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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
TARCIANA CARVALHO GURGEL DE AZEVEDO
AÇÃO DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE Fucus
vesiculosus NA HEMOSTASIA E NO SISTEMA COMPLEMENTO
NATAL
2006
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TARCIANA CARVALHO GURGEL DE AZEVEDO
AÇÃO DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE Fucus
vesiculosus NA HEMOSTASIA E NO SISTEMA COMPLEMENTO
Dissertação apresentada ao
Departamento de Bioquímica da
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em
Bioquímica.
Orientadora Prof
a
: Dr
a
Edda Lisboa Leite.
NATAL
2006
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Divisão de Serviços Técnicos
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede
Azevedo, Tarciana Carvalho Gurgel de.
Ação de polissacarídeos sulfatados de Fucus Vesiculosus na
Hemostasia e no sistema complemento / Tarciana Carvalho Gurgel de
Azevedo. – Natal, RN, 2006.
113 f.
Orientador : Edda Lisboa Leite.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do
Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-graduação em
Bioquímica.
1. Algas marinha – Dissertação. 2. Polissacarideos - Dissertação..
3. Fucanas - Dissertação.. 4. Heparinas – Dissertação.. 5 Atividade
anticoagulante – Dissertação.. 6. Agregação plaquetária - Dissertação. 7.
Atividade anti-hemostática - Dissertação. 8. Sistema complemento -
Dissertação. I. Leite, Edda Lisboa. II. Título.
RN/UF/BCZM CDU 639.64
TARCIANA CARVALHO GURGEL DE AZEVEDO
AÇÃO DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE Fucus vesiculosus NA
HEMOSTASIA E NO SISTEMA COMPLEMENTO
Dissertação apresentada ao
Departamento de Bioquímica da
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em
Bioquímica.
Aprovado em: _____/_____/_____
BANCA EXAMINADORA
____________________________________________________
Prof
a
. Dr
a
. Edda Lisboa Leite
Departamento de Bioquímica – UFRN
Orientadora
____________________________________________________
Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha
Departamento de Bioquímica – UFRN
1º Examinador
______________________________________________
______
Prof
a
. Dr
a
.Norma Maria Benevides
Departamento de Famacologia da UFC
2º Examinador
Dedico esta obra
Aos meus pais Tarcísio Gurgel de Azevedo e Maria Nazaré Carvalho de
Azevedo, pelo incentivo, carinho, compreensão, ajuda, por ter me dado a
base e a segurança que todos nós precisamos, apoiando-me em todos os
sentidos da minha vida, seja ela profissional ou pessoal.
A minha irmã Taísa Gurgel que sempre ouviu as minhas “loucuras” me
permitindo sonhar e lutar pelo o que almejava.
A minha segunda mãe, Maria Ferreira uma das melhores pessoas que já
conheci na vida. Com ela aprendi o significado de generosidade e humildade.
A professora Edda Lisboa Leite que tem sido mais que uma orientadora, uma
amiga, confidente e em muitos momentos uma mãe.
Ao meu amigo Cypriano Neto, um exemplo de força, luta e antes de tudo um
verdadeiro amigo.
A Maria das Graças Bezerra (in memorian), enquanto viva sempre acreditou
nesta vitória e agora ausente sei que esta feliz por esta conquista. Com ela
aprendi a valorizar cada momento da vida, não importando em que
circunstância esteja.
Uma confissão:
Quando resolvi fazer mestrado na bioquímica, lembro que uma das minhas
dificuldades foi arrumar um orientador na “última hora”, tentei inúmeras vezes,
mas como eu sempre deixo tudo para a véspera, todos os professores do
departamento já tinham um aluno para orientar. Mas eu estava decidida,
queria por que queira fazer mestrado na bioquímica. Então, Suely a quem
primeiro eu fui recorrer, mas na época não podia ser minha orientadora
(estava com viagem marcada para fazer o seu Pós-Doc) conversou comigo e
disse que ia falar com a professora Edda.
Tudo bem, eu disse, mas fiquei a pensar, Meu Deussssss quem é Edda???
Descendo a escada, para fazer “aquele lanche” lá na cantiga da Mariquinha,
encontro Ivan, um amigo da Bioquímica, e pergunto informações sobre a
professora Edda.
A resposta?
Simples: ELA É UMA MÃE!
Na hora eu não acreditei, mas hoje....
Professora Edda, fico muito honrada de ter tido a senhora como a minha
orientadora, espero sempre lembrar do exemplo da enorme dedicação,
paciência, incentivo que a senhora sempre teve com seus alunos e um dia
poder ter e empregar tamanha sabedoria.
Muito obrigada por tudo o que a senhora contribuiu na minha vida.
Simmmmm, pq hj eu sou mais uma que diz: A PROFESSORA EDDA É UMA
MÃE.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, por me oferecer condições para realizar este
trabalho.
A minha família, meu pais Maria Nazaré e Tarcísio Gurgel, minha irmã
Taísa, minha segunda “mãe” Maria Ferreira, aos meus tios e primos que
sempre torceram por mim e me incentivaram em todos os momentos.
“Vocês são as estruturas e as interações moleculares da minha existência”.
Amo vocês.
A Maria Emília (Mila), Cybelle (Cyba), André Viana (Magão), Maria Lúcia
(Minha rosa), Cypriano (Neto), Fabiano (Fafi), Júlio César (Cesinha),
Cleysyvan (Nano), Sara (Adotada), Micheline (não sei se digo, rsrsrsrsrs),
Cypriano (Neto), Caroline Adisson que ajudaram no término deste trabalho.
Agradeço não só pelo trabalho realizado, mas principalmente pelo apoio
moral, pelo carinho, respeito e cuidado que vocês tiveram comigo.
O que seria de mim sem vocês??? Muito obrigada. AMO Vocês!
As minhas irmãzinhas de laboratório Celina (Cel-Dore-Davi), Cybelle
(Cyba), Leila (Leiloca), Micheline (Galega, vou amenizar), Caroline (Carol),
Glória (Não tem), Maria Emília (Mila), Sara (adotada), Lissandra
(Lizzandra), Marília (Filha de Creuza), Gabriela (Gabi), Viviane (Vivi), e aos
meus irmãozinhos Leonardo (Léo), Júlio César (Cesinha) e Fernando
(Nando). Muito obrigada pela paciência, e pelos momentos de alegria.
À professora Drª Selma Jerônimo, coordenadora do curso de Pós-
Graduação da Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
À minha orientadora Professora Drª Edda Lisboa Leite, que com muita
sabedoria me apoiou para realização deste trabalho, contribuindo com seus
conhecimentos, dando importantes sugestões e críticas. Além de ser uma
amiga e em muitos momentos uma mãe. Obrigada também pela enorme
paciência (e olha que não foi pouca) e compreensão.
Aos professores do Departamento de Bioquímica: Fernanda Wanderley,
Suely Ferreira, Elizeu Antunes, Maurício Pereira, Selma Jerônimo, Dilma
Ferreira, Carlos Bola, Jacira Maria, José Fernandes, Hugo Alexandre, Luiz
Abreu, Roberto Dimenstein, Luciana Mata, João Felipe – todos sempre
dispostos a me ajudarem nos momentos em que precisei, muito obrigada!
A banca de qualificação, professores Elizeu e Geraldo pelas importantes
sugestões e críticas, contribuindo na elaboração deste trabalho. Obrigada!
Aos meus amigos da turma do mestrado que conviveram comigo nessa
caminhada: Vanessa Olinto, Anne Shyrley, Lucia Lira, Ádila Lorena,
Fabiano Texeira, Celina Dore, Caroline Adisson, Natália Petersen. Obrigada
pelo ombro amigo que em muitos momentos foi preciso.
A todos os meus amigos e colegas. Não irei citar nomes, pois a lista seria
imensa e correria o risco de esquecer alguém.
Aos funcionários do Departamento: Creuza, Eliene, D. Ana, Marcos,
Mônica, Sr. Itamar, Jonas, Michelly Trigueiro, Kildare, Ana Katarina e
Margarita. Vocês foram muito importantes.
A Mariquinha e os demais da cantina do Biociências.
Aos meus filhinhos coelhos Frederico e Lisbela que literalmente doaram o
sangue para a realização desse trabalho.
Aos funcionários do Hemonorte, em especial a doutora Maria Salete
Cesário que me ajudou inúmeras vezes. Muito obrigada pela confiança
depositada.
A minha primeira orientadora Teresa Mota e os demais integrantes da base de
comportamento reprodutivo animal, em especial Lenilde Miranda, Maricele e
Silvia Beatriz. Vocês contribuíram com os meus primeiros passos na minha
vida científica. Muito obrigada.
Aos doadores do Hemonorte que também doaram o sangue para esse
trabalho.
Aos órgãos financiadores CNPq e CAPES que tornaram possível a
realização deste trabalho.
A todos que de forma direta ou indireta contribuíram para esta conquista.
A mente que se abre a uma nova idéia
jamais voltará ao seu tamanho original.
Albert Einstein
RESUMO
Fucanas são uma família de homo e hetero polissacarídeos sulfatados,
formadas por uma cadeia central com ligações Į-(1ĺ2) ou Į-(1ĺ3) unidas através
de resíduos de L-fucose. Propriedades como a habilidade para agir como um
anticoncepcional, reduzir níveis de colesterol, e agir como um agente anti-tumoral
foram relatadas. Nós focalizamos nossa atenção nas propriedades anticoagulantes,
agregação plaquetária, atividade anti-hemostática e sistema de complemento in vitro
do fucoidan comercial e das frações F1, F2 e F3 de Fucus vesiculosus obtidas
através do fracionamento do fucoidan por preciptação com acetona (1, 2 e 3v). A
atividade anticoagulante dos compostos foi avaliada pelo tempo de tromboplastina
parcial ativado (APTT) e o tempo de protrombina (PT) usando plasma humano
citratado. Os resultados do teste de APPT mostraram que o Fucoidan (F) e as
frações F1 e F2 têm altas atividades anticoagulantes 240,0 s (5 µg), enquanto que a
F3 mostrou 73,7s nas mesma concentração. Os resultados obtidos com PT para o F,
F1, F2 e F3 foram 81,5 s, 120,0 s, 57,1 e 32,5 s respectivamente usando a massa
de 50 µg. A dessulfatação do Fucoidan demonstrou uma diminuição da atividade
anticoagulante nos dois testes. O ensaio de agregação plaquetária foi realizado no
agregometro de acordo com o método de Born. A agregação plaquetária induzida
pelo fucoidam e pelas frações de F1, F2 e F3 exibiram uma resposta bifásica na
concentração de 5 mg/mL com amplitude máxima de agregação de 76,36% ± 10,3%;
69,54% ± 9,40%; 75,94% ± 9,01%; 51,13% ± 9,59% respectivamente. Porém, na
concentração 0,1 mg/mL foi observada um perfil hipoagregante para o Fucoidan
(15,17% ± 5,2) e para as frações F1 (7,4% ± 3,04%), F2 (19,1% ± 5,41) e F3 (5,09%
± 3,02%). A atividade anti-hemostática foi realizada com ratos machos da linhagem
Wistar e demonstrou que estes compostos têm efeito hemorrágico residual menor do
que o da heparina. A ação dos polissacarídeos fucosilados sulfatados na via
alternativa do sistema complemento foi realizada através da utilização de eritrócitos
de coelhos não sensibilizados. Os resultados para o Sistema Complemento
mostraram que o F, F2 e F3 têm ação neste sistema, apresentando efeito inibitório
em relação ao grupo controle 0,544, 0,697, 0,622 e 0,958 respectivamente.
Interações dos polissacarídeos com as proteínas C3 e C4 demonstraram que a
fração F1 estimula a atividade hemolítica do complemento usando eritrócitos de
coelho. Concluímos que estes açúcares têm atividade anticoagulante e atuam como
inibidores do sistema complemento sendo uma valiosa droga que pode ser
empregada em doenças relacionadas com inflamação e coagulação sangüínea.
Palavras-chave: Fucanas. Heparinas. Atividade anticoagulante. Agregação
plaquetária. Atividade Anti-hemóstatica. Sistema complemento.
ABSTRACT
Fucans are a family of sulfated homo and heteropolysaccharides respectively,
composed mainly of D- (1o2) and D- (1o3) linked by L-fucose residues. Properties
such as the ability to act as an anti-contraceptive, to reduce cholesterol levels, and to
act as an anti-tumor agent are much related. We have focused our attention on the
anticoagulant properties, platelet aggregation, hemorrhagic activity and complement
system in vitro of commercial fucoidan (F) and their purified fractions (F1, F2 and F3)
from Fucus vesiculosus obtained from fractionation of the fucoidan with different
concentrations of acetone 1, 2 and 3v. These compounds were chemically
characterized and the fucoidan (F) was modified by desulfation. The anticoagulant
activity of the compounds was assessment by activated partial thromboplastin time
(APTT) and prothrombine time assay (PT) using citrated normal human plasma. The
results of APPT test showed that F, F1 and F2 have high anticoagulants activities
240.0 s (5 µg). The F3 showed 73.7 s in the same concentrations. The results
obtained with PT test to F, F1, F2 and F3 were 81.5 s, 120.0 s, 57.1 and 32.5 s
respectively with 50 µg. The dessulfated polymer showed a decrease in the
anticoagulant activity in these two tests. Platelet aggregation assay was measured
turbidimetrically with platelet aggregometer by method of Born. The aggregation
platelet with F and fractions F1, F2 and F3 exhibited a two-phase answer in the
concentration of 5 mg/mL with maximum aggregation of 76.36 ± 10.3% ; 69.54 ±
9.40%; 75.94 ± 9.01%; 51.13 ± 9.59% respectively. However, was observed a
hipoaggregate profile F (15.17 ± 5.2%), F1 (7.40 ± 3.04 %), F2 (19.1 ± 5.41%) and
F3 (5.09 ± 3.02%) at 0.1 mg/mL. The hemorrhagic activity assay was carried in
Wistar rats and showed that these compounds have low hemorrhagic effect when
compared to heparin. The complement system ( alternative pathway was made using
non-sensibilized rabbit red blood cells The results of complement system essay
showed that F , F2 and F3 have action inhibitory in relation to the group control
0.544, 0.697, 0.622 and 0.958 respectively The results showed that these
compounds have action on this system. Interaction of the polisaccharides with
proteins C3 and C4 showed that the fraction F1 stimulated the activity assay
hemolytic using red blood cells.
Key-words: Fucans; Heparins; Anticoagulant activitity; aggregation platelet;
hemorrhagic activity; Complement system.
LISTA DE ABREVIATURAS/ SIGLAS
ADP Adenosina difosfato
Anti-C3 Anticorpos monoclonais para C3
Anti-C4 Anticorpos monoclonais para C4
APTT Tempo de tromboplastina parcialmente ativada
Arg Arginina
AT Antitrombina
Bb Fragmento do Fator B do sistema complemento
C2 Proteína do complemento
C2b Fragmento da proteína C2 do complemento
C3b Fragmento da proteína C3 do complemento
C4b Fragmento da proteína C4 do complemento
C5 Proteína do complemento
C5b-7 Complexo protéico das proteínas do complemento formado na
membrana na membrana da célula alvo
C6 Proteína do complemento
C7 Proteína do complemento
C8 Proteína do complemento
C9 Proteína do complemento
CAMs moléculas de adesão celular
DAF Fator de aceleração de decaimento
DMSO Dimetilsulfóxido
EDTA Etileno Diamino tetraacetato de sódio
EGTA Ácido Bis(2- aminoetil) etilenoglicol-N,N,N’,N’-tetraacético
Enox Enoxeparina
F Fucoidan
F1 Fração F1
F2 Fração F2
F3 Fração F3
Fator B Proteína do complemento
Fator D Serino protease do sistema complemento
FDS Fucoidan dessufatado
FIII Fator tecidual
FIX Fator de Chistmas
FPD Fucoidan parcialmente dessulfatado
FV Fator V- Pró acelerina
FVII Fator VII – Pró convertina
FVIII Fator VIII- Fator anti-hemofílico
FvW Fator de Von Willebrand
FX Fator X- Fator Stuart
FXI Fator XI – Tromblopastina plasmática
FXII Fator XII- Fator de Hageman
GPIIb-IIIa Glicoproteína de integração IIb-IIIa
GPIb-IX- V Glicoproteína de adesão plaquetária
HBPM Heparina de Baixo peso molecular
HSo Controle hemólise realizada pelas proteínas do soro
ICAMs Molécula de adesão intracelulares
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
IL 2 Interleucina 2
IL 6 Interleucina 6
IL 8 Interleucina 8
Liq Liquemine
M Molar
MAC Complexo de ataque à membrana
nm namometro
NO Óxido nítrico
PACKS-4 PLatetet aggregation Chomogenic kinetics Sytem-4
PCa Proteína C ativada
PDA 1,3 diaminopropano acetato
PF4 Fator plaquetário
PGL
2
Prostaciclinas
PLa Plasmina
PLG Plasminogênio
PPP Plasma pobre em plaquetas
PRP Plasma rico em plaquetas
PT Tempo de protrombina
RCA Regulador da ativação do complemento
rpm Rotação por minuto
SC Sistema complemento
TAFI Inibidor da fibrinólise ativado pela trombina
TFPI Inibidor da via do fator teidual
TNF Į Fator de necrose tumoral
TRC Receptores tioll-like
TXA
2
Tromboxano A
2
Val Valina
4-BTG Fator de crescimento
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 Agregação plaquetária....................................................................... 26
Figura 02 Vias intrínseca e extrínseca da coagulação sangüínea e
mecanismos inibidores........................................................................ 28
Figura 03 Vias de ativação e mecanismo de regulação do Sistema
complemento...................................................................................... 35
Figura 04 Fucus vesiculosus............................................................................... 44
Figura 05 Esquema representativo da atividade anti-hemostática..................... 54
Figura 06 Atividade anticoagulante (APTT) dos polissacarídeos sulfatados ..... 60
Figura 07 Atividade anticoagulante (PT) dos polissacarídeos sulfatados .......... 61
Figura 08 Influência do sulfato na Via intrínseca da coagulação (APTT)........... 62
Figura 09 Influência do sulfato na Via extrínseca da coagulação (PT)............... 63
Figura 10 Perfis das agregações plaquetárias induzidas pelos polissacarídeos
sulfatados fucosilados......................................................................... 66
Figura 11 Influência do sulfato nos perfis das agregações plaquetárias
induzidas pelo Fucoidan e pelo Fucoidan dessulfatado.
.................... 67
Figura 12 Perfil de uma onda bifásica da agregação plaquetária....................... 69
Figura 13 Perfis de ondas de agregações plaquetárias induzidas pelos
agentes agonistas ADP, Colágeno e Epinefrina ................................ 70
Figura 14 Gráficos das agregações plaquetárias induzidas pelo Fucoidan e
pelas frações F1, F2, F3 ................................................................. 72
Figura 15 Perfis normoagregados frente aos agentes agonistas ADP,
Colágeno, Fucoidan e Fucoidan dessulfatado................................... 74
Figura 16 Perfis normoagregados frente aos agentes agonistas Colágeno,
Fucoidan e Fucoidan dessulfatado e perfil hipoagregado frente ao
ADP.................................................................................................... 75
Figura 17 Atividade anti-hemostática dos polissacarídeos sulfatados em
função do tempo................................................................................. 77
Figura 18 Efeito hemorrágico residual do Fucoidam e do Fucoidam
dessulfatado de Fucus vesiculosus em função do tempo.................. 78
Figura 19 Efeito das diversas concentrações do Fucoidan (F) na via alternativa
do Sistema Complemento................................................ 80
Figura 20 Efeito das diversas concentrações da fração F1 na via alternativa do
Sistema Complemento................................................................... 81
Figura 21 Efeito das diversas concentrações da fração F2 na via alternativa do
Sistema Complemento................................................................. 82
Figura 22 Efeito das diversas concentrações da fração F3 na via alternativa do
Sistema Complemento.................................................................. 83
Figura 23 Efeito das diversas concentrações da heparina não fracionada
(Liquemine) na via alternativa do Sistema Complemento.................. 84
Figura 24 Efeito das diversas concentrações da heparina de baixo peso
molecular (Enoxeparina) na via alternativa do Sistema
Complemento..................................................................................... 86
Figura 25 Comparação dos polissacarídeos fucosilados e heparinas não
fracionada e de baixo peso molecular que possuem efeitos
inibitórios na via alternativa do Sistema Complemento..................... 88
Figura 26 Efeito das diversas concentrações do Fucoidan e do Fucoidan
dessulfatado na via alternativa do Sistema Complemento................. 89
Figura 27 Influência dos polissacarídeos sulfatados na quantificação da
proteína C3 do Sistema Complemento............................................... 91
Figura 28 Influência dos polissacarídeos sulfatados na quantificação da
proteína C4 do Sistema Complemento............................................... 92
Figura 29 Influência do sulfato na quantificação da proteína C3........................ 94
Figura 30 Influência do sulfato na quantificação da proteína C4........................ 95
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 Componentes químicos dos polissacarídeos sulfatados ........... 58
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...................................................................................... 23
1.1. HEMOSTASIA....................................................................................... 23
1.2. A VASOCONSTRICÇÃO...................................................................... 24
1.3. TAMPÃO PLAQUETÁRIAO.................................................................... 24
1.4. COAGULAÇÃO SANGÜÍNEA............................................................... 27
1.5. FIBRINÓLISE ....................................................................................... 29
1.6. MECANISMOS REGULADORES DA HEMOSTASE............................ 29
1.7. INTERAÇÃO ENTRE OS MECANISMOS REGULADORES DA
HEMOSTASE E DA INFLAMAÇÃO....................................................... 31
1.8. O SISTEMA COMPLEMENTO.............................................................. 32
1.9. REGULAÇÃO DO SISTEMA COMPLEMENTO.................................... 33
1.10. DROGAS QUE ATUAM NO SISTEMA COMPLEMENTO..................... 36
1.11. HEPARINAS PADRÃO E DE BAIXO PESO MOLECULAR............. 37
1.12. POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DAS ALGAS MARINHAS ......... 40
2. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................... 44
2.1. MATERIAIS........................................................................................... 44
2.1.1. Alga marinha....................................................................................... 44
2.1.2. Animais................................................................................................ 44
2.1.3. O sangue humano (Plasma e soro).................................................... 45
2.1.4.
O sangue de coelho (eritrócitos)........................................................ 45
2.1.5. Outros materiais.................................................................................. 45
2.2. Aparelhos.............................................................................................
47
2.3. MÉTODOS............................................................................................ 48
2.3.1. Fracionamento e caracterização da população de Fucoidans
obtidos de Fucus vesiculosus............................................................. 48
2.3.2. Análises químicas................................................................................. 48
2.3.2.1. Açúcares totais...................................................................................... 48
2.3.2.2. Proteína.................................................................................................. 49
2.3.2.3. Sulfato.................................................................................................... 49
2.3.3. Dessulfatação........................................................................................ 49
2.3.4. Atividade anticoagulante...................................................................... 50
2.3.4.1. Tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT).............................. 50
2.3.4.2. Tempo de protrombina (PT)................................................................. 51
2.3.5. Agregação plaquetária......................................................................... 51
2.3.5.1. Plasmas rico em plaquetas (PRP) e pobre em plaquetas (PPP)...... 51
2.3.5.2. Ensaio de agregação plaquetária........................................................ 52
2.3.6. Atividade anti-hemostática.................................................................. 52
2.3.6.1. Ensaio da atividade anti-hemostática................................................. 52
2.3.7. Sistema Complemento.......................................................................... 55
2.3.7.1. Sistema Complemento (via alternativa).............................................. 55
2.3.7.2. Ação dos polissacarídeos sulfatados na proteína C3 e C4 do
Sistema Complemento.......................................................................... 56
2.3.8. Análise Estatística................................................................................ 57
3. RESULTADOS........................................................................................ 58
3.1. PERFIL E CARACTERIZAÇÃO DAS FRAÇÕES OBTIDAS DO
FUCOIDAN DE FUCUS VESICULOSUS............................................... 58
3.2. ATIVIDADE ANTICOAGULANTE........................................................... 59
3.2.1. A avaliação in vitro da ação anticoagulante dos polissacarídeos
sulfatados na via intrínseca (APTT) e extrínseca (PT) da cascata
de coagulação....................................................................................... 59
3.2.2. Efeito do sulfato na via intrínseca (APTT) e extrínseca (PT) de
coagulação............................................................................................. 61
3.3. AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA............................................................... 63
3.3.1. Perfil da agregação plaquetária induzida por ADP, Colágeno e
Epinefrina. ........................................................................................... 64
3.3.2. Indução da agregação plaquetária pelos polissacarídeos
fucosilados............................................................................................ 65
3.3.3. Influência do sulfato no perfil das agregações plaquetárias
induzidas pelo Fucoidan e pelo Fucoidan dessulfatado................... 67
3.3.4. Análise dos traçados de onda induzidos pelos agentes agonistas
(ADP a 3 PM, Colágeno a 5 Pg/mL, Epinefrina a 10 Pg/mL)...............
70
3.3.5. Análise dos traçados de onda induzidos pelo Fucoidan e pelas
frações de Fucus vesiculosus...................... ..................................... 71
3.3.6. Comparação das vias de ativação plaquetária induzida pelos
agentes agonistas (ADP, Colágeno, Fucoidan e pelo Fucoidan
dessulfatado)......................................................................................... 73
3.4. ATIVIDADE ANTI-HEMOSTÁTICA (EFEITO HEMORRÁGICO
RESIDUAL)............................................................................................. 75
3.4.1. Avaliação do efeito hemorrágico residual dos polissacarídeos
sulfatados nas concentrações 25, 50 e 100 Pg/mL............................
75
3.4.2. Influência do sulfato no efeito hemorrágico do Fucoidan e do
Fucoidan dessulfatado......................................................................... 78
3.5. SISTEMA COMPLEMENTO................................................................. 79
3.5.1. Efeito do Fucoidan na via alternativa do Sistema Complemento.... 79
3.5.2. Efeito da fração F1 na via alternativa do Sistema Complemento..... 80
3.5.3. Efeito da fração F2 na via alternativa do Sistema Complemento..... 81
3.5.4. Efeito da fração F3 na via alternativa do Sistema Complemento.... 82
3.5.5. Efeito da heparina não fracionada (Liquemine)na via alternativa do
Sistema Complemento.................................................................... 83
3.5.6. Efeito da heparina de baixo peso molecular (Enoxeparina) na via
alternativa do Sistema Complemento................................................. 85
3.5.7. Comparação dos efeitos inibitórios dos polissacarídeos
sulfatados sobre o Sistema Complemento......................................... 87
3.5.8. Influência do sulfato na via alternativa do Sistema Complemento.. 88
3.5.9. Ação de polissacarídeos sulfatados sobre a proteína C3 do
Sistema Complemento.......................................................................... 90
3.510. Ação de polissacarídeos sulfatados sobre a proteína C4 do
Sistema Complemento......................................................................... 91
3.5.11. Influência do sulfato na dosagem de C3 e C4 do Sistema
Complemento........................................................................................ 93
4. DISCUSSÃO.......................................................................................... 96
5. CONCLUSÕES..................................................................................... 110
REFERÊNCIAS.................................................................................... 112
Introdução
23
1. INTRODUÇÃO
1.1. Hemostasia
Toda a ruptura da parede vascular e, conseqüentemente, o extravasamento
de sangue poderão gerar um fluxo sangüíneo insuficiente para manter funções
teciduais normais, isto é, a diminuição de nutrientes para os tecidos e o retardo na
retirada de metabólitos (BAPTISTA-SILVA, 2004). Sendo assim, após uma lesão da
parede vascular, ocorrerá no local da injúria uma série de mecanismos
hemodinâmicos e bioquímicos que asseguram a obstrução da lesão e o controle da
hemorragia, a hemostase.
Sempre que o vaso é lesionado ou rompido, a hemostase é acionada através
da vasoconstricção, formação do tampão plaquetário, formação do coágulo
sanguíneo, e a sua posterior dissolução. Nestas etapas, ocorrem interações entre
componentes teciduais, proteínas plasmáticas, receptores celulares que não
somente permitem a formação rápida de coágulos sólidos para bloquear pontos de
ruptura ou lesão nos vasos, como também permitem que o sangue permaneça
líquido e sem coágulos dentro do sistema vascular (REVEL; DOGHMI, 2004).
Devido à hemostasia o organismo permanece equilibrado, sem perdas de
sangue, porém, a hemostasia precisa ser controlada por mecanismos inibidores,
pois do contrário, a sua ativação indevida pode levar a formação de trombos
sangüíneos e deposição dos coágulos na parede vascular ocasionando à oclusão
dos vasos e, conseqüentemente, o comprometimento da irrigação sangüínea de
diversos órgãos (DAHLBÄCK, 2005). Além disso, a ativação excessiva da
hemostase poderá também desencadear uma resposta inflamatória (STRUKOVA,
Introdução
24
2001) que compromete o sistema da anticoagulação, contribuindo desta forma, com
a intensificação da hemostase (FRANCHINI; LIPPI; MANZATO, 2006).
1.2. A vasoconstricção
Logo após a ruptura de um vaso sangüíneo, ocorre no local traumatizado
uma contração que restringe o calibre vascular e conseqüentemente diminui a perda
de sangue através da redução do fluxo sangüíneo, fornecendo certo estase
circulatório que favorece as etapas seguintes da hemostase.
Os reflexos vasoconstrictores são resultados das células musculares lisas,
dos reflexos nervosos, de fatores hormonais como a endotelina proveniente das
células endoteliais ou da serotonina e do tromboxano A2 (TXA
2
) provenientes das
plaquetas (GRIENDLING; ALEXANDER, 1996).
No entanto, a vasoconstricção reduz a perda de sangue, porém não a
paralisa. Entre os mecanismos que bloqueiam a perda de sangue após uma injúria
vascular, temos o tampão plaquetário e a formação do coágulo sangüíneo (REVEL;
DOGHMI, 2004).
1.3. Tampão Plaquetário
Sob trauma vascular e tecidual, as plaquetas rapidamente aderem ao local
injuriado e se agregam formando um tampão hemostático (RAND; LEUNG;
PACKHAM, 2003), ver figura 01. A adesão se inicia com a interação das plaquetas
com constituintes presentes no subendotélio, principalmente, devido à ligação das
plaquetas com o colágeno e o fator de Von Willebrand (FvW). Essa interação
Introdução
25
proporciona a ativação de mecanismos intracelulares (ativação plaquetária) que
ocasiona, mudanças na forma esférica da plaqueta, com formação de pseudópodes
e secreção do conteúdo dos seus grânulos, além de ativar a integrina plaquetária
GPIIb-IIIa que se liga ao fibrinogênio e medeia a agregação entre as plaquetas,
formando assim, o tampão plaquetário (ANDREWS; BERNDT, 2004).
A secreção dos agentes agonistas contidos nos grânulos plaquetários como a
adenosina difosfato (ADP), tromboxano A
2
(TXA
2
) e serotonina (KINLOMGH-
RATHBONE; MURTARD, 1999) promovem o recrutamento de mais plaquetas ao
local da injúria, além de promover a ativação de outras plaquetas, devido à ligação
destes agonistas a receptores da superfície plaquetária, reforçando a agregação
dependente da integrina GP IIb/IIIa (XINONG , et al., 2003).
Introdução
26
Figura 01: Agregação plaquetária. A figura mostra o mecanismo de adesão, ativação e agregação
plaquetária. Legenda: GP Ia/IIa- Glicoproteína de adesão plaquetária ao colágeno, GP Ib/Ix/V-
Glicoproteína de adesão plaquetária via colágeno e fator de Von Willebrande (FvW); GP IIb/IIa-
Glicoproteína de agregação via fibrinogênio; ADP- adenosina difosfato; PF4- Fator plaquetário 4.
BTG- Fator de crescimento; P-sel- P-selectina; D- Grânulos densos plaquetários; D- Grânulos alfa
palquetários.
Adaptado de: http://referencelab.clevelandclinic.org/images/PlateletAdhesionActiviationAggregatio.jpg
Acessado em: 12/12/2005
Introdução
27
1.4. Coagulação sangüínea
A rápida geração de uma barreira física no local da injúria vascular, obtida
com a formação do tampão plaquetário, é incapaz de vencer por muito tempo o fluxo
sangüíneo por ser uma barreira frágil e temporária, requerendo, então, uma
consolidação secundária. Esta consolidação é alcançada através de uma rede de
proteínas e células formando uma estrutura sólida, o coágulo sangüíneo (REVEL;
DOGHMI, 2004).
A formação do coágulo de fibrina ou coágulo sangüíneo envolve complexas
interações e reações em cascata entre proteases plasmáticas e seus cofatores,
culminando na ativação da enzima trombina que, por proteólise, converte o
fibrinogênio solúvel em fibrina insolúvel (COLMAN, et al., 2001), conforme
demonstrado na figura 02. Essas reações em cascata iniciam-se após o contato do
fator XII com a superfície mediadora de ativação, por exemplo, o colágeno do
subendotélio ativando a via intrínseca da cascata de coagulação ou através da
ligação do fator VII com o fator tecidual (FIII) que ativa a via extrínseca da cascata
de coagulação. Essas duas vias de ativação convergem a uma via comum
resultando na conversão da protrombina em trombina (BUTENAS; MANN, 2002;
FRANCO, 2001).
A trombina gerada, além de converter o fibrinogênio em fibrina, também
promove algumas reações de feedback positivo, convertendo alguns fatores de
coagulação (FXI, FVIII, FX, FV, protrombina) na sua forma proteoliticamente ativa
e/ou ligando-se a receptores presentes na superfície plaquetária estimulando ainda
mais a agregação das plaquetas (FURIE; FURIE, 2000).
Introdução
28
Figura 02: Vias intrínseca e extínseca da coagulação sangüínea e mecanismos inibidores. A figura
mostra as duas cascatas de coagulação sanguínea e seus fatores. Via intrínseca: XII- Fator XII (Fator
de Hageman); XI- Fator XI (Tromboplastina plasmática); IX- Fator IX (Fator de Christmas); X- Fator X
(Fator Stuart); VIII- Fator VIII (Fator anti-hemofílico); V- Fator V (Pró-acelerina). Via extrínseca: FIII-
Fator tecidual; VII- Fator VII (Pró convertina). Via comum: II- Fator II e IIa (Protrombina e trombina
respectivamente); PL- Fosfolipídeos; Ca
2+
- Íon Cálcio; FXIII- Fator XIII (Fator estabilizador de fibrina).
Em vermelho, proteínas inibidoras das vias da coagulação sangüínea. PCA - Proteína C ativada;
TFPI- Inibidor da via do fator tecidual.
Adaptado de: http://ethesis.helsinki.fi/julkaisut/mat/bioti/vk/wartiovaara/review.html
Acessado em: 05/02/2005
Introdução
29
1.5. Fibrinólise
Completada a formação do coágulo sangüíneo, o vaso deve ser restaurado
para que assim aconteça o restabelecimento do fluxo sangüíneo. Sendo assim, além
da regeneração da parede do vaso é necessário que ocorra também a dissolução do
coágulo, ou seja, a fibrinólise.
A fibrinólise pode ser definida como a degradação da fibrina mediada pela
plasmina. Este sistema tem por base a ativação de uma pró-enzima, o
plasminogênio (PLG), que depois de ativado se transforma na plasmina (PLa), uma
proteína com capacidade de degradar a fibrina. Essa conversão do PLG em PLa é
mediada pela ação dos ativadores do plasminogênio do tipo tecidual (t-PA) e do tipo
uroquinase (U-PA). Os dois ativadores têm alta especificidade de ligação com o seu
substrato, o PLG, promovendo a hidrólise de uma única ponte peptídica (arg-560,
val-561) resultando na formação da plasmina. Além da fibrina a plasmina também
degrada o fibrinogênio, o fator V e o fator VIII (CESARMAN-MAUS; HAJJAR, 2005).
1.6. Mecanismos reguladores da hemostase
Um desequilíbrio no sistema fibrinolítico que conduza a um aumento
exagerado da sua atividade ou a uma diminuição significativa da sua capacidade
lítica, poderá resultar, respectivamente, numa situação hemorrágica ou trombótica.
FAY, et al.,1992; KOLEV; MACHOVICH, 2003).
A dissolução da fibrina é regulada pela ação dos inibidores da ativação do
plasminogênio (PAIs), pela ação dos inibidores da plasmina, tal como o D2-
antiplasmina ou através do inibidor de fibrinólise ativado pela trombina (TAFI)
Introdução
30
(COLLEN, 1999) Além da dissolução, a formação da fibrina também é regulada.
Entre as três importantes proteínas que controlam a formação do coágulo
sangüíneo, temos a antitrombina (AT), o inibidor da via do fator tecidual (TFPI) e a
Proteína C ativada (Figura 02).
A antitrombina exerce o seu papel como anticoagulante através da inibição da
trombina, dos fatores Xa, XIIa, XIa, IXa, da plasmina e da calicreína. Além disso, na
presença da heparina ou heparam sulfato endotelial ocorre uma potencialização da
capacidade inibitória da antitrombina (SOUTER, et al., 2001).
O inibidor da via do fator tecidual bloqueia a ação do complexo fator VIIa/FIII
ao se ligar com o fator Xa. Essa ligação ao fator Xa é necessária para que o TFPI
exerça seu papel inibitório sobre o complexo VIIa/FIII (GORBET ; SEFTON, 2004).
Outra molécula importante no controle da coagulação é a proteína C ativada
(PCa). A ligação da trombina à trombomodulina presente na superfície das células
endoteliais ativa a proteína C, uma vez esta esteja ligada ao receptor endotelial de
Proteína C (EPCR). A PCa inativa os fatores Va e VIIIa, bloqueando a geração da
trombina. Este processo é potencializado pela ação do seu cofator não enzimático, a
proteína S (PS) (COLMAN, et al., 2001).
A produção de óxido nítrico (NO) e prostaciclinas (PGI
2
) pelo endotélio
também são pontos de regulação da hemostase. Através da produção de NO e PGI
2
o endotélio participa do relaxamento da musculatura lisa vascular em resposta
antagônica a agentes vasoconstrictores como a serotonina e a trombina
(MONCADA; PALMER; HIGGS, 1991; GRYGLEWSKIJ, 1995). As PGI
2
além de
serem antiagregantes plaquetários, também impedem a adesão dos trombócitos ao
endotélio (CARTER ; PEASSON, 1992).
Introdução
31
1.7. Interação entre os mecanismos reguladores da hemostase e da inflamação
As vias anticoagulantes naturais não só limitam a coagulação como também
diminuem a resposta inflamatória. A antitrombina, por exemplo, liga-se a
glicosaminoglicanos específicos na superfície das células endoteliais como o
heparam sulfato, induzindo a síntese de prostaciclinas. Estas últimas, por sua vez,
inibem a agregação plaquetária, a expressão de moléculas de adesão e a ligação de
neutrófilos às células endoteliais. Agem ainda, atenuando a liberação de Interleucina
6 (IL-6), Interleucina 8 (IL-8) e TNF-D a partir das células endoteliais (SOUTER, et
al., 2001). Recentes estudos mostraram um possível papel do inibidor da via do fator
tecidual no mecanismo de sinalização intracelular acarretando uma diminuição nos
níveis de TNF-D produzidos pelas células endoteliais (VERSTEEG;
PEPPELENBOSCH; SPEK, 2001).
Uma outra molécula importante é a proteína C, que depois de ativada é capaz
de reduzir a resposta inflamatória por vários mecanismos, como a inibição indireta
da trombina, além de bloquear a ação inflamatória dessa enzima, ao se ligar a seu
receptor presente nos leucócitos (LOPES-AGUIRRE; PÁRAMO, 2001) diminuindo a
geração de citocinas inflamatórias ou reduzindo a expressão de moléculas de
adesão (JOYCE, et al., 2001). Outros componentes do mecanismo inibitório da PCa
também reduzem a resposta inflamatória. A ligação da trombomodulina à trombina,
impede que esta serino protease acione receptores ativados por proteases (PARs)
presentes em células endoteliais impedindo a expressão de moléculas de adesão
como as ICAM-1, E- selectinas ou a liberação de citocinas como a IL-2 e IL-6. Isto
ocorre devido a um mesmo sítio da trombina ser requerido para a ligação da
Introdução
32
trombina-trombomodulina ou trombina-PARs (MARCUM; ROSEMBERG, 1984;
INSHIGURO, et al., 2000; DUGINA, et al., 2002).
Além disso, quando a trombina é bloqueada pela trombomodulina, esta perde
a sua capacidade de ativar a carboxipeptidase plasmática R (também conhecida por
Inibidor da fibrinólise ativado pela trombina-TAFI). A carboxipetidase é um potente
inibidor da anafilatoxina C5a do sistema complemento (CAMPBELL, et al., 2001;
WANG, et al., 2000). A proteína S também atua na inibição do complemento via a
sua ligação com o C4BP, um importante cofator do Fator I que degrada o C4b, um
fragmento protéico essencial na formação da C3 convertase (C4b2a) da via clássica
ou clivando o fragmento C3b importante na formação da C3 convertase da via
alternativa (RESENDE; SIMMONDS; LANE, 2004).
1.8. O Sistema Complemento
O sistema complemento (SC) abrange um conjunto de mais de 35 proteínas,
tanto plasmáticas quanto presentes em superfícies celulares que medeiam
importantes funções efetoras da imunidade humoral e da inflamação (GASQUE,
2004). Os efeitos biológicos do complemento incluem a promoção de quimiotaxia,
anafilaxia, opsonização, lise osmótica e atuam na remoção dos imuno-complexos da
circulação. Além disso, muito dos seus componentes estão envolvidos na fase
aguda da inflamação e suas concentrações aumentam nos estágios de infecção
trauma e injúria.
Esse sistema é ativado por uma grande variedade de substâncias e tem duas
fases. Na primeira fase, uma série de interações específicas conduz à formação da
proteinase intrínseca do complemento, denominada de C3 convertase. A segunda
Introdução
33
fase diz respeito à clivagem de C3, gerando múltiplos fragmentos importantes
biologicamente e grandes complexos potencialmente citolíticos (Figura 03).
As duas fases do Sistema complemento podem ser alcançadas através de 3
vias diferentes, a via Clássica, a via Alternativa e a via das Lectinas (GADJEVA;
THIEL; JENSENIUS, 2000). As reações de ativação incluem a clivagem proteolítica
seqüencial de seus componentes, em que uma proteína quando ativada é capaz de
ativar a outra levando à formação de um complexo citolítico de ataque à membrana
(MAC). Os estímulos que desencadeiam a ativação do sistema são ubíquos e ele
está, portanto, em constante atividade (ULBRICH, 1999).
1.9. Regulação do Sistema Complemento
Cada etapa do sistema complemento está sujeita a um rigoroso
controle por proteínas. Sem esse controle o SC encontrar-se-ia continuamente ativo
e seus componentes seriam rapidamente consumidos. Além disso, as células do
hospedeiro tornar-se-iam, facilmente alvos, pelo excesso de mediadores
inflamatórios formados ou pela deposição do complexo de ataque à membrana
(MAC) e subseqüente lise (ULBRICH, 1999).
Vários pontos de controle são necessários para a manutenção da
atividade desse sistema (Figura 03). A ativação do complexo C1-anticorpo (IgM ou
IgG) e antígeno na via Clássica é regulada pela inibição do C1 pelo inibidor dessa
proteína (C1 inh) (MARKIDES, 1998). As C3 e C5 convertases pertencentes à via
Clássica e Alternativa são controladas por membros dos reguladores da ativação do
complemento (RCA) (CAMPBELL et al., 1988), onde o principal regulador, o Fator I,
associado ao cofator, o Fator H cliva o C3b ligado à membrana gerando o iC3b (C3b
Introdução
34
inativo) e o fragmento solúvel o C3f. Quando está associado a um outro cofator, a
proteína ligadora de C4 (C4BP), o Fator I é capaz de clivar o C4b ligado à
membrana gerando fragmentos C4c solúvel e o fixado à membrana o iC4b,
fragmento C4b inativo (MORGANS ; MERIS, 1994). Além destes, existem outros
cofatores do Fator I, a proteína cofatora de membrana (MCP), o receptor do
complemento tipo I (CR1) que se liga aos monômeros C3b e C4b facilitando a
proteólise mediada pelo Fator I (DORIG et al., 1993).
A desestabilização dos complexos enzimáticos ou o decaimento da
aceleração representa um outro mecanismo regulador na formação das C3
convertases. A principal proteína envolvida nesse mecanismo é o fator de
aceleração de decaimento (DAF) que se associa a C3 convertases provocando a
dissociação de C2a e Bb de C4b e C3b nas vias clássica e alternativa,
respectivamente (MORGAN ; HARRIS, 1999).
Três principais proteínas estão envolvidas na formação do complexo de
ataque a membrana (MAC). A Proteína S controla a fase fluída do MAC ao se ligar
aos complexos C5b-7 impedindo sua inserção na membrana (HÄNSCH, 1988). A
clusterina exerce função similar à proteína S (MURFHY et al., 1989). O CD59
bloqueia a formação do MAC através de sua ligação ao C8 e C9, inibindo a
incorporação e subseqüente polimerização de C9 (MARKIDES, 1998).
Introdução
35
Figura 03: Vias de ativação e mecanismo de regulação do Sistema Complemento. A figura demonstra
as três via de ativação do Sistema Complemento. Via Clássica: C1q, C1r, C1s- Subunidades da
protéica C1 do complemento. C4, C2, C3, C5- Proteínas do complemento; Cab2a- C3 convertase
Clássica; C4b2a3b- C5 convertase Clássica. Via da Lectinas: MBL- Lectina de ligação a manose;
MASPs-1 e MASPs2- Serino proteases associadas a MBL; C4b2a- C3 convertase das Lectina;
C4b2a3b- C5 convertase das Lectinas. Via Alternativa: C3- Proteína do complemento; B- Fator B-
Proteína do complemento; D- Fator D (serino protease); C3bBb- C3 convertase alternativa; C3Bb3b-
C5 convertase alternativa; C5b, C6, C7, C8, C9- Proteínas envolvidas no complexo de ataque a
membrana (MAC). C4a, C2b, C3a, C5a, Ba,- Fragmentos protéicos resultantes da clivagem por
proteases. Mecanismos reguladores do complemento: C1 inh- Inibidor da proteína C1; DAF- Fator de
aceleração do decaimento ( Associa-se a C3 convertases); RCA- Reguladores da ativação do
complemento (Fator I, Proteína ligadora de C4 (C4BP), MCP- Proteína cofatora de membrana, CR1-
Receptor do complemento tipo I). CD59. Proteína S, Clusterina- Proteínas inibidoras do complexo de
ataque a membrana.
Introdução
36
1.10. Drogas que atuam no Sistema Complemento
O emprego de proteínas regulatórias e peptídios inibitórios, entre outras
drogas, vem auxiliando no tratamento de desordens e doenças relacionadas ao
complemento possibilitando, às vezes, a cura como também uma melhor
compreensão das inter-relações existentes entre os componentes do complemento e
outros sistemas orgânicos (MARKIDES, 1998).
Versões solúveis do CR1 (sCR1) e inibidor do C1 (sC1 inib) têm mostrado
êxito no tratamento de modelos de isquemia do miocárdio em animais (WEISMAM et
al., 1990). Anticorpos monoclonais anti-C5 representam uma outra ferramenta
terapêutica para o bloqueio da ativação do complemento (RINDER et al., 1995).
Inibidores de C5a têm reduzido a mortalidade em pacientes submetidos a cirurgias
coronarianas ou na terapia da reincidência da reperfusão de infarto do miocárdio
(VERRIER, et al., 2004). Peptídeos inibidores têm sido usados no tratamento da
rejeição a transplantes do coração, a membranas artificiais, marca passos, assim
como, a problemas decorrentes dos aparatos da hemodiálise (PRUIT; BOLLINGER,
1991).
Polissacarídeos sulfatados como a heparina, condroitim sulfato e dextram
sulfato têm demonstrado propriedades inibidoras do Sistema Complemento
(RAEPPLE, HILL; LOSS, 1976; THOMAS, et al., 1995; TAMIN, et al., 1999). Apesar
desta atividade ser conhecida, o uso deste polissacarídeos como agentes
terapêuticos na inibição do complemento é limitado devido a complicações
hemorrágicas (KAPLUN, et al., 2004).
Introdução
37
1.11. Heparinas padrão e de baixo peso molecular
Tanto a heparina como o condroitim sulfato são glicosaminoglicanos
sulfatados, ou seja, polissacarídeos não ramificados constituídos por resíduos
alternados de ácido urônico (
D-glucorônico ou L-idurônico) e de hexosamina (D-
glucosamina ou
D-galactosamina). Estes carboidratos apresentam ainda, grupos
sulfatados que juntos com os grupos carboxilas dos ácidos urônicos conferem a
estas moléculas características poliânionicas (BOURIN ; LINDAHAL, 1993).
As cadeias das heparinas são compostas por 15-100 unidades
monossacarídicas alternadas de ácido urônico e da D-glucosamina (ROSÉN;
CASONI, 2001). O ácido urônico pode ser do tipo L-idurônico sendo este sulfatado
em C-2, ou D-glucorônico, geralmente não sulfatado (WOLFROND; WANG; HONDA,
1969). A maioria dos resíduos de glucosamina é N-sulfatada e O-sulfatada em C-6.
Esse grau de sulfatação faz da heparina o glicosaminoglicano mais ácido e,
conseqüentemente, o polieletrólito natural mais fortemente carregado. As ligações
glicosídicas dos resíduos dos ácidos L-idurônico e D-glucosamina são do tipo D
(1ĺ4) (DERLIN; MARKIE; DIETRICH, 1971; HOFFMAM ; MEYER, 1962).
A heparina tem sido encontrada nos grânulos dos mastócitos que estão
localizados principalmente em tecidos/órgãos que têm contato direto com o meio
ambiente (pele, intestino, pulmão, brânquias) ou que funcionam como barreira
interna contra agentes infecciosos (timo e gânglios linfáticos) sugerindo que a
heparina poderia estar atuando no animal como um mecanismo de defesa do
organismo contra alguns patógenos (STRAUS et al., 1984; NADER ; DIETRICHI,
1989).
Introdução
38
A heparina para uso clínico é extraída do pulmão bovino ou da mucosa
intestinal de porcinos. Algumas propriedades, bem como o grau de pureza da
heparina, variam com o método de extração e preparo mais do que com a espécie
de animal usada para a extração (BAUGHAM; WOODWARD, 1970). O número e a
seqüência das cadeias que compõem a heparina varia de 3 KDa a 40 KDa. A grande
maioria das moléculas, contudo, se situam entre 10 KDa e 20 KDa.
Entre as propriedades farmacológicas das heparinas temos como a mais
conhecida a atividade anticoagulante, exercida por potencializar a ação inibidora da
antitrombina sobre algumas serinos proteases, incluindo os Fatores IXa, Xa, XIa,
XIIa, a calicreína e a trombina (BOURIN; LINDAHAL, 1993). Atividades como,
inibição da resposta inflamatória (CARR, 1990), varredura dos radicais livres
(OYANAGNI; SATO, 1990) e a modulação de mediadores vasoativos (MINAMI, et
al., 1995) são relatadas.
Embora seja um potente anticoagulante muito empregado na clínica, a
heparina apresenta algumas limitações, incluindo uma eficácia variável em certas
aplicações terapêuticas como a angioplastia coronariana, variedades
farmacocinéticas (RILEY, 2001), efeito hemorrágico residual (NADER, et al., 1979),
trombocitopenia induzida pela heparina (FABRIS, et al., 2001), inibição da função
plaquetária e uma incapacidade da inativação do fator Xa ligado à plaqueta ou da
trombina ligada ao coágulo (RILEY, 2001). Sendo assim, o desenvolvimento de
heparinas de baixo peso molecular surgiu como uma alternativa na terapia
anticoagulante.
As heparinas de baixo peso molecular (HBPMs) são fragmentos obtidos
através do fracionamento ou despolimerização (química ou enzimática), da heparina
não fracionada. O peso molecular destes fragmentos varia entre 4000 Da e 6500 Da
Introdução
39
e a capacidade anticoagulante desses reside na inibição apenas do fator Xa
(HIRSH, 1993). As HBPMs também estimulam a liberação de mediadores
antitrombóticos, profibrinolíticos e o TFPI. Propriedades antinflamatórias como a
redução da adesão endotelial de leucócitos na pós-isquemia foram observadas com
o uso das HBPMs (HABAZETTL, et al., 2004).
A redução no tamanho da cadeia da heparina proporciona a diminuição da
afinidade por proteínas plasmáticas, proteínas vasculares, células endoteliais,
macrófagos e plaquetas. Conseqüentemente possui maior biodisponibilidade, maior
tempo de vida plasmática, melhor resposta terapêutica e uma redução dos efeitos
colaterias (HIRSH; LEVINE, 1994). No entanto, apesar das HBPMs apresentarem
maior eficácia do que as heparinas não fracionadas, complicações em relação ao
ajuste da dose (HIRSH, et al., 1992), aparecimento de hematomas (HIRSH ;
LEVENI, 1994), inibição da função plaquetária e o risco de trombocitopenia são
relatadas (CHONG, 1995).
Assim sendo, estas limitações têm levado ao desenvolvimento ou descoberta
de novos agentes anticoagulantes. Entre as fontes alternativas temos os
polissacarídeos sulfatados das algas marinhas.
Introdução
40
1.12. Polissacarídeos sulfatados das algas marinhas
A diversidades dos constituintes encontrados nas algas marinhas nos dias
atuais é bem conhecida, ou seja, muito se sabe sobre seus compostos, como, por
exemplo, que são ricos em proteínas, mucilagens, carboidratos, vitaminas, fósforo,
iodo, potássio, cloro, entre outros. Alguns desses elementos presentes nas algas
não são encontrados com freqüência em outros organismos, por isso, até em
quantidades diminutas eles têm grande importância (NOSEDA, 1994). Por exemplo,
os polissacarídeos de algas, além de apresentarem em sua estrutura açúcares
bastante comuns, como a glicose, xilose e galactose, possuem açúcares bastante
específicos e incomuns, diferentes dos encontrados em animais e vegetais terrestres
como é o caso da fucose e da anidrogalactose (ZHANG et al., 2003).
Além da anidrogalactose, as algas marinhas possuem polissacarídeos
sulfatados que são comumente encontrados em animais superiores, estando
presentes também em microorganismos e ausentes nas plantas superiores
(PERCIVAL; MCDOWELL, 1990). Nas algas marinhas, estes polissacarídeos são
encontrados com grande variedade nas três principais divisões das macroalgas
(PERCIVAL; MCDOWELL, 1990), as Chlorophytas (algas verdes), as Rhodophytas
(algas vermelhas) e as Phaeophyta (as algas marrons) que juntas compreendem
7000 espécies catalogadas (RORRER; CHENEY, 2004).
Os polissacarídeos sulfatados das algas verdes são polímeros heterogêneos
altamente ramificados, ricos em galactose, manose, xilose, arabinose, glicose e ou
ácidos urônicos, não apresentando unidades repetitivas dissacarídicas (PERCIVAL,
1979; PERCIVAL; MCDOWELL, 1990) como ocorre nos glicosaminoglicanos. Entre
Introdução
41
as atividades farmacológicas destes compostos temos a atividade anticoagulante
(DEACON-SMITH; LEE-POTTER; ROGERS, 1985).
Nas Rhodophytas (algas vermelhas), encontramos as carragenanas que são
uma classe de polímeros constituídos por galactanas sulfatadas lineares e solúveis
em água. São formadas por resíduos de ȕ-D-galactopiranose unidas por ligações
D(1o3) ou Į-D-galactopiranose unidas por ligações D(1o4). Além da galactose,
outros resíduos de carboidratos como xilose, glicose, ácidos urônicos podem estar
presentes em preparações de carragenas (VAN DE VALDE; PEREIRA; ROLLEMA,
2004). As carragenanas têm enorme importância na indústria alimentícia e dos
cosméticos, sendo o principal constituinte da textura de produtos como cremes,
queijos, géis, etc. (VAN DE VALDE; DE RUITER, 2002). Além disso, as
carragenanas vêm sendo utilizadas como ferramentas para investigar o processo
inflamatório em ratos e camundongos (LEVY, 1969).
Algas da classe Phaeophyceae (algas marrons) produzem as fucanas
sulfatadas que são polissacarídeos extremamente heterogêneos e ramificados,
compostos por unidades de D- L- fucose (1Æ3) e D- L- fucose (1Æ4) sulfatadas em
C3, C2 e/ou C4. Além da fucose, podem conter no polímero outros
monossacarídeos como xilose, galactose e ácidos urônicos (LEITE et al., 1998;
DUARTE et al., 2001; ROCHA, 2002; PONCE, et al., 2003). Suas estruturas variam
de espécie para espécie e até nas diferentes partes constituintes da mesma alga
(DIETRICH et al., 1995; ALVES, 2000). A presença de fucanas é também observada
em equinodermos (MOURÃO, et al., 1996).
Várias atividades farmacológicas têm sido atribuídas às fucanas, como
ativação e inibição plaquetária (DURIG et al., 1997; ALMAYN et al., 2000), a
atividade anticoagulante (NISHINO et al., 1991; 1999; 2000; NADERLLA et al.,
Introdução
42
1996), a antitrombótica (NISHINO et al., 1994; MOURÃO; PERREIRA, 1999), a
antitumoral (YAMAMOTO; SUZUKI; UMEZAWA, 1980; ZHUANG; ITOH; MIZUNO,
1995; ELLOAULI, et al., 1993; MSCAFFREY et al., 1996), a antiproliferativa
(LOGEART et al., 1997), a antiviral (HOSHIRO et al., 1998; IQBAL; FLICK-SMITH;
MCCAULEY, 2000), a antiinflamatória (LASKY, 1995), a ação sobre fatores de
crescimento (SOEDA et al., 1992; 2000) e inibição do sistema complemento
(BLONDIN et al., 1994).
Introdução
43
Diante do grande potencial farmacológico das fucanas e mediante a
variabilidade estrutural destas substâncias, diversos modelos experimentais têm sido
empregados como forma de avaliar suas diversas atividades farmacológicas e a
utilização das mesmas.
Um dos grandes interesses das fucanas estaria relacionado com sua
semelhança com algumas atividades biológicas similares as observadas nas
heparinas de altos e baixos pesos moleculares, podendo ser, as fucanas, utilizadas
como fontes alternativas no tratamento clínico de problemas relacionados ao
sistema cardiovascular, como drogas anticoagulantes, antitrombóticas e/ou
antiinflamatórias.
Sendo assim, este trabalho propõe avaliar as atividades anticoagulante, anti-
hemostática, a agregação plaquetária e o Sistema complemento de uma população
de fucanas extraídas da espécie Fucus vesiculosus e comparar estas atividades
biológicas com uma heparina não fracionada e uma de baixo peso molecular, numa
tentativa de obter fucanas farmacologicamente viáveis para serem empregadas no
controle da coagulação e da inflamação.
Materiais e Métodos
44
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Materiais
2.1.1. Alga marinha
O Fucoidan empregado puro ou fracionado neste estudo foi obtido
comercialmente pela empresa Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo, EUA) e pertence
à alga marinha marrom Fucus vesiculosus.
A referidas alga possuem a seguinte taxonomia:
Divisão: Phaeophyta
Classe: Phaeophycea
Ordem: Fucales
Gênero: Fucus
Espécie: Fucus vesiculosus (Figura 04)
Figura 04: Fucus vesiculosus
2.1.2. Animais
Ratos machos da linhagem Wist ar, pesando entre 200-300g com
aproximadamente três meses de idade, foram empregados na atividade anti-
hemostática. Os animais utilizados foram obtidos do biotério do Departamento de
Bioquímica – UFRN estando acondicionados em gaiolas individuais, submetidos à
dieta comercial e água ad libitum em condições controladas de iluminação (ciclo 12
h claro/escuro) e temperatura mantida a 25ºC.
Materiais e Métodos
45
2.1.3. O sangue humano (plasma e soro)
O sangue, utilizado na atividade anticoagulante, agregação plaquetária e
sistema complemento, foi obtido de voluntários sadios que não fizeram o uso de
alguma medicação durante duas semanas antes da coleta, a ingestão de bebidas
alcoólicas nos últimos três dias e não fossem fumantes.
2.1.4. O sangue de coelho (eritrócitos)
Os eritrócitos, utilizados no ensaio da via alternativa do Sistema
Complemento, foram obtidos de coelhos através da coleta de sangue realizada nas
veias distais das orelhas dos animais e colocado em tubos de ensaio com EDTA, na
razão 4,5 mL para 55 PL de EDTA.
2.1.5. Outros materiais
x Ácido acético, acetona, metanol , etanol, cloreto de sódio da Reagen
Quimibrás Indústrias Químicas S. A. (Rio de Janeiro, RJ, Brasil);
x Ácido sulfúrico, ácido clorídrico, ácido fosfórico da Merck (Darmstadt,
Alemanha);
x Agarose (Standart Low-Mr) da BioRad Laboratories (Richmond, CA,EUA);
x Azul de toluidina, vermelho de cresol, coomasie brilliant blue R 250
(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, EUA);
x Éter;
Materiais e Métodos
46
x Heparina padrão (Liquemine ®) e de alto e baixo peso molecular
(Enoxeparina- Clexane);
x Kits comerciais para a avaliação dos tempos de PT ( Soluplastin, Wierner
lab. Argentina) e APTT (DiaMed- Lationo América, A.S. Lab Brasil);
x 1,2-diaminoetano, 1,3-diaminopropano, antrona, carbazol, brometo de
cetiltrimetilamônio (CETAVLON), ácido isobutírico, piridina, N-N-metil bisacrilamida,
e tolueno obtidos da Aldrich Chemical Co. Inc. (Millwaukee, WI, EUA);
x Papéis Whatman n.º 1 e 3 MM obtidos da W & R Balston Ltd. (Maidstone,
Inglaterra);
x Citrato de sódio, Cloreto de sódio, Cloreto de cálcio;
x Seringas;
x Bacto-gelatin da Difco Laboratories;
x Cloreto de magnésio;
x Solução salina 0,9% ( estéril e apirogênica);
x EDTA (ácido etileno-diamino-tetra-acético) (Reagem);
x EGTA,Tampão veronal GVB-EDTA, Tampão venoral GVB (SIGMA);
x DMSO (Merck);
x Kit comercial Anti C3 e anti C4 obtidos da Bio Técnica.
Materiais e Métodos
47
2.2. Aparelhos
Além dos aparelhos usuais de laboratório podemos destacar:
x Agitador orbital mod. 255-B da FANEM Ltda. (São Paulo, SP, Brasil);
x Banhos e estufas de temperatura constante da FANEM Ltda. (São Paulo,
SP, Brasil);
x Bombas peristálticas Microperpex S mod. 2232 da LKB (Bromma, Suécia)
e Econo Pump mod. EP-1 da Bio Rad Laboratories (Hercules, CA, EUA);
x Câmara para eletroforese em gel de agarose, modelo desenvolvido por
Jaques e colaboradores (1968) (Técnica Permatron Ltda., São Paulo, SP, Brasil);
x Centrífuga refrigerada RC 2-B da Ivan Sorvall Inc. (Norwalk, CO, EUA);
x Centrífuga refrigerada CR 21 da Hitachi Koki Co. Ltd. (Tóquio, Japão);
x Espectrofotômetros Varian - Series 634 da Varian Techtron PPTY Ltd.
(Springvale, Vico, Austrália) e Hitachi U-2000 (Tóquio, Japão);
x Evaporador rotatório Evapo-Mix da Buchler Instruments (Fort Lee, NJ,
EUA);
x Fontes de corrente contínuas reguláveis desenvolvidas pelo Dr. H.
Rzeppa, Técnica Permatron Ltda. (São Paulo, SP, Brasil);
x Coagulômetro (DRAKE, mod. Quick times SP. Brasil);
x Agregômetro (PACKS-4- Helena laboratories);
x Contador automático de células;
Materiais e Métodos
48
2.3. Métodos
2.3.1. Fracionamento e caracterização da população de Fucoidans obtidos de
Fucus vesiculosus
O Fucoidan comercial foi pesado (90 mg) e dissolvido em 9 mL de água. A
solução obtida foi denominada de cru de polissacarídeos ou fração total (F). Em
seguida, uma nova pesagem do Fucoidan foi realizada e este foi fracionado
(precipitado) com volumes crescentes de acetona. Para isso 1 g do Fucoidan foi
dissolvido em 25 mL de NaCl (0,25 M),adicionado a 25 mL de acetona e finalmente
mantidos a 4
0
C durante 18 horas.
Após as 18 horas, a mistura foi centrifugada por 20 min a 10000 x g, obtendo
assim um precipitado que foi denominado de fração F1. Ao sobrenadante foi
adicionado mais 25 mL de acetona e, portanto, repetido o processo por mais duas
vezes usando concentrações crescentes de acetona para a obtenção das frações
F2 e F3. Assim a fração F1, a fração F2 e a fração F3 correspondem aos
precipitados, secos à pressão reduzida, a partir de 1, 2 e 3 volumes de acetona.
2.3.2. Análises químicas
2.3.2.1. Açúcares totais
A quantificação dos açúcares totais foi realizada pelo método do fenol/ácido
sulfúrico de acordo com Dubois et al. (1956), empregando-se como monossacarídeo
padrão a L-fucose. As leituras foram realizadas a 490 nm.
Materiais e Métodos
49
2.3.2.2. Proteína
O conteúdo de proteína foi determinado com o reagente de Coomassie blue R
segundo o método de Spector (1978) sendo a leitura realizada a 595 nm,
empregando-se como padrão albumina de soro bovina.
2.3.2.3. Sulfato
O teor de sulfato total foi determinado após hidrólise ácida (HCl 6 N, 6 horas,
100ºC) por turbidimetria pelo método da gelatina-bário (DODGSON; PRICE, 1962).
O sulfato de sódio (1 mg/ml) foi utilizado como padrão sendo submetido às mesmas
condições das amostras em estudo.
2.3.3. Dessulfatação
A dessulfatação do Fucoidan foi realizada de acordo com o método de
Nagasawa, Ivone e Tokuyasu (1979). In icialmente foram pesados 50 mg do
Fucoidan e preparado o sal de piridina. Para isso, o 20 mg do Fucoidan foram
dissolvidos em 5 ml de água destilada em seguida foi misturada com 1 g da resina
Dowex 50 W x 8 para baixar o pH entre 2-3. Após sedimentação da resina, o
sobrenadante foi transferido para outro recipiente e o pH elevado com acréscimo de
piridina (Merck). Foi realizada a liofilização. Posteriormente, o sal de piridina obtido
foi dissolvido em 2,5 mL de DMSO (Merck) e metanol na pr oporção de 9:1 sendo
então encubado a 80ºC por 5 h para parcial dessulfatação e 8 horas para total
dessulfatação. A reação foi interrompida com banho de gelo e 2,5 mL de água
destilada. O pH foi ajustado para 9,0 - 9,5 com NaOH a 0,1 N. Foram realizadas
diálises por 24 horas e posterior liofilização.
Materiais e Métodos
50
2.3.4. Atividade anticoagulante
O tempo de Tromboplastina parcial ativada (APPT) e Protrombina (PT) do
plasma humano misturado ao Fucoidan (F) ou às frações F1, F2 , F3 , à heparina
padrão (Liquemine) ou à de baixo peso molecular (Enoxeparina) foram realizados
através de kits comerciais.
Após a coleta, o sangue foi misturado cuidadosamente com citrato de sódio a
3,2% na proporção de 9 partes de sangue para 1 parte de anticoagulante e em
seguida centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos à temperatura ambiente. O
sobrenadante foi aspirado e colocado em tubos plásticos siliconizados, obtendo
desta forma o plasma citratado.
2.3.4.1. Tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT)
Para a determinação do tempo de Tromboplastina parcial ativada, o pool de
plasma normal humano citratado (90 µL) fo i misturado com 10 µL de uma solução de
polissacarídeo contendo 0,5 ; 1,0 ; 2,0 ; 5,0 ou 10 µg e em seguida incubados por 3
min a 37°C. Então 100 µL de reagente contendo cefalina líquida ativada com
complexo de caolim (DiaMed-Latino América S.A., lab, Brasil) foram adicionados à
mistura e incubados por mais 3 min a 37°C. Posteriormente 100 µL de CaCl
2
0,02 M
foram adicionados e o tempo necessário para a coagulação do plasma foi aferido em
um coagulômetro. Todos os pontos foram feitos em triplicata.
Materiais e Métodos
51
2.3.4.2. Tempo de protrombina (PT)
Para a determinação do tempo de Protrombina, o pool de plasma normal
humano citratado (90 µL) foi misturado com 10 µL de uma solução de polissacarídeo
contendo 5, 10, 20, 50 ou 100 µg e em seguida incubado por 3 min a 37°C. Então
200 µL de reagente Soluplastin pré-aquecido a 37ºC foram adicionados e o tempo
necessário para a coagulação do plasma foi aferido em um coagulômetro. Todos os
pontos foram feitos em triplicata.
2.3.5. Agregação Plaquetária
2.3.5.1. Plasmas rico em plaquetas (PRP) e pobre em plaquetas (PPP)
Após a coleta, o sangue foi misturado cuidadosamente com citrato de sódio a
3,8% na proporção de 9 partes de sangue para 1 parte de anticoagulante e em
seguida centrifugado a 1000 rpm por 6 minutos à temperatura ambiente. O
sobrenadante foi aspirado e colocado em tubos plásticos siliconizados, obtendo
desta forma o plasma rico em plaquetas (PRP). O plasma pobre em plaquetas (PPP)
foi obtido através da centrifugação adicional do precipitado a 3000 rpm por 15
minutos à temperatura ambiente, sendo este também colocado em tubos plásticos
siliconizados. Quando necessário o PRP fo i diluído com o PPP para a obtenção de
uma contagem de plaquetas em torno de 250.000/mm
3
.
Materiais e Métodos
52
2.3.5.2. Ensaio de agregação plaquetária
Os ensaios de agregação plaquetária foram feitos em um agregômetro
através do método turbidométrico de Born e Cross (1963) com algumas
modificações. 450 µL de PRP foram pipetados e colocados em uma cuveta de vidro
siliconizada e mantidos por 2 minutos a 37ºC. Após os dois minutos, a reação de
agregação foi iniciada pela adição de 50 µL de agente agonista. Os agentes
agonistas utilizados neste experimento foram ADP a concentração de 3 µM, solução
de cloreto de sódio a 0,9% (controle positivo e negativo), Epinefrina a 10 Pg/mL,
colágeno a 5 µg/µL e soluções do Fucoidan, do Fucoidan dessulfatado e das
frações F1, F2 e F3 a concentrações de 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,5 mg/mL, 2
mg/mL e 5 mg/mL. O tempo de agregação usado foi de 7 minutos. Agregação foi
quantificada em termos de aumento da extensão máxima (em porcentagem) na
transição da luz dentro de um tempo estabelecido de 7 minutos (KANAYAMA,
2003).Os doadores que apresentaram valores abaixo de 70% de amplitude máxima
para a agregação induzida por ADP a 3 µM, Epinefrina a 10 Pg/mL, colágeno a 5
µg/µL ou curvas de hipoagregação plaquetária foram descartados.
2.3.6. Atividade anti-hemostática
2.3.6.1. Ensaio da atividade anti-hemostática
A atividade anti-hemostática foi determinada utilizando o método de Cruz e
Dietrich (1967), com algumas modificações (Tersariol, Dietrich, Nader, 1992). Esses
autores observaram que a aplicação tópica de heparina na escarificação (lesão na
Materiais e Métodos
53
cauda do rato) causava a ruptura do sistema hemostático, mesmo após extensivas
lavagens da mesma com solução salina. Esse fenômeno foi denominado de efeito
hemorrágico residual da heparina (Atividade anti-hemostática).
Inicialmente, foi feita uma escarificação (10 mm X 1 mm X 0,5 mm) na parte
terminal da cauda do rato com uma lâmina. Em seguida, a cauda escarificada foi
introduzida em tubo de ensaio de 3 mL contento 2 mL de solução salina tamponada
(NaCl 0,85%, NaHCO
3
0,1 mM, pH 7,0, 37ºC). O sangramento foi acompanhado por
uma lupa. A ordem do experimento consiste em mergulhar, verticalmente, a cauda
escarificada em salina e acompanhar o processo de sangramento. Após 5 minutos,
retira-se a cauda do tubo de ensaio e obtém-se um novo sangramento através de
estímulo mecânico (esfregando uma gaze sobre a escarificação) e em seguida a
cauda do rato mergulhada em uma nova solução salina (2 mL), sendo repetido este
procedimento mais uma vez. Desta forma, para os controles, foram realizados três
reaberturas da lesão, com intervalos de 5 minutos, tornando-se uma média referente
a um controle de sangramento. A quantidade de proteína liberada da lesão, neste
processo, serve como controle para os ensaios posteriores. O tempo de
sangramento na faixa normal é de 60 ± 20 s, enquanto que a proteína total liberada
está na faixa de 1500 ± 500 µg.
Após três estímulos mecânicos, a cauda é mergulhada em uma nova solução
contendo os polissacarídeos a serem analisados (F, F1, F2, F3, FDS, Liquemine e
Enoxeparina) nas concentrações de 25, 50 e 100 Pg/mL. Decorrido determinado
período de tempo (2 min), a cauda foi removida da solução contendo os
polissacarídeos e lavada intensivamente com solução salina, sendo o efeito
hemorrágico residual observado através do mergulho da cauda em soluções salinas
novas (sem os polissacarídeos) em intervalos de tempos determinados (2, 4, 8, 12,
Materiais e Métodos
54
16, 20, 24, 28, 32, 36, 40 minutos). O esquema de experimento pode ser visualizado
na figura 05. Os resultados foram expressos pela razão entre a soma cumulativa da
taxa de proteínas liberadas na lesão antes e após o contato com a droga.
Figura 05: Esquema representativo da atividade anti-hemostática.
Materiais e Métodos
55
2.3.7. Sistema complemento
2.3.7.1. Sistema Complemento (via alternativa)
a) O Soro
Após a coleta, o sangue de cada doador foi deixado em repouso durante 45
minutos para a retração do coágulo e conseqüentemente obtenção do soro. Os
soros foram separados por centrifugação a 2.500 rpm por 15 min a temperatura
ambiente. O sobrenadante de cada doador foi aspirado e colocado em tubos
plásticos separadamente e acondicionados a 0°C. Posteriormente, estes soros
foram descongelados e volumes iguais de cada foram pipetados e misturados em
tubos plásticos, em gelo, obtendo-se assim o pool que foi estocado a 0ºC.
Para a utilização do soro nos ensaios funcionais do sistema complemento as
alíquotas de pool foram descongeladas imediatamente antes do experimento, sendo
utilizadas uma única vez.
b) Ativação da Via alternativa
Para a verificação da via alternativa do Sistema Complemento, foram usados
eritrócitos de coelho, pois estes ativam a via independente de anticorpos específicos
(PLATTS-MILLS & ISHIZAKA 1974). Os eritrócitos não sensibilizados foram diluídos
em tampão salina fosfato pH 7,4 contendo 0,15 M de NaCl a uma concentração de 5
x 10
7
células/ mL.
A reação de ativação da via alternativa do complemento foi realizada de
acordo com ADACHI e colaboradores, 1990 com algumas modificações. Para o
Materiais e Métodos
56
ensaio, amostras dos polissacarídeos foram dissolvidas em solução salina 0,9%
(estéril e apirogênica).
50 PL de uma solução contendo polissacarídeos a 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,5
mg/mL e 1 mg/mL para o Fucoidan (F), F1, F2, F3 , Fucoidam dessulfatado (FDS),
Liquemine (heparina padrão) e Enoxeparina (HBPM) ou solução salina a 0,9%
(controle hemólise do soro- HSo) foram misturados com 50 PL de tampão veronal
acrescido de EGTA a 0.05 M e Mg
2+
a 0,01 M (EGTA-GVB- Mg
2+
) e, em seguida,
incubados com 150 PL de soro (pool) por 1 hora a 37ºC. Após esse tempo, essa
mistura foi diluída com 150 PL de tampão veronal acrescido de EGTA a 0,05 M e
Mg
2+
a 0,01M (EGTA-GVB- Mg
2+
). A solução (400 PL) foi misturada com 100 PL de
eritrócitos de coelho a 5 x 10
7
células/mL e novamente incubada por 1 hora a 37ºC.
Passado esse período, 1 mL de solução salina com EDTA (0,01 M) a temperatura
de 0-4ºC foi adicionada para parar a reação. Logo após, os tubos foram
centrifugados a 2500 rpm por 10 min, e a absorbância do sobrenadante foi feita a
414 nm. O controle 100% hemólise foi obtido com a adição de 1,35 mL de água
destilada a 100 PL de eritrócitos de coelho a 5 x 10
7
células/mL, sendo também
centrifugado a 2500 rpm por 10 min e a leitura do sobrenadante feita a 414 nm. Para
o branco da reação foi usada solução salina a 0,9%.
3.2.7.2 Ação dos polissacarídeos sulfatados nas proteínas C3 e C4 do Sistema
Complemento
Para verificar se o Fucoidan (F), F1, F2, F3, Fucoidam parcialmente
dessulfatado (FPD), Fucoidam dessulfatado (FDS), Liquemine (heparina padrão) e
Enoxeparina (HBPM) se ligam a proteína C3 e/ou C4 do complemento, foi executado
Materiais e Métodos
57
o seguinte experimento. 25, 50, 75 Pg de cada polissacarídeo foi pesado e misturado
com 20 PL ou 50 PL de soro diluído a proporção de 1/10 para verificar a interação
com C3 ou C4 respectivamente. Logo em seguida, esta mistura foi incubada com 1
ml de reagente anti-C3 ou anti-C4 (solução contendo anticorpos que se liga a C3 ou
a C4) a 37ºC por 10 minutos. Após esse tempo, foi verificada a absorbância dessa
mistura a 340 nm. O grupo controle consistiu na incubação de 20 PL ou 50 PL de
soro diluído a proporção de 1/10 com 1 mL de reagente anti-C3 ou anti-
respectivamente.
Os valores numéricos da quantificação das proteínas tanto para C3 como
para C4 foram realizadas de acordo com as instruções do kit comercial Biotécnica-
Complemento C3 e C4.
2.3.8. Análise estatística
Para a análise estatística das atividades biológicas testadas neste trabalho
foram usados a Analise de variância (ANOVA) com nível de significância de p, 0,05
e o Teste de Turkey-Kramer, para determinar as diferenças entre os valores obtidos
para os grupos controle e experimentais (comparações múltiplas) com níveis de
significância de p <0,05.
Resultados
58
3. RESULTADOS
3.1. Perfil e caracterização das frações obtidas do Fucoidan de Fucus
vesiculosus
Neste trabalho foram utilizados polissacarídeos sulfatados e fracionados por
precipitação em 1, 2, 3 volumes de acetona (denominados de F1, F2 e F3), a partir
do fucoidan (F) extraído da alga Fucus vesiculosus. Este processo de
fracionamento foi necessário para a obtenção de frações diferenciadas, mais
homogêneas e desprovidas de contaminação por pigmentos e compostos fenólicos
comuns em algumas frações de polissacarídeos vegetais conforme previamente
demonstrado por Lima (2004). A fração F1 apresentou maior rendimento em relação
as demais frações (52,3%). As frações F2 e F3 apresentaram rendimentos de 36,7%
e 10,7% respectivamente.
Inicialmente, esses polímeros foram caracterizados com relação aos seus
percentuais de açúcares totais, sulfato e proteínas (Tabela 1). Tais análises foram
feitas por dosagens colorimétricas, conforme descrito anteriormente em métodos.
Polissacarídeos fucosilados
Açúcares Totais
a
%
Sulfato
b
%Proteinas
c
%
Fucoidan (F)
55,2 44,1 0,8
Fucoidan Parcialmente
Dessulfatado (FPD)
80,0 28,0 0,78
Fucoidan Dessulfatado (FDS)
70,1 18,6 0,78
Fração F1
45,3 54 0,1
Fração F2
44,3 43 0,8
Fração F3
41,5 26 0,7
Tabela 1. Componentes químicos dos polissacarídeos sulfatados.
a- DUBOIS et al., 1956.
b- SPECTOR, 1978.
c- Método tubidimétrico (DODGSON ; PRICE, 1962).
Resultados
59
Os resultados dessas análises mostraram baixas contaminações protéicas
dos polissacarídeos fucosilados utilizados neste estudo, com concentrações
variando de 0,10% a 0,80%. As dosagens dos açúcares totais para todos os
polissacarídeos fucosilados apresentaram altos teores de açúcares totais, com o
fucoidan parcialmente dessulfatado (80,0%) e o fucoidan dessulfatado (70,1%)
apresentando os maiores valores. O teor de sulfatação desses carboidratos variou
entre 18,6% a 54% com o maior grau de sulfatação detectado para a F1 com 54%,
seguida pela F2 com um percentual de 43% e tendo a F3 um menor percentual com
26%.
Modificações químicas compreendendo reações de dessulfatação foram
realizadas com o Fucoidan (F) de F. vesiculosus com o objetivo de dessulfatá-lo total
e parcialmente para um melhor entendimento da relação entre estrutura e função
destes compostos. Estes polímeros modificados foram também analisados
observando-se uma diminuição dos teores de sulfato na ordem de 49% e 70% para
o Fucoidan parcialmente dessulfatado (FPD) e Fucoidan dessulfatado (FDS)
respectivamente conforme mostra a tabela 1.
3.2. Atividade Anticoagulante
3.2.1. A avaliação in vitro da ação anticoagulante dos polissacarídeos
sulfatados na via intrínseca (APTT) e extrínseca (PT) da cascata de coagulação
A atividade anticoagulante dos polissacarídeos deste estudo foi avaliada
segundo os métodos APTT e PT, sendo utilizado plasma humano de doadores
saudáveis. Os resultados obtidos para o APTT indicaram que com 5 Pg o fucoidan
Resultados
60
(F) e as frações F1 e F2 apresentaram o mesmo tempo necessário para inibir a
coagulação (Figura 06). No entanto podemos afirmar que as heparinas tem maior
potencial anticoagulante (240 s com 1 Pg). Contudo, a fração F3 apresentou baixa
atividade anticoagulante (73,6 s com 10 Pg) com p< 0,001 em relação aos demais
compostos analisados.
0
40
80
120
160
200
240
024681012
Massa (ug)
APTT (s)
F
F1
F2
F3
Enoxeparina
Liquemine
Figura 06: Atividade anticoagulante (APTT) dos polissacarídeos sulfatados.
F- Fucoidan; F1, F2, F3- polissacarídeos fucosilados fracionados do Fucoidan de Fucus vesiculosus;
Liquemine- Heparina padrão; Enoxeparina- Heparina de baixo peso molecular.
Os resultados obtidos pelo ensaio do Tempo de Protrombina (PT)
demonstraram que a fração F1 apresentou uma alta atividade anticoagulante (120 s
em 50 Pg) em relação ao fucoidan (F) (81,5 s) e os demais compostos F2 (57,1 s),
F3 (32,5 s) e a heparina de baixo peso molecular (48,2 s) quando se empregou a
mesma concentração (Figura 07). No entanto podemos afirmar que a heparina não
fracionada tem maior potencial anticoagulante (240 s com 5 Pg).
Resultados
61
0
20
40
60
80
100
120
140
0 20 40 60 80 100 120
Massa (ug)
PT (s)
F
F1
F2
F3
Enoxeparina
Liquemine
Figura 07: Atividade anticoagulante (PT) dos polissacarídeos sulfatados.
F- Fucoidan ; F1, F2, F3- polissacarídeos fucosilados fracionados do Fucoidan de Fucus
vesiculosus; Liquemine- Heparina padrão; Enoxeparina- Heparina de baixo peso molecular.
3.2.2. Efeito do sulfato na via intrínseca (APTT) e extrínseca (PT)da cascata de
coagulação
A influência do teor de sulfato na atividade anticoagulante foi verificada pela
dessulfatação parcial (FPD) e total do polímero (FDS). Assim, o Fucoidan (F) foi
modificado quimicamente sendo avaliado em seguida a sua ação sobre a via
intrínseca (APTT) e extrínseca (PT) da cascata de coagulação (Figuras 08 e 09). A
redução de 49% e 70% do teor de sulfato mostrou uma diminuição significativa no
APTT em relação ao Fucoidan na ordem de 44% (p <0,001) para o Fucoidan
parcialmente dessulfatado e de 87% para o Fucoidan dessulfatado (p <0,001). Essa
mesma redução mostrou diferença significativa no PT em relação ao parcialmente
Resultados
62
dessulfatado na ordem de 61% e para o dessulfatado na ordem de 82 % (p <0,001).
Isso demonstrou que o teor de sulfato teve um importante efeito na atividade
anticoagulante apresentada pelos polissacarídeos em questão, agindo nas vias
intrínseca e extrínseca da coagulação sanguínea.
0
40
80
120
160
200
240
00,51 2 510
Massa (ug)
APTT (s)
F
FPD
FDS
Figura 08: Influência do sulfato na Via intrínseca da coagulação (APTT).
F- Fucoidan; FPD- Fucoidan parcialmente dessulfatado; FDS- Fucoidan dessulfatado.
Resultados
63
0
40
80
120
0 5 10 20 50 100
Massa (ug)
PT (s)
F
FPD
FDS
Figura 09: Influência do sulfato na Via extrínseca da coagulação (PT).
F- Fucoidan; FPD- Fucoidan parcialmente dessulfatado; FDS- Fucoidan dessulfatado.
3.3. Agregação Plaquetária
O efeito da ação dos fucoidans sobre a ativação da agregação plaquetária é
pouco conhecido. Sabe-se que estes polímeros têm a capacidade de induzir a
agregação das plaquetas, porém o mecanismo exato desta indução ainda não está
elucidado. Diante disso, a agregação plaquetária desses polímeros foi avaliada
através da curva de agregação plaquetária (CAP), que é um teste que permite
mensurar parâmetros temporais semi-quantitativos e qualitativos da função das
plaquetas frente a vários agentes agregantes como adenosina difosfato (ADP),
colágeno, epinefrina, trombina e ácido aracdônico (AA) por exemplo. Tal análise
pode ser quantificada no plasma rico em plaquetas (PRP).
O método é baseado na medida da formação de agregados de plaquetas
após a sua exposição a um agente agregante. Essa medida é realizada em um
Resultados
64
agregômetro capaz de medir a variação da transmissão de luz através de uma
suspensão de plaquetas, quando estas se agregam na presença de um agonista. O
resultado do teste é habitualmente expresso em porcentagem (amplitude máxima %)
de agregação, que traduz a quantidade de transmissão de luz e, portanto, a
formação de agregados.
3.3.1. Perfil da agregação plaquetária induzida por ADP, Colágeno e Epinefrina
Uma padronização da agregação plaquetária in vitro foi feita devido à
necessidade de estipular valores de referência para o equipamento PACKS-4 e para
as nossas condições laboratoriais, assim como para o resultado da agregação final
em porcentagem no tempo de 7 minutos estipulados no aparelho. A padronização foi
realizada com a utilização do plasma de 30 doadores de sangue (26 do sexo
masculino e 4 do sexo feminino) frente aos agentes agonistas: ADP 3 PM, epinefrina
10 Pg/mL e Colágeno 5 Pg/mL.
Os resultados obtidos para ADP, Colágeno e Epinefrina permitiram estipular,
para o nosso estudo, valores da média e desvio padrão e com esses,
caracterizarmos os valores de referência válidos para as nossas condições
experimentais.
Foram consideradas como perfis hipoagregados, as leituras com agregação
após ADP, Epinefrina e Colágeno, menores ou iguais a 70% e perfis
normoagregados aquelas que, com o mesmo método, mostraram valores maiores
que 70%.
Os resultados da média e desvio padrão em porcentagem da agregação dos
30 doadores expressos no tempo de 7 minutos de agregação, correlacionados com
Resultados
65
os agentes agregantes utilizados ADP, Colágeno e epinefrina foram 78,62 ± 8,98%,
80,18 ± 9,97% e 91,90 ± 7,96%, respectivamente.
3.3.2. Indução da agregação plaquetária pelos polissacarídeos fucosilados
O efeito do fucoidan (F) e da população de fucoidans F1, F2 e F3 na
agregação plaquetária foi estudado em um ensaio convencional turbidimétrico. A
agregação foi quantificada pela medida da amplitude máxima (em porcentagem) do
aumento da transmitância da luz após 7 minutos da adição do agente agonista
(soluções de polissacarídeos de Fucus vesiculosus – F, F1, F2, F3). Todos os
compostos fucosilados foram potentes indutores da agregação plaquetária nas
concentrações 0,5 mg/mL, 2 mg/mL e 5 mg/mL, com nível de significância de p <
0,001 (Figura 10).
Nas concentrações 0,1 mg/mL e 0,2 mg/mL foi verificado um perfil de
hipoagregação (agregação reversível) para todos os compostos fucosilados
estudados, sugerindo que a baixas concentrações o fucoidan e as frações do
fucoidan possuem pequeno efeito indutor plaquetário, com nível de significância p<
0,001 em comparação ao grupo salina 3,02 ± 2,02%.
A resposta da agregação induzida pelo fucoidan e pelas frações de Fucus
vesiculosus foi dose-dependente e observada imediatamente após a adição do
agente agonista (Fucoidan ou suas frações).
Os perfis das agregações plaquetárias induzidas por F, F1, F2 e F3 não
apresentaram diferenças significativas com p >0,05. Isto demonstra que as induções
da agregação plaquetária por estes compostos têm perfis bastante parecidos. No
entanto, a F3 demonstrou uma indução da agregação menor do que os demais
compostos fucosilados (F, F1, F2) p <0,001.
Resultados
66
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5
Concentração (mg/mL)
Amplitude máxima (%)
F
F1
F2
F3
Figura 10: Perfis das agregações plaquetárias induzidos pelos polissacarídeos sulfatados fucosilados.
F- Fucoidan ; F1, F2, F3- polissacarídeos fucosilados fracionados do Fucoidan de Fucus vesiculosus.
Os resultados obtidos no presente estudo também permitiram comparar os
valores das agregações plaquetárias irreversíveis induzidas pelas concentrações 2
mg/mL e 5 mg/mL do fucoidan e das frações F1, F2 e F3 com o ADP a 3 PM e a
Epinefrina a 10 Pg/mL. Somente para a fração F1 na concentração 2 mg/mL (53,36
± 9,77%) e para a fração F3 às concentrações 2 mg/mL e 5 mg/mL (43,44 ± 6,61% e
53,00 ± 9,30%, respectivamente) foram verificadas diferenças significativas para p
<0,001 em relação ao ADP 3 PM (78,62 ± 8,98%) e a epinefrina a 10 Pg/mL (91,90 ±
7,96%). Isso indica que a agregação plaquetária induzida pelo fucoidan (F) (76,36 ±
4,93%), F1 (69,54 ± 9,40%) e F2 (75,94 ± 9,01%) a 5 mg/mL e pelo F (69,82 ±
7,62%) e F2 (74,56 ± 5,02%) à concentração 2 mg/mL tem uma amplitude máxima
de agregação plaquetária similar ao ADP a 3 PM e a Epinefrina a 10 Pg/mL.
Resultados
67
3.3.3. Influência do sulfato nos perfis das agregações plaquetárias induzidas
pelo fucoidan e pelo fucoidan dessulfatado
A influência do sulfato na agregação plaquetária foi analisada. Verificou-se
que a diminuição de 70% no teor de sulfato não influenciou o perfil de agregação
plaquetária induzida pelo fucoidan quando comparado ao fucoidan dessulfatado p >
0,05 (Figura 11).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 0,1 0,2 0,5 2 5
Concentração (mg/mL)
Amplitude máxima (%)
F FDS
Figura 11: Influência do sulfato nos perfis das agregações plaquetárias induzidas pelo Fucoidan e
pelo Fucoidan dessulfatado.
F- Fucoidan; FDS- Fucoidan dessulfatado.
Resultados
68
3.3.4. Análise dos traçados de onda induzidos pelos agentes agonistas (ADP a
3 PM, Colágeno a 5 Pg/mL e Epinefrina a 10 Pg/mL)
A padronização da agregação plaquetária não só nos permitiu estipular
valores de referência quantitativa para as análises das condições laboratoriais ou do
aparelho PACKS-4, como também, nos forneceu dados qualitativos das agregações
plaquetárias induzidas pelos agentes agonistas (ADP a 3 PM, Colágeno a 5 Pg/mL e
Epinefrina a 10 Pg/mL). A resposta das plaquetas a estes agentes forneceu traçados
de ondas que permitiram avaliar a agregação plaquetária de acordo com os
seguintes parâmetros do esquema da figura 12, onde se tem: 1- Adição do reagente
agonista; 2- Onda primária da agregação em resposta ao estímulo do agente
agonista; 3- Término da agregação plaquetária primária em resposta ao agonista; 4-
Indução da resposta da secreção plaquetária; 5- Onda de agregação secundária em
resposta aos agentes endógenos liberados pelas plaquetas (TXA
2
, ADP, etc.); 6-
Término da agregação plaquetária com agregação irreversível das plaquetas.
Resultados
69
Figura 12: Perfil de uma onda bifásica da agregação plaquetária.
Adaptado de: www.newpath.clinical.pathologynews.
Acessado em: 02/03/2005.
O estudo das ondas de agregação nos oferece dados sobre o processo de
agregação plaquetária normal através da análise da primeira e segunda ondas, ou
seja, uma resposta bifásica (Figura 12) ou através da análise da fusão destas
ondas, reapresentando um perfil monofásico (Figura 13B), ou ainda, nos fornecendo
dados sobre uma agregação plaquetária anormal através do aparecimento apenas
da primeira onda de agregação ou da queda da segunda onda (Figura 13D). Para
isto, foram feitos controles com os agonistas citados anteriormente com o objetivo de
se obter uma padronização destas ondas (Figura 13).
A
A
g
g
r
r
e
e
g
g
a
a
ç
ç
ã
ã
o
o
p
p
l
l
a
a
q
q
u
u
e
e
t
t
á
á
r
r
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i
a
a
r
r
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v
v
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e
r
r
s
s
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í
v
v
e
e
l
l
A
A
g
g
r
r
e
e
g
g
a
a
ç
ç
ã
ã
o
o
p
p
l
l
a
a
q
q
u
u
e
e
t
t
á
á
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r
i
i
a
a
i
i
r
r
r
r
e
e
v
v
e
e
r
r
s
s
í
í
v
v
e
e
l
l
Resultados
70
Figura 13: Perfis de ondas de agregações plaquetárias induzidas pelos agentes agonistas ADP,
Colágeno e Epinefrina.
(A)- Curva padrão de agregação induzida pelo colágeno a 5 Pg/mL; (B)- Curva monofásica da
agregação plaquetária induzida por ADP a 3 PM; (C)- Curva bifásica da agregação plaquetária
induzida pela epinefrina a 10 Pg/mL; (D)- Curvas de agregação plaquetária na presença de epinefrina
a 10 Pg/mL . (I)- Perfil de uma normoagregação; (II) Perfil de uma hipoagregação (a curva apresenta
apenas a primeira onda de agregação).
Dos 30 doadores estudados (controles) 26 eram do sexo masculino e 4 do
sexo feminino, com idade entre 18 e 55 anos. Através dos ensaios de agregação
plaquetária destes doadores foi obtido uma padronização com os agentes agonistas
ADP, epinefrina e colágeno (Figura 13). Os resultados observados nos traçados de
ondas da agregação plaquetária induzida pelo ADP a 3 PM demonstraram que a
Tempo (s)
A
B
C
D
I
II
Resultados
71
maioria dos pacientes doadores apresentaram uma curva monofásica de agregação.
No entanto, dois doadores apresentaram um perfil bifásico na curva de agregação
sugerindo que esta curva obtida com a utilização do ADP a 3 PM estaria sujeita a
alterações no seu padrão monofásico devido às características individuais de cada
pessoa. Para a curva de agregação induzida pela epinefrina a 10 Pg/mL todos os
doadores apresentaram uma resposta bifásica na curva de agregação. A onda de
agregação induzida pelo colágeno apresentou-se como uma curva assimétrica
estando dentro dos padrões estabelecidos para uma curva de agregação induzida
por este agonista. (ROBSON et al., 1984; LA DUCA, et al., 1986).
3.3.5. Análise dos traçados de onda induzidos pelo Fucoidan e pelas frações
de Fucus vesiculosus
A agregação plaquetária induzida pelos polissacarídeos fucosilados (F, F1,
F2, F3) nos forneceu traçados de ondas que permitiram também o estudo qualitativo
da agregação plaquetária em resposta a estes agentes (Figura 14) Inicialmente, os
testes foram feitos com baixas concentrações dos polissacarídeos fucosilados (F,
F1, F2, F3) 0,1 mg/mL e 0,2 mg/mL onde ocorreram apenas mudanças mínimas nas
densidades ópticas das suspensões de plaquetas analisadas, ou seja, foi verificada
apenas uma pequena onda de agregação primária para cada uma destas
concentrações, sugerindo que nestas concentrações esses compostos são capazes
de iniciar a agregação plaquetária, agindo portanto como ativadores plaquetários,
porém não desencadeando a resposta secundaria, visto que não ocorreu o
aparecimento da segunda onda.
Resultados
72
Figura 14: Gráficos das agregações plaquetárias induzidas pelo Fucoidan e pela frações F1, F2 e F3.
A - Ondas de agregação plaquetária induzidas a concentração 0,1 mg/mL . B - Ondas de agregação
plaquetária induzidas a concentração 0,2 mg/mL . C - Ondas de agregação plaquetária induzidas a
concentração a 0,5 mg/mL. D - Ondas de agregação plaquetária induzidas a concentrações 2
mg/mL. A figura mostra para as letras A, B e C perfis de hipoagregação enquanto perfis de
normoagregação são verificados na letra D.
F- Fucoidan ; F1, F2, F3- polissacarídeos fucosilados fracionados do Fucoidan de Fucus vesiculosus.
Na concentração de 0,5 mg/mL foram verificados aumentos significativos na
primeira onda de agregação dos compostos fucosilados, no entanto, a segunda
onda ainda não foi verificada (Figura 14). Isso sugere que a esta concentração estes
compostos iniciam a ativação plaquetária, porém a liberação dos conteúdos
plaquetários, responsáveis pelo aparecimento da segunda onda, foi pequena o que
desencadeou apenas uma pequena resposta na agregação secundaria.
Tem
p
o
(
s
)
F
F2
F1
F3
F1
F2
F
F3
A
B
CD
F
F2
F1
F3
F
F2
F1
F3
Resultados
73
Com altas concentrações 2 mg/mL e 5 mg/mL, o fucoidan (F) e as frações F1
e F2 a agregação convencional detectou 2 fases de agregação plaquetária (1ª e 2ª
ondas de agregação). Isso indica que nestas concentrações ocorreram agregações
irreversíveis das plaquetas (Figura 14).
3.3.6. Comparação das vias de ativação plaquetária induzidas pelos agentes
agonistas (ADP, Colágeno, Fucoidan e Fucoidan dessulfatado)
A curva de agregação plaquetária é um teste que avalia a função quantitativa
e qualitativa das plaquetas pela exploração de diferentes vias de ativação
plaquetária in vitro. A ativação de cada via ocorre de forma independente, o que
implica dizer que uma hipoagregação mediante epinefrina, por exemplo, não
necessariamente indica que ocorrerá hipoagregação frente a outros agonistas como
o ADP, colágeno, trombina, etc.
Os nossos resultados demonstraram que os doadores que apresentavam
hipoagregação a ADP não demonstraram um perfil hipoagregante ao fucoidan (5
mg/mL), ao fucoidan dessulfatado (5 mg/mL), ao colágeno (5 Pg/mL), ou a epinefrina
(10 Pg/mL), como demonstrado nas figuras 15 e 16.
Resultados
74
Figura 15: Perfis normoagregados frente aos agentes agonistas ADP, Colágeno, Fucoidan e
Fucoidan dessulfatado.
Agregações plaquetárias induzidas pelo: F- Fucoidan a 5 mg/mL, FDS- Fucoidan dessulfatado a 5
mg/mL , ADP a 3 PM) e COL- colágeno a 5 Pg/mL.
COL
A
DP
F
FDS
Resultados
75
Figura 16: Perfis normoagregados frente aos agentes agonistas Colágeno, Fucoidan e Fucoidan
dessulfatado e perfil hipoagregado frente ao ADP.
Agregações plaquetárias induzidas pelos: F- Fucoidan a 5 mg/mL, FDS- Fucoidan dessulfatado a 5
mg/mL, ADP a 3 PM e COL- colágeno a 5 Pg/mL.
3.4. Atividade anti-hemostática (efeito hemorrágico residual)
3.4.1. Avaliação do efeito hemorrágico residual dos polissacarídeos sulfatados
nas concentrações 25, 50 e 100 Pg/mL
Os efeitos hemorrágicos residuais dos polissacarídeos nas concentrações 25,
50 e 100 Pg/mL foram realizados ao longo de 40 minutos de observação, sendo
feitas curvas cumulativas das potências de sangramento (PS) de cada
concentração em função do tempo de observação. Observa-se na figura 17 que nos
primeiros 15 minutos ocorreram efeitos hemorrágicos significativos que aumentaram
paulatinamente com o decorrer do tempo. Os dados mostraram ainda um pequeno
COL
A
DP
F
FDS
Resultados
76
efeito dose dependente nas concentrações 25 Pg/mL e 100 Pg/mL para o Fucoidan
com p <0,05 e nas concentrações 25 Pg/mL e 50 Pg/mL para a fração F2, p <0,05.
Observa-se também que as frações de polissacarídeos F1 e F3 não apresentaram
relação dose dependente com p >0,05 para todas as concentrações testadas. Isso
indica que o aumento da concentração não estimulou os potenciais de sangramento
dos polissacarídeos fucosilados. Além disso, quando os compostos F, F1, F2, F3
foram comparados entre si em seus perfis hemorrágicos, estes polissacarídeos não
tiveram diferenças significativas p >0,05 apresentando assim o mesmo perfil de
sangramento. Os experimentos realizados com os polissacarídeos fucosilados
mostraram também que estes compostos apresentaram efeitos hemorrágicos
menores na ordem de 55% para o Fucoidan e F2, 65% para as frações F1 e F3
quando comparados a uma heparina padrão (Liquemine) e uma heparina de baixo
peso molecular (Enoxeparina).
Resultados
77
Figura 17: Atividade anti-hemostática dos polissacarídeos sulfatados em função do tempo.
Após contato com os polissacarídeos sulfatados nas concentrações de 25, 50 ou 100 ug/mL por 2
minutos, a cauda escarificada foi exaustivamente lavada com solução salina e reintroduzida em
meio sem os polissacarídeos por 40 min. Cada ponto do gráfico representa a média de 5 animais.
F- Fucoidan ; F1, F2, F3- polissacarídeos fucosilados fracionados do Fucoidan de Fucus
vesiculosus; Liquemine- Heparina padrão; Enoxeparina- Heparina de baixo peso molecular.
Resultados
78
3.4.2. Influência do sulfato no efeito hemorrágico residual do Fucoidan e do
Fucoidan dessulfatado
A influência do sulfato na atividade anti-hemostática foi analisada. Verificou-se que a
diminuição de 70% no teor de sulfato não influenciou o efeito hemorrágico residual
induzido pelo Fucoidan (F) e pelo Fucoidam dessulfatado (FDS) p >0,05 (Figura 18).
Figura 18: Efeito hemorrágico residual do Fucoidan e do Fucoidan dessulfatado de Fucus vesiculosus
em função do tempo.
Após contato com soluções do Fucoidan e o Fucoidan dessulfatado na concentração de 50 ug/mL
para cada composto por 2 min, a cauda escarificada foi exaustivamente lavada com solução salina e
reintroduzida em meio sem os polissacarídeos por 40 min. Cada ponto do gráfico representa a média
de 5 animais.
F- Fucoidan ; FDS- Fucoidan dessulfatado; NS- não ocorreu diferença significativa.
0
2
4
6
0 2 4 8 1216202428323640
Tempo (min)
Potencial de sangramento
F (50 ug/mL)
FDS (50 ug/mL)
N
S
Resultados
79
3.5. Sistema Complemento
3.5.1. Efeito do Fucoidan na via alternativa do Sistema Complemento
No presente estudo, as ações dos diferentes polissacarídeos fucosilados
foram analisadas frente à via alternativa do Sistema Complemento. O Fucoidan na
concentração 0,1 mg/mL não exerceu influência significativa na atividade hemolítica
do complemento quando comparado ao grupo hemólise do soro (HSo) (Figura 19), p
>0,05. No entanto, nas concentrações 0,2 mg/mL, 0,5 mg/mL e 1 mg/mL observou-
se efeitos inibitórios na atividade hemolítica da via alternativa do complemento na
ordem de 43%, com alto nível de significância (p <0,001). Por outro lado, não foi
verificada uma relação dose dependente para estas concentrações p >0,05.
Resultados
80
0,000
0,400
0,800
1,200
1,600
2,000
100%
Hemólise
Hso F 0,1 F 0,2 F 0,5 F 1
Concetração (mg/mL)
Absorbância (414 nm)
Figura 19: Efeito das diversas concentrações do Fucoidan (F) na via alternativa do Sistema
Complemento.
. Diferenças significativas p <0,001.
100 % Hemólise- Controle da hemólise total provocada pela água. HSo- Controle da hemólise
provocada pelo soro. F- Fucoidan.
3.5.2. Efeito da fração F1 na via alternativa do Sistema Complemento
A fração F1 de F. vesiculosus apresentou para todas as concentrações
testadas (0,1- 1,0 mg/mL) diferenças significativas em relação ao grupo Hemólise do
soro (Hso) com nível de significância p <0,001 demonstrando que esta fração
aumentou a ação hemolítica do complemento em 22% quando comparada ao grupo
HSo como demonstrado na figura 20. Não foram, no entanto, verificadas diferenças
significativa entre as concentrações, o que demonstra não haver uma relação dose
resposta p >0,05.
***
***
*** ***
HSo
Resultados
81
0,000
0,400
0,800
1,200
1,600
2,000
100%
hemólise
HSo F1 0,1 F1 0,2 F1 0,5 F1 1
Concentração (mg/mL)
Absorbância (414 nm)
Figura 20: Efeito das diversas concentrações da fração F1 na via alternativa do Sistema
Complemento.
Diferenças significativas p < 0,001.
100 % Hemólise- Controle da hemólise total provocada pela água. HSo- Controle da hemólise
provocada pelo soro. F1- Fração F1 do Fucoidan (F. vesiculosus).
3.5.3. Efeito da fração F2 na via alternativa do Sistema Complemento
A fração F2 de F. vesiculosus apresentou para todas as concentrações (0,1-
1,0 mg/mL) diferenças significativas em relação ao grupo controle que representa a
hemólise do soro (HSo), com alto nível de significância p <0,001, mostrando que o
polímero inibe a ação hemolítica da via alternativa do Sistema Complemento na
ordem de 27% (Figura 21). Não foram verificadas diferenças significativas com o
****** ******
***
Resultados
82
aumento das concentrações demonstrando que nas concentrações utilizadas (0,1 –
1,0 mg/mL) não existe uma relação dose resposta p >0,05.
0,000
0,400
0,800
1,200
1,600
2,000
100%
hemólise
Hso F2 0,1 F2 0,2 F2 0,5 F2 1
Concentração (mg/mL)
Absorbância (141 nm)
Figura 21: Efeito das diversas concentrações da fração F2 na via alternativa do Sistema
Complemento.
] Diferenças significativas p < 0,001.
100 % Hemólise- Controle da hemólise total provocada pela água. HSo- Controle da hemólise
provocada pelo soro. F2- Fração F2 do Fucoidan (F. vesiculosus).
3.5.4. Efeito da fração F3 na via alternativa do Sistema Complemento
A fração F3 de F. vesiculosus apresentou para todas as concentrações (0,1 -
1,0 mg/mL) diferenças significativas (p <0,001), como demonstrado na figura 22.
Isso indica uma redução da atividade hemolítica na ordem de 35% em relação ao
grupo HSo, sugerindo que o polímero (F3) inibe a ação hemolítica da via alternativa
***
***
***
***
***
HSo
Resultados
83
do Sistema Complemento, porém, não existindo uma relação dose dependente p
>0,05.
0,000
0,400
0,800
1,200
1,600
2,000
100%
hemólise
Hso F3 0,1 F3 0,2 F3 0,5 F3 1
Concentração (mg/mL)
Absorbância (414 nm)
Figura 22: Efeito das diversas concentrações da fração F3 na via alternativa do Sistema
Complemento.
Diferenças significativas p <0,001.
100 % Hemólise- Controle da hemólise total provocada pela água. HSo- Controle da hemólise
provocada pelo soro. F3- Fração F3 do Fucoidan (F. vesiculosus).
3.5.5. Efeito da heparina não fracionada (Liquemine) na via alternativa do
Sistema Complemento
A ação inibitória dos polissacarídeos sulfatados na atividade hemolítica do
Sistema Complemento é conhecida. Diante disso, foi verificada a ação de uma
heparina não fracionada (Liquemine) na atividade hemolítica da via alternativa do
***
****** ***
***
HSo
Resultados
84
Sistema Complemento (Figura 23). A heparina não fracionada nas concentrações
0,1, 0,2 e 0,5 mg/mL exerceu uma ação inibitória na via alternativa do Sistema
Complemento na ordem de 17% quando comparada ao grupo HSo, p <0,001. No
entanto quando se utilizou 1 mg/mL observou-se um menor efeito inibitório em
relação as outras concentrações (p <0,01).
0,000
0,400
0,800
1,200
1,600
2,000
100%
hemólise
Hso Liq 0,1 Liq 0,2 Liq 0,5 Liq 1
Concentração (mg/mL)
Absorbância (414 nm)
Figura 23: Efeito das diversas concentrações da Heparina não fracionada (Liquemine) na via
alternativa do Sistema Complemento.
.........Diferenças significativas p <0,001.
. ....... Diferenças significativas p <0,05.
100 % Hemólise- Controle da hemólise total provocada pela água. HSo- Controle da hemólise
provocada pelo soro. Liq- Liquemine.
***
*
********* *
HSo
Resultados
85
3.5.6. Efeito da heparina de baixo peso molecular (Enoxeparina) na via
alternativa do Sistema Complemento
A atividade biológica dos polissacarídeos sulfatados varia de acordo com o
tipo de açúcar constituinte do polímero, de acordo com o grau de sulfatação ou com
o comprimento da cadeia. Sendo assim, além de uma heparina não fracionada, foi
verificada a ação de uma heparina de baixo peso molecular (enoxeparina) na
atividade hemolítica do Sistema Complemento.
Todas as concentrações da enoxeparina (0,1-1,0 mg/mL) apresentaram
diferenças significativas p <0,001, indicando uma redução da atividade hemolítica na
ordem de 22% em relação ao grupo HSo (Figura 24). Foi verificado uma pequena
diferença entre 0,1 mg/mL e 1 mg/mL (p <0,05), demonstrando que a maior ação
inibitória ocorreu com a maior concentração do composto.
Resultados
86
0,000
0,400
0,800
1,200
1,600
2,000
100%
hemólise
Hso Enox 0,1 Enox 0,2 Enox 0,5 Enox 1
Concentração (mg/mL)
Absorbância (414 nm)
Figura 24: Efeito das diversas concentrações da Heparina de baixo peso molecular (Enoxeparina)
na via alternativa do Sistema Complemento.
...........Diferenças significativas p <0,001.
. ..........Diferenças significativas p <0,05.
100 % Hemólise- Controle da hemólise total provocada pela água. HSo- Controle da hemólise
provocada pelo soro. Enox- Enoxeparina.
***
*
*********
*
HSo
Resultados
87
3.5.7. Comparação dos efeitos inibitórios dos polissacarídeos sulfatados sobre
o Sistema Complemento
Após verificar o efeito inibitório dos polímeros F, F2, F3, Liquemine e
Enoxaperina, foi feita uma comparação entre os polissacarídeos para verificar qual
deles apresentava o melhor perfil inibitório no efeito hemolítico do Sistema
Complemento (Figura 25).
Os polissacarídeos fucosilados apresentaram melhor ação inibitória no efeito
hemolítico do que a heparina não fracionada (Liquemine) com p <0,001 para F, p
<0,01 para F2 e p <0,001 para F3. O Fuciodan e a fração F3 também apresentaram
uma maior ação inibitória em comparação a heparina de baixo peso molecular
(Enoxeparina) p <0,001, porém, diferenças significativas entre F2 e a Enoxeparina
ou Liquemine e a Enoxeparina não foram verificadas (p >0,05), o que significa dizer
que estes compostos apresentaram uma ação similar. Além disso, quando
comparadas entre si, às frações F2 e F3 não apresentaram diferenças significativas
no seu efeito inibitório da via alternativa do Sistema Complemento p >0,05.
Resultados
88
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
00,511,5
Concentração (mg/mL)
Absorbância (414 nm)
F
F2
F3
Liquemine
Enoxeparina
Figura 25: Comparação dos polissacarídeos fucosilados e heparinas não fracionada e de baixo
peso molecular que possuem efeitos inibitórios na via alternativa do Sistema Complemento. O
ponto 0 (mg/mL) representa o grupo HSo (hemólise do soro).
F- Fucoidan; F2- Fração F2; F3- Fração F3 de F. vesiculosus; Liquemine- heparina padrão;
Enoxeparina- heparina de baixo peso molecular.
3.5.8. Influência do sulfato na via alternativa do Sistema Complemento
Foi verificada a influência do sulfato na atividade hemolítica da Via alternativa
do Sistema Complemento. A redução do teor de sulfato em 70% influenciou a
atividade hemolítica do Complemento (p <0,001), como demonstrado na figura 26.
Ao se comparar o Fucoidan com o Fucoidan dessulfatado e com o controle Hemólise
do soro (HSo) verificou-se que o Fucoidan nas concentrações 0,2 mg/mL, 0,5
mg/mL e 1 mg/mL inibiu a atividade hemolítica da via alternativa do sistema
complemento (p <0,001) enquanto que o Fucoidan dessulfatado apresentou uma
Resultados
89
inibição menor (p <0,05) em relação ao grupo controle HSo. Isso demonstrou que a
diminuição do teor de sulfato influência o efeito inibitório da atividade hemolítica do
complemento.
Figura 26: Efeito das diversas concentrações do Fucoidan e do Fucoidan dessulfatado na via
alternativa do Sistema Complemento.
..........Diferenças significativas p <0,001.
. ........ Diferenças significativas p <0,05.
100 % Hemólise- Controle da hemólise total provocada pela água. HSo- Controle da hemólise
provocada pelo soro. F- Fucoidan; FDS- Fucoidan dessulfatado.
***
*
*********
**
*
*
0,000
0,400
0,800
1,200
1,600
2,000
100%
hemólise
HSo F 0,1 F 0,2 F 0,5 F 1 FDS 0,1 FDS 0,2 FDS 0,5 FDS 1
Absorbância (414 nm)
Concetração (mg/mL)
*** *** ***
* * * *
Resultados
90
3.5.9. Ação de polissacarídeos sulfatados sobre a proteína C3 do Sistema
Complemento
Os polissacarídeos sulfatados deste estudo foram testados sobre as suas
interações com a proteína C3 do Sistema Complemento (Figura 27). Os resultados
demonstraram que os polissacarídeos, quando comparados ao grupo controle,
influenciaram a dosagem de C3. Diferenças significativas foram verificadas para o
Fucoidan (F), F2, F3, Liquemine, Enoxeparina a concentração 25 ug/mL (p< 0.01).
No entanto, não foram verificadas diferenças significativas para as demais
concentrações (50 e 75 ug/mL). A fração F1 apresentou diferença significativa na
concentração 75 ug/mL (p< 0.01). Os resultados demonstraram que o fucoidan, a
fração F2, a fração F3, a Liquemine e a Enoxeparina inibiram a formação dos
imunecomplexos anticorpo- C3, enquanto a fração F1 estimulou a quantificação dos
imunocomplexos anticorpo-C3, o que provavelmente se deve a ligação destes
carboidratos as proteínas C3.
Resultados
91
-150,00
-100,00
-50,00
0,00
50,00
100,00
150,00
0255075
Concentração (ug/mL)
Absorbância (340 nm)
F
F1
F2
F3
Enoxeparina
Liquemine
Figura 27: Influência dos polissacarídeos sulfatados na quantificação da proteína C3 do Sistema
Complemento.
F- Fucoidan; F1- Fração F1; F2- Fração F2; F3- Fração F3; Enoxeparina- Heparina de baixo peso
molecular; Liquemine- heparina não fracionada.
3.5.10. Ação de polissacarídeos sulfatados sobre a proteína C4 do Sistema
Complemento
Os polissacarídeos sulfatados deste estudo foram testados, também, sobre a
suas interações com a proteína C4 do Sistema Complemento (Figura 28).Os
resultados demonstraram que os polissacarídeos influenciaram a dosagem de C4
quando comparados ao grupo controle. Diferenças significativas foram verificadas
para o Fucoidan, F2, F3 Liquemine e Enoxeparina nas concentrações 25 ug/mL e 50
Pg/mL, sendo p <0,001 para o Fucoidan, F2 e Enoxeparina; p <0,01 para F3 e
Liquemine e p <0,001 para o Fucoidan e a Enoxeparina na concentração 25 Pg/mL
e p <0,01 para F2 e Liquemine na concentração 50 ug/mL. Apenas a fração F3 e a
Resultados
92
Enoxeparina apresentaram diferenças significativas na concentração 75 ug/mL (p
<0,05 para F3 e p <0.001 para a Enoxeparina). No entanto, a fração F1 não
apresentou diferença significativa em todas as concentrações testadas (25, 50, 75
ug/mL) . Os resultados demonstraram que o Fucoidan, F2, F3 , Liquemine e
Enoxaparina inibiram a formação dos imunocomplexos anticorpo-C4, o que
provavelmente se deve a ligação destes carboidratos as proteína C4, enquanto que
a fração F1 não exerceu influência na quantificação dos imunocomplexos anticorpo-
C4.
0
5
10
15
20
25
0255075
Concentração (ug/mL)
Absorbância (340 nm)
F
F1
F2
F3
Enoxeparina
Liquemine
Figura 28: Influência dos polissacarídeos sulfatados na quantificação da proteína C4 do Sistema
Complemento.
F- Fucoidan; F1- Fração F1; F2- Fração F2; F3- Fração F3; Enoxeparina- Heparina de baixo peso
molecular; Liquemine- heparina não fracionada.
Resultados
93
3.5.11. Influência do sulfato na dosagem das proteínas C3 e C4 do Sistema
Complemento
A influência do teor de sulfato na dosagem de C3 e C4 do Sistema
Complemento foi verificada pela dessulfatação parcial (FPD) e total do Fucoidan (F)
(FDS). Assim, o Fucoidan (F) foi modificado quimicamente sendo avaliado em
seguida a sua ação na dosagem das proteínas C3 e C4 (Figura 29 e 30). A redução
de 49% (FPD) e 70% (FDS) no teor de sulfato mostrou uma diminuição significativa
no perfil inibitório em relação à fração não dessulfatada na ordem de 22% (p <0,001)
quando comparada ao Fucoidan para a dosagem da proteína C3 e com relação à
proteína C4 mostrou uma pequena diferença significativa na ordem de 18% para a
concentração 75 Pg/mL com p <0,05. No entanto, quando comparada ao grupo
controle, esta concentração não influenciou a dosagem da proteína C4. Isso
demonstrou que o teor de sulfato teve um importante efeito na interação com a
proteína C3 demonstrando que a diminuição do conteúdo de sulfato diminuiu a
capacidade inibitória do Fucoidan perante a formação do imunecomplexo anticorpo-
C3 e que aparentemente a redução do teor de sulfato não exerce efeito na dosagem
na formação dos imunecomplexos anticorpo- C4.
Resultados
94
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
140,00
160,00
0255075
Concentração
(ug/mL)
Absorbância (340 nm)
F
FPD
FDS
Figura 29: Influência do sulfato na quantificação da proteína C3.
F- Fucoidan; FPD- Fucoidan parcialmente dessulfatado; FDS- Fucoidan dessulfatado.
Resultados
95
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
0255075
Concentrações (ug/mL)
Absorbância (340 nm)
F
FPD
FDS
Figura 30: Influência do sulfato na quantificação da proteína C4.
F- Fucoidan; FPD- Fucoidan parcialmente dessulfatado; FDS- Fucoidan dessulfatado.
Discussão
96
4.Discussão
Entre as drogas que modificam direta ou indiretamente a cinética da
coagulação sanguínea temos as heparinas, os dicumarínicos, os anti-agreagantes
plaquetários e os agentes antitrombóticos (HAMERSCHLAK; ROSENFELD, 1996).
No entanto, vários efeitos colaterais destes compostos têm sido relatados, sendo
então necessário o emprego de terapias alternativas para o controle da formação
dos coágulos sangüíneos. Como uma fonte de novos anticoagulantes que podem
superar algumas destas limitações, temos os polissacarídeos sulfatados de algas
marinhas marrons, fucanas e fucoidans, compostos dotados de atividades bioativas.
A atividade anticoagulante das fucanas foi inicialmente relatada em 1936 por
Chargaff e colaboradores em algas vermelhas e posteriormente, em 1941, quando
efeitos anticoagulantes foram verificados no extrato do gênero Laminaria, uma alga
marinha marrom (KIMURA; HOKKAIO; ZASSHI, 1941) Desde então, inúmeros
estudos têm sido desenvolvidos com o intuito de se caracterizar os aspectos
estruturais das fucanas e identificar as porções da molécula e grupamentos
químicos envolvidos na atividade anticoagulante ou em outras atividades biológicas.
Relatos demonstram que as potencialidades farmacológicas e biológicas das
fucanas estão relacionadas em parte com os métodos de extração empregados.
Segundo Grauffel et al. 1989, diferentes metodologias levam a extração de
diferentes polímeros com potencialidades distintas. Muitas vezes, o método
empregado na extração implica na perda da atividade farmacológica do composto
devido a danos aos polímeros. Grande parte dos estudos realizados emprega
polissacarídeos comerciais de boa procedência. Geralmente os polissacarídeos
extraídos das algas encontram-se contaminados com proteínas. A variabilidade do
Discussão
97
teor protéico destes açúcares está relacionada com o método de extração e com a
espécie da alga. Neste trabalho, foram detectados baixos índices de contaminações
proteícas no Fucoidan e nas frações de polissacarídeos (F1, F2 e F3) obtidas de F.
vesiculosus tornando assim, o trabalho exeqüível.
Existem diversos métodos para quantificar os polissacarídeos em animais e
vegetais (ROBESTS; QUEMENER, 1999). Para quantificar os açúcares totais do
Fucoidan, Fucoidan parcialmente dessulfatado, Fucoidan dessulfatado e das frações
do Fucoidan (F1, F2, F3) foi empregado o método colorimétrico de Dubois et al.
(1956) que permitiu verificar altos teores de açúcares totais em todos os
polissacarídeos fucosilados analisados no presente trabalho. Vale salientar que
estes polissacarídeos continham baixíssimos graus de impurezas, pois quando os
precipitados dessecados dos polissacarídeos foram visualizados
macroscopicamente, apresentavam-se claros indicando a ausência de polifenóis e
pigmentos comuns em polissacarídeos de algas marrons.
Além de altos teores de açúcares e baixos níveis de contaminação protéica,
os compostos fucosilados obtidos de F. vesiculosus exibiram percentuais de sulfato
variando entre 54 e 26%. Um trabalho realizado em nosso laboratório, empregando
a mesma metodologia de fracionamento com acetona, porém com uma outra
espécie de alga marrom a Lobophora variegata (QUEIROZ, 2003), obteve
percentuais de sulfatos variando entre 3,02 - 14%, o que vem a demonstrar um
elevado teor de sulfato nos polissacarídeos utilizados no presente trabalho.
A caracterização química das frações de F. vesiculosus (F1, F2, F3) foi
previamente descrita por Santos (2004). Ficou demonstrado que estas frações eram
constituídas essencialmente de fucose, apresentando quantidades vestigiais de
ácido urônico. Estes resultados foram também coincidentes com os obtidos por
Discussão
98
Patankar et al. (1993). De acordo com Kloareg (1988), as fucanas podem ser
classificadas de acordo com seus açúcares constituintes em homo e heterofucanas.
As fucanas utilizadas nesse trabalho são homofucanas. Fucanas de algas como
Sargassum vulgare, Lobophora variegata e Padina gymnospora, estudadas
previamente em nosso laboratório por Alves (2000), Queiroz (2003) e Silva et al.
(2004), respectivamente, apresentaram teores variados de outros açúcares (xilose,
manose, galactose e acido glucorônico) além da fucose, sendo, portanto,
caracterizados como heterofucanas.
Fucanas de baixo peso molecular (11 - 40 kDa) têm sido produzidas através
da hidrólise ácida e cromatografia de exclusão molecular ou cromatografia de troca
iônica (GRAUFFEL, et al., 1989; COLLIERC; BOISSON-VIDAL;
JOZEFONVIEZ,1994), utilizando-se extratos brutos de várias espécies de algas
marrons. No presente trabalho, o Fucoidan (179 KDa) e as frações F1 (170 KDa) e
F2 (117 KDa) são fucanas de alto peso molecular, enquanto a fração F3 apresenta
uma massa molecular de 15,2 kDa incluída, portanto, na faixa de fucanas de baixos
pesos moleculares. Nishino et al. (1991) demonstraram que a atividade
anticoagulante das fucanas extraídas da alga Ecklonia krone foi dependente do peso
molecular e do teor de sulfato.
Avaliando a atividade anticoagulante dos polissacarídeos sulfatados
estudados com relação ao tempo de tromboplastina parcialmente ativada (APTT),
verificou-se que o Fucoidan, e as frações F1 e F2 de F. vesiculosus, na massa de 10
µg , apresentaram atividades anticoagulantes similares à da heparina comercial
(Liquemine) e a heparina de baixo peso molecular (Enoxeparina). Para o tempo de
protrombina (PT) estes compostos apresentaram também, altas atividades
anticoagulantes quando comparadas com a Liquemine. No entanto, a fração F3
Discussão
99
apresentou baixa atividade anticoagulante em relação aos outros compostos
analisados.
Isso reforça os dados existentes na literatura, demonstrando que a atividade
anticoagulante estaria relacionada com os pesos moleculares dos polissacarídeos
sulfatados, uma vez que a fração F3 é a que possui o menor peso molecular e
apresentou a menor atividade anticoagulante. A influência do teor de sulfato na
atividade anticoagulante também foi verificada neste trabalho. A redução do teor de
sulfato na faixa de 49% (Fucoidan parcialmente dessulfatado) e 70% (Fucoidan
dessulfatado) mostrou que a presença do grupo sulfato é importante juntamente com
a conformação da estrutura para uma atividade anticoagulante efetiva. Nós
comprovamos que a diminuição da resposta anticoagulante pode ser justificada ou
sugerida devido à redução nos teores de sulfato nos polissacarídeos.
Grauffel et al. 1989, estudando fucanas extraídas de cinco algas marrons,
verificaram que a ação anticoagulante era decorrente, principalmente, da interação
com a trombina. Tal fato sugeria um efeito catalítico semelhante ao da heparina não
ocorrendo, porém, inibição do fator Xa. Estes autores observaram também, que
fucanas mais sulfatadas e de pesos moleculares próximo a 50 KDa apresentaram
uma atividade significativamente maior e que a ação inibitória desses compostos
seria mediada pelo Cofator II de heparina. Um outro trabalho realizado com um
Fucoidan purificado também de F.vesiculosus (Nishino et al., 1999) mostrou que
esse composto era capaz de inibir a ativação da protrombina, tanto pela via
intrínseca quanto pela via extrínseca, por impedir a formação da protrombinase
(complexo formado pelos Fatores Xa, Va, fosfolipídeos e cálcio).
Trabalhos realizados, verificando a ação anticoagulante do Fucoidan extraído
da alga F. vesiculosus, demonstraram que o principal mecanismo de ação do
Discussão
100
Fucoidan estaria relacionado com a formação de um complexo ternário entre o
Cofator II da heparina, Fucoidan e trombina (CHURCH et al., 1989, SOEDA et al.,
1992).
Estudos realizados por Durig et al. (1997), utilizando frações não purificadas
de F. vesiculosus, mostraram que frações com diferentes pesos moleculares e
teores de sulfatos, além de terem atividade anticoagulante, exerceram efeitos sobre
a função da plaqueta in vitro. Foi observado, ainda, que estes carboidratos induziam
a agregação plaquetária irreversível de maneira dose dependente e que o peso
molecular e o grau de sulfato dos polímeros exerciam influência significativa na
agregação plaquetária induzida pelos agentes agonistas.
Comparações entre frações de idêntico peso molecular (100 KDa) e
diferentes conteúdos de sulfato (7,6% e 10,2%) mostraram que a fração menos
sulfatada teve uma amplitude de agregação plaquetária maior do que a mais
sulfatada, demonstrando uma relação inversa da obtida com a atividade
anticoagulante. Entre frações de graus de sulfato idênticos, porém com peso
molecular diferentes, o polímero com 150 KDa induziu uma maior amplitude de
agregação que um de 50 KDa.
No presente trabalho, foi investigado o perfil de agregação plaquetária
induzida pelo Fucoidan e pelas frações deste composto. Tanto o Fucoidan como as
frações F1, F2 e F3 induziram a agregação plaquetária de maneira dose dependente
com a menor amplitude de agregação verificada para a fração F3 em todas as
concentrações testadas, a fração que possui menor peso molecular. No entanto, não
observamos influência do sulfato na indução da agregação plaquetária como
observado por Dürig e colaboradores (1997).
Discussão
101
Alwayn, et al. 2000 avaliando a agregação plaquetária in vivo por meio de
aplicação intravenosa do Fucoidan em babuínos xenotransplantados, mostraram
que ao invés de ativar, este composto inibia a agregação plaquetária induzida pelos
agonistas ADP, trombina, colágeno e ristocetina. Os autores surgeriram que esse
mecanismo de ação inibitória poderia estar vinculado a P-selectina que impediria a
adesão e agregação das plaquetas. Por atuarem como um receptor adesivo e
promoverem o contato entre células, as P-selectinas mediam a interação e o
recrutamento de plaquetas, neotrófilos e monócitos (CROVELLO; FURIE 1993,
HAMBURGUER ; MCEVER, 1990) para o sítio da injúria aumentando a inflamação
(GENG ; BEVILACQUA ; MOORE, 1990). Sendo assim, a interação das fucanas
com as P-selectinas teria um papel inibitório na agregação plaquetária, uma vez que,
impediriam a interação plaqueta- plaqueta via P-selectina.
Santos (2004), analisando a atividade antiinflamatória em edemas provocados
na orelha de camundongos com óleo de cróton, verificou que o Fucoidan e as
frações F1, F2 e F3 de F. vesiculosus diminuíam a presença de neutrófilos e células
mononucleares nos cortes histológicos dos grupos tratados com estes compostos
fucosilados em relação ao grupo controle positivo (Infamação induzida pelo óleo).
Isto sugere uma possível ligação destes carboidratos com as selectinas. No entanto,
ao avaliarmos o efeito destes polissacarídeos na função plaquetária verificou-se que
estes induziram a agregação plaquetária in vitro, contrariando em parte as
especulações sobre a inibição da agregação plaquetária pelo Fucoidan via P-
selectina. Possivelmente a ação previamente observada por Santos (2004) seria
decorrente apenas da L -selectina.
Durig et al., 1997, especulando a hipótese de um receptor como um potente
sítio de ligação do Fucoidan na indução da agregação plaquetária, sugeriram um
Discussão
102
receptor específico para heparinoides na superfície das plaquetas. Além disso,
proteínas secretadas como a trombospodina e o Fator plaquetário 4 poderiam atuar
subseqüentemente, potencializando a segunda fase da agregação plaquetária,
permitindo ao Fucoidan ligar-se novamente as plaquetas aumentando o estímulo
resposta a agregação.
Agentes agonistas como o ADP, ao se ligar a receptores presentes na
plaqueta induz apenas uma mudança conformacional e uma agregação reversível,
enquanto que a agregação irreversível é ocasionada pela síntese e liberação de
Tromboxano A
2
, ou seja, o ADP exerce um papel de disparar mecanismos que
induzem a secreção de substâncias que após liberadas irão se ligar a receptores na
membrana plaquetária amplificando a resposta da indução feita pelo ADP (GACHET,
2000).
De acordo com Ozaki e colaboradores (1994), a agregação plaquetária
induzida pela epinefrina consiste em duas fases, sendo a primeira caracterizada pela
formação de pequenos agregados de plaquetas (aproximadamente 100 células) o
que corresponde à primeira onda de agregação plaquetária. A segunda fase,
segunda onda de agregação, corresponderia à formação de um grande agregado de
plaquetas e conseqüentemente a diminuição no número dos pequenos agregados.
Satoh et al., 1996 avaliando a influência da concentração de epinefrina na formação
dos agregados de plaquetas, verificaram que a baixa concentrações (0,03-0,4 PM), a
epinefrina induzia apenas uma mudança mínima na densidade óptica das plaquetas
em suspensão com a formação de poucos grupos de pequenos agregados. No
entanto, em altas concentrações foram detectados duas fases de agregação, a
agregação primária que corresponderia a uma mudança na densidade óptica ao
redor de 10% persistindo por alguns minutos, seguida de uma mudança maior na
Discussão
103
densidade, freqüentemente referida como a agregação secundária ou agregação
irreversível.
A análise dos traçados de onda da agregação plaquetária induzida pelo
Fucoidan e pelas frações obtidas com precipitação com acetona, mostrou que a
baixas concentrações (0,1 mg/mL e 0,2 mg/mL) ocorreu apenas o aparecimento de
uma pequena onda primária, sugerindo que nestas concentrações ocorreriam
apenas a indução da agregação reversível com alterações na conformação
estrutural das plaquetas e estímulo nos pequenos grânulos, porém não ocasionado
liberação do conteúdo plaquetário.
Sob estimulação as plaquetas eliminam o conteúdo dos seus grânulos
promovendo um aumento da hemostasia local, através do recrutamento de
plaquetas, liberação de proteínas necessárias ao processo de coagulação
sangüínea. Contudo, nem sempre ocorre liberação de todo conteúdo dos grânulos
plaquetários; ou apenas alguns tipos de substâncias são liberadas, ou ainda, as
substâncias são liberadas com intensidades diferentes dependendo do estímulo.
(KAPLAN et al., 1979; HOLMSEN ; KAPLAN ; DANGELMANIER , 1982).
Nas concentrações de 2 mg/mL e 5 mg/mL (Fucoidan e das frações F1, F2 e
do Fucoidan dessulfatado) foram obtidas curvas bifásicas de agregação plaquetária
sugerindo que os estímulos-respostas desencadeados por estes agonistas nestas
concentrações induzem a liberação dos grânulos plaquetários ocasionando uma
agregação irreversível. Além disso, a verificação de perfis hipoagregantes para ADP
(3 µM) e normoagregantes para agregação induzida pelo Fucoidan (5 mg/mL),
Fucoidan dessulfatado (5 mg/mL) e colágeno (5 Pg/mL) sugerem que estes
mecanismo de indução da agregação ocorrem de forma independente, reforçando a
hipótese sobre um possível receptor nas plaquetas que o Fucoidan se ligaria
Discussão
104
induzindo a agregação plaquetária. Seria este receptor o mesmo receptor para
heparinóides ?
Farias, Nazareth, Mourão (2001), trabalhando com galactanas sulfatadas
obtidas da alga vermelha Botryocladia occidentalis, verificaram que estes polímeros
tinham potente atividade anticoagulante e como a heparina as galactanas inibiam a
trombina e o Fator Xa através da atuação na antitrombina e cofactor II de heparina,
além da inibição da coagulação aumentar simultaneamente com o conteúdo de
sulfato das frações. Um outro dado observado foi que as D-galactanas sulfatadas
não tinham efeito hemorrágico em altas concentrações, possivelmente uma
conseqüência do efeito indutor da agregação plaquetária pelas galactanas.
Avaliação do potencial hemorrágico dos polissacarídeos fucosilados de F.
vesiculosus mostrou baixo efeito hemorrágico residual em relação a heparina padrão
e heparina de baixo peso molecular e que o aumento da concentração não
estimulou os efeito hemorrágicos destes carboidratos, sendo então uma possível
conseqüência da indução plaquetária pelos mesmos.
Sabemos que a presença de glicosilações nas biomoléculas é essencial para
vida. Quase todos os organismos incluindo fungos, levedos, plantas, insetos, peixes,
algas e mamíferos possuem estruturas glicosiladas. Os oligossacarídeos presentes
nas paredes bacterianas, por exemplo, são capazes de estimular a resposta imune
do hospedeiro. Ainda, nos eventos de reconhecimento, os oligossacarídeos iniciam
funções biológicas através de interações de monossacarídeos com resíduos de
receptores (RUDD et al., 2004). Um exemplo são os clusters de IgG, presentes em
algumas patologias como artrite reumatóide que se ligam a lectina ligadora de
manose. Interações das fucanas com diferentes estruturas têm sido citadas, e,
devido a isto, estas moléculas têm servido tanto como ferramentas no entendimento
Discussão
105
do funcionamento de diversos eventos biológicos, como também, potenciais agentes
terapêuticos (BOINSSON-VIDAL, et al., 1995).
Os primeiros relatos de atividade inibidora das fucanas no Sistema
Complemento foram descritos por Blondin e colaboradores (1994) com a espécie
Ascophyllum nodosum. Desde então, outras fucanas das algas Fucus evanecences
e da ordem Laminariale, (ZYAGINTSEVA et al., 2000) têm sido descritas como
inibidores do Sistema Complemento.
Neste trabalho, a ação inibitória do Fucoidan e das frações obtidas da alga
marrom Fucus vesiculosus foi também verificada. O Fucoidan e as frações F2 e F3
inibiram o sistema hemolítico da via alternativa do Complemento na ordem de 43%,
27% e 35% para o Fucoidan e as frações F2 e F3 respectivamente.
Blondin et al. (1996), trabalhando com frações obtidas da alga Ascophyllum
nodosum e com pesos moleculares na faixa de 4100 a 214000 Da, observaram que
a inibição da hemólise em eritrócitos de carneiro e coelho aumentava
exponencialmente com o peso molecular, começando a ação inibitória a ser
verificada com 46800 Da para a via clássica (eritrócitos de carneiro) enquanto a
inibição da via alternativa (eritrócitos de coelho) era verificada com frações ao redor
de 13500 Da, relatando ainda que estas frações apresentaram uma inibição mais
potente do que uma heparina em inibir a via clássica do Sistema Complemento,
porém menos eficiente em inibir a via alternativa.
Neste trabalho a relação do aumento do peso molecular e o aumento da
atividade inibitória foram observados, reforçando os dados de Blondin et al. 1994 e
1996. Além disso, foi verificado que o Fucoidan e as frações F2 e F3 possuíram uma
ação inibitória maior que a heparina comercial (Liquemine) enquanto o Fucoidan e a
Discussão
106
fração F3 exerceram uma inibição maior do que a heparina de baixo peso molecular
(Enoxeparina) na via alternativa do Sistema Complemento.
Relações entre o peso molecular e atividade anticomplemento são relatadas
para outros polissacarídeos sulfatados como dextram sulfato (CREPON et al., 1984)
e as heparinas (MAILLET et al., 1988). Um outro requisito para a atividade inibitória
do Complemento tem sido o teor de sulfato. Neste trabalho, a redução de 70% do
conteúdo de sulfato influenciou a ação inibitória das fucanas na via alternativa do
Sistema Complemento, mostrando que quanto maior o teor de sulfato menor a
atividade hemolítica do Complemento. Zyagintseva et al. 2000 e Blondin et al. 1996,
no entanto, não observaram essa relação entre o teor de sulfato e atividade inibitória
uma vez que a redução do conteúdo de sulfato de 36% a 9% não afetou a atividade
inibitória do Sistema Complemento.
As ȕ-glucanas (Polissacarídoes extraídos de fungos) são conhecidas por
estimularem a ação do Sistema Complemento devido a interação via opsonização
das ȕ-glucanas com iC3b que promovem a ativação e liberação de citocinas
inflamatórias das células. Além disso, a sua ação estimulatória é verificada em
outros modelos experimentais de inflamação in vitro e in vivo, em que essa
capacidade estimulatória se deve ao reconhecimento das ȕ -glucanas via interação
direta com receptores (CR3 e Dectina-1, receptores Toll-like (TRC) presentes em
macrófagos, linfócitos, neutrófilos, células dentríticas (BROWN et al., 2003). Devido
as ȕ -glucanas serem imunoestimuladoras, elas vêm sendo empregadas como
agentes terapêuticos ao potencializar a resposta do hospedeiro contra uma
variedade de condições, incluindo desenvolvimento de tumores, infecções virais,
bacterianas e protozoários patogênicos (ROSS et al., 1999, TZIONABOS, 2000).
Discussão
107
A capacidade do zymosan, uma ȕ-glucana extraída do fungo Schacaroviceae
cerevisiae, ativar o sistema imune é bastante conhecida (BROWN; GORDON, 2003).
Um mecanismo proposto para explicar esta ativação independente da presença de
anticorpos baseia-se na capacidade do zymosan ligar-se ao C3b, gerado pela fase
fluida da via alternativa do complemento, e estabilizar esta molécula. Além do mais,
a conversão do ZyC3b a ZyC3bBbP, aumentaria a resistência deste complexo
enzimático às proteínas regulatórias do complemento, favorecendo a formação das
C3 convertases da fase líquida e da fase sólida (FEARON; AUSTEN, 1977). Sendo
assim a presença e um Fcoidan com propriedades estimulatórias via alternativa do
Sistema Complemento, possibilita o uma nova ferramenta no estudo das
propriedades do Complemento, como também um novo agente terapêutico em
tratamentos que envolvem imunossupressões do mesmo.
Estudos recentes realizados por Tissot et al. (2003) demonstraram que o
Fucoidan da alga Ascophyllum nodosum bloqueava o consumo das proteínas C2 e
C4 em menor extensão a proteína C3, indicando que o Fucoidan interfere com os
primeiros passos da ativação da via clássica do complemento. Este efeito não seria
devido à inibição da atividade proteolítica C1s, protease responsável pela ativação
de C2 e C4, mas resultado da interação entre o Fucoidan e as proteínas C1q e C4.
O Fucoidan ligado interferiu com a associação do tretâmero C1r2-C1s2 e C1q,
responsável pela ativação proteolítica das proteínas C2 e C4. Finalmente, Tissot ,
Daniel, Place (2003) mostraram que o Fucoidan inibiu a ativação do complexo C1
pela ligação do polímero ao domínio ligante de colágeno de C1q, como resultado
das interações entre resíduos positivos deste domínio e grupos sulfatados dos
polissacarídeos.
Discussão
108
Na cascata de coagulação a ação das cargas de compostos polianiônicos
atuantes sobre a antitrombina inibindo a coagulação do sangue é conhecida. A
diferença entre ativadores e não ativadores da via alternativa do Sistema
Complemento também depende da interação entre cargas. Segundo Meri &
Pangburn (1994), a afinidade do Fator H pelo C3b é regulada positivamente por
sítios carregados. Estes pesquisadores analisaram a habilidade de diferentes
glicosaminoglicanos e outros compostos negativamente carregados de se ligarem
aos sítios de interação polianiônica do fator H, aumentando assim, sua ligação com
C3b. Afirmavam ainda, que a ação de polissacarídeos como dextram sulfato,
heparina, condroitim sulfato e ácido hialurônico sobre o Sistema Complemento,
dependia do número de grupos sulfatos, de sua orientação e arranjo polimérico.
Portanto as fucanas têm suas ações biológicas justificadas em parte por suas cargas
e pelas distribuições destas nos polímeros.
Estudo realizado com fucanas do gênero Ascophyllum por Blondin et al. 1994,
sugeriu que a ação inibitória destes carboidratos na via alternativa do Complemento
seria através da inibição da formação ou da função da C3 convertase da via
alternativa, ou através da supressão da ligação do fator B a C3b ou por interferir com
a Propredina impedindo que esse complexo enzimático seja estabilizado.
Neste trabalho, diferente do proposto por estes autores, o mecanismo
estimulador das fucanas na via alternativa envolveria a ligação destas fucanas as
proteínas do Complemento, favorecendo a formação dos complexos enzimáticos
envolvidos no Complemento, como o que acontece com o zymosan, enquanto que o
mecanismo inibitório seria o oposto no mecanismo estimulatório. Os resultados
demonstrados na quantificação das proteínas C3 sugerem que a estimulação ou
inibição dos polissacarídeos aqui estudados, provavelmente ocorre via interação
Discussão
109
com as proteínas C3, não desprezando o fato destes carboidratos agirem em outras
proteínas do Complemento, como visto na proteína C4, sendo necessários, então,
futuros estudos para uma melhor compreensão deste mecanismo de ação.
Conclusões
110
6. Conclusões
O Fucoidan e as frações do Fucoidan (F1, F2, F3) obtidas de Fucus
vesiculosus através do fracionamento com acetona possuem atividade
anticoagulante nas vias intrínseca e extrínseca da cascata de coagulação, tendo o
peso molecular um importante papel neste processo;
O grau de sulfatação tem uma importante ação sobre a atividade
anticoagulante, uma vez que a dessulfatação do polissacarídeo tem um baixo efeito
sobre esta atividade.
O Fucoidan e as frações F1, F2, F3 apresentaram baixos efeitos
hemorrágicos residuais quando comparados as heparinas;
O Fucoidan e as frações do Fucoidan são agregantes plaquetários em altas
concentrações e em baixas concentrações não induziram uma significante
agregação plaquetária;
A variação do teor de sulfato do Fucoidan não influenciou o efeito
hemorrágico residual e a indução da agregação plaquetária.
O Fucoidan e as frações F2 e F3 inibiram a ação hemolítica da via alternativa
do Sistema Complemento, com exceção da fração F1 que estimulou esse sistema.
A ação dos polissacarídeos sulfatados testados no presente trabalho na via
alternativa do Sistema Complemento provavelmente ocorre via interação com a
proteína C3, não se descartando a possibilidade de ligação com outras proteínas do
Sistema Complemento.
Conclusões
111
Os Fucoidans podem auxiliar no esclarecimento das interações existentes
entre as atividades anticoagulante, antiinflamatória, anti-hemóstática, agregação
plaquetária e Sistema Complemento, que são obscuros quando induzidos
simultaneamente por um único composto.
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