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ATIVIDADE DAS ENZIMAS REDUTASE DO NITRATO E GLUTAMINA
SINTETASE EM CAFEEIRO ARÁBICA
JOSÉ FERNANDES DE ANDRADE NETTO
Dissertação apresentada à Escola Superior de
Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São
Paulo, para obtenção do título de Mestre em
Agronomia, Área de Concentração: Fitotecnia.
P I R A C I C A B A
Estado de São Paulo – Brasil
Fevereiro - 2005
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ATIVIDADE DAS ENZIMAS REDUTASE DO NITRATO E GLUTAMINA
SINTETASE EM CAFEEIRO ARÁBICA
JOSÉ FERNANDES DE ANDRADE NETTO
Engenheiro Agrônomo
Orientador: Prof. Dr. JOSÉ LAÉRCIO FAVARIN
Dissertação apresentada à Escola Superior de
Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São
Paulo, para obtenção do título de Mestre em
Agronomia, Área de Concentração: Fitotecnia.
P I R A C I C A B A
Estado de São Paulo – Brasil
Fevereiro - 2005
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Dados I nt ernaci onai s de Cat al ogação na Publ i cação ( CI P)
DI VI SÃO DE BI BLI OTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/ USP
Andrade Netto, José Fernandes de
Atividade das enzimas redutase do nitrato e glutamina sintetase em cafeeiro arábica /
José Fernandes de Andrade Netto. - - Piracicaba, 2005.
60 p. : il.
Dissertação (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2005.
Bibliografia.
1. Café 2. Condutância estomática 3. Fotossíntese 4. Radiação fotossintética ativa
5. Temperatura atmosférica 6. Transpiração vegetal I. Título
CDD 633.73
“Per mi t i da a cópi a t ot al ou par ci al dest e document o, desde que ci t ada a
f ont e – O aut or”
Aos meus pais, CARLOS e GLÓRIA,
OFEREÇO
À minha querida esposa DÉBORA
e à nossa amada filha CAROLINA,
DEDICO.
AGRADECIMENTOS
À Deus por permitir a conclusão deste trabalho, por estar presente em todos
os momentos da minha vida.
Ao Professor José Laércio Favarin, pela orientação científica, paciência e
amizade.
Ao Professor Luiz Antonio Gallo pelo apoio apresentado em todos os
momentos, pela grande generosidade, pelos valiosos ensinamentos, além da
preciosa amizade.
Ao Biólogo Enio Tiago de Oliveira pelos ensinamentos, apoio durante a fase
experimental e amizade.
Ao amigo Janilson Pinheiro de Assis pelo apoio profissional e pessoal e pela
grande amizade.
Aos colegas Shoey Kanashiro, Adriana Teramoto e Sergio K. Tanioka, pela
amizade e companheirismo.
Aos funcionários do Departamento de Produção Vegetal, Tino, Marcelo,
Osmair e Tanaka, pelo suporte técnico dado ao trabalho.
À Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São
Paulo, pela oportunidade de crescimento pessoal e profissional.
À Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia – UESB, pela concessão da
Bolsa de Estudos.
SUMÁRIO
Página
LISTA DE FIGURAS...................................................................................... viii
LISTA DE TABELAS...................................................................................... x
RESUMO........................................................................................................ xi
SUMMARY..................................................................................................... xiii
1 INTRODUÇÃO...................................................................................... 1
2 REVISÃO DE LITERATURA................................................................ 6
2.1 Classificação taxonômica do cafeeiro.................................................. 6
2.2 Aspectos ecofisiológicos do cafeeiro arábica....................................... 6
2.3 Assimilação de nitrogênio pelas plantas.............................................. 7
2.4 Características da enzima redutase do nitrato – RN............................ 8
2.5 Regulação da atividade da redutase do nitrato – RN........................... 9
2.6 Redutase do nitrato e luminosidade em café....................................... 12
2.7 Características da glutamina sintetase – GS....................................... 14
3 MATERIAL E MÉTODOS..................................................................... 18
3.1 Localização do experimento................................................................. 18
3.2 Formação das mudas de café.............................................................. 18
3.3 Tratamentos utilizados e condução das plantas.................................. 19
3.4 Variáveis avaliadas.............................................................................. 20
3.5 Preparo dos extratos para análise das atividades enzimáticas........... 21
vii
3.5.1 Atividade da redutase do nitrato (RN)............................................... 21
3.5.2 Atividade da glutamina sintetase (GS).............................................. 23
3.6 Avaliações ecofisiológicas................................................................. 23
3.7 Determinação do teor de proteína total solúvel (PTS)....................... 24
3.8 Análise vegetativa.............................................................................. 25
3.8.1 Altura de planta (H)............................................................................ 25
3.8.2 Diâmetro do caule (DC)..................................................................... 25
3.8.3 Número de ramos plagiotrópicos (NRP)............................................ 25
3.8.4 Número de folhas da planta (NF)....................................................... 25
3.8.5 Matéria seca de folhas (MS).............................................................. 26
3.9 Análise química de folhas.................................................................. 26
3.9.1 Preparo do material vegetal para análise.......................................... 26
3.9.2 Determinação de macro e micronutrientes........................................ 27
3.10 Delineamento experimental............................................................... 29
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................... 30
4.1 Atividade da redutase de nitrato (RN)................................................ 30
4.2 Atividade da glutamina sintetase (GS)............................................... 34
4.3 Atributos ecofisiológicos.................................................................... 38
4.4 Resultados da análise química foliar................................................. 42
5 CONCLUSÕES.................................................................................. 46
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................... 47
LISTA DE FIGURAS
Página
1 Método de coleta de discos foliares para determinação da atividade
das enzimas redutase do nitrato e glutamina sintetase em folhas de
C. arabica cv Obatã IAC 1669-20 cultivadas a pleno sol e a meia
sombra às 7:00 h, 12:00 h, 17:00 h e
22:00h.................................................................................................... 22
2 Medidor portátil modelo LI - 6400 utilizado para determinar os
atributos ecofisiológicos como a temperatura atmosférica (Ta),
temperatura foliar (Tf), condutância estomática (gs), taxa de
transpiração (E), taxa de fotossíntese líquida (A) e radiação
fotossinteticamente ativa (PAR)...... ..................................................... 24
3
Mudas de cafeeiro Coffea arabica L. cv Obatã 1669-20 cultivadas a
pleno sol e a meia sombra..................................................................... 26
4
Médias da atividade da redutase do nitrato (RN) em mudas de Coffea
arabica L. cv Obatã IAC 1669-20 cultivadas a pleno sol e a meia
sombra às 7:00 h, 12:00 h, 17:00 h e
22:00h.................................................................................................... 30
ix
5 Médias da atividade da glutamina sintetase (GS) em mudas de
Coffea arabica L. cv Obatã IAC 1669-20 cultivadas a pleno sol e a
meia sombra às 7:00 h, 12:00 h, 17:00 h e
22:00h....................................................................................................
34
6
Médias de proteína total solúvel (PTS) em mudas de Coffea arabica
L. cv Obatã IAC 1669-20 cultivadas a pleno sol e a meia sombra às
7:00 h, 12:00 h, 17:00 h e 22:00 h.........................................................
37
7
Médias da taxa de fotossíntese líquida (A) em mudas de Coffea
arabica L. cv Obatã IAC 1669-20 cultivadas a pleno sol e a meia
sombra às 7:00 h, 12:00 h e 17:00 h..................................................... 39
8
Médias da condutância estomática (gs) em mudas de Coffea arabica
L. cv Obatã IAC 1669-20 cultivadas a pleno sol e a meia sombra às
7:00 h, 12:00 e 17:00 h........................................................................ 40
9
Médias da taxa de transpiração (E) em mudas de Coffea arabica L.
cv Obatã IAC 1669-20 cultivadas a pleno sol e a meia sombra às
7:00 h, 12:00 h e 17:00 h....................................................................... 41
10 Médias do diâmetro de caule (DC); altura da planta (H); número de
folhas (NF) e número de ramos plagiotrópicos (NRP) de mudas de
Coffea arabica L. cv Obatã IAC 1669-20 cultivadas a pleno sol e a
meia sombra................ .........................................................................
43
11
Médias da matéria seca de folhas (MS) de Coffea arabica L. cv
Obatã IAC 1669-20 cultivadas a pleno sol e a meia sombra................. 44
LISTA DE TABELAS
1 Médias da taxa de fotossíntese líquida (A), condutância estomática
(gs), taxa de transpiração (E), temperatura atmosférica (Ta),
temperatura foliar (Tf) e radiação fotossinteticamente ativa (PAR) em
mudas de Coffea arabica L. cv Obatã 1669-20 cultivadas a pleno sol
e a meia sombra.................................................................................... 38
2 Resultados da análise química de amostras foliares utilizadas na
determinação da atividade da redutase do nitrato em mudas de
Coffea arabica L. cv Obatã IAC 1669-20 cultivadas a pleno sol e a
meia sombra..........................................................................................
42
ATIVIDADE DAS ENZIMAS REDUTASE DO NITRATO E GLUTAMINA
SINTETASE EM CAFEEIRO ARÁBICA
Autor: JOSÉ FERNANDES DE ANDRADE NETTO
Orientador: Prof. Dr. JOSÉ LAÉRCIO FAVARIN
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade das enzimas redutase
do nitrato (RN) e glutamina sintetase (GS) em mudas de Coffea arabica L cv
Obatã IAC 1669-20 em função dos atributos ecofisiológicos. O experimento foi
conduzido em casa de vegetação no Laboratório de Biotecnologia Agrícola do
Departamento de Ciências Biológicas da Escola Superior de Agricultura “Luiz
de Queiroz”, Universidade de São Paulo. Para a realização do experimento
adotou-se o delineamento inteiramente casualizado com dois tratamentos: T1
(100% de luz) e T2 (50% de luz) e cinco repetições. As determinações das
atividades enzimáticas foram feitas às 07:00 h; 12:00 h; 17:00 h e 22:00 h, bem
como dos atributos ecofisiológicos: temperatura atmosférica; temperatura foliar;
radiação fotossinteticamente ativa; condutância estomática; taxa de
fotossíntese líquida; taxa de transpiração e proteína total solúvel. O nível de
exposição à luminosidade altera a atividade da redutase do nitrato (RN), cujo
valor foi menor nas plantas a pleno sol às 12:00 h e 17:00 h. A saturação
xii
lumínica e a maior temperatura foliar em relação ao ambiente, às 12:00 h,
diminuiu as trocas gasosas (CO
2
e vapor d’água) e a atividade da RN. Ao longo
do período luminoso, independentemente do nível de exposição à
luminosidade, decresceu a atividade da glutamina sintetase (GS). A
disponibilidade de amônio proveniente da ação da RN no período noturno
elevou a atividade da GS, enquanto a fotorrespiração, por hipótese, forneceu o
substrato (NH
4
+
) para a atividade dessa enzima (GS) nas plantas a pleno sol ao
meio dia. A inibição da redutase do nitrato (RN) no cafeeiro proporcionada pela
fotorrespiração se dá, por hipótese, em resposta a produção de glutamina por
meio da atividade da glutamina sintetase (GS).
Palavras - Chave: Coffea arabica L., condutância estomática, taxa de
fotossíntese líquida, taxa de transpiração, radiação fotossinteticamente ativa,
temperatura atmosférica e foliar
ACTIVITY OF THE NITRATE REDUCTASE AND GLUTAMINE SYNTHETASE
ENZYMES IN ARABIC COFFEE
Author: JOSÉ FERNANDES DE ANDRADE NETTO
Adviser: Prof. Dr. JOSÉ LAÉRCIO FAVARIN
SUMMARY
The aim of this work was to evaluate the activity of the enzymes nitrate
reductase (RN) and glutamine synthetase (GS) in seedlings of Coffea arabica L
cv Obatã IAC 1669 - 20 in face of the eco-physiological attributes. The
experiment was conducted in a greenhouse at the Laboratory of Agricultural
Biotechnology in the Biological Science Department of the Superior School of
Agriculture “Luiz de Queiroz”, São Paulo University. The completely randomized
experimental design was utilized for the experiment with two treatments: T1
(100% of light) e T2 (50% of light), each on made up of five replicates. The
enzymatic activities and eco-physiological attributes determinations such as air
temperature, leaf temperature, photosynthetically active radiation, stomatal
conductance, net photosynthesis rate, transpiration rate and total soluble protein
were made at 7:00 AM, 12:00 AM, 5:00 PM and 10:00 PM. The level of radiation
exposition changes the nitrate reductase activity, whose value was smaller in
plants at full sun at 12:00 AM and 5:00 PM. The light saturation and the higher
leaf temperature in relation to the environment, at 12:00 AM, reduced the gas
xiv
exchanges (CO
2
and water vapor) and RN activity. Along the light period,
independently of radiation exposition level, the activity of the glutamine
synthetase decreased. The availability of ammonium provided by RN during
dark period, independently of the treatments, increase the GS activity, while
photorespiration, hypothetically, supplied the substrate (NH
4
+
) to the GS action
in plants under full sun at 12:00 AM. The RN inhibition in coffee plants provides
the photorespiration occurred in response to the glutamine production through
the GS activity.
Key - words: Coffea arabica L., estomatal conductance, net photosynthesis
rate, transpiration rate, photosynthetically active radiation, leaf and air
temperature
1 INTRODUÇÃO
No Brasil as cultivares de café foram selecionadas a pleno sol, por isso
as mesmas apresentam, potencialmente, adaptações à elevada irradiância
(DaMatta & Rena, 2002). Contudo, a baixa relação entre as clorofilas a e b,
característica das plantas de sombra, tem sido mantida nas folhas expostas ao
sol (Fahl et al., 1994; DaMatta & Maestri, 1997). Por isso, o cafeeiro pode ser
considerado como uma planta facultativa de sombra, com alta plasticidade às
variações de irradiância (DaMatta & Rena, 2002).
Os mecanismos fisiológicos responsáveis pelas diferenças entre as
plantas adaptadas a sombra e ao sol não são bem entendidos. As folhas das
espécies de sombra, geralmente, possuem maior quantidade de clorofila com
base na massa foliar. O aumento desse pigmento nessas plantas está
associado à redução da espessura foliar, aumentando a eficiência na utilização
da luz. Em plantas de café a eficiência quântica das folhas sombreadas é,
frequentemente, superior àquela verificada nas folhas expostas ao sol
(Kozlowski et al., 1991).
O cafeeiro embora possua característica umbrófila, típica de ambiente
de sub-boque, apresenta elevada produção quando cultivado ao sol. Em razão
dessa característica é comum a fotoinibição provocada pela saturação do
aparelho fotossintético sob elevada irradiância (DaMatta & Maestri, 1997).
As folhas sombreadas são mais eficientes na assimilação do carbono
(CO
2
) do que as folhas expostas ao sol, pois nos trópicos a radiação solar,
invariavelmente, supera de 3 a 5 vezes o limite de saturação lumínica. Além
disso, a temperatura foliar pode alcançar 5º C a 20º C a mais que a temperatura
2
do ar, danificando o tecido foliar. Estudos desenvolvidos por Hernandez et al.
(1989) e, recentemente, por Marin et al. (2003), corroboram esta hipótese por
meio de medidas de transpiração. Estes autores verificaram que mesmo
reduzindo a energia radiante às plantas, por meio do sombreamento, a
transpiração diminui cerca de 10 % comparada aos valores determinados nas
plantas a pleno sol.
Os vegetais superiores sintetizam os compostos orgânicos a partir da
fotossíntese e da absorção de água e de nutrientes minerais absorvidos do
solo, incorporando-os em várias substâncias como, por exemplos, os pigmentos
(N e Mg), aminoácidos e proteínas (N e S), parede celular (Ca) e nas enzimas
nitrogenase (Mo), superóxido dismutase (Zn e Cu), redutase do nitrato (Mo) e
desidrogenase glutâmica (Cu).
O nitrato é a principal forma nitrogenada absorvida pelas plantas,
independentemente da natureza química que o nitrogênio é aplicado no solo. O
predomínio do nitrato se deve, basicamente, ao pH da solução, normalmente,
próximo da neutralidade, devido à incubação efetuada para a neutralização da
acidez ativa e potencial, visando à condução de mudas em recipientes que
restringem o volume de solo explorado pelas raízes – como em vasos. Nesta
condição, a nitrificação é favorecida e as bactérias nitrosomonas (nitritação,
NO
2
-
) e nitrobacter (nitratação, NO
3
-
) transformam as diferentes formas de
nitrogênio em nitrato.
Em trabalho realizado por Souza & Lobato (2002), aplicando nitrogênio
amoniacal no solo, os autores verificaram que a concentração foliar de N-NH
4
+
foi detectada nos primeiros cinco dias após o fornecimento do nutriente,
apresentando concentrações foliares semelhantes (50 %) entre as formas N-
NH
4
+
e N-NO
3
-
15 dias após a aplicação. Depois de 25 dias da aplicação 100 %
do nitrogênio determinado na planta estava na forma nítrica. Do exposto,
verifica-se que na ausência de substâncias que impeçam a nitrificação esse
processo é muito rápido, o que explica a absorção de nitrogênio,
predominantemente, na forma nítrica.
3
As plantas utilizam uma porção significativa das suas reservas de
carbono e energia para a assimilação do nitrato (NO
3
-
), principal forma de
nitrogênio absorvido pelos vegetais, em razão do consumo energético para
reduzí-lo a amônio (NH
4
+
), forma que é utilizada para incorporar nitrogênio nas
estruturas de carbono.
Durante a assimilação do nitrogênio em compostos orgânicos, o nitrato
é, primeiramente, reduzido a forma amoniacal por meio de um processo que
envolve a participação de duas enzimas - a redutase do nitrato (RN) e a
redutase do nitrito (RNi) (Crawford et al., 2000).
A luz e o teor de nitrato são fatores importantes na indução e
manutenção da atividade da enzima RN nos tecidos vegetais (Hageman &
Flesher, 1960; Beevers & Hageman, 1969; Galangau et al., 1988; Vincentz et
al., 1993). De acordo com diversos autores a atividade da RN nas folhas de
várias espécies, aumenta durante as horas de luz e decresce no escuro (Harper
& Hageman, 1972; Lewis et al., 1982; Hipkin et al., 1984).
Diferente da maioria das espécies vegetais, nas plantas jovens de café
as maiores atividades da RN foliar ocorrem durante o período escuro,
diminuindo sua ação na presença de luz (Miranda Neto, 1970; Faleiros et al.,
1975; Carvalho, 1975; Cordeiro et al., 1984; Alves et al., 1985). Este
comportamento favorece o crescimento das mudas de café, em particular,
quando as mesmas são expostas a 50 % de luz, conforme estudos realizados
por Silveira & Maestri (1973) e Paiva (2001). Esta é, certamente, a razão
porque as mudas de café são formadas em viveiros expostas a 50 % de luz
(meia sombra).
A quantidade de carboidratos, a luminosidade disponível e outros
fatores ambientais ativam a fosfatase, enzima responsável pela desfosforilação
de vários resíduos de serina na proteína da redutase do nitrato e, com isso,
favorece a ação enzimática da RN. A falta de luz (escuro) e de magnésio
estimulam a fosforilação dos resíduos de serina os quais interagem com uma
4
proteína inibidora, resultando na desativação da redutase do nitrato (RN)
(Kaizer et al., 1999).
Carelli et al. (1990) estudaram o efeito da quantidade de luz (50 % e
100%) e o fornecimento de nitrogênio sobre a ação da enzima RN, bem como o
teor de nitrato e a quantidade de açúcares nas folhas de plantas jovens de café
(Coffea arabica L.). Os autores verificaram que a atividade da RN foi menor nas
folhas de plantas a pleno sol do que nas folhas das plantas a meia sombra
(50% de luz). A taxa de transpiração e os teores de açúcares e de nitrato
aumentaram nas plantas expostas ao sol, indicando que a disponibilidade de
substrato (nitrato) e energia (carboidrato) não limita a assimilação redutiva do
nitrogênio. Este comportamento não foi, devidamente, explicado diferindo
daquele que é observado na maioria das plantas.
Trabalhos recentes demonstraram que um metabólito poderia atuar
como uma molécula sinalizadora e, assim, controlaria a atividade da RN.
Crawford et al. (2000) acreditam que o aminoácido glutamina seria esse
metabólito, devido à relação inversa entre a concentração da glutamina foliar e
a atividade da RN. Para Stitt et al. (2002) a glutamato sintase (GOGAT) e ou
glutamato desidrogenase (GDH) representam uma posição importante para a
regulação do metabolismo do amônio.
Garbayo et al. (2002) trabalhando com células de microalga
Chlamydomonas reinhardtii constataram inibição no consumo de nitrato, o qual
foi substituído por nitrito. O consumo seqüencial de nitrito seguido do nitrato foi
observado após ter sido consumido, praticamente, o amônio disponível. Este
comportamento foi explicado com base na acumulação de amônio produzido
pela fotorrespiração. Os autores sugeriram que uma alta proporção entre O
2
e
CO
2
gerada pelo acúmulo de oxigênio, liberado pela fotossíntese, ao redor de
células isoladas, favoreceu a atividade fotorrespiratoria. O amônio formado,
provavelmente, inibe a atividade da enzima permease para o nitrato, evitando o
seu consumo, o que não ocorre com o nitrito. As medidas da liberação de
oxigênio dependente da luz e da atividade das enzimas assimilatórias de
5
nitrogênio, incluindo a redutase do nitrito (RNi) e a glutamina sintetase (GS),
determinadas sob condições que estimulam a fotorrespiração, dão suporte a
esta hipótese.
A reassimilação do amônio liberado durante o processo fotorrespiratorio
em plantas C
3
representa cerca de 90 % do fluxo por meio da rota GS/GOGAT
nas folhas (Stitt et al., 2002). A menor atividade da enzima RN em plantas
jovens de café cultivadas a pleno sol e, conseqüentemente, o acúmulo de
nitrato, poderiam estar relacionados com o aumento da assimilação do amônio
proveniente da fotorrespiração por meio das atividades das enzimas GS ou
GOGAT.
São escassas as informações sobre a atividade da glutamina sintetase
(GS) em mudas de café, bem como não foi devidamente explicada as razões do
comportamento diferencial da redutase do nitrato (RN) em cafeeiro em relação
à maioria das plantas. Estas observações justificam a realização de pesquisa
exploratória sobre o assunto, com a finalidade de ampliar os conhecimentos
nessa área da ciência agronômica.
Esta pesquisa foi realizada com o objetivo de avaliar as atividades
enzimáticas da redutase do nitrato (RN) e da glutamina sintetase (GS) em
mudas de café cultivadas a pleno sol (100 % de luz) e a meia sombra (50 % de
luz) em função dos atributos ecofisiológicos.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Classificação taxonômica do cafeeiro
O café pertence à família Rubiaceae a qual abrange mais de 10.000
espécies agrupadas em 630 gêneros. As espécies do gênero Coffea distribuem-
se, geograficamente, em uma ampla região do continente Africano, em
Madagascar e regiões vizinhas (Berthaud & Charrier, 1988).
Pela classificação mais recente, segundo Bridson & Verdcourt (1988) e
Bridson (1994), os cafeeiros são agrupados em dois gêneros: Psilanthus Hook.
e Coffea L. os quais se diferenciam por particularidades nas estruturas florais.
Entre as formas selvagens de cafeeiro algumas apresentam
características vantajosas do ponto de vista da resistência a moléstias e a
pragas, tolerância à seca e a outras variações do ambiente.
Embora exista um grande número de espécies de café somente a Coffea
arabica L. e a Coffea canephora Pierre têm importância econômica, uma vez
que, aproximadamente, 70 % do café comercializado provêm das cultivares de
arábica e 30 % das cultivares de canéfora (Berthaud & Charrier, 1988).
2.2 Aspectos ecofisiológicos do cafeeiro arábica
A espécie Coffea arabica L. é nativa de uma região restrita e marginal às
demais espécies de café, localizada no Sudoeste da Etiópia, Sudeste do Sudão
e ao Norte do Quênia, entre 1.000 a 3.000 m de altitude (Carvalho, 1946).
As cultivares de C. arabica L., na grande maioria, são derivadas das
variedades Típica, introduzida no Brasil em 1727, e Bourbon, oriunda da ilha de
mesmo nome (Anthony
et al., 2001). Embora a base genética dessa espécie
7
seja pequena (Berthaud e Charrier, 1988), as cultivares comercializadas
possuem grande variabilidade devido a uma série de mutações e de
cruzamentos naturais (Krug et al., 1939). Este fato justifica as possíveis
alterações fisiológicas entre as primeiras plantas de café e àquelas cultivadas
atualmente.
No ambiente de origem da espécie Coffea arabica L. as plantas vivem
em sub-bosque, encontradas em altitudes variáveis entre 1.600 a 2.800 m e
com pouca oscilação da temperatura atmosférica. Nestas condições, a
temperatura, praticamente, não ultrapassa 30º C e, raramente, atinge valores
inferiores a 5º C, com médias anuais ao redor de 20º C. As chuvas são bem
distribuídas e oscilam entre 1.600 a 2.000 mm por ano, sendo o período seco
inferior a três meses (Sylvain, 1955; Carr, 2001). De acordo com Cannel (1985)
as respostas fisiológicas dessas plantas podem ser compreendidas com base
no conhecimento das condições de sua origem, admitindo que a fotossíntese do
cafeeiro seja típica de plantas adaptadas à sombra.
A regulação estomática é um mecanismo utilizado para evitar a perda
de água pelas plantas, a qual é afetada pelo deficite de pressão de vapor na
espécie Coffea arabica L., conforme verificaram Hernandes et al. (1989), na
pesquisa realizada sobre a condutância foliar à difusão de gases em função da
umidade atmosférica.
Maestri & Gomes (1961) estudando a exposição das mudas de café em
condições de viveiro a 25 %, 50 %, 75 % e 100 % de luz, concluíram que a
matéria seca total, a área foliar e o número médio de folhas aumentaram com a
diminuição da luz até 50 %.
2.3 Assimilação de nitrogênio pelas plantas
A assimilação redutiva do nitrogênio é um processo dispendioso
energeticamente às plantas, razão porque ocorre, predominantemente, nas
folhas, centro da síntese de energia (ATP) e agentes redutores (fornecedores
de elétrons). O processo de incorporação do N compete com a fotossíntese por
8
massa (carboidrato) e energia, consumindo 12 ATPs para cada N assimilado
pela planta (Bloom et al., 1992).
O excesso de amônio no cloroplasto é prejudicial aos vegetais, pois
compromete o fluxo de elétrons pela redução do gradiente de pH entre o
estroma (pH elevado, presença de OH
-
) e o lume (pH baixo, presença de H
+
)
(Bloom, 1997). O amônio (NH
4
+
) no estroma reage com a hidroxila (OH
-
) e
forma amônia (NH
3
) provocando o abaixamento do pH, conforme apresentado
na reação 1:
NH
4
+
(estroma) + OH
-
(pH, elevado) NH
3
(abaixa pH do estroma) (1)
em que a amônia gerada no estroma (reação 1), depois de atravessar o
tilacóide, reage com o H
+
presente no lume, formando amônio, conforme a
reação 2:
NH
3
(lume) + H
+
(pH, baixo) NH
4
+
(eleva pH do lume) (2)
e, em consequência, como resultado líquido dessas reações ocorre a
diminuição da concentração de OH
-
do estroma e de H
+
do lume e, assim,
reduz-se o gradiente de pH (Bloom, 1997). Do exposto, haverá
comprometimento do fluxo eletrônico o que acabará prejudicando a produção
de carboidrato.
2.4 Características da enzima redutase do nitrato – RN
A redutase do nitrato (RN) catalisa o primeiro passo enzimático da
assimilação de nitrogênio pelas plantas superiores por meio da redução do
nitrato (NO
3
-
) a nitrito (NO
2
-
) (Oaks, 1994; Yaneva et al., 2000), conforme
esquematizado na expressão 3:
9
RN
NO
3
-
+ NADPH + 2H
+
+ 2e
-
NO
2
-
+ NADP
+
+ H
2
O(3)
Essa enzima (RN) é uma flavoproteína formada por duas subunidades
idênticas, com três grupos - FAD, heme e um complexo constituído entre o
molibdênio (Mo) e uma molécula orgânica a pterina (Mendel & Stallmeyer,
1995; Campbell, 1999), razão porque é, também, denominada uma
molibdopterina.
A seqüência de aminoácidos da RN polipeptídica foi identificada
mediante a clonagem dessa enzima. Existem, atualmente, mais de 40
seqüências da RN que constitui as formas da enzima das plantas superiores,
algas e fungos. Comparando as seqüências da RN com aquelas das proteínas
e enzimas conhecidas, verifica-se que a RN possui, aproximadamente, 917
resíduos de aminoácidos em cada subunidade, cada um deles contendo todos
os cofatores, similares à proteína arabidopsis NIA2, tornando esta última um
modelo representativo da RN (Campbell, 1999).
A maioria das formas da enzima RN das plantas utiliza o agente redutor
NADH produzido no citossol e não o redutor NADPH formado no cloroplasto
(Solomonson & Barber, 1990). Entretanto, Crawford et al. (2000) afirmam que
algumas formas dessa enzima (RN), com dupla especificidade, podem utilizar
tanto o redutor NADPH quanto NADH.
A enzima RN está localizada, primariamente, no citossol das células
corticais da epiderme da raiz e nas células mesofílicas da parte aérea (Rufty et
al., 1986; Vaughn & Campbell, 1988).
2.5 Regulação da atividade da redutase do nitrato (RN)
Segundo Galangau et al. (1988) e Vincentz et al. (1993) a atividade da
enzima RN nas folhas e raízes pode ser induzida pela presença do substrato
(NO
3
-
). Havendo nitrato ocorre um estímulo à síntese de novo da referida
10
enzima (Hewitt et al., 1976), enquanto que deficite hídrico moderado, da ordem
de -0,8 MPa a -2,0 MPa, pode reduzir sua produção em 20 %, chegando a 50 %
quando a planta sofre um estresse intenso (Hsiao, 1979). Segundo Crocomo
(1985) a menor atividade da redutase do nitrato em plantas sob estresse hídrico
se deve ao decréscimo no fluxo do substrato (NO
3
-
) por falta de umidade,
principal fator regulador da síntese dessa enzima.
O fluxo catalítico da RN ou a capacidade total de redução do nitrato
pelas plantas depende: (i) da disponibilidade de substrato no citoplasma
(concentração em estado de equilíbrio do NADPH e nitrato); (ii) do nível de RN
funcional - quantidade de RN polipeptídica e da disponibilidade de cofatores e
íons metálicos, FAD, heme, Fe, Mo-MPT (molibdênio–molibdopterina) e
molibdênio; (iii) da intensidade da atividade da RN funcional (Campbell, 1999).
Cada processo é regulado direta ou indiretamente e a capacidade de redução
do nitrato é controlada em relação ao nível metabólico total da planta, por
sensores e rotas de tradução de sinais.
A quantidade da glutamina livre e a sua proporção em relação ao
glutamato disponível, assim como os teores de nitrato são, provavelmente, os
metabólitos chaves que governam a capacidade de redução do nitrato na planta
(Solomonson & Barber, 1990; Crawford, 1995; Scheible et al., 1997). Em
condições de baixo teor de glutamina e disponibilidade de nitrato, a intensidade
da RN e a capacidade de redução do nitrogênio aumentam, enquanto que
quantidades elevadas da glutamina diminuem a redução do nitrato e decresce a
atividade da RN (feedback).
O teor de equilíbrio da RN é determinado pela taxa de sua degradação,
assim como, pela taxa de síntese da mesma. A meia vida de uma proteína RN,
recém sintetizada, é de poucas horas na célula e quando a quantidade de
nitrato diminui o teor da RN é rapidamente reduzido (Taiz & Zeiger, 1998).
Portanto, a planta não deve sofre estresse hídrico nos trabalhos que avaliam a
atividade dessa enzima, exceto quando a falta de água é uma das variáveis
experimentais, pois afetaria os resultados da pesquisa.
11
A resposta das plantas à quantidade de nitrato depende de outros
fatores, entre os quais o material genético e o ambiente como, por exemplo, a
luz, os quais influenciam a RN, bem como outros componentes do metabolismo
do nitrato (Campbell, 1999).
Em plantas sob condições ótimas de crescimento, a capacidade de
redução do nitrato é, aproximadamente, o dobro das necessidades da planta. A
atividade da RN varia durante o dia, apresentando baixa atividade no escuro
(Stitt, 1987; Scheible et al., 1997). Para Kaiser & Huber (2001) em condições
normais de ativação e na presença de luz a sua ação seria da ordem de 70 % a
90 %, reduzindo para 10 % a 30 % no escuro. Estes autores afirmam que a luz
não é um sinal direto para a atividade dessa enzima (RN), pois mesmo sob
intensa e contínua luminosidade a RN é inativa quando falta CO
2
, indicando que
a fotossíntese é requerida para a sua ativação (RN).
Considerando a necessidade desse gás para a ação da enzima pode-
se admitir, por hipótese, que as causas que afetam a entrada do CO
2
, como a
abertura estomática, variável com a capacidade da planta de manter a turgidez,
afetaria a eficiência da RN. O cafeeiro arábica, em razão das condições
climáticas relativas à sua origem, pode apresentar menor atividade enzimática
(RN) no período luminoso, devido à baixa condutividade hidráulica dessa
espécie, característica de plantas de sub-bosque que se desenvolvem sob
elevada umidade relativa do ar.
Com base em experimentos efetuados com espinafre, excluindo o CO
2
da atmosfera circundante às folhas, verificou-se decréscimo da atividade da RN
(Kaiser & Brendle-Behnisch, 1991). Esta constatação indica que a redução do
nitrato é sensível à resistência estomática, de maneira que em plantas com
estômatos fechados, como acontece sob deficiência hídrica, para impedir a
perda de água, prejudica a taxa fotossintética e a atividade da RN (Kaiser &
Huber, 2001). Provavelmente, os fotoassimilados exportados para fora do
cloroplasto funcionam como sinalizadores capazes de ativar a RN.
12
Roth et al (1996) examinando um mutante de milho deficiente em
ribulose bifosfato carboxilase, que perdeu a capacidade de processar o ciclo de
Calvin, obtiveram menor atividade da RN na presença de luz e também no
escuro, dando suporte à hipótese de que a ativação da RN na presença de luz
depende dos produtos desse ciclo. Entretanto, não está devidamente
esclarecido quais são os componentes que estão envolvidos quando um sinal é
transferido dos cloroplastos, onde a fotossíntese está ocorrendo, para dentro do
citosol, local de ação da RN. Intermediários ou derivados do ciclo de Calvin
como, por exemplo, açúcares ou açúcar fosfatado, são elos importantes (Huber
et al., 1996; Provan & Lillo, 1999). De acordo com Bachmann et al. (1995) a RN
pode ser ativada no escuro por meio do fornecimento de açúcar às folhas. Além
disso, a inativação dessa enzima (RN) no escuro foi atenuada em um mutante
de Nicotiana sylvestris que não produz amido e acumula altos níveis de açúcar
fosfato.
2.6 Redutase do nitrato e luminosidade em café
Estudando a assimilação do nitrogênio em mudas de café cultivadas
sob diferentes exposições à luz e formas de nitrogênio (nitrato e amônia),
Miranda Neto (1970) verificaram em plantas desenvolvidas com 68 % e 48 % de
luz uma redução na transformação do nitrato em nitrito nas plantas adubadas
com nitrato. O fornecimento de amônia como fonte de nitrogênio, sem inibidor
do processo de nitrificação, proporcionou uma maior atividade da enzima (RN)
nas plantas a pleno sol.
De acordo com Carvalho (1975) a deficiência de nitrogênio em mudas
formadas a pleno sol sugere a existência de uma associação direta entre o uso
de nitrogênio e a formação da enzima – RN. Trabalhando com duas fontes de
nitrogênio (amoniacal e nítrica) sob duas condições de luminosidade (meia
sombra e pleno sol), o autor concluiu que sob 50 % de luz as plantas de café
apresentaram os maiores valores para a altura de planta, área foliar, número de
folhas, matéria seca total e atividade da redutase do nitrato.
13
No trabalho realizado por Faleiros et al. (1975) que estudaram o efeito
da adubação nitrogenada e o desenvolvimento das mudas de café sob 50 % de
luz e a pleno sol, os autores constataram que nas plantas sombreadas
parcialmente (50 % de luz) a atividade da redutase do nitrato foi mais elevada.
Cordeiro et al. (1984) estudaram a atividade da redutase do nitrato em
plantas jovens de cacau e de café (Coffea arabica L.) na luz e no escuro. Os
autores verificaram que essas plantas apresentaram maior atividade da
redutase do nitrato em ambiente escuro, comparativamente aos resultados
obtidos nas plantas iluminadas. Resultado semelhante foi encontrado por Carelli
(1987) que constatou decréscimo na atividade da redutase (RN) durante as
horas de luz e aumento no período de escuro.
Trabalhando com plantas jovens de café submetidas a diferentes
quantidades de luz e de nitrogênio Carelli et al. (1990) observaram que as
plantas cultivadas a pleno sol apresentaram menor atividade da redutase do
nitrato em relação às plantas sombreadas, embora possuíssem teores elevados
de açúcares totais (fonte de energia) e de nitrato (substrato).
A redutase do nitrato na parte aérea e nas raízes de mudas de cafeeiro,
em função do período luminoso, associada aos teores de nitrato e carboidratos
nesses órgãos, apresentou declínio gradual da atividade nas folhas no decorrer
do período, seguido por um aumento da atividade nas primeiras horas de
escuro, com pico no final da noite (Queiroz et al. 1993).
Fahl et al. (1994) estudaram os efeitos da quantidade de radiação
luminosa (30 %, 50 % e 100 %) nos processos fisiológicos envolvidos com o
crescimento vegetativo como a área foliar e a altura de planta, o teor de
clorofila, nitrogênio total e a atividade da redutase do nitrato nas folhas de
várias cultivares de café. Os autores verificaram, 150 dias após o início do
experimento, diferentes respostas às quantidades de luz. A cultivar Apoatã C-
3597 da espécie Coffea canephora Pierre apresentou maior desenvolvimento
quando cultivada a meia sombra (50 % de luz) ao passo que as cultivares da
espécie Coffea arabica L. como, por exemplo, Catuaí H 2077-2-5-81 e Mundo
14
Novo LCP 388-17 não diferiram em relação ao crescimento quando expostas a
50 % e 100 % de luz. O sombreamento excessivo (30 % luz) reduziu o
desenvolvimento das cultivares de Coffea arabica sem afetar a cultivar da
espécie Coffea canephora. A massa foliar específica diminuiu com o aumento
do sombreamento em todas as cultivares. Os teores de clorofila aumentaram
com o sombreamento enquanto os teores de nitrogênio total decresceram. A
atividade da enzima redutase do nitrato nas folhas aumentou com o nível de
sombreamento das plantas em todas as cultivares.
2.7 Características da glutamina sintetase – GS
A principal rota de assimilação do nitrogênio amoniacal (NH
4
+
) nas
plantas se da por meio da atividade da enzima glutamina sintetase (GS), a qual
ocorre em diferentes isoformas e localizações na planta (Miflin et al., 1981;
McNally et al., 1983; Hirel et al., 1984).
A enzima GS catalisa a conversão do aminoácido glutamato (GLU) em
glutamina (GLN) por meio da reação que envolve a participação de GLU,
amônio, ATP e um cátion divalente como cofator, conforme apresentada na
expressão 4.
GS
Glutamato (GLU) + NH
4
+
+ ATP glutamina (GLN) + ADP + ε
(4)
Quando o cofator é o íon Mg
+2
o Km para o amônio está entre 10 e 50
µM (Miflin et al., 1981). Uma vez formada a GLN pode ser utilizada em diversos
eventos metabólicos, cedendo o nitrogênio assimilado para a formação de
outros compostos nitrogenados, sendo, juntamente com a asparagina e
ureídeos, os principais compostos nitrogenados translocados nas plantas (Joy,
1988).
(Mg
2+
, Mn
2+
, Co
2+
)
15
Estruturalmente a enzima GS é composta, predominantemente, de oito
subunidades, resultando num arranjamento octamérico. Cada subunidade tem
massa molecular em torno de 47 kDa que resulta numa massa molecular total
da enzima igual a 380 kDa (Cullimore et al., 1983; Robert & Wong, 1986; Cai &
Wong, 1989).
McNally & Hirel (1983) sugeriram que havia duas isoformas da enzima
GS nas plantas, uma localizada no citoplasma (GS
1
) e a outra no cloroplasto ou
plastídio (GS
2
).
A partir de cloroplastos de tabaco, utilizando dodecil sulfato de sódio em
gel de poliacrilamida em HPLC, foi purificada e identificada uma enzima GS
2
(Hirel et al., 1984). Os autores observaram a ocorrência de uma subunidade
polipeptídica com peso molecular de 45 kDa. Com base nesse resultado foi
sugerida uma composição protéica de 4 subunidades diferentes, com eventuais
modificações pós-transducionais e ou pós-transcricionais.
Ericson (1985) purificou a GS
2
a partir de cloroplastos de espinafre
identificando uma proteína com peso molecular de 360 kDa, composta por oito
subunidades de 44 kDa.
Em estudo realizado sobre a ocorrência de isoenzimas da glutamina
sintetase (GS) em Chrolela kessleri foi observada a mesma massa molecular
para GS
1
e GS
2
em torno de 350 kDa, com predominância da GS
1
da ordem de
60 % a 80 % em relação a GS
2
, bem como uma maior estabilidade da GS
1
ao
calor - 30 ºC durante 30 minutos (Sumar et al., 1984).
Segundo Bennett & Cullimore (1989) e Cock et al. (1991) no feijoeiro
(Phaseolus vulgaris L.) existe, pelo menos quatro isoformas da enzima GS,
inclusive em radículas de plântulas em germinação, assim como isoformas
específicas para as plantas noduladas.
Nas folhas também existem duas enzimas diferentes a GS
1
e a GS
2
. A
GS
1
é restrita ao citossol enquanto a GS
2
ao cloroplasto (Hirel et al., 1984). Tem
sido sugerido que a enzima GS
1
possui a função de assimilação da amônia no
citossol em condições de escuro (McNally et al., 1983). Segundo Edwards &
16
Coruzzi (1989) a enzima GS
2
das folhas é induzida pela luz e o íon NH
4
+
,
estando envolvida, também, no uso do NH
4
+
da fotorrespiração. Wallsgrove et
al. (1987) demonstraram que a amônia produzida durante a fotorrespiração
pode ser reassimilada pela planta no cloroplasto.
De acordo com Lam et al. (1996) a enzima GS, localizada nos plastídios
das raízes, forma N-amida consumido in loco, enquanto a GS dos cloroplastos
foliares reassimila o nitrogênio na forma amoniacal (NH
4
+
) formado durante a
fotorrespiração. A quantidade de carboidrato e de radiação influencia a
expressão das formas dessa enzima presente nos plastídios, sem efeito sobre
as formas citosólicas.
De maneira semelhante à RN a regulação da atividade da glutamina
sintetase (GS) pode ser induzida por diferentes estímulos externos ou
fisiológicos, dependendo do órgão da planta ou da isoforma da GS (Pujade-
Renaud et al., 1994). A luz, por exemplo, aumenta a quantidade de RNAm da
enzima GS
2
em folhas de ervilha, fumo e tomate (Becker et al., 1992). Edwards
& Coruzzi (1989) observaram que a expressão de um gene nuclear para GS
2
é
afetada, sensivelmente, pela luminosidade. Tjaden et al. (1995) descreveram a
flutuação da atividade da enzima GS
2
conforme a quantidade de radiação e da
atividade da RN, observando aumentos da GS na presença de luz
concomitantemente ao aumento da atividade da RN.
Além da atividade da sintetase na assimilação do amônio em
compostos orgânicos a GS atua biossintéticamente na produção de γ - glutamil
hidroxamato a partir do glutamato, ATP e hidroxalamina (Franden & Robertson,
1980).
A partir da análise de extratos Woolfolk & Stadtman (1964), concluíram
que a atividade da GS poderia ser quantificada por meio da formação do γ -
glutamil hidroxamato, a qual pode ser inibida pela ação do AMP, GTP, CTP,
alanina, glicina e triptofano nas concentrações de 0,002 a 0,005 M.
Análises eletroforéticas evidenciaram que a enzima GS é composta por
dois tipos de subunidades polipeptídicas. Tanto a isoforma da GS presente nas
17
raízes como nas folhas são compostas de polipeptídeos denominados α e β
(Lara et al., 1984). Nos nódulos, as subunidades que formam a enzima são do
tipo β e α, as quais diferem entre si no ponto isoelétrico, mas não em relação ao
tamanho. Assim, a GS
n2
seria composta de um conjunto formado apenas por
subunidades β, caracterizada como uma enzima homo-octamérica.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Localização do experimento
O experimento foi instalado em vasos na casa de vegetação do
Laboratório de Biotecnologia Agrícola do Departamento de Ciências Biológicas
da Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São
Paulo, Piracicaba, SP.
De acordo com a classificação de Köppen o clima regional é do tipo
Cwa, tropical de altitude com inverno seco. As coordenadas geográficas da
região são: 22
o
42’ 30’’ de latitude sul, 47
o
38’ 00’’ de longitude oeste e altitude
de 550 m.
3.2 Formação das mudas de café
Para a formação das mudas de café foram utilizadas sementes da
cultivar Obatã IAC 1669-20 da espécie Coffea arabica L., cujas características
principais são: porte baixo, tolerância ao agente da ferrugem, elevada
capacidade produtiva e adaptabilidade para o plantio adensado ou em renque.
As sementes foram distribuídas em germinadores de areia na proporção
de 1 kg m
-2
e, posteriormente, as plântulas germinadas foram repicadas em
tubetes no estádio de folhas cotiledonares expandidas - “orelha de onça”,
conforme recomendações do IBC (1986).
Para o transplante foi retirado o terço final da raiz principal para evitar o
desvio lateral das mesmas. Na seqüência, a muda foi colocada em orifícios
abertos no substrato e, em seguida, efetuou-se uma leve compressão
19
para eliminar os espaços com ar próximo das raízes, com a finalidade de
favorecer a sobrevivência e a fixação da planta.
Após o transplante as mudas permaneceram trinta dias no “viveiro
berçário” com 50 % de luz, proporcionada pela cobertura da tela sombrite. As
plantas nesse período foram irrigadas com turno de 2 h durante cinco minutos,
das 8:00 h às 18:00 h, perfazendo cinco irrigações diárias.
Quando as mudas apresentavam seis pares de folhas expandidas as
mesmas foram transferidas para vasos contendo 5 L de uma mistura de terra
(70 % volume) e esterco (30 % volume), à qual foi adicionada 5 kg de
superfosfato simples, 0,5 kg de cloreto de potássio e 2,5 kg de calcário
dolomítico por metro cúbico (Thomaziello et al., 1996). Ao volume de 1000 litros
formado pela mistura de terra (70 %) e esterco (30 %) foi adicionada as
respectivas quantidades de fertilizantes e corretivos.
Após o plantio das mudas nos vasos, as mesmas permaneceram durante
45 dias em ambiente com 50 % de luz, sob tela sombrite, visando à aclimatação
e sobrevivência das plantas. No final do período foram selecionadas 40 plantas
uniformes quanto ao porte e vigor e que já haviam emitido o sétimo par de
folhas, uma garantia de que as mesmas haviam sobrevivido ao estresse
provocado no plantio.
3.3 Tratamentos utilizados e condução das plantas
As plantas selecionadas foram deixadas a pleno sol até a emissão do
oitavo par de folhas, aproximadamente, 30 dias após o período de aclimatação.
Posteriormente, 20 plantas continuaram expostas ao sol (T1: 100 % de luz) e 20
plantas foram submetidas à meia sombra (T2: 50 % de luz), utilizando tela
sombrite. As plantas dos tratamentos a pleno sol e a meia sombra
permaneceram três meses nestas condições.
Durante o experimento as plantas foram, periodicamente, irrigadas com
a finalidade de mantê-las túrgidas – sem estresse hídrico.
20
A adubação foi feita usando nitrogênio (N) e potássio (K) em duas
coberturas, sendo a primeira realizada 20 dias após a emissão do nono par de
folhas, fornecendo 25 mg planta
-1
de N e K. Trinta dias depois da primeira
cobertura, quando as plantas apresentavam o décimo par de folhas e ramos
plagiotrópicos em crescimento, foi realizada a segunda cobertura, sendo
aplicada 50 mg planta
-1
de N e K, usando como fonte de N a uréia (45 % N) e
de K, o cloreto de potássio (60 % K
2
O).
O controle fitossanitário foi efetuado, preventivamente, por meio da
aplicação no solo de dissulfoton associado ao triadimenol (0,5 g planta
-1
do
produto comercial baysiston).
Esses cuidados tinham como objetivo evitar que as plantas fossem
submetidas a estresses bióticos (pragas e ou doenças) e ou abióticos (falta de
água), exceto em relação à variável em estudo – nível de exposição das plantas
à luminosidade.
3.4 Variáveis avaliadas
Nas mudas de cafeeiro arábica com doze meses de idade, conduzidas
em casa de vegetação a pleno sol (T1: 100 % luz) e a meia sombra (T2: 50 %
de luz), foram efetuadas as determinações das atividades das enzimas
redutase do nitrato – RN (µmol NO
2
-
h
-1
g
-1
MF) e da glutamina sintetase – GS
(µM de γ-GH h
-1
mg
-1
proteína).
Com a finalidade de fornecer subsídios à compreensão dos resultados
foram feitas avaliações ecofisiológicas complementares como: (i) temperatura
atmosférica, no ambiente em que as mudas foram conduzidas – Ta (
o
C), (ii)
temperatura foliar – Tf (
o
C), (iii) radiação fotossinteticamente ativa – PAR (µmol
m
-2
s
-1
), (iv) condutância estomática – gs (mol m
-2
s
-1
), (v) taxa de transpiração
foliar – E (mmol m
-2
s
-1
), (vi) taxa de fotossíntese líquida – A (µmol CO
2
m
-2
s
-1
)
e (vii) teor de proteína total solúvel – PTS (mg PTS g
-1
MF).
21
O crescimento vegetativo das plantas foi analisado mediante a
determinação das variáveis: (viii) altura de plantas – H (cm), (ix) diâmetro de
caule – DC (mm), (x) número de ramos plagiotrópicos – NRP, (xi) número de
folhas – NF e (xii) matéria seca de folhas – MS (g).
3.5 Preparo dos extratos para análise das atividades enzimáticas
De cada planta (repetição) coletou-se 1,0 g de material vegetal na
forma de discos de folhas (Figura 1), o qual foi fracionado e submetido a uma
pequena quantidade de nitrogênio líquido durante a maceração, tendo sido
adicionado 2,0 ml da solução de extração, antes desse processo (maceração
em graal).
O material foi homogeneizado e depois centrifugado a 5000 rpm
durante 5 minutos a 4
o
C. O material sobrenadante foi transferido para outro
tudo de ensaio e acondicionado em recipiente com gelo moído e, em seguida,
foi feita a determinação das atividades enzimáticas.
3.5.1 Atividade da redutase do nitrato (RN)
A determinação da atividade da redutase do nitrato foi feita
empregando-se o ensaio in vivo modificado por Queiroz et al. (1991), com
intervalo de 5 h entre as avaliações, efetuadas às 7:00 h, 12:00 h, 17:00 h e
22:00 h. Esse procedimento foi adotado para permitir a comparação da ação
enzimática nas diferentes condições de luminosidade do experimento (pleno sol
e 50 % de luz) ao longo do período luminoso e a noite, em razão da variação da
irradiância.
As amostras de tecido fresco foram coletadas e lavadas com água
deionizada. Em seguida, retirou-se discos foliares de 100 mg de massa e 0,5
cm de diâmetro (Figura 1), os quais foram colocados em tubos de ensaio
contendo 5 ml de solução tampão PO
4
, pH 7,4 50 mM + KNO
3
200 mM.
Essas amostras foram infiltradas a vácuo durante 1 minuto com a
finalidade de aumentar a penetração da solução nos tecidos. Posteriormente,
22
50 % luz 100 % luz
os tubos de ensaio contendo o material vegetal foram incubados em banho-
maria a 30º C por 1 hora ao abrigo da luz, envoltas com folha de alumínio. A
paralização da reação foi feita com a adição de 1 ml de sulfanilamida a 1 % em
HCl 2 N e, a seguir, adicionou-se 1 ml de α-naftilenodiamino 0,05 %.
Figura 1 – Método de coleta de discos foliares para a determinação da atividade
das enzimas redutase do nitrato e glutamina sintetase em folhas de
Coffea arabica cv. Obatã IAC 1669-20 cultivadas a pleno sol e a
meia sombra
A leitura foi feita em espectrofotômetro a 540 nm, sendo a atividade da
enzima determinada pela quantidade de nitrito (NO
2
-
) produzida, comparando os
23
valores obtidos com uma curva padrão para esse íon, previamente estabelecida.
Os resultados obtidos dessa variável foram expressos em µmol NO
2
-
h
-1
g
-1
MF.
3.5.2 Atividade da glutamina sintetase (GS)
A atividade específica da sintetase da glutamina foi obtida utilizando o
método proposto por Elliott (1953), o qual explora a atividade biossintética dessa
enzima na formação de γ - glutamil hidroxamato.
Essa reação foi realizada sob agitação contínua em banho-maria a 30 ºC
em tubo de ensaio, no qual foram adicionados 0,25 ml de tampão TRIS – HCL
200 mM, pH 7,5; 0,1 ml de ATP 50 mM, pH 7,0; 0,25 ml de glutamato de sódio
500 mM; 0,05 ml de MgSO; 0,05 ml de cisteína 100 mM; 0,15 ml de hidoxilamina
100 mM, pH 7,0 e 0,15 ml de extrato, totalizando 1 mililitro (ml).
Após o período de incubação a reação foi interrompida pela adição de 1
ml do reagente cloreto férrico - FeCl
3
(10 %)/TCA (24 %)/HCl (6 N), 1:1:1 –
formando um complexo marrom amarelado como precipitado. Em seguida, a
mistura foi centrifugada a 5000 rpm e no material sobrenadante foi realizada a
leitura colorimétrica para determinar a formação de γ - glutamil hidroxamato.
A leitura foi feita a 540 nm em espectrofotômetro marca HITACHI e
modelo U – 3210, sendo a determinação da atividade enzimática realizada a partir
da comparação da leitura obtida com uma curva padrão, preparada previamente.
Os resultados obtidos dessa variável foram expressos em µmoles γ-glutamil
hidroxamato produzido por hora por miligrama de proteína (µM de γ-GH h
-1
mg
-1
proteína).
3.6 Avaliações ecofisiológicas
As determinações das variáveis ecofisiológicas como a condutância
estomática (gs, mol m
-2
s
-1
), taxa de transpiração (E, mmol m
-2
s
-1
), taxa de
fotossíntese líquida (A, µmol CO
2
m
-2
s
-1
), temperatura foliar (Tf,
o
C),
temperatura do ar (Ta,
o
C) e radiação fotossinteticamente ativa (PAR, µmol m
-2
s
-1
) foram efetuadas nas folhas utilizadas para a determinação da RN. A
24
avaliação desses atributos ecofisiológicos foi feita utilizando um medidor portátil
modelo LI - 6400 (LICOR NE, USA) (Figura 2), com intervalo de 5 h entre as
avaliações, ou seja, às 7:00 h, 12:00 h e 17:00 h. Esse procedimento foi
adotado para permitir a comparação da ação enzimática nas diferentes
condições de luminosidade do experimento (T1: pleno sol e T2: meia sombra)
ao longo do período luminoso, em função da variação diária da irradiância e dos
referidos atributos ecofisiológicos (Ta, Tf, gs, E, A e PAR).
Figura 2 - Medidor portátil modelo LI - 6400 utilizado para determinar os
atributos ecofisiológicos como a temperatura atmosférica (Ta),
temperatura foliar (Tf), condutância estomática (gs), taxa de
transpiração (E), taxa de fotossíntese líquida (A) e radiação
fotossinteticamente ativa (PAR)
3.7 Determinação do teor de proteína total solúvel (PTS)
Para a determinação do teor de proteína total solúvel (PTS) foi utilizada a
metodologia de Bradford (1976), usando extratos preparados com o tampão TRIS.
25
Numa alíquota de 100 µl do extrato foi acrescentada 5 ml do reagente de
BRADFORD resultando em uma mistura colorida, em que foi feita a leitura a 595
nm em espectrofotômetro marca HITACHI, modelo U – 3210.
O reagente de BRADFORD foi preparado com 100 mg de COMASSIE
BRILLIANT BLUE G – 250 dissolvidos em 50 ml de etanol 95 % e 100 ml de
H
3
PO
4
85 %. O volume dessa mistura foi aferido para 1 litro e filtrado duas vezes
utilizando filtro de papel qualitativo da marca REAGEN.
O teor de proteínas total solúvel (PTS) das amostras foi calculado a partir
de uma curva padrão feita com albumina de soro bovino (BSA), sendo os
resultados obtidos dessa variável expressos em mg g
-1
de matéria fresca (MF).
3.8 Análise vegetativa
3.8.1 Altura de planta (H)
A altura (H; cm) das plantas foi efetuada com uma régua milimetrada
entre o nível do solo, na região do colo da planta, e a inserção do último par de
folhas expandidas.
3.8.2 Diâmetro do caule (DC)
Esse parâmetro (DC; mm) foi determinado utilizando um paquímetro
digital, obtendo as medidas na região do caule localizado abaixo da cicatriz de
inserção das folhas cotiledonares.
3.8.3 Número de ramos plagiotrópicos (NRP)
No final do experimento foram contados os ramos produtivos (NRP)
emitidos pelas plantas de cada tratamento.
3.8.4 Número de folhas da planta (NF)
As folhas do caule e dos ramos produtivos foram, também, recolhidas e
quantificadas (NF).
26
3.8.5 Matéria seca de folhas (MS)
A matéria seca (MS; g) foi obtida por meio da determinação da massa
de folhas em balança de precisão, após a secagem da planta em estufa a 70º C
com circulação de ar forçada durante 36 horas.
Figura 3 – Mudas de cafeeiro Coffea arabica L. cv Obatã IAC 1669-20, com doze
meses de idade, cultivadas a pleno sol e a meia sombra
3.9 Análise química de folhas
3.9.1 Preparo do material vegetal para análise
A análise química para a determinação de macronutrientes e
micronutrientes foi realizada no material vegetal proveniente das análises da
redutase do nitrato (RN). As folhas e os discos foliares utilizados na determinação
da atividade enzimática foram submetidos à secagem em estufa a 70º C com
circulação de ar forçada durante 36 horas. Após o resfriamento do material
realizou-se a medição da matéria seca (g), utilizando-se uma balança de precisão.
Pleno sol Meia sombra
27
Posteriormente, o material foi moído e preparado para a análise química,
conforme metodologia proposta por Malavolta et al. (1989).
3.9.2 Determinação de macro e micronutrientes
Os teores de macronutrientes (P, K, Ca, Mg e S) e micronutrientes (Cu,
Fe, Mn e Zn) foram obtidos através da digestão nitro-perclórica. O N foi
determinado por meio da digestão sulfúrica e o B por incineração (Malavolta et al.,
1989).
Para a digestão nitro-perclórica foi feita inicialmente à pesagem de 0,5 g
de matéria seca (MS) do material a ser analisado, passando em seguida para o
tubo de digestão em bloco de 40 provas, com 6 ml de solução de ácido nítrico
mais perclórico na relação (4+0,5), com temperatura inicial de 50ºC. Em seguida
para 75ºC e 100ºC por mais 15 minutos, depois para 120ºC por 30 minutos e
160ºC até a eliminação total da matéria orgânica, passando depois para 180ºC
visando à homogeneização dos volumes das amostras e, finalmente, para 210ºC
até a saída de fumos brancos ou redução do volume final. Foi utilizada 50 ml de
H
2
O deionizada no tubo e homogeneizado até dissolver os minerais.
Para a determinação do P foi coletado 1 ml do extrato final da digestão
nitro-perclórica e transferido para tubo de ensaio de 15 ml, adicionando ao mesmo
6 ml de uma solução vanado-molíbdica
1
. O valor final foi obtido por determinação
colorimétrica.
Foram feitos, inicialmente, padrões de uma solução 1000 ppm de P, com
ácido (10 ml de solução nitro-perclórica 4+0,5), nas concentrações de 5, 10, 20,
40, 60, 80 e 100 ppm de P partindo da solução de 1000 ppm. Para a
determinação da curva padrão coletou-se 1 ml de cada padrão mais 6 ml de
solução vanado-molíbdica
1
.
28
Solução vanado-molíbdica
1
:
foi usado 125 g de molibdato de amônio em becker contendo 800 ml de
H
2
O deionizada aquecida a 80ºC, agitando-o até a dissolução e, em
seguida, deixou esfriando;
transferiu-se 6,25 g de metavanato de amônio para becker contendo 200
ml de H
2
O deionizada aquecida a 80ºC, agitando-o até dissolução e, em
seguida, deixou esfriando;
juntou-se a essa solução 700 ml de NHO
3
concentrado e deixou esfriar;
misturou-se as duas soluções, previamente resfriadas, em balão de 2 litros
e completou o volume com água deionizada;
finalmente, misturou-se 250 ml desta solução a 275 ml de água deionizada.
A determinação do enxofre (S) foi feita através da transferência de 10 ml
de extrato para tubo de ensaio de 30 ml, adicionando-se a este 1ml de HCl 6N
com 20 ppm de S, mais 0,5 g de BaCl
2
. Foram preparados padrões de 5, 15, 25,
40 e 50 ppm mediante solução estoque de S a 1000 ppm. Utilizou-se, também, o
método colorimétrico.
Por meio do uso de 1 ml de extrato misturado a 19 ml de óxido de lantânio
a 0,1% em tubo de ensaio de 30 ml, os elementos K, Ca e Mg foram quantificados
por espectrofotômetro de absorção atômica com lâmpadas de catodo oco.
Os elementos Cu, Fe, Mn e Zn foram quantificados diretamente mediante
a leitura no extrato nitroperclórico, por espectrofotômetro de absorção atômica.
O nitrogênio foi determinado utilizando o processo de digestão sulfúrica,
pesando inicialmente 0,1 g de MS a qual foi transferida para tubo de digestão,
onde foi adicionada 5 ml da mistura digestora
2
contendo ácido sulfúrico com sais
e catalizadores. A temperatura foi aumentada de 50 em 50ºC por
aproximadamente 30 minutos até atingir 350ºC. Para a destilação utilizou-se o
volume de NaOH ± 15N suficiente para neutralizar o ácido e deixar o meio
alcalino, liberando assim a NH
3
, a qual foi fixada em solução indicadora de ácido
29
bórico. Em seguida, fez-se a titulação com H
2
SO
4
até a formação de (NH
4
)
2
SO
4
na presença de indicador ácido/base.
Solução digestora
2
:
colocou-se 2 litros de H
2
O em becker plástico de 4 litros;
adicionou-se 1 g de Na
2
SeO
3
(selenito de sódio) e dissolveu;
adicionou-se 45 g de CuSO
4
.5H
2
O e dissolveu;
adicionou-se 190 g de Na
2
SO
4
anidro e dissolveu;
adicionou-se 1 litro de H
2
SO
4
contendo 5 g de ácido salicílico dissolvido;
adicionou-se 1 litro de H
2
SO
4
concentrado até completar 2 litros de H
2
SO
4
.
A determinação de boro (B) foi feita em água quente usando aquecimento
em microonda, tendo sido usado 10 cm
3
de solo misturado com 20 ml da solução
extratora de cloreto de bário, formada pela dissolução de 1,25 g L
-1
do sal em 1 L
de água deionizada de acordo com metodologia proposta por Abreu et al. (2001).
3.10 Delineamento experimental
O experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado
utilizando dois tratamentos: T1 - plantas a pleno sol (PS: 100% de luz) e T2 -
plantas a meia sombra (MS: 50 % de luz), com cinco repetições. Cada
repetição era constituída por uma planta por vaso, perfazendo 20 plantas por
tratamento, em razão das avaliações serem realizadas em conjuntos de cinco
plantas em quatro horários diferentes.
Os resultados obtidos para cada variável estudada foram submetidos à
análise de variância para a comparação de médias entre os referidos
tratamentos (T1 e T2).
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Atividade da redutase de nitrato (RN)
A atividade da enzima redutase de nitrato (RN) determinada a pleno sol
(PS) decresceu ao longo do período luminoso (Figura 4), corroborando
resultados anteriores obtidos por Cordeiro et al. (1984), Alves et al. (1985) e
Queiroz et al. (1993).
Figura 4 – Médias da atividade da redutase do nitrato (RN) em mudas de Coffea
arabica L. cv Obatã IAC 1669-20 cultivadas a pleno sol e a meia
sombra às 7:00 h, 12:00 h, 17:00 h e 22:00 h
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
7:00 12:00 17:00 22:00
Período (hs)
RN [
♦
mol N-NO
2
-
h
-1
g
-1
(MF)]
Pleno sol Sombreado
31
As médias obtidas para a atividade da RN às 7:00 h nas plantas a
pleno sol (0,82 µmol NO
2
-
h
-1
g
-1
MF) foram 70 % e 82 % superiores àquelas
determinadas às 12:00 h (0,26 µmol NO
2
-
h
-1
g
-1
MF) e às 17:00 h (0,15 µmol
NO
2
-
h
-1
g
-1
de MF), respectivamente (Figura 4). A atividade dessa enzima (RN)
às 22:00 h mais que duplicou, uma vez que chegou a 1,63 µmol NO
2
-
h
-1
g
-1
de
MF em relação ao valor determinado às 7:00 h.
Nas plantas a meia sombra (50 % luz) a atividade da RN alternou ao
longo do período luminoso (7:00 h às 17:00 h) apresentando uma tendência
diferente do que foi observado em relação a atividade dessa enzima nas
plantas expostas ao sol. Nas plantas conduzidas sob 50 % de luz evidenciou
uma atividade superior da RN durante o período luminoso, às 12:00 h (0,66
µmol NO
2
-
h
-1
g
-1
de MF).
Os resultados obtidos no presente experimento corroboram resultados
publicados por vários autores, os quais verificaram que a atividade da enzima
RN, nas folhas do cafeeiro, aumenta com o sombreamento, no período de
maior irradiância (Miranda Neto, 1970; Carvalho, 1975; Faleiros et al., 1975;
Fahl et al., 1994). Este comportamento pode ser explicado, em parte, pela
reassimilação do nitrogênio liberado no processo fotorrespiratório cuja
ocorrência pode ser inferida com base na elevada temperatura foliar 40,7º C em
relação à temperatura do ar 38,8º C obtida nas plantas a pleno sol (Tabela 1).
De acordo com Stitt et al. (2002) a assimilação do amônio liberado durante a
fotorrespiração em plantas C
3
representa cerca de 90 % do fluxo por meio da
rota GS/GOGAT. O aumento da atividade da RN às 12:00 h a meia sombra
pode ser, também, uma consequência da absorção de nitrogênio do solo, uma
vez que a condutância estomática (Figura 8) e a taxa de transpiração (Figura 9)
mantiveram o fluxo xilemático, tendo apresentado valores superiores àqueles
obtidos nas plantas expostas ao sol. Esta afirmação é reforçada considerando o
teor de N foliar determinado às 12:00 h (29,8 g kg
-1
) comparada a concentração
do elemento às 7:00 h (23,8 g kg
-1
) e às 17:00 h (25,6 g kg
-1
) (Tabela 2).
32
A atividade da redutase do nitrato nas plantas a pleno sol às 7:00 h foi,
em média, 73 % maior (p<0,05) em relação àquela determinada nas plantas a
MS (50 % de luz). Este comportamento pode ser explicado observando as
medidas da taxa de fotossíntese líquida (Figura 7) e da condutância estomática
(Figura 8) nesse momento. Na avaliação feita às 7:00 h, em razão da baixa
luminosidade (45 µmol quanta m
-2
s
-1
sob meia sombra - MS), as médias da
fotossíntese líquida (A: 3,50 µmol CO
2
m
-2
s
-1
) e da condutância estomática (gs:
0,043 mol m
-2
s
-1
) são inferiores àquelas obtidas nas plantas expostas ao sol (A:
8,86 µmol CO
2
m
-2
s
-1
e gs: 0,149 mol m
-2
s
-1
) o que, provavelmente, contribuiu
para a menor atividade da RN (0,335 µmol NO
2
-
h
-1
g
-1
de MF), uma vez que
esta enzima é pouco ativa quando diminui a concentração de CO
2
(Kaiser &
Huber, 2001).
Assumindo que a atividade da RN seja afetada pela quantidade de gás
carbônico, pode-se afirmar que a mesma ocorreu devido à elevada resistência
estomática ao CO
2
, aproximadamente, 3,5 vezes superior à resistência medida
nas plantas exposta ao sol (PS). Outro aspecto a ser considerado é a
concentração de N foliar a qual era da ordem de 30,7 g kg
-1
nas folhas das
plantas ao sol, teor mais elevado do que àquele determinado nas plantas a
meia sombra que foi igual a 23,8 g kg
-1
(Tabela 2).
A tese de que a atividade da RN (Figura 4) depende da fotossíntese
pode ser corroborada por meio das avaliações efetuadas às 7:00 h nas plantas
a pleno sol, bem como nas plantas a meia sombra às 12:00 e 17:00 h, uma vez
que a atividade dessa enzima acompanhou a taxa de fotossíntese líquida
(Figura 7). Entretanto, às 22:00 h os valores dessa variável (RN) também foram
elevados, mesmo na ausência da fotossíntese, pois os estômatos das plantas
C3 (cafeeiro) e C4 estão fechados à noite. A afirmação de Bachmann et al.
(1995), de que a RN pode ser ativada no escuro mediante o fornecimento de
açúcar às folhas pode explicar a atividade da referida enzima às 22:00 h.
Provavelmente, parte das reservas da energia produzida durante o período
33
luminoso seriam utilizadas para ativar a RN (Carelli et al., 1990; Queiroz et al.,
1993).
No início do período luminoso (7:00 h) a elevada taxa fotossintética nas
plantas PS deve ter diminuido a concentração de CO
2
foliar, provocando uma
redução no pH das células guardas estomáticas. Tal condição favorece a
atividade catalizadora da enzima transformadora do amido (insolúvel) em
sacarose (solúvel) (Dennis, 1987). Dessa maneira, haveria uma maior
hidratação das células guardas em razão da solubilidade da sacarose, pelo
abaixamento do potencial osmótico, favorecendo a entrada de água e, em
consequência, a abertura dos estômatos. Neste experimento, essa afirmação
pode ser verificada por meio da condutância estomática (Figura 8), a qual foi
superior (p<0,01) nas plantas expostas ao sol comparativamente às plantas a
meia sombra.
Estudos desenvolvidos por Talbott & Zeiger (1998) confirmaram a
importância da hipótese do açúcar-amido na abertura estomática, abandonada
com a descoberta do papel do K, íon osmoticamente ativo, na regulação da
atividade das células guardas. No presente trabalho, o teor foliar de K na
amostra efetuada às 7:00 h nas plantas a pleno sol foi da ordem de 21,4 g kg
-1
,
semelhante à concentração determinada nas folhas das plantas à meia sombra
(20,7 g kg
-1
) (Tabela 2). Embora não tenha sido avaliado o teor de K das células
guardas, pode-se admitir que a maior condutância estomática verificada às
7:00h deveu-se, em parte, à quantidade de sacarose resultante da
transformação do amido e da taxa fotossintética atual (Figura 7). Assim, na
presença de maior quantidade de carboidrato, embora não tenha sido
quantificado, o mesmo (CH
2
O) pode ter contribuído para o aumento da pressão
de turgor nas células guardas. Esta observação leva em consideração a
ausência de limitação hídrica, a qual pode ser confirmada por meio da elevada
taxa de transpiração às 7:00 h, tendo sido 2,7 vezes superior nas plantas
expostas à irradiação (Figura 9).
34
0
20
40
60
80
100
120
140
7:00 12:00 17:00 22:00
Período (hs)
GS (
µ
mol
γ
GH h
-1
mg
-1
PTS)
Pleno sol Sombreado
4.2 Atividade da glutamina sintetase (GS)
A atividade da glutamina sintetase (GS) diferiu (p<0,01) entre as plantas
expostas ao sol e a meia sombra às 7:00 h e 12:00 h (Figura 5). Nas plantas a
pleno sol a atividade da (GS) foi da ordem de 78,1 µM γ-GH h
-1
mg
-1
PTS, em
média, 28 % inferior àquela obtida nas plantas sombreadas (108,1 µM γ-GH h
-1
mg
-1
PTS).
Figura 5 – Médias da atividade da glutamina sintetase (GS) em mudas de
Coffea arabica L. cv Obatã IAC 1669-20 cultivadas a pleno sol e a
meia sombra às 7:00 h, 12:00 h, 17:00 h e 22:00 h
A elevada atividade da GS nas primeiras horas do período luminoso
pode estar relacionada com a atividade da RN no período noturno antecedente,
uma vez que o cafeeiro, diferente de outras plantas, apresenta grande atividade
da R-NO
3
-
no escuro (Faleiros et al., 1975; Cordeiro et al., 1984; Carelli et al.,
35
1990), apresentando um pico no final da noite (Queiroz et al., 1993). Com isso,
o amônio formado nesse período seria reassimilado pela GS em compostos
orgânicos, para evitar prejuízos às células. De acordo com Matt et al. (2001) a
elevada atividade da GS em plantas de fumo cultivadas em meio contendo
nitrato de amônio, se deveu ao acúmulo durante o dia e por ter permanecido em
níveis elevado a maior parte do período noturno. Fato semelhante ocorreu com
o cafeeiro no presente experimento, só que por motivo diferente, uma vez que a
atividade enzimática da redutase do nitrato no escuro, forneceu substrato
(NH
4
+
) para a ação da glutamina sintetase na antemanhã.
Os resultados da atividade da GS às 17:00 h e 22:00 h não diferem
estatisticamente entre as plantas conduzidas a pleno sol ou expostas a meia
sombra (Figura 5). Verifica-se, entretanto, uma tendência crescente da
atividade dessa enzima nesse período (17:00 h às 22:00 h),
independentemente, do grau de exposição das plantas à irradiância, passando,
em média, de 49,9 µM γ-GH h
-1
mg
-1
PTS para 90,9 µM γ-GH h
-1
mg
-1
PTS nas
plantas do tratamento a pleno sol e de 55,0 µM γ-GH h
-1
mg
-1
PTS para 96,6 µM
γ-GH h
-1
mg
-1
PTS naquelas mantidas sob meia sombra (Figura 5).
A flutuação da atividade da GS pode ser explicada pela sua
dependência da quantidade de luz e da própria atividade da RN (Tjaden et al.,
1995). No período das 17:00 às 22:00 h foi constatado um aumento na
atividade da RN de 0,15 µmol NO
2
-
h
-1
g
-1
de MF para 1,63 µmol NO
2
-
h
-1
g
-1
de
MF nas plantas expostas a irradiação luminosa e de 0,35 µmol NO
2
-
h
-1
g
-1
de
MF para 0,69 µmol NO
2
-
h
-1
g
-1
de MF naquelas mantidas a meia sombra
(Figura 4). Entretanto, os resultados obtidos no período da manhã não
corroboram as afirmações de Tjaden et al. (1995), uma vez que às 7:00 h
verificou-se maior atividade da glutamina sintetase 108,1 µM γ-GH h
-1
mg
-1
PTS
nas plantas à meia sombra e com menor atividade da RN (Figura 4), enquanto
às 12:00 h a maior ação dessa enzima (GS) ocorreu nas plantas expostas ao
sol (73,2 µM γ-GH h
-1
mg
-1
PTS) com menor atividade da RN. Portanto, a
atividade da glutamina sintetase em cafeeiro não pode ser explicada apenas
36
pelos fatores luminosidade e atividade da RN. A ação da R-NO
3
-
no período
escuro, bem como a intensidade da fotorrespiração no cafeeiro,
independentemente da saturação do aparelho fotossintético das plantas
expostas ao sol, evidenciado pelos valores da GS às 22:00 h (90,9 µM γ-GH h
-1
mg
-1
PTS) e às 12:00 h (73,2 µM γ-GH h
-1
mg
-1
PTS), fornecem, provavelmente,
substrato (amônio) à atividade dessa enzima (GS).
A atividade da RN às 12:00 h apresentou, também, diferença
significativa (p<0,01) entre os tratamentos estudados, sendo que, sob
sombreamento, a atividade da RN foi, aproximadamente, 2,5 vezes maior que
àquela obtida nas plantas ao sol (Figura 4). No entanto, os valores obtidos para
a atividade da GS foram maiores (p<0,05) nas plantas expostas à radiação
solar (100 % luz) em comparação às plantas a meia sombra (50 % luz). Esse
comportamento da atividade da GS, provavelmente, está relacionado com a
presença de amônio proveniente da fotorrespiração, visto que o cafeeiro a
pleno sol às 12:00 h encontrava-se sob intensa radiação fotossinteticamente
ativa (PAR: 1.302 µmol m
-2
s
-1
) e elevada temperatura foliar 40,7º C. Nesse
horário (12:00 h), a combinação dos resultados como: baixa condutância
estomática (gs: 0,06 mol m
-2
s
-1
), menor taxa de transpiração (E: 3,90 mol H
2
O
m
-2
s
-1
) e de fotossíntese líquida (A: 7,60 µmol CO
2
m
-2
s
-1
), juntamente com a
reduzida atividade da redutase do nitrato (RN: 0,26 µmol NO
2
h
-1
g
-1
(MF),
comparativamente às médias verificadas nas plantas a meia sombra, não
justificam a elevada atividade da GS determinada às 12:00 h. Esse
comportamento pode ser explicado pelo aumento da disponibilidade de amônio
originado da fotorrespiração que ocorre nas plantas de cafeeiro expostas ao sol,
superando a rota normal, quando o substrato (NH
4
+
) advém da atividade da
redutase do nitrato.
Outra explicação pode ser dada por meio do teor de proteína total
solúvel (PTS) determinado às 12:00 h, o qual diferiu (p<0,05) entre as plantas a
pleno sol (0,482 mg PTS g
-1
MF) e a meia sombra (0,318 mg PTS g
-1
MF)
(Figura 6). Essa diferença pode estar relacionada com o decréscimo na
37
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
7:00 12:00 17:00 22:00
Período (hs)
mgPTS g
-1
(MF)
Pleno sol Sombreado
atividade da GS ocorrido no mesmo horário (Figura 5). Häusler et al. (1994)
estudaram a fotossíntese em folhas de cevada que apresentavam reduzida
atividade da glutamina sintetase. De acordo com os autores houve um
decréscimo na atividade tanto da GS quanto da Fd – GOGAT o que implicou na
diminuição na quantidade de proteína foliar. Para os autores, a proteína total
por unidade de área foliar decresceu 10 % a 17 % quando a atividade da GS
caiu 50 %. Os dados do presente trabalho evidenciaram uma redução de
aproximadamente 38 % nos teores de PTS entre as determinações efetuadas
às 7:00 h e 12:00 h, nas plantas conduzidas à meia sombra (MS). Nesse
período, a atividade da GS decresceu, em média, 58 % passando de 108,1 µM
γ-GH h
-1
mg
-1
PTS para 44,5 µM γ-GH h
-1
mg
-1
PTS (Figura 6).
Figura 6 – Médias de proteína total solúvel (PTS) em mudas de Coffea arabica
L. cv Obatã IAC 1669-20 cultivadas a pleno sol e a meia sombra às
7:00 h, 12:00 h, 17:00 h e 22:00 h
38
4.3 Atributos ecofisiológicos
Neste item serão discutidos os atributos fisiológicos como a
condutância estomática (gs), taxa de fotossíntese líquida (A), taxa de
transpiração (E), bem como aqueles ligados ao clima, ou seja, a temperatura
atmosférica (Ta), a temperatura foliar (Tf) e a radiação fotossinteticamente ativa
(PAR).
A taxa de fotossíntese líquida (A) diferiu (p<0,05) entre os tratamentos
(nível de exposição à radiação) em todos os intervalos estudados (Tabela 1). Às
7:00 h a atividade fotossintética foi maior nas plantas do tratamento PS (8,86
µmol CO
2
m
-2
s
-1
) apresentando, em média, valores 2,5 vezes superiores em
relação às plantas do tratamento MS (3,50 µmol CO
2
m
-2
s
-1
). Estes resultados
estão correlacionados com as médias obtidas para gs (Figura 8) e E (Figura 9),
uma vez que, neste horário, nas plantas a meia sombra, os estômatos estavam
praticamente fechados (0,04 mol m
-2
s
-1
) e com baixíssima taxa transpiratória
(0,50 mmol m
-2
s
-1
) (Tabela 1).
Tabela 1. Médias da taxa de fotossíntese líquida (A), condutância estomática
(gs), taxa de transpiração (E), temperatura atmosférica (Ta),
temperatura foliar (Tf) e radiação fotossinteticamente ativa (PAR),
nas mudas de Coffea arabica L. cv Obatã IAC 1669-20 cultivadas a
pleno sol (PS) e a meia sombra (MS).
7:00 h 12:00 h 17:00 h
Variáveis
PS MS PS MS PS MS
A (µmol CO
2
m
-2
s
-1
)
8,86a
1
3,50b
1
7,60b
1
12,08a
1
6,38b
1
11,64a
1
gs (mol m
-2
s
-1
) 0,15a
1
0,04b
1
0,08b
2
0,21a
2
0,05
ns
0,06
ns
E (mmol m
-2
s
-1
) 1,37a
1
0,50b
1
3,90b
1
7,80a
1
1,87
ns
1,12
ns
Ta (
o
C) 27,0a 27,8a 38,8a 41,3b 36,9a 30,7b
Tf (
o
C) 26,1a 26,9a 40,7c 39,6c 36,6a 29,9c
PAR (µmol m
-2
s
-1
)
90 45 1.302 616 450 220
1
significativo a 1 % de probabilidade,
2
significativo a 5 % e
ns
não significativo
39
0
2
4
6
8
10
12
14
7:00 12:00 17:00
Período (hs)
A (
µ
mol CO
2
m
-2
s
-1
)
Pleno sol Sombreado
Os valores obtidos para a transpiração (E) às 7:00 h diferiram
significativamente, com as plantas expostas ao sol trocando maior quantidade
de gases (CO
2
e vapor d´água) com a atmosfera (1,37 mmol m
-2
s
-1
)
comparativamente às plantas conduzida à meia sombra, em razão da maior
abertura estomática (0,15 mol m
-2
s
-1
) (Figura 8). Não foi constatada diferença
(p>0,05) em relação à temperatura do ambiente (Ta) e a temperatura foliar (Tf)
entre os tratamentos e dentro de cada tratamento (Tabela 1) na avaliação
efetuada às 7:00 h.
Figura 7 – Médias da taxa de fotossíntese líquida (A) determinada em mudas de
Coffea arabica L. cv Obatã IAC 1669 -20 cultivadas a pleno sol e a
meia sombra às 7:00 h, 12:00 h e 17:00 h
No horário das 12:00 h nas plantas a pleno sol as médias de A eram
semelhantes em relação àquelas obtidas às 7:00 h, apresentando uma
40
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
07:00 12:00 17:00
Período (hs)
gs (mol m
-2
s
-1
)
Pleno sol Sombreado
tendência decrescente (Tabela 1). Entretanto, nas plantas do tratamento a MS a
média obtida para A foi igual a 12,0 µmol CO
2
m
-2
s
-1
diferindo (p<0,05) em
relação às plantas do tratamento PS (7,60 µmol CO
2
m
-2
s
-1
). Em condições de
meia sombra (MS) o cafeeiro apresentou maior gs (0,21 mol m
-2
s
-1
) e E (7,80
mmol m
-2
s
-1
), indicando uma atividade fisiológica mais confortável às plantas
em comparação às plantas a pleno sol, uma vez que, nesse ambiente, a
irradiância era muito elevada (1.302 µmol m
-2
s
-1
), superior ao valor considerado
saturante (600 µmol m
-2
s
-1
) ao aparelho fotossintético do cafeeiro (Kumar e
Tieszen, 1980). Neste horário (12:00 h), houve diferença significativa (p<0,05)
em relação à Ta e Tf entre e dentro de cada tratamento (Tabela 1).
Figura 8 – Médias da condutância estomática (gs) em mudas de Coffea arabica
L. cv Obatã IAC 1669-20 cultivadas a pleno sol e a meia sombra às
7:00 h, 12:00 h e 17:00 h
41
0
2
4
6
8
10
12
07:00 12:00 17:00
Periodo (hs)
E (mmol m
-2
s
-1
)
Pleno sol Sombreado
No período estudado a temperatura foliar foi sempre inferior à
temperatura do ar, exceto ao meio dia no tratamento PS. No tratamento MS,
apesar da Ta ter superado a temperatura observada no tratamento PS a Tf foi
mais baixa. Esta elevação na temperatura da folha no tratamento PS,
proporcionada pela elevada irradiância e pela redução da gs e E influenciou a
redução das médias de A em relação às médias verificadas no tratamento MS.
Nas regiões tropicais quando a temperatura atmosférica atinge valores da
ordem de 30 ºC a 35 ºC a temperatura foliar pode chegar a 40 ºC a 45 ºC
(Kumar e Tiezen, 1980). Estes autores verificaram que A permaneceu
relativamente elevada sob 30 ºC a 35 ºC, apresentando fotossíntese líquida
nula quando a Tf chegou a 45 ºC.
Figura 9 – Médias da taxa de transpiração (E) em mudas de Coffea arabica L.
cv Obatã IAC 1669-20 cultivadas a pleno sol e a meia sombra às
7:00 h, 12:00 h e 17:00 h
42
A taxa de fotossíntese líquida às 17:00 h praticamente se manteve
inalterada nas plantas do tratamento MS em relação à avaliação efetuada às
12:00 h. Entretanto, observa-se uma tendência decrescente nos valores de A,
nas plantas do tratamento a pleno sol (PS), desde as primeira horas do dia até
ao entardecer (Figura 7). Comportamento semelhante pode ser observado em
relação à gs nas plantas do mesmo tratamento – expostas a radiação solar
(Figura 8).
4.4 Resultado da análise química foliar
Com relação aos resultados da análise química foliar verificou-se
variações nos teores de nutrientes nos momentos avaliados. O teor de N, tanto
nas plantas dos tratamentos PS quanto nas plantas do tratamento MS variou ao
longo do dia, semelhante ao comportamento apresentado pela atividade da
enzima RN. Nas plantas do tratamento PS, os teores decresceram passando de
30,7 g kg
-1
para 25,3 g kg
-1
e 20,9 g kg
-1
às 7:00 h, 12:00 h e 17:00 h nessa
ordem, aumentando, na seqüência, para uma concentração igual a 30,8 g kg
-1
às 22:00 h (Tabela 2).
Tabela 2. Resultados da análise foliar das amostras utilizadas na determinação
da atividade da redutase do nitrato em mudas de Coffea arabica L. cv
Obatã IAC 1669-20 cultivadas a pleno sol e a meia sombra
N P K Ca Mg S B Cu Mn Zn
Tratamentos horas
g kg
-1
mg kg
-1
07:00
30,7 2,9 21,5 10,4 3,3 0,8 102 13,4 136 25,8
12:00
25,3 2,5 18,4 11,8 3,0 0,8 81 12,3 158 18,9
17:00
20,9 2,3 18,4 12,3 3,0 0,8 89 7,5 144 12,2
Pleno Sol
22:00
30,8 2,7 19,1 10,8 3,1 1,1 137 9,3 140 18,4
07:00
23,8 2,2 20,7 10,8 2,7 1,1 69 13,0 152 22,7
12:00
29,8 2,4 21,4 13,0 3,2 1,3 67 12,3 145 19,1
17:00
25,6 2,1 21,4 12,7 2,8 1,3 74 7,5 141 17,2
Meia sombra
22:00
28,6 2,2 19,9 11,4 2,9 0,9 66 19,9 101 23,7
43
Nas plantas do tratamento a meia sombra (MS) a concentração de N
variou de 23,8 g kg
-1
às 7:00 h para 29,8 g kg
-1
às 12:00 h, decrescendo às
17:00 h para 25,6 g kg
-1
, aumentando, novamente, às 22:00 h para 28,6 g kg
-1
(Tabela 2).
Figura 10 – Médias do diâmetro do caule (DC), altura da planta (H), número de
folhas (NF) e número de ramos plagiotrópicos (NRP) das mudas
de Coffea arabica L. cv Obatã IAC 1669-20 cultivadas a pleno sol
e a meia sombra
Os resultados obtidos para a GS (Figura 5) evidenciam que no intervalo
entre 7:00 h e 12:00 h a enzima apresentou elevada atividade, ao passo que a
RN decresceu. A atividade da GS produz aminoácidos que podem ser utilizados
pela folha ou exportados para os drenos mais próximos como as folhas novas e
as partes em crescimento dos ramos plagiotrópicos (ápice), ao passo que uma
44
46
48
50
52
54
56
58
60
1
0
2
4
6
8
10
12
14
1
0
20
40
60
80
100
120
140
1
0
2
4
6
8
10
12
14
1
Pleno sol Sombreado
44
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
MS 100% luz MS 50% luz
menor atividade da RN pode significar uma queda na entrada de nitrogênio
inorgânico na folha. Esta redução nos teores de nitrogênio, provavelmente, se
justifica em razão do aumento do número de folhas e de ramos plagiotrópicos,
conforme ocorreu nas plantas do tratamento PS (Figura 10).
Figura 11 – Médias da matéria seca das folhas (MS) de Coffea arabica L. cv
Obatã IAC 1669-20 cultivadas a pleno sol e a meia sombra
A maior produção de fitomassa, estimada por meio da matéria seca das
folhas da muda de café, reflete as condições ecofisiológicas obtidas no
experimento. De acordo com os resultados apresentados na Figura 11, as
folhas das mudas conduzidas a meia sombra apresentaram maior quantidade
de massa do que as plantas expostas ao sol em consequência da superioridade
da taxa fotossintética durante a maior parte do período luminoso (Figura 7).
Esta observação pode ser explicada, também, pelo menor gasto de energia
para a assimilação do nitrogênio via redutase do nitrato durante o período
45
noturno. Do exposto, pode-se afirmar que as mudas de café, na fase de viveiro,
apresentam maior crescimento e desenvolvimento vegetativo quando expostas
a meia sombra (50 % de luz).
5 CONCLUSÕES
O nível de exposição à luminosidade altera a atividade da redutase do
nitrato (RN), cujo valor foi menor nas plantas a pleno sol às 12:00 h e 17:00 h.
A saturação lumínica e a maior temperatura foliar em relação ao
ambiente, às 12:00 h, diminuiu as trocas gasosas (CO
2
e vapor d’água) e a
atividade da RN.
Ao longo do período luminoso, independentemente do nível de exposição
à luminosidade, decresceu a atividade da glutamina sintetase (GS).
A disponibilidade de amônio proveniente da ação da RN no período
noturno elevou a atividade da GS, enquanto a fotorrespiração, por hipótese,
forneceu o substrato (NH
4
+
) para a atividade dessa enzima (GS) nas plantas a
pleno sol ao meio dia.
A inibição da redutase do nitrato (RN) no cafeeiro propordionada pela
fotorrespiração se dá, por hipotese, em resposta a produção de glutamina por
meio da atividade da glutamina sintetase (GS).
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