( PDF ) Estudo fitoquímico das raízes de Chiococca alba (L.) HITCHC. (Rubiaceae)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

NÚCLEO DE PESQUISAS DE PRODUTOS NATURAIS

ESTUDO FITOQUÍMICO DAS RAÍZES DE Chiococca alba (L.)

HITCHC. (Rubiaceae)

Ricardo Moreira Borges

Rio de Janeiro

2006

Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Química de Produtos Naturais, Núcleo de

Pesquisas de Produtos Naturais da Universidade Federal

do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários

para a obtenção do título de Mestre em Ciências.

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ESTUDO FITOQUÍMICO DAS RAÍZES DE Chiococca alba (L.)

HITCHC. (Rubiaceae)

Ricardo Moreira Borges

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais

Programa de Química de Produtos Naturais

Orientadores

Prof. Dr. Antonio Jorge Ribeiro da Silva

Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais (UFRJ)

Prof

Dra. Nancy dos Santos Barbi

Faculdade de Farmácia (UFRJ)

Rio de Janeiro

2006

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III

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO - UFRJ

Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais - NPPN

Mestrado em Química de Produtos Naturais

Bloco H, CCS, Cidade Universitária

21 941-590 Rio de Janeiro

Fax 55-21-2562 6512

ESTUDO FITOQUÍMICO das RAÍZES de Chiococca alba (L.)

HITCHC. (Rubiaceae)

Ricardo Moreira Borges

Dissertação submetida ao Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais da

Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos à

obtenção do grau de Mestre em Ciências.

Rio de Janeiro, 30 de novembro de 2006.

Aprovada por:

_______________________

Prof

Dra. Maria Auxiliadora Coelho Kaplan

_______________________

Prof. Dr. José Paz Parente

_______________________

Prof. Dr. José Dias de Souza Filho

_______________________

Prof. Dr. Ricardo Machado Kuster

Rio de Janeiro

2006

FICHA CATALOGRÁFICA

Borges, Ricardo Moreira.

ESTUDO FITOQUÍMICO das RAÍZES de Chiococca alba (L.) HITCHC.

(Rubiaceae)/ Ricardo Moreira Borges. Rio de Janeiro: UFRJ/ NPPN, 2006.

xx, 171f.:il; 30 cm

Orientadores: Prof. Dr. Antonio Jorge Ribeiro da Silva

Prof

Dra. Nancy dos Santos Barbi

Dissertação (Mestrado) – UFRJ/ NPPN/ Programa de Pós-graduação em Química de

Produtos Naturais, 2006.

Referências Bibliográficas: f. 150-171.

1. Chiococca Alba. 2. Rubiaceae. 3.Triterpenos. 4. Saponinas. I. da Silva, A.J.R.. II.

Universidade Federal do Rio de Janeiro, Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais,

Programa de Pós-graduação em Química de

Produtos Naturais. III. Título.

À minha mãe Francisca Hercília Moreira Borges e

à minha avó Querubina Paiva Moreira.

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Antonio Jorge Ribeiro da Silva pelo conhecimento, orientação e incentivo

na realização deste trabalho.

A Prof

Dra. Nancy dos Santos Barbi pelo incentivo e confiança.

A Francisco Santos, Maria Cristina de H.P. Lima e Gisele de Oliveira pela obtenção dos

espectros, análises solicitadas e pela companhia e apoio.

A técnica Maria do Carmo pela produção de diazometano.

À Prof

Dra. Luzineide Tinoco e Instituto de Bioquímica (UFRJ) pelo apoio e obtenção

dos espectros de 400 e 600 MHz tão importantes para o trabalho realizado.

Ao Prof. Dr. José Dias de Souza Filho (UFMG) pela obtenção dos espectros de 400

MHz tão importantes para o trabalho realizado.

Ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Química de Produtos Naturais do

N.P.P.N. pelo conhecimento para a minha formação ética e profissional.

Aos amigos de laboratório Osman, Juan Francisco, Regina, Josiane e Maria Fernanda

pelo apoio, incentivo e, evidentemente, pela descontração.

Ao amigo Douglas Siqueira de Almeida Chaves pela doação da apiina e pelo apoio.

Ao Sr. Goulart pela coleta do material botânico para a confecção da exsicata.

Ao botânico Sebastião Neto do Jardim Botânico do Rio de Janeiro pela identificação da

espécie.

Aos amigos e a toda comunidade científica e funcionários do NPPN em geral pela

colaboração e incentivo.

A minha família e a minha namorada Carolina Ishimaru pelo apoio e incentivo

constante.

A Professora Cristina Tristão (Instituto de Macromoléculas – IMA/UFRJ) pela análise

por CPG.

Ao Laboratório de Análise, Departamento de Química Inorgânica (Instituto de Química-

IQ/UFRJ) pela obtenção dos espectros no IV.

À Coordenação de Pós-graduação, à Direção e à administração do NPPN, por terem

garantido a possibilidade de realização deste trabalho.

À CAPES pelo auxílio financeiro concedido durante a realização deste trabalho.

VII

Índice Geral

Índice de Esquemas

Índice de Figuras

XII

Índice de Tabelas

Lista de Abreviaturas

XVI

Resumo

XIX

Abstract

1 – Introdução 1

1.1 – A Família Rubiaceae 1

1.1.1 – Sistemática e Quimiossistemática 3

1.1.2 – Estudos químicos na família Rubiaceae 4

1.2 – Gênero Chiococca 6

1.2.1 – A espécie Chiococca alba (L.) Hitchc. 6

1.2.2 – Botânica e Sistemática (Cruz, 1930 ; Corrêa, 1931; Gusmão, 1992). 7

1.2.2.1 – Etimologia 7

1.2.2.2 – Sinonímia 7

1.2.2.3 – Descrição macroscópica (Gusmão e col., 1992) 7

1.2.2.4 – Sistemática botânica 8

1.2.2.5 – Distribuição 8

1.3 – Estudos químicos da espécie C. alba 8

1.4 – Atividades biológicas relacionadas com a espécie C. alba 12

1.5 – Saponinas 14

1.5.1 – Classificação e Variação Estrutural 14

1.5.2 – Biossíntese 15

1.5.3 – Ocorrência e Distribuição 18

1.5.4 – Atividade Biológica 18

1.5.5 – Isolamento 21

1.5.6 – Elucidação Estrutural 22

1.5.6.1. – Método Clássico 23

1.5.6.1.1 – Hidrólise 24

1.5.6.1.2 – Análise dos monossacarídeos 24

1.5.6.1.3 – Determinação dos tipos das ligações 25

1.5.6.1.4 – Análise da configuração dos átomos carbonos anoméricos 26

1.5.6.2 –

Métodos Recentes 26

2 – Objetivos 32

3 – Resultados e Discussão 33

3.1 – Geral 33

3.2 – Obtenção dos extratos brutos 34

3.4 – Análise dos extratos 35

3.4.1 – Análise do extrato hexânico (E.H.) 39

3.4.2 – Análise do extrato diclorometânico (E.Cl.) 48

3.4.3 – Análise do extrato etanólico (E.E.b) 60

3.4.3.1 – Elucidação Estrutural de RP-08.s.1 e RP-08.s.2 62

3.4.3.1.1 – Identificação da aglicona 63

3.4.3.1.2 – Caracterização da porção sacarídica 65

3.4.3.1.2.a –Identificação, Seqüenciamento e Proposta Estrutural 65

3.4.3.1.2.a.1 – Monossacarídeos de RP-08.s.2 66

3.4.3.1.2.a.2 – Monossacarídeos de RP-08.s.1 83

VIII

3.4.3.1.2.b – Análise dos Acetatos de Alditóis de RP-08.s.1 e RP-08.s.2 101

4 – Materiais e Métodos 106

4.1 – Materiais. 106

4.1.1 – Fases Estacionárias utilizadas para Cromatografia 106

4.1.2 – Cromatografia em Camada Delgada (CCD) 106

4.1.3 – Solventes 106

4.1.4. – Reagentes 106

4.2 – Equipamentos 108

4.2.1 – Cromatógrafos 108

4.2.2 – Espectrômetros / Espectrofotômetros 108

4.2.3 – Outros 109

4.3 – Métodos e Técnicas 110

4.3 – Obtenção do material botânico 111

4.5 – Obtenção dos extratos brutos 111

4.6 – Fracionamento dos extratos brutos 112

4.6.1 – Extrato hexânico 112

4.6.2 – Extrato diclorometânico 114

4.6.3 – Extrato etanólico 116

4.6.4 – Purificação das saponinas 117

4.7 – Hidrólises 118

4.8 – Obtenção dos produtos derivados 119

4.8.1 – Estér Metílico da Aglicona 119

4.8.2 – Acetatos de Alditóis 120

4.8.3 – Derivados Trimetilsililados dos monossacarídeos 121

5 – Conclusões 122

6 – Anexos 124

Anexo 1

124

Relação das classes de substâncias caracterizadas em espécies da família

Rubiaceae (de 1990 a 2005).*

Anexo 2

130

Dados utilizados como padrão para comparação e identificação da porção

aglicona.*

Anexos 3

131

Espectro de RMN de

C (50 MHz) da saponina RP-08.s.2. Há um sinal em 48,7

ppm não evidenciado. (Solvente: Metanol deuterado; Referência: TMS.).

Espectro de RMN de

H (600 MHz) da saponina RP-08.s.2. (Solvente: Metanol

deuterado; Referência: TMS.).

Mapa de correlação HSQC editado da saponina RP-08.s.2. (Solvente: Metanol

deuterado; Referência: TMS.).

Mapa de correlação HSQC editado (ampliação) da saponina RP-08.s.2.

(Solvente: Metanol deuterado; Referência: TMS.).

Mapa de correlação HSQC editado (ampliação) da saponina RP-08.s.2.

(Solvente: Metanol deuterado; Referência: TMS.).

Mapa de correlação HSQC editado (ampliação) da saponina RP-08.s.2.

(Solvente: Metanol deuterado; Referência: TMS.).

Mapa de correlação COSY da saponina RP-08.s.2. (Solvente: Metanol

deuterado; Referência: TMS.).

Mapa de correlação TOCSY da saponina RP-08.s.2. (Solvente: Metanol

deuterado; Referência: TMS.).

Mapa de correlação HMBC da saponina RP-08.s.2. (Solvente: Metanol

deuterado; Referência: TMS.).

Anexos 4

136

Espectro de RMN de

C (50 MHz) da saponina RP-08.s.1. Há um sinal em 48,7

ppm não evidenciado. (Solvente: Metanol deuterado; Referência: TMS.).

Espectro de RMN de

H (600 MHz) da saponina RP-08.s.1. (Solvente: Metanol

deuterado; Referência: TMS.).

Mapa de correlação HSQC editado da saponina RP-08.s.1. (Solvente: Metanol

deuterado; Referência: TMS.).

Mapa de correlação COSY da saponina RP-08.s.1. (Solvente: Metanol

deuterado; Referência: TMS.).

Mapa de correlação TOCSY da saponina RP-08.s.1. (Solvente: Metanol

deuterado; Referência: TMS.).

Mapa de correlação HMBC da saponina RP-08.s.1. (Solvente: Metanol

deuterado; Referência: TMS.).

Mapa de correlação HSQC-TOCSY da saponina RP-08.s.1. (Solvente: Metanol

deuterado; Referência: TMS.).

Mapa de correlação T-ROESY da saponina RP-08.s.1. (Solvente: Metanol

deuterado; Referência: TMS.).

Espectro de RMN de

C (50 MHz) da saponina RP-08.s.1 metilada com

diazometano. (Solvente: Metanol deuterado; Referência: TMS.).

Anexos 5

141

Cromatograma de uma mistura de padrões de monossacarídeos trimetilsililados.

A ordem de eluição foi Rha, Rib, Ara, Xyl, Man, Gal e Glc. Informações sobre

condições, ver Materiais e Métodos 4.8.3, pg. 119.

Anexos 6

142

Cromatograma obtido no CG-EM de padrões de monossacarídeos reduzidos e

acetilados. A ordem de eluição foi Rha, Rib, Ara, Xyl, Man, Glc e Gal.

Informações sobre condições, ver Materiais e Métodos 4.8.2, pg. 119.

Espectros de massas dos sinais em 25,97, 26,14, 26,47, 32,04 minutos,

respectivamente.

Anexo 7

144

Espectro de massas obtido no Micromass q-TOF, com ionização por

“eletrospray” no modo positivo da amostra RP-08.s.2.

Espectro de massas obtido no Micromass q-TOF, com ionização por

“eletrospray” no modo positivo da amostra RP-08.s.2. Seleção do íon a m/z

1063.

Espectro de massas obtido no Micromass q-TOF, com ionização por

“eletrospray” no modo positivo da amostra RP-08.s.1.

Espectro de massas obtido no Micromass q-TOF, com ionização por

“eletrospray” no modo positivo da amostra RP-08.s.1. Seleção do íon a m/z

1195.

Anexo 8

148

Cromatograma obtido no CG-EM dos monossacarídeos presentes na substância

RP-08.s.2 reduzidos e acetilados. O sinal em 25,56 minutos se refere a uma

ramnose, o sinal em 26,92 minutos a uma arabinose, e os sinais em 26,56 e 31,67

a uma apiose. Condições: ver item 3.4.2.1.2.b, pg. 104.

Cromatograma obtido no CG-EM dos monossacarídeos presentes na substância

RP-08.s.1 reduzidos e acetilados. O sinal em 25,91 minutos se refere a uma

ramnose, o sinal em 26,34 minutos a uma arabinose, e os sinais em 25,45, 26,89

e 32,03 a duas apiose. Condições: ver item 3.4.2.1.2.b, pg. 101.

Espectros de massas (impacto de elétrons-70eV) dos sinais em 25,451 e 26,89

minutos, respectivamente.

7 – Referências Bibliográficas 150

Índice de Esquemas

Esquema 1: Representação da biossíntese dos esqueletos esteroídicos e

triterpenoídicos a partir de uma unidade C-30 (Dewick, 2002; Hostettmann e

Marston, 1995).

Esquema 2: Esquema representativo para a obtenção de uma fração rica em

saponinas (Hostettmann e Marston, 1995; Simões e col., 1999).

Esquema 3: Esquema para a análise estrutural de oligossacarídeos presentes em

saponinas (Agrawal e Pathak, 1996).

Esquema 4: Proposta de fragmentação para a substância E.H.1-3.2 desenvolvida

com base no espectro de massas obtido.

Esquema 5: Proposta de fragmentação para a substância E.H.1-3.3 desenvolvida

com base no espectro de massas obtido.

Esquema 6: Proposta de fragmentação para a substância E.dCl.Me.1.4

desenvolvida com base no espectro de massas obtido.

Esquema 7: Proposta de fragmentação para a substância E.dCl.Me.1.3

desenvolvida com base no espectro de massas obtido.

Esquema 8: Proposta de fragmentação para a substância E.dCl.Me.1.2

desenvolvida com base no espectro de massas obtido.

Esquema 9: Proposta de fragmentação para a substância E.dCl.Me.1.1

desenvolvida com base no espectro de massas obtido.

Esquema 10: Esquema de fragmentação de acetatos de alditol (Kitson e col.,

1996).

102

Esquema 11: Esquema mostrando o procedimento de extração realizado com

auxílio do ultra-som.

112

Esquema 12: Fluxograma para o fracionamento do extrato hexânico. 113

Esquema 13: Fluxograma para o fracionamento do extrato diclorometânico. 115

Esquema 14: Fluxograma para o fracionamento do extrato etanólico. 117

XII

Índice de Figuras

Figura 1: Estruturas da cafeína, emetina e cefalina. 2

Figura 2: Alguns alcalóides indólicos da espécie Uncaria tomentosa

(Muhammad e col., 2001).

Figura 3: Alguns alcalóides isolados das folhas e flores da espécie Psychotria

colorata (Verotta e col., 1998; Rasolonjanahary e col., 1995; Verotta e col.,

2002).

Figura 4: Diversidade química e distribuição dos principais constituintes nas

quatro subfamílias: Ixoroideae (IXO), Cinchonoideae (CIN), Rubioideae (RUB)

e Antirheoideae (ANT) pertencentes à família Rubiaceae (Bolzani e col., 2001).

Figura 5: Estrutura da N,N-dimetiltriptamina (DMT). 6

Figura 6: Chiococca alba (L.) Hitch (disponível no site: http://www.plantatlas.

usf.edu/ images.asp? plantID=948, acessado no dia 7 de agosto de 2006).

Figura 7: Estruturas dos alcalóides 4-(4’-metoxifenil)-6,8-dimetóxi-2-

quinolinona e 4-(4’-metoxifenil)-6,8-dimetóxi-5-hidróxi-2-quinolinona.

Figura 8: Estruturas das hidroxicetonas, a 4-hidroxieptadecan-7-ona e a 5-

hidroxioctadecan-11-ona.

Figura 9: Estrutura do ácido 3β-hidróxiolean-12,15-dien-28-óico.

Figura 10: Estrutura dos iridóides albosídeos I–IV. 11

Figura 11: Estrutura do nor-seco-pimarano Merilactona. 11

Figura 12: Estrutura do flavonóide 4’-metoxikaempferol-7-(acetilóxi)-3,5-O-α-

L-ramnosídeo.

Figura 13: Reação representando a formação do íon alcóxido pela base forte

(dimetilsulfinil; CH

SOCH

), e a reação de substituição nucleofílica (SN

) com

o iodeto de metila (Chaplin e Kennedy, 1994).

Figura 14: Estrutura dos alcalóides 4-(4’-metoxifenil)-6,8-dimetóxi-2-

quinolinona e 4-(4’-metoxifenil)-6,8-dimetóxi-5-hidróxi-2-quinolinona.

Figura 15: Cromatograma (CPG) de Ppt.1. 36

Figura 16: Proposta estrutural para Ppt.1. 36

Figura 17: Mapa de correlações HETCOR de Ppt.1. Em f2 está alocado o

espectro APT.

Figura 18: Espectro de RMN de

H de Ppt.1. 38

Figura 19: Espectro APT de Ppt.1. 38

Figura 20: Espectro no I.V. de Ppt.1. A banda larga a 3431 cm

-1

é advinda da

umidade na amostra analisada.

Figura 21: Cromatograma de massas da fração E.H.1-3. 40

Figura 22: Estruturas básicas dos esqueletos dos tipos filicano e fernano. 41

Figura 23: Espectro de massas da substância E.H.1-3.1. 42

Figura 24: Espectro de massas da substânica E.H.1-3.2. 44

Figura 25: Espectro de massas da substância E.H.1-3.3. 47

Figura 26: Estruturas básicas dos esqueletos dos tipos oleanano e ursano. 49

Figura 27: Cromatograma de massas da fração E.dCl.Me.1. 50

Figura 28: Espectro de massas da substância E.dCl.Me.1.4. 51

Figura 29: Espectro de massas da substância E.dCl.Me.1.3. 52

Figura 30: Espectro de massas da substância E.dCl.Me.1.2. 56

Figura 31: Espectro de massas da substância E.dCl.Me.1.1. 57

Figura 32: Cromatograma da CLMP. Detetor de absorção no UV a 220 nm. 60

Figura 33: CLAE analítica das frações RP-08.s, RP-09.s e RP-10.s (Materiais e

Métodos 4.6.3, pg. 116). Condições: metanol-água-ácido trifluoroacético (TFA;

70:30:0,0125) como fase móvel e detecção por absorção no UV (203 nm) em

XIII

coluna de fase inversa (RP-18).

Figura 34: Cromatograma otimizado da fração RP-08.s. Condições: metanol-

água-ácido trifluoroacético (TFA; 60:40:0,0125) como fase móvel e detecção

por absorção no UV. (modo Spectrum Max plot) em coluna de fase inversa (RP-

18).

Figura 35: Espectro no UV das saponinas presentes na fração RP-08.s.. 62

Figura 36: Espectro de RMN-

C (50 MHz) da saponina RP-08.s.2 (ampliação). 67

Figura 37: Espectro de RMN-

H (600 MHz) da saponina RP-08.s.2

(ampliação).

Figura 38: Mapa de correlação TOCSY da saponina RP-08.s.2 (ampliação).

Correlação a partir do sinal em 1,26 ppm.

Figura 39: Mapa de correlação COSY da saponina RP-08.s.2 (ampliação). No

inserto está a correlação do sinal em 1,26 ppm com o sinal em 3,75 ppm.

Figura 40: Espectro de RMN-

H (600 MHz) da saponina RP-08.s.2

(ampliação).

Figura 41: Mapa de correlação TOCSY da saponina RP-08.s.2 (ampliação).

Correlação entre os sinais 1,28 e 3,52 ppm.

Figura 42: Mapa de correlação TOCSY da saponina RP-08.s.2 (ampliação).

Correlação a partir do sinal em 4,38 ppm.

Figura 43: Mapa de correlação COSY da saponina RP-08.s.2 (ampliação). 71

Figura 44: Espectro de RMN-

H (600 MHz) da saponina RP-08.s.2

(ampliação).

Figura 45: Espectro de RMN-

C (50 MHz) da saponina RP-08.s.1 metilada

com diazometano (ampliação).

Figura 46: Mapa de correlação TOCSY da saponina RP-08.s.2 (ampliação). 75

Figura 47: Mapa de correlação HMBC da saponina RP-08.s.2 (ampliação). 76

Figura 48: Espectro de RMN-

H (600 MHz) da saponina RP-08.s.2

(ampliação).

Figura 49: Mapa de correlação TOCSY da saponina RP-08.s.2 (ampliação).

Correlação a partir do sinal 5,46 ppm.

Figura 50: Mapa de correlação COSY da saponina RP-08.s.2 (ampliação). 78

Figura 51: Mapa de correlação HMBC da saponina RP-08.s.2. 80

Figura 52: Mapa de correlação T-ROESY da saponina RP-08.s.2. 80

Figura 53: Estrutura proposta para RP-08.s.2: 3-O-β-D-glucopiranuronosil-

hidroxiolean-12,15-dien-28-oato de 28-O-α-D-apiofuranosil(1→4)-α-L-

ramnopiranosil(1→2)-α-L-arabinopiranosila.

Figura 54: Proposta de fragmentação resultante de ionização branda para RP-

08.s.2. [M + Na]

: Obs: 1063.5127 Calc. para C

: 1063,50847.

Figura 55: Espectro de RMN-

C (50 MHz) da saponina RP-08.s.1 (ampliação). 83

Figura 56: Espectro de RMN-

H (600 MHz) da saponina RP-08.s.1

(ampliação).

Figura 57: Mapa de correlação TOCSY da saponina RP-08.s.1 (ampliação).

Correlação a partir do sinal em 1,28 ppm.

Figura 58: Mapa de correlação COSY da saponina RP-08.s.1 (ampliação). No

inserto está a correlação do sinal em 1,28 ppm com o sinal em 3,83 ppm.

Figura 59: Espectro de RMN-

H (600 MHz) da saponina RP-08.s.1

(ampliação).

Figura 60: Mapa de correlação TOCSY da saponina RP-08.s.1 (ampliação).

Correlação entre os sinais em 1,28 e 3,62 ppm.

Figura 61: Mapa de correlação TOCSY da saponina RP-08.s.1 (ampliação). 88

XIV

Correlação a partir do sinal em 4,38 ppm.

Figura 62: Mapa de correlação COSY da saponina RP-08.s.1 (ampliação). 88

Figura 63: Espectro de RMN-

H (600 MHz) da saponina RP-08.s.1

(ampliação).

Figura 64: Mapa de correlação COSY da saponina RP-08.s.1 (ampliação). 91

Figura 65: Espectro de DEPT da saponina RP-08.s.1 (ampliação). 91

Figura 66: Espectro de RMN de

H (600 MHz) da saponina RP-08.s.1

(ampliação).

Figura 67: Mapa de correlação TOCSY da saponina RP-08.s.1 (ampliação). 93

Figura 68: Mapa de correlação COSY da saponina RP-08.s.1 (ampliação). 93

Figura 69: Mapa de correlação HMBC da saponina RP-08.s.1 (ampliação). 94

Figura 70: Mapa de correlação COSY da saponina RP-08.s.1 (ampliação). 96

Figura 71: Mapa de correlação HMBC da saponina RP-08.s.1 (ampliação). 97

Figura 72: Mapa de correlação ROESY da saponina RP-08.s.1 (ampliação). 98

Figura 73: Estrutura proposta para RP-08.s.1: 3-O-β-D-glucopiranuronosil-

hidroxiolean-12,15-dien-28-oato de 28-O-α-D-apiofuranosil(1→3)-[α-D-

apiofuranosil (1→4)] -α-L-ramnopiranosil(1→2)-α-L-arabinopiranosila.

Figura 74: Proposta de fragmentação resultante de ionização branda para RP-

08.s.1. [M + Na]

: Obs: 1195,5896. Calc. para C

: 1195,55067.

100

Figura 75:Estrutura da apiina. 104

Figura 76: Cromatograma obtido no CG-EM dos monossacarídeos presentes na

apiina reduzidos e acetilados.

104

Índice de Tabelas

Tabela 1: Principais correlações observadas nos experimentos mais utilizados de

RMN (Claridge, 1999).

Tabela 2: Regras de deslocamento químico e constantes de acoplamento a serem

observadas para a comparação de dados obtidos nos espectros com dados da

literatura.

Tabela 3: Rendimentos aproximados dos extratos obtidos com o auxílio do

extrator de Soxhlet e do ultra-som.

Tabela 4: Deslocamentos químicos (

H), referentes apenas à aglicona, obtidos

para RP-08.s.1 e RP-08.s.2.

Tabela 5: Deslocamentos químicos (

C) e multiplicidades obtidas para RP-

08.s.1 e RP-08.s.2. (Solvente: metanol deuterado, referência: TMS.)

Tabela 6: Deslocamentos químicos de hidrogênio e carbono-13 na ramnose.

Tabela 7: Deslocamentos químicos de hidrogênio e carbono-13 no ácido

glicurônico.

Tabela 8: Deslocamentos químicos (

C) e multiplicidades obtidas para as pró-

saponinas de RP-08.s.1 e RP-08.s.2*.

Tabela 9: Deslocamentos químicos de hidrogênio e carbono-13 na apiose. 76

Tabela 10: Deslocamentos químicos de hidrogênio e carbono-13 na arabinose. 79

Tabela 11: Deslocamentos químicos de hidrogênio e carbono-13 na ramnose. 86

Tabela 12: Deslocamentos químicos de hidrogênio e carbono-13 no ácido

glicurônico.

Tabela 13: Deslocamentos químicos de hidrogênio e carbono-13 na apiose. 92

Tabela 14: Deslocamentos químicos de hidrogênio e carbono-13 na arabinose. 95

Tabela 15: Deslocamentos químicos de hidrogênio e carbono-13 na apiose Ap’. 96

Tabela 16: Dados de áreas relativas dos sinais do cromatograma dos acetatos de

alditóis da amostra RP-08.s.1.

103

Tabela 17: Dados de áreas relativas dos sinais do cromatograma dos acetatos de

alditóis da amostra RP-08.s.2.

105

Tabela 18: Condições gerais para obtenção dos experimentos de RMN. 109

XVI

Lista de Siglas e Abreviaturas

col. Colaboradores

EUA Estados Unidos da América

CG-EM

Cromatografia com Fase Gasosa Acoplada À

Espectrometria de Massas

IXO Ixoroideae

CIN Cinchonoideae

RUB Rubioideae

ANT Antirrheoideae

DMT N,N-Dimetiltriptamina

U.V. UltraVioleta

CCD Cromatografia em Camada Delgada

Concentração letal que mata 50% das cobaias

µg/ml micrograma por mililitro

mg/kg miligrama por quilograma

Glc D-Glicose

Gal D-Galactose

Rha L-Ramnose

Xyl L-Xilose

Ara L-Arabinose

GlcA Ácido Glicurônico

GalA Ácido Galacturônico

Qui Quinovose

NADPH Nicotonamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CCCG Cromatografia de Contra-Corrente de Gotejamento

CLBP Cromatografia Líquida Sob Baixa Pressão

CLMP Cromatografia Líquida Sob Média Pressão

n-BuOH Butanol normal

CG Cromatografia em Fase Gasosa

RMN de

H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

FAB Fast Atom Bombardment

FD Field Desorption

MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionization

ESI Ionização por “Eletrospray”

DMSO Sulfóxido de Dimetila

Substituição Nucleofílica Bimolecular

ppm partes por milhão (expressão)

RMN de

C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13

Hz Hertz

δ deslocamento químico

RMN Ressonância Magnética Nuclear

COSY Correlated Spectroscopy

HETCOR Heteronuclear Correlation

HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

XVII

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

COLOC Correlated Spectroscopy for Long Range Coupling

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

NOEDS Nuclear Overhauser Difference Spectroscopy

NOESY Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy

ROESY Rotating Frame Overhauser Effect Spectroscopy

TOCSY Total Correlated Spectroscopy

HOHAHA Homonuclear Hartmann Hahn

2-D bidimensional

constante de acoplamento

NOE Nuclear Overhauser Efect

1-D monodimensional

DQF-COSY Double Quantum Filtered COSY

p.a. para análise

v/v volume por volume

N Normal

mL mililitro

ºC graus Celsius

Min Minutos

g gramas

NP Natural Product (Reagente)

IV InfraVermelho

S simpleto

D dupleto

T tripleto

M multipleto

Dd dupleto de dupleto

m metro

mm milímetro

µm

micrômetro

cm centímetro

W Watt

V Volt

MHz MegaHertz

CPG Cromatografia de Permeação em Gel

TMS tetrametilsilano

sl simpleto largo

tl tripleto largo

número de onda

md médio

i intenso

f fraco

pH potencial Hidrogeniônico

ODS Octadecilsilano

XVIII

iPrOH Álcool isopropílico

MeOH Metanol

F.M. Fase Móvel

RP-18 Fase Inversa (ODS)

m/z

Relação massa/carga

BuOH Butanol

nm Nanômetro

D.A.D. Detetor de feixe de diodos

µg micrograma

µL microlitro

TFA Ácido trifluoroacético

eV elétron Volt

T-ROESY Transverse-ROESY

XIX

Resumo

Resumo da dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em

Química de Produtos Naturais, Núcleo de Pesquisa de Produtos Naturais da

Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à

obtenção do título de Mestre em Ciência.

A espécie Chiococca alba (L.) Hitch (Rubiaceae) é um arbusto tropical e

subtropical presente em praticamente todo o continente americano. Essa espécie,

conhecida popularmente como “cainca”, “cruzeirinha”, “dambrê”, “purga-preta” e

“cipó-cruz”, dentre outras denominações, tem o chá de suas raízes tradicionalmente

empregado no tratamento de diversas enfermidades por suas atividades anti-reumática,

emética, purgativa, diurética, febrífuga, tônica, antiinflamatória, antiviral,

antiedematogênica, contra envenenamento ofídico e afrodisíaca. São poucos os

trabalhos, tanto químicos quanto farmacológicos, publicados acerca deste gênero. Este

trabalho inclui-se no esforço para o estabelecimento do perfil químico da C. alba.

Os extratos em hexano, diclorometano e etanol revelaram a presença de dois

triterpenos pentacíclicos (um pertencente a classe dos filicanos e outro da classe dos

fernanos) quatro triterpenos pentacíclicos ácidos (o ácido ursólico, o ácido oleanólico e

dois derivados desse último) e 5 saponinas triterpênicas. Dessas saponinas triterpênicas

duas foram identificadas como sendo a 3-O-β-D-glucopiranuronosil-hidróxiolean-

12,15-dien-28-oato de 28-O-α-D-apiofuranosil(1→3)-[α-D-arabinopiranosil (1→4)]-α-

L-ramnopiranosil(1→2)-α-L-arabinopiranosila (RP-08.s.1) e a 3-O-β-D-

glucopiranuronosil-hidroxiolean-12,15-dien-28-oato de 28-O-α-D-apiofurano-sil

(1→3)-α-L-ramnopiranosil(1→2)-α-L-arabinopiranosila (RP-08.s.2).

Os triterpenos caracterizados dos extratos hexânico e diclorometânico tiveram

suas estruturas propostas por métodos espectrométricos (CG-EM, impacto de elétrons-

70eV). As saponinas do extrato etanólico foram identificadas por métodos

espectroscópicos, tais como RMN-

H, RMN-

C, DEPT-135, COSY

H-

H, TOCSY,

HSQC, HMBC, ROESY e JCH resolvido, métodos cromatográficos e evidências

químicas, tais como análises dos produtos das reações de hidrólise (ácida e básica),

derivados ou não.

Abstract

Resumo da dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em

Química de Produtos Naturais, Núcleo de Pesquisa de Produtos Naturais da

Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à

obtenção do título de Mestre em Ciência.

Chiococca alba (L.) Hitch (Rubiaceae) is a tropical and sub-tropical shrub

spread all over the American continent. Commonly known as “cainca”, “cruzeirinha”,

“dambrê”, “purga-preta”, “cipó-cruz”, “caninana”, “raiz-preta”, “raiz-de-frade” and

“quina-preta”, the infusion of its roots is used in traditional medicine for the treatment

of several illnesses for its anti-rheumatic, emetic, purgative, diuretic, antipyretic, tonic,

anti-inflammatory, anti-viral, anti-edema, aphrodisiac and against snakebite activity.

There are few papers, concerning the chemistry and pharmacological activities,

published for Chiococca. This work is a contribution for establishing the chemical

profile of C. alba.

The hexane, methylene chloride and ethanol extracts showed the presence of two

pentacyclic triterpenes (one belonging to the filicane and the other to the fernane

classes), four acid pentacyclic triterpenes (ursolic acid, oleanolic acid as well as two

ursane derivatives) and five tritepenoidal saponins. Two of these triterpenoidal saponins

were identified as 28-O-α-D-apiofuranosyl(1→3)-[α-D-arabinopyranosyl(1→4)]-α-L-

rhamnopyranosyl (1→2)-α-L-arabinopyranosyl 3-O-β-D-glucopyranuronosyl-

hydroxyolean-12,15-dien-28-ate (RP-08.s.1) and 28-O-α-D-apiofuranosyl (1→3)-α-L-

rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosyl 3-O-β-D-glucopyranuronosyl-3β-

hydroxyolean-12,15-dien-28-ate (RP-08.s.2).

The six triterpenes characterized from the hexane and methylene chloride

extracts have their structures proposed on the basis of GC-MS (electron impact – 70

eV). The saponins from the ethanol extract were identified by spectroscopic methods,

such as

H-NMR,

C-NMR, DEPT-135º, COSY

H-

H, TOCSY, HSQC, HMBC e T-

ROESY. Chromatographic methods and chemical evidences, such as hydrolysis

reactions (under acid and basic conditions) and analysis of derivatized products were

also used.

1 – Introdução

1.1 – A Família Rubiaceae

A família Rubiaceae, uma das maiores dentre as Angiospermae, engloba cerca

de 640 gêneros e aproximadamente 10.700 espécies, classificadas em quatro subfamílias

(Cinchonoideae, Ixoroideae, Antirheoideae e Rubioideae) e 44 tribos essencialmente

tropicais (Young e col., 1996). Segundo Mabberley (1997), ela ocupa o quarto lugar em

diversidade entre as Angiospermae, perdendo apenas para Asteraceae, Orchidaceae e

Fabaceae.

As espécies de Rubiaceae são largamente distribuídas nos variados

ecossistemas brasileiros, como nas florestas Amazônica, Atlântica e no Cerrado, além

de ocorrerem também desde a América Central até o sul dos EUA. O número de

espécies nativas da América do Sul supera todas as demais regiões do planeta,

englobando 30% do total, muitas endêmicas do Brasil. As Rubiaceae nativas brasileiras

compreendem cerca de 110 gêneros e 1700 espécies amplamente distribuídas,

predominando sob a forma de árvores e semi-arbustos (Bolzani e col., 2001). Só na

região Nordeste, Barbosa e colaboradores (1996) compilaram 66 gêneros e 277

espécies.

No contexto popular, as espécies da família Rubiaceae sempre foram bastante

exploradas por suas atividades medicinais. Talvez sua maior contribuição à sociedade

ainda seja o café (a infusão de Coffea arabica). O cafeeiro é uma pequena árvore nativa

das zonas montanhosas do sudeste da Etiópia e sul do Sudão. Inicialmente cultivada

pelos árabes, o emprego da C. arabica foi disseminado rapidamente pelo mundo até

alcançar o Brasil, que chegou a ser o primeiro produtor mundial. De fato, sua semente é

uma das maiores commodities do mundo, sendo o principal produto de exportação de

alguns países. Essa espécie é de grande importância pela manufatura de uma bebida

estimulante e alimentícia, consumida mundialmente, e ainda para a extração da cafeína

(Figura 1).

Uma espécie também bastante importante para a família é a Cinchona

officinalis (cinchona), uma árvore que pode crescer até 10 metros e é fonte de uma

variedade de alcalóides, dos quais o mais importante é a quinina, um agente antipirético

bastante usado no tratamento da malária na década de 20. Uma outra Rubiaceae de

interesse é a Cephaelis ipecacuanha (ipecacuanha), espécie nativa do Brasil, da qual são

extraídos alcalóides de grande interesse médico como, por exemplo, a emetina e a

cefalina (Figura 1), estimulantes do sistema nervoso central e periférico (Bucaretchi e

Baracat, 2005).

MeO

OMe

H H

MeO

OMe

H H

Figura 1: Estruturas da cafeína, emetina e cefalina.

As plantas do gênero Uncaria, largamente distribuídas pelas regiões tropicais,

incluindo sul da Ásia, África e América do Sul, são muito utilizadas tradicionalmente

para o tratamento de feridas e úlceras, febre, dores de cabeça, distúrbios gastrintestinais

e infecções por bactérias e fungos, sendo alvo de estudos fitoquímicos desde o início do

século XX (Hammond e col., 2005), principalmente com relação à investigação da

presença de alcalóides indólicos (Figura 2). O gênero Uncaria é representado no

continente sul-americano por duas espécies, U. guianensis (Aubl.) Gmel e U. tomentosa

(Willd.) D.C., ambas conhecidas como unha-de-gato; no Peru, são empregadas na

medicina popular no tratamento de gastrite, reumatismo, artrite, câncer e certas afecções

epidérmicas (Carbonezi e col., 2004).

MeO

Figura 2: Alguns alcalóides indólicos da espécie Uncaria tomentosa (Muhammad e

col., 2001).

cafeína

emetina cefalina

Uncarina C 3S, 7R, 15S, 19S, 20S

Uncarina D 3R, 7S, 15S, 19S, 20S

Uncarina E 3S, 7S, 15S, 19S, 20S

Mitrafilina 3S, 7R, 15S, 19S, 20R

Diversas plantas pertencentes ao gênero Psychotria são usadas na medicina

popular pela sua ação analgésica, baseada nas propriedades que os alcalóides presentes

possuem (Figura 3). A espécie Psychotria colorata (Willd.) contém alcalóides nas

folhas e frutos que apresentam atividade analgésica ligada a mecanismos central e

periférico no alívio da dor (Elisabetsky e col., 1995).

Figura 3: Alguns alcalóides isolados das folhas e flores da espécie Psychotria colorata

(Verotta e col., 1998; Rasolonjanahary e col., 1995; Verotta e col., 2002).

1.1.1 – Sistemática e Quimiossistemática

Até meados da década de 70, estudos sistemáticos baseavam-se apenas em

caracteres morfológicos, não se conhecendo ao certo a possível correlação entre a

filogenia e o perfil químico apresentado pelas espécies. Até então, dados moleculares

(de metabólitos secundários) não eram considerados para a determinação sistemática

das subfamílias e tribos.

A subdivisão mais importante da família Rubiaceae foi feita por Robbrecht

(1988), que a dividiu em quatro subfamílias: Cinchonoideae, Ixoroideae, Antirreoideae

e Rubioideae. O autor introduziu, para sua análise filogenética, caracteres como

placentação, morfologia e anatomia de frutos e sementes. Entretanto, ficou determinado

que o posicionamento das subfamílias e a determinação das tribos, gêneros e espécies

Hodgkinsina

(8-8a), (8’-8’a)-tetradesidroiso-

calicantina 3a(R),3’a(R)

Calicantina Chimonantina

ainda permanecia difícil, em geral devido à falta de informação acerca da distribuição

geográfica e de caracteres morfoanatômicos de diversas espécies.

Com a crescente preocupação em se obter uma classificação mais fidedigna das

subfamílias e tribos, há uma busca por hipóteses filogenéticas que incluam dados

moleculares pertinentes. Grande parte das publicações acerca de investigações

filogenéticas baseia-se principalmente em dados moleculares em conjunto com

morfológicos. A definição de metabólitos secundários já é bem consolidada e a

existência de um padrão filogenético é bem aceita hoje em dia (Bremer, 1996).

Em 1988, Hiroyuke e colaboradores realizaram uma triagem para iridóides em

várias espécies e, baseados em dados obtidos por cromatografia com fase gasosa

acoplada à espectrometria de massas (CG-EM), concluíram que esses metabólitos estão

presentes em todas as subfamílias de Rubiaceae. Nos casos de derivados glicosilados,

este estudo foi realizado com substâncias isoladas. Os gêneros Rubia, Galium e

Morinda são importantes fontes de antraquinonas, na forma de aglicona, mas apesar de

possível, é rara a ocorrência de glicosídeos (Wijinsma e Verpoorte, 1986).

Em estudos posteriores com diferentes espécies da família Rubiaceae, foi

descritas a existência de marcadores quimiotaxonômicos (iridóides, alcalóides indólicos

e antraquinonas) e esses teriam uma ocorrência distinta e padronizada para cada uma

das tribos (Bolzani e col., 2001). Foi visto que a ocorrência desses marcadores era bem

consistente com a subdivisão prevista por Robbrecht em 1988. Na subfamília

Ixoroideae, os iridóides são encontrados como marcadores quimiotaxonômicos

exclusivos, enquanto que em Cinchonoideae os alcalóides indólicos predominam e, em

Rubioideae, as antraquinonas estão presentes como a principal classe de metabólitos

secundários. Já na subfamília Antirreoideae (onde está alocada a espécie Chiococca

alba) não foi observada uma ocorrência padronizada de nenhum desses marcadores

químicos (Bolzani e col., 2001).

1.1.2 – Estudos químicos na família Rubiaceae

A família Rubiaceae apresenta grande diversidade de metabólitos secundários

(Figura 4), tais como iridóides, alcalóides indólicos, antraquinonas, terpenóides

(triterpenos e diterpenos), flavonóides e outros derivados fenólicos. Na família, são

encontrados alcalóides quinolínicos, produtos do rearranjo de alcalóides indólicos

terpenoídicos, e os alcalóides isoquinolínicos, cujo esqueleto é formado pela

condensação da tiramina e secologanina, originando os alcalóides do tipo emetina

(Simões e col., 1999). Os seco-iridóides são substâncias geradas após uma clivagem

metabólica do esqueleto monoterpenoídico, especificamente no anel ciclopenteno

característico dos iridóides (Dewick, 2002).

100

150

200

IXO CIN RUB ANT

Número de composto

Iridóides

Alcalóides Indólicos

Antraquinonas

Flavonóides

Triterpenos

Dervidos Fenólicos

Alcalóides

Figura 4: Diversidade química e distribuição dos principais constituintes nas quatro

subfamílias: Ixoroideae (IXO), Cinchonoideae (CIN), Rubioideae (RUB) e

Antirheoideae (ANT) pertencentes à família Rubiaceae (Bolzani e col., 2001).

Uma rápida busca por trabalhos publicados sobre a fitoquímica da família

Rubiaceae (de 1990 a 2005) deixa claro o anseio dos pesquisadores por substâncias cuja

potencialidade para atividade biológica já esteja provada. Naquele período foram

descritos principalmente a ocorrência de alcalóides, antraquinonas, ácidos fenólicos,

iridóides, triterpenóides e glicosídeos variados (Anexo 1). Porém, é visível o grande

número de alcalóides indólicos, iridóides e antraquinonas presentes nas espécies

apresentadas. As espécies mais estudadas nesses anos são dos gêneros Cephaelis,

Galium, Gardenia, Hedyotis, Morinda, Ophiorrhiza, Psychotria e Uncaria.

Do gênero Coffea, a principal substância conhecida é a cafeína (um alcalóide

derivado da purina, 1,3,7-trimetilxantina, isolada pela primeira vez em 1820, como um

pó cristalino branco). Essa é incluída na composição de diversos analgésicos,

antipiréticos e antigripais, associada com o ácido acetilsalisílico, paracetamol ou

codeína e também usada no alívio ou abortamento de crises de enxaqueca. Por serem

plantas bastante conhecidas popularmente, as espécies do gênero Uncaria foram

submetidas a diversos estudos fitoquímicos no início do século passado. As substâncias

mais proeminentes do gênero foram os alcalóides, muito estudados até a década de 80.

Até hoje, já foram registrados, além de uma grande diversidade de esqueletos

triterpenoídicos (principalmente do tipo ursano), mais de 50 novas substâncias dentre

alcalóides, terpenos, derivados do ácido quinóvico, flavonóides e cumarinas para o

gênero Uncaria (Hammond e col., 2005). As espécies do gênero Psychotria, muito

usadas tradicionalmente, possuem alcalóides ativos aos quais são atribuídas uma série

de efeitos ligados ao mecanismo central e periférico da analgesia (Elisabetsky e

col.,1995). Talvez o principal exemplo desse gênero seja a P. viridis Ruiz et Pavon, um

arbusto possuidor do poderoso alcalóide com propriedades alucinógenas, a N,N-

dimetiltriptamina (DMT; Figura 5), o ingrediente primário de uma bebida conhecida

como “ayahuasca”, usada na América Central e do Sul.

Figura 5: Estrutura da N,N-dimetiltriptamina (DMT).

1.2 – Gênero Chiococca

O gênero Chiococca inclui 22 espécies distribuídas nas Américas e encontram-

se praticamente inexploradas sob o ponto de vista químico, farmacológico e

toxicológico. As poucas publicações existentes sobre esse gênero concentram-se

exclusivamente na espécie C. alba (Figura 6).

1.2.1 – A espécie Chiococca alba (L.) Hitchc.

A espécie C. alba, inicialmente denominada C. brachiata, foi primeiramente

descrita em 1777 no Peru, pelo botânico José Pavon em colaboração com o naturalista

Hipólito Ruiz (Cruz, 1930). A descrição da espécie levou à classificação da mesma

dentro do gênero Chiococca, já descrito anteriormente para outras espécies.

Figura 6: Chiococca alba (L.) Hitch (disponível no site: http://www.plantatlas.usf.edu/

images.asp? plantID=948, acessado no dia 7 de agosto de 2006).

dimetiltriptamina (DMT)

1.2.2 – Botânica e Sistemática (Cruz, 1930 ; Corrêa, 1931; Gusmão, 1992).

1.2.2.1 – Etimologia

Chiococca: nome deriva do latim (Yiwv = neve e xoxxos = baga) alba: branca,

alva.

1.2.2.2 – Sinonímia

Sinonímias científicas

Chiococca brachiata R. P., Chiococca anguifuga Mart., Chiococca racemosa H.B.K.,

Chiococca paniculata Willd.

Sinonímias populares no Brasil

“cainca”, “casinga”, “cruzeirinha”, “dambrê”, “purga-preta”, “quina-de-raiz-preta”,

“cipó-cruz”, “caninana”, “raiz-preta”, “fedorenta”, “raiz-de-frade”, “quina-preta”.

1.2.2.3 – Descrição macroscópica (Gusmão e col., 1992)

Hábito

Arbusto que pode atingir de 2 a 3 metros de altura. Apresenta muitos ramos finos,

nodosos em cruz.

Caule

O caule apresenta formato cilíndrico, diâmetro fino com sulcos longitudinais.

Folhas

As folhas, muito numerosas, são opostas, curtamente pecioladas. Limbo coriáceo,

inteiro, elíptico com base obtusa e ápice mucronado.

Inflorescências

As flores são tetrâmeras, de cor branco-amarelada levemente púrpuras na face externa

do tubo e dispostas em panícolas axilares. A corola é hipocrateriforme, prefloração

imbricada, glabra com lacínios de bordos revirados e esverdeados. Os estames isômeros

são livres. Os filetes levemente concrescidos entre si e a base da corola apresenta pêlos

na região mediana; anteras lineares e ovário ínfero, com 2 lóculos monospermos.

Raiz

A raiz da cainca, parte mais utilizada da planta, apresenta-se em pedaços de dimensões

muito irregulares, sua expessura varia de 5 a 7 mm e seu comprimento pode atingir de

30 a 40 cm. Esses pedaços, geralmente tortuosos, são recobertos por uma casca parda,

quase preta, com numerosas estrias transversais, muito largas e, às vezes, um tanto

regularmente espaçadas.

1.2.2.4 – Sistemática botânica

A tribo Chiococceae compreende 8 gêneros e pertence à subfamília

Antirheoideae. C. alba é apresentada com as seguintes variedades: acuminata,

acutifolia, biformis, conjungens, diplomorpha, genuina, grandifolia, intercedens,

intermidia, lanceolata, microphylla, petiolaris, rigidula, subrhombea, tenuifolia e

valida.

1.2.2.5 – Distribuição

C. alba é distribuída nas partes central e sul do Brasil, além de Peru, Guiana

Francesa, América Central e Flórida (EUA).

1.3 – Estudos químicos da espécie C. alba

A primeira análise química que se tem registro da espécie resultou na

caracterização de várias substâncias. Dentre elas, substâncias graxas de cor verde, uma

matéria corante amarela, uma substância colorida e viscosa e, finalmente, uma

substância trivialmente denominada de ácido caincico. O ácido caincico, posteriormente

denominado caincina, foi apresentado como sendo um glicosídio de cor branca, muito

amargo, acre, inodoro, muito pouco solúvel em água e no éter e bastante solúvel no

álcool, em diversas concentrações (Cruz, 1930). Essas substâncias não tiveram suas

estruturas caracterizadas, permanecendo assim dúvidas sobre suas naturezas químicas.

Apesar da caincina ter sido descrita como princípio ativo da planta (Corrêa, 1931),

trabalhos mais recentes não fazem qualquer referência confirmando essa observação

nem o isolamento das substâncias citadas.

Em outros estudos químicos da espécie, já foram apontados resultados

positivos em testes preliminares para glicosídeos cardiotônicos, saponinas, flavonóides

e taninos nas raízes da planta, e resultados negativos para antraquinonas (Schapoval e

col., 1983). Nesse trabalho foi relatado o resultado negativo para alcalóides e

antraquinonas e a comprovação cromatográfica da presença do salicilato de metila

(identificação realizada por comparações dos tempos de retenção em CCD e espectros

no UV). Em 1989, foi relatada por El Abbadi e colaboradores a presença de dois novos

alcalóides em raízes da C. alba. Os alcalóides 4-(4’-metoxifenil)-6,8-dimetóxi-2-

quinolinona e 4-(4’-metoxifenil)-6,8-dimetóxi-5-hidróxi-2-quinolinona (Figura 7),

foram identificados no extrato metanólico bruto das raízes com o auxílio da variação do

pH e posterior precipitação com éter dietílico. No ano seguinte, Kubo e colaboradores

sintetizaram ambos os alcalóides.

OMe

MeO

Figura 7: Estruturas dos alcalóides 4-(4’-metoxifenil)-6,8-dimetóxi-2-quinolinona e 4-

(4’-metoxifenil)-6,8-dimetoxi-5-hidróxi-2-quinolinona.

Em estudos posteriores realizados com as folhas da cainca não foram

detectadas substâncias da classe dos alcalóides. Entretanto, foi observada a presença de

duas novas hidroxicetonas, a 4-hidroxieptadecan-7-ona e a 5-hidroxioctadecan-11-ona

(Figura 8), juntamente com 5,7,4’-trimetóxi-4-fenilcumarina, exostemina, matairesinol e

(D)-manitol, do extrato mais polar (El-Hafiz e col., 1991). Em 1995, Ballini e

colaboradores sintetizaram aquelas hidroxicetonas pela primeira vez através de um

nitroalcano hidróxilado.

MeMe

OH O

Figura 8: Estruturas das hidroxicetonas, a 4-hidroxieptadecan-7-ona e a 5-

hidroxioctadecan-11-ona.

R= H 4-(4’-metoxifenil)-6,8-dimetóxi-2-quinolinona

R=OH 4-(4’-metoxifenil)-6,8-dimetóxi-5-hidróxi-2-quinolinona

4-hidroxieptadecan-7-ona

5-hidroxioctadecan-11-ona

Um novo triterpeno, com um esqueleto de ácido oleanólico, foi isolado e

identificado da fração hidrossolúvel do extrato das raízes da C. alba, coletadas em Santa

Rica, no Estado da Paraíba, Brasil (Bhattacharyya e Cunha, 1992). Esse triterpeno foi

denominado ácido 3β-hidroxiolean-12,15-dien-28-óico (Figura 9), que não apresenta

absorção no UV e é solúvel em solução aquosa de NaOH e Na

Figura 9: Estrutura do ácido 3β-hidroxiolean-12,15-dien-28-óico.

Em 1999, foram descritos três novos iridóides e um novo seco-iridóide,

denominados albosídeos I–IV (Figura 10), isolados e identificados do extrato bruto em

diclorometano-metanol (2:1) de raízes de C. alba coletadas no Estado de São Paulo. O

seco-iridóide albosídeo IV mostrou ainda atividade moderada contra o mutante RS 321

de Saccharomyces cerevisiae, em estudos de atividade biológica dos novas substâncias

(Carbonezi e col., 1999).

ácido 3

-hidroxiolean-12,15-dien-28-óico

OMe

Figura 10: Estrutura dos iridóides albosídeos I–IV.

Em 1997, Borges-Argaés e colaboradores isolaram um metabólito que

denominaram ent-17-hidróxi-16α-kauran-3-ona. E em 2001, um novo nor-seco-

pimarano, trivialmente nomeado merilactona (Figura 11), foi isolado do extrato

metanólico de raízes da C. alba coletadas no México.

Figura 11: Estrutura do nor-seco-pimarano Merilactona.

Em estudos mais recentes sobre a espécie C. alba, Bolzani e colaboradores, em

2004, isolaram um flavonóide inédito, o 4’-metoxikaempferol-7-(acetiloxi)-3,5-O-α-L-

Merilactona

albosídeo I (R1)

albosídeo II (R2)

albosídeo III (R3)

R1=

R2=

R3=

albosídeo IV

ramnosídeo (Figura 12), três flavonóides conhecidos (apigenina, 7-O-metoxiquercetrina,

quercetrina) e quatro triterpenos (α-amirina, β-amirina, ácido oleanólico e ácido

ursólico) da fração solúvel em acetato de etila do extrato em diclorometano-metanol

(2:1) das folhas da espécie.

Figura 12: Estrutura do flavonóide 4’-metoxikaempferol-7-(acetiloxi)-3,5-O-α-L-

ramnosídeo.

1.4 – Atividades biológicas relacionadas com a espécie C. alba

O emprego das raízes de “cainca” para fins terapêuticos foi muito difundido no

passado. A sua utilização na medicina popular e científica fez com que ela fosse

incluída em várias Farmacopéias nos séculos XIX e XX, dentre elas a Francesa de 1837

e 1866, a Portuguesa de 1836 e 1876, a Grega de 1837, a Belga de 1854 e 1873, a

Espanhola de 1865 e 1884, a Austríaca de 1855 e a Mexicana de 1904 (Schapoval e

col., 1983), mostrando sua importância na época.

A “cainca” tem o chá de suas raízes tradicionalmente empregado no tratamento

de diversas enfermidades por suas atividades anti-reumática, emética, purgativa,

diurética, febrífuga, tônica, antiinflamatória, antiviral, antiedematogênica, antiofídica,

afrodisíaca e contra hidropsia (Bolzani e col., 2001). São citadas também propriedades

emenagoga, hidragoga, anti-asmática e anti-reumática, sendo essa a atividade pela qual

a planta foi comercializada por uma indústria de fitoterápicos durante muito tempo.

Segundo Cruz (1930), a sua reputação no combate aos efeitos da picada de

cobras foi muito explorada pelos curandeiros que empregavam a raiz por via oral com

água ou águardente e ainda como um cataplasma feito com a raiz moída com

águardente. Há ainda relação do uso da “cainca” para obstruções nas vísceras

abdominais, perturbações do sistema linfático, doenças hepáticas e cardíacas, além do

combate a tosse, rouquidão e bronquite, contra angina, laringite e doenças do aparelho

urinário.

4’-metoxikaempferol-7-(acetiloxi)-3,5-O-α-L-ramnosídeo

OMe

MeOCO

Foram publicados trabalhos acerca da avaliação farmacológica da C. alba, nos

quais foram verificadas as atividades antiinflamatória, antimicrobiana e antitumoral.

Estudos com o extrato etanólico e as frações etérea e aquosa demonstraram atividade

antiinflamatória através do teste de edema de pata induzido pela administração de

carragenina, em ratos. Essa atividade foi atribuída à presença de salicilato de metila,

identificado por cromatografia em camada delgada após comparação com amostra

padrão (Schapoval e col., 1983).

A atividade antimicrobiana foi estudada por Borges-Argáez e colaboradores em

1997, com o extrato metanólico das raízes de “cainca”. A inibição do crescimento

bacteriano de cepas de Staphylococcus aureus foi relacionada com o metabólito ent-

kaurano, que provocou uma zona maior de inibição do crescimento bacteriano.

Entretanto, o ent-kaurano mostrou atividade antimicrobiana fraca contra S. aureus e não

foi eficaz contra Bacillus subtilis, Candida albicans, Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa e Saccharomyces cerevisiae.

O albosídeo IV apresentou atividade moderada contra o mutante RS321N

deficiente de reparo de DNA de Saccharomyces cerevisiae, indicando atividade

antitumoral, enquanto que os outros iridóides se mostraram inativos (Carbonezi e col.,

1999).

Estudos toxicológicos verificaram que a “cainca” atua sobre a mucosa

intestinal causando irritação e conduzindo à morte, entretanto nada se mencionou sobre

a natureza da substância ativa (Hoehne, 1939). Posteriormente, outros resultados

demonstraram que a dose letal (DL

) para o extrato alcoólico foi de 134,28 mg/kg por

via intraperitonial, utilizando camundongos Swiss Albinos de ambos os sexos

(Schapoval e col., 1983). Essa toxidez foi atribuída a possível presença não evidenciada

de glicosídeos cardiotônicos.

Mais recentemente, Gazda e colaboradores (2006) observaram que a toxidade

do extrato etanólico da “cainca” foi baixa em camundongos quando administrado por

via oral, e que para doses em torno de 500 mg/kg peso corporal o extrato apresentou

efeito analgésico. Testes realizados nesse estudo demonstraram a não mutagenicidade

pelo Teste de Ames nas quatro cepas bacterianas usadas, na presença e na ausência de

fator extrínseco de metabolização (mistura S9) e atividade citotóxica frente ao

microcrustáceo Artemia salina.

1.5 – Saponinas

Saponinas são substâncias glicosiladas de ocorrência natural de alto peso

molecular (Hostettmann e Marston, 1995). Essa classificação se deu, inicialmente, pela

capacidade de formação de uma espuma persistente e abundante quando sob agitação

em solução aquosa, uma propriedade de praticamente todas as saponinas. A espuma

assim obtida, apresenta estabilidade frente a ácidos minerais diluídos (como o HCl

diluído), o que a diferencia da espuma formada por sabões comuns (derivados de ácidos

graxos). Quimicamente, as saponinas possuem esqueletos triterpenoídicos ou

esteroídicos (C30 ou C27) ligados a um ou mais resíduos de carboidratos. Quando

submetidas a uma reação de hidrólise em condições ácidas geram uma aglicona e

açúcares livres. Portanto, por definição, as saponinas são substâncias triterpenoídicas ou

esteróídicas glicosiladas (Hostettmann e Marston, 1995).

As saponinas são substâncias naturais constituintes de grande parte de drogas

vegetais usadas tradicionalmente, especialmente no oriente. Um número substancial de

revisões acerca de saponinas foi publicado com relatos de variações estruturais,

atividades e funções biológicas, além de métodos de isolamento, purificação e

elucidação estrutural (Agrawal e col., 1974; Hostettmann e Marston, 1995; Sparg e col.,

2004; Francis e col., 2002; ; Oleszek e col., 2002; Sahu e Achari, 2001; Agrawal e col.,

1996; Plock e col., 2001) desde a década de 20 (Kofler Die saponine, 1927 citado por

Hostettmann e Marston 1995).

1.5.1 – Classificação e Variação Estrutural

A natureza da porção aglicona ou não-sacarídica das saponinas, chamada de

genina ou sapogenina, permite a classificação das saponinas em três classes principais.

São as saponinas triterpenoídicas, as esteroídicas e as alcaloídicas. O caráter ácido pode

ser devido à presença de um grupamento carboxila na aglicona ou na cadeia de

monossacarídeos, ou ambos. O caráter básico decorre da presença de nitrogênio (em

geral, sob a forma de amina secundária ou terciária).

Em uma outra classificação, é levado em consideração o número de cadeias de

carboidratos ligadas na aglicona, pela qual a substância pode ser classificada como

sendo mono-desmosídica (geralmente ligada à posição 3), bis-desmosídicas (cadeia

adicional geralmente ligada à posição 26 ou 28), ou tri-desmosídicas, e assim por diante.

Essa classificação é de grande importância, pois, freqüentemente, as saponinas bis-

desmosídicas não apresentam as atividades biológicas registrados para as mono-

desmosídicas. Foi descrito que saponinas mono-desmosídicas possuem maior atividade

hemolítica do que as bis-desmosídicas (Fukuda e col., 1985; Woldemichael e Wink,

2001).

A complexidade química apresentada por essa classe de substâncias é devida,

principalmente, à presença do(s) oligossacarídeo(s) ligado(s). Essa característica,

juntamente com o fato das saponinas possuírem um peso molecular elevado, cria

dificuldades no processo de isolamento e de elucidação estrutural. O oligossacarídeo

pode ser linear ou ramificado com ligações glicosídicas do tipo (1→2), (1→3), (1→4),

(1→6), etc., podendo possuir diferentes configurações anoméricas (α- ou β-), além da

possibilidade de variação do tamanho do anel das unidades monossacarídicas (piranoses

e furanoses; Hostettmann e Marston, 1995).

As unidades de oligossacarídeos mais comumente encontradas nessa classe de

substância são D-glicose (Glc), D-galactose (Gal), L-ramnose (Rha), L-xilose (Xyl) e L-

arabinose (Ara), além de unidades do ácido urônico (glicurônico e galacturônico; GlcA,

GalA). Saponinas isoladas de organismos marinhos geralmente contêm D-quinovose

(Qui) (Hostettmann e Marston, 1995).

A variação estrutural pode ser também advinda do esqueleto da aglicona, onde

hidroxilações na posição 3 e em certas grupos metila são as mais comuns, além de,

evidentemente, as possíveis variações estruturais de cada classe. As classes estruturais

mais comumente encontradas em saponinas esteroídicas são colestano, espirostano e

furostano. Para alcalóides esteroídicos glicosilados são os solanidanos e espirosolanos.

E para saponinas triterpenoídicas são os oleananos (β-amirinas), ursanos (α-amirinas) e

lupanos (Hostettmann e Marston, 1995).

1.5.2 – Biossíntese

Em se tratando da biossíntese de saponinas, temos que a estrutura da aglicona

(o núcleo fundamental) é biossintetizada a partir da via do mevalonato mais

especificamente do acoplamento de duas unidades difosfato de farnesila (C15)

acopladas “cauda a cauda”, gerando o esqualeno (C-30, esqueleto triterpênico). A

ciclização do esqualeno é mediada por um carbocátion, gerado a partir da protonação

direta do epóxido presente no precursor 2,3-epóxido de esqualeno que, por sua vez é

produzido numa reação catalisada pela flavoproteína dependente de oxigênio e do

cofator NADPH (Dewick, 2002). Após a formação desse precursor-chave de 30 átomos

de carbono, dobraduras específicas mantidas através de um posicionamento definido na

“superfície” da enzima, levam a ciclizações (cascata de ciclizações cátion-olefina,

formadora dos carbocátions intermediários cíclicos) e rearranjos distintos, gerando os

dois cátions precursores de todos os esqueletos triterpênicos e esteroídicos (cátion

protosterol I e protosterol II; Dewick, 2002; Torssel, 1997). Distinções nos esqueletos

formados ocorrem, principalmente, através de rearranjos conhecidos como rearranjos de

Wagner-Meerwein, que são migrações de grupos metila e hidretos, assim como

posteriores inclusões funcionais (Dewick, 2002; Torssel, 1997).

No caso do esqueleto esteroídico, o sistema cíclico consiste em quatro anéis

(em sua maioria), representado pelo sistema do lanosterol ou do cicloartenol, com a

ausência de três grupos metila em C-4 e C-14 (Dewick, 2002; Torssel, 1997). A maior

parte das saponinas triterpênicas é derivada dos esqueletos oleanano (β-amirina) ou

damarano, formado diretamente a partir da ciclização do precursor inicial. São

encontrados também com certa freqüência esqueletos triterpênicos da classe dos ursanos

(α-amirina) e lupanos. Certas plantas são capazes de incorporar ao esqueleto esteroídico

um átomo de nitrogênio (geralmente oriundo da arginina) gerando os núcleos de

alcalóides esteroídicos (Hostettmann e Marston, 1995). É observada uma ocorrência

conjunta de saponinas com esqueletos esteroídicos e alcaloídicos. O Esquema 1 mostra

a biossíntese dos esqueletos anteriormente citados.

HO HO HO

Esquema 1: Representação da biossíntese dos esqueletos esteroídicos e triterpenoídicos

a partir de uma unidade C-30 (Dewick, 2002; Hostettmann e Marston, 1995).

As enzimas responsáveis pela catálise das reações de síntese dos triterpenos são

conhecidas coletivamente como triterpeno sintases (Xu e col., 2004), são elas:

esqualeno ciclase, 2,3-oxidoesqualeno ciclase, cicloartenol sintase, lanosterol sintase e

damarenodiol sintase, α- e β-amirina sintases.

Nos processos finais de biossíntese das saponinas, os produtos da ciclização

passam por modificações adicionais onde resíduos de açúcares são acrescentados em

posições específicas do esqueleto triterpenoídico e/ou esteroídico. Essas são,

geralmente, posições previamente hidroxiladas (3, 11, 16, 23, 28 e 30). Com exceção de

C3, esses são potenciais pontos de oxidação no esqueleto triterpenoídico pentacíclico

mais comum.

As unidades de monossacarídeos são ligadas ao esqueleto da aglicona por

ligações glicosídicas através de reações catalisadas por transferases específicas,

localizadas em diferentes compartimentos celulares. Foi sugerido que a introdução da

3- óxido de es

ualeno cátion protosterol II

cátion damarano

cátion

rotosterol I

cátion

protosterol I

lanosterol

cicloartenol

cucurbitacinas

colesterol

quassinóides

Alcalóides esteriodais

cátion

protosterol II

cátion lupanoil

cátion oleanano

α-amirina

-amirina

eol

conformação:

cadeira-bote-cadeira-bote

conformação:

cadeira-cadeira-cadeira-bote

cadeia de açúcares nas posições hidroxiladas ocorra de maneira sequenciada, enquanto

que na posição carboxilada (C-28, mais comum) a introdução da cadeia seja feita com a

cadeia já em sua forma completa (Hostettmann e Marston, 1995). Resultados recentes

na caracterização das saponinas glicosiltransferases evidenciam o fato de que os

resíduos de açúcares são efetivamente adicionados seqüencialmente. Atualmente são

conhecidas algumas saponinas glicosiltranferases para a síntese de saponinas

esteroídicas, as quais já foram isoladas e clonadas. Diversos estudos têm sido

desenvolvidos para a identificação das enzimas responsáveis pela síntese das saponinas

triterpenoídicas (Haralampidis e col., 2002).

1.5.3 – Ocorrência e Distribuição

As saponinas são largamente distribuídas pelo reino vegetal, possuem centenas

de estruturas distintas, estão presentes em mais de 90 famílias e em pelo menos 500

gêneros diferentes de plantas (Basu e Rastogi, 1967; Agarwal e Rastogi, 1974 ;

Hostettmann e Marston, 1995). No caso da família Rubiaceae, a presença de substâncias

dessa classe de metabólitos não é muito evidente, havendo a ocorrência nos gêneros

Catunaregam, Rubus, Galium, Hedyotis, Isertia, Randia, Rudgea e Mussaenda.

Há a ocorrência de saponinas em plantas amplamente utilizadas na alimentação

humana, tais como soja, grão de bico, amendoins, broto de feijão, vagem, feijão

americano, lentilhas, ervilhas, espinafre, aveia, beringelas, aspargos, feno grego, alho,

beterraba, batatas, pimenta verde, tomates, cebolas, chás, cassava, inhame (Hostettmann

e Marston, 1995).

Segundo Anisimov e Chirva (1980), o fato das saponinas estarem localizadas

em organelas possuidoras de uma elevada taxa metabólica indica a possibilidade de

haver uma ligação fisiológica da ocorrência das saponinas, que seriam substâncias

importantes para a regulação e o desenvolvimento do organismo.

1.5.4 – Atividade Biológica

Inicialmente, a classificação de uma saponina era baseada em propriedades

emulsificantes, atividade hemolítica, toxidez em peixes e sabor amargo. Porém, devido

à existência de um contingente elevado de exceções, atualmente a classe é definida com

base na estrutura molecular. A distribuição bastante abrangente, juntamente com a

enorme variação estrutural, antevê um espectro também muito abrangente de atividades

biológicas de grande interesse farmacêutico (Hostettmann e Marston, 1995).

As atividades biológicas mais comumente encontradas nas saponinas já

estudadas não permitem uma generalização de alguma atividade específica para a classe

(Hostettmann e Marston, 1995). Entretanto, é imprescindível a caracterização de

algumas propriedades clássicas apresentadas pela grande maioria das substâncias

isoladas. Tais propriedades são: elevada solubilidade em solventes aquosos

(principalmente em concentrações baixas de base) e álcoois, atividade hemolítica, sabor

amargo, complexação com colesterol (e fosfolipídios de membrana) e propriedade

emulsificante. Entre as atividades biológicas mais citadas para as saponinas incluem-se:

atividade ictiotóxica, moluscicida, antiinflamatória, antifúngica, antimicrobiana,

antiparasitária, antiviral, citotóxica e antitumoral, dentre outras menos citadas (Sparg e

col., 2004; Francis e col., 2002).

O papel das saponinas nas plantas ainda não é totalmente compreendido.

Acredita-se que sua principal função estaria ligada ao sistema de proteção para a planta,

haja visto diversos trabalhos indicando atividades antimicrobiana, inibidora de fungos e

proteção contra ataques de insetos. Foi também proposto que as saponinas seriam, em

alguns casos, fontes de monossacarídeos (Barr e col., 1998). De fato, uma fração rica

em saponinas quando presente no organismo animal influencia uma gama de atividades

biológicas bastante abrangente. Por esse motivo, é difícil estabelecer uma relação

definida sobre estrutura-atividade biológica.

Grande parte dos efeitos biológicos evidentes está relacionada com suas ações

sobre as membranas celulares. É sabido que diversas saponinas possuem uma ação lítica

nos eritrócitos. Essa capacidade parece estar ligada com a propriedade de complexação

da porção aglicona com os esteróides de membrana no eritrócito, particularmente o

colesterol (Glauert e col., 1962). Acreditava-se que o efeito hemolítico fosse resultado

de uma agregação tipo micelar da saponina com o colesterol de membrana. Entretanto,

novas hipóteses têm sido consideradas com mecanismos mais complexos de atuação.

Não foi encontrado um paralelo entre a capacidade de formação de complexos e a

atividade hemolítica. Estudos já provaram que a atividade hemolítica das saponinas

também não está relacionada com sua capacidade emulsificante. Um estudo realizado

com saponinas de Styrax japonica e ginsenosídeos mostrou uma capacidade de

estimulação da troca Na

/Ca

em vesículas do sarcolema cardíaco em cães (Choi e col.,

2001). É possível que a hidrólise das ligações glicosídicas seja responsável pela

atividade hemolítica e a falta dessa atividade seria um resultado da não absorção ou,

ainda, da falta de uma glicosidase necessária.

Estudos realizados in vivo e in vitro revelaram implicações sobre a reabsorção e

o transporte ativo de nutrientes nas membranas intestinais. Foi observado o aumento de

permeabilidade em células da mucosa intestinal e inibição do transporte ativo,

relacionada a algumas saponinas. Nesse caso, são observadas importantes implicações

na absorção de macromoléculas como, por exemplo, compostos alérgenos. A estereo-

estrutura da cadeia de carboidratos parece possuir um efeito determinante nesse tipo de

atividade (Francis e col., 2002). Em contrapartida, há estudos que mostram o bloqueio

de absorção de micro-nutrientes (como Fe, Mg, Ca e Zn), através da formação de

complexos não absorvidos (Southon e col., 1988). A redução observada na digestão de

proteínas está aparentemente relacionada com os mesmos efeitos supracitados.

Muitos estudos revelaram um efeito de redução dos níveis plasmáticos de

colesterol em animais e homens (Southon e col., 1988). Acredita-se que essa atividade

esteja relacionada com a formação de micelas pela interação das saponinas com os

ácidos biliares, resultando em uma elevação do colesterol excretado. Mas a

complexação das saponinas com o colesterol adquirido na dieta, impossibilitando sua

absorção, também é considerado um mecanismo para esse efeito hipo-colesterolêmico

(Southon e col., 1988; Sparg e col., 2004). Um efeito esfoliante (irritante) resultante da

formação de complexos com o colesterol das membranas das células intestinais também

tem sido levado em consideração para explicar uma perda de função e redução da área

de absorção (Simões e col., 1999).

Os efeitos causados por saponinas sobre a membrana celular intestinal não são

ainda totalmente compreendidos. Novas informações poderão vir de estudos realizados

in vivo, principalmente acerca da exposição das saponinas a um ambiente repleto de

possíveis ligantes.

A atividade hipoglicemiante de saponinas isoladas de algumas plantas já foi

provada por meio de testes in vivo. Acredita-se que essa atividade ocorre devido à

supressão da transferência de glicose do estômago para o intestino e inibição do

transporte de glicose através das células do intestino (Sparg e col., 2004).

Há registros do efeito negativo das saponinas sobre a reprodução animal mais

especificamente propriedades abortíferas, antizigóticas e antiimplantações. Os

mecanismos pelos quais essas atividades ocorrem são bem diferenciados, ocorrendo

além de alterações no ciclo reprodutor e nos níveis hormonais da ovulação (Francis e

col., 2002), ruptura da membrana plasmática da célula do espermatozóide (Simões e

col., 1999).

A lista de atividades biológicas associadas às saponinas é muito extensa,

embora seus mecanismos ainda não estejam completamente elucidados. Algumas de

suas atividades são conhecidas há muitos anos; entretanto, novas atividades vêm sendo

descobertas. É importante ressaltar que grande parte dos ensaios foram realizados in

vitro, sendo indispensável para propiciar o desenvolvimento de aplicações terapêuticas,

a avaliação de dados farmacocinéticos relativos à absorção, metabolismo e eliminação.

As saponinas são pouco absorvidas em animais quando administradas por via oral

(Hostettmann e Marston, 1995). Muitas atividades biológicas estão relacionadas com a

absorção da aglicona e não da saponina propriamente dita. A hidrólise prévia das

saponinas por microorganismos, enzimas intestinais ou suco gástrico parece ser um

fator de muita importância para a atividade biológica. É possível que grande parte das

atividades descritas para saponinas ocorra com a assistência deste primeiro processo

farmacocinético.

1.5.5 – Isolamento

Devido à complexidade estrutural apresentada para essa classe de substâncias,

os estudos acerca de caracteres químicos e biológicos apenas tiveram desenvolvimento

nas últimas décadas, já com o advento de técnicas cromatográficas, espectroscópicas e

espectrométricas. O elevado peso molecular, a polaridade elevada e a possibilidade de

misturas bastante complexas devido a variações estruturais mínimas caracterizam o

desafio que é o processo de isolamento de substâncias dessa classe.

Oleszek, em 2002, numa revisão acerca da determinação cromatográfica,

mencionou não haver qualquer metodologia recomendada para a análise rotineira de

misturas complexas de saponinas, e tal determinação permanece como um desafio para

os estudiosos em fitoquímica. A maior dificuldade apresentada pela separação

cromatográfica dessas substâncias seria devida à grande faixa de polaridade e,

principalmente, à falta de um cromóforo que permita o uso da detecção por absorção no

UV. Entretanto, o uso de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com coluna

de fase estacionária inversa (octadecilsilano), permanece como sendo a melhor técnica

para a determinação cromatográfica (Oleszek, 2002).

Para a obtenção de uma fração bruta rica em saponinas, os passos a se seguir já

foram descritos (Hostettmann e Marston, 1995). Esses passos são: extração com

metanol, etanol, água ou solução hidroalcoólica; partição com um solvente apolar,

geralmente éter de petróleo ou diclorometano; ressuspensão do extrato seco com água e

partição deste com n-butanol pré-saturado com água; e precipitação com éter dietílico

ou acetona (Esquema 2). Entretanto, as saponinas ainda estarão acompanhadas de outras

substâncias muito polares, como alguns fenóis. Adicionalmente, elas não são

substâncias de fácil cristalização e, em sua grande maioria, são higroscópicas.

Atualmente, estão descritas na literatura várias técnicas utilizadas para a

purificação preliminar das saponinas (Hostettmann e Marston, 1995). Há a descrição de

técnicas como cromatografia “flash”, cromatografia de contra-corrente de gotejamento

(CCCG), cromatografia líquida sob baixa pressão (CLBP), cromatografia líquida sob

média pressão (CLMP), CCD preparativa e CLAE. Resinas de troca iônica (trocadores

catiônicos) também são usadas em alguns casos explorando a acidez apresentada por

algumas saponinas. Uma revisão produzida acerca da separação cromatográfica de

saponinas traz diferentes dados e condições para a separação cromatográfica de diversas

saponinas (Oleszek, 2002).

Esquema 2: Esquema representativo para a obtenção de uma fração rica em saponinas

(Hostettmann e Marston, 1995; Simões e col., 1999).

1.5.6 – Elucidação Estrutural

Mesmo sendo uma classe de substâncias conhecida há séculos, somente após a

segunda metade do século XX as saponinas começaram a ser analisadas

Extrato botânico

extrato

ola

resíduo a

ola

arti

ão com solvente

extrato

olar seco

fr. butanólicafr. a

uosa

arti

ão com n-BuOH

fr. rica em sa

oninas

reci

itado amorfo

reci

ita

ão com Et

O ou acetona

eva

ora

ão

estruturalmente. A grande complexidade estrutural resultante da presença de

oligossacarídeos é uma dificuldade bastante significativa em processos de elucidação

estrutural, considerando-se as diversas possibilidades conformacionais e de interligação

apresentadas por estas cadeias. Adicionalmente, a notável abrangência em termos de

atividade biológica justifica a necessidade de um protocolo definido e rápido (na medida

do possível) para estudos estruturais de saponinas.

A elucidação estrutural de oligossacarídeos presentes em saponinas tem os

seguintes objetivos: quantificação e identificação dos resíduos de açúcares presentes

bem como suas proporções relativas, determinação da seqüência em que esses se

encontram, determinação das posições e dos tipos das ligações glicosídicas e

configuração dos carbonos anoméricos.

1.5.6.1. – Método Clássico

O processo de elucidação estrutural de saponinas não era viável até meados da

década de 60 em virtude, principalmente, da insuficiência de informações sobre os

detalhes estruturais proporcionados pelos métodos existentes. A metodologia clássica

utilizada para a definição estrutural de saponinas se baseia em reações de hidrólise

(Sahu e Achari, 2001). Com esse primeiro passo degradativo são possíveis as análises

da aglicona e das unidades monossacarídicas como grupos distintos.

Com a obtenção dos monossacarídeos livres, a simples análise em paralelo com

padrões conhecidos permite sua identificação. Até meados de 1970, a técnica analítica

mais utilizada era a cromatografia em papel, cuja principal inconveniência é ser

demorada. Já a partir de 1970 surgiu a possibilidade de analisar e identificar

monossacarídeos por cromatografia com fase gasosa simples ou acoplada a

espectrometria de massas, após processos de derivação (sililação ou acetilação dos

alditóis) para tornar os monossacarídeos voláteis. A grande vantagem da utilização de

CG ou CG-EM é a rapidez da análise, além da necessidade de uma quantidade muito

reduzida de amostra para análise.

Com a obtenção dos monossacarídeos identificados, os próximos passos são as

análises dos tipos de ligações glicosídicas e o seqüenciamento da cadeia de

oligossacarídeos. A análise por CG-EM dos acetatos de alditóis parcialmente metilados

é a técnica de escolha, segundo a metodologia clássica, para a determinação dos tipos de

ligações. Nesta análise, a saponina é submetida a reações de per-metilação, hidrólise,

redução e acetilação, em condições a serem otimizadas.

Para a elucidação da estrutura tridimensional, ainda resta a definição dos

centros esterogênicos. Essa informação era, até a década de 80, deduzida com cálculos

baseados na regra de Klyne, e admitindo-se que D-açúcares ocorrem naturalmente com

ligações β-glicosídicas e L-açúcares com ligações α-glicosídicas (Sahu e Achari, 2001).

Somente anos depois ficou estabelecida a possibilidade de determinação dessa

configuração através das constantes de acoplamento, J, por ressonância magnética

nuclear de hidrogênio (RMN de

H).

Adicionalmente, o desenvolvimento de técnicas de espectrometria de massas

com ionização branda, como FAB, FD, MALDI e ESI, direcionadas a moléculas

maiores, mais polares e não-voláteis permitiu a determinação exata do peso molecular

da substância analisada, além de gerar também informação útil acerca de

seqüenciamento da cadeia.

Os métodos clássicos não se tornaram obsoletos. Até hoje, os processos

químicos juntamente com a análise em CG-EM e até com CCD, são amplamente

empregados para confirmação da estrutura ou como metodologia complementar de

elucidação.

1.5.6.1.1 – Hidrólise

O processo de elucidação estrutural de saponinas inicia-se, normalmente, com a

análise dos produtos da reação de hidrólise, com a finalidade de identificação da

aglicona e dos monossacarídeos livres. A metodologia mais comum é, então, a hidrólise

em meio ácido aquoso para a clivagem de ligações glicosídicas. Porém, foram

desenvolvidas reações de hidrólise em outras condições, como básicas, enzimáticas,

alcoólicas, etc.. Para a clivagem de ligações éster-glicosídicas, usam-se condições

básicas. As hidrólises enzimáticas são benéficas por ocorrerem em condições pouco

drásticas e por possibilitarem clivagens mais seletivas (especialmente importante para

saponinas bis-desmosídicas). Entre as enzimas usadas em tais reações temos as β-

glicosidase, β-glicuronidase, hesperidinase, astragalosidase, naringinase e celulase,

dentre outras (Sahu e Achari, 2001).

1.5.6.1.2 – Análise dos monossacarídeos

A técnica mais utilizada para a determinação dos monossacarídeos a serem

identificados e quantificados é a cromatografia com fase gasosa e detector de massas. A

principal vantagem dessa escolha é a disponibilidade, em geral, de quantidades muito

reduzidas para análise, o que gera problemas na aplicação de outros sistemas

cromatográficos como CCD ou CLAE.

A conversão dos monossacarídeos a substâncias voláteis é um pré-requisito

fundamental para a análise por CG-EM. Metilação, acetilação e trimetilsililação são os

métodos mais convencionais de derivação (com reagentes específicos comercialmente

disponíveis). A trimetilsililação é uma técnica relativamente rápida e simples. Embora a

utilização de reagentes trimetilsililantes produza uma mistura de diversos isômeros

parcialmente derivados, esses apresentam-se em sinais com uma razão de áreas de sinais

constantes, sendo possível a sua identificação. A metodologia que gera cromatogramas

mais simples é a análise por CG-EM de acetatos de alditóis, onde os monossacarídeos

livres são reduzidos com NaBH

e posteriormente acetilados para análise (Chaplin e

Kennedy, 1994). O cromatograma gerado pela análise dos alditóis acetilados é bastante

simples pela formação de um único pico para cada monossacarídeo presente.

1.5.6.1.3 – Determinação dos tipos das ligações

A técnica de escolha para a determinação dos tipos de ligações glicosídicas

presentes, segundo o método clássico, é a análise dos acetatos de alditol parcialmente

metilados. Essa técnica se baseia na completa metilação da saponina, hidrólise ou

metanólise a uma mistura de monossacarídeos livres parcialmente metilados, seguida de

uma reação de redução a alditóis e acetilação para o produto a ser analisado.

Técnica utiliza uma base forte, como o íon dimetilsulfinil (CH

SOCH

), para

gerar íons alcóxido a partir de hidroxilas livres, sulfóxido de dimetila (DMSO) seco,

como solvente para a mistura reacional e iodeto de metila, geralmente como agente

metilante. É necessária a prévia preparação da base forte, a partir de DMSO e hidreto de

sódio, além da secagem do próprio DMSO com hidreto de cálcio em pó sob

aquecimento por várias horas e seguida de destilação (sob atmosfera de nitrogênio e

pressão reduzida). A presença da base forte garante a formação dos íons alcóxidos

referentes a todas as hidroxilas possibilitando a metilação total (Figura 13). As

condições reacionais utilizadas para a per-metilação deverão estar pré-estabelecidas e

otimizadas para que não haja perda de material.

OMe

SOCH

Figura 13: Reação representando a formação do íon alcóxido pela base forte

(dimetilsulfinil; CH

SOCH

), e a reação de substituição nucleofílica (SN

) com o

iodeto de metila (Chaplin e Kennedy, 1994).

1.5.6.1.4 – Análise da configuração dos átomos carbonos anoméricos

Até a década de 80, as configurações anoméricas eram deduzidas assumindo

que D-açúcares ocorrem naturalmente com ligações β-glicosídicas e L-açúcares com

ligações α-glicosídicas. A observação de dados de rotação ótica molecular com valores

calculados baseados na regra de Klyne (para avaliação da rotação óptica específica)

permitiria uma conclusão aparentemente pertinente acerca da configuração dos

carbonos anoméricos.

Um método muito utilizado para a determinação da configuração D ou L de

monossacarídeo é a análise de derivados (–)-2-butil-glicosídeos trimetilsililados por CG

(Vliegenthart e col., 1978). Através desse método é possível a separação cromatográfica

de monossacarídeos com diferentes configurações. Desse modo, uma análise feita com

padrões em paralelo permite a identificação da configuração do monossacarídeo

analisado. Anos após ficou estabelecida a utilização de dados de deslocamento químico

δ (δ 4,5-6,5 ppm para RMN de

H e δ 90-115 ppm para RMN de

C) e constantes de

acoplamento J em RMN de hidrogênio para a análise da configuração dos anoméricos.

A magnitude de

J, entre H

e H

, poderá ser comparada com dados descritos na

literatura, α (entre 1 e 4 Hz) e β (entre 6 e 8 Hz). Puderam também ser usados os valores

J, entre C

e H

, para a confirmação das configurações, α (entre 167-170 Hz) e β

(entre 158-160 Hz).

1.5.6.2 – Métodos Recentes

Sabe-se que saponinas estão presentes em misturas complexas, de modo que o

processo de purificação é um trabalho um tanto quanto exaustivo. Com isso, atualmente,

há uma maior procura por métodos de análise estrutural não degradativos (Sahu e

Achari, 2001; Agrawal e Pathak, 1996; Duus e col., 2000), justificada também pela

necessidade de uma quantidade considerável de amostra requerida para ensaios

biológicos. A técnica mais eficiente, no sentido de gerar informações úteis para análise

estrutural, é a espectroscopia de RMN, que nas últimas décadas evoluiu a excelentes

níveis.

Com o desenvolvimento dos experimentos de RMN através de pulsos e

transformada de Fourier, surgiu a possibilidade de se criarem técnicas mais sofisticadas.

Assim, com a evolução das técnicas espectroscópicas multidimensionais, as

informações estruturais podem ser geradas mais rapidamente do que qualquer outro

método. As técnicas bidimensionais, tanto homo- quanto heteronucleares, mais usadas

são COSY, relayed COSY, HETCOR, HMQC/HSQC, COLOC, HMBC,

NOESY/ROESY e TOCSY/HOHAHA. Essas técnicas 2-D são capazes de expor

informações úteis para a determinação estrutural de toda a molécula, sem a necessidade

de processos degradativos. É possível correlacionar todos os átomos presentes na

molécula através de acoplamentos a distâncias curtas e longas evidenciados em cada

espectro de correlação utilizado (Tabela 1).

Os experimentos de correlação homonuclear, COSY, correlacionam os sinais

(deslocamentos químicos) que compartilham um acoplamento escalar, J, que para

prótons opera ao longo de 2, 3 ou, menos freqüentemente, 4 ligações. Os experimentos

de TOCSY correlacionam os prótons participantes de uma completa rede de

acoplamento, permitindo o desenvolvimento de uma cadeia de sinais relacionados. Para

o experimento de TOCSY é essencial a otimização do tempo de contato (mixing time)

para que a completa rede de acoplamento possa ser correlacionada (relay).

Experimentos de correlação heteronuclear, como HMQC ou HSQC, são úteis para a

identificação de, principalmente, carbonos diretamente ligados a hidrogênios (

importantíssimo para a atribuição dos sinais. Já experimentos de correlação

heteronuclear a longa distância, como o HMBC, identificam correlações via

acoplamento escalar através de 2 ou 3 ligações de distância, provendo uma importante

informação que permite a união de fragmentos já montados.

Tabela 1: Principais correlações observadas nos experimentos mais utilizados de RMN

(Claridge, 1999).

Correlação Principal Técnica Comentário

H-

H COSY

H-

H TOCSY /

HOHAHA

Relaciona prótons de uma rede de

acoplamento – J

H-X HMQC /

H-X HSQC

via transferência de

magnetização do

H para o

H-X HMBC

a longas distâncias

HSQC-TOCSY

X-X COSY

X-X INADEQUATE

, abundância natural >

20 %

H-

H NOEDiff.

1-D e 2-D NOESY

1-D e 2-D ROESY

Correlação através do espaço.

H-

H NOEDiff.

2-D HOESY

Sensibilidade restrita pelo spin X.

Experimentos de correlação via acoplamento espacial, como NOESY ou

ROESY, são muito usados para refinamentos conformacionais da estrutura já formada.

Essencialmente esses experimentos correlacionam hidrogênios que se apresentam com

proximidade no espaço.

O experimento NOESY é utilizado para moléculas pequenas (Mr < 1000) ou

moléculas grandes (Mr > 2000), e para cada caso, o efeito de Overhauser nuclear

apresentará um resultado (relativo ao logaritmo de uma relação (ω

) representativa da

taxa de reorientação), positivo ou negativo, respectivamente. Já o experimento ROESY

é utilizado para moléculas de tamanho médio (1000 > Mr > 2000), apresentando um

resultado sempre positivo (Claridge, 1999).

Conhecendo bem as particularidades de cada técnica de correlação 2-D RMN e

sabendo quais as informações geradas por cada uma, é possível a completa dedução

estrutural do oligossacarídeo analisado (Esquema 3). É sabido que a grande maioria dos

X X

NOE

sinais apresentados pelos açúcares, nos espectros de RMN de

H, está localizada entre 3

e 4,2 ppm (e anoméricos entre 4,5 e 5,8), sendo comum a existência de sobreposição de

sinais. Portanto, é de praxe iniciar as análises de correlações pelos sinais apresentados

pelos carbonos e hidrogênios anoméricos, geralmente em freqüências mais baixas e sem

sobreposições. Desse modo, a identificação dos açúcares deve ser feita através dos

valores das constantes de acoplamentos apresentadas pelos sinais correlacionados, para

cada açúcar por COSY, HOHAHA ou TOCSY, juntamente com informações geradas

pelos ROESY. A seqüência das unidades monossacarídicas é determinada pela

correlação existente entre os átomos envolvidos nas ligações inter-glicosídicas, assim

como a determinação da ligação do oligossacarídeo na aglicona, utilizando como

técnica o HMBC ou ROESY (Claridge, 1999).

Esquema 3: Esquema para a análise estrutural de oligossacarídeos presentes em

saponinas (Agrawal e Pathak, 1996).

número de unidades

de monossacarídeos

anoméricos: RMN

H: δ 4,5-5,8 ppm

RMN

C: δ 90,0-111,0 pm

H-

H COSY e HETCOR / HMQC

H-

H DQF-COSY

TOCSY / HOHAHA

1D e 2D δ

C RMN

HETCOR/HMQC

tipos de ligações inter-glicosídicas

seqüênciamento

H RMN

1-D NOESY/ROESY

2-D TOCSY-ROESY

3-D TOCSY-ROESY

C RMN

HETCOR / HMQC

H-

a longa distância

Oligossacarídeo

identificação dos monossacarídeos

tamanho do anel e orientação dos grupos OH

As configurações relativas apresentadas pelos carbonos anoméricos poderão ser

determinadas pelos valores apresentados pelos acoplamentos

H-H

, entre H

e H

(1-4 Hz para α-anoméricos e 6-8 Hz para β-anoméricos) e C

e H1 (167-170 Hz para α-

anoméricos e 158-160 Hz para β-anoméricos), respectivamente (Agrawal e Pathak,

1996).

Na presença de resíduos da classe 6-desóxi, um sinal de metila será observado

em freqüência mais baixa (por volta de δ 17-20 ppm), sinal este que poderá também

servir como ponto de partida para a análise dos espectros de correlação. Os sinais de

carbono e hidrogênio são relacionados através de técnica de correlação heteronuclear

como HETCOR ou HMQC/HSQC, confirmados com o uso de espectros de HMBC e

NOESY/ROESY. Assim os dados obtidos dos espectros poderão ser ajustados (quando

necessário) respeitando regras de deslocamento químico e constantes de acoplamento

(Tabela 2), e comparados com valores de referência na literatura para a confirmação da

estrutura elucidada (Claridge, 1999).

Tabela 2: Regras de deslocamento químico e constantes de acoplamento a serem

observadas para a comparação de dados obtidos nos espectros com dados da literatura. *

α 4,8 – 5,3 90 – 97 (éster)

β 4,3 – 4,8 100 – 112 (éter)

ppm

furanose -- 105 – 112

α 1 – 4** 167 – 170

β 6 – 8** 158 – 160

Anoméricos

168 – 174

(aldopentofuranoses)

piranosídeos 3,0 – 4,0 60 – 80

Não–anoméricos ppm

furanosídeos 3,8 – 4,5 73 – 83

6-Desoxi-

monossac.

ppm

1,1 – 1,3

(d, 5 – 8 Hz)

17 – 20

Eterificação

deslocamento de 0,4

– 0,1 para valores de

δ maiores

deslocamento do C

diretamente ligado

em 8 – 10 para

valores de δ maiores

Esterificação

deslocamento de 1,0

–0,4 para valores de

δ maiores

deslocamento do C

diretamente ligado

em 8 – 12 para

valores de δ menores

Deslocamento de:

2 - 1,3

3 + 6,5

4 + 0,7

Glicosilação

ppm

Aglicona --

C-28 (p.e.):

180→176

deslocamento de

4 – 10 para valores

de δ menores

Lig.

Interglicosídicas

ppm

deslocamento de

1 – 4 para valores de

δ maiores

* Dados coletados de diversas referências distintas.

**Valores dependente da configuração do carbono da posição 2.

2 – Objetivos

O objetivo geral do presente trabalho é o estudo fitoquímico das raízes da

espécie Chiococca alba (L.) Hitchc., contribuindo para o conhecimento da química da

espécie.

Os objetivos específicos são:

Isolar e caracterizar substâncias potencialmente ativas presentes nos extratos

das raízes;

Aplicar técnicas cromatográficas para o desenvolvimento de uma metodologia

de separação mais rápida e eficiente para triterpenos e saponinas;

Explorar a utilização de técnicas de RMN para a elucidação estrutural de

saponinas.

3 – Resultados e Discussão

3.1 – Geral

Toda a metodologia empregada foi inicialmente desenvolvida com a finalidade

de se obter frações menos complexas a partir de uma separação eficiente e, se possível,

rápida. A avaliação dos constituintes presentes em cada fração ao longo de toda

metodologia utilizada foi realizada através de sucessivas CCD devidamente reveladas

com diferentes reagentes cromogênicos.

Neste trabalho, a utilização do reagente de Draggendorff não apresentou

resultado positivo para a presença de substâncias da classe dos alcalóides em nenhuma

das frações obtidas. Entretanto, analisando a estrutura das substâncias isoladas por El-

Abbadi e colaboradores (Figura 14) observa-se que o hidrogênio ligado ao nitrogênio

não apresenta um caráter básico, já que a estrutura é uma amida cíclica (uma

δ−lactama). Assim, a revelação da CCD com o reagente de Draggendorf indicado para

revelação de bases nitrogenadas, não produzirá um resultado positivo para amidas.

OMe

MeO

Figura 14: Estrutura dos alcalóides 4-(4’-metoxifenil)-6,8-dimetóxi-2-quinolinona e 4-

(4’-metoxifenil)-6,8-dimetóxi-5-hidróxi-2-quinolinona.

No decorrer do trabalho foi observada, no extrato etanólico, a presença de

substâncias da classe das saponinas por análises realizadas por CCD e pela formação

abundante de espuma. A partir daí, e considerando a composição estrutural das

saponinas, analisou-se o extrato diclorometânico em busca da presença de substâncias

triterpênicas, justamente por ser pertinente que ali pudessem ser encontradas as geninas

triterpênicas das sapogeninas.

A maior dificuldade encontrada no processo de fracionamento dos extratos foi a

ausência visível de uma substância majoritária nas frações iniciais. Com isso, muitos

R= H 4-(4’-metoxifenil)-6,8-dimetóxi-2-quinolinona

R=OH 4-(4’-metoxifenil)-6,8-dimetóxi-5-hidróxi-2-quinolinona

dos fracionamentos cromatográficos realizados acabaram por resultar em amostras

muito complexas com concentrações muito baixas.

3.2 – Obtenção dos extratos brutos

A fim de otimizar as condições e o tempo de obtenção dos extratos brutos, foram

comparadas as extrações realizadas com o auxílio de um aparelho gerador de ultra-som

de baixa freqüência e com o extrator de Soxhlet. A utilização de baixas freqüências para

a extração sólido-líquido foi revisada por Vinatoru (2001), que expôs a versatilidade da

utilização da extração auxiliada por ultra-som, principalmente na indústria

fitofarmacêutica. O mecanismo da extração quando essa é auxiliada por ultra-som se

baseia na elevação da taxa de difusão do solvente utilizado através da parede celular e

na capacidade de clivagem da parede celular, que facilita a lavagem das substâncias

presentes nas células. A utilização do extrator de Soxhlet é bastante difundida para a

preparação de extratos vegetais, mesmo com a desvantagem do aquecimento do extrato.

Os rendimentos obtidos nas extrações foram comparados (Tabela 3), levando em

consideração os fatores temperatura e tempo de extração. Enquanto o tempo de extração

utilizando o extrator de Soxhlet foi de 3 dias, a extração com auxilio do ultra-som foi

realizada em 1 hora (período este posteriormente reduzido para 15 minutos), para a

obtenção de rendimentos semelhantes. Os volumes de solvente utilizados para a

obtenção inicial dos extratos foram equivalentes (aproximadamente 1 litro para cada

extrato).

Desse modo a extração assistida por ultra-som do material botânico foi feita de

modo diferencial, ou seja, uma extração usando diferentes solventes (com polaridade

crescente), com hexano, diclorometano e, em seguida, com etanol. Análises com CCD

indicaram equivalência para os extratos obtidos tanto pelo auxílio do ultra-som quanto

pelo extrator de Soxhlet. Com isso a economia de solvente tornou-se mais um fator a ser

considerado, pois as sucessivas partições (necessário para a separação grosseira dos

extratos brutos) são bastante dispendiosas devendo ser utilizado o triplo do volume

inicial a ser particionado.

Para garantir a reprodutibilidade na preparação dos extratos, as extrações foram

realizadas em ciclos (3 x 15 minutos cada), onde a filtração de cada um dos extratos foi

acompanhada por rápidas lavagens com os respectivos solventes de extração (200 mL).

No caso de extrato etanólico (E.E.b.; Materiais e Métodos 4.6.3, pg. 115) foi realizada

uma extração com diclorometano para a exclusão de resíduos mais apolares, garantindo

assim a obtenção de um extrato polar mais simples e reprodutível.

A visível economia de tempo, a simplicidade da metodologia e os bons

rendimentos observados na utilização da extração auxiliada por ultra-som possibilitaram

uma redução significativa do tempo de extração quando comparado com a utilização do

extrator de Soxhlet.

Tabela 3: Rendimentos aproximados dos extratos obtidos com o auxílio do extrator de

Soxhlet e do ultra-som.*

Mat. Botânico

Soxhlet (g)

Tempo Rendimento

Rendimentos parciais

hexano

0,11 %

diclorometano

2,19 %

410

8,0 %

etanol

4,80 %

hexano

0,08 %

diclorometano

2,26 %

410

8,8 %

etanol

5,30 %

hexano

0,12 %

diclorometano

2,25 %

410

3 dias

8,5 %

etanol

5,10 %

Mat. Botânico

Ultra-som (g)

Tempo Rendimento

Rendimentos parciais

hexano

0,79 %

diclorometano

0,68 %

100

7,5 %

etanol

6,03 %

hexano

0,72 %

diclorometano

0,50 %

100

7,0 %

etanol

5,78 %

hexano

0,59 %

diclorometano

0,46 %

200

(3 x 15 minutos)

7,31 %

etanol

6,26 %

* Os rendimentos foram calculados sobre o total de material botânico utilizado para

cada extração.

**Obtidos após partição.

3.4 – Análise dos extratos

Foi observado, nos extratos hexânico e diclorometânico (E.H.b. e E.Cl.b.), o

surgimento de um precipitado branco-amarelado e amorfo quando metanol foi

adicionado (Ppt.1; Materiais e Métodos 4.6, pg. 111). A separação do precipitado foi

realizada de maneira controlada com a adição de pequenos volumes de metanol à

amostra e posterior lavagem do precipitado com acetona. A exclusão deste precipitado

resultou em uma visível simplificação do cromatograma apresentado pelas análises por

CCD. Os espectros de RMN de hidrogênio e carbono também sugeriram que o

precipitado, possuidor de um aspecto de goma, estaria puro, embora seu cromatograma

em CCD revelasse uma mancha arrastada por todo o caminho cromatográfico. As

evidências reunidas (aparência tipo goma e espectros simples) indicaram a presença de

uma substância polimérica, indicação essa confirmada com uma análise por

cromatografia de permeação em gel (CPG). A análise por CPG então permitiu a

determinação do peso molecular médio de Ppt.1. Assim, juntamente com dados obtidos

do espectro no I.V., Ppt.1 foi caracterizado como sendo um poliisopreno linear de peso

molecular médio igual a 57509 unidades (Figuras 15 e 16). Durante a análise dessa

substância foram tomadas como base de referência para comparações outras gomas

anteriormente isoladas de plantas (Tangpakdee e col., 1997; Tanaka e col., 1995; Ohya

e col., 1998).

Figura 15: Cromatograma (CPG) de Ppt.1.

Figura 16: Proposta estrutural para Ppt.1.

As evidências espectroscópicas obtidas para Ppt.1 foram as seguintes (figuras

17, 18 e 19):

O experimento HETCOR revelou as correlações existentes entre os sinais (RMN

H – RMN de

C): 1,65 – 23,31 (CH

); 2,05 – 26,28 (CH

); 2,05 – 32,0 (CH

); 5,10

– 124,9 (CH).

Observou-se que os sinais referentes aos dois metilenos coincidiram no espectro

de RMN de hidrogênio.

A análise dos espectros de RMN sugeriu uma estrutura monomérica composta

de um grupo metila ligado a uma olefina, essa por sua vez é constituída de um átomo de

carbono quaternário e um grupo metino ligados a dois grupos metilenicos em ambas as

extremidades, ou seja, uma estrutura equivalente a unidade isoprênica.

Figura 17: Mapa de correlações HETCOR de Ppt.1. Em f2 está alocado o espectro

APT.

7.264

5.128

2.036

1.681

1.254

Figura 18: Espectro de RMN de

H de Ppt.1.

135.035

124.859

26.234

32.038

23.389

Figura 19: Espectro APT de Ppt.1.

O espectro no I.V. (Figura 20) foi utilizado para confirmação da ausência de um

grupamento funcional. As evidências geradas por essa análise foram:

As bandas em 3035, 2961, 2917, 2853 e 1664 cm

-1

condizem com as vibrações

de deformação axial de ligação C–H, mais especificamente a banda em 3035 sugere a

deformação axial de um grupo C=C–H, as bandas em 2853 e 2917 cm

-1

sugerem

deformações axiais de grupos CH

, a banda em 2961 cm

-1

deformação axial de grupos

e a banda em 1664 cm

-1

deformação axial de grupos C=C. As bandas em 1449 e

1376 cm

-1

condizem com as vibrações de deformação angular de ligação C–H, aquelas a

1449 cm

-1

para grupos CH

e as a 1376 cm

-1

para CH

. A banda em 837 cm

-1

condiz

com as vibrações de deformação angular fora do plano de ligação C–H.

Figura 20: Espectro no I.V. de Ppt.1. A banda larga a 3431 cm

-1

é advinda da umidade

na amostra analisada.

3.4.1 – Análise do extrato hexânico (E.H.)

Após a separação do material polimérico do extrato hexânico, foi observada uma

considerável simplificação do cromatograma apresentado pela CCD. A partir daí, o

material sobrenadante, evaporado à secura (E.H.; Materiais e Métodos 4.6.1, pg. 111),

foi submetido à cromatografia em coluna “flash” com gel de sílica para a obtenção de

frações mais simples. As 41 frações assim obtidas foram agrupadas de acordo com suas

semelhanças cromatográficas em CCD. Entretanto, o resultado desse procedimento não

foi muito satisfatório, revelando frações ainda muito complexas e pouco concentradas.

O primeiro grupo (frações 1-3; E.H.1-3), com um cromatograma (CCD) mais

simples foi submetido à cromatografia com fase gasosa com detecção por

espectrometria de massas. A partir do cromatograma de massas obtido foi possível a

caracterização de três substâncias principais (E.H.1-3.1; E.H.1-3.2; E.H.1-3.3; Figura

21) eluindo nos tempos 18,91, 29,02 e 30,48 minutos. A partir de uma análise inicial

dos espectros de massas, foi possível identificar uma substância como sendo o

esqualeno (E.H.1-3.1) e classificar os outros dois esqueletos como pertencentes às

classes dos filicanos (E.H.1-3.2) e dos fernanos (E.H.1-3.3; Figura 22). A

caracterização estrutural desses dois triterpenos foi proposta a partir do estudo das

fragmentações apresentadas pelos espectros obtidos e comparação com dados da

literatura (Shiojima, 1992; Budzikiewicz, 1963).

Figura 21: Cromatograma de massas da fração E.H.1-3.

27 28

Figura 22: Estruturas básicas dos esqueletos dos tipos filicano e fernano.

As substâncias referentes aos sinais presentes entre 10 a 15 minutos (Figura 20),

segundo seus espectros de massas, são hidrocarbonetos e ácidos graxos. É conhecida a

presença dos ácidos hexadecanóico, octadecanóico, eicosanóico, docosanóico e

tetracosanóico (Gazda e col., 2006) no extrato apolar de raízes de C. alba. A

identificação da substância E.H.1-3.1, referente ao sinal em 18,91 minutos, como sendo

o esqualeno, foi realizada por comparação com dados existentes na biblioteca de

espectros do sistema CG-EM (NIST) (Figura 23).

fernano filicano

Figura 23: Espectro de massas da substância E.H.1-3.1.

A substância E.H.1-3.2, referente ao sinal a 29,02 minutos (espectro de massas;

Figura 24; Esquema 4), foi caracterizada como sendo o filic-7-en-3-ona, com base nas

seguintes evidências:

O fragmento de m/z 424 referente ao íon M

indica a fórmula molecular como

sendo C

O; grau de insaturação (G.I.) igual a 7.

O fragmento de m/z 339 é referente ao íon (M – 85)

e sugere a presença de um

sistema pentacíclico onde o anel E é um ciclopentano.

As fragmentações decorrentes da quebra da ligação C13–C14 geram,

principalmente, os fragmentos de m/z 257 e 243 o que indica, juntamente com a massa

do íon molecular, a presença de um grupamento carbonila. Foi sugerido que esse

grupamento está localizado na posição C3 (anel A) através da observação de outros

fragmentos (m/z 243 e m/z 203) e, evidentemente, à probabilidade biossintética de uma

oxigenação na posição C3 de triterpenos, advinda do precursor chave 2,3-óxido de

esqualeno (Esquema 1, Introdução 1.5.2, pg. 17).

Os fragmentos de m/z 271, 204 e 205 gerados a partir da fragmentação da

ligação C14–C15 juntamente com a massa do íon molecular sugerem a presença de uma

ligação dupla na posição C7. Essa ligação dupla é indicada pelo fragmento de m/z 300

(M-124)

gerado a partir de uma clivagem tipo retro Diels-Alder (rDA). Estas

fragmentações são compatíveis com a presença de um esqueleto da classe dos filicanos

pela perda de um fragmento de m/z 124, referente ao anel A.

Figura 24: Espectro de massas da substânica E.H.1-3.2.

filic-7-en-3-ona

Esquema 4: Proposta de fragmentação para a substância E.H.1-3.2 desenvolvida com

base no espectro de massas obtido.

filic-7-en-3-ona

m/z 339

m/z 300

m/z 271

m/z 243

m/z 217

rDA

m/z 203

m/z 191

409 m/z

- 85

- Me

A substância E.H.1-3.3 (espectro de massas; Figura 25; Esquema 5), referente

ao sinal a 30,48 minutos, foi identificada como sendo o fern-7-en-3-ona, através da

comparação dos valores dos sinais apresentados no espectro de massas com dados da

literatura (Shiojima e col., 1992). Os fragmentos mais úteis nessa identificação foram:

424 (M)

; 339 (M – 85)

; 285; 271 (M – 153)

; 257 (M – 167)

; 245; 231; 217.

Figura 25: Espectro de massas da substância E.H.1-3.3.

fern-7-en-3-ona

Esquema 5: Proposta de fragmentação para a substância E.H.1-3.3 desenvolvida com

base no espectro de massas obtido.

3.4.2 – Análise do extrato diclorometânico (E.Cl.)

É conhecida a presença de ácido ursólico e ácido oleanólico (Bolzani e col.,

2004) e do ácido 3β-hidroxiolean-12,15-dien-28-óico (Bhattacharyya e col., 1992) nos

extratos de polaridade média da C. alba. Este fato motivou a busca de uma fração que

fosse possuidora de todos os triterpenos ácidos, mais comuns em saponinas. Por ser um

fern-7-en-3-ona

m/z 339

m/z 271

m/z 257

m/z 217

m/z 205

m/z 191

m/z 409

- 85

procedimento mais específico e funcional, a separação das substâncias ácidas foi

realizada por extração em fase sólida de gel de sílica impregnada com hidróxido de

potássio, seguindo o procedimento descrito por McCarthy e Duthie (1962) e adaptado

para o uso com uma coluna para cromatografia “flash” por Pinto e colaboradores

(2000). Nestas condições, a formação de grupos Si-OK torna a coluna apta para

extração ácido-base. A posterior acidificação das frações obtidas (em metanol a 100% e

em metanol-ácido fórmico a 20%) seguida de extração com um solvente orgânico

(diclorometano) possibilitaram a obtenção dos componentes ácidos do extrato. Assim,

foi possível a obtenção de uma fração rica contendo quatro substâncias principais,

E.dCl.Me.1.1, E.dCl.Me.1.2, E.dCl.Me.1.3 e E.dCl.Me.1.4 (tempos de retenção a

17,25; 18,28; 19,47; 21,16 minutos, respectivamente; Figura 25 e 26). As quatro

substâncias foram caracterizadas por cromatografia em fase gasosa com detecção de

massas, após metilação com diazometano, como sendo um derivado triênico do ácido

3β-hidroxioleanólico, um ácido 3β-hidroxiolean-12,15-dien-28-óico, o ácido oleanólico

e o ácido ursólico.

23 24

29 30

23 24

Figura 26: Estruturas básicas dos esqueletos dos tipos oleanano e ursano.

oleanano ursano

Figura 27: Cromatograma de massas da fração E.dCl.Me.1.

Os ésteres metílicos dos ácidos oleanólico (M

m/z 470) e ursólico (íon M

m/z

470) foram rapidamente identificados pela comparação dos espectros de massas (Figura

28 e 29; Esquema 6 e 7) com valores de referência obtidos na literatura (Shiojima e col.,

1992). A única diferença passível de ser usada para distinguir os espectros dos ácidos

oleanólico e ursólico é a intensidade apresentada pelo fragmento de m/z 133. Este é

resultado da clivagem heterolítica do anel E.

Figura 28: Espectro de massas da substância E.dCl.Me.1.4.

Figura 29: Espectro de massas da substância E.dCl.Me.1.3.

COOMe

Esquema 6: Proposta de fragmentação para a substância E.dCl.Me.1.4 desenvolvida

com base no espectro de massas obtido.

Éster metílico do

ácido ursólico

m/z 263

m/z 262

m/z 248

m/z 207

m/z 133 m/z 203

m/z 189

m/z 262

rDA

COOMe

Esquema 7: Proposta de fragmentação para a substância E.dCl.Me.1.3 desenvolvida

com base no espectro de massas obtido.

Éster metílico do

ácido oleanólico

m/z 263

m/z 262

m/z 248

m/z 207

m/z 133 m/z 203

m/z 189

m/z 262

rDA

COOMe

COOMe, -

O ácido 3β-hidroxiolean-12,15-dien-28-óico foi identificado através da

observação de valores com duas unidades de massa a menos em alguns sinais em

relação ao ácido oleanólico (Figura 30; Esquema 8) e através da comparação com o

espectro relatado por Bhattacharyya e colaboradores (1992).

O derivado triênico do ácido 3β-hidroxioleanólico (Figura 31; Esquema 9) foi

proposto pela observação de valores com 4 unidades de massa a menos em grande parte

dos sinais em relação ao ácido oleanólico e valores com 2 unidades de massa a menos

em grande parte dos sinais em relação ao ácido3β-hidroxiolean-12,15-dien-28-óico.

Ainda permanece a dúvida da posição onde se encontra a terceira ligação dupla.

Entretanto, a observação do fragmento de m/z 205 indica a presença desta nos anéis A

ou B do triterpeno. Assim é possível que a terceira ligação dupla esteja ou na forma de

cetona (na posição 3), ou nas posições 1 ou 6. Serão necessários outros métodos de

análise estrutural para a exata localização desta e para isso será indispensável a

obtenção de uma maior quantidade desta substância.

De acordo com os dados obtidos na literatura (Shiojiima e col., 1992), os

fragmentos de m/z 262 são resultantes da clivagem do anel C através de uma reação do

tipo retro-Diels-Alder (rDA), a partir do ion molecular com m/z 470, referente ao peso

molecular dos ésteres dos ácidos oleanólico e ursólico. O fragmento de m/z 203 é

resultante da perda de 59 unidades de massa (-COOCH

da posição 28) a partir do ion

em m/z 262.

Figura 30: Espectro de massas da substância E.dCl.Me.1.2.

Figura 31: Espectro de massas da substância E.dCl.Me.1.1.

COOMe

Esquema 8: Proposta de fragmentação para a substância E.dCl.Me.1.2 desenvolvida

com base no espectro de massas obtido.

Éster metílico do ácido

3β-hidróxiolean-12,15-dien-

28-óico

m/z 261

m/z 260

m/z 246

m/z 207

m/z 131

201 m/z

m/z 187

m/z 260

rDA

COOMe

Esquema 9: Proposta de fragmentação para a substância E.dCl.Me.1.1 desenvolvida

com base no espectro de massas obtido.

m/z 261

m/z 260

m/z 246

m/z 205

rDA

m/z 131

m/z 201

m/z 187

m/z 260

COOMe

Éster metílico do derivado

triênico do ácido

3β-hidroxioleanólico

3.4.3 – Análise do extrato etanólico (E.E.b)

A metodologia utilizada para o fracionamento do extrato etanólico foi

direcionada para a obtenção de uma fração rica em saponinas e posterior purificação

destas. Desse modo optou-se pela realização da metodologia descrita (Introdução 1.5.5,

pg. 22). A fração rica em saponinas foi obtida (E.E.Bu.ppt.; Materiais e Métodos 4.6.3,

pg. 115) com um rendimento apreciável (0,24 % do total de material botânico utilizado).

Essa fração, entretanto, ainda possuía uma quantidade considerável de outras

substâncias.

O emprego da CLMP com fase estacionária de gel de sílica funcionalizada com

octadecilsilano (RP-18) foi importantíssimo para a obtenção de frações mais

simplificadas (Figura 32). Assim foram obtidas três frações possuidoras de pelo menos

cinco saponinas distintas (RP-08.s, RP-09.s e RP-10.s; Materiais e Métodos 4.6.3 pg.

116). Foi traçado o perfil cromatográfico das três frações obtidas por CLAE em coluna

de fase inversa com metanol-água-ácido trifluoroacético (70:30:0,0125) como fase

móvel e detecção com D.A.D. a 203 nm (Figura 33).

Figura 32: Cromatograma da CLMP. Detetor de absorção no UV a 220 nm.

A purificação das saponinas por CLAE foi iniciada com a fração RP-08.s. A

fase móvel utilizada para os procedimentos semi-preparativos foi modificada a fim de

garantir separação dos sinais. A Figura 34 mostra o cromatograma obtido com a fase

móvel metanol-água-ácido trifluoroacético (60:40:0,0125) com detecção no UV no

modo Spectrum Max plot (Materiais e Métodos 4.2.1 pg. 107) em escala analítica. A

separação preparativa por CLAE foi executada com um total de 400 mg da fração RP-

8.s 9.s 10.s

08.s de onde foram obtidas duas saponinas purificadas, RP-08.s.1 e RP-08.s.2 (tempos

de retenção: 49 e 66 minutos).

Figura 33: CLAE analítica das frações RP-08.s, RP-09.s e RP-10.s (Materiais e

Métodos 4.6.3, pg. 116). Condições: metanol-água-ácido trifluoroacético (TFA;

70:30:0,0125) como fase móvel e detecção por absorção no UV (203 nm) em coluna de

fase inversa (RP-18).

Figura 34: Cromatograma otimizado da fração RP-08.s. Condições: metanol-água-

ácido trifluoroacético (TFA; 60:40:0,0125) como fase móvel e detecção por absorção no

UV. (modo Spectrum Max plot) em coluna de fase inversa (RP-18).

Nesse ponto do trabalho experimental foi extremamente importante a obtenção

de uma quantidade maior de material de partida, pois se encontrou muita dificuldade no

processo de purificação das duas saponinas presentes na fração RP-08.s.

A identificação dos sinais das saponinas foi realizada pela observação do seu

espectro no UV, sabendo que estas estão em proporção majoritária (segundo análise por

CCD) nas frações analisadas. O espectro no UV das saponinas em questão (Figura 35)

apresenta uma banda de absorção intensa em 200 nm referente à transição eletrônica n

→ σ* e uma banda fraca em cerca de 270 nm referente a transição n → π* (banda R) do

grupamento RC(O)OR’ presente na aglicona (posição 28). Assim ficou possível

identificar os sinais referentes às saponinas no cromatograma.

Figura 35: Espectro no UV das saponinas presentes na fração RP-08.s..

Desse modo foi realizada a purificação de duas saponinas presentes na fração

RP-08.s. A purificação foi feita em uma coluna de escala semi-preparativa com

detecção no UV a 200 nm. As frações obtidas eram rapidamente encaminhadas para o

rota-evaporador para a exclusão do metanol e em seguida eram congeladas para serem

liofilizadas. A preocupação na retirada da fase móvel foi uma forma de prevenir

possíveis degradações da amostra no meio ácido.

3.4.3.1 – Elucidação Estrutural de RP-08.s.1 e RP-08.s.2

Características físico-químicas:

Rotação óptica (c.1; MeOH): RP-08.s.2: [α]

= - 46

RP-08.s.1: [α]

= - 58

Transf.

eletrôn.

máx.

(nm) ε

máx.

π → π* 150 --

n → α* 188 1860

n → π* 279 15

Os valores aqui apresentados estão

sujeitos a deslocamentos, principal-

mente, por efeito do solvente (Silverstein

e col., 1979).

Íon quasimolecular (EM (ESI-TOF)): RP-08.s.2: m/z 1063,4811 [M + Na]

RP-08.s.1: m/z 1195,5923 [M + Na]

3.4.3.1.1 – Identificação da aglicona

As agliconas de ambas as saponinas foram identificadas como sendo o ácido 3β-

hidroxiolean-12,15-dien-28-óico a partir da comparação dos espectros de RMN de

(Tabela 4) e

C (Tabela 5) e do espectro de massas do éster metílico obtido da fração

etérea do produto da hidrólise ácida e metilado com diazometano para ambas as

saponinas (EM (IE,m/z): 468; 260; 245; 231; 207; 201; 187; 173; 157; 145; 131; 119;

105; 95; 81; 69; 55; Figura 27 e 30, pg. 50 e 56).

Os sinais úteis para a identificação do esqueleto da aglicona foram,

principalmente, os referentes as metilas (7 CH

em (

C, ppm): 16,0; 19,9; 18,2; 23,5;

25,0; 28,5; 33,6) e os sinais referentes às olefinas presentes nas posições 12 e 15 (3 CH

em (ppm): 137,8; 128,5; 124; e 1 C em (ppm): 141,5). O deslocamento do sinal

referente ao C3 da aglicona em cerca de 12 ppm (de 78 na aglicona para 91,1 ppm na

RP-08.s.1 e RP-08.s.2) indica uma O-glicosilação com ligação tipo éter. O

deslocamento do sinal referente ao C28 de 178 para 176 ppm indica esterificação por

um monossacarídeo(s) (Introdução 1.5.6.2, pg. 26). No Anexo 2 encontra-se uma

Tabela com valores de deslocamento químico de

C de RP-08.s.1 e de outros

triterpenos e saponinas para comparação.

Tabela 4: Deslocamentos químicos (

H), referentes apenas à aglicona, obtidos para RP-

08.s.1 e RP-08.s.2*. (Solvente: metanol deuterado, referência: TMS.)

RP-08.s.1 RP-08.s.2

0,64 2,92 0,63 2,93

0,86 3,17 0,85 3,17

0,88 5,44 0,88 5,44

0,90 5,54 0,90 5,55

0,93 5,67 0,93 5,66

1,06 1,06

1,17 1,16

*Estes são os sinais úteis à identificação da porção aglicona.

Tabela 5: Deslocamentos químicos (

C) e multiplicidades obtidas para RP-08.s.1 e

RP-08.s.2. (Solvente: metanol deuterado, referência: TMS.)

RP-08.s.1 RP-08.s.2 DEPT RP-08.s.1 RP-08.s.2 DEPT

16,1 16,0 25-CH

68,1 67,4 CH

17,0 16,9 23-CH

69,0 68,9 CH

18,3 18,3 26-CH

-- 71,7 CH

18,5 18,5 CH

72,3 72,5 CH

19,6 19,4 6-CH

72,5 73,2 CH

23,6 23,5 30-CH

73,3 74,4 CH

24,4 24,3 11-CH

74,9 75,1 CH

25,1 25,0 27-CH

75,1 -- CH

27,1 27,1 2-CH

75,4 75,3 CH

28,5 28,4 24-CH

77,7 77,7 CH

31,3 31,3 20-C

78,3 78,4 CH

33,8 33,6 22-CH

78,8 -- CH

33,9 33,6 29-CH

79,3 79,9 CH

33,9 33,6 17-C

80,4 -- C

34,1 33,8 7-CH

80,7 80,6 C

35,7 35,6 21-CH

80,8 -- CH

38,2 38,2 10-C

91,2 91,1 3-CHOH

39,8 39,7 1-CH

94,5 94,1 CH

40,3 40,2 4-C

101,5 101,5 CH

41,3 41,2 8-C

107,0 107,0 CH

43,5 43,4 18-CH

112,2 -- CH

44,6 44,6 19-CH

112,5 111,6 CH

45,6 45,5 14-C

124,7 124,6 12-CH

48,7 48,7 9-CH

128,6 128,7 15-CH

57,2 57,0 5-CH

137,8 137,5 16-CH

64,9 64,0 CH

141,5 141,6 13-C

65,3 65,5 CH

176,1 176,1 28-C=O

COOR

= R

= H

ácido 3β-hidroxiolean-12,15-dien-28-óico

3.4.3.1.2 – Caracterização da porção sacarídica

Com o objetivo de avaliar a utilização de técnicas espectroscópicas para a

elucidação estrutural de saponinas, foram utilizados os experimentos DEPT, COSY,

HSQCeditado, TOCSY, HMBC, HSQC-TOCSY e T-ROESY. Teoricamente cada um dos

experimentos supracitados gerará informações específicas a serem analisadas em conjunto

objetivando a elucidação inequívoca da estrutura completa. Entretanto são encontradas

certas dificuldades, principalmente, quando a correlação a ser observada é muito fraca

resultando em dificuldades no seqüenciamento contínuo dos sinais. Um outro problema é a

intensa sobreposição apresentada pelo espectro de hidrogênio, o que acaba por prejudicar a

análise das correlações entre os hidrogênios do anel.

Os experimentos de correlação homonuclear, COSY, correlacionam os sinais que

compartilham acoplamentos escalares,

J e

J. Os experimentos de TOCSY

correlacionam os prótons participantes de uma rede completa de acoplamentos, permitindo

o encadeamento de fragmentos moleculares cujos hidrogênios estejam acoplados

escalarmente. Experimentos de correlação heteronuclear, como HMQC ou HSQC, são úteis

para a identificação de, principalmente, carbonos diretamente ligados a hidrogênios (

Já experimentos de correlação heteronuclear a longa distância, como o HMBC, identificam

correlações via acoplamento escalar através de 2 ou 3 ligações de distância. Experimentos

de correlação via acoplamento dipolar, como NOESY ou ROESY, são muito usados para

refinamentos na estereoquímica da estrutura já montada. Essencialmente esses

experimentos correlacionam hidrogênios que se apresentam com proximidade no espaço.

3.4.3.1.2.a –Identificação, Seqüenciamento e Proposta Estrutural

A análise dos mapas de correlação COSY, TOCSY, HSQCeditado e HMBC

possibilitou a atribuição e o agrupamento dos sinais referentes aos monossacarídeos em

ambas as saponinas. O espectro de T-ROESY também foi muito útil para a atribuição dos

sinais do meio dos anéis, sendo mais usados para confirmação das informações obtidas

pelos outros experimentos. Inicialmente, esperava-se que o experimento TOCSY gerasse

informação sobre a rede de acoplamentos presente em cada monossacarídeo separadamente

de forma a se obter, dentro do mapa de correlação, uma linha de correlação com todos os

sinais de cada unidade individualmente. Entretanto, devido à ocorrência de constantes de

acoplamento de valor pequeno, o experimento TOCSY nem sempre possibilitou a

visualização (no mapa de correlação) da rede de acoplamentos completa para os

monossacarídeos. Mesmo variando o tempo de contato (o spin-lock time, τ) de 70 para 140

ms (milisegundos), várias correlações deixaram de ser detectadas.

O seqüenciamento dos monossacarídeos foi proposto a partir de dados de

deslocamento químico de carbono, de informações oriundas dos experimentos HMBC e T-

ROESY.

As configurações nos carbonos anoméricos para cada uma das unidades de

monossacarídeos presentes puderam ser identificadas pela medição das constantes de

acoplamento de cada sinal de hidrogênio anomérico.

Nos Anexos 3 e 4 encontram-se os espectros utilizados na discussão a seguir.

3.4.3.1.2.a.1 – Monossacarídeos de RP-08.s.2

Observou-se que os deslocamentos químicos apresentados pelos espectros de RMN-

C de ambas as saponinas são praticamente idênticos salvo por pequenas diferenças

decorrentes da perda de uma unidade monossacarídica na substância RP-08.s.2 (Anexo 2).

Como já foi mencionado anteriormente, estudos acerca da biossíntese de saponinas

relataram que a adição dos monossacarídeos à posição 28 (-COOH) de um triterpeno ocorre

de forma seqüencial, enquanto que na posição 3 o oligossacarídeo seria adicionado por

inteiro. Assim, é pertinente a co-ocorrência de duas saponinas (bis-desmosídicas) distintas

apenas por uma unidade de monosscarídeo no oligossacarídeo ligado na posição 28.

Portanto, a análise estrutural de RP-08.s.2 apresentou pontos de convergência muito úteis à

análise realizada para RP-08.s.1.

Na substância RP-08.s.2, 4 sinais de carbonos anoméricos foram identificados em

94,4, 101,7, 107,0, e 111,7 ppm no espectro de RMN de

C (Figura 36), também

correlacionados (segundo o mapa de correlação HSQC) com 4 sinais referentes a

hidrogênios de carbonos anoméricos, em 5,46, 5,06, 4,38 e 5,33 ppm (Figura 37).

111,6

107,0

101,5

94,1

91,1

Figura 36: Espectro de RMN-

C (50 MHz) da saponina RP-08.s.2 (ampliação).

PPM 5.60 5.50 5.40 5.30 5.20 5.10 5.00 4.90 4.80 4.70 4.60 4.50 4.40 4.30

5.4 6

5.33

5.0

4.3

Figura 37: Espectro de RMN-

H (600 MHz) da saponina RP-08.s.2 (ampliação).

Resíduo R – No mapa de correlação TOCSY foi possível relacionar de forma bem

visível os três sinais a partir do sinal da metila em 1,26 ppm (Figura 38). Foram estes: 3,75,

3,52 e 3,79 ppm (com τ igual a 100 e 140 ms). O sinal referente ao hidrogênio do carbono

anomérico 5,06 ppm foi correlacionado com o sinal em 3,79 ppm, pelo experimento COSY

(Figura 39). Observou-se que o comportamento desse grupo de sinais foi bem parecido com

o comportamento do grupo de sinais referente ao hidrogênio em 5,12 ppm na substância

RP-08.s.1. A Tabela 6 foi montada com os valores de deslocamento químico de hidrogênio

4,38

5,48

5,33

5,06

111,7

107,0

101,7

94,4

e seus respectivos deslocamentos químicos de carbono-13. A atribuição dos sinais e suas

posições no anel foram obtidas pelos experimentos COSY e TOCSY, considerando as

multiplicidades esperadas para cada sinal. A unidade monossacarídica foi identificada

como sendo uma ramnose monossubstituida (na posição 4) e pôde ser confirmada através

da comparação dos seus dados espectroscópicos com valores da literatura (Tan e col.,

1999).

Tabela 6: Deslocamentos químicos de hidrogênio e carbono-13 na ramnose.*

ha 1

ha 2

5,06 101,7

100,8

101,5

3,79 72,7

72,2

71,9

3,86 71,7

72,8

72,5

3,52 80,2

74,1

83,8

3,75 69,2

70,1

68,5

1,26 18,5

18,7

18,8

Ramnose

*Rha 1 refere-se a uma ramnose terminal, a Rha 2 refere-se a uma ramnose

monossubstituída em 4 (Tan e col., 1999).

PPM (F2) 3.92 3.88 3.84 3.80 3.76 3.72 3.68 3.64 3.60 3.56 3.52 3.48 3.44

PPM (F1)

1.38

1.36

1.34

1.32

1.30

1.28

1.26

1.24

1.22

1.20

1.18

1.16

1.14

1.12

Figura 38: Mapa de correlação TOCSY da saponina RP-08.s.2 (ampliação). Correlação a

partir do sinal em 1,26 ppm.

- H5

- H4

PPM (F2) 5.2 5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4

PPM (F1)

5.4

5.2

5.0

4.8

4.6

4.4

4.2

4.0

3.8

3.6

3.4

Figura 39: Mapa de correlação COSY da saponina RP-08.s.2 (ampliação). No inserto está

a correlação do sinal em 1,26 ppm com o sinal em 3,75 ppm.

Analisando os sinais de correlação apresentados nos experimentos COSY, TOCSY

e espectro de RMN-

H, temos que o sinal referente ao H6 (Me) se apresenta como um

dupleto de constante de acoplamento

igual a 6 Hz (Figura 40), o sinal referente ao H5

se apresenta como um multipleto e o sinal referente ao H4 um tripleto de constante de

acoplamento

igual a 8 Hz (Figura 41). O sinal em 3,86 ppm foi atribuído a partir da

observação de uma correlação no experimento COSY com o sinal em 3,79 ppm. As

pequenas correlações apresentadas pelos sinais referentes aos C1–C2–C3 indicam a posição

axial da hidroxila da posição 2, excluindo a possibilidade dessa unidade ser uma fucose (6-

desóxi-galactose) ou uma quinovose (6-desóxi-glicose). Sabendo que o efeito decorrente da

glicosilação seria um deslocamento do carbono diretamente ligado em cerca de 8 a 10 ppm

para valores de deslocamento químicos maiores (Introdução 5.6.2, pg. 31; Tabela 2), foi

proposto que há glicosilação na posição 4 (80,2 ppm) da ramnose. Essa identificação foi

confirmada pela análise dos acetatos de alditóis (Materiais e Métodos 4.8.2, pg. 119).

PPM (F2)

3.760 3.750 3.740 3.730 3.720 3.710

PPM (F1)

1.260

- H2

PPM 2.00 1.90 1.80 1.70 1.60 1.50 1.40 1.30 1.20 1.10 1.00 0.90 0.80 0.70 0.60

510.5

504.5

Figura 40: Espectro de RMN-

H (600 MHz) da saponina RP-08.s.2 (ampliação).

PPM (F2) 3.560 3.550 3.540 3.530 3.520 3.510 3.500 3.490 3.480 3.470

PPM (F1)

1.296

1.292

1.288

1.284

1.280

1.276

1.272

1.268

1.264

1.260

1.256

1.252

1.248

1.244

1.240

1.236

1.232

1.228

1.224

1.22

Dif: 0,02 ppm ~ 8 Hz

Figura 41: Mapa de correlação TOCSY da saponina RP-08.s.2 (ampliação). Correlação

entre os sinais 1,28 e 3,52 ppm.

Resíduo AG – No experimento TOCSY também foi possível correlacionar de forma

bem visível os quatro sinais a partir do sinal em 4,38 ppm (referente ao hidrogênio do

carbono anomérico, 107,0 ppm; Figuras 42 e 43). Foram estes: 3,24, 3,37, 3,51 e 3,79 ppm

(com τ igual a 100 e 140 ms). A Tabela 7 mostra os valores de deslocamento químico de

hidrogênio e seus respectivos deslocamentos químicos de carbono para o resíduo AG.

Dif.: 0,02 ppm ~8 Hz

6 Hz

Tabela 7: Deslocamentos químicos de hidrogênio e carbono-13 no ácido glicurônico.*

Glc

GlcA

4,38 107,0

103,7

107,1

3,24 75,5

76,3

75,5

3,37 77,9

78,8

78,0

3,51 73,4

72,5

73,4

3,79 75,4

77,8

77,7

-- 176,0

63,3

173,3

Ácido Glicurônico

*Glc refere-se a uma glicose e GlcA refere-se a um ácido glicurônico (Tan e col., 1999).

PPM (F2) 3.80 3.76 3.72 3.68 3.64 3.60 3.56 3.52 3.48 3.44 3.40 3.36 3.32 3.28 3.24 3.20

PPM (F1)

4.46

4.44

4.42

4.40

4.38

4.36

4.34

4.32

4.30

4.28

4.26

Figura 42: Mapa de correlação TOCSY da saponina RP-08.s.2 (ampliação). Correlação a

partir do sinal em 4,38 ppm.

HOOC

- H5

- H4

- H3

- H2

PPM (F2) 5.2 5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4

PPM (F1)

5.4

5.2

5.0

4.8

4.6

4.4

4.2

4.0

3.8

3.6

3.4

Figura 43: Mapa de correlação COSY da saponina RP-08.s.2 (ampliação).

A partir da análise dos sinais de correlação apresentados nos experimentos COSY,

TOCSY e espectro de RMN-

H, temos que os sinais em 3,24 (H2) e 3,37 ppm (H3) se

apresentam como dois tripletos de constantes de acoplamento

igual a 8 e 9 Hz (Figura

44), indicando a orientação equatorial para as hidroxilas das posições 1, 2, 3 e 4. Este fato

sugere fortemente uma configuração gluco (Ma e col., 1996; presente em glicose, ácido

glicurônico, quinovose e xilose). A quinovose e a xilose são uma 6-desóxi e uma pentose,

respectivamente, e suas presenças foram descartadas em função da ausência de uma outra

metila (dupleto) de monossacarídeo e pela ausência tanto do pentaacetato de quinovositol

quanto do pentaacetato de xilitol entre os produtos da análise dos acetatos de alditóis.

Os valores de deslocamento químico dos carbonos do interior do anel estão

próximos aos valores relatados para ácido glicurônico terminal e glicose terminal (Tan e

col., 1999). Nos espectros de carbono-13 em metanol não são observadas as presenças de

duas carbonilas. Entretanto, o espectro de carbono-13 obtido da amostra RP-08.s.1

metilada com diazometano apresentou dois sinais referentes a carbonila não observados

anteriormente à metilação e um sinal referente a uma metoxila de éster (Figura 45) em

171,5 ppm. Quando foi realizada a hidrólise básica de ambas as amostras (RP-08.s.1 e RP-

08.s.2) foi observado por RMN que as pró-saponinas C-3 são iguais (ProSap.1 e .2; Tabela

8). Desse modo, essa unidade presente na posição 3 da aglicona foi identificada como

sendo o ácido glicurônico.

- H2

Não foi observado um sinal referente ao ácido glicurônico na análise dos acetatos de

alditóis, pois essa análise é indicada para monossacarídeos neutros (Chaplin e Kennedy,

1994). Foi realizado um teste com padrão de ácido glicurônico na mesma condição

reacional utilizada para obtenção dos acetatos de alditóis, e como resultado foi observado a

degradação de todo o padrão utilizado na etapa de acetilação.

Tabela 8: Deslocamentos químicos (

C) e multiplicidades obtidas para as pró-saponinas

de RP-08.s.1 e RP-08.s.2*. (Solvente: metanol deuterado, referência: TMS.).

ProSap.1 ProSap.2 DEPT ProSap.1 ProSap.2 DEPT

16,0 16,1 CH3

40,3 40,5 C

17,0 17,2 CH3

41,2 41,5 C

18,3 18,4 CH3

43,7 43,9 CH

19,5 19,6 CH2

44,8 44,9 CH2

23,6 23,7 CH3

45,5 45,7 C

24,4 24,6 CH2

48,2 48,2 CH

25,2 25,3 CH3

57,1 57,3 CH

27,1 27,3 CH2

73,3 73,5 CH

28,5 28,7 CH3

75,4 75,6 CH

31,5 31,6 C

76,8 76,8 CH

31,0 31,0 CH2

77,8 78,0 CH

33,8 33,9 CH3

91,2 91,4 CH

34,0 34,2 CH2

107,2 107,3 CH

34,2 34,4 CH2

124,1 124,2 CH

35,8 35,9 CH2

129,7 129,9 CH

38,3 38,4 C

136,5 136,6 CH

39,8 39,9 CH2

142,2 142,4 C

* o sinal referente às carbonilas não ficou visível.

PPM 3.96 3.92 3.88 3.84 3.80 3.76 3.72 3.68 3.64 3.60 3.56 3.52 3.48 3.44 3.40 3.36 3.32 3.28 3.24 3.20 3.16 3.12

1351.0

1345.1

1336.8

1305.0

1297.0

1288.5

Figura 44: Espectro de RMN-

H (600 MHz) da saponina RP-08.s.2 (ampliação).

176,2

171,5

Figura 45: Espectro de RMN-

C (50 MHz) da saponina RP-08.s.1 metilada com

diazometano (ampliação).

Resíduo Ap – Tanto no mapa de correlação COSY quanto no TOCSY, o sinal de

hidrogênio referente a carbono anomérico em 5,33 ppm, correlaciona-se apenas com um

sinal em 3,92 ppm (Figura 46; Tabela 9). Pelo HSQC, foram obtidos os sinais de RMN-

referente aos dois sinais anteriormente mencionados, os sinais 111,7 e 78,6 ppm.

176,2

171

9 Hz

8 Hz

O mapa de correlação HMBC possibilitou a identificação de correlações

entre

o sinal em 5,33 ppm com o sinal em 80,6 ppm (carbono quaternário; informação obtida do

espectro DEPT) e entre o sinal em 3,92 ppm com os sinais em 75,0 e 65,5 ppm (metilenos;

informação também obtida do espectro DEPT; Figura 47). Comparando esses dois sinais

com os dois sinais de RMN de

C referente aos C1 e C2 (da apiose da RP-08.s.1),

juntamente com a presença do sinal de carbono quaternário em 80,6 ppm e 2 sinais de

carbonos metilênicos em 75,0 e 65,5 ppm, essa unidade foi identificada como sendo uma

apiose terminal. Dados de referência confirmaram essa proposta (Tabela 9). Essa

identificação foi confirmada pela análise dos acetatos de alditóis (ver item 3.4.2.1.2.b pg.

100).

PPM (F2) 5.2 5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4

PPM (F1)

5.4

5.2

5.0

4.8

4.6

4.4

4.2

4.0

3.8

3.6

3.4

3.2

Figura 46: Mapa de correlação TOCSY da saponina RP-08.s.2 (ampliação).

- H2

Tabela 9: Deslocamentos químicos de hidrogênio e carbono-13 na apiose.

C Api

5,33 111,7

111,2

3,92 78,6

77,7

-- 80,6

80,1

3,76 / 4,00 75,0

75,0

3,58 65,5

65,6

Apiose

*Api refere-se a uma apiose terminal (Tan e col., 1999).

PPM (F2) 5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2

PPM (F1)

110

106

102

Figura 47: Mapa de correlação HMBC da saponina RP-08.s.2 (ampliação).

As correlações observadas estão de acordo com a estrutura proposta para a apiose.

Os sinais 5,19 (H1) e 4,04 ppm (H2) se apresentam como um dupleto de constante de

acoplamento baixa (1,7 Hz; Figura 48).

- C3

- C4

-C5

PPM 5.64 5.60 5.56 5.52 5.48 5.44 5.40 5.36 5.32 5.28 5.24 5.20 5.16 5.12 5.08

5.33

Figura 48: Espectro de RMN-

H (600 MHz) da saponina RP-08.s.2 (ampliação).

Resíduo A – No experimento TOCSY o sinal de hidrogênio referente a carbono anomérico

em 5,46 ppm está correlacionado com um sinal em 3,78 ppm (também presente no

experimento COSY) e um sinal em 3,86 ppm (Figura 49 e 50; Tabela 10). Pelo HSQC,

foram obtidos os sinais de RMN-

C referente aos dois sinais supracitados, os sinais em

94,4 e 75,4 ppm. No mapa de correlação HMBC as correlações entre sinal em 94,4 ppm e

os sinais em 3,51 e 3,88 ppm (Figura 49) indicam as correlações do tipo

entre as

posições 1 e 3 e entre as posições 1 e 5, sendo essa posição 5 um átomo de carbono

metileno. Pelo mapa de correlação HSQC o sinal em 3,51 ppm é referente ao sinal em 72,5

ppm. Sabendo que a análise dos acetatos de alditóis indicaram a presença de uma ramnose,

uma apiose e uma arabinose, a única possibilidade do sinal de hidrogênio referente ao

carbono anomérico apresentar uma correlação do tipo

com um átomo de carbono

metilênico é o monossacarídeo ser uma a arabinose. Juntamente com comparações feitas

com dados obtidos na literatura, essa unidade foi identificada (Tabela 10). Essa

identificação foi confirmada pela análise dos acetatos de alditóis (Materiais e Métodos

4.8.2, pg. 119).

5,33

PPM (F2) 3.880 3.870 3.860 3.850 3.840 3.830 3.820 3.810 3.800 3.790 3.780 3.770 3.760 3.750

PPM (F1)

5.490

5.480

5.470

5.460

5.450

5.440

5.430

5.420

5.410

Figura 49: Mapa de correlação TOCSY da saponina RP-08.s.2 (ampliação). Correlação a

partir do sinal 5,46 ppm.

PPM (F2) 5.2 5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4

PPM (F1)

5.4

5.2

5.0

4.8

4.6

4.4

4.2

4.0

3.8

3.6

3.4

Figura 50: Mapa de correlação COSY da saponina RP-08.s.2 (ampliação).

- H5

- H3

- H2

Tabela 10: Deslocamentos químicos de hidrogênio e carbono-13 na arabinose. *

Ara 1

Ara 2

5,46 94,4

95,8

93,5

3,78

75,4 2

71,3

2 75,0

3,76 72,5

73,8

70,4

3,82 67,4

67,9

66,3

3,51 / 3,88 64,0

66,0

63,2

Arabinose

* Ara 1 refere-se a uma arabinose terminal esterificada na posição 28 de um triterpeno

oleanólico e

Ara 2 refere-se a uma arabinose glicosilada em C2 esterificada na posição C28

de um triterpeno oleanólico (Tan e col., 1999).

Seqüenciamento

Estando os sinais referentes aos monossacarídeos devidamente atribuídos, os

valores de deslocamento químico de

C foram comparados com valores obtidos na

literatura visando formular uma proposta pertinente para o encadeamento dos resíduos

monossacarídicos, considerando às variações dos deslocamentos químicos observados. Foi

visto que os deslocamentos químicos de carbonos referentes às posições 2 (arabinose) e 4

(ramnose) foram deslocados para valores mais altos, e ainda foi observado também um

deslocamento para valores mais altos da posição 3 (72,2 para 91,2 ppm) e para valores mais

baixos da posição 28 (178,4 para 176,1 ppm) da aglicona; o deslocamento do sinal do

carbono da posição 1 para valores mais baixos indica que este se encontra esterificado.

Esses dados estão de acordo com as regras de deslocamento descritas na introdução desta

dissertação (Introdução 1.5.6.2, pg. 26).

Os diagramas de correlação HMBC e T-ROESY (Figura 51 e 52) foram úteis para a

confirmação do seqüenciamento proposto. A correlação observada no HMBC entre os

sinais 4,38 (H1-ácido glicurônico) e 91,1 ppm indica a presença deste resíduo eterificado na

posição 3 da aglicona. Essa informação foi confirmada com a observação da correlação

existente no experimento T-ROESY entre os sinais 4,38 (H1-ácido glicurônico) e 3,17 ppm

(H3-aglicona). O alto valor do deslocamento químico do H1 (5,46 ppm) do resíduo

arabinose e o baixo valor do deslocamento químico para C1 (94,4 ppm) do mesmo resíduo

indica esterificação desta unidade, na posição 28 da aglicona. A correlação observada no

HMBC entre os sinais 5,06 (H1-ramnose) e 75,4 ppm indicou a ligação da ramnose na

posição 2 da arabinose. No experimento T-ROESY, uma correlação entre os sinais 5,06

(H1-ramnose) e 3,78 ppm confirmou essa indicação. O sinal em 111,7 (C1-apiose)

apresentou uma correlação (no espectro de HMBC) com o sinal em 3,52 ppm indicando a

ligação desse monossacarídeo na posição 4 da ramnose.

PPM (F2) 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4

PPM (F1)

170

160

150

140

130

120

110

100

Figura 51: Mapa de correlação HMBC da saponina RP-08.s.2.

PPM (F2) 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8

PPM (F1)

5.6

5.2

4.8

4.4

4.0

3.6

3.2

2.8

2.4

2.0

1.6

1.2

0.8

Figura 52: Mapa de correlação T-ROESY da saponina RP-08.s.2.

- C2

- C3

Agl.

- H4

- H3

Agl.

- H2

Configurações dos carbonos anoméricos

Os sinais referentes aos hidrogênios dos carbonos anoméricos apresentaram

constante de acoplamento de 7,3 Hz no dupleto em 4,38 ppm, 1,7 Hz no dupleto em 5,33

ppm e 5,4 Hz para o dupleto em 5,46 ppm. O sinal em 5,06 ppm é um simpleto. Os valores

medidos para

(pelo experimento JCH resolvido) para a amostra RP-08.s.1 foram 164,0

Hz para 94,4 ppm, 170,6 Hz para 101,4 ppm, 157,0 Hz para 107,0 ppm, 169,8 Hz para

112,2 ppm e 169,8 Hz para 112,5 ppm. Logo as configurações foram α para os sinais 94,4,

101,4, 112,2 e 112,5 ppm e β para o sinal 107,0 ppm. Para a amostra RP-08.s.2,

comparando os deslocamentos químicos e as constantes de acoplamento no espectro de

hidrogênio, as configurações nos carbonos anoméricos são: α para os sinais 94,4, 101,4 e

111,7 ppm e β para o sinal 107,0 ppm. Assim a estrutura final proposta para RP-08.s.1 foi

3-O-β-D-glucopiranuronosil-hidroxiolean-12,15-dien-28-oato de 28-O-α-D-apiofuranosil

(1→4)-α-L-ramnopiranosil(1→2)-α-L-arabinopiranosila (Figura 53).

Espectrometria de Massas

Esta proposta está de acordo com o espectro de massas obtido (ESI-TOF) que gerou

um íon quasimolecular de m/z 1063 [M + Na]

(Figura 54; Anexo 7). A observação do

fragmento de m/z 931 correspondente a [M + Na

– Api]

e m/z 653 ([M + Na

– Ara – Rha –

Api]

) confirma o seqüenciamento e a estrutura proposta. O fragmento de m/z 437 se refere

a aglicona quando essa perde todos os monossacarídeos. A análise por espectrometria de

massa/massa dos fragmentos do íon precursor de m/z 1063 revelou um fragmento de m/z

887, relativo à perda do ácido glicurônico (terminal na posição 3 da aglicona) e o sinal de

m/z 433, que é referente ao trissacarídeo da posição 28 da aglicona (Anexo 7).

HOOC

Figura 53: Estrutura proposta para RP-08.s.2: 3-O-β-D-glucopiranuronosil-hidroxiolean-

12,15-dien-28-oato de 28-O-α-D-apiofuranosil(1→4)-α-L-ramnopiranosil(1→2)-α-L-

arabinopiranosila.

Figura 54: Proposta de fragmentação resultante de ionização branda para RP-08.s.2.

[M + Na]

: Obs: 1063.5127 Calc. para C

: 1063,50847.

437

653

433

931

997

3.4.3.1.2.a.2 – Monossacarídeos de RP-08.s.1

Na substância RP-08.s.1, 5 sinais de carbonos anoméricos foram identificados em

94,4, 101,4, 107,0, 112,2 e 112,5 ppm no espectro de RMN de

C (Figura 55). Estes foram

correlacionados (segundo o mapa de correlação HSQC) com 5 sinais referentes a

hidrogênios anoméricos, em 5,39, 5,12, 4,38, 5,29 e 5,19 ppm do espectro de RMN de

(Figura 56).

112,5

112,2

107,0

101,5

94,5

91,2

Figura 55: Espectro de RMN-

C (50 MHz) da saponina RP-08.s.1 (ampliação).

PPM 5.60 5.50 5.40 5.30 5.20 5.10 5.00 4.90 4.80 4.70 4.60 4.50 4.40 4.30

5.3

5.28

5.20

5.1

4.38

Figura 56: Espectro de RMN-

H (600 MHz) da saponina RP-08.s.1 (ampliação).

A seguir estão as evidências utilizadas para a identificação da cada unidade de

monossacarídeo separadamente.

112,5

112,2

107,0

101,4

94,4

91,2

5,39

5,29

5,19

5,12

4,38

Resíduo R – No experimento TOCSY foi possível correlacionar de forma bem visível os 5

sinais a partir do sinal da metila em 1,28 ppm (Figura 57). Foram estes: 3,83, 3,62, 3,76 e

3,95 ppm (com τ igual a 100 e 140 ms). O sinal referente ao hidrogênio do carbono

anomérico em 5,12 ppm foi correlacionado com o sinal 3,95 ppm, pelo experimento COSY

(Figura 58). Essa identificação foi confirmada pela análise dos acetatos de alditóis

(Materiais e Métodos 4.8.2 pg. 119).

PPM (F2) 3.94 3.92 3.90 3.88 3.86 3.84 3.82 3.80 3.78 3.76 3.74 3.72 3.70 3.68 3.66 3.64 3.62 3.60 3.58 3.56 3.54 3.52

PPM (F1)

1.38

1.36

1.34

1.32

1.30

1.28

1.26

1.24

1.22

1.20

1.18

1.16

1.14

1.12

Figura 57: Mapa de correlação TOCSY da saponina RP-08.s.1 (ampliação). Correlação a

partir do sinal em 1,28 ppm.

- H4

- H5

- H3

- H2

PPM (F2) 5.2 5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4

PPM (F1)

5.2

5.0

4.8

4.6

4.4

4.2

4.0

3.8

3.6

3.4

3.2

Figura 58: Mapa de correlação COSY da saponina RP-08.s.1 (ampliação). No inserto está

a correlação do sinal em 1,28 ppm com o sinal em 3,83 ppm.

O mapa de correlação HSQC, usado para estabelecer a correlação

, possibilitou

a identificação dos pares

C-

H para todos os sinais. A Tabela 11 mostra os deslocamentos

químicos de hidrogênio e os correspondentes deslocamentos químicos de carbono-13. A

atribuição dos sinais à suas respectivas posições no anel foi auxiliada pelo experimento

COSY, considerando também as multiplicidades esperadas para cada sinal. A unidade

monossacarídica identificada como sendo a ramnose encontra-se dissubstituida em C3 e

C4. Essa dissubstituição pôde ser confirmada pela comparação com valores da literatura

(Tan e col., 1999) também dispostos no Tabela 11.

PPM (F2)

3.850 3.840

PPM (F1)

1.290

1.280

1.270

- H2

Tabela 11: Deslocamentos químicos de hidrogênio e carbono-13 na ramnose.*

ha 1

ha 2

5,12 101,4

100,8

102,3

3,95 72,4

72,2

70,9

3,76 80,7

72,8

82,7

3,62 79,2

74,1

78,7

3,83 69,0

70,1

69,1

1,27 18,5

18,7

19,1

Ramnose

*Rha 1 refere-se a uma ramnose terminal, a Rha 2 refere-se a uma ramnose 3,4

dissubstituída (Tan e col., 1999).

Analisando os sinais de correlação apresentados nos experimentos COSY e

TOCSY, assim como o espectro de RMN de

H, temos que o sinal referente ao H6 (uma

metila) se apresenta como um dupleto (em 1,28 ppm) de constante de acoplamento igual a 6

Hz (Figura 59), o sinal referente ao H5 se apresenta como um multipleto e o sinal referente

à posição 4, um tripleto de constante de acoplamento igual a 8 Hz (Figura 60). As fracas

correlações apresentadas pelos sinais referentes aos H1 – H2 – H3 indicam a posição axial

da hidroxila da posição 2, excluindo a possibilidade dessa unidade monossacarídica ser

uma fucose (6-desoxi-galactose) ou uma quinovose (6-desoxi-glicose). Seguindo a mesma

linha de raciocínio do efeito causado pela glicosilação no carbono diretamente ligado, foi

proposto que há glicosilação nas posições 3 e 4 (80,7 e 79,2 ppm) da ramnose, justificando

tamanhas variações.

PPM 1.90 1.80 1.70 1.60 1.50 1.40 1.30 1.20 1.10 1.00 0.90 0.80 0.70 0.60

515.0

509.1

Figura 59: Espectro de RMN-

H (600 MHz) da saponina RP-08.s.1 (ampliação).

PPM (F2) 3.660 3.650 3.640 3.630 3.620 3.610 3.600 3.590 3.580 3.570 3.560

PPM (F1)

1.320

1.310

1.300

1.290

1.280

1.270

1.260

1.250

1.240

1.230

Dif: 0,02 ppm ~ 8 Hz

Figura 60: Mapa de correlação TOCSY da saponina RP-08.s.1 (ampliação). Correlação

entre os sinais em 1,28 e 3,62 ppm.

Resíduo AG – No experimento TOCSY também foi possível correlacionar os quatro

sinais a partir do sinal em 4,38 ppm (referente a um carbono anomérico; Figuras 61 e 62).

Foram estes: 3,24 ppm, 3,36 ppm, 3,51 ppm e 3,75 ppm (com τ igual a 100 e 140 ms). A

Tabela 12 mostra os valores de deslocamento químico de hidrogênio e carbono-13 para o

resíduo AG.

6 Hz

Dif.: 0,02 ppm ~8 Hz

PPM (F2) 3.80 3.76 3.72 3.68 3.64 3.60 3.56 3.52 3.48 3.44 3.40 3.36 3.32 3.28 3.24 3.20

PPM (F1)

4.48

4.46

4.44

4.42

4.40

4.38

4.36

4.34

4.32

4.30

4.28

Figura 61: Mapa de correlação TOCSY da saponina RP-08.s.1 (ampliação). Correlação a

partir do sinal em 4,38 ppm.

PPM (F2) 5.2 5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4

PPM (F1)

5.2

5.0

4.8

4.6

4.4

4.2

4.0

3.8

3.6

3.4

3.2

Figura 62: Mapa de correlação COSY da saponina RP-08.s.1 (ampliação).

- H2

- H4

- H3

- H5

- H2

Tabela 12: Deslocamentos químicos de hidrogênio e carbono-13 no ácido glicurônico.*

Glc

GlcA

4,38 107,0

103,7

107,1

3,24 75,3

76,3

75,4

3,37 77,7

78,8

78,0

3,51 73,2

72,5

73,4

3,76 75,4

77,8

77,7

-- 176,0

63,3

173,3

Ácido Glicurônico

*Glc refere-se a uma glicose e GlcA refere-se a um ácido glicurônico (Tan e col., 1999).

A partir da análise dos sinais de correlação apresentados nos experimentos COSY,

TOCSY e espectro de RMN de

H, temos que os sinais em 3,24 (H2) e 3,37 ppm (H3) se

apresentam como dois tripletos de constantes de acoplamento igual a 8 e 9 Hz (Figura 63),

indicando a orientação equatorial para as hidroxilas das posições 1, 2, 3 e 4. Este fato

sugere fortemente a uma configuração gluco (Ma e col., 1996). Como já mencionado para

RP-08.s.2, a quinovose e a xilose foram excluídas novamente em função da ausência de

uma outra metila (dupleto) de monossacarídeo e pela ausência tanto do pentaacetato de

quinovositol quanto do pentaacetato de xilitol entre os alditóis acetilados.

Os valores de deslocamento químico dos carbonos do interior do anel estão

próximos aos valores registrados para ácido glicurônico terminal e glicose terminal (Tan e

col., 1999). Nos espectros de carbono-13 em metanol não são observadas as presenças de

duas carbonilas. O espectro de carbono-13 obtido para a amostra RP-08.s.1 metilada com

diazometano, apresentou dois sinais referentes a carbonila. Estes sinais só foram

observados após a reação de metilação. Desse modo, essa unidade presente na posição 3 da

aglicona foi caracterizada como sendo o ácido glicurônico (ver item 2.4.2.1.2.b). Não foi

observado um sinal referente ao ácido glicurônico na análise dos acetatos de alditóis, pois

essa análise é indicada para monossacarídeos neutros.

HOOC

PPM 4.00 3.96 3.92 3.88 3.84 3.80 3.76 3.72 3.68 3.64 3.60 3.56 3.52 3.48 3.44 3.40 3.36 3.32 3.28 3.24 3.20 3.16

1360.0

1351.0

1342.1

1309.6

1301.3

1292.8

Figura 63: Espectro de RMN-

H (600 MHz) da saponina RP-08.s.1 (ampliação).

Resíduo Ap – Tanto no experimento COSY quanto no TOCSY, o sinal de hidrogênio

referente ao carbono anomérico em 5,19 ppm, está correlacionado apenas com um sinal em

4,04 ppm (Figura 64; Tabela 13). O mapa de correlação HMBC possibilitou a identificação

de correlações do sinal em 5,19 ppm com o sinal em 80,3 ppm (carbono quaternário;

informação obtida do espectro DEPT) e do sinal em 4,04 ppm com os em 74,9 e 65,3 ppm

(metilenos; informação também obtida do espectro DEPT; Figura 65). Assim, juntamente

com comparações feitas com dados de referência obtidos na literatura, essa unidade foi

identificada como sendo uma apiose. Essa identificação foi confirmada pela análise dos

acetatos de alditóis (ver item 2.4.2.1.2.b).

9 Hz

8Hz

PPM (F2) 5.30 5.20 5.10 5.00 4.90 4.80 4.70 4.60 4.50 4.40 4.30 4.20 4.10 4.00 3.90 3.80

PPM (F1)

5.40

5.30

5.20

5.10

5.00

4.90

4.80

4.70

4.60

4.50

4.40

4.30

4.20

4.10

4.00

3.90

3.80

3.70

Figura 64: Mapa de correlação COSY da saponina RP-08.s.1 (ampliação).

75.2

75.1

65.5

65.4

65.0

Figura 65: Espectro de DEPT da saponina RP-08.s.1 (ampliação).

75,2

74,9

65,5

65,3

64,9

- H2

Tabela 13: Deslocamentos químicos de hidrogênio e carbono-13 na apiose

5,19 112,5

4,04 79,2

-- 80,3

3,76 / 4,05 74,9

3,59 65,3

Apiose

As correlações observadas estão de acordo com a estrutura proposta para a apiose.

Os sinais 5,19 (H1) e 4,04 ppm (H2) se apresentam como um dupleto (1,7 Hz; Figura 66).

Os sinais referentes aos hidrogênios dos carbonos metilênicos são diastereotópicos, mas

apenas os referentes à posição 4 tem maior não equivalência de deslocamento químico,

mostrando dois dupletos em 3,76 e 4,05 ppm.

PPM 5.64 5.60 5.56 5.52 5.48 5.44 5.40 5.36 5.32 5.28 5.24 5.20 5.16 5.12 5.08

5.1998

Figura 66: Espectro de RMN de

H (600 MHz) da saponina RP-08.s.1 (ampliação).

Resíduo A – No experimento TOCSY o sinal de hidrogênio referente a carbono anomérico

em 5,39 ppm está correlacionado com um sinal em 3,80 ppm (também presente no

experimento COSY) e um em 3,85 ppm (Figura 67 e 68). No HMBC as correlações entre

sinal em 5,39 ppm e os sinais em 64,9 e 72,5 ppm (Figura 69) indicam as correlações do

tipo entre o hidrogênio em 1 e o carbono em 3 e entre hidrogênio 1 e carbono 5, sendo o

5,19

carbono 5 um metileno. Pelo mapa de correlação HSQC o carbono em 72,5 ppm é referente

ao hidrogênio em 3,51 ppm.

PPM (F2) 4.04 4.02 4.00 3.98 3.96 3.94 3.92 3.90 3.88 3.86 3.84 3.82 3.80

PPM (F1)

5.42

5.40

5.38

5.36

5.34

5.32

5.30

5.28

5.26

5.24

5.22

5.20

5.18

5.16

5.14

5.12

5.10

5.08

5.06

5.04

5.02

Figura 67: Mapa de correlação TOCSY da saponina RP-08.s.1 (ampliação).

PPM (F2) 5.30 5.20 5.10 5.00 4.90 4.80 4.70 4.60 4.50 4.40 4.30 4.20 4.10 4.00 3.90 3.80

PPM (F1)

5.40

5.30

5.20

5.10

5.00

4.90

4.80

4.70

4.60

4.50

4.40

4.30

4.20

4.10

4.00

3.90

3.80

3.70

Figura 68: Mapa de correlação COSY da saponina RP-08.s.1 (ampliação).

Considerando a semelhança apresentada pelos espectros de RMN de

C e a

probabilidade biossintética da inclusão seqüencial de resíduos de monossacarídeos na

posição 28 (Introdução 1.5.2, pg. 15), é possível esperar que a única diferença entre as duas

saponinas isoladas seja a ausência de uma unidade monossacarídica terminal (em RP-

- H5

- H2

08.s.2). De acordo com a análise dos acetatos de alditol, a unidade monossacarídica ausente

na substância RP-08.s.2 é o monossacarídeo referente ao carbono anomérico 112,2 ppm

(5,29 ppm). Assim, o sinal em 5,39 ppm que está correlacionado diretamente (HSQC) com

o sinal em 94,4 ppm é referente ao mesmo monossacarídeo presente em RP-08.s.2 também

em 94,4 ppm. Como os sinais referentes a apiose já estão atribuídos, a única possibilidade

do sinal de hidrogênio referente ao carbono anomérico apresentar uma correlação do tipo

com um carbono metilênico, é que este monossacarídeo seja a arabinose. Assim,

juntamente com comparações feitas com dados de referência obtidos na literatura, essa

unidade foi identificada (Tabela 14). A análise dos acetatos de alditóis confirmou a

presença de uma arabinose por coinjeção de padrão (Materiais e Métodos 4.8.2, pg. 119).

PPM (F2) 5.40 5.36 5.32 5.28 5.24 5.20 5.16 5.12 5.08 5.04 5.00 4.96 4.92 4.88 4.84

PPM (F1)

81.0

80.0

79.0

78.0

77.0

76.0

75.0

74.0

73.0

72.0

71.0

70.0

69.0

68.0

67.0

66.0

65.0

64.0

Figura 69: Mapa de correlação HMBC da saponina RP-08.s.1 (ampliação).

- C5

Tabela 14: Deslocamentos químicos de hidrogênio e carbono-13 na arabinose.*

Ara 1

Ara 2

5,39 94,4

95,8

93,5

3,80 75,4

71,3

75,0

3,51 72,5

73,8

70,4

3,81 68,1

67,9

66,3

3,56 / 3,86 64,9

66,0

63,2

Arabinose

* Ara 1 refere-se a uma arabinose terminal esterificada na posição 28 de um triterpeno

oleanólico se e

Ara 2 refere-se a uma arabinose glicosilada em 2 esterificada na posição 28

de um triterpeno oleanólico (Tan e col., 1999).

Resíduo Ap’ – Pelos mapas de correlação COSY e TOCSY, a única correlação

visível com o sinal de hidrogênio referente ao carbono anomérico em 5,29 ppm foi com o

sinal 3,95 ppm (Tabela 15; Figura 70). Pelos altos valores dos deslocamentos químicos

tanto de RMN de

H e

C (5,29 / 112,2 ppm e 3,95 / 78,2 ppm), conclui-se que essa

unidade se trata de um anel furanosídico. Sabendo que nos espectros de HSQC e DEPT

foram contados 5 carbonos metilênicos e a atribuição dos outros quatro monossacarídeos

utilizou apenas 3 deles, conclui-se também que este último monossacarídeo deve conter 2

carbonos metilênicos. Foi observada também a presença de um sinal referente a um

carbono quaternário em 80,4 ppm (informação obtida pelo experimento DEPT).

A partir desses dados a proposta estrutural seria dada com a presença de duas

unidades de apiose ligadas nas posições 4 (resíduo Ap) e 3. Entretanto, comparando os

resultados das duas amostras (RP-08.s.1 e RP-08.s.2) na análise dos acetatos de alditóis

observou-se que os sinais referentes a apiose geram apenas uma unidade em cada amostra e

o sinal em 25,45 minutos (RP-08.s.1) não esta presente na análise da amostra RP-08.s.2.

Outras evidências para a presença de duas unidades de apiose foram verificadas a

partir de dados da análise dos acetatos de alditóis obtidos por hidrólise ácida de RP-o8.s.1

(ver item 3.4.2.1.2.b, pg. 100).

Tabela 15: Deslocamentos químicos de hidrogênio e carbono-13 na apiose Ap’.

Ap’

5,29 112,2

3,95 78,2

-- 80,4

3,77 / 4,05 75,2

3,56 65,5

Apiose

PPM (F2) 5.30 5.20 5.10 5.00 4.90 4.80 4.70 4.60 4.50 4.40 4.30 4.20 4.10 4.00 3.90 3.80

PPM (F1)

5.40

5.30

5.20

5.10

5.00

4.90

4.80

4.70

4.60

4.50

4.40

4.30

4.20

4.10

4.00

3.90

3.80

3.70

Figura 70: Mapa de correlação COSY da saponina RP-08.s.1 (ampliação).

Seqüenciamento

Da mesma forma que o seqüenciamento foi inicialmente proposto em RP-08.s.2, os

valores de deslocamento químico de

C foram comparados com valores obtidos na

literatura para formular uma proposta de encadeamento dos resíduos monossacarídicos. Foi

visto que os deslocamentos químicos de carbonos referentes às posições 2 (arabinose), 3 e 4

(ramnose) foram deslocados para valores mais altos (valores de deslocamentos químicos

maiores) e, novamente, foi observado um deslocamento para valores mais altos da posição

3 (72,2 a 91,1 ppm) e para valores mais baixos da posição 28 (178,4 a 176,1 ppm) da

aglicona.

Os diagramas de correlação HMBC e T-ROESY (Figura 71 e 72), novamente,

foram úteis para a confirmação do seqüenciamento proposto. Foi observado no experimento

Ap’

- H2

Ap’

HMBC uma correlação entre os sinais 5,39 e 176,1 ppm, confirmando a posição

esterificada de C1 da arabinose em C28 da aglicona.

A correlação observada no HMBC entre os sinais 4,38 (H1-ácido glicurônico) e

91,2 ppm indica a presença deste resíduo eterificado na posição 3 da aglicona. Essa

informação foi confirmada com a observação da correlação existente no experimento T-

ROESY entre os sinais 4,38 (H1- ácido glicurônico) e 3,17 ppm (H3-aglicona). A

correlação observada no HMBC entre os sinais 5,12 (H1-ramnose) e 75,4 ppm indicou a

ligação da ramnose na posição C2 da arabinose. No experimento T-ROESY, uma

correlação dos sinais 5,12 (H1-ramnose) e 3,80 ppm confirmou essa indicação. Os sinais

em 112,2 (C1-apiose) e 112,5 ppm (C1-apiose Ap’) apresentam correlações (no espectro de

HMBC) com os sinais em 3,62 e 3,76 ppm indicando a ligação de ambos os

monossacarídeos nas posições 3 e 4 da ramnose, respectivamente.

PPM (F2) 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8

PPM (F1)

170

160

150

140

130

120

110

100

Figura 71: Mapa de correlação HMBC da saponina RP-08.s.1 (ampliação).

Ap’

- H3

- H4

- C2

- C3

Agl.

- C28

Agl.

Figura 72: Mapa de correlação ROESY da saponina RP-08.s.1 (ampliação).

Configurações nos carbonos anoméricos

Os sinais referentes aos hidrogênios dos átomos de carbonos anoméricos

apresentaram constante de acoplamento de 7,3 Hz no dupleto em 4,38 ppm, 1,7 Hz nos

dupletos em 5,19 e 5,29 ppm e 4,3 Hz para o dupleto em 5,39 ppm. O sinal em 5,12 ppm é

um simpleto. Como já mencionado anteriormente, os valores observados para

(pelo

experimento JCH resolvido) realizado com a amostra RP-08.s.1 foram 164,0 Hz para 94,4

ppm, 170,6 Hz para 101,4 ppm, 157,0 Hz para 107,0 ppm, 169,8 Hz para 112,2 ppm e

169,8 Hz para 112,5 ppm. Logo as configurações foram α para os sinais 94,4, 101,4, 112,2

e 112,5 ppm e β para o sinal 107,0 ppm. Assim a estrutura proposta para RP-08.s.1 foi 3-O-

β-D-glucopiranuronosil-hidroxiolean-12,15-dien-28-oato de 28-O-α-D-apiofuranosil(1→3)

-[α-D-arabinopiranosil(1→4)]-α-L-ramnopiranosil(1→2)-α-L-arabinopiranosila (Figura

73). Essa proposta está de acordo com a análise realizada com TOF-MSMS que gerou um

íon molecular em m/z 1195,5896 [M + Na]

- H3

Agl.

- H2

HOOC

Figura 73: Estrutura proposta para RP-08.s.1: 3-O-β-D-glucopiranuronosil-hidroxiolean-

12,15-dien-28-oato de 28-O-α-D-apiofuranosil(1→3)-[α-D-apiofuranosil (1→4)] -α-L-

ramnopiranosil(1→2)-α-L-arabinopiranosila.

Espectrometria de Massas

Esta proposta está de acordo com a análise realizada com TOF-MSMS que gerou

um íon quasimolecular em m/z 1195 [M + Na]

(132 unidades da massa a mais do que a

RP-08.s.2; Figura 74; Anexo 7). A observação dos fragmentos de m/z 931 ([M + Na

–

Api]

) e m/z 653 ([M + Na

– Api – Rha – Ara]

) confirmam o seqüenciamento e a estrutura

proposta. Novamente, o fragmento de m/z 437 se refere a aglicona quando essa perde todos

os monossacarídeos, confirmando a presença da mesma aglicona. A análise por

espectrometria de massa/massa dos fragmentos do íon precursor em m/z 1195 revelou um

fragmento de m/z 1019, relativo à perda do ácido glicurônico (terminal na posição 3 da

aglicona) e o sinal em m/z 565, que é referente ao trissacarídeo da posição 28 da aglicona

(Anexo 7).

100

Figura 74: Proposta de fragmentação resultante de ionização branda para RP-08.s.1.

[M + Na]

: Obs: 1195,5896. Calc. para C

: 1195,55067.

437

653

433

1019

101

3.4.3.1.2.b – Análise dos Acetatos de Alditóis de RP-08.s.1 e RP-08.s.2

Devido à complexidade apresentada pelos espectros de RMN mesmo quando

utilizado um aparelho de 600 MHz, foram realizadas também reações de hidrólise para a

obtenção dos monossacarídeos livres a serem analisados como acetatos de alditol por CG-

EM. A exaustiva análise dos dados dos espectros de RMN em conjunto com informações

obtidas da análise de acetatos de alditóis, possibilitou proposições estruturais completas

para RP-08.s.1 e RP-08.s.2.

As reações de hidrólise ácida foram realizadas com a assistência de micro-ondas por

2 minutos. Em todas as publicações consultadas as reações de hidrólise ácida foram

realizadas em tempos de pelo menos 2 horas a 100 ºC; foi descrita a realização de uma

reação de hidrólise ácida com 2 % de HCl em metanol por 8 dias a 37 ºC (Kesselmeier e

Budzikiewicz, 1979; citado por Hostettmann e Marston, 1995). A elevação brusca da

temperatura e a elevada taxa de movimentação molecular dentro do tubo de reação foram

fatores determinantes para a rápida obtenção dos produtos. É proposto que a aceleração de

reações causada pelas radiações de micro-ondas pode ser resultante tanto do efeito térmico

devido a interações radiação-matéria gerando uma rápida e homogênea elevação da

temperatura, quanto por efeitos térmicos não específicos (Loupy e col., 2004; Sanseverino,

2002).

As análises dos monossacarídeos liberados pelas reações de hidrólise foram

realizadas, primeiramente, após a obtenção dos derivados trimetilsililados com N-

(trimetilsilil)imidazol. Essa derivação foi realizada simplesmente adicionando o reagente de

trimetilsililação à mistura de monossacarídeos liofilizadas obtida da reação de hidrólise. O

cromatograma obtido dos derivados trimetilsililados dos monossacarídeos liberados pelas

reações de hidrólise apresentou um perfil bastante complexo. Entretanto, um teste realizado

com uma mistura de padrões de monossacarídeos (Glc, Gal, Man, Rha, Fuc, Xyl, Rib e

Ara) resultou em um cromatograma simples (Anexo 5), com um sinal para cada unidade de

monossacarídeo. Vale lembrar que essa mistura de padrões não foi sujeita às condições de

hidrólise.

A observação dos cromatogramas complexos apresentados pela análise de derivados

trimetilsililados, após hidrólise, possibilitou concluir que as reações de hidrólise estivessem

102

causando a abertura parcial dos anéis (piranosídicos ou furanosídicos). Daí surgiu a idéia de

seguir com a análise dos acetatos de alditol, já que nessa metodologia é feita uma prévia

redução dos monossacarídeos a seus respectivos alditóis (abertura dos anéis). O teste

realizado com os padrões de monossacarídeos sujeito às condições reacionais de hidrólise e

posteriores redução e acetilação produziram um cromatograma de massas simples e

passível de ser analisado. E os espectros de massas gerados em cada fragmento, juntamente

com a co-injeção de alguns dos padrões separadamente, confirmaram a identificação de

cada um dos monossacarídeos (Anexo 6).

Os espectros referentes aos 6-desoxiexoses apresentaram um fragmento de m/z 303

seguido de m/z 289 (-14) e o fragmento base de m/z 170. Os espectros das pentoses

apresentaram um fragmento de maior massa em m/z 289, a Ara e a Xyl, e m/z 217, a Rib, e

o fragmento base de m/z 115. Já os espectros das hexoses apresentaram um fragmento de

maior massa em m/z 361 seguido de um em m/z 289 e o fragmento base de m/z 115

(Esquema 10).

OC(O)CH

CHO(O)CH

145 103

217 157 115

289 187 127

etc...

Esquema 10: Esquema de fragmentação de acetatos de alditol (Kitson e col., 1996).

Estando estabelecido que a técnica de análise de acetatos de alditóis funciona de

maneira mais eficiente produzindo resultados mais evidentes, seguiu-se com a análise dos

monossacarídeos liberados na hidrólise ácida. O cromatograma gerado pela análise dos

monossacarídeos liberados na hidrólise ácida da fração RP-08.s.1 apresentou 5 sinais, dos

quais dois foram identificados através de co-injeção com os padrões utilizados e também

por dedução, usando como base os espectros de massas e os tempos de retenção. Desse

modo foi possível identificar uma arabinose e uma ramnose, nos tempos de retenção 25,9 e

26,3 minutos (Materiais e Métodos 4.8.2, pg. 119). As áreas aos sinais no cromatograma

103

obtido indicam que, possivelmente, os sinais em 25,45, 26,89 e 32,03 minutos são relativos

a dois monossacarídeos idênticos, quando comparado com as áreas dos sinais referentes a

ramnose e a arabinose (Tabela 16). Sendo assim, a análise dos acetatos de alditóis da

amostra RP-08.s.1 revelou a presença de quatro unidades de monossacarídeos neutros.

Tabela 16: Dados de áreas relativas dos sinais do cromatograma dos acetatos de alditóis da

amostra RP-08.s.1.

Tempo de retenção (min) Area Correção da massa

25,45

3245269 16390,24747

25,90

2359142 7970,07432

26,36

3497959 12404,10993

26,89

1533468 5437,82978

32,03

532411 2218,37916

Segundo Harris (1992), a acetilação da apiose pode ocorrer de forma incompleta

levando à formação de pentaacetato e tetraacetato de apiitol, e os sinais correspondentes

aparecendo separados no cromatograma de massas. A análise dos acetatos de alditóis

obtidos de apiina (Figura 75), isolada de Petroselinum crispum (Apiaceae), um flavonóide

constituído de uma glicose e uma apiose (Chaves, 2006), resultou em um cromatograma

com três sinais, sendo o relativo à glicose bem mais intenso (Figura 76). O tempo de

retenção do primeiro sinal se assemelha ao primeiro sinal gerado pela análise dos acetatos

de alditóis da amostra RP-08.s.1 (Anexo 8), o que nos leva a crer que esse sinal pode ser

também advindo da apiose. Estes resultados sugeriram que nas condições utilizadas para a

acetilação está havendo a formação de três acetatos de apiitol, penta, tetra e triacetato, que

eluem nos tempos de retenção 25,45, 26,89 e 32,03 minutos.

104

OOH

Figura 75:Estrutura da apiina.

Figura 76: Cromatograma obtido no CG-EM dos monossacarídeos presentes na apiina

reduzidos e acetilados.

A presença do ácido glicurônico não pôde ser determinada pelo método de análise

de acetatos de aditóis. A análise de acetatos de alditóis é direcionada para a a análise de

monossacarídeos neutros (Chaplin e Kennedy, 1994). Um teste foi realizado um teste com

D-Apif-β-D-Glcp-O

105

uma amostra padrão de ácido glicurônico na mesma condição reacional utilizada para

obtenção dos acetatos de alditóis, e como resultado foi observado a degradação de todo o

padrão utilizado na etapa de acetilação.

O cromatograma dos acetatos de alditóis produzidos na hidrólise ácida, redução e

acetilação da fração RP-08.s.2 apresentou 4 sinais (Anexo 8). Foi possível identificar,

novamente, uma arabinose e uma ramnose, nos tempos de retenção 25,5 e 26,0 minutos

(Materiais e Métodos 4.8.2, pg. 119). Os sinais em 26,5 e 31,6 minutos foram relacionados

a formação dos pentaacetato e tetraacetato de apiitol. Conclusão essa sustentada também no

fato de que a soma de suas áreas indicarem a presença de um monossacarídeo, quando

comparado com as áreas dos sinais referentes à ramnose e à arabinose (Tabela 17).

Tabela 17: Dados de áreas relativas dos sinais do cromatograma dos acetatos de alditóis da

amostra RP-08.s.2.

Tempo de retenção (min) Area Correção da massa

25,5

27185852 91844,09459

26,0

29875534 105941,60990

26,5

15336848 54385,98581

31,6

4965957 20691,48750

106

4 – Materiais e Métodos

4.1 – Materiais.

4.1.1 – Fases Estacionárias utilizadas para Cromatografia

- gel de sílica 60 (230-400 mesh ASTM) MERCK

- gel de sílica 60 (70-230 mesh ASTM) MERCK

- gel de sílica 60 G (para CCD) MERCK

gel de sílica funcionalizada com grupos octadecilsilano ALDRICH CHEM.

COMPANY

- Dowex

50W-X8 MERCK

(resina trocadora de cátion).

4.1.2 – Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

- placa (de alumínio) de gel de sílica AL 60 F

254

20 x 20 cm MERCK

- placa (de vidro) de gel de sílica RP18 F

254S

5 x 10 cm MERCK

4.1.3 – Solventes

- para cromatografia

Solventes em grau para análise (p.a.) nas cromatografias em camada delgada

e coluna e em grau espectroscópico para análise por cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE). As misturas de solventes foram feitas sempre volume a volume

(v/v).

- para RMN

Solventes deuterados (metanol, clorofórmio, piridina e água).

- para CG-EM

Solventes em grau para análise (p.a.).

4.1.4. – Reagentes

- para preparação dos meios reacionais foram utilizados reagentes em grau para

análise e para meio aquoso empregou-se água desmineralizada.

- para a análise das CCD foram utilizados os seguintes reagentes cromogênicos

(Jork, 1990; Randerath, 1968):

Sulfato cérico a 2% em ácido sulfúrico 2 N.

107

Anisaldeído sulfúrico – 0,5 mL de anisaldeído em 10 mL de ácido acético

glacial. Adicionar 85 mL de metanol e 5ml de ácido sulfúrico concentrado, aquecer

a 100

C/5 min.

Draggendorff – solução A: 16 g de iodeto de potássio dissolvido em 40ml de

água; solução B: 1,7 g de nitrato de bismuto e 20 g de ácido tartárico dissolvido em

80 mL de água. Misturar 1:1 das soluções A e B. Para o reagente em spray:

adicionar 5 mL da solução estoque a 10 g de ácido tartárico em 50 mL de água.

Orcinol Sulfúrico – 2 g do sal misturados a 100 mL de uma solução de

a 20% em etanol.

Reagente de Lieberman-Bouchard – à uma alíquota da amostra seca

solubilizada em clorofórmio é adicionado um mililitro de anidrido acético e três

gotas de ácido sulfúrico concentrado.

NP (“natural products”) – dissolver 1 g de éster etílico do ácido 2-

aminodifenilbórico em 100 mL de metanol para borrifar sobre a placa de CCD.

- para as reações de derivação foram realizadas utilizando os reagentes:

Hidreto de Boro e Sódio (NaBH

), em grau para análise VETEC

Ácido acético glacial VETEC

Piridina VETEC

seca e destilada

Anidrido acético REAGEN

destilado.

N-(trimetilsilil)imidazol (C

Si), em grau para análise ACROS

ORGANICS

- preparação da solução de monossacarídeos padrão:

Uma mistura de 1 mg de cada um dos padrões de monossacarídeos (Glicose,

Galactose, Manose, Fucose, Ramnose, Ribose, Xilose e Arabinose) foi retirado uma

alíquota de 1 mg para a realização das análises.

108

4.2 – Equipamentos

4.2.1 – Cromatógrafos

- para CLAE modo analítico foi utilizado cromatógrafo com sistema injetor com

“loop” de 20 µl, uma bomba SHIMADZU

modelo LC-10AD, um detector de feixe de

diodos (D.A.D.) SHIMADZU

modelo SPD-M10A VP e um sistema de controle

SHIMADZU

modelo SCL-10A VP. O modo Spectrum Max Plot é um cromatograma

onde cada ponto é lanchado no seu valor máximo de absorbância. Este gera uma indicação

da aparência do cromatograma quando o comprimento de onda é otimizado para cada sinal

presente.

- para CLAE modo semipreperativo foi utilizado cromatógrafo com sistema injetor

com “loop” de 100 µl, duas bombas SHIMADZU

modelo LC-10AS , um detector ultra-

violeta SHIMADZU

modelo SPD-10A e um integrador Chromatopac SHIMADZU

modelo C-R6A.

- para cromatografia de permeação em gel (CPG) foi utilizado um cromatógrafo

dotado de uma bomba WATERS

modelo 510 e um detector de índice de refração

diferencial WATERS

modelo 410.

4.2.2 – Espectrômetros / Espectrofotômetros

- para infravermelho (IV) NICOLET MAGNA modelo I.R. 760 em disco de KBr

anidro (pastilha comprimida).

- para RMN foram utilizados os espectrômetros Varian Gemini 200, Bruker DRX

400 e Bruker DRX 600. Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por

milhão (ppm) e as constantes de acoplamento em Hertz (Hz). As áreas relativas dos sinais

foram obtidas por integração eletrônica e a multiplicidade destes descrita como: simpleto

(s), dupleto (d), tripleto (t), multipleto (m) e dupleto duplo (dd). Os experimentos DEPT (1-

D), HSQCeditado, HMBC, COSY, TOCSY e T-ROESY foram realizados usando-se o

software de aquisição pertencentes aos sistemas utilizados. A calibração dos espectros foi

feita com o sinal do TMS (preferencialmente) ou com o sinal do solvente utilizado. A

Tabela 18 mostra as condições gerais utilizadas para a obtenção dos espectros de RMN. Os

processamentos dos espectros foram realizados utilizando-se os software SpinWorks 2.5.4

e MestReC.

109

Tabela 18: Condições gerais para obtenção dos experimentos de RMN.

Experimentos

Mixing Time

(ms)

Tempo de contato

(ms)

Const. de acoplamento

HSQCeditado

- - 145

HMBC

- - 7 e 2

TOCSY

- 70 e 140 -

T-ROESY

300 - -

- para CG-EM foi utilizado um cromatógrafo a gás acoplado a espectrômetro de

massas (CG-EM) SHIMADZU

modelo GCMS-QP5000 equipado com coluna

PHENOMENEX

ZEBRON

ZB-5 ms (30 m, 25 mm DI, com filme de 0,25 µm de

espessura; 5% fenilmetilsilicone).

- para MSMS, foi utilizado um espectrômetro Micromass q-TOF, com ionização por

“eletrospray” no modo positivo. Nos experimentos MS/MS a seleção da massa a ser

analisada foi realizada no quadrupolo e o gás de colisão foi o hélio. A análise dos

fragmentos do íon precursor nestas condições foi realizada no TOF com resolução de 5000.

- para medidas no ultravioleta (UV) foi utilizado um espectrofotômetro

SHIMADZU

modelo

U.V.-1601 com cubetas de quartzo com caminho ótico de 1 cm QS

HELLMA

4.2.3 – Outros

- colunas utilizadas para cromatografias:

Colunas para cromatografia “flash” de 20 x 300 mm e 50 x 300 mm,

empacotadas com aproximadamente 10 g e 25 g da fase estacionária (gel de sílica

60 (230-400 mesh ASTM) – MERCK

), respectivamente como descrito por Still

em 1978.

Coluna aberta de 1 x 20 cm, com vidro sinterizado acima da torneira para

cromatografia líquida à vácuo (CLV) com cerca de 15 g de fase estacionária (gel de

sílica 60 G para CCD).

Coluna segundo Michel & Miller com aproximadamente 30 g da fase

estacionária (gel de sílica funcionalizada com grupos octadecil-silano – ALDRICH

CHEM. COMPANY

110

Coluna Symmetry Shield

(RP-18, 5 µm), de 4,6 x 250 mm WATERS

para CLAE no modo analítico e coluna µ-Bondapak

(RP-18), de 7,8 x 300 mm

WATERS

para CLAE no modo semipreparativo.

Coluna WATERS STYRAGEL

modelo HT 6E de 7,8 x 300 mm para CPG.

- bombas de vácuo e compressor utilizados nas cromatografias sob vácuo, “flash” e

média pressão:

Compressor (freqüência 50/80 Hz) INALAMAX

Compressor e Bomba de vácuo Millipore

Bomba peristáltica de média pressão BIO-RAD

modelo EP-1 Econo pump.

- aparelho gerador de ultra-som de baixa freqüência THORNTON

(T-14).

- coletor de fracionamento BIO-RAD

modelo nº 2110.

- liofilizador LABCONCO

- evaporador rotatório PEMEM

juntamente com uma bomba de vácuo COLE

PARMER INSTRUMENT COMPANY modelo 7049-50 e um banho FISATOM

modelo

550 (1200 W 230 V).

- microondas PANASONIC

modelo NN7809 BH (freqüência de microondas –

2450 MHz).

- tubo de reação sob pressão ACE GLASS CORPORATION (15 x 1 cm).

4.3 – Métodos e Técnicas

- a obtenção dos extratos brutos foi realizada com o auxílio do aparelho de ultra-

som e com o extrator de Soxhlet.

- as partições foram realizadas em funis de separação sendo utilizados volumes

iguais dos diferentes solventes em cada partição, sendo o método repetido três vezes para

cada solvente particionado.

- as reações de derivatização foram realizadas utilizando os reagentes:

Hidreto de Boro e Sódio (NaBH

)

Ácido acético glacial

Piridina seca e destilada

Anidrido acético destilado

N-(trimetilsilil)imidazol

111

4.3 – Obtenção do material botânico

As raízes de Chiococca alba L. Hitch foram coletadas no município de Nova

Friburgo, no Estado do Rio de Janeiro. A identificação botânica foi realizada pelo Dr.

Sebastião Neto do Jardim Botânico do Rio de Janeiro. A exsicata encontra-se depositada no

Herbário do Jardim Botânico do Rio de Janeiro sob o número de registro RB395399.

4.5 – Obtenção dos extratos brutos

As raízes secas de C. alba (410 g), foram trituradas em moinho de navalhas e

submetidas inicialmente à extração com hexano (E.H.b.) e, posteriormente, com

diclorometano (E.dCl.b.) e etanol (E.E.b.), com auxílio do aparelho de ultra-som à

temperatura ambiente (Esquema 11). Foram deixados em contato o material botânico e

cada um dos solventes durante três ciclos de quinze minutos cada. A filtração dos extratos

foi acompanhada por rápidas lavagens com os respectivos solventes de extração (200 mL).

Os extratos assim obtidos foram concentrados à secura sob pressão reduzida, sendo

anotados seus rendimentos (0,6 % para o E.H.b., 0,3 % para o E.dCl.b. e 6,0 % para o

E.E.b. em relação ao material botânico).

Por motivos de comparação, foram realizadas extrações consecutivas com o extrator

de Soxhlet. Foram utilizadas quantidades comparáveis de planta para cada extração. As

extrações com o extrator de Soxhlet foram realizadas apenas com etanol, para a obtenção

de um extrato bruto a ser posteriormente particionado a fim de se obter os extratos de

polaridades distintas. Já as extrações auxiliadas pelo ultra-som foram realizadas

diretamente com os solventes de polaridades distintas.

Cada um dos três extratos (E.H.b., E.dCl.b. e E.E.b.) foi fracionado de maneira

diferenciada e específica, de acordo com seus diferentes comportamentos, frente aos

variados reagentes cromogênicos em CCD, como orcinol sulfúrico, Draggendorff,

anisaldeído sulfúrico e sulfato cérico. O fracionamento foi devidamente monitorado por

cromatografia em camada delgada para avaliação da pureza e do perfil apresentado por

cada fração.

112

Esquema 11: Esquema mostrando o procedimento de extração realizado com auxílio do

ultra-som.

4.6 – Fracionamento dos extratos brutos

2,5 g do extrato bruto em hexano (E.H.b.) foram ressuspendidos em metanol (10

mL) dando origem a um precipitado branco-amarelado (Ppt. 1; 1,7 g), lavado em seguida

com acetona (3 x 10 mL). A análise desse precipitado foi realizada por RMN (

H e

C),

cromatografia de permeação em gel (CPG) e espectrofotometria no I.V. O mesmo

procedimento descrito acima foi realizado com o extrato bruto em diclorometano obtendo-

se o mesmo precipitado Ppt.1 (0,8 g).

Ppt1: aspecto amorfo branco-amarelado; RMN de

H (200 MHz, TMS δ = 0,

CDCl

) δ (ppm): 1,65 (s, CH

); 2,05 (sl, CH

); 5,10 (tl, CH); RMN de

C (50 MHz, TMS δ

= 0, CDCl

) δ (ppm): 23,31 (CH

); 26,28 (CH

); 32,0 (CH

); 124,9 (CH); 135,0 (Cq); I.V.

KBr

: número de onda (cm

-1

): 837 (m); 1376 (i); 1449 (i); 1664 (f); 2726 (f); 2853 (i); 2917

(i); 2961 (i); 3036 (f). Permeação em gel: peso molecular médio igual a 57509 unidades

(baseado na curva padrão realizada com poliestireno).

4.6.1 – Extrato hexânico

O extrato hexânico obtido após a exclusão do material precipitado (E.H.) foi

concentrado sob pressão reduzida fornecendo um resíduo pesando 800 mg (30% do extrato

original em hexano). Este material foi, em seguida, submetido à cromatografia em coluna

Material botânico

extra

ão com hexano

Material botânico

Extrato hexânico ; E.H.b.

extra

ão com diclorometano

Material botânico

Extrato diclorometânico ; E.dCl.b.

extra

ão com etanol

Material botânico

Extrato etanólico ; E.E.b.

113

“flash”, tendo sido obtidas 41 frações de aproximadamente 30 mL cada. As frações 1 a 3

(E.H.1-3, 120 mg) foram reunidas de acordo com suas semelhanças cromatográficas (CCD)

e submetidas à cromatografia com fase gasosa com detecção de massas (por impacto de

elétrons-70 eV; Esquema 12). A partir do cromatograma e dos espectros obtidos foi

possível a caracterização de três substâncias principais nos tempos de retenção 18,91, 29,02

e 30,48 minutos (E.H.1-3.1; E.H.1-3.2; E.H.1-3.3).

Esquema 12: Fluxograma para o fracionamento do extrato hexânico.

E.H.1-3.1 (18,91 minutos): IE-EM m/z : 191; 161; 121; 95; 81; 69; 55.

E.H.1-3.2 (29,02 minutos): IE-EM m/z : 424; 409; 325; 311; 300; 271; 257; 245; 231; 205;

204; 189; 173; 149; 147; 133; 109; 95; 81; 69; 55.

E.H.1-3.3 (30,48 minutos): IE-EM m/z : 424; 409; 325; 311; 285; 271; 257; 245; 231; 201;

173; 147; 123; 109; 95; 81; 69; 55.

41 fra

ões

E.H.1-3

CG-EM

Injetor: 270 ºC

Interface: 230 ºC

Temperatura da coluna: 60 ºC a

290 ºC (20 ºC/min.)

E.H.b.

precipitação com MeOH

Coluna com Gel de Sílica:

1300ml de hexano/acetato de etila, 85:15 (v/v); 200ml de

acetato de etila, 100%

E.H.; 800 mg

t. 1

E.H.1-3.1

E.H.1-3.2

E.H.1-3.3

114

4.6.2 – Extrato diclorometânico

O extrato em diclorometano obtido após a exclusão do material precipitado (E.dCl.;

1,2 g) foi concentrado e submetido à cromatografia “flash” tendo como fase estacionária

aproximadamente 10 g de gel de sílica impregnada com KOH. O gel de sílica foi

previamente tratado com uma solução saturada de KOH em álcool iso-propílico (50 g/l). A

eluição foi realizada pela adição de hexano a 100 % (gerando a fração E.dCl.H.) seguido

por diclorometano a 100 % (gerando a fração E.dCl.dCl.), metanol a 100% (gerando a

fração E.dCl.Me.) e metanol-ácido fórmico a 20% (gerando a fração E.dCl.Me/ac.).

Através de análises feitas com CCD, pôde-se determinar a presença das substâncias-alvo na

fração em metanol (E.dCl.Me.) que, após adição de água e posterior acidificação com

ácido clorídrico (10 N) a um pH equivalente a 1, foi particionada com diclorometano para a

obtenção das substâncias ácidas livres (440 mg).

Para a separação dos ácidos graxos presentes das substâncias de interesse,

prosseguiu-se com uma rápida coluna de cromatografia “flash” com aproximadamente 5 g

de gel de sílica funcionalizada com octadecilsilano (RP-18). Essa coluna foi eluída com

volumes iguais de metanol (E.dCl.Me.1) e diclorometano (E.dCl.Me.2), e gerou apenas

duas frações de 50 mL; 277 e 133 mg, respectivamente. Essas duas frações foram metiladas

com diazometano e analisadas por CG-EM (esquema 13). A partir da análise dos dados

obtidos dessa análise puderam ser identificados quatro triterpenos ácidos de classe dos

oleananos e ursanos, nos tempos de retenção 17,25, 18,28, 19,47 e 21,16 minutos

(E.dCl.Me.1.1; E.dCl.Me.1.2; E.dCl.Me.1.3; E.dCl.Me.1.4), da fração E.dCl.Me.1.

115

Esquema 13: Fluxograma para o fracionamento do extrato diclorometânico.

E.Cl.Me.1.1 (17,25 minutos): IE-EM m/z: 466; 407; 260; 245; 231; 213; 201; 187; 171;

157; 157; 145; 131; 119; 105; 95; 81; 69; 55.

E.Cl.Me.1.2 (18,28 minutos): IE-EM m/z: 468; 260; 245; 231; 207; 201; 187; 173; 157;

145; 131; 119; 105; 95; 81; 69; 55.

E.Cl.Me.1.3 (19,47 minutos): IE-EM m/z: 470; 411; 262; 263; 233; 207; 203; 189; 175;

161; 147; 133; 119; 105; 95; 81; 69; 55.

E.Cl.Me.1.4 (21,16 minutos): IE-EM m/z: 470; 410; 339; 314; 263; 262; 248; 233; 207;

203; 189; 173; 161; 147; 133; 119; 105; 95; 81; 69; 55.

E.dCl.b.

Ppt. 1

CC com Gel de Sílica - KOH

e eluida com: Hexano

MeOH

MeOH / Ác

Fórmico

(8:2)

Adicionou-se H

O / HCl pH = 1;

Particionar com diclorometano

E.Cl.Me.

coluna “flash” com Gel de Sílica RP-18

F.M.: metanol 100% e diclorometano 100%

E.Cl.Me.2

E.dCl.H E.dCl.dCl E.dCl.Me E.dCl.Me/ac.

reci

ita

ão com MeOH

E.Cl.Me.1

CG-EM

Injetor: 270ºC

Interface: 250 ºC

Temperatura da coluna: 60 ºC a

290 ºC (30 ºC/min.)

E.Cl.Me.1.1

E.Cl.Me.1.2

E.Cl.Me.1.3

E.Cl.Me.1.4

E.dCl.

116

4.6.3 – Extrato etanólico

Para os procedimentos realizados no fracionamento do extrato etanólico foi

necessário retornar à fase de obtenção dos extratos brutos a fim de obter uma quantidade

maior de material de partida. Já foi anteriormente citado que o peso molecular elevado, a

polaridade elevada e a possibilidade de misturas bastante complexas caracterizam uma

considerável dificuldade nos processos de purificação e elucidação estrutural de saponinas.

Desse modo, optou-se por repetir a obtenção dos extratos brutos com mais 200 g do

material botânico utilizado.

O E.E.b. foi concentrado à secura sob pressão reduzida (12,05 g) e então

ressuspendido em água destilada. Com essa solução foram realizadas partições com

diclorometano; e a fração aquosa resultante foi particionada com butanol. A fração

butanólica (E.E.Bu.; 4,00 g) assim obtida foi concentrado sob pressão reduzida e o resíduo

resultante foi ressuspendido em metanol. Após precipitação controlada por diferença de

solubilidade com excesso de éter etílico (30 mL) da solução concentrada de metanol o

precipitado (E.E.Bu.ppt.; 2,02 g) foi submetido à cromatografia líquida sob média pressão

(CLMP) em gel de sílica funcionalizada com octadecilsilano (RP-18), na qual foram

isoladas frações ricas em substâncias glicosiladas. Ensaios colorimétricos (principalmente

Liebermann-Bouchard e orcinol sulfúrico), espectros de ressonância magnética (

H e

C) e

a formação de espuma em abundância sugeriram a presença de substâncias da classe das

saponinas. A coluna de CLMP foi eluída com um gradiente de concentração crescente de

metanol em água (água 100%, água/metanol 90 %, água/metanol 80 %, água/metanol 70 %,

água/metanol 50 %, água/metanol 30 %, metanol 100 %). Foram obtidas 163 frações de

aproximadamente 7 mL cada, em um fluxo de eluição de 15 mL por minuto. A análise das

frações oriundas dessa primeira coluna no U.V. a 220 nm estabeleceu um cromatograma

passível de uma separação de dez grupos distintos (Esquema 14).

117

Fr. a

uosa ~200mlFiltrado retomado em

EtOH

(1)-particionado com CH

(2)-particionado com BuOH

E.E.Bu.

MeOH;

O (30 mL)

E.E.Bu.ppt.; 500 mg

- não homogêneo;

- CCD (RP-18)

vanilina e orcinol sulfúrico

Fr. em éter etílico

sobrenadante

CC com Gel de Sílica RP-18:

F.M.: gradiente de H

O e

MeOH Æ 80 frações de 5 mL

100% MeOH Æ ~130 mL

Lieberman-Bouchard

U.V. em 220 nm – 10 grupos de fr.

RP-01

RP-02

RP-03

RP-04

RP-05

RP-06

RP-07

RP-08.s

RP-09.s

RP-10.s

E.E.b.

Esquema 14: Fluxograma para o fracionamento do extrato etanólico.

4.6.4 – Purificação das saponinas

As frações ricas em saponinas obtidas da coluna cromatográfica sob média pressão

(CLMP) foram posteriormente purificadas com a utilização da cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE) com fase estacionária inversa (RP-18) e fase móvel metanol-água-ácido

trifluoroacético (60:40:0,0125, v/v/v). O cromatograma foi obtido com detecção no U.V.

(D.A.D.) a 203 nm. Foram realizadas injeções analíticas com 10 µg em 20 µl da fase móvel

das frações RP-08.s, RP-09.s e RP-10.s.

Os procedimentos semipreparativos de CLAE foram realizados com injeções de 25

mg em 100 µl, sendo injetados um total de 400 mg da fração RP-08.s. O cromatograma foi

Ressuspendido em H

destilada e filtrado

118

obtido com detecção por U.V.. Foram, assim, obtidas duas saponinas purificadas (RP-

08.s.1 e RP-08.s.2), nos tempos de retenção de 49 e 66 minutos (78 mg e 48 mg).

RP-08.s.1 (49 minutos):

C (50 MHz, CD

OD), δ (ppm): 16,1 (CH

); 17,0 (CH

); 18,3

(CH

); 18,5 (CH

); 19,6 (CH

); 23,6 (CH

); 24,4 (CH

); 25,1 (CH

); 27,1 (CH

); 28,5

(CH

); 31,3 (C); 33,8 (CH

); 33,9 (CH

); 33,9 (C); 34,1 (CH

); 35,7 (CH

); 38,2 (C); 39,8

(CH

); 40,3 (C); 41,3 (C); 43,5 (CH); 44,6 (CH

); 45,6 (C); 48,7 (CH); 57,2 (CH); 64,9

(CH

); 65,3 (CH

); 65,5 (CH

); 68,1 (CH); 69,0 (CH); 72,3 (CH); 72,5 (CH); 73,3 (CH);

74,9 (CH

); 75,1 (CH

); 75,4 (CH); 77,7 (CH); 78,3 (CH); 78,8 (CH); 79,3 (CH); 80,4 (C);

80,7 (C); 80,8 (CH); 91,2 (CHOH); 94,5 (CH); 101,5 (CH); 107,0 (CH); 112,2 (CH); 112,5

(CH); 124,7 (CH); 128,6 (CH); 137,8 (CH); 141,5 (C); 176,1 (C=O).

H (600 MHz,

OD), δ (ppm): 0,64; 0,86; 0,88; 0,88; 0,90; 0,93; 1,06; 1,17; 1,28; 2,92; 3,17; 4,38;

5,12; 5,19; 5,29; 5,39; 5,44; 5,54; 5,67. [M + Na]

Observado: m/z 1063,4811; Calculado

para C

: m/z 11063,50898.

RP-08.s.2 (66 minutos):

C (50 MHz, CD

OD), δ (ppm): 16,0 (CH

); 16,9 (CH

); 18,3

(CH

); 18,5 (CH

); 19,4(CH

); 23,5 (CH

); 24,3 (CH

); 25,0 (CH

); 27,1 (CH

); 28,4

(CH

); 31,3 (C); 33,6 (CH

); 33,6 (CH

); 33,6 (C); 33,8 (CH

); 35,6 (CH

); 38,2 (C); 39,7

(CH

); 40,2 (C); 41,2 (C); 43,4 (CH); 44,6 (CH

); 45,5 (C); 48,7 (CH); 57,0 (CH); 64,0

(CH

); 65,5 (CH

); 67,4 (CH); 68,9 (CH); 71,7 (CH); 72,5 (CH); 73,2 (CH); 74,4 (CH);

75,1 (CH

); 75,3 (CH); 77,7 (CH); 78,4 (CH); 79,9 (CH); 80,6 (C); 91,1 (CHOH); 94,1

(CH); 101,5 (CH); 107,0 (CH); 111,6 (CH); 124,6 (CH); 128,7 (CH); 137,5 (CH); 141,6

(C); 176,1 (C=O).

H (600 MHz, CD

OD), δ (ppm): 0,63; 0,85; 0,88; 0,90; 0,93; 1,06;

1,16; 1,27; 2,93; 3,17; 4,38; 5,06; 5,33; 5,46; 5,44; 5,55; 5,66. [M + Na]

Observado: m/z

1195,6062; Calculado para C

: m/z 1195,55124.

4.7 – Hidrólises

As hidrólises ácidas das saponinas (2,00 mg) foram realizadas com uma solução a

0,5 N de ácido trifluoroacético (TFA) em tubo de reação sob pressão, por 2 minutos em

aparelho de microondas doméstico sob potência máxima. Passados esses 2 minutos uma

partição com éter etílico (em água) permitiu a separação da porção aglicona da porção

119

sacarídica. As frações etéreas contendo a aglicona foram evaporadas em evaporador

rotatório, sob pressão reduzida e as frações aquosas foram liofilizadas.

Foi realizada também uma reação de hidrólise ácida com uma solução de 1 N de

ácido trifluoroacético (TFA) sob refluxo por 3 horas. Essa foi realizada com a finalidade de

comparação com as hidrólise sob microondas.

As hidrólises básicas de ambas as saponinas foram realizadas com uma solução de

0,5 M de KOH sob refluxo por 3 horas. Em seguida, a mistura reacional foi submetida a

uma coluna contendo cerca de 30 mL de resina Dowex 50W-X8, ativada com 150 mL de

ácido clorídrico a 1 N, a fim de se eliminar o potássio. A solução neutralizada foi liofilizada

e submetida a uma coluna contendo cerca de 10 mg de gel de sílica de fase inversa (RP-18).

Essa coluna foi eluida com 30 mL de água seguida de 30 mL de metanol para a separação

do oligossacarídeo da pró-saponina (C3).

4.8 – Obtenção dos produtos derivados

4.8.1 – Estér Metílico da Aglicona

A aglicona obtida da reação de hidrólise foi submetida à reação de metilação com

diazometano para posteriormente ser analisada por cromatografia com fase gasosa e

detecção de massas. A identificação da estrutura da aglicona foi confirmada por

comparação dos dados espectrométricos e espectroscópicos (RMN de

H e de

C) com

valores de referência da literatura. A cromatografia com fase gasosa e detecção de massas

foi realizada sob as seguintes condições:

Injetor: 270 ºC

Interface: 250 ºC

Temperatura da coluna: 60 a 290 ºC (30 ºC/min)

Coluna: 5% fenilmetilsilicone

Dimensões: 30 m x 0,25 mm

Fluxo: 1 ml/min

IE-EM m/z: 468; 260; 245; 231; 207; 201; 187; 173; 157; 145; 131; 119; 105; 95; 81; 69;

55.

120

4.8.2 – Acetatos de Alditóis

A identificação dos monossacarídeos obtidos das reações de hidrólise e de padrões

selecionados foi realizada através da análise dos acetatos de alditóis dos monossacarídeos.

A redução dos açúcares obtidos das frações aquosas liofilizadas da hidrólise foi realizada

com uma solução de boroidreto de sódio (NaBH

) em água desmineralizada (cerca de 3,0

mg de NaBH

em 1 mL de água). Após 2 horas, o excesso de boroidreto foi destruído com

ácido acético glacial (cerca de 100 µl). A solução foi, então, passada em uma coluna

montada com uma pipeta de Pasteur (200 x 5 mm) contendo cerca de 1 mL de resina

Dowex 50W-X8, ativada com 5 mL de ácido clorídrico a 1 N, a fim de se eliminar o sódio.

A solução eluída dessa coluna foi liofilizada tratada com metanol e evaporada visando a

eliminação do borato residual. As reações de acetilação dos resíduos de monossacarídeos

reduzidos foram realizadas com uma mistura de anidrido acético destilado e piridina seca

na proporção de 3:2 (2 mL). As reações foram realizadas por 1 hora a 60 ºC sob agitação e

ao abrigo da luz. Após esse tempo as reações foram cessadas com a adição de água e o

produto acetilado foi extraído com diclorometano (2 x 1:1). O solvente foi eliminado em

evaporador rotatório, sob pressão reduzida, e o solvente remanescente (piridina) foi

eliminado por evaporação a vácuo. Os acetatos de alditóis assim obtidos foram submetidos

à análise por cromatografia com fase gasosa e detecção de massas (CG-EM). A CG-EM foi

realizada sob as seguintes condições:

Injetor: 270 ºC

Interface: 250 ºC

Temperatura da coluna: 110 a 290 ºC (4 ºC/min)

Coluna: 5% fenilmetilsilicone

Dimensões: 30 m x 0,25 mm

Fluxo: 1 ml/min

Os tempos de retenção e os espectros de massas dos acetatos de alditóis obtidos

foram comparados com acetatos de alditóis de padrões de ramnose, arabinose, fucose,

xilose, ribose, manose, glicose e galactose. Para ambas as amostra RP-08.s.1 e RP-08.s.2

foi possível a identificação direta por co-injeção de ramnose e arabinose (Anexo 8).

121

4.8.3 – Derivados Trimetilsililados dos monossacarídeos

Foi realizada também a análise de derivados trimetilsililados dos monossacarídeos

obtidos das reações de hidrólise e de padrões selecionados. Para tal, foram adicionados 100

µl de N-(trimetilsilil)imidazol ao resíduo sacarídico seco obtido das hidrólises. As reações

de trimetilsililação foram feitas por 5 minutos sob agitação e as soluções foram submetidas

à análise por CG-EM. As condições de análise foram as seguintes:

Injetor: 270 ºC

Interface: 250 ºC

Temperatura da coluna: 110 a 250 ºC (4 ºC/min)

Coluna: 5% fenilmetilsilicone

Dimensões: 30 m x 0,25 mm

Fluxo: 1 ml/min

122

5 – Conclusões

Foi observado que a obtenção dos extratos de maneira diferencial com o auxílio de ultra-

som foi bastante eficiente em comparação com a obtenção por meio do aparelho de

Soxhlet. A economia de tempo e a manutenção da temperatura ambiente foram os fatores

considerados determinantes para a escolha do modelo desenvolvido para a extração com o

ultra-som.

A partir dos extratos em hexano e diclorometano foi isolado um poliisopreno caracterizado

por CPG e ressonância magnética nuclear de hidrogênio e carbono-13. Essa estrutura ainda

não havia sido descrita para a espécie C. alba.

A partir do extrato em hexano foram identificados os triterpenos pentacíclicos filic-7-en-3-

ona e fern-7-en-3-ona. Ambas as substâncias não possuem descrição na espécie C. alba,

sendo a filic-7-en-3-ona uma substância inédita.

Do extrato em diclorometano foram identificados o ácido ursólico, ácido oleanólico, ácido

3β-hidroxiolean-12,15-dien-28-óico e um derivado triênico do ácido 3β-hidroxioleanólico

por CG-EM após metilação com diazometano de uma fração isolada. O derivado triênico

do ácido 3β-hidroxioleanólico ainda não possui registros nem para a espécie C. alba, sendo

uma substância inédita.

Do extrato em etanol foram isolados e identificados duas saponinas triterpenoídicas. São

elas: 3-O-β-D-glucopiranuronosil-hidroxiolean-12,15-dien-28-oato de 28-O-α-D-

apiofuranosil(1→3)-[α-D-apiofuranosil(1→4)]-α-L-ramnopiranosil(1→2)-α-L-arabino

piranosila e a 3-O-β-D-glucopiranuronosil-hidroxiolean-12,15-dien-28-oato de 28-O-α-D-

apiofuranosil(1→3)-α-L-ramnopiranosil(1→2)-α-L-arabinopiranosila. Ambas as são

inéditas.

123

Foi observado que a intensa sobreposição de sinais nos espectros de ressonância magnética

nuclear, principalmente de hidrogênio, tornou a elucidação estrutural das saponinas em

questão um processo bastante complexo. A utilização apenas de dados dos espectros de

ressonância magnética nuclear obtidos não permitiram a completa identificação estrutural.

Para elucidação estrutural inequivoca, métodos químicos de análise tiveram de ser

utilizados.

Foi também observado que a técnica de análise dos acetatos de alditóis não deve ser tida

como uma técnica universal para a identificação de monossacarídeos. É sabido que essa é

uma técnica utilizada apenas para monossacarídeos neutros, não gerando resultado acerca

de ácidos urônicos, por exemplo. Adicionalmente, a acetilação da apiose deve ser otimizada

com a finalidade de se obter um derivado peracetilado.

124

6 – Anexos

Anexo 1

Relação das classes de substâncias caracterizadas em espécies da família Rubiaceae (de

1990 a 2005).*

Espécie Composto (s) Referência (s)

Triterpenos pentacíclicos glicosilados: der.

oleanólicos

Fan e col., 1997

Adina rubella

Triterpenos pentacíclicos glicosilados

He e col., 1996

Iridóides: iridolactonas

Alberta magna

Ciclopentenos dialdeídicos

Drewes e col., 1998

Triterpenos pentacíclicos: der. oleanólico e ursólico

Flavonóides: flavonas

Alibertia

myrciifolia

Cumarinas metoxiladas

Luciano e col., 2004

Anthocepalus

cadamba

Esteróides

Agusta e cols.,1998

A. chinensis

Iridóides e seco-iridóide glicosilado

Apiglicosídeos fenólicos

Alcalóides indólicos

Kitagawa e col., 1996

Antirhea acutata

Triterpeno-metilésteres: nor-seco-cicloartano

Lee e col., 2001

A. lucida

Alcalóides indólicos

Weniger e cols.,1995

A. portoricensis

Alcalóides indólicos

Weniger e col., 1994

Argostemma yappii

King.

Alcalóide pirrolidinoindólico

[a] Dachriyanus e col.,

2000

Borreria

verticillata

Alcalóide bis-indólico

[a]Balde e col., 1991

Burchellia bubalina

α- e β-Gardiol

Drenes e col., 1998

Calycophyllum

spruceanum

seco-Iridóides glicosilados

Zuleta e cols.,2003

Camptotheca

acuminata

Alcalóides: der. da camptotecina e camptotecina

Lorence e col., 2004

Iridóides glicosilados

Canthium

berberidifolium

Fenólicos diglicosilados

Kanchanapoom e col.,

2002

C. schimperianum

Glicosídeo cianogênico esterificados com iridóides

glicosilados

Schwarz e col., 1996

Catunaregam

nilotica

Triterpenos pentacíclicos glicosilados: der.

oleanólicos

Lemmich e col., 1995

Monoterpenos tetraidroisoquinolinico glicosilado

Itoh e col., 2002

Cephaelis

acuminata

Alcalóides eméticos

[a] Itoh e col., 1999

C. acuminata e

Alangium lamarckii

Alcalóides de Ipeca

[b] Itoh e col., 1999

Alcalóides indólicos

C. dichroa

Alcalóides indólicos glicosilados

Solis e col., 1993

125

Monoterpenos tetraisoquinolínicos glicosilados

Itoh e col., 1994

C. ipecacuanha

Alcalóides eméticos

Yoshimatsu e

cols.,1991

Iridóides

seco-Iridóide

Carbonezi e col., 1999.

Nor-seco-pimarano

Borges-Argáez e

cols.,2001

Triterpenos pentacíclicos: der. oleanólicos

Bhattacharyya e

cols.,1992

Cetoálcoois

Fenilcumarinas

Lignanas

El-Hafiz e col., 1991

C. alba

Alcalóides quinolínicos

El Abbadi e col., 1990

Chiococca

braquiata

Flavonóides

Triterpenos pentacíclicos: der. oleanólico e ursólico

Bolzani e col., 2004

Acetofenonas

Iridóides glicosilados

Chione venosa

Triterpenos tetracíclicos

Lendl e cols.,2005

Antraquinonas

Cinchona robusta

Der. de fenilpropanóides

Schripsema e

cols.,1999

Crossopteryx

febrifuga

Triterpenos pentacíclicos glicosilados: derivado

ursólico

Hoornaert e col., 1991

Crucianella

maritima L.

Antraquinonas

El-Lakany e cols.,2004

C. graeca;

Cruciata glabra;

C. laevipes; e

C. pedemontana

Cumarinas

Iridóides

Mitova e col., 1996

Iridóides

Cruckshanksia

pumila

Secologanina

Piovano e cols.,2003

Corynanthe

pachyceras

Alcalóides indólicos

Staerk e cols.,2000

Coussarea

brevicaulis

Triterpenos pentacíclicos: der. oleanólico e ursólico

Su e cols.,2003

C. hydrangeifolia

Der. glicosilados de fenilpropanóides

Hamerski e col., 2005

Alcalóide: cafeína

Begum e cols.,2003

C. bengalensis

Diterpeno (16-epicafestol)

Hasan e cols.,1994

Damnacanthus

indicus

Antraquinonas

Koyama e col., 1992

Deppea

blumenaviensis

Alcalóide β-carbolinico

Kan-Fan e col., 1995

Dunnia sinensis

Iridóides glicosilados

Wei e col., 2000

Duroia hirsuta

Iridóide lactona

Page e col., 1994

Enterospermum

pruinosum

Triterpenos pentacíclicos glicosilados: der.

oleanólicos

Multari e cols.,1995

madagascariensis

Sesquiterpenos: der. cadinano e guaiano

Raharivelomanana e

col., 2005

nor-Diterpenos

Exostema

acuminatum

4-Fenilcumarinas

Ito e cols.,2000

Galianthe

brasiliensis

Iridóides glicosídeos

de Moura e col., 2005

Galium album; G.

Iridóides glicosilados: der. acetoxiloganina

Hijiena e col., 1996

126

lovcense

G. incurvum

Iridóides glicosilados

[a] Mitova e col., 1996

G. macedonicum

Iridóides: macedonina não glicosilada

[b] Mitova e col., 1996

Antraquinonas

G. sinaicum

Antraquinonas glicosiladas

El-Gamal e col., 1996

G. verum

Antraquinonas

Banthorpe e cols.,1995

Ácido ferrúlico

Moon e cols.,2002

Iridóides glicosilados

Lee e cols.,1998

Monoterpenos

Zhao e cols.,1994

G ardenia

jasminoides

Substâncias voláteis

Buchbauer e col., 1996

G. saxatilis

Triterpenos pentacíclicos: der. oleanólico e ursólico

Suksamrarn e col.,

2003

Sesquiterpeno

Flavonóides: flavonas

G. sootepensis

Der. do ácido benzóico

Rukachaisirikul e

cols.,1998

G. thailandica

Cicloartano

Tuchinda e cols.,2004

Genipa americana

Iridóides glicosilados

Ono e col., 2005

Guettarda

noumeana

Alcalóides quinolínicos

Montagnac e cols.,1997

Hamelia

magniflora

Alcalóides indólicos

Rumbero e col., 1991

Furanoantraquinonas

Ahmad e col., 2005

Alcalóides

Saponinas

Taninos

Antranóides

Lai e cols.,2001

Alcalóides ß-carbolínicos

Phuong e col., 1999

Hedyotis

capitellata

Alcalóides indólicos monoterpênicos

Phuong e col., 1998

Der. asperulosídeos e scandosídeos

Sudarsono, e col., 2004

H. corymbosa (L.)

Iridóides

Sudarsono, e col., 1999

H. chrysotricha

Alcalóides ß-carbolínico

Peng e cols.,1997

H. hedyotidea

Iridóides

Peng e col., 1998

H. herbacea

Flavonóides

Hamzah e col., 1996

H. nudicaulis

Saponinas triterpênicas: der. oleanólicos

Konishi e cols.,1998

Heinsia crinata

Triterpenos pentacíclicos glicosilados

Babady-Bila, e col.,

1994

Heterophyllaea

pustulata

Antraquinonas.

Montoya e col., 2005

Fenilcumarinas

Hintonia latiflora

Fenilestireno

Mata e col., 1992

Hymenodictyon

floribundum

Glicosídeos: der. da scopoletina e β-sitosterol

Mitaine-Offer e col.,

2003

Isertia haenkeana

Alcalóides indólicos

Bruix e col., 1995

Ixora coccinea

Triterpeno pentacíclico: der. ursólico

Latha e cols.,2001

Knoxia

valerianoides

Antraquinonas

Zhou e col., 1994

Lasianthus

gardneri

Triterpenos tetracíclicos: der. seco-lupanos

Dallavalle e cols.,2004

Megastigmane glucosideos

Iridóides glicosilados

Megastigmane glucosideos

L. fordii

Iridóides glicosilados

Takeda e col., 2004

127

Lerchea bracteata

Alcalóide corinantano quaternário

[a] Arbain e cols.,1992

hidroquinona diglicosídeo

Harouna e cols.,1995

Mitracarpus scaber

Substância voláteis: ácidos

Ekpendu e cols.,1993

M. villosus

Fitoesteróis

Triterpeno pentacíclico: der. ursólico

Ekpendu e cols.,2001

Mitragyna inermis

27-Nor-triterpenos glicosilados: der. oleanólico

Cheng e col., 2002

M. speciosa

Alcalóides indólicos

Takayama e col., 2004

Constituintes apolares: E-phitol; der. cicloartano,

stigmasterol e sitosterol; cetoesteróides

Saludes e col., 2002

Iridóides glicosilados

Sang e cols.,2002

Morinda citrifolia

Antraquinonas

Bassetti e col., 1995

Iridóides glicosilados

Fenólicos diglicosilados

seco-Iridóides

M. coreia

Antraquinonas glicosiladas

Kanchanapoom e col.,

2002

Abdullah e cols.,1998

M. elliptica

Antraquinonas

Ismail e col., 1997

M. longissima

Scopoletina

Pham e col., 2005

M. lucida

Antraquinonas

Rath e col., 1995

M. morindoides

Flavonóides O-glicosilados

Cimanga e col., 1995

M. umbellata

Antraquinonas

Chang e col., 1995

Mussaenda incana

Iridolactona e Iridóide glicosilado

Dinda e col., 2005

Triterpenos pentacíclicos: der. oleanólicos e der.

oleanólicos glicosilados

Zhao e cols.,1997

Lactonas monoterpenicas

[b] Zhao e cols.,1996

M. pubescens

Saponinas triterpenicas: der. oleanólicos

Zhao e cols.,1995

Saponinas triterpenicas: der. oleanólicos

Ollivier e cols.,1995

Nauclea diderrichii

Alcalóides gluco-indólicos

Lamidi e col., 2005

N. orientalis

Alcalóides monoterpenico tetraidro-β-carbolínicos

glicosilados

Triterpenos pentacíclicos: der. oleanólicos

Zhen-Dan He e col.,

2005

N. pobequinii

Nauclequiniina

Alcalóides indólico

Anam e col., 1997

seco-iridoides glicosilados

Alcalóides indólicos glicosilados

[a] Itoh e cols.,2003

Triterpenos pentacíclicos: der. oleanólicos

Kang e cols.,2003

Neonauclea

sessilifolia

Saponinas triterpênicas: der. oleanólicos

[b] Itoh e cols.,2003

Neolaugeria

resinosa

Alcalóides oxindólicos

Weniger e col., 1993

Oldenlandia

corymbosa

Iridóides glicosilados

Otsuka e cols.,1991

Triterpenos pentacíclicos: der. ursólicos

Kim e col., 1998

O. diffusa

Triterpenos pentacíclicos: der. ursólicos e oleanólicos

Lu e col., 1996

O. filistipula

Alcalóides normalindina

Arbain e cols.,1993

Ophiorrhiza

blumeana

Alcalóides indólicos

[a] Arbain e col., 1998

O. bracteata

Alcalóide glucoindólico quaternário

[a] Arbain e col., 1997

O. communis

Alcalóides indólicos

[b] Arbain e col., 1997

O. hayatana

Antraquinonas

Chan e col., 2005

O. liukiuensis

Monoterpenos glicosilados

Kitajima e col., 2005

O. pumila

Alcalóides: der. camptotecinas

Saito e col., 2001

128

Antraquinonas

Kitajima e cols.,1998

O. rosacea

Alcalóides indólicos

[b] Dachriyanus e col.,

2000

Iridóides

Suzuki e col., 2004

Paederia scandens

Iridóides glicosilados

Quang e cols.,2002

Monoterpenos ß-carbolínicos glicosilados

Palicourea adusta

Der. do ácido hidroxicinamico

Valverde e col., 1999

Proantocianidina

Flavonóides

Proantocianidina

Pavetta owariensis

Ésteres de der. do ácido ferrúlico

Balde e col., 1991

Pentas bussei

Naftoiidroquinonas pentacíclicas

Bukuru e cols.,2003

P. longiflora

Der. naftoquinóides

Hari e cols.,1991

Psychotria

carthagenensis

Ausência de Alcalóides

Leal e col., 1996

P.colorata

Alcalóides pirrolidinoindólicos

Verotta e col., 1998

Alcalóides indólicos

Der. C13-nor-isoprenóides

P. correae

Carotenóides

Achenbach e col., 1995

P. glomerulata

Alcalóides quinolínicos

Solís e col., 1997

P. ipecacuanha

Alcalóides eméticos

Garcia e col., 2005

P. leiocarpa

Alcalóide indólico monoterpenico

Henriques e col., 2004

P. oleoides e P.

lyciiflora

Alcalóides pirrolidinoindólicos

Jannic e col., 1999

P. suterella

Alcalóide indólico monoterpênico

De Santos e col., 2001

P. viridis

Alcalóide: dimetiltriptamina

Blackledge e col., 2003

Randia formosa

Saponinas triterpênicas der. ursólicos e oleanólicos

Sahpaz e cols.,2000

Randia spinosa

Iridóides glicosilados

Hamerski e col., 2003

R. siamensis

Triterpenos pentacíclicos glicosilados: der.

oleanólicos e ursólicos

Jansakul e cols.,1999

Remijia peruviana

Alcalóides da chinchona

Ruiz-Mesia e col.,

2005

Rothmannia

longiflora

4 oxonicotinamide 1 (1' beta dextro ribofuranoside)

Bringmann e col., 1999

R. urcelliformis

Iridóide alcaloidal

Bringmann e cols.,2001

Rubia akane

Antraquinona aldeído

Morimoto e col., 2002

Componentes do oleo essencial: mollugina,

furomollugina, e (E)-anetol

Mitsuo e col., 2006

Naftoquinonas

Antraquinonas

Koyama e col., 1992

Rubia cordifolia

Iridóides glicosilados: der. geniposídeos

Wu e cols.,1991

Digiferruginol glicosilado

R. schumanniana

Antraquinonas glicosiladas

Liu e cols.,1991

Antraquinonas

Marec e col., 2001

Antraquinonas: Hidroximetilantraquinonas

Antraquinonas glicosiladas

R. tinctorum

Iridóide: asperulosídeo

El-Emary e col., 1998

Sickingia species

Alcalóides glicoindólicos

Aquino e col., 1994

Simira glaziovii

Esteróides

Alcalóides: der. harmanos e opiorinicos

Monoterpenos β-carbolinicos tetraacetilglucosídeos

Bastos e col., 2002

Spermacoce

Ácidos graxos

Ekpendu e cols.,2001

129

verticillata

Monoterpenos

Timonius timon

Triterpenos pentacíclicos: der. oleanólicos

Khan e col., 1993

Tocoyena

brasiliensis

Triterpenos pentacíclicos glicosilados: der.

oleanólicos

Triterpenos pentacíclicos: der. oleanólicos

Hamerski e col., 2005

T. bullata

Iridóides glicosilados

Von Poser e col., 1998

T. formosa

Iridóides

Bolzani e col., 1997

Alcalóides

Terpenes

Flavonóides

Uncaria

Cumarinas

Heitzman e col., 2005

U. callophylla

Alcalóides indólicos diméricos

Kam e col., 1991

U. elliptica

Alcalóides pentacíclicos oxindólicos

Diyabalanage e

cols.,1997

U.glabrata

Glucoalcalóide indólico monoterpenico

[b] Arbain e cols.,1998

Alcalóides

Laus e cols.,2003

U. guianensis

Triterpenos pentacíclicos glicosilados: der. ursólicos

Yépez e cols.,1991

U. macrophylla

Alcalóides oxindólicos

Sakakibara e cols.,1998

Flavonóides

Hou e col., 2005

U. rhynchophylla

Alcalóides oxindólicos e indólicos

Laus e col., 1996

Alcalóides indólicos

Triterpenos pentacíclicos glicosilados: der. oleanólico

Montoro e col., 2004

Alcalóides indólicos glicosilados e β-carbolinicos

Triterpenos pentacíclicos: der. ursólico

Kitajima e col., 2001

Alcalóides oxindólicos

Iridóides glicosilados

Muhammad e col., 2001

Triterpenos pentacíclicos glicosilados: der. ursólicos

Aquino e cols.,1997

Alcalóides indólicos

Laus e col., 1997

U. tomentosa

Alcalóides oxindólicos

Laus e cols.,1994

Xylaria sp.

Derivado do ácido butanóico

Cafeu e col., 2005

* Essa busca foi realizada utilizando os portais www.sciencedirect.com e CASfinder.

130

Anexo 2

Dados utilizados como padrão para comparação e identificação da porção aglicona.*

* A pulcherrimasaponina é uma saponina bis-desmosídica com um ácido olean-12-en-28-

óico, com os oligossacarídeos ligados nas posições 3 e 28. O desacilbellidiosídeo B

também uma saponina bis-desmosídica com um ácido 2β, 3β, 16α, 23-tetraolean-12-em-

óico, com os oligossacarídeos ligados nas posições 3 e 28.

Aglicona

39,1 39,8 45,1 38,40

28,1 27,1 71,8 25,88

78,2 91,2 82,5 88,88

39,5 40,3 43,5 38,67

56,0 57,2 48,0 55,46

17,0 19,6 19,1 18,07

33,5 34,1 33,7 32,98

40,4 41,3 40,9 39,58

47,9 48,7 48,3 46,65

37,8 38,2 37,8 36,51

23,7 24,4 24,7 23,25

123,0 124,7 123,6 122,10

141,7 141,5 144,7 143,72

44,8 45,6 43,0 41,51

129,9 128,6 36,5 35,44

134,9 137,8 74,5 73,57

44,0 33,9 50,2 48,82

42,9 43,5 42,4 40,85

47,9 44,6 48,0 46,80

30,8 31,3 31,3 30,14

35,2 35,7 36,5 35,34

33,5 33,8 31,9 31,41

16,4 17,0 65,7 27,60

28,9 28,5 14,9 16,45

15,5 16,1 18,0 15,12

17,9 18,3 17,9 16,95

25,1 25,1 27,2 26,59

178,4 176,1 177,3 175,40

33,5 33,9 33,3 32,55

25,3 23,6 24,9 24,27

Solvente

Clorofórmio.d Metanol.d

Metanol.d

Piridina.d

Substância

ácido 3β-hidróxiolean-

12,15-dien-28-óico

Aglicona

RP-08.s.1

Desacilbellidio

sídeo B

Pucherrima

saponina

Ref.

Bhattacharyya e col.,

1992

Schöpke e col.,

1996

Da Silva e

col., 2005

131

Anexos 3

Espectro de RMN de

C (50 MHz) da saponina RP-08.s.2. Há um sinal em 48,7 ppm não

evidenciado. (Solvente: Metanol deuterado; Referência: TMS.)

132

PPM 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4

0.999

1.899

1.715

0.830

0.801

1.257

10.21

5.355

1.153

0.994

1.181

0.993

5.566

9.290

7.346

3.267

5.227

14.65

2.637

Espectro de RMN de

H (600 MHz) da saponina RP-08.s.2. (Solvente: Metanol deuterado;

Referência: TMS.)

PPM (F2) 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4

PPM (F1)

150

140

130

120

110

100

Mapa de correlação HSQC editado da saponina RP-08.s.2. (Solvente: Metanol deuterado;

Referência: TMS.)

133

PPM (F2) 5.60 5.50 5.40 5.30 5.20 5.10 5.00 4.90 4.80 4.70 4.60 4.50 4.40 4.30

PPM (F1)

138

136

134

132

130

128

126

124

122

120

118

116

114

112

110

108

106

104

102

100

Mapa de correlação HSQC editado (ampliação) da saponina RP-08.s.2. (Solvente: Metanol

deuterado; Referência: TMS.)

PPM (F2) 4.00 3.90 3.80 3.70 3.60 3.50 3.40 3.30 3.20 3.10

PPM (F1)

Mapa de correlação HSQC editado (ampliação) da saponina RP-08.s.2. (Solvente: Metanol

deuterado; Referência: TMS.)

134

PPM (F2) 1.80 1.70 1.60 1.50 1.40 1.30 1.20 1.10 1.00 0.90 0.80 0.70 0.60

PPM (F1)

Mapa de correlação HSQC editado (ampliação) da saponina RP-08.s.2. (Solvente: Metanol

deuterado; Referência: TMS.)

PPM (F2) 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8

PPM (F1)

5.6

5.2

4.8

4.4

4.0

3.6

3.2

2.8

2.4

2.0

1.6

1.2

0.8

Mapa de correlação COSY da saponina RP-08.s.2. (Solvente: Metanol deuterado;

Referência: TMS.)

135

Mapa de correlação TOCSY da saponina RP-08.s.2. (Solvente: Metanol deuterado;

Referência: TMS.)

PPM (F2) 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4

PPM (F1)

170

160

150

140

130

120

110

100

Mapa de correlação HMBC da saponina RP-08.s.2. (Solvente: Metanol deuterado;

Referência: TMS.)

136

Anexos 4

Espectro de RMN de

C (50 MHz) da saponina RP-08.s.1. Há um sinal em 48,7 ppm não

evidenciado. (Solvente: Metanol deuterado; Referência: TMS.)

137

PPM 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4

0.905

0.957

0.896

0.912

0.950

0.999

4.968

9.406

7.202

0.953

1.155

1.035

0.955

1.078

4.082

8.477

5.229

3.063

5.225

13.60

2.745

Espectro de RMN de

H (600 MHz) da saponina RP-08.s.1. (Solvente: Metanol deuterado;

Referência: TMS.)

Mapa de correlação HSQC editado da saponina RP-08.s.1. (Solvente: Metanol deuterado;

Referência: TMS.)

138

Mapa de correlação COSY da saponina RP-08.s.1. (Solvente: Metanol deuterado;

Referência: TMS.)

Mapa de correlação TOCSY da saponina RP-08.s.1. (Solvente: Metanol deuterado;

Referência: TMS.)

139

Mapa de correlação HMBC da saponina RP-08.s.1. (Solvente: Metanol deuterado;

Referência: TMS.)

Mapa de correlação HSQC-TOCSY da saponina RP-08.s.1. (Solvente: Metanol deuterado;

Referência: TMS.)

140

Mapa de correlação T-ROESY da saponina RP-08.s.1. (Solvente: Metanol deuterado;

Referência: TMS.)

ppm (f1)

50100150

-100

100

200

300

400

500

600

700

Espectro de RMN de

C (50 MHz) da saponina RP-08.s.1 metilada com diazometano.

(Solvente: Metanol deuterado; Referência: TMS.)

141

Anexos 5

Cromatograma de uma mistura de padrões de monossacarídeos trimetilsililados. A ordem

de eluição foi Rha, Rib, Ara, Xyl, Man, Gal e Glc. Informações sobre condições, ver

Materiais e Métodos 4.8.3, pg. 119.

142

Anexos 6

Cromatograma obtido no CG-EM de padrões de monossacarídeos reduzidos e acetilados. A

ordem de eluição foi Rha, Rib, Ara, Xyl, Man, Glc e Gal. Informações sobre condições, ver

Materiais e Métodos 4.8.2, pg. 119.

143

Espectros de massas dos sinais em 25,97, 26,14, 26,47, 32,04 minutos, respectivamente.

144

Anexo 7

Espectro de massas obtido no Micromass q-TOF, com ionização por “eletrospray” no modo

positivo da amostra RP-08.s.2.

145

Espectro de massas obtido no Micromass q-TOF, com ionização por “eletrospray” no modo

positivo da amostra RP-08.s.2. Seleção do íon a m/z 1063.

146

Espectro de massas obtido no Micromass q-TOF, com ionização por “eletrospray” no modo

positivo da amostra RP-08.s.1.

147

Espectro de massas obtido no Micromass q-TOF, com ionização por “eletrospray” no modo

positivo da amostra RP-08.s.1. Seleção do íon a m/z 1195.

148

Anexo 8

Cromatograma obtido no CG-EM dos monossacarídeos presentes na substância RP-08.s.2

reduzidos e acetilados. O sinal em 25,56 minutos se refere a uma ramnose, o sinal em 26,92

minutos a uma arabinose, e os sinais em 26,56 e 31,67 a uma apiose. Condições: ver item

3.4.2.1.2.b, pg. 104.

149

Cromatograma obtido no CG-EM dos monossacarídeos presentes na substância RP-08.s.1

reduzidos e acetilados. O sinal em 25,91 minutos se refere a uma ramnose, o sinal em 26,34

minutos a uma arabinose, e os sinais em 25,45, 26,89 e 32,03 a duas apiose. Condições: ver

item 3.4.2.1.2.b, pg. 101.

Espectros de massas (impacto de elétrons-70eV) dos sinais em 25,451 e 26,89 minutos,

respectivamente.

150

7 – Referências Bibliográficas

[a] Arbain, D.; Byrne, L.T.; Dachriyanus; Evrayoza, N.; Sargent, M.V. Bracteatine, A

Quaternary Glucoalkaloid From Ophiorrhiza bracteata. Australian Journal of

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[b] Arbain, D.; Afrida, Ibrahim, Satria; Sargent, M.V.; Skelton, B.W.; White, A.H. The

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[b] Arbain, D.; Byrne, L.T.; Dachriyanus; Sargent, M.V. Isomalindine-16-Carboxylate,

A Zwitterionic Alkaloid From Ophiorrhiza Cf. Communis. Australian Journal of

Chemistry, 50(11): 1109-1110, 1997.

151

[b] Dachriyanus; Arbain, D.; Putra, D.P.; Sargent, M.V.; Susila, R.; Wahyuni, F.S. Indole

Alkaloids From Two Species of Ophiorrhiza. Australian Journal of Chemistry, 53(3):

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[b] Itoh, A.; Ikuta, Y.; Tanahashi, T.; Nagakura, N. Structures of New Alkaloids From

Cephaelis acuminata and Alangium lamarckii. Tennen Yuki Kagobutsu Toronkai Koen

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[b] Itoh, A.; Tanahashi, T.; Nagakura, N.; Nishi, T. Two Triterpenoid Saponins From

Neonauclea sessilifolia. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 51(11), 1335-1337,

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