, que causou aumento da

mortalidade devido ao crescimento invasivo. Os autores concluíram que o PacC

é requerido para aumentar a virulência de Aspergillus. Esse foi o primeiro

estudo, onde se demonstrou que a expressão gênica regulada por pH e

intermediada pelo fator de transcrição PacC são essenciais à aspergilose

pulmonar. Além disso, foi estabelecido que ambos, o processamento de PacC e

a sinalização mediada por pH, são requeridos para promover processos

integrados a patogenicidade e que a ativação constitutiva de pacC aumenta a

virulência (Bignell et al., 2005).

O pH é um sinal de relevância fisiológica, demonstrada em candidíase

vaginal onde a virulência do mutante de Candida albicans que perdeu a

resposta regulatória ao pH é atenuada. Mutantes para o homólogo de pacC

(Rim101) apresentaram significante redução na virulência (De Bernardis et al.,

1998; Davis et al., 2000b).

Em F. oxysporum, a expressão do gene pacC foi elevada em condições

de crescimento em pH alcalino, mas foi quase imperceptível em condições

ácidas. A obtenção de mutantes com “fenótipo ácido”, ou seja, que expressam

genes que são normalmente transcritos em pH ácido, provocou reduzido

crescimento em pH alcalino, aumento na atividade de protease ácida e alto

nível de transcrição de genes de poligalacturonases. Os merodiplóides PacC

apresentaram: alto nível de transcrição do gene pac, mesmo em pH ácido;

reduzida produção de fosfatase ácida; e aumento na atividade de proteases

alcalinas, conforme o esperado. O mutante PacC

+/-

apresentou aumento na

virulência, em relação ao selvagem, enquanto que o mutante constitutivo

apresentou significante redução na virulência. Desse modo, os autores

propuserem que PacC atuaria como um regulador negativo de virulência,

possivelmente pela repressão da transcrição de genes expressos em pH ácido

e importantes na infecção (Caracuel et al., 2003).

A relação virulência versus PacC dependente da espécie de fungo

analisada, pois os mutantes em C. albicans não são patogênicos, em U. maydis

não há diferenças entre mutantes e selvagem no que diz respeito a

patogenicidade, em F. oxysporum os mutantes são mais virulentos que o

selvagem e em S. sclerotiorum e Aspergillus, os mutantes mostram virulência

reduzida (De Bernardis et al., 1998; Davis et al., 2000a; Caracuel et al., 2003;

Rollins, 2003; Aréchiga-Carvajal & Ruiz-Herrera, 2005; Bignell et al., 2005)

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CAPÍTULO I

Isolamento e caracterização do gene que codifica

endo-xilogalaturonana hidrolase de Crinipellis perniciosa, agente causal

da vassoura-de-bruxa no cacaueiro (Theobroma cacao)

1. RESUMO

O gene que codifica a enzima endo-xilogalacturonana hidrolase de

Crinipellis perniciosa (xghCp), foi clonado e caracterizado. A região codificadora

corresponde a um fragmento de DNA de 1.251 pb e está interrompida por

quatro possíveis íntrons. A proteína deduzida que apresenta 417 aminoácidos,

denominada XghCp, é codificada por um gene cópia única. A análise do

transcrito foi realizada pela técnica de RT-PCR, sendo avaliados os efeitos do

pH e das fontes de carbono glicose e pectina. A transcrição do gene não foi

reprimida por glicose 1% de 8 até 32 horas. Em presença de pectina cítrica os

transcritos do gene xghCp foram detectados em pH variando de 4,0 a 8,0. Na

análise filogenética da proteína deduzida, XghCp agrupou-se com endo-

xilogalacturonana hidrolase de Aspergillus tubingensis, Aspergillus niger e duas

enzimas similares a Xgh de Aspergillus fumigatus. O alinhamento múltiplo

revelou que XghCp apresenta, na região correspondente ao sítio de ligação ao

substrato, a seqüência GIK (Gly-Ile-Lys) que foi comum a todas as endo-

xilogalacturonanas hidrolase analisadas. Este é o primeiro relato da presença

de um gene, que codifica endo-xilogalacturonana hidrolase em um

basidiomiceto.

2. INTRODUÇÃO

A vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao L.) tem como

agente causal o basidiomiceto Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer, um

patógeno hemibiotrófico, que infecta várias espécies dos gêneros Theobroma e

Herrania, ambos membros da família Sterculiaceae. Esta doença constitui um

grande problema fitossanitário com conseqüentes danos socioeconômicos, nas

regiões de cultivo do cacau (Griffith et al., 2003).

Os basidiósporos de C. perniciosa são capazes de infectar o tecido

meristemático e penetrar, diretamente, por meio das hifas primárias, no tecido

da folha de T. cacao (Kilaru & Hasenstein, 2005). A penetração direta no tecido

do cacaueiro e a degradação completa de células do mesófilo (Kilaru &

Hasenstain, 2005) tornam evidente a importância das enzimas responsáveis

pela degradação da parede celular, no sucesso da infecção por C. perniciosa.

Em fungos fitopatogênicos uma das enzimas necessárias à penetração é a

cutinase, que é uma lipase capaz de degradar a cutícula a fim de facilitar a

penetração no hospedeiro (Varley et al., 1992; Li et al., 2003). A segunda

barreira no processo de penetração do patógeno é a parede celular vegetal,

que apresenta uma constituição complexa, tendo como principal componente a

pectina.

A pectina constitui, aproximadamente, 45% da casca do fruto de T.

cacao, mas além dessa fração, o exocarpo apresenta 34% de celulose e

polímeros hemicelulósicos, contendo galactoglucomanana (7- 10%), xiloglucana

fucosilada (5-7%) e xilogalacturonana (4%). Nas sementes, entretanto, a

pectina constitui até 60% da parede celular (Redgwell & Hansen, 2000;

Redgwell et al., 2003).

A degradação enzimática da parede celular vegetal é considerada como

um importante aspecto na infecção. O processo de degradação envolve uma

ação combinada de numerosas enzimas, como a pectina metilesterase, pectina

e pectato liases, endo- ou exo-poligalacturonases e endo-xilogalacturonana

hidrolase. Em fitopatógenos, as enzimas que degradam da parede celular são

consideradas fortes candidatas a fatores de virulência (Walton, 1994; Akimitsu

et al., 2003).

A xilogalacturonana hidrolase (Xgh) é uma pectinase capaz de degradar

xilogalacturonana (XGA), um polímero cujo esqueleto é constituído de α-D-

ácido galacturônico e β-D-xilose. O XGA está presente na parede celular de

várias células e em exsudatos (gomas). Embora a xilogalacturonana hidrolase

possa agir como uma endo-enzima, Zandleven et al., (2005) mostraram que

esta enzima também possui uma ação exolítica e que atua dos finais não-

redutores para os finais redutores. Xgh pertence à família glicohidro-28, que

agrupa pectinases de bactérias, fungos, plantas e insetos (Markovic, 2001). Até

o momento, somente para o gênero Aspergillus havia sido descritas enzimas

capazes de degradar o substrato XGA (Kester et al.,1999; Sakamoto et al.,

2002; Martens-Uzunova et al.,2006).

Em patógenos, a inativação dos genes que codificam enzimas

hidrolíticas, que degradam a parede celular de plantas, tem revelado que essas

enzimas podem ser componentes essenciais da virulência (Vorwerk et al.,

2004). Além disso, na degradação da parede pode ocorrer a liberação de

oligossacarídeos, que são potenciais elicitores da resposta de defesa da planta

(Federici et al., 2006).

Considerando-se a importância que as enzimas pectinolíticas podem ter

como fatores de virulência, o objetivo deste trabalho foi o isolamento e

caracterização do gene xghCp, que codifica a putativa endo-xilogalacturonana

hidrolase de C. perniciosa.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Microrganismo e condições de cultivo

Foi utilizado o isolado de C. perniciosa, identificado como CP02

pertencente ao biótipo C, isolado em Itabuna/BA. O isolado foi cultivado em

meio BDA (batata dextrose ágar) a 27ºC, durante 8 dias.

3.2. Isolamento do gene que codifica a endo-xilogalacturonana hidrolase

de C. perniciosa

Com o objetivo de localizar genes que codificam pectinases, foi realizada

uma busca no banco de seqüências do projeto genoma da vassoura-de-bruxa

(www.Ige.ibi.unicamp.br/vassoura). Para a realização deste trabalho, entre as

seqüências encontradas, foi escolhida uma seqüência de 1.788 pb, que

apresentava 47% de identidade e 60% de similaridade com o gene que codifica

a proteína endo-xilogalacturonana hidrolase de Aspergillus tubingensis.

Baseando-se nessa seqüência e utilizando o programa Primer3 (Rozen &

Skaletsky, 2000) foram desenhados dois oligonucleotídeos iniciadores capazes

de amplificar um fragmento de 894 pb. Os oligonucleotídeos foram nomeados:

ENDOX1 e ENDOX2 (Tabela 1).

O DNA total do isolado CP02 foi extraído conforme descrito por Specht et

al., (1982). Um fragmento de 894 pb foi amplificado do DNA total por PCR,

utilizando-se o termociclador PTC-100 (MJ Research). A reação de amplificação

foi preparada em uma mistura de reação de 25 μL, com Taq DNA polimerase-

pht (Phoneutria), contendo 1x tampão IB (500mM de KCl, 100mM de Tris-HCl

pH 8,4, 1% de Triton X-100) sendo seguida as recomendações do fabricante.

Reações sem DNA foram utilizadas na avaliação da amplificação inespecífica.

O programa utilizado para a amplificação, teve um total de 39 ciclos, com

desnaturação de 30 segundos a 94°C; anelamento durante 30 segundos a

55°C; e extensão de 1 minuto a 72 °C. Após a reação de PCR, 5 μL da mistura

foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,0%. O produto de

amplificação foi clonado no vetor pGEM T-Easy (Promega), conforme protocolo

fornecido pelo fabricante.

Utilizando como sonda o fragmento do gene xghCp clonado em pGEM-T,

realizou-se o isolamento de gene completo do banco genômico de C. perniciosa

construído no bacteriófago λEMBL3 (Stratagene) por Santos (2006). Para

detecção dos fagos recombinantes, aplicou-se a metodologia de hibridização de

DNA em placas de lise, descrita por Benton & Davis (1977), sendo usada a

sonda marcada com o Kit “Gene Images Random Prime Labelling Module”

(Amersham Pharmacia Biotech). Para detecção dos fragmentos, que

hibridizaram com a sonda, foi utilizado o Kit “CDP-StarTM Detection Module”

(Amersham Pharmacia Biotech). As hibridizações foram realizadas à

temperatura de 65ºC durante 16 horas, sendo a membrana lavada duas vezes

em SSC 2X, SDS 0,1% a 60ºC durante 20 minutos e uma vez em SSC 1X, SDS

0,1% a 65ºC durante 10 minutos. Para confirmação dos sinais positivos,

diluições de cada fago recombinante isolado foram utilizadas na realização de

novas hibridizações sob as mesmas condições. Em seguida, as membranas

foram colocadas em contato com filme XOMAT K (Kodak) e reveladas após

exposição durante 24 horas.

A extração de DNA dos fagos recombinantes positivos foi realizada,

conforme descrito por Felipe et al. (1992). Os DNAs extraídos foram clivados

com as enzimas de restrição Sal I, Kpn I e Sac II. Os fragmentos de DNA foram

separados por eletroforese em gel de agarose 0,8%, transferidos para

membrana de náilon (Duralon-Stratagene) e hibridizados com a mesma sonda e

sob as mesmas condições utilizadas na seleção dos fagos. Um fragmento de

DNA hibridizado de aproximadamente 3 kb, obtido pela clivagem com Sal I, foi

clonado no vetor pBluescript II KS+ (Stratagene®), previamente clivado com a

mesma enzima.

Tabela 1. Oligonucleotídeos iniciadores usados para a amplificação do gene

endo-xilogalacturonana de C. perniciosa.

Oligonucleotídeos Seqüências (5’- 3’)

ENDOX1 CCCCGTCTGCACTAAAGAAGCGAG

ENDOX2 CACCCTTGACAATGACGTT

ENDOX F1174 GATTCCACGAAAGCCACTGG

ENDOX F1308 ACACAAGTTCCTGATGACCGG

ENDOX R1383 CGTCGTTCCGCGAATATTCT

EndoX R 272 GCACATCCTGTCTAGTCATCTA

EndoX F NotI GCGGCCGCATGGCACTTTTCAGAGCGCTC

EndoX R NotI GCGGCCGCAATCCACAACTCATCCAGACGC

CPRDNA1 ACTGCGAGTGAAGAGGGAAA

CPRDNA2 AACCGCCGTATACGACAAAG

3.3. Seqüenciamento e análise das seqüências

Para o seqüenciamento de DNA, foi utilizando o seqüenciador

MegaBACE 500 DNA Analysys System (Amersham Pharmacia Biotech

Limited), empregando-se o método de terminação de cadeia por

dideoxinucleotídeos (Sanger et al., 1977). As seqüências resultantes de DNA

foram analisadas por meio da ferramenta BLAST- Basic Local Alignment Search

Tool (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) (Altschul et al., 1997). Subseqüentes

análises da seqüência de DNA e da proteína foram realizadas, utilizando-se o

programa CLUSTAL W (Thompson et al., 1994), enquanto, para a análise

filogenética utilizou-se o programa MEGA3 (Kumar et al., 2004).

Os códigos de acesso das seqüências, utilizadas nas análises, foram:

Xgh A. tubingensis (CAB65657); Xgh A. fumigatus Af293 (XP_747488); Exopg

A tubingensis (Q00293); Exopg A. niger (ABD61562,); Exopg A. fumigatus

Af293 (XP_747778); Exopg Botryotinia fuckeliana (AAF05088); Exopg

Cochliobolus carbonum (Q00359); ExopgA A. niger (ABD61563); Exopg F.

oxysporum f. sp (BAD97415); Xgh A. fumigatus Af293(EAL85450); XghA A.

niger (ABD61571); EndopgA A. niger (CAB72125); Endopg5 B. fuckeliana

(AAC24955); Endopg Phytophthora parasitica (AAW22993); Endopg Sclerotinia

sclerotiorum (Q12708) e XghCp Crinipellis perniciosa (ainda não depositada no

NCBI).

3.4. Detecção do número de cópias do gene xghCp

Alíquotas de 4 μg de DNA genômico foram digeridas com as enzimas de

restrição Bgl II, Hind III, Sac I e Sal I que não clivam o gene xghCp. Os

fragmentos de DNA foram separados por eletroforese em gel de agarose 0,8%

e transferidos para membrana de náilon (Duralon - Stratagene

), conforme

protocolos gerais (Sambrook et al., 1989).

A hibridização foi realizada à temperatura de 65°C. O plasmídeo

contendo o gene xghCp foi utilizado como sonda. A marcação foi feita com [α-

P] d-ATP, utilizando-se o “Random Primer IT II Labeling Kit” (Stratagene). As

lavagens das membranas foram feitas a 65 °C, em SSC 1X, SDS 0,1%,

seguindo-se uma segunda lavagem em SSC 0,1X, SDS 0,1%. Cada lavagem

foi feita durante 20 minutos. As membranas foram expostas a filmes XOMAT K

(Kodak) durante 3 horas à temperatura de -80 °C.

3.5. Extração de RNA total e análise por RT-PCR (Reverse Transcriptase -

Polymerase Chain Reaction)

Discos de micélio de C. perniciosa do isolado CP02 foram inoculados em

BDA a 27 °C durante 10 dias. Após esse período, 10 discos de micélio de 7 mm

foram cortados em pequenos fragmentos e transferidos para Erlenmeyers de

125 mL, contendo 50 mL de meio mínimo tamponado em pH 6,8 (KH

6,8 g,

HPO

8,6 g, KNO

6,0 g, KCl 0,52 g; FeSO

0,01 g; ZnSO

0,01 g; glicose 10

g; água destilada 1 L), sendo , então, incubados a 27

C, em agitação a 250

rpm, durante um período de 8 dias, a fim de obter a massa micelial. Os micélios

foram lavados, recuperados, e transferidos para meios contendo 1% de pectina

cítrica, glicose, pectina + glicose ou extrato da polpa de cacau.

Para avaliação do efeito do pH na expressão do gene xghCp, o micélio

foi transferido para meios contendo 1% de pectina cítrica, preparados em

tampão citrato pH 4,0, citrato-fosfato pH 6,8 e tampão fosfato de sódio pH 8,0,

os quais foram incubados durante períodos de 8, 18 e 32h. O RNA total foi

extraído, conforme o protocolo disponível no endereço eletrônico

www.tigr.org/tdb/potato/microarray_SOPs.shtml, sendo, então, checados em gel

de agarose 1%, enquanto sua pureza e quantificação foram determinadas a 260

nm, utilizando-se o Programa RNA Quantify and Purity Check do

espectrofotômetro Pharmacia Biotech. Ultraspec

3000.

Cinco μg de RNA total foram tratados com DNase RQI RNase Free

(Promega) conforme recomendações do fabricante. Após o tratamento, foi

realizada uma reação de PCR com os oligonucleotídeos CPrDNA1 e CPrDNA2

(Tabela 1) para detecção de DNA genômico. Nas reações de transcrição

reversa, para síntese das primeiras fitas de cDNA, empregou-se o kit ImProm

II (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. A identificação dos

transcritos do gene xghCp foi realizada por RT-PCR.

Para estabelecer os parâmetros de amplificação para o RT-PCR

semiquantitativo, foi utilizada como controle uma parte do gene do rDNA 28S de

C. perniciosa. Para isto, foram feitas reações de PCR a fim de detectar os ciclos

correspondentes à fase de amplificação logarítmica do rDNA. Para estas

análises utilizou-se 1 μL de cDNA, bem como os oligonucleotídeos CPrDNA1 e

CPrDNA2 (Tabela 1) que amplificam um fragmento de 495 pb do gene rDNA de

C. perniciosa. As condições de amplificação foram: 1 minuto à temperatura de

C, 1 minuto a 57

C e 1 minuto a 72

C, sendo as alíquotas retiradas com 20,

22, 24, 26 e 40 ciclos. A partir destas análises, todas as reações foram feitas

com 25 ciclos de amplificação. Para análise da expressão do gene xghCp,

foram utilizados os oligonucleotídeos iniciadores ENDOX1 e ENDOX2 (Tabela

1), que amplificam um fragmento de 894 pb, contendo dois íntrons. O tamanho

esperado para o produto de amplificação foi de 786 pb, utilizando-se o cDNA

como molde. As condições de amplificação foram: 1 minuto a 94

C; 1 minuto a

C; 1 minuto a 72

C com 39 ciclos para RT-PCR e 25 para RT-PCR

semiquantitativo. Os fragmentos de DNA foram analisados em gel de agarose

1,5 %. Para realização das análises de intensidade dos fragmentos de DNA

amplificados, o programa ImageJ (Abramoff et al., 2004), disponível no site

http://rsb.info.nih.gov/ij/, foi utilizado.

4. RESULTADOS

4.1. Caracterização da endo-xilogalacturonana hidrolase de C. perniciosa

O gene xghCp foi clonado e seqüenciado, utilizando-se oligonucleotídeos

específicos (Tabela 1). A análise da seqüência com a utilização da ferramenta Blast

revelou uma ORF de 1.251 pb, interrompida por 4 possíveis íntrons (Figura 1).

A proteína deduzida apresentou 417 aminoácidos (Figura 2), com ponto

isoelétrico (pI) de 8,70 e massa molecular de 43.7088 kDa, com identidade de 50%

e similaridade de 64% com endo-xilogalacturonana hidrolase de A. tubingensis

(CAB65657) e 51% e 65% de identidade e similaridade, respectivamente, com a

endo-xilogalacturonana hidrolase A de A. niger (ABD61571).

A região 5’ não codificadora possui 204 pb, contendo um típico TATA

box (TATAAA) de eucariotos na posição -44, uma seqüência CCAAT na

posição -155, a qual é frequentemente observada em promotores de fungos. A

seqüência 5’CATAATGGC em torno do códon de iniciação ATG, é semelhante

à seqüência Kozak (CAMMATGNC) encontrada em fungos filamentosos e em

genes de eucariotos. Na região 3’ não codificadora (470pb), não foi encontrado

um típico sítio de poliadenilação (AATAAA), mas foram detectadas seqüências

similares nas posições 71 (AATGA), 111 (AATTA) e 251(ATAA). Duas

seqüências apresentando o consenso (CWTS), envolvido na terminação da

tradução e proposto como sítio de poliadenilação, foram detectadas nas

posições 31 e 41 após o sítio de terminação da tradução. Uma seqüência

correspondente ao possível sítio de clivagem TAGT foi encontrada na posição

278 (Figura 1). Tanto o sítio de poliadenilação quanto o sinal de clivagem são

requeridos para o processamento do mRNA, e a perda desses motivos sugere

diferenças na maquinaria de processamento (Unkles, 1992).

A seqüência de aminoácidos RIK (Arg-Ile-Lys) considerada uma

assinatura e encontrada em todos as endopoligalacturonases de fungos e

exopoligalacturonases de plantas, não foi encontrada em XghCp. Esta

seqüência também não foi localizada na endo-xilogalacturonana hidrolase de A.

tubingensis (CAB65657), A. fumigatus Af293 (XP_747488) e A. niger

(ABD61571), sugerindo que embora XghCp apresente 51% de similaridade com

exopg de Aspergillus terreus (XP_001209838), ela não pertence à classe das

exopoligalacturonases.

Os sítios ativos de poligalacturonases de fungos apresentam

seqüência de aminoácido consenso CXGGHGXSIGSVG, que foi encontrado em

XghCp localizada entre os resíduos 242-254, com modificações para

CTG[S/G]HGLS[V/I]GS[L/V][A/G].

Foram detectados três potenciais sítios de N-glicosilação, apresentando a

seqüência consenso (NXS/T) nas posições Asn

161

(Asn-Leu-Ser), Asn

189

(Asn-Ala-Thr)

e Asn

295

(Asn-Val-Thr), este último, apresentou liminar acima de 0,5 (NetNGlyc 1.0

Server – prediction) e é conservado tanto em endo-xilogalacturonana hidrolase de A.

tubingensis quanto em exopoligalaturonase semelhante a Xgh de A. fumigatus Af293

(Figura 2).

O número de cópias de xghCp foi determinado por hibridização do DNA

genômico digerido com quatro enzimas diferentes: Bgl II, Hind III, Sac I, Sal l.

Uma única banda foi observada após a hibridização, em todas as digestões,

indicando a presença de uma única cópia no genoma. Na clivagem com Hind III

uma banda menos intensa é observada, possivelmente devido à clivagem

parcial (Figura 3).

-204 tacggaagatatctatccatctatctttacatcgtgtcggacaattgcaacggcccacgg

-144 cggccttctttccgtaccaccaccaccagacgactactatacacaactctggaagaattc

-84 aggaaataatgggtagatgactagacaggatgtgctatg

tataaaggtacgtttcacagg

-24 tgtatgtttcttcactagcccataATGGCACTTTTCAGAGCGCTCCGACTCGTCGCGATC

M A L F R A L R L V A I

37 CTTTCATTCCTTTCCCTCGTCTCAGGATCCCCGTCTGCACTAAAGAAGCGAGCAACATGT

L S F L S L V S G S P S A L K K R A T C

97 ACCGTCTCATCTGCAGGCACTGCAGGTACCGATGACGTTCCAGCTATCGAAAATGCAATT

T V S S A G T A G T D D V P A I E N A I

361 AAGTCTTGTGGCAACGGGGGAATCATTGTCCTATCCGCCGGCAAAACCTACATGATTCGC

K S C G N G G I I V L S A G K T Y M I R

421 TCGACATTGGATTGCACCGGGTGTTCAGGATGTGAAGTTCAGATTGAAGGCACCCTGAAA

S T L D C T G C S G C E V Q I E G T L K

481 CTATCGGATGACACGAATTTCTGGAATGGCGTCAGGGCAGCCATACTTCTGACGAATCTG

L S D D T N F W N G V R A A I L L T N L

541 AACGGTGCAACCGTCCATTCCAAGACTGGCTCTGGCGTTGTTGACGGAAATGGGGTACCC

N G A T V H S K T G S G V V D G N G V P

601 TTCTGGCAAA

gtatgtttctgtgctccataggtctacttttctcaccttgatgtccagAG

F W Q E

661 TTTGCTTCGGATAACACCTTCAAACGCCCTACGTTGATGTATATTTCCGGCGGTTCTAAC

F A S D N T F K R P T L M Y I S G G S N

721 ATTGTTGTGGAGAATCTCTCTTTCAAGAACGCGCCAAATGTCTTCCATTCTGTCACCGAT

I V V E N L S F K N A P N V F H S V T D

781 GGTGCTACGAACGTAATTTATCGCGGACTCAAGCTGAACGCGACGCCGAAAGATGGGGCC

G A T N V I Y R G L K L N A T P K D G A

841 GTCCCGAAAAATACAGATG

gtcccttttcaactttttttgttgtgcctcaaatgctcatg

V P K N T D

901 cgcttat

tagGTTTCGATGTCGGAAAATCCACCTATGTGACTATCAGCAACACCAACGTT

G F D V G K S T Y V T I S N T N V

961 GTCAATCAGGATGACTGTGTTGCTTTCAAACCTGGTTGTAACTATGTCACTGTCACCGAT

V N Q D D C V A F K P G C N Y V T V T D

1021 ATCACTTGCACCGGATCCCATGGGCTTTCCGTCGGTAGCCTTGCAAAAGGCAGCAACGAC

I T

C T G S H G L S V G S L A K G S N D

1081

gttgtatgtctcttcgcttttgagttctcccactgttagtctgacgggtctgtacagGTC

1141 ACCAACGTCATTGTCAAGGGTGCTACGATGATTGATTCCACGAAAGCCACTGGGATCAAA

T N V I V K G A T M I D S T K A T G I K

1201 CTCTACGACGGTGCTTCGGGCCATGGCGTAGCCACGGTCCGAAATGTTACTTTCCAAGAT

L Y D G A S G H G V A T V R N V T F Q D

1261 GTCACTCTACAGAATTGCGAGTACGCCGCGCACATCCAGACCTGCTACCGGTCATCAGGA

V T L Q N C E Y A A H I Q T C Y R S S G

1321 ACTTGTGTCCCCAGCAAGCACAACGTTGACCAAGTTTACTGGAAGAATATTCGCGGAACG

T C V P S K H N V D Q V Y W K N I R G T

1381 ACTTGTGTCCCCAGCAAGCACAACGTTGACCAAGTTTACTGGAAGAATATTCGCGGAACG

T C V P S K H N V D Q V Y W K N I R G T

1441 AC

gtaggtgtctttgatttcctttgaattaccttgcgcctaatcctttttcaccagTGCT

T A

1501 ACGAAGTTTGACCCAACAGTTGCGAATATGAACTGCCCCAGTTCTGGAACGTGTAATATC

T K F D P T V A N M N C P S S G T C N I

1561 TTTTTCCAGGACTTTACTGTCAAGGCACCGTCTGGCAAGGCAAATGTGTTGTGTTCAGCT

F F Q D F T V K A P S G K A N V L C S A

1621 GTTGACAGTAGTTTGGGTGTTAGCTGTAGCGGAAGCGCGTCTGGATGAgttgtggattca

V D S S L G V S C S G S A S G *

1681 tacagattactttcccgcccatcgttcctcatctgattttctgtaaactctcgctggtaa

1741 tgacaccatggatgactcaaagcgggtgaatgccgaccaattactgtcgttcctcgtgaa

1801 tgttggtcccattgtgcgtcaagctgggcgaggaaggcgaaacgagttcgagttcatgat

1861 cgttgatttgatatggccccgaagtagggctttctatgacgatgacgagcgtgtatggat

1921 aagttcgttgactcacgacatcctcaaggatattagttcggcaatgcctttctacccacc

1981 cattcagtttcatgtttccaggcctcaaaaaagattcagcccaccactgtacgaggaggt

2041 acattntgacaagcacatttctgaactccaattcgggtggtataaacattgacctacact

2101 ttatccatagcataccaaaacacatcatttatgtacct

Figura 1. Seqüências de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos do gene que codifica endo-

xilogalacturonana hidrolase de C. perniciosa. As regiões 5’ e 3’ não codificadoras e os íntrons foram

colocados em letras minúsculas.Os sítios putativos CAAAT box , sítio rico em GC e TATA box estão em

negrito e sublinhados na região 5’. Os possíveis sítios de poliadenilação estão em negrito e sublinhados

na região 3’. O códon de parada está sinalizado com um asterisco, enquanto o sítio de clivagem do

peptídeo sinal TAGT está em caixa cinza. A seqüência consenso CWTS está representada em caixa

cinza, em negrito e sublinhada. A seqüência consenso interna de cada íntron está em negrito e

sublinhada. A seqüência semelhante a Kozak em torno do códon de iniciação está em cinza.

1 MALFRALRLV AILSFLSLVSG SPSALKKRA TCTVSSAGTA GTDDVPAIEN AIKSCGNGGI

61 IVLSAGKTYM IRSTLDCTGC SGCEVQIEGT LKLSDDTNFW NGVRAAILLT NLNGATVHSK

121 TGSGVVDGNG VPFWQKFASD NTFKRPTLMY ISGGSNIVVE NLSFKNAPNV FHSVTDGATN

181 VIYRGLKLNA TPKDGAVPKN TDGFDVGKST YVTISNTNVV NQDDCVAFKP GCNYVTVTDI

241 TCTGSHGLSV GSLAKGSNDV TNVIVKGATM IDSTKATGIK LYDGASGHGV ATVRNVTFQD

301 VTLQNCEYAA HIQTCYRSSG TCVPSKHNVD QVYWKNIRGT TCVPSKHNVD QVYWKNIRGT

361 TATKFDPTVA NMNCPSSGTC NIFFQDFTVK APSGKANVLC SAVDSSLGVS CSGSASG

Figura 2. (A), proteína deduzida endo-xilogalacturonana hidrolase de C.

perniciosa. Possíveis sítios de N-glicosilação estão em caixas cinza e negrito. A

seqüência correspondente ao peptídeo-sinal é indicada em negrito e

sublinhada; a seqüência GIK, que é uma assinatura das XGH, é apresentada

em negrito e sublinhada. Seqüência relacionada ao consenso

CXGGHGXSIGSVG, correspondente ao sítio ativo de poligalacturonase, está

sublinhada. (B), esquema representando o domínio glicohidro 28, pertencente a

família glicosil hidrolase 28, encontrado também em poligalacturonases.

Figura 3 Análise do número de cópias do gene xghCp. DNA genômico do

isolado CP02 foi digerido com as enzimas Bgl II, Hind III, Sac I, Sal l, e os

fragmentos de DNA foram separados por eletroforese em gel de agarose 0,8%

preparado em TBE 1X e transferidos para membrana de nailon (Stratagene)

conforme o método de Sambrook et al. (1989). A hidridização foi realizada com

[

P] dATP marcado. Os fragmentos de DNA do marcador λ Hind III são

indicados em kilobase (kb) à direita e o tamanho aproximado das bandas é

indicado, ao lado, pelas setas.

4.2. Análise da transcrição do gene xghCp

Na análise da transcrição gênica por PCR semiquantitativa é medido o

acúmulo do produto de PCR, formado durante a fase exponencial da reação,

por meio da interrupção da PCR após um determinado número de ciclos. Foi

analisada a transcrição do gene xghCp, em glicose e na mistura glicose com

pectina no pH 6,8, e em pectina cítrica nos pHs 4,0, 6,8 e 8,0. Um gene

transcrito constitutivamente pela célula foi usado como controle. A razão dada

por meio da relação do gene xghCp pelo gene controle é apresentada,

esquematicamente, na Figura 4.

O gene, que codifica a endo-xilogalaturonana hidrolase de C. perniciosa,

foi transcrito em todas as fontes de carbono e pHs analisados. Os resultados

mostram que não houve repressão por glicose à concentração de 1% (Figura

4).

4.3. Análise filogenética e alinhamento das seqüências

A seqüência de aminoácidos da proteína XghCp possui um alto grau de

similaridade com as enzimas endo-xilogalacturonana hidrolase e

exopoligalacturonase. Alinhamento múltiplo da seqüência deduzida do gene xghCp

com outras Xgh e Exopgs é mostrado na Figura 5. A seqüência RIK conservado em

todas as poligalacturonases, apresenta-se modificado nas Xghs, em que o resíduo R

(arginina) é substituído por G (glicina). A arginina (R

256

) e a lisina (K

258

) estão

envolvidas na ligação ao substrato na proteína EndopgII de A. niger (Armand et al.,

2000). Apesar de existir um pequeno número de seqüências de Xgh depositadas no

banco de dados (NCBI), a seqüência GIK pode ser considerada a assinatura para a

endo-xilogalacturonana hidrolase (Figura 5). Conforme se observa na Figura 6, a

análise filogenética por meio do método de agrupamento de vizinhos (Neighbour-

Joining–NJ), reúne, em ramos separados, todas as exopoligalacturonases,

endopoligalacturonases e endo-xilogalacturonana hidrolase, incluíndo a XghCp.

0.5

1.5

2.5

08h pec pH 4.0

18h pec pH 4.0

18h pec pH 6.8

32h pec pH 6.8

08h pec pH 8.0

18h pec pH 8.0

08h p+g pH 6.8

18h p+g pH 6.8

08h glu pH 6.8

18h glu pH 6.8

32h glu pH 6.8

Figura 4. (A) Análise da transcrição do gene xghCp pela técnica de RT-PCR

semiquantitativo. (B) Os resultados da análise densimétrica dos produtos amplificados

são mostrados no gráfico. As fontes de carbono avaliadas foram pectina (pec), glicose

(glu) e na mistura pectina + glicose (p+g) em pH, 4,0, 6,8, e 8,0, durante 8, 18 e

32horas.

Figura 5. Múltiplo alinhamento da seqüência deduzida XghCp com outras endo-

xilogalacturonana hidrolases, endopoligalacturonases e exopoligalacturonases.

As seqüências analisadas incluem: Xgh de Aspergillus tubingensis (CAB65657);

Xgh de Aspergillus fumigatus Af293 (XP_747488); Exopg de A tubingensis

(Q00293); exopg de Aspergillus niger (ABD61562,); Exopg de A. fumigatus

Af293 (XP_747778); Exopg de Botryotinia fuckeliana (AAF05088); Exopg de

Cochliobolus carbonum (Q00359); ExopgA de A. niger (ABD61563); Exopg de

Fusarium oxysporum f. sp (BAD97415); Xgh de A. fumigatus Af293(EAL85450);

XghA de A. niger (ABD61571); EndopgA de A niger (CAB72125); Endopg5 de

B. fuckeliana (AAC24955); Endopg de Phytophthora parasitica (AAW22993);

Endopg de Sclerotinia sclerotiorum (Q12708) e Xgh de C. perniciosa. As setas

indicam o sítio ativo e o motivo R[G]IK.

Continuação

XghB Aspergillus-fumigatus

Xgh-Aspergillus-fumigatus Af293

Xgh-Aspergillus-niger

Xgh-Aspergillus-tubingensis

Xgh-Crinipellis-perniciosa

ExoPG-Fusarium-oxysporum

ExoPGA-Aspergillus-niger

ExoPG-Botryotinia-fuckeliana

ExoPG-Cochliobolus-carbonum

ExoPG-Aspergillus-fumigatus Af293

ExoPG-Aspergillus-niger

ExoPG-Aspergillus-tubingensis

EndoPG-Phytophthora-parasitica

EndoPGA-Aspergillus-niger

EndoPG5-Botryotinia-fuckeliana

EndoPG Sclerotinia sclerotiorum

100

0.2

Figura 6. Análise filogenética da proteína deduzida XghCp, realizada por meio do

método de agrupamento de vizinhos (NJ), utilizando o programa MEGA 3.1. O

comprimento dos ramos horizontais e propocional a distância genética. Os valores de

“boostrap” de 5000 réplicas são indicados na parte superior de cada ramo e a

distância dos ramos na parte inferior. Os organismos e os números de acesso

utilizados foram: Xgh de Aspergillus tubingensis (CAB65657); Xgh de Aspergillus

fumigatus Af293 (XP_747488); Exopg de A tubingensis (Q00293); Exopg de

Aspergillus niger (ABD61562); Exopg de A. fumigatus Af293 (XP_747778);

Exopg de Botryotinia fuckeliana (AAF05088); Exopg de Cochliobolus carbonum

(Q00359); ExopgA de A. niger (ABD61563); Exopg de Fusarium oxysporum f.

sp (BAD97415); Xgh de A. fumigatus Af293(EAL85450); XghA de A. niger

(ABD61571); EndopgA de A niger (CAB72125); Endopg5 de B. fuckeliana

(AAC24955); Endopg de Phytophthora parasitica (AAW22993); Endopg de

Sclerotinia sclerotiorum (Q12708) e XghCp de Crinipellis perniciosa (ainda não

depositada no NCBI).

5. DISCUSSÃO

A ruptura da cutícula mediante a penetração direta de C. perniciosa no

tecido do cacaueiro, bem como a conseqüente degradação completa das

células do mesófilo, ressalta a importância das enzimas pectinolíticas

responsáveis pela degradação da parede celular da planta. Além disso, a

degradação da parede pode levar à liberação de oligossacarídeos, que são

potenciais elicitores da resposta de defesa da planta (Federici et al., 2006).

Neste trabalho, foi descrita a clonagem e caracterização do gene xghCp, que

codifica uma endo-xilogalacturonana hidrolase de C. perniciosa. Somente uma

cópia foi detectada, após a hibridização, sugerindo que não existem outras

seqüências homólogas a xghCp. Geralmente, os fungos possuem múltiplas

formas de pectinases, como as poligalacturonases devido à presença de

múltiplos genes ou até mesmo modificações pós-traducionais de uma mesma

proteína (Wubben et al., 1999). Após análise do banco de dados do projeto

genoma da vassoura-de-bruxa, observou-se que o fungo C. perniciosa possui,

pelo menos, quatro poligalacturonases, duas endopoligalacturonases e duas

exopoligalacturonases. Destas já foram clonadas e caracterizadas uma exopg e

uma endopg (dados não publicados). Tem sido proposto que múltiplas formas

dessas enzimas fornecem, ao patógeno, um aumento na eficiência da

degradação, possibilitando a colonização de uma ampla gama de hospedeiros,

visto que a constituição da pectina da parede celular varia, amplamente, entre

as espécies, e entre diferentes tecidos do mesmo hospedeiro. Portanto,

múltiplas formas garantem, ao patógeno, a habilidade de obtenção de

nutrientes dos diferentes tecidos, o que assegura sua melhor adaptação e

sucesso na infecção (Williams et al., 2002; Gotesson et al., 2002).

Análise filogenética da seqüência de aminoácidos deduzida indica que

XghCp é semelhante a outras Xgh e Exopgs, conforme apresentado na Figura 6. O

alinhamento múltiplo mostra que seqüência RIK, conservado em todas as

poligalacturonases, apresenta-se modificado nas Xghs, em que o resíduo R (arginina)

é substituído por G (glicina). A arginina (R

256

) e a lisina (K

258

) estão envolvidas na

ligação ao substrato na proteína EndopgII de A. niger (Armand et al., 2000). Embora

um pequeno número de seqüências Xgh estejam depositadas no banco de dados

(NCBI), a sequência GIK pode considerada a assinatura para a endo-

xilogalacturonana hidrolase (Figura 5). Mesmo ocorrendo uma alta similaridade com

Exopgs de fungos, Xghs não contêm motivos conservados em regiões características,

indicando ser uma nova enzima (Markovic & Janecek, 2001; van der Vlugt-Bergmans

et al., 2000). A análise filogenética, realizada com a utilização do método de

agrupamento de vizinhos (neighbour-joining – NJ), reúne em ramos separados todas

as exopoligalacturonases, endopoligalacturonases e endo-xilogalacturonana

hidrolases incluíndo a putativa XghCp.

Foram detectados três potenciais sítios de N-glicosilação, apresentando a

seqüência consenso (NXS/T) nas posições Asn

161

(Asn-Leu-Ser), Asn

189

(Asn-Ala-Thr)

e Asn

295

(Asn-Val-Thr), sendo que, este último apresenta liminar acima de 0,5

(NetNGlyc 1.0 Server – prediction) e é conservado tanto em endo-xilogalacturonana

hidrolase de A. tubingensis quanto em exopoligalacturonase semelhante a Xgh de A.

fumigatus Af293. A glicosilação é uma importante modificação pós-traducional e

representa um processo primordial para formação das proteínas secretadas e de

membrana, além de poder afetar expressão e função (Kasturi et al., 1997). Assim

como a maioria das poligalacturonases, possivelmente XghCp atue

extracelularmente na parede celular do hospedeiro. Por este motivo, foram

analisadas possíveis seqüências de endereçamento. Estas são constituídas de

domínios polipeptídicos presentes em proteínas secretadas, denominadas

peptídeo-sinal (SP), o qual é necessário para a entrada da pré-proteína no

lúmen do RE. Seqüência da região N-terminal da Xgh de C. perniciosa

apresenta 21 peptídeos ricos em resíduos hidrofóbicos correspondente ao SP.

A produção extracelular de pectinases é, geralmente, condicionada à

repressão catabólica por meio de carboidratos prontamente metabolizáveis. Em

muitos casos, a expressão gênica das poligalacturonases tem sido

condicionada ao pH ambiental (Cotton et al., 2003; Wubben et al., 2000).

Entretanto, algumas poligalacturonases apresentam expressão constitutiva,

como os genes pgaA e pgaB de A. niger e Bcpg1 e Bcpg2 de Botrytis cinerea

(Parenicova et al., 2000, Wubben et al., 2000) ou diferencialmente expressa

dependendo do estádio de infecção e do hospedeiro (ten Have et al., 2001). Em

outros casos, a transcrição é regulada por sinais presentes durante a interação

planta-patógeno (Yang et al., 2005).

O o transcrito do gene xghCp foi detectado por RT-PCR, em pH 4,0, 6,8

e 8,0, nas fontes de carbono pectina cítrica, glicose e na mistura glicose com

pectina. Os resultados mostram que não houve repressão por glicose na

concentração de 1%. Em Fusarium moniliforme, glicose 0,2% aumentou a

produção de poligalacturonase, e em concentração cinco vezes maior, inibiu

completamente sua secreção (Niture et al., 2006). Os transcritos foram

detectatos em pectina pH 4,0, 6,8 e 8,0 (Figura 4).

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CAPÍTULO II

Caracterização dos genes relacionados ao pH: pacC e palA de Crinipellis

perniciosa, agente causal da vassoura-de-bruxa no cacaueiro (Theobroma

cacao)

1. RESUMO

O fungo Crinipellis perniciosa é o agente causal da vassoura-de-bruxa no

cacaueiro (Theobroma cacao), que é a doença mais devastadora encontrada

nesta cultura. Além do cacaueiro, C. perniciosa é capaz de infectar outras

plantas hospedeiras, tendo sido descritos diferentes biótipos. Durante o

desenvolvimento da doença, diferentes enzimas são produzidas, sendo que o

controle da síntese e secreção envolve tanto proteínas receptoras, que são

capazes de detectar as características do ambiente em que o fungo se

encontra, quanto reguladores específicos capazes de ativar ou desativar a

transcrição de genes, cujos produtos são necessários ao desenvolvimento da

doença. Neste trabalho foi realizada a clonagem e caracterização dos genes

palA e pacC, relacionados à transdução de sinal em resposta ao pH em C.

perniciosa. A transcrição do gene palACp não é regulada por pH e a proteína

deduzida apresentou o domínio conservado BRO1. A análise filogenética

mostrou que esta proteína é conservada de fungos a humanos. Foram

seqüenciados 4.347 pb correspondentes ao gene pacCCp, que apresentou uma

ORF de 2.472 pb interrompida por 8 íntrons putativos. Na região promotora,

foram localizados três possíveis sítios de reconhecimento para PacC

(5’GCCAG3’), o que sugere um sistema de auto-indução deste gene em pH

alcalino. Os transcritos do gene pacCCp foram detectados por RT-PCR em pH

6,8 e 8,0 em 8, 18 e 32 horas após a indução. Em pH 4,0, foi observada a

transcrição basal no período de 8 a 32 horas. A seqüência deduzida apresentou

824 aminoácidos, com domínios dedos de zinco extremamente conservados em

leveduras e fungos filamentosos. Motivos de reconhecimento proteína-proteína

YPXL/I de interação com PalA foram localizados na região C-terminal da

proteína PacCCp entre os aminoácidos 637 e 742. A identificação dos genes

pacCCp e palACp sugere que C. perniciosa apresenta a cascata de sinalização

em resposta ao pH.

2. INTRODUÇÃO

Crinipellis perniciosa é o agente etiológico da vassoura-de-bruxa do

cacaueiro (Theobroma cacau). Este fungo apresenta ciclo de vida

hemibiotrófico, que se caracteriza por uma fase biotrófica monocariótica,

seguindo-se uma fase necrotrófica dicariótica. Além do cacaueiro, C. perniciosa

é capaz de infectar outras plantas hospedeiras, tendo sido descritos diferentes

biótipos. O biótipo C infecta espécies dos gêneros Theobroma e Herrania sendo o

principal responsável por perdas econômicas na cultura do cacau; o biótipo S está

associado a sintomas de vassoura-de-bruxa em várias espécies da família

Solanaceae; e o biótipo L é saprófita sendo encontrado em lianas, mais

especificamente na espécie Arabidaea verrucosa (Griffith & Hedger, 1994; Griffith et

al., 2003).

Os microrganismos possuem a capacidade de adaptar-se ao pH do

ambiente. Um dos aspectos dessa adaptação, particularmente importante para

os organismos que crescem sobre ampla variação de pH é a capacidade de

expressão gênica adequada ao ambiente (Arst & Peñalva 2003; Peñalva & Arst,

2004).

Em fungos filamentosos, o pacC é o principal gene responsável pela

regulação em resposta ao pH. A proteína PacC liga-se ao DNA no cis-elemento

5’-GCCAAG-3’, que está presente, em número variável, nas regiões promotoras

de todos os genes regulados por esta proteína. As análises de mutantes

específicos demonstraram a importância do cis-elemento, em que a substituição

de bases resultou em substancial ou completa perda de ligação, exceto a

adenina 5 (parcialmente trocada por G). Um T, precedendo o hexanucleotídeo,

aumentou a ligação (Espeso et al.,1997).

A proteína PacC é sintetizada em sua forma inativa denominada PacC

que sofre processamento pós-traducional por meio de dois passos proteolíticos

para ativação em condições de pH alcalino. O primeiro passo é dependente do

pH com formação do PacC

, uma forma intermediária entre a forma ativa

PacC

resultante do segundo passo proteolítico. O polipepitídeo com 27 kDa

contém cerca de 250 resíduos da região N-terminal de PacC que inclui os três

dedo de zinco (Arst & Peñalva 2003; Peñalva & Arst, 2004).

A proteína PacC atua em resposta a uma cascata de sinalização, em que

os componentes são codificados por seis genes, palA, palB, palC, palF, palH,

palI, destes, os dois últimos são proteínas transmembrana capazes de perceber

o pH externo. Os produtos dos genes palC e palF ainda não possuem um papel

claro na cascata de sinalização. A transdução de sinal, mediada por pH,

culmina na clivagem do fator de transcrição PacC para a sua forma ativa, e para

que isto ocorra, a proteína PalA liga-se a dois motivos YPXL/I localizados em

cada lado da região de sinalização para a protease. Adicionalmente, PalA

interage com Vps32/Snf7 e recruta a proteína PalB, que é uma císteina

protease (Caddick et al., 1986; Denison et al., 1995; Xu & Mitchell, 2001; Arst &

Pañalva, 2003; Vincent et al., 2003; Herranz et al., 2005; Tilburn et al., 2005).

PalA, Bro1 e Alix (ALG-2) são membros de um grupo de proteínas,

caracterizadas por possuir o domínio BRO1. Eles são componentes de rotas de

transdução de sinal que é encontrado de fungos a mamíferos. Uma

característica comum a PalA, Bro1 e seus homólogos é a habilidade para

interagir com proteínas do ESCRT (Endosomal Sorting Complex Required of

Transport). O homólogo humano de Bro1 tem um papel-chave no

desenvolvimento de retrovirus, porque ele interage com HIV-1 e outras

proteínas retrovirais, as quais contêm o motivo YPXL (Kim, et al., 2005;

Odorizzi, 2006; Hurley & Emr, 2006).

O fato da transdução de sinal ocorrer, apenas, em pH alcalino é bastante

intrigante, uma vez que nenhum dos seis genes pal tem mostrado evidência de

regulação por pH; assim sendo, a resposta ao pH deve ocorrer após a

transcrição (Díez et al., 2002; Espeso & Arst, 2000; Rollins, 2003; Aréchiga-

Carvajal & Ruiz-Herrera, 2005).

Muitos fungos modificam ativamente o pH do ambiente pela excreção de

ácidos orgânicos, como os ácidos oxálico, cítrico e glucônico, que efetivamente

acidificam o meio. Outros alcalinizam o tecido do hospedeiro pela secreção de

amônia (Akimitsu et al., 2004; Prusky & Yakoby, 2003; Prusky et al., 2004). Os

resultados das pesquisas de Prusky et al. (2001) sugerem que a excreção de

amônia é uma importante condição para a virulência.

Os fungos fitopatogênicos vêm sendo estudados no que diz respeito ao

pH ambiental e seu processo funcional ligado à virulência. Em Botrytis cinerea,

é requerida a expressão coordenada de uma grande quantidade de enzimas,

que são necessárias à degradação da camada protetora das células da planta e

à defesa química, como as poligalacturonases, pectina metilesterase, proteases

e lacases (Manteau et al., 2003; Rollins & Dickman, 2001). Os genes que

codificam estas enzimas normalmente estão sujeitos ao controle em resposta

ao pH.

Para estudar, funcionalmente, o gene pac1 de Sclerotinia sclerotiorum

(homólogo a pacC/Rim101) Rollins (2003) obteve, por troca gênica, mutantes

com perda da função. Os mutantes pacC1 apresentaram crescimento micelial

normal em pH ácido; entretanto, esse crescimento foi inibido com o aumento do

pH. A produção de ácido oxálico permaneceu responsiva ao pH alcalino e a

acumulação foi intensamente alterada.

No fitopatógeno Ustilago maydis foi isolado um mutante pacC

, que

mostrou um fenótipo pleiotrópico com alteração na morfogênese, redução na

produção de protease e aumento na sensibilidade a Na

e Li

. Outras

características fenotípicas não reportadas, previamente, em mutantes pacC,

tais como mudanças morfológicas, aumento da sensibilidade a enzimas líticas e

aumento da secreção de polissacarídeos, foram também reportadas nesse

mutante (Aréchiga-Carvajal & Ruiz-Herrera, 2005).

Bignell et al. (2005) estudaram a virulência em resposta ao pH na

patogênese de doenças pulmonares causadas por Aspergillus. Mutantes para o

fator de transcrição PacC tiveram a rota de transdução de sinal bloqueada ou

ausência do processamento proteolítico, atenuando severamente a virulência.

As infecções, causadas por esse mutante, são caracterizadas pelo crescimento

limitado in vivo e redução na infiltração celular inflamatória, em contraste com a

ativação constitutiva do fator PacC que causa aumento na mortalidade devido

ao crescimento invasivo. Os autores concluíram, portanto, que o PacC é

requerido para aumentar a virulência na patogênese pulmonar. Esse foi o

primeiro estudo, demonstrando que a expressão gênica regulada por pH e

intermediada pelo fator de transcrição PacC são essenciais para a aspergilose

pulmonar. Além disso, estabeleceu que ambos, o processamento de PacC e a

sinalização mediada por pH são requeridos para promover processos

integrados a patogenicidade e que a ativação constitutiva de pacC aumenta a

virulência.

O pH é um sinal de relevância fisiológica demonstrada em candidíase

vaginal, em que a virulência do mutante de Candida albicans, que perdeu a

resposta regulatória ao pH, é atenuada e mutantes para o homólogo de pacC

(Rim101) apresentam significante redução na virulência (De Bernardis et al.,

1998; Davis et al., 2000).

Em Fusarium oxysporum, a expressão do gene pacC foi elevada em

condições de crescimento alcalino e quase imperceptível em condições ácidas.

A obtenção de mutantes com “fenótipo ácido”, ou seja, que expressam genes

que são normalmente transcritos em pH ácido, resultou em baixo crescimento

em pH alcalino, aumento na atividade de protease ácida e alto nível de

transcrição de genes de poligalacturonases. Os merodiplóides PacC

apresentaram alto nível de transcrição do gene pacC, mesmo em pH ácido,

reduzida produção de fosfatase ácida e aumento na atividade de proteases

alcalinas, conforme esperado. O mutante PacC

+/-

apresentou um aumento na

virulência, em relação ao selvagem, enquanto o mutante constitutivo

apresentou significante redução na virulência. Desse modo, os autores

propuseram que PacC atuaria como um regulador negativo de virulência,

possivelmente por meio da repressão da transcrição de genes expressos em

pH ácido, importantes na infecção (Caracuel et al., 2003).

A relação virulência versus PacC depende da espécie de fungo

analisada, devido a seguinte razão: os mutantes em C. albicans não são

patogênicos; em U. maydis, não há diferença entre os mutantes e o selvagem

no que diz respeito a patogenicidade; em F. oxysporum, os mutantes são mais

virulentos do que o selvagem e em S. sclerotiorum e Aspergillus, os mutantes

mostram virulência reduzida (De Bernardis et al., 1998; Davis et al., 2000;

Caracuel et al., 2003; Rollins, 2003; Aréchiga-Carvajal & Ruiz-Herrera, 2005;

Bignell et al., 2005).

Devido à importância da cascata de sinalização em resposta ao pH em

diferentes fungos patogênicos, este trabalho teve como objetivos isolar e

caracterizar os genes que codificam PacC e PalA em C. perniciosa.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Microrganismo e condições de cultivo

O isolado de Crinipellis perniciosa utilizado neste trabalho foi CP02

(biótipo C, Itabuna-Ba, Este isolado foi cultivado em BDA (batata dextrose ágar)

a 27ºC, por 8 dias.

3.2. Clonagem dos genes palACp e pacCCp

Seqüências presentes no banco de dados do projeto genoma da vassoura-

de-bruxa (www.Ige.ibi.unicamp.br/vassoura) com homologia aos genes que

codificam o fator de transcrição PacC e a proteína PalA foram utilizadas para

desenhar oligonucleotídeos iniciadores. Por meio do programa Primer3 (Rozen

& Skaletsky, 2000) foram desenhados dois pares oligonucleotídeos iniciadores

que amplificam fragmentos de 278 pb (pacCCp) e de 2300 pb (palACp). Os

produtos das amplificações foram clonados no vetor pGEM T-Easy (Promega)

de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. Os fragmentos de DNA

clonados foram seqüenciados para confirmação da identidade e utilizados para

o isolamento dos respectivos genes do banco genômico construído em lambda

EMBL3 (Stratagene) por Santos (2006). A metodologia de hibridização de DNA

em placas de lise, descrita por Benton e Davis (1977) foi utilizada para a

detecção e isolamento dos fagos recombinantes. As sondas utilizadas foram

marcadas com o Kit “Gene Images Random Prime Labelling Module”

(Amersham Pharmacia Biotech). Para detecção dos fragmentos que

hibridizaram com as sondas foi utilizado o Kit “CDP-StarTM Detection Module”

(Amersham Pharmacia Biotech). As hibridizações foram realizadas à

temperatuda de 65ºC durante 16 horas e as membranas foram lavadas duas

vezes em SSC 2X, SDS 0,1% a 60ºC durante 20 minutos cada e uma vez em

SSC 1X, SDS 0,1%, a 65ºC durante 10 minutos. Para confirmação dos sinais

positivos, diluições de cada fago recombinante isolado foram utilizadas na

realização de novas hibridizações sob as mesmas condições. As membranas

foram colocadas em contato com filme XOMAT K (Kodak) e reveladas após 24

horas em exposição.

Tabela 1. Oligonucleotídeos iniciadores usados no estudo do gene pacC de C.

perniciosa

Oligonucleotídeos Seqüências (5’- 3’)

Pac F GGGCGCAAGAGTACCAATAA

Pac R TCCTGAGGACGCTTGAAAGA

Pac2F CCTTTTCATATCCATTTCTCACT

Pac2R AGGATTCATCCTTCTCTTTGTCAT

PacR 130 GATATTACCAGCGTTGGGAA

PacR 1201 AGGACATTTTGATGGCAAGTGC

PacF 2005 CATCATTACCCTCACCAATCTCCA

PacF 1398 GCGTGGATGACTTTTTCACAGA

Pac F 3085 TCCACGTCTTCTCTACAATCAC

PacF 3480 GGTGCGACATATGGAGCTCATT

CPRDNA1 ACTGCGAGTGAAGAGGGAAA

CPRDNA2 AACCGCCGTATACGACAAAG

Tabela 2. Oligonucleotídeos iniciadores usados no estudo do gene palA de C.

perniciosa

Oligonucleotídeos Seqüências (5’- 3’)

palA F

CGTCGGACCAGAAACATTCAT

palA R TCAAACATGACGGGTTGA

palA 89F CCAGAGGATGAAGAAAGACCAC

palA 890R GCTCCGTAAAATATCACCTGCT

palA R1 TGAATACAATTGATGCCCTTTCGA

palA R2 CTTGACAGCCTTCATTCCGAAC

CPRDNA1 ACTGCGAGTGAAGAGGGAAA

CPRDNA2 AACCGCCGTATACGACAAAG

3.3. Extração e caracterização dos fragmentos de DNA dos fagos

recombinantes

A extração de DNA dos fagos recombinantes positivos foi realizada,

conforme descrito por Felipe et al. (1992). Os DNAs extraídos foram clivados

com as enzimas de restrição Apa I, Sac I, Sac II para pacCCp e Apa I, EcoR I,

Hind III e Kpn I para palACp. Os fragmentos de DNA foram separados por

eletroforese em gel de agarose 0,8%, transferidos para membrana de náilon

(Duralon-Stratagene) e hibridizados com a mesma sonda utilizada na seleção

dos fagos. Os fragmentos de DNA correspondentes aos genes foram clonados

no vetor pBluescript II KS+ (Stratagene®), previamente clivado com a mesma

enzima. Para completar a seqüência do gene pacC foi usado PCR inverso

(IPCR) utilizando os oligonucleotídeos PacR 130 e PacF 3085 (Tabela 1). O

DNA do fago foi clivado com Sac II e circularizado, usando-se T4 ligase (Figura

1). A amplificação foi realizada com PCR Kit Advantage 2 da Clontech, segundo

as recomendações do fabricante. Um fragmento de aproximadamente 4,3 kb foi

seqüenciado utilizando os oligonucleotídeos PacF 3085 e 3480 (Tabela 1).

O gene palACp foi clonado por PCR inverso a partir do DNA do fago

palACp digerido com Hind III. O DNA foi ligado usando T4 ligase a 16ºC e

utilizado como molde em PCR, usando os oligonucleotídeos palAR1 e palAR2

(Figura 2 B). A amplificação foi realizada com PCR Kit Advantage 2 da Clontech

segundo recomendações do fabricante. Um fragmento de aproximadamente 2,3

kb foi clonado no vetor pGEM T-Easy (Promega), de acordo com o protocolo

fornecido pelo fabricante.

Figura 1. Esquema do PCR inverso usado para amplificar parte do gene

pacCCp. Os oligonucleotídeos PacR 130 R1 e PacF 3085 foram usados para

amplificação das extremidades do gene pacCCp, a partir do DNA do fago

circularizado após clivagem com Sac II.

Figura 2. Esquema da amplificação de parte do gene palACp. A. Os retângulos

representam os dois fragmentos do gene palACp, encontrados no banco de

dados do projeto genoma da vassoura-de-bruxa. As setas mostram as direções

de amplificação dos oligonucleotídeos iniciadores, empregados na clonagem e

sequenciamento de parte do gene palACp (Tabela 2). B. Esquema do PCR

inverso. Os oligonucleotídeos palA R1 e palA R2 (Tabela 2) foram usados para

amplificação das extremidades do gene palACp, a partir do DNA do fago

circularizado, após clivagem com Hind III.

3.4. Sequenciamento e análise das seqüências

O seqüenciamento de DNA foi realizado, utilizando-se o seqüenciador

MegaBACE 500 DNA Analysis System (Amersham Pharmacia Biotech Limited)

pelo método de terminação de cadeia por dideoxinucleotídeos (Sanger et al.,

1977). As seqüências de DNA resultantes foram analisadas por meio da

ferramenta BLAST Basic Local Alignment Search Tool

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) (Altschul et al., 1997). Subseqüentes

análises das seqüências de DNA e das proteínas foram realizadas no programa

CLUSTAL W (Thompson et al., 1994), enquanto a análise filogenética foi

realizada no programa MEGA3 (Kumar et al., 2004).

Os códigos de acesso das seqüências utilizadas na análise da proteína

PalA foram: Rim20p Yarrowia lipolytica (XP_503059); Rim20p Debaryomyces

hansenii (XP_460839); Rim20p Candida albicans (AAD51716); PalA Aspergillus

oryzae (BAD83606); PalA Aspergillus terreus (XP_001214761); PalA

Aspergillus fumigatus Af293(XP_752184); PalA Aspergillus nidulans

(XP_408488); PalA Magnaporthe grisea (XP_368411); PalA Neurospora crassa

(XP_959867); PalA Cryptococcus neoformans (XP_571758); PalA Ustilago

maydis (XP_401494); ALIX (Apoptosis-linked gene 2 interacting protein X)

Caenorhabditis elegans (NP_001022713); ALIX Caenorhabditis elegans

(NP_001022714); PrCD (programmed cell death) Aedes aegypti (EAT36654);

PrCD Danio rerio (NP_998525); PrCD Xenopus laevis (Q9W6C5); PrCD Gallus

gallus (XP_418826); PrCD Mus musculus (AAH26823); ALG2 Mus musculus

(Q9WU78); ALG2 Rattus norvegicus (XP_001076624); ALG2 Rattus norvegicus

(XP_343495); PrCD Canis familiaris (XP_858504); PrCD Canis familiaris

(XP_534215); PrCD Pan troglodytes (XP_001169526); ALG2 Homo sapiens

(AAF08220); PrCD Homo sapiens (NP_037506); A LG-2 Dictyostelium

discoideum (XP_643566); BRO1 C. neoformans (XP_571916); BRO1 U. maydis

(Q4PHA8); BRO1 Emericella nidulans (AAR02857); Bro1 A. fumigatus

(EAL93470); e PalA de Crinipellis perniciosa (ainda não depositada no NCBI).

Os códigos de acesso, utilizados na análise da proteína PacC, foram:

proteina hipotética de Coprinopsis cinerea (EAU92749); PacC Cryptococcus

neoformans (XP_572292); PacC Ustilago maydis (CAG34353); Rim 101

Kluyveromyces lactis (XP_453982); Rim 101 Saccharomyces cerevisiae

(NP_011836); PacC Acremonium chrysogenum (Q96X49); PacC Gibberella

moniliformis (Q873X0); PacC de Neurospora crassa (Q7RVQ8); PacC Fusarium

oxysporum (Q870A3); PacC Emericella nidulans (Q00202); PacC Sclerotinia

sclerotiorum (Q9P413); PacC Aspergillus oryzae (Q9HFB3); PacC Gibberella

fujikuroi (Q8J1U9); PacC Trichophyton rubrum (Q9C1A4); PacC Aspergillus

niger (Q00203); PacC Botryotinia fuckeliana (AAV54519); PacC Aspergillus

giganteus (Q5XL24); PacC Penicillium chrysogenum (Q01864); PacC

Aspergillus fumigatus Af293 (XP_754424) e PacC de C. perniciosa (ainda não

depositada).

3.5. Extração de RNA total e análise por RT-PCR (Reverse Transcriptase -

Polymerase Chain Reaction)

Discos de micélio de C. perniciosa do isolado CP02 foram inoculados em

BDA a 27 °C por 10 dias. Após esse período, 10 discos de micélio de 7 mm

foram cortados em pequenos fragmentos e transferidos para Erlenmeyers de

125 mL, contendo 50 mL de meio mínimo tamponado em pH 6,8 (KH

6,8 g,

HPO

8,6 g, KNO

6,0 g, KCl 0,52 g; FeSO

0,01 g; ZnSO

0,01 g; glicose 10

g; água destilada 1 L) e incubados a 27

C, com agitação a 250 rpm, durante um

período de 8 dias, a fim de obter massa micelial. Após esse período, os micélios

foram lavados, recuperados, e transferidos para meios contendo 1% de pectina,

glicose, pectina + glicose ou extrato da polpa de cacau.

Para avaliação do efeito do pH na transcrição dos genes palACp e

pacCCp, foi realizada a transferência do micélio para meios contendo 1% de

pectina cítrica, preparados em tampão citrato pH 4,0, citrato-fosfato 6,8 e

tampão fosfato de sódio pH 8,0. O RNA total foi extraído nos tempos de 8, 18 e

32h após a transferência, de acordo com o protocolo disponibilizado no

endereço eletrônico www.tigr.org/tdb/potato/microarray_SOPs.shtml. O RNA

total extraído foi checado em gel de agarose 1% e sua pureza e quantificação

foram determinados a 260 nm, utilizando-se o Programa RNA Quantify and

Purity Check do espectrofotômetro Pharmacia Biotech. Ultraspec

3000.

A identificação dos transcritos dos genes foi realizada por RT-PCR. Foram

realizadas as reações de transcrição reversa, para síntese das primeiras fitas

de cDNA, empregando-se o kit ImProm

II (Promega) de acordo com as

instruções do fabricante. Em cada reação de RT, utilizaram-se 5 μg de RNA

total, previamente, tratado com Dnase RQI Rnase Free (Promega).

A amplificação da região correspondente ao rDNA 28S de C. perniciosa,

foi utilizada como controle, sendo as reações realizadas com 1 μL de cDNA e

os oligonucleotídeos CPRDNA1 e CPRDNA2 (Tabela 1), que amplificam um

fragmento de 495 pb. As condições de amplificação foram: 1 minuto a 94

C, 1

minuto a 57

C e 1 minuto a 72

A análise da transcrição do gene pacCCp foi realizada utilizando-se os

oligonucleotídeos Pac2F e Pac2R (Tabela 1), que amplificam um fragmento de

901 pb do DNA genômico interrompido por 2 íntrons, gerando um produto de

786 pb do cDNA. A análise da transcrição de palACp, em diferentes pHs, foi

realizada por utilizando-se os oligonucleotídeos palA89R e palAR (Tabela 2),

que amplificam 1.856 pb do DNA genômico e 1.361 pb do cDNA. As condições

de amplificação foram: 1 minuto a 94

C, 1 minuto a 55

C, 1 minuto a 68

C com

39 ciclos para o RT-PCR. Os fragmentos foram analisados por eletroforese em

gel de agarose 1,5 %.

4. RESULTADOS

4.1. Isolamento e caracterização do gene palACp

Duas seqüências correspondentes ao gene, que codifica a proteína PalA de C.

perniciosa, foram localizadas no banco de dados do projeto genoma da vassoura-de-

bruxa. A primeira seqüência, apresentando 932 pb, codifica à porção amino terminal

da proteína PalA de Cryptococcus neoformans (69 ao 207aa) e a segunda com 1751

pb é referente aos aminoácidos 248 a 699. Um fragmento de aproximadamente 2,3 kb

do gene palACp (Figura 2) foi amplificado com os oligonucleotídeos palAF e palAR

(Tabela 2), desenhados a partir das sequências clonadas no vetor pGEM T-Easy

(Promega) (Figura 2A). Este plasmídeo recombinante foi utilizado no isolamento dos

fagos de um banco genômico. Três fagos positivos foram clivados com as enzimas

Apa I, EcoR I, e Hind III e revelaram o mesmo perfil de bandas. O gene

completo foi obtido por PCR inverso, utilizando-se os oligonucleotídeos palAR1

e palAR2 (Tabela 2 e Figura 2B). A seqüência do gene palACp, obtida até o

momento, possui 12 íntrons putativos (Figura 3) e a proteína deduzida 627 aa,

que apresenta o domínio BRO1 (Figura 4).

Pesquisa em banco de dados de proteínas, com a seqüência de

aminoácidos deduzida da proteína PalACp, revelou alta similaridade com a

proteína Rim20 de leveduras, PalA e BRO1 de fungos filamentosos

ascomicetos e basidiomicetos, bem como os homólogos ALIX (

Apoptosis-

Linked gene 2 Interacting protein X) e ALG2 (Apoptose Linked Gene-2) de

mamíferos.

A análise filogenética da proteína deduzida separou basidiomicetos e

ascomicetos, dentro deste, levedura e fungos filamentosos foram separados em

diferentes clusters. Como se observa na Figura 6, a análise filogenética separa,

claramente, os grupos distintos, conforme mostrado, na seta ao lado da árvore,

que também indica o aumento da complexidade evolutiva dos grupos de

Candida albicans ao Homo sapiens.

A transcrição do gene palACp foi avaliada em pH 4,0, 6,8 e 8,0 durante

32 horas (Figura 5). O transcrito foi detectado tanto em pH ácido quanto

alcalino, não demonstrando regulação em resposta ao pH.

1 AAGACAGCTTTCCCTGCTTATGACTCTAGAGGATCCCAGTCAATCAATTAGAAAACTGAC

61 TTCTGCCAGGTATCACGCCCAGCTAACTTCTGTTCTCGCAAAATTGCCAGCCGATgtgcg

121 tggaatatacgtcggaccagaaacattcatatataagagaaatctagATTCGATTGGATA

181 TTGCATATGCACCCGTATTCTCGCCGTCAGCGCTACCCATAACACTAAGAAACCTCGTTT

241 TCGAAAGGGCATCAATTGTATTCAATCTAGCCGCATTGTATTCTCAACTAGCGGCGGCGG

301 AAGATCGCTCCCATGGAGATGGAATCAAACGCGCTGGAGGGTTGTATCAG

gtgagctgaa

361 ctattttatcaccctctttcaatatccacattcgtgttact

cagAACGCGTCAGGGTCCT

421 TACAATACTTGAGGACTGAGGTGCTTCCAAAGCTCATATTCTCCCCAGAGGATGAAGAAA

481 GACCACTAGACCTATCTGTCCCTTTCGTTCATGCCTTGGAATGGTTCTTGCTTGCTCAGG

541 CTCAAGAGTGTTACTGGCAGAAGGCACGACTCGGTATTCATTCGCCCCGTCATTTACGCG

601 agcggaacggcactgacaaatgtctgtcactttcacagataactacaaaaat

gctctgaa

661 taccaaacttgcagccagtgtacgtcctatgcccaggtaacttgacatatgactggaatg

721 ttttaaa

aagGCGTCTAAACTGTATCAAAACGCGATGGCGGCCATCCgcgaggcttcccc

781 TCCAGTCAAACACCTTTTTCCAAACGTAAGTGCGGATGCCCGTCTCATCTGGGATTCTTA

841 acagtgtttgacagGATTGGCTGGCACATATCGAAGCGAAGCAGCACCACTTTGAAGCGG

901 TCGCCCTTTATCGCAAAAGTAGAGACGAACTAGAGACTAGCAGGtgatattttacggagc

961 ccttacgtgctgtagtattgatggaacttattagGTACGGCTACGAATTGGCATATCTGG

1021 CACAAGCGCTTTCTGGGGCCAAGAAGGCATATGATATAGCTCGCAAAGGGAAAGTATCAC

1081 CAGCCGTTCTACACGACGTACAG

gtgtgatgatttcttaaacgccgccctttgcggcacg

1141 atgtatctcatactttttttta

tagGTATTTCTTGAAGCTGTACAAAAGGACGTTACAAG

1201 AGCTGAGCGTGACAACGATTTAATATATCATCAAGATGTTCCTGCGTCGTCCGTGCTCCC

1261 ACAGATTGCGCACGCCACAGTCGCTCAGATCACTGTACCAAAGGAGCTAGTCAATCCCAA

1321 TGAAATCGTCGCTAATGAAGACATGTTGTTCTCGGAGTTATTAGGCTGGGGTGCTCGTGA

1381 AGCTATCA

gtaagcgcctcaggtgtcctcatctttatggctaactagcgtcccggaaatt

1441 c

tagATATCTACAACGACAGGAGGAAGAATCTAATTCAGGATGAATTGGTACAGTGCTCC

1501 CGCGAAGCTCGAGATCAAGCGGACCA

gtgagtaattcgatgtattcattttttgcaacac

1561 taatgctatgatt

aagAACGTTGCGCGAGCTCAACCTTCCCGCATCACTAGAAGCCTTAG

1621 AACGTCCTATTGGATTACCACCCAGCCTTCTTAAGAAAGCAGAAGAGGTCCGGCTTGAGA

1681 ATGGGCCAGTGAAGATCGAAGCTGCGATCAAGGACCTGCGTAGGTTGGCTCGTCAAAACA

1741 ACAAAATTCTGGACGAGGTGGG

gcacacattttatactgcgtcatttcgccactgatatc

1801 ctgg

tagGCAATGGATATTCTTGACCATGAAGCCTCGGAGGATGAGAACACCCGGGCCAC

1861 TATTTCACTCGACCGACCGCCTTCTCACGAA

gcaaatgttcacttgattgagaaggaaaa

1921 gcgttatcgccgcatacttgaacaagcccga

gagAGTGACGAGACTGTTCGAACAAAATG

1981 GGATCAATGGGAGCAGAATATTACAGA

gttgacgtgggaagaggtcaattcatcgctttg

2041 tccgctaatgga

aagACTTATTTCCCCAACAGGCTGACCTCGAGGCTTCCATACCTTCGA

2101 CTACTATTTCCGCCGGTAGCTCCCTCGCTTCTGATAGTACGGGGAAGCGCGCAAGAAATT

2161 TGAGAGTACTACTCGAACAGCTTGACAGCCTTCATTCCGAACGCGAGGACATTGTCAGGC

2221 GTGCTCAGAAGCTAGCTGAAGTAGATGACATCCAACCCCGGATCGCCAAGGCAGCTGCGG

2281 GCTTTGCACGTTTAGCTGAAGTTCAACCCGTCATGTTTGAAGACATCTCAGACGAGGGAC

2341 TCTCCAAATACGACAAATTCATGAAATGGATCAAGGAACTACAGCCTCGTCAGGAGGAAC

2401 TACTCAACGCGATCAAG

gtgagatgcatctcatttcagaatgatgtgtatattaattgag

2461 gcgatca

tagGCGGAAAATGAGTCGTTCCTTCAATCACGAAAGGACGATGATAACGTCAA

2521 AGACAGAGAACGTGCATTACAGTCTCTTGATATTTCGTACCATAAGTACCAGGAGATCAT

Figura 3. Seqüência parcial do gene palACp. Os íntrons estão em letras minúsculas e

as seqüências consensos em negrito e sublinhado.

1 RQLSLLMTLE DPSQSIRKLT SARYHAQLTS VLAKLPADIR LDIAYAPVFS PSALPITLRN

61 LVFERASIVF NLAALYSQLA AAEDRSHGDG IKRAGGLYQN ASGSLQYLRT EVLPKLIFSP

121 EDEERPLDLS VPFVHALEWF LLAQAQECYW QKARLGIHSP RHLRERNGTD KCLSLSQITT

181 KMRLNCIKTR WRPSDWLAHI EAKQHHFEAV ALYRKSRDEL ETSRYGYELA YLAQALSGAK

241 KAYDIARKGK VSPAVLHDVQ VFLEAVQKDV TRAERDNDLI YHQDVPASSV LPQIAHATVA

301 QITVPKELVN PNEIVANEDM LFSELLGWGA REAINIYNDR RKNLIQDELV QCSREARDQA

361 DQTLRELNLP ASLEALERPI GLPPSLLKKA EEVRLENGPV KIEAAIKDLR RLARQNNKIL

421 DEVGQWIFLT MKPRRMRTPG PLFHSTDRLL TKVTRLFEQN GINGSRILQN LFPQQADLEA

481 SIPSTTISAG SSLASDSTGK RARNLRVLLE QLDSLHSERE DIVRRAQKLA EVDDIQPRIA

541 KAAAGFARLA EVQPVMFEDI SDEGLSKYDK FMKWIKELQP RQEELLNAIK AENESFLQSR

601 KDDDNVKDRE RALQSLDISY HKYQEII

(627 aa)

Figura 4. A. Seqüência parcial de aminoácidos deduzida da proteína PalACp. B.

Esquema mostrando o domínio conservado BRO1, que compreende os resíduos de 1

-364 com “score” de 39,896.

rDNA

Figura 5. Análise da transcrição do gene palACp pela técnica RT-PCR. O fungo foi

cultivado em meio de cultura, apresentando pH, 4,0, 6,8, ou 8.0, durante 32horas. M

representa marcador DNA PhyX-174 digerido com Hae III e DNA lambda Hind III. PC

representa a amplificação do DNA genômico, que foi usado como controle positivo. A

região correspondente ao rDNA 28S foi usada como controle para amplificação do

cDNA.

Figura 6- Análise filogenética de PalACp, pelo método da Evolução Mínima (ME) utilizou-se o programa MEGA 3.1 com

bootstrap de 1000 réplicas. Os códigos de acesso das seqüências, utilizadas na análise da proteína PalA foram:

Rim20p Yarrowia lipolytica (XP_503059); Rim20p Debaryomyces hansenii (XP_460839); Rim20p Candida albicans

(AAD51716); PalA Aspergillus oryzae (BAD83606); PalA Aspergillus terreus (XP_001214761); PalA Aspergillus

fumigatus Af293(XP_752184); PalA Aspergillus nidulans (XP_408488); PalA Magnaporthe grisea (XP_368411); PalA

Neurospora crassa (XP_959867); PalA Cryptococcus neoformans (XP_571758); PalA Ustilago maydis (XP_401494);

ALIX (Apoptosis-linked gene 2 interacting protein X); Caenorhabditis elegans (NP_001022713); ALIX Caenorhabditis

elegans (NP_001022714); PrCD (programmed cell death) Aedes aegypti (EAT36654); PrCD Danio rerio (NP_998525);

PrCD Xenopus laevis (Q9W6C5); PrCD Gallus gallus (XP_418826); PrCD Mus musculus (AAH26823); ALG2 Mus

musculus (Q9WU78); ALG2 Rattus norvegicus (XP_001076624); ALG2 Rattus norvegicus (XP_343495); PrCD Canis

familiaris (XP_858504); PrCD Canis familiaris (XP_534215); PrCD Pan troglodytes (XP_001169526); ALG2 Homo

sapiens (AAF08220); PrCD Homo sapiens (NP_037506); ALG-2 Dictyostelium discoideum (XP_643566); BRO1 C.

neoformans (XP_571916); BRO1 U. maydis (Q4PHA8); BRO1 Emericella nidulans (AAR02857); Bro1 A. fumigatus

(EAL93470); e PalA de Crinipellis perniciosa (ainda não depositada no NCBI).

4.2. Isolamento e caracterização do gene pacCCp

O gene pacCCp foi isolado de um banco genômico construído no fago lambda

EMBL3 por meio de triagem, usando-se uma sonda homóloga, obtida pela

amplificação de um fragmento de 278 pb correspondente ao domínio dedo de zinco.

Um fragmento de 3,6 kb, obtido após a clivagem de um fago recombinante com a

enzima Sac I, foi clonado no vetor pBluescript II KS+ e seqüenciado, utilizando-se

oligonucleotídeos específicos (Tabela 1). O seqüenciamento deste revelou que a

porção C-terminal da proteína PacC e a região 3’ não codificante do gene não tinham

sido clonadas. Para obtenção da seqüência completa, realizou-se PCR inverso

(Figura 1).

O fragmento de DNA seqüenciado apresenta 4.347 pb, com uma ORF de

2472 pb interrompida por 8 íntrons putativos (Figura 8). A proteína PacCCp

deduzida possui 824 aminoácidos, com ponto isoelétrico (pI) de 9,46 e massa

molecular de 91,634 kDa, com identidade (35%) e similaridade (44%) com

PacC do basidiomiceto Cryptococcus neoformans (XP_572292) e 44% e 53%

de identidade e similaridade, respectivamente, com uma proteína putativa do

também basidiomiceto Coprinopsis cinerea okayama (EAU92749).

A região 5’ não codificadora possui 1018 pb, contendo um típico TATA

box (TATAAA) de eucariotos nas posições (-34 e - 482), e três seqüências

CCAAT box em (-110, -192 e -225), que é freqüentemente observada em

promotores de fungos. A seqüência 5’ACTCATGGA3’ em torno do códon de

iniciação ATG, difere da seqüência Kozak (CAMMATGNC), encontrada em

fungos filamentosos e em genes de eucariontes. Na região promotora, foram

encontrados três possíveis sítios para o fator de transcrição PacC (Figura 8). Na

região 3’ não codificadora (403 pb), foi encontrado um típico sítio de

poliadenilação (AATAAA) 155 pb após o códon de terminação. Esta distância é

compatível com aquela encontrada em outros fungos filamentosos. Duas

seqüências apresentando o consenso (CWTS) envolvido na terminação da

tradução, também propostas como sitios de poliadenilação, foram detectadas

na posição 58 e 136 após o códon de terminação. A seqüência correspondente

ao possível sítio de clivagem TAGT foi encontrada na posição 392 (Figura 8).

O alinhamento múltiplo da proteína deduzida PacC de C. perniciosa

com PacC de fungos filamentosos e da proteína homóloga Rim101p de

leveduras indica que a identidade foi maior na região correspondente aos três

dedos de zinco (C

), que se apresenta, extremamente, conservada em todos

os organismos analisados (Figura 10). O aminoácido triptofano (W), localizado

entre as duas cisteínas no primeiro e no segundo dedo de zinco, é conservado

entre todos os organismos estudados. A glicina (Q) e as duas lisinas (K) que

precedem a histidina (H) do terceiro dedo de zinco, também são conservadas

em todos os organismos e são importantes na localização nuclear (Fernández-

Martínez et al., 2003).

Para investigar o efeito do pH na transcrição do gene pacCCp, o micélio

de C. perniciosa foi cultivado em meio mínimo, contendo glicose 1%, em pH 6,8

durante 7 dias e transferido para meio tamponando em pH 4,0, 6,8, e 8,0 e

incubado durante 8, 18 e 32 horas. A detecção dos transcritos foi realizada por

RT-PCR, utilizando os oligonucleotídeos Pac2F e Pac2R, que amplificam um

fragmento de 901 pb a partir do DNA genômico e 786 pb do cDNA (Figura 10).

Os transcritos foram observados em pH 6,8 e 8,0, em 8, 18 e 32 horas, e em pH

4,0, foi observada expressão basal em 8 a 32 horas.

Para examinar a relação filogenética com outros fatores de transcrição

PacC/Rim101 de fungos filamentosos e leveduras, análise filogenética foi realizada

baseada no método da evolução mínima, que separa claramente PacCCp e PacC de

outros fungos em grupos distintos (Figura 11). A proteína PacCCp ficou agrupada,

juntamente com as demais proteínas de basidiomicetos analisadas e, conforme

esperado, é mais proximamente relacionada à proteína de Coprinopsis cinerea. Os

fungos C. perniciosa e C. cinerea pertencem a ordem agaricales.

-1018 cccgggacccggaagacttccgccccttgtgacctcccggggggaaattccggaaatctt

-958 ctgcgaaagttgcccctgggaaccgtcctacgcaaaacaagagacgtgaacaagttgcgg

-898 naacgcgaccggganaccaagaggaatgaatggccgaaaaatagtccaaattccctgggg

-838 ttttcttcggggtacaacgcacgagaaagttcttcctggattaacgttgggaactgacaa

-778 attcggatgaacgatagtttaaagacgaggatgtggactgttgtcttagcagagctggat

-718 taagagagaaaagaatggcgaagaaaatagacgcacgagtgttacaccattga

GCCAGGg

-658 cagagaagatgcttagacctattcaatgaaccgattaatgggcacgaagagggaagggca

-598 aaaaagagacatacagcatgctccgcaacagaaagctgcagtcagc

GCCAGGggtatcag

-538 caatgttaaaagttaatttgatagatttggcaggagaaagagagaacagag

tataagttt

-478 tagcctcatgatgaccggtcgatgaccgtccatcaaaagggatggtacaaggccgtttcc

-418 agaggtaccggtggaccaggaaatcgaaaacgtgactctgctggaggccgcgtcaatggc

-358 ggatgcgatgtcgaatcctttttgtcgtcgtcgtcgggctcgctatccagacaggacatg

-298 acgaagcctgaga

GCCAAGgtggttctcacaagaagctcaactcaatacagtatgtatca

-238 attatcc

acaaatcacggcttttccggacctcattaagactacaatccaacaaccgcatc

-178 atgaggtatcgcttcggagtaccactctttgaattgtttggtatttgtattgaaaacctg

-118 tt

acaaattacagaggaactatacagtctgtgacgtttgcagaacactaggacgcgtgct

-58 cccgattcccaacgctgg

taatatctttctgcaaatccaaactgcccggacccgactcAT

1 M

3 GAGCTTGTTGCATGTTAGAGGCATTGTCAGGCGCCTGA

gtcctactgtcgttgccgctat

2 S L L H V R G I V R R L S

64 tccagtttgaaggtggaggg

cagCTGCTGAAGTTGATCGGCCCAGAGAATTTGTCCTTCA

15 A E V D R P R E F V L Q

114

gttttctttgggattccaagactatttccggctacactaataaagGGTCCCAGCTCCTTT

25 V P A P L

174 GCACTTGCCATCAAAATGTCCTCCGCTGCCCTCCCGTCCGTCTCCCCCGTACCACGACTC

30 H L P S K C P P L P S R P S P P Y H D S

234 TGATAAGAGGCATGTCATAACTAATCCTTTTCATATCCATTTCTCACTCTTGCCTTCAGT

51 D K R H V I T N P F H I H F S L L P S V

294 CCACCACCATCAGCGTTCACTCGCCATGCACAAATGTCTCTGGCAAGAATGCACTCAGTC

71 H H H Q R S L A M H K C L W Q E C T Q S

354 TTTCACAGATCCCGAGACGCTCTACAACCATCTTTGCAATGATCACATTGGGCGCAAGAG

91 F T D P E T L Y N H L C N D H I G R K S

414 TACCAATAATCTTTGCTTGACTTGCAGGTGGAAGGATTGCTCCACAACTTGCGCAAAACG

111 T N N L C L T C R W K D C S T T C A K R

474 TGACCATATTACCAGTCATCTCCGAG

gtatgtcgtgttccttctttgttctggcactcgc

131 D H I T S H L R

534 acctcattccaatacc

cagTTCATACCCCTCTCAAGCCCCATATCTGTGAGgtacgactt

139 V H T P L K P H I C E

594 tggtctcgtcgtcgccgatggtcctctcaatatgtcttactctcccgtgt

cagGTCTGCA

150 V C K

654 AAAAGTCTTTCAAGCGTCCTCAGGACTTGAAGAAACACGAAAAGATCCATACAGAGGAAC

154 K S F K R P Q D L K K H E K I H T E E H

714 ATCATGCGCAGCACAAACATTCCAAAGCCATTACTGTCGTCGACCCTGCTTACGTTTCCC

174 H A Q H K H S K A I T V V D P A Y V S R

774 GAGTAAGAGGCGATGCAGGCGGCAAGCCTATATCCTCCCAGAACCTTAGGGTTCCTGTTC

194 V R G D A G G K P I S S Q N L R V P V R

834 GCGCTGCTTCCCATTCGTCGTCAAGCTCCGATAGTAAGTCTATCATCATCATCATCGTCA

214 A A S H S S S S S D S K S I I I I I V I

894 TCATTGTACCTTTGATACGAAGATACATATCTTTTTTTCTTTTTGCAGGTTCCCACTTCC

234 I V P L I R R Y I S F F L F A G S H F L

954 TTTTACCAACCCCTTCCCCAGAACTTGCCCCCGCGCATCATTACCCTCACCAATCTCCAA

254 L P T P S P E L A P A H H Y P H Q S P T

1014 CCATTGCCGATGTTTCGCTTCATAGTCACCTTCCAACTTGGGAGGTCCTTGAGCAACCAG

274 I A D V S L H S H L P T W E V L E Q P V

1074 TCTCTGCCGGCTTAAAGCGATCATATGATCACGACTACAGCGTGGATGACTTTTTCACAG

294 S A G L K R S Y D H D Y S V D D F F T D

1134 ATATGACAAAGAGAAGGATGAATCCTTCTTACGACTCACGTAA

gtaggttcttctcctcg

314 M T K R R M N P S Y D S R K

1194 ataggttacgtgataggtccgcgagtact

tagTCATTTCTTTTCCTTCACAGGAATGGCA

328 H F F S F T G M A

1254 GAGCGCCTCAATAACCTTGCCTATCCTCCCCATGGTAATGGCGGCAATAATCCGACCGGA

337 E R L N N L A Y P P H G N G G N N P T G

1314 ACCTTTAATCCCCGCTCTGTTTCGCTCGATATTCGGACTCCCGAGGAACTCGCTGCTGTG

357 T F N P R S V S L D I R T P E E L A A V

1374 AACCAGTTTCTAGTCACCCTCGGAAGAGACGTCTCAGGAACGGTTCGCTCCACTCACTCT

377 N Q F L V T L G R D V S G T V R S T H S

1434 CATCATCATCATGGCCATTCAGCTTCAGTACCCAATATTCCGCCCGACTACTTTGATCCA

397 H H H H G H S A S V P N I P P D Y F D P

1494 GCCATCCTAAGTCAACTGGGTCTCACTGGCATGCCGGGCATTTCTCCGGCCGATGACTTT

417 A I L S Q L G L T G M P G I S P A D D F

1554 GCGAGTACCGCCTACGCCACGAATCAATCCTCTCATCAGTATTATGCCAATCAACGACAC

437 A S T A Y A T N Q S S H Q Y Y A N Q R H

1614 CAATCTTCCTATGGTGCTTCCATGTATCGCGATGTAGGCTTCGGTCCGCAGCAGCAGCAT

457 Q S S Y G A S M Y R D V G F G P Q Q Q H

1674 GGACCAGATGCCATGCGTCGCTCATCTGTCCATCATCAACATAAATATAGCCAACCGCCT

477 G P D A M R R S S V H H Q H K Y S Q P P

1734 TCCTCCATGTCCTCGAACGGATACTCCTCGCACCACAACAGCGGCTATCACCACCAGCCT

497 S S M S S N G Y S S H H N S G Y H H Q P

1794 ACACCACCCTCGATGCTAGCACAGGCTCACCGCATTCTTCATCGTCTGCGTCGTCTCCTG

517 T P P S M L A Q A H R I L H R L R R L L

1854 TCGCTACGACACCACCGCAAATGTCACTTTCCATGCCGGCGACCATGTCCAGCATGGGTC

537 S L R H H R K C H F P C R R P C P A W V

1914 CTTCCCCAGACAGTGCAGTGGCATTCGATTATCTCAGACCATCGAGAGGCCCCTGGTCCG

557 L P Q T V Q W H S I I S D H R E A P G P

1974 GTGATCGGTCTCGTACCTGGCGATTACACCAGCCCGAGTATGAGGCCTATCGTTCCGTTG

577 V I G L V P G D Y T S P S M R P I V P L

2034 AAAACTGCACCCACTTCTTCTGCTTCCACGTCTTCTCTACAATCACCTGCTCAGAGTCGA

597 K T A P T S S A S T S S L Q S P A Q S R

2094 AGGAGTCTCACGCCCACGCCTACTCCGGCCGCTTCGACGTCAGTGTCCAAATCGTCGTCG

617 R S L T P T P T P A A S T S V S K S S S

2154 CTTTATCCGCTTCTTAGTTCGGGTGACGAGCAGTACAAGCTTCCTCCGCTGCAGTCGAGG

637 L Y P L L S S G D E Q Y K L P P L Q S R

2214 TATAGGTCCCCATCACCGGCCAACTCGAGGGAGAGCACACCGGGCGCGAGCTCATCGTCA

657 Y R S P S P A N S R E S T P G A S S S S

2274 TCATCGCGCTTCGACGTCAGTGTCCAAATC

gtcgtcgctttatccgcttcttagttcggg

677 S S R F D V S V Q I

2334 tgacgagcagtac

aagCTTCCTCCGCTGCAGTCGAGGTATAGGTCCCCATCACCGGCCAA

687 L P P L Q S R Y R S P S P A N

2394 CTCGAGGGAGAGCACACCGGGCGCGAGCTCATCGTCATCATCGTCGAGCGGATCTGCAGC

702 S R E S T P G A S S S S S S S S G S A A

2414 GATTTTTAGAGTTGAGCTAGAAGATGATAACTTTGACAC

gtggtaccagtgaaagatatg

722 I F R V E L E D D N F D

2474 aggagggccacctactttgacgatccttgtgcgttgtttctgaacgtataaaccgattga

2534 gaaaactt

gagCTGTCTCTGGTTCAAACATGTCTCGTACCCTGGTCTACTGATAAGTTCG

734 S C L W F K H V S Y P G L L I S S

2594

gtgacaagagtcagcttacactaacttgaagaaggttaacattgagcttgagcttgagCT

751 A

2654 TGCTCGTCGCCCGATTGGCGTCGCTATGGTGAGAGTAACAGCAAGAGGCCAGATGTTGGA

752 A R R P I G V A M V R V T A R G Q M L D

2714 TGACAAGCCAAGTAAGGACCATGAATCATCGACCGCAGAAATTGTCGTATGGGTCGAGGC

772 D K P S K D H E S S T A E I V V W V E A

2774 CGAAGACCACTCCATGCTGGTGACGGTCGCAAATCCAAGGCGCGATCCTCGCTGCGCTGA

792 E D H S M L V T V A N P R R D P R C A D

2834 TCTCGGCTCTCGTGCTAACAATAAGCACCCTTCGGAATTTTGAatgcacatacagtatac

812 L G S R A N N K H P S E F *

2894 cccaacagtccatatgtatgtaaagtanttattattaccataatatatagttggccactt

2954 ggtgccgaaaaaacgcattagaaaacccggtacaatccccgaattggtaacaaacaccga

3014 aggaaagagATAAAcggcAATAAcgactggctattggtcaacccaagtaagggcgcaaac

3074 gggnaaccacacattgaacataaannttggccgggacaccaaatattccacaagtaaagc

3134 acatgagaatcccacaatggttgaaagggaacccaaaataaccaaagaganaaacaggac

3194 aacaaagtgggccacaacaaggtcnaaacgagtttaagaanatatcaacagtaacaagac

3254 acaagcggtgagcnactaagcacana

Figura 7. Seqüência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos do gene, que

codifica PacC de C. perniciosa. As regiões 5’ e 3’ não codificadoras e os íntrons

foram colocadas em letras minúsculas.As seqüências putativas CAAAT box e

TATA box estão em negrito e sublinhadas na região 5’. Os sítios de ligação ao

fator PacC estão em negrito e letras maiúsculas. Os possíveis sítios de

poliadenilação estão em letras maiúsculas e negrito na região 3’. O códon de

parada está sinalizado com um asterisco. O consenso CWTS, envolvido na

terminação da tradução, está representado em caixa cinza.

1 MSLLHVRGIV RRLTAEVDRP REFVLQVPAP LHLPSKCPPL PSRPSPPYHD SDKRHVITNP

61 FHIHFSLLPS VHHHQRSLAM HKCLWQECTQ SFTDPETLYN HLCNDHIGRK STNNLCLTCR

121 WKDCSTTCAK RDHITSHLRV HTPLKPHICE VCKKSFKRPQ DLKKHEKIHT EEHHAQHKHS

181 KAITVVDPAY VSRVRGDAGG KPISSQNLRV PVRAASHSSS SSDSKSIIII IVIIVPLIRR

241 YISFFLFAGS HFLLPTPSPE LAPAHHYPHQ SPTIADVSLH SHLPTWEVLE QPVSAGLKRS

301 YDHDYSVDDF FTDMTKRRMN PSYDSRNHFF SFTGMAERLN NLAYPPHGNG GNNPTGTFNP

361 RSVSLDIRTP EELAAVNQFL VTLGRDVSGT VRSTHSHHHH GHSASVPNIP PDYFDPAILS

421 QLGLTGMPGI SPADDFASTA YATNQSSHQY YANQRHQSSY GASMYRDVGF GPQQQHGPDA

481 MRRSSVHHQH KYSQPPSSMS SNGYSSHHNS GYHHQPTPPS MLAQAHRILH RLRRLLSLRH

541 HRKCHFPCRR PCPAWVLPQT VQWHSIISDH REAPGPVIGL VPGDYTSPSM RPIVPLKTAP

601 TSSASTSSLQ SPAQSRRSLT PTPTPAASTS VSKSSSLYPL LSSGDEQYKL PPLQSRYRSP

661 SPANSRESTP GASSSSSSRF DVSVQILPPL QSRYRSPSPA NSRESTPGAS SSSSSSSGSA

721 AIFRVELEDD NFDTCLWFKH VSYPGLLISS LARRPIGVAM VRVTARGQML DDKPSKDHES

781 STAEIVVWVE AEDHSMLVTV ANPRRDPRCA DLGSRANNKH PSEF*

(824aa)

Figura 8. A. Seqüência de aminoácidos deduzida do gene pacCCp. A região

correspondente aos dedos de zinco (C

) 1, 2 e 3 está sublinhada, as cisteínas e

histidinas estão em caixas cinza e, em vermelho, estão os aminoácidos considerados,

funcionalmente importantes. Os dois sítios de ligação a PalA, apresentando a

seqüência YPXL, estão em negrito na porção C-terminal. B. Esquema dos três dedos

de zinco de PacC na região N-terminal e os sitos de ligação a PalA na região C-

terminal estão representados por círculos vermelhos. C. Esquema baseado em

Fernández-Martínez et al., (2003) representando a seqüência de aminoácidos dos

três dedo de zinco da proteína PacCCp. As setas indicam os aminoácidos cisteínas e

histidinas responsáveis pela formação dos dedos de zinco, em vermelho e indicado

por setas pretas, estão os aminoácidos funcionalmente importantes e conservados

nos diferentes organismos.

rDNA

Figura 10. Análise da transcrição do gene pacCCp por meio da técnica de RT-PCR. O

fungo foi cultivado durante 8, 18 e 32 horas em pH, 4,0, 6,8, ou 8.0. M representa

marcador PhyX-174 digerido com Hae III. NC indica o controle negativo onde não foi

adicionado DNA. PC é o controle positivo, onde foi amplificado o DNA genômico com

os mesmos oligonucleotídeos.

Figura 9. Múltiplo alinhamento dos aminoácidos da região dedo de zinco da

proteína PacCCp, com regiões correspondentes em outros fungos. Os

organismos e as seqüências analisadas incluem: proteina hipotética de

Coprinopsis cinerea (EAU92749); PacC de Cryptococcus neoformans

(XP_572292); PacC de Ustilago maydis (CAG34353); Rim 101 de

Kluyveromyces lactis (XP_453982); Rim 101 de Saccharomyces cerevisiae

(NP_011836); PacC de Acremonium chrysogenum (Q96X49); PacC de

Gibberella moniliformis (Q873X0); PacC de Neurospora crassa (Q7RVQ8);

PacC de Fusarium oxysporum (Q870A3); PacC de Emericella nidulans

(Q00202); PacC de Sclerotinia sclerotiorum (Q9P413); PacC de Aspergillus

oryzae (Q9HFB3); PacC de Gibberella fujikuroi (Q8J1U9); PacC Trichophyton

rubrum (Q9C1A4); PacC de Aspergillus niger (Q00203); PacC de Botryotinia

fuckeliana (AAV54519); PacC de Aspergillus giganteus (Q5XL24); PacC de

Penicillium chrysogenum (Q01864); PacC de Aspergillus fumigatus Af293

(XP_754424); e PacC de C. perniciosa (seqüência ainda não depositada).

PacC-A.oryzae

PacC-A.niger

PacC-A.giganteus

PacC-A.fumigatus

PacC-E.nidulans

PacC-P.chrysogenum

PacC-T.rubrum

PacC-S.sclerotiorum

PacC-B.fuckeliana

PacC-N.crassa

PacC-A.chrysogenum

PacC-F.oxysporum

PacC-G.moniliformis

PacC-G.fujikuroi

PacC-C.neoformans

PacC-U.maydis

PacC-C.cinerea

PacC-C.perniciosa

Rim101-K.lactis

Rim101-S.cerevisiae

100

0.1

Figura 11- Análise filogenética do fator de transcrição PacC/Rim101 de C. perniciosa,

usando o programa MEGA 3.1 pelo método da Evolução Mínima (ME) com bootstrap

de 1000 réplicas.Os organismos utilizados e número de acesso foram: proteina

hipotética de Coprinopsis cinerea (EAU92749); PacC de Cryptococcus

neoformans (XP_572292); PacC de Ustilago maydis (CAG34353); Rim 101 de